RS61871B1 - Anti-htra1 antitela i postupci za njihovu primenu - Google Patents

Anti-htra1 antitela i postupci za njihovu primenu

Info

Publication number
RS61871B1
RS61871B1 RS20210613A RSP20210613A RS61871B1 RS 61871 B1 RS61871 B1 RS 61871B1 RS 20210613 A RS20210613 A RS 20210613A RS P20210613 A RSP20210613 A RS P20210613A RS 61871 B1 RS61871 B1 RS 61871B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
amino acid
seq
acid sequence
htra1
Prior art date
Application number
RS20210613A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert F Kelley
Daniel K Kirchhofer
Joyce Lai
Chingwei V Lee
Wei-Ching Liang
Michael T Lipari
Kelly M Loyet
Tao Sai
Lookeren Campagne Menno Van
Yan Wu
Germaine Fuh
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS61871B1 publication Critical patent/RS61871B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A61K9/0051—Ocular inserts or implants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

OPIS
OBLAST PRONALASKA
Pronalazak se generalno odnosi na anti-HtrA1 antitela i postupke za primenu istih. OSNOVA PRONALASKA
Serinska proteaza HtrA serinska peptidaza 1 (HtrA1) (PRSS11; klan PA, porodica 51) pripada evoluciono očuvanoj porodici HtrA proteina. Kod ljudi, HtrA1, HtrA3 i HtrA4 dele istu arhitekturu domena: N-terminalni modul sličan IGFBP-u i modul sličan kazalu, domen proteaze sa naborima sličnim tripsinu i C-terminalnog PDZ domena. Fiziološka važnost HtrA1 je čvrsto utvrđena identifikacijom mutacija gubitka funkcije kod ljudi koje uzrokuju porodičnu ishemijsku bolest malih krvnih sudova mozga. Molekulski mehanizam uključuje nedovoljnu inhibiciju TGFβ pomoću HtrA1, što dovodi do povećane signalizacije TGFβ. Neregulisans signalizacija TGFβ aberantnom ekspresijom HtrA1 takođe može da doprinese artritičnoj bolesti, možda zajedno sa degradacijom različitih komponenata ekstracelularne matrice posredovanom putem HtrA1, ili indirektno preko ushodne regulacije metaloproteaza matrice. Pored toga, ljudska genetska ispitivanja su utvrdila snažnu korelaciju između progresije starosne degeneracije makule (AMD) i SNP-a u regionu HtrA1 promotera, što dovodi do povećanih nivoa transkripta HtrA1 (pogledajte, na primer, Dewan et al., Science 314:989-992, 2006 i Yang et al., Science 314:992-993, 2006).
AMD je progresivna hronična bolest centralne mrežnjače sa značajnim posledicama na oštrinu vida. Kasni oblici bolesti su vodeći uzrok gubitka vida u industrijskim zemljama. Za belu populaciju ≥ 40 godina, prevalencija ranog AMD-a se procenjuje na oko 6,8%, a naprednog AMD-a na oko 1,5%. Prevalencija kasnog AMD-a drastično raste sa povećanjem starosti, na oko 11,8% nakon 80 godina starosti. Postoje dve vrste AMD-a, neeksudativni (suvi) i eksudativni (vlažni) AMD. Češći suvi AMD uključuje atrofične i hipertrofične promene u pigmentnom epitelu mrežnjače (RPE) ispod centralne mrežnjače (makule), kao i naslage (druze) na RPE. Uznapredovali suvi AMD može dovesti do značajnog oštećenja mrežnjače, uključujući geografsku atrofiju (GA), uz nepovratan gubitak vida. Štaviše, pacijenti sa suvim AMD-om mogu preći u vlažni oblik, u kojem se abnormalni krvni sudovi zvani horoidalne neovaskularne membrane (CNVM) razvijaju ispod mrežnjače, propuštaju tečnost i krv, i na kraju izazivaju zaslepljujući disciformni ožiljak u mrežnjači i ispod nje.
WO 2013/055998 A1 otkriva anti-HtrA1 antitela i postupke za primenu istih.
Ostaje potreba za anti-HtrA1 antitelima sa poboljšanim svojstvima, kao što je afinitet vezivanja, stabilnost i inhibitorna (blokirajuća) aktivnost, kao i za terapijsku i dijagnostičku upotrebu istih.
REZIME PRONALASKA
Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-HtrA1 antitela i postupke za njihovu primenu u terapeutske i dijagnostičke svrhe. Anti-HtrA1 antitela prema pronalasku su veoma potentna, i imaju veliki afinitet vezivanja za HtrA1. Poboljšana svojstva antitela prema pronalasku čine ih pogodnim za upotrebu u terapiji.
U jednom aspektu, pronalazak sadrži izolovano monoklonsko, humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za HtrA1, pri čemu antitelo sadrži domen za vezivanje koji sadrži promenljivi domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21, i varijabilni laki lanac (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22.
U nekim otelotvorenjima bilo kog prethodnog aspekta, antitelo je fragment antitela koji se vezuje za HtrA1. U nekim otelotvorenjima, fragment antitela je izabran iz grupe koja sadrži fragmente Fab, Fab’-SH, Fv, scFv i (Fab’)2. U nekim otelotvorenjima, fragment antitela je Fab. U nekim otelotvorenjima, Fab sadrži skraćenje u regionu pregiba konstantnog regiona teškog lanca. U nekim otelotvorenjima, Fab sadrži skraćenje u gornjem delu pregiba konstantnog regiona teškog lanca. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca završava se na položaju 221 (EU numeracija). U nekim otelotvorenjima, aminokiselinski ostatak na položaju 221 je ostatak asparaginske kiseline (Asp). U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 160. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 159. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 160 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 159.
U nekim otelotvorenjima, Fab je Fab IgG1.
U nekim otelotvorenjima bilo kog prethodnog aspekta, antitelo je antitelo pune dužine. U nekim otelotvorenjima, antitelo je IgG antitelo. U nekim otelotvorenjima, antitelo je monospecifično antitelo.
U nekim otelotvorenjima bilo kog prethodnog aspekta, antitelo je bispecifično antitelo. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo sadrži drugi vezujući domen koji se vezuje za faktor D.
U drugom aspektu, pronalazak obuhvata izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koje ovde opisano antitelo. U drugom aspektu, pronalazak sadrži vektor (npr. ekspresioni vektor) koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu za ekspresiju antitela. U drugom aspektu, pronalazak obuhvata ćelije domaćine koje sadrže prethodne nukleinske kiseline i/ili vektore. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je ćelija sisara. U nekim otelotvorenjima, ćelija sisara je ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelija 293. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariotska ćelija. U nekim otelotvorenjima, prokariotska ćelija je E. coli.
U drugom aspektu, pronalazak obuhvata postupak za proizvodnju bilo kog ovde opisanog antitela, pri čemu postupak podrazumeva kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži bilo koji od prethodnih vektora (npr. ekspresione vektore) u medijumu za kulturu. U nekim otelotvorenjima, postupak dalje uključuje rekuperovanje antitela iz ćelije domaćina ili medijuma za kulturu.
U drugom aspektu, pronalazak obuhvata kompoziciju koja sadrži bilo koje od prethodnih antitela. U nekim otelotvorenjima, kompozicija dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, pomoćnu supstancu ili razblaživač. U nekim otelotvorenjima, kompozicija je farmaceutska kompozicija. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je liofilizovana. U nekim otelotvorenjima, kompozicija dalje sadrži antagonist za vezivanje faktora D. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja faktora D je anti-faktor D antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. U nekim otelotvorenjima, fragment koji vezuje antigen je Fab ili (Fab’)2. U nekim otelotvorenjima, fragment antitela koji vezuje antigen za faktor D je lampalizumab.
U drugom aspektu, pronalazak obuhvata terapijsku formulaciju koja sadrži bilo koje od prethodnih anti-HtrA1 antitela i antagonist faktora D. U posebnom otelotvorenju, antagonist faktora D je anti-faktor D antitelo. U posebnom otelotvorenju, antagonist faktora D je lampalizumab. U posebnom otelotvorenju, anti-faktor D antagonist se daje sekvencijalno.
U nekim aspektima, bilo koje od prethodnih antitela može da se koristi kao lek.
U nekim aspektima, bilo koje od prethodnih antitela može da se koristiti u lečenju poremećaja povezanih sa HtrA1 ili očnih poremećaja. U nekim otelotvorenjima, poremećaj povezan sa HtrA1 ili očni poremećaj je senilna degeneracija makule (AMD), dijabetička retinopatija, retinopatija nedonoščadi ili polipoidna horoidalna vaskulopatija. U nekim otelotvorenjima, poremećaj povezan sa HtrA1 ili očni poremećaj je AMD. U nekim otelotvorenjima, AMD je rani suvi AMD, srednje suvi AMD ili uznapredovali suvi AMD. U nekim otelotvorenjima, uznapredovali suvi AMD je geografska atrofija.
U nekim aspektima, bilo koje od prethodnih antitela može da se koristi u proizvodnji leka za lečenje poremećaja povezanih sa HtrA1 ili očnih poremećaja. U nekim otelotvorenjima, poremećaj povezan sa HtrA1 ili očni poremećaj je AMD, dijabetička retinopatija, retinopatija nedonoščadi ili polipoidna horoidalna vaskulopatija. U nekim otelotvorenjima, poremećaj povezan sa HtrA1 ili očni poremećaj je AMD. U nekim otelotvorenjima, AMD je rani suvi AMD, srednje suvi AMD ili uznapredovali suvi AMD. U nekim otelotvorenjima, uznapredovali suvi AMD je geografska atrofija. U nekim otelotvorenjima, lek je formulisan za upotrebu u kombinaciji sa antagonistom vezivanja faktora D. U nekim otelotvorenjima, antagonist vezivanja faktora D je anti-faktor D antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. U nekim otelotvorenjima, fragment koji vezuje antigen je Fab ili (Fab’)2. U nekim otelotvorenjima, fragment koji vezuje antigen za antifaktor D je lampalizumab.
U drugom aspektu, pronalazak obuhvata bilo koje od prethodnih antitela za upotrebu u postupku za lečenje poremećaja povezanih sa HtrA1 ili očnih poremećaja kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata primenu terapeutski efikasne količine antitela bilo kog od prethodnih antitela. U nekim otelotvorenjima, poremećaj povezan sa HtrA1 ili očni poremećaj je AMD, dijabetička retinopatija, retinopatija nedonoščadi ili polipoidna horoidalna vaskulopatija. U nekim otelotvorenjima, poremećaj povezan sa HtrA1 ili očni poremećaj je AMD. U nekim otelotvorenjima, AMD je rani suvi AMD, srednje suvi AMD ili uznapredovali suvi AMD. U nekim otelotvorenjima, uznapredovali suvi AMD je geografska atrofija. U nekim otelotvorenjima, postupak dalje uključuje primenu antagonista vezivanja faktora D.
U drugom aspektu, pronalazak obuhvata bilo koje od prethodnih antitela za upotrebu u postupku za inhibiranje degeneracije mrežnjače ili fotoreceptorskih ćelija kod ispitanika, pri čemu postupak obuhvata davanje ispitaniku efikasne količine bilo kog od prethodnih antitela, čime se inhibira degeneracija mrežnjače ili fotoreceptorskih ćelija.
U drugom aspektu, pronalazak obuhvata bilo koje od prethodnih antitela za upotrebu u postupku za inhibiranje aktivnosti serinske proteaze HtrA1 u oku ispitanika, pri čemu postupak obuhvata davanje ispitaniku efikasne količine bilo kog od prethodnih antitela, čime se inhibira aktivnost serinske proteaze HtrA1 u oku. U nekim otelotvorenjima, postupak dalje uključuje primenu antagonista vezivanja faktora D.
U drugom aspektu, pronalazak obuhvata bilo koje od prethodnih antitela za upotrebu u postupku lečenja poremećaja povezanih sa HtrA1 ili poremećaja povezanih sa komplementom kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata davanje ispitaniku terapeutski efikasne količine antagonista vezivanja HtrA1 i antagonista vezivanja faktora D. U nekim otelotvorenjima, poremećaj povezan sa HtrA1 ili poremećaj povezan sa komplementom je očni poremećaj. U nekim otelotvorenjima, očni poremećaj je izabran iz grupe koju čine AMD, dijabetička retinopatija, horoidalna neovaskularizacija (CNV), uveitis, dijabetički edem makule, patološka miopija, fon Hipel-Lindauova bolest, histoplazmoza oka, začepljenje centralne vene mrežnjače, vaskularizacija rožnjače i neovaskularizacija mrežnjače. U nekim otelotvorenjima, očni poremećaj je AMD. U nekim otelotvorenjima, AMD je rani suvi AMD, srednje suvi AMD ili uznapredovali suvi AMD. U nekim otelotvorenjima, uznapredovali suvi AMD je geografska atrofija.
U drugom aspektu, pronalazak sadrži bilo koje od prethodnih antitela za upotrebu u postupku lečenja poremećaja povezanih sa HtrA1 ili poremećaja povezanih sa komplementom kod ispitanika komea je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata davanje ispitaniku terapeutski efikasne količine bilo kog od prethodnih antitela i terapeutski efikasne količine antagonista vezivanja faktora D.
U nekim otelotvorenjima bilo kog prethodnog aspekta, antagonist vezivanja faktora D je anti-faktor D antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. U nekim otelotvorenjima, fragment koji vezuje antigen je Fab ili (Fab’)2. U nekim otelotvorenjima, fragment koji vezuje antigen za anti-faktor D je lampalizumab.
U nekim otelotvorenjima bilo kog prethodnog aspekta, antitelo se daje intravitrealno, okularno, intraokularno, jukstaskleralno, subtenonalno, superhoroidno, topikalno, intravenski, intramuskularno, intradermalno, perkutano, intraarterijski, intraperitonealno, intraleziono, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatički, intrapleuralno, intratrahealno, intratekalno, intranazalno, intravaginalno, intrarektalno, topikalno, intraperitonealno, peritonealno, intraventrikularno, subkutano, subkonjunktivno, intravezikularno, mukozno, intraperikardijalno, intraumbilično, intraorbitalno, oralno, transdermalno, putem inhalacije, injekcije, očnih kapi, implantacijom, infuzijom, kontinuiranom infuzijom, direktnim lokalizovanim perfuzionim kupanjem ciljnih ćelija, kateterom, ispiranjem, u kremama ili u lipidnim kompozicijama. U nekim otelotvorenjima, antitelo se daje intravitrealno, okularno, intraokularno, jukstaskleralno, subtenonalno, superhoroidno ili topikalno. U nekim otelotvorenjima, antitelo se daje intravitrealno injekcijom. U nekim otelotvorenjima, antitelo se daje topikalno putem kapi ili masti za oči. U nekim otelotvorenjima, antitelo se daje sistemom za isporuku sa produženim delovanjem. U posebnim otelotvorenjima, sistem za isporuku sa produženim delovanjem je čvrsti implantat na bazi PLGA ili implantabilni sistem za isporuku.
U nekim otelotvorenjima bilo kog od prethodnih aspekata, ispitanik je čovek.
KRATAK OPIS SLIKA SL. 1A-1B su grafikoni koji prikazuju da je većina ispitanih pozitivnih klonova hibridoma u testu imunosorbenta vezanog za enzim (ELISA) pokazala slične profile reaktivnosti i na humani (hu) i na mišji (mu) HtrA1 domen proteaze (PD). Grafikoni prikazuju optičku gustinu na 650 nm (OD650nm) za svaki od navedenih 75 klonova. Pozadinski signal u ovom testu je bio < 0,05 OD650nm. Humani i mišji HtrA1 domeni proteaze dele 91% homologije.
SL. 2A je šematski dijagram testa blokiranja koji se koristi za određivanje sposobnosti naznačenih supernatanta klonova anti-HtrA1 hibridoma da inhibiraju HtrA1-PD posredovano cepanje fluorescentnog supstrata obeleženog sa BODIPY® FL.
SL. 2B-2C su grafikoni koji prikazuju da je 10 supernanata klonova anti-HtrA1 hibridoma izrazito inhibiralo cepanje supstrata posredovano humanim HtrA1-PD korišćenjem testa blokiranja opisanog na slici 2A i u primeru 1. Grafikoni prikazuju prosečni fluorescentni signal (mili relativne fluorescentne jedinice (mRFU)/min) za supernatante hibridoma iz naznačenih klonova. Antitelo YW505.94 (koje se takođe naziva „94 IgG“, pogledajte Međunarodnu publikaciju patentne prijave br. WO 2013/055998, koja je ovde u celosti inkorporisana putem reference) na 10 µg/ml u kondicioniranom medijumu (CM ili kond. medijum) služilo je kao pozitivna kontrola da pokaže da test nije prikazao promene zbog medijuma, i da je stabilan tokom vremena ispitivanja. Pufer ili medijum su služili kao negativne kontrole. Slika 2C prikazuje početne i krajnje rezultate testa za pufer, E medijum (hranljivi medijum bogat nutrijentima CLONACELL™) i kondicionirani medijum. 100% ukazuje na potpunu inhibiciju.
SL. 3A-3B su grafikoni koji prikazuju sposobnost naznačenih supernatanta hibridoma da inhibiraju cepanje fluorescentnog supstrata pomoću muHtrA1-PD (slika 3A) ili huHtrA1-PD (slika 3B). Na slici 3A, korišćeno je 40 nM muHtrA1-PD u odnosu od 40 µl muHtrA1-PD prema 60 µl supernatanta hibridoma. Na slici 3B, korišćeno je 20 nM huHtrA1-PD u odnosu od 40 µl huHtrA1-PD prema 60 µl supernatanta hibridoma. Antitelo YW505.94 („94 IgG“) služilo je kao pozitivna kontrola. Pufer i CM su služili kao negativne kontrole.
SL. 4A je šematski dijagram testa blokiranja na bazi FRET koji se koristi za određivanje sposobnosti prečišćenih klonova anti-HtrA1 antitela da inhibiraju HtrA1-PD posredovano cepanje supstrata na bazi FRET, H2-Opt.
SL. 4B-4C su grafikoni koji prikazuju da su prečišćeni klonovi antitela 15H6, 19B12, 3A5, 12A5 i 20E2 zadržali sposobnost da inhibiraju cepanje supstrata posredovano mišjim (slika 4B) i humanim (slika 4C) HtrA1-PD. Dodatak bez antitela („no ab“) služio je kao negativna kontrola, dok je antitelo YW505.94 („94 IgG“) služilo kao pozitivna kontrola. Prečišćena antitela su dodata u koncentracijama od 5 nM, 50 nM ili 500 nM. Dok je 15 nM muHtrA1-PD-Fc korišćen u testu prikazanom na slici 4B, dok je 3 nM huHtrA1-PD-Fc korišćen u testu prikazanom na slici 4C.
SL. 5A-5B su grafikoni koji prikazuju da naznačeni prečišćeni klonovi mlgG antitela inhibiraju cepanje peptidnog supstrata FRET- posredovanog humanim HtrA1 pune dužine (huHtrA1-FL). Grafikon prikazuje aktivnost (mRFU/min) u funkciji koncentracije IgG. huHtrA1-FL je dodat u koncentraciji od 5 nM. YW505.94 u formatu IgG („IgG94“) i njegova himerna varijanta („IgG94-ch“), kako je opisano u Cifferi et al. (2015) Biochem. J.
472(2):169-81, služili su kao pozitivne kontrole. Prikazana je polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) za svaki klon antitela.
SL. 5C-5D su grafikoni koji prikazuju da naznačeni prečišćeni klonovi mlgG antitela inhibiraju muHtrA1-FL posredovano cepanje peptidnog supstrata FRET. Grafikon prikazuje aktivnost (mRFU/min) u funkciji koncentracije IgG. muHtrA1-FL je dodat pri 5 nM. IgG94 i IgG94-ch su služili kao pozitivne kontrole, kao što je opisano u opisu slike za Sl. 5A i 5B. Prikazana je polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50).
SL. 6A prikazuje poravnavanje aminokiselinskih sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca (VH) klonova antitela 19B12, 20E2, 3A5, 12A5 i 15H6.
SL. 6B prikazuje poravnavanje aminokiselinskih sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca (VL) klonova antitela 19B12, 20E2, 3A5, 12A5 i 15H6.
SL. 7A-7B su grafikoni koji prikazuju rezultate testa blokiranja na bazi FRET, koristeći klon mlgG antitela 15H6 (slika 7A) ili klon 19B12 (slika 7B), prečišćen iz supernatanta hibridoma („hib“) ili rekombinantno eksprimiran iz ćelija 293 („293“). Grafikoni prikazuju Vmax(mRFU/min) kao funkciju koncentracije antitela (nM). U svakom testu je korišćen 3 nM huHtrA1-FL. Takođe su prikazane vrednosti IC50 za naznačene klonove antitela.
SL. 8A-8B prikazuju poravnavanje aminokiselinskih sekvenci VL (slika 8A) i VH (slika 8B) klonova anti-HtrA1 antitela m15H6, H15H6.v1, H15H6.v2 i h15H6.v2.APEG (takođe ovde nazvane „h15H6.v3“) u poređenju sa sekvencom ljudskog konsenzusa κ1 (slika 8A) ili VH1 sekvencom (slika 8B). HVR sekvence su ograničene označenim okvirima za svaki od klonova antitela. HVR sekvence prema Kabatovoj definiciji su podvučene. Ostaci prikazani belim tekstom u osenčenim okvirima ukazuju na ostatke koji se razlikuju između sekvence VH1 humanog konsenzusa i klonova anti-HtrA1 antitela.
SL. 9A-9D su grafikoni koji prikazuju rezultate BIACORE™ analize površinske plazmonske rezonance (SPR) vezivanja m15H6 ili h15H6.v1 za biotinilovani humani ili mišji HtrA1 uhvaćen na streptavidinu. Korišćena je kinetička analiza sa jednim ciklusom. Grafikoni prikazuju jedinice odgovora (RU) u zavisnosti od vremena (s). Slika 9A prikazuje rezultate vezivanja m15H6 Fab za huHtrA1. Slika 9B prikazuje rezultate vezivanja m15H6 Fab za muHtrA1. Slika 9C prikazuje rezultate vezivanja h15H6.v1 za huHtrA1. Slika 9D prikazuje rezultate vezivanja h15H6.v1 za huHtrA1. Kon, Koffi KD određeni iz svake analize su prikazani kao tekst unutar svakog grafikona.
SL. 10A-10B su grafikoni koji prikazuju rezultate eksperimenata kompetitivnog ELISA testa faga za vezivanje naznačenih h15H6.v1 Fab varijanti za mišji (slika 10A) ili ljudski (slika 10B) HtrA1. Grafikoni prikazuju vezani fag (OD450 nm) kao funkciju koncentracije HtrA1 (nM).
SL. 11A-11B su grafikoni koji prikazuju rezultate BIACORE™ SPR analize upoređujući vezivanje klona antitela h15H6.v2 i varijanti HVR-L3 LC-W91L i LC-W91I za mišji (slika 11A) ili humani (slika 11B) HtrA1. Korišćena antitela su u Fab formatu. Kon, Koffi KD određeni iz svake analize su prikazani kao tekst unutar svakog grafikona.
SL. 12A je grafikon koji prikazuje rezultate BIACORE™ SPR analize upoređujući vezivanje klona antitela h15H6.v2 (matičnog) i naznačenih varijanti na VL položaju 94 (tj. LC-N94A LC-P95 (AP), LC-N94E LC-P95 (EP), LC-N94Q LC-P95 (QP) i LC-N94S LC-P95 (SP)) za huHtrA1. Korišćena antitela su u Fab formatu. Grafikon prikazuje jedinice odgovora (RU) u zavisnosti od vremena (u sekundama).
SL. 12B je tabela koja sumira rezultate BIACORE™ SPR analize prikazane na slici 12A.
SL. 13A je grafikon koji prikazuje rezultate BIACORE ™ SPR analize upoređujući vezivanje klona antitela h15H6.v2 (matičnog) i naznačenih varijanti na VH položaju 55 i/ili 56 (tj. HC-D55A HC-G56 (AG), HC-D55E HC-G56 (EG), HC-D55S HC-G56 (SG) i HC-D55 HC-G56A (DA)) na huHtrA1. Korišćena antitela su u Fab formatu. Grafikon prikazuje jedinice odgovora (RU) u zavisnosti od vremena (u sekundama).
SL. 13B je tabela koja sumira rezultate BIACORE™ SPR analize prikazane na slici 13A.
SL. 14A je grafikon koji prikazuje rezultate BIACORE™ SPR analize upoređujući vezivanje klona antitela h15H6.v2 („matični“) i naznačene varijante kombinacije na VL položaju 94 i VH položaju 55 i/ili 56 na huHtrA1. AP_EG: LC-N94A LC-P95 HC-D55E HC-G56 (takođe se naziva „h15H6.v2.APEG“ i „h15H6.v3“). EP_EG: LC-N94E LC-P95 HC-D55E HC-G56. QP_EG: LC-N94Q LC-P95 HC-D55E HC-G56. SP_EG: LC-N94S LC-P95 HC-D55E HC-G56.
SL. 14B je tabela koja sumira rezultate BIACORE™ SPR analize prikazane na slici 14A.
SL. 14C je grafikon koji prikazuje rezultate testa blokiranja na bazi FRET koji testira sposobnost h15H6.v2 IgG, h15H6.v2 Fab i naznačenih varijanti kombinacija na VL položaju 94 i VH položaju 55 i/ili 56 da inhibiraju aktivnost HtrA1. Grafikon prikazuje procentualnu maksimalnu aktivnost u funkciji logaritma koncentracije antitela (M).
SL. 14D je tabela koja prikazuje vrednosti IC50 za svaki od klonova antitela testiranih na slici 14C.
SL. 15A-15B pokazuju poravnavanje aminokiselinskih sekvenci VL (slika 15A) i VH (slika 15B) klonova anti-HtrA1 antitela m19B12 i h19B12.v1 u poređenju sa sekvencom ljudskog konsenzusa κ4 (slika 15A) ili VH3 sekvenca (slika 15B). HVR sekvence su ograničene označenim okvirima za svaki od klonova antitela. HVR sekvence prema Kabatovoj definiciji su podvučene. Ostaci prikazani belim tekstom u osenčenim okvirima ukazuju na ostatke koji se razlikuju između sekvence VH1 humanog konsenzusa i klonova anti-HtrA1 antitela.
SL. 16A-16D su grafikoni koji prikazuju rezultate BIACORE™ SPR analize vezivanja klona antitela m19B12 ili h19B12.v1 za humani ili mišji HtrA1. Korišćena je kinetička analiza sa jednim ciklusom. Grafikoni prikazuju jedinice odgovora (RU) u zavisnosti od vremena (s). Slika 16A prikazuje rezultate vezivanja m19B12 Fab za huHtrA1. Slika 16B prikazuje rezultate vezivanja m19B12 Fab za muHtrA1. Sl.16C prikazuje rezultate vezivanja h19B12.v1 Fab za huHtrA1. Sl. 16D prikazuje rezultate vezivanja h19B12.v1 Fab za huHtrA1. Kon, Koffi KD određeni za svaku analizu su prikazani kao tekst unutar svakog grafikona.
SL. 17 je šematski dijagram koji ističe strategiju panovanja faga koja se koristi za NNK mutagenezu dubokog skeniranja HVR-ova HC i LC h15H6.v2 na afinitetno sazrevanje.
SL. 18A-18B prikazuju toplotne karte log2 koeficijenta obogaćenja za mutacije na naznačenim pozicijama VH (slika 18A) ili VL (slika 18B) HVR izračunate deljenjem frekvencije date mutacije na datoj poziciji u sortiranom uzorku učestalošću iste mutacije u nesortiranom uzorku. Koeficijenti obogaćenja primera mutacija naznačeni su pod toplotnim mapama.
SL. 19 je tabela koja prikazuje mutacije za koje je utvrđeno da su obogaćene u sortiranom uzorku u poređenju sa nesortiranim uzorkom iz NNK biblioteka i/ili biblioteka meke randomizacije VH i VL h15v6.v2.
SL. 20 je tabela koja pokazuje rezultate BIACORE™ SPR analize vezivanja naznačenih afinitetno sazrelih varijanti klonova Fab antitela. Kon, Koffi KD za svaku varijantu afinitetno sazrelog klona antitela dobijeni iz ove analize prikazani su u poređenju sa h15H6.v2 i h15H6.v2.APEG (takođe poznatim kao h15H6.v3).
SL. 21A-21B pokazuju poravnavanje aminokiselinskih sekvenci VL (slika 21A) i VH (slika 21B) afinitetno sazrelih varijanti klonova anti-HtrA1 antitela.
SL. 22A je tabela u kojoj su sumirani rezultati naznačenih afinitetno sazrelih varijanti klonova anti-HtrA1 Fab antitela u inhibiranju aktivnosti HtrA1 kako je procenjeno u testovima H2-Opt aktivnosti zasnovanim na FRET. Tabela prikazuje rezultate 3 nezavisna eksperimenta, kao i prosečnu vrednost i standardnu devijaciju (StDev). Ovi eksperimenti su koristili analizu brzine (RFU/s).
SL. 22B je grafikon koji prikazuje primer dijagrama rezultata ispitivanja aktivnosti H2-Opt korišćenjem rekombinantnog HtrA1 prikazanog na slici 22A. Uslovi testa su obuhvatali 400 pM HtrA1 i 2,5 µM supstrata. Pufer je bio 50 mM Tris, 200 mM NaCl, 0,25% CHAPS, pH 8,3. Ovi podaci su iz drugog ponavljanja tri nezavisna eksperimenta na slici 22A.
SL. 23A-23D su grafikoni koji prikazuju rezultate ispitivanja aktivnosti H2-Opt za naznačene formate varijanti antitela h15H6 analizirane primenom pristupa brzini RFU/s. Grafikoni prikazuju procenat kontrole (RFU/S) u funkciji koncentracije antitela (nM) za h15H6.v4 IgG monoklonsko antitelo (mAb) (slika 23A), pozitivno kontrolno anti-HtrA1 antitelo (YW505.94A IgG, pogledajte, npr. WO 2013/055998) (slika 23B), h15H6.v4 Fab (slika 23C) i 15H6.v2 Fab (slika 23D). Tabela pored svakog grafikona prikazuje IC50, opseg Y, faktor nagiba i pozadinu svake analize.
SL. 23E-23H su grafikoni koji prikazuju rezultate ispitivanja aktivnosti H2-Opt za naznačene formate varijanti antitela h15H6 analizirane primenom pristupa krajnjoj tački (RFU). Grafikoni prikazuju procenat kontrole (RFU/S) u funkciji koncentracije antitela (nM) za h15H6.v4 IgG Mab (slika 23E), pozitivnu kontrolu anti-HtrA1 antitelo (YW505.94A IgG) (slika 23F), h15H6.v4 Fab (slika 23G) i 15H6.v2 Fab (slika 23H). Tabela pored svakog grafikona prikazuje IC50, opseg Y, faktor nagiba i pozadinu svake analize.
SL. 24A-24B su tabele koje prikazuju rezultate IC50 (slika 24A) i IC90 (slika 24B) za naznačene formate varijanti antitela h15H6 iz prvog skupa od tri nezavisna eksperimenta. Vrednosti IC50 su određene pomoću uklapanja 4 parametra. Vrednosti IC90 su određene iz vrednosti IC50 i odgovarajućeg nagiba. Eksperiment I odgovara podacima prikazanim na Sl.
23A-23F. CV%, koeficijent varijacije. Podaci su analizirani pomoću pristupa brzine (RFU/s).
SL. 25A-25B su tabele koje prikazuju rezultate IC50 (slika 25A) i IC90 (slika 25B) za naznačene formate varijanti antitela h15H6 iz drugog skupa od tri nezavisna eksperimenta. Vrednosti IC50 su određene pomoću uklapanja 4 parametra. Vrednosti IC90 su određene iz vrednosti IC50 i odgovarajućeg nagiba. Podaci su analizirani pomoću pristupa brzine (RFU/s) ili pristupa krajnje tačke (RFU).
SL. 26A je grafikon koji prikazuje netaknutu krivu titracije α-kazeina. Eksperimentalna koncentracija je prikazana u funkciji teoretske koncentracije unosa (µg/ml). Koeficijent korelacije (R<2>) je 0,999.
SL. 26B je grafikon koji prikazuje rezultate ispitivanja aktivnost HtrA1 na osnovu masene spektrometrije. Sposobnost APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4) da inhibira aktivnost Htra1-PD procenjena je kao što je opisano u Primeru 3, odeljak G. Inhibitor malog molekula ucf-101 je služio kao pozitivna kontrola.
SL. 27A-27B su grafikoni koji prikazuju rezultate dva nezavisna endogena testa aktivnosti HtrA1, eksperimenta I (slika 27A) i eksperimenta II (slika 27B). Za svaki Fab antitela, br. 1 i br. 2 ukazuju na zasebne serije razblaženja istog antitela, sa početnim razblaženjima koja se izvode odvojeno. Dve serije razblaženja su rađene na istoj ploči sa ostalim reagensima iz istog preparata.
SL. 27C je tabela koja sumira rezultate endogenih testova aktivnosti HtrA1 prikazanih na Sl.27A i 27B.
SL. 28 je tabela koja sumira kinetička svojstva vezivanja i inhibitornu aktivnost naznačenih varijanti i derivata h15H6.v2 Fab. YW505.94a.28 (pogledajte, npr., WO 2013/055998) služio je kao pozitivna kontrola. Sve varijante i derivati h15H6 Fab pokazali su poboljšani afinitet i poboljšanu potentnost u poređenju sa YW505.94a.28 Fab, dok h15H6.v4 Fab pokazuje približno 30 puta veće poboljšanje afiniteta u poređenju sa ovim antitelom.
SL. 29A prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanog HtrA1. Zrela sekvenca je prikazana velikim slovima, domen proteaze je podvučen, a ostaci N224 i K248 su osenčeni.
SL. 29B prikazuje aminokiselinsku sekvencu mišjeg HtrA1. Zrela sekvenca je prikazana velikim slovima, a domen proteaze je podvučen.
SL. 30 prikazuje poravnavanje varijabilnih domena lakog i teškog lanca referentnog anti-faktor D antitela („WT“) i njegovih odabranih varijanti. HVR-ovi unutar varijabilnih domena su podvučeni. Supstitucije ostataka u varijantama su prikazane podebljanim slovima.
SL. 31A-31B prikazuje vezivanje YW505.94 Fab (kao što je opisano u WO 2013/055998) za HtrA1. Kada se aminokiseline označene na slici 31A zamene alaninom, afinitet vezivanja YW505.94 Fab za mutirani protein je smanjen. Struktura prikazana na slici 31B generisana je elektronskom mikroskopijom, kako je opisano u Ciferri et al. (2015) Biochem. J. 472(2):169-81. Krug prikazuje epitop za YW505.94 Fab na HtrA1 proteinu. YW505.94 Fab se vezuje za petlje „B“ i „C“ proteina HtrA1.
SL. 32A-32B prikazuju vezivanje 15H6.v4 Fab za HtrA1, i pokazuju da se HtrA1 epitop vezan od strane15H6.v4 Fab razlikuje od epitopa vezanog od strane YW505.94 Fab. Slika 32A prikazuje interakciju između 15H6.v4 Fab i njegovog epitopa na proteinu HtrA1, kako je određeno rendgenskom kristalografijom. 15H6.v4 Fab se vezuje za LA petlju proteina HtrA1 (pogledajte, na primer, Glaza P et al. (2015) PLoS One 10(6):e0131142). Struktura prikazana na slici 32B je generisana elektronskom mikroskopijom. Krug prikazuje 15H6V.4 Fab epitop na proteinu HtrA1.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
I. DEFINICIJE
Termin „oko“ koji se ovde koristi, odnosi se na uobičajeni opseg grešaka za odgovarajuću vrednost dobro poznatu stručnjaku u ovom tehničkom području. Upotreba reči „oko“ za vrednost ili parametar u ovom dokumentu obuhvata (i opisuje) otelotvorenja koja se odnose na tu vrednost ili parametar sam po sebi.
„Humani akceptorski okvir“ je za ovde navedene svrhe okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvira varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisano u nastavku. Humani akceptorski okvir „dobijen od“ okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može da sadrži istu aminokiselinsku sekvencu kao i ova dva okvira, ili može da sadrži izmene u aminokiselinskoj sekvenci. U nekim otelotvorenjima, broj aminokiselinskih izmena je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, humani akceptorski okvir VL je po sekvenci identičan sekvenci okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa VL.
„Aktivna“ ili „aktivnost“ ili „biološka aktivnost“ u kontekstu antitela iz ovog pronalaska je sposobnost antagonizacije (delimičnog ili potpunog inhibiranja) biološke aktivnosti njegovog cilja, na primer, in vitro i/ili in vivo. Jedan primer biološke aktivnosti antitela je sposobnost postizanja merljivog poboljšanja stanja, na primer, patologije, poremećaja povezanog sa njegovim ciljem. Na primer, za anti-HtrA1 antitela, poremećaj može biti poremećaj povezan sa HtrA1, kao što je, na primer, AMD (npr. geografska atrofija). Aktivnost anti-HtrA1 antitela može da se odredi in vitro ili in vivo testovima, uključujući testove vezivanja, testove aktivnosti (npr. testove aktivnosti zasnovane na FRET-u (npr. upotreba supstrata H2-Opt) ili testove aktivnosti na bazi masene spektrometrije), koristeći odgovarajući životinjski model ili klinička ispitivanja na ljudima. U drugom primeru, za anti-faktor D antitelo (npr. anti-HtrA1/anti-faktor D antitelo), poremećaj može biti poremećaj povezan sa komplementom, kao što je, na primer, očni poremećaj povezan sa komplementom. Aktivnost anti-faktor D antitela može da se odredi in vitro ili in vivo testovima, uključujući testove vezivanja, testove hemolize alternativnog puta (npr. testove koji mere inhibiciju aktivnosti ili aktivacije komplementa alternativnog puta), koristeći odgovarajući životinjski model ili klinička ispitivanja na ljudima.
„Afinitet“ se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja“ se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može generalno da se predstavi putem konstante disocijacije (KD). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Specifična otelotvorenja data kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisana su u nastavku.
Termin „afinitetno sazrelo“ antitelo se odnosi na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), i/ili regiona okvira (FR) u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, pri čemu takve izmene dovode do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu.
Izraz „anti-HtrA1 antitelo“ i „antitelo koje se specifično vezuje za HtrA1“ odnosi se na antitelo koje je sposobno da veže HtrA1 sa dovoljnim afinitetom, na takav način da antitelo bude korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje HtrA1. U jednom otelotvorenju, obim vezivanja anti-HtrA1 antitela za nepovezani protein koji nije HtrA1 je manji od oko 10% od vezivanja antitela za HtrA1, kao što je izmereno, npr. radioimunotestom (RIA). U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za HtrA1 ima konstantu disocijacije (KD) od<≦>1μM,<≦>100 nM,<≦>10 nM,<≦>1 nM,<≦>0,1 nM,<≦>0,01 nM ili<≦>0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U određenim aspektima, anti-HtrA1 antitelo se vezuje za epitop HtrA1 koji je konzerviran u HtrA1 različitih vrsta. Anti-HtrA1 antitelo može biti, na primer, bilo koje anti-HtrA1 antitelo opisano ovde ili u Međunarodnoj publikaciji za patentnu prijavu br. WO 2013/055998, koja je ovde u celosti inkorporisana putem reference.
Termini „anti-faktor D antitelo“ i „antitelo koje se specifično vezuje za faktor D“ se odnose na antitelo koje je sposobno da veže faktor D sa dovoljnim afinitetom, na takav način da antitelo bude korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje faktora D, na primer, na takav način da inhibira ili značajno smanji aktivaciju komplementa. U jednom otelotvorenju, obim vezivanja anti-faktor D antitela za nepovezani protein koji nije faktor D je manji od oko 10% od vezivanja antitela za faktor D kao što je izmereno, npr., putem RIA. U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za faktor D ima konstantu disocijacije (KD) od<≦>1μM,<≦>100 nM,<≦>10 nM,<≦>1 nM,<≦>0,1 nM,<≦>0,01 nM ili<≦>0,001 nM (npr. 10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U određenim otelotvorenjima, anti-faktor D antitelo se vezuje za epitop faktora D koji je konzerviran između faktora D različitih vrsta. Anti-faktor D antitelo može biti bilo koje anti-faktor D antitelo opisano ovde i/ili u američkim patentima br. 8,067,002; 8,273,352; i 8.268.310; i američkoj patentnoj prijavi br. 14/700,853, od kojih je svaki ovde u celosti uključen putem reference.
Termin „antitelo“ ovde je upotrebljen u najširem smislu, i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu antigen-vezujuću aktivnost.
„Fragment antitela“ ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH,F(ab’)2; dijatela; linearna antitela; molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv); i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.
Digestija antitela papainom daje dva identična antigen-vezujuća fragmenta, pod nazivom „Fab“ fragmenti, a ostatak je „Fc“ fragment, oznaka koja odražava sposobnost lake kristalizacije. Fab fragment se sastoji od čitavog lakog (L) lanca uz domen varijabilnog regiona teškog (H) lanca (VH), i prvog konstantnog domena jednog teškog lanca (CH1). Obrada antitela pepsinom daje jedinstveni veliki fragment F(ab’)2koji približno odgovara dvema Fab fragmentima povezanih disulfidnom vezom koji imaju dvovalentnu aktivnost vezivanja antigena i još uvek su sposobni za unakrsno vezivanje antigena. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po tome što imaju još nekoliko ostataka na karboksi terminusu CH1 domena, uključujući jedan ili više cisteina iz regiona pregiba antitela. Fab’-SH je ovde oznaka za Fab’ u kome ostatak cisteina konstantnih domena nosi slobodnu tiol grupu. F(ab’)2fragmenti antitela su prvobitno proizvedeni kao parovi Fab’ fragmenata koji između sebe imaju pregibe cisteina. Takođe su poznati i drugi hemijski sklopovi fragmenata antitela.
Izraz „Fc region“ u ovom dokumentu se koristi da definiše C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Ovaj izraz podrazumeva nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednom otelotvorenju, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, na C-terminalnom kraju Fc regiona lizin (Lys447) može, ali ne mora da bude prisutan. Ako ovde nije drugačije naznačeno, numeracija aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što je opisano u: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
„Fv“ se sastoji od dimera varijabilnog regiona domena jednog teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj asocijaciji. Iz preklapanja ova dva domena nastaje šest hipervarijabilnih petlji (po 3 petlje iz H i L lanca) koje pomažu aminokiselinskim ostacima u vezivanju antigena i pružaju specifičnost vezivanja antigena za antitelo. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri HVR-a specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, ali često sa nižim afinitetom od celog mesta vezivanja.
„Jednolančani Fv“, takođe skraćeno „sFv“ ili „scFv“, jesu fragmenti antitela koji sadrže domene VH i VL antitela povezane u jedan polipeptidni lanac. Poželjno, sFv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava da sFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Pregled sFv daje Plückthun u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg i Moore izd., Springer-Verlag, New York, str.269-315 (1994).
Termin „dijatela“ odnosi se na male fragmente antitela dobijene konstrukcijom sFv fragmenata (pogledajte prethodni paragraf) sa kratkim linkerima (oko 5-10 ostataka) između VH i VL domena, tako da se postigne interlančano, ali ne i intralančano uparivanje V domena, što ima za rezultat dvovalentni fragment, tj. fragment koji ima dva mesta za vezivanje antigena. Bispecifična dijatela su heterodimeri dva „unakrsna“ sFv fragmenta u kojima su prisutni VH i VL domeni dva antitela na različitim polipeptidnim lancima. Dijatela su detaljnije opisana, na primer, u EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448,1993.
„Blokirajuće“ antitelo ili „antagonističko“ antitelo je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena za koji se vezuje. Određena blokirajuća antitela ili antagonistička antitela suštinski ili u potpunosti inhibiraju biološku aktivnost antigena.
„Antitelo koje se vezuje za isti epitop“ kao referentno antitelo se odnosi na antitelo koje stupa u kontakt sa preklapajućim skupom aminokiselinskih ostataka antigena u poređenju sa referentnim antitelom ili blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više. Aminokiselinski ostaci antitela koji stupaju u kontakt sa antigenom mogu se odrediti, na primer, određivanjem kristalne strukture antitela u kompleksu sa antigenom ili vršenjem razmene vodonik/deuterijum. U nekim otelotvorenjima, smatra se da su ostaci antitela unutar 5 Å od antigena u kontaktu sa antigenom. U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za isti epitop kao referentno antitelo blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više. Ovde je dat primer kompetitivnog testa.
Termin „himerno“ antitelo ukazuje na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.
„Klasa“ antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1i lgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.
Izraz „efektorske funkcije“ odnosi se na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, koje variraju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: Vezivanje C1q i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC); Fc receptorsko vezivanje; antitelo-zavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.
„Okvir“, „okvirni region“ ili „FR“ se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4.
Izrazi „antitelo pune dužine“, „netaknuto antitelo“ i „kompletno antitelo“ u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi, i odnose se na antitelo koje ima strukturu suštinski sličnu strukturi nativnog antitela, ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region, kao što je definisano u ovom dokumentu.
„Region pregiba“ se generalno definiše kao prostiranje od 216-238 (EU numeracija) ili 226-251 (Kabatova numeracija) humanog IgG1. Pregib se može dalje podeliti na tri različita regiona, gornji, srednji (npr. jezgro) i donji region pregiba. U određenim otelotvorenjima, region pregiba humanog IgG1 antitela je generalno definisan na sledeći način:
Gornji pregib sadrži aminokiseline koje imaju sekvencu (SEQ ID NO: 157). U određenim otelotvorenjima, gornji pregib sadrži aminokiseline na položajima 216-225 (EU numeracija) ili 226-238 (Kabatova numeracija).
Srednji deo pregiba (npr. jezgro) sadrži aminokiseline koje imaju sekvencu
(SEQ ID NO: 122). U određenim otelotvorenjima, pregib jezgra sadrži aminokiseline na položajima 226-229 (EU numeracija) ili 239-242 (Kabatova numeracija).
Donji pregib sadrži aminokiseline koje imaju sekvencu (SEQ ID NO: 158). U određenim otelotvorenjima, donji pregib sadrži aminokiseline na položajima 230-238 (EU numeracija) ili 243-251 (Kabatova numeracija).
„Humano antitelo“ je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci antitela koju proizvodi čovek ili humana ćelija, ili ono dobijeno iz nehumanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži antigen vezujuće ostatke koji nisu ljudskog porekla.
„Okvir humanog konsenzusa“ je okvir koji predstavlja najčešće aminokiselinske ostatke u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Po pravilu, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vol.1-3. U jednom otelotvorenju, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I, kao u Kabat et al., supra. U jednom otelotvorenju, za VH, podgrupa je podgrupa III, kao u Kabat et al., supra.
„Humanizovani“ oblici nehumanih antitela (npr. glodara) su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu dobijenu od nehumanih antitela. Najvećim delom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primalac) kod kojih su ostaci hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjeni ostacima hipervarijabilnog regiona nehumane vrste (donorsko antitelo), kao što je miš, pacov, zec ili nehumani primat koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet antitela. U nekim slučajevima, ostaci FR regiona humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ostacima koji nisu ljudskog porekla. Nadalje, humanizovana antitela mogu uključivati ostatke koji nisu nađeni u antitelu primaocu ili u donorskom antitelu. Te modifikacije su načinjene kako bi se dodatno preradilo dejstvo antitela. Uopšteno, humanizovano antitelo će da sadrži u suštini sve ili barem jedan, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima iz nehumanog imunoglobulina, i svi ili suštinski svi FR-i su oni iz sekvenci humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će opciono takođe da sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično humanog imunoglobulina. Za više detalja pogledajte: Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992).
Termin „varijabilni“ se odnosi na činjenicu da se određeni segmenti varijabilnih domena u velikoj meri razlikuju po sekvenci između antitela. Varijabilni ili „V“ domen posreduje u vezivanju antigena i definiše specifičnost određenog antitela prema njegovom specifičnom antigenu. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena u rasponu varijabilnih domena. Umesto toga, V regioni sadrže relativno nepromenljive delove nazvane okvirni regioni (FR) od 15–30 aminokiselina odvojenih kraćim regionima ekstremne varijabilnosti pod nazivom „hipervarijabilni regioni“ koji su dužine 9–12 aminokiselina. Termin „hipervarijabilni region“ ili „HVR“, kada se ovde koristi, odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region obično sadrži aminokiselinske ostatke, na primer, oko 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) ostataka u VL, i oko 26-35 (H1), 49-65 (H2) i 95-102 (H3) ostataka u VH (u jednom otelotvorenju, H1 je otprilike oko 31-35 ostataka); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) i/ili one ostatke iz „hipervarijabilne petlje“ (npr. ostaci 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u VL i 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u VH; Chothia i Lesk J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987). Svaki varijabilni domen nativnih teških i lakih lanaca čine četiri FR, koji u velikoj meri zauzimaju konfiguraciju beta-ravni, povezanu sa tri hipervarijabilna regiona, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima i formiraju, deo konfiguracije beta-ravni. Hipervarijabilni regioni u svakom lancu držani su zajedno u neposrednoj blizini od strane FR-a, i sa hipervarijabilnim regionima iz drugog lanca doprinose stvaranju antigen-vezujućeg mesta antitela (pogledajte Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izdanje. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećem redosledu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC).
Termini „numerisanje ostataka varijabilnog domena kao u Kabatu“, „Kabatov aminokiselinski ostatak“ ili „numerisanje pozicije aminokiselina kao u Kabatu“, i njihove varijacije, odnose se na sistem numeracije koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca kompilacije antitela u Kabat et al., supra. Pri korišćenju ovog sistema numeracije, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržati manje ili više aminokiselina, što odgovara skraćivanju, odnosno umetanju u FR ili HVR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da uključuje umetanje jedne aminokiseline (ostatak 52a prema Kabatu) nakon ostatka 52 iz H2 i ubačene ostatke (npr. ostaci 82a, 82b i 82c, itd. prema Kabatu) nakon ostatka 82 FR teškog lanca. Numeracija ostataka prema Kabatu se može odrediti za dato antitelo poravnavanjem u oblastima homologije sekvence antitela sa „standardnom“ numerisanom Kabatovom sekvencom.
Sistem numerisanja prema Kabatu se generalno koristi kada se govori o ostatku u varijabilnom domenu (otprilike ostaci 1-107 lakog lanca i ostaci 1-113 teškog lanca) (npr. Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). „EU sistem numerisanja“ ili „EU indeks“ se generalno koristi kada se ukazuje na ostatak u konstantnom regionu teškog lanca imunoglobulina (npr. EU indeks koji su objavili Kabat et al., supra). „EU indeks kao u Kabatu“ se odnosi na numerisanje ostataka humanog IgG1 EU antitela. Osim ako nije drugačije objavljeno, reference na brojeve ostataka u varijabilnom domenu antitela označavaju numeraciju ostataka pomoću sistema numerisanja prema Kabatu. Osim ako nije drugačije navedeno, reference na brojeve ostataka u konstantnom domenu antitela označavaju numeraciju ostataka pomoću EU sistema numerisanja (npr. pogledajte Privremenu prijavu US br. 60/640,323, podaci za EU sistem numerisanja).
Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su numerisani prema radu Kabat et al., gore.
„Imunokonjugat“ je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterolognih molekula, uključujući, bez ograničenja, citotoksični agens.
Termin „izolovano antitelo“, kada se koristi za opisivanje različitih ovde otkrivenih antitela, podrazumeva antitelo koje je identifikovano i odvojeno i/ili izolovano iz ćelije ili ćelijske kulture iz koje je eksprimirano. Komponente zagađivača njegove prirodne sredine su supstance koje bi obično ometale dijagnostiku ili terapeutsku primenu polipeptida, i mogu uključivati enzime, hormone, i druge proteinske ili neproteinske rastvorene supstance. U nekim otelotvorenjima, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95% ili 99% kao što je određeno, na primer, elektroforetskim (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografskim (npr. jonskom izmenom ili reversno faznom HPLC metodom) pristupom. Za pregled metoda za procenu čistoće antitela, pogledajte npr. Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007). U poželjnim otelotvorenjima, antitelo će biti prečišćeno (1) do stepena koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne aminokiselinske sekvence korišćenjem uređaja za sekvenciranje sa rotacionom posudom, ili (2) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod neredukujućim ili redukujućim uslovima, korišćenjem kumasi plave ili, poželjno, bojenja srebrom. Izolovano antitelo obuhvata in situ antitela u rekombinantnim ćelijama, jer barem jedna komponenta iz prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Međutim, izolovani polipeptid će obično biti pripremljen najmanje jednim korakom prečišćavanja.
Termin „monoklonsko antitelo“, kako je ovde korišćen, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja su sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koja sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom stvaranja preparata monoklonskog antitela, a takve su varijante uopšteno prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Stoga reč „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao da podrazumeva zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na metodu hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke u kojima se koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.
Termin „multispecifično antitelo“ se koristi u najširem smislu, i posebno obuhvata antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL), gde VH-VL jedinica ima poliepitopsku specifičnost (tj. sposobna je za vezivanje za dva različita epitopa na jednom biološkom molekulu, ili svaki epitop na drugom biološkom molekulu). Takva multispecifična antitela uključuju, ali nisu ograničena na, antitela pune dužine, antitela koja imaju dva ili više VL i VH domena, fragmente antitela kao što su Fab, Fv, dsFv, scFv, dijatela, bispecifična dijatela i trijatitela, fragmente antitela vezane kovalentno ili nekovalentno. „Poliepitopska specifičnost“ se odnosi na sposobnost specifičnog vezivanja na dva ili više različitih epitopa na istim ili različitim ciljevima. „Dvojna specifičnost“ ili „bispecifičnost“ se odnosi na sposobnost specifičnog vezivanja na dva različita epitopa na istom cilju ili različitim ciljevima. Međutim, za razliku od bispecifičnih antitela, dvojno specifična antitela imaju dva kraka za vezivanje antigena koji su identični u aminokiselinskoj sekvenci, i svaki Fab krak može da prepozna dva antigena.
Dvojna specifičnost omogućava antitelima da sa velikim afinitetom interaguju sa dva različita antigena kao jedan molekul Fab ili IgG. Prema jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo u IgG1 obliku se vezuje za svaki epitop sa afinitetom od 5 µM do 0,001 pM, 3 µM do 0,001 pM, 1 µM do 0,001 pM, 0,5 µM do 0,001 pM, ili 0,1 µM do 0,001 pM. „Monospecifični“ se odnosi na sposobnost vezivanja samo jednog epitopa.
„Nativna antitela“ ukazuju na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena.
Što se tiče vezivanja antitela za ciljani molekul, termin „specifično vezivanje“ ili „specifično se vezuje za“ ili „specifičan za“ određeni polipeptid ili epitop na određenom polipeptidnom cilju znači vezivanje koje je merljivo različito od nespecifične interakcije. Specifično vezivanje se može meriti, na primer, određivanjem vezivanja molekula u poređenju sa vezivanjem kontrolnog molekula. Na primer, specifično vezivanje se može odrediti takmičenjem sa kontrolnim molekulom koji je sličan cilju, na primer, viškom neoznačenog cilja. U ovom slučaju, specifično vezivanje je naznačeno ako je vezivanje označene mete na sondu konkurentno inhibirano viškom neobeleženog cilja. Izraz „specifično vezivanje“ ili „specifično se vezuje za“ ili je „specifičan za“ određeni polipeptid ili epitop na određenom polipeptidnom cilju, kako se ovde koristi, može biti prikazan, na primer, molekulom koji ima KD za cilj 10<-4>M ili manje, alternativno 10<-5>M ili manje, alternativno 10<-6>M ili manje, alternativno 10<-7>M ili manje, alternativno 10<-8>M ili manje, alternativno 10<-9>M ili manje, alternativno 10<-10>M ili manje, alternativno 10<-11>M ili manje, alternativno 10<-12>M ili manje, ili KD u opsegu od 10<-4>M do 10<-6>M ili 10<-6>M do 10<-10>M ili 10<-7>M do 10<-9>M. Kao što će stručnjak proceniti, vrednosti afiniteta i KD su obrnuto srazmerne. Veliki afinitet prema antigenu se meri malom vrednošću KD. U jednom otelotvorenju, termin „specifično vezivanje“ se odnosi na vezivanje gde se molekul vezuje za određeni polipeptid ili epitop na određenom polipeptidu bez suštinskog vezivanja za bilo koji drugi polipeptid ili polipeptidni epitop.
„Nukleinska kiselina koja kodira antitelo“ ukazuje na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćinu. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina kodira anti-HtrA1 antitelo. U drugim otelotvorenjima, nukleinska kiselina može da kodira anti-faktor D antitelo (npr. anti-HtrA1/anti-faktor D antitelo).
Termin „vektor“, kao što se ovde koristi, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji može da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Ovaj termin obuhvata vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao „ekspresioni vektori“.
Termini „ćelija domaćin“, „linija ćelije domaćina“ i „kultura ćelije domaćina“ koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“, koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kakva je ispitana ili odabrana u originalno transformisanoj ćeliji.
„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence“ u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručna lica iz ove oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.
U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način: 100 puta razlomak X/Y, gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti aminokiselinske sekvence B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije objavljeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene su, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, pomoću računarskog programa ALIGN-2.
Za protein, uključujući antitelo, kaže se da je „stabilan“ ako u osnovi zadržava netaknutu konformacionu strukturu i biološku aktivnost. U ovoj oblasti su dostupne razne analitičke tehnike za merenje stabilnosti proteina, a prikazane su, npr. u Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) i Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev.10: 29-90. Varijanta antitela sa „poboljšanom stabilnošću“ odnosi se na varijantu antitela koja je stabilnija u poređenju sa početnim referentnim antitelom. Poželjno, varijante antitela sa poboljšanom stabilnošću su varijante referentnih antitela (divljeg tipa) u kojima su specifični aminokiselinski ostaci izmenjeni u svrhu poboljšanja fizičke stabilnosti, i/ili hemijske stabilnosti, i/ili biološke aktivnosti, i/ili smanjenja imunogenosti nativnih antitela.
Izraz „izomerizacija“ se odnosi generalno na hemijski postupak kojim se hemijsko jedinjenje transformiše u bilo koji od svojih izomernih oblika, tj. u oblike sa istim hemijskim sastavom, ali sa različitom strukturom ili konfiguracijom i, prema tome, uglavnom sa različitim fizičkim i hemijskim svojstvima. Ovde se posebno koristi izomerizacija aspartata, postupak u kome su jedan ili više ostataka asparaginske kiseline (D ili Asp) polipeptida transformisani u ostatak (ili ostatke) izoasparaginske kiseline. Pogledajte, npr. Geigeret al., J. Biol. Chem.262:785-94, 1987.
Izraz „deamidacija“ se odnosi generalno na hemijsku reakciju u kojoj se amidna funkcionalna grupa uklanja iz organskog jedinjenja. Ovde se posebno koristi deamidacija asparagina, postupak u kojem su jedan ili više ostataka asparagina (N ili Asn) polipeptida (npr. antitela) pretvoreni u asparaginsku kiselinu (D ili Asp), tj. neutralna amidna strana lanca je pretvorena u ostatak sa ukupnim kiselim svojstvom. Pogledajte, npr. Xie et al., J. Pharm. Sci. 88:8-13, 1999.
„Oksidisana“ varijanta molekula polipeptida (npr. antitelo) je polipeptid, pri čemu je jedan ili više ostataka metionina (M ili Met) ili triptofana (W ili Trp) originalnog polipeptida pretvoreno u sulfon ili sulfoksid preko sumpora metionina. Oksidacija može da se spreči pretvaranjem metionina (M ili Met) u leucin (L ili Leu) ili izoleucin (I ili Ile). Pogledajte, npr. Amphlettet al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140, 1996.
Ostaci aminokiselina „skloni“ određenim identifikovanim fizičkim ili hemijskim procesima (npr. izomerizacija, deamidacija ili oksidacija) odnose se na one ostatke u određenom molekulu proteina za koje je utvrđeno da imaju sklonost da pretrpe identifikovane procese, kao što je izomerizacija, deamidacija, ili oksidacija. Njihove sklonosti često se određuju preko njihovog relativnog položaja u primarnoj i/ili konformacionoj strukturi proteina. Na primer, pokazano je da je prvi Asp u motivu Asp-XXX (pri čemu XXX može biti Asp, Gly, His, Ser ili Thr) sklon izomerizaciji Asp zbog učešća njegovog susednog ostatka, dok neki drugi Asp u istom proteinu možda neće posedovati takvu sklonost. Analize za identifikovanje ostataka sklonih određenim postupcima u određenom molekulu proteina su poznati u struci. Pogledajte, npr. Cacia et al., Biochem.35:1897-1903, 1996.
Termin „HtrA serin peptidaza 1 (HtrA1)“ ili „HtrA1“, kako se ovde naizmenično koristi, ukazuje na svaki nativni HtrA1 koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađen HtrA1, „kompletne dužine“, kao i svaki oblik HtrA1 koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante HtrA1, npr. splajsovane ili alelne varijante. Sekvenca aminokiselina primera humanog HtrA1 je prikazana u SEQ ID NO: 121 (pogledajte sliku 29A). UniProt pristupni broj za humani HtrA1 je Q92743. Aminokiselinska sekvenca primera mišjeg HtrA1 je prikazana u SEQ ID NO: 155 (pogledajte sliku 29B). UniProt pristupni broj za mišji HtrA1 je Q9R118. Kao što je ovde opisano, aminokiselinski ostaci huHtrA1 i muHtrA1 su napravljeni u odnosu na SEQ ID NO: 121 i SEQ ID NO: 155. Položaji aminokiselina navedeni su jednoslovnim aminokiselinskim kodom, a zatim njihovim položajem unutar SEQ ID NO: 121 ili SEQ ID NO: 155 (pogledajte Sliku 29B). Kao što je prikazano na Slici 29A, zrela sekvenca humanog HtrA1 sadrži sekvencu koja počinje od glutamina na položaju 23 u SEQ ID NO: 121 i završava se na prolinu na položaju 480 SEQ ID NO: 121, npr. Q23-P480. Primeri fragmenata humanog HtrA1 uključuju fragmente koji sadrže, suštinski se sastoje, ili se sastoje od aminokiselina D161-K379. HtrA1 je takođe poznat u struci kao proteaza, serin, 11 (vezivanje IGF) (PRSS11), ARMD7, HtrA i IGFBP5-proteaza.
Termin „HtrA1“ takođe uključuje „varijante HtrA1“, što znači aktivni polipeptid HtrA1 koji ima najmanje oko 80% identičnosti aminokiselinske sekvence sa nativnom sekvencom polipeptida HtrA1, kao što je SEQ ID NO: 121 ili SEQ ID NO: 155. Uobičajeno, varijanta HtrA1 će imati najmanje oko 80% identičnosti aminokiselinske sekvence, ili najmanje oko 85% identičnosti aminokiselinske sekvence, ili najmanje oko 90% identičnosti aminokiselinske sekvence, ili najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence, ili najmanje oko 98% identičnosti aminokiselinske sekvence, ili najmanje oko 99% identičnosti aminokiselinske sekvence sa nativnom sekvencom HtrA1, npr. SEQ ID NO: 121 ili SEQ ID NO: 155.
Izraz „antagonist vezivanja za HtrA1“ koristi se u najširem smislu, i uključuje bilo koji molekul koji je sposoban da neutrališe, blokira, delimično ili u potpunosti inhibira, ukida, smanjuje ili ometa biološku aktivnost HtrA1. Antagonisti vezivanja HtrA1 uključuju, bez ograničenja, anti-HtrA1 antitela, njihove varijante antitela, njihove fragmente koji se vezuju za antigen, druge vezujuće polipeptide, peptide i male molekule koji nisu peptid, koji se vezuju za HtrA1 i sposobni su da neutrališu, blokiraju ili delimično ili potpuno da inhibirajue, ukidaju, smanjuju ili ometaju aktivnost HtrA1, kao što je sposobnost HtrA1 da cepa supstrat in vitro (npr. H2-Opt supstrat ili kazein) ili in vivo (npr. sposobnost HtrA1 da doprinese patologiji očnog poremećaja (npr. AMD (npr. geografska atrofija)).
Termin „faktor D“, kako se ovde koristi, odnosi se na nativne sekvence i varijante polipeptida faktora D. Faktor D je takođe poznat u struci kao faktor komplementa D (CFD), C3 proaktivator konvertaza, properdin faktor D esteraza i adipsin.
„Nativna sekvenca faktora D“ je polipeptid koji ima istu aminokiselinsku sekvencu kao i polipeptid faktora D dobijen iz prirode, bez obzira na način pripreme. Stoga, nativne sekvence faktora D se mogu izolovati iz prirode ili proizvesti rekombinantnim i/ili sintetičkim putem. Pored zrelog proteina faktora D, poput zrelog humanog proteina faktora D (pogledajte, npr., NCBI referentnu sekvencu NM_001928, SEQ ID NO: 126), termin „nativna sekvenca faktora D“, posebno obuhvata forme prekursora faktora D koje se javljaju u prirodi (npr. neaktivni pretprotein, koji je proteolitički pocepan da bi se dobio aktivni oblik), prirodne oblike varijanti (npr. alternativno splajsovane oblike) i alelne varijante faktora D koje se javljaju u prirodi, kao i varijante strukturne konformacije molekula faktora D koji imaju istu aminokiselinsku sekvencu kao i polipeptid faktora D dobijen iz prirode. UniProt pristupni broj za humani faktor D je P00746. Polipeptidi faktora D nehumanih životinja, uključujući više primate i nehumane sisare, posebno su obuhvaćeni ovom definicijom.
„Varijanta faktora D“ znači aktivni polipeptid faktora D koji ima najmanje oko 80% identičnosti aminokiselinske sekvence sa polipeptidom nativne sekvence faktora D, kao što je polipeptid nativne sekvence humanog faktora D (npr. NM_001928, SEQ ID NO: 126). Uobičajeno, varijanta faktora D će imati najmanje oko 80% identičnosti aminokiselinske sekvence, ili najmanje oko 85% identičnosti aminokiselinske sekvence, ili najmanje oko 90% identičnosti aminokiselinske sekvence, ili najmanje oko 95% identičnosti aminokiselinske sekvence, ili najmanje oko 98% identičnosti aminokiselinske sekvence, ili najmanje oko 99% identičnosti aminokiselinske sekvence sa zrelom humanom aminokiselinskom sekvencom (npr. NM_001928, SEQ ID NO: 126).
Izraz „antagonist vezivanja faktora D“ koristi se u najširem smislu, i uključuje bilo koji molekul koji je sposoban da neutrališe, blokira, delimično ili u potpunosti inhibira, ukida, smanjuje ili ometa biološku aktivnost faktora D. Antagonisti vezivanja faktora D uključuju, bez ograničenja, anti-faktor D antitela i njihove varijante antitela, njihove fragmente koji vezuju antigen, druge vezujuće polipeptide, peptide i male molekule koji nisu peptid, koji se vezuju za faktor D i sposobni su za neutralizaciju, blokiranje, delimično ili potpuno inhibiranje, ukidanje, smanjenje ili ometanje aktivnosti faktora D, kao što je sposobnost faktora D da učestvuje u patologiji stanja oka povezanog sa komplementom.
Termin „VEGF antagonist“, kako se ovde koristi, odnosi se na molekul sposoban da se veže za VEGF, smanjuje nivoe ekspresije VEGF ili da neutrališe, blokira, inhibira, ukida, smanjuje ili ometa biološke aktivnosti VEGF, uključujući, bez ograničenja, vezivanje VEGF za jedan ili više receptora VEGF, VEGF signalizaciju i VEGF posredovanu angiogenezu i preživljavanje ili proliferaciju endotelnih ćelija. Na primer, molekul sposoban da neutrališe, blokira, inhibira, ukida, redukuje ili ometa biološke aktivnosti VEGF može da ostvari svoje efekte vezivanjem za jedan ili više VEGF receptora (VEGFR) (npr. VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, membranski vezani VEGF receptor (mbVEGFR) ili rastvorljivi VEGF receptor (sVEGFR)). Antagonisti VEGF korisni u postupcima iz pronalaska su polipeptidi koji se specifično vezuju za VEGF, anti-VEGF antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti, molekuli receptora i derivati koji se specifično vezuju za VEGF, čime se izoluje njegovo vezivanje za jedan ili više receptora, fuzije proteina (npr. VEGF-zamka (Regeneron)) i VEGF121-gelonin (Peregrine). Antagonisti VEGF takođe uključuju verzije antagonista VEGF polipeptida, antisens oligomera nukleobaze komplementarne barem sa fragmentom molekula nukleinske kiseline koji kodira polipeptid VEGF; male RNK komplementarne barem sa fragmentom molekula nukleinske kiseline koji kodira polipeptid VEGF; ribozime koji ciljaju VEGF; peptidna tela na VEGF; i aptamere VEGF. Antagonisti VEGF takođe uključuju polipeptide koji se vezuju za VEGFR, anti-VEGFR antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente, i derivate koji se vezuju za VEGFR, čime blokiraju, inhibiraju, ukidaju, smanjuju ili ometaju biološke aktivnosti VEGF (npr. VEGF signalizacija), ili fuzione proteine. Antagonisti VEGF takođe uključuju nepeptidne male molekule koji se vezuju za VEGF ili VEGFR i sposobni su da blokiraju, inhibiraju, ukidaju, smanjuju ili ometaju biološke aktivnosti VEGF. Prema tome, izraz „aktivnosti VEGF“ posebno uključuje biološke aktivnosti VEGF posredstvom VEGF. U određenim otelotvorenjima, antagonist VEGF smanjuje ili inhibira, za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više, nivo ekspresije ili biološku aktivnost VEGF. U nekim otelotvorenjima, VEGF inhibiran VEGF-specifičnim antagonistom je VEGF (8-109), VEGF (1-109) ili VEGF165.
Kako se ovde koriste, antagonisti VEGF mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, anti-VEGFR2 antitela i srodne molekule (npr. ramucirumab, tanibirumab, aflibercept), anti-VEGFR1 antitela i srodne molekule (npr. ikrukumab, aflibercept (VEGF zamka za oko; EYLE®) i ziv-aflibercept (VEGF zamka; ZALTRAP®)), bispecifična VEGF antitela (npr. MP-0250, vanucizumab (VEGF-ANG2) i bispecifična antitela objavljena u US 2001/0236388), bispecifična antitela, uključujući kombinacije dva kraka anti-VEGF, anti-VEGFR1 i anti-VEGFR2, anti-VEGF antitela (npr. bevacizumab, sevacizumab i ranibizumab) i nepeptidne antagoniste VEGF malog molekula (npr. pazopanib, aksitinib, vandetanib, stivarga, kabozantinib, lenvatinib, nintedanib, orantinib, telatinib, dovitinig, cediranib, motesanib, sulfatinib, apatinib, foretinib, famitinib i tivozanib).
Termin „anti-VEGF antitelo“, „antitelo koje se vezuje za VEGF“ ili „antitelo koje se specifično vezuje za VEGF“ odnosi se na antitelo koje je sposobno za vezivanje VEGF-a sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens kada se cilja na VEGF. U jednom otelotvorenju, obim vezivanja anti-VEFG antitela za nepovezani protein koji nije VEGF je manji od oko 10% od vezivanja antitela za VEFG kao što je izmereno, na primer, radioimunotestom (RIA). U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za VEFG ima konstantu disocijacije (Kd) ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U određenim otelotvorenjima, anti-VEGF antitelo se vezuje za epitop VEGF koji je konzerviran između VEGF različitih vrsta.
U određenim otelotvorenjima, anti-VEGF antitelo prema pronalasku može se koristiti kao terapeutsko sredstvo u ciljanju i ometanju bolesti ili stanja kod kojih je uključena aktivnost VEGF. Takođe, antitelo može biti podvrgnuto drugim analizama biološke aktivnosti, npr. da bi se procenila njegova efikasnost kao terapeutika. Takvi testovi su poznati u struci, i zavise od ciljnog antigena i predviđene upotrebe antitela. Primeri uključuju HUVEC test inhibicije; testove inhibicije rasta tumorskih ćelija (kao što je, na primer, opisano u WO 89/06692); testove citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) i citotoksičnosti posredovane komplementom (CDC) (US pat. br. 5,500,362); i testove agonističke aktivnosti ili hematopoeze (pogledajte WO 95/27062). Anti-VEGF antitelo se obično neće vezati za druge VEGF homologe kao što su VEGF-B ili VEGF-C, niti druge faktore rasta, kao što su PIGF, PDGF ili bFGF. U jednom otelotvorenju, anti-VEGF antitelo je monoklonsko antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i monoklonsko anti-VEGF antitelo A4.6.1 proizvedeno putem hibridoma ATCC HB 10709. U još jednom otelotvorenju, anti-VEGF antitelo je rekombinantno humanizovano anti-VEGF monoklonsko antitelo generisano prema Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599, uključujući, bez ograničenja, antitelo poznato kao bevacizumab (BV; AVASTIN®).
Anti-VEGF antitelo „ranibizumab“ takođe poznato kao „LUCENTIS®“ ili „rhuFab V2“, je humanizovani, anti-humani VEGF Fab fragment sa zrelim afinitetom. Ranibizumab se proizvodi standardnim rekombinantnim tehnikama u ekspresionom vektoru Escherichia coli i bakterijskom fermentacijom. Ranibizumab nije glikozilovan i ima molekulsku masu od ~ 48.000 daltona. Pogledajte WO 98/45331 i US 2003/0190317. Dodatna poželjna antitela uključuju antitela serije G6 ili B20 (npr. G6-31, B20-4.1), kako je opisano u PCT prijavi br. WO 2005/012359 i WO 2005/044853, koje su ovde u celosti inkorporisane putem reference. Za dodatna poželjna antitela pogledajte US pat. br. 7,060,269, 6,582,959, 6,703,020; 6,054,297; WO98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; US publikaciju patentne prijave br. 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409 i 20050112126; i Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004). Druga poželjna antitela obuhvataju ona koja se vezuju za funkcionalni epitop na humanom VEGF, koja sadrže ostatke F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191, K101, E103 i C104 ili, alternativno, sadrže ostatke F17, Y21, Q22, Y25, D63, 183, Q89. Dodatna anti-VEGF antitela uključuju anti-VEGF antitela opisana u PCT publikaciji prijave br. WO 2009/155724.
Izraz „antagonist koji vezuje IL-6“ odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koja nastaje usled interakcije IL-6 sa jednim ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što je receptor za interleukin-6 (IL-6R) (takođe nazvan CD126) i/ili gp130 (takođe nazvan CD130). Primeri antagonista za vezivanje IL-6 uključuju, na primer, anti-IL-6 antagoniste (uključujući anti-IL-6 antitela, npr. EBI-031 („Eleven Biotherapeutics“)) i anti-IL-6R antagoniste (uključujući anti-IL-6R antitela, npr. tocilizumab (ACTEMRA®). Ovde je „mali molekul“ definisan kao onaj koji ima molekulsku masu manju od oko 600, poželjno manju od oko 1000 daltona.
„Poremećaj“ je svako stanje koje bi imalo koristi od lečenja antitelom. To uključuje hronične i akutne poremećaje i bolesti, uključujući ona patološka stanja koja predstavljaju predispoziciju sisara za odgovarajući poremećaj. Neograničavajući primeri poremećaja koji će se ovde lečiti uključuju poremećaje povezane sa HtrA1, očne poremećaje i/ili poremećaje povezane sa komplementom.
Termin „poremećaj povezan sa HtrA1“, kako se ovde koristi, odnosi se u najširem smislu na bilo koji poremećaj ili stanje povezano sa abnormalnom ekspresijom ili aktivnostima HtrA1. U nekim otelotvorenjima, poremećaji povezani sa HtrA1 su povezani sa viškom nivoa ili aktivnosti HtrA1 u kojima se atipični simptomi mogu manifestovati zbog nivoa ili aktivnosti HtrA1 lokalno (npr. u oku) i/ili sistemski u telu. Primeri poremećaja povezanih sa HtrA1 uključuju očne poremećaje povezane sa HtrA1, koji uključuju, ali nisu ograničeni na, starosnu degeneraciju makule (AMD), uključujući vlažni (eksudativni) AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali vlažni AMD) i suvi (neeksudativni) AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali suvi AMD (npr. geografska atrofija (GA)).
Kako se ovde koristi, termin „očni poremećaj“ uključuje, ali nije ograničen na, poremećaje oka, uključujući degenerativne bolesti makule, poput starosne degeneracije makule (AMD), uključujući vlažni (eksudativni) AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali vlažni AMD) i suvi (neeksudativni) AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali suvi AMD (npr. geografska atrofija (GA)); dijabetičku retinopatiju (DR) i druge retinopatije povezane sa ishemijom; endoftalmitis; uveitis; horoidalnu neovaskularizaciju (CNV); retinopatiju nedonoščadi (ROP); polipoidnu horoidnu vaskulopatiju (PCV); dijabetički edem makule; patološku miopiju; von Hipel-Lindauovu bolest; histoplazmozu oka; okluziju centralne vene mrežnjače (CRVO); neovaskularizaciju rožnjače i neovaskularizaciju mrežnjače. U nekim otelotvorenjima, očni poremećaj je AMD (npr. GA).
Termin „poremećaj povezan sa komplementom“ koristi se u najširem smislu, i uključuje poremećaje povezane sa prekomernom ili nekontrolisanom aktivacijom komplementa. Oni uključuju aktivaciju komplementa tokom operacija kardiopulmonalnog bajpasa; aktivaciju komplementa usled ishemije-reperfuzije nakon akutnog infarkta miokarda, aneurizme, moždanog udara, hemoragičnog šoka, postkompresivnog sindroma, otkazivanja više organa, hipobolemijskog šoka, crevne ishemije, ili drugih događaja koji uzrokuju ishemiju. Takođe se pokazalo da je aktivacija komplementa povezana sa inflamatornim stanjima kao što su teške opekotine, endotoksemija, septički šok, respiratorni distres sindrom odraslih, hemodijaliza; anafilaktički šok, teška astma, angioedem, Kronova bolest, anemija srpastih ćelija, poststreptokokni glomerulonefritis i pankreatitis. Poremećaj može biti rezultat neželjene reakcije na lek, alergije na lek, sindroma vaskularnog curenja izazvanog putem IL-2 ili alergije na radiografski kontrastni medijum. Takođe uključuje autoimunske bolesti, kao što su sistemski eritematozni lupus, miastenija gravis, reumatoidni artritis, Alchajmerova bolest i multipla skleroza. Aktivacija komplementa takođe je povezana sa odbacivanjem transplantata. Aktivacija komplementa je takođe povezana sa očnim poremećajima, kao što su očni poremećaji povezani sa komplementom.
Termin „očni poremećaj povezan sa komplementom“ koristi se u najširem smislu, i uključuje sva očna stanja čija patologija uključuje komplement, uključujući klasične i alternativne puteve, a posebno alternativni put komplementa. Očni poremećaji povezani sa komplementom uključuju, bez ograničenja, degenerativne bolesti makule, kao što su sve faze starosne degeneracije makule (AMD), horoidalna neovaskularizacija (CNV), uveitis, dijabetesne i druge retinopatije povezane sa ishemijom, endoftalmitis, uveitis i druge intraokularne neovaskularne bolesti, kao što su dijabetički edem makule, patološka miopija, fon Hipel-Lindauova bolest, histoplazmoza oka, začepljenje centralne vene mrežnjače (CRVO), neovaskularizacija rožnjače i neovaskularizacija mrežnjače. U jednom primeru, AMD uključuje vlažni AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali vlažni AMD) i suvi AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali suvi AMD (npr. geografska atrofija (GA)). U daljem primeru, suvi (neeksudativni) AMD može uključivati prisustvo tvrdih druza, mekih druza, geografsku atrofiju i/ili nakupljanje pigmenta. Rani AMD može, na primer, uključivati više malih do jedne ili više neekstenzivnih druza srednje veličine. Srednji AMD može, na primer, uključivati opsežnu srednju druzu do jedne ili više velikih druza. Pogledajte, npr. Ferris et al., AREDS Report No. 18; Sallo et al., Eye Res, 34(3):238-40,2009; Jager et al., New Engl. J. Med., 359(1):1735, 2008. U daljem primeru, srednji suvi AMD može uključivati veliku spojenu druzu. U daljem primeru, geografska atrofija može da uključuje gubitak fotoreceptora i/ili retinalnog pigmentanog epitela (RPE). U daljem primeru, područje geografske atrofije može biti malo ili veliko i/ili može biti u području makule ili u perifernoj mrežnjači. U jednom primeru, očni poremećaj povezan sa komplementom je srednji suvi AMD. U jednom primeru, očni poremećaj povezan sa komplementom je geografska atrofija. U jednom primeru, očni poremećaj povezan sa komplementom je vlažni AMD (npr. horoidalna neovaskularizacija (CNV)).
Gornji spiskovi nisu sveobuhvatni, i podrazumeva se da bolest ili poremećaj mogu spadati u različite kategorije. Na primer, AMD se u nekim slučajevima može kategorisati kao poremećaj povezan sa HtrA1, očni poremećaj i poremećaj povezan sa komplementom.
Kako se ovde koristi, „primena“ podrazumeva postupak davanja doze jedinjenja (npr. anti-HtrA1 antitela prema pronalasku, nukleinske kiseline koja kodira anti-HtrA1 antitelo prema pronalasku) ili kompozicije (npr. farmaceutska kompozicija, npr. farmaceutska kompozicija koja uključuje anti-HtrA1 antitelo prema pronalasku) ispitaniku. Kompozicije koje se koriste u ovde opisanim postupcima mogu se primenjivati, na primer, intravitrealno (npr. intravitrealnom injekcijom), okularno (npr. okularnom injekcijom), intraokularno (npr. intraokularnom injekcijom), jukstaskleralno (npr. juktaskleralnom injekcijom), subtenonalno (npr. subtenonalnom injekcijom), superhoroidno (npr. superhoroidnom injekcijom), lokalno (npr. putem kapi za oči), intramuskularno, intravenski, intradermalno, perkutano, intraarterijski, intraperitonealno, intraleziono, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatički, intrapleuralno, intratrahealrno, intratekalno, intranazalno, intravaginalno, intrarektalno, intratumorski, peritonealno, subkutano, subkonjunktivno, intravaskularno, mukozno, intraperikardijalno, intraumbilično, intraorbitalno, oralno, transdermalno, putem inhalacije, putem injekcije, putem implantacije, putem infuzije, putem kontinualne infuzije, putem direktnog lokalizovanog perfuzionog kupanja ciljnih ćelija, putem katetera, putem ispiranja, u kremama, ili u lipidnim kompozicijama. Kompozicije korišćene u ovde opisanim postupcima mogu takođe da se primenjuju sistemski ili lokalno. Način primene može da varira u zavisnosti od različitih faktora (npr. jedinjenja ili kompozicije koja se primenjuje i težine stanja, bolesti ili poremećaja koji se leči). U određenim otelotvorenjima, ovde opisana antitela (npr. anti-HtrA1 antitela, anti-faktor D antitela i anti-HtrA1/anti-faktor D antitela) primenjuju se intravitrealnom injekcijom.
Primena „u kombinaciji sa“ jednim ili više daljih terapeutskih sredstava uključuje simultanu (istovremeno) i uzastopnu primenu bilo kojim redosledom.
Izrazi „produžena isporuka“, „produženo oslobađanje“ i „kontrolisano oslobađanje“ generalno se koriste za opisivanje mehanizma za isporuku koji koristi formulaciju, dozni oblik, uređaj ili druge vrste tehnologija za postizanje produženog ili proširenog oslobađanja ili bioraspoloživosti terapeutskog agensa (npr. antitelo prema pronalasku). Može se odnositi na tehnologije koje obezbeđuju produženo ili prošireno oslobađanje leka ili bioraspoloživost leka za opštu sistemsku cirkulaciju, ili ispitanika ili lokalna mesta delovanja kod ispitanika, uključujući (bez ograničenja) ćelije, tkiva, organe, zglobove, regione, i slično. Nadalje, ovi pojmovi mogu da se odnose na tehnologiju koja se koristi za produženje ili proširenje oslobađanja leka iz formulacije ili doznog oblika, ili se mogu odnositi na tehnologiju koja se koristi za produženje ili proširenje bioraspoloživosti ili farmakokinetike ili trajanja delovanja leka na ispitanika, ili se mogu odnositi na tehnologiju koja se koristi za produženje ili proširenje farmakodinamičkog efekta koji izaziva formulacija.
„Formulacija sa produženim delovanjem“, „formulacija sa produženim oslobađanjem“ ili „formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem“ je farmaceutska formulacija, dozni oblik ili druga tehnologija koja se koristi za obezbeđivanje dugotrajne isporuke. U jednom aspektu, kontrolisano oslobađanje se koristi za poboljšanje lokalne bioraspoloživosti terapeutskog agensa, posebno vremena boravka u oku u kontekstu okularne isporuke. „Produženo vreme boravka u oku“ odnosi se na period posle isporuke tokom kojeg isporučeni očni lek ostaje efikasan i u pogledu kvaliteta (npr. aktivnosti) i u pogledu količine (npr. delotvorne količine). Pored, ili umesto, velike doze i kontrolisanog oslobađanja, lek se može modifikovati posttranslaciono, kao što je putem PEGilovanja, da bi se postigao produženi poluživot in vivo.
„Delotvorna količina“ agensa, npr. farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima delotvorna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.
„Pojedinac“ ili „ispitanik“ je sisar. Sisari uključuju, bez ograničenja, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). U određenim otelotvorenjima, pojedinac ili ispitanik je čovek. „Ispitanik“ može biti „pacijent“.
Termin „uputstvo za upotrebu“ koristi se da se ukaže na uputstvo koje se tipično nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.
„Farmaceutski prihvatljiv nosač“ se odnosi na sastojak farmaceutske formulacije koji nije aktivni sastojak, i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
Termin „farmaceutska formulacija“ se odnosi na preparat koji je u takvom obliku koji omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj sadrži bude efikasna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.
U smislu ovog dokumenta, „lečenje“ (i gramatički oblici ove reči, kao što je „lečiti”) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, i može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti ili poremećaja, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti ili poremećaja, smanjenje brzine napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti ili poremećaja, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, antitela iz pronalaska se primenjuju da odlože razvoj bolesti ili poremećaja, ili da uspore napredovanje bolesti ili poremećaja. U nekim primerima, poremećaj je poremećaj povezan sa HtrA1, očni poremećaj i/ili poremećaj povezan sa komplementom, na primer, AMD (npr. GA).
„Izolovani“ molekul nukleinske kiseline je molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen od najmanje jednog zagađujućeg molekula nukleinske kiseline sa kojim je obično povezan u prirodnom izvoru nukleinske kiseline. Izolovani molekul nukleinske kiseline nije u onom obliku ili okruženju u kojem se nalazi u prirodi. Stoga se izolovani molekuli nukleinske kiseline razlikuju od molekula nukleinske kiseline kakav postoji u prirodnim ćelijama. Međutim, izolovani molekul nukleinske kiseline uključuje molekul nukleinske kiseline sadržan u ćelijama koje obično eksprimiraju antitelo, gde se, na primer, molekul nukleinske kiseline nalazi na hromozomskom mestu koje se razlikuje od položaja u prirodnim ćelijama.
Izraz „kontrolne sekvence“ se odnosi na sekvence DNK neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćina. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promoter, opciono operatorsku sekvencu, i mesto vezivanja ribozoma. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotere, poliadenilacione signale i pojačivače.
Nukleinska kiselina je „operativno povezana“ kada se stavi u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za predsekvencu ili sekretorni lider su operativno povezani sa DNK za polipeptid ako se eksprimiraju kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je pozicionirano tako da olakšava translaciju. Uopšteno, „operativno povezan“ znači da su sekvence DNK koje su povezane susedne, i, u slučaju sekretornog lidera, susedne i u okviru faze čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju biti susedni. Povezivanje se postiže ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri u skladu sa konvencionalnom praksom.
Kako se ovde koriste, izrazi „ćelija“, „ćelijska linija“ i „ćelijska kultura“ se koriste kao sinonimi, i sve takve oznake uključuju potomstvo. Tako, reči „transformanti“ i „transformisane ćelije“ uključuju primarnu ćeliju ispitanika i kulture koje su od nje izvedene, bez obzira na broj prenosa. Takođe se podrazumeva da svako potomstvo možda nije precizno identično po sadržaju DNK, usled namernih ili nenamernih mutacija. Ovde se uključuje mutirano potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano u originalno transformisanoj ćeliji. Tamo gde su nameravane različite oznake, to će biti jasno iz konteksta.
Kako se ovde koristi, „biblioteka“ se odnosi na mnoštvo sekvenci antitela ili fragmenata antitela (npr. anti-HtrA1 antitela prema pronalasku), ili nukleinskih kiselina koje kodiraju ove sekvence, pri čemu su sekvence različite u kombinaciji varijantnih aminokiselina koje su uvedene u ove sekvence, na primer, kako je ovde opisano.
„Mutacija“ je brisanje, umetanje ili supstitucija nukleotida u odnosu na referentnu nukleotidnu sekvencu, kao što je sekvenca divljeg tipa.
Kako se ovde koristi, „skup kodona“ se odnosi na skup različitih sekvenci nukleotidnih tripleta koji se koriste za kodiranje željenih varijantnih aminokiselina. Skup oligonukleotida može da se sintetiše, na primer, sintezom u čvrstoj fazi, uključujući sekvence koje predstavljaju sve moguće kombinacije nukleotidnih tripleta koje obezbeđuje skup kodona, i koje će kodirati željenu grupu aminokiselina. Standardni oblik označavanja kodona je oblik IUB koda, koji je poznat u struci. Skup kodona obično je predstavljen sa 3 velika slova u kurzivu, npr. NNK, NNS, XYZ, DVK, i slično. Sinteza oligonukleotida sa „degeneracijom“ odabranih nukleotida na određenim položajima je dobro poznata u struci, na primer, TRIM pristup (Knappek et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 1999; Garrard et al., Gene 128:103, 1993). Takvi skupovi oligonukleotida koji imaju određene skupove kodona mogu se sintetizovati pomoću komercijalnih sintetizatora nukleinske kiseline (dostupni su, na primer, od kompanije „Applied Biosystems“, Foster City, CA), ili se mogu dobiti komercijalno (na primer, od kompanije „Life Technologies“, Rockville, MD). Prema tome, skup oligonukleotida sintetizovanih sa određenim skupom kodona obično uključuje mnoštvo oligonukleotida sa različitim sekvencama, razlike utvrđene skupom kodona u ukupnoj sekvenci. Oligonukleotidi, kako se koriste prema pronalasku, imaju sekvence koje omogućavaju hibridizaciju do šablona nukleinske kiseline sa varijabilnim domenom i takođe mogu, ali ne moraju, da uključuju mesta restrikcionih enzima korisna, na primer, u svrhu kloniranja.
„Prikaz faga“ je tehnika kojom se varijantni polipeptidi prikazuju kao fuzioni proteini najmanje na delu proteina omotača na površini čestica faga, na primer, filamentoznog faga. Korisnost prikaza faga leži u činjenici da se velike biblioteke randomizovanih varijanti proteina mogu brzo i efikasno sortirati za one sekvence koje se vezuju za ciljni antigen sa velikim afinitetom. Prikaz biblioteka peptida i proteina na fagu korišćen je za skrining miliona polipeptida radi onih sa specifičnim svojstvima vezivanja. Polivalentne metode prikaza faga korišćene su za prikazivanje malih nasumičnih peptida i malih proteina putem fuzija do gena III ili gena VIII filamentoznog faga. Pogledajte, na primer, Wells et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 3:355-362, 1992, i tamo citirane reference. U prikazu jednovalentnog faga, proteinska ili peptidna biblioteka je fuzionisana sa genom III ili njegovim delom, i eksprimira se na niskim nivoima u prisustvu gena III divljeg tipa proteina, tako da čestice faga prikazuju jednu kopiju ili nijedan fuzioni protein. Efekti avidnosti su smanjeni u odnosu na polivalentni fag, tako da je sortiranje zasnovano na unutrašnjem afinitetu liganda, i koriste se fagemidni vektori koji pojednostavljuju DNK manipulacije. Pogledajte, npr. Lowman et al., Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:205-216, 1991.
„Varijanta“ ili „mutant“ polaznog ili referentnog polipeptida (npr. referentno antitelo ili njegovi varijabilni domeni/HVR-i) je polipeptid koji (1) ima aminokiselinsku sekvencu različitu od početnog ili referentnog polipeptida i (2) izveden je iz početnog ili referentnog polipeptida bilo prirodnom ili veštačkom (koju je izvršio čovek) mutagenezom. Takve varijante uključuju, na primer, brisanje i/ili umetanje i/ili zamenu ostataka u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida od interesa, koji se ovde nazivaju „izmene aminokiselinskog ostatka“. Prema tome, varijanta HVR se odnosi na HVR koji sadrži varijantnu sekvencu u odnosu na početnu ili referentnu polipeptidnu sekvencu (poput one izvornog antitela ili fragmenta koji vezuje antigen). Izmena aminokiselinskog ostatka, u ovom kontekstu, odnosi se na aminokiselinu različitu od aminokiseline na odgovarajućem položaju u početnoj ili referentnoj sekvenci polipeptida (kao što je ona referentnog antitela ili njegovog fragmenta). Svaka kombinacija izbacivanja, umetanja i supstitucije može biti napravljena da se dođe do konačne varijante ili mutanta konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene funkcionalne karakteristike. Izmene aminokiselina takođe mogu da promene posttranslacione procese polipeptida, kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije.
Sekvenca „divljeg tipa (WT)“ ili „referentna“ sekvenca ili sekvenca proteina/polipeptida „divljeg tipa“ ili „referentna“, kao što je HVR ili varijabilni domen referentnog antitela, može biti referentna sekvenca od koje su varijantni polipeptidi izvedeni uvođenjem mutacija. Generalno, sekvenca „divljeg tipa“ za dati protein je sekvenca koja je najčešća u prirodi. Slično tome, sekvenca gena „divljeg tipa“ je sekvenca tog gena koja se najčešće nalazi u prirodi. Mutacije mogu da se uvedu u gen „divljeg tipa“ (a samim tim i u protein koji on kodira) bilo prirodnim procesima bilo sredstvima koja izaziva čovek. Produkti takvih procesa su „varijantni“ ili „mutirani“ oblici izvornog proteina ili gena „divljeg tipa“.
„Referentno antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo ili njegov fragment čija sekvenca koja vezuje antigen služi kao obrazac sekvence na kojoj se vrši diversifikacija prema ovde opisanim kriterijumima. Sekvenca za vezivanje antigena generalno uključuje varijabilni region antitela, poželjno najmanje jedan HVR, po mogućnosti uključujući okvirne regione.
„Obogaćen“, kako se ovde koristi, znači da je entitet (npr. izmena aminokiselinskog ostatka) prisutan češće u razvrstanoj biblioteci u poređenju sa odgovarajućom referentnom bibliotekom (npr. nesortirana biblioteka, ili biblioteka koja je sortirana za drugačiji ili nerelevantni antigen). Nasuprot tome, „osiromašen“ znači da je entitet (na primer, izmena aminokiselinskog ostatka) prisutan ređe u razvrstanoj biblioteci u poređenju sa odgovarajućom referentnom bibliotekom (npr. nesortirana biblioteka, ili biblioteka koja je sortirana za drugačiji ili nerelevantni antigen). Termin „neutralan“, kada se koristi u odnosu na postupke identifikovanja varijanti aminokiselinskih ostataka, znači da entitet nije ni obogaćen ni osiromašen, drugim rečima, prisutan je približno u istoj učestalosti u razvrstanoj biblioteci u poređenju sa odgovarajućom referentnom bibliotekom (npr. nesortirana biblioteka ili biblioteka koja je sortirana za drugačiji ili nerelevantni antigen).
Pod „izoelektričnom tačkom (pl)“ podrazumeva se pH vrednost na kojoj molekul (npr., protein, kao što je antitelo) nema neto električno naelektrisanje, takođe poznata u struci kao „pH(I)“ ili „IEP“.
II. KOMPOZICIJE I POSTUPCI
Pronalazak obezbeđuje nova antitela koja se vezuju za HtrA1 i postupke za njihovo pravljenje i upotrebu, na primer, za terapeutsku i dijagnostičku upotrebu. Antitela prema pronalasku su korisna, na primer, za dijagnozu ili lečenje različitih poremećaja, uključujući poremećaje povezane sa HtrA1, očne poremećaje i/ili poremećaje povezane sa komplementiom, uključujući starosnu degeneraciju makule (npr. geografsku atrofiju).
A. Primeri za anti-HtrA1 antitela
U jednom aspektu, pronalazak se delimično zasniva na antitelima koja se specifično vezuju za HtrA1. Antitela prema pronalasku su korisna, na primer, za lečenje ili dijagnozu poremećaja, uključujući poremećaje povezane sa HtrA1, očne poremećaje i/ili poremećaje povezane sa komplementom, uključujući starosnu degeneraciju makule (npr. geografsku atrofiju).
Ovde su otkrivena izolovana antitela koja se specifično vezuju za HtrA1. U nekim slučajevima, HtrA1 je humani HtrA1 (huHtrA1). U drugim slučajevima, HtrA1 je mišji HtrA1 (muHtrA1). U određenim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo prema pronalasku specifično vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od 100 nM ili manje (npr. 100 nM ili manje, 10 nM ili manje, 5 nM ili manje, 2,5 nM ili manje, 1 nM ili manje, 100 pM ili manje, 10 pM ili manje, 1 pM ili manje ili 0,1 pM ili manje). Na primer, u nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo prema pronalasku specifično vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od 1 nM ili manje (npr. 1 nM ili manje, 900 pM ili manje, 800 pM ili manje, 700 pM ili manje, 600 pM ili manje, 550 pM ili manje, 500 pM ili manje, 400 pM ili manje, 300 pM ili manje, 200 pM ili manje, 150 pM ili manje, 125 pM ili manje, 100 pM ili manje, 75 pM ili manje, 50 pM ili manje, 25 pM ili manje ili 1 pM ili manje). U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 40 pM do oko 700 pM (npr. od oko 40 pM do oko 700 pM, od oko 40 pM do oko 600 pM, od oko 40 pM do oko 550 pM, od oko 40 pM do oko 500 pM, od oko 40 pM do oko 400 pM, od oko 40 pM do oko 300 pM, od oko 40 pM do oko 250 pM, od oko 50 pM do oko 200 pM, od oko 50 pM do oko 175 pM, od oko 50 pM do oko 150 pM, od oko 50 pM do oko 125 pM, od oko 70 pM do oko 125 pM, ili od oko 50 pM do oko 125 pM). U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD oko 110 pM. U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD oko 60 pM. Bilo koja od prethodnih vrednosti KD može predstavljati afinitet vezivanja anti-HtrA1 antitela iz pronalaska (npr. Fab anti-HtrA1 antitela iz pronalaska) za domen proteaze (PD) huHtrA1 (huHtrA1-PD), na primer, mereno upotrebom površinske plazmonske rezonance BIACORE®, na primer, kako je ovde opisano.
U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo prema pronalasku je sposobno da inhibira aktivnost HtrA1. U nekim slučajevima, antitelo inhibira aktivnost domena proteaze huHtrA1-PD sa 50% inhibitornom koncentracijom (IC50) od 10 nM ili manje (npr. 10 nM ili manje, 5 nM ili manje, 2 nM ili manje, 1,5 nM ili manje, 1 nM ili manje, 900 pM ili manje, 800 pM ili manje, 700 pM ili manje, 600 pM ili manje, 500 pM ili manje, 400 pM ili manje, 300 pM ili manje, 200 pM ili manje, 100 pM ili manje, 50 pM ili manje, ili 1 pM ili manje). U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo inhibira aktivnost huHtrA1-PD sa IC50 od oko 0,25 nM do oko 1 nM (npr. od oko 0,25 nM do oko 1 nM, od oko 0,25 nM do oko 0,9 nM, od oko 0,25 nM do oko 0,8 nM, od oko 0,25 nM do oko 0,7 nM, od oko 0,25 nM do oko 0,6 nM, od oko 0,25 nM do oko 0,5 nM, ili od oko 0,25 nM do oko 0,4 nM). U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo inhibira aktivnost huHtrA1-PD sa IC50 od oko 0,3 nM. U bilo kom od prethodnih slučajeva, inhibitorna aktivnost može biti in vitro merenje testa blokiranja na bazi FRET. U nekim slučajevima, in vitro test blokiranja na bazi FRET obuhvata cepanje H2-Opt sonde (npr. (Mca) (Dnp)KK (SEQ ID NO: 152). U bilo kom od prethodnih slučajeva, vrednost IC50 može da se zasniva na sposobnosti anti-HtrA1 u dvovalentnom formatu (npr. IgG format) da inhibira aktivnost huHtrA1-PD.
Pronalazak takođe uključuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop HtrA1, pri čemu HtrA1 epitop sadrži najmanje jednu aminokiselinu proteina HtrA1 odabranu iz grupe koju čine Arg190, Leu192, Pro193, Phe194 i Arg197, gde se numerisanje aminokiselina odnosi na numerisanje humanog prekursorskog proteina HtrA1. U jednom otelotvorenju, humani prekursorski protein HtrA1 ima sekvencu SEQ ID NO: 121.
U nekim otelotvorenjima, rastojanje između antitela i jedne ili više aminokiselina određuje se kristalografijom, na primer, korišćenjem kristalografskih postupaka opisanih u primerima.
U nekim aspektima pronalaska, anti-HtrA1 antitelo može da sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) izabranih od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 1), pri čemu, X1je Met ili Leu; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 2), pri čemu, X2je Glu ili Asp; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 4), pri čemu, X3je Glu ili Asn; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 5), pri čemu, X4je Asn, His ili Glu; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 6), pri čemu, X5je Ser ili Tyr, i X6je Ala ili Asn, ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih HVR-ova i jedne ili više njihovih varijanti koje imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti) bilo kojeg SEQ ID NOs: 1-6.
Na primer, anti-HtrA1 antitelo može da sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-a izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 7); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 8); (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 9); (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 10); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 11), ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih HVR-ova i jedne ili više njihovih varijanti koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti) sa bilo kojim od SEQ ID NO: 3 ili 7-11.
U nekim aspektima pronalaska, bilo koje od prethodnih anti-HtrA1 antitela može da sadrži jedan, dva, tri ili četiri od sledećih regiona okvira (FR) varijabilnog domena teškog lanca (VH): (a) FR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 12), pri čemu, X1je Lys ili Thr, i X2je Thr, Lys, ili Arg; (b) FR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 13); (c) FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 14); i (d) FR-H4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 15).
U nekim aspektima pronalaska, bilo koje od prethodnih anti-HtrA1 antitela može da sadrži jedno, dva, tri ili četiri od sledećih FR-a varijabilnog domena lakog (VL: (a) FR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 17); (b) FR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 18); (c) FR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 19); i (d) FR-L4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 20).
Na primer, u nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo uključuje sledećih šest HVR-a: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 7); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 8); (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 9); (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 10); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 11). U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo uključuje sledeća četiri FR-a varijabilnog domena teškog lanca: (a) FR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 16); (b) FR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 13); (c) FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 14); i (d) FR-H4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 15). U daljim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo uključuje sledeća četiri FR-a varijabilnog domena lakog lanca: (a) FR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 17); (b) FR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 18); (c) FR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 19); i (d) FR-L4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 20). U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22. U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo je APEG.LC3.HC3.
U drugom primeru, u nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo uključuje sledećih šest HVR-a: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 7); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 123); (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 124); (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 10); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 125). U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo uključuje sledeća četiri FR-a varijabilnog domena teškog lanca: (a) FR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 25); (b) FR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 26); (c) FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 27); i (d) FR-H4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 28). U daljim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo uključuje sledeća četiri FR-a varijabilnog domena lakog lanca: (a) FR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 29); (b) FR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 30); (c) FR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 31); i (d) FR-L4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 32). U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24. U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo je 15H6 (takođe se naziva m15H6).
U drugom primeru, anti-HtrA1 antitelo može da sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-a odabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 39); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 40); (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 41); (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 42); (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 43); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 44), ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih HVR-ova i jedne ili više njihovih varijanti koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti) sa bilo kojim od SEQ ID NO: 39-44.
U nekim slučajevima, bilo koje od prethodnih anti-HtrA1 antitela može da sadrži jedan, dva, tri ili četiri od sledećih FR-a varijabilnog domena teškog lanca: (a) FR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 47) ili (SEQ ID NO: 57); (b) FR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 48) ili (SEQ ID NO: 58); (c) FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 49) ili (SEQ ID NO: 59); i (d) FR-H4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 50) ili (SEQ ID NO: 60).
U nekim slučajevima, bilo koje od prethodnih anti-HtrA1 antitela može da sadrži jedan, dva, tri ili četiri od sledećih FR-a varijabilnog domena lakog lanca: (a) FR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 51) ili (SEQ ID NO: 61); (b) FR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 52) ili (SEQ ID NO: 62); (c) FR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 53) ili (SEQ ID NO: 63); i (d) FR-L4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 54) ili (SEQ ID NO: 64).
Na primer, u nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo uključuje sledećih šest HVR-a: (SEQ ID NO: 39); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 40); (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 41); (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 42); (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 43); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 44). U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo uključuje sledeća četiri FR-a varijabilnog domena teškog lanca: (a) FR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 47); (b) FR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 48); (c) FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 49); i (d) FR-H4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 50). U daljim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo uključuje sledeća četiri FR-a varijabilnog domena lakog lanca: (a) FR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 51); (b) FR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 52); (c) FR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 53); i (d) FR-L4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 54). U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46. U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo je h19B12.v1.
U drugom primeru, u nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo uključuje sledećih šest HVR-a: (SEQ ID NO: 39); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 40); (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 41); (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 42); (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 43); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 44). U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo uključuje sledeća četiri FR-a varijabilnog domena teškog lanca: (a) FR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 57); (b) FR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 58); (c) FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 59); i (d) FR-H4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 60). U daljim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo uključuje sledeća četiri FR-a varijabilnog domena lakog lanca: (a) FR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 61); (b) FR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 62); (c) FR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu 63); i (d) FR-L4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 64). U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55 i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 56. U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo je 19B12 (takođe se naziva m19B12).
U drugom primeru, ovde otkriveno anti-HtrA1 antitelo uključuje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova varijabilnih domena lakog i teškog lanca antitela 20E2 (SEQ ID NO: 66, odnosno 65), i pri čemu (i) sekvenca HVR-L1 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 24-34, sekvenca HVR-L2 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 50-56, i sekvenca HVR-L3 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 89-97 SEQ ID NO: 66, i (ii) sekvenca HVR-H1 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 31-35, sekvenca HVR-H2 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 50-65, i sekvenca HVR-H3 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 95-102 SEQ ID NO: 65, ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih HVR-ova i jedne ili više njihovih varijanti koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti) sa bilo kojim od gorenavedenih HVR-a antitela 20E2. U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 90% identičnosti sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, SEQ ID NO: 65; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 90% sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, SEQ ID NO: 66; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b). U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 65 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66.
U drugom primeru, ovde otkriveno anti-HtrA1 antitelo uključuje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova varijabilnih domena lakog i teškog lanca 3A5 antitela (SEQ ID NO: 68, odnosno 67), i pri čemu (i) sekvenca HVR-L1 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 24-34, sekvenca HVR-L2 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 50-56, i sekvenca HVR-L3 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 89-97 SEQ ID NO: 68, i (ii) sekvenca HVR-H1 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 31-35, sekvenca HVR-H2 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 50-65, i sekvenca HVR-H3 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 95-102 SEQ ID NO: 67, ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih HVR-ova i jedne ili više njihovih varijanti koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti) sa bilo kojim od gorenavedenih HVR-a antitela 3A5. U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 90% identičnosti sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, SEQ ID NO: 67; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 90% sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, SEQ ID NO: 68; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b). U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 67 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68.
U drugom primeru, ovde otkriveno anti-HtrA1 antitelo uključuje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova varijabilnih domena lakog i teškog lanca 12A5 antitela (SEQ ID NO: 70, odnosno 69), i pri čemu (i) sekvenca HVR-L1 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 24-34, sekvenca HVR-L2 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 50-56, i sekvenca HVR-L3 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 89-97 SEQ ID NO: 70, i (ii) sekvenca HVR-H1 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 31-35, sekvenca HVR-H2 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 50-65, i sekvenca HVR-H3 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 95-102 SEQ ID NO: 69, ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih HVR-ova i jedne ili više njihovih varijanti koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti) sa bilo kojim od gorenavedenih HVR-a antitela 12A5. U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 90% identičnosti sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, SEQ ID NO: 69; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 90% sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, SEQ ID NO: 70; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b). U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 70.
U nekim slučajevima pronalaska, anti-HtrA1 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 90% identičnosti sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, bilo kojeg od SEQ ID NO: 21, 23, 76, 77, 78, 93-101, 106 ili 107; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 90% sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, bilo kojeg od SEQ ID NO: 22, 24, 72-74, 81-92, 105 ili 108; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b). Na primer, u nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 72. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 95 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 94 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 83. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 100 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 99 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 101 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 86. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 82. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 81. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 98 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 95 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 83. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 83. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 94 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 83. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 94 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 83. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 95 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 94 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 95 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 85. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 95 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 94 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 84. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 106 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 105. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 107 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 105. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 106 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 108. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 107 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 108.
U nekim slučajevima, bilo koje od prethodnih anti-HtrA1 antitela može da sadrži jedan, dva, tri ili četiri od sledećih okvirnih regiona (FR) varijabilnog domena teškog lanca: (a) FR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 12), pri čemu, X1je Lys ili Thr, i X2je Thr, Lys, ili Arg; (b) FR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 13); (c) FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 14); i (d) FRH4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 15). U drugim slučajevima, bilo koje od prethodnih anti-HtrA1 antitela može da sadrži jedan, dva, tri ili četiri od sledećih FR-a varijabilnog domena teškog lanca: (a) FR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 25); (b) FR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 26); (c) FR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 27); i (d) FR-H4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 28).
U nekim slučajevima, bilo koje od prethodnih anti-HtrA1 antitela može da sadrži jedan, dva, tri ili četiri od sledećih FR-a varijabilnog domena lakog lanca: (a) FR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 17); (b) FR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 18); (c) FR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 19); i (d) FR-L4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 20). U drugim slučajevima, bilo koje od prethodnih anti-HtrA1 antitela može da sadrži jedan, dva, tri ili četiri od sledećih FR-a varijabilnog domena lakog lanca: (a) FR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 29); (b) FR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 30); (c) FR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 31); i (d) FR-L4 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 32).
U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 90% identičnosti sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, bilo kojeg od SEQ ID NO: 45, 55, 65, 67 ili 69; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 90% sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, bilo kojeg od SEQ ID NOs: 46, 56, 66, 68 ili 70; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b). Na primer, u nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 56. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 65 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 67 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 69 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 70.
U nekim slučajevima, pronalazak daje izolovano antitelo koje specifično vezuje HtrA1, pri čemu antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21; i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22, kao što je antitelo koje se ovde naziva APEG.LC3.HC3.
U nekim slučajevima, pronalazak daje izolovano antitelo koje specifično vezuje HtrA1, pri čemu antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45; i (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, kao što je antitelo koje se ovde naziva h19B6.v1.
U određenim slučajevima, pronalazak daje anti-HtrA1 antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i bilo koje od prethodnih antitela. U nekim slučajevima, pronalazak pruža anti-HtrA1 antitelo koje se takmiči u vezivanju za HtrA1 sa bilo kojim od prethodnih antitela.
U određenim otelotvorenjima, bilo koje od prethodnih anti-HtrA1 antitela može da ima jedno ili više od sledećih svojstava: (i) vezuje se za HtrA1 u odnosu od 1 varijabilnog domena na jednu podjedinicu HtrA1 trimera (npr. Fab se vezuje za HtrA1 trimer u odnosu od 3 Fab na 1 HtrA1 trimer, i IgG se vezuje za HtrA1 trimer u odnosu od 3 IgG na 2 trimera HtrA1), (ii) za antitela koja sadrže dva varijabilna domena, vezuje se za HtrA1 na način koji dovodi do formiranja „kaveza“ sličnog onom prikazanom na SL. 9 US publikacije patentne prijave US 2013/0129743, (iii) ne sprečava stvaranje trimera HtrA1, (iv) unakrsno reaguje sa mišjim HtrA1; (v) ne reaguje unakrsno sa HtrA2, HtrA3 i/ili HtrA4; (vi) vezuje se za HtrA1 kompetitivno sa anti-HtrA1 antitelom YW505.94.28a (pogledajte, npr. WO 2013/055998), (vii) inhibira stvaranje kompleksa između HtrA1 i al-antitripsina (AIAT). U nekim aspektima, pronalazak daje antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i bilo koje od prethodnih antitela.
U daljem aspektu, anti-HtrA1 antitelo prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može da uključi bilo koju karakteristiku, samu ili u kombinaciji, kao što je opisano u odeljcima 1-8 odeljka C „Svojstva i karakteristike antitela“ u nastavku.
B. Primeri anti-faktor D antitela
Pronalazak obezbeđuje anti-faktor D antitela koja se mogu koristiti sa anti-HtrA1 antitelima prema pronalasku, na primer, u postupcima lečenja poremećaja, uključujući poremećaj povezan sa HtrA1, očni poremećaj i/ili poremećaj povezan sa komplementom (npr. AMD (npr. geografska atrofija)). Pronalazak takođe pruža multispecifična (npr.
bispecifična) antitela koja se specifično vezuju za HtrA1 i faktor D (npr. anti-HtrA1/antifaktor D antitela). Bilo koje pogodno anti-faktor D antitelo može da se koristi u kompozicijama i postupcima prema pronalasku. Kao neograničavajući primer, bilo koje antifaktor D antitelo opisano ovde i/ili u US patentima br.8,067,002; 8,268,310; 8,273,352; i/ili u US patentnoj prijavi br. 14/700,853 može da se koristi u kompozicijama i postupcima iz predmetnog pronalaska.
Na primer, u nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, monoklonskog antitela 166-32 proizvedenog iz hibridoma deponovanog u Američkoj kolekciji tipova kultura (ATCC) i označenog sa HB12476. Na primer, u nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, SEQ ID NO: 136; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr., najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, SEQ ID NO: 137; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b). Na primer, u nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137, kao što je monoklonsko anti-faktor D antitelo 166-32. U nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo je humanizovani derivat monoklonskog antitela 166-32. U nekim otelotvorenjima, anti-faktor D antitelo se vezuje za isti epitop kao i monoklonsko antitelo 166-32. U nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo je fragment antitela izveden iz monoklonskog antitela 166-32. U nekim slučajevima, fragment antitela izveden iz monoklonskog antitela 166-32 je Fab, Fab’-SH, Fv, scFv ili (Fab’)2fragment. U nekim otelotvorenjima, fragment antitela izveden iz monoklonskog antitela 166-32 je Fab.
U nekim slučajevima, humanizovani derivati monoklonskog antitela 166-32 mogu da se koriste u kompozicijama i postupcima prema pronalasku. Na primer, bilo koji humanizovani derivat monoklonskog antitela 166-32 opisan, na primer, u US patentu br.
8,067,002, može da se koristi u kompozicijama i postupcima prema pronalasku. Primeri humanizovanih derivata monoklonskog antitela 166-32 opisani u US patentu br. 8,067,002 uključuju, na primer, humanizovane klonove anti-faktor D antitela br. 111, br. 56, br. 250 i br. 416. Aminokiselinske sekvence VH i VL domena humanizovanih klonova anti-faktor D antitela br. 111, br. 56, br. 250 i br. 416 prikazane su, na primer, na slici 5 US patenta br.
8,067,002. U nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, klona anti-faktor D antitela br. 111, br. 56, br.250 ili br.416.
U nekim slučajevima, modifikovana ili varijantna humanizovana anti-faktor D antitela i njihovi fragmenti mogu se koristiti u kompozicijama i postupcima prema pronalasku. Na primer, bilo koja modifikovana ili varijantna verzija humanizovanog klona anti-faktor D antitela br. 111 opisana, na primer, u US patentu br. 8,273,352, može da se koristi u kompozicijama i postupcima iz pronalaska, na primer, klon antitela 238 ili 238-1. U nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, klona anti-faktor D antitela 238 ili 238-1.
U nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen može da sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-a izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 109); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 110), pri čemu, X1je Asp ili Glu; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 111), pri čemu, X1je Asn ili Ser; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 112), pri čemu, X1je Asp ili Ser, X2je Asp ili Glu, i X3je Asp ili Ser; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 113); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 114), pri čemu, X1je Asp ili Glu, ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih HVR-ova i jedne ili više njihovih varijanti koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti) sa bilo kojim od SEQ ID NO: 109-114. Na primer, u nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži sledećih šest HVR-ova: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 109); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 110), pri čemu, X1je Asp ili Glu; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 111), pri čemu, X1je Asn ili Ser; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 112), pri čemu, X1je Asp ili Ser, X2je Asp ili Glu, i X3je Asp ili Ser; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 113); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 114), pri čemu, X1je Asp ili Glu.
Na primer, u nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen može da sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-a izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 109); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 115); (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 116); (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 117); (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 113); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 118), ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih HVR-ova i jedne ili više njihovih varijanti koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti) sa bilo kojim od SEQ ID NO: 109, 113 ili 115-118. Na primer, u nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži sledećih šest HVR-ova: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 109); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 115); (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 116); (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 117); (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 113); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 118).
U nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 90% identičnosti sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, bilo kojeg od SEQ ID NO: 119, 131 ili 132; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 90% identičnosti sekvence (npr., najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, bilo kojeg od SEQ ID NO: 120, 133, 134, ili 135; ili (c) VH kao pod (a) i VL kao pod (b). Na primer, u nekim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120. U drugim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133. U drugim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134. U drugim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135. U drugim slučajevima, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135. Bilo koje anti-faktor D antitelo prikazano na slici 30, ili njegova varijanta, ili njegov fragment, može da se koristi u kompozicijama i postupcima prema pronalasku. U nekim otelotvorenjima, anti-faktor D antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120. U nekim slučajevima, fragment antifaktor D antitela koji vezuje antigen je lampalizumab koji ima CAS registarski broj 1278466-20-8.
U drugom primeru, u nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo je antitelo 20D12, ili je izvedeno iz njega, na primer, kao što je opisano u US patentu br. 8,268,310. U jednom primeru, anti-faktor D antitelo uključuje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova varijabilnih domena lakog i teškog lanca 20D12 antitela (SEQ ID NO: 128, odnosno 127), i pri čemu (i) sekvenca HVR-L1 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 24-34, sekvenca HVR-L2 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 50-56, i sekvenca HVR-L3 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 89-97 SEQ ID NO: 128, i (ii) sekvenca HVR-H1 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 31-35, sekvenca HVR-H2 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 50-65, i sekvenca HVR-H3 sadrži Kabatove aminokiselinske ostatke 95-102 SEQ ID NO: 127, ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih HVR-ova i jedne ili više njihovih varijanti koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti) sa bilo kojim gorenavedenim HVR-om antitela 20D12.
U nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, SEQ ID NO: 127; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr., najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, SEQ ID NO: 128; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b). Na primer, u nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128, kao što je anti-faktor D antitelo 20D12. U nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129, i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130. U nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo je humanizovani derivat monoklonskog antitela 20D12. U nekim otelotvorenjima, anti-faktor D antitelo se vezuje za isti epitop kao monoklonsko antitelo 20D12 ili njegov humanizovani derivat. U nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo je fragment antitela izveden iz monoklonskog antitela 20D12 ili njegovog humanizovanog derivata. U nekim slučajevima, fragment antitela izveden iz monoklonskog antitela 20D12 ili njegovog humanizovanog derivata je Fab, Fab’-SH, Fv, scFv ili (Fab’)2fragment. U nekim otelotvorenjima, fragment antitela izveden iz monoklonskog antitela 20D12 ili njegovog humanizovanog derivata je Fab.
U nekim slučajevima, fragmenti bilo kog od prethodnih anti-faktor D antitela (npr. fragmenti koji vezuju antigen) mogu se koristiti u kompozicijama i postupcima prema pronalasku. Fragmenti antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti, na primer Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, (scFv)2, dAb, fragmenti hipervarijabilnog regiona (HVR), linearna antitela, molekuli jednolančanih antitela, minitela, dijatela, ili multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. U daljem otelotvorenju, fragment anti-faktor D antitela (npr. fragment koji vezuje antigen) koji je sposoban da prodre suštinski kroz čitavu mrežnjaču može se koristiti u kompozicijama i postupcima prema pronalasku. U još daljem otelotvorenju, fragment anti-faktor D antitela (npr. fragment koji vezuje antigen) koji je sposoban da prodre kroz celu debljinu mrežnjače može se koristiti u kompozicijama i postupcima prema pronalasku.
U nekim slučajevima, pronalazak može da uključuje upotrebu humanizovanih antifaktor D antitela, pri čemu Fab fragment takvih antitela ima vreme poluraspada najmanje 3, 5, 7, 10 ili 12 dana nakon primene u oko sisara (npr. čoveka) putem jedne intravitrealne injekcije. U još jednom otelotvorenju, pronalazak može da uključuje upotrebu humanizovanih anti-faktor D antitela, pri čemu Fab fragment takvih antitela inhibira aktivaciju komplementa alternativnog puta (AP) tokom najmanje 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 ili 115 dana nakon primene u oko sisara (npr. čoveka) jednom intravitrealnom injekcijom. U još jednom otelotvorenju, pronalazak može da uključuje upotrebu humanizovanih anti-faktor D antitela, pri čemu se koncentracija Fab fragmenta takvih antitela koji inhibira aktivaciju komplementa alternativnog puta (AP) održava u tkivu mrežnjače tokom najmanje 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 ili 85 dana nakon primene u oko sisara (npr. čoveka) jednom intravitrealnom injekcijom. U još jednom otelotvorenju, pronalazak može da uključuje upotrebu humanizovanih anti-faktor D antitela, pri čemu se koncentracija Fab fragmenta takvih antitela koji inhibira aktivaciju komplementa alternativnog puta (AP) održava u staklastom telu najmanje tokom 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 ili 115 dana nakon primene u oko sisara (npr. čoveka) jednom intravitrealnom injekcijom. U jednom primeru, pronalazak uključuje upotrebu fragmenta pomenutih anti-faktor D antitela (npr. fragmenti koji vežu antigen).
U nekim slučajevima, bilo koje od prethodnih anti-faktor D antitela vezuje faktor D sa konstantom KD od oko 20 nM ili manjom u svom jednovalentnom obliku (npr. KD antitela kao Fab fragment za faktor D). U nekim slučajevima, ovde dato antitelo vezuje faktor D sa konstantom KD od oko 10 nM ili manjom u svom jednovalentnom obliku. U nekim slučajevima, ovde dato antitelo vezuje faktor D sa konstantom KD od oko 5 nM ili manjom u svom jednovalentnom obliku. U nekim slučajevima, ovde dato antitelo vezuje faktor D sa konstantom KD od oko 2 nM ili manjom u svom jednovalentnom obliku. Na primer, u nekim slučajevima, antitelo vezuje faktor D sa konstantom KD od oko 0,5 pM do oko 2 nM (npr. oko 0,5 pM, oko 1 pM, oko 2 pM, oko 3 pM, oko 4 pM, oko 5 pM, oko 6 pM, oko 7 pM, oko 8 pM, oko 9 pM, oko 10 pM, oko 15 pM, oko 20 pM, oko 25 pM, oko 50 pM, oko 75 pM, oko 100 pM, oko 125 pM, oko 150 pM, oko 175 pM, oko 200 pM, oko 225 pM, oko 250 pM, oko 275 pM, oko 300 pM, oko 325 pM, oko 350 pM, oko 375 pM, oko 400 pM, oko 425 pM, oko 450 pM, oko 475 pM, oko 500 pM, oko 525 pM, oko 550 pM, oko 575 pM, oko 600 pM, oko 625 pM, oko 650 pM, oko 675 pM, oko 700 pM, oko 725 pM, oko 750 pM, oko 775 pM, oko 800 pM, oko 825 pM, oko 850 pM, oko 875 pM, oko 900 pM, oko 925 pM, oko 950 pM, oko 975 pM, oko 1 nM, oko 1,1 nM, oko 1,2 nM, oko 1,3 nM, oko 1,4 nM, oko 1,5 nM, oko 1,6 nM, oko 1,7 nM, oko 1,8 nM, oko 1,9 nM, ili oko 2 nM) u svom jednovalentnom obliku. U nekim slučajevima, antitelo vezuje faktor D sa konstantom KD od oko 0,5 pM do oko 100 pM u svom jednovalentnom obliku. U nekim slučajevima, antitelo vezuje faktor D sa konstantom KD od oko 0,5 pM u svom jednovalentnom obliku. U nekim slučajevima, antitelo vezuje faktor D sa konstantom KD manjom od oko 10 pM u svom jednovalentnom obliku.
U nekim slučajevima, bilo koje od prethodnih anti-faktor D antitela vezuje faktor D sa konstantom KD od oko 10 nM ili manjom u svom dvovalentnom obliku (npr. KD antitela kao IgG za faktor D). U nekim slučajevima, ovde dato antitelo vezuje faktor D sa konstantom KD od oko 5 nM ili manjom u svom dvovalentnom obliku. U nekim slučajevima, ovde dato antitelo vezuje faktor D sa konstantom KD od oko 2 nM ili manjom u svom dvovalentnom obliku. Na primer, u nekim slučajevima, antitelo vezuje faktor D sa konstantom KD od oko 0,5 pM do oko 2 nM (npr. oko 0,5 pM, oko 1 pM, oko 2 pM, oko 3 pM, oko 4 pM, oko 5 pM, oko 6 pM, oko 7 pM, oko 8 pM, oko 9 pM, oko 10 pM, oko 15 pM, oko 20 pM, oko 25 pM, oko 50 pM, oko 75 pM, oko 100 pM, oko 125 pM, oko 150 pM, oko 175 pM, oko 200 pM, oko 225 pM, oko 250 pM, oko 275 pM, oko 300 pM, oko 325 pM, oko 350 pM, oko 375 pM, oko 400 pM, oko 425 pM, oko 450 pM, oko 475 pM, oko 500 pM, oko 525 pM, oko 550 pM, oko 575 pM, oko 600 pM, oko 625 pM, oko 650 pM, oko 675 pM, oko 700 pM, oko 725 pM, oko 750 pM, oko 775 pM, oko 800 pM, oko 825 pM, oko 850 pM, oko 875 pM, oko 900 pM, oko 925 pM, oko 950 pM, oko 975 pM, oko 1 nM, oko 1,1 nM, oko 1,2 nM, oko 1,3 nM, oko 1,4 nM, oko 1,5 nM, oko 1,6 nM, oko 1,7 nM, oko 1,8 nM, oko 1,9 nM, ili oko 2 nM) u svom dvovalentnom obliku. U nekim slučajevima, antitelo vezuje faktor D sa konstantom KD od oko 0,5 pM do oko 100 pM u svom dvovalentnom obliku. U nekim slučajevima, antitelo vezuje faktor D sa konstantom KD od oko 0,5 pM u njegovom dvovalentnom obliku. U nekim slučajevima, antitelo vezuje faktor D sa konstantom KD od oko 10 pM u svom dvovalentnom obliku.
U daljem aspektu, anti-faktor D antitelo prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može da uključi bilo koju karakteristiku, samu ili u kombinaciji, kao što je opisano u odeljcima 1-8 odeljka C „Svojstva i karakteristike antitela“ u nastavku.
C. Svojstva i karakteristike antitela
Ovde opisana antitela (npr. anti-HtrA1 antitela i anti-faktor D antitela, kao što je gore opisano, kao i anti-HtrA1/anti-faktor D antitela opisana u nastavku), kao i bilo koje od antitela za primenu u ovde opisanom postupku, mogu imati bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, opisanih u odeljcima 1-8 ispod.
1. Afinitet antitela
U nekim otelotvorenjima, ovde dato antitelo (npr. anti-HtrA1 antitelo, anti-faktor D antitelo ili biospecifično anti-HtrA1 anti-faktor D antitelo) ima konstantu disocijacije (KD) od ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr., 10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). Na primer, u nekim slučajevima, ovde dato antitelo vezuje humani HtrA1 (huHtrA1) sa konstantom KD od oko 10 nM ili manjom. U nekim slučajevima, ovde dato antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 5 nM ili manjom. U nekim slučajevima, ovde dato antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 2 nM ili manjom. Na primer, u nekim slučajevima, antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 25 pM do oko 2 nM (npr. oko 25 pM, oko 50 pM, oko 75 pM, oko 100 pM, oko 125 pM, oko 150 pM, oko 175 pM, oko 200 pM, oko 225 pM, oko 250 pM, oko 275 pM, oko 300 pM, oko 325 pM, oko 350 pM, oko 375 pM, oko 400 pM, oko 425 pM, oko 450 pM, oko 475 pM, oko 500 pM, oko 525 pM, oko 550 pM, oko 575 pM, oko 600 pM, oko 625 pM, oko 650 pM, oko 675 pM, oko 700 pM, oko 725 pM, oko 750 pM, oko 775 pM, oko 800 pM, oko 825 pM, oko 850 pM, oko 875 pM, oko 900 pM, oko 925 pM, oko 950 pM, oko 975 pM, oko 1 nM, oko 1,1 nM, oko 1,2 nM, oko 1,3 nM, oko 1,4 nM oko 1,5 nM, oko 1,6 nM, oko 1,7 nM, oko 1,8 nM, oko 1,9 nM, ili oko 2 nM). U nekim slučajevima, antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 75 pM do oko 600 pM (npr. oko 75 pM, oko 100 pM, oko 125 pM, oko 150 pM, oko 175 pM, oko 200 pM, oko 225 pM, oko 250 pM, oko 275 pM, oko 300 pM, oko 325 pM, oko 350 pM, oko 375 pM, oko 400 pM, oko 425 pM, oko 450 pM, oko 475 pM, oko 500 pM, oko 525 pM, oko 550 pM, oko 575 pM, oko 600 pM). U nekim slučajevima, antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 75 pM do oko 500 pM. U nekim slučajevima, antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 75 pM do oko 400 pM. U nekim slučajevima, antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 75 pM do oko 300 pM. U nekim slučajevima, antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 75 pM do oko 200 pM. U nekim slučajevima, antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 75 pM do oko 150 pM. U nekim slučajevima, antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 75 pM do oko 125 pM. U nekim slučajevima, antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 75 pM do oko 100 pM. U nekim slučajevima, antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 80 pM. U nekim slučajevima, antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 60 pM. U nekim slučajevima, antitelo vezuje huHtrA1 sa konstantom KD od oko 40 pM.
U jednom otelotvorenju, KD se meri testom vezivanja radioaktivno označenog antigena (RIA). U jednom otelotvorenju, RIA se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovog antigena. Na primer, afinitet vezivanja Fab u rastvoru za antigen meri se uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog sa (<125>I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče prevučene anti-Fab antitelom (videti npr., Chen et al. J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). Da bi se utvrdili uslovi za test, MICROTITER® ploče sa više bunarčića (Thermo Scientific) preko noći su prevučene sa 5 μg/ml anti-Fab antitela koje služi za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9,6) i nakon toga su blokirane 2% (m/V) albuminom goveđeg seruma u PBS-u tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko 23 °C). Na neadsorbujućoj ploči (Nunc br. 269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena je pomešano sa serijskim razblaženjima željenog Fab (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12 u radu Presta et al., Cancer Res.57:4593-4599 (1997)). Željeni Fab je zatim inkubiran tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr. oko 65 sati) kako bi se obezbedilo uspostavljanje ravnoteže. Nakon toga, smeše su prenete na ploču za hvatanje i inkubirane su na sobnoj temperaturi (npr. tokom jednog sata). Rastvor je zatim uklonjen, i ploča je isprana osam puta 0,1% polisorbatom 20 (TWEEN-20®) u PBS-u. Kada se ploče osuše, dodato je 150 μl scintilansa po bunarčiću (MICROSCINT-20™; Packard), a zatim su ploče merene na TOPCOUNT™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja odabrane su za primenu u testovima kompetitivnog vezivanja.
Prema drugom otelotvorenju, KD se meri pomoću testa površinske plazmonske rezonance (SPR) BIACORE®. Na primer, analiza pomoću uređaja BIACORE®-2000 ili BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) obavljena je na 25 °C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom uz ~10 jedinica odgovora (response units, RU). U jednom otelotvorenju, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIAcore, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen se razblažuje pomoću 10 mM natrijum acetata, pH 4,8, do 5 μg/ml (~0,2 μM) pre injektovanja pri protoku od 5 μl/min da bi se dobilo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja antigena, injektuje se 1 M etanolamin da bi se blokirale neproreagovale grupe. Za merenja kinetike, injektovane su dvostruke serije razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) u PBS-u sa surfaktantom 0,05% polisorbatom 20 (TWEEN®-20) (PBST) na 25 °C pri protoku od oko 25 μl/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE® Evaluation Software verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon. Pogledajte, na primer, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>prema gore opisanom testu plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja, koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25 °C kod 20 nM antiantigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja toka (Aviv Instruments) ili serija 8000 SLM-AMINCO™ spektrofotometra (ThermoSpectronic) sa kivetom sa mešanjem. KD se takođe može meriti korišćenjem BIACORE® SPR testa, kako je opisano u primerima dole.
2. Stabilnost antitela
Pronalazak obezbeđuje antitela sa povećanom stabilnošću, na primer, u poređenju sa referentnim anti-HtrA1 antitelom. Stabilnost antitela može da se odredi bilo kojim postupkom poznatim u struci, na primer, spektroskopijom (npr. masena spektroskopija), diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom (DSF), cirkularnim dihroizmom (CD), svojstvenom fluorescencijom proteina, diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom, rasipanjem svetlosti (npr. dinamičkim rasipanjem svetlosti (DLS) i statičkim rasipanjem svetlosti (SLS), hromatografijom samo-interakcije (SIC). Anti-HtrA1 antitelo može da ima, na primer, povišenu temperaturu topljenja (Tm), temperaturu agregacije (Tagg), ili druge mere stabilnosti u poređenju sa referentnim anti-HtrA1 antitelom.
Pronalazak obezbeđuje antitela sa smanjenom deamidacijom u poređenju sa referentnim anti-HtrA1 antitelom. Deamidacija može da se smanji ili spreči kako je ovde opisano i/ili korišćenjem postupaka poznatih u struci. Pronalazak takođe obezbeđuje antitela sa smanjenom oksidacijom (npr. oksidacija triptofana, na primer na položaju LC-W91), na primer, u poređenju sa referentnim anti-HtrA1 antitelom. Oksidacija (npr. oksidacija triptofana) može da se smanji ili spreči kako je ovde opisano i/ili upotrebom postupaka poznatih u tehnici. Pronalazak takođe obezbeđuje antitela sa smanjenom izomerizacijom, na primer, u poređenju sa referentnim anti-HtrA1 antitelom. Izomerizacija može da se smanji ili spreči kako je ovde opisano i/ili korišćenjem postupaka poznatih u struci.
3. Fragmenti antitela
U određenim otelotvorenjima, antitelo koje je ovde dato je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, bez ograničenja, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv i scFv fragmente, kao i druge fragmente opisane u nastavku. Za pregled određenih fragmenata antitela, videti Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite, npr. u Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), str. 269-315 (1994); takođe pogledajte WO 93/16185; i US patent br. 5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab’)2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorskih vezujućih epitopa i koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br.5,869,046.
Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Pogledajte, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003).
Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U pojedinim otelotvorenjima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; pogledajte, npr. U.S. Patent br.
6,248,516 B1).
Fragmenti antitela se mogu dobiti različitim tehnikama, uključujući, bez ograničenja, proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
U nekim slučajevima, ovde dato antitelo (npr. anti-HtrA1 antitelo) je Fab. U nekim otelotvorenjima, Fab sadrži skraćenje u regionu pregiba (npr. gornjeg pregiba) konstantnog regiona teškog lanca. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca Fab završava se na položaju 221 (EU numeracija). U nekim otelotvorenjima, aminokiselinski ostatak na položaju 221 je ostatak asparaginske kiseline (D221). U nekim aspektima pronalaska, konstantni region teškog lanca Fab sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 156. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 160. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 159. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 160 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 159. U nekim otelotvorenjima, Fab je Fab IgG1.
U nekim slučajevima, Fab se vezuje za HtrA1 i može da sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-a izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 7); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 8); (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
D NO: 3); (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
O: 9); (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 10); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 11), ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih HVR-ova i jedne ili više njihovih varijanti koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti) sa bilo kojim od SEQ ID NO: 3 ili 7-11. U nekim slučajevima, takav Fab može da uključuje skraćivanje u regionu pregiba (npr. gornji pregib) konstantnog regiona teškog lanca. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca Fab završava se na položaju 221 (EU numeracija). U nekim otelotvorenjima, aminokiselinski ostatak na položaju 221 je Asp (D221). U nekim aspektima pronalaska, konstantni region teškog lanca Fab sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 156. U nekim slučajevima, Fab uključuje sledećih šest HVR-a: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 7); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 8); (c) HVR-H3 koji
aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 11), i dalje uključuje konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 156.
U nekim slučajevima, Fab se vezuje za HtrA1 i sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 21; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr., najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 22; i (c) skraćivanje u regionu pregiba (npr. gornjeg pregiba) konstantnog regiona teškog lanca. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca Fab završava se na položaju 221 (EU numeracija). U nekim otelotvorenjima, aminokiselinski ostatak na položaju 221 je Asp (D221). U nekim aspektima pronalaska, konstantni region teškog lanca Fab sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 156. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 160. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 159. U nekim otelotvorenjima, antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 160 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 159.
U nekim slučajevima, Fab se vezuje za HtrA1 i sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22; i (c) konstantni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 156.
4. Himerna i humanizovana antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela su opisana, na primer u US patentu br.4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži nehumani varijabilni region (npr. varijabilni domen dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili nehumanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni domen. U drugom primeru, himerno antitelo je antitelo „sa zamenjenom klasom“, kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela obuhvataju njihove antigen-vezujuće fragmente.
U određenim otelotvorenjima, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Najčešće, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog nehumanog antitela. Po pravilu, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, na primer CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od nehumanog antitela, a FR-ovi (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim otelotvorenjima, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima nehumanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.
Pregled humanizovanih antitela i metoda za njihovo dobijanje daje se, na primer, u Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), a dodatno su opisani, na primer, u Riechmann et al. Nature 332:323-329 (1988); Queen et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US patentima br. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (gde se opisuje graftovanje regiona koji određuje specifičnost (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (gde se opisuje „preuređivanje površine“); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (gde se opisuje „mešanje FR“); i Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (gde se opisuje pristup „vođene selekcije“ kod mešanja FR).
Humani regioni okvira koji mogu da se koriste za humanizaciju uključuju, ali se ne ograničavaju na: regione okvira izabrane postupkom „najboljeg slaganja“ (pogledajte, npr. Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); okvirne regione dobijene od sekvence konsenzusa humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti npr. Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta et al. J. Immunol.151:2623 (1993)); humane zrele (somatski mutirane) okvirne regione ili okvirne regione humane germinativne linije (pogledajte, npr. Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i okvirne regione dobijene pregledanjem FR biblioteka (videti npr. Baca et al., J. Biol. Chem.272:10678-10684 (1997) i Rosok et al., J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)).
5. Humana antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je humano antitelo. Humana antitela se mogu dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su opisana u van Dijk et al. Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) i u Lonberg, Curr. Opin. Immunol.
20:450-459 (2008).
Humana antitela se mogu dobiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili su nasumično integrisani u životinjske hromozome. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su po pravilu inaktivirani. Pogledajte pregled metoda za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Takođe pogledajte, na primer, US patente br. 6,075, 181 i 6, 150, 584 koji opisuju tehnologiju XENOMOUSE™; US patent br. 5,770,429 koji opisuje tehnologiju HUMAB®; US patent br. 7,041,870 koji opisuje tehnologiju K-M MOUSE®, i US publikaciju patentne prijave br. US 2007/0061900, koja opisuje tehnologiju VELOCIMOUSE®). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koje stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, na primer kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.
Humana antitela se mogu takođe dobiti postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Pogledajte, npr. Kozbor J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner et al. J. Immunol., 147: 86 (1991).) Humana antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma humanih B-ćelija takođe su opisana u Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br.7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (opisuje humano-humane hibridome). Tehnologiju humanih hibridoma (tehnologija trioma) takođe su opisali Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
Humana antitela takođe mogu da se proizvedu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.
6. Antitela dobijena iz biblioteka
Antitela iz predmetnog pronalaska mogu da se izoluju pretraživanjem kombinatornih biblioteka u potrazi za antitelima sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u struci je poznat veliki broj metoda za stvaranje biblioteka prikaza faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Pregled takvih metoda daju npr. Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., eds., Human Press, Totowa, NJ, 2001) a opisane su i npr. u McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992); Marks i Bradbury, u Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.
340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i u Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
Kod pojedinih metoda displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR) i nasumično rekombinovani u bibliotekama faga, koje zatim mogu da se pretražuju prema antigen-vezujućem fagu, kao što opisuju Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao jednolančanih Fv (scFv) fragmenata ili kao Fab fragmenata. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela su, na primer, sledeće: US Patent br.
5,750,373, i US Patent Publication br. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.
Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
7. Multispecifična antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je multispecifično antitelo, na primer, bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. U određenim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa HtrA1. U određenim otelotvorenjima, jedna od specifičnosti vezivanja je za HtrA1, a druga je za bilo koji drugi antigen (npr. drugi biološki antigen, npr. faktor D). Shodno tome, bispecifično antitelo može da ima specifičnost vezivanja za HtrA1 i faktor D. Bispecifična antitela mogu da se pripreme kao antitela pune dužine ili kao fragmenti antitela. Bilo koje od ovde opisanih anti-HtrA1 antitela može da se koristi za stvaranje multispecifičnog antitela (npr. bispecifičnog antitela), na primer, anti-HtrA1/anti-faktor D bispecifičnog antitela. Bilo koje od anti-faktor D antitela ovde opisanih i/ili poznatih u struci može da se koristi za stvaranje takvog anti-HtrA1/anti-Faktor D bispecifičnog antitela.
Na primer, u nekim slučajevima, bispecifično anti-HtrA1 antitelo koje sadrži prvi vezujući domen koji specifično vezuje HtrA1, i sastoji se od najmanje jednog, dva, tri, četiri, pet ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) odabranih od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 1), pri čemu, X1je Met ili Leu; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 2), pri čemu, X1je Glu ili Asp; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 4), pri čemu, X3je Glu ili Asn; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 5), pri čemu, X4je Asn, His ili Glu; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 6), pri čemu, X5je Ser ili Tyr, i X6Ala ili Asn, ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih HVR-ova i jedne ili više njihovih varijanti koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti) sa bilo kojim od SEQ ID NO: 1-6, može imati drugi vezujući domen koji se vezuje za faktor D. Drugi vezujući domen koji se specifično vezuje za faktor D može, na primer, da sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-a odabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 109); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 110), pri čemu, X1je Asp ili Glu; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 111), pri čemu, X1je Asn ili Ser; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 112), pri čemu, X1je Asp ili Ser, X2je Asp ili Glu, i X3je Asp ili Ser; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 113); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 114), pri čemu, X1je Asp ili Glu, ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih HVR-ova i jedne ili više njihovih varijanti koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identiteta) sa bilo kojim SEQ ID NO: 109-114.
Na primer, u nekim slučajevima, bispecifično anti-HtrA1 antitelo koje sadrži prvi vezujući domen koji specifično vezuje HtrA1, i sastoji se od najmanje jednog, dva, tri, četiri, pet ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) odabranih od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 7); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 8); (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 9); (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 10); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 11), ili kombinaciju jednog ili više gore navedenih HVR-ova i jedne ili više njihovih varijanti koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti) sa bilo kojim od SEQ ID NO: 3 ili 7-11, može imati drugi vezujući domen koji se vezuje za faktor D. Drugi vezujući domen koji se specifično vezuje za faktor D može, na primer, da sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-a odabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 109); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 115); (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 116); (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 117); (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 113); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 118), ili kombinaciju jednog ili više gore navedenih HVR-ova i jedne ili više njihovih varijanti koji imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr.
81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti) sa bilo kojim SEQ ID NO: 109, 113 ili 115-118.
U određenim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje bispecifično anti-HtrA1 antitelo koje specifično vezuje i HtrA1 i faktor D, pri čemu antitelo sadrži prvi vezujući domen koji se specifično vezuje za HtrA1 i sadrži sledećih šest HVR-a: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 7); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 8); (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 3), (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 9); (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 10); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 11); i drugi vezujući domen koji specifično vezuje faktor D koji sadrži sledećih šest HVR-a: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 109); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 115); (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 116); (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 117); (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 113); i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 118). U nekim slučajevima, drugi vezujući domen sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-a anti-faktor D fragmenta antitela koji vezuje antigen lampalizumaba.
U nekim slučajevima, bispecifično anti-HtrA1 antitelo sadrži prvi vezujući domen koji se specifično vezuje za HtrA1 koji sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, SEQ ID NO: 21; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr., najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, SEQ ID NO: 22; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b), kao što je APEG.LC3.HC3, može da ima drugi domen vezivanja koji se vezuje za faktor D. Drugi domen vezivanja koji se specifično vezuje za Faktor D može, na primer, da sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence)sa sekvencom, ili sekvencu SEQ ID NO: 119; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr., najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu, SEQ ID NO: 120; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b). U nekim slučajevima, drugi vezujući domen koji se specifično vezuje za faktor D može da sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence) sa sekvencom, ili sekvencu anti-faktor D fragmenta antigen vezujućeg antitela lampalizumaba; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence (npr. najmanje 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence)sa sekvencom, ili sekvencu anti-faktor D fragmenta antigen vezujućeg antitela lampalizumaba; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b).
Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac koji imaju različite specifičnosti (pogledajte Milstein i Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J.10: 3655 (1991)) i inženjering „dugme u rupici“ (pogledajte npr. US patent br. 5,731,168). Multispecifična antitela mogu takođe da se dobiju dizajniranjem efekata elektrostatičkog upravljanja za dobijanje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); ukrštanja dva ili više antitela ili fragmenata (pogledajte, npr. US Patent br.4,676,980, i Brennan et al. Science, 229: 81 (1985)); pomoću leucinskih zatvarača, kako bi se proizvela bispecifična antitela (pogledajte npr. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); primenom tehnologije „dijatela“ za dobijanje bispecifičnih fragmenata antitela (pogledajte npr. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera (pogledajte, npr. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i proizvodnjom trispecifičnih antitela kako opisuju, na primer Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991).
Ovde su takođe obuhvaćena konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući „antitela hobotnice“ (pogledajte npr. US 2006/0025576A1).
Ovde antitelo ili fragment takođe uključuje „dvojno delujuće FAb“ ili „DAF“, koje sadrži mesto vezivanja antigena koje se vezuje za HtrA1, kao i za drugi, različit antigen (pogledajte, npr US 2008/0069820).
8. Varijante antitela
U određenim otelotvorenjima, ovde se razmatraju varijante sekvence aminokiselina (npr. varijante antitela, uključujući jednu ili više promena ostataka aminokiselina) ovde navedenih antitela. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanje, i/ili umetanje, i/ili supstituciju ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Bilo koja kombinacija uklanjanja, umetanja i supstitucije može se napraviti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, na primer, antigen vezujuće karakteristike.
a) Varijante supstitucije, ubacivanja i uklanjanja
U pojedinim otelotvorenjima, date su varijante antitela koja imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i FR-ove. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije“. Konkretnije izmene su date u Tabeli 1 pod naslovom „primeri supstitucija“ i, kako je opisano u nastavku, prema klasama bočnih nizova aminokiselina. Aminokiselinske supstitucije mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvode ispitane na željenu aktivnost, na primer, zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.
Tabela 1
Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog lanca: (1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) bazne: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.
Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona i/ili ostataka FR-a matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Po pravilu, nastale varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, povećana stabilnost, povećana ekspresija, promenjen pi i/ili smanjena imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, na primer, korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan HVR ostatak ili više HVR ostataka je mutirano, a varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).
Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR-ima, na primer, radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu biti napravljene na „žarišnim tačkama“ HVR-a, tj. na ostacima koji su kodirani kodonima koji učestalo trpe mutaciju tokom procesa somatskog sazrevanja (videti npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), i/ili ostacima koji su u kontaktu sa antigenom, pri čemu se nastala varijanta VH ili VL ispituje na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka opisano je, na primer, u Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al. eds., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). U nekim otelotvorenjima afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo koje od raznovrsnih metoda (npr. PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr. 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom skenirajuće mutageneze sa alaninom ili modelovanja. Posebno su često ciljani HVR-H3 i HVR-L3.
U pojedinim otelotvorenjima, supstitucije, umetanja ili izbacivanja se mogu desiti u jednom ili više HVR regiona, dokle god takve izmene u značajnoj meri ne umanjuju sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, u HVR regionima se mogu načiniti konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje znatno ne umanjuju afinitet vezivanja. Takve izmene mogu, na primer, biti izvan ostataka koji ostvaruju kontakt sa antigenom u HVR-ima. U pojedinim otelotvorenjima varijantnih sekvenci VH i VL datih iznad, svaki HVR je ili neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.
U pojedinim otelotvorenjima, supstitucije, umetanja ili izbacivanja se mogu desiti u jednom ili više FR-ova, dokle god takve izmene u značajnoj meri ne umanjuju sposobnost antitela da vezuje antigen. Takve promene mogu, na primer, da poboljšaju afinitet antitela i/ili stabilnost (npr. procenjeno povećanom temperaturom topljenja).
Primeri ostataka okvirnog regiona ili ostataka HVR regiona za modifikovanje uključuju moguća mesta deamidacije (tj. asparagin (N ili Asn), mesta oksidacije (tj. metionin (M ili Met) ili triptofan (W ili Trp) ili mesta konverzije piroglutamata (tj. glutamin (Q ili Gln), pri čemu modifikacija na takvim mestima sprečava ili smanjuje deamidaciju i/ili oksidaciju i/ili konverziju piroglutamata.
Da bi se sprečilo ili smanjilo stvaranje deamidiranih varijanti, asparagin (N ili Asn) može da bude mutiran u alanin (A ili Ala), glutamin (Q ili Gln) ili serin (S ili Ser). Da bi se sprečilo ili smanjilo stvaranje oksidovanih varijanti, metionin (Met) ili triptofan (W ili Trp) mogu biti mutirani u leucin (L) ili izoleucin (I). Da bi se sprečilo ili smanjilo stvaranje varijanti piroglutamata, glutamin (Q ili Gln) može biti mutiran u glutamat (E ili Glu). Pogledajte, npr. Amphlett et al., Pharm. Biotechnol., 9:1-140, 1996. Alternativno, ili pored toga, jedna ili više promena (npr. supstitucije) ostataka okvirnog regiona mogu biti u Fc regionu u matičnom antitelu.
Koristan postupak za identifikovanje ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu se zove „ciljana mutageneza sa alaninom“, opisana u Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U tom postupku, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao Arg, Asp, His, Lys i Glu) se identifikuju i zamene neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen–antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu pregledati da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.
Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci obuhvataju spajanje amino- i/ili karboksiterminalnog kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže sto ili više ostataka, kao i ubacivanje u sekvencu jednog aminokiselinskog ostatka, ili većeg broja. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante molekula antitela sa umetanjem obuhvataju spajanje sa N-terminalnim ili C-terminalnim krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom, što povećava poluživot antitela u serumu.
b) Varijante glikozilacije
U određenim otelotvorenjima, antitelo koje je ovde dato je izmenjeno da bi se povećao ili smanjio stepen do kog je antitelo glikozilovano. Dodavanje ili uklanjanje mesta glikozilacije na antitelu može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da se jedno ili više mesta glikozilacije dodaju ili uklone.
Kada antitelo sadrži Fc region, može biti izmenjen ugljovodonik vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je tipično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Pogledajte, npr., Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da obuhvata različite ugljene hidrate, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc na „bazi” biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim otelotvorenjima, modifikacije oligosaharida u antitelu iz predmetnog pronalaska mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
U jednom otelotvorenju, date su varijante antitela koja imaju ugljovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u tom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 (npr. kompleksne, hibridne ili strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je određeno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO 2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline ushodno ili nishodno od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Pogledajte, na primer US Patentnu publikaciju br. US 2003/0157108; US 2004/0093621. Primeri publikacija vezanih za „defukozilovane“ varijante antitela ili varijante „sa manjkom fukoze“ su sledeći: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol.336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija koje mogu da proizvedu defukozilovana antitela uključuju Lec13 CHO ćelije sa manjkom fukozilacije proteina (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl br. US 2003/0157108 A1, Presta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams et al. posebno u primeru 11), i nokaut ćelijske linije, poput gena alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelija (pogledajte npr. Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).
Varijante antitela su dalje obezbeđene sa prepolovljenim oligosaharidima, npr. kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektovan pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878; US patentu br.
6,602,684 i US 2005/0123546 (Umana et al.). Takođe se obezbeđuju i varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, na primer u WO 1997/30087, WO 1998/58964 i WO 1999/22764.
c) Varijante Fc regiona
U određenim otelotvorenjima, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region antitela iz ovog dokumenta, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. humani Fc region IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži ostatke modifikacije aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više mesta aminokiselina.
U pojedinim otelotvorenjima, pronalazak razmatra varijantu antitela koje ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što ga čini pogodnim kandidatom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, ali su pojedine efektorske funkcije (kao što je komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti se mogu sprovesti radi potvrde smanjenja/sniženja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelo nema FcγR vezivanje (stoga verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje kod ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirana u Tabeli 3 na strani 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991).
Neograničavajući primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula su opisani u US patentu br.5,500,362 (pogledajte, npr. Hellstrom et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) i Hellstrom et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); U.S. Pat. No. 5,821,337; i Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu da se koriste neradioaktivni testovi (pogledajte, na primer, ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CYTOTOX 96® neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). U korisne efektorske ćelije za takve testove spadaju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, na primer, na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Testovi vezivanja C1q mogu takođe da se izvedu kako bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q i da, stoga, nema CDC aktivnost. Pogledajte, na primer, ELISA test vezivanja C1q i C3c u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se odredila aktivacija komplementa, može da se obavi CDC test (pogledajte, npr. Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003); i Cragg et al., Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (pogledajte, npr. Petkova et al., Int’l. Immunol.
18(12):1759-1769 (2006)).
Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br.
6,737,056). Takvi Fc mutanti obuhvataju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA” Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581).
Opisane su pojedine varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (Pogledajte, npr. US patent br. 6,737,056; WO 2004/056312 i Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)).
U pojedinim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).
U pojedinim otelotvorenjima, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. poboljšano ili smanjeno) C1q vezivanje i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što opisuje US patent br.6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie et al., J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).
Antitela sa povećanim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG-ova majke na fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) i Kim et al. J. Immunol. 24:249 (1994)), opisana su u US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US Patent br. 7,371,826). Pogledajte takođe Duncan i Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. Patent br. 5,648,260; U.S. Patent br. 5,624,821; i WO 94/29351 koji se tiču drugih primera za varijante Fc regiona.
d) Varijante antitela konstruisane sa cisteinom
U pojedinim otelotvorenjima, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr. „tioMAb“, kod kojih je jedan ili više ostataka antitela zamenjen ostacima cisteina. U određenim otelotvorenjima, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na antitelu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili funkcionalni ostaci linker-lek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je opisano ovde. U pojedinim otelotvorenjima, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) teškog lanca Fc regiona. Antitela konstruisana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, npr. u U.S. Patentu br.7,521,541.
e) Derivati antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo može se dalje modifikovati da sadrži dodatne neproteinske funkcionalne ostatke koji su poznati u struci i dostupni su. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, bez ograničenja, polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri za polimere rastvorljive u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimere propropilen glikola, kopolimere prolipropilen oksid/etilen oksid, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, i može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. U suštini, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, bez ograničenja, naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati, i da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, i slično.
Konjugati antitelo-polimer mogu da se naprave bilo kojom pogodnom tehnikom za derivatizaciju antitela polimerima. Podrazumeva se da pronalazak nije ograničen na konjugate koji koriste bilo koju određenu vrstu veze između antitela ili fragmenta antitela i polimera.
U jednom aspektu, konjugati iz pronalaska uključuju vrste u kojima je polimer kovalentno vezan za određeno mesto ili određena mesta na matičnom antitelu, tj. vezivanje polimera ciljano je na određeni region ili određeni aminokiselinski ostatak ili ostatke u matičnom antitelu ili fragmentu antitela. Konjugacija polimera specifična za određenu lokaciju se najčešće postiže vezivanjem za ostatke cisteina u matičnom antitelu ili fragmentu antitela. U takvim otelotvorenjima, hemija za spajanje može, na primer, da koristi slobodnu sulfhidrilnu grupu ostatka cisteina koja nije u disulfidnom mostu u matičnom antitelu. Polimer se može aktivirati sa bilo kojom funkcionalnom grupom koja je sposobna da specifično reaguje sa slobodnom sulfhidrilnom ili tiolnom grupom (grupama) na matičnim antitelima, kao što su maleimid, sulfhidril, tiol, triflat, tesilat, aziridin, eksiran i 5-piridil funkcionalne grupe. Polimer se može povezati sa matičnim antitelom koristeći bilo koji protokol pogodan za hemiju izabranog sistema za spajanje, kao što su protokoli i sistemi opisani u US patentima br. 4,179,337 i 7,122,636; i Jevsevar et al., Biotech. J. 5:113-128, 2010.
U jednom otelotvorenju, jedan ili više ostataka cisteina koji su prirodno prisutni u matičnim antitelima koristi se kao mesto za vezivanje za konjugaciju polimera. U još jednom otelotvorenju, jedan ili više ostataka cisteina se postavlja u izabrano mesto ili mesta u matičnom antitelu u svrhu obezbeđivanja određenog mesta ili određenih mesta vezivanja za polimer.
U jednom aspektu, otkriće obuhvata konjugate fragmenta antitela i polimera, pri čemu je fragment antitela Fab, i polimer je vezan za jedan ili više ostataka cisteina u lakom ili teškom lancu Fab fragmenta koji bi obično činili međulanac disulfidne veze koja povezuje laki i teški lanac.
U drugom aspektu, pronalazak obuhvata konjugate fragmenta antitela i polimera, pri čemu je fragment antitela Fab’, i polimerno vezivanje je ciljano na region pregiba fragmenta Fab’. U jednom otelotvorenju, jedan ili više cisteinskih ostataka koji su prirodno prisutni u regionu pregiba fragmenta antitela koriste se za vezivanje polimera. U još jednom otelotvorenju, jedan ili više cisteinskih ostataka se postavlja(ju) u regionu pregiba fragmenta Fab’ u svrhu obezbeđivanja određenog mesta ili određenih mesta vezivanja za polimer. U jednom otelotvorenju, Fab fragment pronalaska (npr. anti-HtrA1 Fab fragment, anti-faktor D Fab fragment ili anti-HtrA1/anti-faktor D Fab fragment) se modifikuje dodavanjem jednog cisteina na kraj C’- priključka u svrhu obezbeđenja jednog mesta vezivanja za konjugaciju polimera. U još jednom otelotvorenju, Fab fragment iz pronalaska se modifikuje dodavanjem četiri dodatna ostatka, Cys-Pro-Pro-Cys (SEQ ID NO: 122), na C’-terminalnom kraju u svrhu obezbeđenja dva mesta vezivanja za konjugaciju polimera.
Jedna od najčešće korišćenih konjugacija antitela je PEGilacija, pri čemu su jedan ili više polimera polietilen glikola (PEG) kovalentno vezani za konstantni region antitela. Pogledajte US pat. br. 4,179,337 i 7,122,636. PEG polimeri različitih veličina (npr. od oko 500 D do oko 300.000 D) i oblika (npr. ravni ili razgranati) poznati su i mnogo se koriste u oblasti. Polimeri korisni za predmetni pronalazak mogu se dobiti komercijalno (npr. od kompanije Nippon Oil and Fats; Nektar Therapeutics; Creative PEGWorks) ili pripremiti od komercijalno dostupnih polaznih supstanci primenom konvencionalnih hemijskih postupaka. PEGilacija menja fizička i hemijska svojstva leka antitela, i može dovesti do poboljšanog farmakokinetičkog ponašanja, kao što je poboljšana stabilnost, smanjena imunogenost, produženi vek u krvotoku, kao i produženo vreme zadržavanja. U još jednom otelotvorenju, bilo koje ovde opisano antitelo (npr. anti-HtrA1 antitelo prema pronalasku) može biti konjugovano sa hijaluronskom kiselinom (HA).
U drugom otelotvorenju, dati su konjugati antitela i neproteinskog ostatka koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U jednom otelotvorenju, neproteinski ostatak je ugljenična nanocevčica (Karn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Radijacija može biti bilo koje talasne dužine i uključuje, bez ograničenja, talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski funkcionalni ostatak na temperaturu na kojoj stradaju ćelije u blizini neproteinskog funkcionalnog ostatka antitela.
f) Varijante izoelektrične tačke
Pronalazak pruža varijante antitela sa izmenjenom izoelektričnom tačkom. Na primer, pronalazak pruža varijante antitela sa smanjenom izoelektričnom tačkom (pl), na primer, u poređenju sa referentnim anti-HtrA1 antitelom. U nekim slučajevima, površinsko naelektrisanje je smanjeno pri fiziološkom pH. U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo ima pl jednak ili manji od oko 8 (npr. oko 8, oko 7, oko 6, oko 5 ili oko 4). U nekim slučajevima, antitelo ima pl od oko 4 do oko 8 (npr. oko 4, oko 5, oko 6, oko 7 ili oko 8). U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo ima pl od oko 5 do oko 7 (npr. oko 5, oko 6 ili oko 7). U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo ima pl od oko 5 do oko 6 (npr. oko 5,1, oko 5,2, oko 5,3, oko 5,4, oko 5,5, oko 5,6, oko 5,7, oko 5,8, oko 5,9 ili oko 6).
Antitela iz ovog pronalaska mogu da se projektuju tako da imaju smanjen pi, na primer, zamenom aminokiselinskih ostataka divljg tipa na datom položaju aminokiselinom koja ima niži pI. pl aminokiseline može da se odredi na osnovu pKa vrednosti amina (-NH2), karboksilne kiseline (-COOH) i bočnog lanca aminokiseline, koje su poznate u struci. U nekim otelotvorenjima, površinski izloženi aminokiselinski ostaci mogu biti supstituisani da se smanji pl antitela. U jednom otelotvorenju, površinski izloženi aminokiselinski ostaci mogu biti supstituisani glutamatom (E). U jednom otelotvorenju, površinski izloženi aminokiselinski ostaci mogu biti supstituisani aspartatom (D).
D. Rekombinantni postupci i kompozicije
Bilo koje od ovde opisanih antitela (npr. anti-HtrA1 antitela) može se proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i kompozicija, na primer, kao što je opisano u US patentu br. 4,816,567. U jednom otelotvorenju, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-HtrA1 antitelo iz ovog dokumenta. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr. laki i/ili teški lanac antitela). U sledećem otelotvorenju, obezbeđen je jedan ili više vektora (npr., ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U sledećem otelotvorenju, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom otelotvorenju, ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je eukariotska, na primer. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za proizvodnju anti-HtrA1 antitela, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kako je dato gore, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i, eventualno, rekuperovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).
Za rekombinantnu proizvodnju anti-HtrA1 antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, na primer, kako je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćinu. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se selektivno vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).
Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakteriji, pogledajte, na primer US patente br. 5,648,237, 5,789,199, i 5,840,523. Takođe pogledajte Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), str. 245-254, gde je opisana ekspresija fragmenta antitela u E. coli. Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.
Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani”, što dovodi do stvaranja antitela sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Pogledajte Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), i Li et al., Nat. Biotech.24:210-215 (2006).
Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela su takođe izvedene od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Pogledajte, na primer US patente br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Drugi primeri ćelijskih linija sisara koje se koriste kao domaćini su: CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); bubrežna linija humanog embriona (293 ili 293 ćelije kao što su opisane, npr., u Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK); mišje Sertolijeve ćelije (TM4 ćelije kao što su opisane, npr., u Mather, Biol. Reprod.
23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije humanog karcinoma cerviksa (HELA); bubrežne ćelije psa (MDCK; ćelije jetre Buf pacova (BRL3A); ćelije pluća čoveka (W138); ćelije jetre čoveka (Hep G2); mišji tumor dojke (MMT 060562); TRI ćelije, kako su opisane, npr., u Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); MRC 5 ćelije; i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Pregled inekih ćelijskih linija domaćina sisara pogodnih za proizvodnju antitela pogledajte, na primer, u Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str. 255-268 (2003).
E. Testovi
Anti-HtrA1 antitela (npr. anti-HtrA1 antitela i anti-HtrA1/anti-faktor D antitela) koja su ovde data mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema svojim fizičkim/hemijskim svojstvima i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.
1. Testovi vezivanja i drugi testovi
U jednom aspektu, antitelo iz pronalaska ispitano je na aktivnost vezivanja antigena, npr. poznatim postupcima kao što je ELISA, vestern blot, testovi površinske plazmonske rezonance (npr., BIACORE®) itd.
U jednom aspektu, aktivnost vezivanja antigena (npr., kako je naznačeno putem KD) meri se pomoću BIACORE® testa površinske plazmonske rezonance (SPR). Na primer, analiza pomoću uređaja BIACORE®-2000 ili BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) obavljena je na 25 °C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom uz ~10 jedinica odgovora (response units, RU). U jednom otelotvorenju, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIAcore, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen se razblažuje pomoću 10 mM natrijum acetata, pH 4,8, do 5 μg/ml (~0,2 μM) pre injektovanja pri protoku od 5 μl/min da bi se dobilo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja antigena, injektuje se 1 M etanolamin da bi se blokirale neproreagovale grupe. Za merenja kinetike, injektovane su dvostruke serije razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) u PBS-u sa surfaktantom 0,05% polisorbatom 20 (TWEEN®-20) (PBST) na 25 °C pri protoku od oko 25 μl/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE® Evaluation Software verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon. Pogledajte, na primer, Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>prema gore opisanom testu plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja, koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25 °C kod 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja toka (Aviv Instruments) ili serija 8000 SLM-AMINCO™ spektrofotometra (ThermoSpectronic) sa kivetom sa mešanjem. KD se takođe može meriti korišćenjem BIACORE® SPR testa, kako je opisano u primerima dole.
U drugom aspektu, mogu se koristiti kompetitivni testovi za identifikovanje antitela koje se takmiči sa antitelom iz ovog dokumenta u pogledu vezivanja za HtrA1. U određenim otelotvorenjima, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezuje antitelo, kao što je opisano ovde. Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo dati su u: Morris (1996) „Epitope Mapping Protocols,” u Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, NJ).
U primeru kompetitivnog testa, imobilisani HtrA1 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za HtrA1 i drugo neobeleženo antitelo, čija se sposobnost takmičenja sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za HtrA1 ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani HtrA1 je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo, obeleženo antitelo, ali ne i drugo, neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije, u uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za HtrA1, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisano HtrA1. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani HtrA1 u ispitivanom uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za HtrA1. Pogledajte Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. Testovi za merenje aktivnosti
U jednom aspektu, dati su testovi za identifikaciju ovih anti-HtrA1 antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može uključivati, na primer, inhibiciju, blokiranje, antagonizovanje, suzbijanje, ometanje, modulaciju i/ili smanjenje jedne ili više bioloških aktivnosti HtrA1. Antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro takođe su obezbeđena.
U pojedinim otelotvorenjima, antitelo iz pronalaska je ispitano na takvu biološku aktivnost. U pojedinim otelotvorenjima, anti-HtrA1 antitelo se vezuje za HtrA1 i smanjuje ili inhibira aktivnost serinske proteaze za jedan ili više supstrata HtrA1, uključujući, na primer, supstrat H2-Opt, α-kazein, β-kazein ili BODIPY® FL kazeinske supstrate kao što je opisano u primerima ispod, ili bilo koje druge pogodne supstrate HtrA1. U pojedinim otelotvorenjima, anti-HtrA1 antitelo inhibira aktivnost HtrA1 serinske proteaze sa IC50manjim od 50 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1 nM, 800 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM ili manje za jedan ili više supstrata HtrA1. U pojedinim otelotvorenjima, ani-HtrA1 antitelo štiti fotoreceptorske ćelije od degradacije, štiti debljinu spoljnog nuklearnog sloja ili štiti funkcionalnu aktivnost elektroretinograma u modelu očne bolesti, kao što je model miša sa stalnom izloženošću svetlu opisan u Primeru 10 iz U.S.2013./0129743.
Da bi se utvrdilo da li su anti-faktor D antitelo ili njegova varijanta ili fragment (npr. fragment koji vezuje antigen) sposobni da se vežu za faktor D i vrše biološki efekat, može se koristiti, na primer, inhibicija hemolize alternativnog puta, testovi hemolitičke inhibicije koristeći crvena krvna zrnca (RBC) zeca, uključujući one opisane u Primeru 2 US patenta br.
8,273,352, koji je ovde u celosti uključen kao referenca. Takva hemolitička inhibicija može da se odredi pomoću standardnih testova (Kostavasili et al., J. Immunology 158:1763-72, 1997; Wiesmann et al., Nature 444:159-60, 2006). Aktivacija komplementa u takvim testovima može se započeti serumom ili plazmom. Odgovarajuće koncentracije faktora D u serumu ili plazmi (Pascual et al., Kidney International 34:529-536, 1998; Complement Facts Book, Bernard J. Morley i Mark J. Walport, urednici, Academic Press (2000); Barnum et al., J. Immunol. Methods, 67: 303-309, 1984) mogu se rutinski odrediti prema postupcima poznatim u struci, uključujući one koji su opisani u referencama kao što su Pascual et al., supra i Barnum et al., supra, i Primer 4 iz US patenta br.8,273,352. Ovde opisana anti-faktor D antitela, generalno su sposobna da inhibiraju biološku aktivnosti povezanu sa faktorom D. Na primer, u koncentraciji od 18 µg/ml (što odgovara oko 1,5 puta molarnoj koncentraciji humanog faktora D u krvi; molski odnos anti-faktor D antitela prema faktoru D od oko 1,5:1), može se uočiti značajna inhibicija alternativne aktivnosti komplementa antitelom (pogledajte, npr., US patent br.6,956,107).
3. Analize stabilnosti
U jednom aspektu, obezbeđeni su testovi za određivanje stabilnosti (npr. termostabilnosti) anti-HtrA1 antitela. Na primer, stabilnost antitela može da se odredi bilo kojim postupkom poznatim u struci, na primer, diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom (DSF), cirkularnim dihroizmom (CD), unutrašnjom fluorescencijom proteina, diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom, spektroskopijom, rasipanjem svetlosti (npr. dinamičko rasipanje svetlosti (DLS) i statičko rasipanje svetlosti (SLS), hromatografijom samointerakcije (SIC). Stabilnost testa može da se odredi kako je ovde opisano, na primer, primenom masene spektrometrije kako je opisano, na primer, u primeru 4, na primer, u kontekstu AAPH testa stresa i/ili testa toplotnog stresa.
F. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detektovanje
U pojedinim otelotvorenjima, svako od anti-HtrA1 antitela koja su ovde data korisno je za detektovanje HtrA1 u biološkim uzorcima. Termin „detekcija“, kako se ovde koristi, obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U određenim otelotvorenjima, biološki uzorak sadrži ćeliju ili tkivo, kao što je uzorak koji sadrži fotoreceptorske ćelije, ćelije pigmentnog epitela mrežnjače, ćelije spoljnog sloja jedra, unutrašnji sloj jedra, Milerove ćelije, cilijarni epitel ili tkivo mrežnjače. U nekim otelotvorenjima, biološki uzorak sadrži telesnu tečnost, npr. staklasto telo ili krv.
U jednom otelotvorenju, dato je anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u postupcima za dijagnozu ili detekciju. U sledećem aspektu, obezbeđen je postupak za detekciju prisustva HtrA1 u biološkom uzorku. U pojedinim otelotvorenjima, postupak obuhvata kontakt biološkog uzorka sa anti-HtrA1 antitelom kao što je ovde opisano, pod uslovima koji dopuštaju vezivanje anti-HtrA1 antitela sa HtrA1, i detektovanje nastajanja kompleksa između anti-HtrA1 antitela i HtrA1. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U jednom otelotvorenju, anti-HtrA1 antitelo je upotrebljeno da se izabere ispitanik podoban za terapiju anti-HtrA1 antitelom, na primer, kada je HtrA1 biomarker za izbor pacijenata.
U određenim otelotvorenjima, pacijent pogodan za lečenje anti-HtrA1 antitelom može se identifikovati otkrivanjem jednog ili više polimorfizama u HtrA1 genu ili kontrolnoj sekvenci HtrA1, kao što je polimorfizam HtrA1 promotera rs11200638 (G/A) (pogledajte, npr., DeVan et al., Science 314: 989-992, 2006, koji je ovde u celosti uključen putem reference).
Primeri poremećaja koji se mogu dijagnostikovati korišćenjem antitela prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, poremećaje povezane sa HtrA, očne poremećaje, poremećaje povezane sa komplementom i preeklampsiju. U nekim slučajevima, očni poremećaj uključuje, na primer, ali bez ograničenja, AMD, uključujući vlažni AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali vlažni AMD) i suvi AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali suvi AMD (npr. geografska atrofija (GA)), dijabetička retinopatija (DR), retinopatija nedonoščadi (ROP) ili polipoidna horoidna vaskulopatija (PCV).
U nekim otelotvorenjima, preeklampsija može da se dijagnostikuje korišćenjem antitela iz pronalaska. U nekim otelotvorenjima, povećani nivo HtrA1 u uzorku dobijenom od ispitanika u odnosu na referentni nivo HtrA1 može ukazivati na to da ispitanik ima preeklampsiju ili joj je podložan. Pogledajte, npr. Teoh et al. Placenta 36(9):990-995, 2015. U nekim otelotvorenjima, nivoi HtrA1 u serumu mogu da se detektuju korišćenjem antitela prema pronalasku. U drugim otelotvorenjima, nivoi HtrA1 u placenti mogu da se otkriju korišćenjem antitela prema pronalasku.
U pojedinim otelotvorenjima, data su obeležena anti-HtrA1 antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili ostatke koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i funkcionalne ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali se ne ograničavaju na radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofore, kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (U.S. Patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindione, peroksidazu rena (HRP), alkalnu fosfatazu, βgalaktozidazu, glukoamilazu, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidazu ili mikroperoksidazu, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofaga, stabilne slobodne radikale, i slično.
U sledećem otelotvorenju pronalaska, antitelo ne mora biti obeleženo, a njegovo prisustvo se može detektovati upotrebom obeleženog antitela koje se vezuje za antitelo.
Antitela iz ovog pronalaska mogu se koristiti u bilo kom poznatom postupku ispitivanja, kao što su testovi kompetitivnog vezivanja, direktni i indirektni sendvič testovi i testovi imunoprecipitacije. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, str.147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
Analize kompetitivnog vezivanja se oslanjaju na sposobnost obeleženog standarda da se takmiči sa test uzorkom koji analizira vezivanje za ograničenu količinu antitela. Količina antigena u uzorku za testiranje je obrnuto proporcionalna količini standarda koja postaje vezana za antitela. Da bi se olakšalo određivanje količine standarda koji se vezuje, antitela se uglavnom ne rastvaraju pre ili posle takmičenja, tako da se standard i analiza koji su vezani za antitela mogu pogodno odvojiti od standarda i analize koji ostaju nevezani.
Sendvič testovi uključuju upotrebu dva antitela, od kojih je svako sposobno da se veže za različit imunogeni deo ili epitop proteina koji treba detektovati. U sendvič testu, analit uzorka za testiranje vezan je prvim antitelom koje je imobilisano na čvrstom nosaču, a zatim se drugo antitelo vezuje za analit, stvarajući tako nerastvorljivi trodelni kompleks. Pogledajte, na primer, US patent br. 4,376,110. Drugo antitelo može samo po sebi da se obeleži detektujućim ostatkom (direktni sendvič testovi) ili može biti mereno pomoću antiimunoglobulinskog antitela koje je obeleženo detektabilnim ostatkom (indirektni sendvič test). Na primer, jedan tip sendvič testa je ELISA test, u kom slučaju je detektabilni ostatak enzim.
Za imunohistohemiju, uzorak može biti svež ili smrznut ili može biti ugrađen u parafin i fiksiran konzervansom, kao što je, na primer, formalin.
G. Dijagnostički kompleti
Iz praktičnih razloga, antitelo iz ovog pronalaska (npr. anti-HtrA1 antitelo ili anti-HtrA1/anti-faktor D antitelo) može da se dobije u kompletu, tj. upakovanoj kombinaciji reagenasa u unapred određenim količinama sa uputstvom za izvođenje dijagnostičkog testa. Tamo gde je antitelo obeleženo enzimom, komplet će sadržati supstrate i kofaktore potrebne enzimu (npr. prekursor supstrata koji obezbeđuje hromofor ili fluorofor koji se mogu detektovati). Pored toga, mogu se uključiti i drugi aditivi, kao što su stabilizatori, puferi (npr. blok pufer ili pufer za lizu), i slično. Relativne količine različitih reagenasa mogu široko varirati kako bi se obezbedile koncentracije u rastvoru reagensa koje u velikoj meri optimizuju osetljivost testa. Naročito, reagensi se mogu dobiti u obliku suvog praha, obično liofilizovanog, uključujući ekscipijense koji će rastvaranjem dati rastvor reagensa odgovarajuće koncentracije.
H. Farmaceutske formulacije
Terapeutske formulacije antitela ili njegove varijante antitela (npr. anti-HtrA1 antitelo ili anti-HtrA1/anti-faktor D antitelo iz ovog pronalaska) mogu se pripremiti za skladištenje u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora mešanjem polipeptida koji ima željeni stepen čistoće sa opcionim „farmaceutski prihvatljivim“ nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima koji se obično koriste u struci (koji se svi nazivaju „ekscipijensi“). Na primer, puferski agensi, stabilizatori, konzervansi, izotonifikatori, nejonski deterdženti, antioksidansi, i drugi mešoviti aditivi. Pogledajte npr., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, A. Osol, izd. (1980). Takvi aditivi ne smeju biti toksični za primaoce u dozama i koncentracijama koje se koriste.
Puferski agensi pomažu u održavanju pH vrednosti u opsegu koji je približan fiziološkim uslovima. Poželjno su prisutni u koncentraciji u rasponu od oko 2 mM do oko 50 mM. Pogodni puferski agensi za upotrebu sa ovim pronalaskom uključuju i organske i neorganske kiseline i njihove soli, poput citratnih pufera (npr. smeša mononatrijum citrata i dinatrijum citrata, smeša limunske kiseline i trinatrijum citrata, smeša limunske kiseline i mononatrijum citrata, itd.), sukcinatnih pufera (npr. smeša sukcinske kiseline i mononatrijum sukcinata, smeša sukcinske kiseline i natrijum hidroksida, smeša sukcinske kiseline i dinatrijum sukcintata, itd.), tartaratnih pufera (npr. smeša vinske kiseline i natrijum tartarata, smeša vinske kiseline i kalijum tartarata, smeša vinske kiseline i natrijum hidroksida, itd.), fumaratnih pufera (npr. smeša fumarne kiseline i mononatrijum fumarata, smeša fumarne kiseline i dinatrijum fumarata, smeša mononatrijum fumarata i dinatrijum fumarata, itd.), glukonatnih pufera (npr. smeša glukonske kiseline i natrijum glikonata, smeša glukonske kiseline i natrijum hidroksida, smeša glukonske kiseline i kalijum gliukonata, itd.), oksalatnih pufera (npr. smeša oksalne kiseline i natrijum oksalata, smeša oksalne kiseline i natrijum hidroksida, smeša oksalne kiseline i kalijum oksalata, itd.), laktatnih pufera (npr. smeša mlečne kiseline i natrijum laktata, smeša mlečne kiseline i natrijum hidroksida, smeša mlečne kiseline i kalijum laktata, itd.) i acetatnih pufera (npr. smeša sirćetne kiseline i natrijum acetata, smeša sirćetne kiseline i natrijum hidroksida, itd.). Pored toga, mogu se pomenuti fosfatni puferi, histidinski puferi i soli trimetilamina, kao što je Tris.
Konzervansi se mogu dodati da usporavaju rast mikroba, i mogu se dodati u količinama u rasponu od 0,2%-1% (m/v). Pogodni konzervansi za upotrebu sa predmetnim pronalaskom uključuju fenol, benzil alkohol, meta-krezol, metil paraben, propil paraben, oktadecil dimetil benzil amonijum hlorid, benzalkonijum halide (npr. hlorid, bromid, jodid), heksametonijum hlorid, alkil parabene poput metil ili propil parabena, katehol, rezorcinol, cikloheksanol i 3-pentanol.
Izotonifikatori, poznati i kao „stabilizatori“, mogu se dodati kako bi se osigurala izotoničnost tečnih kompozicija iz predmetnog pronalaska, i uključuju polihidrilne šećerne alkohole, po mogućnosti trihidrilne ili više šećerne alkohole, kao što je glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol.
Stabilizatori se odnose na široku kategoriju pomoćnih supstanci koje mogu da se razlikuju u funkciji od agensa za punjenje do aditiva koji solubilizuje terapeutsko sredstvo ili pomaže u sprečavanju denaturacije ili prianjanja za zid kontejnera. Tipični stabilizatori mogu biti polihidrilni šećerni alkoholi (gore nabrojani); aminokiseline kao što je arginin, lizin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, alanin, ornitin, L-leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin, itd.; organski šećeri ili šećerni alkoholi, kao što je laktoza, trehaloza, stahioza, manitol, sorbitol, ksilitol, ribitol, mioinizitol, galaktitol, glicerol, i slično, uključujući ciklitole, kao što je inozitol; polietilen glikol; aminokiselinski polimeri; redukciona sredstva koja sadrže sumpor, kao što je urea, glutation, tioktinska kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, a-monotioglicerol i natrijum tiosulfat; polipeptidi male molekulske mase (tj. <10 ostataka); proteini kao što su humani albumin iz seruma, goveđi albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, poput polivinil pirolidona; monosaharidi, kao što je ksiloza, manoza, fruktoza i glukoza; disaharidi, kao što je laktoza, maltoza i saharoza; i trisahaharidi, kao što je rafinoza; i polisaharidi, kao što je dekstran. Stabilizatori mogu biti prisutni u rasponu od 0,1 do 10.000 mase po masenom delu aktivnog proteina.
Nejonski tenzidi ili deterdženti (takođe poznati kao „kvašljivci“) mogu se dodati kako bi pomogli solubilizaciji terapeutskog proteina (npr. antitela), kao i da bi zaštitili terapeutski protein od agregacije izazvane agitacijom, što takođe omogućava da formulacija bude izložena površinskom naponu smicanja bez izazivanja denaturacije proteina. Pogodni nejonski tenzidi uključuju polisorbate (20, 80, i slično), polioksamere (184, 188, i slično), PLURONIC® poliole, polioksietilen sorbitan monoetre (TWEEN®-20, TWEEN®-80, i slično). Nejonski tenzidi mogu biti prisutni u opsegu od oko 0,05 mg/ml do oko 1,0 mg/ml, poželjno oko 0,07 mg/ml do oko 0,2 mg/ml.
Dodatni razni pomoćni sastojci uključuju sredstva za punjenje (npr. skrob), helirajuće agense (npr. EDTA), antioksidanse (npr. askorbinsku kiselinu, metionin i vitamin E) i korastvarače. Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog jedinjenja, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, možda će biti poželjno uključiti antagonist vezivanja HtrA1 (npr. anti-HtrA1 antitelo) i antagonist vezivanja faktora D (npr. anti-faktor D antitelo). U drugom primeru, za lečenje očnog poremećaja povezanog sa neželjenom neovaskularizacijom, kao što je vlažni AMD, može biti poželjno da se dalje obezbedi antiangiogena terapija, kao što je VEGF antagonistička terapija, na primer, LUCENTIS® (ranibizumab). Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.
Aktivni sastojci mogu takođe da se nalaze u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili međupovršinske polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula i mikrokapsula poli-(metilmetakrilata), u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomima, albuminskim mikrosferama, mikroemulzijama, nanočesticama i nanokapsulama), ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, A. Osal, izd. (1980).
Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, ili varijantu ili fragment antitela (npr. antigen-vezujući fragment) čije su matrice u određenom obliku, npr. film ili mikrokapsule. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem obuhvataju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (U.S. Pat. br.3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i etil-L-glutamat, nedegradabilni etilen-vinil acetat, degradabilne kopolimere mlečna kiselinaglikolna kiselina, kao što je LUPRON DEPOT™ (injektabilne mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečna kiselina-glikolna kiselina i leuprolid acetata) i poli-D-(-)-3-hidroksibuternu kiselinu. Dok polimeri kao što su etilen vinil acetat i mlečna kiselinaglikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula tokom više od 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine u kraćim vremenskim periodima. Kada enkapsulirana antitela ostanu u telu dugo vremena, mogu se denaturisati ili agregirati usled izlaganja vlazi na 37 °C, što dovodi do gubitka biološke aktivnosti i mogućih promena imunogenosti. Mogu se osmisliti racionalne strategije za stabilizaciju u zavisnosti od uključenog mehanizma. Na primer, ako se otkrije da je mehanizam agregacije intermolekulska formacija S-S veze putem izmene tiodisulfida, stabilizacija se može postići menjanjem sulfhidrilnih ostataka, liofilizacijom iz kiselih rastvora, kontrolom sadržaja vlage, korišćenjem odgovarajućih aditiva i razvijanjem specifične polimerske kompozicije matrice.
I. Postupci lečenja i preparati
Bilo koje od ovde datih anti-HtrA1 antitela (npr. anti-HtrA1 antitela i anti-HtrA1/antifaktor D antitela) mogu se koristiti u terapeutskim postupcima.
U jednom aspektu, dato je anti-HtrA1 antitelo da se koristi kao lek. U daljim aspektima, pronalazak daje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u lečenju poremećaja povezanog sa HtrA1. U nekim otelotvorenjima, poremećaj povezan sa HtrA1 je AMD, uključujući vlažni AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali vlažni AMD) i suvi AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali suvi AMD (npr. geografska atrofija (GA)). U nekim slučajevima, AMD je uznapredovali suvi AMD (npr. GA).
U drugom otelotvorenju, pronalazak daje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u lečenju očnog poremećaja. U nekim slučajevima, očni poremećaj je AMD, uključujući vlažni (eksudativni) AMD (uključujući rani, srednji i napredni vlažni AMD) i suvi (neeksudativni) AMD (uključujući rani, srednji i napredni suvi AMD (npr. GA); dijabetička retinopatija (DR) i druge retinopatije povezane sa ishemijom; endoftalmitis; uveitis; horoidalna neovaskularizacija (CNV); retinopatija nedonoščadi (ROP); polipoidna horoidna vaskulopatija (PCV); dijabetički edem makule; patološka miopija oka; okluzija centralne vene mrežnjače (CRVO); neovaskularizacija rožnjače ili neovaskularizacija mrežnjače. U nekim otelotvorenjima, očni poremećaj je AMD (npr. uznapredovali suvi AMD (npr. GA)).
U drugom aspektu, dato je anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u postupku lečenja. U pojedinim slučajevima, pronalazak daje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u postupku lečenja ispitanika koji ima poremećaj povezan sa HtrA1 koji obuhvata davanje pojedincu efikasne količine anti-HtrA1 antitela. U nekim otelotvorenjima, poremećaj povezan sa HtrA1 je AMD, uključujući vlažni AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali vlažni AMD) i suvi AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali suvi AMD (npr. GA)). U nekim slučajevima, AMD je uznapredovali suvi AMD (npr. GA).
U drugom slučaju, pronalazak daje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u postupku lečenja ispitanika koji ima očni poremećaj, koji obuhvata davanje pojedincu efikasne količine anti-HtrA1 antitela. U nekim slučajevima, očni poremećaj je AMD, uključujući vlažni (eksudativni) AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali vlažni AMD) i suvi (neeksudativni) AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali suvi AMD (npr. GA); DR i druge retinopatije povezane sa ishemijom; endoftalmitis; uveitis; CNV; ROP; PCV; dijabetički edem makule; patološka kratkovidost; fon Hipel-Lindauova bolest; histoplazmoza oka; CRVO; neovaskularizacija rožnjače ili neovaskularizacija mrežnjače. U nekim otelotvorenjima, očni poremećaj je AMD (npr. uznapredovali suvi AMD (npr. GA)).
U nekim slučajevima, otkriće daje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u inhibiranju degeneracije mrežnjače ili fotoreceptorskih ćelija kod ispitanika. U drugim slučajevima, pronalazak obezbeđuje anti-HtrA1 antitelo za upotrebu u inhibiranju aktivnosti HtrA1 serinske proteaze u oku ispitanika. „Ispitanik“ prema bilo kojoj od gore navedenih upotreba može biti čovek.
Otelotvorenje obezbeđuje upotrebu anti-HtrA1 antitela u proizvodnji ili pripremi leka. Na primer, u jednom slučaju, lek je za lečenje poremećaja povezanog sa HtrA1. U daljem slučaju, lek je predviđen za upotrebu u postupku lečenja poremećaja povezanih sa HtrA1 koji se sastoji od davanja efikasne količine leka ispitaniku koji ima poremećaj povezan sa HtrA1. U bilo kom od prethodnih upotreba leka, postupak može uključivati davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je opisano u nastavku. U nekim otelotvorenjima, poremećaj povezan sa HtrA1 je AMD, uključujući vlažni AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali vlažni AMD) i suvi AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali suvi AMD (npr. GA)). U nekim slučajevima, AMD je uznapredovali suvi AMD (npr. GA).
U daljem slučaju, lek je predviđen za upotrebu u lečenju očnog poremećaja koji se sastoji od davanja efikasne količine leka ispitaniku koji ima očni poremećaj. U nekim slučajevima, očni poremećaj je AMD, uključujući vlažni (eksudativni) AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali vlažni AMD) i suvi (neeksudativni) AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali suvi AMD (npr. GA); DR i druge retinopatije povezane sa ishemijom; endoftalmitis; uveitis; CNV; ROP; PCV; dijabetički edem makule; patološka kratkovidost; fon Hipel-Lindauova bolest; histoplazmoza oka; CRVO; neovaskularizacija rožnjače ili neovaskularizacija mrežnjače. U nekim otelotvorenjima, očni poremećaj je AMD (npr. uznapredovali suvi AMD (npr. GA)).
Pronalazak pruža postupak za lečenje poremećaja povezanih sa HtrA1. U jednom otelotvorenju, postupak uključuje davanje ispitaniku, koji ima poremećaj povezan sa HtrA1, efikasne količine anti-HtrA1 antitela. U nekim otelotvorenjima, poremećaj povezan sa HtrA1 je AMD, uključujući vlažni AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali vlažni AMD) i suvi AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali suvi AMD (npr. GA)). U nekim slučajevima, AMD je uznapredovali suvi AMD (npr. GA). U daljim slučajevima, postupak se dodatno sastoji od davanja ispitaniku efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, kao što je opisano u nastavku. „Ispitanik“ prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja može biti čovek.
Pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje očnih poremećaja. U jednom otelotvorenju, postupak uključuje davanje ispitaniku koji ima očni poremećaj efikasne količine anti-HtrA1 antitela. U nekim slučajevima, očni poremećaj je AMD, uključujući vlažni (eksudativni) AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali vlažni AMD) i suvi (neeksudativni) AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali suvi AMD (npr. GA); DR i druge retinopatije povezane sa ishemijom; endoftalmitis; uveitis; CNV; ROP; PCV; dijabetički edem makule; patološka kratkovidost; fon Hipel-Lindauova bolest; histoplazmoza oka; CRVO; neovaskularizacija rožnjače ili neovaskularizacija mrežnjače. U nekim otelotvorenjima, očni poremećaj je AMD (npr. uznapredovali suvi AMD (npr. GA)).
Pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje poremećaja povezanih sa HtrA1, očnog poremećaja i/ili poremećaja povezanog sa komplementom kod ispitanika kome je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata davanje ispitaniku terapeutski efikasne količine antagonista koji vezuje HtrA1 i/ili antagonista vezivanja faktora D. U nekim otelotvorenjima, poremećaj povezan sa HtrA1 ili poremećaj povezan sa komplementom je očni poremećaj. U nekim otelotvorenjima, očni poremećaj je izabran iz grupe koju čine AMD, dijabetička retinopatija, horoidalna neovaskularizacija (CNV), uveitis, dijabetički edem makule, patološka miopija, fon Hipel-Lindauova bolest, histoplazmoza oka, začepljenje centralne vene mrežnjače, vaskularizacija rožnjače i neovaskularizacija mrežnjače. U nekim slučajevima, očni poremećaj je AMD, uključujući vlažni AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali vlažni AMD) i suvi AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali suvi AMD (npr. GA)). U nekim slučajevima, AMD je uznapredovali suvi AMD (npr. GA). U bilo kom od prethodnih otelotvorenja, antagonist koji vezuje HtrA1 može biti anti-HtrA1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, na primer, bilo koje ovde opisano anti-HtrA1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. U nekim otelotvorenjima, fragment antitela koji vezuje antigen je izabran iz grupe koja sadrži fragmente Fab, Fab’-SH, Fv, scFv i (Fab’)2. U nekim otelotvorenjima, fragment antitela koji vezuje antigen je Fab. U nekim otelotvorenjima, Fab sadrži skraćenje u regionu pregiba (npr. gornjeg pregiba) konstantnog regiona teškog lanca. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca Fab završava se na položaju 221 (EU numeracija). U nekim otelotvorenjima, aminokiselinski ostatak na položaju 221 je ostatak asparaginske kiseline. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca Fab sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 156. U nekim otelotvorenjima, Fab je Fab IgG1. U nekim slučajevima, antagonist vezivanja faktora D je anti-faktor D antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, na primer, bilo koje od ovde opisanih anti-faktor D antitela.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu bispecifičnog antitela koje se specifično vezuje i za HtrA1 i za faktor D ili za njegov fragment antitela koji vezuje antigen u proizvodnji leka za lečenje poremećaja povezanog sa HtrA1, očnog poremećaja i/ili poremećaja povezanog sa komplementom. U nekim otelotvorenjima, poremećaj povezan sa HtrA1 i/ili poremećaj povezan sa komplementom je očni poremećaj. U nekim slučajevima, očni poremećaj je AMD, uključujući vlažni AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali vlažni AMD) i suvi AMD (uključujući rani, srednji i uznapredovali suvi AMD (npr. GA)). U nekim otelotvorenjima, AMD je uznapredovali suvi AMD (npr. GA). Bispecifično antitelo može sadržati vezujući domen koji se specifično vezuje za HtrA1 koji je izveden iz bilo kog ovde opisanog anti-HtrA1 antitela. Bispecifično antitelo može sadržati vezujući domen koji se specifično vezuje za faktor D koji je izveden iz bilo kog ovde opisanog anti-faktor D antitela. U nekim otelotvorenjima, fragment antitela koji vezuje antigen je Fab fragment ili (Fab’)2fragment.
Bilo koje od anti-faktor D antitela ili njihovih antigen vezujućih fragmenata koji su ovde opisani i/ili poznati u struci može se koristiti u bilo kom od prethodnih postupaka ili primena. Na primer, u nekim slučajevima, anti-faktor D antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen uključuje sledećih šest HVR-ova: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 109); (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 110), pri čemu, X1je Asp ili Glu; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 111), pri čemu, X1je Asn ili Ser; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 112), pri čemu, X1je Asp ili Ser, X2je Asp ili Glu, i X3je Asp ili Ser; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 113); i (f) HVR-L3 koji sadrži
fragment koji vezuje antigen uključuje (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 119; (b) VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 120; ili (c) VH domen kao pod (a) i VL domen kao pod (b). U nekim slučajevima, VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119. U nekim slučajevima, VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120. U nekim slučajevima, fragment anti-faktor D antitela koji vezuje antigen je lampalizumab koji ima CAS registarski broj 1278466-20-8.
Smatra se da se antitelo iz predmetnog pronalaska može koristiti za lečenje sisara. U jednom otelotvorenju, antitelo se daje nehumanom sisaru, na primer, u svrhu dobijanja pretkliničkih podataka. Primeri za nehumane sisare koji se leče uključuju nehumane primate, pse, mačke, glodare (npr. miševe i pacove) i druge sisare na kojima se izvode pretklinička ispitivanja. Takvi sisari mogu biti uspostavljeni životinjski modeli bolesti koja se leči antitelom, ili se mogu koristiti za proučavanje toksičnosti antitela od interesa. U svakom od ovih otelotvorenja, studije sa povećanjem doze mogu se izvesti na sisaru.
U daljem aspektu, pronalazak daje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od ovde datih anti-HtrA1 antitela, na primer za upotrebu u bilo kom od gornjih terapeutskih postupaka. U jednom otelotvorenju, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih anti-HtrA1 antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom otelotvorenju, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih anti-HtrA1 antitela, i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, na primer, kao što je dole opisano.
U bilo kojoj od ovde opisanih terapeutskih upotreba i postupaka, anti-HtrA1 antitelo može biti Fab. U nekim otelotvorenjima, Fab sadrži skraćenje u regionu pregiba (npr. region gornjeg pregiba) konstantnog regiona teškog lanca. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca Fab završava se na položaju 221 (EU numeracija). U nekim otelotvorenjima, aminokiselinski ostatak na položaju 221 je ostatak asparaginske kiseline. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca Fab sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 156. U nekim otelotvorenjima, Fab je Fab IgG1.
Antitelo prema pronalasku (i bilo koje dodatno terapeutsko sredstvo) za prevenciju ili lečenje očne bolesti ili stanja može se primeniti na bilo koji pogodan način, uključujući, ali bez ograničenja, na primer, okularnu, intraokularnu i/ili intravitrealnu injekciju i/ili jukstaskleralnu injekciju, i/ili subtenonalnu injekciju i/ili superhoroidnu injekciju, i/ili topikalnu primenu u obliku kapi za oči i/ili masti. Takva antitela prema pronalasku mogu se isporučiti različitim postupcima, na primer, intravitrealno kao uređaj i/ili depo koji omogućava sporo otpuštanje jedinjenja u staklasto telo, uključujući ona opisana u referencama kao što su Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, i Pearson, izdavači, Taylor & Francis (mart 2006.). U jednom primeru, uređaj može biti u obliku mini pumpe i/ili matrice i/ili pasivnog difuzionog sistema i/ili inkapsuliranih ćelija koje oslobađaju jedinjenje tokom dužeg vremenskog perioda (Intraocular Drug Delivery, Jaffe, Jaffe, Ashton, i Pearson, izdavači, Taylor & Francis (mart 2006.). Takođe se mogu koristiti i drugi načini primene, koji uključuju, ali nisu ograničeni na, topikalnu, parenteralnu, potkožnu, intraperitonealnu, intrapulmonalnu, intranazalnu i intralezijsku primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu.
Formulacije za okularnu, intraokularnu ili intravitrealnu primenu mogu se pripremiti postupcima i upotrebom ekscipijenasa poznatih u struci. Važna karakteristika efikasnog lečenja je pravilno prodiranje kroz oko. Za razliku od bolesti prednjeg dela oka, gde se lekovi mogu da se isporučuju topikalno, bolesti mrežnjače obično imaju koristi od pristupa koji je specifičniji za određenu lokaciju. Kapi i masti za oči retko prodiru u zadnji deo oka, a krvnoočna barijera ometa prodor sistemski primenjenih lekova u očno tkivo. Shodno tome, izabrani postupak za primenu leka za lečenje bolesti mrežnjače, kao što su AMD i CNV, obično je direktna intravitrealna injekcija. Intravitrealne injekcije se obično ponavljaju u intervalima koji zavise od stanja pacijent, i svojstava i poluživota isporučenog leka. Kod intraokularne (npr. intravitrealne) penetracije, obično se daje prednost molekulu manje veličine.
Oči imaju mnoštvo biofizičkih i anatomskih karakteristika koje očnu primenu lekova mogu učiniti izazovnom. Na primer, krvno-očne barijere su odbrambeni mehanizmi koji štite oko od infekcije, ali istovremeno otežavaju prodor leka, posebno kod bolesti u zadnjim segmentima oka. Shodno tome, primena velikih doza je često poželjna da bi se postigla i održala biološka raspoloživost leka na mestu (npr. vreme boravka u oku) kako bi se poboljšala efikasnost. U međuvremenu, ograničeni prostor u zadnjem delu oka sputava količinu leka za primenu, što zauzvrat može favorizovati lekove koji se isporučuju u formulaciji sa velikom koncentracijom.
Pacijenti sa očnim poremećajima (npr. AMD (npr. geografska atrofija)) mogu takođe imati koristi od produženog/sporog oslobađanja terapeutika. Manje učestalo doziranje bi omogućilo bolju pogodnost za pacijenta, imalo potencijalne koristi od smanjenja stope infekcije i povećane kliničke efikasnosti. Kontrolisano otpuštanje velikih doza lekova takođe može da smanji neželjene efekte leka. Dva perspektivna sistema za produženu isporuku su čvrsti implantati zasnovani na PLGA i sistem za isporuku implantabilnih priključaka (PDS). Oba sistema mogu da pruže kinetiku oslobađanja gotovo nultog reda tokom dužeg vremenskog perioda. Za PLGA implantate, proteinski lek se enkapsulira u hidrofobni polimerni matriks, i oslobađanje leka se postiže sporom hidrolizom polimera. Brzina otpuštanja se može kontrolisati promenom naelektrisanja leka, hidrofobnosti polimera ili molekulske težine polimera. PDS je dopunjivi uređaj kod koga se otpuštanje u staklasto telo kontroliše putem porozne metalne membrane koja sadrži titanijumsku fritu. S obzirom na to da rezervoar ima malu zapreminu, potrebna je velika koncentracija proteina za efikasnu isporuku sa PDS-om.
Pored visoke koncentracije i produžene isporuke, povećana bioraspoloživost leka (npr. vreme boravka u oku) može se postići ili olakšati posttranslacionim modifikacijama, pri čemu je proteinski lek kovalentno konjugovan sa prirodnim ili sintetičkim polimerima kao što je kao polisialilacija, HESilacija (konjugacija sa hidroksietil skrobom) i PEGilacija. Pogledajte, npr., Chen et al., Expert. Opin. Drug Deliv. 8:1221-36, 2011; Kontermann, BioDrugs 23:93-109, 2011. PEGilacija, kovalentno vezivanje polimernog polietilen glikola (PEG) za protein, je dobro uspostavljena tehnologija posebno korisna za produžavanje poluvremena fragmenata antitela za lečenje. Jevsevar et al., Biotech. J.5:113-128, 2010.
Uslovi kojima je lek izložen variraju u zavisnosti od sistema isporuke koji se koristi. Za ugradnju u čvrste PLGA implantate koristi se liofilizovani lek ili lek osušen raspršivačem. Implantati se proizvode postupkom ekstruzije vrućeg rastopa, tako da je lek na kratko izložen temperaturi do oko 90 °C. Iako lek ostaje u čvrstom stanju za vreme oslobađanja, razgradnja PLGA može izložiti lek okruženju sa niskom pH vrednošću. Nasuprot tome, lek isporučen sa PDS-om održava se u velikoj koncentraciji u tečnom stanju i izlaže staklastom telu koje je okarakterisano kao redukujuće okruženje pri fiziološkoj jonskoj jačini i pH vrednosti.
Količina antitela ili njegove varijante antitela koji će biti efikasni u lečenju određenog očnog poremećaja ili stanja zavisiće od prirode poremećaja ili stanja, i može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama. Gde je to moguće, poželjno je odrediti krivu zavisnosti doze i odgovora, i farmaceutske kompozicije iz pronalaska prvo in vitro, a zatim na korisnim sistemima životinjskih modela pre testiranja na ljudima.
Dodatna pogodna sredstva za primenu uključuju parenteralnu, intrapulmonalnu i intranazalnu i, ako je poželjno za lokalni tretman, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, na primer putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju. U nekim slučajevima, anti-HtrA1 antitelo se može primenjivati intravenski, intramuskularno, intradermalno, perkutano, intraarterijski, intraperitonealno, intraleziono, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatično, intrapleuralno, intratrahealno, intratekalno, intranazalno, intravaginalno, intrarektalno, topikalno, intratumorski, intraperitonealno, peritonealno, intraventrikularno, subkutano, subkonjunktivalno, intravezikularno, mukozno, intraperikardijalno, intraumbilično, intraorbitalno, oralno, topikalno, transdermalno, inhalacijom, injekcijom, implantacijom, infuzijom, kontinualnom infuzijom, lokalizovanim perfuzionim kupkama ciljanih ćelija direktno, kateterom, ispiranjem, u kremama ili u lipidnim kompozicijama.
Efikasnost lečenja očnih poremećaja (npr. očnih poremećaja povezanih sa komplementom), poput AMD ili CNV, može se meriti različitim krajnjim tačkama koje se obično koriste u proceni intraokularnih bolesti. Na primer, može se proceniti gubitak vida. Gubitak vida se može proceniti bilo kojim postupkom poznatim u struci i/ili ovde opisanim, uključujući, bez ograničenja, na primer, merenje putem srednje promene najbolje korekcije oštrine vida (BCVA) od početne vrednosti do željenog termina (npr. gde se BCVA zasniva na tabeli oštrine vida u ranom lečenju dijabetesne retinopatije (ETDRS) i proceni testom na razdaljini od 4 metra), mereći udeo ispitanika koji u željenom terminu izgube manje od 15 slova u oštrini vida u poređenju sa početnom vrednošću, merenje udela ispitanika koji dobijaju najmanje 15 slova u oštrini vida u željenom terminu u poređenju sa početnom vrednošću, merenjem udela ispitanika sa oštrinom vida Snelenovog ekvivalenta 20/2000 ili gorom u željenom terminu, merenje NEI upitnika za vizuelno funkcionisanje, merenje veličine CNV i količine curenja CNV u željenom terminu, npr. fluoresceinskom angiografijom, i slično. Okularne procene se mogu izvršiti, na primer, obuhvataju, bez ograničenja, npr. izvođenje pregleda oka, merenje očnog pritiska, procenu oštrine vida, merenje pritiska špalt lampe, procenu intraokularne inflamacije, i slično.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela iz pronalaska (kada se koristi samo ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, bilo da se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitela, i odluke nadležnog lekara. Antitelo se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,8 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, ili 10 mg/kg) antitela može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, bilo kao jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. U nekim otelotvorenjima, korišćeno antitelo je oko 0,01 mg/kg do oko 45 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 40 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 35 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 30 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 25 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 20 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 15 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 5 mg/kg, ili oko 0,01 mg/kg do oko 1 mg/kg. Jedna tipična dnevna doza se može kretati u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će po pravilu biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti.
U nekim slučajevima, fiksna doza anti-HtrA1 antitela prema pronalasku daje se, na primer, u oko. U nekim slučajevima, oko 0,1 mg do oko 10 mg ili oko 5-15 mg anti-HtrA1 antitela prema pronalasku se daje u oko, npr. oko 0,1 mg/oko do oko 0,5 mg/oku, oko 0,5 mg/oku do oko 1 mg/oku, oko 1 mg/oku do oko 1,5 mg/oku, oko 1,5 mg/oku do oko 2 mg/oku, oko 2 mg/oku do oko 2,5 mg/oku, oko 2,5 mg/oku do oko 3 mg/oku, oko 3 mg/oku do oko 3,5 mg/oku, oko 3,5 mg/oku do oko 4 mg/oku, oko 4 mg/oku do oko 4,5 mg/oku, oko 4,5 mg/oku do oko 5 mg/oku, oko 5 mg/oku do oko 5,5 mg/oku, oko 5,5 mg/oku do oko 6 mg/oku, oko 6 mg/oku do oko 6,5 mg/oku, oko 6,5 mg/oku do oko 7 mg/oku, oko 7 mg/oku do oko 7,5 mg/oku, oko 7,5 mg/oku do oko 8 mg/oku, oko 8 mg/oku do oko 8,5 mg/oku, oko 8,5 mg/oku do oko 9 mg/oku, oko 9 mg/oku do oko 9,5 mg/oku, ili oko 9,5 mg/oku do oko 10 mg/oku. U nekim slučajevima, antitelo se koristi do oko 0,1 mg/oku do oko 2 mg/oku, oko 0,1 mg/oku do oko 3 mg/oku, oko 0,1 mg/oku do oko 5 mg/oku, oko 0,1 mg/oku do oko 6 mg/oku, oko 0,1 mg/oku do oko 7 mg/oku, oko 0,1 mg/oku do oko 8 mg/oku, oko 0,1 mg/oku do oko 9 mg/oku, oko 0,1 mg/oku do oko 10 mg/oku, oko 0,5 mg/oku do oko 2 mg/oku, oko 0,5 mg/oku do oko 3 mg/oku, oko 1 mg/oku do oko 3 mg/oku, ili oko 2 mg/oku do oko 5 mg/oku. U nekim slučajevima, koristi se fiksna doza anti-HtrA1 antitela od oko 0,5 mg/oku, oko 1 mg/oku, oko 1,5 mg/oku, oko 2 mg/oku, oko 2,5 mg/oku, oko 3 mg/oku, oko 3,5 mg/oku, oko 4 mg/oku, oko 4,5 mg/oku, oko 5 mg/oku, oko 5,5 mg/oku, oko 6 mg/oku, oko 6,5 mg/oku, oko 7 mg/oku, oko 7,5 /oku, oko 8 mg/oku, oko 8,5 mg/oku, oko 9 mg/oku, oko 9,5 mg/oku, oko 10 mg/oku, ili više. U određenom slučaju, na primer, daje se fiksna doza anti-HtrA1 antitela sa oko 2 mg/oku.
U nekim otelotvorenjima doza se može primenjivati jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje, jednom u četiri nedelje, jednom u pet nedelja, jednom u šest nedelja, jednom u sedam nedelja, jednom u osam nedelja, jednom u devet nedelja, jednom u deset nedelja, jednom u jedanaest nedelja, ili jednom u dvanaest nedelja.
Antagonist vezivanja HtrA1 (npr. anti-HtrA1 antitelo iz ovog pronalaska) može da se primenjuje samostalno ili u kombinaciji sa najmanje jednim drugim terapeutskim jedinjenjem. Primena antagonista vezivanja HtrA1 (npr. anti-HtrA1 antitelo iz ovog pronalaska) i bilo kog drugog terapeutskog jedinjenja može se vršiti istovremeno, npr. kao jedna kompozicija ili kao dve ili više različitih kompozicija, koristeći isti ili različiti način primene. Alternativno, ili dodatno, primena se može izvršiti uzastopno, bilo kojim redosledom. U određenim otelotvorenjima, intervali u rasponu od minuta do dana, do nedelja do meseci, mogu biti prisutni između primene dve ili više kompozicija. Na primer, prvo se može primeniti antagonist vezivanja HtrA1 (npr. anti-HtrA1 antitelo iz ovog pronalaska), a zatim drugo terapeutsko jedinjenje. Međutim, takođe se razmatra istovremena primena ili primena drugog terapeutskog jedinjenja pre antagonista vezivanja HtrA1 (npr. anti-HtrA1 antitela iz ovog pronalaska). U jednom primeru, antagonist vezivanja HtrA1 je anti-HtrA1 antitelo, na primer, bilo koje anti-HtrA1 antitelo koje je ovde opisano ili poznato u struci. U jednom primeru, drugo terapeutsko jedinjenje je antagonist vezivanja faktora D. U daljem primeru, antagonist vezivanja faktora D je anti-faktor D antitelo, na primer, bilo koje ovde opisano ili poznato u struci anti-faktor D antitelo. U određenim otelotvorenjima, anti-faktor D antitelo je lampalizumab. U daljim otelotvorenjima, anti-faktor D antitelo se daje u dozi od 1-15 mg, na primer u dozi od 10 mg. U određenim otelotvorenjima, lampalizumab se daje jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje ili jednom u četiri nedelje. U određenim otelotvorenjima, dodatno terapeutsko sredstvo je terapeutsko sredstvo pogodno za lečenje očnih poremećaja povezanih sa neželjenom neovaskularizacijom oka, kao što je, na primer, vlažni AMD. Pogodna terapeutska sredstva uključuju, na primer, antiangiogene terapije, kao što su VEGF antagonisti (npr. anti-VEGF antitela i fragmenti antitela, uključujući LUCENTIS® (ranibizumab), i anti-VEGFR1 antitela i srodne molekule (npr. aflibercept (VEGF Trap-Eye; EYLEA®)); inhibitori sistema komplementa, kao što su antagonisti faktora komplementa C2 (uključujući, na primer, anti-CFC2 antitela); i antiinflamatorna sredstva, kao što su antagonisti vezivanja IL-6 (npr. tocilizumab (ACTEMRA®) i EBI-031 (Eleven Biotherapeutics). U drugim otelotvorenjima, lečenje bolesti ili poremećaja povezanog sa neželjenom okularnom neovaskularizacijom može da uključuje kombinaciju anti-HtrA1 antitela i fotodinamičke terapije (npr. sa MACUGEN™ ili VISUDYNE™).
Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa obuhvaćeni istom formulacijom, ili različitim formulacijama), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena antitela predmetnog pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili agenasa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. U jednom otelotvorenju, primena vezujućeg antagonista HtrA1 (npr. anti-HtrA1 antitela) i primena dodatnog terapeutskog agensa se dešavaju približno u roku od jednog meseca, ili približno u roku od jedne, dve ili tri nedelje, ili približno u roku od jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest dana, jedna od druge.
Podrazumeva se da bilo koja od gorenavedenih formulacija ili terapeutskih postupaka može biti izvedena uz upotrebu imunokonjugata iz pronalaska umesto anti-HtrA1 antitela, ili kao njegov dodatak.
J. Proizvodi
U drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje gore opisanih poremećaja. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži preparat koji je sam po sebi ili u kombinaciji sa drugim preparatom efikasan u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je antitelo predmetnog pronalaska. Etiketa ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovom otelotvorenju predmetnog pronalaska može dodatno da sadrži uputstvo za upotrebu koje ukazuje da kompozicije mogu da se koriste za lečenje određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekciju (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dodatno da sadrži druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i sa aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
III. PRIMERI
Razvoj stabilnih antitela velike potentnosti i velikog afiniteta koja vezuju HtrA1 Cilj sledećih eksperimenata bio je otkrivanje novih anti-HtrA1 antitela koja imaju veću potentnost i veći afinitet prema HtrA1.
Prvo su generisani mHtrA1 nokaut miševi. Bilo je neophodno koristiti nokaut miševe jer početni napori za generisanje hibridoma od miševa koji eksprimiraju HtrA1 nisu bili uspešni, verovatno zato što mišji i humani proteini HtrA1 dele 98% identifikovanih sekvenci.
Sledeće, HtrA1 nokaut miševi su imunizovani domenom proteaze mHtrA1. Dobijeni hibridomi su pregledani ELISA testom i identifikovano je 75 ELISA pozitivnih klonova. 75 klonova je testirano na sposobnost inhibiranja cepanja HtrA1 supstrata proteaze. Pokazalo se da 10 od 75 klonova inhibiraju aktivnost HtrA1 proteaze.
Sedam od ovih klonova je odabrano za dalju analizu na osnovu njihove sposobnosti da inhibiraju aktivnost proteaze, da se vežu za humani i mišji HtrA1 i da selektivno vezuju muHtrA1 preko muHtrA3 i muHtrA4. Ovih sedam klonova je podvrgnuto daljem skriningu, i utvrđeno je da četiri imaju poboljšanu potentnost prema HtrA1 u poređenju sa kontrolnim antitelom YW505.94. Dva od ovih antitela, 15H6 i 9B12, odabrana su za dalji razvoj na osnovu njihovog poželjnog molekulskog profila, uključujući potentnost i selektivnost.
Hipervarijabilni regioni izabranih antitela su graftovani na humani okvir, kako je dole navedeno. Važnost Vernijeovih referenci lakog lanca miša testirana je za 15H6 pojedinačnim zamenom ovih ostataka i testiranjem vezivanja za humani i mišji HtrA1. Jedna supstitucija je ukinula vezivanje, dve su smanjile vezivanje, dve su uticale samo na vezivanje za mišji HtrA1, a tri nisu imale značajan uticaj na vezivanje. Ove tri supstitucije su uvedene u antitelo 15H6.v1 da bi se dobilo antitelo 15H6.v2
Tada je napravljeno 15H6.v2 antitelo da bi se poboljšala njegova stabilnost. Identifikovani su potencijalno nestabilni ostaci koji mogu dovesti do oksidacije (W91 u HVR-L3), odsecanja (N94 P95 u HVR-LC) i deamidacije (D55 G56 u HVR-H2). Supstitucije W91 su značajno uticale na vezivanje. Testirane su četiri supstitucije na položaju N94. Dve od ovih supstitucija su uticale na vezivanje, ali dve su odabrane za dodatnu analizu. Testirane su četiri supstitucije na položaju D55. Samo jedna od ovih supstitucija pokazala je uporedivo vezivanje za matični molekul.
Sledeći korak je bio poboljšanje afiniteta vezivanja h15H6.v2 za HtrA1. Kao prvi korak, korišćeno je duboko sekvenciranje za ispitivanje odnosa struktura/funkcija za h15H6.v2. Od mnogih pojedinačnih mutacija testiranih u ovom eksperimentu, utvrđeno je da približno 19 pojedinačnih mutacija poboljšava afinitet prema HtrA1. Dizajnirana su i testirana antitela koja sadrže kombinacije mutacija LC i HC sa najmanjom povratnom brzinom, što je dovelo do identifikacije varijantnih antitela koja imaju poboljšanu potentnost i afinitet prema HtrA1. Takođe su projektovane varijante sa najboljim afinitetom i potentnošću da bi se uvele gore opisane stabilizujuće supstitucije. Od rezultujućih varijanti, utvrđeno je da h15H6.v4 ima najveću potentnost na HtrA1.
Struktura h15H6.v4 u Fab formatu vezanom za HtrA1 određena je rendgenskom kristalografijom i elektronskom mikroskopijom. Ova strukturna analiza je otkrila da se h15H6.v4 Fab blisko vezuje za „LA petlju“ proteina HtrA1. Epitop vezan od strane h15H6.v4 razlikuje se od epitopa vezanog kontrolnim antitelom YW505.94. Iako nije predviđeno da se predmetni pronalazak veže nekim određenim mehanizmom, moguće je da bliska interakcija između h15H6.v4 i LA petlje HtrA1 objašnjava značajno poboljšani afinitet i potentnost ovog antitela u poređenju sa YW505.94.
Gore opisani eksperimenti detaljnije su opisani u nastavku.
Primer 1: Stvaranje anti-HtrA1 antitela primenom pristupa hibridoma
A. Medijumi i antitela
CLONACELL™-HY medijum B (kat. br. 03802), medijum C (kat. br. 03803), medijum D (kat. br. 03804) i medijum E (kat. br. 03805) su bili od kompanije StemCell Technologies. CITOFUSION® medijum C (kat. br. LCM-C) koji se koristi za elektrofuziju je bio od kompanije Cito Pulse Sciences. Kozji alofikocijaninom (APC)-obeleženi F(ab’)2 antimišji Ig bio je od kompanije SouthernBiotech (kat. br. 1012-11), antimišji IgG Fc konjugovana peroksidaza rena (HRP) bila je od kompanije Sigma. TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin) jednokomponentni HRP Microwell supstrat (kat. br. TMBW-1000-01) i TMB zaustavni reagens (kat. br. BSTP-1000-01) bili su od kompanije BioFx Laboratories.
B. In vivo imunizacija miševa
Imunizovano je pet HtrA1 nokaut miševa (HtrA1.noneo.BALB.ko.C1-3) prečišćenim His-obeleženim rekombinantnim mišjim HtrA1 domenom proteaze (ovde se naziva muHtrA1-PD-His, SEQ ID NO: 153; pogledajte primer 2 iz WO 2013/055998) suspendovan u adjuvansu monofosforil lipid A/trehaloza dikorinomikolat ubrizgavanjem u jastučić na šapi (2 µg/injekciji po mišu) u intervalima od 3 do 4 dana za ukupno 12 pojačanja, praćeno sa 2 pojačanja pre fuzije sa antigenom u fiziološkom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS). Tri dana nakon konačnog pojačanja, limfociti iz slezine i limfnih čvorova imunizovanih miševa su sakupljeni i izolovani. muHtrA1-PD-His je pripremljen za injekciju prečišćavanjem kako je opisano u primeru 2 iz WO 2013/055998.
C. Fuzija ćelija, skrining hibridoma i subkloniranje
Izolovane ćelije slezine miša od dva miša (brojevi 748 i 749) fuzionisane su sa ćelijama mijeloma SP2/0 (American Type Culture Collection) upotrebom aparata Cyto Pulse CEEF-50 (Cyto Pulse Sciences). Ukratko, nakon dva ispiranja medijumom C CYTOFUSION®, izolovane ćelije slezine i SP2/0 ćelije su pomešane u odnosu 1:1, a zatim ponovo suspendovane u CYTOFUSION® medijumu C u koncentraciji od 10 miliona ćelija/ml. Elektrofuzija je izvedena prema uputstvu proizvođača. Spojene ćelije su kultivisane u CLONACELL™-HY medijumu C preko noći na 37 °C u inkubatoru sa 7% CO2. Sledećeg dana, spojene ćelije su centrifugirane, a zatim resuspendovane u 10 ml CLONACELL™-HY medijuma C, a zatim pažljivo pomešane sa 90 ml CLONACELL™-HY medijuma D na bazi metilceluloze koji sadrži selektivne reagense hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT). Ćelije su stavljene u Petrijeve posude dimenzija 40 x 100 mm (kat. br. 351029, Becton Dickinson) i ostavljene da rastu na 37 °C u inkubatoru sa 7% CO2. Posle 10 dana inkubacije, 1429 pojedinačnih klonova hibridoma je odabrano korišćenjem sistema CLONEPIX™ (Genetix, Ujedinjeno Kraljevstvo) i prebačeno na ploče sa 15 x 96 bunarčića sa ćelijskim kulturama (br. 353075, Becton Dickinson) sa 200 µl/bunarčiću CLONACELL™-HI medijuma E. Medijumi za kulturu hibridoma su zamenjeni, a 3 dana kasnije supernatanti hibridoma su pregledani testom sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA) kako bi se utvrdilo vezivanje za muHtrA1-PD-His.
ELISA analiza je izvršena prema standardnom protokolu. Ukratko, mikrotitarske ELISA ploče sa 96 bunarčića (Greiner, Nemačka) obložene su sa 100 µl/bunarčiću muHtrA1-PD-His ili huHtrA1-PD-His (SEQ ID NO: 154) pri 2 µg/ml u 0,05 M karbonatnom puferu (pH 9,6) na 4 °C preko noći. Posle tri ispiranja puferom za ispiranje (0,05 % TWEEN® 20 u PBS-u, Sigma), ploče su blokirane sa 100 µl razblaživača za ELISA test sa BSA. Dodato je 100 µl kultivisanih supernatanta ili razblaženih prečišćenih monoklonskih antitela (mAb) i inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta i inkubirane sa HRP konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG Fc 1 sat. Posle tri ispiranja, vezani enzim je detektovan dodavanjem 100 µl/bunarčiću TMB supstrata (BioFX Laboratories) tokom 5 minuta. Reakcije su zaustavljene dodavanjem 100 µl/bunarčiću zaustavnog reagensa (BioFX Laboratories), a zatim je detektovana boja pri apsorbanci na 650 nm (A650 nm). Identifikovano je 105 početnih ELISA pozitivnih supernatanta. Posle ekspanzije i kultivisanja tokom 3 dana, ovi klonovi su ponovo pregledani u sledećem ELISA testu koji je potvrdio da je 75 od 105 klonova i dalje ELISA-pozitivno na vezivanje za muHtrA1-PD-His (Sl. 1A i 1B). Većina od ovih 75 klonova takođe se vezala za humani HtrA1 domen proteaze (Sl.1A i 1B).
Sledećih 75 ELISA-pozitivnih klonova je testirano korišćenjem in vitro testa za procenu sposobnosti supernatanta hibridoma da inhibira cepanje supstrata humanim HtrA1 domenom proteaze (huHtrA1-PD-His; SEQ ID NO: 154). Korišćen je test ENZCHEK® zelene fluorescentne proteaze (ThermoFisher Scientific). Ovaj test koristi derivat kazeina koji je jako obeležen sa pH-neosetljivom zelenom fluorescentnom bojom BODIPY® FL kao supstrat. Fluorescencija BODIPY® FL boje se intramolekularno gasi u supstratu obeleženom u punoj dužini. Cepanjem supstrata huHtrA1-PD oslobađaju se fluorescentni BODIPY® FL-obeleženi peptidi, što dovodi do povećanja fluorescentnog signala (slika 2A). Ukratko, supernatant hibridoma i HtrA1-PD (20 nM hHtrA1-PD; 40 µl hHtrA1-PD do 60 µl supernatanta) inkubirani su u puferu (50 mM Tris, 200 mM NaCl, 0,25% CHAPS, pH 8,0) u finalnoj zapremini od 200 µl tokom 20 minuta na 37 °C. Dodato je 5 µg/ml supstrata označenog sa BODIPY® FL i očitana je fluorescencija (mili relativne fluorescentne jedinice (mRFU)/min) tokom 20 minuta. Koristeći ovaj test blokiranja, pronađeno je da 10 od 75 klonova inhibira cepanje supstrata posredovano humanim HtrA1-PD (Sl. 2B i 2C). Sl. 3A i 3B pokazuju poređenje sposobnosti podskupa klonova da inhibiraju aktivnost muHtrA1-PD u poređenju sa huHtrA1-PD.
Posle najmanje 2 ciklusa subkloniranja pojedinačnih ćelija ograničavanjem razblaženja, 7 klonova sa različitim karakteristikama (20E2, 19B12, 12A5, 3A5, 15H6, 15E3 i 19G10) je umnoženo, i supernatanti su prikupljeni za prečišćavanje antitela i dalju procenu. Ovi klonovi su izabrani delimično na osnovu sposobnosti da inhibiraju in vitro HtrA1 aktivnost i vezivanje za muHtrA3 (19B12). 7 klonova je takođe testirano na sposobnost otkrivanja muHtrA1 u imunohistohemiji, kao i na sposobnost vezivanja mišjeg HtrA3-PD i mišjeg HtrA4-PD (kako je procenjeno ELISA testom). Tabela 2 prikazuje rezime kvalitativnih svojstava ovih 7 klonova.
Tabela 2: Osobine 7 finalnih klonova odabranih za prečišćavanje antitela
Sledeći korak je bio da se utvrdi da li je sedam gore izabranih antitela inhibiralo cepanje posredovano pomoću HtrA1, mereno FRET testom.
Supernatanti hibridoma su prečišćeni afinitetnom hromatografijom sa proteinom A, praćeno sterilnom filtracijom (veličina pora 0,2 um, Nalge Nunc International, NI, SAD) i skladištenjem na 4 °C u PBS-u. Prečišćena monoklonska antitela su potvrđena od strane ELISA i FACS pre daljeg ispitivanja u funkcionalnim testovima. Izotipovi prečišćenih mAb su određeni pomoću ISOSTRIP™ kompleta za izotipizaciju monoklonskih antitela miša (Roche Diagnostics Corporation).
Prečišćena antitela su testirana na sposobnost inhibiranja aktivnosti HtrA1 u testu blokiranja zasnovanom na FRET (npr. H2-Opt test). U ovom testu je utvrđena sposobnost antitela da inhibira cepanje supstrata fluorescentnog rezonantnog prenosa energije (FRET, koji se takođe naziva i Forsterov prenos rezonantne energije). FRET peptidni supstrat H2-Opt, koji ima molekulsku težinu od 1600 Da, uključuje donatora Mca (7-metoksikumarin-4-il-acetil) i akceptor (sredstvo za prekidanje reakcije) Dnp (N-2,4-dinitrofenil). Kompletna sekvenca FRET peptidnog supstrata je (Mca)IRRVSYSF(Dnp)KK (SEQ ID NO: 152). U netaknutom peptidnom supstratu, ostatak za prekidanje reakcije Dnp gasi fluorescenciju Mca donora. Proteolitičko cepanje supstrata FRET peptida razdvaja fluorofor i kaljenje, oslobađajući tako gašenje Mca fluorescencije i dovodeći do povećanog fluorescentnog signala (Slika 4A). Analiza je izvedena korišćenjem uslova H2-Opt testa opisanih dole u primeru 3, odeljak F. Povećanje intenziteta fluorescencije zavisno od vremena povezano je sa obimom hidrolize supstrata. Antitela su testirana u koncentracijama od 5 nM, 50 nM i 500 nM. Pet prečišćenih anti-HtrA1 antitela (15H6, 19B12, 3A5, 12A5 i 20E2) zadržalo je sposobnost da blokira cepanje supstrata posredovanog humanim HtrA1-PD (Sl.4B i 4C).
Zatim je ispitana sposobnost prečišćenih antitela da inhibiraju cepanje supstrata posredstvom HtrA1 kompletne dužine. Test blokiranja zasnovan na FRET-u, opisan u prethodnom paragrafu, korišćen je koristeći prečišćeni muHtrA1 ili huHtrA1 pune dužine (FL). muHtrA1-FL i huHtrA1-FL su prečišćeni kao što je opisano u primeru 2 iz WO 2013/055998. Prečišćena antitela, uključujući 15H6 i 19B12, inhibirala su aktivnost huHtrA1-FL (Sl. 5A-5B) i muHtrA1-FL (Sl. 5C-5D). U ovom testu, klon 15H6 je inhibirao huHtrA1-FL sa IC50 od 0,7 nM, što je približno dvostruko poboljšano u poređenju sa IC50 pozitivnog kontrolnog antitela YW505.94. 15H6 je inhibirao muHtrA1-FL sa IC50 od 1,1 nM, što je gotovo 5 puta poboljšano u poređenju sa pozitivnim kontrolnim antitelom YW505.94. Klon 19B12 inhibirao je huHtrA1-FL sa IC50 od 1,4 nM, a inhibirao je muHtrA1-FL sa IC50 od 1,0 nM. Odabrana antitela su sekvencirana kako je opisano dole u odeljku D. Sekvence ovih pet antitela prikazane su na slikama 6A i 6B. Dva antitela, 15H6 i 19B12, odabrana su za dalji razvoj na osnovu poželjnog molekulskog profila, uključujući njihovu potentnost i selektivnost. Ponovno formatiranje ovih antitela je opisano u nastavku u odeljku E,
D. Sekvenciranje antitela iz klonova hibridoma
i. Kloniranje sekvenci gena varijabilnog regiona iz ćelija hibridoma pomoću 5’-brze amplifikacije krajeva cDNK (5’-RACE) u formatu sa 96 bunarčića
Za svaki klon hibridoma, oko 25 µl ćelija koje rastu u log fazi (0,5-1,0x10<6>ćelija/ml) prebačeno je sa ploča za kulturu tkiva na ploče sa 96 bunarčića sa U-dnom. Zatim je dodato 150 µl hladnog 1x PBS-a za ispiranje ćelija pre centrifugiranja na 1000 o/min tokom 5 minuta. Supernatant je uklonjen, i ćelijski pelet je resuspendovan u 25 µl hladnog 1x PBS-a.
ii. Reakcija reverzne transkripcije-lančane reakcije polimeraze (RT-PCR)
U ependorf epruveti je pripremljena osnovna smeša koja se sastojala od sledećeg (za 50 bunarčića): 2,5 µl RNASEOUT™ (Invitrogen br. 10777019), 12,5 µl 10x pufera za sintezu (5x SUPERSCRIPT® pufer), 12,5 µl ditiotreitola (DTT) (0,1 M Invitrogen br. P/NY00147), 6,25 µl dNTP (10 mM Invitrogen br. 18427-013), 12,5 µl 2,5% nonil fenoksi polietoksil etanola (NP-40), 6,25 µl albumina goveđeg seruma (BSA) pri 2 mg/ml (BioLabs br. 9001S), 25 µl prajmera RACE4muHC (1:100 u vodi PCR čistoće) (Race 3 kapa prajmer zamenjen je za sekvenciranje lakog lanca (LC)), 37,5 µl vode PCR čistoće i 10 µl enzima SUPERSCRIPT® 3 (Invitrogen br. 18080-093). Nukleotidna sekvenca degenerisanog prajmera Race4muHC je (SEQ ID NO: 139), gde Y kodira C ili T, a K kodira G ili T. Sekvenca Race 3 kapa nukleotidnog prajmera je
GTA GAA GTT GTT CAA GAA G(SEQ ID NO: 140).
2,5 µl/bunarčiću osnovne smeše je zatim prebačeno na PCR reakcionu ploču sa 96 bunarčića. Na ploču je dodato 1 µl ćelija/bunarčiću, ploča je kratko centrifugirana 30 sekundi, a zatim je ploča protresena. Ploča je postavljena u PCR mašinu, i program je podešen na 30 minuta na 45 °C, a zatim 30 minuta na 50 °C. Ova ploča je označena kao ploča A.
iii. Reakcija tejlinga
Napravljen je 10x koncentrovani pufer za tejling sa sledećim sastojcima (za 50 bunarčića): 5 µl 1 M MgCl2, 5 µl 0,1 M DTT, 5 µl 1 M Tris pH 7,5, 10 µl 100 mM dGTP i 25 µl vode PCR čistoće.
Napravljen je radni rastvor sa sledećim sastojcima (za 50 bunarčića): 50 µl 10x koncentrovanog pufera za tejling, 312,5 µl vode PCR čistoće i 12,5 µl terminalne dezoksinukleotidil transferaze (TdT) od 300 jedinica (Promega br. M828A/C).
Ovaj radni rastvor je zatim dodat u PCR reakcionu ploču A sa 7,5 ul/bunarčiću. Ploča A je zatim stavljena u PCR mašinu na 1 sat na 37 °C, a zatim 5 minuta na 65 °C. Ova ploča je označena kao ploča A/B da bi se razlikovao tejlnig ove ploče.
iv. Prva PCR reakcija
Pripremljena je osnovna smeša koja se sastojala od sledećeg (za 50 bunarčić) u Falcon epruveti od 15 ml: 1050 µl vode PCR čistoće, 500 µl 5x GC cDNK reakcionog pufera za PCR, 500 µl GC-reagensa za topljenje (Clontech br. S1091), 50 µl direktnog prajmera DC5dn, 50 µl Race7muHC (Race 2 kapa prajmer za LC), 50 µl dNTP (10 mM) i 50 µl GC ADVANTAGE® polimeraze (Clontech br. S1088). Nukleotidna sekvenca degenerisanog prajmera gde R kodira A ili G, M kodira A ili C, i D kodira G ili A ili T. Nukleotidna sekvenca Race 2 kapa prajmera j
45 µl ove osnovne smeše je zatim preneto u bunarčiće nove PCR reakcione ploče i zatim je dodato 1 µl šablona sa ploče A/B. Zatim je ova ploča stavljena u PCR mašinu i puštena u rad „Touchdown PCR“ postupkom sa smanjenjem temperature komplementarnog vezivanja prajmera, kako je navedeno u nastavku. Ova ploča je označena kao ploča C.
„Touchdown PCR“ postupak:
96 °C tokom 4 min
3 ciklusa od [96 °C tokom 45 s, 64 °C tokom 30 s, 68 °C tokom 90 s], 3 ciklusa od [96 °C tokom 45 s, 61 °C tokom 30 s, 68 °C tokom 90 s], 3 ciklusa od [96 °C tokom 45 s, 58 °C tokom 30 s, 68 °C tokom 90 s], 3 ciklusa od [96 °C tokom 45 s, 57 °C tokom 30 s, 68 °C tokom 90 s], 3 ciklusa od [96 °C tokom 45 s, 55 °C tokom 30 s, 68 °C tokom 90 s] 25 ciklusa od [96 °C tokom 45 s, 52 °C tokom 30 s, 68 °C tokom 90 s]
68 °C tokom 5 min, pa zadržavanje na 4 °C.
Posle toga, 3 µl PCR proizvoda je propušteno na 2% etidijum bromidu (EtBr) E-GEL® i proverene su trake. Egzol/alkalna fosfataza iz škampa (SAP) dodat je sa 10 µl/bunarčiću i stavljen u PCR mašinu tokom 45 minuta na 37 °C, a zatim 15 minuta na 85 °C. Osnovna smeša egzol/SAP napravljena je za 50 bunarčića: 2,5 µl 20 jedinica/µl egzonukleaze I (Fermentas br. EN0582), 25 µl SAP (USB br. 70092I), 472,5 µl vode PCR kvaliteta. PCR proizvod je razblažen u vodi 1:4. Race7muHC prajmer je korišćen za sekvenciranje teškog lanca (HC), a Race7.1 muLC prajmer je korišćen za sekvenciranje LC. Nukleotidna sekvenca
Za analizu gel filtracije, 10 ml prečišćenog uzorka injektovano je u TSK-GEL® Super SW3000 (unutrašnji prečnik 4,6 mm x 30 cm, TOSOH Bioscience) pri 0,35 ml/min koristeći 200 mM K2PO4, 250 mM KCl, pH 7,0 kao mobilnu fazu. Oko 2 mg prečišćenog IgG redukovano je sa 50 mM ditioreitola na 37 °C tokom 20 minuta i analizirano masenom spektrometrijom vremena prolaska (TOF) (Agilent LC/MS 6224) nakon razdvajanja obrnute faze na mreži pomoću PLRP-S kolone (Agilent) i gradijenta acetonitrila. Netaknute mase su određene maksimalnom dekonvolucijom entropije sakupljenih m/z spektara korišćenjem softvera MassHunter Qualitative Analysis (Agilent).
vi. Rezultati
Sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) za 19B12, 20E2, 3A5, 12A5 i 15H6 prikazane su na slici 6A. Sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL) za 19B12, 20E2, 3A5, 12A5 i 15H6 prikazane su na slici 6B. Ovi klonovi imaju jedinstvene teške i lake lance. Podaci masene spektrometrije potvrdili su podatke o sekvencama (pogledajte Tabele 3 i 4) (pogledajte, na primer, Bos et al. Biotechnol. Bioeng.112(9): 1832-1842, 2015).
Tabela 3: HC mase utvrđene masenom spektrometrijom
Tabela 4: LC mase utvrđene masenom spektrometrijom
E. Reformatiranje antitela 15H6 i 19B12
i. TOPO® kloniranje antitela 15H6 i 19B12
TOPO® kloniranje je izvedeno da bi se potvrdile sekvence varijabilnog regiona klonova antitela 15H6 i 19B12 dobijene direktnim sekvenciranjem 5’-RACE PCR proizvoda (gore opisano). Reakcija TOPO® TA kloniranja izvedena je kako je opisano u priručniku pCR™4-TOPO® TA kompleta za kloniranje za sekvenciranje (Invitrogen K4575-02). Ukratko, 2 µl PCR proizvoda, 2 µl vode, 1 µl 10 pCR™4-TOPO® vektora i 1 µl uključenog rastvora soli kombinovani su u epruveti, pomešani i inkubirani 5 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcija je zatim stavljena na led, i 2 µl ove reakcije kloniranja TOPO® je dodato u odmrznutu bočicu ONE-SHOT® hemijski kompetentnih TOP10 ćelija Escherichia coli (Invitrogen K4575-02) i pomešano bez pipetiranja. Reakcija je inkubirana na ledu 5-30 min. Ćelije su zatim podvrgnute toplotnom šoku tokom 30 sekundi na 42 °C bez mućkanja.
15 epruveta je odmah prebačeno na led. Dodato je 250 µl SOC medijuma na sobnoj temperaturi. Epruveta je zatvorena i mućkana horizontalno na 200 o/min na 37 °C tokom 1 h.
Zatim je 50 µl iz svake transformacije rašireno na prethodno zagrejanu LB agar ploču koja sadrži 50 µg/ml karbenicilina. Ploče su inkubirane na 37 °C preko noći, kolonije su izabrane sledećeg dana, i izvršeno je prečišćavanje plazmida. Sekvence su potvrđene, i određeni bunarčići koji sadrže 15H6 VH i VL i 19B12 VH i VL sekvence, svaka u TOPO® vektoru, odabrani su za upotrebu kao izvorni vektori u kloniranju bez restrikcija.
ii. Kloniranje bez restrikcija u mlgG2a
Varijabilni regioni teškog i lakog lanca u TOPO® vektorima su pojačani postavljanjem PCR smeše na sledeći način za LC: 0,5 µl DNK šablona (miniprep izvorni vektor), 4 µl 15H6 VL direktnog prajmera, 4 µl 15H6 VL reverznog prajmera, 2 µl 10 mM dNTP, 20 µl 5x HF pufera, 1 µl PHUSION® polimeraze (F-549L, Thermo Scientific, 2 U/µl) i 68,5 µl vode. Reakciona smeša za kloniranje HC je postavljena na isti način, osim što su korišćeni direktni i reverzni prajmeri 15H6 VH. 19B12 PCR smeše su postavljene na isti način kao i 15H6 smeše, osim što su korišćeni prajmeri 19B12. Sekvence prajmera su bile sledeće:
15H6 VL direktni prajmer nukleotidne sekvence (SEQ ID NO: 144).
15H6 VL reverzni prajmer nukleotidne sekvence:
145).
15H6 VH direktni prajmer nukleotidne sekvence:
NO: 146).
15H6 VH reverzni prajmer nukleotidne sekvence:
(SEQ ID NO: 147).
19B12 VL direktni prajmer nukleotidne sekvence:
(SEQ ID NO: 148).
19B12 VL reverzni prajmer nukleotidne sekvence:
(SEQ ID NO: 149).
19B12 VH direktni prajmer nukleotidne sekvence: (SEQ ID NO: 150).
19B12 VH reverzni prajmer nukleotidne sekvence
(SEQ ID NO: 151).
Uslovi za PCR ciklus su bili sledeći:
98 °C tokom 30 sekundi
35 ciklusa od [98 °C tokom 15 sekundi, 68 °C tokom 30 sekundi, 72 °C tokom 35 sekundi]
72 °C tokom 10 minuta
Amplifikovani VH i VL su korišćeni kao prajmeri za pojačavanje DNK šablona postavljanjem PCR smeše na sledeći način za 15H6 LC: 1,25 µl šablona mlgG2a PRK vektorske DNK (razblaživanje miniprep 1:10), 0,5 µl 15H6 VL PCR proizvoda (100-200 ng/µl), 1 µl 10 mM dNTP, 10 µl HF pufera (5x), 1 µl PHUSION® polimeraze, i 35,75 µl vode. Smeša 15H6 HC PCR je postavljena na isti način, osim što je korišćen 15H6 VH PCR proizvod. PCR smeše 19B12 postavljene su na isti način, osim što su korišćeni PCR proizvodi 19B12.
Uslovi za PCR ciklus su bili sledeći:
98 °C tokom 30 sekundi
25 ciklusa od [98 °C tokom 15 sekundi, 68 °C tokom 30 sekundi, 72 °C tokom 4 minuta]
72 °C tokom 10 minuta
18 µl PCR reakcije je zatim prebačeno u novu epruvetu i digestirano sa 2 µl Dpnl (br. RO176L, NEB 20.000 U/ml) tokom 2 sata na 37 °C, uz periodično centrifugiranje epruvete.
30 µl kompetentnih NOVABLUE SINGLES™ kompetentnih ćelija (Novagen, 70181) transformisano je sa 1 µl Dpnl digesta u skladu sa uputstvom proizvođača. Ukratko, ćelije su odmrznute, dodata je DNK, i ćelije su inkubirane na ledu 5 minuta pre nego što su podvrgnute toplotnom šoku tokom 30 s, vraćene na led 2 min, pa je dodat SOC medijum. 25 µl ili 50 µl stavljeno je na ploče od 50 µg/ml koje sadrže karbenicilin i postavljeno na 37 °C preko noći. Kolonije su izabrane sledećeg dana, prečišćavanje plazmida izvršeno je putem miniprep, i sekvencirani su plazmidi.
iii. Prečišćavanje antitela
Automatizovano prečišćavanje iz supernatanta ćelija 293 je izvedeno na sistemu za rukovanje tečnostima Tecan Freedom EVO® 200 sa glavom MCA96 od 500 ml. Ukratko, IgG-ovi su uhvaćeni pomoću vrhova kolona koji su bili posebno upakovani sa 20 ml MABSELECT SURE™ smole (Glygen Corp., Kolumbija, Merilend i GE Healthcare, Pitsburg, Pensilvanija). Posle ispiranja sa 1x PBS pH 7,4, IgG su eluirani u 160 ml 50 mM fosforne kiseline, pH 3, i neutralisani sa 12 ml 20x PBS pH 11. Vrhovi kolona MABSELECT SURE™ su odstranjeni u 0,1 M NaOH i regenerisani sa 1x PBS pH 7,4 za uzastopnu upotrebu do 15 puta. Slično tome, Fab su uhvaćeni pomoću vrhova kolona pakovanih sa 20 ml GAMMABIND™ Plus smole (Glygen Corp i GE Healthcare) i potom isprani sa 1x PBS pH 7,4. Fab su eluirani u 190 ml 10 mM citrata, pH 2,9, i neutralisani sa 19 ml 0,4 M Tris pH 8,7. Vrhovi kolona GAMMABIND™ Plus su odstranjeni sa 6 M gvanidina i regenerisani sa 1x PBS pH 7,4 za uzastopnu upotrebu do 15 puta.
iv. Rekombinantna antitela 15H6 i 19B12 zadržavaju izvorne blokirajuće aktivnosti Sposobnost rekombinantnih antitela 15H6 i 19B12 da inhibiraju aktivnost huHtrA1-FL procenjena je upotrebom FRET testa blokiranja opisanog u odeljku C gore. Oba rekombinantna antitela zadržala su svoje izvorne blokirajuće aktivnosti kako je utvrđeno iz antitela izvedenih iz hibridoma (Sl.7A i 7B). Rekombinantno antitelo 15H6 imalo je IC50 od približno 0,7 nM, dok je rekombinantno antitelo 19B12 imalo IC50 od približno 1,2 nM, što je odražavalo aktivnost antitela izvedenih iz hibridoma (Sl.7A i 7B).
Primer 2: Humanizacija anti-HtrA1 antitela hibridoma 15H6 i 19B12
A. Humanizacija anti-HtrA1 antitela 15H6
Sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i varijabilnog regiona teškog lanca (VH) mišjeg 15H6 antitela (koje se takođe naziva m15H6) usklađene su sa sekvencama konsenzusa humanih antitela, i kapa I humanog konsenzusa lakog lanca (hur1) i podgrupa I humanog konsenzusa teškog lanca (huVH1) identifikovani su kao najbliži humani okviri (Sl.
8A i 8B).
Hipervarijabilni regioni (HVR) lakog i teškog lanca m15H6 graftovanini su u hurl, odnosno huVH1 okvire konsenzusnog akceptora, Kunkelovom mutagenezom (pogledajte, na primer, Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382, 1987) koristeći odvojene oligonukleotide za svaki hipervarijabilni region da bi generisali klon antitela h15H6.v1 (Sl.
8A i 8B). U ovom procesu, položaji 24-34 u HVR-L1, 50-56 u HVR-L2 i 89-97 u HVR-L3 m15H6 VL su graftovani na konsenzusni akceptor hurl, a položaji 26-35 u HVR-H1, 49-65 u HVR-H2 i 95-102 u HVR-H3 m15H6 VH su graftovani na huGl konsenzusni akceptor. Položaji 46, 47 i 49 u okvirnom regionu 2 lakog lanca (FR-L2) i položaji 67, 69, 71 i 93 u okvirnom regionu 3 teškog lanca (FR-L3) takođe su bili uključeni u proces humanizacije jer su Fute i Vinter analizirali kristalne strukture kompleksa antitela i antigena, i otkrili da su ovi položaji deo ostataka okvira koji deluju kao Vernijeova zona, što može prilagoditi strukturu HVR-a i fino se prilagoditi da odgovara antigenu (Foote et al., J Mol. Biol. 224:487-499, 1992) (Sl. 8A-8B). Afinitet vezivanja m15H6 i h15H6.v1 u Fab formatu za humani i mišji HrtA1 izmeren je analizom vezivanja površinske plazmonske rezonance (SPR) BIACORE™, kao što je opisano u pododeljku ii odeljka C ispod (Sl.9A-9D). Tabela 5 sumira rezultate ove analize.
Tabela 5: Analiza kinetičkog vezivanja m15H6 i h15H6.v1 za HtrA1
Da bi se dalje procenila važnost mišjih Vernijeovih ostataka u h15H6.v1, ovo antitelo je izloženo na fagu, i pojedinačni mišji Vernijeovi ostaci (LC: P46, W47, S49; HC: A67, L69, A71 i T93) zamenjeni su humanim ostacima (LC: L46, L47, Y49; HC: V67, I69, R71 i A93) da bi se generisale varijante tačkaste mutacije. Svih 7 varijanti bilo je podvrgnuto kompetitivnom ELISA testu faga protiv humanog ili mišjeg HtrA1 radi određivanja afiniteta vezivanja (u pogledu IC50 faga, pogledajte pododeljak i odeljka C ispod). Rezultati su pokazali da je varijanta LC-P46L potpuno ukinula vezivanje h15H6.v1 i za humani i za mišji HtrA1. Varijanta LC-S49Y smanjila je vezivanje za humani i mišji HtrA1 oko 10 puta (Sl.
10A i 10B). HC varijante HC-A67V i HC-T93A su uticale samo na vezivanje za mišji HtrA1, ali ne i za humani HtrA1 (Sl.10A i 10B). Ostale varijante, LC-W47L, HC-L69I i HC-A71R, nisu pokazale značajniji pad vezivanja za humani i mišji HtrA1 (Sl.10A i 10B). Stoga je klon antitela h15H6.v1 dalje projektovan dodavanjem sledećih mutacija: LC-V47L, HC-L69I i HC-A71R za generisanje klona antitela h15H6.v2 (pogledajte Sl.8A i 8B).
Analiza hemijske stabilnosti klona antitela h15H6.v2 identifikovala je nekoliko potencijalno nestabilnih ostataka ili parova ostataka u HVR-ima: W91 u HVR-L3 (oksidacija), N94 P95 u HVR-L3 (odsecanje) i D55 G56 u HVR-H2 (izomerizacija). Pogledajte, npr. primer 4 ispod. Da bi se rešila oksidacija W91 u HVR-L3, generisane su 2 varijante (LC-W91Y i LC-W91L) koje su proizvedene kao Fab za BIACORE™ SPR analizu vezivanja. Rezultati, rezimirani u Tabeli 6 ispod, pokazali su da je položaj LC-W91 važan za afinitet vezivanja, a supstitucije su uticale na vezivanje za humani i mišji HtrA1 za oko 20-50 puta (Sl.11A i 11B).
Tabela 6: Analiza kinetičkog vezivanja h15H6.v2 LC-W91 varijanti za HtrA1
Za odsecanje na položajima LC-N94 LC-P95 HVR-L3, četiri varijante h15H6.v2 (LC-N94A LC-P95 (takođe se naziva AP), LC-N94E LC-P95 (takođe se naziva EP), LC-N94Q LC-P95 (takođe se naziva QP) i LC-N94S LC-P95 (takođe se naziva SP)) generisane su i proizvedene kao Fab za BIACORE™ analizu vezivanja. Rezultati su pokazali da su AP i EP varijante pokazale sličan afinitet vezivanja za humani HtrA1, a varijante QP i SP imale su približno 2-struko smanjenje afiniteta vezivanja za humani HtrA1 (Sl.12A-12B). Tabela koja rezimira rezultate ove analize prikazana je na Sl.12B.
Za izomerizaciju na ostacima HC-D55 HC-G56 HVR-H2, četiri varijante (HC-D55A HC-G56 (takođe se naziva AG), HC-D55E HC-G56 (takođe naziva EG), HC-D55S HC-G56 (takođe se naziva SG) i HC-D55 HC-G56A (takođe se naziva i DA)) generisane su i proizvedene kao Fab za BIACORE™ analizu vezivanja. Rezultati su pokazali da je samo EG varijanta pokazala uporediv afinitet vezivanja u poređenju sa humanim HtrA1, a ostale varijante na pozicijama teškog lanca 55 i/ili 56 imale su 2-struko do 3-struko smanjenje afiniteta vezivanja za humani HtrA1 (Sl. 13A i 13B). Tabela koja rezimira rezultate ove analize prikazana je na Sl.13B.
Na osnovu ovih rezultata, obe varijante AP (HVR-L3) i EG (HVR-H2) uvedene su u sekvencu klona antitela h15H6.v2 da bi se generisao klon antitela h15H6.v2.APEG (takođe poznat kao h15H6.v3 ili AP_EG) (pogledajte Sl. 8A i 8B). Ovaj klon je takođe upoređen sa nekoliko drugih varijanti h15H6.v2, uključujući LC-N94E LC-P95 HC-D55E HC-G56 (takođe se naziva EP_EG); LC-N94Q LC-P95 HC-D55E HC-G56 (takođe se naziva QP_EG); i LC-N94S LC-P95 HC-D55E HC-G56 (takođe se naziva SP_EG). BIACORE™ SPR analiza je pokazala da je h15H6.v2.APEG zadržao sličan afinitet vezivanja u poređenju sa h15H6.v2 (Sl. 14A i 14B). Tabela koja rezimira rezultate ove analize prikazana je na Sl.
14B. Sposobnost ovih varijanti da blokiraju aktivnost HtrA1 određena je korišćenjem testa blokiranja na bazi FRET opisanog u primeru 1 (Sl. 14C i 14D). pI ovih varijanti u Fab formatu je takođe određen pomoću softverskog programa SMACK (pogledajte, npr. Sharma et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111: 18601, 2014) i prikazan je u Tabeli 7 u poređenju sa anti-VEGF Fab ranibizumabom (LUCENTIS®).
Tabela 7: pl H15H6.v2 varijanti
B. Humanizacija anti-HrtA1 antitela hibridoma 19B12
Aminokiselinske sekvence VL i VH mišjeg antitela 19B12 (takođe se naziva i m19B12) bile su poravnate sa sekvencama humanog konsenzusa, a identifikovani su humani konsenzus lakog lanca kapa IV (huk4) i humani konsenzus teškog lanca podgrupa III (huVH3) kao najbliži humani okviri (Sl.15A-15B).
Hipervarijabilni regioni lakog lanca i teškog lanca m19B12 graftovani su u akceptorske okvire konsenzusa hur4, odnosno huVH3, Kunkelovom mutagenezom, koristeći odvojene oligonukleotide za svaki hipervarijabilni region, da bi se proizvela direktna HVR graftovana varijanta, ovde navedena kao klon antitela h19B12. v1. U ovom procesu, položaji 24-34 u HVR-L1, 50-56 u HVR-L2 i 89-97 u HVR-L3 19B12 VL graftovani su za akceptor konsenzusa hur4, a položaji 26-35 u HVR-H1, 50-65 u HVR-H2 i 95-102 u HVR-H3 iz 19B12 VH graftovani su na huGIII akceptor konsenzusa (Sl.15A-15B).
Afinitet vezivanja m19B12 i h19B12.v1 (u Fab formatu) određen je korišćenjem BIACORE™ SPR (Sl. 16A-16D) koristeći pristup opisan u pododeljku ii odeljka C ispod. Rezultati ove analize su rezimirani u Tabeli 8 ispod. Ravnotežna konstanta vezivanja (KD) h19B12.v1 za humani HtrA1 poboljšala se približno 2-struko nakon humanizacije (Tabela 8) u poređenju sa m19B12.
Tabela 8: Analiza kinetičkog vezivanja m19B12 ili h19B12.v1 za HtrA1
i. Kompetitivni ELISA test faga za određivanje IC50 faga
MAXISORP™ mikrotitarske ploče su obložene humanim HtrA1-PD-His sa 2 µg/ml u PBS-u tokom 2 sata, a zatim su blokirane PBST puferom (0,5% BSA i 0,05% TWEEN®20 u PBS-u) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Fag prečišćen iz supernatanta kulture inkubiran je sa serijski razblaženim humanim ili mišjim HtrA1 u PBST puferu na mikrotitarskoj ploči za kulturu tkiva tokom 1 sata, nakon čega je 80 µl smeše prebačeno u bunarčiće obložene humanim HtrA1 tokom 15 minuta da bi se uhvatili nevezani fagi. Ploča je isprana PBT puferom (0,05% TWEEN®20 u PBS-u), i dodato je HRP konjugovano anti-M13 antitelo (Amersham Pharmacia Biotech) (1:5000 u PBST puferu) tokom 40 minuta. Ploča je isprana PBT puferom i razvijena dodavanjem supstrata tetrametilbenzidina (Kirkegaard and Perri Laboratories, Gaithersburg, MD). Apsorbanca na 450 nm je prikazana u funkciji ciljne koncentracije u rastvoru za određivanje IC50 faga. Ovo je korišćeno kao procena afiniteta za Fab klon prikazan na površini faga.
ii. Određivanje afiniteta antitela pomoću BIACORE™
Da bi se odredio afinitet vezivanja anti-HtrA1 Fab pomoću kinetike jednog ciklusa, korišćeno je (SPR) merenje pomoću instrumenta BIACORE™ T100. Ukratko, čip CM5 serije S je aktiviran reagensima 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) prema uputstvu dobavljača, i streptavidin (Pierce) je kuplovan da bi se postiglo približno 2500 jedinica odgovora (RU), pa su neproreagovale grupe blokirane 1 M etanolaminom.
Za kinetička merenja, biotinilovani humani ili mišji HtrA1-PD-His je prvo injektovan pri protoku od 10 µl/min da bi se uhvatilo približno 150 RU u 3 različite protočne ćelije (FC), osim FC1 (koji je služio kao referenca), a zatim 5-struka serijska razblaženja anti-HtrA1 Fab u puferu HBS-P (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,005% surfaktanta P20) od malog (0,48 nM) do velikog (300 nM) (protok: 30 µl/min) jedno za drugim u istom ciklusu bez regeneracije između injektovanja. Senzorgram je snimljen i pregledan, i oduzet je pufer pre procene pomoću softvera za procenu BIACORE™ T100 (verzija 2.0). Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon.
Primer 3: Afinitetno sazrevanje klona antitela na HtrA1 h15H6.v2
A. Afinitetno sazrevanje h15H6.v2 NNK izgradnja i panovanje biblioteke
Da bi se dalje poboljšao afinitet klona anti-HtrA1 antitela h15H6.v2, biblioteke faga su konstruisane od varijante h15H6.v2 u formatu ćilibarnog Fab za jednovalentni Fab prikaz faga sa ostatkom bilo HVR lakog lanca (tj. HVR-L1, HVR-L2, i HVR-L3) ili ostatkom HVR teškog lanca (tj. HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3) ostaci su randomizovani korišćenjem NNK degenerisanog kodona koji kodira svih 20 aminokiselina sa 32 kodona (pogledajte, na primer, Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(12): 5381-5383, 1992). Biblioteke su dizajnirane da omoguće jednu NNK mutaciju u svakom od tri HVR-a lakog ili teškog lanca. Dobijena biblioteka DNK je elektroporisana u ćelije E. coli XL1, dajući približno 10<9>transformanata. U nekim slučajevima su korišćene biblioteke meke randomizacije i NNK epistaze, kako je opisano u PCT/US2015/055672. Biblioteke faga su inkubirane sa 750 mM NaCl u SUPERBLOCK™ PBS puferu (Pierce) i 0,05% TWEEN® 20 tokom 30 minuta, a zatim primenjene na biotinilovani HtrA1-His oznaka uhvaćen neutravidinom za prvi ciklus panovanja radi smanjenja nespecifične naelektrisane interakcije između HtrA1 i faga. U naredna dva ciklusa korišćenjem opadajuće koncentracije biotinilovanog huHtrA1-PD-His antigena sa 1000x nebiotinilovanog HtrA1 kao konkurenta u rastvoru za povećanje strogosti selekcije. Pogledajte sliku 17 za šematski dijagram strategije panovanja.
B. Dubinsko sekvenciranje biblioteka afinitetnog sazrevanja h15H6.v2
Za duboko sekvenciranje, fagemidna dvolančana DNK izolovana je iz ćelija E. coli XL-1 koje nose fagemidne vektore iz početne biblioteke faga i iz trećeg ciklusa selekcije. Prečišćena DNK je korišćena kao obrazac za ograničeni ciklus amplifikacije VL i VH regiona na bazi PCR korišćenjem PHUSION® DNK polimeraze (New England Biolabs). PCR proizvodi su prečišćeni ekstrakcijom agaroznog gela i prečišćavanjem (Qiagen Gel Extraction Kit). Eluirana DNK amplikona je korišćena kao osnova za pripremu biblioteke sa dubokim sekvenciranjem standardnim postupcima pripreme biblioteke Illumina, koristeći TRUSEQ™ komplet za pripremu uzoraka DNK (Illumina). Biblioteke povezane sa adapterom bile su podvrgnute jednom ciklusu PCR i sekvencirane na Illumina MISEQ®, koristeći sekvenciranje sparenih krajeva sa veličinom umetka od 200 bp ili 300 bp, kako je prikladno da pokrije čitavu dužinu amplikona.
C. Analiza dubinskog sekvenciranja biblioteka afinitetnog sazrevanja h15H6.v2 Podaci sekvenciranja su analizirani pomoću statističkog programskog jezika R (pogledajte, npr., R Core Team, R: A language and environment for statistical computing, 2013) i „ShortRead“ paket (pogledajte Morgan et al., Bioinformatics 25(19): 2607-2608, 2009). Kontrola kvaliteta (QC) je izvršena na identifikovanim HVR sekvencama, gde je svaka HVR sekvenca proverena u tačnoj dužini i dozvoljeno joj je da nosi samo do jedne NNK mutacije i bez mutacije koja nije NNK. Matrice težine položaja generisane su izračunavanjem učestalosti svih mutacija svakog nasumičnog položaja. Koeficijenti obogaćenja za svaku mutaciju izračunati su deljenjem frekvencije date mutacije na datom položaju u sortiranom uzorku učestalošću iste mutacije u nesortiranom uzorku, kao što je prethodno opisano (Fowler et al., Nature Methods 7(9): 741-746, 2010). Toplotne karte koje prikazuju koeficijente obogaćenja za svaku mutaciju u položaju HVR lakog lanca i položaju HVR teškog lanca prikazane su na Sl.18A, odnosno 18B.
Pojedinačne mutacije iz biblioteka lakog lanca ili teškog lanca sa visokim koeficijentom obogaćivanja odabrane su da se sintetišu za kloniranje u Fab ekspresioni konstrukt sisara koji sadrži oznaku Flag za generisanje fuzionih proteina Fab-Flag oznaka. Plazmidi koji kodiraju teški ili laki lanac su transficirani u 293T ćelije za ekspresiju od 30 ml i Fab su prečišćeni pomoću anti-Flag kolone.
Prečišćeni Fab koji sadrže pojedinačne mutacije korišćeni su za određivanje afiniteta vezivanja korišćenjem BIACORE™ SPR analize (pogledajte odeljak D ispod). Podaci o afinitetu za pojedinačne mutacije su sumirani u Tabeli 9. Brzina disocijacije se kretala od oko 0,0013 do oko 0,004, u poređenju sa vrednošću od oko 0,0016 za h15H6.v2. Varijanta LC3 (LC-N31E) poboljšala je brzinu disocijacije 2 do 3 puta u odnosu na 15H6.v2.
Tabela 9: Afinitet vezivanja mutacija h15H6.v2 identifikovanih mutagenezom dubokog skeniranja
D. Kombinacija izabranih varijanti za dalje poboljšanje afiniteta
Većina pojedinačnih mutacija iz NNK biblioteke teškog lanca ili lakog lanca nije poboljšala afinitet vezivanja za HtrA1 preko matičnog klona h15H6.v2 (Tabela 9). Varijante sa najmanjom brzinom disocijacije odabrane su od varijanti lakog lanca (LC3, LC4 i LC7) i teškog lanca (HC1, HC2, HC3 i HC5) kako bi se generisali kombinovani mutanti. Ovi kombinovani mutanti su uključivali i varijantu lakog lanca i varijantu teškog lanca. Izvršena je BIACORE™ kinetička analiza (kako je opisano u odeljku C ispod) primenom kombinovanih mutanata. Kombinovani mutanti LC3.HC3, LC3.HC1 i LC7.HC2 su 2-3 puta poboljšali poboljšanje afiniteta u odnosu na matični Fab (h15H6.v2) (Tabela 10).
Tabela 10: Kinetička analiza vezivanja kombinovanih mutanata za HtrA1
Zatim su LC mutanti (LC37 = LC3_LC7, LC347 = LC3_LC4_LC7) i HC mutanti (HC13 = HC1_HC3, HC23 = HC2_HC3) dalje kombinovani. Ovi mutanti su dalje modifikovani ugrađivanjem varijanti HVR-L3 N94A i HVR-H2 D55E (tj. AP_EG, pogledajte primer 2) da bi se izbeglo samocepanje i deamidacija za kinetičku analizu afiniteta.
APEG.LC3.HC1, APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4), APEG.LC37.HC13, APEG.LC37.HC23, APEG.LC347.HC13 i APEG.LC347.HC23 su bili glavni klonovi, sa poboljšanjima od 3 do 5 puta u proseku, u odnosu na h15H6.v2 (Sl. 20). VL i VH aminokiselinske sekvence ovih varijanti prikazane su na Sl. 21A, odnosno 21B. Sekvence ovih klonova su analizirane potencijalnim rizikom od oksidacije na HVR-L3 W91 koristeći analizu kompjuterskom simulacijom (Sharma et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:18601, 2014). APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4), APEG.LC37.HC13 i APEG.LC347.HC13 su rangirani sa ekvivalentnim rizikom kao h15H6.v3. Drugi imaju veći rizik nego h15H6.v2.
E. Određivanje afiniteta Fab pomoću BIACORE® SPR
Da bi se odredio afinitet vezivanja odabranih varijanti Fab za HtrA1, izvršeno je SPR merenje pomoć instrumentau BIACORE™ T200. Ukratko, senzorski čip CM5 serije S aktiviran je reagensima 1-EDC i NHS prema uputstvu dobavljača, a anti-His antitelo je povezano da bi se postiglo 200-300 jedinica odgovora (RU), a zatim su blokirane neizreagovale grupe sa 1 M etanolaminom. Za kinetička merenja, približno 5 nM huHtrA1-PD-His je prvo injektovano pri protoku od 10 pl/min da bi se uhvatilo približno 100 RU u 2 različite protočne ćelije (FC), osim FC1 (koja je bila referentna). Zatim su injektovana 5-struka serijska razblaženja Fab u HBS-P puferu (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,005% surfaktanta P20) od malog (0,8 nM) do velikog (50 nM) (protok: 30 µl/min). Odgovori vezivanja za HtrA1 korigovani su oduzimanjem RU od prazne protočne ćelije. Senzorgram je snimljen i pregledan, i oduzet je pufer pre procene pomoću softvera za procenu BIACORE® T200 (verzija 2.0). Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon.
F. Inhibitorna aktivnost varijanti h15H6.v2 u testu blokiranja na bazi HtrA1 FRET (test blokiranja H2-Opt)
Odabrane afinitetno sazrele varijante h15H6.v2 su testirane na sposobnost inhibicije aktivnosti HtrA1. Izvršeni su testovi blokiranja zna bazi in vitro FRET upotrebom H2-Opt supstrata ((Mca)IRRVSYSF(Dnp)KK). Testovi blokiranja H2-Opt izvedeni su kako je opisano u Primeru 3 US publikacije patentne prijave br. 2013/0129743A1, koja je ovde u celosti uključena kao referenca. Ukratko, peptid H2-Opt (Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK) (SEQ ID NO: 152), prvobitno opisan kao supstrat za HtrA2 (pogledajte, na primer, Martins et al., J. Biol. Chem. 278:49417-27, 2003), sintetisan je na Fmoc-Lys(Boc)-wang smoli primenom standardnih postupaka kuplovanja sa HBTU. Fmoc-Lys(DNP)-OH (Anaspec) je ugrađen u položaj P5’. Peptid je sintetisan do P5 (Mca, 7-metoksi-kumarin, Aldrich), a zatim je odvojen od čvrstog nosača koristeći trifluorsirćetnu kiselinu, triizoproplisilan i vodu tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Peptid je istaložen iz etil etra, ekstrahovan sirćetnom kiselinom, acetonitrilom, vodom, i liofilizovan. Sirovi obeleženi peptid je rastvoren i prečišćen na reversno faznoj preparativnoj koloni C18 upotrebom acetonitrila/vode. Prečišćene frakcije su objedinjene, liofilizovane i analizirane tečnom hromatografijom/masenom spektrometrijom (PE/Sciex), i utvrđeno je da su u skladu sa njihovom izračunatom masom.
HtrA1 je inkubiran u crnim pločama sa optičkim dnom sa 96 bunarčića (Nalge Nunc Int., Rochester, NY) sa anti-HtrA1 antitelima serijski razblaženim u puferu za ispitivanje (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 0,25% CHAPS) tokom 20 min na 37 °C. 10 mM osnovni rastvor peptidnog supstrata Mca-IRRVSYSF(Dnp)KK (SEQ ID NO: 152) (H2-Opt) u DMSO razblažen je u vodi na 12,5 µM, prethodno zagrejan na 37 °C i zatim dodat u reakcionu smešu. Porast fluorescentnog signala (ekscitacija 328 nm, emisija 393 nm) izmeren je na čitaču mikroploča SPECTRAMAX® M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.) i određene su linearne brzine cepanja H2-Opt (mRFU/min).
Sl. 22A prikazuje rezime rezultata tri nezavisna eksperimenta H2-Opt testa izvedena u osnovi kako je gore opisano. Većina klonova je imala IC50 vrednosti u opsegu od oko 0,4 nm do oko 0,5 nM, u poređenju sa oko 0,39 nM za h15H6.v2. Anti-HtrA1 antitelo APEG.LC3.HC3 (takođe se naziva i h15H6.v4) pokazalo je najbolju IC50 vrednost sa oko 0,386 nM u ovom testu (Sl. 22A). Sl. 22B prikazuje reprezentativni prikaz iz ove analize. Generalno, afinitetno sazrele varijante h15H6.v2 pokazale su poboljšanu maksimalnu inhibiciju HtrA1 u poređenju sa h15H6.v2 (Sl. 22A), sa maksimalnim vrednostima inhibicije u rasponu od oko 78% do oko 96%.
Test blokiranja H2-Opt na bazi FRET je korišćen za procenu sposobnosti različitih formata antitela u varijantama h15H6.v2, uključujući h15H6.v4, da inhibiraju aktivnost HtrA1. H2-Opt test izveden je u osnovi kako je gore opisano, osim što su uslovi ispitivanja bili: Enzim 1 nM huHtrA1-PD, 1,25 µM H2-Opt supstrat, 50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 0,25% CHAPS. Rezultati su analizirani na osnovu relativnih fluorescentnih jedinica (RFU)/s brzine (50-1000 s) ili vrednosti RFU krajnje tačke na 2000 s. Sl.23A-23H prikazuju rezultate primera nezavisnog eksperimenta koji upoređuje sposobnost h15H6.v2 u Fab formatu i h15H6.v4 u IgG ili Fab formatu da inhibiraju aktivnost huHtrA1-PD. Anti-HtrA1 antitelo YW505.94a (pogledajte WO2013/055988) služilo je kao pozitivna kontrola. Sl. 24A i 24B prikazuju rezime rezultata IC50, odnosno IC90, iz prvog skupa od tri nezavisna eksperimenta analizirana korišćenjem pristupa RFU/s. Sl. 25A i 25B prikazuju sažetak rezultata IC50, odnosno IC90, iz drugog skupa od tri nezavisna eksperimenta analizirana korišćenjem pristupa RFU/s ili RFU krajnje tačke za h15H6.v4 Fab.
G. Sposobnost blokiranja APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4) u testu aktivnosti na bazi masene spektrometrije
Sposobnost APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4) da inhibira cepanje netaknutog supstrata pune dužine (α-kazein) posredstvom huHtrA1-PD procenjena je korišćenjem testa aktivnosti na bazi masene spektrometrije (MS). U ovom primeru, anti-HtrA1 antitelo h15H6.v4 je upoređeno sa inhibitorom malog molekula HtrA proteaza, ucf-101, koji je opisan kao antagonist HtrA2 (takođe poznat kao Omi) (Cilenti et al., J. Biol. Chem. 278(13):11489-11494, 2003). Oznake tandemske mase (TMT) za označavanje izobarske mase su korišćene za MS kvantifikaciju cepanja α-kazeina pomoću HtrA1 u prisustvu h15H6.v4 ili ucf-101. α-Kazein ima tri P1’ostatka koji se mogu cepati pomoću HtrA1: Ser72, Thr95 i Ser157.
TMTDUPLEX™ reagensi za označavanje izobarske mase su korišćeni za različito obeležavanje standarda α-kazeina i uzoraka za određivanje netaknutog α-kazeina. TMTDUPLEX™ reagensi su skupovi izobarskih jedinjenja (tj. iste mase i strukture, takođe nazvani izotopomeri) koja su NHS-aktivirana za kovalentno, nepovratno obeležavanje grupa primarnih amina (-NH2). Svaki izobarski reagens sadrži različit broj teških izotopa u ostatku oznake masenog reportera, što dovodi do jedinstvene mase reportera tokom tandem MS/MS za identifikaciju uzorka i relativnu kvantifikaciju.
100 mM trietilamonijum bikarbonat, 100 nM huHtrA1, 100 µg/ml α-kazeina i inhibitor (tj. ucf-101 ili h15H6.v4) inkubirani su (konačna zapremina 20 µl) na 37 °C tokom 18 sati (digestovani rastvor). Odvojeno, slični rastvor je napravljen bez inhibitora i identično inkubiran (kontrolni rastvor). h15H6.v4 Fab je testiran u koncentraciji u rasponu od 3,12 nM do 100 nM, dok je pozitivni kontrolni inhibitor malog molekula ucf-101 testiran u koncentraciji od 2 nm do 250 nM.
Osnovni rastvori za tandemske masene oznake (TMTDUPLEX™) napravljeni su prema preporukama dobavljača (Thermo Fisher Scientific). U digestovani rastvor je dodato 5 µL TMT-126, a u kontrolni rastvor je dodato 5 µL TMT-127. Posle 1 h inkubacije na sobnoj temperaturi, gornji rastvori su kombinovani u jednakoj zapremini. Uzorci su pušteni na LC-MS i kvantifikovani fragmentacijom najintenzivnijih jonskih pikova korišćenjem disocijacije C-zamke više energije (HCD); odnos intenziteta reporter jona od 126/127 nakon fragmentacije korišćen je za određivanje koncentracije u digestovanom rastvoru.
Kriva titracije pokazala je da je test tačno kvantifikovao netaknuti α-kazein (Sl.26B). U ovom testu, h15H6.v4 Fab inhibira cepanje netaknutog α-kazeina posredstvom huHtrA1-PD sa IC50 od oko 45 nM (IC90 = oko 71 nM). Ova vrednost je značajno poboljšana u poređenju sa inhibitorom malog molekula ucf-101, koji je imao IC50 od 77 µM.
H. Sposobnost blokiranja h15H6.v2 afinitetno sazrelih varijanti u testu aktivnosti endogenog HtrA1
Procenjena je sposobnost afinitetno sazrelih varijanti h15H6.v2 da inhibiraju endogenu aktivnost HtrA1 na modelu zečjeg oka. Za test aktivnosti endogenog HtrA1 gena, kao izvor HtrA1 korišćeni su medijumi iz ćelija koje sekretuju HtrA1 (humane ćelije C32 melanoma). Pogledajte, npr. Ciferri et al. Biochem J. 18. septembar 2015, DOI: 10.1042/BJ20150601. Imajte na umu da u endogenom testu postoji približno 10 puta veća koncentracija HtrA1 u poređenju sa rekombinantnim HtrA1 H2-Opt testom (pogledajte, na primer, Sl. 28), i smatra se da to objašnjava različite vrednosti IC50 uočene u H2-Opt testovima koji koriste endogeni HtrA1 i rekombinantni HtrA1. Sl. 27A-27C prikazuju rezultate ispitivanja endogenog HtrA1. Konkretno, klon APEG.LC3.HC3 (h15H6.v4) imao je IC50 od oko 1,125 nM (Sl.27C), sa maksimalnom inhibicijom od oko 80,1%.
I. Rezime svojstava za odabrane varijante h15H6.v2
Kinetičko vezivanje i inhibitorna aktivnost odabranih derivata klona anti-HtrA1 antitela h15H6.v2 upoređivani su korišćenjem BIACORE SPR analize i ispitivanja aktivnosti H2-Opt na bazi FRET. Da bi se utvrdila maksimalna inhibicija, korišćene su pozitivne i negativne kontrole za određivanje 0% inhibicije (samo enzim, bez inhibitora) i 100% inhibicije (bez enzima). Rezultati ovog poređenja prikazani su na Sl.28.
Primer 4: Analiza molekulske procene anti-HtrA1 antitela
Klonovi anti-HtrA1 antitela h15H6.v2, h15H6.v2.APEG (takođe se naziva h15H6.v3) i APEG.LC3.HC3 (takođe poznati kao h15H6.v4) testirani su u analizama molekulske procene (MA) na svojstva stabilnosti. Takođe je testiran klon anti-HtrA1 antitela h19B12.v1. Ukratko, anti-HtrA1 antitela (1 mg/ml) testirana su na stres pod hemijskim uslovima sa AAPH (2,2-azobis(2-amidinopropan)dihidrohlorid), malim molekulom za koji je poznato da generiše slobodne radikale (pogledajte, na primer, Ji et al., J. Pharm. Sci.98 (12): 4485-4500, 2009), kao i pod termičkim uslovima pri promenljivoj pH vrednosti (dvonedeljni test toplotnog stresa na 40 °C, pH 5,5) (pogledajte, npr. Zhang et al., J. Chromatography A 1272:56-64, 2013).
Tabela 11 prikazuje poređenje između rezultata MA analize za h15H6.v2 i h15H6.v3. Značajno je da LC-W91 u HVR-L3 ima povećanu oksidaciju nakon AAPH stresa, i u h15H6.v2 i u h15H6.v3 (oko 84,5%, odnosno oko 86,4%). Tabela 12 prikazuje rezultate MA analize za h15H6.v4. Iznenađujuće je da je oksidacija na LC-W91 u HVR-L3 za h15H6.v4 smanjena u poređenju sa h15H6.v2 i h15H6.v3, samo sa 26,5% povećanja oksidacije nakon AAPH stresa u poređenju sa približno 84,5-86,4% povećanja oksidacije za h15H6.v2 i h15H6.v3. Ovo poboljšanje je bilo neočekivano, jer APEG.LC3.HC3 ima samo dve supstitucije u poređenju sa h15H6.v3, tj. HC-T28K u regionu FR-H1 i LC-N31E u HVR-L1, a obe su uvedene radi poboljšanja afiniteta, a nije se se očekivalo da nijedna od njih utiče na oksidaciju LC-W91. Antitelo h15H6.v4 korišćeno u ovoj MA analizi pripremljeno je postupkom prečišćavanja na jednoj koloni. Kada je ponovljena MA analiza za h15H6.v4, koristeći antitelo pripremljeno postupkom prečišćavanja na dve kolone, LC-W91 je pokazao da je nestabilan pod AAPH stresom. Veruje se da se rezultati procene AAPH stresa izvedene sa supstancom prečišćenom na dve kolone razlikuju od rezultata dobijenih korišćenjem supstance prečišćene na jednoj koloni, jer je prečišćena supstanca na jednoj koloni sadržala zagađivač koji je ometao procenu AAPH stresa.
Tabela 11: MA svojstva h15H6.v2 i h15H6.v3
Tabela 12: MA svojstva h15H6.v4 (APEG.LC3.HC3)
Tabela 13 prikazuje rezultate MA analize za klon anti-HtrA1 antitela h19B12.v1. Utvrđeno je da je HC-N52a HC-G53 u HVR-H2 nestabilan, sa porastom deamidacije od 49%. Shodno tome, očekuje se da supstitucije na ovim HVR-H2 položajima h19B12.v1 (npr. HC-N52aE, HC-N52aS, HC-N52aS i HC-N52a HC-G53A) poboljšaju stabilnost.
Tabela 13: MA svojstva h19B12.v1
Primer 5: Struktura h15H6.v4 Fab vezanog za HtrA1
Struktura h15H6.v4 Fab vezanog za HtrA1 određena je rendgenskom kristalografijom i elektronskom mikroskopijom. Rezultati su pokazali da epitop h15H6.v4 Fab HtrA1 formiraju prvenstveno aminokiseline koje čine zaokret LA petlje HtrA1.
Sinteza peptida.
Peptidi koji odgovaraju regionima proteina HtrA1 generisani su postupcima dobro poznatim u struci. Pogledajte, na primer Atherton, E., et al. (1978). J. Chem Soc. Chem. Commun. 13:537-539.
Kristalizacija:
Fab h15H6.v4 (1 ml) pri 10 mg/ml u 0,15 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,5 inkubiran je preko noći na 4 °C sa 1 mg peptida (3-struki molski višak peptida/proteina) koji sadrži aminokiseline u LA petlji HtrA1. Kompleks Fab-peptid je kristalisan upotrebom 2 M amonijum sulfata, 0,2 M kalijum acetata.
Rendgensko utačnjavanje:
Sakupljen je peptidni kristal h15H6.v4 Fab/HtrA1 i konzerviran za difrakcionu analizu potapanjem u krioprotektivni rastvor napravljen dodavanjem 30% glicerola u matičnu tečnost praćen naglim potapanjem u tečni azot. Podaci su prikupljeni na SSRL snopu zraka 12-2 i obrađeni pomoću XDS (Kabasch W (2010) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.
266:125-32). Molekulska zamena za kompleks Fab-peptid postignuta je korišćenjem Fab strukture kao sonde za pretragu u CCP4 (Winn MD et al. (2011) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67:235-42). Nakon utačnjavanja krutog tela, mogla se videti Fo-Fc gustina peptida. Deo ostataka domena HtrA1 proteaze iz petlje A ( ) (PDB 3TJO) je tada uklopljen u gustinu u osnovi kako je opisano u Emsley et al. (2010) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66:125-32.
Korišćeno je nekoliko ciklusa utačnjavanja u programu Phenix (Adams PD et al. (2010) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66:213-21). Poslednji ciklus utačnjavanja u programu Buster (Bricogne G et al. (2011) doveo je vrednosti R do R = 16,8%, Rfree = 19,8% 2,1 Å rezolucija.
Struktura elektronske mikroskopije (EM) Fab15H6.v4 vezanog za HtrA1
Za EM snimanje, 4 µl kompleksa HtrA1-hFab15H6.v4 inkubirano je 30 sekundi na kontinualnoj bakarnoj mreži sa ugljenikom od 400 meša sa svežim luminiscentnim pražnjenjem (Electron Microscopy Sciences). Posle inkubacije, uzorak je negativno obojen rastvorom 2% (m/V) uranil formata (SPI Supplies). Višak rastvora za bojenje je uklonjen Vatmanovim papirom, i rešetka je osušena na vazduhu. Uzorak HtrA1-Fab15H6.v4 je analiziran na Tecnai-12 BioTween (FEI) opremljenom LaB6 filamentom, i radio je na 120 keV u uslovima male doze. Slike su prikupljene pomoću CCD kamere od 4 k x 4 k (Gatan Inc.) pri nominalnom uvećanju od x 62.000 (2,22 Å po pikselu).27.346 čestica, veličine polja od 128 piksela, poluautomatski je odabrano, koristeći algoritam rojeva dostupan u okviru rutine e2dogpicker.py koja je uključena u distribuciju EMAN2 (Tang L et al. (2007) J. Chem.
Inf. Model. 47:1438-45). Zatim su ove čestice podvrgnute 2D klasifikaciji bez reference pomoću softverskog paketa Relion (Scheres SH (2012) J. Struct. Biol.180:519-30). S obzirom na fleksibilnost između HTRA1 trimera i vezanih Fab-ova, algoritam 3D klasifikacije Relion korišćen je za generisanje pet 3D volumena koristeći kao polazni model kristalnu strukturu HtrA1 trimera (PDB ID 3TJO) niskopropusno filtriranu do rezolucije od 60 Å. Svaki od ovih volumena je konačno utačnjen korišćenjem algoritma Refine3D u softverskom paketu Relion. Atomske gustine trimera HTRA1 i kristalna struktura Fab15H6.v4 uklopljene su u EM gustinu koristeći algoritam uklapanja u mapu u sistemu Chimera (Pettersen EF et al., 2004). J. Comput. Chem.25:1605-12 (2004).
Validacija strukture Fab15H6.v4 Fab vezanog za HtrA1 primenom supstitucije alanina
Gore opisane strukturne studije pokazale su da Fab15H6.v4 Fab blisko interaguje sa petljom „A“ proteina HtrA1. Da bi se to potvrdilo, sintetisan je peptid koji odgovara ostacima 190-201 humane sekvence HtrA1 (gde numeracija odgovara numeraciji prekursorskog proteina) i testiran je na vezivanje za h15H6.v4 Fab koristeći površinsku plazmonsku rezonancu (SPR), kako je opisano gore. Peptid (LA-pep1) pokazao je snažnu interakciju vezivanja za 15H6.v4 Fab, pošto je imao vrednost KD od 0,4 nM. Pogledajte Tabelu 14.
Supstitucije alanina u ovoj peptidnoj sekvenci smanjuju (LA-pep2, LA-pep5) ili potpuno ukidaju (LA-pep3, LA-pep4, LA-pep5) vezivanje za 15H6.v4 Fab. Ovi biofizički rezultati su u skladu sa gore opisanim strukturnim studijama i na Sl.32A i 32B i pokazuju da vezujući epitop za 15H6.v4 formiraju prvenstveno aminokiseline koje čine zaokret LA petlje HtrA1.
Nasuprot tome, YW505.94 Fab se nije vezao za LA-pep1, niti za bilo koji od mutantnih oblika (Tabela 14). To ukazuje na to da, uprkos činjenici da se YW505.94 Fab i h15H6.v4 međusobno takmiče u vezivanju za HtrA1, epitopi ova dva Fab-a su različiti. Epitop YW505.94 Fab centriran je na petlje B i C, dok se epitop 15H6.v4 Fab uglavnom sastoji od vrha LA petlje.
Iako nije predviđeno da se ovaj pronalazak veže za neki određeni mehanizam, moguće je da bliska interakcija između h15H6.v4 i LA petlje HtrA1 objašnjava značajno poboljšani afinitet i potentnost ovog antitela u poređenju sa YW505.94.
Tabela 14: Peptidi HtrA1 petlje A (LA) koji se vezuju za 15H6.v4 Fab i YW505.94 Fab

Claims (27)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Izolovano monoklonsko, humanizovano antitelo koje specifično vezuje HtrA1, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22.
2. Antitelo prema zahtevu 1, pri čemu, antitelo je fragment antitela koji se vezuje za HtrA1.
3. Antitelo prema zahtevu 2, pri čemu, antitelo je fragment antitela izabran iz grupe koja se sastoji od fragmenata Fab, Fab’-SH, Fv, scFv i (Fab’)2.
4. Antitelo prema zahtevu 2, pri čemu, fragment antitela je Fab.
5. Antitelo prema zahtevu 4, pri čemu Fab sadrži skraćenje u gornjem delu pregiba konstantnog regiona teškog lanca.
6. Antitelo prema zahtevu 5, pri čemu se konstantni region teškog lanca završava na položaju 221 (EU numeracija).
7. Antitelo prema bilo kom od zahteva 2-6, pri čemu antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 160.
8. Antitelo prema bilo kom od zahteva 2-7, pri čemu antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 159.
9. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1-8, pri čemu antitelo je bispecifično antitelo.
10. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema bilo kom od zahteva 1-9.
11. Postupak za proizvodnju antitela, pri čemu postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži vektor sa izolovanom nukleinskom kiselinom prema zahtevu 10, i rekuperovanje antitela iz ćelije domaćina ili medijuma kulture ćelije domaćina.
12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1-9 i dalje sadrži najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, pomoćnu supstancu ili razblaživač.
13. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 12, pri čemu, kompozicija je liofilizovana.
14. Terapeutska formulacija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1-9 i antagonist faktora D, pri čemu, antagonist faktora D je anti-faktor D antitelo.
15. Terapeutska formulacija prema zahtevu 14, pri čemu, anti-faktor D antitelo je lampalizumab.
16. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1-9 za upotrebu kao lek.
17. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1-9 za upotrebu u lečenju poremećaja povezanih sa HtrA1 ili očnog poremećaja, pri čemu je poremećaj povezan sa HtrA1 senilna degeneracija makule (AMD), dijabetička retinopatija, retinopatija nedonoščadi, ili polipoidna horoidalna vaskulopatija.
18. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 17, pri čemu, poremećaj povezan sa HtrA1 ili očni poremećaj je senilna degeneracija makule (AMD), dijabetička retinopatija, retinopatija nedonoščadi, ili polipoidna horoidna vaskulopatija.
19. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 17 ili 18, pri čemu, poremećaj povezan sa HtrA1 ili očni poremećaj je rani suvi AMD, srednje suvi AMD ili uznapredovali suvi AMD.
20. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 19, pri čemu, uznapredovali suvi AMD je geografska atrofija.
21. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 16-20, pri čemu je antitelo formulisano za primenu sa antagonistom faktora D, pri čemu, antagonist faktora D je antifaktor D antitelo.
22. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 21, pri čemu se anti-faktor D antitelo daje sekvencijalno.
23. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 21, pri čemu, anti-faktor D antitelo je lampalizumab.
24. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 17-23, pri čemu se antitelo primenjuje intravitrealno, okularno, intraokularno, jukstaskleralno, subtenonalno, superhoroidno ili lokalno.
25. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 24, pri čemu se antitelo daje intravitrealno injekcijom.
26. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 17-24, pri čemu se antitelo daje sistemom isporuke sa produženim delovanjem.
27. Antitelo za upotrebu prema zahtevu 26, pri čemu, sistem za isporuku sa produženim delovanjem je čvrsti implantat na bazi PLGA ili sistem za isporuku u obliku implantata.
RS20210613A 2015-10-30 2016-10-27 Anti-htra1 antitela i postupci za njihovu primenu RS61871B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562248871P 2015-10-30 2015-10-30
US201662345669P 2016-06-03 2016-06-03
US201662411113P 2016-10-21 2016-10-21
EP16794157.4A EP3368578B1 (en) 2015-10-30 2016-10-27 Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof
PCT/US2016/059110 WO2017075212A1 (en) 2015-10-30 2016-10-27 Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61871B1 true RS61871B1 (sr) 2021-06-30

Family

ID=57256463

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210613A RS61871B1 (sr) 2015-10-30 2016-10-27 Anti-htra1 antitela i postupci za njihovu primenu

Country Status (33)

Country Link
US (5) US10421821B2 (sr)
EP (2) EP3922649B1 (sr)
JP (2) JP6750010B2 (sr)
KR (2) KR102440160B1 (sr)
CN (2) CN115160439A (sr)
AU (2) AU2016344399B2 (sr)
BR (1) BR112018007703A2 (sr)
CA (2) CA3001362C (sr)
CL (3) CL2018001139A1 (sr)
CO (1) CO2018005393A2 (sr)
CR (1) CR20180296A (sr)
DK (1) DK3368578T3 (sr)
ES (1) ES2870141T3 (sr)
HR (1) HRP20210736T1 (sr)
HU (1) HUE054093T2 (sr)
IL (3) IL295097A (sr)
LT (1) LT3368578T (sr)
MA (1) MA43113B1 (sr)
MX (2) MX395572B (sr)
MY (1) MY196448A (sr)
NZ (1) NZ741780A (sr)
PE (1) PE20181009A1 (sr)
PH (2) PH12022550450A1 (sr)
PL (1) PL3368578T3 (sr)
PT (1) PT3368578T (sr)
RS (1) RS61871B1 (sr)
RU (2) RU2750285C2 (sr)
SG (2) SG10202001808VA (sr)
SI (1) SI3368578T1 (sr)
TW (2) TWI747850B (sr)
UA (1) UA123773C2 (sr)
WO (1) WO2017075212A1 (sr)
ZA (2) ZA201802382B (sr)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3003647A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 Genentech, Inc. Anti-factor d antibody formulations
NZ741780A (en) 2015-10-30 2019-11-29 Genentech Inc Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof
EP4036120A1 (en) * 2015-10-30 2022-08-03 F. Hoffmann-La Roche AG Hinge modified antibody fragments and methods of making
WO2017222914A1 (en) 2016-06-21 2017-12-28 Inception 4, Inc. Carbocyclic prolinamide derivatives
CN109476637B (zh) 2016-06-21 2022-02-01 奥瑞恩眼科有限责任公司 杂环脯氨酰胺衍生物
CR20180606A (es) 2016-07-01 2019-02-14 Hoffmann La Roche Oligonucleótidos antisentido para modular la expresión de htra1
CN118980816A (zh) 2017-12-21 2024-11-19 豪夫迈·罗氏有限公司 Htra1 rna拮抗剂的伴随诊断
TW202039585A (zh) * 2018-11-16 2020-11-01 美商雙子治療公司 靶向htra1之基於抗體之療法及使用方法
CA3143522A1 (en) * 2019-06-26 2020-12-30 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Egfr antigen binding fragments and compositions comprising same
CA3174680A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
CN118339187A (zh) * 2021-12-31 2024-07-12 上海宏成药业有限公司 抗pd-1抗体及其用途
EP4673478A2 (en) * 2023-02-28 2026-01-07 Kodiak Sciences Inc. Antibodies to htra1 and conjugates thereof

Family Cites Families (230)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
CA1188246A (en) 1981-08-31 1985-06-04 Jerry L. Gregory Immobilized microbe recycle apparatus
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
IE61148B1 (en) 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
FI903489A0 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Ligander med en enda sektion, receptorer innehaollande naemnda ligander, foerfaranden foer deras framstaellning samt anvaendning av liganderna och receptorerna.
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
EP0451221B1 (en) 1989-08-31 1994-10-12 City Of Hope Chimeric dna-rna catalytic sequences
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
EP0497875B1 (en) 1989-10-24 2000-03-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2' modified oligonucleotides
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DE69032425T2 (de) 1990-05-11 1998-11-26 Microprobe Corp., Bothell, Wash. Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
ES2083593T3 (es) 1990-08-03 1996-04-16 Sterling Winthrop Inc Compuestos y metodos para inhibir la expresion de genes.
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
JP3257675B2 (ja) 1990-10-12 2002-02-18 マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フェルデルング デル ビッセンシャフテン エー．ファウ． 修飾リボザイム
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US5278299A (en) 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
US20030206899A1 (en) 1991-03-29 2003-11-06 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
ATE181571T1 (de) 1991-09-23 1999-07-15 Medical Res Council Methoden zur herstellung humanisierter antikörper
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
AU3144193A (en) 1991-11-21 1993-06-15 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Controlling degradation of glycoprotein oligosaccharides by extracellular glycosisases
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
EP0666868B2 (en) 1992-10-28 2006-06-14 Genentech, Inc. Use of anti-VEGF antibodies for the treatment of cancer
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
AU6449394A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
ES2114218T3 (es) 1993-09-09 1998-05-16 Procter & Gamble Detergente para el lavado automatico de vajillas con tensioactivo de alcoxi- o ariloxi-amidas.
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5635388A (en) 1994-04-04 1997-06-03 Genentech, Inc. Agonist antibodies against the flk2/flt3 receptor and uses thereof
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
AU2766195A (en) 1994-06-03 1996-01-05 Brigham And Women's Hospital Identification of polycystic kidney disease gene, diagnostics and treatment
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
IL117645A (en) 1995-03-30 2005-08-31 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CA2225313A1 (en) 1995-06-21 1997-01-09 Martek Biosciences Corporation Combinatorial libraries of labeled biochemical compounds and methods for producing same
US5837492A (en) 1995-12-18 1998-11-17 Myriad Genetics, Inc. Chromosome 13-linked breast cancer susceptibility gene
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6274376B1 (en) 1996-02-20 2001-08-14 Smithkline Beecham Corporation ClpL
EP0828003A3 (en) 1996-09-06 2003-01-15 SmithKline Beecham plc Human serine protease
US5800998A (en) 1996-11-12 1998-09-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Assays for diagnosing type II diabetes in a subject
DE69834027D1 (de) 1997-01-14 2006-05-18 Human Genome Sciences Inc Tumor-nekrose-faktor rezeptor 5
US7122636B1 (en) 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
CN101665536B (zh) 1997-04-07 2013-07-03 基因技术股份有限公司 抗-血管内皮生长因子的抗体
KR100870353B1 (ko) 1997-04-07 2008-11-25 제넨테크, 인크. 항-ｖｅｇｆ 항체
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
AR013269A1 (es) 1997-08-04 2000-12-13 Scras Producto que contiene por lo menos un rna de doble filamento combinado con por lo menos un agente anti-viral, para la utilizacion terapeutica en eltratamiento de una enfermedad viral, en especial de la hepatitis viral
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
AU760562B2 (en) 1997-12-05 2003-05-15 Scripps Research Institute, The Humanization of murine antibody
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6274720B1 (en) 1997-12-31 2001-08-14 Incyte Genomics, Inc. Human preproneurotensin/neuromedin N
US6956107B2 (en) 1998-02-20 2005-10-18 Tanox, Inc. Inhibitors of complement activation
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
AU3669499A (en) 1998-04-28 1999-11-16 Axys Pharmaceuticals, Inc. Novel serine protease capable of selective cleavage of insulin-like growth factor binding protein
GB9827152D0 (en) 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
WO2000008134A2 (en) 1998-08-03 2000-02-17 Novartis Ag HUMAN HtrA SERINE PROTEASE
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
EP2314700A1 (en) 1999-01-28 2011-04-27 Medical College of Georgia Research Institute, Inc Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6703020B1 (en) 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
WO2001029058A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
AU7950400A (en) 1999-10-19 2001-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Process for producing polypeptide
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
WO2001044463A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
ES2637801T3 (es) 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CN102311986B (zh) 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
AUPR670701A0 (en) 2001-07-30 2001-08-23 Prince Henry's Institute Of Medical Research Novel serine protease
RU2321630C2 (ru) 2001-08-03 2008-04-10 Гликарт Биотекнолоджи АГ Гликозилированные антитела (варианты), обладающие повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
JP2003135075A (ja) 2001-11-05 2003-05-13 Research Association For Biotechnology 新規な全長ｃＤＮＡ
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
CN1305905C (zh) 2002-03-22 2007-03-21 Aprogen株式会社 人源化抗体及其制备方法
WO2003084569A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Drug containing antibody composition
JP4628679B2 (ja) 2002-04-09 2011-02-09 協和発酵キリン株式会社 Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
US20040132140A1 (en) 2002-04-09 2004-07-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
US20050031613A1 (en) 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
CN102911987B (zh) 2002-04-09 2015-09-30 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
JP4753578B2 (ja) 2002-06-03 2011-08-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 合成抗体ファージライブラリー
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
ES2347241T3 (es) 2002-12-16 2010-10-27 Genentech, Inc. Variantes de inmunoglobulina y sus utilizaciones.
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
KR20160014775A (ko) 2003-05-30 2016-02-11 제넨테크, 인크. 항-ｖｅｇｆ 항체를 사용한 치료
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
US20070134759A1 (en) 2003-10-09 2007-06-14 Harue Nishiya Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
ES2672640T3 (es) 2003-11-05 2018-06-15 Roche Glycart Ag Moléculas de unión a antígeno con afinidad de unión a receptores Fc y función efectora incrementadas
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CN1942483B (zh) 2004-04-13 2012-09-26 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗p型选凝素抗体
US20060009360A1 (en) 2004-06-25 2006-01-12 Robert Pifer New adjuvant composition
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
NZ565659A (en) 2005-06-08 2010-03-26 Univ Pittsburgh Susceptibility genes for age-related maculopathy (ARM) on chromosome 10Q26
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2007134050A2 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
EP2059533B1 (en) 2006-08-30 2012-11-14 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US20100166743A1 (en) 2006-10-06 2010-07-01 University Of Utah Research Foundation Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same
SI2097455T1 (sl) 2006-11-02 2015-03-31 Genentech, Inc. Humanizirana protitelesa proti faktorju tipa d
US20100129358A1 (en) 2006-12-22 2010-05-27 University Of Utah Research Foundation Method of detecting ocular diseases and pathologic conditions and treatment of same
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008103299A2 (en) 2007-02-16 2008-08-28 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Methods and compositions for prognosing, detecting, and treating age-related macular degeneration
AR065370A1 (es) 2007-02-16 2009-06-03 Genentech Inc Moduladores de htra1 - pdz y htra3 pdz
AR066660A1 (es) 2007-05-23 2009-09-02 Genentech Inc Prevencion y tratamiento de condiciones del ojo asociadas con su complemento
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
EP2044951A1 (en) * 2007-10-02 2009-04-08 Merz Pharma GmbH & Co. KGaA The use of substances for the treatment of loss of eyesight in humans with glaucoma and other degenerative eye diseases
WO2009046405A2 (en) 2007-10-05 2009-04-09 University Of Utah Research Foundation Antibodies to htra1 and methods of using the same
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
CR20170001A (es) 2008-04-28 2017-08-10 Genentech Inc Anticuerpos anti factor d humanizados
HUE032894T2 (hu) 2008-06-25 2017-11-28 Esbatech Alcon Biomed Res Unit VEGF-gátló, stabilis és oldható antitestek
WO2010123136A1 (en) * 2009-04-20 2010-10-28 The University Of Tokyo Association of htra1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease
EP2766281A4 (en) 2011-10-13 2015-05-27 Advanced Tech Materials SHIPPING AND OUTDOOR CONTAINERS WITH CLOTHING FOR THE FURTHER STERILE STORAGE, DELIVERY, AND DISTRIBUTION OF MATERIALS
JP6532678B2 (ja) 2011-10-14 2019-06-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ＨｔｒＡ１抗体及び使用方法
NZ741780A (en) 2015-10-30 2019-11-29 Genentech Inc Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP3922649A1 (en) 2021-12-15
CA3001362C (en) 2020-10-13
JP6750010B2 (ja) 2020-09-02
NZ741780A (en) 2019-11-29
HUE054093T2 (hu) 2021-08-30
IL258627B (en) 2022-06-01
ZA201802382B (en) 2020-08-26
WO2017075212A1 (en) 2017-05-04
ES2870141T3 (es) 2021-10-26
LT3368578T (lt) 2021-05-25
CA3088612A1 (en) 2017-05-04
US11512143B2 (en) 2022-11-29
PL3368578T3 (pl) 2021-07-26
HK1256094A1 (zh) 2019-09-13
AU2016344399B2 (en) 2019-03-28
CR20180296A (es) 2018-08-10
KR20190131624A (ko) 2019-11-26
US20230383008A1 (en) 2023-11-30
PE20181009A1 (es) 2018-06-26
SI3368578T1 (sl) 2021-08-31
MX2018004509A (es) 2018-08-01
UA123773C2 (uk) 2021-06-02
TWI747850B (zh) 2021-12-01
US20170145113A1 (en) 2017-05-25
BR112018007703A2 (pt) 2018-11-06
AU2016344399A1 (en) 2018-05-10
KR102162324B1 (ko) 2020-10-07
KR102440160B1 (ko) 2022-09-02
AU2019204537B2 (en) 2021-04-22
IL295097A (en) 2022-09-01
CN115160439A (zh) 2022-10-11
JP6944552B2 (ja) 2021-10-06
RU2750285C2 (ru) 2021-06-25
PT3368578T (pt) 2021-05-06
DK3368578T3 (da) 2021-05-25
EP3922649B1 (en) 2024-01-17
AU2019204537A1 (en) 2019-07-18
TW201722992A (zh) 2017-07-01
HRP20210736T1 (hr) 2021-06-11
RU2018119014A3 (sr) 2019-12-02
MA43113B1 (fr) 2021-06-30
US20190048097A1 (en) 2019-02-14
EP3368578B1 (en) 2021-03-17
MX395572B (es) 2025-03-25
RU2021117293A (ru) 2021-06-23
MA43113A (fr) 2018-09-05
SG10202001808VA (en) 2020-04-29
KR20180069069A (ko) 2018-06-22
PH12018500887A1 (en) 2018-10-29
ZA202001985B (en) 2022-12-21
CL2018001139A1 (es) 2019-02-22
RU2018119014A (ru) 2019-12-02
CA3001362A1 (en) 2017-05-04
IL258627A (en) 2018-06-28
CN108290957A (zh) 2018-07-17
CO2018005393A2 (es) 2018-06-12
SG11201803356SA (en) 2018-05-30
CA3088612C (en) 2022-04-12
CL2020002103A1 (es) 2020-10-23
MX2022002954A (es) 2022-04-06
IL270793A (en) 2020-01-30
US10421821B2 (en) 2019-09-24
US20240067752A1 (en) 2024-02-29
EP3368578A1 (en) 2018-09-05
US20190375856A1 (en) 2019-12-12
EP3922649C0 (en) 2024-01-17
MY196448A (en) 2023-04-12
TW202229360A (zh) 2022-08-01
US10421822B2 (en) 2019-09-24
JP2019506135A (ja) 2019-03-07
PH12022550450A1 (en) 2023-05-03
CN108290957B (zh) 2022-06-17
JP2020099329A (ja) 2020-07-02
CL2021000163A1 (es) 2021-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240067752A1 (en) ANTI-HtrA1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
JP6416630B2 (ja) Ｃｓｆ１ｒ阻害剤を用いるための組成物及び方法
KR20140116490A (ko) 항-lrp5 항체 및 사용 방법
JP2018534930A (ja) 抗ｄ因子抗体及びコンジュゲート
TW202517673A (zh) 與Ｃ３ｂＢｂ結合之抗體
HK1256094B (en) Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof