DE69032425T2

DE69032425T2 - Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden

Info

Publication number: DE69032425T2
Application number: DE69032425T
Authority: DE
Inventors: Charles E. Woodinville Washington 98072 Petrie; John C. Bothell Washington 98011 Tabone; Jeffrey Bothell Washington 98011 Van Ness; Nicolaas M.J. Woodinville Washington 98072 Vermeulen
Original assignee: MicroProbe Corp
Current assignee: Nanogen Inc
Priority date: 1990-05-11
Filing date: 1990-09-04
Publication date: 1998-11-26
Anticipated expiration: 2010-09-05
Also published as: EP0745689A2; EP0455905B1; ATE167523T1; DE69032425D1; DK0455905T3; EP0745689A3; EP0455905A2; JPH0420300A; US5514785A; ES2116977T3; EP0455905A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Tauchstaub für eine Nukleinsäure-Hybridisierungs-Untersuchung zur Bestimmung spezifischer Polynukleotidsequenzen.
Die Nukleinsäure-Hybridisierung ist eine bekannte Methode zur Identifizierung spezifischer Sequenzen von Nukleinsäuren. Die Hybridisierung basiert auf dem Basenpaaren zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen. Wenn Nukleinsäuren mit einfachen Strängen inkubiert werden in geeigneten Pufferlösungen, paaren sich komplementäre Basensequenzen zur Bildung von doppelsträngigen stabilen Molekülen. Die Gegenwart oder Abwesenheit solcher Paarung kann durch mehrere unterschiedliche Methoden bestimmt werden, die im Stand der Technik beschrieben sind.
Viele bekannte Hybridisierungsuntersuchungen umfassen zahlreiche Schritte, beispielsweise die Hybridisierungstechnik, die von Dunn, et al., in Cell 12:23- 36 (1977) beschrieben wurde, bei der eine Untersuchung vom Sandwichtyp besteht in einer ersten Hybridisierung zwischen einer "Ziel"-Nukleinsäure und einer "Einfang"-Nukleinsäuresonde, die immobilisiert wurde an einen festen Träger und einer zweiten Hybridisierung zwischen einer "Signal"-Nukleinsäuresonde, die typischerweise mit einem radioaktiven Isotop markiert ist, und einer unterschiedlichen Region an der immobilisierten Zielnukleinsäure. Die Hybridisierung der Signalsonde kann z.B. bestimmt werden durch Autoradiographie.
Ranki, et al., U.S. 4,486,539 und U.S. 4,563,419, beschreiben Sandwichtyp-Untersuchungen, die zunächst Schritte erfordern um die Nukleinsäuren einzelsträngig zu machen, bevor die einfachsträngigen Nukleinsäuren hybridisieren können mit einer Nukleinsäure die an einen festen Träger fixiert ist und mit einer Nukleinsäure, die mit einem Radioisotop markiert ist.
Carrico, et. al., U.S. 4,806,546, und Carrico, et al., Europäische Patentanmeldung 86112899.9, veröffentlicht als EP-A-0219695, haben die Behandlung eines Nylonträgers mit einem Alkylierungsagenz beschrieben, um Amidingruppen an der Oberfläche des Nylon einzuführen. Die derivatisierte Nylonoberfläche besitzt die Fähigkeit nicht kovalent einfachsträngige Nukleinsäuren zu binden. Die nicht kovalent gebundenen Nukleinsäuren werden dann verwendet als Sonden zur spezifischen Bestimmung von Zielnukleinsäuren in Lösungen.
Hunger, et. al., Analytical Biochemistry 165:45-55 (1987); Hunger, et. al., Analytical Biochemistry 156:286-299 (1986); Hunger et. al., Europäische Patentanmeldung 84109485.7, veröffentlicht als EP-A-0134025, beschreiben die Verwendung von Cyanurchlorid aktiviertem Zellulosepapier das immobilisierte beschränkte Genom-DNA hat in Southern blot Techniken für die Bestimmung von Subpicogrammmengen an komplementärer DNA.
Biagoni, et. al., Analytical Biochemistry 89:616-619 (1978), beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von DNA-Zellulose unter Verwendung von Cyanurchlorid, bei dem die DNA-Zellulose eingesetzt wird in Affinitäts-Chromatographie-Verfahren.
Herzberg, et. al., Europäische Patentanmeldung 0171150, beschreiben die Verwendung von Oligonukleotiden, die immobilisiert sind an feste Träger in Untersuchungen mit Tauchstäben.
Litmann, et. al., U.S. 4,391,904, beschreiben Kits mit Teststreifen bei denen ein Glied eines immunologischen Paar an einen festen Träger gebunden wird. Ebenfalls beschreiben Miller et. al., Clin. Chem. 30:1467-1472 (1984), und Brown, et. al., Clin. Chem. 31:1500-1505 (1985), eine analytische Testkammer die Zellulosefasern enthält, die an einen Antikörper als eine Festmatrix gebunden sind, die es erlaubt, Vielfachtests aus einer einzigen Probe durchzuführen.
Pedley et. al. (GB 2197720 A)beschreibt die Immobilisierung eines Polynukleotids an einem Plastikträger mit Vertiefungen durch Binden eines Polyethylenimins (PEI) an den Plastikträger mit Vertiefungen und Verwendung von Glutaraldehyd zur Bildung von Brücken zwischen den Aminogruppen des PEI und direkt den Aminogruppen in den Adenin, Guanin und Cytosinresten des Polynukleotids.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die ein Oligonukleotid umfaßt, das kovalent an einen festen Träger gebunden ist, beschichtet mit einem aminhaltigen Polymeren, wobei die kovalente Bindung auftritt zwischen dem Amin des polymerbeschichteten festen Trägers und einem Amin, das mit dem Oligonukleotid verknüpft ist.
Der feste Träger der beschichtet ist mit einem aminhaltigen Polymeren ist vorzugsweise eine Nylonkugel und ist kugelförmig in der Form. Der Durchmesser einer solchen Kugel liegt vorzugsweise im Bereich von zwischen 0,025 cm bis 1,27 cm, weiter vorzugsweise von 0,15 cm bis 0,23 cm.
Außerdem wird im Einklang mit der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Oligonukleotids zur Verfügung gestellt, das kovalent an ein aminhaltiges Polymeres gebunden ist, über ein Amin, das mit dem 5- Ende oder dem 3- Ende oder an einer Stelle zwischen dem 5- Ende und dem 3- Ende eines Oligonukleotids verknüpft ist, wobei dieses Verfahren umfaßt:
Das Aktivieren eines Aminoalkyl-substituierten Oligonukleotids mit Cyanurchlorid und das konjugieren des aktivierten Oligonukleotids an ein aminhaltiges Polymeres.
Die Verwendung von Kugeln oder ähnlichen Strukturen in einem Tauchstabformat erzielt eine bedeutende Abnahme in dem nicht spezifischen Hintergrundlevel von Signalsystemen, weil ein einfacher Drucksitz gegeben ist, mittels dessen die Kugel oder ähnliche Struktur an dem Tauchstab angebracht ist, verglichen mit Membranträgern und dergleichen, die notwendigerweise zwischen zwei Trägern als Sandwich vorliegen müssen oder an einer Stelle angeleimt oder angebracht werden müssen.
Ein weiteres Verständnis der Natur und der Vorteile der vorliegenden Erfindung ergibt sich durch Bezugnahme auf den weiteren Teil der Beschreibung und die Zeichnungen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Ausbildung eines Tauchstabs gemäß der vorliegenden Erfindung;
Fig. 2 ist eine Indikatorkarte mit vielen Stellen, die für die Diagnose von Periodontitis verwendet werden kann;
Fig. 3 sind HPLC Profile (Hochauflösende Flüssigchromatographie) die zeigen, daß Cyanurchlorid selektiv mit dem 5- angebundenen Amin eines Oligonukleotids reagiert und nicht mit dessen Zuckern oder Basen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung umfaßt Zusammensetzungen, die verwendbar sind in Nukleinsäure-Hybridisierungs- Untersuchungen. Diese Zusammensetzungen umfassen ein Dichlortriazin-Oligonukleotid und andere aktivierte Oligonukleotide, die kovalent an eine polymerbeschichtete Kugel oder eine ähnliche Struktur gebunden sind.
Weiterhin sind Verfahren für das kovalente Immobilisieren eines Oligonukleotids an einem festen Nylonträger, vorzugsweise einer Kugel, eingeschlossen. Im allgemeinen umfassen diese Verfahren die Schritte das Behandelns eines festen Nylonträgers mit einem Alkylierungsagenz, das zur Reaktion bringen des behandelten festen Trägers mit einem aminhaltigen Polymeren, wobei das Polymer kovalent den festen Träger beschichtet, das Aktivieren eines Oligonukleotids mit einem monofunktionalen oder multifunktionalen Reagenz, vorzugsweise mit einem homotrifunktionalen Reagenz, Cyanurchlorid (d.h. 2, 4, 6- Trichlortriazin); und das Konjugieren des aktivierten Oligonukleotids und des polymerbeschichteten festen Trägers. Die unreagierten Amine werden dann blockiert durch Acylierung um der festen Trägeroberfläche die geeignete Oberflächenladung zu verleihen.
Der Begriff "fester Träger" bezieht sich auf irgendeine Oberfläche, die von Lösung zu Lösung übertragbar ist oder eine Struktur bildet für die Durchführung von Untersuchungen auf Basis von Oligonukleotiden, und dieser Begriff schließt ein Kugeln, Membranen, Miktrotiter-Vertiefungen, Fäden oder Drähte, Kunststoffstreifen, oder irgendeine Oberfläche an die die Nukleinsäuresonden immobilisiert werden können.
So wie hierin verwendet umfaßt der Begriff "Kugel" irgendeinen Typ einer festen oder hohlen Kugel, eines Balls, Lagers, Zylinders, oder einer anderen ähnlichen Konfiguration bestehend aus Kunststoff, Keramik, Metall oder polymerem Material an das eine Nukleinsäure kovalent immobilisiert werden kann. Somit umfaßt dieser Begriff auch einen Nylonfaden oder Nylonfäden. Vorzugsweise wird in den vorliegenden Zusammensetzungen eine Nylonkugel verwendet, die in ihrer Form sphärisch ist, und ein bevorzugter Durchmesserbereich für eine solche Kugel liegt von etwa 0,025 bis 1,27 cm (0,01 inch bis etwa 0,5 inch), weiter vorzugsweise von etwa 0,15 bis 0,23 cm (0,06 inch bis etwa 0,09 inch, (entsprechend den kommerziell erhältlichen 0,23 cm oder 3/32 inch Nylonkugeln), und am meisten bevorzugt etwa 0,23 cm (0,09 inch) (entsprechend den kommerziell erhältlichen 0,23 cm oder 3/32 inch Nylonkugeln). Außerdem ist es bevorzugt, daß die Nylonkugeln unpoliert sind oder wenn sie poliert sind aufgerauht werden bevor die Behandlung mit einem Akylierungsagenz erfolgt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine Nylonkugel oder Kugeln oder irgendeine Zusammensetzung oder Struktur aus Nylon zunächst derivatisiert (präpariert) durch Behandlung der Kugeln mit einem Alkylierungsagenz. Alkylierungsagenzien die auf diese Weise verwendet werden reagieren mit Amiden die in dem Nylon vorhanden sind zur Bildung eines reaktiven Imidadesters.
Bevorzugte Alkylierungsagenzien umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Alkylsulfate, Alkyltriflate, Alkyldiphenylsulfoniumsalze, Alkylperchlorate und vorzugsweise Trialkyloxoniumsalze. Die letztgenannten umfassen die niederen Alkylsalze, Trilmethyloxonium und Triethyloxoniumsalze. Das Salzgegenion kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Hexachlorantimonat, Hexafluorophosphat und Tetrafluoroborat, wobei das letztgenannte Gegenion bevorzugt ist. Jedoch können auch andere Salzgegenionen ebenso verwendet werden und es ist für den Fachmann auf dem relevanten Fachgebiet offensichtlich, daß dies möglich ist.
Die Auswahl eines Lösungsmittels für das Alkylierungsagenz ist für die vorliegende Erfindung bedeutsamt. Ein Solvenz sollte verwendet werden, das Nylon nicht löst oder klebrig macht während der Alkylierung. Nicht nucleophile organische Solvenzien, wie z.B. Dichlormethan, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, N-Methyl-Pyrrolidon und andere sind geeignete Solvenzien. Insbesondere wird N-Methyl-Pyrrolidon bevorzugt.
Die resultierenden Imidatester an der Kugeloberfläche werden dann unter geeigneten Bedingungen mit einem aminhaltigen Polymeren zur Reaktion gebracht, wobei Amidinreste gebildet werden. Irgendein primäres oder sekundäres aminhaltiges Polymeres kann verwendet werden zur Bildung von Amidinresten, so daß es kovalent immobilisiert das Polymere an die Oberfläche der Kugel. Poly (Ethylenimin), Polyallylamine und Polyvinylamin sind bevorzugte Beispiele. Das bevorzugte Solvenz das zum Lösen des Polymeren während der Konjugation des Polymeren zu der aktivierten Nylonkugel verwendet wird ist N-Methyl-Pyrrolidon.
Nylon kann auch partiell hydrolisiert werden um reaktives Amin oder Carboxyl-Gruppen zu liefern, die reaktiv sind gegenüber Amin- oder carboxylhaltigen Polymeren. In ähnlicher Weise können Carboxylanteile, die die Oberfläche eines festen Trägers beschichten, mit aminhaltigen Polymeren unter ähnlichen chemischen Bedingungen wie oben beschrieben beschichtet werden.
Außerdem ist jedes andere Polymere, das geeignet ist mit irgendeinem primären oder sekundären aliphatischem oder aromatischem Amin zu derivatisieren, geeignet für die vorliegende Erfindung. Die Einheiten eines solchen Polymers werden verbunden durch direktes Binden über einen Polymerisierungsprozeß oder durch Verknüpfen über ein Kopplungsagenz. Die direkte Polymerisierung produziert eine Verknüpfung untereinander von geeigneten chemischen Gruppen oder Gerüsteinheiten in benachbarten Einheiten. Beispielsweise können oxidative Enzyme verwendet werden, um Monomereinheiten zu polymerisieren durch oxidatives Crossvernetzen. Alternativ kann ein Kopplungsagenz, das von einem bifunktionalen oder multifunktionalen organischen Crossvernetzungsreagenz abgeleitet ist, mit der geeigneten chemischen Gruppe oder Gerüsteinheit dieser Einheiten verknüpft werden. In diesem Kontext bedeutet der Begriff "Kopplungsagenz" die Verknüpfungsgruppe nach dem Binden und der Begriff "Crossvernetzungsreagenz" bezeichnet die Verknüpfungsverbindung vor dem Binden.
Das Crossvernetzungsreagenz hat die allgemeine Formel:
Worin die reaktiven Gruppen A, B und E unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, einer Carboxylsäuregruppe, einem Säurehalogenid, einem aktivierten Ester, einem gemischten Anhydrid, einem Iminoester, einem primären Amin, einer Aldehydgruppe, einer α-Halomethylcarbonylgruppe einer Hydrazingruppe, einer Acylhydrazidgruppe, einer Azidgruppe, und einer N- Maleimidgruppe, worin wenigstens zwei von A, B und E nicht Wasserstoff sind. R¹ ist eine aliphatische Gruppe mit wenigstens zwei Kohlenstoffatomen oder eine aromatische oder heterocyclische Gruppe mit wenigstens 6 Kohlenstoffatomen.
Multifunktionale Crossvernetzungsreagenzien mit mehr als drei reaktiven Gruppen die ähnliche sind mit A, B und E liegen ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung. Diese zusätzlichen reaktiven Gruppen werden unabhängig voneinander ausgewählt aus den vorangegangenen Definitionen für A, B und E.
Die Auswahl der reaktiven Gruppen hängt ab von der Auswahl der chemischen Gruppen oder Gerüsteinheiten der Polymereinheiten (monomere Einheiten) die miteinander verknüpft werden sollen. Jeder Typ einer chemischen Gruppe oder Gerüsteinheit reagiert mit einer geeigneten reaktiven Gruppe oder Gruppen. Beispielsweise wird eine Amingruppe mit einer Carboxylsäuregruppe reagieren, einem Säurehalogenid, einem aktivierten Ester, einem gemischten Anhydrid, einem Acylimidazolid, einer N-(Carbonyloxy)Imidgruppe, einem Iminoester oder einer Aldehydgruppe. Eine oxidierte 1, 2- Diolgruppe (ein Dialdehyd) wird reagieren mit einem primären Amin, einer Hydrazingruppe, einem Azid oder einer Acylhydrazidgruppe. Eine Carbonylgruppe wird reagieren mit einem primären Amin, einer Hydrazingruppe, oder einer Acylhydrazidgruppe. Eine Mercaptangruppe wird reagieren mit einer Carbonsäuregruppe, einem Säurehalogenid, einem aktivierten Ester, einem gemischten Anhydrid, einem Acylimidazolid, oder einem N-(Carbonyloxy)imid. Eine Kohlenstoff-Wasserstoff Bindung wird reagieren mit einem Azid (Nitren). Die festen Träger werden somit beschichtet mit dem ausgewählten Polymeren, einschließlich multifunktionaler Polymere, die eine große Anzahl an aktivierbaren primären und sekundären Aminen enthalten.
Die unten wiedergegebene Tabelle erläutert, ohne die Erfindung einzuschränken, die Typen an Reaktionen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung anwendbar sind, um entweder direkt oder über einen Distanzarm ein Polymeres an einen festen Träger kovalent anzubinden. Wie man sehen kann, können andere Polymere, die Thiol oder Carboxylgruppen enthalten ebenfalls verwendet werden, obwohl aminhaltige Polymere bevorzugt sind.
Die polymerbeschichteten festen Träger werden dann konjugiert mit aktivierten Oligonukleotiden unter Verwendung ähnlicher oder identischer Chemie wie sie oben beschrieben wurde. In der Verwendung hierin bezieht sich Oligonukleotide auf kurze Nukleinsäuresequenien die etwa 16 bis 100 Basen in der Länge umfassen. Solche Oligonukleotide können verwendet werden als Einfangsonden in Hybridisierungsuntersuchungen und sie werden vorzugsweise chemisch synthetisiert unter Verwendung kommerziell erhältlicher Methoden und Ausrüstungen. Beispielsweise kann die Festphasen-Phosphoramiditmethode verwendet werden zur Erzeugung kurzer Sonden mit zwischen 15 und 20 Basen die ein Molekulargewicht von weniger als 16.000 Dalton haben. Für die Synthese von Oligonukleotiden siehe Caruthers, et al., Cold Spring Harbour Symp. Quant. Biol., 47:411-418 (1982); Adams, et al., J. Am. Chem. Soc., 105:661 (1983).
Wenn eine Oligonukleotidsonde für eine spezifische Zielnukleinsäure synthetisiert wird, bestimmt die Auswahl der Nukleotidsequenz die Spezifität des Tests. Beispielsweise, wenn man DNA-Sequenzen aus verschiedenen Bakterienisolaten vergleicht, kann man eine Sequenz für die Bakterienbestimmung auswählen, die entweder typenspezifisch oder genusspezifisch ist. Vergleiche von DNA Regionen und Sequenzen können erreicht werden unter Verwendung kommerziell erhältlicher Computerprogramme.
Die bevorzugten Einfangoligonukleotide für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind synthetische Oligonukleotide von etwa 20 bis etwa 100 Basen in der Länge. Ein Distanzarm (Verknüpfungsarm), d.h. eine chemische Einheit, die andere chemischen Gruppen verlängert oder verknüpft, und vorzugsweise ist dies eine Kohlenstoffkette die von etwa 2 bis 12 Kohlenstoffatome enthält, weiter vorzugsweise etwa 6 Kohlenstoffatome, die eine blockierte Aminogruppe enthält, die während der Synthese unter Verwendung herkömmlicher Chemie an eine 5'-Hydroxylgruppe eines Oligonukleotids gekoppelt werden kann. Eine primäre Aminogruppe ist die bevorzugte Gruppe für die Anknüpfung an monofunktionale oder multifunktionale Reagenzien und seine Anknüpfung über einen Hexylarm ist bevorzugt. Die Reagenzien für die Anknüpfung eines primären Distanzarms der in einem primären Amin endet sind kommerziell erhältlich sind. Ausgangsmaterialien die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind werden beschrieben in Wo-A-86 / 07363; Nucl. Acids Res. 15:3131 (1987); Nucl. Acids Res. 15:2891 (1987); und Nucl. Acids Res. 14:7985 (1986).
Vorzugsweise wird hierin ein Oligonukleotid verwendet, das eine 5'-Endstruktur hat wie z.B.
als ein Distanzarm, n ist 2 bis 12 einschließlich, vorzugsweise 6; X ist -NH- oder -NHC:O (CH&sub2;)m NH-, vorzugsweise -NH-; worin m 2 bis 12 ist einschließlich; Y ist ein 4,6-Dichlortriazin (bevorzugt) oder eine reaktive Thiol (Sulfhydryl) Einheit; und A ist ein Oligonucleotid, im Bereich von zwischen etwa 9 bis 50 Basen, vorzugsweise zwischen etwa 15 bis 30 Basen, mit lediglich der 5'- Hydroxylgruppe die modifiziert werden muß für die Anknüpfung.
Alternativ dazu kann ein Oligonukleotid modifiziert werden an dem 3'-Ende mit einem Distanzarm, der eine blockierte Aminogruppe enthält. Dies kann erfolgen durch Ausführung einer DNA-Synthese an einem festen Träger, der ein konjugiertes Ribonukleotid enthält. Nach der Entfernung von dem festen Träger wird ein DNA Oligonukleotid erhalten, das ein einziges 3'-End-Ribonukleotid enthält. Dieses kann modifiziert werden mit einem Distanzarm, der ein nucleophiles Amin enthält, beispielsweise durch oxidieren des Ribonukleotid cis-Glycols mit Periodat; behandeln des Oligonukleotids, das so modifiziert wurde mit beispielsweise Butandiamin zur Bildung einer Schiffschen Base und behandeln mit Natriumborhydrid oder Cyanoborhydrid zur Bildung eines stabilen reduzierten Derivats einer Schiffschen Base, in der eines der Amine frei bleibt für eine nachfolgende Konjugation.
Die ausgewählten Oligonukleotide können dann aktiviert werden mit einem monofunktionalen oder multifunktionalen Reagenz. "Aktivierte Oligonukleotide" bedeutet im allgemeinen Oligonukleotide, die mit einer chemischen Verbindung reagiert haben und chemisch aktiv gemacht wurden. So wie hierin verwendet bezieht sich "aktivierbar" auf das Potential chemisch reaktiv zu werden. Multifunktionelle Reagenzien umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, homotrifunktionale, heterotrifunktionale, homobifunktionale und heterobifunktionale Reagenzien.
Aktivierte Oligonukleotide können an polymerbeschichtete feste Träger geknüpft werden gemäß der nachfolgenden Chemie. Im allgemeinen gibt es zwei Arten mittels derer das Oligonukleotid kovalent an das Polymere an diesem Punkt angebunden werden kann. Ein Oligonukleotid mit einem Aminschwanz kann aktiviert werden durch ein monofunktionales oder multifunktionales Reagenz, beispielsweise Cyanurchlorid, wodurch ein Alkylaminodichlortriazin gebildet wird, welches dann reaktiv ist gegenüber einem aminhaltigen Polymeren. Alternativ kann das Polymer an der Oberfläche der Kugel aktiviert werden mit einem Reagenz, vorzugsweise mit dem homotrifunktionalen Reagenz Cyanurchlorid, welches aktiv ist gegenüber dem Aminschwanz oder einem Aminderivaten des Oligonukleotids.
Obwohl Cyanurchlorid&sub1; ein homotrifunktionales Reagenz bevorzugt ist, können auch andere Reagenzien verwendet werden. Beispielsweise ist N-Succinimidyl-4-(Iodacetamido)- Benzoat (SIAB) ein heterobifunktionales Reagenz und Disuccinimidylsuberat ist ein homobifunktionales Reagenz. Wenn Carboxylgruppen involviert sind, kann das Heterobifunktionale Reagenz 1-Ethyl-3-(Dimethylaminopropyl)- Carbodiimid verwendet werden. Andere ähnliche monofunktionale und multifunktionale (heteromultifunktionale und homomultifunktionale) Reagenzien sind für die Verwendung in den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Die Chemie die in der vorliegenden Erfindung angewandt wird resultiert in der selektiven Aktivierung einer Aminogruppe an einem Oligonukleotid, ohne Modifikation irgendeiner der Purin und Pyrimidinbasen des Oligonukleotids, wie unten in Beispiel 1 demonstriert wird. Die Anbringung des aminhaltigen Polymeren an die Kugeloberfläche und die kovalente Immobilisierung eines aktivierten Einfangoligonukleotids an eine solche Oberfläche erhöht die Geschwindigkeit oder das Ausmaß des Einfangens der Zielnukleinsäure 5 bis 25 fach verglichen mit Diaminverbindungen, beispielsweise Hexandiamin. Außerdem wird die nicht spezifische Bindung eines biologischen Materials an die Oberfläche der Kugel wesentlich reduziert.
Die bevorzugte Chemie verwendet Cyanurchlorid (d.h. 2, 4, 6- Trichlortriazin). Die Chemie der Cyanurchloridreaktion ist wie folgt:
worin R ein Oligonukleotid ist und vorzugsweise die Struktur hat wie sie für ein 5'-Aminohexyloligonukleotid beschrieben wurde.
Oligonukleotide die eine 5'- oder 3'- verknüpfte (über einen Hexylarm) nucleophile Amineinheit enthalten (oder interne Aminoalkylgruppen die substituiert sind an Pyrimidine oder Purinbasen) werden mit einem Überschuß, vorzugsweise etwa dem 50 fachen bis etwa dem 200 fachen Überschuß, weiter vorzugsweise dem 125 fachen Überschuß an recrystallinisiertem Cyanurchlorid bei vorzugsweise 15-50º C, weiter vorzugsweise 19-25º C, in einem Teil organisches Lösungsmittel für eine bevorzugte Zeitdauer von etwa 30 Minuten bis etwa 6 Stunden, weiter vorzugsweise von etwa 1 bis 2 Stunden zur Reaktion gebracht.
Wenn einmal ein Oligonukleotid aktiviert wurde mit Cyanurchlorid, kann es kovalent mit Molekülen verknüpft werden, die Amine enthalten. Genauer, zusätzlich zu kovalenten Anknüpfungen an feste Träger wie sie oben diskutiert wurden, können Dichlortriazin-Oligonukleotide als Electrophile dienen für eine kovalente Anknüpfung an viele Zusammensetzungen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein: Proteine, wie z.B. Enzyme, Antikörper, Lectine und Proteinträger die zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden; von Nucleophilen abgeleitete Oligonukleotide, wie z.B. Oligonukleotide mit 5'- oder 3'-Aminohexyl-Schwänzen; nucleophilhaltige Polymere, wie z.B. Poly (Ethylenimin), Polyallylamine und Polyvinylamine; Verbindungen mit niederem Molekulargewicht, die Nucleophile enthalten, wie z.B. radioaktive Markierer, Chemilumineszenz-Markierer, Fluoreszenz-Markierer, farbige Markierer und immunogene Markierer; etc. Dichlortriazin-Oligonukleotide sind von der vorliegenden Erfindung umfaßt, ebenso wie Prozesse zur Aktivierung von Oligonukleotiden mit Cyanurchlorid zur Bildung von Dichlortriazin-Oligonukleotiden wie sie weiter unten diskutiert werden.
Das nicht abreagierte Cyanurchlorid kann entfernt werden durch Ausschlußchromatographie oder Ultrafiltration, und die Kugel und das abgeleitete Oligonukleotid, das daran konjugiert ist, werden zusammen vermischt und bei vorzugsweise 20 bis 50º C eine bis 24 Stunden lang inkubiert. Die restlichen (nicht abreagierten) Amine an der Kugeloberfläche können blockiert werden (verdeckt werden) mit einem Agenz wie z.B. Succinanhydrid, vorzugsweise in N- Methylpyrrolidon in der Gegenwart einer geeigneten Base wie z.B. Natriumborat, um die Oberfläche kompatibel zu machen (negativ geladen) für die Nukleinsäure-Hybridisierung. Ein solches Blockieren von Aminen tritt während einer Acylierungsreaktion auf oder einer Reaktion von Aminen mit einem aktivierten Ester, was zu einer nicht aktivierbaren Einheit führt. Es ist festzustellen, daß die Fähigkeit der Kugeloberfläche gegeben ist, chemisch derivatisiert zu werden, so daß eine positive, negative oder neutrale Ladung an der Kugel angebracht werden kann.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Tauchstäbe, die geeignet sind in Nukleinsäure-Hybridisierungen und einen nicht porösen festen Träger umfassen und Mittel für die Anknüpfung einer Kugel. Nicht poröse feste Träger sind im Stand der Technik bekannt und die vorliegende Erfindung betrifft das Anknüpfen einer Kugel an einen Tauchstab. Ein Beispiel für eine Kugel-Anknüpfung ist die Gegenwart einer Perforation oder von Perforationen (oder eine Vertiefung oder Vertiefungen) in dem Tauchstab, wo die Kugeln angebunden werden können. Vorzugsweise werden Perforationen verwendet und die Kugeln werden über einen Drucksitz in dem Umfang der Öffnung angeknüpft. Eine solche Druckanbindung kann beispielsweise erfolgen, wenn der Umfang der Perforation (oder Vertiefung) geringfügig geringer ist als der Umfang der Kugel, so daß die Kugel in ihren Sitz gepreßt wird.
Bevorzugte Kugeln sind unten aufgeführt und können kovalent gebunden werden entweder direkt oder über einen Distanzarm an aktivierte Oligonukleotide der gleichen oder einer unterschiedlichen Sequenz über eine gegebene Kugel, wie oben ebenfalls beschrieben wurde.
Der Tauchstab kann mehr als eine Kugel enthalten, vorzugsweise von etwa 2 bis 10, jede in ihrer eigenen Öffnung, und vorzugsweise untergebracht in einer Reihe entlang einer Kante des Tauchstabs. Ein solcher Tauchstab kann als eine Indikatorkarte dienen, bei der eine Vielzahl von Kugeln kovalent an Oligonukleotide mit verschiedenen Sequenzen oder Spezifitäten gebunden sind und nahe nebeneinander in Reihe an einem Tauchstab mit einer Vielzahl von Stellen angeordnet werden können, mittels dessen eine Vielzahl von Pathogenen in einer einzigen biologischen Probe bestimmt werden kann. Eine einzelne Kugel kann Oligonukleotide mit mehr als einer Nukleinsäuresequenz enthalten, beispielsweise Sequenzen aus verwandten Organismen, oder eine Kugel kann nur Oligonukleotide mit einer vorgegebenen Nukleinsäuresequenz enthalten.
Zahlreiche Organismen und Zelltypen, einschließlich pathogene und nicht pathogene Einheiten, können auf diese Weise aus verschiedenartigen Typen von biologischen Proben bestimmt werden. Die Organismen schließen ein Bakterien und Viren sowie andere Mikroorganismen, die Zelltypen umfassen beispielsweise diejenigen, die für Erbkrankheiten und metabolische Störungen verantwortlich sind. Viele andere Anwendungen zur Bestimmung sind für den durchschnittlichen Fachmann offensichtlich. Beispielsweise können bakterielle Agenzien, die angeblich Periodontitis verursachen, wie z.B. Actinobazillus Actinomycetemcomitans, Bacteroides gingivalis, Bateroides forsythus, Bacteroides intermedius, Eikenella corrodens, Fusobacterum nucleatum und Wolinella recta, identifiziert werden.
Es ist für den durchschnittlichen Fachmann offensichtlich, daß viele andere Anwendungen dieser Tauchstäbe möglich sind, auch wenn die vorliegende Erfindung von Nukleinsäure- Hybridisierungsuntersuchungen spricht. Irgendein Mitglied eines Ligandenpaars kann an Kugeln in dem Tauchstab angebunden werden, und der Tauchstab kann dann verwendet werden, um das korrespondierende Ligandglied zu identifizieren. Beispielsweise könnten Antigene oder Antikörper an Kugeln gebunden werden, wie dies oben beschrieben wurde, an einem Tauchstab und dann können ihre korrespondierenden Antikörper oder Antigene jeweils bestimmt werden. Auf ähnliche Weise können Biotin und Streptavidin verwendet werden.
Weiterhin schließt die vorliegende Erfindung auch Verfahren ein für die Bestimmung von Nukleinsäuren, bei denen eine Zusammensetzung umfassend eine polymerbeschichtete Kugel, die vorzugsweise aktivierbare Amingruppen hat, kovalent gebunden an ein aktiviertes Oligonukleotid, mit einer Zielnukleinsäure unter geeigneten Bedingungen für die Hybridisierung in Kontakt gebracht wird und das hybridisierte Produkt bestimmt wird. Solche Verfahren können in einer Mikrotitervertiefung, einer Durchflußkolonne und unter Verwendung eines Tauchstabs erfolgen, wie dies oben beschrieben wurde.
Die Zielnukleinsäure ist im allgemeinen ein Polynukleotid mit einer durchschnittlichen Länge von etwa 20 bis 20.000 Basen oder Nukleotiden in der Länge. Geeignete Bedingungen für die Hybridisierung sind strenge Bedingungen bei denen keine Fehlbildung bei der Basenpaarung auftritt und das hybridisierte Produkt eine perfekte Basenpaarung aufweist.
Eine besondere Hybridisierungstechnik ist für die Erfindung nicht wesentlich und ein durchschnittlicher Fachmann ist sich der verschiedenen Möglichkeiten solcher Techniken bewußt. Hybridisierungstechniken sind allgemein beschrieben bei Hames, B.D., et al. (ed.), Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, New York (1985). Soweit Verbesserungen in Hybridisierungstechniken erfolgen, können sie ohne weiteres auf die vorliegende Erfindung angewandt werden.
Sandwich Untersuchungen können vorzugsweise in dem vorliegenden Verfahren angewandt werden, wobei die Zielnukleinsäure, die zu bestimmen ist, entweder extrahiert wird oder sich in der Originalprobe befindet und sequestriert wird (eingefangen) an dem festen Träger, wie z.B. an Kugeln, durch Hybridisierung (d.h. Paaren der Komplementären Basen) an Einfangoligonukleotidsonden, die kovalent an der Oberfläche des Trägers immobilisiert sind. Die eingefangene Nukleinsäure wird dann hybridisiert an eine Signaloligonukleotidsonde oder alternativ kann dieser Schritt gleichzeitig durchgeführt werden mit dem Einfangen des Ziels, wobei man beispielsweise die Signalsonde in die Hybridisierungslösung mit einbringt. Die Signalsonde kann beispielsweise mit Biotin markiert werden. Dies führt zu einem "Sandwich" aus der Einfangoligonukleotidsonde: Zielnukleinsäure: Signaloligonukleotidsonde, was zu einer Sandwich Untersuchung führt. Der feste Träger wird dann gewaschen zur Entfernung von unhybridisiertem Material und die markierte Nukleinsäure wird dann gemessen im Einklang mit bestimmbaren Charakteristika des Markiermittels.
Verschiedene Markierer können in Hybridisierungsuntersuchungen für diese Erfindung geeignet sein. Solche Markierer fungieren als Berichtsgruppen (Reportergruppen) für die Bestimmung der Duplexbildung zwischen der Zielsequenz und ihrer komplementären Signalsequenz. Eine Reportergruppe wie sie hierin verwendet wird ist eine Gruppe die eine chemische oder physikalische Eigenschaft hat, die gemessen oder bestimmt werden kann. Die Bestimmbarkeit kann durch solche Charakteristika erzielt werden wie eine Farbänderung, Lumineszenz, Fluoreszenz oder Radioaktivität, oder erzeugt werden durch die Fähigkeit der Reportergruppe als eine Ligandenerkennungsstelle zu dienen. Irgendeine Hapten oder Antigenverbindung kann verwendet werden in Komibination mit einem geeigneten markierten Antikörper.
Enzyme die als Reportergruppen interessant sind, sind in erster Linie Hydrolasen, insbesondere Phosphotasen, Esterasen, Ureasen und Glycosidasen oder Oxidoreductasen, insbesondere Peroxidasen. Fluoreszierende Verbindungen umfassen Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Umbelliferon usw. Chemilumineszenzstoffe umfassen Luciferin, Luminol und Oxetandione. Die obige Liste ist nicht vollständig und die Auswahl des Markiermittels hängt ab von der erforderlichen Sensibilität, von der Leichtigkeit der Konjugation mit der Sonde, Stabilitätserfordernissen und einer geeigneten Instrumentierung.
Es versteht sich, daß die obige Beschreibung und der nachfolgende experimentelle Abschnitt nur erläuternden und nicht beschränkenden Charakter haben. Viele Variationen und Anwendungen ergeben sich ohne weiteres für einen durchschnittlichen Fachmann, wenn er diese Beschreibung liest.
In dem nachfolgenden experimentellen Abschnitt beschreibt Beispiel 1 die selektive Aktivierung von Oligonukleotiden die einen Aminohexylschwanz haben mit Cyanurchlorid. Beispiel 2 beschreibt den Vergleich von Nylonkugeln die von verschiedenen Diaminen und Poly (Ethylenimin) abgeleitet sind, ausgedrückt als Fähigkeit des festen Trägers, die Hybridisierung zu fördern. Beispiel 3 beschreibt die Verwendung eines Oligonukleotids abgeleitet von Nylonkugeln in einer Sandwich Untersuchung, in der die Hybridisierung bestimmt wird unter Verwendung eines unlöslichen kolorimetrischen Substrats. Beispiel 4 beschreibt die Verwendung von Nylonkugeln, die von Oligonukleotiden abgeleitet sind in einer Sandwich Untersuchung, bei der das Ziel in komplexen biologischen Proben bestimmt wird.
Beispiel 5 beschreibt die Verwendung von von Oligonukleotiden abgeleiteten Nylonkugeln in einem Sandwich, bei dem das Ziel durch Chemilumineszenz bestimmt wird. Beispiel 6 beschreibt die Verwendung von von Oligonukleotiden abgeleiteten Nylonkugeln, die an einem Tauchstab immobilisiert sind, um eine Platte oder Karte mit Vielfachbestimmungsstellen zu bilden.
Der nachfolgende Abschnitt Materialien und Methoden betrifft die oben zusammenfassend angegebenen Beispiele 1 bis 6.

Materialien

APB Puffer ist 0,18 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl pH = 7,6, 5 mM EDTA und 0,5% Tween 20.
TMNZ Puffer ist 0,05 M Tris pH = 9,5, 1 mM MgCl&sub2;, 0,5 mM ZnCl&sub2;.
FW (Filterwäsche) ist 0,09 M Natriumchlorid, 50 mM Tris pH 7,6, 25 mM EDTA.
SDS/FW ist FW und 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS).
HRP (Meerrettichperoxidase) Substratlösung ist 0,1 M Natriumcitrat pH 6,5, 0,2 M NaPhosphat, 0,5 mg/ml.
4-Methoxy-1-Naphthol, 0,02 mg/ml 3-Methyl-2-Benzothiazolinon Hydrazon und 0,0135 % Wasserstoffperoxid.
AP (Alkaliphosphatase) Substratlösung ist 1 mM 5-Brom-4- Chlorindoyl-3-Phosphat, 1 mM nitro Blau tetrazolium und 0,01 % Tween 20 in TMNZ.
Lysis und Hybridisierungslösung ist 3 M Guanidinium Thiocyanat, 2 % N-Lauroylsarcosin (Sarcosyl), 50 mM Tris pH 7,6, 25 mM EDTA.
CAP Puffer ist 0,1 M NaCitrat pH = 6,5 und 0,2 M Naphosphat.
Das Fluoreszenzsubstrat für Alkaliphosphatase ist 0,02 mM 4- Methyl-Umbelliferonphosphat, 0,05 M Tris pH = 9,5, 1 mM MgCl&sub2;, 0,5 mM ZnCl&sub2;.
Das Chemilumineszenzsubstrat für Alkaliphosphatase war ein vorbereiteter Cocktail von Lumigen, Inc. (Detroit, MI). Oligonukleotidsequenzen
Poly (Ethylenimin) wurde erhalten von Polysciences (Warrington, PA).
Polierte oder Unpolierte Nylonkugeln wurden erhalten von Precision Ball Company (Chicago,IL) und The Hoover Group (Sault St. Marie, MI.)
Triethyloxoniumtetrafluoroborat, Hexandiamin, Phenylendiamin, Succinsäureanhydrid und N-Methyl-Pyrrolidon (N-Methyl- Pyrrolidon, M-Pyrol) wurden erhalten von Aldrich Chemical (Milwaukee, IL).
N-Succinimidyl 4-(Iodacetamido)-Benzoat (SIAB) und Tween 20 wurden erhalten von Pierce (Rockford, IL).
Guanidiumisothioscyanat (GuSCN) wurden erhalten von Kodak (Rochester, NY).
Nylonmembran, Nytran , wurde erhalten von Schleicher & Schuell (Keene, NH).
Die Di- und Triamine EDR-148, ED-400, ED-6000 und T-3000 waren ein Geschenk von Texaco Chemical Company, (Housten, TX).

Verfahren

Oligonukleotidsynthese:

Oligonukleotide komplementär zu Abschnitten die konserviert wurden oder hypervariablen Abschnitten der 16S-Ribosomal RNA von entweder Actinobazillus Actinomycetemcomitans (Aa), Bacteroides gingivalis (Bg), Bacteroides intermedius (Bi), Eikenella corrodens (Ek), Fusobacterium nucleatum (Fn), oder Wolinella recta (Wr) wurden synthetisiert unter Verwendung der Phosporamiditchemie an entweder einem ABI 380B oder einem automatischen Milligen 7500 DNA Synthesizer. Die Oligonukleotide wurden hergestellt unter Verwendung der Standardphosphoramiditchemie die von dem Verkäufer geliefert wurde oder der H-Phosphonatchemie. Geeignet blockierte dA, dG, dC und T-Phosphoramidite sind in dieser Form kommerziell erhältlich und synthetische Nucleoside können ohne weiteres in die geeignete Form gebracht werden. Die Oligonukleotide wurden gereinigt durch Anpassung von Standardmethoden. Oligonukleotide mit 5'-Tritylgruppen wurden an HPLC chromatographiert unter Verwendung einer 12 um, 300 Å Rainin (Woburn, MA) Dynamax C-8 4.2x250 mm Umkehrphasenkolonne unter Verwendung eines Gradienten von 15 % bis 55 % MeCN in 0,1 N Et&sub3;NH&spplus;OAc&supmin;, pH 7,0, 20 Minuten lang. Wenn die Detritylierung ausgeführt war, wurden die Oligonukleotide weiter gereinigt durch Gelausschlußchromatographie. Analytische Untersuchungen der Qualität der Oligonukleotide wurden durchgeführt mit einer Toso-Haas DEAE-NPR Kolonne bei alkalischem pH und mittels Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE).

Herstellung der polymerbeschichteten Nylonkugel:

25.000 unpolierte Nylonkugeln mit einem Durchmesser von 0,23 cm (3/32 inch) wurden in einen Kolben gebracht, der 1.800 mm 100 % wasserfreies N-Methyl-Pyrrolidon enthielt und wurden 5 Minuten lang gemischt bei Raumtemperatur. 200 mm an 1 molarem Triethyloxonium Tetrafluoroborat in Dichlormethan wurden zugegeben und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Kugeln wurden dann dekantiert und rasch gewaschen mit 4x500 ml Mengen an 100 % N-Methyl- Pyrrolidon. Die Kugeln wurden dann in eine Lösung überführt, die aus 3 % w/v 10.000 MW Poly (Ethylenimin) bestand, hergestellt aus einer 30 % Lösung an Poly (Ethylenimin), in N-Methyl-Pyrrolidon und gerührt für 12 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur. Die Kugeln wurden gewaschen mit 2.000 mm N- Methyl-Pyrrolidon, 1.000 mm SDS/FW und schließlich 10 x 2 Liter destilliertem Wasser. Die Kugeln wurden dann getrocknet unter einem hohem Vakuum für 4 bis 5 Stunden lang unter Verwendung von Wärme. Der Amingehalt der Kugeln wurde bestimmt durch Reaktion mit Picrylsulfonsäure.

Herstellung von Cyanurchlorid-derivatisierten Oligonukleotiden:

10 bis 1.000 ug an 5'-Amino verknüpftem Oligonukleotid wurden zur Reaktion gebracht mit einem Überschuß an rekristallisiertem Cyanurchlorid in 10 % N-Methyl-Pyrrolidon in einem Alkalipuffer (pH 8,3 bis 8,5 vorzugsweise) bei 19º bis 25º C für 30 bis 120 Minuten lang. Die abschließenden Reaktionsbedingungen bestanden in 0,15 M Natriumborat bei pH 8,3, 2 mg/ml rekristallisiertes Cyanurchlorid und 500 ug/ml jeweils Aminohexyloligonukleotid. Das nicht reagierte Cyanurchlorid wurde entfernt durch Größenausschlußchromatigraphie an einer G-50 Sephadex (Pharmacia, Uppsala, Schweden) Säule.

Herstellung von Iodacetamidobenzoylierten Oligonukleotiden:

100 bis 1.000 ug an 5'-Amino verknüpftem Oligonukleotid (UP9A) Oligonukleotid wurde zur Reaktion gebracht mit einem Überschuß an N-Succinimidyl 4-(Iodacetamido)-Benzoat (SIAB) in einem Alkalipuffer (vorzugsweise pH 8,0) bei 18º bis 25º C für 30 bis 120 Minuten lang. Das unreagierte SIAB wurde entfernt durch Größenausschlußchromatographie an G-50 Sephadex (Pharmacia, Uppsala, Schweden).

Herstellung von Oligonukleotid derivatisierten Nylonkugeln:

Für Cyanurchlorid derivatisierte Oligonukleotide wurden Poly (Ehtylenimin) beschichtete Nylonkugeln wie sie oben beschrieben sind in ein Volumen von 0,1 M Natriumborat mit pH 8,3 gebracht entsprechend dem Volumen der Kugeln bei 4º C. Das gereinigte Cyanurchlorid-derivatisierte Oligonukleotid wurde dann zu den Kugeln zugegeben und die Mischung wurde heftig geschüttelt bei Raumtemperatur (19º bis 23º C) für 60 Minuten. Die Kugeln wurden dann zweimal mit 0,1 M Natriumborat bei pH 8,3 gewaschen. Bernsteinsäureanhydrid wurde dann zugegeben bei einer Konzentration von 10 mg/ml in 90 % N-Methyl-Pyrrolidon, 10 % 1 M Natriumborat pH 8,3 mit einem Volumen 3 mal so groß wie das Volumen der Kugeln. Die Reaktion ließ man eine Stunde bei Raumtemperatur ablaufen. Die Kugeln wurden dann dreimal gewaschen mit 250 ml an 100 % N-Methyl-Pyrrolidon, zweimal mit destilliertem Wasser, fünfmal mit 250 ml SDS/FW und dann viermal mit einem Liter destilliertes Wasser. Die Kugeln wurden trocken gelagert oder in 25 mM EDTA. Radioaktivität pro Kugel wurde bestimmt durch Flüssigszintillationszählung.
Für Iodacetamidobenzoylierte Oligonukleotide wurden Poly(Ethylenimin) beschichtete Nylonkugeln wie sie oben beschrieben sind in ein Volumen von 0,1 M Natriumborat bei pH 8,3 gebracht entsprechend dem Volumen der Kugeln, und Iminothiolan wurde zugegeben bis zu einem abschließenden Volumen von 5 mg/ml. Die Kugeln ließ man dann reagieren eine Stunde lang bei Raumtemperatur und sie wurden zehnmal gewaschen mit 0,1 M Natriumborat bei pH 8,3 und 10 mM EDTA bei 40 C. Die thiolierten Poly (Ethylenimin) beschichteten Nylonkugeln die oben beschrieben wurden wurden in ein Volumen von 0,1 M Natriumborat bei pH 8,3 und 25 mM EDTA gebracht entsprechend dem Volumen der Kugeln bei 4º C. Die gereinigten Iodacetamidobenzoylierten Oligonukleotide wurden dann zu den Kugeln zugegeben und die Mischung wurde heftig geschüttelt (gerührt) bei Raumtemperatur (19º bis 23º C) 4 Stunden lang. Die Kugeln wurden dann zweimal mit 0,1 M Natriumborat und 25 mM EDTA gewaschen und dann inkubiert mit einem Volumen entsprechend dem dreifachen der Kugeln mit 10 mg/ml Iodacetamid in einem 1:1 v/v Verhältnis N-Methyl-Pyrrolidon und 0,1 M Natriumborat bei pH 8,3. Die Reaktion ließ man bei Raumtemperatur eine Stunde lang ablaufen. Die Kugeln wurden dann dreimal mit 250 ml an 100 % N-Methyl-Pyrrolidon gewaschen, zweimal mit destilliertem Wasser, fünfmal mit 250 ml SDS/FW und dann viermal mit einem Liter an destilliertem Wasser. Die Kugeln wurden trocken gelagert oder in 25 mM EDTA. Die Radioaktivität pro Kugel wurde dann bestimmt durch Flüssigszintillationszählung.

Herstellung des festen Membranträgers:

Ein 16 cm² Stück von Nytran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) wurde mit 10 ml an 5 mg/ml Iminothiolan in 0,1 M Natriumborat bei einem pH von 8,3 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membran wurde mit 5 Wechselmengen an Natriumboratpuffer wie oben beschrieben gewaschen. Die eingeführten Thiolgruppen wurden dann bestimmt unter Verwendung von 5,5-Dithio-Bis (2-Nitrobenzoesäure). Die derivatisierte Membran wurde dann geschnitten in 0,28 cm² Scheiben und wurde einmal gewaschen mit 0,1 M Natriumboratpuffer. IAB-Oligonukleotid wurde hergestellt wie oben beschrieben und gemischt mit den Membranscheiben. 300 Membranscheiben wurden eingetaucht in 2 ml an 0,1 M Natriumboratpuffer der 1,0 mg an IAB-Oligonukleotid enthält, und man ließ die Reaktion ablaufen bei Raumtemperatur mit konstantem Rühren 16 Stunden lang in der Dunkelheit. Die Scheiben wurden dann nachfolgend gewaschen mit 0,1 M Natriumborat, SDS/FW. 1,2 mikrogramm an Bg5B Oligonukleotid wurde gebunden pro Filterscheibe. Die nicht abreagierten Thiolgruppen wurden blockiert mit 50 mg/ml Iodacetamid in 0,1 M Natriumborat pH = 8,3. Die Filter wurden dann weiter gewaschen mit Natriumborat und SDS/FW.
Lysis von Bakterien und Hybridisierungsbedingungen:
1 x 10&sup8; Zellen an Bakteroides gingivalis (Bg) wurde aufgelöst in 100 ul an Lysislösung bei 190 C. Das Zell-Lysat wurde dann erhitzt in einem 65º Wasserbad zehn Minuten lang. Die biotinylierte Probe wurde zu der Lysatlösung zugegeben und zu dem Verdünnungsmittel (GuSCN Lysislösung) bis zu einer abschließenden Konzentration an 100 ng/ml und 5 bis 8fache Serienverdünnungen wurden von dem Ausgangslysat hergestellt. Die Lösungen wurden dann inkubiert mit entweder der derivatisierten Nylonkugel oder dem Nytran das kovalent immobilisiert wurde mit 0,1 ug der jeweiligen Oligonukleotidsonde (Einfangsonde) eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit mildem Rühren. Die festen Träger wurden dann gewaschen einmal mit der Lysis und Hybridisierungslösung, einmal mit FW und einmal mit SDS/FW. Streptavidin / HRP Konjugat wurde zugegeben bis zu einer abschließenden Konzentration von 1 microgramm/ml (auf Bais von Streptavidin) in SDS/FW und inkubiert 10 bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter mildem Rühren. Die Kugeln und Filter wurden dann dreimal gewaschen mit SDS/FW und dann einmal mit CAP Puffer. 4-Methoxy-Naphtol Naphtolsubstratlösung wie oben beschrieben wurde zugegeben und man ließ die Reaktion 15 Minuten lang bei Raumtemperatur ablaufen. Die Kugeln oder Filter wurden dann rasch gewaschen einmal mit SDS/FW und dann einmal mit FW und man erlaubte ihnen an der Luft in der Dunkelheit zu trocknen. Das Ausmaß der Hybridisierung ist direkt korrelierbar mit der Dichte der gefärbten Substrate die auf den Kugeln abgelagert sind.

Beispiel 1

Beispiel 1 beschreibt die selektive Modifikation und Aktivierung des angeknüpften 5'-Amins der Oligonukleotide mit Cyanurchlorid. Es wird gezeigt, daß die Derivatisierung des Oligonukleotids nur an dem angeknüpften Amin auftritt.
Die Sequenz UP9A, die entweder einen 5'-Aminohexylschwanz besaß oder nicht, wurde verglichen im Hinblick auf die Reaktivität mit Cyanurchlorid. 50 ug jedes Typs des Oligonukleotids wurden in einem 400 ul Volumen zur Reaktion gebracht, das 0,15 M Natriumborat bei pH = 8,3, enthielt, 2 mg/ml Cyanurchlorid (aus 50 mg/ml frisch präpariertem Vorrat in 100 % Acetonitril) . Man ließ die Reaktion bei 19º C 30 Minuten lang ablaufen. Das Reaktionsgemisch wurde dann analysiert durch C-18 Umkehrphasen HPLC unter Verwendung von 5 bis 45 % Acetonitril-Gradientem in TEA. Die Chromatogramme aus den jeweiligen Reaktionsmischungen und von beiden Typen des Ausgangsoligonukleotids sind in Fig. 3 dargestellt.
Die Oligonukleotidsequenz UP9A ohne Schwanz ist in Panel A dargestellt und tritt aus der Säule aus bei 9,025 Minuten wohingegen die Oligonukleotidsequenz UP9A mit Aminschwanz bei 9,205 Minuten austritt (Panel B). Der Chromatograph in Panel C zeigt daß die Oligonukleotidsequenz UP9A ohne Schwanz nicht mit Cyanurchlorid reagiert, wobei das Oligonukleotid weiterhin bei 9,005 Minuten austritt. In Panel D reagiert die Oligonukleotidsequenz UP9A mit Aminschwanz nahezu vollständig mit Cyanurchlorid was zu einem Dichlortriazinderivat führt, das bei 11,6 Minuten eluiert, nahezu 2,5 Minuten später als das Startmaterial UP9A mit Aminschwanz. Die Profile zeigen, daß nur die UP9A Sequenz die das 5'-angeknüpfte Amin enthält mit Cyanurchlorid reagiert, was demonstriert, daß das Cyanurchlorid selektiv mit dem Amin reagiert und nicht mit einem der Zucker oder Basen die in dem Oligonukleotid anwesend sind. Daher konnte gezeigt werden, daß 5'-Aminohexyl Oligonukleotide selektiv mit Cyanurchlorid aktiviert werden, was zu einer Sonde führt, die nur an dem 5'-Ende an einen festen Träger immobilisiert wird.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Derivatisierung von Nylonkugeln mit verschiedenen Typen von Diaminen und Poly (Ethylenimin) und dann die nachfolgende Anknüpfung von 4,6- Dichlortriazin-Oligonukleotiden. Ein Vergleich der Hybridisierungseigenschaften der jeweiligen Kugeln ist ebenfalls beschrieben.
200 Kugelansätze wurden derivatisiert entweder mit Hexandiamin, Jeffamin EDR 148, 1,4-Phenylendiamin, Jeffamin T3000, oder Poly (Ethylenimin) unter Verwendung des Verfahrens das oben beschrieben wurde in Verbindung mit der Herstellung von polymerbeschichteten Kugeln. Jeder Diamin oder Triamin-Kugeltyp enthielt zwischen 200 nmoles bis 2 umoles an Amin und das Poly (Ethylenimin) enthielt annähernd 100 nmoles an Amin.
Jeder Kugeltyp wurde dann zur Reaktion gebracht mit 4,6- Dichlortriazin-aktiviertem Oligonukleotid (BgS Sequenz) wie oben beschrieben. Die nicht reagierten Amine wurden dann blockiert mit Succinanhydrid wie oben beschrieben und untersucht in Hybridisierungsuntersuchungen gemäß obiger Beschreibung. Die Phenylendiaminkugeln zeigten keine Fähigkeit Zielnukleinsäure einzufangen, währen die Jeffamine EDR-148, T-3000 und die Kugeln vom Hexandiamintyp Zielnukleinsäuren einfingen, jedoch mit einer Geschwindigkeit die etwa 25fach geringer war als die der Poly (Ethylenimin) Kugeln. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt.
Die Resultate zeigen an, daß polymerbeschichtete Kugeln ungefähr 25fach stärker effizient waren im Einfangen von Zielnukleinsäure und daher den besten Oberflächentyp für die kovalente Immobilisierung von Oligonukleotiden und das Einfangen von Zielnukleinsäuren darstellen.

Beispiel 3

Beispiel 3 vergleicht die festen Träger die aus den Nytranmembranen und Nylonkugeln gebildet wurden in einem Sandwichuntersuchungsformat, in dem eine Zielnukleinsäuresequenz sequestriert wurde und dann bestimmt wurde unter Verwendung eines kolorimetrischen Untersuchungsformats.
3 M GnSCN Lysislösung wurde dann verwendet um 1 x 10&sup8; Zellen an Actinobazillus Acinomycetemcomitans aufzulösen (Aa), Bakteroides gingivalis (Bg), Bakteroides intermedius (Bi), Eikenella corrodens (Ec), Fusobakterium nucleatum (Fn), und Wolinella recta (Wr) in 100 Mikroliter Volumen bei 19º C. Das Lysat wurde dann erwärmt auf 65º C für 5 Minuten. Eine biotinylierte 24-Mer Oligonukleotidsonde komplementär zu konservierten Bereichen an bakterieller 16s rRNA (Signalsonde) wurde zugegeben bis zu einer abschließenden Konzentration von 100 Nanogramm pro ml.
5fache Serienverdünnungen der Lysate wurden durchgeführt unter Verwendung von Verdünnungsmitteln die biotinylierte Signaloligonukleotide enthielten und 1 x 10&sup8; Gesamtzellen an Aa, Bi, Ek, Fn und Wr. Die Lösungen wurden dann inkubiert für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Nytranscheiben oder zwei Nylonkugeln, die kovalent immobilisiert aufwiesen 0,1 ug an Bgl spezifischer Oligonukleotidsonde (Einfangsonde). Die festen Träger wurde dann gewaschen mit SDS/FW bei Raumtemperatur und dann inkubiert mit 10 ng/ml an Strepatividin/Meerrettichperoxidase (SA/HRP) Konjugat in SDS/FW für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Die festen Träger wurden dann gewaschen mit SDS/FW, FW und dann wurde die Anwesenheit der Peroxidase bestimmt durch Inkubieren der Filter mit der HRP Substratlösung wie oben beschrieben zur Bildung eines unlöslichen Produkts.
Die Resultate zeigten an, daß in der 30 Minuten Hybridisierung, 2 x 10&sup5; Zellen bestimmt wurden bei Verwendung der Nylonkugeln als feste Träger, wohingegen 1 x 10&sup6; Zellen bestimmt wurden bei der Verwendung von festen Nytranträgern. Die Kontrolle in der Aa, Bi, Ek und Wr Zellen anwesend waren und Bg abwesend war zeigte keine Farbe, was anzeigte, daß das Einfangen von Bg spezifisch war. Es wurde auch festgestellt, daß die meisten unlöslichen HRP Substrate verblaßten beim Färben an den Nytranmembranen, wohingegen kein Ausbleichen auftrat an den Nylonkugeln.

Beispiel 4

Beispiel 4 vergleicht die festen Träger, die mit der Nytranmembran gebildet wurden und den Nylonkugeln in einem Sandwich Untersuchungsformat, in dem eine Zielnukleinsäuresequenz sequestriert wird und dann bestimmt wird in einer komplexen biologischen Probe, die Gesamtblut enthielt.
3 M GnSCN Lösung wurde verwendet, um 1 x 10&sup8; Zellen von Bakteroides gingivalis (Bg) aufzulösen, die in eine Plattenprobe gespießt waren, die sichtbare Mengen an Blut enthielt (ungefähr 25 Mikroliter gepacktes Zeilvolumen) in 250 Mikroliter Volumen bei 19º C und dann aufgeteilt in zwei gleiche Volumina. Die Lysate wurden dann erhitzt auf 65º C für 5 Minuten. Eine biotinylierte 24-Mer Oligonukleotidsonde komplementär zu den konservierten Regionen der bakteriellen 16s rRNA (Signalsonde) wurde zugegeben bis zu einer abschließenden Konzentration von 100 Nanogramm pro ml.
5fache Serienverdünnungen der Lysate wurden durchgeführt unter Verwendung von Verdünnungsmitteln in 3 M GuSCN Lysis und Hybridisierungslösung, die die biotinylierten Signaloligonukleotide enthielten und einen Teil auf zehn des Gesarntbluts. Die Lösungen wurden dann inkubiert für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einer Nytranscheibe oder zwei Nylonkugeln, die kovalent daran immobilisiert hatten 0,1 ug an Bgl spezifischer oligonukleotidsonde (Einfangsonde) - Die festen Träger wurden dann gewaschen mit SDS/FW bei Raumtemperatur und inkubiert mit 10 ng/ml an Strepatividin/Meerrettichperoxidase (SA/HRP) Konjugat in SDS/FW für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Die festen Träger wurden dann gewaschen mit SDS/FW, FW und die Gegenwart an Peroxidase wurde bestimmt durch Inkubieren der Filter mit der HRP Substratlösung wie oben beschrieben zur Bildung eines unlöslichen Produkts.
Die Ergebnisse zeigten an, daß in der 30 Minuten Hybridisierung 8 x 10&sup5; Zellen bestimmt wurden unter Verwendung der Nylonkugeln als feste Träger, während 4 x 10&sup6; Kugeln bestimmt wurden bei Verwendung der festen Nytranträger. Noch bedeutsamer war, daß die Nytranf ilter wesentlich gefärbt wurden mit den aufgelösten Blutprodukten, während die Nylonkugeln ihre Ausgangsfarbe behielten.

Beispiel 5

Beispiel 5 vergleicht die festen Träger, die aus Nytranmernbranen und Nylonkugeln gebildet wurden in einem Sandwich Untersuchungsformat, in dem eine Zielnukleinsäuresequenz sequestriert wird und dann bestimmt wird unter Verwendung eines Chemilumineszenz Untersuchungsformat.
3 M GnSCN Lysislösung wurde verwendet, um 1 x 10&sup8; Zellen an Actinobazillus actinomycetemcomitans (Aa), Bakteroides gingivalis (Bg), Bakteroides intermedius (Bi), Eikenella corrodens (Ec), Fusobaktenum nucleatum (Fn) und Wolinella recta (Wr) in 100 Mikroliter Volumen bei 19º C aufzulösen. Die Lysate wurden dann erwärmt auf 65º C für fünf Minuten. Eine biotinylierte 24-Mer Oligonukleotidsonde komplementär zu den konservierten Regionen an bakterieller 165 rRNA (Signalsonde) wurde zugegeben bis zu einer abschließenden Konzentration von 100 Nanogramm pro ml.
Fünffache Serienverdünnungen der Lysate wurden durchgeführt unter Verwendung von Verdünnungsmitteln in 3 M GuSCN Lysis und Hybridisierungslösung enthaltend die biotinylierten Signaloligonukleotide und 1 x 10&sup8; Gesamtzellen an Aa, Bi, Ek, Fn und Wr. Die Lösungen wurden dann inkubiert 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Nytranscheiben oder zwei Nylonkugeln, die kovalent daran immobilisiert hatten 0,1 ug an Bg1 spezifischer Oligonukleotidsonde (Einfangsonde). Die festen Träger wurden dann gewaschen mit SDS/FW bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Waschung mit 0,5 % Tween 20, 1 mM MgCl2, 0,01 M Tris-HCl pH 8,0 (APB) und dann inkubiert mit 0,4 ug/ml an Streptavidin/Alkaliphosphatase (SA/AP) Konjugat in APB für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Die festen Träger wurden dann gewaschen fünfmal mit APB, TMNZ und dann wurde die Gegenwart von Alkaliphosphatase bestimmt durch Inkubieren entweder der Nitranfilter oder der Nylonkugeln mit 200 Mikrolitern an Lumigen (von Lumigen, Inc., Detroit, MI) in 5mm x 40 mm Polypropylenröhrchen. Die Resultate sind in der nachfolgend wiedergegebenen Tabelle gezeigt.
Somit zeigen die Ergebnisse, daß in der 30 Minuten Hybridisierung 3 x 10&sup4; Zellen bestimmt wurden bei Verwendung der Nylonkugeln als feste Träger, während nur 1 x 10&sup8; Zellen bestimmt wurden bei Verwendung der festen Nytranträger. Diese ungefähr 10.000fache Differenz in dem unteren Spiegel der Bestimmung des Ziels war zurückzuführen auf den ernstzunehmenden Hintergrund an nichtspezifischer Bindung der Alkaliphosphatase an die Nytranfilter. Die Nylonkugeln erlaubten es daher sensitiv zu bestimmten die Bg 16s rRNA unter Verwendung eines Signalsystems aus Chemilumineszenzbasis.

Beispiel 6

Beispiel 6 beschreibt die Verwendung von 0,23 (3/32 inch) Nylonkugeln immobilisiert in einer nicht porösen Kunststoffkarte zur Bildung einer Multipanelbestimmungs- Zusammensetzung die hierin als Tauchstab bezeichnet wird. Der Tauchstab (oder die Indikatorkarte) der so gebildet wurde besitzt multiple und voneinander verschiedene Stellen die die spezifische Bestimmung multipler Pathogene in einer einzelnen Probe erlauben. In diesem Beispiel wird die spezifische Bestimmung von Bg und Ek demonstriert.
Ein Set von sechs identischen Tauchstäben wurde hergestellt, in denen die generelle Konfiguration des Tauchstabs in den Fig. 1 und 2 gezeigt ist. Die fünf Kugeln, jeweils ein unterschiedliches Einfangoligonukleotid besitzend, wurden in den Tauchstab gebracht von links nach rechts in folgender Reihenfolge:
1: PA005 (positive Kontrolle)
2: Aa004 (für die Bestimmung von Aa rRNA)
3: 8g002 (für die Bestimmung von Bg rRNA)
10 4: Ek007 (für die Bestimmung von Ek rRNA)
5: PA505 (negative Kontrolle)
Jeder Tauchstab wurde untersucht in 400 ul Lysis und Hybridisierungslösung wie oben beschrieben enthaltend biotinyliertes UP9A und UP007 mit 500 ng/ml, PA505 mit 5 ng/ml und entweder:
1) 1 x 10&sup8; Bg Zellen.
2) 2 x 10&sup7; Bg Zellen.
3) 1 x 10&sup8; Ek Zellen.
4) 2 x 10&sup7; Ek Zellen.
5) 1 x 10&sup8; Bg Zellen und 1 x 10&sup8; Ek Zellen.
6) 2 x 10&sup8; Bg Zellen und 2 x 10&sup8; Ek Zellen.
Die Tauchstäbe wurden nacheinander behandelt durch die folgenden Lösungen mit konstantem Rühren bei 2 Hertz: 10 Minuten in der Hybridisierungslösung, 2 Minuten in SDS/FW, 5 Minuten in SA/HRP Konjugat, 2 Minuten in SDS/FW, 2 Minuten in CAP Puffer, und dann entwickelt 10 Minuten in 4 MN Substratlösung. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle beschrieben.
Worin ++ anzeigt starkes kolorimetrisches Signal, + anzeigt mittleres kolorimetrisches Signal, - anzeigt kein Signal. Die Resultate zeigen an, daß der Tauchstab in der Lage war spezifisch die Anwesenheit von Bg und Ek zu bestimmen.

Claims

1. Zusammensetzung umfassend ein Oligonukleotid, das kovalent an einen festen Träger gebunden ist, der mit einem Amin-haltigen Polymeren beschichtet ist, wobei die kovalente Anbindung auftritt zwischen dem Arnin des Polymer-beschichteten festen Trägers und einem Amin, das mit dem Oligonukleotid verknüpft ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der das Oligonukleotid aktiviert ist mit einem monofunktionalen oder multifunktionalen Reagenz.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, in der das Reagenz homotrifunktional ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, in der das Reagenz Cyanurchlorid ist.

5. Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, in der der feste Träger, der mit einem Amin-haltigen Polymeren beschichtet ist, eine Nylonkugel ist und eine sphärische Form aufweist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, in der die Polymerbeschichtete Kugel einen Durchmesser im Bereich von 0,025 bis 1,27 cm (0,01 inch bis 0,5 inch) hat.

7. Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, in der die Polymerbeschichtete Kugel einen Durchmesser von 0,15 bis 0,23 cm (0,06 inch bis 0,09 inch) hat.

8. Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, in der die Polymerbeschichtete Kugel einen Durchmesser von etwa 0,23 cm (0,09 inch) hat.

9. Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, in der das Oligonukleotid mit dem polymerbeschichteten festen Träger verknüpft ist über ein Amin, das an das 5- oder 3- Ende des Oligonukleotids angeknüpft ist.

10. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, in der das Oligonukleotid mit dem polymerbeschichteten festen Träger über ein Amin verknüpft wird, das an das Oligonukleotid angeknüpft ist an einer Stelle zwischen den 5- und 3- Enden des Oligonukleotids.

11. Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, in der das Polymere Poly (Ethylenimin), Polyvinylamin, Polyallylamin oder Poly (Acylhydrazid) ist.

12. Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, in der nicht reagierte Amine des Polymeren blockiert sind.

13. Verfahren zur Herstellung eines Oligonukleotids, das kovalent an ein Amin-haltiges Polymeres gebunden ist, über ein Amin, das an das 5- Ende oder 3- Ende oder an einer Stelle zwischen dem 5- Ende und dem 3- Ende des Oligonukleotids angeknüpft ist, wobei das Verfahren umfaßt:

das Aktivieren eines Aminoalkylsubstituierten Oligonukleotids mit Cyanurchlorid und das konjugieren des aktivierten Oligonukleotids an ein Amin-haltiges Polymer.