RS62416B1 - Predikcija epitopa t-ćelija korisnih za vakcinaciju - Google Patents

Predikcija epitopa t-ćelija korisnih za vakcinaciju

Info

Publication number
RS62416B1
RS62416B1 RS20211140A RSP20211140A RS62416B1 RS 62416 B1 RS62416 B1 RS 62416B1 RS 20211140 A RS20211140 A RS 20211140A RS P20211140 A RSP20211140 A RS P20211140A RS 62416 B1 RS62416 B1 RS 62416B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
protein
cells
tumor
modification
cell
Prior art date
Application number
RS20211140A
Other languages
English (en)
Inventor
Ugur Sahin
Martin Löwer
Arbel D Tadmor
Sebastian Boegel
Barbara Schrörs
Mathias Vormehr
Sebastian Kreiter
Original Assignee
BioNTech SE
Tron Translationale Onkologie An Der Univ Medizin Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Ggmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BioNTech SE, Tron Translationale Onkologie An Der Univ Medizin Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Ggmbh filed Critical BioNTech SE
Publication of RS62416B1 publication Critical patent/RS62416B1/sr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in epitope analysis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/30—Detection of binding sites or motifs
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Description

Opis
TEHNIČKO POLJE PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupke za predikciju epitopa T-ćelija korisnih za vakcinaciju. Konkretno, ovaj pronalazak se odnosi na postupke za predikciju da li su modifikacije peptida ili polipeptida, kao što su tumor-asocirani neoantigeni, imunogene, i konkretno, korisne za vakcinaciju, ili za predikciju koje od tih modifikacija su najimunogenije i, konkretno, najkorisnije za vakcinaciju. Postupci pronalaska mogu da se koriste, konkretno, za dobijanje vakcina specifičnih prema tumoru pacijenta i, prema tome, u kontekstu personalizovanih vakcina protiv kancera.
OSNOV PRONALASKA
[0002] Mutacije se smatraju idealnim metama za delovanje imunoterapije kancera. Budući da predstavljaju neo-epitope koji se nikako ne eksprimiraju u bilo kom zdravom tkivu, očekivano je da budu bezbedne i da mogu da izbegnu centralne mehanizme tolerancije. Sistematska upotreba mutacija za pristupe u izradi vakcina, međutim, otežana je jedinstvenošću repertoara mutacija ("mutanom") u tumoru svakog pacijenta (Alexandrov, L. B., et al., Nature 500, 415 (2013)). Podnosioci prijave su nedavno predložili personalizovani imunoterapijski pristup koji ciljno deluje na spektar pojedinačnih mutacija (Castle, J. C., et al., Cancer Res 72, 1081 (2012)). WO2012/159754 otkriva postupak za obezbeđivanje individualizovane vakcine protiv kancera koji obuhvata korake: (a) identifikovanje somatskih mutacija specifičnih za kancer u uzorku tumora pacijenta sa kancerom, kako bi se dobio profil mutacija kancera specifičan za pacijenta; i (b) dobijanje vakcine koja se odlikuje specifičnim profilom mutacija kancera dobijenim u koraku (a).
[0003] Međutim, postoji potreba za modelom za predikciju da li će epitop, konkretno neo-epitop, izazvati efikasan imunitet i time biti koristan u vakcinaciji.
[0004] U ovom dokumentu, podnosioci prijave pokazuju, u tri nezavisna modela tumora miša, da je značajan deo nesinonimnih kancerskih mutacija imunogen i da neočekivano imunogeni mutanom prevashodno prepoznaju CD4<+>T-ćelije ("CD4<+>imunom"). Vakcinacija takvim CD4<+>imunogenim mutacijama daje snažnu antitumorsku aktivnost. Ohrabreni ovim nalazima, podnosioci prijave su uspostavili postupak koji uključuje otkrivanje mutacija sekvenciranjem egzoma, odabir ciljeva vakcine isključivo određivanjem bioinformatičkim pristupom prioritetnih mutiranih epitopa za koje se predviđa da će biti obilno eksprimirani i dobro se vezivati za MHC klase II, i brzu proizvodnju sintetičkih iRNK vakcina koje kodiraju više ovih mutiranih epitopa. Podnosioci prijave su pokazali da vakcinacija takvim poli-neo-epitopskim iRNK vakcinama izaziva snažnu kontrolu tumora i potpuno odbacivanje ustanovljenih agresivno-rastućih tumora kod miševa. Osim toga, podnosioci prijave su pokazali da vakcinacija neo-epitopom CD4<+>T-ćelija indukuje CTL odgovore na nezavisni imunodominantni antigen kod miševa koji nose tumore, što ukazuje na orkestraciju širenja antigena. Konačno, analizama odgovarajućih tipova kancera kod ljudi istim bioinformatičkim algoritmima demonstrirano je obilje mutacija za koje se predviđa da će se vezati za MHC klase II i kod kancera ljudi. Tako se prilagođeni imunoterapijski pristup koji je ovde predstavljen može smatrati univerzalno primenljivim obrascem za sveobuhvatno korišćenje velikog ciljnog repertoara neo-epitopa kancera koji omogućava ciljno delovanje na tumor svakog pacijenta vakcinama proizvedenim "tačno na vreme".
OPIS PRONALASKA
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0005] Ovaj pronalazak se sastoji od sledećih aspekata:
1. Postupak za predikciju jedne ili više imunogenih modifikacija aminokiselina koje su korisne za vakcinaciju, pri čemu se modifikacije javljaju u proteinu koji sadrži neoantigen povezan sa tumorom pacijenta, gde postupak obuhvata korake:
a) utvrđivanja skora vezivanja modifikovanog peptida koji predstavlja fragment modifikovanog proteina za jedan ili više molekula MHC klase II kod navedenog pacijenta,
b) utvrđivanja skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina, pri čemu utvrđivanje skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina obuhvata utvrđivanje nivoa ekspresije proteina sa kojim je modifikacija povezana i određivanje učestalosti modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana, pri čemu se učestalost modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana određuje utvrđivanjem učestalosti alelne varijante, i
c) predikcije jedne ili više imunogenih modifikacija aminokiselina,
gde skor vezivanja navedenog peptida za navedeni molekul MHC klase II odražava verovatnoću vezivanja navedenog peptida za navedeni molekul MHC klase II, gde učestalost alelne varijante predstavlja zbir detektovanih sekvenci, u konkretnim očitavanjima, koja obuhvataju mesto mutacije i nose mutaciju, podeljen zbirom svih detektovanih sekvenci, u konkretnim očitavanjima, koja obuhvataju mesto mutacije, pri čemu se, za utvrđivanje skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina, skor nivoa ekspresije proteina sa kojim je modifikacija povezana množi skorom učestalosti modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana, gde se predikcija imunogenih modifikacija aminokiselina odnosi na predikciju da li će peptid koji sadrži takve modifikacije aminokiselina biti imunogen, i stoga koristan kao epitop u vakcinaciji.
2. Postupak za izbor i/ili rangiranje imunogenih modifikacija aminokiselina koje su korisne za vakcinaciju, pri čemu se modifikacije javljaju u proteinu koji sadrži neoantigen povezan sa tumorom pacijenta, gde postupak obuhvata korake:
a) utvrđivanja skora vezivanja modifikovanog peptida koji je fragment modifikovanog proteina za jedan ili više molekula MHC klase II pomenutog pacijenta,
i
b) utvrđivanja skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina, pri čemu utvrđivanje skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina obuhvata utvrđivanje nivoa ekspresije proteina sa kojim je modifikacija povezana i određivanje učestalosti modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana, pri čemu se učestalost modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana određuje utvrđivanjem učestalosti alelne varijante,
pri čemu postupak obuhvata izvođenje koraka a) i b) na dve ili više različitih modifikacija, i gde postupak dalje obuhvata korak:
c) odabira i/ili rangiranja imunogenih modifikacija aminokiselina korisnih za vakcinaciju,
gde skor vezivanja navedenog peptida za navedeni molekul MHC klase II odražava verovatnoću vezivanja navedenog peptida za navedeni molekul MHC klase II,
gde učestalost alelne varijante predstavlja zbir detektovanih sekvenci, u konkretnim očitavanjima, koja obuhvataju mesto mutacije i nose mutaciju, podeljen zbirom svih detektovanih sekvenci, u konkretnim očitavanjima, koja obuhvataju mesto mutacije, pri čemu se, za utvrđivanje skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina, skor nivoa ekspresije proteina sa kojim je modifikacija povezana množi skorom učestalosti modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana.
3. Postupak prema aspektu 2, koji obuhvata poređenje skorova navedene dve ili više različitih modifikacija, pri čemu se, poželjno, skorovi navedene dve ili više različitih modifikacija upoređuju rangiranjem različitih modifikacija prema njihovim skorovima vezivanja za MHC klase II.
4. Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 3, koja obuhvata izvođenje koraka a) na dva ili više različitih modifikovanih peptida, pri čemu navedena dva ili više različitih modifikovanih peptida sadrže istu modifikaciju/modifikacije.
5. Postupak prema aspektu 4, gde dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju/modifikacije sadrže različite fragmente modifikovanog proteina, pri čemu navedeni različiti fragmenti sadrže istu modifikaciju/modifikacije prisutne u proteinu, i/ili
dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju/modifikacije sadrže različite potencijalne fragmente vezivanja MHC klase II modifikovanog proteina, gde navedeni fragmenti sadrže istu modifikaciju/modifikacije prisutne u proteinu, i/ili dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju/modifikacije se razlikuju po dužini i/ili položaju modifikacije/modifikacija.
6. Postupak prema aspekatima 4 ili 5 koji dalje obuhvata odabir modifikovanog/modifikovanih peptida od dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju/modifikacije koji imaju verovatnoću ili imaju najveću verovatnoću za vezivanje za jedan ili više molekula MHC klase II.
7. Postupak prema bilo kom od aspekata 4 do 6, pri čemu se najbolji skor vezivanja za jedan ili više molekula MHC klase II dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju/modifikacije dodeljuje modifikaciji/modifikacijama.
8. Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 7, pri čemu se navedeno određivanje nivoa ekspresije proteina sa kojim je modifikacija povezana i/ili određivanje učestalosti modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana obavlja na nivou RNK.
9. Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 8, gde modifikovani peptid sadrži fragment modifikovanog proteina, pri čemu pomenuti fragment sadrži modifikaciju prisutnu u proteinu.
10. Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 9, koja dalje obuhvata identifikaciju nesinonimnih mutacija u jednom ili više regiona koji kodiraju proteine.
11. Postupak prema bilo kom od aspekata 1 do 10, gde se modifikacije aminokiselina identifikuju delimičnim ili potpunim sekvenciranjem genoma ili transkriptoma jedne ili više ćelija, kao što su jedna ili više kancerskih ćelija i opciono jedna ili više nekancerskih ćelija i identifikovanjem mutacija u jednom ili više regiona koji kodiraju proteine.
12. Postupak prema aspekatu 10 ili 11, gde su navedene mutacije somatske mutacije i/ili kancerske mutacije.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0006] Iako je predmetni pronalazak detaljno opisan u nastavku, smatraće se da pronalazak nije ograničen konkretnim ovde opisanim metodologijama, protokolima i korišćenim reagensima, jer oni mogu da variraju. Takođe treba da se razume da korišćena terminologija ima za cilj samo da opiše konkretne primere izvođenja, a ne da ograniči obim predmetnog pronalaska, koji će biti ograničen isključivo priloženim patentnim zahtevima. Ukoliko nije drugačije naznačeno, svi ovde upotrebljeni tehnički i naučni termini imaju značenja koja obično podrazumeva stručnjak u ovoj oblasti.
[0007] Poželjno, termini koji su korišćeni u ovoj prijavi opisani su u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland.
[0008] U izvođenju predmetnog pronalaska biće primenjene, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne metode biohemije, ćelijske biologije, imunologije i rekombinantne DNK tehnologije, opisane u referentnoj literaturi u ovim oblastima (uporediti na primer, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2<nd>Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
[0009] U celoj specifikaciji i zahtevima koji je prate, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč “sadrži” i varijacije kao što su “sadrže” i “koje sadrže”, ukazuju na uključenost navedenog člana, celog broja ili koraka, ili grupe članova celih brojeva ili koraka, a ne na isključenost nekog člana, celog broja ili koraka, ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, mada u nekim primerima izvođenja, taj član, ceo broj ili korak, ili grupa članova, celih brojeva ili koraka može biti isključena, to jest, značenje se sastoji od uključivanja navedenog člana, celog broja ili koraka, ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Termini u jednini, koji se ovde koriste u opisivanju pronalaska (naročito u kontekstu zahteva), odnose se i na jedninu i množinu, ukoliko nije drugačije naznačeno, ili jasno negirano kontekstom. Navođenje opsega vrednosti ima za cilj da posluži kao skraćeni metod individualnog ukazivanja na posebne vrednosti unutar datog opsega. Ukoliko nije drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost je sastavni deo opisa, kao da je pojedinačno ovde navedena.
[0010] Svi opisani postupci mogu se izvesti bilo kojim pogodnim redosledom, osim ukoliko nije jasno drugačije naznačeno, ili negirano kontekstom. Primena svakog ili svih primera, ili reprezentativnih reči (na primer, “kao što je”), ima za cilj da bolje ilustruje pronalazak, a ne da nametne ograničenja obima pronalaska. Ni jedna reč u opisu ne treba da se tumači kao indikator nekog esencijalnog elementa realizacije pronalaska, ako nije obuhvaćen zahtevima.
[0011] Prema predmetnom pronalasku, termin "peptid" odnosi se na supstance koje sadrže dva ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 10 ili više, ili poželjnije, 13 ili više, poželjno 16 ili više, poželjno 21 ili više i poželjno do 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, konkretno 100 aminokiselina, međusobno kovalentno povezanih peptidnim vezama. Termin "polipeptid" ili "protein" odnosi se na velike peptide, poželjno peptide sa više od 100 aminokiselinskih ostataka, ali u načelu, termini "peptid", "polipeptid" i "protein" su sinonimi i koriste se naizmenično.
[0012] Prema predmetnom pronalasku, termin "modifikacija" u kontekstu peptida, polipeptida ili proteina, odnosi se na izmenu sekvence peptida, polipeptida ili proteina u odnosu na prvobitnu sekvencu, kao što je sekvenca peptida, polipeptida ili proteina divljeg tipa. Ovaj termin obuhvata varijante nastale insercijom aminokiseline, varijante nastale adicijom aminokiseline, varijante nastale delecijom aminokiseline, varijante nastale supstitucijom aminokiseline, poželjno varijante nastale supstitucijom aminokiseline. Sve navedene promene sekvence, prema pronalasku, mogu potencijalno da kreiraju nove epitope.
[0013] Varijante nastale insercijom aminokiseline obuhvataju inserciju jedne ili više aminokiselina u konkretnu aminokiselinsku sekvencu.
[0014] Varijante nastale adicijom aminokiseline obuhvataju amino- i/ili karboksi-terminalne fuzije jedne ili više aminokiselina, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5, ili više aminokiselina.
[0015] Varijante nastale delecijom aminokiselina odlikuju se uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence, kao što je uklanjanje 1, 2, 3, 4 ili 5, ili više aminokiselina.
[0016] Varijante nastale supstitucijom aminokiseline odlikuju su uklanjanjem najmanje jedne rezidue u sekvenci i ugrađivanjem druge rezidue na isto mesto.
[0017] Prema pronalasku, modifikacija ili modifikovani peptid primenjen za testiranje u postupcima prema pronalasku, mogu se dobiti od proteina koji sadrži modifikaciju.
[0018] Termin "dobijen" označava prema pronalasku, da je specifičan entitet, konkretno, neka peptidna sekvenca prisutna u izvoru iz kojeg je dobijena. U slučaju aminokiselinskih sekvenci, posebno u slučaju nekih regiona sekvenci, “dobijen” posebno označava da je relevantna sekvenca aminokiselina dobijena iz aminokiselinske sekvence u kojoj je prisutna.
[0019] Protein koji sadrži modifikaciju, a iz kojeg je dobijena modifikacija ili modifikovani peptid korišćen za testiranje u postupcima prema pronalasku, može biti neoantigen.
[0020] Prema pronalasku, termin "neoantigen" odnosi se na peptid ili protein, koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija u odnosu na polazni peptid ili protein. Na primer, neoantigen može biti tumor-asocirani neoantigen, gde termin “tumor-asocirani neoantigen” obuhvata peptid ili protein koji sadrži aminokiselinske modifikacije do kojih je došlo usled tumor-specifičnih mutacija.
[0021] Prema pronalasku, termini "tumor-specifična mutacija" ili "kancer-specifična mutacija" odnose se na somatsku mutaciju koja je prisutna u nukleinskoj kiselini tumorske ili kancerske ćelije, a odsutna je u nukleinskoj kiseline odgovarajuće normalne, odnosno, ne-tumorske ili nekancerske ćelije. Termini "tumor-specifična mutacija" i "tumorska mutacija" i termini "kancerspecifična mutacija" i "kancerska mutacija" međusobno su sinonimni.
[0022] Termin "imunski odgovor" odnosi se na integrisani telesni odgovor usmeren prema ciljnom molekulu, kao što je antigen i poželjno, na ćelijski imunski odgovor ili na ćelijski i humoralni imunski odgovor. Imunski odgovor može biti protektivan/preventivan/profilaktički i/ili terapeutski.
[0023] "Indukovanje imunskog odgovora" može da znači da pre indukcije nije bilo imunskog odgovora, ali može takođe da znači da je pre indukcije postojao neki stepen imunskog odgovora, koji je nakon indukcije pojačan. Dakle, “indukcija imunskog odgovora” takođe obuhvata i frazu “pojačavanje imunskog odgovora”. Poželjno, nakon indukcije imunskog odgovora kod subjekta, navedeni subjekt je zaštićen od razvoja bolesti, kao što je kancer, ili je indukcijom imunskog odgovora njegovo patološko stanje ublaženo. Na primer, imunski odgovor usmeren prema tumor-eksprimiranom antigenu može se indukovati kod pacijenta koji ima kancer ili kod subjekta kod kojeg postoji rizik od razvoja kancera. Indukcija imunskog odgovora u ovom slučaju može da znači da je patološko stanje pacijenta ublaženo, da subjekt ne razvija metastaze ili da subjekt kod kojeg je postojao rizik od razvoja kancera, ne razvija kancersku bolest.
[0024] Termini "ćelijski imunski odgovor" i "ćelijski odgovor" i slični termini odnose se na imunski odgovor usmeren prema ćelijama koji se odlikuje prezentacijom antigena T-ćelijama koja uključuje MHC molekule klase I ili klase II ili T-limfocitima koji deluju kao “pomoćnici” ili “ubice”. Pomoćničke T-ćelije (takođe označene kao CD4<+>T-ćelije), igraju centralnu ulogu u regulaciji imunskog odgovora, dok ćelije-ubice (takođe označene kao citotoksične T-ćelije, citolitičke T-ćelije, CD8<+>T-ćelije ili CTL), ubijaju obolele ćelije, kao što su kancerske ćelije i sprečavaju nastanak novih obolelih ćelija. U poželjnim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obuhvata stimulaciju antitumorskog CTL odgovora usmerenog protiv tumorskih ćelija koje eksprimiraju jedan ili više tumor-asociranih antigena i poželjno, prezentaciju ovih tumor-asociranih antigena pomoću MHC molekula klase I.
[0025] "Antigen" prema predmetnom pronalasku označava svaku supstancu, poželjno peptid ili protein, koja je meta i/ili indukuje imunski odgovor, kao što je specifična reakcija antitela ili T-limfocita (T-ćelija). Poželjno, antigen sadrži najmanje jedan epitop, kao što je epitop koji prepoznaje T-ćelija. U kontekstu sadašnjeg pronalaska, poželjno je da je antigen molekul koji, opciono nakon obrade, indukuje imunsku reakciju poželjno specifičnu za antigen (uključujući i ćelije koje eksprimiraju dati antigen). Antigen ili njegov T-ćelijski epitop poželjno prezentuje ćelija, poželjno, antigen-prezentujuća ćelija, što može biti obolela ćeliju, konkretno, kancerska ćelija, u kontekstu MHC molekula, što rezultira imunskim odgovorom usmerenim protiv antigena (kao i protiv ćelija koje eksprimiraju antigen).
[0026] U jednom primeru izvođenja, antigen je tumorski antigen (takođe ovde označen kao tumor-eksprimirani antigen), odnosno, deo tumorske ćelije, na primer, neki protein ili peptid eksprimiran u tumorskoj ćeliji koji može da potiče iz njene citoplazme, ćelijske membrane ili jedra, posebno oni koji se primarno javljaju unutarćelijski ili kao površinski antigeni tumorskih ćelija. Na primer, tumorski antigeni obuhvataju karcinoembrionalni antigen, α1-fetoprotein, izoferitin i fetalni sulfoglikoprotein, α2-H-feroprotein i γ-fetoprotein. Prema predmetnom pronalasku, tumorski antigen poželjno obuhvata bilo koji antigen koji se eksprimira u tumorskoj ćeliji, i opciono je karakterističan u odnosu na tip i/ili nivo ekspresije tumora ili kancera, i za tumorske ili kancerske ćelije, odnosno, to je tumor-asocirani antigen. U jednom primeru izvođenja, termin “tumor-asocirani antigen” odnosi se na proteine koji su pod normalnim uslovima eksprimirani u malom broju tkiva i/ili organa ili se eksprimiraju samo tokom određenih razvojnih stadijuma, na primer, tumor-asocirani antigeni mogu pod normalnim uslovima biti eksprimirani u tkivu želuca, na primer, u sluzokoži želuca, u reproduktivnim organima, na primer, testisu, tkivu trofoblasta, na primer, u placenti ili u germinativnoj ćelijskoj liniji, ali se eksprimiraju, ili se aberantno eksprimiraju, u jednom ili više tumorskih ili kancerskih tkiva. U ovom kontekstu, “mali broj” poželjno označava ne više od 3, poželjnije ne više od 2 tkiva/organa. Tumorski antigeni u kontekstu predmetnog pronalaska, obuhvataju, na primer, antigene diferencijacije, poželjno ćelijski specifične antigene diferencijacije, na primer, proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u određenim tipovima ćelija na određenom stupnju diferencijacije, kancerske/testis antigene, odnosno, proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u testisima i nekad u placenti, i antigene specifične za germinativnu liniju. Poželjno je da se kancerske ćelija može identifikovati ekspresijom tumorski antigena ili aberantnom ekspresijom tumorski antigena. U kontekstu predmetnog pronalaska, poželjno je da je tumorski antigen koji se eksprimira u kancerskoj ćeliji subjekta, odnosno, kod pacijenta obolelog od kancera, sopstveni protein datog subjekta. U poželjnim primerima izvođenja, tumorski antigen u kontekstu predmetnog pronalaska se pod normalnim uslovima specifično eksprimira u tkivu ili organu koji nije esencijalan, na primer, u tkivima ili organima, koji kada su oštećeni od strane imunskog sistema ne dovode do smrti subjekta, ili u organima ili strukturama tela koje nisu dostupne, ili su teško dostupne imunskom sistemu.
[0027] Prema pronalasku, termini "tumorski antigen", "tumor-eksprimirani antigen", "kancerski antigen" i "kancer-eksprimirani antigen" međusobno su ekvivalentni i sinonimni.
[0028] Termin "imunogenost" odnosi se na relativnu efikasnost indukcije imunskog odgovora koji je povezan sa lečenjem, kao što je terapija kancera. U značenju koje je ovde primenjeno, termin "imunogenost" se odnosi na svojstvo ispoljavanja imunogenosti. Na primer, termin ”imunogena modifikacija”, kada se koristi u kontekstu peptida, polipeptida ili proteina, odnosi se na sposobnost da navedeni peptid, polipeptid ili protein indukuju imunski odgovor koji je uzrokovan i/ili uslovljen navedenom modifikacijom. Poželjno je da nemodifikovani peptid, polipeptid ili protein ne indukuju imunski odgovor, da indukuju drugačiji imunski odgovor ili da indukuju drugačiji nivo, poželjno niži nivo imunskog odgovora.
[0029] Prema pronalasku, termin "imunogenost" ili "imunogeni" poželjno se odnosi na relativnu efikasnost izazivanja biološki relevantnog imunskog odgovora, naročito imunskog odgovora koji je koristan za vakcinaciju. Prema tome, u jednom poželjnom primeru izvođenja, modifikacija aminokiseline ili modifikovani peptid je imunogen ako indukuje imunski odgovor na ciljnu modifikaciju kod subjekta, pri čemu imunski odgovor može da bude koristan u terapeutske ili profilaktičke svrhe.
[0030] Termini "glavni kompleks tkivne podudarnosti" i skraćenica "MHC" obuhvataju MHC molekule klase I i MHC molekule klase II, i odnose se na kompleks gena koji postoji kod svih kičmenjaka. MHC proteini ili molekuli važni su u signalizaciji između limfocita i antigenprezentujućih ćelija ili obolelih ćelija u imunskim reakcijama, pri čemu MHC proteini ili molekuli vezuju peptide i prezentuju ih kako bi oni bili prepoznati od strane T-ćelijskih receptora. Proteini kodirani MHC genima eksprimiraju se na površini ćelija i prezentuju T-ćelijama i sopstvene antigene (peptidne fragmente iz samih ćelija) i antigene koji nisu sopstvenog porekla (na primer, fragmente mikroorganizama).
[0031] MHC kompleks podeljen je u tri podgrupe, klase I, klase II i klase III. Proteini MHC klase I sadrže α-lanac i β2-mikroglobulin (koji nije kodiran genima MHC kompleksa na hromozomu 15). Ovi proteini prezentuju fragmente antigena citotoksičnim T-ćelijama. Na većini ćelija imunskog sistema, konkretno, na antigen-prezentujućim ćelijama proteini MHC klase II sadrže α- i β-lanac i ovi molekuli prezentuju fragmente antigena pomoćničkim T-ćelijama. MHC molekuli klase III kodiraju druge imunske komponente, kao što su komponente komplementa i neke od citokina.
[0032] MHC kompleks je poligenski (postoji nekoliko gena za molekule MHC klase I i MHC klase II) i polimorfan kompleks (postoji više alela svakog od gena).
[0033] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "haplotip" odnosi se na HLA alele koji se nalaze na jednom hromozomu i na proteine koje ovi aleli kodiraju. Haplotip može takođe da se odnosi na alele prisutne na svakom lokusu MHC. Svaka klasa MHC ima nekoliko lokusa: na primer, HLA-A (Humani leukocitni antigen-A), HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-P i HLA-V za klasu I i HLA-DRA, HLA-DRB1-9, HLA-, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, i HLA-DOB za klasu II. Termini "HLA alel" i "MHC alel" su sinonimni.
[0034] MHC molekuli ispoljavaju ogroman polimorfizam: na svakom genskom lokusu u humanoj populaciji, postoji veliki broj haplotipova koji sadrže različite alele. Različiti polimorfni MHC aleli obe klase I i II, ispoljavaju različitu specifičnost prema peptidima: svaki alel kodira proteine koji vezuju peptide koji pokazuju određene obrasce sekvenci.
[0035] U jednom poželjnom primeru izvođenja svih aspekata pronalaska, MHC molekul je HLA molekul.
[0036] Prema pronalasku, MHC klase II uključuje HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ i HLA-DR.
[0037] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin “MHC-vezujući peptid”, obuhvata peptide koji vezuju MHC molekule klase I i/ili klase II ili peptide koji mogu da se obrade tako da daju peptide koji vezuju MHC molekul klase I i/ili klase II. U slučaju kompleksa MHC molekula klase I/peptid, vezujući peptidi tipično imaju dužinu od 8-12, poželjno 8-10 aminokiselina, iako i kraći i duži peptidi mogu da budu efikasni. U slučaju kompleksa MHC molekul klase II/peptid, vezujući peptidi tipično imaju 9-30, poželjno 10-25 aminokiselina u nizu, konkretno 13-18 aminokiselina, mada i kraći i duži peptidi mogu da budu efikasni.
[0038] Peptid koji će biti direktno prezentovan, odnosno, bez obrade, i posebno, bez isecanja, ima dužinu koja je pogodna za vezivanje za MHC molekul, konkretno za MHC molekul klase I, i poželjno ima dužinu od 7-30 aminokiselina, na primer, 7-20 aminokiselina, poželjnije 7-12 aminokiselina, poželjnije 8 -11 aminokiselina, konkretno, 9 ili 10 aminokiselina.
[0039] Ako je peptid deo većeg entiteta koji sadrži dodatne sekvence, na primer, sekvencu ili polipeptid vakcine, i treba da bude prezentovan nakon obrade, konkretno nakon isecanja, peptid koji će nastati obradom ima dužinu koja je pogodna za vezivanje MHC molekula, konkretno MHC molekula klase I, i poželjno ima dužinu od 7-30 aminokiselina, na primer, 7-20 aminokiselina, poželjnije 7-12 aminokiselina, još poželjnije 8-11 aminokiselina, konkretno 9 ili 10 aminokiselina u nizu. Poželjno je da je sekvenca peptida koji će biti prezentovan nakon obrade dobijena od aminokiselinske sekvence antigena ili polipeptida koji se koristi u vakcinaciji, to jest, da njegova sekvenca suštinski odgovara ili da je potpuno identična fragmentu antigena ili polipeptida.
[0040] Stoga, MHC vezujući peptid u jednom primeru izvođenja obuhvata sekvencu koja suštinski odgovara i poželjno je potpuno identična fragmentu antigena.
[0041] Termin "epitop" odnosi se na antigenu determinantu molekula, kao što je antigen, odnosno, na deo ili fragment molekula koji je prepoznat od strane imunskog sistema, na primer, koji je prepoznat od strane T-ćelija, konkretno, kada se prezentuje u kontekstu MHC molekula. Epitop proteina, na primer, tumorski antigena, poželjno sadrži kontinualni ili diskontinualni deo molekula navedenog proteina, i poželjno je taj deo dužine od 5 do 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 aminokiselina u nizu, na primer, epitop može da ima dužinu od 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 aminokiselina. Naročito je poželjno da je epitop u kontekstu predmetnog pronalaska, epitop T-ćelija.
[0042] Prema pronalasku, epitop može da bude vezan od strane MHC molekula, kao što su MHC molekuli na površini ćelije, pa stoga može biti “MHC-vezujući peptid”.
[0043] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "neo-epitop" odnosi se na epitop koji nije prisutan u ćelijama, na primer, u normalnim ne-kancerskim ćelijama ili u liniji germinativnih ćelija, ali se nalazi u kancerskim ćelijama. To uključuje, konkretno, slučajeve u kojima je odgovarajući epitop eksprimiran i u normalnim ne-kancerskim ćelijama ili germinativnim ćelijama, ali se usled jedne ili više mutacija u kancerskoj ćeliji, sekvenca epitopa menja, pa zbog izmene nastaje neo-epitop.
[0044] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "T-ćelijski epitop" odnosi se na peptid koji se vezuje za MHC molekul u konfiguraciji koju prepoznaje T-ćelijski receptor. Uobičajeno, T-ćelijski epitopi prezentuju se na površini antigen-prezentujućih ćelija.
[0045] U značenju kako je ovde primenjeno, termin "predikcija imunogenih modifikacija aminokiselina" odnosi se na predviđanje da li će peptid koji sadrži takvu modifikaciju aminokiseline biti imunogen i stoga koristan kao epitop, posebno T-ćelijski epitop, u vakcinaciji.
[0046] Prema pronalasku, T-ćelijski epitop može biti prisutan u vakcini, kao deo većeg entiteta, kao što je sekvenca i/ili polipeptid vakcine, u kojem se nalazi više od jednog T-ćelijskog epitopa. Takav prezentovani peptid ili T-ćelijski epitop nastaje nakon odgovarajuće obrade.
[0047] T-ćelijski epitopi mogu se modifikovati na jednoj ili više rezidua koje nisu esencijalne za prepoznavanje od strane TCR ili za vezivanje za MHC. Ovako modifikovani T-ćelijski epitopi mogu se smatrati imunološki ekvivalentnima.
[0048] Poželjno je da je T-ćelijski epitop, kada je prezentovan od strane MHC i prepoznat od strane T-ćelijskog receptora, sposoban da indukuje, u prisustvu odgovarajućih ko-stimulatornih signala, klonsku ekspanziju T-ćelija koje na sebi imaju eksprimiran T-ćelijski receptor koji specifično prepoznaje kompleks peptid/MHC.
[0049] Poželjno je da T-ćelijski epitop sadrži aminokiselinsku sekvencu koja suštinski odgovara aminokiselinskoj sekvenci fragmenta antigena. Poželjno je da je navedeni fragment antigena, peptid prezentovan od strane MHC molekula klase I i/ili klase II.
[0050] Poželjno je da se T-ćelijski epitop prema pronalasku odnosi na deo ili fragment antigena koji je sposoban da stimuliše imunski odgovor, poželjno, ćelijski imunski odgovor usmeren prema tom antigenu ili ćelijama koje se odlikuju ekspresijom antigena, i poželjno prezentacijom antigena, kao što su obolele ćelije, konkretno, kancerske ćelije. Poželjno je da je T-ćelijski epitop sposoban da stimuliše ćelijski odgovor usmeren prema ćeliji koja prezentuje taj antigen sa MHC molekulom klase I, i poželjno može da stimuliše antigen-reaktivne citotoksične T-limfocite (CTL).
[0051] "Obrada antigena" ili "obrada", odnosi se na isecanje peptida, polipeptida ili proteina na odgovarajuće proizvode, odnosno, fragmente navedenog peptida, polipeptida ili proteina (na primer, putem isecanja polipeptida u peptide), i na asocijaciju jednog ili više ovih fragmenata (na primer, vezivanjem), sa MHC molekulima, kako bi bili prezentovani od strane ćelija, poželjno, od strane antigen-prezentujućih ćelija, specifičnim T-ćelijama.
[0052] "Antigen-prezentujuće ćelije" (APC) su ćelije koje zajedno sa MHC molekulima na svojoj površini, prezentuju peptidne fragmente proteinskih antigena. Neke APC ćelije mogu aktivirati antigen-specifične T-ćelije.
[0053] Specijalizovane antigen-prezentujuće ćelije veoma su efikasne u internalizaciji antigena u ćeliju, bilo posredstvom fagocitoze ili receptorom-posredovane endocitoze, a zatim u izlaganju fragmenata antigena, vezanog za MHC molekul klase II, na svojoj membrani. T-ćelija prepoznaje i stupa u interakciju sa kompleksom antigen-MHC molekul klase II, na membrani antigen-prezentujuće ćelije. Tada u antigen-prezentujućim ćelijama nastaje dodatni kostimulatorni signal, što dovodi do aktivacije T-ćelija. Ekspresija ko-stimulatornih molekula ključna je odlika profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija.
[0054] Osnovni tipovi specijalizovanih antigen-prezentujućih ćelija su: dendritske ćelije, koje imaju najširi opseg prezentacije antigena, i verovatno su najvažnije antigen-prezentujuće ćelije, zatim, makrofagi, B-ćelije i neke aktivirane epitelne ćelije. Dendritske ćelije (DC) čine populaciju leukocita, čija je uloga da antigene uhvaćene u perifernim tkivima prezentuju T-ćelijama, posredstvom antigen-prezentujućih puteva obe klase MHC molekula II i I. Poznato je da su dendritske ćelije snažni induktori imunskih odgovora i da aktivacija ovih ćelija predstavlja kritičan događaj u indukciji antitumorskog imuniteta. Dendritske ćelije obično se dele na “nezrele” i “zrele”, što je jednostavan način da se razlikuju dva dobro okarakterisana fenotipa ovih ćelija. Međutim, ova podela ne treba da ograniči sve moguće intermedijarne faze diferencijacije. Odlika nezrelih dendritskih ćelija je da su to antigen-prezentujuće ćelije sa visokim kapacitetom preuzimanja i obrade antigena, što korelira sa visokom ekspresijom Fcγ receptora i receptora za manozu. Fenotip zrele ćelije tipično se odlikuje niskom ekspresijom ovih markera, ali visokom ekspresijom površinskih molekula, odgovornih za aktivaciju T-ćelija, kao što su MHC molekuli klase I i klase II, adhezioni molekuli (na primer, CD54 i CD11) i kostimulatorni molekuli (na primer, CD40, CD80, CD86 i 4-1 BB). Sazrevanje dendritskih ćelija predstavlja stepen njihove ćelijske aktivacije na kojem antigen-prezentujuća dendritska ćelija vodi ka pripremi naivnih T-ćelija za aktivaciju, dok prezentacija od strane nezrelih dendritskih ćelija rezultira tolerancijom. Sazrevanje dendritskih ćelija pretežno je izazvano biomolekulima sa mikrobnim svojstvima koje detektuju urođeni receptori (bakterijska DNK, virusna RNK, endotoksin, itd.), pro-inflamatorni citokini (TNF, IL-1, IFN), ligacija CD40 na površini dendritskih ćelija od strane CD40L, i supstance oslobođenje iz ćelija koje podležu nekrozi. Dendritske ćelije se mogu dobiti kultivisanjem ćelija koštane srži sa citokinima in vitro, kao što su granulocitni-makrofagni faktor stimulacije kolonija (GM-CSF) i faktor nekroze tumora alfa.
[0055] Nespecijalizovane antigen-prezentujuće ćelije ne eksprimiraju konstitutivno proteine MHC klase II, koji su neophodni za interakciju sa naivnim T-ćelijama; ovi proteini se eksprimiraju tek nakon stimulacije ne-specijalizovanih antigen-prezentujućih ćelija nekim citokinima, kao što je IFNγ.
[0056] Antigen-prezentujuće ćelije mogu se obložiti peptidima prezentovanim od strane MHC molekula klase I, transdukcijom ćelija nukleinskom kiselinom, poželjno RNK, koja kodira peptid ili polipeptid koji sadrži peptid koji treba da bude prezentovan, na primer, nukleinskom kiselinom koja kodira antigen ili polipeptid koji se koristi u vakcini.
[0057] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija ili vakcina koja sadrži vehikulum za isporuku nukleinske kiseline koji ciljano deluje na dendritske ili druge antigenprezentujuće ćelije, može se administrirati pacijentu, što će dovesti do transfekcije in vivo. Transfekcija dendritskih ćelija in vivo, na primer, može se načelno sprovesti primenom bilo kojih postupaka poznatih u stanju tehnike, kao što su oni opisani u WO 97/24447, ili primenom postupka genskog pištolja, koji je opisan kod Mahvi et al. , Immunology and cell Biology 75: 456-460, 1997.
[0058] Prema pronalasku, termin "antigen-prezentujuća ćelija" takođe obuhvata ciljne ćelije.
[0059] "Ciljna ćelija" označava ćeliju prema kojoj je usmeren imunski odgovor, na primer, ćelijski imunski odgovor. Ciljne ćelije uključuju ćelije koje prezentuju antigen, odnosno, peptidni fragment koji je dobijen od antigena, i obuhvataju bilo koje neželjene ćelije, kao što je kancerska ćelija. U poželjnim primerima izvođenja, ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira antigen, kao što je ovde opisano i poželjno prezentuje navedeni antigen sa MHC molekulom klase I.
[0060] Termin "deo" označava frakciju. U odnosu na konkretnu strukturu, kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein, termin “deo” može da označava kontinualnu ili diskontinualnu frakciju navedene strukture. Poželjno, deo aminokiselinske sekvence obuhvata najmanje 1%, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjno najmanje 50%, još poželjnije najmanje 60%, još poželjnije najmanje 70%, još poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije, najmanje 90% aminokiselina naznačene aminokiselinske sekvence. Poželjno, ako je deo diskontinualna frakcija, navedena diskontinualna frakcija sačinjena je od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više delova strukture, gde je svaki deo kontinualni element te strukture. Na primer, diskontinualna frakcija neke aminokiselinske sekvence može biti sačinjena od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više, poželjno ne više od 4 dela navedene aminokiselinske sekvence, pri čemu svaki deo poželjno sadrži najmanje 5 susednih aminokiselina, najmanje 10 susednih aminokiselina, poželjno najmanje 20 susednih aminokiselina, poželjno najmanje 30 susednih aminokiselina iz te aminokiselinske sekvence.
[0061] Termini "deo" i "fragment" koriste se kao sinonimi i odnose se na kontinualni element. Na primer, deo neke strukture, kao što je sekvenca aminokiselina ili proteina, odnosi se na kontinualni element navedene strukture. Razdeo, deo ili fragment strukture, poželjno obuhvata jedno ili više funkcionalnih svojstava navedene strukture. Na primer, poželjno je da je razdeo, deo ili fragment epitopa, peptida ili proteina imunološki ekvivalentan epitopu, peptidu ili proteinu od kojeg je dobijen. U kontekstu pronalaska, “deo” strukture, kao što je sekvenca aminokiselina, poželjno obuhvata najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 94%, najmanje 96%, najmanje 98%, najmanje 99% ukupne strukture ili aminokiselinske sekvence.
[0062] Termin "imunoreaktivna ćelija" u kontekstu predmetnog pronalaska, odnosi se na ćeliju koja ispoljava efektorske funkcije tokom imunske reakcije. “Imunoreaktivna ćelije" sposobna je da veže antigen ili ćeliju koja prezentuje antigen ili njegov peptidni fragment (na primer, T-ćelijski epitop) i da izvede imunski odgovor. Na primer, takve ćelije izlučuju citokine i/ili hemokine, izlučuju antitela, prepoznaju kancerske ćelije i opciono, eliminišu ove ćelije. Na primer, imunoreaktivne ćelije obuhvataju T-ćelije (citotoksične T-ćelije, pomoćničke T-ćelije, tumor infiltrirajuće T-ćelije), B-ćelije, ćelije-prirodne ubice, neutrofile, makrofage, i dendritske ćelije. Poželjno, u kontekstu predmetnog pronalaska, “imunoreaktivne ćelije” su T-ćelije, poželjno CD4<+>i/ili CD8<+>ćelije.
[0063] Poželjno, "imunoreaktivna ćelija" prepoznaje antigen ili njegov peptidni fragment sa izvesnim stepenom specifičnosti, konkretno ako je prezentovan u kontekstu MHC molekula, kao što su oni na površini antigen-prezentujućih ćelija ili obolelih ćelija kao što su kancerske ćelije. Poželjno, to prepoznavanje omogućava ćeliji koja prepoznaje antigen ili njegov peptidni fragment da bude responsivna ili reaktivna. Ukoliko je imunoreaktivna ćelija pomoćnička T-ćelija (CD4<+>T-ćelija), koja nosi receptore koji prepoznaju antigen ili njegov peptidni fragment u kontekstu molekula MHC klase II, takva responsivnost ili reaktivnost mogu da uključe oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8<+>limfocita (CTL) i/ili B-ćelija. Ako je imunoreaktivna ćelija CTL ćelija, takva responsivnost ili reaktivnost mogu da uključe eliminaciju ćelija prezentovanih u kontekstu MHC molekula klase I, odnosno, ćelija koje se odliku prezentacijom antigena sa molekulima MHC klase I, na primer, posredstvom apoptoze ili perforinomposredovane ćelijske lize. Prema pronalasku, CTL responsivnost može da uključuje produženu ulaznu struju kalcijuma, deobu ćelije, proizvodnju citokina, kao što su IFN-γ i TNF-α, ushodnu regulaciju markera aktivacije, kao što su CD44 i CD69, i specifično citolitičko ubijanje ćelija koje eksprimiraju antigen. CTL responsivnost može se takođe odrediti pomoću artificijelnog reportera koji precizno ukazuje na CTL responsivnost. CTL ćelije koje prepoznaju antigen ili fragment antigena i koje su responsivne ili reaktivne ovde su označene i kao “antigenresponsivne CTL”. Ako je imunoreaktivna ćelija B-ćelija, responsivnost može da uključuje oslobađanje imunoglobulina.
[0064] Termini "T-ćelija" i "T-limfocit" koriste se kao sinonimi i obuhvataju pomoćničke T-ćelije (CD4<+>T-ćelije) i citotoksične T-ćelije (CTL, CD8<+>T-ćelije), koje obuhvataju citolitičke T-ćelije.
[0065] T-ćelije pripadaju grupi belih krvnih ćelija, poznatih pod imenom limfociti, a igraju centralnu ulogu u ćelijskoj imunosti. One se mogu razlikovati od ostalih grupa limfocita, kao što su B-ćelije i ćelije-prirodne ubice, po prisustvu posebnih receptora na površini ćelije, označenih kao T-ćelijski receptor (TCR). Timus je glavno mesto sazrevanja T-ćelija. Otkriveno je nekoliko podsetova T-ćelija, svaki sa posebnom ulogom.
[0066] Pomoćničke T-ćelije pomažu drugim belim krvnim ćelijama u imunološkim procesima, koji obuhvataju sazrevanje B-ćelija u plazma ćelije i aktivacija citotoksičnih T-ćelija i makrofaga, između ostalog. Ove ćelije su poznate i kao CD4<+>T-ćelije, jer eksprimiraju CD4 protein na svojoj površini. Pomoćničke T-ćelije se aktiviraju kada su im prezentovani peptidni antigeni od strane MHC molekula klase II, koji su eksprimirani na površini antigenprezentujućih ćelija (APC). Kada su aktivirane, one se brzo dele i izlučuju proteine male molekulske težine, koji se nazivaju citokini, a čija je uloga regulacija ili pomoć u aktivnom imunskom odgovoru.
[0067] Citotoksične T-ćelije uništavaju ćelije inficirane virusom ili tumorske ćelije, a takođe imaju ulogu u odbacivanju transplanta. Ove ćelije su poznate kao CD8<+>T-ćelije, jer eksprimiraju glikoprotein CD8 na svojoj površini. Ove ćelije prepoznaju svoje mete vezivanjem za antigen asociran sa MHC klasom I, koji je prisutan na površini gotovo svih ćelija u organizmu.
[0068] Većina T-ćelija na svojoj površini eksprimira T-ćelijski receptor (TCR), u vidu kompleksa nekoliko proteina. T-ćelijski receptor sastavljen je od dva odvojena peptidna lanca, koja su kodirana nezavisnim genima za T-ćelijski receptor alfa i beta (TCRα i TCRβ), a nazivaju se α- i β-TCR lanci. γδ T-ćelije (gama-delta T-ćelije) predstavljaju malu podgrupu T-ćelija, koja na svojoj površini poseduje drugačiji T-ćelijski receptor (TCR). Međutim, u ovoj grupi γδ T-ćelija, TCR je sačinjen od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T-ćelija je znatno manje zastupljena od αβ T-ćelija (2% ukupnog broja T-ćelija).
[0069] Prvi signal u aktivaciji T-ćelija obezbeđen je vezivanjem T-ćelijskog receptora za kratak peptid prezentovan od strane MHC na drugoj ćeliji. Ovo osigurava da se aktiviraju samo T-ćelije koje poseduju TCR specifičan za taj peptid. Partnerska ćelija je najčešće antigen-prezentujuća ćelija, kao što je specijalizovana antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritska ćelija u slučaju odgovora naivnih ćelija, iako i B-ćelije i makrofagi mogu biti važne APC.
[0070] Prema predmetnom pronalasku, molekul je sposoban da se veže za metu, ukoliko ima značajan afinitet prema toj predeterminisanoj meti i vezuje se za metu u standardnim esejima. "Afinitet" ili "vezujući afinitet" najčešće se meri pomoću ravnotežne konstante disocijacije (KD). Molekul (suštinski) nije sposoban da se veže za metu ukoliko nema značajan afinitet prema toj meti, i ukoliko se ne vezuje značajno za metu u standardnim esejima.
[0071] Citotoksični T-limfociti mogu se dobiti in vivo, ugrađivanjem antigena ili njegovog peptidnog fragmenta u antigen-prezentujuće ćelije in vivo. Antigen ili njegov peptidni fragment mogu biti u formi proteina, DNK (na primer, u sastavu vektora) ili RNK. Antigen može biti obrađen, tako da nastane peptidni partner za MHC molekul, dok njegov fragment može biti prezentovan bez dodatne obrade. Ovo poslednje je posebno slučaj kada su sposobni da se vežu za MHC molekule. Načelno, moguća je primena kod pacijenta intradermalnom injekcijom. Injekcija se može plasirati intranodalno u limfni čvor (Maloy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303). Rezultujuće ćelije prezentuju komplekse od interesa i prepoznate su od autolognih citotoksičnih T-limfocita koji se dalje umnožavaju.
[0072] Specifičnu aktivaciju CD4<+>ili CD8<+>T-ćelija moguće je detektovati na više načina. Postupci detekcije aktivacije specifičnih T-ćelija obuhvataju detekciju proliferacije T-ćelija, proizvodnju citokina (na primer, limfokina), ili ispoljavanje citolitičke aktivnosti. Za CD4<+>T-ćelije, poželjan postupak detekcije aktivacije specifičnih T-ćelija zasniva se na detekciji proliferacije T-ćelija. Za CD8<+>T-ćelije, poželjan postupak detekcije specifičnih T-ćelija jeste detekcija nastanka citolitičke aktivnosti.
[0073] Pod frazom "ćelija koja se odlikuje prezentacijom antigena" ili "ćelija koja prezentuje antigen" ili slično, podrazumeva se ćelija kao što je obolela ćelija, na primer, kancerska ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija koja prezentuje eksprimirani antigen ili fragment dobijen od navedenog antigena, u kontekstu MHC molekula, posebno MHC molekula klase I. Slično, fraza "bolest koja se odlikuje prezentacijom antigena" odnosi se na bolest koja uključuje ćelije koje prezentuju antigen, konkretno koje prezentuju antigen u kontekstu MHC molekula klase I. Prezentacija antigena od strane ćelije može se postići i kada se ćelija transfektuje nukleinskom kiselinom, na primer, molekulom RNK koja kodira dati antigen.
[0074] "Fragment antigena koji je prezentovan" ili slične fraze, označavaju fragment koji može biti prezentovan od strane MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I, na primer, kada se direktno doda antigen-prezentujućim ćelijama. U jednom primeru izvođenja, fragment je fragment koji se prirodno prezentuje od strane ćelija koje eksprimiraju antigen.
[0075] Termin "imunološki ekvivalent" označava da je imunološki ekvivalentan molekul, kao što je imunološki ekvivalentna sekvenca aminokiselina, koja poseduje identična ili suštinski ista imunološka svojstva i/ili ispoljava iste ili suštinski iste imunološke efekte, na primer, u odnosu na tip imunološkog efekta, kao što je indukcija humoralnog i/ili ćelijskog imunskog odgovora, jačina i/ili trajanje indukovane imunske reakcije, ili specifičnost indukovane imunske reakcije. U kontekstu predmetnog pronalaska, fraza "imunološki ekvivalentan" poželjno se koristi u vezi sa imunološkim efektima ili svojstvima peptida za imunizaciju. Na primer, neka sekvenca aminokiselina imunološki je ekvivalentna referentnoj aminokiselinskoj sekvenci, ako navedena aminokiselinska sekvenca, kada je izložena imunskom sistemu osobe, indukuje imunski odgovor iste specifičnosti reagovanja kao i referentna aminokiselinska sekvenca.
[0076] Fraza "imunske efektorske funkcije" u kontekstu predmetnog pronalaska, obuhvata sve funkcije posredovane komponentama imunskog sistema, koje rezultiraju, na primer, ubijanjem tumorskih ćelija ili inhibicijom rasta tumora i/ili inhibicijom napredovanja tumora, uključujući inhibiciju širenja tumora i metastaze. Poželjno, imunske efektorske funkcije u kontekstu pronalaska, su efektorske funkcije posredovane T-ćelijama. Ove funkcije obuhvataju, u slučaju pomoćničkih T-ćelija (CD4<+>T-ćelija) prepoznavanje antigena ili antigenskog fragmenta asociranog sa MHC molekulima klase II, od strane T-ćelijskih receptora, oslobađanje citokina i/ili aktivacija CD8<+>limfocita (CTL) i/ili B-ćelija, i, u slučaju CTL, prepoznavanje antigena ili fragmenata antigena u kontekstu MHC molekula klase I od strane T-ćelijskih receptora, eliminaciju ćelija prezentovanih u kontekstu MHC molekula klase I, odnosno, ćelija koje prezentuju antigen sa MHC molekulom klase I, na primer, posredstvom apoptoze ili perforinommodifikovane ćelijske lize, produkciju citokina, kao što su IFN-γ i TNF-α, i specifično citolitičko ubijanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju antigen.
[0077] Prema pronalasku, termin "skor" odnosi se na rezultat, obično izražen numerički, testiranja ili ispitivanja. Termini kao što je “imaju veći skor” ili “najveći skor” takođe se odnose na bolje ili najbolje rezultate testiranja ili ispitivanja.
[0078] Prema pronalasku, modifikovani peptidi se boduju prema predviđenoj sposobnosti vezivanja za MHC klase II i prema ekspresiji ili zastupljenosti modifikovanih proteina iz kojih su izvedeni modifikovani peptidi. Uopšteno, peptid sa predviđenom većom sposobnošću vezivanja za MHC klase II ima bolji rezultat od peptida sa predviđenom nižom sposobnošću da se veže za MHC klase II. Štaviše, peptid sa većom ekspresijom ili zastupljenošću odgovarajućeg modifikovanog proteina ima bolji rezultat od peptida sa nižom ekspresijom ili zastupljenošću odgovarajućeg modifikovanog proteina.
[0079] Termini kao što su "predviđanje", "predviđati" ili "predikcija" odnose se na određivanje verovatnoće.
[0080] Prema pronalasku, utvrđivanje skora vezivanja peptida za jedan ili više MHC molekula klase II obuhvata određivanje verovatnoće vezivanja peptida za jedan ili više MHC molekula klase II.
[0081] Skor vezivanja peptida za jedan ili više MHC molekula klase II može se utvrditi primenom bilo kog pogodnog alata za predviđanje vezivanja peptid:MHC. Na primer, može se koristiti baza podataka za analizu imunskih epitopa (IEDB-AR: http://tools.iedb.org).
[0082] Predikcije se obično prave prema setu MHC molekula klase II, kao što je skup različitih alela MHC klase II, kao što su svi mogući aleli MHC klase II ili skup ili podskup alela MHC klase II pronađen kod pacijenata. Poželjno je da pacijent ima modifikaciju/modifikacije čiju imunogenost treba odrediti prema pronalasku ili koje treba izabrati i/ili rangirati prema njihovoj predviđenoj imunogenosti prema pronalasku. Poželjno je da se ovde opisana vakcina na kraju obezbedi za navedenog pacijenta. Shodno tome, ovaj pronalazak može takođe da uključuje određivanje obrasca ekspresije MHC klase II kod pacijenta.
[0083] Predmetni pronalazak takođe može da obuhvata izvođenje postupka prema pronalasku na različitim peptidima koji sadrže istu modifikaciju/modifikacije i/ili različite modifikacije.
[0084] Fraza "različiti peptidi koji sadrže istu modifikaciju/modifikacije” u jednom primeru izvođenja se odnosi na peptide koji sadrže ili se sastoje od različitih fragmenata modifikovanog proteina, gde navedeni fragmenti obuhvataju istu modifikaciju/modifikacije koja se nalaze u proteinu, ali se razlikuju po dužini i/ili poziciji modifikacije/modifikacija. Ako protein ima modifikaciju na poziciji x, dva ili više fragmenata navedenog proteina, od kojih svaki sadrži različite okvire sekvence navedenog proteina koji obuhvataju navedenu poziciju x, smatraju se različitim peptidima koji imaju istu modifikaciju/modifikacije.
[0085] Fraza "različiti peptidi koji sadrže različite modifikacije", u jednom primeru izvođenja odnosi se na peptide iste i/ili različitih dužina, koji sadrže različite modifikacije istog i/ili različitih proteina. Ako protein nosi modifikacije na pozicijama x i y, dva fragmenta navedenog proteina, od kojih svaki sadrži okvir sekvence navedenog proteina u kojem se nalaze pozicija x ili pozicija y, smatraju se različitim peptidima koji sadrže različite modifikacije.
[0086] Predmetni pronalazak takođe može da obuhvati isecanje proteinskih sekvenci koje sadrže modifikacije, čiju imunogenost treba predvideti primenom postupka prema pronalasku ili koje treba da budu odabrane i/ili rangirane prema svojoj predviđenoj imunogenosti, u skladu sa pronalaskom, na MHC-vezujuće peptide odgovarajuće dužine i utvrđivanje skora vezivanja različitih modifikovanih peptida, koji nose istu i/ili različite modifikacije istog i/ili različitih proteina, za jedan ili više MHC molekula klase II. Izlazni rezultati mogu da se rangiraju i mogu da se sastoje od liste peptida i predviđenih skorova koji ukazuju na verovatnoću vezivanja.
[0087] Korak utvrđivanja skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina može da se sprovede na svim različitim modifikacijama, njihovom podskupu, npr., na onim modifikacijama koje imaju najbolji skor vezivanja za jedan ili više MHC molekula klase II, ili samo sa onim modifikacijama koje imaju najbolji skor vezivanja za jedan ili više MHC molekula klase II.
[0088] Prateći ove dodatne korake, moguće je rangirati rezultate i sačiniti listu peptida i njihovih predviđenih skorova, koji ukazuju na verovatnoću da su imunogeni.
[0089] Prema pronalasku, utvrđivanje skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina može se izvršiti za pacijenta kao što je pacijent sa kancerom, na primer, na uzorku tumora pacijenta kao što je pacijent ja kancerom.
[0090] Prema pronalasku, utvrđivanje skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina može uključivati određivanje nivoa ekspresije proteina sa kojim je modifikacija povezana i/ili određivanje nivoa ekspresije RNK koja kodira protein sa kojim je modifikacija povezana (što opet može biti indikativno za nivo ekspresije proteina sa kojim je modifikacija povezana) i određivanje učestalosti modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana i/ili određivanje učestalosti RNK koja kodira modifikovani protein u okviru RNK koja kodira protein sa kojim je modifikacija povezana.
[0091] Učestalost modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana i/ili učestalost RNK koja kodira modifikovani protein u okviru RNK koja kodira protein sa kojim je modifikacija povezana može se smatrati udelom modifikovanog proteina unutar proteina sa kojim je modifikacija povezana i/ili udelom RNK koja kodira modifikovani protein unutar RNK koja kodira protein sa kojim je modifikacija povezana.
[0092] Prema pronalasku, izraz "protein sa kojim je modifikacija povezana" odnosi se na protein koji može da sadrži modifikaciju i uključuje protein u njegovom nemodifikovanom, kao i modifikovanom stanju.
[0093] Prema pronalasku, izraz "nivo ekspresije" može da se odnosi na apsolutnu ili relativnu količinu.
[0094] Aminokiselinske modifikacije, čija imunogenost treba da bude određena primenom postupka prema pronalasku, ili koje treba da budu odabrane i/ili rangirane prema svojoj predviđenoj imunogenosti u skladu sa pronalaskom, mogu nastati usled mutacija u nukleinskoj kiselini ćelije. Ove mutacije se mogu identifikovati poznatim tehnikama sekvenciranja.
[0095] U jednom primeru izvođenja, mutacije su kancer-specifične somatske mutacije u uzorku tumorskog tkiva pacijenta, koje se mogu utvrditi identifikovanjem razlika u sekvenci genoma, egzoma, i/ili transkriptoma uzorka tumora i sekvence genoma, egzoma ili transkriptoma nekancerskog uzorka tkiva.
[0096] Prema pronalasku, uzorak tumora označava bilo koji telesni uzorak dobijen od pacijenta, koji sadrži ili se očekuje da sadrži tumorske ili kancerske ćelije. Uzorci mogu biti uzeti iz bilo kog tkiva, kao što je krv, tkivni uzorak primarnog tumora ili tumorskih metastaza ili bilo koji drugi uzorak koji sadrži tumor ili kancerske ćelije. Poželjno je da je uzorak, uzorak krvi, a kancer-specifične somatske mutacije ili razlike sekvenci se određuju jednom ili više cirkulišućih tumorskih ćelija (CTC) sadržanih u krvi. U narednom primeru izvođenja, uzorak tumora se odnosi na jednu ili više izolovanih tumorskih ili kancerskih ćelija, kao što su cirkulišuće tumorske ćelije (CTC) ili uzorak sadrži jednu ili više tumorskih ili kancerskih ćelija (CTC).
[0097] Netumorigeni uzorak označava svaki uzorak, kao što je telesni uzorak dobijen od pacijenta ili druge individue koja poželjno pripada istoj vrsti kao i pacijent, po mogućstvu od zdrave individue koja ne sadrži ili se ne očekuje da sadrži tumorske ili kancerske ćelije. Ovaj telesni uzorak može biti bilo koji tkivni uzorak, kao što je krv ili uzorak netumorigenog tkiva.
[0098] Pronalazak može da obuhvatu određivanje specifične kancerske mutacije kod pacijenta. Fraza "specifična kancerska mutacija" može da označi sve kancerske mutacije prisutne u jednoj ili više kancerskih ćelija pacijenta ili može da se odnosi samo na deo kancerskih mutacija prisutnih u jednoj ili više kancerskih ćelija pacijenta. Shodno tome, predmetni pronalazak može da uključi identifikovanje svih kancer-specifičnih mutacija prisutnih u jednoj ili više kancerskih ćelija pacijenta ili može da obuhvati identifikaciju jednog broja kancer-specifičnih mutacija prisutnih kod pacijenta. Načelno, postupci pronalaska obezbeđuju identifikaciju broja mutacija koji obezbeđuje dovoljan broj modifikacija ili modifikovanih peptida koje treba uključiti u postupke prema pronalasku.
[0099] Poželjno je da su mutacije identifikovane primenom postupka prema pronalasku, nesinonimne mutacije, poželjno ne-sinonimne mutacije proteina koji se eksprimiraju tumorskoj ili kancerskoj ćeliji.
[0100] U jednom primeru izvođenja, kancer-specifične somatske mutacije ili razlike sekvenci, određuju se u genomu, poželjno, u celom genomu uzorka tumora. Stoga, pronalazak može da uključi identifikovanje signature kancerskih mutacija celog genoma, poželjno celog genoma jedne ili više kancerskih ćelija. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja kancerspecifičnih somatskih mutacija u uzorku tumora kancerskog pacijenta, obuhvata identifikaciju mutacionog profila celog genoma.
[0101] U jednom primeru izvođenja, kancer-specifične somatske mutacije ili razlike sekvenci određuju se u egzomu, poželjno celom egzomu uzorka tumora. Stoga, pronalazak može da obuhvati identifikovanje signature kancerskih mutacija celog egzoma, poželjno celog egzoma jedne ili više kancerskih ćelija. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja kancerspecifičnih somatskih mutacija u uzorku tumora kancerskog pacijenta obuhvata identifikovanje kancerskog mutacionog profila celog egzoma.
[0102] U jednom primeru izvođenja, kancer-specifične somatske mutacije ili razlike među sekvencama određuju se u transkriptomu, poželjno u celom transkriptomu uzorka tumora. Stoga, pronalazak može da obuhvati određivanje signature kancerskih mutacija celog transkriptoma, poželjno celog transkriptoma jedne ili više ćelija. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja kancer-specifičnih somatskih mutacija u uzorku tumora kancerskog pacijenta obuhvata identifikovanje kancerskog profila celog transkriptoma.
[0103] U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja kancer-specifičnih somatskih mutacija ili identifikovanja razlika među sekvencama obuhvata sekvenciranje pojedinačnih ćelija, poželjno 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više kancerskih ćelija. Stoga, pronalazak može da obuhvati identifikovanje signature kancerskih mutacija jedne ili više kancerskih ćelija. U jednom primeru izvođenja, kancerske ćelije su cirkulišuće tumorske ćelije. Kancerske ćelije, kao što su cirkulišuće tumorske ćelije mogu se izolovati pre sekvenciranja na nivou ćelije.
[0104] U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja kancer-specifičnih somatskih mutacija ili identifikovanja razlika među sekvencama obuhvata primenu naredne generacije sekvenciranja (NGS).
[0105] U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja kancer-specifičnih somatskih mutacija ili identifikovanja razlika među sekvencama obuhvata sekvenciranje genomske DNK i/ili RNK u uzorku tumora.
[0106] Da bi se otkrile kancer-specifične somatske mutacije ili razlike sekvence, poželjno je da se informacija o sekvenci dobijenoj iz uzorka tumora uporedi sa referentnom sekvencom, kao što je sekvenca dobijena sekvenciranjem nukleinskih kiselina, DNK ili RNK zdrave, ne-kancerske ćelije, kao što je ćelija germinativne linije dobijena od istog pacijenta ili od druge zdrave osobe. U jednom primeru izvođenja, normalna ne-kancerska germinativna genomska DNK izoluje iz perifernih mononuklearnih ćelija (PBMC).
[0107] Termin "genom" odnosi se na ukupnu količinu genetičkih informacija na hromozomima organizma ili ćelije.
[0108] Termin "egzom" odnosi se na deo genoma koji formiraju egzoni, koji predstavljaju kodirajuće delove eksprimiranih gena. Egzom predstavlja genetički otisak koji se koristi u sintezi proteina i drugih funkcionalnih proizvoda gena. To je funkcionalno najrelevantniji deo genoma, i stoga, verovatno najviše doprinosi fenotipu organizma. Procenjuje se da egzom humanog genoma obuhvata 1.5 % ukupnog genoma (Ng, PC et al. , PLoS Gen., 4(8): 1-15, 2008).
[0109] Termin "transkriptom" odnosi se na komplet svih RNK molekula, uključujući iRNK, rRNK, tRNK, i druge ne-kodirajuće RNK koje nastaju u jednoj ćeliji ili populaciji ćelija. U kontekstu predmetnog pronalaska, transkriptom označava komplet svih RNK molekula koji nastaju u jednoj ćeliji ili populaciji ćelija, poželjno u populaciji kancerskih ćelija, ili svih ćelija jedne osobe u određenom trenutku.
[0110] "Nukleinska kiselina" je, prema pronalasku, poželjno dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK), poželjnije RNK, najpoželjnije in vitro transkribovana RNK (IVT RNK) ili sintetska RNK. Nukleinske kiseline obuhvataju prema pronalasku, genomsku DNK, cDNK, iRNK, rekombinantnu DNK i hemijski sintetisanu nukleinsku kiselinu. Prema pronalasku, nukleinska kiselina može biti jednolančana ili dvolančana i linearna ili kovalentno zatvoren cirkularni molekul. Nukleinska kiselina može biti izolovana. Termin “izolovana nukleinska kiselina” označava prema pronalasku, da je ta nukleinska kiselina (i) umnožena in vitro, na primer, pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR), (ii) proizvedena rekombinantno, kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer, isecanjem i razdvajanjem gel elektroforezom, ili (iv) sintetisana, na primer, hemijskom sintezom. Nukleinska kiselina može se iskoristiti za uvođenje u ćelije, na primer transfekcijom, konkretno u formi RNK koja je dobijena in vitro transkripcijom sa DNK matrice. RNK se može modifikovati pre aplikacije, stabilizovanjem sekvence, obeležavanjem ili poli-adenilacijom.
[0111] Fraza "genetički materijal" odnosi se na izolovanu nukleinsku kiselinu, DNK ili RNK, isečak dvostruke zavojnice, deo hromozoma ili ukupnog genoma nekog organizma, konkretno, egzom ili transkriptom.
[0112] Termin "mutacija" odnosi se na promenu ili razliku sekvence nukleinske kiseline (nukleotidna supstitucija, adicija ili delecija) u odnosu na referentnu sekvencu. "Somatska mutacija" može da se desi u bilo kojoj telesnoj ćeliji organizma, osim u germinativnoj ćeliji (spermatozoid, jajna ćelija), pa se zato ne prenosi na potomstvo. Ove promene mogu (ali ne moraju uvek) da izazovu kancer ili neku drugu bolest. Poželjno je da je mutacija ne-sinonimna mutacija. Termin “ne-sinonimna mutacija” označava mutaciju, poželjno nukleotidnu supstituciju, koja ne dovodi do aminokiselinske izmene, kao što je supstitucija aminokiseline u finalnom translacionom proizvodu.
[0113] Prema pronalasku, termin “mutacija” obuhvata tačkaste mutacije, indele, fuzije, hromotripsise i uređivanja RNK.
[0114] Prema pronalasku, termin "indel" opisuje posebnu klasu mutacija, koja se definiše kao mutacija usled kolonizacione insercije ili delecije i neto povećanja ili smanjenja broja nukleotida. U kodirajućim regionima genoma, ukoliko dužina indela nije umnožak broja 3, ove mutacije proizvode potpunu promenu okvira čitanja. Indel se razlikuje od tačkaste mutacije; dok indel dodaje ili oduzima nukleotide iz sekvence, tačkasta mutacija zamenjuje jedan nukleotid drugim nukleotidom.
[0115] Fuzije mogu da stvore hibridne gene, koji nastaju spajanjem dva prethodno razdvojena gena. One mogu da se dese usled translokacije, intersticijalne delecije ili hromozomske inverzije. Čest je slučaj da su fuzioni geni, onkogeni. Onkogeni fuzioni geni mogu dovesti do genskog proizvoda sa novim ili promenjenim funkcijama dva fuziona partnera. Alternativno, protoonkigen je fuzionisan sa snažnim promotorom, i stoga se aktivira onkogena funkcija, ushodnom regulacijom koju izaziva snažni promoter uzvodnog fuzionog partnera. Onkogeni fuzioni transkripti mogu takođe nastati usled unakrsne obrade transkripata ili preskakanja nukleotida u sekvenci.
[0116] Prema pronalasku, termin "hromotripsis" odnosi se na genetički fenomen kojim specifični regioni genoma postaju oštećeni, a zatim međusobno povezani, tokom pojedinačnog devastirajućeg događaja.
[0117] Prema pronalasku, termin "uređivanje RNK" ili "RNK editovanje" odnosi se na molekularne procese u kojima je se informacioni sadržaj RNK molekula menja kroz hemijske izmene osnovnog uređenja. Uređivanje RNK obuhvata modifikacije nukleozida, kao što su deaminacija citidina (C) u uridin (U) i adenozina (A) u inozin (I), kao i nukleotidne adicije ili insercije, kojih nema na zapisu sekvence u DNK. Uređivanje RNK kod iRNK efikasno menja aminokiselinsku sekvencu kodiranog proteina, tako da se ona razlikuje od predviđene genomske DNK sekvence.
[0118] Termin "specifična kancerska mutacija" odnosi se na grupu mutacija prisutnih u kancerskoj ćeliji, kada se uporedi sa ne-kancerskim referentnim ćelijama.
[0119] Prema pronalasku, "referentno" se koristi da se koreliraju ili uporede rezultati dobijeni postupcima prema pronalasku, iz uzorka tumora. Tipično, “referentno” se može dobiti na osnovu jednog ili više normalnih uzoraka, konkretno, uzoraka koji nisu zahvaćeni kancerom, bilo da su dobijeni od pacijenta ili od jedne ili više osoba, poželjno zdravih osoba iste vrste. “Referentno” se može odrediti empirijski, testiranjem dovoljno velikog broja normalnih uzoraka.
[0120] Za određivanje mutacija prema pronalasku, moguće je primeniti svaki pogodan postupak sekvenciranja. pri čemu je poželjno primeniti tehnologije Naredne generacije sekvenciranja (Next Generation Sequencing (NGS)). Metode Treće generacije sekvenciranja mogu da zamene NGS u budućnosti, sa ciljem ubrzavanja koraka sekvenciranja u ovom postupku. U cilju pojašnjenja: fraza "Naredna generacija sekvenciranja" ili "NGS", u kontekstu predmetnog pronalaska, označava sve nove tehnologije visoko-propusnog sekvenciranja, koje, za razliku od “konvencionalnih” postupaka sekvenciranja poznatih pod terminom Sangerova hemija, čitaju šablone nukleinskih kiselina nasumice paralelno duž celokupnog genoma, deleći genom na manje delove. Pomenute NGS tehnologije (poznate i pod imenom masivno paralelno sekvenciranje), sposobne su da pruže informacije o sekvenci nukleinske kiseline celokupnog genoma, egzoma, transkriptoma (svih transkribovanih sekvenci genoma) ili metiloma (svih metilovanih sekvenci genoma) u veoma kratkom vremenu, na primer, tokom 1-2 nedelje, poželjno 1-7 dana ili najpoželjnije za manje od 24 sata i dozvoljavaju, sekvenciranje na nivou pojedinačne ćelije. U kontekstu predmetnog pronalaska moguće je primeniti veći broj komercijalno dostupnih NGS platformi ili one platforme opisane u literaturi, na primer, kod Zhang et al. 2011: The impact of next-generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38 (3), 95-109; ili u Voelkerding et al.2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641-658. Neograničavajući primeri NGS tehnologija/platformi su:
1) Tehnologija sekvenciranja sintezom, poznata i kao pirosekvenciranje, primenjena je u GS-FLX 454 Genome Sequencer™ od kompanije pridružene kompaniji Roche, 454 Life Sciences (Branford, Connecticut), prvi put opisana u Ronaghi et al. 1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363-365. Ova tehnologija koristi emulzioni PCR, u kojoj su zrnca koja vezuju jednolančanu DNK, snažnim vorteksovanjem inkapsulirana u vodene micele, u kojima se nalaze PCR reaktanti, okružene uljem za emulzionu PCR amplifikaciju. Tokom procesa pirosekvenciranja, svetlost koju emituju fosfatni molekuli tokom ugrađivanja nukleotida registruje se kao polimerazna sinteza DNK lanca.
2) Pristupi sekvenciranja sintezom razvijeni su od strane Solexa (sada deo Illumina Inc., San Diego, California), a zasnivaju se na reverzibilnim stop-bojama i primenjeni su, na primer, u analizatorima Illumina/Solexa Genome Analyzer™ i u Illumina HiSeq 2000 Genome Analyzer™. U ovoj tehnologiji, sva četiri nukleotida istovremeno se dodaju fragmentima oligo-prajmera, u protočne kanale zajedno sa DNK polimerazom. Metoda poznata pod imenom amplifikacija mosta izdužuje klaster lanac sa sve četiri fluorescentno obeležena nukleotida za sekvenciranje.
3) Postupci sekvenciranja ligacijom, primenjeni su kod SOLid™ platforme proizvedene u Applied Biosystems (now Life Technologies Corporation, Carlsbad, California). U ovoj tehnologiji, skup svih mogućih oligonukleotida fiksne dužine obeležava se na osnovu sekvencirane pozicije. Oligonukleotidi se tope i ligiraju; preferencijalna ligacija posredstvom DNK ligaze za uklapanje sekvence rezultira oslobađanjem signala koji daje informaciju u položaju nukleotida na toj poziciji. Pre sekvenciranja, DNK se umnožava emulzionom PCR-om. Rezultujuća zrnca, od kojih svako sadrži samo kopije istog DNK molekula, postavljaju se na staklene pločice. Drugi primer je Polonator™ G.007 platforma, proizvedena od Dover Systems (Salem, New Hampshire), takođe primenjuje sekvenciranje ligacijom, primenom nasumično poređanih zrnaca i emulzionog PCR-a za umnožavanje DNK fragmenata paralelnim sekvenciranjem.
4) Tehnologije molekulskog sekvenciranja, kao što su, na primer, one implementirane kod PacBio RS sistema proizvedenog u Pacific Biosciences (Menlo Park, California) ili HeliScope™ platforma od Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts). Specifična svojstva ovih tehnologija su sposobnost da se sekvencira jedan DNK ili RNK molekul bez amplifikacije, što je nazvano DNK sekvenciranjem pojedinačnih molekula u realnom vremenu (Single-Molecule Real Time (SMRT)). Na primer, HeliScope koristi veoma osetljivu fluorescentnu detekciju da direktno detektuje svaki nukleotid, onog trenutka kada se veže u molekul. Sličan pristup zasnovan na fluorescentnom rezonantnom transferu energije (FRET), razvijen je od Visigen Biotechnology (Houston, Texas). Drugi fluorescentni postupci sekvenciranja pojedinačnih molekula razvijeni su od U.S. Genomics (GeneEngine™) i Genovoxx (AnyGene™).
5) Primenjene su nano-tehnologije za sekvenciranje pojedinačnih molekula u kojima se koriste različite nanostrukture aranžirane na čip, kako bi se pratio pokret polimeraznog molekula na jednom lancu tokom replikacije. Neograničavajući primeri sekvenciranja zasnovani na nano-tehnologijama su GridON™ platforma od Oxford Nanopore Technologies (Oxford, UK), platforma za hibridizaciono sekvenciranje pomoću nanopora (HANS™), razvijena od kompanije Nabsys (Providence, Rhode Island), i platform za sekvenciranje DNK, sa tehnologijom DNK nano-loptica (DNB), nazvana kombinovana ligacija proba-sidro (cPAL™).
6) Tehnologije sekvenciranje pojedinačnih molekula koje se zasnivaju na elektronskoj mikroskopiji, na primer, one koje su razvijene od LightSpeed Genomics (Sunnyvale, California) i Halcyon Molecular (Redwood City, California)
7) Jon-poluprovodničko sekvenciranje, koje se zasniva na detekciji vodonikovih jona koji se oslobađaju tokom polimerizacije DNK. Na primer, Ion Torrent Systems (San Francisco, California) primenjuje niz mikrobunarčića visoke gustine kako bi obavio biohemijski postupak na masivan paralelan način. Svaki bunarić nosi različitu DNK matricu. Ispod bunarića se nalazi jon-senzitivni sloj, a ispod njega jonski senzor.
[0121] Poželjno je da, preparati DNK i RNK služe kao polazni materijal za NGS. Ove nukleinske kiseline mogu lako da se dobiju iz uzorka biološkog materijala, na primer, svežih, sveže smrznutih, ili u formalinu fiksiranih parafinskih preparata tumorskog tkiva (FFPE) ili se mogu izolovati iz ćelija ili CTC-ćelija, prisutnih u perifernoj krvi pacijenata. Normalna, nemutirana genomska DNK ili RNK mogu se ekstrahovati iz normalnog, somatskog tkiva, ali je u kontekstu predmetnog pronalaska poželjno da to budu germinativne ćelije. DNK i RNK germinativnih ćelija može se ekstrahovati iz perifernih mononuklearnih ćelija (PBMC) pacijenata sa nehematološkim malignitetima. Iako su nukleinske kiseline izolovane iz FFPE ili iz sveže izolovanih pojedinačnih ćelija veoma fragmentisane, one su pogodne za NGS analizu.
[0122] U literature je opisano nekoliko NGS postupaka sekvenciranja egzoma (za pregled, videti, na primer, Teer and Mullikin 2010: Human Mol Genet 19 (2), R145-51), i svi se mogu biti primeniti u kontekstu predmetnog pronalaska. Većina ovih postupaka (označenih terminima hvatanje genoma, genomsko parcionisanje, obogaćivanje genoma itd.), primenjuju tehnike hibridizacije i uključuju hibridizaciju na čipu i (npr. Hodges et al. 2007: Nat. Genet. 39, 1522-1527) ili u tečnoj fazi (npr. Choi et al. 2009: Proc. Natl. Acad. Sci USA 106, 19096-19101). Komercijalno su dostupni kompleti za izolovanje DNK i hvatanje genoma: na primer, Illumina Inc. (San Diego, California) ima u ponudi komplet za izolovanje DNK TruSeq™ DNA Sample Preparation Kit i za izolovanje egzoma, Exome Enrichment Kit TruSeq™ Exome Enrichment Kit.
[0123] Da bi se smanjio broj lažno pozitivnih nalaza u detekciji kancer-specifičnih somatskih mutacija ili razlika sekvenci kada se uporede sekvenca tumorskog uzorka i referentna sekvenca, kao što je sekvenca uzorka germinativne ćelije, poželjno je više puta uraditi sekvenciranje jednog ili oba tipa uzorka. Poželjno je stoga, da se sekvenca referentnog uzorka, kao što je sekvenca germinativne linije utvrdi dva puta, tri puta ili više puta. Alternativno ili dodatno, sekvenca tumorskog uzorka određuje se dva puta, tri puta ili više puta. Takođe može da bude moguće da se odredi referentna sekvenca, kao što je sekvenca germinativne ćelije i/ili sekvenca tumorskog uzorka više puta, određivanjem najmanje jednom sekvence u genomskoj DNK i određivanjem najmanje jednom sekvence RNK navedenog referentnog uzorka i/ili navedenog tumorskog uzorka. Na primer, određivanjem varijacija koje se javljaju između replikata referentnog uzorka, na primer uzorka germinativne linije, određuje se statistička vrednost očekivane stope lažno pozitivnih (FDR) somatskih mutacija. Tehnički replikati uzorka treba da proizvedu identične rezultate, pa svaka detektovana varijacija dobijen poređenjem tehničkih replikata “isto sa istim” jeste lažno pozitivna mutacija. Konkretno, da bi se odredila stopa lažnih otkrića somatskih mutacija u tumorskom uzorku u odnosu na referentni uzorak, moguće je koristiti tehničke replikate referentnog uzorka kao standard za procenu broja lažno pozitivnih mutacija. Moguće je dalje kombinovati različita merenja kontrole kvaliteta (na primer, pokrivenost ili SNP kvalitet) u jedinstveni kvalitativni skor, primenom mašinskog učenja. Za određenu somatsku varijaciju moguće je izbrojati sve ostale varijacije koje imaju veći kvalitativni skor, što omogućava rangiranje svih varijacija u setu podataka.
[0124] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin “RNK” odnosi se na molekul koji sadrži najmanje jedan ribonukleotid, i poželjno je sačinjen isključivo od ribonukleotida. "Ribonukleotid" je nukleotid sa hidroksil grupom na 2’-poziciji β-D-ribofuranozil grupe. Termin "RNK" obuhvata dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK, kao što je delimično ili potpuno prečišćena RNK, suštinski prečišćena RNK, sintetska RNK ili rekombinantna RNK, kao što je modifikovana RNK, koja se razlikuje od prirodne RNK po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili promeni jednog ili više nukleotida. Ove promene mogu da obuhvate adiciju ne-nukleotidnog materijala na kraj(eve) RNK molekula ili unutar molekula, na primer, na jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u RNK molekulima mogu takođe da sadrže ne-standardne nukleotide, kao što su prirodno nepostojeći nukleotidi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili dezoksinukleotidi. Ovako izmenjene RNK označavaju se terminom analozi ili analozi prirodno postojećih RNK. Prema predmetnom pronalasku, termin “RNK” obuhvata i poželjno se odnosi na “iRNK”. Termin “iRNK” označava informacionu-RNK i odnosi se na “transkript” koji nastaje prepisivanjem DNK matrice, a nastala iRNK kodira peptid ili polipeptid. Tipično, iRNK obuhvata 5’-UTR, protein kodirajući region i 3’-UTR. Informaciona RNK ima ograničen poluživot u ćeliji i in vitro. U kontekstu predmetnog pronalaska, iRNK se može proizvesti in vitro transkripcijom, sa DNK matrice. Metodologije in vitro transkripcije poznata su u stanju tehnike. Na primer, komercijalno su dostupni brojni transkripcioni kompleti za in vitro transkripciju iRNK.
[0125] Ako je potrebno, stabilnost i translaciona efikasnost RNK mogu se modifikovati, prema pronalasku. Na primer, RNK se može stabilizovati i njena translacija se može povećati uvođenjem jedne ili više modifikacija koje imaju stabilišući efekat i/ili koje povećavaju translacionu efikasnost RNK. Ove modifikacije opisane su, na primer, u PCT/EP2006/009448. Da bi se povećala ekspresija RNK u kontekstu pronalaska, iRNK se može modifikovati unutar kodirajućeg regiona, na primer, unutar sekvence koja kodira peptid ili protein, poželjno bez izmene sekvence aminokiselina u eksprimiranom peptidu ili proteinu, povećanjem GCnukleotidnog sadržaja, što povećava stabilnost iRNK, ili optimizacijom kodona, čime se povećava translacija konkretne iRNK u ćelijama.
[0126] Termin "modifikacija”, u kontekstu RNK koja se koristi prema pronalasku, obuhvata svaku modifikaciju RNK, koja ne postoji prirodno u tom RNK molekulu.
[0127] U jednom primeru izvođenja pronalaska, RNK primenjena prema pronalasku nema nezaštićeni 5’-trifosfat. Uklanjanje ovog nezaštićenog 5’-trifosfata može se postići tretiranjem RNK fosfatazom.
[0128] Da bi se povećala stabilnost i/ili smanjila citotoksičnost, RNK prema pronalasku može imati modifikovane ribonukleotide. Na primer, u jednom primeru izvođenja, u molekulu RNK, 5-metilcitidin je delimično ili u potpunosti, a poželjno je u potpunosti, supstituisan za citidin. Alternativno, ili dodatno, u jednom primeru izvođenja, u molekulu RNK koja se koristi prema pronalasku, pseudouridin je delimično ili potpuno, poželjno potpuno, supstituisan za uridin.
[0129] U jednom primeru izvođenja, termin "modifikacija" odnosi se na dobijanje RNK sa 5’-kapom ili analogom 5’-kape. Termin “5’-kapa” odnosi se na strukturu kape koja se nalazi na 5’-kraju iRNK molekula i načelno se sastoji od guanozinskog nukleotida povezanog za iRNK posredstvom neobične 5’-5’ trifosfatne veze. U jednom primeru izvođenja, metilovan je guanozin na poziciji 7. Termin “konvencionalna 5’-kapa” odnosi se na prirodno postojeću RNK 5’-kapu, poželjno na 7-metil-guanozin kapu (m<7>G). U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "5’-kapa", obuhvata analog 5’-kape, koji liči na prirodnu RNK kapu, a modifikovana je tako da poveća stabilnost RNK i/ili da poveća translaciju RNK za koju je zakačen, poželjno, in vivo i/ili u ćeliji.
[0130] Dobijanje RNK sa 5’-kapom ili analogom 5’-kape može se postići in vitro transkripcijom DNK u prisustvu navedene 5’-kape ili analoga 5’-kape, pri čemu je 5’-kapa ko-transkripciono ugrađena u sintetisani RNK lanac, ili se RNK može proizvesti transkripcijom in vitro, a 5’-kapa može biti zakačena za RNK posttranskripciono, uz pomoć enzima, na primer, vakcinija virusa [0131] RNK može sadržati i druge modifikacije. Na primer, dodatne modifikacije RNK koja se koristi prema predmetnom pronalasku, mogu biti produženja ili skraćenja prirodno postojećeg poli(A) repa ili promene 5’- ili 3’-netranslirajućih regiona (UTR), kao što je uvođenje UTR, koja nije povezana sa kodirajućim regionom RNK, na primer, izmena 3’-UTR ili insercija jedne ili više, poželjno dve kopije 3’-UTR dobijene iz globinskog gena, kao što je alfa2-globin, alfa1-globin, beta-globin, poželjno, beta-globin, još poželjnije, humani beta-globin.
[0132] RNK sa demaskiranom poli-A sekvencom, efikasnije se translira od RNK koja ima maskiran poli-(A) rep. Termini "poli(A) rep" ili "poli-A sekvenca" odnose se na niz adenil (A) ostataka, koja se obično nalazi na 3’-kraju RNK molekula, dok termin "demaskirana poli-A sekvenca” označava da se poli-A sekvenca na 3’- kraju RNK molekula završava A nukleotidom, iza kojeg ne slede drugi nukleotidi osim A na 3’-kraju, odnosno, nizvodno od poli-A sekvence. Takođe, dugačka poli-A sekvenca od oko 120 baznih parova rezultira optimalnom transkripcionom stabilnošću i translacionom efikasnošću RNK.
[0133] Da bi se povećala stabilnost i/ili ekspresija RNK koja se koristi prema pronalasku, ona se može modifikovati, tako da bude povezana sa poli-A sekvencom, poželjno poli-A sekvencom dužine 10 do 500, poželjnije 30 do 300, i još poželjnije 65 do 200 i naročito poželjno, 100 do 150 ostataka adenozina. U naročito poželjnom primeru izvođenja, poli-A sekvenca ima dužinu od oko 120 nukleotida. Da bi se dodatno povećala stabilnost i/ili ekspresija RNK koja se koristi prema pronalasku, poli-A sekvenca se može demaskirati.
[0134] Uz ovo, ugrađivanje 3’-netranslirajućeg regiona (UTR) u 3’-netranslirajući region RNK molekula može da rezultira povećanjem translacione efikasnosti. Može se očekivati sinergistički efekat ugrađivanjem dva ili više 3’-netranslirajuća regiona. Ovi 3’-netranslirajući regioni mogu biti autologni ili heterologni u odnosu na RNK u koju se ugrađuju. U jednom poželjnom primeru izvođenja, 3’-netranslirajući region je dobijen iz humanog gena za β-globin.
[0135] Kombinovanje prethodno pomenutih modifikacija, konkretno, ugrađivanje poli-A sekvence, demaskiranje poli-A sekvence i ugrađivanje jednog ili više 3’-netranslirajuća regiona može delovati sinergistički na stabilnost RNK i na povećanje njene translacione efikasnosti.
[0136] Termin "stabilnost" RNK odnosi se na “polu-život” RNK. Načelno, "polu-život" označava vreme koje je potrebno da se eliminiše polovina aktivnosti, količine ili broja molekula. U kontekstu predmetnog pronalaska, polu-život RNK ukazuje na njenu stabilnost. Polu-život RNK može da utiče na “trajanje ekspresije” RNK. Može se očekivati da će RNK koja ima veći polu-život biti eksprimirana tokom dužeg perioda.
[0137] Ako je prema pronalasku potrebno da se smanji stabilnost i/ili translaciona efikasnost RNK, moguće je modifikovati RNK tako da ta modifikacija utiče na funkciju opisanih elemenata, a koji deluju tako što povećavaju stabilnost i/ili translacionu efikasnost RNK.
[0138] Termin "ekspresija" se prema pronalasku koristi u svom najširem značenju i obuhvata produkciju RNK i/ili peptida, polipeptida ili proteina, procesima transkripcije i/ili translacije. U odnosu na RNK, termini “ekspresija” ili “translacija” odnose se na nastanak peptida, polipeptida ili proteina. Termini takođe obuhvataju delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Ekspresija može biti prolazna ili stabilna.
[0139] Prema pronalasku, termin ekspresija takođe obuhvata “aberantnu ekspresiju” ili “nenormalnu ekspresiju”. U kontekstu pronalaska, “aberantna ekspresija” ili “nenormalna ekspresija” znače da je ekspresija izmenjena, poželjno povećana, u odnosu na referent ekspresiju, a to je ekspresija kod subjekta koji nema bolest povezanu sa aberantnom ili nenormalnom ekspresijom nekog proteina, na primer, tumorski antigena. Termin povećanje ekspresije odnosi se na povećanje od najmanje 10%, konkretno, najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100% ili više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija je utvrđena samo u obolelom tkivu, dok je u zdravom tkivu ekspresija represirana.
[0140] Termin "specifično eksprimiran" označava da je protein suštinski eksprimiran samo u određenom tkivu ili organu. Na primer, tumorski antigen specifično eksprimiran u sluzokoži želuca znači da je navedeni protein primarno eksprimiran u sluzokoži želuca i da u drugim tkivima i organima nije eksprimiran u značajnoj meri. Stoga je protein koji se isključivo eksprimira u ćelijama sluzokože želuca i značajno manje u svim drugim tkivima, kao što je na primer, testis, specifično eksprimiran u sluzokoži želuca. U neki primerima izvođenja tumorski antigen može biti specifično eksprimiran pod normalnim uslovima u više od jednog tkiva ili organa, kao što su 2 ili 3 tipa tkiva ili organa, ali poželjno u ne više od 3 različita tkiva ili organa. U ovom slučaju, tumorski antigen je specifično eksprimiran u ovim organima. Na primer, ako je tumor antigen pod normalnim uslovima eksprimiran na sličnom nivou u plućima i želucu, navedeni tumor antigen je specifično eksprimiran u plućima i želucu.
[0141] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin “transkripcija” odnosi se na proces, naznačen time da se genetički kod DNK sekvence “prepisuje”, odnosno, transkribuje u RNK. Nakon toga, nastala RNK translira se u protein. Prema predmetnom pronalasku, termin “transkripcija” obuhvata “in vitro transkripciju”, pri čemu se termin “in vitro transkripcija” odnosi na proces naznačen time da se RNK, konkretno iRNK sintetiše u in vitro sistemu van ćelije, pogodno u prisustvu potrebnih ćelijskog ekstrakta. Poželjno je korišćenje vektora za kloniranje. Vektori za kloniranje se nazivaju i transkripcioni vektori i prema pronalasku su obuhvaćeni terminom “vektor”. Poželjno je da je RNK koja se koristi prema pronalasku, in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK), koja se može dobiti in vitro transkripcijom odgovarajuće DNK matrice. Promotor koji kontroliše transkripciju može biti promotor RNK polimeraze. Konkretni primeri RNK polimeraza su T7, T3, i SP6 RNK polimeraze. Poželjno je da je in vitro transkripcija prema pronalasku pod kontrolom T7 ili SP6 promotora. DNK matrica za in vitro transkripciju može se dobiti kloniranjem neke nukleinske kiseline, konkretno cDNK, i njenim uvođenjem u odgovarajući vektor za in vitro transkripciju. cDNK se može dobiti reverznom transkripcijom RNK.
[0142] Termin "translacija", odnosi se na proces na ćelijskim ribozomima tokom kojeg lanac informacione RNK usmerava povezivanje aminokiselina u sekvencu peptide, polipeptida ili proteina.
[0143] “Sekvence koje kontrolišu ekspresiju” ili “regulatorne sekvence”, mogu biti funkcionalno povezane sa nukleinskom kiselinom i mogu biti homologne ili heterologne u odnosu na nukleinsku kiselinu. Kodirajuća sekvenca i regulatorna sekvenca “funkcionalno” su povezane ukoliko su međusobno kovalentno vezane, tako da su transkripcija ili translacija kodirajuće sekvence pod kontrolom ili pod uticajem regulatorne sekvence. Ukoliko kodirajuća sekvenca treba da se translira u funkcionalni protein, uz funkcionalnu vezu između regulatorne sekvence i kodirajuće sekvence, indukcija regulatorne sekvence dovodi do transkripcije kodirajuće sekvence, ali tako da ne dođe do promene okvira čitanja u kodirajućoj sekvenci, niti nemogućnosti da se kodirajuća sekvenca translira u željeni protein ili peptid.
[0144] Termin "sekvenca koja kontroliše ekspresiju” ili "regulatorna sekvenca" obuhvata prema pronalasku, sekvence koja se vezuje za ribozom i ostale kontrolne elemente, koji kontrolišu transkripciju nukleinske kiseline ili translaciju dobijene RNK. U nekim primerima izvođenja, regulatorna sekvenca se može kontrolisati. Precizna struktura regulatornih sekvenci može da varira zavisno od vrste ili zavisno od ćelijskog tipa, ali načelno obuhvata 5’-netranskribujuće i 5’- i 3’-netranslirajuće sekvence, koje su uključene u inicijaciju transkripcije ili translacije, kao što su TATA-boks, sekvenca kape, CAAT-sekvenca i slično. Konkretno, 5’-netranskribujuće regulatorne sekvence sadrže promotorski region koji obuhvata promotorsku sekvencu za transkripcionu kontrolu gena za koji su funkcionalno vezane. Regulatorne sekvence mogu takođe da obuhvate sekvence pojačivača ili ushodne aktivatorske sekvence.
[0145] Poželjno, prema pronalasku, RNK koja se eksprimira u ćeliji uvodi se u tu ćeliju. U jednom primeru izvođenja postupka prema pronalasku, RNK koja je uvedena u ćeliju dobijena je in vitro transkripcijom odgovarajuće DNK matrice.
[0146] Prema pronalasku, fraze kao što su "RNK koja je sposobna da se eksprimira” ili “RNK koja kodira”, koriste se kao sinonimne fraze i u kontekstu konkretnog peptida ili polipeptida, fraza označava da ta RNK, ako je u pogodnom okruženju, poželjno u ćeliji, može da se eksprimira i da proizvede navedeni peptid ili polipeptid. Poželjno, RNK koja je prema pronalasku sposobna da stupi u interakciju sa ćelijskom mašinerijom za translaciju kako bi nastao peptid ili polipeptid, sposobna je da se eksprimira.
[0147] Termini kao što su "transferirati", "uvesti" ili "transfektovati" koriste se kao sinonimi i odnose na se uvođenje nukleinskih kiselina, konkretno egzogenih ili heterolognih nukleinskih kiselina, konkretno RNK, u neku ćeliju. Prema predmetnom pronalasku, ćelija može biti deo organa, tkiva i/ili organizma. Prema pronalasku, nukleinska kiselina se administrira kao gola nukleinska kiselina ili u kombinaciji sa administrirajućim agensom. Poželjno je da se nukleinska kiselina administrira u formi gole nukleinske kiseline. Poželjno je da se RNK administrira u kombinaciji sa stabilizujućim supstancama, kao što su inhibitori RNKaze. Predmetni pronalazak takođe predviđa ponovljeno uvođenje nukleinske kiseline u ćelije kako bi se obezbedila produžena ekspresija tokom dužeg vremena.
[0148] Ćelije se mogu transfektovati posredstvom svakog nosača sa kojim je moguće povezati RNK, na primer, formiranjem kompleksa sa RNK ili posredstvom vezikula u kojima je RNK zatvorena ili inkapsulirana, što povećava stabilnost RNK u odnosu na golu RNK. Nosači koji se mogu primeniti prema pronalasku, obuhvataju, na primer, lipidne nosače, kao što su katjonski lipidi, lipozomi, konkretno, katjonski lipozomi, micele i nano-čestice. Katjonski lipidi mogu formirati komplekse sa negativno naelektrisanim molekulima nukleinskih kiselina. Prema pronalasku je moguće primeniti bilo koji katjonski lipid.
[0149] Poželjno, uvođenje RNK koja kodira peptid ili polipeptid u ćeliju, konkretno u ćeliju in vivo, dovodi do promene ekspresije tog peptida ili polipeptida u navedenoj ćeliji. U konkretnim primerima izvođenja, poželjno je direktno usmeravanje nukleinske kiseline u određene ćelije. U ovim primerima izvođenja, nosač koji se primenjuje u administraciji nukleinske kiseline u ćeliju (na primer, retrovirus ili lipozom), ispoljavaju usmeravajući molekul. Na primer, molekuli, kao što su antitela specifična za molekule membrane ciljne ćelije ili ligandi receptora prisutni na ciljnoj ćeliji, mogu se ugraditi u nosač nukleinske kiseline ili se za njega mogu vezati. Kada se nukleinska kiselina administrira putem lipozoma, u lipozome je moguće ugraditi protein koji stupa u interakciju sa membranskim proteinom uključenim u proces endocitoze, čime se omogućava ciljano delovanje i/ili preuzimanje. Među usmeravajuće proteine spadaju i proteini kapsida ili njihovi fragmenti specifični za određeni tip ćelije, antitela specifična za proteine koji se uvode u ćeliju, proteine koji su usmereni prema unutarćelijskoj lokaciji, i slično.
[0150] Termin "ćelija" ili "ćelija-domaćin", označava neku intaktnu ćeliju, odnosno, ćeliju sa intaktnom ćelijskom membranom, koja nije oslobodila svoj uobičajen unutarćelijski sadržaj, na primer, enzime, organele ili genetički materijal. Poželjno je da je intaktna ćelija, vijabilna ćelija, odnosno, da je živa i sposobna da obavlja svoje normalne metaboličke funkcije. Navedeni termin se poželjno odnosi na bilo koju ćeliju koja se može transformisati ili transfektovati egzogenom nukleinskom kiselinom. Prema pronalasku, termin ”ćelija” obuhvata prokariotske ćelije (na primer, E. coli) ili eukariotske ćelije (na primer, dendritske ćelije, B-ćelije, CHO ćelije, COS ćelije, K562 ćelije, HEK293 ćelije, HELA ćelije, ćelije kvasca i ćelije insekata). Egzogena nukleinska kiselina se može naći unutar ćelije (i) slobodno raspršena, kao takva (ii) ugrađena u rekombinantni vektor, ili (iii) integrisana u genom ili mitohondrijsku DNK ćelije-domaćina. Posebno su poželjne sisarske ćelije, kao što su humane ćelije i ćelija miševa, hrčaka, svinja, koza ili primata. Ćelije se mogu dobiti iz velikog broja tkiva, i obuhvataju primarne ćelije i ćelijske linije. Primeri obuhvataju ćelije, kao što su keratinocite, leukocite periferne krvi, matične ćelije koštane srži, embrionalne matične ćelije. U nekim primerima izvođenja, ćelija je antigenprezentujuća ćelija, konkretno, dendritska ćelija, monocit ili makrofag.
[0151] Poželjno je da ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline eksprimira peptid ili polipeptid koji kodiran tom nukleinskom kiselinom.
[0152] Termin "klonska ekspanzija" odnosi se na proces umnožavanja nekog specifičnog entiteta. U kontekstu predmetnog pronalaska, termin se poželjno koristi u kontekstu imunološkog odgovora u kojem limfociti stimulisani antigenom, proliferišu, a umnožavaju se samo specifični limfociti koji prepoznaju taj antigen. Poželjno je da klonska ekspanzija dovodi do diferencijacije limfocita.
[0153] Termini kao što su "redukovanje" ili "inhibiranje" odnose se na sposobnost da se izazove smanjenje nivoa, poželjno, 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije 50% ili više, i najpoželjnije 75% ili više. Termin “inhibira” i slični obuhvata potpunu ili suštinski potpunu inhibiciju, odnosno, smanjenje do nule ili suštinski do nule.
[0154] Termini kao što je "povećanje", "pojačavanje", "podsticanje" ili "produžavanje" odnose se na povećanje, pojačanje, podsticanje ili produženje za najmanje 10%, poželjno, najmanje 20%, poželjno, najmanje 30%, poželjno, najmanje 40%, poželjno, najmanje 50%, poželjno, najmanje 80%, poželjno, najmanje 100%, poželjno, najmanje 200% i posebno poželjno, najmanje 300%. Ovi termini takođe se odnose na povećanje, pojačavanje, podsticanje ili produženje od nule ili nemerljivog i nedetektabilnog nivoa do nivoa koji je veći od nule ili koji se može meriti ili detektovati.
[0155] Predmetni pronalazak obezbeđuje vakcine, na primer, kancersku vakcinu dizajniranu na bazi aminokiselinskih modifikacija ili modifikovanih peptida, čija se imunogenost predviđa primenom postupka prema pronalasku.
[0156] Prema pronalasku, termin "vakcina" se odnosi na farmaceutski preparat (farmaceutsku kompoziciju) ili proizvod koji, nakon administracije, indukuje imunski odgovor, konkretno, ćelijski imunski odgovor, koji prepoznaje i napada patogen ili obolelu ćeliju, kao što je kancerska ćelija. Vakcina se može koristiti u prevenciji ili tretmanu bolesti. Termin “personalizovana vakcina protiv kancera” ili “individualizovana vakcina protiv kancera” odnosi se na konkretnog kancerskog pacijenta i označava da je kancerska vakcina prilagođena potrebama ili specijalnim okolnostima pojedinačnog kancerskog pacijenta.
[0157] U jednom primeru izvođenja, obezbeđena je vakcina koja sadrži peptid ili polipeptid, sa jednom ili više aminokiselinskih modifikacija ili sadrži jedan ili više modifikovanih peptida, čija je imunogenost predviđena postupcima prema pronalasku ili sadrži nukleinsku kiselinu, poželjno RNK, koja kodira naznačeni peptid ili polipeptid.
[0158] Kancerske vakcine obezbeđene predmetnim pronalaskom, kada se administriraju pacijentu, obezbeđuju jedan ili više epitopa T-ćelija pogodnih za stimulaciju, upoznavanje i/ili ekspanziju T-ćelija usmerenih nasuprot tumora tog pacijenta. T-ćelije su posebno usmerene prema ćelijama koje ispoljavaju antigene od kojih su dobijeni epitopi T-ćelija. Stoga su opisane vakcine sposobne da indukuju ili podstaknu ćelijski odgovor, poželjno aktivnost citotoksičnih T-ćelija, protiv kancera koje se odlikuje prezentacijom jednog ili više tumor-asociranih neoantigena sa klasom I MHC molekula. S obzirom na to da će vakcina prema pronalasku biti usmerena na kancer-specifične mutacije, ona će biti specifična za tumor konkretnog pacijenta.
[0159] Vakcina dobijena prema pronalasku, odnosi se na vakcinu koja, kada se administrira pacijentu, obezbeđuje jedan ili više epitopa T-ćelija, kao što su 2 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 30 ili više i poželjno do 60, do 55, do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 epitopa T-ćelija, sa ugrađenim aminokiselinskim modifikacijama, ili modifikovanim peptidima, za koje je primenom postupka prema pronalasku, predviđeno da su imunogeni. Ovi epitopi T-ćelija takođe se nazivaju "neo-epitopi". Prezentacija neo-epitopa od strane ćelija pacijenta, konkretno tumor-prezentujućih ćelija, poželjno dovodi do toga da T-ćelije ciljaju epitop kada je povezan sa MHC, pa stoga, deluju protiv tumora pacijenta, poželjno, primarnog tumora, i tumorskih metastaza, koje eksprimiraju antigene od kojih je T-ćelijski epitop dobijen i prezentuju iste epitope na površini tumorskih ćelija.
[0160] Postupci predmetnog pronalaska dalje obuhvataju korak određivanja primenjivosti identifikovanih aminokiselinskih modifikacija ili modifikovanih peptida za potrebe proizvodnje vakcine protiv kancera. Dakle, dodatni koraci mogu da obuhvate jedan ili više narednih postupaka:
(i) utvrđivanje da li je modifikacija lokalizovana u poznatim ili predviđenim MHC prezentovanim epitopima, (ii) in vitro i/ili in silico testiranje da li je modifikacija lokalizovana u MHC prezentovanim epitopima, na primer, testiranje da li su modifikacije deo peptidnih sekvenci koje se obrađuju u i/ili prezentuju kao MHC prezentovani epitopi, i (iii) in vitro testiranja da li su predviđeni modifikovani epitopi, konkretno, kada su prisutni su prirodnom kontekstu sekvence, na primer, kada su okruženi aminokiselinskim sekvencama koje takođe okružuju navedeni epitop u prirodno postojećem proteinu, i kada se eksprimiraju u antigenprezentujućim ćelijama, sposobni da stimulišu T-ćelije, na primer, T-ćelije pacijenta koje imaju željenu specifičnost. Ovakve bočne sekvence mogu da sadrže 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više i poželjno, do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 aminokiselina, i mogu da okružuju sekvencu epitopa sa N-terminalnog i/ili C-terminalnog kraja.
[0161] Modifikovani peptidi određeni prema pronalasku, mogu se rangirati na osnovu mogućnosti da se primene kao epitopi za razvoj kancerske vakcine. Stoga, u jednom aspektu, postupak prema pronalasku obuhvata manuelni ili kompjuterizovani analitički proces, kojim se identifikovani modifikovani peptidi analiziraju i selektuju prema mogućnosti da obezbede odgovarajuće vakcine. U poželjnom primeru izvođenja, naznačeni analitički proces je kompjuterizovani algoritamski proces. Poželjno, naznačeni analitički proces obuhvata određivanje i/ili rangiranje epitopa prema predviđanju njegove sposobnosti da bude imunogen.
[0162] Neo-epitopi identifikovani prema pronalasku i obezbeđeni vakcinom prema pronalasku, prisutni su u formi polipeptida u kojem se nalaze navedeni neo-epitopi, kao što su poliepitopski polipeptidi ili nukleinske kiseline, konkretno RNK, koja kodira takav polipeptid. Dalje, neoepitopi mogu biti prisutni u polipeptidu u formi sekvence vakcine, odnosno, prisutni u njihovom prirodnom kontekstu te sekvence, na primer, okruženi aminokiselinskim sekvencama koje okružuju te epitope u prirodno postojećem proteinu. Takve bočne sekvence mogu da sadrže 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više, i poželjno, do 50, do 45, do 40, do 35 do 30 aminokiselina i mogu da okružuju sekvencu epitopa sa N-terminalnog i/ili C-terminalnog kraja. Stoga sekvenca vakcine može da sadrži 20 ili više, 25 ili više, 30 ili više, 35 ili više, 40 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 aminokiselina. U jednom primeru izvođenja, neo-epitopi i/ili sekvence vakcine poravnate su u polipeptidu od početka ka kraju.
[0163] U jednom primeru izvođenja, sekvence neo-epitopa i/ili vakcine razdvojene su linkerima, konkretno neutralnim linkerima. Termin "linker", prema pronalasku, odnosi se na peptid dodat između dva domena peptida, na primer, dve sekvence epitopa ili vakcine, kako bi se ti domeni povezali. Ne postoje posebna ograničenja u pogledu sekvence linkera. Međutim, poželjno je da sekvenca linkera smanjuje sterična ometanja između dva peptidna domena, da se dobro translira i da omogućava obradu epitopa. Takođe, linker treba da ne sadrži ili da sadrži malo imunogenih elemenata. Linkeri ne treba da kreiraju ne-endogene neo-epitope, kao što su oni dobijeni na mestu povezivanja susednih neo-epitopa, a koji mogu izazovu neželjene imunske reakcije. Stoga, poliepitopska vakcina treba da sadrži sekvencu linkera koja je sposobna da smanji broj neželjenih MHC vezivanja susednih epitopa. Hoyt et al. (EMBO J.25(8), 1720-9, 2006) i Zhang et al. (J. Biol. Chem., 279(10), 8635-41, 2004) pokazuju da sekvence bogate glicinom onemogućavaju proteazomalnu obradu, pa primena linkera sa visokim sadržajem glicina u sekvenci smanjuje broj peptida sa linkerom koje se mogu obraditi proteazomom. Takođe, uočeno je da glicin smanjuje snažno vezivanje peptide u MHC-vezujućoj poziciji žljeba (Abastado et al.
, J. Immunol. 151(7), 3569-75, 1993). Studija Schlessinger et al. (Proteins, 61(1), 115-26, 2005) pokazuje da aminokiseline glicin i serin u sastavu aminokiselinske sekvence, daju fleksibilniji protein koji se lakše translira i obrađuje proteazomom, što omogućava bolji pristup kodiranim neo-epitopima. Linker može da sadrži 3 ili više, 6 ili više, 9 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 do 30 aminokiselina. Poželjno je da je linker bogat aminokiselinama glicin i/ili serin. Poželjno je da najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 95% sekvence linkera čine glicin i/ili serin. U jednom poželjnom primeru izvođenja, linker je suštinski sačinjen od aminokiselina glicin i serin. U jednom primeru izvođenja, sekvenca linkera je (GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e, pri čemu a, b, c, d i e, nezavisno predstavljaju brojeve izabrane između 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 i pri čemu je a b c d e različito od 0 i poželjno je 2 ili više, 3 ili više, 4 ili više ili 5 ili više. U jednom primeru izvođenja, linker sadrži opisanu sekvencu, i sekvencu opisanu u primerima, na primer, GGSGGGGSG.
[0164] U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, polipeptid u koji je ugrađeno jedan ili više neo-epitopa, kao što je poli-epitopski polipeptid prema pronalasku, administrira se pacijentu u formi nukleinske kiseline, poželjno RNK, na primer in vitro transkribovane ili sintetske RNK, koja se eksprimira u ćeliji pacijenta, kao što je antigen-prezentujuća ćelija, kako bi se proizveo polipeptid. Predmetni pronalazak takođe predviđa administraciju jednog ili više multi-epitopskih polipeptida, koji su, za potrebe ovog pronalaska, obuhvaćeni terminom “poli-epitopski polipeptidi”, poželjno u formi nukleinske kiseline, poželjno RNK, kao što je in vitro transkribovana ili sintetska RNK, koja može da se eksprimira u ćeliji pacijenta, na primer, antigen-prezentujućoj ćeliji, kako bi se proizveo jedan ili više polipeptida. U slučaju administracije jednog ili više multi-epitopskih polipeptida, neo-epitopi u sastavu multiepitopskih polipeptida mogu se delimično ili potpuno preklapati. Kada se nađu u ćeliji pacijenta, kao što je antigen-prezentujuća ćelija, polipeptid se obrađuje, kako bi nastali neo-epitopi, identifikovani prema pronalasku. Primena vakcine prema pronalasku može da obezbedi epitope prezentovane posredstvom MHC molekula klase II, sposobne da iniciraju odgovor CD4<+>pomoćničkih T-ćelija, protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih su dobijeni MHC-prezentovani epitopi. Primena vakcine prema pronalasku, može da obezbedi epitope prezentovane posredstvom MHC molekula klase I, sposobnih da iniciraju odgovor CD8<+>T-ćelija protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih su MHC-prezentovani epitopi dobijeni. Dalje, administracija vakcine prema pronalasku, može da obezbedi jedan ili više neo-epitopa (uključujući poznate neo-epitope i neo-epitope identifikovane postupkom prema pronalasku), kao i jedan ili više epitopa koji ne sadrže kancer-specifičnu somatsku mutaciju, ali su eksprimirani u kancerskim ćelijama i poželjno indukuju imunski odgovor protiv kancerskih ćelija, poželjno, kancer-specifičan imunski odgovor. U jednom primeru izvođenja, primena vakcine prema pronalasku obezbeđuje neo-epitope, koji su prezentovani posredstvom MHC molekula klase II, i/ili su sposobni da iniciraju odgovor CD4<+>pomoćničkih T-ćelija, usmeren protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih su MHC-prezentovani epitopi dobijeni, kao i epitopa koji ne sadrže kancer-specifične somatske mutacije koje su epitopi prezentovani posredstvom MHC molekula klase I i/ili su sposobni da iniciraju odgovor CD8<+>T-ćelija usmeren protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih se MHC-prezentovani epitopi dobijeni. U jednom primeru izvođenja, epitopi koji ne sadrže kancer-specifične somatske mutacije dobijeni su od tumor- antigena. U jednom primeru izvođenja, neo-epitopi i epitopi koji ne sadrže kancerspecifične somatske mutacije ispoljavaju sinergistički efekat u terapiji kancera. Poželjno, vakcina prema pronalasku korisna je za poliepitopsku stimulaciju odgovora citotoksičnih i/ili pomoćničkih T-ćelija.
[0165] Vakcina prema pronalasku može biti rekombinantna vakcina. Termin "rekombinantan" u kontekst pronalaska, označava da je “dobijen genetičkim inženjerstvom”. Poželjno, “rekombinantan entitet”, kao što je rekombinantan polipeptid u kontekstu pronalaska, nije prirodno postojeći protein i rezultat je kombinacije entiteta, kao što su aminokiseline ili nukleinske kiseline, koje se ne kombinuju međusobno u prirodi. Na primer, rekombinantan polipeptid u kontekstu pronalaska, može da sadrži sekvencu od nekoliko aminokiselina, kao što su sekvence neo-epitopa ili vakcine dobijene iz različitih proteina ili različitih delova istog proteina, povezanih zajedno, na primer, peptidnom vezom ili odgovarajućim linkerom.
[0166] Termin "prirodno postojeći", u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, peptid ili nukleinska kiselina koji su prisutni u organizmu (kao i u virusima), i koji se mogu izolovati iz izvora u prirodi i koji nisu namerno izmenjeni od strane čoveka u laboratoriji smatraju se prirodno postojećima.
[0167] Opisani agensi, kompozicije i postupci mogu se primeniti u terapiji bolesti subjekta, na primer, bolesti koja se odlikuje prisustvom obolelih ćelija koje eksprimiraju antigen ili njegov fragment. Konkretno te bolesti su kanceri. Opisani agensi, kompozicije i postupci takođe se mogu primeniti u imunizaciji ili vakcinaciji sa ciljem sprečavanja opisanih bolesti.
[0168] Prema pronalasku, termin “bolest” odnosi se na svako patološko stanje, uključujući kancer, konkretno na opisane forme kancera.
[0169] Termin "normalan" odnosi se na zdrav status ili stanje zdravog subjekta ili tkiva, odnosno, na ne-patološke uslove, pri čemu “zdravo” poželjno znači ne-kancerozno.
[0170] "Bolest koja uključuje ćelije koje eksprimiraju antigen”, prema pronalasku označava da je detektovana ekspresija antigena u ćelijama obolelog tkiva ili organa. Ekspresija u ćelijama obolelog tkiva ili organa može biti povećana u odnosu na stanje kod zdravog tkiva ili organa. Povećanje se odnosi na povećanje od najmanje 10%, konkretno, najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10 000% ili čak više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se detektuje samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu represirana. Prema pronalasku, bolesti koje obuhvataju ili su povezane sa ćelijama koje eksprimiraju antigen, obuhvataju kancerske bolesti.
[0171] Prema pronalasku, termini "tumor" ili "tumorska bolest" odnose se na nenormalan rast ćelija (koje se nazivaju neoplastične ćelije, tumorigene ćelije ili tumorske ćelije), koje formiraju oteklinu ili leziju. Pod “tumorskom ćelijom” se podrazumeva izmenjena ćelija koja raste nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste i nakon početka delovanja stimulusa koji prekida rast. Tumori pokazuju delimičan ili potpuni gubitak strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom, i uobičajeno formiraju distinktivnu masu tkiva, koja može biti benigna, pre-maligna i maligna.
[0172] Kancer (medicinski termin: maligna neoplazija) predstavlja klasu bolesti u kojoj kolekcija ćelija ispoljava nekontrolisano rast (deobe preko normalnog limita), invazivnost (upad u susedna tkiva i njegova destrukcija), i nekada metastazu (širenje na druga mesta u telu preko limfe i krvi). Ova tri maligna svojstva razlikuju benigne tumore, koji su samo-ograničavajući i koji ne invadiraju i ne metastaziraju. Većina kancera formira tumor, ali neki, kao što je leukemija ne. Malignitet, maligna neoplazija i maligni tumor su suštinski sinonimi sa kancerom.
[0173] Neoplazma je nenormalna masa tkiva koja je rezultat neoplazije. Neoplazija (novi rast, na grčkom jeziku), označava nekontrolisanu proliferaciju ćelija. Rast ćelija prevazilazi rast normalnog tkiva i nije koordinisan sa okolnim zdravim tkivom. Rast se nastavlja na isti preterani način, čak i nakon početka delovanja stimulusa koji prekida rast. To najčešće uzrokuje izraslinu ili tumor. Neoplazme mogu biti benigne, pre-maligne ili maligne.
[0174] "Rast tumora" ili "tumorski rast", prema pronalasku, odnose se na tendenciju tumora da uveća svoju veličinu i/ili na tendenciju tumorskih ćelija da proliferišu.
[0175] Za potrebe predmetnog pronalaska, termini “kancer” i “kancerska bolest” koriste se kao međusobno zamenjivi sinonimi sa terminima "tumor" i "tumorska bolest".
[0176] Kanceri se klasifikuju na osnovu tipa ćelija na koje tumor liči, i, stoga, tkiva iz koga se pretpostavlja da tumor vodi poreklo. Kriterijumi klasifikacije su histologija, odnosno lokalizacija.
[0177] Termin "kancer", prema pronalasku, obuhvata karcinome, adenokarcinome, blastome, leukemije, seminome, melanome, teratome, limfome, neuroblastome, gliome, rektalni kancer, endometrijalni kancer, kancer bubrega, adrenalni kancer, tiroidni kancer, kancer krvi, kancer kože, kancer mozga, cervikalni kancer, intestinalni kancer, kancer jetre, kancer debelog creva, kancer želuca, kancer tankog creva, kancer glave i vrata, gastrointestinalni kancer, kancer limfnog čvora, kancer jednjaka, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer uha, nosa i grla (ENT), kancer dojke, kancer prostate, kancer materice, ovarijalni kancer i kancer pluća, i njihove metastaze. Primeri su plućni karcinomi, karcinomi dojke, karcinomi prostate, karcinomi debelog creva, karcinomi bubrežnih ćelija, cervikalni karcinomi, ili metastaze tipova kancera ili tiumora koji su pomenuti. Termin kancer, prema pronalasku takođe obuhvata metastaze kancera i relaps kancera.
[0178] Pod "metastazom" se podrazumeva širenje kancera sa originalnog mesta u druge delove tela. Formiranje metastaze je složen proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije u vanćelijski matriks, probijanja endotelne bazalne lamine, kako bi zašao u telesne šupljine ili sudove, i, nakon što je transportovan krvlju, infiltriranja u druge, ciljne organe. Nakon toga rast novog tumora, odnosno, sekundarnog tumora ili metastatskog tumora na udaljenom mestu, zavisi od angiogeneze. Tumorska metastaza najčešće se dešava nakon uklanjanja primarnog tumora, jer tumorske ćelije ili komponente mogu da ostanu nakon intervencije i da razviju metastatski potencijal. U jednom primeru izvođenja, termin “metastaza” prema pronalasku, odnosi se na “udaljene metastaze”, koje označavaju metastaze udaljene od primarnog tumora i regionalnog limfnog čvora.
[0179] Ćelije sekundarnog ili metastatskog tumora su slične originalnom tumoru. To znači, na primer, kada metastazira ovarijalni kancer u jetru, sekundarni tumor je sačinjen od izmenjenih ovarijalnih ćelija, a ne od izmenjenih ćelija jetre. Tumor u jetri se tada označava terminom metastatski ovarijalni kancer, a ne kancer jetre.
[0180] Termin "cirkulišuće tumorske ćelije" ili "CTC" označava ćelije koje su se odvojile od primarnog tumora ili tumorskih metastaza i cirkulišu krvotokom. CTC mogu da budu začetak rasta narednih tumora (metastaza) u drugim tkivima. Cirkulišuće tumorske ćelije se uočavaju u frekvenciji od 1-10 CTC ćelija po mL ukupne krvi pacijenta sa metastatskim tumorom. Razvijeni su istraživački postupci za izolovanje CTC. Nekoliko istraživačkih postupaka za izolovanje CTC opisano je u stanju tehnike, na primer, postupci koji se zasnivaju na činjenici da epitelne ćelije eksprimiraju ćelijski adhezioni molekul EpCAM, koji se ne eksprimira u normalnim ćelijama krvi. Vezivanje zasnovano na imunomagnetnim perlama uključuje tretiranje uzorka krvi antitelima usmerenim protiv EpCAM, koja su konjugovana sa magnetnim česticama, nakon čega sledi separacija obeleženih ćelija u magnetnom polju. Izolovane ćelije se zatim boje antitelima na druge epitelne markere, citokeratin, kao i na uobičajeni leukocitni marker CD45, kako bi se razlikovale retke CTC od kontaminirajućih belih krvnih ćelija. Ovaj robusni i poluautomatizovanu pristup identifikuje CTC sa prosečnim prinosom od oko 1 CTC/mL i čistoćom od 0.1% (Allard et al. , 2004: Clin Cancer Res 10, 6897-6904). Drugi postupak izolovanja CTC ćelija bazira se na primeni mikrofluidnog CTC-vezujućeg uređaja, koji uključuje proticanje cele krvi kroz komoru sa 80 000 mikronskih mesta koji su obloženi antitelom specifičnim za EpCAM. CTC se boje sekundarnim antitelima specifičnim za citokretain ili neke tkivne specifične markere, kao što je PSA kod kancera prostate, ili HER2 kod kancera dojke, i vuzuelizuju se automatizovanim skeniranjem mikro-pozicija u više planova trodimenzionalnog sistema. CTC-čipovi mogu da identifikuju citokeratin-pozitivne cikrulišuće tumorske ćelije kod pacijenata, sa srednjim prinosom od 50 ćelija/ml i čistoćom od 1-80% (Nagrath et al. , 2007: Nature 450, 1235-1239). Još jedna mogućnost izolovanja CTC bazira se na primeni CellSearch™ Circulating Tumor Cell (CTC) Testa koji je proizveden u Veridex, LLC (Raritan, NJ), koji omogućava vezivanje, identifikovanje i brojanje CTC-a u epruveti sa krvlju. Sistem The CellSearch™ system je odobrila Američka administracija za hranu i lekove (FDA), za brojanje CTC u celoj krvi, a zasniva se na kombinaciji imunomagnetskog obeležavanja i automatizovane digitalne mikroskopije. U literaturi su opisane i druge metode izolovanja CTC, i sve se mogu primeniti u vezi sa predmetnim pronalaskom.
[0181] Relaps ili obnavljanje bolesti koji se dešava se kada je osoba pogođena patološkim stanjem koje se već desilo u prošlosti. Na primer, ako je pacijent bolovao od tumora, primio uspešnu terapiju za navedenu bolest i ponovo nakon nekog vremena razvio istu bolest, navedena pojava bolesti može se smatrati relapsom ili recidivom. Međutim, prema pronalasku, relaps ili recidiv tumora može i ne mora da se ponovi na mestu originalnog tumora. Tako, na primer, ako je pacijentkinja bolovala od ovarijalnog tumora i primila uspešan tretman, relaps ili recidiv mogu biti recidiv ovarijalnog tumora ili recidiv tumora na drugom mestu. Relaps ili recidiv tumora takođe obuhvata situacije naznačene time da se tumor javlja na drugačijem mestu od originalnog tumora, ili na mestu originalnog tumora. Poželjno, originalni tumor za koji je pacijent dobio tretman naziva se primarni tumor, a tumor na mestu koje se razlikuje od mesta originalnog tumora je sekundarni ili metastatski tumor.
[0182] Pod terminom "lečiti" podrazumeva se administracija jedinjenja ili kompozicije prema pronalasku, u cilju prevencije ili eliminacije tumora ili broja tumora kod pacijenta; prestanka ili usporavanja bolesti kod subjekta; inhibicije ili usporenja razvoja nove bolesti kod subjekta; smanjenja frekvencije ili ozbiljnosti simptoma i/ili recidiva kod subjekta koji trenutno boluje ili je bolovao od bolesti; i/ili produženje, povećanje životnog veka subjekta. Konkretno, termin “lečenje bolesti” obuhvata izlečenje, skraćenje trajanja, ublažavanje, prevenciju, usporavanje ili inhibiciju progresije ili pogoršanja, ili prevenciju ili odlaganje početka bolesti ili njenih simptoma.
[0183] Pod terminom "biti u riziku" označava se subjekt, odnosno, pacijent, kod kojeg je identifikovana veća šansa da razvije bolest, konkretno kancer, u odnosu na opštu populaciju. Uz to, subjekt koji je imao ili trenutno ima bolest, konkretno, kancer, jeste subjekt kod kojeg postoji povećani rizik od razvoja bolesti, jer takav subjekt može da nastavi da razvija bolest. Subjekti koji trenutno boluju ili su imali kancer, takođe su u povećanom riziku od kancerskih metastaza.
[0184] Termin "imunoterapija" označava tretman koji uključuje aktivaciju specifične imunske reakcije. U kontekstu predmetnog pronalaska, termini kao što su “štiti”, “prevenira”, “profilaksa” ili “protekcija” odnose se na prevenciju ili tretman ili oboje, recidiva i/ili propagacije bolesti kod subjekta, konkretno, na smanjenje verovatnoće da će subjekt razviti bolest ili na odlaganje razvoja bolesti. Na primer, osoba u riziku od tumora, kao što je opisano, bila bi kandidat za terapiju prevencije tumora.
[0185] Profilaktička primena imunoterapije, na primer, profilaktička primena vakcine prema pronalasku, štiti primaoca od razvoja bolesti. Terapeutska administracija imunoterapije, na primer, terapeutska administracija vakcine prema pronalasku, može dovesti do inhibicije progresije/rasta bolesti. To obuhvata usporavanje progresije/rasta bolesti, konkretno sprečavanje progresije bolesti, što poželjno dovodi do uklanjanja bolesti.
[0186] Imunoterapija se može izvesti primenom različitih tehnika, u kojima agensi prema pronalasku uklanjaju bolesne ćelije pacijenta. Uklanjanje se može desiti usled pojačavanja ili indukovanja u pacijentu, imunskog odgovora specifičnog za antigen ili za ćelije koje eksprimiraju antigen.
[0187] U okviru nekih primera izvođenja, imunoterapija može biti aktivna imunoterapija, kod koje se tretman zasniva na in vivo stimulaciju endogenog imunskog sistema koji reaguje nasuprot obolelih ćelija administracijom agenasa koji modifikuju imunski odgovor (kao što su polipeptid i nukleinske kiseline, prema pronalasku).
[0188] Agensi i kompozicije prema pronalasku koriste se samostalno ili u kombinaciji sa konvencionalnim terapeutskim režimima, kao što su hirurška operacija, zračenje, hemoterapija i/ili transplantacija koštane srži (autologna, singena, alogena ili nesrodna).
[0189] Termini "imunizacija" ili "vakcinacija" opisuju postupak tretiranja subjekta sa ciljem indukovanja imunskog odgovora iz terapeutskih ili profilaktičkih razloga.
[0190] Termin "in vivo” odnosi se na stanje u živom subjektu.
[0191] Termini "subjekt", "individua", "organizam" ili "pacijent" koriste se kao sinonimi, i odnose se na kičmenjake, poželjno sisare. Na primer, sisari u kontekstu pronalaska, su ljudi, primati, domaće životinje, kao što su psi, mačke, ovce, goveda, koze, svinje, konji itd., laboratorijske životinje, kao što su miševi, pacovi, zečevi, zamorci, itd., kao i životinje u zatočeništvu, na primer, u zoološkim vrtovima. Termin “životinja”, u značenju koje je ovde primenjeno, obuhvata ljude. Termin “subjekt” takođe može da označi pacijenta, odnosno, životinju, poželjno čoveka koji je bolestan, poželjno od opisanih bolesti.
[0192] Termin "autologno" se koristi da opiše bilo šta što je dobijeno od subjekta. Na primer, “autologni transplant” se odnosi na transplant tkiva ili organa koji je dobijen od istog tog subjekta. Ovi postupci su pogodni jer prevazilaze imunološke barijere koje bi dovele do odbacivanja.
[0193] Termin "heterologno" se koristi da opiše nešto što se sastoji od više različitih elemenata. Na primer, transfer koštane srži jedne osobe u drugu osobu predstavlja heterolognu transplantaciju. Heterologni gen je gen dobijen iz drugog izvora, a ne od subjekta.
[0194] Kao deo kompozicije za imunizaciju ili vakcinaciju, poželjno se administrira jedan ili više agenasa, zajedno sa jednim ili više adjuvanasa za indukciju imunskog odgovora ili povećanje imunskog odgovora. Termin “adjuvans” odnosi se na jedinjenja koja prolongiraju ili pojačavaju ili ubrzavaju imunski odgovor. Kompozicija prema pronalasku ispoljava efekat bez dodavanja adjuvansa. Ipak, kompozicija prema pronalasku može da sadrži poznate adjuvanse. Adjuvans obuhvata heterologne grupe jedinjenja, kao što su uljane emulzije (na primer Frojndov adjuvans), mineralna jedinjenja (na primer, aluminijum), bakterijske proizvode (kao što je, Bordetella pertussis toksin), lipozome, i imuno-stimulatorne komplekse. Primeri mogućih adjuvanasa su monofosforil-lipid-A (MPL SmithKline Beecham). Saponini, kao što je QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, i QS-L1 (So et al. , 1997, Mol. Cells 7: 178-186), nekompletni Frojndov adjuvans, kompletni Frojndov adjuvans, vitamin E, montanid, aluminijum, CpG oligonukleotidi (Krieg et al. , 1995, Nature 374: 546-549), i različite emulzije voda-u-ulju, koje se dobijaju od biološki razgradivih ulja, kao što je skvalen i/ili tokoferol.
[0195] Moguće je administrirati i druge supstance koje stimulišu imunski odgovor pacijenta. U sastavu vakcine moguće je primeniti citokine, zbog njihovih regulatornih efekata prema limfocitima. Citokini uključuju, interleukin-12 (IL-12), koji povećava protektivne efekte vakcina (uporediti, Science 268:1432-1434, 1995), zatim GM-CSF i IL-18.
[0196] Brojna jedinjenja pojačavaju imunski odgovor, pa se mogu primeniti u proizvodnju vakcine. Ta jedinjenja uključuju ko-stimulatorne molekule u formi proteina ili nukleinskih kiselina, kao što su B7-1 i B7-2 (CD80, odnosno, CD86).
[0197] Uzorak, prema pronalasku, može biti tkivni uzorak, uključujući telesne tečnosti, i/ili ćelijski uzorak. Telesni uzorci se mogu dobiti na uobičajeni način, na primer, biopsijom, uključujući biopsiju male količine tkiva, uzimanje krvi, bronhijalnog aspirata, ispljuvka, urina, fecesa, i drugih telesnih tečnosti. Prema pronalasku, termin “uzorak” takođe obuhvata obrađene uzorke, kao što su frakcije ili izolati bioloških uzoraka, na primer, nukleinske kiseline ili ćelijski izolati.
[0198] Agensi, kao što su opisane vakcine i kompozicije, mogu se administrirati na uobičajeni način, uključujući injekciju ili infuziju. Administracija se može sprovesti, na primer, oralno, intravenski, intraperitonealno, intramuskularno, subkutano ili transdermalno. U jednom primeru izvođenja, administracija se izvodi intranodalno, na primer, injektovanjem direktno u limfni čvor. Ostale forme administracije predviđaju in vitro transfekciju antigen-prezentujućih ćelija, kao što su dendritske ćelije, opisanim nukleinskim kiselinama, i sledstvenu administraciju antigen-prezentujućih ćelija.
[0199] Opisani agensi se primenjuju u efektivnim količinama. Termin “efektivna količina” odnosi se na količinu koja postiže željenu reakciju ili željeni efekat samostalno ili u kombinaciji sa drugim dozama. U slučaju tretmana određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija se odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo uključuje usporavanje napretka bolesti i konkretno, prekid ili reverziju napretka bolesti. Željena reakcija u tretmanu bolesti ili stanja takođe može biti odlaganje početka ili prevencija početka naznačene bolesti ili stanja.
[0200] Efektivna količina opisanog agensa zavisi od patološkog stanja koje se tretira, ozbiljnosti bolesti, individualnih parametara pacijenta, fiziološkog stanja, veličine i mase, trajanja tretmana, tipa prateće terapije (ako je ima), specifične rute administracije i drugih sličnih faktora. Shodno tome, doze opisanih agenasa koje se administriraju zavise od različitih parametara. U slučaju da je nakon početne doze pacijent pokazao nedovoljnu reakciju, doza se može povećati (ili se efektivno povećati, što se postiže lokalizovanijim putem primene).
[0201] Poželjno je da su farmaceutske kompozicije, prema pronalasku, sterilne i da sadrže efektivnu količinu terapeutski aktivne supstance, kako bi se izazvala željena reakcija ili željeni efekat.
[0202] Opisane farmaceutske kompozicije se načelno administriraju u farmaceutski pogodnim količinama i u farmaceutski kompatibilnim preparatima. Termin “farmaceutski kompatibilan” odnosi se na netoksični materijal koji ne interferira sa aktivnošću aktivne komponente farmaceutske kompozicije. Preparati ovoga tipa mogu da sadrže soli, pufere, konzervanse, nosače, imuno-suplemente, kao što su adjuvansi, na primer, CpG oligonukleotide, citokine, hemokine, saponine, GM-CSF i/ili RNK i, kada je potrebno, ostala terapeutski aktivna jedinjenja. Kada se koriste u farmaceutske svrhe, soli treba da budu farmaceutski prihvatljive. Međutim, soli koje nisu farmaceutski prihvatljive mogu se koristiti za dobijanje farmaceutski kompatibilnih soli i stoga su uključene u predmetni pronalazak. Farmakološki i farmaceutski kompatibilne soli ovog tipa su, bez ograničenja, one koje su dobijene od narednih kiselina: hlorovodonična, bromovodonična, sumporna, azotna, fosforna, maleinska, sirćetna, salicilna, limunska, mravlja, jabučna, ćilibarna i slične. Farmaceutski kompatibilne soli mogu se dobiti kao soli alkalnih metala ili alkalnih zemljanih metala, kao što su soli natrijuma, soli kalijuma ili soli kalcijuma.
[0203] Opisana farmaceutska kompozicija može da sadrži farmaceutski kompatibilan nosač. Termin “nosač” označava organsku ili neorgansku komponentu, prirodnu ili sintetsku, sa kojoj se aktivna supstanca meša, kako bi se olakšala primena. Termin “farmaceutski kompatibilan nosač”, prema pronalasku, obuhvata jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih filera, rastvarača i inkapsulirajućih supstanci, pogodnih za primenu kod pacijenta. Komponente farmaceutske kompozicije prema pronalasku, najčešće su takve, da nema interakcija koje značajno utiču na željenu farmaceutsku efikasnost.
[0204] Opisane farmaceutske kompozicije mogu da sadrže pogodne pufere, kao što su soli sirćetne kiseline, soli limunske kiseline, soli borne kiseline i soli fosforne kiseline.
[0205] Farmaceutske kompozicije mogu, kada je potrebno, da sadrže i konzervanse, kao što su benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerozal.
[0206] Farmaceutske kompozicije obično su u uniformnim doznim formama i mogu se pripremiti prema poznatim postupcima. Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu biti u formi kapsula, tableta, lozengi, rastvora, suspenzija, sirupa, eliksira ili u formi emulzije, npr.
[0207] Kompozicije pogodne za parenteralnu primenu sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je izotoničan sa krvlju primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Takođe, kao medijumi za rastvore ili suspenzije najčešće se koriste sterilna fiksna ulja.
[0208] Predmetni pronalazak je detaljno objašnjen narednim slikama i primerima, čija je svrha da pronalazak ilustruju, a ne da ga ograniče. Zahvaljujući opisu i primerima, sledeći primeri izvođenja dostupni su poznavaocima stanja tehnike.
SLIKE
[0209]
Slika 1. Nesinonimne mutacije povezane sa kancerom često su imunogene i prvenstveno ih prepoznaju CD4<+>T-ćelije. a, Za testiranje imunogenosti, miševi (n = 5 za b i c, n = 3 za d) su vakcinisani ili sintetičkim peptidima i poli (I:C) kao adjuvansom (b) ili sa RNK koja kodira antigen (c, d) koji predstavlja mutirane epitope (dve mutacije po mišu). Splenociti su restimulisani ex vivo mutiranim peptidom ili irelevantnim kontrolnim peptidom i testirani pomoću IFNγ Elispot (videti primer sl. 2a) i unutarćelijskim bojenjem citokina i površinskim bojenjem CD4/CD8 da bi se procenio podtip izazvanih imunskih odgovora. b-c, T-ćelijski odgovori dobijeni vakcinacijom miševa C57BL/6 epitopima mutiranim u modelu tumora B16F10. Levo, prevalencija neimunogenih, mutiranih epitopa ograničenih MHC klasom I ili klasom II. Desno, primeri za detekciju i tipizaciju T-ćelija specifičnih za mutacije (videti tabelu 1 za podatke o pojedinačnim epitopima). d Levo, prevalencija neimunogenih, mutiranih epitopa ograničenih MHC klasom I ili klasom II otkrivenih u CT26 modelu. Desno, MHC restrikcija imunogenih mutiranih epitopa sa prioritetom određenim na osnovu predviđenog vezivanja MHC klase I i odabranih na osnovu dobrih (0.1-2.1) ili loših (> 3.9) skorova vezivanja. Videti tabelu 2 za podatke o pojedinačnim epitopima.
Slika 2. Efikasna kontrola tumora i korist preživljavanja kod melanoma B16F10 imunizacijom RNK vakcinom koja kodira pojedinačni mutirani epitop CD4<+>T-ćelija. a, Splenociti miševa (n = 5) vakcinisanih sa B16-M30 RNK testirani su pomoću ELISpot na prepoznavanje sintetičkih peptida. Levo, mutirana (B16-M30) naspram odgovarajuće sekvence divljeg tipa (B16-WT30). Desno, definisanje minimalnog epitopa testiranjem za prepoznavanje skraćenih varijanti B16-M30 (srednja vrednost SEM). b, Srednji rast tumora SEM (levo) i preživljavanje (desno) miševa C57BL/6 (n = 10) inokulisanih subkutano ćelijama tumora B16F10 i ostavljenih netretiranih (kontrola) ili imunizovanih IV sa RNK koja kodira B16-M30 (B16- M30) sa ili bez davanja antitela koja iscrpljuju CD4 ili CD8, c, B6 albino miševi (n = 10) koji razvijaju plućne metastaze nakon IV injekcije tumorskih ćelija B16F10 sa transgenom luciferazom (B16F10-Luc) tretirani su sa RNK koja kodira B16-M30 (B16-M30) ili irelevantnom kontrolnom RNK. Srednji rast tumora određen je pomoću BLI. d, Jednoćelijske suspenzije tumora B16F10 netretiranih (kontrola, n = x) ili miševa imunizovanih sa B16-M30 RNK (n = 4) restimulisane su peptidom B16-M30, srednjim ili irelevantnim peptidom (VSV-NP52-59) i ispitane u testu IFNγ ELISpot (srednja vrednost SEM). e, Karakterizacija protočnom citometrijom leukocita koji infiltriraju tumor kod miševa vakcinisanih sa B16-M30 RNK. Prikazana je učestalost CD4<+>, CD8<+>ili FoxP3<+>/CD4<+>T-ćelija među CD45<+>ćelijama i Gr1<+>/CD11b<+>ćelijama (MDSC) netretiranih (kontrolnih) ili C57BL/6 miševa vakcinisanih sa Mut30 RNK (n = 3) inokulisanih subkutano tumorskim ćelijama B16F10.
Slika 3. Imunizacija RNK pentatopima indukuje T -ćelijske odgovore na pojedinačne mutirane epitope i daje kontrolu bolesti i značajnu korist preživljavanja u modelima tumora miša. a, Konstruisanje poli-neo-epitopske RNK vakcine. Pentatop RNK sadrži pet 27-mernih sekvenci povezanih linkerima gly/ser umetnutim u osnovni lanac pSTI-Sp-MITD-2hBgUTR-A120. (UTR, netranslirani region; sp, signalni peptid; MITD, transportni domen MHC klase I), b, BALB/c miševi (n = 5) su vakcinisani ili pentatopskom RNK (35 µg) ili odgovarajućom mešavinom pet monotopa RNK (7 µg svaki). Odgovori T-ćelija u splenocitima miševa stimulisanim peptidom mereni su ex vivo 19. dana u IFNγ ELISpot testu (srednja vrednost SEM od koje je oduzeta kontrola medijuma). c, miševi BALB/c (n = 10) koji su razvili plućne metastaze nakon IV injekcije ćelija CT26-Luc tretirani su istovremeno mešavinom dva pentatopa RNK ili su ostavljeni netretirani (kontrola). Prikazani su medijana rasta tumora pomoću BLI (levo), podaci o preživljavanju (sredina) i pluća lečenih životinja (desno). d, isečci tkiva obojeni za CD3 iz pluća životinja tretiranih pentatopom 1+2 (gornji panel). Na levoj strani svakog panela nalaze se analizirani isečci, na desnoj strani su uvećani prikazi (skala: skenovi: 1000 µm, gornje slike: 100 µm, donje slike: 50 µm). Površine CD3<+>, CD4<+>, FoxP3<+>i CD8<+>(izračunato prema površini CD3<+>- površina CD4<+>) u uzastopnim imunohistohemijskim isečcima plućnog tkiva kontrole (n = 6) ili životinja tretiranih pentatopom RNK (CD3: n = 14; CD4, CD8, FoxP3: n = 12) su kvantifikovane i izračunate su proporcije tumora. Desna slika prikazuje poređenje površine tumora u isečcima kontrolnih (n = 18) i životinja tretiranih pentatopom 1+2 (n = 39) (isključene su životinje bez tumora grupe tretmana pentatopom 1+2). Prikazana je srednja vrednost ± SEM.
Slika 4. RNK pentatopske vakcine sa mutacijama, izabranim prema in silico predviđenim povoljnim svojstvima vezivanja MHC klase II i obilnoj ekspresiji, daju moćnu antitumorsku kontrolu. a, Poređenje skorova vezivanja za MHC II imunogenih i neimunogenih mutacija (prikazane medijane), b, Mutacije sa visokim nivoima ekspresije odabrane su sa ('ME' mutacije) ili bez ('E' mutacije) uzimanja u obzir skora vezivanja MHC klase II . Videti takođe tabelu 4. Deset mutacija iz svake kategorije predstavljene sa po dva pentatopa korišćeno je za vakcinaciju miševa koji nose tumor pluća CT26-Luc. Prikazane su krive rasta tumora (levo), površina ispod krivine (sredina) i pluća tretirana mastilom (desno). c, U miševima (5 po grupi) su analizirani odgovori T-ćelija protiv vakcinalnih pentatopa restimulacijom singenim BMDC elektroporisanim sa RNK u IFNγ ELISpot testu. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost broja tačaka kod jednog miša od koje je oduzeta vrednost irelevantne kontrolne RNK (srednja vrednost ±SEM). d, Tumorski čvorići po plućima BALB/c miševa (n = 10) koji su inokulisani IV tumorskim ćelijama CT26 i ostavljeni netretirani ili im je ubrizgana irelevantna RNK, pentatop1, pentatop2 ili CT26-M19 RNK. e, T-ćelijski odgovori na gp70423-431(gp70-AH1) određeni su pomoću IFNγ ELISpot testa u krvi (sakupljene od 5 miševa, 20. dana nakon inokulacije tumora) i slezini (n = 5). (Prikazana je srednja vrednost ±SEM od koje je oduzeta bazalna vrednost bez kontrole peptida)), f, podaci o somatskim mutacijama i RNK-Seq podaci za pojedinačne uzorke kancera kod ljudi (crne tačke) iz Atlasa genoma kancera (TCGA) korišćeni su za identifikaciju genomskih (gornji panel) i eksprimiranih (srednji panel) nesinonimnih varijacija pojedinačnih nukleotida (nsSNV). (donji panel) Prikazani su neo-epitopi za koje se predviđa da će se vezati za alele pacijenata HLA-DRB1 (percentilni rang <10%) (SKCM, kutani melanom kože; COAD, adenokarcinom debelog creva; BRCA, invazivni karcinom dojke).
Slika 5: Proračun učestalosti alelne varijante (VAF). Na slici je prikazan idealizovani gen kao kombinacija egzona na delu genomske DNK (gornji deo) i primeri očitavanja sekvenci poravnatih sa ovim lokusom (donji deo, u višem nivou zumiranja). Mesto mutacionog događaja ("mesto mutacije") prikazano je isprekidanom linijom (gornji deo) ili okvirom (donji deo). Mutirani nukleotidi su obojeni crvenom bojom, nukleotidi divljeg tipa su obojeni zeleno. Isto tako, zbirovi tih nukleotida u VAF formuli obojeni su na odgovarajući način.
Slika 6: Uticaj ekspresije mutiranog alela na performanse predviđanja MHC II-skorova.
185 odabranih mutacija iz modela tumora miša 4T1, CT26 i B16F10 testirano je na njihovu antigenost. Performanse predviđanja izračunatih MHC II skorova izvedene su iz površine ispod krive operativnih karakteristika prijemnika (AUC, prazni krug). Ova vrednost je naknadno preračunata nakon primene različitih pragova za ukupnu ekspresiju iRNK (levi panel) i ekspresiju mutiranog alela (desni panel, ekspresija iRNK * frekvencija mutiranog alela, ispunjeni krugovi). Prikazane su maksimalne vrednosti AUC. Ekspresija mutiranog alela više doprinosi poboljšanju performansi predviđanja.
Slika 7: Poređenje krivih operativnih karakteristika prijemnika (ROC) sa i bez praga ekspresije. ROC krive ukazuju na performanse predviđanja antigenosti za svih 185 odabranih mutacija iz modela tumora miša 4T1, CT26 i B16F10 (tačkaste krive) i za one mutacije, za koje je ekspresija iRNK bila ≥6 RPKM (levi panel, puna kriva) ili je ekspresija mutiranog alela bila ≥4 RPKM (desni panel, puna kriva). Izabrani pragovi su postigli maksimalne vrednosti AUC (vidi sliku 6).
[0210] Ovde upotrebljene tehnike i postupci su opisani u ovom dokumentu ili se sprovode se na način koji je poznat i opisan, na primer, u Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2<nd>Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Svi postupci, uključujući upotrebu kompleta i reagenasa, sprovode se prema uputstvima proizvođača, ukoliko nije drugačije naznačeno.
Primer 1: Materijali i postupci
[0211] Uzorci. Ženke 8-12 nedelja starih miševa C57BL/6, BALB/c (Janvier Labs) i miševa C57BL/6BrdCrHsd-Tyr<c>(B6 albino, Harlan) držani su u skladu sa saveznom politikom o istraživanju na životinjama Univerziteta u Majncu. Ćelijska linija melanoma B16F10, ćelijska linija karcinoma debelog creva CT26 i ćelije 4T1-luc2-tdtomato (4T1-Luc) nabavljene su u 2010, 2011. i 2011., redom (ATCC CRL-6475 lot br. 58078645, ATCC CRL-2638 lot br.
58494154, Caliper 125669 lot br.101648) i održavane prema sugestijama dobavljača. Ćelije koje eksprimiraju luciferazu svica CT26-Luc i ćelije B16F10-Luc transdukovane su lentivirusom. Napravljene su glavne i radne ćelijske banke, od kojih su treća i četvrta pasaža upotrebljene za eksperimente sa tumorom.
[0212] Naredna generacija sekvenciranja i obrada podataka su ranije opisani (Castle, J. C., et al., Cancer Res 72, 1081 (2012); Castle, J. C., et al., BMC Genomics 15, 190 (2014)). Ukratko, odabir egzoma iz tumorskih ćelija miša i uzoraka tkiva repa miševa BALB/c ili C57BL/6 sekvencirani su u triplikatu (4T1-Luc u duplikatu). Biblioteke sekvenciranja RNK na bazi oligo(dT) za profilisanje genske ekspresije napravljene su u triplikatu. Biblioteke su sekvencirane pomoću Illumina HiSeq2000 da bi se dobila očitavanja od 50 nukleotida sa nesparenim krajem (B16F10) ili 100 nukleotida sa sparenim krajem (CT26, 4T1-Luc), redom. Vrednosti genske ekspresije određene su brojanjem očitavanja egzona i spojeva transkripata koji se preklapaju, i normalizovanjem prema RPKM jedinicama ekspresije (očitavanja koja mapiraju po kilobazi dužine transkripta na milion mapiranih očitavanja). Ekspresija mutacija određena je normalizacijom očitavanja mutiranih RNK prema ukupnom broju mapiranih očitavanja pomnoženom sa 100 miliona (normalizovani broj očitavanja varijanti; NVRC).
[0213] Selekcija, validacija i određivanje prioriteta mutacija je prethodno opisana (Castle, J. C., et al., Cancer Res 72, 1081 (2012); Castle, J. C., et al., BMC Genomics 15, 190 (2014); Lower, M., et al., PLoS Comput Biol 8, e1002714 (2012)). Mutacije koje treba sprovesti odabrane su na osnovu sledećih kriterijuma: (i) prisutne u triplikatima sekvenciranja odgovarajuće tumorske ćelijske linije i odsutne u triplikatima odgovarajućih uzoraka zdravog tkiva, (ii) javljaju se u transkriptu RefSeq i (iii) uzrokuju nesinonimne promene. Dalji kriterijumi su bili pojava u eksprimiranim genima tumorskih ćelijskih linija (medijana RPKM u replikatima). Za validaciju, mutacije su amplifikovane iz DNK ćelija B16F10, CT26 ili 4T1-Luc i repnog tkiva miševa C57BL/6 ili BALB/c i podvrgnute Sanger sekvenciranju. Mutacije koje potiču iz DNK klasifikovane su kao validirane ako su potvrđene ili Sangerovim sekvenciranjem ili očitavanjima RNASeq. Nije izvršena potvrda putem Sangerovog sekvenciranja i testiranja imunogenosti za eksperimente prikazane na slici 4. Za eksperimente prikazane na slici 1, određen je prioritet mutiranih epitopa prema predviđenom vezivanju MHC klase I na osnovu metode konsenzusa (verzija 2.5) baze podataka imunoloških epitopa (Vita, R., et al., Nucleic Acids Res 38, D854-D862 (2010)). Mutacije ciljane u eksperimentu prikazanom na slici 4b-e odabrane su samo na osnovu njihove ekspresije (NVRC) ili u kombinaciji sa predviđenom sposobnošću vezivanja peptida MHC klase II (IEDB metoda konsenzusa verzija 2.5). Retrospektivna analiza predviđanja vezivanja MHC II prikazana na slici 4a određena je IEDB metodom konsenzusa verzija 2.12. Za analizu mutacija u humanim tumorima, podaci o sekvenciranju DNK kutanog melanoma kože (SKCM, n = 308), adenokarcinoma debelog creva (COAD, n = 192) ili invazivnog karcinoma dojke (BRCA, n = 872) preuzeti iz Atlasa genoma kancera ( TCGA) (avgust 2014) filtrirani su kako bi se dobile genomske nesinonimne tačkaste mutacije (nsSNV). RNA-Seq podaci (TCGA) uzoraka tumora sa identifikovanim genomskim mutacijama korišćeni su za definisanje eksprimiranih nsSNV. Da bi se predvidelo vezivanje za MHC II eksprimiranih neo-epitopa, korišćen je seq2HLA za identifikaciju pacijentove četvorocifrene HLA klase II (HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRB1). Predviđanje vezivanja IEDB konsenzusa (verzija 2.12) korišćeno je za predviđanje vezivanja MHC klase II iz 27mer peptida i alela pacijenata HLA-DRB1. Prema preporuci IEDB, neo-eptiopi sa percentilnim rangom ispod 10% smatrani su vezujućim.
[0214] Sintetska RNK i sintetski peptidi. Identifikovane nesinonimne mutacije ispitivane su u kontekstu odgovarajućeg 27-mernog aminokiselinskog epitopa sa mutiranom aminokiselinom u centru (položaj 14). Svaki od ovih mutiranih peptida su sintetisani zajedno sa kontrolnim peptidima (nukleo-protein virusa vezikulo-stomatitisa (VSV-NP52-59), gp70-AH1 (gp70423-431) i tirozinaza-srodni protein 2 (Trp2180-188) u JPT Peptide Technologies GmbH. Alternativno, sekvence koje kodiraju mutirane 27-merne peptide klonirane su u osnovni lanac pST1-Sp-MITD-2hBgUTR-A120 (Holtkamp, S., et al., Blood 108, 4009 (2006)) koji sadrži elemente sekvence za farmakološki optimizovanu sintetičku RNK u smislu efikasnosti translacije i obrade epitopa od strane MHC klase I/II bilo kao monotopa ili kao pentatopa međusobno spojenih sekvencama koje kodiraju glicin-serinski linker od 10 aminokiselina između njih. Linearizacija ovih plazmidnih konstrukata, in vitro translacija (IVT) ovih matrica i prečišćavanje detaljno su opisani na drugom mestu (Holtkamp, S., et al., Blood 108, 4009 (2006)).
Mišji modeli.
[0215] Za eksperimente koji su ispitivali imunogenost mutiranih epitopa, ženke miševa C57BL/6 ili BALB/c usklađenog uzrasta su vakcinisane na dan 0, 3, 7 i 14 (imunizacija sa RNK) ili dan 0 i 7 (imunizacija peptidom), očitavanje je izvršeno pet do šest dana nakon poslednje imunizacije. Vakcinacija je izvedena ili retro-orbitalnom injekcijom od 200 µl (20 µg po mutaciji za B16F10, 40 µg po mutaciji za CT26) RNK u kompleksu sa katjonskim lipidima (rukopis u pripremi) ili subkutanom injekcijom 100 µg sintetičkog peptida i 50 µg poli (I:C) formulisano u PBS (ukupna zapremina 200 µL) u bok. Testirane su dve mutacije po mišu (n = 5 za B16F10, n = 3 za CT26). Za potvrdu imunogenih mutacija i podtipizacije, miševi su vakcinisani protiv jedne mutacije (n = 5).
[0216] Za eksperimente terapije tumora, miševi C57BL/6 su inokulisani subkutano sa 1x10<5>ćelija melanoma B16F10 u desni bok i nasumično raspoređeni u tretmanske grupe. Zapremina tumora je merena bez zaslepljivanja kaliperom i izračunata po formuli (AxB<2>)/2 (A kao najveći i B najmanji prečnik tumora). U eksperimentima sa plućnim metastazama injektovano je 5x10<5>CT26-Luc ili 2x10<5>CT26 ćelija u repnu venu BALB/c miševa ili 1.5x10<5>B16F10-Luc tumorskih ćelija u B6 albino miševe da bi se dobili tumori pluća. Rast tumora ćelija koje imaju transgenu luciferazu praćen je bez zaslepljivanja bioluminescentnim snimanjem nakon i.p. injekcija vodenog rastvora D-luciferina (250 µl, 1.6 mg, BD Bioscience) uređajem IVIS Lumina (Caliper Life Sciences). Pet minuta nakon ubrizgavanja emitovani fotoni su kvantifikovani. In vivo bioluminescencija u regionima od interesa (ROI) kvantifikovana je kao ukupni fluks (fotoni/sek) korišćenjem softvera IVIS Living Image 4.0. Miševi su nasumično raspoređeni na osnovu vrednosti ukupnog fluksa (ANOVA-P metoda, Daniel's XL Toolbox V6.53). Opterećenje tumorom pluća CT26 je kvantifikovano bez zaslepljivanja nakon trahealne injekcije mastila (razređenog 1:10 u PBS) i fiksacije Feketeovim rastvorom (5 ml 70% EtOH, 0.5 ml formalina i 0.25 ml glacijalne sirćetne kiseline). U terapijskim eksperimentima miševima su davane ponovljene doze bilo monotopa (40 µg), pentatopske RNK (ukupno 40 µg) ili ekvimolarnih količina irelevantne RNK.
Za mehanicističke studije, ponovljene doze antitela koja osiromašuju CD8 (klon YTS191, BioXcell), osiromašuju CD4 (klon YTS169.1, Biocell) ili blokiraju CD40L (klon MR1, ljubazni poklon prof. Stephena Schoenbergera) su primenjene intraperitonealno kao što je prikazano na slici (200 µg/miš u 200 µl PBS).
[0217] Enzimski-vezan imunospot test (ELISpot) je prethodno opisan (Kreiter, S., et al., Cancer Res 70, 9031 (2010)). Ukratko, 5 x 10<5>splenocita je kultivisano tokom noći na 37 °C u Multiscreen pločama sa 96 bunarčića (Millipore) obloženim sa anti-INF-γ (10 µg/mL, klon AN18, Mabtech) i sekrecija citokina je detektovana pomoću anti-IFN-γ antitela (1 µg/mL, klon R4-6A2, Mabtech). Za stimulaciju je dodato ili 2 µg/mL peptida ili su ćelije slezine koinkubirane sa 5 x 10<4>singenih dendritskih ćelija poreklom iz koštane srži (BMDC) transficiranih sa RNK. Za analizu limfocita koji infiltriraju tumor, jednoćelijske suspenzije plućnih metastaza ostavljene su preko noći da bi se uklonile žive ćelije tumora putem adherencije na plastiku. Vijabilne ćelije su odvojene centrifugiranjem sa gradijentom gustine. Sve dobijene ćelije su dodate na ploču ELISpot. Za analizu odgovora T-ćelija u perifernoj krvi, PBMC su izolovane centrifugiranjem sa gradijentom gustine, prebrojane i restimulisane dodatkom peptidnog i singenog BMDC. Subtipizacija T-ćelijskih odgovora izvedena je dodavanjem antitela koje blokira MHC klase II (20 µg/ml, klon M5/114, BioXcell). Svi uzorci su testirani u duplikatima ili triplikatima.
[0218] Protočna citometrijska analiza je korišćena za određivanje podtipa mutaciono reaktivnih T-ćelija. U prisustvu Brefeldina A (Sigma-Aldrich) 2x10<6>splenocita je stimulisano sa 2x10<5>BMDC transficiranih sa RNK ili 2 µg/mL peptida. Kao pozitivna kontrola, splenociti su tretirani forbol 12-miristat 13-acetatom (PMA, 0,5 µg/ml, Sigma-Aldrich) i jonomicinom (1 µg/ml, Sigma-Aldrich). Ćelije su inkubirane 5 sati na 37 °C i zatim obojene na marker ćelijske površine CD4<+>i CD8<+>. Ćelije su permeabilizovane i fiksirane pomoću BD Cytofix/Cytoperm prema protokolu proizvođača i nakon toga obojene na citokine INF-γ, TNF-α i IL-2 (BD Biosciences). Sekrecija citokina u CD4<+>ili CD8<+>T-ćelijama u stimulisanim uzorcima upoređena je sa kontrolnim uzorcima (srednja, irelevantna RNK ili irelevantni peptid) kako bi se odredio podtip T-ćelija koji reaguje (n = 5). Leukociti koji infiltriraju tumor pripremljeni su iz potkožnih tumora B16F10 kao što je prethodno opisano (PMID:2071934). Dobijena ćelijska suspenzija je obojena na površinski marker CD4, CD8, Gr-1 i CD11b. Bojenje unutarćelijskog FoxP3 izvedeno je prema protokolu proizvođača (Mouse Foxp3 Buffer Set, BD). Uzorci su uzeti na BD FACSCanto II.
[0219] Imunološka histohemija. Pluća miševa sa CT26 tumorom fiksirana su preko noći u 4% rastvoru formaldehida puferisanom fosfatom (Carl Roth) i obložena parafinom. Uzastopni isečci od 50 µm (3 po mišu) obojeni su na CD3 (klon SP7, Abcam), CD4 (klon 1, kat. br. 50134-M08H, Sino Biologinal) i FoxP3 (poliklonalni, kat. br. NB100-39002, Novus Biologicals) nakon detekcije pomoću antitela konjugovanog sa HRP (Poli-HRP-anti-zečji IgG, ImmunoLogic) i odgovarajućeg supstrata peroksidaze (Vector Nova Red, Vector Laboratories) i kontrastno obojeni hematoksilinom. CD3<+>, CD4<+>, FoxP3<+>i tumorska područja su snimljeni pomoću Axio Scan.Z1 (Zeiss) i ručno unapred definisani regioni tumora i pluća su kvantifikovani pomoću računarskog softvera za analizu slike (Tissue Studio 3.6.1, Definiens).
[0220] Imunofluorescentno bojenje. Kriokonzervirani organi su isečeni na isečke od 8 µm i pričvršćeni na predmetna stakla Superfrost. Isečci su osušeni preko noći na sobnoj temperaturi (RT) i fiksirani u 4% para-formaldehidu (PFA) 10 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Isečci su isprani 3 puta sa PBS i blokirani rastvorom PBS sa 1% BSA, 5% seruma miša, 5% seruma pacova i 0.02% Nonidenta tokom 1 sata na sobnoj temperaturi u mraku. Fluorescentno obeležena antitela (FoxP3, klon FJK-16s, eBioscience; CD8, klon 53-6,7, BD; CD4, klon RM4-5, BD) razblažena su u puferu za bojenje (PBS dopunjen sa 1% BSA, 5% mišjim serumom i 0,02% Nonidentom) i isečci su obojeni preko noći na 4 °C. Nakon dva ispiranja puferom za ispiranje (PBS dopunjen sa 1% BSA i 0.02% Nonidenta) i jednom sa PBS, predmetna stakla su bojena 3 minuta bojom Hoechst (Sigma), isprana 3 puta PBS-om, jednom destilovanom vodom i fiksirana pomoću Mounting Medium Flouromount G (eBioscience). Imunofluorescentne slike su dobijene pomoću epifluorescentnog mikroskopa (ApoTome, Zeiss). Tumorska, CD4, CD8 i FoxP3 obojena područja kvantifikovana su unutar ručno unapred definisanih regiona tumora pomoću računarskog softvera za analizu slike (Tissue Studio 3.6.1., Definiens).
[0221] Statistika. Srednje vrednosti su upoređene korišćenjem Studentovog t-testa za dve grupe. Za poređenje srednjih vrednosti u više od dve grupe primenjen je jednosmerni ANOVA sa Tukey-evim testom. Površina ispod krive (AUC) za poređenje dinamike rasta tumora određena je za pojedinačne miševe po grupi i prikazana je kao medijana. Statističke razlike u medijanama između dve grupe izračunate su neparametarskim Mann-Whitney U testom. Korist preživljavanja je utvrđena pomoću log-rang testa. Sve analize su dvostrane i izvedene su pomoću GraphPad Prism 5.03. nz: P> 0.05, *: P <0.05, **: P ≤0.01, ***: P <0.001. Grubb-ov test je korišćen za identifikaciju rezultata koji pokazuju ekstremna odstupanja (alfa = 0.05).
Primer 2: T-ćelijski epitopi ograničeni MHC klasom II u neo-epitopskim vakcinama
A. Karakterizacija podtipova T-ćelija reaktivnih prema mutiranim epitopima
[0222] Nedavno su podnosioci prijave opisali tok rada za sveobuhvatno mapiranje nesinonimnih mutacija tumora B16F10 pomoću NGS (sl.1a) (Castle, J. C., et al., Cancer Res 72, 1081 (2012)). Miševi C57BL/6 koji nose tumor imunizovani su sintetičkim 27-mernim peptidima koji kodiraju mutirani epitop (mutacija na poziciji 14), što je rezultiralo odgovorima T-ćelija koji su dali in vivo kontrolu tumora. U nastavku tog rada, sada su okarakterisali odgovore T-ćelija protiv mutiranih epitopa, počevši od onih sa velikom verovatnoćom vezivanja za MHC I. Miševi su vakcinisani sintetičkim 27-mernim peptidima mutiranog epitopa (sl. 1b gore desno). Njihovi splenociti su testirani u IFN-γ ELISpot testu u cilju identifikacije imunogenih mutacija za dalju analizu podtipa i ekspresije citokina (sl. 1a). Otkriveno je da je oko 30% mutiranih epitopa indukovalo T-ćelije koje izlučuju citokine reaktivne prema mutacijama kod miševa (sl. 1b). Iznenađujuće, odgovori na skoro sve mutirane epitope (16/17, 95%) bili su CD4<+>T-ćelijskog tipa (sl.1b, tabela 1).
Tabela 1: Imunogene mutacije B16F10. Mutacije B16F10 za koje je utvrđeno da su imunogene nakon imunizacije pomoću peptida ili RNK (kao što je opisano na slici 1). (WT, divlji tip; AA#, broj mutiranih aminokiselina; Mut, mutacija)
[0223] Da bi se isključilo svako odstupanje povezano sa formatom vakcine zasnovane na peptidima, ovaj eksperiment je ponovljen korišćenjem in vitro transkribovane (IVT) iRNK koja kodira mutirane epitope (sl. 1c gornji grafikon sa desne strane). Reaktivnost T-ćelija određena ovim monotopima RNK bila je u velikoj meri uporediva sa podacima dobijenim sa sintetičkim peptidima (sl. 1c, tabela 1), sa nešto manjim brojem imunogenih epitopa (oko 25%). Važno je da su i u ovom okruženju većinu imunskih odgovora specifičnih za mutacije (10/12, ~80%) dale CD4<+>T-ćelije.
[0224] Autori su proširili ovu studiju na hemijski indukovani model karcinoma debelog creva CT26 (Griswold, DP and Corbett, T.H., Cancer 36, 2441 (1975)) na BALB/c miševima, u kojima su nedavno identifikovali preko 1680 nesinonimnih mutacija (Castle, JC , et al., BMC Genomics 15, 190 (2014)). Podnosioci prijave su odabrali 96 mutacija na osnovu njihovih predviđenih svojstava vezivanja MHC klase I. Po analogiji sa studijom B16F10, polovina kandidata je ispoljila dobro vezivanje („niska ocena“ 0.1-2.1). Druga polovina je namerno izabrana zbog lošeg vezivanja za MHC I („visoka ocena“ >3.9). Ukupno, oko 20% mutiranih epitopa bilo je imunogeno kod miševa imunizovanih odgovarajućim monotopima RNK (sl.1d kružni grafikon, tabela 2). Važno je napomenuti da je u podgrupi sa „niskim“ rezultatom MHC I identifikovano nekoliko epitopa koji indukuju CD8<+>T-ćelije, što nije bio slučaj u podgrupi sa „visokim“ rezultatima (sl. 1d desno). Ovo očigledno nije dovelo do odstupanja usmerenog protiv epitopa ograničenih MHC klasom II, jer su oni bili zastupljeni u sličnoj učestalosti u obe podgrupe koje čine većinu imunogenih mutacija CT26 (16/21, 80%).
Tabela 2: Imunogene mutacije CT26. Mutacije CT26 za koje je utvrđeno da su imunogene nakon imunizacije sa RNK (kao što je opisano na slici 1). (WT, divlji tip; AA#, broj mutiranih aminokiselina; Mut, mutacija)
[0225] Slično tome, prilikom analize svih imunoloških odgovora na monotope RNK koji predstavljaju svih 38 mutacija koje smo identifikovali u modelu karcinoma dojke 4T1, skoro 70% prepoznatih epitopa prepoznale su CD4<+>T-ćelije (podaci nisu prikazani; tabela 3).
Tabela 3: Imunogene mutacije 4T1. Mutacije 4T1 za koje je utvrđeno da su imunogene nakon imunizacije sa RNK (kao što je opisano na slici 1). (WT, divlji tip; AA#, broj mutiranih aminokiselina; Mut, mutacija)
[0226] Tako su podnosioci prijave otkrili u tri nezavisna mišja modela tumora na različitim osnovama MHC da je značajan deo nesinonimnih kancerskih mutacija imunogen i da neočekivano imunogeni mutanom prevashodno prepoznaju CD4<+>T-ćelije.
B. Kancerske mutacije ograničene MHC klasom II kao ciljno mesto delovanja vakcina
[0227] Kako bi istražili da li su kancerske mutacije ograničene MHC klasom II dobra ciljna mesta za delovanje vakcine in vivo, podnosioci prijave su nastavili da koriste sintetičku RNK kao format vakcine. Sintetička RNK koja kodira antigen pojavljuje se kao obećavajuća tehnologija za proizvodnju vakcina zbog svojih prednosti, uključujući sposobnost da isporuči više od jednog epitopa, selektivno preuzimanje u antigen-prezentujuće ćelije (APC) i njenu suštinsku mogućnost pojačavanja adjuvansima (Diken, M., et al., Gene Ther 18, 702 (2011); Kreiter, S., et al., Curr Opin Immunol 23, 399 (2011); Pascolo, S., Handb Exp Pharmacol , 221 (2008); Sahin, U., et al., Nat Rev Drug Discov 13, 759 (2014); Van, L. S., et al., Hum Vaccin Immunother 9 (2013)). Podnosioci prijave su razvili farmakološki optimizovanu RNK (stabilizujući elementi u sekvenci RNK i lipozomska formulacija), koja je u međuvremenu dostigla stadijum kliničkih ispitivanja (NCT01684241) (Holtkamp, S., et al., Blood 108, 4009 (2006); Kreiter, S., et al., J Immunol 180, 309 (2008); Kuhn, A. N., et al. Gene Ther 17, 961 (2010)). Podnosioci prijave su konstruisali RNK koja kodira B16-M30, jedan od epitopa identifikovanih u modelu tumora B16F10. B16-M30 je izazvao snažne odgovore CD4<+>T-ćelija, koje nisu prepoznale peptid divljeg tipa (sl. 2a levo) budući da se pokazalo da je mutirana aminokiselina od suštinskog značaja prepoznavanje T-ćelijama (sl. 2a desno). Kada su miševi C57BL/6 koji nose tumor B16F10 ponovljeno vakcinisani RNK monotopom B16-Mt30, rast tumora je značajno usporen (sl. 2b). Polovina miševa tretiranih sa B16-M30 RNK bila je još uvek živa 120 dana posle vakcinacije protiv tumora, dok su svi miševi tretirani kontrolnom RNK uginuli u okviru 65 dana.
[0228] Slično tome, ponovljena vakcinacija u modelu metastaza na plućima ćelijama B16F10 transdukovanim luciferazom otkrila je efikasnu eradikaciju metastaza pomoću B16-M30 RNK, ali ne i pomoću kontrolne sintetičke RNK kod velike većine miševa što je pokazano bioluminescentnim snimanjem (BLI) (sl. 2c). Dosledno tome, leukociti koji infiltriraju tumor prečišćeni iz B16F10 tumora miševa imunizovanih sa B16-M30 RNK pokazali su snažnu reaktivnost protiv B16-M30 (sl.2d).
[0229] Zajedno uzevši, ovi podaci uspostavljaju B16-M30 kao novi glavni antigen odbacivanja u tumorima B16F10. Oni takođe predstavljaju primer da imunizacija sa RNK koja kodira jedan imunogeni mutirani epitop može dovesti do stvaranja funkcionalnih T-ćelija. Izgleda da da su ove ćelije sposobne da ciljno deluju na kancersku leziju što dovodi do stavljanja pod kontrolu, pa čak i izlečenja u modelima tumora miša. Nalazi podnosilaca prijave u skladu su sa nedavnim izveštajima koji podržavaju ključnu ulogu CD4<+>T-ćelijskog imuniteta u kontroli kancera (Schumacher, T., et al., Nature 512, 324 (2014); Tran, E., et al., Science 344, 641 (2014)).
[0230] Budući da je velika većina mutacija jedinstvena za svakog pacijenta, korišćenje mutanoma kao izvora antigena vakcine zahteva aktivno individualizovan pristup (Britten, C. M., et al., Nat Biotechnol 31, 880 (2013)). U tom pogledu, jedan od glavnih izazova je trenutna proizvodnja prilagođene vakcine na zahtev. To se može rešiti pomoću tehnologije RNK vakcine. Proizvodnja RNK zasnovana na in vitro transkripciji obično traje nekoliko dana (slika 3a). Trenutno se materijal koji ispunjava zahteve DPP može pripremiti za puštanje u promet u roku od tri nedelje, a ovaj postupak se stalno optimizuje kako bi mu se skratilo trajanje. S druge strane, iako su podnosioci prijave pokazali eradikaciju tumora na modelima miša sa jednom mutacijom, idealno bi bilo kombinovati nekoliko mutacija u poli-neo-epitopskoj vakcini. To bi nam omogućilo da se pronađe rešenje za nekoliko faktora koji umanjuju klinički uspeh vakcina kod ljudi, poput heterogenosti tumora i imunoeditovanja (Gerlinger, M., et al., N Engl J Med 366, 883 (2012); Koebel, C. M., et al., Nature 450, 903 (2007)).
[0231] U svetlu ovih razmatranja, podnosioci prijave su istražili kako da iskoriste svoje uvide o imunogenim epitopima za razvoj koncepta vakcine protiv kancera koji se naziva "imunoterapijom konstruisanim monotopima RNK" (MERIT) (slika 3a). Kako bi testirali ovaj koncept, podnosioci prijave su odabrali četiri mutacije ograničene MHC klasom II (CT26-M03, CT26-M20, CT26-M27, CT26-M68) i jednu ograničenu MHC klasom I (CT26-M19) koje su potiču iz CT26 modela (vidi tabelu 2) i konstruisali monotope RNK koji kodiraju svaku od njih. Pored toga, konstruisan je sintetički pentatop RNK koji kodira svih pet mutiranih epitopa povezanih 10-mernim neimunogenim linkerima glicin/serin kako bi se izbeglo stvaranje spojnih epitopa (sl. 3a). Imunizacijom naivnih BALB/c miševa podnosioci prijave su otkrili da je količina T-ćelija koje proizvode IFN izazvana pentatopom uporediva sa onom koju izaziva odgovarajući monotop za tri od ovih mutacija (sl. 3b). Međutim, za dve od ovih mutacija pentatopska RNK je bila značajno superiornija u snažnoj ekspanziji T-ćelija specifičnih za mutacije.
[0232] Podnosioci prijave su procenili antitumorsku efikasnost imunskih odgovora izazvanih RNK pentatopskim vakcinama u modelu plućnih metastaza tumora CT26 transfektanata luciferaze (CT26-Luc). BALB/c miševi koji nose tumor bili su vakcinisani više puta mešavinom dva RNK pentatopa (3 epitopa ograničena MHC klasom I i 7 epitopa ograničenih klasom II), uključujući mutacije ispitivane u prethodnom eksperimentu. Rast tumora kod vakcinisanih miševa bio je značajno inhibiran mereno pomoću BLI pluća (sl. 3c levo). Svi miševi u grupi RNK pentatopa bili su živi 32. dana, dok je 80% kontrolnih miševa već uginulo (sl.3c u sredini).
Makroskopska (sl. 3c desno), histološka (sl. 3d desno) i kompjuterizovana analiza slike (podaci nisu prikazani) preseka tkiva nakon uginuća otkrile su značajno manje tumorsko opterećenje kod vakcinisanih miševa u poređenju sa netretiranim kontrolama. Tumorske lezije miševa vakcinisanih pentatopskom RNK intenzivno su infiltrirane CD3<+>T-ćelijama, dok je broj CD3<+>T-ćelija bio značajno manji u okolnom plućnom tkivu. Tumori netretiranih kontrola pokazali su bojenje ćelija CD3<+>koje se nije mnogo razlikovalo po količini od onog u okolnom plućnom tkivu, i to uglavnom u graničnim delovima tumora, ali ne unutar tumora. (sl.3d).
[0233] Zajedno uzevši, ovi nalazi ukazuju na to da MERIT pristup koji koristi RNK vakcinu koja kodira poli-neo-epitop pobuđuju T-ćelije protiv svakog pojedinačnog epitopa. Ove T-ćelije ciljno deluju na tumorske lezije, prepoznaju njihove mutirane mete i rezultiraju efikasnom kontrolom tumora in vivo.
C. Selekcija mutacija koje izazivaju antitumorski imunitet
[0234] Jedno od ključnih pitanja je kako odabrati mutacije sa najvećom verovatnoćom izazivanja efikasnog antitumorskog imuniteta. Podnosioci prijave (sl. 1d desno) i drugi istraživači (Matsushita, H., et al., Nature 482, 400 (2012); Robbins, P. F., et al., Nat Med 19, 747 (2013); van, R. N., et al., J Clin Oncol 31, e439-e442 (2013)) su pokazali da skorovi vezivanja MHC klase I omogućavaju obogaćivanje kandidata za mutirane epitope koji izazivaju CD8<+>odgovore i odbacivanje tumora (Duan, F., et al., J Exp Med 211, 2231 (2014)). Gore opisani nalazi podnosilaca prijave ukazuju da mutirani epitopi prezentovani MHC klasom II čak mogu da budu od veće važnosti za pristup MERIT. U stvari, korelaciona analiza je otkrila da imunogene mutacije imaju značajno bolji skor vezivanja za MHC klasu II u poređenju sa neimunogenim (sl.
4a). Kod većine kancera ekspresija MHC klase II izostaje. Efikasno prepoznavanje neo-epitopa od strane CD4<+>T-ćelija u tumorima negativnim na MHC klase II trebalo bi da zavisi od oslobađanja tumorskih antigena koje treba da preuzmu i prezentuju antigen-prezentujuće ćelije (APC). Ovo bi trebalo da bude najefikasnije za antigene sa izrazito bogatom ekspresijom. Da bi testirali ovu hipotezu, podnosioci prijave su primenili algoritam koji kombinuje dobro vezivanje za MHC klase II sa obilnom ekspresijom iRNK koja kodira mutirani epitop. Za ovo poslednje, koristili su potvrđena očitavanja sekvenciranih mutiranih RNK normalizovana na ukupan broj očitavanja (NVRC: normalizovani broj očitavanja varijanti). Ovim algoritmom podnosioci prijave su rangirali podatke o mutanomima CT26 i odabrali prvih deset mutacija ('ME' mutacije u tabeli 4) za koje se predviđa da će dobro vezivati MHC klase II među najzastupljenijim epitopima kandidatima (NVRC ≥60). Za kontrolu je izabrano deset mutacija zasnovanih samo na obilnoj ekspresiji ('E' mutacije u tabeli 4). Ono što je najvažnije, ovi epitopi su korišćeni bez ikakve dodatne prethodne validacije ili ispitivanja imunogenosti za konstruisanje dva RNK pentatopa za svaku grupu (PMEi PEpentatopi). Kada su miševi sa uspostavljenim tumorima pluća CT26-Luc vakcinisani ovim epitopima, PMEsu u poređenju sa PEpentatopima izazvali mnogo jači odgovor T-ćelija (sl. 4c). Uspostavljene metastaze u plućima bile su potpuno odbačene kod skoro svih miševa, dok PEpentatopi nisu bili u stanju da obezbede kontrolu rasta tumora (sl.4b).
Tabela 4: In silico predikcija mutacija CT26 sa obimnom ekspresijom i poželjnim svojstvima vezivanja MHC klase II. Mutacije CT26 izabrane prema visokoj ekspresiji sa (ME) ili bez (E) razmatranja percentilnog ranga MHC II (IEDB konsenzus verzija 2.5). (WT, divlji tip; AA#, broj mutiranih aminokiselina; Mut, mutacija)
[0235] Antigen-specifične THćelije podstiču imunogenu unakrsnu prezentaciju za aktivaciju tumor-specifičnih CTL odgovora putem licenciranja dendritskih ćelija posredovanog CD40 ligandom. Ovo može dovesti do širenja antigena ako THćelije prepoznaju svoj antigen na istoj APC koja unakrsno prezentuje nesrodni CTL epitop (Bennett, S. R., et al., Nature 393, 478 (1998); Schoenberger, S. P., et al., Nature 393, 480 (1998)). U skladu sa tim, u krvi i slezini miševa imunizovanih pomoću PME, ali ne i PEpentatopa, podnosioci prijave su otkrili snažne odgovore CD8<+>T-ćelija protiv gp70-AH1, dobro okarakterisanog imunodominantnog CTL epitopa poreklom iz endogenog antigena ćelijske površine povezanog sa mišjim virusom leukemije (sl. 4d). Ovo ukazuje na to da THćelije specifične za tumorski neo-epitop, analogno T-ćelijama specifičnim za virusni neo-antigen (Croxford, J. L., et al., Autoimmun Rev 1, 251 (2002)), mogu da ispoljavaju svoju antitumorsku funkciju širenjem antigena i pojačanjem CTL odgovora.
D. Rezime
[0236] Ukratko, podaci koje su prikazali podnosioci prijave ukazuju na to da su T-ćelijski epitopi ograničeni MHC klasom II prisutni u značajnoj meri u mutanomu karcinoma i da mogu da se koriste za pravljenje poli-neo-epitopskih vakcina zasnovanih na RNK sa značajnim terapijskim dejstvom u modelima tumora miša.
[0237] Mehanizam odgovoran za visoku stopu prepoznavanja mutacija od strane CD4<+>T-ćelija još nije jasan. Jednostavno objašnjenje može biti duža i promenljiva veličina peptida prezentovanih na molekulima MHC klase II u poređenju sa epitopima MHC klase I čime se povećava verovatnoća da je mutacija obuhvaćena odgovarajućim peptidom. Epitopi T-ćelija prezentovani molekulima MHC klase I tipično su peptidi dužine između 8 i 11 aminokiselina sa dobro definisanim N- i C-krajevima. Molekuli MHC klase II prezentuju duže peptide dužine 13-17 aminokiselina sa jezgrom regiona vezivanja za MHC II od 9 aminokiselina i promenljivim brojem dodatnih oivičavajućih aminokiselina od kojih oba doprinose prepoznavanju od strane CD4<+>T-ćelija (Arnold, P. Y., et al., J Immunol 169, 739 (2002)).
[0238] Dok su prvi dokazi o spontanim odgovorima CD8<+>i CD4<+>T-ćelija usmerenim protiv mutiranih genskih proizvoda kod pacijenata sa kancerom nastali 1990-ih (Dubey, P., et al., J Exp Med 185, 695 (1997); Lennerz, V., et al., Proc Natl Acad Sci USA 102, 16013 (2005); Wolfel, T., et al., Science 269, 1281 (1995)), tek su nedavne publikacije visokog nivoa obezbedile široko prihvatanje ogromnog potencijala T-ćelija specifičnih za mutacije da pruže antitumorsku aktivnost kod pacijenata obolelih od kancera (Lu, Y. C., et al., J Immunol 190, 6034 (2013); Schumacher, T., et al., Nature 512, 324 (2014); Tran, E., et al., Science 344, 641 (2014)). Da bi procenili da li principi otkriveni u mišjim modelima melanoma, kancera debelog creva i dojke mogu da se primene i kod ljudi, podnosioci prijave su analizirali podatke o mutacijama i RNA-Seq u iste tri vrste kancera kod ljudi iz Atlasa genoma kancera (TCGA). Kod sve tri vrste kancera kod ljudi podnosioci prijave su potvrdili obilje mutacija za koje se predviđa da će se vezati za MHC klasu II, koje su otkrivene na modelima miša (sl.4.e).
Pristup MERIT koji su podnosioci prijave ovde predstavili integriše napredak u oblasti sekvenciranja sledeće generacije, računarske imunologije i sintetičke genomike i na taj način pruža integrisanu tehnologiju za sveobuhvatnu eksploataciju neo-epitopskog ciljnog repertoara. Ciljno delovanje na više mutacija odjednom može bar u teoriji da otvori put za rešavanje kritičnih problema u trenutnom razvoju lekova za kancer, poput klonske heterogenosti i bekstva antigena (Kroemer, G. and Zitvogel, L., Oncoimmunology 1, 579 (2012); Mittal, D., et al., Curr Opin Immunol 27, 16 (2014)).
[0239] U međuvremenu, na osnovu ove studije i prethodnog rada podnosilaca prijave, pokrenuto je prevođenje u kliničku praksu, i prvo ispitivanje koncepta kod pacijenata sa melanomom (Castle, J. C., et al., Cancer Res 72, 1081 (2012); Castle, J. C., et al., Sci Rep 4, 4743 (2014); Lower, M., et al., PLoS Comput Biol 8, el002714 (2012)) aktivno regrutuje ispitanike (NCT02035956) i potvrđuje da je proizvodnja "tačno na vreme" poli-neo-epitopske vakcine protiv kancera na bazi iRNK u stvari izvodljiva.
Primer 3: Selekcija mutacija koje izazivaju antitumorski imunitet
[0240] Za izbor/rangiranje modifikacija aminokiselinske sekvence može se postupiti na sledeći način:
1. Unutar date liste nesinonimnih tačkastih mutacija, izračunati peptidnu sekvencu koja ima mutiranu aminokiselinu u sredini i oivičena je sa do 13 aminokiselina na N i C-terminalnom kraju, respektivno; ovo će se u nastavku teksta zvati 27-mer (dužina obe bočne sekvence može da bude manja od 13 aminokiselina kada je mutacija blizu N ili C-kraja celog proteina)
2. Izračunati konsenzusne skorove predikcije vezanja MHC klase II (npr. pomoću alata za predikciju T-ćelija IEDB [Wang P, et al. (2010) BMC Bioinformatics. 11: 568. PMID: 21092157. http://tools.immuneepitope.org /mhcii/]) za svaku preklapajuću podsekvencu od 15 nt svakog 27-mera; najbolji (= najniži) skor dodeljuje se celom 27-meru
3. Izračunati ekspresiju (poželjno u RPKM jedinicama [Ali Mortazavi, et al. (2008) Nature Methods 5, 621 - 628]) gena sa kojim su povezani 27-meri
4. Izračunati frekvenciju alelne varijantne (VAF) svake mutacije u RNK:
o ulazni podaci su kratka očitavanja poravnanja RNA-Seq eksperimenta urađena sa istim uzorkom tumora koji se koristi za detekciju mutacije
o potražiti poravnanja i očitavanja koja se preklapaju sa mestom mutacije
o označiti nukleotide koji su mapirani na mestu mutacije koristeći očitavanja sakupljena u prethodnom koraku
o izračunati zbir nukleotida mutantnog alela podeljen zbirom svih nukleotida mapiranih na genomskom mestu mutacije (slika 5)
5. Pomnožiti odgovarajuću ekspresiju gena sa VAF da bi se dobila ekspresija mutacije (poželjno u RPKM jedinicama)
6. Rangirati sve 27-mere prema skoru vezivanja za MHC (kako je izračunato u koraku 2, najniži skor je najbolji) i ukloniti 27-mere sa pridruženom ekspresijom mutacije manjom od datog praga
Primena na skup podataka koji se odnosi na miševe:
[0241] Za testiranje algoritma, 185 mutacija odabranih iz modela tumora miša 4T1, CT26 i B16F10 ispitano je na njihovu antigenost. Zatim su podnosioci prijave prvo pokušali da ispitaju uticaj nivoa ekspresije gena i mutacije na prediktivne performanse algoritma (slika 6). Ovde može da se primeti da je maksimalna površina ispod krive operativnih karakteristika prijemnika (ROC AUC [Fawcett T., Pattern Recogn Lett. 2006;27:861-874. doi: 10.1016/j.patrec.2005.10.010]) veća kada se odabere ekspresija mutacije umesto ekspresije gena (slika 6, levi grafikon (ekspresija gena) naspram desnog grafikona (ekspresija mutacije)).
Slika 7 prikazuje ROC krive za optimalne pragove, što ukazuje na izražen uticaj ekspresije mutacija na vezujuće agense sa osrednjim relativnim afinitetom vezivanja (slika 7, desni panel, vrednosti između lažno pozitivne stope od oko 0.3 i 0.6).
<170> PatentIn verzija 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 1
Phe Val Val Lys Ala Tyr Leu Pro Val Asn Glu Ser Phe Ala Phe Thr 1 5 10 15
Ala Asp Leu Arg Ser Asn Thr Gly Gly Gln Ala
20 25
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 2
Ala Asn Phe Glu Ser Gly Lys His Lys Tyr Arg Gln Thr Ala Met Phe 1 5 10 15
Thr Ala Thr Met Pro Pro Ala Val Glu Arg Leu
20 25
<210> 3
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 3
Thr Pro Pro Pro Glu Glu Ala Met Pro Phe Glu Phe Asn Gly Pro Ala 1 5 10 15
Gln Gly Asp His Ser Gln Pro Pro Leu Gln Val
20 25
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 4
Val Val Asp Arg Asn Pro Gln Phe Leu Asp Pro Val Leu Ala Tyr Leu 1 5 10 15
Met Lys Gly Leu Cys Glu Lys Pro Leu Ala Ser
20 25
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 5
Phe Arg Arg Lys Ala Phe Leu His Trp Tyr Thr Gly Glu Ala Met Asp 1 5 10 15
Glu Met Glu Phe Thr Glu Ala Glu Ser Asn Met
20 25
<210> 6
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 6
Ser Ser Pro Asp Glu Val Ala Leu Val Glu Gly Val Gln Ser Leu Gly 1 5 10 15
Phe Thr Tyr Leu Arg Leu Lys Asp Asn Tyr Met
20 25
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 7
Pro Lys Pro Asp Phe Ser Gln Leu Gln Arg Asn Ile Leu Pro Ser Asn 1 5 10 15
Pro Arg Val Thr Arg Phe His Ile Asn Trp Asp
20 25
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 8
Thr Ala Val Ile Thr Pro Pro Thr Thr Thr Thr Lys Lys Ala Arg Val 1 5 10 15
Ser Thr Pro Lys Pro Ala Thr Pro Ser Thr Asp
20 25
<210> 9
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 9
Ser Thr Ala Asn Tyr Asn Thr Ser His Leu Asn Asn Asp Val Trp Gln 1 5 10 15
Ile Phe Glu Asn Pro Val Asp Trp Lys Glu Lys
20 25
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 10
Arg Glu Gly Val Glu Leu Cys Pro Gly Asn Lys Tyr Glu Met Arg Arg 1 5 10 15
His Gly Thr Thr His Ser Leu Val Ile His Asp
20 25
<210> 11
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 11
Asn Ile Glu Gly Ile Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys Lys Pro Phe Leu 1 5 10 15
Val Asn Asn Lys Ile Asn Lys Ile Glu Asn Ile
20 25
<210> 12
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 12
Ile Pro Ser Gly Thr Thr Ile Leu Asn Cys Phe His Asp Val Leu Ser 1 5 10 15
Gly Lys Leu Ser Gly Gly Ser Pro Gly Val Pro
20 25
<210> 13
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 13
Pro Ser Lys Pro Ser Phe Gln Glu Phe Val Asp Trp Glu Asn Val Ser 1 5 10 15
Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro Phe Leu
20 25
<210> 14
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 14
Asp Ser Gly Ser Pro Phe Pro Ala Ala Val Ile Leu Arg Asp Ala Leu 1 5 10 15
His Met Ala Arg Gly Leu Lys Tyr Leu His Gln
20 25
<210> 15
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 15
Cys Gly Thr Ala Phe Phe Ile Asn Phe Ile Ala Ile Tyr His His Ala 1 5 10 15
Ser Arg Ala Ile Pro Phe Gly Thr Met Val Ala
20 25
<210> 16
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 16
Glu Phe Lys His Ile Lys Ala Phe Asp Arg Thr Phe Ala Asn Asn Pro 1 5 10 15
Gly Pro Met Val Val Phe Ala Thr Pro Gly Met
20 25
<210> 17
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 17
Glu Cys Arg Ile Thr Ser Asn Phe Val Ile Pro Ser Glu Tyr Trp Val 1 5 10 15
Glu Glu Lys Glu Glu Lys Gln Lys Leu Ile Gln
20 25
<210> 18
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 18
Asn His Ser Gly Leu Val Thr Phe Gln Ala Phe Ile Asp Val Met Ser 1 5 10 15
Arg Glu Thr Thr Asp Thr Asp Thr Ala Asp Gln
20 25
<210> 19
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 19
Gly Arg Gly His Leu Leu Gly Arg Leu Ala Ala Ile Val Gly Lys Gln 1 5 10 15
Val Leu Leu Gly Arg Lys Val Val Val Val Arg
20 25
<210> 20
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 20
Ser His Cys His Trp Asn Asp Leu Ala Val Ile Pro Ala Gly Val Val 1 5 10 15
His Asn Trp Asp Phe Glu Pro Arg Lys Val Ser
20 25
<210> 21
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 21
Gly Phe Ser Gln Pro Leu Arg Arg Leu Val Leu His Val Val Ser Ala 1 5 10 15
Ala Gln Ala Glu Arg Leu Ala Arg Ala Glu Glu
20 25
<210> 22
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<223> Epitop
<400> 22
Asp Lys Pro Leu Arg Arg Asn Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Met Ala 1 5 10 15
Ile Cys Gly Met Pro Leu Asp Ser Phe Arg Ala
20 25
<210> 23
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 23
Tyr Arg Gly Ala Asn Leu His Leu Glu Glu Thr Leu Ala Gly Phe Trp 1 5 10 15
Ala Arg Leu Leu Glu Arg Leu Phe Lys Gln Leu
20 25
<210> 24
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 24
Ala Gly Thr Gln Cys Glu Tyr Trp Ala Ser Arg Ala Leu Asp Ser Glu 1 5 10 15
His Ser Ile Gly Ser Met Ile Gln Leu Pro Gln
20 25
<210> 25
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<223> Epitop
<400> 25
Gln Ala Ile Val Arg Gly Cys Ser Met Pro Gly Pro Trp Arg Ser Gly 1 5 10 15
Arg Leu Leu Val Ser Arg Arg Trp Ser Val Glu
20 25
<210> 26
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 26
Pro Leu Leu Pro Phe Tyr Pro Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ile Gly Leu 1 5 10 15
Glu Leu Asn Ser Ser Ala Leu Pro Pro Thr Glu
20 25
<210> 27
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 27
Met Lys Ala Phe Ile Phe Lys Tyr Ser Ala Lys Thr Gly Phe Thr Lys 1 5 10 15
Leu Ile Asp Ala Ser Arg Val Ser Glu Thr Glu
20 25
<210> 28
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 28
Val Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu 1 5 10 15
Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Pro
20 25
<210> 29
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 29
Glu His Ile His Arg Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala Asp Ala Ile Gln 1 5 10 15
Val Gly Phe Gly Arg Ile Gly Lys His Phe Trp
20 25
<210> 30
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 30
His Thr Pro Ser Ser Tyr Ile Glu Thr Leu Pro Lys Ala Ile Lys Arg 1 5 10 15
Arg Ile Asn Ala Leu Lys Gln Leu Gln Val Arg
20 25
<210> 31
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
Glu Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr Met Arg Asp Val Ile Ala Ile 1 5 10 15
Glu Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala Pro His
20 25
<210> 32
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 32
Gly Tyr Ile Ser Arg Val Thr Ala Gly Lys Asp Ser Tyr Ile Ala Leu 1 5 10 15
Val Asp Lys Asn Ile Met Gly Tyr Ile Ala Ser
20 25
<210> 33
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 33
Ser His Asp Ser Arg Lys Ser Thr Ser Phe Met Ser Val Asn Pro Ser 1 5 10 15
Lys Glu Ile Lys Ile Val Ser Ala Val Arg Arg
20 25
<210> 34
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
Ala Ala Tyr Lys Gly His His Tyr Pro Gly Pro Gly Asn Tyr Phe Trp 1 5 10 15
Lys Cys Leu Phe Met Ser Gly Leu Ser Glu Val
20 25
<210> 35
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 35
Glu Gly Asp Pro Cys Leu Arg Ser Ser Asp Cys Ile Asp Glu Phe Cys 1 5 10 15
Cys Ala Arg His Phe Trp Thr Lys Ile Cys Lys
20 25
<210> 36
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 36
Cys Gly Tyr Pro Leu Cys Gln Lys Lys Leu Gly Val Ile Ser Lys Gln 1 5 10 15
Lys Tyr Arg Ile Ser Thr Lys Thr Asn Lys Val
20 25
<210> 37
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 37
Val Thr Ser Ile Pro Ser Val Ser Asn Ala Leu Asn Trp Lys Glu Phe 1 5 10 15
Ser Phe Ile Gln Ser Thr Leu Gly Tyr Val Ala
20 25
<210> 38
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 38
Lys Thr Thr Leu Ser His Thr Gln Asp Ser Ser Gln Ser Leu Gln Ser 1 5 10 15
Ser Ser Asp Ser Ser Lys Ser Ser Arg Cys Ser
20 25
<210> 39
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 39
Pro Ala Pro Arg Ala Val Leu Thr Gly His Asp His Glu Ile Val Cys 1 5 10 15
Val Ser Val Cys Ala Glu Leu Gly Leu Val Ile
20 25
<210> 40
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 40
Leu His Ser Gly Gln Asn His Leu Lys Glu Met Ala Ile Ser Val Leu 1 5 10 15
Glu Ala Arg Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gln Ser
20 25
<210> 41
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 41
Asn Cys Lys Tyr Asp Thr Lys Cys Thr Lys Ala Asp Cys Leu Phe Thr 1 5 10 15
His Met Ser Arg Arg Ala Ser Ile Leu Thr Pro
20 25
<210> 42
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 42
Leu Arg Ser Ser Leu Val Asn Asn Arg Thr Gln Ala Lys Ile Ala Glu 1 5 10 15
Glu Leu Gly Met Gln Glu Tyr Ala Ile Thr Asn
20 25
<210> 43
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 43
Ile Pro His Asn Pro Arg Val Ala Val Lys Thr Thr Asn Asn Leu Val Met Lys Asn Ser Val Cys Leu Glu Arg Asp Ser
20 25
<210> 44
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 44
Leu Ala Ala Gln Ser Leu Gly Glu Pro Ala Thr Gln Ile Thr Leu Asn 1 5 10 15
Thr Phe His Tyr Ala Gly Val Ser Ala Lys Asn
20 25
<210> 45
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 45
Gln Gly Val Thr Val Leu Ala Val Ser Ala Val Tyr Asp Ile Phe Val 1 5 10 15
Phe His Arg Leu Lys Met Lys Gln Ile Leu Pro
20 25
<210> 46
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 46
Ala His Ile Arg Gly Ala Lys His Gln Lys Val Val Thr Leu His Thr 1 5 10 15 Lys Leu Gly Lys Pro Ile Pro Ser Thr Glu Pro
20 25
<210> 47
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 47
Glu Leu Ala Trp Glu Ile Asp Arg Lys Val Leu His Gln Asn Arg Leu 1 5 10 15
Gln Arg Thr Pro Ile Lys Leu Gln Cys Phe Ala
20 25
<210> 48
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 48
Phe Leu Lys Asp Arg Leu Leu Glu Asp Lys Lys Ile Ala Val Leu Leu 1 5 10 15
Asp Glu Val Ala Glu Asp Met Gly Lys Cys His
20 25
<210> 49
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 49
Asn Asp Glu Pro Asp Leu Asp Pro Val Gln Glu Leu Ile Tyr Asp Leu 1 5 10 15 Arg Ser Gln Cys Asp Ala Ile Arg Val Thr Lys
20 25
<210> 50
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 50
Asp Ala Ala Ala Leu Gln Met Ile Ile Ala Tyr Ala Tyr Arg Gly Asn 1 5 10 15
Leu Ala Val Asn Asp Ser Thr Val Glu Gln Leu
20 25
<210> 51
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 51
Lys Asp Tyr Thr Ala Ala Gly Phe Ser Ser Phe Gln Lys Leu Arg Leu 1 5 10 15
Asp Leu Thr Ser Met Gln Ile Ile Thr Thr Asp
20 25
<210> 52
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 52
Ala Val Lys Glu Glu Asp Ser Leu His Trp Gln Arg Pro Glu Asp Val 1 5 10 15 Gln Lys Val Lys Ala Leu Ser Phe Tyr Gln Pro
20 25
<210> 53
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 53
Phe Ala Ile Cys Phe Ser Cys Leu Leu Ala His Ala Leu Asn Leu Ile 1 5 10 15
Lys Leu Val Arg Gly Arg Lys Pro Leu Ser Trp
20 25
<210> 54
<211> 23
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 54
Met Gly Ala Ala Ile Ser Gln Gly Ala Ile Ile Ala Ile Val Cys Asn 1 5 10 15
Gly Leu Val Gly Phe Leu Leu
20
<210> 55
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 55
Glu Lys Tyr Pro Arg Thr Pro Lys Cys Ala Arg Cys Gly Asn His Gly 1 5 10 15
Val Val Ser Ala Leu Lys Gly His Lys Arg Tyr
<210> 56
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 56
Ser His Arg Ser Cys Ser His Gln Thr Ser Ala Pro Ser Pro Lys Ala 1 5 10 15
Leu Ala His Asn Gly Thr Pro Arg Asn Ala Ile
20 25
<210> 57
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 57
Lys Glu Leu Leu Gln Phe Lys Lys Leu Lys Lys Gln Asn Leu Gln Gln 1 5 10 15
Met Gln Ala Glu Ser Gly Phe Val Gln His Val
20 25
<210> 58
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 58
Arg Lys Gly Glu Arg Glu Glu Met Gln Asp Ala His Val Ser Leu Asn 1 5 10 15
Asp Ile Thr Gln Glu Cys Asn Pro Pro Ser Ser
20 25
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 59
Arg Val Glu Lys Leu Gln Leu Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ser Arg Thr 1 5 10 15
Glu Cys Ile Thr Ala Thr Ser Gln Met Thr Ala
20 25
<210> 60
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 60
Asp Ser Val Val Ile Phe Ser Gly Glu Gly Ser Asp Glu Phe Thr Gln 1 5 10 15
Gly Tyr Ile Tyr Phe His Lys Ala Pro Ser Pro
20 25
<210> 61
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 61
Pro Gln Thr Ser Pro Thr Gly Ile Leu Pro Thr Thr Ser Asn Ser Ile 1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Met Thr Trp Lys Ser Ser Leu
20 25
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 62
Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe His Gln Met 1 5 10 15
Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Gly
20 25
<210> 63
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 63
Ser Ala Leu Gly Ser Leu Ala Leu Met Ile Trp Leu Met Thr Thr Pro 1 5 10 15
His Ser His Glu Thr Glu Gln Lys Arg Leu Gly
20 25
<210> 64
<211> 26
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 64
Asp Leu Arg Thr Ala Ala Tyr Val Asn Ala Ile Glu Lys Ile Phe Lys 1 5 10 15
Val Tyr Asn Glu Ala Gly Val Thr Phe Thr
20 25
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 65
Lys Leu Cys Leu Glu Leu Leu Asn Val Gly Val Glu Ser Asn Leu Ile 1 5 10 15
Leu Lys Gly Val Ile Leu Leu Ile Val Asp Lys
20 25
<210> 66
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 66
Asn Val His Tyr Glu Asn Tyr Arg Ser Arg Lys Leu Ala Thr Val Thr 1 5 10 15
Tyr Asn Gly Val Asp Asn Asn Lys Asn Lys Gly
20 25
<210> 67
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 67
Tyr Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met Glu Asn Gln Pro 1 5 10 15
Leu Ile Gly Ile Gln Ser Thr Ala Ile Pro Ala
20 25
<210> 68
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 68
Lys Pro Ser Thr Leu Arg Glu Leu Glu Arg Tyr Val Leu Ala Cys Leu 1 5 10 15
Arg Lys Lys Pro Arg Lys Pro Tyr Thr Ile Arg
20 25
<210> 69
<211> 20
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 69
Lys Phe Met Glu Arg Asp Pro Asp Glu Leu Arg Phe Asn Thr Ile Ala 1 5 10 15
Leu Ser Ala Ala
20
<210> 70
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 70
Leu His Ser Gly Gln Asn His Leu Lys Glu Met Ala Ile Ser Val Leu 1 5 10 15
Glu Ala Arg Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gln Ser
20 25
<210> 71
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 71
Asp Thr Leu Ser Ala Met Ser Asn Pro Arg Ala Met Gln Val Leu Leu 1 5 10 15
Gln Ile Gln Gln Gly Leu Gln Thr Leu Ala Thr
20 25
<210> 72
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 72
Asp Gly Gln Leu Glu Leu Leu Ala Gln Gly Ala Leu Asp Asn Ala Leu 1 5 10 15
Ser Ser Met Gly Ala Leu His Ala Leu Arg Pro
20 25
<210> 73
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 73
Trp Lys Gly Gly Pro Val Lys Ile Asp Pro Leu Ala Leu Met Gln Ala 1 5 10 15
Ile Glu Arg Tyr Leu Val Val Arg Gly Tyr Gly
20 25
<210> 74
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 74
Gln Asp Ile Asn Asp Asn Asn Pro Ser Phe Pro Thr Gly Lys Met Lys 1 5 10 15
Leu Glu Ile Ser Glu Ala Leu Ala Pro Gly Thr
20 25
<210> 75
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 75
Ser Asp Pro Arg Ala Ala Tyr Phe Arg Gln Ala Glu Asn Asp Met Tyr 1 5 10 15
Ile Arg Met Ala Leu Leu Ala Thr Val Leu Gly
20 25
<210> 76
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 76
Met Asp Leu Leu Ala Phe Glu Arg Lys Leu Asp Gln Thr Val Met Arg 1 5 10 15
Lys Arg Leu Asp Ile Gln Glu Ala Leu Lys Arg
20 25
<210> 77
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<223> Epitop
<400> 77
Ile Thr Thr Cys Leu Ala Val Gly Gly Leu Asp Val Lys Phe Gln Glu 1 5 10 15
Ala Ala Leu Arg Ala Ala Pro Asp Ile Leu Ile
20 25
<210> 78
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 78
Lys Ala Arg Leu Lys Ser Lys Asp Val Lys Leu Ala Glu Ala His Gln 1 5 10 15
Gln Glu Cys Cys Gln Lys Phe Glu Gln Leu Ser
20 25
<210> 79
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 79
Gly Glu Val Pro Pro Gln Lys Leu Gln Ala Leu Gln Arg Ala Leu Gln 1 5 10 15
Ser Glu Phe Cys Asn Ala Val Arg Glu Val Tyr
20 25
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<223> Epitop
<400> 80
Asp Trp Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro 1 5 10 15
<210> 81
<211> 14
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 81
Asp Trp Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln 1 5 10
<210> 82
<211> 13
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 82
Asp Trp Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp
1 5 10
<210> 83
<211> 12
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 83
Asp Trp Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu Asn Ser Thr
1 5 10
<210> 84
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<223> Epitop
<400> 84
Asp Trp Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu Asn Ser
1 5 10
<210> 85
<211> 14
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 85
Trp Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro 1 5 10
<210> 86
<211> 12
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 86
Trp Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp
1 5 10
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 87
Trp Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu Asn Ser Thr
1 5 10
<210> 88
<211> 13
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 88
Glu Asn Val Ser Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro
1 5 10
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 89
Asn Val Ser Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro
1 5 10
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Epitop
<400> 90
Val Ser Pro Glu Leu Asn Ser Thr Asp Gln Pro
1 5 10
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sekvenca linkera
<220>
<221> PONOVAK
<222> (1)..(3)
<223> Deo sekvence ponovljen a puta, gde je a nezavisno broj odabran od 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (1)..(15)
<223> a b c d e su različiti od 0 i poželjno su 2 ili više, 3 ili više, 4 ili više ili 5 ili više
<220>
<221> PONOVAK
<222> (4)..(6)
<223> Deo sekvence ponovljen b puta, gde je b nezavisno broj odabran od 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20
<220>
<221> PONOVAK
<222> (7)..(9)
<223> Deo sekvence ponovljen c puta, gde je c nezavisno broj odabran od 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20
<220>
<221> PONOVAK
<222> (10)..(12)
<223> Deo sekvence ponovljen d puta, gde je d nezavisno broj odabran od 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20
<220>
<221> PONOVAK
<222> (13)..(15)
<223> Deo sekvence ponovljen e puta, gde je e nezavisno broj odabran od 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20
<400> 91
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sekvenca linkera
<400> 92
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 93
<212> DNK
<213> Mus musculus
<400> 93
ttcaggaccc a 11
<210> 94
<211> 16
<212> DNK
<213> Mus musculus
<400> 94
ttcaggaccc acacga 16
<210> 95
<211> 27
<212> DNK
<213> Mus musculus
<400> 95
ttcaggaccc acacgacggg aagacaa 27
<210> 96
<211> 29
<212> DNK
<213> Mus musculus
<400> 96
ttcaggacca acacgacggg aagacaagt 29
<210> 97
<211> 27
<212> DNK
<213> Mus musculus
<400> 97
caggacccac acgacgggta gacaagt 27
<210> 98
<211> 23
<212> DNK
<213> Mus musculus
<400> 98
acccacacga cgggtagaca agt 23
<210> 99
<211> 23
<212> DNK
<213> Mus musculus
<400> 99
acccacacga gccctagaca agt 23
<210> 100
<211> 15
<212> DNK
<213> Mus musculus
<400> 100
gacgggaaga caagt 15
<210> 101
<211> 52
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Idealizovani gen
<400> 101
tgcaagaacg cgtacttatt cgccgccatg attatgacca gtgtttccag tc 52
<210> 102
<211> 48
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Idealizovani gen
<400> 102
caagaacgcg tacttattcg ccaccatgat tatgaccagt gtttccag 48
<210> 103
<211> 46
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Idealizovani gen
<400> 103
aacgcgtact tattcgccac catgattatg accagtgttt ccagtc 46
<210> 104
<211> 46
<212> DNK
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Idealizovani gen
<400> 104
tgcaagaacg cgtacttatt cgccgccatg attatgacca gtgttt 46

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Postupak za predikciju jedne ili više imunogenih modifikacija aminokiselina koje su korisne za vakcinaciju, naznačen time, što se modifikacije javljaju u proteinu koji sadrži neoantigen povezan sa tumorom pacijenta, gde postupak obuhvata korake:
a) utvrđivanja skora vezivanja modifikovanog peptida koji predstavlja fragment modifikovanog proteina za jedan ili više molekula MHC klase II kod navedenog pacijenta,
b) utvrđivanja skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina, pri čemu utvrđivanje skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina obuhvata utvrđivanje nivoa ekspresije proteina sa kojim je modifikacija povezana i određivanje učestalosti modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana, pri čemu se učestalost modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana određuje utvrđivanjem učestalosti alelne varijante, i
c) predikcije jedne ili više imunogenih modifikacija aminokiselina,
gde skor vezivanja navedenog peptida za navedeni molekul MHC klase II odražava verovatnoću vezivanja navedenog peptida za navedeni molekul MHC klase II, gde učestalost alelne varijante predstavlja zbir detektovanih sekvenci, u konkretnim očitavanjima, koja obuhvataju mesto mutacije i nose mutaciju, podeljen zbirom svih detektovanih sekvenci, u konkretnim očitavanjima, koja obuhvataju mesto mutacije, pri čemu se, za utvrđivanje skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina, skor nivoa ekspresije proteina sa kojim je modifikacija povezana množi skorom učestalosti modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana, gde se predikcija imunogenih modifikacija aminokiselina odnosi na predikciju da li će peptid koji sadrži takve modifikacije aminokiselina biti imunogen, i stoga koristan kao epitop u vakcinaciji.
2. Postupak za izbor i/ili rangiranje imunogenih modifikacija aminokiselina koje su korisne za vakcinaciju, naznačen time, što se modifikacije javljaju u proteinu koji sadrži neoantigen povezan sa tumorom pacijenta, gde postupak obuhvata korake:
a) utvrđivanja skora vezivanja modifikovanog peptida koji je fragment modifikovanog proteina za jedan ili više molekula MHC klase II pomenutog pacijenta,
b) utvrđivanja skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina, pri čemu utvrđivanje skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina obuhvata utvrđivanje nivoa ekspresije proteina sa kojim je modifikacija povezana i određivanje učestalosti modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana, pri čemu se učestalost modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana određuje utvrđivanjem učestalosti alelne varijante,
pri čemu postupak obuhvata izvođenje koraka a) i b) na dve ili više različitih modifikacija, i gde postupak dalje obuhvata korak:
c) odabira i/ili rangiranja imunogenih modifikacija aminokiselina korisnih za vakcinaciju,
gde skor vezivanja navedenog peptida za navedeni molekul MHC klase II odražava verovatnoću vezivanja navedenog peptida za navedeni molekul MHC klase II, gde učestalost alelne varijante predstavlja zbir detektovanih sekvenci, u konkretnim očitavanjima, koja obuhvataju mesto mutacije i nose mutaciju, podeljen zbirom svih detektovanih sekvenci, u konkretnim očitavanjima, koja obuhvataju mesto mutacije, pri čemu se, za utvrđivanje skora ekspresije ili zastupljenosti modifikovanog proteina, skor nivoa ekspresije proteina sa kojim je modifikacija povezana množi skorom učestalosti modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 2, koji obuhvata poređenje skorova navedene dve ili više različitih modifikacija, pri čemu se, poželjno, skorovi navedene dve ili više različitih modifikacija upoređuju rangiranjem različitih modifikacija prema njihovim skorovima vezivanja za MHC klase II.
4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, koji obuhvata izvođenje koraka a) na dva ili više različitih modifikovanih peptida, pri čemu navedena dva ili više različitih modifikovanih peptida sadrže istu modifikaciju/modifikacije.
5. Postupak prema patentnom zahtevu 4, naznačen time, što
dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju/modifikacije sadrže različite fragmente modifikovanog proteina, pri čemu navedeni različiti fragmenti sadrže istu modifikaciju/modifikacije prisutne u proteinu, i/ili
dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju/modifikacije sadrže različite potencijalne fragmente vezivanja MHC klase II modifikovanog proteina, gde navedeni fragmenti sadrže istu modifikaciju/modifikacije prisutne u proteinu, i/ili dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju/modifikacije razlikuju se po dužini i/ili položaju modifikacije/modifikacija.
6. Postupak prema patentnim zahtevima 4 ili 5, koji dalje obuhvata odabir modifikovanog/modifikovanih peptida od dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju/modifikacije koji imaju verovatnoću ili imaju najveću verovatnoću za vezivanje za jedan ili više molekula MHC klase II.
7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 6, naznačen time, što se najbolji skor vezivanja za jedan ili više molekula MHC klase II dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju/modifikacije dodeljuje modifikaciji/modifikacijama.
8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačen time, što se navedeno određivanje nivoa ekspresije proteina sa kojim je modifikacija povezana i/ili određivanje učestalosti modifikovanog proteina u okviru proteina sa kojim je modifikacija povezana obavlja na nivou RNK.
9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačen time, što modifikovani peptid sadrži fragment modifikovanog proteina, pri čemu navedeni fragment sadrži modifikaciju prisutnu u proteinu.
10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, koji dalje obuhvata identifikaciju nesinonimnih mutacija u jednom ili više regiona koji kodiraju proteine.
11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, naznačen time, što se modifikacije aminokiselina identifikuju delimičnim ili potpunim sekvenciranjem genoma ili transkriptoma jedne ili više ćelija, kao što su jedna ili više kancerskih ćelija i opciono jedna ili više nekancerskih ćelija i identifikovanjem mutacija u jednom ili više regiona koji kodiraju proteine.
12. Postupak prema patentnom zahtevu 10 ili 11, naznačen time, što su navedene mutacije somatske mutacije i/ili kancerske mutacije.
RS20211140A 2015-02-12 2016-02-09 Predikcija epitopa t-ćelija korisnih za vakcinaciju RS62416B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2015/053021 WO2016128060A1 (en) 2015-02-12 2015-02-12 Predicting t cell epitopes useful for vaccination
PCT/EP2016/052684 WO2016128376A1 (en) 2015-02-12 2016-02-09 Predicting t cell epitopes useful for vaccination
EP16704567.3A EP3256853B1 (en) 2015-02-12 2016-02-09 Predicting t cell epitopes useful for vaccination

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62416B1 true RS62416B1 (sr) 2021-10-29

Family

ID=52469061

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211140A RS62416B1 (sr) 2015-02-12 2016-02-09 Predikcija epitopa t-ćelija korisnih za vakcinaciju

Country Status (20)

Country Link
US (2) US11156617B2 (sr)
EP (2) EP3954383A1 (sr)
JP (2) JP6882178B2 (sr)
KR (3) KR20240095527A (sr)
CN (2) CN113484523A (sr)
AU (3) AU2016217965B2 (sr)
CY (1) CY1124558T1 (sr)
DK (1) DK3256853T3 (sr)
ES (1) ES2888430T3 (sr)
HR (1) HRP20211419T1 (sr)
HU (1) HUE056658T2 (sr)
IL (1) IL253627B (sr)
LT (1) LT3256853T (sr)
MX (3) MX2017010332A (sr)
PL (1) PL3256853T3 (sr)
PT (1) PT3256853T (sr)
RS (1) RS62416B1 (sr)
SI (1) SI3256853T1 (sr)
SM (1) SMT202100535T1 (sr)
WO (2) WO2016128060A1 (sr)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
PL4023249T3 (pl) 2014-04-23 2025-03-10 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
WO2016128060A1 (en) 2015-02-12 2016-08-18 Biontech Ag Predicting t cell epitopes useful for vaccination
MA42543A (fr) * 2015-07-30 2018-06-06 Modernatx Inc Arn épitope peptidiques concatémériques
AU2016341309A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Cancer vaccines
ES2970865T3 (es) 2015-12-16 2024-05-31 Gritstone Bio Inc Identificación, fabricación y uso de neoantígenos
IL260030B2 (en) 2016-01-08 2025-12-01 Nykode Therapeutics ASA Therapeutic anticancer neoepitope vaccine
US20170224796A1 (en) 2016-02-05 2017-08-10 Xeme Biopharma Inc. Therapeutic Cancer Vaccine Containing Tumor-Associated Neoantigens and Immunostimulants in a Delivery System
WO2017143092A1 (en) 2016-02-19 2017-08-24 Nant Holdings Ip, Llc Methods of immunogenic modulation
KR101925040B1 (ko) * 2016-11-11 2018-12-04 한국과학기술정보연구원 Mhc와 펩타이드 사이의 결합 친화성 예측 방법 및 장치
US20190351040A1 (en) * 2017-02-01 2019-11-21 Modernatx, Inc. Rna cancer vaccines
US11965892B2 (en) 2017-02-12 2024-04-23 Biontech Us Inc. HLA-based methods and compositions and uses thereof
JP7155470B2 (ja) * 2017-03-31 2022-10-19 エーシーティー ジェノミックス （アイピー） カンパニー リミテッド 免疫原性がん特異的エピトープのためのランク付けシステム
US11905525B2 (en) 2017-04-05 2024-02-20 Modernatx, Inc. Reduction of elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
WO2018224166A1 (en) * 2017-06-09 2018-12-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Methods for predicting the usefulness of disease specific amino acid modifications for immunotherapy
EP4576103A3 (en) 2017-10-10 2025-08-27 Gritstone bio, Inc. Neoantigen identification using hotspots
US20210177964A1 (en) * 2017-11-06 2021-06-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Heat-inactivated vaccinia virus as a vaccine immune adjuvant
CN111630602A (zh) 2017-11-22 2020-09-04 磨石肿瘤生物技术公司 减少新抗原的接合表位呈递
EP3743102A1 (en) 2018-01-26 2020-12-02 Nantcell, Inc. Compositions and methods for combination cancer vaccine and immunologic adjuvant therapy
WO2019147921A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Nantcell, Inc. Rapid verification of virus particle production for a personalized vaccine
CN108491689B (zh) * 2018-02-01 2019-07-09 杭州纽安津生物科技有限公司 基于转录组的肿瘤新抗原鉴定方法
WO2020020444A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Individualized vaccines for cancer
MX2021003654A (es) * 2018-09-27 2021-05-28 Nykode Therapeutics AS Metodo para seleccionar neoepitopes.
MX2021005656A (es) * 2018-11-15 2021-07-07 Nouscom Ag Seleccion de mutaciones de cancer para la generacion de una vacuna contra cancer personalizada.
WO2020118004A1 (en) * 2018-12-05 2020-06-11 Linearx, Inc. Amplicon expression vector vaccines
KR20240091046A (ko) * 2018-12-21 2024-06-21 바이오엔테크 유에스 인크. Hla 클래스 ii-특이적 에피토프 예측 및 cd4+ t 세포 특징화를 위한 방법 및 시스템
CN111621564B (zh) * 2019-02-28 2022-03-25 武汉大学 一种鉴定有效肿瘤新抗原的方法
WO2020221783A1 (en) * 2019-04-29 2020-11-05 Vaccibody As Methods for pre-selection of neoepitopes
KR102184720B1 (ko) * 2019-10-11 2020-11-30 한국과학기술원 암 세포 표면의 mhc-펩타이드 결합도 예측 방법 및 분석 장치
CN111429965B (zh) * 2020-03-19 2023-04-07 西安交通大学 一种基于多连体特征的t细胞受体对应表位预测方法
CN111617238B (zh) * 2020-06-02 2022-12-13 苏州药明康德新药开发有限公司 小鼠ct26结直肠癌治疗性肿瘤多肽疫苗制剂及其制备方法
CN115836350A (zh) 2020-07-14 2023-03-21 米尼奥公司 用于确定新抗原的呈递可能性的方法、系统和计算机程序产品
WO2022110010A1 (zh) * 2020-11-27 2022-06-02 苏州吉玛基因股份有限公司 免疫激活剂、抗原和抗体在制备预防、治疗肿瘤产品中的应用
CN114984198B (zh) * 2021-02-24 2025-04-29 中国科学院上海药物研究所 包含肿瘤新生抗原纳米制剂和树突状细胞疫苗的试剂盒及其用途
CN113012756A (zh) * 2021-03-08 2021-06-22 杭州纽安津生物科技有限公司 一种个体化肿瘤新生抗原肽的筛选方法及其疫苗制剂
WO2023025404A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 BioNTech SE In vitro transcription technologies
EP4466706A1 (en) * 2022-01-18 2024-11-27 NEC Laboratories Europe GmbH Methods of vaccine design
WO2024083345A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 BioNTech SE Methods and uses associated with liquid compositions
WO2025202937A1 (en) 2024-03-26 2025-10-02 BioNTech SE Cancer vaccines

Family Cites Families (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5804381A (en) 1996-10-03 1998-09-08 Cornell Research Foundation Isolated nucleic acid molecule encoding an esophageal cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US6235525B1 (en) 1991-05-23 2001-05-22 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
EP0871747A1 (en) 1996-01-02 1998-10-21 Chiron Viagene, Inc. Immunostimulation mediated by gene-modified dendritic cells
JP4108126B2 (ja) 1996-04-26 2008-06-25 リュクスウニヴェルシテート テ レイデン Ｔ細胞ペプチド・エピトープの選択と産生方法および選択したエピトープを組込むワクチン
CN1138533C (zh) 1996-09-13 2004-02-18 利普森有限公司 脂质体
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
US6074645A (en) 1996-11-12 2000-06-13 City Of Hope Immuno-reactive peptide CTL epitopes of human cytomegalovirus
TR200001253T2 (tr) 1997-11-06 2000-11-21 Roche Diagnostics Gmbh Tümöre özel antijenler
US6432925B1 (en) 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
EP1117430A1 (en) 1998-10-05 2001-07-25 Genzyme Corporation Genes differentially expressed in cancer cells to design cancer vaccines
CN100352921C (zh) 1999-05-06 2007-12-05 威克福雷大学 用于鉴定引起免疫反应的抗原的组合物和方法
EP1261704B1 (en) 1999-11-30 2009-07-01 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules encoding cancer associated antigens, the antigens per se, and uses thereof
EP1242108B1 (en) 1999-12-28 2007-07-11 Pharmexa Inc. Optimized minigenes and peptides encoded thereby
US7462354B2 (en) 1999-12-28 2008-12-09 Pharmexa Inc. Method and system for optimizing minigenes and peptides encoded thereby
WO2001055393A2 (en) 2000-01-28 2001-08-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mhc class ii restricted t cell epitopes from the cancer antigen ny-eso-1
DK1276896T3 (da) * 2000-04-28 2010-10-18 Mannkind Corp Epitop-synkronisering i antigen-præsenterende celler
WO2001093902A2 (en) 2000-06-07 2001-12-13 Biosynexus Incorporated Immunostimulatory rna/dna hybrid molecules
US6472176B2 (en) 2000-12-14 2002-10-29 Genvec, Inc. Polynucleotide encoding chimeric protein and related vector, cell, and method of expression thereof
ES2340499T3 (es) 2001-06-05 2010-06-04 Curevac Gmbh Arnm de antigeno tumoral estabilizado con un contenido de g/c aumentado.
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
AUPS054702A0 (en) 2002-02-14 2002-03-07 Immunaid Pty Ltd Cancer therapy
WO2003106692A2 (en) 2002-06-13 2003-12-24 Merck Patent Gmbh Methods for the identification of all-antigens and their use for cancer therapy and transplantation
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
AU2003267401A1 (en) 2002-10-02 2004-04-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel mhc ii associated peptides
DE10344799A1 (de) 2003-09-26 2005-04-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
WO2005039533A1 (en) 2003-10-15 2005-05-06 Medigene Ag Method of administering cationic liposomes comprising an active drug
PL1692516T3 (pl) 2003-10-24 2011-05-31 Immunaid Pty Ltd Sposób terapii
US7303881B2 (en) 2004-04-30 2007-12-04 Pds Biotechnology Corporation Antigen delivery compositions and methods of use
DE102004023187A1 (de) 2004-05-11 2005-12-01 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
DE102004057303A1 (de) 2004-11-26 2006-06-01 Merck Patent Gmbh Stabile Kristallmodifikationen von DOTAP Chlorid
CA2592972A1 (en) 2004-12-29 2006-07-06 Mannkind Corporation Methods to bypass cd+4 cells in the induction of an immune response
EP1715346A1 (en) * 2005-04-22 2006-10-25 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Method of identifying CD4+ T cell antigens
DK2439273T3 (da) 2005-05-09 2019-06-03 Ono Pharmaceutical Co Humane monoklonale antistoffer til programmeret død-1(pd-1) og fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af anti-pd-1- antistoffer alene eller i kombination med andre immunterapeutika
PT1907424E (pt) 2005-07-01 2015-10-09 Squibb & Sons Llc Anticorpos monoclonais humanos para o ligando 1 de morte programada (pd-l1)
PL2578685T3 (pl) 2005-08-23 2020-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna zawierający zmodyfikowane nukleozydy i sposoby jego zastosowania
DE102005041616B4 (de) 2005-09-01 2011-03-17 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Melanom-assoziierte MHC Klasse I assoziierte Oligopeptide und für diese kodierende Polynukleotide und deren Verwendungen
EP1762575A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy
JP2009532664A (ja) 2006-02-27 2009-09-10 アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツ・フォー・アンド・オン・ビハーフ・オブ・アリゾナ・ステイト・ユニバーシティ 癌の治療のためのノボペプチドの同定および使用
US20090304711A1 (en) 2006-09-20 2009-12-10 Drew Pardoll Combinatorial Therapy of Cancer and Infectious Diseases with Anti-B7-H1 Antibodies
DE102006060824B4 (de) 2006-12-21 2011-06-01 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Nachweis von individuellen T-Zell-Reaktionsmustern gegen Tumor-assoziierte Antigene (TAA) in Tumorpatienten als Basis für die individuelle therapeutische Vakzinierung von Patienten
KR101523391B1 (ko) 2006-12-27 2015-05-27 에모리 유니버시티 감염 및 종양 치료를 위한 조성물 및 방법
US8140270B2 (en) 2007-03-22 2012-03-20 National Center For Genome Resources Methods and systems for medical sequencing analysis
US8877206B2 (en) 2007-03-22 2014-11-04 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by cationic lipids
BR122017025062B8 (pt) 2007-06-18 2021-07-27 Merck Sharp & Dohme anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo para o receptor de morte programada humano pd-1, polinucleotídeo e composição compreendendo o referido anticorpo ou fragmento
EP2060583A1 (en) 2007-10-23 2009-05-20 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
DK2276486T3 (da) 2008-03-24 2013-11-25 4Sc Discovery Gmbh Nye substituerede imidazo-quinoliner
EP2276495B1 (en) 2008-04-17 2018-11-21 PDS Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by enantiomers of cationic lipids
DE102008061522A1 (de) 2008-12-10 2010-06-17 Biontech Ag Verwendung von Flt3-Ligand zur Verstärkung von Immunreaktionen bei RNA-Immunisierung
CA2769670C (en) 2009-07-31 2018-10-02 Ethris Gmbh Rna with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
WO2013040142A2 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Iogenetics, Llc Bioinformatic processes for determination of peptide binding
EP2569633B1 (en) 2010-05-14 2016-02-10 The General Hospital Corporation Compositions and methods of identifying tumor specific neoantigens
EP2625189B1 (en) 2010-10-01 2018-06-27 ModernaTX, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
DE102011102734A1 (de) 2011-05-20 2012-11-22 WMF Württembergische Metallwarenfabrik Aktiengesellschaft Vorrichtung zum Aufschäumen von Milch, Getränkebereiter mit dieser Vorrichtung und Verfahren zum Aufschäumen von Milch
PL3892295T3 (pl) * 2011-05-24 2023-07-24 BioNTech SE Zindywidualizowane szczepionki przeciwnowotworowe
WO2012159643A1 (en) 2011-05-24 2012-11-29 Biontech Ag Individualized vaccines for cancer
DE19216461T1 (de) 2011-10-03 2021-10-07 Modernatx, Inc. Modifizierte nukleoside, nukleotide und nukleinsäuren und verwendungen davon
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US20150030576A1 (en) 2012-01-10 2015-01-29 Moderna Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeting agents into and across the blood-brain barrier
EP3072898A1 (en) 2012-02-20 2016-09-28 Universita' degli Studi di Milano Homo- and heterodimeric smac mimetic compounds as apoptosis inducers
US20130255281A1 (en) 2012-03-29 2013-10-03 General Electric Company System and method for cooling electrical components
WO2013151665A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
WO2014012051A1 (en) 2012-07-12 2014-01-16 Persimmune, Inc. Personalized cancer vaccines and adoptive immune cell therapies
WO2014093924A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
KR102121086B1 (ko) 2012-11-01 2020-06-09 팩터 바이오사이언스 인크. 세포에서 단백질을 발현시키는 방법들과 생성물들
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
US20160022840A1 (en) 2013-03-09 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Heterologous untranslated regions for mrna
EP2968391A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US20160032316A1 (en) 2013-03-14 2016-02-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and Purity Assessment of RNA Molecules Synthesized with Modified Nucleosides
US10590161B2 (en) 2013-03-15 2020-03-17 Modernatx, Inc. Ion exchange purification of mRNA
WO2014152027A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
EP2971165A4 (en) 2013-03-15 2016-11-23 Moderna Therapeutics Inc DISSOLUTION OF DNA FRAGMENTS IN MRNA MANUFACTURING METHODS
WO2014144039A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
US20160017313A1 (en) 2013-03-15 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Analysis of mrna heterogeneity and stability
EP2983702A2 (en) * 2013-04-07 2016-02-17 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for personalized neoplasia vaccines
WO2014180490A1 (en) * 2013-05-10 2014-11-13 Biontech Ag Predicting immunogenicity of t cell epitopes
WO2015014375A1 (en) 2013-07-30 2015-02-05 Biontech Ag Tumor antigens for determining cancer therapy
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
EP3041934A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015038892A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide compositions containing amino acids
US9950065B2 (en) 2013-09-26 2018-04-24 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Particles comprising a shell with RNA
EP3052511A4 (en) 2013-10-02 2017-05-31 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
EP3052479A4 (en) 2013-10-02 2017-10-25 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015058780A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Biontech Ag Method and kit for determining whether a subject shows an immune response
EP3076994A4 (en) 2013-12-06 2017-06-07 Modernatx, Inc. Targeted adaptive vaccines
EP3053585A1 (en) 2013-12-13 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
JP2017507703A (ja) 2014-02-05 2017-03-23 バイオエヌテック アーゲーＢｉｏＮＴｅｃｈ ＡＧ カニューレ、注射または注入装置、およびカニューレまたは注射もしくは注入装置を使用する方法
PL4023249T3 (pl) 2014-04-23 2025-03-10 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
WO2015172843A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Biontech Diagnostics Gmbh Methods and kits for the diagnosis of cancer
WO2016062323A1 (en) 2014-10-20 2016-04-28 Biontech Ag Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer
PT4023755T (pt) 2014-12-12 2023-07-05 CureVac SE Moléculas de ácido nucleico artificiais para uma expressão melhorada de proteína
EP3240558A1 (en) 2014-12-30 2017-11-08 CureVac AG Artificial nucleic acid molecules
WO2016128060A1 (en) 2015-02-12 2016-08-18 Biontech Ag Predicting t cell epitopes useful for vaccination
WO2016155809A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Lipid particle formulations for delivery of rna and water-soluble therapeutically effective compounds to a target cell
EP3323070B1 (en) * 2015-07-14 2024-05-08 Personal Genome Diagnostics Inc. Neoantigen analysis
ES2970865T3 (es) 2015-12-16 2024-05-31 Gritstone Bio Inc Identificación, fabricación y uso de neoantígenos
CA3060569A1 (en) 2017-04-19 2018-10-25 Gritstone Oncology, Inc. Neoantigen identification, manufacture, and use
AU2018279627B2 (en) 2017-06-09 2023-08-10 Seattle Project Corp. Neoantigen identification, manufacture, and use
US20200363414A1 (en) 2017-09-05 2020-11-19 Gritstone Oncology, Inc. Neoantigen Identification for T-Cell Therapy
EP4576103A3 (en) 2017-10-10 2025-08-27 Gritstone bio, Inc. Neoantigen identification using hotspots
CN111630602A (zh) 2017-11-22 2020-09-04 磨石肿瘤生物技术公司 减少新抗原的接合表位呈递
EP3759131A4 (en) 2018-02-27 2021-12-01 Gritstone bio, Inc. NEOANTIGEN IDENTIFICATION WITH PAN ALLELE MODELS

Also Published As

Publication number Publication date
EP3954383A1 (en) 2022-02-16
KR20220021014A (ko) 2022-02-21
PT3256853T (pt) 2021-09-16
AU2016217965A1 (en) 2017-08-24
JP2018507686A (ja) 2018-03-22
KR20170117514A (ko) 2017-10-23
AU2022215196B2 (en) 2025-04-24
AU2022215196A1 (en) 2022-09-01
SI3256853T1 (sl) 2021-12-31
US20220074948A1 (en) 2022-03-10
JP7244571B2 (ja) 2023-03-22
KR102670064B1 (ko) 2024-05-29
HUE056658T2 (hu) 2022-03-28
CN113484523A (zh) 2021-10-08
ES2888430T3 (es) 2022-01-04
BR112017017293A2 (pt) 2018-08-28
CA2982971A1 (en) 2016-08-18
HRP20211419T1 (hr) 2021-12-10
IL253627B (en) 2022-04-01
SMT202100535T1 (it) 2021-11-12
MX2022000012A (es) 2022-05-20
CN107430132A (zh) 2017-12-01
IL253627A0 (en) 2017-09-28
AU2016217965B2 (en) 2022-05-26
MX2023002858A (es) 2023-04-03
AU2025206387A1 (en) 2025-08-07
JP2021129569A (ja) 2021-09-09
WO2016128376A1 (en) 2016-08-18
JP6882178B2 (ja) 2021-06-02
KR20240095527A (ko) 2024-06-25
PL3256853T3 (pl) 2021-12-27
CN107430132B (zh) 2021-06-29
EP3256853A1 (en) 2017-12-20
LT3256853T (lt) 2021-10-25
EP3256853B1 (en) 2021-08-18
HK1246852A1 (zh) 2018-09-14
MX2017010332A (es) 2018-03-28
US11156617B2 (en) 2021-10-26
KR102359213B1 (ko) 2022-02-08
DK3256853T3 (da) 2021-09-13
WO2016128060A1 (en) 2016-08-18
CY1124558T1 (el) 2022-07-22
US20190250166A1 (en) 2019-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022215196B2 (en) Predicting T cell epitopes useful for vaccination
KR102516166B1 (ko) 향상된 효능을 갖는 치료를 위한 질병-특이적 표적으로서 네오에피토프의 선택
RS61868B1 (sr) Predviđanje imunogenosti epitopa t-ćelija
CA2982971C (en) Predicting t cell epitopes useful for vaccination
HK40068529A (en) Predicting t cell epitopes useful for vaccination
HK40061504A (en) Predicting t cell epitopes useful for vaccination
HK40071503A (en) Selecting neoepitopes as disease-specific targets for therapy with enhanced efficacy
HK1247989B (en) Predicting t cell epitopes useful for vaccination
HK1246852B (zh) 预测可用於疫苗接种的t细胞表位
HK40009417B (en) Selecting neoepitopes as disease-specific targets for therapy with enhanced efficacy
BR112017017293B1 (pt) Método para predizer uma ou mais modificações de aminoácidos imunogênicos, método para selecionar e/ou classificar modificações de aminoácidos imunogênicos, método para fornecer uma vacina e vacina