RS62457B1

RS62457B1 - Antitela specifična za tgf-beta

Info

Publication number: RS62457B1
Application number: RS20211295A
Authority: RS
Inventors: Daniel Bedinger; Shireen S Khan; Amer Mirza; Ajay J Narasimha; Toshihiko Takeuchi
Original assignee: Xoma Technology Ltd
Priority date: 2011-06-03
Filing date: 2012-06-01
Publication date: 2021-11-30
Also published as: SI2714735T1; AU2021215206A1; PH12013502489B1; US20180057578A1; PH12013502489A1; JP2023015300A; AU2019204781B2; CN108424451A; EP2714735B1; IL274595A; IL229638B; CY1124610T1; PH12018500401A1; HUE056808T2; JP6571843B2; BR112013030958B1; EA201391777A1; CA2837556C; CN116333113A; KR20190134826A

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetno obelodanjivanje se generalno odnosi na materijale i metode za antitela specifična za transformaciju faktora rasta beta (TGFβ), uključujući TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3, i takve materijale za upotrebu u lečenju ispitanika obolelih od raka, očne bolesti, stanja ili poremećaja, fibroze, uključujući fibrozu oka ili oftalmološke fibroze, i druga stanja ili poremećaje povezane sa ekspresijom TGFβ.

POZADINA

[0002] Porodica proteina transformišućeg faktora rasta beta (TGFβ) sastoji se iz tri različite izoforme koje nalazimo kod sisara (TGFβ1, TGFβ2, i TGFβ3). Proteini TGFβ aktiviraju i regulišu više genskih odgovora koji utiču na bolesna stanja, uključujući ćelijsku proliferaciju, inflamatorna i kardiovaskularna stanja. TGFβ je multifunkcionalni citokin prvobitno nazvan po svojoj sposobnosti da transformiše normalne fibroblaste u ćelije sposobne za rast nezavisan od sidrenja. Molekule TGFβ prvenstveno proizvode hematopoetske i tumorske ćelije i mogu regulisati, tj., stimulisati ili inhibirati rast i diferencijaciju ćelija iz različitih i normalnih i neoplastičnih tkiva (Sporn i dr., Science, 233: 532 (1986)), i stimulišu stvaranje i širenje različitih stromalnih ćelija.

[0003] Poznato je da su TGFβ uključeni u mnoge proliferativne i neproliferativne ćelijske procese kao što su proliferacija i diferencijacija ćelija, embrionalni razvoj, formiranje vanćelijskog matriksa, razvoj kostiju, zarastanje rana, hematopoeza i imunološki i inflamatorni odgovori. Videti npr., Pircher i dr, Biochem. Biophys. Res. Commun., 136: 30-37 (1986); Wakefield i dr., Growth Factors, 1: 203-218 (1989); Roberts and Sporn, pp 419-472 in Handbook of Experimental Pharmacology eds M. B. Sporn & A. B. Roberts (Springer, Heidelberg, 1990); Massague i dr., Annual Rev. Cell Biol., 6: 597-646 (1990); Singer and Clark, New Eng. J. Med., 341: 738-745 (1999). Also, TGFβ is used in the treatment and prevention of diseases of the intestinal mucosa (WO 2001/24813). TGFβ takođe je poznato da ima snažne imunosupresivne efekte na različite tipove imunoloških ćelija, uključujući inhibiciju citotoksičnih T limfocita (CTL) (Ranges i dr., J. Exp. Med., 166: 991, 1987), Espevik i dr., J. Immunol., 140: 2312, 1988), depresivna limfopoeza B ćelija i ekspresija lakog lanca kapa (Lee i dr., J. Exp. Med., 166: 1290, 1987), negativna regulacija hematopoeze (Sing i dr., Blood, 72: 1504, 1988), donja regulacija ekspresije HLA-DR na ćelijama tumora (Czarniecki i dr., J. Immunol., 140: 4217, 1988), i inhibicija proliferacije B limfocita aktiviranih antigenom kao odgovor na faktor rasta B-ćelija (Petit-Koskas i dr., Eur. J. Immunol., 18: 111, 1988). Videti takođe patent SAD 7,527,791.

[0004] Antitela na TGFβ su opisana u patentu SAD br.7,527,791; 7,927,593; 7,494,651; 7,369,111; 7,151,169; 6,492,497; 6,419,928; 6,090,383; 5,783,185; 5,772,998; 5,571,714; i 7,723,486.

[0005] Swati Biswas i dr., Journal Of Clinical Investigation, Vol.117, No.5, 1 May 2007, stranice 1305-1313, US 2006/251658 A1, US 2008/292638 A1, US 2005/276802 A1, Hoefer M i dr., Cancer Immunology And Immunotherapy, Vol. 41, No. 5, 1 January 1995, pages 302-308, Maclellan W R i dr., Annual Review Of Physiology, Vol.62, 1 January 2000, stranice 289-319, svaki obelodanjuje antitela na TGFp i različitu upotrebu u lečenju bolesti.

REZIME PRONALASKA

[0006] Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje postupke i sastave za upotrebu u lečenju bolesti ili poremećaja povezanih sa ekspresijom TGFβ. Obelodanjivanje pruža antitela koja vezuju TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3. Predviđeno je da ovde opisana antibakterijska sredstva mogu imati različit afinitet za bilo koju ili sve izoforme TGFβ. Dalje, ovde je otkriveno da obelodanjena antitela specifična za TGFβ neočekivano moduliraju imunološke ćelije u tumorima (npr., infiltriraju se u tumore) i da su predviđena za lečenje tumora povezanih sa ekspresijom TGFβ, kao i drugih stanja ili poremećaja povezanih sa ekspresijom TGFβ.

[0007] Pronalazak obezbeđuje antitelo koje vezuje transformacioni faktor rasta beta (TGFβ)1, TGFβ2 i TGFβ3 koje sadrži:

(a) CDR1 aminokiselinska sekvenca teškog lanca navedena u SEQ ID NO: 19;

(b) CDR2 aminokiselinska sekvenca teškog lanca navedena u SEQ ID NO: 20; i

(c) CDR3 aminokiselinska sekvenca teškog lanca navedena u SEQ ID NO: 21;

(d) CDR1 aminokiselinska sekvenca lakog lanca navedena u SEQ ID NO: 22;

(e) CDR2 aminokiselinska sekvenca lakog lanca navedena u SEQ ID NO: 23; i

(f) CDR3 aminokiselinska sekvenca lakog lanca navedena u SEQ ID NO: 24;

pri čemu se antitelo vezuje za TGFβ1 i TGFβ2 sa većim afinitetom od TGFβ3 i vezuje TGFβ1 i TGFβ2 sa afinitetom Kd od 10<-9>M ili manje, mereno površinskom plazmonskom rezonancom ili testom kinetičke isključenosti.

[0008] U nekim otelotvorenjima, smatra se da antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca izloženoj u SEQ ID NO: 6. U srodnom otelotvorenju, antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičnu aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca izloženoj u SEQ ID NO: 6.

[0009] U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselina sa okvirom teškog lanca zamenjene su odgovarajućim aminokiselinama iz druge aminokiselinske sekvence humanog antitela.

[0010] U jednom otelotvorenju, antitelo koje je ovde razmatrano sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 70% identičnu aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca predstavljenoj u SEQ ID NO: 8. U srodnom otelotvorenju, antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca izloženoj u SEQ ID NO: 8. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičnu aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca izloženoj u SEQ ID NO: 8. U još jednom otelotvorenju, antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je navedena u SEQ ID NO: 8.

[0011] U nekim otelotvorenju, antitelo iz predmetnog obelodanjivanja dalje sadrži konstantan region teškog lanca, gde je konstantan region teškog lanca modifikovani ili nemodifikovani IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, njihov fragment ili njihove kombinacije.

[0012] U nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je antitelo u kome su jedna ili više aminokiselina sa okvirom lakog lanca zamenjene odgovarajućom aminokiselinama iz druge aminokiselinske sekvence humanog antitela.

[0013] U jednom aspektu, antitelo iz predmetnog obelodanjivanja je XPA.42.089. Aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca XPA.42.089 navedene su u SEQ ID NO: 6 i 8, respektivno.

[0014] U jednom otelotvorenju, ovde opisano antitelo dalje sadrži konstantni region humanog lakog lanca vezanu za pomenuti varijabilni region lakog lanca. U nekim otelotvorenjima, konstantan region lakog lanca je modifikovana ili nemodifikovana konstantna oblast lambda lakog lanca, konstantna oblast lakog lanca kapa, njegov fragment ili njihove kombinacije.

[0015] Obelodanjivanje pruža antitelo specifično za TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3 sa afinitetom Kd od 10<-6>M ili manjim. Ovde opisano anti-TGFβ antitelo može da veže najmanje jednu izoformu TGFβ sa afinitetom od 10<-6>M, 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M ili manje, ili opciono vezuje dve izoforme TGFβ, ili sve TGFβ1, 2 ili 3 sa afinitetom od 10<-6>M. 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, ili 10<-12>M ili manje za jednu ili više izoformi. Ovde opisano antitelo može da se veže za TGFβ1 i TGFβ2 sa najmanje 2-50 puta, 10-100 puta, 2 puta, 5 puta, 10 puta, 25 puta, 50 puta ili 100 puta ili 2050%, 50-100%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%ili 100%veći afinitet (npr., prvenstveno se vezuje za TGFβ1 i TGFβ2) u poređenju sa za vezivanje za TGFβ3. Alternativno, ovde opisano antitelo vezuje svaku od TGFβ izoformi TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3 sa afinitetom unutar 3, 5 ili 10 puta jedno prema drugom. U pronalasku, kako se tvrdi, antitelo se vezuje za TGFβ1 i TGFβ2 sa većim afinitetom od TGFβ3, mereno površinskom plazmonskom rezonancom ili testom kinetičke isključenosti.

[0016] U nekim otelotvorenjima, antitelo neutrališe aktivnost TGFβ1 i TGFβ2 u većoj meri nego TGFβ3. U nekim otelotvorenjima, neutralizacija antitela TGFβ1 i TGFβ2 je najmanje 2-50 puta, 10-100 puta, 2, 5, 10, 10, 25, 50 ili 100 puta, ili 20 50%, 50-100%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%ili 100%snažnije od neutralizacije TGFβ3. Primeri testova neutralizacije koji su ovde razmatrani uključuju, ali nisu ograničeni na, test oslobađanja interleukin-11 i test proliferacije ćelija HT-2. Pored toga, može se izvršiti ispitivanje aktivnosti TGFβ da bi se utvrdilo da li ovde obelodanjeno antitelo inhibira jednu izoformu TGFβ, preferencijalno, uključujući test fosforilacije pSMAD ili test vezivanja rhLAP. U sledećem otelotvorenju, antitelo ima niži IC50 (tj., bolje vezivanje, veću moć) za TGFβ1 i TGFβ2 u poređenju sa TGFβ3.

[0017] U drugom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira teški lanac i/ili laki lanac kako je ovde opisano.

[0018] U daljem aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji je ovde predviđen operativno povezan sa sekvencom za kontrolu ekspresije. Takođe se razmatra ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor ili molekul nukleinske kiseline iz predmetnog obelodanjivanja. U nekim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira teški lanac i varijabilni region lakog lanca, pri čemu su nukleinske kiseline teškog lanca i lakog lanca eksprimirane različitim nukleinskim kiselinama ili na istoj nukleinskoj kiselini.

[0019] U srodnom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje postupak korišćenja ćelije domaćina kako je ovde opisano za proizvodnju antitela, pri čemu se postupak sastoji od uzgoja ćelije domaćina pod odgovarajućim uslovima i oporavka pomenutog antitela. Takođe je obezbeđeno antitelo proizvedeno postupkom koji je ovde obelodanjen.

[0020] Obelodanjivanje dalje razmatra sterilni farmaceutski sastav koji sadrži antitelo kako je ovde obelodanjeno i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0021] U drugom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje antitelo prema pronalasku za upotrebu u postupku za lečenje bolesti, stanja ili poremećaja povezanih sa ekspresijom TGFβ, koje obuhvata korak davanja ispitaniku kome je to potrebno, terapeutski efikasne količine antitela ili farmaceuta kompozicija koja se ovde razmatra. U nekim otelotvorenjima, bolest, stanje ili poremećaj se bira iz grupe koju čine rak, očna (npr., očna, optička, oftalmološke ili oftamološka) bolest, stanje ili poremećaj, oboljenje ili poremećaj povezan sa fibrozom, npr., fibroproliferativne bolesti, stanja ili poremećaji, ili bolesti, stanja ili poremećaji koji imaju pridruženu fibrozu.

[0022] Fibroproliferativne bolesti, stanja ili poremećaji ili bolesti povezane sa fibrozom uključuju one koje utiču na bilo koji organ ili tkivo u telu, uključujući, ali ne ograničavajući se na kožu, pluća, bubrege, srce, mozak i oko. Fibroproliferativne bolesti, stanja ili poremećaji ili bolesti koje imaju pridruženu fibrozu uključuju, ali nisu ograničene na plućnu fibrozu, idiopatsku plućnu fibrozu, peribronhiolarnu fibrozu, intersticijska bolest pluća, hronična opstruktivna bolest pluća (KOPB), bolest malih disajnih puteva (npr. opstruktivni bronhiolitis), emfizem, sindrom odrasle osobe ili akutni respiratorni distres sindrom (ARDS), akutna povreda pluća (ALI), plućna fibroza uzrokovana infektivnim ili toksičnim uzročnicima, fibroza bubrega, glomerulonefritis (GN) svih etiologija, mezangijalna proliferativna GN, imunološka GN, polumesec GN, glomeruloskleroza, tubulointersticijalna povreda, bubrežna intersticijska fibroza, bubrežna fibroza i svi uzroci bubrežne intersticijalne fibroze, bubrežna fibroza koja je rezultat komplikacija izloženosti lekovima, uključujući lečenje ciklosporina primalaca transplantata, nefropatiju povezanu sa HIV-om, transplantaciona nefropatija, dijabetička bolest bubrega, dijabetička nefropatija, nefrogena sistemska fibroza, dijabetes, idiopatska retroperitonealna fibroza, skleroderma, fibroza jetre, oboljenja jetre povezana sa prekomernim ožiljcima i progresivna skleroza, ciroza jetre zbog svih etiologija, poremećaji bilijarnog stabla, disfunkcija jetre koja se pripisuje infekcijama, fibrocistične bolesti, kardiovaskularne bolesti, kongestivna srčana insuficijencija, proširena kardiomiopatija, miokarditis, vaskularna stenoza srčana fibroza, postinfarktna srčana fibroza, post infarkt miokarda, hipertrofija leve komore, veno-okluzivna bolest, restenoza, post-angioplastična restenoza, otkazivanje arteriovenskog transplantata, ateroskleroza, hipertenzija, hipertenzivna bolest srca, srčana hipertrofija, hipertrofična kardiomiopatija, srčana insuficijencija, bolest aorte, progresivna sistemska skleroza; polimiozitis; sistemski lupus eritematozus; dermatomiozitis, fašisti, Rainaudov sindrom, reumatoidni artritis, proliferativna vitreoretinopatija, vitreoretinopatija bilo koje etiologije, fibroza povezana sa hirurgijom oka, lečenje glaukoma, ponovna vezanost mrežnjače, ekstrakcija katarakte ili procedure drenaže bilo koje vrste, ožiljci u rožnjači i konjunktivi, fibroza u endotelu rožnjače, opekotine alkalijama, (npr. alkalne opekotine do rožnjače) posle operacije katarakte fibroza kapsule sočiva, višak ožiljaka u tkivu oko ekstraokularnih mišića u operaciji strabizma, prednji deo subkapsularna katarakta i zamućenje zadnje kapsule, fibrotične bolesti prednjeg segmenta oka, fibroza rožnične strome, fibroza povezana sa zamućenjem rožnjače, fibroza trabekularne mreže, fibroza povezana sa glaukomom, fibrotične bolesti zadnjeg segmenta oka, fibrovaskularni ožiljci, fibroza u retinalnoj ili horoidalnoj vaskulaturi oko, fibroza mrežnjače, epiretinalna fibroza, glioza mrežnjače, subretinalna fibroza, fibroza povezana sa starosnom makularnom degeneracijom, post retinalna operacija i operacija glaukoma, trakciono odvajanje mrežnjače u vezi sa kontrakcijom tkiva kod dijabetičke retinopatije, Peironiejeva bolest, sistemska skleroza, post-kičmena moždina, osteoporoza, Camurati-Engelmann bolest, Kronova bolest, ožiljci, Marfanov sindrom, prerano otkazivanje jajnika, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, fibroza usled hirurških rezova ili mehaničkih trauma, fibroza povezana sa operacijom oka i prekomerna ili hipertrofična ožiljka ili formiranje keloida u dermisu tokom zarastanja rana nastalih usled traume ili hirurških rana.

[0023] Primerne očne bolesti (npr. Očne, optičke, oftalmološke ili oftalmološke bolesti), stanja ili poremećaji, uključuju, ali se ne ograničavaju na njih, fibroproliferativne poremećaje, fibrozu oka, oftalmološke fibroze, disfunkciju mrežnjače, fibrozu povezanu sa disfunkcijom mrežnjače, vlažnu ili suvu makularna degeneracija, proliferativna vitreoretinopatija, vitreoretinopatija bilo koje etiologije, fibroza povezana sa hirurgijom oka, kao što je lečenje glaukoma, mrežnjača, ekstrakcija katarakte, ili postupci drenaže bilo koje vrste, ožiljci u rožnjači i konjunktivi, fibroza u endotelu rožnjače, opekotine alkalija (na primer, alkalne opekotine do rožnjače), fibroza kapsule sočiva nakon operacije katarakte, višak ožiljaka u tkivu oko ekstraokularnog područja mišići u operaciji strabizma, prednja subkapsularna katarakta i zamućenje zadnje kapsule, fibrotične bolesti oka prednjeg segmenta, fibroza strome rožnjače (npr. povezana sa zamućenjem rožnjače), fibroza trabekularne mreže (npr. povezana sa glaukomom), fibrotične bolesti zadnjeg segmenta oka, fibrovaskularni ožiljci (npr. u retini) ili horoidalna vaskulatura oka), retinalna fibroza, epiretinalna fibroza, retinalna glioza, subretinalna fibroza (npr. povezana sa starosnom degeneracijom makule), fibroza povezana sa post retinalnom i glaukomskom operacijom, trakciono odvajanje mrežnjače povezano sa kontrakcijom tkiva kod dijabetičke retinopatije.

[0024] Primeri fibroproliferativne bolesti, stanja ili poremećaja oka, fibroze oka, očne fibroze ili oftalmološke fibroze uključuju, ali nisu ograničeni na, proliferativnu vitreoretinopatiju, vitreoretinopatiju bilo koje etiologije, fibrozu povezanu sa disfunkcijom mrežnjače, fibrozu povezanu sa vlažnom ili suvom. makularna degeneracija, fibroza povezana sa hirurgijom oka, kao što je lečenje glaukoma, ponovno povezivanje mrežnjače, ekstrakcija katarakte ili bilo koje vrste drenažnih procedura, ožiljci u rožnjači i konjunktivi, fibroza u endotelu rožnjače, fibroza povezana sa opekotinama alkalija, operacija nakon katarakte fibroza kapsula sočiva, višak ožiljka tkiva oko ekstraokularnih mišića u operaciji strabizma, prednja subkapsularna katarakta i zamagljivanje zadnje kapsule, fibrotične bolesti prednjeg segmenta oka, fibroza strome rožnjače (npr. povezana sa zamućenjem rožnjače), fibroza trabekularne mreže (npr. povezana sa glaukomom), fibrozne bolesti oka zadnjeg segmenta , fibrovaskularni ožiljci (npr. u retinalnoj ili horoidalnoj vaskulaturi oka), retinalna fibroza, epiretinalna fibroza, retinalna glioza, subretinalna fibroza (na primer, povezana sa starosnom makularnom degeneracijom), fibroza povezana sa post retinalnom i glaukomskom operacijom, trakciono odvajanje mrežnjače povezano sa kontrakcijom tkiva kod dijabetičke retinopatije.

[0025] U različitim otelotvorenjima, fibroproliferativna bolest, stanje ili poremećaj oka je izabran iz grupe koju čine proliferativna vitreoretinopatija, fibroza povezana sa hirurgijom oka, fibroza sočiva nakon operacije katarakte, fibroza strome rožnjače i opekotina lužine.

[0026] U srodnom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje antitelo pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje karcinoma koji se sastoji u davanju ispitaniku kome je to potrebno terapeutski efikasne količine antitela ili farmaceutskog sastava koji je ovde razmatran. U nekim otelotvorenjima, rak je izabran iz grupe koju čine rak pluća, rak prostate, rak dojke, hepatocelularni karcinom, rak jednjaka, kolorektalni karcinom, rak pankreasa, rak bešike, rak bubrega, rak jajnika, rak želuca, fibrotični karcinom, gliom i melanom.

[0027] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili sastav povećavaju broj ćelija prirodnih ubica (NK) u tumoru. U različitim otelotvorenjima, antitelo ili sastav povećavaju citolitičku aktivnost NK ćelija. Na primer, u različitim otelotvorenjima, ovde opisano antitelo ili sastav povećava proizvodnju perforina i granzima NK ćelijama. U jednom otelotvorenju, antitelo je XPA.42.089.

[0028] U različitim otelotvorenjima, ovde opisano antitelo ili sastav smanjuju broj regulatornih T ćelija u tumoru i/ili inhibiraju regulatornu funkciju T ćelija. Na primer, u različitim otelotvorenjima, ovde opisano antitelo ili sastav inhibira sposobnost Treg da dole reguliše imunološki odgovor ili da migrira na mesto imunog odgovora.

[0029] U različitim otelotvorenjima, antitelo ili sastav povećavaju broj citotoksičnih T ćelija u tumoru i/ili pojačavaju CTL aktivnost, na primer, pojačavaju, povećavaju ili promovišu CTL aktivnost. Na primer, u različitim otelotvorenjima, ovde opisano antitelo ili sastav povećavaju perforin i granzim pomoću CTL-a i povećavaju citolitičku aktivnost CTL-a. U jednom otelotvorenju, antitelo jeKSPA.42.089.

[0030] U drugom otelotvorenju, antitelo ili sastav smanjuju broj matičnih ćelija izvedenih iz monocita (MDSC) u tumoru i/ili inhibiraju funkciju MDSC. Na primer, u različitim otelotvorenjima, ovde opisano antitelo ili sastav inhibiraju sposobnost MDSCs da potisnu imunološki odgovor, inhibiraju imunosupresivnu aktivnost MDSCs i/ili inhibiraju sposobnost MDSCs da promovišu ekspanziju i/ili funkciju Treg. Antitelo može biti XPA.42.089.

[0031] U različitim otelotvorenjima, antitelo smanjuje broj dendritičnih ćelija (DC) u tumoru i/ili inhibira tolerogenu funkciju (npr., tolerogeni efekat) dendritičnih ćelija. Na primer, u različitim otelotvorenjima, ovde opisano antitelo ili sastav smanjuju tolerantni efekat CD8+ dendritičnih ćelija. U jednom otelotvorenju, antitelo je XPA.42.089.

[0032] U drugom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje antitelo pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje fibroze koji se sastoji u davanju ispitaniku kome je to potrebno terapeutski efikasne količine antitela ili farmaceutskog sastava koji je ovde razmatran.

[0033] U različitim otelotvorenjima, antitelo je za davanje sa drugim sredstvom. U jednom otelotvorenju, drugo sredstvo je izabrano iz grupe koja se sastoji iz proteina koji razgrađuje vanćelijski matriks, antifibrotičnog sredstva, hirurške terapije, hemoterapije, citotoksičnog sredstva ili terapije zračenjem. Primeri drugih sredstava su detaljnije obelodanjeni u Detaljnom opisu.

[0034] Terapija se može primenjivati periodično, na primer, po satu, dnevno, nedeljno, svake 2 nedelje, svake 3 nedelje, mesečno ili u dužim intervalima. U primerima lečenja, ovde otkriveno antitelo može se primenjivati u dozi od oko 1 mg/dan, 5 mg/dan, 10 mg/dan, 20 mg/dan, 50 mg/dan, 75 mg/dan, 100 mg/dan , 150 mg/dan, 200 mg/dan, 250 mg/dan, 500 mg/dan ili 1000 mg/dan. Ove koncentracije se mogu primeniti kao pojedinačni oblik doziranja ili kao više doza.

[0035] Takođe se razmatra sastav koji sadrži bilo koje od iznad navedenih antitela ili sastava iz predmetnog obelodanjivanja koja vezuju TGFβ, ili njihovu upotrebu u pripremi leka, za lečenje bilo kog od ovde opisanih poremećaja povezanih sa ekspresijom TGFβ. Špricevi, npr., špricevi za jednokratnu upotrebu ili napunjeni špricevi, sterilno zatvoreni kontejneri, npr., takođe se razmatraju bočice, bočice, posude i/ili kompleti ili pakovanja koja sadrže bilo koje od gorenavedenih antitela ili sastava, opciono sa odgovarajućim uputstvima za upotrebu.

[0036] Podrazumeva se da je svako obeležje ili otelotvorenje ili kombinacija, opisano ovde, neograničavajući, ilustrativni primer bilo kog aspekta pronalaska i, kao takvo, zamišljeno je da se može kombinovati sa bilo kojim drugim svojstvom ili aspektom, ili kombinacijom, ovde opisanih. Na primer, gde su karakteristike opisane jezikom kao što su "jedno otelotvorenje", "neka otelotvorenja", "određena otelotvorenja", "dalja otelotvorenja", "specifične primeri otelotvorenja" i/ili "drugo otelotvorenje", svaki od ovih tipova otelotvorenja su neograničavajući primer svojstva koje je namenjeno kombinovanju sa bilo kojim drugim svojstvom ili kombinacijom obeležja, opisanih ovde, bez navođenja svih mogućih kombinacija. Takve karakteristike ili kombinacije obeležja primenjuju se na bilo koji aspekt pronalaska. Tamo gde su obelodanjeni primeri vrednosti koje spadaju u opsege, bilo koji od ovih primera se razmatra kao moguće krajnje tačke opsega, razmatraju se sve i sve numeričke vrednosti između takvih krajnjih tačaka, a predviđene su sve kombinacije gornjih i donjih krajnjih tačaka.

KRATAK OPIS SLIKA

[0037]

Slika 1 je grafik koji prikazuje konkurenciju vezivanja TGFβ1 za rhLAP pomoću antitela na TGFβ. Slika 2 prikazuje neutralizaciju pSMAD signalizacije u ćelijama pomoću antitela na TGFβ. (A) TGFβ1; (B) TGFβ2; (C) TGFβ3.

Slika 3 je grafik koji prikazuje inhibiciju regulatornih T ćelija (Treg) antitelima na TGFβ.

Slika 4 je grafik koji prikazuje inhibiciju tumora u modelu ksenografta miša pomoću TGFβ antitela. Slika 5 je grafik koji prikazuje inhibiciju tumora u modelu ksenografta miša pomoću TGFβ antitela. Slika 6 je grafik koji prikazuje inhibiciju tumora u singenom modelu miša pomoću TGFβ antitela. Slika 7 je grafik koji prikazuje inhibiciju tumora u singenom modelu miša pomoću TGFβ antitela. Slika 8 je grafik koji prikazuje inhibiciju tumora u singenom modelu miša pomoću TGFβ antitela. Slika 9 je grafik koji prikazuje inhibiciju tumora u singenom modelu miša pomoću TGFβ antitela. Slika 10 je grafik koji prikazuje in vivo efekat TGFβ antitela na prirodne ćelije ubice u tumorima, u modelu singenog mišijeg tumora.

Slika 11 je grafik koji prikazuje in vivo efekat TGFβ antitela na ćelijama supresorima dobijenim mijeloidima u tumorima, u modelu singenog miša.

Slika 12 je grafik koji prikazuje in vivo efekat TGFβ antitela na dendritične ćelije ubice u tumorima, u modelu singenog mišijeg tumora.

Slika 13 je grafik koji prikazuje in vivo efekat TGFβ antitela na regulatorne T ćelije ubice u tumorima, u modelu singenog mišijeg tumora.

Slika 14 je grafik koji prikazuje in vivo efekat TGFβ antitela na citotoksične T ćelije u tumorima, u modelu singenog mišijeg tumora.

Slika 15 je grafik koji prikazuje in vitro efekte antitela na TGFβ na citolitičku aktivnost NK ćelija.

Slika 16 je grafik koji prikazuje efekat TGFβ antitela na proliferaciju T ćelija.

Slika 17 je grafik koji prikazuje efekat TGFβ antitela na CTL aktivaciju procenjenu ekspresijom granzima B (GzmB) (Slika 17A) i perforina (Slika 17B).

Slika 18 je grafik koji prikazuje efekat TGFβ antitela na nivoe azota uree u serumu (BUN) u serumu u CsA tretiranih ili kontrolnih životinja kojima je davano antitelo na TGFβ.

Slika 19 je grafik koji prikazuje efekat TGFβ antitela na akumulaciju albumina, što je karakteristično za glomerularnu disfunkciju u bolesnom bubregu, u urinu CsA tretiranih ili kontrolnih životinja kojima su davana antitela na TGFβ.

Slika 20 je grafik koji prikazuje efekat TGFβ antitela na nivo kolagena tipa IV u urinu, koji odražava stepen taloženja ECM-a i fibroze u bubrezima, u urinu CsA tretiranih ili kontrolnih životinja kojima je davano antitelo na TGFβ.

Slika 21 je grafik koji prikazuje efekat TGFβ antitela na ekspresiju gena uključenih u fibrozu prema proceni kvantitativne RT-PCR izvršene na tkivu bubrega. Efekti na ekspresiju TGF-β1 (Slika 21A) i kolagena tipa III (Slika 21B) procenjeni su kod CsA tretiranih ili kontrolnih životinja kojima su davana antitela na TGFβ.

Slika 22 je grafik koji prikazuje efekat TGFβ antitela na povećanje pSMAD2 u ćelijama pigmentnog epitela retine (RPE) nakon davanja TGFβ1.

DETALJNI OPIS

[0038] Predmetno obelodanjivanje pruža terapiju za lečenje stanja ili poremećaja povezanih sa ekspresijom TGFβ, na primer, raka i fibroze. Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje molekule ili sredstva koja stupaju u interakciju sa TGFβ i inhibiraju jedan ili više njegovih funkcionalnih efekata, kao što je na primer signalizacija preko vezujućih partnera TGFβ. Sastavi koji su ovde obelodanjeni imaju prednost da moduliraju aktivnost imunih ćelija u tumorima, pružajući na taj način lečenje raka utičući na populaciju ćelija koja direktno ili indirektno utiče na rast tumora. Pronalazak je kao što je definisano patentnim zahtevima.

[0039] Da bi se obelodanjivanje moglo potpunije razumeti, izloženo je nekoliko definicija.

[0040] Kako se ovde koristi, "cilj" ili "ciljni antigen" se odnosi na bilo koji ili sve molekule TGF-β, uključujući TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3.

[0041] Kako se ovde koristi, "TGFβ" se odnosi na bilo koju jednu ili više izoforma TGFβ, uključujući TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3 ili njihove varijante. Slično, termin "TGFβ receptor", osim ako nije drugačije naznačeno, odnosi se na bilo koji receptor koji vezuje najmanje jednu izoformu TGFβ

[0042] Kako se ovde koristi, "željena biološka aktivnost" antitela protiv cilja je sposobnost da se vezuje za TGFβ i inhibira jedan ili više njegovih funkcionalnih efekata.

[0043] Kako se ovde koristi, "stanje" ili "poremećaj povezan sa ekspresijom cilja" je stanje ili poremećaj u kojem je ciljna aktivnost štetna i uključuje bolesti i druge poremećaje kod kojih se pokazalo da su visoki ciljevi ili se sumnja da su odgovoran za patofiziologiju poremećaja ili faktor koji doprinosi pogoršanju poremećaja, kao i za bolesti i druge poremećaje kod kojih su visoki nivoi ekspresije cilja povezani sa nepoželjnim kliničkim znacima ili simptomima. Takvi poremećaji se mogu dokazati, na primer, povećanjem nivoa lučene mete i/ili na ćelijskoj površini i/ili pojačanom signalizacijom u zahvaćenim ćelijama ili tkivima ispitanika koji pati od poremećaja. Povećanje ciljnih nivoa može se otkriti, na primer, korišćenjem antitela specifičnog za metu, kako je ovde opisano.

[0044] Primeri bolesti, stanja ili poremećaja povezanih sa ekspresijom TGFβ koji se mogu lečiti supstancom antitela koja vezuje TGFβ (npr., antitela prema predmetnom obelodanjivanju) uključuju karcinom, kao što su rak pluća, rak prostate, rak dojke, hepatocelularni karcinom, rak jednjaka, kolorektalni karcinom, rak pankreasa, rak bešike, rak bubrega, rak jajnika, rak želuca, fibrozni rak, gliom i melanom, bolesti oka (npr.

očne, optičke, oftalmološke ili oftalmološke) bolesti, stanja ili poremećaji, oboljenja ili poremećaji povezani sa fibroze, npr. fibroproliferativne bolesti, stanja ili poremećaji, ili bolesti, stanja ili poremećaji koji imaju pridruženu fibrozu.

[0045] Fibroproliferativne bolesti, stanja ili poremećaji ili bolesti stanja ili poremećaja povezanih sa fibrozom uključuju one koje utiču na bilo koji organ ili tkivo u telu, uključujući, ali ne ograničavajući se na kožu, pluća, bubrege, srce, mozak i oko. Fibroproliferativne bolesti, stanja ili poremećaji ili bolesti koje imaju pridruženu fibrozu uključuju, ali nisu ograničene na, plućnu fibrozu, idiopatsku plućnu fibrozu, peribronhiolarnu fibrozu, intersticijalnu bolest pluća, hroničnu opstruktivnu bolest pluća (COPD), bolesti malih disajnih puteva (npr. opstruktivni bronhiolitis), emfizem, odrasli ili akutni respiratorni distres sindrom (ARDS), akutna povreda pluća (ALI), plućna fibroza uzrokovana infektivnim ili toksičnim uzročnicima, fibroza bubrega, glomerulonefritis (GN) svih etiologija, npr., mezangijalna proliferativna GN, imunološka GN i polumesečna GN, glomeruloskleroza, tubulointersticijska povreda, intersticijska fibroza bubrega, fibroza bubrega i svi uzroci bubrežne intersticijalne fibroze, bubrežna fibroza koja je rezultat komplikacija izloženosti lekovima, uključujući lečenje ciklosporina primalaca transplantata, npr. lečenje ciklosporinom, nefropatija povezana sa HIV-om, transplantaciona nefropatija, dijabetička bolest bubrega (npr. dijabetička nefropatija), nefrogena sistemska fibroza, dijabetes, idiopatska retroperitonealna fibroza, skleroderma, fibroza jetre, bolesti jetre povezane sa prekomernim ožiljcima i progresivna skleroza, uključujući cirozu jetre zbog svih etiologija, poremećaje bilijarnog stabla, disfunkciju jetre koja se može pripisati infekcijama, fibrocistične bolesti, kardiovaskularne bolesti, poput kongestivne otkazivanje srca; proširena kardiomiopatija, miokarditis, vaskularna stenoza srčana fibroza (npr. postinfarktna srčana fibroza), post infarkt miokarda, hipertrofija leve komore, venookluzivna bolest, restenoza (npr. post-angioplastična restenoza), otkazivanje arteriovenskog grafta, hipertenzija, hipertenzija, hipertenzivna bolest srca, hipertrofija srca, hipertrofična kardiomiopatija, srčana insuficijencija, bolest aorte, progresivna sistemska skleroza, polimiozitis, sistemski eritematozni lupus, dermatomiozitis, Rainaudov sindrom, reumatoidni artritis, proliferativna vitreoretinopatija, vitreoretinopatija bilo koje etiologije ili fibroze povezane sa hirurgijom oka, kao što je lečenje glaukoma, mrežnjača, ekstrakcija katarakte ili bilo kakve vrste drenaže, ožiljci na rožnjači i konjunktivi, fibroza u endotelu rožnjače, opekotine lužina (npr. lužine do rožnjače), fibroza kapsule sočiva nakon operacije katarakte, višak ožiljka tkiva oko ekstraokularnih mišića u operaciji strabizma, prednja subkapsularna katarakta i zamagljivanje zadnje kapsule, fibrotične bolesti prednjeg segmenta oka, fibroza strome rožnjače (npr. povezana sa zamućenjem rožnjače), fibroza trabekularne mreže (npr. povezana sa glaukomom), fibrozne bolesti oka zadnjeg segmenta , fibrovaskularni ožiljci (npr. u retinalnoj ili horoidnoj vaskulaturi oka), retinalna fibroza, epiretinalna fibroza, glioza retine, subretinalna fibroza (npr. povezana sa starosnom makularnom degeneracijom), fibroza povezana sa post retinalnom i glaukomskom operacijom, trakciono odvajanje mrežnjače povezano sa kontrakcijom tkiva kod dijabetičke retinopatije, Peironiejeve bolesti, sistemske skleroze, post-kičmene moždine, osteoporoze, Camurati-Engelmannove bolesti, Kronove bolesti, ožiljaka, Marfanovog sindroma, prevremenog zatajenja jajnika, Alchajmerove bolesti i Parkinsonove bolesti, fibroza usled hirurških rezova ili mehaničkih trauma, fibroza povezana sa hirurgijom oka; i prekomerno ili hipertrofično stvaranje ožiljka ili keloida u dermisu koji se javlja tokom zarastanja rana nastalih usled traume ili hirurških rana.

[0046] Primerne očne bolesti (npr., očne, optičke, oftalmološke ili oftalmološke bolesti), stanja ili poremećaji, uključuju, ali se ne ograničavaju na njih, fibroproliferativne poremećaje, fibrozu oka, oftalmološke fibroze, disfunkciju mrežnjače, fibrozu povezanu sa disfunkcijom mrežnjače, vlažnu ili suvu makularna degeneracija, proliferativna vitreoretinopatija, vitreoretinopatija bilo koje etiologije, fibroza povezana sa hirurgijom oka, kao što je lečenje glaukoma, mrežnjača, ekstrakcija katarakte, ili postupci drenaže bilo koje vrste, ožiljci u rožnjači i konjunktivi, fibroza u endotelu rožnjače, opekotine alkalija (na primer, alkalne opekotine do rožnjače), fibroza kapsule sočiva nakon operacije katarakte, višak ožiljaka u tkivu oko ekstraokularnog područja mišići u operaciji strabizma, prednja subkapsularna katarakta i zamućenje zadnje kapsule, fibrotične bolesti oka prednjeg segmenta, fibroza strome rožnjače (npr. povezana sa zamućenjem rožnjače), fibroza trabekularne mreže (npr. povezana sa glaukomom), fibrotične bolesti zadnjeg segmenta oka, fibrovaskularni ožiljci (npr. u retini) ili horoidalna vaskulatura oka), retinalna fibroza, epiretinalna fibroza, retinalna glioza, subretinalna fibroza (npr. povezana sa starosnom degeneracijom makule), fibroza povezana sa post retinalnom i glaukomskom operacijom, trakciono odvajanje mrežnjače povezano sa kontrakcijom tkiva kod dijabetičke retinopatije.

[0047] Primeri fibroproliferativne bolesti, stanja ili poremećaja oka, fibroze oka, očne fibroze ili oftalmološke fibroze uključuju, ali nisu ograničeni na, proliferativnu vitreoretinopatiju, vitreoretinopatiju bilo koje etiologije, fibrozu povezanu sa disfunkcijom mrežnjače, fibrozu povezanu sa vlažnom ili suvom. makularna degeneracija, fibroza povezana sa hirurgijom oka, kao što je lečenje glaukoma, ponovno povezivanje mrežnjače, ekstrakcija katarakte ili bilo koje vrste drenažnih procedura, ožiljci u rožnjači i konjunktivi, fibroza u endotelu rožnjače, fibroza povezana sa opekotinama alkalija, operacija nakon katarakte fibroza kapsula sočiva, višak ožiljka tkiva oko ekstraokularnih mišića u operaciji strabizma, prednja subkapsularna katarakta i zamagljivanje zadnje kapsule, fibrotične bolesti prednjeg segmenta oka, fibroza strome rožnjače (npr. povezana sa zamućenjem rožnjače), fibroza trabekularne mreže (npr. povezana sa glaukomom), fibrozne bolesti oka zadnjeg segmenta , fibrovaskularni ožiljci (npr. u retinalnoj ili horoidalnoj vaskulaturi oka), retinalna fibroza, epiretinalna fibroza, retinalna glioza, subretinalna fibroza (na primer, povezana sa starosnom makularnom degeneracijom), fibroza povezana sa post retinalnom i glaukomskom operacijom, trakciono odvajanje mrežnjače povezano sa kontrakcijom tkiva kod dijabetičke retinopatije.

[0048] U različitim otelotvorenjima, fibroproliferativna bolest, stanje ili poremećaj oka je izabran iz grupe koju čine proliferativna vitreoretinopatija, fibroza povezana sa hirurgijom oka, fibroza sočiva nakon operacije katarakte, fibroza strome rožnjače i opekotina lužine.

[0049] "Imunoglobulin" ili "izvorno antitelo" je tetramerni glikoprotein. U imunoglobulinu koji se javlja u prirodi, svaki tetramer se sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, od kojih svaki par ima jedan "lagani" (oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje promenljivo područje od oko 100 do 110 ili više aminokiselina, prvenstveno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region prvenstveno odgovornu za efektorsku funkciju. Humani lagani lanac je klasifikovan kao kapa (κ) i lambda (λ) lanac. Teški lanci su klasifikovani kao mu (µ), delta (Δ), gama (γ), alfa (α) i epsilon (ε) i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. Unutar lakih i teških lanaca, promenljivi i konstantni regioni su spojeni sa "J" regionom od oko 12 ili više aminokiselina, pri čemu teški lanac takođe uključuje "D" region sa još oko 10 aminokiselina. Videti uopšteno, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Varijabilni regioni svakog para lakog/teškog lanca formiraju mesto vezivanja antitela tako da intaktni imunoglobulin ima dva mesta vezivanja.

[0050] Svaki teški lanac ima na jednom kraju promenljivi domen (VH) iza kojeg sledi niz konstantnih domena. Svaki laki lanac ima promenljiv domen na jednom kraju (VL) i konstantan domen na svom drugom kraju; konstantan domen lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, a promenljivi domen lakog lanca je poravnat sa promenljivim domenom teškog lanca. Veruje se da posebni aminokiselinski ostaci formiraju interfejs između varijabilnih domena lakog i teškog lanca (Chothia i dr., J. Mol. Biol.196:901-917, 1987).

[0051] Imunoglobulinski varijabilni domeni pokazuju istu opštu strukturu relativno očuvanih okvirnih regiona (FR) spojenih sa tri hipervarijabilne regione ili CDR-i. Od N-terminala do C-terminala, i laki i teški lanci sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dodeljivanje aminokiselina svakom domenu je u skladu sa definicijama Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), ili Chothia & Lesk, (J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987); Chothia i dr., (Nature 342:878-883, 1989).

[0052] Hipervarijabilni region antitela odnosi se na aminokiselinske ostatke CDR antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži aminokiselinske ostatke iz CDR-a [npr., ostatke 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 31-35 (H1), 50- 65 (H2) i 95-102 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca kako su opisali Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] i/ili oni ostaci iz hipervarijabilne petlje (npr., ostaci 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca kako je opisano [Chothia i dr., J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987)]. CDR-ovi su takođe identifikovani i numerisani prema ImMunoGenTics (IMGT) numeraciji (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. i dr., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003), koji opisuje lokacije CDR-a u varijabilnim domenima lakog i teškog lanca na sledeći način: CDR1, približno ostaci 27 do 38; CDR2, približno ostaci 56 do 65; i, CDR3, približno ostaci 105 do 116 (germinalna linija) ili ostaci 105 do 117 (preuređeni). U jednom otelotvorenju, razmatra se da se CDR nalaze na približno ostacima 26-31 (L1), 49-51 (L2) i 88-98 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i približno na ostacima 26-33 (H1) , 50-58 (H2) i 97-111 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca teškog ili lakog lanca antitela približno slične dužine onima koji su ovde opisani. Međutim, stručnjak u ovoj oblasti razume da se stvarna lokacija CDR ostataka može razlikovati od iznad navedenih projektovanih ostataka kada se identifikuje sekvenca određenog antitela.

[0053] Okvirni ili FR ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona.

[0054] "Varijabilni region teškog lanca", kako se ovde koristi, odnosi se na region molekula antitela koji sadrži najmanje jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) pomenutog varijabilnog domena teškog lanca antitela. Varijabilni region teškog lanca može sadržati jedan, dva ili tri CDR pomenutog teškog lanca antitela.

[0055] "Varijabilni region lakog lanca", kako se ovde koristi, odnosi se na region molekula antitela, koji sadrži najmanje jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) navedenog varijabilnog domena lakog lanca antitela. Varijabilni region lakog lanca može sadržati jedan, dva ili tri CDR navedenog lakog lanca antitela, koji može biti ili kappa ili lambda laki lanac u zavisnosti od antitela.

[0056] Termin "antitelo" se koristi u najširem smislu i uključuje potpuno sastavljena antitela, tetramerna antitela, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), fragmente antitela koji mogu vezati antigen (npr., Fab', F'(ab)2, Fv, jednolančana antitela, dijatela), i rekombinantni peptidi koji sadrže ostatak sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost. "Imunoglobulin" ili "tetramerno antitelo" je tetramerni glikoprotein koji se sastoji od dva teška lanca i dva laka lanca, od kojih svaki sadrži varijabilni region i konstantan region. Delovi koji se vezuju za antigen mogu se proizvesti tehnikama rekombinantne DNK ili enzimskim ili hemijskim cepanjem netaknutih antitela. Fragmenti antitela ili delovi koji se vezuju za antigen uključuju, između ostalog, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, antitelo domena (dAb), fragmente regiona za određivanje komplementarnosti (CDR), antitela kalemljena na CDR, jednolančana antitela (scFv), fragmenti antitela sa jednim lancem, himerna antitela, dijatela, tri antitela, tetra antitela, mini tela, linearna antitela; helirajuće rekombinantno antitelo, tri ili jedno ili drugo antitelo, intratelo, nanotelo, mali modularni imunofarmaceutik (SMIP), fuzioni protein imunoglobulinskog domena koji vezuje antigen, kamelizovano antitelo, antitelo koje sadrži VHH, ili njegova varijanta ili derivat, i polipeptidi koji sadrže najmanje deo imunoglobulina koji je dovoljan za davanje specifičnog vezivanja antigena za polipeptid, kao što su jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest CDR sekvenci, sve dok antitelo zadrži željenu biološku aktivnost.

[0057] "Monoklonalno antitelo" se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije znatno homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična, osim mogućih prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u manjim količinama.

[0058] "Varijanta antitela" kako se ovde koristi odnosi se na polipeptidnu sekvencu antitela koja sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju, deleciju ili umetanje u varijabilni region domena varijabilnog regiona referentnog antitela. Varijante mogu biti u suštini homologne ili u suštini identične nemodifikovanom antitelu.

[0059] "Himerno antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na sekvencu koja sadrži antitela izvedena iz dva različita antitela (videti, na primer., patent SAD br.4,816,567) koja tipično potiču od različitih vrsta. Najčešće, himerna antitela obuhvataju fragmente antitela čoveka i glodara, generalno humane konstantne i mišje varijabilne regione.

[0060] "Neutralizujuće antitelo" je molekul antitela koji je u stanju da eliminiše ili značajno smanji biološku funkciju ciljnog antigena za koji se vezuje. Shodno tome, "neutralizirajuće" antitelo protiv cilja je sposobno da eliminiše ili značajno smanji biološku funkciju, kao što je aktivnost enzima, vezivanje liganda ili unutarćelijska signalizacija.

[0061] "Izolovano" antitelo je ono koje je identifikovano i odvojeno i/ili oporavljeno od komponente svog prirodnog okruženja. Zagađujuće komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi ometali dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu antitela i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvore. U poželjnim pristupima, antitelo će se prečistiti, (1) do više od 95 mas.% antitela kako je određeno Lovrijevom metodom, a najpoželjnije više od 99 mas.%, (2) do stepena dovoljnog da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje aminokiseline sekvencu upotrebom sekvenatora za predenje čaša, ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod uslovima redukcije ili smanjenja upotrebom Kumasi plave ili, poželjno, srebrne boje. Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ unutar rekombinantnih ćelija jer najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Uobičajeno, međutim, izolovano antitelo će se pripremiti najmanje jednim korakom prečišćavanja.

[0062] Kako se ovde koristi, antitelo koje se "specifično vezuje" je "specifično za metu", "specifično za" metu ili je "imunoreaktivno" sa ciljnim antigenom odnosi se na antitelo ili supstancu antitela koja veže ciljni antigen sa većim afinitetom nego sa sličnim antigeni. U jednom aspektu obelodanjivanja, polipeptidi koji se vezuju za metu, ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati, će se vezati sa većim afinitetom za ljudsku metu u poređenju sa njenim afinitetom vezivanja za metu drugih vrsta, tj. ali vezni polipeptidi koji prepoznaju i vezuju ortologe mete su u okviru predviđenog opsega.

1

[0063] Na primer, polipeptid koji je antitelo ili njegov fragment "specifičan" po svom srodnom antigenu ukazuje na to da varijabilne regije antitela prepoznaju i vezuju polipeptid od interesa sa uočljivom preferencijom (tj., sposobne da razlikuju polipeptid od interesa od drugih poznati polipeptidi iste porodice, zahvaljujući merljivim razlikama u afinitetu vezivanja, uprkos mogućem postojanju lokalizovanog identiteta sekvence, homologije ili sličnosti među članovima porodice). Razumeće se da specifična antitela mogu takođe stupiti u interakciju sa drugim proteinima (na primer, protein S. aureus A ili druga antitela u ELISA tehnikama) kroz interakcije sa sekvencama izvan varijabilnog regiona antitela, a posebno u konstantnom regionu molekul. Skrining testovi za određivanje specifičnosti vezivanja antitela za upotrebu u postupcima predmetnog obelodanjivanja su dobro poznati i rutinski se primenjuju u struci. Za sveobuhvatnu diskusiju o takvim testovima Harlow i dr. (Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Chapter 6. Antitela za upotrebu u postupcima mogu se proizvesti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici.

[0064] Termin "epitop" se odnosi na onaj deo bilo kog molekula koji je sposoban da prepozna i veže selektivno vezivno sredstvo na jednom ili više regiona za vezivanje antigena. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula, kao što su amino kiseline ili bočni lanci ugljenih hidrata i imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Epitopi koji se ovde koriste mogu biti susedni ili ne-susedni. Štaviše, epitopi mogu biti mimetički (mimotopi) po tome što sadrže trodimenzionalnu strukturu koja je identična epitopu koji se koristi za stvaranje antitela, a ipak ne sadrži nikakve ili samo neke od aminokiselinskih ostataka pronađenih u meti koji su korišćeni za stimulisanje imunološki odgovor antitela. Kako se ovde koristi, mimotop se ne smatra različitim antigenom od epitopa vezanog selektivnim vezujućim sredstvom; selektivno vezujuće sredstvo prepoznaje istu trodimenzionalnu strukturu epitopa i mimotopa.

[0065] Termin "derivat" kada se koristi u vezi sa supstancama antitela i polipeptidima predmetnog obelodanjivanja odnosi se na polipeptide hemijski modifikovane takvim tehnikama kao što su sveprisutnost, konjugacija sa terapeutskim ili dijagnostičkim sredstvima, obeležavanje (npr., sa radionuklidima ili različitim enzimima), vezivanje kovalentnog polimera kao što je pegilacija (derivatizacija polietilen glikolom) i umetanje ili supstitucija hemijskom sintezom aminokiselina kao što je ornitin, koje se obično ne javljaju u ljudskim proteinima. Derivati zadržavaju svojstva vezivanja nedovoljno privatizovanih molekula iz predmetnog obelodanjivanja.

[0066] "Otkriven deo" ili "oznaka" odnosi se na kompoziciju koja se može detektovati spektroskopskim, fotohemijskim, biohemijskim, imunohemijskim ili hemijskim sredstvima. Na primer, korisne oznake uključuju 32P, 35S, fluorescentne boje, reagense sa gustinom elektrona, enzime (npr., koji se obično koriste u ELISA), biotin-streptavadin, dioksigenin, haptene i proteine za koje su na raspolaganju antiserumi ili monoklonska antitela ili nukleinska molekuli kiseline sa sekvencom komplementarnom meti. Detektovani deo često generiše merljivi signal, kao što je radioaktivni, hromogeni ili fluorescentni signal, koji se može koristiti za kvantifikaciju količine vezanog otkrivenog dela u uzorku.

[0067] Termin "terapeutski efikasna količina" se ovde koristi za označavanje količine sastava specifične za cilj obelodanjivanja koja je efikasna za ublažavanje ili smanjenje simptoma ili znakova bolesti povezanih sa ekspresijom ciljnog proteina.

[0068] Termini "lečenje", "tretiranje" i "tretman", koji se koriste u vezi sa ovde navedenim postupcima, odnose se na uklanjanje, smanjenje, suzbijanje ili ublažavanje, privremeno ili trajno, delimično ili potpuno, kliničkog simptoma, manifestacije ili progresije događaj, bolest ili stanje povezano sa ekspresijom TGFβ. Takav tretman ne mora biti apsolutni da bi bio koristan.

[0069] Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje antitelo specifično za metu, koje može sadržati one primerne sekvence navedene u Tabeli 1, njegove fragmente, varijante i derivate, farmaceutske formulacije uključujući gorenavedeno antitelo specifično za metu, metode pripreme farmaceutskih formulacija i postupke lečenje pacijenata farmaceutskim formulacijama i jedinjenjima.

[0070] U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, imunoglobulini se mogu dodeliti različitim klasama, IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, koje se dalje mogu podeliti u podklase ili izotipove, npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate. Različiti izotipovi imaju različite efektorske funkcije; na primer, izotipi IgG1 i IgG3 imaju ADCC aktivnost. Ovde obelodanjeno antitelo, ako sadrži konstantan domen, može biti bilo koje od ovih podklasa ili izotipova.

[0071] Antitela pronalaska pokazuju afinitet vezivanja za TGFβ1 i TGFβ2 sa afinitetom Kd od 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, ii 10<-12>M ili manje, mereno korišćenjem tehnologije površinske plazmonske rezonance (SPR) (npr., instrument BIAcore 2000, koristeći opšte procedure koje je naveo proizvođač) ili kinetički test isključivanja. Podaci o afinitetu mogu se analizirati, na primer, postupkom Scatchard i dr., (Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660, 1949).

[0072] KinExA test kinetičke isključenosti može se koristiti za merenje afiniteta antitela za njegov antigen. KinExA tehnologija meri događaje vezivanja u fazi rastvora, umesto događaja vezivanja između faze rastvora i čvrste faze. Osim toga, dok mnoge metode za merenje događaja vezivanja zahtevaju da se barem jedan reaktant modifikuje imobilizacijom ili obeležavanjem, KinExA postupak ne zahteva modifikaciju molekula koji se proučavaju. Veruje se da postupak KinExA omogućava merenje šireg opsega konstanti vezivanja od drugih trenutno dostupnih metoda. Dodatni opis o KinExA uređajima i radu za karakterizaciju antitela dostupan je od proizvođača (Sapidine Instruments, Inc., Boise, ID) i može se naći u objavljenoj literaturi, na primer patent SAD br. 6,664,114 i Darling i dr., "Kinetic Exclusion Assay Technology: Characterization of Molecular Interactions." Assay and Drug Development Technologies, 2004, 2:647-657.

Transformacioni faktor rasta β

[0073] TGFβ je disulfidno povezan dimer koji se sintetiše kao preproprotein od oko 400 aminokiselina (aa) koji se deli pre sekrecije da bi proizveo zreo TGFβ. Fragment deljenja N-terminala, poznat kao "peptid povezan sa latencijom" (LAP), može ostati nekovalentno vezan za dimer, čime se inaktivira TGFβ. TGFβ izolovan in vivo, nalazi se pretežno u neaktivnom, "latentnom" obliku, tj., povezan sa LAP. Latentni TGFβ kompleks može se aktivirati na nekoliko načina, na primer, vezivanjem za receptor na ćelijskoj površini koji se naziva katjon-nezavisni receptor faktora rasta sličan manozi-6-fosfatu/insulinu. Vezivanje se odvija preko ostataka manoze-6-fosfata vezanih na mestima glikozilacije unutar LAP. Nakon vezivanja za receptor, TGFβ se oslobađa u zrelom obliku. Zreli, aktivni TGFβ se tada slobodno vezuje za svoj receptor i vrši svoje biološke funkcije. Glavni domen za vezivanje TGFβ u receptoru za TGFβ tipa II mapiran je u sekvencu od 19 aminokiselina (Demetriou i dr., J. Biol. Chem., 271:12755, 1996). Videti takođe patent SAD 7,867,496.

[0074] Trenutno postoji pet poznatih izoformi TGFβ (TGFβ1 do TGFβ5; TGFβ1-3 su sisari, TGFβ4 se nalazi u piletini; i TGFβ5 pronađeni u žabi), koji su svi međusobno homologni (60-80% identiteta), formiraju homodimere od oko 25 kDa i deluju na uobičajene receptore TGFβ (TGFβ-RI, TGFβ-RII, TGFβ-RIIB, i TGFβ-RIII). Strukturni i funkcionalni aspekti TGFβ, kao i TGFβ receptora, dobro su poznati u tehnici (videti, na primer, Cytokine Reference, eds. Oppenheim i dr., Academic Press, San Diego, Calif., 2001). TGFβ je dobro očuvan među vrstama. Na primer, aminokiselinske sekvence pacova i humanih zrelih TGFβ1 su skoro identične. Videti takođe patent SAD 7,867,496.

[0075] TGFβ1 igra važnu ulogu u procesu zarastanja rana u biološkim tkivima (New Engl. J. Med., Vol.331, p. 1286, 1994 and J. Cell. Biol., Vol.119, p.1017,1992). Na mestu ranjenog tkiva dolazi do bioloških reakcija kao što su infiltracija inflamatornih ćelija i ćelija fibroblasta, proizvodnja vanćelijskog matriksa (ECM) i vaskularizacija, te rast ćelija za naknadnu regeneraciju tkiva radi popravke povređenog tkiva. Videti takođe patent SAD 7,579,186.

[0076] Miševi sa nedostatkom TGFβ2 pokazuju značajne razvojne nedostatke, uključujući srčane, plućne, kraniofacijalne, udove, kičmu, oko, uho i urogenitalne nedostatke (Dunker i dr., Eur J Biol 267:6982-8, 2001). Miševi sa nedostatkom TGFβ3 pokazuju skoro 100% smrtnost 24 sata nakon rođenja. Ovi miševi pokazuju značajno oštećenje nepca i odloženi razvoj pluća (Dunker i dr., supra). TGFβ2 je takođe bio umešan u razvoj glaukom (Luthen-Driscoll, Experimental Eye Res 81:1-4, 2005), fibroze povezane sa Kronovom bolešću (Van Assche i dr., Inflamm Bowel Dis. 10:55-60, 2004), u lečenju rana i dijabetičkoj nefropatiji (Pohlers i dr., Biochim Biophys Acta 1792:746-56, 2009)

[0077] Uočeno je da mnogi humani tumori (deMartin i dr., EMBO J., 6: 3673 (1987), Kuppner i dr., Int. J. Cancer, 42: 562 (1988)) i mnoge ćelijske linije tumora (Derynck i dr., Cancer Res., 47: 707 (1987), Roberts i dr., Br. J. Cancer, 57: 594 (1988)) proizvode TGFβ i predlažu mogući mehanizam za te tumore da izbegnu normalan imunološki nadzor.

[0078] Ekspresija izoforme TGFβ u raku je složena i promenljiva sa različitim kombinacijama izoforma TGFβ koje imaju različite uloge u određenim vrstama raka. Videti npr., patent SAD 7,927,593. Na primer, TGFβ1 i TGFβ3 mogu igrati veću ulogu u raku jajnika i njegovoj progresiji od TGFβ2; dok je ekspresija TGFβ1 i TGFβ2 veća u tumorima hondrosarkoma višeg stepena od TGFβ3. Kod raka dojke kod ljudi, TGFβ1 i TGFβ3 su visoko izraženi, pri čemu se čini da je ekspresija TGFβ3 u korelaciji sa ukupnim preživljavanjem pacijenata sa metastazama u čvorovima i pozitivnom ekspresijom TGFβ3 imaju loše prognostičke ishode. Međutim, kod karcinoma debelog creva, TGFβ1 i TGFβ2 su izraženije od TGFβ3 i prisutni su u većim nivoima cirkulacije nego kod osoba bez raka. U gliomima, TGFβ2 je važan za migraciju ćelija.

[0079] Ekspresija TGFβ je takođe umešana u nastanak različitih fibroza tkiva, poput nefroskleroze, plućne fibroze i ciroze; kao i nastanak različitih stanja, kao što su hronični hepatitis, reumatoidni artritis, vaskularna restenoza i keloid kože. Predviđene fibroze, uključujući fibroze povezane sa bolešću ili poremećajem (npr. Fibroproliferativne bolesti ili poremećaji), ili lečenje bolesti ili poremećaja, uključuju, ali nisu ograničene na, plućnu fibrozu, idiopatsku plućnu fibrozu, peribronhiolarnu fibrozu, intersticijalnu bolest pluća, hronična opstruktivna plućna bolest (HOBP), bolest malih disajnih puteva (npr., opstruktivni bronhiolitis), emfizem, sindrom odrasle osobe ili akutni respiratorni distres (ARDS), akutna povreda pluća (ALI); plućna fibroza uzrokovana infektivnim ili toksičnim uzročnicima, fibroza bubrega, glomerulonefritis (GN) svih etiologija, npr., mezangijalna proliferativna GN, imunološka GN i polumesečna GN, glomeruloskleroza, tubulointersticijalna povreda, intersticijska fibroza bubrega, fibroza bubrega i svi uzroci bubrežne intersticijalne fibroza, bubrežna fibroza nastala usled komplikacija izloženosti lekovima, uključujući lečenje ciklosporina primaocima transplantacije, npr. lečenje ciklosporinom, nefropatija povezana sa HIV-om; transplantacijska nefropatija, dijabetička bolest bubrega (npr., dijabetička nefropatija), nefrogena sistemska fibroza, dijabetes, idiopatska retroperitonealna fibroza, skleroderma, fibroza jetre, bolesti jetre povezane sa prekomernim ožiljcima i progresivna skleroza, uključujući cirozu jetre zbog svih etiologija, poremećaje bilijarnog trakta drvo, disfunkcija jetre koja se pripisuje infekcijama, fibrocističnim bolestima, kardiovaskularnim bolestima, kao što je kongestivna srčana insuficijencija; proširena kardiomiopatija, miokarditis, vaskularna stenoza, srčana fibroza (npr., postinfarktna srčana fibroza), post infarkt miokarda, hipertrofija leve komore, venookluzivna bolest, restenoza (npr., post-angioplastična restenoza), otkazivanje arteriovenskog transplantata, hipertenzija, ateroskleroza , hipertenzivna bolest srca, hipertrofija srca, hipertrofična kardiomiopatija, srčana insuficijencija, bolest aorte, progresivna sistemska skleroza; polimiozitis, sistemski eritematozni lupus, dermatomiozitis, fašisti, Rainaudov sindrom, reumatoidni artritis, proliferativna vitreoretinopatija, vitreoretinopatija bilo koje etiologije, fibroza povezana sa hirurgijom oka, kao što je lečenje glaukoma, fibroza povezana sa disfunkcijom mrežnjače, retinalna retraktacija, retinalna procedura bilo koje vrste, ožiljci u rožnjači i konjunktivi, fibroza u endotelu rožnjače, fibroza povezana sa opekotinama alkalija, operacija nakon katarakte fibroza kapsule sočiva, višak ožiljka tkiva oko ekstraokularnih mišića u operaciji strabizma, prednja subkapsularna katarakta i zamućenje zadnje kapsule, fibrotične bolesti prednjeg segmenta oka, fibroza rožnjače (npr. povezane sa rožnjačom), fibroza trabekularne mreže (npr. povezana sa glaukomom), fibrotične bolesti oka zadnjeg segmenta, fibrovaskularni ožiljci (npr., u retinalnoj ili horoidalnoj vaskulaturi oka), retinalna fibroza, epiretinalna fibroza, retinalna glioza, subretinalna fibroza (npr., povezana sa starosnom degeneracijom makule), hirurgija nakon retine i glaukoma, trakciono odvajanje retine u vezi sa kontrakcijom tkivo kod dijabetičke retinopatije, Pejronijeve bolesti, sistemske skleroze, post-kičmene moždine, osteoporoze, Camurati-Engelmannove bolesti, Kronove bolesti, ožiljaka, Marfanovog sindroma, prevremenog otkaza jajnika, Alchajmerove bolesti i Parkinsonove bolesti, fibroze usled hirurških rezova ili mehaničke traume, fibroza povezana sa operacijom oka; i prekomerno ili hipertrofično stvaranje ožiljka ili keloida u dermisu koji se javlja tokom zarastanja rana nastalih usled traume ili hirurških rana.

[0080] Kod plućne fibroze i nefroskleroze, koncentracija TGFβ je visoka i dovodi do progresije morbidnih stanja, poput fibroze (Yamamoto i dr., Kidney Int.45:916-27, 1994 i Westergren-Thorsson i dr., J. Clin. Invest.

92:632-7, 1993). Pretpostavlja se da trajna povreda tkiva kontinuirano transdukuju signale za ekspresiju TGFβ, da potiskuje signal negativne regulacije za ekspresiju TGFβ pomoću ECM-a, ili izaziva oba događaja sinergistički kod plućne fibroze i nefroskleroze. Suzbijanje aktivnosti TGFβ i akumulacija ekstracelularnog matriksa u dijagnostici i lečenju fibrotičnih bolesti, upotrebom inhibitora TGFβ, obelodanjeno je u WO 1991/04748, WO 1993/10808 i WO 2000/40227. Neutralizujuća anti-TGF-beta antitela korišćena su u lečenju eksperimentalne dijabetičke bolesti bubrega (Han and Ziyadeh, Peritoneal dialysis international, 19 Suppl 2: S234-237 (1999)). Videti takođe patent SAD 7,527,791 koji dalje opisuje upotrebu inhibitora TGFβ u različitim indikacijama.

[0081] Primerne očne bolesti (npr. Očne, optičke, oftalmološke ili oftalmološke bolesti), stanja ili poremećaji, uključuju, ali se ne ograničavaju na njih, fibroproliferativne poremećaje, fibrozu oka, oftalmološke fibroze, disfunkciju mrežnjače, fibrozu povezanu sa disfunkcijom mrežnjače, vlažnu ili suvu makularna degeneracija, proliferativna vitreoretinopatija, vitreoretinopatija bilo koje etiologije, fibroza povezana sa hirurgijom oka, kao što je lečenje glaukoma, mrežnjača, ekstrakcija katarakte, ili postupci drenaže bilo koje vrste, ožiljci u rožnjači i konjunktivi, fibroza u endotelu rožnjače, opekotine alkalija (na primer, alkalne opekotine do rožnjače), fibroza kapsule sočiva nakon operacije katarakte, višak ožiljaka u tkivu oko ekstraokularnog područja mišići

1

u operaciji strabizma, prednja subkapsularna katarakta i zamućenje zadnje kapsule, fibrotične bolesti oka prednjeg segmenta, fibroza strome rožnjače (npr. povezana sa zamućenjem rožnjače), fibroza trabekularne mreže (npr. povezana sa glaukomom), fibrotične bolesti zadnjeg segmenta oka, fibrovaskularni ožiljci (npr. u retini) ili horoidalna vaskulatura oka), retinalna fibroza, epiretinalna fibroza, retinalna glioza, subretinalna fibroza (npr. povezana sa starosnom degeneracijom makule), fibroza povezana sa post retinalnom i glaukomskom operacijom, trakciono odvajanje mrežnjače povezano sa kontrakcijom tkiva kod dijabetičke retinopatije.

[0082] Primeri fibroproliferativne bolesti, stanja ili poremećaja oka, fibroze oka, očne fibroze ili oftalmološke fibroze uključuju, ali nisu ograničeni na, proliferativnu vitreoretinopatiju, vitreoretinopatiju bilo koje etiologije, fibrozu povezanu sa disfunkcijom mrežnjače, fibrozu povezanu sa vlažnom ili suvom. makularna degeneracija, fibroza povezana sa hirurgijom oka, kao što je lečenje glaukoma, ponovno povezivanje mrežnjače, ekstrakcija katarakte ili bilo koje vrste drenažnih procedura, ožiljci u rožnjači i konjunktivi, fibroza u endotelu rožnjače, fibroza povezana sa opekotinama alkalija, operacija nakon katarakte fibroza kapsula sočiva, višak ožiljka tkiva oko ekstraokularnih mišića u operaciji strabizma, prednja subkapsularna katarakta i zamagljivanje zadnje kapsule, fibrotične bolesti prednjeg segmenta oka, fibroza strome rožnjače (npr. povezana sa zamućenjem rožnjače), fibroza trabekularne mreže (npr. povezana sa glaukomom), fibrozne bolesti oka zadnjeg segmenta , fibrovaskularni ožiljci (npr. u retinalnoj ili horoidalnoj vaskulaturi oka), retinalna fibroza, epiretinalna fibroza, retinalna glioza, subretinalna fibroza (na primer, povezana sa starosnom makularnom degeneracijom), fibroza povezana sa post retinalnom i glaukomskom operacijom, trakciono odvajanje mrežnjače povezano sa kontrakcijom tkiva kod dijabetičke retinopatije.

[0083] U različitim otelotvorenjima, fibroproliferativna bolest, stanje ili poremećaj oka je izabran iz grupe koju čine proliferativna vitreoretinopatija, fibroza povezana sa hirurgijom oka, fibroza sočiva nakon operacije katarakte, fibroza strome rožnjače i opekotina lužine.

Polipeptidi antitela

[0084] Predmetno obelodanjivanje obuhvata molekule aminokiselina koje kodiraju antitela specifična za metu. U primerima otelotvorenja, ciljno specifično antitelo iz ovog otkrića može sadržati humanu kapu (k) ili humani lambda (λ) laki lanac ili aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz nje, ili humani lanac ili sekvencu izvedenu iz nje, ili obe teške i laki lanci zajedno u jednom lancu, dimernom, tetramernom ili drugom obliku. U nekim otelotvorenjima, teški lanac i laki lanac imunoglobulina specifičnog za metu su različiti molekuli aminokiselina. U drugim otelotvorenjima, isti molekul aminokiseline sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca ciljnog specifičnog antitela.

[0085] Aminokiselinska sekvenca humanog anti-ciljnog antitela sadrži CDR-ove aminokiselinske sekvence zrele (tj., nestale signalne sekvence) varijabilnog regiona lakog lanca (VL) antitela XPA.42.089 navedene u SEQ ID NO: 8 ili njihove varijante, uključujući CDR kalemljena, modifikovana, humanizovana, himerna ili antitela proizvedena od strane čoveka ili bilo koje druge varijante opisane ovde. U nekim otelotvorenjima, VL sadrži aminokiselinsku sekvencu od početka CDR1 do kraja CDR3 lakog lanca bilo kog od iznad navedenih antitela.

[0086] Antitelo specifično za humanu metu sadrži CDR-ove aminokiselinske sekvence zrelog (tj., nestale signalne sekvence) varijabilnog regiona teškog lanca (VH) antitela XPA.42.089 navedenog u SEQ ID NO: 6 ili njihove varijante. U nekim otelotvorenjima, VH sadrži aminokiselinsku sekvencu od početka CDR1 do kraja CDR3 bilo kog od teških lanaca navedenih antitela.

[0087] U nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je antitelo koje sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje oko 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%ili više identično varijabilnom regionu teškog lanca navedenom u SEW ID NO: 6 i/ili aminokiselinska sekvenca aminokiselinska sekvenca najmanje oko 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% , 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%ili više identična varijabilnom regionu lakog lanca navedenom u SEQ ID NO: 8 , antitelo koje sadrži sve HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 ili LCDR3.

[0088] U srodnom otelotvorenju, ostaci okvira su promenjeni. Regioni okvira čitanja teškog lanca koja se mogu promeniti nalaze se u regionima označenim H-FR1, H-FR2, H-FR3 i H-FR4, koji okružuju ostatke CDR-a teškog lanca, i ostatke okvira lakih lanaca koji se mogu promeniti leže unutar regiona označenih L-FR1, L-FR2, L-FR3 i L-FR4, koji okružuju CDR ostatke lakog lanca. Aminokiselina u okviru okvira može se zameniti, na primer, bilo kojom pogodnom aminokiselinom identifikovanom u okviru čoveka ili u okviru ljudskog konsenzusa.

[0089] U nekim od različitih antitela koja su ovde obelodanjena, ovde opisano antitelo na TGFp specifično vezuje najmanje jednu izoformu TGFβ izabranu iz grupe koju čine TGFβ1, TGFβ2, and TGFβ3. U drugim, antitelo na TGFp se specifično vezuje: (a) TGFβ1, TGFβ2, i TGFβ3 ("pan-reaktivno antitelo" ili "pan-vezujuće antitelo"); (b) TGFβ1 i TGFβ2; (c) TGFβ1 i TGFβ3; i (d) TGFβ2 i TGFβ3. U drugim, ovde opisano antitelo na TGFp vezuje najmanje jednu izoformu TGFβ sa afinitetom od 10<-6>M, 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, ili 10<-12>M ili manje (niže znači veći afinitet vezivanja), ili opciono vezuje dve izoforme TGFβ, ili sve TGFβ1, 2 ili 3 sa afinitetom 10<-6>M. 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M 10<-10>M, 10<-11>M, ili 10<-12>M ili manje za jednu ili više izoformi. U drugim otelotvorenjima, ovde opisano antitelo se vezuje za TGFβ1 i TGFβ2 sa najmanje 2-50 puta, 10-100 puta, 2 puta, 5 puta, 10 puta, 25 puta, 50 puta ili 100 puta, ili 20-50%, 50-100%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100% veći afinitet (npr., preferencijalno se vezuje za TGFβ1 i TGFβ2) u poređenju sa vezivanjem za TGFβ3. Ovde opisano antitelo može vezati svaku od TGFβ izoformi TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3 sa afinitetom unutar 3, 5 ili 10 puta jedno prema drugom.

[0090] U nekim otelotvorenjima, neutralizacija antitela TGFβ1 i TGFβ2 je najmanje 2-50 puta, 10-100 puta, 2, 5, 10, 10, 25, 50 ili 100 puta, ili 2050%, 50-100%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%ili 100%snažnije od neutralizacije TGFβ3.

[0091] Aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca XPA.42.089 navedene su u SEQ ID NO: 6 i 8, respektivno. Aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca XPA.42.068 navedene su u SEQ ID NO: 2, odnosno 4, i aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca XPA.42.681 navedene su u SEQ ID NO: 10 i 12, respektivno.

Nukleinske kiseline antitela

[0092] Predmetno obelodanjivanje takođe obuhvata molekule nukleinske kiseline koji kodiraju antitela specifična za metu. U nekim otelotvorenjima, različiti molekuli nukleinske kiseline kodiraju varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca specifičnog ciljnog antitela. U drugim otelotvorenjima, isti molekul nukleinske kiseline kodira varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca specifičnog ciljnog antitela. U jednom otelotvorenju, nukleinska kiselina kodira specifično ciljno antitelo prema predmetnom obelodanjivanju, kao i bilo koji od polipeptida kodiranih nukleinskim kiselinama opisanim ovde.

[0093] U jednom aspektu, molekul nukleinske kiseline prema ovom otkriću sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira VL aminokiselinsku sekvencu antitela XPA.42.089 navedenu u SEQ ID NO: 8 ili njegov deo. U srodnom aspektu, sekvenca aminokiselina VL je konsenzusna sekvenca.

[0094] U jednom otelotvorenju, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje jedinjenja koja se vezuju za antigen, uključujući funkcionalne fragmente, sa aminokiselinskom sekvencom varijabilnog regiona navedenom u SEQ ID NO: 6 i 8. U srodnom otelotvorenju, prethodno pomenuto jedinjenje za vezivanje antigena je izabrano iz grupe koju čine potpuno sastavljena tetramerna antitela, monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo; humano antitelo; himerno antitelo; multispecifično antitelo, fragment antitela, Fab, F(ab')2; Fv; scFv ili jednolančani fragment antitela; dijatelo; triatela, tetratelo, mini telo, linearno antitelo; helirajuće rekombinantno antitelo, tri ili jedno ili više antitela, intratelo, nanotelo, mali modularni imunofarmaceutik (SMIP), fuzijski protein imunoglobulina sa vezivnim domenom, kamelizovano antitelo, antitelo koje sadrži VHH ili varijanta ili derivat bilo kog od ovih antitela, koja pokazuju željenu biološku aktivnost, ili mešavina dva ili više antitela.

[0095] U jednom aspektu, antitela prema predmetnom obelodanjivanju sadrže varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca kako je navedeno u aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 8, respektivno.

[0096] U još jednom otelotvorenju, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 6 i varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 8.

[0097] U srodnom aspektu, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 8. U jednom otelotvorenju, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 7. Molekuli nukleinske kiseline iz predmetnog obelodanjivanja dalje uključuju sve sekvence nukleinskih kiselina, uključujući sekvence u SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 i 11 i sekvence nukleinskih kiselina sadrže degenerisane kodone zasnovane na raznolikosti genetskog koda, kodirajući aminokiselinsku sekvencu varijabilnih regiona teškog i lakog lanca ovde opisanog antitela ili bilo kog HCDR ili LCDR ovde opisanih i kako je navedeno u SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 i 13-30, kao i

1

nukleinske kiseline koje se hibridiziraju pod izuzetno strogim uslovima, kao što su oni ovde opisani, u sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnih regiona teškog i lakog lanca ovde opisanog antitela ili bilo koji HCDR ili LCDR koji su ovde opisani, i kako je navedeno u SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 i 13-30.

[0098] U nekim otelotvorenjima, molekul nukleinske kiseline kodira sekvencu aminokiselina VL koja je najmanje 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 9697, 98 ili 99% identična do VL aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 8. Molekuli nukleinske kiseline iz predmetnog obelodanjivanja uključuju nukleinske kiseline koje se hibridiziraju pod veoma strogim uslovima, kao što su oni ovde opisani, u sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu lakog lanca varijabilnog regiona SEQ ID NO: 8, ili koja ima sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 7.

[0099] Dalje se razmatra da molekul nukleinske kiseline iz predmetnog obelodanjivanja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira VH aminokiselinsku sekvencu antitela XPA.42.089.

[0100] U srodnom aspektu, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 6. U jednom otelotvorenju, molekul nukleinske kiseline sadrži nukleotidnu sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 5.

[0101] U nekim otelotvorenjima, molekul nukleinske kiseline kodira sekvencu aminokiselina VL koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična do VH aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 6. U srodnom aspektu, sekvenca aminokiselina VH je konsenzusna sekvenca. Molekuli nukleinske kiseline iz predmetnog obelodanjivanja dalje uključuju nukleinske kiseline koje se hibridiziraju pod veoma strogim uslovima, kao što su oni ovde opisani, u sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu teškog lanca varijabilnog regiona SEQ ID NO: 6, ili koja ima sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 5.

[0102] Dalje se razmatra da nukleinske kiseline iz predmetnog obelodanjivanja mogu kodirati laki lanac ili teški lanac pune dužine antitela XPA.42.089 pri čemu laki lanac pune dužine ili teški lanac pune dužine sadrži konstantan region lakog lanca ili teški lanac konstantan region, respektivno, konstantni regioni lakog lanca opciono uključuju nemodifikovane ili modifikovane kappa ili lambda regione, a teški konstantni regioni uključuju nemodifikovane ili modifikovane konstantne regione bilo koje klase, kao što su IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD ili IgE.

[0103] U jednom aspektu, antitelo lakog lanca pune dužine sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 8. Dalje se razmatra da nukleotid koji kodira laki lanac pune dužine kodira sekvencu SEQ ID NO: 8, i sadrži sekvencu nukleotida navedenu u SEQ ID NO: 7.

[0104] U jednom aspektu, antitelo teškog lanca pune dužine sadrži sekvencu u SEQ ID NO 6. Dalje se razmatra da nukleotid koji kodira teški lanac pune dužine kodira teški lanac SEQ ID NO: 6 i sadrži sekvencu nukleotida navedenu u SEQ ID NO: 5.

[0105] U primerima otelotvorenja, antitelo iz predmetnog obelodanjivanja sadrži humanu kapu (k) ili humani lambda (λ) laki lanac ili aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz nje, ili humani lanac ili sekvencu izvedenu iz nje, ili obe teške i laki lanci zajedno u jednom lancu, dimernom, tetramernom ili drugom obliku.

Monoklonska antitela

[0106] Monoklonalno antitelo se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije znatno homogenih antitela Monoklonska antitela su generalno visoko specifična i mogu biti usmerena protiv jednog antigenskog mesta, za razliku od konvencionalnih (poliklonskih) preparata antitela koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv istih ili različitih determinanti (epitopa). Pored svoje specifičnosti, monoklonska antitela su povoljna i po tome što ih sintetiše homogena kultura, ne kontaminirana drugim imunoglobulinima sa različitim specifičnostima i karakteristikama.

[0107] Monoklonska antitela mogu se dobiti hibridomskim postupkom koju je prvi opisao Kohler i dr. (Nature, 256:495-7, 1975) (Harlow & Lane; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1988); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986), ili se mogu izraditi metodama rekombinantne DNK (videti, npr., patent SAD br.

4,816,567). Monoklonska antitela se takođe mogu izolovati iz biblioteka fagnih antitela koristeći tehnike opisane u, na primer, Clackson i dr., (Nature 352:624-628, 1991) i Marks i dr., (J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991). Dodatni postupci za proizvodnju monoklonskih antitela dobro su poznati prosečnim stručnjacima.

1

[0108] Monoklonska antitela, kao što su ona proizvedena iznad navedenim postupcima, prikladno su odvojena od medijuma za kulturu, ascitesne tečnosti ili seruma konvencionalnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina, kao što je, na primer, protein A-sefaroza, hromatografija sa hidrofobnom interakcijom (HIC), hromatografija sa jonskom izmenom, hromatografija hidroksiapatita, elektroforeza u gelu, dijaliza i/ili hromatografija sa afinitetom.

[0109] Dalje se razmatra da se antitela prema predmetnom obelodanjivanju mogu koristiti kao manji fragmenti antitela koji vezuju antigen koji su dobro poznati u tehnici i ovde opisani.

Fragmenti antitela

[0110] Fragmenti antitela sadrže deo netaknutog antitela pune dužine, poželjno vezujući antigen ili varijabilni region netaknutog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela (npr., scFv); fragmenti multispecifičnih antitela kao što su bispecifična, trispecifična itd. antitela (npr., dijatela, triatela, tetratela); minitela; helirajuća rekombinantno antitelo; triatela ili bitela; intratela; nanotela; mali modularni imunofarmaceutici (SMIP), fuzioni proteini vezujućeg domena imunoglobulina; kamelizovana antitela; antitela koja sadrže VHH; i druge polipeptide formirane iz fragmenata antitela. Videti na primer Holliger & Hudson (Nat. Biotech.23:1126-36 (2005)).

[0111] Papainska digestija antitela proizvodi dva identična fragmenta koji se vezuju za antigen, nazvane "Fab" fragmenti, monovalentni fragmenti koji se sastoje od domena VL, VH, CL i CH sa svakim po jednim mestom za vezivanje antigena, i zaostali "Fc" fragment, čije ime odražava njegovu sposobnost da se lako kristališe. Tretman pepsinom daje F(ab')2 fragment, dvovalentni fragment koji se sastoji od dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u šarkama, koji ima dva fragmenta antitela "jednolančani" ili "scFv" koji sadrže domene VH i VL antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Poželjno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava Fv da formira željenu strukturu za vezivanje antigena, što rezultira jednolančanim antitelom (scFv), u kome su VL i VH region upareni sa formiraju monovalentni molekul putem sintetičkog linkera koji im omogućava da se naprave kao jedan lanac proteina (Bird i dr., Science 242:423-426, 1988, i Huston i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). Za pregled scFv videti Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994). Fd fragment se sastoji iz VH i CH1 domena.

[0112] Dodatni fragmenti antitela uključuju fragment domena antitela (dAb) (Ward i dr., Nature 341:544-546, 1989) koji se sastoji od VH domena. Dijatela su dvovalentna antitela u kojima su VH i VL domeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali koristeći linker koji je prekratak da omogući uparivanje između dva domena u istom lancu, primoravajući tako domene da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanac i stvaranje dva mesta za vezivanje antigena (videti npr., EP 404,097; WO 93/11161; Holliger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993, i Poljak i dr., Structure 2:1121-1123, 1994). Dijatela mogu biti bispecifična ili monospecifična.

[0113] Funkcionalna antitela teškog lanca lišena lakih lanaca prirodno se javljaju kod morskih pasa (Greenberg i dr., Nature 374:168-73, 1995), ćilim ajkule (Nuttall i dr., Mol Immunol.38:313-26, 2001) i porodice kamila (Hamers-Casterman i dr., Nature 363: 446-8, 1993; Nguyen i dr., J. Mol. Biol. 275: 413, 1998), kao što su kamile, dromedari, alpake i lame. Mesto vezivanja antigena je redukovano na jedan domen, VHH domen, kod ovih životinja. Ova antitela formiraju regione koji se vezuju za antigen koristeći samo varijabilni region teškog lanca, tj., ova funkcionalna antitela su homodimeri teških lanaca samo sa strukturom H2L2 (nazivaju se "antitela teškog lanca" ili "HCAbs"). Kamelidni VHH se navodno rekombinuje sa IgG2 i IgG3 konstantnim regionima koji sadrže šarke, CH2 i CH3 domene i nemaju CH1 domen (Hamers-Casterman i dr., Gore). Na primer, lama IgG1 je konvencionalni (H2L2) izotip antitela u kome se VH rekombinuje sa konstantnim regionom koji sadrži šarke, CH1, CH2 i CH3 domene, dok su lama IgG2 i IgG3 izotipi samo u teškom lancu kojima nedostaju domeni CH1 i ne sadrže lake lance. Utvrđeno je da se kamelidni VHH domeni vezuju za antigen sa visokim afinitetom (Desmyter i dr., J. Biol. Chem.276:26285-90, 2001) i poseduju visoku stabilnost u rastvoru (Ewert i dr., Biochemistry 41:3628-36, 2002). Klasične fragmente samo za VH je teško proizvesti u rastvorljivom obliku, ali poboljšanja u rastvorljivosti i specifičnom vezivanju mogu se postići kada se ostaci okvira promene da budu više slični VHH. (Videti npr., Reichman, i dr., J Immunol Methods 1999, 231:25-38.) Postupci za generisanje antitela sa teškim lancima kamela opisani su, na primer, u Patentna objava SAD brs.

20050136049 i 20050037421.

[0114] Varijabilni domen teškog lanca antitela je najmanji potpuno funkcionalan fragment koji se vezuje za antigene sa molekulskom masom od samo 15 kDa, ovaj entitet se naziva nanotelo (Cortez-Retamozo i dr.,

1

Cancer Research 64:2853-57, 2004). Biblioteka nanotela može biti generisana iz imunizovanog dromedara kako je opisano u Conrath i dr., (Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001) ili korišćenjem rekombinantnih postupaka kako je opisano u Revets i dr, Expert Opin. Biol. Ther.5(1):111-24 (2005).

[0115] Proizvodnja bispecifičnog Fab-scFv ("bitela") i trispecifična Fab-(scFv)(2) ("tritela") opisana je u Schoonjans i dr. (J Immunol. 165:7050-57, 2000) i Willems i dr. (J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003). Za bitela ili tritela, molekul scFv je spojen sa jednim ili oba lanca VL-CL (L) i VH-CH1 (Fd), na primer, da bi se proizvelo tri telo, dva scFv su spojena na C-član Fab dok su u bibodi jedan scFv je spojen sa C-terminom Fab-a.

[0116] "Minitelo" koje se sastoji od scFv kondenzovanog sa CH3 preko peptidnog linkera (bez šarki) ili preko IgG šarke opisano je u Olafsen, i dr., Protein Eng Des Sel.17(4):315-23, 2004.

[0117] Intra antitela su jednolančana antitela koja pokazuju unutarćelijsku ekspresiju i mogu da manipulišu funkcijom unutarćelijskog proteina (Biocca, i dr., EMBO J.9:101-108, 1990; Colby i dr., Proc Natl Acad Sci U S A. 101:17616-21, 2004). Intratela, koja sadrže ćelijske signalne sekvence koje zadržavaju konstrukciju antitela u unutarćelijskim regionima, mogu se proizvesti kako je opisano u Mhashilkar i dr (EMBO J 14:1542-51, 1995) i Wheeler i dr. (FASEB J. 17:1733-5. 2003). Trans tela su antitela propusna za ćelije u kojima je domen transdukcije proteina (PTD) spojen sa antitelima jednolančanog varijabilnog fragmenta (scFv) Heng i dr., (Med Hypotheses.64:1105-8, 2005).

[0118] Dalje se razmatraju antitela koja su SMIP-ovi ili fuzioni proteini imunoglobulina vezivnog domena specifični za ciljni protein. Ovi konstrukti su jednolančani polipeptidi koji sadrže domene koji vezuju antigen spojeni sa domenima imunoglobulina neophodnim za obavljanje efektorskih funkcija antitela. Videti npr., WO03/041600, patentna objava SAD 20030133939 i Patentna objava SAD 20030118592.

Multispecifična antitela

[0119] U nekim otelotvorenjima, može biti poželjno generisanje multispecifičnog (npr., bispecifičnog) antitela protiv antitela koje ima specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita epitopa istih ili različitih molekula. Primeri bispecifičnih antitela mogu se vezati za dva različita epitopa ciljnog molekula. Alternativno, krak antitela specifičnog za cilj može se kombinovati sa krakom koji se veže za molekul ćelijske površine, kao što je molekul receptora T-ćelije (npr., CD2 ili CD3), ili Fc receptori za IgG (FciR), kao što je FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) i FcyRIII (CD16) kako bi se fokusirali ćelijski odbrambeni mehanizmi na metu. Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za lokalizaciju citotoksičnih sredstava u ćelije koje eksprimiraju ili preuzimaju cilj. Ova antitela poseduju krak koji se vezuje za metu i krak koji vezuje citotoksično sredstvo (npr., saporin, anti-interferon-60, vinka alkaloid, lanac ricin A, metotreksat ili radioaktivni izotop hapten). Bispecifična antitela mogu se pripremiti kao antitela pune dužine ili fragmenti antitela (npr., F(ab')2 bispecifična antitela).

[0120] Prema drugom pristupu za stvaranje bispecifičnih antitela, interfejs između para molekula antitela može se konstruisati tako da maksimizira procenat heterodimera koji se oporavljaju iz rekombinantne ćelijske kulture. Poželjni interfejs obuhvata najmanje deo CH3 domena konstantnog domena antitela. U ovom postupku, jedan ili više malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog molekula antitela zamenjeni su većim bočnim lancima (npr., tirozin ili triptofan). Kompenzatorne "šupljine" identične ili slične veličine velikom bočnom lancu (lancima) stvaraju se na interfejsu drugog molekula antitela zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjima (npr., alanin ili treonin). Ovo obezbeđuje mehanizam za povećanje prinosa heterodimera nad drugim neželjenim krajnjim proizvodima, poput homodimera. Videti WO96/27011.

[0121] Bispecifična antitela uključuju umrežena ili "heterokonjugovana" antitela. Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može biti vezano za avidin, drugo za biotin. Heterokonjugatna antitela mogu se napraviti bilo kojim prikladnim postupkom umrežavanja. Pogodna sredstva za umrežavanje dobro su poznata u tehnici i obelodanjena su u U.S. Pat. br.4,676,980, zajedno sa brojnim tehnikama umrežavanja.

[0122] Tehnike stvaranja bispecifičnih antitela iz fragmenata antitela takođe su opisane u literaturi. Na primer, bispecifična antitela se mogu pripremiti korišćenjem hemijskog povezivanja. Brennan i dr., (Science 229:81-83, 1985) opisuju postupak u kome se netaknuta antitela proteolitički dele da bi se generisali fragmenti F(ab')2. Ovi fragmenti se redukuju u prisustvu ditiol kompleksatora natrijum arsenita radi stabilizacije vicinalnih ditiola i sprečavanja stvaranja među molekulskog disulfida. Generisani Fab' fragmenti se zatim konvertuju u derivate tionitrobenzoata (TNB). Jedan od derivata Fab'-TNB se zatim ponovo pretvara u Fab'-tiol redukcijom sa merkaptoetilaminom i meša se sa ekvimolarnom količinom drugog derivata Fab'-TNB da bi se formiralo bispecifično antitelo. Proizvedena bispecifična antitela mogu se koristiti kao sredstva za selektivnu imobilizaciju enzima. U sledećem otelotvorenju, Fab'-SH fragmenti direktno izlučeni iz E. coli mogu se

1

hemijski spojiti in vitro da bi se formirala bispecifična antitela. (Shalaby i dr., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992))

[0123] Shalaby i dr., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) opišu proizvodnju molekula F(ab')2 potpuno humanizovanog bispecifičnog antitela. Svaki Fab' fragment je odvojeno izlučen iz E.coli i podvrgnut usmerenoj hemijskoj sprezi in vitro da se formira bispecifično antitelo. Tako formirano bispecifično antitelo je moglo da se veže za ćelije koje prekomerno eksprimiraju HER2 receptor i normalne humane T ćelije, kao i da pokrene litičku aktivnost humanih citotoksičnih limfocita na mete humanog tumora dojke.

[0124] Opisane su i različite tehnike za pravljenje i izolovanje fragmenata bispecifičnih antitela direktno iz rekombinantne ćelijske kulture. Na primer, bispecifična antitela su proizvedena pomoću leucinskih zatvarača. (Kostelny i dr., J. Immunol.148:1547-1553, 1992). Peptidi zatvarača leucina iz proteina Fos i Jun povezani su Fab' delovima dva različita antitela fuzijom gena. Homodimeri antitela su redukovani u šarkama u obliku monomera, a zatim su ponovo oksidovani da bi formirali heterodimere antitela. Ovaj postupak se takođe može koristiti za proizvodnju homodimera antitela. Tehnologiju "diatela" koju je opisao Hollinger i dr. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993) je obezbedio alternativni mehanizam za stvaranje fragmenata bispecifičnih antitela.

[0125] Fragmenti sadrže varijabilni region teškog lanca (VH) povezanu sa varijabilnom regijom lakog lanca (VL) pomoću veznika koji je prekratak da bi se omogućilo uparivanje između dva domena na istom lancu. Shodno tome, domeni VH i VL jednog fragmenta su prisiljeni da se uparuju sa komplementarnim VL i VH domenima drugog fragmenta, formirajući tako dva mesta za vezivanje antigena. Takođe je prijavljena druga strategija za stvaranje fragmenata bispecifičnih antitela upotrebom jednolančanih Fv (scFv) dimera. Videti Gruber i dr., J. Immunol.152: 5368 (1994).

[0126] Alternativno, bispecifično antitelo može biti "linearno antitelo" proizvedeno kako je opisano u Zapata i dr. Protein Eng. 8:1057-62 (1995). Linearna antitela sadrže par tandemskih Fd segmenata (VH-CH1-VH-CH1) koji čine par regiona za vezivanje antigena. Linearna antitela mogu biti bispecifična ili monospecifična.

[0127] U sledećem otelotvorenju, bispecifično antitelo može biti helatirajuće rekombinantno antitelo (CRAb). Helativno rekombinantno antitelo prepoznaje susedne i nepreklapajuće epitope ciljnog antigena i dovoljno je fleksibilno da se veže za oba epitopa istovremeno (Neri i dr., J Mol Biol.246:367-73, 1995).

[0128] Takođe se razmatraju antitela sa više od dve valencije. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela. (Tutt i dr., J. Immunol.147:60, 1991).

Himerna i humanizovana antitela

[0129] Pošto su himerna ili humanizovana antitela manje imunogena kod ljudi od roditeljskih ne-humanih (na primer, mišjih) monoklonskih antitela, mogu se koristiti za lečenje ljudi sa daleko manjim rizikom od anafilaksije.

[0130] Himerna monoklonska antitela, u kojima su promenljivi Ig domeni ne-humanog (na primer, miševog) monoklonskog antitela spojeni sa humanim konstantnim Ig domenima, mogu se generisati primenom standardnih procedura poznatih u tehnici (videti Morrison i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855 (1984); i, Boulianne i dr, Nature 312, 643-646, (1984)).

[0131] Humanizovana antitela se mogu postići različitim postupcima, uključujući, na primer: (1) kalemljenje ne-humanih regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) na ljudski okvir i stalni region (proces koji se u tehnici naziva humanizacijom putem "CDR kalemljenja"), (2) transplantacija čitavih promenljivih domena koji nisu humani, ali "prikrivanje" njih površinom sličnom čoveku zamenom površinskih ostataka (proces koji se u tehnici naziva "furniranje"), ili, alternativno, (3) zamenom humanih aminokiselina na položajima za koje je malo verovatno da će negativno uticati ili vezivanje antigena ili savijanje proteina, ali verovatno smanjuje imunogenost u ljudskom okruženju (npr., HUMAN ENGINEERING™). U ovom obelodanjivanju, humanizovana antitela će uključivati i "humanizovana", "furnirana" i "HUMAN ENGINEERED™" antitela. Ovi postupci su obelodanjeni u, npr.., Jones i dr., Nature 321:522525 (1986); Morrison i dr., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyer i dr., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun.28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immunol.31:169-217 (1994); Studnicka i dr. patent SAD br.5,766,886; Studnicka i dr., (Protein Engineering 7: 805-814, 1994; Co i dr., J. Immunol. 152, 2968-2976 (1994); Riechmann, i dr., Nature 332:323-27 (1988); i Kettleborough i dr., Protein Eng.4:773-783 (1991).

[0132] CDR kalemljenje uključuje uvođenje jednog ili više od šest CDR-a iz varijabilnih Ig domena miša

1

teškog i lakog lanca u odgovarajuća četiri okvirna regiona humanih varijabilnih Ig domena. Ova tehnika (Riechmann, i dr., Nature 332:323-27 (1988)), koristi očuvane okvirne regione (FR1-FR4) kao skelu za podršku CDR petlji koje su primarni kontakti sa antigenom. Nedostatak CDR kalemljenja je, međutim, to što može rezultirati humanizovanim antitelom koje ima značajno niži afinitet vezivanja od originalnog mišjeg antitela, jer aminokiseline okvirnih regiona mogu doprineti vezivanju antigena i zato što aminokiseline CDR-a petlje mogu uticati na asocijaciju dva varijabilna Ig domena. Da bi se održao afinitet humanizovanog monoklonalnog antitela, tehnika kalemljenja CDR-a može se poboljšati odabirom humanih okvirnih regiona koji najviše liče na okvirne regione originalnog mišjeg antitela i mutagenezom usmerenom na pojedinačne aminokiseline unutar okvira ili CDR-a uz pomoć računarskog modeliranja mesta vezivanja antigena (npr., Co i dr., J. Immunol.152, 2968-2976 (1994)).

Humana antitela transgenskih životinja

[0133] Humana antitela na ciljni protein mogu se takođe proizvesti korišćenjem transgenskih životinja koje nemaju endogenu proizvodnju imunoglobulina i koje su projektovane da sadrže lokuse humanog imunoglobulina. Na primer, WO 98/24893 obelodanjuje transgenske životinje koje imaju humani Ig lokus gde životinje ne proizvode funkcionalne endogene imunoglobuline zbog inaktivacije endogenih lokusa teškog i lakog lanca. WO 91/00906 takođe obelodanjuje transgenske domaćine sisara koji nisu primati koji su sposobni da uspostave imunološki odgovor na imunogen, pri čemu antitela imaju primate konstantne i/ili varijabilne regione, i gde su endogeni lokusi kodiranja imunoglobulina supstituisani ili inaktivirani. WO 96/30498 i US Patent No.6,091,001 obelodanjuje upotrebu Cre/Lox sistema za modifikaciju imunoglobulinskog lokusa kod sisara, kao što je zamena celog ili dela konstantnog ili varijabilnog regiona da bi se formirao modifikovani molekul antitela. WO 94/02602 obelodanjuje domaćine sisara koji nisu humani imunoglobulini i funkcionalni humani Ig lokusi. Patent SAD No. 5,939,598 obelodanjuje postupke pravljenja transgenih miševa kod kojih miševima nedostaju endogeni teški lanci, i eksprimiraju egzogeni imunoglobulinski lokus koji sadrži jednu ili više ksenogenih konstantnih regiona. Videti takođe, patente SAD br.6,114,598, 6,657,103 i 6,833,268.

[0134] Korišćenjem gore opisane transgene životinje, može se proizvesti imunološki odgovor na izabrani antigenski molekul, a ćelije koje proizvode antitela mogu se ukloniti sa životinje i koristiti za proizvodnju hibridoma koji luče humana monoklonska antitela. Protokoli imunizacije, adjuvansi i slično poznati su u tehnici, i koriste se za imunizaciju, na primer, transgenog miša kako je opisano u WO 96/33735. Ova publikacija otkriva monoklonska antitela protiv različitih antigenih molekula, uključujući IL-6, IL-8, TNFa, humani CD4, L selektin, gp39 i toksin tetanusa. Monoklonska antitela se mogu testirati na sposobnost inhibiranja ili neutralisanja biološke aktivnosti ili fiziološkog dejstva odgovarajućeg proteina. WO 96/33735 obelodanjena da su monoklonska antitela protiv IL-8, izvedena iz imunih ćelija transgenih miševa imunizovanih sa IL-8, blokirala IL-8 indukovane funkcije neutrofila. Humana monoklonska antitela sa specifičnošću za antigen koji se koristi za imunizaciju transgenih životinja takođe su obelodanjena u WO 96/34096 i Patentna objava SAD br.20030194404; i Patentna objava SAD br.20030031667.

[0135] Dodatne transgenske životinje korisne za stvaranje monoklonskih antitela uključuju Medarek HuMAb-MOUSE®, opisan u U.S. Pat. br.5,770,429 i Fishwild, i dr. (Nat. Biotechnol.14:845-851 (1996)), koji sadrži sekvence gena iz neuređenih gena humanih antitela koji kodiraju teške i lake lance humanih antitela. Imunizacija HuMAb-MOUSE® omogućava proizvodnju potpuno humanih monoklonskih antitela na ciljni protein.

[0136] Takođe, Ishida i dr. (Cloning Stem Cells.4:91-102 (2002)) opisuje TransChromo miša (TCMOUSE™) koji sadrži segmente ljudske DNK veličine megabaze i koji uključuje čitave lokuse humanog imunoglobulina (hIg). TCMOUSE™ ima potpuno raznolik repertoar hIg-ova, uključujući sve podklase IgG (IgG1-G4). Imunizacija TCMOUSE™ sa različitim ljudskim antigenima proizvodi reakcije antitela koja sadrže humana antitela.

[0137] Videti takođe Jakobovits i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits i dr., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann i dr., Year in Immunol., 7:33 (1993); i U.S. Pat. br.5,591,669, Patent SAD br. 5,589,369, Patent SAD br. 5,545,807; i Patentna objava SAD br.20020199213. Patentna objava SAD br.

20030092125 opisuje postupke za podsticanje imunološkog odgovora životinje na željeni epitop. Humana antitela se takođe mogu generisati in vitro aktiviranim B ćelijama (videti U.S. Pat. Nos.5567610 i 5229275).

Humana antitela iz tehnologije prikaza

[0138] Razvoj tehnologija za izradu repertoara gena rekombinantnih humanih antitela i prikaz kodiranih fragmenata antitela na površini vlaknastog bakteriofaga obezbedio je sredstvo za direktnu proizvodnju

2

humanih antitela. Antitela proizvedena faznom tehnologijom proizvode se kao fragmenti koji vezuju antigenobično Fv ili Fab fragmenti-u bakterijama i stoga nemaju efektorske funkcije. Efektorske funkcije mogu se uvesti pomoću jedne od dve strategije: Fragmenti se mogu konstruisati, na primer, u potpuna antitela za ekspresiju u ćelijama sisara, ili u fragmente bispecifičnih antitela sa drugim veznim mestom sposobnim da pokrenu efektorsku funkciju.

[0139] Predmetno obelodanjivanje razmatra postupak za proizvodnju antitela specifičnog za metu ili njegovog dela koji se vezuje za antigen, koji obuhvata korake sinteze biblioteke humanih antitela na fagu, skrining biblioteke sa ciljnim proteinom ili njegovim delom, izolovanje faga koji vezuje metu i dobijanje antitela iz faga. Na primer, jedan postupak za pripremu biblioteke antitela za upotrebu u tehnikama prikazivanja faga obuhvata korake imunizacije životinje koja nije humana, a sastoji se od lokusa humanog imunoglobulina sa ciljnim antigenom ili njegovim antigenim delom za stvaranje imunološkog odgovora, izdvajajući antitela koja proizvode ćelije imunizovane životinje; izolovanje RNK iz ekstrahovanih ćelija, obrnuta transkripcija RNK za proizvodnju cDNK, amplifikacija cDNK pomoću prajmera i umetanje cDNK u vektor prikaza faga tako da se antitela eksprimiraju na fagu. Rekombinantna antitela specifična za cilj iz predmetnog obelodanjivanja mogu se dobiti na ovaj način.

[0140] U drugom primeru, ćelije koje proizvode antitela mogu biti ekstrahovane iz neimunizovanih životinja, RNK izolovana iz ekstrahovanih ćelija i obrnuto transkribovana da bi se dobila cDNK, koja je amplifikovana pomoću prajmera, i umetnuta u vektor za prikaz faga tako da se antitela eksprimiraju na fag. Procesi prikaza faga oponašaju imunološku selekciju prikazivanjem repertoara antitela na površini filamentoznog bakteriofaga, a zatim selekcijom faga njihovim vezivanjem za antigen po izboru. Jedna takva tehnika opisana je u WO 99/10494, koja opisuje izolaciju antitela visokog afiniteta i funkcionalnih agonista za MPL i msk receptore koristeći takav pristup. Antitela iz predmetnog obelodanjivanja mogu se izolovati skriningom rekombinantne biblioteke kombinatornih antitela, poželjno scFv biblioteke prikaza faga, pripremljene korišćenjem humanih VL i VH cDNK pripremljenih od mRNK izvedene iz humanih limfocita. Metodologije za pripremu i pregled takvih biblioteka su poznate u tehnici. Videti npr., Patent SAD No. 5,969,108. Postoje komercijalno dostupni kompleti za generisanje biblioteka fag displeja (npr., Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, kataloški br. 27-9400-01; i Stratagene SurfZAP.TM. komplet za prikaz faga, kataloški br.

240612). Postoje i druge metode i reagensi koji se mogu koristiti u generisanju i skriningu biblioteka za prikazivanje antitela (videti, npr., Ladner i dr. pat. SAD. No. 5,223,409; Kang i dr. patentna objava PCT br. WO 92/18619; Dower i dr. patentna objava PCT br. WO 91/17271; Winter i dr. patentna objava PCT br. WO 92/20791; Markland i dr. patentna objava PCT br. WO 92/15679; Breitling i dr. patentna objava PCT br. WO 93/01288; McCafferty i dr. patentna objava PCT br. WO 92/01047; Garrard i dr. patentna objava PCT br. WO 92/09690; Fuchs i dr. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay i dr. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse i dr. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty i dr., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths i dr. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins i dr. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson i dr. (1991) Nature 352:624-628; Gram i dr. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad i dr. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom i dr. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; i Barbas i dr. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982.

[0141] U jednom otelotvorenju, da bi se izolovala humana antitela specifična za ciljni antigen sa željenim karakteristikama, humana VH i VL biblioteka se pregleda da bi se odabrali fragmenti antitela koja imaju željenu specifičnost. Biblioteke antitela koje se koriste u ovoj metodi su poželjno biblioteke scFv pripremljene i pregledane kako je ovde opisano i u struci (McCafferty i dr., PCT objava br. WO 92/01047, McCafferty i dr., (Nature 348:552-554 (1990)); i Griffiths i dr., (EMBO J 12:725-734 (1993)). Biblioteke scFv antitela se poželjno pregledaju koristeći ciljni protein kao antigen.

[0142] Alternativno, Fd fragment (VH-CH1) i laki lanac (VL-CL) antitela se zasebno kloniraju PCR-om i rekombinuju nasumično u kombinovanim bibliotekama za prikaz faga, koje se zatim mogu izabrati za vezivanje za određeni antigen. Fab fragmenti su eksprimirani na površini faga, tj., fizički su povezani sa genima koji ih kodiraju. Dakle, odabir Fab vezivanjem za antigen ko-bira za Fab kodirajuće sekvence, koje se mogu naknadno pojačati. Kroz nekoliko rundi vezivanja i ponovnog pojačavanja antigena, postupak nazvan paniranje, Fab specifičan za antigen, obogaćen je i konačno izolovan.

[0143] 1994. godine opisan je pristup humanizacije antitela, nazvan "vođena selekcija". Vođeni odabir koristi snagu tehnike prikaza faga za humanizaciju mišjih monoklonskih antitela (videti Jespers, L. S., i dr., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). U tu svrhu, Fd fragment mišjeg monoklonalnog antitela može se prikazati u kombinaciji sa bibliotekom humanog lakog lanca, a rezultujuća hibridna Fab biblioteka se tada može odabrati sa antigenom. Fd fragment miša pruža šablon za vođenje izbora. Zatim su odabrani humani laki lanci kombinovani sa bibliotekom humanih Fd fragmenata. Odabir rezultirajuće biblioteke daje potpuno humanu Fab.

[0144] Opisani su različiti postupci za dobijanje ljudskih antitela iz biblioteka za prikaz faga (videti, na primer,, Hoogenboom i dr., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks i dr., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); pat. SAD. br.

5,565,332 i 5,573,905; Clackson, T., and Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)). Konkretno, in vitro selekcija i evolucija antitela izvedenih iz biblioteka fag displeja postala je moćno oruđe (videti Burton, D. R., and Barbas III, C. F., Adv. Immunol.57, 191-280 (1994); Winter, G., i dr., Annu. Rev. Immunol.12, 433-455 (1994); patentna objava SAD br. 20020004215 i WO 92/01047; patentna objava SAD br. 20030190317; i patente SAD br.6,054,287 i 5,877,293.

[0145] Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178:187-193 (2002), i Patentna objava SAD br.

20030044772, published March 6, 2003, opisuju postupke za skrining biblioteka antitela eksprimiranih fagom ili drugih vezujućih molekula pomoću podizanja hvatanja, metod koji uključuje imobilizaciju kandidata za vezivanje molekula na čvrstom nosaču.

[0146] Fv fragmenti su prikazani na površini faga, povezivanjem jednog lanca eksprimiran kao fuzija proteina faga (npr., sa M13 genom III) sa komplementarnim lancem izraženim kao rastvorljivi fragment. Smatra se da bi fag mogao biti nitasti fag, kao što je jedan od faga klase I: fd, M13, f1, If1, lke, ZJ/Z, Ff i jedan od faga klase II Xf, Pf1 i Pf3. Fag može biti M13, ili fd ili njegov derivat.

[0147] Kada se izaberu početni humani VL i VH segmenti, izvode se eksperimenti „mešaj i podudaraj“, u kojima se različiti parovi prvobitno odabranih VL i VH segmenata proveravaju radi vezivanja za ciljanje, za odabir željenih kombinacija VL/VH parova. Dodatno, radi daljeg poboljšanja kvaliteta antitela, VL i VH segmenti poželjnih VL/VH parova mogu biti nasumično mutirani, poželjno unutar bilo kog od CDR1, CDR2 ili CDR3 regiona VH i/ili VL, u procesu analognom procesu somatske mutacije in vivo odgovornom za sazrevanje afiniteta antitela tokom prirodnog imunološkog odgovora. Ovo sazrevanje afiniteta in vitro može da se postigne amplifikacijom VL i VH regiona pomoću PCR prajmera koji su komplementarni sa VH CDR1, CDR2 i CDR3, odnosno VL CDR1, CDR2 i CDR3, respektivno, čiji su prajmeri "dodati" nasumičnom smešom četiri nukleotidne baze na određenim položajima, tako da rezultujući PCR proizvodi kodiraju segmente VL i VH u koje su nasumične mutacije uvedene u regione VH i/ili VL CDR3. Ovi nasumično mutirani segmenti VL i VH mogu se ponovo pregledati radi vezivanja za ciljni antigen.

[0148] Nakon skrininga i izolacije ciljnog specifičnog antitela iz biblioteke za prikaz rekombinantnog imunoglobulina, nukleinska kiselina koja kodira izabrano antitelo može se izvući iz prikazanog paketa (npr., iz gena faga) i subklonirani u druge vektore ekspresije standardnim tehnikama rekombinantne DNK. Po želji, nukleinskom kiselinom se može dalje manipulisati da bi se stvorili drugi oblici antitela iz predmetnog, kao što je ispod opisano. Za ekspresiju rekombinantnog humanog antitela izolovanog skriningom kombinatorne biblioteke, DNK koja kodira antitelo se klonira u rekombinantni ekspresioni vektor i uvodi u ćeliju domaćina sisara, kao što je ovde opisano.

[0149] Predviđeno je da se metoda prikaza faga može izvesti u mutatorskom soju bakterije ili ćelije domaćina. Soj mutatora je ćelija domaćin koja ima genetski defekt zbog čega DNK replicirana u njoj mutira u odnosu na svoju matičnu DNK. Primeri sojeva mutatora su NR9046mutD5 i NR9046 mut T1.

[0150] Takođe se razmatra da se postupak prikaza faga može izvesti pomoću pomoćnog faga. Ovo je fag koji se koristi za inficiranje ćelija koje sadrže defektni genom faga i koji funkcioniše kao dopuna defekta. Neispravan genom faga može biti fagemid ili fag sa uklonjenom funkcijom koja kodira genske sekvence. Primeri pomoćnih faga su M13K07, M13K07 gen III br. 3; i fag koji prikazuje ili kodira vezujući molekul fuzionisan sa kapsidnim proteinom.

[0151] Antitela se takođe stvaraju postupcima skrininga fagnog prikaza primenom hijerarhijskog dvostrukog kombinatornog pristupa opisanog u WO 92/01047 u kome se pojedinačna kolonija koja sadrži klon H ili L lanca koristi za infekciju kompletne biblioteke klonova koji kodiraju drugi lanac (L ili H) i rezultujući dvolančani specifični vezujući član je izabran u skladu sa tehnikama prikaza faga, kao što su one opisane u njemu. Ova tehnika je takođe obelodanjena u Marks i dr, (Bio/Technology, 10:779-783 (1992)).

[0152] Postupcima za prikazivanje peptida na površini ćelija kvasca, mikroorganizama i sisara takođe su korišćene za identifikaciju antigena specifičnih antitela. Videti na primer, patent SAD br. 5,348,867; 5,723,287; 6,699,658; Wittrup, Curr Op. Biotech.12:395-99 (2001); Lee i dr, Trends in Biotech.21(1) 45-52 (2003); Surgeeva i dr, Adv. Drug Deliv. Rev. 58: 1622-54 (2006). Biblioteke antitela mogu biti vezane za proteine kvasca, kao što je aglutinin, efikasno imitirajući prikaz ćelijske površine antitela B ćelija u imunološkom sistemu.

[0153] Pored postupaka prikaza faga, antitela se mogu izolovati metodama prikaza in vitro i prikazom mikrobnih ćelija, uključujući prikaz ribozoma i prikaz mRNK (Amstutz i dr, Curr. Op. Biotech. 12: 400-05 (2001)). Izbor polipeptida pomoću prikaza ribozoma opisan je u Hanes i dr., (Proc. Natl Acad Sci USA, 94:4937-4942 (1997)) i U.S. Pat. Nos. 5,643,768 i 5,658,754 izdati Kavasakiju. Prikaz ribozoma je takođe koristan za brzu mutacijsku analizu antitela velikih razmera. Pristup selektivne mutageneze takođe obezbeđuje metodu proizvodnje antitela sa poboljšanim aktivnostima koje se mogu odabrati upotrebom ribozomalnih tehnika prikaza.

Varijante sekvence aminokiselina

[0154] Predviđeno je da se generišu modifikovane polipeptidne kompozicije koje sadrže jedan, dva, tri, četiri, pet i/ili šest CDR antitela, pri čemu se CDR menja kako bi se obezbedila povećana specifičnost ili afinitet prema ciljnom molekulu. Lokacije unutar CDR-ova antitela se tipično menjaju u seriji, na primer, zamenom prvo konzervativnim izborom (npr., hidrofobna aminokiselina zamenjena za ne identičnu hidrofobnu aminokiselinu), a zatim sa više različitih izbora (npr., hidrofobna aminokiselina zamenjena naelektrisanim amino kiselina), a zatim se na ciljnom mestu mogu izvršiti brisanja ili umetanja. Na primer, korišćenjem konzerviranih okvirnih sekvenci koje okružuju CDR, PCR prajmeri komplementarni ovim konsenzusnim sekvencama generišu se za pojačavanje antigen-specifične CDR sekvence koja se nalazi između regiona prajmera. Tehnike za kloniranje i ekspresiju nukleotidnih i polipeptidnih sekvenci su dobro poznate u tehnici [videti npr. Sambrook i dr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York (1989)]. Amplifikovane CDR sekvence se vezuju u odgovarajući plazmid. Plazmid koji sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet i/ili šest kloniranih CDR po izboru sadrži dodatne regione koji kodiraju polipeptide povezane sa CDR.

[0155] Supstance antitela koje sadrže modifikovane CDR se proveravaju na afinitet vezivanja za originalni antigen. Dodatno, antitelo ili polipeptid se dalje testira na njegovu sposobnost da neutrališe aktivnost ciljnih antigena. Na primer, antitela iz predmetnog obelodanjivanja mogu se analizirati kako je navedeno u Primerima kako bi se odredila njihova sposobnost da ometaju biološku aktivnost ciljnog antigena.

[0156] Modifikacije se mogu izvršiti konzervativnim ili ne konzervativnim supstitucijama aminokiselina koje su detaljnije opisane u nastavku. "Insercije" ili "delecije" su poželjno u opsegu od oko 1 do 20 aminokiselina, poželjnije 1 do 10 aminokiselina. Varijacija se može uvesti sistematskim zamenom aminokiselina u molekulu polipeptida antitela primenom tehnika rekombinantne DNK i ispitivanjem rezultujućih rekombinantnih varijanti za aktivnost. Promene nukleinske kiseline mogu se izvršiti na mestima koja se razlikuju po nukleinskim kiselinama od različitih vrsta (promenljivi položaji) ili u visoko očuvanim regionima (stalna područja). Postupci za promenu sekvenci antitela i ekspresiju polipeptidnih sastava antitela korisni u obelodanjivanju su detaljnije opisani u nastavku.

[0157] Insercije aminokiselinske sekvence uključuju fuzije amino- i/ili karboksilnih terminala u dužini od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i ubacivanja intra sekvenci pojedinačnih ili višestrukih aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionilnim ostatkom ili antitelo (uključujući fragment antitela) spojeno sa epitopskom oznakom ili epitopom receptora za spasavanje. Druge varijante umetanja molekula antitela uključuju fuziju u polipeptid koji povećava polu-raspad antitela u serumu, npr. na N-terminalu ili C-terminalu.

[0158] Termin "označen epitop" odnosi se na antitelo spojeno sa epitopskom oznakom. Polipeptid oznake epitopa ima dovoljno ostataka da obezbedi epitop protiv koga se može stvoriti antitelo, ali je dovoljno kratak da ne ometa aktivnost antitela. Poželjno je da je epitop oznaka dovoljno jedinstvena tako da antitelo protiv njega u suštini ne unakrsno reaguje sa drugim epitopima. Pogodni polipeptidi oznaka generalno imaju najmanje 6 aminokiselinskih ostataka i obično između oko 8-50 aminokiselinskih ostataka (poželjno između oko 9-30 ostataka). Primeri uključuju polipeptid oznake hemaglutinin (HA) gripa i njegovo antitelo 12CA5 (Field i dr., Mol. Cell. Biol.8: 2159-2165 (1988)); c-myc oznaka i 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 i 9E10 njihova antitela (Evan i dr., Mol. Cell. Biol.5:3610-16 (1985)); i oznaku glikoproteina D (gD) virusa Herpes Simplex virusa i njegovo antitelo (Paborsky i dr., Protein Engineering 3:547-53 (1990)). Druge primerne oznake su poli-histidinska sekvenca, generalno oko šest histidinskih ostataka, koja dozvoljava izolaciju jedinjenja tako obeleženog pomoću helacije nikla. Ostale oznake i oznake, poput oznake FLAG® (Eastman Kodak, Rochester, NY), dobro poznate i rutinski korišćene u struci, obuhvaćene su obelodanjivanjem.

2

[0159] Kako se ovde koristi, termin "epitop za vezivanje receptora za spasavanje" odnosi se na epitop Fc regiona molekula IgG (npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji je odgovoran za povećanje poluvremena in vivo seruma Molekul IgG.

[0160] Druga vrsta varijante je varijanta supstitucije aminokiselina. Ove varijante imaju najmanje jedan molekul antitela u svojoj aminokiselinskoj sekvenci uklonjen i različit ostatak ubačen na njegovo mesto. Predviđena je supstituciona mutageneza u bilo kojoj od hipervarijabilnih ili CDR regiona ili okvirnih regiona. Konzervativne supstitucije uključuju zamenu aminokiseline drugim članom svoje klase. Nekonzervativne zamene uključuju zamenu člana jedne od ovih klasa članom druge klase.

[0161] Konzervativne supstitucije aminokiselina su napravljene na osnovu sličnosti polariteta, naboja, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti i/ili amfipatske prirode uključenih ostataka. Na primer, nepolarne (hidrofobne) aminokiseline uključuju alanin (Ala, A), leucin (Leu, L), izoleucin (Ile, I), valin (Val, V), prolin (Pro, P), fenilalanin (Phe, F), triptofan (Trp, V) i metionin (Met, M); polarne neutralne aminokiseline uključuju glicin (Gly, G), serin (Ser, S), treonin (Thr, T), cistein (Cys, C), tirozin (Tyr, I), asparagin (Asn, N) i glutamin (Gln, K); pozitivno naelektrisane (bazične) aminokiseline uključuju arginin (Arg, R), lizin (Lys, K) i histidin (His, H); i negativno naelektrisane (kisele) aminokiseline uključuju asparaginsku kiselinu (Asp, D) i glutaminsku kiselinu (Glu, E).

[0162] Svaki ostatak cisteina koji nije uključen u održavanje pravilne konformacije antitela takođe može biti zamenjen, generalno serinom, radi poboljšanja oksidativne stabilnosti molekula i sprečavanja aberantnog umrežavanja. Nasuprot tome, cisteinska veza(e) može se dodati antitelu radi poboljšanja njegove stabilnosti (naročito ako je antitelo fragment antitela, poput fragmenta Fv).

Sazrevanje afiniteta

[0163] Sazrevanje afiniteta generalno uključuje pripremu i skrining varijanti antitela koje imaju supstitucije unutar CDR-a roditeljskog antitela i odabir varijanti koje imaju jedno ili više poboljšanih bioloških svojstava, kao što je afinitet vezivanja u odnosu na roditeljsko antitelo. Pogodan način za generisanje takvih supstitucionih varijanti je sazrevanje afiniteta pomoću fagnog displeja. Ukratko, nekoliko lokacija hipervarijabilnih regiona (npr.6-7 mesta) može biti mutirano da bi se generisale sve moguće amino supstitucije na svakom mestu. Tako generisane varijante antitela prikazane su na monovalentan način od filamentoznih čestica faga kao fuzije do proizvoda gena III M13 upakovanog u svaku česticu. Varijante prikazane fagnim prikazom se zatim pregledaju na njihovu biološku aktivnost (npr., afinitet za vezivanje). Videti npr., WO 92/01047, WO 93/112366, WO 95/15388 i WO 93/19172.

[0164] Trenutni postupci sazrevanja afiniteta antitela pripadaju dve kategorije mutageneze: stohastički i ne stohastički. PCR skloni greškama, sojevi bakterija mutatora (Low i dr., J. Mol. Biol.260, 359-68 (1996) Irving i dr., Immunotechnology 2, 127-143 (1996)), i mutageneza zasićenja (Nishimiya i dr.,. J. Biol. Chem.

275:12813-20 (2000); Chowdhury, P. S. Methods Mol. Biol.178, 269-85 (2002)) tipični su primeri postupaka stohastičke mutageneze (Rajpal i dr., Proc Natl Acad Sci U S A.102:8466-71 (2005)). Nestohastičke tehnike često koriste skeniranje alaninom ili mutagenezu usmerenu na lokaciju za generisanje ograničenih zbirki specifičnih varijanti. Neki postupci su detaljnije opisani u nastavku.

[0165] Sazrevanje afiniteta putem postupka pomicanja-Sazrevanje afiniteta rekombinantnih antitela obično se izvodi kroz nekoliko rundi pomicanja antitela kandidata u prisustvu sve manjih količina antigena. Smanjivanjem količine antigena po krugu biraju se antitela sa najvećim afinitetom prema antigenu, čime se dobijaju antitela visokog afiniteta iz velikog broja polaznog materijala. Sazrevanje afiniteta putem pomicanja dobro je poznato u tehnici i opisano je, na primer, u Huls i dr. (Cancer Immunol Immunother. 50:163-71 (2001)). Postupci sazrevanja afiniteta korišćenjem tehnologija fagnog prikaza opisani su ovde drugde i poznati u tehnici (videti npr., Daugherty i dr., Proc Natl Acad Sci U S A.97:2029-34 (2000)).

[0166] Pregledna mutageneza-Pregledna mutageneza (LTM) (Rajpal i dr., Proc Natl Acad Sci U S A.

102:8466-71 (2005)) pruža postupak za brzo mapiranje mesta vezivanja antitela. Za LTM, devet aminokiselina, predstavnika glavnih hemija bočnih lanaca koje obezbeđuje 20 prirodnih aminokiselina, odabrano je za disekciju funkcionalnih doprinosa bočnog lanca vezivanju na svakom mestu u svih šest CDR antitela. LTM generiše pozicioni niz pojedinačnih mutacija unutar CDR-a gde je svaki ostatak "divljeg tipa" sistematski supstituisan jednom od devet odabranih aminokiselina. Mutirani CDR-i se kombinuju da bi generisali kombinatorne biblioteke varijabilnih jednolančanih fragmenata (scFv) sve veće složenosti i veličine, a da ne postanu zabranjene za kvantitativni prikaz svih varijanti. Nakon pozitivne selekcije, klonovi sa poboljšanim vezivanjem sekvenciraju, a korisne mutacije se mapiraju.

[0167] PCR skloni greškama-PCR skloni greškama uključuje randomizaciju nukleinskih kiselina između različitih krugova selekcije. Do randomizacije dolazi pri niskoj stopi zbog stope unutrašnje greške korišćene polimeraze, ali se može poboljšati PCR-om sklonom greškama (Zaccolo i dr.,. J. Mol. Biol. 285:775-783 (1999)) korišćenje polimeraze sa visokom stopom unutrašnje greške tokom transkripcije (Hawkins i dr., J Mol Biol. 226:889-96 (1992)). Nakon ciklusa mutacije, klonovi sa poboljšanim afinitetom za antigen se biraju korišćenjem rutinskih postupaka u tehnici.

[0168] DNK Mešanje-Mešanje nukleinske kiseline je postupak za in vitro ili in vivo homolognu rekombinaciju bazena kraćih ili manjih polinukleotida za proizvodnju varijantnih polinukleotida. Mešanje DNK je opisano u US Patent No. 6,605,449, US Patent 6,489,145, WO 02/092780 i Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10747-51 (1994). Generalno, mešanje DNK se sastoji iz 3 koraka: fragmentacija gena za mešanje sa DNazom I, nasumična hibridizacija fragmenata i ponovno sastavljanje ili popunjavanje fragmentiranog gena pomoću PCR u prisustvu DNK polimeraze (seksualna PCR), i amplifikacija ponovo sastavljenog proizvoda konvencionalnom PCR.

[0169] Mešanje DNK razlikuje se od PCR sklonog greškama po tome što je inverzna lančana reakcija. U PCR-u sklonom greškama, broj početnih mesta polimeraze i broj molekula raste eksponencijalno. Nasuprot tome, u ponovnom sastavljanju ili mešanju slučajnih polinukleotida nukleinske kiseline, broj početnih mesta i broj (ali ne i veličina) slučajnih polinukleotida se s vremenom smanjuje.

[0170] U slučaju antitela, mešanje DNK omogućava slobodno kombinatorno povezivanje svih CDRl sa svim CDR2 sa svim CDR3, na primer. Smatra se da se više porodica sekvenci može mešati u istoj reakciji. Dalje, mešanjem se generalno čuva relativni redosled, tako da se, na primer, CDR1 neće naći u položaju CDR2. Retki mešalice će sadržati veliki broj najboljih (npr. najvećeg afiniteta) CDR -a, a ti retki se mogu izabrati na osnovu njihovog superiornog afiniteta.

[0171] Predložak polinukleotida koji se može koristiti u mešanju DNK može biti DNK ili RNK. Može biti različitih dužina u zavisnosti od veličine gena ili kraćeg ili manjeg polinukleotida koji će se rekombinovati ili ponovo sastaviti. Poželjno, šablon polinukleotida je od 50 bp do 50 kb. Šablon polinukleotida često treba da bude dvolančani.

[0172] Predviđeno je da se jednolančani ili dvolančani polinukleotidi nukleinske kiseline koji imaju regione identičnosti sa šablonskim polinukleotidom i regione heterologije sa šablonskim polinukleotidom mogu biti dodati u polinukleotid šablona tokom početnog koraka selekcije gena. Takođe se razmatra da se dva različita, ali povezana polinukleotidna šablona mogu mešati tokom početnog koraka.

[0173] Skeniranje alaninom - Mutageneza skeniranja alanina može se izvršiti da bi se identifikovali ostaci hipervarijabilnog regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena. Cunningham and Wells, (Science 244:1081-1085 (1989)). Ostaci ili grupa ciljnih ostataka se identifikuju (npr., naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys i glu) i zamenjeni su neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (najpoželjnije alanin ili polialanin) kako bi uticali na interakciju aminokiseline sa antigenom. One lokacije aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije se zatim poboljšavaju uvođenjem daljih ili drugih varijanti na, ili za, mesta supstitucije.

[0174] Kompjuterski potpomognuti dizajn - Alternativno, ili pored toga, može biti korisno analizirati kristalnu strukturu kompleksa antigen-antitelo da bi se identifikovale kontaktne tačke između antitela i antigena ili koristiti računarski softver za modeliranje takvih kontaktnih tačaka. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za zamenu prema tehnikama koje su ovde razrađene. Kada se takve varijante generišu, panel varijanti se podvrgava skriningu kao što je ovde opisano i antitela sa superiornim svojstvima u jednom ili više relevantnih testova mogu biti odabrana za dalji razvoj.

[0175] Alternativno, ili pored toga, mogu se koristiti razne druge tehnike sazrevanja afiniteta poznate u tehnici, uključujući na primer tehnike opisane u objavljenim patentnim prijavama WO2009/088933; WO2009/088928; WO2009/088924; kao i Clackson i dr., Nature 352:624-628, 1991; Marks i dr., Biotechnology 10:779-783, 1992; Virnekas i dr., Nucleic Acids Res.22:5600-5607, 1994; Glaser i dr., J. Immunol.149:3903-3913, 1992; Jackson i dr., J. Immunol. 154:3310-3319, 1995; Schier i dr., J. Mol. Biol. 255:28-43, 1996; i Yang i dr., J. Mol. Biol.254:392-403, 1995.

Izmenjena glikozilacija

[0176] Takođe se mogu proizvesti varijante antitela koje imaju modifikovan obrazac glikozilacije u odnosu na roditeljsko antitelo, na primer, brisanjem jednog ili više ugljenih hidratnih delova pronađenih u antitelu i/ili

2

dodavanjem jednog ili više mesta glikozilacije koje nisu prisutne u antitelu.

[0177] Glikozilacija antitela je obično ili N-vezana ili O-vezana. N-vezana se odnosi na vezivanje ugljenih hidrata na bočni lanac ostatka asparagina. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serina i asparagin-X-treonina, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, su sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljenog hidrata u bočni lanac asparagina. Prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. Prema tome, mesta glikozilacije vezana sa N mogu se dodati u antitelo promenom aminokiselinske sekvence tako da ona sadrži jednu ili više ovih tripeptidnih sekvenci. O-vezana glikozilacija odnosi se na vezanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze na hidroksiamino kiselinu, najčešće serin ili treonin, mada se takođe može koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin. O-vezana mesta glikozilacije mogu se dodati antitelu umetanjem ili supstitucijom jednog ili više serinskih ili treoninskih ostataka u sekvencu originalnog antitela.

[0178] Fc glikani utiču na vezivanje IgG za Fc receptore i C1q, pa su stoga važni za efektorske funkcije IgG. Mogu se proizvesti varijante antitela sa modifikovanim Fc glikanima i izmenjenom efektorskom funkcijom. Na primer, antitela sa modifikovanim terminalnim šećerima, kao što su sijalinske kiseline, jezgrasta fukoza, ostaci N-acetilglukozamina koji se dele, i ostaci manoze su mogli promeniti vezivanje za receptor FcyRIIIa i promeniti aktivnost ADCC. U daljem primeru, antitela sa modifikovanim terminalnim ostacima galaktoze su možda promenila vezivanje za C1q i izmenjenu aktivnost CDC (Raju, Curr. Opin. Immunol. 20: 471-78 (2008).

[0179] Takođe se razmatraju molekuli antitela sa odsutnom ili smanjenom fukozilacijom koji pokazuju poboljšanu aktivnost ADCC. U struci su poznati različiti načini da se to postigne. Na primer, efektorska aktivnost ADCC posreduje vezivanjem molekula antitela za receptor FcyRIII, za koji se pokazalo da zavisi od strukture ugljenih hidrata N-vezane glikozilacije na Asn-297 CH2 domena. Ne-fukozilirana antitela vezuju ovaj receptor sa povećanim afinitetom i aktiviraju efektorske funkcije posredovane FcyRIII efikasnije od izvornih, fukozilovanih antitela. Na primer, rekombinantna proizvodnja ne-fukozilovanog antitela u CHO ćelijama u kojima je enzim alfa-1,6-fukozil transferaza izbačen rezultira antitelom sa 100 puta povećanom aktivnošću ADCC (Yamane-Ohnuki i dr., Biotechnol Bioeng.87:614-22 (2004)). Slični efekti se mogu postići smanjenjem aktivnosti ovog ili drugih enzima na putu fukozilacije, na primer, tretiranjem siRNK ili antisens RNK, inženjeringom ćelijskih linija za izbacivanje enzima (enzima) ili kultivisanjem sa selektivnim inhibitorima glikozilacije (Rothman i dr., Mol Immunol.26:1113-23 (1989)). Neki sojevi ćelija domaćina, npr. ćelijska linija Lec13 ili hibridoma IB2/0 pacova prirodno proizvodi antitela sa nižim nivoima fukozilacije. (Shields i dr., J Biol Chem. 277:26733-40 (2002); Shinkawa i dr., J Biol Chem. 278:3466-73 (2003)). Povećanje nivoa podeljenih ugljenih hidrata, npr. preko rekombinantno proizvedenog antitela u ćelijama koje prekomerno eksprimiraju enzim GnTIII, takođe je utvrđeno da povećava aktivnost ADCC (Umana i dr., Nat Biotechnol. 17:176-80 (1999)). Predviđeno je da odsustvo samo jednog od dva ostatka fukoze može biti dovoljno za povećanje aktivnosti ADCC (Ferrara i dr., Biotechnol Bioeng.93:851-61 (2006)).

Varijante sa izmenjenom efektorskom funkcijom

[0180] Razmatraju se i druge modifikacije antitela. U jednom aspektu, može biti poželjno modifikovati antitelo iz obelodanjivanja u odnosu na efektorsku funkciju, na primer, kako bi se povećala efikasnost antitela u lečenju raka. Jedan postupak za modifikovanje efektorske funkcije uči da se cisteinski ostaci mogu uneti u Fc region, čime se omogućava stvaranje međulančanih disulfidnih veza u ovom regionu. Tako generisano homodimerno antitelo može imati poboljšanu sposobnost internalizacije i/ili povećano ubijanje ćelija posredovano komplementom i ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Videti Caron i dr., (J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992)) i Shopes, B. (J. Immunol.148: 2918-2922 (1992)). Homodimerna antitela sa pojačanom antitumorskom aktivnošću mogu se takođe pripremiti korišćenjem heterobifunkcionalnih umreživača kako je opisano u Wolff i dr., (Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)). Alternativno, može se proizvesti antitelo koje ima dvostruke Fc regione i na taj način može poboljšati lizu komplementa i ADCC sposobnosti. Videti Stevenson i dr., (Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)). Osim toga, pokazano je da sekvence unutar CDR-a mogu izazvati vezivanje antitela za MHC klasu II i izazvati neželjeni odgovor pomoćnih T-ćelija. Konzervativna supstitucija može dozvoliti da antitelo zadrži vezujuću aktivnost, ali izgubi sposobnost da izazove neželjeni odgovor T-ćelija. Takođe videti Steplewski i dr., (Proc Natl Acad Sci U S A. 85:4852-56 (1998)), koji je opisao himerna antitela gde je mišji varijabilni region spojena sa humanom gama 1, gama 2, gama 3 i gama 4 stalni regioni.

[0181] U nekim otelotvorenjima predmetnog obelodanjivanja, može biti poželjno koristiti fragment antitela, umesto netaknutog antitela, za povećanje penetracije tumora, na primer. U ovom slučaju, može biti poželjno

2

modifikovati fragment antitela kako bi se povećao njegov polu-raspad u serumu, na primer, dodavanjem molekula poput PEG ili drugih polimera rastvorljivih u vodi, uključujući polisaharidne polimere, fragmentima antitela kako bi se produžio polu-raspad. Ovo se takođe može postići, na primer, uključivanjem epitopa koji spašava receptor koji vezuje receptor u fragment antitela (npr., mutacijom odgovarajućeg regiona u fragmentu antitela ili uključivanjem epitopa u peptidnu oznaku koja se zatim fuzioniše sa antitelom fragment na bilo kom kraju ili u sredini, npr., sintezom DNK ili peptida) (videti, npr., WO96/32478).

[0182] Epitop za vezivanje spašavajućih receptora poželjno čini region u kojem se bilo koji jedan ili više aminokiselinskih ostataka iz jedne ili dve petlje Fc domena prenose na analogni položaj fragmenta antitela. Još poželjnije je da se prenesu tri ili više ostataka iz jedne ili dve petlje Fc domena. Još poželjnije, epitop se uzima iz CH2 domena Fc regiona (npr., IgG) i prenosi u CH1, CH3 ili VH region, ili u više od jednog takvog regiona, antitela. Alternativno, epitop se uzima iz CH2 domena Fc regiona i prenosi u CL region ili VL region, ili oboje, fragmenta antitela. Videti takođe International applications WO 97/34631 i WO 96/32478 koje opisuju varijante Fc i njihovu interakciju sa receptorom za spasavanje.

[0183] Prema tome, antitela prema predmetnom obelodanjivanju mogu sadržati humani deo Fc, humani konsenzusni deo Fc ili njegovu varijantu koja zadržava sposobnost interakcije sa receptorom za spašavanje Fc, uključujući varijante u kojima su cisteini uključeni u disulfidno vezivanje modifikovani ili uklonjeni, i/ili u kojima je a met dodat na N-terminalu i/ili je uklonjena jedna ili više N-terminalnih 20 aminokiselina, i/ili regioni koji stupaju u interakciju sa komplementom, kao što je mesto vezivanja C1q, se uklanjaju, i/ili je ADCC lokacija uklonjena [vidi, npr.,Sarmay i dr., Molec. Immunol.29:633-9 (1992)].

[0184] Prethodne studije su mapirale mesto vezivanja na humanom i mišjem IgG za FcR prvenstveno na donju zglobni region sastavljenu od IgG ostataka 233-239. Druga ispitivanja su predložila dodatne široke segmente, npr. Gly316-Lis338 za humani Fc receptor I, Lys274-Arg301 i Tyr407-Arg416 za humani Fc receptor III, ili je pronašao nekoliko specifičnih ostataka izvan donje šarke, na primer, Asn297 i Glu318 za mišji IgG2b u interakciji sa mišjim Fc receptorom II. Izveštaj o kristalnoj strukturi 3.2-Å kristala humanog IgG1 Fc fragmenta sa humanim Fc receptorom IIIA razgraničio je IgG1 ostatke Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299 i Ala327-Ile332 kao uključene u vezivanje za Fc receptor IIIA. Na osnovu kristalne strukture predloženo je da pored donje šarke (Leu234-Gli237), ostaci u petljama domena IgG CH2 FG (ostaci 326-330) i BC (ostaci 265-271) mogu igrati ulogu u vezivanju za Fc receptor IIA. Videti Shields i dr., (J. Biol. Chem., 276:6591-604 (2001)). Mutacija ostataka unutar mesta vezivanja Fc receptora može rezultirati izmenjenom efektorskom funkcijom, kao što je izmenjena aktivnost ADCC ili CDC, ili promenjeni polu-raspad. Kao što je iznad opisano, potencijalne mutacije uključuju umetanje, brisanje ili supstituciju jednog ili više ostataka, uključujući supstituciju alaninom, konzervativnu supstituciju, ne konzervativnu supstituciju ili zamenu odgovarajućim aminokiselinskim ostatkom na istoj poziciji iz različite podgrupe IgG (npr., zamena IgG1 ostatka odgovarajućim IgG2 ostatkom na tom mestu).

[0185] Shields i dr. izvestili su da se ostaci IgG1 uključeni u vezivanje za sve humane Fc receptore nalaze u domenu CH2 proksimalno od šarki i spadaju u dve kategorije na sledeći način: 1) položaji koji mogu direktno da interaguju sa svim FcR uključuju Leu234-Pro238, Ala327 i Pro329 (i verovatno Asp265); 2) položaji koji utiču na prirodu ili položaj ugljenih hidrata uključuju Asp265 i Asn297. Dodatni IgG1 ostaci koji su uticali na vezivanje za Fc receptor II su sledeći: (najveći efekat) Arg255, Thr256, Glu258, Ser267, Asp270, Glu272, Asp280, Arg292, Ser298, i (najveći efekat) His268, Asn276, His285, Asn286, Lys290, Gln295, Arg301, Thr307, Leu309, Asn315, Lys322, Lys326, Pro331, Ser337, Ala339, Ala378, i Lys414. A327Q, A327S, P329A, D265A i D270A smanjeno vezivanje. Pored iznad navedenih ostataka za sve FcR, dodatni ostaci IgG1 koji su smanjili vezivanje za Fc receptor IIIA za 40% ili više su sledeći: Ser239, Ser267 (samo Gly), His268, Glu293, Gln295, Tyr296, Arg301, Val303, Lys338, i Asp376. Varijante koje su poboljšale vezivanje za FcRIIIA uključuju T256A, K290A, S298A, E333A, K334A, i A339T. Lys414 je pokazao smanjenje vezivanja za 40% za FcRIIA i FcRIIB, Arg41630% smanjenje za FcRIIA i FcRIIIA, Gln41930% smanjenje za FcRIIA i 40% smanjenje za FcRIIB i Lys360 za 23% poboljšanje za FcRIIIA. Videti takođe Presta i dr., (Biochem. Soc. Trans.30:487-490, 2001), koji opisuje nekoliko položaja u Fc regionu IgG1, koji su poboljšali vezivanje samo za specifične Fc gama receptore (R) ili istovremeno poboljšali vezivanje za jedan tip Fc gama R i smanjili vezivanje za drugi tip. Odabrane varijante IgG1 sa poboljšanim vezivanjem za Fc gama RIIIa su zatim testirane u testu in vitro antitelo-zavisne ćelijske citotoksičnosti (ADCC) i pokazale su povećanje ADCC kada su korišćene mononuklearne ćelije periferne krvi ili ćelije prirodne ubice.

[0186] Na primer, Patent SAD No. 6,194,551 opisuje varijante sa izmenjenom efektorskom funkcijom koja sadrži mutacije u humanom IgG Fc regionu, na položaju aminokiselina 329, 331 ili 322 (korišćenjem Kabat numerisanja), od kojih neke pokazuju smanjeno vezivanje C1q ili aktivnost CDC. Kao drugi primer, Patent

2

SAD No. 6,737,056, opisuje varijante sa izmenjenim vezivanjem efektora ili Fc-gama receptora koje sadrže mutacije u humanom IgG Fc regionu, na položaju aminokiselina 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ili 439 (koristeći Kabat numerisanje), od kojih neki prikazuju profile vezivanja receptora povezane sa smanjenom aktivnošću ADCC ili CDC. Od ovih, navodi se da mutacija na aminokiselinskom položaju 238, 265, 269, 270, 327 ili 329 smanjuje vezivanje za FcRI, mutaciju na položaju aminokiselina 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 ili 439 se navodi da smanjuju vezivanje za FcRII i mutaciju na položaju aminokiselina 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 ili 437 navedeno je da smanjuje vezivanje za FcRIII.

[0187] Patent SAD No. 5,624,821 izveštava da se aktivnost vezivanja Clq mišjeg antitela može promeniti mutiranjem aminokiselinskog ostatka 318, 320 ili 322 teškog lanca i da zamena ostatka 297 (Asn) dovodi do uklanjanja litičke aktivnosti.

[0188] Patentna objava SAD br. 20040132101 opisuje varijante sa mutacijama na pozicijama aminokiselina 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328, ili 332 (koristeći Kabat numerisanje) ili položaje 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, ili 332 (koristeći Kabat numerisanje), od kojih mutacije na pozicijama 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330, ili 332 može smanjiti aktivnost ADCC ili smanjiti vezivanje za Fc gama receptor.

[0189] Chappel i dr. (Proc Natl Acad Sci U S A.88:9036-40 (1991)) izveštavaju da je citofilna aktivnost IgG1 suštinsko svojstvo njegovog CH2 domena teškog lanca. Mutacije u jednoj tački na bilo kom od aminokiselinskih ostataka 234-237 IgG1 značajno su smanjile ili ukinule njegovu aktivnost. Za vraćanje potpune aktivnosti vezivanja bila je potrebna supstitucija svih IgG1 ostataka 234-237 (LLGG) u IgG2 i IgG4. Primećeno je da je antitelo IgG2 koje sadrži čitavu sekvencu ELLGGP (ostaci 233-238) aktivnije od IgG1 divljeg tipa.

[0190] Isaacs i dr. (J Immunol. 161:3862-9 (1998)) izveštavaju da su mutacije unutar motiva kritičnog za vezivanje Fc gamaR (glutamat 233 za prolin, leucin/fenilalanin 234 za valin i leucin 235 za alanin) potpuno sprečile iscrpljivanje ciljnih ćelija. Mutacija glutamata 318 u alaninu eliminisala je efektorsku funkciju mišjeg IgG2b i takođe smanjila potenciju humanog IgG4.

[0191] Armour i dr. (Mol Immunol. 40:585-93 (2003)) identifikovane varijante IgG1 koje reaguju sa aktivirajućim receptorom, FcgamaRIIa, najmanje 10 puta manje efikasno od IgG1 divljeg tipa, ali čije se vezivanje za inhibitorni receptor, FcgammaRIIb, smanjuje samo četiri puta. Mutacije su izvršene u regionu aminokiselina 233-236 i/ili na pozicijama aminokiselina 327, 330 i 331. Videti takođe WO 99/58572.

[0192] Xu i dr. (J Biol Chem. 269:3469-74 (1994)) izveštavaju da je mutacija IgG1 Pro331 na Ser značajno smanjila vezivanje C1q i praktično eliminisala litičku aktivnost. Nasuprot tome, supstitucija Pro za Ser331 u IgG4 dala je delimičnu litičku aktivnost (40%) varijanti IgG4 Pro331.

[0193] Schuurman i dr. (Mol Immunol.38:1-8 (2001)) izveštavaju da je mutiranje jednog od zglobnih cisteina uključenih u formiranje veze među teškim lancem, Cys226, do serina rezultiralo stabilnijom vezom između teških lanaca. Mutiranje IgG4 šarke sekvence Cys-Pro-Ser-Cys u sekvencu šarke IgG1 Cys-Pro-Pro-Cys takođe značajno stabilizuje kovalentnu interakciju između teških lanaca.

[0194] Angal i dr. (Mol Immunol. 30:105-8 (1993)) izvestili su da je mutiranje serina na aminokiselinskom položaju 241 u IgG4 do prolina (pronađeno na tom položaju u IgG1 i IgG2) dovelo do proizvodnje homogenog antitela, kao i do produženja polu-raspada seruma i poboljšanja distribucije tkiva u poređenju sa originalnim himernim IgG4.

Kovalentne modifikacije

[0195] Kovalentne modifikacije antitela su takođe uključene u opseg predmetnog obelodanjivanja. Mogu se napraviti hemijskom sintezom ili enzimskim ili hemijskim deljenjem antitela, ako je primenljivo. Druge vrste kovalentnih modifikacija antitela uvode se u molekul reakcijom ciljanih aminokiselinskih ostataka antitela sa organskim derivatizacionim sredstvom koje je sposobno da reaguje sa izabranim bočnim lancima ili N- ili C-terminalnim ostacima.

2

[0196] Cisteinilnski ostaci najčešće reaguju sa α-haloacetatama (i odgovarajućim aminima), kao što su hlorosirćetna kiselina ili hloroacetamid, dajući karboksimetil ili karboksiamidometil derivate. Cisteinilnski ostaci se takođe prevode reakcijom sa bromotrifluoroacetonom, α-bromo-β-(5-imidozoil)propionskom kiselinom, hloroacetil fosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil 2-piridil disulfidom, p-hloromerkuribenzoatom, 2-hloromerkuri-4-nitrofenol ili hloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol.

[0197] Histidilnski ostaci su derivatizovani reakcijom sa dietilpirokarbonatom pri pH 5,5-7,0, jer je ovo sredstvo relativno specifično za bočni lanac histidila. Para-bromofenacil bromid je takođe koristan; reakcija se poželjno izvodi u 0,1M natrijum kakodilata pri pH 6,0.

[0198] Lizinilni i amino-terminalni ostaci reaguju sa sukcinom ili drugim anhidridima karboksilne kiseline. Derivatizacija ovim sredstvima ima efekat preokretanja naelektrisanja lizinilnih ostataka. Drugi pogodni reagensi za derivatizaciju ostataka koji sadrže alfa-amino uključuju imidoestere kao što su metil pikolinimidat, piridoksal fosfat, piridoksal, hloroborohidrid, trinitrobenzensulfonska kiselina, O-metilisurea, 2,4-pentandion i transaminaza katalizovana reakcija.

[0199] Arginilni ostaci su modifikovani reakcijom sa jednim ili nekoliko uobičajenih reagensa, među kojima su fenilglioksal, 2,3-butanedion, 1,2-cikloheksandion i ninhidrin. Derivatizacija ostataka arginina zahteva da se reakcija izvodi u alkalnim uslovima zbog visokog pKa guanidinske funkcionalne grupe. Dalje, ovi reagensi mogu reagovati sa grupama lizina kao i arginin epsilon-amino grupom.

[0200] Specifične modifikacije tirozilnih ostataka mogu da se izvrše, od posebnog interesa za uvođenje spektralnih oznaka u tirozilne ostatke reakcijom sa aromatičnim diazonijum-jedinjenjima ili tetranitrometanom. Najčešće se N-acetilimidizol i tetranitrometan koriste za formiranje O-acetil tirozilnih vrsta i 3-nitro derivata. Tirozilni ostaci su jodirani koristeći<125>I ili<131>I da se pripreme obeleženi proteini za upotrebu u radioimuno ispitivanju.

[0201] Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) selektivno su modifikovane reakcijom sa karbodiimidima (R-N.dbd.C.dbd.N-R'), pri čemu su R i R' različite alkilne grupe, kao što je 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil)karbodiimid ili 1-etil-3-(4-azonija-4,4-dimetilpentil)karbodiimid. Pored toga, ostaci aspartil i glutamil pretvaraju se u ostatke asparaginil i glutaminil reakcijom sa amonijum-jonima.

[0202] Ostaci glutaminil i asparaginil često se deamidiraju u odgovarajuće ostatke glutamila i aspartila. Ovi ostaci se deamidiraju pod neutralnim ili bazičnim uslovima. Deamidovani oblik ovih ostataka spada u opseg predmetnog obelodanjivanja.

[0203] Ostale modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa ostataka serila ili treonila, metilaciju α-amino grupa lizina, arginina i histidinskih bočnih lanaca (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilacija N-terminalnog amina i amidacija bilo koje C-terminalne karboksilne grupe.

[0204] Druga vrsta kovalentne modifikacije uključuje hemijsko ili enzimsko spajanje glikozida sa antitelom. Ovi postupci su povoljni jer ne zahtevaju proizvodnju antitela u ćeliji domaćinu koja ima sposobnost glikozilacije za N- ili O-vezanu glikozilaciju. U zavisnosti od korišćenog načina povezivanja, šećer (i) se mogu vezati za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksilne grupe, (c) slobodne sulfhidrilne grupe kao što su cistein, (d) slobodne hidroksilne grupe kao što su oni serina, treonina ili hidroksiprolina, (e) aromatski ostaci kao što su fenilalanin, tirozin ili triptofan, ili (f) amidna grupa glutamina. Ovi postupci su opisane u WO87/05330 i u Aplin and Wriston, (CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306 (1981)).

[0205] Uklanjanje svih delova ugljenih hidrata prisutnih na antitelu može se izvršiti hemijski ili enzimski. Hemijska deglikosilacija zahteva izlaganje antitela jedinjenju trifluorometansulfonska kiselina ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovakav tretman rezultira deljenjem većine ili svih šećera, osim šećera koji povezuje (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktosamin), a antitelo ostavlja netaknutim. Hemijska deglikozilacija je opisana sa Hakimuddin i dr., (Arch. Biochem. Biophys.259: 52 (1987)) i od Edge i dr., (Anal. Biochem.118: 131 (1981)). Enzimsko deljenje delova ugljenohidrata na antitelima može se postići primenom različitih endoi egzo-glikozidaza kako je opisano u Thotakura i dr., (Meth. Enzymol.138: 350 (1987)).

[0206] Druga vrsta kovalentne modifikacije antitela obuhvata povezivanje antitela sa jednim od niza neproteinskih polimera, na primer, polietilen glikolom, polipropilen glikolom, polioksietiliranim poliolima, polioksietiliranim sorbitolom, polioksietiliranom glukozom, polioksietiliranim glicerolom, polioksialkilenima ili polisaharidnim polimerima. Takvi postupci su poznati u tehnici, videti, npr. Patent SAD Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192, 4,179,337, 4,766,106, 4,179,337, 4,495,285, 4,609,546 ili EP 315 456.

2

Derivati

[0207] Kao što je gore navedeno, derivat se odnosi na polipeptide hemijski modifikovane tehnikama kao što su sveprisutna upotreba, obeležavanje (na primer, radionuklidima ili različitim enzimima), vezivanje kovalentnog polimera kao što je PEGilacija (derivatizacija polietilen glikolom) i umetanje ili supstitucija hemijskom sintezom aminokiselina, kao što je kao ornitin. Derivati supstance antitela prema pronalasku, kao što je bispecifično antitelo, takođe su korisni kao terapeutska sredstva i mogu se proizvesti ovim postupcima.

[0208] Konjugovani deo može biti inkorporiran ili vezan za supstancu antitela bilo kovalentno, bilo putem jonskih, van der Valsovih ili vodonikovih veza, na primer, inkorporacijom radioaktivnih nukleotida ili biotinilovanih nukleotida koje prepoznaje streptavadin.

[0209] Polietilen glikol (PEG) se može vezati za supstance antitela kako bi se obezbedio duži polu-raspad in vivo. PEG grupa može biti bilo koje pogodne molekulske mase i može biti linearna ili razgranata. Prosečna molekulska težina PEG -a će se poželjno kretati od oko 2 kiloDaltona ("kD") do oko 100 kDa, poželjnije od oko 5 kDa do oko 50 kDa, najpoželjnije od oko 5 kDa do oko 10 kDa. PEG grupe će generalno biti vezane za supstance antitela iz predmetnog obelodanjivanja acilacijom ili redukcionom alkilacijom kroz prirodnu ili projektovanu reaktivnu grupu na PEG delu (npr., aldehidnu, amino, tiol ili estarsku grupu) za reaktivnu grupu na supstanca antitela (npr., aldehidna, amino ili estarska grupa). Dodavanje PEG ostataka supstancama antitela može se izvršiti korišćenjem tehnika dobro poznatih u tehnici. Videti npr., International Publication No. WO 96/11953 i Patent SAD No.4,179,337.

[0210] Ligacija supstance antitela sa PEG obično se odvija u vodenoj fazi i može se lako pratiti pomoću reverzno-fazne analitičke HPLC. PEGilirane supstance se prečišćavaju preparativnom HPLC i karakterišu analitičkom HPLC, analizom aminokiselina i laserskom desorpcionom masenom spektrometrijom.

Konjugati antitela

[0211] Antitelo se može primeniti u svom "golom" ili nekonjugovanom obliku, ili može biti direktno konjugovano sa drugim terapeutskim ili dijagnostičkim sredstvima, ili može biti indirektno konjugovano sa polimerima nosačima koji sadrže takva druga terapeutska ili dijagnostička sredstva. U nekim otelotvorenjima, antitelo je konjugovano sa citotoksičnim sredstvom, kao što je hemoterapeutsko sredstvo, lek, sredstvo za inhibiciju rasta, toksin (npr., enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla ili njegovi fragmenti), ili radioaktivni izotop (tj., radiokonjugat). Pogodna hemoterapeutska sredstva uključuju: daunomicin, doksorubicin, metotreksat i vindesin (Rowland i dr., (1986) supra). Odgovarajući toksini uključuju: bakterijski toksini kao što je toksin difterije; biljni toksini kao što je ricin; toksini malih molekula kao što je geldanamicin (Mandler i dr J. Natl. Cancer Inst.92(19):1573-81 (2000); Mandler i dr., Bioorg. Med. Chem. Letters 10:1025-1028 (2000); Mandler i dr., Bioconjugate Chem.13.786-91 (2002)), maitansinoidi (EP 1391213; Liu i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-23 (1996)), auristatini (Doronina i dr., Nat. Biotech.

21: 778-84 (2003) i kaliheamicin (Lode i dr., Cancer Res.58:2928 (1998); Hinman i dr., Cancer Res.53:3336-3342 (1993)).

[0212] Antitela se mogu detektovati obeležavanjem upotrebom radioizotopa, oznaka afiniteta (poput biotina, avidina itd.), enzimskih oznaka (kao što je peroksidaza od hrena, alkalna fosfataza itd.) fluorescentnih ili luminiscentnih ili bioluminescentnih oznaka (kao što su FITC ili rodamin itd.), paramagnetni atomi i slično. Postupci za postizanje takvog označavanja dobro su poznati u tehnici; na primer videti (Sternberger, L.A. i dr., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. i dr., Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval, E. i dr., Immunol.109:129 (1972); Goding, J.W. J. Immunol. Meth.13:215 (1976)).

[0213] Konjugacija delova antitela opisana je u Patent SAD No.6,306,393. Opšte tehnike su takođe opisane u Shih i dr., Int. J. Cancer 41:832-839 (1988); Shih i dr., Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990); i Shih i dr., Pat. SAD br. 5,057,313. Ovaj opšti postupak uključuje reakciju komponente antitela koja ima oksidovani deo ugljenih hidrata sa polimerom nosačem koji ima najmanje jednu funkciju slobodnog amina i koji je pun više lekova, toksina, helatora, dodataka bora ili drugog terapijskog sredstva. Ova reakcija rezultira inicijalnom Schiffovom baznom (iminskom) vezom, koja se može stabilizovati redukcijom u sekundarni amin da bi se formirao konačni konjugat.

[0214] Polimer nosilac može biti, na primer, aminodekstran ili polipeptid sa najmanje 50 aminokiselinskih ostataka. U tehnici su poznate različite tehnike za konjugovanje leka ili drugog sredstva sa polimerom nosačem. Umesto aminodekstrana može se koristiti polipeptidni nosač, ali polipeptidni nosač treba da ima najmanje 50 aminokiselinskih ostataka u lancu, poželjno 100-5000 aminokiselinskih ostataka. Najmanje neke od aminokiselina treba da budu ostaci lizina ili ostaci glutamata ili aspartata. Privesci aminskih ostataka lizina i privesci karboksilati glutamina i aspartata pogodni su za vezivanje leka, toksina, imunomodulatora, helatora, dodatka bora ili drugog terapijskog sredstva. Primeri pogodnih polipeptidnih nosača uključuju polizin, poliglutaminsku kiselinu, poliasparaginsku kiselinu, njene ko-polimere i mešovite polimere ovih aminokiselina i druge, na primer, serine, da daju dobijena opterećena nosača i konjugat željena svojstva rastvorljivosti. Primeri sredstava na koje se antitelo može konjugovati uključuju bilo koje od ovde opisanih citotoksičnih ili hemoterapeutskih sredstava.

[0215] Alternativno, konjugovana antitela se mogu pripremiti direktnom konjugacijom komponente antitela sa terapijskim sredstvom. Opšta procedura je analogna indirektnom postupku konjugacije, osim što je terapijsko sredstvo direktno vezano za komponentu oksidovanog antitela. Na primer, ugljeni hidratni deo antitela može biti vezan za polietilenglikol kako bi se produžio polu-raspad.

[0216] Alternativno, terapeutsko sredstvo može biti pričvršćeno na zglobni region redukovane komponente antitela stvaranjem disulfidne veze, ili upotrebom heterobifunkcionalnog umreživača, kao što je N-sukcinil 3-2-piridilditio) proprionat (SPDP). Yu i dr., Int. J. Cancer56:244 (1994). Opšte tehnike za takvu konjugaciju su dobro poznate u tehnici. Videti na primer, Wong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross-Linking (CRC Press 1991); Upeslacis i dr., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch i dr. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc.1995); Price, "Production and Characterization of Sintetički peptid-Derived Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter i dr. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995). U struci su poznati različiti bifunkcionalni agensi za povezivanje proteina, kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestera (kao što je dimetil adipimidat HCL), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutareldehid), bis-azido jedinjenja (kao što su bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), derivati bis-diazonijuma (kao što je bis- (pdiazoniumbenzoil) -etilendiamin) (diizozo) kao što je tolen 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen).

Antitela fuzionih proteina

[0217] Postupci za dobijanje antitela fuzionih proteina su dobro poznati u tehnici. Videti, npr., Patent SAD No.6,306,393. Fuzioni proteini antitela koji sadrže deo interleukin-2 opisani su prema Boleti i dr., Ann. Oncol.

6:945 (1995), Nicolet i dr., Cancer Gene Ther.2:161 (1995), Becker i dr., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 93:7826 (1996), Hank i dr., Clin. Cancer Res.2:1951 (1996), i Hu i dr., Cancer Res.56:4998 (1996). Dodatno, Yang i dr., (Hum. Antibodies Hybridomas 6:129 (1995)), opišu fuzioni protein koji uključuje F(ab')2 fragment i alfa deo faktora tumorske nekroze. Daljnje primere antitela fuzionih proteina opisali su Pastan i dr, Nat. Reviews Cancer 6: 559-65 (2006).

[0218] Postupci za pravljenje fuzionih proteina antitelo-toksin u kojima rekombinantni molekul sadrži jednu ili više komponenti antitela i toksin ili hemoterapeutsko sredstvo takođe su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, fuzioni proteini antitela-Pseudomonas egzotoksin A su opisani Chaudhary i dr., Nature 339:394 (1989), Brinkmann i dr., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:8616 (1991), Batra i dr., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:5867 (1992), Friedman i dr., J. Immunol.150:3054 (1993), Wels i dr., Int. J. Can.60:137 (1995), Fominaya i dr., J. Biol. Chem. 271:10560 (1996), Kuan i dr., Biochemistry 35:2872 (1996), i Schmidt i dr., Int. J. Can.

65:538 (1996). Fuzioni proteini antitela i toksina koji sadrže deo toksina difterije opisani su u Kreitman i dr., Leukemia 7:553 (1993), Nicholls i dr., J. Biol. Chem. 268:5302 (1993), Thompson i dr., J. Biol. Chem.

270:28037 (1995), i Vallera i dr., Blood 88:2342 (1996). Deonarain i dr., Tumor Targeting 1:177 (1995), su opisali fuzioni protein antitelo-toksin koji ima deo RNaze, dok su Linardou i dr., Cell Biophys. 24-25:243 (1994), proizveo je fuzioni protein antitelo-toksin koji sadrži komponentu DNaze I. Gelonin je korišćen kao deo toksina u fuzionom proteinu antitelo-toksin Wang i dr., Abstracts of the 209th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., Apr. 2-6, 1995, Part 1, BIOT005. Kao dodatni primer, Dohlsten i dr., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:8945 (1994), prijavili su fuzioni protein antitelo-toksin koji sadrži stafilokokni enterotoksin-A.

[0219] Ilustrativni toksini koji su prikladno upotrebljeni u pripremi takvih fuzionisanih proteina su ricin, abrin, ribonukleaza, DNaza I, stafilokokni enterotoksin-A, antivirusni protein pokeve, gelonin, toksin difterina, Pseudomonas egzotoksin i Pseudomonas endotoksin. Videti na primer, Pastan i dr., Cell 47:641 (1986), i Goldenberg, CA--A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994). Stručnjacima su poznati i drugi pogodni toksini.

[0220] Antitela prema predmetnom obelodanjivanju mogu se takođe koristiti u ADEPT konjugovanjem

1

antitela u enzim koji aktivira prolekove koji pretvara prolek (npr., peptidil hemoterapeutsko sredstvo, videti WO81/01145) u aktivni lek protiv raka. Videti, na primer, WO88/07378 i Patent SAD No.4,975,278.

[0221] Enzimska komponenta imunokonjugata korisna za ADEPT uključuje bilo koji enzim sposoban da deluje na prolek na takav način da ga prikrije u aktivniji, citotoksični oblik.

[0222] Enzimi koji su korisni u predmetnom obelodanjivanju uključuju, ali nisu ograničeni na, alkalnu fosfatazu korisnu za pretvaranje prolekova koji sadrže fosfate u slobodne lekove; arilsulfataza korisna za pretvaranje prolekova koji sadrže sulfat u besplatne lekove; citozin deaminaza, korisnu za pretvaranje netoksičnog 5-fluorocitozina u lek protiv raka, 5-fluorouracil; proteaze, kao što su seratia proteaza, termolizin, subtilisin, karboksipeptidaze i katepsini (kao što su katepsini B i L), koje su korisne za pretvaranje prolekova koji sadrže peptide u slobodne lekove; D-alanilkarboksipeptidaze, korisne za pretvaranje prolekova koji sadrže supstituente D-aminokiselina; enzimi za deljenje ugljenih hidrata kao što su α-galaktozidaza i neuraminidaza, korisni za pretvaranje glikoziliranih prolekova u slobodne lekove; β-laktamaza, korisnu za pretvaranje lekova derivatizovanih β-laktamima u slobodne lekove; i penicilin amidaze, kao što su penicilin V amidaza ili penicilin G amidaza, korisne za pretvaranje lekova izvedenih iz njihovih aminskih azota sa fenoksiacetilnom ili fenilacetilnom grupom u slobodne lekove. Alternativno, antitela sa enzimskom aktivnošću, takođe poznata u tehnici kao abzimi, mogu se koristiti za pretvaranje prolekova opisanog u slobodne aktivne lekove (videti, na primer, Massey, Nature 328: 457-458 (1987). Konjugati antitela-abzim mogu se pripremiti kao što je ovde opisano za isporuku abzima populaciji tumorskih ćelija.

[0223] Iznad navedeni enzimi mogu biti kovalentno vezani za antitela tehnikama koje su dobro poznate u tehnici, kao što je upotreba heterobifunkcionalnih reagensa za umrežavanje koji su iznad razmatrani. Alternativno, fuzioni proteini koji sadrže najmanje region za vezivanje antigena antitela iz predmetnog obelodanjivanja vezanog za najmanje funkcionalno aktivan deo enzima iz predmetnog obelodanjivanja mogu se konstruisati korišćenjem tehnika rekombinantne DNK dobro poznatih u tehnici (videti, npr., Neuberger i dr., Nature 312:604-608 (1984))

Rekombinantna proizvodnja antitela

[0224] DNK koja kodira antitelo prema predmetnom obelodanjivanju može se izolovati i sekvencirati primenom konvencionalnih procedura (npr., upotrebom oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Obično je za to potrebno kloniranje DNK ili, poželjno, mRNK (tj. CDNK) koja kodira antitela. Kloniranje i sekvenciranje se sprovode standardnim tehnikama, kao što je na primer lančana reakcija polimeraze (PCR), (videti, npr., Sambrook i dr. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press; Ausubel, i dr. (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994))).

[0225] Reakcije nukleotidnih sondi i druge reakcije nukleotidne hibridizacije sprovode se u uslovima koji omogućavaju identifikaciju polinukleotida koji se hibridiziraju jedni s drugima pod određenim uslovima. Jedan primer uslova je sledeći: stroga hibridizacija na 42 °C u 50% formamidu, 5X SSC, 20 mM Na•PO4, pH 6,8; i pranje u 1X SSC na 55 °C tokom 30 minuta. Formule za izračunavanje ekvivalentnih uslova hibridizacije i/ili odabir drugih uslova za postizanje željenog nivoa strogosti su dobro poznate. U tehnici se razume da se uslovi ekvivalentne strogosti mogu postići varijacijom temperature i pufera, ili koncentracije soli kako je opisano Ausubel, i dr. (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pp. 6.0.3 to 6.4.10. Modifikacije u uslovima hibridizacije mogu se empirijski odrediti ili precizno izračunati na osnovu dužine i procenta uparivanja sonde baze gvanozin/citozin (GC). Uslovi hibridizacije mogu se izračunati kako je opisano u Sambrook, i dr., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp.9.47 to 9.51

[0226] Kako se ovde koristi, "izolovani" molekul nukleinske kiseline ili "izolovana" sekvenca nukleinske kiseline je molekul nukleinske kiseline koji je ili (1) identifikovan i odvojen od najmanje jednog molekula nukleinske kiseline zagađivača sa kojim je obično povezan u prirodnom izvoru nukleinske kiseline ili (2) klonirane, amplifikovane, obeležene ili na drugi način razlikovane od pozadinskih nukleinskih kiselina tako da se može odrediti sekvenca nukleinske kiseline od interesa smatra se izolovanom. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji je različit od oblika ili okruženja u kojem se nalazi u prirodi. Izolovani molekuli nukleinske kiseline se stoga razlikuju od molekula nukleinske kiseline kakav postoji u prirodnim ćelijama. Međutim, izolovani molekul nukleinske kiseline uključuje molekul nukleinske kiseline sadržan u ćelijama koje obično eksprimiraju antitelo gde se, na primer, molekul nukleinske kiseline nalazi na hromozomskoj lokaciji različitoj od one u prirodnim ćelijama.

2

[0227] Jedan izvor RNK koji se koristi za kloniranje i sekvenciranje je hibridom proizveden dobijanjem B ćelije od transgenog miša i spajanjem B ćelije sa besmrtnom ćelijom. Prednost upotrebe hibridoma je ta što se oni mogu lako pregledati i izabrati hibridom koji proizvodi humano monoklonsko antitelo od interesa. Alternativno, RNK se može izolovati iz B ćelija (ili cele slezine) imunizovane životinje. Kada se koriste izvori osim hibridoma, može biti poželjno proveriti sekvence koje kodiraju imunoglobuline ili imunoglobulinske polipeptide sa specifičnim karakteristikama vezivanja. Jedan od postupaka za takav skrining je upotreba tehnologije prikaza faga. Fazni prikaz je dalje opisan ovde i takođe je dobro poznat u tehnici. Videti, npr., Dower i dr., WO 91/17271, McCafferty i dr., WO 92/01047, i Caton and Koprowski, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-54 (1990)). U jednom aspektu korišćenjem tehnologije prikaza faga, izoluje se cDNK iz imunizovanog transgenog miša (npr., ukupna cDNK slezine), lančana reakcija polimeraze se koristi za amplifikaciju sekvenci cDNK koje kodiraju deo polipeptida imunoglobulina, na primer, regione CDR, i pojačane sekvence se ubacuju u fag vektor. cDNK koje kodiraju peptide od interesa, na primer, peptidi promenljive regije sa željenim karakteristikama vezivanja, identifikuju se standardnim tehnikama kao što je pomeranje.

[0228] Obično se određuje sekvenca koja kodira čitavu varijabilnu regiju polipeptida imunoglobulina, međutim, ponekad će adekvatnom sekvencirati samo deo varijabilne regije, na primer, deo koji kodira CDR. Obično će sekvencirani deo imati najmanje 30 baza po dužini, češće zasnovano kodiranje za najmanje jednu trećinu ili bar oko polovine dužine varijabilnog regiona će biti sekvencirano.

[0229] Sekvenciranje se vrši standardnim tehnikama (videti, npr., Sambrook i dr. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, i Sanger, F. i dr. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467). Poređenjem sekvence klonirane nukleinske kiseline sa objavljenim sekvencama gena humanog imunoglobulina i cDNK, stručnjak će lako moći da odredi, u zavisnosti od regiona koji je sekvenciran, (i) upotrebu segmenta zametne linije polipeptida imunoglobulina (uključujući izotip teškog lanca) i (ii) sekvencu varijabilnih regiona teškog i lakog lanca, uključujući sekvence nastale dodavanjem N-regiona i procesom somatske mutacije. Jedan izvor informacija o sekvenci gena imunoglobulina je Nacionalni centar za biotehnološke informacije, Nacionalna medicinska biblioteka, Nacionalni instituti za zdravlje, Bethesda, Md.

[0230] Jednom izolovana, DNK se može staviti u ekspresione vektore, koji se zatim transfektuju u ćelije domaćine, kao što su ćelije E. coli, ćelije majmuna COS, ćelije bubrega humanog embriona 293 (npr., ćelije 293E), ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, da bi se dobila sinteza monoklonskih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćinima. Rekombinantna proizvodnja antitela je dobro poznata u tehnici.

[0231] Sekvence za kontrolu ekspresije se odnose na sekvence DNK potrebne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćinu. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promotor, po izboru operatorsku sekvencu i mesto vezivanja ribosoma. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotore, signale poliadenilacije i pojačivače.

[0232] Nukleinska kiselina je operativno povezana kada je stavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za sekretornog vođu je operativno povezan sa DNK za polipeptid ako je izražen kao preprotein koji učestvuje u lučenju polipeptida; promoter ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je postavljeno tako da dozvoljava prevođenje. Uopšteno, operativno povezani znači da su povezane DNK sekvence susedne, au slučaju sekretornog vođe susedne i u fazi čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju biti susedni. Povezivanje se postiže ligacijom na pogodnim mestima ograničenja. Ako takva mesta ne postoje, sintetički oligonukleotidni adapteri ili veznici se koriste u skladu sa konvencionalnom praksom.

[0233] Ćelija, ćelijska linija i ćelijska kultura se često koriste naizmenično i sve takve oznake ovde uključuju potomstvo. Transformatori i transformisane ćelije uključuju primarnu ćeliju ispitanika i kulture izvedene iz njih bez obzira na broj prenosa. Takođe se razume da svi potomci možda nisu tačno identični u sadržaju DNK, zbog namernih ili nenamernih mutacija. Uključeno je mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je pregledano u prvobitno transformisanoj ćeliji. Gde su namenjene različite oznake, biće jasno iz konteksta.

[0234] U alternativnom otelotvorenju, aminokiselinska sekvenca imunoglobulina od interesa može se odrediti direktnim sekvenciranjem proteina. Pogodne kodirajuće nukleotidne sekvence mogu se dizajnirati prema univerzalnoj tabeli kodona.

[0235] Varijante aminokiselinske sekvence mogu se pripremiti uvođenjem odgovarajućih promena nukleotida u kodirajuću DNK ili sintezom peptida. Takve varijante uključuju, na primer, brisanje i/ili umetanje u i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci antitela. Bilo koja kombinacija brisanja, umetanja i zamene dolazi do konačne konstrukcije, pod uslovom da konačna konstrukcija poseduje željene karakteristike. Promene aminokiselina takođe mogu da promene posttranslacione procese molekula, kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije.

[0236] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijante sekvence aminokiselina antitela se pripremaju različitim postupcima poznatim u tehnici. Ovej postupak uključuju, ali nisu ograničene na, izolaciju iz prirodnog izvora (u slučaju prirodnih varijanti sekvenci aminokiselina) ili pripremu mutagenezom posredovanom oligonukleotidom (ili usmerenom na lokaciju), PCR mutagenezom i kasetnom mutagenezom ranije pripremljenu varijantu ili varijantu varijante antitela.

[0237] Predmetno obelodanjivanje takođe obezbeđuje izolovana antitela koja kodiraju nukleinsku kiselinu iz ovog otkrića, opciono operativno povezana sa kontrolnim sekvencama koje prepoznaje ćelija domaćin, vektori i ćelije domaćini koje sadrže nukleinske kiseline, i rekombinantne tehnike za proizvodnju antitela, koje mogu obuhvatati kultivisanje ćelije domaćina tako da se nukleinska kiselina eksprimira i, opciono, da se antitelo izvuče iz kulture ćelije domaćina ili medijuma za kulturu. Razmatrani su različiti sistemi i metode za proizvodnju antitela Birch & Racher (Adv. Drug Deliv. Rev.671-685 (2006)).

[0238] Za rekombinantnu proizvodnju antitela, nukleinska kiselina koja ga kodira se izoluje i ubaci u ponovljivi vektor radi daljeg kloniranja (amplifikacija DNK) ili radi ekspresije. DNK koja kodira monoklonsko antitelo se lako izoluje i sekvencira primenom konvencionalnih procedura (npr., korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Dostupno je mnogo vektora. Vektorske komponente generalno uključuju, ali nisu ograničene na, jedno ili više od sledećeg: signalna sekvenca, poreklo replikacije, jedan ili više gena selektivnih markera, pojačivački element, promoter i sekvencija za završetak transkripcije.

(1) Komponenta sekvence signala

[0239] Antitela prema predmetnom obelodanjivanju mogu se proizvesti rekombinantno, ne samo direktno, već i kao fuzioni polipeptid sa heterolognim polipeptidom, koji je poželjno signalna sekvenca ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto deljenja na N-terminalu zrelog proteina ili polipeptida. Poželjno je da se izabere signalna sekvenca koja je prepoznata i obrađena (tj., deljenje signalnom peptidazom) od strane ćelije domaćina. Ako prokariotske ćelije domaćini ne prepoznaju i ne obrade signalnu sekvencu izvornog antitela, signalna sekvenca može biti zamenjena signalnom sekvencom odabranom, na primer, iz grupe pektat liaze (npr., PelB) alkalne fosfataze, penicilinaze, lpp ili lideri enterotoksina II otporni na toplotu. Za izlučivanje kvasca, nativna signalna sekvenca može biti zamenjena, na primer, liderom invertaze kvasca, vođom a faktora (uključujući lidere -faktora Saccharomyces i Kluyveromyces), ili liderom kisele fosfataze, liderom C. albicans glukoamilaze ili signalom opisanim u WO90/13646. U ekspresiji ćelija sisara, signalne sekvence sisara, kao i vođe sekrecije virusa, na primer, gD signal herpes simpleksa, su dostupne.

[0240] DNK za takav prekursorski region se u okviru za čitanje veže za DNK koja kodira antitelo.

(2) Poreklo komponente replikacije

[0241] I ekspresijski i klonirajući vektori sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava vektoru da se replicira u jednoj ili više odabranih ćelija domaćina. Generalno, u vektorima za kloniranje ova sekvenca je ona koja omogućava vektoru da se replicira nezavisno od hromozomske DNK domaćina, i uključuje poreklo replikacije ili autonomno replicirajuće sekvence. Takve sekvence su dobro poznate po raznim bakterijama, kvascima i virusima. Poreklo replikacije iz plazmida pBR322 pogodno je za većinu gram-negativnih bakterija, poreklo 2 µ plazmida je pogodno za kvasac, a različito poreklo virusa je korisno za kloniranje vektora u ćelijama sisara. Generalno, poreklo komponente replikacije nije potrebno za vektore ekspresije sisara (poreklo SV40 se obično može koristiti samo zato što sadrži rani promotor).

(3) Komponenta selektivnog markera

[0242] Vektori ekspresije i kloniranja mogu sadržati selektivni gen, koji se takođe naziva selekcioni marker. Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji (a) pružaju otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, neomicin, metotreksat, tetraciklin, G418, genetinin, histidinol ili mikofenolna kiselina (b) nadopunjuju auksotrofne nedostatke, ili (c) snabdevaju kritične hranljive materije nije dostupan iz složenih medija, npr., gen koji kodira D-alanin racemazu za Bacilli.

4

[0243] Jedan primer šeme selekcije koristi lek za zaustavljanje rasta ćelije domaćina. Te ćelije koje se uspešno transformišu sa heterolognim genom proizvode protein koji daje rezistenciju na lekove i na taj način preživljavaju režim selekcije. Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove metotreksat, neomicin, histidinol, puromicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin.

[0244] Drugi primer pogodnih selektivnih markera za ćelije sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija sposobnih da preuzmu nukleinsku kiselinu koja kodira antitela, kao što su DHFR, timidin kinaza, metalotionein-I i -II, poželjno geni primata metalotioneina, adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza itd.

[0245] Na primer, ćelije transformisane sa DHFR selekcionim genom se prvo identifikuju kultivisanjem svih transformanata u medijumu za kulturu koji sadrži metotreksat (Mtx), kompetitivni antagonist DHFR. Odgovarajuća ćelija domaćin kada se koristi DHFR divljeg tipa je ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO) sa nedostatkom DHFR aktivnosti.

[0246] Alternativno, ćelije domaćini (posebno domaćini divljeg tipa koji sadrže endogeni DHFR) transformisani ili ko-transformisani sa DNK sekvencama koje kodiraju antitelo iz predmetnog obelodanjivanja, DHFR protein divljeg tipa i drugi marker koji se može izabrati, kao što je aminoglikozid 3'-fosfotransferaza (APH), mogu biti odabrani ćelijskim rastom u medijumu koji sadrži selekciono sredstvo za marker koji se može izabrati, kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr., kanamicin, neomicin ili G418. Videti Patent SAD No.4,965,199.

[0247] Pogodan selekcioni gen za upotrebu u kvascu je gen trp1 prisutan u plazmidu kvasca YRp7 (Stinchcomb i dr., Nature, 282: 39 (1979)). Trp1 gen obezbeđuje selekcioni marker za mutirani soj kvasca koji nema sposobnost rasta u triptofanu, na primer, ATCC br. 44076 ili PEP4-1. Jones, (Genetics 85:12 (1977)). Prisustvo trp1 lezije u genomu ćelije domaćina kvasca tada pruža efikasno okruženje za detekciju transformacije rastom u odsustvu triptofana. Slično, sojevi kvasca sa nedostatkom Leu2 (ATCC 20,622 ili 38,626) dopunjeni su poznatim plazmidima koji nose gen Leu2. Sojevi kvasca sa nedostatkom Ura3 dopunjeni su plazmidima koji nose gen ura3.

[0248] Osim toga, vektori izvedeni iz 1,6 µm kružnog plazmida pKD1 mogu se koristiti za transformaciju Kluyveromyces kvasca. Alternativno, sistem ekspresije za veliku proizvodnju rekombinantnog telećeg himozina prijavljen je za K. lactis Van den Berg, (Bio/Technology, 8:135 (1990)). Takođe su otkriveni stabilni ekspresijski vektori u više kopija za sekreciju zrelog rekombinantnog humanog serumskog albumina industrijskim sojevima Kluyveromyces (Fleer i dr, Bio/Technology, 9:968-975 (1991)).

(4) Komponenta promotera

[0249] Vektori ekspresije i kloniranja obično sadrže promotor koji prepoznaje organizam domaćin i operativno je povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira antitela. Promotori pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju promotor arabinoze (npr., araB) ph9oA promotor, sistemi promotora β-laktamaze i laktoze, alkalne fosfataze, sistema promotora triptofana (trp) i hibridnih promotora kao što je tac promotor. Međutim, pogodni su i drugi poznati promoteri bakterija. Promotori za upotrebu u bakterijskim sistemima će takođe sadržavati Shine-Dalgarno (S.D.) sekvencu operativno povezanu sa DNK koja kodira antitelo iz predmetnog obelodanjivanja.

[0250] Promotorske sekvence su poznate za eukariote. Praktično svi eukariotski geni imaju region bogat AT-om koji se nalazi otprilike 25 do 30 baza uzvodno od mesta na kojem se započinje transkripcija. Druga sekvenca pronađena 70 do 80 baza uzvodno od početka transkripcije mnogih gena je region CNCAAT gde N može biti bilo koji nukleotid. Na 3' kraju većine eukariotskih gena nalazi se AATAAA sekvenca koja može biti signal za dodavanje poli A repa na 3' kraj kodirajuće sekvence. Sve ove sekvence su prikladno umetnute u eukariotske ekspresione vektore.

[0251] Primeri pogodnih promotivnih sekvenci za upotrebu sa domaćinima kvasca uključuju promotore 3-fosfoglicerat kinaze ili drugih glikolitičkih enzima, kao što su enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triosefosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza i glukokinaza.

[0252] Drugi promotori kvasca, koji su inducibilni promotori koji imaju dodatnu prednost transkripcije kontrolisanu uslovima rasta, su regioni promotera za alkohol dehidrogenazu 2, izocitohrom C, kiselu fosfatazu, razgradive enzime povezane sa metabolizmom azota, metalotionein, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu i enzimi odgovorni za iskorišćavanje maltoze i galaktoze. Pogodni vektori i promotori za upotrebu u ekspresiji kvasca dalje su opisani u EP 73,657. Poboljšivači kvasca se povoljno koriste sa promotorima kvasca.

[0253] Transkripciju antitela iz vektora u ćelijama domaćina sisara kontrolišu, na primer, promotori dobijeni iz genoma virusa poput virusa Abelson leukemije, polioma virusa, virusa peradi, adenovirusa (kao što je Adenovirus 2), goveđeg papiloma virusa, virusa sarkoma ptica, najpoželjnije citomegalovirus, retrovirus, virus hepatitisa-B, Simian Virus 40 (SV40), od heterolognih promotera sisara, npr., promotora aktina ili promotora imunoglobulina, od promotora toplotnog šoka, pod uslovom da su takvi promotori kompatibilni sa sistemima ćelija domaćina.

[0254] Rani i kasni promotori virusa SV40 pogodno se dobijaju kao SV40 restrikcioni fragment koji takođe sadrži SV40 virusno poreklo replikacije. Neposredni rani promoter humanog citomegalovirusa pogodno se dobija kao HindIII E restrikcioni fragment. Sistem za ekspresiju DNK kod domaćina sisara koji koristi goveđi papiloma virus kao vektor obelodanjen je u Patent SAD No.4,419,446. Modifikacija ovog sistema opisana je u Patent SAD No. 4,601,978. Videti takođe Reyes i dr., Nature 297: 598-601 (1982) o ekspresiji humane βinterferonske cDNK u ćelijama miša pod kontrolom promotora timidin kinaze iz virusa herpes simpleksa. Alternativno, dugotrajno ponavljanje virusa rous sarkoma može se koristiti kao promoter.

(5) Komponenta elementa pojačivača

[0255] Transkripcija DNK koja kodira antitelo predmetnog obelodanjivanja višim eukariotima često se povećava umetanjem pojačivača u vektor. Poznate su mnoge sekvence pojačivača iz gena sisara (globin, elastaza, albumin, alfa-fetoprotein i insulin). Obično će se, međutim, koristiti pojačivač iz virusa eukariotskih ćelija. Primeri uključuju pojačivač SV40 na kasnoj strani izvora replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotora citomegalovirusa, pojačivač polioma na kasnoj strani izvora replikacije i pojačivače adenovirusa. Videti takođe Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) o poboljšanju elemenata za aktivaciju eukariotskih promotera. Pojačivač se može spojiti u vektor na poziciji 5' ili 3' u odnosu na sekvencu koja kodira antitela, ali se poželjno nalazi na mestu 5' od promotora.

(6) Komponenta terminacije transkripcije

[0256] Ekspresioni vektori koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćinima (kvasci, gljivice, insekti, biljke, životinje, ljudi ili jezgra iz drugih višećelijskih organizama) takođe će sadržati sekvence neophodne za prekid transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence su obično dostupne iz 5' i, povremeno 3', neprevedenih regiona eukariotskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilovani fragmenti u neprovedenom delu mRNK kodirajućeg antitela. Jedna korisna komponenta za prekid transkripcije je region poliadenilacije goveđeg hormona rasta. Videti WO94/11026 i vektor ekspresije koji je u njemu obelodanjen. Drugi je terminator transkripcije lakog lanca mišjeg imunoglobulina.

(7) Izbor i transformacija ćelija domaćina

[0257] Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju DNK u vektorima ovde su iznad opisane ćelije prokariota, kvasca ili viših eukariota. Pogodni prokarioti za ovu svrhu uključuju eubakterije, kao što su gramnegativni ili gram-pozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae kao što su Escherichia, npr. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr., Salmonella tiphimurium, Serratia, npr., Serratia marcescans i Shigella, kao i Bacilli kao što su B. subtilis i B. licheniformis (npr., B. licheniformis 41 P obelodanjena u DD 266,710 published Apr. 12, 1989), Pseudomonas such as P. aeruginosa, i Streptomyces. Poželjan E. coli domaćin kloniranja je E. coli 294 (ATCC 31,446), iako su drugi sojevi kao što su E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), i E. coli W3110 (ATCC 27,325) pogodni. Ovi primeri su ilustrativni, a ne ograničavajući.

[0258] Pored prokariota, eukariotski mikrobi poput nitastih gljivica ili kvasca su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju antitela. Saccharomyces cerevisiae, ili obični pekarski kvas, najčešće se koristi među nižim eukariotskim mikroorganizmima domaćina. Međutim, mnogi drugi rodovi, vrste i sojevi su ovde dostupni i korisni, kao što je Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces domaćono kao što su npr., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans i K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces kao što je Schwanniomyces occidentalis; i nitaste gljivice, npr., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, i Aspergillus domaćini kao što su A. nidulans i A. niger.

[0259] Odgovarajuće ćelije domaćini za ekspresiju glikoziliranih antitela potiču od višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni bakulovirusni sojevi i varijante i odgovarajuće dozvoljene ćelije domaćina insekata od domaćina kao što su Spodoptera frugiperda (gusenica), Aedes aegipti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (plodna muva) i Bombyx mori. Različiti virusni sojevi za transfekciju su javno dostupni, npr., L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, a takvi virusi se mogu koristiti kao virus u skladu sa predmetnim obelodanjivanjem, posebno za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.

[0260] Biljne ćelijske kulture pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza, duvana i drugih biljnih ćelija takođe se mogu koristiti kao domaćini.

[0261] Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su ćelije jajnika kineskog hrčka, uključujući CHOK1 ćelije (ATCC CCL61), DXB-11, DG-44 i ćelije jajnika kineskog hrčka/- DHFR (CHO, Urlaub i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); majmunski bubreg CV1 linija transformisana pomoću SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humana embrionalna linija bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast kulture suspenzije, Graham i dr., J. Gen Virol.36: 59, 1977); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); mišje sertolijske ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod.23: 243-251, 1980); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); Ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); bubrežne ćelije psa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bizamskog pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije pluća čoveka (W138, ATCC CCL 75); ćelije jetre čoveka (Hep G2, HB 8065); tumor dojke kod miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather i dr., Annals N.Y Acad. Sci.383: 44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i humana hepatomska linija (Hep G2).

[0262] Ćelije domaćini se transformišu ili transficiraju sa gore opisanim vektorima ekspresije ili kloniranja za proizvodnju antitela i kultivišu u konvencionalnim hranljivim medijumima modifikovanim kako je prikladno za indukovanje promotora, odabir transformanata ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvence. Osim toga, novi vektori i transficirane ćelijske linije sa više kopija transkripcionih jedinica odvojenih selektivnim markerom su posebno korisne i poželjne za ekspresiju antitela koja vezuju metu.

(8) Uzgoj ćelija domaćina

[0263] Ćelije domaćini koje se koriste za proizvodnju antitela prema predmetnom obelodanjivanju mogu se kultivisati u različitim medijima. Komercijalno dostupni mediji, kao što su Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) su pogodni za uzgoj ćelija domaćina. Osim toga, bilo koji od medija opisanih u Ham i dr., (Meth. Enz.

58: 44, 1979), Barnes i dr., Anal. Biochem.102: 255 (1980), patent SAD br.4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ili 5,122,469; WO90103430; WO 87/00195; ili Patent SAD Re. br. 30,985 mogu se koristiti kao medijum za kulturu ćelija domaćina. Bilo koji od ovih medijuma može se prema potrebi dopuniti hormonima i/ili drugim faktorima rasta (poput insulina, transferina ili epidermalnog faktora rasta), solima (poput natrijum hlorida, kalcijuma, magnezijuma i fosfata), puferima (kao što je HEPES), nukleotidi (kao što su adenozin i timidin), antibiotici (kao što je lek gentamicin), elementi u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja obično prisutna u krajnjim koncentracijama u mikromolarnom opsegu) i glukoza ili ekvivalentni izvor energije. Bilo koji drugi neophodni dodaci mogu takođe biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama koje bi bile poznate stručnjacima. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćinom odabranom za ekspresiju i biće očigledno uobičajenom stručnjaku.

(9) Prečišćavanje antitela

[0264] Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo se može proizvesti unutar ćelije, u periplazmatskom prostoru, ili direktno izlučiti u medijum, uključujući iz mikrobnih kultura. Ako se antitelo proizvodi unutar ćelije, kao prvi korak, čestice čestica, bilo ćelije domaćina ili lizirani fragmenti, uklanjaju se, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Better i dr. (Science 240:1041-43, 1988; ICSU Short Reports 10:105 (1990); i Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:457-461 (1993) opišu postupak izolacije antitela koja se izlučuju u periplazmatični prostor E. coli. [Videti takođe, (Carter i dr., Bio/Technology 10:163-167 (1992)].

[0265] Kompozicija antitela pripremljena od mikrobnih ćelija ili ćelija sisara može se prečistiti korišćenjem, na primer, hidroksilapatitne hromatografske katjonske ili hromatografije ptičje izmene, i afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija poželjna tehnika prečišćavanja. Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrste i izotipa bilo kog imunoglobulinskog Fc domena koji je prisutan u antitelu. Protein A se može koristiti za prečišćavanje antitela zasnovanih na teškim lancima humanih γ1, γ2 ili γ4 (Lindmark i dr., J. Immunol. Meth. 62: 1-13, 1983). Protein G se preporučuje za sve mišje izotipove i za humani γ3 (Guss i dr., EMBO J. 5:15671575 (1986)). Matrica na koju je vezan afinitetni ligand je najčešće agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne matrice, poput stakla sa kontrolisanim porama ili poli (stirendivinil) benzena, omogućavaju brže protoke i kraće vreme obrade nego što se može postići sa agarozom. Tamo gde antitelo sadrži CH3 domen, Bakerbond ABX™ smola (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) je korisna za prečišćavanje. Druge tehnike za prečišćavanje proteina, kao što su frakcionisanje na koloni za izmenjivanje jona, taloženje etanola, HPLC sa obrnutom fazom, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparinskoj SEPHAROSE® hromatografiji na anjonskoj ili katjonoizmenjivačkoj smoli (kao što je kolona sa poliasparaginskom kiselinom), hromatofokusiranje, SDS-PAGE i taloženje amonijum sulfata su takođe dostupni u zavisnosti od antitela koje treba izlučiti.

Postupci skrininga

[0266] Efikasna terapija zavisi od identifikovanja efikasnih agenasa bez značajne toksičnosti. Antitela se mogu proveriti na afinitet za vezivanje postupcima poznatim u tehnici. Na primer, mogu se koristiti testovi pomeranja gela, Vestern blotovi, radioaktivno obeleženi testovi konkurencije, ko-frakcionisanje hromatografijom, kotaloženje, unakrsno povezivanje, ELISA i slično, koji su opisani u, na primer, Current Protocols in Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, NY.

[0267] Postupci skrininga antitela koja moduliraju aktivnost ciljnog antigena mogu da obuhvataju kontaktiranje test antitela sa ciljnim polipeptidom i ispitivanje prisustva kompleksa između antitela i ciljnog liganda. U takvim testovima, ligand je tipično obeležen. Nakon odgovarajuće inkubacije, slobodni ligand se odvaja od prisutnog u vezanom obliku, a količina slobodne ili nekompleksirane oznake je mera sposobnosti određenog antitela da se veže za ciljni ligand.

[0268] Može se primeniti skrining velike produktivnosti za fragmente antitela ili CDR koji imaju odgovarajući afinitet vezivanja za ciljni polipeptid. Ukratko, veliki broj različitih malih peptidnih test jedinjenja se sintetiše na čvrstoj podlozi. Antitela za ispitivanje peptida dolaze u kontakt sa ciljnim polipeptidom i isperu se. Vezani polipeptidi se zatim detektuju postupcima dobro poznatim u tehnici. Prečišćena antitela iz predmetnog obelodanjivanja se takođe mogu premazati direktno na ploče za upotrebu u iznad pomenutim tehnikama skrininga lekova. Pored toga, ne-neutralizirajuća antitela se mogu koristiti za hvatanje mete i njeno imobilizovanje na čvrstom nosaču.

[0269] Postupci za procenu neutralisanja biološke aktivnosti antitela na TGFβ i anti-TGFβ poznati su u tehnici. Videti npr., patent SAD 7,867,496. Primeri in vitro biotesta uključuju: (1) indukcija stvaranja kolonije NRK ćelija u mekom agaru u prisustvu EGF (Roberts i dr. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:5339-5343); (2) indukcija diferencijacije primitivnih mezenhimalnih ćelija radi izražavanja hrskavičnog fenotipa (Seyedin i dr. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:2267-2271); (3) inhibicija rasta mink epitelnih ćelija pluća Mv1Lu (Danielpour i dr. (1989) J. Cell. Physiol., 138:79-86) i ćelije bubrega majmuna BBC-1 (Holley i dr. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5989-5992); (4) inhibicija mitogeneze C3H/HeJ mišjih timocita (Wrann i dr. (1987) EMBO J., 6:1633-1636); (5) inhibicija diferencijacije ćelija moboblasta L6 pacova (Florini i dr. (1986) J. Biol. Chem., 261:16509-16513); (6) merenje proizvodnje fibronektina (Wrana i dr. (1992) Cell, 71:1003-1014); (7) indukcija promotora inhibitora inhibitora plazminogena I (PAI-1) spojena sa reporterskim genom luciferaze (Abe i dr. (1994) Anal. Biochem., 216:276-284); (8) sendvič enzimski imunosorbentski testovi (Danielpour i dr. (1989) Growth Factors, 2:61-71); i (9) ćelijski testovi opisani u Singh i dr. (2003) Bioorg. Med. Chem. Lett., 13(24):4355-4359.

[0270] U nekim otelotvorenjima, neutralizacija antitela TGFβ1 i TGFβ2 je najmanje 2-50 puta, 10-100 puta, 2, 5, 10, 10, 25, 50 ili 100 puta, ili 2050%, 50-100%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%ili 100%snažnije od neutralizacije TGFβ3.

[0271] Dodatni postupci za procenu biološke aktivnosti i neutralizacije TGFβ (npr., pomoću antitela na TGFβ) dati su u Primerima. Na primer, neutralizacija se može meriti analizama neutralizacije i izraziti kao vrednost IC50. IC50 vrednost se može izračunati za dati molekul određivanjem koncentracije molekula potrebne za izazivanje pola inhibicije maksimalnog biološkog odgovora drugog molekula ili ćelijske aktivnosti. Što je manji IC50, veća je moć molekula da inhibira željenu aktivnost proteina. Primeri testova neutralizacije koji su ovde razmatrani uključuju, ali nisu ograničeni na, test oslobađanja interleukin-11 i test proliferacije ćelija HT-2/IL-4. Pored toga, može se izvršiti ispitivanje aktivnosti TGFβ da bi se utvrdilo da li antitelo inhibira jednu izoformu TGFβ, preferencijalno, uključujući test fosforilacije pSMAD ili test vezivanja rhLAP. U sledećem otelotvorenju, antitelo ima niži IC50 (tj., bolje vezivanje, veću moć) za TGFβ1 i TGFβ2 u poređenju sa TGFβ3.

Kombinovana terapija

[0272] Antitelo prema predmetnom obelodanjivanju može se primeniti sa drugim sredstvom korisnim za lečenje bolesti ili poremećaja kako je ovde opisano. Ako se identifikuje više od jednog antitela koje je efikasno u vezivanju sa ciljnim antigenom, smatra se da se dva ili više antitela na različite epitope ciljnog antigena i/ili koji se prvenstveno vezuju za različite izoforme TGFβ mogu pomešati tako da se kombinacija antitela zajedno da bi se obezbedila još bolja efikasnost protiv stanja ili poremećaja povezanih sa ciljnim polipeptidom. Sastavi koji sadrže jedno ili više antitela prema pronalasku mogu se davati osobama ili sisarima koji pate od ili su skloni da pate od stanja ili poremećaja za lečenje povezanih sa ciljnim polipeptidom.

[0273] Istovremeno davanje dva terapeutska sredstva ne zahteva da se sredstva daju istovremeno ili istim putem, sve dok postoji preklapanje u vremenskom periodu tokom kojeg sredstva ispoljavaju svoj terapeutski efekat. Predviđena je istovremena ili sekvencijalna primena, kao i primena različitim danima ili nedeljama.

[0274] Drugo sredstvo može biti druga terapeutska sredstva, kao što su citokini, faktori rasta, antitela na druge ciljne antigene, antiinflamatorna sredstva, sredstva protiv zgrušavanja, sredstva koja inhibiraju proizvodnju ekstracelularnog matriksa, sredstva koja snižavaju ili smanjuju krvni pritisak, sredstva koja smanjiće holesterol, trigliceride, LDL, VLDL ili lipoprotein(i) ili povećati HDL, sredstva koja će povećati ili smanjiti nivo proteina koji regulišu holesterol, lekove ili molekule protiv neoplazme. Za pacijente sa hiperproliferativnim poremećajem, poput raka ili tumora, takođe se razmatra kombinacija sa drugim terapijskim modalitetima kao što su radioterapija, hemoterapija, fotodinamička terapija ili operacija.

[0275] Predviđeno je da se antitelo prema predmetnom obelodanjivanju i drugo sredstvo mogu dati istovremeno, u istoj formulaciji. Dalje se razmatra da se sredstva daju u zasebnoj formulaciji i primenjuju istovremeno, pri čemu se istovremeno odnose na sredstva data u roku od 30 minuta jedan od drugog.

[0276] U drugom aspektu, drugo sredstvo se daje pre davanja smeše antitela. Prethodno davanje se odnosi na davanje drugog sredstva u rasponu od nedelju dana pre tretmana sa antitelom, do 30 minuta pre primene antitela. Dalje se razmatra da se drugo sredstvo daje nakon davanja smeše antitela. Naknadno davanje treba da opiše primenu od 30 minuta nakon tretmana antitelima do jedne nedelje nakon davanja antitela.

[0277] Dalje se razmatra da se mogu primeniti i druge dodatne terapije, gde je to prikladno. Na primer, pacijentu se takođe može primeniti ekstracelularni protein koji razgrađuje matriks, hirurška terapija, hemoterapija, citotoksično sredstvo ili terapija zračenjem gde je to potrebno.

[0278] Dalje se razmatra da kada se antitelo daje u kombinaciji sa drugim sredstvom, kao što je na primer, gde je drugo sredstvo citokin ili faktor rasta, ili hemoterapeutsko sredstvo, davanje takođe uključuje upotrebu radioterapijskog sredstva ili zračne terapije. Radioterapija koja se primenjuje u kombinaciji sa sastavom antitela primenjuje se kako je odredio lekar, i u dozama koje se tipično daju pacijentima koji se leče od raka.

[0279] Citotoksično sredstvo odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili izaziva uništavanje ćelija. Ovaj termin uključuje radioaktivne izotope (npr., I131, I125, I90 i Re186), hemoterapeutska sredstva i toksine kao što su enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla ili sintetički toksini, ili njihovi fragmenti. Necitotoksično sredstvo odnosi se na supstancu koja ne inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili ne izaziva uništavanje ćelija. Necitotoksično sredstvo može uključivati sredstvo koje se može aktivirati da bude citotoksično. Necitotoksično sredstvo može uključivati zrnce, lipozom, matriks ili čestice (videti, npr., Patent SAD Publications 2003/0028071 i 2003/0032995). Takva sredstva mogu biti konjugovani, spregnuti, povezani ili povezani sa antitelom prema obelodanjivanju.

[0280] Hemoterapeutska sredstva predviđena za upotrebu sa antitelima prema predmetnom obelodanjivanju uključuju, ali nisu ograničeni na ona navedena u Tabeli I:

Tabela I

thrietilenmelamin (TEM) trietilen tiofosforamid (tiotepa) heksametilmelamin

(HMM, altretamin)

Alkil sulfonati

busulfan

Triazini

dakarbazin (DTIC)

Antimetaboliti

Analozi folne kiseline metotreksat

Trimetreksat

Pemetreksed (višeciljni antifolat)

Analozi pirimidina

5-fluorouracil fluorodeoksiuridin

gemcitabin

citozin arabinozid

(AraC, citarabin)

5-azacitidin

2,2'-difluorodeooksi-citidin

Analozi purina

6-merkaptopurin

6-tioguanin

azatioprin

2'-deoksikoformicin (pentostatin) eritrohidroksinonil-adenin (EHNA) fludarabin fosfat

2-hlorodeoksiadenozin (kladribin, 2-CdA)

Inhibitori topoizomeraze tipa I kamptotecin

topotekan

itinotekan

Modifikatori biološkog odgovora G-CSF

GM-CSF

Agenti za diferencijaciju derivati retinoične kiseline

Hormoni i antagonisti Adrenokortikosteroidi/ antagonisti prednizolona i ekvivalenati deksametazon ainoglutetimid

Progestini

hidroksiprogesteron kaproat medroksiprogesteron acetat megestrol acetat

4

[0281] Takođe se smatra da je drugi agens anti-fibrotičan. Primeri anti-fibrotičnih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, druga sredstva koja smanjuju aktivnost transformacije faktora rasta-beta (TGF-β) (uključujući, ali bez ograničenja, GC-1008 (Genzyme/MedImmune); lerdelimumab (CAT-152; Trabio, Cambridge Antibody); metelimumab(CAT-192,Cambridge Antibody,); LY-2157299 (Eli Lilly); ACU-HTR-028 (Opko Health)) uključujući antitela koja ciljaju jednu ili više TGF-β izoformi, inhibitore receptorskih kinaza TGF-β TGFBR1 (ALK5) i TGFBR2 i modulatore signalnih puteva nakon receptora; signalizacija receptora hemokina; antagonisti endotelinskih receptora, uključujući inhibitore koji ciljaju i na endotelinske receptore A i B i one koji selektivno ciljaju na endotelinski receptor A (uključujući, ali bez ograničenja, ambrisentan; avosentan; bosentan; klazosentan; darusentan; BQ-153; FR-139317, L-744453; macitentan; PD-145065; PD-156252; PD163610;PS-433540; S-0139; sitaksentan natrijum; TBC-3711; zibotentan); sredstva koja smanjuju aktivnost faktora rasta vezivnog tkiva (CTGF) (uključujući, ali bez ograničenja na FG-3019, FibroGen), a takođe uključuju i druga antitela koja neutrališu CTGF; inhibitori matriks metaloproteinaze (MMP) (uključujući, ali bez ograničenja, MMPI-12, PUP-1 i tigapotid triflutat); sredstva koja smanjuju aktivnost receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) uključujući, ali ne ograničavajući se na erlotinib, gefitinib, BMS-690514, cetuksimab,, antitela koja ciljaju na receptor EGF, inhibitore receptorske kinaze EGF i modulatore signalnih puteva nakon receptora; sredstva koja smanjuju aktivnost faktora rasta izvedenog iz trombocita (PDGF) (uključujući, ali bez ograničenja, imatinib-mezilat (Novartis)), a takođe uključuju i antitela koja neutrališu PDGF, antitela koja ciljaju na receptor PDGF (PDGFR), inhibitore aktivnosti PDGFR kinaze i postreceptor signalni putevi; sredstva koja smanjuju aktivnost vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF) (uključujući, ali bez ograničenja, aksitinib, bevacizumab, BIBF-1120, CDP-791, CT-322, IMC-18F1, PTC-299 i ramucirumab), uključujući i VEGF-neutrališuća antitela, antitela koja ciljaju na VEGF receptor 1 (VEGFR1, Flt-1) i VEGF receptor 2 (VEGFR2, KDR), rastvorljivi oblik VEGFR1 (sFlt) i njegovi derivati koji neutrališu VEGF i inhibitori aktivnosti kinaze receptora VEGF; inhibitori više receptorskih kinaza kao što je BIBF-1120 koji inhibira receptorske kinaze za vaskularni endotelni faktor rasta, faktor rasta fibroblasta i faktor rasta izveden iz trombocita; sredstva koja ometaju funkciju integrina (uključujući, ali bez ograničenja na STX-100 i IMGN-388), a takođe uključuju i antitela ciljana na integrin; sredstva koja ometaju pro-fibrotičke aktivnosti IL-4 (uključujući, ali bez ograničenja na AER-001, AMG-317, APG-201 i sIL-4Ra) i IL-13 (uključujući, ali bez ograničenja na AER-001, AMG-317, anrukinzumab, CAT-354, besudotoks od cintredekina, MK-6105, QAX-576, SB-313, SL-102 i TNX-650), uključujući i neutralisanje antitela na bilo koji citokin, antitela koja ciljaju na IL- 4 receptor ili IL-13 receptor, rastvorljivi oblik receptora IL-4 ili njegovi derivati za koje se izveštava da vezuju i neutrališu i IL-4 i IL-13, himerne proteine uključujući ceo ili deo IL-13 i toksin, posebno pseudomonas endotoksin, signalizirajući putem JAK-STAT kinaze; sredstva koja ometaju epitelnu mezenhimalnu tranziciju uključujući inhibitore mTor (uključujući, ali bez ograničenja, AP-23573); sredstva koja smanjuju nivoe bakra kao što je tetratiomolibdat; sredstva koja smanjuju oksidativni stres uključujući N-acetil cistein i tetratiomolibdat; i interferon gama. Takođe se razmatraju sredstva koja su inhibitori fosfodiesteraze 4 (PDE4) (uključujući, ali bez ograničenja, Roflumilast); inhibitori fosfodiesteraze 5 (PDE5) (uključujući, ali bez ograničenja, mirodenafil, PF-4480682, sildenafil citrat, SLx-2101, tadalafil, udenafil, UK-369003, vardenafil i zaprinast); ili modifikatori putanje arahidonske kiseline, uključujući inhibitore ciklooksigenaze i 5-lipoksegenaze (uključujući, ali bez ograničenja, Zileuton). Dalje se razmatraju jedinjenja koja smanjuju remodeliranje tkiva ili fibrozu, uključujući inhibitore prolil hidrolaze (uključujući, ali bez ograničenja na 1016548, CG-0089, FG-2216, FG-4497, FG-5615, FG-6513, fibrostatin A (Takeda), lufironil, P-1894B i safironil) i agoniste-PPA-aktiviranih receptora proliferatora peroksisoma (PPAR) (uključujući, ali bez ograničenja, pioglitazon i rosiglitazon).

[0282] Drugi specifični anti-fibrotični agensi koji se razmatraju uključuju relaksin, pirfenidon, ufironil, surifonil, CAT-192, CAT-158; ambresentan, telin; FG-3019, antitelo CTGF; anti-EGFR antitelo, inhibitor EGFR kinaze; tarceva; gefitinib; antitelo PDGF, inhibitor PDGFR kinaze; glevec; BIBF-1120, VEGF, FGF, i inhibitor PDGF receptora; anti-integrin antitelo; IL-4 antitelo; tetratiomolibdat, helatno sredstvo za bakar; interferon-gamma; NAC, pro-lek cisteina; faktor rasta hepatocita (HGF); KGF; blokatori receptora angiotenzije, ACE inhibitori, inhibitori renina; COX i LO inhibitori; Zileuton; monteleukast; avastin; statini; Inhibitori PDE5, kao što su sildenafil, udenafil, tadalafil, vardenafil ili zaprinast; rofumilast; etanercept (Enbrel); prokoagulant; prostaglandini, kao što je PGE2, PRX-08066, antagonist receptora 5HT2B; cintredekin besudotok, himerni humani IL13 konjugovan sa genetski modifikovanim egzotoksinom Pseudomonas; roflumilast, PDE4 inhibitor; FG-3019, humano monoklonsko antitelo protiv faktora rasta vezivnog tkiva; GC-1008, TGF-β humano monoklonsko antitelo; treprostinil, analog prostaciklina; interferon-α; KAX-576, IL13 modulator; WEB 2086, antagonist PAF-receptora; imatinib mezilat; FG-1019; Suramin; Bosentan; IFN-1b; anti-IL-4; anti-IL-13; taurin, niacin, NF-κB antisens oligonukleotidi; i inhibitori sintaze azot-oksida.

Lečenje poremećaja

[0283] Predmetno obelodanjivanje predviđa inhibiranje ciljne aktivnosti davanjem ciljano specifičnog antitela pacijentu kome je to potrebno. Bilo koja od ovde opisanih vrsta antitela može se koristiti terapeutski. U primerinim otelotvorenjima, ciljno specifično antitelo je humano, himerno ili humanizovano antitelo. U drugom primeru otelotvorenja, meta je čovek, a pacijent humani pacijent. Alternativno, pacijent može biti sisar koji eksprimira ciljni protein sa kojim unakrsna antitela specifično ciljaju. Antitelo se može primeniti na sisavca koji nije human i koji eksprimira ciljani protein sa kojim antitelo uzajamno reaguje (tj. primat) u veterinarske svrhe ili kao životinjski model ljudske bolesti. Takvi životinjski modeli mogu biti korisni za procenu terapeutske efikasnosti ciljnih specifičnih antitela iz predmetnog obelodanjivanja.

[0284] Obelodanjivanje obezbeđuje lečenje stanja ili poremećaja povezanih sa ekspresijom TGF-β koji se sastoji od davanja ispitaniku kome je to potrebno terapeutski efikasne količine antitela ili farmaceutskog sastava kako je ovde opisano.

[0285] Primeri stanja ili poremećaja povezanih sa ekspresijom TGFβ koji se mogu lečiti supstancom antitela koja vezuje TGFβ (npr., antitela prema predmetnom obelodanjivanju) uključuju karcinom, kao što su rak pluća, rak prostate, rak dojke, hepatocelularni karcinom, rak jednjaka, kolorektalni karcinom, rak pankreasa, rak bešike, rak bubrega, rak jajnika, rak želuca, fibrozni rak, gliom i melanom, bolesti oka (npr. očne, optičke, oftalmološke ili oftalmološke) bolesti, stanja ili poremećaji, oboljenja ili poremećaji povezani sa fibroze, npr. fibroproliferativne bolesti, stanja ili poremećaji, ili bolesti, stanja ili poremećaji koji imaju pridruženu fibrozu.

[0286] Fibroproliferativne bolesti, stanja ili poremećaji ili bolesti povezane sa fibrozom uključuju one koje utiču na bilo koji organ ili tkivo u telu, uključujući, ali ne ograničavajući se na kožu, pluća, bubrege, srce, mozak i oko. Fibroproliferativne bolesti, stanja ili poremećaji ili bolesti koje imaju pridruženu fibrozu uključuju, ali nisu ograničene na plućnu fibrozu, idiopatsku plućnu fibrozu, peribronhiolarnu fibrozu, intersticijalnu bolest pluća, hroničnu opstruktivnu bolest pluća (COPD), bolesti malih disajnih puteva (npr. opstruktivni bronhiolitis), emfizem, odrasli ili akutni respiratorni distres sindrom (ARDS), akutna povreda pluća (ALI), plućna fibroza uzrokovana infektivnim ili toksičnim uzročnicima, fibroza bubrega, glomerulonefritis (GN) svih etiologija, npr. , mezangijalna proliferativna GN, imunološka GN i polumesečna GN, glomeruloskleroza, tubulointersticijska povreda, intersticijska fibroza bubrega, fibroza bubrega i svi uzroci bubrežne intersticijalne fibroze, bubrežna fibroza koja je rezultat komplikacija izloženosti lekovima, uključujući lečenje ciklosporina primalaca transplantata, npr. lečenje ciklosporinom, nefropatija povezana sa HIV-om, transplantaciona nefropatija, dijabetička bolest bubrega (npr. dijabetička nefropatija), nefrogena sistemska fibroza, dijabetes, idiopatska retroperitonealna fibroza, skleroderma, fibroza jetre, bolesti jetre povezane sa prekomernim ožiljcima i progresivna skleroza, uključujući cirozu jetre zbog svih etiologija, poremećaje bilijarnog stabla, disfunkciju jetre koja se može pripisati infekcijama, fibrocistične bolesti, kardiovaskularne bolesti, poput kongestivne otkazivanje srca; proširena kardiomiopatija, miokarditis, vaskularna stenoza srčana fibroza (npr. postinfarktna srčana fibroza), post infarkt miokarda, hipertrofija leve komore, venookluzivna bolest, restenoza (npr. post-angioplastična restenoza), otkazivanje arteriovenskog grafta, hipertenzija, hipertenzija, hipertenzivna bolest srca, hipertrofija srca, hipertrofična kardiomiopatija, srčana insuficijencija, bolest aorte, progresivna sistemska skleroza, polimiozitis, sistemski eritematozni lupus, dermatomiozitis, fašisti, Rainaudov sindrom, reumatoidni artritis, proliferativna vitreoretinopatija, vitreoretinopatija bilo koje etiologije ili fibroze povezane sa hirurgijom oka, kao što je lečenje glaukoma, mrežnjača, ekstrakcija katarakte ili bilo kakve vrste drenaže, ožiljci na rožnjači i konjunktivi, fibroza u endotelu rožnjače, opekotine lužina (npr. lužine do rožnjače), fibroza kapsule sočiva nakon operacije katarakte, višak ožiljka tkiva oko ekstraokularnih mišića u operaciji strabizma, prednja subkapsularna katarakta i zamagljivanje zadnje kapsule, fibrotične bolesti prednjeg segmenta oka, fibroza strome rožnjače (npr. povezana sa zamućenjem rožnjače), fibroza trabekularne mreže (npr. povezana sa glaukomom), fibrozne bolesti oka zadnjeg segmenta, fibrovaskularni ožiljci (npr. u retinalnoj ili horoidnoj vaskulaturi oka), retinalna fibroza, epiretinalna fibroza, glioza retine, subretinalna fibroza (npr. povezana sa starosnom makularnom degeneracijom), post retinalna i glaukomska operacija, trakciono odvajanje mrežnjače povezano sa kontrakcijom tkiva kod dijabetičke retinopatije, Peironiejeve bolesti, sistemske skleroze, post-kičmene moždine, osteoporoze, Camurati-Engelmannove bolesti, Kronove bolesti, ožiljaka, Marfanovog sindroma, prevremenog zatajenja jajnika, Alchajmerove bolesti i Parkinsonove bolesti, fibroza usled hirurških rezova ili mehaničkih trauma, fibroza povezana sa hirurgijom oka, i prekomerno ili hipertrofično stvaranje ožiljka ili keloida u dermisu koji se javlja tokom zarastanja rana nastalih usled traume ili hirurških rana.

[0287] Primerne očne bolesti (npr. Očne, optičke, oftalmološke ili oftalmološke bolesti), stanja ili poremećaji, uključuju, ali se ne ograničavaju na njih, fibroproliferativne poremećaje, fibrozu oka, oftalmološke fibroze, disfunkciju mrežnjače, fibrozu povezanu sa disfunkcijom mrežnjače, vlažnu ili suvu makularna degeneracija, proliferativna vitreoretinopatija, vitreoretinopatija bilo koje etiologije, fibroza povezana sa hirurgijom oka, kao što je lečenje glaukoma, mrežnjača, ekstrakcija katarakte, ili postupci drenaže bilo koje vrste, ožiljci u rožnjači i konjunktivi, fibroza u endotelu rožnjače, opekotine alkalija (na primer, alkalne opekotine do rožnjače), fibroza kapsule sočiva nakon operacije katarakte, višak ožiljaka u tkivu oko ekstraokularnog područja mišići u operaciji strabizma, prednja subkapsularna katarakta i zamućenje zadnje kapsule, fibrotične bolesti oka prednjeg segmenta, fibroza strome rožnjače (npr. povezana sa zamućenjem rožnjače), fibroza trabekularne mreže (npr. povezana sa glaukomom), fibrotične bolesti zadnjeg segmenta oka, fibrovaskularni ožiljci (npr. u retini) ili horoidalna vaskulatura oka), retinalna fibroza, epiretinalna fibroza, retinalna glioza, subretinalna fibroza (npr. povezana sa starosnom degeneracijom makule), fibroza povezana sa post retinalnom i glaukomskom operacijom, trakciono odvajanje mrežnjače povezano sa kontrakcijom tkiva kod dijabetičke retinopatije.

[0288] Primeri fibroproliferativne bolesti, stanja ili poremećaja oka, fibroze oka, očne fibroze ili oftalmološke fibroze uključuju, ali nisu ograničeni na, proliferativnu vitreoretinopatiju, vitreoretinopatiju bilo koje etiologije, fibrozu povezanu sa disfunkcijom mrežnjače, fibrozu povezanu sa vlažnom ili suvom. makularna degeneracija, fibroza povezana sa hirurgijom oka, kao što je lečenje glaukoma, ponovno povezivanje mrežnjače, ekstrakcija katarakte ili bilo koje vrste drenažnih procedura, ožiljci u rožnjači i konjunktivi, fibroza u endotelu rožnjače, fibroza povezana sa opekotinama alkalija, operacija nakon katarakte fibroza kapsula sočiva, višak ožiljka tkiva oko ekstraokularnih mišića u operaciji strabizma, prednja subkapsularna katarakta i zamagljivanje zadnje kapsule, fibrotične bolesti prednjeg segmenta oka, fibroza strome rožnjače (npr. povezana sa zamućenjem rožnjače), fibroza trabekularne mreže (npr. povezana sa glaukomom), fibrozne bolesti oka zadnjeg segmenta , fibrovaskularni ožiljci (npr. u retinalnoj ili horoidalnoj vaskulaturi oka), retinalna fibroza, epiretinalna fibroza, retinalna glioza, subretinalna fibroza (na primer, povezana sa starosnom makularnom degeneracijom), fibroza povezana sa post retinalnom i glaukomskom operacijom, trakciono odvajanje mrežnjače povezano sa kontrakcijom tkiva kod dijabetičke retinopatije.

[0289] Fibroproliferativna bolest, stanje ili poremećaj oka može biti izabran iz grupe koju čine proliferativna vitreoretinopatija, fibroza povezana sa hirurgijom oka, fibroza sočiva nakon operacije katarakte, fibroza strome rožnjače i opekotina lužine.

[0290] Primeri karcinoma koji se mogu lečiti supstancom antitela prema predmetnom pronalasku uključuju karcinom, kao što su rak pluća, rak prostate, rak dojke, hepatocelularni karcinom, rak jednjaka, kolorektalni karcinom, rak pankreasa, rak bešike, rak bubrega, rak jajnika, rak želuca, fibrozni rak, gliom i melanom.

[0291] Uočeno je da mnogi humani tumori (deMartin i dr., EMBO J., 6: 3673 (1987), Kuppner i dr., Int. J. Cancer, 42: 562 (1988)) i mnoge ćelijske linije tumora (Derynck i dr., Cancer Res., 47: 707 (1987), Roberts i dr., Br. J. Cancer, 57: 594 (1988)) proizvode TGFβ i predlažu mogući mehanizam za te tumore da izbegnu normalan imunološki nadzor.

4

[0292] Ekspresija izoforme TGFβ u raku je složena i promenljiva sa različitim kombinacijama izoforma TGFβ koje imaju različite uloge u određenim vrstama raka. Molekuli TGFβ mogu delovati i kao supresori tumora i kao tumorski promotori. Na primer, brisanje ili smanjena regulacija signalizacije TGFβ kod životinja može dovesti do povećanja raka dojke, crevnog karcinoma, raka pankreasa, karcinoma debelog creva i karcinoma pločastih ćelija, što ukazuje na to da je prisustvo TGFβ važno za sprečavanje ili usporavanje progresije tumoraYang i dr., Trends Immunol 31:220-27, 2010). Međutim, poznato je da je prekomerna ekspresija TGFβ pro-onkogena i povećana ekspresija je otkrivena u mnogim vrstama tumora (Yang i dr., supra)

[0293] Dodatne složenosti su takođe obelodanjene u US Patent 7,927,593. Na primer, čini se da su različite izoforme TGFβ relevantnije za različite vrste karcinoma. TGFβ1 i TGFβ3 mogu igrati veću ulogu u raku jajnika i njegovoj progresiji od TGFβ2; dok je ekspresija TGFβ1 i TGFβ2 veća u tumorima hondrosarkoma višeg stepena od TGFβ3. Kod raka dojke kod ljudi, TGFβ1 i TGFβ3 su visoko izraženi, sa ekspresijom TGFβ3 u korelaciji sa ukupnim preživljavanjem, dok pacijenti sa metastazama u čvorovima i pozitivnom ekspresijom TGFβ3 imaju loše prognostičke ishode. Međutim, kod karcinoma debelog creva, TGFβ1 i TGFβ2 su izraženije od TGFβ3 i prisutni su u većim nivoima cirkulacije nego kod osoba bez raka. U gliomima, TGFβ2 je važan za migraciju ćelija. Iz nedavnih ispitivanja nije jasno koje bi izoforme TGFβ bile najkorisnije inhibirati kod određenog karcinoma i u kojoj meri.

[0294] Smatra se da je infiltracija imunoloških ćelija u tumorska mesta uobičajen faktor koji doprinosi rastu tumora. Ovi infiltrati imunih ćelija mogu imati blagotvorno dejstvo pomažući u čišćenju tumora, ali mogu biti i štetni ako omogućavaju toleranciju na tumorske antigene. Pokazano je da TGFβ može uticati na nivo imunih ćelija u tumorima (videti, npr., Yang i dr., Trends Immunol 31:220-27, 2010; Flavell i dr., Nature Immunol 10:554-567, 2010; Nagarau i dr., Expert Opin Investig Drugs 19:77-91, 2010). Na primer, TGFβ potiskuje ćelije prirodne ubice koje infiltriraju tumore kako bi očistile tumore iz tela. TGFβ takođe potiskuje aktivnost citotoksičnih T ćelija i CD4+ pomoćnih T ćelija, tipova ćelija koje pomažu u uklanjanju tumora (Yang, supra). TGFβ takođe igra ulogu u regulisanju aktivnosti dendritičnih ćelija, na primer inhibiranjem migracije na mesta povrede i prezentacijom antigena za podsticanje imunološkog odgovora. Dendritične ćelije reaguju na TGFβ i izlučuju TGFβ. Na primer, dendritične ćelije infiltriraju tumore i preuzimaju ćelije, izlučuju TGFβ i aktiviraju regulatorne T ćelije, što zauzvrat može sprečiti uklanjanje tumora (Flavell i dr., supra). Dodatno, supresorske ćelije izvedene iz mijeloida (MDSC) su ćelije izvedene iz koštane srži koje se šire tokom progresije tumora. MDSC inhibiraju proliferaciju T ćelija, potiskuju sazrevanje dendritičnih ćelija i inhibiraju aktivnost ćelija prirodnih ubica, pomažući tako ćelijama da izbegnu imunološki odgovor (Li i dr., J Immunol. 182:240-49, 2009). Pokazalo se da TGFβ doprinosi efektima MDSC na inhibiranje aktivnosti ćelija prirodnih ubica (Li i dr., supra; Xiang i dr., Int J Cancer124:2621-33, 2009). Uloga različitih izoformi TGFβ u svakom od ovih imunoloških procesa je nejasna. Selektivno ciljanje izoformi TGFβ i njihovo inhibiranje u različitom stepenu može biti od pomoći u moduliranju imunog odgovora domaćina na borbu i čišćenje tumora.

[0295] Ovde opisano antitelo ili sastav mogu modulirati imunološke ćelije u tumoru. Antitelo ili sastav mogu povećati broj ćelija prirodnih ubica (NK) u tumoru i/ili povećati citolitičku aktivnost NK ćelija. Ovde opisano antitelo ili sastav mogu smanjiti broj regulatornih T ćelija u tumoru i/ili inhibirati regulatornu funkciju T ćelija. Na primer, ovde opisano antitelo ili sastav mogu inhibirati sposobnost Treg da snizi imunološki odgovor ili da migrira na mesto imunog odgovora.

[0296] Ovde opisano antitelo ili sastav čine nešto za citotoksične T ćelije u tumoru i/ili pojačavaju CTL aktivnost, na primer, pojačavaju, povećavaju ili promovišu CTL aktivnost. Na primer, u različitim otelotvorenjima, ovde opisano antitelo ili sastav povećavaju perforin i granzim pomoću CTL-a i povećavaju citolitičku aktivnost CTL-a.

[0297] Ovde opisano antitelo ili sastav mogu smanjiti broj matičnih ćelija izvedenih iz monocita (MDSC) u tumoru i/ili inhibirati funkciju MDSC. Na primer, ovde opisano antitelo ili sastav može inhibirati sposobnost MDSCs da potisnu imunološki odgovor, inhibirati imunosupresivnu aktivnost MDSCs i/ili inhibirati sposobnost MDSCs da promovišu ekspanziju i/ili funkciju Treg.

[0298] Ovde opisano antitelo ili sastav mogu smanjiti broj dendritičnih ćelija (DC) u tumoru i/ili inhibirati tolerogenu funkciju (npr., tolerogeni efekat) dendritičnih ćelija. Na primer, ovde opisano antitelo ili sastav mogu smanjiti tolerantni efekat CD8+ dendritičnih ćelija.

[0299] U različitim otelotvorenjima, antitelo XPA.42.089 ili njegove varijante kako je ovde opisano modulira jednu ili više imunoloških aktivnosti opisanih iznad.

[0300] Kao što je prethodno rečeno, ekspresija TGFβ je takođe umešana u nastanak različitih fibroza tkiva, poput nefroskleroze, plućne fibroze i ciroze; kao i nastanak različitih stanja, kao što su hronični hepatitis, reumatoidni artritis, vaskularna restenoza i keloid kože. Ovde opisana antitela mogu se koristiti za lečenje fibroze ili fibrotičnog stanja. Primerne fibroze ili fibrotične bolesti uključuju, ali nisu ograničene na, glomerulonefritis, sindrom odrasle osobe ili akutni respiratorni distres (ARDS), dijabetes, dijabetičku bolest bubrega, fibrozu jetre, fibrozu bubrega, fibrozu pluća, post-infarktnu srčanu fibrozu, fibrocistične bolesti, fibrozni karcinom , post infarkta miokarda, hipertrofija leve komore, plućna fibroza, ciroza jetre, venookluzivna bolest, post-kičmena moždina, post-retinalna operacija i operacija glaukoma, restenoza nakon angioplastike, intersticijska fibroza bubrega, otkazivanje arteriovenskog transplantata i ožiljci.

[0301] Tretman ovih poremećaja ili stanja kod životinje kojoj je potrebno pomenuto lečenje, obuhvata davanje životinji efikasne količine antitela ili kompozicije koja sadrži ovde opisano antitelo.

[0302] Uslovi koji se mogu lečiti postupcima predmetnog obelodanjivanja poželjno se javljaju kod sisara. Sisavci uključuju, na primer, ljude i druge primate, kao i kućne ljubimce ili kućne ljubimce kao što su psi i mačke, laboratorijske životinje kao što su pacovi, miševi i zečevi i domaće životinje kao što su konji, svinje, ovce i goveda.

Ne-terapeutska upotreba

[0303] Antitela prema predmetnom obelodanjivanju mogu se koristiti kao sredstva za prečišćavanje afiniteta za metu ili u dijagnostičkim testovima za ciljni protein, na primer, za otkrivanje njegove ekspresije u specifičnim ćelijama, tkivima ili serumu. Antitela se takođe mogu koristiti za in vivo dijagnostičke testove. Generalno, u ove svrhe, antitelo je obeleženo radionuklidom (kao što je<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<125>I,<3>H,<32>P ili<35>S), tako da se antitelo može lokalizovati pomoću imunoscintiografije.

[0304] Antitela prema predmetnom obelodanjivanju mogu se koristiti u bilo kom poznatom postupku ispitivanja, kao što su testovi konkurentnog vezivanja, direktni i indirektni sendvič testovi, kao što su ELISA, i testovi imunoprecipitacije. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987). Antitela se takođe mogu koristiti za imunohistohemiju, za obeležavanje uzoraka tkiva ili ćelija primenom postupaka poznatih u tehnici.

[0305] Antitela na specifična cilja mogu se koristiti u konvencionalnom imunološkom testu, uključujući, bez ograničenja, ELISA, RIA, FACS, imunohistohemiju tkiva, Western blot ili imunoprecipitaciju, koje su sve tehnike dobro poznate u tehnici. Antitela iz predmetnog obelodanjivanja mogu se koristiti za otkrivanje mete kod ljudi i drugih sisara. Predmetno obelodanjivanje obezbeđuje postupak za otkrivanje mete u biološkom uzorku koji se sastoji u kontaktu biološkog uzorka sa antitelom specifičnim za metu iz predmetnog obelodanjivanja i otkrivanju vezanog antitela. U jednom otelotvorenju, ciljno specifično antitelo je direktno obeleženo detektujućom oznakom. U drugom otelotvorenju, ciljano specifično antitelo (prvo antitelo) je neobeleženo, a drugo antitelo ili drugi molekul koji može da vezuje ciljno specifično antitelo je obeleženo. Kao što je stručnjaku dobro poznato, bira se drugo antitelo koje je sposobno da specifično veže određenu vrstu i klasu prvog antitela. Na primer, ako je ciljno specifično antitelo humani IgG, onda bi sekundarno antitelo moglo biti anti-humani IgG. Drugi molekuli koji se mogu vezati za antitela uključuju, bez ograničenja, protein A i protein G, koji su oba komercijalno dostupna, npr., od Pierce Chemical Co.

[0306] Smatra se da se iznad opisani imunološki testovi koriste u brojne svrhe. Na primer, antitela specifična za metu mogu se koristiti za detekciju mete u ćelijama ili na površini ćelija u ćelijskoj kulturi, ili se izlučuju u medijum za kulturu tkiva. Antitela na metu se mogu koristiti za određivanje količine cilja na površini ćelija ili izlučivanje u medijum za kulturu tkiva koji je tretiran različitim jedinjenjima. Ovaj postupak se može koristiti za identifikaciju jedinjenja koja su korisna za inhibiranje ili aktiviranje ekspresije ili sekrecije cilja. Prema ovom postupku, jedan uzorak ćelija se tretira ispitivanim jedinjenjem tokom određenog vremenskog perioda, dok se drugi uzorak ne tretira. Ako se želi meriti ukupni nivo mete, ćelije se liziraju i ukupni ciljni nivo se meri pomoću jednog od iznad opisanih imunoloških testova. Upoređuje se ukupni nivo mete u tretiranim ćelijama sa netretiranim ćelijama da bi se utvrdio efekat jedinjenja koje se testira.

Oznake

[0307] Supstanca antitela može biti označena radi lakšeg otkrivanja. "Oznaka" ili "detektovan deo" je sastav koji se može detektovati spektroskopskim, fotohemijskim, biohemijskim, imunohemijskim, hemijskim ili drugim fizičkim sredstvima. Na primer, oznake pogodne za upotrebu u predmetnom obelodanjivanju uključuju, radioaktivne oznake (npr.,<32>P), fluorofore (npr., fluorescein), reagense guste elektrone, enzime (npr., koji se obično koriste u ELISA), biotin, digoksigenin ili haptene kao i proteini koji se mogu učiniti detektabilnim, na primer, uključivanjem radio-oznake u hapten ili peptid, ili se koriste za detekciju antitela

4

specifično reaktivnih sa haptenom ili peptidom.

[0308] Primeri oznaka pogodnih za upotrebu uključuju, ali nisu ograničeni na, fluorescentne boje (npr. Fluorescein izotiocijanat, teksaško crveno, rodamin i slično), radioaktivne oznake (npr.,<3>H,<125>I,<35>S,<14>C, ili<32>P), enzimi (npr., peroksidaza od rotkve, alkalna fosfataza i drugi koji se obično koriste u ELISA) i kolorimetrijske oznake kao što su koloidno zlato, obojeno staklo ili plastične perle (npr., polistiren, polipropilen, lateks itd.).

[0309] Oznaka se može direktno ili indirektno spojiti sa željenom komponentom testa prema postupcima dobro poznatim u tehnici. Poželjno, oznaka je kovalentno vezana za biopolimer koristeći izocijanatni reagens za konjugaciju aktivnog sredstva prema obelodanjivanju. Bifunkcionalni izocijanatni reagensi mogu se koristiti za konjugovanje oznake na biopolimer da bi se formirao označeni biopolimerni konjugat bez aktivnog sredstva vezanog za njega. Označeni biopolimerni konjugat može se koristiti kao međuproizvod za sintezu obeleženog konjugata prema obelodanjivanju ili se može koristiti za detekciju biopolimernog konjugata. Kao što je iznad naznačeno, može se koristiti veliki broj oznaka, sa izborom oznake u zavisnosti od potrebne osetljivosti, lakoće konjugacije sa željenom komponentom testa, zahteva stabilnosti, dostupnih instrumenata i odredbi o odlaganju. Neradioaktivne oznake se često pričvršćuju indirektnim putem. Generalno, molekul liganda (npr., biotin) je kovalentno vezan za molekul. Ligand se tada vezuje za drugi molekul (npr., streptavidin), koji je ili inherentno detektibilan ili kovalentno vezan za signalni sistem, kao što je detektirajući enzim, fluorescentno jedinjenje ili hemiluminiscentno jedinjenje.

[0310] Jedinjenja prema predmetnom obelodanjivanju se takođe mogu direktno konjugovati sa jedinjenjima koja generišu signal, na primer, konjugacijom sa enzimom ili fluoroforom. Enzimi pogodni za upotrebu kao etikete uključuju, ali nisu ograničeni na, hidrolaze, naročito fosfataze, esteraze i glikozidaze ili oksidotaze, naročito peroksidaze. Fluorescentna jedinjenja, odnosno fluorofori, pogodni za upotrebu kao oznake, uključuju, ali nisu ograničeni na, fluorescein i njegove derivate, rodamin i njegove derivate, dansil, umbelliferon itd., dalji primeri pogodnih fluorofora uključuju, ali nisu ograničeni na, eozin , TRITC-amin, kinin, fluorescein V, akridin žuti, lisamin rodamin, B sulfonil hlorid eritroscein, rutenijum (tris, bipiridinijum), Teksas crvena, nikotinamid adenin dinukleotid, flavin adenin dinukleotid itd. ali nisu ograničeni na, luciferin i 2,3-dihidroftalazindione, npr., luminol. Za pregled različitih sistema označavanja ili proizvodnje signala koji se mogu koristiti, videti Patent SAD No.4,391,904.

[0311] Sredstva za obelodanjivanje etiketa dobro su poznata stručnjacima. Tako, na primer, gde je oznaka radioaktivna, sredstva za detekciju uključuju scintilacioni brojač ili fotografski film, kao u autoradiografiji. Tamo gde je oznaka fluorescentna oznaka, može se otkriti pobuđivanjem fluorohroma odgovarajućom talasnom dužinom svetlosti i detektovanjem rezultujuće fluorescencije. Fluorescencija se može vizuelno detektovati upotrebom elektronskih detektora, kao što su uređaji povezani sa punjenjem (CCD) ili fotomultiplikatori i slično. Slično, enzimske oznake se mogu detektovati obezbeđivanjem odgovarajućih supstrata za enzim i detektovanjem rezultujućeg produkta reakcije. Kolorimetrijske ili hemiluminiscentne etikete mogu se otkriti jednostavnim posmatranjem boje povezane sa etiketom. Drugi sistemi označavanja i detekcije pogodni za upotrebu u postupcima predmetnog obelodanjivanja biće lako očigledni stručnjacima u ovoj oblasti. Takvi označeni modulatori i ligandi mogu se koristiti u dijagnostici bolesti ili zdravstvenog stanja.

Formulacija farmaceutskih sastava

[0312] Za davanje supstanci antitela prema predmetnom obelodanjivanju ljudima ili životinjama za testiranje, poželjno je formulisati supstance antitela u kompoziciji koja sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Termin "farmaceutski ili farmakološki prihvatljiv" odnosi se na molekularne entitete i sastave koji ne izazivaju alergijske ili druge neželjene reakcije kada se primenjuju putevima dobro poznatim u tehnici, kako je ispod opisano. "Farmaceutski prihvatljivi nosači" obuhvataju sve i sve klinički korisne rastvarače, disperzione medije, premaze, antibakterijska i antigljivična sredstva, izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije i slično.

[0313] Osim toga, jedinjenja mogu formirati solvate sa vodom ili uobičajenim organskim rastvaračima. Takvi solvati se takođe razmatraju.

[0314] Antitelo se primenjuje na bilo koji pogodan način, uključujući parenteralno, potkožno, intraperitonealno, intrapulmonalno i intranazalno, i, ako se želi za lokalni tretman, intralesionalnu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intravenoznu, intraarterijsku, intraperitonealnu, intramuskularnu, intradermalnu ili potkožnu primenu. Osim toga, antitelo se prikladno primenjuje pulsnom infuzijom, posebno sa smanjenjem doza antitela. Poželjno je da se doziranje daje injekcijama, najpoželjnije intravenoznim ili

4

potkožnim injekcijama, zavisno delimično od toga da li je primena kratka ili hronična. Predviđeni su i drugi načini primene, uključujući lokalnu, posebno transdermalnu, transmukoznu, rektalnu, oralnu ili lokalnu primenu, npr. kroz kateter postavljen blizu željenog mesta. Poželjno je ubrizgavanje, posebno intravenozno.

[0315] Farmaceutski preparati predmetnog obelodanjivanja koji sadrže supstancu antitela iz predmetnog obelodanjivanja kao aktivni sastojak mogu sadržati farmaceutski prihvatljive nosače ili aditive u zavisnosti od načina primene. Primeri takvih nosača ili aditiva uključuju vodu, farmaceutski prihvatljiv organski rastvarač, kolagen, polivinil alkohol, polivinilpirolidon, karboksivinil polimer, natrijum karboksimetilcelulozu, natrijum alkinat, natrijum alginat, dekstran rastvorljiv u vodi, natrijum karboksimetil skrob, pektin, metil celulozu, etil celuloza, ksantan guma, arapska guma, kazein, želatin, agar, diglicerin, glicerin, propilen glikol, polietilen glikol, vazelin, parafin, stearil alkohol, stearinska kiselina, humani serumski albumin (HSA), manitol, sorbitol, laktoza, farmaceutski prihvatljiva surfaktant i slično. Korišćeni aditivi se biraju između, ali bez ograničenja, iznad navedenih ili njihovih kombinacija, prema potrebi, u zavisnosti od oblika doziranja predmetnog obelodanjivanja.

[0316] Formulacija farmaceutskog sastava će se razlikovati u zavisnosti od izabranog načina primene (npr., rastvor, emulzija). Odgovarajuća kompozicija koja sadrži antitelo za primenu može se pripremiti u fiziološki prihvatljivom nosaču ili nosaču. Za rastvore ili emulzije, odgovarajući nosači uključuju, na primer, vodene ili alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferisane podloge. Parenteralni nosači uključuju rastvor natrijum hlorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, ili Ringerova ili fiksirana ulja. Intravenski nosači mogu uključivati različite aditive, konzervanse ili sredstva za dopunu tečnosti, hranljivih materija ili elektrolita.

[0317] Različiti vodeni nosači, npr., sterilni rastvori soli puferisani fosfatom, bakteriostatička voda, voda, puferisana voda, 0,4% fiziološki rastvor, 0,3% glicina i slično, a mogu uključivati i druge proteine za poboljšanu stabilnost, kao što su albumin, lipoprotein, globulin itd., podvrgnuti blagim hemijskim modifikacijama ili slično.

[0318] Terapeutske formulacije antitela se pripremaju za skladištenje mešanjem antitela željenog stepena čistoće sa opcionalnim fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, pomoćni ekscipijensi ili stabilizatori nisu toksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanti uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil paraben poput metila ili propil parabena; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptidi niske molekularne mase (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su albumin u serumu, želatina ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, poput polivinilpirolidona; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helirajuća sredstva kao što je EDTA; šećeri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-joni koji stvaraju sol kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr., Zn-protein kompleksi); i/ili nejonske površinski aktivne tvari kao što su TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).

[0319] Formulacija ovde takođe može sadržati više od jednog aktivnog jedinjenja po potrebi za određenu indikaciju koja se leči, po mogućnosti one sa komplementarnim aktivnostima koje međusobno ne negativno deluju. Takvi molekuli su prikladno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za predviđenu svrhu.

[0320] Aktivni sastojci se mogu takođe ugraditi u mikrokapsulu pripremljenu, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozom ili želatinskomikrokapsulom, odnosno poli-(metilmetakrilatskim) mikrokapsulama, u sistemima za koloidnu primenu lekova (na primer, lipozomi, mikrosfere albumina, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su obelodanjene u Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

[0321] Formulacije koje se koriste za in vivo primenu moraju biti sterilne. Ovo se lako postiže filtriranjem kroz sterilne membrane za filtriranje.

[0322] Vodene suspenzije mogu sadržati aktivno jedinjenje u smeši sa ekscipijensima koji su pogodni za proizvodnju vodenih suspenzija. Takvi ekscipijenti su suspendujuća sredstva, na primer natrijum karboksimetilceluloza, metilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza, natrijum alginat, polivinilpirolidon, tragakant i guma akacija; sredstva za raspršivanje ili ovlaživanje mogu biti prirodni fosfatidi, na primer lecitin,

4

ili proizvodi kondenzacije alkilen oksida sa masnim kiselinama, na primer polioksietilen stearat, ili proizvodi kondenzacije etilen oksida sa alifatskim alkoholima dugog lanca, na primer heptadekaetil-eneoksicetanol, ili produkti kondenzacije etilen oksida sa parcijalnim estarima izvedenim iz masnih kiselina i heksitola kao što je polioksietilen sorbitol monooleat, ili proizvodi kondenzacije etilen oksida sa parcijalnim estrima izvedenim iz masnih kiselina i anhidrida heksitola, na primer polietilen sorbitan monooleat. Vodene suspenzije mogu takođe sadržati jedan ili više konzervansa, na primer etil, ili n-propil, p-hidroksibenzoat.

[0323] Antitela prema predmetnom obelodanjivanju mogu biti liofilizirana za skladištenje i rekonstituisana u odgovarajućem nosaču pre upotrebe. Ova tehnika se pokazala efikasnom kod konvencionalnih imunoglobulina. Mogu se primeniti sve odgovarajuće tehnike liofilizacije i rekonstitucije. Stručnjaci će ceniti da liofilizacija i rekonstitucija mogu dovesti do različitih stepena gubitka aktivnosti antitela i da će se nivoi upotrebe možda morati prilagoditi da bi se kompenzovali.

[0324] Disperzivni praškovi i granule pogodne za pripremu vodene suspenzije dodavanjem vode obezbeđuju aktivno jedinjenje u smeši sa sredstvom za dispergovanje ili vlaženje, sredstvom za suspendovanje i jednim ili više konzervansa. Prikladna sredstva za dispergovanje ili vlaženje i sredstva za suspendovanje su ilustrovana iznad.

[0325] Koncentracija antitela u ovim formulacijama može široko da varira, na primer od manje od oko 0,5%, obično na ili najmanje oko 1% do čak 15 ili 20% po težini i biće izabrano prvenstveno na osnovu zapremina tečnosti, viskoznosti, itd., u skladu sa odabranim načinom davanja. Tako bi se tipični farmaceutski sastav za parenteralnu injekciju mogla sastojati od 1 ml sterilne puferisane vode i 50 mg antitela. Tipičan sastav za intravenoznu infuziju mogao bi se sastojati od 250 ml sterilnog Ringerovog rastvora i 150 mg antitela. Stvarni postupci za pripremu sastava za parenteralno davanje biće poznati ili očigledni stručnjacima u oblasti tehnike i biće detaljnije opisani, na primer, u, Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980). Efikasna doza antitela je u opsegu od 0,01 mg do 1000 mg po kg telesne masa po davanju.

[0326] Farmaceutski sastav mogu biti u obliku sterilne injekcione vodene, uljane suspenzije, disperzija ili sterilnih praškova za privremeno pripremanje sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Suspenzija se može formulisati u skladu sa poznatom strukom koristeći ona pogodna sredstva za dispergovanje ili vlaženje i sredstva za suspendovanje koja su gore pomenuta. Sterilni injektabilni preparat može takođe biti sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču, na primer kao rastvor u 1,3-butan diolu. Nosač može biti rastvarač ili medijum za disperziju koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i slično), njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja, Ringerov rastvor i izotonični natrijum rastvor hlorida. Dodatno, sterilna fiksirana ulja se konvencionalno koriste kao rastvarači ili podloge za suspendovanje. Za ovu svrhu bilo koje blago fiksirano ulje može biti iskorišćeno uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Dodatno, masne kiseline kao što je oleinska kiseline korišćene su za pripremanje ovih sredstava za ubrizgavanje.

[0327] U svim slučajevima, oblik mora biti sterilan i mora biti tečan do te mere da postoji mogućnost jednostavnog štrcanja. Ispravna tečnost može se održati, na primer, upotrebom obloga kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom površinski aktivnih materija. Mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti očuvan od zaraznog dejstva mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice. Do sprečavanja delovanja mikroorganizama mogu doći različiti antibakterijski i antifungalna sredstva, na primer, parabeni, hlorobutanol, fenol, sorbinska kiselina, timerosal i slično. U mnogim slučajevima biće poželjno uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injekcionih kompozicija može se postići upotrebom u sastavima sredstava koji odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0328] Sastave korisne za davanje mogu se formulisati sa pojačivačima usvajanja ili apsorpcije kako bi se povećala njihova efikasnost. Takvi pojačivači uključuju, na primer, salicilat, glikoholat/linoleat, glikolat, aprotinin, bacitracin, SDS, kaprat i slično. Videti npr, Fix (J. Pharm. Sci., 85:1282-1285 (1996)) and Oliyai and Stella (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:521-544 (1993)).

[0329] Sastavi antitela predviđeni za upotrebu za inhibiranje ciljne aktivnosti, uključujući vezivanje mete za njen srodni receptor ili ligand, signalizaciju posredovanu metom i slično. Posebno, sastavi pokazuju inhibitorna svojstva u koncentracijama koje su u suštini bez neželjenih efekata, pa su stoga korisne za proširene protokole tretmana. Na primer, istovremena primena sastava antitela sa drugim, toksičnijim, citotoksičnim agensom može postići blagotvornu inhibiciju stanja ili poremećaja koji se leči, uz efikasno smanjenje toksičnih nuspojava kod pacijenta.

4

[0330] Osim toga, svojstva hidrofilnosti i hidrofobnosti sastava predviđenih za upotrebu u ovom otkriću su dobro izbalansirana, čime se povećava njihova upotrebljivost i za in vitro i posebno in vivo upotrebu, dok su druge kompozicije koje nemaju takvu ravnotežu znatno manje korisne. Konkretno, sastavi predviđene za upotrebu u otkriću imaju odgovarajući stepen rastvorljivosti u vodenoj podlozi koji dozvoljava apsorpciju i bioraspoloživost u telu, dok takođe imaju stepen rastvorljivosti u lipidima koji omogućava jedinjenjima da prelaze ćelijsku membranu do navodnog mesta postupak. Tako su predviđeni sastavi antitela maksimalno efikasne kada se mogu isporučiti na mesto aktivnosti ciljnog antigena.

Davanje i doziranje

[0331] Farmaceutski sastav može biti sterilni sastav.

[0332] Mogu se koristiti bilo koji medicinski prihvaćeni načini za uvođenje terapeuta direktno ili indirektno kod ispitanika sisara, uključujući, ali bez ograničenja, injekcije, oralno uzimanje, intranazalno, lokalno, transdermalno, parenteralno, inhalacijski sprej, vaginalnu ili rektalnu primenu. Termin parenteralno kako se ovde koristi uključuje potkožne, intravenozne, intramuskularne i intracisternalne injekcije, kao i tehnike katetera ili infuzije. Predviđena je i primena putem, intradermalne, intramamarne, intraperitonealne, intratekalne, retrobulbarne, intrapulmonalne injekcije ili hirurške implantacije na određenom mestu.

[0333] Davanje se može izvršiti na mestu raka, fibroze ili zahvaćenog tkiva koje zahteva lečenje direktnom injekcijom u mesto ili putem mehanizma za odloženo oslobađanje ili produženo oslobađanje, koji može da isporuči formulaciju interno. Na primer, biorazgradive mikrosfere ili kapsule ili druge biorazgradive polimerne konfiguracije sposobne za kontinuiranu isporuku kompozicije (npr., rastvorljivi polipeptid, antitelo ili mali molekul) mogu biti uključene u formulacije otkrića implantirane blizu ili na mestu raka, fibroze ili zahvaćenog tkiva ili organa.

[0334] Terapeutski sastavi se takođe mogu isporučiti pacijentu na više mesta. Višestruka davanja se mogu primeniti istovremeno ili se mogu primeniti tokom određenog vremenskog perioda. U nekim slučajevima, korisno je obezbediti kontinuirani protok terapijskog sastava. Dodatna terapija se može primenjivati periodično, na primer, po satu, dnevno, nedeljno, svake 2 nedelje, svake 3 nedelje, mesečno ili u dužim intervalima.

[0335] Takođe se razmatra u predmetnom obelodanjivanju davanje više sredstava, kao što je sastav antitela zajedno sa drugim sredstvom kao što je ovde opisano, uključujući, ali bez ograničenja, hemoterapeutsko sredstvo ili sredstvo korisno za lečenje fibroze.

[0336] Količine sastava antitela u datoj dozi mogu varirati u zavisnosti od veličine pojedinca kome se terapija daje, kao i karakteristika poremećaja koji se leči. U primernim tretmanima, možda će biti potrebno primeniti oko 1 mg/dan, 5 mg/dan, 10 mg/dan, 20 mg/dan, 50 mg/dan, 75 mg/dan, 100 mg/dan, 150 mg/dan , 200 mg/dan, 250 mg/dan, 500 mg/dan ili 1000 mg/dan. Ove koncentracije se mogu primeniti kao pojedinačni oblik doziranja ili kao više doza. Takođe će biti očigledno da se doziranje može modifikovati ako se tradicionalni lekovi daju u kombinaciji sa terapeuticima iz predmetnog obelodanjivanja.

[0337] Takođe će biti očigledno da se doziranje može modifikovati ako se tradicionalni lekovi daju u kombinaciji sa terapeuticima iz predmetnog obelodanjivanja.

Kompleti

[0338] Kao dodatni aspekt, obelodanjivanje uključuje komplete koji sadrže jedno ili više jedinjenja ili sastava upakovanih na način koji olakšava njihovu upotrebu u praksi postupaka obelodanjivanja. Takav komplet može uključivati ovde opisano jedinjenje ili sastav (npr., kompoziciju koja sadrži samo antitelo specifično za metu ili u kombinaciji sa drugim sredstvom), upakovano u kontejner kao što je zapečaćena boca ili posuda, sa nalepnicom nalepljenom na kontejnera ili uključeno u paket koji opisuje upotrebu jedinjenja ili sastava u uvežbavanju postupka. Poželjno je da se jedinjenje ili sastav pakuju u obliku jedinične doze. Komplet može dalje da sadrži uređaj pogodan za davanje sastava prema specifičnom putu davanja ili za uvežbavanje testa skrininga. Poželjno, komplet sadrži oznaku koja opisuje upotrebu sastava antitela.

[0339] Dodatni aspekti i detalji obelodanjivanja biće jasni iz sledećih primera, koji imaju za cilj da budu ilustrativni, a ne ograničavajući. Primeri van patentnih zahteva su za referencu.

PRIMERI

Primer 1. Izolacija antitela na TGFβ iz biblioteka prikaza faga antitela

4

[0340] Za izolaciju panela antitela sposobnih da neutrališu aktivnost humanog TGFβ, tri izoforme proteina TGFβ, TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3 su korišćene za pomicanje biblioteka za prikazivanje faga humanih antitela kao što je ispod opisano.

Pomicanje:

[0341] TGFβ antigeni (PeproTech, Rocki Hill, NJ #100-21, 100-35B, 100-36E) su prvo pripremljeni biotinilacijom sa NHS-PEG4-biotinom (Pierce, Rockford, IL) koristeći protokol proizvođača. Ukratko, antigeni TGFβ, koji su uskladišteni u puferu sa niskim pH, neutralisani su dodavanjem 20X PBS da bi se pH doveo do približno 6,0. 30-struki molarni višak prethodno aktiviranog biotina je dodat i pomešan, a zatim je 20 minuta zadržan na sobnoj temperaturi. Zatim je dodat jednak volumen od 10 mM glicina pH 3,0 i uzorci su odmah stavljeni na dijalizu koristeći 6-8 kDa graničnu jedinicu za dijalizu nasuprot 10 mM citratnog pufera, pH 3,5. Biblioteka Fab fag displeja (XOMA, Berkeley, CA) je panovana biotinilovanim TGFβ koristeći rastvorljivi postupak pomicanja. Svaka izoforma TGFβ je panovana zasebno u tri kruga selekcije. Kappa i lambda biblioteke su se posebno pakovale.

[0342] Za prvu rundu pomicanja faga, 50X bibliotečkih ekvivalenata (∼2x 10<12>cfu) biblioteke je blokirano na ledu 1 sat u 1 mL 5% mleka/PBS. Veziva za streptavidin su poništena odabirom iz blokiranog faga dodavanjem blokiranog faga u magnetni DYNABEADS® M-280 obložen streptavidinom i inkubirana sa rotacijom 30 minuta. Korak poništavanja izbora je ponovljen još jednom. Za odvajanje perli od faga korišćen je magnet. Paralelno sa koracima de selekcije, dozvoljeno je 200 pmola biotinilovanog TGFβ da vezuje magnetni DYNABEADS® M-280 obložen streptavidinom inkubacijom na sobnoj temperaturi sa rotacijom 30 minuta. Nakon vezivanja, biotinilovane TGFβ perle su isprane dva puta sa 5% Milk-PBS. Selekcija je izvršena dodavanjem deselektiranog faga u biotinilirani TGFβ vezan za zrna magnetnog streptavidina i inkubirana rotacijom 1,5 do 2 sata. Nakon selekcije, nevezani fag je ispran sa zrnaca pomoću Kingfisher procesora magnetnih čestica (Thermo Scientific) koji je programiran za brzo pranje perli 3 puta sa PBS-0,1% TWEEN, nakon čega su usledila dodatna 3 brza ispiranja sa PBS. Vezani fag je eluiran iz zrna nakon koraka ispiranja dodatkom 100 mM trietilamina i inkubiran sa rotacijom na sobnoj temperaturi 30 minuta. Eluirani fag je neutralizovan dodatkom jednake zapremine 1M Tris-HCl, pH 7,4. Eluirani neutralizovani fag je zatim sakupljen u Falcon epruvetu od 50 mL (Falcon br.352070) i upotrebljena za infekciju bakterijskih ćelija TG1 koje rastu iz trupaca (OD600∼0.5). Infekcija je bila na 37°C 30 minuta bez mućkanja, nakon čega je usledila dodatna inkubacija od 30 minuta na 37°C uz mućkanje pri 90 o/min. Ćelije su stavljene na 2IT podlogu dopunjenu sa 100 ug/mL karbenicilina i 2% glukoze (2YTCG) agar ploča za biološku analizu i inkubirane preko noći na 30°C kako bi se omogućio rast travnjaka preko noći.

[0343] U pripremama za upotrebu kao ulaz za sledeću rundu, 100X rezultata prethodne runde je spašeno superinfekcijom pomoću pomoćnog faga MK07. To je učinjeno inokuliranjem 2YTCG medija ćelijama sastruganim sa prethodnog ispisa. OD600nmje izmereno za početnu kulturu i podešeno tako da odražava početni OD600nm∼0,05. Ćelije su uzgajane na 37°C uz mućkanje dok ćelije nisu dostigle fazu rasta log od OD600nm∼0,5. Ćelije su inficirane sa MK07 (Nev England Biolabs, MA) pri višestrukoj infekciji (MOI) = -20, na 37°C tokom 30 minuta bez mućkanja, nakon čega je usledilo dodatnih 30 minuta inkubacije na 37°C uz mućkanje pri 150 o/min. Nakon infekcije na 37°C, ćelije su peletirane i prebačene u novu 2YT podlogu dopunjenu sa 50 ug/mL Kanamycin i 100 ug/mL Carbenicillina (2YTCK). Kulture su uzgajane preko noći na 25°C. Fag je odvojen od ćelija i ostataka centrifugiranjem, a dobijeni supernatant je izdvojen i korišćen kao ulaz za sledeću rundu pomicanja. Obogaćivanje selekcije praćeno je količinom inputa koja se koristi za svaki krug pomicanja i rezultirajućim titrom faga izlaza.

[0344] Za drugi i treći krug pomeranja korišćeni su isti protokoli faze rešenja koji su praćeni u prvom krugu sa sledećim izuzecima. Količina faga koja se koristi u drugom i trećem krugu pomicanja iznosila je -1,0 x 10<11>cfu. Za drugu rundu, 100 pmola biotinilovanog antigena je korišćeno pri selekciji, a za treću rundu, 50 pmola biotinilovanog antigena. Kingfisher je korišćen za ispiranje nevezanog faga sa perli nakon selekcije. U drugom krugu, Kingfisher je programiran za pranje perli 3 puta sa PBS-0,1% TWEEN 2 minuta, nakon čega je sledilo 1 ml PBS pranja 2 minuta, ponovljeno 3 puta. U trećoj rundi, perle su isprane 3 puta sa PBS-0,1% TWEEN tokom 6 minuta, nakon čega su usledila dva četvorominutna ispiranja i jedno šestominutno ispiranje sa PBS.

[0345] Bakterijski periplazmatični ekstrakti koji sadrže izlučene fragmente antitela za upotrebu u skriningu na veziva TGFβ pripremljeni su standardnim postupcima. Pojedinačne kolonije su sakupljene u ploče sa 96 udubljenja napunjene sa 2ITC dopunjene sa 100 ug/mL Carbenicilina i 0,1% medijuma glukoze. Kulture su ostavljene da rastu na 37°C uz mućkanje dok se ne dostigne faza uzgoja trupaca (OD600nm= 0,5). Kolonije su zatim indukovane da proizvode rastvorljiva fragment antitela dodavanjem ImM IPTG final i inkubirane preko noći na 25°C uz mućkanje. Periplazmatski ekstrakti (PPE) koji sadrže antitela rastvorljivog fragmenta pripremljeni su od indukovanih ćelija standardnom metodom dodavanja zapreminskog odnosa 1:3 ledeno hladnog rastvora PPB (Teknova, Hollister, CA) i dvostruko destilovane vode (ddH2O) sa kompletnim bez EDTA koktel tablete sa inhibitorom proteaze. OZO su zatim korišćene za skrining na vezivna sredstva TGF-βb.

Skrining:

[0346] Dva alternativna formata testa skrininga su korišćena za identifikaciju klonova koji su vezali TGFβ, uključujući klonove koji su se vezali za sve tri izoforme TGFβ i bili jedinstveni u svojim sekvencama. Prvi test skrininga koristio je imunološki test zasnovan na ploči, a drugi test skrininga je izveden korišćenjem postupka skrininga SPR. Analiza zasnovana na pločama obuhvatala je oblaganje neprozirnih belih EIA ploča od 384 udubljenja sa 1 ug/mL klona Anti-His antitela AD.1.10 (R&D Systems, Minneapolis, MN) pri 1 ug/mL u PBS puferu četiri sata na sobnoj temperaturi. Zatim je ploča isprana 3X u PBS-TWEEN i zatim blokirana sa 0.5% BSA u PBS-TWEEN tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Sledećih 30 uL/bunar biotinilovanog TGFβ je dodato između 0,1 ug/mL za TGFβ1 i TGFβ2 i 0,2 ug/mL za TGFβ3, razblaženo u puferu za blokiranje. Zatim je dodato 30 uL periplazmatskog ekstrakta i inkubirano na 4°C preko noći na laganoj mućkalici za ploče. Ploče su isprane 3 puta u PBS-TWEEN, zatim je dodato 50 uL/udubljenju od 2,5 ug/mL Streptavidin-evropijuma (SA-Eu, PerkinElmer) razblaženog u puferu za razblaživanje za analizu DELFIA (PerkinElmer) u svako udubljenje i inkubirano 30 minuta na sobnoj temperaturi šejker. Ploče su isprane 7 puta sa PBS-TWEEN i dodato je 50 ul/udubljenju DELFIA reagensa za poboljšanje (PerkinElmer) i stavljeno na šejker 8 minuta na sobnoj temperaturi, zatim je očitano na čitaču ploča Molecular Devices FlekStation 3 u TRF režimu sa vremenom sakupljanja 200-1200µs i Exc.=345nm, Emm.=618nm, i granična vrednost=590nm, podešavanje visokog PMT-a, 20 očitavanja/udubljenju. Uzorci sa signalom više od 2,1 puta većim signalom od negativne kontrole OZO smatrani su pozitivnim.

[0347] SPR test je izveden BIACORE A100 testom direktnog vezivanja. U ovom testu, CM5 BIACORE čip je pripremljen pomoću standardne hemije sprezanja amina korišćenjem BIACORE kompleta za spajanje amina (GE Healthcare, Piscataway, NJ). TGFβ antigeni su razblaženi do 6 ug/mL u acetatu pH 4.0 i injektirani 7 minuta (tačke 1, što je TGFβ1) i 10 minuta (tačke 2 i 4, koje su TGFβ2 i TGFβ3). Ovo imobilizuje između 3400 i 4800 RU svakog TGFβ antigena. Uzorci su deaktivirani pomoću 1M etanolamina. Periplazmatski ekstrakti su razblaženi 1:1 sa HBS-EP+ (Teknova) sa 2 mg/mL BSA i filtrirani kroz 0,2 uM Millex GV filter ploču (Millipore), a zatim su ubrizgani pri 30 uL/minuti tokom 240 sekundi sa disocijacijom od 30 sekundi. Regeneracija nakon svake injekcije PPE bila je 10 sekundi 100 mM HCl. Tačka ranog izveštaja o stabilnosti u softveru BIACORE A100 korišćena je za procenu nivoa vezivanja PPE. Granični nivoi su određeni za svaku izoformu TGFβ nezavisno kao vizuelno iznad nivoa pozadine. Granične vrednosti RU bile su 245, 175 i 125 za TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3, respektivno.

Sazrevanje afiniteta:

[0348] Jedno antitelo, XPA.42.068, koje je imalo značajno veću vezujuću i neutrališuću aktivnost za TGFβ1 i TGFβ2 u odnosu na TGFβ3, podvrgnuto je sazrevanju afiniteta kako bi se povećao njegov afinitet i potencija prema TGFβ3. Biblioteka varijanti sekvence generisana sazrevanjem afiniteta je panovana korišćenjem TGFβ2 i TGFβ3, pri čemu su izlazni klonovi pregledani prvenstveno radi poboljšanja vezivanja TGFβ3.

[0349] Za skrining, SPR test je izveden BIACORE A100 testom direktnog vezivanja. U ovom testu CM5 BIACORE čip je pripremljen pomoću standardne hemije sprezanja amina korišćenjem BIACORE kompleta za spajanje amina. TGFβ antigeni su razblaženi do 1 ug/mL u acetatu pH 4.0 i injektirani 5 minuta (tačke 1 i 5, koje su TGFβ3 i TGFβ1 respektivno) i 8 minuta (tačke 2, što je TGFβ2). Ovo imobilizuje između 200 i 450 RU svakog TGFβ. Uzorci su deaktivirani pomoću 1M etanolamina. Periplazmatski ekstrakti su razblaženi 1:1 sa HBS-EP+ sa 2 mg/mL BSA i filtrirani kroz 0,2 µm Millex GV filter ploču (Millipore) i zatim ubrizgani pri 30 uL/minuti tokom 240 sekundi sa disocijacijom od 600 sekundi. Regeneracija nakon svake injekcije PPE bila je 10 sekundi 100 mM HCl. Referentni oduzeti podaci su iscrtani i vizuelno pregledani za klonove za koje se činilo da imaju ili veću stabilnost ili veće nivoe vezivanja. Jedan klon derivata, označen kao XPA.42.681, koji je pokazao pojačano vezivanje za TGFβ3, uključen je u dalja ispitivanja naznačavanja.

[0350] Odabrani klonovi su ponovo formatirani kao IgG2 antitela. Varijabilni teški (VH) i laki (VL) lanci odabranih Fab fragmenata su PCR-amplifikovani, klonirani u plazmidne vektore koji sadrže sekvence konstantnog regiona antitela i prolazno transfektovani u ćelije 293E koristeći standardne metode za generisanje materijala za dalju karakterizaciju, uključujući ispod opisana ispitivanja.

1

Primer 2. Merenje afiniteta vezivanja TGFβ antitela

[0351] Antitela su okarakterisana protiv TGFβ izoformi TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3 zbog njihovog afiniteta za vezivanje (KD), smanjivanje (kd) i povećanje (ka) korišćenjem tehnologije površinske plazmonske rezonance (SPR). Analiza je izvršena pomoću dva postupka. Jedan postupak je bio postupak direktne imobilizacije antigena u kojoj su proteini TGFβb imobilizovani na površinu pri maloj gustini sa antitelima ubrizganim u više koncentracija radi kinetičke analize. Drugi postupak je bio postupak imobilizovanih antitela pomoću injekcija različitih koncentracija ubrizganih proteina TGFβ.

Postupak kinetike imobilizovanih antitela:

[0352] Senzor CM4 čip (GE Healthcare) korišćen je u sistemu BIACORE 2000 (GE Healthcare). Čip je prethodno kondicioniran sa dve injekcije od 30 sekundi, svaka pri brzini protoka od 50 µL/minuti od 100 mM HCl, pH glicina 2,0, 50 mM NaOH, i puferom u toku pre imobilizacije. Pufer za imobilizaciju je bio HEPES puferisani fiziološki rastvor (HBS-EP+) sa 10 mM hepesa, 150 mM natrijum hlorida, 3 mM EDTA i 0,05% polisorbata 20 (Teknova). Površina čipsa aktivirana je sedmo minutnom injekcijom pri 10 µL/minuti sveže pomešanog 1:1 rastvora 0,1 M N-hidroksisukcinimida (NHS) i 0,4 M 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorida (EDC). Nakon aktivacione injekcije, 1 ug/mL anti-TGFβ antitela u acetatu pH 4,5 je ubrizgano pri 10 µL/minuti tokom jednog minuta, sa injekcijama usmerenim na 120 RU. 8 minuta 1M etanolamin hidrohlorida-NaOH pH 8,5 je ubrizgano da blokira površinu. Korišćeni NHS, EDC i etanolamin su bili iz BIACORE kompleta za spajanje amina.

[0353] Kinetička analiza je izvedena koristeći tekući pufer temeljno degaziranog oblika HBS-EP+ pufera iznad dopunjenog sa 1 mg/mL BSA (Sigma Aldrich, St. Louis MO). Injekcije uzorka TGFβ izvedene su pri 50 µL/minuti tokom četiri minuta sa vremenom disocijacije 900 sekundi. Svaki protein TGFβ (TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3) je ubrizgan na 10 nM, 2 nM, 0,4 nM, 0,08 nM (350 ng/mL sa 5 puta serijskim razblaženjem) sa praznim okvirima za svaku seriju koncentracija i četvorostrukim injekcijama. Regeneracija je zatim izvedena sa tri injekcije od po 30 sekundi svaka po 100 mM HCl u 3 M MgCl2, nakon čega je usledila završna injekcija pufera od 30 sekundi.

[0354] Podaci su analizirani korišćenjem Scrubber2 (BioLogic Software, Campbell Australia) i dvostruko su referencirani oduzimanjem podataka o ćelijama sa praznim protokom i prosečnim bracketing praznim injekcijama. Podaci su usklađeni istovremenim uklapanjem (KD) off-rate (kd) i on-rate (ka), a prikazani su u Tabeli 2 ispod. Podaci za prethodno izmerena uporedna antitela, označena BM-1 (1D11, R&D Systems MAB1835) takođe su uključeni u Tabelu 2. BM-1 podaci su generisani na BIACORE A100. Ukratko, BM-1 antitelo je uhvaćeno pri približno 100 RU gustine na površini čipa Fc CM5 čipa velike gustine zeca (GE Healthcare). TGFβ proteini su ubrizgani u istim koncentracijama kao što je iznad opisano pri 30 µL/minuti. Ovi podaci su dvostruko referencirani i analizirani u softveru BIACORE A100.

Tabela 2. Podaci o afinitetu iz testa koji koristi imobilizovano antitelo i ubrizgan TGFβ

[0355] Podaci o afinitetu mereni u ovom testu korišćenjem imobilizovanih antitela pokazali su da XPA.42.681 ima najjače (najuže) vezivanje od svih antitela za svaku od tri izoforme TGFβ, a takođe vezuje svaku od izoformi TGFβ sa sličnim afinitetima. Osim toga, antitela XPA.42.068 i KSPA.42.089 imala su slično ili jače vezivanje za izoforme TGFβ1 i TGFβ2 u poređenju sa antitelom BM-1, ali su pokazala značajno manje vezivanje za izoformu TGFβ3, u poređenju sa BM-1 antitelom ili u odnosu na vezivanje TGFβ1 i TGFβ2.

Postupak afiniteta prema imobilizovanom TGFβ:

[0356] Čip CM1 senzora (GE Healthcare) koji ima ravnu -COOH površinu korišćen je na sistemu BIACORE 2000. Čip je prethodno kondicioniran sa dve injekcije od 30 sekundi, svaka pri brzini protoka od 50 µL/minuti od 100 mM HCl, pH glicina 2,0, 50 mM NaOH, i puferom u toku pre imobilizacije. Pufer za imobilizaciju je bio HEPES puferisani fiziološki rastvor (HBS-EP+) sa 10 mM hepesa, 150 mM natrijum hlorida, 3 mM EDTA i 0,05% polisorbata 20. Površina čipa aktivirana je četvorominutnim injekcijama pri 20 mL/minuti sveže pomešanog 1:1 rastvora 0,1M N-hidroksisukcinimida (NHS) i 0,4M 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)

2

karbodiimid hidrohlorida (EDC). Nakon aktivacione injekcije, 0,1 ug/mL rastvora TGFβ u acetatu pH 4,0 je ubrizgavano pri 20 µL/minuti nekoliko minuta. Svaki TGFβ je koristio zaseban korak aktivacije na sopstvenoj protočnoj ćeliji, tako da je TGFβ1 imobilizovan na Fc2, TGFβ2 na Fc3 i TGFβ3 na Fc4 sa Fc1 kao aktiviranom i inaktiviranom slepom. Injekcije TGFβ izvedene su kao serija injekcija od 1 do 2 minute gledajući imobilizovani nivo između svake injekcije. Ciljna imobilizovana gustina svakog TGFβ liganda bila je 30 RU. Nakon injekcija imobilizacije TGFβ, 4 minute 1 M etanolamin hidrohlorida-NaOH pH 8,5 je ubrizgano da blokira površinu. Korišćeni NHS, EDC i etanolamin su bili iz kompleta za spajanje amino kiselina BIACORE, a TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3 iz R&D Systems.

[0357] Za analizu afiniteta, tekući pufer je prebačen na potpuno degazovan oblik HBS-EP+ pufera iznad dopunjenog sa 1 mg/mL BSA (Sigma Aldrich, St. Louis MO). Svako od antitela je razblaženo u tekućem puferu do 5 µg/mL (33,3 nM) i pripremljena su 4 sledeća petostruka razblaženja postavljajući koncentracije od 33,33 nM, 6,67 nM, 1,33 nM, 267 pM i 53 pM za svako. Oni su zatim ubrizgani pomoću podešavanja Kinject četiri minuta pri 50 µL/minuti, sa vremenom disocijacije od 900 sekundi. Regeneracija je zatim izvedena sa 12 µL (14,4 sekunde) injekcijom 100 mM HCl pri 50 µL/minuti, nakon čega je usledila injekcija pufera od 18 sekundi. Injekcije su bile istovremeno u svim protočnim ćelijama i uzorci su ubrizgavani u četiri puta sa praznim injekcijama koje su nosile svaki skup silaznih koncentracionih grupa za svako antitelo. To znači da su pre drugog ubrizgavanja istog uzorka sve ostale koncentracije svih antitela ubrizgane jednom.

[0358] Podaci su analizirani korišćenjem Scrubber2 (BioLogic Software, Campbell Australia) i dvostruko su referencirani oduzimanjem podataka o ćelijama sa praznim protokom i prosečnim bracketing praznim injekcijama. Podaci su usklađeni istovremenim podešavanjem (KD) off-rate (kd) i on-rate (ka), a prikazani su u Tabeli 3 ispod.

Tabela 3. Podaci o afinitetu iz testa koji koristi imobilizovani TGFβ i ubrizgana antitela.

[0359] U skladu sa rezultatima imobilizovanih antitela iz Tabele 2, podaci o afinitetu izmereni u testovima sa imobilizovanim antigenom (Tabela 3) takođe su pokazali da XPA.42.681 ima najjače (najuže) vezivanje od svih antitela za svaku od tri izoforme TGFβ, sa sličnim afinitetom za svaku od izooblika TGFβ. Pored toga, XPA.42.068 i XPA.42.089 imali su slično ili jače vezivanje za izoforme TGFβ1 i TGFβ2 u poređenju sa BM-1, ali značajno manje vezivanje za izoformu TGFβ3, u poređenju sa BM-1 antitelom ili u odnosu na vezivanje TGFβ1. Razlika u konstantama brzine merena korišćenjem testova imobilizovanog antitela u poređenju sa imobilizovanim antigenom verovatno je rezultat inherentnih složenosti sistema, ali ipak svaki pruža relativno visokokvalitetne kinetičke podatke i konzistentnost u svojstvima vezivanja u izoformama TGFβ i među antitelima međusobno.

Primer 3. Merenje receptorske konkurencije pomoću antitela na TGFβ

[0360] Antitela su okarakterisana po svojoj sposobnosti da inhibiraju ili blokiraju vezivanje svakog od tri TGFβ liganda za TGFβ receptore pomoću SPR testova konkurencije. TGFβ signalizira kroz receptor TGFβ tipa II (TGFβ-RII koji je transmembranski protein serin treonin kinaze i zahteva aktivaciju citoplazmatske asocijacije proteina tipa 1 receptora TGFβ (TGFβ-R1). Uloga vezivanja TGFβ-RI za ligand nije jasna i rekombinantni oblik TGFβ-RI nije pokazao nikakvo vezivanje pri ispitivanim koncentracijama za bilo koji od TGFβ1, TGFβ2 ili TGFβ3 liganda, ili za TGFβ-RII vezane oblike tih liganda, i stoga se ne mogu oceniti u eksperimentima sa takmičenjem receptora. TGFβ receptor tipa III (TGFβ-RIII) ima i membranski vezane i rastvorljive oblike i ne veruje se da je uključen u signalizaciju TGFβ. TGFβ-RIIb je varijanta spajanja koja sadrži umetanje 26 aminokiselina blizu N-terminala i ima jedinstveno svojstvo da se veže za sve tri izoforme TGFβ sa dobrim afinitetom. TGFβ-RII se čvrsto veže samo za TGFβ1 i TGFβ3 ligande, dok se TGFβ-RIII najbolje vezuje za TGFβ2 ligand.

[0361] Senzor CM5 čip (GE Healthcare) korišćen je u sistemu BIACORE 2000. Čip je prethodno kondicioniran sa nekoliko injekcija od 30 sekundi svaka pri brzini protoka od 50 µL/minuti od 100 mM HCl i 50 mM NaOH pre imobilizacije. Pufer za imobilizaciju je bio HEPES puferisani fiziološki rastvor (HBS-EP+) sa 10 mM hepesa, 150 mM natrijum hlorida, 3 mM EDTA i 0,05% polisorbata 20. Površina čipsa aktivirana je sedmominutnom injekcijom pri 10 µL/minuti sveže pomešanog 1:1 rastvora 0,1 M N-hidroksisukcinimida (NHS) i 0,4 M 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorida (EDC). Nakon aktivacione injekcije, 5 ug/mL TGFβ-RII, TGFβ-RIIb ili TGFβ-RIII (R&D sistemi) u acetatu pH 4,5 je ubrizgano pri 20 µL/minuti četiri minuta i rezultiralo je imobilizacijom od 1000-4000 RU za svaki od receptori TGFβ. Zatim je 8 minuta ubrizgano 1 M etanolamin hidrohlorida-NaOH pH 8,5 da bi se blokirala površina. Korišćeni NHS, EDC i etanolamin su bili iz BIACORE kompleta za spajanje amina. Fc1 je bila aktivirana i deaktivirana kontrola.

[0362] Testovi konkurencije su izvedeni koristeći tekući pufer potpuno degaziranog oblika HBS-EP+ pufera iznad dopunjenog sa 1 mg/mL BSA. TGFβ ligandi su korišćeni u svim injekcijama osim slepih kontrola pri 100 ng/mL (10 nM) do 40 ng/mL (4 nM) i pripremljeni su sa 10 ug/mL (66.6 nM) konkurentskih i kontrolnih antitela. Ostavljeno je da uzorci dođu u ravnotežu 40 minuta na sobnoj temperaturi pre početka rada BIACORE. Ravnotežni uzorci su zatim ubrizgani pri 10 uL/minuti tokom dve minute. Regeneracija je izvedena svakog ciklusa sa jednom injekcijom pH 2,5 glicina pri 50 uL/minuti tokom 9,6 sekundi (8 µLs). Uzorci su izvođeni u najmanje duplikatima i analizirani na nivo vezanog TGFβ.

[0363] Kao što je prikazano u Tabeli 4 ispod, rezultati za antitela XPA.42.068, XPA.42.089, XPA.42.681 i komparator BM-1 sugerišu da svako od ovih antitela blokira asocijaciju sva tri TGFβ liganda sa TGFβ-RII i TGFβ-RIII receptora, i da nije napravljena jasna razlika. Ovaj obrazac konkurencije receptora nije bio univerzalan među svim ostalim testiranim antitelima, ali za koje podaci nisu prikazani u predmetnom obelodanjivanju.

Tabela 4. Test konkurencije receptora EC50 (nM antitelo)

[0364] Jačina antitela XPA.42.068, XPA.42.089, XPA.42.681 i BM-1 u konkurenciji receptora je generalno korelirala sa njihovim afinitetima prema različitim izoformama TGFβ.

Primer 4. Merenje konkurencije epitopa među antitelima na TGFβ

[0365] Procenjivana je sposobnost antitela XPA.42.068 i XPA.42.089 da se vezuju za nezavisne ili preklapajuće epitope na proteinima TGFβ. Iako ova analiza u paru nije bila jednostavna zbog različitih afiniteta antitela među različitim izoformama TGFβ, i kovalentne homodimerizacije TGFβ liganda, što dovodi do vezivanja u dva odnosa IgG po homodimeru (npr., samoparivanje), razvijen je rastvorljivi test zasnovan na konkurenciji.

[0366] Senzor CM5 čip (GE Healthcare) korišćen je u sistemu BIACORE 2000. Čip je prethodno kondicioniran sa četiri injekcije od 30 sekundi pri protoku od 50 uL/minuti od 100 mM HCl pre imobilizacije. Pufer za imobilizaciju je bio HEPES puferisani fiziološki rastvor (HBS-EP+) sa 10 mM hepesa, 150 mM natrijum hlorida, 3 mM EDTA i 0,05% polisorbata 20. Površina čipsa aktivirana je sedmominutnom injekcijom pri 10 µL/minuti sveže pomešanog 1:1 rastvora 0,1 M N-hidroksisukcinimida (NHS) i 0,4 M 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorida (EDC). Nakon aktivacione injekcije, 1 ug/mL antitela XPA.42.089 u acetatu pH 4,5 i injektirano je pri 10 µL/minuti tokom nekoliko minuta injekcija. Injekcije su praćene i izvedene uzastopno da bi se utvrdili nivoi imobilizacije vrlo blizu 300 RU. Zatim je 8 minuta ubrizgano 1 M etanolamin hidrohlorida-NaOH pH 8,5 da bi se blokirala površina. Korišćeni NHS, EDC i etanolamin su bili iz BIACORE kompleta za spajanje amina. Fc1 je bila aktivirana i deaktivirana kontrola.

[0367] Testovi konkurencije su izvedeni koristeći tekući pufer potpuno degaziranog oblika HBS-EP+ pufera iznad dopunjenog sa 1 mg/mL BSA. TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3 su korišćeni u svim injekcijama pri 0,1 ug/mL (4 nM), osim slepih kontrola, i pripremljeni su sa 20 ug/mL (133 nM) konkurentskih antitela. TGFβ-RIIb-Fc rekombinantni receptor (R&D Systems) je takođe uključen kao konkurent. Ostavljeno je da uzorci dođu u ravnotežu 40 minuta na sobnoj temperaturi pre početka rada BIACORE. Ravnotežni uzorci su zatim ubrizgani pri 30 uL/minuti tokom tri minuta u sve protočne ćelije. Regeneracija se izvodila svakog ciklusa sa jednom injekcijom 50 mM NaOH pri 50 uL/minuti tokom 6 sekundi (5 µLs), a zatim je usledila injekcija pufera od trideset sekundi. Uzorci su vođeni u duplikatima i analizirani na nivo vezanog TGFβ na kraju tri minuta.

4

Tabela 5. Obavezujuće takmičenje (XPA.42.089 imobilizovano)

[0368] Kao što je prikazano u Tabeli 5 iznad, podaci ukazuju da su XPA.42.068 i XPA.42.089 pokazali jaku konkurenciju jedni s drugima za vezivanje svake od TGFβ izoformi. Vrednosti predstavljaju prosečan RU ili intenzitet signala vezivanja TGFβ koji je meren tokom injekcija kompleksa. Ovo pokazuje da je signal znatno smanjen kada je prisutno kompleksno antitelo. Svaka disocijacija kompleksa tokom injekcije mogla bi omogućiti slobodan ili monovalentno vezan TGFβ da se vezuje sa antitelom za hvatanje XPA.42.089. Pokazano je da je interakcija TGFβ-RIIb sa TGFb2 mnogo slabija od proteina TGFβ1 i TGFβ3, a brzi offrate omogućava relativno lošu konkurenciju za TGFβ2 u odnosu na XPA.42.089 visokog afiniteta. Antitelo XPA.42.681, koje je izvedeno iz XPA.42.068, nije testirano u testovima konkurencije.

Primer 5. Merenje rhLAP konkurencije pomoću TGFβ antitela

[0369] Preduzeti su dodatni testovi konkurencije kako bi se utvrdilo da li antitela takođe interaguju sa latentnim oblikom TGFβ. TGFβ pro-protein se cepa unutar golgija konvertazom sličnom furinu u peptid povezan sa N-terminalnom 249 aminokiselinom povezanom sa latencijom i zrelim TGFβ1 sa 112 aminokiselina na C-terminalu.

[0370] Senzor CM5 čip (GE Healthcare) korišćen je u sistemu BIACORE 2000. Čip je prethodno kondicioniran sa nekoliko injekcija od 30 sekundi svaka pri brzini protoka od 50 µL/minuti od 100 mM HCl i 50 mM NaOH pre imobilizacije. Pufer za imobilizaciju je bio HEPES puferisani fiziološki rastvor (HBS-EP+) sa 10 mM hepesa, 150 mM natrijum hlorida, 3 mM EDTA i 0,05% polisorbata 20. Površina čipsa aktivirana je sedmominutnom injekcijom pri 10 µL/minuti sveže pomešanog 1:1 rastvora 0,1 M N-hidroksisukcinimida (NHS) i 0,4 M 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorida (EDC). Posle aktivacione injekcije, 2 ug/mL rekombinantnog humanog TGFβ1 peptida povezanog sa kašnjenjem (rhLAP) (R&L sistemy) u acetatu pH 4,5 je ubrizgano pri 10 µL/minuti četiri minuta i rezultovalo je 400 RU imobilisanog rhLAP. Osam minuta ubrizgano je 1 M etanolamin hidrohlorida-NaOH pH 8,5 da bi se blokirala površina. Fc1 je bila aktivirana i deaktivirana kontrola.

[0371] Analiza konkurencije rhLAP-a izvedena je koristeći tekući pufer temeljno degaziranog HBS-EP+ pufera kao što je iznad dopunjeno sa 1 mg/mL BSA. TGFβ1 je korišćen u svim injekcijama osim slepih kontrola pri 0,25 ug/mL (10 nM) i pripremljen je sa 10 ug/mL (66,6 nM) konkurentskih i kontrolnih antitela. Ostavljeno je da uzorci dođu u ravnotežu 40 minuta na sobnoj temperaturi pre početka BIACORE ciklusa. Ravnotežni uzorci su zatim injektirani pri 40 uL/minuti dva minuta preko kontrole i površine rhLAP. Regeneracija je izvedena svakog ciklusa sa dve injekcije 100 mM HCl pri 100 uL/minuti tokom 9,6 sekundi (16 µLs). Uzorci su vođeni u duplikatima i analizirani na nivo vezanog TGFβ1.

[0372] Antitela XPA.42.068, XPA.42.089 i komparator BM-1 su testirana u rhLAP testu konkurencije. Antitelo XPA.42.681, koje je izvedeno iz XPA.42.068, nije testirano. Kao što je prikazano na Slici 1, XPA.42.068, XPA.42.089 i BM-1 su pokazali visok nivo konkurencije sa rhLAP, što ukazuje na to da antitela stupaju u interakciju sa aktivnim oblikom TGFβ i da ne prepoznaju latentni TGFβ.

Primer 6. Merenje neutralizacije pomoću antitela na TGFβ u testu HT-2

[0373] Da bi se utvrdilo da li su antitela funkcionalno neutralisala izoforme TGFβ, postupci ispitivanja Ruegemer i dr. (J Immunol.144:1767-76; 1990) su adaptirani pri čemu se HT-2 mišje T ćelije uzgajaju sa IL-4, i sa ili bez dodatka TGFβ1, TGFβ2 ili TGFβ3. Izoforme TGFβ inhibiraju IL-4 zavisan rast HT-2 ćelija transaktivacijom gena koji promovišu zaustavljanje ćelijskog ciklusa. IL-4 transaktivira program ekspresije mitogenih gena aktiviranjem ciljeva kao što su c-myc i GM-CSF; dok signalizacija TGFβ transaktivira gene koji potiskuju ekspresiju c-myc i GM-CSF. Ako se signalizacija TGFβ poništi neutralizirajućim antitijelom, ćelije HT-2 se razmnožavaju. Razlike u rastu postignute su testom održivosti CELL TITERGLO® (Promega #G7571) koji meri ATP kao očitavanje metabolički aktivnih ćelija.

[0374] HT-2 mišje T ćelije su održavane deljenjem svaka 2-3 dana na 1.5e4-2.5e4 ćelija/mL u RPMI 10% FBS, 10 mM Hepes, 2 mM glutamina, 50 uM 2-ME. Svež rekombinantni mišji IL-2 (R&D Systems) je dodat u 200 IU/mL u svaku tikvicu iz koncentrovane zalihe. Prvog dana ćelije su isprane u medijumu da bi se uklonio IL-2 i raspršile u neprozirne ploče sa 96 udubljenja po 10000 ćelija po udubljenju sa 2000 IU/ml rekombinantnog mišjeg IL-4 (R&D Systems). TGFβ1, TGFβ2 ili TGFβ3 (PeproTech #100-21, 100-35B, 100-36E) je dodat nakon 1 sata pre inkubacije sa ili bez antitela kroz niz titracija. Posle 48 -časovne inkubacije na 37°C, populacija održivih ćelija je ocenjena na MDS Flekstation3 korišćenjem CELL TITERGLO® prema preporukama proizvođača.

Tabela 6. Test neutralizacije ćelija HT-2

[0375] Antitela su u početku testirana na neutralizaciju aktivnosti TGFβ2 na jednoj tački razblaženja 10 ug/ml u testu HT-2, i potvrđeno je da je svako od antitela pozitivno, sa antitelima XPA.42.068, XPA.42.089 i XPA.42.681 koji imaju veću moć od uporednog antitela BM-1 u jednoj testiranoj tački. Neutralizacija TGFβ1 i TGFβ3 je zatim određena i izračunato je IC50 za svako antitelo u nizu razblaženja od 6 tačaka. Opet, svaki od XPA.42.068, XPA.42.089 i XPA.42.681 pokazao je veću moć od komparatora BM-1 u odnosu na neutralizaciju TGFβ1, ali je samo KSPA.42.681 pokazalo da ima veću efikasnost neutralizacije TGFβ3, pa je stoga bio najveći snažan pan-inhibitor TGFβ (Tabela 6). XPA.42.681 je pokazao povećanu moć u ovom testu, pri čemu su najniže testirane koncentracije značajno inhibirale TGFβ1, pa se nije mogao izvršiti poseban proračun IC50.

Primer 7. Merenje neutralizacije pomoću antitela na TGFβ u testu oslobađanja IL-11

[0376] Drugi test neutralizacije postigao je TGFβ posredovanu sekreciju IL-11 iz ćelija karcinoma pluća A549, što je deo pro-fibrotičkog odgovora u plućnim fibroblastima i epitelnim ćelijama. TGFβ takođe posreduje lučenje IL-11 iz ćelija MDA-MB-231 što promoviše metastaze u kosti. Ovaj test modelira biološke odgovore posredovane TGFβ koji doprinose fibrozi i metastatskoj bolesti. Test oslobađanja IL-11 prilagođen je iz Rapoza i dr. (J Immunol. Methods 316:18-26; 2006), pri čemu su ćelije A549 zasejane u ploče sa 96 udubljenja i ćelije sledećeg dana su tretirane sa ili bez izoformi TGFβ, prethodno inkubirane sa ili bez neutralizujućih antitela. Oslobađanje IL-11 je ocenjeno u supernatantima ćelijske kulture pomoću ELISA.

[0377] U ovom testu, ćelije A549 su uzgajane u F12 10% serumu. Dan pre analize, ćelije su odvojene versenom (da bi se zadržala receptorska ekspresija) i zasejane na 40000 ćelija/udubljenju u ploču sa 96 udubljenja sa ravnim dnom. Sledećeg dana TGFβ1, TGFβ2 ili TGFβ3 na EC80 su prethodno inkubirani 1 sat sa ili bez antitela u nizu razblaženja pre dodavanja ćelijama. Kao kontrola, samo TGFβ, kontrolno antitelo ili samo medijum TGFβ anti-KLH-G2 je dodato u ploče. Posle 24 sata na 37°C, supernatant je sakupljen i IL-11 je ocenjen ELISA-om pomoću IL-11 Duo Set ELISA kompleta (R&D Systems) prema preporukama proizvođača.

Tabela 7. Test oslobađanja IL-11 - IC50 (ng/mL)

[0378] Kao što je prikazano u Tabeli 7 iznad, i slično testu HT-2, rezultati testa oslobađanja IL-11 pokazali su da je XPA.42.681 najmoćnije od bilo kog od antitela za svaku od tri izoforme TGFβ. Za razliku od HT-2 testa, antitelo XPA.42.681 pokazalo je dozno zavisan efekat na oslobađanje IL-11 što je omogućilo određivanje IC50, a takođe je otkrilo generalno slične vrednosti IC50 za svaku izoformu TGFβ. Antitela XPA.42.068 i XPA.42.089 takođe su pokazala dobru neutralizaciju izoformnih oblika TGFβ1 i TGFβ2 (snažnije od komparatora BM-1), ali sa znatno manjom neutralizacijom TGFβ3 u poređenju sa antitelom BM-1 ili u odnosu na neutralizaciju TGFβ1 i TGFβ2.

Primer 8. Merenje neutralizacije pomoću antitela na TGFβ u testu pSMAD2

[0379] Za dalju karakterizaciju antitela, razvijen je test fosfo-SMAD2 (pSMAD2) da se postigne neutralisanje TGFβ signalizacije kroz kompleks receptora TGFβRII/TGFβRI. Detroit 562 ćelije su održavane u IMDM 10% FBS. Ćelije su odvojene versenom i stavljene u posudu sa 6 udubljenja sa 500.000 ćelija po udubljenju. Sledećeg dana, ćelije su gladovane serumom u IMDM bez seruma 3 sata pre 30-minutne izloženosti TGFβ1, TGFβ2 ili TGFβ3 prethodno inkubirane 1 sat sa ili bez antitela. Posle 30 minuta na 37°C, ćelije su lizirane i pSMAD2 i ukupni SMAD2 su ocenjeni pomoću ELISA korišćenjem komercijalnih kompleta (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) prema preporukama proizvođača za detekciju. Procenat pSMAD2 je normalizovan na ukupni SMAD2 i procenat inhibicije je izračunat za svaki klon iz normalizovanog % pSMAD2 u odnosu na kontrolu protiv KLH (Slika 2). T test (dva repa) je pokazao da je antitelo XPA.42.681 bilo znatno moćnije od uporednog antitela BM-1 u neutralisanju pSMAD signalizacije u svim izoformama TGFβ (p <0,05). Dodatno, XPA.42.068 je bio znatno jači u odnosu na TGFβ2 u odnosu na komparator BM-1.

Primer 9. Merenje aktivnosti antitela na TGFβ u regulatornom testu T ćelija

[0380] Da bi se okarakterisala aktivnost antitela na endogenom TGFβ, uspostavljen je regulatorni T ćelijski test, zasnovan na metodama sličnim Tran i dr. (Blood 110:2983-2990; 2007). T ćelije su izolovane iz zamrznutih bočica humanih PBMC pomoću EasySep kompleta za obogaćivanje T ćelija (StemCell Technologies, Vancouver, BC). T ćelije su aktivirane sa anti-humanim CD3 antitelom vezanim za ploču (eBioscience, San Diego, CA) pri 10 ug/ml i rastvorljivim anti-humanim antitelom na CD28 (eBioscience) pri 2 ug/ml. Ćelije su takođe tretirane istovremeno sa 15 ug/ml TGFβ antitela ili kontrola. Posle 4 dana, ćelije su obojene anti-humanim CD4-FITC (BD Biosciences) i anti-humanim CD25-A647 (BioLegend, San Diego, CA) 30 minuta na 4°C. Ćelije su fiksirane sa FOXP3 Fik puferom (BioLegend) 20 minuta na sobnoj temperaturi, i permeabilizovane 15 minuta na sobnoj temperaturi sa puferom za permeabilizaciju FOXP3 (BioLegend). Ćelije su obojene razblaženjem 1:25 anti-humanog FOXP3-PE (BioLegend) i analizirane na BD FACSCanto™ sistemu. CD4+ ćelije su gatirane, a subpopulacije CD4+CD25+Foxp3 kvantifikovane su softverom Flowjo. Antitela su procenjena u ovom testu koristeći 4 ili 5 različitih davalaca PBMC i prikazani su reprezentativni podaci od 2 davaoca (Slika 3).

[0381] Iako je niz aktivnosti pronađen zbog razlika u zavisnosti od donora u populaciji ćelija, generalno, XPA.42.681 i uporedna antitela BM-1 inhibirala su populaciju Treg ćelija, dok su antitela XPA.42.068 i XPA.42.089 obezbedila delimičnu aktivnost u ovoj populaciji.

Primer 10. Merenje aktivnosti antitela na TGFβ u EMT testu

[0382] Epitelna do mezenhimalna tranzicija (EMT) omogućava samoobnavljanje tumorskih ćelija radi promovisanja invazije raka i metastaza. Indukciju EMT pokreću citokini, uključujući TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3, a sve tri izoforme mogu biti uključene sekvencijalno u EMT u zavisnosti od tipa tkiva (Boyer i dr., Dev. Biol.

208:530-545, 1999; Bhowmick i dr., Mol. Biol. Cell 12:27-36, 2001; Camenisch i dr., Dev. Biol.248:170-181, 2002). EMT test je razvijen korišćenjem primarnih epitelnih ćelija humane dojke (HMEC), slično Mani i dr. (Cell 133:704-715; 2008) da bi se utvrdilo da li antitela in vitro inhibiraju ovaj proces.

[0383] Epitelne ćelije humane dojke (Lonza, Basel, Švajcarska) uzgajane su u kompletnoj podlozi MEGM (Lonza) prema preporuci proizvođača. Za subkultivisanje, ćelije su tripsinizirane i tretirane rastvorom za neutralizovanje tripsina (Lonza) pre sejanja. HMEC ćelije su zasejane na 3500 ćelija/cm2 u pločicama sa komorama sa 8 udubljenja i tretirane sa ili bez TGFβ pri 2,5 ng/ml, prethodno inkubirane sa ili bez antitela tokom 30 minuta. Ćelije su inkubirane na 37°C 8 dana, a sveži medijum reagensi su dodati nakon 4 dana. Osmog dana ćelije su fiksirane sa 4% paraformaldehidom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su dva puta isprane u PBS i permeabilizovane u PBS 0,25% Triton X-100 tokom 10 minuta, pre blokiranja sa PBS-TWEEN 10% kozjeg seruma tokom 30 minuta. Ćelije su obojene preko noći na 4°C za mezenhimalni marker koristeći anti-humani vimentin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) i za epitelni marker koristeći antihumani E-kadherin (Cell Signaling Technologi) razblažen 1:200 ili 1:500, respektivno. Ćelije su isprane u PBS 3 puta i inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelima Aleka Fluor 488 kozji anti-zec ili Alexa Fluor 568 kozji anti-zec (Invitrogen, Carlsbad, CA) razblažen u rastvoru za blokiranje tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i zaštićen od svetlosti. Oni su isprani i montirani sa Gold Anti-Fade/DAPI pre fluorescentne mikroskopije.

[0384] Izlaganje HMEC ćelija TGFβ u prisustvu anti-KLH kontrolnog antitela dovodi do povećanog bojenja vimentinom i smanjenja ukupne gustine ćelija, u skladu sa zaustavljanjem rasta i diferencijacijom posredovanom TGFβ do mezenhimskog fenotipa. Neutralizacija EMT posredovana TGFβ1 bila je evidentna na osnovu smanjenog bojenja vimentinom, što je koreliralo sa povećanom gustinom ćelija za antitela XPA.42.681, XPA.42.068 i XPA.42.089, dok je za BM-1 uporedni odgovor primećen srednji odgovor, kao bojanje vimentinom bio prisutan, mada ne u istom stepenu kao kontrola protiv KLH (podaci nisu prikazani). Dodatno, svako od antitela inhibiralo je EMT koji pokreće TGFβ2, iako je komparativno antitelo BM-1 delovalo manje moćno na osnovu intenziteta signala Vimentina, bojenja E-kadherina i povećane gustine ćelija. Za neutralizaciju EMT posredovanog TGFβ3, antitelo XPA.42.681 je bilo najmoćnije, zatim BM-1 i XPA.42.068, dok se XPA.42.089 nije razlikovalo od kontrole protiv KLH.

Primer 11. Inhibicija tumora TGFβ antitelima u modelu miša sa ksenograftom

[0385] Antitela XPA.42.068 i XPA.42.089 su procenjena na njihovu sposobnost da inhibiraju rast tumora u modelu ksenografta izvedenom iz Detroita 562, ćelijske linije humanog ždrela raka (Van Aarsen i dr., Cancer Res. 68:561-70; 2008). Nu/Nu miševi stari osam do devet nedelja (Charles River Laboratories) implantirani su potkožno sa 5x10<6>Detroit 562 ćelija u BD MATRIGEL™ (1:1, 200 uL) po životinji, u donji levi ventralni abdominalni region. Životinje su nasumično postavljene u testne grupe od po dvanaest miševa: kontrola izotipa humanog IgG2 anti-KLH (10 mg/kg), XPA.42.068 (doza od 1, 3 ili 10 mg/kg), XPA.42.089 (doza od 1, 3 ili 10 mg/kg), komparator BM-1 (3 mg/kg), ili IgG1 mišićnog izotipa za kontrolu (3 mg/kg). Merenje doziranja i zapremine tumora vršeno je dvonedeljno (Slika 4). Životinje su žrtvovane dan nakon poslednje doze (28. dan), nakon 7 doza tretmana antitelima. Za sva merenja, statistička značajnost je određena jednostranim Studentovim t-testom.

[0386] Kao što je prikazano na Slici 4, tumori tretirani sa XPA.42.089 bili su manji od tumora lečenih sa XPA.42.068, sa značajnim razlikama u višim nivoima doze u poređenju sa kontrolom humanog IgG2 anti-KLH. Procenat inhibicije rasta tumora (TGI) upoređen je sa IgG kontrolnim antitelom 28. dana u svim ispitnim grupama. Tumori iz grupa tretiranih XPA.42.068 (3 i 10 mg/kg), XPA.42.089 (3 i 10 mg/kg), kao i komparatora BM-1 (3 mg/kg) bili su značajno manji 28. dana od 1 mg/kg tretirane grupe (vrednost P <0,05). Dodatno, XPA.42.068 pri 10 mg/kg i XPA.42.089 pri 3 i 10 mg/kg pokazale su značajne razlike u poređenju sa kontrolom IgG koristeći Tukeijevo ANOVA testiranje (Tabela 8).

Tabela 8. Inhibicija rasta tumora u modelu tumora ksenografta

[0387] Dalje vrednovanje u modelu ksenografta Detroit 562 sprovedeno je korišćenjem antitela XPA.42.068, XPA.42.089 i XPA.42.681. Nu/Nu miševi stari osam do devet nedelja (Charles River Laboratories) implantirani su potkožno sa 5x10<6>Detroit 562 ćelija u BD MATRIGEL™ (1:1, 200 uL) po životinji, u donji levi ventralni abdominalni region. Životinje su nasumično postavljene u testne grupe od po dvanaest miševa: kontrola izotipa humanog IgG2 anti-KLH (3 mg/kg), XPA.42.068 (doza 1 ili 3 mg/kg), XPA.42.089 (doza od 1 ili 3 mg/kg), XPA.42.681 (1 ili 3 mg/kg doza), komparator BM-1 (doza od 1 ili 3 mg/kg). Merenje doziranja i zapremine tumora vršeno je dvonedeljno (Slika 5). Životinje su žrtvovane dan nakon poslednje doze (30. dan), nakon 7 doza tretmana antitelima. Za sva merenja, statistička značajnost je određena jednostranim Studentovim t-testom.

[0388] Kao što je prikazano na Slici 5 i Tabeli 9, tumori tretirani sa XPA.42.681, XPA.42.089 i komparatorom BM-1 u dozi od 3 mg/kg pokazali su značajne razlike u procentima TGI i srednjoj zapremini tumora na dan 30. u poređenju sa kontrolnim antitelom. Poređenja među ovim grupama nisu pokazala značajne razlike koristeći Tukeijevo ANOVA testiranje.

Tabela 9. Inhibicija rasta tumora u modelu tumora ksenografta

Primer 12. Inhibicija tumora TGFβ antitelima u modelu singenom miša

[0389] Antitela XPA.42.068 i XPA.42.089 su takođe procenjena na njihovu sposobnost da inhibiraju rast tumora u singenom modelu, koristeći 4T1 ćelije raka dojke, koristeći protokol prilagođen od Nam i dr. (Cancer Res. 68:3915-23; 2008). Ženke miševa Balb/c starosti od osam nedelja implantirane su potkožno sa 250.000 4T1 ćelija u četvrti masni jastučić dojke na dan 0. Životinje su randomizovane u ispitivane grupe od po dvanaest miševa i davane su antitela tri puta nedeljno (počevši od dana -1) u pojedinačnoj dozi od 10 mg/kg, sa kontrolom izotipa humanog IgG2 anti-KLH, XPA.42.068, XPA.42.089, komparator BM-1 ili mišji izotip kontrole IgG1. Zapremine tumora su merene dva puta nedeljno tokom eksperimenta, a podaci su prikazani na Slici 6. Podaci o zapremini tumora na kraju ispitivanja pokazali su da su XPA.42.068 i XPA.42.089 značajno inhibirali rast tumora u poređenju sa kontrolnim antitelom KLH.

[0390] Dodatno, životinje su žrtvovane poslednjeg dana ispitivanja (23. dan) i tumori su uklonjeni da bi se odredila masa tumora. Svako od antitela XPA.42.089, XPA.42.068 i BM-1 značajno je smanjilo masu tumora u odnosu na kontrolna antitela čoveka ili miša (Slika 7).

[0391] Dalje vrednovanje u singenom modelu 4T1 sprovedeno je korišćenjem antitela XPA.42.068, XPA.42.089 i XPA.42.681. Osam nedeljnih Balb/c miševa implantirano je subkutano sa 250.0004T1 ćelija u 4. masnu podlogu mlečne žlezde dana 0. Životinje su randomizovane u ispitivane grupe od po dvanaest miševa i davane su antitela tri puta nedeljno (počevši od dana -1) u pojedinačnoj dozi od 10 mg/kg, sa kontrolom izotipa humanog IgG2 anti-KLH, XPA.42.068, XPA. 42.089, XPA.42.681, BM-1 ili mišji izotip kontrole IgG1. Zapremine tumora su merene dva puta nedeljno tokom eksperimenta, a podaci su prikazani na Slici 8. Podaci o zapremini tumora na kraju ispitivanja pokazali su da svako od antitela XPA.42.068, XPA.42.089, XPA.42.681 i BM-1 značajno inhibira rast tumora u poređenju sa kontrolnim antitelima čoveka ili miša.

[0392] Dodatno, životinje su žrtvovane poslednjeg dana ispitivanja (21. dan) i tumori su uklonjeni da bi se odredila masa tumora. Svako od antitela XPA.42.089, XPA.42.068, XPA.42.681 i BM-1 značajno je smanjilo masu tumora u odnosu na kontrolna antitela čoveka ili miša (Slika 9).

Primer 13. In vivo efekat TGFβ antitela na NK ćelije u modelu tumora miša

[0393] Da bi se procenilo da li su antitela na TGFβ pokazala imunomodulatorni efekat in vivo na ćelije prirodnih ubica (NK) prisutne u tumorima, izolovani tumori koji su uklonjeni sa miševa u iznad navedenim eksperimentima singenom modela 4T1 digestirani su za stvaranje suspenzija pojedinačnih ćelija. Ukratko, sveže sakupljeni tumori su mleveni i razgrađeni u 2,5 mg/mL kolagenaze II i 2,5 mg/mL kolagenaze IV u HBSS (15 minuta na 37°C). Ćelije su prebrojane i resuspendovane na 2e6/mL u PBS-u, 0.5% BSA, 0.1% NaN3 i 10 ug/mL 2.4G2 anti-mišjeg Fc blokirajućeg antitela (eBioscience, San Diego, CA), i inkubirane 15 minuta na 4°C. Posle ispiranja u PBS sa 0,5% BSA, ćelije su obojene 30 minuta na 4°C sa anti-CD335 (anti-NKp46) antitelom, konjugovanim za imunofluorescentno bojenje sa protočnom citometrijskom analizom (BioLegend, San Diego, CA). CD335, takođe poznat kao NKp46, je marker ćelijske površine ekspresioniran isključivo na CD3-CD56+ NK ćelijama i smatra se univerzalnim markerom za NK ćelije. Ćelije su fiksirane u sveže pripremljenom 2% paraformaldehidu i analizirane na BD FACSCanto sistemu. Za kompenzaciju su takođe pripremljene kontrole u jednoj boji. Kao što je prikazano na Slici 10, antitelo XPA.42.089 je značajno povećalo ekspresiju NK ćelijskog markera NKp46 (CD335) unutar tumora uklonjenih sa miševa, u poređenju sa kontrolnim antitelom izotipa. Antitela BM-1, XPA.42.068 i XPA.42.681 nisu dovela do sličnog povećanja NKp46.

Primer 14. In vivo efekat TGFβ antitela na MDSC u modelu tumora miša

[0394] Da bi se procenilo da li su antitela na TGFβ pokazala imunomodulatorni efekat in vivo na supresorske ćelije izvedene mijeloidima (MDSC) (CD11b+/Gr1+) prisutne u tumorima, pripremljeni su izolovani tumori koji su uklonjeni sa miševa u eksperimentima 4T1 singenom modela kao što je iznad opisano i obojen 30 minuta na 4°C sa anti-CD11b i anti-Grl antitelima konjugovanim za imunofluorescentno bojenje sa protočnom citometrijskom analizom (BioLegend, San Diego, CA). CD11b, takođe poznat kao αM-integrin, i antigen za razlikovanje mijeloidne loze Gr1, takođe poznat kao Ly6G, su markeri ćelijske površine koekspresovani na MDSC. Ćelije su fiksirane u sveže pripremljenom 2% paraformaldehidu i analizirane na BD FACSCanto sistemu. Za kompenzaciju su takođe pripremljene kontrole u jednoj boji. Kao što je prikazano na Slici 11, antitela XPA.42.068, XPA.42.089 i XPA.42.681 značajno su smanjila nakupljanje supresorskih ćelija izvedenih iz mijeloida (MDSC, CD11b+/Gr1+) unutar tumora uklonjenih sa miševa, u poređenju sa kontrolnim antitelom izotipa. Uporedno antitelo BM-1 nije pokazalo slično smanjenje MDSC.

Primer 15. In vivo efekat TGFβ antitela na dendritične ćelije u modelu tumora miša

[0395] Da bi se procenilo da li su antitela na TGFβ pokazala imunomodulatorni efekat in vivo na dendritične ćelije (DC) prisutne u tumorima, izolovani tumori koji su uklonjeni sa miševa u eksperimentima sa singenim modelom 4T1 pripremljeni su kako je gore opisano i obojeni 30 minuta na 4°C sa anti-CD11c antitelom konjugovanim za imunofluorescentno bojenje protočnom citometrijskom analizom (BioLegend, San Diego, CA). CD11c, takođe poznat kao aX integrin, je marker ćelijske površine koji se nalazi na DC. Ćelije su fiksirane u sveže pripremljenom 2% paraformaldehidu i analizirane na BD FACSCanto sistemu. Za kompenzaciju su takođe pripremljene kontrole u jednoj boji. Kao što je prikazano na Slici 12, antitelo XPA.42.089 je značajno smanjilo ekspresiju DC markera CD11c unutar tumora uklonjenih sa miševa, u poređenju sa kontrolnim antitelom izotipa. Antitela BM-1, XPA.42.068 i XPA.42.681 nisu pokazala slično smanjenje CD11c.

Primer 16. In vivo efekat TGFβ antitela na regulatorne T ćelije u modelu tumora miša

[0396] Da bi se procenilo da li su antitela na TGFβ pokazala imunomodulatorni efekat in vivo na regulatorne T ćelije (Treg) prisutne u tumorima, izolovani tumori koji su uklonjeni sa miševa u eksperimentima sa sintetičkim modelom 4T1 pripremljeni su kako je iznad opisano i obojeni 30 minuta na 4°C sa anti-CD4, anti-CD25 i anti-FOKSP3 antitelima konjugovanim za imunofluorescentno bojenje sa protočnom citometrijskom analizom (BioLegend, San Diego, CA). CD4, takođe poznat kao L3T4, kao i CD25, takođe poznat kao IL-2Ra sa niskim afinitetom, a takođe i FOXP3, takođe poznat kao Forkhead bok protein P3, su svaki markeri ćelijske površine koji se nalaze na ćelijama Treg. Ćelije su fiksirane u sveže pripremljenom 2% paraformaldehidu i analizirane na BD FACSCANTO™ sistemu. Za kompenzaciju su takođe pripremljene kontrole u jednoj boji. Kao što je prikazano na Slici 13, antitelo XPA.42.068 značajno je smanjilo akumulaciju Treg ćelija unutar tumora uklonjenih sa miševa, u poređenju sa kontrolnim izotipom antitela. Antitela BM-1, XPA.42.089 i XPA.42.681 nisu pokazala slično smanjenje T-reg ćelija.

Primer 17. In vivo efekat TGFβ antitela na citotoksične T ćelije u modelu tumora miša

[0397] Da bi se procenilo da li su antitela na TGFβ pokazala imunomodulatorni efekat in vivo na citotoksične T ćelije (CTL) prisutne u tumorima, izolovani tumori koji su uklonjeni sa miševa u eksperimentima sa singenim modelom 4T1 pripremljeni su kako je gore opisano i obojeni 30 minuta na 4°C sa anti-CD8 antitelom konjugovanim za imunofluorescentno bojenje protočnom citometrijskom analizom (BioLegend, San Diego, CA). CD8 je marker ćelijske površine koji se nalazi na CTL. Ćelije su fiksirane u sveže pripremljenom 2% paraformaldehidu i analizirane na BD FACSCANTO™ sistemu. Za kompenzaciju su takođe pripremljene kontrole u jednoj boji. Kao što je prikazano na Slici 14, antitelo XPA.42.068 značajno je povećalo nivo CTL unutar tumora uklonjenih sa miševa, u poređenju sa kontrolnim izotipom antitela. Antitela BM-1, XPA.42.089 i XPA.42.681 nisu pokazala slično povećanje CTL.

[0398] Iznad navedeni rezultati pokazuju da ovde otkrivena antitela na TGFβ imaju sposobnost da smanje veličinu tumora, kao i da moduliraju imunološke ćelije koje infiltriraju tumore i doprinose rastu tumora in vivo. Ovo sugeriše da će ovde opisana antitela na TGFβ pružiti terapeutsku korist u lečenju karcinoma, naročito kod karcinoma kod kojih se jedna ili više imunoloških ćelija iz iznad navedenih primera infiltrira u ćelije tumora.

Primer 18. Poboljšanje citolitičke aktivnosti NK ćelija

[0399] Sistem zajedničke kulture ćelija prirodnih ubica (NK) razvijen je da imitira hroničnu interakciju između NK ćelija i tumorskih ćelija in vivo, za procenu sposobnosti antitela na TGFβ da poboljšaju citolitičku aktivnost NK ćelija. Korišćena je ćelijska linija karcinoma dojke miševa koja proizvodi TGFβ, 4T1. NK ćelije su prečišćene iz slezine normalnih Balb/c miševa i kokultivisane sa CFSE-obeleženim 4T1 tumorskim ćelijama tokom 48 sati u prisustvu IL-2 (500 IU/ml) u ploči sa 6 udubljenja. Anti-TGFβ i kontrolna antitela su dodata u sistem za zajedničku kulturu i NK ćelije su sakupljene 48 sati kasnije. IFNγ proizvodnja NK ćelija je merena odmah nakon kokulture unutarćelijskim bojenjem. NK ćelije su sortirane kao CFSE negativne ćelije i njihova citolitička aktivnost je analizirana standardnim testovima ubijanja protiv Yac-1 tumorske ćelijske linije. NK ćelije su kultivisane zajedno sa ćelijama označenim sa CFSE Yac-1 u odnosu efektor: meta (E:T) od 20:1 tokom 4 sata u ploči sa okruglim dnom sa 96 udubljenja. Boja propidijum jodida (PI) korišćena je za obeležavanje ćelijske smrti.

[0400] NK ćelije su pokazale povišen, ali ne i značajan porast proizvodnje IFNγ među grupama tretiranim antitelima u poređenju sa grupom tretiranom anti-KLH. U testovima ubijanja, pri odnosu efektor: meta od 20:1, antitelo BM-1 i antitela XPA.42.089 i XPA.42.681 značajno su poboljšala citolitičku aktivnost NK ćelija (Slika 15). Štaviše, i antitela XPA.42.089 i XPA.42.681 povećala su sposobnost NK ćelija da ubiju ciljne tumorske ćelije na 97,8% i 96,7%, što je bilo značajno više od referentnog poređenja (P <0,0001). Ovaj rezultat ukazuje na to da antitela za neutralisanje TGFβ prema predmetnom obelodanjivanju mogu značajno poboljšati citolitičku aktivnost NK ćelija koja je oslabljena hroničnom interakcijom sa tumorskim ćelijama koje proizvode TGFβ in vitro.

Primer 19. Inhibicija tolerogene funkcije CD8+ dendritičnih ćelija

[0401] In vitro sistem zasnovan na reakciji mešovitih limfocita (MLR) razvijen je za procenu sposobnosti antitela na TGFβ da inhibiraju tolerogenu funkciju TGF-β na CD8+ dendritičnim ćelijama (DC). MLR je klasičan eksperiment koji se koristi za testiranje prezentacije DC antigena bez dodavanja spoljnih antigena u sistem. Slezine normalnih miševa Balb/c su isečene na male fragmente i inkubirane u 10% RPMI i 1 mg/ml kolagenaze tipa IV tokom 1 sata na 37°C u inkubatoru koji se trese. Nakon dodavanja EDTA dodatnih 5 minuta, rastvor je filtriran kroz najlonsku mrežu. CD11c+ DC obojeni su biotinilovanim anti-CD11c antitelom i pozitivno odabrani korišćenjem kompleta za prečišćavanje biotina iz kompanije Stemcell Technologies. CD11c+ DC obojeni su sa CD8 antitelom. Populacije CD8+ i CD8 sortirane su na BD FACSARIA™ sortirniku ćelija. CD8+ DC su kultivisani sa anti-TGFβ antitelima ili kontrolnim antitelom 24 sata i mešani u CD8-DC u odnosu 1:10. T ćelije su prečišćene iz normalne B6 slezine koristeći komplet za negativnu selekciju T ćelija iz Stemcell Technologies i obeležene sa CFSE. Mešani DC su zatim kokultivisani sa B6 T ćelijama 5 dana u pločama sa okruglim dnom sa 96 udubljenja. Imuno-inhibitorna funkcija CD8+ DC procenjena je proliferacijom T ćelija. Ako CD8+ DC inhibiraju sposobnost CD8-DC da predstave antigene, B6 T ćelije se manje razmnožavaju. Ako antitela na TGFβ blokiraju autokrini TGFβ i umanjuju tolerantnu funkciju CD8+ DC, B6 T ćelije se više razmnožavaju.

[0402] Kao što je prikazano na Slici 16, primećena je mala promena u proliferaciji T ćelija za grupu tretiranu BM-1 u poređenju sa kontrolnom grupom protiv KLH. Nasuprot tome, i antitela XPA.42.089 i XPA.42.681 značajno su povećala proliferaciju T ćelija u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom anti-KLH, a efekat XPA.42.681 na proliferaciju T ćelija bio je značajan u poređenju sa referentnim antitelom BM-1. Ovi podaci pokazuju da se blokiranjem TGF-β može smanjiti tolerogeni efekat CD8+ DC na imunogene DC, što može obezbediti pojačanu prezentaciju antigena imunogenim DC.

Primer 20. Poboljšanje CTL funkcije

[0403] In vitro sistem je razvijen da imitira aktivaciju CTL u uslovima tumora i utvrdi da li bi funkcija CTL-a mogla biti pojačana antitelima na TGFβ. CTL aktivacija je procenjena ekspresijom i funkcijom CD25 bojenjem perforina i granzima B (GzmB) (Massague i dr. Cancer Cell 8: 369-380, 2005). T ćelije su prečišćene iz normalne Balb/c slezine negativnom selekcijom T ćelija (Stemcell Technologies). Zrnca MAC-a su obložena anti-CD3 i anti-CD28 antitelima sa kompletom za aktivaciju/ekspanziju T ćelija od strane Miltenyi Biotec (Auburn, CA). T ćelije i MAC perle obložene anti-CD3 i anti-CD28 kokultivisane su u odnosu 1:1 u koncentraciji 2X10e6/mL u ploči sa okruglim dnom sa 96 udubljenja u prisustvu 20 ul supernatanta 4T1 kulture tokom 48 sati, sa anti-TGFβ antitelima i kontrolnim antitelom. CTL aktivacija je procenjena sa ekspresijom CD25 na ćelijskoj površini, a funkcija je procenjena sa ekspresijom GzmB (Slika 17A) i perforina (Slika 17B), određenom intracelularnim bojenjem pomoću protokola bojenja FoxP3.

[0404] U skladu sa objavljenim podacima, promene u ekspresiji CD25 nisu primećene između grupa tretiranih antitelima i kontrolne grupe. CTL-ovi tretirani BM-1 pokazali su minimalne promene u ekspresiji GzmB i perforina. Međutim, i antitela XPA.42.089 i XPA.42.681 značajno su povećala ekspresiju GzmB u CTL u poređenju sa kontrolnim anti-KLH tretmanom (P <0,001). Štaviše, povećanje ekspresije GzmB u XPL.42.089 tretiranih CTL bilo je značajno veće od komparatora BM-1 (P <0,05). Za ekspresiju perforina, i XPA.42.089

1

i XPA.42.681 tretirani CTL proizvodili su značajno više perforina u poređenju sa kontrolnim CTL tretiranim anti-KLH (P <0,05). Pored toga, XPA.42.681 je značajno poboljšao ekspresiju perforina u CTL u poređenju sa BM-1 komparatorom (P <0,05). Prema tome, i XPA.42.089 i XPA.42.681 mogu vratiti ekspresiju i GzmB i perforina potisnutog TGF-β izlučenog iz tumorskih ćelija u ovom in vitro sistemu kulture, i stoga pruža mehanizam za pojačavanje CTL funkcije neutraliziranjem TGFβ koji proizvodi tumor ćelije.

Primer 21. Inhibicija funkcije MDSC i Treg

[0405] In vitro sistem zajedničke kulture razvijen je za procenu efekta supresorskih ćelija izvedenih iz mijeloida (MDSCs) na ekspanziju i funkciju regulatornih T ćelija (Treg), i sposobnost anti-TGFβ antitela prema predmetnom obelodanjivanju da inhibiraju MDSC i Treg aktivnost.

[0406] Poznato je da MDSC potiskuju imunološki odgovor na tumore i promovišu tumorsku invaziju i metastaze, kao i da promovišu širenje i funkciju Treg, za koje je poznato da snižavaju imunološke odgovore. Ženke BALB/c miševa su inokulirane u abdominalnu mlečnu žlezdu sa 7 X10<3>4T1 tumorskih ćelija u 50 ul IX PBS. Slezine se uzimaju 21. dana i MDSC se prečišćavaju pomoću biotina obeleženog antitela CD11b i kompleta za selekciju biotina (Stemcell Technologies). Istovremeno se sakupljaju normalne BALB/c slezine i T ćelije se prečišćavaju pomoću kompleta za negativnu selekciju T ćelija (Stemcell Technologies). Ćelije su obojene anti-CD4-FITC i anti-CD25-PE. Dvostruko pozitivne ćelije sortiraju se pomoću FACSARIA™ sortirnika ćelija (BD Biosciences). Treg populacija je označena CFSE i kokultivisana je sa MDSCs iz miševa ubrizganih tumorom 4T1 u odnosu 1:1 tokom 5 dana u prisustvu anti-TGFβ ili kontrolnih antitela. Ekspanziju Treg mere CFSE divizije. Da bi se procenio uticaj MDSC na funkciju Treg, MDSC sakupljeni od 4T1 ubrizganih BalB/c miševa su označeni CFSE i kokultivisani sa Treg tokom 5 dana u prisustvu anti-TGFβ ili kontrolnih antitela. Treg su sortirani kao CFSE negativna populacija iz kokulture. T ćelije iz normalnih BALB/c miševa su označene CFSE i postavljene na 2X10<6>ćelija/ml sa anti-CD3 i anti-CD28 perlicama. Sortirani Treg se dodaju u sistem kulture. Inhibitorna funkcija Treg meri se analizom broja CFSE podela T ćelija.

Primer 22. Inhibicija fibroze TGFβ antitelima u mišjem modelu

[0407] Antitela prema predmetnom obelodanjivanju se takođe procenjuju na njihovu sposobnost da inhibiraju fibrozu (npr., fibrozu pluća, fibrozu bubrega) na životinjskim modelima fibroze.

Fibroza bubrega

[0408] Za procenu antitela na TGFβ korišćen je model fibroze bubrega (Ling i dr., J. Am. Soc. Nephrol.

14:377-388; 2003). Ciklosporin A (CsA, 30 mg/kg) ili maslinovo ulje kao kontrola nosača ubrizgavano je potkožno jednom dnevno tokom 4 nedelje u muške ICR miševe stare 6-7 nedelja na dijeti sa malo soli (LSD, 50-100 ppm NaCl) da bi započeli fibrotična bolest bubrega. Kontrolni miševi su održavani na normalnoj ishrani i nisu primali CsA. Anti-TGFβ antitelo XPA.42.089 ili IgG kontrolno antitelo je dozirano intraperitonealno (2,5 mg/kg, TIV) počevši jedan dan pre početka tretmana CsA. Životinje su eutanazirane, a serum, urin i bubrezi su sakupljeni radi procene histologije i krajnjih tačaka funkcije bubrega.

[0409] Histopatološki pregled izveden je bojenjem preseka bubrega fiksiranog formalinom i parafinom (5 µm) hematoksilin-eozinom (H&E) i Masson trihroma, koristeći standardne tehnike. Procena histopatoloških promena izazvanih CsA može uključivati opšteprihvaćeno polu kvantitativno bodovanje (Ling i dr., Am. J. Physiol. 277:F383-F390, 1999) kodiranih preseka i procenu na osnovu bilo kojeg ili svih oštećenja tubula, intersticijskih infiltrata, zadebljanja arteriola, tubulointersticijske ekspanzije i fibroze, uključujući, na primer, brojanje procenta obolele površine po delu bubrega. Odseci sagitalnog bubrega iz normalne kontrole, miševi ubrizgani CsA i XPA.42.089 antitela obojeni su Massonovom tri hrom bojom. Razvoj fibroze izazvane CsA primećen je u tubulointersticijumu miševa injektiranih CsA, ali ne i kod kontrolnih životinja. Dodatno, povećanje luminalnog prečnika nekih tubula je primećeno kod miševa tretiranih CsA. Tretman sa antitelom XPA.42.089 smanjio je količinu fibroze izazvane CsA uočenu u tubulointersticijumu i smanjio prečnik tubula.

[0410] Bubrežna funkcija se takođe može proceniti pomoću bilo kog ili celog serumskog kreatinina, azota uree u krvi i biomarkera disfunkcije bubrega u urinu.

[0411] Azot uree u serumu u krvi (BUN) je pokazatelj disfunkcije bubrega. U ovom ispitivanju, BUN je značajno povećan kod miševa izloženih CsA u poređenju sa kontrolnim miševima hranjenim obrokom ili LSD-om (Slika 18). Tretman sa XPA.42.089 značajno je smanjio BUN u serumu u poređenju sa IgG kontrolnim antitelom.

[0412] Albuminurija ili povećanje akumulacije albumina u urinu karakteristično je za glomerularnu

2

disfunkciju u bolesnom bubregu. U ovom ispitivanju, albumin u urinu je povećan skoro četiri puta u miševa CsA u odnosu na kontrolne miševe hranjene žvakanim ili LSD (Slika 19). Tretman sa XPA.42.089 rezultirao je značajnim poboljšanjem albuminurije u poređenju sa miševima tretiranim IgG kontrolnim antitelima.

[0413] Nivoi kolagena tipa IV u urinu, koji odražavaju stepen taloženja ECM i fibroze u bubrezima, značajno su povišeni kod miševa sa CsA u odnosu na kontrolne miševe hranjene obrokom ili LSD (Slika 20). Tretman sa XPA.42.089 umereno je smanjio kolagen tipa IV urina u poređenju sa kontrolnim antitelom IgG.

[0414] Kvantitativna RT-PCR je izvršena na tkivu bubrega da bi se utvrdila ekspresija gena uključenih u fibrozu. Ukupna RNK je izolovana iz bubrega (korteks i medula) pomoću RNeasi Kit (Qiagen, Germantown, MD) prema protokolu proizvođača. CDNA prvog lanca je sintetizovana korišćenjem slučajnih prajmera i MULTISCRIBE™ RT (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Kvantitativna RT-PCR je zatim izvedena na 2 µl cDNK koristeći SIBR Green mix (Roche) na PCR sistemu LIGHTCYCLER 480 u realnom vremenu (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Vrednosti su normalizovane na ciklofilin i izračunate primenom uporednog CT postupka. TGF-β1 je snažan induktor diferencijacije fibroblasta i taloženja ECM proteina, uključujući kolagen tipa III. Ekspresija TGF-β1 bila je skoro dva puta veća kod životinja tretiranih CsA u poređenju sa kontrolnim miševima (Slika 21A). Tretman sa XPA.42.089 značajno je smanjio nivoe ekspresije TGF-β1 u bubrezima u poređenju sa kontrolnim antitelom IgG. Sličan efekat je primećen kod ekspresije kolagena tipa III, sa umerenim povišenjem kod miševa tretiranih CsA (Slika 21B). Tretman sa XPA.42.089 rezultirao je smanjenjem nivoa ekspresije kolagena tipa III u poređenju sa miševima tretiranim IgG kontrolnim antitelima.

Fibroza pluća

[0415] Može se koristiti model fibroze pluća, u suštini kako je opisano u Wilson i dr. (J. Exp. Med.207:535-552; 2010). Miševi C57BL/6 se anesteziraju i ukapavaju intratrahealno sa 0,15 U bleomicin sulfata (Calbiochem, La Jolla, CA) u fiziološkom rastvoru, sa ili bez antitela (npr., N=10 po grupi, 500 ug) dana -1, 3 i 5. Životinje su žrtvovane 7. dana radi analize histologije pluća, sadržaja kolagena u plućima (npr., taloženje kolagena) i inflamatorne infiltracije. Za histologiju pluća, preseci plućnog tkiva ugrađenog parafinom od 5 µm obojeni su Masonovim tri hromom. Povreda pluća, merena kao bronhoalveolarna lavaža (BAL) kolagena i taloženje kolagena u plućima, kvantifikovana je pomoću Sircol testa. Inflamatorna infiltracija se meri u BAL protočnom citometrijom.

Primer 23. Lečenje oftalmoloških poremećaja posredovanih TGFβ

[0416] Antitela na TGF-β prema predmetnom obelodanjivanju mogu se koristiti za lečenje brojnih oftalmoloških (tj., očnih) bolesti i stanja, uključujući, na primer, fibrotična oboljenja oka (npr., Bolesti povezane sa fibroproliferativnim stanjima).

Neutralizacija TGFβ1 u retinalnim pigmentnim epitelnim ćelijama

[0417] Održavanje epitelnog fenotipa kritično je za homeostazu tkiva. U retini de-diferencijacija retinalnog pigmentnog epitela (RPE) dovodi do retinalne disfunkcije i fibroze, a TGFβ doprinosi de-diferencijaciji mrežnjače brojnim mehanizmima, od kojih neki zavise od aktivacije SMAD2 puta. Antitela prema ovom otkriću su procenjena na njihovu sposobnost da spreče aktivaciju TGFβ odgovora u RPE ćelijama, korišćenjem testa pSMAD2.

[0418] Epitelne ćelije retinalnog pigmenta (Lonza #194987) održavane su u medijumu za rast epitelnih ćelija retinalnih pigmentnih ćelija (Lonza #00195409). Ćelije su odvojene tripsinom, tripsin je neutralizovan (Tripsin Neutralization Solution, Lonza#CC-5002), i ćelije su granulirane, resuspendovane na 1e6 ćelija/mL i stavljene na 100.000 - 200.000 ćelija/bunar u posudu sa 6 udubljenja. Sledećeg dana, ćelije su isprane i dodat je RPE bazalni medijum (Lonza#00195406) da se ćelije zaustave u G0/G1 fazi. Sledećeg dana, ćelije su tretirane sa 10ng/ml TGFβ1 (Peprotech #100-21) prethodno inkubiranim tokom 5 minuta sa ili bez antitela na TGFβ XPA.42.068, XPA.42.089 i XPA.42.681, referentnih antitela BM-1 i BM-2, ili kontrolno anti-KLH-G2 antitelo pri 10 ug/ml. Posle 30 minuta na 37°C, ćelije su lizirane u puferu za lizu ćelija (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) koji sadrži svež IMM fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF). Nakon ljuljanja 5 minuta na 4°C, ćelije su sastrugane i razbacane u ploču sa 96 udubljenja da se liziraju na ledu 20 minuta. Lizati su centrifugirani na 3K tokom 5 minuta na 4°C. Lizati su razblaženi i rade u skladu sa preporukama proizvođača za detekciju fosfo-SMAD2 (ćelijska signalizacija #7348) i ukupne SMAD2 (ćelijska signalizacija #7244).

[0419] Kao što je prikazano na Slici 22, tretman TGFβ1 uzrokuje snažno povećanje pSMAD2 u RPE ćelijama, koje je značajno neutralizovano svakim od antitela XPA.42.089, XPA.42.068 i XPA.42.681, i referentnim antitelima. Ovi podaci sugerišu da XPA.42.089, 068 i 681 mogu da se suprotstave signaliziranju posredovanom TGFβ u ćelijama RPE i ukazuju na to da antitela mogu biti korisna za lečenje retinalnih disfunkcija.

Proliferativna vitreoretinopatija

[0420] Proliferativna vitreoretinopatija (PVR) je najčešći uzrok neuspeha u operaciji odvajanja mrežnjače. PVR karakteriše formiranje fibrovaskularnih membrana unutar staklene šupljine iznad i ispod retine, uzrokujući naknadno odvajanje mrežnjače. Različiti faktori doprinose progresiji PVR, a veruje se da TGFβ igra ključnu ulogu. TGFβ je bogat u staklastom telu pacijenata sa PVR, a karakteristične funkcije TGFβ, kao što su indukcija epitelne u mezenhimalnu tranziciju (EMT), stimulacija proizvodnje ekstracelularnog matriksa, kontrakcija ćelijske membrane i indukcija upale, svi su negativni faktori u napredovanje PVR.

[0421] Da bi se procenio efekat antitela prema predmetnom obelodanjivanju, eksperimentalni PVR je indukovan u modelu zeca (Oshima i dr., 2002, Gene Ther. 9:1214-1220; Fastenberg i dr., Gene Ther.

2002(9):1214-1220). Odrasli pigmentirani zečevi se anesteziraju intramuskularnom injekcijom izoflurana ili ketamina i ksilazina. Zenice su proširene sa jednom kapom 10% fenilefrin hidrohlorida, 1% tropikamida i 1% atropin sulfata. U jedno oko svakog zeca ubrizgano je 5,0 × 10e5 zečje konjunktivne ćelije fibroblasta u 0,1 ml rastvora BSS u staklastoj šupljini kroz pars plana. Pars plana vitrektomija će indukovati PVR model. Odmah nakon toga, jedna intravitrealna injekcija BSS, antitela na TGFβ (npr., XPA.42.089, XPA.42.681, 5 mg) ili kontrolnog antitela (npr., anti-KLH-G2) se primenjuje na grupe od 10 životinja, i opciono ponavlja nedeljno. Sve ubrizgane oči se oftalmoskopski pregledaju 1, 3, 5, 7, 10, 14 i 28. dan, pri čemu je PVR klasifikovan u šest faza koristeći kliničke kriterijume koje su opisali Fastenberg i dr., Am. J. Ophthalmol.93:565-572, 1982).

Bazne opekotine do rožnjače

[0422] Okularna trauma u obliku opekotina rožnjače ozbiljan je klinički problem i može uzrokovati ozbiljna i trajna oštećenja vida. Aktivacija ćelija rožnjače, tj., keratocita i epitelnih ćelija, i priliv inflamatornih ćelija poput monocita/makrofaga, uključeni su u patogenezu povrede nakon oštećenja alkalnog tkiva u rožnjači i mogu dovesti do trajnih epitelnih defekata. Štaviše, razgradnja bazalne membrane matriksnim metaloproteinazama (MMP, želatinaze) koje luče ove ćelije doprinosi patogenom ulceraciji i perforaciji strome. Konjunktivizacija površine rožnjače zbog gubitka matičnih ćelija limba zajedno sa zamućenjem i neovaskularizacijom strome rožnjače oštećuju vid pacijenata u kasnijim fazama lečenja. Veruje se da su brojni faktori rasta i citokini, uključujući TGF-β, uključeni u uništavanje tkiva i kasne ožiljke koji se javljaju u rožnjači nakon opekotina.

[0423] Da bi se procenio efekat antitela prema ovom otkriću, korišćen je model sagorevanja alkalnog miša (Saika i dr., Am. J. Pathol.2005(166):1405-18). Ukratko, tri µl 1 N rastvora natrijum hidroksida nanose se na desno oko odraslih miševa C57BL/6 (n = 72) da bi se izazvala opekotina površine očne površine pod opštom i lokalnom anestezijom. Anti-TGF-β antitela (npr., XPA.42.089, XPA.42.681) ili kontrolna antitela (npr., anti-KLH-G2) se daju (n = 24/grupi) 2 sata i dana 5, 10 i 15 posle izloženost alkalijama. Bojenje rožnjače fluoresceinom se koristi za vizualizaciju površinskih defekata (npr., povređenog epitela). Nakon pregleda fluoresceina rožnjače, očna kugla se enukleira 2 sata nakon označavanja bromodeoksiuridin i obrađuje za histološki pregled bilo parafinom ili kriosekcijama 3., 5., 10. i 20. dana.

Fibroza sočiva

[0424] Nakon povrede, epitelne ćelije sočiva prolaze kroz EMT, što doprinosi stvaranju fibroznog tkiva u povređenom sočivu. Sličan fenomen primećen je u kapsuli ljudskog sočiva nakon ekstrakcije katarakte i implantacije veštačkog intraokularnog sočiva. Takva fibrotička reakcija vezana za EMT klinički je nepovoljna jer može izazvati zamućenje i kontrakciju preostale prednje kapsule sočiva, kao i zamućenje u zadnjoj kapsuli. Očna vodica sadrži obilje TGF-β i predložena je uloga TGF-β u EMT povezanom sa povredama u epitelnim ćelijama sočiva.

[0425] Da bi se procenio efekat antitela prema ovom otkriću, eksperimentalna fibroza rožnjače je indukovana u modelu miša (Saika, i dr., Am J Pathol. 2004(164):651-663). Odrasli miševi (stari od 4 do 6 nedelja) anestezirani su intraperitonealnom injekcijom pentobarbital natrijuma (70 mg/kg). Mali rez je napravljen u centralnoj prednjoj kapsuli sa oštrim delom podkožne igle od 26 kalibra kroz rez rožnjače na desnom oku nakon topikalne primene midrijatika i kapi oksibuprokaina kao anestetika. Odmah nakon toga, anti-TGFβ antitela (npr., XPA.42.089, KSPA.42.681) ili kontrolno antitelo (npr., anti-KLH-G2) (n = 24/grupa) se daju u oči dva puta nedeljno tokom trajanja ispitivanja. Levo oko služi kao nepovređena kontrola. Dubina povrede je -300 µm, ili približno jedna četvrtina dužine sečiva igle, što dovodi do stvaranja fibroznog tkiva oko kapsularnog loma. Nakon ukapavanja masti ofloksacina, životinjama je dozvoljeno da leče 6 sati do 8 nedelja.

4

Proliferirajuće ćelije su obeležene intraperitonealnom injekcijom bromodeoksiuridina, nakon čega su žrtvovane životinje 2 sata kasnije i enukleacija svakog oka radi analize.

Postoperativna operacija glaukoma

[0426] Glavna odrednica dugoročnog ishoda operacije glaukoma je odgovor zarastanja rana. Prekomerni postoperativni ožiljci na nivou konjunktive i sklerostomisita povezani su sa lošom kontrolom postoperativnog pritiska. Upotreba antiproliferativnih sredstava 5-fluourouracil (5-FU) i mitomicin C (MMC) u takvoj operaciji takođe može izazvati široko rasprostranjenu ćelijsku smrt i apoptozu i može dovesti do erozije rožnjače i cističnih avaskularnih mrlja.

[0427] Da bi se procenio efekat antitela prema predmetnom obelodanjivanju na ova stanja povezana sa operacijom glaukoma, koristi se model zeca (Mead i dr., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.2003(44):3394-3401). Operacija filtracije glaukoma izvodi se na levom oku novozelandskih belih zečeva (starih 12 i 14 nedelja) pod opštom anestezijom (ketamin i ksilazin). Ekstenzija šava svilene rožnjače delimične debljine 8-0 postavlja se na 12 sati, kako bi se dobila izloženost gornjoj konjunktivi. Konjunktivni režanj na bazi forniksa je podignut, a tupa disekcija subkonjunktivnog prostora se izvodi na udaljenosti od 15 mm iza limbusa. Oštrica MVR koristi se za oblikovanje skleralnog tunela delimične debljine, počevši 4 mm iza limbusa i nastavljajući sve dok oštrica nije vidljiva samo u prednjoj stromi rožnjače. Intravenozna kanila od 22 metra/25 mm zatim se prolazi kroz skleralni tunel sve dok igla kanile ne postane vidljiva u čistoj rožnjači. Igla kanile ulazi u prednju komoru, kanila se gura do sredine zenice i igla se izvlači. Konačno, kanila se skraćuje i zakosi na svom skleralnom kraju tako da strči 1 mm od mesta umetanja, a najlonski šav od 10-0 se koristi za pričvršćivanje cevi na površinu sklere. Rez konjunktive zatvara se sa dva prekinuta šava i centralnim najlonskim šavom tipa madraca od 10-0 na igli kako bi se obezbedilo nepropusno zatvaranje. Na kraju operacije ukapa se jedna kap atropin sulfata 1% i betametazon natrijum fosfata 0,1%, neomicin sulfata 0,5% masti. Životinje se zatim nasumično dodeljuju da bi primile postoperativni tok subkonjunktivnih injekcija (100 µL) anti-TGFβ antitela (npr., XPA.42.089, KSPA.42.681) ili kontrolnog antitela (npr., anti-KLH-G2) (npr. 5 mg /mL; 16/grupi). Subkonjunktivne injekcije se daju 2., 3., 4., 7., 9., 11. i 14. dan nakon operacije (dan 0) pod lokalnom anestezijom (proksimetakain hidrohlorid 0,5% kapi za oči, 1 kap po oku), pomoću igle od 30 merača. Antitelo se ubrizgava 5 mm iza limbusa na nosnom rubu gornjeg mišića rektusa.5-FU se primenjuje za 180° od mesta operacije.

[0428] Merenje očnog pritiska na oba oka vrši se ručnim tonometrom nakon lokalnog ukapavanja 0,5% kapi za oči proksimetakain HCl. Uočava se izgled konjunktive i područje drenaže. Sve životinje pregleda maskirani posmatrač u određeno vreme nakon operacije. Procena oba oka (kontralateralno neobrađeno oko koje se koristi kao kontrola) vrši se svakodnevno od 0. do 4. dana, a zatim u redovnim periodima, najmanje dva puta nedeljno. Karakteristike fleka, uključujući dužinu, širinu i visinu, mere se čeljustima i beleži se očni pritisak. Karakteristike vaskularnosti drenažnih fleka ocenjuju se deljenjem konjunktivnih područja u kvadrante i bodovanjem izgleda (0, avaskularno; 1, normalna vaskularnost; 2, hiperemična; i 3, veoma hiperemična). Pregled lampe sa prorezom vrši se radi identifikacije aktivnosti prednje komore (0, tiho; 1, ćelije; 2, fibrin; i 3, hipopion) i dubina prednje komore, koja se beleži kao duboka (+2), plitka (+1) ili ravna (0). Procena trajanja epiteliopatije rožnjače vrši se nakon topikalne ugradnje lignokain fluoresceina u levo oko i ocenjuje se prema površini zahvaćene rožnjače (0, nula; 1, <5%; 2, <50%; 3, <75%; 4, <90%; 5, do 100%). Preživljavanje mehurića uzima se kao primarna krajnja tačka efikasnosti. Neuspeh mehurića se definiše kao pojava ravne, vaskularizovane i mrlje ožiljci u prisustvu duboke prednje komore. Analiziraju se površina i visina mehurića, dubina i aktivnost prednje komore i vaskularnost konjunktive po kvadrantu. Tkiva se takođe obrađuju za histološki pregled (na primer, subkonjunktivno taloženje kolagena) kod nekih životinja.

[0429] Očekuje se da ovde obelodanjena anti-TGFβ antitela inhibiraju aktivnost TGFβ tokom fibrotičnih incidenata u oku, čime se smanjuje taloženje fibroze i poboljšavaju simptomi povezani sa fibrozom oka.

[0430] Očekuje se da će se stručnjaci u ovoj oblasti pojaviti brojne modifikacije i varijacije u obelodanjivanju kako je navedeno u gornjim ilustrativnim primerima. Shodno tome, samo takva ograničenja koja se pojavljuju u priloženim patentnim zahtevima treba da budu stavljena na obelodanjivanje.

1

2

4

Claims

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje vezuje transformacioni faktor rasta beta (TGFβ)1, TGFβ2 i TGFβ3 koje sadrži:

(a) CDR1 aminokiselinska sekvenca teškog lanca navedena u SEQ ID NO: 19;

(b) CDR2 aminokiselinska sekvenca teškog lanca navedena u SEQ ID NO: 20; i

(c) CDR3 aminokiselinska sekvenca teškog lanca navedena u SEQ ID NO: 21;

(d) CDR1 aminokiselinska sekvenca lakog lanca navedena u SEQ ID NO: 22;

(e) CDR2 aminokiselinska sekvenca lakog lanca navedena u SEQ ID NO: 23; i

(f) CDR3 aminokiselinska sekvenca lakog lanca navedena u SEQ ID NO: 24;

2. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koje dalje obuhvata konstantni region teškog lanca, gde je konstantna oblast teškog lanca modifikovani ili nemodifikovani IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, njihov fragment ili njihove kombinacije.

3. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, u kome je jedna ili više aminokiselina sa okvirom lakog lanca zamenjeno odgovarajućom(ih) aminokiselinama iz druge aminokiselinske sekvence humanog antitela.

4. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo ima aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je navedena u SEQ ID NO: 6 i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca navedena u SEQ ID NO: 8.

5. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koje dalje sadrži konstantni region humanog lakog lanca vezanu za pomenutu varijabilnu oblast lakog lanca.

6. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo neutrališe aktivnost TGFβ1 i TGFβ2 u većoj meri nego TGFβ3.

7. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira teški lanac i nukleotidnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela, pri čemu isti molekul nukleinske kiseline kodira teški lanac i laki lanac; ili

izolovani molekuli nukleinske kiseline koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira teški lanac i nukleotidnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela, pri čemu različiti molekuli nukleinske kiseline kodiraju teški lanac i laki lanac;

pri čemu je antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.

8. Ekspresioni vektor ili vektori ekspresije koji sadrže molekul nukleinske kiseline ili molekule nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 7, gde su svaki nukleotidni niz koji kodira teški lanac i nukleotidni niz koji kodira laki lanac operativno povezani sa sekvencom za kontrolu ekspresije.

9. Ćelija domaćin koja sadrži vektor ili vektore prema patentnom zahtevu 8 ili molekul nukleinske kiseline ili molekule nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 7.

10. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 9, koja sadrži molekul nukleinske kiseline ili molekule nukleinske kiseline koji kodiraju teški lanac i varijabilni region lakog lanca, pri čemu su nukleinske kiseline teškog lanca i lakog lanca izražene različitim nukleinskim kiselinama ili na istoj nukleinskoj kiselini.

11. Postupak upotrebe ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 9 ili 10 za proizvodnju antitela, koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 9 ili 10 pod odgovarajućim uslovima i oporavak pomenutog antitela.

12. Sterilni farmaceutski sastav, koji sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

13. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 12, za upotrebu u postupku za lečenje raka ili fibroze, pri čemu postupak obuhvata korak davanja ispitaniku kome je to potrebno, terapeutski efikasne količine antitela ili farmaceutski sastav.

14. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 12, za upotrebu u postupku za lečenje raka kod ispitanika kome je to potrebno.

15. Antitelo ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, gde antitelo ili sastav povećavaju broj ćelija prirodnih ubica (NK) u tumoru i/ili poboljšavaju citolitičku aktivnost NK ćelija.

16. Antitelo ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, gde antitelo ili sastav smanjuju broj regulatornih T ćelija u tumoru i/ili inhibiraju funkciju regulatornih T ćelija.

17. Antitelo ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, gde antitelo ili sastav povećavaju broj citotoksičnih T ćelija (CTL) u tumoru i/ili pojačavaju funkciju CTL.

18. Antitelo ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, gde antitelo smanjuje broj supresorskih ćelija izvedenih iz mijeloida (MDSC) u tumoru i/ili inhibira funkciju MDSC.

19. Antitelo ili farmaceutski sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, gde antitelo smanjuje broj dendritičnih ćelija (DC) u tumoru i/ili inhibira tolerogenu funkciju dendritičnih ćelija.

20. Antitelo ili farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 14 do 19, pri čemu je rak izabran iz grupe koju čine rak pluća, rak prostate, rak dojke, hepatocelularni karcinom, rak jednjaka, kolorektalni karcinom, rak pankreasa, rak bešike, rak bubrega, rak jajnika, rak želuca, fibrozni rak, gliom i melanom.

21. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 12, za upotrebu u postupku lečenja fibroze kod ispitanika kome je to potrebno.