RS62497B1 - Individualizovane vakcine protiv kancera - Google Patents

Individualizovane vakcine protiv kancera

Info

Publication number
RS62497B1
RS62497B1 RS20211268A RSP20211268A RS62497B1 RS 62497 B1 RS62497 B1 RS 62497B1 RS 20211268 A RS20211268 A RS 20211268A RS P20211268 A RSP20211268 A RS P20211268A RS 62497 B1 RS62497 B1 RS 62497B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
cancer
tumor
mutations
rna
Prior art date
Application number
RS20211268A
Other languages
English (en)
Inventor
Ugur Sahin
Sebastian Kreiter
Mustafa Diken
Jan Diekmann
Michael Koslowski
Cedrik Britten
John Castle
Martin Löwer
Bernhard Renard
Tana Omokoko
Graaf Johannes Hendrikus De
Original Assignee
BioNTech SE
Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2011/002576 external-priority patent/WO2012159643A1/en
Application filed by BioNTech SE, Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh filed Critical BioNTech SE
Priority claimed from EP18199105.0A external-priority patent/EP3473267B1/en
Publication of RS62497B1 publication Critical patent/RS62497B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
    • G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
    • G16C20/70—Machine learning, data mining or chemometrics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Software Systems (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE PRONALASKA
[0001] Predmetni navodi se odnose na obezbeđivanje vakcina koje su specifične za tumor pacijenta i potencijalno su korisne za imunoterapiju primarnog tumora kao i za metastaze tumora.
OSNOV PRONALASKA
[0002] Kancer predstavlja primarni uzrok mortaliteta, odgovoran za jednu četvrtinu svih smrtnih ishoda. Lečenje kancera se tradicionalno bazira na zakonu prosečnih vrednosti - koristi se ono što je najbolje za najveći broj pacijenata. Međutim, zbog molekularne heterogenosti kancera, često manje od 25% lečenih osoba ima koristi od odobrenih terapija. Smatra se da je individualizovana medicina, zasnovana na precizno "skrojenom" lečenju pacijenata, mogući način rešavanja problema niske efikasnosti i visokih troškova inovacija u razvoju lekova.
[0003] Cilj antigen-specifične imunoterapije je pojačanje ili indukovanje specifičnih imunskih odgovora kod pacijenata i bila je uspešno korišćena za kontrolu kancera. T ćelije imaju centralnu ulogu u ćelijski posredovanom imunitetu, kod ljudi i životinja. Prepoznavanje i vezivanje za određeni antigen posredovano je T ćelijskim receptorima (T cell receptor, TCR) koji se eksprimiraju na površini T ćelija. T ćelijski receptor (TCR) T ćelije može da interaguje sa imunogenim peptidima (epitopi) vezanim za molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (major histocompatibility complex, MHC) i prezentovanim na površini ciljnih ćelija. Specifično vezivanje TCR pokreće signalnu kaskadu u T ćeliji dovodeći do proliferacije i diferencijacije zrelih efektorskih T ćelija.
[0004] Identifikacija rastućeg broja antigena udruženih sa patogenima i antigena udruženih sa tumorima (tumor associated antigen, TAA) dovela je do stvaranja široke kolekcije ciljeva pogodnih za imunoterapiju. Ćelije koje prikazuju imunogene peptide (epitope) izvedene iz ovih antigena mogu se specifično ciljati strategijama aktivne ili pasivne imunizacije. Aktivna imunizacija može težiti da indukuje i ekspandira pacijentove antigen-specifične T ćelije koje su sposobne da specifično prepoznaju i ubiju obolele ćelije. za vakcinaciju protiv tumora mogu se koristiti Različiti formati antigena, uključujući cele kancerske ćelije, proteine, peptide ili imunizujuće vektore kao što su RNK, DNK ili virusni vektori, koji mogu da se primene direktno in vivo ili in vitro podsticanjem DC posle transfera u pacijenta.
[0005] Kanceri mogu nastati usled akumulacije genomskih mutacija i epigenetskih promena, od kojih deo može imati ulogu uzročnika. Pored antigena udruženih sa tumorom, humani kanceri nose prosečno 100-120 nesinonimnih mutacija, od kojih mnoge mogu biti ciljane vakcinama. Više od 95% mutacija u tumoru jedinstveno je i specifično za pacijenta (Weide et al. 2008: J. Immunother. 31, 180-188). Broj somatskih mutacija koje dovode do promene proteina, što može rezultovati tumor-specifičnim T ćelijskim epitopima, u opsegu je od 30 do 400. Kompjuterskim simulacijama (in silico) bilo je predviđeno postojanje 40 do 60 epitopa ograničenih na klasu I HLA po pacijentu, poreklom od somatskih mutacija specifičnih za tumor (Azuma et al.1993: Nature 366, 76-79. Štaviše, de novo imunogeni epitopi ograničeni na klasu II HLA, verovatno su takođe rezultat mutacija udruženih sa tumorom, međutim, njihov broj još uvek nije poznat.
[0006] Važno je napomenuti da su neke nesinonimne mutacije uzročno povezane sa neoplastičnom transformacijom, ključne za održavanje onkogenog fenotipa ("driver", vodeće mutacije) i mogu predstavljati potencijalnu "Ahilovu petu" kancerskih ćelija. Kako takve nesinonimne mutacije nisu podložne centralnoj imunskoj toleranciji, one mogu biti idealni kandidati za razvijanje individualnih vakcina protiv kancera. Rammensee et al H-G 2008, Chapter 50 of Genomic and Personalized Medicine, Elsevier, je prikaz u radu koji pominje različite pokušaje za razvoj vakcina za kancer, uključujući pojedinačne vakcine za kancer zasnovane na peptidima, DNK ili RNK.
[0007] Mutacije nađene u primarnom tumoru mogu biti prisutne i u metastazama. Međutim, nekoliko studija je pokazalo da metastatski tumori pacijenata stiču dodatne, često klinički relevantne, genetičke mutacije tokom individualne evolucije tumora (Suzuki et al.2007: Mol. Oncol. 1 (2), 172-180; Campbell et al. 2010: Nature 467 (7319), 1109-1113). Pored toga, molekularne karakteristike mnogih metastaza značajno odstupaju od molekularnih karakteristika tumora.
[0008] Tehnički problem u osnovi predmetnih navoda je obezbediti visokoefikasnu individualizovanu vakcinu protiv kancera.
[0009] Predmetni navodi baziraju se na identifikaciji za pacijenta specifičnih kancerskih mutacija i ciljanju pacijentove individualne kancerske mutacione "signature". Specifično, cilj predmetnih navoda koji uključuje individualizovanu imunoterapiju baziranu na sekvenciranju genoma, poželjno egzoma, ili transkriptoma, je imunoterapijsko ciljanje većeg broja individualnih mutacija u kanceru. Sekvenciranje korišćenjem sekvenciranja sledeće generacije (next generation sequencing, NGS) omogućava brzu i isplativu identifikaciju pacijentovih specifičnih kancerskih mutacija.
[0010] Identifikacija nesinonimnih tačkastih mutacija koje rezultuju promenama aminokiselina koje će biti prezentovane u sklopu pacijentovih molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC), obezbeđuje nove epitope (neo-epitope) koji su specifični za pacijentov kancer, ali se ne nalaze u pacijentovim normalnim ćelijama. Prikupljanje seta mutacija iz kancerskih ćelija kao što su cirkulišuće tumorske ćelije (circulating tumor cells, CTC) omogućava obezbeđivanje vakcine koja indukuje imunski odgovor koji potencijalno cilja primarni tumor čak i ako on sadrži genetički različite subpopulacije, kao i tumorske metastaze. Za vakcinaciju, takvi neo-epitopi identifikovani u skladu sa predmetnom patentnom prijavom, obezbeđeni su u patentu u formi polipeptida koji sadrži pomenute neo-epitope i posle odgovarajuće obrade i prezentovanja u sklopu MHC molekula, neo-epitopi se prikazuju pacijentovom imunskom sistemu da bi se stimulisale odgovarajuće T-ćelije.
[0011] Poželjno, takav polipeptid se kod pacijenta obezbeđuje primenom RNK koja kodira polipeptid. Strategija pri kojoj se in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK) direktno injektira u pacijenta različitim putevima imunizacije, uspešno je testirana na različitim animalnim modelima. RNK može da se translatuje u transfektovanim ćelijama i eksprimirani protein posle obrade prezentuje u sklopu MHC molekula na površini ćelija kako bi se izazvao imunski odgovor.
[0012] Prednosti upotrebe RNK kao vrste reverzibilne genske terapije uključuju prolaznu ekspresiju i netransformišući karakter. RNK ne mora da uđe u nukleus da bi se eksprimirala, i štaviše, ne može da se integriše u genom domaćina, čime se eliminiše rizik onkogeneze. Stope transfekcije koje se ostvaruju korišćenjem RNK relativno su visoke. Pored toga, dostignute količine proteina odgovaraju onima pri fiziološkoj ekspresiji.
[0013] Opravdanje za imunoterapijsko ciljanje većeg broja pojedinačnih mutacija je to što se (i) ove mutacije eksprimiraju isključivo, (ii) može se očekivati da su mutirani epitopi idealni za T-ćelijsku imunoterapiju jer T ćelije koje ih prepoznaju nisu prošle selekciju u timusu, (iii) tumorsko izbegavanje imunskog odgovora može biti redukovano npr., ciljanjem vodećih mutacija koje su visoko relevantne za tumorski fenotip, i (iv) veća je verovatnoća da će multiepitopski imunski odgovor za rezultat imati veću kliničku korist.
PRONALAZAK
[0014] Predmetni pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima. Pronalazak je zasnovan na sledećim opštim navodima:
OPIS
KRATAK OPIS
[0015] Predmetni navodi se odnose na efikasne postupke za obezbeđivanje individualizovanih rekombinantnih vakcina protiv kancera, koje indukuju efikasan i specifičan imunski odgovor kod pacijenta obolelog od kancera i potencijalno ciljaju primarni tumor kao i tumorske metastaze. Vakcine protiv kancera obezbeđene prema navodima kada se primene na pacijenta obezbeđuju kolekciju MHC-prezentovanih epitopa specifičnih za pacijentov tumor, pogodnih za stimulisanje, senzibilisanje i/ili ekspandiranje T ćelija usmerenih protiv ćelija koje eksprimiraju antigene iz kojih su izvedeni epitopi prezentovani u sklopu MHC. Prema tome, vakcine opisane u ovom tekstu su poželjno sposobne da indukuju ili promovišu ćelijski odgovor, poželjno aktivnost citotoksičnih T ćelija, protiv kancera, koji se karakteriše prezentacijom jednog ili više antigena eksprimiranih od strane kancerskih ćelija, u sklopu MHC klase I. Pošto će vakcina obezbeđena prema predmetnim navodima ciljati mutacije specifične za kancer, ona će biti specifična za pacijentov tumor.
[0016] U jednom aspektu, predmetni navodi se odnose na postupak za obezbeđivanje individualizovane vakcine za kancer koji sadrži korake:
(a) identifikovanje za kancer specifičnih somatskih mutacija u uzorku tumora pacijenta obolelog od kancera da bi se obezbedila kancerska mutaciona signatura pacijenta; i
(b) obezbeđivanje vakcine koja sadrži kancersku mutacionu signaturu dobijenu u koraku (a).
[0017] U jednom primeru izvođenja, postupak prema navodima sadrži sledeće korake:
i) obezbeđivanje uzorka tumora od pacijenta obolelog od kancera i netumorogenog uzorka koji je poželjno poreklom iz pacijenta obolelog od kancera;
ii) identifikovanje različitosti između sekvenci genoma, egzoma i/ili transkriptoma uzorka tumora i genoma, egzoma i/ili transkriptoma netumorogenog uzorka iii) dizajniranje polipeptida koji uključuje epitope sa sekvencionim različitostima određenim u koraku (ii);
iv) obezbeđivanje polipeptida dizajniranog u koraku (iii) ili nukleinske kiseline, poželjno RNK, koja kodira navedeni polipeptid; i
v) obezbeđivanje vakcine koja sadrži polipeptid ili nukleinsku kiselinu obezbeđene u koraku (iv).
[0018] Prema navodima, uzorak tumora odnosi se na bilo koji uzorak kao što je telesni uzorak poreklom iz pacijenta koji sadrži ili za koji se očekuje da sadrži tumorske ili kancerske ćelije. Telesni uzorak može biti bilo koji uzorak tkiva, na primer, krv, uzorak tkiva dobijen iz primarnog tumora ili iz tumorske metastaze ili bilo koji drugi uzorak koji sadrži tumorske ili kancerske ćelije. Poželjno, telesni uzorak je krv, i kancer-specifične somatske mutacije ili različitosti sekvenci određuju se u jednoj ili više cirkulišućih tumorskih ćelija (CTC) koje se nalaze u krvi. U sledećem primeru izvođenja, uzorak tumora odnosi se na jednu ili više izolovanih tumorskih ili kancerskih ćelija kao što su cirkulišuće tumorske ćelije (CTC) ili uzorak kojii sadrži jednu ili više izolovanih tumorskih ili kancerskih ćelija kao što su cirkulišuće tumorske ćelije (CTC).
[0019] Netumorogeni uzorak odnosi se na bilo koji uzorak kao što je telesni uzorak poreklom iz pacijenta ili druge jedinke koja je poželjno iste vrste kao pacijent, poželjno zdrave jedinke koja ne sadrži ili za koju se ne očekuje da sadrži tumorske ili kancerske ćelije. Telesni uzorak može biti bilo koji uzorak tkiva kao što je krv ili uzorak iz netumorogenog tkiva.
[0020] Prema navodima, izraz "kancerska mutaciona signatura" može se odnositi na sve kancerske mutacije prisutne u jednoj ili više pacijentovih kancerskih ćelija ili se može odnositi samo na deo kancerskih mutacija prisutnih u jednoj ili više pacijentovih kancerskih ćelija. U skladu sa tim, predmetni navodi mogu uključivati identifikaciju svih kancer-specifičnih mutacija prisutnih u jednoj ili više pacijentovih kancerskih ćelija ili može uključivati identifikaciju samo dela kancer-specifičnih mutacija prisutnih u jednoj ili više pacijentovih kancerskih ćelija. Uopšteno, postupak prema navodima obezbeđuje identifikaciju onog broja mutacija koji daje dovoljan broj neo-epitopa koji će biti uključeni u vakcinu. "Kancerska mutacija" odnosi se na razliku u sekvenci između nukleinske kiseline sadržane u kancerskoj ćeliji i nukleinske kiseline sadržane u normalnoj ćeliji.
[0021] Poželjno, mutacije identifikovne u postupcima prema predmetnim navodima su nesinonimnne mutacije, poželjno nesinonimne mutacije proteina koji se eksprimiraju u tumorskoj ili kancerskoj ćeliji.
[0022] U jednom primeru izvođenja, kancer-specifične somatske mutacije ili razlike u sekvenci određuju se u genomu, poželjno čitavom genomu, tumorskog uzorka. Prema tome, postupak prema navodima može uključivati identifikovanje kancerske mutacione signature genoma, poželjno čitavog genoma jedne ili više kancerskih ćelija. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja kancer-specifičnih somatskih mutacija u uzorku tumora pacijenta obolelog od kancera uključuje identifikovanje kancerskog mutacionog profila za ceo genom.
[0023] U jednom primeru izvođenja, za kancer specifične somatske mutacije ili razlike u sekvenci određuju se u egzomu, poželjno čitavom egzomu, tumorskog uzorka. Egzom je deo genoma organizma sačinjen od egzona, koji predstavljau kodirajuće delove eksprimiranih gena. Egzom obezbeđuje genetičku šemu (blueprint) koja se koristi za sintezu proteina i drugih funkcionalnih proizvoda gena. To je funkcionalno najrelevantniji deo genoma i, prema tome, najverovatnije doprinosi fenotipu organizma. Procenjuje se da egzom humanog genoma sadrži 1.5% ukupnog genoma (Ng, PC et al, PLoS Gen., 4(8): 1-15, 2008). Prema tome, postupak prema navodima može uključivati identifikovanje kancerske mutacione signature egzoma, poželjno čitavog egzoma jedne ili više kancerskih ćelija. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja kancer-specifičnih somatskih mutacija u uzorku tumora pacijenta obolelog od kancera uključuje identifikovanje kancerskog mutacionog profila celog egzoma.
[0024] U jednom primeru izvođenja, kancer-specifične somatske mutacije ili razlike u sekvenci određuju se u transkriptomu, poželjno čitavom transkriptomu, uzorka tumora. Transkriptom je set svih RNK molekula, uključujući mRNK, rRNK, tRNK, i druge nekodirajuće RNK proizvedene u jednoj ćeliji ili u populaciji ćelija. U kontekstu predmetnih navoda, transkriptom označava set svih RNK molekula proizvedenih u jednoj ćeliji, populaciji ćelija, poželjno populaciji ćelija kancera, ili u svim ćelijama date jedinke u određenom trenutku vremena. Prema tome, postupak prema navodima može uključivati identifikovanje kancerske mutacione signature transkriptoma, poželjno čitavog transkriptoma jedne ili više kancerskih ćelija. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja kancer-specifičnih somatskih mutacija u uzorku tumora pacijenta obolelog od kancera uključuje identifikovanje kancerskog mutacionog profila za ceo transkriptom.
[0025] U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja kancer-specifičnih somatskih mutacija ili identifikovanja razlike u sekvenci uključuje sekvenciranje pojedinačne ćelije od jedne ili više, poželjno 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili čak i više kancerskih ćelija. Prema tome, postupak prema navodima može uključivati identifikovanje kancerske mutacione signature pomenute jedne ili više kancerskih ćelija. U jednom primeru izvođenja, kancerske ćelije su cirkulišuće tumorske ćelije. Kancerske ćelije kao što su cirkulišuće tumorske ćelije mogu se izolovati pre sekvenciranja pojedinačnih ćelija.
[0026] U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja kancer-specifičnih somatskih mutacija ili identifikovanja razlike u sekvenci uključuje korišćenje sekvenciranja sledeće generacije (NGS).
[0027] U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja kancer-specifičnih somatskih mutacija ili identifikovanja razlike u sekvenci uključuje sekvenciranje genomske DNK i/ili RNK uzorka tumora.
[0028] Da bi se otkrile kancer-specifične somatske mutacije ili razlike u sekvenci, informacija o sekvenci dobijena iz uzorka tumora poželjno se upoređuje sa referencom kao što je informacija o sekvenci dobijena sekvenciranjem nukleinske kiseline kao što je DNK ili RNK normalnih nekanceroznih ćelija kao što su ćelije germinativne linije koje se mogu dobiti od pacijenta. U jednom primeru izvođenja, normalna genomska DNK germinativne linije dobijena je iz mononuklearnih ćelia periferne krvi (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)
[0029] Vakcina obezbeđena prema postupcima predmetnih navoda odnosi se na vakcinu koja, kada se primeni kod pacijenta, poželjno obezbeđuje kolekciju epitopa prezentovanih u sklopu MHC, na primer 2 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 30 ili više i poželjno do 60, do 55, do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 epitopa prezentovanih u sklopu MHC, koji inkorporišu promene sekvence bazirane na identifikovanim mutacijama ili razlikama sekvence. Takvi epitopi prezentovani u sklopu MHC, koji inkorporišu promene sekvence bazirane na identifikovanim mutacijama ili razlikama sekvence nazivaju u ovom tekstu i "neo-epitopi". Prezentovanje ovih epitopa od strane pacijentovih ćelija, posebno antigen-prezentujućih ćelija, poželjno rezultuje T ćelijama koje ciljaju epitope kada su vezani za MHC i tako, pacijentov tumor, poželjno primarni tumor kao i tumorske metastaze, koji eksprimiraju antigene iz kojih su izvedeni epitopi prezentovani u sklopu MHC i predstavljaju iste epitope na površini tumorskih ćelija.
[0030] Za obezbeđivanje vakcine, postupak prema navodima može uključivati arbitrarno uključivanje dovoljnog broja neo-epitopa (poželjno u formi kodirajuće nukleinske kiseline) u vakcini ili može uključivati dodatni korak određivanja upotrebljivosti identifikovanih mutacija u epitopima za vakcinaciju protiv kancera. Dodatni koraci mogu dakle uključivati jedno ili više od sledećeg: (i) procenjivanje da li su promene sekvence lokalizovane u poznatim ili pretpostavljenim MHC-prezentovanim epitopima, (ii) in vitro i/ili in silico testiranje da li su promene u sekvenci locirane u MHC-prezentovanim epitopima, npr., testiranje da li su promene u sekvenci deo peptidnih sekvenci obrađenih i/ili prezentovanih kao MHC-prezentovani epitopi, i (iii) in vitro testiranje da li predviđeni mutirani epitopi, posebno kada su prisutni u svom prirodnom sekvencionom kontekstu, npr., kada su sa obe strane ograničeni aminokiselinskim sekvencama kojima su ograničeni i u proteinu koji se prirodno sreće, i kada se eksprimiraju u antigen-prezentujućim ćelijama, mogu da stimulišu pacijentove T ćelije koje imaju željenu specifičnost. Svaka od tih graničnih sekvenci može sadržati 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više,15 ili više, 20 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 amino-kiselina i mogu ograničavati epitopsku sekvencu N-terminalno i/ili C-terminalno.
[0031] Mutacije ili razlike u sekvenci određene u skladu sa navodima mogu se rangirati u pogledu svoje upotrebljivosti kao epitopa za vakcinaciju protiv kancera. Tako, u jednom aspektu, postupak prema navodima uključuje manuelni ili kompjuterizovani analitički proces u kojem se identifikovane mutacije analiziraju i selektuju u pogledu svoje iskoristljivosti u respektivnoj vakcini koja će biti obezbeđena. U poželjnom primeru pomenuti analitički proces je proces baziran na kompjuterizovanom algoritmu. Poželjno, pomenuti analitički proces uključuje jedan ili više, poželjno sve sledeće korake:
- identifikovanje eksprimiranih, protein-modifikujućih mutacija, npr., analiziranjem transkripata;
- identifikovanje potencijalno imunogenih mutacija tj., upoređivanjem dobijenih podataka sa raspoloživim setovima podataka potvrđenih imunogenih epitopa, npr. onih sadržanih u javnoj bazi podataka imunskih epitopa, kao što je IMMUNE EPITOPE DATABASE AND ANALYSIS RESOURCE na http://www.immunoepitope.org
[0032] Korak identifikovanja mutacija koje su potencijalno imunogene može uključivati određivanje i/ili rangiranje epitopa prema predikciji njihovog kapaciteta vezivanja za MHC, poželjno kapaciteta vezivanja za MHC klase I.
[0033] U drugom primeru navoda, epitopi mogu da se selektuju i/ili rangiraju korišćenjem dodatnih parametara kao što su uticaj proteina, udružena genska ekspresija, jedinstvenost sekvence, predviđena verovatnoća prezentovanja i udruživanje sa drugim onkogenima.
[0034] Višestruke CTC analize takođe omogućavaju selekciju i prioritizaciju mutacija. Na primer, mutacija koja se nalazi u većem delu CTC može da se prioritizuje kao viša nego mutacija koja se nalazi u manjem delu.
[0035] Kolekcija neo-epitopa baziranih na mutaciji, identifikovanih prema navodima i obezbeđenih vakcinom prema navodima poželjno postoji u vidu RNK koja kodira polipeptid koji uključuje pomenute neo-epitope (poliepitopski polipeptid) ili nukleinske kiseline, naročito RNK, koja kodira navedeni polipeptid. Pored toga, neo-epitopi mogu postojati u polipeptidu u formi sekvence za vakcinu, tj., prisutni u svom prirodnom sekvencionom kontekstu, npr., sa obe strane ograničeni aminokiselinskim sekvencama koje ograničavaju pomenute epitope i u proteinu koji se prirodno sreće. Takve granične sekvence mogu sadržati 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 amino-kiselina i mogu ograničavati epitopsku sekvencu N-terminalno i/ili C-terminalno. Prema tome, sekvenca vakcine može sadržati 20 ili više, 25 ili više, 30 ili više, 35 ili više, 40 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 amino-kiselina. U jednom primeru izvođenja, neo-epitopi i/ili sekvence za vakcinu postavljeni su u polipeptidu u vidu "glava ka repu".
[0036] U jednom primeru izvođenja, neo-epitopi i/ili sekvence za vakcinu razdvojeni su linkerima, posebno prirodnim linkerima. Izraz "linker" prema navodima odnosi se na peptid dodat između dva peptidna domena kao što su epitopi ili sekvence za vakcinu, da povežu pomenute peptidne domene. Nema posebnog ograničenja u vezi sa linkerskom sekvencom. Međutim, poželjno je da linkerska sekvenca smanji steričko ometanje koje se javlja između dva peptidna domena, da se dobro translatuje i podržava ili omogućava obradu epitopa. Pored toga, linker bi trebalo da nema ili da ima samo malo imunogenih elemenata u sekvenci. Linkeri poželjno ne bi trebalo da stvaraju neendogene neo-epitope kao što su oni stvoreni od spojne suture između susednih neo-epitopa, koji bi mogli da proizvedu neželjene imunske reakcije. Prema tome, poliepitopska vakcina bi poželjno trebalo da sadrži linkerske sekvence koje su u stanju da smanje broj neželjenih vezivanja epitopa sa spojem (junction epitopes) sa MHC. Hoyt et al. (EMBO J.25(8), 1720-9, 2006) i Zhang et al. (J. Biol. Chem., 279(10), 8635-41, 2004) pokazali su da glicinom bogate sekvence ometaju proteazomsku obradu i tako upotreba linkerskih sekvenci bogatih glicinom deluje da na najmanju meru svede broj linkersadržavajućih peptida koji mogu da se obrade proteazomima. Pored toga, zapaženo je da glicin inhibira snažno vezivanje na pozicijama MHC vezujućeg žleba (Abastado et al, J. Immunol.
151(7), 3569-75, 1993). Schlessinger et al. (Proteins, 61(1), 115-26, 2005) su pronašli da amino-kiseline glicin i serin, uključene u aminokiselinsku sekvencu, daju mnogo fleksibilniji protein koji se efikasnije translatuje i obrađuje proteazomima, omogućavajući bolji pristup kodiranim neo-epitopima. Svaki linker može sadržati 3 ili više, 6 ili više, 9 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 amino-kiselina. Poželjno linker je bogat amino-kiselinama glicinom i/ili serinom. Poželjno, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 95% amino-kiselina linkera su glicin i/ili serin. U jednom poželjnom primeru izvođenja, linker je suštinski sačinjen od amino-kiselina glicina i serina. U jednom primeru izvođenja, linker sadrži aminokiselinsku sekvencu (GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e gde su a, b, c, d i e nezavisni brojevi odabrani između 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 i gde se a b c d e razlikuje od 0 i poželjno iznosi 2 ili više, 3 ili više, 4 ili više ili 5 ili više. U jednom primeru izvođenja, linker sadrži sekvencu kako je opisano u ovom tekstu, uključujući linkersku sekvencu opisanu u primerima, kao što je sekvenca GGSGGGGSG.
1
[0037] U sledećem primeru izvođenja predmetnih navoda, kolekcija neo-epitopa baziranih na neo-epitopima identifikovanih prema navodima i obezbeđenih vakcinom prema navodima poželjno je prisutna u formi kolekcije polipeptida koji uključuju pomenute neo-epitope na različitim polipeptidima, pri čemu svaki pomenuti polipetid sadrži jedan ili više neo-epitopa, koji mogu biti i preklapajući, ili kolekcije nukleinskih kiselina, naročito RNK, koje kodiraju navedene polipeptide.
[0038] U jednom naročitom primeru izvođenja poliepitopski polipeptid prema predmetnim navodima daje se pacijentu u formi nukleinske kiseline, poželjno RNK kao što je in vitro transkribovana ili sintetska RNK, koja se može eksprimirati u pacijentovim ćelijama da bi se proizveo polipeptid. Predmetni navodi takođe imaju u vidu primenu jednog ili više multiepitopskih polipeptida koji su za potrebe predmetnih navoda obuhvaćeni izrazom "poliepitopski polipeptid", poželjno u obliku nukleinske kiseline, poželjno RNK kao što je in vitro transkribovana ili sintetska RNK, koja se može eksprimirati u pacijentovim ćelijama kao što su antigen-prezentujuće ćelije, kako bi se proizveo jedan ili više polipeptida. U slučaju primene više od jednog multiepitopskog polipeptida, neo-epitopi obezbeđeni različitim multiepitopskim polipeptidima mogu biti različiti ili delimično preklapajući. Kada se nađe u pacijentovim ćelijama kao što su antigen-prezentujuće ćelije, polipeptid prema navodima se obrađuje da bi se proizveli neo-epitopi identifikovani prema navodima. Primena vakcine za upotrebu prema pronalasku može obezbediti epitope koji se prezentuju u sklopu MHC klase II, koji mogu da pobude odgovor CD4+ pomažućih T ćelija protiv ćelija koje eksprimiraju antigene iz kojih su izvedeni epitopi prezentovani u sklopu MHC. Alternativno ili dodatno, primena vakcine obezbeđene prema navodima može obezbediti epitope koji se prezentuju u sklopu MHC klase I, koji mogu da pobude odgovor CD8+ T ćelija protiv ćelija koje eksprimiraju antigene iz kojih su izvedeni epitopi prezentovani u sklopu MHC. Pored toga, primena vakcine obezebđene prema navodima može obezbediti jedan ili više neo-epitopa (uključujući poznate neo-epitope i neo-epitope identifikovane prema navodima) kao i jedan ili više epitopa koji ne sadrže kancer-specifične somatske mutacije, ali se eksprimiraju od strane kancerskih ćelija i poželjno indukuju imunski odgovor protiv kancerskih ćelija. U jednom primeru izvođenja, primena vakcine obezbeđene prema navodima obezbeđuje neo-epitope koji su epitopi koji se prezentuju u sklopu MHC klase II i/ili sposobni su da pobude odgovor CD4+ pomažućih T ćelija protiv ćelija koje eksprimiraju antigene iz kojih su izvedeni epitopi prezentovani u sklopu MHC, kao i epitope koji ne sadrže kancer-specifične somatske mutacije, koji su epitopi koji se prezentuju u sklopu MHC klase I i/ili su sposobni da pobude odgovor CD8+ T ćelija protiv ćelija koje eksprimiraju antigene iz kojih su izvedeni epitopi prezentovani u sklopu MHC. U jednom primeru izvođenja, epitopi koji ne sadrže kancer-specifične somatske mutacije izvedeni su iz tumorskog antigena. U jednom primeru izvođenja, neo-epitopi i epitopi koji ne sadrže kancer-specifične somatske mutacije imaju sinergistički efekat u lečenju kancera. Poželjno, vakcina obezbeđena prema navodima korisna je za poliepitopsku stimulaciju odgovora citotoksičnih i/ili T pomažućih ćelija.
[0039] U dodatnom aspektu, predmetni navodi obezbeđuju vakcinu koja se može dobiti postupkom prema navodima. Prema tome, predmetni navodi odnose se i na vakcinu koja sadrži rekombinantni polipeptid koji sadrži neo-epitope bazirane na mutaciji, pomenuti neo-epitopi rezultat su kancer-specifičnih somatskih mutacija u uzorku tumora pacijenta obolelog od kancera, ili nukleinsku kiselinu koja kodira pomenuti polipeptid. Takav pomenuti rekombinantni polipetid može uključivati i epitope koji ne sadrže kancer-specifične somatske mutacije, kako je gore bilo reči. Poželjni primeri izvođenja takve vakcine su kao što je opisano ranije u ovom tekstu, u kontekstu postupka prema navodima.
[0040] Vakcina obezbeđena prema navodima može uključivati farmaceutski prihvatljivi nosač i može opciono uključivati jedan ili više adjuvansa, stabilizera itd. Vakcina može biti u formi terapijske ili profilaktičke vakcine.
[0041] Sledeći aspekt se odnosi na postupak za indukovanje imunskog odgovora kod pacijenta, koji uključuje primenu na pacijenta, vakcine obezbeđene prema navodima.
[0042] Sledeći aspekt se odnosi na postupak za lečenje pacijenta sa kancerom koji sadrži korake:
(a) obezbeđivanje individualizovane vakcine protiv kancera pomoću postupka prema navodima; i
(b) primenu navedene vakcine na pacijenta.
[0043] Sledeći aspekt se odnosi na postupak za lečenje pacijenta sa kancerom koji sadrži primenu vakcine prema navodima na pacijenta.
[0044] U dodatnim aspektima, navodi obezbeđuju vakcine opisane ovde za upotrebu u postupcima za lečenje koji su ovde opisani, naročito za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera.
[0045] Lečenje kancera opisano u ovom tekstu može se kombinovati sa hirurškom resekcijom i/ili radijacionom i/ili tradicionalnom hemioterapijom.
[0046] Sledeći aspekt navoda koji nije deo pronalaska odnosi se na postupak za određivanje lažno pozitivnih rezultata, baziran na podacima sekvenciranja sledeće generacije, pri čemu pomenuti postupak uključuje:
uzimanje prvog uzorka genetičkog materijala od životinje ili čoveka;
uzimanje drugog uzorka genetičkog materijala od životinje ili čoveka;
uzimanje prvog uzorka genetičkog materijala iz tumorskih ćelija;
uzimanje drugog uzorka genetičkog materijala iz pomenutih tumorskih ćelija; određivanje opšte pokrivenosti poređenja tumora brojanjem svih baza referentnog genoma uključenih i u tumor i u najmanje jedan od pomenutog prvog uzorka genetičkog materijala iz životinje ili čoveka i pomenutog drugog uzorka genetičkog materijala iz životinje ili čoveka;
određivanje opšte pokrivenosti poređenja "isto vs. isto" brojanjem svih baza referentnog genoma pokrivenih i pomenutim prvim uzorkom genetičkog materijala iz životinje ili čoveka i pomenutim drugim uzorkom genetičkog materijala iz životinje ili čoveka; deljenje pomenute opšte pokrivenosti poređenja tumora pomenutom opštom pokrivenošću poređenja "isto vs. isto" da bi se izvršila normalizacija;
određivanje stope lažnog otkrivanja deljenjem 1) broja varijacija pojedinačnog nukleotida sa skorom kvaliteta većim od Q u poređenju pomenutog prvog uzorka genetičkog materijala iz životinje ili čoveka i pomenutog drugog uzorka genetičkog materijala iz životinje ili čoveka, sa 2) brojem varijacija pojedinačnog nukleotida sa skorom kvaliteta većim od Q u poređenju pomenutog prvog uzorka genetičkog materijala iz pomenutih tumorskih ćelija i pomenutog drugog uzorka genetičkog materijala iz pomenutih tumorskih ćelija i 3) umnožavanje rezultata pomenutom normalizacijom.
[0047] U jednom primeru izvođenja, pomenuti genetički materijal je DNK.
[0048] U jednom primeru izvođenja, Q se određuje:
uspostavljanjem seta osobina kvaliteta S=(s1,...,sn) pri čemu je S preferentno u odnosu na T=(t1,...,tn), označeno kao S>T, kada je si>tiza sve i=1,...,n;
definisanjem intermedijarne stope lažnog otkrivanja deljenjem 1) broja pojedinačnih nukleotidnih varijacija sa skorom kvaliteta S>T, u poređenju pomenutog prvog DNK uzorka iz životinje ili čoveka i pomenutog drugog DNK uzorka iz životinje ili čoveka, sa 2) brojem pojedinačnih nukleotidnih varijacija sa skorom kvaliteta S>T, u poređenju pomenutog prvog DNK uzorka iz pomenutih tumorskih ćelija i pomenutog drugog DNK uzorka iz pomenutih tumorskih ćelija i 3) umnožavanje rezultata pomenutom
1
normalizacijom, čime se određuje opseg vrednosti za svaku osobinu za m mutacije, svaka sa n osobinama kvaliteta;
uzorkovanjem do p vrednosti iz pomenutog opsega vrednosti;
kreiranjem svih mogućih kombinacija uzorkovanih vrednosti kvaliteta što rezultuje p<n>tačkama podataka;
korišćenjem nasumičnog uzorka pomenutih tačaka podataka kao prediktora za obučavanje po postupku slučajnih šuma (random forest);
korišćenjem odgovarajuće vrednosti intermedijarne stope lažnog otkrivanja kao odgovora za pomenuto obučavanje po postupku slučajnih šuma, pri čemu rezultujući regresioni skor pomenutog obučavanja po postupku slučajnih šuma iznosi Q.
[0049] U jednom primeru izvođenja, pomenuti drugi DNK uzorak iz životinje ili čoveka je alogen za pomenuti prvi DNK uzorak iz životinje ili čoveka. U jednom primeru izvođenja, pomenuti drugi DNK uzorak iz životinje ili čoveka je autolog za pomenuti prvi DNK uzorak iz životinje ili čoveka. U jednom primeru izvođenja, pomenuti drugi DNK uzorak iz životinje ili čoveka je ksenogen za pomenuti prvi DNK uzorak iz životinje ili čoveka.
[0050] U jednom primeru izvođenja, pomenuti genetički materijal je RNK.
[0051] U jednom primeru izvođenja, Q se određuje:
uspostavljanjem seta osobina kvaliteta S=(s1,...,sn) pri čemu je S preferentno u odnosu na T=(t1,...,tn), označeno kao S>T, kada je si>tiza sve i=1,...,n;
definisanjem intermedijarne stope lažnog otkrivanja deljenjem 1) broja pojedinačnih nukleotidnih varijacija sa skorom kvaliteta S>T, u poređenju pomenutog prvog RNK uzorka iz životinje ili čoveka i pomenutog drugog RNK uzorka iz životinje ili čoveka, sa 2) brojem pojedinačnih nukleotidnih varijacija sa skorom kvaliteta S>T, u poređenju pomenutog prvog RNK uzorka iz pomenutih tumorskih ćelija i pomenutog drugog RNK uzorka iz pomenutih tumorskih ćelija i 3) umnožavanjem rezultata pomenutom normalizacijom, čime se određuje opseg vrednosti za svaku osobinu za m mutacije, svaka sa n osobinama kvaliteta;
uzorkovanjem do p vrednosti iz pomenutog opsega vrednosti;
kreiranjem svih mogućih kombinacija uzorkovanih vrednosti kvaliteta, što rezultuje p<n>tačkama podataka;
korišćenjem nasumičnog uzorka pomenutih tačaka podataka kao prediktora za obučavanje po postupku slučajnih šuma;
korišćenjem odgovarajuće vrednosti intermedijarne stope lažnog otkrivanja kao odgovora za pomenuto obučavanje po postupku slučajnih šuma, pri čemu rezultujući regresioni skor pomenutog obučavanja po postupku slučajnih šuma iznosi Q.
[0052] U jednom primeru izvođenja, pomenuti drugi RNK uzorak iz životinje ili čoveka je alogen za pomenuti prvi RNK uzorak iz životinje ili čoveka. U jednom primeru izvođenja, pomenuti drugi RNK uzorak iz životinje ili čoveka je autolog za pomenuti prvi RNK uzorak iz životinje ili čoveka. U jednom primeru izvođenja, pomenuti drugi RNK uzorak iz životinje ili čoveka je ksenogen za pomenuti prvi RNK uzorak iz životinje ili čoveka.
[0053] U jednom primeru izvođenja, pomenuta stopa lažnog otkrivanja koristi se za pravljenje formulacije vakcine. U jednom primeru izvođenja, pomenuta vakcina se može dostaviti intravenski. U jednom primeru izvođenja, pomenuta vakcina se može dostaviti dermalno. U jednom primeru izvođenja, pomenuta vakcina se može dostaviti muskularno. U jednom primeru izvođenja, pomenuta vakcina se može dostaviti subkutano. U jednom primeru izvođenja, pomenuta vakcina je prilagođena specifičnom pacijentu.
[0054] U jednom primeru izvođenja, jedan od pomenutog prvog uzorka genetičkog materijala iz životinje ili čoveka i pomenutog drugog uzorka genetičkog materijala iz životinje ili čoveka je iz pomenutog specifičnog pacijenta. U jednom primeru izvođenja, u pomenutom koraku određivanja opšte pokrivenosti poređenja tumora brojanjem svih baza referentnog genoma uključenih i u tumor i u najmanje jedan od pomenutog prvog uzorka genetičkog materijala iz životinje ili čoveka i pomenutog drugog uzorka genetičkog materijala iz životinje ili čoveka, koristi se automatizovani sistem za brojanje svih baza.
[0055] U jednom primeru izvođenja, u pomenutom koraku određivanja opšte pokrivenosti "isto vs. isto" poređenja brojanjem svih baza referentnog genoma koje su pokrivene i pomenutim prvim uzorkom genetičkog materijala iz životinje ili čoveka i pomenutim drugim uzorkom genetičkog materijala iz životinje ili čoveka, koristi se pomenuti automatizovani sistem.
[0056] U jednom primeru izvođenja, u pomenutom koraku deljenja pomenute opšte pokrivenosti poređenja tumora pomenutom opštom pokrivenošću "isto vs. isto" poređenja da bi se formirala normalizacija, koristi se pomenuti automatizovani sistem.
[0057] U jednom primeru izvođenja, navedeni korak određivanja stope lažnog otkrivanja deljenjem 1) broja pojedinačnih nukleotidnih varijacija sa skorom kvaliteta većim od Q u poređenju pomenutog prvog uzorka genetičkog materijala iz životinje ili čoveka i pomenutog drugog uzorka genetičkog materijala iz životinje ili čoveka, sa 2) brojem pojedinačnih nukleotidnih varijacija sa skorom kvaliteta većim od Q u poređenju pomenutog prvog uzorka
1
genetičkog materijala iz pomenutih tumorskih ćelija i pomenutog drugog uzorka genetičkog materijala iz pomenutih tumorskih ćelija i 3) umnožavanjem rezultata pomenutom normalizacijom, koristi se pomenuti automatizovani sistem.
[0058] Sledeći aspekt navoda koji nije deo pronalaska odnosi se postupak za određivanje procenjene ROC krive (receiver operating curve), pomenuti postupak uključuje:
primanje seta podataka mutacija, svaka mutacija udružena je sa stopom lažnog otkrivanja (false discovery rate, FDR); i
za svaku mutaciju:
određivanje stope stvarnih pozitivnih (true positive rate, TPR) oduzimanjem pomenute FDR od jedan; i
određivanje stope lažno pozitivnih (false positive rate, FPR) postavljanjem pomenutog FPR jednakim pomenutom FDR; i
formiranje procenjene ROC unošenjem, za svaku mutaciju, tačke na kumulativnim TPR i FPR vrednostima do pomenute mutacije, podeljeno zbirom svih TPR i FPR vrednosti.
[0059] Druge osobine i prednosti sadašnjih navoda biće vidljive iz detaljnog opisa i patentnih zahteva koji slede.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0060] Iako su predmetni navodi detaljno opisani u nastavku ovog teksta, treba razumeti da ovi navodi nisu ograničeni na određene metodologije, protokole i reagense opisane u ovom tekstu jer je njihovo menjanje moguće. Treba takođe razumeti da je terminologija upotrebljena u ovom tekstu namenjena samo opisivanju posebnih primera izvođenja, i nije joj cilj da ograniči obim predmetnih navoda, koji će biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini upotrebljeni u ovom tekstu imaju ona značenja koja uobičajeno razume prosečno obučeni stručnjak u oblasti.
[0061] U nastavku, biće opisani elementi predmetnih navoda. Ovi elementi su navedeni uz specifične primere izvođenja, međutim, treba razumeti da oni mogu da se kombinuju na bilo koji način i u bilo kojem broju da bi se stvorili dodatni primeri izvođenja. Različite opisane primere i poželjne primere izvođenja ne treba shvatiti kao ograničenja predmetnih navoda jedino na eksplicitno opisane primere izvođenja. Treba razumeti da ovaj opis podržava i obuhvata primere izvođenja u kojima se eksplicitno opisani primeri izvođenja kombinuju sa
1
bilo kojim brojem objavljenih i/ili poželjnih elemenata. Pored toga, sve permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj patentnoj prijavi treba smatrati da su objavljene opisom predmetne patentne prijave, osim ako kontekst jasno ne kazuje drugačije. Na primer, ako u poželjnom primeru izvođenja RNK uključuje poli(A)-rep koji se sastoji od 120 nukleotida i u drugom poželjnom primeru izvođenja RNK molekul uključuje 5’-"kapa" analog, onda u poželjnom primeru izvođenja, RNK uključuje poli(A)-rep koji se sastoji od 120 nukleotida i 5’-"kapa" analoga.
[0062] Poželjno, izrazi upotrebljeni u ovom tekstu definisani su kako je opisano u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH 4010 Basel, Švajcarska.
[0063] U praksi, predmetni navodi će koristiti, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne metode biohemije, ćelijske biologije, imunologije i tehnike rekombinantne DNK, objašnjene u literaturi u ovoj oblasti (uporedi, npr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
[0064] U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč "uključivati/sadržati", i varijacije kao što su "sadrži/uključuje" i "koji sadrži/koji uključuje", podrazumevaju uključivanje navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kojeg drugog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, iako u nekim primerima izvođenja takav drugi član, ceo broj ili korak ili grupa članova, celih brojeva ili koraka mogu biti izostavljeni, tj., predmet podrazumeva inkluziju navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Treba razumeti da određeni izrazi upotrebljeni u kontekstu opisivanja navoda (posebno u kontekstu patentnih zahteva) obuhvataju i jedinu i množinu, ukoliko nije drugačije navedeno u ovom tekstu ili ako tekst jasno ne ukazuje na suprotno. Navođenje opsega vrednosti u ovom tekstu služi samo kao postupak skraćivanja pojedinačnog navođenja svake zasebne vrednosti obuhvaćene opsegom. Ukoliko nije drugačije naznačeno u ovom tekstu, svaka pojedinačna vrednost uključena je u specifikaciju kao da je posebno navedena.
[0065] Svi postupci opisani u ovom tekstu mogu se izvesti bilo kojim pogodnim redom ukoliko u ovom tekstu nije drugačije navedeno ili nije na neki način u suprotnosti sa kontekstom. U ovom tekstu, upotreba bilo kojeg i svih primera, ili odgovarajućeg izraza u vezi sa primerima (npr., "kao što je"), namenjena je jedino boljem ilustrovanju navoda i ne predstavlja ograničenje obima navoda na koji se, inače, patentni zahtevi odnose. Nijedan izraz u ovoj specifikaciji ne
1
treba razumeti kao da označava element neobuhvaćen patentnim zahtevima, bitan za primenu navoda.
[0066] Vakcina obezbeđena prema navodima je rekombinantna vakcina.
[0067] Izraz "rekombinantan" u kontekstu predmetnih navoda znači "napravljen genetičkim inženjeringom". Poželjno, "rekombinantni entitet", kao što je rekombinantni polipeptid u kontekstu predmetnih navoda, ne sreće se u prirodi i poželjno je rezultat kombinacije entiteta kao što su sekvence amino-kiselina ili nukleinskih kiselina koje se ne kombinuju u prirodnim uslovima. Na primer, rekombinantni polipeptid u kontekstu predmetnih navoda može sadržati nekoliko aminokiselinskih sekvenci kao što su neo-epitopske sekvence ili sekvence vakcine izvedene iz različitih proteina ili različitih delova istog proteina, spojene npr., peptidnim vezama ili odgovarajućim linkerima.
[0068] Izraz "nalaziti se u prirodi", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na činjenicu da objekat može da se nađe u prirodi. Na primer, peptid ili nukleinska kiselina, koji su prisutni u organizmu (uključujući viruse) i mogu se izolovati iz izvora u prirodi, i koje čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji, jesu oni koji se prirodno sreću.
[0069] Prema navodima, izraz "vakcina" odnosi se na farmaceutski preparat (farmaceutsku kompoziciju) ili proizvod koji posle primene indukuje imunski odgovor, posebno ćelijski imunski odgovor, koji prepoznaje i napada patogen ili obolelu ćeliju kao što je kancerska ćelija. Vakcina može da se koristi za prevenciju ili lečenje oboljenja. Izraz "individualizovana vakcina protiv kancera" razmatra određenog pacijenta obolelog od kancera i označava da je vakcina protiv kancera prilagođena potrebama ili posebnim uslovima vezanim za pojedinačnog pacijenta obolelog od kancera.
[0070] Izraz "imunski odgovor" odnosi se na integrisani odgovor tela na antigen i poželjno označava ćelijski imunski odgovor ili ćelijski i humoralni imunski odgovor. Imunski odgovor može biti protektivan/preventivan/profilaktički i/ili terapijski.
[0071] "Indukovati imunski odgovor " može da označava da pre indukcije ne postoji imunski odgovor protiv određenog antigena, ali takođe može da znači i da je pre indukcije postojao određeni nivo imunskog odgovora protiv određenog antigena, a da je posle indukcije pomenuti imunski odgovor pojačan. Prema tome, "indukovati imunski odgovor" takođe uključuje "pojačati imunski odgovor". Poželjno, posle indukovanja imunskog odgovora kod subjekta, pomenuti subjekt je zaštićen od razvijanja bolesti kao što je kancer, ili je stanje bolesti ublaženo indukovanjem imunskog odgovora. Na primer, imunski odgovor protiv tumor-eksprimiranog antigena može se indukovati kod pacijenta koji ima kancer ili kod subjekta koji ima rizik razvijanja kancera. Indukovanje imunskog odgovora u ovom slučaju može značiti da je
1
subjektovo stanje bolesti ublaženo, da subjekt ne razvija metastaze, ili da subjekt koji ima rizik da razvije kancer ne oboljeva od kancera.
[0072] "Ćelijski imunski odgovor", "ćelijski odgovor", "ćelijski odgovor protiv antigena" ili sličan izraz, treba da uključe ćelijski odgovor usmeren prema ćelijama koje se karakterišu prezentovanjem antigena u sklopu MHC klase I ili klase II. Ćelijski odgovor odnosi se na ćelije nazvane T ćelije ili T-limfociti, koji deluju kao "pomagači" ili kao "ubice". T ćelije-pomagači (označene i kao CD4+ T ćelije) imaju centralnu ulogu time što regulišu imunski odgovor, a ćelije-ubice (označene i kao citotoksične T ćelije, citolitičke T ćelije, CD8+ T ćelije ili CTL) ubijaju obolele ćelije kao što su ćelije kancera, prevenirajući dalji nastanak obolelih ćelija. U poželjnim primerima izvođenja, predmetni navodi uključuju stimulaciju antitumorskog CTL odgovora protiv tumorskih ćelija koje eksprimiraju jedan ili više tumor-eksprimirajućih antigena i poželjno prezentuju takve tumor-eksprimirajuće antigene u sklopu MHC klase I.
[0073] "Antigen" prema navodima podrazumeva svaku supstancu koja će pobuditi imunski odgovor. Posebno, "antigen" se odnosi na svaku supstancu, poželjno peptid ili protein, koja reaguje specifično sa antitelima ili T limfocitima (T ćelijama). Prema predmetnim navodima, izraz "antigen" uključuje svaki molekul koji sadrži najmanje jedan epitop. Poželjno, antigen je u kontekstu predmetnih navoda molekul koji, opciono posle procesovanja, indukuje imunsku reakciju koja je poželjno specifična za antigen (uključujući ćelije koje eksprimiraju antigen). Prema predmetnim navodima, može se koristiti svaki poželjan antigen koji je kandidat za imunsku reakciju, pri čemu je imunska reakcija poželjno ćelijska imunska reakcija. U kontekstu primera izvođenja predmetnih navoda, antigen je poželjno prezentovan od strane ćelije, poželjno od strane ćelije koja prezentuje antigen, uključujući obolelu ćeliju, posebno kancersku ćeliju, u kontekstu MHC molekula, što za rezultat ima imunsku reakciju protiv antigena. Antigen je poželjno proizvod koji odgovara ili je izveden iz antigena koji se prirodno sreće. Takvi antigeni koji se sreću prirodno uključuju tumorske antigene.
[0074] U poželjnom primeru izvođenja, antigen je tumorski antigen, tj., deo tumorske ćelije kao što je protein ili peptid eksprimiran u tumorskoj ćeliji, koji može biti poreklom iz citoplazme, sa površine ćelije ili iz nukleusa ćelije, posebno onaj koji se prvenstveno sreće unutar ćelije ili kao površinski antigen tumorskih ćelija. Na primer, tumorski antigeni uključuju karcinoembrionski antigen, α1-fetoprotein, izoferitin, i fetalni sulfoglikoprotein, α2-H-feroprotein i γ-fetoprotein. Prema predmetnim navodima, tumorski antigen poželjno podrazumeva svaki antigen koji se eksprimira i opciono je karakterističan u pogledu tipa i/ili ekspresionog nivoa za tumore ili kancere kao i za tumorske ili kancerske ćelije. U jednom primeru izvođenja, izraz "tumorski antigen" ili "tumor-asocirani antigen" odnosi se na proteine
1
koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u ograničenom broju tkiva i/ili organa ili u specifičnim razvojnim stadijumima, na primer, tumorski antigen može se pod normalnim uslovima specifično eksprimirati u želudačnom tkivu, poželjno u želudačnoj mukozi, u reproduktivnim organima, npr., u testisima, u tkivu trofoblasta, npr., u placenti, ili u ćelijama germinativne linije, a eksprimiraju se ili se aberantno eksprimiraju u jednom ili više tumorskih ili kancerskih tkiva. U tom kontekstu, "ograničen broj" poželjno označava ne više od 3, poželjnije ne više od 2. Tumorski antigeni u kontekstu predmetnih navoda pronalaska uključuju, na primer, različite antigene, poželjno antigene diferencijacije specifične za tip ćelije, tj., proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u određenom tipu ćelije u određenom stadijumu diferencijacije, kancerske/testisne antigene, tj., proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u testisu i ponekad u placenti, i antigene specifične za ćelije germinativne linije. Poželjno, tumorski antigen ili aberantna ekspresija tumorskog antigena identifikuje kancerske ćelije. U kontekstu predmetnih navoda, tumorski antigen koji se eksprimira od strane kancerske ćelije kod subjekta, npr., pacijenta obolelog od kancera, poželjno za pomenutog subjekta predstavlja sopstveni protein. U poželjnim primerima izvođenja, tumorski antigen u kontekstu predmetnih navoda eksprimira se pod normalnim uslovima specifično u tkivu ili organu koji nisu esencijalni, tj., u tkivima ili organima čije oštećenje imunskim sistemom neće dovesti do smrti subjekta, ili u organima ili strukturama tela koje nisu dostupne ili su samo teško dostupne imunskom sistemu.
[0075] Prema navodima, izrazi "tumorski antigen", "tumor-eksprimirajući antigen", "kancerski antigen" "kancer-eksprimirani antigen" su ekvivalentni i koriste se u ovom tekstu naizmenično.
[0076] Izraz "imunogenost" odnosi se na relativnu efikasnost antigena da indukuje imunsku reakciju.
[0077] "Antigeni peptid" prema navodima poželjno se odnosi na deo ili fragment antigena sposoban da stimuliše imunski odgovor, poželjno ćelijski odgovor protiv antigena ili ćelija koje se karakterišu ekspresijom antigena i posebno prezentovanjem antigena, kao što su obolele ćelije, posebno kancerske ćelije. Poželjno, antigeni peptid je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv ćelije koja se karakteriše prezentacijom antigena u sklopu MHC klase I i poželjno sposoban je da stimuliše citotoksične T limfocite (CTL) koji odgovaraju na antigen. Poželjno, antigeni peptidi prema navodima su peptidi koji se prezentuju u sklopu MHC klase I i/ili klase II ili mogu da se obrade da proizvedu peptide koji se prezentuju u sklopu MHC klase I i/ili klase II. Poželjno, antigeni peptidi uključuju aminokiselinsku sekvencu koja suštinski odgovara aminokiselinskoj sekvenci fragmenta antigena. Poželjno, pomenuti fragment antigena je peptid koji se prezentuje u sklopu MHC klase I i/ili klase II. Poželjno, antigeni peptid prema
2
navodima sadrži aminokiselinsku sekvencu koja suštinski odgovara aminokiselinskoj sekvenci takvog fragmenta i obrađuje se da bi se dobio takav fragment, tj., peptid koji se prezentuje u sklopu MHC klase I i/ili klase II izveden iz antigena.
[0078] Ako se peptid prezentuje direktno, tj., bez obrade, tačnije bez sečenja, on ima dužinu koja je pogodna za vezivanje za MHC molekul, posebno MHC klase I, i poželjno dug je 7-20 amino-kiselina, poželjnije dug je 7-12 amino-kiselina, poželjnije dug je 8-11 amino-kiselina, posebno dug je 9 ili 10 amino-kiselina.
[0079] Ako je peptid deo većeg entiteta koji uključuje dodatne sekvence, npr., sekvencu vakcine ili polipeptida i treba da se prezentuje posle obrade, tačnije posle sečenja, peptid proizveden obradom ima dužinu koja je pogodna za vezivanje za MHC molekul, posebno MHC klase I, i poželjno dug je 7-20 amino-kiselina, poželjnije dug je 7-12 amino-kiselina, poželjnije dug je 8-11 amino-kiselina, posebno dug je 9 ili 10 amino-kiselina. Poželjno, sekvenca peptida koji treba da bude prezentovan posle obrade izvedena je iz aminokiselinske sekvence antigena, tj. njegova sekvenca suštinski odgovara i poželjno potpuno je identična fragmentu antigena. Prema tome, antigeni peptid ili sekvenca vakcine prema navodima u jednom primeru izvođenja uključuju sekvencu dugu 7-20 amino-kiselina, poželjnije dugu 7-12 amino-kiselina, poželjnije 8-11 amino-kiselina, posebno dugu 9 ili 10 amino-kiselina, koja suštinski odgovara i poželjno je potpuno identična fragmentu antigena, i posle obrade antigenog peptida ili sekvence vakcine čini prezentovani peptid. Prema navodima, takav obradom proizvedeni peptid sadrži identifikovanu promenu sekvence.
[0080] Prema navodima, antigeni peptid ili epitop može biti prisutan u vakcini ili kao deo većeg entiteta kao što je sekvenca vakcine i/ili polipeptid koji uključuje više od jednog antigenog peptida ili epitopa. Prezentovani antigeni peptid ili epitop proizveden je posle odgovarajućeg procesovanja.
[0081] Peptidi sa aminokiselinskim sekvencama koje suštinski odgovaraju sekvenci peptida koji se prezentuje u sklopu MHC klase I, mogu se razlikovati u jednoj ili više rezidua koje nisu esencijalne za TRC-prepoznavanje peptida prezentovanog u sklopu MHC klase I, ili za vezivanje peptida za MHC. Takvi suštinski odgovarajući peptidi takođe mogu da stimulišu CTL koji odgovaraju na antigen i mogu se smatrati imunološkim ekvivalentima. Peptidi sa aminokiselinskim sekvencama koje se razlikuju od prezentovanog peptida na reziduama koje ne afektuju TCR-prepoznavanje, ali poboljšavaju stabilnost vezivanja za MHC, mogu poboljšati imunogenost antigenog peptida, i mogu se označiti u ovom tekstu kao "optimizovani peptid". Korišćenjem postojećeg znanja o tome koja od ovih rezidua verovatnije može da utiče na vezivanje za MHC ili za TCR, može se upotrebiti racionalni pristup dizajniranju suštinski odgovarajućih peptida. Rezultujući peptidi koji su funkcionalni razmatraju se kao antigeni peptidi.
[0082] Kada se antigeni peptid prezentuje u sklopu MHC trebalo bi da ga prepozna T-ćelijski receptor. Poželjno, antigeni peptid, ako ga prepozna T-ćelijski receptor, sposoban je da u prisustvu odgovarajućih kostimulatornih signala indukuje klonsku ekspanziju T ćelija koje nose T-ćelijski receptor za specifično prepoznavanje antigenog peptida. Poželjno, antigeni peptidi, posebno ako su prezentovani u kontekstu MHC molekula, sposobni su da stimulišu imunski odgovor, poželjno ćelijski odgovor protiv antigena iz kojeg su izvedeni ili ćelija koje se karakterišu ekspresijom antigena i poželjno koje se karakterišu prezentacijom antigena. Poželjno, antigeni peptid može da stimuliše ćelijski odgovor protiv ćelije koja se karakteriše prezentacijom antigena u sklopu MHC klase I i poželjno može da stimuliše CTL koje odgovaraju na antigen. Takva ćelija je, poželjno, ciljna ćelija.
[0083] "Procesovanje/obrađivenje antigena" ili "procesovanje/obrada" odnosi se na degradaciju polipeptida ili antigena u proizvode procesovanja, što su fragmenti pomenutog polipeptida ili antigena (npr., degradacija polipeptida u peptide) i asocijaciju jednog ili više ovih fragmenata (npr., vezivanjem) sa MHC molekulima za prezentaciju ćelijama, poželjno antigenprezentujućim ćelijama, specifičnim T ćelijama.
[0084] "Antigen-prezentujuće ćelije" (antigen presenting cells, APC) su ćelije koje na svojoj površini prezentuju peptidne fragmente proteinskih antigena u asocijaciji sa MHC molekulima. Neke APC mogu aktivirati antigen-specifične T ćelije.
[0085] Profesionalne antigen-prezentujuće ćelije veoma su efikasne u internalizaciji antigena fagocitozom, ili endocitozom posredovanom receptorima, i zatim prikazivanju fragmenta antigena, vezanog za MHC molekul klase II, na membrani. T ćelija prepoznaje i interaguje sa kompleksom antigen-MHC molekul klase II na membrani antigen-prezentujuće ćelije. Dodatni kostimulatorni signal se zatim proizvodi od strane antigen-prezentujuće ćelije, dovodeći do aktivacije T ćelije. Ekspresija kostimulatornih molekula je definišuća osobina profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija.
[0086] Glavni tipovi profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija su dendritske ćelije koje imaju najširi opseg prezentacije antigena, i verovatno su najvažnije antigen-prezentujuće ćelije, zatim makrofagi, B-ćelije, i određene aktivirane epitelske ćelije.
[0087] Dendritske ćelije (dendritic cell, DC) predstavljaju populacije leukocita koji prezentuju antigene zarobljene u perifernim tkivima, T ćelijama, preko puteva prezentovanja antigena u sklopu MHC klase II i I. Dobro je poznato da su dendritske ćelije potentni induktori imunskih odgovora i aktivacija ovih ćelija je kritičan korak za indukciju antitumorskog imuniteta.
[0088] Dendritske ćelije se pogodno kategorišu kao "nezrele" i "zrele" ćelije, što može da se koristi kao jednostavan način za diskriminisanje dva dobro okarakterisana fenotipa. Međutim, ne bi trebalo shvatiti da ova nomenklatura isključuje sve moguće intermedijarne stupnjeve diferencijacije.
[0089] Nezrele dendritske ćelije karakterišu se kao antigen-prezentujuće ćelije sa visokim kapacitetom za preuzimanje i procesovanje antigena, što korelira sa visokom ekspresijom Fcγ receptora i manoznog receptora. Zreli fenotip se tipično karakteriše nižom ekspresijom ovih markera, ali visokom ekspresijom ćelijskih površinskih molekula odgovornih za aktivaciju T ćelija, kao što su MHC klase I i klase II, adhezivnih molekula (npr. CD54 i CD11) i kostimulatornih molekula (npr., CD40, CD80, CD86 i 4-1 BB).
[0090] Sazrevanje dendritskih ćelija odnosi se na stanje aktivacije dendritskih ćelija pri kojem takve antigen-prezentujuće dendritske ćelije dovode do inicijacije T ćelija, dok prezentacija nezrelim dendritskim ćelijama rezultuje tolerancijom. Maturacija dendritskih ćelija uglavnom je uzrokovana biomolekulima sa mikrobnim osobinama detektovanim urođenim receptorima (bakterijska DNK, virusna RNK, endotoksin, itd.), proinflamatornim citokinima (TNF, IL-1, IFN), ligacijom CD40 na površini dendritskih ćelija pomoću CD40L, i supstancama oslobođenim iz ćelija koje podležu stresnoj ćelijskoj smrti. Dendritske ćelije mogu da se izvedu kultivisnjem ćelija kostne srži in vitro sa citokinima, kao što su faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) i faktor nekroze tumora-alfa.
[0091] Neprofesionalne antigen-prezentujuće ćelije ne eksprimiraju konstitutivno MHC proteine klase II potrebne za interakciju sa naivnim T ćelijama; oni se eksprimiraju samo posle stimulacije neprofesionalnih antigen-prezentujućih ćelija određenim citokinima kao što je IFNγ.
[0092] "Antigen-prezentujuće ćelije" mogu da prime peptide prezentovane u sklopu MHC klase I transdukovanjem ćelija nukleinskom kiselinom, poželjno RNK kodirajućom za peptid ili polipeptid uključujući peptid koji će se prezentovati, npr,. nukleinskom kiselinom koja kodira antigen.
[0093] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija prema navodima koja sadrži prenosnik za dostavu gena, koji cilja dendritsku ili drugu antigen-prezentujuću ćeliju, može se primeniti kod pacijenta, rezultujući transfekcijom koja se dešava in vivo. In vivo transfekcija dendritskih ćelija, na primer, može uopšteno da se izvede korišćenjem bilo kojeg postupka poznatog u struci, kao što su postupci opisani u WO 97/24447, ili pristupom "genskog pištolja" koji su opisali Mahvi et al., Immunology and Cell Biology 75: 456-460, 1997.
2
[0094] Prema navodima, izraz "antigen-prezentujuća ćelija" uključuje i ciljne ćelije.
[0095] "Ciljna ćelija" će označavati ćeliju koja je cilj za imunski odgovor kao što je ćelijski imunski odgovor. Ciljne ćelije uključuju ćelije koje prezentuju antigen ili antigeni epitop, tj. peptidni fragment izveden iz antigena, i uključuju svaku nepoželjnu ćeliju kao što je kancerska ćelija. U poželjnom primeru izvođenja, ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira antigen kako je opisano u ovom tekstu i poželjno koja prezentuje pomenuti antigen u sklopu MHC klase I.
[0096] Izraz "epitop" odnosi se na antigensku determinantu u molekulu kao što je antigen, tj., na deo ili fragment molekula koji biva prepoznat imunskim sistemom, na primer koji se prepoznaje T ćelijom, posebno kada je prezentovan u kontekstu MHC molekula. Epitop proteina kao što je tumorski antigen poželjno uključuje kontinuirani ili diskontinuirani deo pomenutog proteina i poželjno je dug između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 amino-kiselina, na primer, epitop može biti dug poželjno 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 amino-kiselina. Posebno je poželjno da epitop u kontekstu predmetnih navoda bude T-ćelijski epitop.
[0097] Prema navodima, epitop može da se veže za MHC molekule kao što su MHC molekuli na površini ćelije i tako može biti "MHC-vezujući peptid" ili "antigeni peptid". Izraz "MHC-vezujući peptid" odnosi se na peptid koji se vezuje za MHC molekule klase I i/ili MHC klase II. U slučaju kompleksa MHC klase I/peptid, vezujući peptidi su tipično dugi 8-10 aminokiselina iako efikasni mogu biti i duži ili kraći peptidi. U slučaju kompleksa MHC klase I/peptid, vezujući peptidi su tipično dugi 10-25 amino-kiselina i posebno, dugi su 13-18 aminokiselina, iako efikasni mogu biti i duži i kraći peptidi.
[0098] Izrazi "epitop", "antigeni peptid", "antigeni epitop", "imunogeni peptid" i "MHC-vezujući peptid" koriste se naizmenično u ovom tekstu i poželjno se odnose na nepotpun predstavu antigena koji je poželjno sposoban da pobudi imunski odgovor protiv antigena ili ćelije koja eksprimira ili sadrži i poželjno prezentuje antigen. Poželjno, izrazi se odnose na imunogeni deo antigena. Poželjno, to je deo antigena koji biva prepoznat (tj., specifično vezan) za T-ćelijski receptor, posebno ako je prezentovan u kontekstu MHC molekula. Poželjno, takvi imunogeni delovi vezuju se za MHC molekule klase I ili klase II. Kako se koristi u ovom tekstu, za imunogeni deo se kaže da se "vezuje za" MHC molekule klase I ili klase II ako je takvo vezivanje detektabilno korišćenjem nekog u struci poznatog testa.
[0099] Kako se koristi u ovom tekstu izraz "neo-epitop" odnosi se na epitop koji nije prisutan u referenci kao što je normalna nekancerozna ćelija ili ćelija germinativne linije, ali se nalazi u kancerskim ćelijama. Ovo uključuje, posebno, situacije u kojima se odgovarajući epitop nalazi u normalnoj nekanceroznoj ćeliji ili ćeliji germinativne linije, međutim, usled jedne ili više mutacija u kancerskoj ćeliji sekvenca epitopa je izmenjena, tako da kao rezultat nastaje neoepitop.
[0100] Izraz "deo" odnosi se na frakciju. Uzimajući u obzir određenu strukturu kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein, izraz njen/njegov "deo" može označavati kontinuiranu ili diskontinuiranu frakciju pomenute strukture. Poželjno, deo aminokiselinske sekvence sadrži najmanje 1%, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjno najmanje 50%, poželjnije najmanje 60%, poželjnije najmanje 70%, još poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 90% amino-kiselina pomenute aminokiselinske sekvence. Poželjno, ako je deo predstavljen diskontinuiranom frakcijom, pomenuta diskontinuirana frakcija sačinjena je od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više delova strukture, svaki deo je kontinuirani element strukture. Na primer, diskontinuirana frakcija aminokiselinske sekvence može biti sačinjena od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više, poželjno ne više od 4 dela pomenute aminokiselinske sekvence, pri čemu svaki deo poželjno uključuje najmanje 5 kontinuiranih amino-kiselina, najmanje 10 kontinuiranih amino-kiselina, poželjno najmanje 20 kontinuiranih amino-kiselina, poželjno najmanje 30 kontinuiranih amino-kiselina aminokiselinske sekvence.
[0101] Izrazi "deo" i "fragment" koriste se naizmenično u ovom tekstu i odnose se na kontinuirane elemente. Na primer, deo strukture kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein odnose se na kontinuirani element pomenute strukture. Porcija, deo ili fragment strukture poželjno uključuju jednu ili više funkcionalnih osobina pomenute strukture. Na primer, porcija, deo ili fragment epitopa, peptida ili proteina poželjno je imunološki ekvivalentan epitopu, peptidu ili proteinu od kojeg je izveden. U kontekstu predmetnih navoda, "deo" strukture kao što je aminokiselinska sekvenca poželjno uključuje, poželjno se sastoji od najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 94%, najmanje 96%, najmanje 98%, najmanje 99% čitave strukture ili aminokiselinske sekvence.
[0102] Izraz "imunoreaktivna ćelija" u kontekstu predmetnih navoda odnosi se na ćeliju koja ispoljava efektorske funkcije tokom imunske reakcije. "Imunoreaktivna ćelija" je poželjno sposobna da se veže sa antigenom ili ćelijom koja se karakteriše prezentacijom antigena ili antigenog peptida izvedenog iz antigena i posreduje u imunskom odgovoru. Na primer, takve ćelije sekretuju citokine i/ili hemokine, sekretuju antitela, prepoznaju kancerske ćelije, i opciono eliminišu takve ćelije. Na primer, imunoreaktivne ćelije uključuju T ćelije (citotoksične T ćelije, pomažuće T ćelije, tumor-infiltrirajuće T ćelije), B ćelije, ćelije prirodne
2
ubice, neutrofile, makrofage, i dendritske ćelije. Poželjno, u kontekstu predmetnih navoda, "imunoreaktivne ćelije" su T ćelije, poželjo CD4+ i/ili CD8+ T ćelije.
[0103] Poželjno, "imunoreaktivna ćelija" prepoznaje antigen ili antigeni peptid izveden iz antigena sa nekim stepenom specifičnosti, posebno ako je prezentovan u kontekstu MHC molekula, na primer na površini antigen-prezentujućih ćelija ili obolelih ćelija kao što su kancerske ćelije. Poželjno, pomenuto prepoznavanje omogućava ćeliji da prepozna antigen ili antigeni peptid izveden iz pomenutog antigena da bi odgovorila ili bila reaktivna. Ako je ćelija pomažuća T ćelija (CD4+ T ćelija) koja nosi receptore koji prepoznaju antigen ili antigeni peptid izveden iz antigena u kontekstu MHC molekula klase II, takav odgovor ili reaktivnost mogu uključivati oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8+ limfocita (CTL) i/ili B-ćelija. Ako je ćelija CTL, takav odgovor ili reaktivnost mogu uključivati eliminaciju ćelija prezentovanih u kontekstu MHC molekula klase I, tj., ćelija koje se karakterišu prezentacijom antigena u sklopu MHC klase I, na primer, apoptozom ili lizom ćelija posredovanom perforinom. Prema navodima, CTL-odgovor može uključiti održavani fluks kalcijuma, ćelijsku deobu, proizvodnju citokina kao što su IFN-γ i TNF-α, pozitivnu regulaciju markera aktivacije kao što su CD44 i CD69, i specifično citolitičko ubijanje antigen-eksprimirajućih ciljnih ćelija. CTL odgovor može biti određen i korišćenjem arteficijalnog reportera koji pouzdano ukazuje na CTL odgovor. Takvi CTL koji prepoznaju antigen ili antigeni peptid izveden iz antigena i odgovaraju ili su reaktivni označavaju se u ovom tekstu i kao "CTL koji odgovaraju na antigen". Ako je ćelija B ćelija, takav odgovor može uključivati oslobađanje imunoglobulina.
[0104] Izrazi "T ćelija" i "T limfocit" koriste se naizmenično u ovom tekstu i uključuju T pomažuće ćelije (CD4+ T ćelije) i citotoksične T ćelije (CTL, CD8+ T ćelije) koje uključuju citolitičke T ćelije.
[0105] T ćelije pripadaju grupi belih krvnih ćelija poznatih kao limfociti, i imaju centralnu ulogu u imunitetu posredovanom ćelijama. Mogu se razlikovati od drugih tipova limfocita, kao što su B ćelije i ćelije prirodne ubice po prisustvu specijalnog receptora na svojoj površini nazvanog T-ćelijski receptor (T cell receptor). Timus je glavni organ odgovoran za maturaciju T ćelija. Otkriveno je nekoliko različitih podgrupa T ćelija, svaka sa različitom funkcijom.
[0106] T pomažuće ćelije pomažu drugim belim krvnim ćelijama u imunološkim procesima, uključujući maturaciju B ćelija u plazma ćelije i aktivaciju citotoksičnih T ćelija i makrofaga, pored ostalih funkcija. Ove ćelije su poznate i kao CD4+ T ćelije zato što na svojoj površini eksprimiraju CD4 protein. Pomažuće T ćelije se aktiviraju kada im se prezentuju peptidni antigeni u sklopu MHC molekula klase II koji se eksprimiraju na površini antigen-prezentujućih
2
ćelija (APC). Kada se aktiviraju, ubrzano se dele i sekretuju male proteine koji se nazivaju citokini, koji regulišu ili pomažu aktivnom imunskom odgovoru.
[0107] Citotoksične T ćelije uništavaju virusom inficirane ćelije i tumorske ćelije, a takođe su uključene u odbacivanje transplantata. Ove ćelije su poznate i kao CD8+ T ćelije pošto eksprimiraju na svojoj površini glikoprotein CD8. Ove ćelije prepoznaju svoje ciljeve vezivanjem za antigen udružen sa MHC klase I, prisutnim na površini skoro svake ćelije u telu.
[0108] Većina T ćelija ima T-ćelijski receptor (TCR) koji postoji kao kompleks nekoliko proteina. T-ćelijski receptor sačinjen je od dva zasebna peptidna lanca proizvedena na osnovu dva nezavisna gena za T-ćelijski receptor alfa i beta (TCRα i TCRβ), nazvana α- i β-TCR lanci. γδ T ćelije (gama delta T ćelije) predstavljaju malu podgrupu T ćelija koje poseduju poseban T-ćelijski receptor (TCR) na svojoj površini. Međutim, u γδ T ćelijama, TCR je načinjen od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T ćelija je mnogo manje česta (2% od svih T ćelija) nego αβ T ćelije.
[0109] Prvi signal u aktivaciji T ćelija obezbeđen je vezivanjem T ćelijskog receptora za kratki peptid prezentovan u sklopu glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) na drugoj ćeliji. Ovo osigurava da bude aktivirana samo T ćelija sa TCR specifičnim za taj peptid. Partnerska ćelija je obično profesionalna antigen-prezentujuća ćelija (APC), obično dendritska ćelija u slučaju naivnih odgovora, iako B ćelije i makrofagi mogu biti važne APC. Peptidi prezentovani CD8+ T ćelijama u sklopu MHC molekula klase I tipično su dugi 8-10 amino-kiselina; peptidi prezentovani CD4+ T ćelijama sklopu MHC molekula klase II tipično su duži, jer su krajevi vezujućeg žleba MHC molekula klase II otvoreni.
[0110] Prema predmetnim navodima, T ćelijski receptor je sposoban za vezivanje sa unapred određenim ciljem ukoliko on ima značajan afinitet za pomenuti unapred određeni cilj i vezuje se za pomenuti unapred određeni cilj u standardnim testovima. "Afinitet" ili "vezujući afinitet" obično je meren ravnotežnom konstantom disocijacije (KD). T-ćelijski receptor nije (suštinski) sposoban da se veže za cilj ako nema značajan afinitet za pomenuti cilj i ne vezuje se značajno za pomenuti cilj u standardnim testovima.
[0111] T-ćelijski receptor je poželjno sposoban da se veže specifično za unapred određeni cilj. T-ćelijski receptor je specifičan za unapred određeni cilj ako je sposoban za vezivanje za pomenuti unapred određeni cilj dok nije (suštinski) sposoban da se veže za druge ciljeve, tj., nema značajan afinitet za druge ciljeve i ne vezuje se značajno za druge ciljeve u standardnim testovima.
[0112] Citotoksični T limfociti mogu da se generišu in vivo inkorporisanjem antigena ili antigenog peptida u antigen-prezentujuće ćelije in vivo. Antigen ili antigeni peptid može biti u
2
vidu proteina, DNK (npr. u vektoru) ili RNK. Antigen može biti procesovan da proizvede peptidnog partnera za MHC molekul, dok njegov fragment može biti prezentovan bez potrebe za daljim procesovanjem. Ovo drugo je slučaj posebno ako je moguće vezivanje za MHC molekule. Uopšteno, moguća je primena kod pacijenta putem intradermalne injekcije. Međutim, injektiranje se može obaviti i intranodalno u limfni čvor (Maloy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303). Rezultujuće ćelije prisutne u kompleksu od interesa prepoznaju se autologim citotoksičnim T limfocitima koji se zatim propagiraju.
[0113] Specifična aktivacija CD4+ ili CD8+ T ćelija može se detektovati na različite načine. Postupci detektovanja specifične aktivacije T ćelija uključuju detektovanje proliferacije T ćelija, proizvodnje citokina (npr., limfokina), ili nastanka citolitičke aktivnosti. Za CD4+ T ćelije, poželjan postupak detektovanja specifične aktivacije predstavlja detektovanje proliferacije T ćelija. Za CD8+ T ćelije, poželjan postupak detektovanja specifične aktivacije predstavlja detektovanje nastanka citolitičke aktivnosti.
[0114] Izraz "glavni kompleks histokompatibilnosti" i skraćenica "MHC" uključuju MHC molekule klase I i MHC molekule klase II i odnose se na kompleks gena koji se nalaze kod svih vertebrata. MHC proteini ili molekuli važni su za signalizaciju između limfocita i antigenprezentujućih ćelija ili obolelih ćelija u imunskim reakcijama, pri čemu se MHC proteini ili molekuli vezuju sa peptidima i prezentuju ih za prepoznavanje T-ćelijskim receptorima. Proteini kodirani MHC eksprimiraju se na površini ćelija, i T ćelijama prikazuju i sopstvene antigene (peptidne fragmente iz samih ćelija) i nesopstvene antigene (npr., fragmente invadirajućih mikroorganizama).
[0115] MHC region je podeljen na tri podgrupe, klasu I, klasu II i klasu III. MHC proteini klase I sadrže α-lanac i β2-mikroglobulin (nije deo MHC kodiranog hromozomom 15). Oni prezentuju antigene fragmente citotoksičnim T ćelijama. Na većini ćelija imunskog sistema, specifično na antigen-prezentujućim ćelijama, MHC proteini klase II sadrže α- i β-lance i oni prezentuju antigene fragmente T-pomažućim ćelijama. MHC region klase III kodira druge imunske komponente, kao što su komponente komplementa i neki citokini.
[0116] Kod ljudi, geni u MHC regionu koji kodiraju antigen-prezentujuće proteine na ćelijskoj površini označeni su kao geni za humani leukocitni antigen (HLA geni). Međutim. skraćenica MHC se često koristi da označi HLA genske proizvode. HLA geni uključuju devet takozvanih klasičnih MHC gena: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, i HLA-DRB1.
[0117] U jednom poželjnom primeru izvođenja svih aspekata navoda MHC molekul je HLA molekul.
2
[0118] Pod "ćelija koja se karakteriše prezentovanjem antigena" ili "ćelija koja prezentuje antigen" ili sličnim izrazima, podrazumeva se ćelija kao što je obolela ćelija, npr. kancerska ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija koja prezentuje antigen koji eksprimira, ili fragment izveden iz pomenutog antigena, npr. obradom antigena, u kontekstu MHC molekula, posebno MHC molekula klase I. Slično tome, izraz "bolest koja se karakteriše prezentacijom antigena" označava bolest koja uključuje ćelije koje se karakterišu prezentacijom antigena, posebno u sklopu MHC klase I. Ćelija može prezentovati antigen tako što se izvrši transfektovanje ćelije nukleinskom kiselinom, npr. RNK, koja kodira antigen.
[0119] Pod "fragment antigena koji se prezentuje" ili sličnim izrazima označava se da fragment može biti prezentovan u sklopu MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I, npr., kada se direktno doda antigen-prezentujućim ćelijama. U jednom primeru izvođenja, fragment je fragment koji se prirodno prezentuje ćelijama koje eksprimiraju antigen.
[0120] Izraz "imunološki ekvivalentan" znači da imunološki ekvivalentan molekul kao što je imunološki ekvivalentna aminokiselinska sekvenca, ispoljava iste ili suštinski iste imunološke osobine i/ili ispoljava iste ili suštinski iste imunološke efekte, npr., u pogledu tipa imunološkog efekta kao što je indukcija humoralnog i/ili ćelijskog imunskog odgovora, snage i/ili dužine trajanja indukovane imunske reakcije, ili specifičnosti indukovane imunske reakcije. U kontekstu predmetnih navoda, izraz "imunološki ekvivalentan" poželjno se koristi u vezi sa imunološkim efektima ili osobinama peptida upotrebljenog za imunizaciju. Na primer, aminokiselinska sekvenca je imunološki ekvivalentna referentnoj aminokiselinskoj sekvenci ako pomenuta aminokiselinska sekvenca, kada se izloži imunskom sistemu subjekta, indukuje imunsku reakciju sa specifičnošću reagovanja sa referentnom aminokiselinskom sekvencom.
[0121] Izraz "imunske efektorske funkcije" u kontekstu predmetnih navoda uključuje sve funkcije posredovane komponentama imunskog sistema koje za rezultat imaju, na primer, ubijanje tumorskih ćelija, ili inhibiciju rasta tumora i/ili inhibiciju razvoja tumora, uključujući inhibiciju diseminacije i metastaziranja tumora. Poželjno, imunske efektorske funkcije u kontekstu predmetnih navoda su efektorske funkcije posredovane T ćelijama. Takve funkcije uključuju, u slučaju pomažućih T ćelija (CD4+ T ćelije), prepoznavanje antigena ili antigenog peptida izvedneog iz antigena u kontekstu MHC molekula klase II T-ćelijskim receptorima, oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8+ limfocita (CTL) i/ili B-ćelija, i u slučaju CTL, prepoznavanje antigena ili antigenog peptida izvedenog iz antigena u kontekstu MHC molekula klase I T-ćelijskim receptorima, eliminaciju ćelija koje vrše prezentovanje u kontekstu MHC molekula klase I, tj., ćelija koje se karakterišu prezentovanjem antigena u sklopu MHC klase I, na primer, apoptozom ili ćelijskom lizom posredovanom perforinom, proizvodnjom citokina
2
kao što su IFN-γ i TNF-α, i specifičnim citolitičkim ubijanjem antigen-eksprimirajućih ciljnih ćelija.
[0122] Izraz "genom" odnosi se na ukupnu količinu genetičke informacije u hromozomima organizma ili ćelije. Izraz "egzom" odnosi se na kodirajuće regione genoma. Izraz "transkriptom" odnosi se na set svih RNK molekula.
"Nukleinska kiselina" je, prema navodima, poželjno deoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselna (RNK), poželjnije RNK, najpoželjnije in vitro transkribovana RNK (IVT RNK) ili sintetska RNK. Prema navodima, nukleinske kiseline uključuju genomsku DNK, cDNK, mRNK, rekombinantno proizvedene i hemijski sintetisane molekule. Prema navodima, nukleinska kiselina može biti prisutna u vidu jednolančanog ili dvolančanog i linearnog ili kovalentno cirkularno zatvorenog molekula. Prema navodima, nukleinska kiselina može biti izolovana. Izraz "izolovana nukleinska kiselina" znači, prema navodima, da je nukleinska kiselina (i) amplifikovana in vitro, na primer lančanom reakcijom polimeraze (polymerase chain reaction, PCR), (ii) proizvedena rekombinantno kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer, sečenjem i razdvajanjem elektroforezom na gelu, ili (iv) sintetisana, na primer, hemijskom sintezom. Nukleinska kiselina se može upotrebiti za introdukovanje tj., transfekciju ćelija, posebno u formi RNK koja se može pripremiti in vitro transkripcijom od DNK templata. Pored toga, RNK može da se pre primene modifikuje stabilisanjem sekvenci, dodavanjem "capping"-grupe i poliadenilacijom.
[0123] Izraz "genetički materijal" odnosi se na izolovanu nukleinsku kiselinu, bilo da je DNK ili RNK, deo dvostrukog heliksa, deo hromozoma, ili čitav genom organizma ili ćelije, posebno egzom ili transkriptom.
[0124] Izraz "mutacija" odnosi se na promenu ili razliku u sekvenci nukleinske kiseline (supstitucija, adicija ili delecija nukleotida) u poređenju sa referentnom sekvencom. "Somatska mutacija" može da se sretne u bilo kojoj od telesnih ćelija izuzev germinativnih ćelija (spermatozoidu i jajnoj ćeliji) i prema tome ne prenosi se na potomstvo. Ove promene mogu (ali ne moraju) biti uzrok kancera ili drugih oboljenja. Poželjno, mutacija je nesinonimna mutacija. Izraz "nesinonimna mutacija" odnosi se na mutaciju, poželjno supstitucija nukleotida, koja za rezultat ima promenu amino-kiseline na primer aminokiselinsku supstituciju u proizvodu translacije.
[0125] U skladu sa navodima, izraz "mutacija" uključuje tačkaste mutacije, indele, fuzije, hromotripsis i editovanje RNK.
[0126] Prema navodima, izraz "indel" opisuje specijalnu klasu mutacija, definisanih kao mutacije koje za rezultat imaju kolokalizovanu inserciju i deleciju i ukupni dobitak ili gubitak nukleotida. U kodirajućim regionima genoma, osim ako dužina indela nije umnožak broja 3, one proizvode "frameshift"-mutaciju (pomak u ramu čitanja). Indeli se razlikuju od tačkastih mutacija; dok indel insertuje i uklanja nukeotide iz sekvence, tačkasta mutacija je forma supstitucije koja vrši promenu jednog od nukleotida.
[0127] Fuzijama se mogu stvoriti hibridni geni koji se formiraju od dva ranije odvojena gena. Mogu se sresti kao rezultat translokacije, intersticijalne delecije, ili hromozomske inverzije. Često, fuzioni geni su onkogeni. Onkogeni fuzioni geni mogu dati genski proizvod sa novom ili izmenjenom funkcijom u odnosu na dva fuziona partnera. Alternativno, protoonkogen se fuzioniše sa jakim promotorom, na taj način se aktivira onkogena funkcija usled pozitivne regulacije prouzrokovane jakim promotorom ushodnog fuzionog partnera. Onkogeni fuzioni transkripti mogu biti rezultat i trans-splajsovanja ili "read-through" događaj (transkripcija se ne završava na terminacionoj sekvenci).
[0128] U skladu sa navodima, izraz "hromotripsis" odnosi se na genetički fenomen kojim se u okviru jednog štetnog događaja specifični regioni genoma prekidaju, a zatim povezuju.
[0129] U skladu sa navodima, izraz "proizvod RNK editovanja" ili "RNK editovanje" odnosi se na molekulske procese u kojima se informacioni sadržaj u RNK molekulu menja kroz hemijske promene u sastavu baza. Editovanje RNK uključuje modifikacije nukleozida kao što su deaminacija citidina (C) u uridin (U) i adenozina (A) u inozin (I), kao i netemplatne adicije i insercije nukleotida. Editovanje RNK u mRNK efikasno menja aminokiselinsku sekvencu kodiranog proteina tako da se on razlikuje od onog koji je predviđen genomskom sekvencom DNK.
[0130] Izraz "kancerska mutaciona signatura" odnosi se na set mutacija koje su prisutne u kancerskim ćelijama kada se izvrši upoređivanje sa nekancerskim referentnim ćelijama.
[0131] U skladu sa navodima, izraz "referenca" može se koristiti za korelisanje i upoređivanje rezultata dobijenih iz uzorka tumora, primenom postupka prema navodima. Tipično, "referenca" se može dobiti na osnovu jednog ili više normalanih uzoraka, tačnije uzoraka koji nisu uzorci kancera, a koji su dobijeni ili od pacijenta ili od jedne ili više različitih jedinki, poželjno zdravih jedinki, naročito jedinki iste vrste. "Referenca" se može odrediti empirijski, testiranjem dovoljno velikog broja normalnih uzoraka.
[0132] U skladu sa navodima, može se koristiti svaki pogodan postupak sekvenciranja. Poželjne su tehnologije sekvenciranja sledeće generacije (NGS). Postupci sekvenciranja treće generacije (third generation sequencing methods) mogu u budućnosti zameniti NGS tehnologiju, kako bi se ubrzao sekvencirajući korak postupka. Radi razjašnjenja: izrazi "sekvenciranje sledeće generacije" ili "NGS", u kontekstu predmetnih navoda, označavaju sve nove visokopropusne
1
tehnologije sekvenciranja koje, suprotno "konvencionalnoj" metodologiji sekvenciranja poznatoj kao Sangerova hemija, čitaju template nukleinske kiseline nasumice paralelno duž čitavog genoma sečenjem čitavog genoma u male delove. Takve NGS tehnologije (poznate i kao tehnologije masivnog paralelnog sekvenciranja) mogu da pruže obaveštenje o sekvenci nukleinske kiseline celog genoma, egzoma, transkriptoma (sve transkribujuće sekvence genoma) ili metiloma (sve metilisane sekvence genoma), u veoma kratkim vremenskim periodima, npr. u roku od 1-2 nedelje, poželjno u roku od 1-7 dana ili najpoželjnije za manje od 24 sata, i omogućavaju, u principu, pristup koji podrazumeva sekvenciranje pojedinačnih ćelija. Veći broj komercijalno dostupnih ili u literaturi pomenutih NGS platformi moguće je koristiti u kontekstu predmetnih navoda pronalaska npr. one koje su detaljno opisane u Zhang et al.2011: The impact of next-generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38 (3), 95-109; ili u Voelkerding et al. 2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641-658. Neograničavajući primeri takvih NGS tehnologija/platformi su
1) Tehnologija sekvenciranja sintezom, poznata kao pirosekvenciranje, implementirana npr., u GS-FLX 454 Genome Sequencer™, Roche pridružena kompanije 454 Life Sciences (Branford, Connecticut), prvi put opisano u Ronaghi et al.1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363-365. U ovoj tehnologiji koristi se emulziona PCR u kojoj se perlice koje vezuju jednolančanu DNK inkapsuliraju snažnim vorteksovanjem u vodeni rastvor micela koje sadrže PCR reaktante okružene uljem, za obavljanje emulzione PCR amplifikacije. Tokom procesa pirosekvenciranja, registruje se svetlost emitovana sa fosfatnih molekula tokom inkorporacije nukleotida, tokom sinteze DNK lanca polimerazom.
2) Pristup sekvenciranja sintezom, koji je razvio Solex (sada deo Illumina Inc., San Diego, California), baziran je na reverzibilnim terminatorima obeleženim bojom, a implementiran je npr., u Illumina/Solexa Genome Analyzer™ i u Illumina HiSeq 2000 Genome Analyzer™. U ovoj tehnologiji, sva četiri nukleotida dodaju se simultano u oligo-prajmovane klasterske fragmente u kanalima protočnih ćelija, zajedno sa DNK polimerazom. Amplifikacijom putem mosta produžavaju se klasterski lanci dodavanjem sva četiri fluorescentno obeležena nukleotida za sekvenciranje.
3) Pristup sekvenciranja ligacijom, implementiran je npr., u SOLid™ platformi, Applied Biosystems (sada Life Technologies Corporation, Carlsbad, California). U ovoj tehnologiji, pul svih mogućih oligonukleotida fiksirane dužine obeleži se prema poziciji
2
u sekvenci. Oligonukleotidi se hibridizuju i vrši se ligacija; preferencijalna ligacija DNK-ligazom za sekvence koje se uklapaju rezultuje signalom koji obaveštava o nukleotidu na toj poziciji. Pre sekvenciranja, DNK se amplifikuje emulzionom PCR. Dobijene perlice, od kojih svaka sadrži samo kopije istog DNK molekula, deponuju se na staklenoj pločici. Kao drugi primer, Polonator™ G.007 platforma, Dover Systems (Salem, New Hampshire) takođe koristi pristup sekvenciranja ligacijom korišćenjem emulzione PCR na mikročipovima baziranim na perlicama, za nasumičnu amplifikaciju fragmenata DNK za paralelno sekvenciranje.
4) Tehnike sekvenciranja pojedinačnih molekula kao što su npr., one koje su implementirane u PacBio RS sistemu, Pacific Biosciences (Menlo Park, California) ili u HeliScope™ platformi, Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts). Posebna karakteristika ove tehnologije je njena sposobnost da sekvencira pojedinačne molekule DNK ili RNK, bez amplifikacije, što se definiše kao sekvenciranje pojedinačnih molekula DNK u realnom vremenu (single-molecule real time, SMRT). Na primer, HeliScope koristi visoko senzitivni fluorescentni detekcioni sistem za direktno detektovanje svakog nukleotida, kako se sintetiše. Sličan pristup baziran na transferu fluorescentne rezonantne energije (fluorescence resonance energy transfer, FRET) razvili su Visigen Biotechnology (Houston, Texas). Druge tehnike pojedinačnih molekula bazirane na fluorescenciji obezbeđene su od strane U.S. Genomics (GeneEngine™) i Genovoxx (AnyGene™).
5) Nanotehnologije za sekvenciranje pojedinačnih molekula, u kojima se koriste različite nanostrukture koje su npr., aranžirane na čipu, za praćenje kretanja molekula polimeraze na jednom lancu tokom replikacije. Neograničavajući primeri pristupa baziranog na nanotehnologijama su GridON™ platforma, Oxford Nanopore Technologies (Oxford, UK), platforme za sekvenciranje nanoporama potpomognuto hibridizacijom (hybridization-assisted nano-pore sequencing, HANS™) koje su razvili Nabsys (Providence, Rhode Island), i vlasnička platforma bazirana na ligazi za sekvenciranje DNK tehnologijom DNK nanoloptica (DNA nanoball, DNB), nazvana kombinatorna ligacija sa ukotljavanjem probe (combinatorial probe-anchor ligation, cPAL™).
6) Tehnologije bazirane na elektronskoj mikroskopiji, za sekvenciranje pojedinačnih molekula, na primer one koje su razvili LightSpeed Genomics (Sunnyvale, California) i Halcyon Molecular (Redwood City, California)
7) Sekvenciranje uz detekciju jona vodonika senzorom na bazi poluprovodnika, koje se zasniva na detekciji vodonikovih jona oslobođenih tokom polimerizacije DNK. Na primer, Ion Torrent Systems (San Francisco, California) koristi čip visoke gustine sa mikro-mašinskim bunarčićima za izvođenje ovog biohemijskog procesa na masivan paralelan način. Svaki bunarčić sadrži drugačiji DNK templat. Ispod bunarčića je jonosenzitivni sloj, a ispod njega vlasnički jonski senzor.
[0133] Poželjno, kao polazni materijal za NGS služe DNK i RNK preparati. Takve nukleinske kiseline mogu lako da se dobiju iz uzoraka kao što je biološki materijal, npr., iz svežih, brzo smrznutih ili u formalinu fiksiranih i u parafinu ukalupljenih (formalin-fixed paraffin embedded, FFPE) tumorskih tkiva ili iz sveže izolovanih ćelija ili iz CTC prisutnih u perifernoj krvi pacijenata. Normalna nemutirana genomska DNK ili RNK mogu se ekstrahovati iz normalnog telesnog tkiva, međutim, u kontekstu predmetnih navoda poželjne su ćelije germinativne linije. DNK ili RNK germinativne linije ekstrahuje se iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) pacijenata sa nehematološkim malignitetima. Iako su nukleinske kiseline ekstrahovane iz FFPE tkiva ili iz sveže izolovanih pojedinačnih ćelija visoko fragmentisane, pogodne su za primenu u NGS.
[0134] U literaturi je opisano nekoliko ciljanih postupaka NGS za sekvenciranje egzoma (za pregled vidi npr. Teer and Mullikin 2010: Human Mol Genet 19 (2), R145-51), koje se sve mogu koristiti sa predmetnim navodima. U mnogim od ovih postupaka (opisanih kao npr. imobilisanje genoma, deljenje genoma, obogaćivanje genoma itd.) koriste se tehnike hibridizacije i uključuju na čipovima bazirane (npr. Hodges et al.2007: Nat. Genet.39, 1522-1527) i na tečnosti bazirane (npr. Choi et al. 2009: Proc. Natl. Acad. Sci USA 106, 19096-19101) hibridizacione pristupe. Na raspolaganju su i komercijalni kitovi za pripremanje uzoraka DNK i zatim imobilisanja egzoma: na primer, Illumina Inc. (San Diego, California) nudi TruSeq™ DNA Sample Preparation Kit i TruSeq™ Exome Enrichment Kit.
[0135] Da bi se smanjio broj lažno pozitivnih nalaza prilikom detekcije kancer-specifičnih somatskih mutacija ili razlika u sekvenci, kada se upoređuje npr. sekvenca tumorskog uzorka sa sekvencom referentnog uzorka kao što je sekvenca uzorka germinativne linije, poželjno je odrediti sekvencu u replikatima jednog ili oba ova tipa uzorka. Prema tome, poželjno je da se sekvenca referentnog uzorka, na primer sekvenca uzorka germinativne linije, determiniše dva puta, tri puta ili više puta. Alternativno ili dodatno, sekvenca tumorskog uzorka determiniše se dva puta, tri puta ili više puta. Isto tako, moguće je odrediti sekvencu referentnog uzorka kao što je sekvenca uzorka germinativne linije i/ili sekvencu tumorskog uzorka više od jedanput,
4
određivanjem najmanje jedanput sekvence u genomskoj DNK i određivanjem najmanje jedanput sekvence u RNK pomenutog referentnog uzorka i/ili pomenutog tumorskog uzorka. Na primer, određivanjem varijacija između replikata referentnog uzorka kao što je uzorak germinativne linije, može se proceniti očekivana stopa lažno pozitivnih (FDR) somatskih mutacija kao statistički kvantitet. Tehnički ponovci uzorka trebalo bi da daju identične rezultate i svaka detektovana mutacija u ovom "poređenju isto vs. isto" je lažno pozitivna. Posebno, da bi se odredila stopa lažnog otkrivanja za detekciju somatske mutacije u uzorku tumora u odnosu na referentni uzorak, tehnički ponovak referentnog uzorka može se koristiti kao referentan za procenu broja lažno pozitivnih rezultata. Pored toga, različita metrika u vezi sa kvalitetom (npr., pokrivenost ili SNP kvalitet) mogu da se kombinuju u jedan skor kvaliteta korišćenjem pristupa mašinskog učenja. Za datu somatsku varijaciju, mogu se brojati sve druge varijacije sa prekoračenjem skora kvaliteta, što dopušta rangiranje svih varijacija u setu podataka.
[0136] U skladu sa navodima, može se primeniti visokopropusni postupak genotipizacije celog genoma jedne ćelije.
[0137] U jednom primeru izvođenja visokopropusnog postupka genotipizacije celog genoma pojedinačnih ćelijae može se koristiti Fluidigm platforma. Taj pristup može uključivati sledeće korake:
1. Uzorkovanje tumorskog tkiva/ćelija i zdravog tkiva iz datog pacijenta.
2. Genetički materijal se ekstrahuje iz kanceroznih i zdravih ćelija i zatim se njihov egzom (DNK) sekvencira korišćenjem standardnih protokola sekvenciranja sledeće generacije (NGS). Pokrivenost NGS je takva da heterozigotni aleli sa frekvencijom od najmanje 5% mogu da se detektuju. Transkriptom (RNK) se takođe ekstrahuje iz kancerskih ćelija, konvertuje u cDNK i sekvencira, da bi se odredilo koji se geni eksprimiraju u kancerskim ćelijama.
3. Nesinonimne eksprimirane jednonukleotidne varijacije (single nucleotide variations, SNV) identifikovane su i opisane u ovom tekstu. Mesta koja su SNP u zdravom tkivu se isfiltriraju.
4. N=96 mutacija iz (3) se selektuju, obuhvatajući različite frekvencije. Testovi SNP genotipizacije bazirani na detekciji fluorescencije dizajnirani su i sintetisani za ove mutacije (primeri takvih testova uključuju: TaqMan bazirane SNP testove, Life Technologies ili SNPtype testove, Fluidigm). Testovi će uključiti prajmere za amplifikaciju specifičnog cilja (specific target amplification, STA), za amplifikovanje amplikona koji sadrže datu SNV (ovo je standard u TaqMan i SNPtype testovima).
5. Pojedinačne ćelije će biti izolovane iz tumora i iz zdravog tkiva laserskom mikrodisekcijom (laser microdissection, LMD) ili disagregacijom u suspenziju pojedinačnih ćelija, što je praćeno sortiranjem, kako je ranije opisano (Dalerba P. et al. (2011) Nature Biotechnology 29: 1120-1127). Ćelije se mogu odabrati bez prethodne selekcije (tj., nepristrasno), ili alternativno, može se vršiti obogaćivanje kancerskim ćelijama. Postupci obogaćivanja uključuju: specifično bojenje, sortiranje po veličini ćelije, histološku inspekciju prilikom LMD, i tako dalje.
6. Pojedinačne ćelije će biti izolovane u epruvetama za PCR koje sadrže mastermešavinu sa STA prajmerima i amplifikovaće se amplikoni koji sadrže SNV. Alternativno, genom jedne ćelije će se amplifikovati putem amplifikacije celog genoma (whole genome amplification, WGA), kako je ranije opisano (Frumkin D. et al. (2008) Cancer Research 68: 5924). Liza ćelija postići će se ili korakom zagrevanja na 95°C ili korišćenjem litičkog pufera.
7. STA amplifikovani uzorci razblažuju se i nanose na Fluidigm genotipizirajući čip.
8. Uzorci uzeti iz zdravog tkiva koristiće se kao pozitivne kontrole za određivanje homozigotnih alelskih klastera (bez mutacije). Pošto NGS podaci ukazuju da su homozigotne mutacije izuzetno retke, očekuju se tipično samo dva klastera: XX i XY, gde je X=zdrav.
9. Broj čipova koji se mogu iskoristiti nije ograničen, što omogućava da se testira praktično do ∼1000 pojedinačnih ćelija (∼10 čipova). Ako se izvodi na 384-pločama, priprema uzoraka može da se skrati na nekoliko dana.
10. Zatim se određuju SNV za svaku ćeliju.
[0138] U sledećem primeru izvođenja visokopropusnog postupka genotipizacije celog genoma pojedinačne ćelije može se koristiti NGS platforma. Taj pristup može uključivati sledeće korake:
1. Koraci od 1 do 6, gore, su identični što N (broj testiranih SNV) može biti mnogo veći od 96. U slučaju WGA, nekoliko ciklusa STA će se obaviti kasnije. STA prajmeri će sadržati dve univerzalne markerske sekvence na svakom prajmeru.
2. Posle STA, barkod-prajmeri će se amplifikovati korišćenjem PCR u amplikone. Barkod-prajmeri sadrže jedinstvene barkod-sekvence i gornje univerzalne markerske sekvence. Svaka ćelija će tako sadržati jedinstveni barkod.
3. Amplikoni iz svih ćelija će se pomešati i sekvencirati pomoću NGS. Praktično ograničenje u vezi sa brojem ćelija koje mogu biti multipleksirane je broj ploča koje se mogu pripremiti. Pošto uzorci mogu da se pripreme na 384-pločama, praktični limit bi bio ∼5000 ćelija.
4. Na bazi podataka o sekvenci detektuju se SNV (ili druge strukturne anomalije) pojedinačnih ćelija.
[0139] U skladu sa navodima, za prioritizaciju antigena može se koristiti filogenetska rekonstrukcija tumora bazirana na genotipizaciji pojedinačne ćelije ("filogenetska prioritizacija antigena"). Pored prioritizacije antigena bazirane na kriterijumima kao što su ekspresija, tip mutacije (nesinonimna prema drugim), MHC-vezujuće karakteristike i slično, može se koristiti dodatna dimenzija prioritizacije dizajnirana radi prevazilaženja intra- i intertumorske heterogenosti, a ciljana biopsija se može koristiti kako je opisano na primer u nastavku ovog teksta.
1. Identifikovanje najzastupljenijih antigena
[0140] Frekvencija svake SNV može se pouzdano proceniti na osnovu gore opisanog testa pojedinačnih ćelija, zajedno sa visokopropusnim postupkom genotipizacije celog genoma pojedinačnih ćelija i mogu se selektovati najzastupljenije prisutne SNV kako bi se obezbedile individualizovane vakcine protiv kancera (individualized vaccines for cancer, IVAC).
2. Identifikovanje primarnih bazalnih antigena na osnovu analize "ukorenjenog stabla" (rooted tree analysis)
[0141] NGS podaci iz tumora sugerušu da su homozigotne mutacije (pogoci u oba alela) retki događaji. Prema tome, nema potrebe da se vrši haplotipizacija, a filogenetsko stablo tumorskih somatskih mutacija može se kreirati na osnovu SNV seta podataka pojedinačnih ćelija. Sekvenca germinativne linije iskoristiće se za ukorenjivanje stabla. Korišćenjem algoritama za reprodukovanje predačkih sekvenci, reprodukovaće se sekvence čvorova u blizini korena stabla. Ove sekvence sadrže mutacije za koje je predviđeno da su najranije postojale u primarnom tumoru (definisane ovde kao primarne bazalne mutacije/antigeni). Zbog niske verovatnoće da će se dve mutacije sresti na istim alelima na istoj poziciji u genomu, pretpostavlja se da će mutacije u predačkim sekvencama biti fiksirane u tumoru.
[0142] Prioritizacija primarnih bazalnih antigena nije ekvivalentna prioritizaciji nejčešćih mutacija u uzorku dobijenom biopsijom (iako se očekuje da su primarne bazalne mutacije među najčešćim u uzorku dobijenom biopsijom). Razlog je sledeći: recimo, dve SNV prisutne su u svim ćelijama poreklom iz uzorka dobijenog biopsijom (i tako imaju istu frekvenciju - 100%), ali jedna mutacija je bazalna, a druga nije, u tom slučaju bi bazalna mutacija trebalo da se selektuje za IVAC. Ovo je zbog toga što je verovatno da je bazalna mutacija prisutna u svim regionima tumora, dok druga mutacija može biti novija mutacija koja je slučajno bila fiksirana u regionu odakle je uzorak uzet biopsijom. Pored toga, verovatno je da bazalni antigeni postoje u metastatskim tumorima izvedenim iz primarnog tumora. Prema tome, prioritizovanjem bazalnih antigena za IVAC u velikoj meri se može povećati šansa da će IVAC biti sposobna da iskoreni čitav tumor, a ne samo deo tumora.
[0143] Ako postoje sekundarni tumori i ako su i oni uzorkovani uzorkovani, moguće je proceniti evoluciono stablo svih tumora. Ovo može poboljšati robusnost stabla i omogućiti detektovanje mutacija koje su bazalne za sve tumore.
3. Identifikovanje antigena koji maksimalno prožimaju tumor(e)
[0144] Drugi pristup za dobijanje antigena koji maksimalno pokrivaju sva tumorska mesta je uzimanje biopsijom nekoliko uzoraka iz tumora. Jedna strategija bila bi odabrati antigene čije je prisustvo identifikovano NGS analizom u svim uzorcima dobijenim biopsijam. Da bi se poboljšali izgledi za identifikovanje bazalnih mutacija, može se izvesti filogenetska analiza zasnovana na mutacijama pojedinačnih ćelija iz svih uzoraka dobijenih biopsijom.
[0145] U slučaju metastaze, biopsijom se mogu dobiti uzorci iz svih tumora i mutacije za koje se pomoću NGS ustanovi da su zajedničke za sve tumore, mogu se selektovati.
4. Korišćenje CTC za prioritizaciju antigena koji inhibiraju metastaze
[0146] Veruje se da metastatski tumori vode poreklo od pojedinačnih ćelija. Prema tome, genotipizacijom pojedinačnih ćelija ekstrahovanih iz različitih tumora datog pacijenta, zajedno sa genotipizacijom pacijentovih cirkulišućih tumorskih ćelija (CTC), moguće je rekonstruisati evolucionu istoriju kancera. Očekuje se da uoči matastatski tumor koji se razvio od originalnog tumora, preko klade CTC poreklom iz primarnog tumora.
[0147] U tekstu koji sledi (nepristrasni postupak za identifikovanje, brojanje i genetičko ispitivanje CTC) opisujemo nastavak gore opisanog visokopropusnog postupka genotipizacije celog genoma pojedinačnih ćelija za nepristrasnu izolaciju i genomsku analizu CTC. Korišćenjem gore opisane analize, moguće je rekonstruisati filogenetsko stablo osnovnog tumora, CTC i sekundarnih tumora nastalih od metastaza (ako postoje). Na osnovu ovog stabla, moguće je identifikovati mutacije (prateće ili vodeće) koje se sreću u vreme ili blisko posle prvog odvajanja CTC od primarnog tumora. Očekuje se da su genomi CTC nastalih od primarnog tumora evolutivno sličniji genomima primarnog tumora nego genomima sekundarnih tumora. Pored toga, očekuje se da će genomi CTC nastalih od primarnog tumora sadržati jedinstvene mutacije koje su fiksirane u sekundarnim tumorima, ili koje će verovatno biti fiksirane u sekundarnim tumorima koji će se formirati u budućnosti. Ove jedinstvene mutacije mogu biti prioritizovane za IVAC da bi ciljale (ili prevenirale) metastaze.
[0148] Prednost prioritizacije CTC mutacija u odnosu na primarne bazalne mutacije je ta da antigeni izvedeni iz CTC mogu specifično mobilisati T ćelije da ciljaju metastaze, i da će one prema tome predstavljati ogranak nezavisan od T ćelija koje ciljaju primarni tumor (koristeći različite antigene). Pored toga, ako ima malo (ili ako nema) sekundarnih tumora, onda se očekuje da je šansa za izbegavanje imunskog odgovora na CTC-izvedeni antigene niža jer bi verovatnoću "spasavanja" tumora trebalo meriti brojem kancerskih ćelija koje nose dati antigen.
5. Identifikovanje antigena koji se zajedno javljaju na istoj ćeliji ("koktel" IVAC)
[0149] Veruje se da tumor evoluira kako bi suprimirao mutacije usled selekcionog pritiska imunskog sistema i terapije. Vakcine protiv kancera usmerene ka većem broju antigena koji se zajedno javljaju na istoj ćeliji i koji su takođe česti u tumoru, imaju veću šansu da nadvladaju mehanizme "spasavanja" tumora i tako smanje izglede za relaps. Takve "koktel-vakcine" bile bi analogne antiretrovirusnoj kombinacionoj terapiji za HIV+ pacijente. Mutacije koje se zajedno javljaju mogu se identifikovati filogenetskom analizom ili razmatranjem SNV poravnavanja svih ćelija.
[0150] Pored toga, u skladu sa navodima, može se koristiti nepristrasni postupak za identifikovanje, brojanje i genetičko ispitivanje CTC. Taj pristup može uključivati sledeće korake:
1. Dobiti uzorke tumora biopsijom i odrediti atlas somatskih mutacija.
2.
Opcija 1: Odabrati N≥96 mutacija za dalje ispitivanje, na osnovu ranije uspostavljenih šema prioritizacije.
Opcija 2: Izvesti test na pojedinačnim ćelijama (vidi gore opisani visokopropusni postupak genotipizacije celog genoma pojedinačnih ćelija) praćen filogenetskom analizom za selektovanje N≥96 primarnih bazalnih mutacija i moguće više nedavnih mutacija, kako bi se maksimizirao diverzitet. Ranije mutacije su korisne za identifikovanje CTC (vidi u nastavku), a kasnije za generisanje filogenetske analize (vidi odeljak "Identifikovanje antigena koji se zajedno javljaju na istoj ćeliji ('koktel' IVAC)").
3. Dobiti celu krv od pacijenta obolelog od kancera
4. Lizirati crvena krvna zrnca
5. Ukloniti bela krvna zrnca odstranjivanjem CD45+ ćelija (npr., sortiranjem, magnetnim perlicama konjugovanim za anti-CD45 antitelo itd.) da bi se dobio proizvod obogaćen CTC.
6. Ukloniti slobodnu DNK digestijom DNKazom. Slobodna DNK može poreklom biti DNK prisutna u krvi ili DNK iz mrtvih ćelija.
7. Sortirati preostale ćelije u epruvete za PCR, izvesti STA (na osnovu odabranih mutacija) i skrining na Fluidigm (gore opisani visokopropusni postupak genotipizacije celog genoma pojedinačnih ćelija). CTC bi trebalo uopšteno da budu pozitivne za veći broj SNV.
8. Ćelije identifikovane kao kancerske (=CTC) mogu se zatim dodatno analizirati filogenetski na osnovu panela pretraženih SNV (vidi odeljak odeljak "Identifikovanje antigena koji se zajedno javljaju na istoj ćeliji ('koktel' IVAC)").
[0151] Isto tako, moguće je ovaj postupak kombinovati sa ranije utvrđenim postupcima za izolovane CTC. Na primer, moguće je sortirati EpCAM+ ćelije, ili ćelije pozitivne na citokeratine (Rao CG. et al. (2005) International journal of oncology 27: 49; Allard WJ. et al. (2004) Clinical Cancer Research 10: 6897-6904). Ove pretpostavljene CTC mogu zatim da se verifikuju/profilišu na Fluidigm/NGS da bi se izvele njihove mutacije.
[0152] Ovaj postupak može da se upotrebi za brojanje CTC. Pošto postupak ne počiva na jednom određenom markeru koji može, ali ne mora da se eksprimira u kancerskim ćelijama, nego na mutacionom profilu kancerskih somatskih mutacija jedinstvenih za pacijenta, ovo je nepristrasni postupak detektovanja i nabrajanja CTC.
[0153] U skladu sa navodima, može se upotrebiti pristup koji uključuje filogenetsku rekonstrukciju tumora zasnovanu na genotipizaciji pojedinačnih ćelija da bi se dobilo obogaćenje vodećim mutacijama ("filogenetsko filtriranje").
[0154] U jednom primeru izvođenja ovog pristupa, obavlja se pan-tumorska filogenetska analiza za dobijanje vodećih mutacija. Na primer, mogu se detektovati vodeće mutacije od n=1 tumora. U gornjem odeljku "Identifikovanje primarnih bazalnih antigena na osnovu analize
4
"ukorenjenog stabla", opisujemo postupak dobijanja predačkih sekvenci i/ili identifikovanje ćelija koje imaju sekvence bliske korenu stabla. Očekuje se da broj mutacija u ovim sekvencama bude značajno manji od broja mutacija u osnovnom uzorku kancera jer su po definiciji ove sekvence bliske korenu stabla. Stoga, selektovanjem sekvenci koje su bliske korenu stabla, očekuje se da mnoge prateće mutacije budu "filogenetski filtrirane". Ovaj postupak ima potencijal da obezbedi obogaćenje vodećim mutacijama. Vodeće mutacije mogu zatim da se koriste za identifikovanje/selektovanje tretmana za pacijenta ili mogu da se koriste kao predvodnici novih terapija.
U sledećem primeru, mogu se detektovati vodeće mutacije iz n>1 tumora datog tipa.
[0155] Rekonstruisanjem primarnih bazalnih mutacija iz mnogih tumora određenog tipa moguće je u velikoj meri povećati izglede za detektovanje vodećih mutacija. Pošto bazalne sekvence blizu korena stabla filtriraju mnoge prateće mutacije, očekuje se da odnos signala prema šumu u detektovanju vodećih mutacija u velikoj meri raste. Prema tome, ovaj postupak ima potencijal da detektuje (1) manje frekventne vodeće mutacije (2) frekventne vodeće mutacije iz manje uzoraka.
[0156] U sledećem primeru izvođenja pristupa koji uključuje filogenetsku rekonstrukciju tumora zasnovanu na genotipizaciji pojedinačnih ćelija, za obogaćivanje vodećim mutacijama ("filogenetsko filtriranje"), obavljena je filogenetska analiza vodećih mutacija koje prouzrokuju metastaze.
U gornjem odeljku "Korišćenje CTC za prioritizaciju antigena koji inhibiraju metastaze" opisali smo postupak za detektovanje CTC-asociranih mutacija. Ovaj postupak može da se koristi i za obogaćivanje vodećim mutacijama koje dovode do metastaza. Na primer, mapiranjem kombinovane filogenije primarnog tumora, sekundarnih tumora i CTC, CTC poreklom iz primarnog tumora trebalo bi da spoje klade primarnih i sekundarnih tumora. Takva filogenetska analiza može da pomogne u preciziranju mutacija jedinstvenih za ovu tranziciju između osnovnog i sekundarnih tumora. Frakcija ovih mutacija mogu biti vodeće mutacije. Pored toga, upoređivanjem jedinstvenih CTC mutacija iz različitih slučajeva istih kancera (i.e., n>1 tumora), moguće je postići dodatno obogaćivanje jedinstvenim vodećim mutacijama koje prouzrokuju metastaze.
[0157] Prema navodima, filogenetska analiza se može koristiti za identifikovanje primarnog u odnosu na sekundarne tumore. U slučaju metastaza, ako su uzorkovani svi tumori, ukorenjeno stablo može da se koristi za predikciju vremenskog redosleda pojave tumora: koji tumor je primarni tumor (čvorovi najbliži korenu stabla), a koji tumori su najskoriji. Ovo može pomoći u slučajevima u kojima je teško odrediti koji tumor je primaran.
[0158] U kontekstu predmetnih navoda pronalaska, izraz "RNK" odnosi se na molekul koji sadrži najmanje jednu ribonukleotidnu reziduu i poželjno sačinjen je u potpunosti ili suštinski, od ribonukleotidnih rezidua. "Ribonukleotid" se odnosi na nukleotid sa hidroksilnom grupom na 2’-poziciji β-D-ribofuranozil grupe. Izraz "RNK" uključuje dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK kao što je delimično ili potpuno prečišćena RNK, suštinski čistu RNK, sintetsku RNK, i rekombinantno generisanu RNK kao što je modifikovana RNK koja se po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili alteraciji jednog ili više nukleotida razlikuje od RNK koja se sreće prirodno. Takve alteracije mogu uključivati dodavanje nenukleotidnog materijala, na primer na kraj/krajeve RNK ili unutar molekula, na primer na jednom ili više RNK nukleotida. Nukleotidi u molekulima RNK mogu biti i nestandardni nukleotidi, kao što su nukleotidi koji se ne sreću u prirodi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili deoksinukleotidi. Ove izmenjene RNK mogu da se označe kao analozi ili analozi prirodnih RNK.
[0159] Prema predmetnim navodima, izraz "RNK" uključuje i poželjno odnosi se na "mRNK". Izraz "mRNA" označava informacionu (messenger) RNK i odnosi se na "transkript" koji se stvara korišćenjem DNK templata i kodira peptid ili polipeptid. Tipično, mRNK uključuje 5’-UTR, protein-kodirajući region, i 3’-UTR. mRNK ima samo ograničeni poluživot u ćelijama i in vitro. U kontekstu predmetnih navoda, mRNK može da se generiše in vitro transkripcijom sa DNK templata. Metodologija in vitro transkripcije poznata je stručnjaku u oblasti. Na primer, postoje različiti komercijalno dostupni kitovi za transkripciju in vitro.
[0160] Prema navodima, stabilnost i efikasnost translacije RNK može se po potrebi modifikovati. Na primer, RNK može da se stabiliše, a njena translacija poveća jednom ili više modifikacija koje imaju stabilišuće efekte i/ili povećanjem efikasnosti translacije RNK. Takve modifikacije opisane su, na primer, u PCT/EP2006/009448 (priznat od strane Evropskog Patentnog Zavoda kao EP 1934 345 B1 i od strane Zavoda za patentne i žigove SAD-a kao US 9,476,055 i kao US 10,106,800). Sa ciljem povećanja ekspresije RNK upotrebljene u skladu sa predmetnim navodima, ona se može modifikovati unutar kodirajućeg regiona, tj. sekvence koja kodira eksprimirani peptid ili protein, poželjno bez menjanja sekvence eksprimiranog peptida ili proteina, tako da se poveća GC-sadržaj da bi se povećala stabilnost RNK i izvela optimizacija kodona i tako pojačala translacija u ćelijama.
[0161] Izraz "modifikacija" u kontekstu RNK, upotrebljen u predmetnim navodima uključuje svaku modifikaciju RNK koja nije prirodno prisutna u pomenutoj RNK.
[0162] U jednom primeru izvođenja navoda, RNK upotrebljena u skladu sa navodima nema otkrivene 5’-trifosfate. Uklanjanje takvih nepokrivenih 5’-trifosfata može se postići tretiranjem RNK fosfatazom.
[0163] U skladu sa navodima, RNK može imati modifikovane ribonukleotide kako bi joj se povećala stabilnost i/ili smanjila citotoksičnost. Na primer, u jednom primeru izvođenja, u RNK korišćenoj prema navodima, 5-metilcitidin zamenjuje delimično ili potpuno, poželjno potpuno, citidin. Alternativno ili dodatno, u jednom primeru izvođenja, u RNK korišćenoj prema navodima pseudouridin zamenjuje delimično ili potpuno, poželjno potpuno, uridin.
[0164] U jednom primeru izvođenja, izraz "modifikacija" odnosi se na obezbeđivanje RNK sa 5’-"cap" ili 5’-"cap" analogom. Izraz "5’-cap" ("kapa") odnosi se na pokrivajuću strukturu koja se nalazi na 5’-kraju molekula mRNK i obično se sastoji od guanozinskog nukleotida spojenog sa mRNK preko neuobičajene 5’ ka 5’ trifosfat-veze. U jednom primeru izvođenja, ovaj guanozin je metilisan na poziciji 7. Izraz "konvencionalna 5’-cap" odnosi se na RNK 5’-"cap" koja se sreće u prirodi, poželjno na 7-metilguanozinsku "cap" (m7G). U kontekstu predmetnih navoda, izraz "5’-cap" uključuje 5’-"cap"-analog koji liči na RNK "cap" strukturu i modifikovan je da poseduje sposobnost stabilisanja RNK i/ili pojačanja translaciju RNK ukoliko je za nju prikačen, poželjno in vivo i/ili u ćeliji.
[0165] Poželjno, 5’ kraj RNK uključuje "cap"-strukturu koja ima sledeću opštu formulu:
gde su R1i R2nezavisno hidroksi ili metoksi i W-, X- i Y- su nezavisno kiseonik, sumpor, selen, ili BH3. U poželjnom primeru izvođenja, R1i R2su hidroksi i W-, X- i Y- su kiseonik. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, jedan od R1i R2, poželjno R1je hidroksi i drugi je metoksi i W-, X- i Y- su kiseonik. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, R1i R2su hidroksi i jedan od W-, X- i Y-, poželjno X- je sumpor, selen, ili BH3, poželjno sumpor, dok su drugi kiseonik. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, jedan od R1i R2, poželjno R2je hidroksi i drugi je metoksi i jedan od W-, X- i Y-, poželjno X- je sumpor, selen, ili BH3, poželjno sumpor, dok su drugi kiseonik.
[0166] U gornjoj formuli, nukleotid na desnoj strani spojen je sa lancem RNK preko 3’ grupe.
[0167] "Cap"-strukture u kojima je najmanje jedan od W-, X- i Y- sumpor, tj. koje imaju fosforotioatnu komponentu, postoje u različitim dijastereoizomernim formama koje su sve
4
obuhvaćene ovim tekstom. Pored toga, predmetni navodi obuhvataju sve tautomere i steroizomere gornje formule.
[0168] Na primer, "cap"-struktura koja ima gornju strukturu, gde je R1metoksi, R2je hidroksi, X- je sumpor i W- i Y- su kiseonik, postoji u dve dijastereoizomerne forme (Rp i Sp). One mogu da se razdvoje reverzno-faznom HPLC i nazvane su D1 i D2 prema redosledu eluiranja sa kolone za reverzno-faznu HPLC. U skladu sa navodima, posebno je poželjan D1 izomer m2<7,2’-O>GppspG.
[0169] Obezbeđivanje RNK sa 5’-"cap" ili 5’-"cap"-analogom može se postići in vitro transkripcijom DNK templata u prisustvu pomenute 5’-"cap" ili 5’-"cap"-analoga, pri čemu se pomenuta 5’-"cap" kotranskripciono inkorporiše u generisani RNK lanac, ili RNK može da se generiše, na primer, in vitro transkripcijom, a 5’-"cap" može da se prikači za RNK posttranskripciono korišćenjem "capping" enzima vakcinija virusa.
[0170] RNK može sadržati dodatne modifikacije. Na primer, dodatne modifikacije RNK upotrebljene u predmetnim navodima mogu biti produženje ili skraćenje prirodnog poli(A) repa ili alteracija 5’- ili 3’-netranslatujućih regiona (untranslated regions, UTR) kao što je uvođenje UTR koji nije povezan sa kodirajućim regionom pomenute RNK, na primer, zamena postojećeg 3’-UTR ili insercija jedne ili više, poželjno dve kopije 3’-UTR poreklom iz globinskog gena, kao što je alfa2-globin, alfa1-globin, beta-globin, poželjno beta-globin, poželjnije humani betaglobin.
[0171] RNK sa demaskiranom poli-A sekvencom translatuje se efikasnije nego RNK sa maskiranom poli-A sekvencom. Izraz "poli(A) rep" ili "poli-A sekvenca" odnosi se na sekvencu adenil (A) rezidua koja je tipično locirana na 3’-kraju RNK molekula i "demaskirana poli-A sekvenca" znači da se poli-A sekvenca na 3’ kraju molekula RNK završava sa A iz poli-A sekvence i nije praćena nukleotidima različitim od A, lociranim na 3’ kraju, tj. nishodno od poli-A sekvence. Pored toga, duga poli-A sekvenca od oko 120 baznih parova rezultuje optimalnom stabilnošću transkripta i efikasnošću translacije RNK.
[0172] Prema tome, da bi se povećale stabilnost i/ili ekspresija RNK upotrebljene prema predmetnim navodima, ona se može modifikovati tako da postoji sa poli-A sekvencom koja poželjno ima dužinu od 10 do 500, poželjnije 30 do 300, još poželjnije 65 do 200 i posebno 100 do 150 adenozinskih rezidua. U posebno poželjnom primeru izvođenja poli-A sekvenca ima dužinu od približno 120 adenozinskih rezidua. Da bi se dodatno povećale stabilnost i/ili ekspresije RNK upotrebljene prema predmetnom pronalasku, poli-A sekvenca može biti demaskirana.
[0173] Pored toga, inkorporisanje 3’-netranslatujućege regiona (UTR) u 3’-netranslatujući region RNK molekula, može za rezultat imati pojačanje efikasnosti translacije. Sinergistički efekat se može postići inkorporisanjem dva ili više takvih 3’-netranslatujućih regiona. 3’-netranslatujući regioni mogu biti autologi ili heterologi sa RNK u koju su introdukovani. U jednom posebnom primeru izvođenja 3’-netranslatujući region izveden je iz humanog βglobinskog gena.
[0174] Kombinacija gore opisanih modifikacija, tj. inkorporacija poli-A sekvence, demaskiranje poli-A sekvence i inkorporisanje jednog ili više 3’-netranslatujućih regiona, ima sinergistički uticaj na stabilnost RNK i porast efikasnosti translacije.
[0175] Izraz "stabilnost" RNK odnosi se na "poluživot" RNK. "Poluživot" se odnosi na period vremena potreban da se eliminiše polovina aktivnosti, količine, ili broja molekula. U kontekstu predmetnih navoda, poluživot RNK ukazuje na stabilnost pomenute RNK. Poluživot RNK može uticati na "dužinu ekspresije" RNK. Očekuje se da se RNK sa dugim poluživotom eksprimirati tokom dužeg vremenskog perioda.
[0176] Naravno, ako je u skladu sa predmetnim navodima poželjno smanjiti stabilnost i/ili translacionu efikasnost RNK, moguće je modifikovati RNK tako da interferira sa funkcijom elemenata kako je gore opisano, koji povećavaju stabilnost i/ili efikasnosti translacije RNK.
[0177] Izraz "ekspresija" se koristi u skladu sa navodima u svom najopštijem značenju i uključuje proizvodnju RNK i/ili peptida ili polipeptida, npr transkripcijom i/ili translacijom. U vezi sa RNK, izrazi "ekspresija" ili "translacija" odnose se posebno na proizvodnju peptida ili polipeptida. Oni uključuju i parcijalnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Pored toga, ekspresija može biti prolazna ili stabilna.
[0178] U skladu sa navodima, izraz ekspresija uključuje i "aberantnu ekspresiju" ili "abnormalnu ekspresiju". "Aberantna ekspresija" ili "abnormalna ekspresija" znači prema navodima da je ekspresija izmenjena, poželjno povećana, u poređenju sa referentnom, npr. u poređenju sa situacijom kod subjekta koji nema oboljenje udruženo sa aberantnom ili abnormalnom ekspresijom određenog proteina, npr., tumorskog antigena. Porast ekspresije odnosi se na porast od najmanje 10%, posebno najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100%, ili više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se sreće samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu pod represijom.
[0179] Izraz "specifično eksprimiran" znači da se protein suštinski eksprimira samo u specifičnom tkivu ili organu. Na primer, tumorski antigen koji se specifično eksprimira u želudačnoj mukozi znači da se pomenuti protein eksprimira primarno u želudačnoj mukozi, a ne eksprimira se u drugim tkivima ili se ne eksprimira u značajnoj meri u drugim tipovima tkiva
4
ili organa. Prema tome, protein koji se eksprimira isključivo u ćelijama želudačne mukoze, a u značajno nižoj meri u bilo kom drugom tkivu, kao što je testis, je protein koji se specifično eksprimira u ćelijama želudačne mukoze. U nekim primerima izvođenja, tumorski antigen može i da se specifično eksprimira pod normalnim uslovima u više od jednog tipa tkiva ili organa, na primer u 2 ili 3 tipa tkiva ili organa, ali poželjno u ne više od 3 različita tipa tkiva ili organa. U tom slučaju, tumorski antigen se specifično eksprimira u tim organima. Na primer, ako se tumorski antigen eksprimira pod normalnim uslovima poželjno u približno jednakoj meri u plućima i želucu, pomenuti tumorski antigen se specifično eksprimira u plućima i želucu.
[0180] U kontekstu predmetnih navoda, izraz "transkripcija" odnosi se na proces u kojem se genetički kod u DNK sekvenci transkribuje u RNK. Posle toga, RNK može da se translatuje u protein. U skladu sa predmetnim navodima, izraz "transkripcija" uključuje "in vitro transkripciju", pri čemu se izraz "in vitro transkripcija" odnosi na proces u kojem se RNK, posebno mRNK, sintetiše in vitro u sistemu koji ne sadrži ćelije, poželjno uz korišćenje odgovarajućih ćelijskih ekstrakata. Poželjno, klonirajući vektori se primenjuju za generisanje transkripata. Ovi klonirajući vektori su uopšteno dizajnirani kao transkripcioni vektori i u skladu sa predmetnim navodima obuhvaćeni su izrazom "vektor". U skladu sa predmetnim navodima, RNK upotrebljena u predmetnim navodima poželjno je in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK) i može se dobiti in vitro transkripcijom odgovarajućeg DNK templata. Promotor za kontrolu transkripcije može biti bilo koji promotor za bilo koju RNK polimerazu. Posebni primeri RNK polimeraza su T7, T3, i SP6 RNK polimeraze. Poželjno, in vitro transkripcija prema navodima kontrolisana je promotorom T7 ili SP6. DNK templat za in vitro transkripciju može se dobiti kloniranjem nukleinske kiseline, posebno cDNK, i introdukovanjem u odgovarajući vektor za in vitro transkripciju. cDNK može se dobiti reverznom transkripcijom RNK.
[0181] Izraz "translacija" se, u skladu sa navodima, odnosi na proces u ribozomima ćelije kojim lanac informacione RNK usmerava sklapanje sekvence amino-kiselina da bi se napravio peptid ili polipeptid.
[0182] Ekspresiona kontrolna sekvenca ili regulatorna sekvenca, koja prema navodima može biti funkcionalno povezana sa nukleinskom kiselinom, može biti homologa ili heterologa u odnosu na nukleinsku kiselinu. Kodirajuća sekvenca i regulatorna sekvenca povezane su jedna sa drugom "funkcionalno" ako su povezane kovalentno, tako da su transkripcija ili translacija kodirajuće sekvence pod kontrolom ili pod uticajem regulatorne sekvence. Ako kodirajuća sekvenca treba da se translatuje u funkcionalni protein, sa funkcionalnim spojem regulatorne sekvence sa kodirajućom sekvencom, indukcija regulatorne sekvence dovodi do transkripcije
4
kodirajuće sekvence, bez izazivanja pomaka u ramu čitanja u kodirajućoj sekvenci koja treba da se translatuje u željeni protein ili peptid.
[0183] Izraz "ekspresiona kontrolna sekvenca" ili "regulatorna sekvenca" uključuje prema navodima, promotore, ribozom-vezujuće sekvence i druge kontrolne elemente koji kontrolišu transkripciju nukleinske kiseline ili translaciju izvedene RNK. U određenim primerima izvođenja navoda, regulatorne sekvence mogu da se kontrolišu. Precizna struktura regulatornih sekvenci može varirati u zavisnosti od vrste ili u zavisnosti od tipa ćelije, ali obično uključuje 5’-netranskribujući i 5’- i 3’-netranslatujuće sekvence koje su uključene u inicijaciju transkripcije ili translacije, kao što su TATA-boks, "capping"-sekvenca, CAAT-sekvenca i slično. Posebno, 5’-netranskribujuće regulatorne sekvence uključuju promotorski region koji uključuje promotorsku sekvencu za kontrolu transkripcije funkcionalno vezanog gena. Regulatorne sekvence mogu uključivati i enhenserske sekvence ili ushodne aktivatorske sekvence.
[0184] Poželjno, prema navodima, RNK koja treba da se eksprimira u ćeliji uvedena je u pomenutu ćeliju. U jednom primeru izvođenja postupak u skladu sa navodima, RNK koja treba da se uvede u ćeliju dobija se in vitro transkripcijom odgovarajućeg DNK templata.
[0185] U skladu sa navodima, izrazi kao "RNK sposobna za ekspresiju" i "RNK koja kodira" koriste se naizmenično u ovom tekstu i u vezi sa određenim peptidom ili polipeptidom označavaju da RNK, ako je prisutna u odgovarajućem okruženju, poželjno u ćeliji, može da se eksprimira da proizvede pomenuti peptid ili polipeptid. Poželjno, RNK prema navodima može da interaguje sa ćelijskom translacionom mašinerijom za obezbeđivanje peptida ili polipeptida koji može da eksprimira.
[0186] Izrazi kao što su "prenošenje", "introdukovanje" ili "transfektovanje" koriste se naizmenično u ovom tekstu i odnose se na introdukovanje nukleinskih kiselina, posebno egzogenih ili heterologih nukleinskih kiselina, posebno RNK, u ćeliju. U skladu sa predmetnim navodima, ćelija može formirati deo organa, tkiva i/ili organizma. U skladu sa predmetnim navodima, nukleinska kiselina se primenjuje ili u vidu gole nukleinske kiseline ili u kombinaciji sa reagensom za primenu. Poželjno, nukleinske kiseline se primenjuju u vidu golih nukleinskih kiselina. Poželjno, RNK se primenjuje u kombinaciji sa stabilišućim supstancama kao što su inhibitori RNaze. Predmetni navodi imaju u vidu i ponavljano introdukovanje nukleinskih kiselina u ćelije da bi se obezbedila trajna ekspresija tokom dužih vremenskih perioda.
[0187] Ćelije mogu da se transfektuju bilo kojim nosačem sa kojim može da se udruži RNK, npr., formiranjem kompleksa sa RNK ili formiranjem vezikula u kojima je RNK zatvorena ili inkapsulirana, što za rezultat ima povećanu stabilnost RNK u poređenju sa golom RNK. Nosači
4
korisni u skladu sa navodima uključuju, na primer, lipid-sadržavajuće nosače kao što su katjonski lipidi, lipozomi, posebno katjonski lipozomi, i micele, i nanopartikule. Katjonski lipidi mogu formirati komplekse sa negativnio naelektrisanim nukleinskim kiselinama. Svaki katjonski lipid može se koristiti u skladu sa navodima.
[0188] Poželjno, introdukovanje RNK koja kodira peptid ili polipeptid u ćeliji, posebno u ćeliji prisutnoj in vivo, za rezultat ima ekspresiju pomenutog peptida ili polipeptida u ćeliji. U posebnim primerima izvođenja, poželjno je upućivanje nukleinskih kiselina ka posebnim ćelijama. U takvim primerima izvođenja, nosač koji se koristi za dostavljanje nukleinske kiseline ćeliji (na primer, retrovirus ili lipozom), ispoljava ciljajući molekul. Na primer, molekul kao što je antitelo koje je specifično za površinski membranski protein na ciljnoj ćeliji ili ligand za receptor na ciljnoj ćeliji može biti inkorporisan u nosač nukleinske kiseline ili može biti za njega vezan. U slučaju da se nukleinska kiselina dostavlja lipozomima, proteini koji se vezuju za protein na površini membrane udružen sa endocitozom mogu se inkorporisati u lipozomsku formulaciju da bi se omogućilo ciljanje i/ili preuzimanje. Takvi proteini obuhvataju proteine kapsida ili njihove fragmente koji su specifični za određeni tip ćelije, antitela protiv proteina koja se internalizuju, proteini koji ciljaju unutarćelijsku lokaciju itd.
[0189] U skladu sa predmetnim navodima, izraz "peptid" odnosi se na supstance koje sadrže dva ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 ili više, poželjno 21 ili više i do poželjno 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, posebno 100 amino-kiselina spojenih kovalentno peptidnim vezama. Izraz "polipeptid" ili "protein" odnosi se na velike peptide, poželjno peptide sa više od 100 aminokiselinskih rezidua, ali uopšteno izrazi "peptid", "polipeptid" i "protein" su sinonimi i koriste se u ovom tekstu naizmenično.
[0190] U skladu sa navodima, izraz "promena sekvence" u vezi sa peptidima ili proteinima odnosi se na aminokiselinske insercione varijante, aminokiselinske adicione varijante, aminokiselinske delecione varijante i aminokiselinske supstitucione varijante, poželjno aminokiselinske supstitucione varijante. Sve ove promene sekvence prema navodima mogu potencijalno kreirati nove epitope.
[0191] Aminokiselinske insercione varijante uključuju insercije jedne ili dve ili više aminokiselina u određenoj aminokiselinskoj sekvenci.
[0192] Aminokiselinske adicione varijante uključuju amino- i/ili karboksiterminalne fuzije jedne ili više amino-kiselina, na primer 1, 2, 3, 4 ili 5, ili više amino-kiselina.
[0193] Aminokiselinske delecione varijante karakterišu se uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence, na primer uklanjanjem 1, 2, 3, 4 ili 5, ili više amino-kiselina.
4
[0194] Aminokiselinske supstitucione varijante karakterišu se uklanjanjem najmanje jedne rezidue u sekvenci i insertovanjem druge rezidue na njeno mesto.
[0195] Izraz "izveden" označava, prema navodima, da je određeni entitet, posebno određena sekvenca, prisutna u objektu iz kojeg je izvedena, posebno organizmu ili molekulu. U slučaju aminokiselinskih sekvenci, posebno određenih sekvencionih regiona, "izveden" posebno znači da je relevantna aminokiselinska sekvenca izvedena iz aminokiselinske sekvence u kojoj je prisutna.
[0196] Izraz "ćelija" ili "ćelija-domaćin" poželjno je intaktna ćelija, tj., ćelija sa intaktnom membranom, koja nije oslobodila svoje normalne unutarćelijske komponente kao što su enzimi, organele, ili genetički materijal. Intaktna ćelija je poželjno vijabilna ćelija, tj., živa ćelija sposobna da vrši svoje normalne metaboličke funkcije. Poželjno, pomenuti izraz odnosi se, u skladu sa navodima, na bilo koju ćeliju koja može biti transformisana ili transfektovana egzogenom nukleinskom kiselinom. Izraz "ćelija" uključuje, prema navodima, prokariotske ćelije (npr., E. coli) ili eukariotske ćelije (npr., dendritske ćelije, B ćelije, CHO ćelije, COS ćelije, K562 ćelije, HEK293 ćelije, HELA ćelije, ćelije kvasca i insekatske ćelije). Egzogena nukleinska kiselina može da se nađe unutar ćelije (i) slobodno dispergovana kao takva, (ii) inkorporisana u rekombinantni vektor, ili (iii) integrisana u genom ćelije-domaćina ili mitohondrijalnu DNK. Sisarske ćelije su posebno poželjne, na primer ćelije ljudi, miševa, zamoraca, svinja, koza i primata. Ćelije mogu biti poreklom iz velikog broja tipova tkiva i uključuju primarne ćelije i ćelijske linije. Specifični primeri uključuju keratinocite, leukocite periferne krvi, ćelije kostne srži i embrionske matične ćelije. U dodatnim primerima izvođenja, ćelija je antigen-prezentujuća ćelija, posebno dendritska ćelija, monocit, ili makrofag.
[0197] Ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline poželjno eksprimira peptid ili polipeptid kodiran nukleinskom kiselinom.
[0198] Izraz "klonska ekspanzija" odnsoi se na proces u kojem je specifični entitet multiplikovan. U kontekstu predmetnih navoda, izraz se poželjno koristi u kontekstu imunskog odgovora u kojem se limfociti stimulišu antigenom, proliferišu i specifični limfocit koji prepoznaje pomenuti antigen se umnožava. Poželjno, klonska ekspanzija dovodi do diferencijacije limfocita.
[0199] Izrazi kao što su "redukovanje" ili "inhibiranje" odnose se na sposobnost da se izazove ukupno smanjenje nivoa, poželjno 5% ili veće, 10% ili veće, 20% ili veće, poželjnije 50% ili veće, i najpoželjnije 75% ili veće. Izraz "inhibira" ili slični izrazi uključuju kompletnu ili suštinski kompletnu inhibiciju, tj. redukciju do nule ili suštinski do nule.
4
[0200] Izrazi kao što su "povećanje", "pojačanje", "promovisanje" ili "produžavanje" poželjno se odnose na porast, pojačanje, promociju ili produženje za oko najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjno najmanje 50%, poželjno najmanje 80%, poželjno najmanje 100%, poželjno najmanje 200% i posebno najmanje 300%. Ovi izrazi mogu takođe da se odnose na porast, pojačanje, promociju ili produženje od nule ili nemerljivog ili nedetektabilnog nivoa do nivoa koji je veći od nule ili nivoa koji je merljiv ili detektabilan.
[0201] Sredstva, kompozicije i postupci opisani u ovom tekstu mogu se koristiti za lečenje subjekta sa bolešću, npr., bolešću koja se karakteriše prisustvom obolelih ćelija koje eksprimiraju antigen i prezentuju antigeni peptid. Posebno poželjna oboljenja su kancerska oboljenja. Sredstva, kompozicije i postupci opisani u ovom tekstu mogu da se koriste i za imunizaciju ili vakcinaciju, kako bi se prevenirala bolest opisana u ovom tekstu.
[0202] U skladu sa navodima, izraz "oboljenje" odnosi se na svako patološko stanje, uključujući kancerske bolesti, posebno one forme kancerskih bolesti koje su opisane u ovom tekstu.
[0203] Izraz "normalno" odnosi se na zdravo stanje ili uslove kod zdravog subjekta ili tkiva, tj., nepatološka stanja, pri čemu "zdrav" poželjno znači nekancerozan.
[0204] "Bolesti koje uključuju ćelije koje eksprimiraju antigen" znači, u skladu sa navodima, da je detektovana ekspresija antigena u ćelijama bolesnog tkiva ili organa. Ekspresija u ćelijama obolelog tkiva ili organa može biti povećana u poređenju sa stanjem u zdravom tkivu ili organu. Porast se odnosi na porast od najmanje 10%, posebno najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak i više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija je prisutna samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu pod represijom. U skladu sa navodima, bolesti koje uključuju ili su udružene sa ćelijama koje eksprimiraju antigen uključuju kancerska oboljenja.
[0205] Kancer (medicinski izraz: maligna neoplazma) predstavlja klasu oboljenja u kojoj grupa ćelija pokazuje nekontrolisani rast (deobu izvan normalnih limita), invazivnost (napad i destrukciju susednih tkiva), i ponekad metastaze (širenje na druge lokacije u telu preko limfe ili krvi). Ove tri maligne osobine kancera razlikuju ih od benignih tumora, koji su samoograničavajući, i nisu invazivni i ne metastaziraju. Većina kancera formira tumor ali neki, kao leukemija, to ne čine.
[0206] Maligni tumor je suštinski sinonim za kancer. Malignitet, maligna neoplazma, i maligni tumor suštinski su sinonimi za kancer.
[0207] U skladu sa navodima, izraz "tumor" ili "tumorska bolest" odnose se na abnormalni rast ćelija (nazvanih neoplastične ćelije, tumorogene ćelije ili tumorske ćelije) koje poželjno formiraju otok ili leziju. Pod "tumorska ćelija" podrazumeva se abnormalna ćelija koja raste brzom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste i posle prekidanja stimulusa koji su inicirali novi rast. Tumori pokazuju delimični ili potpuni nedostatak strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom, i obično formiraju prepoznatljivu masu tkiva koja može biti benigna, premaligna ili maligna.
[0208] Benigni tumor je tumor kojem nedostaju sve tri maligne osobine kancera. Tako, po definiciji, benigni tumor ne raste na neograničen, agresivan način, ne invadira okolna tkiva, i ne širi se u nesusedna tkiva (ne metastazira).
[0209] Neoplazma je abnormalna masa tkiva koja nastaje kao rezultat neoplazije. Neoplazija (grčki: novi rast) je abnormalna proliferacija ćelija. Rast ćelija premašuje i nije koordinisan sa tastom normalnih okolnih tkiva. Rast nastavlja da se odvija na isti preteran način čak i posle prestanka stimulusa. Često dovodi do formiranja čvorića ili tumora. Neoplazme mogu biti benigne, premaligne ili maligne.
[0210] "Rast tumora" ili "tumorski rast", u skladu sa navodima, odnosi se na tendenciju tumora da poveća svoju veličinu i/ili na tendenciju tumorskih ćelija da proliferišu.
[0211] U svrhu predmetnih navoda, izrazi "kancer" i "kancerska bolest" koriste se naizmenično sa izrazima "tumor" i "tumorska bolest".
[0212] Kanceri se klasifikuju po tipu ćelije na koju tumor liči i, dakle, po tkivu za koje se pretpostavlja da predstavlja izvor tumora. Ovo su histologija, odnosno lokacija.
[0213] Izraz "kancer", prema navodima, uključuje leukemije, seminome, melanome, teratome, limfome, neuroblastome, gliome, rektalni kancer, kancer endometrijuma, kancer bubrega, kancer nadbubrežne žlezde, kancer tiroidee, kancer krvi, kancer kože, kancer mozga, kancer cerviksa, intestinalni kancer, kancer jetre, kancer kolona, kancer želuca, intestinalni kancer, kancer glave i vrata, gastrointestinalni kancer, kancer limfnih čvorova, kancer ezofagusa, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer uha, nosa i grla (ear, nose and throat, ENT), kancer dojke, kancer prostate, kancer uterusa, kancer ovarijuma i kancer pluća, kao i njihove metastaze. Njihovi primeri su karcinomi pluća, karcinomi mlečne žlezde, karcinomi prostate, karcinomi kolona, karcinomi bubrežnih ćelija, karcinomi cerviksa, ili metastaze kancerskih tipova ili tumora opisanih gore. Izraz kancer u skladu sa navodima uključuje i kancerske metastaze i relaps kancera.
[0214] Glavni tipovi kancera pluća su sitnoćelijski karcinom pluća (small cell lung carcinoma, SCLC) i nesitnoćelijski karcinom pluća (non-small cell lung carcinoma, NSCLC). Postoje tri glavna podtipa nesitnoćelijskog karcinoma pluća: karcinom pluća skvamoznih ćelija, adenokarcinom, i krupnoćelijski karcinom pluća. Adenokarcinomi čine približno 10% kancera
1
pluća. Ovaj kancer se obično vidi periferno u plućima, za razliku od sitnoćelijskog plućnog kancera i karcinoma pluća skvamoznih ćelija koji teže da budu locirani više centralno.
[0215] Kancer kože je maligna izraslina na koži. Najčešći kanceri kože su kancer bazalnih ćelijam, kancer skvamoznih ćelija i melanom. Maligni melanom je ozbiljan tip kancera kože. Nastaje usled nekontrolisanog rasta pogmentnih ćelija nazvanih melanociti.
[0216] U skladu sa navodima, "karcinom" je maligni tumor poreklom od epitelnih ćelija. Ova grupa predstavlja najčešće kancere, uključujući česte forme kancera dojke, prostate, pluća i kolona.
[0217] "Bronhiolarni karcinom" je karcinom pluća, iako se misli da vodi poreklo od epitela terminalnih bronhiola, odakle se neoplastično tkivo pruža duž alveolarnih zidova i raste u vidu malih masa unutar alveola. Mucin može da bude prisutan u nekim od ćelija i u materijalu u alveolama, koji sadrži i denudirane ćelije.
[0218] "Adenokarcinom" je kancer poreklom od žlezdanog tkiva. Ovo tkivo je takođe deo veće kategorije tkiva poznate kao epitelno tkivo. Epitelno tkivo uključuje kožu, žlezde i različita druga tkiva koja oivičavaju šupljine i organe u telu. Epitel embriološki može biti poreklom od ektoderma, endoderma i mezoderma. Da bi tumor bio klasifikovan kao adenokarcinom, ćelije ne moraju obavezno biti deo žlezde, dok god imaju sekretorne osobine. Ova forma karcinoma može se javiti kod nekih viših sisara, uključujući ljude. Dobro diferencirani adenokarcinomi teže da liče na žlezdano tkivo iz kojeg su izvedeni, dok slabo diferencirani ne moraju biti takvi. Bojenjem ćelija dobijenih biopsijom, patolog će odrediti da li je tumor adenokarcinom ili neki drugi tip kancera. Adenokarcinomi mogu nastati u mnogim tkivima tela usled sveprisutnosti žlezda u telu. Iako svaka žlezda ne mora sekretovati istu supstancu, dok god ćelija ima egzokrinu funkciju, ona se smatra žlezdanom i njena maligna forma se dakle naziva adenokarcinom. Maligni adenokarcinomi naseljavaju druga tkiva i često metastaziraju ako imaju za to dovoljno vremena. Ovarijalni adenokarcinom je najčešći tip karcinoma ovarijuma. On uključuje serozne i mucinozne adenokarcinome, adenokarcinom svetlih ćelija i endometroidni adenokarcinom.
[0219] Karcinom bubrežnih ćelija, poznat i kao kancer bubrežnih ćelija ili adenokarcinom bubrežnih ćelija je kancer bubrega koji vodi poreklo od ćelija koje oblažu proksimalni izuvijani kanalić, veoma male kanaliće u bubregu koji filtriraju krv i uklanjaju otpadne proizvode. Karcinom bubrežnih ćelija je daleko najčešći tip kancera bubrega kod odraslih i najletalniji od svih genitourinarnih tumora. Različiti podtipovi karcinoma bubrežnih ćelija su karcinom svetlih ćelija bubrega i papilarni karcinom ćelija bubrega. Karcinom svetlih ćelija bubrega je najčešća forma karcinoma bubrežnih ćelija. Kada se posmatraju pod mikroskopom, ćelije koje čine
2
karcinom svetlih ćelija bubrega izgledaju veoma blede ili providne. Papilarni karcinom bubrežnih ćelija je drugi najčešći podtip. Ovi kanceri formiraju male prstolike projekcije (nazvane papile) u nekim, ako ne i u većini, tumora.
[0220] Limfomi i leukemije su maligniteti poreklom od hematopoetskih ćelija (ćelija koje formiraju krv).
[0221] Blastični tumor ili blastom je tumor (obično maligni) koji liči na nezrelo ili embrionsko tkivo. Mnogi od ovih tumora se najčešće javljaju kod dece.
[0222] Pod "metastazom" označava se širenje kancerskih ćelija sa njihovog originalnog mesta u druge delove tela. Formiranje metastaza je veoma kompleksan proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije vanćelijskog matriksa, prolaska kroz bazalnu membranu endotela da bi se ušlo u telesne šupljine i sudove, i zatim, posle transporta krvlju, infiltracije ciljnih organa. Konačno, rast novog tumora tj. sekundarnog tumora ili metastatskog tumora, na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Tumorska metastaza se često dešava čak i posle uklanjanja primarnog tumora zato što tumorske ćelije ili komponente mogu zaostati i razviti metastatski potencijal. U jednom primeru izvođenja, izraz "metastaza" u skladu sa navodima odnosi se na "udaljenu metastazu" što se odnosi na metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i regionalnog sistema limfnih čvorova.
[0223] Ćelije sekundarnog ili metastatskog tumora su kao one u originalnom tumoru. To znači, na primer, ako kancer ovarijuma metastazira u jetru, sekundarni tumor je sačinjen od abnormalnih ćelija ovarijuma, a ne od abnormalnih ćelija jetre. Tumor u jetri se tada naziva metastatski kancer ovarijuma, a ne kancer jetre.
[0224] U kanceru ovarijuma, metastaziranje se dešava na sledeći način: direktnim kontaktom ili ekstenzijom, on može naseliti najbliže tkivo ili organ lociran uz ili u blizini ovarijuma, na primer jajovode, uterus, mokraćnu bešiku, rektum, itd.; rasejavanjem ili odvajanjem u abdominalnu duplju, što je najčešći način širenja kancera ovarijuma. Kancerske ćelije se odvajaju sa površine ovarijalne mase i "padaju" na druge strukture u abdomenu, na primer jetru, želudac, kolon ili dijafragmu; odvajanjem od ovarijalne mase, invazijom limfnih sudova i zatim putovanjem do drugih oblasti tela ili udaljenih organa kao što su pluća ili jetra; odvajanjem od ovarijalne mase, invazijom krvnog sistema i putovanjem do drugih oblasti tela ili udaljenih organa.
[0225] U skladu sa navodima, metastatski kancer ovarijuma uključuje kancer jajovoda, kancer abdominalnih organa kao što su kancer u debelom crevu, kancer u uterusu, kancer u mokraćnoj bešici, kancer u rektumu, kancer u jetri, kancer u želucu, kancer u kolonu, kancer u dijafragmi, kancer u plućima, kancer u tkivu koje oblaže abdomen ili karlicu (peritoneum), i kancer u mozgu. Slično tome, metastatski kancer pluća označava kencer koji se širi iz pluća do udaljenih i/ili više mesta u telu i uključuje kancer u jetri, kancer u nadbubrežnim žlezdama, kancer u kostima i kancer u mozgu.
[0226] Izraz "cirkulišuće tumorske ćelije " ili "CTC" odnosi se na ćelije koje su se otkačile od primarnog tumora ili tumorskih metastaza i cirkulišu u krvnom toku. CTC mogu sačinjavati seme za kasniji rast dodatnih tumora (metastaza) u različitim tkivima. Cirkulišuće tumorske ćelije nalaze se sa frekvencijom reda 1-10 CTC po mL cele krvi kod pacijenata sa metastatskom bolešću. Razvijeni su istraživački postupci za izolaciju CTC. Nekoliko istraživačkih postupaka za izolaciju CTC opisano je u struci, npr., tehnike u kojima se koristi činjenica da epitelne ćelije uobičajeno eksprimiraju protein ćelijske adhezije EpCAM, koji je odsutan u normalnim ćelijama krvi. Imobilizacija bazirana na imunomagnetnim perlicama uključuje tretiranje uzoraka krvi antitelom na EpCAM koje je konjugovano sa megnetnim česticama, posle čega sledi separacija ciljnih ćelija u magnetnom polju. Izolovane ćelije se zatim boje antitelom na drugi epitelni marker, citokeratin, kao i na uobičajeni marker leukocita CD45, tako da se retke CTC razlikuju od kontaminirajućih belih krvnih ćelija. Ovim robusnim i poluautomatizovanim pristupom identifikuju se CTC sa prosečnim prinosom od približno 1 CTC/mL i čistoćom od 0.1% (Allard et al., 2004: Clin Cancer Res 10, 6897-6904). U drugom postupku izolovanja CTC koristi se uređaj za imobilizaciju CTC baziran na mikrofluidu, koji uključuje propuštanje cele krvi kroz komoru u kojoj je uklopljeno 80.000 mikropostolja koja su učinjena funkcionalnim tako što su obložena antitelom na EpCAM. CTC se zatim boje sekundarnim antitelima protiv citokeratina ili tkivno-specifičnih markera, kao što je PSA u kanceru prostate ili HER2 u kanceru dojke i vizuelizuju automatskim skeniranjem mikropostolja u više ravni duž trodimenzionalnih koordinata. CTC-čipovi mogu da identifikuju citokeratin-pozitivne cirkulišuće tumorske ćelije kod pacijenata, sa medijanom prinosa od 50 ćelija/ml i čistoćom u opsegu od 1 do 80% (Nagrath et al., 2007: Nature 450, 1235-1239). Druga mogućnost za izolovanje CTC je korišćenje CellSearch™ Circulating Tumor Cell (CTC) testa, Veridex, LLC (Raritan, NJ) koji imobiliše, identifikuje i broji CTC u epruveti krvi. CellSearch™ sistem je metodologija odobrena od strane U.S. Food and Drug Administration (FDA), za brojanje CTC u celoj krvi, koja je bazirana na kombinaciji imunomagnetnog obeležavanja i automatizovane digitalne mikrosopije. Postoje i drugi postupci za izolovanje CTC opisani u literaturi, od kojih se svi mogu koristiti zajedno sa predmetnim navodima.
[0227] Relaps ili recidiv dešava se kad osoba ponovo bude pod uticajem stanja koje je na nju uticalo u prošlosti. Na primer, ako je pacijent patio od tumorskog oboljenja, primio uspešan tretman za pomenutu bolest i ponovo razvio pomenutu bolest, pomenuta novorazvijena bolest
4
može da se razmatra kao relaps ili recidiv. Međutim, u skladu sa navodima, relaps ili recidiv tumorskog oboljenja mogu, ali se ne moraju obavezno desiti na mestu originalnog tumorskog oboljenja. Prema tome, na primer, ako je pacijent patio od tumora ovarijuma i primio je uspešan tretman, relaps ili recidiv može biti pojava tumora ovarijuma ili pojava tumora na mestu različitom od ovarijuma. Relaps ili recidiv tumora uključuje i situacije u kojima se tumor sreće na mestu različitom od mesta originalnog tumora kao i na mestu originalnog tumora. Poželjno, originalni tumor za koji je pacijent primio tretman je primarni tumor, a tumor na mestu različitom od mesta originalnog tumora je sekundarni ili metastatski tumor.
[0228] Pod "lečiti/tretirati" misli se na primernu jedinjenja ili kompozicije, kako je opisano u ovom tekstu, kod subjekta, sa ciljem prevencije ili eliminisanja bolesti, uključujući smanjenje veličine tumora ili broja tumora kod subjekta; zaustavljanje ili usporsvanje bolesti kod subjekta; inhibiranje ili usporenje razvoja nove bolesti kod subjekta; smanjenje frekvencije ili jačine simptoma i/ili recidive kod subjekta koji trenutno ima ili koji je prethodno imao bolest; i/ili prolongiranje, tj. povećanje životnog veka subjekta. Posebno, izraz "lečenje bolesti" uključuje izlečenje, skraćenje trajanja, ublažavanje, prevenciju, usporenje ili zaustavljanje napredovanja ili pogoršanja, ili prevenciju ili odlaganje pojave bolesti ili njenih simptoma.
[0229] Pod "biti pod rizikom" podrazumeva se subjekt tj., pacijent koji je identifikovan da ima šansu veću od normalne da razvije bolest, posebno kancer, u poređenju sa opštom populacijom. Pored toga, subjekt koji je imao ili koji trenutno ima bolest, posebno kancer, je subjekt koji ima povišen rizik da razvije bolest, jer taj subjekt može nastaviti da razvija bolest. Subjekti koji trenutno imaju ili koji su imali kancer takođe imaju povišen rizik za kancerske metastaze.
[0230] Izraz "imunoterapija" odnosi se na lečenje koje uključuje aktivaciju specifične imunske reakcije. U kontekstu predmetnih navoda, izrazi kao "zaštititi", "prevenirati", "profilaktički", "preventivan", ili "protektivan" odnose se na prevenciju ili lečenje ili oba, pojave i/ili propagacije bolesti kod subjekta i, posebno, na minimiziranje izgleda da će subjekt razviti bolest ili odložiti razvoj bolesti. Na primer, osoba koja je pod rizikom za tumor, kako je gore opisano, biće kandidat za terapiju kako bi se tumor prevenirao.
[0231] Profilaktička primena imunoterapije, na primer profilaktička primena kompozicije prema navodima, poželjno štiti primaoca od razvoja bolesti. Terapijska primena imunoterapije, na primer, terapijska primena kompozicije prema navodima, može dovesti do inhibicije napredovanja/rasta bolesti. Ovo uključuje usporavanje napredovanja/rasta bolesti, posebno prekid napredovanja bolesti, što poželjno dovodi do eliminacije bolesti.
[0232] Imunoterapija može da se izvede korišćenjem bilo koje od različitih tehnika, gde sredstva data u ovom tekstu funkcionišu tako što uklanjaju obolele ćelije iz pacijenta. Takvo uklanjanje može da se desi kao rezultat pojačanja ili indukovanja pacijentovog imunskog odgovora specifičnog za antigen ili ćeliju koja eksprimira antigen.
[0233] U određenim primerima izvođenja, imunoterapija može biti aktivna imunoterapija, u kojoj tretman počiva na in vivo stimulaciji endogenog domaćinovog imunskog sistema da reaguje protiv obolelih ćelija, primenom agenasa koji modifikuju imunski odgovor (kao što su polipeptidi i nukleinske kiseline kako je dato u ovom tekstu).
[0234] Sredstva i kompozicije obezbeđeni u ovom tekstu mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa konvencionalnim terapijskim režimima kao što su operacija, zračenje, hemioterapija i/ili transplantacija kostne srži (autologa, singena, alogena ili nesrodna).
[0235] Izrazi "imunizacija" ili "vakcinacija" opisuju proces lečenja subjekta u svrhu indukovanja imunskog odgovora iz terapijskih ili profilaktičkih razloga.
[0236] Izraz "in vivo" odnosi se na situaciju kod subjekta.
[0237] Izrazi "subjekt", "osoba", "organizam" ili "pacijent" koriste se naizmenično i odnose se na vertebrate, poželjno sisare. Na primer, sisari u kontekstu predmetnih navodima su ljudi, nehumani primati, domestifikovane životinje kao psi, mačke, ovce, goveda, koze, svinje, konji itd., laboratorijske životinje kao miševi, pacovi, začevi, zamorci itd. kao i životinje u zarobljeništvu, na primer životinje u zoološkim vrtovima. Izraz "životinja", kako se koristi u ovom tekstu, uključuje i ljude. Izraz "subjekt" može uključivati i pacijenta, tj., životinju, poželjno čoveka koji ima bolest, poželjno bolest kako je opisano u ovom tekstu.
[0238] Izraz "autologi" koristi se da opiše bilo šta što je izvedeno iz istog subjekta. Na primer, "autologi transplantat" odnosi se na transplantat tkiva ili organa poreklom iz istog subjekta. Takve procedure su pogodne jer prevazilaze imunsku barijeru koja bi inače rezultovala odbacivanjem.
[0239] Izraz "heterolog" koristi se da opiše nešto što se sastoji od više različitih elemenata. Kao primer, transfer kostne srži jedne osobe u drugu osobu predstavlja heterologu transplantaciju. Heterologi gen je gen poreklom iz izvora različitog od subjekta.
[0240] Kao deo kompozicije za imunizaciju ili vakcinu, poželjno, jedno ili više sredstava kako je opisano u ovom tekstu primenjuju se zajedno sa jednim ili više adjuvansa za indukovanje imunskog odgovora ili za pojačanje imunskog odgovora. Izraz "adjuvans" odnosi se na jedinjenja koja produžavaju ili pojačavaju ili ubrzavaju imunski odgovor. Kompozicija predmetnih navoda poželjno ispoljava svoj efekat bez dodavanja adjuvansa. Ipak, kompozicija ove patentne prijave može sadržati bilo koji poznati adjuvans. Adjuvansi uključuju heterogenu grupu jedinjenja kao što su uljane emulzije (npr., Freundov adjuvans), mineralna jedinjenja (kao alum), bakterijske proizvode (kao toksin Bordetella pertussis), lipozome, i imunostimulatorne komplekse. Primeri adjuvansa su monofosforillipid-A (MPL SmithKline Beecham). Saponini kao što su QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, i QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), nekompletni Freundov adjuvans, kompletni Freundov adjuvans, vitamin E, montanid, alum, CpG oligonukleotidi (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549), i različite emulzije tipa voda u ulju koje su pripremljene od biološki degradabilnih ulja kao skvalen i/ili tokoferol.
[0241] Mogu se primeniti i druge supstance koje stimulišu pacijentov imunski odgovor. U vakcinaciji se, na primer, mogu koristiti citokini, zahvaljujući njihovim regulatornim osobinama prema limfocitima. Takvi citokini uključuju, na primer, interleukin-12 (IL-12) za koji je pokazano da povećava protektivna dejstva vakcina (uporedi, Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF i IL-18.
[0242] Postoje brojna jedinjenja koja pojačavaju imunski odgovor i koja, prema tome, mogu da se koriste u vakcinaciji. Pomenuta jedinjenja uključuju kostimulišuće molekule obezbeđene u formi proteina ili nukleinskih kiselina kao što su B7-1 i B7-2 (CD80 odnosno CD86,).
[0243] U skladu sa navodima, "uzorak tumora" je uzorak kao što je telesni uzorak koji sadrži tumorske ili kancerske ćelije kao što su cirkulišuće tumorske ćelije (CTC), posebno uzorak tkiva koji uključuje telesne tečnosti i/ili ćelijski uzorak. Prema navodima, "netumorogeni uzorak" je uzorak kao što je telesni uzorak koji ne sadrži tumorske ili kancerske ćelije kao što su cirkulišuće tumorske ćelije (CTC), posebno uzorak tkiva, uključujući telesne tečnosti i/ili ćelijski uzorak. Takvi telesni uzorci mogu se dobiti na konvencionalan način kao što je biopsija tkiva, uključujući "punch" biopsiju, i uzimanjem krvi, bronhijalnog aspirata, sputuma, urina, fecesa ili drugih telesnih tečnosti. Prema navodima, izraz "uzorak" uključuje i obrađeni uzorak kao što su frakcije ili izolati bioloških uzoraka, npr. nukleinska kiselina ili ćelijski izolati.
[0244] Terapijski aktivna sredstva, vakcine i kompozicije opisani u ovom tekstu mogu se primeniti bilo kojim konvencionalnim putem, uključujući primenu putem injekcije ili infuzije. Primena se može izvesti, na primer, oralno, intravenski, intraperitonealno, intramuskularno, subkutano ili transdermalno. U jednom primeru izvođenja, primena se obavlja intranodalno na primer injekcijom u limfni čvor. Druge forme primene predviđaju in vitro transfekciju antigenprezentujućih ćelija kao što su dendritske ćelije, nukleinskim kiselinama opisanim u ovom tekstu, posle čega sledi primena antigen-prezentujućih ćelija.
[0245] Sredstva opisana u ovom tekstu primenjuju se u efikasnim količinama. "Efikasna količina" odnosi se na količinu koja postiže željenu reakciju ili željeni efekat sama ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju lečenja određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija se poželjno odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo uključuje usporavanje napredovanja bolesti i, posebno, prekid ili reverziju napredovanja bolesti. Željena reakcija u lečenju bolesti ili stanja može biti i odlaganje pojave ili prevencija pojave pomenute bolesti ili pomenutog stanja.
[0246] Efikasna količina sredstva opisanog u ovom tekstu zavisiće od stanja koje se leči, jačine bolesti, individualnih pacijentovih parametara, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, dužinu trajanja tretmana, tip pridružene terapije ako je prisutna), specifični put primene i slične faktore. Prema tome, primenjene doze sredstava opisanih u ovom tekstu mogu zavisiti od različitih takvih parametara. U slučaju da reakcija kod pacijenta bude nedovoljna posle početne doze, mogu se upotrebiti veće doze (ili efektivno veće doze postignute različitim, više lokalizovanim putem primene).
[0247] Farmaceutske kompozicije prema navodima su poželjno sterilne i sadrže efikasnu količinu terapijski efikasne supstance za proizvođenje željene reakcije i željenog efekta.
[0248] Farmaceutske kompozicije prema navodima se obično daju u farmaceutski kompatibilnim količinama i u farmaceutski kompatibilnim preparatima. Izraz "farmaceutski kompatibilan" odnosi se na netoksični materijal koji ne interaguje sa dejstvom aktivne komponente farmaceutske kompozicije. Preparati ove vrste mogu obično sadržati soli, puferišuće supstance, prezervanse, nosače, dodatne imunopojačivačke supstance kao što su adjuvansi, npr., CpG oligonukleotidi, citokini, hemokini, saponin, GM-CSF i/ili RNK i, kada je pogodno, druga terapijski aktivna jedinjenja. Kada se koriste u medicini, soli bi trebalo da budu farmceutski kompatibilne. Međutim, soli koje nisu farmaceutski kompatibilne mogu da se koriste za pripremanje farmaceutski kompatibilnih soli i uključene su u skladu sa navodima. Farmakološki i farmaceutski kompatibilne soli ove vrste uključuju, bez ograničavanja, one koje su pripremljene od sledećih kiselina: hlorovodonične, bromovodonične, sumporne, azotne, fosforne, maleinske, sirćetne, salicilne, limunske, mravlje, malonske, sukcinske kiseline i slično. Farmaceutski kompatibilne soli mogu da se pripreme i kao soli alkalnih metala ili soli zemno-alkalnih metala, kao što su natrijumove soli, kalijumove soli ili kalcijumove soli.
[0249] Farmaceutska kompozicija prema navodima može sadržati farmaceutski kompatibilan nosač. Izraz "nosač" odnosi se na organsku ili neorgansku komponentu prirodne ili sintetske prirode, sa kojom se aktivna komponenta kombinuje da bi se olakšala primena. U skladu sa navodima, izraz "farmaceutski prihvatljivi nosač" uključuje jednu ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih potpornih supstanci, razblaživača ili inkapsulišućih supstanci, pogodnih za primenu kod pacijenta. Komponente farmaceutske kompozicije prema navodima obično su takve da ne dolazi do interakcije koja bi suštinski omela željenu farmaceutsku efikasnost.
[0250] Farmaceutske kompozicije prema navodima mogu sadržati pogodne puferišuće supstance kao što su sirćetna kiselina u vidu soli, limunska kiselina u vidu soli, borna kiselina u vidu soli i fosforna kiselina u vidu soli.
[0251] Farmaceutske kompozicije mogu, kada je pogodno, sadržati i pogodne prezervanse kao što su benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.
[0252] Farmaceutske kompozicije su obično obezbeđene u uniformin doznim formama i mogu se pripremiti na način koji je poznat kao takav. Farmaceutske kompozicije prema navodima mogu biti u vidu kapsula, tableta, lozengi, rastvora, suspenzija, sirupa, eliksira ili u vidu emulzije, na primer.
[0253] Kompozicije pogodne za parenteralnu primenu obično sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je poželjno izotoničan sa krvlju primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, obično se sterilna neisparljiva ulja koriste kao medijum za rastvor ili suspenziju.
[0254] Predmetni pronalazak je detaljno opisan slikama i primerima koji slede u nastavku, koji služe samo za ilustraciju.
SLIKE
[0255]
Slika 1:
Gore: Proces za otkrivanje i prioritizaciju verovatnih imunogenih somatskih mutacija u uzorcima osnovne mase tumora. Dole: Proces primenjen na B16 i Black6 sistem.
Slika 2: Primer validiranih mutacija u Kif18b
Mutacija identifikovana u genu Kif18b pomoću NGS egzom-sekvenciranja, koja je bila potvrđena Sangerovim sekvenciranjem. U ćelijama divljeg tipa, sekvenca je T/T. U tumorskim ćelijama, sekvenca je mešavina T/G.
Slika 3: Imunološka reaktivnost protiv mutiranih sekvenci
Miševi (n=5) su imunizovani dva puta (d0, d7) mutiranim peptidnim sekvencama (100 μg 50 μg PoliI:C; s.c.). Na dan 12 miševi su žrtvovani i izolovane su ćelije slezine. Izveden je IFNγ ELISpot uz korišćenje 5x10<5>slezinskih ćelija/bunarčiću kao efektora i 5x10<4>dendritskih ćelija kostne srži sa dodatim peptidima (2 μg/ml, 2 h na 37°C i 5% CO2) kao ciljnih ćelija. Efektorske ćelije slezine bile su testirane protiv mutiranog peptida, peptida divljeg tipa i kontrolnog peptida (nukleoprotein virusa vezikulostomatitisa, vesiculostomatitis virus nucleoprotein, VSV-NP, aa (amino acid, amino-kiselina) 52-59). Prikazana je srednja vrednost izmerenog broja tačaka od kojeg su oduzete pozadinske tačke protiv VSV-NP, za svakog miša (prazni krugovi: miševi imunizovani peptidom divljeg tipa; ispunjeni pravougaonici: miševi imunizovani mutiranim peptidima). Podaci su prikazani za svakog miša i uneta je srednja vrednost ± SEM.
Slika 4: Preživljavanje miševa vakcinisanih novoidentifikovanom mutiranom peptidnom sekvencom
B16F10 ćelije (7.5 x 10<4>) bile su inokulirane subkutano na d0. Miševi su vakcinisani peptidom 30 (Jerini Peptide Technologies (Berlin); 100 μg peptida 50 μg PoliI:C s.c. (Invivogen)) na dan -4, dan 2, dan 9. Kontrolna grupa primila je samo Poli I:C (50 μg s.c.). Rast tumora praćen je do dana 16 *, p < 0,05 u Log-rank (Mantel-Cox) testu. ;;Slika 5: ;(A) Primeri pojačane ekspresije proteina (levo eGFP, desno luciferaza) sa RNK optimizovanom u pogledu stabilnosti i translacione efikasnosti (B) Primer poliepitopske ekspanzije antigen-specifičnih CD8+ i CD4+ T ćelija sa RNK optimizovanom za efikasno usmeravanje antigena (v. referencu Kreiter, Konrad, Sester et al, Cancer Immunol. Immunother. 56: 1577-1587, 2007). T (C) Primer prekliničkog dokaza antitumorske efikasnosti u modelu B16 melanoma korišćenjem RNK vakcine koja kodira jedan epitop (OVA-SIINFEKL). Podaci o preživljavanju dobijeni su za miševe tretirane samo vakcinom ili vakcinom u kombinaciji sa adjuvansom. (D) Dizajn individualizovane, polineo-epitopske vakcine. Prenosilac za vakcinu integriše funksionalne elemente za povećanu ekspresiju i optimizovanu imunogenost. Do 30 mutiranih epitopa koji su razdvojeni linkerima može se integrisati po molekulu, u njihovom prirodnom sekvencionom kontekstu. ;;Slika 6: Dizajn konstrukta ;(A) Šematski dijagram RNK poliepitopskog konstrukta. "Cap": "cap" analogon; 5’UTR: 5’netranslatujući region; L: linker; Sekv. 1: RNK sekvenca kodirajuća za peptid koji sadrži mutiranu aa; 3’UTR: 3’netranslatujuća sekvenca; poli-A: poli-A rep. (B) Sekvenca RNK konstrukata kodirajućih za 2 aa sekvence koje uključuju mutirane aa iz B16F10. Start- i stop-kodon kao i signalni peptid i MITD sekvenca nisu deo šematskog crteža što je simbolizovano sa "....". ;Slika 7: Funkcionalnost RNK poliepitopa ;(A-C) Podaci za IFNγ ELISpot uz korišćenje 5 x 10<5>ćelija slezine po bunarčiću kao efektora i 5 x 10<4>BMDC kao ciljnih ćelija. BMDC se napune peptidom (2 μg/ml, 2 h na 37°C i 5% CO2) ili transfektuju sa RNK (20 μg) elektroporacijom. Kontrolna RNK bila je eGFP (leva tabla) ili RNK konstrukt kodirajući za 2 nesrodna peptida koja sadrže mutirane aa razdvojene linkerom. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM. (A) Podaci za mutacioni peptid 30, divlji tip peptida 30 i RNK koja kodira mutaciju 30 i 31 kako je pokazano. (B) Prikazani su podaci za mutacioni peptid 12, divlji tip peptida 12 i RNK kodirajuću za mutaciju 12 i 39. (C) Prikazan je reprezentativni ELISpot sken za jednog miša očitavanja pokazanog na (B). ;;Slika 8: Dva primera izvođenja RNK polineo-epitopskih vakcina koje pokazuju spojne epitope ;RNK vakcina može da se konstruiše sa (gore) ili bez (dole) linkera između peptida koji kodiraju mutaciju. Dobri epitopi uključuju one koji sadrže somatsku mutaciju ("*") i vezuju se za MHC molekule. Loši epitopi uključuju epitope koji se vezuju za MHC molekule, ali sadrže delove dva peptida (dole) ili delove peptidne i linkerske sekvence (gore).
Slika 9: Otkriće i karakterizacija "T-ćelijskog mutanoma koji se vezuje za lek" (A) Protočni dijagram daje pregled eksperimentalnog postupka počevši od B16F10 i C57BL/6 uzoraka do ELISPOT očitavanja. (B) Prikazani su broj pogodaka za svaki korak evaluacije i postupak selekcije mutacija za validaciju DNK i testiranje imunogenosti. Mutacije odabrane za validaciju i testiranje imunogenosti bile su one za koje je bilo pretpostavljeno da su imunogene i u genima eksprimiranim pri RPKM > 10.
(C) T-ćelijski mutanom koji se vezuje za lek mapiran je na genomu B16F10. Prstenovi spolja ka unutra označavaju sledeće podgrupe: (1) prisutan u svim triplikatima, (2) ima FDR < 0.05, (3) locirani su u protein-kodirajućim regionima, (4) izazivaju nesinonimne promene, (5) lokalizovani su u eksprimiranim genima i (6) u validacionom su setu. Mišji hromozomi (spoljni krug), gustina gena (zeleno), genska ekspresija (zeleno(nisko)/žuto/crveno(visoko)), i somatske mutacije (narandžasto).
Slika 10: Imunski odgovori pobuđeni in vivo vakcinacijom miševa mutacijom koja predstavlja duge sintetske peptide
1
(A,B) IFN-γ ELISPOT analiza T-ćelijskih efektora iz miševa vakcinisanih peptidima koji kodiraju mutacije. Stubići predstavljaju srednje vrednosti (±SEM) za 5 miševa po grupi. Zvezdice ukazuju na značajne razlike reaktivnosti protiv mutacije i divljeg tipa peptida (Studentov t-test; vrednost p < 0.05). (A) Splenociti vakcinisanih miševa bili su restimulisani sa BMDC transfektovanim mutacijom koja kodira peptid upotrebljen za vakcinaciju, odgovarajući peptid divljeg tipa i irelevantni kontrolni peptid (VSV-NP).
(B) Za analizu T-ćelijske reaktivnosti protiv endogeno obrađenih mutacija, splenociti vakcinisanih miševa restimulisani su sa BMDC transfektovanim sa kontrolnom RNK (eGFP) ili RNK koja kodira navedenu mutaciju. (C) Mutacija 30 (gen Kif18B, protein Q6PFD6, mutacija p.K739N). Sangerov sekvencioni trag i sekvenca mutacije (gore). Proteinski domeni i lokacija mutacije (dole).
Slika 11: Antitumorski efekti vakcina sa mutiranim peptidima kod miševa sa agresivno rastućim B16F10 tumorima
(A) C57BL/6 miševi (n = 7) inokulisani su sa 7.5 x 10<4>B16F10 ćelijama s.c. u bočni region miševa. Na dan 3 i 10 posle inokulacije tumora, miševi su bili vakcinisani sa 100 μg MUT30 ili MUT44 peptida 50 μg poli(I:C) ili samo adjuvansom. (B) C57BL/6 miševi (n = 5) primili su jednu imunizaciju od 100 μg MUT30 peptida 50 μg poli(I:C) na dan -4. Na dan 0, 7.5 x 10<4>B16F10 ćelija inokulisano je s.c u bočni region miševa. Buster imunizacije sa MUT30 peptidom (+ poli(I:C)) obavljena je na dane 2 i 9. Kaplan-Meierov dijagram preživljavanja (levo). Kinetika rasta tumora (desno).
Slika 12: Vakcinacija sa RNK koja kodira mutaciju dovodi do odgovora CD4+ i CD8+ T-ćelija
Podaci analize bojenja unutarćelijskih citokina, za IFN-γ, u CD4+ i CD8+ T-ćelijskim efektorima iz miševa vakcinisanih sa RNK koje kodiraju mutacije. RNK su kodirale 1 (monoepitop, gornji red), 2 (biepitop, srednji red), ili 16 (poliepitop, donji red) različitih mutacija. Tačke predstavljaju srednje vrednosti za 3 miša po grupi. Zvezdice ukazuju na statistički značajne razlike u reaktivnosti na mutaciju i kontrolni peptid (VSV-NP) (Studentov t-test; vrednost p < 0.05). FACS dijagrami prikazuju efektore iz životinja koje sekretuju najviše IFN-γ, za svaku mutaciju, i ukazuju na fenotip T-ćelijskog odgovora.
Slika 13: Vakcinacija poliepitopskom RNK koja kodira mutaciju, dovodi do odgovora T-ćelija na nekoliko mutacija
2
IFN-γ ELISPOT analiza T-ćelijskih efektora iz miševa vakcinisanih poliepitopom koji kodira mutaciju, koji uključuje 16 različitih mutacija. Stubići predstavljaju srednju vrednost (± SEM) za 3 miša po grupi. Fotografija prikazuje triplikatne bunarčiće za jednu reprezentativnu životinju restimulisanu naznačenim peptidima.
Slika 14: Vakcinacija sa 5 različitih model-epitopa kodiranih jednom RNK dovodi do imunskih odgovora na sve kodirane epitope
A) IFN-γ ELISPOT analiza T-ćelijskih efektora iz miševa vakcinisanih mutacijakodirajućim model-poliepitopom koji uključuje 5 različitih model-epitopa (SIINFEKL, Trp2, VSV-NP, Inf-NP, OVA klasa II). Splenociti su restimulisani navedenim peptidima. Tačke predstavljaju srednje vrednosti za triplikate bunarčića za 5 miševa po grupi. B) Pentamerno bojenje limfocita iz krvi jednog kontrolnog miša i jednog miša imunizovanog model-poliepitopom. Inf-NP Pentamer-obojene CD8+ ćelije specifične su za Inf-NP peptid.
Slika 15: mutacija koja indukuje CD4+ T-ćelije može indukovati snažni antitumorski efekat B16F10 melanoma u sinergiji sa slabim CD8+ T-ćelijskim epitopom
C57BL/6 miševi (n = 8) inokulisani su sa 1 x 10<5>B16F10 ćelija s.c. u bočni region. Na dane 3, 10 i 17 posle inokulacije tumora, miševi su vakcinisani sa 100 μg MUT30, Trp2 ili oba peptida 50 μg poli(I:C). A) Prikazane su srednje vrednosti kinetike rasta tumora za svaku grupu. Na dan 28 srednje vrednosti između grupe jednog tretmana i netretiranih životinja i kombinacione grupe bile su statistički značajne (Mann-Whitney test, pvrednost < 0.05). B) Kaplan-Meyer dijagram preživljavanja za različite grupe. Krive preživljavanja MUT30 i MUT30 Trp2 vakcinisanih miševa statistički su različite (logrank test, p-vrednost = 0.0029).
Slika 16: Pregled procesa pronalaženja somatskih mutacija u B16
Brojevi za pojedinačne korake dati su kao primer za jedan B16 uzorak, u poređenju sa jednim black6 uzorkom. "Egzoni" odnosi se na egzonske kordinate definisane svim protein-kodirajućim RefSeq transkriptima.
Slika 17: Vennov dijagram koji pokazuje brojeve somatskih varijacija u proteinkodirajućim egzonima, nađenih pomoću jednog, dva, odnosno sva tri softverska alata
Brojevi su izračunati posle filtriranja i predstavljaju konsenzus sva tri uzorka.
Slika 18: A Primeri nađenih varijacija pojedinačnih nukleotida: Somatska mutacija nađena u sva tri B16 uzorka (levo), nesomatska mutacija nađena u svim B16 i black6 uzorcima (sredina) i mutacija nađena samo u jednom black6 uzorku (desno). B Izračunata FDR distribucija za set podataka iz kojeg su izabrane validirane mutacije; distribucija je vizuelizovana kao prosečna procenjena ROC kriva sa sivim stubićima koji daju 95% interval pouzdanosti za srednju vrednost u obe dimenzije pri ujednačeno uzorkovanim pozicijama. Srednja vrednost je dobijena iz distribucije procenjenih ROC krivih FDR za svih mogućih 18 kombinacija (vidi tekst).
Slika 19: A Procenjene ROC krive za poređenje tri različita softverska alata (duplikati, 38x pokrivenost). B Procenjene ROC krive za poređenje različitih prosečnih sekvencirajućih dubina ("samtools", bez replika). 38x označava pokrivenost dobijenu eksperimentom, dok su druge pokrivenosti uzorkovane naniže počevši od ovog podatka.
C Procenjene ROC krive koje vizuelizuju efekat ponavljanja eksperimenta (38x pokrivenost, "samtools"). D Procenjene ROC krive za različite protokole sekvenciranja ("samtools", bez replika). Krive su izračunate korišćenjem rezultata biblioteke 2x100 nt.
Slika 20: A Deset validiranih mutacija sa najnižim FDR, odabranih korišćenjem optimalnog seta parametara iz finalnog seta od 2396 varijacija. Nijedna od ovih mutacija nije prisutna u dbSNP (verzija 128; asambliranje genoma mm9). B Relativna količina varijacija nađenih u istom setu podataka kao A za datu FDR graničnu vrednost, uneta zasebno za sve varijante u setu podataka i validirane mutacije. Da bi bilo vizuelno jasnije, prikazane su samo vrednosti od 0 do 10% FDR.
Slika 21: Antitumorska aktivnost mutacija-kodirajuće poliepitopske RNK vakcine C57BL/6 miševi (n = 10) inokulisani su sa 1 x 10<5>B16F10 ćelija s.c. u bočni region. Na dane 0 3, 6, 10, 17 i 21 posle inokulacije tumora, miševi su vakcinisani politopskom RNK formulisanom kao lipozomski RNK transfekcioni reagens. Kontrolna grupa je primila lipozome bez RNK. Slika prikazuje Kaplan-Meyerov dijagram preživljavanja za različite grupe. Krive preživljavanja su statistički različite (log-rank test, p-vrednost = 0.0008).
PRIMERI
4
[0256] Tehnike i postupci upotrebljeni u ovom tekstu opisani su ovde ili sprovedeni na način koji je poznat po sebi i kako je opisano, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Svi postupci koji uključuju upotrebu kitova i reagenasa izvedeni su prema uputstvima proizvođača, osim ako nije specifično naglašeno drugačije.
Primer 1: Detekcija i prioritizacija mutacija
[0257] Prvo prikazujemo sekvenciono profilisanje tumora i normalnih uzoraka za nepristrasno identifikovanje mutacija. Ovo smo pokazali ne samo za uzorke osnovnog tumora, nego je prvi put pokazana mogućnost identifikovanja mutacija iz pojedinačnih cirkulišućih tumorskih ćelija. Zatim, prioritizovali smo mutacije u pogledu uključivanja u polineo-epitopsku vakcinu na osnovu predviđene imunogenosti mutacije i pokazali da su identifikovane mutacije zaista imunogene.
Detekcija mutacija
[0258] Obrazloženje za upotrebu CTC: detekcija cirkulišućih tumorskih ćelija (CTC) iz periferne krvi pacijenata obolelih od kancera prepoznaje se kao nezavisni prognostički marker za klinički tok tumora (Pantel et al, Trends Mol Med 2010; 16(9):398-406). Tokom mnogo godina, klinički značaj CTC predmet je intenzivnih naučnih i kliničkih istraživanja u onkologiji. Pokazano je da detekcija CTC u krvi pacijenata sa metastatskim kancerom dojke, prostate i kolorektalnim kancerom ima prognostičku relevantnost, obezbeđujući informacije dodatne onima koje se dobijaju konvencionalnim tehnikama vizuelizacije i korišćenjem drugih prognostičkih tumorskih biomarkera. Uzastopno uzorkivanje krvi od pacijenta pre, tokom ranog stupnja, i posle lečenja terapijskim sredstvom (sistemski ili ciljano) obezbeđuje informacije o odgovoru ili izostanku odgovora na lečenje. Molekularna analiza CTC rezistentnih na lek može obezbediti dodatni uvid u mehanizme rezistencije (npr. mutacije u specifičnim signalnim putevima ili gubitak ciljane ekspresije) kod pojedinačnih pacijenata. Dodatna mogućnost proizašla iz profilisanja i genetičke karakterizacije CTC je identifikacija novih kancerskih ciljeva za razvoj novih ciljanih terapija. Ova nova dijagnostička strategija označena je kao "tečna tumorska biopsija". Pošto ovo profilisanje može da se vrši brzo i repetitivno, zahtevajući samo pacijentovu krv i bez hirurške intervencije, ono obezbeđuje uvid "u realnom vremenu" o stanju tumora.
[0259] Mutacije iz tumorskih ćelija: Našu sposobnost identifikovanja mutacija pokazali smo korišćenjem ćelija B16 melanoma, imobilisanjem egzoma za ekstrahovanje protein-kodirajućih regiona, sekvenciranjem sledeće generacije uz korišćenje našeg HiSeq 2000, što je bilo praćeno bioinformatičkom analizom korišćenjem našeg "iCAM" softverskog "cevovoda" (Slika 1). Identifikovali smo 2448 nesinonimnih mutacija i selektovali 50 za potvrdu. Mogli smo da potvrdimo svih 50 somatskih mutacija.
[0260] Sledi primer uticaja otkrivene somatske mutacije u ćelijama B16 melanoma na protein:
Kif18b, NM_197959, egzon 3
Mutacija (+15 aa)
SPSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLPS
Divlji tip (+15 aa)
SPSKPSFQEFVDWEKVSPELNSTDQPFLPS
[0261] Mutacije iz pojedinačnih cirkulišućih tumorskih ćelija (CTC): Zatim, mogli smo da identifikujemo tumor-specifične somatske mutacije na osnovu NGS profilisanja RNK iz pojedinačnih CTC. Obeležene B16 melanoma ćelije intravenski su injektirane u rep miševa, miševi su žrtvovani, krv je sakupljena iz srca, ćelije sortirane da se izdvoje obeležene cirkulišuće B16 ćelije (CTC), RNK je ekstrahovana, i izveden su SMART-bazirana cDNK sinteza i nespecifična amplifikacija, praćeno NGS RNA-Seq testom i zatim analizom podataka (dole).
[0262] Profilisali smo osam pojedinačnih CTC i identifikovali somatske mutacije. Pored toga, u osam od osam ćelija, identifikovane su somatske mutacije koje su i ranije bile identifikovane. U većem broju slučajeva, podaci su pokazali heterogenost na nivou pojedinačnih ćelija. Na primer, na poziciji 144078227 na hromozomu 2 (skup mm9), u genu Snx15, dve ćelije su pokazale referentni nukleotid (C) dok su dve ćelije pokazale mutirani nukleotid (T).
[0263] Ovo pokazuje da smo u mogućnosti da profilišemo pojedinačne CTC kako bismo identifikovali somatske mutacije, što je fundamentalni put ka iVAC (individualizovane vakcine) u "realnom vremenu", gde se pacijenti profilišu repetitivno i rezultati reflektuju trenutno pacijentovo stanje, a ne njegovo stanje u ranijim vremenskim tačkama. Pored toga, ovo pokazuje da smo u mogućnosti da identifikujemo heterogene somatske mutacije koje su prisutne u podgrupi tumorskih ćelija, što dopušta evaluaciju frekvencije mutacija na primer za identifikaciju glavnih mutacija i retkih mutacija.
Metode
[0264] Uzorci: Za eksperimente profilisanja, uzorci su uključivali uzorke iz repa, sa visine od 5-10 mm iz C57BL/6 miševa ("Black6") i visokoagresivne ćelije B16F10 mišjeg melanoma ("B16"), koje su originalno izvedene iz Black6 miševa.
[0265] Cirkulišuće tumorske ćelije (CTC) pripremljene su korišćenjem fluorescentno obeleženih B16 melanoma ćelija. B16 ćelije su resuspendovane u PBS i dodata im je jednaka zapremina sveže pripremljenog CFSE-rastvora (5 μM u PBS). Uzorak se blago vorteksuje i zatim inkubira 10 min na sobnoj temperaturi. Za zaustavljanje reakcije obeležavanja, uzorku se doda jednaka količina PBS koji sadrži 20% FSC i blago se promeša na vorteksu. Posle 20 min inkubacije na sobnoj temperaturi, ćelije se isperu dva puta korišćenjem PBS. Konačno, ćelije se resuspenduju u PBS i injektiraju intravenski (i.v.) u miševe. Posle 3 minuta miševi se žrtvuju i krv se sakupi.
[0266] Eritrociti iz uzoraka krvi liziraju se dodavanjem 1,5 ml sveže pripremljenog PharmLyse Solution (Beckton Dickinson) na 100 μl krvi. Posle jednog koraka ispiranja, 7-AAD se doda u uzorke i inkubira 5 min na sobnoj temperaturi. Inkubaciju prate dva koraka ispiranja i uzorak se resuspenduje u 500 μl PBS.
[0267] CFSE obeležene cirkulišuće B16 ćelije sortiraju se uz korišćenje Aria I sortera ćelija (BD). Pojedinačne ćelije se sortiraju na pločama sa 96 bunarčića sa "v"-dnom pripremljenim sa 50 μl/bunarčiću RLT pufera (Quiagen). Posle završenog sortiranja ploče se skladište na -80°C dok ne počne ekstrakcija nukleinske kiseline i pripremanje uzorka.
[0268] Ekstrakcija nukleinske kiseline i pripremanje uzorka: nukleinske kiseline iz B16 ćelija (DNK i RNK) i tkiva repa Black6 (DNK) ekstrahuju se korišćenjem Qiagen DNeasy kita za krv i tkivo (DNK) i Qiagen RNeasy mikro kita (RNK).
[0269] Za individualno sortirane CTC, RNK se ekstrahuje i izvedu se SMART-bazirana cDNK sinteza i nespecifična amplifikacija. RNK iz sortiranih CTC ćelija se ekstrahuje pomoću RNeasy mikro kita (Qiagen, Hilden, Germany) prema uputstvu dobavljača. Modifikovani BD SMART protokol se koristi za sintezu cDNK: Mint reverzna transkriptaza (Evrogen, Moscow, Russia) kombinuje se sa oligo(dT)-T-prajmerom "long" za prajmovanje reakcije sinteze prvog lanca i TS-"short" (Eurogentec S.A., Seraing, Belgium) uz uvođenje oligo(riboG) sekvence da se omogući kreiranje produženog templata terminalno-transferaznom aktivnošću reverzne transkriptaze i za "switch" templata [Chenchik, A., Y. et al.1998. Generation and use of high quality cDNA from small amounts of total RNA by SMART PCR. U: Gene Cloning and Analysis by RT-PCR. P. L. J. Siebert, ed. BioTechniques Books, MA, Natick.305-319]. Prvi lanac cDNK sintetisan prema instrukcijama proizvođača izloži se na 35 ciklusa amplifikacije sa 5 U PfuUltra Hotstart High-Fidelity DNK Polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) i 0.48 μM TS-PCR prajmera u prisustvu 200 μM dNTP (ciklirajući uslovi: 2 min na 95 °C, 30 s na 94 °C, 30 s na 65 °C, 1 min na 72 °C za finalnu ekstenziju od 6 min na 72 °C). Uspešna amplifikacija CTC gena kontroliše se specifičnim prajmerima za praćenje aktina i GAPDH.
[0270] Sekvenciranje sledeće generacije, sekvenciranje DNK: Imobilisanje egzoma za DNK resekvenciranje izvršeno je korišćenjem Agilent Sure-Select solution-baziranog testa imobilizacije [Gnirke A et al: Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat Biotechnol 2009, 27:182-189], u ovom slučaju dizajniranom za imobilisanje svih protein-kodirajućih regiona miša.
[0271] Ukratko, 3 μg prečišćene genomske DNK fragmentiše se u fragmente od 150-200 bp korišćenjem Covaris S2 ultrazvučnog uređaja. Izvrši se reparacija krajeva fragmenata gDNK korišćenjem T4 DNK polimeraze, Klenow DNK polymeraze i 5’ fosforilisanje korišćenjem T4 polinukleotid kinaze. Fragmenti gDNA sa tupim krajevima se 3’ adenillišu korišćenjem Klenow fragmenta (3’ ka 5’ egzo minus). "3’ single T-overhang" Illumina parni adapteri za krajeve vežu se za gDNK fragmente korišćenjem 10:1 molarnog odnosa adaptera prema genomskom DNK insertu uz upotrebu T4 DNK ligaze. Adapter-vezani gDNK fragmenti obogaćeni su pre imobilizacije, i specifične sekvence za protočne ćelije dodaju se korišćenjem Illumina PE PCR prajmera 1.0 i 2.0 i Herculase II polimeraze (Agilent) uz upotrebu 4 PCR ciklusa.
[0272] 500 ng za adapter vezanih, PCR-obogaćenih gDNK fragmenata hibridizuju se sa Agilent SureSelect biotinizovanim mamcima biblioteke RNK celog egzoma miša, 24 h na 65 °C. Mamci hibridizovanih gDNK/RNK kompleksa uklanjaju se korišćenjem streptavidinom obloženih magnetnih perlica. gDNK/RNK mamac-kompleksi isperu se i RNK mamci se odseku tokom eluiranja u SureSelect puferu za eluiranje, ostavljajući imobilisane za adapter vezane, PCR-obogaćene gDNK fragmente. gDNK fragmenti su PCR-amplifikovani posle zadržavanja korišćenjem Herculase II DNK polimeraze (Agilent) i SureSelect GA PCR prajmera tokom 10 ciklusa.
[0273] Sva uklanjanja nevezanih reagenasa obavljaju se korišćenjem 1,8x zapremina AMPure XP magnetnih perlica (Agencourt). Kontrola kvaliteta vrši se korišćenjem Invitrogen Qubit HS testa i veličina fragmenata se određuje korišćenjem Agilent 2100 Bioanalyzer HS DNK testa.
[0274] Egzom-obogaćene gDNK biblioteke grupisane su na cBot korišćenjem Truseq SR klaster kita v2.5 uz upotrebu 7 pM i 50 bps sekvencirano je na Illumina HiSeq2000 korišćenjem SBS kit-HS 50 bp.
[0275] Sekvenciranje sledeće generacije, sekvenciranje RNK (RNA-Seq): Barkodirane mRNA-seq cDNK biblioteke pripremljene su od 5 μg ukupne RNK korišćenjem modifikovane verzije Illumina mRNA-seq protokola. mRNK je izolovana korišćenjem Seramag Oligo(dT) magnetnih perlica (Thermo Scientific). Izolovana mRNK je fragmentisana korišćenjem dvovalentnih katjona i toplote, što je rezultovalo fragmentima u rasponu od 160-220 bp. Fragmentisana mRNK konvertovana je u cDNA korišćenjem nasumičnih prajmera i Super-ScriptII (Invitrogen), što je praćeno sintezom drugog lanca korišćenjem DNK polimeraze I i RNazeH. cDNK krajevi su reparirani korišćenjem T4 DNK polimeraze, Klenow DNK polimeraze i 5’ fosforilisani korišćenjem T4 polinukleotid kinaze. cDNK fragmenti zatupljenih krajeva su 3’ adenilisani korišćenjem Klenow fragmenta (3’ ka 5’ egzo minus). "3’ single T-overhang" Illumina multipleksni specifični adapteri vežu se korišćenjem 10:1 molarnog odnosa adaptera prema cDNK insertu, uz upotrebu T4 DNK ligaze.
[0276] cDNK biblioteke se prečiste i veličina se selektuje na 200-220 bp korišćenjem E-Gel 2% SizeSelect gela (Invitrogen). Obogaćivanje, dodavanje Illumina šestobaznog indeksa i specifičnih sekvenci za protočne ćelije obavljeno je pomoću PCR korišćenjem Phusion DNK polimeraze (Finnzymes). Sva uklanjanja nevezanih reagenasa obavljena su korišćenjem 1,8x zapremina gencourtAMPure XP magnetnih perlica. Kontrola kvaliteta je vršena korišćenjem Invitrogen Qubit HS testa i veličina fragmenata je određivana korišćenjem Agilent 2100 Bioanalyzer HS DNA testa.
[0277] Barkodirane RNA-Seq biblioteke grupisane su u klastere na cBot korišćenjem Truseq SR klaster kita v2.5 uz upotrebu 7 pM i 50 bps sekvencirano je na Illumina HiSeq2000 korišćenjem Truseq SBS kit-HS 50 bp.
[0278] CTC: Za profilisanje RNA-Seq CTC, upotrebljena je modifikovana verzija ovog protokola po kojoj je korišćeno 500-700 ng SMART amplifikovane cDNK, spareni završni adapteri su vezani i PCR obogaćivanje je obavljeno korišćenjem Illumina PE PCR prajmera 1.0 i 2.0.
[0279] NGS analiza podataka, genska ekspresija: Da bi se odredile vrednosti ekspresije, izlazna očitavanja sekvenci iz RNK uzoraka sa Illumina HiSeq 2000 preobrađivana su prema standardnom Illumina protokolu. Ovo uključuje filtriranje očitavanja niskog kvaliteta i demultipleksiranje. Za analizu RNA-Seq transkriptoma, očitavanja sekvenci se poravnavaju sa referentnom genomskom sekvencom [Mouse Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature, 420, 520-562 (2002)] korišćenjem "bowtie" (verzija 0.12.5) [Langmead B. et al. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol 10:R25] korišćenjem parametara "- v2 -best" za poravnavanje genoma i zadatih parametara za poravnavanja transkripta. Koordinate za poravnavanje upoređivane su sa egzonskim koordinatama RefSeq transkripata [Pruitt KD. et al. NCBI Reference Sequence (RefSeq): a curated non-redundant sequence database of genomes, transcripts and proteins. Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33(Database issue):D501-4] i za svaki transkript beleži se broj preklapajućih poravnanja. Očitavanja sekvenci neporavnatih sa genomskom sekvencom poravnavaju se sa bazom podataka svih mogućih egzon-egzon "junction"-sekvenci RefSeq transkripata. Brojanja očitavanja poravnatih sa splajsujućim spojnicama udružuju se sa respektivnim brojevima transkripata dobijenim u prethodnom koraku i normalizuju prema RPKM (broj očitavanja po kilobazi egzonskog modela na milion mapiranih očitavanja [Mortazavi, A. et al. (2008). Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by rna-seq. Nat Methods, 5(7):621-628]) za svaki transkript. Vrednosti genske ekspresije i egzonske ekspresije izračunavaju se na osnovu normalizovanog broja očitavanja koja preklapaju svaki gen, odnosno egzon.
[0280] Otkrivanje mutacija, osnovni tumor: 50 nt, jedan kraj, očitavanja sa Illumina HiSeq 2000 poravnaju se korišćenjem "bwa" (verzija 0.5.8c) [Li H. and Durbin R. (2009) Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics, 25:1754-60] uz upotrebu zadatih opcija, sa referentnim genomom miša, skup mm9. Dvoznačna očitavanja -ona očitavanja koja mapiraju više lokacija genoma - uklanjaju se, preostala poravnanja se sortiraju, indeksiraju i konvertuju u binarni i komprimovani format (binary and compressed format, BAM) i skorovi kvaliteta očitavanja konvertuju iz Illumina standard phred+64 u standardne Sangerove skorove kvaliteta korišćenjem programa "shell scripts".
[0281] Za svaku liniju sekvenciranja, mutacije se identifikuju korišćenjem tri softverska programa: uključujući samtools (verzija 0.1.8) [Li H. Improving SNP discovery by base alignment quality. Bioinformatics. 2011 Apr 15;27(8):1157-8. Epub 2011 Feb 13], GATK (verzija 1.0.4418) [McKenna A. et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 2010 Sep;20(9):1297-303. Epub 2010 Jul 19], i SomaticSniper (http://genome.wustl.edu /software/somaticsniper). Za samtools, koristi se opcija koju predlaže autor i kriterijumi filtera, uključujući prvi krug filtriranja, maksimalna pokrivenost 200. Za samtools, drugu rundu filtriranja, minimalni indel qualitativni skor bio je 50, za tačkastu mutaciju minimalni kvalitet je bio 30. Za GATK mutacioni odziv, pratili smo vodič najbolje prakse dizajniran od strane autora na GATK uputstvu za upotrebu (http://www.broadinstitute. org/gsa/wiki/index.php/The_Genome_Analysis_Toolkit). Korak rekalibrisanja varijantnog skora izostaje i zamenjuje se opcijom jakog filtriranja. Za SomaticSniper mutacioni odziv, koriste se zadate opcije i u nastavku se razmatraju samo predviđene mutacije sa "somatskim skorom" od 30 ili više.
[0282] Otkrivanje mutacija, CTC: Kao za iCAM proces za osnovni tumor, 50 nt, jedan kraj, očitavanja sa Illumina HiSeq 2000, poravnaju se korišćenjem "bwa" (verzija 0.5.8c) [5]) uz upotrebu zadatih opcija, sa referentnim genomom miša, skup mm9. Kako su CTC NGS očitavanja izvedena iz RNA-Seq testa, očitavanja su takođe poravnata sa sekvencama transkriptoma, uključujući egzon-egzon spojeve, koristeći "bowtie" (gore). Korišćenjem svih poravnavanja, nukleotidne sekvence iz očitavanja upoređuju se sa referentnim genomom i B16 mutacijama izvedenim iz osnovnog tumora. Identifikovane mutacije evaluirane su korišćenjem perl scripts i ručno, korišćenjem softverskih programa samtools i IGV (Integrated Genome Viewer) za prikazivanje rezultata.
[0283] Izlaz "otkrića mutacija" je identifikacija somatskih mutacija u tumorskim ćelijama, od uzoraka do NGS podataka, do liste mutacija. Koristeći resekvenciranje egzoma, u B16 uzorcima, identifikovali smo 2448 somatskih mutacija.
Prioritizacija mutacija
[0284] Zatim, pokazali smo mogućnost "cevovoda" prioritizacije mutacija za uključivanje u vakcinu. Ovaj metod nazvan "cevovod detekcije individualnih kancerskih mutacija" (cancer mutation detection pipeline, iCAM) identifikuje i vrši prioritizaciju somatske mutacije kroz niz koraka koji inkorporišu višestruke granične algoritme i bioinformatičke metode. Izlaz ovog procesa je spisak somatskih mutacija, prioritizovanih na osnovu verovatne imunogenosti.
[0285] Identifikacija somatskih mutacija: Mutacije se identifikuju korišćenjem tri različita algoritma, za B16 i Black6 uzorke (Otkrivanje mutacija, gore). Prvi iCAM korak je kombinovati izlazne liste iz svakog algoritma da bi se generisala visoko pouzdana lista somatskih mutacija. GATK i samtools saopštavaju varijante u jednom uzorku u odnosu na referentni genom. Da bi se selektovale visoko pouzdane mutacije sa malo lažno pozitivnih rezultata za dati uzorak (tj., tumor ili normalno), selektuju se mutacije koje su identifikovane u svim replikatima. Zatim, selektuju se varijante koje su prisutne u tumorskom uzorku, ali nisu prisutne u normalnom uzorku. SomaticSniper automatski saopštava potencijalne somatske varijacije iz parova podataka za tumorske i normalne uzorke. Dalje smo filtrirali rezultate intersekcijom rezultata dobijenih iz replikata. Da bi se uklonilo što je moguće više lažno pozitivnih odziva, pravili smo preseke liste mutacija izvedenih iz upotrebe sva tri algoritma i svih replikata. Finalni korak za svaku somatsku mutaciju je pripisivanje vrednosti pouzdanosti (p-vrednost) za svaku mutaciju na bazi dubine pokrivanja, SNP kvaliteta, kvaliteta konsenzusa i kvaliteta mapiranja.
1
[0286] Mutacioni uticaj: uticaj filtriranih, konsenzusnih, somatskih mutacija određen je skriptom unutar iCaM mutacionog "cevovoda". Prvo, mutacije do kojih dolazi u genomskim regionima koji nisu jedinstveni u genomu, što se dešava za neke proteinske paraloge i pseudogene, isključuju se iz analize jer se očitavanja sekvenci koje se poravnavaju sa većim brojem lokacija uklanjaju. Drugo, određuje se da li se mutacija dešava u transkriptu. Treće, određuje se da li se mutacija dešava u protein-kodirajućem regionu. Četvrto, sekvenca transkripta se translatuje sa i bez mutacije da bi se odredilo da li ima promene u aminokiselinskoj sekvenci.
[0287] Ekspresija mutacija: iCAM "cevovod" selektuje somatske mutacije koje se nalaze u genima i egzonima koji se eksprimiraju u tumorskim ćelijama. Nivoi ekspresije se određuju pomoću NGS RNA-Seq tumorskih ćelija (gore). Broj očitavanja koja preklapaju gen i egzon ukazuju na nivoe ekspresije. Ova brojanja se normalizuju prema RPKM (očitavanja po kilobazi model-egzona na milion mapiranih očitavanja, [Mortazavi A. et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods.2008 Jul;5(7):621-8. Epub 2008 May 30]) i selektuju se ona koja su eksprimirana iznad 10 RPKM.
[0288] MHC vezivanje: da bi se odredila verovatnoća da se epitop-sadržavajući mutirani peptid veže za MHC molekul, iCAM "cevovod" koristi modifikovanu verziju MHC predikcionog softvera iz Immune Epitope Database (http://www.iedb.org/). Lokalna instalacija uključuje modifikacije za optimizovanje protoka podataka kroz algoritam. Za B16 i Black6 podatke, predikcija se vrši korišćenjem svih raspoloživih black6 MHC klasa I alela i svih epitopa za dužine respektivnih peptida. Selektuju se mutacije koje spadaju u epitop rangiran u 95. persentilu distribucije predikcionog skora IEDB podataka za obučavanje (http://mhcbindingpredictions.immuneepitope.org/dataset.html), imajući u vidu sve MHC alele i sve potencijalne epitope koji preklapaju mutaciju.
[0289] Kriterijumi za selektovanje mutacija: somatske mutacije se selektuju prema sledećim kriterijumima: a) imaju jedinstveni sekvencioni sadržaj, b) identifikovane su pomoću sva tri programa, c) visoka mutaciona pouzdanost, d) nesinonimna promena proteina, e) visoka ekspresija transkripta, f) i povoljna predikcija vezivanja za MHC klase I.
[0290] Izlaz za ovaj proces je lista somatskih mutacija, prioritizovanih na osnovu verovatne imunogenosti. U B16 melanoma ćelijama, ima 2448 somatskih mutacija. 1247 njih nađeno je u genskim transkriptima. Od toga, 734 dovodi do nesinonimnih proteinskih promena. Od njih, 149 su u genima koji se eksprimiraju u tumorskim ćelijama. Od toga, predviđa se da će 102 od ovih eksprimiranih nesinonimnih mutacija biti prisutne na MHC molekulima. Ove 102 verovatno imunogene mutacije se zatim sprovode na potvrdu matacija (u nastavku).
2
Potvrda mutacija
[0291] Somatske mutacije iz DNK egzom-resekvenciranja potvrđene su jednim od dva metoda, resekvenciranjem mutiranog regiona i RNA-Seq analizom.
[0292] Za potvrdu mutacija resekvenciranjem, region genoma koji sadrži mutaciju bio je amplifikovan standardnom PCR od 50 ng tumorske DNK i normalne kontrolne DNK. Veličina amplifikovanih proizvoda bila je u opsegu od 150 do 400 nt. Specifičnost reakcije kontrolisana je nanošenjem proizvoda PCR na Qiaxel uređaj (Qiagen). PCR proizvodi su prečišćeni korišćenjem minElute PCR kita za prečišćavanje (Qiagen). Specifični PCR proizvodi su sekvencirani korišćenjem standardnog Sangerovog metoda sekvenciranja (Eurofins), praćenog elektroferogramskom analizom.
[0293] Potvrda mutacija obavlja se i ispitivanjem tumorske RNK. Ekspresione vrednosti tumorskog gena i egzona generišu se iz RNA-Seq (NGS RNK), što stvara nukleotidne sekvence koje su mapirane za transkripciju i brojane. Ispitali smo podatke za sekvence da bismo identifikovali mutacije u tumorskom uzorku [Berger MF. et al. Integrative analysis of the melanoma transcriptome. Genome Res. 2010 Apr;20(4):413-27. Epub 2010 Feb 23], obezbeđujući nezavisnu potvrdu somatskih mutacija izvedenih iz DNK.
Tabela 1: Lista gena koji sadrže 50 validiranih mutacija
4
Primer 2: IVAC selekcioni algoritam omogućava detekciju imunogenih mutacija
[0294] Da bi se ispitalo da li specifični T-ćelijski odgovori mogu da se indukuju protiv potvrđenih mutacija iz B16F10 melanoma ćelija, "naivni" C57BL/6 miševi (n=5/peptidu) imunizuju se dva puta (d0, d7) subkutano sa 100 μg peptida (+ 50 μg PoliI:C kao adjuvansa) uključujući mutirani ili divlji tip aa sekvence (vidi Tabelu 2). Svi peptidi imaju dužinu od 27 aa sa mutiranim/divljim tipom aa na centralnoj poziciji. Na dan 12, miševi se žrtvuju i ćelije slezine se prikupe. Kao metod očitavanja izvede se IFNγ ELISpot korišćenjem 5x10<5>slezinskih ćelija/bunarčiću kao efektora i 5x10<4>dendritskih ćelija iz kostne srži napunjenih peptidima (2 μg/ml) kao ciljnih ćelija. Efektorske slezinske ćelije testiraju se protiv mutiranog peptida, divljeg tipa peptida i kontrolnog peptida (nukleoprotein virusa vezikulostomatitisa, VSVNP).
[0295] Sa 44 testirane sekvence zapazili smo da 6 od njih indukuju T-ćelijsku imunost usmerenu samo protiv mutirane sekvence, ali ne i protiv divljeg tipa peptida (Sl.3).
[0296] Podaci pokazuju da identifikovane i prioritizovane mutacije mogu da se koriste da indukuju tumor specifičnu T-ćelijsku imunost pošto se upotrebe kao peptidne vakcine u antigen-"naivnim" miševima.
Tabela 2: Spisak mutiranih sekvenci koje indukuju T-ćelijsku reaktivnost specifičnu za mutirani u odnosu na divlji tip peptida. Aminokiselinska promena je podvučena.
Primer 3: Identifikovane mutacije mogu obezbediti terapijsku antitumorsku imunost
[0297] Sa ciljem validiranja da li identifikovane mutacije imaju potencijal da obezbede antitumorsku imunost posle vakcinisanja "naivnih" miševa, istraživali smo ovo pitanje uz upotrebu peptida za mutaciju broj 30 za koji je pokazano da indukuje mutaciono selektivnu reaktivnost T ćelija. B16F10 ćelije (7.5 x 10<4>) inokulisano je subkutano na d0. Miševi su vakcinisanim peptidom 30 (vidi tabelu 1; 100 μg peptida 50 μg PoliI:C s.c.) na dan -4, dan 2, i dan 9. Kontrolna grupa primila je samo Poli I:C (50 μg s.c.). Rast tumora praćen je svakog drugog dana. Na dan 16 zapazili smo da se samo kod 1 od 5 peptidom vakcinisanih miševa razvio tumor, dok su u kontrolnoj grupi 4 od 5 miševa pokazala rast tumora.
[0298] Podaci dokazuju da peptidna sekvenca koja inkorporiše B16F10 specifičnu mutaciju može obezbediti antitumorsku imunost koja može efikasno da razori tumorske ćelije (vidi Sl.
4). Pošto je B16F10 visoko agresivna tumorska ćelijska linija, nalaz da je metodologija primenjena za identifikovanje i prioritizaciju mutacija konačno dovela do selekcije mutacija koje su već po sebi potentne kao vakcina, važan su dokaz koncepta za čitav proces.
Primer 4: Podaci koji podržavaju poliepitopsku prezentaciju antigena
[0299] Validirane mutacije iz pacijentovih protein-kodirajućih regiona čine pul iz kojeg se mogu selektovati kandidati za sklapanje polineo-epitopskog templata za vakcinu, koji će se koristiti kao prekursor za GMP izradu RNK vakcine. Pogodne vektorske kasete kao osnov vakcine već su ranije opisane (Holtkamp, S. et al., Blood, 108: 4009-4017, 2006; Kreiter, S. et al., Cancer Immunol. Immunother., 56: 1577-1587, 2007; Kreiter, S. et al., J.Immunol., 180: 309-318, 2008). Poželjne vektorske kasete modifikovane su u svojim kodirajućim i netranslatujućim regionima (UTR) i osiguravaju maksimalnu translaciju kodiranog proteina tokom dužeg perioda (Holtkamp, S. et al., Blood, 108: 4009-4017, 2006; Kuhn, A. N. et al., Gene Ther., 17: 961-971, 2010). Pored toga, vektorska osnova sadrži antigen-usmeravajuće module za simultanu ekspanziju kako citotoksičnih tako i pomažućih T-ćelija (Kreiter, S. et al., Cancer Immunol. Immunother., 56: 1577-1587, 2007; Kreiter, S. et al., J. Immunol., 180: 309-318, 2008; Kreiter, S. et al., Cancer Research, 70 (22), 9031-9040, 2010 (Slika 5). Što je važno, dokazali smo da takva RNK vakcina može da se koristi za prezentovanje više epitopa u sklopu MHC klase I i klase II, istovremeno.
[0300] IVAC polineo-epitopske RNK sekvence vakcina sačinjene su od nizova koji sadrže do 30 amino-kiselina, koji uključuju mutaciju u centru. Ove sekvence su spojene "glava ka repu" preko kratkih linkera tako da formiraju polineo-epitopsku vakcinu koja kodira za do 30 ili više selektovanih mutacija i njihove bočne regione. Ovi za pacijenta specifični, individualno prilagođeni inserti su kodon-optimizovani i klonirani u gore opisanu RNK osnovu. Kontrola kvaliteta takvih konstrukata uključuje in vitro transkripciju i ekspresiju u ćelijama za validaciju funkcionalne transkripcije i translacije. Analiza translacije biće izvedena antitelima protiv cterminalnih ciljajući domena.
Primer 5: Naučni dokaz koncepta za RNK polineo-epitopski konstrukt
[0301] RNK polineo-epitopski koncept baziran je na dugoj in vitro transkribovanoj mRNK koja se sastoji od sekvenci aranžiranih u nizu, koje kodiraju mutirane peptide spojene linkerskim sekvencama (vidi Sl. 6). Kodirajuće sekvence su odabrane između nesinonimnih mutacija i uvek su izgrađene od kodona za mutiranu amino-kiselinu ograničenu regionima od 30 do 75 baznih parova iz originalnog sekvencionog konteksta. Linkerska sekvenca kodira aminokiseline koje se preferencijalno ne procesuju ćelijskom mašinerijom za procesovanje antigena. In vitro transkripcioni konstrukti bazirani su na pST1-A120 vektoru koji sadrži T7 promotor, tandem beta-globin 3’ UTR sekvencu i 120-bp poli(A) rep, za koje je pokazano da povećavaju stabilnost i translacionu efikasnost RNK, pojačavajući time kapacitet kodiranog antigena za stimulisanje T-ćelija (Holtkamp S. et al., Blood 2006; PMID: 16940422). Pored toga, insertovani su MHC klasa I-fragment signalnog peptida i transmembranski i citosolni domeni uključujući stop-kodon (MHC klasa I transportni signal ili MITD) koji ograničavaju polilinkersku sekvencu za kloniranje epitopa (Kreiter S. et al., J. Immunol., 180: 309-318, 2008). Pokazano je da ovo drugo povećava prezentaciju antigena, čime se pojačava ekspanzija antigen-specifičnih CD8+ i CD4+ T ćelija i poboljšavaju efektorske funkcije.
[0302] Za prvi dokaz koncepta, korišćeni su biepitopski vektori, tj. oni koji kodiraju jedan polipeptid koji sadrži dva mutirana epitopa. Kodon-optimizovane sekvence koje kodiraju za (i) mutirani epitop od 20 do 50 amino-kiselina, (ii) glicin/serin-bogati linker, (iii) drugi mutirani epitop od 20 do 50 amino-kiselina, i (iv) dodatni glicin/serin-bogati linker - ograničen pogodnim mestima prepoznavanja za restrikcione endonukleaze, koji će biti kloniran u pST1-bazirani konstrukt kako je gore opisano - dizajnirani su i sintetisani od strane komercijalnog dobavljača (Geneart, Regensburg, Germany). Posle verifikacije sekvence, vrši se kloniranje u pST1-baziranu vektorsku osnovu da se dobiju konstrukti kako je prikazano na Slici 6.
[0303] pST1-A120-bazirani plazmidi, kako je gore opisano, linearizovani su restrikcionom endonukleazom klase IIs. Linearizovane plazmidne DNK su prečišćene ekstrakcijom fenolhloroformom i precipitacijom etanolom. Linearizovane vektorske DNK kvantifikovane su spektrofotometrijski i podvrgnute in vitro transkripciji suštinski kako je opisano u Pokrovskaya and Gurevich (1994, Anal. Biochem. 220: 420-423). "Cap" analog dodat je u reakciju transkripcije da se dobiju RNK sa odgovarajuććim modifikovanim 5’-"cap" strukturama. U reakcijama, GTP je prisutan u količini od 1.5 mM, dok je "cap"-analog bio prisutan u količini od 6.0 mM. Svi drugi NTP bili su prisutni u količini od 7.5 mM. Na kraju reakcije transkripcije, linearizovana vektorska DNK bila je digestirana sa 0.1 U/μl TURBO DNaze (Ambion, Austin/TX, USA) 15 minuta na 37°C. RNK su prečišćene iz ovih reakcija korišćenjem MEGAclear kita (Ambion, Austin/TX, USA) po protokolu proizvođača. RNK koncentracija i kvalitet procenjivani su spektrofotometrijski i analizirani na 2100 Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA, USA).
[0304] Da bi se dokazalo da sekvenca koja inkorporiše mutiranu amino-kiselinu i koja je 5’-kao i 3’-ograničena linkerskom sekvencom može da se obradi, prezentuje i prepozna antigenspecifičnim T-ćelijama, kao efektorske ćelije koristili smo T-ćelije iz miševa vakcinisanih peptidom. U IFNγ ELISpot testirali smo da li T-ćelije indukovane vakcinacijom peptidom kako je gore opisano, mogu da prepoznaju ciljne ćelije (dendritske ćelije kostne srži BMDC) stimulisane peptidom (2 μg/ml tokom 2 h na 37°C i 5% CO2) ili transfektovane sa RNK (20 μg proizvedeno kako je gore opisano) elektroporacijom. Kako je primerom prikazano na Sl.7 za mutaciju 12 i 30 (vidi tabelu 2) mogli smo da zapazimo da RNK konstrukt može dati epitop koji se prepoznaje T ćelijama specifičnim za mutaciju.
[0305] Uz date podatke, mogli smo da prikažemo da RNK-kodirani polineo-epitop koji uključuje linker bogat glicinom/serinom može da se translatuje i procesuje u antigenprezentujućim ćelijama, dovodeći do prezentacije ispravnog epitopa koji biva prepoznat antigen-specifičnim T ćelijama.
Primer 6: Dizajn polineo-epitopske vakcine -relevantnost linkera
[0306] Polineo-epitopski RNK konstrukt sadrži osnovni konstrukt u koji je stavljeno više somatskim mutacijama kodiranih peptida spojenih linkerskom peptidnom sekvencom. Pored optimizacije kodona i porasta stabilnosti RNK i translacione efikasnosti zbog osnove, jedan primer izvođenja RNK polineo-epitopske vakcine sadrži linkere dizajnirane da povećaju prezentaciju antigenih peptida u sklopu MHC klase I i II i smanje prezentaciju štetnih epitopa.
[0307] Linker: linkerska sekvenca dizajnirana je da spoji više peptida koji sadrže mutaciju. Linker bi trebalo da omogući kreaciju i prezentaciju mutacionog epitopa uz ometanje stvaranja štetnih epitopa, kao što su oni stvoreni na spojevima između susednih peptida ili između linkerske sekvence i endogenih peptida. Ovi "spojeni" epitopi ne samo da mogu kompetirati sa željenim epitopima za prezentovanje na površini ćelije, smanjujući efikasnost vakcine, nego mogu da generišu neželjenu autoimunsku reakciju. Prema tome, dizajnirali smo linkersku sekvencu za a) izbegavanje stvaranja "spoj"-peptida koji se vezuju za MHC molekule, b) izbegavanje obrade proteazomima, koja bi stvorila "spoj"-peptide, c) efikasnu translaciju i obradu proteazomom.
[0308] Da bi se izbeglo stvaranje "spoj"-peptida koji se vezuju za MHC molekule, uporedili smo različite linkerske sekvence. Glicin, na primer, inhibira jako vezivanje na pozicijama vezujućeg žleba MHC [Abastado JP. et al., J Immunol.1993 Oct 1;151(7): 3569-75]. Ispitali smo veći broj linkerskih sekvenci i veći broj dužina linkera i izračunali broj "spoj"-peptida koji se vezuju za MHC molekule. Upotrebili smo softverske alate iz baze podataka imunskih epitopa (Immune Epitope Database, IEDB, http://www.immuneepitope.org/) da izračunamo verovatnoću da data peptidna sekvenca sadrži ligand koji će se vezati za MHC molekule klase I.
[0309] U B16 modelu, identifikovali smo 102 eksprimirane, nesinonimne somatske mutacije za koje je predviđeno da će biti prezentovane u sklopu MHC molekula klase I. Korišćenjem 50 potvrđenih mutacija, kompjuterski smo dizajnirali različite konstrukte za vakcine, bez linkera ili uz korišćenje različitih linkerskih sekvenci, i kompjuterski odredili broj štetnih "spoj"-peptida korišćenjem IEDB algoritma (Slika 8).
[0310] Tabela 5 prikazuje rezultate za nekoliko različitih linkera, linkera različitih dužina, i bez linkera i uz korišćenje pet linkera. Broj MHC-vezujućih "spoj"-peptida u rasponu je od 2 do 91 za predikcije epitopa sa 9 aa i 10 aa (gore i u sredini). Veličina linkera utiče na broj "spoj"-peptida (dole). Za ovu sekvencu, predviđeni su bar 9 aa-epitopi za 7 aa-linkersku sekvencu GGSGGGG.
[0311] Linker 1 i Linker 2 upotrebljeni u RNK polineo-epitopskim vakcinskim konstruktima testiranima eksperimentalno (vidi kasnije) takođe su imali pogodno mali broj predviđenih neoepitopa sa spojem. Ovo važi za predikcije 9-mera i 10-mera.
[0312] Ovo pokazuje da je sekvenca linkera od kritične važnosti za stvaranje loših MHC-vezujućih epitopa. Pored toga, dužina linkerske sekvence utiče na broj loših MHC-vezujućih epitopa. Našli smo da sekvence koje su bogate G ometaju stvaranje MHC-vezujućih liganda.
Tabela 3. Uticaj linkera (epitopi od 10 aa). Predviđeni broj loših epitopa definisanih kao epitopi koji se vezuju za MHC klase I, koji sadrže spojne sekvence, za svaki peptidni linker. Ovde se razmatraju epitopi sa 10 amino-kiselina. Glicinom bogati linkeri imaju najmanje "spoj"-epitopa.
Tabela 4. Uticaj linkerskog dela (9 aa-epitopi). Predviđeni broj loših epitopa, definisanih kao epitopi koji se vezuju za MHC klase I, koji sadrže spojne sekvence, za svaki peptidni linker. Ovde se razmatraju epitopi sa 9 aa. Glicinom bogati linkeri imaju najmanje spojepitopa.
Tabela 5: Uticaj linkerskog dela. Predviđeni broj loših epitopa, definisanih kao epitopi koji se vezuju za MHC klase I, koji sadrže spojne sekvence, za svaki peptidni linker. Ovde se razmatraju epitopi sa 9 aa. Gore: broj 9 aa "spoj"-epitopa kada se izostavi linker i za 5 različitih linkera. Sredina: broj 10 aa "spoj"-epitopa kada se izostavi linker i za 5 različitih linkera. Dole: broj 9 aa spoj-epitopa za slične linkere različite dužine. Glicinom bogati linkeri imaju najmanje "spoj"-epitopa.
1
[0313] Da bi se izbegla obrada proteazomima, koja bi mogla da dovede do nastanka "spoj"-peptida, ispitali smo korišćenje različitih amino-kiselina u linkeru. Glicinom bogate sekvence ometaju obradu proteazomima [Hoyt MA et al. (2006). EMBO J 25 (8): 1720-9; Zhang M. and Coffino P. (2004) J Biol Chem 279 (10): 8635-41]. Prema tome, glicinom bogate linkerske sekvence deluju tako da na najmanju meru svedu broj linker-sadržavajućih peptida koji mogu da se obrađuju proteazomima.
[0314] Linker treba da omogući peptidima koji sadrže mutaciju da se efikasno translatuju i obrade proteazomima. Amino-kiseline glicin i serin su fleksibilne [Schlessinger A and Rost B., Proteins. 2005 Oct 1;61(1):115-26]; njihovo uključivanje u linker rezultuje fleksibilnijim proteinom. Inkorporisali smo glicin i serin u linker da bi povećali fleksibilnost proteina, što bi omogućilo efikasniju translaciju i obradu proteazomom, što bi onda omogućilo bolji pristup kodiranim antigenim peptidima.
[0315] Prema tome, linker bi trebalo da bude bogat glicinom da bi se omelo vezivanje loših epitopa za MHC; trebalo bi da se omete sposobnost proteazoma da obradi linkerski peptid, što može da se obavi uključivanjem glicina; trebalo bi da bude fleksibilan da bi se povećao pristup peptidima koji sadrže mutaciju, što se može postići kombinacijom glicinskih i serinskih aminokiselina. Prema tome, u jednom primeru izvođenja konstrukta vakcine prema navodima, sekvence GGSGGGGSGG i GGSGGGSGGS poželjno su uključene kao linkerske sekvence.
2
Primer 7: RNK polineo-epitopske vakcine
[0316] RNK polineo-epitopski konstrukti vakcina bazirani su na pST1-A120 vektoru koji sadrži T7 promotor, tandem beta-globin 3’ UTR sekvencu i 120-bp poli(A) rep, za koji je pokazano da povećava stabilnost i translacionu efikasnost RNK, povećavajući time kapacitet kodiranog antigena da stimuliše T-ćelije ((Holtkamp S. et al., Blood 2006; PMID: 16940422). Pored toga, insertovani su signalni peptidni fragment za MHC klasu I i transmembranski i citosolni domen uključujući stop-kodon (MHC klasa I transportni ili MITD) koji se nalaze bočno uz polilinkersku sekvencu za kloniranje epitopa (Kreiter S. et al., J. Immunol., 180: 309-318, 2008). Za ovaj drugi je pokazano da povećava prezentaciju antigena, čime se pojačava ekspanzija antigen-specifičnih CD8+ i CD4+ T ćelija i poboljšavaju efektorske funkcije.
[0317] Da bi se obezbedili RNK polineo-epitopski konstrukti za 50 identifikovanih i validiranih mutacija B16F10 generisana su 3 RNK konstrukta. Konstrukt se sastoji od kodonoptimizovanih sekvenci koje kodiraju (i) mutirani epitop od 25 amino-kiselina, (ii) linker bogat glicinom/serinom, (iii) ponovke mutirane epitopske sekvence praćena linkerom bogatim glicinom/serinom. Lanac mutiranog epitopa koji sadrži sekvence i linkere bočno je ograničen pogodnim mestima prepoznavanja za restrikcione endonukleaze koje će biti klonirane u pST1-bazirani konstrukt, kako je gore opisano. Konstrukti vakcina dizajnirani su i sintetisani pomoću GENEART. Posle verifikacije sekvence, ovo se klonira u pST1-baziranu vektorsku osnovu da se dobiju RNK polineo-epitopski konstrukti vakcine.
Opis kliničkog pristupa
[0318] Klinička primena obuhvata sledeće korake:
• Potrebno je da pacijenti koji ispunjavaju uslove daju pristanak za DNK analizu sekvenciranjem sledeće generacije.
• Tumorski uzorak dobijen rutinskom dijagnostičkom procedurom (tkivo fiksirano u formalinu i ukalupljeno u parafinu) i ćelije periferne krvi dobiće se i upotrebiti za mutacionu analizu, kako je opisano.
• Otkrivene mutacije će se potvrditi
• Na osnovu prioritizacije, dizajniraće se vakcina. Za RNK vakcine master plazmidni templat generisaće se genskom sintezom i kloniranjem
• Plazmidi će se upotrebiti za RNK proizvodnju kliničkog stepena, kontrolu kvaliteta i oslobađanje RNK vakcine.
• Lekoviti proizvod u vidu vakcine poslaće se u odgovarajuće centre za ispitivanje, da bi se klinički primenio.
• RNK vakcina može da se koristi kao gola vakcina u formulacionom puferu ili inkapsulirana u nanopartikule ili lipozome za direktno injektiranje u npr. limfne čvorove, s.c., i.v, i.m. Alternativno, RNK vakcina može da se koristi za in vitro transfekciju npr. dendritskih ćelija za usvajajući transfer.
[0319] Čitav klinički proces traje manje od 6 nedelja. Tokom "faze zaostajanja" između pacijentovog pristanka i dostupnosti leka pažljivo će se razmatrati protokol kliničkog ispitivanja, uključujući dopuštanje nastavka standardnih režima lečenja dok lekoviti proizvod koji se ispituje ne postane dostupan.
Primer 8: Identifikacija tumorskih mutacija i njihovo korišćenje za vakcinisanje protiv tumora
[0320] Primenili smo NGS egzomsko resekvenciranje za otkrivanje mutacije u ćelijskoj liniji B16F10 mišjeg melanoma i identifikovali 962 nesinonimne somatske tačkaste mutacije, 563 u eksprimiranim genima. Potencijalne vodeće mutacije dešavaju se u klasičnim tumorsupresorskim genima (Pten, Trp53, Tp63, Pml) i genima uključenim u protoonkogene signalne puteve koji kontrolišu proliferaciju ćelija (npr. Mdm1, Pdgfra), ćelijsku adheziju i migraciju (npr. Fdz7, Fat1) ili apoptozu (Casp9). Pored toga, B16F10 nosi mutacije u Aim1 i Trrap za koje je prethodno opisano da su često izmenjene u humanom melanomu.
[0321] Imunogenost i specifičnost 50 validiranih mutacija testirane su korišćenjem C57BL/6 miševa imunizovanih dugim peptidima koji kodiraju mutirane epitope. Pokazano je da je jedna trećina (16/50) njih imunogena. Od toga, 60% pobuđenih imunskih odgovora preferencijalno je usmereno protiv mutirane sekvence, u poređenju sa sekvencom divljeg tipa.
[0322] Testirali smo hipotezu u modelima transplantacije tumora. Imunizacija peptidima obezbeđuje in vivo kontrolu tumora u protektivnoj i terapijskoj postavci, kvalifikujući mutirane epitope koji sadrže pojedinačne aminokiselinske supstitucije kao efikasne vakcine.
Životinje
[0323] C57BL/6 miševi (Jackson Laboratories) držani su u skladu sa saveznim i državnim pravilnikom o istraživanjima na životinjama na Univerzitetu u Majncu.
Ćelije
4
[0324] B16F10 ćelijska linija melanoma nabavljena je 2010. od American Type Culture Collection (Proizvod: ATCC CRL-6475, broj partije: 58078645). Rane (treća, četvrta) pasaže ćelija upotrebljene su za eksperimente sa tumorima. Ćelije su rutinski testirane na Mycoplasma. Ponovna autentifikacija ćelija nije vršena od prijema.
Sekvenciranje sledeće generacije
[0325] Ekstrahovanje nukleinske kiseline i pripremanje uzorka: DNK i RNK ćelija iz osnovnog tumora B16F10 i DNK iz C57BL/6 tkiva repa ekstrahovane su u triplikatu korišćenjem Qiagen DNeasy kita za krv i tkivo (za DNK) i Qiagen RNeasy mikro kita (za RNK).
[0326] Sekvenciranje DNK egzoma: Imobilisanje egzoma za resekvenciranje DNK obavljeno je u triplikatu korišćenjem Agilent Sure-Select mišjeg na rastvoru baziranog imobilizacionog testa (Gnirke A et al., Nat Biotechnol 2009;27:182-9), dizajniranog za zadržavanje svih mišjih protein-kodirajućih regiona. 3 μg prečišćene genomske DNK (gDNK) fragmentiše se u delove od 150-200 bp korišćenjem Covaris S2 ultrazvučnog uređaja. Krajevi fragmenata se repariraju i 5’ fosforilišu i 3’ adenilišu prema uputstvima proizvođača. Illumina parni adapteri za krajeve vežu se za gDNK fragmente korišćenjem 10:1 molarnog odnosa adaptera prema gDNK. Obogaćene prezadržavajuće sekvence i sekvence specifične za protočne ćelije dodaju se korišćenjem Illumina PE PCR prajmera 1.0 i 2.0 tokom 4 PCR ciklusa.500 ng adapter-vezanih, PCR obogaćenih gDNK fragmenata hibridizuje se sa Agilent SureSelect biotinizovanim mamcima biblioteke RNK celog egzoma miša, 24 h na 65 °C. Hibridizovani kompleksi gDNK/RNK mamci, uklone se korišćenjem streptavidinom obloženih magnetnih perlica, isperu i RNK mamci se odseku tokom eluiranja u SureSelect puferu za eluiranje. Ovi eluirani gDNK fragmenti se amplifikuju pomoću PCR posle zadržavanja, u 10 ciklusa. Egzomske obogaćene gDNK biblioteke grupišu se na cBot korišćenjem Truseq SR klaster-kita v2.5 uz upotrebu 7 pM i 50 bps se sekvencira na Illumina HiSeq2000 pomoću Truseq SBS kit-HS 50 bp.
[0327] RNK genska ekspresija i profilisanje "transkriptoma" (RNA-Seq): Barkodirane mRNA-seq cDNK biblioteke pripreme se u triplikatu, od 5 μg ukupne RNK (modifikovani Illumina mRNA-seq protokol). mRNK se izoluje korišćenjem Seramag Oligo(dT) magnetnih perlica (Thermo Scientific) i fragmentiše korišćenjem dvovalentnih katjona i toplote. Dobijeni fragmenti (160-220 bp) konvertuju se u cDNK korišćenjem nasumičnih prajmera i SuperScriptII (Invitrogen), što je praćeno sintezom drugog lanca korišćenjem DNK polimeraze I i RNazeH. cDNK krajevi se repariraju, 5’ fosforilišu i 3’ adenilišu prema uputstvima proizvođača. "3’ single T-overhang" Illumina multipleksni specifični adapteri vežu se T4 DNK ligazom korišćenjem10:1 molarnog odnosa adaptera prema cDNK insertu uz upotrebu T4 DNK ligaze. cDNK biblioteke se prečiste i selektuje se veličina od 200-220 bp (E-Gel 2% SizeSelect gel, Invitrogen). Obogaćivanje, dodavanje šestobaznog indeksa i specifičnih sekvenci za protočne ćelije obavlja se pomoću PCR, korišćenjem Phusion DNK polimeraze (Finnzymes). Sva uklanjanja nevezanih reagenasa u ovom koraku obavljena su korišćenjem 1,8x zapremina gencourtAMPure XP magnetnih perlica. Kontrola kvaliteta je vršena korišćenjem Invitrogen Qubit HS testa i veličina fragmenata je određivana korišćenjem Agilent 2100 Bioanalyzer HS DNA testa. Barkodirane mRNA-seq biblioteke grupisane su i sekvencirane kako je opisano gore.
[0328] NGS analiza podataka, ekspresija gena: Izlazna očitavanja sekvenci sa RNK uzoraka preprocesovana su u skladu sa Illumina standardnim protokolom, uključujući filtriranje za očitavanja niskog kvaliteta. Očitavanja sekvenci poravnata su sa mm9 referentnom genomskom sekvencom (Waterston RH et al., Nature 2002;420:520-62) pomoću "bowtie" (verzija 0.12.5) (Langmead B et al., Genome Biol 2009;10:R25). Za poravnavanja genoma, dozvoljena su dva loša poklapanja i samo se najbolje poravnanje ("-v2 -best") beleži; za poravnavanje transkriptoma koriste se zadati parametri. Očitavanja koja ne mogu da se poravnaju sa genomskom sekvencom poravnata su sa bazom podataka svih mogućih egzon-egzon spojnih sekvenci RefSeq transcripata (Pruitt KD et al., Nucleic Acids Res 2007;35:D61-D65). Vrednosti ekspresije određene su intersekcijom očitanih koordinata sa onima od RefSeq transkripata, brojanjem preklapajućih egzonskih i spojnih očitavanja, i normalizacijom prema RPKM ekspresionim jedinicama (očitavanja koja mapiraju po kilobazi egzonskog modela na milion mapiranih očitavanja) (Mortazavi A et al., Nat Methods 2008;5:621-8).
[0329] NGS analiza podataka, otkriće somatskih mutacija: Somatske mutacije su identifikovane kako je opisano u Primeru 9. 50 nukleotida (nt), očitavanja sa jednog kraja, poravnata su sa mm9 referentnim mišjim genomom korišćenjem "bwa" (zadate opcije, verzija 0.5.8c) (Li H and Durbin R, Bioinformatics 2009;25:1754-60). Uklanjaju se dvosmislena očitavanja koja mapiraju više lokacija genoma. Mutacije se identifikuju korišćenjem tri softverska programa: samtools (version 0.1.8) (Li H, Bioinformatics 2011;27:1157-8), GATK (verzija 1.0.4418) (McKenna A et al, Genome Res 2010;20:1297-303), i SomaticSniper (http://genome.wustl.edu/software/somaticsniper) (Ding L et al., Hum Mol Genet 2010;19:R188-R196). Potencijalne varijacije identifikovane u svim B16F10 triplikatima označavaju se kao vrednost pouzdanosti "stope lažnog otkrivanja" (FDR) (uporediti sa Primerom 9).
Selekcija mutacija, validacija i funkcija
[0330] Selekcija: Mutacije treba da ispune sledeće kriterijume da bi bile odabrane: (i) prisustvo u svim B16F10 i odsustvo u svim C57BL/6 triplikatima, (ii) FDR ≤0.05, (iii) homogenost u C57BL/6, (iv) sreću se u RefSeq transkriptu, i (v) dovode do nesinonimnih promena koje će se oceniti kao autentične mutacije. Selekcija za validaciju i testiranje imunogenosti zahtevaju da su mutacije eksprimirani geni (medijana RPKM duž replikata >10).
[0331] Validacija: DNK-izvedene mutacije klasifikuju se kao validirane ako su bile potvrđene Sangerovim sekvenciranjem ili B16F10 RNA-Seq očitavanjima. Sve selektovane varijante bile su amplifikovane od 50 ng DNK iz B16F10 ćelija i C57BL/6 tkiva repa korišćenjem bočnograničnih prajmera, produkti su vizuelizovani (QIAxcel sistem, Qiagen) i prečišćeni (QIAquick PCR Purification kit, Qiagen). Amplikon očekivane veličine isečen je sa gela, prečišćen (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen) i podvrgnut Sangerovom sekvenciranju (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Germany) sa uzvodnim prajmerima upotrebljenim za PCR amplifikaciju.
[0332] Funkcionalni uticaj: Programi SIFT (Kumar P et al., Nat Protoc 2009;4:1073-81) i POLYPHEN-2 (Adzhubei IA et al., Nat Methods 2010;7:248-9), koji vrše predikciju funkcionalnog značaja amino-kiseline na funkciju proteina na osnovu lokacije proteinskog domena i konzervacije sekvence među vrstama, iskorišćeni su za procenu uticaja odabranih mutacija. Ingenuity IPA alati upotrebljeni su za zaključivanje o funkciji gena.
Sintetski peptidi i adjuvansi
[0333] Svi peptidi uključujući ovalbumin klase I (OVA258-265), klase II (OVA klase II330-338), nukleoprotein influence (Inf-NP366-374), nukleoprotein virusa vezikulostomatitisa (VSV-NP52-
59) i sa tirozinazom vezani protein 2 (Trp2180-188) kupljeni su od Jerini Peptide Technologies (Berlin, Germany). Sintetski peptidi su bili dugi 27 amino-kiselina sa mutiranim (MUT) ili divljim tipom (WT) amino-kiseline na poziciji 14. Poliinozinska:policitidilna kiselina (poli(I:C), InvivoGen) upotrebljena je kao subkutano injektirani adjuvans. MHC-pentamer specifičan za Inf-NP366-374peptid kupljen je od ProImmune Ltd.
Imunizacija miševa
[0334] Ženke C57BL/6 miševa odgovarajuće starosti injektirane su subkutano sa 100 μg peptida i 50 μg poli(I:C) formulisanih u PBS (ukupna zapremina 200 μl) u bočni region (5 miševa po grupi). Svaka grupa je imunizovana na dan 0 i dan 7 sa dva različita mutacijama kodirana peptida, jedan peptid po boku. Dvanaest dana posle prve injekcije miševi su žrtvovani i splenociti su izolovani za imunološko testiranje.
[0335] Alternativno, ženke C57BL/6 miševa odgovarajuće starosti injektirane su intravenski sa 20 μg in vitro transkribovane RNK formulisane sa 20 μl Lipofectamine™ RNAiMAX (Invitrogen) u PBS u ukupnoj zapremini injekcije od 200 μl (3 miša po grupi). Sve grupe su imunizovane na dan 0, 3, 7, 14 i 18. Dvadeset tri dana posle prve injekcije miševi su žrtvovani i splenociti su izolovani za imunološko testiranje. DNK-sekvence koje predstavljaju jednu (Monoepitop), dve (Biepitop), ili 16 mutacija (Poliepitop) konstruisane su korišćenjem 50 amino-kiselina sa mutacijom na poziciji 25 (Biepitop) ili 27 aa sa mutacijom na poziciji 14 (Mono- i Poliepitop), bile su razdvojene glicin/serin linkerom od 9 aa i klonirane u pST1-2BgUTR-A120 osnovu (Holtkamp et al., Blood 2006;108:4009-17). In vitro transkripcija sa ovog templata i prečišćavanje opisani su ranije (Kreiter et al., Cancer Immunol Immunother 2007;56:1577-87).
Enzimski imunospot test
[0336] Enzimski imunospot (enzyme-linked immunospot, ELISPOT) test (Kreiter S et al., Cancer Res 2010;70:9031-40) i generisanje singenih dendritskih ćelija poreklom iz kostne srži (BMDC) kao stimulatora ranije su opisani (Lutz MB et al., J Immunol Methods 1999;223:77-92). BMDC bile su podstaknute peptidom (2 μg/ml), ili transfektovane sa in vitro transkribovanom (IVT) RNK kodirajućom za navedenu mutaciju ili za kontrolnu RNK (eGFP-RNK). Sekvence koje predstavljaju dve mutacije, svaka sadrži 50 amino-kiselina sa mutacijom na poziciji 25 i razdvojene glicin/serinskim linkerom od 9 aa klonirane su u pST1-2BgUTR-A120 osnovu (Holtkamp S et al., Blood 2006;108:4009-17). In vitro transkripcija sa ovog templata i prečišćavanje ranije su opisani (Kreiter S et al., Cancer Immunol Immunother 2007;56:1577-87). Za test, 5 × 10<4>peptida ili RNK inženjerisanih BMDC koinkubirane su sa 5 × 10<5>sveže izolovanih splenocita na mikrotitarskoj ploči obloženoj anti-IFN-γ antitelom (10 μg/mL, klon AN18; Mabtech). Posle 18 sati na 37°C, detektovana je sekrecija citokina pomoću anti-IFN-γ antitela (klon R4-6A2; Mabtech). Brojevi tačaka su određivani i analizirani pomoću ImmunoSpot® S5 Versa ELISPOT analizatora, ImmunoCaptureTM Image Acquisition softvera i ImmunoSpot® Analysis softvera verzija 5. Statistička analiza obavljena je Studentovim t-testom i Mann-Whitney testom (neparametarski test). Odgovori su smatrani za značajne kada je test dao p-vrednost < 0.05 i kada je srednji broj tačaka bio >30 tačaka/5x10<5>efektorskih ćelija. Reaktivnosti su ocenjivane srednjim brojem tačaka (-: <30; : >30; +: >50; ++ >200 tačaka/bunarčiću).
Test na unutarćelijske citokine
[0337] Alikvoti splenocita pripremljenih za ELISPOT test podvrgnuti su analizi proizvodnje citokina unutarćelijskom protočnom citometrijom. Da bi se to postiglo 2 x 10<6>splenocita po uzorku zaseje se u medijum za kultivaciju (RPMI 10% FCS) dopunjenom Golgi inhibitorom brefeldinom A (10 μg/mL) na ploči sa 96 bunarčića. Ćelije iz svake životinje bile su restimulisane tokom 5 h na 37°C sa 2 x 10<5>peptidom-podstaknutih BMDC. Posle inkubacije ćelije su isprane pomoću PBS, resuspendovane u 50 μl PBS i vanćelijski obojene sledećim antimišjim antitelima, 20 min na 4°C: anti-CD4 FITC, anti-CD8 APC-Cy7 (BD Pharmingen). Posle inkubacije ćelije su isprane pomoću PBS i zatim resuspendovane u 100 μL Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience) rastvora, 20 min na 4°C za permeabilizaciju ćelijske membrane. Posle permeabilizacije, ćelije se isperu Perm/Wash-puferom (BD Bioscience), resuspenduju u 50 μL/uzorku u Perm/Wash-puferu i unutarćelijski oboje sledećim antimišjim antitelima, 30 min na 4°C: anti-IFN- γ PE, anti-TNF-α PE-Cy7, anti-IL2 APC (BD Pharmingen). Posle ispiranja Perm/Wash-puferom, ćelije se resuspenduju u PBS koji sadrži 1% paraformaldehid za analizu protočnom citometrijom. Uzorci se analiziraju korišćenjem BD FACSCanto™ II citometra i FlowJo (verzija 7.6.3).
Tumorski model B16 melanoma
[0338] Za eksperimente vakcinisanja protiv tumora 7.5 × 10<4>B16F10 melanoma ćelija inokuliše se s.c. u bočne regione C57BL/6 miševa. U profilaktičkoj postavci, imunizacija mutacija-specifičnim peptidom izvrši se 4 dana ranije i na dane 2 i 9 posle inokulacije tumora. Za terapijski eksperiment peptidna vakcina se primeni na dane 3 i 10 posle injekcije tumora. Veličina tumora meri se svaka tri dana i miševi se žrtvuju kada prečnih tumora dostigne 15 mm.
[0339] Alternativno, za eksperimente vakcinacije protiv tumora 1 × 10<5>B16F10 melanoma ćelija inokuliše se s.c. u bočne regione ženki C57BL/6 miševa odgovarajuće starosti. Vakcinacija peptidom obavi se na dane 3, 10 i 17 posle inokulisanja tumora, sa 100 μg peptida i 50 μg poli(I:C) formulisanog u PBS (ukupna zapremina 200 μl) injektiranog subkutano u bok. RNK imunizacije obave se korišćenjem 20 μg in vitro transkribovane RNK koja kodira mutaciju, formulisane sa 20 μl Lipofectamine™ RNAiMAX (Invitrogen) u PBS u ukupnoj zapremini za injektiranje od 200 μl. Kao kontrola, jedna grupa životinja injektirana je sa RNAiMAX (Invitrogen) u PBS. Životinje su imunizovane na dane 3, 6, 10, 17 i 21 posle inokulacije tumora. Veličina tumora meri se svaka tri dana nonijusom i miševi se žrtvuju kada prečnih tumora dostigne 15 mm.
Identifikacija nesinonimnih mutacija u B16F10 mišjem melanomu
[0340] Naš cilj bio je da identifikujemo potencijalno imunogene somatske tačkaste mutacije u B16F10 mišjem melanomu pomoću NGS i da ih testiramo u pogledu in vivo imunogenosti vakcinisanjem miševa peptidom, merenjem izazvanih odgovora T-ćelija ELISPOT testom (Slika 9A). Sekvencirali smo egzome C57BL/6 pozadinskog genoma divljeg tipa i B16F10 ćelija, svaki sa ekstrakcijom i imobilisanjem u triplikatima. Za svaki uzorak, generisano je više od 100 miliona očitavanja 50 nt sa jednog kraja. Od toga 80%, se poravnava jedinstveno sa mišjim mm9 genomom i 49% se poravnava sa ciljem, što pokazuje uspešno obogaćivanje cilja i za rezultat ima pokrivenost veću od 20 puta, za 70% ciljnih nukleotida u svakom od triplikatnih uzoraka. RNA-Seq B16F10 ćelija, takođe uz profilisanje u triplikatima, generisala je medijanu od 30 miliona očitavanja 50 nt sa jednog kraja, od kojih se 80% poravnava sa transkriptomom miša.
[0341] DNK očitavanja (egzom-imobilizacija) iz B16F10 i C57BL/6 analizirana su da bi se identifikovale somatske mutacije. Analiza varijacije broja kopija (Sathirapongsasuti JF et al., Bioinformatics 2011;27:2648-54) pokazala je DNK amplifikacije i delecije u B16F10, uključujući homozigotnu deleciju tumor-supresora Cdkn2a (ciklin-zavisna kinaza-inhibitor 2A, p16Ink4A). Fokusiranjem na tačkaste mutacije za identifikovanje mogućih imunogenskih mutacija, identifikovali smo 3570 somatskih tačkastih mutacija pri FDR ≤ 0.05 (Slika 9B). Najčešće klasa mutacija bile su C>T/G>A tranzicije, koje su tipično bile rezultat delovanja ultravioletnog svetla (Pfeifer GP et al., Mutat Res 2005;571:19-31). Od ovih somatskih mutacija, 1392 su se desile u transkriptima, uz 126 mutacija u netranslatujućim regionima. Od 1266 mutacija u kodirajućim regionima, 962 dovele su do nesinonimnih proteinskih promena i 563 od njih desile su se u eksprimiranim genima (Slika 9B).
Pripisivanje identifikovanih mutacija genima-nosiocima i validacija
[0342] Važno je napomenuti da su mnogi od mutiranih gena (962 gena koja sadrže nesinonimne somatske tačkaste mutacije) bili ranije udruženi sa kancerskim fenotipovima. Mutacije su nađene u potvrđenim tumor-supresorskim genima uključujući Pten, Trp53 (nazvan i p53), i Tp63. U Trp53, nabolje potvrđenom tumor-supresoru (Zilfou JT et al., Cold Spring Harb Perspect Biol 2009;1:a001883), mutacija asparagina u asparaginsku kiselinu na poziciji 127 u proteinu 127 (p.N127D) lokalizovana je u DNK-vezujućem domenu i pomoću SIFT predviđena je da menja funkciju. Pten sadrži dve mutacije (p.A39V, p.T131P), za obe je predviđeno da imaju štetan uticaj na funkciju proteina. p.T131P mutacija je susedna mutaciji (p.R130M) za koju je pokazano da smanjuje fosfataznu aktivnost (Dey N et al., Cancer Res 2008;68:1862-71). Pored toga, mutacije su nađene u genima udruženim sa putevima DNK reparacije, kao što su Brca2 (kancer dojke 2, rana pojava), Atm (ataksija-teleangiektazija mutirani), Ddb1 (za oštećenje specifični DNK vezujući protein 1) i Rad9b (RAD9 homolog B). Pored toga, mutacije se sreću u drugim tumor-asociranim genima, uključujući Aim1 (tumor-supresor "odsutan u melanomu 1", "absent in melanoma 1"), Flt1 (onkogen Vegr1, fms-vezana tirozin kinaza 1), Pml (tumor-supresor "promijelocitna leukemija "), Fat1 ("FAT tumor-supresor homolog 1"), Mdm1 (TP53 vezujući nukleusni protein), Mta3 (metastaza-udruženi 1 familija, član 3), i Alk (anaplastični limfom-receptorska tirozin kinaza). Našli smo mutaciju na p.S144F u Pdgfra (receptor za faktor rasta krvnih pločica, platelet-derived growth factor receptor, alfa polipeptid), za ćelijsku membranu vezanu receptorsku tirozin kinazu MAPK/ERK puta, ranije identifikovanu u tumorima (Verhaak RG et al., Cancer Cell 2010;17:98-110). Mutacija koja se sreće na p.L222V u Casp9 (kaspaza 9, za apoptozu vezana cistein-peptidaza). CASP9 proteolitički iseca poli(ADP-riboza) polimerazu (PARP), reguliše apoptozu, i u vezi je sa nekoliko kancera (Hajra KM et al., Apoptosis 2004;9:691-704). Mutacija koju smo našli može uticati na PARP i apoptotsku signalizaciju. Najinteresantnije, nisu nađene mutacije u Braf, c-Kit, Kras ili Nras. Međutim, mutacije su identifikovane u Rassf7 (RAS-udruženi protein) (p.S90R), Ksr1 (kinaza supresor ras 1) (p.L301V), i Atm (PI3K put) (p.K91T), za koje je sve bilo predviđeno da značajno utiču na funkciju proteina. Trrap (transformacija/transkripcija domen-udruženi protein) identifikovan je ranije ove godine u uzorcima humanog melanoma kao novi potencijalni cilj u melanomu (Wei X et al., Nat Genet 2011;43:442-6). U B16F10, Trrap mutacija dešava se na p.K2783R i predviđeno je da ometa preklapajući fosfatidilinozitol kinaza (PIK)-vezani FAT domen.
[0343] Od 962 nesinonimne mutacije identifikovane korišćenjem NGS, odabrali smo 50 mutacija, uključujući 41 sa FDR < 0.05, za PCR-baziranu validaciju i testiranje imunogenosti. Selekcioni kriterijumi bili su lociranost u eksprimiranom genu (RPKM > 10) i predviđena imunogenost. Važno je pomenuti da smo bili u mogućnosti da validiramo svih 50 mutacija (Tabela 6, Slika 9B).
1
Tabela 6: Mutacije odabrane za validaciju. Sleva: pridruženi ID, simbol gena, aminokiselinska supstitucija i pozicija, ime gena, predviđena subćelijska lokalizacija i tip
(Ingenuity).
2
4
[0344] Slika 9C prikazuje lokaciju B16F10 hromozoma, gensku gustinu, gensku ekspresiju, mutacije, i filtrirane mutacije (unutrašnji prstenovi).
In vivo testiranje imunogenosti dugim peptidima koji prezentuju mutacije
[0345] Da bi se obezbedili antigeni za testiranje imunogenosti ovih mutacija, upotrebili smo duge peptide koji imaju mnogo prednosti nad drugim peptidima za imunizaciju (Melief CJ and van der Burg SH, Nat Rev Cancer 2008;8:351-60). Dugi peptidi su u stanju da indukuju antigenspecifične CD8+ kao i CD4+ T-ćelije (Zwaveling S et al., Cancer Res 2002;62:6187-93; Bijker MS et al., J Immunol 2007;179:5033-40). Pored toga, dugi peptidi treba da se obrade da bi bili prezentovani na MHC molekulima. To se najefikasnije obavlja dendritskim ćelijama koje su optimalne za pokretanje snažnog T-ćelijskog odgovora. Nasuprot tome, peptidi koji "pasuju" ne zahtevaju skraćivanje i nanose se egzogeno na sve ćelije koje eksprimiraju MHC molekule, uključujući neaktivirane B i T-ćelije, što dovodi do indukcije tolerancije i fratricida (ubijanje srodnih ćelija) (Toes RE et al., J Immunol 1996;156:3911-8; Su MW et al., J Immunol 1993;151:658-67). Za svaku od 50 validiranih mutacija, dizajnirali smo peptide dužine 27 amino-kiselina sa mutiranim ili divljim tipom amino-kiselina pozicioniranim centralno. Prema tome, svaki potencijalni epitop za MHC klasu I i klasu II dužine od 8 do 14 amino-kiselina, koji nosi mutaciju može biti procesovanjem izveden od ovog prekursorskog peptida. Kao adjuvans za vakcinaciju peptidom koristimo poli(I:C) za koji je poznato da pokreće unakrsnu prezentaciju i povećava efikasnost vakcine (Datta SK et al., J Immunol 2003;170:4102-10; Schulz O et al., Nature 2005;433:887-92). Testirano je 50 mutacija in vivo u miševima, za indukciju T-ćelija. Impresivno, nađeno je da 16 od 50 peptida kodiranih mutacijom podstiču imunske odgovore u imunizovanim miševima. Indukovane T-ćelije pokazuju različite obrasce reaktivnosti (Tabela 7).
Tabela 7: Zbirni prikaz T-ćelijske reaktivnosti određene posle vakcinacije mutacijom kodiranim peptidom. Statistička analiza obavljena je Studentovim t-testom i Mann-Whitneyjevim testom (neparametarski test). Odgovori su smatrani značajnim ako je test dao p-vrednost < 0,05 i srednji broj tačaka je bio >30 tačaka/5x10<5>efektorskih ćelija. Reaktivnosti su ocenjene prema srednoj vrednosti broja tačaka -: <30; : >30; +: >50; ++ >200 tačaka/bunarčiću.
[0346] Jedanaest peptida indukovalo je imunski odgovor preferencijalno prepoznajući mutirani epitop. Ovo je pokazano na primeru miševa imunizovanih mutacijama 30 (MUT30, Kif18b) i 36 (MUT36, Plod2) (Slika 10A). ELISPOT testiranje pokazalo je snažne mutaciono-specifične imunske odgovore bez unakrsne reaktivnosti protiv divljeg tipa peptida ili nesrodnog kontrolnog peptida (VSV-NP). Sa pet peptida, uključujući mutacije 05 (MUT05, Eef2) i 25 (MUT25, Plod2) (Slika 10A), dobijeni su imunski odgovori sa uporedivim prepoznavanjem oba mutirana kao i divljeg tipa peptida. Većina mutiranih peptida nije mogla da indukuje značajne T-ćelijske odgovore što je kao primer prikazano mutacijama 01 (MUT01, Fzd7), 02 (MUT02, Xpot), i 07 (MUT07, Trp53). Imunski odgovori indukovani pomoću nekoliko otkrivenih mutacija bili su u opsegu imunogenosti (500 tačaka/5x10<5>ćelija) generisane imunizovanjem miševa kao pozitivne kontrole opisanim epitopom za MHC klase I iz tumorskog antigena mišjeg melanoma tirozinaza-srodnog proteina proteina 2 (Trp2180-188, Slika 10A) (Bloom MB et al., Exp Med 1997;185:453-9; Schreurs MW et al. Cancer Res 2000;60:6995-7001). Za odabrane peptide koji indukuju snažan mutaciono-specifičan odgovor T-ćelija, potvrdili smo imunsko prepoznavanje nezavisnim pristupom. Umesto dugih peptida, za imunološka očitavanja korišćena je in vitro transkribovana RNK (IVT RNK) koja kodira mutirane peptidne fragmente MUT17, MUT30 i MUT44. BMDC transfektovane mutacijakodirajućom RNK ili irelevantnom RNK služile su kao antigen-prezentujuće ćelije (APC) u ELISPOT testu, dok su slezinske ćelije imunizovanih miševa služile kao populacija efektorskih ćelija. BMDC transfektovane sa mRNK kodirajućom za MUT17, MUT30 i MUT44 bile su specifično i snažno prepoznate splenocitima miševa imunizovanih respektivnim dugim peptidima (Slika 10B). Zabeležena je značajno niža reaktivnost protiv kontrolnih RNK-transfektovanih BMDC, što je verovatno posledica nespecifične aktivacije BMDC jednolančanom RNK (Studentov t-test; MUT17: p = 0.0024, MUT30: p = 0.0122, MUT44: p = 0.0075). Ovi podaci potvrđuju da indukovane mutaciono-specifične T-ćelije u stvari prepoznaju endogeno procesovane epitope. Dve mutacije koje indukuju preferentno prepoznavanje mutiranih epitopa su u genima Actn4 i Kif18b. Somatska mutacija u ACTN4 (aktinin, alfa 4) je na p.F835V u kalcijum-vezujućem "EF-hand" proteinskom domenu. Dok SIFT i POLYPHEN predviđaju značajan uticaj ove mutacije na funkciju proteina, gen nije potvrđeni onkogen. Međutim, mutacija-specifične T-ćelije protiv ACTN4 nedavno su udružene sa pozitivnim ishodom kod pacijenata (Echchakir H et al., Cancer Res 2001;61:4078-83). KIF18B (član kinezinske familije 18B) je kinezin sa mikrotubularnom motornom aktivnošću i vezuje se sa ATP i nukleotidima što je uključeno u regulaciju ćelijske deobe (Lee YM et al., Gene 2010;466:16-25) (Slika 10C). DNK sekvenca na poziciji koja kodira p.K739 je homogena u referentnim C57BL/6, dok B16F10 DNK očitavanja otkrivaju heterozigotnu somatsku mutaciju. Oba nukleotida su detektovana u B16F10 RNA-Seq očitavanjima i validirana Sangerovim sekvenciranjem. KIF18B nije ranije bio asociran sa kancerskim fenotipom. Mutacija p.K739N nije lokalizovana u poznatom funkcionalnom ili konzerviranom proteinskom domenu (Slika 10C, dole) i, prema tome, najverovatnije je prateća, a ne vodeća mutacija. Ovi primeri ukazuju na nedostatak korelacije između sposobnosti indukovanja mutacija-prepoznavajućeg imunskog odgovora i funkcionalne ili imunološke relevantnosti.
In vivo procena antitumorske aktivnosti kandidata za vakcine
[0347] Da bi se procenilo da li se imunski odgovori pobuđeni in vivo translatuju u antitumorske efekte u miševima koji nose tumor, odabrali smo MUT30 (mutacija u Klf18b) i MUT44 kao primere. Pokazano je da su ove mutacije indukovale snažnu imunsku reakciju preferentno protiv mutiranog peptida i da su endogeno procesovane (Slika 10A, B). Terapijski potencijal vakcinisanja mutiranim peptidima ispitivan je imunizovanjem miševa sa MUT30 ili MUT44 i adjuvansom, 3 i 10 dana posle graftovanja sa 7.5x105 B16F10. Rast tumora je inhibiran pomoću obe vakcinacije peptidima u poređenju sa kontrolnom grupom (Slika 11A). Kako je B16F10 veoma agresivno rastući tumor, testirali smo i protektivne imunske odgovore. Miševi su bili imunizovani MUT30 peptidom, inokulisani s.c. sa 7.5x10<5>B16F10 ćelija 4 dana kasnije i odgovor je pojačan korišćenjem MUT30, 2 i 9 dana posle "izazivanja" tumorom. Zapažena je potpuna zaštita od tumora i preživljavanje od 40% kod miševa tretiranih sa MUT30, dok su svi miševi u kontrolnoj grupi uginuli u roku od 44 dana (Slika 11B levo). Kod miševa koji su razvili tumor uprkos imunizaciji pomoću MUT30, rast tumora bio je sporiji što je rezultovalo produženjem medijane preživljavanja za 6 dana u poređenju sa kontrolnom grupom (Slika 11B desno). Ovi podaci ukazuju da je već vakcinacija protiv jedne mutacije sposobna da obezbedi antitumorski efekte.
Imunizacija mutacija-kodirajućim RNK
[0348] Pedeset validiranih mutacija iz ćelijske linije B16F10 melanoma upotrebljeno je za konstruisanje različitih RNK vakcina. DNK-sekvence koje predstavljaju jednu (monoepitop), dve (biepitop), ili 16 različitih mutacija (poliepitop), konstruisane su korišćenjem 50 aminokiselina (aa) sa mutacijom na poziciji 25 (biepitop) ili 27 aa sa mutacijom na poziciji 14 (monoi poliepitop) i razdvojene linkerom glicin/serin od 9 aa. Ovi konstrukti su klonirani u pST1-2BgUTR-A120 osnovu za in vitro transkripciju mRNK (Holtkamp et al., Blood 2006;108:4009-17).
[0349] Da bi se ispitala in vivo sposobnost indukovanja odgovora T-ćelija protiv različitih RNK-vakcina, grupe od po tri C57BL/6 miša imunizovane su formulisanjem RNK sa RNAiMAX lipofektaminom i zatim intravenskim injektiranjem. Posle 5 imunizacija, miševi su žrtvovani i splenociti analizirani na mutacija-specifične odgovore T-ćelija korišćenjem bojenja unutarćelijskih citokina i IFN-γ ELISPOT analizom posle restimulacije odgovarajućim mutacija-kodiranim peptidom ili kontrolnim peptidom (VSV-NP).
[0350] Slika 12 prikazuje jedan primer za svaki dizajn vakcine. U gornjem redu miševi su vakcinisani monoepitopskom-RNK koja kodira MUT30 (mutacija u Kif18b), što indukuje MUT30-specifične CD4+ T-ćelije (vidi primer FACS-dijagrama). U srednjem redu grafikon i FACS-dijagram pokazuju indukciju MUT08-specifičnih (mutacija u Ddx23) CD4+ T-ćelija posle imunizacije biepitopom koji kodira MUT33 i MUT08. U donjem redu miševi su bili imunizovani poliepitopom koji kodira 16 različitih mutacija uključujući MUT08, MUT33 i MUT27 (vidi Tabelu 8). Grafikon i FACS-dijagram ilustruju da su MUT27 reaktivne T-ćelije CD8 fenotipa.
Tabela 8. Pregled mutacija i imena gena kodiranih mono-, bi- i poliepitopskim RNK-vakcinama.
[0351] Isti poliepitop upotrebljen je za generisanje podataka pokazanih na Slici 13. Grafikon pokazuje ELISPOT podatke posle restimulacije splenocita kontrolnim (VSV-NP), MUT08, MUT27 i MUT33 peptidima, dokazujući da poliepitopska vakcina može da indukuje specifične T-ćelijske odgovore protiv nekoliko različitih mutacija.
[0352] Posmatrani zajedno, podaci pokazuju mogućnost indukovanja mutaciono-specifičnih T-ćelija korišćenjem RNK-kodiranih mono-, bi- i poliepitopa. Pored toga, podaci pokazuju indukciju CD4+ i CD8+ T ćelija i indukciju nekoliko različitih specifičnosti iz jednog konstrukta.
Imunizacija model-epitopima
[0353] Da bi se dodatno okarakterisao dizajn poliepitopske RNK-vakcine konstruisana je DNK-sekvenca koja uključuje pet različitih poznatih model-epitopa, uključujući jedan epitop za MHC klasu II (ovalbumin klasa I (SIINFEKL), klasa II (OVA klasa II), nukleoprotein influence (Inf-NP), nukleoprotein virusa vezikulo-stomatitisa (VSV-NP) i tirozinaza srodan protein 2 (Trp2)). Epitopi su razdvojeni istim glicin/serin linkerom od 9 aa upotrebljenim za mutacioni poliepitop. Ovi konstrukti se kloniraju u pST1-2BgUTR-A120 osnovu za in vitro transkripciju mRNK.
[0354] In vitro transkribovana RNK upotrebljena je za vakcinisanje pet C57BL/6 miševa intranodalnom imunizacijom (četiri imunizacije sa 20 μg RNK u ingvinalne limfne čvorove). Pet dana posle poslednje imunizacije uzorci krvi i splenociti uzeti su iz miševa za analizu. Slika 14A prikazuje IFN-γ ELISPOT analizu splenocita restimulisanih navedenim peptidima. Jasno se može videti da sva tri epitopa za MHC-klasu I (SIINFEKL, Trp2 i VSV-NP) indukuju veoma visok broj antigen-specifičnih CD8+ T ćelija. Isto tako epitop za MHC-klasu II OVA klasa II indukuje snažan CD4+ T-ćelijski odgovor. Četvrti MHC klasa I epitop bio je analiziran bojenjem Inf-NP-specifičnih CD8+ T-ćelija sa fluorescentno obeleženim pentamernim kompleksom MHC-peptid (pentamer) (Slika 14B).
[0355] Ovi podaci dokazuju da poliepitopski dizajn uz korišćenje glicin/serin linkera za razdvajanje različitih imunogenih epitopa za MHC-klase I i -klase II može da indukuje specifične T-ćelije protiv svakog kodiranog epitopa, bez obzira na njegovu imunodominanciju.
Anti-tumorski odgovor posle terapije mutacija-kodirajućom poliepitopskom RNK vakcinom
[0356] Isti poliepitop koji je bio analiziran na Slici 13 u pogledu imunogenosti upotrebljen je za ispitivanje antitumorske aktivnosti mutacija-kodirajućih RNK protiv B16F10 tumorskih ćelija. Detaljnije, grupe C57BL/6 miševa (n=10) subkutano su inokulisane sa 1 x 10<5>B16F10 melanoma ćelija, u bočni region. Na dane 3, 6, 10, 17 i 21 miševi su imunizovani politopskom RNK korišćenjem lipozomskog transfekcionog reagensa. Kontrolna grupa je bila injektirana samo lipozomima.
1
[0357] Slika 21 prikazuje krive preživljavanja grupa, otkrivajući izrazito poboljšanu medijanu preživljavanja od 27 dana, uz 1 od 10 miševa koji je preživeo bez tumora, u poređenju sa medijanom preživljavanja od 18,5 dana u kontrolnoj grupi.
Antitumorski odgovor posle terapije kombinacijom mutiranog i normalnog peptida
[0358] Antitumorska aktivnost validiranih mutacija bila je evaluirana terapijskim in vivo tumorskim eksperimentom korišćenjem MUT30 kao peptidne vakcine. Detaljnije, grupe C57BL/6 miševa (n=8) subkutano su inokulisane sa 1 x 10<5>B16F10 melanoma ćelija, u bočni region. Na dane 3, 10 i 17 miševi su imunizovani korišćenjem poliI:C kao adjuvansa sa MUT30, tirozinaza-srodnim proteinom 2 (Trp2180-188) ili kombinacijom oba peptida. Trp2 je poznati CD8+ epitop koji eksprimiraju B16F10 melanoma ćelije.
[0359] Slika 15 A prikazuje srednji rast tumora za grupe. Jasno se može videti da je do dana 28 rast tumora gotovo sasvim inhibiran u grupi koja je bila imunizovana kombinacijom poznatog CD8+ T-ćelijskog epitopa i CD4+ T-ćelijskog indukujućeg MUT30. Poznati Trp2 epitop sam nije dovoljan da obezbedi dobar antitumorski efekat u ovoj postavci, ali obe grupe za terapiju (MUT30 i Trp2) i dalje obezbeđuju inhibiciju rasta tumora u poređenju sa netretiranom grupom na početku eksperimenta do dana 25. Ove podatke podržavaju krive preživljavanja prikazane na Slici 15 B. Medijana preživljavanja je jasno povećana za miševe injektirane pojedinačnim peptidima, uz 1 od 8 miševa koji je preživeo u grupi sa Trp2 vakcinacijom. Pored toga, grupa tretirana sa oba peptida pokazuje još bolju medijanu preživljavanja, sa 2 preživela miša od njih 8.
[0360] Posmatrano zajedno, oba epitopa deluju sinergistički, obezbeđujući snažni antitumorski efekat.
Primer 9: Okvir za detekciju somatskih mutacija na osnovu pouzdanosti i primena na B16-F10 melanoma ćelijama
[0361] NGS je nepristrasno po tome što omogućava visokopropusno otkrivanje varijacija unutar čitavog genoma ili ciljnih regiona, kao što su protein-kodirajući egzoni.
[0362] Međutim, iako revolucionarna, NGS platforma još uvek je podložna greškama koje vode do pogrešnih varijacionih odziva. Pored toga, kvalitet rezultata zavisi od parametara eksperimentalnog dizajna i metodologija analize. Dok varijacioni odzivi tipično uključuju skorove dizajnirane za razlikovanje pravih varijacija od grešaka, upotrebljivost ovih skorova nije u potpunosti shvaćena, a ni njihova interpretacija u vezi sa optimizacijom eksperimenata.
1 1
Ovo posebno važi kada se upoređuju statusi tkiva, na primer kada se upoređuje tumorsko i normalno tkivo u pogledu somatskih mutacija. Kao posledica, istraživači su primorani da se oslone na lično iskustvo za određivanje eksperimentalnih parametara i arbitrarno filtriranje pragova za selektovanje mutacija.
[0363] Naša studija za cilj ima a) uspostavljanje okvira za upoređivanje parametara i metoda identifikovanja somatskih mutacija i b) pripisivanje vrednosti pouzdanosti identifikovanim mutacijama. Sekvencirali smo triplikatne uzorke iz C57BL/6 miševa i B16-F10 melanoma ćelijske linije. Korišćenjem ovih podataka, formulisali smo stopu lažnog otkrivanja detektovanih somatskih mutacija, što je mera koju smo zatim koristili za evaluiranje postojećih softvera i laboratorijskih protokola za otkrivanje mutacija.
[0364] Različiti eksperimentalni i algoritamski faktori doprinose lažno pozitivnoj stopi varijacija nađenih pomoću NGS [Nothnagel, M. et al., Hum. Genet. 2011 Feb 23 [Epub pre štampane verzije]]. Izvori grešaka uključuju PCR artefakte, pristrasnost u senzibilizaciji [Hansen, K.D., et al., Nucleic. Acids. Res.38, e131 (2010); Taub, M.A. et al., Genome Med.2, 87 (2010)] i ciljano obogaćivanje [Bainbridge, M.N. et al., Genome Biol. 11, R62 (2010)], sekvencione efekte [Nakamura, K. et al., Acids Res.(2011) prvi put publikovano "online" 16. maja 2011 doi:10.1093/nar/gkr344], bazni odziv koji dovodi do sekvencionih grešaka [Kircher, M. et al., Genome Biol.10, R83 (2009). Epub 2009 Aug 14] i čitanje poravnavanje [Lassmann, T. et al., Bioinformatics 27, 130-131 (2011)], što dovodi do varijacija u pokrivenosti i sekvencirajućih grešaka, što utiče na dalju nishodnu analizu, npr., varijantni odziv oko indela [Li, H., Bioinformatics 27, 1157-1158 (2011)].
[0365] Ne postoji opisan uopšteni statistički model za opisivanje uticaja različitih izvora grešaka na somatske mutacione odzive; pokriveni su samo pojedinačni aspekti, bez uklanjanja svake pristrasnosti. Noviji računarski metodi merenja očekivane količine lažno pozitivnih mutacionih odziva uključuju korišćenje tranziciono/transverzionog odnosa seta varijacija [Zhang, Z., Gerstein, M., Nucleic Acids Res 31, 5338-5348 (2003); DePristo, M.A. et al., Nature Genetics 43, 491-498 (2011)], mašinsko učenje [DePristo, M.A. et al., Nature Genetics 43, 491-498 (2011)] i greške u nasleđivanju kada se radi sa genomima porodica [Ewen, K.R. et al., Am. J. Hum. Genet.67, 727-736 (2000)] ili pulovanim uzorcima [Druley, T.E. et al., Nature Methods 6, 263 - 265 (2009); Bansal, V., Bioinformatics 26, 318-324 (2010)]. Za optimizaciju, Druley et al. [Druley, T.E. et al., Nature Methods 6, 263 - 265 (2009)] oslonili su se na kratke fragmente plazmidne sekvence, koji međutim možda nisu reprezentativni za uzorak. Za set varijacija pojedinačnih nukleotida (SNV) i odabrane eksperimente, izvodljivo je poređenje sa
1 2
SNV identifikovanim drugim tehnikama [Van Tassell, C.P. et al., Nature Methods 5, 247 - 252 (2008)] ali je teško za evaluaciju u smislu novih somatskih mutacija.
[0366] Korišćenjem projekta sekvenciranja egzoma kao primera, predložili smo izračunavanje stope lažnog otkrivanja (FDR) na bazi samo NGS podataka. Metod nije potpuno primenljiv za selekciju i prioritizaciju dijagnostičkih i terapijskih ciljeva, ali takođe podržava razvijanje algoritma i metoda omogućivši nam da definišemo na pouzdanosti zasnovane preporuke za slične eksperimente.
[0367] Da bi se otkrile mutacije, DNK iz tkiva repa tri C57BL/6 (black6) miša (isto leglo) i DNK iz B16-F10 (B16) melanoma ćelija, u triplikatu, individualno se obogati u pogledu protein-kodirajućih egzona (Agilent Sure Select Whole Mouse Exome), što za rezultat ima 6 uzoraka. RNK se ekstrahuje iz B16 ćelija u triplikatu. Očitavanje sa jednog kraja 50 nt (1x50 nt) i očitavanje uparenih krajeva 100 nt (2x100 nt) generiše se na llumina HiSeq 2000. Svaki uzorak se nanese na zasebnu traku, što rezultuje prosekom od 104 miliona očitavanja po traci. DNK očitavanja se poravnaju sa mišjim referentnim genomom korišćenjem "bwa" [Li, H. Durbin, R., Bioinformatics 25, 1754-1760 (2009)] i RNK očitavanja se poravnaju sa "bowtie" [Langmead, B. et al., Genome Biol. 10, R25 (2009)]. Srednja pokrivenost 38 puta od 97% ciljanih regiona postignuta je za 1x50 nt biblioteke, dok je 2x100 nt eksperiment dao prosečnu pokrivenost od 165 puta za 98% ciljanih regiona.
[0368] Somatske varijacije bile su nezavismo identifikovane korišćenjem softverskih paketa SAMtools [Li, H. et al., Bioinformatics 25, 2078-2079 (2009)], GATK [DePristo, M.A. et al., Nature Genetics 43, 491-498 (2011)] i SomaticSNiPer [Ding, L. et al., Hum. Mol. Genet (2010) prvo publikovano "online" 15. septembra 2010] (Sl. 16) upoređivanjem pojedinačnih nukleotidnih varijacija nađenih u B16 uzorcima sa odgovarajućim lokusima u uzorcima black6 (B16 ćelije su originalno poreklom iz black6 miša). Potencijalne mutacije su filtrirane prema preporukama autora svakog od softvera (SAMtools i GATK) ili odabirom pogodnog donjeg praga za somatsku skor u slučaju SomaticSNiPer.
[0369] Da bi se kreirala stopa lažnog otkrivanja (FDR) za otkrivanje mutacija, prvo smo napravili intersekcije mesta mutacija i dobili 1355 visokokvalitetnih somatskih mutacija kao konsenzus među sva tri programa (Sl. 17). Međutim, zapažene razlike u rezultatima primenjenih softverskih alata bile su značajne. Da bi se izbegli pogrešni zaključci, razvili smo metod pripisivanja FDR svakoj mutaciji korišćenjem replikata. Tehnički ponovci uzoraka trebalo bi da daju identične rezultate i svaka detektovana mutacija u ovom "upoređivanju isto vs. isto" je lažno pozitivna. Prema tome, da bismo odredili stopu lažnog otkrivanja za detekciju somatskih mutacija u uzorku tumora u odnosu na normalni uzorak ("tumorsko poređenje"),
1
možemo koristiti tehničko ponavljanje normalnog uzorka kao referentno za procenu broja lažno pozitivnih rezultata.
[0370] Slika 18A pokazuje primere varijacija nađenih u black6/B16 podacima, uključujući somatsku mutaciju (levo), nesomatsku varijaciju u odnosu na referencu (sredina), i moguće lažno pozitivne (desno). Svaka somatska mutacija može biti udružena sa skorom kvaliteta Q. Broj lažno pozitivnih u tumorskom poređenju označava broj lažno pozitivnih u poređenju "isto vs. isto". Prema tome, za datu mutaciju sa skorom kvaliteta Q, detektovanim u tumorskom poređenju, procenili smo stopu lažnog otkrivanja izračunavanjem odnosa mutacija "isto vs. isto" sa skorom Q ili boljim, prema ukupnom broju mutacija nađenih u tumorskom poređenju sa skorom Q ili boljim.
[0371] Izazov je predstavljalo definisanje Q jer većina okvira za detektovanje mutacija računa veći broj skorova kvaliteta. Mi smo ovde primenili klasifikator nasumične šume [Breiman, L., Statist. Sci. 16, 199-231 (2001)] za kombinovanje većeg broja skorova u jedan skor kvaliteta Q. Upućujemo na odeljak o metodu za detalje u vezi sa izračunavanjem skora kvaliteta i FDR.
[0372] Potencijalna pristrasnost u upoređivanju metoda je diferencijalna pokrivenost; mi tako normalizujemo stopu lažnog otkrivanja za pokrivenost:
[0373] Izračunali smo opštu pokrivenost brojanjem svih baza referentnog genoma koje su pokrivene i tumorskim i normalnim uzorkom, ili sa oba "isto vs. isto" uzorka, respektivno.
[0374] Procenjujući broj lažno pozitivnih i pozitivnih za svaki FDR (vidi Metode), generisali smo ROC krive (receiver operating characteristic curves) i izračunali AUC (area under the curve, područje ispod krive) za svaki metod otkrivanja mutacija, omogućavajući tako poređenje strategija za otkrivanje mutacija (Sl.18B).
[0375] Pored toga, selekcija referentnih podataka može uticati na izračunavanje FDR. Korišćenjem raspoloživih black6/B16 podataka moguće je kreirati 18 tripleta (kombinacije black6 vs. black6 i black6 vs. b16). Kada se upoređuju dobijene FDR distribucije za setove somatskih mutacija, rezultati su konzistentni (Sl.18B).
[0376] Korišćenjem ove definicije ili stope lažnog otkrivanja, uspostavili smo generički okvir za evaluaciju uticaja brojnih eksperimentalnih i algoritamskih parametara na rezultujući set somatskih mutacija. Posle toga, primenili smo taj okvir za studiju uticaja softverskih alata, pokrivenosti, sekvenciranja uparenih krajeva i broja tehničkih replikata na identifikaciju somatskih mutacija.
1 4
[0377] Prvo, izbor softverskog alata ima jasan uticaj na identifikovane somatske mutacije (Sl.
19A). O testnim podacima, SAMtools proizvodi najvišu obogaćenost stvarnih pozitivnih u setu somatskih mutacija rangiranih pomoću FDR. Međutim, zapazili smo da svi alati nude mnoge parametre i skorove kvaliteta za pojedinačne mutacije. Mi smo ovde upotrebili zadate postavke kako su specifikovali oni koji su razvili algoritam; očekujemo da bi parametri mogli da se optimizuju i istaknu da je ovde definisan FDR okvir dizajniran da sprovede i evaluira takvu optimizaciju.
[0378] Za opisani eksperiment sekvenciranja B16, sekvencirali smo svaki uzorak u pojedinačnoj traci protočne ćelije i dobili srednju baznu pokrivenost ciljnog regiona od 38 puta za pojedinačne uzorke. Međutim, ova pokrivenost ne mora biti potrebna za dobijanje jednako dobrog seta somatskih mutacija, što moguće redukuje troškove. Isto tako, o uticaju dubine pokrivanja na SNV detekciju celog genoma diskutovano je nedavno [Ajay, S.S. et al., Genome Res. 21, 1498-1505 (2011)]. Sa ciljem izučavanja efekta pokrivenosti na podatke imobilisanja egzona, izvršili smo decimaciju broja očitavanja poravnatih sekvenci za svaku 1x50 nt biblioteku da bismo generisali približnu pokrivenost od 5, 10 i 20 puta, respektivno, i zatim ponovo primenili algoritme odziva mutacija. Očekivano, viša pokrivenost rezultovala je boljim (tj. manjim brojem lažno pozitivnih) setom somatskih mutacija, iako je poboljšanje iz pokrivenosti 20 puta prema maksimumu bilo marginalno (Sl.19B).
[0379] Direktan postupak je stimulisati i rangirati različite eksperimentalne postavke korišćenjem raspoloživih podataka i okvira. Kada se upoređuju duplikati i triplikati, triplikati nisu korisniji od duplikata (Sl. 19C), dok duplikati daju jasno poboljšanje u poređenju sa studijom bez replikata. U pogledu odnosa somatskih mutacija u datim setovima, vidimo obogaćenje pri FDR od 5% na 24.2% za tok bez replikata do 71.2% za duplikate i 85.8% za triplikate. Uprkos obogaćenju, korišćenje intersekcije triplikata uklanja više mutacija sa niskom FDR nego onih sa visokom FDR, što je naznačeno nižom ROC AUC i pomeranjem krive nalevo (Sl. 19C): specifičnost je blago povećanja na račun niže osetljivosti.
[0380] Dodatno sekvencirana 2x100 nt biblioteka upotrebljena je za simulaciju 1x100, dve 2x50 i dve 1x50 nt biblioteke, respektivno, in silicio uklanjanjem drugog očitavanja i/ili 3’ i 5’ krajeva očitavanja, što za rezultat ima ukupno 5 simuliranih biblioteka. Ove biblioteke se upoređuju korišćenjem izračunatih FDR za predviđene mutacije (Sl.19D). Uprkos mnogo višoj srednjoj pokrivenosti (više od 77 prema 38), somatske mutacije nađene korišćenjem 2x505’ i 1x100 nt biblioteka imaju nižu ROC AUC, a tako i lošiju FDR distribuciju nego 1x50 nt biblioteka. Ovaj fenomen je rezultat akumulacije mutacija sa visokom FDR u regionima niske pokrivenosti, pošto su nađeni setovi mutacija sa niskim FDR veoma slični. Posledica je ta da je
1
optimalna dužina sekvenciranja mala tako da su sekvencirane baze koncentrovane oko sekvenci imobilizacijske probe (ipak uz potencijalno gubljenje informacija o somatskom statusu mutacija u nepokrivenim regionima) ili treba da su bliske dužini fragmenta (2x100 nt = 200 nt ukupna dužina za ∼250 nt fragmenata u našem slučaju), efikasno popunjavajući procepe pokrivenosti. Ovo je takođe podržano ROC AUC 2x50 nt 3’ biblioteke (simulirano korišćenjem samo 3’ krajeva 2x100 nt biblioteke), što je više od jedne od 2x50 nt 5’ biblioteke (simulirano korišćenjem samo 5’ krajeva 2x100 nt biblioteke) uprkos nižem kvalitetu baza 3’ očitanih krajeva.
[0381] Ova zapažanja nam omogućavaju da definišemo najbolje praktične postupke za otkrivanje somatskih mutacija. Posmatrajući sve evaluirane parametre, pokrivenost 20 puta u oba uzorka i korišćenje tehničkog duplikata dostiže rezultate bliske optimumu u ovim relativno homogenim uzorcima, takođe imajući u vidu i troškove. 1x50 nt biblioteka koja rezultuje sa približno 100 miliona očitavanja izgleda da je najpragmatičniji izbor za postizanje ove pokrivenosti. Ovo važi i za sve moguće parove setova podataka. Retrospektivno smo primenili ove parametarske postavke, bez dodatnog filtriranja sirovih varijantnih odziva, i izračunali FDR za 50 odabranih mutacija iz intersekcije za sva tri metoda, kao što je pokazano na Slici 17. Sve mutacije su potvrđene kombinacijom Sangerovog resekvenciranja i B16 RNA-Seq očitavanjima sekvenci. 44 od tih mutacija bile bi nađene korišćenjem FDR granične vrednosti od 5% (Sl.20). Kao negativna kontrola, resekvencirali smo lokuse od 44 predviđene mutacije sa visokim FDR (> 50%) i ispitali respektivne sekvence u RNA-Seq podacima. Našli smo da 37 od ovih mutacija nije bilo validirano dok je preostalih sedam lokusa potencijalnih mutacija bilo nepokriveno RNA-Seq očitavanjima i nije dalo sekvencirajuću reakciju.
[0382] Iako prikazujemo primenu okvira na četiri specifična pitanja, on ni na koji način nije ograničen na ove parametre, nego može da se primeni na izučavanje uticaja svih eksperimentalnih ili algoritamskih parametara, npr. uticaja softvera za poravnavanje, izbora mutacione metrike, ili izbor dostavljača za selekciju egzoma.
[0383] Sve eksperimente izveli smo na B16 melanoma ćelijama; međutim, metod nije ograničen na te podatke. Jedini zahtev je dostupnost "isto-vs-isto" referentnog seta podataka, što znači da bi za svaki novi protokol trebalo da se izvede najmanje jedan tehnički ponovak netumorskog uzorka. Naši eksperimenti ukazuju na robusnost metoda u pogledu izbora tehničkog ponovka u određenim granicama, tako da ponovak nije neophodan za svaki pojedinačni eksperiment. Međutim, metod zahteva da različita merenja kvaliteta budu komparabilna između referentnog seta podataka i ostalih setova podataka.
1
[0384] U okviru ovog doprinosa, prvi smo postavili okvir za detekciju somatskih mutacija vođenu stopom otkrivanja lažno pozitivnih rezultata. Ovaj okvir primenljiv je ne samo za selekciju dijagnostičkog ili terapijskog cilja, nego omogućava generičko poređenje koraka eksperimentalnog i kompjuterskog protokola u generisanju kvazi-osnovnih istinitih podataka. Ovde smo primenili tu ideju da napravimo protokol odlučivanja u odnosu na softverske pakete, pokrivenost, replikate kao i sekvenciranje uparenih krajeva.
Metode
Imobilisanje biblioteke i sekvenciranje
[0385] Sekvenciranje sledeće generacije, DNK sekvenciranje: Imobilisanje egzoma za DNK resekvenciranje izvedeno je korišćenjem Agilent Sure-Select na rastvoru baziranog imobilizacionog testa [Gnirke, A., et al., Nat. Biotechnol.27, 182-189 (2009)], u ovom slučaju dizajniranog da zadrži sve poznate mišje egzone. 3 μg prečišćene genomske RNK fagmentiše se u delove od 150-200 nt korišćenjem Covaris S2 ultrazvučnog uređaja. gDNK fragmenti se repariraju na krajevima korišćenjem T4 DNK polimeraze, Klenow DNK polimeraze i 5’ fosforilišu uz upotrebu T4 polinukleotid kinaze. gDNK fragmenti zatupljenih krajeva se 3’ adenilišu korišćenjem Klenowog fragmenta (3’ ka 5’ egzo minus). "3’ single T-overhang" Illumina parni adapteri za krajeve vežu se za gDNK fragmente korišćenjem 10:1 molarnog odnosa adaptera prema genomskom DNK insertu, korišćenjem T4 DNK ligaze. Adapter-vezani gDNK fragmenti obogaćeni su pre imobilizacije i specifične sekvence protočnih ćelija dodaju se korišćenjem Illumina PE PCR prajmera 1.0 i 2.0 i Herculase II polimeraze (Agilent) uz upotrebu 4 PCR ciklusa.
[0386] 500 ng za adapter vezanih, PCR-obogaćenih gDNK fragmenata hibridizuje se sa Agilent SureSelect biotinizovanim mamcima biblioteke RNK celog egzoma miša, 24 h na 65 °C. Mamci hibridizovanih gDNK/RNK kompleksa uklanjaju se korišćenjem streptavidinom obloženih magnetnih perlica. gDNK/RNK mamac-kompleksi isperu se i RNK mamci se odseku tokom eluiranja u SureSelect puferu za eluiranje, ostavljajući imobilisane za adapter vezane, PCR-obogaćene gDNK fragmente. gDNK fragmenti su PCR-amplifikovani posle zadržavanja korišćenjem Herculase II DNA polimeraze (Agilent) i SureSelect GA PCR prajmera tokom 10 ciklusa.
[0387] Uklanjanje nevezanih reagenasa obavljeno je korišćenjem 1,8x zapremina AMPure XP magnetnih perlica (Agencourt). Kontrola kvaliteta je vršena korišćenjem Invitrogen Qubit HS testa i veličina fragmenata je određivana korišćenjem Agilent 2100 Bioanalyzer HS DNA testa.
1
[0388] Egzom-obogaćene gDNK biblioteke grupisane su na cBot korišćenjem Truseq SR klaster kita v2.5 uz upotrebu 7 pM i 50 bps sekvencirano je na Illumina HiSeq2000 korišćenjem SBS kit-HS 50 bp.
Analiza egzomskih podataka
[0389] Očitavanja sekvenci poravnata su, korišćenjem "bwa" (verzija 0.5.8c) [Li, H. Durbin, R., Bioinformatics 25, 1754-1760 (2009)] uz upotrebu zadatih opcija, sa referentnim mišjim genomskim skupom mm9 [Mouse Genome Sequencing Consortium, Nature 420, 520-562 (2002)]. Dvoznačna očitavanja - ona očitavanja koja mapiraju više lokacija genoma kako je dobijeno BWA izlazom - uklanjaju se. Preostala poravnanja se sortiraju, indeksiraju i konvertuju u binarni i komprimovani format (binary and compressed format, BAM) i skorovi kvaliteta očitavanja konvertuju iz Illumina standard phred+64 u standardne Sangerove skorove kvaliteta korišćenjem "shell scripts" programa.
[0390] Za svaku liniju sekvenciranja, mutacije se identifikuju korišćenjem tri softverska programa: SAMtools (verzija 0.1.8) [Li H. et al., Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009)], GATK (verzija 1.0.4418) [DePristo, M.A. et al., Nature Genetics 43, 491-498 (2011)], i SomaticSniper [Ding, L. et al., Hum. Mol. Genet (2010) prvi put publikovano "online" 15. septembra 2010]. Za SAMtools, koristi se opcija koju predlaže autor i kriterijumi filtera (http://sourceforge.net/apps/mediawiki/SAMtools/index.php?title=SAM_FAQ; pristup septembar 2011), uključujući prvi krug filtriranja, maksimalna pokrivenost 200. Za SAMtools, drugu rundu filtriranja, minimalni indel kvalitativni skor bio je 50, za tačkastu mutaciju minimalni kvalitet je bio 30. Za GATK mutacioni odziv, pratili smo vodič najbolje prakse dizajniran od strane autora na GATK uputstvu za upotrebu (http://www.broadinstitute. org/gsa/wiki/index.php/The_Genome_Analysis_Toolkit pristupljeno oktobra 2010). Za svaki uzorak izvedeno je lokalno ponovno poravnavanje oko indel mesta praćeno rekalibrisanjem kvaliteta baza. UnifiedGenotyper modul primenjen je na dobijene setove podataka iz poravnavanja. Po potrebi, poznati polimorfizmi dbSNP [Sherry, S.T. et al., Nucleic Acids Res.
29, 308-311 (2009)] (verzija 128 za mm9) dodati su pojedinačnim koracima. Korak rekalibrisanja varijantnog skora izostaje i zamenjuje se opcijom jakog filtriranja. Za SomaticSniper mutacioni odziv, koriste se zadate opcije i samo predviđene mutacije sa "somatskim skorom" od 30 ili više razmatraju se u nastavku. Pored toga, za svaki potencijalno mutirani lokus zahtevali smo nenultu pokrivenost u normalnom tkivu i uklanjanje svih mutacija
1
lociranih u repetitivnim sekvencama, kako je definisano po RepeatMasker, UCSC Genome Browser za mišji genomski skup mm9 [Fujita, P.A. et al., Nucleic Acids Res. 39, 876-882 (2011)].
RNA-Seq
[0391] Barkodirane mRNA-seq cDNK biblioteke pripremljene su od 5 μg ukupne RNK korišćenjem modifikovane verzije Illumina mRNA-seq protokola. mRNK je izolovana korišćenjem Seramag Oligo(dT) magnetnih perlica (Thermo Scientific). Izolovana mRNK je fragmentisana korišćenjem dvovalentnih katjona i toplote, što je rezultovalo fragmentima u rasponu od 160-220 bp. Fragmentisana mRNK konvertovana je u cDNA korišćenjem nasumičnih prajmera i Super-ScriptII (Invitrogen), što je praćeno sintezom drugog lanca korišćenjem DNK polimeraze I i RNazeH. cDNK krajevi su reparirani korišćenjem T4 DNK polimeraze, Klenow DNK polimeraze i 5’ fosforilisani korišćenjem T4 polinukleotid kinaze. cDNK fragmenti zatupljenih krajeva su 3’ adenilisani korišćenjem Klenow fragmenta (3’ ka 5’ egzo minus). "3’ single T-overhang" Illumina multipleksni specifični adapteri vežu se na cDNK fragmente korišćenjem T4 DNK ligaze. cDNK biblioteke se prečiste i selektuju po veličini na 300 bp korišćenjem E-Gel % SizeSelect gela (Invitrogen). Obogaćivanje, dodavanje Illumina šestobaznog indeksa i sekvenci specifičnih za protočne ćelije obavljeno je PCR uz korišćenje Phusion DNA polimeraze (Finnzymes). Uklanjanje svih nevezanih reagenasa obavlejno je korišćenjem 1,8x zapremina Agencourt AMPure XP magnetnih perlica.
[0392] Barkodirane RNA-Seq biblioteke grupisane su u klastere na cBot korišćenjem Truseq SR klaster kita v2.5 uz korišćenje 7 pM i sekvencirane na Illumina HiSeq2000 uz korišćenje Truseq SBS kita.
[0393] Sirovi izlazni podaci HiSeq obrađeni su prema Illumina standardnom protokolu, uključujući uklanjanje očitavanja niskog kvaliteta i demultipleksiranje. Sekvenciona očitavanja se zatim poravnavaju sa referentnom genomskom sekvencom [Mouse Genome Sequencing Consortium, Nature 420, 520-562 (2002)] korišćenjem "bowtie" [Langmead, B. et al., Genome Biol. 10, R25 (2009)]. Koordinate poravnavanja upoređuju se sa koordinatama egzona RefSeq transkripata [Pruitt, K.D. et al., Nucleic Acids Res.33, 501-504 (2005)] i za svaki transkript se beleže brojanja preklapajućih poravnavanja. Sekvenciona očitavanja koja se ne poravnavaju sa genomskom sekvencom poravnavaju se sa bazom podataka za sve moguće egzon-egzon spojne sekvence RefSeq transkripata [Pruitt, K.D. et al., Nucleic Acids Res. 33, 501-504 (2005)]. Koordinate poravnavanja upoređuju se sa RefSeq egzonskim i spojnim koordinatama, očitavanja broje i normalizuju prema RPKM (broj očitavanja koja mapiraju po kilobazi
1
nukleotida transkripta na milion mapiranih očitavanja [Mortazavi, A. et al., Nat. Methods 5, 621-628 (2008)]) za svaki transkript.
Validacija SNV
[0394] Odabrali smo SNV za validaciju Sangerovim resekvenciranjem i RNK, identifikovane su SNV koje su bile predviđene korišćenjem sva tri programa, nesinonimno, i nađene u transkriptima sa najmanje 10 RPKM. Od toga, odabrali smo 50 sa najvišim SNP skorovima kvaliteta, kako je obezbeđeno programima. Kao negativna kontrola, odabrane su 44 SNV koje imaju FDR od 50% ili više, prisutne u samo jednom uzorku ćelijske linije i predviđene samo jednim programom odziva mutacija. Korišćenjem DNK, odabrane varijante su validirane PCR amplifikacijom regiona korišćenjem 50 ng DNK, praćeno Sangerovim sekvenciranjem (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Germany). Reakcije su uspešne za 50 i 32 lokusa pozitivnih i negativnih kontrola, respektivno. Validacija je obavljena i ispitivanjem tumorskih RNA-Seq očitavanja.
Izračunavanje FDR i mašinsko učenje
[0395] Izračunavanje skora kvaliteta slučajnih šuma: Najčešće korišćeni algoritmi mutacionih odziva (DePristo, M.A. et al., Nature Genetics 43, 491-498 (2011), Li, H. et al., Bioinformatics 25, 2078-2079 (2009), Ding, L. et al., Hum. Mol. Genet (2010) prvo publikovano "online" 15. septembra 2010) su izlazni višestruki skorovi, koji svi potencijalno utiču na kvalitet mutacionog odziva. Ovo uključuje - ali se ne ograničava na - kvalitet baze od interesa, kako je pripisano instrumentom, kvalitet poravnavanja za tu poziciju, broj očitavanja koja pokrivaju tu poziciju ili skor za razliku između dva genoma upoređena na toj poziciji. Za izračunavanje stope lažnog otkrivanja zahtevamo uređenost mutacija, međutim to nije direktno izvodljivo za sve mutacije jer možemo dobiti kontadiktorne informacije iz različitih skorova kvaliteta.
[0396] Mi koristimo sledeću strategiju za postizanje potpune uređenosti. U prvom koraku, primenjujemo vrlo rigoroznu definiciju superiornosti pretpostavljajući da jedna mutacija ima bolji kvalitet od druge ako i samo ako je superiorna u svim kategorijama. Dakle, set osobina kvaliteta S=(s1,...,sn) je poželjno do T=(t1,...,tn), označeno kao S>T, iff (ako i samo ako) si> tiza sve i=1,...,n. Definišemo intermedijarnu FDR (IFDR) na sledeći način
11
[0397] Međutim, smatramo da je IFDR samo intermedijarni korak jer u mnogim blisko povezanim slučajevima, nije izvodljivo poređenja i tako nemamo koristi od velike količine raspoloživih podataka. Prema tome, mi koristimo osobinu dobre generalizacije regresije slučajne šume [Breiman, L., Statist. Sci.16, 199-231 (2001)] i treniranje slučajne šume kako je implementirano u R (R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2010, Liaw, A., Wiener, M., R News 2, 18-22 (2002)).
[0398] Za m ulazne mutacije sa n osobinama kvaliteta svaka, određen je opseg vrednosti za svaku osobinu i do p vrednosti je uzorkovano sa ravnomernim razmakom van ovog raspona; kada je set vrednosti za osobinu kvaliteta manji od p, ovaj set se koristi umesto uzorkovanog seta. Zatim se kreira svaka moguća kombinacija uzorkovane ili odabrane vrednosti kvaliteta, što rezultuje maksimumom pn tačaka podataka u n-dimenzionalnom prostoru kvaliteta. Nasumični uzorak od 1% ovih tačaka i odgovarajuće IFDR vrednosti koriste se kao prediktor i odgovor, respektivno, za obučavanje slučajne šume.
[0399] Rezultujući regresioni skor je naš generalizovani skor kvaliteta Q; on se može razmatrati kao lokalno ponderisana kombinacija individualnih skorova kvaliteta. To omogućava direktno poređenje pojedinačne vrednosti za bilo koje dve mutacije i izračunavanje aktuelne stope lažnog otkrivanja:
[0400] Za obučavanje modela slučajne šume upotrebljenog za kreiranje rezultata ove studije, izračunali smo uzorački IFDR na somatskim mutacijama svih uzoraka pre biranja 1% nasumične podgrupe. Ovo osigurava mapiranje celog raspoloživog prostora kvaliteta za FDR vrednosti. Upotrebili smo osobine kvaliteta "SNP kvalitet", "dubina pokrivenosti", "konsenzusni kvalitet" i "RMS mapirajući kvalitet" (SAMtools, p = 20); "SNP kvalitet", "dubina pokrivenosti", "varijantna pouzdanost/nefiltrirana dubina" i "RMS mapirajući kvalitet " (GATK, p = 20); ili SNP kvalitet", "dubina pokrivenosti", "konsenzusni kvalitet", "RMS mapirajući kvalitet" i "somatski skor"
[0401] (SomaticSNiPer, p = 12), respektivno. Različite vrednosti p osiguravaju veličinu seta komparabilne magnitude.
[0402] Izračunavanje opšte pokrivenosti: Broj mogućih mutacionih odziva može uvesti glavnu pristrasnost u definiciju stope lažnog otkrivanja. Samo ako imamo isti broj mogućih lokacija za mutacije koje se dešavaju za naše tumorsko poređenje i za naše poređenje "isto vs. isto", broj mutacionih odziva je komparabilan i može služiti kao baza za izračunavanje stope lažnog otkrivanja. Da bi se ispravila ova potencijalna pristrasnost, koristimo odnos opšte pokrivenosti. Kao opštu pokrivenost, definišemo broj baza sa pokrivenošću od bar jedan u oba uzorka koja su upotrebljena za mutacioni odziv. Izračunavamo opštu pokrivenost individualno za tumorsko poređenje kao i za poređenje "isto vs. isto".
ROC procena
[0403] ROC krive i odgovarajuće područje ispod krive (AUC) korisni su za organizovanje klasifikatora i vizuelizovanje njihovih performansi [Fawcett, T., Pattern Recogn. Lett.27, 861-874 (2006)]. Proširili smo ovaj koncept na evaluiranje performanse eksperimentalnih i računarskih procedura. Međutim, konstruisanje ROC grafikona zahteva poznavanje svih istinitih i lažno pozitivnih (TP i FP) primera u setu podataka, što je informacija koja obično nije data i teško se uspostavlja za podatke visoke propustljivosti (kao što su NGS podaci). Prema tome, koristimo izračunate FDR za procenu respektivnih TP i FP stopa i konstruisanje ROC grafikona i izračunavanje AUC. Centralna ideja je da FDR za jednu mutaciju u setu podataka daje proporciju koliko ta mutacija doprinosi sumi TP/FP mutacija, respektivno. Isto tako, za listu nasumičnih pripisivanja TP i FP, rezultantna ROC AUC biće jednaka 0.5 sa našim metodom, što ukazuje na potpuno nasumičnu predikciju. Polazimo od dva uslova:
sa FPR i TPR kao potrebnim lažno pozitivnim-stvarno pozitivnim odnosima, respektivno, za datu mutaciju, što definiše odgovarajuću tačku u ROC prostoru. [1] i [2] mogu se rearanžirati u
[0404] Da bi se dobila procenjena ROC kriva, mutacije u setu podataka sortirane su po FDR i za svaku mutaciju tačka je uneta pri kumulativnim TPR i FPR vrednostima do te mutacije, podeljeno zbirom svih TPR i TPR vrednosti, respektivno. AUC se izračinava sabiranjem područja svih uzastopnih trapezoida između krive i x-ose.
11
11
11
11
11
11
12
12

Claims (13)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Individualizovana vakcina protiv kancera za upotrebu u postupku lečenja pacijenta sa kancerom, pri čemu pomenuti postupak sadrži korake:
(A) obezbeđivanja individualizovane vakcine protiv kancera postupkom koji uključuje korake:
(a) identifikovanje za kancer specifičnih somatskih mutacija u uzorku tumora pacijenta sa kancerom da bi se obezbedila kancerska mutaciona signatura pacijenta sa kancerom, koje sadrži
(aa) dobijanje informacije o sekvenci nukleinske kiseline sekvenciranjem genomske DNK i/ili RNK uzorka tumora pacijenta sa kancerom,
(bb) dobijanje informacije o referentnoj sekvenci nukleinske kiseline sekvenciranjem DNK ili RNK normalnih nekanceroznih ćelija dobijenih iz pacijenta sa kancerom, i
(cc) upoređivanje informacije o sekvenci nukleinske kiseline od uzorka tumora dobijenog u koraku (aa) sa informacijom referentne sekvence nukleinske kiseline dobijene u koraku (bb); i
(b) obezbeđivanje RNK vakcine koja sadrži kancersku mutacionu signaturu dobijenu u koraku (a), pri čemu RNK vakcina sadrži RNK koja kodira rekombinantni poliepitopski polipeptid koji sadrži neoepitope bazirane na mutaciji; i
(B) primenu individualizovane vakcine protiv kancera na pacijenta sa kancerom.
2. Individualizovana vakcina protiv kancera za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što korak identifikovanja za kancer specifičnih somatskih mutacija sadrži identifikovanje kancerske mutacione signature egzoma jedne ili više kancerskih ćelija.
3. Individualizovana vakcina protiv kancera za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što korak identifikovanja za kancer specifičnih somatskih mutacija sadrži sekvenciranje jedne ćelije, od jedne ili više kancerskih ćelija, pri čemu, izborno, kancerske ćelije su cirkulišuće tumorske ćelije.
4. Individualizovana vakcina protiv kancera za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačena time što korak identifikovanja za kancer specifičnih somatskih mutacija uključuje upotrebu sekvenciranja sledeće generacije (NGS).
5. Individualizovana vakcina protiv kancera za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačena time što je infromacija o referentnoj sekvenci nukleinske kiseline dobijena od ćelija klicine linije, ili pri čemu je informacija o referentnoj sekvenci nukleinske kiseline dobijena od genomske DNK klicine linije dobijene od mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMCs).
6. Individualizovana vakcina protiv kancera za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, naznačena time što korak identifikovanja za kancer specifičnih somatskih mutacija u uzorku tumora dodatno sadrži korake:
(dd) obezbeđivanja filogenetskog stabla za kancer specifičnih somatskih mutacija, pri čemu je sekvenca klicine linije korišćena za ukorenjivanje stabla,
(ee) reprodukovanja predačkih sekvenci upotrebom algoritama, pri čemu, predačke sekvence su sekvence nodusa blizu korena filogenetskog stabla koje sadrže primarne bazalne mutacije, pri čemu, primarne bazalne mutacije su najranije mutacije predviđene da postoje u primarnom tumoru; i
(ff) selekcije primarnih bazalnih mutacija iz predačkih sekvenci identifikovanih u koraku (ee).
7. Individualizovana vakcina protiv kancera za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačena time što korak identifikovanja za kancer specifičnih somatskih mutacija je ponovljen najmanje u duplikatima.
8. Individualizovana vakcina protiv kancera za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačena time što polipeptid sadrži 5 ili više, 10 ili više ili 20 ili više neoepitopa na bazi mutacije.
9. Individualizovana vakcina protiv kancera za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačena time što polipeptid dodatno sadrži epitope koji ne sadrže za kancer specifične somatske mutacije koje su eksprimirane u kancerskim ćelijama.
10. Individualizovana vakcina protiv kancera za upotrebu prema patentnom zahtevu 6, naznačena time što polipeptid sadrži neo-epitope koji su bazirani na primarnoj bazalnoj mutaciji, pri čemu, primarne bazalne mutacije su najranije mutacije za koje je predviđeno da postoje u primarnom tumoru.
11. Individualizovana vakcina protiv kancera za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, naznačena time što su neo-epitopi ili epitopi u svom prirodnom sekvencionom kontekstu tako da formiraju sekvencu vakcine, pri čemu, izborno, sekvenca vakcine sadrži 20 ili više aminokiselina.
12. Individualizovana vakcina protiv kancera za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, naznačena time što su neo-epitopi, epitopi i/ili sekvence vakcine postavljeni "glava prema repu" i/ili su razdvojeni linkerima.
13. Individualizovana vakcina protiv kancera za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, naznačena time što vakcina, kada je primenjena na pacijenta, obezbeđuje kolekciju MHC-prezentovanih epitopa koji obuhvataju promene sekvence baziranih na identifikovanim mutacijama, pri čemu, izborno, MHC-prezentovani epitopi su MHC klase II-prezentovani epitopi koji su sposobni da izazovu odgovor CD4+ pomoćnih T ćelija protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih su MHC-prezentovani epitopi izvedeni i izborno MHC klase I-prezentovani epitopi koji su sposobni da izazovu CD8+ T ćelijski odgovor protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih su MHC-prezentovani epitopi izvedeni.
12
RS20211268A 2011-05-24 2012-05-23 Individualizovane vakcine protiv kancera RS62497B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2011/002576 WO2012159643A1 (en) 2011-05-24 2011-05-24 Individualized vaccines for cancer
EP2012000006 2012-01-02
EP18199105.0A EP3473267B1 (en) 2011-05-24 2012-05-23 Individualized vaccines for cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62497B1 true RS62497B1 (sr) 2021-11-30

Family

ID=46148823

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211268A RS62497B1 (sr) 2011-05-24 2012-05-23 Individualizovane vakcine protiv kancera
RS20230380A RS64230B1 (sr) 2011-05-24 2012-05-23 Individualizovane vakcine protiv kancera
RS20250794A RS67093B1 (sr) 2011-05-24 2012-05-23 Individualizovane vakcine protiv kancera

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230380A RS64230B1 (sr) 2011-05-24 2012-05-23 Individualizovane vakcine protiv kancera
RS20250794A RS67093B1 (sr) 2011-05-24 2012-05-23 Individualizovane vakcine protiv kancera

Country Status (23)

Country Link
US (3) US10738355B2 (sr)
JP (6) JP6444171B2 (sr)
CN (3) CN103608033B (sr)
AU (5) AU2012261237B2 (sr)
BR (1) BR112013029834A8 (sr)
CA (1) CA2836494C (sr)
DK (3) DK3892295T3 (sr)
ES (4) ES2746233T3 (sr)
FI (2) FI4223311T3 (sr)
HR (3) HRP20211595T1 (sr)
HU (4) HUE073292T2 (sr)
LT (4) LT4223311T (sr)
MX (3) MX386793B (sr)
NZ (2) NZ742420A (sr)
PL (2) PL3892295T3 (sr)
PT (4) PT3473267T (sr)
RS (3) RS62497B1 (sr)
RU (1) RU2670745C9 (sr)
SG (2) SG193553A1 (sr)
SI (3) SI3473267T1 (sr)
SM (3) SMT202500304T1 (sr)
WO (1) WO2012159754A2 (sr)
ZA (1) ZA201306944B (sr)

Families Citing this family (243)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
EP2364368B1 (en) 2008-11-07 2014-01-15 Sequenta, Inc. Methods of monitoring conditions by sequence analysis
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
ES2726702T3 (es) 2009-01-15 2019-10-08 Adaptive Biotechnologies Corp Perfilado de la inmunidad adaptativa y métodos para la generación de anticuerpos monoclonales
WO2010151416A1 (en) 2009-06-25 2010-12-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of measuring adaptive immunity
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2625189B1 (en) 2010-10-01 2018-06-27 ModernaTX, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
PL3892295T3 (pl) 2011-05-24 2023-07-24 BioNTech SE Zindywidualizowane szczepionki przeciwnowotworowe
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
EP2768982A4 (en) 2011-10-21 2015-06-03 Adaptive Biotechnologies Corp QUANTIFICATION OF ADAPTIVE IMMUNOCELL GENOMES IN A COMPLEX MIX OF CELLS
US9824179B2 (en) 2011-12-09 2017-11-21 Adaptive Biotechnologies Corp. Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
CA2865575C (en) 2012-02-27 2024-01-16 Cellular Research, Inc. Compositions and kits for molecular counting
EP3372694A1 (en) 2012-03-05 2018-09-12 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
WO2013151665A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
HUE029357T2 (en) 2012-05-08 2017-02-28 Adaptive Biotechnologies Corp Preparations and devices for measuring and calibrating amplification distortion in multiplex PCR reactions
WO2014012051A1 (en) * 2012-07-12 2014-01-16 Persimmune, Inc. Personalized cancer vaccines and adoptive immune cell therapies
WO2014028429A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Moderna Therapeutics, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of rna
LT2901341T (lt) * 2012-09-28 2019-09-25 The University Of Connecticut Protekcinių vėžio epitopų identifikavimas, skirtas vėžio gydymui
EP3330384B1 (en) 2012-10-01 2019-09-25 Adaptive Biotechnologies Corporation Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization
WO2015160439A2 (en) 2014-04-17 2015-10-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
EP3417874B1 (en) * 2012-11-28 2024-09-11 BioNTech SE Individualized vaccines for cancer
WO2014093186A1 (en) * 2012-12-12 2014-06-19 Garvin Alex M Non-invasive detection of colorectal neoplasia using circular consensus sequencing
EP4414990A3 (en) 2013-01-17 2024-11-06 Personalis, Inc. Methods and systems for genetic analysis
EP2968391A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
KR20150132479A (ko) * 2013-03-15 2015-11-25 어댑티브 바이오테크놀로지스 코포레이션 복합 유전자 세트에서의 독특하게 태그되고 재배열된 적응 면역 수용체 유전자
EP2983702A2 (en) * 2013-04-07 2016-02-17 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for personalized neoplasia vaccines
WO2014180490A1 (en) * 2013-05-10 2014-11-13 Biontech Ag Predicting immunogenicity of t cell epitopes
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
US20160186260A1 (en) * 2013-07-26 2016-06-30 Sequenta, Llc Cancer vaccination with antigen evolution
KR102758333B1 (ko) 2013-08-28 2025-01-23 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
WO2015031689A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Personalis, Inc. Methods and systems for genomic analysis
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
WO2015051275A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Personalis, Inc. Methods for analyzing genotypes
US9582877B2 (en) 2013-10-07 2017-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
WO2015077717A1 (en) 2013-11-25 2015-05-28 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status
ES2693217T3 (es) * 2013-12-02 2018-12-10 Personal Genome Diagnostics Inc. Método para evaluar variantes minoritarias en una muestra
WO2015085147A1 (en) 2013-12-05 2015-06-11 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
US20160310584A1 (en) * 2013-12-06 2016-10-27 The Broad Institute Inc. Formulations for neoplasia vaccines
KR20230076867A (ko) 2013-12-20 2023-05-31 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신생항원 백신과의 병용 요법
WO2015134787A2 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
PL4023249T3 (pl) 2014-04-23 2025-03-10 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
US10017759B2 (en) * 2014-06-26 2018-07-10 Illumina, Inc. Library preparation of tagged nucleic acid
CN113791220A (zh) 2014-09-10 2021-12-14 豪夫迈·罗氏有限公司 免疫原性突变体肽筛选平台
US11338026B2 (en) 2014-09-10 2022-05-24 The University Of Connecticut Identification of immunologically protective neo-epitopes for the treatment of cancers
JP6599450B2 (ja) 2014-10-02 2019-10-30 アメリカ合衆国 がん特異的突然変異に対し抗原特異性を有するｔ細胞を単離する方法
CA2966201A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 Adaptive Biotechnologies Corp. Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples
US10125399B2 (en) 2014-10-30 2018-11-13 Personalis, Inc. Methods for using mosaicism in nucleic acids sampled distal to their origin
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
AU2015353581A1 (en) 2014-11-25 2017-06-15 Adaptive Biotechnologies Corporation Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing
EP3234130B1 (en) 2014-12-19 2020-11-25 The Broad Institute, Inc. Methods for profiling the t-cell- receptor repertoire
US10975442B2 (en) 2014-12-19 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
WO2016128060A1 (en) * 2015-02-12 2016-08-18 Biontech Ag Predicting t cell epitopes useful for vaccination
EP3259371B1 (en) * 2015-02-19 2020-09-02 Becton, Dickinson and Company High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information
CA2976580A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 Adaptive Biotechnologies Corp. Methods for diagnosing infectious disease and determining hla status using immune repertoire sequencing
US10780021B2 (en) 2015-02-26 2020-09-22 Sio2 Medical Products, Inc. Cycloolefin polymer container with a scratch resistant and anti-static coating
WO2016138496A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
WO2016160844A2 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for combinatorial barcoding
EP3277294B1 (en) 2015-04-01 2024-05-15 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target
EP4582556A3 (en) 2015-04-23 2025-10-08 Becton, Dickinson and Company Methods and compositions for whole transcriptome amplification
CN117467603A (zh) * 2015-04-27 2024-01-30 癌症研究技术有限公司 治疗癌症的方法
WO2016180467A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Enhancing the effect of car-engineered t cells by means of nucleic acid vaccination
EA201792501A1 (ru) * 2015-05-13 2018-10-31 Эйдженус Инк. Вакцины для лечения и профилактики рака
IL294183B2 (en) 2015-05-20 2023-10-01 Dana Farber Cancer Inst Inc shared neoantigens
WO2016196229A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Cellular Research, Inc. Methods for rna quantification
TW202241500A (zh) * 2015-06-09 2022-11-01 美商博德研究所有限公司 用於贅瘤疫苗之調配物及其製備方法
MA42543A (fr) * 2015-07-30 2018-06-06 Modernatx Inc Arn épitope peptidiques concatémériques
GB201516047D0 (en) 2015-09-10 2015-10-28 Cancer Rec Tech Ltd Method
JP6940484B2 (ja) 2015-09-11 2021-09-29 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド ライブラリー正規化のための方法および組成物
EP3359670B2 (en) 2015-10-05 2024-02-14 ModernaTX, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
WO2017059902A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
EP3362929B1 (en) 2015-10-12 2020-08-12 Nantomics, LLC Viral neoepitopes and uses thereof
MX2018004544A (es) 2015-10-12 2018-11-09 Nantomics Llc Composiciones y métodos para los neoepítopos de cáncer viral.
AU2016341309A1 (en) * 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Cancer vaccines
ES2970865T3 (es) 2015-12-16 2024-05-31 Gritstone Bio Inc Identificación, fabricación y uso de neoantígenos
CN105349533A (zh) * 2015-12-21 2016-02-24 生工生物工程（上海）股份有限公司 构建链特异性转录组文库的方法
EP3400005A1 (en) * 2016-01-08 2018-11-14 Vaccibody AS Neoepitope rna cancer vaccine
IL260030B2 (en) 2016-01-08 2025-12-01 Nykode Therapeutics ASA Therapeutic anticancer neoepitope vaccine
KR20180117227A (ko) 2016-03-24 2018-10-26 난트셀, 인크. 네오에피토프 제시를 위한 시퀀스들 및 시퀀스 배열들
JP2019513373A (ja) 2016-03-31 2019-05-30 ネオン セラピューティクス， インコーポレイテッド ネオ抗原およびその使用方法
AU2017254477A1 (en) 2016-04-18 2018-11-01 Jennifer G. ABELIN Improved HLA epitope prediction
EP3445392A1 (en) * 2016-04-22 2019-02-27 CureVac AG Rna encoding a tumor antigen
JP7129343B2 (ja) 2016-05-02 2022-09-01 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 正確な分子バーコーディング
CN109328070A (zh) * 2016-05-04 2019-02-12 免疫疫苗技术有限公司 包含两亲化合物、新抗原和疏水载体的疫苗组合物及其使用方法
WO2017194170A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Methods for predicting the usefulness of proteins or protein fragments for immunotherapy
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
ES2979395T3 (es) 2016-05-26 2024-09-25 Becton Dickinson Co Métodos de ajuste del recuento de etiquetas moleculares
CN109890408A (zh) * 2016-05-27 2019-06-14 埃特彼塞斯公司 新表位疫苗组合物及其使用方法
US11299783B2 (en) 2016-05-27 2022-04-12 Personalis, Inc. Methods and systems for genetic analysis
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
SG11201811258UA (en) * 2016-07-13 2019-01-30 Vaximm Ag Process for the production of a dna vaccine for cancer immunotherapy
SG11201900132QA (en) * 2016-07-20 2019-02-27 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Selecting neoepitopes as disease-specific targets for therapy with enhanced efficacy
US10428325B1 (en) 2016-09-21 2019-10-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Identification of antigen-specific B cell receptors
CN109791157B (zh) 2016-09-26 2022-06-07 贝克顿迪金森公司 使用具有条形码化的寡核苷酸序列的试剂测量蛋白质表达
JP7228510B2 (ja) 2016-11-08 2023-02-24 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 細胞標識分類の方法
US11164659B2 (en) 2016-11-08 2021-11-02 Becton, Dickinson And Company Methods for expression profile classification
WO2018089637A1 (en) 2016-11-11 2018-05-17 Nantbio, Inc. Immunomodulatory compositions, processes for making the same, and methods for inhibiting cytokine storms
CN108090325B (zh) * 2016-11-23 2022-01-25 中国科学院昆明动物研究所 一种应用β-稳定性分析单细胞测序数据的方法
WO2018132753A1 (en) * 2017-01-13 2018-07-19 Nantbio, Inc. Validation of neoepitope-based treatment
ES2961580T3 (es) 2017-01-13 2024-03-12 Cellular Res Inc Revestimiento hidrófilo de canales de fluidos
WO2018136664A1 (en) * 2017-01-18 2018-07-26 Ichan School Of Medicine At Mount Sinai Neoantigens and uses thereof for treating cancer
US11549149B2 (en) 2017-01-24 2023-01-10 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide
BR112019015797A2 (pt) * 2017-02-01 2020-03-17 Modernatx, Inc. Composições de mrna terapêuticas imunomoduladoras que codificam peptídeos de mutação de oncogene de ativação
US20190351040A1 (en) * 2017-02-01 2019-11-21 Modernatx, Inc. Rna cancer vaccines
CN110382708A (zh) 2017-02-01 2019-10-25 赛卢拉研究公司 使用阻断性寡核苷酸进行选择性扩增
US11965892B2 (en) 2017-02-12 2024-04-23 Biontech Us Inc. HLA-based methods and compositions and uses thereof
US20200101108A1 (en) 2017-03-31 2020-04-02 The Board Of Trustees Of The Le-Land Standford Junior University Methods of treating t cell exhaustion by inhibiting or modulating t cell receptor signaling
CA3058807A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Biontech Us Inc. Protein antigens and uses thereof
US11905525B2 (en) 2017-04-05 2024-02-20 Modernatx, Inc. Reduction of elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
US11779637B2 (en) 2017-04-24 2023-10-10 Nantcell, Inc. Targeted neoepitope vectors and methods therefor
EP3634449A4 (en) 2017-05-08 2021-03-17 Gritstone Oncology, Inc. ALPHAVIRUS NEOANTIGEN VECTORS
US11464798B2 (en) 2017-05-11 2022-10-11 Theralase Technologies Inc. Vaccine containing cancer cells inactivated by photodynamic treatment with metal-based coordination complexes, and immunotherapy method using same
EP3933408A1 (en) 2017-05-30 2022-01-05 Nant Holdings IP LLC Circulating tumor cell enrichment using neoepitopes
CN110719959B (zh) 2017-06-05 2021-08-06 贝克顿迪金森公司 针对单细胞的样品索引
WO2018224166A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Methods for predicting the usefulness of disease specific amino acid modifications for immunotherapy
WO2018234506A2 (en) 2017-06-21 2018-12-27 Transgene Sa PERSONALIZED VACCINE
US20200219586A1 (en) 2017-06-27 2020-07-09 Institute For Cancer Research D/B/A The Research Institute Of Fox Chase Cancer Center MHC-1 Genotypes Restricts The Oncogenic Mutational Landscape
JP7298926B2 (ja) * 2017-07-12 2023-06-27 ノイスコム アーゲー 癌の治療のためのネオアンチゲンワクチン組成物
US10636512B2 (en) 2017-07-14 2020-04-28 Cofactor Genomics, Inc. Immuno-oncology applications using next generation sequencing
EP3688020A4 (en) 2017-09-25 2021-07-14 University of Florida Research Foundation, Incorporated IMMUNOASSAYS FOR DETECTION OF RAN PROTEINS
EP4576103A3 (en) 2017-10-10 2025-08-27 Gritstone bio, Inc. Neoantigen identification using hotspots
CN111630602A (zh) * 2017-11-22 2020-09-04 磨石肿瘤生物技术公司 减少新抗原的接合表位呈递
US20200354730A1 (en) * 2017-11-27 2020-11-12 Nantcell, Inc. Improved Yeast Polytope Vaccine Compositions And Methods
US11254980B1 (en) 2017-11-29 2022-02-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements
US20200368336A1 (en) * 2017-12-01 2020-11-26 Shanghai Jenomed Biotech Co., Ltd. Method for preparing personalized cancer vaccine
TW201930340A (zh) 2017-12-18 2019-08-01 美商尼恩醫療公司 新抗原及其用途
CA3083792A1 (en) * 2017-12-18 2019-06-27 Personal Genome Diagnostics Inc. Machine learning system and method for somatic mutation discovery
EP3728636B1 (en) 2017-12-19 2024-09-11 Becton, Dickinson and Company Particles associated with oligonucleotides
MX2020007077A (es) 2018-01-04 2020-10-28 Iconic Therapeutics Inc Anticuerpos anti-factor tisular, conjugados anticuerpo-farmaco y metodos relacionados.
JP7437310B2 (ja) * 2018-03-14 2024-02-22 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ Ｒｎａシーケンシングデータの転写発現レベルを解釈するために局所的なユニークな特徴を使用するシステム及び方法
US12462935B2 (en) * 2018-03-30 2025-11-04 Nucleix Ltd. Deep learning-based methods, devices, and systems for prenatal testing
MA52363A (fr) 2018-04-26 2021-03-03 Agenus Inc Compositions peptidiques de liaison à une protéine de choc thermique (hsp) et leurs méthodes d'utilisation
JP7358388B2 (ja) 2018-05-03 2023-10-10 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 反対側の転写物末端における分子バーコーディング
CN112272710A (zh) 2018-05-03 2021-01-26 贝克顿迪金森公司 高通量多组学样品分析
IL259392A (en) 2018-05-15 2018-08-01 Yeda Res & Dev Vaccination with cancer neoantigens
WO2019227106A1 (en) * 2018-05-25 2019-11-28 The Wistar Institute Tumor-specific neoantigens and methods of using the same
CN108897986B (zh) * 2018-05-29 2020-11-27 中南大学 一种基于蛋白质信息的基因组序列拼接方法
US10801064B2 (en) 2018-05-31 2020-10-13 Personalis, Inc. Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples
US11814750B2 (en) 2018-05-31 2023-11-14 Personalis, Inc. Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples
MX2020014243A (es) 2018-06-19 2021-05-12 Biontech Us Inc Neoantigenos y usos de los mismos.
AU2019293244B2 (en) * 2018-06-27 2026-04-02 Modernatx, Inc. Personalized cancer vaccine epitope selection
WO2020020444A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Individualized vaccines for cancer
CA3106564A1 (en) 2018-07-26 2020-01-30 Frame Pharmaceuticals B.V. Cancer vaccines for breast cancer
US20220349010A1 (en) 2018-07-26 2022-11-03 Frame Pharmaceuticals B.V. Method of preparing subject-specific immunogenic compositions based on a neo open-reading-frame peptide database
MX2021003654A (es) 2018-09-27 2021-05-28 Nykode Therapeutics AS Metodo para seleccionar neoepitopes.
ES2992135T3 (es) 2018-10-01 2024-12-09 Becton Dickinson Co Determinar secuencias de transcripción 5’
WO2020072700A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hla single allele lines
CN114681600A (zh) * 2018-10-19 2022-07-01 杭州纽安津生物科技有限公司 通用性多肽疫苗及其在制备治疗/预防胰腺癌药物中的应用
MA54192A (fr) * 2018-11-07 2021-09-15 Modernatx Inc Vaccins à arn contre le cancer
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
MX2021005656A (es) * 2018-11-15 2021-07-07 Nouscom Ag Seleccion de mutaciones de cancer para la generacion de una vacuna contra cancer personalizada.
US11492660B2 (en) 2018-12-13 2022-11-08 Becton, Dickinson And Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
US20220062394A1 (en) 2018-12-17 2022-03-03 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
KR20240091046A (ko) * 2018-12-21 2024-06-21 바이오엔테크 유에스 인크. Hla 클래스 ii-특이적 에피토프 예측 및 cd4+ t 세포 특징화를 위한 방법 및 시스템
GB201821205D0 (en) * 2018-12-24 2019-02-06 Tcer Ab Immunotherapy
GB201821207D0 (en) 2018-12-24 2019-02-06 Tcer Ab Immunotherapy therapy
AU2020207053B2 (en) * 2019-01-08 2025-07-31 Caris Mpi, Inc. Genomic profiling similarity
AU2020208193A1 (en) * 2019-01-14 2021-07-29 BioNTech SE Methods of treating cancer with a PD-1 axis binding antagonist and an RNA vaccine
US11371076B2 (en) 2019-01-16 2022-06-28 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
ES2945227T3 (es) 2019-01-23 2023-06-29 Becton Dickinson Co Oligonucleótidos asociados con anticuerpos
CN113396230A (zh) 2019-02-08 2021-09-14 豪夫迈·罗氏有限公司 癌症的诊断和治疗方法
WO2020167920A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Cellular Research, Inc. Hybrid targeted and whole transcriptome amplification
EP3923979A1 (en) * 2019-02-15 2021-12-22 Rjan Holding AB Autologous cancer tumour associated extrachromosomal circular dna for use as a therapeutic vaccine
EP3930755A4 (en) * 2019-03-01 2023-03-22 Flow Pharma Inc. DESIGN, MANUFACTURE AND USE OF PERSONALIZED CANCER VACCINES
US20220154180A1 (en) 2019-03-13 2022-05-19 Toyobo Co., Ltd. Production and amplification of nucleic acids
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
CN112011833B (zh) * 2019-05-30 2024-04-26 上海桀蒙生物技术有限公司 筛选和分离肿瘤新生抗原的方法
MX2021014525A (es) 2019-05-30 2022-03-17 Gritstone Bio Inc Adenovirus modificados.
CN120099137A (zh) 2019-07-22 2025-06-06 贝克顿迪金森公司 单细胞染色质免疫沉淀测序测定
CN110277135B (zh) * 2019-08-10 2021-06-01 杭州新范式生物医药科技有限公司 一种基于预期疗效选择个体化肿瘤新抗原的方法和系统
TWI793451B (zh) * 2019-09-20 2023-02-21 納維再生科技股份有限公司 個人化癌症免疫治療
WO2021055880A1 (en) * 2019-09-20 2021-03-25 University Of Florida Researchfoundation, Incorporated Detection of antibodies against ran proteins from serum and tissue lysates
US12394502B2 (en) 2019-10-02 2025-08-19 The General Hospital Corporation Method for predicting HLA-binding peptides using protein structural features
JP7470787B2 (ja) 2019-11-05 2024-04-18 パーソナリス，インコーポレイティド 単一試料からの腫瘍純度の推定
JP7522189B2 (ja) 2019-11-08 2024-07-24 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 免疫レパートリーシーケンシングのための完全長ｖ（ｄ）ｊ情報を得るためのランダムプライミングの使用
CN112795647B (zh) * 2019-11-14 2022-08-16 北京肿瘤医院(北京大学肿瘤医院) 一种肿瘤标志物及其应用
WO2021119505A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Genentech, Inc. Anti-ly6g6d antibodies and methods of use
WO2021146219A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Cell capture using du-containing oligonucleotides
US11649497B2 (en) 2020-01-13 2023-05-16 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and RNA
WO2021155057A1 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Becton, Dickinson And Company Barcoded wells for spatial mapping of single cells through sequencing
WO2021173719A1 (en) 2020-02-25 2021-09-02 Becton, Dickinson And Company Bi-specific probes to enable the use of single-cell samples as single color compensation control
US20230114434A1 (en) 2020-03-13 2023-04-13 Codiak Biosciences, Inc. Extracellular vesicles for treating neurological disorders
JP2023518414A (ja) 2020-03-20 2023-05-01 コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 治療のための細胞外小胞
US11920202B2 (en) 2020-04-09 2024-03-05 University Of Connecticut Unbiased identification of tumor rejection mediating neoepitopes
US11661625B2 (en) 2020-05-14 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
WO2021242793A2 (en) 2020-05-26 2021-12-02 The Broad Institute, Inc. Nucleic acid artificial mini-proteome libraries
US12157913B2 (en) 2020-06-02 2024-12-03 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides and beads for 5 prime gene expression assay
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US12391940B2 (en) 2020-07-31 2025-08-19 Becton, Dickinson And Company Single cell assay for transposase-accessible chromatin
CN116438308A (zh) 2020-08-06 2023-07-14 磨石生物公司 多表位疫苗盒
WO2022036146A1 (en) 2020-08-12 2022-02-17 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
GB2613718A (en) * 2020-08-31 2023-06-14 World Biotech Regenerative Medical Group Ltd Personalized immunogenic compositions and methods for producing and using same
US20240082389A1 (en) 2020-09-23 2024-03-14 Lonza Sales Ag Methods of producing extracellular vesicles
US11161892B1 (en) 2020-12-07 2021-11-02 Think Therapeutics, Inc. Method of compact peptide vaccines using residue optimization
US11421015B2 (en) 2020-12-07 2022-08-23 Think Therapeutics, Inc. Method of compact peptide vaccines using residue optimization
EP4247967A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
CN116710115A (zh) 2020-11-20 2023-09-05 思维疗法股份有限公司 用于优化的肽疫苗的组合物和方法
US11058751B1 (en) 2020-11-20 2021-07-13 Think Therapeutics, Inc. Compositions for optimized RAS peptide vaccines
JP2024501482A (ja) 2020-12-14 2024-01-12 ビオンテック ユーエス インコーポレイテッド がん免疫療法のための組織特異的抗原
CN116685850A (zh) 2020-12-15 2023-09-01 贝克顿迪金森公司 单细胞分泌组分析
US11464842B1 (en) 2021-04-28 2022-10-11 Think Therapeutics, Inc. Compositions and method for optimized peptide vaccines using residue optimization
WO2023025404A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 BioNTech SE In vitro transcription technologies
WO2023059654A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Personalis, Inc. Customized assays for personalized cancer monitoring
EP4426829A1 (en) 2021-11-01 2024-09-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Biologically selected nucleic acid artificial mini-proteome libraries
CN118318038A (zh) 2021-11-10 2024-07-09 东洋纺株式会社 改良的文库制备方法
CN114181287B (zh) * 2021-12-10 2023-09-19 商丘美兰生物工程有限公司 一种dna病毒疫苗的制备方法
CN114350800B (zh) * 2021-12-29 2024-03-19 中南大学湘雅医院 Sphk1在制备pd-l1/pd-1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用
CN114410778B (zh) * 2021-12-29 2024-03-19 中南大学湘雅医院 Pf543在制备pd-l1/pd-1单抗肿瘤免疫治疗药物中的应用
KR20230130804A (ko) * 2022-03-04 2023-09-12 (주)큐리진 순환종양세포 검출을 위한 아데노바이러스 5/3 형
EP4253550A1 (en) 2022-04-01 2023-10-04 GenCC GmbH 6 Co. KG Method for the manufacture of a viral system, a vector system or any transport system for cancer-specific crispr complexes
WO2023209068A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Carbocalyx Gmbh Personalized anticancer vaccine comprising glycoengineered tumour cells or tumour cell fragments
WO2024015892A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 The Broad Institute, Inc. Hla-ii immunopeptidome methods and systems for antigen discovery
WO2024064931A1 (en) * 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of liver stage antigens and related methods
WO2024063788A1 (en) * 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of malaria antigens and related methods
WO2024083345A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 BioNTech SE Methods and uses associated with liquid compositions
CN120584195A (zh) 2023-01-26 2025-09-02 东洋纺株式会社 源自核糖体rna的逆转录的抑制
WO2024231973A1 (ja) * 2023-05-08 2024-11-14 株式会社日立製作所 情報処理装置
US12531162B1 (en) * 2023-05-31 2026-01-20 Northeastern University Multi-dimensional phenotypic space for genotype to phenotype mapping and intelligent design of cancer drug therapies using a deep learning net
EP4736848A1 (en) 2023-06-28 2026-05-06 Shanghai Regenelead Therapies Co., Ltd. Pharmaceutical composition containing cationic lipid and use thereof
WO2025024337A1 (en) * 2023-07-24 2025-01-30 BioNTech SE Compositions for delivery of plasmodium antigens and related methods
WO2025064850A1 (en) * 2023-09-22 2025-03-27 BioNTech SE Rna constructs with n-terminal degrons to enhance an immune response
WO2025097055A2 (en) 2023-11-02 2025-05-08 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of use of t cells in immunotherapy
US12562256B2 (en) * 2023-11-07 2026-02-24 New York University Systems, methods and computer-accessible medium for identifying target pairs for CAR-T therapy
WO2025146078A1 (en) * 2024-01-04 2025-07-10 Everest Medicines (China) Co., Ltd. Cancer vaccines and uses thereof
WO2025191449A1 (en) 2024-03-11 2025-09-18 Instadeep Ltd Systems and methods for machine learning-based genome annotation
WO2025202937A1 (en) 2024-03-26 2025-10-02 BioNTech SE Cancer vaccines
WO2025207807A1 (en) * 2024-03-27 2025-10-02 The University Of Florida Research Foundation, Inc. Ctc rna-loaded nanoparticles and use thereof for the treatment of cancer
WO2025257735A1 (en) 2024-06-10 2025-12-18 BioNTech SE Systems and methods for machine learning model-based prediction of immune response
CN119049567B (zh) * 2024-08-08 2025-07-22 笙源生命科技(安吉)有限公司 一种基于单细胞测序区分嵌合体动物模型中异种杂交样本遗传物质和细胞物种来源的方法
EP4711456A1 (en) 2024-09-11 2026-03-18 GenCC GmbH & Co. KG Method for the manufacture of individualized crispr/cas complexes and individualized crispr/cas complexes

Family Cites Families (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5804381A (en) 1996-10-03 1998-09-08 Cornell Research Foundation Isolated nucleic acid molecule encoding an esophageal cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US6235525B1 (en) 1991-05-23 2001-05-22 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
EP0871747A1 (en) 1996-01-02 1998-10-21 Chiron Viagene, Inc. Immunostimulation mediated by gene-modified dendritic cells
ES2180045T3 (es) * 1996-04-19 2003-02-01 Us Gov Sec Health Peptidos ras mutados para la generacion de linfocitos t citotoxicos cd8+.
JP4108126B2 (ja) 1996-04-26 2008-06-25 リュクスウニヴェルシテート テ レイデン Ｔ細胞ペプチド・エピトープの選択と産生方法および選択したエピトープを組込むワクチン
CN1138533C (zh) 1996-09-13 2004-02-18 利普森有限公司 脂质体
ATE229810T1 (de) * 1996-10-11 2003-01-15 Univ California Krebs immuntherapie unter verwendung von tumorzellen kombiniert mit lymphozytmischungen
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
US6074645A (en) 1996-11-12 2000-06-13 City Of Hope Immuno-reactive peptide CTL epitopes of human cytomegalovirus
TR200001253T2 (tr) 1997-11-06 2000-11-21 Roche Diagnostics Gmbh Tümöre özel antijenler
WO1999034014A2 (en) 1997-12-23 1999-07-08 Roche Diagnostics Gmbh A method for the determination of a nucleic acid
AU1774299A (en) * 1997-12-24 1999-07-19 Imperial Cancer Research Technology Limited Polymorphisms within the rsk-3 gene related to cancer and methods of diagnosis, prognosis, and treatment
US6432925B1 (en) 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
EP1117430A1 (en) 1998-10-05 2001-07-25 Genzyme Corporation Genes differentially expressed in cancer cells to design cancer vaccines
CN100352921C (zh) 1999-05-06 2007-12-05 威克福雷大学 用于鉴定引起免疫反应的抗原的组合物和方法
CA2384987A1 (en) 1999-09-16 2001-03-22 Zycos Inc. Nucleic acids encoding polyepitope polypeptides
EP1222289B1 (en) * 1999-10-20 2008-04-16 The Johns Hopkins University School Of Medicine Chimeric immunogenic compositions and nucleic acids encoding them
EP1261704B1 (en) 1999-11-30 2009-07-01 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules encoding cancer associated antigens, the antigens per se, and uses thereof
EP1242108B1 (en) 1999-12-28 2007-07-11 Pharmexa Inc. Optimized minigenes and peptides encoded thereby
US7462354B2 (en) 1999-12-28 2008-12-09 Pharmexa Inc. Method and system for optimizing minigenes and peptides encoded thereby
WO2001093902A2 (en) 2000-06-07 2001-12-13 Biosynexus Incorporated Immunostimulatory rna/dna hybrid molecules
JP5087201B2 (ja) * 2000-08-03 2012-12-05 ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ 抗原に小胞体シャペロンポリペプチドを連結した分子ワクチン
US6472176B2 (en) 2000-12-14 2002-10-29 Genvec, Inc. Polynucleotide encoding chimeric protein and related vector, cell, and method of expression thereof
ES2340499T3 (es) 2001-06-05 2010-06-04 Curevac Gmbh Arnm de antigeno tumoral estabilizado con un contenido de g/c aumentado.
AUPR593101A0 (en) * 2001-06-26 2001-07-19 Council Of The Queensland Institute Of Medical Research, The Cytomegalovirus t cell epitopes
NZ533237A (en) 2001-11-26 2005-11-25 Univ Queensland Flavivirus vaccine delivery system
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
WO2003059381A2 (en) 2002-01-18 2003-07-24 Curevac Gmbh Immunogenic preparations and vaccines on the basis of mrna
AUPS054702A0 (en) 2002-02-14 2002-03-07 Immunaid Pty Ltd Cancer therapy
WO2003070162A2 (en) * 2002-02-19 2003-08-28 Genzyme Corporation Par-3 compounds for therapy and diagnosis and methods for using same
WO2003078595A2 (en) * 2002-03-15 2003-09-25 Astral, Inc. Immunostimulatory double stranded rna and methods of inducing, enhancing or modulating the immune response
WO2003106692A2 (en) 2002-06-13 2003-12-24 Merck Patent Gmbh Methods for the identification of all-antigens and their use for cancer therapy and transplantation
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
DE10335833A1 (de) * 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie
IL158140A0 (en) 2003-09-25 2004-03-28 Hadasit Med Res Service Multiepitope polypeptides for cancer immunotherapy
DE10344799A1 (de) 2003-09-26 2005-04-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
WO2005039533A1 (en) 2003-10-15 2005-05-06 Medigene Ag Method of administering cationic liposomes comprising an active drug
PL1692516T3 (pl) 2003-10-24 2011-05-31 Immunaid Pty Ltd Sposób terapii
EP1589030A1 (en) * 2004-04-14 2005-10-26 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Bob-1 specific T cells and methods to use
US7303881B2 (en) 2004-04-30 2007-12-04 Pds Biotechnology Corporation Antigen delivery compositions and methods of use
DE102004023187A1 (de) 2004-05-11 2005-12-01 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
DE102004035227A1 (de) 2004-07-21 2006-02-16 Curevac Gmbh mRNA-Gemisch zur Vakzinierung gegen Tumorerkrankungen
DE102004057303A1 (de) 2004-11-26 2006-06-01 Merck Patent Gmbh Stabile Kristallmodifikationen von DOTAP Chlorid
CA2592972A1 (en) 2004-12-29 2006-07-06 Mannkind Corporation Methods to bypass cd+4 cells in the induction of an immune response
DK2439273T3 (da) 2005-05-09 2019-06-03 Ono Pharmaceutical Co Humane monoklonale antistoffer til programmeret død-1(pd-1) og fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af anti-pd-1- antistoffer alene eller i kombination med andre immunterapeutika
PT1907424E (pt) 2005-07-01 2015-10-09 Squibb & Sons Llc Anticorpos monoclonais humanos para o ligando 1 de morte programada (pd-l1)
PL2578685T3 (pl) 2005-08-23 2020-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna zawierający zmodyfikowane nukleozydy i sposoby jego zastosowania
DE102005041616B4 (de) 2005-09-01 2011-03-17 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Melanom-assoziierte MHC Klasse I assoziierte Oligopeptide und für diese kodierende Polynukleotide und deren Verwendungen
EP1762575A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
JP2009532664A (ja) 2006-02-27 2009-09-10 アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツ・フォー・アンド・オン・ビハーフ・オブ・アリゾナ・ステイト・ユニバーシティ 癌の治療のためのノボペプチドの同定および使用
WO2007106523A2 (en) 2006-03-13 2007-09-20 Veridex, Llc Propagation of primary cells
US8768629B2 (en) 2009-02-11 2014-07-01 Caris Mpi, Inc. Molecular profiling of tumors
US20090304711A1 (en) 2006-09-20 2009-12-10 Drew Pardoll Combinatorial Therapy of Cancer and Infectious Diseases with Anti-B7-H1 Antibodies
DE102006060824B4 (de) 2006-12-21 2011-06-01 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Nachweis von individuellen T-Zell-Reaktionsmustern gegen Tumor-assoziierte Antigene (TAA) in Tumorpatienten als Basis für die individuelle therapeutische Vakzinierung von Patienten
KR101523391B1 (ko) 2006-12-27 2015-05-27 에모리 유니버시티 감염 및 종양 치료를 위한 조성물 및 방법
US8140270B2 (en) 2007-03-22 2012-03-20 National Center For Genome Resources Methods and systems for medical sequencing analysis
US8877206B2 (en) 2007-03-22 2014-11-04 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by cationic lipids
BR122017025062B8 (pt) 2007-06-18 2021-07-27 Merck Sharp & Dohme anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo para o receptor de morte programada humano pd-1, polinucleotídeo e composição compreendendo o referido anticorpo ou fragmento
WO2009046738A1 (en) * 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating lung cancer, particularly of non-small lung cancers (nsclc)
EP2060583A1 (en) 2007-10-23 2009-05-20 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
DK2276486T3 (da) 2008-03-24 2013-11-25 4Sc Discovery Gmbh Nye substituerede imidazo-quinoliner
EP2276495B1 (en) 2008-04-17 2018-11-21 PDS Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by enantiomers of cationic lipids
JP5268444B2 (ja) * 2008-06-23 2013-08-21 株式会社日立ハイテクノロジーズ 単分子リアルタイムシーケンス装置，核酸分析装置及び単分子リアルタイムシーケンス方法
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
EP2337795A2 (en) * 2008-10-01 2011-06-29 Dako Denmark A/S Mhc multimers in cancer vaccines and immune monitoring
US20110195090A1 (en) 2008-10-11 2011-08-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Method of making a vaccine
MX2011005691A (es) 2008-11-28 2011-07-20 Univ Emory Metodos para el tratamiento de infecciones y tumores.
DE102008061522A1 (de) 2008-12-10 2010-06-17 Biontech Ag Verwendung von Flt3-Ligand zur Verstärkung von Immunreaktionen bei RNA-Immunisierung
CA2769670C (en) 2009-07-31 2018-10-02 Ethris Gmbh Rna with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
WO2013040142A2 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Iogenetics, Llc Bioinformatic processes for determination of peptide binding
GB201006360D0 (en) 2010-04-16 2010-06-02 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for differentially quantifying naturally processed HLA-restricted peptides for cancer, autoimmune and infectious diseases immunotherapy development
EP2569633B1 (en) * 2010-05-14 2016-02-10 The General Hospital Corporation Compositions and methods of identifying tumor specific neoantigens
EP2625189B1 (en) 2010-10-01 2018-06-27 ModernaTX, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
DE102011102734A1 (de) 2011-05-20 2012-11-22 WMF Württembergische Metallwarenfabrik Aktiengesellschaft Vorrichtung zum Aufschäumen von Milch, Getränkebereiter mit dieser Vorrichtung und Verfahren zum Aufschäumen von Milch
EP3892295B1 (en) 2011-05-24 2023-04-26 BioNTech SE Individualized vaccines for cancer
WO2012159643A1 (en) 2011-05-24 2012-11-29 Biontech Ag Individualized vaccines for cancer
PL3892295T3 (pl) 2011-05-24 2023-07-24 BioNTech SE Zindywidualizowane szczepionki przeciwnowotworowe
DE19216461T1 (de) 2011-10-03 2021-10-07 Modernatx, Inc. Modifizierte nukleoside, nukleotide und nukleinsäuren und verwendungen davon
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US20150030576A1 (en) 2012-01-10 2015-01-29 Moderna Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeting agents into and across the blood-brain barrier
EP3072898A1 (en) 2012-02-20 2016-09-28 Universita' degli Studi di Milano Homo- and heterodimeric smac mimetic compounds as apoptosis inducers
US20130255281A1 (en) 2012-03-29 2013-10-03 General Electric Company System and method for cooling electrical components
WO2013151665A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
WO2014012051A1 (en) 2012-07-12 2014-01-16 Persimmune, Inc. Personalized cancer vaccines and adoptive immune cell therapies
WO2014093924A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
KR102121086B1 (ko) 2012-11-01 2020-06-09 팩터 바이오사이언스 인크. 세포에서 단백질을 발현시키는 방법들과 생성물들
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
US20160022840A1 (en) 2013-03-09 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Heterologous untranslated regions for mrna
EP2968391A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US20160032316A1 (en) 2013-03-14 2016-02-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and Purity Assessment of RNA Molecules Synthesized with Modified Nucleosides
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
WO2014144039A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
WO2014152027A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
US10590161B2 (en) 2013-03-15 2020-03-17 Modernatx, Inc. Ion exchange purification of mRNA
EP2971165A4 (en) 2013-03-15 2016-11-23 Moderna Therapeutics Inc DISSOLUTION OF DNA FRAGMENTS IN MRNA MANUFACTURING METHODS
US20160017313A1 (en) 2013-03-15 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Analysis of mrna heterogeneity and stability
EP2983702A2 (en) 2013-04-07 2016-02-17 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for personalized neoplasia vaccines
WO2015014375A1 (en) 2013-07-30 2015-02-05 Biontech Ag Tumor antigens for determining cancer therapy
EP3041934A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
WO2015038892A1 (en) 2013-09-13 2015-03-19 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide compositions containing amino acids
US9950065B2 (en) 2013-09-26 2018-04-24 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Particles comprising a shell with RNA
EP3052511A4 (en) 2013-10-02 2017-05-31 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
EP3052479A4 (en) 2013-10-02 2017-10-25 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015058780A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Biontech Ag Method and kit for determining whether a subject shows an immune response
EP3076994A4 (en) 2013-12-06 2017-06-07 Modernatx, Inc. Targeted adaptive vaccines
EP3053585A1 (en) 2013-12-13 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
JP2017507703A (ja) 2014-02-05 2017-03-23 バイオエヌテック アーゲーＢｉｏＮＴｅｃｈ ＡＧ カニューレ、注射または注入装置、およびカニューレまたは注射もしくは注入装置を使用する方法
PL4023249T3 (pl) 2014-04-23 2025-03-10 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
WO2015172843A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Biontech Diagnostics Gmbh Methods and kits for the diagnosis of cancer
WO2016062323A1 (en) 2014-10-20 2016-04-28 Biontech Ag Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer
PT4023755T (pt) 2014-12-12 2023-07-05 CureVac SE Moléculas de ácido nucleico artificiais para uma expressão melhorada de proteína
EP3240558A1 (en) 2014-12-30 2017-11-08 CureVac AG Artificial nucleic acid molecules
WO2016155809A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Lipid particle formulations for delivery of rna and water-soluble therapeutically effective compounds to a target cell

Also Published As

Publication number Publication date
FI3892295T3 (fi) 2023-05-10
PT3892295T (pt) 2023-06-01
PT4223311T (pt) 2025-08-21
DK4223311T3 (da) 2025-08-25
HUE062102T2 (hu) 2023-09-28
RU2670745C9 (ru) 2018-12-13
PT3473267T (pt) 2021-11-02
BR112013029834A8 (pt) 2019-05-07
US11248264B2 (en) 2022-02-15
JP6444171B2 (ja) 2018-12-26
HRP20211595T1 (hr) 2022-01-21
BR112013029834A2 (pt) 2016-12-06
PT2714071T (pt) 2019-09-30
AU2025267474A1 (en) 2026-01-08
CA2836494A1 (en) 2012-11-29
JP2017018129A (ja) 2017-01-26
ES2746233T8 (es) 2020-03-13
NZ617217A (en) 2016-04-29
RU2013157150A (ru) 2015-06-27
CN105999250A (zh) 2016-10-12
SI3892295T1 (sl) 2023-09-29
AU2012261237B2 (en) 2017-06-01
SG193553A1 (en) 2013-10-30
JP2023083289A (ja) 2023-06-15
JP2019050831A (ja) 2019-04-04
PL4223311T3 (pl) 2025-09-08
FI4223311T3 (fi) 2025-08-12
RS67093B1 (sr) 2025-09-30
DK3892295T3 (da) 2023-05-15
AU2019229434A1 (en) 2019-10-03
NZ742420A (en) 2022-10-28
SMT202500304T1 (it) 2025-09-12
ES2897656T3 (es) 2022-03-02
US10738355B2 (en) 2020-08-11
JP2020128423A (ja) 2020-08-27
HRP20230443T1 (hr) 2023-09-15
WO2012159754A2 (en) 2012-11-29
ES3038443T3 (en) 2025-10-13
LT3473267T (lt) 2021-11-25
CN103608033B (zh) 2016-06-15
RU2670745C2 (ru) 2018-10-25
JP7297715B2 (ja) 2023-06-26
SI3473267T1 (sl) 2022-01-31
MX2013013659A (es) 2014-02-27
SI4223311T1 (sl) 2025-11-28
NZ718326A (en) 2020-05-29
LT2714071T (lt) 2019-10-10
SG10201911616QA (en) 2020-01-30
HRP20250981T1 (hr) 2025-10-24
AU2017213515B2 (en) 2019-07-04
MX360823B (es) 2018-11-16
WO2012159754A3 (en) 2013-06-27
LT3892295T (lt) 2023-07-10
AU2017213515A1 (en) 2017-08-31
ZA201306944B (en) 2015-02-25
HUE046152T2 (hu) 2020-02-28
SMT202100611T1 (it) 2022-01-10
US20140178438A1 (en) 2014-06-26
AU2019229434B2 (en) 2021-12-16
CN103608033A (zh) 2014-02-26
SMT202300161T1 (it) 2023-07-20
MX386793B (es) 2025-03-19
ES2746233T3 (es) 2020-03-05
JP2014523406A (ja) 2014-09-11
MX2020011767A (es) 2020-11-24
DK2714071T3 (da) 2019-09-16
ES2946072T3 (es) 2023-07-12
JP6456888B2 (ja) 2019-01-23
RS64230B1 (sr) 2023-06-30
US20210164034A1 (en) 2021-06-03
LT4223311T (lt) 2025-09-25
US20220282322A1 (en) 2022-09-08
HUE073292T2 (hu) 2026-01-28
AU2022201275A1 (en) 2022-03-17
AU2022201275B2 (en) 2025-08-14
HUE057608T2 (hu) 2022-06-28
PL3892295T3 (pl) 2023-07-24
CA2836494C (en) 2023-01-03
AU2012261237A1 (en) 2013-11-14
NZ730355A (en) 2022-10-28
CN111286537A (zh) 2020-06-16
CN105999250B (zh) 2020-03-10
JP2025109722A (ja) 2025-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7645616B2 (ja) 癌のための個別化ワクチン
AU2022201275B2 (en) Individualized vaccines for cancer
RS59369B1 (sr) Individualizovane vakcine protiv kancera
HK40098119B (en) Individualized vaccines for cancer
HK40098119A (en) Individualized vaccines for cancer
HK40120924A (en) Individualized vaccines for cancer
RU2779946C2 (ru) Индивидуализированные противоопухолевые вакцины
HK1229234B (zh) 用於癌症的个体化疫苗
HK40052764A (en) Individualized vaccines for cancer
NZ617217B2 (en) Individualized vaccines for cancer
HK40052764B (en) Individualized vaccines for cancer
HK40000563A (en) Individualized vaccines for cancer
HK40000563B (en) Individualized vaccines for cancer
NZ718326B2 (en) Individualized vaccines for cancer