RS63063B1 - Anti-ngf antitela i njihova upotreba - Google Patents

Anti-ngf antitela i njihova upotreba

Info

Publication number
RS63063B1
RS63063B1 RS20220295A RSP20220295A RS63063B1 RS 63063 B1 RS63063 B1 RS 63063B1 RS 20220295 A RS20220295 A RS 20220295A RS P20220295 A RSP20220295 A RS P20220295A RS 63063 B1 RS63063 B1 RS 63063B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
antibody
ngf
antigen
amino acid
Prior art date
Application number
RS20220295A
Other languages
English (en)
Inventor
Susan E Lacey
Jeffrey A Barbon
Meha Chhaya
Emma Fung
Charles W Hutchins
Diane M Lang
Eve H Barlow
Mary Leddy
Ravi Chari
Original Assignee
Zoetis Belgium S A
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zoetis Belgium S A filed Critical Zoetis Belgium S A
Publication of RS63063B1 publication Critical patent/RS63063B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)

Description

Opis
Tehnička oblast
[0001] Otkriće se odnosi na anti-NGF antitela i polinukleotide koji ih kodiraju, i upotrebu takvih antitela i/ili polinukleotida u lečenju i/ili prevenciji bola, uključujući ali ne ograničavajući se na postoperativni bol, bol kod reumatoidnog artritisa, bol kod raka, i bol kod osteoartritisa.
Osnova
[0002] Faktor rasta nerava (NGF) je protein koji se izlučuje koji je otkriven pre više od 50 godina kao molekul koji promoviše opstanak i diferencijaciju senzornih i simpatičkih neurona. (Za pregled videti Levi-Montalcini, Science 187: 113 (1975), za pregled). Utvrđena je kristalna struktura NGF i NGF u kompleksu sa receptorom tirozinkinaze A (TrkA) (McDonald et al., Nature 354: 411 (1991); Viesmann et al., Nature 401: 184-188 (1999)).
[0003] Uloga NGF-a u razvoju i preživljavanju i perifernih i centralnih neurona je dobro okarakterisana. Pokazalo se da je NGF kritičan faktor preživljavanja i održavanja u razvoju perifernih simpatičkih i embrionalnih senzornih neurona i holinergičkih neurona bazalnog prednjeg mozga (videti, npr. Smeine et al., Nature 368: 246-9 (1994); i Crovlei et al., Cell, 76:1001-11 (1994)). Pokazalo se da inhibira amiloidogenezu koja dovodi do Alchajmerove bolesti (Calissano et al., Cell Death and Differentiation, 17: 1126-1133 (2010.)). NGF reguliše ekspresiju neuropeptida u senzornim neuronima (Lindsai et al., Nature, 337:362-364 (1989)) i njegova aktivnost je posredovana preko dva različita receptora vezana za membranu, TrkA receptor i p75 zajednički neurotrofin receptor (Chao et al., Science, 232:518-521 (1986); Huang et al., Annu. Rev. Neurosci., 24:677-736 (2001); Bibel et al., Genes Dev., 14:2919-2937 (2000.)).
[0004] NGF proizvodi veliki broj tipova ćelija uključujući mastocite (Leon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 3739-3743 (1994.).)), B-limfocite (Torcia, et al., Cell, 85: 345-356 (1996.), keratinocite (Di Marco, et al., J. Biol Chem., 268: 22838-22846)), ćelije glatkih mišića (Ueiama, et al., J. Hypertens., 11: 1061-1065 (1993.)), fibroblaste (Lindholm, et al., Eur. J.
Neurosci., 2: 795-801 (1990)), epitelne ćelije bronhija (Kassel, et al., Clin, Exp. Allergy, 31:1432-40 (2001)), bubrežne mezangijalne ćelije (Steiner, et al., Am. J. Physiol., 261: F792-798 (1991.).)) i miotubule skeletnih mišića (Schvartz, et al., JPhotochem. Photobiol., B66: 195-200 (2002)). Pored toga, NGF receptori su pronađeni na različitim tipovima ćelija izvan nervnog sistema.
[0005] NGF je uključen u procese izvan nervnog sistema, na primer, pokazalo se da NGF poboljšava vaskularnu permeabilnost (Otten, et al., Eur J Pharmacol., 106: 199-201 (1984.)), pojačava imuni odgovor T- i B-ćelija (Otten, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86: 10059-10063 (1989)), indukuje diferencijaciju limfocita i proliferaciju mastocita i izaziva oslobađanje rastvorljivih bioloških signala iz mastocita (Matsuda, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 6508-6512 (1988.).); Pearce, et al., J. Physiol., 372:379-393 (1986.); Bischoff, et al., Blood, 79: 2662-2669 (1992.); Horigome, et al., J. Biol. Chem, 268: 14881-14887 (1993)).
[0006] Pokazalo se da i lokalna i sistemska primena NGF-a izaziva hiperalgeziju i alodiniju (Levin, G.R. et al., Eur. J. Neurosci. 6: 1903-1912 (1994)). Intravenska infuzija NGF kod ljudi izaziva mijalgiju celog tela, dok lokalna primena izaziva hiperalgeziju i alodiniju na mestu injekcije pored sistemskih efekata (Apfel, S.C. et al., Neurology, 51: 695-702 (1998.)). Dodatno, kod određenih oblika raka, višak NGF-a olakšava rast i infiltraciju nervnih vlakana sa indukcijom bola kod raka (Zhu, Z. et al., J. Clin. Oncol., 17: 241-228 (1999.).)). Iako se pokazalo da je egzogeno dodat NGF sposoban da ima sve ove efekte, važno je napomenuti da se samo retko pokazalo da je endogeni NGF važan u bilo kom od ovih procesa in vivo (Torcia, et al., Cell, 85(3): 345-56 (1996.))).
[0007] Povišen nivo NGF-a je impliciran u određenim inflamatornim stanjima kod ljudi i životinja, na primer, sistemski eritemski lupus (Bracci-Laudiero, et al., Neuroreport, 4: 563-565 (1993.)), multipla skleroza (Bracci-Laudiero, et al., Neurosci. Lett., 147:9-12 (1992.).)), psorijaza (Raichaudhuri, et al., Acta Derm. l'enereal., 78: 84-86 (1998.).)), artritis (Falcim, et al., Ann. Rheum. Dis., 55: 745-748 (1996.).)), intersticijalni cistitis (Okragli, et al., J. Urology, 161: 438-441 (1999.)) i astma (Braun, et al., Eur. J Immunol., 28:3240-3251 (1998)). Sinovijum pacijenata obolelih od reumatoidnog artritisa izražava visoke nivoe NGF-a, dok je prijavljeno da se kod sinovijuma koji nije pod inflamacijom NGF ne može detektovati (Aloe, et al., Arch. Rheum., 35:351-355 (1992.).)). Slični rezultati su primećeni kod pacova sa eksperimentalno izazvanim reumatoidnim artritisom (Aloe, et al., Clin. Exp. Rheumatol., 10: 203-204 (1992.).)). Prijavljeni su povišeni nivoi NGF kod transgenih artritičnih miševa zajedno sa povećanjem broja mastocita (Aloe, et al., Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects, 15: 139-143 (1993.).)). Pored toga, povišen nivo ekspresije NGF kod pasa je prikazan kod hromih pasa (Isola, M., Ferrari, V., Stabile, F., Bernardini, D., Carnier, P., Busetto, R. Nerve growth factor concentrations in the synovial fluid from healthy dogs and dogs with secondary osteoarthritis. Vet. Comp. Orthop. Traumatol. 4: 279 (2011)). PCT Publication No. WO 02/096458 otkriva upotrebu anti-NGF antitela određenih svojstava u lečenju različitih poremećaja povezanih sa NGF, kao što je inflamatorno stanje (npr., reumatoidni artritis). Prijavljeno je da je prečišćeno anti-NGF antitelo ubrizgano u artritične transgene miševe koji nose humani gen faktora nekroze tumora (TNF) izazvalo smanjenje broja mastocita, kao i smanjenje nivoa histamina i supstance P u sinovijumu miševa sa artritisom (Aloe et al., Reumatol. Int., 14: 249-252 (1995.).)). Pokazalo se da egzogena primena NGF antitela smanjuje povećan nivo TNF koji se javlja kod artritičnih miševa (Manni et al., Rheumatol. Int., 18: 97-102 (1998.).)).
[0008] Povećana ekspresija NGF i NGF receptora visokog afiniteta (TrkA) primećena je u hondrocitima humanog osteoartritisa (Iannone et al., Rheumatology, 41: 1413-1418 (2002.)). Prijavljena su anti-NGF antagonistička antitela glodara (Hongo et al., Hibridoma, 19(3):215-227 (2000.); Ruberti et al., Cell. Molec. Neurobiol., 13(5): 559-568 (1993.).)). Međutim, kada se antitela glodara koriste u terapiji kod subjekata koji nisu glodari, kod značajnog broja lečenih subjekata razvija se odgovor anti-mišjih antitela.
[0009] Učešće NGF-a u hroničnom bolu dovelo je do značajnog interesovanja za terapijske pristupe zasnovane na inhibiciji efekata NGF-a (Saragovi, et al., Trends Pharmacol Sci. 21: 93-98 (2000.).)). Na primer, rastvorljivi oblik TrkA receptora je korišćen da blokira aktivnost NGF, za koji se pokazalo da značajno smanjuje formiranje neuroma, odgovornih za neuropatski bol, bez oštećenja tela ćelija oštećenih neurona (Kriger, et al., J. Hand Surg. (Am.), 26: 635-644 (2001)).
[0010] Određena anti-NGF antitela su opisana (PCT objave br. WO 2001/78698, WO 2001/64247, WO 2002/096458, WO 2004/032870, WO 2005/061540, WO 2006/131951, WO 2006/110883; SAD objave br. US 20050074821, US 20080033157, US 20080182978 i US 20090041717; i U.S. Patent br. 7,449,616). U životinjskim modelima neuropatskog bola (npr., ligacija nervnog stabla ili kičmenog nerva) sistemska injekcija neutralizujućih antitela na NGF sprečava i alodiniju i hiperalgeziju (Ramer et al., Eur. J. Neurosci., 11: 837-846 (1999.).); Ro et al., Pain, 79: 265-274 (1999)).
[0011] WO 2002/096458 se uopšteno odnosi na postupci upotrebe anti-NGF antitela u lečenju različitih poremećaja povezanih sa NGF, uključujući astmu, artritis i psorijazu. Postupci su efikasne u lečenju ovih poremećaja kod pacijenata bez značajnog štetnog uticaja na imuni sistem pacijenta.
[0012] WO 2004/058184 se odnosi na anti-NGF antitela (kao što su anti-NGF antagonistička antitela) i polinukleotide koji ih kodiraju. Dalje je otkrivena upotreba takvih antitela i/ili polinukleotida u lečenju i/ili prevenciji bola, uključujući post-hirurški bol, bol od reumatoidnog artritisa i bol od osteoartritisa.
[0013] WO 2009/150623 se odnosi na upotrebu anti-NGF antitela u lečenju ili prevenciji bola i/ili simptoma donjeg urinarnog trakta (LUTS) povezanih sa hroničnim prostatitisom i/ili sindromom hroničnog karličnog bola.
[0014] WO 2009/023540 se odnosi na ljudsko antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje humani faktor rasta nerava (NGF) sa KD od 5 pM ili manje, ne reaguje unakrsno sa neurotrofinom-3 (NT-3) i vezuje humani NGF sa KD od oko 2 do oko 10 puta više od antitela ili fragmenta vezuje NGF pacova i miša.
[0015] WO 2003/060080 otkriva nukleinske kiseline i polipeptide teškog i lakog lanca pasa i lambda i kapa varijabilnog domena. Dalje su otkrivena kaninizovana antitela koja se sastoje od okvirnih sekvenci varijabilnog domena pasa i CDR-ova specifičnih za antigen dobijen iz antitela različitih od psećih.
[0016] Nadalje, tretman neutralizujućim anti-NGF antitelom dovodi do značajnog smanjenja bola u modelu bola kod mišjih karcinoma (Sevcik et al., Pain, 115: 128-141 (2005.)). Dakle, postoji ozbiljna potreba za anti-NGF antagonističkim antitelima za ljude i životinje.
Rezime pronalaska
[0017] Ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sposoban da se specifično veže za faktor rasta nerava (NGF) koji sadrži:
a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži:
(a) region 1 za određivanje komplementarnosti (CDR1) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 61;
(b) region 2 za određivanje komplementarnosti (CDR2) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 62; i
(c) region 3 za određivanje komplementarnosti (CDR3) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 63; i
b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži:
(a) region 1 za određivanje komplementarnosti (CDR1) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 64;
(b) region 2 za određivanje komplementarnosti (CDR2) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 65; i
(c) region 3 za određivanje komplementarnosti (CDR3) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 66;
pri čemu je Koffkonstanta najviše 10<-3>s<-1>mereno rezonancom površinskog plazmona.
[0018] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sposoban da se specifično veže za faktor rasta nerava (NGF) koji sadrži:
a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa amino kiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 166; i SEQ ID NO: 197; i b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa amino kiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 172; i SEQ ID NO: 196; pri čemu je Koffkonstanta najviše 10<-3>s<-1>mereno rezonancom površinskog plazmona.
[0019] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži navedena antitela i medicinsku upotrebu pomenute farmaceutske kompozicije.
[0020] Ovo otkriće obezbeđuje novu familiju vezujućih proteina, CDR graftovanih antitela, mamlizovanih (kao što su bovinizovana, kamelizovana, kaninizovana, ekvinizovana, felinizovana, humanizovana itd.) antitela i njihovih fragmenata, sposobnih da vezuju i neutrališu NGF. Otkriće obezbeđuje terapeutsko sredstvo pomoću kojeg se inhibira NGF i obezbeđuje kompozicije i postupke za lečenje bolesti povezanih sa povećanim nivoima NGF, posebno inflamatornih poremećaja.
[0021] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein, ili njegov fragment, koji sadrži sekvence hipervarijabilnog regiona koje su u potpunosti ili suštinski identične sekvencama antitela vrste donora; i sekvence konstantnog regiona koje su potpuno ili suštinski identične sekvencama antitela iz ciljne vrste, pri čemu su donor i ciljna vrsta različite. Vezujući protein može, na primer, specifično da veže NGF i ima teški lanac koji ima varijabilni region teškog lanca i laki lanac koji ima varijabilni region lakog lanca.
[0022] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein koji specifično vezuje NGF i koji ima teški lanac koji ima varijabilni region teškog lanca i laki lanac koji ima varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu aminokiselina koja najmanje 90% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEK ID
[0023] NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, ili njihov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
[0024] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje vezujući protein koji specifično vezuje NGF i koji ima težak lanac koji ima varijabilni region teškog lanca i laki lanac koji ima varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 i SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 174 : 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, ili njihov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
[0025] Vezujući protein ovog otkrića može da sadrži najmanje jedan CDR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu između: a) CDR-ova teškog lanca koji se sastoje od SEQ ID NO: 55, 56, 57, 61, 62, 63, 67, 68, 69, 73, 74, 75, 79, 80, 81 i modifikovane CDR aminokiselinske sekvence koje imaju identičnost sekvence od najmanje 50% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci; i b) CDR lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 58, 59, 60, 64, 65, 66, 70, 71, 72, 76, 77, 78, 82, 83, 84 i modifikovanih CDR aminokiselinskih sekvenci koje imaju identičnost sekvence od najmanje 50% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci. Alternativno, vezujući protein ovog otkrića može da sadrži najmanje jedan CDR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od: a) CDR-ova teškog lanca koji se sastoje od SEQ ID NO: 55, 56, 57, 61, 62, 63, 67, 68, 69, 73, 74, 75, 79, 80, 81 i modifikovane CDR aminokiselinske sekvence koje imaju identičnost sekvence od najmanje 70% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci; i b) CDR lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 58, 59, 60, 64, 65, 66, 70, 71, 72, 76, 77, 78, 82, 83, 84 i modifikovanih CDR aminokiselinskih sekvenci koje imaju identičnost sekvence od najmanje 70% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci. Vezujući protein ovog otkrića može da sadrži najmanje jedan CDR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu između: a) CDR-ova teškog lanca koji se sastoje od SEQ ID NO: 55, 56, 57, 61, 62, 63, 67, 68, 69, 73, 74, 75, 79, 80, 81 i modifikovane CDR aminokiselinske sekvence koje imaju identičnost sekvence od najmanje 80% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci; i b) CDR lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 58, 59, 60, 64, 65, 66, 70, 71, 72, 76, 77, 78, 82, 83, 84 i modifikovanih CDR aminokiselinskih sekvenci koje imaju identičnost sekvence od najmanje 80% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci. Vezujući protein ovog otkrića može sadržati najmanje jedan CDR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu između: a) CDR-ova teškog lanca koji se sastoje od SEQ ID NO: 55, 56, 57, 61, 62, 63, 67, 68, 69, 73, 74, 75, 79, 80, 81 i modifikovane CDR aminokiselinske sekvence koje imaju identičnost sekvence od najmanje 90% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci; i b) CDR lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 58, 59, 60, 64, 65, 66, 70, 71, 72, 76, 77, 78, 82, 83, 84 i modifikovanih CDR aminokiselinskih sekvenci koje imaju identičnost sekvence od najmanje 90% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci.
[0026] Vezujući protein ovog otkrića može da sadrži konstantni domen teškog lanca humanog imunoglobulina izabran iz grupe koju čine IgM konstantni domen, IgG4 konstantni domen, IgG1 konstantni domen, IgE konstantni domen, IgG2 konstantni domen, IgG3 konstantni domen i IgA konstantni domen. Vezujući protein ovog otkrića može alternativno da sadrži konstantni domen teškog lanca imunoglobulina psa izabran iz grupe koju čine IgM konstantni domen, IgG4 konstantni domen, IgG1 konstantni domen, IgE konstantni domen, IgG2 konstantni domen, IgG3 konstantni domen i IgA konstantni domen domena. Vezujući protein prema ovom pronalasku može alternativno da sadrži konstantni domen teškog lanca imunoglobulina mačke. Vezujući protein prema ovom pronalasku može alternativno da sadrži konstantni domen teškog lanca imunoglobulina konja. Vezujući protein ovog otkrića može dalje da sadrži konstantni region koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:52 i SEQ ID NO:54.
[0027] Bilo koji od prethodnih vezujućih proteina može biti izabran iz grupe koju čine; molekul imunoglobulina, disulfidno vezano Fv, monoklonsko antitelo, scFv, himerno antitelo, jednodomensko antitelo, CDR-graftovano antitelo, diatelo, humanizovano antitelo, kaninizovano mAb, pseće mAb, mačje mAb, felinizovano mAb, mAb konja, ekvinzovano mAb, multispecifično antitelo, Fab, dvostruko specifično antitelo, DVD-Ig, Fab', bispecifično antitelo, F(ab')2 i Fv.
[0028] Bilo koji od prethodnih vezujućih proteina može biti sposoban da moduliše biološku funkciju NGF-a ili da neutrališe NGF.
[0029] Bilo koji od gore navedenih vezujućih proteina može biti sposoban da neutrališe NGF sa potencijom (IC50) od najmanje oko 10 nM, najmanje oko 5 nM, najmanje oko 1 nM, najmanje oko 0,5 nM, najmanje oko 0.1 nM, najmanje oko 0.05 nM, najmanje oko 0,01 nM, ili najmanje oko 0,001 nM, kao što je mereno u testu proliferacije ćelija TF-1 ili testovima pERK i Pathhunter.
[0030] Bilo koji od gore navedenih vezujućih proteina može imati konstantu uključenja (Kon) za NGF od: najmanje oko 10<2>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<3>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<4>M<-1>s<-1>, najmanje oko 10<5>M<-1>s<-1>, ili bar oko 10<6>M<-1>s<-1>, ili bar oko 10<7>M<-1>s<-1>, mereno rezonancom površinskog plazmona.
[0031] Bilo koji od gore navedenih vezujućih proteina može imati konstantu isključenja (Koff) za NGF izabranu iz grupe koju čine: najviše oko 10<-3>s<-1>, najviše oko 10<-4>s<-1>, najviše oko 10<-5>s<-1>, najviše oko 10<-6>s<-1>, a najviše oko 10<-7>s<-1>, mereno rezonancom površinskog plazmona.
[0032] Bilo koji od gore navedenih vezujućih proteina može imati konstantu disocijacije (KD) za NGF izabranu iz grupe koju čine: najviše oko 10<-7>M, najviše oko 10<-8>M, najviše oko 10<-9>M, najviše oko 10<-10>M, najviše oko 10<-11>M najviše oko 10<-12>M, najviše oko 10<-13>M i najviše oko 10<-14>M. Konstanta disocijacije (KD) može biti, na primer, oko 1×10<-9>M, oko 1×10<-10>M, oko 3,14×10<-10>M, oko 1×10<-11>M, oko 2,37×10<-11>M, oko 1×10<-12>M, oko 1×10<-13>M, i oko 3,3×10<-14>M.
[0033] Bilo koji od prethodnih vezujućih proteina može dalje da sadrži agens izabran iz grupe koju čine; imunoadhezioni molekul, agens za vizuelizacuiju, terapeutski agens i citotoksični agens. Sredstvo može biti, na primer, agens za vizuelizacuiju izabran iz grupe koju čine radioobeleživač, enzim, fluorescentna oznaka, luminescentna oznaka, bioluminiscentna oznaka, magnetna oznaka i biotin. Sredstvo za snimanje može biti radioobeleživač izabran iz grupe koju čine: 3H, 14C, 35S, 90I, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho i 153Sm. Alternativno, agens može biti terapeutsko ili citotoksično sredstvo, kao što je, na primer, antimetabolit, agens za alkilovanje, antibiotik, faktor rasta, citokin, antiangiogeno sredstvo, antimitotički agens, antraciklin, toksin i apoptotički agens.
[0034] Bilo koji od vezujućih proteina može imati mišji, pseći, mačji, humani ili konjski obrazac glikozilacije.
[0035] Bilo koji od vezujućih proteina može biti kristalizovani vezujući protein. Kristalizovani vezujući protein može biti kristalizovani vezujući protein bez nosača sa kontrolisanim oslobađanjem.
[0036] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koji od prethodnih vezujućih proteina. Izolovana nukleinska kiselina može da sadrži RNK ili DNK.
[0037] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži ili je komplementarna sekvenci nukleinske kiseline koja kodira vezujući protein koji specifično vezuje NGF koji ima teški lanac koji ima varijabilni region teškog lanca i laki lanac koji ima varijabilni region lakog lanca, pri čemu je varijabilni region teškog lanca kodiran nukleotidnom sekvencom koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17 i 21.
[0038] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži ili je komplementarna sekvenci nukleinske kiseline koja kodira vezujući protein koji specifično vezuje NGF koji ima teški lanac koji ima varijabilni region teškog lanca i laki lanac koji ima varijabilni region lakog lanca, pri čemu je varijabilni region lakog lanca kodiran nukleotidnom sekvencom koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15, 19 i 23.
[0039] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje rekombinantni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira vezujući protein koji specifično vezuje NGF kao što je ovde opisano. Rekombinantni vektor u skladu sa ovim otkrićem može da sadrži pcDNK, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV ili pBJ. Takođe je obezbeđena ćelija domaćina koja sadrži takav rekombinantni vektor. Ćelija domaćin može biti na primer eukariotska ćelija ili prokariotska ćelija. Ćelija domaćin može biti ćelija protista; životinjska ćeliju kao što je, ali bez ograničenja na, ćeliju sisara, ptičiju ćeliju; ćeliju insekata, kao što je, ali bez ograničenja, ćelija insekta Sf9; biljnu ćeliju; ili gljivičnu ćeliju. Ćelija domaćin može biti na primer an E. coli ćelija. Ćelija domaćin može biti CHO ćelija ili COS ćelija. Takođe je obezbeđena izolovana ćelijska linija koja proizvodi vezujući protein koji specifično vezuje NGF kao što je ovde opisano.
[0040] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje farmaceutsku ili dijagnostičku kompoziciju koja sadrži vezujući protein koji specifično vezuje NGF kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent. Farmaceutska kompozicija može da sadrži terapeutski efikasnu količinu NGF vezujućeg proteina.
[0041] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje kompoziciju za oslobađanje vezujućeg proteina, pri čemu kompozicija sadrži: (a) kompoziciju koja sadrži vezujući protein koji specifično vezuje NGF kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijens
1
ili razblaživač, i (b) najmanje jedan polimerni nosač.
[0042] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupak za smanjenje aktivnosti NGF kod subjekta (na primer, psa, mačke, konja, feretke, itd.) koji pati od poremećaja u kome je aktivnost NGF štetna, koji obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količina vezujućeg proteina koji specifično vezuje NGF kao što je ovde opisano.
[0043] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupak za pravljenje anti-NGF antitela koji obuhvata: (a) proizvodnju mišjih monoklonskih antitela; (b) skrining supernatanta hibridoma; (c) graftovanje CDR-a donatora u ciljne okvire; i (d) uvođenje povratnih mutacija u okvirni region ciljnih antitela, pri čemu anti-NGF antitela sadrže sekvence hipervarijabilnog regiona koje su u potpunosti ili suštinski identične sekvencama antitela donorske vrste i sekvencama konstantnog regiona koje su u potpunosti ili suštinski identične sekvencama nekog antitela. antitelo iz ciljne vrste, pri čemu su donor i ciljna vrsta različite. U postupku, donor može biti, na primer, miš, a ciljni organizam sisar koji nije miš, kao što su, ali ne ograničavajući se na, goveda, pse, konje ili mačke, ili kamila, koza, čovek ili ovca.
[0044] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje postupak za detekciju prisustva ili količine NGF u uzorku, koji obuhvata: obezbeđivanje reagensa koji sadrži bilo koji od prethodnih vezujućih proteina koji specifično vezuju NGF; kombinovanje vezujućeg proteina sa uzorkom tokom vremena i pod uslovima dovoljnim da se vezujući protein vezuje za bilo koji NGF u uzorku; i određivanje prisustva ili količine NGF u uzorku na osnovu specifičnog vezivanja vezujućeg proteina za NGF. U postupku, vezujući protein može biti imobilizovan ili može biti sposoban da se imobiliše na čvrstoj podlozi. U postupku, vezujući protein može biti spojen sa obeleživačem koji se može detektovati, kao što je, na primer, agens za vizuelizaciju kao što je, ali ne ograničavajući se na, radioobeleživač, enzim, fluorescentna oznaka, luminiscentna oznaka, bioluminiscentna oznaka, magnetna oznaka, obeleživač i biotin. Agens za vizuelizaciju može biti na primer radioobeleživač izabran iz grupe koju čine: 3H, 14C, 35S, 90I, 99Tc, 111In, 1251, 1311, 177Lu, 166Ho i 153Sm.
[0045] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje uređaj za imunotestiranje za detekciju prisustva ili količine NGF u uzorku, pri čemu uređaj sadrži bilo koji od gore navedenih vezujućih proteina koji specifično vezuju NGF, imobilisan na čvrstoj podlozi.
[0046] U drugom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje komplet za detekciju prisustva ili količine NGF u uzorku, pri čemu komplet sadrži: imunoreagens koji sadrži bilo koji od gornjih vezujućih proteina koji specifično vezuju NGF, i uputstva za određivanje prisustva ili količine NGF u uzorku na osnovu specifičnog vezivanja imunoreagensa za NGF. U kompletu, vezujući protein može biti imobilisan na čvrstoj podlozi.
[0047] U još jednom aspektu, ovo otkriće se odnosi na antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji sadrži:
varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEK ID BR: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: SEK ID BR : 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEK ID BR: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEK ID BR. : 206, SEQ ID NO: 207, ili njihov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment; i
varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEK ID BR: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 32 : 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 i SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, ili njihov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.
[0048] Tačnije, prethodno opisano antitelo može da sadrži najmanje jedan CDR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od: a) CDR-ova teškog lanca koji se sastoje od SEQ ID NO: 55, 56, 57, 61, 62, 63, 67, 68, 69, 73, 74, 75, 79, 80, 81 i modifikovane CDR aminokiselinske sekvence koje imaju identičnost sekvence od najmanje 50% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci; i b) CDR lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 58, 59, 60, 64, 65, 66, 70, 71, 72, 76, 77, 78, 82, 83, 84 i modifikovanih CDR aminokiselinskih sekvenci koje imaju identičnost sekvence od najmanje 50% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci. Alternativno, prethodno opisano antitelo može da sadrži najmanje jedan CDR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu između: a) CDR-ova teškog lanca koji se sastoje od SEQ ID NO: 55, 56, 57, 61, 62, 63, 67, 68, 69, 73, 74, 75, 79, 80, 81 i modifikovane CDR aminokiselinske sekvence koje imaju identičnost sekvence od najmanje 70% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci; i b) CDR lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 58, 59, 60, 64, 65, 66, 70, 71, 72, 76, 77, 78, 82, 83, 84 i modifikovanih CDR aminokiselinskih sekvenci koje imaju identičnost sekvence od najmanje 70% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci. Alternativno, prethodno opisano antitelo može da sadrži najmanje jedan CDR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu između: a) CDR-ova teškog lanca koji se sastoje od SEQ ID NO: 55, 56, 57, 61, 62, 63, 67, 68, 69, 73, 74, 75, 79, 80, 81 i modifikovane CDR aminokiselinske sekvence koje imaju identičnost sekvence od najmanje 80% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci; i b) CDR lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 58, 59, 60, 64, 65, 66, 70, 71, 72, 76, 77, 78, 82, 83, 84 i modifikovanih CDR aminokiselinskih sekvenci koje imaju identičnost sekvence od najmanje 80% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci. Alternativno, prethodno opisano antitelo može da sadrži najmanje jedan CDR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu između: a) CDR-ova teškog lanca koji se sastoje od SEQ ID NO: 55, 56, 57, 61, 62, 63, 67, 68, 69, 73, 74, 75, 79, 80, 81 i modifikovane CDR aminokiselinske sekvence koje imaju identičnost sekvence od najmanje 90% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci; i b) CDR lakog lanca koji se sastoji od SEQ ID NO: 58, 59, 60, 64, 65, 66, 70, 71, 72, 76, 77, 78, 82, 83, 84 i modifikovanih CDR aminokiselinskih sekvenci koje imaju identičnost sekvence od najmanje 90% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci.
[0049] Prethodno opisano antitelo može da sadrži konstantni domen teškog lanca humanog imunoglobulina izabran iz grupe koju čine IgM konstantni domen, IgG4 konstantni domen, IgG1 konstantni domen, IgE konstantni domen, IgG2 konstantni domen, IgG3 konstantni domen i IgA konstantni domen. Tačnije, antitelo može da sadrži konstantni domen teškog lanca imunoglobulina psa izabran iz grupe koju čine IgM konstantni domen, IgG4 konstantni domen, IgG1 konstantni domen, IgE konstantni domen, IgG2 konstantni domen, IgG3 konstantni domen i IgA konstantni domen. Alternativno, antitelo sadrži konstantni domen teškog lanca mačjeg imunoglobulina. Alternativno, antitelo sadrži konstantni domen teškog lanca konjskog imunoglobulina. Dodatno, prethodno opisano antitelo može da sadrži konstantni region koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:52 i SEQ ID NO:54. Dodatno, prethodno opisano antitelo je izabrano iz grupe koju čine: molekul imunoglobulina, disulfidno vezano Fv, monoklonsko antitelo, scFv, himerno antitelo, jednodomensko antitelo, CDR-graftovano antitelo, diatelo, humanizovano antitelo, kaninizovano mAb, pas mAb, mačje mAb, felinizovano mAb, konjsko mAb, ekvinizovano mAb, multispecifično antitelo, Fab, dvostruko specifično antitelo, DVD-Ig, Fab', bispecifično
1
antitelo, F(ab')2, i Fv.
[0050] U drugom aspektu, prethodno identifikovano antitelo je sposobno da moduliše biološku funkciju NGF.
[0051] U još jednom aspektu, ovo otkriće se odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira prethodno opisano antitelo.
[0052] U drugom aspektu, ovo otkriće se odnosi na antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom SEQ ID NO:37 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom SEQ ID NO:38. Gore opisano antitelo može da sadrži konstantni domen teškog lanca humanog imunoglobulina izabran iz grupe koju čine IgM konstantni domen, IgG4 konstantni domen, IgG1 konstantni domen, IgE konstantni domen, IgG2 konstantni domen, IgG3 konstantni domen i IgA konstantni domen. Tačnije, antitelo može da sadrži konstantni domen teškog lanca imunoglobulina psa izabran iz grupe koju čine IgM konstantni domen, IgG4 konstantni domen, IgG1 konstantni domen, IgE konstantni domen, IgG2 konstantni domen, IgG3 konstantni domen i IgA konstantni domen. Alternativno, antitelo sadrži konstantni domen teškog lanca mačjeg imunoglobulina. Alternativno, antitelo sadrži konstantni domen teškog lanca konjskog imunoglobulina. Dodatno, prethodno opisano antitelo može da sadrži konstantni region koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:52 i SEQ ID NO:54. Dodatno, prethodno opisano antitelo je izabrano iz grupe koju čine: molekul imunoglobulina, disulfidno vezano Fv, monoklonsko antitelo, scFv, himerno antitelo, jednodomensko antitelo, CDR-graftovano antitelo, diatelo, humanizovano antitelo, kaninizovano mAb, pas mAb, mačje mAb, felinizovano mAb, konjsko mAb, ekvinizovano mAb, multispecifično antitelo, Fab, dvostruko specifično antitelo, DVD-Ig, Fab', bispecifično antitelo, F(ab')2, i Fv.
[0053] U drugom aspektu, prethodno identifikovano antitelo je sposobno da moduliše biološku funkciju NGF.
[0054] U još jednom aspektu, ovo otkriće se odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira prethodno opisano antitelo.
[0055] U drugom aspektu, ovo otkriće se odnosi na antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom SEQ ID NO: 192 i varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinska sekvenca koja ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom SEQ ID NO: 193. Prethodno opisano antitelo može sadržati konstantni domen teškog lanca humanog imunoglobulina izabran iz grupe koju čine IgM konstantni domen, IgG4 konstantni domen, IgG1 konstantni domen, IgE konstantni domen, IgG2 konstantni domen, IgG3 konstantni domen i IgA konstantni domen. Tačnije, antitelo može da sadrži konstantni domen teškog lanca imunoglobulina pasa izabran iz grupe koju čine IgM konstantni domen, IgG4 konstantni domen, IgG1 konstantni domen, IgE konstantni domen, IgG2 konstantni domen, IgG3 konstantni domen i IgA konstantni domen. Alternativno, antitelo sadrži konstantni domen teškog lanca mačjeg imunoglobulina. Alternativno, antitelo sadrži konstantni domen teškog lanca konjskog imunoglobulina. Dodatno, prethodno opisano antitelo može da sadrži konstantni region koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 52 i SEQ ID NO: 54. Dodatno, prethodno opisano antitelo je izabrano iz grupe koju čine: molekul imunoglobulina, disulfidno vezano Fv, monoklonsko antitelo, scFv, himerno antitelo, jednodomensko antitelo, CDR-graftovano antitelo, diatelo, humanizovano antitelo, kaninizovano mAb, pseće mAb, mačje mAb, felinizovano mAb, konjsko mAb, ekvinizovano mAb, multispecifično antitelo, Fab, dvostruko specifično antitelo, DVD-Ig, Fab', bispecifično antitelo, F(ab')2, i Fv.
[0056] U drugom aspektu, prethodno identifikovano antitelo je sposobno da moduliše biološku funkciju NGF.
[0057] U još jednom aspektu, ovo otkriće se odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira prethodno opisano antitelo.
[0058] U još jednom aspektu, ovo otkriće se odnosi na farmaceutsku ili dijagnostičku kompoziciju koja sadrži najmanje jedno od gore opisanih antitela, i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens. Tačnije, farmaceutska ili dijagnostička kompozicija može da sadrži terapeutski efikasnu količinu najmanje jednog od gore opisanih antitela. Pored toga, farmaceutska ili dijagnostička kompozicija može da sadrži jedan konzervans. Primeri najmanje jednog konzervansa koji se može koristiti su metilparaben, propilparaben, benzil alkohol, hlorobutanol ili benzalkonijum hlorid.
[0059] Farmaceutska kompozicija može imati pH veći od oko 7,0. Alternativno, farmaceutska kompozicija može imati pH između oko 6,8 i oko 8,2. Alternativno, farmaceutska kompozicija može imati pH između oko 7,2 i oko 7,8. Alternativno, pH farmaceutske kompozicije može biti između oko 7,4 i oko 7,6. Alternativno, pH farmaceutske kompozicije može biti oko 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1 ili 8.2.
[0060] Farmaceutska kompozicija prema ovom pronalasku može imati polu-život od oko 8.0 dana do oko 15.0 dana kada se dozira intravenski ili subkutano. Alternativno, farmaceutska
1
kompozicija ovog pronalaska može imati poluživot od oko 10.0 dana do oko 13.0 dana. Još dalje alternativno, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može imati poluživot od oko 8,0 dana, oko 8,5 dana, oko 9,0 dana, oko 9,5 dana, oko 10,0 dana, oko 10,5 dana, oko 11,0 dana, oko 11,5 dana, oko 12,0 dana, oko 12,5 dana, oko 13,0 dana, oko 13,5 dana, oko 14,0 dana, oko 14,5 dana ili oko 15,0 dana.
[0061] U drugom aspektu, ovo otkriće se odnosi na postupak za smanjenje aktivnosti NGF kod subjekta koji pati od poremećaja u kojem je aktivnost NGF štetna, koji obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta od najmanje jednog od gore opisanih antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata.
Kratak opis slika
[0062]
Slika 1 ilustruje PR-1254972 VH nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 1) mišjeg anti-NGF antitela.
Slika 2 ilustruje PR-1254972 VH aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 2) mišjeg anti-NGF antitela.
Slika 3 ilustruje PR-1254972 VL nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 3) mišjeg anti-NGF antitela.
Slika 4 ilustruje PR-1254972 VL aminokiselinu (SEQ ID NO: 4) mišjeg anti-NGF antitela. Slika 5 ilustruje PR-1254973 VH nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 5) mišjeg anti-NGF antitela.
Slika 6 ilustruje PR-1254973 VH aminokiselinu (SEQ ID NO: 6) mišjeg anti-NGF antitela. Slika 7 ilustruje PR-1254973 VL nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 7) mišjeg anti-NGF antitela.
Slika 8 ilustruje PR-1254973 VL aminokiselinu (SEQ ID NO: 8) mišjeg anti-NGF antitela. Slika 9 ilustruje PR-1254977 VH nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 9) mišjeg anti-NGF antitela.
Slika 10 ilustruje PR-1254977 VH aminokiselinu (SEQ ID NO: 10) mišjeg anti-NGF antitela. Slika 11 ilustruje PR-1254977 VL nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 11) mišjeg anti-NGF antitela.
Slika 12 ilustruje PR-1254977 VL aminokiselinu (SEQ ID NO: 12) mišjeg anti-NGF antitela. Slika 13 ilustruje PR-1254980 VH nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 13) mišjeg anti-NGF antitela.
1
Slika 14 ilustruje PR-1254980 VH aminokiselinu (SEQ ID NO: 14) mišjeg anti-NGF antitela. Slika 15 ilustruje PR-1254980 VL nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 15) mišjeg anti-NGF antitela.
Slika 16 ilustruje PR-1254980 VL aminokiselinu (SEQ ID NO: 16) mišjeg anti-NGF antitela. Slika 17 ilustruje PR-1254981 VH nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 17) mišjeg anti-NGF antitela.
Slika 18 ilustruje PR-1254981 VH aminokiselinu (SEQ ID NO: 18) mišjeg anti-NGF antitela. Slika 19 ilustruje PR-1254981 VL nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 19) mišjeg anti-NGF antitela.
Slika 20 ilustruje PR-1254981 VL aminokiselinu (SEQ ID NO: 20) mišjeg anti-NGF antitela. Slika 21 ilustruje PR-1254982 VH nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 21) mišjeg anti-NGF antitela.
Slika 22 ilustruje PR-1254982 VH aminokiselinu (SEQ ID NO: 22) mišjeg anti-NGF antitela. Slika 23 ilustruje PR-1254982 VL nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 23) mišjeg anti-NGF antitela.
Slika 24 ilustruje PR-1254982 VL aminokiselinu (SEQ ID NO: 24) mišjeg anti-NGF antitela. Slika 25 ilustruje mišje anti-NGF mAb kaninizovano CDR graftovanjem na pseće Ig okvire (CDR-ovi su podvučeni), SEQ ID NO: 25 (72.1 VH aminokiselina).
Slika 26 ilustruje mišje anti-NGF mAb kaninizovano CDR graftovanjem na pseće Ig okvire (CDR-ovi su podvučeni), SEQ ID NO: 26 (72.1 VL aminokiselina).
Slika 27 ilustruje mišje anti-NGF mAb kaninizovano CDR graftovanjem na pseće Ig okvire (CDR-ovi su podvučeni) SEQ ID NO: 27 (73.1 VH aminokiselina).
Slika 28 ilustruje mišje anti-NGF mAb kaninizovano CDR graftovanjem na Ig okvire pasa (CDR-ovi su podvučeni) SEQ ID NO: 28 (73.1 VL aminokiselina).
Slika 29 ilustruje mišje anti-NGF mAb kaninizovano CDR graftovanjem na pseće Ig okvire (CDR-ovi su podvučeni), SEQ ID NO: 29 (77.1 VH aminokiselina).
Slika 30 ilustruje mišje anti-NGF mAb kaninizovano CDR graftovanjem na pseće Ig okvire (CDR-ovi su podvučeni), SEQ ID NO: 30 (77.1 VL aminokiselina).
Slika 31A ilustruje mišje anti-NGF mAb kaninizovano CDR graftovanjem na pseće Ig okvire (CDR-ovi su podvučeni), SEQ ID NO: 31 (81.1 VH aminokiselina).
Slika 31B ilustruje mišje anti-NGF mAb kaninizovano CDR graftovanjem na pseće Ig okvire (CDR-ovi su podvučeni), SEQ ID NO: 177 (81.1B VH aminokiselina).
Slika 32 ilustruje mišje anti-NGF mAb kaninizovano CDR graftovanjem na Ig okvire pasa (CDR-ovi su podvučeni), SEQ ID NO: 32 (81.1 VL aminokiselina)
1
Slika 33 ilustruje mišje anti-NGF mAb kaninizovano CDR graftovanjem na Ig okvire pasa (CDR-ovi su podvučeni), SEQ ID NO: 33 (82.1 VH aminokiselina)
Slika 34 ilustruje mišje anti-NGF mAb kaninizovano CDR graftovanjem na pseće Ig okvire (CDR-ovi su podvučeni), SEQ ID NO: 34 (82.1 VL aminokiselina).
Slika 35 ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 35 (72.2 VH aminokiseline).
Slika 36A ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 36 (72.2 VL aminokiselina).
Slika 36B ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 179 (72.3 VH aminokiselina).
Slika 36C ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 180 (72,4 VH aminokiseline).
Slika 36D ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 181 (72,4 VL aminokiselina).
Slika 37 ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 37 (73,2 VH aminokiseline).
Slika 38A ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 38 (73,2 VL aminokiselina).
Slika 38B ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 182 (73,4 VH aminokiselina).
Slika 38C ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 183 (73,4 VL aminokiselina).
Slika 39 ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 39 (77,2 VH aminokiselina).
1
Slika 40A ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 40 (77,2 VL aminokiselina).
Slika 40B ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 184 (77,3 VH aminokiselina).
Slika 40C ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 185 (77,4 VH aminokiselina).
Slika 40D ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 186 (77,4 VL aminokiselina).
Slika 41 ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 41 (81.2 VH aminokiselina).
Slika 42A ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 42 (81.2 VL aminokiselina).
Slika 42B ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 187 (81.4 VH aminokiselina).
Slika 42C ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 188 (81,4 VL aminokiselina).
Slika 42D ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 189 (81.2B VH aminokiselina).
Slika 42E ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 190 (81.4B VH aminokiselina).
Slika 42F ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima, SEQ ID NO: 206 (81.5B VH aminokiselina).
Slika 42G ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije
1
(ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima, SEQ ID NO: 207 (81.6B VH aminokiselina).
Slika 43 ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 43 (82,2 VH aminokiselina).
Slika 44A ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 44 (82.2 VL aminokiselina).
Slika 44B ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 191 (82,3 VL aminokiselina).
Slika 44C ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 192 (82,4 VH aminokiselina).
Slika 44D ilustruje kaninizovana anti-NGF antitela koja sadrže ostatke povratne mutacije (ostaci povratne mutacije prikazani podebljanim slovima), SEQ ID NO: 193 (82,4 VL aminokiselina).
Slika 45 ilustruje sekvencu prajmera za kloniranje NGF pasa, SEQ ID NO: 45 (NGF-Dog-S prajmer).
Slika 46 ilustruje sekvencu prajmera za kloniranje NGF pasa, SEQ ID NO: 46 (NGF-Dog-AS prajmer).
Slika 47 ilustruje sekvencu prajmera za kloniranje NGF pasa, SEQ ID NO: 47 (NGF-d-Ec-S prajmer).
Slika 48 ilustruje sekvencu prajmera za kloniranje NGF pasa, SEQ ID NO: 48 (NGF-d-Ec-AS prajmer).
Slika 49 ilustruje pseću NGF C-terminalnu 6His fuzionu nukleotidnu sekvencu, SEQ ID NO: 49.
Slika 50 ilustruje 6-His aminokiselinsku sekvencu C-terminala NGF pasa, SEQ ID NO: 50. Slika 51 ilustruje sekvencu nukleotida konstantnog regiona IgG pasa, SEQ ID NO: 51.
Slika 52 ilustruje aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona IgG pasa, SEQ ID NO: 52. Slika 53 ilustruje nukleotidnu sekvencu konstantnog regiona kapa, SEQ ID NO: 53 Slika 54 ilustruje aminokiselinsku sekvencu konstantnog kapa regiona, SEQ ID NO: 54. Slika 55 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 55 (72.1 VH aminokiselina; CDR1).
2
Slika 56 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 56 (72.1 VH aminokiselina; CDR2).
Slika 57 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 57 (72.1 VH aminokiselina; CDR3).
Slika 58 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 58 (72.1 VL aminokiselina; CDR1).
Slika 59 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 59 (72.1 VL aminokiselina; CDR2).
Slika 60 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 60 (72.1 VL aminokiselina; CDR3).
Slika 61 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 61 (73.1 VH aminokiselina; CDR1).
Slika 62 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 62 (73.1 VH aminokiselina; CDR2).
Slika 63 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 63 (73.1 VH aminokiselina; CDR3).
Slika 64 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 64 (73.1 VL aminokiselina; CDR1).
Slika 65 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 65 (73.1 VL aminokiselina; CDR2).
Slika 66 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 66 (73.1 VL aminokiselina; CDR3).
Slika 67 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 67 (77.1 VH aminokiselina; CDR1).
Slika 68 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 68 (77.1 VH aminokiselina; CDR2).
Slika 69 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 69 (77.1 VH aminokiselina; CDR3).
Slika 70 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 70 (77.1 VL aminokiselina; CDR1).
Slika 71 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 71 (77.1 VL aminokiselina; CDR2).
Slika 72 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 72 (77.1 VL aminokiselina; CDR3).
Slika 73 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 73 (81.1 VH aminokiselina; CDR1).
Slika 74 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 74 (81.1 VH aminokiselina; CDR2).
Slika 75 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 75 (81.1 VH aminokiselina; CDR3).
Slika 76 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 76 (81.1 VL aminokiselina; CDR1).
Slika 77 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 77 (81.1 VL aminokiselina; CDR2).
Slika 78 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 78 (81.1 VL aminokiselina; CDR3).
Slika 79 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 79 (82.1 VH aminokiselina; CDR1).
Slika 80 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 80 (82.1 VH aminokiselina; CDR2).
Slika 81 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 81 (82.1 VH aminokiselina; CDR3).
Slika 82 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 82 (82.1 VL aminokiselina; CDR1).
Slika 83 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 83 (82.1 VL aminokiselina; CDR2).
Slika 84 ilustruje region koji određuje komplementarnost, SEQ ID NO: 84 (82.1 VL aminokiselina; CDR3).
Slika 85 ilustruje sekvencu humanog βNGF (SEQ ID NO: 85).
Slika 86 ilustruje sekvence prikazane u tabeli 12.
Slika 87 ilustruje sekvence prikazane u tabeli 13.
Slika 88 ilustruje sekvence prikazane u tabeli 14.
Slika 89 ilustruje sekvence prikazane u tabeli 15.
Slika 89 ilustruje sekvence prikazane u Tabeli 15A.
Detaljan opis otkrića
[0063] Otkriće opisuje NGF vezujuće proteine, posebno anti-NGF antitela, ili njihove antigen-vezujuće fragmente, koji vezuju NGF. Različiti aspekti otkrića se odnose na antitela i fragmente antitela, i njihove farmaceutske kompozicije, kao i na nukleinske kiseline, rekombinantne ekspresione vektore i ćelije domaćina za pravljenje takvih antitela i fragmenata. Postupci korišćenja antitela iz ovog otkrića za otkriće humanog i psećeg NGF, za inhibiciju aktivnosti NGF kod ljudi i pasa, bilo in vitro ili in vivo; i da regulišu ekspresiju gena takođe su obuhvaćeni otkrićem.
[0064] Osim ako nije drugačije definisano ovde, naučni i tehnički termini koji se koriste u vezi sa ovim otkrićem imaće značenja koja obično podrazumevaju stručnjaci u ovoj oblasti. Značenje i obim termina treba da budu jasni, međutim, u slučaju bilo kakve latentne dvosmislenosti, ovde date definicije imaju prednost u odnosu na bilo koji rečnik ili ekstrinzičnu definiciju. Dalje, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, izrazi u jednini će uključivati množinu, a izrazi u množini će uključivati jedninu. U ovoj prijavi, upotreba "ili" znači "i/ili" osim ako nije drugačije navedeno. Dodatno, upotreba termina „uključujući“, kao i drugih oblika, kao što su “uključuje” i “uključeno”, nije ograničavajuća. Takođe, termini kao što su “element” ili “komponenta” obuhvataju i elemente i komponente koje se sastoje od jedne jedinice i elemente i komponente koje se sastoje od više od jedne podjedinice osim ako nije drugačije navedeno.
[0065] Generalno, nomenklature koje se koriste u vezi sa, i tehnike kulture ćelija i tkiva, molekularne biologije, imunologije, mikrobiologije, genetike i hemije proteina i nukleinskih kiselina i hibridizacije koje su ovde opisane su one koje su dobro poznate i koje se obično koriste u tehnici. Postupci i tehnike ovog otkrića se generalno izvode u skladu sa konvencionalnim postupcima dobro poznatim u tehnici i kako je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i diskutovane u ovoj specifikaciji osim ako nije drugačije naznačeno. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se izvode u skladu sa specifikacijama proizvođača, kao što je uobičajeno u tehnici ili kako je ovde opisano. Nomenklature koje se koriste u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane su one koje su dobro poznate i koje se obično koriste u tehnici. Standardne tehnike se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutsku pripremu, formulaciju i isporuku i lečenje pacijenata.
[0066] Da bi se ovo otkriće lakše razumelo, izabrani termini i izrazi kako se ovde koriste su definisani u nastavku.
A. Definicije
2
[0067] Termini „akceptor” i „akceptorsko antitelo” odnose se na antitelo ili sekvencu nukleinske kiseline koja obezbeđuje ili kodira najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili 100% aminokiselinske sekvence jednog ili više okvirnih regiona. Termin "akceptor" obuhvata sekvencu amino kiseline ili nukleinske kiseline antitela koja obezbeđuje ili kodira konstantni region(e). Termin takođe obuhvata aminokiselinsku ili sekvencu nukleinske kiseline antitela koja obezbeđuje ili kodira jedan ili više regiona okvira i konstantni region(e). Na primer, termin "akceptor" može da se odnosi na sekvencu aminokiselina ili nukleinske kiseline ljudskog antitela koja obezbeđuje ili kodira najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100% aminokiselinskih sekvenci jednog ili više okvirnih regiona. Takav akceptor može da sadrži najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, ili najmanje 10 aminokiselinskih ostataka koji se (ne) javljaju na jednoj ili više specifičnih pozicija humanog antitela. Okvirni region akceptora i/ili konstantni region(i) akceptora mogu biti, na primer, izvedeni ili dobijeni iz gena antitela klicine linije, gena zrelog antitela, funkcionalnog antitela (npr. antitela dobro poznata u tehnici, antitela u razvoju, ili komercijalno dostupna antitela).
[0068] Termin "agonist" se odnosi na modulator koji, kada je u kontaktu sa molekulom od interesa, izaziva povećanje veličine određene aktivnosti ili funkcije molekula u poređenju sa veličinom aktivnosti ili funkcije uočene u odsustvu agonista. Posebni agonisti od interesa mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, NGF polipeptide ili polipeptide, nukleinske kiseline, ugljene hidrate ili bilo koje druge molekule koji se vezuju za NGF.
[0069] Izraz "antagonist" ili "inhibitor" odnosi se na modulator koji, kada je u kontaktu sa molekulom od interesa izaziva smanjenje veličine određene aktivnosti ili funkcije molekula u poređenju sa veličinom aktivnosti ili funkcije uočene u odsustvu antagonista. Posebni antagonisti od interesa uključuju one koji blokiraju ili moduliraju biološku ili imunološku aktivnost NGF-a. Antagonisti i inhibitori NGF mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, proteine, nukleinske kiseline, ugljene hidrate ili bilo koje druge molekule, koji se vezuju za NGF.
[0070] Termin "antitelo" se u širokom smislu odnosi na bilo koji molekul imunoglobulina (Ig) koji se sastoji od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca, ili bilo koji njihov funkcionalni fragment, mutant, varijantu ili derivat, koji zadržava bitne karakteristike vezivanja epitopa molekula Ig. Takvi mutantni, varijantni ili derivati anittela su poznati u tehnici. Neograničavajući primeri su razmatrani u nastavku.
[0071] U antitelu pune dužine, svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao HCVR ili VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde je skraćeno LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, CL. VH i VL regioni se mogu dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regionima koji određuju komplementarnost (CDR), ispresecane regionima koji su više očuvani, nazvanim okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređenih od aminoterminusa do karboksi-terminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Molekuli imunoglobulina mogu biti bilo kog tipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgI), klase (npr. IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase.
[0072] Izraz "konjugat antitela" odnosi se na vezujući protein, kao što je antitelo, hemijski vezano za drugu hemijsku grupu, kao što je terapeutsko ili citotoksično sredstvo. Termin "sredstvo" se ovde koristi da označi hemijsko jedinjenje, mešavinu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul ili ekstrakt napravljen od bioloških materijala. U jednom aspektu terapeutski ili citotoksični agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, toksin pertusisa, taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorohidrubicin, dakorohidrubicin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoidi, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i njihovi analozi ili homolozi.
[0073] Izraz "konstrukt antitela" se odnosi na polipeptid koji sadrži jedan ili više delova koji se vezuju za antigen koji su vezani za linker polipeptid ili konstantni domen imunoglobulina. Linker polipeptidi linkera obuhvataju dva ili više aminokiselinskih ostataka spojenih peptidnim vezama i koriste se za povezivanje jednog ili više delova koji se vezuju za antigen. Takvi linker polipeptidi su dobro poznati u tehnici (Holliger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 6444-6448 (1993.).); Poljak et al., Structure 2: 1121-1123 (1994.)). Konstantni domen imunoglobulina se odnosi na konstantni domen teškog ili lakog lanca. Sekvence aminokiselina konstantnog domena teškog i lakog lanca humanog IgG su poznate u tehnici; pseći, konjski i mačiji su ređi.
[0074] Termin "fragmenti antitela" ili "deo koji se vezuje za antigen" obuhvata deo antitela pune dužine, generalno njegov antigen vezujući ili varijabilni domen. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab)2, Fv, sFv fragmenti, diatela, linearna antitela, jednolančani molekuli antitela.
[0075] Termin "antigen-vezujući fragment antitela" (ili jednostavno "deo antitela") odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za
2
antigen (npr. NGF). Pokazalo se da funkciju vezivanja antigena antitela mogu obavljati fragmenti antitela pune dužine. To takođe mogu biti bispecifični, dvostruki specifični ili multispecifični formati; specifično vezivanje za dva ili više različitih antigena. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih terminom " antigen-vezujući fragment " antitela uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab')2fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAb fragment (Vard et al., Nature, 341: 544-546 (1989); PCT objava WO 90/05144), koji se sastoji od jednog promenljivog domena; i (vi) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR). Dodatno, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana odvojenim genima, oni mogu biti spojeni, korišćenjem rekombinantnih postupaka, pomoću sintetičkog linkera koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kome se VL i VH regioni uparuju tako da formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv) (Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); i Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 5879-5883 (1988.).)). Ovakva jednolančana antitela takođe treba da budu obuhvaćena terminom " antigen-vezujući fragment" antitela. Drugi oblici jednolančanih antitela, kao što su diatela, takođe su obuhvaćeni. Diatela su bivalentna, bispecifična antitela u kojima su VH i VL domeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali koriste vezu koja je suviše kratka da bi omogućila uparivanje između dva domena u istom lancu, čime se primoravaju domeni da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvaranje dva mesta vezivanja antigena (Holliger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 6444-6448 (1993.).); Poljak et al., Structure 2: 1121-1123 (1994.)). Takvi antigen-vezujući fragment su poznati u tehnici (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York.790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).
[0076] Dalje, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može biti deo većeg imunoadhezionog molekula, formiranog kovalentnom ili nekovalentnom asocijacijom antitela ili dela antitela sa jednim ili više drugih proteina ili peptida. Primeri takvih imunoadhezionih molekula uključuju upotrebu regiona jezgra streptavidina da bi se napravio tetramerni scFv molekul (Kipriianov, S.M., et al., Human Antibodies and Hybridomas, 6: 93-101 (1995))) i korišćenje ostatka cisteina, marker peptida i C-terminalne polihistidinske oznake za pravljenje dvovalentnih i biotinilovanih scFv molekula (Kipriianov, et al., Mol. Immunol., 31: 1047-1058 (1994.).)). Delovi antitela, kao što su Fab i F(ab')2fragmenti, mogu biti pripremljeni od celih antitela korišćenjem konvencionalnih tehnika, kao što je varenje
2
papainom ili pepsinom, respektivno, celih antitela. Dodatno, antitela, delovi antitela i imunoadhezioni molekuli mogu se dobiti korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNK, kao što je ovde opisano.
[0077] Izraz "anti-NGF antitelo" se odnosi na antitelo koje je u stanju da se veže za faktor rasta nerava (NGF) i inhibira biološku aktivnost NGF i/ili nizvodni put(eve) posredovan NGF signalizacijom. Anti-NGF antitelo obuhvata antitela koja blokiraju, antagonizuju, potiskuju ili smanjuju (uključujući značajno) biološku aktivnost NGF, uključujući nizvodne puteve posredovane NGF signalizacijom, kao što je vezivanje receptora i/ili izazivanje ćelijskog odgovora na NGF. Anti-NGF antitela obuhvataju ona koja neutrališu biološku aktivnost NGF, vezuju NGF i sprečavaju dimerizaciju NGF i/ili vezivanje za NGF receptor (kao što je p75 i/ili trkA), i/ili vezuju NGF i sprečavaju dimerizaciju trkA receptora i/ili trkA autofosforilacija. Ovde su dati primeri anti-NGF antitela.
[0078] Termin "vezujući protein" se odnosi na prirodni ili sintetički polipeptid koji se specifično vezuje za bilo koji deo mete kao što je antigen. Termin "vezujući protein" obuhvata antitela kao što je ovde opisano, uključujući izolovano antitelo, njegov deo koji se vezuje za antigen ili njihov imunološki funkcionalni fragment.
[0079] Izraz "pseće antitelo" odnosi se na imunoglobulin koji se pojavljuje u prirodi ili se rekombinantno proizvodi sastavljen od sekvenci aminokiselina koje predstavljaju prirodna antitela izolovana iz pasa različitih rasa. Pseća antitela su antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci imunoglobulina klicine linije pasa. Pseća antitela iz ovog otkrića mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina pseće klicine linije (npr mutacije uvedene nasumičnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR-ovima i posebno CDR3. Međutim, termin "pseće antitelo" nije namenjen da uključi antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz klicine linije druge vrste sisara, kao što je miš, graftovane na sekvence psećeg okvira.
[0080] Termin "kaninizacija" je definisan kao postupak za prenos aminokiselina koje se ne vezuju za pseći antigen sa donatorskog antitela u okvir akceptora psećeg antitela da bi se stvorili proteinski terapijski tretmani korisni kod pasa.
[0081] Termin "kaninizovano antitelo" odnosi se na antitela koja sadrže sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca iz ne-pseće vrste (na primer., miš), ali u kojima je bar deo VH i/ili VL sekvence izmenjen da bude više „sličan psećoj“, tj. sličniji varijabilnim sekvencama klicine linije pasa. Jedan tip kaninizovanog antitela je CDR-graftovano antitelo, u kome se ne-pseće CDR sekvence uvode u pseće VH i VL sekvence da bi se zamenile
2
odgovarajuće pseće CDR sekvence.
[0082] Kaninizovani oblici ne-psećih antitela koji su ovde dati su pseća antitela koja sadrže sekvencu izvedenu iz ne-psećeg antitela. U većini slučajeva, kaninizovana antitela su sekvence psećeg antitela ("akceptor" ili "recipijent" antitela) u kojima su ostaci hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjeni ostacima hipervarijabilnog regiona iz ne-pseće vrste ("donorsko" antitelo) kao što je miš, pacov, zec, mačka, koza, kokoška, goveda, konj, lama, kamila, jednogrba kamila, ajkule, primati koji nisu ljudi, humana, humanizovana, rekombinantna sekvenca ili konstruisana sekvenca koja ima željena svojstva. U nekim slučajevima, ostaci okvirnog regiona (FR) psećeg antitela su zamenjeni odgovarajućim nepsećim FR ostacima. Dodatno, kaninizovana antitela mogu uključivati ostatke koji se ne nalaze u antitelu recipijenta ili u antitelu donora. Ove modifikacije su napravljene da bi se dodatno poboljšale performanse antitela. Kaninizovano antitelo takođe može sadržati bar deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc) psećeg antitela. Strategije za kaninizaciju antitela uključuju, ali nisu ograničene na, strategije otkrivene u WO 2003/060080.
[0083] Kaninizovano antitelo je antitelo ili njegova varijanta, derivat, analog ili fragment koji se imunospecifično vezuje za antigen od interesa i koji sadrži okvirni (FR) region koji ima suštinski aminokiselinsku sekvencu psećeg antitela i region za određivanje komplementarnosti (CDR) koji imaju suštinski aminokiselinsku sekvencu ne-psećeg antitela. Kaninizovano antitelo sadrži uglavnom sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) u kojima svi ili uglavnom svi CDR regioni odgovaraju onima koji nisu - pseći imunoglobulin (tj. donorsko antitelo) i svi ili suštinski svi okvirni regioni su oni konsenzus sekvence psećeg imunoglobulina. Kaninizovano antitelo takođe sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj psećeg imunoglobulina. Pasje ili kaninizovano antitelo može sadržati i laki lanac kao i najmanje varijabilni domen teškog lanca. Antitelo takođe može uključivati CH1, zglob, CH2, CH3 i CH4 regione teškog lanca. Kaninizovano antitelo može da sadrži samo kaninizovani laki lanac, ili može da sadrži samo kaninizovani teški lanac. Primer kaninizovanog antitela sadrži kaninizovani varijabilni domen lakog lanca i kaninizovani varijabilni domen teškog lanca.
[0084] Termin "kanonski" ostatak se odnosi na ostatak u CDR-u ili okviru koji definiše određenu kanonsku CDR strukturu kako je definisano u Chothia et al. (J. Mol. Biol., 196:901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799 (1992)). Prema Chothia et al., kritični delovi CDR-a mnogih antitela imaju skoro identične konformacije peptidne kičme uprkos velikoj raznolikosti na nivou sekvence aminokiselina. Svaka kanonska struktura specificira prvenstveno skup uglova torzije peptidne kičme za susedni segment
2
aminokiselinskih ostataka koji formiraju petlju.
[0085] Termin "CDR" se odnosi na region koji određuje komplementarnost unutar varijabilnih sekvenci antitela. Postoje tri CDR-a u svakom od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca, koji su označeni kao CDR1, CDR2 i CDR3, za svaki od varijabilnih regiona. Termin "CDR set" se odnosi na grupu od tri CDR-a koji se javljaju u jednom varijabilnom regionu koji je sposoban da veže antigen. Tačne granice ovih CDR-ova su različito definisane prema različitim sistemima. Sistem koji je opisao Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)) ne samo da obezbeđuje nedvosmislen sistem numerisanja ostataka primenljiv na bilo koji varijabilni region antitela, već takođe obezbeđuje precizne granice ostataka koje definišu tri CDR-a. Ovi CDR-ovi se mogu nazvati Kabat CDR-ovima. Chothia i saradnici (Chothia & Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987.).) i Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)) otkrili su da određene podporcije unutar Kabat CDR-a usvajaju skoro identične konformacije peptidne kičme, uprkos tome što imaju veliku raznolikost na nivou sekvence aminokiselina. Ovi pod-delovi su označeni kao L1, L2 i L3 ili H1, H2 i H3 gde "L" i "H" označavaju regione lakog i teškog lanca, respektivno. Ovi regioni se mogu nazvati Chothia CDR-ovima, koji imaju granice koje se preklapaju sa Kabat CDR-ovima. Druge granice koje definišu CDR-ove koji se preklapaju sa Kabat CDR-ovima su opisane od strane Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) i MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996.)). Ipak, druge definicije granica CDR-a možda neće striktno pratiti jedan od gore navedenih sistema, ali će se ipak preklapati sa Kabat CDR-ovima, iako se mogu skratiti ili produžiti u svetlu predviđanja ili eksperimentalnih nalaza da određeni ostaci ili grupe ostataka ili čak celi CDR-ovi ne utiču značajno na vezivanje antigena. Postupci koje se ovde koriste mogu da koriste CDR definisane prema bilo kom od ovih sistema, iako određeni postupci opisani ovde koriste CDR definisane kao Kabat ili Chothia.
[0086] Termin "CDR-graftovano antitelo" odnosi se na antitela koja sadrže sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca jedne vrste, ali u kojima su sekvence jednog ili više CDR regiona VH i/ili VL zamenjene CDR sekvencama druge vrste, kao što su antitela koja imaju varijabilne regione teškog i lakog lanca miša u kojima je jedan ili više mišjih CDR (na primer., CDR3) zamenjen humanim CDR sekvencama.
[0087] Termin "himerno antitelo" se odnosi na antitela koja sadrže sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca jedne vrste i sekvence konstantnog regiona druge vrste, kao što su antitela koja imaju varijabilne regione teškog i lakog lanca miša povezane sa humanim, psećim, konjskim ili mačjim konstantnim regionima. Himerna antitela obuhvataju deo teškog
2
i/ili lakog lanca koji je identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama antitela koja potiču od određene vrste ili pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca (lanaca) identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama u antitelima iz druge vrste ili koji pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmenti takvih antitela, koji pokazuju željenu biološku aktivnost (vidi npr. U.S. Pat. No. 4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 81:6851-6855 (1984)).
[0088] Izrazi "kristal" i "kristalizovan" odnose se na antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, a koji postoji u obliku kristala. Kristali su jedan oblik čvrstog stanja materije, koji se razlikuje od drugih oblika kao što su amorfno čvrsto stanje ili tečno kristalno stanje. Kristali se sastoje od pravilnih, ponavljajućih, trodimenzionalnih nizova atoma, jona, molekula (npr. proteina kao što su antitela) ili molekularnih sklopova (npr. kompleksa antigen/antitelo). Ovi trodimenzionalni nizovi su raspoređeni prema specifičnim matematičkim odnosima koji su dobro shvaćeni u ovoj oblasti. Osnovna jedinica, ili gradivni blok, koji se ponavlja u kristalu naziva se asimetrična jedinica. Ponavljanje asimetrične jedinice u rasporedu koji je u skladu sa datom, dobro definisanom kristalografskom simetrijom, obezbeđuje "jediničnu ćeliju" kristala. Ponavljanje jedinične ćelije redovnim translacijama u sve tri dimenzije daje kristal. Videti Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999).
[0089] Termin "diatela" se odnosi na male fragmente antitela sa dva mesta za vezivanje antigena, čiji fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Korišćenjem kratkog linkera koji onemogućava uparivanje između dva domena u istom lancu, domeni su primorani da se upare sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvore dva mesta za vezivanje antigena.
[0090] Izrazi "donor" i "donorsko antitelo" odnose se na antitelo koje obezbeđuje jedan ili više CDR. Donorsko antitelo može biti antitelo iz vrste različite od antitela iz kojeg su dobijeni ili izvedeni okvirni regioni. U kontekstu humanizovanog antitela, izraz "donorsko antitelo" se odnosi na ne-humano antitelo koje obezbeđuje jedan ili više CDR. U kontekstu kaninizovanog antitela, izraz "donorsko antitelo" se odnosi na ne-pseće antitelo koje obezbeđuje jedan ili više CDR. U kontekstu mačjeg antitela, izraz "donorsko antitelo" se odnosi na ne-mačja antitela koja obezbeđuju jedan ili više CDR. U kontekstu ekvinizovanog antitela, izraz "donorsko antitelo" se odnosi na antitelo koje nije konjsko koje obezbeđuje jedan ili više CDR.
[0091] Termin "epitop" uključuje bilo koju polipeptidnu determinantu sposobnu da se specifično veže za imunoglobulin ili T-ćelijski receptor. Odrednice epitopa mogu uključivati hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil, i mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop je region antigena koji je vezan antitelom. Za antitelo se kaže da specifično vezuje antigen kada preferencijalno prepoznaje svoj ciljni antigen u kompleksnoj mešavini proteina i/ili makromolekula.
[0092] Izraz "antitelo konja" odnosi se na imunoglobulin koji se pojavljuje u prirodi ili se rekombinantno proizvodi sastavljen od sekvenci aminokiselina koje predstavljaju prirodna antitela izolovana od konja različitih rasa. Antitela konja su antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci imunoglobulina klicine linije konja. Antitela konja prema pronalasku mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina konjske klicine linije (npr. mutacije uvedene nasumičnom ili specifičnom mutagenezom na određenom mestu in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR-ovima i posebno CDR3. Međutim, termin "antitelo konja" nije namenjen da uključuje antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz klicine linije druge vrste sisara, kao što je miš, graftovane na sekvence okvira konja.
[0093] Termin "ekvinizacija" je definisan kao postupak za prenos aminokiselina koje se ne vezuju za konjski antigen sa donatorskog antitela u okvir akceptora konjskog antitela da bi se stvorili proteinski terapijski tretmani korisni kod konja.
[0094] Termin "ekvinizovano antitelo" odnosi se na antitela koja sadrže sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca iz ne-konjskih vrsta (na primer., miš), ali u kojima je bar deo VH i/ili VL sekvence izmenjen da bude više „sličan konjskim“, tj. sličniji varijabilnim sekvencama klicine linije konja. Jedan tip ekvinizovanog antitela je CDR-graftovano antitelo, u kome se ne-konjske CDR sekvence uvode u konjske VH i VL sekvence da bi se zamenile odgovarajuće konjske CDR sekvence.
[0095] Ekvinizovani oblici antitela koji nisu konjski koji su ovde dati su konjska antitela koja sadrže sekvencu izvedenu iz antitela ne-ekvina. U većini slučajeva, ekvinizovana antitela su sekvence konjskih antitela (“akceptor” ili “recipijent” antitelo) u kojima su ostaci hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjeni ostacima hipervarijabilnog regiona iz nekonjskih vrsta („donorsko” antitelo) kao što je miš, pacov, zec, mačka, psi, koza, kokoška, goveda, konj, lama, kamila, jednogrba kamila, ajkule, primati koji nisu ljudi, humana, humanizovana, rekombinantna sekvenca ili projektovana sekvenca koja ima željena svojstva. U nekim slučajevima, ostaci okvirnog regiona (FR) konjskog antitela su zamenjeni
1
odgovarajućim ostacima FR koji nisu konjski. Dodatno, ekvinizovana antitela mogu uključivati ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaoca ili u antitelu donora. Ove modifikacije su napravljene da bi se dodatno poboljšale performanse antitela. Ekvinizovano antitelo može takođe da sadrži bar deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc) konjskog antitela.
[0096] Ekvinizovano antitelo je antitelo ili njegova varijanta, derivat, analog ili fragment koji se imunospecifično vezuje za antigen od interesa i koji sadrži okvirni (FR) region koji ima suštinski aminokiselinsku sekvencu konjskog antitela i region za određivanje komplementarnosti (CDR ) koji imaju suštinski aminokiselinsku sekvencu antitela koje nije konjsko. Ekvinizovano antitelo sadrži u suštini sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima koji nisu - konjski imunoglobulin (tj. donorsko antitelo) i svi ili suštinski svi okvirni regioni su oni konsenzus sekvence imunoglobulina konja. Ekvinizovano antitelo takođe sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj konjskog imunoglobulina. Konjsko ili ekvinizovano antitelo, na primer, može da sadrži i laki lanac kao i najmanje varijabilni domen teškog lanca. Antitelo takođe može uključivati CH1, zglob, CH2, CH3 i CH4 regione teškog lanca. Ekvinizovano antitelo može da sadrži samo ekvinizovani laki lanac ili ekvinizovani teški lanac. Primer ekvinizovanog antitela sadrži ekvinizovani varijabilni domen lakog lanca i ekvinizovani varijabilni domen teškog lanca. Izotipovi konja uključuju, na primer, IgGa, IgGb, IgGc, IgG(T), IgM, IgA
[0097] Termin "Fab" se odnosi na fragmente antitela. Digestija antitela papainom proizvodi dva identična fragmenta koji se vezuju za antigen, nazvana "Fab" fragmenti, svaki sa jednim mestom za vezivanje antigena, i rezidualni "Fc" fragment, čije ime odražava njegovu sposobnost da lako kristališe. Tretman pepsinom daje vezujući antigen za unakrsno vezivanje. Fab fragment takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata dodatkom nekoliko ostataka na karboksilnom kraju CH1 domena teškog lanca uključujući jedan ili više cisteina iz zglobnog regiona antitela. Fab'-SH je ovde oznaka za Fab' u kojoj cisteinski ostatak (ostacii) konstantnih domena nose slobodnu tiol grupu. F(ab')2fragmenti antitela su prvobitno proizvedeni kao parovi Fab' fragmenata koji imaju zglobne cisteine između sebe. Poznata su i druga hemijska kuplovanja fragmenata antitela.
[0098] Izraz "mačja antitela" odnosi se na imunoglobulin koji se pojavljuje u prirodi ili se rekombinantno proizvodi sastavljen od sekvenci aminokiselina koje predstavljaju prirodna antitela izolovana od mačaka različitih rasa. Mačja antitela su antitela koja imaju varijabilne i
2
konstantne regione izvedene iz sekvenci imunoglobulina klicine linije mačaka. Mačja antitela iz ovog otkrića mogu da obuhvataju aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina klicine linije mačaka (npr. mutacije uvedene nasumičnom ili specifičnom mutagenezom na određenom mestu in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR-ovima i posebno CDR3. Međutim, termin "mačja antitela" nije namenjen da uključi antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz klicine linije druge vrste sisara, kao što je miš, graftovane na sekvence mačjeg okvira.
[0099] Termin "felinizacija" je definisan kao postupaka za prenos aminokiselina koje ne vezuju mačji antigen sa donatorskog antitela u okvir akceptora mačjih antitela da bi se stvorili proteinski terapijski tretmani korisni kod mačaka.
[0100] Termin "felinizovano antitelo" odnosi se na antitela koja sadrže sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca iz ne-mačjih vrsta (na primer., miš) ali u kojima je bar deo VH i/ili VL sekvence izmenjen da bude više „mačji“, tj. sličnije varijabilnim sekvencama klicine linije mačaka. Jedan tip mačjeg antitela je CDR-graftovano antitelo, u kome se ne-mačje CDR sekvence uvode u VH i VL sekvence mačaka da bi se zamenile odgovarajuće CDR sekvence mačaka.
[0101] Felinizovani oblici ne-mačjih antitela koji su ovde dati su mačja antitela koja sadrže sekvencu izvedenu iz ne-mačjih antitela. U većini slučajeva, felinizovana antitela su sekvence mačjih antitela ("akceptor" ili "recipijent" antitela) u kojima su ostaci hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjeni ostacima hipervarijabilnog regiona iz ne-mačjih vrsta ("donorsko" antitelo) kao što je miš, pacov, zec, mačka, psi, koza, kokoška, goveda, konj, lama, kamila, jednogrba kamila, ajkule, primati koji nisu ljudi, ljudska, humanizovana, rekombinantna sekvenca ili konstruisana sekvenca koja ima željena svojstva. U nekim slučajevima, ostaci okvirnog regiona (FR) mačjeg antitela su zamenjeni odgovarajućim nemačjim FR ostacima. Dodatno, felinizovana antitela mogu uključivati ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaoca ili u antitelu donora. Ove modifikacije su napravljene da bi se dodatno poboljšale performanse antitela. Felinizovano antitelo takođe može da sadrži bar deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc) mačjeg antitela.
[0102] Felinizovano antitelo je antitelo ili njegova varijanta, derivat, analog ili fragment koji se imunospecifično vezuje za antigen od interesa i koje sadrži okvirni (FR) region koji ima suštinski aminokiselinsku sekvencu mačjeg antitela i region za određivanje komplementarnosti (CDR ) koji imaju suštinski aminokiselinsku sekvencu ne-mačjeg antitela. Felinizovano antitelo sadrži uglavnom sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima koji nisu -mačji imunoglobulin (tj. donorsko antitelo) i svi ili suštinski svi okvirni regioni su oni konsenzus sekvence mačjeg imunoglobulina. Felinizovano antitelo takođe sadrži najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), tipično onaj mačjeg imunoglobulina. Mačja ili felinizovana antitela mogu da sadrže i laki lanac kao i najmanje varijabilni domen teškog lanca. Antitelo takođe može uključivati CH1, zglob, CH2, CH3 i CH4 regione teškog lanca. Felinizovano antitelo može da sadrži samo felinizovani laki lanac ili felinizovani teški lanac. Primer felinizovanog antitela sadrži samo felinizovani varijabilni domen lakog lanca i felinizovani varijabilni domen teškog lanca.
[0103] Izraz "okvir" ili "okvirna sekvenca" se odnosi na preostale sekvence varijabilnog regiona minus CDR. Pošto tačna definicija CDR sekvence može biti određena različitim sistemima, značenje okvirne sekvence podleže odgovarajućim različitim tumačenjima. Šest CDR-ova (CDR-L1, -L2 i -L3 lakog lanca i CDR-H1, -H2 i -H3 teškog lanca) takođe dele okvirne regione na lakom lancu i teškom lancu u četiri podregiona (FR1, FR2, FR3 i FR4) na svakom lancu, u kome je CDR1 pozicioniran između FR1 i FR2, CDR2 između FR2 i FR3 i CDR3 između FR3 i FR4. Bez specificiranja određenih podregiona kao FR1, FR2, FR3 ili FR4, okvirni region, kako ga drugi navode, predstavlja kombinovane FR unutar varijabilnog regiona jednog, prirodnog lanca imunoglobulina. FR predstavlja jedan od četiri podregiona, a FR predstavlja dva ili više od četiri podregiona koji čine okvirni region. Akceptorske sekvence ljudskog teškog i lakog lanca su poznate u tehnici. Takođe su poznate sekvence akceptora teškog i lakog lanca pasa (publikacija patentne prijave WO03/060080 i US patent 7261890B2).
[0104] Termin „gen za antitelo klicine linije“ ili „fragment gena“ odnosi se na imunoglobulinsku sekvencu kodiranu nelimfoidnim ćelijama koje nisu prošle proces sazrevanja koji dovodi do genetskog preuređivanja i mutacije za ekspresiju određenog imunoglobulina (Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002).); Marchalonis et al., Adv Ekp Med Biol. 484:13-30 (2001.).)). Jedna od prednosti koje obezbeđuju vezujući proteini ovog otkrića proizilazi iz prepoznavanja da je veća verovatnoća da će geni antitela klicine linije od gena zrelih antitela sačuvati strukture sekvence esencijalnih aminokiselina karakteristične za pojedince u vrsti, pa je stoga manje verovatno da će biti prepoznati kao strani izvor kada se koriste u terapiji kod te vrste.
[0105] Termin "Fv" se odnosi na minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto za prepoznavanje i vezivanje antigena. Ovaj region se sastoji od dimera jednog teškog lanca i jednog varijabilnog domena lakog lanca.
[0106] Izraz "ljudsko antitelo" se odnosi na antitela koja imaju varijabilne i konstantne
4
regione izvedene iz sekvenci imunoglobulina humane klicine linije. Humana antitela iz ovog otkrića mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina humane klicine linije (npr. mutacije uvedene nasumičnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR-ovima i posebno CDR3. Međutim, termin "ljudsko antitelo" nije namenjen da uključi antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz klicine linije druge vrste sisara, kao što je miš, graftovane na sekvence ljudskog okvira.
[0107] Termin "humanizovano antitelo" se odnosi na antitela koja sadrže sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca iz neljudske vrste (na primer., miš), ali u kojima je bar deo VH i/ili VL sekvence izmenjen da bude više „sličan čoveku“, tj. sličnije varijabilnim sekvencama ljudske klicine linije. Jedan tip humanizovanog antitela je CDR-graftovano antitelo, u kome se ne-humane CDR sekvence uvode u humane VH i VL sekvence da bi se zamenile odgovarajuće humane CDR sekvence.
[0108] Humanizovano antitelo je antitelo ili njegova varijanta, derivat, analog ili fragment koji se imunospecifično vezuje za antigen od interesa i koji sadrži okvirni (FR) region koji ima suštinski aminokiselinsku sekvencu humanog antitela i region za određivanje komplementarnosti (CDR) koji imaju suštinski aminokiselinsku sekvencu ne-humanog antitela. Humanizovano antitelo obuhvata suštinski sve, ili najmanje jedan, i tipično dva, varijabilna domena (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima od nehumanog imunoglobulina (tj. donorsko antitelo) i svi ili suštinski svi okvirni regioni su oni konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo takođe sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj humanog imunoglobulina. Humanizovano ili kaninizovano antitelo može da sadrži i laki lanac kao i najmanje varijabilni domen teškog lanca. Antitelo takođe može uključiti CH1, zglob, CH2, CH3 i CH4 regione teškog lanca. Alternativno, humanizovano antitelo može da sadrži samo humanizovani laki lanac ili humanizovani teški lanac. Primer humanizovanog antitela sadrži humanizovani varijabilni domen lakog lanca i humanizovani varijabilni domen teškog lanca.
[0109] Bovinizovano, kamelizovano, kaninizovano, ekvinizovano, felinizovano ili humanizovano antitelo može biti odabrano iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo koji izotip, uključujući bez ograničenja IgG 1, IgG2, IgG3 i IgG4. Bovinizovano, kamelizovano, kaninizovano, ekvinizovano, felinizovano ili humanizovano antitelo može da sadrži sekvence iz više od jedne klase ili izotipa, a određeni konstantni domeni mogu biti odabrani da optimizuju željene efektorske funkcije korišćenjem tehnika dobro poznatih u tehnici.
[0110] Okvir i CDR regioni bovinizovanog, kamelizovanog, kaninizovanog, ekvinizovanog, felinizovanog ili humanizovanog antitela ne moraju tačno da odgovaraju roditeljskim sekvencama, na primer, CDR donorskog antitela ili konsenzus okvir mogu biti mutagenizovani supstitucijom, umetanjem i/ili brisanjem od najmanje jednog aminokiselinskog ostatka tako da CDR ili okvirni ostatak na tom mestu ne odgovara ni donoru antitelu ni konsenzusnom okviru. Takve mutacije, međutim, neće biti opsežne. Obično će najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% i najmanje 95% bovinizovanih, kamelizovanih, kaninizovanih, ekvinizovanih, felinizovanih ili humanizovanih ostataka antitela odgovarati one roditeljske FR i CDR sekvence. Termin "konsenzus okvir" se odnosi na okvirni region u konsenzus imunoglobulinskoj sekvenci. Termin "konsenzus imunoglobulinska sekvenca" odnosi se na sekvencu formiranu od najčešće prisutnih aminokiselina (ili nukleotida) u porodici srodnih imunoglobulinskih sekvenci (vidi npr. Vinnaker, Od gena do klonova (Verlagsgesellschaft, Veinheim, Nemačka 1987.). U porodici imunoglobulina, svaku poziciju u konsenzus sekvenci zauzima aminokiselina koja se najčešće javlja na toj poziciji u porodici. Ako se dve aminokiseline javljaju podjednako često, svaka može biti uključena u konsenzus sekvencu.
[0111] Termin "hipervarijabilni region" odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži amino kiselinske ostatke iz „regiona koji određuje komplementarnost” ili „CDR” u varijabilnom domenu lakog lanca i u varijabilnom domenu teškog lanca kako je definisano Kabat et al., 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) i/ili kako je definisano (Chothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-917 (1987.).) i/ili kao što je definisano kao "AbM petlje" od strane Martin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 86:9268-9272 (1989) i/ili kako je definisano u Lefranc et al., Nucleic Acids Res, 27:209-212 (1999.) u međunarodnoj bazi podataka informacionih sistema ImMunoGeneTics. "Okvirni" ili "FR" ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona kako je ovde definisano.
[0112] Termin "identičnost" se odnosi na odnos između sekvenci dva ili više polipeptidnih molekula ili dva ili više molekula nukleinske kiseline, kao što je određeno upoređivanjem njihovih sekvenci, pri čemu se "identičnost" preciznije odnosi na stepen srodnosti sekvence između molekula nukleinske kiseline ili polipeptida, kao što je određeno poklapanjem između nizova dva ili više nukleotida ili dve ili više sekvenci aminokiselina. „Identičnost“ meri procenat identičnih podudaranja između manje od dve ili više sekvenci sa poravnanjima praznina (ako ih ima) kojima se bavi određeni matematički model ili računarski program (tj. „algoritmi“). Termin "sličnost" se koristi u odnosu na srodni koncept u odnosu na odnos dva ili više molekula nukleinske kiseline ili dva ili više polipeptidnih molekula. Za razliku od "identičnosti", "sličnost" se odnosi na meru srodnosti, koja uključuje i identične poklapanja i poklapanja konzervativne supstitucije. Na primer, za dve polipeptidne sekvence koje imaju 50/100 identičnih aminokiselina, a ostatak su sve nekonzervativne supstitucije, tada bi procenat identičnosti i sličnosti bio 50%. U odnosu na iste dve sekvence, ako bi još 25 pozicija imalo konzervativne zamene, tada procenat identičnosti ostaje 50%, dok bi procenat sličnosti bio 75% (75/100). Identičnost i sličnost srodnih nukleinskih kiselina i polipeptida mogu se lako izračunati postupcima koji su dobro poznati i lako dostupni u tehnici, uključujući, ali nisu ograničene na, one opisane u R COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk, A. M., ed.), 1988, Oxford University Press, New York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D. W., ed.), 1993, Academic Press, New York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, Humana Press, New Jersey; von Heinje, G., SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, M. Stockton Press, New York; Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073; and Durbin et al., 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press.
[0113] Poželjni postupci za određivanje identičnosti su dizajnirani da obezbede najveće podudaranje između upoređenih sekvenci i dobro su opisani u javno dostupnim kompjuterskim programima. Poželjni takvi kompjuterizovani postupci za određivanje identičnosti između dve sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na, GCG programski paket, uključujući GAP (Devereuk et al., 1984, Nucl. Kiselina. Res., 12:387; Genetics Computer Group, Univerzitet u Viskonsinu, Madison, Vis., BLASTP, BLASTN i FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol Biol., 215:403-410). BLASTX program je javno dostupan u Nacionalnom centru za biotehnološke informacije (NCBI) i drugim izvorima (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., 1990, prethodno). Dobro poznati algoritam Smith Vaterman takođe se može koristiti za određivanje identičnosti.
[0114] Izrazi "pojedinac", "pacijent" i "subjekat" se ovde koriste naizmenično da se odnose na sisare, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ljude, miševe, majmune, mačke, pse, kopitare, goveda, svinje, ovce, koze, domaće i poljoprivredne životinje sisare, sportske životinje sisare i kućni ljubimce sisare. Primeri subjekata su životinje, kao što su pas, mačka ili konj.
[0115] "Izolovano antitelo" se odnosi na antitelo koje je u suštini bez drugih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje se specifično vezuje za NGF je u suštini bez antitela koja specifično vezuju antigene različite od NGF). Izolovano antitelo koje specifično vezuje NGF može, međutim, da ima unakrsnu reaktivnost na druge antigene, kao što su NGF molekuli drugih vrsta. Dodatno, izolovano antitelo može biti u suštini bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.
[0116] Termini "izolovani polinukleotid" i "izolovana nukleinska kiselina" kako se ovde koriste naizmenično odnose se na polinukleotid genomskog, cDNK ili sintetičkog porekla ili neku njihovu kombinaciju, koji zbog svog porekla nije povezan sa celim ili delom polinukleotida u kojoj se izolovani polinukleotid nalazi u prirodi, ili je vezan za neki drugi polinukleotid za koji nije vezan u prirodi, ili se ne nalazi u prirodi u okviru veće sekvence.
[0117] Termin "izolovani protein" ili "izolovani polipeptid" je protein ili polipeptid koji na osnovu svog porekla ili izvora derivacije nije povezan sa prirodno povezanim komponentama koje ga prate u njegovom prirodnom stanju; u suštini je bez drugih proteina iste vrste; eksprimira se u ćeliji druge vrste; ili se ne javlja u prirodi. Dakle, polipeptid koji se hemijski sintetiše ili sintetiše u ćelijskom sistemu različitom od ćelije iz koje prirodno potiče biće "izolovan" od svojih prirodno povezanih komponenti. Protein se takođe može osloboditi prirodno povezanih komponenti izolacijom, korišćenjem tehnika prečišćavanja proteina dobro poznatih u tehnici.
[0118] Termin „Kd" odnosi se na konstantu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen kao što je poznato u tehnici.
[0119] Termin „Kna" se odnosi na konstantu brzine za povezivanje antitela sa antigenom da bi se formirao kompleks antitelo/antigen kao što je poznato u tehnici.
[0120] Termin „Kvan" se odnosi na konstantu isključena za disocijaciju antitela od kompleksa antitelo/antigen kao što je poznato u tehnici.
[0121] Termini "Kabat numerisanje", "Kabat definicije i "Kabat obeležavanje" se ovde koriste naizmenično. Ovi termini, koji su priznati u tehnici, odnose se na sistem numerisanja aminokiselinskih ostataka koji su promenljiviji (tj. hipervarijabilni) od ostalih aminokiselinskih ostataka u varijabilnim regionima teškog i lakog lanca antitela, ili njegovog dela koji se vezuje za antigen (Kabat et al., Ann. NI Acad, Sci., 190:382-391 (1971); i Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)). Za varijabilni region teškog lanca, hipervarijabilni region se kreće od položaja aminokiselina 31 do 35 za CDR1, aminokiselinskih položaja od 50 do 65 za CDR2 i položaja aminokiselina od 95 do 102 za CDR3. Za varijabilni region lakog lanca, hipervarijabilni region se kreće od aminokiselinskih položaja 24 do 34 za CDR1, aminokiselinskih položaja 50 do 56 za CDR2 i aminokiselinskih položaja 89 do 97 za CDR3.
[0122] Termin "ključni ostatak" se odnosi na određene ostatke unutar varijabilnog regiona koji imaju veći uticaj na specifičnost vezivanja i/ili afinitet antitela, posebno na sisarsko antitelo kao što je humanizovano, kaninizovano, ekvinizovano ili felinizovano antitelo. Ključni ostatak uključuje, ali nije ograničen na, jedno ili više od sledećeg: ostatak koji je u blizini CDR-a, potencijalno mesto glikozilacije (može biti ili N- ili O-glikozilaciono mesto), retki ostatak, ostatak sposoban za interakciju sa antigenom, ostatak sposoban za interakciju sa CDR, kanonski ostatak, kontaktni ostatak između varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca, ostatak unutar Vernijeove zone i ostatak u regionu koji se preklapa između Chothia definicija CDR1 varijabilnog teškog lanca i Kabat definicija prvog okvira teškog lanca.
[0123] Termin "obeleženi vezujući protein" odnosi se na protein sa ugrađenom oznakom koja omogućava identifikaciju vezujućeg proteina. U jednom aspektu, oznaka je marker koji se može detektovati, npr. ugradnja radio-obeležene amino kiseline ili vezivanje za polipeptid biotinil delova koji se mogu detektovati obeleženim avidinom (npr. streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimska aktivnost koja se može detektovati pomoću optičke ili kolorimetrijske postupci). Primeri oznaka za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.<3>H,<14>C,<35>S,<90>I,<99>Tc,<111>u,<125>ja,<131>ja,<177>Lu,<166>Ho, ili<153>Sm); fluorescentne oznake (npr. FITC, rodamin, lantanidni fosfori), enzimske oznake (npr. peroksidaza rena, luciferaza, alkalna fosfataza); hemiluminiscentni markeri; biotinil grupe; unapred određeni polipeptidni epitopi koje prepoznaje sekundarni reporter (npr. sekvence para leucina, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni za vezivanje metala, oznake epitopa); i magnetna sredstva, kao što su gadolinijum helati.
[0124] Izraz "sisarizacija" se odnosi na postupak za prenos informacija o vezivanju antigena donora na akceptor antitela sisara da bi se generisali korisni terapeutski tretmani. Tačnije, otkriće daje postupci za felinizaciju, ekvinizaciju i kaninizaciju antitela.
[0125] Izraz "sisarsko antitelo" se odnosi na antitela koja sadrže sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca iz vrste sisara (npr. miša), ali u kojima je bar deo VH i/ili VL sekvence izmenjen tako da bude sličniji "sisar od interesa", videti na primer, humanizovana, kaninizovana, ekvinizovana ili felinizovana antitela definisana ovde. Takva sisarska antitela uključuju, ali nisu ograničena na, bovinizovana, kamelizovana, kaninizovana, ekvinizovana, felinizovana ili humanizovana antitela.
[0126] Termini "modulirati" i "regulisati" se koriste naizmenično i odnose se na izmenu ili promenu aktivnosti molekula od interesa (npr., biološka aktivnost NGF). Modulacija može biti povećanje ili smanjenje veličine određene aktivnosti ili funkcije molekula od interesa. Primeri aktivnosti i funkcija molekula uključuju, ali nisu ograničeni na, karakteristike vezivanja, enzimsku aktivnost, aktivaciju ćelijskog receptora i transdukciju signala.
[0127] Termin "modulator" je jedinjenje koje je sposobno da izmeni ili promeni aktivnost ili funkciju molekula od interesa (npr. biološku aktivnost NGF). Na primer, modulator može izazvati povećanje ili smanjenje veličine određene aktivnosti ili funkcije molekula u poređenju sa veličinom aktivnosti ili funkcije uočene u odsustvu modulatora. Modulator može biti inhibitor, koji smanjuje veličinu najmanje jedne aktivnosti ili funkcije molekula. Primeri inhibitora uključuju, ali nisu ograničeni na, proteine, peptide, antitela, peptitela, ugljene hidrate ili male organske molekule. Peptitela su opisana, npr WO01/83525.
[0128] Termin "monoklonsko antitelo" se odnosi na antitelo koje je izvedeno iz jednog klona, uključujući bilo koji eukariotski, prokariotski ili fag klon; a ne postupkom kojim se proizvodi i nije ograničen na antitela proizvedena hibridom tehnologijom.
[0129] Termin "multivalentni vezujući protein" se koristi u ovoj specifikaciji da označi vezujući protein koji sadrži dva ili više mesta za vezivanje antigena. Multivalentni vezujući protein je projektovan tako da ima tri ili više mesta vezivanja antigena i generalno nije prirodno antitelo. Termin "multispecifični vezujući protein" odnosi se na vezujući protein sposoban da veže dve ili više srodnih ili nepovezanih ciljeva. Vezujući protein sa dvostrukim varijabilnim domenom (DVD) su vezujući proteini koji sadrže dva ili više mesta za vezivanje antigena i predstavljaju tetravalentne ili multivalentne vezujuće proteine. Takvi DVD-ovi mogu biti monospecifični, tj. sposobni da vežu jedan antigen ili multispecifični, tj. sposobni da vežu dva ili više antigena. DVD vezujući proteini koji sadrže dva DVD polipeptida teškog lanca i dva DVD polipeptida lakog lanca nazivaju se DVD Ig. Svaka polovina DVD Ig sadrži DVD polipeptid teškog lanca i DVD polipeptid lakog lanca i dva mesta vezivanja antigena. Svako mesto vezivanja sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca sa ukupno 6 CDR-ova uključenih u vezivanje antigena po mestu vezivanja antigena. DVD vezujući proteini i postupci pravljenja DVD vezujućih proteina su otkriveni u US. Patent Application No.11/507,050
[0130] Jedan aspekt otkrića se odnosi na DVD vezujući protein koji sadrži vezujuće proteine sposobne da vezuju NGF. U drugom aspektu, DVD vezujući protein je sposoban da veže NGF i drugu metu.
[0131] Izrazi "faktor rasta nerava" i "NGF" odnose se na faktor rasta nerava i njegove varijante koje zadržavaju bar deo biološke aktivnosti NGF-a. NGF obuhvata sve vrste sisara prirodne sekvence NGF, uključujući mišje, pacovske, humane, zečje, pseće, mačje, konjske
4
ili goveđe.
Tabela 1: Sekvenca NGF
[0132] Termin "NGF receptor" se odnosi na polipeptid koji je vezan ili aktiviran pomoću NGF-a. NGF receptori uključuju TrkA receptor i p75 receptor bilo koje vrste sisara, uključujući, ali nisu ograničeni na, ljude, pse, mačke, kopitare, primate ili goveda.
[0133] Termini "bolest povezana sa NGF" i "poremećaj povezan sa NGF" obuhvataju svaku bolest ili poremećaj za koji se pokazalo da je aktivnost NGF kod subjekta koji pati od bolesti ili poremećaja ili se sumnja da je odgovorna za patofiziologiju. bolesti ili poremećaja, ili faktor koji doprinosi pogoršanju bolesti ili poremećaja, koji se može javiti kao rezultat povećanih nivoa NGF ili povećane osetljivosti subjekta na NGF. Shodno tome, bolest povezana sa NGF ili poremećaj povezan sa NGF je bolest ili poremećaj kod koga se očekuje da smanjenje aktivnosti NGF ublaži simptome i/ili progresiju bolesti ili poremećaja. Takve bolesti i poremećaji se mogu dokazati, na primer, povećanjem koncentracije NGF u biološkoj tečnosti subjekta koji pati od poremećaja (npr. povećanje koncentracije NGF u serumu, plazmi, sinovijalnoj tečnosti, itd. subjekta), što se može detektovati, na primer, korišćenjem anti-NGF antitela kao što je prethodno opisano. Neograničavajući primeri bolesti i poremećaja koji se mogu lečiti antitelima iz otkrića uključuju one bolesti i poremećaje o kojima se govori u odeljku u nastavku koji se odnosi na farmaceutske kompozicije antitela iz otkrića, i obuhvataju akutni bol koji je rezultat na primer operacije ili druge traume i hronični bol.
[0134] Termin "neutralisanje" se odnosi na neutralizaciju biološke aktivnosti NGF-a kada vezujući protein specifično vezuje NGF. Neutralizujući vezujući protein je neutralizujuće antitelo, čije vezivanje za NGF dovodi do inhibicije biološke aktivnosti NGF. Neutralizujući vezujući protein vezuje NGF i smanjuje biološku aktivnost NGF za najmanje 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ili više. Inhibicija biološke aktivnosti NGF neutralizujućim vezujućim proteinom može se proceniti merenjem jednog ili više indikatora biološke aktivnosti NGF dobro poznatih u struci, uključujući proliferaciju ćelija, promene ćelijske morfologije, ćelijsku signalizaciju ili bilo koji detektabilan ćelijski odgovor koji je rezultat vezivanja NGF-a za TrkA receptor.
[0135] Izraz "operativno povezan" odnosi se na jukstapoziciju u kojoj su opisane komponente u odnosu koji im omogućava da funkcionišu na njihov predviđeni način. Kontrolna sekvenca "operativno povezana" sa kodirajućom sekvencom je vezana na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima kompatibilnim sa kontrolnim sekvencama. „Operativno povezane“ sekvence obuhvataju i sekvence kontrole ekspresije koje su u blizini gena od interesa i sekvence kontrole ekspresije koje deluju u trans ili na daljinu za kontrolu gena od interesa. Termin "sekvenca za kontrolu ekspresije" odnosi se na polinukleotidne sekvence koje su neophodne da bi se izvršila ekspresija i procesiranje kodirajućih sekvenci za koje su vezane. Sekvence kontrole ekspresije uključuju odgovarajuće sekvence inicijacije, terminacije, promotera i pojačivača transkripcije; efikasne signale za obradu RNK kao što su signali spajanja i poliadenilacije; sekvence koje stabilizuju citoplazmatsku iRNK; sekvence koje poboljšavaju efikasnost prevođenja (tj. Kozak konsenzus sekvenca); sekvence koje poboljšavaju stabilnost proteina; a po želji i sekvence koje pojačavaju lučenje proteina. Priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma domaćina; kod prokariota, takve kontrolne sekvence generalno uključuju promoter, ribozomsko vezivno mesto i sekvencu za završetak transkripcije; kod eukariota, generalno, takve kontrolne sekvence uključuju promotere i sekvencu terminacije transkripcije. Termin "kontrolne sekvence" ima za cilj da uključi komponente čije je prisustvo bitno za ekspresiju i procesiranje, a može takođe uključiti dodatne komponente čije prisustvo ima prednost, na primer, liderske sekvence i sekvence fuzionog partnera.
[0136] Termin "farmaceutski prihvatljiv nosač" obuhvata sve rastvarače, disperzione medije, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije, koji su fiziološki kompatibilni. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju jedan ili više od vode, fiziološkog rastvora, fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom, dekstroze, glicerola, etanola kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima, biće poželjno da se u kompoziciju uključe izotonična sredstva, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu dalje sadržati manje količine pomoćnih supstanci kao što su sredstva za vlaženje ili emulgovanje, konzervansi ili puferi, koji produžavaju rok trajanja ili efikasnost antitela ili dela antitela.
[0137] Termin "polinukleotid" označava polimerni oblik od dva ili više nukleotida, bilo ribonukleotida ili dezoksinukleotida ili modifikovani oblik bilo kog tipa nukleotida. Termin uključuje jednolančane i dvolančane oblike DNK. Termin "izolovani polinukleotid" će značiti polinukleotid (npr. genomskog, cDNK ili sintetičkog porekla, ili neku njihovu kombinaciju) koji, na osnovu svog porekla, "izolovani polinukleotid" nije povezan sa celim ili jednim delom polinukleotid sa kojim se "izolovani polinukleotid" nalazi u prirodi; je operativno vezan za polinukleotid za koji nije vezan u prirodi; ili se ne javlja u prirodi kao deo veće sekvence.
[0138] Termin "polipeptid" se odnosi na bilo koji polimerni lanac aminokiselina. Termini "peptid" i "protein" se koriste naizmenično sa terminom polipeptid i takođe se odnose na polimerni lanac aminokiselina. Termin "polipeptid" obuhvata prirodne ili veštačke proteine, proteinske fragmente i polipeptidne analoge proteinske sekvence. Polipeptid može biti monomeran ili polimeran.
[0139] Izraz "profilaktički efikasna količina" odnosi se na količinu efektivnu, u dozama i tokom vremenskih perioda neophodnih za postizanje željenog profilaktičkog rezultata.
[0140] Termin "rekombinantna ćelija domaćin" (ili jednostavno "ćelija domaćin") treba da se odnosi na ćeliju u koju je uvedena egzogena DNK. Podrazumeva se da se takvi termini ne odnose samo na određenu ćeliju, već i na potomstvo takve ćelije. Pošto se određene modifikacije mogu javiti u narednim generacijama zbog mutacije ili uticaja okoline, takvo potomstvo možda nije identično roditeljskoj ćeliji, ali je i dalje obuhvaćeno terminom „ćelija domaćin“. U jednom aspektu, ćelije domaćini uključuju prokariotske i eukariotske ćelije odabrane iz bilo kog filuma živog sveta. Eukariotske ćelije uključuju ćelije protista, gljivica, biljaka i životinja. U drugom aspektu ćelije domaćini uključuju, ali nisu ograničene na, prokariotsku ćelijsku liniju E. coli; ćelijske linije sisara CHO, HEK 293 i COS; ćelijska linija insekata Sf9; i gljivična ćelija Saccharomices cerevisiae.
[0141] Standardne tehnike se mogu koristiti za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida i kulturu i transformaciju tkiva (npr. elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu se izvoditi u skladu sa specifikacijama proizvođača ili kao što je uobičajeno u struci ili kako je ovde opisano. Prethodne tehnike i procedure mogu se generalno izvoditi prema konvencionalnim postupcima dobro poznatim u tehnici i kako je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i diskutovane u ovoj specifikaciji. Videti npr. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989.)),
[0142] Termin "rekombinantno antitelo" odnosi se na sve vrste antitela ili imunoglobulina koji su pripremljeni, eksprimirani, stvoreni ili izolovani rekombinantnim sredstvima, kao što su antitela eksprimirana korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćina, antitela izolovana iz rekombinantnog, kombinatornog humane biblioteke antitela (Hoogenboom, TIB Tech., 15: 62-70 (1997.).); Azzazi et al., Clin. Biochem., 35: 425-445 (2002).); Gavilondo et al., BioTechnikues, 29: 128-145 (2002.); Hoogenboom et al.,
4
Imunology Today, 21: 371-378 (2000.)), antitela izolovana od životinje (npr. miša) koja su transgena za gene humanog imunoglobulina (videti npr. Tailor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann et al., Current Opinion in Biotechnology, 13: 593-597 (2002.); Little et al., Imunology Today, 21: 364-370 (2000.)) ili antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje sekvenci gena imunoglobulina na druge sekvence DNK. Takva rekombinantna antitela imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci imunoglobulina klicine linije specifičnih za vrstu. Takva rekombinantna antitela mogu biti podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi životinjska transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatska mutageneza) i stoga aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako su izvedene i povezane sa VH i VL sekvencama klicine linije specifične za vrstu, možda prirodno ne postoje unutar repertoara klicine linije antitela. in vivo.
[0143] Izraz "rekuperacija" se odnosi na proces pretvaranja hemijske vrste kao što je polipeptid u suštinski slobodnu od prirodno povezanih komponenti izolacijom, npr., korišćenjem tehnika prečišćavanja proteina dobro poznatih u tehnici.
[0144] Termin "uzorak" se koristi u najširem smislu. „Biološki uzorak“ uključuje, ali nije ograničen na, bilo koju količinu supstance iz živog ili prethodno živog bića. Takva živa bića uključuju, ali nisu ograničena na, ljude, miševe, pacove, majmune, pse, zečeve i druge životinje. Takve supstance uključuju, ali nisu ograničene na, krv, serum, urin, sinovijalnu tečnost, ćelije, organe, tkiva, koštanu srž, limfne čvorove i slezinu.
[0145] Izraz "jednolančani Fv" ili "scFv" se odnosi na fragmente antitela koji sadrže VH i VL domene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava sFv-u da formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled scFv, vidi Pluckthun u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg i Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).
[0146] Izrazi "specifično vezivanje" ili "se specifično vezuje" u odnosu na interakciju antitela, proteina ili peptida sa drugom hemijskom vrstom znače da interakcija zavisi od prisustva određene strukture (npr. antigene determinante ili epitopa) na hemijsku vrstu; na primer, antitelo prepoznaje i vezuje se za specifičnu strukturu proteina, a ne za proteine uopšte. Ako je antitelo specifično za epitop „A“, prisustvo molekula koji sadrži epitop A (ili slobodnog, neobeleženog A), u reakciji koja sadrži obeleženo „A“ i antitelo, smanjiće količinu obeleženog A vezanog za antitelo .
[0147] Termin "suštinski" u kontekstu CDR odnosi se na CDR koji ima sekvencu aminokiselina najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnu na aminokiselinsku sekvencu CDR ne-humanog antitela.
[0148] Termin „površinska plazmonska rezonanca“ se odnosi na optički fenomen koji omogućava analizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu otkrićem promena u koncentracijama proteina unutar matriksa biosenzora, na primer korišćenjem BIAcore sistema (Pharmacia Biosensor AB, Upsala, Švedska i Piscatavai, NJ). Za dalje opise (Jonsson, et al. Ann. Biol. Clin. 51: 19-26 (1993.).); Jonsson, et al., Biotechniques 11: 620-627 (1991.); Johnsson, et al., J. Mol. Recognit. 8:125-131 (1995.).); i Johnnson, B., et al., Anal. Biochem., 198: 268-277 (1991.).)).
[0149] Izraz "terapeutski efikasna količina" odnosi se na količinu efektivnu, u dozama i tokom vremenskih perioda neophodnih za postizanje željenog terapeutskog rezultata. Terapijski efikasna količina može biti količina i/ili trajanje terapije koja je dovoljna da smanji ili ublaži ozbiljnost i/ili trajanje poremećaja ili jednog ili više simptoma, spreči napredovanje poremećaja, izazove regresiju poremećaja, sprečiti ponavljanje, razvoj, početak ili progresiju jednog ili više simptoma povezanih sa poremećajem, otkriti poremećaj ili poboljšati ili poboljšati profilaktički ili terapeutski efekat(e) druge terapije (npr. profilaktičko ili terapeutsko sredstvo). Terapijski efikasnu količinu antitela ili dela antitela može odrediti osoba verzirana u tehnici i može varirati u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pojedinca, kao i sposobnost antitela ili antitela deo da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj su svi toksični ili štetni efekti antitela, ili dela antitela, nadmašeni terapeutski korisnim efektima.
[0150] Termin "transformacija" se odnosi na bilo koji proces kojim egzogena DNK ulazi u ćeliju domaćina. Transformacija se može desiti u prirodnim ili veštačkim uslovima korišćenjem različitih postupaka dobro poznatih u tehnici. Transformacija se može oslanjati na bilo koji poznati postupak za umetanje stranih sekvenci nukleinskih kiselina u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina. Postupak se bira na osnovu transformacije ćelije domaćina i može uključivati, ali nije ograničeno na, virusnu infekciju, elektroporaciju, lipofekciju i bombardovanje česticama. Takve "transformisane" ćelije uključuju stabilno transformisane ćelije u kojima je umetnuta DNK sposobna za replikaciju bilo kao plazmid koji se autonomno replicira ili kao deo hromozoma domaćina. Oni takođe uključuju ćelije koje prolazno eksprimiraju umetnutu DNK ili RNK u ograničenom vremenskom periodu.
[0151] Izraz "transgeni organizam" se odnosi na organizam koji ima ćelije koje sadrže transgen, pri čemu transgen unet u organizam (ili predak organizma) eksprimira polipeptid koji nije prirodno eksprimiran u organizmu. "Transgen" je DNK konstrukt, koji je stabilno i
4
operativno integrisan u genom ćelije iz koje se razvija transgeni organizam, usmeravajući ekspresiju kodiranog genskog proizvoda u jednom ili više tipova ćelija ili tkiva transgenog organizma.
[0152] Termin "vektor" je namenjen da se odnosi na molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Jedan tip vektora je "plazmid", koji se odnosi na kružnu dvolančanu DNK petlju u koju se mogu vezati dodatni segmenti DNK. Drugi tip vektora je virusni vektor, pri čemu dodatni segmenti DNK mogu biti vezani u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr., bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni vektori sisara). Drugi vektori (npr. neepizomalni vektori sisara) mogu biti integrisani u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, i na taj način se repliciraju zajedno sa genomom domaćina. Dodatno, određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena za koje su operativno povezani. Takvi vektori se ovde pominju kao "rekombinantni ekspresioni vektori" (ili jednostavno, "ekspresioni vektori"). Generalno, ekspresioni vektori korisni u tehnikama rekombinantne DNK su često u obliku plazmida. U ovoj specifikaciji, "plazmid" i "vektor" se mogu koristiti naizmenično pošto je plazmid najčešće korišćeni oblik vektora. Međutim, ovo otkriće treba da uključi takve druge oblike ekspresionih vektora, kao što su virusni vektori (npr. retrovirusi sa defektnom replikacijom, adenovirusi i virusi povezani sa adeno), koji služe ekvivalentnim funkcijama.
[0153] Termin "Venijerova zona" se odnosi na podskup ostataka okvira koji mogu prilagoditi CDR strukturu i fino podesiti uklapanje u antigen kako je opisano u Foote and Vinter (1992, J. Mol. Biol.224:487-499), ostaci Vernijeove zone formiraju sloj ispod CDR-a i mogu uticati na strukturu CDR-a i afinitet antitela.
B. Anti NGF vezujući proteini
[0154] Ovo otkriće obezbeđuje novu porodicu vezujućih proteina, mišjih antitela, CDR kalemljenih antitela, mamalizovanih (bovinizovanih, kamelizovanih, kaninizovanih, ekvinizovanih, felinizovanih ili humanizovanih) antitela i njihovih fragmenata, sposobnih da vezuju i moduliraju biološku aktivnost ili funkciju NGF, uključujući sposobnost neutralizacije NGF. Otkriće stoga takođe obezbeđuje terapeutsko sredstvo pomoću kojeg se inhibira NGF i obezbeđuje kompozicije i postupke za lečenje bolesti povezanih sa povećanim nivoima NGF, posebno bolesti, stanja ili poremećaja gde su povećani nivoi NGF, u poređenju sa nivoima NGF primećenim u uporedivim normalnim nivoima štetni.
4
[0155] Vezujući protein prema ovom pronalasku može biti napravljen bilo kojom od brojnih tehnika poznatih u tehnici i kao što je ovde opisano, uključujući kultivisanje ćelije domaćina koja je ovde opisana u medijumu kulture pod uslovima dovoljnim da proizvede vezujući protein sposoban da veže NGF.
[0156] Monoklonska antitela se mogu pripremiti korišćenjem širokog spektra tehnika poznatih u tehnici, uključujući upotrebu hibridoma, rekombinantnih i tehnologija prikaza faga, ili njihove kombinacije. Na primer, monoklonska antitela se mogu proizvesti korišćenjem hibridomskih tehnika uključujući one poznate u struci i podučavane, na primer, u Harlov et al., Antibodies: Laboratori Manual, (Cold Spring Harbor Laboratori Press, 2nd ed.
1988); Hammerling, et al., u: Monoklonska antitela i hibridomi T-ćelija 563-681 (Elsevier, Njujork, 1981).
[0157] Postupci za proizvodnju i skrining specifičnih antitela korišćenjem hibridomske tehnologije su dobro poznati u tehnici. Takvi postupci uključuju, na primer, kultivisanje hibridomske ćelije koja luči antitelo prema pronalasku, pri čemu se hibridom generiše spajanjem splenocita izolovanih iz miša imunizovanog antigenom otkrivenog sa ćelijama mijeloma i zatim skrining hibridoma koji nastaje fuzijom sa hibridoma klonovima koji luče antitelo sposobno da veže polipeptid prema ovom pronalasku. Ukratko, ili na primer, miševi mogu biti imunizovani NGF antigenom. NGF antigen se može primeniti, sa ili bez adjuvansa, da bi se stimulisao imuni odgovor. Takvi adjuvansi uključuju kompletan ili nepotpun Freundov adjuvans, RIBI (muramil dipeptid) ili ISCOM (imunostimulišuće komplekse). Takvi adjuvansi mogu zaštititi polipeptid od brzog rasprostiranja tako što ga sekvestriraju u lokalni depozit, ili mogu sadržati supstance koje stimulišu domaćina da luči faktore koji su hemotaktični za makrofage i druge komponente imunog sistema. Ako se primenjuje polipeptid, raspored imunizacije će uključivati dve ili više administracija polipeptida, raspoređenih na nekoliko nedelja.
[0158] Posle imunizacije životinje sa NGF antigenom, antitela i/ili ćelije koje proizvode antitela mogu se dobiti od životinje. Serum koji sadrži anti-NGF antitelo može se dobiti od životinje krvarenjem ili žrtvovanjem životinje. Serum se može koristiti onako kako je dobijen od životinje, frakcija imunoglobulina se može dobiti iz seruma, ili anti-NGF antitela mogu biti prečišćena iz seruma. Serum ili imunoglobulini dobijeni na ovaj način su poliklonski, tako da imaju heterogenu lepezu svojstava.
[0159] Kada se detektuje imuni odgovor, na primer, antitela specifična za antigen NGF se detektuju u serumu miša, mišja slezina se može sakupiti i izolovati splenociti. Splenociti se zatim spajaju dobro poznatim tehnikama sa svim pogodnim ćelijama mijeloma, kao što su, na
4
primer, ćelije iz ćelijske linije SP20 dostupne od ATCC. Hibridomi mogu biti odabrani i klonirani ograničenim razblaženjem. Klonovi hibridoma se zatim mogu analizirati postupcima poznatim u tehnici za ćelije koje luče antitela sposobna da vežu NGF. Ascitna tečnost, koja generalno sadrži visoke nivoe antitela, može da se generiše imunizacijom miševa pozitivnim klonovima hibridoma.
[0160] Besmrtni hibridomi koji proizvode antitela mogu se pripremiti od imunizovane životinje. Nakon imunizacije, životinja može biti žrtvovana, a B ćelije slezine spojene sa besmrtnim ćelijama mijeloma kao što je dobro poznato u tehnici (Harlov et al., supra). Alternativno, ćelije mijeloma mogu biti iz ne-sekretorne ćelijske linije i ne luče polipeptide imunoglobulina. Posle fuzije i selekcije antibiotika, hibridomi se mogu pregledati korišćenjem NGF, ili njegovog dela, ili ćelije koja eksprimira NGF. Inicijalni skrining se može izvesti, na primer, korišćenjem enzimske imunoanalize (ELISA) ili radioimunog testa (RIA). Primer ELISA skrininga je dat u WO 00/37504.
[0161] Hibridomi koji proizvode anti-NGF antitela mogu da se izaberu, kloniraju i dalje pregledaju u odnosu na poželjne karakteristike, uključujući snažan rast hibridoma, visoku proizvodnju antitela i poželjne karakteristike antitela, kao što je diskutovano dalje u nastavku. Hibridomi se mogu kultivisati i ekspandirati in vivo kod singenih životinja, kod životinja koje nemaju imuni sistem, na primer golih miševa, ili u ćelijskoj kulturi in vitro. Postupci selekcije, kloniranja i ekspandiranja hibridoma su dobro poznate prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti.
[0162] Primer životinjskog sistema za pripremu hibridoma je miš. Proizvodnja hibridoma kod miševa je vrlo dobro uspostavljena, a protokoli imunizacije i tehnike za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su dobro poznati. Takođe su poznati fuzioni partneri (npr. ćelije mijeloma miša) i postupci fuzije. Alternativno, hibridomi se mogu proizvesti u neljudskim, ne-mišjim vrstama kao što su pacov, ovca, svinja, koza, govedo ili konj. Alternativno, mogu se proizvesti humani hibridomi, u kojima je humani nesekretorni mijelom spojen sa ljudskom ćelijom koja eksprimira anti-NGF antitelo.
[0163] Fragmenti antitela koji prepoznaju specifične epitope mogu se generisati poznatim tehnikama. Na primer, Fab i F(ab')2 fragmenti iz ovog otkrića mogu biti proizvedeni proteolitičkim cepanjem molekula imunoglobulina, korišćenjem enzima kao što su papain (za proizvodnju Fab fragmenata) ili pepsin (za proizvodnju F(ab')2 fragmenata). F(ab')2 fragmenti sadrže varijabilni region, konstantni region lakog lanca i CHI domen teškog lanca.
[0164] Rekombinantna antitela se mogu generisati iz pojedinačnih, izolovanih limfocita korišćenjem postupka koji se u struci pominje kao postupak izabranog limfocitnog antitela
4
(SLAM), kao što je opisano u U.S. Patent No. 5,627,052, PCT Publication WO 92/02551 i Babcock et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 7843-7848 (1996.).). U ovom postupku, pojedinačne ćelije koje luče antitela od interesa, na primer, limfociti dobijeni od bilo koje od imunizovanih životinja opisanih u Odeljku 1, se skrinuju korišćenjem testa hemolitičkog plaka specifičnog za antigen, gde je antigen NGF ili njegov fragment kuplovan sa ovčijim crvenim krvnim zrncima koristeći linker, kao što je biotin, i koristi se za identifikaciju pojedinačnih ćelija koje luče antitela sa specifičnošću za NGF. Nakon identifikacije interesantnih ćelija koje luče antitela, cDNK varijabilnog regiona teškog i lakog lanca mogu da se rekuperuju iz ćelija pomoću reverzna transkriptaza-PCR i ovi varijabilni regioni se zatim mogu eksprimirati, u kontekstu odgovarajućih konstantnih regiona imunoglobulina (npr. humani konstantni regioni), u ćelijama domaćina sisara, kao što su COS ili CHO ćelije. Ćelije domaćina transfektovane sa amplifikovanim imunoglobulinskim sekvencama, izvedenim iz in vivo odabranih limfocita, zatim mogu biti podvrgnute daljoj analizi i selekciji in vitro, na primer paningom transfektovanih ćelija da bi se izolovale ćelije koje eksprimiraju antitela na NGF. Amplifikovane sekvence imunoglobulina mogu se dalje manipulisati in vitro, kao što je sa in vitro postupcima sazrevanja prema afinitetu kao što su oni opisani u PCT objavi WO 97/29131 i PCT objavi WO 00/56772.
[0165] Antitela se mogu proizvesti imunizacijom životinje koja nije čovek i koja sadrži neke ili sve lokuse humanog imunoglobulina sa NGF antigenom. Na primer, ljudska monoklonska antitela usmerena protiv NGF-a mogu da se generišu korišćenjem transgenih miševa koji nose delove ljudskog imunog sistema, a ne mišjeg sistema, koji se u literaturi i ovde pominju kao "HuMab" miševi, sadrže minilokus humanog imunoglobulina gena koji kodira nepreuređene humane sekvence imunoglobulina teškog (µ i γ) i κ lakog lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse µ i κ lanca (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). Ovi miševi pokazuju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili κ i kao odgovor na imunizaciju, a uvedeni humani transgeni teškog i lakog lanca podležu promeni klasa i somatskoj mutaciji da bi se generisala monoklonska antitela visokog afiniteta humanih IgG κ. Priprema HuMab miševa je dobro opisana u literaturi. (Videti, npr. Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Tailor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg & Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; i Harding & Lonberg, 1995, Ann. NY Acad. Sci 764:536-546). Alternativno, drugi poznati sojevi miševa kao što su HCo7, HCo12 i KM transgeni sojevi miševa mogu se koristiti za stvaranje humanih anti-NGF antitela. Još jedan pogodan, iako neograničavajući primer transgenog miša je XENOMOUSE<®>transgeni miš, koji je
4
projektovani soj miša koji sadrži velike fragmente lokusa humanog imunoglobulina i koji nedostaje u proizvodnji mišjih antitela. Videti, npr. Green et al. Nature Genetics, 7:13-21 (1994); i United States Patents 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 i 6,130,364; WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00 09560, i WO 00/037504. XENOMOUSE<®>transgeni miš proizvodi ljudski repertoar potpuno humanih antitela sličan adultnom i generiše humane Mab specifične za antigen. XSENOMOUSE<®>transgeni miš sadrži približno 80% repertoara humanih antitela kroz uvođenje IAC fragmenata veličine megabaze, konfiguracije klicine linije, lokusa humanog teškog lanca i lokusa lakog lanca (Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green et al., J. Exp. med., 188: 483-495 (1998.).)).
[0166] In vitro postupci se takođe mogu koristiti za pravljenje antitela prema pronalasku, pri čemu se biblioteka antitela pregleda da bi se identifikovalo antitelo koje ima željenu specifičnost vezivanja. Postupci za takav skrining biblioteka rekombinantnih antitela su dobro poznate u tehnici i uključuju postupke opisane u npr. U.S. Patent No. 5,223,409; PCT Publication Nos. WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; Fuchs et al. Bio/Technologi, 9:1370-1372 (1991.).); Hai et al., Hum Antibod Hibridomas, 3: 81-85 (1992.)); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989.); McCafferti et al., Nature, 348: 552-554 (1990.); Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993.); Havkins et al., J Mol Biol., 226: 889-896 (1992.); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991.); Gram et al., PNAS, 89: 3576-3580 (1992.); Garrad et al., Bio/Technologi, 9:1373-1377 (1991.); Hoogenboom et al., Nuc Acid Res, 19: 4133-4137 (1991.)); i Barbas et al., PNAS, 88: 7978-7982 (1991.), US patent application publication 20030186374, i PCT Publication No. WO 97/29131.
[0167] Biblioteka rekombinantnih antitela može biti od subjekta imunizovanog sa NGF, ili delom NGF. Alternativno, biblioteka rekombinantnih antitela može biti od naivnog subjekta koji nije imunizovan sa NGF, kao što je biblioteka psećih antitela od psećeg subjekta koji nije imunizovan psećim NGF. Antitela iz ovog otkrića se biraju skriningom biblioteke rekombinantnih antitela sa peptidom koji sadrži NGF pasa da bi se na taj način selektovala ona antitela koja prepoznaju NGF. Postupci za sprovođenje takvog skrininga i da bi se selektovala su dobro poznate u tehnici, kao što je opisano u referencama u prethodnom paragrafu. Da bi se selektovala antitela prema pronalasku koja imaju posebne afinitete vezivanja za hNGF, kao što su ona koja se odvajaju od NGF pasa sa određenim koffkonstanta brzine, poznati postupak rezonance površinskog plazmona može se koristiti za odabir antitela koja imaju željenu stopu koffkonstante. Da bi se selektovala antitela prema pronalasku koja imaju određenu neutralizujuću aktivnost za hNGF, kao što su ona sa određenim IC50, mogu se koristiti standardni postupci poznati u tehnici za procenu inhibicije aktivnosti hNGF.
[0168] Na primer, antitela prema ovom pronalasku takođe mogu biti generisana korišćenjem različitih postupaka prikaza faga poznatih u tehnici. U postupcima prikaza faga, funkcionalni domeni antitela su prikazani na površini čestica faga koje nose polinukleotidne sekvence koje ih kodiraju. U posebnom aspektu, takav fag može da se koristi za prikazivanje domena koji se vezuju za antigen eksprimiran iz repertoara ili kombinatorne biblioteke antitela (npr. pseći, humani ili mišji). Fag koji eksprimira domen za vezivanje antigena koji vezuje antigen od interesa može biti odabran ili identifikovan sa antigenom, na primer, korišćenjem obeleženog antigena ili antigena vezanog ili uhvaćenog za čvrstu površinu ili kuglicu. Fag koji se koristi u ovim postupcima je tipično filamentozni fag uključujući fd i M13 vezujuće domene eksprimirane iz faga sa Fab, Fv ili disulfidom stabilizovanim domenima Fv antitela koji su rekombinantno fuzionisani sa genom III ili genom VIII faga. Primeri postupaka prikaza faga koji se mogu koristiti za pravljenje antitela prema ovom pronalasku uključuju one koji su otkriveni u Brinkman et al., J. Immunol Methods, 182: 41-50 (1995.); Ames et al., J. Immunol. Methods, 184: 177-186 (1995.).); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24:952-958 (1994.).); Peršić et al., Gene, 187: 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology, 57: 191-280 (1994.); PCT application No. PCT/GB91/01134; PCT publications WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; i U.S. Pat. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727; 5,733,743 i 5,969,108.
[0169] Kao što je opisano u gornjim referencama, nakon selekcije faga, regioni koji kodiraju antitelo iz faga mogu se izolovati i koristiti za generisanje celih antitela uključujući humana antitela ili bilo koji drugi željeni fragment koji se vezuje za antigen, i eksprimirati u bilo kom željenom domaćinu, uključujući ćelije sisara, ćelije insekata, biljne ćelije, kvasac i bakterije, na primer, kao što je detaljno opisano u nastavku. Na primer, tehnike za rekombinantnu proizvodnju Fab, Fab' i F(ab')2 fragmenata mogu se takođe koristiti korišćenjem postupaka poznatih u tehnici, kao što su one otkrivene u PCT objavama WO 92/22324; Mullinak et al., BioTechnikues, 12(6):864-869 (1992.)); i Savai et al., AJRI 34:26-34 (1995); i Better et al., Science, 240:1041-1043 (1988) Primeri tehnika koje se mogu koristiti za proizvodnju jednolančanih Fvs i antitela uključuju one opisane u U.S. Pat.4,946,778 i 5,258, 498; Huston et al., Methods in Enzimology, 203:46-88 (1991.); Shu et al., PNAS, 90:7995-7999 (1993.); i
1
Skerra et al., Science, 240:1038-1040 (1988.).
[0170] Alternative skriningu biblioteka rekombinantnih antitela pomoću prikaza faga su poznate i obuhvataju druge metodologije za skrining velikih kombinatornih biblioteka koje se mogu primeniti na identifikaciju antitela sa dvostrukom specifičnošću prema pronalasku. Jedan tip alternativnog sistema ekspresije je onaj u kome se biblioteka rekombinantnih antitela eksprimira kao fuzije RNK-proteina, kao što je opisano u PCT Publication No. WO 98/31700, u Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:12297-12302 (1997)). U ovom sistemu, stvara se kovalentna fuzija između iRNK i peptida ili proteina koje ona kodira preko in vitro translacije sintetičkih iRNK koje nose puromicin, antibiotik akceptor peptida, na svom 3' kraju. Dakle, specifična iRNK može biti obogaćena iz složene mešavine iRNK (na primer., kombinatorna biblioteka) zasnovana na svojstvima kodiranog peptida ili proteina, npr., antitela ili njegovog dela, kao što je vezivanje antitela, ili njegovog dela, za antigen dvostruke specifičnosti. Sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju antitela, ili njihove delove, dobijene iz skrininga takvih biblioteka mogu se eksprimirati rekombinantnim sredstvima kao što je prethodno opisano (na primer., u ćelijama domaćina sisara) i, dodatno, mogu biti podvrgnuti daljem sazrevanju prema afinitetu bilo dodatnim krugovima skrininga fuzije iRNK-peptida u kojima su mutacije uvedene u prvobitno odabranu sekvencu(e), ili drugim postupcima za sazrevanje afiniteta in vitro rekombinantnih antitela, kao što je prethodno opisano.
[0171] U drugom pristupu, antitela prema ovom pronalasku takođe mogu da se generišu ili afinitetno sazrevaju korišćenjem postupaka prikaza kvasca poznatih u tehnici. U postupcima prikaza kvasca, genetski postupci se koriste za vezivanje domena antitela za ćelijski zid kvasca i njihovo prikazivanje na površini kvasca. Konkretno, takav kvasac može da se koristi za prikazivanje domena za vezivanje antigena eksprimiranih iz repertoara ili kombinatorne biblioteke antitela (npr. humanih ili mišjih). Primeri postupaka prikazivanja kvasca koji se mogu koristiti za pravljenje antitela iz ovog otkrića uključuju one koji su otkriveni Wittrup, et al. U.S. Patent No.6,699,658
[0172] Ovde opisana antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen mogu takođe biti proizvedeni genetskim inženjeringom. Na primer, tehnologija za ekspresiju gena i teškog i lakog lanca u E. coli je predmet PCT patentnih prijava: broj objave WO 901443, WO901443, i WO 9014424 u Huse et al., 1989 Science 246:1275-81. Ovo otkriće tako takođe obuhvata izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od vezujućih proteina opisanih ovde, kao i rekombinantni vektor koji sadrži takav molekul nukleinske kiseline, i ćeliju domaćina koja sadrži takav rekombinantni vektor.
2
[0173] Vektor je molekul nukleinske kiseline, koji može biti konstrukt, sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Vektor može uključivati bilo koje poželjne ili potrebne operativne elemente. Poželjni vektori su oni za koje su opisana restrikciona mesta i koji sadrže operativne elemente potrebne za transkripciju sekvence nukleinske kiseline. Takvi operativni elementi uključuju, na primer, najmanje jedan pogodan promoter, najmanje jedan operator, najmanje jednu lidersku sekvencu, najmanje jedan terminator kodon, i bilo koje druge sekvence DNK neophodne ili poželjne za odgovarajuću transkripciju i naknadnu translaciju sekvence nukleinske kiseline. Takvi vektori sadrže najmanje jedan oridžin replikacije koji prepoznaje organizam domaćin zajedno sa najmanje jednim selektivnim markerom i najmanje jednom promotorskom sekvencom koja može da pokrene transkripciju sekvence nukleinske kiseline. Vektor može biti plazmid u koji se mogu vezati dodatni segmenti DNK. Vektor može biti virusni vektor, pri čemu dodatni segmenti DNK mogu biti vezani u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr., bakterijski vektori koji imaju bakterijski oridžin replikacije i epizomalni vektori sisara). Drugi vektori (npr. neepizomalni vektori sisara) mogu biti integrisani u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, i na taj način se repliciraju zajedno sa genomom domaćina. Dodatno, određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena za koje su operativno povezani. Takvi vektori se ovde pominju kao "rekombinantni ekspresioni vektori" (ili jednostavno, "ekspresioni vektori"). Generalno, ekspresioni vektori korisni u tehnikama rekombinantne DNK su često u obliku plazmida. U ovoj specifikaciji, "plazmid" i "vektor" se mogu koristiti naizmenično jer je plazmid najčešće korišćeni oblik vektora. Međutim, ovo otkriće je namenjeno da uključi takve druge oblike ekspresionih vektora, kao što su virusni vektori (npr. retrovirusi sa defektnom replikacijom, adenovirusi i virusi povezani sa adeno), koji služe ekvivalentnim funkcijama. Kao primer, a ne kao ograničenje, pogodni vektori uključuju pcDNK, pTT (Durocher et al., Nucleic Acids Research, Vol 30, No.2 (2002)); pTT3 (pTT sa dodatnim mestom za višestruko kloniranje, pEFBOS (Mizushima et al., Nucleic acids Research, Vol 18, No.17 (1990)), pBV, pJV, pBJ ili pHibE (patentna objava br.: US 2009/0239259 A1) .
[0174] Sekvence koje su operativno povezane su u vezi koja im omogućava da funkcionišu na način na koji su predviđeni. Kontrolna sekvenca koja je operativno vezana za kodirajuću sekvencu je vezana na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima kompatibilnim sa kontrolnim sekvencama. Operativno povezane sekvence obuhvataju i sekvence kontrole ekspresije koje su u blizini gena od interesa i sekvence kontrole ekspresije koje deluju u trans ili na daljinu da kontrolišu gen od interesa. Sekvence za kontrolu ekspresije su polinukleotidne sekvence koje su neophodne da bi se izvršila ekspresija i procesiranje kodirajućih sekvenci za koje su vezane. Sekvence kontrole ekspresije uključuju odgovarajuće sekvence inicijacije, terminacije, promotera i pojačivača transkripcije; efikasne signale za obradu RNK kao što su signali spajanja i poliadenilacije; sekvence koje stabilizuju citoplazmatsku iRNK; sekvence koje poboljšavaju efikasnost prevođenja (tj. Kozak konsenzus sekvenca); sekvence koje poboljšavaju stabilnost proteina; a po želji i sekvence koje pojačavaju lučenje proteina. Priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma domaćina; kod prokariota, takve kontrolne sekvence generalno uključuju promoter, ribozomsko vezivno mesto i sekvencu za završetak transkripcije; kod eukariota, takve kontrolne sekvence generalno uključuju promotere i sekvencu terminacije transkripcije. Kontrolne sekvence mogu uključivati komponente čije je prisustvo bitno za ekspresiju i procesiranje, a mogu takođe uključiti dodatne komponente čije prisustvo je korisno, na primer, liderske sekvence i sekvence partnera fuzije.
[0175] Ćelija domaćina može biti transformisana vektorom koji uvodi egzogenu DNK u ćeliju domaćina. Transformacija se može desiti u prirodnim ili veštačkim uslovima korišćenjem različitih postupaka dobro poznatih u tehnici. Transformacija se može oslanjati na bilo koji poznati postupak za umetanje stranih sekvenci nukleinskih kiselina u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina. Metoda se bira na osnovu transformacije ćelije domaćina i može uključivati, ali nije ograničeno na, virusnu infekciju, elektroporaciju, lipofekciju, precipitaciju kalcijum-fosfata, transfekciju DEAE-dekstranom, bombardovanje česticama. Transformisane ćelije uključuju stabilno transformisane ćelije u koje su umetnute ćelije. DNK je sposobna za replikaciju ili kao plazmid koji se autonomno replicira ili kao deo hromozoma domaćina, i ćelije koje prolazno eksprimiraju umetnutu DNK ili RNK u ograničenom vremenskom periodu.
[0176] Organizmi domaćini kao što su ćelije domaćini se uzgajaju u uslovima odgovarajućim za amplifikaciju vektora i ekspresiju proteina, kao što je dobro poznato u tehnici. Eksprimirani rekombinantni proteini se mogu detektovati bilo kojim od brojnih postupaka takođe dobro poznatih u tehnici.
[0177] Pogodni organizmi domaćini uključuju na primer prokariotski ili eukariotski ćelijski sistem. Eukariotska ćelija može biti ćelija protista, životinjska, biljna ili ćelija gljiva. Eukariotska ćelija je na primer životinjska ćelija koja može biti ćelija sisara, ptičja ćelija ili ćelija insekata kao što je ćelija insekta Sf9. Mogu se koristiti ćelije iz uspostavljenih i lako dostupnih, kao što su, ali ne ograničavajući se na HeLa, MRC-5 ili CV-1. Ćelija domaćin može biti an E.coli ćelija, ili ćelija kvasca kao što je, ali nije ograničeno na Saccharomices
4
cerevisiae. Ćelije domaćini sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela iz ovog otkrića takođe uključuju ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr-CHO ćelije, opisane u Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 4216-4220 (1980.).), koji se koristi sa markerom koji se može izabrati DHFR, na primer., kako je opisano u Kaufman et al., Mol. Biol., 159: 601-621 (1982.).)), NS0 ćelije mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela unesu u ćelije domaćina sisara, antitela se proizvode kultivisanjem ćelija domaćina tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćina, ili sekrecijom antitela u kulturu. medijum u kome se gaje ćelije domaćina. Antitela se mogu dobiti iz medijuma kulture korišćenjem standardnih postupaka prečišćavanja proteina.
[0178] Ćelije domaćini se takođe mogu koristiti za proizvodnju funkcionalnih fragmenata antitela, kao što su Fab fragmenti ili scFv molekuli. Shvatiće se da su varijacije prethodne procedure unutar obima ovog otkrića. Na primer, može biti poželjno da se ćelija domaćina transfektuje sa DNK koja kodira funkcionalne fragmente bilo lakog lanca i/ili teškog lanca antitela iz ovog otkrića. Tehnologija rekombinantne DNK se takođe može koristiti da se ukloni deo ili celu DNK koja kodira jedan ili oba laka i teška lanca koji nije neophodan za vezivanje za antigene od interesa. Molekuli eksprimirani iz takvih skraćenih molekula DNK takođe su obuhvaćeni antitelima iz ovog otkrića. Pored toga, mogu se proizvesti bifunkcionalna antitela u kojima su jedan teški i jedan laki lanac antitela prema ovom pronalasku, a drugi teški i laki lanac su specifični za antigen koji nije antigen od interesa unakrsnim vezivanjem antitela iz ovog otkrića sa drugim antitelom standardnim postupcima hemijskog unakrsnog vezivanja.
[0179] U sistemu za rekombinantnu ekspresiju antitela, ili njegovog dela koji se vezuje za antigen, prema pronalasku, rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira i teški lanac antitela i laki lanac antitela se uvodi u dhfr-CHO ćelije transfekcijom posredovanom kalcijum fosfatom. Unutar rekombinantnog ekspresionog vektora, geni teškog i lakog lanca antitela su svaki operativno povezani sa regulatornim elementima pojačivača CMV/AdMLP promotera da bi pokrenuli visoke nivoe transkripcije gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi DHFR gen, koji omogućava selekciju CHO ćelija koje su transfektovane vektorom korišćenjem selekcije/amplifikacije metotreksata. Odabrane transformantne ćelije domaćini se kultivišu da bi se omogućila ekspresija teških i lakih lanaca antitela, a intaktno antitelo se dobija iz medijuma za kulturu. Standardne tehnike molekularne biologije se koriste za pripremu rekombinantnog ekspresionog vektora, transfekciju ćelija domaćina, selekciju transformanata, kultivaciju ćelija domaćina i rekuperaciju antitela iz medijuma kulture. Dalje, pronalazak obezbeđuje postupak sintetize rekombinantnog antitela prema pronalasku kultivisanjem ćelije domaćina prema pronalasku u pogodnom medijumu kulture sve dok se ne sintetiše rekombinantno antitelo prema pronalasku. Postupak može dalje da obuhvata izolovanje rekombinantnog antitela iz medijuma kulture.
[0180] Ovo otkriće stoga obezbeđuje anti NGF vezujuće proteine koji su specifični za i suštinski neutrališu NGF polipeptide, uključujući aktivni humani NGF. Takođe su obezbeđene aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca antitela koje su suštinski specifične i suštinski neutrališu NGF polipeptide kada su vezani za njih. Ova specifičnost omogućava da anti-humana NGF humana antitela i ljudska monoklonska antitela sa sličnom specifičnošću budu efikasna imunoterapija za bolesti povezane sa NGF.
[0181] Ovo otkriće obuhvata anti NGF vezujuće proteine koji sadrže najmanje jednu od sekvenci aminokiselina izabranih iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207 i SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 i SEK ID BROJ: 44, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, i koji vezuje NGF polipeptidni epitop sa značajno visokim afinitetom kao što je ovde opisano i ima kapacitet da suštinski moduliše, uključujući značajno smanjenje, aktivnost NGF polipeptida.
[0182] Primeri takvih vezujućih proteina uključuju vezujuće proteine koji sadrže varijabilni polipeptid teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEK ID BR: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: SEK ID BR : 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEK ID BR: 189, SEK ID BR: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEK ID BR. : 206 i SEQ ID NO: 207; i varijabilni polipeptid lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SED ID BR: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 i SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200 i SEQ ID NO: 202.
[0183] Primeri uparivanja varijabilnog polipeptida teškog lanca i polipeptida varijabilnog lakog lanca su predstavljeni sledećim uparivanjama: SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25 i SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27 i SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29 i SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 31 i SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 177 i SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 i SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37 i SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39 i SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41 i SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43 i SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 180 i SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182 i SEQ ID NO: 183; SEQ ID NO: 185 i SEQ ID NO: 186; SEQ ID NO: 187 i SEQ ID NO: 188; i SEQ ID NO: 192 i SEQ ID NO: 193.
[0184] Otkrićem su takođe obuhvaćeni vezujući proteini koji specifično vezuju NGF kao što je ovde opisano i koji sadrže varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sa bilo kojim od SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEK ID BR: 37, SEK ID BR: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 165 : 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, SEK ID BR: 206, SEQ ID NO: 207. Takođe su obuhvaćeni vezujući proteini koji specifično vezuju NGF kako je ovde opisano i sadrže varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, na najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sa bilo kojim od SED ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEK ID BR: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: : 42 i SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202.
[0185] Primeri vezujućih proteina koji specifično vezuju NGF kao što je ovde opisano poželjno obuhvataju varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca kao što sledi:
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sa SEQ ID NO: 2, ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 4 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 6 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 8 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sa SEQ ID NO: 10 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 12 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 14 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 16 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sa SEQ ID NO: 18 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 20 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sa SEQ ID NO: 22 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 24 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 25 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 26 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sa SEQ ID NO: 27 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 %) identičnost sa SEQ ID NO: 28 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 29 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 30 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sa SEQ ID NO: 31 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 32 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sa SEQ ID NO: 177 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 32 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sa SEQ ID NO: 33 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 34 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sa SEQ ID NO: 35 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 36 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 37 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 38 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 39 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 40 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sa SEQ ID NO: 41 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 42 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sa SEQ ID NO: 43 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 44 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 180 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 181 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 182 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 183 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 185 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 186 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima
1
najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 187 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 188 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 189 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 42 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sa SEQ ID NO: 190 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 188 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sa SEQ ID NO: 206 ili njegov antigen vezujući ili imunološki funkcionalan imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 42 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom;
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 207 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 188 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom; i
varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 192 ili njegov antigen-vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sa SEQ ID NO: 193 ili njegovim antigen-vezujućim ili imunološki
2
funkcionalnim imunoglobulinskim fragmentom.
[0186] Primeri vezujućih proteina kako su ovde otkriveni mogu uključivati najmanje jedan CDR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od: a) CDR-ova teškog lanca koji se sastoje od SEQ ID NOS: 55, 56, 57, 61, 62, 63, 67, 68, 69, 73, 74, 75, 79, 80, 81; ili modifikovane CDR aminokiselinske sekvence koje imaju identičnost sekvence od najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci; b) CDR-ovi lakog lanca koji se sastoje od SEQ ID NOS: 58, 59, 60, 64, 65, 66, 70, 71, 72, 76, 77, 78, 82, 83, 84; ili modifikovane CDR aminokiselinske sekvence koje imaju identičnost sekvence od najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% u odnosu na jednu od navedenih sekvenci.
[0187] Podrazumeva se da se razmatraju varijacije u bilo kojoj od sekvenci nukleinskih kiselina i aminokiselina koje su ovde opisane. Takve varijacije uključuju one koje će rezultirati sekvencom nukleinske kiseline koja je sposobna da usmerava proizvodnju analoga odgovarajućih NGF vezujućih proteina. Podrazumeva se da zbog degeneracije genetskog koda mogu da se naprave mnoge zamene nukleotida koje će dovesti do DNK sekvence koja ostaje sposobna da usmerava proizvodnju odgovarajućeg proteina ili njegovih analoga. Sve takve varijante DNK sekvence koje su funkcionalno ekvivalentne bilo kojoj od ovde opisanih sekvenci su obuhvaćene ovim otkrićem.
[0188] Varijanta bilo kog od vezujućih proteina opisanih ovde označava protein (ili polipeptid) koji se razlikuje od datog proteina (npr. anti-NGF antitela) u sekvenci aminokiselina dodavanjem (npr. umetanjem), brisanjem ili konzervativnom supstitucijom aminokiselina, ali koja zadržava biološku aktivnost datog proteina. Konzervativna supstitucija aminokiseline, tj. zamena aminokiseline drugom amino kiselinom sličnih svojstava (npr. hidrofilnost i stepen i distribucija naelektrisanih regiona) je prepoznata u tehnici kao tipično da uključuje manju promenu. Ove manje promene se mogu identifikovati, delimično, uzimanjem u obzir hidropatskog indeksa aminokiselina, kako se shvata u struci (videti, npr. Kite et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982.).)). Hidropatski indeks aminokiseline zasniva se na razmatranju njene hidrofobnosti i naelektrisanja. U struci je poznato da aminokiseline sličnih hidropatskih indeksa mogu biti supstituisane i da i dalje zadržavaju funkciju proteina. U jednom aspektu, aminokiseline koje imaju hidropatski indeks ± 2 su supstituisane. Hidrofilnost aminokiselina se takođe može koristiti za otkriće supstitucija koje bi dovele do toga da proteini zadrže biološku funkciju. Razmatranje hidrofilnosti aminokiselina u kontekstu peptida dozvoljava izračunavanje najveće lokalne prosečne hidrofilnosti tog peptida, što je korisna mera za koju se navodi da dobro korelira sa antigenošću i imunogenošću (videti, npr. U.S. Patent No. 4,554,101). Supstitucija aminokiselina koje imaju slične vrednosti hidrofilnosti može dovesti do toga da peptidi zadrže biološku aktivnost, na primer imunogenost, kao što se shvata u tehnici. U jednom aspektu, supstitucije se izvode sa aminokiselinama koje imaju vrednosti hidrofilnosti unutar ±2 jedna od druge. I indeks hidrofobnosti i vrednost hidrofilnosti aminokiselina su pod uticajem određenog bočnog lanca te aminokiseline. U skladu sa tim zapažanjem, podrazumeva se da zamene aminokiselina koje su kompatibilne sa biološkom funkcijom zavise od relativne sličnosti aminokiselina, a posebno bočnih lanaca tih aminokiselina, kao što je otkriveno hidrofobnošću, hidrofilnošću, naelektrisanjem, veličinom i druga svojstva. „Varijanta“ se takođe može koristiti za opisivanje polipeptida ili njegovog fragmenta koji je različito obrađen, kao što je proteoliza, fosforilacija ili druga posttranslaciona modifikacija, a ipak zadržava svoju biološku aktivnost ili reaktivnost antigena, npr. sposobnost vezivanja za NGF. Upotreba "varijante" ovde je namenjena da obuhvati fragmente varijante osim ako nije drugačije u suprotnosti sa kontekstom.
[0189] Vezujući protein koji su ovde opisani obuhvataju molekul imunoglobulina, disulfidno povezan Fv, scFv, monoklonsko antitelo, mišje antitelo, himerno antitelo, jednodomensko antitelo, CDR-graftovano antitelo, diatelo, mamalizovano (bovinizovano, kamelizovano, kaninizovano, ekvinizovano ili humanizovano, ) antitelo, pseće antitelo, mačje antitelo, konjsko antitelo, mišje antitelo, multispecifično antitelo, Fab, dvostruko specifično antitelo, DVD, Fab', bispecifično antitelo, F(ab')2 ili Fv uključujući jednolančani Fv fragment.
[0190] Vezujući protein može da sadrži određeni konstantni region teškog lanca, kao što je IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD konstantni region. Primer vezivnog proteina uključuje konstantni region teškog lanca IgG1 ili konstantni region teškog lanca IgG4. Dodatno, antitelo može da sadrži konstantni region lakog lanca, kao što je konstantni region kapa lakog lanca ili konstantni region lambda lakog lanca. Primer vezivnog proteina obuhvata konstantni region kapa lakog lanca.
[0191] Zamene aminokiselinskih ostataka u Fc delu radi promene efektorske funkcije antitela su poznate u tehnici (Winter, et al. US PAT NOS 5,648,260; 5624821). Fc deo antitela posreduje u nekoliko važnih efektorskih funkcija, npr. indukcija citokina, ADCC, fagocitoza, citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) i poluživot/brzina klirensa kompleksa antitela i antigen-antitela. U nekim slučajevima ove efektorske funkcije su poželjne za terapeutsko antitelo, ali u drugim slučajevima mogu biti nepotrebne ili čak štetne, u zavisnosti od terapijskih ciljeva. Određeni humani izotipovi IgG, posebno IgG1 i IgG3, posreduju u ADCC
4
i CDC vezivanjem za FcγR i dopunjuju C1k, respektivno. Neonatalni Fc receptori (FcRn) su kritične komponente koje određuju cirkulišući poluživot antitela. Najmanje jedan aminokiselinski ostatak može biti zamenjen u konstantnom regionu antitela, na primer Fc regionu antitela, tako da se efektorske funkcije antitela menjaju.
[0192] Vezujući proteini u skladu sa ovim otkrićem mogu sadržati konstantni domen imunoglobulina teškog lanca kao što je, na primer, humani ili pseći ili konjski ili mačji IgM konstantni domen, humani ili pseći ili konjski ili mačji IgG4 konstantni domen, humani ili pseći ili konjski ili mačji IgG1 konstantni domen, humani ili pseći ili konjski ili mačji IgG konstantni domen, humani ili pseći ili konjski ili mačji IgG2 konstantni domen, humani ili pseći ili konjski ili mačji IgG3 konstantni domen i humani ili pseći ili konjski IgG3 ili konstantni domen mačjeg IgA. Vezujući protein kao što je ovde opisan može sadržati konstantni domen imunoglobulina lakog lanca kao što je, ali ne ograničavajući se na, bilo koji od ljudskih, psećih, konjskih ili mačjih, kapa ili lambda konstantnih domena, ili bilo koji od psećih, konjskih ili mačjih kapa ili lambda ekvivalentnih konstantnih domena . Primer takvog vezujućeg proteina ima konstantni region koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 52 ili SEQ ID NO: 54.
[0193] Vezujući proteini kao što je ovde opisano mogu takođe da obuhvataju NGF antiidiotip antitelo u odnosu na najmanje jedan NGF vezujući protein prema ovom pronalasku. Anti-idiotipsko antitelo uključuje bilo koji molekul koji sadrži protein ili peptid koji sadrži najmanje deo molekula imunoglobulina kao što je, ali nije ograničeno na, najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) teškog ili lakog lanca ili njegov deo koji se vezuje za ligand, varijabilni region teškog ili lakog lanca, konstantni region teškog lanca ili lakog lanca, okvirni region, ili; bilo koji njegov deo, koji može biti ugrađen u vezujući protein prema ovom pronalasku.
[0194] Vezujući protein prema pronalasku su sposobni da se vežu za humani i pseći NGF sa visokom specifičnošću, i dodatno su sposobni da modulišu biološku aktivnost ili funkciju NGF u organizmu ili subjektu, uključujući suštinski neutralisanje humanog i psećeg NGF. Takođe su ovim otkrićem obuhvaćena izolovana mišja monoklonska antitela, ili njihovi delovi koji se vezuju za antigen, koji se vezuju za NGF sa značajno visokim afinitetom, imaju malu brzinu i/ili imaju značajno visok kapacitet neutralizacije. Primer vezivnog proteina kako je ovde otkriven je sposoban da neutrališe NGF sa potencijom (IC50) od najmanje oko 10 nM, najmanje oko 5 nM, najmanje oko 1 nM, najmanje oko 0,5 nM, najmanje oko 0.1 nM, najmanje oko 0.05 nM, najmanje oko 0,01 nM, ili najmanje oko 0,001 nM, kao što je mereno u testu proliferacije ćelija TF-1 ili testovima pERK i Pathhunter. Vezujući protein kako je ovde opisano mogu imati konstantu brzine uključenja (Kna) do NGF od najmanje oko 10<2>M<-1>s<-1>; najmanje oko 10<3>M<-1>s<-1>; najmanje oko 10<4>M<-1>s<-1>; najmanje oko 10<5>M<-1>s<-1>; najmanje oko 10<6>M<-1>s<-1>; ili najmanje oko 10<7>M<-1>s<-1>, mereno rezonancom površinskog plazmona. Vezujući proteini kao što je ovde opisano mogu imati konstantu stopu isključenja (Koff) prema NGF od najviše oko 10<-3>s<-1>; najviše oko 10<-4>s<-1>; najviše oko 10<-5>s<-1>; najviše oko 10<-6>s<-1>ili najviše oko 10<-7>s<-1>, mereno rezonancom površinskog plazmona. Vezujući proteini kao što je ovde opisano mogu imati konstantu disocijacije (KD) prema NGF od najviše oko 10<-7>M; najviše oko 10<-8>M; najviše oko 10<-9>M; najviše oko 10<-10>M; najviše oko 10<-11>M; najviše oko 10<-12>M; najviše oko 10<-13>M, ili najviše oko 10<-14>M. Na primer, vezujući protein kao što je ovde opisan može imati konstantu disocijacije (KD) od oko 1×10<-9>M, oko 1×10<-10>M, oko 3,14×10<-10>M, oko 1×10<-11>M, oko 2,37×10<-11>M, oko 1×10<-12>M, oko 1×10<-13>M, ili oko 3,3×10<-14>M.
[0195] Vezujući protein kao što je ovde opisano, uključujući izolovano antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, ili njegov imunološki funkcionalni fragment, mogu da vežu NGF i da se odvoje od NGF sa koffkonstantom isključenja od oko 0.1s<-1>ili manje, kao što je određeno rezonancom površinskog plazmona, ili može inhibirati aktivnost NGF sa IC50od oko 1 × 10<-6>M ili manje. Alternativno, antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može da se odvoji od NGF sa koffkonstantom isključenja od oko 1 × 10<-2>s<-1>ili manje, kao što je određeno rezonancom površinskog plazmona, ili može inhibirati aktivnost NGF sa IC50od oko 1 × 10<-7>M ili manje. Alternativno, antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može da se odvoji od NGF sa koffkonstantom iskljčenja od oko 1 × 10<-3>s<-1>ili manje, kao što je određeno rezonancom površinskog plazmona, ili može inhibirati NGF sa IC50od oko 1 × 10<-8>M ili manje. Alternativno, antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može da se odvoji od NGF sa koffkonstantom isključenja od oko 1 × 10<-4>s<-1>ili manje, kao što je određeno rezonancom površinskog plazmona, ili može inhibirati aktivnost NGF sa IC50od oko 1 × 10<-9>M ili manje. Alternativno, antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može da se odvoji od NGF sa koffkonstantom isključenja od oko 1 × 10<-5>s<-1>ili manje, kao što je određeno rezonancom površinskog plazmona, ili može inhibirati aktivnost NGF sa IC50od oko 1 × 10<-10>M ili manje. Alternativno, antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može da se odvoji od NGF sa koffkonstantom isključenja od oko 1 × 10<-5>s<-1>ili manje, kao što je određeno rezonancom površinskog plazmona, ili može inhibirati aktivnost NGF sa IC50od oko 1 × 10<-11>M ili manje.
[0196] Vezujući protein kao što je ovde opisan može da veže NGF pasa, pri čemu antitelo ili njegov deo koji se vezuje za antigen može da se odvoji od NGF pasa sa koffkonstantom isključenja od oko 0.1s<-1>ili manje, kako je određeno rezonancom površinskog plazmona, ili može inhibirati aktivnost NGF pasa sa IC50od oko 1 × 10<-6>M ili manje. Alternativno, antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može da se odvoji od NGF pasa sa koffkonstantom isključenja od oko 1 × 10<-2>s<-1>ili manje, kako je određeno rezonancom površinskog plazmona, ili može inhibirati aktivnost NGF pasa sa IC50od oko 1 × 10<-7>M ili manje. Alternativno, antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može da se odvoji od NGF pasa sa koffkonstantom isključenja od oko 1 × 10<-3>s<-1>ili manje, kako je određeno rezonancom površinskog plazmona, ili može inhibirati NGF pasa sa IC50od oko 1 × 10<-8>M ili manje. Alternativno, antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može da se odvoji od NGF pasa sa koffkonstantom isključenja od oko 1 × 10<-4>s<-1>ili manje, kako je određeno rezonancom površinskog plazmona, ili može inhibirati aktivnost NGF pasa pomoću IC50od oko 1 × 10<-9>M ili manje. Alternativno, antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može da se odvoji od NGF pasa sa koffkonstantom isključenja od oko 1 × 10-<5>s<-1>ili manje, kako je određeno rezonancom površinskog plazmona, ili može inhibirati aktivnost NGF pasa pomoću IC50od oko 1 × 10<-10>M ili manje. Alternativno, antitelo, ili njegov deo koji se vezuje za antigen, može da se odvoji od NGF pasa sa koffkonstantom isključenja od oko 1 × 10<-5>s<-1>ili manje, kako je određeno rezonancom površinskog plazmona, ili može inhibirati aktivnost NGF pasa pomoću IC50od oko 1 × 10<-11>M ili manje.
[0197] Vezujući proteini prema pronalasku dalje obuhvataju vezujuće proteine spojene na imunoadhezionim molekulom, agensom za vizuelizaciju, terapeutskim agensom ili citotoksičnim agensom. Neograničavajući primeri pogodnih agenasa za snimanje uključuju enzim, fluorescentnu oznaku, luminiscentnu oznaku, bioluminiscentnu oznaku, magnetni obeleživač, biotin ili radioobeleživač uključujući, ali ne ograničavajući se na, 3H, 14C, 35S, 90I, 99Tc, 111In, 125I, 131, 177Lu, 166Ho i 153Sm. Terapeutski ili citotoksični agens može biti antimetabolit, alkilujući agens, antibiotik, faktor rasta, citokin, antiangiogeno sredstvo, antimitotičko sredstvo, antraciklin, toksin ili apoptotički agens. Ovde je takođe obezbeđen obeleženi vezujući protein pri čemu je antitelo ili deo antitela iz ovog otkrića derivatizovan ili vezan za drugi funkcionalni molekul (npr., drugi peptid ili protein). Na primer, obeleženi vezujući protein iz ovog otkrića može biti izveden funkcionalnim povezivanjem antitela ili dela antitela otkrivenog vezujućeg proteina (hemijskim spajanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili na neki drugi način) sa jednim ili više drugih molekularnih entiteta, kao što je drugi antitelo (npr. bispecifično antitelo ili diatelo), agens koji se može detektovati, citotoksični agens, farmaceutski agens i/ili protein ili peptid koji može da posreduje u vezi sa antitelom ili delom antitela sa drugim molekulom (kao što je region jezgra streptavidina ili polihistidinska oznaka).
[0198] Korisni agensi koji se mogu detektovati pomoću kojih antitelo ili deo antitela iz otkrića mogu biti derivatizovani, mogu uključivati fluorescentna jedinjenja. Primeri fluorescentnih detektabilnih agenasa uključuju, na primer, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, 5-dimetilamin-1-naftalensulfonil hlorid, fikoeritrin. Antitelo takođe može biti derivatizovano enzimima koji se mogu detektovati, kao što su alkalna fosfataza, peroksidaza rena, glukoza oksidaza. Kada se antitelo derivatizuje pomoću enzima koji se može detektovati, detektuje se dodavanjem dodatnih reagenasa koje enzim koristi da bi proizveo proizvod reakcije koji se može detektovati. Na primer, kada je prisutan agens peroksidaze rena koji se može detektovati, dodavanje vodonik peroksida i diaminobenzidina dovodi do obojenog reakcionog proizvoda, koji se može detektovati. Antitelo se takođe može derivatizovati biotinom i detektovati indirektnim merenjem vezivanja avidina ili streptavidina.
[0199] Ovde opisani vezujući proteini mogu biti u kristalizovanom obliku. Kristalizovani vezujući proteini u skladu sa ovim otkrićem mogu se proizvesti prema postupcima poznatim u tehnici, kao što je otkriveno na primer u WO 02072636. Poželjno, kristalizovani vezujući protein zadržava biološku aktivnost nakon kristalizacije. Vezujući proteini se stoga mogu obezbediti kao kristali celih anti-NGF antitela ili njihovi delovi ili fragmenti kao što je ovde otkriveno. Takvi kristali se mogu koristiti za pripremu formulacija i kompozicija koje sadrže anti NGF vezujuće proteine, uključujući dijagnostičke i terapeutske kompozicije. Primer takvog kristalizovanog vezujućeg proteina je kristalizovani vezujući protein bez nosača, sa kontrolisanim oslobađanjem. Primer kristalizovanog vezujućeg proteina pokazuje duži poluživot in vivo nego rastvorljivi pandan vezujućeg proteina.
[0200] Anti NGF vezujući proteini kao što je ovde opisano mogu biti glikozilovani. Glikozilacija može pokazati, na primer, uzorak glikozilacije goveda, kamila, pasa, miša, konja, mačaka ili ljudi. Glikozilovani vezujući proteini kao što je ovde opisano uključuju antitelo ili deo koji se vezuje za antigen spojen na jedan ili više ostataka ugljenih hidrata. Nascentna in vivo proizvodnja proteina može biti podvrgnuta daljoj obradi, poznatoj kao post-translaciona modifikacija. Ostaci šećera (glikozila) mogu se dodati enzimatski, proces poznat kao glikozilacija. Dobijeni proteini koji nose kovalentno povezane bočne lance oligosaharida poznati su kao glikozilovani proteini ili glikoproteini. Glikozilacija proteina zavisi od sekvence aminokiselina proteina od interesa, kao i od ćelije domaćina u kojoj je protein eksprimiran. Različiti organizmi mogu proizvoditi različite enzime glikozilacije (npr. glikoziltransferaze i glikozidaze) i imaju različite supstrate (nukleotidne šećere) na raspolaganju. Zbog takvih faktora, obrazac glikozilacije proteina i sastav glikozilnih ostataka, mogu se razlikovati u zavisnosti od sistema domaćina u kome je određeni protein eksprimiran. Glikozilni ostaci korisni u pronalasku mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, glukozu, galaktozu, manozu, fukozu, n-acetilglukozamin i sijalinsku kiselinu. Glikozilovani vezujući protein sadrži glikozilne ostatke tako da je obrazac glikozilacije humani, mišji, pseći, mačji, goveđi ili konjski.
[0201] Stručnjacima je poznato da različita glikozilacija proteina može rezultirati u različitim karakteristikama proteina. Na primer, efikasnost terapeutskog proteina proizvedenog u mikroorganizmu domaćinu, kao što je kvasac, i glikozilovanog korišćenjem endogenog puta domaćina, može biti smanjena u poređenju sa onom istog proteina eksprimiranog u ćeliji sisara, kao što je CHO ćelijska linija. Takvi glikoproteini takođe mogu biti imunogeni kod ljudi i pokazuju smanjeni poluživot in vivo posle administracije. Specifični receptori kod ljudi i drugih životinja mogu prepoznati specifične ostatke glikozila i promovisati brzo uklanjanje proteina iz krvotoka. Drugi štetni efekti mogu uključivati promene u pakovanju proteina, rastvorljivosti, osetljivosti na proteaze, promet, transport, razdvajanje, sekreciju, prepoznavanje od strane drugih proteina ili faktora, antigenost ili alergenost. Shodno tome, praktičar može da preferira terapeutski protein sa specifičnim sastavom i obrascem glikozilacije, kao što je glikozilaciona kompozicija i obrazac identičan, ili barem sličan, onom koji se proizvodi u ljudskim ćelijama ili u ćelijama specifičnim za određenu životinju subjekta.
[0202] Ekspresija glikozilovanih proteina različitih od onih u ćeliji domaćinu može se postići genetskom modifikacijom ćelije domaćina da bi se eksprimirali heterologni enzimi glikozilacije. Koristeći tehnike poznate u tehnici, praktičar može da generiše antitela ili njihove delove koji se vezuju za antigen koji pokazuju glikozilaciju humanog proteina. Na primer, sojevi kvasca su genetski modifikovani da eksprimiraju enzime glikozilacije koji se ne pojavljuju u prirodi tako da glikozilovani proteini (glikoproteini) proizvedeni u ovim sojevima kvasca pokazuju glikozilaciju proteina identičnu onoj u životinjskim ćelijama, posebno humanim ćelijama (U.S patentne prijave 20040018590 i 20020137134).
[0203] Dalje, stručnjaci iz ove oblasti će shvatiti da protein od interesa može biti eksprimiran korišćenjem biblioteke ćelija domaćina genetski konstruisanih da eksprimiraju različite enzime glikozilacije tako da ćelije domaćoni koje su članovi biblioteke proizvode protein od interesa sa varijantnim obrascima glikozilacije. Praktičar onda može da izabere i izoluje protein od interesa sa određenim novim obrascima glikozilacije. Protein koji ima posebno odabran novi obrazac glikozilacije pokazuje poboljšana ili izmenjena biološka svojstva.
Anti NGF himerna antitela
[0204] Himerno antitelo je molekul u kome su različiti delovi antitela izvedeni iz različitih životinjskih vrsta, kao što su antitela koja imaju varijabilni region izveden iz mišjeg monoklonskog antitela i konstantnog regiona imunoglobulina koji nije mišji. Mogu se koristiti postupci za proizvodnju himernih antitela su poznati u tehnici, vidi npr. Morison, Science, 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechnikues, 4: 214 (1986); Gillies et al., J Immunol. Postupci, 125: 191-202 (1989.).); U.S. Pat. Nos. 5,807,715; 4,816,567; i 4,816,397. Pored toga, razvijene su tehnike za proizvodnju "himernih antitela" (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci.81: 851-855 (1984.).); Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature, 314: 452-454 (1985.)) splajsovanjem gena iz molekula mišjeg antitela odgovarajuće antigenske specifičnosti zajedno sa genima iz molekula humanog antitela odgovarajuće biološke aktivnosti.
Anti NGF CDR graftovana antitela
[0205] CDR-graftovana antitela prema pronalasku mogu sadržati sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca iz antitela koji nije mišje, gde je jedan ili više CDR regiona VHi/ili VLzamenjen CDR sekvencama mišjih antitela prema pronalasku. Okvirna sekvenca iz bilo kog ne-mišjeg antitela može poslužiti kao šablon za CDR graftovanje. Međutim, zamena pravog lanca u takav okvir često dovodi do izvesnog gubitka afiniteta vezivanja za antigen. Što je neko nemišje antitelo više homologo sa originalnim mišjim antitelom, manja je verovatnoća da će kombinovanje mišjih CDR-ova sa ne-mišjim okvirom dovesti do izobličenja u CDR-ovima koji bi mogli smanjiti afinitet.
[0206] Nemišji varijabilni okvir koji je izabran da zameni mišji varijabilni okvir osim CDR-a može imati najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% identičnosti sekvence sa mišjim okvirom varijabilnog regiona antitela. Nemišji varijabilni okvir, osim CDR-ova, koji je izabran da zameni mišji varijabilni okvir, osim CDR-a, može biti varijabilni okvir goveda, kamila, pasa, konja, mačaka ili ljudi. Na primer, ne-mišji varijabilni okvir koji je izabran da zameni mišji varijabilni okvir, osim CDR-a, je varijabilni okvir pasa i ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnost sekvence sa okvirom varijabilnog regiona mišjeg antitela.
[0207] Postupci za proizvodnju CDR-graftovanih antitela su poznate u tehnici (videti EP 239,400; PCT publication WO 91/09967; U.S. Pat. Nos.5,225,539; 5,530.101; i 5,585,089), i uključuju fasetiranje ili obnavljanje površine (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498 (1991.)); Studnička et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994.)); Roguška et al., PNAS, 91:969-973 (1994)), i mešanje lanca (U.S. Pat. No.
5,565,352).
Anti NGF humanizovana antitela
[0208] Proces modifikacije monoklonskog antitela od životinje da bi se ono učinilo manje imunogenim za terapeutsku primenu kod ljudi (humanizacija) je agresivno praćen i opisan je u brojnim publikacijama (Antibody Engineering: A practical Guide. Carl A.K. Borrebaeck ed. V.H. Freeman and Company, 1992; i prethodno citirane reference). Humanizovana antitela su molekuli antitela iz antitela ne-humane vrste koja vezuju željeni antigen koji ima jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) iz ne-humanih vrsta i okvirnih regiona iz molekula humanog imunoglobulina. Poznate humane Ig sekvence su otkrivene na različitim veb lokacijama koje su dostupne na Internetu (kao što je NCBI veb lokacija, Antibody Resource, i poznate stručnjacima u ovoj oblasti kao i Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983.). Dodatne sekvence su prikazane u tabeli 1A u nastavku. Takve importovane sekvence mogu se koristiti za smanjenje imunogenosti ili smanjenje, poboljšanje ili modifikovanje vezivanja, afiniteta, stope uključenja, stope isključenja, avidnosti, specifičnosti, poluživota ili bilo koje druge pogodne karakteristike antitela, kao što je poznato u tehnici.
Tabela 1A: CDR-ovi mišjih anti-NGF mAb graftovanih na humani Ig okvir (CDR-graftovana anti-NGF abs (ova tabela 1A je identična tabeli 15 u primerima)
1
2
[0209] Ostaci okvira u humanim okvirnim regionima mogu biti zamenjeni odgovarajućim ostatkom iz CDR donora antitela da bi se promenilo ili poboljšalo vezivanje antigena. Ove supstitucije okvira se identifikuju postupcima dobro poznatim u tehnici, na primer, modeliranjem interakcija CDR i ostataka okvira da bi se identifikovali ostaci okvira važni za vezivanje antigena i poređenje sekvenci da bi se identifikovali neuobičajeni ostaci okvira na određenim pozicijama. (Videti, npr. Queen et al., U.S. Pat. No.5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988).) Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su uobičajeno dostupni i poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacione strukture odabranih kandidatskih sekvenci imunoglobulina. Inspekcija ovih prikaza dozvoljava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju sekvence kandidata imunoglobulina, tj. analizu ostataka koji utiču na sposobnost imunoglobulina kandidata da veže svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci se mogu odabrati i kombinovati iz konsenzusnih i importovanih sekvenci tako da se postigne željena karakteristika antitela, kao što je povećan afinitet za ciljni antigen(e). Generalno, CDR ostaci su direktno i najbitnije uključeni u uticaj na vezivanje antigena. Antitela se mogu humanizovati korišćenjem različitih tehnika poznatih u tehnici, kao što su, ali bez ograničenja na, one opisane u Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeien et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993.).); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.
196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Miolecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991.)); Studnička et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994.); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994); PCT objava WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, U.S. Pat. Nos. 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530.101, 5,585,089, 5,225,539; i 4,816,567.
Anti NGF kaninizovana antitela
[0210] U US 7,261,890 B22007 opisan je postupak modifikacije monoklonskog antitela iz životinje da bi se učinilo manje imunogenim za terapeutsku primenu na pse (kaninizacija). Aminokiselinska sekvenca psećeg IgG1 je data u GenBank-u (AF354264). Određivanje aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona i psećeg IgM i psećeg IgA teškog lanca (Vasserman et al., Biochem., 16, 3160 (1977), određivanje aminokiselinske sekvence κ lakog lanca iz psećeg IgA (Vasserman et al., Immunochem., 15, 303 (1978.)), otkrivena je kompletna aminokiselinska sekvenca psećeg µ lanca (McCumber et al., Mol. Immunol., 16, 565 (1979).)), otkrivena je jedna cDNK IgG-Aγ lanca pasa i četiri proteinske sekvence psećeg IgG-Aγ lanca (Tang et al., Vet. Immunology Immunopathology, 80, 259 (2001)). Opisuje PCR amplifikaciju cDNK biblioteke pasje slezine sa degenerisanim oligonukleotidnim prajmerom dizajniranim iz očuvanih regiona humanih, mišjih, svinjskih i goveđih IgG. Varijabilni domeni psećeg imunoglobulina, kaninizovana antitela i postupci za njihovu proizvodnju i upotrebu su otkriveni u US patentnoj prijavi br. 2004/0181039 i US
4
Patent Nos.7,261,890; 6,504,013; 5,852,183; 5,5225,539.
[0211] Tabela 2 u nastavku je lista aminokiselinskih sekvenci VH i VL regiona odabranih kaninizovanih anti-NGF antitela prema pronalasku.
Tabela 2
C. Upotreba anti-NGF antitela
[0212] Vezujući protein kao što je ovde opisano mogu da se koriste u postupku za detekciju prisustva NGF u uzorku in vivo ili in vitro (npr. u biološkom uzorku, kao što je serum, plazma, tkivo, biopsija). in vitro postupak se može koristiti na primer za dijagnozu bolesti ili poremećaja, npr. poremećaja povezanog sa NGF. Postupak uključuje (i) dovođenje u kontakt uzorka ili kontrolnog uzorka sa anti-NGF antitelom ili njegovim fragmentom kao što je ovde opisano; i (ii) otkriće formiranja kompleksa između anti-NGF antitela ili njegovog fragmenta i uzorka ili kontrolnog uzorka, pri čemu statistički značajna promena u formiranju kompleksa u uzorku u odnosu na kontrolni uzorak ukazuje na prisustvo NGF u uzorku.
[0213] Vezujući proteini kao što je ovde opisano mogu da se koriste u postupku za detekciju prisustva NGF in vivo (na primer., in vivo vizuelizacija kod subjekta). Postupak se može koristiti za dijagnozu poremećaja, na primer, poremećaja povezanog sa NGF. Postupak uključuje: (i) davanje anti-NGF antitela ili njegovog fragmenta kao što je ovde opisano subjektu ili kontrolnom subjektu pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje antitela ili fragmenta za NGF; i (ii) otkriće formiranja kompleksa između antitela ili fragmenta i NGF, pri čemu statistički značajna promena u formiranju kompleksa kod subjekta u odnosu na kontrolnog subjekta ukazuje na prisustvo NGF.
[0214] S obzirom na sposobnost vezivanja za NGF, anti-NGF antitela, ili njihovi delovi, ili njihove kombinacije, kao što je ovde opisano, mogu se koristiti kao imunoreagens(i) za detekciju NGF (na primer., u biološkom uzorku, kao što je serum ili plazma), u konvencionalnom imunoeseju, kao što je enzimska imuno analiza (ELISA), radioimuno test (RIA) ili imunohistohemija tkiva. Postupak za detekciju NGF-a u biološkom uzorku uključuje dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa antitelom ili delom antitela iz ovog otkrića i otkriće bilo antitela (ili dela antitela) vezanog za NGF ili nevezanog antitela (ili dela antitela), da bi se na taj način otkrilo NGF u biološkom uzorku. Vezujući protein može biti direktno ili indirektno obeležen detektabilnom supstancom da bi se olakšalo otkriće vezanog ili nevezanog antitela. Pogodne supstance koje se mogu detektovati uključuju različite enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminiscentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, βgalaktozidazu ili acetilholinesterazu; primeri pogodnih kompleksa prostetičke grupe uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbelliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid ili fikoeritrin; primer luminiscentnog materijala uključuje luminol; a primeri pogodnog radioaktivnog materijala uključuju<3>H,<14>C,<35>S,<90>I,<99>Tc,<111>u,<125>1,<131>1,<177>Lu,<166>Ho, ili<153>Sm.
[0215] NGF se alternativno može analizirati u biološkim tečnostima kompetitivnim imunološkim testom koji koristi rekombinantne NGF standarde obeležene detektabilnom supstancom i neobeleženim anti-NGF antitelom. U ovom testu, biološki uzorak, obeleženi rekombinantni NGF standardi i anti-NGF antitelo se kombinuju i određuje se količina obeleženog rNGF standarda vezanog za neobeleženo antitelo. Količina NGF-a u biološkom uzorku je obrnuto proporcionalna količini obeleženog rNGF standarda vezanog za anti-NGF antitelo. Slično, NGF se takođe može analizirati u biološkim tečnostima kompetitivnim imunološkim testom koji koristi rNGF standarde obeležene detektabilnom supstancom i neobeleženim anti-NGF antitelom.
[0216] Otkriće stoga takođe razmatra reagense, uređaje i komplete za imunološki test koji uključuju jedan ili više od sada otkrivenih vezujućih proteina za detekciju prisustva ili količine NGF u uzorku. Predviđeno je, na primer, da imunoreagens koji sadrži jedan ili više od sada otkrivenih vezujućih proteina može biti obezbeđen u obliku kompleta sa jednim ili više kontejnera kao što su bočice ili boce, pri čemu svaki kontejner sadrži poseban reagens kao što je anti- NGF vezujući protein, ili koktel anti-NGF vezujućih proteina, reagensi za detekciju i reagensi za ispiranjekoji se koriste u testu. Imunoreagens(i) mogu biti povoljno obezbeđeni u uređaju u kome su imunoreagensi imobilisani na čvrstoj podlozi, kao što su, ali ne ograničavajući se na, kivete, epruvete, mikrotitarske ploče ili udubljenja, trake, čipove ili perle. Komplet može da sadrži najmanje jedan kontejner za sprovođenje testa, i/ili pufer, kao što je pufer za analizu ili pufer za ispiranje, od kojih bilo koji od njih može biti obezbeđen kao koncentrovani rastvor, rastvor supstrata za oznaku koja se može detektovati (npr., enzimska oznaka) ili stop rastvor. Poželjno, komplet sadrži sve komponente, tj. reagense, standarde, pufere, razblaživače, itd., koji su neophodni za izvođenje testa. Komplet može sadržati uputstva za određivanje prisustva ili količine NGF-a u uzorku na osnovu specifičnog vezivanja imunoreagensa za NGF, u papirnom obliku ili kompjuterski čitljivom obliku, kao što je disk, CD, DVD i/ili može biti dostupan na mreži.
[0217] Vezujući proteini u kompletu mogu biti obeleženi detektabilnom oznakom kao što je ona koja je perthodno opisana, uključujući fluorofor, radioaktivni deo, enzim, biotin/avidin oznaku, hromofor, hemiluminiscentnu oznaku ili slično; ili komplet može uključivati reagense za sprovođenje detektabilnog obeležavanja. Antitela, kalibratori i/ili kontrole mogu da se obezbede u odvojenim kontejnerima ili unapred raspoređeni u odgovarajući format za analizu, na primer, u mikrotitarske ploče.
[0218] Izborno, komplet uključuje komponente za kontrolu kvaliteta (na primer, panele osetljivosti, kalibratori i pozitivne kontrole). Priprema reagenasa za kontrolu kvaliteta je dobro poznata u tehnici i opisana je na umetnutim listovima za različite imunodijagnostičke proizvode. Članovi panela osetljivosti se opciono koriste za uspostavljanje karakteristika performansi testa, i dalje izborno su korisni pokazatelji integriteta reagensa kompleta za imuno analizu i standardizacije testova.
[0219] Komplet takođe može izborno da sadrži druge reagense potrebne za sprovođenje dijagnostičke analize ili olakšavanje evaluacije kontrole kvaliteta, kao što su puferi, soli, enzimi, kofaktori enzima, supstrati enzima, reagensi za detekciju. Druge komponente, kao što su puferi i rastvori za izolaciju i/ili tretman uzorka za testiranje (npr. reagensi za prethodnu obradu), takođe mogu biti uključeni u komplet. Komplet može dodatno uključiti jednu ili više drugih kontrola. Jedna ili više komponenti kompleta mogu biti liofilizovane, u kom slučaju komplet može dalje da sadrži reagense pogodne za rekonstituciju liofilizovanih komponenti.
[0220] Različite komponente kompleta su izborno obezbeđene u odgovarajućim kontejnerima po potrebi, na primer, mikrotitarska ploča. Komplet može dalje da sadrži kontejnere za držanje ili čuvanje uzorka (npr. kontejner ili kertridž za uzorak urina). Tamo gde je prikladno, komplet izborno takođe može da sadrži reakcione sudove, posude za mešanje i druge komponente koje olakšavaju pripremu reagensa ili uzorka za ispitivanje. Komplet takođe može da sadrži jedan ili više instrumenata za pomoć pri dobijanju uzorka za testiranje, kao što su špric, pipeta, pinceta, merena kašika ili slično. Uputstva:
Biće cenjeno da su antitela i delovi antitela u ovom pronalasku sposobni da suštinski neutrališu aktivnost NGF-a. in vitro i in vivo. Shodno tome, takva antitela i delovi antitela iz otkrića se takođe mogu koristiti za suštinsku inhibiciju aktivnosti NGF, npr., u ćelijskoj kulturi koja sadrži NGF, kod subjekata sisara koji imaju NGF sa kojim antitelo iz otkrića unakrsno reaguje. Otkriće stoga obezbeđuje postupak za inhibiciju aktivnosti NGF koji obuhvata dovođenje u kontakt NGF sa antitelom ili delom antitela u pronalasku tako da je aktivnost NGF suštinski inhibirana. Na primer, u ćelijskoj kulturi koja sadrži, ili se sumnja da sadrži NGF, antitelo ili deo antitela iz otkrića se može dodati u medijum kulture da bi se inhibirala aktivnost NGF u kulturi.
[0221] Shodno tome, otkriće takođe obezbeđuje postupak za inhibiciju NGF aktivnosti koja obuhvata dovođenje u kontakt NGF sa vezujućim proteinom tako da je aktivnost NGF suštinski inhibirana. U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje postupak za inhibiciju aktivnosti NGF kod subjekta koji pati od poremećaja u kome je aktivnost NGF štetna, koji obuhvata davanje subjektu vezujućeg proteina koji je gore otkriven tako da je aktivnost NGF kod subjekta u suštini inhibirana i lečenje je postignuto.
[0222] Otkriće takođe obezbeđuje postupak za smanjenje aktivnosti NGF kod subjekta, kao što je subjekt koji pati od bolesti ili poremećaja kod kojih je aktivnost NGF štetna. Otkriće obezbeđuje postupke za smanjenje aktivnosti NGF kod subjekta koji pati od takve bolesti ili poremećaja, pri čemu postupak obuhvata davanje subjektu antitela ili dela antitela iz otkrića tako da je aktivnost NGF kod subjekta smanjena. Subjekt može biti sisar koji eksprimira NGF za koji je antitelo prema pronalasku sposobno da se veže. Dalje, subjekt može biti sisar u koji je NGF uveden (npr. davanjem NGF-a ili ekspresijom NGF transgena). Antitelo prema ovom pronalasku može se davati subjektu kome je to potrebno u terapeutske svrhe.
[0223] Antitelo prema pronalasku se može primeniti u veterinarske svrhe ne-humanom sisaru koji eksprimira NGF sa kojim je antitelo sposobno da se veže. Na primer, antitelo prema pronalasku se može primeniti u veterinarske svrhe ne-humanim sisarima kao što su pas, konj, mačka ili stoka (goveda i mlečna goveda, svinje, ovce, koze, živina, itd.) koje izražavaju NGF za koji je antitelo sposobno da se veže.
[0224] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak lečenja (npr. izlečenje, suzbijanje, poboljšanje, odlaganje ili sprečavanje ili smanjenje rizika od početka, ponovnog pojavljivanja ili relapsa) ili prevencije poremećaja povezanog sa NGF kod subjekta. Postupak uključuje: davanje subjektu otkrivenog proteina koji vezuje NGF (posebno antagonista), npr., anti-NGF antitela ili njegovog fragmenta kako je ovde opisano, u količini dovoljnoj za lečenje ili prevenciju poremećaja povezanog sa NGF. NGF antagonist, npr., anti-NGF antitelo ili njegov fragment, može se davati subjektu, sam ili u kombinaciji sa drugim terapijskim modalitetima kao što je ovde opisano.
[0225] Antitelo prema pronalasku se može primeniti na sisara koji nije čovek koji eksprimira NGF sa kojim je antitelo sposobno da se veže kao životinjski model ljudske bolesti. Takvi životinjski modeli mogu biti korisni za procenu terapeutske efikasnosti antitela iz otkrića (na primer., ispitivanje doza i vremenskih tokova primene).
[0226] U drugom aspektu, antitela i vezujući proteini prema pronalasku su korisni za lečenje bolesti i poremećaja povezanih sa NGF, uključujući ili koji uključuju akutni ili hronični bol. Neograničavajući primeri bolesti i poremećaja povezanih sa NGF uključuju opštu upalu, hirurški i post-hirurški bol uključujući bol od amputacije, bol u zubu, bol od traume, bol od preloma, bol od apscesa, neuropatski bol, hiperalgeziju i alodiniju, neuropatski bol, postherpetična neuralgija, dijabetes uključujući, ali ne ograničavajući se na, bol dijabetičke neuropatije, moždani udar, sindrom talamusnog bola, giht bol u zglobovima, osteoartritis ili bol reumatoidnog artritisa, reumatske bolesti, lupus, psorijazu, išijas, bol povezan sa mišićnoskeletnim bolestima uključujući, ali nije ograničeno na, hronični bol u donjem delu leđa, fibromialgija, uganuća, bolovi povezani sa krizama srpastih ćelija, opšta glavobolja, migrena, klaster glavobolja, tenziona glavobolja, trigeminalna neuralgija, dismenoreja, endometrioza, ciste jajnika, visceralni bol, prostatitis, interstitis, eritromelalgija ili bol izazvan pankreatitisom ili kamenom u bubregu, opšti gastrointestinalni poremećaji uključujući, ali ne ograničavajući se na to, kolitis, čir na želucu i dvanaestopalačnom crevu, gastroezofagealni refluks, dispepsija, inflamatorni poremećaji creva, sindrom iritabilnog creva, inflamatorni poremećaji bešike, incizioni bol, bol od opekotina i/ili rana, ankilozni spondilitis, ali ne i kancer, ograničeno na bol od metastaza u kostima i bol od lečenja karcinoma i bol od HIV-a ili AIDS-a. Drugi primeri bolesti i stanja povezanih sa NGF uključuju maligni melanom, Sjogren-ov sindrom, rinitis, bronhijalne poremećaje i astmu, kao što je nekontrolisana astma sa teškom hiperreaktivnošću disajnih puteva, kašalj koji se ne može izlečiti; i bol od kožnih bolesti ili poremećaja sa inflamatornom komponentom kao što su, ali bez ograničenja, opekotine od sunca, alergijske kožne reakcije, dermatitis, svrab i vitiligo.
[0227] Otkriće takođe obezbeđuje postupak lečenja subjekta koji pati od poremećaja u kome je NGF štetan, koji obuhvata primenu vezujućeg proteina pre, istovremeno ili posle primene drugog agensa. U drugom aspektu, dodatni terapeutski agens koji se može davati zajedno i/ili koformulisati sa jednim ili više antagonista NGF, (npr. anti-NGF antitela ili njihovih fragmenata), uključuje, ali nije ograničeno na, TNF antagoniste; rastvorljivi fragment TNF receptora; ENBREL<®>; antagonisti TNF enzima; inhibitori TNF konvertujućeg enzima (TACE); antagonisti muskarinskih receptora; TGF-beta antagonisti; interferon gama; perfenidon; hemoterapeutski agensi, metotreksat; leflunomid; sirolimus (rapamicin) ili njegov analog, CCI-779; inhibitori COKS2 ili cPLA2; NSAIDs; imunomodulatori; inhibitori p38; inhibitori TPL-2, MK-2 i NFκB; budenozid; epidermalni faktor rasta; kortikosteroidi; ciklosporin; sulfasalazin; aminosalicilati; 6-merkaptopurin; azatioprin; metronidazol; inhibitori lipoksigenaze; mesalamin; olsalazin; balsalazid; antioksidansi; inhibitori tromboksana; anti-IL-6 antitela; faktori rasta; inhibitori elastaze; jedinjenja piridinilimidazola; antitela ili agonisti TNF, CGRP, supstance P, bradikinina, MMP-2, MMP-9, MMP-13, LT, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL -19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, EMAP-II, GM-CSF, FGF ili PDGF; antitela CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 ili njihovih liganda; FK506; rapamicin; mikofenolat mofetil; ibuprofen; prednizolon; inhibitori fosfodiesteraze; agonisti adensozina; antitrombotička sredstva; inhibitori komplementa; adrenergički agensi; inhibitori IRAK, NIK, IKK, p38 ili MAP kinaze; inhibitori enzima konvertovanja IL-1β; inhibitori TNFα konvertujućeg enzima; inhibitori signalizacije T-ćelija; inhibitori metaloproteinaze; 6-merkaptopurini; inhibitori enzima koji konvertuje angiotenzin; rastvorljivi citokinski receptori; rastvorljivi p55 TNF receptor; rastvorljivi p75 TNF receptor; sIL-1RI; sIL-1RII; sIL-6R; antiinflamatorni citokini; IL-4; IL-10; IL-11; i TGFβ.
D. Farmaceutske kompozicije
[0228] Antitela i delovi antitela prema pronalasku mogu biti ugrađeni u farmaceutske
1
kompozicije pogodne za davanje subjektu. Tipično, farmaceutska kompozicija sadrži najmanje jedno antitelo ili deo antitela prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač. Takve kompozicije se mogu koristiti na primer u postupku za lečenje sisara od bolesti ili poremećaja koji uključuju povećane nivoe NGF davanjem efikasne količine kompozicije sisaru. Farmaceutski sastav može uključiti terapeutski efikasnu količinu antitela ili dela antitela. Farmaceutske kompozicije kao što su ovde opisane mogu se koristiti za dijagnostikovanje, otkriće ili praćenje poremećaja ili jednog ili više njegovih simptoma; sprečavanje, lečenje, upravljanje ili ublažavanje poremećaja ili jednog ili više njegovih simptoma; i/ili istraživanja. Kako se ovde koristi, fraza "povećani nivoi NGF" se odnosi na nivo NGF kod subjekta, kao što je sisar, koji je veći ili viši od utvrđenog ili unapred određenog osnovnog nivoa NGF, kao što je, na primer, nivo prethodno utvrđen za navedenog subjekta ili prosečna vrednost za grupu subjekata.
[0229] Farmaceutska kompozicija može da sadrži, na primer, vezujući protein i farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijent ili razblaživač. Na primer, farmaceutske kompozicije mogu da sadrže terapeutski efikasnu količinu jednog ili više vezujućih proteina kako je ovde otkriveno, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, nosačem, solubilizatorom, emulgatorom, konzervansom i/ili adjuvansom. Farmaceutska kompozicija može da sadrži jedan ili više različitih formulacionih materijala za modifikaciju, održavanje ili očuvanje kompozicije ili svojstava kompozicije, na primer, boju, konzistenciju, izotoničnost, miris, osmolarnost, pH, sterilnost, stabilnost, viskoznost i druga svojstva kompozicija. Takvi materijali za formulaciju su generalno dobro poznati i mnogi pogodni materijali za formulaciju su opisani na primer u REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Ed. (A. R. Gennaro, ed.) 1990, Mack Publishing Company. Neograničavajući primeri pogodnih materijala za formulaciju uključuju aminokiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin); antimikrobna sredstva; antioksidanse (kao što su askorbinska kiselina, natrijum-sulfit ili natrijum-hidrogen-sulfit); pufere (kao što su borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline); sredstva za povećanje zapremine (kao što su manitol ili glicin); helatne agense (kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)); agense za stvaranje kompleksa (kao što su kofein, polivinilpirolidon, betaciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin); punila; monosaharide; disaharide; i druge ugljene hidrate (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini); proteine (kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini); sredstva za bojenje, arome i razblaživanje; emulgatore; hidrofilne polimere (kao što je polivinilpirolidon); polipeptide male molekulske težine; protivjone koji stvaraju soli (kao što je natrijum); konzervanse (kao što su benzalkonijum
2
hlorid, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid); rastvarače (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); šećerne alkohole (kao što su manitol ili sorbitol); sredstva za suspendovanje; surfaktante ili sredstva za vlaženje (kao što su pluronic, PEG, sorbitan estri, polisorbati kao što je polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); sredstva za poboljšanje stabilnosti (kao što su saharoza ili sorbitol); sredstva za poboljšanje toničnosti (kao što su halogenidi alkalnih metala, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol sorbitol); vehikulume za dopremu; razblaživače; ekscipijente i/ili farmaceutske adjuvanse. Pored toga, farmaceutska kompozicija takođe može da sadrži jedan ili više konzervansa. Primeri pogodnih konzervansa koji se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničeni na, metilparaben, propilparaben, benzil alkohol, hlorobutanol i benzalkonijum hlorid. Optimalne farmaceutske formulacije može lako odrediti stručnjak u ovoj oblasti u zavisnosti od, na primer, nameravanog puta administracije, formata isporuke i željene doze.
[0230] Farmaceutska kompozicija može da sadrži najmanje jedan dodatni terapeutski agens za lečenje poremećaja kod kojih je aktivnost NGF štetna. Dodatni agens može biti, na primer, terapeutsko sredstvo, agens za vizuelizaciju, citotoksični agens, inhibitori angiogeneze, inhibitori kinaze, blokatori kostimulacionih molekula, blokatori molekula adhezije, anticitokinsko antitelo ili njegov funkcionalni fragment, metotreksat, ciklosporin, rapamicin, FK506, detektabilna oznaka ili reporter, TNF antagonist, antireumatik, mišićni relaksant, narkotik, nesteroidni antiinflamatorni lek (NSAID), analgetik, anestetik, sedativ, lokalni anestetik, neuromišićni blokator, antimikrobni, antipsorijatični, kortikosteroidni steroid,, eritropoetin, imunoglobulin, imunosupresiv, hormon rasta, lek za zamenu hormona, radiofarmaceutik, antidepresiv, antipsihotik, stimulans, lek za astmu, beta agonist, inhalacioni steroid, oralni steroid, epinefrin ili analog, citokin ili antagonist citokina.
[0231] Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može imati pH veći od oko 7,0 ili između oko 7,0 i oko 8,0. Alternativno, farmaceutska kompozicija može imati pH između oko 7,2 do oko 7,8. Alternativno, pH farmaceutske kompozicije može biti između oko 7,4 do oko 7,6. Alternativno, pH farmaceutske kompozicije može biti oko 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 ili 8,0. Što se tiče farmaceutskih kompozicija prema ovom pronalasku, postoji povećanje degradacije, povećanje fragmentacije ili povećanje degradacije i povećanje fragmentacije pri pH od 6,0 ili manje. Ovaj nalaz je bio iznenađujući jer mnoge farmaceutske kompozicije koje sadrže humanizovana antitela pokazuju povećanje degradacije, povećanje fragmentacije ili povećanje degradacije i povećanje fragmentacije pri pH nižem od 5,0 i ponovo pri pH većem od oko 6,0. Shodno tome, većina farmaceutskih kompozicija koje sadrže humanizovana antitela su stabilne na pH između oko 5,0 do oko 6,0.
[0232] Kompozicija za oslobađanje vezujućeg proteina može da sadrži, na primer, formulaciju koja uključuje količinu kristalizovanog vezujućeg proteina, kristalizovanog konstrukta antitela ili kristalizovanog konjugata antitela kao što je prethodno otkriveno. Kompozicija može dalje da sadrži dodatni sastojak, kao što je nosač, ekscipijent ili razblaživač, i najmanje jedan polimerni nosač. Polimerni nosač može da sadrži jedan ili više polimera izabranih od sledećeg: poli (akrilna kiselina), poli (cijanoakrilati), poli (amino kiseline), poli (anhidridi), poli (depsipeptid), poli (estri), poli (mlečna kiselina). ), poli (mlečna-ko-glikolna kiselina) ili PLGA, poli (b-hidroksibutriat), poli (kaprolakton), poli (dioksanon); poli (etilen glikol), poli ((hidroksipropil) metakrilamid, poli [(organo) fosfazen], poli (orto estri), poli (vinil alkohol), poli (vinilpirolidon), anhidrid maleinske kiseline- alkil vinil etar kopolimeri, pluronski polioli, alginat, celuloza i derivati celuloze, kolagen, fibrin, želatin, hijaluronska kiselina, oligosaharidi, glikaminoglikani, sulfatisani polieaharidi, njihove mešavine i kopolimeri Dodatni sastojak može biti, na primer, albumin, saharoza, saharoza, trilaksilaks β-ciklodekstrin, metoksipolietilen glikol i polietilen glikol.
[0233] Polimerni nosač može biti sposoban da utiče na oslobađanje vezujućeg proteina iz kompozicije kao što je dalje opisano u nastavku. Polimerni materijali se mogu koristiti u formulaciji farmaceutskih kompozicija koje sadrže otkrivene vezujuće proteine da bi se postiglo kontrolisano ili produženo oslobađanje otkrivenih vezujućih proteina (Medicinske primene kontrolisanog otpuštanja, Langer and Vise (ur.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974.); Kontrolisana biodostupnost leka, dizajn i učinak leka, Smolen and Ball (ed.), Vilei, Njujork (1984.); Rangeret al., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983).); Levi et al., Science, 228: 190 (1985); Tokom et al., Ann. Neurol., 25: 351 (1989).); Hovard et al., J. Neurosurg., 7 1:105 (1989); U.S. Pat. Nos. 5,679,377; 5, 916,597; 5,912,015; 5,989,463; 5,128,326; PCT objave br. WO 99/15154; i WO 99/20253). Primeri polimera koji se koriste u formulacijama sa produženim oslobađanjem uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(2-hidroksi etil metakrilat), poli(metil metakrilat), poli(akrilnu kiselinu), poli(etilen-ko-vinil acetat), poli(metakrilat) kiselina), poliglikolidi (PLG), polianhidridi, poli(N-vinil pirolidon), poli(vinil alkohol), poliakrilamid, poli(etilen glikol), polilaktidi (PLA), poli(laktid-koglikolidi) (PLGA) i poliortoesteri. Polimer koji se koristi u formulaciji sa produženim oslobađanjem može biti inertan, bez nečistoća koje se mogu izlužiti, stabilan pri skladištenju, sterilan i biorazgradiv. Sistem sa kontrolisanim ili produženim oslobađanjem može biti postavljen u blizini profilaktičke ili terapijske mete, tako da zahteva samo delić sistemske doze (videti, na primer, Goodson, u Medicinskim aplikacijama kontrolisanog oslobađanja,
4
supra, tom 2, str.115 -138 (1984)).
[0234] Sistemi kontrolisanog oslobađanja su razmatrani u pregledu od strane Langer (Science, 249:1527-1533 (1990)). Bilo koja tehnika poznata stručnjaku može se koristiti za proizvodnju formulacija sa produženim oslobađanjem koje sadrže jedan ili više terapeutskih agenasa prema pronalasku (U. S. Pat. No. 4,526, 938; PCT objave br. WO 91/05548 i WO 96/20698; Ning et al., Radiotherapy & Oncology, 39: 179-189 (1996.), Song et al., PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology, 50: 372-397 (1995.); Cleek et al., Pro. Int'l. Simp. Control. Rel. Bioact. Mater., 24: 853-854 (1997.).); i Lam et al., Proc. Int'l. Simp. Control Rel. Bioact. Mater., 24: 759-760 (1997.).)).
[0235] Vezujući proteini prema ovom pronalasku mogu se davati različitim postupcima poznatim u tehnici. Na primer, vezujući proteini prema ovom pronalasku mogu se davati subkutanom injekcijom, intravenskom injekcijom ili infuzijom. Administracija može biti sistemska ili lokalna. Kao što će iskusni stručnjak shvatiti, put i/ili način primene mogu da variraju u zavisnosti od željenih rezultata. Aktivno jedinjenje se može pripremiti sa nosačem koji će zaštititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i mikrokapsulirane sisteme za oslobađanje. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Stručnjacima su poznati mnogi postupci za pripremu takvih formulacija. Videti, na primer., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978
[0236] Na primer, takve farmaceutske kompozicije mogu da se daju subjektu parenteralno, intradermalno, subkutano, intramuskularno, intravenski, intraartikularno, intrabronhijalno, intraabdominalno, intrakapsularno, intrakartilaginalno, intrakavitarno, intracelijakalno, intracerebelarno, intracerebroventrikularno, intrakolikalno, intracervikalno, intragastrično, intrahepatično, intramiokardijalno, intraostealno, intrapelvično, intraperikardijalno, intraperitonealno, intrapleuralno, intraprostatično, intrapulmonalno, intrarektalno, intrarenalno, intraretinalno, intraspinalno, intrasinovijalno, intratorakalno, intrauterino, intravezikalno, bolus, vaginalno, rektalno, bukalno, sublingvalno, intranazalno ili transdermalno. Postupci primene profilaktičkog ili terapeutskog agensa prema pronalasku takođe uključuju, ali nisu ograničeni na, epiduralnu primenu, intratumoralnu primenu i mukoznu primenu (npr. intranazalni i oralni putevi). Pored toga, plućna primena se može ostvariti, na primer, upotrebom inhalatora ili nebulizatora, i formulacijom sa agensom za aerosolizaciju (U.S. Pat. br. 6, 019,968; 5,985, 320; 5,985,309; 5,934, 272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290, 540; i 4,880,078; i PCT objave br. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, i WO 99/66903). Ovde opisana antitela i delovi antitela mogu se davati na primer korišćenjem Alkermes AIR<®>tehnologije za isporuku lekova u pluća (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). Profilaktički ili terapeutski agensi se mogu primeniti na bilo koji pogodan način i mogu se davati zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima.
[0237] Poznati su različiti sistemi isporuke i mogu se koristiti za davanje jednog ili više otkrivenih vezujućih proteina ili kombinacije jednog ili više otkrivenih vezujućih proteina i profilaktičkog agensa ili terapeutskog agensa korisnog za prevenciju, upravljanje, lečenje ili ublažavanje poremećaja ili jednog ili više njegovih simptoma, npr. inkapsulacija u lipozome, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne da eksprimiraju antitelo ili fragment antitela, endocitoza posredovana receptorima (videti, npr. Vu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987)), konstrukcija nukleinske kiseline kao dela retrovirusnog ili drugog vektora, itd. Može biti poželjno da se otkriveni vezujući proteini daju lokalno na oblast kojoj je potreban tretman, što se može postići npr. bez ograničavanja, lokalnom infuzijom, injekcijom ili pomoću implantata, navedeni implantat je od poroznog ili neporoznog materijala, uključujući membrane i matrikse, kao što su sijlastične membrane, polimeri, vlaknasti matriks (npr. Tissuel<®>), ili kolageni matriksi. Efikasna količina jednog ili više otkrivenih vezujućih proteina može se primeniti lokalno na zahvaćeno područje subjektu da bi se sprečio, lečio, upravljao i/ili ublažio poremećaj ili njegov simptom. Alternativno, na subjekta se može primeniti efikasna količina jednog ili više otkrivenih vezujućih proteina primenjenih lokalno na zahvaćeno područje u kombinaciji sa efikasnom količinom jedne ili više terapija (npr. jednog ili više profilaktičkih ili terapeutskih agenasa) različitih od otkrivenih vezujućih proteina za sprečavanje, lečenje, upravljanje i/ili ublaživanje poremećaja ili jednog ili više simptoma.
[0238] Otkriveni vezujući proteini mogu biti isporučeni u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem ili produženim oslobađanjem kao što je, na primer, uređaj za infuzionu pumpu koji može da funkcioniše da postigne kontrolisano ili produženo oslobađanje otkrivenih vezujućih proteina (videti Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:20 (1987); Buchvald et al., Surgeri, 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321: 574 (1989)).
[0239] Kada kompozicija kako je ovde opisana sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira vezujući protein kao što je ovde opisano kao profilaktički ili terapeutski agens, nukleinska kiselina se može primeniti in vivo da promoviše ekspresiju svog kodiranog profilaktičkog ili terapeutskog agensa, konstruišući ga kao deo odgovarajućeg ekspresionog vektora nukleinske kiseline i dajući ga tako da postane intracelularan, npr. upotrebom retrovirusnog vektora (videti U. S. Pat. No. 4,980,286), ili direktnom injekcijom, ili upotrebom bombardovanja mikročesticama (npr., genski pištolj; Biolistic, Dupont), ili oblaganjem lipidima ili receptorima na površini ćelije ili agensima za transfekciju, ili primenom u vezi sa peptidom sličnim homeoboksu za koje se zna da ulazi u jezgro (Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 1864-1868 (1991.).)). Alternativno, nukleinska kiselina se može uvesti intracelularno i ugraditi u DNK ćelije domaćina za ekspresiju homolognom rekombinacijom.
[0240] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku je formulisana tako da bude kompatibilna sa predviđenim načinom primene. Primeri puteva primene obuhvataju, ali nisu ograničeni na, parenteralnu, npr., intravenoznu, intradermalnu, subkutanu, oralnu, intranazalnu (npr. inhalaciju), transdermalnu (npr. lokalnu), transmukoznu i rektalnu primenu. Na primer, kompozicija se može formulisati u skladu sa rutinskim procedurama kao farmaceutska kompozicija prilagođena za intravenoznu, subkutanu, intramuskularnu, oralnu, intranazalnu ili topikalnu primenu na ljudima i kućnim životinjama. Tipično, kompozicije za intravenosku primenu su rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Tamo gde je potrebno, kompozicija takođe može da sadrži sredstvo za rastvaranje i lokalni anestetik kao što je lignokamne da bi se ublažio bol na mestu injekcije.
[0241] Ako se kompozicije iz ovog otkrića primenjuju lokalno, kompozicije se mogu formulisati u obliku masti, kreme, transdermalnog flastera, losiona, gela, šampona, spreja, aerosola, rastvora, emulzije ili drugog oblika koji je dobro poznat stručnjaku (Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)). Za lokalne dozne oblike koji se ne mogu prskati, tipično se koriste viskozni do polučvrsti ili čvrsti oblici koji sadrže nosač ili jedan ili više ekscipijenata kompatibilnih sa lokalnom primenom i koji imaju dinamički viskozitet veći od vode. Pogodne formulacije uključuju, bez ograničenja, rastvore, suspenzije, emulzije, kreme, masti, prahove, masti, meleme, koji se, po želji, sterilišu ili mešaju sa pomoćnim agensima (npr. konzervansi, stabilizatori, sredstva za vlaženje, puferi ili soli) za uticaj na različita svojstva, kao što je, na primer, osmotski pritisak. Drugi pogodni oblici doziranja za lokalnu upotrebu obuhvataju aerosolne preparate za raspršivanje u kojima je aktivni sastojak, u kombinaciji sa čvrstim ili tečnim inertnim nosačem, upakovan u smešu sa isparljivim sredstvom pod pritiskom (npr. gasovitim pogonskim gorivom, kao što je freon) ili u bocu za ceđenje. Ovlaživači ili humektanti se takođe mogu dodati farmaceutskim kompozicijama i oblicima doze ako se želi. Primeri takvih dodatnih sastojaka su dobro poznati u tehnici.
[0242] Farmaceutski sastav prema ovom pronalasku može imati polu-život od oko 8 dana do oko 15 dana kada se dozira intravenski ili subkutano. Alternativno, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može imati poluvreme od oko 10 dana do oko 13 dana. Alternativno, farmaceutska kompozicija ovog pronalaska može imati poluživot od oko 8 dana, kao što je oko 8,5 dana, oko 9 dana, kao što je oko 9,5 dana, oko 10 dana, kao što je oko 10,5 dana, oko 11 dana. dana, kao što je oko 11,5 dana, oko 12 dana, oko 12,5 dana, oko 13 dana, kao što je oko 13,5 dana, oko 14 dana, kao što je oko 14,5 dana, ili oko 15 dana.
[0243] Ako postupak prema pronalasku obuhvata intranazalnu primenu kompozicije, kompozicija se može formulisati u obliku aerosola, spreja, magle ili u obliku kapi. Konkretno, profilaktički ili terapeutski agensi za upotrebu u skladu sa ovim otkrićem mogu se prikladno isporučiti u obliku aerosol spreja iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, uz upotrebu odgovarajućeg potisnog gasa (npr. dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan dioksida ili drugog pogodnog gasa). U slučaju aerosola pod pritiskom, jedinica doze se može odrediti obezbeđivanjem ventila za isporuku odmerene količine. Kapsule i kertridži (sastavljeni od, na primer, želatina) za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu da se formulišu tako da sadrže mešavinu praha jedinjenja i pogodne praškaste baze kao što je laktoza ili skrob.
[0244] Ako postupak prema otkriću obuhvata oralnu primenu, kompozicije se mogu formulisati oralno u obliku tableta, kapsula, kapsula, gelcapsa, rastvora, suspenzija, tablete ili kapsule se mogu pripremiti na konvencionalne načine sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima kao što su vezujući agensi (npr., preželatinizovani kukuruzni skrob, polivinilpirolidon ili hidroksipropil metilceluloza); punila (npr. laktoza, mikrokristalna celuloza ili kalcijum hidrogen fosfat); maziva (npr. magnezijum stearat, talk ili silicijum dioksid); sredstva za dezintegraciju (npr. krompirov skrob ili natrijum skrob glikolat); ili sredstva za vlaženje (npr. natrijum lauril sulfat). Tablete mogu biti obložene postupcima dobro poznatim u tehnici. Tečni preparati za oralnu primenu mogu biti u obliku, ali ne ograničavajući se na, rastvor, sirup ili suspenziju, ili mogu biti predstavljeni kao suvi proizvod za konstituisanje sa vodom ili drugim pogodnim nosačem pre upotrebe. Takvi tečni preparati se mogu pripremiti na uobičajene načine sa farmaceutski prihvatljivim aditivima kao što su agensi za suspendovanje (npr., sorbitol sirup, derivati celuloze ili hidrogenizovane jestive masti); emulgatori (npr. lecitin ili akacija); nevodeni prenosioci (npr. bademovo ulje, uljni estri, etil alkohol ili frakcionisana biljna ulja); i konzervansi (npr. metil ili propil-phidroksibenzoati ili sorbinska kiselina). Preparati mogu takođe da sadrže puferske soli, arome, boje i zaslađivače prema potrebi. Preparati za oralnu primenu mogu biti pogodno formulisani za sporo oslobađanje, kontrolisano oslobađanje ili produženo oslobađanje profilaktičkog ili terapeutskog agensa (agenasa).
[0245] Metoda ovog otkrića može da obuhvata plućnu primenu, na primer, korišćenjem inhalatora ili nebulizatora, kompozicije formulisane sa agensom za aerosolizaciju (U.S. Pat. br. 6,019, 968, 5,985, 320, 5, 985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, i 4,880,078; i PCT objave br. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, i WO 99/66903). Na primer, antitelo iz ovog otkrića, kombinovana terapija i/ili kompozicija iz otkrića može se primeniti korišćenjem Alkermes AIR<®>tehnologije za isporuku lekova u pluća (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).
[0246] Postupak pronalaska može da obuhvata davanje kompozicije formulisane za parenteralnu primenu putem injekcije (npr. bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom). Formulacije za injekcije mogu biti predstavljene u obliku jedinične doze (npr. u ampulama ili u kontejnerima za više doza) sa dodatkom konzervansa. Kompozicije mogu imati takve oblike kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u uljanim ili vodenim nosačima, i mogu sadržati sredstva za formulaciju kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju. Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praha za konstituisanje sa odgovarajućim nosačem (npr. sterilna voda bez pirogena) pre upotrebe.
[0247] Postupci pronalaska mogu dodatno da obuhvataju davanje kompozicija formulisanih kao depo preparati. Takve formulacije dugog dejstva mogu se davati implantacijom (npr. subkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Tako, na primer, kompozicije mogu biti formulisane sa pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (npr., kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili smolama za izmenu jona, ili kao slabo rastvorljivi derivati (npr., kao slabo rastvorljiva so).
[0248] Postupci prema pronalasku obuhvataju primenu kompozicija formulisanih kao neutralni ili oblici soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju one formirane sa anjonima, kao što su one izvedene iz hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline, itd., i one formirane sa katjonima kao što su oni dobijeni od natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma, gvožđe hidroksida, izopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina itd.
[0249] Sastojci otkrivenih kompozicija mogu se isporučiti ili odvojeno ili pomešati zajedno u jediničnom doznom obliku, na primer, kao suvi liofilizovani prah ili u suštini koncentrat bez vode u hermetički zatvorenom kontejneru kao što je ampula ili kesica koja može da ukaže na količinu aktivnog sredstva. Tamo gde je način primene infuzija, otkrivene kompozicije mogu da se izdaju sa rastvorom za infuziju koji sadrži sterilni rastvor farmaceutskog kvaliteta kao što je voda ili fiziološki rastvor. Kada je način primene injekcijom, može se obezbediti ampula sterilnog rastvora kao što je voda ili fiziološki rastvor tako da se sastojci mogu mešati pre primene.
[0250] Konkretno, otkriće takođe obezbeđuje da je jedan ili više otkrivenih vezujućih proteina ili njihovih farmaceutskih kompozicija upakovano u hermetički zatvorenu posudu kao što je ampula ili kesica koja može da ukaže na količinu agensa. Jedan ili više otkrivenih vezujućih proteina ili njihovih farmaceutskih kompozicija mogu se isporučiti kao suvi sterilizovani liofilizovani prah ili koncentrat uglavnom bez vode u hermetički zatvorenoj posudi i mogu se rekonstituisati (npr. vodom ili fiziološkim rastvorom) do odgovarajuće koncentracije za primenu na subjekta. Jedan ili više otkrivenih vezujućih proteina ili njihovih farmaceutskih kompozicija mogu se isporučiti kao suvi sterilni liofilizovani prah u hermetički zatvorenoj posudi u jediničnoj dozi od najmanje oko 0,5 mg, 1 mg, 2 mg, 4 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg, 25 mg, 35 mg, 45 mg, 50 mg, 75 mg ili 100 mg. Otkriveni liofilizovani vezujući proteini ili njihove farmaceutske kompozicije mogu se čuvati na bilo kojoj pogodnoj temperaturi, kao što je, na primer, između oko 2°C i oko 8°C i mogu se čuvati u svom originalnom kontejneru. Otkriveni vezujući proteini ili njihove farmaceutske kompozicije mogu se davati u roku od oko 1 nedelje, u roku od oko 5 dana, u roku od oko 72 sata, u roku od oko 48 sati, u roku od oko 24 sata, u roku od oko 12 sati, u roku od oko 6 sati, u roku od oko 5 sati, u roku od oko 3 sata, ili u roku od oko 1 sat nakon rekonstituisanja. Alternativno, jedan ili više otkrivenih vezujućih proteina ili njihovih farmaceutskih kompozicija mogu biti isporučeni u tečnom obliku u hermetički zatvorenoj posudi koja može da ukazuje na količinu i koncentraciju agensa. Tečni oblik primenjene kompozicije može da se isporučuje u hermetički zatvorenoj posudi u koncentracijama od najmanje oko 0,01 mg/mL, najmanje oko 0.05 mg/mL, najmanje oko 0.1 mg/mL, najmanje oko 0,2 mg/mL, najmanje oko 0,25 mg/ml, najmanje oko 0,5 mg/ml, najmanje oko 1 mg/ml, najmanje oko 2,5 mg/ml, najmanje oko 5 mg/ml, najmanje oko 8 mg/ml, najmanje oko 10 mg/ml, najmanje oko 15 mg/kg, najmanje oko 25 mg/ml, najmanje oko 50 mg/ml, najmanje oko 75 mg/ml, ili najmanje oko 100 mg/ml. Tečni oblik se može čuvati na bilo kojoj pogodnoj temperaturi kao što je između oko 2°C i oko 8°C i može se čuvati u svom originalnom kontejneru.
[0251] Vezujući proteini prema pronalasku mogu se ugraditi u farmaceutsku kompoziciju pogodnu za parenteralnu primenu. U jednom aspektu, vezujući proteini se pripremaju kao rastvor za injekcije koji sadrži između oko 0.1 i oko 250 mg/ml antitela. Rastvor za injekcije može da se sastoji od tečnog ili liofilizovanog doznog oblika u bočici od kremena ili ćilibara, ampule ili napunjenom špricu. Pufer može biti bilo koji pogodan pufer kao što je L-histidin ili fiziološki rastvor fosfatnog pufera u koncentraciji od oko 1-50 mM, ili oko 5-10 mM. Drugi pogodni puferi uključuju, ali nisu ograničeni na, natrijum sukcinat, natrijum citrat, natrijum fosfat i kalijum fosfat. Puferi se mogu koristiti za modifikovanje toksičnosti farmaceutske kompozicije. Na primer, natrijum hlorid se može koristiti za modifikovanje toksičnosti rastvora vezujućeg proteina u koncentraciji od oko 0.1 do oko 300 mM, kao što je oko 150 mM fiziološki rastvor da bi se modifikovala toksičnost tečnog doznog oblika. Krioprotektanti, kao što je saharoza, mogu se koristiti u liofilizovanom doznom obliku u koncentraciji od oko 0.1 do oko 10% ili od oko 0,5 do oko 1,0%. Drugi pogodni krioprotektori uključuju, ali nisu ograničeni na, trehalozu i laktozu. Sredstva za povećanje zapremine, kao što je manitol, mogu biti uključena u liofilizovani dozni oblik u koncentraciji od oko 1 do oko 10%, ili od oko 2 do oko 4%. Stabilizatori, kao što je L-metionin, mogu se koristiti iu tečnim i u liofilizovanim oblicima doze u koncentraciji od oko 1 do oko 50 mM, ili oko 5 do oko 10 mM). Drugi pogodni agensi za povećanje zapremine uključuju, ali nisu ograničeni na, glicin i arginin. Surfaktanti, kao što je polisorbat-80, mogu biti uključeni u tečne i liofilizovane dozne oblike u koncentraciji od oko 0,001 do oko 0.05% ili oko 0,005 do oko 0,01%. Dodatni surfaktanti uključuju, ali nisu ograničeni na, polisorbat 20 i BRIJ surfaktante.
[0252] Primer farmaceutske formulacije ili kompozicije ovog pronalaska može biti tečna farmaceutska kompozicija koja ima pH između oko 7,4 do oko 8,0. Tečna farmaceutska kompozicija sadrži oko 5 mg/ml do oko 50 mg/ml antitela koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu SEQ ID NO: 37 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 38. Tečna farmaceutska kompozicija dalje sadrži najmanje jedan pufer (kao što je fiziološki rastvor fosfatnog pufera, tris ili histidin). Molarnost pufera koji se može koristiti može biti od oko 1 mM do oko 60 mM. Opciono, pomenuta farmaceutska kompozicija ili formulacija takođe može da sadrži najmanje jedan konzervans, kao što je metilparaben, propilparaben, benzil alkohol, hlorobutanol ili benzalkonijum hlorid. Količina konzervansa koja se može koristiti može biti od oko 0,01% po zapremini do oko 5,0% po zapremini u zavisnosti od korišćenog konzervansa.
[0253] Druga primerna farmaceutska formulacija ili kompozicija ovog otkrića može biti tečna farmaceutska kompozicija koja sadrži pH između oko 7,4 do oko 8,0. Tečna farmaceutska kompozicija sadrži oko 5 mg/ml do oko 50 mg/ml antitela koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu SEQ ID NO: 192 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 193. Tečna farmaceutska kompozicija dalje sadrži najmanje jedan pufer (kao što je fiziološki rastvor fosfatnog pufera, tris ili histidin). Molarnost pufera koji se
1
može koristiti može biti od oko 1 mM do oko 60 mM. Opciono, pomenuta farmaceutska kompozicija ili formulacija takođe može da sadrži najmanje jedan konzervans, kao što je metilparaben, propilparaben, benzil alkohol, hlorobutanol ili benzalkonijum hlorid. Količina konzervansa koja se može koristiti može biti od oko 0,01% po zapremini do oko 5,0% po zapremini u zavisnosti od korišćenog konzervansa.
[0254] Kompozicije ovog otkrića mogu biti u različitim oblicima. To uključuje, na primer, tečne, polučvrste i čvrste dozne oblike, kao što su tečni rastvori (npr. rastvori za injekcije i rastvori za infuziju), disperzije ili suspenzije, tablete, pilule, praškovi, lipozomi i supozitorije. Oblik opisane kompozicije može zavisiti od nameravanog načina primene i terapeutske primene. Otkrivene kompozicije mogu biti u obliku rastvora za injektiranje ili infuzije, kao što su kompozicije slične onima koje se koriste za pasivnu imunizaciju ljudi drugim antitelima. Način primene može biti parenteralni (npr. intravenski, subkutano, intraperitonealno, intramuskularno). Otkriveni vezujući proteini se mogu primeniti intravenskom infuzijom ili injekcijom, ili intramuskularnom ili subkutanom injekcijom.
[0255] Terapeutske kompozicije obično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, lipozom ili druga pogodna uređena struktura kao što su one koje su pogodne za visoku koncentraciju leka. Sterilni rastvori za injekcije se mogu pripremiti ugradnjom aktivnog jedinjenja (tj., antitelo ili deo antitela) u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih iznad, prema potrebi, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija. Disperzije se mogu pripremiti ugrađivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od prethodno nabrojanih. U slučaju sterilnih, liofilizovanih praškova za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, postupci pripreme uključuju, ali nisu ograničeni na, sušenje u vakuumu i sušenje raspršivanjem koje daju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora. Odgovarajuća tečnost rastvora se može održati, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Produžena apsorpcija kompozicija za injekcije može se postići uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju kao što su, na primer, soli monostearata i želatin.
[0256] Antitelo ili deo antitela prema pronalasku mogu se oralno davati, na primer, sa inertnim razblaživačem ili jestivim nosačem koji se može asimilirati. Jedinjenje (i drugi sastojci, ako se želi) takođe može biti zatvoreno u želatinsku kapsulu sa tvrdom ili mekom ljuskom, kompresovano u tablete ili direktno uključeno u ishranu subjekta. Za oralnu
2
terapijsku primenu, jedinjenja se mogu ugraditi sa ekscipijentima i koristiti u obliku tableta za gutanje, bukalnih tableta, pastila, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, vafla. Da bi se jedinjenje prema ovom pronalasku primenilo drugačije od parenteralne primene, može biti neophodno da se jedinjenje obloži sa, ili da se jedinjenje primeni zajedno sa materijalom da bi se sprečila njegova inaktivacija.
[0257] Otkriveni vezujući proteini se mogu davati zajedno sa drugim aktivnim jedinjenjima koja se takođe mogu ugraditi u opisane kompozicije. Antitelo ili deo antitela u pronalasku može biti koformulisan sa i/ili zajedno sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa koji su korisni za lečenje poremećaja kod kojih je aktivnost NGF štetna. Na primer, anti-NGF antitelo ili deo antitela iz ovog otkrića može biti koformulisan i/ili zajedno sa jednim ili više dodatnih antitela koja vezuju druge mete (npr. antitela koja vezuju druge citokine ili koja vezuju molekule na površini ćelije). Dalje, jedan ili više otkrivenih vezujućih proteina mogu se koristiti u kombinaciji sa dva ili više od navedenih terapeutskih agenasa. Takve kombinovane terapije mogu, na primer, omogućiti upotrebu nižih doza primenjenih terapeutskih agenasa, čime se izbegavaju moguće toksičnosti ili komplikacije povezane sa različitim monoterapijama.
[0258] Antitelo na NGF ili njegov fragment može biti formulisano sa vehikulumom koji produžava poluživot vezujućeg proteina. Pogodni nosači poznati u tehnici uključuju, ali nisu ograničeni na, Fc domen, polietilen glikol i dekstran. Takvi vehikulumi su opisani, npr u U.S. prijavi serijski br.09/428,082 i objavljeno PCT prijava br. WO 99/25044.
[0259] Izolovane sekvence nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju otkrivene vezujuće proteine ili drugi profilaktički ili terapeutski agens iz ovog otkrića mogu se davati za lečenje, prevenciju, upravljanje ili ublažavanje poremećaja ili jednog ili više njegovih simptoma putem genske terapije. Genska terapija se odnosi na terapiju sprovedenu davanjem subjektu eksprimirane ili ekspresibilne nukleinske kiseline, pri čemu nukleinske kiseline proizvode svoje kodirano antitelo ili profilaktički ili terapeutski agens prema pronalasku koji posreduje profilaktički ili terapeutski efekat.
[0260] Bilo koji postupak za gensku terapiju koja je dostupna u tehnici može se koristiti u skladu sa ovim otkrićem. Za opšte preglede postupaka genske terapije, pogledati Goldspiel et al., Clinical Pharmaci, 12: 488-505 (1993.); Vu et al., Biotherapy, 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 573-596 (1993.).); Mulligan, Science, 260: 926-932 (1993); i Morgan et al., Ann. Rev. Biochem., 62: 191-217 (1993.).); TIBTECH, 11(5):155-215 (1993.).). Opšte poznati postupci u oblasti tehnologije rekombinantne DNK koje se mogu koristiti su opisani u, na primer, Ausubel i dr. (ur.), Current Protocols in Molecular Biology, John Vilei & Sons, NI (1993.); i Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Detaljni opisi različitih postupaka genske terapije su objavljeni u US20050042664A1.
[0261] Antitela prema pronalasku, ili njihovi delovi koji se vezuju za antigen, mogu se koristiti sama ili u kombinaciji za lečenje bolesti povezanih sa NGF. Trebalo bi shvatiti da se antitela iz ovog otkrića ili njihov deo koji se vezuje za antigen mogu koristiti sama ili u kombinaciji sa dodatnim agensom, na primer, terapeutskim agensom, pri čemu pomenuti dodatni agens bira stručnjak u odnosu na njegovu namenu. Na primer, dodatni agens može biti terapeutski agens koji je u struci priznat kao koristan za lečenje bolesti ili stanja koje se leči antitelom prema ovom pronalasku. Dodatni agens takođe može biti agens koji daje koristan atribut terapeutskoj kompoziciji, na primer, agens koji utiče na viskozitet kompozicije.
[0262] Dalje treba razumeti da su kombinacije koje treba da budu uključene u ovo otkriće one kombinacije korisne za njihovu predviđenu svrhu. Agensi navedeni u nastavku su ilustrativni u tu svrhu i nisu ograničeni. Kombinacije, koje su deo ovog otkrića, mogu biti antitela iz ovog otkrića i najmanje jedan dodatni agens izabran sa dole navedenih lista. Kombinacija takođe može uključivati više od jednog dodatnog agensa, na primer, dva ili tri dodatna sredstva ako je kombinacija takva da formirana kompozicija može da izvrši svoju predviđenu funkciju.
[0263] Kombinacije uključuju nesteroidne antiinflamatorne lekove koji se takođe nazivaju NSAID koji uključuju lekove kao što je ibuprofen. Druge kombinacije su kortikosteroidi uključujući prednizolon; dobro poznati neželjeni efekti upotrebe steroida mogu se smanjiti ili čak eliminisati smanjenjem doze steroida koja je potrebna kada se pacijenti leče u kombinaciji sa anti-NGF antitelima iz ovog otkrića. Neograničavajući primeri terapeutskih sredstava za reumatoidni artritis ili bol sa kojima se može kombinovati antitelo ili deo antitela iz pronalaska obuhvataju sledeće: antiinflamatorni lek (lekove) koji suprimiraju citokine (CSAID); antitela ili antagonisti citokina ili faktora rasta, na primer, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL -15, IL-16, IL-18, IL-21, interferoni, EMAP-II, GM-CSF, FGF i PDGF. Antitela iz ovog otkrića, ili njihovi delovi koji se vezuju za antigen, mogu se kombinovati sa antitelima na molekule površine ćelije kao što su CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA ili njihove ligande uključujući CD154 (gp39 ili CD40L).
[0264] Kombinacije terapeutskih agenasa mogu interferirati u različitim tačkama autoimune i kasnijoj inflamatornoj kaskadi; primeri uključuju TNF antagoniste poput himernih,
4
humanizovanih ili humanih TNF antitela, D2E7, (PCT objava br. WO 97/29131), CA2 (Remicade™), CDP 571, i rastvorljivi p55 ili p75 TNF receptori, njihovi derivati, (p75TNFR1gG (Enbrel™) ili p55TNFR1gG (Lenercept), kao i inhibitori TNFα konvertujućeg enzima (TACE); slično tome, drugi inhibitori IL-1 (inhibitori enzima koji konvertuje interleukin-1, IL-1RA itd.) mogu biti efikasni iz istog razloga. Druge kombinacije uključuju interleukin 11.
[0265] Antitela iz otkrića, ili njihovi delovi koji se vezuju za antigen, takođe mogu da se kombinuju sa agensima, kao što su metotreksat, 6-MP, azatioprin sulfasalazin, mesalazin, olsalazin hlorokinin/hidroksihlorokin, pencilamin, aurotiomalat ili intramušićni, pricizahiolat i kortikosteroidi (oralne, inhalacione i lokalne injekcije), agonisti beta-2 adrenoreceptora (salbutamol, terbutalin, salmeteral), ksantini (teofilin, aminofilin), kromoglikat, nedokromil, ketotifen, ipratropijum i oksitropijum, F ciklopacinomifem, F-ciklo-50-mosporin,, NSAIL, na primer, ibuprofen, kortikosteroidi kao što je prednizolon, inhibitori fosfodiesteraze, agonisti adensozina, antitrombotički agensi, inhibitori komplementa, adrenergični agensi, agensi koji ometaju signalizaciju proinflamatornih citokina kao što su TNFeg, NIKK IL, inhibitori p38 ili MAP kinaze), inhibitori enzima konvertovanja IL-1β, inhibitori enzima konvertovanja TNFα (TACE), inhibitori signalizacije T-ćelija kao što su inhibitori kinaze, inhibitori metaloproteinaze, sulfasalazin, azatioprin, 6-merkaptopurini, inhibitori enzima koji konvertuje angiotenzin, rastvorljivi receptori citokina i njihovi derivati (npr. rastvorljivi p55 ili p75 TNF receptori i derivati p75TNFRIgG (Enbrel™ i p55TNFRIgG (Lenercept)), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R), antiinflamatorni citokini (npr. IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 i TGFβ), celekoksib, folna kiselina, hidroksihlorokin sulfat, rofekoksib, etanercept, infliksimab, naproksen, valdekoksib, sulfasalazin, metilprednizolon, meloksikam, metilprednizolon acetat, zlatni natrijum tiomalat, aspirin, triamcinolon acetonid, propoksifen napsilat, apapksinakofel, fodiksin napsilat, apapbunakopostupkuks, napsilat, apapbukofel hcl, hidrokodon bitartrat/apap, diklofenak natrijum/misoprostol, fentanil, anakinra, humani rekombinant, tramadol hcl, salsalat, sulindak, cijanokobalamin/fa/piridoksin, acetaminofen, natrijum alendronat, natrijum alendronat, lifoglukozamidohlorid, hondroitin, amitriptilin hcl, sulfadiazin, oksikodon hcl/acetaminofen, olopatadin hcl, misoprostol, naproksen natrijum, omeprazol, ciklofosfamid, rituksimab, IL-1 TRAP, MRA, B, CTLA-8-8 IL1 5, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, Roflumilast, IC-485, CDC-801 i Mesopram. Druge kombinacije uključuju metotreksat ili leflunomid i u umerenim ili teškim slučajevima reumatoidnog artritisa, ciklosporin. Antitela prema pronalasku, ili njihovi delovi koji se vezuju za antigen, takođe mogu da se kombinuju sa agensima, kao što su hemoterapeutici protiv raka, antimikrobni lekovi, antiinflamatorni lekovi i anthelmintici koji se koriste kod životinja.
[0266] NSAID može biti bilo koje nesteroidno antiinflamatorno jedinjenje. NSAIL su kategorisani na osnovu njihove sposobnosti da inhibiraju ciklooksigenazu. Ciklooksigenaza 1 i ciklooksigenaza 2 su dve glavne izoforme ciklooksigenaze i većina standardnih NSAIL su mešani inhibitori ove dve izoforme. Većina standardnih NSAIL spada u jednu od sledećih pet strukturnih kategorija: (1) derivati propionske kiseline, kao što su ibuprofen, naproksen, naprosin, diklofenak i ketoprofen; (2) derivate sirćetne kiseline, kao što su tolmetin i slindak; (3) derivate fenaminske kiseline, kao što su mefenaminska kiselina i meklofenamska kiselina; (4) derivate bifenilkarboksilne kiseline, kao što su diflunisal i flufenisal; i (5) oksikami, kao što su piroksim, sudoksikam i izoksikam. Opisana je još jedna klasa NSAIL koja selektivno inhibiraju ciklooksigenazu 2. Opisani su inhibitori Cox-2 (U.S. Pat. Nos. 5,616,601; 5,604,260; 5,593,994; 5,550.142; 5,536,752; 5,521,213; 5,475,995; 5,639,780; 5,604,253; 5,552,422; 5,510,368; 5,436,265; 5,409,944; i 5,130,311). Neki primeri inhibitora COX-2 uključuju celekoksib (SC-58635), rofekoksib, DUP-697, flosulid (CGP-28238), meloksikam, 6-metoksi-2 naftilosirćetnu kiselinu (6-MNA), MK-966, nabumeton (prolek za 6-MNA), nimesulid, NS-398, SC-5766, SC-58215, T-614; ili njihove kombinacije.
[0267] NGF antagonist i/ili dodatni terapeutski agens, kao što je NSAID, mogu da se daju subjektu na bilo koji pogodan način. Na primer, mogu se davati zajedno ili odvojeno, i/ili istovremeno i/ili uzastopno, oralno, intravenski, sublingvalno, subkutano, intraarterijsko, intramuskularno, rektalno, intraspinalno, intratorakalno, intraperitonealno, intraventrikularno, sublingvalno, transdermalno ili inhalacijom. Primena može biti sistemska, na primer, intravenska ili lokalizovana. Antagonist faktora rasta nerava i dodatni terapeutski agens mogu biti prisutni zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenata, ili mogu biti prisutni u odvojenim kompozicijama. U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje sinergistički sastav NGF antagonista i NSAID.
[0268] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu uključiti "terapeutski efikasnu količinu" ili "profilaktički efikasnu količinu" antitela ili dela antitela u pronalasku. Režimi doziranja se mogu prilagoditi da bi se obezbedio optimalan željeni odgovor (npr. terapeutski ili profilaktički odgovor). Na primer, može se primeniti jedan bolus, može se primeniti nekoliko podeljenih doza tokom vremena ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno zahtevima terapijske situacije. Posebno je korisno formulisati parenteralne kompozicije u obliku jedinične doze radi lakšeg ordiniranja i uniformnosti doziranja. Jedinični oblik doze se odnosi na fizički diskretne jedinice pogodne kao jedinstvene doze za subjekte sisara koji se leče; svaka jedinica koja sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapeutski efekat u kombinaciji sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacije za oblike jedinične doze iz otkrića su diktirane i direktno zavise od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapeutskog ili profilaktičkog efekta koji treba da se postigne, i (b) ograničenja svojstvenih tehnici za takvo aktivno jedinjenje za lečenje osetljivosti kod pojedinaca.
[0269] Primerni, neograničavajući opseg za terapeutski ili profilaktički efikasnu količinu antitela ili dela antitela iz otkrića je oko 0,001 do oko 20 mg/kg ili oko 0,001 do oko 10 mg/kg. Treba napomenuti da vrednosti doze mogu varirati u zavisnosti od vrste i težine stanja koje treba ublažiti. Dalje treba razumeti da za bilo kog određenog subjekta, specifični režimi doziranja treba da se prilagođavaju tokom vremena u skladu sa individualnim potrebama i profesionalnom procenom osobe koja primenjuje ili nadgleda davanje kompozicija, i da su rasponi doza koji su ovde navedeni samo kao primeri i nemaju za cilj da ograniče obim ili upotrebu kompozicije za koju se traži zaštita.
[0270] Stručnjacima će biti jasno da su druge pogodne modifikacije i adaptacije postupaka opisanih ovde očigledne i da se mogu napraviti korišćenjem odgovarajućih ekvivalenata bez odstupanja od obima otkrića ili primera izvođenja koji su ovde otkriveni. Pošto je sada detaljno opisano ovo otkriće, isto će biti jasnije shvaćeno pozivanjem na sledeće primere, koji su uključeni samo u svrhu ilustracije i nemaju nameru da ograničavaju otkriće.
E. Primeri
Primer 1: Imunizacija miševa sa NGF
[0271] Da bi se generisala mišja anti-NGF mAbs, ženke A/J miševa su imunizovane subkutano sa 25 µg humanog β NGF (R&D Systems catalog # 256-GF/CF) u CFA. Životinje su bustovane svake tri nedelje sa 25 µg humanog β NGF u IFA. Četiri dana pre fuzije, miševi su intravenski bustovani sa 10 µg humanog β NGF u sterilnom fiziološkom rastvoru. Ćelije slezine imunizovanog miša su spojene sa SP2/0-Ag14 ćelijama mijeloma u odnosu 5:1 slezine prema SP2/0 ćelijama, korišćenjem standardnih tehnika. Sedam do deset dana nakon fuzije, kada su uočene makroskopske kolonije, supernatanti su testirani u ELISA formatu za hvatanje za vezivanje za biotinilovani humani ili pacovski β NGF. ELISA-pozitivni bunari su prošireni na ploče sa 24 bunarčića i testirani na vezivanje za biotinilovani β NGF pacova. Supernatanti iz hibridomskih ćelijskih linija koji su bili pozitivni i na humani i na pacovski NGF su procenjeni u formatu biološke analize. Ćelijske linije od interesa su klonirane ograničenim razblaženjem da bi se izolovalo NGF-specifično mišje monoklonsko antitelo.
Primer 2:Skrining supernatanata hibridoma za identifikaciju sekretovanih anti-NGF MAbs
A. Indirektno vezivanje ELISA
[0272] Da bi se utvrdilo da li su anti-NGF mAbs bila prisutna u supernatantima hibridoma, ELISA ploče su obložene kozjim antimišjim IgG Fc (Jackson ImmunoResearch, cat. no.115-005-164) i inkubirane preko noći na 4°C. Ploče su isprane tri puta puferom za ispiranje. Ploče su blokirane sa 200 ul 2% mleka i inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su oprane kao prethodno. Supernatanti hibridoma su razblaženi 5 puta, 25 puta, 125 puta i 1625 puta sa PBS, a zatim dodati u bunarčiće ploče i inkubirani 1 sat na sobnoj temperaturi. Pozitivna kontrola je bio sirov serum (razblažen 1:500 sa PBS) izolovan iz β NGF imunizovanog miša, a negativna kontrola je bio supernatant hibridoma dobijen od miša imunizovanog antigenom koji nije NGF. Ploče su isprane, a zatim je dodato 50 ul biotinilovanog humanog ili pacovskog β NGF od 50 ng/ml i inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane. Streptavidin-HRP (Thermo, cat #21126) konjugat je razblažen na 10,000 i dodat na ploče. Ploče su inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane, a zatim je dodat TMB supstrat (Invitrogen, catalog #00-2023). Reakcija je zaustavljena upotrebom 2N H2SO4(VWR, catalog # BDH3500-1). Apsorbanca na 450 nm je očitana na Spectromax 2E čitaču ploča (Molecular Devices); ova očitavanja apsorpcije su prikazana u tabelama 1 i 2. Numerička vrednost ukazuje na vezivanje mišjih anti-NGF antitela za biotinilovani humani ili pacovski β NGF. Ovi podaci ukazuju da je nekoliko supernatanata hibridoma sadržalo anti-NGF antitela.
B. ELISA za TrkA vezivanje
[0273] Da bi se utvrdilo da li anti-NGF mAbs u supernatantima hibridoma blokiraju NGF u
1
odnosu na vezivanje za TrkA receptor, ELISA ploče su obložene kozjim anti-humanim IgG Fc (Jackson ImmunoResearch, cat. no. 109-005-008) pri 2 µg/ml u PBS inkubirano preko noći na 4°C. Ploče su isprane tri puta sa PBS/Tween. Ploče su blokirane sa 200 ul/bunarčiću 2% mleka u PBS tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta kao prethodno. Pacovska TrkA/Fc himera (R&D Sistems, catalog #1056-TK) je dodata u količini od 1 µg/ml (50 µl/bunarčiću) u PBS/0.1% BSA i zatim inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Biotinilovani humani NGF je titriran i prethodno inkubiran sa supernatantima anti-NGF antitela razblaženim 1 puta, 5 puta i 25 puta, ili prečišćenim anti-NGF mAbs razblaženim do 0,08, 0,4, 2 ili 10 µg/ml za 1 sat na sobnoj temperaturi na šejkeru. Negativna kontrola je bio nesrodni kondicionirani supernatant. Pozitivna kontrola su serumi od miša imunizovanog sa NGF. Ploče su isprane i zatim je 50 ul svake biotinilovane mešavine NGF/Ab dodato u odgovarajuće bunarčiće. Ploče su inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane. Dodato je 50 µl streptavidin-HRP (Thermo, cat. br.21126) u razblaženju od 10,000. Ploče su inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane. Dodato je 50 µl TMB (Invitrogen, cat. no.00-2023) i reakcija je zaustavljena upotrebom 2N H2SO4(VWR, cat. no. BDH3500-1). Apsorbanca na 450 nm je očitana na Spectromax 2E čitaču ploča (Molecular Devices), a očitavanja apsorbancije su prikazana u tabeli 3. Numerička vrednost ukazuje na vezivanje biotinilovanog humanog β NGF za TrkA/Fc himeru pacova. Ovi podaci ukazuju da nekoliko supernatanata hibridoma sadrži antitela koja blokiraju receptore NGF.
1 1
�� C. SureFire ćelijski fosfo-ERK (pERK) test
[0274] Da bi se utvrdilo da li su anti-NGF mAbs u supernatantima hibridoma blokirale nizvodnu signalizaciju kao rezultat blokiranja vezivanja NGF-a za TrkA, ćelije Neuroscreen-1 (Thermo Fisher Scientific) su uzgajane na bocama obloženim kolagenom I u medijumu RPMI sa dodatkom 10% konjskog seruma., 5% FBS, 100 jedinica/ml penicilina/streptomicina, 2 mM L-glutamina i 10 mM HEPES na 37°C u vlažnoj atmosferi na 95% vazduha i 5% CO2. Za ERK fosforilacioni test, 5 × 10<4>ćelije su zasejane u svaki bunar ploče sa 96 bunarčića obložene kolagenom I (Becton Dickinson). Ćelije su zatim izgladnjavane u serumu 24 sata pre stimulacije. 130 pM humani β NGF (catalog R&D sistema #256-GF/CF) je pomešan u razblažene hibridoma supernatante (da bi se postiglo konačno razblaživanje (puta) supernatanta od 10 puta, 100 puta, 500 puta ili 1000 puta) i smeše su prethodno inkubirane 15 min na 37°C pre dodavanja ćelijama. Svaki razređeni supernatant hibridoma je testiran u četiri primerka. Posle 5 minuta stimulacije, medijum je uklonjen i zamenjen sa SureFire™ AlphaScreen cell lysis (PerkinElmer). Ćelijski lizati su zatim obrađeni u skladu sa uputstvima proizvođača i fluorescentni signali su kvantifikovani korišćenjem EnVision čitača ploča (PerkinElmer); podaci o fluorescenciji su sumirani u tabeli 4. Numerička vrednost ukazuje na fosforilaciju ERK usled TrkA signalizacije u prisustvu humanog β NGF i izražena je kao procenat signala u odnosu na maksimalni signal. Maksimalni signal je definisan kao 100% odgovor ćelija koje pokazuju fosforilaciju ERK u prisustvu samo β NGF (bez hibridomskog supernatanta). Ovi podaci ukazuju da je nekoliko supernatanata hibridoma sadržalo neutrališuća anti-NGF antitela.
1
D. PathHunter analiza
14
[0275] Da bi se utvrdilo da li su anti-NGF mAbs u supernatantima hibridoma blokirale nizvodnu signalizaciju kao rezultat blokiranja vezivanja NGF-a za TrkA, PathHunter U2OS stabilna ćelijska linija koja stabilno eksprimira NGF receptor TrkA i koaktivatorski protein SHCl fuzionisan sa komplementarnim fragmentima β- galaktozidaza kupljena je od DiscoveRx. Ćelije su uzgajane u MEM medijumu sa dodatkom 10% FBS, 100 jedinica/ml penicilina/streptomicina, 2 mM L-glutamina, 500 µg/ml Geneticin G418 i 250 µg/ml higromicina na 37°C u vlažnoj atmosferi od 95% vazduha i 5% CO2. Šesnaest sati pre testa, 2 × 10<4>ćelije su zasejane u svaki bunar crne ploče sa 96 bunarčića pola zapremine u 40 µl MEM medijuma sa dodatkom 0,5% konjskog seruma. 440 pM humani β NGF (R and D Systems catalog # 256-GF/CF) je pomešan u razblažene hibridoma supernatante (da bi se postiglo konačno razblaživanje supernatanta od 10 puta, 100 puta, 500 puta ili 1000 puta) i mešavine su prethodno inkubirane 15 minuta na 37°C pre dodavanja ćelijama. Ćelijske ploče su inkubirane 5 minuta na sobnoj temperaturi pre stimulacije sa 10 µl po bunarčiću mešavine NGF/antitela. Posle 3 sata indukcije ćelija na sobnoj temperaturi, 25 µl PathHunter detekcionog reagensa je dodato u svaki bunarčić prema uputstvima proizvođača. Hemiluminiscentni signal je detektovan 1 sat kasnije korišćenjem TopCount čitača ploča (PerkinElmer); podaci o signalu hemiluminiscencije su prikazani u tabeli 5. Numerička vrednost ukazuje na stvaranje β-galaktozidaze usled TrkA signalizacije u prisustvu humanog β NGF i izražena je kao procenat signala u odnosu na maksimalni signal. Maksimalni signal je definisan kao 100% odgovor ćelija koje pokazuju u prisustvu generisanja β-galaktozidaze u prisustvu samo β NGF (bez supernatanta hibridoma). Ovi podaci ukazuju da je nekoliko supernatanata hibridoma sadržalo neutrališuća anti-NGF antitela.
1
Primer 3: Sub-kloniranje hibridoma
[0276] Hibridomske ćelijske linije su subklonirane korišćenjem standardnih tehnika ograničavanja razblaživanja. Ćelije su razblažene do koncentracije od 50, 5 ili 0.5 ćelija/mL.
200 uL razblaženih ćelijskih suspenzija je postavljeno u ploče za kulturu tkiva sa 96 bunarčića. Ploče su inkubirane na 37 ° C sa 5% CO2i ~90% relativne vlažnosti. Rast je
1
vizuelno proveren 7. dana za makroskopske kolonije. Supernatanti iz bunarčića su testirani na proizvodnju antitela kada je rast kolonije bio vidljiv. U tabeli 6 prikazana je nomenklatura identifikacije subklona i nazivi. Ovi podaci ukazuju da se nekoliko anti-NGF antitela može izolovati iz klonske populacije ćelija.
Tabela 6: Identifikacija subklona hibridoma i nazivi
Primer 4: Povećanje i prečišćavanje monoklonskih antitela
[0277] Subklonirane hibridoma ćelijske linije su proširene u Hibridoma SFM (Invitrogen catalog # 12045) sa 5% goveđim serumom sa niskim IgG (Invitrogen katalog # 16250-078). Supernatanti su sakupljeni, centrifugirani i filtrirani da bi se uklonili ćelijski ostaci, i koncentrisani. Antitela su pomešana sa Pierce puferom za vezivanje A (Thermo, catalog # 21001) u odnosu 1. Antitela su stavljena na kolonu za hromatografiju sa rekombinantnom ProteinA sefarozom (GE Healthcare, catalog number 17-1279-04), eluirano korišćenjem Pierce pufera za eluiranje (Thermo, catalog # 21004), neutralizovano korišćenjem 2M Tris pH 7,5, a zatim dijalizirano PBS. Ova obrada je omogućila izolaciju anti-NGF mAbs za studije karakterizacije.
1
Primer 5: Kloniranje psećeg NGF
[0278] Kodirajući region NGF pasa je amplifikovan iz univerzalne cDNK pasa (Biochain Institute, catalog #4734565) korišćenjem prajmera SEQ ID NO: 45 i SEQ ID NO: 46 ili prajmera SEQ ID NO: 47 i SEQ ID NO: 48 i kloniran u vektor ekspresije sisara ili bakterija, respektivno. PCR reakcije su postavljene prema preporuci proizvođača (Novagen, KOD Hot Start Master Mix, catalog # 71842-3). Klon sisara je napravljen kao C-terminalni 6-His fuzioni protein vezivanjem PCR proizvoda sa pTT6 vektorom (Abbott) na KpnI/KsbaI restrikcionim mestima. Bakterijski klon je napravljen sa pro-NGF sekvencom korišćenjem klona sisara kao šablona i povezan sa pET15B (Novagen) na NdeI/KshoI restrikcionim mestima. DNK sekvenca i sekvenca aminokiselina izolovanog NGF pasa su navedene kao SEQ ID NO: 49 i SEQ ID NO: 50, respektivno. Ova obrada je omogućila ekspresiju psećeg NGF proteina za prečišćavanje.
Primer 6: Ekspresija psećeg NGF
[0279] Klon NGF pasa u vektoru za ekspresiju bakterija uzgajan je na 37°C u ekspresnoj auto-indukujućoj Terrific Broth preko noći (Novagen) u Rosetta2 (DE3) domaćinu E. coli (EMD Biosciences) u 2 L bocama bez pregrada. Ćelije su centrifugirane i ćelijska pasta je resuspendovana u 100 mL pufera za lizu (25 mM Tris, 300 mM NaCl, 10% glicerol, 0.1% Triton X 100 pH 8,0) sa lizonazom i sonikovana 2 minuta na ledu. Uzorak je centrifugiran na 15000 RPM i pelet je rastvorena u 50 mL 25 mM Tris, 6 M GdHCl pH 8,0. Uzorak je centrifugiran na 15000 rpm tokom 30 minuta i supernatant je stavljen na 10 ml IMAC smole.
A. IMAC hromatografija
[0280] Pripremljena je kolona GE-Ni FF od 10 ml. Pufer A: 25 mM Tris, 6 M GdHCl pH 8,0, Pufer B: A 500 mM Imidazol. Smola je uravnotežena i napunjena recirkulacijom da bi se omogućilo potpuno vezivanje (∼10 prolaza) preko noći na 4°C. Kolona je isprana puferom A. Serijsko eluiranje je izvedeno sa 40 ml pufera A, a zatim sa 30 ml pufera A. Frakcije od 5 ml su sakupljene i spojene.
B. Ponovno saviajnje sa brzim rastvaranjem
1
[0281] Skupljena frakcija je redukovana dodavanjem 50 mM DTT, a EDTA je dodat do 10 mM i inkubiran 1 h na ST. Uzorak je zakiseljen dodavanjem 6M HCl do pH 4,0 i dijalizovan u 6M GdHCl pH 5.0 da bi se uklonio višak DTT. Ponovno savijanje je izvedeno razblaživanjem redukovanog/zakiseljenog uzorka u 1 L 100 mM Tris, 1 M arginina, 5 mM EDTA, 5 mM GSH, 1 mM GSSG pH 9.5 tokom 4 h na 4°C. Ponovo savijeni protein je dijalizovan nasuprot 25 mM Tris, 200 mM NaCl, 10% glicerola pH 8,0. Precipitat je očišćen filtracijom. Prečišćeni uzorak je koncentrovan i dijafiltriran u 25 mM Tris, 200 mM NaCl, 10% glicerol pH 8,0 korišćenjem 10K membrane.
C. Ni-IMAC
[0282] Ponovo savijeni pro-NGF je napunjen na 5 ml Ni-IMAC. Pufer A: 25 mM Tris, 300 mM NaCl, 10% glicerol pH 8,0. Pufer B: A 500 mM imidazola. Kolona je isprana puferom A. Sakupljene su frakcije od 8 ml. Eluiranje je izvedeno sa linearnim gradijentom 0-100% pufera B. Sakupljene su frakcije od 5 ml. Uzorci svake frakcije su pomešani sa neredukcionim NuPage SLB (Invitrogen) i razdvojeni na 4-12% NuPAGE Novex Bis-Tris Midi gelu za analizu. Frakcije koje sadrže protein su sakupljene i dijalizovane nasuprot 20 mM Na fosfata, 50 mM NaCl, 10% glicerola pH 7,4.
D. Digestija tripsinom
[0283] Pro-β NGF je pomešan sa tripsinom u puferu za resuspendovanje i inkubiran na ledu 30 minuta. Dodan je imobilisani inhibitor i inkubiran 15 min, a zatim filtriran.
E. Sefaroza katjonska hromatografija
[0284] Uzorak je stavljen na kolonu za hromatografiju visoke performanse SP Sepharose od 5 ml (GE Healthcare). Pufer A: 20 mM Na fosfat, 50 mM NaCl, 10% glicerol pH 7,4, Pufer B: A 1 M NaCl. Kolona je isprana puferom A. Eluiranje je izvedeno sa linearnim gradijentom 0-100% pufera B. Sakupljene su frakcije od 5 ml. Frakcije su razdvojene na 4-12% Criterion KST Bis-Tris Midi gelu za analizu. Frakcije koje sadrže protein su sakupljene, dijalizovane u PBS pH 7,4 i koncentrovane.
[0285] Ova obrada je rezultovala proizvodnjom nekoliko miligrama prečišćenog NGF pasa za studije karakterizacije i za studije anti-NGF psećih antitela.
1
Primer 7: Karakterizacija subkloniranih i prečišćenih hibridoma antitela
A. ELISA za direktno vezivanje psećeg NGF
[0286] Da bi se utvrdilo da li se prečišćena mišja anti-NGF mAbs vezuju za pseći β NGF, ELISA ploče su obložene sa 50 µl/bunariću psećeg NGF-a (Abbott Laboratories) pri 1 µg/ml u PBS-u i inkubirane preko noći na 4°C. Ploče su isprane tri puta sa PBS Tween puferom. Ploče su blokirane sa 200 ul/bunariću 2% mleka u PBS tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta kao prethodno. Prečišćena antitela su razblažena do 0,4, 2 ili 10 µg/ml. 50 ul svake koncentracije prečišćenog antitela je dodato na ploče. Ploče su inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče su oprane. Dodato je 50 µl 5000 puta razblaženog kozjeg anti-mišjeg IgG Fc-HRP (Thermo, catalog # 31439). Ploče su inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi. Dodato je 50 µl TMB (Invitrogen, catalog # 00-2023) i reakcija je zaustavljena upotrebom 2N H2SO4(VWR, catalog # BDH3500-1). Apsorbanca na 450 nm je očitana na Spectromax 2E čitaču ploča (Molecular Devices). Rezultati su prikazani u tabeli 7, a numerička vrednost ukazuje na vezivanje mišjih anti-NGF antitela za pseći β NGF.
Tabela 7: ELISA podaci za direktno vezivanje psećeg NGF korišćenjem prečišćenih anti-NGF mAbs
11
B.Test potencije proliferacije ćelija TF-1
[0287] TF-1 je humana eritroleukemijska ćelijska linija koja eksprimira humani TrkA i proliferira kao odgovor na rekombinantni β NGF. Da bi se utvrdilo da li su prečišćena anti-NGF mAbs blokirala proliferaciju izazvanu NGF-om, TF-1 ćelije (ATCC# CRL-2003) su održavane na 37°C i 5% CO2u RPMI (Gibco, cat. no. 11875-093) medijumu koji sadrži rekombinantni humani GM-CSF u 2 ng/mL (R&D Sistems, cat. no. 215-GM) i fetalni goveđi serum (FBS, Hiclone, cat. no. SH 30070.03). GM-CSF i FBS su uklonjeni 24 sata pre testa. Prvog dana testa svako anti-NGF mAb je titrirano (koncentracije u rasponu od 33,3 nM do 1,7 fM) i dodato u fiksnu koncentraciju rekombinantnog NGF pasa (70 pM) i TF-1 ćelija (2,5 x 10<4>ćelije/ bunarčiću) u RPMI 4% FBS tokom 72 sata. Proliferacija ćelija je merena korišćenjem Cell Titer-glo (Promega, kat. # G7571). IC50vrednosti svakog anti-NGF mAb na proliferaciju TF-1 ćelija izazvanu sa NGF kod pasa prikazane su u tabeli 8, a podaci pokazuju da u prisustvu 70 pM NGF pasa, većina anti-NGF antitela pokazuje potencije ispod nM, a neka pokazuju potencije manje od 50 pM.
Tabela 8: Potentnost mišjih anti-NGF antitela u odnosu na proliferaciju TF-1 ćelija izazvanu sa psećim NGF
C. SureFire ćelijske pERK i PathHunter analize
[0288] Da bi se utvrdilo da li su prečišćena mišja anti-NGF mAbs blokirala ćelijske odgovore izazvane sa NGF kod pasa, prečišćena antitela su okarakterisana titracijom u SureFire ćelijskom pERK-u (koristeći 128 pM psećeg β NGF-a u svakom test bunarčiću) i PathHunter testovima (koristeći 441 pM psećeg NGF u svakom test bunarčiću) kao što je opisano u Primeru 2, odeljci C i D. IC5Osvakog anti-NGF mAb na pseće β NGF-indukovane ćelijske odgovore je sažeto u tabeli 9, a podaci pokazuju da u prisustvu 128 pM psećeg NGF-a sva anti-NGF antitela pokazuju potencije ispod nM, a neka pokazuju potencije manje od 50 pM (pERK test). Takođe, u prisustvu 441 pM psećeg NGF, sva anti-NGF antitela pokazuju potencije ispod nM, a neka pokazuju potencije manje od 150 pM (PathHunter test).
Tabela 9: Rezime podataka pERK i Path Hunter testa za prečišćena anti-NGF mAbs
11
Primer 8: Karakterizacija prečišćenih anti-NGF antitela nakon subkloniranja hibridoma
A.Masena spektrofotometrija (MS) i analiza ekskluzione hromatografije (SEC) na anti-NGF antitela
[0289] Mišja anti-NGF mAbs su redukovana korišćenjem 1M DTT i analizirana korišćenjem HPLC/MS na 6224 TOF masenom spektrometru i 1200 HPLC (Agilent technologies) korišćenjem Vidac C4, 1MMx150mm kolone (CN# 214TP5115, Nest Group) pri protoku brzina od 50 µl/min. Pufer A: 99,9% HPLC voda 0.1% FA 0,01% TFA i pufer B: 99,9% ACN 0.1% FA 0,01% TFA. LC ravnoteža i odsoljavanje uzorka izvedeno je korišćenjem 5% pufera B tokom 7 minuta. Gradijent razdvajanja je izveden korišćenjem 30% do 50% pufera B tokom 10 minuta, a korak ispiranja je izveden sa 95% pufera B tokom 10 minuta. Parametri akvizicije TOF-a bili su: temperatura gasa na 350C i OCT/RF na 750V. Opseg mase je bio od 600-3200 m/z, a specificirana brzina je bila 1,03 spektra/s. Softver za kvalitativne analize (Agilent) je korišćen za dekonvoluciju molekulskih težina antitela.
[0290] Antitela su analizirana na sistemu Shimadzu LC-10AVP (Shimadzu Scientific). Korišćena SEC kolona je Superdex-20010/300L (GE Healthcare). Brzina protoka je bila 0,75 ml/min i UV280 je korišćen za praćenje pikova. Upotrebljeni pufer je bio Na2SO4+92mM NaPO4+5mM NaZ3, pH 7,0. Antitelo reagensa je ubrizgano u 10 µL (10 µg). Gel proteinski markeri na SEC su iz Bio-Rad (CN#151-1901). Rezultati MS i SEC su sumirani u tabeli 10. Ovi podaci su utvrdili da su antitela dobijena iz hibridoma bila visoko monomerna nakon prečišćavanja. Pored toga, određene su molekulske težine teških i lakih lanaca koji sadrže antitela dobijena iz hibridoma.
B. Određivanje izotipa antitela
[0291] Izotip anti-NGF mAbs je određen korišćenjem Zimed Mouse MonoAb-ID kompleta (Invitrogen catalog # 90-6550 lot # 1407589). Rezultati izotipizacije su sumirani u tabeli 10. Ovi podaci ukazuju da su mišja antitela IgG1/k, IgG2a/k i IgG2b/k sposobna da vežu i neutrališu NGF.
Tabela 10: Izotipizacija, ekskluziona hromatografija i masena spektrometrija anti-NGF antitela
Naziv Nadimak Lot Izotip % Laki lanac Lanac
Primer 9: Kinetika vezivanja anti-NGF antitela
[0292] Analiza biomolekulske interakcije proteina je korišćena da se proceni kinetika vezivanja interakcije između prečišćenih anti-NGF hibridomskih antitela i rekombinantnog
11
psećeg β NGF. Antitela su uhvaćena korišćenjem kozjeg antimišjeg IgG FC (10000 RU) površine koja je direktno imobilizovana na CM5 čipu primenom postupka kuplovanja amina prema uputstvima proizvođača (Biacore). Veličina uzorka od 5 µl antitela u koncentraciji od 1 µg/ml je uhvaćena pri 10 µL/min. Kao antigen je korišćen rekombinantni pseći NGF. Pseći NGF je ubrizgan pri 75 µl/min (opseg koncentracije: 5-0,039 nM) za mišja antitela. Stopa asocijacije je praćena 3,3 minuta, a brzina disocijacije je praćena 10 minuta. Alikvoti psećeg NGF-a su takođe istovremeno ubrizgani preko referentne reakcione CM površine da bi se zabeležila bilo koja nespecifična pozadina vezivanja. Osetljivost instrumenta za merenje uključenja je 1×10<7>, tako da bilo koja stopa uključenja koja je veća od 1×10<7>možda neće biti tačno izmerena; osetljivost instrumenta za stopu isključenja je 1×10<-6>, tako da je bilo koja stopa isključenja sporija od 1x10<-6>možda neće biti tačno izmerena. Dakle, stopa uključenja koja je veća od 1×10<7>se beleži kao >1×10<7>i stopa uključenja koja je sporija od 1×10<-6>se beleži kao <1×10<-6>. Rezultati analize biomolekulske interakcije proteina su sumirani u Tabeli 11. Ovi podaci pokazuju da izolovana mišja anti-NGF mAbs imaju brze stope uključenja (od veće od 7×10<6>) i spore stope isključenja (od manje od 1×10<-3>). Ukupni KD mišjih anti-NGF mAbs kreću se od oko 300 pM do 0.1 pM, što pokazuje efikasno vezivanje prečišćenih anti-NGF hibridomskih antitela za rekombinantni pseći β NGF.
Tabela 11: Kinetika vezivanja anti-NGF mAbs za pseći NGF
11
Primer 10: Metoda za identifikaciju sekvenci anti-NGF antitela iz hibridoma kloniranjem i sekvenciranjem
[0293] Da bi se identifikovala nukleotidna i aminokiselinska sekvenca šest subkloniranih hibridomskih mAbs prikazanih u Tabeli 11, RNK iz pojedinačnih kultura hibridoma je ekstrahovana sa Kiagen RNeasy kompletom (Kiagen, cat. no. 74104). RNK je reverzno transkribovana i sekvence cDNK antitela su amplifikovane korišćenjem Kiagen One-Step
11
RT-PCR kompleta (Kiagen, catalog # 210212). Prednji prajmeri su degenerisani i dizajnirani da se angažuju u varijabilnim regionima (prajmeri teškog lanca: 1HA, 1HB, 1HC, 1HD, 1HE, 1HF; i prajmeri lakog lanca: 1LA, 1LB, 1LC, 1LD, 1LE, 1LF, 1LG) (EMD4 Biosciences catalog # 69896). Reverzni prajmeri su takođe degenerisani i napravljeni do konstantnih regiona gama (teški lanci) i kapa (laki lanci). PCR proizvodi od približno 400-450 parova baza su izolovani u gelu i prečišćeni sa Kiagen kompletom za ekstrakciju gela (Kiagen, cat. br. 28706).
[0294] Prečišćeni PCR proizvodi su klonirani u TOPO TA vektore za kloniranje (Invitrogen, cat. no. K4500-01SC). Svaka reakciona smeša topoizomeraze je korišćena za transformaciju TOP 10 hemijski kompetentnih bakterija i postavljena na LB ploče sa 75 µg/ml ampicilina i 60 µl 2% Bluo-Gal (Invitrogen, cat. no. 15519-028). Izolovane kolonije su sakupljene sa LB ploče za inokulaciju 20 µl LB bujona/100 µg/ml karbenicilina. Jedan µl ove mini-kulture je korišćen u PCR reakciji sa M13 prednjim i reverznim prajmerima za amplifikaciju inserta u TOPO vektoru. PCR proizvodi su razdvojeni na 2% agaroznih gelova; uzorci koji ukazuju na umetak odgovarajuće veličine u vektoru su sekvencionirani korišćenjem Applied Biosystems model 3730S DNK sekvencera. DNK sekvence izvedene iz identifikacije svih varijabilnih domena teškog i lakog mAb mišjih mAb prevedene su u proteinsku sekvencu i prikazane su na Slici 1 do Slici 24.
Primer 11: Modeliranje homologije mišjih anti-NGF antitela
[0295] Sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca svakog anti-NGF antitela su uvezene u InsightII (Accelris, San Diego, CA). Svaka sekvenca je korišćena kao šablon za BLAST da bi se pronašle rendgenske kristalne strukture iz Protein Data Bank (www.rcsb.org) koje su bile najbliže po identičnostu. Jedna struktura za svaki od teških i lakih lanaca je izabrana na osnovu procenta identičnosti i na osnovu tačne dužine svih CDR petlji. Sekvence svakog šablona i svake sekvence upita su usklađene, a standardne tehnike modeliranja homologije korišćene su za konstruisanje homologih modela svakog lanca. Kompleks oba modelirana lanca je zatim minimiziran za 50 ciklusa ograničenog (500 Kcal/Angstrem za sve teške atome) minimizacije gradijenta konjugata korišćenjem CVFF polja sile u programu DISCOVER (Accelris, San Diego, CA).
[0296] Verovatnoća da će dati okvirni ostatak uticati na svojstva vezivanja antitela zavisi od njegove blizine CDR ostacima. Prema tome, korišćenjem modelnih struktura, ostaci koji su unutar 5 Å od bilo kog CDR atoma identifikovani su kao najvažniji i preporučeni su da budu
11
kandidati za zadržavanje mišjeg ostatka u sekvencama kaninizovanih antitela. Promena nukleotida (ili više njih) u mutantnom genu koja obnavlja originalnu sekvencu i stoga se originalni fenotip često naziva povratnom mutacijom. Prema tome, ostatke koji su kandidati za zadržavanje mišjeg ostatka u sekvencama kaninizovanih antitela nazivamo povratnim mutacijama.
Primer 12: Identifikacija psećih sekvenci antitela teškog i lakog lanca iz psećih PBMC
[0297] Da bi se identifikovale aminokiselinske sekvence varijabilnog domena teškog Ig i lamda lakog lanca antitela, RNK je izolovana iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) pasa mešanaca korišćenjem kompleta RNEasy (Kiagen #74104). PBMC iRNK pasa je reverzno transkribovana (RT) sa SuperScript III reverznom transkriptazom (Invitrogen catalog #18080-093) i cDNK su amplifikovane korišćenjem 5' RACE sistema (Rapid Amplification of cDNK Ends) (Invitrogen #18374-058). RT i PCR prajmeri (RK323, RK324, RK122, LG010, LG011, LG012) su opisani u objavi patenta broj US 7,261,890 B2 pod nazivom Methods for Using Canine Immunoglobulin Variable Domains and Caninized Antibodies). Prajmeri RK323 i RK324 su korišćeni za reverznu transkripciju IgG pasa, nakon čega je usledio ugnežđeni PCR sa RK326 i Abridged Anchor Primer (AAP) (Invitrogen). LG011 je korišćen za RT PCR lambda lakog lanca pasa, nakon čega je usledio ugnežđeni PCR sa LG010 i LG012 i AAP.
[0298] Dobijeni PCR proizvodi su razdvojeni elektroforezom u agaroznom gelu. PCR proizvodi od 600 parova baza (lambda i kapa laki lanci pasa) i 800 parova baza (teški lanac Ig pasa) PCR su prečišćeni iz agaroze korišćenjem kompleta za ekstrakciju gela (Kiagen #28706) i klonirani na TA mesto pCR2.1 TOPO vektori koji koriste TOPO-TA sistem kloniranja (Invitrogen #K4500-01SC). Transformisane TOP10 bakterije su odabrane i plazmidna DNK je izolovana korišćenjem Kiaprep Spin Mini-Prep kompleta (Kiagen #27104). Plazmidna DNK iz 25 kolonija teškog lanca, 38 kapa lakog lanca i 23 kolonije lambda lakog lanca je sekvencionirana da bi se identifikovale nukleotidne i odgovarajuće aminokiselinske sekvence. Kompletni podaci o sekvenci varijabilnog domena su dobijeni od 25 klonova teškog lanca, 38 kapa lakog lanca i 19 klonova lambda lakog lanca. Podaci o sekvenci varijabilnog domena uključujući vodeći peptid (kada je identifikovan) prikazani su u tabelama 12, 13 i 14. Sve izvedene sekvence teškog i lakog lanca su jedinstvene u poređenju sa onima otkrivenim u broju publikacije patenta: US 7,261,890 B2.
11
Tabela 12: Sekvence varijabilnog domena teškog lanca pasa izvedene iz pseće PBMC RNK
12
Naziv Niz
Naziv Niz
Tabela 13: Sekvence varijabilnog domena lambda lakog lanca pasa izvedene iz pseće PBMC
RNK
12
Naziv Niz
Naziv Niz
12
Tabela 14: Sekvence varijabilnog domena lakog lanca kapa pasa izvedene iz pseće PBMC
RNK
12
12
12
12
1
11
Primer 13: CDR-graftovanje za stvaranje kaninizovanih monoklonskih antitela
[0299] Da bi se generisale sekvence kaninizovanih antitela od mišjih anti-NGF antitela, svaka sekvenca mišjeg varijabilnog gena teškog lanca antitela je odvojeno poravnata sa 36 sekvenci varijabilnog teškog lanca pseće Ig klicine linije korišćenjem Vector NTI softvera. Izvedeno je jedanaest sekvenci varijabilnog teškog lanca Ig klicine linije pasa iz US Patent No. 7,261,890 B2, (Methods for Using Canine Immunoglobulin Variable Domains and Caninized Antibodies), i 25 varijabilnih sekvenci teškog lanca klicine linije pasa je izvedeno iz Tabele 12 (Sekvence varijabilnog domena teškog lanca pasa izvedene iz pseće PBMC RNK). Svaka sekvenca gena varijabilnog lakog lanca miša je zasebno poravnata sa 68 sekvenci varijabilnog lakog lanca klicine linije (izvedene iz US Patent No. 7,261,890 B2) koristeći Vector NTI softver. Sekvence varijabilnog domena pasa koje imaju najveću ukupnu homologiju sa originalnim mišjim sekvencama su odabrane za svaku sekvencu teškog i lakog lanca da bi se obezbedila okvirna sekvenca. In silico konstrukcija kompletnih CDR graftovanih antitela je postignuta supstitucijom CDR sekvenci varijabilnog domena pasa sa mišjim CDR sekvencama (izvedenim od subkloniranih anti-NGF antitela hibridoma mAbs). Da bi se identifikovali ostaci u svakoj sekvenci, prva aminokiselina u svakoj navedenoj
1 2
sekvenci je definisana kao 1, a svi preostali ostaci su nakon toga uzastopno numerisani korišćenjem Kabat sistema numerisanja.
[0300] CDR sekvence teškog lanca iz PR-1254972 su graftovane in silico na pseći 894 na sledeći način: (1) Jedan N-vezani obrazac glikozilacije (N-{P}-S/T) je pronađen u ovim predloženim konstruktima. (2) Šest povratnih mutacija (K3H, V37I, K46E, D73N, T77N, R83K) je uvedeno da bi se napravila 72.2 VH sekvenca. (3) Jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest gore otkrivenih povratnih mutacija mogu se uvesti u 72.2 VH da bi se održao afinitet antitela na NGF nakon kaninizacije mAb 72.2. (4) Jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest od ovih povratnih mutacija mogu biti zamenjene tokom naknadnog sazrevanja afiniteta 72,2 VH. 72.3 VH je generisan uvođenjem povratnih mutacija u 72.2 VH uz dodatak povratne mutacije H39K.
72.4 VH je generisan uvođenjem povratnih mutacija K3H, H39K, K46E, D73N. CDR sekvence lakog lanca iz PR-1254972 su graftovane in silico na pseći 1001 na sledeći način: (1) Nije pronađen N-vezan obrazac glikozilacije (N-{P}-S/T) u ovim predloženim konstruktima. (2) Četiri povratne mutacije (I2V, V3L, K45K, S59P) su uvedene da bi se napravila sekvenca 72.2 VL. (3) Jedna, dve, tri ili četiri od ovih povratnih mutacija mogu se uvesti u 72.2 VL da bi se održao afinitet antitela na NGF nakon kaninizacije mAb 72.2. (4) Jedna, dve, tri ili četiri od ovih povratnih mutacija mogu biti zamenjene tokom naknadnog sazrevanja afiniteta 72,2 VL. 72.4 VL je generisan uvođenjem povratnih mutacija K45K i S59P.
[0301] CDR sekvence teškog lanca iz PR-1254973 su graftovane in silico na pseći 894 na sledeći način: (1) Nije pronađen N-vezani obrazac glikozilacije (N-{P}-S/T) u ovim predloženim konstruktima. (2) Osam povratnih mutacija (T24A, M48I, V67A, L69V, T73K, N76S, V78A, A93T) je uvedeno da bi se napravila 73.2 VH sekvenca. (3) Jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam od ovih povratnih mutacija se mogu uvesti u 73.2 VH da bi se održao afinitet antitela na NGF nakon kaninizacije mAb 73.2. (4) Jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam od ovih osam povratnih mutacija mogu biti zamenjene tokom naknadnog sazrevanja afiniteta 73,2 VH. 73.4 VH je generisan uvođenjem povratnih mutacija T24A, T73K, A93T. CDR sekvence lakog lanca iz PR-1254973 su graftovane in silico na pseći 1034 na sledeći način: (1) Nije pronađen N-vezani obrazac glikozilacije (N-{P}-S/T) u ovim predloženim konstruktima. (2) Osam povratnih mutacija (I1D, V3K, S22T, F36H, R46L, I48V, D60S, D70K) je uvedeno da bi se napravila sekvenca 73.2 VL. (3) Jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam od ovih povratnih mutacija se mogu uvesti u 73.2 VL da bi se održao afinitet antitela na NGF nakon kaninizacije mAb 73.2. (4) Jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam od ovih osam povratnih mutacija mogu biti zamenjene tokom naknadnog
1
sazrevanja afiniteta 73,2 VL.73.4 VL je generisan uvođenjem povratnih mutacija I1D, V3K, F36H, R46L, D60S, D70K.
[0302] CDR sekvence teškog lanca iz PR-1254977 su graftovane in silico na pseći 894 na sledeći način: (1) Nije pronađen N-vezani obrazac glikozilacije (N-{P}-S/T) u ovim predloženim konstruktima. (2) Osam povratnih mutacija (T24A, K38K, M48I, R66K, V67A, T68S, L69I, V78A) je uvedeno da bi se napravila 77.2 VH sekvenca. (3) Jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam od ovih povratnih mutacija mogu se uvesti u 77.2 VH da bi se održao afinitet antitela na NGF nakon kaninizacije mAb 77.2. (4) Jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam ili osam od ovih povratnih mutacija mogu biti zamenjene tokom naknadnog sazrevanja afiniteta 77,2 VH.77.3 VH je generisan uvođenjem povratnih mutacija u 77.2 VH uz dodatak R94G povratne mutacije. 77.4 VH je generisan uvođenjem povratnih mutacija T24A, K38K i R94G. CDR sekvence lakog lanca iz PR-1254977 su graftovane in silico na pseći 997 na sledeći način: (1) Nije pronađen N-vezan obrazac glikozilacije (N-{P}-S/T) u ovim predloženim konstruktima. (2) Četiri povratne mutacije (L2V, F36I, R46L, S98G) su uvedene da bi se napravila sekvenca 77.2 VL. (3) Jedna, dve, tri ili četiri od ovih povratnih mutacija mogu se uvesti u 77.2 VL da bi se održao afinitet antitela na NGF nakon kaninizacije mAb 77.2. (4) Jedna, dve, tri ili četiri od ovih povratnih mutacija mogu biti zamenjene tokom naknadnog sazrevanja afiniteta 77,2 VL. 77.4 VL je generisan uvođenjem povratnih mutacija F36I i R46L.
[0303] CDR sekvence teškog lanca iz PR-1254981 su graftovane in silico na pseći 876 na sledeći način: (1) Nije pronađen N-vezani obrazac glikozilacije (N-{P}-S/T) u ovim predloženim konstruktima. (2) Šest povratnih mutacija (K46E, G49A, T77N, R83K, L91I, E93T) je uvedeno da bi se napravila 81.2 VH sekvenca. (3) Jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest od ovih povratnih mutacija mogu se uvesti u 81.2 VH da bi se održao afinitet antitela na NGF nakon kaninizacije mAb 81.2. (4) Jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest od ovih šest povratnih mutacija mogu biti zamenjene tokom naknadnog sazrevanja afiniteta 81,2 VH. 81.4 VH je generisan uvođenjem povratnih mutacija K46E, G49A, L91I i E93T.
[0304] CDR sekvence lakog lanca iz PR-1254981 su graftovane in silico na pseći 1011 na sledeći način: (1) Nije pronađen N-vezani obrazac glikozilacije (N-{P}-S/T) u ovim predloženim konstruktima. (2) Četiri povratne mutacije (V3L, A7T, F36I, R46L) su uvedene da bi se napravila sekvenca 81.2 VL. (3) Jedna, dve, tri ili četiri od ovih povratnih mutacija mogu se uvesti u 81.2 VL da bi se održao afinitet antitela na NGF nakon kaninizacije mAb 81.2. (4) Jedna, dve, tri ili četiri od ovih povratnih mutacija mogu biti zamenjene tokom naknadnog sazrevanja afiniteta 81.2 VL.81.4 VL je generisan uvođenjem povratnih mutacija
1 4
A7T, F36I i R46L.
[0305] Alternativno, CDR sekvence teškog lanca iz PR-1254981 su graftovane in silico na pseći 1005 VH na sledeći način: (1) Nije pronađen N-vezani obrazac glikozilacije (N-{P}-S/T) u ovim predloženim konstruktima. (2) Uvedeno je sedam povratnih mutacija (K46E, T77N, F79I, R83K, F91I, V93T, K94R) da bi se napravila 81.5B VH sekvenca. (3) Jedna, dve, tri, četiri, pet, šest ili sedam od ovih povratnih mutacija mogu se uvesti u 81.5B VH da bi se održao afinitet antitela na NGF nakon kaninizacije mAb 81.5B. (4) Jedna, dve, tri, četiri, pet, šest ili sedam od ovih sedam povratnih mutacija mogu biti zamenjene tokom naknadnog sazrevanja afiniteta 81.5B VH. 81.6B je generisan uvođenjem povratnih mutacija K46E, F79I, F91I i V93T. Varijante 81.2B i 81.4B su generisane uvođenjem mutacije A84K u 81.5B i 81.6B, respektivno.
[0306] CDR sekvence teškog lanca iz PR-1254982 su graftovane in silico na pseći 892 na sledeći način: (1) Nije pronađen N-vezani obrazac glikozilacije (N-{P}-S/T) u ovim predloženim konstruktima. (2) Uvedeno je dvanaest povratnih mutacija (I3K, I37V, M48L, I67L, T70S, A71K, G73N, N76S, H77K, L78V, S79F, T93A) da bi se napravila 82.2 VH sekvenca. (3) Jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest ili dvanaest od ovih povratnih mutacija se mogu uvesti u 82.2 VH da bi se održao afinitet antitela na NGF nakon kaninizacije mAb 82.2. (4) Jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest ili dvanaest od ovih povratnih mutacija mogu biti zamenjene tokom naknadnog sazrevanja afiniteta 82,2 VH. 82.4 VH je generisan uvođenjem povratnih mutacija I3K, A71K, H77K, S79F i T93A. CDR sekvence lakog lanca iz PR-1254982 su graftovane in silico na pas 1034 na sledeći način: (1) Nije pronađen N-vezan obrazac glikozilacije (N-{P}-S/T) u ovim predloženim konstruktima. (2) Deset povratnih mutacija (I1D, V3K, S22T, F36I, K45K, R46L, D60S, F71I, T72S, I87F) je uvedeno da bi se napravila sekvenca 82.2 VL. (3) Jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset od ovih povratnih mutacija se mogu uvesti u 82.2 VL da bi se održao afinitet antitela na NGF nakon kaninizacije mAb 82.2. (4) Jedna, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset od ovih povratnih mutacija mogu biti zamenjene tokom naknadnog sazrevanja afiniteta 82,2 VL. 82.3 VH je generisan uvođenjem povratnih mutacija u 82.2 VH uz dodatak povratne mutacije P44V. 82.4 VL je generisan uvođenjem povratnih mutacija I1D, V3K, F36I, K45K, R46L, D60S, F71I i I87F.
Primer 14: Izoelektrična tačka aminokiselina okvira pasa
[0307] Okvirne aminokiseline teškog lanca (tj. ne-CDR aminokiseline) kaninizovanih IgG1
1
kapa antitela daju izračunatu izoelektričnu tačku manju od 8,0. Okvirne aminokiseline lakog lanca, kada je laki lanac kapa, daju izračunatu izoelektričnu tačku manju od 6,5. Izoelektrična tačka kaninizovanih antitela kao celine, odnosno kombinovanog teškog i lakog lanca, zbog okvirnih aminokiselina, i kada je laki lanac kapa, manja je od 8,0. Poređenja radi, okvirne aminokiseline teških lanaca humanog IgG1 tipično daju izoelektrične tačke veće od 8,0. Okvirne aminokiseline ljudskih kapa lakih lanaca obično daju izoelektrične tačke veće od 6,5. Okvirne aminokiseline celih humanih IgG1/k antitela obično daju izoelektrične tačke veće od 8,0.
Primer 15: CDR-graftovanje za stvaranje humanizovanih monoklonskih antitela
[0308] Svaka mišja varijabilna genska sekvenca teškog i varijabilnog lakog lanca antitela (kao što je navedeno u tabeli 14) je zasebno poravnata sa 44 varijabilne sekvence teškog lanca klicine linije humanog imunoglobulina ili 46 sekvenci varijabilnog lakog lanca klicine linije (izvedeno sa veb stranice NCBI Ig Blast koja je dobro poznata stručnjacima) koristeći Vector NTI softver. Sekvence humanog varijabilnog domena koje imaju najveću ukupnu homologiju sa originalnim mišjim sekvencama su odabrane za svaku sekvencu antitela teškog i lakog lanca da bi se obezbedile sekvence 1, 2 i 3 okvira (FV) za potrebe CDR-graftinga. Identifikacija odgovarajućeg ljudskog promenljivog FV4 regiona teškog i lakog lanca (takođe poznatog kao region „spajanja“) je postignuta zasebnim poravnavanjem svakog FV4 regiona teškog lanca i lakog lanca miša sa 6 zametnih linija humanog imunoglobulina koje spajaju teški lanac i 5 zametnih linija koje spajaju laki lanac sekvence u bazi podataka NCBI. In silico konstrukcija kompletnih CDR graftovanih varijabilnih domena je postignuta supstitucijom CDR sekvenci humanog varijabilnog domena (izvedenih sa veb stranice NCBI) sa mišjim CDR sekvencama (izvedenim iz mišjih antitela) uz dodatak FV4 regiona (izvedenog sa veb stranice NCBI) svakom 3' kraj. Dalja humanizacija se može postići identifikacijom povratnih mutacija. Humani Ig pune dužine se može proizvesti ekspresijom varijabilnih domena svakog CDR-graftovanog mAb sa humanim IgG konstantnim domenom unutar okvira. CDR-ovi mišjih anti-NGF mAb kalemljenih na humane Ig okvire (CDR-grafted Anti-NGF Abs) su oni navedeni u Tabeli 15.
1
Tabela 15: CDR-ovi mišjih anti-NGF mAb humanizovani CDR graftovanjem na humani Ig okvir
1
Primer 16: Metoda za konstruisanje mišjih/psećih himernih i kaninizovanih antitela pune dužine
1
[0309] Koristeći konvencionalne tehnike molekularne biologije, fragment cDNK koji kodira konstantni region IgG1 pasa (koji je dobijen iz IMGT<®>, Internacionalni informacioni sistem ImMunoGeneTics, koji je globalna referenca u imunogenetici i imunoinformatici, kreiran od strane Marie-Paule Lefranc (Universite Montepellier 2 i CNRS)) je sintetizovan i vezan za 3' kraj svakog od dobijenih varijabilnih domena teškog lanca od mišjih anti-NGF monoklonskih antitela PR-1254972, PR-1254973, PR-1254977, PR-1254981, PR-1254982. Za ove iste anti-NGF mAbs, cDNK fragment koji kodira konstantni region pseće kapa dobijen od US Patent No. 5,852,183A, (sekvenca ID br. 54) je sintetisan i vezan na 3' kraj svakog od varijabilnih domena lakog lanca. Kompletna sekvenca nukleotida konstantnog domena teškog lanca IgG pasa i sekvenca aminokiselina prikazane su kao SEQ ID NO: 51 i SEQ ID NO: 52, respektivno. Kompletna sekvenca nukleotida konstantnog domena kapa lakog lanca pasa i sekvenca aminokiselina prikazane su kao SEQ ID NO: 53 i SEQ ID NO: 54, respektivno. Kompletne himerne cDNK teškog i lakog lanca su vezane u pHibE ekspresioni plazmid; sekvence ovih himernih mAbs su u Tabeli 15A ispod.
Tabela 15A: Sekvence himernih antitela miša/pasa
1
14
[0310] Nukleotidna sekvenca IgG1 konstantnog regiona pasa takođe je vezana za 3' kraj svake cDNK koja kodira varijabilne domene teškog lanca izvedene iz kaninizovanih anti-NGF monoklonskih antitela 72.2 VH, 72.3 VH, 72.4 VH, 73.2 VH, 7 . 77,2 VH, 77,3 VH, 77,4 VH, 81,2 VH, 81,4 VH, 81,2B, 81,4B, 81,5B, 81,6B, 82,2 VH, 82,4 VH. Prethodno opisana nukleotidna sekvenca konstantnog domena lakog lanca pasa takođe je vezana za 3' kraj svake cDNK koja kodira varijabilne domene lakog lanca izvedene iz kaninizovanih anti-NGF monoklonskih antitela 72.2 VL, 72.4, 73.2 VL, 73.4 VL, 77, 77.4 VL, 81.2 VL, 81.4 VL, 82.2 VL.
[0311] Himerna ili kaninizovana antitela pune dužine su prolazno eksprimirana u 293-6E ćelijama ko-transfekcijom kombinacija pHibE plazmida teškog i lakog lanca. Tabela 17A naglašava sve moguće kombinacije kaninizovanih teških i lakih lanaca koji se mogu kombinovati da bi se proizvelo kaninizovano antitelo prema nazivu u tabeli (Tabela 17A). U tabeli 17A, plazmidi teškog lanca koji kodiraju kaninizovane verzije mišjih teških lanaca navedeni su u gornjoj liniji i nastavljaju udesno. Plazmidi lakog lanca koji kodiraju kaninizovane verzije mišjih lakih lanaca navedeni su u levoj koloni i idu nadole. Na svakoj tački gde se ove kutije ukrštaju, naznačeno je ime koje opisuje potencijalno rezultirajuće kaninizovano antitelo.
Primer 17: Ekspresija i prečišćavanje kaninizovanih monoklonskih antitela
[0312] Odabrani himerni plazmidi teškog i lakog lanca miša/pasa i kaninizovani plazmidi antitela su kotransfektovani u 293-6e ćelije u suspenziji i ostavljeni da rastu 7-8 dana. Supernatanti ćelija su sakupljeni, centrifugirani i filtrirani. Za svako eksprimirano antitelo, supernatant je pomešan sa jednakom zapreminom Pierce vezivnog pufera da bi se izvršila afinitetna hromatografija za protein A sefarozu prema uputstvima proizvođača (GE Healthcare #17-1279-04). Iako se prema nekoliko izvora pseći IgG vezuju direktno za protein A umereno dobro (GE Healthcare Antibody Purification Handbook package insert; Scott, M.A., et.al., Vet Immunol-Immunopatho, 59:205, 1997; Warr, G.W and Hart, I.R., Am J Vet Res, 40:922, 1979; Thermo Scientific Pierce Antibody Production and Purification Technical Handbook) monoklonska pseća mAb se nisu kvantitativno vezala za protein A i stoga se ne mogu prečistiti iz supernatanata bez modifikacije metodologije prečišćavanja proteina A.
[0313] Da bi se omogućilo kvantitativno vezivanje IgG pasa za protein A, supernatanti su koncentrovani i pomešani sa jednakom zapreminom Pierce pufera za vezivanje (Thermo #21007). Koncentrovanim i razblaženim supernatantima, NaCl je dodat do konačne koncentracije od 2,5 M. Supernatant prilagođen NaCl je stavljen na Protein A Sepharose neprekidnim punjenjem preko noći, ispran Pirsovim puferom za vezivanje i eluiran korišćenjem Pierceovog elucionog pufera (Thermo # 21004). Eluati su neutralisani dodavanjem kap po kap 1M Tris pH 8.0; nakon toga neutralizovana antitela su dijalizovana u PBS i količine antitela su kvantifikovane spektrofotometrijski pomoću OD280. Prečišćena količina je matematički podeljena sa ukupnom zapreminom prečišćenog supernatanta ćelije da bi se odredili ukupni procenjeni nivoi ekspresije u ug/mL. Izolacija i prečišćavanje psećih IgG1/k mAbs omogućilo je da se završe studije analitičke karakterizacije mAbs.
[0314] Za prečišćavanje supernatanata velikih razmera (10-15 L), ćelijski supernatanti su koncentrovani, zatim pomešani sa Pierce puferom za vezivanje A (Thermo, catalog # 21001) u odnosu 1 prema 1. Ovoj smeši je dodato 5 M NaCl do 1,3 M konačne koncentracije. pH smeše je podešen na 8,5 sa 10 N NaOH. pH-prilagođene ćelijske supe su stavljene na kolonu za hromatografiju Protein A MabSelect SuRe (GE Healthcare, catalog # 17-5438-03) i eluirane u dva koraka. Prvi korak eluiranja je izveden korišćenjem 20 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 8,0, 7,4 mS/cm. Frakcije koje sadrže antitela su identifikovane pomoću OD280i hromatografijom isključivanja veličine. Da bi se kvantitativno izolovalo preostalo antitelo vezano za kolonu proteina A, drugi korak elucije je izveden korišćenjem Pierce elucionog pufera (Thermo, catalog # 21004), pH 2,7, 3,7 mS/cm, a frakcije koje sadrže antitela su identifikovane pomoću OD280i ekskluzionom hromatografijom. Sve frakcije koje sadrže antitela su neutralizovane korišćenjem 2M Tris pH 8,5, a zatim dijalizovane u PBS. Postupak koji se koristi za prečišćavanje velikih količina ćelijskog supernatanta koji sadrži
14
monoklonska antitela pasa (npr. 10-15 L) razlikuje se od postupka koji se obično koristi za prečišćavanje humanih antitela iz velikih zapremina. Za humana antitela, prečišćavanje proteina A se obično postiže uz uslove vezivanja ćelijskog supernatanta od pH 7,0 do 8,3 i 15 do 20 mS/cm, ispiranje u sličnim uslovima (1 × PBS) i eluiranje humanih antitela u jednom koraku sa 0.1 M sirćetnom kiselinom., 0.15 M natrijum hlorid, pH 2,7 na 15 do 20 mS/cm ili Thermo IgG pufer za eluiranje, pH 2,7, na 15 mS/cm.
[0315] Prečišćena pseća antitela su analizirana masenom spektroskopijom (MS) da bi se potvrdilo da molekulska težina proteina antitela odgovara očekivanoj težini na osnovu sekvence aminokiselina. Pored toga, pseća antitela su analizirana hromatografijom isključivanja veličine (SEC) da bi se odredio procenat monomera. Ovi podaci su ukazivali na to da se mišja/pseća himerna IgG1/k mAbs mogu prolazno eksprimirati u 293-6e ćelijama i da su 81% ili više monomerni nakon prečišćavanja. Ovi podaci su takođe pokazali da kaninizovana IgG1/k mAbs mogu biti prolazno eksprimirana u 293-6e ćelijama i da su u većini slučajeva 80% ili više monomerna nakon prečišćavanja. U nekim slučajevima, ekspresija proteina možda neće biti otkrivena, a u nekim slučajevima prečišćeno kaninizovano mAb je između 24 i 34% monomernih. Podaci su sažeti u tabelama 16 i 17B.
Tabela 16: Podaci o karakterizaciji mišjih/psećih himernih monoklonskih antitela
14
Tabela 17B: Podaci o karakterizaciji kaninizovanih monoklonskih antitela
14
Primer 18: Analiza afiniteta psećih antitela
[0316] Prečišćena himerna antitela miša/pasa i kaninizovana antitela su analizirana na afinitet prema NGF pasa korišćenjem Biacore T100 instrumenta. Kozji anti Canine IgG (Southern Biotech) je imobilisan na 5000-10000 RU na CM5 čipu korišćenjem postupka kuplovanja amina prema uputstvima proizvođača (Biacore). Pseći NGF je ubrizgan pri 50 uL/min u opsegu koncentracija od 50-0.156 nM za himerna antitela miša/pasa ili 10-0.156 nM za kaninizovana antitela. Stopa asocijacije je praćena 5 minuta, a brzina disocijacije je praćena 10-20 minuta. Površina čipa je regenerisana korišćenjem 50-75 uL 10 mM glicina pH 1,5 pri brzini protoka od 50-100 uL/min. Podaci su analizirani korišćenjem softvera Biaevaluation T100, verzija 2.0.2, GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ). Ukupni parametri afiniteta utvrđeni za mišja/pseća himerna antitela su sumirani u tabeli 18, a za kaninizovana antitela u tabeli 19. Ovi podaci ukazuju da izolovana mišja/pseća himerna anti-NGF mAbs imaju brzu stopu uključivanja (od više od 2×10<6>) i spore stope isključenja (od manje od 3×10<3>). Ukupan KDs mišjih/psećih anti-NGF mAbs u rasponu od oko 1300 pM do 1,6 pM. Ovi podaci takođe ukazuju na to da izolovana kaninizovana himerna anti-NGF mAbs imaju brze stope uključivanja (od veće od 6×10<6>) i spore stope isključenja (od manje od 2×10<-4>) . Ukupan KDs kaninizovanih anti-NGF mAbs u rasponu od oko 42 pM do 1,2 pM.
Tabela 18: Parametri afiniteta mišjih/psećih himernih monoklonskih antitela na NGF pasa
14
Tabela 19: Parametri afiniteta kaninizovanih monoklonskih antitela na NGF pasa
Primer 19: Karakterizacija psećih antitela pomoću testa potencije proliferacije ćelija TF-1
[0317] Prečišćena mišja/pseća himerna antitela i kaninizovana antitela su okarakterisana korišćenjem testa potencije proliferacije ćelije TF-1 (prethodno opisanog) korišćenjem 70 pM psećeg NGF u testu. Sumirani podaci o potenciji su u tabelama 20 i 21. Podaci pokazuju da u prisustvu 70 pM psećeg NGF-a, sva himerna anti-NGF antitela miša/pasa pokazuju potencije ispod nM, a sve pokazuju potencije manje od 50 pM. Podaci pokazuju da u prisustvu 70 pM psećeg NGF, neka od kaninizovanih anti-NGF antitela nemaju potenciju neutralizacije na 70
14
pM psećeg NGF. Neka kaninizovana mAb imaju potencije ispod nM, a neka imaju snagu manju od 20 pM.
Tabela 20: Potencija mišjih/psećih himernih NGF monoklonskih antitela na proliferaciju ćelija TF-1 izazvanu NGF kod pasa
Tabela 21: Potencija kaninizovanih NGF monoklonskih antitela na proliferaciju ćelija TF-1 izazvanu NGF kod pasa (N/A = nije primenljivo)
Primer 20: Karakterizacija rastvorljivosti i stabilnosti kaninizovanih anti-NGF antitela
[0318] Dobijeni su osnovni rastvori dva kaninizovana anti-NGF antitela (73,2 pseći IgG1/k i 82,4 pseći IgG1/k). [Da li su ovo kanonizovani Abs proizvedeni u pr. 13?] Antitela su formulisana u fiziološkom rastvoru fosfatnog pufera (PBS) u koncentracijama ispod 5 mg/ml (PBS sadrži, ali nije ograničen na, sledeće sastojke: 15 mM fosfatnog pufera i 150 mM natrijum hlorida pri pH 7,4).
Rastvorljivost:
1
[0319] Rastvorljivost kaninizovanih antitela u visokim koncentracijama u PBS-u je procenjena koncentrovanjem antitela sa Amicon 30K centrifugalnim filterima za ekskluziju na osnovu molekulske težine. Konačne koncentracije su određene UV apsorpcijom.
[0320] Na sobnoj temperaturi, 73,2 psećeg IgG1/k bilo je rastvorljivo do najmanje 54 mg/ml, a 82,4 psećeg IgG1/k bilo je rastvorljivo do najmanje 83 mg/ml. Kada se čuva na 5°C tokom 5 sati pri tim koncentracijama, 73,2 psećeg IgG1/k formiralo je sloj gela na dnu spremnika, dok je 82,4 psećih IgG1/k ostalo kao uniforman rastvor. Kada se ponovo uravnoteži na sobnu temperaturu, 73,2 psećeg IgG1/k postao je uniforman rastvor. Kada je 73,2 psećeg IgG1/k razblaženo do 27 mg/ml, ostalo je kao uniformni rastvor na 5°C.
[0321] Za poređenje, adalimumab, humano antitelo, pokazao je rastvorljivost od najmanje 150 mg/ml na 5°C i na sobnoj temperaturi. Ovo je primećeno u formulaciji sa pH od 7 i sa koncentracijom natrijum hlorida od 150 mM. Zapažanja su opisana u tabeli 22.
Tabela 22: Rastvorljivost 73,2 psećih IgG1/k, 82,4 psećih IgG1/k i humanog antitela adalimumaba u PBS.
[0322] Rastvorljivost 73,2 psećeg IgG1/k 82,4 psećeg IgG1/k je takođe procenjena u 15 mM histidinskom puferu pH 6,0. Ovo je pufer koji se obično koristi za formulisanje humanih terapeutskih antitela. PBS pufer koji se sastoji od osnovnih rastvora 73,2 psećih IgG1/k i 82,4 psećih IgG1/k zamenjen je histidinskim puferom korišćenjem Amicon 30K centrifugalnih filtera za ekskluziju na osnovu molekulske težine. Posle razmene pufera, antitela su pokazala belu precipitaciju i rastvorljivost manju od 2 mg/ml na sobnoj temperaturi, što je određeno UV apsorbancijom. Za poređenje, primećeno je da ljudsko antitelo adalimumab dostiže
1 1
koncentraciju od najmanje 150 mg/ml u 15 mM histidinskom puferu pH 6,0 na sobnoj temperaturi. Ova zapažanja su rezimirana u tabeli 23.
Tabela 23: Rastvorljivost anti-NGF kaninizovanih antitela 73,2 psećeg IgG1/k, 82,4 psećeg IgG1/k i humanog antitela adalimumab u 15 mM histidinskom puferu pH 6,0.
Stabilnost pri zamrzavanju-odmrzavanju
[0323] Urađena je procena stabilnosti zamrzavanja-odmrzavanja (FT) 73,2 psećeg IgG1/k i 82,4 psećeg IgG1/k u PBS, a nakon razblaženja sa PBS do 1 mg/ml. Oba antitela su zamrznuta na -80°C najmanje 4 sata. Zatim su odmrznuta u vodenom kupatilu na 30°C (ovo predstavlja jedan ciklus zamrzavanja-odmrzavanja). Stabilnost je procenjena za četiri ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja sa ekskluzionom HPLC (SEC). Analiza zamrzavanja-odmrzavanja je sažeta u tabeli 24.
Tabela 24: Stabilnost zamrzavanja-odmrzavanja 73,2 psećih IgG1/k i 82,4 psećih IgG1/k pri 1 mg/ml u PBS.
1 2
Stabilnost pri skladištenju i stabilnost pri ubrzanim uslovima skladištenja:
[0324] Procenjena je stabilnost 73,2 psećeg IgG1/k i 82,4 psećeg IgG1/k kada se formuliše u koncentraciji od 10 mg/mL i unutar pH opsega od 5 do 8 i na niskim (~ 7,5 mM) i visokim (~> 150 mM)) jonskim jačinama. Stabilnost u ovim uslovima je procenjena praćenjem stabilnosti antitela u sledećim puferima i koncentracijama soli: (A) 15 mM acetat pH 5; (B) 15 mM acetat pH 5 150 mM NaCl; (C) 15 mM histidina pH 6 150 mM NaCl; (D) 15 mM fosfata pH 7,4; (E) PBS pH 7,4; (F) 15 mM Tris pH 7,5; (G) 15 mM Tris pH 8,0. Natrijumazid (0,02 %) je dodat svim puferima kao antimikrobni agens.
[0325] Osnovni rastvori 73,2 psećeg IgG1/k i 82,3 psećeg IgG1/k u PBS-u su koncentrovani do 15 mg/ml korišćenjem 30K centrifugalnih filtera ekskluziju na osnovu molekulske težine. Zatim su dijalizovani u odnosu na pufere navedene iznad tokom 18 sati korišćenjem minidijaliznih epruveta za dijalizu sa molekulskom težinom od 1 kDa (GE Healthcare). Nakon dijalize, uzorci su razblaženi odgovarajućim puferima do konačne koncentracije od 10 mg/ml. 150 µl svakog uzorka je alikvotirano u krio-ovionice koje su zatim čuvane na 40°C ili 5°C. Uzorci su analizirani u vreme = 0 sati (T0), 7 dana (T7d) i 21 dan (T21d), a stabilnost je procenjena pomoću SEC.
[0326] Posle 21 dana na 40°C, ubrzano testiranje stabilnosti pokazalo je da 73,2 pseći IgG1/k i 82,3 pseći IgG1/k imaju mnogo veću fragmentaciju pri pH vrednostima ispod 7,4 nego pri pH vrednostima iznad 7,4. Za poređenje, humano antitelo adalimumab, pokazalo je manju fragmentaciju u pH opsegu od 4 do 8 tokom 21 dana na 40°C. Konkretno, fragmentacija adalimumaba pri pH 6 bila je mnogo manja od fragmentacije 73,2 psećeg IgG1/k ili 82,4 psećeg IgG1/k pri pH 6. Takođe, adalimumab u uslovima većeg stresa od pH 4 pokazao je jednaku ili manju fragmentaciju u poređenju sa 73,2 pseći IgG1/k ili 82,4 pseći IgG1/k pri nižim stresnim uslovima pH 5. Rezultati analize stabilnosti i profila fragmentacije prikazani su, respektivno, u tabelama 25 i 26. Ovi podaci sugerišu da pseća IgG1/k monoklonska
1
antitela imaju drugačiji profil razgradnje u poređenju sa humanim IgG1/k monoklonskim antitelima. Konkretno, čini se da je fragmentacija opsežnija za pseća IgG1/k antitela nego za ljudska antitela na pH 6 i niže.
Tabela 25: Podaci o stabilnosti iz SEC-a za 73,2 pseći IgG1/k, 82,4 pseći IgG1/k i humano antitelo adalimumab u različitim formulacijama na 7 i 21 dan na 5°C i na 40°C.
1 4
1
Tabela 26: Profil fragmentacije iz SEC-a za 73,2 pseći IgG1/k, 82,4 pseći IgG1/k i humano antitelo adalimumab u različitim formulacijama na 21 dan i na 40°C.
Antitelo Buffer Povećanje procenta fragmentacije
1
Primer 21: PK studija jedne doze kod pasa i test premošćavanja antigena za analizu uzorka PK seruma
[0327] Nivoi u serumu od 73,2 psećeg IgG1/k i 82,4 psećeg IgG1/k su analizirani nakon pojedinačne doze od 4,5 mg/kg (intravenski ili subkutano) kod pasa mešanaca. Nakon injekcije, prikupljeno je 13 uzoraka venske krvi tokom 672 sata. Uzorci krvi su ostavljeni da se zgrušaju, a serum je uklonjen za kvantifikaciju antitela.
[0328] Razvijen je test premošćavanja NGF za kvantitaciju psećih anti-NGF mAbs u serumu. Ploče sa 96 bunarčića obložene streptavidinom (MSD #L11SA-1) su blokirane blokatorom A (MSD #R93BA-4). Pseće anti-NGF antitelo prisutno u serumu (ili u PBS) je pomešano sa ekvi-molarnim odnosima NGF-a označenog biotinom i NGF-a označenog sulfo (Sulfo reagens MSD #R91AN-1) i inkubirano da bi se formirao kompleks NGF antitelo. Konačna koncentracija biotinom obeleženog NGF i sulfo-označenog NGF u testu bila je između 1-2 nM. Kompleksi NGF-antitela su dodati na ploču obloženu streptavidinom i ostavljeni da se vežu 60 minuta. Nakon inkubacije, ploče su isprane sa PBS plus 0.05% Tween-20, a vezani kompleksi NGF-antitela su detektovani u Read Buffer T (MSD #R92TC-1) na MSD SECTOR Imager 6000. Podaci su kvantitifikovani da bi se procenila ukupna količina antitelo u ug/mL tečnosti uzorka i dato je ispod u Tabelama 27-30.
Tabela 27: Koncentracije 82,4 psećeg IgG1/k u serumu nakon jedne potkožne doze
1
Tabela 28: Koncentracije 82,4 psećeg IgG1/k u serumu nakon jedne intravenske doze
1
Pas # 1072705 1073804 1073303 1073903 1074502
Tabela 29: Koncentracije 73,2 psećeg IgG1/k u serumu nakon jedne potkožne doze Pas # 1072607 1074307 1072606 1074503
Tabela 30: Koncentracije 73,2 psećeg IgG1/k u serumu nakon jedne intravenske doze
1
Primer 22: Farmakokinetička analiza podataka o koncentraciji u serumu
[0329] Farmakokinetički parametri i za intravenski (IV) i za subkutani (SC) put doziranja su izračunati za svaku životinju korišćenjem WinNonlin softvera (Pharsight Corporation, Mountain Viev, CA) nekompartmentalnom analizom. Drugi proračuni, npr. srednja vrednost, standardna devijacija (SD) i procenat subkutane bioraspoloživosti (F: %) su sprovedeni korišćenjem Microsoft Ekcel softvera (Microsoft Corporation Redmond, WA). Podaci su prikazani u tabeli 31 i 32.
Tabela 31: Farmakokinetička analiza 73,2 psećeg IgG1/k nakon jedne intravenske doze
1
Tabela 32: Farmakokinetička analiza 82,4 psećeg IgG1/k nakon jedne intravenske doze
[0330] Podaci pokazuju da pseći mAbs 73.2 i 82.4 imaju poluživot od oko 8 do oko 15 dana kada se daju IV ili SC, što sugeriše da ovi molekuli pokazuju poluživot poput antitela sisara i ukupni PK parametri.
Primer 23: ELISA za titraciju psećih antitela
[0331] Da bi se kvantifikovala pseća antitela u ćelijskim supernatantima (ili drugim tečnostima), EIA ploče sa visokim stepenom vezivanja (Costar #9018) su obložene poliklonalnim kozjim anti-psećim IgG antitelima (Rockland #604-1102) u 4 ug/ml u PBS. Nakon blokiranja sa 2% nemasnog mleka u PBS, pseća monoklonska antitela su dodata na ploče i ploče su isprane sa PBS plus 0.05% Tween-20. Vezana pseća mAb detektovana su sa HRP-označenim kozjim anti-psećim IgG antitelima (Rockland #604-1302) pri 0.1 ug/ml. Ploče su isprane sa PBS plus 0.05% Tween-20. Pseća mAbs detektovana su dodavanjem TMB supstrata (Neogen #308177), a reakcija je zaustavljena sa 1N HCl. Vezana pseća antitela su kvantifikovana apsorpcijom na 450 nM da bi se procenila ukupna količina antitela u ug/mL tečnosti uzorka.
[0332] Ovo otkriće se odnosi na tehnike dobro poznate u oblasti molekularne biologije. Ove tehnike uključuju, ali nisu ograničene na, tehnike opisane u sledećim publikacijama:
1 1
Ausubel, F.M. et al. eds., Short Protocols In Molecular Biology (4th Ed.1999) John Wiley & Sons, NY. (ISBN 0-471-32938-X).
Lu and Weiner eds., Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis (2001) BioTechniques Press.
Westborough, MA. 298 pp. (ISBN 1-881299-21-X). Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York.790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).
Old, R.W. & S.B. Primrose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering (3d Ed. 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology; V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4).
Sambrook, J. et al. eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Ed.1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3. (ISBN 0-87969-309-6).
Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers, NY (translated by Horst Ibelgaufts). 634 pp. (ISBN 0-89573-614-4).
[0333] Iako je veći broj primera izvođenja, aspekata i karakteristika prethodno opisan, stručnjaci sa iskustvom u tehnici će shvatiti da se modifikacije i varijacije opisanih realizacija i karakteristika mogu napraviti bez odstupanja od predmetnog otkrića ili otkrića kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima.
1 2
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sposoban da se specifično veže za faktor rasta nerva (NGF) koji sadrži:
a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži:
(a) region 1 za određivanje komplementarnosti (CDR1) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 61;
(b) region 2 za određivanje komplementarnosti (CDR2) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 62; i
(c) region 3 za određivanje komplementarnosti (CDR3) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 63; i
b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži:
(a) region 1 za određivanje komplementarnosti (CDR1) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 64;
(b) region 2 za određivanje komplementarnosti (CDR2) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 65; i
(c) region 3 za određivanje komplementarnosti (CDR3) koji se sastoji od aminokiselinske sekvence kao što je navedeno u SEQ ID NO: 66; pri čemu je Koffkonstanta najviše 10<-3>s<-1>mereno rezonancom površinskog plazmona.
2. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sposoban da se specifično veže za faktor rasta nerva (NGF) koji sadrži:
a) varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnost sekvence sa amino kiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 166; i SEQ ID NO: 197; i
b) varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa amino kiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 172; i SEQ ID NO: 196;
pri čemu je Koffkonstanta najviše 10<-3>s<-1>mereno rezonancom površinskog plazmona.
3. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time da
2 2
varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 90% identičnost sekvence sa SEQ ID NO: 37 i varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 38.
4. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time da varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 166 i varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90 % identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 172.
5. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva naznačeno time da je pomenuto antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen izabran iz grupe koju čine: molekul imunoglobulina, disulfidno vezani Fv, monoklonsko antitelo, scFv, himerno antitelo, jednodomensko antitelo, CDR-graftovano antitelo, diatelo, humanizovano mAb, kaninizovano mAb, pseće mAb, mačje mAb, felinizovano mAb, konjsko mAb, ekvinizovano mAb, multispecifično antitelo, Fab, dvostruko specifično antitelo, DVD-Ig, Fab', bispecifično antitelo, a F(ab')2 i a Fv.
6. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time da je pomenuto antitelo ili antigen-vezujući fragment monoklonsko antitelo.
7. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time da je pomenuto antitelo ili antigen-vezujući fragment kaninizovano mAb.
8. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time da je pomenuto antitelo ili antigen-vezujući fragment humanizovano mAb.
9. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da antitelo ili antigen-vezujući fragment sadrži konstantni domen teškog lanca izabran iz grupe koju čine: IgM konstantni domen, IgG4 konstantni domen, IgG1 konstantni domen, IgE konstantni domen, IgG2 konstantni domen, IgG3 konstantni domen i IgA konstantni domen.
10. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, naznačen time da je konstantni domen teškog lanca izabran između konstantnog domena humanog imunoglobulina ili konstantnog domena psećeg imunoglobulina.
11. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži konstantni region koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 52 i SEQ ID NO: 54.
12. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time da je antitelo ili antigen-vezujući fragment sposoban da moduliše biološku funkciju NGF.
13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent.
14. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13 za upotrebu u postupku lečenja subjekta koji pati od poremećaja u kome je aktivnost NGF štetna, a postupak obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine pomenutog antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta.
2 4
RS20220295A 2010-08-19 2011-08-19 Anti-ngf antitela i njihova upotreba RS63063B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37519310P 2010-08-19 2010-08-19
EP18153957.8A EP3333188B1 (en) 2010-08-19 2011-08-19 Anti-ngf antibodies and their use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63063B1 true RS63063B1 (sr) 2022-04-29

Family

ID=44773134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220295A RS63063B1 (sr) 2010-08-19 2011-08-19 Anti-ngf antitela i njihova upotreba

Country Status (15)

Country Link
US (4) US9505829B2 (sr)
EP (3) EP3333188B1 (sr)
JP (5) JP6121903B2 (sr)
AU (1) AU2011291462A1 (sr)
CA (1) CA2808577C (sr)
DK (1) DK3333188T3 (sr)
ES (2) ES2665954T3 (sr)
HR (1) HRP20220405T1 (sr)
HU (1) HUE058226T2 (sr)
LT (1) LT3333188T (sr)
PL (1) PL3333188T3 (sr)
PT (1) PT3333188T (sr)
RS (1) RS63063B1 (sr)
SI (1) SI3333188T1 (sr)
WO (1) WO2012024650A2 (sr)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140186361A1 (en) * 2012-09-07 2014-07-03 Coherus Biosciences, Inc. Stable Aqueous Formulations of Adalimumab
DK1575517T3 (da) * 2002-12-24 2012-05-14 Rinat Neuroscience Corp Anti-ngf-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse af samme
SI2350075T1 (sl) 2008-09-22 2014-06-30 Array Biopharma, Inc. Substituirane imidazo (1,2b)piridazinske spojine kot Trk kinazni inhibitorji
CN102264736B (zh) 2008-10-22 2013-08-14 阵列生物制药公司 作为TRK激酶抑制剂的取代的吡唑并[1,5-a]嘧啶化合物
AR077468A1 (es) 2009-07-09 2011-08-31 Array Biopharma Inc Compuestos de pirazolo (1,5 -a) pirimidina sustituidos como inhibidores de trk- quinasa
BR122019024201B1 (pt) 2010-05-20 2021-08-03 Array Biopharma Inc Composto macrocíclico como inibidores de trk quinase, seu uso, e composição farmacêutica
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
US9783601B2 (en) 2010-12-01 2017-10-10 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
SG10201500957QA (en) * 2011-05-06 2015-04-29 Nvip Pty Ltd Anti-nerve growth factor antibodies and methods of preparing and using the same
CA2835094C (en) * 2011-05-06 2020-12-22 David Gearing Anti-nerve growth factor antibodies and methods of preparing and using the same
GB2504889C (en) * 2011-05-06 2015-08-26 Nvip Pty Ltd Therapeutic canine immunoglobulins and methods of using the same
PT3498732T (pt) * 2011-05-06 2022-02-02 Zoetis Services Llc Anticorpos anti-fator de crescimento do nervo e método para preparação e utilização dos mesmos
AU2012252152B2 (en) * 2011-05-06 2016-07-07 Zoetis Services Llc Anti-nerve growth factor antibodies and methods of preparing and using the same
GB201114858D0 (en) * 2011-08-29 2011-10-12 Nvip Pty Ltd Anti-nerve growth factor antibodies and methods of using the same
US9580496B2 (en) 2011-05-06 2017-02-28 Nexvet Australia Pty Ltd Therapeutic canine immunoglobulins and methods of using same
KR20160105535A (ko) * 2012-03-07 2016-09-06 카딜라 핼쓰캐어 리미티드 TNF-α 항체의 약제학적 제형
US9617334B2 (en) 2012-06-06 2017-04-11 Zoetis Services Llc Caninized anti-NGF antibodies and methods thereof
US9499621B2 (en) * 2013-04-08 2016-11-22 Cytodyn, Inc. Felinized antibodies and methods of treating retroviral infections in felines
US9500598B2 (en) 2013-10-07 2016-11-22 Micro Measurement Laboratories, Inc. Challenge sets and methods of making and using the same
TWI746426B (zh) 2014-11-16 2021-11-21 美商亞雷生物製藥股份有限公司 (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-二氟苯基)-吡咯啶-1-基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-3-羥基吡咯啶-1-甲醯胺硫酸氫鹽結晶型
EP3954710A3 (en) * 2015-04-02 2022-07-20 Intervet International B.V. Antibodies to canine interleukin-4 receptor alpha
EP3344294A4 (en) * 2015-08-31 2019-03-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania CHIMERIC AAV ANTI-VEGF FOR THE TREATMENT OF CANCER IN DOGS
EP3368039A1 (en) 2015-10-26 2018-09-05 The Regents of The University of Colorado, A Body Corporate Point mutations in trk inhibitor-resistant cancer and methods relating to the same
UA125026C2 (uk) 2016-04-04 2021-12-29 Локсо Онколоджі, Інк. РІДКІ КОМПОЗИЦІЇ (S)-N-(5-((R)-2-(2,5-ДИФТОРФЕНІЛ)ПІРОЛІДИН-1-ІЛ)ПІРАЗОЛО[1,5-a]ПІРИМІДИН-3-ІЛ)-3-ГІДРОКСИПІРОЛІДИН-1-КАРБОКСАМІДУ
UA125025C2 (uk) 2016-04-04 2021-12-29 Локсо Онколоджі, Інк. Способи лікування дитячих ракових захворювань
US11071782B2 (en) 2016-04-20 2021-07-27 Coherus Biosciences, Inc. Method of filling a container with no headspace
MX392604B (es) 2016-05-18 2025-03-24 Array Biopharma Inc Procesos para la preparacion de (s)-n-(5-((r)-2-(2,5-difluorofenil)pirrolidin-1-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il)-3-hidroxipirrolidin-1-carboxamida y sales del mismo.
WO2018071718A1 (en) * 2016-10-14 2018-04-19 Nima Labs, Inc. Anti-gliadin antibodies
JOP20190092A1 (ar) 2016-10-26 2019-04-25 Array Biopharma Inc عملية لتحضير مركبات بيرازولو[1، 5-a]بيريميدين وأملاح منها
JOP20190213A1 (ar) 2017-03-16 2019-09-16 Array Biopharma Inc مركبات حلقية ضخمة كمثبطات لكيناز ros1
KR20200054300A (ko) * 2017-09-21 2020-05-19 메르크 파텐트 게엠베하 Fgf-18 모이어티를 포함하는 융합 단백질
BR112020017701A2 (pt) * 2018-03-12 2020-12-29 Zoetis Services Llc Anticorpos anti-ngf e métodos dos mesmos
EP3848450A4 (en) 2018-10-01 2022-06-29 Kataoka Corporation Cell culture tool and method for manufacturing cell culture tool
GB2578867A (en) 2018-10-09 2020-06-03 Genome Res Ltd Animal models and therapeutic molecules
JP7469305B2 (ja) 2018-11-19 2024-04-16 バイオサイトジェン ファーマシューティカルズ （ベイジン） カンパニー リミテッド 抗ｐｄ－１抗体およびその使用
IL297287A (en) 2020-04-17 2022-12-01 Zoetis Services Llc Canine antibody variants
EP4136109A1 (en) 2020-04-17 2023-02-22 Zoetis Services LLC Feline antibody variants
AU2020204105B2 (en) * 2020-06-19 2023-06-08 Dartsbio Pharmaceuticals Ltd. Anti-human ngf antibodies and methods using same
US11655292B2 (en) 2020-06-23 2023-05-23 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Anti-human NGF antibodies and methods using same
KR20220011931A (ko) * 2020-07-22 2022-02-03 (주)지아이이노베이션 IgE Fc 수용체를 포함하는 융합단백질 및 이를 포함하는 개 알레르기성 질환 치료 용도
CN116003590A (zh) * 2020-08-06 2023-04-25 熙源安健医药（上海）有限公司 抗ngf抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用
CA3194936A1 (en) 2020-09-28 2022-03-31 Zoetis Services Llc Canine antibody variants
IL301414A (en) 2020-09-29 2023-05-01 Zoetis Services Llc Feline antibody variants
KR20230104157A (ko) * 2020-10-07 2023-07-07 조에티스 서비시즈 엘엘씨 항-ngf 항체 및 그의 사용 방법
US20230391862A1 (en) * 2020-10-22 2023-12-07 Scout Bio, Inc. Method of suppressing immune response to vector-delivered therapeutic protein
CA3202331A1 (en) * 2020-12-18 2022-06-23 Stephanie A. Pierce Tnf alpha and ngf antibodies for veterinary use
CA3232382A1 (en) * 2021-09-27 2023-03-30 Zoetis Services Llc Anti- tgf.beta.1,2,3 antibodies and therapeutic uses thereof
US20250011410A1 (en) * 2021-11-23 2025-01-09 Invetx, Inc. Anti-ngf antibodies and uses thereof
AU2023289332A1 (en) * 2022-06-21 2024-12-12 Zoetis Services Llc Canine antibody mutants

Family Cites Families (207)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US938A (en) 1838-09-22 Improvement in paddle-wheels for propelling boats
US4526A (en) 1846-05-16 Improvement in the mode o
US225A (en) 1837-06-03 Machine fob
US5258A (en) 1847-08-28 Cooking-stove
US5780A (en) 1848-09-19 Improvement in preparing shoe-pegs
US498A (en) 1837-12-01 Improvement in mode of constructing saw-cylinders for cotton-gins
US4230691A (en) 1978-05-23 1980-10-28 The Massachusetts General Hospital Nerve growth factor antibody and process
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
EP0092918B1 (en) 1982-04-22 1988-10-19 Imperial Chemical Industries Plc Continuous release formulations
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
DE3587814T2 (de) 1985-03-30 1994-11-10 Marc Ballivet Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren.
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
AU3418389A (en) 1988-03-28 1989-10-16 Regents Of The University Of California, The Nerve growth factor peptides
AU4058489A (en) 1988-08-08 1990-03-05 Michael A. Iffiu Collapsible recumbent bicycle with streamlined three-part folding canopy
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DE68927933T2 (de) 1988-09-02 1997-08-14 Dyax Corp Herstellung und auswahl von rekombinantproteinen mit verschiedenen bindestellen
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
FI903489A7 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Yhden osan sisältävät ligandit, näitä ligandeja sisältävät reseptorit, menetelmiä niiden valmistamiseksi sekä ligandien ja reseptorien käytt ö
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8905669D0 (en) 1989-03-13 1989-04-26 Celltech Ltd Modified antibodies
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
EP0478627A4 (en) 1989-05-16 1992-08-19 William D. Huse Co-expression of heteromeric receptors
AU640397B2 (en) 1989-08-25 1993-08-26 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Dog-mouse heterohybridoma and gene fragment coding for constant region of canine immunoglobulin
US5656435A (en) 1989-08-28 1997-08-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to peptides having NGF-like activity, said antibodies having no substantial cross-reactivity with NGF, and use thereof
AU6430190A (en) 1989-10-10 1991-05-16 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
CA2071867A1 (en) 1989-11-06 1991-05-07 Edith Mathiowitz Method for producing protein microspheres
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5242937A (en) 1990-03-19 1993-09-07 Research Corporation Technologies, Inc. Topically active ocular thiadiazole sulfonamide carbonic anhydrase inhibitors
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
ES2139598T3 (es) 1990-07-10 2000-02-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de miembros de parejas de union especifica.
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
EP0544809B1 (en) 1990-08-24 1998-12-16 Ixsys, Inc. Methods of synthesizing oligonucleotides with random codons
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
US5147294A (en) 1990-10-01 1992-09-15 Trustees Of Boston University Therapeutic method for reducing chronic pain in a living subject
FR2669336B1 (fr) 1990-11-20 1993-01-22 Adir Nouveaux derives d'oxazolo pyridines, leurs procedes de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
CA2097309A1 (en) 1990-11-30 1992-05-31 Peter S. Distefano Immunoassay and monoclonal antibodies useful for detecting truncated nerve growth factor receptor
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
IE914504A1 (en) 1990-12-20 1992-07-01 Ixsys Optimization of binding proteins
DE69233697T2 (de) 1991-03-01 2008-01-24 Dyax Corp., Cambridge Verfahren zur Entwicklung von bindenden Mikroproteinen
PT100379B (pt) 1991-04-10 1999-01-29 Scripps Research Inst Bibliotecas de receptores heterodimericos usando fagomideos
JPH06507404A (ja) 1991-05-01 1994-08-25 ヘンリー　エム．ジャクソン　ファウンデイション　フォー　ザ　アドバンスメント　オブ　ミリタリー　メディスン 感染性の呼吸性疾患の治療方法
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US6797492B2 (en) 1991-05-17 2004-09-28 Merck & Co., Inc. Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
JPH07503124A (ja) 1991-06-14 1995-04-06 ゾーマ・コーポレーション 微生物によって生産される抗体断片とそれらの複合体
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5350576A (en) 1991-09-13 1994-09-27 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates for controlling acarides
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
JP3540315B2 (ja) 1991-09-23 2004-07-07 メディカル リサーチ カウンシル キメラ抗体の製造−組合せアプローチ
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
WO1993011794A1 (en) 1991-12-13 1993-06-24 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5342942A (en) 1992-06-09 1994-08-30 Warner-Lambert Company Pyrazoloquinazolone derivatives as neurotrophic agents
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5604260A (en) 1992-12-11 1997-02-18 Merck Frosst Canada Inc. 5-methanesulfonamido-1-indanones as an inhibitor of cyclooxygenase-2
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
AU6132994A (en) 1993-02-02 1994-08-29 Scripps Research Institute, The Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
US5409944A (en) 1993-03-12 1995-04-25 Merck Frosst Canada, Inc. Alkanesulfonamido-1-indanone derivatives as inhibitors of cyclooxygenase
US6180377B1 (en) 1993-06-16 2001-01-30 Celltech Therapeutics Limited Humanized antibodies
US5436265A (en) 1993-11-12 1995-07-25 Merck Frosst Canada, Inc. 1-aroyl-3-indolyl alkanoic acids and derivatives thereof useful as anti-inflammatory agents
US5474995A (en) 1993-06-24 1995-12-12 Merck Frosst Canada, Inc. Phenyl heterocycles as cox-2 inhibitors
US5565352A (en) 1993-11-24 1996-10-15 Arch Development Corporation Deubiquitinating enzyme: compositions and methods
US5753225A (en) 1993-12-03 1998-05-19 The Regents Of The University Of California Antibodies that mimic actions of neurotrophins
JPH09506262A (ja) 1993-12-08 1997-06-24 ジェンザイム・コーポレイション 特異的抗体の製造方法
ES2201097T3 (es) 1994-01-31 2004-03-16 Trustees Of Boston University Bibliotecas de anticuerpos policlonales.
GB9402331D0 (en) 1994-02-07 1994-03-30 Univ Mcgill Nerve growth factor structural analogs and their uses
US5844092A (en) 1994-03-18 1998-12-01 Genentech, Inc. Human TRK receptors and neurotrophic factor inhibitors
US5877016A (en) 1994-03-18 1999-03-02 Genentech, Inc. Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors
US6291247B1 (en) 1994-05-11 2001-09-18 Queen's University At Kingston Methods of screening for factors that disrupt neurotrophin conformation and reduce neurotrophin biological activity
US5475995A (en) 1994-05-16 1995-12-19 Livingston; George G. Truck spare tire locking rod
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
GB9514160D0 (en) 1994-07-25 1995-09-13 Zeneca Ltd Aromatic compounds
US5616601A (en) 1994-07-28 1997-04-01 Gd Searle & Co 1,2-aryl and heteroaryl substituted imidazolyl compounds for the treatment of inflammation
US5521213A (en) 1994-08-29 1996-05-28 Merck Frosst Canada, Inc. Diaryl bicyclic heterocycles as inhibitors of cyclooxygenase-2
US5448082A (en) 1994-09-27 1995-09-05 Opto Diode Corporation Light emitting diode for use as an efficient emitter or detector of light at a common wavelength and method for forming the same
US5593994A (en) 1994-09-29 1997-01-14 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Prostaglandin synthase inhibitors
ATE252894T1 (de) 1995-01-05 2003-11-15 Univ Michigan Oberflächen-modifizierte nanopartikel und verfahren für ihre herstellung und verwendung
US5552422A (en) 1995-01-11 1996-09-03 Merck Frosst Canada, Inc. Aryl substituted 5,5 fused aromatic nitrogen compounds as anti-inflammatory agents
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
AU705616B2 (en) 1995-04-21 1999-05-27 Cell Genesys, Inc. Generation of large genomic DNA deletions
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5604253A (en) 1995-05-22 1997-02-18 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzylindol-3-yl propanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors
US5510368A (en) 1995-05-22 1996-04-23 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzyl-3-indoleacetic acids as antiinflammatory drugs
US5639780A (en) 1995-05-22 1997-06-17 Merck Frosst Canada, Inc. N-benzyl indol-3-yl butanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5693735A (en) 1995-07-12 1997-12-02 Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. Trimethylsiloxy group-containing polysiloxane and a process for producing the same
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
AU710347B2 (en) 1995-08-31 1999-09-16 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
AU3695295A (en) 1995-10-25 1997-05-15 Queen's University At Kingston Neurotrophin antagonists
US6331431B1 (en) 1995-11-28 2001-12-18 Ixsys, Inc. Vacuum device and method for isolating periplasmic fraction from cells
GB9525180D0 (en) 1995-12-08 1996-02-07 Univ Mcgill Design of hormone-like antibodies with agonistic and antagonistic fuctions
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
ATE239041T1 (de) 1996-02-09 2003-05-15 Basf Ag Humane antikörper welche an humanen tnfalpha binden
US5985320A (en) 1996-03-04 1999-11-16 The Penn State Research Foundation Materials and methods for enhancing cellular internalization
TR199801731T2 (xx) 1996-03-05 1999-02-22 Children's Hospital Medical Center Siklooksijenaz önleyicileri olarak merkapto türevleri.
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
GB9616105D0 (en) 1996-07-31 1996-09-11 Univ Kingston TrkA binding site of NGF
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
AU728523C (en) 1996-10-21 2001-08-09 Nps Pharmaceuticals, Inc. Neurotrophin antagonist compositions
US6284794B1 (en) 1996-11-05 2001-09-04 Head Explorer Aps Method for treating tension-type headache with inhibitors of nitric oxide and nitric oxide synthase
EP1972194A1 (en) 1996-12-03 2008-09-24 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
DE69732306T2 (de) 1997-01-16 2006-01-12 Massachusetts Institute Of Technology, Cambridge Zubereitung von partikelhaltigen arzneimitteln zur inhalation
IL131016A (en) 1997-01-21 2004-12-15 Gen Hospital Corp Selection of proteins using RNA-protein blends
US6194167B1 (en) 1997-02-18 2001-02-27 Washington State University Research Foundation ω-3 fatty acid desaturase
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
AU8691398A (en) 1997-08-04 1999-02-22 Ixsys, Incorporated Methods for identifying ligand specific binding molecules
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
KR20010034554A (ko) 1998-03-03 2001-04-25 레이몬드, 엠. 위티 치료제로서의 ｃｄ147 결합 분자
US6504013B1 (en) 2000-02-01 2003-01-07 Idexx Laboratories, Inc. Canine allergy therapeutic recombinant chimeric anti-IgE monoclonal antibody
GB9807781D0 (en) 1998-04-09 1998-06-10 Univ Bristol Therapeutic agent
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
ES2198922T3 (es) 1998-06-24 2004-02-01 Advanced Inhalation Research, Inc. Particulas porosas grandes emitadas por un inhalador.
JP2002522063A (ja) 1998-08-17 2002-07-23 アブジェニックス インコーポレイテッド 増加した血清半減期を有する改変された分子の生成
ES2706547T3 (es) 1998-12-23 2019-03-29 Pfizer Anticuerpos monoclonales humanos para CTLA-4
MXPA01009363A (es) 1999-03-18 2002-06-04 Merck Patent Gmbh Proteina para bloquear la adhesion de plaquetas.
BR0009323A (pt) 1999-03-25 2002-01-08 Knoll Gmbh Anticorpos humanos que ligam a il-12 humana e métodos para a produção
US6492380B1 (en) 1999-05-17 2002-12-10 Queen's University At Kingston Method of inhibiting neurotrophin-receptor binding
IT1306704B1 (it) 1999-05-26 2001-10-02 Sirs Societa Italiana Per La R Anticorpi monoclonali e suoi derivati sintetici o biotecnologici ingrado di agire come molecole antagoniste per il ngf.
US6399780B1 (en) 1999-08-20 2002-06-04 Cephalon, Inc. Isomeric fused pyrrolocarbazoles and isoindolones
EP1130098A3 (en) 2000-02-29 2003-09-10 Pfizer Products Inc. Mammalian osteoregulins
US6548062B2 (en) 2000-02-29 2003-04-15 Cephalon, Inc. Method of treating cancer with anti-neurotrophin agents
US6703360B2 (en) 2000-04-07 2004-03-09 Heska Corporation Compositions and methods related to canine IgG and canine IL-13 receptors
FR2807660A1 (fr) 2000-04-13 2001-10-19 Warner Lambert Co Utilisation d'antagonistes du ngf pour la prevention ou le traitement de douleurs viscerales chroniques
EP1278778A2 (en) 2000-05-03 2003-01-29 Amgen Inc., Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents
US7022484B2 (en) 2000-06-08 2006-04-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for treating neuropathological states and neurogenic inflammatory states and methods for identifying compounds useful therein
US7220840B2 (en) 2000-06-16 2007-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator protein
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US7029872B2 (en) 2000-06-28 2006-04-18 Glycofi, Inc Methods for producing modified glycoproteins
EP1345968A2 (en) 2000-12-28 2003-09-24 Altus Biologics Inc. Crystals of whole antibodies and fragments thereof and methods for making and using them
US7117096B2 (en) 2001-04-17 2006-10-03 Abmaxis, Inc. Structure-based selection and affinity maturation of antibody library
KR20100132559A (ko) 2001-05-30 2010-12-17 제넨테크, 인크. 다양한 질환의 치료에 유용한 항-엔지에프 항체
US20030008807A1 (en) 2001-06-14 2003-01-09 The Regents Of The University Of California Novel signaling pathway for the production of inflammatory pain and neuropathy
US20030031671A1 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Sydney Welt Methods of treating colon cancer utilizing tumor-specific antibodies
WO2003022261A1 (en) 2001-09-13 2003-03-20 Miller Kenneth E Method of alleviating pain
US20030186374A1 (en) 2001-10-01 2003-10-02 Hufton Simon E. Multi-chain eukaryotic display vectors and uses thereof
US7393648B2 (en) 2001-12-03 2008-07-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Hybrid antibodies
CA2469833C (en) * 2001-12-21 2008-05-20 Idexx Laboratories, Inc. Canine immunoglobulin variable domains, caninized antibodies, and methods for making and using them
US20060078533A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Omoigui Osemwota S Method of prevention and treatment of aging and age-related disorders including atherosclerosis, peripheral vascular disease, coronary artery disease, osteoporosis, arthritis, type 2 diabetes, dementia, alzheimer's disease and cancer
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
EP1545615A4 (en) 2002-10-04 2006-03-01 Rinat Neuroscience Corp METHODS OF TREATING CARDIAC ARRHYTHMIA AND PREVENTING DEATH OF CARDIAC ARRHYTHMIA USING NGF ANTAGONISTS
UA80447C2 (en) 2002-10-08 2007-09-25 Methods for treating pain by administering nerve growth factor antagonist and opioid analgesic
WO2004032870A2 (en) 2002-10-08 2004-04-22 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating post-surgical pain by admisnistering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same
US7255860B2 (en) 2002-10-08 2007-08-14 Rinat Neuroscience Corp. Methods for treating post-surgical pain by administering an anti-nerve growth factor antagonist antibody
US7569364B2 (en) 2002-12-24 2009-08-04 Pfizer Inc. Anti-NGF antibodies and methods using same
DK1575517T3 (da) 2002-12-24 2012-05-14 Rinat Neuroscience Corp Anti-ngf-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse af samme
US20060147932A1 (en) 2003-01-18 2006-07-06 Alun Davies Methods of screening for modulators of nerve growth factor
KR20050111598A (ko) 2003-02-19 2005-11-25 리나트 뉴로사이언스 코퍼레이션 신경 성장 인자 길항제 및 ｎｓａｉｄ를 투여함으로써통증을 치료하는 방법 및 그것을 함유하는 조성물
UA97086C2 (uk) 2003-07-15 2012-01-10 Емджен, Інк. Виділене людське антитіло, яке специфічно зв'язується з фактором росту нервової тканини (ngf)
US20050042664A1 (en) 2003-08-22 2005-02-24 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
ITRM20030601A1 (it) 2003-12-24 2005-06-25 Lay Line Genomics Spa Metodo per l'umanizzazione di anticorpi e anticorpi umanizzati con esso ottenuti.
KR101637908B1 (ko) 2004-04-07 2016-07-11 리나트 뉴로사이언스 코프. 신경성장인자 길항제의 투여에 의한 골암 통증의 치료방법
ME00226B (me) * 2004-07-15 2011-02-10 Medarex Llc Humana anti-ngf neutrališuća antitijela kao selektivni inhibitori ngf signalne kaskade
JP5096167B2 (ja) 2005-01-24 2012-12-12 メドイミューン リミテッド Ｎｇｆに対する特異的結合メンバー
WO2006108863A2 (en) 2005-04-13 2006-10-19 Thomson Licensing Process for scalable coding of images
ITRM20050290A1 (it) 2005-06-07 2006-12-08 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di inibire il legame tra ngf e il suo recettore trka come analgesici ad effetto prolungato.
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CA2673533A1 (en) 2006-10-13 2008-04-17 Centocor Ortho Biotech Inc. Enhancement of hybridoma fusion efficiencies through cell synchronization
PL2187964T3 (pl) 2007-08-10 2015-03-31 Regeneron Pharma Ludzkie przeciwciała o wysokim powinowactwie przeciw ludzkiemu czynnikowi wzrostu nerwu
JP5737944B2 (ja) 2007-12-17 2015-06-17 ファイザー・リミテッドＰｆｉｚｅｒ Ｌｉｍｉｔｅｄ 間質性膀胱炎の治療
ES2579231T3 (es) 2008-01-15 2016-08-08 Abbvie Inc Vectores de expresión de mamíferos mejorados y usos de los mismos
WO2009091972A2 (en) 2008-01-18 2009-07-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemically modified oligonucleotides and small molecules for use in reducing micro rna activity levels and uses thereof
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
WO2009150623A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Pfizer Inc Treatment of chronic prostatitis
EP2331579B1 (en) 2008-09-04 2017-07-05 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013542716A (ja) 2013-11-28
JP2023025172A (ja) 2023-02-21
DK3333188T3 (da) 2022-03-07
ES2910305T3 (es) 2022-05-12
EP4056589A1 (en) 2022-09-14
CA2808577C (en) 2018-09-25
JP6121903B2 (ja) 2017-04-26
CA2808577A1 (en) 2012-02-23
EP3333188B1 (en) 2022-02-09
JP2019176857A (ja) 2019-10-17
US20160264656A1 (en) 2016-09-15
US20180362629A1 (en) 2018-12-20
US9505829B2 (en) 2016-11-29
PL3333188T3 (pl) 2022-05-09
EP2606067B1 (en) 2018-02-21
US10125192B2 (en) 2018-11-13
AU2011291462A1 (en) 2013-03-14
US20130330348A1 (en) 2013-12-12
US10093725B2 (en) 2018-10-09
WO2012024650A2 (en) 2012-02-23
HRP20220405T1 (hr) 2022-05-27
PT3333188T (pt) 2022-03-28
JP6891217B2 (ja) 2021-06-18
WO2012024650A3 (en) 2012-05-31
EP2606067A2 (en) 2013-06-26
US20160002324A1 (en) 2016-01-07
ES2665954T3 (es) 2018-04-30
JP2021052785A (ja) 2021-04-08
SI3333188T1 (sl) 2022-04-29
JP2017176178A (ja) 2017-10-05
HUE058226T2 (hu) 2022-07-28
EP3333188A1 (en) 2018-06-13
LT3333188T (lt) 2022-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6891217B2 (ja) 抗ｎｇｆ抗体およびその使用
AU2016270640B2 (en) Anti-CD40 antibodies and uses thereof
TW201307387A (zh) ＴＮＦ－α結合蛋白
JP2012531902A (ja) ポリペプチドおよび治療の方法
AU2017206283B2 (en) Anti-NGF antibodies and their use
HK1248718B (en) Anti-cd40 antibodies and uses thereof