RS63178B1 - Upotreba fgfr mutantnih genskih panela u identifikovanju pacijenata sa karcinomom koji će reagovati na lečenje sa inhibitorom fgfr - Google Patents

Upotreba fgfr mutantnih genskih panela u identifikovanju pacijenata sa karcinomom koji će reagovati na lečenje sa inhibitorom fgfr

Info

Publication number
RS63178B1
RS63178B1 RS20220400A RSP20220400A RS63178B1 RS 63178 B1 RS63178 B1 RS 63178B1 RS 20220400 A RS20220400 A RS 20220400A RS P20220400 A RSP20220400 A RS P20220400A RS 63178 B1 RS63178 B1 RS 63178B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
fgfr
fgfr3
fgfr2
primers
Prior art date
Application number
RS20220400A
Other languages
English (en)
Inventor
Jayaprakash Karkera
Suso Jesus Platero
Original Assignee
Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54337343&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63178(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Janssen Pharmaceutica Nv filed Critical Janssen Pharmaceutica Nv
Publication of RS63178B1 publication Critical patent/RS63178B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/498—Pyrazines or piperazines ortho- and peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinoxaline, phenazine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Ovde su obezbeđene metode identifikovanja pacijenta sa karcinomom koji će reagovati na lečenje sa inhibitorom receptora fibroblastnog faktora rasta.
POZADINA PRONALSKA
[0002] Identifikacija genetskih abnormalnosti može biti korisna u selekciji odgovarajućeg (ih) terapeutika (a) za pacijente sa karcinomom. Ovo je takođe korisno za pacijente sa karcinomom koji ne uspevaju u glavnoj terapijskoj opciji (terapiji na prvoj liniji) za tu vrstu karcinoma, naročito ako ne postoji prihvaćeni standard brige za drugu i naknadnu linijsku terapiju. Receptori fibroblastnih faktora rasta (FGFRi) su familija receptora tirozinskih kinaza uključenih u regulisanju preživljavanja ćelija, proliferacije, migracije i diferencijacije. Promene FGFR su uočene kod nekih karcinoma. Do danas, ne postoje odobrene terapije koje su efikasne kod pacijenata sa promenama FGFR.
[0003] US2013/296326 opisuje metod kojim se traže genetske varijacije unutar gena koji kodira FGFR2. WO2014/071419 i WO2014/113729 obezbeđuju FGFR fuzione gene i inhibitore za FGFR2 za upotrebu u primenjivanju kod pacijenata sa karcinomom. Wu et al. identifikuje FGFR fuzione proteine i njihov efekat na lečenje karcinoma. Trudel et al. identifikuje određenu mutaciju unutar gena koji kodira FGFR3. WO2014/007369 identifikuje fuzione transkripte unutar okvira između gena FGFR2 i, između ostalog, BICC1. EP1659175 obezbeđuje nalaz da mutacije unutar gena FGFR3 daju osetljivost na lečenje neoplastičnih bolesti sa inhibitorima na FGFR3. WO2014/018841 obezbeđuje metod u kome se lečenje karcinoma sa inhibitorima FGFR odvija u slučaju mutiranog gena FGFR3. WO2013/179034 obezbeđuje metod u kome FGFR3 obuhvata aktivirajuće mutacije. Singh et al se fokusiraju na efekat FGFR3:TACC3 fuzionih gena i proteina u kontekstu inhibitora FGFR od glioblastoma. Parker et al opisuju kako tumorogena fuzija gena FGFR3-TACC3 izbegava regulaciju miR99a u glioblastomu. Williams et al. opisuju onkogene fuzije gena FGFR3 kod karcinoma mokraćne bešike. WO2014/051022 obezeđuje fuzioni protein FGFR3:BAIAP21L. Sabnis et al. identifikuje višestruke FGFR fuzione proteine kod različitih karcinoma. WO2013/089882 obezbeđuje metod vizualizacije fuzionog proteina FGFR2:AFF3 i naknadnu aplikaciju inhibitora puta fuzije gena. Shinmura et al opisuju novu somatsku mutaciju FGFR3 u primarnom karcinomu pluća. EP1964837 razmatra primenu inhibitora FGFR3 na pacijentima koji pate od karcinoma. Unosi u bazu podataka Geneseq sa EBI pristupnim brojevima GSN:BAT14432 i GDN:ATM46802 obezbeđuju PCR prajmere za fuziju gena FGFR3-TACC3 i ciljne sekvence humane FGFR2 mRNK, respektivno.
REZIME
[0004] Pronalazak obezbeđuje metod za identifikovanje pacijenta sa karcinomom mokraćne bešike koji reaguje na lečenje sa inhibitorom receptora fibroblastnog faktora rasta (FGFR), pri čemu inhibitor FGFR sadrži jedinjenje koji ima strukturu Formule (I),
njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat, i pri čemu metod obuhvata:
(a) procenjivanje biološkog uzorka od pacijenta za FGFR mutant iz panela FGFR mutantnog gena, pri čemu je FGFR mutant polimorfizam jednog nukleotida FGFR FGFR3 S249C, i pri čemu navedena procena obuhvata amplifikovanje cDNK sa parom prajmera koji se vežu i umnožavaju jedan ili više FGFR mutanata iz panela FGFR mutantnog gena; i utvrđivanje da li su jedan ili više FGFR mutanata iz panela FGFR mutantnog gena prisutni u uzorku, pri čemu prisustvo jednog ili više FGFR mutanata od kojih bi jedan mutant bio FGFR3 S249C, ukazuje na to da pacijent reaguje na lečenje sa FGFR inhibitorom; ili,
(b) procenjivanje biološkog uzorka od pacijenta za prisustvo jednog ili više FGFR mutanata iz panela FGFR mutantnog gena, pri čemu je FGFR mutant FGFR polimorfizam jednog nukleotida FGFR FGFR3 S249C, pri čemu prisustvo jednog ili više FGFR mutanata ukazuje da pacijent reaguje na lečenje sa inhibitorom FGFR.
[0005] Ovdje su otkrivene metode identifikovanja pacijenta sa karcinomom koji će reagovati na lečenje sa inhibitorom receptora fibroblastnog faktora rasta (FGFR) koji obuhvata:
procenjivanje biološkog uzorka od pacijenta za FGFR mutant iz panela FGFR mutantnog gena, pri čemu je FGFR mutant fuzioni gen FGFR ili polimorfizam jednog nukleotida FGFR, i pri čemu navedeno procenjivanje obuhvata amplifikovanje cDNK sa parom prajmera koji se vezuju za i amplificiraju jedan ili više FGFR mutanata iz panela FGFR mutantnog gena; i
određivanje da li su jedan ili više FGFR mutanata iz genskog panela prisutni u uzorku, pri čemu prisustvo jednog ili više FGFR mutanata ukazuje da će pacijent reagovati na lečenje sa inhibitorom FGFR.
[0006] Takođe su otkrivene metode lečenja karcinoma kod pacijenata koje uključuju: procenu biološkog uzorka od pacijenta na prisustvo jednog ili više FGFR mutanata iz panela FGFR mutantnog gena; i lečenje pacijenta sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više FGFR mutanta.
[0007] Kompleti i prajmeri za identifikovanje prisustva jednog ili više FGFR mutantnih gena u biološkom uzorku su dalje obezbeđeni ovde.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0008] Rezime, kao i sledeći detaljni opis, dalje je razumljiv kada se čita zajedno sa priloženim crtežima. U svrhu ilustrovanja otkrivenih metoda, kompleta, i prajmera, na crtežima su prikazani primeri izvođenja metoda, kompleta i prajmera; međutim, metode, kompleti i prajmeri nisu ograničeni na otkrivena specifična izvođenja. Na crtežima:
SL. 1 je ilustracija primera FGFR fuzionih gena, od kojih prisustvo najmanje jednog ukazuje na to da će pacijent reagovati na lečenje sa inhibitorom FGFR. Takođe ilustrovane (male strelice) su primerne lokacije prajmera za amplifikovanje fuzionih gena.
SL. 2, sadržavajući SLIKE 2A-2I, predstavlja rezultate Sangerovog sekvenciranja iz FFPET uzoraka pozitivnih na: A) FGFR3:TACC3 v1; B) FGFR3:TACC3 v3; C) FGFR3:TACC3 Intron; D) FGFR3:BAIAP2L1; E) FGFR2:AFF3; F) FGFR2:BICC1; G) FGFR2:CASP7; H) FGFR2:CCDC6; i I) FGFR2:OFD1.
SL. 3 ilustruje primer strategije za SNP-specifičan qRT-PCR korišćenjem 3’ dideoksi divlji tip (WT) blokator oligonukleotida.
SL. 4 ilustruje primer strategije analitičke validacije za otkrivanje FGFR SNP-a. Eksperimenti su izvedeni na inženjerisanim RK3E ćelijskim linijama koje eksprimiraju fuzije FGFR i razblažene u ćelijsku liniju divljeg tipa koja ne sadrži fuzije FGFR3/FGFR2.
SL. 5, sadržavajući SLIKE 5A-5D, ilustruje SNP-specifičan PCR sa dideoksi WT blokatorom za (a) G370C, (B) Y373C, (C) S249C i (D) R248C.
SL. 6, sadržavajući SLIKE 6A-6I, predstavlja standardne krive efikasnosti za testove FGFR fuzije gena: A) FGFR3:TACC3 v1; B) FGFR3:TACC3 v3; C) FGFR3:TACC3 Intron; D) FGFR3:BAIAP2L1; E) FGFR2:AFF3; F) FGFR2:BICC1; G) FGFR2:CASP7; H) FGFR2:CCDC6; i I) FGFR2:OFD1.
SL. 7 je primer prikaza statusa FGFR fuzionog gena u bešici (primarni i metastatski), NSCLC (adenokarcinom i skvamozni), jajnicima, jednjaku (primarni i metastatski), glavi i vratu (H&N; primarni i metastatski), endometrijumu (metastatski), dojci i karcinom prostate.
SL.8 je primerni prikaz FGFR fuzionog gena i statusa mutacije u NSCLC adenokarcinomu i karcinomu skvamoznih ćelija.
SL. 9, sadržavajući SLIKE 9A-9D, predstavlja primerne rezultate iz uzoraka pacijenata faze I. Testovi su izvedeni korišćenjem kontrole sintetičkog uzorka testa (ST), prajmera za GAPDH (uzorak kontrole kvaliteta) ili prajmera specifičnih za: A) FGFR2:BICC1 fuzije; B) FGFR3:TACC3 (ekson 18: ekson 1) fuzije; C) FGFR2:CCDC6 fuzije; ili D) FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3 ili FGFR2:CCDC6 fuzije. Uzorci pacijenata su sledeći: A - urotelialni karcinom; B -karcinom mokraćne bešike; C - holangiokarcinom; i D - karcinom nadbubrežne žlezde.
SL. 10 predstavlja primer dizajna studije faze I za prvu studiju JNJ-42756493 na ljudima kod pacijenata sa uznapredovalim solidnim tumorom.
SL.11 predstavlja maksimalni inhibitorni procenat smanjenja zbira prečnika ciljanih lezija u odnosu na osnovnu liniju sa nivoom doze većim ili jeDNKkim do 6 mg. Pacijenti sa solidnim tumorom su lečeni sa inhibitorom FGFR JNJ-42756493 u različitim dozama primenjenim ili kao dnevni režim ili kao povremeni režim doziranja (7 dana na - 7 dana pauze). Indikovane su doze i vrste tumora. Smanjenje tumora je mereno prema RECIST kriterijumu. Čini se da su pacijenti čiji tumori sadrže translokacije i mutacije FGFR gena osetljiviji na FGFR inhibitor JNJ-42756493.
SL.12 ilustruje ekspresiju različitih FGFR fuzija u RK3E ćelijama stabilno transfektovanim sa naznačenom FGFR fuzijom.
SL. 13, sadržavajući SLIKE 13A-13B, ilustruje testove formacije kolonije u RK3E ćelijama stabilno transfektovanim sa naznačenom FGFR fuzijom. (A) 0.1% krezil kristalno ljubičasto obojene komore sa 6 jažica i (B) trakasti grafikon koji ilustruje broj kolonija/100 ćelija na ploči. Rezultati su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta.
SL. 14, sadržavajući SLIKE 14A-14H, ilustruje stabilnu ekspresiju primernih nizvodnih ciljeva u RK3E ćelijama stabilno transfektovanim naznačenom fuzijom FGFR.
DETALJAN OPIS ILUSTROAVNIH IZVOĐENJA
[0009] Otkrivene metode, kompleti i prajmeri mogu se lakše razumeti pozivanjem na sledeći detaljni opis dat u vezi sa pratećim slikama, koje čine deo ovog otkrića. Podrazumeva se da otkrivene metode, kompleti i prajmeri nisu ograničeni na specifične metode, komplete i prajmere opisane i/ili prikazane ovde, i da je terminologija korišćena ovde u svrhu opisivanja određenih izvođenja kao primer i nije namera da bude ograničavanje metoda, kompleta i prajmera za koje se traži zaštita.
[0010] Pozivanje na određenu numeričku vrednost uključuje najmanje tu konkretnu vrednost, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Kada je izražen raspon vrednosti, drugo izvođenje uključuje od jedne određene vrednosti i/ili do druge određene vrednosti. Dalje, upućivanje na vrednosti navedene u rasponima uključuje svaku vrednost unutar tog raspona. Svi rasponi su uključivi i mogu se kombinovati.
[0011] Treba uzeti u obzir da se određene karakteristike otkrivenih metoda, kompleta i prajmera koji su, radi jasnoće, ovde opisani u kontekstu odvojenih izvođenja, takođe mogu dati u kombinaciji u jednom izvođenju. Suprotno tome, različite karakteristike opisanih metoda, kompleta i prajmera koji su, radi kratkoće, opisani u kontekstu jednog izvođenja, takođe mogu biti obezbeđeni odvojeno ili u bilo kojoj podkombinaciji.
[0012] Kao što se ovde koriste, oblici jednine "a", "an" i "the" uključuju množinu.
[0013] Sledeće skraćenice se koriste u celoj specifikaciji: FGFR (receptor fibroblastnih faktora rasta); LLOQ (donja granica kvantitacije); FGFR3:TACC3 (fuzija između gena koji kodiraju FGFR3 i transformišući kiselu upredenu zavojnicu koja sadrži protein 3); FGFR3:BAIAP2L1 (fuzija između gena koji kodiraju FGFR3 i moždano specifičnog inhibitora angiogeneze 1-povezanog sa proteinom 2 sličnom proteinu 1); FGFR2:AFF3 (fuzija između gena koji kodiraju FGFR2 i AF4/FMR2 familiju, član 3); FGFR2:BICC1 (fuzija između gena koji kodiraju FGFR2 i bikaudalni C homolog 1); FGFR2: CASP7 (fuzija između gena koji kodiraju FGFR2 i kaspazu 7); FGFR2:CCDC6 (fuzija između gena koji kodiraju FGFR2 i domen upredene zavojnice koja sadrži 6); FGFR2:OFD1 (fuzija između gena koji kodiraju FGFR2 i oralno-facijalnog digitalnog sindroma 1); FFPET (Tkivo ugrađeno u parafin fiksirano formalinom); SNP (polimorfizam jednog nukleotida); NSCLC (Nemaloćelijski karcinom pluća), ct (prag ciklusa).
[0014] Kao što se ovde koristi, "lečenje" i slični termini se odnose na smanjenje nivoa težine oboljenja i/ili učestalosti simptoma karcinoma, uklanjanje simptoma karcinoma i/ili osnovnog uzroka navedenih simptoma, smanjenje učestalosti ili verovatnoće simptoma karcinoma i/ili njihovog osnovnog uzroka, i poboljšanje ili saniranje štete uzrokovane, direktno ili indirektno, karcinom.
[0015] "Biološki uzorci" se odnose na bilo koji uzorak od pacijenta u kojem se mogu dobiti kancerogene ćelije i izolovana RNK. Pogodni biološki uzorci uključuju, ali nisu ograničeni na, krv, limfnu tečnost, koštanu srž, čvrsti uzorak tumora ili bilo koju kombinaciju od njih. U nekim izvođenjima, biološki uzorak može biti FFPET.
[0016] Kao što se ovde koristi, "pre-amplifikacija" se odnosi na PCR postupak koji se izvodi pre koraka amplifikacije da bi se povećala količina šablonske cDNK za korak amplifikacije. Korak pre-amplifikacije može biti izveden, na primer, korišćenjem tzv. "TaqMan® PreAmp Master Mix" (Life Technologies/Applied Biosystems® product # 4391128).
[0017] Kao što se ovde koristi, "amplifikovanje", "amplifikovati" i slični termini se odnose na generisanje brojnih identičnih kopija uzorka nukleinske kiseline. Pogodne tehnike za amplifikovanje uzorka nukleinske kiseline uključuju, ali nisu ograničene na, reakciju lančane polimeraze (PCR) i reakciju lančane polimeraze u realnom vremenu (RT-PCR). U nekim izvođenjima, korak amplifikovanja obuhvata RT-PCR.
FGFR mutanti
[0018] Kao što se ovde koristi, fraza "FGFR mutant" se odnosi na fuzioni gen FGFR, polimorfizam jednog nukleotida FGFR ili oboje.
[0019] "FGFR fuzija" ili "FGFR fuzioni gen" se odnosi na gen koji kodira FGFR (npr. FGRF2 ili FGFR3), ili njegov dio, i jedan od ovde otkrivenih fuzionih partnera, ili njegov deo, stvoren translokacijom između dva gena. Prisustvo jednog ili više od sledećih FGFR fuzionih gena u biološkom uzorku od pacijenta može biti determinisano korišćenjem otkrivenih metoda: FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 Intron, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6, FGFR2:OFD1, ili bilo koje kombinacije od njih. Tabela 1 daje FGFR fuzione gene i FGFR i eksone partnera fuzije koji su fuzionisani. SL.1 daje ilustraciju različitih FGFR fuzionih gena. Sekvence individualnih FGFR fuzionih gena su otkrivene u Tabeli 16.
Tabela 1
[0020] "Polimorfizam jednog nukleotida FGFR" (SNP) se odnosi na gen FGFR2 ili FGFR3 u kojem se jedan nukleotid razlikuje među pojedinim. Konkretno, polimorfizam jednog nukleotida FGFR" (SNP) se odnosi na gen FGFR3 u kojem se jedan nukleotid razlikuje među pojedinim. Prisustvo jednog ili više sledećih FGFR SNPa u biološkom uzorku od pacijenta može biti determinisan korišćenjem otkrivenih metoda: FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C, FGFR3 Y373C, ili bilo koje kombinacije od njih. Sekvence FGFR SNPa su date u Tabeli 2.
Tabela 2
[0021] Kao što se ovde koristi, "FGFR mutantni genski panel" uključuje jedan ili više od iznad navedenih FGFR mutanata. Ponekad, FGFR mutantni genski panel zavisi od vrste karcinoma pacijenta.
[0022] FGFR mutantni panel koji se koristi u koraku evaluacije otkrivenih metoda je delimično, zasnovan na vrsti karcinoma pacijenta. Za pacijente sa karcinomom mokraćne bešike, pogodan FGFR mutantni genski panel može sadržavati FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C, ili FGFR3 Y373C, ili bilo koju kombinaciju od njih.
[0023] Za pacijente sa metastatskim karcinomom mokraćne bešike, pogodan FGFR mutantni genski panel može sadržavati FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C, ili FGFR3 Y373C, ili bilo koju kombinaciju od njih.
Primeri za amplifikovanje FGFR mutanata
[0024] Prosečan stručnjak u ovoj oblast tehnike zna da amplifikacija nukleinske kiseline zahteva prajmere koji su komplementarni i vezuju se na 5’ i 3’ regiju lanca nukleinske kiseline koja okružuje regiju koja se želi amplificirati. Kao što se ovde koristi, "par prajmera" se odnosi na prednji i reverzni prajmer koji se koriste u koraku amlofikovanja. Parovi prajmera pogodni za izvođenje otkrivenih metoda su navedeni u Tabeli 3.
Tabela 3
[0025] Ovde su otkriveni prajmeri koji imaju sekvencu nukleinske kiseline SEK ID BR:5, SEK ID BR:6, SEK ID BR:7, SEK ID BR:8, SEK ID BR:9, SEK ID BR:10, SEK ID BR:11, SEK ID BR:12,:13, SEK ID BR:14, SEK ID BR:15, SEK ID BR:16, SEK ID BR:17, SEK ID BR:18, SEK ID BR:19, SEK ID BR:20, SEK ID BR:21, SEK ID BR:22, SEK ID BR:23, SEK ID BR:24, SEK ID BR:25, SEK ID BR:26, SEK ID BR:27, SEK ID BR:28, SEK ID BR:29, SEK ID BR:30, SEK ID BR:31, SEK ID BR:32, SEK ID BR:33, SEK ID BR:34, SEK ID BR:35, SEK ID BR:36, SEK ID BR:37, SEK ID BR:38, ili bilo koju kombinaciju od njih.
[0026] Ovde su takođe otkriveni setovi prajmera koji imaju sekvence SEK ID BR:5 i SEK ID BR:6, SEK ID BR:7 i SEK ID BR:8, SEK ID BR:9 i SEK ID BR:10, SEK ID BR:11 i SEK ID BR:12, SEK ID BR:13 i SEK ID BR:14, SEK ID BR:15 i SEK ID BR:16, SEK ID BR:17 i SEK ID BR:18, SEK ID BR:19 i SEK ID BR:20, SEK ID BR:21 i SEK ID BR:22, SEK ID BR:23 i SEK ID BR:24, SEK ID BR:25 i SEK ID BR:26, SEK ID BR:27 i SEK ID BR:28, SEK ID BR:29 i SEK ID BR:30, SEK ID BR:31 i SEK ID BR:32, SEK ID BR:33 i SEK ID BR:34, SEK ID BR:35 i SEK ID BR:36, SEK ID BR:37 i SEK ID BR:38, ili bilo koju kombinaciju od njih.
[0027] U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR:5 i SEK ID BR:6. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR:7 i SEK ID BR:8. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR:9 i SEK ID BR:10. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR:11 i SEK ID BR:12. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR:13 i SEK ID BR:14. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR:15 i SEK ID BR:16. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR:17 i SEK ID BR:18. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR 19 i SEK ID BR:20. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR:21 i SEK ID BR:22. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR:23 i SEK ID BR:24. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR:25 i SEK ID BR:26. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR:27 i SEK ID BR:28. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvenc SEK ID:29 i SEK ID:30. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID:31 i SEK ID:32. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR:33 i SEK ID BR:34. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR:35 i SEK ID:36. U nekim izvođenjima, set prajmera može imati sekvencu SEK ID BR:37 i SEK ID BR:38. U nekim izvođenjima set prajmera može imati sekvence bilo koje kombinacije gornjih setova prajmera.
FGFR inhibitori za upotrebu u otkrivenim metodama
[0028] Ovde su obezbeđeni pogodni inhibitori FGFR za upotrebu u otkrivenim metodama.
[0029] Ponekad, ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR opisanom u U.S. Publ. No. 2013/0072457 A1, uključujući bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, i njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili solvat (pogodne R grupe su takođe otkrivene u U.S. Publ. No. 2013/0072457 A1). U metodu prema pronalasku, pacijent može biti lečen sa N-(3,5-dimetoksifenil)-N’-(1-metiletil)-N-[3-(1-metil-1H-pirazol-4-il)hinoksalin-6-il]etan-1,2-diaminom (ovde se odnosi na "JNJ-42756493" ili "JNJ493"):
uključujući njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat. U nekim aspektima, farmaceutski prihvatljiva so je HCl so. U nekim aspektima, pacijent se može lečiti sa JNJ493 bazom.
[0030] Ponekad pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako je jedan ili više FGFR mutanata prisutno u uzorku, pri čemu inhibitor FGFR je N-[5-[2-(3,5-Dimetoksifenil)etil]-2H-pirazol-3-il]-4-(3,5- diemtilpiperazin-1-il)benzamid (AZD4547), kao što je opisano u Gavine, P.R., et al., AZD4547: An Orally Bioavailable, Potent, i Selective Inhibitor of the Fibroblast Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Family, Cancer Res. April 15, 201272; 2045:
uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, i njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat.
[0031] Ponekad pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pri čemu inhibitor FGFR je 3-(2,6- Dihloro-3,5-dimetoksi-fenil)-1-{ 6-[4-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamino]-pirimid-4-il}-1-metil-urea (NVP-BGJ398) kao što je opisano u Int’l Publ. No. WO2006/000420:
uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, i njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat.
[0032] Ponekad pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pri čemu inhibitor FGFR je 4-amino-5-fluoro-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]-1H-hinolin-2-on(dovitinib) kao što je opisano u Int’t Publ. No. WO2006/127926:
uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, i njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat.
[0033] Ponekad pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pri čemu inhibitor FGFR je 6-(7-((1-Aminociklopropil)-metoksi)-6-metoksihinolin-4-iloksi)-N-metil-1-naftamid (AL3 810) (lucitanib; E-3810), kao što je opisano u Bello, E. et al., E-3810 Is a Potent Dual Inhibitor of VEGFR i FGFR that Exerts Antitumor Activity in Multiple Preclinical Models, Cancer Res February 15, 201171(A)1396-1405 and Int’l Publ. No. WO2008/112408:
uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, i njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat.
[0034] Ponekad pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pri čemu inhibitor FGFR je anti-FGFR2 antitelo kao što je ono opisano u WO2013/076186.
[0035] Dodatni pogodni inhibitori FGFR uključuju BAY1163877 (Bayer), BAY1179470 (Bayer), TAS-120 (Taiho), ARQ087 (ArQule), ASP5878 (Astellas), FF284 (Chugai), FP-1039 (GSK/FivePrime), Blueprint, LY-2874455 (Lilly), RG- 7444 (Roche), ili kombinaciju od njih uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koje tautomerne ili stereohemijski izomerne oblike od njih, N-okside od njih, farmaceutski prihvatljive soli od njih ili solvate od njih.
[0036] Ponekad, pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pri čemu inhibitor FGFR je BAY1163877 (Bayer), uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat.
[0037] Ponekad, pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pri čemu inhibitor FGFR je BAY1179470 (Bayer), uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat.
[0038] Ponekad, pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pri čemu inhibitor FGFR je TAS-120 (Taiho), uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat.
[0039] Ponekad, pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pri čemu inhibitor FGFR je ARQ087 (ArQule), uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat.
[0040] Ponekad, pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pri čemu inhibitor FGFR je ASP5878 (Astellas), uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat.
[0041] Ponekad, pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pri čemu inhibitor FGFR je FF284 (Chugai), uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat.
[0042] Ponekad, pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pri čemu inhibitor FGFR je FP-1039 (GSK/FivePrime), uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat.
[0043] Ponekad, pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pri čemu inhibitor FGFR je Blueprint, uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat.
[0044] Ponekad, pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pri čemu inhibitor LY-2874455 (Lilly), uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat.
[0045] Ponekad, pacijent može biti lečen sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više mutanata FGFR, pri čemu inhibitor RG-7444 (Roche), uključujući, kada je to hemijski moguće, bilo koji njegov tautomerni ili stereohemijski izomerni oblik, njegov N-oksid, njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili njegov solvat.
[0046] Soli mogu biti sintetizovane iz matičnog jedinjenja koje sadrži bazni ili kiseli deo-ostatak po konvencionalnim hemijskim metodama opisanim u Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002. Generalno, takve soli mogu biti pripremljene reagovanjem slobodnih kiselinskih ili baznih oblika ovih jedinjenja sa odgovarajućom bazom ili kiselinom u vodi ili u organskom rastvaraču, ili u smeši ova dva; generalno su korišćeni nevodeni medijumi kao što su eter, etil acetat, etanol, izopropanol ili acetonitril. Inhibitori FGFR za upotrebu u otkrivenim metodama mogu postojati kao mono- ili di-soli, u zavisnosti od pKa kiseline iz koje je formirana so.
[0047] Kisele adicione soli mogu biti formirane sa širokim spektrom kiselina, i neorganskih i organskih. Primeri kiselih adicionih soli uključuju soli formirane sa kiselinom uključujući, ali ne ograničavajući se na, sirćetnu, 2,2-dihlorosirćetnu, adipinsku, alginsku, askorbinsku (npr. L-askorbinsku), L-asparaginsku, benzensulfonsku, benzojevu, 4-acetamidobenzojevu, butansku, (+) kamfornu, kamfor-sulfonsku, (+)-(1S)-kamfor-10-sulfonsku, kaprinsku, kapronsku, kaprilnu, cimetnu, limunsku, ciklaminsku, dodecilsulfonsku, etan-1,2-disulfonsku, etansulfonsku, 2-hidroksietansulfonsku, mravlju, fumarnu, galaktarinsku, gentizinsku, glukoheptonsku, D-glukonsku, ,glukuronsku (npr. D-glukuronsku), glutaminsku (npr. L-glutaminsku), ɑ -oksoglutarnu glikolnu, hipurinsku, bromovodoničnu, hidrovodoničnu, jodovodoničnu, isetionsku, mlečnu (npr. (+)-L-mlečnu, (±)-DL-mlečnu), laktobionsku, maleinsku, jabučnu, (-)-L-jabučnu, malonsku, (±)-DL-mandelinsku, metansulfonsku, naftalensulfonsku (npr. naftalen-2-sulfonsku), naftalen-1,5-disulfonsku, 1-hidroksi-2-naftoičnu, nikotinsku, azotnu, oleinsku, orotičnu, oksalnu, palmitinsku, pamoinsku, fosfornu, propionsku, L-piroglutaminsku, piruvinsku, salicilnu, 4-amino-salicilnu, sebacinsku, stearinsku, sukcinsku, sumpornu, taninsku, (+)-L-vinsku, tiocijansku, toluensulfonsku (npr. p-toluen-sulfonsku), undecilensku i valerijanske kiseline, kao i acilovane aminokiseline i katjonsko izmenjivačke smole.
[0048] Jednu posebnu grupu soli čine soli koje se formiraju od sirćetne, hlorovodonične, jodovodonične, fosforne, azotne, sumporne, limunske, mlečne, sukcinske, maleinske, jabučne, isetionske, fumarne, benzensulfonske, toluensulfonske, metansulfonske (mezilat), etansulfonske, naftalensulfonske, valerijanske, propionske, butanoinske, malonske, glukuronske i laktobionske kiseline. Druga grupa kiselih adicionih soli uključuje soli formirane od sirćete, adipinske, askorbinske, asparaginske, limunske, DL-mlečne, fumarne, glukonske, glukuronske, hipurinske, hlorovodonične, glutaminske, DL-jabučne, metansulfonske, sebacinske, stearinske, sukcinske i vinske kiseline.
[0049] Ako je jedinjenje anjonsko, ili ima funkcionalnu grupu koja može biti anjonska (npr. -COOH može biti -COO-), tada se može formirati so sa ppogodnim katjonom. Primeri pogodnih neorganskih katjona uključuju, ali nisu ograničeni na, jone alkalnih metala kao što su Na<+>i K<+>, katjone zemnoalkalnih metala kao što su Ca<2+>i Mg<2+,>i druge katjone kao što je Al<3+>Primeri pogodnih organskih katjona uključuju, ali nisu ograničeni na, amonijum jon (tj. NH4<+>) i supstituisane amonijumove jone (npr. NH3R<+>, NH2R2<+>, NR4<+>).
[0050] Primeri nekih pogodnih supstituisanih amonijum jona su oni koji su izvedeni iz: etilamina, dietilamina, dicikloheksilamina, trietilamina, butilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, holina, meglumina, i trometamina, kao i aminokiselina, kao što je lizin i arginin. Primer uobičajenog kvaternarnog amonijum jona je N(CH3)4<+>.
[0051] Gde jedinjenja sadrže aminsku funkciju, ona mogu formirati kvaternarne amonijum soli, na primer reakcijom sa agensom za alkilovanje prema metodama dobro poznatim stručnjaku. Takva kvaternarna amonijum jedinjenja su unutar obima otkrivenih jedinjenja. Jedinjenja koja sadrže aminsku funkciju mogu takođe formirati N-okside. Referenca ovde za jedinjenje koje sadrži aminsku funkciju takođe uključuje N-oksid. Gde jedinjenje sadrži nekoliko aminskih funkcija, jedan ili više od jednog atoma azota može biti oksidovano da se formira N-oksid. Konkretni primeri N-oksida su N-oksidi tercijalnog amina ili atom azota heterocikla koji sadrži azot. N-oksidi mogu biti formirani tretmanom odgovarajućeg amina oksidacionim agensom kao što je vodonik peroksid ili per-kiselina (npr. peroksikarboksilna kiselina), videti npr. Advanced Organic Chemistry, by Jerry March, 4th Edition, Wiley Interscience, pages. Tačnije, N-oksidi se mogu dobiti postupkom od L. W. Deady (Syn. Comm. (1977), 7, 509-514) u kojem jedinjenje amina reaguje sa m-hloroperoksibenzojevom kiselinom (MCPBA), na primer, u inertnom rastvaraču kao što je dihlorometan.
[0052] Kao što se ovde koristi, termin "solvat" označava fizičku povezanost jedinjenja sa jednim ili više molekula rastvarača. Ova fizička povezanost uključuje različite stepene jonskog i kovalentnog vezivanja, uključujući vodonično vezivanje. U određenim slučajevima solvat će biti sposoban za izolaciju, na primer kada je jedan ili više molekula rastvarača inkorporisano u kristalnu rešetku kristalne čvrste supstance. Termin "solvat" je namenjen da obuhvati i fazu rastvora i solvate koji se mogu izolovati. Neograničavajući primeri pogodnih solvata uključuju otkrivena jedinjenja u kombinaciji sa vodom, izopropanolom, etanolom, metanolom, DMSO, etil acetatom, sirćetnom kiselinom, etanolaminom i slično. Jedinjenje može ispoljiti svoje biološke efekte dok je u rastvoru.
[0053] Solvati su dobro poznati u farmaceutskoj hemiji. Oni mogu biti važni za procese pripreme supstance (npr. u odnosu na njihovo prečišćavanje), skladištenje supstance (npr. njezina stabilnost) i jednostavnost rukovanja supstance, a često su formirani kao deo izolacije ili faze prečišćavanja hemijske sinteze. Stručnjak u ovom području tehnike može pomoću standardnih i dugo korišćenih tehnika odrediti da li je formiran hidrat ili drugi solvat prema uslovima izolacije ili uslovima prečišćavanja koji se koriste za pripremu datog jedinjenja. Primeri takvih tehnika uključuju termogravimetrijsku analizu (TGA), diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju (DSC), rendgensku kristalografiju (npr. kristalografiju rendgenskih zraka jednog kristala ili difrakciju rendgenskih zraka na prahu) i NMR čvrstog stanja (SS-NMR, takođe poznat kao tzv. "Magic Angle -Spinning NMR Magic NMR" ili MAS-NMR). Takve tehnike su deo standardnog analitičkog alata stručnog hemičara kao što su NMR, IR, HPLC i MS. Alternativno, stručnjak može namerno formirati solvat koristeći uslove kristalizacije koji uključuju količinu rastzvarača koja je potrebna za određeni solvat. Nakon toga, standardne metode opisane iznad, mogu se koristiti za utvrđivanje da li su se formirali solvati. Takođe su obuhvaćeni svi kompleksi (npr. inkluzioni kompleksi ili klatrati sa sjedinjenjima kao što su ciklodekstrini ili kompleksi sa metalima) FGFR-a inhibitora.
[0054] Pored toga, jedinjenje može imati jedan ili više polimorfnih (kristalnih) ili amorfnih oblika.
[0055] Jedinjenja uključuju jedinjenja sa jednom ili više izotopskih supstitucija, i referenca na određeni element uključuje u okviru svog obima sve izotope elementa. Na primer, referenca na vodonik uključuje u okviru svog obima<1>H,<2>H (D) i<3>H (T). Slično, reference na ugljenik i kiseonik uključuju u okviru njihovog obima<12>C,<13>C i<14>C i<16>O i<18>O. Izotopi mogu biti radioaktivni ili neradioaktivni. U jednom izvođenju, jedinjenja ne sadrže radioaktivne izotope. Takva jedinjenja su poželjna za terapijsku upotrebu. U drugom izvođenju, međutim, jedinjenje može sadržavati jedan ili više radioizotopa. Jedinjenja koja sadrže takve radioizotope mogu biti korisna u dijagnostičkom kontekstu.
[0056] U metodi prema pronalasku, pacijent je lečen sa inhibitorom FGFR ako su jedan ili više FGFR mutanata prisutni u uzorku, pri čemu inhibitor FGFR je N-(3,5-dimethoksifenil)-N’-(1-metiletil)-N-[3-(1-metil-1H-pirazol-4-il)hinoksalin-6-il]etan-1,2-diamin (koji se ovde odnosi na "JNJ-42756493"), ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili solvat.
Metode lečenja karcinoma kod pacijenta
[0057] Ovde su otkrivene metode lečenja karcinoma kod pacijenata koje se sastoje od: procenjivanja biološkog uzorka od pacijenta na prisustvo jednog ili više FGFR mutanata iz FGFR mutantnog genskog panela; i lečenja pacijenta sa inhibitorom FGFR ako su u uzorku prisutni jedan ili više FGFR mutanata.
[0058] Otkrivene metode mogu biti korišćene za lečenje raznih vrsta karcinoma uključujući, ali ne ograničavajući se na, karcinom mokraćne bešike, metastatski karcinom mokraćne bešike, karcinom jajnika, karcinom glave i vrata, metastatski karcinom glave i vrata, karcinom jednjaka, metastatski karcinom jednjaka, nemaloćelijski adenokarcinom pluća, nemaloćelijski karcinom skvamoznih ćelija pluća, karcinom prostate, karcinom pluća, karcinom želuca, urotelialni karcinom, maloćelijski karcinom pluća, karcinom dojke, karcinom endometrijuma, metastatski karcinom endometrijuma, holangiokarcinom, hepatocelularni karcinom, glioblastom, gliome, karcinom debelog creva, sarkome, solidne tumore skvamoznog porekla i multipli mijelom.
[0059] FGFR mutantni panel koja je korišćen u koraku procene je zasnovan, delimično, na vrsti karcinoma pacijenta. Za pacijente sa karcinomom mokraćne bešike, na primer, prikladan FGFR mutantni genski panel može sadržavati FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C, ili FGFR3 Y373C, ili bilo koju kombinaciju od njih. Prema tome, u nekim izvođenjima, pacijent koji ima kacinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je u uzorku prisutan FGFR3:TACC3 v1. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima kacinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR3:TACC3 v3 prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima kacinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR3:BAIAP2L1 prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima kacinom mokraćne bešike se leči inhibitorom FGFR ako je FGFR2:BICC 1 prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima kacinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR2:AFF3 prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima kacinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR2:CASP7 prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima kacinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR3 R248C prisutan u uzorku. U metodi prema pronalasku, pacijent koji ima kacinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR3 S249C prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima kacinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR3 G370C prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima kacinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR3 Y373C prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima kacinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je bilo koja kombinacija od iznad navedenih FGFR mutanata prisutna u uzorku.
[0060] Za pacijente sa metastatskim karcinomom mokraćne bešike, na primer, pogodni FGFR mutantni genski panel može sadržavati FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C, ili FGFR3 Y373C, ili bilo koju kombinaciju od njih. Prema tome, u nekim izvođenjima, pacijent koji ima metastatski karcinom mokraćne bešike se leči inhibitorom FGFR ako je FGFR3:TACC3 v1 prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima metastatski karcinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR3:TACC3 v3 prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima metastatski karcinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR3:BAIAP2L1 prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima metastatski karcinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR2:BICC1 prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima metastatski karcinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR2:AFF3 prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima metastatski karcinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR2:CASP7 prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima metastatski karcinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR3 R248C prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima metastatski karcinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR3 S249C prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima metastatski karcinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR3 G370C prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima metastatski karcinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je FGFR3 Y373C prisutan u uzorku. U nekim izvođenjima, pacijent koji ima metastatski karcinom mokraćne bešike se leči sa inhibitorom FGFR ako je bilo koja kombinacija od iznad navedenih FGFR mutanata prisutna u uzorku.
[0061] U nekim izvođenjima, korak evaluacije obuhvata: izolovanje RNK iz biološkog uzorka; sintetizovanje cDNK iz izolovane RNK; prethodno amplificirane cDNK; i amplifikovanje prethodno amplifikovane cDNK sa parom prajmera koji se vezuju i amplificiraju jedan ili više FGFR mutanata iz FGFR mutantnog genskog panela.
[0062] Izolovanje RNK iz biološkog uzorka može biti izvedeno brojnim postupcima poznatim stručnjaku sa ovog područja tehnike. U jednom izvođenju, RNK može biti izolovana iz biološkog uzorka korišćenjem kompleta AllPrep DNK/RNK FFPE iz Qiagena (proizvod # 80234).
[0063] Sintetizovanje cDNK iz izolovane RNK može biti izvedeno brojnim postupcima poznatim stručnjaku sa ovog područja tehnike. U jednom izvođenju, cDNK može biti sintetizovana iz izolovane RNK korišćenjem kompleta reverzne transkriptaze cDNK visokog kapaciteta sa inhibitorom RNaze iz ABI (proizvod # 4374966).
[0064] PrethoDNK amplifikacija cDNK može može biti izvedena brojnim postupcima poznatim stručnjaku sa ovog područja tehnike. Postupci amplifikacije su dobro poznati u tehnici. U jednom izvođenju, cDNK može biti prethodno amplificirana korišćenjem tzv. "TaqMan® PreAmp Master Mix " (Life Technologies/Applied Biosystems® product # 4391128).
[0065] U nekim izvođenjima, korak amplifikacije može obuhvatiti izvođenje PCR-e u realnom vremenu (qRT-PCR). Primer qRT-PCR postupaka su diskutovani u odeljku Primera ovde. U nekim aspektima, qRT-PCR može biti Taqman® PCR test u realnom vremenu. qRT-PCR postupci mogu uključii upotrebu sondi za povećanje specifičnosti testa. Pogodne sonde za upotrebu u qRT-PCR testa uključuju bilo koju od ovde otkrivenih sondi, na primer, sonde prikazane u Tabeli 15. U nekim izvođenjima, na primer, PCR u realnom vremenu može biti izveden sa jednom ili više sondi
sadržavajući SEK ID BR: 43, SEK ID BR:44, SEK ID BR: 45, SEK ID BR: 46, SEK ID BR: 47, SEK ID BR: 48, SEK ID BR: 49, SEK ID BR: 50, SEK ID BR: 51, SEK ID BR: 52, SEK ID BR: 53, SEK ID BR: 54, i/ili SEK ID BR: 55. U drugim izvđenjima, PCR u realnom vremenu može biti izveden sa jednom ili više sondi koje se uglavnom sastoje od SEK ID BR: 43, SEK ID BR:44, SEK ID BR: 45, SEK ID BR: 46, SEK ID BR: 47, SEK ID BR: 48, SEK ID BR: 49, SEK ID BR: 50, SEK ID BR: 51, SEK ID BR: 52, SEK ID BR: 53, SEK ID BR: 54, i/ili SEK ID BR: 55. U drugim izvđenjima, PCR u realnom vremenu može biti izveden sa jednom ili više sondi koje se sastoje od SEK ID BR: 43, SEK ID BR: 44, SEK ID BR: 45, SEK ID BR: 46, SEK ID BR: 47, SEK ID BR: 48, SEK ID BR: 49, SEK ID BR: 50, SEK ID BR: 51, SEK ID BR: 52, SEK ID BR: 53, SEK ID BR: 54, i/ili SEK ID BR: 55.
U drugim izvđenjima, PCR u realnom vremenu može biti izveden sa jednom ili više sondi imajući SEK ID BR: 43, SEK ID BR:44, SEK ID BR: 45, SEK ID BR: 46, SEK ID BR: 47, SEK ID BR: 48, SEK ID BR: 49, SEK ID BR: 50, SEK ID BR: 51, SEK ID BR: 52, SEK ID BR: 53, SEK ID BR: 54, i/ili SEK ID BR: 55.
[0066] qRT-PCR može biti izveden sa jednim ili više 3' blokirajućih oligonukleotida. Primer qRT-PCR postupaka koji koriste 3' blokirajuće oligonukleotide su otkriveni u odeljku Primera ovde. Pogodni 3' blokirajući oligonukleotidi uključuju, na primer, one otkrivene u Tabeli 8. U nekim izvođenjima, qRT-PCR može biti izveden sa jednim ili više 3' blokirajućih oligonukleotida koji sadrže SEK ID BR: 39, SEK ID BR: 40, SEK ID BR: 41, i/ili SEK ID BR: 42. U nekim izvođenjima, qRT-PCR može biti izveden sa jednim ili više 3' blokirajućih oligonukleotida koji se suštinski sastoje od SEK ID BR: 39, SEK ID BR: 40, SEK ID BR: 41, i/ili SEK ID BR: 42. U nekim izvođenjima, qRT-PCR može biti izveden sa jednim ili više 3' blokirajućih oligonukleotida koji se suštinski sastoje od SEK ID BR: 39, SEK ID BR: 40, SEK ID BR: 41, i/ili SEK ID BR: 42. U nekim izvođenjima, qRT-PCR može biti izveden sa jednim ili više 3' blokirajućih oligonukleotida imajući SEK ID BR: 39, SEK ID BR: 40, SEK ID BR: 41, i/ili SEK ID BR: 42.
[0067] Pogodni parovi prajmera za upotrebu u koraku amplificiranja uključuju one prikazane u Tabeli 3. Na primer, u nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR3:TACC3 v1 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR i SEK ID BR:6. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR3:TACC3 v3 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:7 i SEK ID BR:8. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR3:TACC3 Intron i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:9 i SEK ID BR:10. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR3: BAIAP2L1 i prajmeri
koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:11 i SEK ID BR:12. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR2:BICC1 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:13 i SEK ID BR:14. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR2:AFF3 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:15 i SEK ID BR:16. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR2:CASP7 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:17 i SEK ID BR:18. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR2:CCDC6 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:19 i SEK ID BR:20. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR2:OFD1 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:21 i SEK ID BR:22. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti R248C i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:23 i SEK ID BR:24 ili SEK ID BR:31 i SEK ID BR:32. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti S249C i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:25 i SEK ID BR:26 ili SEK ID BR:33 i SEK ID BR:34. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti G370C R248C i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:27 i SEK ID BR:28 ili SEK ID BR:35 i SEK ID BR:36. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti Y373C i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:29 i SEK ID BR:30 ili SEK ID BR:37 i SEK ID BR:38. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera može biti bilo koja kombinacija iznad otkrivenih FGFR mutanata i odgovarajućeg para prajmera.
[0068] U nekim izvođenjima, korak amplificiranja može biti izveden sa sledećim:
a. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:5 i SEK ID BR:6, i sonda ima sekvencu SEK ID BR:43;
b. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:7 i SEK ID BR:8 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:44;
c. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:9 i SEK ID BR:10 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:46;
d. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:11 i SEK ID BR:12 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:47;
e. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:13 i SEK ID BR:14 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:45;
f. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:15 i SEK ID BR:16 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:48;
g. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:17 i SEK ID BR:18 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:49;
h. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:19 i SEK ID BR:20 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:50;
i. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:21 i SEK ID BR:22 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:51;
j. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:23 i SEK ID BR:24 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:52;
k. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:25 i SEK ID BR:26 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:53;
l. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:27 i SEK ID BR:28 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:54;
m. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:29 i SEK ID BR:30 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:55;
n. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:31 i SEK ID BR:32, sonda ima sekvencu SEK ID BR:52, i 3’ blokirajući oligonukleotid ima sekvencu SEK ID BR:39;
o. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:33 i SEK ID BR:34, sonda ima sekvencu SEK ID BR:53, i 3’ blokirajući oligonukleotid ima sekvencu SEK ID BR:40;
p. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:35 i SEK ID BR:36, sonda ima sekvencu SEK ID BR:54, i 3’ blokirajući oligonukleotid ima sekvencu SEK ID BR:41;
q. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:37 i SEK ID BR:38, sonda ima sekvencu SEK ID BR:55, i 3’ blokirajući oligonukleotid ima sekvencu SEK ID BR:42; ili
r. bilo kojom kombinacijom od njih.
[0069] Otkrivene metode obuhvataju lečenje pacijenta ako je jedan ili više FGFR mutanata prisutno u uzorku. Prisustvo jednog ili više FGFR mutanata u uzorku može se odrediti, na primer, sekvenciranjem amplificirane cDNK.
[0070] Pogodni inhibitori FGFR za upotrebu u metodama lečenja uključuju one koji su prethodno opisani ovde.
[0071] Takođe su otkriveni inhibitori FGFR za upotrebu u lečenju karcinoma kod pacijenata kod kojeg je identifikovano da pacijent reaguje na lečenje sa inhibitorom FGFR procenom biološkog uzorka dobijenog od pacijenta na prisustvo jednog ili više FGFR mutanata iz FGFR mutantnog genskog panela, pri čemu je detektovano prisustvo jednog ili više FGFR mutanata u uzorku.
[0072] Dalje su otkriveni inhibitori FGFR za upotrebu u lečenju karcinoma kod pacijenata kod kojeg je identifikovano da pacijent reaguje na lečenje sa inhibitorom FGFR procenom biološkog uzorka dobijenog od pacijenta na prisustvo jednog ili više FGFR mutanata iz FGFR mutantnog genskog panela, pri čemu su jedan ili više FGFR mutanata fuzioni gen FGFR ili FGFR SNP, pri čemu je detektovano prisustvo jednog ili više FGFR mutanata u uzorku, i pri čemu navedeno procenjivanje obuhvata amplificiranje cDNK sa parom prajmera koji se vezuje za i amplificira jedan ili više FGFR mutanata iz FGFR mutantnog genskog panela.
[0073] Dalje su otkriveni inhibitori FGFR za upotrebu u lečenju karcinoma kod pacijenata kod kojeg je identifikovano da pacijent reaguje na lečenje sa inhibitorom FGFR procenom biološkog uzorka dobijenog od pacijenta na prisustvo jednog ili više FGFR mutanata iz FGFR mutantnog genskog panela, pri čemu mutant FGFR je fuzioni gen FGFR ili FGFR SNP, pri čemu je detektovano prisustvo jednog ili više FGFR mutanata u uzorku, i pri čemu navedeno procenjivanje obuhvata amplificiranje prethodno amplificirane cDNK sa parom prajmera koji se vezuje za i amplificira jedan ili više FGFR mutanata iz FGFR mutantnog genskog panela.
Metode identifikovanja pacijenta sa karcinomom koji će reagovati na lečenje sa inhibitorom receptora fibroblastnih faktora rasta (FGFR)
[0074] Ovde su otkrivene metode identifikovanja pacijenta sa karcinomom koji će reagovati na lečenje sa inhibitorom receptora fibroblastnih faktora rasta (FGFR) obuhvatajući: procenjivanje biološkog uzorka od pacijenta za FGFR mutant iz FGFR mutantnog genskog panela, pri čemu je FGFR mutant fuzioni gen FGFR ili polimorfizam jednog nukleotida FGFR, i pri čemu navedena procena obuhvata amplificiranje cDNK sa parom prajmera koji se vezuju za i amplificiraju jedan ili više FGFR mutanata iz FGFR mutantnog genskog panela i određujući da li je jedan ili više FGFR mutanata iz genskog panela prisutno u uzorku, pri čemu prisustvo jednog ili više FGFR mutanata ukazuje da će pacijent reagovati na lečenje sa inhibitorom FGFR.
[0075] Takođe su obezbeđene metode identifikovanja pacijenta sa karcinomom koji reaguje na lečenje sa inhibitorom receptora fibroblastnih faktora rasta (FGFR) obuhvatajući: procenu biološkog uzorka od pacijenta za FGFR mutant iz FGFR mutantnog genskog panela, pri čemu je FGFR mutant fuzioni gen FGFR ili polimorfizam jednog nukleotida FGFR, i pri čemu navedena procena obuhvata amplificiranje cDNK sa parom prajmera koji se vezuju za i amplificiraju jedan ili više FGFR mutanata iz FGFR mutantnog genskog panela i određujući da li je jedan ili više FGFR mutanata iz genskog panela prisutno u uzorku, pri čemu prisustvo jednog ili više FGFR mutanata ukazuje da pacijent reaguje na lečenje sa inhibitorom FGFR.
[0076] Dalje su su obezbeđene metode identifikovanja pacijenta sa karcinomom koji reaguje na lečenje sa inhibitorom receptora fibroblastnih faktora rasta (FGFR) obuhvatajući procenjivanje biološkog uzorka od pacijenta za prisustvo jednog ili više FGFR mutanta iz FGFR mutantnog genskog panela, pri čemu je FGFR mutant fuzioni gen FGFR ili polimorfizam jednog nukleotida FGFR, pri čemu prisustvo jednog ili više FGFR mutanata ukazuje na to da pacijent reaguje na lečenje sa inhibitorom FGFR.
[0077] U nekim izvođenjima, procenjivanje može obuhvatiti amplificiranje cDNK sa parom prajmera koji se vezuju za i amplificiraju jedan ili više FGFR mutanata iz FGFR mutantnog genskog panela. U nekim izvođenjima, cDNK može biti prethodno amplificirana cDNK.
[0078] U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata: izolovanje RNK iz biološkog uzorka i sintetizovanje cDNK iz izolovane RNK. U nekim aspektima, korak procenjivanja može biti izveden na prethodno amplificiranoj cDNK. Zbog toga, korak procenjivanja može dalje sadržavati prethodno amplificirajuću cDNK pre navedenog koraka amplificiranja. Izolovanje RNK iz biološkog uzorka može biti izvedeno brojnim postupcima poznatim stručnjaku sa ovog područja tehnike. U jednom izvođenju, RNK može biti izolovana iz biološkog uzorka korišćenjem kompleta AllPrep DNK/RNK FFPE iz Qiagena (na primer, proizvod 80234). Sintetizovanje cDNK iz izolovane RNK može biti izvedeno brojnim postupcima poznatim prosečnom stručnjaku sa ovog područja tehnike. U jednom izvođenju, cDNK može biti sintetizovana iz izolovane RNK korišćenjem High Capacity cDNK Reverse Transcriptase kompleta sa inhibitorom RNaze iz ABI (na primer, proizvod # 4374966). PrethoDNK amplifikacija cDNK može biti izvedena brojnim postupcima poznatim prosečnom stručnjaku sa ovog područja tehnike. Postupci amplifikacije su dobro poznati u tehnici. U jednom izvođenju, cDNK može biti prethodno amplificirana korišćenjem tzv."TaqMan® PreAmp Master Mix" (Life Technologies/Applied Biosystems® product # 4391128).
[0079] Otkrivene metode mogu biti korišćene za identifikaciju pacijenata sa brojnim različitim vrstama karcinoma koji će reagovati na lečenje sa inhibitorom receptora fibroblastnih faktora rasta (FGFR), uključujući, ali ne ograničavajući se na, karcinom mokraćne bešike, metastatski karcinom mokraćne bešike, karcinom jajnika, karcinom glave i vrata, karcinom jednjaka, nemaloćelijski adenokarcinom pluća, nemaloćelijski karcinom skvamoznih ćelija pluća, karcinom prostate, karcinom pluća, karcinom želuca, urotelialni karcinom, maloćelijski karcinom pluća, karcinom dojke, karcinom endometrijuma, holangiokarcinom, hepatocelularni karcinom, glioblastom, gliome, karcinom debelog creva, sarkome, solidne tumore skvamoznog porekla i multipli mijelom.
[0080] FGFR mutantni panel koji je korišćen u koraku procenjivanja je delimično zasnovan, na vrsti karcinoma pacijenta. Za pacijente sa karcinomom mokraćne bešike, na primer, pogodan FGFR mutantni genski panel može sadržavati FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C, ili FGFR3 Y373C, ili bilo koju kombinaciju od njih. Pema tome, u nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR3:TACC3 v1 prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR3:TACC3 v3 prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR3:BAIAP2L 1 prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR2:BICC1 prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR2:AFF3 prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR2:CASP7 prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR3 R248C prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima karcinom mokraćne bešike. U metodi prema pronalasku, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li FGFR3 S249C prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR3 G370C prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR3 Y373C prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je bilo koja kombinacija od iznad FGFR mutanata prisutna u biološkom uzorku od pacijenta koji ima karcinom mokraćne bešike.
[0081] Za pacijente sa metastatskim karcinomom mokraćne bešike, na primer, pogodni FGFR mutantni genski panel može sadržavati FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 S249C, FGFR3 G370C, ili FGFR3 Y373C, ili bilo koju kombinaciju od njih. Prema tome, u nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR3:TACC3 v1 prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima metastaski karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR3:TACC3 v3 prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima metastaski karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR3:BAIAP2L1 prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima metastaski karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR2:BICC1 prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima metastaski karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR2:AFF3 prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima metastaski karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR2:CASP7 prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima metastaski karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR3 R248C prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima metastaski karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR3 S249C prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima metastaski karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR3 G370C prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima metastaski karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je FGFR3 Y373C prisutan u biološkom uzorku od pacijenta koji ima metastaski karcinom mokraćne bešike. U nekim izvođenjima, korak procenjivanja obuhvata određivanje da li je bilo koja kombinacija od iznad FGFR mutanata prisutna u biološkom uzorku od pacijenta koji ima metastatski karcinom mokraćne bešike.
[0082] Pogodni parovi prajmera za upotrebu u koraku amplificiranja uključuju one otkrivene u Tabeli 3. Na primer, u nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR3:TACC3 v1 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:5 i SEK ID BR:6. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR3:TACC3 v3 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:7 i SEK ID BR:8. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR3:TACC3 Intron i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:9 i SEK ID BR:10. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR3:BAIAP2L1 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:11 i SEK ID BR:12. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR2:BICC1 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:13 i SEK ID BR:14. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR2:AFF3 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:15 i SEK ID BR:16. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR2:CASP7 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:17 i SEK ID BR:18. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR2:CCDC6 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:19 i SEK ID BR:20. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti FGFR2:OFD1 i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:21 i SEK ID BR:22. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti R248C i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:23 i SEK ID BR:24 ili SEK ID BR:31 i SEK ID BR:32. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti S249C i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:25 i SEK ID BR:26 ili SEK ID BR:33 i SEK ID BR:34. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti G370C i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:27 i SEK ID BR:28 ili SEK ID BR:35 i SEK ID BR:36. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti Y373C i prajmeri koji imaju aminokiselinske sekvence SEK ID BR:29 i SEK ID BR:30 ili SEK ID BR:37 i SEK ID BR:38. U nekim izvođenjima, FGFR mutant i par prajmera mogu biti bilo koja kombinacija iznad otkrivenih FGFR mutanata i odgovarajućeg para prajmera.
[0083] Otkrivene metode obuhvataju određivanje da li su jedan ili više FGFR mutanata iz genskog panela prisutni u uzorku. U nekim izvođenjima, korak određivanja obuhvata sekvenciranje amplificirane cDNK.
[0084] U nekim izvođenjima, metod dalje obuhvata lečenje pacijenta sa inhibitorom FGFR ako su jedan ili više FGFR mutanata iz genskog panela prisutni u uzorku. Pogodni inhibitori FGFR za upotrebu u metodama lečenja uključuju one koji su prethodno opisani ovde, naročito JNJ-42756493.
Kompleti za identifikovanje prisustva mutantnih gena FGFR
[0085] Dalje su otkriveni kompleti za identifikovanje prisustva jednog ili više mutanta gena FGFR u biološkom uzorku obuhvatajući: parove prajmera koji imaju sekvence SEK ID BR:5 i SEK ID BR:6, SEK ID BR:7 i SEK ID BR:8, SEK ID BR:9 i SEK ID BR:10, SEK ID BR:11 i SEK ID BR:12, SEK ID BR:13 i SEK ID BR:14, SEK ID BR:15 i SEK ID BR:16, SEK ID BR:17 i SEK ID BR:18, SEK ID BR:19 i SEK ID BR 20, SEK ID BR:21 i SEK ID BR:22, SEK ID BR:23 i SEK ID BR:24, SEK ID BR:25 i SEK ID BR:26, SEK ID BR:27 i SEK ID BR:28, SEK ID BR:29 and SEK ID BR:30, SEK ID BR:31, SEK ID BR:32, SEK ID BR 33, SEK ID BR:34, SEK ID BR:35, SEK ID BR:36, SEK ID BR:37, SEK ID BR:38, ili bilo koje kombinacije od njih; i instrukcije za izvođenje testa za detekciju jednog ili više FGFR mutantnih gena.
[0086] Kompleti mogu dalje sadržavati jednu ili više sondi, jedan ili više 3' blokirajućih oligonukleotida, ili oboje. Ponekad, kompleti mogu dalje sadržavati jednu ili više sondi, na primer, bilo koju ili više sondi otkrivenih u Tabeli 15. Ponekad, kompleti mogu dalje sadržavati jedan ili više 3' blokirajućih oligonukleotida, na primer, bilo koji jedan ili više 3' blokirajućih oligonukleotida otkrivenih u Tabeli 8. Ponekad, kompleti mogu dalje sadržavati jednu ili više sondi i jedan ili više 3' blokirajućih oligonukleotida. Na primer, ponekad kompleti mogu dalje sadržavati:
a. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:5 i SEK ID BR:6 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:43;
b. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:7 i SEK ID BR:8 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:44;
c. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:9 i SEK ID BR: 10 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:46;
d. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:11 i SEK ID BR:12 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:47;
e. par prajmera ima sekvence SEK ID BR: 13 i SEK ID BR:14 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:45;
f. par prajmera ima sekvence SEK ID BR: 15 i SEK ID BR: 16 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:48;
g. par prajmera ima sekvence SEK ID BR: 17 i SEK ID BR: 18 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:49;
h. par prajmera ima sekvence SEK ID BR: 19 i SEK ID BR:20 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:50;
i. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:21 i SEK ID BR:22 i sonda ima sekvencu SEK ID BR: 51;
j. par prajmera ima sekvence SEK ID BR: 23 i SEK ID BR:24 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:52;
k. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:25 i SEK ID BR:26 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:53;
l. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:27 i SEK ID BR:28 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:54;
m. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:29 i SEK ID BR:30 i sonda ima sekvencu SEK ID BR:55;
n. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:31 i SEK ID BR:32, i sonda ima sekvencu SEK ID BR :52, and the 3’ blokirajući oligonukleotid ima sekvencu SEK ID BR:39;
o. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:33 i SEK ID BR:34, i sonda ima sekvencu SEK ID BR:53, i 3' blokirajući oligonukleotid ima sekvencu SEK ID BR:40;
p. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:35 i SEK ID BR:36, sonda ima sekvencu SEK ID BR:54, i 3' blokirajući oligonukleotid ima sekvencu SEK ID BR: 41;
q. par prajmera ima sekvence SEK ID BR:37 i SEK ID BR:38, sonda ima sekvencu SEK ID BR:55, i 3' blokirajući oligonukleotid ima sekvencu SEK ID BR:42; ili
r.bilo koju kombinaciju od njih.
Oligonukleotidne sonde
[0087] Takođe su otkrivene oligonukleotidne sonde koje imaju sekvencu bilo koje od SEK ID BRi:43-55. U nekim izvođenjima, oligonukleotiDNK sonda može imati sekvencu SEK ID BR:43. U nekim izvođenjima, oligonukleotiDNK sonda može imati sekvencu SEK ID BR:44. U nekim izvođenjima, oligonukleotiDNK sonda može imati sekvencu SEK ID BR:45. U nekim izvođenjima, oligonukleotiDNK sonda može imati sekvencu SEK ID BR:46. U nekim izvođenjima, oligonukleotiDNK sonda može imati sekvencu SEK ID BR:47. U nekim izvođenjima, oligonukleotiDNK sonda može imati sekvencu SEK ID BR:48. U nekim izvođenjima, oligonukleotiDNK sonda može imati sekvencu SEK ID BR:49. U nekim izvođenjima, oligonukleotiDNK sonda može imati sekvencu SEK ID BR:50. U nekim izvođenjima, oligonukleotiDNK sonda može imati sekvencu SEK ID BR:51. U nekim izvođenjima, oligonukleotiDNK sonda može imati sekvencu SEK ID BR:52. U nekim izvođenjima, oligonukleotiDNK sonda može imati sekvencu SEK ID BR:53. U nekim izvođenjima, oligonukleotiDNK sonda može imati sekvencu SEK ID BR:54. U nekim izvođenjima, oligonukleotiDNK sonda može imati sekvencu SEK ID BR:55.
3’ blokirajući oligonukleotid
[0088] Ovde su takođe otkriveni oligonukleotidi koji imaju sekvencu bilo koju od SEK ID BRi:39-42. U nekim izvođenjima, 3' blokirajući oligonukleotid može ima sekvencu SEK ID BR:39. U nekim izvođenjima, 3' blokirajući oligonukleotid može ima sekvencu SEK ID BR:40. U nekim izvođenjima, 3' blokirajući oligonukleotid može ima sekvencu SEK ID BR:41. U nekim izvođenjima, 3' blokirajući oligonukleotid može ima sekvencu SEK ID BR:42.
PRIMERI
Primer 1 - Izolacija i prečišćavanje plazmida DNK
[0089] Ispod je primer postupka za pripremanje FGFR fuzije plazmida DNK.
[0090] Potrebna oprema: centrifuga, sposobna za 1500 x g; mikrocentrifuga; pipete, sa pozitivnim pomeranjem ili vazdušnim pomeranjem; vortekser; nanodrop spektrofotometar; 37°C šejker/inkubator; i pećnica zagrejana na 37°C.
[0091] Potrebni materijali: zamrznuta bakterijska zaliha glicerola koja sadrži plazmid DNK; Kanamicin LB agar ploče (Teknova #L1155); LB bujon (Life Technologies #10855-021); Kanamicin (Sigma #K0254); komplet za prečišćavanje plazmida (Qiagen# 12123); apsolutni etanol (Sigma Aldrich # E7023); izopropanol (Sigma Aldrich #W292907); voda bez nukleaze (Ne-tretirana DEPC) (iz IDT ili Ambion # AM9932); Barijera bez RNaze (Filter) Tips; Mikroepruvete bez RNaze (1.5 to 2 mL VWR# 10011-724); serološke pipete; i epruvete sa okruglim dnom od 14 ml (VWR #352057).
[0092] Da bi se oporavile bakterije iz zalihe glicerola, smrznute bakterije su sastrugane sa vrha epruvete sa zalihom glicerola korišćenjem sterilnog vrha pipete, nanesene na ploču sa LB agarom i stavljene naopako u pećnicu na 37°C preko noći.
[0093] DNK plazmidi su prečišćeni korišćenjem protokola tzv. "Qiagen plazmid DNK prečišćavanja". Ukratko, jeDNK kolonija je sakupljena sa pločice sa prugama i inkubirana u kulturi od 5 ml -LB medijuma koji sadrži 50 µg/ml kanamicina preko noći u šejkeru na 37°C pri približno 300 rpm. Bakterijske ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 6000 X g tokom 15 minuta na 4°C, i pelet je resuspendovan u 300 µl pufera P1. Dodato je 300 µl pufera P2, pomešano invertovanjem epruveta 4-6 puta i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. Dodato je 300 µl ohlađenog pufera P3, odmah pomešano invertovanjem 4-6 puta, inkubirano na ledu tokom 5 minuta i centrifugirano pri maksimalnoj brzini tokom 10 minuta. Supernatant koji je sadržavao plazmid DNK je odmah uklonjen. Qiagen-tip 20 je uravnotežen primenom 1 ml pufera QBT i ostavljen da se isprazni gravitacionim tokom. Supernatant je primenjen na Qiagen-tipu 20 i ostavljen da uđe u smolu gravitacionim tokom. Qiagen-tip 20 je ispran sa 2 x 2 ml pufera QC, a DNK je eluirana sa 800 µl pufera QF, i eluat je sakupljen u tzv. "Eppendorf " epruveti od 1.5 ml. DNK je precipitirana dodavanjem 0.7 zapremine izopropanola, pomešana i odmah centrifugirana na 15000 X g tokom 30 minuta u mikrocentrifugi. Supernatant je dekantovan, i DNK pelet je ispran u 1 ml 70% etanola i centrifugiran na 15000 X g tokom 10 minuta. Supernatant je dekantovan. Pelet je osušen na vazduhu tokom 5-10 minuta i DNK je ponovo rastvorena u 100 µl ili prikladnoj zapremini vode bez nukleaze. Plazmid DNK je kvantifikovan pomoću Nanodropa i pohranjen na -20°C do dalje upotrebe.
Primer 2 - Generisanje NRK ćelijskih linija
[0094] Konstruisani su ekspresioni vektori koji eksprimiraju svaku od fuzija FGFR. Ekspresioni vektor je zatim transfektovan u normalne ćelije epitelnih ćelija bubrega pacova (NRK). Stabilne ćelijske linije su izabrane u medijumu koji sadrži kanamicin nakon transfekcije. Ove ćelije su zatim uzgajane i mRNK je izolovana i podvrgnuta testovima fuzije FGFR da bi se potvrdilo prisustvo specifične FGFR fuzije mRNK.
Primer 3 – Održavanje FGFR-Fuzije ćelijske linije
[0095] Protokol u nastavku opisuje primerni postupak za kultivisanje i održavanje ćelijskih linija sa prekomernom ekspresijom NRK FGFR-fuzije. Ćeljske linije uključuju, ali nisu ograničene na: NRK/FGFR3:TACC3v1, NRK/FGFR3:TACC3 v3, NRK/FGFR3:BAIAP2L1, NRK/FGFR2: BICC1, NRK/FGFR2:CASP7, NRK/FGFR2:CCDC6, NRK/FGFR2:AFF3, NRK/FGFR2:OFD1, i NRK/EMPTY VECTOR (kontrola plazmida).
[0096] Potrebna oprema: biološki kabinet, opremljen sistemom vakumske aspiracije; CO2inkubator, podešen na 37°C sa 5% CO2; -80 °C zamrzivač; spremnik za tečni azot; vodena kupka, podešena na 37°C; i mikroskop.
[0097] Potreban materijal: serološke pipete; bočice za kulturu tkiva (T75 VWR # BD353136 i/ili T150 VWR# 15705-074); kultura tkiva 0.2 µm jedinice za filtriranje ( (Thermo Scientific #566-0020); DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) medijum za ćelijsku kulturu (Life Technologies, # 11965-084); Fetalni goveđi serum (FBS), sertifikovan, toplotno inaktivisan (Life Technologies, # 10082147); PenStrep rastvor antibiotika (Life Technologies #15140-122); Tripsin-EDTA 0.25% rastvor (Life Technologies, # 25200-056); DPBS (Dulbekov rastvor puferovan sa fosfatom, bez kalcijuma, bez magnezijuma) (Life Technologies, # 14190136); spremnik za zamrzavanje ćelija za krioprezervaciju; ručni pipetman; medijum za zamrzavanje ćelija (Life Technologies, # 12648-010); 15 ml konusne epruvete (VWR # 62406-2); i kriobočice (VWR # 89094-800).
[0098] Za pripremu medijuma za ćelijsku kulturu, DMEM medijum je pripremljen kombinovanjem 445 ml DMEM, 50 ml FBS i 5 ml PenStrep. Pripremljeni medijum je propušten kroz jedinicu filtera od 0.2 µm i pohranjen na 4°C.
[0099] Za odmrzavanje smrznutih ćelija, pripremljen DMEM medijum je zagrevan u vodenoj kupki na 37°C najmanje 15 minuta i 15 ml zagrevanog medijuma je stavljeno u laboratorijsku bocu T75. Ćelije su uklonjene iz spremnika sa tečnim azotom i odmah stavljene u vodenu kupku na 37°C dok se ne odmrznu. Krioepruvete su obilno poprskane sa 70% alkohola, a višak je obrisan papirnim ubrusima. Ceo sadržaj je alikvotiran u T75 laboratorijsku bocu koja je sadržavala DMEM. Boca se lagano vrtela da se promeša i stavljena je u inkubator tokom 24 sata. Ako ćelije nisu bile spremne za cepanje, medijum je promenjen u sveže pripremljen DMEM da bi se uklonio preostali medijum za zamrzavanje. Ako su ćelije bile spremne za cepanje, svaka se ćelijska linija razmnožava nakon što je pistigla 80% konfluentnosti (odnos cepanja za svaku ćelijsku liniju je zavisio od eksperimentalnih potreba).
[0100] Za zamrzavanje ćelijskih linija, ćelije su uklonjene iz boce za kulturu i okrenute nadole-centrifugirane u konusnoj epruveti od 15 ml tokom 5 minuta pri 1500 RPM na sobnoj temperaturi. Medijum je aspiriran i dodato je 6 ml medijuma za zamrzavanje ćelija. Ćelije su pomešane pipetiranjem gore-dole nekoliko puta, i 1 ml ćelijskog rastvora je alikvotiran u svaku od 5 krioepruveta. Krioepruvete sa ćelijama su stavljene u spremnik za kriozamrzavanje, koji je preko noći skladišten u zamrzivaču na -80°C, praćen dugotrajnim skladištenjem u rezervoaru sa tečnim azotom.
Primer 4 - FFPET SNP test
[0101] Primer toka rada i protokola za izvođenje FFPET SNP testa je opisan ispod. Sličan postupak je izveden za FFPET testove fuzije, čiji su rezultati prikazani na SL.2.
De-parafinizacija FFPET
[0102] Stakalca su podvrgnuta povećanim količinama ksilena, nakon čega je usledio tretman alkoholom da bi se uklonio parafin.
Ekstakcija FFPET RNK
[0103] Postupak za ekstrahovanje RNK iz uzoraka tkiva karcinoma dojke ugrađenih u parafin fiksirani formalinom za nizvodno ispitivanje ekspresije gena je opisan ispod.
[0104] Potrebna oprema: centrifuga sa adapterom za ploču, sposobna za 1500 x g; mikrocentrifuga; pipete, pozitivno pomeranje ili vazdušno pomeranje; vortekser; NanoDrop 8000; grejni blok sposoban za inkubaciju na 37°C, 56°C i 80°C; i pasterova pipeta (Pipet Trans EX-FT 1.5ml pk 500, VWR# 14670-329).
[0105] Potrebni materijali: AllPrep DNK/RNK FFPE komplet (Qiagen# 80234); Apsolutni etanol (Sigma Aldrich # E7023); izopropanol; ksilen; voda bez nukleaze (netretirana DEPC-om) (iz IDT ili Ambion # AM9932); barijera bez RNaze (filter)Tips; bez RNaze; mikroepruveta (1.5 do 2 mL VWR# 10011-724); i priručnik za komplet tzv. "Qiagen AllPrep DNK/RNK FFPE"
[0106] RNK je ekstrahovana korišćenjem kompleta AllPrep DNK/RNK FFPE. Ukratko, jedan deo od 1-10 µm je stavljen u reakcionu epruvetu od 1.5 ml i dodato je 800 µl HemoDe ili ksilena. Uzorak je mešan na vorteksu 4 sekunde 3 puta, inkubiran tokom 2 minuta, mešan na vorteksu 4 sekunde 3 puta i inkubiran tokom 5 minuta.
[0107] Uzorak je centrifugiran tokom 2 minuta pri maksimalnoj brzini (12.000 - 14.000 x g) i supernatant je odbačen aspiracijom. Epruvete su odmah zatvorene da bi se izbeglo sušenje tkiva.
[0108] Iznad navedeni koraci su ponovljeni.
[0109] 800 µl etanola aps. je dodato, epruveta je protresena da se izmesti pelet, mešana vorteksom tokom 4 sekunde 3 puta, centrifugirana tokom 2 minuta pri maksimalnoj brzini (12, 000 - 14 ,000 x g), i supernatant je odbačen aspiracijom.
[0110] Dodato je 800 µl 70%-tnog etanola, epruveta je protresena da se izmesti pelet, mešana vorteksom tokom 4 sekunde 3 puta, centrifugirana tokom 2 minuta pri maksimalnoj brzini, i supernatant je odbačen aspiracijom. Nakon uklanjanja 70% etanola, epruveta se ponovo vrtela 10 - 20 sekundi, i zaostala tečnost je pažljivo uklonjena pipetom sa finim otvorom.
[0111] Otvorene epruvete su inkubirane u grejnom bloku tokom 5 - 15 minuta na 37°C da se pelet tkiva osuši na vazduhu.
[0112] Pelet je resuspendovan dodavanjem 150 µl pufera PKD i epruveta je pomerana da bi se kuglica olabavila. 10 µl proteinaze K je dodato i epruveta je mešana vorteksom.
[0113] Epruvete su inkubirane na 56°C tokom 15 minuta, inkubirane na ledu tokom 3 minuta i centrifugirane tokom 15 minuta na 20, 000 x g.
[0114] Supernatant je pažljivo prebačen bez ometanja peleta u novu epruvetu za mikrocentrifugu od 1.5 ml za prečišćavanje RNK. Supernatant je inkubiran na 80°C tokom 15 minuta. Epruveta je kratko centrifugirana da bi se uklonile kapi sa unutrašnje strane poklopca. Dodato je 320 µl pufera RLT da se podese uslovi vezivanja, a epruveta je mešana na vorteksu ili pipetiranjem. Dodato je 1120 µl etanola (96-100%) i epruveta je dobro mešana vorteksom ili pipetiranjem.
[0115] 700 µl uzorka, uključujući bilo koji precipitat koji je mogao biti formiran, je prebačeno u RNeasy MinElute spin kolonu postavljenu u epruvetu za sakupljanje od 2 ml i centrifugirano tokom 15 sekundi na ≥8000 x g (≥10, 000 rpm). Protok je odbačen. Ovaj korak je ponavljen sve dok celi uzorak nije prošao kroz RNeasy MinElute spin kolonu.
[0116] 350 µl pufera FRN je dodato u RNeasy MinElute spin kolonu i centrifugirano tokom 15 sekundi na ≥8000 x g (≥10,000 rpm). Protok je odbačen.
[0117] 10 µl zalihe rastvora DNKze I je dodato u 70 µl pufera RDD, pomešano blagim okretanjem epruvete i kratko centrifugirano da bi se prikupila zaostala tečnost sa strana epruvete.
[0118] Mešavina za inkubaciju DNKze I (80 µl) je dodata direktno u membranu RNeasy MinElute spin kolone, i smeštena na radnu ploču (20-30°C) tokom 15 minuta.
[0119] 500 µl pufera FRN je dodato u RNeasy MinElute spin kolonu i centrifugirano tokom 15 sekundi na ≥8000 x g (≥10,000 rpm). Protok je sačuvan za upotrebu u sledećem koraku, jer sadrži male RNKe.
[0120] RNeasy MinElute spin kolona je stavljena u novu epruvetu za sakupljanje od 2 ml (isporučena). Protok iz prethodnog koraka je primenjen na spin kolonu i centrifugiran tokom 15 sekundi na ≥8000 x g (≥10,000 rpm). Protok je odbačen.
[0121] 500 µl pufera RPE je dodato u RNeasy MinElute spin kolonu i centrifugirano tokom 15 sekundi na ≥8000 x g (≥10,000 rpm) da se opere membrana spin kolone. Protok je odbačen.
[0122] 500 µl pufera RPE je dodato u RNeasy MinElute spin kolonu i centrifugirano tokom 15 sekundi na ≥8000 x g (≥10,000 o/min) da bi se isprala membrana spin kolone. Cev za sakupljanje sa protokom je odbačena.
[0123] RNeasy MinElute spin kolona je stavljena u novu epruvetu za sakupljanje od 2 ml i centrifugirana pri punoj brzini tokom 5 minuta. Sabirna cev sa protokom je odbačena.
[0124] RNeasy MinElute spin kolona je stavljena u novu epruvetu za sakupljanje od 1.5 ml, 30 µl vode bez RNaze je dodato direktno u membranu spin kolone, inkubirano tokom 1 minuta na sobnoj temperaturi i centrifugirano punom brzinom tokom 1 minute da se eluira RNK.
[0125] Uzorci RNK su odmah uskladišteni u zamrzivaču na -80°C.
cDNK Sineza
[0126] Ispod je otkriven postupak sinteze cDNK za FFPET SNP testove korišćenjem PCR u realnom vremenu (RT-PCR) analize.
[0127] Potrebna oprema: centrifuga sa adapterom za ploču, sposobna za 1500 x g, mikrocentrifuga; pipetori (poželjni jednokanalni i višekanalni pipetori), sa pozitivnim pomeranjem ili sa pomeranjem vazduha; vortekser; i GeneAmp® PCR System 9700 (ABI# 4314879) ili ekvivalent.
[0128] Potrebni materijali: Komplet cDNK reverzne transkriptaze velikog kapaciteta sa inhibitorom RNaze, 200 reakcija (ABI# 4374966); Voda bez nukleaze (netretirana DEPC-om) (iz IDT-a) ili ekvivalent; Saveti za barijeru (filter) bez RNaze; Mikroepruvete bez RNaze (1.5 do 2 mL VWR# 10011-724); ™ Optičke reakcijske ploče sa 96 jažica (Life Technologies, #4306736); i film-folija za hermetičko zatvaranje (VWR #60941-072).
[0129] Nakon ekstrakcije RNK (opisane iznad) epruveta (e) za uzorak RNK su držane na ledu.
[0130] Komponente kompleta su korišćene za pripremu 2x glavne mešavine reverzne transkripcije (RT) za sve reakcije, uključujući 1 negativnu (vodenu) kontrolu. Komponente su odmrznute na ledu otprilike 15 minuta, lagano preokrenute da se promešaju i kratko centrifugiraju da bi se rastvor spustio. Svi reagensi su vraćeni na led. Epruvete nisu bile vorteksirane.
[0131] JeDNK glavna mešavina je pripremljena na ledu u epruveti od 1.5 ml za odgovarajući broj reakcija (# reakcije 10%, po reakciji od 20 µL) kombinovanjem sledeće količine reagensa po jednoj reakciji: 2 µl 10X RT puferske mešavine; 0.8 ml 25X dNTP Miks; 2 µl 10X RT Nasumični Prajmeri; 1 µl 50 U/mL MultiScribe reverzne transkriptaze; 1 µl inhibitora RNaze; i 3.2 µl H2O bez nukleaze/RNaze.
[0132] Glavna mešavina je vorteksirana nekoliko puta (5 do 10) da se meša i kratko centrifugira (1500 x g, 5 do 10 sekundi).10 µl reakcione smeše je dodato u odgovarajuće jažice ploče sa 96 jažica.
[0133] RNK uzorci su razblaženi do koncentracije od 20 µg/ml. Dodato je 10 µL svakog uzorka RNK, uključujući vodenu negativnu kontrolu, u prikladne odgovarajuće jažice ploče sa 96 jažica do konačne reakcione zapremine od 20 µL. Jažice su nežno pomešane pipetiranjem gore-dole 3 puta, hermetički zatvorene pločom i kratko centrifugirane (1500 x g 60 sekundi). Ploče su držane na ledu dok nisu bile spremne za punjenje u termocikler.
[0134] Reakciona ploča je ubačena u ABI 9700 Termalni cikler u čistoj laboratorij ili radnoj stanici, pokrenuta korišćenjem sledećeg programa reverzne transkripcije sa reakcionom zapreminom od 20 µl:
Korak 1: 25°C tokom 10 minuta
Korak 2: 37°C tokom 120 minuta
Korak 3: 85°C tokom 5 sekundi
Korak 4: 4°C beskonačno držanje
[0135] Sintetizovana cDNK je skladištena na -20°C za sledeći korak Pre-amplifikacije.
Priprema preamplifikacione smeše skupa testa
[0136] Preamp smeša skupa testa je povezana sa FFPET SNP protokolom za preamplifikaciju je pripremljena kao što je opisano ispod.
[0137] Potrebna oprema: mikrocentrifuga; pipetori, sa pozitivnim pomeranjem ili pomeranjem vazduha; i vortekser.
[0138] Potrebni materijali: voda bez nukleaze (netretirana DEPC-om) (iz IDT-a) ili ekvivalent; IDTE pH 8.0 (IX TE rastvor) (IDT Technologies); Saveti za barijeru (filter) bez RNaze; i epruvete bez RNaze (1.5 do 2mL VWR# 10011-724).
[0139] Svi TaqMan SNP testovi su naručeni od Applied Biosystems, Life Technologies, Inc.
[0140] Pripremljeno je 100 µL 20X SNP testova.
[0141] Da bi se pripremio 0.2X Preamp bazen za ispitivanje,svi testovi su odmrznuti na ledu za otprilike 15 minuta. U epruvetu od 1.5 ml dodata je sledeća zapremina komponenti:
Tabela 4
[0142] 0.2X PreAmp skup testa je kratko vorteksiran za mešanje (5 do 10 sekundi) i kratko centrifugiran (1500 x g, 5-10 sekundi).100 µL PreAmp skupa testa je podeljeno u epruvete od 1.5 ml i pohranjeno na -20°C.
Pre-amplifikacija za test SNP za za tkivo ugrađeno u parafin fiksirano sa formalinom karcinoma dojke koristeći PCR analizu u realnom vremenu (RTPCR)
[0143] Potrebna oprema: centrifuga sa adapterom za ploču, sposobna za 1500 x g; mikrocentrifuga; pipetator, pozitivno pomeranje ili pomeranje vazduha; vortekser; GeneAmp® PCR System 9700 (ABI# 4314879) ili ekvivalent.
[0144] Potrebni materijali: tzv."TaqMan® PreAmp Master Mix" (2X) (Life Technologies # 4391128); 0.2X Mešavina skupa testa (videti Assay Preparation and Handling Protocol); 1X IDTE pufer (10mM Tris/0.1mM EDTA, pH7.5, from IDT) ili ekvivalent; Voda bez nukleaze (netretirana DEPC-om) (iz IDT) ili ekvivalent; Barijera bez RNaze (Filter) Tips; Mikroepruvete bez RNaze (1.5 to 2 mL VWR# 10011-724); MicroAmp™ Optičke reakcione ploče sa 96-jažica (Life Technologies, #4306736); MicroAmp® Optical Adhesive Film (Applied Biosystems PN 4311971); duboke bunarske ploče (VWR# 47734-788); folije za hermetičko zatvaranje (VWR # 60941-126).
[0145] Uzorci su pripremljeni stavljanjem cDNK i 0.2X mešavine skupa testa na ledu da se odmrzne, otprilike 5 minuta, i kratkim centrifugiranjem ploče (1500xg iokom 5 do 10 sekundi).
[0146] Komponente kompleta su korišćene za pripremu 2x PreAmp. glavne mešavine. Komponente kompleta su ostavljene da se odmrznu na ledu otprilike 5 minuta. Nakon što su svi reagensi odmrznuti, epruvete su lagano preokrenute da se pomešaju i kratko centrifugirane da bi se rastvor spustio. Svi reagensi su vraćeni na led. Epruvete nisu bile vorteksirane.
[0147] U čistoj laboratoriji ili Biosigurnoj napi, svaka glavna mešavina je pripremljena za odgovarajući broj reakcija na ledu kombinovanjem potrebnih zapremina reagensa kao što je navedeno u Tabeli 5 ispod (# reakcija 10%):
Tabela 5
[0148] Skupovi testa sadrže prajmere i sonde.
[0149] Da bi se spričio unakrsni- prajming SNP testova, svih 5 testova su podeljeni u 3 reakcije preamplifikacije po uzorku.
[0150] Svaka glavna mešavina je mešana u vorteksu nekoliko puta (5 do 10) da bi se mešala, nakon čega je sledila kratka centrifuga (1500 xg, 5 do 10 sekundi).18.75 µL svake glavne mešavine je alikvotirano u odgovarajuće jažice na reakcionoj ploči sa 96 jažica. 6.25 µL svakog od uzoraka cDNK, uključujući vodenu negativnu kontrolnu jažicu, je prebačeno u odgovarajuće jažice u reakcionoj ploči glavne mešavine za svaku reakciju preamplifikacije. Uzorak je nežno pomešan pipetiranjem gore-dole 3 puta i poklopac je zatvoren. Ploča je kratko centrifugirana (1500 x g tokom 60 sekundi) i držana na ledu dok nije spremna za punjenje u termocikler.
[0151] Reakciona ploča ABI 9700 Termalnog ciklera je napunjena je i pokrenuta pomoću sledećeg programa:
Korak 1: 95°C tokom 10 minuta
Korak 2: 95°C tokom 15 sekundi
Korak 3: 60°C tokom 4 minute
Korak 4: Podesiti korak 2-3 na 10 ciklusa
Ako je korišćen zlatni ili srebrni blok, izabran je maksimalni način rada, i stopa porasta je podešena na 77%.
Ako je korišćen aluminijski blok, odabran je standardni način rada (bez promene stope).
Korak 5: 4°C beskonačno zadržavanje
Reakciona zapremina je podešena na 25 µL
[0152] PreAmp reakciona ploča je kratko centrifugirana (1500 x g tokom 60 sekundi) nakon završetka PreAmp-e.100 µl IDTE je dodato u odgovarajuće jažice nove duboke ploče sa 96 jažica i 25 µL svakog proizvoda PreAmp je prebačeno u odgovarajuće jažice da bi se dobla konačna zapremina razblaženja od 125 µL. Svaka jažica je pomešana pipetiranjem gore-dole 3 puta, ploča je hermetički zatvorena sa adhezivnom folijom, ploča je kratko centrifugirana (1500 x g tokom 5 do 10 sekundi), i PreAmp proizvod je pohranjen na -20°C do dalje upotrebe.
FFPET SNP Analiza – Realno vreme PCR
[0153] U nastavku je opisan postupak za test SNP tkiva ugrađenog u parafin fiksiranog u formalinu korišćenjem PCR analize u realnom vremenu.
[0154] Potrebna oprema: centrifuga sa adapterom za ploču, sposobna za 1500 x g; mikrocentrifuga; pipetori (poželjno jednokanalni i višekanalni pipetor), sa pozitivnim pomeranjem ili pomeranjem vazduha; vortekser; i ABI ViiA 7 PCR instrument u realnom vremenu (Life Technologies).
[0155] Potrebni materijali: TaqMan Genotyping glavna mešavina (Life Technologies # 4371355); SNP testovi; voda bez nukleaze (netretirana DEPC-om, iz IDT-a) ili ekvivalent; Saveti za barijeru (filter) bez RNaze; Mikroepruveta bez RNaze (1.5 do 2 mL VWR# 10011-724); MicroAmp® optički adhezivni film (Applied Biosystems PN 4311971); i MicroAmp™ Optički reakcione ploče sa 384 jažice.
[0156] Tabela 15 navodi sekvence sondi korištenih tokom PCR testova u realnom vremenu.
[0157] Za pripremu uzoraka, u čistoj laboratoriji ili radnoj stanici, SNP testovi su stavljeni na led da se odmrznu otprilike 5 minuta. Svi reagensi su zaštićeni od svetlosti, radi zaštite od izloženosti fluorescentnim sondama. Razblažene PreAmp ploče su stavljene na led da se odmrznu u prljavoj laboratoriji ili radnoj stanici nakon pripremanja Genotipiziranja glavne mešavine.
[0158] Da se pripremi glavna mešavina za genotipiziranje, glavna mešavina za genotipizaciju je odmrznuta na ledu otprilike 5 minuta. Glavna mešavina (MM) je pripremljena u potrebnom broju epruveta na ledu. Potrebne količine reagenasa su kombinovane u odgovarajuće označene epruvete kao što je navedeno u Tabeli 6 ispod (# reakcije 10%):
Tabela 6
[0159] Glavna mešavina je vorteksirana nekoliko puta (5 do 10) da se pomeša i zatim kratko centrifugira (1500 x g, 5 do 10 sekundi). 15 µl svake glavne mešavine je dodato u odgovarajuće jažice MicroAmp™ optički reakcionih ploča sa 384 jažice. Reakcione ploče su hermetički zatvorene sa optički adhezivnim filmom.
[0160] Ploča sa 1:5 razblaženim PreAmp proizvodom je stavljena na led otprilike 5-10 minuta da se odmrzne. Korišćenjem višekanalnog pipetora, 5 mL svakog razblaženog proizvoda PreAmp je prebačeno u prikladne odgovarajuće jažice. Reakcona ploča je hermetički zatvorena sa optičkim adhezivnim filmom i kratko centrifugirana (1500 x g 60 sekundi). Ploče su držane na ledu dok nisu bile spremne za punjenje u termocikler.
[0161] Sledeći uslovi su pokrenuti korišćenjem softvera viiA 7 sa zapreminom postavljenom na 20 µl:
Tabela 7
FGFR SNP-Specifični qRT-PCR
[0162] Detekcija retkih somatskih mutacija u višku alela divljeg tipa sve je važnija u dijagnostici karcinoma. Kada su mutacije od interesa blizu jeDNK drugoj, otkrivanje postaje izazovno. Da bi se pomoglo u identifikaciji FGFR SNP-a iz FFPET-a, razvijen je SNP-specifičan qRT-PCR test, u kojem je korišćena SNP-specifična amplifikacija korišćenjem Taqman MGB sondi kombinovanih sa 3’ dideoksi divljim tipom (WT) blokatorom alela. Test je sprečio nespecifično vezivanje, poboljšao broj amplifikacije na cilju, minimizirao lažno pozitivne signale iz WT alela i povećao osetljivost testa. Ovaj test detekcije SNP je zasnovan na RNK, kombinovan sa korakom preamplifikacije u testu, pojačava niske ili retke signale mutanta.
[0163] Primer strategije za SNP-specifičan qRT-PCR korišćenjem 3' dideoksi WT blokatora oligonukleotida je prikazan na SL.3, i primer strategije validacije FFPE uzorka je ilustrovan na SL. 4. Ukratko, qRT-PCR je izveden korišćenjem FGFR SNP prajmera u prisustvu 3’ dideoksi WT blokatora oligonukleotida, koji je bio komplementaran i sadržavao kratak deo nukleotida koji je bočno pratio WT alel. Vezivanje oligonukleotida blokatora na alel WT je sprečio amplifikaciju alela WT, dok su se FGFR SNP prajmeri vezali i specifično amplifikovali FGFR SNP. 3' dideoksi WT blokator oligonukleotidi korišćeni u FGFR SNP-specifičnom qRT-PCR-u su prikazani u Tabeli 8. GFR SNP prajmeri su korišćeni u FGFR SNP-specifičnom qRT-PCR-u su bili: SEK ID BR:31 i SEK ID BR:32 (FGFR3 R248C); SEK ID BR:33 i SEK ID BR:34 (FGFR3 S249C); SEK ID BR:35 i SEK ID BR:36 (FGFR3 G370C); i SEK ID BR:37 i SEK ID BR:38 (FGFR3 Y373). Tabela 15 navodi sekvence sondi korišćenih tokom PCR testova u realnom vremenu.
Tabela 8
[0164] Uzorci za validacijske studije su pripremljeni kao što je prikazano u Tabeli 9. Primer validacijskog podatka SNP-specifičnog qRT-PCR-a korišćenjem 3' dideoksi WT blokatora oligonukleotida za FGFR3 G370C, FGFR3 Y373, FGFR3 S249C i FGFR3 R248 je ilustrovan u SLIKAMA 5A-5D, respektivno. Sirovi podaci o Ct (prag ciklusa) za FFPE uzorke sa SNP-specifičnim qRT-PCR sa 3' dideoksi WT blokatorskim oligonukleotidima su prikazani u Tabeli 10. Podaci izvedeni iz DNK i RNK korišćenjem različitih platformi/tehnika sugerišu da SNP-specifični PCR sa 3' blokirajućem nukleotidom je robustan, pouzdan i osetljiv na test. Podaci o validaciji sugerišu da jedan mutantni alel/SNP može biti detektovan u velikom višku genomske DNK koja nosi WT, čime se naglašava osetljivost i specifičnost svakog testa.
Tabela 9
Tabela 10
Primer 5 - Validacija prilagođenog testa detekcije FGFR fuzionog gena
Generisanje pozitivnih kontrola za testove fuzije FGFR
[0165] Generisani su "sintetički mini-geni" fuzije FGFR, plazmidi koji kodiraju fuzije FGFR i stabilne ćelijske linije koje sadrže FGFR fuzije. Ukratko, sintetički mini geni su veštački konstruisani povezivanjem serija nukleotida, od oko 100 baznih parova, jedni sa drugim koji odgovaraju ciljnoj DNK sekvenci gena od interesa. Plazmidi koji kodiraju FGFR fuzije su generisani kloniranjem cDNK koja kodira različite FGFR fuzione gene u ekspresioni vektor. Stabilne ćelijske linije koje sadrže FGFR fuzije su generisane transfekcijom plazmida koji kodiraju FGFR gene u normalne epitelne ćelije bubrega pacova (NRK ćelije). Stabilne ćelijske linije su izabrane pod antibiotikom G418. Taqmanov test fuzije FGFR je izveden na ukupnoj RNK izolovanoj iz ovih ćelijskih linija kako bi se potvrdilo uspešno generisanje stabilne ćelijske linije (a) koje eksprimiraju FGFR fuziju (e). Stabilne ćelijske linije koje eksprimiraju FGFR fuzije su korišćene kao pozitivna kontrola. Tabela 15 navodi sekvence sondi korišćenih tokom PCR testova u realnom vremenu.
Analiza donje granice kvantifikacije i efikasnost testova fuzije FGFR
[0166] Da bi se odredila donja granica kvantifikacije (LLOQ) i efikasnost testova FGFR fuzionog gena, fuzioni proizvodi FGFR su generisani TaqMan PCR-om (kao što je opisano u Primeru 4) i potvrđeni Sangerovim sekvenciranjem (SL. 2). 100 pg fuziono pozitivne DNK je pomešano sa normalnom humanom cDNK (potvrđeno fuziono negativnom), serijski razblaženo 1:10 i analizirano korišćenjem Applied Biosystems ViiA7 Software v1.1. Standardne krive efikasnosti su prikazane na SL. 6. FGFR fuzija LLOQ i efikasnost su prikazani u Tabeli 11.
Tabela 11
[0167] Sledeći test FGFR fuzionog gena je potvrđen u ćelijskim linijama pozitivnih na fuzioni gen. Ekspresija fuziionog gena FGFR, serijska razblaženja su pripremljena ubacivanjem ćeliskih linija pozitivnih na fuzioni protein u ćelijsku liniju negativnu na fuzioni protein. Na primer, pripremljeno je serijsko razblaženje 1:2 za oba FGFR3:TACC3v1 i FGFR3:BAIAP2L1 i uneseno u 1 milijun BAF ćelija. RNK je izolovana (korišćenjem Qiagen Rneasy kompleta), i zatim RT-PCR, preamplifikacija cDNK i TaqMan realno vreme PCR za ciljani FGFR fuzioni gen. Kao što je prikazano u Tabeli 12, i FGFR3:TACC3v1 i FGFR3:BAIAP2L1 fuzioni gen TaqMan testova mogu otkriti cilj fuzije u 31 od 1 miliona fuziono negativnih ćelija (osetljivost od 0.003%).
Tabela 12
Primer 6 - Validacija prilagođenog testa detekcije FGFR SNP
Procena mutacija FGFR3 kod karcinoma mokraćne bešike
[0168] SNP-i R248C, S249C i Y373C su primećeni u približno 8%, približno 61% i približno 19% testiranih uzoraka karcinoma mokraćne bešike, respektivno.
Primer 7 - Analiza uzoraka karcinoma
[0169] Uzorci su analizirani korišćenjem istog postupka kao što je opisano u primeru 4. Rezultati su prikazani u Tabeli 13 i SL.
7. Tabela 13 prikazuje prevalenciju fuzije FGFR kod različitih karcinoma. FGFR fuzije otkrivene u FFPE uzorcima iz različitih karcinoma kao što su karcinomi mokraćne bešike (primarni i metastatski), NSCLC (adenokarcinom i skvamozni), jajnika, jednjaka (primarni i metastatski), glave i vrata (H&N; primarni i metastatski), endometrijuma (metastatski), dojke, i karcinom prostate korišćenjem qRT-PCR metode. Sve testirane fuzije FGFR su bile negativne na uzorke karcinoma prostate. Fuzija FGFR3:TACC3introna je bila negativna u mokraćnoj bešici (primarni), NSCLC (skvamoznom), jajnicima i jednjaku (primarni), H&N (primarni i metastatski) i dojci. FGFR2: OFD1 fuzija je bila negativna u mokraćnoj bešici (primarni i metastatski), NSCLC (adenokarcinom), jajnicima i jednjaku (primarni i metastatski). FGFR2:CCDC6 fuzija je bila negativna u mokraćnoj bešici (primarni i metastatski), NSCLC (adenokarcinomu), jajnicima i jednjaku (primarni) i H&N (primarni i metastatski).
[0170] SL. 8 je primerni prikaz FGFR fuzionog gena i statusa mutacije u NSCLC adenokarcinomu i karcinomu skvamoznih ćelija. U uzorcima NSCLC adenokarcinoma pozitivnog na FGFR fuziju, 3/17 uzoraka je bilo pozitivno na EGFR mutaciju, 3/17 uzoraka je bilo pozitivno na KRAS mutaciju, i 1/17 uzoraka je bilo pozitivno na mutaciju cMET. Međutim, nisu uočene mutacije EGFR, KRAS ili cMET u uzorcima karcinoma skvamoznih ćelija NSCLC pozitivnog na FGFR fuziju.
[0170] FIG. 8 is an exemplary representation of FGFR fusion gene and mutation status in NSCLC adenocarcinoma
and squamous cell carcinoma. In FGFR fusion positive NSCLC adenocarcinoma samples, 3/17 samples were positive for EGFR mutation, 3/17 samples were positive for KRAS mutation, and 1/17 samples were positive for cMET mutation.
No EGFR, KRAS, or cMET mutations, however, were observed in FGFR fusion positive NSCLC squamous cell carcinoma samples.
Primer 8 – Lečenje pacijenata sa uznapredovalim solidnim tumorima
Treatment of patients with advanced solid tumors
[0171] Sprovedeno je kliničko ispitivanje u kojem su pacijenti sa različitim solidnim tumorima koji eksprimiraju fuzione gene FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR2:CCDC6 i FGFR2:BICC1 lečeni sa JNJ-42756493. SL. 9 ilustruje primere rezultata iz uzoraka pacijenata faze I, u kojima su FGFR fuzije u ispitivanim uzorcima faze I JNJ-427493 (EDI10001) otkrivene korišćenjem qRT-PCR testa. Svi testovi fuzije FGFR su sprovedeni istovremeno sa pozitivnim kontrolama (ST) i GAPDH za procenu kontrole kvaliteta RNK. A) Grafički prikaz qRT-PCR podataka generisanih za pt#1000081: pozitivan samo za fuziju FGFR2:BICC1 (umetnuti deo prikazuje detalje o vrednostima Ct za fuziju FGFR2:BICC1, ST-pozitivnu kontrolu i GAPDH). B) Grafički prikaz qRT-PCR podataka generisanih za pt#33000158: pozitivan samo za fuziju FGFR3:TACC3v1 (umetnuti deo prikazuje detalje o vrednostima Ct za fuziju FGFR3:TACC3v1, ST-pozitivnu kontrolu i GAPDH). C) Grafički prikaz qRT-PCR podataka generisanih za pt#34000123: pozitivan samo za fuziju FGFR2:CCDC6 (umetnuti deo prikazuje detalje o vrednostima Ct za fuziju FGFR2:CCDC6, ST-pozitivnu kontrolu i GAPDH). D) Grafički prikaz qRT-PCR podataka generisanih za pt#340000115: pozitivan za fuzije FGFR3:TACC3v1, FGFR3:TACC#v3 i FGFR2:CCDC6 (umetnuti su detalji o vrednostima Ct za fuzije FGFR, ST-pozitivne kontrole i GAPDH).
[0172] SL. 10 predstavlja primer dizajna studije faze I za prvu studiju kod ljudi JNJ-42756493 kod pacijenata sa uznapredovalim solidnim tumorom. Prikazan je grafički prikaz tradicionalne metode eskalacije doze 3+3 dizajna za kliničko ispitivanje faze I. Faza eskalacije doze je imala za cilj uspostavljanje maksimalne podnošljive doze (MTD) i preporučene doze faze II (RPD). Ruka 1. dela je korišćena za određivanje povremenog rasporeda doziranja, tj. 7 dana i sedam dana odmora (10 mg/kg i 12 mg/kg). Ruka 2. dela je korišćena za određivanje PD biomarkera (farmakodinamički biomarkeri; ispitani proizvođači kako bi povezali efekat leka sa ciljnim i biološkim odgovorom tumora) pri čemu su testirani biopsija i uzorak krvi. U ruci 3. dela je korišćena kohorta proširenja doze i uključivala je prikupljanje dodatnih pacijenata sa specifičnim indikacijama (NSCLC, SCLC, tumori dojke i solidni tumori) sa različitim kriterijimom prihvatljivosti (FGFR aberacije: translokacija/mutacija /amplifikacije) za daljnju karakterizaciju profila toksičnosti JNJ493.
Evaluacija kliničke aktivnosti
[0173] Značajni klinički odgovori (RECIST) su uočeni pri dozi od 9 mg jednom dnevno (QD), 12 mg QD i 12 mg 7d uključeno/isključeno kod pacijenata sa FGFR fuzionim genima. (SL.11; predstavlja sve režime doziranja).
Primer 9 -Generisanje FGFR fuzijom stabilno transfektovanih RK3E ćelija
FGFR Fuzija prekomerno eksprimirajućih ćelijskih linija
[0174] Ćelje RK3E (epitelialne ćelije bubrega pacova) su kupljene od ATCC (Manassas, VA, USA) i kultivisane u DMEM-u dopunjene sa FBS i antibioticima (Invitrogen, Grand Island, NY, SAD). FGFR fuzioni genski konstrukti su dizajnirani i klonirani u ekspresijski vektor pReceiver (Genecopoeia, Rockville, MD, USA), koji sadrži HA-tag. Klonovi su transfektovani u RK3E ćelije korišćenjem Nukleofektora Amaksa ćelijke linije (Lonza, Basel, Switzerland) prateći protokol proizvođača. Stabilno transfektovane ćelije su izbrane u kompletnom medijumu sa 800 ug/ml G418 (Invitrogen). Prekomerna ekspresija fuzije u stabilno transfektovanim ćelijama je potvrđena PCR-om u realnom vremenu i imunoblotiranjem korišćenjem anti-pFGFR antitela (SL. 12). Kao što je prikazano na SL. 12, stabilne ćelijske linije su pokazale ekspresiju aktivnih FGFR fuzionih kinaza, kao što je prikazano ekspresijom fosforilacije FGFR.
Test formiranja kolonija
[0175] Testiran je rast stabilno transfektovanih RK3E ćelija fuzijom FGFR, nezavisan od pričvršćenja. 1 ml medijuma za kulturu sa 0.8% agaroze niske tačke topljenja je prvo postavljeno u svaku od tri jažice ploče sa šest jažica. Nakon što je agar očvrsnuo, svaka jažica je primila još 1 ml 0.4% agara u medijumu za kulturu koji je sadržavao 100 ćelija. Nakon 14 dana, kolonije su fiksirane i obojene sa 0.1% krezil kristalno ljubičastom. Broj kolonija je određen mikroskopski ručnim brojanjem iz trostrukih jažica za svaku ćelijsku liniju. Reprezentativni prikaz svake ćelijske linije sa prekomernom ekspresijom fuzije je prikazan na SL. 13A. Rast ćelija nezavisan od pričvršćenja u mekom agaru bi se mogao otkriti u stabilno transfektovanim ćelijama FGFR fuzijom, ali ne i u kontroli praznog vektora. SL. 13B predstavlja kvantitativnu analizu kolonija u mekom agaru za stabilno transfektovane RK3E ćelije FGFR fuzijom i praznu kontrolu vektora. Svi eksperimenti su izvedeni u duplikatu, i rezultati su eksprimirani kao kolonije/100 ćelija na ploči. Sve FGFR fuzije koje su testirane izazvale su nezavisan rast od pričvršćenja, naglašavajući njihovu sposobnost transformacije.
NizvoDNK ekspresija cilja
[0176] FGFR fuzijom stabilno transfektovane RK3E ćelije su stavljene u kompletni medijum za rast, serum je izgladnjivan preko noći, zatim ponovo hranjen sa 0.5% FBS medijumom za rast. Ćelije su tretirane sa 1 µM JNJ-42756493, AZD4547 ili NVP-BGJ398 u prisustvu liganada tokom 1 sata. Za imunoblotiranje, lizati celih ćelija su sakupljeni u RIPA puferu (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) i koncentracija proteina u uzorku je ispitana korišćenjem BCA Proteinskog testa (Thermo Scientific). JeDNKke količine proteina (30 µg po traci) su nanete na 4-12% Bis-Tris gelove (Invitrogen) pre nego što je izvršena SDS stranice. Proteini su prebačeni u nitrocelulozne membrane i ispitani sa antitelima protiv p-FGFR, total-FGFR2, p-MAPK, total-MAPK, p-S6, ukupnog S6, B-aktina (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) i total-FGFR3 (Santa Cruz, Dallas, TX, SAD). Membrane su blokirane puferom za blokiranje Odyssey tokom 1 h na sobnoj temperaturi i inkubirane preko noći na 4°C u primarnom rastvoru antitela razblaženog u puferu za blokiranje tzv."Odyssey" (1:1000). Nakon tri ispiranja u 0.1% tzv."Tween tris" puferovanom fiziološkom rastvoru (TBST), membrane su sondirane sa kozjim anti-mišjim ili magarećim anti-zečjim IR-Dye 670 ili 800cw označenim sekundarnim antiserumom u puferu za blokiranje tzv."Odyssey" tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Ispiranja su ponovljena nakon sekundarnog označavanja, i membrane su snimljene korišćenjem skenera LiCor Odyssey i analitičkog softvera Odyssey 3.0 (LiCor, Lincoln, NE, SAD). Efekti JNJ-42756493 su upoređeni sa AZD4547 i NVP-BGJ398. Kao što je prikazano na SL.
14A-14H, tretman sa JNJ-42756493, AZD4547 i NVP-BGJ398 (trake 2-4 u svakom blotu) je inhibirao fosforilaciju FGFR i nizvodnih ciljeva, tj. MAPK i S6.
Testiranje odgovora na lek za ćelijske linije prekomerne ekspresije FGFR-fuzije
[0177] FGFR fuzijom stabilno transfektovane RK3E ćelije su zasejane u ploče sa 96 jažica (1000 ćelija/jažici) u tri primerka u kompletnom medijumu plus za rast i liganda FGF-1 i FGF-2. Nakon 24 sata, ćelije su gladovale u serumu preko noći, zatim ponovno hranjene sa 0.5% FBS medijumom za rast. 72 sata nakon postavljanja, ćelije su tretirane sa različitim koncentracijama serija razblaženja 18 tačake 1:3, počevši od 10 µM, JNJ493, AZD4547 (AZD) i NVP-BGJ398 (NVS). Mikrotitarske ploče su zatim inkubirane 72 sata i testirane na sadržaj adenozin trifosfata (ATP; marker metabolički aktivnih ćelija) korišćenjem Cell Titer-Glo® Luminescent Cell Viability assay (Promega Corp., Madison, WI, USA) prateći uputstva proizvođača, sa modifikacijama. Ukratko, ćelije su ostavljene da se uravnoteže do sobne temperature, i tada je dodata smeša Cell Titer-Glo® reagensa 1:1. Ćelije su zatim stavljene na orbitalni šejker tokom 2 minuta i inkubirane tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi da bi se stabilizovao luminiscentni signal. Luminiscencija je kvantifikovana i sprovedena su merenja pomoću Envision Multilabel čitača ploča (Perkin Elmer; Waltham, MA, USA). Vrednosti IC50(prikazane u Tabeli 14) su izračunate korišćenjem GraphPad Prism 5.0. Kao što je prikazano u Tabeli 14, ćelije koje sadrže fuzije FGFR su pokazale osetljivost na inhibitor FGFR JNJ-42756493, AZD4547 i NVP-BGJ398 in vitro, sa JNJ-42756493 koji pokazuje povećanu osetljivost (nanomolarni raspon koncentracije) u poređenju sa AZD4547 and NVP-BGJ398, dok prazna vektorska kontrola nije.
Tabela 14
Tabela 15
[0178] Stručnjaci će ceniti da se brojne promene i modifikacije mogu biti napravljene u poželjnim izvođenjima pronalaska i da se takve promene i modifikacije mogu izvršiti. Zbog toga je predviđeno da priloženi patentni zahtevi pokriju sve takve ekvivalentne varijacije koje spadaju u obim pronalaska.
NukleotiDNK slekvenca fuzionih gena FGFR
[0179] Nukleotidne sekvence za FGFR fuziju cDNK koje su inženjerisane u ekspresione vektore su date u Tabeli 16. Podvučene sekvence odgovaraju ili FGFR3 ili FGFR2, sekvence u normalnom fontu predstavljaju partnere fuzije, i sekvence u kurzivu predstavljaju intronsku sekvencu FGFR3 gena.

Claims (9)

  1. Patentni zahtevi 1. Metod identifikacije pacijenta sa rakom mokrać ne bešike koji reaguje na tretman receptorom faktora rasta fibroblasta (FGFR) inhibitor, pri čemu inhibitor FGFR sadrži jedinjenje koje ima strukturu formule (I),
    njegov N-oksid, njegova farmaceutski prihvatljiva so ili njegov solvat, i pri čemu postupak obuhvata: (a) procenu biološkog uzorka od pacijenta za FGFR mutant iz panela gena mutanta FGFR, pri čemu je FGFR mutant FGFR polimorfizam jednog nukleotida FGFR3 S249C, i pri čemu navedena procena obuhvata amplifikaciju cDNK sa parom prajmera koji se vezuju za, i amplificiraju jedan ili više FGFR mutanta iz FGFR-a panela mutantnih gena; i određivanje da li su jedan ili više FGFR mutanta iz FGFR panela mutantnih gena prisutni u uzorku, pri čemu prisustvo jednog ili više FGFR mutanta od kojih bi jedan mutant bio FGFR3 S249C, ukazuje da pacijent reaguje na tretman sa FGFR inhibitorom; ili, (b) procenu biološkog uzorka od pacijenta na prisustvo jednog ili više FGFR mutanta iz FGFR panela mutantnih gena, gde je FGFR mutant polimorfizam jednog nukleotida FGFR FGFR3 S249C, pri čemu prisustvo jednog ili više FGFR mutanta ukazuje na to da pacijent reaguje na lečenje sa FGFR inhibitorom.
  2. 2. Metod prema patentnom zahtevu 1, pri čemu panel mutantnih gena dalje sadrži: (a) FGFR fuzioni gen FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:TACC3 Intron, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR2:CCDC6 ili FGFR2:OFD1, ili bilo koju njihovu kombinaciju; i/ili, (b) polimorfizam jednog nukleotida FGFR FGFR3 R248C, FGFR3 G370C ili FGFR3 I373C, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
  3. 3. Metod prema patentnom zahtevu 1, pro čemu FGFR panel mutantnih gena dalje sadrži FGFR3:TACC3 v1, FGFR3:TACC3 v3, FGFR3:BAIAP2L1, FGFR2:BICC1, FGFR2:AFF3, FGFR2:CASP7, FGFR3 R248C, FGFR3 G370C ili FGFR3 I373C, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
  4. 4. Metod prema bilo kom od patetnih zahteva od 1(b) do 3, pri čemu procena obuhvata amplifikaciju cDNK sa parom prajmera koji se vezuju za i pojačavaju jedan ili više FGFR mutanata iz FGFR mutantnog genskog panela; opciono, pri čemu je cDNK je prethodno amplifikovana cDNK.
  5. 5. Metod prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu su FGFR mutant i par prajmera FGFR3 S249C i prajmeri koji imaju sekvence SEK ID BR:25 i SEK ID BR:26 ili SEK ID BR:33 i SEK ID BR:34, i po potrebi: FGFR3:TACC3 v1 i prajmeri imajući aminokiselinske sekvence SEK ID BR:5 i SEK ID BR:6; FGFR3:TACC3 v3 i prajmeri koji imaju sekvence od SEK ID BR:7 i SEK ID BR:8; FGFR3:TACC3 Intron i prajmeri koji imaju sekvence od SEK ID BR:9 i SEK ID BR:10; FGFR3:BAIAP2L1 i prajmeri koji imaju sekvence od SEK ID BR: 11 i SEK ID BR:12; FGFR2:BICC1 i prajmeri koji imaju sekvence od SEK ID BR:13 i SEK ID BR:14; FGFR2:AFF3 i prajmeri koji imaju sekvence od SEK ID BR:15 i SEK ID BR:16; FGFR2:CASP7 i prajmeri koji imaju sekvence od SEK ID BR:17 i SEK ID BR:18; FGFR2:CCDC6 i prajmeri koji imaju sekvence od SEK ID BR:19 i SEK ID BR:20; FGFR2:OFD1 i prajmeri koji imaju sekvence od SEK ID BR:21 i SEK ID BR:22; FGFR3 R248C i prajmeri koji imaju sekvence od SEK ID BR:23 i SEK ID BR:24 or SEK ID BR:31 i SEK ID BR:32; FGFR3 G370C i prajmeri koji imaju sekvence od SEK ID BR:27 i SEK ID BR:28 or SEK ID BR:35 i SEK ID BR:36; FGFR3 Y373C i prajmeri koji imaju sekvence od SEK ID BR:29 i SEK ID BR:30 or SEK ID BR:37 i SEK ID BR:38; ili bilo koju kombinaciju od njih.
  6. 6. Metod prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pre čemu procena obuhvata: izolovanje RNK iz biološkog uzorka i sinteza cDNK iz izolovane RNK; opciono, pri čemu postupak dalje obuhvata preamplifikaciju cDNK pre koraka amplifikacije.
  7. 7. Metod prema bilo kom od patentnih zahteva 1(a) ili 2 do 6, pri čemu je cDNK prethodno amplifikovana.
  8. 8. Metod prema bilo kom od zahteva 1(a) ili 2-7, naznačena time što korak amplifikacije obuhvata izvođenje PCR-a u realnom vremenu; opciono, pri čemu se PCR u realnom vremenu izvodi sa jednom ili više sondi koje sadrže SEK ID BR:43, SEK ID BR:44, SEK ID BR:45, SEK ID BR:46, SEK ID BR:47, SEK ID BR:48, SEK ID BR:49, SEK ID BR:50, SEK ID BR:51, SEK ID BR:52, SEK ID BR:53, SEK ID BR:54 i/ili SEK ID BR:55; i/ili, opciono, pri čemu se u realno vreme PCR izvodi sa jednim ili više 3’ blokirajuć ih oligonukleotida koji sadrže SEK ID BR:39, SEK ID BR:41, i/ili SEK ID BR:42.
  9. 9. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 1(a) ili 2-8, pri čemu navedeni korak određivanja obuhvata sekvenciranje amplifikovane cDNK.
RS20220400A 2014-09-26 2015-09-18 Upotreba fgfr mutantnih genskih panela u identifikovanju pacijenata sa karcinomom koji će reagovati na lečenje sa inhibitorom fgfr RS63178B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462056159P 2014-09-26 2014-09-26
PCT/US2015/050996 WO2016048833A2 (en) 2014-09-26 2015-09-18 Use of fgfr mutant gene panels in identifying cancer patients that will be responsive to treatment with an fgfr inhibitor
EP15782109.1A EP3198033B1 (en) 2014-09-26 2015-09-18 Use of fgfr mutant gene panels in identifying cancer patients that will be responsive to treatment with an fgfr inhibitor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63178B1 true RS63178B1 (sr) 2022-06-30

Family

ID=54337343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220400A RS63178B1 (sr) 2014-09-26 2015-09-18 Upotreba fgfr mutantnih genskih panela u identifikovanju pacijenata sa karcinomom koji će reagovati na lečenje sa inhibitorom fgfr

Country Status (38)

Country Link
US (3) US20160090633A1 (sr)
EP (2) EP3198033B1 (sr)
JP (4) JP6766037B2 (sr)
KR (3) KR102470456B1 (sr)
CN (2) CN113957146B (sr)
AR (1) AR102345A1 (sr)
AU (3) AU2015321626B2 (sr)
CA (1) CA2962075C (sr)
CO (1) CO2017003528A2 (sr)
CR (1) CR20170104A (sr)
CY (1) CY1125190T1 (sr)
DK (1) DK3198033T3 (sr)
EA (1) EA037920B1 (sr)
EC (1) ECSP17025787A (sr)
ES (1) ES2912567T3 (sr)
GT (1) GT201700059A (sr)
HR (1) HRP20220496T1 (sr)
HU (1) HUE058219T2 (sr)
IL (3) IL324511A (sr)
JO (1) JO3681B1 (sr)
LT (1) LT3198033T (sr)
MA (1) MA40761B1 (sr)
MX (2) MX392774B (sr)
MY (1) MY194567A (sr)
NI (1) NI201700035A (sr)
PH (1) PH12017500556A1 (sr)
PL (1) PL3198033T3 (sr)
PT (1) PT3198033T (sr)
RS (1) RS63178B1 (sr)
SG (1) SG11201702381QA (sr)
SI (1) SI3198033T1 (sr)
SM (1) SMT202200177T1 (sr)
SV (1) SV2017005415A (sr)
TW (1) TWI706136B (sr)
UA (1) UA122564C2 (sr)
UY (1) UY36325A (sr)
WO (1) WO2016048833A2 (sr)
ZA (1) ZA201702899B (sr)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI606066B (zh) 2012-09-27 2017-11-21 中外製藥股份有限公司 FGFR3 Fusion Gene and Its Targeted Medicine
WO2015111716A1 (ja) 2014-01-24 2015-07-30 公益財団法人がん研究会 新規融合体及びその検出法
RU2715236C2 (ru) 2014-03-26 2020-02-26 Астекс Терапьютикс Лтд Комбинации
KR102470456B1 (ko) 2014-09-26 2022-11-23 얀센 파마슈티카 엔.브이. Fgfr 억제제를 사용한 치료에 반응할 암 환자를 확인하는 데 있어서 fgfr 돌연변이 유전자 패널의 사용
TWI719960B (zh) 2015-02-10 2021-03-01 英商阿斯迪克治療公司 新穎組成物
US10478494B2 (en) 2015-04-03 2019-11-19 Astex Therapeutics Ltd FGFR/PD-1 combination therapy for the treatment of cancer
US11883404B2 (en) 2016-03-04 2024-01-30 Taiho Pharmaceuticals Co., Ltd. Preparation and composition for treatment of malignant tumors
EP3424505A4 (en) * 2016-03-04 2019-10-16 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. PREPARATION AND COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF MALIGNANT TUMORS
JOP20190280A1 (ar) 2017-06-02 2019-12-02 Janssen Pharmaceutica Nv مثبطات fgfr2 لعلاج سرطان الأوعية الصفراوية
CN112119311B (zh) 2018-07-27 2024-12-20 泽普托生命技术股份有限公司 用于处理基于gmr的生物标志物检测中的分析物信号的系统和方法
WO2020058432A1 (en) * 2018-09-21 2020-03-26 Janssen Pharmaceutica Nv Treatment of cholangiocarcinoma
EP3923942A1 (en) * 2019-02-12 2021-12-22 Janssen Pharmaceutica NV Cancer treatment
PH12021552342A1 (en) * 2019-03-29 2022-08-22 Janssen Pharmaceutica Nv Fgfr tyrosine kinase inhibitors for the treatment of urothelial carcinoma
MA55486A (fr) 2019-03-29 2022-02-09 Janssen Pharmaceutica Nv Inhibiteurs de la tyrosine kinase fgfr pour le traitement du carcinome urothélial
AU2020282816A1 (en) * 2019-05-31 2022-01-06 Qed Therapeutics, Inc. Methods of treating urinary system cancers
CN110241183B (zh) * 2019-06-13 2022-10-28 南京世和基因生物技术股份有限公司 一种fgfr融合基因的检测方法、试剂盒以及探针库
WO2021010326A1 (ja) * 2019-07-12 2021-01-21 中外製薬株式会社 抗変異型ｆｇｆｒ３抗体およびその使用
CN115335701A (zh) * 2019-09-09 2022-11-11 泽普托生命技术有限责任公司 用于检测核酸中基因变异的系统和方法
EP4034118A1 (en) 2019-09-26 2022-08-03 Janssen Pharmaceutica NV Use of fgfr inhibitors in fgfr-genetically altered cancers to enhance patient response to immune checkpoint inhibitors in sequential treatment settings
EP4087625A4 (en) 2020-01-08 2024-03-13 Zepto Life Technology, LLC POLYMER COMPOSITIONS AND BIOSURFACES INCLUDING THEM ON SENSORS
CN115103678A (zh) * 2020-02-12 2022-09-23 詹森药业有限公司 用于治疗高风险非肌层浸润性膀胱癌的fgfr酪氨酸激酶抑制剂
TWI900527B (zh) 2020-02-12 2025-10-11 比利時商健生藥品公司 用於治療尿路上皮癌的ｆｇｆｒ酪胺酸激酶抑制劑和抗ｐｄ１藥劑
CN115916241A (zh) * 2020-04-15 2023-04-04 奥克梅斯制药爱尔兰有限公司 与血管生成抑制剂组合的免疫刺激剂
CN111440790A (zh) * 2020-05-08 2020-07-24 公安部物证鉴定中心 唾液斑迹dna和rna同时提取的方法
EP4210702A1 (en) 2020-09-14 2023-07-19 JANSSEN Pharmaceutica NV Fgfr inhibitor combination therapies
CN112143815B (zh) * 2020-11-25 2021-02-26 江苏申基生物科技有限公司 一种用于检测人fgfr2基因融合突变的核酸组合物、试剂盒及检测方法
BR112023023935A2 (pt) 2021-05-19 2024-01-30 Janssen Pharmaceutica Nv Inibidores de tirosina quinase de fgfr para o tratamento de tumores sólidos avançados
IL312063A (en) 2021-10-12 2024-06-01 Taris Biomedical Llc Ardafitinib formulations and systems for intravesical administration
KR20240145513A (ko) 2022-02-18 2024-10-07 타리스 바이오메디컬 엘엘씨 에르다피티닙 제형 및 방광내 투여를 위한 삼투성 시스템
KR20250143348A (ko) 2023-02-13 2025-10-01 타리스 바이오메디컬 엘엘씨 방광암 치료에 사용하기 위한 방광내 투여용 에르다피티닙
EP4665341A1 (en) 2023-02-13 2025-12-24 Janssen Pharmaceutica NV Fgfr tyrosine kinase inhibitors for the treatment of high-risk non-muscle invasive bladder cancer
CN120731077A (zh) 2023-02-17 2025-09-30 塔里斯生物医药公司 膀胱内施用厄达替尼以用于治疗膀胱癌
WO2025059602A1 (en) 2023-09-14 2025-03-20 Taris Biomedical Llc Methods of treating bladder cancer using intravesical administration of erdafitinib
CN119219611B (zh) * 2024-12-03 2025-04-18 南京诺源医疗器械有限公司 用于主动靶向成纤维细胞生长因子受体的近红外荧光探针及其制备方法与应用

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5214500A (en) 1999-05-05 2000-11-21 Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.) Means for detecting and treating pathologies linked to fgfr3
US7135311B1 (en) 1999-05-05 2006-11-14 Institut Curie Means for detecting and treating pathologies linked to FGFR3
EP1554407B1 (en) 2002-10-01 2009-07-29 Epigenomics AG Method for the treatment of breast cell proliferative disorders
EP1611252B1 (en) * 2003-03-26 2009-07-29 Progenika Biopharma, S.A. In vitro method to detect bladder transitional cell carcinoma
GB0512324D0 (en) 2005-06-16 2005-07-27 Novartis Ag Organic compounds
EP1659175A1 (en) * 2004-11-18 2006-05-24 Institut Curie Alterations in seborrheic keratoses and their applications
BRPI0611375A2 (pt) 2005-05-23 2010-08-31 Novartis Ag formas cristalinas e outras de sais de ácido láctico de 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1h-benzimid azol-2-il]-1h-quinolin-2-ona
EP1964837A4 (en) * 2005-11-22 2010-12-22 Eisai R&D Man Co Ltd Antitumor agent against multiple myeloma
KR20080080525A (ko) * 2005-12-08 2008-09-04 노파르티스 아게 유전자 전사에 대한 ｆｇｆｒ３의 억제제의 효과
EP1918376A1 (en) * 2006-11-03 2008-05-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. FGFR4 promotes cancer cell resistance in response to chemotherapeutic drugs
KR20090123870A (ko) 2007-02-27 2009-12-02 노파르티스 아게 섬유모세포 성장 인자 수용체 또는 이의 변이체에 의해 매개되는 신호전달의 조정에 대한 감수성을 나타내는 세포의 확인 방법
WO2008109369A2 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tnf gene expression and uses thereof
US8163923B2 (en) 2007-03-14 2012-04-24 Advenchen Laboratories, Llc Spiro substituted compounds as angiogenesis inhibitors
US9458451B2 (en) 2007-06-21 2016-10-04 Gen-Probe Incorporated Multi-channel optical measurement instrument
US8071338B2 (en) 2007-08-08 2011-12-06 Roche Molecular Systems, Inc. Suppression of amplification using an oligonucleotide and a polymerase significantly lacking 5′-3′ nuclease activity
WO2013173480A1 (en) 2012-05-15 2013-11-21 Predictive Biosciences, Inc. Detection of bladder cancer recurrence
WO2013173485A1 (en) 2012-05-15 2013-11-21 Predictive Biosciences, Inc. Detection of bladder cancers
GB0718542D0 (en) 2007-09-22 2007-10-31 Univ Dundee Targeted modulation of gene expression
AR073770A1 (es) 2008-10-20 2010-12-01 Imclone Llc Anticuerpo aislado que se enlaza especificamente con, e induce la degradacion del receptor-3 del factor de crecimiento del fibroblasto humano (fgfr-3), fragmento de enlace fgfr-3 humano del mismo, composicion farmaceutica y producto que lo comprenden
WO2010111625A1 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for using multispecific-binding proteins comprising an antibody-receptor combination
WO2011027219A1 (en) 2009-09-04 2011-03-10 Progenika Biopharma, S.A. High throughput detection of small genomic deletions and insertions
US9140689B2 (en) * 2010-03-14 2015-09-22 Translational Genomics Research Institute Methods of determining susceptibility of tumors to tyrosine kinase inhibitors
GB201007286D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Astex Therapeutics Ltd New compounds
GB201020179D0 (en) * 2010-11-29 2011-01-12 Astex Therapeutics Ltd New compounds
CN102293770A (zh) * 2011-05-25 2011-12-28 温州医学院 新型成纤维细胞生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂
CN102319224B (zh) * 2011-07-27 2013-03-20 赛乐医药科技(上海)有限公司 复方甲氧那明的速释－缓释渗透泵制剂
CN103906848B (zh) 2011-08-18 2016-03-02 雀巢产品技术援助有限公司 用于检测等位变体的组合物和方法
US20130096021A1 (en) 2011-09-27 2013-04-18 Arul M. Chinnaiyan Recurrent gene fusions in breast cancer
AR088941A1 (es) 2011-11-23 2014-07-16 Bayer Ip Gmbh Anticuerpos anti-fgfr2 y sus usos
WO2013088191A1 (en) * 2011-12-12 2013-06-20 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Antagonist of the fibroblast growth factor receptor 3 (fgfr3) for use in the treatment or the prevention of skeletal disorders linked with abnormal activation of fgfr3
KR102032007B1 (ko) * 2012-02-28 2019-10-14 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤 질소 함유 방향족 헤테로환 화합물
PL2824181T3 (pl) 2012-03-08 2019-02-28 Astellas Pharma Inc. Nowa fuzja fgfr3
US9254288B2 (en) * 2012-05-07 2016-02-09 The Translational Genomics Research Institute Susceptibility of tumors to tyrosine kinase inhibitors and treatment thereof
GB201209609D0 (en) * 2012-05-30 2012-07-11 Astex Therapeutics Ltd New compounds
US20150191791A1 (en) * 2012-07-05 2015-07-09 Lsip, Llc Fgfr2 fusion gene
WO2014018673A2 (en) * 2012-07-24 2014-01-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fusion proteins and methods thereof
US20140030259A1 (en) * 2012-07-27 2014-01-30 Genentech, Inc. Methods of treating fgfr3 related conditions
TWI606066B (zh) * 2012-09-27 2017-11-21 中外製藥股份有限公司 FGFR3 Fusion Gene and Its Targeted Medicine
US11230589B2 (en) * 2012-11-05 2022-01-25 Foundation Medicine, Inc. Fusion molecules and uses thereof
CA3150658A1 (en) * 2013-01-18 2014-07-24 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating cholangiocarcinoma
WO2014165710A2 (en) 2013-04-05 2014-10-09 Life Technologies Corporation Gene fusions
EP3004380A2 (en) 2013-05-27 2016-04-13 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis Novel translocations in lung cancer
WO2015006723A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Recurrent gene fusions in cancer
KR102470456B1 (ko) 2014-09-26 2022-11-23 얀센 파마슈티카 엔.브이. Fgfr 억제제를 사용한 치료에 반응할 암 환자를 확인하는 데 있어서 fgfr 돌연변이 유전자 패널의 사용
US20200208224A1 (en) 2014-09-26 2020-07-02 Janssen Pharmaceutica Nv Use Of FGFR Mutant Gene Panels In Identifying Cancer Patients That Will Be Responsive To Treatment With An FGFR Inhibitor
HUE062453T2 (hu) 2017-02-06 2023-11-28 Janssen Pharmaceutica Nv Rákbetegség kezelése

Also Published As

Publication number Publication date
EP4063516A1 (en) 2022-09-28
CN107002141B (zh) 2021-11-02
BR112017006088A2 (pt) 2017-12-19
UA122564C2 (uk) 2020-12-10
JP2020124192A (ja) 2020-08-20
TWI706136B (zh) 2020-10-01
AU2015321626B2 (en) 2021-12-16
KR20250119657A (ko) 2025-08-07
CR20170104A (es) 2017-05-31
MA40761B1 (fr) 2022-04-29
WO2016048833A2 (en) 2016-03-31
US20160090633A1 (en) 2016-03-31
CN107002141A (zh) 2017-08-01
SG11201702381QA (en) 2017-04-27
JP2022109910A (ja) 2022-07-28
LT3198033T (lt) 2022-05-10
IL291633A (en) 2022-05-01
ES2912567T3 (es) 2022-05-26
SI3198033T1 (sl) 2022-06-30
CY1125190T1 (el) 2024-12-13
GT201700059A (es) 2019-08-21
IL291633B1 (en) 2025-12-01
WO2016048833A3 (en) 2016-05-19
CO2017003528A2 (es) 2017-07-11
IL324511A (en) 2026-01-01
PL3198033T3 (pl) 2022-08-29
NZ730886A (en) 2024-08-30
PH12017500556A1 (en) 2017-08-30
KR102839867B1 (ko) 2025-07-28
SMT202200177T1 (it) 2022-05-12
ZA201702899B (en) 2019-06-26
AR102345A1 (es) 2017-02-22
JP2017529090A (ja) 2017-10-05
JP2024112991A (ja) 2024-08-21
DK3198033T3 (da) 2022-04-11
CA2962075C (en) 2025-09-09
UY36325A (es) 2016-04-01
MY194567A (en) 2022-12-02
TW201619609A (zh) 2016-06-01
IL251264B (en) 2022-04-01
CN113957146A (zh) 2022-01-21
JP7051920B2 (ja) 2022-04-11
SV2017005415A (es) 2017-07-03
US20240309463A1 (en) 2024-09-19
EP3198033A2 (en) 2017-08-02
CA2962075A1 (en) 2016-03-31
EA201790716A1 (ru) 2017-10-31
US20190078166A1 (en) 2019-03-14
NI201700035A (es) 2017-06-22
KR20220162823A (ko) 2022-12-08
PT3198033T (pt) 2022-05-25
KR102470456B1 (ko) 2022-11-23
US12037644B2 (en) 2024-07-16
JO3681B1 (ar) 2020-08-27
IL291633B2 (en) 2026-04-01
JP7558216B2 (ja) 2024-09-30
EP3198033B1 (en) 2022-02-16
MX2017003954A (es) 2017-12-14
EA037920B1 (ru) 2021-06-07
AU2015321626A1 (en) 2017-04-06
AU2021277633A1 (en) 2021-12-23
KR20170062495A (ko) 2017-06-07
MA40761A (fr) 2017-08-01
MX392774B (es) 2025-03-24
JP6766037B2 (ja) 2020-10-07
AU2021277633B2 (en) 2024-11-28
AU2025201448A1 (en) 2025-03-20
MX2022006536A (es) 2022-07-11
HRP20220496T1 (hr) 2022-05-27
CN113957146B (zh) 2026-04-03
ECSP17025787A (es) 2018-07-31
HUE058219T2 (hu) 2022-07-28
IL251264A0 (en) 2017-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240309463A1 (en) Use of fgfr mutant gene panels in identifying cancer patients that will be responsive to treatment with an fgfr inhibitor
US12325880B2 (en) Identification of PDE3 modulator responsive cancers
US20200208224A1 (en) Use Of FGFR Mutant Gene Panels In Identifying Cancer Patients That Will Be Responsive To Treatment With An FGFR Inhibitor
JP6858563B2 (ja) Ｂｒａｆ変異検出によるｅｇｆｒ阻害剤の効果予測
WO2017033905A1 (ja) Ｏｃｌｎ－ａｒｈｇａｐ２６遺伝子の検出方法
HK40081326A (en) Use of fgfr mutant gene panels in identifying cancer patients that will be responsive to treatment with an fgfr inhibitor
HK1239756B (en) Use of fgfr mutant gene panels in identifying cancer patients that will be responsive to treatment with an fgfr inhibitor
HK1239756A1 (en) Use of fgfr mutant gene panels in identifying cancer patients that will be responsive to treatment with an fgfr inhibitor
HK1235833B (zh) 使用fgfr突变基因组鉴定将对用fgfr抑制剂进行治疗有反应的癌症患者
HK1235833A1 (en) Use of fgfr mutant gene panels in identifying cancer patients that will be responsive to treatment with an fgfr inhibitor
BR112017006088B1 (pt) Métodos para a identificação de um paciente com câncer de bexiga que é responsivo ao tratamento com um inibidor do fgfr e kit
HK40066090A (zh) 使用fgfr突变基因组鉴定将对用fgfr抑制剂进行治疗有反应的癌症患者
BR122024005360A2 (pt) Métodos para a identificação de um paciente com câncer de bexiga que é responsivo ao tratamento com um inibidor do fgfr e kit
WO2017033906A1 (ja) Ｒｐ２－ａｒｈｇａｐ６遺伝子の検出方法
BR122024005365A2 (pt) Métodos para a identificação de um paciente com câncer de bexiga que é responsivo ao tratamento com um inibidor do fgfr e kit