RS63329B1 - Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen - Google Patents

Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen

Info

Publication number
RS63329B1
RS63329B1 RS20220595A RSP20220595A RS63329B1 RS 63329 B1 RS63329 B1 RS 63329B1 RS 20220595 A RS20220595 A RS 20220595A RS P20220595 A RSP20220595 A RS P20220595A RS 63329 B1 RS63329 B1 RS 63329B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rna
liposome
liposomes
peg
lipid
Prior art date
Application number
RS20220595A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew Geall
Ayush Verma
Original Assignee
Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44653554&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63329(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Glaxosmithkline Biologicals Sa filed Critical Glaxosmithkline Biologicals Sa
Publication of RS63329B1 publication Critical patent/RS63329B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36171—Demonstrated in vivo effect
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak je u oblasti nevirusne isporuke RNK za imunizaciju, preko lipozoma unutar kojih je inkapsulirana RNK (koja kodira imunogen od interesa).
OSNOVA TEHNIKE
[0002] Isporuka nukleinskih kiselina za imunizaciju životinja je cilj već nekoliko godina. Testirani su različiti pristupi, uključujući upotrebu DNK ili RNK, virusnih ili nevirusnih nosača za isporuku (ili čak bez nosača za isporuku, u „goloj“ vakcini), vektora koji se repliciraju ili se ne repliciraju, ili virusnih ili nevirusnih vektora.
[0003] Mockei et al., 2007, Cancer Gene Ther, 14:9, 802-814 opisuju vakcinu protiv raka zasnovanu na iRNK za terapiju melanoma.
[0004] Ostaje potreba za daljim i poboljšanim vakcinama sa nukleinskom kiselinom i, posebno, za poboljšanim načinima isporuke vakcina sa nukleinskom kiselinom.
OPIS PRONALASKA
[0005] Prema pronalasku, imunizacija nukleinskom kiselinom se postiže davanjem RNK inkapsulirane unutar lipozoma. RNK kodira imunogen od interesa. RNK takođe uključuje 5' kapu koja sadrži 7'-metilguanozin, a prvih 1, 2 ili 3 5' ribonukleotida su metilovani na 2' poziciji riboze. Lipozom uključuje PEGilovani lipid tj. lipid je modifikovan kovalentnim vezivanjem polietilen glikola. PEG obezbeđuje lipozomima omotač koji može dati povoljne farmakokinetičke karakteristike, npr. može povećati stabilnost i sprečiti nespecifičnu adsorpciju lipozoma. Pronalazači su otkrili da dužina PEG može uticati na in vivo ekspresiju inkapsulirane RNK i stoga pronalazak koristi lipozome koji sadrže PEG koji ima prosečnu molekulsku masu između 1kDa i 3kDa. PEG sa manjom molekulskom težinom (npr. 500 ili 750 Da) ne formira stabilne lipozome.
[0006] Stoga pronalazak obezbeđuje lipozom u kome je inkapsulirana RNK koja kodira imunogen od interesa, pri čemu lipozom sadrži najmanje jedan lipid koji uključuje polietilen glikol deo, tako da je polietilen glikol prisutan na spoljašnjosti lipozoma, pri čemu je prosečna molekulska masa polietilen glikola između 1kDa i 3kDa; pri čemu RNK uključuje 5' kapu koja sadrži 7'-metilguanozin, a prvi 1, 2 ili 3 5' ribonukleotida su metilovani na 2' poziciji riboze. Ovi lipozomi su pogodni za in vivo isporuku RNK u ćeliju kičmenjaka i stoga su korisni kao komponente u farmaceutskim kompozicijama za imunizaciju subjekata protiv različitih bolesti.
[0007] Pronalazak takođe obezbeđuje proces za pripremu lipozoma koji sadrži RNK, koji obuhvata korak mešanja RNK sa jednim ili više lipida, pod uslovima takvim da lipidi formiraju lipozom u kome je RNK inkapsulirana, pri čemu najmanje jedan lipid uključuje polietilen glikolni deo koji se nalazi na spoljašnjosti lipozoma tokom procesa, i gde je prosečna molekulska masa polietilen glikola između 1kDa i 3kDa; i pri čemu RNK uključuje 5' kapu koja sadrži 7'-metilguanozin, a prva 1, 2 ili 35' ribonukleotida su metilovana na 2' poziciji riboze.
Lipozom
[0008] Pronalazak koristi lipozome unutar kojih je inkapsulirana RNK koja kodira imunogen. Tako je RNK (kao u prirodnom virusu) odvojena od bilo kog spoljašnjeg medijuma. Utvrđeno je da inkapsulacija unutar lipozoma štiti RNK od digestije sa RNKazom. Lipozomi mogu uključivati neku spoljašnju RNK (npr. na njihovoj površini), ali najmanje polovina RNK (i idealno cela) je inkapsulirana u jezgru lipozoma. Inkapsulacija unutar lipozoma se razlikuje od, na primer, kompleksa lipid/RNK opisanih u referenci 1, gde je RNK pomešana sa prethodno formiranim lipozomima.
[0009] Različiti amfifilni lipidi mogu formirati dvoslojne strukture u vodenom okruženju da inkapsuliraju vodeno jezgro koje sadrži RNK kao lipozom. Ovi lipidi mogu imati anjonsku, katjonsku ili cviterjonsku hidrofilnu vodeću grupu. Formiranje lipozoma iz anjonskih fosfolipida datira još od 1960-ih, a katjonski lipozomi koji formiraju lipidi proučavaju se od 1990-ih. Neki fosfolipidi su anjonski, dok su drugi cviterjonski, a drugi su katjoni. Pogodne klase fosfolipida uključuju, ali nisu ograničene na, fosfatidiletanolamine, fosfatidilholine, fosfatidilserine i fosfatidil-glicerole, a neki korisni fosfolipidi su navedeni u Tabeli 1. Korisni katjonski lipidi uključuju, ali nisu ograničeni na dioleoil trimetilamonijum propan (DOTAP), 1,2-disteariloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DSDMA), 1,2-dioleiloksi-N,Ndimetil-3aminopropan (DODMA), 1,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DLenDMA). Cviterjonski lipidi uključujueali nisu ograničeni na, acil cviterjonske lipide i etar cviterjonske lipide. Primeri korisnih cviterjonskih lipida su DPPC, DOPC, DSPC, dodecilfosfoholin, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamin (DOPE), i 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DPyPE). Lipidi mogu biti zasićeni ili nezasićeni. Poželjna je upotreba najmanje jednog nezasićenog lipida za pripremu lipozoma. Ako nezasićeni lipid ima dva repa, oba repa mogu biti nezasićena, ili može imati jedan zasićeni rep i jedan nezasićeni rep. Lipid može uključiti grupu steroida u jednom repu npr. kao u RV05.
[0010] Tako, u jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje lipozom koji ima lipidni dvosloj koji inkapsulira vodeno jezgro, pri čemu: (i) lipidni dvosloj sadrži najmanje jedan lipid koji uključuje polietilen glikol deo, tako da je polietilen glikol prisutan na spoljašnjosti lipozoma, pri čemu prosečna molekulska masa polietilen glikola je između 1kDa i 3kDa; i (ii) vodeno jezgro uključuje RNK koja kodira imunogen; i pri čemu RNK uključuje 5' kapu koja sadrži 7'-metilguanozin, a prva 1, 2 ili 35' ribonukleotida su metilovana na 2' poziciji riboze.
[0011] Lipozomi pronalaska se mogu formirati od jednog lipida ili od mešavine lipida. Smeša može da sadrži (i) mešavinu anjonskih lipida (ii) mešavinu katjonskih lipida (iii) mešavinu cviterjonskih lipida (iv) mešavinu anjonskih lipida i katjonskih lipida (v) mešavinu anjonskih lipida i cviterjonskih lipida (vi) mešavina cviterjonskih lipida i katjonskih lipida ili (vii) mešavinu anjonskih lipida, katjonskih lipida i cviterjonskih lipida. Slično, smeša može da sadrži i zasićene i nezasićene lipide. Na primer, smeša može da sadrži DSPC (cviterjonski, zasićeni), DlinDMA (katjonski, nezasićeni) i/ili DMG (anjonski, zasićeni). Kada se koristi mešavina lipida, ne moraju svi komponentni lipidi u smeši biti amfifilni, npr. jedan ili više amfifilnih lipida se mogu pomešati sa holesterolom.
[0012] Kada se lipozom pronalaska formira iz mešavine lipida, poželjno je da udeo onih lipida koji su PEGilovani kako je ovde opisano bude manji od 10% ukupne količine lipida, npr. između 0,5-5%, između 1-4%, ili oko 2%. Na primer, korisni lipozomi su prikazani u nastavku u kojima je 2% ukupnog lipida PEG-DMG. Ostatak se može napraviti od npr. holesterola (npr. 35-50% holesterola) i/ili katjonskog lipida (npr.30-70%) i/ili DSPC (npr.5-15%). Takve smeše se koriste u nastavku. Ove procentualne vrednosti su molski procenti.
[0013] Tako se lipozom može formirati od katjonskog lipida (npr. DlinDMA, RV05), cviterionski lipid (npr. DSPC, DPiPE), holesterol i PEGilovani lipid. U primerima je korišćena mešavina DSPC, DlinDMA, PEG-DMG i holesterola, kao i nekoliko daljih smeša.
[0014] Najmanje jedan lipid unutar lipozoma uključuje polietilen glikol deo. Lipozomi koji uključuju ove PEGilovane lipide će imati PEG orijentisan tako da je prisutan barem na spoljašnjoj strani lipozoma (ali neki PEG takođe mogu biti izloženi unutrašnjosti lipozoma tj. vodenom jezgru). Ova orijentacija se može postići pričvršćivanjem PEG-a na odgovarajući deo lipida. Na primer, u amfifilnom lipidu PEG bi bio vezan za hidrofilnu glavu, pošto je glava ta koja se orijentiše prema vodenoj spoljašnjosti lipidnog dvosloja. PEGilacija na ovaj način se može postići kovalentnim vezivanjem PEG-a za lipid npr. koristeći tehnike kao što su one otkrivene u referencama 2 i 3.
[0015] Tako će PEGilovani lipidi sadržavati PEG strukturu:
gde n obezbeđuje molekulsku težinu za PEG između 1kDa i 3kDa npr. između 23 i 68, ili oko 45 za 2kDa PEGilaciju (npr. vidi SI.16).
[0016] PEG deo može da se završi sa -O-metil grupom, i tako PEGilovani lipid može da sadrži:
[0017] Uključujući vezivanje za azot u grupi glave lipida, prema tome, PEGilovani lipid koristan prema pronalasku može sadržati:
[0018] Jedan pogodan PEGilovani lipid za upotrebu prema pronalasku je PEG-DMG, kako se koristi u primerima. Sl. 17A do 17E pokazuju dalje korisne PEGilovane lipide. PEGilovani holesterol se takođe može koristiti. Mogu se koristiti i drugi PEGilovani lipidi npr. lipidi formule (X):
gde:
Z je hidrofilna komponenta glavne grupe izabrana od PEG-a i polimera na bazi poli(oksazolina), poli(etilen oksida), poli(vinil alkohola), poli(glicerola), poli(N-vinilpirolidona), poli[N-(2-) hidroksipropil)metakrilamid] i poli(aminokiselina) pri čemu polimer može biti linearan ili razgranat, i gde polimer može biti opciono supstituisan;
Z je polimerizovan sa n podjedinicama;
n je prosečni stepen polimerizacije između 10 i 200 jedinica Z (i može se optimizovati za različite Z grupe);
L1je opciono supstituisani C1-10alkilen ili C1-10heteroalkilenski linker uključujući nula, jedan ili dva etra (npr. -O-), estra (npr. -C(O)O-), sukcinata (npr. -O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-)), karbamat (npr. -OC(O)-NR'-), karbonat (npr. -OC(O)O-), urea (npr. -NRC(O)NR'- ), amin (npr. -NR'-), amid (npr. -C(O)NR'-), imin (npr. -C(NR')-), tioetar (npr. -S-), ksantat ( npr. -OC(S)S-) i fosfodiestar (npr. -OP(O)2O-), pri čemu je R' nezavisno izabran od -H, -NH-, -NH2-O-, -S-, fosfat ili opciono supstituisani C1-10alkilen;
X1i X2su nezavisno izabrani od ugljenika ili heteroatoma izabranog od -NH-, -O-, -S- ili fosfata;
A1i A2su ili nezavisno izabrani od C6-30alkil, C6-30alkenil i C6-30alkinil, pri čemu A1i A2mogu biti isti ili različiti, ili A1i A2zajedno sa atomom ugljenika za koji su vezani formiraju opciono supstituisani steroid.
[0019] Lipozom pronalaska će tipično uključivati veliki broj PEG grupa, koje mogu biti iste ili različite. Prosečna molekulska masa PEG u lipozomu pronalaska je između 1 kDa i 3 kDa npr. između 1,5-2,5 kDa, između 1,7-2,3 kDa, između 1,8-2,2 kDa, između 1,9-2,1 kDa ili 2 kDa. Stoga PEG može biti PEG koji je uobičajeno poznat kao "PEG 2000" ili "PEG 2k", iako se mogu koristiti i kraći "PEG 1000" i duži "PEG 3000".
[0020] PEG će obično sadržati linearne polimerne lance, ali, u nekim primerima izvođenja, PEG može da sadrži razgranate polimerne lance.
[0021] Takođe je moguće da jedan lipidni molekul uključuje više od jedne PEG grupe npr. vezan za različite atome ugljenika u grupi glave lipida (npr. vidi SI.18). U ovim okolnostima pozivanje na molekulsku masu PEG u lipozomu je molekulska masa po molekulu lipida, a ne po PEG supstituentu. Dakle, u lipozomu u kome jedini PEGilovani lipid ima strukturu prikazanu na Sl.18, gde je upakovana molekulska težina 2 kDa i sastoji se od dva lanca od 1 kDa svaki, prosečna molekulska masa PEG je 2 kDa, a ne 1 kDa.
[0022] U nekim primerima izvođenja PEG može biti supstituisani PEG npr. u kojoj je jedan ili više atoma ugljenika u polimeru supstituisano sa jednom ili više alkil, alkoksi, acil ili aril grupa.
[0023] U nekim primerima izvođenja PEG može da sadrži kopolimer grupe npr. jedan ili više propilen monomera, da bi se formirao PEG polipropilen polimer.
[0024] Lipozomi se obično dele u tri grupe: multilamelarne vezikule (MLV); male unilamelarne vezikule (SUV); i velike unilamelarne vezikule (LUV). MLV imaju više dvoslojnih slojeva u svakoj vezikuli, formirajući nekoliko odvojenih vodenih pregrada. SUV i LUV vehikulumi imaju jedan dvoslojni omotač koji obuhvata vodeno jezgro; SUV vehikulumi obično imaju prečnik ≤50nm, a LUV-ovi imaju prečnik >50nm. Lipozomi pronalaska su idealno LUV sa prečnikom u opsegu od 60-180 nm, a poželjno u opsegu od 80-160 nm.
[0025] Lipozom ovog pronalaska može biti deo kompozicije koja sadrži veći broj lipozoma, a lipozomi unutar njih mogu imati opseg prečnika. Za kompoziciju koja sadrži populaciju lipozoma različitih prečnika: (i) najmanje 80% po broju lipozoma treba da ima prečnike u opsegu od 60-180nm, a poželjno u opsegu od 80-160nm, i/ili (ii ) prosečan prečnik (po intenzitetu npr. Z-prosek) populacije je idealno u opsegu od 60-180nm, a poželjno u opsegu od 80-160nm. Prečnici unutar više njih bi idealno trebalo da imaju indeks polidisperznosti <0,2. Očekuje se da kompleksi lipozom/RNK iz reference 1 imaju prečnik u opsegu od 600-800 nm i visoku polidisperznost.
[0026] Tehnike za pripremu pogodnih lipozoma su dobro poznate u tehnici npr. videti reference 4 do 6. Jedna korisna metoda je opisana u referenci 7 i uključuje mešanje (i) etanolnog rastvora lipida (ii) vodenog rastvora nukleinske kiseline i (iii) pufera, nakon čega sledi mešanje, ekvilibracija, razblaživanje i prečišćavanje. Poželjni lipozomi pronalaska se mogu dobiti ovim postupkom mešanja.
[0027] Da bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom (prečnicimaima), mešanje se može izvršiti korišćenjem postupka u kome se dve struje vodenog rastvora RNK kombinuju u jednoj zoni mešanja sa jednom strujom etanolnog rastvora lipida, sve pri istoj brzini protoka npr. u mikrofluidnom kanalu kao što je opisano u nastavku.
RNK
[0028] Lipozomi pronalaska uključuju RNK molekul koji (za razliku od siRNK, kao u referenci 2) kodira imunogen; i koji uključuje 5' kapu koja sadrži 7'-metilguanozin, a prva 1, 2 ili 3 5' ribonukleotida su metilovani na 2' poziciji riboze. Posle in vivo primene čestica, RNK se oslobađa iz čestica i translatira unutar ćelije da bi obezbedila imunogen in situ.
[0029] RNK je -lančana, i tako je ćelije mogu translatirati bez potrebe za bilo kakvim koracima replikacije kao što je reverzna transkripcija. Takođe se može vezati za TLR7 receptore koje eksprimiraju imune ćelije, čime se pokreće pomoćni efekat.
[0030] Poželjne -lančane RNK se samorepliciraju. Molekul RNK koji se samoreplicira (replikon) može, kada se isporuči u ćeliju kičmenjaka čak i bez ikakvih proteina, dovesti do proizvodnje više ćerki RNK transkripcijom samog sebe (preko antisens kopije koju generiše od sebe). Molekul RNK koji se samoreplicira je stoga tipično molekul -lanca koji se može direktno translatirati nakon isporuke u ćeliju, a ova translacija obezbeđuje RNK-zavisnu RNK polimerazu koja zatim proizvodi i antisens i sens transkripte iz isporučene RNK. Tako isporučena RNK dovodi do proizvodnje više ćerki RNK. Ove ćerke RNK, kao i kolinearni subgenomski transkripti, mogu se sami translatirati da bi se obezbedila in situ ekspresija kodiranog imunogena, ili može biti transkribovana da bi se obezbedili dalji transkripti sa istim smislom kao isporučena RNK koja se translatira da obezbedi in situ ekspresija imunogena. Ukupni rezultat ove sekvence transkripcija je ogromno povećanje broja uvedenih replikonskih RNK i tako kodirani imunogen postaje glavni polipeptidni proizvod ćelija.
[0031] Jedan pogodan sistem za postizanje samoreplikacije je upotreba replikona RNK zasnovanog na alfavirusu. Ovi -lančani replikoni se prevode nakon isporuke u ćeliju da bi se dobila replikaza (ili replikaza-transkriptaza). Replikaza se prevodi kao poliprotein koji se auto-iseca da bi obezbedio replikacioni kompleks koji stvara kopije genomskih –lanaca isporučene RNK sa -lancem. Ovi –lančani transkripti mogu sami biti transkribovani da daju dalje kopije -lančane roditeljske RNK i takođe da daju subgenomski transkript koji kodira imunogen. Translacija subgenomskog transkripta tako dovodi do in situ ekspresije imunogena od strane inficirane ćelije. Odgovarajući replikoni alfavirusa mogu koristiti repliku iz virusa Sindbis, Semliki forest virusa, virusa istočnog konjskog encefalitisa, virusa venecuelanskog konjskog encefalitisa, itd. Mogu se koristiti sekvence virusa mutanta ili divljeg tipa npr. atenuirani TC83 mutant VEEV je korišćen u replikonima [8].
[0032] Poželjni molekul RNK koji se samoreplicira tako kodira (i) RNK-zavisnu RNK polimerazu koja može transkribovati RNK iz molekula RNK koji se samoreplicira i (ii) imunogen. Polimeraza može biti replika alfavirusa npr. koji sadrže jedan ili više alfavirusnih proteina nsP1, nsP2, nsP3 i nsP4.
[0033] Dok prirodni genomi alfavirusa kodiraju strukturne virionske proteine pored poliproteina nestrukturne replikaze, poželjno je da samoreplicirajući RNK molekul pronalaska ne kodira strukturne proteine alfavirusa. Prema tome, poželjna samoreplicirajuća RNK može dovesti do proizvodnje sopstvenih kopija genomske RNK u ćeliji, ali ne i do proizvodnje viriona koji sadrže RNK. Nemogućnost proizvodnje ovih viriona znači da, za razliku od alfavirusa divljeg tipa, molekul RNK koji se samoreplicira ne može da se perpetuira u infektivnom obliku. Strukturni proteini alfavirusa koji su neophodni za perpetuaciju kod virusa divljeg tipa su odsutni u samoreplicirajućim RNK pronalaska i njihovo mesto zauzima(ju) gen(i) koji kodiraju imunogen od interesa, tako da subgenomski transkript kodira imunogen, a ne strukturne alfavirus virion proteine.
[0034] Prema tome, samoreplicirajući RNK molekul koristan prema pronalasku može imati dva otvorena okvira čitanja. Prvi (5') otvoreni okvir čitanja kodira repliku; drugi (3') otvoreni okvir za čitanje kodira imunogen. U nekim primerima izvođenja RNK može imati dodatne (npr. nishodno) otvoreni okviri za čitanje npr. za kodiranje daljih imunogena (videti u nastavku) ili za kodiranje pomoćnih polipeptida.
[0035] Molekul RNK koji se samoreplicira može imati 5' sekvencu koja je kompatibilna sa kodiranom replikazom.
[0036] Molekuli RNK koji se samorepliciraju mogu imati različite dužine, ali su obično dugi 5000-25000 nukleotida npr. 8000-15000 nukleotida, ili 9000-12000 nukleotida. Stoga je RNK duža nego što se vidi pri isporuci siRNK.
[0037] Molekul RNK prema pronalasku ima 5' kapu (npr. 7-metilguanozin). Ova kapa može poboljšati in vivo translaciju RNK. Pored toga, prva 1, 2 ili 3 5' ribonukleotida RNK su metilovani na 2' poziciji riboze.
[0038] 5' nukleotid molekula RNK koji je koristan sa pronalaskom može imati 5' trifosfatnu grupu. U RNK sa kapom ovo može biti povezano sa 7-metilguanozinom preko 5'-do-5' mosta. 5' trifosfat može poboljšati vezivanje RIG-I i tako podstaći adjuvantne efekte.
[0039] Molekul RNK može imati 3' poli-A rep. Takođe može uključivati sekvencu prepoznavanja poli-A polimeraze (npr. AAUAAA) blizu njegovog kraja od 3'.
[0040] Molekul RNK koristan sa pronalaskom će tipično biti jednolančani. Jednolančane RNK generalno mogu inicirati adjuvantni efekat vezivanjem za TLR7, TLR8, RNK helikaze i/ili PKR. RNK isporučena u dvolančanom obliku (dsRNK) može se vezati za TLR3, a ovaj receptor takođe može biti pokrenut sa dsRNK koja se formira ili tokom replikacije jednolančane RNK ili unutar sekundarne strukture jednolančane RNK.
[0041] Molekul RNK koristan sa pronalaskom može se prikladno pripremiti pomoću in vitro transkripcija (IVT). IVT može da koristi (cDNK) šablon kreiran i razmnožen u obliku plazmida u bakterijama, ili stvoren sintetički (na primer, sintezom gena i/ili postupcima inženjeringa lančane reakcije polimeraze (PCR)). Na primer, RNK polimeraza zavisna od DNK (kao što su RNK polimeraze bakteriofaga T7, T3 ili SP6) može se koristiti za transkripciju RNK sa DNK šablona. Odgovarajuće reakcija stavljanja kape i dodavanja poli-A mogu se koristiti po potrebi (iako je poli-A replikona obično kodirana unutar DNK šablona). Ove RNK polimeraze mogu imati stroge zahteve za transkribovane 5' nukleotide i u nekim primerima izvođenja ovi zahtevi moraju biti usklađeni sa zahtevima kodirane replike, kako bi se osiguralo da IVT-transkribovana RNK može efikasno da funkcioniše kao supstrat za njenu sopstveno kodiranu replikazu.
[0042] Kao što je diskutovano u referenci 9, RNK koja se samoreplicira može uključiti (pored bilo koje strukture 5' kape) jedan ili više nukleotida koji imaju modifikovanu nukleobazu. Tako RNK može da sadrži m5C (5-metilcitidin), m5U (5-metiluridin), m6A (N6-metiladenozin), s2U (2-tiouridin), Um (2’-O-metiluridin), m1A (1-metiladenozin); m2A (2-metiladenozin); Am (2’-O-metiladenozin); ms2m6A (2-metiltio-N6-metiladenozin); i6A (N6-izopenteniladenozin); ms2i6A (2-metiltio-N6 izopenteniladenozin); io6A (N6-(cishidroksiizopentenil)adenozin); ms2io6A (2-metiltio-N6-(cis-hidroksiizopentenil) adenozin); g6A (N6-glicinilkarbamoiladenozin); t6A (N6-treonil karbamoiladenozin); ms2t6A (2-metiltio-N6-treonil karbamoiladenozin); m6t6A (N6-metil-N6-treonilkarbamoiladenozin); hn6A(N6.-hidroksinorvalilkarbamoil adenozin); ms2hn6A (2-metiltio-N6-hidroksinorvalil karbamoiladenozin); Ar(p) (2’-O-ribosiladenozin (fosfat)); I (inozin); m11 (1-metilinozin); m’Im (1,2’-O-dimetilinozin); m3C (3-metilcitidin); Cm (2T-O-metilcitidin); s2C (2-tiocitidin); ac4C (N4-acetilcitidin); f5C (5-fonilcitidin); m5Cm (5,2-0-dimetilcitidin); ac4Cm (N4 acetil2TOmetilcitidin); k2C (lizidin); m1G (1-metilguanozin); m2G (N2-metilguanozin); m7G (7-metilguanozin); Gm (2’-O-metilguanozin); m22G (N2,N2-dimetilguanozin); m2Gm (N2,2’-O-dimetilguanozin); m22Gm (N2,N2,2’-O-trimetilguanozin); Gr(p) (2’-O-ribosilguanozin (fosfat)) ; iW (vibutozin); o2iW (peroksivibutozin); OHiW (hidroksivibutozin); OHiW∗ (podmodifikovani hidroksivibutozin); imG (viozin); mimG (metilguanozin); Q (kveuozin); oQ (epoksikveuozin); galQ (galtaktozilkveuozin); manQ (manozil-kveuozin); preQo (7-cijano-7-deazaguanozin); preQi (7-aminometil-7-deazaguanozin); G∗ (archaeozin); D (dihidrouridin); m5Um (5,2’-O-dimetiluridin); s4U (4-tiouridin); m5s2U (5-metil-2-tiouridin); s2Um (2-tio-2’-O-metiluridin); acp3U (3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin); ho5U (5-hidroksiuridin); mo5U (5-metoksiuridin); cmo5U (uridin 5-oksisirćetna kiselina); mcmo5U (uridin metil estar 5-oksisirćetne kiseline); chm5U (5-(karboksihidroksimetil)uridin)); mchm5U (5-(karboksihidroksimetil)uridin metil ester); mcm5U (5-metoksikarbonil metiluridin); mcm5Um (S-metoksikarbonilmetil-2-O-metiluridin); mcm5s2U (5-metoksikarbonilmetil-2-tiouridin); nm5s2U (5-aminometil-2-tiouridin); mnm5U (5-metilaminometiluridin); mnm5s2U (5-metilaminometil-2-tiouridin); mnm5se2U (5-metilaminometil-2-selenouridin); ncm5U (5-karbamoilmetil uridin); ncm5Um (5-karbamoilmetil-2’-O-metiluridin); cmnm5U (5-karboksimetilaminometiluridin); cnmm5Um (5-karboksimetilaminometil-2-L-O-metiluridin); cmnm5s2U (5-karboksimetilaminometil-2-tiouridin); m62A (N6,N6-dimetiladenozin); Tm (2’-O-metilinozin); m4C (N4-metilcitidin); m4Cm (N4,2-O-dimetilcitidin); hm5C (5-hidroksimetilcitidin); m3U (3-metiluridin); cm5U (5-karboksimetiluridin); m6Am (N6,T-O-dimetiladenozin); rn62Am (N6,N6,O-2-trimetiladenozin); m2’7G (N2,7-dimetilguanozin);
1
m2’2’7G (N2,N2,7-trimetilguanozin); m3Um (3,2T-O-dimetiluridin); m5D (5-metildihidrouridin); f5Cm (5-formil-2’-O-metilcitidin); m1Gm (1,2’-Odimetilguanozin); m’Am (1,2-O-dimetil adenozin) irinometiluridin); tm5s2U (S-taurinometil-2-tiouridin)); imG-14 (4-demetil guanozin); imG2 (izoguanozin); ili ac6A (N6-acetiladenozin), hipoksantin, inozin, 8-oksoadenin, njegovi 7-supstituisani derivati, dihidrouracil, pseudouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-aminouracil, 5-(C1-C6)-alkiluracil, 5-metiluracil, 5-(C2-C6)-alkeniluracil, 5-(C2-C6)-alkiniluracil, 5-(hidroksimetil)uracil, 5-chlorouracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-hidroksicitozin, 5-(C1-C6 )-alkilcitozin, 5-metilcitozin, 5-(C2-C6)-alkenilcitozin, 5-(C2-C6)-alkinilcitozin, 5-hlorocitozin, 5-fluorocitozin, 5-bromocitozin, N2-dimetilguanin, 7-deazaguanin, 8-azaguanin, 7-deaza-7-supstituisani guanin, 7-deaza-7-(C2-C6)alkinilguanin, 7-deaza-8-supstituisani guanin, 8-hidroksiguanin, 6-tioguanin, 8-oksoguanin, 2-aminopurin, 2-amino-6-hloropurin, 2,4-diaminopurin, 2,6-diaminopurin, 8-azapurin, supstituisani 7-deazapurin, 7-deaza-7-supstituisani purin, 7-deaza-8-supstituisani purin, ili abazični nukleotid. Na primer, RNK koja se samoreplicira može uključivati jednu ili više modifikovanih pirimidinskih nukleobaza, kao što su pseudouridin i/ili ostaci 5-metilcitozina. Prema pronalasku, RNK uključuje 5' kapu koja sadrži 7'-metilguanozin, a prvi 1, 2 ili 35' ribonukleotida su metilovani na 2' poziciji riboze.
[0043] RNK koja se koristi u pronalasku idealno uključuje samo fosfodiestarske veze između nukleozida, ali u nekim primerima izvođenja može da sadrži fosforoamidn, fosforotioatne i/ili metilfosfonatne veze.
[0044] U idealnom slučaju, lipozom uključuje manje od 10 različitih vrsta RNK npr.5, 4, 3, ili 2 različite vrste; najpoželjnije, lipozom uključuje jednu vrstu RNK tj. svi molekuli RNK u lipozomu imaju istu sekvencu i istu dužinu.
[0045] Količina RNK po lipozomu može varirati. Broj pojedinačnih samoreplicirajućih RNK molekula po lipozomu je tipično ≤50 npr. <20, <10, <5 ili 1-4 po lipozomu.
Imunogen
[0046] Molekuli RNK koji se koriste u pronalasku kodiraju polipeptidni imunogen. Nakon primene lipozoma, RNK se translatira in vivo, a imunogen može izazvati imuni odgovor kod primaoca. Imunogen može izazvati imuni odgovor protiv bakterije, virusa, gljivice ili parazita (ili, u nekim primerima izvođenja, protiv alergena; a u drugim primerima izvođenja, protiv tumorskog antigena). Imuni odgovor može da obuhvata odgovor antitela (obično uključujući IgG) i/ili imuni odgovor posredovan ćelijama. Polipeptidni imunogen će obično izazvati imuni odgovor koji prepoznaje odgovarajući bakterijski, virusni, gljivični ili parazitski (ili alergen ili tumor) polipeptid, ali u nekim primerima izvođenja polipeptid može delovati kao mimotop da izazove imuni odgovor koji prepoznaje bakterijski, virusni, gljivični ili parazitski saharid. Imunogen će tipično biti površinski polipeptid npr. adhezin, hemaglutinin, glikoprotein omotača, spajk glikoprotein, itd.
[0047] Molekul RNK može da kodira jedan polipeptidni imunogen ili više polipeptida. Više imunogena može biti predstavljeno kao jedan polipeptidni imunogen (fuzioni polipeptid) ili kao zasebni polipeptidi. Ako se imunogeni eksprimiraju kao odvojeni polipeptidi iz replikona, onda jedan ili više njih mogu biti obezbeđeni ushodnim IRES ili dodatnim elementom virusnog promotora. Alternativno, višestruki imunogeni mogu biti eksprimirani iz poliproteina koji kodira pojedinačne imunogene spojene sa kratkom autokatalitičkom proteazom (npr. virus slinavke i šapa 2A protein) ili kao inteini.
[0048] Za razliku od referenci 1 i 10, RNK kodira imunogen. Da bi se izbegla sumnja, pronalazak ne obuhvata RNK koja kodira luciferazu svica ili koja kodira fuzioni protein E.coli β-galaktozidaze ili koja kodira zeleni fluorescentni protein (GFP). Takvi polipeptidi mogu biti korisni kao markeri, ili čak u kontekstu genske terapije, ali pronalazak se odnosi na isporuku RNK za izazivanje sistema imunološkog odgovora. Dakle, imunogen takođe nije sopstveni protein koji se isporučuje kao dopuna ili zamena za defektni protein domaćina (kao u genskoj terapiji). Takođe, RNK nije totalna RNK timusa miša.
[0049] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv jedne od ovih bakterija: Neisseria meningitidis: korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, membranske proteine kao što su adhezini, autotransporteri, toksini, proteini za sticanje gvožđa i protein koji vezuje faktor H. Kombinacija tri korisna polipeptida je otkrivena u referenci 11.
[0050] Streptococcus pneumonie: korisni polipeptidni imunogeni su otkriveni u referenci 12. Ovo uključuje, ali nije ograničeno na, podjedinicu RrgB pilus, prekursor beta-N-acetilheksosaminidaze (spr0057), spr0096, protein opšteg stresa GSP-781 (spr2021), SP2216, serin/treonin kinaza StkP (SP1732) i pneumokokni površinski adhezin PsaA.
[0051] Streptococcus piogenes: korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referencama 13 i 14.
Moraxella catarrhalis.
[0052] Bordetella pertussis: Korisni imunogeni protiv pertusisa uključuju, ali nisu ograničeni na, toksin ili toksoid pertusisa (PT), filamentni hemaglutinin (FHA), pertaktin i aglutinogene 2 i 3.
[0053] Staphylococcus aureus: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referenci 15, kao što su hemolizin, eskA, eskB, protein koji vezuje ferihrom (sta006) i/ili sta011 lipoprotein.
[0054] Clostridium tetani: tipični imunogen je tetanusni toksoid.
[0055] Cornynebacterium diphtheriae: tipičan imunogen je toksoid difterije.
[0056] Haemophilus influenzae: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referencama 16 i 17.
Pseudomonas aeruginosa
[0057] Streptococcus agalactiae: korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referenci 13.
[0058] Chlamydia trachomatis: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, OmpH-like, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA i MurG (npr. kao što je otkriveno u referenci 18. LcrE [19] i HtrA [20] su dva poželjna imunogena.
[0059] Chlamydia pneumoniae: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referenci 21.
[0060] Helicobacter pylori: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, CagA, VacA, NAP i/ili ureazu [22].
[0061] Escherichia coli: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, imunogene izvedene iz enterotoksigena E. coli (ETEC), enteroagregativan E. coli (EAggEC), difuzno prianjajući E. coli (DAEC), enteropatogen E. coli (EPEC), ekstraintestinalni patogen E. coli (EkPEC) i/ili enterohemoragični E. coli (EHEC). EkPEC sojevi uključuju uropatogene E.coli (UPEC) i povezan sa meningitisom/sepsom E.coli (MNEC). Korisni UPEC polipeptidni imunogeni su otkriveni u referencama 23 i 24. Korisni MNEC imunogeni su otkriveni u referenci 25. Korisni imunogen za nekoliko E.coli tipova je AcfD [26].
Bacillus anthracis
[0062] Yersinia pestis: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one otkrivene u referencama 27 i 28.
1
Staphylococcus epidermis
Clostridium perfringens ili Clostridium botulinums
Legionella pneumophila
Coxiella burnetii
[0063] Brucella, kao što je B.abortus, B.canis, B.melitensis, B.neotomae, B.ovis, B.suis, B.pinnipediae.
[0064] Francisella, kao što je F.novicida, F.philomiragia, F.tularensis.
Neisseria gonorrhoeae
Treponema pallidum
Haemophilus ducreyi
Enterococcus faecalis ili Enterococcus faecium
Staphylococcus saprophyticus
Yersinia enterocolitica
Mycobacterium tuberculosis
Rickettsia
Listeria monocytogenes
Vibrio cholerae
Salmonella typhi
Borrelia burgdorferi
Porphyromonas gingivalis
Klebsiella
[0065] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv jednog od ovih virusa:
Orthomyxovirus: Korisni imunogeni mogu biti iz virusa gripa A, B ili C, kao što su hemaglutinin, neuraminidaza ili matriksni M2 proteini. Tamo gde je imunogen hemaglutinin virusa gripa A, on može biti iz bilo kog podtipa npr. H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ili H16.
[0066] Paramyxoviridae virusi: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od pneumovirusa (npr. respiratorni sincicijalni virus, RSV), Rubulavirusi (npr. virus zauški), paramiksovirusi (npr. virus parainfluence), metapneumovirusi i morbilivirusi (npr. virus morbila).
[0067] Poxviridae: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Orthopoxvirus kao što je Variola vera, uključujući, ali ne ograničeno na, Variola major i Variola minor.
[0068] Picornavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od pikornavirusa, kao što su enterovirusi, rinovirusi, heparnavirusi, kardiovirusi i aftovirusi. U jednom primeru izvođenja, enterovirus je poliovirus npr. poliovirus tipa 1, tipa 2 i/ili tipa 3. U drugom primeru izvođenja, enterovirus je EV71 enterovirus. U drugom primeru izvođenja, enterovirus je koksaki A ili B virus.
[0069] Bunyavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Ortobunyavirus, kao što je virus kalifornijskog encefalitisa, Phlebovirus, kao što je virus groznice doline Rift, ili Nairovirus, kao takav Krim-Kongo hemoragična groznica virus.
[0070] Heparnavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Heparnavirusa, kao što je virus hepatitisa A (HAV).
[0071] Filovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od filovirusa, kao što je virus ebole (uključujući ebolavirus Zaira, Obale Slonovače, Reston ili Sudan) ili virus Marburg.
[0072] Togavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Togavirusa, kao što su Rubivirus, Alfavirus ili Arterivirus. Ovo uključuje virus rubeole.
1
[0073] Flavivirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Flavivirusa, kao što je virus krpeljnog encefalitisa (TBE), virus Denga (tipovi 1, 2, 3 ili 4), virus žute groznice, virus japanskog encefalitisa, Kyasanur Forest virus, virus encefalitisa Zapadnog Nila, virus encefalitisa Sent Luisa, virus ruskog prolećno-letnjeg encefalitisa, virus Powassan encefalitisa.
[0074] Pestivirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od pestivirusa, kao što je virusna dijareja goveda (BVDV), klasična svinjska kuga (CSFV) ili granična bolest (BDV).
[0075] Hepadnavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Hepadnavirusa, kao što je virus hepatitisa B. Kompozicija može uključivati površinski antigen virusa hepatitisa B (HBsAg).
[0076] Drugi virusi hepatitisa: Kompozicija može uključiti imunogen iz virusa hepatitisa C, virusa delta hepatitisa, virusa hepatitisa E ili virusa hepatitisa G.
[0077] Rhabdovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Rhabdovirusa, kao što je Lyssavirus (npr. virus besnila) i vezikulovirus (VSV).
[0078] Caliciviridae: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Calciviridae, kao što je Norwalk virus (Norovirus), i viruse nalik Norwalk, kao što su virus Havaja i Snow Mountain Virus.
[0079] Korona virus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od SARS koronavirusa, infektivnog bronhitisa ptica (IBV), virusa mišjeg hepatitisa (MHV) i virusa prenosivog gastroenteritisa svinja (TGEV). Imunogen za koronavirus može biti spajk polipeptid.
[0080] Retrovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od onkovirusa, lentivirusa (npr. HIV-1 ili HIV-2) ili Spumavirus.
[0081] Reovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od ortoreovirusa, rotavirusa, orbivirusa ili kolitivirusa.
[0082] Parvovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Parvovirusa B19.
[0083] Herpesvirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od humanog herpes virusa, kao što su, samo kao primer, Herpes Simplex Virusi (HSV) (npr. HSV tipovi 1 i 2), virus Varicella-zoster (VZV), Epstein-Barr virus (EBV), Citomegalovirus (CMV), Humani herpesvirus 6 (HHV6), Humani herpesvirus 7 (HHV7) i Humani Herpesvirus 8 (HHV8).
[0084] Papovavirusi: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od
1
papiloma virusa i polioma virusa. (humani) papiloma virus može biti serotipa 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 ili 65 npr. od jednog ili više serotipova 6, 11, 16 i/ili 18.
[0085] Adenovirus: Virusni imunogeni uključuju one izvedene iz adenovirusa serotipa 36 (Ad-36).
[0086] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv virusa koji inficira ribu, kao što su: virus infektivne anemije lososa (ISAV), virus bolesti pankreasa lososa (SPDV), virus infektivne pankreasne nekroze (IPNV), virus kanalnog soma (CCV) , virus bolesti limfocistisa riba (FLDV), virus infektivne hematopoetske nekroze (IHNV), koi herpesvirus, virus sličan picorna lososa (takođe poznat kao virus atlantskog lososa sličan picorna), virus lososa kopnene vode (LSV), rotavirus atlantskog lososa (ASR ), virus bolesti crvenila pastrmke (TSD), virus tumora koho lososa (CSTV) ili virus virusne hemoragične septikemije (VHSV).
[0087] Gljivični imunogeni mogu biti izvedeni iz Dermatophytres, uključujući: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, and/or Trichophyton faviforme; or from Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis and Enterocytozoon bieneusi; the less common are Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp.,
1
Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaria spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp, i Cladosporium spp.
[0088] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv parazita iz roda Plasmodium, kao npr P.falciparum, P.vivax, P.malariae ili P.ovale. Stoga se pronalazak može koristiti za imunizaciju protiv malarije. U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv parazita iz Caligidae porodice, posebno one iz Lepeophtheirus i Caligus rodova npr. morske vaške kao npr Lepeophtheirus salmonis ili Caligus rogercresseii.
[0089] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv: alergena polena (alergeni polena drveća, biljaka, korova i trava); alergeni insekata ili arahnida (inhalacioni alergeni, pljuvačka i otrov, npr. alergeni grinja, alergeni bubašvaba i mušica, alergeni otrova himenoptera); alergeni životinjske dlake i peruti (od npr. pas, mačka, konj, pacov, miš, itd.); i alergeni u hrani (npr. glijadin). Važni polenski alergeni drveća, trava i bilja su takvi koji potiču iz taksonomskih redova Fagales, Oleales, Pinales i Platanaceae uključujući, ali ne ograničavajući se na, brezu (Betula), jovu (Alnus), lesku (Corylus), grab (Carpinus) i maslina (Olea), kedar (Cryptomeria i Juniperus), platana (Platanus), red Poales uključujući trave iz rodova Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale i Sorghum, redovi Asterales i Urticales uključujući biljke iz rodova Ambrosia, Artemisia i Parietaria. Drugi važni inhalacioni alergeni su oni iz grinja kućne prašine iz roda Dermatophagoides i Euroglyphus, grinja za skladištenje. npr. Lepidoglyphys, Glycyphagus i Tyrophagus, oni od bubašvaba, mušica i buva npr. Blatella, Periplaneta, Chironomus i Ctenocepphalides, i oni od sisara kao što su mačke, psi i konji, alergeni otrova, uključujući one koji potiču od insekata koji ubadaju ili grizu, kao što su oni iz taksonomskog reda Hymenoptera uključujući pčele (Apidae), ose (Vespidea), i mravi (Formicoidae).
[0090] U nekim primerima izvođenja, imunogen je tumorski antigen izabran između: (a) antigena raka testisa kao što su NI-ESO-1, SSKS2, SCP1 kao i polipeptida porodice RAGE, BAGE, GAGE i MAGE, na primer, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 i MAGE-12 (koji se mogu koristiti, na primer, za lečenje melanoma, pluća, glave i vrata , NSCLC, tumori dojke, gastrointestinalnog trakta i mokraćne bešike; (b) mutirani antigeni, na primer, p53 (povezan sa različitim čvrstim tumorima, npr., kolorektalni rak, rak pluća, glave i vrata), p21/Ras (povezan sa, npr., melanomom, rakom pankreasa i kolorektalnim kancerom), CDK4 (povezan sa, npr., melanomom), MUM1 (povezan sa, npr., melanomom), kaspaza-8 (povezana sa, npr., rakom glave i vrata), CIA
1
0205 (povezan sa, npr., rakom mokraćne bešike), HLA-A2-R1701, beta katenin (povezan sa, npr., melanomom), TCR (povezan sa, npr., T-ćelijski ne-Hodgkinov limfom), BCR-abl (povezan sa, npr., hroničnom mijelogenom leukemijom), triozefosfat izomeraza, KIA 0205, CDC-27 i LDLR-FUT; (c) prekomerno eksprimirani antigeni, na primer, galektin 4 (povezan sa, npr., kolorektalnim karcinomom), Galektin 9 (povezan sa, npr., Hočkinovom bolešću), proteinaza 3 (povezana sa, npr., hroničnom mijelogenom leukemijom), VT 1 (povezan sa, npr., raznim leukemijama), karboanhidraza (povezana sa, npr., rakom bubrega), aldolaza A (povezana sa, npr., rakom pluća), PRAME (povezan sa, npr., melanomom), HER-2/neu (povezan sa, npr., rakom dojke, debelog creva, pluća i jajnika), mamaglobin, alfa-fetoprotein (povezan sa, npr., hepatomom), KSA (povezan sa, npr., kolorektalnim karcinomom), gastrin (povezan sa, npr., rakom pankreasa i želuca), katalitički protein telomeraze, MUC-1 (povezan sa, npr., rakom dojke i jajnika), G-250 (povezan sa, npr., karcinomom bubrežnih ćelija), p53 (povezan sa, npr., rakom dojke, debelog creva) i karcinoembrionalni antigen (povezan sa, npr., rakom dojke, rakom pluća i karcinomom gastrointestinalnog trakta kao što je kolorektalni kancer); (d) zajednički antigeni, na primer, antigeni za diferencijaciju melanoma i melanocita kao što su MART-1/Melan A, gp100, MC1R, receptor hormona koji stimuliše melanocite, tirozinaza, protein srodan tirozinazi-1/TRP1 i protein povezan sa tirozinazom-2/TRP2 (povezan sa, npr., melanom); (e) antigeni povezani sa prostatom kao što su PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, povezani sa npr., karcinomom prostate; (f) idiotipi imunoglobulina (povezani sa mijelomom i B ćelijskim limfomima, na primer). U određenim primerima izvođenja, imunogeni tumora uključuju, ali nisu ograničeni na, p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MIL-RAR, antigene virusa Epstein Barr, EBNA, humane antigene papiloma virusa (HPV), uključujući E6 i E7, antigene virusa hepatitisa B i C, antigene humanog limfotropnog virusa T-ćelija, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15- 3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag , MOV18, NB/70K, NI-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (Mac-2 vezujući protein/protein povezan sa ciklofilinom C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS i slično.
Farmaceutske kompozicije
[0091] Lipozomi pronalaska su korisni kao komponente u farmaceutskim kompozicijama za
1
imunizaciju subjekata protiv različitih bolesti. Ove kompozicije će tipično uključiti farmaceutski prihvatljiv nosač pored lipozoma. Detaljna diskusija o farmaceutski prihvatljivim nosačima dostupna je u referenci 29.
[0092] Farmaceutska kompozicija pronalaska može uključivati jedan ili više imunopotencijatora malih molekula. Na primer, kompozicija može uključivati agonist TLR2 (npr. Pam3CSK4), agonist TLR4 (npr. aminoalkil glukozaminid fosfat, kao što je E6020), agonist TLR7 (npr. imikvimod), agonist TLR8 (npr. resikvimod) i/ili agonist TLR9 (npr. IC31). Bilo koji takav agonist idealno ima molekulsku težinu od <2000Da. U nekim primerima izvođenja, takvi agonisti su takođe inkapsulirani sa RNK unutar lipozoma, ali u drugim primerima izvođenja oni su nekapsulirani. Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu uključivati lipozome u običnoj vodi (npr. v.f.i.) ili u tamponu npr. fosfatni pufer, Tris pufer, boratni pufer, sukcinatni pufer, histidinski pufer ili citratni pufer. Puferske soli će obično biti uključene u opsegu 5-20 mM.
[0093] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu imati pH između 5,0 i 9.5 npr. između 6,0 i 8,0.
[0094] Kompozicije pronalaska mogu uključivati natrijumove soli (npr. natrijum hlorid) da daju toničnost. Tipična je koncentracija od 10±2 mg/ml NaCl npr. oko 9 mg/ml.
[0095] Kompozicije pronalaska mogu uključivati helatore metalnih jona. Oni mogu produžiti stabilnost RNK uklanjanjem jona koji mogu ubrzati hidrolizu fosfodiestera. Stoga kompozicija može uključivati jednu ili više od EDTA, EGTA, BAPTA, pentetinske kiseline, itd. Takvi helatori su tipično prisutni između 10-500 uM npr. 0.1mM. Citratna so, kao što je natrijum citrat, takođe može delovati kao helator, dok je povoljno takođe da obezbedi pufersku aktivnost.
[0096] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu imati osmolalnost između 200 mOsm/kg i 400 mOsm/kg, npr. između 240-360 mOsm/kg ili između 290-310 mOsm/kg.
[0097] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu uključivati jedan ili više konzervansa, kao što su tiomersal ili 2-fenoksietanol. Poželjne su kompozicije bez žive, a mogu se pripremiti vakcine bez konzervansa.
[0098] Farmaceutske kompozicije pronalaska su poželjno sterilne.
[0099] Farmaceutske kompozicije pronalaska su poželjno nepirogene npr. koji sadrži <1 EU (jedinica endotoksina, standardna mera) po dozi, a poželjno <0,1 EU po dozi.
[0100] Farmaceutske kompozicije pronalaska su poželjno bez glutena.
[0101] Farmaceutske kompozicije pronalaska se mogu pripremiti u obliku jedinične doze. U nekim primerima izvođenja, jedinična doza može imati zapreminu između 0,1-1,0 ml npr.
2
oko 0,5 ml.
[0102] Kompozicije se mogu pripremiti kao injekcije, bilo kao rastvori ili suspenzije. Kompozicija se može pripremiti za plućnu primenu npr. pomoću inhalatora, koristeći fini sprej. Kompozicija se može pripremiti za nazalnu, ušnu ili okularnu primenu npr. kao sprej ili kapi. Tipične su injekcije za intramuskularnu primenu.
[0103] Kompozicije sadrže imunološki efikasnu količinu lipozoma, kao i bilo koje druge komponente, po potrebi. Pod 'imunološki efikasnom količinom', podrazumeva se da je primena te količine pojedincu, bilo u jednoj dozi ili kao deo serije, efikasna za lečenje ili prevenciju. Ovaj iznos varira u zavisnosti od zdravlja i fizičkog stanja pojedinca koji se leči, starosti, taksonomske grupe pojedinca koji se leči (npr. ne-humani primat, primat, itd.), kapaciteta imunog sistema pojedinca da sintetiše antitela, željenog stepena zaštite, formulacije vakcine, procene medicinske situacije od strane lekara i drugih relevantnih faktora. Očekuje se da će količina biti u relativno širokom rasponu koji se može utvrditi kroz rutinska ispitivanja. Sadržaj lipozoma i RNK u kompozicijama pronalaska će generalno biti izražen u odnosu na količine RNK po dozi. Poželjna doza ima ≤100µg RNK (npr. od 10-100 µg, kao što je oko 101 µg, 25 µg, 50 µg, 75 µg ili 100 µg), ali ekspresija se može videti na mnogo nižim nivoima npr. ≤1 µg/doza, ≤100 ng/doza, ≤10 ng/doza, ≤1 ng/doza, itd
[0104] Pronalazak takođe obezbeđuje uređaj za isporuku (npr. špric, nebulizator, raspršivač, inhalator, dermalni flaster, itd.) koji sadrže farmaceutsku kompoziciju pronalaska. Ovaj uređaj se može koristiti za davanje kompozicije kičmenjacima.
[0105] Lipozomi pronalaska ne sadrže ribozome.
Medicinske upotrebe
[0106] Za razliku od čestica otkrivenih u referenci 10, lipozomi i farmaceutske kompozicije pronalaska su za in vivo upotrebu za izazivanje imunološkog odgovora protiv imunogena od interesa.
[0107] Pronalazak takođe obezbeđuje lipozom ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska za upotrebu u postupku za izazivanje imunog odgovora kod kičmenjaka.
[0108] Izazivanjem imunološkog odgovora kod kičmenjaka ovim upotrebama, kičmenjak se može zaštititi od različitih bolesti i/ili infekcija npr. protiv bakterijskih i/ili virusnih bolesti kao što je prethodno diskutovano. Lipozomi i kompozicije su imunogeni, i poželjnije su kompozicije vakcine. Vakcine prema pronalasku mogu biti ili profilaktičke (tj. za sprečavanje infekcije) ili terapijske (tj. za lečenje infekcije), ali će obično biti profilaktičke.
[0109] Poželjno je da je kičmenjak sisar, kao što je čovek ili veliki veterinarski sisar (npr. konji, goveda, jeleni, koze, svinje). Tamo gde je vakcina za profilaktičku upotrebu, čovek je poželjno dete (npr. malo dete ili novorođenče) ili tinejdžer; gde je vakcina za terapeutsku upotrebu, čovek je poželjno tinejdžer ili odrasla osoba. Vakcina namenjena deci može se davati i odraslima npr. da proceni bezbednost, dozu, imunogenost, itd.
[0110] Vakcine pripremljene prema pronalasku mogu se koristiti za lečenje i dece i odraslih. Dakle, humani pacijent može biti star manje od 1 godine, manje od 5 godina, 1-5 godina, 5-15 godina, 15-55 godina ili najmanje 55 godina. Poželjni pacijenti za primanje vakcina su starije osobe (npr. ≥50 godina, ≥60 godina, a poželjno ≥65 godina), mladi (npr. ≤5 godina), hospitalizovani pacijenti, zdravstveni radnici, pripadnici oružanih snaga i vojnog osoblja, trudnice, hronični bolesnici ili pacijenti sa imunodeficijencijom. Međutim, vakcine nisu pogodne samo za ove grupe i mogu se koristiti generalno u populaciji.
[0111] Kompozicije pronalaska će se generalno davati direktno pacijentu. Direktna isporuka se može postići parenteralnom injekcijom (npr. subkutano, intraperitonealno, intravenozno, intramuskularno, intradermalno ili u intersticijski prostor tkiva; za razliku od reference 1, intraglosalna injekcija se obično ne koristi sa ovim pronalaskom). Alternativni putevi primene uključuju rektalni, oralni (npr. tableta, sprej), bukalni, sublingvalni, vaginalni, lokalni, transdermalni ili transkutani, intranazalni, okularni, auralni, plućni ili drugi mukozni put primene. Intradermalna i intramuskularna primena su dva poželjna načina. Injekcija može biti putem igle (npr. hipodermalna igla), ali se alternativno može koristiti injekcija bez igle. Tipična intramuskularna doza je 0,5 ml.
[0112] Pronalazak se može koristiti za izazivanje sistemskog i/ili mukoznog imuniteta, poželjno za izazivanje poboljšanog sistemskog i/ili mukoznog imuniteta.
[0113] Doziranje može biti prema rasporedu jedne doze ili rasporedu višestrukih doza. Višestruke doze se mogu koristiti u rasporedu primarne imunizacije i/ili u rasporedu dopunske imunizacije. U šemi višestrukih doza različite doze se mogu davati istim ili različitim putevima npr. parenteralni prajming i nuster preko sluzokože, prajming preko sluzokože i parenteralni buster, itd. Više doza će se obično davati u razmaku od najmanje 1 nedelje (npr. oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 4 nedelje, oko 6 nedelja, oko 8 nedelja, oko 10 nedelja, oko 12 nedelja, oko 16 nedelja, itd.). U jednom primeru izvođenja, višestruke doze se mogu primeniti približno 6 nedelja, 10 nedelja i 14 nedelja nakon rođenja, npr. u dobi od 6 nedelja, 10 nedelja i 14 nedelja, kako se često koristi u World Health Organisation’s Expanded Program on Immunisation ("EPI"). U alternativnom priemru izvođenja, dve primarne doze se daju u razmaku od oko dva meseca, npr. u razmaku od oko 7, 8 ili 9 nedelja, nakon čega sledi jedna ili više buster doza oko 6 meseci do 1 godine nakon druge primarne doze, npr. oko 6, 8, 10 ili 12 meseci nakon druge primarne doze. U daljem izvođenju, tri primarne doze se daju u razmaku od oko dva meseca, npr. u razmaku od oko 7, 8 ili 9 nedelja, nakon čega sledi jedna ili više buster doza oko 6 meseci do 1 godine nakon treće primarne doze, npr. oko 6, 8, 10 ili 12 meseci nakon treće primarne doze.
Formula (X)
[0114] Jedinjenja formule (X) sadrže hidrofilnu polimernu glavnu grupu vezanu za lipidni deo. Oni se mogu opisati kao "stelt lipidi" i imaju formulu:
gde:
Z je hidrofilna komponenta glavne grupe izabrana od PEG i polimera na bazi poli(oksazolina), poli(etilen oksida), poli(vinil alkohola), poli(glicerola), poli(N-vinilpirolidona), poli[N-(2-) hidroksipropil)metakrilamid] i poli(aminokiselina) pri čemu polimer može biti linearan ili razgranat, i gde polimer može biti opciono supstituisan; pri čemu je Z polimerizovan sa n podjedinicama;
n je prosečni stepen polimerizacije između 10 i 200 jedinica Z, pri čemu je n optimizovan za različite tipove polimera;
L1je opciono supstituisani C1-10alkilen ili C1-10heteroalkilenski linker uključujući nula, jedan ili dva etra (npr. -O-), estra (npr. -C(O)O-), sukcinata (npr. -O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-)), karbamat (npr. -OC(O)-NR'-), karbonat (npr. -OC(O)O-), urea (npr. -NRC(O)NR'- ), amin (npr. -NR'-), amid (npr. -C(O)NR'-), imin (npr. -C(NR')-), tioetar (npr. -S-), ksantat ( npr. -OC(S)S-) i fosfodiestar (npr. -OP(O)2O-),
pri čemu je R' nezavisno izabran od -H, -NH-, -NH2-O-, -S-, fosfat ili opciono supstituisani C1-10alkilen;
X1i X2su nezavisno izabrani od ugljenika ili heteroatoma izabranog od -NH-, -O-, -S- ili fosfata;
A1i A2su nezavisno izabrani od C6-30alkil, C6-30alkenil i C6-30alkinil, pri čemu A1i A2mogu biti isti ili različiti, ili A1i A2zajedno sa atomom ugljenika za koji su vezani formiraju opciono supstituisani steroid.
[0115] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje formule (X) ima formulu (X')
2
gde
PEG je poli(etilen glikol) podjedinica, pri čemu PEG može biti linearan ili razgranat;
n je prosečni stepen polimerizacije između 10 i 200 jedinica PEG, poželjno oko 45 jedinica; L1je opciono supstituisani C1-10heteroalkilenski linker koji sadrži jedan ili dva etra, estra, sukcinata, karbamata, karbonata, uree, amina, amida, imina, tioetra, ksantata i fosfodiestara; X1i X2su kiseonik;
A1i A2su nezavisno izabrani od C6-30alkil, C6-30alkenil i C6-30alkinil, pri čemu A1i A2mogu biti isti ili različiti, ili pri čemu A1i A2zajedno sa atomom ugljenika za koji su vezani formiraju opciono supstituisani steroid.
[0116] Lipidi formula (X) i (X'), kada su formulisani sa katjonskim lipidima za formiranje lipozoma, mogu produžiti trajanje lipozoma in vivo (npr. u krvi). Oni mogu zaštititi površinu površine lipozoma i na taj način smanjiti opsonizaciju proteina u krvi i preuzimanje od strane makrofaga. Dalji detalji su u referencama 30 i 31. U jednom primeru izvođenja, lipid sadrži grupu odabranu od PEG (ponekad se naziva poli(etilen oksid)) i polimera na bazi poli(oksazolina), poli(vinil alkohola), poli(glicerola), poli(N-vinilpirolidona), poli[N-(2-hidroksipropil)metakrilamida] i poli(aminokiselina).
[0117] Pogodni PEGilovani lipidi za upotrebu u pronalasku obuhvataju konjugate polietilenglikol-diacilglicerola ili polietilenglikol-diacilglikamida (PEG-DAG), uključujući one koji sadrže dialkilglicerol ili dialkilglikamid grupu koja ima dužinu alkilnog lanca nezavisno do oko 40 sa 4 atoma ugljenika. Dialkilglicerol ili dialkilglikamidna grupa može dalje da sadrži jednu ili više supstituisanih alkil grupa. PEGilovani lipid se može izabrati između PEG-dilaurilglicerola, PEG-dimiritilglicerola (kataloški #GM-020 od NOF), PEG-dipalmitoilglicerola, PEG-disterilglicerola, PEG-dilaurilglikemida, PEG-dimiritilglicemida i PEG-dimiritilglikamida, PEG-holesterola (1-[8'-(holest-5-en-3p-oksi)karboksamido-3',6'-dioksaoktanil]karbamoil-[omega]-metil-poli(etilen glikol), PEG -DMB (3,4-ditetradekoksilbenzil-[omega]-metil-poli(etilen glikol) etar), 1,2-dimirstoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi (polietilen glikol)-2000] (kataloški #880150P od Avanti Polar Lipids). Ostali korisni PEGilovani lipidi su S001, S002, S003, S004, S005, S006, S007, S008, S009, S010, S011 i CS-020SA (NOF i S010); 32 pod oznakama IVa i IVc, respektivno. U ref. 32, drugačija sinteza od one koja je ovde navedena je korišćena za dobijanje IVa i IVc.
Hemijski pojmovi i definicije
Halo
[0118] Termin "halogen" (ili "halo") uključuje fluor, hlor, brom i jod.
Alkil, alkilen, alkenil, alkinil, cikloalkil itd.
[0119] Izrazi "alkil", "alkilen", "alkenil" i "alkinil" se ovde koriste da se odnose na aciklične oblike ravnog i razgranatog lanca. Njihovi ciklični analozi se nazivaju cikloalkil, itd.
[0120] Termin "alkil" uključuje monovalentne, ravne ili razgranate, zasićene, aciklične hidrokarbilne grupe. U jednom primeru izvođenja alkil je C1-10alkil, u drugom primeru izvođenja C1-6alkil, u drugom primeru izvođenja C1-4alkil, kao što su metil, etil, n-propil, ipropil ili t-butil grupe.
[0121] Termin "cikloalkil" uključuje monovalentne, zasićene, ciklične hidrokarbil grupe. U jednom primeru izvođenja cikloalkil je C3-10cikloalkil, u drugom primeru izvođenja C3-
6cikloalkil kao što su ciklopentil i cikloheksil.
[0122] Termin "alkoksi" označava alkil-O-.
[0123] Termin "alkenil" uključuje monovalentne, prave ili razgranate, nezasićene, aciklične hidrokarbil grupe koje imaju najmanje jednu dvostruku vezu ugljenik-ugljenik i, u jednom primeru izvođenja, nema trostruke veze ugljenik-ugljenik. U jednom primeru izvođenja alkenil je C2-10alkenil, u drugom primeru izvođenja C2-6alkenil, u drugom primeru izvođenja C2-4alkenil.
[0124] Izraz "cikloalkenil" uključuje monovalentne, delimično nezasićene, ciklične hidrokarbil grupe koje imaju najmanje jednu dvostruku vezu ugljenik-ugljenik i, u jednom primeru izvođenja, nema trostruke veze ugljenik-ugljenik. U jednom primeru izvođenja cikloalkenil je C3-10cikloalkenil, u drugom primeru izvođenja C5-10cikloalkenil, npr. cikloheksenil ili benzocikloheksil.
[0125] Izraz "alkinil" uključuje monovalentne, prave ili razgranate, nezasićene, aciklične hidrokarbil grupe koje imaju najmanje jednu trostruku vezu ugljenik-ugljenik i, u jednom primeru izvođenja, ne postoje dvostruke veze ugljenik-ugljenik. U jednom primeru izvođenja, alkinil je C2-10alkinil, u drugom primeru izvođenja C2-6alkinil, u drugom primeru izvođenja C2-4alkinil.
2
[0126] Izraz "cikloalkinil" uključuje monovalentne, delimično nezasićene, ciklične hidrokarbil grupe koje imaju najmanje jednu trostruku vezu ugljenik-ugljenik i, u jednom primeru izvođenja, ne postoje dvostruke veze ugljenik-ugljenik. U jednom primeru izvođenja cikloalkinil je C3-10cikloalkenil, u drugom primeru izvođenja C5-10cikloalkinil.
[0127] Termin "alkilen" uključuje dvovalentne, ravne ili razgranate, zasićene, aciklične hidrokarbiln grupe. U jednom primeru izvođenja alkilen je C1-10alkilen, u drugom primeru izvođenja C1-6alkilen, u drugom primeru izvođenja C1-4alkilen, kao što su metilen, etilen, npropilen, i-propilen ili t-butilen grupe.
[0128] Termin "alkenilen" uključuje dvovalentne, prave ili razgranate, nezasićene, aciklične hidrokarbil grupe koje imaju najmanje jednu dvostruku vezu ugljenik-ugljenik i, u jednom primeru izvođenja, nema trostruke veze ugljenik-ugljenik. U jednom primeru izvođenja alkenilen je C2-10alkenilen, u drugom primeru izvođenja C2-6alkenilen, u drugom primeru izvođenja C2-4alkenilen.
[0129] Termin "alkinilen" uključuje dvovalentne, prave ili razgranate, nezasićene, aciklične hidrokarbil grupe koje imaju najmanje jednu trostruku vezu ugljenik-ugljenik i, u jednom primeru izvođenja, ne postoje dvostruke veze ugljenik-ugljenik. U jednom primeru izvođenja alkinilen je C2-10alkinilen, u drugom primeru izvođenja C2-6alkinilen, u drugom primeru izvođenja C2-4alkinilen.
Heteroalkil itd.
[0130] Termin "heteroalkil" uključuje alkil grupe u kojima je do šest atoma ugljenika, u jednom primeru izvođenja do pet atoma ugljenika, u drugom primeru izvođenja do četiri atoma ugljenika, u drugom primeru izvođenja do tri atoma ugljenika, u drugom primeru izvođenja do dva atoma ugljenika, u drugom izvođenju jedan atom ugljenika, svaki je nezavisno zamenjen sa O, S(O)k, N, P(O)rili Si (i poželjno O, S(O)kili N), pod uslovom da ostane najmanje jedan od atoma alkil ugljenika. Heteroalkil grupa može biti C-vezana ili hetero-vezana, tj. može biti povezana sa ostatkom molekula preko atoma ugljenika ili preko O, S(O)k, N, P(O)rili Si.
[0131] Termin "heterocikloalkil" uključuje cikloalkil grupe u kojima je do šest atoma ugljenika, u jednom primeru izvođenja do pet atoma ugljenika, u drugom primeru izvođenja do četiri atoma ugljenika, u drugom primeru izvođenja do tri atoma ugljenika, u drugom primeru izvođenja do dva atoma ugljenika, u drugom primeru izvođenja jedan atom ugljenika, svaki je nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje
2
jedan od cikloalkil atoma ugljenika. Primeri heterocikloalkil grupa uključuju oksiranil, tiaranil, aziridinil, oksetanil, tiatanil, azetidinil, tetrahidrofuranil, tetrahidrotiofenil, pirolidinil, tetrahidropiranil, tetrahidrotiopiranil, morperidinil, piperidinil, piperioksianl-4- , 1,4-azatianil, oksepanil, tiepanil, azepanil, 1,4-dioksepanil, 1,4-oksatiepanil, 1,4-oksaazepanil, 1,4-ditiepanil, 1,4-tiazepanil i 1,4-tieazepanil i 1,4-oksatiepanil. Heterocikloalkil grupa može biti C-vezana ili N-vezana, tj. može biti vezan za ostatak molekula preko atoma ugljenika ili preko atoma azota.
[0132] Termin "heteroalkenil" uključuje alkenil grupe u kojima su do tri atoma ugljenika, u jednom primeru izvođenja do dva atoma ugljenika, u drugom primeru izvođenja jedan atom ugljenika, svaki nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od atoma alkenil ugljenika. Heteroalkenil grupa može biti C-vezana ili hetero-vezana, tj. može biti povezan sa ostatkom molekula preko atoma ugljenika ili preko O, S(O)kili N.
[0133] Termin "heterocikloalkenil" uključuje cikloalkenil grupe u kojima su do tri atoma ugljenika, u jednom primeru izvođenja do dva atoma ugljenika, u drugom primeru izvođenja jedan atom ugljenika, svaki nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od cikloalkenil atoma ugljenika. Primeri heterocikloalkenil grupa uključuju 3,4-dihidro-2H-piranil, 5-6-dihidro-2H-piranil, 2H-piranil, 1,2,3,4-tetrahidropiridinil i 1,2,5,6-tetrahidropiridinil. Heterocikloalkenil grupa može biti C-vezana ili N-vezana, tj. može biti vezana za ostatak molekula preko atoma ugljenika ili preko atoma azota.
[0134] Termin "heteroalkinil" uključuje alkinil grupe u kojima su do tri atoma ugljenika, u jednom primeru izvođenja do dva atoma ugljenika, u drugom primeru izvođenja jedan atom ugljenika, svaki nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od atoma alkinil ugljenika. Heteroalkinil grupa može biti C-vezana ili hetero-vezana, tj. može biti povezan sa ostatkom molekula preko atoma ugljenika ili preko O, S(O)kili N.
[0135] Termin "heterocikloalkinil" uključuje cikloalkinil grupe u kojima su do tri atoma ugljenika, u jednom primeru izvođenja do dva atoma ugljenika, u drugom primeru izvođenja jedan atom ugljenika, svaki nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od cikloalkinil atoma ugljenika. Heterocikloalkenil grupa može biti C-vezana ili N-vezana, tj. može biti vezana za ostatak molekula preko atoma ugljenika ili preko atoma azota.
[0136] Termin "heteroalkilen" uključuje alkilenske grupe u kojima su do tri atoma ugljenika, u jednom primeru izvođenja do dva atoma ugljenika, u drugom primeru izvođenja jedan atom ugljenika, svaki nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od atoma ugljenika alkilena.
2
[0137] Izraz "heteroalkenilen" uključuje alkenilenske grupe u kojima su do tri atoma ugljenika, u jednom primeru izvođenja do dva atoma ugljenika, u drugom primeru izvođenja jedan atom ugljenika, svaki nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od atoma ugljenika alkenilena.
[0138] Termin "heteroalkinilen" uključuje alkinilenske grupe u kojima su do tri atoma ugljenika, u jednom primeru izvođenja do dva atoma ugljenika, u drugom primeru izvođenja jedan atom ugljenika, svaki nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od atoma ugljenika alkinilena.
Aril
[0139] Termin "aril" uključuje monovalentne, aromatične, ciklične hidrokarbil grupe, kao što su fenil ili naftil (npr. 1-naftil ili 2-naftil). Generalno, aril grupe mogu biti monociklične ili policiklične kondenzovane prstenaste aromatične grupe. Poželjni aril su C6-C14aril.
[0140] Drugi primeri aril grupa su monovalentni derivati aceantrilena, acenaftilena, acefenantrilena, antracena, azulena, hrizena, koronena, fluorantena, fluorena, as-indacena, sindacena, indena, naftalena, ovalena, perilena, fenalena, fenantrena, picena, pleiadena, pirena, pirantrena i rubicena.
[0141] Termin "arilalkil" označava alkil supstituisan sa aril grupom, npr. benzil.
[0142] Termin "arilen" uključuje dvovalentne aromatične, ciklične hidrokarbil grupe, kao što je fenilen. Generalno, arilen grupe mogu biti monociklične ili policiklične kondenzovane prstenaste aromatične grupe. Poželjni arilen su C6-C14arilen. Drugi primeri arilenskih grupa su dvovalentni derivati aceantrilena, acenaftilena, acefenantrilena, antracena, azulena, hrizena, koronena, fluorantena, fluorena, as-indacena, s-indacena, indena, naftalena, ovalena, perilena, fenalena, fenantrena, picena, pleiadena, pirena, pirantrena i rubicena.
Heteroaril
[0143] Termin "heteroaril" uključuje monovalentne, heteroaromatične, ciklične hidrokarbil grupe koje dodatno sadrže jedan ili više heteroatoma nezavisno odabranih od O, S, N i NR<N>, gde je R<N>je definisan u nastavku (i u jednom primeru izvođenja je H ili alkil (npr. C1-6alkil)).
[0144] Generalno, heteroaril grupe mogu biti monociklične ili policiklične (npr. biciklične) spojene prstenaste heteroaromatične grupe. U jednom primeru izvođenja, heteroaril grupe
2
sadrže 5-13 članova prstena (poželjno 5-10 članova) i 1, 2, 3 ili 4 heteroatoma u prstenu koji se nezavisno biraju između O, S, N i NR<N>. U jednom primeru izvođenja, heteroaril grupa može imati 5, 6, 9 ili 10 članova, npr. 5-člani monociklični, 6-člani monociklični, 9-člani biciklični spojeni prsten ili 10-člani biciklični spojeni prsten.
[0145] Monociklične heteroaromatične grupe obuhvataju heteroaromatične grupe koje sadrže 5-6 članova prstena i 1, 2, 3 ili 4 heteroatoma izabranih između O, S, N ili NR<N>.
[0146] U jednom primeru izvođenja, 5-člane monociklične heteroaril grupe sadrže 1 član prstena koji je -NR<N>- grupa, -O- atom ili -S- atom i, opciono, 1-3 člana prstena (npr. 1 ili 2 člana prstena) koji su =N-atomi (gde su ostatak od 5 članova prstena atomi ugljenika).
[0147] Primeri 5-članih monocikličnih heteroaril grupa su pirolil, furanil, tiofenil, pirazolil, imidazolil, izoksazolil, oksazolil, izotiazolil, tiazolil, 1,2,3 triazolil, 1,2,4 triazolil, 1,2,3 oksadiazolil. 1,2,4 oksadiazolil, 1,2,5 oksadiazolil, 1,3,4 oksadiazolil, 1,3,4 tiadiazolil, piridil, pirimidinil, piridazinil, pirazinil, 1,3,5 triazinil, 1,2,4 triazinil 2,3 triazinil i tetrazolil.
[0148] Primeri 6-članih monocikličnih heteroaril grupa su piridinil, piridazinil, pirimidinil i pirazinil.
[0149] U jednom primeru izvođenja, 6-člane monociklične heteroaril grupe sadrže 1 ili 2 člana prstena koji su =N-atomi (gde su ostatak od 6 članova prstena atomi ugljenika).
[0150] Biciklične heteroaromatične grupe uključuju heteroaromatične grupe spojenog prstena koje sadrže 9-13 članova prstena i 1, 2, 3, 4 ili više heteroatoma izabranih između O, S, N ili NR<N>.
[0151] U jednom primeru izvođenja, 9-člane biciklične heteroaril grupe sadrže 1 član prstena koji je -NR<N>- grupa, -O- atom ili -S- atom i, opciono, 1-3 člana prstena (npr. 1 ili 2 člana prstena) koji su =N-atomi (gde su ostatak od 9 članova prstena atomi ugljenika).
[0152] Primeri bicikličnih heteroaril grupa sa 9-članim spojenim prstenom su benzofuranil, benzotiofenil, indolil, benzimidazolil, indazolil, benzotriazolil, pirolo[2,3-b]piridinil, pirolo[2,3-c]piridinil, pirolo[3,2-2] c]piridinil, pirolo[3,2-b]piridinil, imidazo[4,5-b]piridinil, imidazo[4,5-c]piridinil, pirazolo[4,3-d]piridinil, pirazolo[4,3- c]piridinil, pirazolo[3,4-c]piridinil, pirazolo[3,4-b]piridinil, izoindolil, indazolil, purinil, indolininil, imidazo[1,2-a]piridinil, imidazo[1,5-a] piridinil, pirazolo[1,2-a]piridinil, pirolo[1,2-b]piridazinil i imidazo[1,2-c]pirimidinil.
[0153] U jednom primeru izvođenja, 10-člane biciklične heteroaril grupe sadrže 1-3 člana prstena koji su =N-atomi (gde su ostatak od 10 članova prstena atomi ugljenika).
[0154] Primeri bicikličnih heteroaril grupa sa 10-članim spojenim prstenom su hinolinil, izohinolinil, cinolinil, hinazolinil, hinoksalinil, ftalanil, 1,6-naftiridinil, 1,7-naftiridinil, 1,8-
2
naftiridinil, 1,5-naftiridinil, 2,6-naftiridinil, 2,7-naftiridinil, pirido[3,2-d]pirimidinil, pirido[4,3-d]pirimidinil, pirido[3,4-d]pirimidinil, pirido[2,3-d]pirimidinil, pirido[2,3-b]pirazinil, pirido[3,4-b]pirazinil, pirimido[5,4-d]pirimidinil, pirazino[2,3-b]pirazinil i pirimido[4,5-d]pirimidinil.
[0155] Termin "heteroarilalkil" označava alkil supstituisan sa heteroaril grupom.
[0156] Termin "heteroarilen" uključuje dvovalentne heteroaromatične, ciklične hidrokarbil grupe koje dodatno sadrže jedan ili više heteroatoma nezavisno odabranih od O, S, N i NR<N>, gde je R<N>je definisan u nastavku (i u jednom primeru izvođenja je H ili alkil (npr. C1-6alkil)). Generalno, heteroarilenske grupe mogu biti monociklične ili policiklične (npr. biciklične) spojene prstenaste heteroaromatične grupe. U jednom primeru izvođenja, heteroarilenske grupe sadrže 5-13 članova prstena (poželjno 5-10 članova) i 1, 2, 3 ili 4 heteroatoma u prstenu, nezavisno odabranih od O, S, N i NR<N>. U jednom primeru izvođenja, heteroarilen grupa može imati 5, 6, 9 ili 10 članova, npr. 5-člani monociklični, 6-člani monociklični, 9-člani biciklični spojeni prsten ili 10-člani biciklični spojeni prsten. Izraz "heteroaril" uključuje dvovalentne derivate svake od heteroaril grupa o kojima je prethodno diskutovano.
[0157] Izrazi "aril", "aromatični", "heteroaril" i "heteroaromatični" takođe uključuju grupe koje su delimično redukovane. Tako, na primer, "heteroaril" uključuje fuzionisane vrste u kojima je jedan od prstenova redukovan u zasićeni prsten (npr. 1,2,3,4-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il).
Opšte
[0158] Osim ako nije eksplicitno drugačije naznačeno, gde se kombinacije grupa ovde pominju kao jedan deo, npr. arilalkil, poslednja pomenuta grupa sadrži atom pomoću kojeg je deo vezan za ostatak molekula.
[0159] Kada se upućuje na atom ugljenika alkil grupe ili druge grupe koja je zamenjena sa O, S(O)k, N ili P(O)r, namera je da:
se zamenjuje sa
ili
(pri čemu E ne može biti H);
-CH= se zamenjuje sa -N= ili -P(O)r=;
≡C-H se zamenjuje sa ≡N ili ≡P(O)r; ili
-CH2- se zamenjuje sa -O-, -S(O)k-, -NR<N>- ili -P(O)rR<N>-, gde je R<N>je H ili opciono supstituisan C1-6alkil, C1-6heteroalkil, C3-6cikloalkil, C3-6heterocikloalkil, C2-6alkenil, C2-
6heteroalkenil, C3-6cikloalkenil, C3-6heterocikloalkenil, fenil ili heteroaril koji sadrži 5 ili 6 članova prstena. R<N>je poželjno H, C1-6alkil ili C3-6cikloalkil.
[0160] k je nezavisno 0, 1 ili 2. U jednom primeru izvođenja, k je 0.
[0161] r je nezavisno 0 ili 1. U jednom primeru izvođenja, r je 0.
[0162] Kada se pominje atom ugljenika koji je zamenjen Si, ono što je predviđeno je da se atom ugljenika zameni atomom silicijuma, ali da veze inače ostaju iste. Tako, na primer, -CH2- se zamenjuje sa -SiH2-; -CH= se zamenjuje sa -SiH=; i =C-H je zamenjen sa ≡Si-H.
[0163] Radi pojašnjenja, u odnosu na prethodno navedene grupe koje sadrže heteroatom (kao što je heteroalkil itd.), gde je dat broj atoma ugljenika, na primer C3-6heteroalkil, namera je da to bude grupa zasnovana na C3-6alkil u kome je jedan ili više od 3-6 lančanih atoma ugljenika zamenjeno sa O, S(O)kili N. Shodno tome, C3-6heteroalkil grupa bi, na primer, sadržala manje od 3-6 lančanih atoma ugljenika. Kao još jedan primer, piridil grupa bi bila klasifikovana kao C6heteroaril grupa iako sadrži 5 atoma ugljenika.
Supstitucija
[0164] Grupe jedinjenja pronalaska (npr. alkil, cikloalkil, alkoksi, alkenil, cikloalkenil, alkinil, alkilen, alkenilen, heteroalkil, heterocikloalkil, heteroalkenil, heterocikloalkenil, heteroalkinil, heteroalkilen, heteroalkenilen aril, arilkenilen aril, arilkenilen aril, arilkenilen aril, arilkenilen, heteroalkenil heteroalkil heteroalkil heteroalkil heteroalkenil grupe itd.) mogu biti supstituisane ili nesupstituisane, u jednom primeru izvođenja nesupstituisane. Tipično, supstitucija uključuje zamišljenu zamenu atoma vodonika sa supstituentskom grupom, ili dva atoma vodonika u slučaju supstitucije sa =O.
[0165] Tamo gde je supstituisano, generalno će postojati 1 do 5 supstituenata na svakoj grupi, u jednom primeru izvođenja 1 do 3 supstituenta, u jednom primeru izvođenja 1 ili 2
1
supstituenta, u jednom primeru izvođenja 1 supstituent. Jedan primer izvođenja uključuje više od jednog supstituenta na istom atomu, npr. acetal grupa.
[0166] U jednom primeru izvođenja, supstituent(i) je/su nezavisno Sub<1>ili Sub<2>(u jednom primeru izvođenja pod<2>) gde:
Sub<1>je nezavisno halogen, trihalometil, trihaloetil, -NO2, -CN, -N<+>(R<s>)2O-, -CO2H, -CO2R<s>, -SO3H, -SOR<s>, -SO2R<s>, -SO3R<s>, -OC(=O)OR<s>, -C(=O)H, -C(=O)R<s>, -OC(=O)R<s>, =O, -NR<s>2, -C(=O)NH2, -C(=O)NRs2, -N(R<s>)C(=O)ILI<s>, -N(R<s>)C(=O)NR<s>2, -OC(=O)NRs2, -N(R<s>)C(=O)R<s>, -C(=S)NR<s>2, -NR<s>C(=S)R<s>, -SO2NVs2, -NR<s>SO2R<s>, -N(R<s>)C(=S)NR<s>2, -N(R<s>)SO2NRs2, -R<s>ili -Z<s>R<s>, gde;
Z<s>je nezavisno O, S ili NR<s>;
R<s>je nezavisno H ili C1-6alkil, C1-6heteroalkil, -(Alk<a>)f-C3-6cikloalkil, -(Alk<a>)f-C3-
6heterocikloalkil, C2-6alkenil, C2-6heteroalkenil, -(Alk<a>)f-C3-6cikloalkenil, -(Alk<a>)f-C3-
6heterocikloalkenil, C2-6alkinil, C2-6heteroalkinil, -(Alk<a>)f-C6-14aril, -(Alk<a>)f-C6-14aril ili -(Alk<a>)f-heteroaril (gde heteroaril sadrži 5-13 članova prstena), gde
f je 0 ili 1;
Alk<a>je C1-6alkilen ili C1-6heteroalkilen; i
R<s>je opciono sam po sebi supstituisan (u jednom primeru izvođenja nesupstituisan) sa 1 do 3 supstituenta Sub<2>;
Sub<2>je nezavisno halogen, trihalometil, trihaloetil, -NO2, -CN, -N<+>(C1-6alkil)2O-, -CO2H, -CO2C1-6alkil, -SO3H, -SOC1-6alkil, -SO2C1-6alkil, -SO3C1-6alkil, -OC(=O)OC1-6alkil, -C(=O)H, -C(=O)C1-6alkil, -OC(=O)C1-6alkil, =O, -N(C1-6alkil)2, -C(=O)NH2, -C(=O)N(C1-
6alkil)2, -N(C1-6alkil)C(=O)O(C1-6alkil), -N(C1-6alkil)C(=O)N(C1-6alkil)2, -OC(=O)N(C1-
6alkil)2, -N(C1-6alkil)C(=O)C1-6alkil, -C(=S)N(C1-6alkil)2, -N(C1-6alkil)C(=S)C1-6alkil, -SO2N(C1-6alkil)2, -N(C1-6alkil)SO2C1-6alkil, -N(C1-6alkil)C(=S)N(C1-6alkil)2, -N(C1-6alkil) Dakle2N(C1-6alkil)2, -C1-6alkil, -C1-6heteroalkil, -C3-6cikloalkil, -C3-6heterocikloalkil, -C2-
6alkenil, -C2-6heteroalkenil, -C3-6cikloalkenil, -C3-6heterocikloalkenil, -C2-6alkinil, -C2-
6heteroalkinil, -C6-14aril, -C5-13heteroaril, -Z<t>-C1-6alkil, -Z<t>-C3-6cikloalkil, -Z<t>-C2-6alkenil, -Z<t>-C3-6cikloalkenil, ili -Z<t>-C2-6alkinil; i
Z<t>je nezavisno O, S, NH ili N(C1-6alkil).
[0167] Dok R<s>u Sub<1>može opciono biti supstituisan sa 1 do 3 supstituenta Sub<2>, Sub<2>je nesupstituisan. Međutim, u jednom primeru izvođenja, R<s>je nesupstituisan.
[0168] U jednom primeru izvođenja, R<s>je H ili C1-6alkil, opciono supstituisan sa 1 do 3 supstituenta Sub<2>.
[0169] U jednom primeru izvođenja, Sub<2>je nezavisno halogen, trihalometil, trihaloetil, -
2
NO2, -CN, -N<+>(C1-6alkil)2O-, -CO2H, -SO3H, -SOC1-6alkil, -SO2C1-6alkil, -C(=O)H, -C(=O)C1-6alkil, =O, -N(C1-6alkil)2, -C(=O)NH2, -C1-6alkil, -C3-6cikloalkil, -C3-
6heterocikloalkil, -Z<t>-C1-6alkil ili - Z<t>-C3-6cikloalkil.
[0170] U jednom primeru izvođenja, gde je supstituisana grupa aciklična (npr. alkil, heteroalkil, alkenil itd.), Sub<1>nije -R<s>i Sub<2>nije -C1-6alkil, -C1-6heteroalkil, -C2-6alkenil, -C2-
6heteroalkenil, -C2-6alkinil ili -C2-6heteroalkinil.
[0171] Gde je grupa osim Sub<2>ima najmanje 2 pozicije koje mogu biti supstituisane, grupa može biti supstituisana sa oba kraja alkilenskog, alkenilenskog, alkinilenskog, heteroalkilenskog, heteroalkenilenskog ili heteroalkinilenskog lanca (u jednom primeru izvođenja koji sadrži 1 do 6 atoma, u sledećoj varijanti 3 do 6 atoma i u daljem izvođenju 3 ili 4 atoma) da bi se formirao ciklični deo. Taj lanac je opciono supstituisan sa 1 do 3 supstituenta Sub<2>. U jednom primeru izvođenja taj lanac nije zamenjen. Dakle, termini opciono supstituisani "cikloalkil", "cikloalkenil", "cikloalkinil", "heterocikloalkil", "heterocikloalkenil", "heterocikloalkinil", "aril" i "heteroaril" uključuju spojene vrste. Npr. "opciono supstituisani cikloalkil" uključuje vrste u kojima su spojena dva cikloalkil prstena, a "opciono supstituisani heteroaril" uključuje vrste u kojima je heterocikloalkil prsten fuzionisan sa aromatičnim prstenom (npr.5,6,7,8-tetrahidro-1, 8-naftiridin-2-il).
[0172] Gde grupa osim Sub<2>ima atom koji može biti supstituisan dva puta, taj atom može biti supstituisan sa oba kraja alkilenskog, alkenilenskog, alkinilenskog, heteroalkilenskog, heteroalkenilenskog ili heteroalkinilenskog lanca (u jednom primeru izvođenja koji sadrži 2 do 8 atoma, u sledećoj varijanti 3 do 6 atoma, i u daljem izvođenju 4 ili 5 atoma) da bi se formirao ciklični deo. Taj lanac je opciono supstituisan sa 1 do 3 supstituenta Sub<2>. U jednom primeru izvođenja taj lanac nije zamenjen. Dakle, termini opciono supstituisani "cikloalkil", "cikloalkenil", "cikloalkinil", "heterocikloalkil", "heterocikloalkenil", "heterocikloalkinil", "aril" i "heteroaril" uključuju spiro vrste.
[0173] Radi pojašnjenja, kada grupa ima heteroatom, supstituent može biti vezan za heteroatom. Tako, na primer, "opciono supstituisani heteroalkil" uključuje -CH2-N(Sub<1>)-CH2-, -CH(Sub<1>)-NH-CH2- i -CH(Sub<1>)-N(Sub<1>)-CH2- itd.
Modifikator termina
[0174] Kada listi prethodi modifikator, podrazumeva se da se modifikator razume kao primenljiv na svaku od stavki na listi. Na primer, fraza „opciono zamenjena C3-20-heterocikloalkil, C3-20-heterocikloalkenil, C3-20-heterocikloalkinil ili C5-20-heteroaril grupa" znači da svaka od četiri stavke na listi, odnosno C3-20-heterocikloalkil grupa, C3-20-heterocikloalkenil grupa, C3-20-heterocikloalkinil grupa i C6-20-heteroaril grupa, može biti opciono supstituisana.
[0175] Kada je grupa okarakterisana prvim modifikatorom, a zatim, kasnije, ista grupa je okarakterisana sledećim modifikatorom, podrazumeva se da grupu karakterišu oba modifikatora istovremeno. Na primer, ako je grupa opisana kao "C3-20-heterocikloalkinil" (prvi modifikator) grupa, a zatim se kasnije ista grupa opisuje kao "C5-16" (sledeći modifikator) grupa, to znači da je C5-16heterocikloalkinil grupa.
Steroidi
[0176] Kako se ovde koristi, termin "steroid" se odnosi na bilo koju grupu koja sadrži sledeću strukturu (struktura koja se ovde naziva "steroidni skelet").
[0177] Čisto u svrhu ilustracije, steroidni skelet je gore nacrtan kao potpuno zasićen. Termin steroid, međutim, takođe je namenjen da pokrije slučajeve u kojima postoji nezasićenost u steroidnom skeletu. Na primer, termin steroid pokriva grupu koja obuhvata potpuno nezasićeni (mancude) osnovni skelet, 15H-ciklopenta[a]fenantren:
[0178] Termin steroid takođe pokriva grupu koja obuhvata delimično nezasićeni steroidni skelet.
[0179] Termin steroid takođe obuhvata "seko" derivate steroidnog skeleta, tj. grupe u kojima je došlo do cepanja prstena; „nor“ i „homo“ derivati steroidnog skeleta koji uključuju kontrakciju i širenje prstena, respektivno (videti Systemic Nomenclature of Organic Chemistry, by D. Hellwinkel, published by Springer, 2001, ISBN: 3-540-41138-0, str.203 za "seco" i str. 204 za "nor" i "homo"). U jednom primeru izvođenja, međutim, takvi seko derivati nisu obuhvaćeni terminom "steroid". U drugom primeru izvođenja, takvi niti derivati nisu obuhvaćeni terminom "steroid". U drugom primeru izvođenja, takvi homo derivati nisu
4
obuhvaćeni terminom "steroid". Prema tome, u jednom primeru izvođenja, takvi seko, niti i homo derivati nisu obuhvaćeni terminom "steroid".
[0180] Termin steroid takođe pokriva slučajeve kada je jedan ili više atoma ugljenika u strukturi označenoj steroidnim skeletom zamenjeno heteroatomom. U jednoj takvoj realizaciji, do šest atoma ugljenika, u jednom primeru izvođenja do pet atoma ugljenika, u drugoj realizaciji do četiri atoma ugljenika, u drugoj realizaciji do tri atoma ugljenika, u drugoj realizaciji do dva atoma ugljenika, u drugoj realizaciji jedan atom ugljenika, svaki je nezavisno zamenjen sa O, S(O)k, N, P(O)rili Si (i poželjno O, S(O)kili N). U jednom primeru izvođenja, međutim, izraz "steroid" obuhvata vrste u kojima "osnovni skelet steroida" ne sadrži heteroatome.
[0181] Sistem steroidnih prstenova je numerisan prema dole navedenoj konvenciji.
[0182] Termin steroid obuhvata sterole, steroidne hormone, žučne kiseline i soli žučnih kiselina. Sterol je bilo koji steroid sa hidroksilnom grupom na poziciji 3 A-prstena.
Nezasićenost
[0183] U skladu sa standardnom upotrebom, pozicija omega-3 se odnosi na treću vezu sa (metil) terminala lanca; pozicija omega-6 se odnosi na šestu vezu sa (metil) terminala lanca, a pozicija omega-9 se odnosi na devetu vezu sa (metil) terminala lanca.
Opšte
[0184] U izvođenju ovog pronalaska će se koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalni postupci hemije, biohemije, molekularne biologije, imunologije i farmakologije, u okviru tehnike. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. vidi, npr., reference 33-39, itd.
[0185] Termin „sadrži“ obuhvata „uključuje“ kao i „sastoji se“ npr. kompozicija "koja sadrži" X može se sastojati isključivo od X ili može uključivati nešto dodatno npr. X I.
[0186] Termin „oko“ u odnosu na brojčanu vrednost X je opciono i znači, na primer, X+10%.
[0187] Reč "suštinski" ne isključuje "potpuno" npr. kompozicija koja je "suštinski oslobođena" od I može biti potpuno slobodna od I. Gde je potrebno, reč "u suštini" može biti izostavljena iz definicije pronalaska.
[0188] Reference na naelektrisanje, katjone, anjone, cviterjone, itd., uzimaju se na pH 7.
[0189] TLR3 je receptor 3 sličan Toll-u. To je jedan receptor koji se proteže kroz jednu membranu i igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. Poznati agonisti TLR3 uključuju poli(I:C). „TLR3“ je odobreni naziv HGNC za gen koji kodira ovaj receptor, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC: 11849. RefSeq sekvenca za ljudski TLR3 gen je GI:2459625.
[0190] TLR7 je receptor 7 sličan Tollu. To je receptor koji se proteže kroz jednu membranu i igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. Poznati agonisti TLR7 uključuju npr. imihimod. „TLR7“ je odobreni naziv HGNC za gen koji kodira ovaj receptor, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC: 15631. RefSeq sekvenca za ljudski TLR7 gen je GI:67944638.
[0191] TLR8 je receptor 8 sličan Tollu. To je receptor koji se proteže kroz jednu membranu i igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. Poznati agonisti TLR8 uključuju npr. resihimod. „TLR8“ je odobreni naziv HGNC za gen koji kodira ovaj receptor, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC:15632. RefSeq sekvenca za ljudski TLR8 gen je GI:20302165.
[0192] Porodica receptora sličnih RIG-I („RLR“) uključuje različite RNK helikaze koje igraju ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu[40]. RLR-1 (takođe poznat kao RIG-I ili gen I koji indukuje retinoičnu kiselinu) ima dva domena za regrutovanje kaspaze u blizini svog N-terminusa. Odobreni naziv HGNC za gen koji kodira RLR-1 helikazu je „DDKS58“ (za DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) boks polipeptid 58) i jedinstveni HGNC ID je HGNC:19102. RefSeq sekvenca za humani gen RLR-1 je GI:77732514. RLR-2 (takođe poznat kao MDA5 ili gen 5 povezan sa diferencijacijom melanoma) takođe ima dva domena za regrutovanje kaspaze u blizini svog N-terminusa. Odobreni naziv HGNC za gen koji kodira helikazu RLR-2 je „IFIH1“ (za interferon indukovan domenom helikaze C 1), a jedinstveni HGNC ID je HGNC:18873. RefSeq sekvenca za humani RLR-2 gen je GI: 27886567. RLR-3 (takođe poznat kao LGP2 ili laboratorija za genetiku i fiziologiju 2) nema domene za regrutovanje kaspaze. Odobreni naziv HGNC za gen koji kodira RLR-3 helikazu je „DHKS58“ (za DEKSH (Asp-Glu-X-His) bok polipeptid 58) i jedinstveni HGNC ID je HGNC:29517. RefSeq sekvenca za humani gen RLR-3 je GI:149408121.
[0193] PKR je dvolančana RNK zavisna protein kinaza. On igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. „EIF2AK2“ (za eukariotski faktor inicijacije translacije 2-alfa kinazu 2) je odobreni naziv HGNC za gen koji kodira ovaj enzim, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC:9437. RefSeq sekvenca za humani PKR gen je GI:208431825.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0194]
SL. 1 prikazuje gel sa obojenom RNK. Trake pokazuju (1) markere (2) goli replikon (3) replikon nakon tretmana RNaze (4) replikon inkapsuliran u lipozomu (5) lipozom nakon tretmana RNaze (6) lipozom tretiran RNazom zatim podvrgnut ekstrakciji fenolom/hloroformom.
SL. 2 je elektronski mikrograf lipozoma.
SL. 3 prikazuje ekspresiju proteina (kao relativne svetlosne jedinice, RLU) 1, 3 i 6 dana nakon isporuke RNK u lipozomima sa PEG-ovima različite dužine: 1kDa (trouglovi); 2kDa (krugovi); 3kDa (kvadrati).
SL. 4 prikazuje gel sa obojenom RNK. Trake pokazuju (1) markere (2) goli replikon (3) replikon inkapsuliran u lipozomu (4) lipozom tretiran RNazom zatim podvrgnut ekstrakciji fenolom/hloroformom.
SL. 5 prikazuje ekspresiju proteina u danima 1, 3 i 6 nakon isporuke RNK u vidu replikona upakovanog virionima (kvadrati), kao gole RNK (romb), ili u lipozomima (+ = 0,1 µg, k = 1 µg).
SL. 6 prikazuje ekspresiju proteina u danima 1, 3 i 6 nakon isporuke četiri različite doze RNK inkapsulirane u lipozomima.
SL. 7 prikazuje titre anti-F IgG kod životinja koje primaju replikon upakovan u virionima (VRP ili VSRP), 1 µg gole RNK i 1 µg RNK inkapsulirane u lipozomima.
SL. 8 prikazuje titre anti-F IgG kod životinja koje primaju VRP, 1 µg gole RNK i 0,1 g ili 1 µg RNK inkapsulirane u lipozomima.
SL. 9 prikazuje titre neutralizujućih antitela kod životinja koje primaju VRP ili 0,1 g ili 1 ug RNK inkapsulirane lipozomima.
SL. 10 prikazuje nivoe ekspresije nakon isporuke replikona kao gola RNK (krugovi), RNK inkapsulirana u lipozomima (trougao i kvadrat), ili kao lipoplek (obrnuti trougao).
SL. 11 prikazuje F-specifične titre IgG (2 nedelje nakon druge doze) nakon isporuke replikona kao gole RNK (0,01-1 µg), RNK inkapsulirane u lipozomima (0,01-10 µg) ili pakovane kao virion (VRP, 10<6>infektivne jedinice ili IU).
SL. 12 prikazuje F-specifične IgG titre (krugovi) i PRNT titre (kvadrati) nakon isporuke replikona kao gole RNK (1 µg), RNK inkapsulirane u lipozomima (0,1 ili 1 µg) ili pakovane kao virion (VRP, 10<6>IU). Prikazani su i titri kod naivnih miševa. Pune linije pokazuju geometrijske sredine.
SL. 13 prikazuje intracelularnu proizvodnju citokina nakon restimulacije sa sintetičkim peptidima koji predstavljaju glavne epitope u F proteinu, 4 nedelje nakon druge doze. I-osa prikazuje % citokina+ CD8+CD4-.
SL. 14 prikazuje strukturu lipida "RV05".
SL. 15 prikazuje F-specifične IgG titre (srednji log10titri std dev) tokom 210 dana nakon imunizacije teladi. Tri linije se lako razlikuju 63. dana i to su, odozdo prema gore: PBS negativna kontrola; RNK isporučena lipozomima; i proizvod „Triangle 4“.
SL. 16 prikazuje strukture tri PEG-konjugovana DMG lipida (1-3kDa).
Sl. 17A do 17E prikazuju strukture različitih PEG-konjugovanih lipida, gde R je PEG željene dužine.
SL. 18 prikazuje strukturu korisnog "split" PEG-konjugovanog lipida. Pravougaonik prikazuje ukupnu MV PEG u lipidu (koji je, u konkretnom primeru u nastavku, bio 2000).
REFERENTNI PRIMERI
RNK replikoni
[0195] U nastavku se koriste različiti replikoni. Generalno, oni su zasnovani na hibridnom genomu alfavirusa sa nestrukturnim proteinima iz venecuelanskog virusa konjskog encefalitisa (VEEV), signalu pakovanja iz VEEV i 3' UTR iz Sindbis virusa ili VEEV mutanta. Replikon je dugačak oko 10 kb i ima poli-A rep.
[0196] Plazmidna DNK koja kodira replikone alfavirusa (nazvana: pT7-mVEEV-FL.RSVF ili A317; pT7-mVEEV-SEAP ili A306; pSP6-VCR-GFP ili A50) služila je kao šablon za sintezu RNK in vitro. Replikoni sadrže genetske elemente alfavirusa koji su potrebni za replikaciju RNK, ali nemaju one koji kodiraju genske proizvode neophodne za sklapanje čestica; strukturni proteini su umesto toga zamenjeni proteinom od interesa (bilo reporterom, kao što je SEAP ili GFP, ili imunogenom, kao što je RSV F protein pune dužine) i tako replikoni nisu u stanju da indukuju stvaranje infektivnih čestica. Promotor bakteriofaga (T7 ili SP6) ushodno od cDNK alfavirusa olakšava sintezu replikonske RNK in vitro a ribozim virusa hepatitisa delta (HDV) odmah nishodno od poli(A)-repa generiše ispravan 3'-kraj kroz svoju aktivnost samo-isecanja.
[0197] Nakon linearizacije plazmidne DNK nishodno od HDV ribozima sa odgovarajućom restrikcionom endonukleazom, “run-off” transkripti su sintetizovani in vitro korišćenjem DNK-zavisne RNK polimeraze T7 ili SP6 bakteriofaga. Transkripcije su vršene 2 sata na 37°C u prisustvu 7,5 mM (T7 RNK polimeraza) ili 5 mM (SP6 RNK polimeraza) svakog od nukleozid trifosfata (ATP, CTP, GTP i UTP) prema uputstvima koja je dao proizvođač (Ambion). Nakon transkripcije, šablonska DNK je digestirana sa TURBO DNase (Ambion). Replikon RNK je precipitiran sa LiCl i rekonstituisan u vodi bez nukleaza. RNK bez kape je zatvorena posle transkripcije sa Vaccinia Capping Enzime (VCE) korišćenjem sistema za postavljanje kape ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies) kao što je navedeno u korisničkom priručniku; replikoni sa kapama dodatim na ovaj način dobijaju prefiks "v". npr. vA317 je replikon A317 sa VCE. RNK kojoj je post-transkripciono stavljena kapa je precipitirana sa LiCl i rekonstituisana u vodi bez nukleaza. Koncentracija uzoraka RNK određena je merenjem OD260nm. Integritet in vitro transkripata je potvrđen elektroforezom denaturišućeg agaroznog gela.
Lipozomalna inkapsulacija
[0198] RNK je inkapsulirana u lipozomima napravljenim u suštini postupkom iz referenci 7 i 41. Lipozomi su napravljeni od 10% DSPC (cviterjonski), 40% DlinDMA (katjonski), 48% holesterola i 2% PEG-konjugovanog DMG. Ove proporcije se odnose na % molova u ukupnom lipozomu.
[0199] DlinDMA (1,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan) je sintetizovan korišćenjem procedure iz reference 2. DSPC (1,2-Diastearoil-sn-glicero-3-fosfoholin) je nabavljen od Genzime. Holesterol je dobijen od Sigma-Aldrich. PEG-konjugovani DMG (1,2-dimirstoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi(polietilen glikol), amonijum so), DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan, hloridna so) i DC-hol (3β-[N-(N',N'-dimetilaminoetan)-karbamoil]holesterol hidrohlorid) su iz Avanti Polar Lipids.
[0200] Ukratko, lipidi su rastvoreni u etanolu (2 ml), replikon RNK je rastvoren u puferu (2ml, 100mM natrijum citrat, pH 6) i pomešani su sa 2 ml pufera nakon čega je usledio 1 čas ekvilibracije. Smeša je razblažena sa 6 ml pufera, a zatim filtrirana. Dobijeni proizvod je sadržao lipozome, sa ~95% efikasnosti inkapsulacije. SL. 2 prikazuje primer elektronske mikrografije lipozoma pripremljenih ovim metodama. Ovi lipozomi sadrže inkapsuliranu RNK koja kodira RSV F antigen pune dužine. Dinamičko rasipanje svetlosti jedne serije pokazalo je prosečan prečnik od 141 nm (po intenzitetu) ili 78 nm (po broju).
[0201] U jednom posebnom postupku inkapsulacije, pripremljeni su sveži osnovni rastvori lipida u etanolu. Izmereno je 37 mg DlinDMA, 11,8 mg DSPC, 27,8 mg holesterola i 8,07 mg PEG-konjugovanog DMG i rastvoreno u 7,55 mL etanola. Korišćeno je pet različitih konjugovanih PEG: PEG-500, PEG-750, PEG-1000, PEG-2000 ili PEG-3000. Sveže pripremljeni osnovni rastvor lipida je lagano mućkan na 37°C oko 15 min da bi se formirala homogena smeša. Zatim je 226,7 µL matične mase dodato u 1,773 mL etanola da bi se napravio radni osnovni rastvor lipida od 2 mL. Radni rastvor RNK od 2 mL je takođe pripremljen iz osnovnog rastvora od ~ 1 µg/µL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Tri staklene bočice od 20 mL (sa šipkama za mešanje) su isprane rastvorom RNase Away i isprane sa puno MilliQ vode pre upotrebe da bi se dekontaminirale bočice RNK. Jedna od bočica je korišćena za radni rastvor RNK, a druge za sakupljanje mešavine lipida i RNK (kao što je opisano u nastavku). Radni rastvori lipida i RNK su zagrevani na 37 ° C tokom 10 minuta pre nego što su stavljeni u 3cc luer-lok špriceve. 2 mL citratnog pufera (pH 6) je stavljeno u drugi špric od 3 cc. Špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na T mikser (PEEK<™>500 µm ID spoj) korišćenjem FEP cevi (fluorovani etilen-propilen; sve korišćene
4
FEP cevi imale su unutrašnji prečnik 2 mm i spoljašnji prečnik 3 mm; dobijeno od Idex Health Science). Izlaz iz T miksera je takođe bio FEP cev. Treći špric koji je sadržao citratni pufer povezan je sa zasebnim komadom cevi. Svi špricevi su zatim pokretani brzinom protoka od 7 mL/min pomoću pumpe za špriceve. Izvodi epruvete su postavljeni da sakupljaju smeše u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi 1 sat. Zatim je smeša napunjena u špric od 5 cc, koji je postavljen na komad FEP cevi i u drugi špric od 5 cc sa jednakom dužinom FEP cevi, jednaka zapremina 100 mM citratnog pufera (pH 6) je stavljena. Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 7 mL/min korišćenjem špriceve pumpe i konačna smeša je sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani nasuprot 10-15 zapremina IX PBS korišćenjem sistema za filtriranje tangencijalnog protoka (TFF) pre dobijanja konačnog proizvoda. TFF sistem i filterske membrane sa šupljim vlaknima su kupljeni od Spectrum Labs i korišćeni su u skladu sa uputstvima proizvođača. Korišćene su filtracione membrane od šupljih vlakana sa presekom veličine pora od 100 kD i površinom od 20 cm<2>. Za in vitro i in vivo eksperimente, formulacije su razblažene do potrebne koncentracije RNK sa IX PBS.
[0202] Procenat inkapsulirane RNK i koncentracije RNK je određen Quant-iT RiboGreen RNK kompletom reagensa (Invitrogen), prateći uputstva proizvođača. Standard ribozomske RNK koji se nalazi u kompletu je korišćen za generisanje standardne krive. Lipozomi su razblaženi 10x ili 100x u IX TE puferu (iz kompleta) pre dodavanja boje. Odvojeno, lipozomi su razblaženi 10x ili 100x u IX TE puferu koji sadrži 0,5% Triton X pre dodavanja boje (da bi se poremetili lipozomi i na taj način ispitala ukupna RNK). Zatim je jednaka količina boje dodata svakom rastvoru, a zatim je ~180 µL svakog rastvora nakon dodavanja boje stavljeno u duplikatu u ploču za kulturu tkiva sa 96 bunarčića. Fluorescencija (Ek 485 nm, Em 528 nm) je očitana na čitaču mikroploče. Sve formulacije lipozoma su dozirane in vivo na osnovu inkapsulirane količine RNK.
[0203] Da bi se dobili manji lipozomi, postupak šprica/cevi je zamenjen postupkom u kojem se rastvori lipida i RNK mešaju u kanalima na mikrofluidnom čipu. Pripremljeni su sveži osnovni rastvori lipida u etanolu. Izmereno je 37 mg DlinDMA, 11,8 mg DSPC, 27,8 mg holesterola i 8,07 mg PEG-DMG i rastvoreno u 7,55 mL etanola. Sveže pripremljeni osnovni rastvor lipida je lagano mućkan na 37°C oko 15 min da bi se formirala homogena smeša. Zatim je 226,7 µL matične mase dodato u 1,773 mL etanola da bi se napravio radni osnovni rastvor lipida od 2 mL. Radni rastvor RNK od 4 mL je takođe pripremljen iz osnovnog rastvora od ~ 1 µg/µL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Četiri staklene bočice od 20 mL (sa šipkama za mešanje) su isprane rastvorom RNase Away i isprane sa puno MilliQ vode pre upotrebe da bi se dekontaminirale bočice RNK. Dve bočice su korišćene za radni rastvor RNK (2 mL u svakoj bočici), a druge za sakupljanje mešavine lipida i RNK. Radni rastvori lipida i RNK su zagrevani na 37°C tokom 10 minuta pre nego što su stavljeni u 3cc luer-lok špriceve. Špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na Mitos Droplet junction Chip (stakleni mikrofluidni uređaj dobijen od Syrris, deo br. 3000158) korišćenjem PTFE cevi 0,03 inča ID x 1/16 inča OD, (Syrris) koristeći 4-smern ivični konektor. Dve struje RNK i jedna struja lipida pokretane su špric pumpama, a mešanje etanola i vodene faze je obavljeno na X spoju (100 µm k 105 µm) čipa. Brzina protoka sve tri struje je održavana na 1,5 mL/min, pa je odnos ukupnog vodenog i etanolnog protoka bio 2:1. Izlaz epruvete je postavljen tako da se mešavine sakupljaju u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi 1 sat. Zatim je smeša napunjena u špric od 5 cc koji je postavljen na komad PTFE cevi 0,03 inča ID x 1/16 inča OD i u drugi špric od 5 cc sa jednakom dužinom PTFE cevi, napunjena je jednaka zapreminu 100 mM citratnog pufera (pH 6). Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 3 mL/min korišćenjem pumpe za špric i konačna smeša je sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani nasuprot 10-15 zapremina IX PBS korišćenjem TFF sistema pre dobijanja konačnog proizvoda. Korišćene su filtracione membrane od šupljih vlakana sa ograničenjem veličine pora od 100 kDa i površinom od 20 cm<2>. Za in vitro i in vivo eksperimente, formulacije su razblažene do potrebne koncentracije RNK sa IX PBS. Dok su lipozomi pripremljeni metodom šprica/epruvete sa 75 µg RNK imali Z-prosečan prečnik (Zav) od 148 nm i indeks polidisperznosti (pdI) od 0,122, mešanje čipova dalo je lipozome sa Zav od 97 nm i pdI od 0. Udeo inkapsulirane RNK se blago smanjio sa 90% na 87%.
[0204] Pokazalo se da inkapsulacija u lipozomima štiti RNK od digestije RNKaze. Eksperimenti su koristili 3,8 mAU RNaze A po mikrogramu RNK, inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi. RNaza je inaktivirana proteinazom K na 55°C tokom 10 minuta. Zatim je dodata mešavina uzorka 1:1 zapr/zapr do 25:24:1 zapr/zapr/v, fenol:hloroform:izoamil alkohol da bi se RNK ekstrahovala iz lipida u vodenu fazu. Uzorci su mešani vorteksovanjem nekoliko sekundi, a zatim stavljeni na centrifugu na 15 minuta na 12 k RPM. Vodena faza (koja sadrži RNK) je uklonjena i korišćena za analizu RNK. Pre punjenja (400 ng RNK po bunarčiću) svi uzorci su inkubirani sa formaldehid bojom za punjenje, denaturisani 10 minuta na 65°C i ohlađeni na sobnu temperaturu. Ambion Millennium markeri su korišćeni za aproksimaciju molekulske težine RNK konstrukta. Gel je pušten na 90 V. Gel je obojen korišćenjem 0,1% SYBR zlata prema uputstvima proizvođača u vodi ljuljanjem na sobnoj temperaturi 1 sat. SL.1 pokazuje da RNaza potpuno digestira RNK u odsustvu inkapsulacije (traka 3). RNK se ne može detektovati nakon inkapsulacije (traka 4) i nikakva promena se ne vidi ako se ovi lipozomi tretiraju sa RNazom (traka 4). Nakon što se lipozomi tretirani RNazom podvrgnu ekstrakciji fenola, vidi se nedigestirana RNK (traka 6). Čak i posle 1 nedelje na 4°C, RNK se mogla videti bez ikakve fragmentacije (Slika 4, strelica). Ekspresija proteina in vivo je ostala nepromenjena nakon 6 nedelja na 4 °C i jednog ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja. Stoga je RNK inkapsulirana u lipozomima stabilna.
[0205] Da bi se procenila in vivo ekspresija RNK, enzim reporter (SEAP; izlučena alkalna fosfataza) je kodiran u replikonu, a ne imunogen. Nivoi ekspresije su mereni u serumima razblaženim 1:4 u puferu za razblaživanje IX Phospha-Light korišćenjem hemiluminiscentnog alkalnog fosfatnog supstrata. 8-10 nedelja starim BALB/c miševima (5/grupa) je ubrizgano intramuskularno dana 0, 50 µl po nozi sa dozom od 0,1 µg ili 1 µg RNK. Isti vektor je takođe primenjen bez lipozoma (u IX PBS bez RNaze) u dozi od 1 ug. Takođe su testirani replikoni upakovani u virion. Replikoni upakovani u virione koji se ovde koriste (koji se nazivaju „VRPs“) dobijeni su postupcima iz reference 42, gde je replikon alfavirusa izveden iz mutantnog VEEV ili himere izvedene iz genoma VEEV konstruisanog da sadrži 3' UTR od Sindbis virusa i signal za pakovanje Sindbis virusa (PS), upakovani koelektroporacijom u BHK ćelije sa defektnim pomoćnim RNK koje kodiraju kapsid i glikoproteinske gene Sindbis virusa.
[0206] Kao što je prikazano na Sl. 5, inkapsulacija je povećala nivoe SEAP-a za oko 1⁄2 log pri dozi od 1 µg, a 6. dana ekspresija iz inkapsulirane doze od 0,1 µg odgovara nivoima uočenim sa 1 µg neinkapsuliranom dozom. Do trećeg dana nivoi ekspresije su premašili one postignute sa VRP (kvadrati). Stoga je ekspresija povećana kada je RNK formulisana u lipozomima u odnosu na kontrolu gole RNK, čak i pri 10 puta nižoj dozi. Ekspresija je takođe bila veća u odnosu na VRP kontrolu, ali je kinetika ekspresije bila veoma različita (videti SLIKU 5). Isporuka RNK elektroporacijom je rezultirala povećanom ekspresijom u odnosu na kontrolu gole RNK, ali su ovi nivoi bili niži nego kod lipozoma.
[0207] Da bi se procenilo da li je efekat primećen u grupama lipozoma bio posledica samo komponenti lipozoma, ili je bio povezan sa inkapsulacijom, replikon je davan u inkapsuliranom obliku (sa dva različita protokola prečišćavanja, 0,1 µg RNK), ili pomešan sa lipozomima nakon njihovo formiranja (neinkapsulirani "lipopleks", 0,1 µg RNK), ili kao gola RNK (1 µg). SL. 10 pokazuje da je lipopleks dao najniže nivoe ekspresije, pokazujući da je inkapsulacija neophodna za potentnu ekspresiju.
4
[0208] Dalji SEAP eksperimenti su pokazali jasan odgovor na dozu in vivo, sa ekspresijom koja se vidi nakon isporuke samo 1 ng RNK (Slika 6). Dalji eksperimenti za upoređivanje ekspresije iz inkapsuliranih i golih replikona pokazali su da je 0,01 µg inkapsulirane RNK ekvivalentno 1 µg gole RNK. U dozi od 0,5 µg RNK, inkapsulirani materijal je dao 12 puta veću ekspresiju 6. dana; pri dozi od 0,1 µg nivoi doze su bili 24 puta veći 6. dana.
[0209] Umesto da se posmatraju prosečni nivoi u grupi, proučavane su i pojedinačne životinje. Dok nekoliko životinja nije reagovalo na gole replikone, inkapsulacija je eliminisala one koji nisu reagovali.
[0210] Dalji eksperimenti zamenili su DlinDMA sa DOTAP-om. Iako su DOTAP lipozomi dali bolju ekspresiju od golog replikona, bili su inferiorni u odnosu na DlinDMA lipozome (2- do 3-struka razlika na dan 1).
[0211] Za procenu in vivo imunogenosti replikon je konstruisan da eksprimira F protein pune dužine iz respiratornog sincicijalnog virusa (RSV). Ovo je isporučeno golo (1 µg), inkapsulirano u lipozome (0,1 ili 1 µg) ili upakovano u virione (10<6>IU; "VRP") u danima 0 i 21. Sl. 7 pokazuje titre anti-F IgG 2 nedelje nakon druge doze, a lipozomi jasno povećavaju imunogenost. SL. 8 prikazuje titre 2 nedelje kasnije, do kada nije bilo statističke razlike između inkapsulirane RNK od 0,1 µg, inkapsulirane RNK od 1 µg ili VRP grupe. Titri neutralizacije (mereni kao smanjenje plaka od 60%, "PRNT60") nisu se značajno razlikovali u ove tri grupe 2 nedelje nakon druge doze (Slika 9). SL. 12 prikazuje titre IgG i PRNT 4 nedelje nakon druge doze.
[0212] SL.13 potvrđuje da RNK izaziva snažan odgovor CD8 T ćelija.
[0213] Dalji eksperimenti su upoređivali titre F-specifičnih IgG kod miševa koji su primali VRP, 0,1 µg RNK inkapsulirane lipozomima ili 1 µg RNK inkapsulirane lipozomima. Odnosi titra (VRP: lipozom) u različitim vremenima nakon druge doze bili su sledeći:
[0214] Stoga RNK inkapsulirana u lipozomima indukuje u suštini istu veličinu imunog odgovora kao što se vidi kod isporuke viriona.
[0215] Dalji eksperimenti su pokazali superiorne F-specifične IgG odgovore sa dozom od 10 µg, ekvivalentne odgovore za doze od 1 µg i 0,1 µg i niži odgovor sa dozom od 0,01 µg. SL.
11 prikazuje titre IgG kod miševa koji primaju replikon u golom obliku u 3 različite doze, u lipozomima u 4 različite doze, ili kao VRP (10<6>IU). Odgovor uočen sa RNK inkapsuliranom u lipozomima od 1 µg bio je statistički beznačajan (ANOVA) u poređenju sa VRP, ali veći odgovor primećen sa RNK inkapsuliranom u lipozomima od 10 µg bio je statistički značajan (p<0,05) u poređenju sa obe ove grupe.
[0216] Dalja studija je potvrdila da je 0,1 µg RNK inkapsulirane u lipozomima dalo mnogo veće anti-F IgG odgovore (15 dana nakon druge doze) od 0,1 µg isporučene DNK, i čak je bilo imunogenije od 20 µg plazmidne DNK koji kodira F antigen, isporučen elektroporacijom (Elgen<™>DNA Delivery System, Inovio).
Postupci proizvodnje lipozoma
[0217] Generalno, korišćeno je osam različitih postupaka za pripremu lipozoma prema pronalasku. Oni se u tekstu pominju kao postupci (A) do (H) i razlikuju se uglavnom u odnosu na korake filtracije i TFF. Detalji su sledeći:
(A) Pripremljeni su sveži osnovni rastvori lipida u etanolu. 37 mg DlinDMA, 11,8 mg DSPC, 27,8 mg holesterola i 8,07 mg PEG DMG 2000 je izmereno i rastvoreno u 7,55 mL etanola. Sveže pripremljeni osnovni rastvor lipida je lagano mućkan na 37°C oko 15 min da bi se formirala homogena smeša. Zatim je 755 µL matične mase dodato u 1,245 mL etanola da bi se napravio radni osnovni rastvor lipida od 2 mL. Ova količina lipida je korišćena za formiranje lipozoma sa 250 µg RNK. Radni rastvor RNK od 2 mL je takođe pripremljen iz osnovnog rastvora od ~ 1 µg/µL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Tri staklene bočice od 20 mL (sa šipkama za mešanje) su isprane rastvorom RNase Away (Molecular BioProducts, San Diego, California) i isprane sa puno MilliQ vode pre upotrebe da bi se dekontaminirale bočice RNaze. Jedna od bočica je korišćena za radni rastvor RNK, a druge za sakupljanje mešavine lipida i RNK (kao što je opisano kasnije). Radni rastvori lipida i RNK su zagrevani na 37°C tokom 10 minuta pre nego što su stavljeni u 3cc luer-lok špriceve. 2 mL citratnog pufera (pH 6) je stavljeno u drugi špric od 3 cc. Špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na T mikser (PEEK<™>500 µm ID spoj, Idex Health Science, Oak Harbor, VA) korišćenjem FEP cevi (fluorovani etilen-propilen; al FEP cev ima unutrašnji prečnik 2 mm x 3 mm spoljašnji prečnik, isporučuje Idex Health Science). Izlaz iz T miksera je takođe bio FEP cev. Treći špric koji je sadržao citratni pufer
4
povezan je sa zasebnim komadom FEP cevi. Svi špricevi su zatim pokretani brzinom protoka od 7 mL/min pomoću pumpe za špriceve. Izvodi epruvete su postavljeni da sakupljaju smeše u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi 1 sat. 4 ml smeše je stavljeno u špric od 5 cc, koji je bio spojen na komad FEP cevi i u drugom špricu od 5 cc spojenom na FEP cev iste dužine, jednaka količina 100 mM citratnog pufera (pH 6) je bila napunjena. Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 7 mL/min korišćenjem špriceve pumpe i konačna smeša je sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim, smeša sakupljena iz drugog koraka mešanja (lipozomi) je propuštena kroz Mustang Q membranu (podloga za izmenu anjona koja vezuje i uklanja anjonske molekule, dobijena od Pall Corporation, AnnArbor, MI, SAD). Pre prolaska kroz lipozome, 4 mL 1 M NaOH, 4 mL 1 M NaCl i 10 mL 100 mM citratnog pufera (pH 6) su sukcesivno propušteni kroz Mustang membranu. Lipozomi su zagrevani 10 minuta na 37°C pre nego što su prošli kroz membranu. Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani protiv 10-15 zapremina IX PBS koristeći TFF pre nego što je dobijen krajnji proizvod. TFF sistem i filterske membrane sa šupljim vlaknima su kupljeni od Spectrum Labs i korišćeni su u skladu sa uputstvima proizvođača. Korišćene su filtracione membrane od polisulfonskih šupljih vlakana (broj dela P/N: X1AB-100-20P) sa graničnom veličinom pora od 100 kD i površinom od 8 cm<2>. Za in vitro i in vivo eksperimente, formulacije su razblažene do potrebne koncentracije RNK sa IX PBS.
(B) Kao postupak (A) osim što je, nakon ljuljanja, 226,7 µL stok materijala dodato u 1,773 mL etanola da bi se napravio radni lipidni osnovni rastvor od 2 mL, čime je modifikovan odnos lipid:RNK.
(C) Kao postupak (B) osim što je Mustang filtracija izostavljena, tako da su lipozomi prešli iz staklene bočice od 20 mL u TFF dijalizu.
(D) Kao postupak (C) osim što je TFF koristio polietarsulfonske (PES) membrane od šupljih vlakana (broj dela P-C1-100E-100-01N) sa graničnom veličinom pora od 100 kD i 20 cm<2>površina.
(E) Kao postupak (D) osim što je korišćena Mustang membrana, kao u postupku (A). (F) Kao postupak (A) osim što je Mustang filtracija izostavljena, tako da su lipozomi prešli iz staklene bočice od 20 mL u TFF dijalizu.
(G) Kao postupak (D) osim što je radni rastvor RNK od 4 mL pripremljen iz osnovnog rastvora od ~ 1 µg/µL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Zatim su četiri
4
staklene bočice od 20 mL pripremljene na isti način. Dve od njih su korišćenw za radni rastvor RNK (2 mL u svakoj bočici), a drugi za sakupljanje mešavine lipida i RNK, kao u (C). Umesto da koriste T mikser, špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na Mitos Droplet junction Chip (stakleni mikrofluidni uređaj dobijen od Syrris, deo br. 3000158) korišćenjem PTFE cevi (0,03 inča unutrašnjeg prečnika k 1/16 inča spoljašnjeg prečnika) koristeći 4-smerni ivični konektor (Syrris). Dve struje RNK i jedna struja lipida pokretane su špric pumpama, a mešanje etanola i vodene faze je obavljeno na X spoju (100 µm k 105 µm) čipa. Brzina protoka sve tri struje je održavana na 1,5 mL/min, pa je odnos ukupnog vodenog i etanolnog protoka bio 2:1. Izlaz epruvete je postavljen tako da se smeše sakupljaju u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi 1 h. Zatim je smeša napunjena u špric od 5 cc, koji je postavljen na drugi komad PTFE cevi; u još jedan špric od 5 cc sa jednakom dužinom PTFE cevi, stavljena je jednaka zapremina 100 mM citratnog pufera (pH 6). Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 3 mL/min korišćenjem pumpe za špriceve i konačna smeša je sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani nasuprot 10-15 zapremina IKS PBS koristeći TFF, kao u (D).
(H) Kao postupak (A) osim što je 2 mL radnog osnovnog rastvora lipida napravljen mešanjem 120,9 µL lipidnog osnovnog rastvora sa 1,879 mL etanola. Takođe, nakon mešanja u T mikseru, lipozomi iz bočice od 20 mL su stavljeni u Pierce Slide-A-Lyzer kasetu za dijalizu (Thermo Scientific, ekstra jačine, 0,5-3 mL kapaciteta) i dijalizirani nasuprot 400-500 mL IX PBS preko noći na 4°C u autoklaviranoj plastičnoj posudi pre nego što se dobije konačni proizvod.
RSV imunogenost
[0218] Replikon vA317 koji se samoreplicira i kodira RSV F protein davan je BALB/c miševima, 4 ili 8 životinja po grupi, bilateralnim intramuskularnim vakcinacijama (50 µL po nozi) 0. i 21. dana sa replikonom (1 µg) samim ili formulisanim kao lipozomi sa DlinDMA ("RV01") ili DOTAP ("RV13") ili lipidom prikazanim na Sl. 14 („RV05“). RV01 lipozomi su imali 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% holesterola i 2% PEG-DMG, ali sa različitim količinama RNK. RV05 lipozomi su imali ili 40% RV05, 10% DSPC, 48% holesterola i 2% PEG-DMG ili 60% RV05, 38% holesterola i 2% PEG-DMG. RV13 lipozomi su imali 40%
4
DOTAP, 10% DOPE, 48% holesterola i 2% PEG-DMG. U svim slučajevima PEG je bio PEG-2000 (tj. 2 kDa PEG). Za poređenje, gola plazmidna DNK (20 µg) koja eksprimira isti RSV-F antigen je isporučena ili korišćenjem elektroporacije ili sa RV01(10) lipozomima (0,1 µg DNK). Četiri miša su korišćena kao naivna kontrolna grupa.
[0219] Lipozomi su pripremljeni postupkom (A) ili postupkom (B). Za neke lipozome napravljene postukom (A) korišćena je dupla ili pola količine RNK. Z prosečni prečnik čestica i indeks polidisperznosti bili su:
[0220] Serum je sakupljen za analizu antitela 14., 36. i 49. dana. Slezine su sakupljene od miševa 49. dana za analizu T ćelija.
[0221] F-specifični titri IgG u serumu (GMT) bili su sledeći:
4
[0222] Udeo T ćelija koje su pozitivne na citokine i specifične za RSV F51-66 peptid je sledeći, pokazujući samo brojke koje su statistički značajno iznad nule:
[0223] Stoga su formulacije lipozoma značajno poboljšale imunogenost u odnosu na gole RNK kontrole, što je određeno povećanjem F-specifičnih IgG titara i frekvencije T ćelija. Plazmidna DNK formulisana sa lipozomima, ili isporučena gola korišćenjem elektroporacije, bila je značajno manje imunogena od samoreplicirajuće RNK formulisane u lipozomima.
[0224] Dalji RV01 lipozomi su pripremljeni postupkom (H), ponovo korišćenjem 2 kDa PEG konjugovanog sa DMG i ili inkapsulacijom 150 µg RNK (vA375 replikon koji kodira površinski fuzioni glikoprotein RSV) ili inkapsuliranjem samo pufera. Tako su ovi lipozomi imali 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% Chol i 2% PEG-DMG. Veličine i inkapsulacija su bili sledeći:
[0225] Lipozomi su davani BALB/c miševima (10 po grupi) bilateralnom intramuskularnom injekcijom (50 µl po nozi) dana 0 i 21. Doze su bile 0,01, 0,03, 0,1, 0,3 ili 1 ug. F-specifični titri IgG u serumu i PRNT60 (GMT) bili su sledeći, 2 nedelje nakon prve ili druge injekcije:
4
Imunogenost citomegalovirusa
[0226] RV01 lipozomi sa DLinDMA kao katjonskim lipidom i 2 kDa PEG korišćeni su za isporuku RNK replikona koji kodiraju CMV glikoproteine. Replikon "vA160" kodira glikoproteine pune dužine H i L (gH/gL), dok replikon "vA322" kodira rastvorljivi oblik (gHsol/gL). Dva proteina su pod kontrolom odvojenih subgenomskih promotora u jednom replikonu; istovremena primena dva odvojena vektora, jednog koji kodira gH i jednog koji kodira gL, nije dala dobre rezultate.
[0227] BALB/c miševima, 10 po grupi, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0, 21. i 42. dana sa VRP-ovima koji izražavaju gH/gL (1×10<6>IU), VRP-ovi koji izražavaju gHsol/gL (1×10<6>IU) i PBS kao kontrole. Dve test grupe su primile 1 µg replikona vA160 ili vA322 formulisanog u lipozomima (40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% Chol, 2% PEG-DMG; napravljen korišćenjem metode (D) ali sa veličinom serije RNK od 150 µg).
[0228] Lipozomi vA160 su imali Zav prečnik od 168,8 nm, pdI od 0,144 i 87,4% inkapsulacije. Lipozomi vA322 su imali Zav prečnik od 162 nm, pdI od 0,131 i 90% inkapsulaciju.
[0229] Replikoni su bili u stanju da eksprimiraju dva proteina iz jednog vektora.
[0230] Serumi su sakupljeni za imunološku analizu 63. dana (3wp3). Titri neutralizacije CMV (recipročna vrednost razblaženja seruma koja dovodi do 50% smanjenja broja pozitivnih žarišta virusa po bunarčiću, u odnosu na kontrole) bili su sledeći:
[0231] RNK koja je eksprimirala ili punu dužinu ili rastvorljivu formu CMV gH/gL kompleksa je tako izazvala visoke titre neutralizujućih antitela, kao što je ispitano na epitelnim ćelijama. Prosečni titri izazvani RNK inkapsuliranim u lipozomima bili su barem toliko visoki kao za odgovarajuće VRP.
[0232] Ponovljeni eksperimenti su potvrdili da je replikon bio u stanju da eksprimira dva proteina iz jednog vektora. Replikon RNK je dao titar 3wp3 od 11457, u poređenju sa 5516 sa VRP.
Kinetika ekspresije
[0233] Za proučavanje kinetike ekspresije proteina nakon injekcije korišćen je samoreplicirajući RNK replikon ("vA311") koji eksprimira reporterski gen luciferaze (luc). BALB/c miševi, 5 životinja po grupi, primili su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0. dana sa:
Grupa 1 DNK koja eksprimira luciferazu, isporučena pomoću elektroporacije (10 µg) Grupa 2 samoreplicirajuća RNK (1 µg) formulisana u lipozomima (40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% holesterol, 2% PEG-2000 konjugovan sa DMG
Grupa 3 samoreplicirajuća RNK (1µg) formulisana sa katjonskom nanoemulzijom (CNE17) Grupa 4 samoreplicirajuća RNK (1µg) formulisana sa različitom katjonskom nanoemulzijom Grupa 5 VRP (1×10<6>IU) koji eksprimira luciferazu
[0234] Pre vakcinacije, miševi su depilirani. Miševi su anestezirani (2% izofluran u kiseoniku), dlake su prvo uklonjene električnim brijačem, a zatim hemijskim Nair. Podaci o bioluminescenciji su zatim dobijeni korišćenjem sistema za snimanje Xenogen IVIS 200 (Caliper Life Sciences) dana 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63 i 70. Pet minuta pre snimanja miševima je intraperitonealno ubrizgano 8 mg/kg rastvora luciferina. Životinje su zatim anestezirane i prebačene u sistem za snimanje. Vremena snimanja slike su održavana konstantnim jer je bioluminiscentni signal meren hlađenom CCD kamerom.
[0235] U vizuelnom smislu, primećeno je da ćelije koje eksprimiraju luciferazu ostaju prvenstveno na mestu ubrizgavanja RNK, a životinje snimljene nakon uklanjanja quads nisu pokazale nikakav signal.
[0236] U kvantitativnom smislu, ekspresija luciferaze je merena kao prosečni sjaj tokom perioda od 70 dana (p/s/cm<2>/sr), a rezultati su bili sledeći za 5 grupa:
1
[0237] Samoreplicirajuća RNK formulisana katjonskim nanoemulzijama pokazala je merljivu bioluminescenciju 3. dana, koja je dostigla vrhunac 7. dana, a zatim smanjena na osnovne nivoe od 28. do 35. dana. Kada je formulisana u lipozomima, RNK je pokazala merljivu bioluminescenciju 3. dana, koja je dostigla vrhunac na dan 7 i smanjena na osnovne nivoe do 63. dana. RNK isporučena korišćenjem VRPs pokazala je poboljšanu bioluminescenciju 21. dana u poređenju sa formulisanom RNK, ali je ekspresija smanjena na osnovne nivoe do 28. dana. Elektroporisana DNK je pokazala najviši nivo bioluminescencije u svim vremenskim tačkama izmereni i nivoi bioluminescencije se nisu smanjili na osnovne nivoe tokom 70 dana eksperimenta.
Zapremina isporuke
[0238] Hidrodinamička isporuka koristi silu koja se stvara brzim ubrizgavanjem velike zapremine rastvora da bi se prevazišle fizičke barijere ćelijskih membrana koje sprečavaju ulazak velikih i za membrane nepropusnih jedinjenja u ćelije. Ranije se pokazalo da je ovaj fenomen koristan za intracelularnu isporuku DNK vakcina.
[0239] Tipična primenjena zapremina za intramuskularnu injekciju u miša je 50 µl u zadnju nogu, što je relativno velika zapremina za mišiće noge miša. Nasuprot tome, ljudska intramuskularna doza od ~0,5 ml je relativno mala. Ako bi imunogenost kod miševa zavisila od zapremine, onda bi efikasnost replikonskih vakcina mogla biti posledica, barem delimično, hidrodinamičkih sila, što ne bi bilo ohrabrujuće za upotrebu istih vakcina kod ljudi
2
i većih životinja.
[0240] Replikon vA317 je isporučen BALB/c miševima, 10 po grupi, bilateralnim intramuskularnim vakcinacijama (5 ili 50 po nozi) 0. i 21. dana:
Grupa 1 primili goli replikon, 0,2 µg u 50 µL po nozi
Grupa 2 primili goli replikon, 0,2 µg u 5 µL po nozi
Grupa 3 primili replikon formulisan u emulziji (0,2 µg, 50 µL po nozi)
Grupa 4 primili replikon formulisan u emulziji (0,2 µg, 5 µL po nozi)
Grupa 5 primili replikon formulisan lipozomima (0,2 µg, 50 µL po nozi)
Grupa 6 primili replikon formulisan lipozomima (0,2 µg, 5 µL po nozi)
[0241] Lipozomi za grupe 5 i 6 su bili 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% holesterol i 2% PEG-2000 konjugovan sa DMG.
[0242] Serum je sakupljen za analizu antitela 14. i 35. dana. F-specifični serumski IgG GMT su bili:
[0243] Dakle, imunogenost formulisanog replikona nije varirala u zavisnosti od isporučenog volumena, što ukazuje da se ove RNK vakcine ne oslanjaju na hidrodinamičku isporuku za svoju efikasnost.
Pamučni pacovi
[0244] Studija je sprovedena na pamučnim pacovima (Sigmodon hispidis) umesto miševa. Inkapsulacija lipozoma sa dozom od 1 µg povećala je F-specifične titre IgG za 8,3 puta u poređenju sa golom RNK i povećala titre PRNT za 9,5 puta. Veličina odgovora antitela bila je ekvivalentna onom indukovanom sa 5×10<6>IU VRP. I gola i RNK inkapsulirana u lipozomima su bile u stanju da zaštite pamučne pacove od izazivanja RSV (1x10<5>jedinice koje formiraju plak), smanjujući virusno opterećenje pluća za najmanje 3,5 log. Enkapsulacija je povećala smanjenje za oko 2 puta.
[0245] Dalji rad na pamučnim pacovima koristio je četiri različita replikona: vA317 eksprimira RSV-F pune dužine; vA318 eksprimira skraćeni (transmembranski i citoplazmatski rep uklonjen) RSV-F; vA142 eksprimira RSV-F sa deletiranim fuzionim peptidom; vA140 eksprimira skraćeni RSV-F takođe bez njegovog peptida. Pamučnim pacovima, 4 do 8 životinja po grupi, date su intramuskularne vakcine (100 µL u jednoj nozi) 0. i 21. dana sa četiri različita replikona u dve doze (1,0 i 0,1 µg) formulisanim u lipozomima napravljenim korišćenjem 2 kDa PEG-konjugovanog DMG postupkom (D), ali sa veličinom serije RNK od 150 µg. Kontrolne grupe su primile RSV-F podjediničnu proteinsku vakcinu (5 µg) sa adjuvansom sa stipsom (8 životinja/grupi), VRPs koji eksprimiraju RSV-F pune dužine (1x10<6>IU, 8 životinja/grupi), ili naivna kontrola (4 životinje/grupa). Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 21. i 34. dana.
[0246] F-specifični titri IgG u serumu i titri antitela koji neutrališu serum RSV 21. i 34. dana bili su:
[0247] Sva četiri replikona procenjena u ovoj studiji (vA317, vA318, vA142, vA140) bila su imunogena kod pamučnih pacova kada su isporučeni lipozomom, iako su titri neutralizacije seruma bili najmanje deset puta niži od onih indukovanih proteinskim vakcinama sa adjuvansom ili VRP. Lipozomske/RNK vakcine su izazvale serumska F-specifična IgG i RSV neutrališuća antitela nakon prve vakcinacije, a druga vakcinacija je efikasno pojačala odgovor. F-specifični IgG titri posle druge vakcinacije sa 1 µg replikona bili su 2 do 3 puta veći nego posle druge vakcinacije sa 0,1 µg replikona. Četiri replikona su izazvala uporedive
4
titre antitela, što sugeriše da su RSV-F pune dužine i skraćeni, svaki sa ili bez fuzionog peptida, slično imunogeni kod pamučnih pacova.
[0248] Dalji rad na pamučnim pacovima ponovo je koristio replikone vA317, vA318 i vA142. Pamučnim pacovima, 2-8 životinja po grupi, date su intramuskularne vakcinacije (100 µL na jednoj nozi) 0. i 21. dana sa replikonima (0,1 ili 1 µg) inkapsuliranim u RV01 lipozome (sa PEG-2000) napravljenim postupkom (D) ali sa veličinom serije od 150 µg RNK. Kontrolne grupe su primile RSV-F podjediničnu proteinsku vakcinu (5 µg) sa adjuvansom sa stipsom ili VRPs koji eksprimiraju RSV-F pune dužine (1x10<6>IU, 8 životinja/grupa). Sve ove životinje su primile treću vakcinaciju (56. dan) sa RSV-F podjediničnom proteinskom vakcinom (5 µg) sa adjuvansom sa stipsom. Pored toga, postojala je i naivna kontrola (4 životinje/grupa). Dodatno, dodatnoj grupi su date bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0. i 56. dana sa 1 µg vA317 RNK u lipozomima, ali nije primila treću vakcinu sa podjediničnom proteinskom vakcinom.
[0249] Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 21, 35, 56, 70, plus dana 14, 28 i 42 za dodatnu grupu. F-specifični titri IgG u serumu (GMT) bili su sledeći:
[0250] Titri neutralizacije seruma su bili sledeći (60% titri neutralizacije RSV za 2 grupe od 3-4 životinje po grupi, GMT od ove 2 grupe po grupi):
[0251] Titri seruma i titri neutralizacije za dodatnu grupu bili su sledeći:
[0252] Stoga su replikoni potvrđeni kao imunogeni kod pamučnih pacova, izazivajući serumska F-specifična IgG i RSV neutrališuća antitela nakon prve vakcinacije. Druga vakcinacija je efikasno pojačala odgovore. F-specifični IgG titri posle druge vakcinacije sa 1,0 µg replikona bili su 1,5 do 4 puta veći nego posle druge vakcinacije sa 0,1 µg replikona.
[0253] Treća vakcinacija (protein 56. dana) nije povećala titre kod pamučnih pacova koji su prethodno vakcinisani sa F trimer podjedinicom stipsa, ali je pružila veliko povećanje titra kod pamučnih pacova koji su prethodno vakcinisani replikonom. U većini slučajeva, titri neutralizacije RSV seruma nakon dve vakcinacije replikona praćene povećanjem proteina bili su jednaki ili veći od titara izazvanih sa dve ili tri uzastopne vakcinacije proteina.
[0254] Ova studija je takođe procenila kinetiku odgovora antitela na 1,0 µg vA317. F-specifični serumski IgG i RSV neutralizacioni titri indukovani jednom vakcinacijom dostigli su svoj vrhunac oko 21. dana i održavali su se tokom najmanje 56. dana (50-70% pad titra F-specifičnog IgG, mala promena u titru neutralizacije RSV). Homologna druga vakcinacija je data ovim životinjama 56. dana i povećani titri antitela do nivoa koji je najmanje jednak onom postignutom kada je druga vakcinacija primenjena 21. dana.
[0255] Dalji eksperimenti su uključivali virusni izazov. Replikon vA368 kodira površinski fuzioni glikoprotein RSV pune dužine sa izbrisanim fuzionim peptidom, sa ekspresijom koju pokreće EV71 IRES. Pamučnim pacovima, 7 po grupi, date su intramuskularne vakcinacije (100 µL po nozi) 0. i 21. dana sa vA368 u lipozomima pripremljenim metodom (H), 175 µg RNK veličine serije, ili sa VRP-ovima koji imaju isti replikon. Lipozomi su uključivali 2kDa PEG, konjugovan sa DMG. Kontrolna grupa je primila 5 µg proteina sa adjuvansom stipsom, a uključena je i naivna kontrolna grupa.
[0256] Sve grupe su primile intranazalni izazov (i.n.) sa 1x10<6>PFU RSV četiri nedelje nakon konačne imunizacije. Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 21, 35 dana. Titri virusa u plućima su mereni 5 dana nakon izazivanja. Rezultati su bili sledeći:
[0257] Stoga je RNK vakcina smanjila virusno opterećenje pluća za više od tri log, sa približno 10<6>PFU/g kod nevakcinisanih kontrolnih pamučnih pacova na manje od 10<3>PFU/g kod vakcinisanih pamučnih pacova.
Studija na velikim sisarima
[0258] Studija na velikim životinjama je sprovedena na govedima. Telad (4-6 nedelja stara, ~60-80 kg, 5 po grupi) su imunizovana sa 66 µg replikona vA317 koji kodira RSV F protein pune dužine u danima 0, 21, 86 i 146. Replikoni su formulisani unutar lipozoma napravljenih sa postupkom (E) ali sa veličinom serije RNK od 1,5 mg; imali su 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% holesterola i 2% PEG-2000 konjugovanog sa DMG. Kao negativna kontrola korišćen je samo PBS, a kao pozitivna kontrola korišćena je licencirana vakcina („Triangle 4“ iz Fort Dodge, koji sadrži ubijeni virus). Sva telad su 146. dana primila 15 µg F proteina sa adjuvansom MF59 emulzije.
[0259] RNK vakcine su kodirale ljudski RSV F, dok vakcina "Triangle 4" sadrži goveđi RSV F, ali RSV F protein je visoko očuvan između BRSV i HRSV.
[0260] Telad su primila 2 ml svake eksperimentalne vakcine, primenjene intramuskularno po 2x1ml na svakoj strani vrata. Nasuprot tome, vakcina "Triangle 4" je data kao pojedinačna doza od 2 ml u vrat.
[0261] Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 14, 21, 35, 42, 56, 63, 86, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 146, 160, 167, 174, 18, 181. i 202. Ako je pojedinačna životinja imala titar ispod granice detekcije, dodeljen joj je titar 5.
[0262] SL.15 prikazuje F-specifične IgG titre tokom 210 dana. Tokom prva 63 dana replikon RNK je bio imunogen kod krava preko lipozoma, iako je davao niže titre od licencirane vakcine. Sve vakcinisane krave su pokazale F-specifična antitela posle druge doze, a titri su bili veoma stabilni u periodu od 2 do 6 nedelja nakon druge doze (i bili su posebno stabilni za RNK vakcine). Titri do 202. dana su bili sledeći:
[0263] Titri antitela za neutralizaciju RSV seruma bili su sledeći:
[0264] Materijal korišćen za drugu dozu lipozoma nije bio sveže pripremljen, a ista serija RNK je pokazala smanjenje potencije u studiji imunogenosti kod miševa. Stoga je moguće da bi vakcina bila imunogenija da je za sve vakcinacije korišćen svež materijal.
[0265] Kada su testirani sa komplementom, neutralizujuća antitela su otkrivena kod svih vakcinisanih krava. U ovom testu, sva vakcinisana telad imala su dobre titre neutralizujućih antitela posle druge RNK vakcinacije. Štaviše, RNK vakcina je izazvala F-specifične serumske IgG titre koji su otkriveni kod nekoliko teladi posle druge vakcinacije i kod svih teladi posle treće.
[0266] RSV-F sa adjuvansom MF59 je bio u stanju da pojača IgG odgovor kod svih prethodno vakcinisanih teladi i da poveća titre neutralizacije nezavisne od komplementa teladi koja su prethodno vakcinisana RNK.
[0267] Dokaz koncepta za RNK vakcine kod velikih životinja je posebno važan u svetlu gubitka potencije koji je ranije primećen kod vakcina zasnovanih na DNK kada se prelazi sa modela malih životinja na veće životinje i ljude. Tipična doza za DNK vakcinu krava bi bila 0,5-1 mg [43, 44] i stoga je veoma ohrabrujuće da su imuni odgovori indukovani sa samo 66 µg RNK.
Efekat dužine PEG
[0268] Kao što je gore pomenuto, lipozomi su pripremljeni korišćenjem DMG na koji je konjugovano pet različitih PEG-ova. Prosečna molekulska težina PEG-a bila je 500Da, 750Da, 1kDa, 2kDa ili 3kDa.
[0269] Lipozomi formirani korišćenjem najkraćih PEG-ova (500Da i 750Da) bili su nestabilni ili agregirani tokom TFF prečišćavanja. PEG-750 je dao lipozome sa značajno većim Zav prečnikom (669 nm) i indeksom polidisperznosti (0,21), sa 77% inkapsulacije. PEG-500 lipozomi su vidljivo agregirani u rastvoru tokom TFF procesa i eksperiment je prekinut. Stoga su ovi kratki PEG lipozomi bili nestabilni, ali duži PEG su formirali stabilne lipozome.
[0270] Različite dužine PEG (slika 16) imale su mali uticaj na prečnik lipozoma i indeks polidisperznosti. Zav prečnik bio je 197 nm (0,119 pdI) za 1kDa PEG, 142 nm (0,137 pdI) za 2 kDa PEG i 147 nm (0,075 pdI) za 3 kDa PEG. Inkapsulacija RNK se postepeno povećavala kako se dužina PEG povećavala, sa 81,7% na 85,9% do 91,5% (iako ovaj odnos nije uvek primećen u narednim eksperimentima).
[0271] Lipozomi su davani miševima intramuskularnom injekcijom dana 0. Nivoi SEAP u serumu su mereni 1, 3 i 6 dana hemiluminescentnim testom. Kao što je prikazano na Sl. 3, sve tri dužine PEG-a su bile efikasne, ali je variranje dužine PEG-a imalo izvestan uticaj na nivoe SEAP-a u serumu, pri čemu je PEG 2000 davao najveću ekspresiju.
Različiti lipidi i PEG dužine
[0272] Replikon vA317 je davan u lipozomima koji imaju niz različitih lipida sa različitim PEG dužinama. Svi lipozomi su imali 40% DlinDMA, 10% DSPC i 48% holesterola, ali je preostalih 2% bilo različito, sa različitim PEGilovanim lipidima (npr. Sl. 17A do 17E) i različite dužine PEG.
[0273] Fizičke karakteristike lipozoma, napravljenih postupkom (H), bile su:
[0274] BALB/c miševima, 8 po grupi, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0. i 21. dana sa replikonom, bilo golim (1 µg) ili inkapsuliranim u ovim lipozomima (0,1 µg). Serum je sakupljen za analizu antitela 14. i 35. dana.
[0275] F-specifični titri IgG u serumu (GMT) bili su sledeći, 2 nedelje nakon dve injekcije (2vp1):
[0276] Rezultati pokazuju trend, koji ukazuje da su grupe PEG glava veće molekularne težine imunogenije. Kako se dužina DMG-konjugovanog PEG-a povećava sa 1000Da na 3000Da, titri 2vp2 F-specifičnih IgG se povećavaju sa 7412 na 15659 na 22378.
[0277] Promena regiona linkera iz estra u etar nije značajno uticala na titre. Takođe, pri istoj molekulskoj težini glave grupe (2000) postojao je trend da povećanje dužine lipidnih repova smanjuje titre (H sa C14 dialkil vs. I sa C18 dialkilom). Zamena repa PEG di-alkil lipida holesterolom je imala mali uticaj na imunogenost (A sa DMG vs. G sa holesterolom).
[0278] Slični eksperimenti su izvedeni sa različitim lipidima u kojima je 2 kDa PEG podeljen u grupe 2 x 1 kDa (Slika 18, sa ukupnim MV u pravougaonom regionu 2000). Replikon vA317 je ponovo korišćen, sa BALB/c miševima, 8 po grupi, kojima su date bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) dana 0 i 21 sa 1 µg gole RNK ili 0,1 µg RNK inkapsulirane lipozomima. Svi lipozomi su imali 40% katjonskog lipida (DlinDMA), 10% DSPC i 48% holesterola, ali preostalih 2% je bilo različito, sa različitim PEGilovanim lipidima (ali svi sa 2kDa PEG). Napravljeni su postupkom (H).
[0279] Fizičke karakteristike lipozoma su bile:
[0280] Dalji lipozomi su napravljeni sa RV05. Lipozomi su imali 40% katjonskog lipida (RV05) i 2% PEGilovanog DMG (2kDa PEG), dok su preostale komponente varirale (ali holesterol je uvek bio uključen). Lipozomi su napravljeni postupkom (H) ali sa pH 5. Fizičke karakteristike su:
1
[0281] BALB/c miševima, 8 po grupi, date su bilateralne intramuskularne vakcine (50 µL po nozi) 0. i 21. dana sa replikonom, bilo golim (1 µg) ili inkapsuliranim (0,1 µg). Serum je sakupljen za analizu antitela 14. i 35. dana. F-specifični titri IgG u serumu (GMT) su bili sledeći, 2 nedelje nakon dve injekcije (2vp1):
[0282] Cepanje grupa PEG glava je na taj način smanjilo in vivo titre. Uključivanje dvostruke veze (1 stepen nezasićenosti po alkilnom repu) u repovima PEG lipida povećalo je titre IgG, 6 puta 14. dana i 7 puta 35. dana. Za katjonski lipid sa asimetričnim lipidnim repovima (alkil holesterol), promena neutralnog lipida iz DSPC (zasićeni C18 lipidni rep) do 18:2 ili 18:3 PC (sa 2 i 3 nezasićene dvostruke veze po repu) povećao je ukupne titre IgG. Uporedivi rezultati su primećeni zamenom DSPC sa DPiPE.
Tabela 1: korisni fosfolipidi
DDPC 1,2-Didekanoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
DEPA 1,2-Dierucoil-sn-Glicero-3-fosfat
DEPC 1,2-Erukoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
DEPE 1,2-dierukoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamin
DEPG 1,2-dierukoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DLOPC 1,2-Linoleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
2
DLPA 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfat
DLPC 1,2-Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
DLPE 1,2-Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamin
DLPG 1,2-dilauroil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DLPS 1,2-Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidilserin
DMG 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin
DMPA 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfat
DMPC 1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
DMPE 1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamin
DMPG 1,2-miristoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DMPS 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilserin DOPA 1,2-dioleoil-snglicero-3-fosfat
DOPC 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin DOPE 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamin
DOPG 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3 [fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DOPS 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserin
DPPA 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfat
DPPC 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
DPPE 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamin
DPPG 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...) DPPS 1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserin
DPiPE 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin
DSPA 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfat
DSPC 1,2-Distearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
DSPE 1,2-Diostearpil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamin
DSPG 1,2-distearoil-sn-glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DSPS 1,2-Distearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserin
EPC Egg-PC
HEPC Hidrogenizovano EGG PC
HSPC Hidrogenizovana soja PC visoke čistoće
HSPC Hidrogenizovana soja PC
LISOPC MIRISTIC 1-Miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
LISOPC PALMITIC 1-Palmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
LISOPC STEARIC 1-Stearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
Mlečni sfingomijelin 1-Miristoil,2-palmitoil-sn-Glicero 3-fosfatidilholin
MPPC MSPC 1-miristoil,2-stearoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
PMPC 1-Palmitoil,2-miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
POPC 1-Palmitoil,2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
PAPA 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamin
POPG 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3[fosfatidil-rac-(1-glicerol)...]
PSPC 1-Palmitoil,2-stearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilholin
SMPC 1-stearoil,2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
SOPC 1-stearoil,2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
SPPC 1-stearoil,2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilholin
REFERENCE
[0283]
[1] Johanning et al. (1995) Nucleic Acids Res 23:1495-1501.
[2] Heyes et al. (2005) J Controlled Release 107:276-87.
[3] WO2005/121348.
[4] Liposomes: Methods and Protocols, Volume 1: Pharmaceutical Nanocarriers: Methods and Protocols. (ed. Weissig). Humana Press, 2009. ISBN 160327359X.
[5] Liposome Technology, volumes I, II & III. (ed. Gregoriadis). Informa Healthcare, 2006.
[6] Functional Polymer Colloids and Microparticles volume 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes). (eds. Arshady & Guyot). Citus Books, 2002.
[7] Jeffs et al. (2005) Pharmaceutical Research 22 (3):362-372.
[8] WO2005/113782.
[9] WO2011/005799.
[10] El Ouahabi et al. (1996) FEBS Letts 380:108-12.
[11] Giuliani et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103(29): 10834-9.
[12] WO2009/016515.
[13] WO02/34771.
4
[14] WO2005/032582.
[15] WO2010/119343.
[16] WO2006/110413.
[17] WO2005/111066.
[18] WO2005/002619.
[19] WO2006/138004.
[20] WO2009/109860.
[21] WO02/02606.
[22] WO03/018054.
[23] WO2006/091517.
[24] WO2008/020330.
[25] WO2006/089264.
[26] WO2009/104092.
[27] WO2009/031043.
[28] WO2007/049155.
[29] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.
[30] Romberg et al. (2008) Pharmaceutical Research 25:55-71.
[31] Hoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52
[32] WO2009/086558
[33] Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)
[34] Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications)
[35] Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press).
[36] Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997)
[37] Ausubel et al. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5th edition (Current Protocols).
[38] Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press)
[39] PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag)
[40] Yoneyama & Fujita (2007) Cytokine & Growth Factor Reviews 18:545-51.
[41] Maurer et al. (2001) Biophysical Journal, 80: 2310-2326.
[42] Perri et al. (2003) J Virol 77:10394-10403.
[43] Boxus et al. (2007) J Virol 81:6879-89.
[44] Taylor et al. (2005) Vaccine 23:1242-50.

Claims (13)

Patentni zahtevi
1. Lipozom unutar koga je inkapsulirana RNK koja kodira imunogen od interesa, naznačen time da lipozom sadrži najmanje jedan lipid koji uključuje polietilen glikol deo, tako da je polietilen glikol prisutan na spoljašnjosti lipozoma, pri čemu je prosečna molekulska masa polietilen glikola između 1 kDa i 3 kDa; pri čemu RNK uključuje 5' kapu koja sadrži 7'-metilguanozin, a prva 1, 2 ili 35' ribonukleotida su metilovani na 2' poziciji riboze.
2. Lipozom prema patentnom zahtevu 1, naznačen time da je prosečna molekulska masa polietilen glikola između 1,5 i 2,5 kDa, između 1,7 i 2,3 kDa, između 1,8 i 2,2 kDa, između 1,9 i 2,1 kDa, ili 2 kDa.
3. Lipozom prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time da lipozom ima prečnik od 80-160 nm.
4. Lipozom prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time da lipozom sadrži lipid sa katjonskom grupom glave.
5. Lipozom prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time da lipozom sadrži lipid sa cviterjonskom grupom glave.
6. Lipozom prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time da RNK je samoreplicirajuća RNK.
7. Lipozom prema patentnom zahtevu 6, naznačen time da molekul RNK koji se samoreplicira kodira (i) RNK-zavisnu RNK polimerazu koja može da transkribuje RNK iz molekula RNK koji se samoreplicira i (ii) imunogen.
8. Lipozom prema patentnom zahtevu 7, naznačen time da molekul RNK ima dva otvorena okvira za čitanje, od kojih prvi kodira replikazu alfavirusa, a drugi kodira imunogen.
9. Lipozom prema bilo kom od prethodnih patentnom zahteva, naznačen time da je molekul RNK dugačak 9000-12000 nukleotida.
10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži lipozom prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačena time da farmaceutska kompozicija sadrži veći broj takvih lipozoma.
11. Lipozom prema patentnim zahtevima 1-9, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10, za upotrebu u postupku za izazivanje zaštitnog imunološkog odgovora kod kičmenjaka, koji obuhvata korak davanja kičmenjaku efektivne količine navedenog lipozoma, ili pomenute farmaceutske kompozicije.
12. Postupak za pripremu lipozoma koji sadrži RNK, koji obuhvata korak mešanja RNK sa jednim ili više lipida, pod uslovima takvim da lipidi formiraju lipozom u kome je RNK inkapsulirana, naznačen time da najmanje jedan lipid uključuje polietilen glikol deo koji se locira na spoljašnjosti lipozoma tokom procesa, i gde je prosečna molekulska masa polietilen glikola između 1 kDa i 3 kDa; i gde RNK uključuje 5' kapu koja sadrži 7'-metilguanozin, a prva 1, 2 ili 35' ribonukleotida su metilovana na 2' poziciji riboze.
13. Postupak prema zahtevu 12, koji dalje obuhvata pripremu farmaceutske kompozicije koja pored lipozoma sadrži i farmaceutski prihvatljiv nosač.
RS20220595A 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen RS63329B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37882610P 2010-08-31 2010-08-31
EP21207859.6A EP3970742B1 (en) 2010-08-31 2011-08-31 Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63329B1 true RS63329B1 (sr) 2022-07-29

Family

ID=44653554

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20221147A RS63816B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20220501A RS63315B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20230135A RS63983B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20220594A RS63367B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20220595A RS63329B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20230096A RS63949B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen

Family Applications Before (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20221147A RS63816B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20220501A RS63315B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20230135A RS63983B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20220594A RS63367B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230096A RS63949B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen

Country Status (22)

Country Link
US (3) US20130202684A1 (sr)
EP (11) EP4226940A1 (sr)
JP (1) JP5911870B2 (sr)
CN (1) CN103179984A (sr)
AU (1) AU2011295935B2 (sr)
BR (1) BR112013004866A2 (sr)
CA (1) CA2809851A1 (sr)
CY (3) CY1125209T1 (sr)
DK (7) DK4066855T3 (sr)
ES (7) ES2918649T3 (sr)
FI (3) FI4226941T3 (sr)
HR (7) HRP20230226T1 (sr)
HU (7) HUE058361T2 (sr)
LT (7) LT3970742T (sr)
MX (1) MX2013002336A (sr)
PL (7) PL2611461T3 (sr)
PT (7) PT3981427T (sr)
RS (6) RS63816B1 (sr)
RU (1) RU2013114362A (sr)
SI (7) SI4066857T1 (sr)
SM (6) SMT202200290T1 (sr)
WO (1) WO2012031043A1 (sr)

Families Citing this family (279)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3243526T (pt) 2010-07-06 2020-03-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Distribuição de arn para despoletar múltiplas vias imunitárias
FI4005592T3 (fi) * 2010-07-06 2023-01-13 Virionin kaltaisia kuljetuspartikkeleita itsereplikoituville rna-molekyyleille
CN103153284B (zh) 2010-07-06 2015-11-25 诺华股份有限公司 含有其pKa值有利于RNA递送的脂质的脂质体
US10487332B2 (en) 2010-07-06 2019-11-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunisation of large mammals with low doses of RNA
CA2807552A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
JP5911870B2 (ja) * 2010-08-31 2016-04-27 ノバルティス アーゲー 免疫原をコードするｒｎａの送達のためのｐｅｇ化リポソーム
RS63890B1 (sr) 2010-08-31 2023-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
EP2857499A1 (en) 2010-10-01 2015-04-08 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
KR102266691B1 (ko) 2010-10-11 2021-06-23 노파르티스 아게 항원 전달 플랫폼
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
KR20220025112A (ko) 2011-06-08 2022-03-03 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. Mrna 전달을 위한 지질 나노입자 조성물 및 방법
JP2014522842A (ja) * 2011-07-06 2014-09-08 ノバルティス アーゲー 免疫原性組み合わせ組成物およびその使用
RU2014104090A (ru) * 2011-07-06 2015-08-20 Новартис Аг Липосомы с эффективным соотношением n:p для доставки молекул phk
PT2750707T (pt) 2011-08-31 2019-01-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lipossomas peguilados para distribuição de arn que codifica imunogénio
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
PT3682905T (pt) 2011-10-03 2022-04-07 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos e ácidos nucleicos modificados e respetivas utilizações
ES2923757T3 (es) 2011-12-16 2022-09-30 Modernatx Inc Composiciones de ARNm modificado
WO2013151664A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
CN104411338A (zh) 2012-04-02 2015-03-11 现代治疗公司 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9512456B2 (en) 2012-08-14 2016-12-06 Modernatx, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of RNA
PT2922554T (pt) 2012-11-26 2022-06-28 Modernatx Inc Arn modificado nas porções terminais
AU2014204826A1 (en) 2013-01-10 2015-07-09 Seqirus UK Limited Influenza virus immunogenic compositions and uses thereof
EP3434774A1 (en) 2013-01-17 2019-01-30 ModernaTX, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
ES2887254T3 (es) 2013-03-08 2021-12-22 Novartis Ag Lípidos y composiciones lipídicas para el suministro de agentes activos
US20160024181A1 (en) 2013-03-13 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
PL2970948T3 (pl) 2013-03-15 2019-06-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sposoby oczyszczania rna
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
PL3019619T3 (pl) * 2013-07-11 2022-01-10 Modernatx, Inc. Kompozycje zawierające syntetyczne polinkleotydy kodujące białka powiązane z crispr i syntetyczne sgrna oraz sposoby ich stosowania
CA2923029A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
KR20160067219A (ko) 2013-10-03 2016-06-13 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 저밀도 지단백질 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
MX2016008568A (es) * 2013-12-27 2017-04-13 Teloregen Inc Composiciones y metodos para proveer telomerasa activa a las celulas in vivo.
EP3096742B1 (en) 2014-01-20 2024-06-12 University of Utah Research Foundation Compositions and methods for modifying the surface of cells and methods of use
US10842859B2 (en) 2014-03-25 2020-11-24 Yale University Uses of parasite macrophage migration inhibitory factors
HRP20220070T1 (hr) 2014-04-23 2022-04-01 Modernatx, Inc. Cjepiva nukleinske kiseline
EP2974739A1 (en) 2014-07-15 2016-01-20 Novartis AG RSVF trimerization domains
CA2953341C (en) 2014-06-25 2023-01-24 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
WO2016011226A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3171895A1 (en) 2014-07-23 2017-05-31 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
EP3061826A1 (en) 2015-02-27 2016-08-31 Novartis AG Flavivirus replicons
EP4353257A3 (en) 2015-04-13 2024-08-07 CureVac Manufacturing GmbH Method for producing rna compositions
HUE067372T2 (hu) 2015-06-29 2024-10-28 Acuitas Therapeutics Inc Lipidek és nanoszemcsés lipid formulázások nukleinsavak beadására
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
MA42502A (fr) 2015-07-21 2018-05-30 Modernatx Inc Vaccins contre une maladie infectieuse
WO2017031232A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
HRP20220156T1 (hr) 2015-09-17 2022-04-15 Modernatx, Inc. Spojevi i pripravci za unutarstaničnu isporuku terapeutskih sredstava
EP3359670B2 (en) 2015-10-05 2024-02-14 ModernaTX, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
SG11201803360UA (en) 2015-10-22 2018-05-30 Modernatx Inc Nucleic acid vaccines for varicella zoster virus (vzv)
MA45209A (fr) 2015-10-22 2019-04-17 Modernatx Inc Vaccins contre les maladies sexuellement transmissibles
DE20164728T1 (de) 2015-10-22 2021-09-30 Modernatx, Inc. Impfstoffe gegen atemwegsvirus
EP3364981A4 (en) 2015-10-22 2019-08-07 ModernaTX, Inc. VACCINE AGAINST THE HUMAN CYTOMEGALOVIRUS
WO2017070624A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
CN108368028B (zh) 2015-10-28 2021-09-03 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的新型脂质和脂质纳米颗粒制剂
DK3386484T3 (da) 2015-12-10 2022-07-04 Modernatx Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til afgivelse af terapeutiske midler
RS63051B1 (sr) 2015-12-22 2022-04-29 Modernatx Inc Jedinjenja i kompozicije za intracelularnu isporuku agenasa
SMT202200310T1 (it) 2015-12-23 2022-09-14 Modernatx Inc Metodi di utilizzo dei polinucleotidi codificanti il ligando di ox40
US12678515B2 (en) 2015-12-30 2026-07-14 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
US20190241658A1 (en) 2016-01-10 2019-08-08 Modernatx, Inc. Therapeutic mRNAs encoding anti CTLA-4 antibodies
WO2017162265A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Trans-replicating rna
WO2017162266A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Rna replicon for versatile and efficient gene expression
KR102483033B1 (ko) * 2016-05-16 2022-12-30 액세스 투 어드밴스드 헬스 인스티튜트 페길화된 리포솜 및 이의 용도
US12128113B2 (en) 2016-05-18 2024-10-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding JAGGED1 for the treatment of Alagille syndrome
CN115837014A (zh) 2016-05-18 2023-03-24 摩登纳特斯有限公司 编码松弛素的多核苷酸
WO2017208191A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Zika viral antigen constructs
CN109715205A (zh) 2016-08-19 2019-05-03 库瑞瓦格股份公司 用于癌症治疗的rna
WO2018060288A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions and methods of treatment of persistent hpv infection
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
EP3538067A1 (en) 2016-11-08 2019-09-18 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
EP3541416A1 (en) 2016-11-17 2019-09-25 GlaxoSmithKline Biologicals SA Zika viral antigen constructs
WO2018104538A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Curevac Ag Rna for treatment or prophylaxis of a liver disease
WO2018104540A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Curevac Ag Rnas for wound healing
EP3551193A4 (en) 2016-12-08 2020-08-19 Modernatx, Inc. NUCLEIC ACID VACCINES AGAINST RESPIRATORY VIRUSES
WO2018115525A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Curevac Ag Lassa virus vaccine
WO2018115527A2 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Curevac Ag Mers coronavirus vaccine
MX2019009070A (es) * 2017-02-01 2019-10-30 Modernatx Inc Composiciones de arnm terapeuticas inmunomoduladoras que codifican peptidos de mutacion de oncogenes de activacion.
MA47515A (fr) 2017-02-16 2019-12-25 Modernatx Inc Compositions immunogènes très puissantes
JP7332478B2 (ja) 2017-03-15 2023-08-23 モデルナティエックス インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子製剤
WO2018170256A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
WO2018170260A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Respiratory syncytial virus vaccine
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
RS63953B1 (sr) 2017-03-15 2023-02-28 Modernatx Inc Jedinjenje i kompozicije za intracelularnu isporuku terapeutskih sredstava
WO2018170322A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Crystal forms of amino lipids
WO2018170347A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Modernatx, Inc. Zoonotic disease rna vaccines
CA3050614A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Curevac Ag Rna vaccine and immune checkpoint inhibitors for combined anticancer therapy
MX2019011215A (es) 2017-03-24 2020-02-12 Curevac Ag Ácidos nucleicos que codifican proteínas asociadas a crispr y usos de los mismos.
MA48047A (fr) 2017-04-05 2020-02-12 Modernatx Inc Réduction ou élimination de réponses immunitaires à des protéines thérapeutiques administrées par voie non intraveineuse, par exemple par voie sous-cutanée
KR102945203B1 (ko) 2017-05-08 2026-03-31 시애틀 프로젝트 코포레이션 알파바이러스 신생항원 벡터
EP4253544A3 (en) 2017-05-18 2023-12-20 ModernaTX, Inc. Modified messenger rna comprising functional rna elements
AU2018270111B2 (en) 2017-05-18 2022-07-14 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (IL12) polypeptides and uses thereof
BR112019025104A2 (pt) * 2017-05-30 2020-06-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Método de fabricar um sistema de entrega não viral, sistema de entrega não viral, e, composição
GB2600652B (en) 2017-05-30 2022-11-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel compositions
US11015204B2 (en) 2017-05-31 2021-05-25 Arcturus Therapeutics, Inc. Synthesis and structure of high potency RNA therapeutics
EP3638678B1 (en) 2017-06-14 2025-12-03 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
EP3638292A1 (en) 2017-06-14 2020-04-22 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding coagulation factor viii
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
JP7722629B2 (ja) 2017-07-04 2025-08-13 キュアバック エスイー 新規核酸分子
JP7355731B2 (ja) 2017-08-16 2023-10-03 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子製剤における使用のための脂質
MX2020002348A (es) 2017-08-31 2020-10-08 Modernatx Inc Métodos de elaboración de nanopartículas lipídicas.
AU2018333530B2 (en) 2017-09-13 2024-05-30 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh RNA replicon for expressing a T cell receptor or an artificial T cell receptor
US12291717B2 (en) 2017-09-13 2025-05-06 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh RNA replicon for reprogramming somatic cells
EP3681514A4 (en) 2017-09-14 2021-07-14 ModernaTX, Inc. RNA VACZINE AGAINST ZIKA VIRUS
EP3461497A1 (en) 2017-09-27 2019-04-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Viral antigens
BR112020004351A2 (pt) 2017-10-19 2020-09-08 Curevac Ag moléculas de ácido nucleico artificial
WO2019094702A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Cocoon Biotech Inc. Ocular applications of silk-based products
EP3714048B1 (en) 2017-11-22 2025-04-09 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of urea cycle disorders
US11939601B2 (en) 2017-11-22 2024-03-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase for the treatment of phenylketonuria
JP7424976B2 (ja) 2017-11-22 2024-01-30 モダーナティエックス・インコーポレイテッド プロピオン酸血症の治療用のプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼアルファ及びベータサブユニットをコードするポリヌクレオチド
KR102823029B1 (ko) 2017-12-20 2025-06-20 브이엘피 테라퓨틱스 인코포레이티드 알파바이러스 레플리콘 입자
KR20240134250A (ko) 2018-01-04 2024-09-06 아이코닉 테라퓨틱스, 인코포레이티드 항-조직 인자 항체, 항체-약물 결합체, 및 관련 방법
US11802146B2 (en) 2018-01-05 2023-10-31 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding anti-chikungunya virus antibodies
US11911453B2 (en) 2018-01-29 2024-02-27 Modernatx, Inc. RSV RNA vaccines
US20210163928A1 (en) 2018-04-11 2021-06-03 Modernatx, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements
MA52709A (fr) 2018-05-23 2021-03-31 Modernatx Inc Administration d'adn
WO2020023390A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Modernatx, Inc. Mrna based enzyme replacement therapy combined with a pharmacological chaperone for the treatment of lysosomal storage disorders
AU2019321186B2 (en) 2018-08-17 2024-05-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions and uses thereof
MA53545A (fr) 2018-09-02 2021-07-14 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour l'acyl-coa déshydrogénase à très longue chaîne pour le traitement de l'insuffisance en acyl-coa déshydrogénase à très longue chaîne
US12644102B2 (en) 2018-09-13 2026-06-02 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex E1-α, E1-β, and E2 subunits for the treatment of maple syrup urine disease
JP2022500436A (ja) 2018-09-13 2022-01-04 モダーナティエックス・インコーポレイテッドModernaTX, Inc. 糖原病を処置するためのグルコース−６−ホスファターゼをコードするポリヌクレオチド
MA53615A (fr) 2018-09-14 2021-07-21 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour le polypeptide a1, de la famille de l'uridine diphosphate glycosyltransférase 1, pour le traitement du syndrome de crigler-najjar
WO2020058239A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Universiteit Gent Therapeutic nanoparticles and methods of use thereof
CN112996854B (zh) 2018-09-19 2024-08-30 摩登纳特斯有限公司 高纯度peg脂质和其用途
US12151029B2 (en) 2018-09-19 2024-11-26 Modernatx, Inc. PEG lipids and uses thereof
EP3853202A1 (en) 2018-09-19 2021-07-28 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
US12090235B2 (en) 2018-09-20 2024-09-17 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
EP3852911B1 (en) 2018-09-21 2025-01-22 Acuitas Therapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing lipid nanoparticles and liposomes
WO2020069169A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding arginase 1 for the treatment of arginase deficiency
CA3116576A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
KR20210090650A (ko) 2018-11-07 2021-07-20 그릿스톤 바이오, 인코포레이티드 알파바이러스 신생항원 벡터 및 인터페론 억제제
US20220001026A1 (en) 2018-11-08 2022-01-06 Modernatx, Inc. Use of mrna encoding ox40l to treat cancer in human patients
EP3886901A1 (en) 2018-11-29 2021-10-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Methods for manufacturing an adjuvant
TWI852977B (zh) 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
WO2020144295A1 (en) 2019-01-10 2020-07-16 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Localized administration of rna molecules for therapy
PL3908568T3 (pl) 2019-01-11 2024-12-02 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipidy do dostarczania środków czynnych w nanocząstkach lipidowych
CN113939282A (zh) 2019-01-31 2022-01-14 摩登纳特斯有限公司 制备脂质纳米颗粒的方法
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
MA55082A (fr) 2019-03-01 2022-01-05 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Compositions, procédés, et kits pour l'administration de polyribonucléotides
KR102901623B1 (ko) 2019-03-01 2025-12-18 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 폴리리보뉴클레오티드 및 이의 미용적 용도
MA55321A (fr) 2019-03-15 2022-01-19 Modernatx Inc Vaccins à base d'arn contre le vih
WO2020227642A1 (en) 2019-05-08 2020-11-12 Modernatx, Inc. Compositions for skin and wounds and methods of use thereof
SG11202113187WA (en) 2019-05-30 2021-12-30 Gritstone Bio Inc Modified adenoviruses
MA56517A (fr) 2019-06-24 2022-04-27 Modernatx Inc Arn messager comprenant des éléments d'arn fonctionnels et leurs utilisations
EP3987027A1 (en) 2019-06-24 2022-04-27 ModernaTX, Inc. Endonuclease-resistant messenger rna and uses thereof
ES2982157T3 (es) 2019-07-18 2024-10-14 Institut Nat De La Sante Et De Larecherche Medicale Inserm Mutante de RAC2 para su uso en la ablación de la hematopoyesis y en el tratamiento de neoplasias malignas hematopoyéticas
MX2022000879A (es) 2019-07-21 2022-05-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vacuna viral terapeutica.
WO2021038508A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Jet mixing lipid nanoparticle manufacturing process
EP4031524A1 (en) 2019-09-19 2022-07-27 ModernaTX, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
AU2020351220A1 (en) 2019-09-19 2022-04-07 Modernatx, Inc. Carbonate containing lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
AU2020355000A1 (en) 2019-09-23 2022-03-17 Sepia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein B (APOB) gene expression
CN114729376A (zh) 2019-09-23 2022-07-08 欧米茄治疗公司 用于调节肝细胞核因子4α(HNF4α)基因表达的组合物和方法
EP3819377A1 (en) 2019-11-08 2021-05-12 Justus-Liebig-Universität Gießen Circular rna and uses thereof for inhibiting rna-binding proteins
EP4061405A1 (en) 2019-11-18 2022-09-28 Janssen Biotech, Inc. Vaccines based on mutant calr and jak2 and their uses
US12194089B2 (en) 2020-02-04 2025-01-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
JP2023517644A (ja) 2020-03-09 2023-04-26 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッド コロナウイルスワクチン組成物及び方法
WO2021183720A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
IL296660A (en) 2020-03-24 2022-11-01 Generation Bio Co Non-viral DNA vectors and their use for therapeutic expression of factor ix
IL296662A (en) 2020-03-24 2022-11-01 Generation Bio Co Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing gaucher therapeutics
US20230364219A1 (en) 2020-04-16 2023-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sars cov-2 spike protein construct
IL298363A (en) 2020-05-20 2023-01-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Immunogenic compositions and uses thereof
AU2021285812A1 (en) 2020-06-01 2023-01-05 Modernatx, Inc. Phenylalanine hydroxylase variants and uses thereof
JP7769644B2 (ja) 2020-06-04 2025-11-13 バイオエヌテック エスエー 多用途かつ効率的な遺伝子発現のためのｒｎａレプリコン
WO2021245611A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified betacoronavirus spike proteins
EP4171629A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Adjuvants
EP4175664A2 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
WO2022009049A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
KR20230051172A (ko) 2020-07-16 2023-04-17 아퀴타스 테라퓨틱스 인크. 지질 나노 입자에 사용하기 위한 양이온성 지질
MX2023001109A (es) 2020-07-27 2023-04-24 Anjarium Biosciences Ag Composiciones de moleculas de adn, metodos para elaborar las mismas, y metodos de usos de las mismas.
IL300026A (en) 2020-08-06 2023-03-01 Gritstone Bio Inc Multiepitope vaccine cassettes
US12178921B2 (en) 2020-08-14 2024-12-31 Arcturus Therapeutics, Inc. Method of lyophilizing lipid nanoparticles
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
IL300947A (en) 2020-09-03 2023-04-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Immunogenic compositions and uses thereof
CA3199784A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
EP4008785A1 (en) 2020-12-03 2022-06-08 Justus-Liebig-Universität Gießen Circular nucleic acids and uses thereof for interfering with genome expression and proliferation of coronaviruses
MX2023007574A (es) 2020-12-22 2023-09-29 CureVac SE "vacuna de arn contra variantes de sars-cov-2.
US20240301006A1 (en) 2020-12-23 2024-09-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Self-amplifying messenger rna
EP4032546A1 (en) 2021-01-20 2022-07-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Therapeutic viral vaccine
WO2022173667A1 (en) * 2021-02-09 2022-08-18 Serina Therapeutics, Inc. Polyoxazoline-lipid conjugates and lipid nanoparticles and pharmaceutical compositions including same
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
WO2022204369A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
US20240189449A1 (en) 2021-03-24 2024-06-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
US20240207374A1 (en) 2021-03-24 2024-06-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof
WO2022204380A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof
WO2022204390A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof
EP4313152A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic compositions
JP2024517427A (ja) 2021-04-20 2024-04-22 アンジャリウム バイオサイエンシズ エージー アミロ－α－１，６－グルコシダーゼ、４－α－グルカノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子の組成物、その作製の方法、及びその使用の方法
JP2024515788A (ja) 2021-04-27 2024-04-10 ジェネレーション バイオ カンパニー 治療抗体を発現する非ウイルスｄｎａベクター及びその使用
US20240216535A1 (en) 2021-04-27 2024-07-04 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing anti-coronavirus antibodies and uses thereof
CN113230394B (zh) * 2021-04-30 2024-04-30 广州源博医药科技有限公司 一种用于牛病毒性腹泻的rna疫苗及其构建方法
US20240285755A1 (en) 2021-05-24 2024-08-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuvants
WO2022259191A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Release assay for determining potency of self-amplifying rna drug product and methods for using
US20240384277A1 (en) 2021-06-15 2024-11-21 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression
US20240376445A1 (en) 2021-06-22 2024-11-14 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
WO2023283359A2 (en) 2021-07-07 2023-01-12 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
EP4377331A2 (en) 2021-07-30 2024-06-05 CureVac SE Mrnas for treatment or prophylaxis of liver diseases
WO2023020993A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
US20250134824A1 (en) 2021-08-16 2025-05-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Low-dose lyophilized rna vaccines and methods for preparing and using the same
US20240350410A1 (en) 2021-08-16 2024-10-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Freeze-drying of lipid nanoparticles (lnps) encapsulating rna and formulations thereof
WO2023020994A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023020992A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023031855A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Substitution of nucleotide bases in self-amplifying messenger ribonucleic acids
US20250017867A1 (en) 2021-10-01 2025-01-16 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease
US20250236883A1 (en) 2021-10-18 2025-07-24 BioNTech SE Modified replicable rna and related compositions and their use
EP4419708A1 (en) 2021-10-18 2024-08-28 BioNTech SE Methods for determining mutations for increasing modified replicable rna function and related compositions and their use
WO2023081526A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Orna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions for delivering circular polynucleotides
US12186387B2 (en) 2021-11-29 2025-01-07 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2023114943A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2023135273A2 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Anjarium Biosciences Ag Compositions of dna molecules encoding factor viii, methods of making thereof, and methods of use thereof
WO2023135298A1 (en) 2022-01-17 2023-07-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of inducing cell death of a population of solid tumor cells
WO2023144193A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 CureVac SE Mrnas for treatment of hereditary tyrosinemia type i
WO2023152365A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of the 15-lipoxygenase for the treatment of lymphedema
US20250327041A1 (en) 2022-02-24 2025-10-23 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
EP4493212A1 (en) 2022-03-14 2025-01-22 Generation Bio Co. Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use
WO2023183909A2 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding fanconi anemia, complementation group proteins for the treatment of fanconi anemia
WO2023213378A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 BioNTech SE Replicon compositions and methods of using same for the treatment of diseases
WO2023239756A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof
WO2023242817A2 (en) 2022-06-18 2023-12-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Recombinant rna molecules comprising untranslated regions or segments encoding spike protein from the omicron strain of severe acute respiratory coronavirus-2
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024017479A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 BioNTech SE Multifunctional cells transiently expressing an immune receptor and one or more cytokines, their use and methods for their production
AU2023316015A1 (en) 2022-07-25 2025-02-13 Centre Hospitalier Universitaire De Toulouse Use of apelin for the treatment of lymphedema
EP4562163A1 (en) 2022-07-26 2025-06-04 ModernaTX, Inc. Engineered polynucleotides for temporal control of expression
WO2024040222A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Generation Bio Co. Cleavable closed-ended dna (cedna) and methods of use thereof
WO2024044147A1 (en) 2022-08-23 2024-02-29 Modernatx, Inc. Methods for purification of ionizable lipids
WO2024047247A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
WO2024056856A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 BioNTech SE Systems and compositions comprising trans-amplifying rna vectors with mirna
CA3267272A1 (en) 2022-09-26 2024-04-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa FLU VIRUS VACCINES
JP7557915B2 (ja) 2022-10-18 2024-09-30 株式会社チップトン テイラー反応装置及びカプセル粒子の製造方法
WO2024089638A1 (en) 2022-10-28 2024-05-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine
TW202428289A (zh) 2022-11-08 2024-07-16 美商歐納醫療公司 環狀rna組合物
WO2024102730A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102762A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
AU2023406321A1 (en) 2022-12-01 2025-05-29 Generation Bio Co. Novel polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same
EP4626402A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids and lipid-anchored polymers
US20260207525A1 (en) 2022-12-01 2026-07-23 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids, ionizable lipids, sterols, lipid anchored polymers and helper lipids, their uses
JP2025541726A (ja) 2022-12-01 2025-12-23 ジェネレーション バイオ カンパニー 細胞標的化のためのステルス脂質ナノ粒子組成物
EP4630033A1 (en) 2022-12-09 2025-10-15 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Novel human antiviral genes related to the eleos and lamassu prokaryotic systems
WO2024133160A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis b compositions
JP2026503277A (ja) 2023-01-09 2026-01-28 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 心筋梗塞を経験した患者における有害な虚血後心臓リモデリングを処置するためのアンジオポエチン様４の組み換えフィブリノーゲン様ドメインの使用
WO2024153636A1 (en) 2023-01-17 2024-07-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Vasorin as a biomarker and biotarget in nephrology
WO2024156835A1 (en) 2023-01-27 2024-08-02 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of amphiregulin (areg) in methods of treating vascular hyperpermeability
WO2024160936A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rna formulation
GB202302092D0 (en) 2023-02-14 2023-03-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Analytical method
WO2024197033A1 (en) 2023-03-21 2024-09-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of heart failure
WO2024194484A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Modulating the expression and/or activity of gas7 for modulating viral replication
WO2024205657A2 (en) 2023-03-29 2024-10-03 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
EP4701657A1 (en) 2023-04-27 2026-03-04 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Influenza virus vaccines
JP2026518411A (ja) 2023-04-27 2026-06-08 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム インフルエンザウイルスワクチン
EP4704816A1 (en) 2023-05-03 2026-03-11 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
WO2024233308A2 (en) 2023-05-05 2024-11-14 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
EP4716741A2 (en) 2023-05-23 2026-04-01 Flagship Labs 114, Inc. Compositions and methods for reducing cxcl9, cxcl10, and cxcl11 gene expression
EP4724115A1 (en) 2023-06-06 2026-04-15 Evonik Operations GmbH Hydrogel patch made from a collagen-like protein (clp)
CN121532514A (zh) 2023-07-07 2026-02-13 上海环码生物医药有限公司 用于季节性流感的环状rna疫苗及使用方法
WO2025019352A2 (en) * 2023-07-14 2025-01-23 Modernatx, Inc. Mers-cov mrna vaccines
WO2025040709A1 (en) 2023-08-24 2025-02-27 BioNTech SE Systems and compositions comprising highly active trans-amplifying replicases
EP4771042A1 (en) 2023-08-29 2026-07-08 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd Circular rna encoding vegf polypeptides, formulations, and methods of uses
WO2025049690A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Orna Therapeutics, Inc. Circular polyethylene glycol lipids
EP4520345A1 (en) 2023-09-06 2025-03-12 Myneo Nv Product
WO2025052180A2 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Axelyf ehf. Lipids and lipid nanoparticles
WO2025051381A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 BioNTech SE Methods and compositions for localized expression of administered rna
WO2025072482A1 (en) 2023-09-27 2025-04-03 Modernatx, Inc. Immunoglobulin a protease polypeptides, polynucleotides, and uses thereof
WO2025083211A1 (en) 2023-10-20 2025-04-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of factor h for the treatment of dementia
CN122497525A (zh) 2023-11-07 2026-07-31 欧纳医疗公司 环状rna组合物
WO2025132839A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
GB202404607D0 (en) 2024-03-29 2024-05-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNA formulation
WO2025215072A1 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Class i lanthipeptides with anti-viral function
WO2025229572A1 (en) 2024-05-01 2025-11-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Epstein-barr virus antigen-encoding messenger ribonucleic acid and antigen protein vaccines
WO2025248096A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antimicrobial peptides having liquid-liquid phase separation activities
WO2025255199A1 (en) 2024-06-05 2025-12-11 Modernatx, Inc. Argininosuccinate synthase 1 and argininosuccinate lyase polypeptides and polynucleotides and uses thereof
WO2026003582A2 (en) 2024-06-27 2026-01-02 Axelyf ehf. Lipids and lipid nanoparticles
WO2026064512A1 (en) 2024-09-18 2026-03-26 Generation Bio Co. Polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same
WO2026085495A1 (en) 2024-10-18 2026-04-23 Generation Bio Co. Synthetic partially single-stranded nucleic acid compositions and uses and methods therefor
WO2026093547A1 (en) 2024-10-31 2026-05-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and vaccine compositions for the treatment of cancer
WO2026139456A2 (en) 2024-12-23 2026-07-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Self-amplifying messenger rna molecules
WO2026152164A1 (en) 2025-01-13 2026-07-16 Sail Biomedicines, Inc. Cd5-targeted lipid nanoparticles encapsulating polyribonucleotides encoding chimeric antigen receptors, and methods to generate car-expressing t cells in vivo

Family Cites Families (258)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6090406A (en) 1984-04-12 2000-07-18 The Liposome Company, Inc. Potentiation of immune responses with liposomal adjuvants
US4853228A (en) * 1987-07-28 1989-08-01 Micro-Pak, Inc. Method of manufacturing unilamellar lipid vesicles
DK0737750T3 (da) 1989-03-21 2003-09-01 Vical Inc Ekspression af exogene polynucleotidsekvenser i vertebrater
US6867195B1 (en) 1989-03-21 2005-03-15 Vical Incorporated Lipid-mediated polynucleotide administration to reduce likelihood of subject's becoming infected
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
FR2676072B1 (fr) 1991-05-03 1994-11-18 Transgene Sa Vecteur de delivrance d'arn.
US5750390A (en) 1992-08-26 1998-05-12 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of diseases caused by expression of the bcl-2 gene
US5693535A (en) 1992-05-14 1997-12-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. HIV targeted ribozymes
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
JPH07509133A (ja) 1992-07-17 1995-10-12 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 動物疾患の処置のための方法および剤
US5474914A (en) 1992-07-29 1995-12-12 Chiron Corporation Method of producing secreted CMV glycoprotein H
US20020102273A1 (en) 1995-08-08 2002-08-01 Robert B. Grieve Use of alphavirus expression vectors to produce parasite anitgens
JPH09500013A (ja) 1993-06-01 1997-01-07 ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド カチオン性脂質による遺伝子免疫
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
AU2215995A (en) 1994-04-07 1995-10-30 Akzo Nobel N.V. Freeze-dried compositions comprising rna
US5993850A (en) * 1994-09-13 1999-11-30 Skyepharma Inc. Preparation of multivesicular liposomes for controlled release of encapsulated biologically active substances
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
WO1996017072A2 (en) 1994-11-30 1996-06-06 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
US5965434A (en) 1994-12-29 1999-10-12 Wolff; Jon A. Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for delivering biologically active compounds
US5792462A (en) 1995-05-23 1998-08-11 University Of North Carolina At Chapel Hill Alphavirus RNA replicon systems
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US6264957B1 (en) * 1995-09-27 2001-07-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Product of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
CA2244110A1 (en) 1996-02-12 1997-08-14 Cobra Therapeutics Limited Novel methods of vaccination and vaccines thereof comprising a nucleic acid encoding a first epitope and a peptide containing a second epitope
DE19605548A1 (de) 1996-02-15 1997-09-04 Boehringer Ingelheim Int Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
US6451592B1 (en) 1996-04-05 2002-09-17 Chiron Corporation Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis
WO1997038010A2 (en) 1996-04-11 1997-10-16 The University Of British Columbia Fusogenic liposomes
JP2001503735A (ja) 1996-07-03 2001-03-21 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ 親水性活性試薬のためのエマルジョン処方物
US7384923B2 (en) 1999-05-14 2008-06-10 Lipoxen Technologies Limited Liposomes
EP0938298B1 (en) 1996-09-13 2002-12-04 Lipoxen Technologies Limited Liposome-based composition
US6395302B1 (en) 1996-11-19 2002-05-28 Octoplus B.V. Method for the preparation of microspheres which contain colloidal systems
CA2289702C (en) 1997-05-14 2008-02-19 Inex Pharmaceuticals Corp. High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
US6048546A (en) 1997-07-31 2000-04-11 Sandia Corporation Immobilized lipid-bilayer materials
US6060308A (en) 1997-09-04 2000-05-09 Connaught Laboratories Limited RNA respiratory syncytial virus vaccines
NZ504725A (en) 1997-11-28 2003-02-28 Crown In The Right Of The Quee Flavivirus expression and delivery system
US6009406A (en) 1997-12-05 1999-12-28 Square D Company Methodology and computer-based tools for re-engineering a custom-engineered product line
GB9726555D0 (en) 1997-12-16 1998-02-11 Smithkline Beecham Plc Vaccine
US6432925B1 (en) 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
EP2311436A1 (en) 1998-04-27 2011-04-20 Altus Pharmaceuticals Inc. Stabilized protein crystals, formulations containing them and methods of making them
US6517842B1 (en) 1998-06-29 2003-02-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Marburg virus vaccines
ATE237312T1 (de) 1998-07-20 2003-05-15 Protiva Biotherapeutics Inc In liposomen verkapselte nukleinsäurekomplexe
AU2221600A (en) 1998-12-31 2000-07-31 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
ATE492644T1 (de) 1999-09-09 2011-01-15 Curevac Gmbh Transfer von mrna unter verwendung von polykationischen verbindungen
DE60038622D1 (de) 1999-10-20 2008-05-29 Univ Johns Hopkins Med Chimäre immunogene zusammensetzungen und dafür kodierende nukleinsäure
US8541008B2 (en) * 1999-11-19 2013-09-24 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Pharmaceutical compositions and methods to vaccinate against candidiasis
US20030212022A1 (en) 2001-03-23 2003-11-13 Jean-Marie Vogel Compositions and methods for gene therapy
WO2001079253A1 (en) 2000-04-18 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Extracellular matrix polynucleotides, polypeptides, and antibodies
CN1981873A (zh) * 2000-06-09 2007-06-20 莱古伦公司 制备微胶粒的方法和所述微胶粒的用途
ATE440861T1 (de) 2000-07-03 2009-09-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunisierung gegen chlamydia pneumoniae
WO2002009645A2 (en) 2000-08-01 2002-02-07 The Johns Hopkins University Intercellular transport protein linked to an antigen as a molecular vaccine
US20040142474A1 (en) 2000-09-14 2004-07-22 Expression Genetics, Inc. Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent
US20030138453A1 (en) 2000-09-28 2003-07-24 O'hagan Derek Microparticles for delivery of heterologous nucleic acids
US7939087B2 (en) 2000-10-27 2011-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Nucleic acids and proteins from Streptococcus groups A & B
WO2002079239A2 (en) 2001-01-31 2002-10-10 U.S. Army Medical Research Institute Of Infectious Diseases Chimeric filovirus glycoprotein
WO2002061113A2 (en) 2001-02-01 2002-08-08 The Johns Hopkins University Nucleic acid derived vaccine that encodes an antigen linked to a polypeptide that promotes antigen presentation
US20030040498A1 (en) 2001-03-14 2003-02-27 Ansardi David Calvert Oncolytic RNA replicons
WO2002074920A2 (en) 2001-03-16 2002-09-26 Johns Hopkins University A replication-defective alphavirus vaccine linking antigen with an immunogenicity-potentiating polypeptide and a method of delivery the same
JP2004535388A (ja) 2001-04-30 2004-11-25 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション 脂質含有薬物送達複合体およびそれらの生成方法
US20030077251A1 (en) 2001-05-23 2003-04-24 Nicolas Escriou Replicons derived from positive strand RNA virus genomes useful for the production of heterologous proteins
ATE291925T1 (de) 2001-06-05 2005-04-15 Curevac Gmbh Stabilisierte mrna mit erhöhtem g/c-gehalt und optimierter codon usage für die gentherapie
WO2003018054A1 (en) 2001-08-31 2003-03-06 Chiron Srl. Helicobacter pylori vaccination
WO2003023026A1 (en) * 2001-09-06 2003-03-20 Alphavax, Inc. Alphavirus replicon vector systems
AU2003211103A1 (en) 2002-02-13 2003-09-04 Northeastern University Intracellular delivery of therapeutic agents
DE10207177A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Fakultativ kationische Lipide
EP1519714B1 (en) 2002-06-28 2010-10-20 Protiva Biotherapeutics Inc. Method and apparatus for producing liposomes
JP4294584B2 (ja) 2002-07-05 2009-07-15 リポクセン・テクノロジーズ・リミテツド 核酸ワクチン接種の免疫応答を高めるための方法
ES2242462B1 (es) 2002-07-18 2007-01-01 Marti Industria Metalurgica, S.L Pulverizador giratorio seleccionable.
US20060251620A1 (en) * 2002-08-22 2006-11-09 Lidia Ivanova Inducible alphaviral/orip based gene expression system
EA008940B1 (ru) * 2002-09-13 2007-10-26 Репликор, Инк. Антивирусные олигонуклеотиды, не связанные с комплементарностью последовательностей
AU2003297039B2 (en) 2002-12-13 2009-03-05 Alphavax, Inc. Multi-antigenic alphavirus replicon particles and methods
WO2004058166A2 (en) 2002-12-23 2004-07-15 Vical Incorporated Codon-optimized polynucleotide-based vaccines against human cytomegalovirus infection
WO2004069148A2 (en) 2003-02-04 2004-08-19 Bar-Ilan University Snornai-small nucleolar rna degradation by rna interference in trypanosomatids
WO2004076645A2 (en) 2003-02-27 2004-09-10 University Of Massachusetts Compositions and methods for cytomegalovirus treatment
EP1608762B1 (en) 2003-03-20 2014-01-08 Alphavax, Inc. Improved alphavirus replicons and helper constructs
US7731967B2 (en) 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
US20070042979A1 (en) 2003-05-30 2007-02-22 Junichi Yano Oligonucleic acid-bearing composite and pharmaceutical composition containing the composite
WO2005002619A2 (en) 2003-06-26 2005-01-13 Chiron Corporation Immunogenic compositions for chlamydia trachomatis
PT1651666E (pt) 2003-07-11 2009-08-28 Alphavax Inc Vacinas de citomegalovírus à base de alfavírus
US7368537B2 (en) * 2003-07-15 2008-05-06 Id Biomedical Corporation Of Quebec Subunit vaccine against respiratory syncytial virus infection
AU2004257373B2 (en) 2003-07-16 2011-03-24 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
US7709009B2 (en) 2003-07-31 2010-05-04 Novartis Vaccines And Diagnostics, Srl Immunogenic compositions for streptococcus pyogenes
EP1512393A1 (de) * 2003-09-08 2005-03-09 BOEHRINGER INGELHEIM PHARMA GMBH &amp; CO. KG Verfahren zur Herstellung von homogenen Liposomen und Lipoplexen
CN1882693B (zh) 2003-09-15 2012-08-15 普洛体维生物治疗公司 聚乙二醇修饰的脂质化合物及其应用
WO2005046621A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Enhancement of vaccine-induced immune responses and protection by heterologous boosting with alphavirus replicon vaccines
US20120027841A1 (en) 2004-01-07 2012-02-02 Biomedical Research Models, Inc. Novel mucosal vaccination approach for herpes simplex virus type-2
US20050202075A1 (en) 2004-03-12 2005-09-15 Pardridge William M. Delivery of genes encoding short hairpin RNA using receptor-specific nanocontainers
US7303881B2 (en) 2004-04-30 2007-12-04 Pds Biotechnology Corporation Antigen delivery compositions and methods of use
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
PT1751289E (pt) 2004-05-18 2009-03-31 Alphavax Inc Vectores de alfavirais derivados da tc-83, partículas e métodos
JP5331340B2 (ja) 2004-05-18 2013-10-30 バイカル インコーポレイテッド インフルエンザウィルスワクチン組成物、及びその使用方法
US20090104226A1 (en) 2004-05-21 2009-04-23 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Alphavirus Vectors for Respiratory Pathogen Vaccines
GB0411428D0 (en) 2004-05-21 2004-06-23 Got A Gene Ab Vectors
WO2005121369A2 (en) * 2004-06-02 2005-12-22 Sourcepharm, Inc. Rna-containing microvesicles and methods therefor
US7745651B2 (en) 2004-06-07 2010-06-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
AU2005327198B2 (en) 2004-07-09 2011-03-31 University Of North Carolina At Chapel Hill Viral adjuvants
WO2006007712A1 (en) * 2004-07-19 2006-01-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents
WO2006038129A2 (en) 2004-10-01 2006-04-13 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Hepatitis c virus replication system
EP1811960A2 (en) 2004-11-19 2007-08-01 Novosom AG Improvements in or relating to pharmaceutical compositions for local administration
GB2421025A (en) 2004-12-09 2006-06-14 Oxxon Therapeutics Ltd HSV vaccination vectors
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
CA2597724A1 (en) 2005-02-14 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them
AU2006214064B2 (en) 2005-02-18 2012-04-26 J. Craig Venter Institute, Inc. Proteins and nucleic acids from meningitis/sepsis-associated escherichia coli
JP2008530245A (ja) 2005-02-18 2008-08-07 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 尿路病原性菌株由来の抗原
DE602006008278D1 (de) 2005-03-02 2009-09-17 Pharmazeutische zusammensetzung
GB0504436D0 (en) 2005-03-03 2005-04-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
AU2006235045A1 (en) 2005-03-30 2006-10-19 J. Craig Venter Institute, Inc. Haemophilus influenzae type b
US7618393B2 (en) 2005-05-03 2009-11-17 Pharmajet, Inc. Needle-less injector and method of fluid delivery
AU2006259858A1 (en) 2005-05-12 2006-12-28 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Immunogenic compositions for Chlamydia trachomatis
US8703095B2 (en) 2005-07-07 2014-04-22 Sanofi Pasteur S.A. Immuno-adjuvant emulsion
EP1909758A1 (en) * 2005-08-02 2008-04-16 I.D.M. Immuno-Designed Molecules Process for the preparation of liposomal formulations
US7951384B2 (en) 2005-08-05 2011-05-31 University Of Massachusetts Virus-like particles as vaccines for paramyxovirus
PL2578685T3 (pl) 2005-08-23 2020-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna zawierający zmodyfikowane nukleozydy i sposoby jego zastosowania
WO2007107304A2 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Novosom Ag An efficient method for loading amphoteric liposomes with nucleic acid active substances
EP1764089A1 (en) 2005-09-15 2007-03-21 Novosom AG Serum stable liposomes comprising amphoter II lipid mixtures
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
ATE493405T1 (de) 2005-09-29 2011-01-15 Elan Pharm Inc Pyrimidinylamidverbindungen, die die durch vla-4 vermittelte leukozytenadhäsion inhibieren
EP1945247A1 (en) 2005-10-18 2008-07-23 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles
JP2007112768A (ja) 2005-10-24 2007-05-10 Kyoto Univ 肝指向性リポソーム組成物
EP1954306A2 (en) 2005-10-25 2008-08-13 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Compositions comprising yersinia pestis antigens
WO2007081447A2 (en) 2005-11-22 2007-07-19 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Norovirus and sapovirus antigens
US9393215B2 (en) 2005-12-02 2016-07-19 Novartis Ag Nanoparticles for use in immunogenic compositions
EP2010659B1 (en) 2006-04-14 2014-06-18 CellScript, Inc. Kits and methods for generating 5' capped RNA
US7704510B2 (en) 2006-06-07 2010-04-27 The Trustees Of Princeton University Cytomegalovirus surface protein complex for use in vaccines and as a drug target
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
PT2035581E (pt) 2006-06-21 2012-12-06 Scripps Research Inst Composição de adn contra o antigénio do estroma tumoral fap e métodos de utilização desta
EP2049665A2 (en) 2006-07-28 2009-04-22 Applera Corporation Dinucleotide mrna cap analogs
EP2586790A3 (en) 2006-08-16 2013-08-14 Novartis AG Immunogens from uropathogenic Escherichia coli
US20090022760A1 (en) 2006-09-12 2009-01-22 Alphavax Alphavirus Replicon Particles Matched to Protein Antigens as Immunological Adjuvants
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
US20080171078A1 (en) 2007-01-12 2008-07-17 Mark Gray Uniformly sized liposomes
WO2008103276A2 (en) * 2007-02-16 2008-08-28 Merck & Co., Inc. Compositions and methods for potentiated activity of biologicaly active molecules
US20100196492A1 (en) 2007-03-08 2010-08-05 Green Jordan J Electrostatic coating of particles for drug delivery
US8877206B2 (en) 2007-03-22 2014-11-04 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by cationic lipids
JP5350360B2 (ja) * 2007-03-29 2013-11-27 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド エボラ由来の遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法
US8748591B2 (en) 2007-04-17 2014-06-10 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Chimeric sindbis-western equine encephalitis virus and uses thereof
EP3434259A1 (en) 2007-05-04 2019-01-30 Marina Biotech, Inc. Amino acid lipids and uses thereof
EP2152890A1 (en) 2007-05-23 2010-02-17 MannKind Corporation Multicistronic vectors and methods for their design
DE102007029471A1 (de) 2007-06-20 2008-12-24 Novosom Ag Neue fakultativ kationische Sterole
DK2947149T3 (en) 2007-06-21 2018-06-06 Alphavax Inc ALPHAVIRUS REPLICATION PARTICLES FOR USE IN VACCINATION
US8202518B2 (en) 2007-07-04 2012-06-19 Ribovax Biotechnologies S.A. Antibodies against human cytomegalovirus (HCMV)
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
WO2009026328A2 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Immune Disease Institute, Inc. Methods of delivery of agents to leukocytes and endothelial cells
GB0717187D0 (en) 2007-09-04 2007-10-17 Novartis Ag Compositions comprising yersinia pestis antigens
WO2009042794A2 (en) 2007-09-26 2009-04-02 Vanderbilt University Venezuelan equine encephalitis replicons expressing paramyxovirus glycoproteins as vaccine
EP2042193A1 (en) 2007-09-28 2009-04-01 Biomay AG RNA Vaccines
US8470560B2 (en) * 2007-10-03 2013-06-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army CR-2 binding peptide P28 as molecular adjuvant for DNA vaccines
WO2009079185A2 (en) 2007-11-26 2009-06-25 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Methods of generating alphavirus particles
EP2067749A1 (en) 2007-11-29 2009-06-10 Total Petrochemicals France Process for purification of an aqueous phase containing polyaromatics
WO2009074861A2 (en) 2007-12-10 2009-06-18 Powderject Research Limited Improved vaccine
WO2009111088A2 (en) * 2008-01-02 2009-09-11 The Johns Hopkins University Antitumor immunization by liposomal delivery of vaccine to the spleen
EP3100718B1 (en) 2008-01-02 2019-11-27 Arbutus Biopharma Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
ITMI20081249A1 (it) 2008-07-09 2010-01-09 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunogeni di escherichia coli con solubilità migliorata.
WO2009109860A2 (en) 2008-03-06 2009-09-11 Novartis Ag Mutant forms of chlamydia htra
EP2279254B1 (en) 2008-04-15 2017-07-05 Protiva Biotherapeutics Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
WO2009132131A1 (en) 2008-04-22 2009-10-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Amino lipid based improved lipid formulation
WO2009132206A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Liquidia Technologies, Inc. Compositions and methods for intracellular delivery and release of cargo
US20100040650A1 (en) 2008-05-30 2010-02-18 Crowe Jr James E Virus-Like paramyxovirus particles and vaccines
EP2130912A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-09 Institut für Viruskrankeiten und Immunprophylaxe Pestivirus replicons providing an RNA-based viral vector system
EP2310045A1 (en) 2008-06-25 2011-04-20 Novartis AG Rapid responses to delayed booster immunisations
US20110229969A1 (en) 2008-06-25 2011-09-22 Volker Sandig Cell Line for Propagation of Highly Attenuated AlphaViruses
PE20141398A1 (es) 2008-07-16 2014-10-18 Inst Research In Biomedicine Anticuerpos neutralizantes de citomegalovirus humano
AU2008359583B2 (en) 2008-07-16 2012-04-05 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof
JP2010025644A (ja) 2008-07-16 2010-02-04 Kochi Univ Of Technology 硝酸イオンの呈色試薬並びにこれを用いた硝酸イオンの検出及び定量方法
WO2010017330A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Novartis Ag Microparticles for use in immunogenic compositions
CL2008002322A1 (es) 2008-08-07 2009-06-05 Univ Concepcion Formulacion farmaceutica veterinaria que comprende un sistema vectorial viral constituido por una particula recombinante de arn que codifica una cu/zn superoxido dismutasa de la bacteria patogena de bovinos brucella abortus, y al menos un alfavirus arn perteneciente a la familia del virus semliki forest (sfv), util como vacuna.
ES2915692T3 (es) 2008-08-13 2022-06-24 California Inst Of Techn Nanopartículas portadoras y composiciones, métodos y sistemas relacionados
US20110177122A1 (en) 2008-09-26 2011-07-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health & Human Services Dna prime/activated vaccine boost immunization to influenza virus
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
AU2009303345B2 (en) 2008-10-09 2015-08-20 Arbutus Biopharma Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
WO2010053572A2 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
EP3699172A3 (en) 2008-11-10 2020-11-18 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
AU2009316680B2 (en) 2008-11-18 2016-03-24 Takeda Vaccines, Inc. RSV F VLPs and methods of manufacture and use thereof
EP2391343B1 (en) * 2009-01-29 2017-03-01 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation for the delivery of nucleic acids
EP2419129A2 (en) 2009-04-14 2012-02-22 Novartis AG Compositions for immunising against staphylococcus aerus
CA2760706C (en) 2009-05-05 2019-08-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods of delivering oligonucleotides to immune cells
KR20220038506A (ko) 2009-06-10 2022-03-28 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
ES2613498T3 (es) 2009-07-01 2017-05-24 Protiva Biotherapeutics Inc. Nuevas formulaciones de lípidos para el suministro de agentes terapéuticos a tumores sólidos
US20120100207A1 (en) 2009-07-02 2012-04-26 Konica Minolta Holdings, Inc. Process for producing liposomes by two-step emulsification method utilizing outer aqueous phase containing specific dispersing agent, process for producing liposome dispersion or dry powder thereof using the process for producing liposomes, and liposome dispersion or dry powder thereof produced thereby
EP2451475A2 (en) * 2009-07-06 2012-05-16 Novartis AG Self replicating rna molecules and uses thereof
EP4183412B1 (en) 2009-07-15 2024-08-14 GlaxoSmithKline Biologicals SA Rsv f protein compositions and methods for making same
DK2453914T3 (en) 2009-07-16 2018-10-08 Vaxil Biotherapeutics Ltd ANTIGEN-SPECIFIC MULTIPLE PIT-BASED ANTI-INFECTIOUS VACCINES
EA022786B1 (ru) 2009-07-31 2016-03-31 Этрис Гмбх Рнк с комбинацией из немодифицированных и модифицированных нуклеотидов для экспрессии белков
US9950062B2 (en) 2009-09-02 2018-04-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compounds and compositions as TLR activity modulators
JO3257B1 (ar) 2009-09-02 2018-09-16 Novartis Ag مركبات وتركيبات كمعدلات لفاعلية tlr
US20110070260A1 (en) 2009-09-09 2011-03-24 Baric Ralph S Multivalent Immunogenic Compositions Against Noroviruses and Methods of Use
RU2573409C2 (ru) 2009-11-04 2016-01-20 Дзе Юниверсити Оф Бритиш Коламбиа Содержащие нуклеиновые кислоты липидные частицы и относящиеся к ним способы
US20110112353A1 (en) 2009-11-09 2011-05-12 Circulite, Inc. Bifurcated outflow cannulae
SI2506857T1 (en) 2009-12-01 2018-08-31 Translate Bio, Inc. Delivery of mRNA for the enrichment of proteins and enzymes in human genetic diseases
CA3044884A1 (en) 2009-12-07 2011-06-16 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
ES2769129T3 (es) 2009-12-07 2020-06-24 Univ Pennsylvania Preparaciones de ARN que comprenden ARN modificado purificado para reprogramar células
US20130017223A1 (en) 2009-12-18 2013-01-17 The University Of British Columbia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
WO2011076807A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
EP2525815B1 (en) 2010-01-24 2015-02-25 Novartis AG Irradiated biodegradable polymer microparticles
US9744228B2 (en) 2010-04-07 2017-08-29 Norvartis Ag Method for generating a parvovirus B19 virus-like particle
FI4005592T3 (fi) 2010-07-06 2023-01-13 Virionin kaltaisia kuljetuspartikkeleita itsereplikoituville rna-molekyyleille
CA2804591C (en) 2010-07-06 2019-01-22 Novartis Ag Cationic oil-in-water emulsions
US10487332B2 (en) 2010-07-06 2019-11-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunisation of large mammals with low doses of RNA
CA2804501C (en) 2010-07-06 2021-01-26 Novartis Ag Noro virus derived immunogenic compositions and methods
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
CN103153284B (zh) 2010-07-06 2015-11-25 诺华股份有限公司 含有其pKa值有利于RNA递送的脂质的脂质体
PT3243526T (pt) 2010-07-06 2020-03-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Distribuição de arn para despoletar múltiplas vias imunitárias
US8898852B2 (en) 2010-08-04 2014-12-02 Honeywell International Inc. Air burst to clear detection window
CA2807552A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3542789A3 (en) 2010-08-31 2020-01-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Lipids suitable for liposomal delivery of protein-coding rna
RS63890B1 (sr) 2010-08-31 2023-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
JP5911870B2 (ja) 2010-08-31 2016-04-27 ノバルティス アーゲー 免疫原をコードするｒｎａの送達のためのｐｅｇ化リポソーム
EP2614072A4 (en) 2010-09-09 2014-03-19 Univ Virginia Commonwealth VACCINE AGAINST THE HUMAN CYTOMEGALOVIRUS
EP2857499A1 (en) 2010-10-01 2015-04-08 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
KR102266691B1 (ko) 2010-10-11 2021-06-23 노파르티스 아게 항원 전달 플랫폼
PH12013500764A1 (en) 2010-10-25 2015-09-23 Stepan Co Quaternized fatty amines, amidoamines, and their derivatives from natural oil metathesis
ES3018416T3 (es) 2011-01-26 2025-05-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Régimen de inmunización del VRS
CA2826199A1 (en) 2011-01-31 2012-08-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecules encoding novel herpes antigens, vaccine comprising the same, and methods of use thereof
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
RS56748B1 (sr) 2011-05-13 2018-03-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pre-fuzioni rsv f antigeni
CN103687957A (zh) 2011-05-17 2014-03-26 现代治疗公司 工程化核酸及其用于非人类脊椎动物的方法
EP4074693A1 (en) 2011-06-08 2022-10-19 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
US11058762B2 (en) 2011-07-06 2021-07-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions and uses thereof
RU2014104090A (ru) 2011-07-06 2015-08-20 Новартис Аг Липосомы с эффективным соотношением n:p для доставки молекул phk
JP2014522842A (ja) 2011-07-06 2014-09-08 ノバルティス アーゲー 免疫原性組み合わせ組成物およびその使用
US9655845B2 (en) 2011-07-06 2017-05-23 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids
US9636410B2 (en) 2011-07-06 2017-05-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Cationic oil-in-water emulsions
PT2750707T (pt) 2011-08-31 2019-01-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lipossomas peguilados para distribuição de arn que codifica imunogénio
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
PT3682905T (pt) 2011-10-03 2022-04-07 Modernatx Inc Nucleósidos, nucleótidos e ácidos nucleicos modificados e respetivas utilizações
BR112014008694A2 (pt) 2011-10-11 2017-06-20 Novartis Ag moléculas de ácido nucleico policistrônico recombinante
US20140348863A1 (en) 2011-10-12 2014-11-27 Alessia Bianchi Cmv antigens and uses thereof
WO2013130161A1 (en) 2011-12-14 2013-09-06 modeRNA Therapeutics Methods of responding to a biothreat
ES2923757T3 (es) 2011-12-16 2022-09-30 Modernatx Inc Composiciones de ARNm modificado
AU2012358384A1 (en) 2011-12-21 2014-07-31 Moderna Therapeutics, Inc. Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant
WO2013151664A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins
CN104411338A (zh) 2012-04-02 2015-03-11 现代治疗公司 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸
PT2922554T (pt) 2012-11-26 2022-06-28 Modernatx Inc Arn modificado nas porções terminais
AU2014204826A1 (en) 2013-01-10 2015-07-09 Seqirus UK Limited Influenza virus immunogenic compositions and uses thereof
US9504747B2 (en) 2013-03-08 2016-11-29 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
WO2014160243A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and purity assessment of rna molecules synthesized with modified nucleosides
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US10059655B2 (en) 2013-12-19 2018-08-28 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
US9686692B2 (en) 2014-03-20 2017-06-20 Microsoft Technology Licesning, LLC Wi-Fi tile transfer
US10842859B2 (en) * 2014-03-25 2020-11-24 Yale University Uses of parasite macrophage migration inhibitory factors
CA2953341C (en) 2014-06-25 2023-01-24 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
HUE067372T2 (hu) 2015-06-29 2024-10-28 Acuitas Therapeutics Inc Lipidek és nanoszemcsés lipid formulázások nukleinsavak beadására
HRP20220156T1 (hr) 2015-09-17 2022-04-15 Modernatx, Inc. Spojevi i pripravci za unutarstaničnu isporuku terapeutskih sredstava
CN108368028B (zh) 2015-10-28 2021-09-03 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的新型脂质和脂质纳米颗粒制剂
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
CN116549671A (zh) 2016-11-10 2023-08-08 川斯勒佰尔公司 用于递送mrna的改进的基于ice的脂质纳米颗粒制剂
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
AU2019384557B2 (en) 2018-11-21 2025-07-17 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of nebulized mRNA encoding CFTR
WO2021038508A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Jet mixing lipid nanoparticle manufacturing process
MX2023007574A (es) 2020-12-22 2023-09-29 CureVac SE "vacuna de arn contra variantes de sars-cov-2.
WO2022150717A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 Modernatx, Inc. Seasonal rna influenza virus vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
BR112013004866A2 (pt) 2016-06-07
SI4226941T1 (sl) 2025-04-30
LT4066855T (lt) 2023-03-10
HRP20241772T1 (hr) 2025-02-28
EP4226940A1 (en) 2023-08-16
EP3970742B1 (en) 2022-05-25
EP4066855B1 (en) 2022-12-28
WO2012031043A1 (en) 2012-03-08
PL4066857T3 (pl) 2023-03-20
JP5911870B2 (ja) 2016-04-27
PL3970742T3 (pl) 2022-09-19
SI4066855T1 (sl) 2023-04-28
LT3981427T (lt) 2022-08-10
CY1125575T1 (el) 2025-05-09
HUE060524T2 (hu) 2023-03-28
SI3970742T1 (sl) 2022-08-31
DK4066856T3 (da) 2022-12-19
SMT202200311T1 (it) 2022-09-14
PT4066857T (pt) 2023-01-31
HRP20230185T8 (hr) 2023-07-21
HUE061043T2 (hu) 2023-05-28
US20130202684A1 (en) 2013-08-08
SMT202200497T1 (it) 2023-01-13
EP3981427A1 (en) 2022-04-13
CY1125492T1 (el) 2025-05-09
RS63816B1 (sr) 2023-01-31
MX2013002336A (es) 2013-03-18
ES2918192T3 (es) 2022-07-14
SMT202300066T1 (it) 2023-03-17
ES2918649T3 (es) 2022-07-19
EP4101462A1 (en) 2022-12-14
EP4066856B1 (en) 2022-12-07
JP2013536803A (ja) 2013-09-26
PT4066855T (pt) 2023-02-28
DK3970742T3 (da) 2022-07-04
PL4066856T3 (pl) 2023-02-27
PL2611461T3 (pl) 2022-07-04
FI4226941T3 (fi) 2025-01-10
US20240216276A1 (en) 2024-07-04
PT3981427T (pt) 2022-06-27
ES2995282T3 (en) 2025-02-10
CA2809851A1 (en) 2012-03-08
SI4066856T1 (sl) 2023-03-31
SMT202300075T1 (it) 2023-05-12
LT4226941T (lt) 2025-01-10
HUE058666T2 (hu) 2022-09-28
EP2611461A1 (en) 2013-07-10
EP3981427B9 (en) 2022-07-27
PT2611461T (pt) 2022-05-26
EP4066857A1 (en) 2022-10-05
LT4066857T (lt) 2023-02-27
LT2611461T (lt) 2022-08-10
ES2938327T3 (es) 2023-04-10
RU2013114362A (ru) 2014-10-10
EP3970742A1 (en) 2022-03-23
DK2611461T3 (da) 2022-05-16
RS63367B1 (sr) 2022-07-29
HRP20220835T8 (hr) 2023-01-06
AU2011295935B2 (en) 2016-02-11
EP4226941B1 (en) 2024-10-23
RS63983B1 (sr) 2023-03-31
HUE061068T2 (hu) 2023-05-28
HRP20221533T1 (hr) 2023-02-17
DK3981427T3 (da) 2022-07-11
DK4226941T3 (da) 2024-12-02
PT3970742T (pt) 2022-06-27
SMT202200290T1 (it) 2022-09-14
PT4066856T (pt) 2023-01-02
RS63315B1 (sr) 2022-07-29
HRP20230185T1 (hr) 2023-03-31
SI2611461T1 (sl) 2022-08-31
SMT202200223T1 (it) 2022-07-21
EP4066857B1 (en) 2022-12-21
HUE058667T2 (hu) 2022-09-28
AU2011295935A1 (en) 2013-04-04
HRP20220695T1 (hr) 2022-07-08
EP4066856A1 (en) 2022-10-05
EP4147718A1 (en) 2023-03-15
ES2938866T3 (es) 2023-04-17
SI3981427T1 (sl) 2022-08-31
PL3981427T3 (pl) 2022-09-19
EP4119155A1 (en) 2023-01-18
EP3981427B1 (en) 2022-05-25
SI4066857T1 (sl) 2023-04-28
US11759422B2 (en) 2023-09-19
PT4226941T (pt) 2024-11-18
HRP20230226T1 (hr) 2023-04-14
HUE058361T2 (hu) 2022-07-28
EP4066855A1 (en) 2022-10-05
DK4066855T3 (da) 2023-02-20
EP4226941A1 (en) 2023-08-16
RS63949B1 (sr) 2023-02-28
CY1125209T1 (el) 2025-03-28
PL4066855T3 (pl) 2023-05-08
HUE069090T2 (hu) 2025-02-28
PL4226941T3 (pl) 2025-03-31
HRP20220835T1 (hr) 2022-10-14
LT3970742T (lt) 2022-08-10
FI4066855T3 (fi) 2023-03-23
ES2935009T3 (es) 2023-03-01
CN103179984A (zh) 2013-06-26
EP2611461B1 (en) 2022-03-09
LT4066856T (lt) 2023-01-25
US20200230058A1 (en) 2020-07-23
ES2913791T3 (es) 2022-06-06
HRP20221023T1 (hr) 2022-11-11
FI4066857T3 (fi) 2023-03-20
DK4066857T3 (da) 2023-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240216276A1 (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
EP2611420B1 (en) Lipids suitable for liposomal delivery of protein-coding rna
RS63817B1 (sr) Čestice za isporuku slične virionu za molekule samoreplicirajuće rnk
HK40078743A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40084980A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40081868A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40093846A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40093846B (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40093845A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40079351A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40062525A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40062524A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40062525B (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna