RS63315B1 - Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen - Google Patents

Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen

Info

Publication number
RS63315B1
RS63315B1 RS20220501A RSP20220501A RS63315B1 RS 63315 B1 RS63315 B1 RS 63315B1 RS 20220501 A RS20220501 A RS 20220501A RS P20220501 A RSP20220501 A RS P20220501A RS 63315 B1 RS63315 B1 RS 63315B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rna
liposome
liposomes
peg
lipid
Prior art date
Application number
RS20220501A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew Geall
Ayush Verma
Original Assignee
Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44653554&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63315(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Glaxosmithkline Biologicals Sa filed Critical Glaxosmithkline Biologicals Sa
Publication of RS63315B1 publication Critical patent/RS63315B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36171—Demonstrated in vivo effect
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
[0001] Ova prijava se poziva na prioritet SAD privremene prijave broj 61/378,826, koja je podneta 31. avgusta 2010.
TEHNIČKA OBLAST
[0002] Ovaj pronalazak je u oblasti nevirusne isporuke RNK za imunizaciju.
TEHNIČKA OSNOVA
[0003] Isporuka nukleinskih kiselina za imunizaciju životinja je več neko vreme cilj. Testirani su različiti pristupi, uključujući upotrebu DNK ili RNK, virusnih ili nevirusnih nosača za isporuku (ili čak bez nosača za isporuku, u „goloj“ vakcini), vektora koji se repliciraju ili se ne repliciraju, ili virusnih ili ne-virusnih vektora.
[0004] Ostaje potreba za daljim i poboljšanim vakcinama sa nukleinskom kiselinom i, posebno, za poboljšanim načinima isporuke vakcina nukleinske kiseline.
[0005] WO 2009/086558 opisuje kompozicije i postupke za isporuku terapeutskih agenasa u ćelije. Kompozicije su novi lipidi i čestice nukleinske kiseline-lipida koje inkapsuliraju nukleinsku kiselinu i obezbeđuju isporuku inkapsulirane nukleinske kiseline ćelijama in vivo.
[0006] WO 2008/103276 opisuje kompozicije koje uključuju molekul nosača u kombinaciji sa nosačem i biološki aktivnim molekulom od interesa za potenciranje aktivnosti biološki aktivnog molekula. Naveden je veliki broj sredstava za isporuku, uključujući katjonske lipide.
[0007] Mockey M et al, Cancer Gene Therapy, vol.14, No.9, september 2007, pp. 802-814, "iRNK-based cancer vaccine: prevention of B16 melanoma progression and metastasis by systemic injection of MART1 iRNK histidylated lipopolyplexes" opisuje upotrebu PEGilovanih lipozoma kao sredstava za isporuku iRNK.
OPIS PRONALASKA
[0008] Prema pronalasku, imunizacija nukleinskom kiselinom se postiže davanjem RNK inkapsulirane unutar lipozoma. RNK kodira imunogen od interesa. Lipozom uključuje PEGilovani lipid tj. lipid je modifikovan kovalentnim vezivanjem polietilen glikola. PEG obezbeđuje lipozomima omotač koji može dati povoljne farmakokinetičke karakteristike na primer može povećati stabilnost i sprečiti nespecifičnu adsorpciju lipozoma. Pronalazači su otkrili da dužina PEG može uticati na in vivo ekspresiju inkapsulirane RNK i stoga pronalazak koristi lipozome koji sadrže PEG koji ima prosečnu molekulsku masu između 1 kDa i 3 kDa. PEG sa manjom molekulskom težinom (npr.500 ili 750 Da) ne formira stabilne lipozome.
[0009] Stoga pronalazak obezbeđuje lipozom u kome je inkapsulirana RNK koja kodira imunogen od interesa, pri čemu lipozom sadrži najmanje jedan lipid koji uključuje polietilen glikol deo, tako da je polietilen glikol prisutan na spoljašnjosti lipozoma, pri čemu je prosečna molekulska masa polietilen glikol između 1 kDa i 3 kDa; i gde (a) lipid koji uključuje polietilen glikol deo nije PEG-DMG 2000; i/ili (b) RNK koja kodira imunogen od interesa ne uključuje modifikovane nukleobaze osim 5' kape koja sadrži 7'metilguanozin, i/ili metilaciju na 2' poziciji riboze prvih 1, 2 ili 35' ribonukleotida. Ovi lipozomi su pogodni za in vivo isporuku RNK u ćeliju kičmenjaka i na taj način su korisni kao komponente u farmaceutskim kompozicijama za imunizaciju subjekata protiv različitih bolesti.
[0010] Ovde je takođe opisan postupak za pripremu lipozoma koji sadrži RNK, koji obuhvata korak mešanja RNK sa jednim ili više lipida, pod uslovima takvim da lipidi formiraju lipozom u kome je RNK inkapsulirana, pri čemu najmanje jedan lipid uključuje polietilen glikolni deo koji se nalazi na spoljašnjosti lipozoma tokom procesa, i gde je prosečna molekulska masa polietilen glikola između 1 kDa i 3 kDa.
Lipozom
[0011] Pronalazak koristi lipozome unutar kojih je inkapsulirana RNK koja kodira imunogen. Tako je RNK (kao u prirodnom virusu) odvojena od bilo kog spoljašnjeg medijuma. Utvrđeno je da inkapsulacija unutar lipozoma štiti RNK od digestije sa RNKazom. Lipozomi mogu uključivati neku spoljašnju RNK (npr. na njihovoj površini), ali najmanje polovina RNK (i idealno cela) je inkapsulirana u jezgru lipozoma. Inkapsulacija unutar lipozoma se razlikuje od, na primer, kompleksa lipid/RNK opisanih u referenci 1, gde je RNK pomešana sa prethodno formiranim lipozomima.
[0012] Različiti amfifilni lipidi mogu formirati dvoslojne slojeve u vodenom okruženju da inkapsuliraju vodeno jezgro koje sadrži RNK kao lipozom. Ovi lipidi mogu imati anjonsku, katjonsku ili cviterjonsku hidrofilnu glavnu grupu. Formiranje lipozoma iz anjonskih fosfolipida datira još iz 1960-ih, a katjonski lipozomi koje formiraju lipidi proučavaju se od 1990-ih. Neki fosfolipidi su anjonski, dok su drugi cviterjonski, a drugi su katjoni. Pogodne klase fosfolipida uključuju, ali nisu ograničene na, fosfatidiletanolamine, fosfatidilholine, fosfatidilserine i fosfatidil-glicerole, a neki korisni fosfolipidi su navedeni u Tabeli 1. Korisni kationski lipidi, uključujum, ali nisu ograničeni na dioleoil trimetilamonijum propan (DOTAP), 1,2-disteariloksi-N,N-dimetill-3-aminopropan (DSDMA), 1,2-dioleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DODMA), 1,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DLenDMA). Cviterjonski lipidi uključuju, ali nisu ograničeni na, acil cviterjonske lipide i etarske cviterjonske lipide. Primeri korisnih cviterjonskih lipida su DPPC, DOPC, DSPC, dodecilfosfoholin, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamin (DOPE) i 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetan (DPF). Lipidi mogu biti zasićeni ili nezasićeni. Poželjna je upotreba najmanje jednog nezasićenog lipida za pripremu lipozoma. Ako nezasićeni lipid ima dva repa, oba repa mogu biti nezasićena, ili mogu imati jedan zasićeni rep i jedan nezasićeni rep. Lipid može uključiti grupu steroida u jednom repu na primer kao u RV05.
[0013] Tako, u jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje lipozom koji ima lipidni dvosloj koji inkapsulira vodeno jezgro, pri čemu: (i) lipidni dvosloj sadrži najmanje jedan lipid koji uključuje polietilen glikol deo, tako da je polietilen glikol prisutan na spoljašnjosti lipozoma, pri čemu prosečna molekulska masa polietilen glikola je između 1 kDa i 3 kDa; i (ii) vodeno jezgro uključuje RNK koja kodira imunogen; i gde (a) lipid koji uključuje polietilen glikol deo nije PEG-DMG 2000; i/ili (b) RNK koja kodira imunogen ne uključuje modifikovane nukleobaze osim 5' kapice koja sadrži 7'metilguanozin, i/ili metilaciju na 2' poziciji riboze prvog 1, 2 ili 35' ribonukleotidi.
[0014] Lipozomi pronalaska se mogu formirati od jednog lipida ili od mešavine lipida. Smeša može da sadrži (i) mešavinu anjonskih lipida (ii) mešavinu katjonskih lipida (iii) mešavinu cviterjonskih lipida (iv) mešavinu anjonskih lipida i katjonskih lipida (v) mešavinu anjonskih lipida i cviterjonskih lipida (vi) mešavina cviterjonskih lipida i katjonskih lipida ili (vii) mešavina anjonskih lipida, katjonskih lipida i cviterjonskih lipida. Slično, smeša može da sadrži i zasićene i nezasićene lipide. Na primer, smeša može da sadrži DSPC (cviterjonski, zasićeni), DlinDMA (katjonski, nezasićeni) i/ili DMG (anjonski, zasićeni). Kada se koristi mešavina lipida, ne moraju svi komponentni lipidi u smeši biti amfifilni na primer jedan ili više amfifilnih lipida se mogu pomešati sa holesterolom.
[0015] Kada se lipozom pronalaska formira iz mešavine lipida, poželjno je da udeo onih lipida koji su PEGilovani kako je ovde opisano bude manji od 10% ukupne količine lipida na primer između 0,5-5%, između 1-4%, ili oko 2%. Na primer, korisni lipozomi su prikazani ispod u kojima je 2% ukupnog lipida PEG-DMG. Ostatak se može napraviti od npr. holesterola (npr. 35-50% holesterola) i/ili katjonskog lipida (npr.30-70%) i/ili DSPC (npr.5-15%). Takve smeše se koriste u nastavku. Ove procentualne vrednosti su molski procenti.
[0016] Tako se lipozom može formirati od katjonskog lipida (npr. DlinDMA, RV05), cviterionskog lipida (npr. DSPC, DPiPE), holesterola i PEGilovanog lipida. U primerima je korišćena mešavina DSPC, DlinDMA, PEG-DMG i holesterola, kao i nekoliko dodatnih smeša.
[0017] Najmanje jedan lipid unutar lipozoma uključuje polietilen glikol deo. Lipozomi koji uključuju ove PEGilovane lipide će imati PEG orijentisan tako da je prisutan barem na spoljašnjoj strani lipozoma (ali neki PEG takođe mogu biti izloženi unutrašnjosti lipozoma tj. do vodenog jezgra). Ova orijentacija se može postići pričvršćivanjem PEG-a na odgovarajući deo lipida. Na primer, u amfifilnom lipidu PEG bi bio vezan za hidrofilnu glavu, pošto je to glava koja se orijentiše prema vodenoj spoljašnjosti lipidnog dvosloja. PEGilacija na ovaj način se može postići kovalentnim vezivanjem PEG-a za lipid npr. koristeći tehnike kao što su one otkrivene u referencama 2 i 3.
[0018] Tako će PEGilovani lipidi sadržavati PEG strukturu:
gde n obezbeđuje molekulsku težinu za PEG između 1 kDa i 3 kDa npr. između 23 i 68, ili oko 45 za 2kDa PEGilaciju (npr. vidi Sl.16).
[0019] PEG deo može da se završi sa -O-metil grupom, i tako PEGilovani lipid može da sadrži:
[0020] Uključujući vezivanje za azot u grupi glave lipida, prema tome, PEGilovani lipid koristan prema pronalasku može sadržati:
[0021] Jedan pogodan PEGilovani lipid za upotrebu u pronalasku je PEG-DMG, kako se koristi u primerima. Sl. 17A do 17E pokazuju dalje korisne PEGilovane lipide. PEGilovani holesterol se takođe može koristiti. Mogu se koristiti i drugi PEGilovani lipidi npr. lipidi formule (X):
gde:
Z je hidrofilna komponenta glavne grupe izabrana od PEG-a i polimera na bazi poli(oksazolina), poli(etilen oksida), poli(vinil alkohola), poli(glicerola), poli(N-vinilpirolidona), poli[N-(2-) hidroksipropil)metakrilamida] i poli(aminokiselina) pri čemu polimer može biti linearan ili razgranat, i gde polimer može biti izborno supstituisan;
Z je polimerizovan sa n podjedinicama;
n je prosečni stepen polimerizacije između 10 i 200 jedinica Z (i može se optimizovati za različite Z grupe);
L1je izborno supstituisani C1-10alkilen ili C1-10heteroalkilenski linker uključujući nula, jedan ili dva etra (npr. -O-), estra (npr. -C(O)O-), sukcinata (npr. -O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-)), karbamat (npr. -OC(O)-NR'-), karbonat (npr. -OC(O)O-), urea (npr. -NRC(O)NR'- ), amin (npr. -NR'-), amid (npr. -C(O)NR'-), imin (npr. -C(NR')-), tioetar (npr. -S-), ksantat ( npr. -OC(S)S-) i fosfodiestar (npr. -OP(O)2O-), pri čemu je R' nezavisno izabran od -H, -NH-, -NH2-O-, -S-, fosfat ili izborno supstituisani C1-10alkilen;
X1i X2su nezavisno izabrani od ugljenika ili heteroatoma izabranog od -NH-, -O-, -S- ili fosfata;
A1i A2su ili nezavisno izabrani od C6-30alkil, C6-30alkenil i C6-30alkinil, pri čemu A1i A2mogu biti isti ili različiti, ili A1i A2zajedno sa atomom ugljenika za koji su vezani formiraju izborno supstituisani steroid.
[0022] Lipozom pronalaska će tipično uključivati veliki broj PEG grupa, koje mogu biti iste ili različite. Prosečna molekulska masa PEG u lipozomu pronalaska je između 1 kDa i 3 kDa, npr. između 1,5-2,5 kDa, između 1,7-2,3 kDa, između 1,8-2,2 kDa, između 1,9-2,1 kDa ili 2 kDa. Stoga PEG može biti PEG koji je uobičajeno poznat kao "PEG 2000" ili "PEG 2k", iako se mogu koristiti i kraći "PEG 1000" i duži "PEG 3000".
[0023] PEG će obično sadržati linearne polimerne lance, ali, u nekim primerima izvođenja, PEG može da sadrži razgranate polimerne lance.
[0024] Takođe je moguće da jedan lipidni molekul uključuje više od jedne PEG grupe npr. vezan za različite atome ugljenika u grupi glave lipida (npr. vidi SI.18). U ovim okolnostima pozivanje na molekulsku masu PEG u lipozomu je molekulska masa po molekulu lipida, a ne po PEG supstituentu. Dakle, u lipozomu u kome jedini PEGilovani lipid ima strukturu prikazanu na Sl.18, gde je upakovana molekulska težina 2 kDa i sastoji se od dva lanca od 1 kDa svaki, prosečna molekulska masa PEG je 2 kDa, a ne 1 kDa.
[0025] U nekim primerima izvođenja PEG može biti supstituisani PEG npr. u kome je jedan ili više atoma ugljenika u polimeru supstituisano sa jednom ili više alkil, alkoksi, acil ili aril grupa.
[0026] U nekim primerima izvođenja PEG može da sadrži kopolimer grupe npr. jedan ili više propilen monomera, da bi se formirao PEG polipropilen polimer.
[0027] Kao alternativa PEGilaciji, lipid može biti modifikovan kovalentnim vezivanjem ostatka koji se razlikuje od PEG. Na primer, u nekim primerima izvođenja lipid može uključivati polifosfazen. U nekim primerima izvođenja lipid može uključivati poli(vinil pirolidon). U nekim primerima izvođenja lipid može uključivati poli(akril amid). U nekim primerima izvođenja lipid može uključivati poli(2-metil-2-oksazolin). U nekim primerima izvođenja lipid može uključivati poli(2-etil-2-oksazolin). U nekim primerima izvođenja lipid može uključivati fosfatidil poliglicerol. U nekim primerima izvođenja lipid može uključivati poli[N-(2-hidroksipropil) metakrilamid]. U nekim primerima izvođenja lipid može uključiti polimer polialkilen etra, osim PEG.
[0028] Lipozomi se obično dele u tri grupe: multilamelarne vezikule (MLV); male unilamelarne vezikule (SUV); i velike unilamelarne vezikule (LUV). MLV imaju više dvoslojnih slojeva u svakoj vezikuli, formirajući nekoliko odvojenih vodenih pregrada. SUV i LUV vehikulumi imaju jedan dvoslojni omotač koji obuhvata vodeno jezgro; SUV vehikulumi obično imaju prečnik ≤50nm, a LUV-ovi imaju prečnik >50nm. Lipozomi pronalaska su idealno LUV sa prečnikom u opsegu od 60-180 nm, a poželjno u opsegu od 80-160 nm.
[0029] Lipozom ovog pronalaska može biti deo kompozicije koja sadrži veći broj lipozoma, a lipozomi unutar više njih mogu imati opseg prečnika. Za kompoziciju koja sadrži populaciju lipozoma različitih prečnika: (i) najmanje 80% po broju lipozoma treba da ima prečnike u opsegu od 60-180nm, a poželjno u opsegu od 80-160nm, i/ili (ii ) prosečan prečnik (po intenzitetu npr. Z-prosek) populacije je idealno u opsegu od 60-180nm, a poželjno u opsegu od 80-160nm. Prečnici unutar mnoštva bi idealno trebalo da imaju indeks polidisperznosti <0.2. Očekuje se da kompleksi lipozom/RNK iz reference 1 imaju prečnik u opsegu od 600-800 nm i visoku polidisperznost.
[0030] Tehnike za pripremu pogodnih lipozoma su dobro poznate u tehnici npr. videti reference 4 do 6. Jedna korisna metoda je opisana u referenci 7 i uključuje mešanje (i) etanolnog rastvora lipida (ii) vodenog rastvora nukleinske kiseline i (iii) pufera, nakon čega sledi mešanje, ekvilibrisanje, razblaživanje i prečišćavanje. Poželjni lipozomi pronalaska se mogu dobiti ovim postupkom mešanja.
[0031] Da bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom(prečnicima), mešanje se može izvršiti korišćenjem procesa u kome se dve struje vodenog rastvora RNK kombinuju u jednoj zoni mešanja sa jednom strujom etanolnog rastvora lipida, sve pri istoj brzini protoka npr. u mikrofluidnom kanalu kao što je opisano u nastavku.
RNK
[0032] Lipozomi pronalaska uključuju RNK molekul koji (za razliku od siRNK, kao u referenci 2) kodira imunogen, pri čemu RNK koja kodira imunogen od interesa ne uključuje modifikovane nukleobaze osim 5' kapice koja sadrži 7'metilguanozin, i/ili metilaciju na poziciji 2' riboze prvih 1, 2 ili 35' ribonukleotida. Posle in vivo administracija čestica, RNK se oslobađa iz čestica i prevodi unutar ćelije da obezbedi imunogen in situ.
[0033] RNK je -lančana, i tako je mogu prevesti ćelije bez potrebe za bilo kakvim koracima replikacije kao što je reverzna transkripcija. Takođe se može vezati za TLR7 receptore koje eksprimiraju imune ćelije, čime se pokreće pomoćni efekat.
[0034] Poželjne -lančane RNK se samorepliciraju. Molekul RNK koji se samoreplicira (replikon) može, kada se isporuči u ćeliju kičmenjaka čak i bez ikakvih proteina, dovesti do proizvodnje više ćerki RNK transkripcijom svog molekula (preko antisens kopije koju generiše od sebe). Molekul RNK koji se samoreplicira je stoga tipično molekul -lanca koji se može direktno prevesti nakon isporuke u ćeliju, a ovaj prevod obezbeđuje RNK-zavisnu RNK polimerazu koja zatim proizvodi i antisens i sens transkripte iz isporučene RNK. Tako isporučena RNK dovodi do proizvodnje više ćerki RNK. Ove ćerke RNK, kao i kolinearni subgenomski transkripti, mogu se sami prevesti da bi obezbedili in situ ekspresija kodiranog imunogena, ili može biti transkribovana da bi se obezbedili dalji transkripti sa istim sensom kao isporučena RNK koja se prevodi da obezbedi in situ ekspresiju imunogena. Ukupni rezultat ove sekvence transkripcija je ogromno povećanje broja uvedenih replikonskih RNK i tako kodirani imunogen postaje glavni polipeptidni proizvod ćelija.
[0035] Jedan pogodan sistem za postizanje samoreplikacije je upotreba replikona RNK zasnovanog na alfavirusu. Ovi -lančani replikoni se prevode nakon isporuke u ćeliju da bi se dobila replikaza (ili replikaza-transkriptaza). Replikaza se prevodi kao poliprotein koji se auto-cepa da bi obezbedio replikacioni kompleks koji stvara kopije genomskih –lanaca isporučene RNK sa -lancom. Ovi –lančani transkripti mogu sami biti transkribovani da daju dalje kopije -lančane roditeljske RNK i takođe da daju subgenomski transkript koji kodira imunogen. Prevođenje subgenomskog transkripta tako dovodi do in situ ekspresija imunogena od strane inficirane ćelije. Odgovarajući replikoni alfavirusa mogu koristiti repliku iz virusa Sindbis, Semliki forest virusa, virusa istočnog konjskog encefalitisa, virusa venecuelanskog konjskog encefalitisa, itd. Mogu se koristiti sekvence virusa mutanta ili divljeg tipa npr. atenuirani TC83 mutant VEEV je korišćen u replikonima [8].
[0036] Poželjni molekul RNK koji se samoreplicira tako kodira (i) RNK-zavisnu RNK polimerazu koja može transkribovati RNK iz molekula RNK koji se samoreplicira i (ii) imunogen. Polimeraza može biti replika alfavirusa npr. koji sadrže jedan ili više alfavirusnih proteina nsP1, nsP2, nsP3 i nsP4.
[0037] Dok prirodni genomi alfavirusa kodiraju strukturne virionske proteine pored poliproteina nestrukturne replikaze, poželjno je da samoreplicirajući RNK molekul pronalaska ne kodira strukturne proteine alfavirusa. Prema tome, poželjna samoreplicirajuća RNK može dovesti do proizvodnje sopstvenih kopija genomske RNK u ćeliji, ali ne i do proizvodnje viriona koji sadrže RNK. Nemogućnost proizvodnje ovih viriona znači da, za razliku od alfavirusa divljeg tipa, molekul RNK koji se samoreplicira ne može da se perpetuira u infektivnom obliku. Strukturni proteini alfavirusa koji su neophodni za perpetuaciju kod virusa divljeg tipa su odsutni u samoreplicirajućim RNK pronalaska i njihovo mesto zauzima(ju) gen(i) koji kodiraju imunogen od interesa, tako da subgenomski transkript kodira imunogen, a ne strukturne alfavirus virion proteine.
[0038] Prema tome, samoreplicirajući RNK molekul koristan prema pronalasku može imati dva otvorena okvira čitanja. Prvi (5') otvoreni okvir čitanja kodira repliku; drugi (3') otvoreni okvir za čitanje kodira imunogen. U nekim primerima izvođenja RNK može imati dodatne (npr. nizvodno) otvorene okvire za čitanje npr. za kodiranje daljih imunogena (videti u nastavku) ili za kodiranje pomoćnih polipeptida.
[0039] Molekul RNK koji se samoreplicira može imati 5' sekvencu koja je kompatibilna sa kodiranom replikazom.
[0040] Molekuli RNK koji se samorepliciraju mogu imati različite dužine, ali su obično dugi 5000-25000 nukleotida npr. 8000-15000 nukleotida, ili 9000-12000 nukleotida. Stoga je RNK duža nego što se vidi u isporuci siRNK.
[0041] Molekul RNK koji je koristan prema pronalasku može imati 5' kapu (npr. 7-metilguanozin). Ova kapa može poboljšati in vivo translaciju RNK.
[0042] 5' nukleotid molekula RNK koji je koristan prema pronalasku može imati 5' trifosfatnu grupu. U zatvorenoj RNK ovo može biti povezano sa 7-metilguanozinom preko 5'do-5' mosta. 5' trifosfat može poboljšati vezivanje RIG-I i tako podstaći adjuvantne efekte.
[0043] Molekul RNK može imati 3' poli-A rep. Takođe može uključivati sekvencu prepoznavanja poli-A polimeraze (npr. AAUAAA) blizu njegovog kraja od 3'.
[0044] Molekul RNK koristan prema pronalasku će tipično biti jednolančani. Jednolančane RNK generalno mogu inicirati adjuvantni efekat vezivanjem za TLR7, TLR8, RNK helikaze i/ili PKR. RNK isporučena u dvolančanom obliku (dsRNK) može se vezati za TLR3, a ovaj receptor takođe može biti pokrenut dsRNK koja se formira ili tokom replikacije jednolančane RNK ili unutar sekundarne strukture jednolančane RNK.
[0045] Molekul RNK koristan prema pronalasku može se prikladno pripremiti pomoću in vitro transkripcija (IVT). IVT može da koristi (cDNK) šablon kreiran i razmnožen u obliku plazmida u bakterijama, ili stvoren sintetički (na primer, sintezom gena i/ili postupcima inženjeringa lančane reakcije polimeraze (PCR)). Na primer, RNK polimeraza zavisna od DNK (kao što su RNK polimeraze bakteriofaga T7, T3 ili SP6) može se koristiti za transkripciju RNK sa DNK šablona. Odgovarajuće zatvaranje i reakcije dodavanja poli-A mogu se koristiti po potrebi (iako je poli-A replikona obično kodiran unutar DNK šablona). Ove RNK polimeraze mogu imati stroge zahteve za transkribovane 5' nukleotide i u nekim primerima izvođenja ovi zahtevi moraju biti usklađeni sa zahtevima kodirane replike, kako bi se osiguralo da IVT-transkribovana RNK može efikasno da funkcioniše kao supstrat za sebe -kodirana replika.
[0046] Kao što je navedeno u zahtevu 1, RNK koja kodira imunogen od interesa ne uključuje modifikovane nukleobaze osim 5' kapice koja sadrži 7'metilguanozin, i/ili metilaciju na 2' poziciji riboze prvog 1, 2 ili 35' ribonukleotidi.
[0047] Kao što je razmatrano u referenci 9 uopštenije, RNK koja se samoreplicira može uključivati (pored bilo koje strukture 5' kape) jedan ili više nukleotida koji imaju modifikovanu nukleobazu. Tako RNK može da sadrži m5C (5-metilcitidin), m5U (5-metiluridin), m6A (N6-metiladenozin), s2U (2-tiouridin), Um (2'-O-metiluridin), m1A (1-metiladenozin); m2A (2-metiladenozin); Am (2'-O-metiladenozin); ms2m6A (2-metiltio-N6-metiladenozin); i6A (N6-izopenteniladenozin); ms2i6A (2-metiltio-N6izopenteniladenozin); io6A (N6-(cis-hidroksiizopentenil)adenozin); ms2io6A (2-metiltio-N6-(cishidroksiizopentenil) adenozin); g6A (N6-glicinilkarbamoiladenozin); t6A (N6-treonil karbamoiladenozin); ms2t6A (2-metiltio-N6-treonil karbamoiladenozin); m6t6A (N6-metil-N6-treonilkarbamoiladenozin); hn6A(N6.-hidroksinorvalikarbamoil adenozin); ms2hn6A (2-metiltio-N6-hidroksinorvalil karbamoiladenozin); Ar(p) (2'-O-riboziladenozin (fosfat)); I (inozin); m11 (1-metilinozin); m'Im (1,2'-O-dimetilinozin); m3C (3-metilcitidin); Cm (2T-O-
1
metilcitidin); s2C (2-tiocitidin); ac4C (N4-acetilcitidin); f5C (5-fonilcitidin); m5Cm (5,2-0-dimetilcitidin); ac4Cm (N4acetil2TOmetilcitidin); k2C (lizidin); m1G (1-metilguanozin); m2G (N2-metilguanozin); m7G (7-metilguanozin); Gm (2'-O-metilguanozin); m22G (N2,N2-dimetilguanozin); m2Gm (N2,2'-O-dimetilguanozin); m22Gm (N2,N2,2'-O-trimetilguanozin); Gr(p) (2'-O-ribozilguanozin (fosfat)); iV (vibutozin); o2iV (peroksivibutozin); OHiV (hidroksivibutozin); OHiV<∗>(nedovoljno modifikovan hidroksivibutozin); imG (viozin); mimG (metilguanozin); Q (kevozin); oQ (epoksikeuozin); galQ (galtaktozilkeuozin); manK (manozil-keuozin); preQo (7-cijano-7-deazaguanozin); preQi (7-aminometil-7-deazaguanozin); G<∗>(arheozin); D (dihidrouridin); m5Um (5,2'-O-dimetiluridin); s4U (4-tiuridin); m5s2U (5-metil-2-tiouridin); s2Um (2-tio-2'-O-metiluridin); acp3U (3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin); ho5U (5-hidroksiuridin); mo5U (5-metoksiuridin); cmo5U (uridin 5-oksisirćetna kiselina); mcmo5U (metil estar uridin 5-oksisirćetne kiseline); chm5U (5-(karboksihidroksimetil)uridin)); mchm5U (5-(karboksihidroksimetil)uridin metil estar); mcm5U (5-metoksikarbonil metiluridin); mcm5Um (S-metoksikarbonilmetil-2-O-metiluricin); mcm5s2U (5-metoksikarbonilmetil-2-tiouridin); nm5s2U (5-aminometil-2-tiouridin); mnm5U (5-metilaminometiluridin); mnm5s2U (5-metilaminometil-2-tiouridin); mnm5se2U (5-metilaminometil-2-selenouridin); ncm5U (5-karbamoilmetil uridin); ncm5Um (5-karbamoilmetil-2'-O-metiluridin); cmnm5U (5-karboksimetilaminometiluridin); cnmm5Um (5-karboksimetilaminometil-2-L-O-metiluridin); cmnm5s2U (5-karboksimetilaminometil-2-tiouridin); m62A (N6,N6-dimetiladenozin); Tm (2'-O-metilinozin); m4C (N4-metilcitidin); m4Cm (N4,2-O-dimetilcitidin); hm5C (5-hidroksimetilcitidin); m3U (3-metiluridin); cm5U (5-karboksimetiluridin); m6Am (N6,T-O-dimetiladenozin); rn62Am (N6,N6,O-2-trimetiladenozin); m2'7G (N2,7-dimetilguanozin); m2'2'7G (N2,N2,7-trimetilguanozin); m3Um (3,2T-O-dimetiluridin); m5D (5-metildihidrouridin); f5Cm (5-formil-2'-O-metilcitidin); m1Gm (1,2'-O-dimetilguanozin); m'Am (1,2-O-dimetil adenozin) irinometiluridin); tm5s2U (S-taurinometil-2-tiouridin)); imG-14 (4-demetil guanozin); imG2 (izoguanozin); ili ac6A (N6-acetiladenozin), hipoksantin, inozin, 8-okso-adenin, njihovi 7-supstituisani derivati, dihiduroracil, pseudouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-aminouracil, 5--(C1-luracil) 5-metiluracil, 5-(C2-C6)-alkeniluracil, 5-(C2-C6)-alkiniluracil, 5-(hidroksimetil)uracil, 5-hlorouracil, 5-fluorouracil, 5-bromuracil, 5-hidroksicitozin, 5-( C1-C6)-alkilcitozin, 5-metilcitozin, 5-(C2-C6)-alkenilcitozin, 5-(C2-C6)-alkinilcitozin, 5-hlorocitozin, 5-fluorocitozin, 5-bromocitozin, N2-guanin-dimetilanin , 8-azaguanin, 7-deaza-7-supstituisani guanin, 7-deaza-7-(C2-C6)alkinilguanin, 7-deaza-8-supstituisani guanin, 8hidroksiguanin, 6-tioguanin, 8-oksoguanin, aminopurin, 2-amino-6-hlorpurin, 2,4-diaminopurin, 2,6-diaminopurin, 8-azapurin, supstituisani 7-deazapurin, 7-deaza-7-supstituisani purin, 7-deaza-8-supstituisani purin, ili abazični nukleotid. Na primer, samoreplicirajuća RNK može uključiti jednu ili više modifikovanih pirimidinskih nukleobaza, kao što su pseudouridin i/ili ostaci 5-metilcitozina. U nekim slučajevima, međutim, RNK ne uključuje modifikovane nukleobaze, a možda i ne sadrži modifikovane nukleotide tj. svi nukleotidi u RNK su standardni A, C, G i U ribonukleotidi (osim bilo koje 5' kapice strukture, koja može uključivati 7'-metilguanozin). RNK koja se koristi u pronalasku idealno uključuje samo fosfodiestarske veze između nukleozida, ali u nekim primerima izvođenja može da sadrži fosfororamidne, fosforotioatne i/ili metilfosfonatne veze.
[0048] U idealnom slučaju, lipozom uključuje manje od 10 različitih vrsta RNK npr.5, 4, 3, ili 2 različite vrste; najpoželjnije, lipozom uključuje jednu vrstu RNK tj. svi molekuli RNK u lipozomu imaju istu sekvencu i istu dužinu.
[0049] Količina RNK po lipozomu može varirati. Broj pojedinačnih samoreplicirajućih RNK molekula po lipozomu je tipično ≤50 npr. <20, <10, <5 ili 1-4 po lipozomu.
Imunogen
[0050] Molekuli RNK koji se koriste u pronalasku kodiraju polipeptidni imunogen. Nakon primene lipozoma, RNK se prevodi in vivo a imunogen može izazvati imuni odgovor kod primaoca. Imunogen može izazvati imuni odgovor protiv bakterije, virusa, gljivice ili parazita (ili, u nekim primerima izvođenja, protiv alergena; a u drugim primerima izvođenja, protiv tumorskog antigena). Imuni odgovor može da obuhvata odgovor antitela (obično uključujući IgG) i/ili imuni odgovor posredovan ćelijama. Polipeptidni imunogen će tipično izazvati imuni odgovor koji prepoznaje odgovarajući bakterijski, virusni, gljivični ili parazitski (ili alergen ili tumor) polipeptid, ali u nekim primerima izvođenja polipeptid može delovati kao mimotop da izazove imuni odgovor koji prepoznaje bakterijski, virusni, gljivični ili parazitski saharid. Imunogen će tipično biti površinski polipeptid npr. adhezin, hemaglutinin, glikoprotein omotača, spajk glikoprotein, itd.
[0051] Molekul RNK može da kodira jedan polipeptidni imunogen ili više polipeptida. Više imunogena može biti predstavljeno kao jedan polipeptidni imunogen (fuzioni polipeptid) ili kao zasebni polipeptidi. Ako se imunogeni eksprimiraju kao odvojeni polipeptidi iz replikona, onda jedan ili više njih mogu biti obezbeđeni uzvodnim IRES ili dodatnim elementom virusnog promotera. Alternativno, višestruki imunogeni mogu biti eksprimirani iz poliproteina koji kodira pojedinačne imunogene spojene sa kratkom autokatalitičkom proteazom (npr. virus slinavke i šapa (protein 2A) ili kao inteini.
[0052] Za razliku od referenci 1 i 10, RNK kodira imunogen. Da bi se izbegla sumnja, pronalazak ne obuhvata RNK koja kodira luciferazu svitaca ili koja kodira fuzioni protein E.coli β-galaktozidazu ili koja kodira zeleni fluorescentni protein (GFP). Takvi polipeptidi mogu biti korisni kao markeri, ili čak u kontekstu genske terapije, ali pronalazak se odnosi na isporuku RNK za izazivanje odgovora imunološkog sistema. Dakle, imunogen takođe nije samoprotein koji se isporučuje kao dopuna ili zamena za defektni protein domaćina (kao u genskoj terapiji). Takođe, RNK nije totalna RNK timusa miša.
[0053] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv jedne od ovih bakterija:
Neisseria meningitidis: korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, membranske proteine kao što su adhezini, autotransporteri, toksini, proteini za vezivanje gvožđa i protein koji vezuje faktor H. Kombinacija tri korisna polipeptida je otkrivena u referenci 11.
Streptokokus pneumonie: korisni polipeptidni imunogeni su otkriveni u referenci 12. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, subjedinicu RrgB pilus, prekursor beta-N-acetilheksosaminidaze (spr0057), spr0096, protein opšteg stresa GSP-781 (spr2021, SP2216), serin/treonin kinaza StkP (SP1732) i pneumokokni površinski adhezin PsaA.
Streptococcus piogenes: korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referencama 13 i 14.
Morakella catarrhalis.
Bordetella pertussis: Korisni imunogeni protiv pertusisa uključuju, ali nisu ograničeni na, toksin ili toksoid pertusisa (PT), filamentni hemaglutinin (FHA), pertaktin i aglutinogene 2 i 3.
Staphilococcus aureus: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referenci 15, kao što su hemolizin, eskA, eskB, protein koji vezuje ferihrom (sta006) i/ili sta011 lipoprotein.
1
Clostridium tetani: tipični imunogen je tetanusni toksoid.
Corninebacterium diphtheriae: tipičan imunogen je toksoid difterije.
Haemophilus influenzae: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referencama 16 i 17.
Pseudomonas aeruginosa
Streptococcus agalactiae: korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referenci 13.
Chlamidia trachomatis: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, OmpH-like, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA i MurG (npr. kao što je otkriveno u referenci 18. LcrE [19] i HtrA [20] su dva poželjna imunogena.
Chlamidia pneumoniae: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide otkrivene u referenci 21.
Helicobacter pilori: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, CagA, VacA, NAP i/ili ureazu [22].
Escherichia coli: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, imunogene izvedene iz enterotoksigena E. coli (ETEC), enteroagregativan E. coli (EAggEC), difuzno prianjajući E. coli (DAEC), enteropatogen E. coli (EPEC), ekstraintestinalni patogen E. coli (EkPEC) i/ili enterohemoragični E. coli (EHEC). EkPEC sojevi uključuju uropatogene E. coli (UPEC) i imunogen povezan sa meningitisom/sepsom E.coli (MNEC). Korisni UPEC polipeptidni imunogeni su otkriveni u referencama 23 i 24. Korisni MNEC imunogeni su otkriveni u referenci 25. Korisni imunogen za nekoliko E.coli vrste je AcfD [26].
Bacillus anthracis
Iersinia pestis: Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one otkrivene u referencama 27 i 28.
Staphilococcus epidermis
Clostridium perfringens ili Clostridium botulinums
Legionella pneumophila
Cokiella burnetii
Bruccela, kao što je B. abortus, B.canis, B.melitensis, B.neotomae, B.ovis, B.suis, B.pinnipediae.
Francisella, kao što je F.novicida, F.philomiragia, F. tularensis.
Neisseria gonorrhoeae
Treponema pallidum
Haemophilus ducreii
Enterococcus faecalis ili Enterococcus faecium
Staphilococcus saprophiticus
Iersinia enterocolitica
Micobacterium tuberculosis
Rickettsia
Listeria monocitogenes
Vibrio cholerae
Salmonella tiphi
1
Borrelia burgdorferi
Porphiromonas gingivalis
Klebsiella
[0054] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv jednog od ovih virusa:
Ortomixovirus: Korisni imunogeni mogu biti iz virusa gripa A, B ili C, kao što su hemaglutinin, neuraminidaza ili matriksni M2 proteini. Tamo gde je imunogen hemaglutinin virusa gripa A, on može biti iz bilo kog podtipa npr. H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 ili H16.
Paramixoviridae virusi: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od pneumovirusa (npr. respiratorni sincicijalni virus, RSV), Rubulavirusi (npr. virus zauški), paramiksovirusi (npr. virus parainfluence), metapneumovirusi i morbilivirusi (npr. virus morbila).
Poxviridae: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Orthopoxvirus kao što su Variola vera, uključujući, ali ne ograničeno na, Variola major i Variola minor.
Picornavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od pikornavirusa, kao što su enterovirusi, rinovirusi, heparnavirusi, kardiovirusi i aftovirusi. U jednom aspektu, enterovirus je poliovirus npr. poliovirus tipa 1, tipa 2 i/ili tipa 3. U drugom aspektu, enterovirus je EV71 enterovirus. U drugom aspektu, enterovirus je koksaki A ili B virus.
Bunyavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Ortobunya virusa, kao što je virus kalifornijskog encefalitisa, flebovirus, kao što je virus groznice doline Rift, ili nairovirus, kao što je virus Krim-Kongo hemoragične groznice.
1
Heparnavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Heparnavirusa, kao što je virus hepatitisa A (HAV).
Filovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od filovirusa, kao što je virus ebole (uključujući ebola virus Zaira, Obale Slonovače, Reston ili Sudan) ili virus Marburg.
Togavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Togavirusa, kao što su Rubivirus, Alfavirus ili Arterivirus. Ovo uključuje virus rubeole.
Flavivirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Flavivirusa, kao što su virus krpeljnog encefalitisa (TBE), virus Denga (tipovi 1, 2, 3 ili 4), virus žute groznice, virus japanskog encefalitisa, Kyasanur forest virus, virus encefalitisa Zapadnog Nila, virus encefalitisa Sent Luisa, virus ruskog prolećno-letnjeg encefalitisa, virus Povassan encefalitisa.
Pestivirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od pestivirusa, kao što je goveđa virusna dijareja (BVDV), klasična svinjska kuga (CSFV) ili granična bolest (BDV).
Hepadnavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Hepadnavirusa, kao što je virus hepatitisa B. Kompozicija može uključivati površinski antigen virusa hepatitisa B (HBsAg).
Drugi virusi hepatitisa: Kompozicija može uključivati imunogen iz virusa hepatitisa C, virusa delta hepatitisa, virusa hepatitisa E ili virusa hepatitisa G.
Rabdovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Rhabdovirusa, kao što je Lissavirus (npr. virus besnila) i vezikulovirus (VSV).
Caliciviridae: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Calciviridae, kao što je Norvalk virus (Norovirus) i viruse slični Norvalku, kao što su Havajski virus i Snow Mountain virus.
1
Coronavirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od SARS koronavirusa, infektivnog bronhitisa ptica (IBV), virusa mišjeg hepatitisa (MHV) i virusa prenosivog gastroenteritisa svinja (TGEV). Imunogen za koronavirus može biti spajk polipeptid.
Retrovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od onkovirusa, lentivirusa (npr. HIV-1 ili HIV-2) ili Spumavirus.
Reovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od ortoreovirusa, rotavirusa, orbivirusa ili kolitivirusa.
Parvovirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od Parvovirusa B19.
Herpesvirus: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od humanog herpes virusa, kao što su, samo kao primer, Herpes simplex virusi (HSV) (npr. HSV tipovi 1 i 2), virus Varicella-zoster (VZV), Epstein-Barr virus (EBV), Cyitomegalovirus (CMV), Humani herpesvirus 6 (HHV6), Humani herpesvirus 7 (HHV7) i Humani herpesvirus 8 (HHV8).
Papovavirusi: Virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji potiču od papiloma virusa i polioma virusa. (Humani) papiloma virus može biti serotipa 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 ili 65 npr. od jednog ili više serotipova 6, 11, 16 i/ili 18.
Adenovirus: Virusni imunogeni uključuju one izvedene iz adenovirusa serotipa 36 (Ad-36).
[0055] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv virusa koji inficira ribu, kao što su: virus infektivne anemije lososa (ISAV), virus bolesti pankreasa lososa (SPDV), virus infektivne pankreasne nekroze (IPNV), virus kanalskog soma (CCV) , virus bolesti limfocistisa riba (FLDV), virus infektivne hematopoetske nekroze (IHNV), koi herpesvirus, virus sličan picorni lososa (takođe poznat kao virus atlantskog lososa sličan picorni), virus lososa koji nema izlaz na more (LSV), rotavirus atlantskog lososa (ASR), virus bolesti sa crvenilom pastrmke (TSD), virus tumora koho lososa (CSTV) ili virus virusne
1
hemoragične septikemije (VHSV).
[0056] Gljivični imunogeni mogu biti izvedeni iz Dermatophitresa, uključujući: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, and/or Trichophyton faviforme; or from Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis and Enterocytozoon bieneusi; the less common are Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaria spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp, and Cladosporium spp.
[0057] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv parazita iz Plasmodium roda, kao npr P.falciparum, P. vivax, P. malariae ili P. ovale. Stoga se pronalazak može koristiti za imunizaciju protiv malarije. U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv parazita iz porodice Caligidae, posebno one iz Lepeoftheirus i Caligus rodova npr. morske vaške kao npr Lepeophtheirus salmonis ili Caligus rogercresseii.
[0058] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor protiv: alergena polena (alergeni polena drveća, biljaka, korova i trava); alergeni insekata ili arahnida
1
(alergeni koji se udišu, pljuvačka i otrov, npr. alergeni grinja, alergeni bubašvaba i mušica, alergeni otrova himenoptera); alergeni životinjske dlake i peruti (od npr. pas, mačka, konj, pacov, miš, itd.); i alergeni u hrani (npr. glijadin). Važni polenski alergeni drveća, trava i bilja su takvi koji potiču iz taksonomskih redova Fagales, Oleales, Pinales i platanaceae uključujući, ali ne ograničavajući se na, brezu (Betula), jovu (Alnus), lesku (Corilus), grab (Carpinus) i maslinu (Olea), kedar (Criptomeria i Juniperus), platan (Platanus), red Poales uključujući trave iz rodova Lolium, Phleum, Poa, Cinodon, Dactilis, Holcus, Phalaris, Secale i Sorghum, redovi Asterales i Urticales uključujući biljke iz rodova Ambrosia, Artemisia i Parietaria. Drugi važni inhalacioni alergeni su oni iz grinja u kućnoj prašini iz roda Dermatophagoides i Eurogliphus, grinja iz skladišta. npr. Lepidoglifi, glicifag i tirofag, oni od bubašvaba, mušica i buva npr. Blatella, Periplaneta, Chironomus i Ctenocepphalides, i oni od sisara kao što su mačke, psi i konji, alergeni na otrov, uključujući one koji potiču od insekata koji ubadaju ili grizu, kao što su oni iz taksonomskog reda Himenoptera uključujući pčele (Apidae), ose (Vespidea), i mravi (Formicoidae).
[0059] U nekim primerima izvođenja, imunogen je tumorski antigen izabran između: (a) antigena raka testisa kao što su NI-ESO-1, SSKS2, SCP1 kao i polipeptida porodice RAGE, BAGE, GAGE i MAGE, na primer, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 i MAGE-12 (koji se mogu koristiti, na primer, za lečenje melanoma, pluća, glave i vrata , NSCLC, tumora dojke, gastrointestinalnog trakta i mokraćne bešike; (b) mutirani antigeni, na primer, p53 (povezan sa različitim solidnim tumorima, npr., kolorektalni rak, rak pluća, glave i vrata), p21/Ras (povezan sa, npr., melanom, rak pankreasa i kolorektalni kancer), CDK4 (povezan sa, npr., melanomom), MUM1 (povezan sa, npr., melanomom), kaspaza-8 (povezana sa, npr., rak glave i vrata), CIA 0205 (povezan sa, npr., rakom mokraćne bešike), HLA-A2-R1701, beta katenin (povezan sa, npr., melanomom), TCR (povezan sa, npr., T-ćelijskim ne-Hodgkinovim limfomom), BCR-abl (povezan sa, npr., hroničnom mijelogenom leukemijom), triosefosfat izomeraza, KIA 0205, CDC-27 i LDLR-FUT; (c) prekomerno eksprimirani antigeni, na primer, galektin 4 (povezan sa, npr., kolorektalni karcinom), galektin 9 (povezan sa, npr., Hočkinova bolest), proteinaza 3 (povezana sa, npr., hroničnom mijelogenom leukemijom), VT 1 (povezan sa, npr., raznim leukemijama), karboanhidraza (povezana sa, npr., rakom bubrega), aldolaza A (povezana sa, npr., rakom pluća), PRAME (povezan sa, npr., melanomom), HER-2/neu (povezan sa, npr., rakom dojke, debelog creva, pluća i jajnika), mamaglobin, alfa-fetoprotein (povezan sa, npr., hepatom), KSA (povezan sa, npr., kolorektalnim karcinomom), gastrin (povezan sa, npr., rakonm pankreasa i želuca), katalitički protein telomeraze, MUC-1 (povezan sa, npr., rakom
2
dojke i jajnika), G-250 (povezan sa, npr., karcinomom bubrežnih ćelija), p53 (povezan sa, npr., rakom dojke, debelog creva) i karcinoembrionalni antigen (povezan sa, npr., rakom dojke, rakom pluća i karcinom gastrointestinalnog trakta kao što je kolorektalni kancer); (d) zajednički antigeni, na primer, antigeni za diferencijaciju melanoma i melanocita kao što su MART-1/Melan A, gp100, MC1R, receptor hormona koji stimuliše melanocite, tirozinaza, protein srodan tirozinazi-1/TRP1 i protein povezan sa tirozinazom-2/TRP2 (povezan sa, npr., melanomom); (e) antigeni povezani sa prostatom kao što su PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, povezani sa npr., karcinomom prostate; (f) idiotipi imunoglobulina (povezani sa mijelomom i B ćelijskim limfomima, na primer). U određenim primerima izvođenja, imunogeni tumora uključuju, ali nisu ograničeni na, p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MIL-RAR, antigene virusa Epstein Barr, EBNA, humane antigene papiloma virusa (HPV), uključujući E6 i E7, antigene virusa hepatitisa B i C, antigene humanog limfotropnog virusa T-ćelija, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15- 3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag , MOV18, NB/70K, NI-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (Mac-2 vezujući protein/protein povezan sa ciklofilinom C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS i slično.
Farmaceutske kompozicije
[0060] Lipozomi pronalaska su korisni kao komponente u farmaceutskim kompozicijama za imunizaciju subjekata protiv različitih bolesti. Ove kompozicije će tipično uključivati farmaceutski prihvatljiv nosač pored lipozoma. Detaljna diskusija o farmaceutski prihvatljivim nosačima dostupna je u referenci 29.
[0061] Farmaceutska kompozicija pronalaska može uključivati jedan ili više imunopotencijatora malih molekula. Na primer, kompozicija može uključivati agonist TLR2 (npr. Pam3CSK4), agonist TLR4 (npr. aminoalkil glukozaminid fosfat, kao što je E6020), agonist TLR7 (npr. imihimod), agonist TLR8 (npr. resihimod) i/ili agonist TLR9 (npr. IC31). Bilo koji takav agonist idealno ima molekulsku težinu od <2000Da. U nekim primerima izvođenja, takvi agonisti su takođe inkapsulirani sa RNK unutar lipozoma, ali u drugim primerima izvođenja oni su nekapsulirani.
[0062] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu uključivati lipozome u običnoj vodi (npr.
v.f.i.) ili u tamponu npr. fosfatni pufer, Tris pufer, boratni pufer, sukcinatni pufer, histidinski pufer ili citratni pufer. Puferske soli će obično biti uključene u opsegu 5-20 mM.
[0063] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu imati pH između 5,0 i 9.5 npr. između 6,0 i 8,0.
[0064] Kompozicije pronalaska mogu uključivati natrijumove soli (npr. natrijum hlorid) da daju toničnost. Koncentracija od 10±2 mg/ml NaCl je tipična npr. oko 9 mg/ml.
[0065] Kompozicije pronalaska mogu uključivati helatore metalnih jona. Oni mogu produžiti stabilnost RNK uklanjanjem jona koji mogu ubrzati hidrolizu fosfodiestera. Stoga kompozicija može uključivati jednu ili više od EDTA, EGTA, BAPTA, pentetinske kiseline, itd. Takvi helatori su tipično prisutni između 10-500 uM npr. 0.1mM. Citratna so, kao što je natrijum citrat, takođe može delovati kao helator, dok je povoljno takođe da obezbedi pufersku aktivnost.
[0066] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu imati osmolalnost između 200 mOsm/kg i 400 mOsm/kg, npr. između 240-360 mOsm/kg ili između 290-310 mOsm/kg.
[0067] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu uključivati jedan ili više konzervansa, kao što su tiomersal ili 2-fenoksietanol. Poželjne su kompozicije bez žive, a mogu se pripremiti vakcine bez konzervansa.
[0068] Farmaceutske kompozicije pronalaska su poželjno sterilne.
[0069] Farmaceutske kompozicije pronalaska su poželjno nepirogene npr. sadrže <1 EU (jedinica endotoksina, standardna mera) po dozi, a poželjno <0,1 EU po dozi.
[0070] Farmaceutske kompozicije pronalaska su poželjno bez glutena.
[0071] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu se pripremiti u obliku jedinične doze. U nekim primerima izvođenja, jedinična doza može imati zapreminu između 0,1-1,0 ml npr. oko 0,5 ml.
[0072] Kompozicije se mogu pripremiti kao injekcije, bilo kao rastvori ili suspenzije. Kompozicija se može pripremiti za plućnu primenu npr. pomoću inhalatora, koristeći fini sprej. Kompozicija se može pripremiti za nazalnu, ušnu ili okularnu primenu npr. kao sprej ili kapi. Tipične su injekcije za intramuskularnu primenu.
[0073] Kompozicije sadrže imunološki efikasnu količinu lipozoma, kao i bilo koje druge komponente, po potrebi. Pod “imunološki efikasnom količinom”, podrazumeva se da je primena te količine na individuu, bilo u jednoj dozi ili kao deo serije, efikasna za lečenje ili prevenciju. Ovaj iznos varira u zavisnosti od zdravlja i fizičkog stanja individue koji se leči, starosti, taksonomske grupe individue koji se leči (e.g. ne-ljudi primat, primat, itd.), kapaciteta imunog sistema individue da sintetiše antitela, željenog stepena zaštite, formulacije vakcine, procene medicinske situacije od strane lekara i drugih relevantnih faktora. Očekuje se da će količina pasti u relativno širokom rasponu koji se može utvrditi kroz rutinska ispitivanja. Sadržaj lipozoma i RNK u kompozicijama pronalaska će generalno biti izražen u odnosu na količinu RNK po dozi. Poželjna doza ima ≤100µg RNK (npr. od 10-100µg, kao što je oko 10µg, 25µg, 50µg, 75µg ili 100µg), ali ekspresija se može videti na mnogo nižim nivoima npr. ≤1µg/doza, ≤100ng/doza, ≤10ng/doza, ≤1ng/doza, itd
[0074] Pronalazak takođe obezbeđuje uređaj za isporuku (npr. špric, nebulizator, raspršivač, inhalator, kožni flaster, itd.) koji sadrže farmaceutsku kompoziciju pronalaska. Ovaj uređaj se može koristiti za davanje kompozicije kičmenjaku.
[0075] Lipozomi pronalaska ne sadrže ribozome.
Postupci lečenja i medicinske upotrebe
[0076] Za razliku od čestica otkrivenih u referenci 10, lipozomi i farmaceutske kompozicije pronalaska su za in vivo upotrebu za izazivanje imunog odgovora protiv imunogena od interesa.
[0077] Ovde je takođe opisan postupak za podizanje imunog odgovora kod kičmenjaka koji obuhvata korak primene efikasne količine lipozoma ili farmaceutske kompozicije pronalaska. Imuni odgovor je poželjno zaštitni i poželjno uključuje antitela i/ili ćelijski posredovan imunitet. Postupak može izazvati pojačani odgovor.
[0078] Pronalazak takođe obezbeđuje lipozom ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska za upotrebu u postupku za podizanje imunog odgovora kod kičmenjaka.
[0079] Ovde je takođe opisana upotreba lipozoma pronalaska u proizvodnji leka za podizanje imunog odgovora kod kičmenjaka.
[0080] Podizanjem imunološkog odgovora kod kičmenjaka ovim upotrebama i postupcima, kičmenjak se može zaštititi od različitih bolesti i/ili infekcija npr. protiv bakterijskih i/ili virusnih bolesti kao što je prethodno diskutovano. Lipozomi i kompozicije su imunogeni, i poželjnije su kompozicije vakcine. Vakcine prema pronalasku mogu biti ili profilaktičke (tj. za sprečavanje infekcije) ili terapijski (tj. za lečenje infekcije), ali će obično biti profilaktički.
[0081] Poželjno je da je kičmenjak sisar, kao što je čovek ili veliki veterinarski sisar (npr. konji, goveda, jeleni, koze, svinje). Tamo gde je vakcina za profilaktičku upotrebu, čovek je poželjno dete (npr. malo dete ili novorođenče) ili tinejdžer; gde je vakcina za terapeutsku upotrebu, čovek je poželjno tinejdžer ili odrasla osoba. Vakcina namenjena deci može se davati i odraslima npr. da se proceni bezbednost, dozu, imunogenost, itd.
2
[0082] Vakcine pripremljene prema pronalasku mogu se koristiti za lečenje i dece i odraslih. Dakle, humani pacijent može biti star manje od 1 godine, manje od 5 godina, 1-5 godina, 5-15 godina, 15-55 godina ili najmanje 55 godina. Poželjni pacijenti za primanje vakcina su starije osobe (npr. ≥50 godina, ≥60 godina, a poželjno ≥65 godina), mladi (npr. ≤5 godina), hospitalizovani pacijenti, zdravstveni radnici, pripadnici oružanih snaga i vojnog osoblja, trudnice, hronični bolesnici ili pacijenti sa imunodeficijencijom. Međutim, vakcine nisu pogodne samo za ove grupe i mogu se koristiti generalno u populaciji.
[0083] Kompozicije pronalaska će se generalno davati direktno pacijentu. Direktna isporuka se može postići parenteralnom injekcijom (npr. subkutano, intraperitonealno, intravenozno, intramuskularno, intradermalno ili u intersticijski prostor tkiva; za razliku od reference 1, intraglosalna injekcija se obično ne koristi sa ovim pronalaskom). Alternativni putevi porođaja uključuju rektalni, oralni (npr. tableta, sprej), bukalna, sublingvalna, vaginalna, lokalna, transdermalna ili transkutana, intranazalna, okularna, auralna, plućna ili druga mukozna primena. Intradermalna i intramuskularna primena su dva poželjna načina. Injekcija može biti putem igle (npr. hipodermna igla), ali se alternativno može koristiti injekcija bez igle. Tipična intramuskularna doza je 0,5 ml.
[0084] Pronalazak se može koristiti za izazivanje sistemskog i/ili mukoznog imuniteta, poželjno za izazivanje poboljšanog sistemskog i/ili mukoznog imuniteta.
[0085] Doziranje može biti prema rasporedu jedne doze ili rasporedu višestrukih doza. Višestruke doze se mogu koristiti u rasporedu primarne imunizacije i/ili u rasporedu dopunske imunizacije. U shemi višestrukih doza različite doze se mogu davati istim ili različitim putevima npr. primarna doza primljena parenteralno i buster preko sluzokože, primarna doza primljena preko sluzokože i buster parenteralno, itd. Više doza će se obično davati u razmaku od najmanje 1 nedelje (npr. oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 4 nedelje, oko 6 nedelja, oko 8 nedelja, oko 10 nedelja, oko 12 nedelja, oko 16 nedelja, itd.). U jednom aspektu, višestruke doze se mogu primeniti približno 6 nedelja, 10 nedelja i 14 nedelja nakon rođenja, npr. u dobi od 6 nedelja, 10 nedelja i 14 nedelja, kako se često koristi u Proširenom programu imunizacije Svetske zdravstvene organizacije („EPI“). U alternativnom izvođenju, dve primarne doze se daju u razmaku od oko dva meseca, npr. u razmaku od oko 7, 8 ili 9 nedelja, nakon čega sledi jedna ili više buster doza oko 6 meseci do 1 godine nakon druge primarne doze, npr. oko 6, 8, 10 ili 12 meseci nakon druge primarne doze. U daljem izvođenju, tri primarne doze se daju u razmaku od oko dva meseca, npr. u razmaku od oko 7, 8 ili 9 nedelja, nakon čega sledi jedna ili više buster doza oko 6 meseci do 1 godine nakon treće primarne doze, npr. oko 6, 8, 10 ili 12 meseci nakon treće primarne doze.
Formula (X)
[0086] Jedinjenja formule (X) sadrže hidrofilnu polimernu glavnu grupu vezanu za lipidni deo. Oni se mogu opisati kao "stelt lipidi" i imaju formulu:
gde:
Z je hidrofilna komponenta glavne grupe izabrana od PEG-a i polimera na bazi poli(oksazolina), poli(etilen oksida), poli(vinil alkohola), poli(glicerola), poli(N-vinilpirolidona), poli[N-(2-) hidroksipropil)metakrilamid] i poli(aminokiselina) pri čemu polimer može biti linearan ili razgranat, i gde polimer može biti izborno supstituisan; pri čemu je Z polimerizovan sa n podjedinicama;
n je prosečni stepen polimerizacije između 10 i 200 jedinica Z, pri čemu je n optimizovan za različite tipove polimera;
L1je izborno supstituisani C1-10alkilen ili C1-10heteroalkilenski linker uključujući nula, jedan ili dva etra (npr. -O-), estra (npr. -C(O)O-), sukcinata (npr. -O(O)C-CH2-CH2-C(O)O-)), karbamat (npr. -OC(O)-NR'-), karbonat (npr. -OC(O)O-), urea (npr. -NRC(O)NR'- ), amin (npr. -NR'-), amid (npr. -C(O)NR'-), imin (npr. -C(NR')-), tioetar (npr. -S-), ksantat ( npr. -OC(S)S-) i fosfodiestar (npr. -OP(O)2O-),
pri čemu je R' nezavisno izabran od -H, -NH-, -NH2-O-, -S-, fosfat ili izborno supstituisani C1-10alkilen;
X1i X2su nezavisno izabrani od ugljenika ili heteroatoma izabranog od -NH-, -O-, -S- ili fosfata;
A1i A2su nezavisno izabrani od C6-30alkil, C6-30alkenil i C6-30alkinil, pri čemu A1i A2mogu biti isti ili različiti, ili A1i A2zajedno sa atomom ugljenika za koji su vezani formiraju izborno supstituisani steroid.
[0087] U jednom aspektu, jedinjenje formule (X) ima formulu (X')
gde
PEG je poli(etilen glikol) podjedinica, pri čemu PEG može biti linearan ili razgranat;
n je prosečni stepen polimerizacije između 10 i 200 jedinica PEG, poželjno oko 45 jedinica;
2
L1je izborno supstituisani C1-10heteroalkilenski linker koji sadrži jedan ili dva etra, estra, sukcinata, karbamata, karbonata, uree, amina, amida, imina, tioetra, ksantata i fosfodiestera; X1i X2su kiseonik;
A1i A2su nezavisno izabrani od C6-30alkil, C6-30alkenil i C6-30alkinil, pri čemu A1i A2mogu biti isti ili različiti, ili pri čemu A1i A2zajedno sa atomom ugljenika za koji su vezani formiraju izborno supstituisani steroid.
[0088] Lipidi formula (X) i (X'), kada su formulisani sa katjonskim lipidima za formiranje lipozoma, mogu povećati dužinu vremena za koje lipozom može postojati in vivo (npr. u krvi). Oni mogu zaštititi površinu površine lipozoma i na taj način smanjiti opsonizaciju proteina u krvi i preuzimanje od strane makrofaga. Dalji detalji su u referencama 30 i 31. U jednom aspektu, lipid sadrži grupu odabranu od PEG (ponekad se naziva poli(etilen oksid)) i polimera na bazi poli(oksazolina), poli(vinil alkohola), poli(glicerola) ), poli(N-vinilpirolidon), poli[N-(2-hidroksipropil)metakrilamid] i poli(aminokiselina).
[0089] Pogodni PEGilovani lipidi za upotrebu u pronalasku obuhvataju konjugate polietilenglikol-diacilglicerol ili polietilenglikol-diacilglikamid (PEG-DAG), uključujući one koji sadrže dialkilglicerol ili dialkilglikamid grupu koja ima dužinu alkilnog lanca nezavisno do oko 40 sa 4 atoma ugljenika. Dialkilglicerol ili dialkilglikamidna grupa može dalje da sadrži jednu ili više supstituisanih alkil grupa. PEGiltaed lipid se može izabrati između PEG-dilaurilglicerola, PEG-dimiritilglicerola (katalog #GM-020 od NOF), PEG-dipalmitoilglicerola, PEG-disterilglicerola, PEG-dilaurilglikemida, PEG-dimiritilglicemida i PEG-dimiritilglikamida, , PEG-holesterol (1-[8'-(Cholest-5-en-3p-oksi)karboksamido-3',6'-dioksaoktanil]karbamoil-[omega]-metil-poli(etilen glikol), PEG -DMB (3,4-ditetradekoksilbenzil-[omega]-metil-poli(etilen glikol) etar), 1,2-dimirstoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi (polietilen glikol)-2000] (katalog #880150P od Avanti Polar Lipids). Ostali korisni PEGilovani lipidi su S001, S002, S003, S004, S005, S006, S007, S008, S009, S010, S011 i CS-020SA (NOF i S010); 32 pod oznakama IVa i IVc, respektivno.. U ref. 32, drugačija sinteza od one koja je ovde navedena je korišćena za dobijanje IVa i IVc.
Hemijski pojmovi i definicije
Halo
2
[0090] Termin "halogen" (ili "halo") uključuje fluor, hlor, brom i jod.
Alkil, alkilen, alkenil, alkinil, cikloalkil itd.
[0091] Izrazi "alkil", "alkilen", "alkenil" i "alkinil" se ovde koriste da se odnose na aciklične oblike ravnog i razgranatog lanca. Njihovi ciklični analozi se nazivaju cikloalkil, itd.
[0092] Termin "alkil" uključuje monovalentne, prave ili razgranate, zasićene, aciklične ugljovodonične grupe. U jednom aspektu alkil je C1-10alkil, u drugom aspektu C1-6alkil, u drugom aspektu C1-4alkil, kao što su metil, etil, n-propil, i-propil ili t-butil grupe.
[0093] Termin "cikloalkil" uključuje monovalentne, zasićene, ciklične ugljovodonične grupe. U jednom aspektu cikloalkil je C3-10cikloalkil, u drugom aspektu C3-6cikloalkil kao što su ciklopentil i cikloheksil.
[0094] Termin "alkoksi" označava alkil-O-.
[0095] Termin "alkenil" uključuje monovalentne, prave ili razgranate, nezasićene, aciklične ugljovodonične grupe koje imaju najmanje jednu dvostruku vezu ugljenik-ugljenik i, u jednom aspektu, nema trostruke veze ugljenik-ugljenik. U jednom aspektu alkenil je C2-
10alkenil, u drugom aspektu C2-6alkenil, u drugom aspektu C2-4alkenil.
[0096] Izraz "cikloalkenil" uključuje monovalentne, delimično nezasićene, ciklične ugljovodonične grupe koje imaju najmanje jednu dvostruku vezu ugljenik-ugljenik i, u jednom aspektu, nema trostruke veze ugljenik-ugljenik. U jednom aspektu cikloalkenil je C3-
10cikloalkenil, u drugom aspektu C5-10cikloalkenil, npr. cikloheksenil ili benzocikloheksil.
[0097] Izraz "alkinil" uključuje monovalentne, prave ili razgranate, nezasićene, aciklične ugljovodonične grupe koje imaju najmanje jednu trostruku vezu ugljenik-ugljenik i, u jednom aspektu, ne postoje dvostruke veze ugljenik-ugljenik. U jednom aspektu, alkinil je C2-
10alkinil, u drugom aspektu C2-6alkinil, u drugom aspektu C2-4alkinil.
[0098] Izraz "cikloalkinil" uključuje monovalentne, delimično nezasićene, ciklične ugljovodonične grupe koje imaju najmanje jednu trostruku vezu ugljenik-ugljenik i, u jednom aspektu, ne postoje dvostruke veze ugljenik-ugljenik. U jednom izvođenju cikloalkinil je C3-
10cikloalkenil, u drugom aspektu C5-10cikloalkinil.
[0099] Termin "alkilen" uključuje dvovalentne, ravne ili razgranate, zasićene, aciklične ugljovodonične grupe. U jednom aspektu alkilen je C1-10alkilen, u drugom aspektu C1-
6alkilen, u drugom aspektu C1-4alkilen, kao što su metilen, etilen, n-propilen, i-propilen ili tbutilen grupe.
[0100] Termin "alkenilen" uključuje dvovalentne, prave ili razgranate, nezasićene, aciklične
2
ugljovodonične grupe koje imaju najmanje jednu dvostruku vezu ugljenik-ugljenik i, u jednom aspektu, nema trostruke veze ugljenik-ugljenik. U jednom aspektu alkenilen je C2-
10alkenilen, u drugom aspektu C2-6alkenilen, u drugom aspektu C2-4alkenilen.
[0101] Termin "alkinilen" uključuje dvovalentne, prave ili razgranate, nezasićene, aciklične ugljovodonične grupe koje imaju najmanje jednu trostruku vezu ugljenik-ugljenik i, u jednom aspektu, ne postoje dvostruke veze ugljenik-ugljenik. U jednom aspektu alkinilen je C2-
10alkinilen, u drugom aspektu C2-6alkinilen, u drugom aspektu C2-4alkinilen.
Heteroalkil itd.
[0102] Termin "heteroalkil" uključuje alkil grupe u kojima je do šest atoma ugljenika, u jednom aspektu do pet atoma ugljenika, u drugom aspektu do četiri atoma ugljenika, u drugom aspektu do tri atoma ugljenika, u drugom aspektu do dva atoma ugljenika atomi, u drugom izvođenju jedan atom ugljenika, svaki je nezavisno zamenjen sa O, S(O)k, N, P(O)rili Si (i poželjno O, S(O)kili N), pod uslovom da ostane najmanje jedan od atoma alkil ugljenika. Heteroalkil grupa može biti C-vezana ili hetero-vezana, tj. može biti povezan sa ostatkom molekula preko atoma ugljenika ili preko O, S(O)k, N, P(O)rili Si.
[0103] Termin "heterocikloalkil" uključuje cikloalkil grupe u kojima je do šest atoma ugljenika, u jednom aspektu do pet atoma ugljenika, u drugom aspektu do četiri atoma ugljenika, u drugom aspektu do tri atoma ugljenika, u drugom aspektu do dva atoma ugljenika atomi, u drugom izvođenju jedan atom ugljenika, svaki je nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od cikloalkil atoma ugljenika. Primeri heterocikloalkil grupa obuhvataju oksiranil, tiaranil, aziridinil, oksetanil, tiatanil, azetidinil, tetrahidrofuranil, tetrahidrotiofenil, pirolidinil, tetrahidropiranil, tetrahidrotiopiranil, morperidinil, piperidinil, piperidinil, piperioksian1-4- , 1,4-azatianil, oksepanil, tiepanil, azepanil, 1,4-dioksepanil, 1,4-oksatiepanil, 1,4-oksaazepanil, 1,4-ditiepanil, 1,4-tiazepanil i 1,4-tieazepanil i 1,4-oksatiepanil. Heterocikloalkil grupa može biti C-vezana ili N-vezana, tj. može biti vezan za ostatak molekula preko atoma ugljenika ili preko atoma azota.
[0104] Termin "heteroalkenil" uključuje alkenil grupe u kojima su do tri atoma ugljenika, u jednom aspektu do dva atoma ugljenika, u drugom aspektu jedan atom ugljenika, svaki nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od atoma alkenil ugljenika. Heteroalkenil grupa može biti C-vezana ili hetero-vezana, tj. može biti povezan sa ostatkom molekula preko atoma ugljenika ili preko O, S(O)kili N.
[0105] Termin "heterocikloalkenil" uključuje cikloalkenil grupe u kojima su do tri atoma
2
ugljenika, u jednom aspektu do dva atoma ugljenika, u drugom aspektu jedan atom ugljenika, svaki nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od cikloalkenil atoma ugljenika. Primeri heterocikloalkenil grupa uključuju 3,4-dihidro-2H-piranil, 5-6-dihidro-2H-piranil, 2H-piranil, 1,2,3,4-tetrahidropiridinil i 1,2,5,6-tetrahidropiridinil. Heterocikloalkenil grupa može biti C-vezana ili N-vezana, tj. može biti vezan za ostatak molekula preko atoma ugljenika ili preko atoma azota.
[0106] Termin "heteroalkinil" uključuje alkinil grupe u kojima su do tri atoma ugljenika, u jednom aspektu do dva atoma ugljenika, u drugom aspektu jedan atom ugljenika, svaki nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od atoma alkinil ugljenika. Heteroalkinil grupa može biti C-vezana ili hetero-vezana, tj. može biti povezan sa ostatkom molekula preko atoma ugljenika ili preko O, S(O)kili N.
[0107] Termin "heterocikloalkinil" uključuje cikloalkinil grupe u kojima su do tri atoma ugljenika, u jednom aspektu do dva atoma ugljenika, u drugom aspektu jedan atom ugljenika, svaki nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od cikloalkinil atoma ugljenika. Heterocikloalkenil grupa može biti C-vezana ili N-vezana, tj. može biti vezan za ostatak molekula preko atoma ugljenika ili preko atoma azota.
[0108] Termin "heteroalkilen" uključuje alkilenske grupe u kojima su do tri atoma ugljenika, u jednom aspektu do dva atoma ugljenika, u drugom aspektu jedan atom ugljenika, svaki nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od atoma ugljenika alkilena.
[0109] Izraz "heteroalkenilen" uključuje alkenilenske grupe u kojima su do tri atoma ugljenika, u jednom aspektu do dva atoma ugljenika, u drugom aspektu jedan atom ugljenika, svaki nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od atoma ugljenika alkenilena.
[0110] Termin "heteroalkinilen" uključuje alkinilenske grupe u kojima su do tri atoma ugljenika, u jednom aspektu do dva atoma ugljenika, u drugom aspektu jedan atom ugljenika, svaki nezavisno zamenjen sa O, S(O)kili N, pod uslovom da ostane najmanje jedan od atoma ugljenika alkinilena.
Aril
[0111] Termin "aril" uključuje monovalentne, aromatične, ciklične ugljovodonične grupe, kao što su fenil ili naftil (npr. 1-naftil ili 2-naftil). Generalno, aril grupe mogu biti monociklične ili policiklične kondenzovane prstenaste aromatične grupe. Poželjni aril su C6-
2
C14aril.
[0112] Drugi primeri aril grupa su monovalentni derivati aceantrilena, acenaftilena, acefenantrilena, antracena, azulena, hrizena, koronena, fluorantena, fluorena, as-indacena, sindacena, indena, naftalena, ovalena, perilena, fenalena, fenatrena, picena, pleiadena, pirena, pirantrena i rubicena.
[0113] Termin "arilalkil" označava alkil supstituisan sa aril grupom, npr. benzil.
[0114] Termin "arilen" uključuje dvovalentne aromatične, ciklične ugljovodonične grupe, kao što je fenilen. Generalno, arilen grupe mogu biti monociklične ili policiklične kondenzovane prstenaste aromatične grupe. Poželjni arilen su C6-C14arilen. Drugi primeri arilenskih grupa su dvovalentni derivati aceantrilena, acenaftilena, acefenantrilena, antracena, azulena, hrizena, koronena, fluorantena, fluorena, as-indacena, s-indacena, indena, naftalena, ovalena, perilena, fenalena, fenatrena, picena, pleiadena, pirena, pirantrena i rubicena..
Heteroaril
[0115] Termin "heteroaril" uključuje monovalentne, heteroaromatične, ciklične ugljovodonične grupe koje dodatno sadrže jedan ili više heteroatoma nezavisno odabranih od O, S, N i NR<N>, gde je R<N>je definisan u nastavku (i u jednom aspektu je H ili alkil (npr. C1-
6alkil)).
[0116] Generalno, heteroaril grupe mogu biti monociklične ili policiklične (npr. biciklične) spojene prstenaste heteroaromatične grupe. U jednom aspektu, heteroaril grupe sadrže 5-13 članova prstena (poželjno 5-10 članova) i 1, 2, 3 ili 4 heteroatoma u prstenu koji se nezavisno biraju između O, S, N i NR<N>. U jednom aspektu, heteroaril grupa može imati 5, 6, 9 ili 10 članova, npr. 5-člani monociklični, 6-člani monociklični, 9-člani biciklični spojeni prsten ili 10-člani biciklični spojeni prsten.
[0117] Monociklične heteroaromatične grupe obuhvataju heteroaromatične grupe koje sadrže 5-6 članova prstena i 1, 2, 3 ili 4 heteroatoma izabranih između O, S, N ili NR<N>.
[0118] U jednom aspektu, 5-člane monociklične heteroaril grupe sadrže 1 član prstena koji je -NR<N>- grupa, -O- atom ili -S- atom i, izborno, 1-3 člana prstena (npr. 1 ili 2 člana prstena) koji su =N-atomi (gde su ostatak od 5 članova prstena atomi ugljenika).
[0119] Primeri 5-članih monocikličnih heteroaril grupa su pirolil, furanil, tiofenil, pirazolil, imidazolil, izoksazolil, oksazolil, izotiazolil, tiazolil, 1,2,3 triazolil, 1,2,4 triazolil, 1,2,3 oksadiazolil, 1,2,4 oksadiazolil, 1,2,5 oksadiazolil, 1,3,4 oksadiazolil, 1,3,4 tiadiazolil, piridil, pirimidinil, piridazinil, pirazinil, 1,3,5 triazinil, 1,2,4 triazinil, 1,2,3 triazinil i tetrazolil.
[0120] Primeri 6-članih monocikličnih heteroaril grupa su piridinil, piridazinil, pirimidinil i pirazinil.
[0121] U jednom aspektu, 6-člane monociklične heteroaril grupe sadrže 1 ili 2 člana prstena koji su =N-atomi (gde su ostatak od 6 članova prstena atomi ugljenika).
[0122] Biciklične heteroaromatične grupe uključuju heteroaromatične grupe spojenog prstena koje sadrže 9-13 članova prstena i 1, 2, 3, 4 ili više heteroatoma izabranih između O, S, N ili NR<N>.
[0123] U jednom aspektu, 9-člane biciklične heteroaril grupe sadrže 1 član prstena koji je -NR<N>- grupa, -O- atom ili -S- atom i, izborno, 1-3 člana prstena (npr.1 ili 2 člana prstena) koji su =N-atomi (gde su ostatak od 9 članova prstena atomi ugljenika).
[0124] Primeri bicikličnih heteroaril grupa sa 9-članim spojenim prstenom su benzofuranil, benzotiofenil, indolil, benzimidazolil, indazolil, benzotriazolil, pirolo[2,3-b]piridinil, pirolo[2,3-c]piridinil, pirolo[3,2-2] c]piridinil, pirolo[3,2-b]piridinil, imidazo[4,5-b]piridinil, imidazo[4,5-c]piridinil, pirazolo[4,3-d]piridinil, pirazolo[4,3- c]piridinil, pirazolo[3,4-c]piridinil, pirazolo[3,4-b]piridinil, izoindolil, indazolil, purinil, indolininil, imidazo[1,2-a]piridinil, imidazo[1,5-a] piridinil, pirazolo[1,2-a]piridinil, pirolo[1,2-b]piridazinil i imidazo[1,2-c]pirimidinil.
[0125] U jednom aspektu, 10-člane biciklične heteroaril grupe sadrže 1-3 člana prstena koji su =N-atomi (gde su ostatak od 10 članova prstena atomi ugljenika).
[0126] Primeri bicikličnih heteroaril grupa sa 10-članim spojenim prstenom su hinolinil, izohinolinil, cinolinil, hinazolinil, hinoksalinil, ftalanil, 1,6-naftiridinil, 1,7-naftiridinil, 1,8-naftiridinil, 1,8-,5,naftiril2, 6-naftiridinil, 2,7-naftiridinil, pirido[3,2-d]pirimidinil, pirido[4,3-d]pirimidinil, pirido[3,4-d]pirimidinil, pirido[2,3-d]pirimidinil, pirido[2,3-b]pirazinil, pirido[3,4-b]pirazinil, pirimido[5,4-d]pirimidinil, pirazino[2,3-b]pirazinil i pirimido[4,5-d]pirimidinil.
[0127] Termin "heteroarilalkil" označava alkil supstituisan sa heteroaril grupom.
[0128] Termin "heteroarilen" uključuje dvovalentne heteroaromatične, ciklične ugljovodonične grupe koje dodatno sadrže jedan ili više heteroatoma nezavisno odabranih od O, S, N i NR<N>, gde je R<N>je definisan u nastavku (i u jednom aspektu je H ili alkil (npr. C1-
6alkil)). Generalno, heteroarilenske grupe mogu biti monociklične ili policiklične (npr. biciklične) spojene prstenaste heteroaromatične grupe. U jednom aspektu, heteroarilenske grupe sadrže 5-13 članova prstena (poželjno 5-10 članova) i 1, 2, 3 ili 4 heteroatoma u prstenu, nezavisno odabranih od O, S, N i NR<N>. U jednom aspektu, heteroarilen grupa može imati 5, 6, 9 ili 10 članova, npr. 5-člani monociklični, 6-člani monociklični, 9-člani biciklični
1
spojeni prsten ili 10-člani biciklični spojeni prsten. Izraz "heteroarilen" uključuje dvovalentne derivate svake od heteroaril grupa o kojima je gore razmatrano.
[0129] Izrazi "aril", "aromatični", "heteroaril" i "heteroaromatični" takođe uključuju grupe koje su delimično redukovane. Tako, na primer, "heteroaril" uključuje fuzionisane vrste u kojima je jedan od prstenova redukovan u zasićeni prsten (npr. 1,2,3,4-tetrahidro-1,8-naftiridin-2-il).
Opšte
[0130] Osim ako nije eksplicitno drugačije naznačeno, gde se kombinacije grupa ovde pominju kao jedan deo, npr. arilalkil, poslednja pomenuta grupa sadrži atom pomoću kojeg je deo vezan za ostatak molekula.
[0131] Kada se upućuje na atom ugljenika alkil grupe ili druge grupe koja je zamenjena sa O, S(O)k, N ili P(O)r, ono što je namenjeno je da:
se zamenjuje sa
(pri čemu E ne može biti H);
-CH= se zamenjuje sa -N= ili -P(O)r=;
≡C-H se zamenjuje sa ≡N ili ≡P(O)r; ili
-CH2- se zamenjuje sa -O-, -S(O)k-, -NR<N->ili -P(O)rR<N>-, gde je R<N>je H ili izborno supstituisan C1-6alkil, C1-6heteroalkil, C3-6cikloalkil, C3-6heterocikloalkil, C2-6alkenil, C2-
6heteroalkenil, C3-6cikloalkenil, C3-6heterocikloalkenil, fenil ili heteroaril koji sadrži 5 ili 6 članova prstena. R<N>je poželjno H, C1-6alkil ili C3-6cikloalkil.
[0132] k je nezavisno 0, 1 ili 2. U jednom aspektu, k je 0.
[0133] r je nezavisno 0 ili 1. U jednom aspektu, r je 0.
[0134] Kada se pominje atom ugljenika koji je zamenjen Si, ono što je predviđeno je da se atom ugljenika zameni atomom silicijuma, ali da veze inače ostaju iste. Tako, na primer, -CH2- se zamenjuje sa -SiH2-; -CH= se zamenjuje sa -SiH=; i =C-H je zamenjen sa ≡Si-H.
2
[0135] Radi pojašnjenja, u odnosu na prethodno navedene grupe koje sadrže heteroatom (kao što je heteroalkil itd.), gde je dat broj atoma ugljenika, na primer C3-6heteroalkil, ono što je namenjeno je grupa zasnovana na C3-6alkilu u kome je jedan ili više od 3-6 atoma ugljenika u lancu zamenjeno sa O, S(O)kili N. Shodno tome, C3-6heteroalkil grupa bi, na primer, sadržala manje od 3-6 lančanih atoma ugljenika. Kao još jedan primer, piridil grupa bi bila klasifikovana kao C6heteroaril grupa iako sadrži 5 atoma ugljenika.
Supstitucija
[0136] Grupe jedinjenja pronalaska (npr. alkil, cikloalkil, alkoksi, alkenil, cikloalkenil, alkinil, alkilen, alkenilen, heteroalkil, heterocikloalkil, heteroalkenil, heterocikloalkenil, heteroalkinil, heteroalkilen, heteroalkenilen aril, arilkenilen aril, arilkenilen aril, arilkenilen aril, arilkenilen, heteroalkenil heteroalkil heteroalkil heteroalkil heteroalkenil grupe itd.) mogu biti supstituisani ili nesupstituisani, u jednom aspektu nesupstituisani. Tipično, supstitucija uključuje zamišljenu zamenu atoma vodonika sa supstituentskom grupom, ili dva atoma vodonika u slučaju supstitucije sa =O.
[0137] Tamo gde je supstituisan, generalno će postojati 1 do 5 supstituenata na svakoj grupi, u jednom aspektu 1 do 3 supstituenta, u jednom aspektu 1 ili 2 supstituenta, u jednom aspektu 1 supstituent. Jedna realizacija uključuje više od jednog supstituenta na istom atomu, npr. acetal grupa.
[0138] U jednom aspektu, supstituent(i) je/su nezavisno Sub<1>ili Sub<2>(u jednom aspektu Sub<2>) gde:
Sub<1>je nezavisno halogen, trihalometil, trihaloetil, -NO2, -CN, -N<+>(R<s>)2O-, -CO2H, -CO2R<s>, -SO3H, -SOR<s>, -SO2R<s>, -SO3R<s>, -OC(=O)OR<s>, -C(=O)H, -C(=O)R<s>, -OC(=O)R<s>, =O, -NR<s>2, -C(=O)NH2, -C(=O)NRs2, -N(R<s>)C(=O)ILI<s>, -N(R<s>)C(=O)NR<s>2, -OC(=O)NRs2, -N(R<s>)C(=O)R<s>, -C(=S)NR<s>2, -NR<s>C(=S)R<s>, -SO2NRs2, -NR<s>SO2R<s>, -N(R<s>)C(=S)NR<s>2, -N(R<s>)SO2NRs2, -R<s>ili -Z<s>R<s>, gde;
Z<s>je nezavisno O, S ili NR<s>;
R<s>je nezavisno H ili C1-6alkil, C1-6heteroalkil, -(Alk<a>)f-C3-6cikloalkil, -(Alk<a>)f-C3-
6heterocikloalkil, C2-6alkenil, C2-6heteroalkenil, -(Alk<a>)f-C3-6cikloalkenil, -(Alk<a>)f-C3-
6heterocikloalkenil, C2-6alkinil, C2-6heteroalkinil, -(Alk<a>)f-C6-14aril, -(Alk<a>)f-C6-14aril ili -(Alk<a>)f-heteroaril (gde heteroaril sadrži 5-13 članova prstena), gde
f je 0 ili 1;
Alk<a>je C1-6alkilen ili C1-6heteroalkilen; i
R<s>je izborno sam po sebi supstituisan (u u jednom primeru izvođenja nesupstituisan) sa 1 do 3 supstituenta Sub<2>;
Sub<2>je nezavisno halogen, trihalometil, trihaloetil, -NO2, -CN, -N<+>(C1-6alkil)2O-, -CO2H, -CO2C1-6alkil, -SO3H, -SOC1-6alkil, -SO2C1-6alkil, -SO3C1-6alkil, -OC(=O)OC1-6alkil, -C(=O)H, -C(=O)C1-6alkil, -OC(=O)C1-6alkil, =O, -N(C1-6alkil)2, -C(=O)NH2, -C(=O)N(C1-
6alkil)2, -N(C1-6alkil)C(=O)O(C1-6alkil), -N(C1-6alkil)C(=O)N(C1-6alkil)2, -OC(=O)N(C1-
6alkil)2, -N(C1-6alkil)C(=O)C1-6alkil, -C(=S)N(C1-6alkil)2, -N(C1-6alkil)C(=S)C1-6alkil, -SO2N(C1-6alkil)2, -N(C1-6alkil)SO2C1-6alkil, -N(C1-6alkil)C(=S)N(C1-6alkil)2, -N(C1-
6alkil)SO2N(C1-6alkil)2, -C1-6alkil, -C1-6heteroalkil, -C3-6cikloalkil, -C3-6heterocikloalkil, -C2-
6alkenil, -C2-6heteroalkenil, -C3-6cikloalkenil, -C3-6heterocikloalkenil, -C2-6alkinil, -C2-
6heteroalkinil, -C6-14aril, -C5-13hetero-aril, -Z<t>-C1-6alkil, -Z<t>-C3-6cikloalkil, -Z<t>-C2-6alkenil, -Z<t>-C3-6cikloalkenil, ili -Z<t>-C2-6alkinil; i
Z<t>je nezavisno O, S, NH ili N(C1-6alkil).
[0139] Dok je R<s>u Sub<1>može izborno biti supstituisan sa 1 do 3 supstituenta Sub<2>, Sub<2>je nesupstituisan. Međutim, u u jednom primeru izvođenja, R<s>je nesupstituisan.
[0140] U jednom aspektu, R<s>je H ili C1-6alkil, izborno supstituisan sa 1 do 3 supstituenta Sub<2>.
[0141] U jednom aspektu, Sub<2>je nezavisno halogen, trihalometil, trihaloetil, -NO2, -CN, -N<+>(C1-6alkil)2O-, -CO2H, -SO3H, -SOC1-6alkil, -SO2C1-6alkil, -C(=O)H, -C(=O)C1-6alkil, =O, -N(C1-6alkil)2, -C(=O)NH2, -C1-6alkil, -C3-6cikloalkil, -C3-6heterocikloalkil, -Z<t>-C1-6alkil ili -Z<t>-C3-6cikloalkil.
[0142] U jednom aspektu, gde je supstituisana grupa aciklična (npr. alkil, heteroalkil, alkenil itd.), Sub<1>nije -R<s>i Sub<2>nije -C1-6alkil, -C1-6heteroalkil, -C2-6alkenil, -C2-6heteroalkenil, -C2-
6alkinil ili -C2-6heteroalkinil.
[0143] Gde je grupa koja nije Sub<2>ima najmanje 2 pozicije koje mogu biti supstituisane, grupa može biti supstituisana sa oba kraja alkilenskog, alkenilenskog, alkinilenskog, heteroalkilenskog, heteroalkenilenskog ili heteroalkinilenskog lanca (u jednom aspektu koji sadrži 1 do 6 atoma, u sledećoj varijanti 3 do 6 atoma i u daljem izvođenju 3 ili 4 atoma) da bi se formirao ciklični deo. Taj lanac je izborno supstituisan sa 1 do 3 supstituenta Sub<2>. U jednom aspektu taj lanac nije zamenjen. Dakle, termini izborno supstituisani "cikloalkil", "cikloalkenil", "cikloalkinil", "heterocikloalkil", "heterocikloalkenil", "heterocikloalkinil", "aril" i "heteroaril" uključuju spojene vrste. Na primer. "izborno supstituisani cikloalkil"
4
uključuje vrste u kojima su spojena dva cikloalkil prstena, a "izborno supstituisani heteroaril" uključuje vrste u kojima je heterocikloalkil prsten fuzionisan sa aromatičnim prstenom (npr.
5,6,7,8-tetrahidro-1, 8-naftiridin-2-il).
[0144] Gde je grupa koja nije Sub<2>ima atom koji može biti supstituisan dva puta, taj atom može biti supstituisan sa oba kraja alkilenskog, alkenilenskog, alkinilenskog, heteroalkilenskog, heteroalkenilenskog ili heteroalkinilenskog lanca (u jednom aspektu koji sadrži 2 do 8 atoma, u sledećoj varijanti 3 do 6 atoma, i u daljem izvođenju 4 ili 5 atoma) da bi se formirao ciklični deo. Taj lanac je izborno supstituisan sa 1 do 3 supstituenta Sub<2>. U jednom aspektu taj lanac nije zamenjen. Dakle, termini izborno supstituisani "cikloalkil", "cikloalkenil", "cikloalkinil", "heterocikloalkil", "heterocikloalkenil", "heterocikloalkinil", "aril" i "heteroaril" uključuju spiro vrste.
[0145] Radi pojašnjenja, kada grupa ima heteroatom, supstituent može biti vezan za heteroatom. Tako, na primer, "izborno supstituisani heteroalkil" uključuje -CH2-N(Sub<1>)-CH2-, -CH(Sub<1>)-NH-CH2- i -CH(Sub<1>)-N(Sub<1>)-CH2- itd.
Termini modifikatora
[0146] Kada listi prethodi modifikator, modifikator se podrazumeva kao primenljiv na svaku od stavki na listi. Na primer, fraza „izborno supstituisani C3-20-heterocikloalkil, C3-20-heterocikloalkenil, C3-20-heterocikloalkinil ili C5-20-heteroaril grupa" znači da svaka od četiri stavke na listi, odnosno C3-20-heterocikloalkil grupa, C3-20-heterocikloalkenil grupa, C3-20-heterocikloalkinil grupa i C6-20-heteroaril grupa, može biti izborno supstituisana.
[0147] Kada je grupa okarakterisana prvim modifikatorom, a zatim, kasnije, ista grupa je okarakterisana sledećim modifikatorom, podrazumeva se da grupu karakterišu oba modifikatora istovremeno. Na primer, ako je grupa opisana kao "C3-20-heterocikloalkinil" (prvi modifikator) grupa, a zatim kasnije ista grupa je opisana kao "C5-16" (sledeći modifikator) grupa, ono što se misli je C5-16heterocikloalkinil grupa.
Steroidi
[0148] Kako se ovde koristi, termin "steroid" se odnosi na bilo koju grupu koja sadrži sledeću strukturu (struktura se ovde naziva "steroidni skelet").
[0149] Čisto u svrhu ilustracije, steroidni skelet je gore nacrtan kao potpuno zasićen. Termin steroid, međutim, takođe je namenjen da pokrije slučajeve u kojima postoji nezasićenost u steroidnom skeletu. Na primer, termin steroid pokriva grupu koja obuhvata potpuno nezasićeni (mancude) osnovni skelet, 15H-ciklopenta[a]fenantren:
[0150] Termin steroid takođe pokriva grupu koja obuhvata delimično nezasićeni steroidni skelet.
[0151] Termin steroid takođe obuhvata "seko" derivate steroidnog skeleta, tj. grupe u kojima je došlo do cepanja prstena; "nor" i "homo" derivati steroidnog skeleta koji uključuju kontrakciju i širenje prstena, respektivno (videti S Systemic Nomenclature of Organic Chemistry, by D. Hellwinkel, published by Springer, 2001, ISBN: 3-540-41138-0, page 203 za "seco" i strana 204 za "nor" i "homo"). U jednom primeru izvođenja, međutim, takvi seko derivati nisu obuhvaćeni terminom "steroid". U drugom primeru izvođenja, takvi nor derivati nisu obuhvaćeni terminom "steroid". U drugom primeru izvođenja, takvi homo derivati nisu obuhvaćeni terminom "steroid". Prema tome, u jednom primeru izvođenja, takvi seko, nor i homo derivati nisu obuhvaćeni terminom "steroid".
[0152] Termin steroid takođe pokriva slučajeve u kojima je jedan ili više atoma ugljenika u strukturi označenoj steroidnim skeletom zamenjeno heteroatomom. U jednom takvom primeru izvođenja, do šest atoma ugljenika, u jednom primeru izvođenja do pet atoma ugljenika, u sledećem primeru izvođenja do četiri atoma ugljenika, u sledećem primeru izvođenja do tri atoma ugljenika, u sledećem primeru izvođenja do dva atoma ugljenika, u sledećem primeru izvođenja jedan atom ugljenika, svaki je nezavisno zamenjen sa O, S(O)k, N, P(O)rili Si (i poželjno O, S(O)kili N). U jednom primeru izvođenja, međutim, izraz "steroid" obuhvata vrste u kojima "osnovni skelet steroida" ne sadrži heteroatome.
[0153] Sistem steroidnih prstenova je numerisan prema konvenciji navedenoj u nastavku.
[0154] Termin steroid obuhvata sterole, steroidne hormone, žučne kiseline i soli žučnih kiselina. Sterol je bilo koji steroid sa hidroksilnom grupom na poziciji 3 A-prstena.
Nezasićenost
[0155] U skladu sa standardnom upotrebom, pozicija omega-3 se odnosi na treću vezu sa (metil) terminala lanca; pozicija omega-6 se odnosi na šestu vezu sa (metil) terminala lanca, a pozicija omega-9 se odnosi na devetu vezu sa (metil) terminala lanca.
Opšte
[0156] Praksa ovog pronalaska će koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne metode hemije, biohemije, molekularne biologije, imunologije i farmakologije, u okviru veštine tehnike. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. vidi, npr., reference 33-39, itd.
[0157] Termin „sadrži“ obuhvata „uključuje“ kao i „sastoji se“ npr. kompozicija "koja sadrži" X može se sastojati isključivo od X ili može uključivati nešto dodatno npr. X I.
[0158] Termin „oko“ u odnosu na brojčanu vrednost X je izborno i znači, na primer, k+10%.
[0159] Reč "suštinski" ne isključuje "potpuno" npr. kompozicija koja je "suštinski oslobođena" od I može biti potpuno slobodna od I. Gde je potrebno, reč "u suštini" može biti izostavljena iz definicije pronalaska.
[0160] Reference na naelektrisanje, katjone, anjone, cviterjone, itd., uzimaju se na pH 7.
[0161] TLR3 je receptor 3 sličan Toll. To je pojedinačni receptor koji se proteže kroz membranu i igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. Poznati agonisti TLR3 uključuju poli(I:C). „TLR3“ je odobreni naziv HGNC za gen koji kodira ovaj receptor, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC: 11849. RefSeq sekvenca za ljudski TLR3 gen je GI:2459625.
[0162] TLR7 je receptor 7 sličan Toll. T pojedinačni receptor koji se proteže kroz membranu i igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. Poznati agonisti TLR7 uključuju npr. imihimod. „TLR7“ je odobreni naziv HGNC za gen koji kodira ovaj receptor, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC: 15631. RefSeq sekvenca za ljudski TLR7 gen je GI:67944638.
[0163] TLR8 je receptor 8 sličan Toll. To je pojedinačni receptor koji se proteže kroz membranu i igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. Poznati agonisti TLR8 uključuju npr. resihimod. „TLR8“ je odobreni naziv HGNC za gen koji kodira ovaj receptor, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC: 15632. RefSeq sekvenca za ljudski TLR8 gen je GI:20302165.
[0164] Porodica receptora sličnih RIG-I („RLR“) uključuje različite RNK helikaze koje igraju ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu[40]. RLR-1 (takođe poznat kao RIG-I ili gen I koji indukuje retinoičnu kiselinu) ima dva domena za regrutovanje kaspaze u blizini svog N-terminusa. Odobreni naziv HGNC za gen koji kodira RLR-1 helikazu je „DDKS58“ (za DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) bok polipeptid 58) i jedinstveni HGNC ID je HGNC:19102. RefSeq sekvenca za ljudski gen RLR-1 je GI:77732514. RLR-2 (takođe poznat kao MDA5 ili gen 5 povezan sa diferencijacijom melanoma) takođe ima dva domena za regrutovanje kaspaze blizu svog N-terminusa. Odobreni naziv HGNC za gen koji kodira helikazu RLR-2 je „IFIH1“ (za interferon indukovan domenom helikaze C 1), a jedinstveni HGNC ID je HGNC:18873. RefSeq sekvenca za ljudski RLR-2 gen je GI: 27886567. RLR-3 (takođe poznat kao LGP2 ili laboratorija za genetiku i fiziologiju 2) nema domene za regrutovanje kaspaze. Odobreni naziv HGNC za gen koji kodira RLR-3 helikazu je „DHKS58“ (za DEKSH (Asp-Glu-X-His) bok polipeptid 58) i jedinstveni HGNC ID je HGNC:29517. RefSeq sekvenca za ljudski gen RLR-3 je GI: 149408121.
[0165] PKR je dvolančana RNK zavisna protein kinaza. Ona igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom sistemu. „EIF2AK2“ (eukariotski faktor inicijacije translacije 2-alfa kinaze 2) je odobreni naziv HGNC za gen koji kodira ovaj enzim, a njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC:9437. RefSeq sekvenca za ljudski PKR gen je GI:208431825.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0166]
SL. 1 prikazuje gel sa obojenom RNK. Trake pokazuju (1) markere (2) goli replikon (3) replikon nakon tretmana RNase (4) replikon inkapsuliran u lipozomu (5) lipozom nakon tretmana RNaze (6) lipozom tretiran RNazom zatim podvrgnut ekstrakciji fenolom/hloroformom.
SL. 2 je elektronski mikrograf lipozoma.
SL. Slika 3 prikazuje ekspresiju proteina (kao relativne svetlosne jedinice, RLU) 1, 3 i 6 dana nakon isporuke RNK u lipozomima sa PEG-ovima različite dužine: 1 kDa (trouglovi); 2 kDa (krugovi); 3 kDa (kvadrati).
SL. 4 prikazuje gel sa obojenom RNK. Trake pokazuju (1) markere (2) goli replikon (3) replikon inkapsuliran u lipozomu (4) lipozom tretiran RNazom zatim podvrgnut ekstrakciji fenolom/hloroformom.
SL. 5 prikazuje ekspresiju proteina u danima 1, 3 i 6 nakon isporuke RNK u vidu replikona upakovanog virionima (kvadrati), kao gole RNK (romb), ili u lipozomima (+ = 0,1 µg, k = 1 µg).
SL. 6 prikazuje ekspresiju proteina u danima 1, 3 i 6 nakon isporuke četiri različite doze RNK inkapsulirane u lipozomima.
SL. 7 prikazuje titre anti-F IgG kod životinja koje primaju replikon upakovan u virionima (VRP ili VSRP), 1 µg gole RNK i 1 µg RNK inkapsulirane u lipozomima.
SL. 8 prikazuje titre anti-F IgG kod životinja koje primaju VRP, 1 µg gole RNK i 0,1 g ili 1 µg inkapsulirane RNK u lipozomima.
SL. 9 prikazuje titre neutralizujućih antitela kod životinja koje primaju VRP ili 0,1 g ili 1 ug RNK inkapsulirane lipozomima.
SL. 10 prikazuje nivoe ekspresije nakon isporuke replikona kao gola RNK (krugovi), RNK inkapsulirana u lipozomima (trougao i kvadrat), ili kao lipopleks (obrnuti trougao).
SL. 11 prikazuje F-specifične titre IgG (2 nedelje nakon druge doze) nakon isporuke replikona kao gole RNK (0,01-1 µg), RNK inkapsulirane u lipozomima (0,01-10 µg) ili pakovane kao virion (VRP, 10<6>infektivne jedinice ili IU).
SL. 12 prikazuje F-specifične IgG titre (krugovi) i PRNT titre (kvadrati) nakon isporuke replikona kao gole RNK (1 µg), RNK inkapsulirane u lipozomima (0,1 ili 1 µg) ili pakovane kao virion (VRP, 10<6>IU). Prikazani su i titri kod naivnih miševa. Pune linije pokazuju geometrijske sredine.
SL. 13 prikazuje intracelularnu proizvodnju citokina nakon restimulacije sa sintetičkim peptidima koji predstavljaju glavne epitope u F proteinu, 4 nedelje nakon druge doze. y-osa prikazuje % citokina+ CD8+CD4-.
SL. 14 prikazuje strukturu lipida "RV05".
SL. 15 prikazuje F-specifične IgG titre (srednji log10titri std dev) tokom 210 dana nakon imunizacije teladi. Tri linije se lako razlikuju 63. dana i to su, odozdo prema gore: PBS negativna kontrola; RNK isporučena lipozomima; i proizvod „Triangle 4“.
SL. 16 prikazuje strukture tri PEG-konjugovana DMG lipida (1-3kDa).
SL. 17A do 17E prikazuju strukture različitih PEG-konjugovanih lipida, gde R je PEG željene dužine.
SL. 18 prikazuje strukturu korisnog "split" PEG-konjugovanog lipida. Pravougaonik prikazuje ukupnu MV PEG u lipidu (koji je, u konkretnom primeru ispod, bio 2000).
NAČINI ZA IZVOĐENJE PRONALASKA
RNK replikoni
[0167] U nastavku se koriste različiti replikoni. Generalno, oni su zasnovani na hibridnom genomu alfavirusa sa nestrukturnim proteinima iz venecuelanskog virusa konjskog encefalitisa (VEEV), signalu pakovanja iz VEEV i 3' UTR iz Sindbis virusa ili VEEV mutanta. Replikon je dugačak oko 10 kb i ima poli-A rep.
[0168] Plazmidna DNK koja kodira replikone alfavirusa (nazvana: pT7-mVEEV-FL.RSVF
4
ili A317; pT7-mVEEV-SEAP ili A306; pSP6-VCR-GFP ili A50) služila je kao šablon za sintezu RNK in vitro. Replikoni sadrže genetske elemente alfavirusa koji su potrebni za replikaciju RNK, ali nemaju one koji kodiraju genske proizvode neophodne za sklapanje čestica; strukturni proteini su umesto toga zamenjeni proteinom od interesa (bilo reporterom, kao što je SEAP ili GFP, ili imunogenom, kao što je RSV F protein pune dužine) i usled toga replikoni nisu u stanju da indukuju stvaranje infektivnih čestica. Promotor bakteriofaga (T7 ili SP6) uzvodno od cDNK alfavirusa olakšava sintezu replikonske RNK in vitro a ribozim virusa hepatitisa delta (HDV) odmah nizvodno od poli(A)-repa generiše ispravan 3'-kraj kroz svoju aktivnost samocepanja.
[0169] Nakon linearizacije plazmidne DNK nizvodno od HDV ribozima sa odgovarajućom restrikcionom endonukleazom, “run-off” transkripti su sintetizovani in vitro korišćenjem DNK-zavisne RNK polimeraze T7 ili SP6 bakteriofaga. Transkripcije su vršene 2 sata na 37°C u prisustvu 7,5 mM (T7 RNK polimeraza) ili 5 mM (SP6 RNK polimeraza) svakog od nukleozid trifosfata (ATP, CTP, GTP i UTP) prema uputstvima koja su data od strane proizvođača (Ambion). Nakon transkripcije, šablonska DNK je digestirana sa TURBO DNase (Ambion). Replikon RNK je precipitiran sa LiCl i rekonstituisan u vodi bez nukleaza. RNK bez kape je stavljena kapa posle transkripcije sa Vaccinia Capping Enzime (VCE) korišćenjem sistema za stavljanje kape ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies) kao što je navedeno u korisničkom priručniku; replikonima ograničenim na ovaj način dat je prefiks "v", npr. vA317 je replikon A317 koji je ograničen VCE. RNKsa post-transkripciono stavljenom kapom je precipitirana sa LiCl i rekonstituisana u vodi bez nukleaza. Koncentracija uzoraka RNK određena je merenjem OD260nm. Integritet in vitro transkripata je potvrđen elektroforezom denaturšućeg agaroznog gela.
Lipozomalna inkapsulacija
[0170] RNK je inkapsulirana u lipozomima napravljenim u suštini postupkom iz referenci 7 i 41. Lipozomi su napravljeni od 10% DSPC (cviterjonski), 40% DlinDMA (katjonski), 48% holesterola i 2% PEG-konjugovanog DMG. Ove proporcije se odnose na % molova u ukupnom lipozomu.
[0171] DlinDMA (1,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan) je sintetizovan korišćenjem procedure iz reference 2. DSPC (1,2-Diastearoil-sn-glicero-3-fosfoholin) je nabavljen od Genzime. Holesterol je dobijen od Sigma-Aldrich. PEG-konjugovani DMG (1,2-dimirstoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi(polietilen glikol), amonijum so), DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan, hloridna so) i DC-hol (3β-[N-(N',N'-dimetilaminoetan)-karbamoil]holesterol hidrohlorid) su iz Avanti Polar Lipids.
[0172] Ukratko, lipidi su rastvoreni u etanolu (2ml), replikon RNK je rastvoren u puferu (2ml, 100mM natrijum citrat, pH 6) i oni su pomešani sa 2 ml pufera nakon čega je usledio 1 sat ekvilibracije. Smeša je razblažena sa 6 ml pufera, a zatim filtrirana. Dobijeni proizvod je sadržao lipozome, sa ~95% efikasnosti inkapsulacije. SL. 2 prikazuje primer elektronske mikrografije lipozoma pripremljenih ovim metodama. Ovi lipozomi sadrže inkapsuliranu RNK koja kodira RSV F antigen pune dužine. Dinamičko rasipanje svetlosti jedne serije pokazalo je prosečan prečnik od 141 nm (po intenzitetu) ili 78 nm (po broju).
[0173] U jednom posebnoj postupku inkapsulacije, pripremljeni su sveži osnovni rastvori lipida u etanolu. Izmereno je 37 mg DlinDMA, 11,8 mg DSPC, 27,8 mg holesterola i 8,07 mg PEG-konjugovanog DMG-a i rastvoreno u 7,55 mL etanola. Korišćeno je pet različitih konjugovanih PEG-ova: PEG-500, PEG-750, PEG-1000, PEG-2000 ili PEG-3000. Sveže pripremljeni osnovni rastvor lipida je lagano mućkan na 37°C oko 15 min da bi se formirala homogena smeša. Zatim je 226,7 µL matične mase dodato u 1,773 mL etanola da bi se napravio radni osnovni rastvor lipida od 2 mL. Radni rastvor RNK od 2 mL je takođe pripremljen iz osnovnog rastvora od ~ 1 µg/µL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Tri staklene bočice od 20 mL (sa šipkama za mešanje) su isprane rastvorom RNaze Avai i isprane sa puno MilliQ vode pre upotrebe da bi se dekontaminirale bočice RNK. Jedna od bočica je korišćena za radni rastvor RNK, a druge za sakupljanje mešavine lipida i RNK (kao što je opisano kasnije).
[0174] Radni rastvori lipida i RNK su zagrevani na 37 ° C tokom 10 minuta pre nego što su stavljeni u 3cc luer-lok špriceve. 2 mL citratnog pufera (pH 6) je stavljeno u drugi špric od 3 cc. Špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na T mikser (PEEK<™>500 µm ID spoj) korišćenjem FEP cevi (fluorovani etilen-propilen; sve korišćene FEP cevi imale su unutrašnji prečnik 2 mm i spoljašnji prečnik 3 mm; dobijeno od Idek Health Science). Izlaz iz T miksera je takođe bio FEP cev. Treći špric koji je sadržao citratni pufer povezan je sa zasebnim komadom cevi. Svi špricevi su zatim pokretani brzinom protoka od 7 mL/min pomoću pumpe za špriceve. Izvodi epruvete su postavljeni da sakupljaju smeše u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi 1 sat. Zatim je smeša napunjena u špric od 5 cc, koji je postavljen na komad FEP cevi i u drugi špric od 5 cc sa jednakom dužinom FEP cevi, jednaka zapremina 100 mM citratnog pufera (pH 6) je stavljena. Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 7 mL/min korišćenjem špriceve pumpe i konačna smeša je sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani protiv 10-15 zapremina 1X PBS korišćenjem sistema za filtriranje tangencijalnog protoka (TFF) pre dobijanja konačnog proizvoda. TFF sistem i filterske membrane sa šupljim vlaknima su kupljeni od Spectrum Labs-a i korišćeni su u skladu sa uputstvima proizvođača. Filtracione membrane od šupljih vlakana sa presekom veličine pora od 100 kD i 20 cm<2>korišćena je površina. Za in vitro i in vivo eksperimentima, formulacije su razblažene do potrebne koncentracije RNK sa 1X PBS.
[0175] Procenat inkapsulirane RNK i koncentracije RNK je određen Quant-iT RiboGreen RNA kompletom reagensa (Invitrogen), prateći uputstva proizvođača. Standard ribozomske RNK koji se nalazi u kompletu je korišćen za generisanje standardne krive. Lipozomi su razblaženi 10× ili 100× u 1X TE puferu (iz kompleta) pre dodavanja boje. Odvojeno, lipozomi su razblaženi 10× ili 100× u 1X TE puferu koji sadrži 0,5% Triton X pre dodavanja boje (da bi se poremetili lipozomi i na taj način ispitala ukupna RNK). Zatim je jednaka količina boje dodata svakom rastvoru, a zatim je ~180 µL svakog rastvora nakon dodavanja boje stavljeno u duplikatu u ploču za kulturu tkiva sa 96 bunarčića. Fluorescencija (Ek 485 nm, Em 528 nm) je očitana na čitaču mikroploče. Sve formulacije lipozoma su dozirane in vivo na osnovu inkapsulirane količine RNK.
[0176] Da bi se dobili manji lipozomi, postupak šprica/cevi je zamenjen postupkom u kome se rastvori lipida i RNK mešaju u kanalima na mikrofluidnom čipu. Pripremljeni su sveži osnovni rastvori lipida u etanolu. Izmereno je 37 mg DlinDMA, 11,8 mg DSPC, 27,8 mg holesterola i 8,07 mg PEG-DMG i rastvoreno u 7,55 mL etanola. Sveže pripremljeni osnovni rastvor lipida je lagano mućkan na 37°C oko 15 min da bi se formirala homogena smeša. Zatim je 226,7 µL matične mase dodato u 1,773 mL etanola da bi se napravio radni osnovni rastvor lipida od 2 mL. Radni rastvor RNK od 4 mL je takođe pripremljen iz osnovnog rastvora od ~ 1 µg/µL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Četiri staklene bočice od 20 mL (sa šipkama za mešanje) su isprane rastvorom RNaze Avai i isprane sa dosta MilliQ vode pre upotrebe da bi se dekontaminirale bočice sa RNKzama. Dve bočice su korišćene za radni rastvor RNK (2 mL u svakoj bočici), a druge za sakupljanje mešavine lipida i RNK. Radni rastvori lipida i RNK su zagrevani na 37 ° C tokom 10 minuta pre nego što su stavljeni u 3cc luer-lok špriceve. Špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na Mitos Droplet junction Chip (stakleni mikrofluidni uređaj dobijen od Sirris-a, deo br. 3000158) korišćenjem PTFE cevi 0,03 inča ID × 1/16 inča OD, (Sirris) koristeći 4-smerni konektor. Dve struje RNK i jedna struja lipida pokretane su špric pumpama, a mešanje etanola i vodene faze je obavljeno na X spoju (100 µm × 105 µm) čipa. Brzina protoka sve tri struje je održavana na 1,5
4
mL/min, pa je odnos ukupnog vodenog i etanolnog protoka bio 2:1. Izlaz epruvete je postavljen tako da se mešavine sakupljaju u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi 1 sat. Zatim je smeša napunjena u špric od 5 cc koji je postavljen na komad PTFE cevi 0,03 inča ID × 1/16 inča OD i u drugi špric od 5 cc sa jednakom dužinom PTFE cevi, jednaku zapreminu 100 mM citratnog pufera (pH 6) je učitano. Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 3 mL/min korišćenjem špriceve pumpe i konačna smeša je sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani nasuprot 10-15 zapremina IX PBS korišćenjem TFF sistema pre dobijanja konačnog proizvoda. Korišćene su filtracione membrane od šupljih vlakana sa ograničenjem veličine pora od 100 kDa i 20 cm<2>površine. Za in vitro i in vivo eksperimente, formulacije su razblažene do potrebne koncentracije RNK sa IX PBS. Dok su lipozomi pripremljeni postupkom šprica/epruvete sa 75 µg RNK imali Z-prosečan prečnik (Zav) od 148 nm i indeks polidisperznosti (pdI) od 0,122, mešanje čipova dalo je lipozome sa Zav od 97 nm i pdI od 0. Udeo inkapsulirane RNK se blago smanjio sa 90% na 87%.
[0177] Pokazalo se da inkapsulacija u lipozomima štiti RNK od digestije sa RNKazom. Eksperimenti su koristili 3,8 mAU RNKaze A po mikrogramu RNK, inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi. RNKaza je inaktivirana proteinazom K na 55°C tokom 10 minuta. Zatim je dodata mešavina uzorka 1:1 zapr/zapr do 25:24:1 zapr/zapr/zapr, fenol:hloroform:izoamil alkohol da bi se RNK ekstrahovala iz lipida u vodenu fazu. Uzorci su mešani vorteksovanjem nekoliko sekundi, a zatim stavljeni na centrifugu na 15 minuta na 12 x RPM. Vodena faza (koja sadrži RNK) je uklonjena i korišćena za analizu RNK. Pre punjenja (400 ng RNK po bunarčiću) svi uzorci su inkubirani sa bojom za punjenje formaldehida, denaturisani 10 minuta na 65°C i ohlađeni na sobnu temperaturu. Ambion Millennium markeri su korišćeni za aproksimaciju molekulske težine RNK konstrukta. Gel je pušten na 90 V. Gel je obojen korišćenjem 0,1% SIBR gold prema uputstvima proizvođača u vodi ljuljanjem na sobnoj temperaturi 1 sat. SL. 1 pokazuje da RNaza potpuno vari RNK u odsustvu inkapsulacije (traka 3). RNK se ne može detektovati nakon inkapsulacije (traka 4) i nikakva promena se ne vidi ako se ovi lipozomi tretiraju sa RNKazom (traka 4). Nakon što se lipozomi tretirani RNKazom podvrgnu ekstrakciji fenola, vidi se nedigestovana RNK (traka 6). Čak i posle 1 nedelje na 4°C, RNK se mogla videti bez ikakve fragmentacije (Slika 4, strelica). Ekspresija proteina in vivo ostala je nepromenjena nakon 6 nedelja na 4 °C i jednog ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja. Na taj način RNK inkapsulirana u lipozomima je stabilna.
[0178] Da bi se procenila in vivo ekspresija RNK, enzim reporter (SEAP; izlučena alkalna fosfataza) je kodiran u replikonu, a ne imunogen. Nivoi ekspresije su mereni u serumima razblaženim 1:4 u puferu za razblaživanje IX Phospha-Light korišćenjem hemiluminiscentnog alkalnog fosfatnog supstrata. 8-10 nedelja starim BALB/c miševima (5/grupa) je ubrizgano intramuskularno dana 0, 50 µl po nozi sa dozom od 0,1 µg ili 1 µg RNK. Isti vektor je takođe primenjen bez lipozoma (u IX PBS bez RNKaze) u dozi od 1 ug. Takođe su testirani replikoni upakovani virionom. Replikoni upakovani u virione koji se ovde koriste (koji se nazivaju „VRPs“) dobijeni su metodama reference 42, gde je replikon alfavirusa izveden iz mutantnog VEEV ili himere izvedene iz genoma VEEV konstruisanog da sadrži 3' UTR od Sindbis virus i signal za pakovanje Sindbis virusa (PS), upakovani koelektroporacijom u BHK ćelije sa defektnim pomoćnim RNK koje kodiraju kapsid virusa Sindbis i glikoproteinske gene.
[0179] Kao što je prikazano na Sl. 5, inkapsulacija je povećala nivoe SEAP-a za oko 1⁄2 log pri dozi od 1 µg, a 6. dana ekspresija od 0,1 µg inkapsulirane doze odgovara nivoima viđenim sa 1 µg nekapsuliranom dozom. Do trećeg dana nivoi ekspresije su premašili one postignute sa VRP (kvadrati). Ovako izražena povećana kada je RNK formulisana u lipozomima u odnosu na kontrolu gole RNK, čak i pri 10 k nižoj dozi. Ekspresija je takođe bila veća u odnosu na VRP kontrolu, ali je kinetika ekspresije bila veoma različita (videti SLIKU 5). Isporuka RNK elektroporacijom je rezultirala povećanom ekspresijom u odnosu na kontrolu gole RNK, ali su ovi nivoi bili niži nego kod lipozoma.
[0180] Da bi se procenilo da li je efekat primećen u grupama lipozoma bio posledica samo komponenti lipozoma, ili je bio povezan sa inkapsulacijom, replikon je davan u inkapsuliranom obliku (sa dva različita protokola prečišćavanja, 0,1 µg RNK), ili pomešan sa lipozomima nakon njihovo formiranje (nekapsulirani "lipopleks", 0,1 µg RNK), ili kao gola RNK (1 µg). SL. 10 pokazuje da je lipopleks dao najniže nivoe ekspresije, pokazujući da je inkapsulacija neophodna za moćnu ekspresiju.
[0181] Dalji SEAP eksperimenti su pokazali jasan odgovor na dozu in vivo, sa ekspresijom koja se vidi nakon isporuke samo 1 ng RNK (Slika 6). Dalji eksperimenti upoređujući ekspresiju iz inkapsuliranih i golih replikona pokazali su da je 0,01 µg inkapsulirane RNK ekvivalentno 1 µg gole RNK. U dozi od 05 µg RNK, inkapsulirani materijal je dao 12 puta veću ekspresiju 6. dana; pri dozi od 0,1 µg nivoi doze su bili 24 puta veći 6. dana.
[0182] Umesto da se posmatraju prosečni nivoi u grupi, proučavane su i pojedinačne životinje. Dok nekoliko životinja nije reagovalo na gole replikone, inkapsulacija je eliminisala one koje nisu reagovale.
[0183] Dalji eksperimenti zamenili su DlinDMA sa DOTAP-om. Iako su DOTAP lipozomi
4
dali bolju ekspresiju od golog replikona, bili su inferiorni u odnosu na DlinDMA lipozome (2- do 3-struka razlika na dan 1).
[0184] Da bi se procenila in vivo imunogenost replikon je konstruisan da eksprimira F protein pune dužine iz respiratornog sincicijalnog virusa (RSV). Isporučen je go (1 µg), inkapsuliran u lipozome (0,1 ili 1 µg) ili upakovan u virione (10<6>IU; "VRP") u danima 0 i 21. Sl. 7 pokazuje titre anti-F IgG 2 nedelje nakon druge doze, a lipozomi jasno povećavaju imunogenost. SL. 8 prikazuje titre 2 nedelje kasnije, do kada nije bilo statističke razlike između inkapsulirane RNK od 0,1 µg, inkapsulirane RNK od 1 µg ili VRP grupe. Titri neutralizacije (mereni kao smanjenje plaka od 60%, "PRNT60") nisu se značajno razlikovali u ove tri grupe 2 nedelje nakon druge doze (Slika 9). SL. Slika 12 prikazuje titre IgG i PRNT 4 nedelje nakon druge doze.
[0185] SL.13 potvrđuje da RNK izaziva snažan odgovor CD8 T ćelija.
[0186] Dalji eksperimenti su upoređivali titre F-specifičnih IgG kod miševa koji su primali VRP, 0,1 µg RNK inkapsulirane lipozomima ili 1 µg RNK inkapsulirane lipozomima. Odnosi titra (VRP: lipozom) u različitim vremenima nakon druge doze bili su sledeći:
[0187] Stoga RNK inkapsulirana u lipozomima indukuje u suštini istu veličinu imunog odgovora kao što se vidi kod isporuke viriona.
[0188] Dalji eksperimenti su pokazali superiorne F-specifične IgG odgovore sa dozom od 10 µg, ekvivalentne odgovore za doze od 1 µg i 0,1 µg i niži odgovor sa dozom od 0,01 µg. SL. Slika 11 prikazuje titre IgG kod miševa koji primaju replikon u golom obliku u 3 različite doze, u lipozomima u 4 različite doze ili kao VRP (10<6>IU). Odgovor uočen sa RNK inkapsuliranom lipozomima od 1 µg bio je statistički beznačajan (ANOVA) u poređenju sa VRP, ali je veći odgovor primećen sa RNK inkapsuliranom u lipozomima od 10 µg bio je statistički značajan (p<0,05) u poređenju sa obe ove grupe.
[0189] Dalja studija je potvrdila da je 0,1 µg RNK inkapsulirane u lipozomima dalo mnogo veće anti-F IgG odgovore (15 dana nakon druge doze) od 0,1 µg isporučene DNK, i čak je bilo imunogenije od 20 µg plazmidne DNK koji kodira F antigen, isporučuje se elektroporacijom (Elgen<™>Sistem za isporuku DNK, Inovio).
4
Postupci proizvodnje lipozoma
[0190] Generalno, korišćeno je osam različitih postupaka za pripremu lipozoma prema pronalasku. Oni se u tekstu pominju kao postupci (A) do (H) i razlikuju se uglavnom u odnosu na korake filtracije i TFF. Detalji su sledeći:
(A) Pripremljeni su sveži osnovni rastvori lipida u etanolu.37 mg DlinDMA, 11,8 mg DSPC, 27,8 mg holesterola i 8,07 mg PEG DMG 2000 je izmereno i rastvoreno u 7,55 mL etanola. Sveže pripremljeni osnovni rastvor lipida je lagano mućkan na 37°C oko 15 min da bi se formirala homogena smeša. Zatim je 755 µL matične mase dodato u 1,245 mL etanola da bi se napravio radni osnovni rastvor lipida od 2 mL. Ova količina lipida je korišćena za formiranje lipozoma sa 250 µg RNK. Radni rastvor RNK od 2 mL je takođe pripremljen iz osnovnog rastvora od ∼ 1 µg/µL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Tri staklene bočice od 20 mL (sa šipkama za mešanje) su isprane rastvorom RNase Avai (Molecular BioProducts, San Dijego, Kalifornija) i isprane sa dosta MilliQ vode pre upotrebe da bi se dekontaminirale bočice RNaze. Jedna od bočica je korišćena za radni rastvor RNK, a druge za sakupljanje mešavine lipida i RNK (kao što je opisano kasnije). Radni rastvori lipida i RNK su zagrevani na 37 ° C tokom 10 minuta pre nego što su stavljeni u 3cc luer-lok špriceve. 2 mL citratnog pufera (pH 6) je stavljeno u drugi špric od 3 cc. Špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na T mikser (PEEK<™>500 µm ID spoj, Idex Health Science, Oak Harbor, WA) korišćenjem FEP cevi (fluorovani etilen-propilen; al FEP cev ima unutrašnji prečnik 2 mm × spoljašnji prečnik 3 mm, isporučuje Idex Health Science). Izlaz iz T miksera je takođe bio FEP cev. Treći špric koji je sadržao citratni pufer povezan je sa zasebnim komadom FEP cevi. Svi špricevi su zatim pokretani brzinom protoka od 7 mL/min pomoću pumpe za špriceve. Izvodi epruvete su postavljeni da sakupljaju smeše u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi 1 sat. 4 ml smeše je stavljeno u špric od 5 cc, koji je bio spojen na komad FEP cevi i u drugom špricu od 5 cc spojenom na FEP cev iste dužine, jednaka količina 100 mM citratnog pufera (pH 6) je bila napunjena. Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 7 mL/min korišćenjem špriceve pumpe i konačna smeša je sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim, smeša sakupljena iz drugog koraka mešanja (lipozomi) je propuštena kroz Mustang K membranu (podloga za izmenu anjona koja
4
vezuje i uklanja anjonske molekule, dobijena od Pall Corporation, AnnArbor, MI, SAD). Pre prolaska kroz lipozome, 4 mL 1 M NaOH, 4 mL 1 M NaCl i 10 mL 100 mM citratnog pufera (pH 6) su sukcesivno propušteni kroz Mustang membranu. Lipozomi su zagrevani 10 minuta na 37° C pre prolaska kroz membranu. Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani nasuprot 10-15 zapremina 1X PBS koristeći TFF pre nego što je dobijen krajnji proizvod. TFF sistem i filterske membrane sa šupljim vlaknima su kupljeni od Spectrum Labs i korišćeni su u skladu sa uputstvima proizvođača. Korišćene su polisulfonske filterske membrane od šupljih vlakana (broj dela P/N: X1AB-100-20P) sa graničnom veličinom pora od 100 kD i površinom od 8 cm<2>. Za in vitro i in vivo eksperimente, formulacije su razblažene do potrebne koncentracije RNK sa 1X PBS.
(B) Kao postupak (A) osim što je, nakon ljuljanja, 226,7 µL stok materijala dodato u 1,773 mL etanola da bi se napravio radni lipidni osnovni rastvor od 2 mL, čime je modifikovan odnos lipid:RNK.
(C) Kao postupak (B) osim što je Mustang filtracija izostavljena, tako da su lipozomi prešli iz staklene bočice od 20 mL u TFF dijalizu.
(D) Kao postupak (C) osim što je TFF koristio polietersulfonske (PES) membrane od šupljih vlakana (broj dela P-C1-100E-100-01N) sa graničnom veličinom pora od 100 kD i površonom od 20 cm<2>.
(E) Kao postupak (D) osim što je korišćena Mustang membrana, kao u postupku (A). (F) Kao postupak (A) osim što je Mustang filtracija izostavljena, tako da su lipozomi prešli iz staklene bočice od 20 mL u TFF dijalizu.
(G) Kao postupak (D) osim što je radni rastvor RNK od 4 mL pripremljen iz osnovnog rastvora od ~ 1 µg/µL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Zatim su četiri staklene bočice od 20 mL pripremljene na isti način. Dve od njih su korišćene za radni rastvor RNK (2 mL u svakoj bočici), a drugi za sakupljanje mešavine lipida i RNK, kao u (C). Umesto da koriste T mikser, špricevi koji sadrže RNK i lipide su povezani na Mitos Droplet junction Chip (stakleni mikrofluidni uređaj dobijen od Sirris, deo br.
3000158) korišćenjem PTFE cevi (0,03 inča unutrašnjeg prečnika × 1/16 inča spoljašnjeg prečnika) koristeći 4-smerni konektor (Sirris). Dve struje RNK i jedna struja lipida pokretane su špric pumpama, a mešanje etanola i vodene faze je obavljeno na X spoju (100 µm × 105 µm) čipa. Brzina protoka sva tri toka je održavana na 1,5 mL/min, pa je odnos ukupnog vodenog i etanolnog protoka bio 2:1. Izlaz epruvete je postavljen tako da se mešavine sakupljaju u staklenu bočicu od 20
4
mL (uz mešanje). Mešalica je izvađena i etanol/vodeni rastvor je ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi 1 h. Zatim je smeša napunjena u špric od 5 cc, koji je postavljen na drugi komad PTFE cevi; u drugom špricu od 5 cc sa jednakom dužinom PTFE cevi, stavljena je jednaka zapremina 100 mM citratnog pufera (pH 6). Dva šprica su pokretana brzinom protoka od 3 mL/min korišćenjem pumpe šprica i konačna smeša je sakupljena u staklenu bočicu od 20 mL (uz mešanje). Zatim, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizovani protiv 10-15 zapremina IX PBS koristeći TFF, kao u (D).
(H) Kao postupak (A) osim što je 2 mL radnog osnovnog rastvora lipida napravljeno mešanjem 120,9 µL lipidnog osnovnog rastvora sa 1,879 mL etanola. Takođe, nakon mešanja u T mikseru, lipozomi iz bočice od 20 mL su stavljeni u Pierce Slide-A-Lizer kasetu za dijalizu (Thermo Scientific, ekstra jačine, 0,5-3 mL kapaciteta) i dijalizirani nasuprot 400-500 mL 1X PBS preko noći na 4°C u autoklaviranoj plastičnoj posudi pre nego što se dobije konačni proizvod.
RSV imunogenost
[0191] Replikon vA317 koji se samoreplicira i kodira RSV F protein davan je BALB/c miševima, 4 ili 8 životinja po grupi, bilateralnim intramuskularnim vakcinacijama (50 µL po nozi) 0. i 21. dana sa replikonom (1 µg) samim ili formulisanim kao lipozomi sa DlinDMA ("RV01") ili DOTAP ("RV13") ili lipidom prikazanim na Sl. 14 („RV05“). RV01 lipozomi su imali 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% holesterola i 2% PEG-DMG, ali sa različitim količinama RNK. RV05 lipozomi su imali ili 40% RV05, 10% DSPC, 48% holesterola i 2% PEG-DMG ili 60% RV05, 38% holesterola i 2% PEG-DMG. RV13 lipozomi su imali 40% DOTAP, 10% DOPE, 48% holesterola i 2% PEG-DMG. U svim slučajevima PEG je bio PEG-2000 (tj. 2kDa PEG). Za poređenje, gola plazmidna DNK (20 µg) koja eksprimira isti RSV-F antigen je isporučena ili korišćenjem elektroporacije ili sa RV01(10) lipozomima (0,1 µg DNK). Četiri miša su korišćena kao naivna kontrolna grupa.
[0192] Lipozomi su pripremljeni metodom (A) ili metodom (B). Za neke lipozome napravljene metodom (A) korišćena je dupla ili polovina količine RNK. Z prosečni prečnik čestica i indeks polidisperznosti bili su:
4
[0193] Serum je sakupljen za analizu antitela 14., 36. i 49. dana. Slezine su sakupljene od miševa 49. dana za analizu T ćelija.
[0194] F-specifični titri IgG u serumu (GMT) bili su sledeći:
[0195] Udeo T ćelija koje su pozitivne na citokine i specifične za RSV F51-66 peptid je sledeći, pokazujući samo brojke koje su statistički značajno iznad nule:
[0196] Stoga su formulacije lipozoma značajno poboljšale imunogenost u odnosu na gole RNK kontrole, što je određeno povećanjem F-specifičnih IgG titara i frekvencije T ćelija. Plazmidna DNK formulisana sa lipozomima, ili isporučena gola pomoću elektroporacije, bila je značajno manje imunogena od samoreplicirajuće RNK formulisane lipozomima.
[0197] Dalji RV01 lipozomi su pripremljeni metodom (H), ponovo korišćenjem 2kDa PEG konjugovanog sa DMG i ili inkapsulacijom 150 µg RNK (vA375 replikon koji kodira površinski fuzioni glikoprotein RSV) ili kapsuliranjem samo pufera. Tako su ovi lipozomi imali 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% Chol i 2% PEG-DMG. Veličine i inkapsulacija su bile sledeće:
[0198] Lipozomi su davani BALB/c miševima (10 po grupi) bilateralnom intramuskularnom injekcijom (50 ul po nozi) dana 0 i 21. Doze su bile 0,01, 0,03, 0,1, 0,3 ili 1 ug. F-specifični titri IgG u serumu i PRNT60 (GMT) bili su sledeći, 2 nedelje nakon prve ili druge injekcije:
1
Imunogenost citomegalovirusa
[0199] RV01 lipozomi sa DLinDMA kao katjonskim lipidom i 2kDa PEG korišćeni su za isporuku RNK replikona koji kodiraju CMV glikoproteine. Replikon "vA160" kodira glikoproteine pune dužine H i L (gH/gL), dok replikon "vA322" kodira rastvorljivi oblik (gHsol/gL). Dva proteina su pod kontrolom odvojenih subgenomskih promotera u jednom replikonu; istovremena primena dva odvojena vektora, jednog koji kodira gH i jednog koji kodira gL, nije dala dobre rezultate.
[0200] BALB/c miševima, 10 po grupi, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0, 21. i 42. dana sa VRP-ovima koji izražavaju gH/gL (1×10<6>IU), VRP-ovi koji izražavaju gHsol/gL (1×10<6>IU) i PBS kao kontrole. Dve test grupe su primile 1 µg replikona vA160 ili vA322 formulisanog u lipozomima (40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% hol, 2% PEG-DMG; napravljen korišćenjem postupka (D) ali sa veličinom serije RNK od 150 µg).
[0201] Lipozomi vA160 su imali Zav prečnik od 168,8 nm, pdI od 0,144 i 87,4% inkapsulacije. Lipozomi vA322 su imali Zav prečnik od 162 nm, pdI od 0,131 i 90% inkapsulaciju.
[0202] Replikoni su bili u stanju da eksprimiraju dva proteina iz jednog vektora.
[0203] Serumi su sakupljeni za imunološku analizu 63. dana (3vp3). Titri neutralizacije CMV (recipročna vrednost razblaženja seruma koja dovodi do 50% smanjenja broja pozitivnih žarišta virusa po bunarčiću, u odnosu na kontrole) bili su sledeći:
[0204] RNK koja je eksprimirala ili punu dužinu ili rastvorljivu formu CMV gH/gL kompleksa je tako izazvala visoke titre neutralizujućih antitela, kao što je ispitano na epitelnim ćelijama. Prosečni titri izazvani RNK inkapsuliranim u lipozomima bili su barem toliko visoki kao za odgovarajuće VRP.
[0205] Ponovljeni eksperimenti su potvrdili da je replikon bio u stanju da eksprimira dva proteina iz jednog vektora. Replikon RNK je dao titar 3vp3 od 11457, u poređenju sa 5516 sa VRP.
2
Kinetika ekspresije
[0206] Za proučavanje kinetike ekspresije proteina nakon injekcije korišćen je samoreplicirajući RNK replikon ("vA311") koji eksprimira reporterski gen luciferaze (luc). BALB/c miševi, 5 životinja po grupi, primili su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0. dana sa:
Grupa 1 DNK koja eksprimira luciferazu, isporučena pomoću elektroporacije (10 µg) Grupa 2 samoreplicirajuća RNK (1 µg) formulisana u lipozomima (40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% holesterol, 2% PEG-2000 konjugovan sa DMG
Grupa 3 samoreplicirajuća RNK (1µg) formulisana sa katjonskom nanoemulzijom (CNE17) Grupa 4 samoreplicirajuća RNK (1µg) formulisana sa različitom katjonskom nanoemulzijom Grupa 5 VRP (1×10<6>IU) koji izražava luciferazu
[0207] Pre vakcinacije, miševi su depilirani. Miševi su anestezirani (2% izofluran u kiseoniku), dlake su prvo uklonjene električnim brijačem, a zatim hemijskim Nair. Podaci o bioluminiscenciji su zatim dobijeni korišćenjem sistema za snimanje Xenogen IVIS 200 (Caliper Life Sciences) dana 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63 i 70. Pet minuta pre snimanja miševima je intraperitonealno ubrizgano 8 mg/kg rastvora luciferina. Životinje su zatim anestezirane i prebačene u sistem za snimanje. Vremena dlikanja su održavana konstantnim jer je bioluminiscencijski signal meren hlađenom CCD kamerom.
[0208] U vizuelnom smislu, primećeno je da ćelije koje eksprimiraju luciferazu ostaju prvenstveno na mestu ubrizgavanja RNK, a životinje snimljene nakon uklanjanja četvorostrukih ćelija nisu pokazale nikakav signal.
[0209] U kvantitativnom smislu, ekspresija luciferaze je merena kao prosečna radijansa tokom perioda od 70 dana (p/s/cm<2>/sr), a rezultati su bili sledeći za 5 grupa:
[0210] Samoreplicirajuća RNK formulisana katjonskim nanoemulzijama pokazala je merljivu bioluminiscenciju 3. dana, koja je dostigla vrhunac 7. dana, a zatim smanjena na osnovne nivoe od 28. do 35. dana. Kada je formulisana u lipozomima, RNK je pokazala merljivu bioluminiscenciju 3. dana, koja je dostigla vrhunac na dan 7 i smanjena na osnovne nivoe do 63. dana. RNK isporučena korišćenjem VRPs pokazala je poboljšanu bioluminiscenciju 21. dana u poređenju sa formulisanom RNK, ali je ekspresija smanjena na osnovne nivoe do 28. dana. Elektroporisana DNK je pokazala najviši nivo bioluminiscencije u svim vremenskim tačkama izmereni i nivoi bioluminiscencije se nisu smanjili na osnovne nivoe tokom 70 dana eksperimenta.
Zapremina isporuke
[0211] Hidrodinamička isporuka koristi silu koja se stvara brzim ubrizgavanjem velike zapremine rastvora da bi se prevazišle fizičke barijere ćelijskih membrana koje sprečavaju ulazak velikih i za membrane nepropusnih jedinjenja u ćelije. Ranije se pokazalo da je ovaj fenomen koristan za intracelularnu isporuku DNK vakcina.
[0212] Tipična davana zapremina za miša za intramuskularnu injekciju je 50 µl u zadnju nogu, što je relativno velika zapremina za mišiće noge miša. Nasuprot tome, ljudska intramuskularna doza od ~0,5 ml je relativno mala. Ako bi imunogenost kod miševa zavisila od zapremine, onda bi efikasnost replikonskih vakcina mogla biti posledica, barem delimično, hidrodinamičkih sila, što ne bi bilo ohrabrujuće za upotrebu istih vakcina kod ljudi i većih životinja.
[0213] Replikon vA317 je isporučen BALB/c miševima, 10 po grupi, bilateralnim intramuskularnim vakcinacijama (5 ili 50 po nozi) 0. i 21. dana:
Grupa 1 je primila goli replikon, 0,2 µg u 50 µL po nozi
Grupa 2 je primila goli replikon, 0,2 µg u 5 µL po nozi
Grupa 3 je primila replikon formulisan u emulziji (0,2 µg, 50 µL po nozi)
4
Grupa 4 je primila replikon formulisan u emulziji (0,2 µg, 5 µL po nozi)
Grupa 5 je primila replikon formulisan u lipozomima (0,2 µg, 50 µL po nozi)
Grupa 6 je primila replikon formulisan u lipozomima (0,2 µg, 5 µL po nozi)
[0214] Lipozomi za grupe 5 i 6 su bili 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% holesterol i 2% PEG-2000 konjugovan sa DMG.
[0215] Serum je sakupljen za analizu antitela 14. i 35. dana. F-specifični serumski IgG GMT su bili:
[0216] Dakle, imunogenost formulisanog replikona nije varirala u zavisnosti od isporučenog volumena, što ukazuje da se ove RNK vakcine ne oslanjaju na hidrodinamičku isporuku za svoju efikasnost.
Pamučni pacovi
[0217] Studija je sprovedena na pamučnim pacovima (Sigmodon hispidis) umesto miševa. Inkapsulacija lipozoma sa dozom od 1 µg povećala je F-specifične titre IgG za 8,3 puta u poređenju sa golom RNK i povećala titre PRNT za 9,5 puta. Veličina odgovora antitela bila je ekvivalentna onom indukovanom sa 5×10<6>IU VRP. I gola i RNK inkapsulirana u lipozomima su bile u stanju da zaštite pamučne pacove od izazivanja RSV (1×10<5>jedinice koje formiraju plak), smanjujući virusno opterećenje pluća za najmanje 3,5 log. Enkapsulacija je povećala smanjenje za oko 2 puta.
[0218] Dalji rad na pamučnim pacovima koristio je četiri različita replikona: vA317 eksprimira RSV-F pune dužine; vA318 eksprimira skraćeni (transmembranski i citoplazmatski rep uklonjen) RSV-F; vA142 eksprimira RSV-F sa deletiranim fuzionim peptidom; vA140 eksprimira skraćeni RSV-F takođe bez njegovog peptida. Pamučnim pacovima, 4 do 8 životinja po grupi, date su intramuskularne vakcinacije (100 µL u jednoj nozi) 0. i 21. dana sa četiri različita replikona u dve doze (1,0 i 0,1 µg) formulisanim u lipozomima napravljenim korišćenjem 2 kDa PEG-konjugovanog DMG postupkom (D), ali sa veličinom serije RNK od 150 µg. Kontrolne grupe su primile RSV-F podjediničnu proteinsku vakcinu (5 µg) sa adjuvansom sa stipsom (8 životinja/grupi), VRPs koji eksprimiraju RSV-F pune dužine (1×10<6>IU, 8 životinja/grupi), ili naivna kontrola (4 životinje/grupa). Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 21. i 34. dana.
[0219] F-specifični titri IgG u serumu i titri antitela koji neutrališu serum RSV 21. i 34. dana bili su:
[0220] Sva četiri replikona procenjena u ovoj studiji (vA317, vA318, vA142, vA140) bila su imunogena kod pamučnih pacova kada su isporučeni lipozomom, iako su titri neutralizacije seruma bili najmanje deset puta niži od onih indukovanih proteinskim vakcinama sa adjuvansom ili VRP. Lipozomske/RNK vakcine su izazvale serumska F-specifična IgG i RSV neutrališuća antitela nakon prve vakcinacije, a druga vakcinacija je efikasno pojačala odgovor. F-specifični IgG titri posle druge vakcinacije sa 1 µg replikona bili su 2 do 3 puta veći nego posle druge vakcinacije sa 0,1 µg replikona. Četiri replikona su izazvala uporedive titre antitela, što sugeriše da su RSV-F pune dužine i skraćeni, svaki sa ili bez fuzionog peptida, slično imunogeni kod pamučnih pacova.
[0221] Dalji rad na pamučnim pacovima ponovo je koristio replikone vA317, vA318 i vA142. Pamučnim pacovima, 2-8 životinja po grupi, date su intramuskularne vakcinacije (100 µL na jednoj nozi) 0. i 21. dana sa replikonima (0,1 ili 1 µg) inkapsuliranim u RV01 lipozome (sa PEG-2000) napravljenim postupkom (D) ali sa veličinom serije od 150 µg RNK. Kontrolne grupe su primile RSV-F podjediničnu proteinsku vakcinu (5 µg) sa adjuvansom sa stipsom ili VRPs koji eksprimiraju RSV-F pune dužine (1×10<6>IU, 8 životinja/grupa). Sve ove životinje su primile treću vakcinaciju (56. dan) sa RSV-F podjediničnom proteinskom vakcinom (5 µg) sa adjuvansom sa stipsom. Pored toga, postojala je i naivna kontrola (4 životinje/grupa). Dodatno, dodatnoj grupi su date bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0. i 56. dana sa 1 µg vA317 RNK u lipozomima, ali nije primila treću vakcinu sa podjediničnom proteinskom vakcinom.
[0222] Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 21, 35, 56, 70, plus dana 14, 28 i 42 za dodatnu grupu. F-specifični titri IgG u serumu (GMT) bili su sledeći:
[0223] Titri neutralizacije seruma su bili sledeći (60% titri neutralizacije RSV za 2 grupe od 3-4 životinje po grupi, GMT od ove 2 grupe po grupi):
[0224] Titri seruma i titri neutralizacije za dodatnu grupu bili su sledeći:
[0225] Tako su replikoni potvrđeni kao imunogeni kod pamučnih pacova, izazivajući serumska F-specifična IgG i RSV neutrališuća antitela nakon prve vakcinacije. Druga vakcinacija je efikasno pojačala odgovore. F-specifični IgG titri posle druge vakcinacije sa 1,0 µg replikona bili su 1,5 do 4 puta veći nego posle druge vakcinacije sa 0,1 µg replikona.
[0226] Treća vakcinacija (protein 56. dana) nije povećala titre kod pamučnih pacova koji su prethodno vakcinisani sa F trimer podjedinicom stipsa, ali je pružila veliko povećanje titra kod pamučnih pacova koji su prethodno vakcinisani replikonom. U većini slučajeva, titri neutralizacije RSV seruma nakon dve vakcinacije replikona praćene povećanjem proteina bili su jednaki ili veći od titara izazvanih dve ili tri uzastopne vakcinacije proteina.
[0227] Ova studija je takođe procenila kinetiku odgovora antitela na 1,0 µg vA317. F-specifični serumski IgG i RSV neutralizacioni titri indukovani jednom vakcinacijom dostigli su svoj vrhunac oko 21. dana i održavali su se tokom najmanje 56. dana (50-70% pad titra F-specifičnog IgG, mala promena u titru neutralizacije RSV). Homologna druga vakcinacija je data ovim životinjama 56. dana i povećani titri antitela do nivoa koji je najmanje jednak onom postignutom kada je druga vakcinacija primenjena 21. dana.
[0228] Dalji eksperimenti su uključivali virusni izazov. Replikon vA368 kodira površinski fuzioni glikoprotein RSV pune dužine sa deltiranim fuzionim peptidom, sa ekspresijom koju pokreće EV71 IRES. Pamučnim pacovima, 7 po grupi, date su intramuskularne vakcinacije (100 µL po nozi) 0. i 21. dana sa vA368 u lipozomima pripremljenim metodom (H), 175 µg RNK veličine serije, ili sa VRP-ovima koji imaju isti replikon. Lipozomi su uključivali 2kDa PEG, konjugovan sa DMG. Kontrolna grupa je primila 5 µg proteina sa alum adjuvansom, a uključena je i naivna kontrolna grupa.
[0229] Sve grupe su primile intranazalni izazov (i.n.) sa 1×10<6>PFU RSV četiri nedelje nakon konačne imunizacije. Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 21, 35 dana. Titri virusa pluća su mereni 5 dana nakon izazivanja. Rezultati su bili sledeći:
[0230] Tako je RNK vakcina smanjila virusno opterećenje pluća za više od tri loga, sa približno 10<6>PFU/g kod nevakcinisanih kontrolnih pamučnih pacova na manje od 10<3>PFU/g kod vakcinisanih pamučnih pacova.
Studija velikih sisara
[0231] Studija na velikim životinjama je sprovedena na govedima. Telad (4-6 nedelja stara, ~60-80 kg, 5 po grupi) su imunizovana sa 66 µg replikona vA317 koji kodira RSV F protein pune dužine u danima 0, 21, 86 i 146. Replikoni su formulisani unutar lipozoma napravljenih sa postupkom (E) ali sa veličinom serije RNK od 1,5 mg; imali su 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% holesterola i 2% PEG-2000 konjugovanog sa DMG. Kao negativna kontrola korišćen je samo PBS, a kao pozitivna kontrola korišćena je licencirana vakcina („Triangle 4“ iz Fort Dodge, koji sadrži ubijeni virus). Sva telad su 146. dana primila 15 µg F proteina sa MF59 emulzijom kao adjuvansom.
[0232] RNK vakcine su kodirale humani RSV F, dok vakcina "Triangle 4" sadrži goveđi RSV F, ali RSV F protein je visoko očuvan između BRSV i HRSV.
[0233] Telad su primila 2 ml svake eksperimentalne vakcine, primenjene intramuskularno po 2×1 ml na svakoj strani vrata. Nasuprot tome, vakcina "Triangle 4" je data kao pojedinačna doza od 2 ml u vrat.
[0234] Serum je sakupljen za analizu antitela 0, 14, 21, 35, 42, 56, 63, 86, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 146, 160, 167, 174, 18, 181. i 202. Ako je pojedinačna životinja imala titar ispod granice detekcije, dodeljen joj je titar 5.
[0235] SL.15 prikazuje F-specifične IgG titre tokom 210 dana. Tokom prva 63 dana replikon RNK je bio imunogen kod krava preko lipozoma, iako je davao niže titre od licencirane vakcine. Sve vakcinisane krave su pokazale F-specifična antitela posle druge doze, a titri su bili veoma stabilni u periodu od 2 do 6 nedelja nakon druge doze (i bili su posebno stabilni za RNK vakcine). Titri do 202. dana su bili sledeći:
[0236] Titri antitela koji neutrališu serum RSV bili su sledeći:
[0237] Materijal korišćen za drugu dozu lipozoma nije bio sveže pripremljen, a ista serija RNK je pokazala smanjenje potencije u studiji imunogenosti kod miševa. Stoga je moguće da bi vakcina bila imunogenija da je za sve vakcinacije korišćen svež materijal.
[0238] Kada su testirani sa komplementom, neutralizujuća antitela su otkrivena kod svih vakcinisanih krava. U ovom testu, sva vakcinisana telad imala su dobre titre neutralizujućih antitela posle druge RNK vakcinacije. Dodatno, RNK vakcina je izazvala F-specifične serumske IgG titre koji su otkriveni kod nekoliko teladi posle druge vakcinacije i kod svih teladi posle treće.
[0239] RSV-F sa adjuvansom MF59 je bio u stanju da pojača IgG odgovor kod svih prethodno vakcinisanih teladi i da poveća titre neutralizacije nezavisne od komplementa teladi koja su prethodno vakcinisana sa RNK.
[0240] Dokaz koncepta za RNK vakcine kod velikih životinja je posebno važan u svetlu gubitka potencije koji je ranije primećen kod vakcina zasnovanih na DNK kada se prelazi sa modela malih životinja na veće životinje i ljude. Tipična doza za DNK vakcinu krava bi bila 0,5-1 mg [43, 44] i stoga je veoma ohrabrujuće da su imuni odgovori indukovani sa samo 66 µg RNK.
Efekat dužine PEG
[0241] Kao što je prethodno pomenuto, lipozomi su pripremljeni korišćenjem DMG na koji je konjugovano pet različitih PEG-ova. Prosečna molekulska težina PEG-a bila je 500Da, 750Da, 1kDa, 2kDa ili 3kDa.
[0242] Lipozomi formirani korišćenjem najkraćih PEG-ova (500Da i 750Da) bili su nestabilni ili agregirani tokom TFF prečišćavanja. PEG-750 je dao lipozome sa značajno većim Z-prosečan prečnik prečnikom (669 nm) i indeksom polidisperznosti (0,21), sa 77% inkapsulacije. PEG-500 lipozomi su vidljivo agregirani u rastvoru tokom TFF procesa i eksperiment je prekinut. Stoga su ovi kratki PEG lipozomi bili nestabilni, ali duži PEG su formirali stabilne lipozome.
[0243] Različite dužine PEG (slika 16) imale su mali uticaj na prečnik lipozoma i indeks polidisperznosti. Z-prosečan prečnik bio je 197 nm (0,119 pdI) za 1 kDa PEG, 142 nm (0,137 pdI) za 2 kDa PEG i 147 nm (0,075 pdI) za 3 kDa PEG. Inkapsulacija RNK se postepeno povećavala kako se dužina PEG-a povećavala, sa 81,7% na 85,9% do 91,5% (iako ovaj odnos nije uvek primećen u narednim eksperimentima).
[0244] Lipozomi su davani miševima intramuskularnom injekcijom na dan 0. Nivoi SEAP u serumu su mereni 1, 3 i 6 dana hemiluminiscentnim testom. Kao što je prikazano na Sl.3, sve tri dužine PEG-a su bile efikasne, ali je variranje dužine PEG-a imalo izvestan uticaj na nivoe SEAP-a u serumu, pri čemu je PEG 2000 davao najveću ekspresiju.
Različiti lipidi i PEG dužine
[0245] Replikon vA317 je davan u lipozomima koji imaju niz različitih lipida sa različitim PEG dužinama. Svi lipozomi su imali 40% DlinDMA, 10% DSPC i 48% holesterola, ali preostalih 2% je bilo različito, sa različitim PEGilovanim lipidima (npr. Sl. 17A do 17E) i različite dužine PEG.
[0246] Fizičke karakteristike lipozoma, napravljenih metodom (H), bile su:
1
[0247] BALB/c miševima, 8 po grupi, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0. i 21. dana sa replikonom, bilo golim (1 µg) ili inkapsuliranim u ovim lipozomima (0,1 µg). Serum je sakupljen za analizu antitela 14. i 35. dana.
[0248] F-specifični titri IgG u serumu (GMT) bili su sledeći, 2 nedelje nakon dve injekcije (2vp1):
[0249] Rezultati pokazuju trend, koji ukazuje da su grupe PEG glava veće molekularne težine imunogenije. Kako se dužina DMG-konjugovanog PEG-a povećava sa 1000Da na 3000Da, 2vp2 F-specifični IgG titri se povećavaju sa 7412 na 15659 na 22378.
[0250] Promena regiona linkera iz estra u etar nije značajno uticala na titre. Takođe, pri istoj
2
molekulskoj težini glave grupe (2000) postojao je trend da povećanje dužine lipidnih repova smanjuje titre (H sa C14 dialkil nasuprot I sa C18 dialkilom). Zamena repa PEG di-alkil lipida holesterolom imala je mali uticaj na imunogenost (A sa DMG nasuprot G sa holesterolom).
[0251] Slični eksperimenti su izvedeni sa različitim lipidima u kojima je 2kDa PEG-a podeljen u grupe 2k 1kDa (Slika 18, sa ukupnim MV u pravougonikom zaokruženom regionu 2000). Replikon vA317 je ponovo korišćen, sa BALB/c miševima, 8 po grupi, kojima su date bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) dana 0 i 21 sa 1 µg gole RNK ili 0,1 µg RNK inkapsulirane lipozomima. Svi lipozomi su imali 40% katjonskog lipida (DlinDMA), 10% DSPC i 48% holesterola, ali preostalih 2% je bilo različito, sa različitim PEGilovanim lipidima (ali svi sa 2kDa PEG). Napravljeni su metodom (H).
[0252] Fizičke karakteristike lipozoma su bile:
[0253] Dalji lipozomi su napravljeni sa RV05. Lipozomi su imali 40% katjonskog lipida (RV05) i 2% PEGiliranog DMG (2kDa PEG), dok su preostale komponente varirale (ali je holesterol uvek bio uključen). Lipozomi su napravljeni postupkom (H) ali sa pH 5. Fizičke karakteristike su:
[0254] BALB/c miševima, 8 po grupi, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 µL po nozi) 0. i 21. dana sa replikonom, bilo golim (1 µg) ili inkapsuliranim (0,1 µg). Serum je sakupljen za analizu antitela 14. i 35. dana. F-specifični titri IgG u serumu (GMT) bili su sledeći, 2 nedelje nakon dve injekcije (2vp1):
[0255] Cepanje grupa PEG glava je na taj način snizilo in vivo titre. Uključivanje dvostruke veze (1 stepen nezasićenosti po alkilnom repu) u repovima PEG lipida povećalo je titre IgG, 6 puta 14. i 7 puta 35. dana. Za katjonski lipid sa asimetričnim lipidnim repovima (alkil holesterol), promena neutralnog lipida iz DSPC (zasićeni C18 lipidni rep) u 18:2 ili 18:3 PC (sa 2 i 3 nezasićene dvostruke veze po repu) povećao je ukupne titre IgG. Uporedivi rezultati su primećeni zamenom DSPC sa DPiPE.
[0256] Podrazumeva se da je pronalazak opisan samo kao primer i da se modifikacije mogu izvršiti dok ostaju unutar obima i duha pronalaska.
Tabela 1: korisni fosfolipidi
4
REFERENCE
[0257]
[1] Johanning et al. (1995) Nucleic Acids Res 23:1495-1501.
[2] Heyes et al. (2005) J Controlled Release 107:276-87.
[3] WO2005/121348.
[4] Liposomes: Methods and Protocols, Volume 1: Pharmaceutical Nanocarriers: Methods and Protocols. (ed. Weissig). Humana Press, 2009. ISBN 160327359X.
[5] Liposome Technology, volumes I, II & III. (ed. Gregoriadis). Informa Healthcare, 2006.
[6] Functional Polymer Colloids and Microparticles volume 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes). (eds.Arshady & Guyot). Citus Books, 2002.
[7] Jeffs et al. (2005) Pharmaceutical Research 22 (3):362-372.
[8] WO2005/113782.
[9] WO2011/005799.
[10] El Ouahabi et al (1996) FEBS Letts 380:108-12.
[11] Giuliani et al (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103(29):10834-9.
[12] WO2009/016515.
[13] WO02/34771.
[14] WO2005/032582.
[15] WO2010/119343.
[16] WO2006/110413.
[17] WO2005/111066.
[18] WO2005/002619.
[19] WO2006/138004.
[20] WO2009/109860.
[21] WO02/02606.
[22] WO03/018054.
[23] WO2006/091517.
[24] WO2008/020330.
[25] WO2006/089264.
[26] WO2009/104092.
[27] WO2009/031043.
[28] WO2007/049155.
[29] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20<th>edition, ISBN: 0683306472.
[30] Romberg et al (2008) Pharmaceutical Research 25:55-71.
[31] Hoekstra et al., Biochimica et Biophisica Acta 1660 (2004) 41-52
[32] WO2009/086558
[33] Methods In Enzimologi (S. Colovick i N. Kaplan, ur., Academic Press, Inc.)
[34] Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Veir i C.C. Blackvell, eds., 1986, Blackvell Scientific Publications)
[35] Sambrook et al. (2001) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press).
[36] Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997)
[37] Ausubel et al (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5th edition (Current Protocols).
[38] Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press)
[39] PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Nevton & Graham eds., 1997, Springer Verlag)
[40] Ioneiama & Fujita (2007) Cytokin & Growth Factor Reviews 18:545-51.
[41] Maurer et al (2001) Biophysical Journal, 80: 2310-2326.
[42] Perri et al. (2003) J Virol 77:10394-10403.
[43] Bokus et al. (2007) J Virol 81:6879-89.
[44] Tailor et al. (2005) Vaccine 23:1242-50.

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Lipozom u kome je inkapsulirana RNK koja kodira imunogen od interesa, pri čemu lipozom sadrži najmanje jedan lipid koji uključuje polietilen glikol deo, tako da je polietilen glikol prisutan na spoljašnjosti lipozoma, pri čemu je prosečna molekulska masa polietilen glikola između 1 kDa i 3 kDa, naznačenio time da:
(a) lipid koji uključuje polietilen glikol deo nije PEG-DMG 2000; i/ili
(b) RNK koja kodira imunogen od interesa ne uključuje modifikovane nukleobaze osim 5' kape koja sadrži 7'-metilguanozin, i/ili metilaciju na 2' poziciji riboze prvih 1, 2 ili 3 5' ribonukleotida.
2. Lipozom prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži PEG-DMG.
3. Lipozom prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time da lipozom ima prečnik u opsegu od 80-160 nm.
4. Lipozom prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time da lipozom sadrži lipid sa katjonskom grupom glave.
5. Lipozom prema bilo kom prethodnom zahtevu, naznačen time da lipozom sadrži lipid sa cviterjonskom grupom glave.
6. Lipozom prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time da je RNK samoreplicirajuća RNK.
7. Lipozom prema patentnom zahtevu 6, naznačen time da molekul RNK koji se samoreplicira kodira (i) RNK-zavisnu RNK polimerazu koja može da transkribuje RNK iz molekula RNK koji se samoreplicira i (ii) imunogen.
8. Lipozom prema patentnom zahtevu 7, gde molekul RNK ima dva otvorena okvira za čitanje, od kojih prvi kodira replikazu alfavirusa, a drugi kodira imunogen.
9. Lipozom prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time da je molekul RNK dugačak 9000-12000 nukleotida.
10. Lipozom prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu imunogen može izazvati imuni odgovor in vivo protiv bakterije, virusa, gljivice ili parazita.
11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži lipozom prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.
12. Lipozom prema patentnim zahtevima 1-10, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11, za upotrebu u postupku za podizanje zaštitnog imunološkog odgovora kod kičmenjaka, koji obuhvata korak davanja kičmenjaku efikasne količine navedenog lipozoma, ili pomenute farmaceutske kompozicije.
RS20220501A 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen RS63315B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37882610P 2010-08-31 2010-08-31
EP11758014.2A EP2611461B1 (en) 2010-08-31 2011-08-31 Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
PCT/US2011/050095 WO2012031043A1 (en) 2010-08-31 2011-08-31 Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63315B1 true RS63315B1 (sr) 2022-07-29

Family

ID=44653554

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20221147A RS63816B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20220501A RS63315B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20220594A RS63367B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20220595A RS63329B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20230135A RS63983B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20230096A RS63949B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20221147A RS63816B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220594A RS63367B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20220595A RS63329B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20230135A RS63983B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen
RS20230096A RS63949B1 (sr) 2010-08-31 2011-08-31 Pegilovani lipozomi za isporuku rnk koja kodira imunogen

Country Status (22)

Country Link
US (3) US20130202684A1 (sr)
EP (11) EP4066857B1 (sr)
JP (1) JP5911870B2 (sr)
CN (1) CN103179984A (sr)
AU (1) AU2011295935B2 (sr)
BR (1) BR112013004866A2 (sr)
CA (1) CA2809851A1 (sr)
CY (3) CY1125209T1 (sr)
DK (7) DK4226941T3 (sr)
ES (7) ES2918649T3 (sr)
FI (3) FI4226941T3 (sr)
HR (7) HRP20221023T1 (sr)
HU (7) HUE058667T2 (sr)
LT (7) LT4226941T (sr)
MX (1) MX2013002336A (sr)
PL (7) PL4066855T3 (sr)
PT (7) PT2611461T (sr)
RS (6) RS63816B1 (sr)
RU (1) RU2013114362A (sr)
SI (7) SI3970742T1 (sr)
SM (6) SMT202300075T1 (sr)
WO (1) WO2012031043A1 (sr)

Families Citing this family (271)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2591114B1 (en) 2010-07-06 2016-06-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunisation of large mammals with low doses of rna
ES2646669T3 (es) 2010-07-06 2017-12-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimientos de aumento de una respuesta inmunitaria mediante el suministro de ARN
ES2557382T3 (es) 2010-07-06 2016-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomas con lípidos que tienen un valor de pKa ventajoso para el suministro de ARN
MX342608B (es) * 2010-07-06 2016-10-06 Novartis Ag * Particulas de suministro similares a viriones para moleculas de arn de autorreplicacion.
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
SI4043040T1 (sl) 2010-08-31 2023-04-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali liposomi za dostavo imunogen-kodirajoče RNA
LT4226941T (lt) 2010-08-31 2025-01-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilintos liposomos, skirtos imunogeną koduojančios rnr pristatymui
EP2625189B1 (en) 2010-10-01 2018-06-27 ModernaTX, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2012051211A2 (en) 2010-10-11 2012-04-19 Novartis Ag Antigen delivery platforms
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
RU2013154295A (ru) 2011-06-08 2015-07-20 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. КОМПОЗИЦИИ ЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ И СПОСОБЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ мРНК
EP2729165B1 (en) 2011-07-06 2017-11-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic combination compositions and uses thereof
EP4115875A1 (en) * 2011-07-06 2023-01-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
MX366055B (es) * 2011-08-31 2019-06-26 Novartis Ag Liposomas pegilados para admistracion de acido ribonucleico (arn) que codifica para inmunogeno.
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
DE19216461T1 (de) 2011-10-03 2021-10-07 Modernatx, Inc. Modifizierte nukleoside, nukleotide und nukleinsäuren und verwendungen davon
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
CN104411338A (zh) 2012-04-02 2015-03-11 现代治疗公司 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
WO2013151665A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
WO2014028429A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Moderna Therapeutics, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of rna
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
CN109045294A (zh) * 2013-01-10 2018-12-21 思齐乐 流感病毒免疫原性组合物及其应用
AU2013374345A1 (en) 2013-01-17 2015-08-06 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
CN107879960B (zh) 2013-03-08 2021-06-22 诺华股份有限公司 用于传递活性成分的脂质和脂质组合物
EP2968391A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
DK2970948T3 (en) 2013-03-15 2019-04-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa METHODS OF RNA PURIFICATION
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
CA2917348A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
EP3041934A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052521A1 (en) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
US20160324986A1 (en) * 2013-12-27 2016-11-10 Teloregen, Inc. Compositions and methods for providing active telomerase to cells in vivo
ES2981281T3 (es) 2014-01-20 2024-10-08 Univ Utah Res Found Composiciones y métodos para modificar la superficie de las células y métodos de uso
EP3798229A1 (en) 2014-03-25 2021-03-31 Yale University Uses of parasite macrophage migration inhibitory factors
PL4023249T3 (pl) 2014-04-23 2025-03-10 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
EP2974739A1 (en) 2014-07-15 2016-01-20 Novartis AG RSVF trimerization domains
HUE060907T2 (hu) 2014-06-25 2023-04-28 Acuitas Therapeutics Inc Új lipidek és lipid nanorészecske formulációk nukleinsavak bevitelére
US20170204152A1 (en) 2014-07-16 2017-07-20 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3171895A1 (en) 2014-07-23 2017-05-31 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
EP3061826A1 (en) 2015-02-27 2016-08-31 Novartis AG Flavivirus replicons
EP4353257A3 (en) 2015-04-13 2024-08-07 CureVac Manufacturing GmbH Method for producing rna compositions
PT3313829T (pt) 2015-06-29 2024-07-08 Acuitas Therapeutics Inc Formulações de lípidos e de nanopartículas lipídicas para a administração de ácidos nucleicos
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
MA42502A (fr) 2015-07-21 2018-05-30 Modernatx Inc Vaccins contre une maladie infectieuse
US11564893B2 (en) 2015-08-17 2023-01-31 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
JP6948313B6 (ja) 2015-09-17 2022-01-14 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療剤の細胞内送達のための化合物および組成物
EP3359670B2 (en) 2015-10-05 2024-02-14 ModernaTX, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
AU2016342376A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Sexually transmitted disease vaccines
EP4011451A1 (en) 2015-10-22 2022-06-15 ModernaTX, Inc. Metapneumovirus mrna vaccines
WO2017070624A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
WO2017070601A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Nucleic acid vaccines for varicella zoster virus (vzv)
AU2016342045A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
HRP20230209T1 (hr) 2015-10-28 2023-04-14 Acuitas Therapeutics Inc. Novi lipidi i lipidne formulacije nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina
PL3386484T3 (pl) 2015-12-10 2022-07-25 Modernatx, Inc. Kompozycje i sposoby dostarczania środków terapeutycznych
LT3394030T (lt) 2015-12-22 2022-04-11 Modernatx, Inc. Junginiai ir kompozicijos terapinei medžiagai teikti intraceliuliniu būdu
PL3394093T3 (pl) 2015-12-23 2022-05-16 Modernatx, Inc. Metody stosowania polinukleotydów kodujących ligand ox40
MA43587A (fr) 2016-01-10 2018-11-14 Modernatx Inc Arnm thérapeutiques codant pour des anticorps anti-ctla-4
WO2017162265A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Trans-replicating rna
WO2017162266A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Rna replicon for versatile and efficient gene expression
WO2017200957A1 (en) * 2016-05-16 2017-11-23 Infectious Disease Research Institute Pegylated liposomes and methods of use
IL263079B2 (en) 2016-05-18 2024-05-01 Modernatx Inc Polynucleotides encoding relaxin
WO2017201342A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding jagged1 for the treatment of alagille syndrome
BE1024796B9 (fr) 2016-06-02 2019-01-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Constructions antigeniques du virus zika
CN109715205A (zh) 2016-08-19 2019-05-03 库瑞瓦格股份公司 用于癌症治疗的rna
WO2018060288A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions and methods of treatment of persistent hpv infection
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
WO2018091540A1 (en) 2016-11-17 2018-05-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Zika viral antigen constructs
WO2018104540A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Curevac Ag Rnas for wound healing
WO2018107088A2 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
EP3551230A1 (en) 2016-12-08 2019-10-16 CureVac AG Rna for treatment or prophylaxis of a liver disease
WO2018115527A2 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Curevac Ag Mers coronavirus vaccine
US11464847B2 (en) 2016-12-23 2022-10-11 Curevac Ag Lassa virus vaccine
BR112019015797A2 (pt) * 2017-02-01 2020-03-17 Modernatx, Inc. Composições de mrna terapêuticas imunomoduladoras que codificam peptídeos de mutação de oncogene de ativação
MA47515A (fr) 2017-02-16 2019-12-25 Modernatx Inc Compositions immunogènes très puissantes
WO2018170322A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Crystal forms of amino lipids
EP3595713A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS Vaccine
CA3055653A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
WO2018170256A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
EP4186888B1 (en) 2017-03-15 2025-11-26 ModernaTX, Inc. Compound and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
JP2020514370A (ja) 2017-03-17 2020-05-21 キュアバック アーゲー 組合せ抗癌療法のためのｒｎａワクチン及び免疫チェックポイント阻害剤
EP3595676A4 (en) 2017-03-17 2021-05-05 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZOONOSES
SG11201906297QA (en) 2017-03-24 2019-10-30 Curevac Ag Nucleic acids encoding crispr-associated proteins and uses thereof
US11905525B2 (en) 2017-04-05 2024-02-20 Modernatx, Inc. Reduction of elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
EP3634449A4 (en) 2017-05-08 2021-03-17 Gritstone Oncology, Inc. ALPHAVIRUS NEOANTIGEN VECTORS
JP7285220B2 (ja) 2017-05-18 2023-06-01 モデルナティエックス インコーポレイテッド 連結したインターロイキン－１２（ｉｌ１２）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子
US11485972B2 (en) 2017-05-18 2022-11-01 Modernatx, Inc. Modified messenger RNA comprising functional RNA elements
BR112019025104A2 (pt) * 2017-05-30 2020-06-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Método de fabricar um sistema de entrega não viral, sistema de entrega não viral, e, composição
GB2600653B (en) 2017-05-30 2022-11-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
ES3039647T3 (en) 2017-05-31 2025-10-23 Arcturus Therapeutics Inc Synthesis and structure of high potency rna therapeutics
WO2018232120A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
EP3638292A1 (en) 2017-06-14 2020-04-22 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding coagulation factor viii
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
SG11201911430PA (en) 2017-07-04 2020-01-30 Curevac Ag Novel nucleic acid molecules
CA3073020A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
EP3675817A1 (en) 2017-08-31 2020-07-08 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
EP3681904A1 (en) 2017-09-13 2020-07-22 Biontech Cell&Gene Therapies GmbH Rna replicon for expressing a t cell receptor or an artificial t cell receptor
EP3681993B1 (en) 2017-09-13 2026-04-01 BioNTech SE Rna replicon for reprogramming somatic cells
WO2019055807A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZIKA VIRUS
EP3461497A1 (en) 2017-09-27 2019-04-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Viral antigens
US20220233568A1 (en) 2017-10-19 2022-07-28 Curevac Ag Novel artificial nucleic acid molecules
WO2019094702A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Cocoon Biotech Inc. Ocular applications of silk-based products
US11939601B2 (en) 2017-11-22 2024-03-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase for the treatment of phenylketonuria
CA3079428A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of urea cycle disorders
EP3714045A1 (en) 2017-11-22 2020-09-30 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits for the treatment of propionic acidemia
SG11202005792RA (en) 2017-12-20 2020-07-29 Vlp Therapeutics Llc Alphavirus replicon particle
MX2020007077A (es) 2018-01-04 2020-10-28 Iconic Therapeutics Inc Anticuerpos anti-factor tisular, conjugados anticuerpo-farmaco y metodos relacionados.
MA51523A (fr) 2018-01-05 2020-11-11 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour des anticorps anti-virus du chikungunya
EP3746090A4 (en) 2018-01-29 2021-11-17 ModernaTX, Inc. RSV RNA Vaccines
EP3773745A1 (en) 2018-04-11 2021-02-17 ModernaTX, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements
WO2019226650A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Modernatx, Inc. Delivery of dna
US20220184185A1 (en) 2018-07-25 2022-06-16 Modernatx, Inc. Mrna based enzyme replacement therapy combined with a pharmacological chaperone for the treatment of lysosomal storage disorders
US12083174B2 (en) 2018-08-17 2024-09-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions and uses thereof
WO2020047201A1 (en) 2018-09-02 2020-03-05 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding very long-chain acyl-coa dehydrogenase for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency
MX2021003015A (es) 2018-09-13 2021-07-15 Modernatx Inc Polinucleotidos que codifican glucosa-6-fosfatasa para el tratamiento de la glucogenosis.
WO2020056155A2 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex e1-alpha, e1-beta, and e2 subunits for the treatment of maple syrup urine disease
JP2022500444A (ja) 2018-09-14 2022-01-04 モダーナティエックス・インコーポレイテッドModernaTX, Inc. クリグラー−ナジャー症候群の治療のためのウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドａ１をコードするポリヌクレオチド
CA3113025A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Peg lipids and uses thereof
WO2020061295A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. High-purity peg lipids and uses thereof
WO2020061367A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2020061457A1 (en) 2018-09-20 2020-03-26 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
IL281615B2 (en) 2018-09-21 2026-01-01 Acuitas Therapeutics Inc Systems and methods for producing lipid nanoparticles and liposomes
EP3856233A1 (en) 2018-09-27 2021-08-04 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding arginase 1 for the treatment of arginase deficiency
CA3116576A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
WO2020097409A2 (en) 2018-11-08 2020-05-14 Modernatx, Inc. Use of mrna encoding ox40l to treat cancer in human patients
EP3886901A1 (en) 2018-11-29 2021-10-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Methods for manufacturing an adjuvant
WO2020144295A1 (en) 2019-01-10 2020-07-16 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Localized administration of rna molecules for therapy
TWI852977B (zh) 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
PT3908568T (pt) 2019-01-11 2024-09-30 Acuitas Therapeutics Inc Lípidos para a administração de agentes ativos por nanopartículas lipídicas
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
AU2020232238B2 (en) 2019-03-01 2025-10-30 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Polyribonucleotides and cosmetic uses thereof
MA55082A (fr) 2019-03-01 2022-01-05 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Compositions, procédés, et kits pour l'administration de polyribonucléotides
US12070495B2 (en) 2019-03-15 2024-08-27 Modernatx, Inc. HIV RNA vaccines
JP2022532078A (ja) 2019-05-08 2022-07-13 アストラゼネカ アクチボラグ 皮膚及び創傷のための組成物並びにその使用の方法
MX2021014525A (es) 2019-05-30 2022-03-17 Gritstone Bio Inc Adenovirus modificados.
EP3987027A1 (en) 2019-06-24 2022-04-27 ModernaTX, Inc. Endonuclease-resistant messenger rna and uses thereof
US20220387628A1 (en) 2019-06-24 2022-12-08 Modernatx, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements and uses thereof
EP3999097B1 (en) 2019-07-18 2024-05-29 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Rac2 mutant for use in ablating hematopoiesis and in the treatment of hematopoietic malignancies
US20220273789A1 (en) 2019-07-21 2022-09-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Therapeutic viral vaccine
EP4021407A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Jet mixing lipid nanoparticle manufacturing process
AU2020350759A1 (en) 2019-09-19 2022-03-31 Modernatx, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
CA3155015A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Modernatx, Inc. Carbonate containing lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
EP4048807A1 (en) 2019-09-23 2022-08-31 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating apolipoprotein b (apob) gene expression
CN114729376A (zh) 2019-09-23 2022-07-08 欧米茄治疗公司 用于调节肝细胞核因子4α(HNF4α)基因表达的组合物和方法
EP3819377A1 (en) 2019-11-08 2021-05-12 Justus-Liebig-Universität Gießen Circular rna and uses thereof for inhibiting rna-binding proteins
CR20220220A (es) 2019-11-18 2022-09-20 Janssen Biotech Inc Vacunas basadas en calr y jak2 mutantes y sus usos
US12194089B2 (en) 2020-02-04 2025-01-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
AU2021236068A1 (en) 2020-03-09 2022-10-06 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for inducing immune responses
CA3173528A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating forkhead box p3 (foxp3) gene expression
JP2023520763A (ja) 2020-03-24 2023-05-19 ジェネレーション バイオ カンパニー ゴーシェ治療薬を発現するための非ウイルス性ｄｎａベクター及びその使用
US20230138409A1 (en) 2020-03-24 2023-05-04 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing factor ix therapeutics
WO2021209970A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sars cov-2 spike protein construct
EP4153223A1 (en) 2020-05-20 2023-03-29 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Immunogenic compositions and uses thereof
EP4158005A1 (en) 2020-06-01 2023-04-05 ModernaTX, Inc. Phenylalanine hydroxylase variants and uses thereof
JP7769644B2 (ja) 2020-06-04 2025-11-13 バイオエヌテック エスエー 多用途かつ効率的な遺伝子発現のためのｒｎａレプリコン
WO2021245611A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified betacoronavirus spike proteins
WO2022002783A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuvants
EP4175664A2 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
ES3054438T3 (en) 2020-07-16 2026-02-03 Acuitas Therapeutics Inc Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
JP2023535632A (ja) 2020-07-27 2023-08-18 アンジャリウム バイオサイエンシズ エージー Ｄｎａ分子の組成物、その作製方法、及びその使用方法
CN116438308A (zh) 2020-08-06 2023-07-14 磨石生物公司 多表位疫苗盒
EP4196128A4 (en) 2020-08-14 2024-06-12 Arcturus Therapeutics, Inc. METHOD FOR FREEZE DILIZATION OF LIPID NANOPARTICLES
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
AU2021336976A1 (en) 2020-09-03 2023-03-23 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
WO2022104131A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
EP4008785A1 (en) 2020-12-03 2022-06-08 Justus-Liebig-Universität Gießen Circular nucleic acids and uses thereof for interfering with genome expression and proliferation of coronaviruses
US11918643B2 (en) 2020-12-22 2024-03-05 CureVac SE RNA vaccine against SARS-CoV-2 variants
EP4267593A2 (en) 2020-12-23 2023-11-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Self-amplifying messenger rna
EP4032546A1 (en) 2021-01-20 2022-07-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Therapeutic viral vaccine
US12233132B2 (en) * 2021-02-09 2025-02-25 Serina Therapeutics, Inc. Polyoxazoline-lipid conjugates and lipid nanoparticles and pharmaceutical compositions including same
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
WO2022204370A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
US20240216288A1 (en) 2021-03-24 2024-07-04 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof
US20240226025A1 (en) 2021-03-24 2024-07-11 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
US20240207374A1 (en) 2021-03-24 2024-06-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof
WO2022204390A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof
CA3212653A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions
JP2024517427A (ja) 2021-04-20 2024-04-22 アンジャリウム バイオサイエンシズ エージー アミロ－α－１，６－グルコシダーゼ、４－α－グルカノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子の組成物、その作製の方法、及びその使用の方法
AU2022264509A1 (en) 2021-04-27 2023-12-14 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing therapeutic antibodies and uses thereof
US20240216535A1 (en) 2021-04-27 2024-07-04 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing anti-coronavirus antibodies and uses thereof
CN113230394B (zh) * 2021-04-30 2024-04-30 广州源博医药科技有限公司 一种用于牛病毒性腹泻的rna疫苗及其构建方法
WO2022248353A1 (en) 2021-05-24 2022-12-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuvants
EP4352247A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Release assay for determining potency of self-amplifying rna drug product and methods for using
EP4355882A2 (en) 2021-06-15 2024-04-24 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression
WO2022271776A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
EP4367242A2 (en) 2021-07-07 2024-05-15 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
US20240342206A1 (en) 2021-07-30 2024-10-17 CureVac SE mRNAS FOR TREATMENT OR PROPHYLAXIS OF LIVER DISEASES
US20240350410A1 (en) 2021-08-16 2024-10-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Freeze-drying of lipid nanoparticles (lnps) encapsulating rna and formulations thereof
WO2023020993A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023020992A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
EP4387596A1 (en) 2021-08-16 2024-06-26 GlaxoSmithKline Biologicals SA Low-dose lyophilized rna vaccines and methods for preparing and using the same
WO2023020994A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
CA3229889A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Substitution of nucleotide bases in self-amplifying messenger ribonucleic acids
WO2023056044A1 (en) 2021-10-01 2023-04-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease
EP4419708A1 (en) 2021-10-18 2024-08-28 BioNTech SE Methods for determining mutations for increasing modified replicable rna function and related compositions and their use
EP4419695A1 (en) 2021-10-18 2024-08-28 BioNTech SE Modified replicable rna and related compositions and their use
TW202334080A (zh) 2021-11-08 2023-09-01 美商歐納醫療公司 用於遞送環狀聚核苷酸之脂質奈米粒子組合物
US12186387B2 (en) 2021-11-29 2025-01-07 BioNTech SE Coronavirus vaccine
CA3242402A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
JP2025504404A (ja) 2022-01-14 2025-02-12 アンジャリウム バイオサイエンシズ エージー Ｖｉｉｉ因子をコードするｄｎａ分子の組成物、それを作製する方法、及びその使用方法
JP2025502257A (ja) 2022-01-17 2025-01-24 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 固形腫瘍細胞の集団の細胞死を誘導する方法
WO2023144193A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 CureVac SE Mrnas for treatment of hereditary tyrosinemia type i
US20250064899A1 (en) 2022-02-14 2025-02-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of the 15-lipoxygenase for the treatment of lymphedema
US20250327041A1 (en) 2022-02-24 2025-10-23 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
CN119072330A (zh) 2022-03-14 2024-12-03 世代生物公司 异源初免加强疫苗组合物和使用方法
US20250221931A1 (en) 2022-03-25 2025-07-10 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding fanconi anemia, complementation group proteins for the treatment of fanconi anemia
WO2023213378A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 BioNTech SE Replicon compositions and methods of using same for the treatment of diseases
EP4536197A1 (en) 2022-06-07 2025-04-16 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof
WO2023242817A2 (en) 2022-06-18 2023-12-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Recombinant rna molecules comprising untranslated regions or segments encoding spike protein from the omicron strain of severe acute respiratory coronavirus-2
WO2024002985A1 (en) 2022-06-26 2024-01-04 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024017479A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 BioNTech SE Multifunctional cells transiently expressing an immune receptor and one or more cytokines, their use and methods for their production
AU2023316015A1 (en) 2022-07-25 2025-02-13 Centre Hospitalier Universitaire De Toulouse Use of apelin for the treatment of lymphedema
WO2024026254A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for temporal control of expression
US20260055426A1 (en) 2022-08-19 2026-02-26 Generation Bio Co. CLEAVABLE CLOSED-ENDED DNA (ceDNA) AND METHODS OF USE THEREOF
WO2024044147A1 (en) 2022-08-23 2024-02-29 Modernatx, Inc. Methods for purification of ionizable lipids
WO2024047247A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Base editing approaches for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
CA3267295A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 TRON – TRANSLATIONALE ONKOLOGIE AN DER UNIVERSITATSMEDIZIN DER JOHANNES GUTENBERG-UNIVERSITAT MAINZ GEMEINNUTZIGE GMBH-Aysegul YILDIZ SYSTEMS AND COMPOSITIONS CONTAINING TRANS-AMPLIFYING RNA VECTORS WITH MIARN
AU2023353931A1 (en) 2022-09-26 2025-03-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
EP4606372A1 (en) 2022-10-18 2025-08-27 Tipton Corp. Taylor reactor and capsule particle manufacturing method
EP4608442A1 (en) 2022-10-28 2025-09-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Nucleic acid based vaccine
WO2024102762A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102730A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102677A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
AU2023406303A1 (en) 2022-12-01 2025-05-29 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids, ionizable lipids, sterols, lipid anchored polymers and helper lipids, their uses
EP4626400A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 Generation Bio Co. Novel polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same
WO2024119074A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Stealth lipid nanoparticle compositions for cell targeting
WO2024119103A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids and lipid-anchored polymers
WO2024121378A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Novel human antiviral genes related to the eleos and lamassu prokaryotic systems
WO2024133160A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis b compositions
JP2026503277A (ja) 2023-01-09 2026-01-28 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 心筋梗塞を経験した患者における有害な虚血後心臓リモデリングを処置するためのアンジオポエチン様４の組み換えフィブリノーゲン様ドメインの使用
WO2024153636A1 (en) 2023-01-17 2024-07-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Vasorin as a biomarker and biotarget in nephrology
JP2026503627A (ja) 2023-01-27 2026-01-29 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 血管透過性亢進の処置方法におけるアンフィレグリン（ａｒｅｇ）の使用
WO2024160936A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rna formulation
GB202302092D0 (en) 2023-02-14 2023-03-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Analytical method
WO2024197033A1 (en) 2023-03-21 2024-09-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of heart failure
WO2024194484A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Modulating the expression and/or activity of gas7 for modulating viral replication
WO2024205657A2 (en) 2023-03-29 2024-10-03 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
AU2024260120A1 (en) 2023-04-27 2025-11-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
WO2024223724A1 (en) 2023-04-27 2024-10-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
EP4704816A1 (en) 2023-05-03 2026-03-11 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
EP4705481A2 (en) 2023-05-05 2026-03-11 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
EP4716741A2 (en) 2023-05-23 2026-04-01 Flagship Labs 114, Inc. Compositions and methods for reducing cxcl9, cxcl10, and cxcl11 gene expression
CN121263216A (zh) 2023-06-06 2026-01-02 赢创运营有限公司 由胶原样蛋白(clp)制备的水凝胶贴剂
WO2025011529A2 (en) 2023-07-07 2025-01-16 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd. Circular rna vaccines for seasonal flu and methods of uses
WO2025019352A2 (en) * 2023-07-14 2025-01-23 Modernatx, Inc. Mers-cov mrna vaccines
IL326711A (en) 2023-08-24 2026-04-01 BioNTech SE Systems and compositions comprising highly active trans-amplifying replicases
WO2025049690A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Orna Therapeutics, Inc. Circular polyethylene glycol lipids
WO2025045142A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd. Circular rna encoding vegf polypeptides, formulations, and methods of uses
EP4520345A1 (en) 2023-09-06 2025-03-12 Myneo Nv Product
WO2025052180A2 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Axelyf ehf. Lipids and lipid nanoparticles
WO2025051381A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 BioNTech SE Methods and compositions for localized expression of administered rna
WO2025072482A1 (en) 2023-09-27 2025-04-03 Modernatx, Inc. Immunoglobulin a protease polypeptides, polynucleotides, and uses thereof
WO2025083211A1 (en) 2023-10-20 2025-04-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of factor h for the treatment of dementia
WO2025101501A1 (en) 2023-11-07 2025-05-15 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2025132839A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
GB202404607D0 (en) 2024-03-29 2024-05-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNA formulation
WO2025215072A1 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Class i lanthipeptides with anti-viral function
WO2025229572A1 (en) 2024-05-01 2025-11-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Epstein-barr virus antigen-encoding messenger ribonucleic acid and antigen protein vaccines
WO2025248096A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antimicrobial peptides having liquid-liquid phase separation activities
WO2025255199A1 (en) 2024-06-05 2025-12-11 Modernatx, Inc. Argininosuccinate synthase 1 and argininosuccinate lyase polypeptides and polynucleotides and uses thereof
WO2026003582A2 (en) 2024-06-27 2026-01-02 Axelyf ehf. Lipids and lipid nanoparticles
WO2026064512A1 (en) 2024-09-18 2026-03-26 Generation Bio Co. Polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same
WO2026085495A1 (en) 2024-10-18 2026-04-23 Generation Bio Co. Synthetic partially single-stranded nucleic acid compositions and uses and methods therefor

Family Cites Families (258)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6090406A (en) 1984-04-12 2000-07-18 The Liposome Company, Inc. Potentiation of immune responses with liposomal adjuvants
US4853228A (en) * 1987-07-28 1989-08-01 Micro-Pak, Inc. Method of manufacturing unilamellar lipid vesicles
US6867195B1 (en) 1989-03-21 2005-03-15 Vical Incorporated Lipid-mediated polynucleotide administration to reduce likelihood of subject's becoming infected
CA2489769A1 (en) 1989-03-21 1990-10-04 Philip L. Felgner Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
FR2676072B1 (fr) 1991-05-03 1994-11-18 Transgene Sa Vecteur de delivrance d'arn.
US5693535A (en) 1992-05-14 1997-12-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. HIV targeted ribozymes
US5750390A (en) 1992-08-26 1998-05-12 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of diseases caused by expression of the bcl-2 gene
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
EP0786522A2 (en) 1992-07-17 1997-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecules for treatment of stenotic conditions
US5474914A (en) 1992-07-29 1995-12-12 Chiron Corporation Method of producing secreted CMV glycoprotein H
US20020102273A1 (en) 1995-08-08 2002-08-01 Robert B. Grieve Use of alphavirus expression vectors to produce parasite anitgens
EP1624068A1 (en) 1993-06-01 2006-02-08 Life Technologies Inc. Genetic immunization with cationic lipids
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
AU2215995A (en) 1994-04-07 1995-10-30 Akzo Nobel N.V. Freeze-dried compositions comprising rna
US5993850A (en) * 1994-09-13 1999-11-30 Skyepharma Inc. Preparation of multivesicular liposomes for controlled release of encapsulated biologically active substances
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
AU4594996A (en) 1994-11-30 1996-06-19 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
US5965434A (en) 1994-12-29 1999-10-12 Wolff; Jon A. Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for delivering biologically active compounds
US5792462A (en) 1995-05-23 1998-08-11 University Of North Carolina At Chapel Hill Alphavirus RNA replicon systems
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US6264957B1 (en) * 1995-09-27 2001-07-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Product of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
EP0880360B1 (en) 1996-02-12 2002-10-09 Cobra Therapeutics Limited Novel methods of vaccination and vaccines therefore comprising a nucleic acid encoding a first epitope and a peptide containing a second epitope
DE19605548A1 (de) 1996-02-15 1997-09-04 Boehringer Ingelheim Int Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
US6451592B1 (en) 1996-04-05 2002-09-17 Chiron Corporation Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis
WO1997038010A2 (en) 1996-04-11 1997-10-16 The University Of British Columbia Fusogenic liposomes
CA2259179C (en) 1996-07-03 2008-09-23 University Of Pittsburgh Emulsion formulations for hydrophilic active agents
US7384923B2 (en) 1999-05-14 2008-06-10 Lipoxen Technologies Limited Liposomes
CN1138533C (zh) 1996-09-13 2004-02-18 利普森有限公司 脂质体
US6395302B1 (en) 1996-11-19 2002-05-28 Octoplus B.V. Method for the preparation of microspheres which contain colloidal systems
AU733310C (en) 1997-05-14 2001-11-29 University Of British Columbia, The High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
US6048546A (en) 1997-07-31 2000-04-11 Sandia Corporation Immobilized lipid-bilayer materials
US6060308A (en) 1997-09-04 2000-05-09 Connaught Laboratories Limited RNA respiratory syncytial virus vaccines
CA2311395C (en) 1997-11-28 2006-11-28 Replikun Biotech Pty Ltd Flavivirus expression and delivery system
US6009406A (en) 1997-12-05 1999-12-28 Square D Company Methodology and computer-based tools for re-engineering a custom-engineered product line
GB9726555D0 (en) 1997-12-16 1998-02-11 Smithkline Beecham Plc Vaccine
WO1999055310A1 (en) 1998-04-27 1999-11-04 Altus Biologics Inc. Stabilized protein crystals, formulations containing them and methods of making them
US6432925B1 (en) 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
WO2000000616A2 (en) 1998-06-29 2000-01-06 U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases Marburg virus vaccines
AU747597B2 (en) 1998-07-20 2002-05-16 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
AU2221600A (en) 1998-12-31 2000-07-31 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
ES2238799T3 (es) 1999-09-09 2005-09-01 Curevac Gmbh Transferencia de arn-m.
EP1222289B1 (en) 1999-10-20 2008-04-16 The Johns Hopkins University School Of Medicine Chimeric immunogenic compositions and nucleic acids encoding them
US8541008B2 (en) * 1999-11-19 2013-09-24 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Pharmaceutical compositions and methods to vaccinate against candidiasis
US20030212022A1 (en) 2001-03-23 2003-11-13 Jean-Marie Vogel Compositions and methods for gene therapy
EP1287015A1 (en) 2000-04-18 2003-03-05 Human Genome Sciences, Inc. Extracellular matrix polynucleotides, polypeptides, and antibodies
AU2001275423B2 (en) * 2000-06-09 2007-01-11 Regulon, Inc. Encapsulation of polynucleotides and drugs into targeted liposomes
JP2004502415A (ja) 2000-07-03 2004-01-29 カイロン　エセ．ピー．アー． Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫化
AU2001290520A1 (en) 2000-08-01 2002-02-13 The Johns Hokpins University Intercellular transport protein linked to an antigen as a molecular vaccine
US20040142474A1 (en) 2000-09-14 2004-07-22 Expression Genetics, Inc. Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent
ES2260291T3 (es) 2000-09-28 2006-11-01 Chiron Corporation Microparticulas para la administracion de acidos nucleicos heterologos.
CA2881568C (en) 2000-10-27 2019-09-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
US7731975B2 (en) 2001-01-31 2010-06-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Chimeric filovirus glycoprotein
WO2002061113A2 (en) 2001-02-01 2002-08-08 The Johns Hopkins University Nucleic acid derived vaccine that encodes an antigen linked to a polypeptide that promotes antigen presentation
US20030040498A1 (en) 2001-03-14 2003-02-27 Ansardi David Calvert Oncolytic RNA replicons
WO2002074920A2 (en) 2001-03-16 2002-09-26 Johns Hopkins University A replication-defective alphavirus vaccine linking antigen with an immunogenicity-potentiating polypeptide and a method of delivery the same
JP2004535388A (ja) 2001-04-30 2004-11-25 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション 脂質含有薬物送達複合体およびそれらの生成方法
US20030077251A1 (en) 2001-05-23 2003-04-24 Nicolas Escriou Replicons derived from positive strand RNA virus genomes useful for the production of heterologous proteins
ES2340499T3 (es) 2001-06-05 2010-06-04 Curevac Gmbh Arnm de antigeno tumoral estabilizado con un contenido de g/c aumentado.
WO2003018054A1 (en) 2001-08-31 2003-03-06 Chiron Srl. Helicobacter pylori vaccination
ES2330202T5 (es) * 2001-09-06 2014-01-20 Alphavax, Inc. Sistemas vectores basados en replicones de alfavirus
AU2003211103A1 (en) 2002-02-13 2003-09-04 Northeastern University Intracellular delivery of therapeutic agents
DE10207177A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Fakultativ kationische Lipide
EP1519714B1 (en) 2002-06-28 2010-10-20 Protiva Biotherapeutics Inc. Method and apparatus for producing liposomes
US7604803B2 (en) 2002-07-05 2009-10-20 Lipoxen Technologies Limited Method to enhance an immune response of nucleic acid vaccination
ES2242462B1 (es) 2002-07-18 2007-01-01 Marti Industria Metalurgica, S.L Pulverizador giratorio seleccionable.
WO2004018506A2 (en) * 2002-08-22 2004-03-04 Cytos Biotechnology Ag Inducible alphaviral/orip based gene expression system
BR0314236A (pt) * 2002-09-13 2005-08-09 Replicor Inc Formulação de oligonucleotìdeo, composição farmacêutica, kit, composto antiviral, preparação de oligonucleotìdeo e métodos para seleção de um oligonucleotìdeo antiviral para uso como um agente antiviral, para profilaxia ou tratamento de uma infecção viral em um paciente, para tratamento profilático de câncer causado por oncovìrus, para identificação de um composto que altera a ligação de um oligonucleotìdeo a pelo menos um componente viral, para purificação da ligação de oligonucleotìdeos a pelo menos um componente viral e para enriquecimento de oligonucleotìdeos a partir de um agrupamento de oligonucleotìdeos
US20040208848A1 (en) 2002-12-13 2004-10-21 Smith Jonathan F. Multi-antigenic alphavirus replicon particles and methods
DK2311848T3 (da) 2002-12-23 2013-10-14 Vical Inc Kodon-optimerede polynukleotidbaserede vacciner mod human cytomegalovirus-infektion
WO2004069148A2 (en) 2003-02-04 2004-08-19 Bar-Ilan University Snornai-small nucleolar rna degradation by rna interference in trypanosomatids
US20040228842A1 (en) 2003-02-27 2004-11-18 Shan Lu Compositions and methods for cytomegalovirus treatment
US7442381B2 (en) 2003-03-20 2008-10-28 Alphavax, Inc. Alphavirus replicons and helper constructs
US7731967B2 (en) 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
EP1637144A4 (en) 2003-05-30 2010-01-13 Nippon Shinyaku Co Ltd OLIGONUCLEIC ACID CONTAINING COMPOSITE AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THE SAME
MXPA05013260A (es) 2003-06-26 2006-03-09 Chiron Corp Composiciones inmunogenicas para chlamydia trachomatis.
DE602004021260D1 (de) 2003-07-11 2009-07-09 Alphavax Inc Cytomegalovirusimpfstoffe, die auf dem alphavirus basieren
US7368537B2 (en) * 2003-07-15 2008-05-06 Id Biomedical Corporation Of Quebec Subunit vaccine against respiratory syncytial virus infection
CA2532228C (en) 2003-07-16 2017-02-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
ES2505695T3 (es) 2003-07-31 2014-10-10 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Composiciones inmunógenas para Streptococcus pyogenes
EP1512393A1 (de) * 2003-09-08 2005-03-09 BOEHRINGER INGELHEIM PHARMA GMBH &amp; CO. KG Verfahren zur Herstellung von homogenen Liposomen und Lipoplexen
EP1664316B1 (en) 2003-09-15 2012-08-29 Protiva Biotherapeutics Inc. Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
EP1687033A4 (en) 2003-11-12 2008-06-11 Us Navy IMPROVEMENT OF VACCINE-INDUCED IMMUNE REACTIONS AND PROTECTION THROUGH HETEROLOGY REINFORCEMENT WITH ALPHAVIRUS REPLICON VACCINE
US20120027841A1 (en) 2004-01-07 2012-02-02 Biomedical Research Models, Inc. Novel mucosal vaccination approach for herpes simplex virus type-2
US20050202075A1 (en) 2004-03-12 2005-09-15 Pardridge William M. Delivery of genes encoding short hairpin RNA using receptor-specific nanocontainers
US7303881B2 (en) 2004-04-30 2007-12-04 Pds Biotechnology Corporation Antigen delivery compositions and methods of use
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
CN1989250B (zh) 2004-05-18 2013-11-20 阿尔法瓦克斯公司 Tc-83衍生的甲病毒属载体、颗粒和方法
JP5331340B2 (ja) 2004-05-18 2013-10-30 バイカル インコーポレイテッド インフルエンザウィルスワクチン組成物、及びその使用方法
GB0411428D0 (en) 2004-05-21 2004-06-23 Got A Gene Ab Vectors
EP2848692B1 (en) 2004-05-21 2017-08-16 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Alphavirus vectors for influenza virus vaccines
JP2008501336A (ja) * 2004-06-02 2008-01-24 ソースフアーム・インコーポレイテツド Ｒｎａを含有する微小胞およびそのための方法
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
JP4764426B2 (ja) 2004-06-07 2011-09-07 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド カチオン性脂質および使用方法
EP1773403B1 (en) 2004-07-09 2018-04-25 The University of North Carolina At Chapel Hill Alphavirus-based adjuvants
US20060051405A1 (en) * 2004-07-19 2006-03-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions for the delivery of therapeutic agents and uses thereof
JP5086082B2 (ja) 2004-10-01 2012-11-28 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル Ｃ型肝炎ウイルス複製系
JP2008520600A (ja) 2004-11-19 2008-06-19 ノヴォソム アクチェンゲゼルシャフト 局所投与のための医薬組成物におけるまたはそれに関する改善
GB2421025A (en) 2004-12-09 2006-06-14 Oxxon Therapeutics Ltd HSV vaccination vectors
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
WO2007086881A2 (en) 2005-02-14 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them
SI1858920T1 (sl) 2005-02-18 2016-07-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Proteini in nukleinske kisline iz escherichia coli, povezane z meningitisom/sepso
JP2008530245A (ja) 2005-02-18 2008-08-07 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 尿路病原性菌株由来の抗原
US20080138431A1 (en) 2005-03-02 2008-06-12 James Edward Eyles Pharmaceutical Composition
GB0504436D0 (en) 2005-03-03 2005-04-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP1871888A4 (en) 2005-03-30 2013-08-21 Novartis Vaccines & Diagnostic HAEMOPHILUS INFLUENZAE OF TYPE B
US7618393B2 (en) 2005-05-03 2009-11-17 Pharmajet, Inc. Needle-less injector and method of fluid delivery
RU2007146137A (ru) 2005-05-12 2009-06-27 Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс, Инк. (Us) Иммуногенные композиции на основе chlamydia trachomatis
US8703095B2 (en) 2005-07-07 2014-04-22 Sanofi Pasteur S.A. Immuno-adjuvant emulsion
EP1909758A1 (en) * 2005-08-02 2008-04-16 I.D.M. Immuno-Designed Molecules Process for the preparation of liposomal formulations
US7951384B2 (en) 2005-08-05 2011-05-31 University Of Massachusetts Virus-like particles as vaccines for paramyxovirus
PL2578685T3 (pl) 2005-08-23 2020-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna zawierający zmodyfikowane nukleozydy i sposoby jego zastosowania
EP1764089A1 (en) 2005-09-15 2007-03-21 Novosom AG Serum stable liposomes comprising amphoter II lipid mixtures
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
BRPI0616687A2 (pt) 2005-09-29 2011-06-28 Elan Pharm Inc compostos de pirimidinil amida que inibem a adesão leucocitária mediada por vla-4
CA2626253A1 (en) 2005-10-18 2007-04-26 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles
JP2007112768A (ja) 2005-10-24 2007-05-10 Kyoto Univ 肝指向性リポソーム組成物
EP1954306A2 (en) 2005-10-25 2008-08-13 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Compositions comprising yersinia pestis antigens
ES2514316T3 (es) 2005-11-22 2014-10-28 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Partículas similares a virus (VLPs) de Norovirus y Sapovirus
CA2631714C (en) 2005-12-02 2014-09-16 Novartis Ag Nanoparticles for use in immunogenic compositions
EP2004141A2 (en) 2006-03-17 2008-12-24 Novosom AG An efficient method for loading amphoteric liposomes with nucleic acid active substances
EP2010659B1 (en) 2006-04-14 2014-06-18 CellScript, Inc. Kits and methods for generating 5' capped RNA
EP3031469B1 (en) 2006-06-07 2023-08-23 The Trustees Of Princeton University Cytomegalovirus surface protein complex for use in vaccines and as a drug target
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
PT2035581E (pt) 2006-06-21 2012-12-06 Scripps Research Inst Composição de adn contra o antigénio do estroma tumoral fap e métodos de utilização desta
US8304529B2 (en) 2006-07-28 2012-11-06 Life Technologies Corporation Dinucleotide MRNA cap analogs
EP2586790A3 (en) 2006-08-16 2013-08-14 Novartis AG Immunogens from uropathogenic Escherichia coli
CA2663295C (en) 2006-09-12 2020-03-10 Alphavax, Inc. Alphavirus replicon particles matched to protein antigens as immunological adjuvants
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
US20080171078A1 (en) 2007-01-12 2008-07-17 Mark Gray Uniformly sized liposomes
CA2689042A1 (en) * 2007-02-16 2008-08-28 Merck & Co., Inc. Compositions and methods for potentiated activity of biologicaly active molecules
US20100196492A1 (en) 2007-03-08 2010-08-05 Green Jordan J Electrostatic coating of particles for drug delivery
US8877206B2 (en) 2007-03-22 2014-11-04 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by cationic lipids
EP2905336A1 (en) * 2007-03-29 2015-08-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola
US8748591B2 (en) 2007-04-17 2014-06-10 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Chimeric sindbis-western equine encephalitis virus and uses thereof
HUE040417T2 (hu) 2007-05-04 2019-03-28 Marina Biotech Inc Aminosavlipidek és alkalmazásuk
WO2008148068A1 (en) 2007-05-23 2008-12-04 Mannkind Corporation Multicistronic vectors and methods for their design
DE102007029471A1 (de) 2007-06-20 2008-12-24 Novosom Ag Neue fakultativ kationische Sterole
US8460913B2 (en) 2007-06-21 2013-06-11 Alpha Vax, Inc. Promoterless cassettes for expression of alpha virus structural proteins
EP2173771A1 (en) 2007-07-04 2010-04-14 Ribovax Biotechnologies SA Antibodies against human cytomegalovirus (hcmv)
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
WO2009026328A2 (en) 2007-08-21 2009-02-26 Immune Disease Institute, Inc. Methods of delivery of agents to leukocytes and endothelial cells
GB0717187D0 (en) 2007-09-04 2007-10-17 Novartis Ag Compositions comprising yersinia pestis antigens
CA2704153A1 (en) 2007-09-26 2009-04-02 Vanderbilt University Vaccine for rsv and mpv
EP2042193A1 (en) 2007-09-28 2009-04-01 Biomay AG RNA Vaccines
WO2009046388A1 (en) * 2007-10-03 2009-04-09 United States Medical Research & Material Command Cr-2 binding peptide p28 as molecular adjuvant for dna vaccines
AU2008338803B2 (en) 2007-11-26 2015-02-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Methods of generating alphavirus particles
EP2067749A1 (en) 2007-11-29 2009-06-10 Total Petrochemicals France Process for purification of an aqueous phase containing polyaromatics
WO2009074861A2 (en) 2007-12-10 2009-06-18 Powderject Research Limited Improved vaccine
WO2009086558A1 (en) * 2008-01-02 2009-07-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
WO2009111088A2 (en) * 2008-01-02 2009-09-11 The Johns Hopkins University Antitumor immunization by liposomal delivery of vaccine to the spleen
ITMI20081249A1 (it) 2008-07-09 2010-01-09 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunogeni di escherichia coli con solubilità migliorata.
WO2009109860A2 (en) 2008-03-06 2009-09-11 Novartis Ag Mutant forms of chlamydia htra
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
WO2009132131A1 (en) 2008-04-22 2009-10-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Amino lipid based improved lipid formulation
WO2009132206A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Liquidia Technologies, Inc. Compositions and methods for intracellular delivery and release of cargo
US20100040650A1 (en) 2008-05-30 2010-02-18 Crowe Jr James E Virus-Like paramyxovirus particles and vaccines
EP2130912A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-09 Institut für Viruskrankeiten und Immunprophylaxe Pestivirus replicons providing an RNA-based viral vector system
US20110229969A1 (en) 2008-06-25 2011-09-22 Volker Sandig Cell Line for Propagation of Highly Attenuated AlphaViruses
EP2310045A1 (en) 2008-06-25 2011-04-20 Novartis AG Rapid responses to delayed booster immunisations
JP2010025644A (ja) 2008-07-16 2010-02-04 Kochi Univ Of Technology 硝酸イオンの呈色試薬並びにこれを用いた硝酸イオンの検出及び定量方法
AU2008359583B2 (en) 2008-07-16 2012-04-05 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus neutralising antibodies and use thereof
DK2352759T3 (en) 2008-07-16 2017-12-18 Inst Res Biomedicine ANTIBODIES THAT NEUTRALIZE HUMAN CYTOMEGALOVIRUS AND USE THEREOF
CA2733147A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 Novartis Ag Microparticles for use in immunogenic compositions
CL2008002322A1 (es) 2008-08-07 2009-06-05 Univ Concepcion Formulacion farmaceutica veterinaria que comprende un sistema vectorial viral constituido por una particula recombinante de arn que codifica una cu/zn superoxido dismutasa de la bacteria patogena de bovinos brucella abortus, y al menos un alfavirus arn perteneciente a la familia del virus semliki forest (sfv), util como vacuna.
US8557292B2 (en) 2008-08-13 2013-10-15 California Institute Of Technology Carrier nanoparticles and related compositions, methods and systems
WO2010036948A2 (en) 2008-09-26 2010-04-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Dna prime/inactivated vaccine boost immunization to influenza virus
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
CA2740000C (en) 2008-10-09 2017-12-12 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
EP3269395A1 (en) 2008-11-07 2018-01-17 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
CN111808084A (zh) 2008-11-10 2020-10-23 阿布特斯生物制药公司 用于递送治疗剂的新型脂质和组合物
JP6046348B2 (ja) 2008-11-18 2016-12-14 タケダ ヴァクシーンズ， インコーポレイテッド Ｒｓｖｆｖｌｐならびにその製造および使用の方法
EP3243504A1 (en) * 2009-01-29 2017-11-15 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation
EP3263128A3 (en) 2009-04-14 2018-01-24 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Compositions for immunising against staphylococcus aureus
CA3045126A1 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Arbutus Biopharma Corporation Methods of delivering oligonucleotides to immune cells
KR101766408B1 (ko) 2009-06-10 2017-08-10 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
WO2011000107A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
EP2450031B1 (en) 2009-07-02 2018-08-29 Konica Minolta Holdings, Inc. Method for producing liposomes by two-stage emulsification method using outer aqueous phase containing specific dispersing agent, method for producing liposome dispersion or dry powder thereof using the method for producing liposomes, and liposome dispersion or dry powder thereof produced thereby
CA2766907A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Novartis Ag Self replicating rna molecules and uses thereof
CA2768186A1 (en) 2009-07-15 2011-01-20 Novartis Ag Rsv f protein compositions and methods for making same
US9642903B2 (en) 2009-07-16 2017-05-09 Lior Carmon Antigen specific multi epitope-based anti-infective vaccines
CA2769670C (en) 2009-07-31 2018-10-02 Ethris Gmbh Rna with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
JO3257B1 (ar) 2009-09-02 2018-09-16 Novartis Ag مركبات وتركيبات كمعدلات لفاعلية tlr
WO2011027222A2 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Novartis Ag Immunogenic compositions including tlr activity modulators
US20110070260A1 (en) 2009-09-09 2011-03-24 Baric Ralph S Multivalent Immunogenic Compositions Against Noroviruses and Methods of Use
CN107028886A (zh) 2009-11-04 2017-08-11 不列颠哥伦比亚大学 含有核酸的脂质粒子及相关的方法
US20110112353A1 (en) 2009-11-09 2011-05-12 Circulite, Inc. Bifurcated outflow cannulae
EP3318248B1 (en) 2009-12-01 2019-04-10 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
EP3296398A1 (en) 2009-12-07 2018-03-21 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
US8808982B2 (en) 2009-12-07 2014-08-19 Cellscript, Llc Compositions and methods for reprogramming eukaryotic cells
EP3494963A1 (en) 2009-12-18 2019-06-12 The University of British Columbia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
CA3009891C (en) 2009-12-23 2020-09-15 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
EP2525815B1 (en) 2010-01-24 2015-02-25 Novartis AG Irradiated biodegradable polymer microparticles
US9744228B2 (en) 2010-04-07 2017-08-29 Norvartis Ag Method for generating a parvovirus B19 virus-like particle
AU2011276328C1 (en) 2010-07-06 2016-01-21 Novartis Ag Norovirus derived immunogenic compositions and methods
MX342608B (es) 2010-07-06 2016-10-06 Novartis Ag * Particulas de suministro similares a viriones para moleculas de arn de autorreplicacion.
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
NZ606591A (en) 2010-07-06 2015-02-27 Novartis Ag Cationic oil-in-water emulsions
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
EP2591114B1 (en) 2010-07-06 2016-06-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunisation of large mammals with low doses of rna
ES2557382T3 (es) 2010-07-06 2016-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomas con lípidos que tienen un valor de pKa ventajoso para el suministro de ARN
ES2646669T3 (es) 2010-07-06 2017-12-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimientos de aumento de una respuesta inmunitaria mediante el suministro de ARN
US8898852B2 (en) 2010-08-04 2014-12-02 Honeywell International Inc. Air burst to clear detection window
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
SI4043040T1 (sl) 2010-08-31 2023-04-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali liposomi za dostavo imunogen-kodirajoče RNA
MX2013002332A (es) 2010-08-31 2013-03-18 Novartis Ag Lipidos apropiados para suministro liposomal del arn que codifica la proteina.
LT4226941T (lt) 2010-08-31 2025-01-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilintos liposomos, skirtos imunogeną koduojančios rnr pristatymui
EP2614072A4 (en) 2010-09-09 2014-03-19 Univ Virginia Commonwealth VACCINE AGAINST THE HUMAN CYTOMEGALOVIRUS
EP2625189B1 (en) 2010-10-01 2018-06-27 ModernaTX, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2012051211A2 (en) 2010-10-11 2012-04-19 Novartis Ag Antigen delivery platforms
PH12013500764A1 (en) 2010-10-25 2015-09-23 Stepan Co Quaternized fatty amines, amidoamines, and their derivatives from natural oil metathesis
WO2012103361A1 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Novartis Ag Rsv immunization regimen
EA033467B1 (ru) 2011-01-31 2019-10-31 Univ Pennsylvania Молекула нуклеиновой кислоты для индукции иммунного ответа против герпесвируса и ее применение
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
CA2835644C (en) 2011-05-13 2021-06-15 Novartis Ag Pre-fusion rsv f antigens
CA2835428A1 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof for non-human vertebrates
ES2795110T3 (es) 2011-06-08 2020-11-20 Translate Bio Inc Lípidos escindibles
EP4115875A1 (en) 2011-07-06 2023-01-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
CA2841047A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof
EP2729165B1 (en) 2011-07-06 2017-11-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic combination compositions and uses thereof
MX350258B (es) 2011-07-06 2017-08-31 Novartis Ag Emulsiones cationicas de aceite en agua.
JP6059220B2 (ja) 2011-07-06 2017-01-18 ノバルティス アーゲー 核酸を含む水中油型エマルジョン
MX366055B (es) 2011-08-31 2019-06-26 Novartis Ag Liposomas pegilados para admistracion de acido ribonucleico (arn) que codifica para inmunogeno.
WO2013039861A2 (en) 2011-09-12 2013-03-21 modeRNA Therapeutics Engineered nucleic acids and methods of use thereof
DE19216461T1 (de) 2011-10-03 2021-10-07 Modernatx, Inc. Modifizierte nukleoside, nukleotide und nukleinsäuren und verwendungen davon
RU2014118727A (ru) 2011-10-11 2015-11-20 Новартис Аг Рекомбинантные самореплицирующиеся полицистронные молекулы рнк
US20140348863A1 (en) 2011-10-12 2014-11-27 Alessia Bianchi Cmv antigens and uses thereof
WO2013130161A1 (en) 2011-12-14 2013-09-06 modeRNA Therapeutics Methods of responding to a biothreat
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
CN104968354A (zh) 2011-12-21 2015-10-07 现代治疗公司 增加器官或器官外植体的活力或寿命的方法
WO2013151665A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
CN104411338A (zh) 2012-04-02 2015-03-11 现代治疗公司 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
CN109045294A (zh) 2013-01-10 2018-12-21 思齐乐 流感病毒免疫原性组合物及其应用
US9504747B2 (en) 2013-03-08 2016-11-29 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US20160032316A1 (en) 2013-03-14 2016-02-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and Purity Assessment of RNA Molecules Synthesized with Modified Nucleosides
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
EP3083556B1 (en) 2013-12-19 2019-12-25 Novartis AG Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
US9686692B2 (en) 2014-03-20 2017-06-20 Microsoft Technology Licesning, LLC Wi-Fi tile transfer
EP3798229A1 (en) * 2014-03-25 2021-03-31 Yale University Uses of parasite macrophage migration inhibitory factors
HUE060907T2 (hu) 2014-06-25 2023-04-28 Acuitas Therapeutics Inc Új lipidek és lipid nanorészecske formulációk nukleinsavak bevitelére
PT3313829T (pt) 2015-06-29 2024-07-08 Acuitas Therapeutics Inc Formulações de lípidos e de nanopartículas lipídicas para a administração de ácidos nucleicos
JP6948313B6 (ja) 2015-09-17 2022-01-14 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療剤の細胞内送達のための化合物および組成物
HRP20230209T1 (hr) 2015-10-28 2023-04-14 Acuitas Therapeutics Inc. Novi lipidi i lipidne formulacije nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
CA3043033A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Translate Bio, Inc. Improved ice-based lipid nanoparticle formulation for delivery of mrna
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
WO2020106946A1 (en) 2018-11-21 2020-05-28 Translate Bio, Inc. TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS BY DELIVERY OF NEBULIZED mRNA ENCODING CFTR
EP4021407A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Jet mixing lipid nanoparticle manufacturing process
US11918643B2 (en) 2020-12-22 2024-03-05 CureVac SE RNA vaccine against SARS-CoV-2 variants
EP4274607A1 (en) 2021-01-11 2023-11-15 ModernaTX, Inc. Seasonal rna influenza virus vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
FI4066857T3 (fi) 2023-03-20
EP4066857A1 (en) 2022-10-05
SI4066855T1 (sl) 2023-04-28
HRP20241772T1 (hr) 2025-02-28
HRP20230185T8 (hr) 2023-07-21
HUE061068T2 (hu) 2023-05-28
RS63367B1 (sr) 2022-07-29
CY1125575T1 (el) 2025-05-09
SI4226941T1 (sl) 2025-04-30
PT4226941T (pt) 2024-11-18
SI2611461T1 (sl) 2022-08-31
EP4226941B1 (en) 2024-10-23
EP4226940A1 (en) 2023-08-16
SMT202300066T1 (it) 2023-03-17
ES2918192T3 (es) 2022-07-14
CN103179984A (zh) 2013-06-26
RU2013114362A (ru) 2014-10-10
EP2611461A1 (en) 2013-07-10
SI4066857T1 (sl) 2023-04-28
HRP20220835T1 (hr) 2022-10-14
EP4101462A1 (en) 2022-12-14
ES2918649T3 (es) 2022-07-19
PT3970742T (pt) 2022-06-27
SI4066856T1 (sl) 2023-03-31
EP4226941A1 (en) 2023-08-16
HRP20220695T1 (hr) 2022-07-08
JP5911870B2 (ja) 2016-04-27
HUE058361T2 (hu) 2022-07-28
US11759422B2 (en) 2023-09-19
PT2611461T (pt) 2022-05-26
MX2013002336A (es) 2013-03-18
EP3970742B1 (en) 2022-05-25
RS63949B1 (sr) 2023-02-28
US20130202684A1 (en) 2013-08-08
SMT202300075T1 (it) 2023-05-12
HUE061043T2 (hu) 2023-05-28
CA2809851A1 (en) 2012-03-08
DK4066855T3 (da) 2023-02-20
SI3981427T1 (sl) 2022-08-31
AU2011295935B2 (en) 2016-02-11
EP3970742A1 (en) 2022-03-23
EP4066856A1 (en) 2022-10-05
US20240216276A1 (en) 2024-07-04
DK3981427T3 (da) 2022-07-11
LT3970742T (lt) 2022-08-10
PT4066856T (pt) 2023-01-02
EP3981427A1 (en) 2022-04-13
LT4066856T (lt) 2023-01-25
US20200230058A1 (en) 2020-07-23
DK4066857T3 (da) 2023-02-20
LT4226941T (lt) 2025-01-10
PL3970742T3 (pl) 2022-09-19
HUE058667T2 (hu) 2022-09-28
PL3981427T3 (pl) 2022-09-19
HUE058666T2 (hu) 2022-09-28
SMT202200497T1 (it) 2023-01-13
PT3981427T (pt) 2022-06-27
ES2935009T3 (es) 2023-03-01
HRP20230226T1 (hr) 2023-04-14
PL4066856T3 (pl) 2023-02-27
ES2913791T3 (es) 2022-06-06
JP2013536803A (ja) 2013-09-26
HRP20221023T1 (hr) 2022-11-11
HUE069090T2 (hu) 2025-02-28
SMT202200311T1 (it) 2022-09-14
EP4119155A1 (en) 2023-01-18
RS63816B1 (sr) 2023-01-31
DK4066856T3 (da) 2022-12-19
ES2938327T3 (es) 2023-04-10
RS63983B1 (sr) 2023-03-31
PL4066857T3 (pl) 2023-03-20
WO2012031043A1 (en) 2012-03-08
ES2938866T3 (es) 2023-04-17
PT4066855T (pt) 2023-02-28
EP2611461B1 (en) 2022-03-09
LT4066857T (lt) 2023-02-27
EP3981427B9 (en) 2022-07-27
PL2611461T3 (pl) 2022-07-04
HRP20221533T1 (hr) 2023-02-17
AU2011295935A1 (en) 2013-04-04
SI3970742T1 (sl) 2022-08-31
RS63329B1 (sr) 2022-07-29
EP4147718A1 (en) 2023-03-15
PL4226941T3 (pl) 2025-03-31
LT4066855T (lt) 2023-03-10
PL4066855T3 (pl) 2023-05-08
SMT202200223T1 (it) 2022-07-21
HUE060524T2 (hu) 2023-03-28
FI4226941T3 (fi) 2025-01-10
EP4066855B1 (en) 2022-12-28
LT3981427T (lt) 2022-08-10
DK3970742T3 (da) 2022-07-04
ES2995282T3 (en) 2025-02-10
PT4066857T (pt) 2023-01-31
BR112013004866A2 (pt) 2016-06-07
EP4066855A1 (en) 2022-10-05
DK2611461T3 (da) 2022-05-16
CY1125209T1 (el) 2025-03-28
HRP20220835T8 (hr) 2023-01-06
HRP20230185T1 (hr) 2023-03-31
EP4066857B1 (en) 2022-12-21
SMT202200290T1 (it) 2022-09-14
FI4066855T3 (fi) 2023-03-23
LT2611461T (lt) 2022-08-10
CY1125492T1 (el) 2025-05-09
EP3981427B1 (en) 2022-05-25
DK4226941T3 (da) 2024-12-02
EP4066856B1 (en) 2022-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240216276A1 (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
EP2611420B1 (en) Lipids suitable for liposomal delivery of protein-coding rna
EP2750707B1 (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40078743A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40081868A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40084980A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40093845A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40062525A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40062524A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40093846A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40093846B (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40079351A (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40062525B (en) Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna