RS63336B1 - Kompozicije i postupci za isporuku terapijskih agenasa - Google Patents

Kompozicije i postupci za isporuku terapijskih agenasa

Info

Publication number
RS63336B1
RS63336B1 RS20220606A RSP20220606A RS63336B1 RS 63336 B1 RS63336 B1 RS 63336B1 RS 20220606 A RS20220606 A RS 20220606A RS P20220606 A RSP20220606 A RS P20220606A RS 63336 B1 RS63336 B1 RS 63336B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
lipid
lnp
peg
group
cells
Prior art date
Application number
RS20220606A
Other languages
English (en)
Inventor
Gilles Besin
Stephen Hoge
Joseph Senn
Kerry Benenato
Staci Sabnis
Original Assignee
Modernatx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Modernatx Inc filed Critical Modernatx Inc
Publication of RS63336B1 publication Critical patent/RS63336B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A61K47/544—Phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/331—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen
    • C08G65/332—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen containing carboxyl groups, or halides, or esters thereof
    • C08G65/3322—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen containing carboxyl groups, or halides, or esters thereof acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/331—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen
    • C08G65/332—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen containing carboxyl groups, or halides, or esters thereof
    • C08G65/3324—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen containing carboxyl groups, or halides, or esters thereof cyclic
    • C08G65/3326—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing oxygen containing carboxyl groups, or halides, or esters thereof cyclic aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33303—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing amino group
    • C08G65/33306—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing amino group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33303—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing amino group
    • C08G65/3331—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing amino group cyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33303—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing amino group
    • C08G65/33317—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing amino group heterocyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/3332—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing carboxamide group
    • C08G65/33324—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing carboxamide group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/334—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing sulfur
    • C08G65/3348—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing sulfur containing nitrogen in addition to sulfur
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/335—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing phosphorus
    • C08G65/3356—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing phosphorus having nitrogen in addition to phosphorus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G2650/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G2650/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule characterized by the type of post-polymerisation functionalisation
    • C08G2650/04—End-capping
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Description

Opis
POZADINA
[0001] Efikasna in vivo isporuka aktivnih agenasa kao što su lekovi malog molekula, proteini, peptidi, i nukleinske kiseline predstavlja kontinuirani medicinski izazov. Imunski sistem prepoznaje neke aktivne agense, rezultujući smanjenom efikasnošću. Kako bi se rešio ovaj problem, određene formulacije aktivnih agenasa imaju inkorporisane polimere kao što je polietilen glikol za koji se smatralo da prikriva ili maskira agens, time redukujući njegovu antigenost i imunogenost. Međutim, čak i ove "stelt" formulacije imaju svoja ograničenja, uključujući nemogućnost da se ponovljeno i često doziraju, na primer, tokom perioda od nekoliko dana bez gubitka aktivnosti.
[0002] Pored toga, neki agensi ili formulacije kada se primenjuju in vivo mogu da interaguju sa jednom ili više ćelija ili faktora, potencijalno ometajući njihove funkcije, i na kraju rezultujući neželjenim efektima. Takvi neželjeni efekti mogu ograničiti učestalost primene i/ili primenjenu dozu agensa, ili mogu u potpunosti da spreče in vivo upotrebu.
[0003] WO2013/086373 se tiče lipida za isporuku aktivnih agenasa. WO2015/058069 se tiče kompozicija i postupaka za tolerisanje ćelijskih sistema. WO2015/199952 se tiče novih lipida za isporuku nukleinskih kiselina.
SAŽETAK
[0004] Na osnovu objave koja je ovde sadržana, predmetni pronalazak obezbeđuje lipidnu nanočesticu (LNP) koja inkapsulira iRNK koja kodira terapijski protein, pri čemu LNP sadrži katjonski lipid, pomoćni lipid, strukturni lipid, i stabilizator, pri čemu je katjonski lipid jonizujući lipid, pri čemu je stabilizator PEG lipid, i pri čemu je PEG lipid jedinjenje Formule (V-OH):
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu: r je ceo broj između 1 i 100, uključujući; i R<5>je opciono supstituisani C10-40alkil, opciono supstituisani C10-40alkenil, ili opciono supstituisani C10-
40alkinil; i pri čemu LNP ne pokreće ubrzani klirens iz krvi.
[0005] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje lipidne nanočestice (LNP) za upotrebu u postupku isporučivanja terapijskog nivoa proteina od interesa subjektu, pri čemu je LNP LNP iz pronalaska, pri čemu postupak sadrži primenu prve doze i druge doze LNP subjektu; i pri čemu prva doza LNP ne indukuje imunski odgovor koji promoviše ubrzani klirens iz krvi (ABC) nakon primene druge doze LNP.
[0006] Predmetni pronalazak je definisan u nezavisnim patentnim zahtevima i njegova određena opciona svojstva su definisana u zavisnim patentnim zahtevima. U meri u kojoj se ovde upotrebljavaju termini "pronalazak", "primer" i "primer izvođenja", ovo će se tumačiti na takav način da je jedina zaštita tražena za pronalazak kao što se zahteva patentom.
[0007] Predmetna objava se zasniva, barem delimično, na otkrićima da komponente lipidnih nanočestica (LNP) mogu indukovati urođeni imunski odgovor. U nekim primerima izvođenja komponente LNP, kao što je fosfatidilholin, mogu indukovati proizvodnju prirodnih IgM i/ili IgG molekula, što može biti posredovano aktivacijom B1 ćelija, kao što su B1a i/ili B1b ćelije. Ovi biološki mehanizmi mogu doprineti odgovorima na lekove koji su izazvani od strane LNP, uključujući ubrzani klirens iz krvi (ABC) i toksičnost koja ograničava dozu kao što je odgovor akutne faze (APR) i pseudoalergija povezana sa aktivacijom komplementa (CARPA). I B1a ćelije i krvne pločice eksprimiraju CD36, koji može da vezuje fosfatidilholin.
[0008] Aktivacija B1 ćelija i krvnih pločica od strane LNP može biti posredovana aktivacijom CD36 receptora od strane komponente u LNP kao što je fosfatidilholin. Pored toga, PEG-lipid na LNP može doprineti proizvodnji prirodnog IgM i/ili anti-PEG IgG i IgM. U skladu sa tim, ovde su obezbeđeni postupci i kompozicije za isporučivanje LNP subjektu bez promovisanja istog stepena odgovora na lekove povezane sa LNP kao što je ovde navedeno upotrebom LNP koje ne pokreću urođeni imunski odgovor okarakterisan proizvodnjom prirodnog IgM, proizvodnjom prirodnog IgG, anti-PEG IgM, anti-PEG IgG, aktivacijom B1a ćelija, aktivacijom B1b ćelija, aktivacijom pDC ćelija i/ili agregacijom i/ili aktivacijom krvnih pločica, i/ili upotrebom sekundarnih agenasa, posebno farmakoloških agenasa, koji inhibiraju proizvodnju ovog urođenog imunskog odgovora, kao i suprimiraju nizvodne signalne puteve koji vode do odgovora na lekove povezane sa LNP.
[0009] Ova objava obezbeđuje, delimično, nove lipidne nanočestice (LNP) i LNP formulacije koje su manje podložne prepoznavanju, i stoga klirensu, od strane imunskog sistema. LNP koja je ovde obezbeđena ima iznenađujuće poboljšan profil klirensa i, u nekim instancama, toksičnosti. Iako bez namere da bude vezano bilo kojim posebnim mehanizmom ili teorijom, veruje se da poboljšani profili klirensa imaju redukovano prepoznavanje od strane i/ili vezivanje za određene imunske ćelije i manji ukupni efekat na te i druge imunske ćelije i faktore. Tačnije, određene LNP koje su ovde obezbeđene ne vezuju se ili se slabo vezuju za B1a i/ili B1b ćelije, nemaju ili imaju slabu aktivnost aktiviranja B1a i/ili B1b, aktivnost aktiviranja pDC, aktivnost agregacije krvnih pločica, i/ili aktivnost aktiviranja krvnih pločica. Ova aktivnost može biti barem delimično zbog komponenti LNP, ili agensa koji inhibira imunske odgovore indukovane komponentama LNP. Takav agens može biti inkorporisan unutar LNP koja se primenjuje ili formulisan odvojeno.
[0010] U ovoj objavi su takođe obezbeđena jedinjenja i kompozicije, uključujući formulacije, koje moduliraju imunske odgovore na primenjene nanočestice kao što je LNP. Ovde su takođe obezbeđeni postupci upotrebe takvih jedinjenja i kompozicija, posebno onih koje se odnose na imunsku modulaciju in vivo. Takođe su obezbeđeni postupci upotrebe LNP zajedno sa određenim klasama sekundarnih agenasa, uključujući na primer upotrebu LNP kod subjekata koji su komedicirani, npr. pre-medicirani sa određenim sekundarnim agensima. Takođe su obezbeđeni postupci skrininga pre primene i/ili pre lečenja koji identifikuju pacijente koji reaguju na primenu LNP i opciono klasifikuju takve pacijente u skladu sa stepenom njihovog odgovora. Identifikovanje takvih subjekata može dovesti, u nekim instancama, do modifikovanog režima lečenja.
[0011] Određene LNP koje su ovde obezbeđene sadrže katjonski lipid, pomoćni lipid, strukturni lipid, i stabilizator koji može, ali ne mora biti obezbeđen konjugovan za drugi lipid.
[0012] Katjonski lipid može biti ali nije ograničen na DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA i DODMA. Katjonski lipid može biti jonizujući lipid.
[0013] Strukturni lipid može biti, ali nije ograničen na sterol, kao što je na primer holesterol.
[0014] Pomoćni lipid je amfifilni površinski aktivni lipid, ili surfaktant. U nekim primerima izvođenja to je nekatjonski lipid. Pomoćni lipid može da sadrži najmanje jedan nepolarni lanac i najmanje jednu polarnu glavenu funkcionalnu grupu. Pomoćni lipid se takođe može označavati kao komplementarni lipid, tj. lipid koji funkcioniše da "komplementira" amino lipid i poveća fuzogenost dvosloja kako bi pomogao begu iz endozoma. U nekim primerima izvođenja nepolarni lanac je lipid. U drugim primerima izvođenja to je masna kiselina od najmanje 8C. U primerima primera izvođenja, pomoćni lipid se ne javlja u prirodi (npr. ne javlja se u prirodi kod ljudi) ili je egzogen.
[0015] Određenim LNP nedostaju bilo kakvi fosfatidil holin (PC) lipidi (tj. oni su bez fosfatidil holina (PC)). Određenim LNP koje su ovde obezbeđene nedostaju specifični fosfatidil holin lipidi kao što su ali ne ograničavajući se na DSPC. Određene LNP sadrže analog fosfatidil holina, pri čemu takvi analozi sadrže modifikovane glavene grupe (npr. modifikovanu glavenu grupu kvaternarnog amina), modifikovanu grupu jezgra, i/ili modifikovanu repnu grupu lipida. Takvi analozi mogu da sadrže cviterjonsku grupu koja je ne-PC cviterjonska grupa. Pomoćni lipid može biti lipid bilo koje ili bilo koje kombinacije Formula I, I-a, I-b, I-b-1. I-b-2. I-b-3. I-b-4, I-c, I-c-1, I-c-2, I-c-3, ili II kao što je ovde obezbeđeno.
[0016] Određene LNP sadrže druge pomoćne nekatjonske lipide uključujući na primer oleinsku kiselinu ili analoge oleinske kiseline. Pomoćni lipid može biti lipid Formule IV kao što je ovde obezbeđeno.
[0017] Stabilizator može biti polietilen glikol (PEG). PEG može biti konjugovan za lipid i stoga može biti obezbeđen kao PEG-c-DOMG ili PEG-DMG, na primer. Stabilizator, bilo da je obezbeđen u konjugovanom ili nekonjugovanom obliku, može da čini 1,5 mol % LNP, ili može da čini manje od 0,5 mol % LNP. Na primer, može da čini manje od 0,4 mol %, manje od 0,3 mol %, manje od 0,2 mol %, ili manje od 0,1 mol %.
[0018] LNP može da sadrži PEGilovani lipid Formule III, uključujući Formule III-OH, III-a-1, III-a-2, III-b-1, IIII-b-2, III-b-1-OH, III-b-2-OH, V, V-OH.
[0019] Određene LNP koje su ovde obezbeđene ne sadrže ili sadrže niske nivoe PEGilovanih lipida, uključujući one koji nemaju ili imaju niske nivoe alkil-PEGilovanih lipida, i mogu se ovde označavati kao da ne sadrže PEG ili PEGilovane lipide. Stoga, neke LNP sadrže manje od 0,5 mol % PEGilovanog lipida. U nekim instancama, PEG može biti alkil-PEG kao što je metoksi-PEG. Još neke LNP sadrže ne-alkil-PEG kao što je hidroksi-PEG, i/ili ne-alkil-PEGilovane lipide kao što su hidroksi-PEGilovani lipidi.
[0020] PEGilovani lipid može biti Jed420, Jed396, Jed394, Jed397, Jed395, Jed417, Jed418, ili Jed419.
[0021] U nekim instancama, LNP može da sadrži oko 50 mol %, 10 mol % pomoćnog lipida, 1,5 mol % PEGilovanog lipida, i 38,5 mol % strukturnog lipida.
[0022] U nekim instancama, LNP može da sadrži oko 50 mol %, 10 mol % pomoćnog lipida, manje od 0,5 mol % PEGilovanog lipida, i 39,5 mol % strukturnog lipida.
[0023] U nekim primerima izvođenja, stabilizator je ne-PEG funkcionalna grupa kao što je XTEN peptid koji može ali ne mora biti konjugovan za lipid. XTEN peptid je sposoban da formira hidratizovanu školjku oko LNP zbog svoje hidrofilne prirode. Dodatno služi da poveća poluživot LNP, u poređenju sa LNP kojoj nedostaje (ili je bez) bilo kakvog stabilizatora. Za razliku od PEG, međutim, on je biorazgradiv i sopšteno je da je neimunogen. X TEN peptid može imati aminokiselinsku sekvencu MAEPAGSPTSTEEGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGS (SEQ ID NO:1) ili MAEPAGSPTSTEEGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGS (SEQ ID NO:2). Druge XTEN amino-kiselinske sekvence su poznate u struci, uključujući, na primer, one koje su saopštene u S.A.D. patentu br.9,062,299. Primeri XTEN konjugovanih lipida uključuju ali nisu ograničeni na Jed431, i Jed432 i Jed433. Klik hemija se može upotrebljavati za konjugovanje XTEN peptida za lipid.
[0024] U nekim primerima izvođenja, stabilizator je ne-PEG funkcionalna grupa kao što je PAS peptid. PAS peptid je peptid koji sadrži prvenstveno ukoliko ne isključivo prolin, alanin i serin. Kao PEG i XTEN peptidi, PAS peptid je sposoban da formira hidratizovanu školjku oko LNP. On takođe služi da poveća poluživot LNP, u poređenju sa LNP kojoj nedostaje (ili je bez) stabilizatora. Za razliku od XTEN peptida, međutim, PAS peptidi imaju tendenciju da budu neutralnog naelektrisanja, i stoga su barem u ovom pogledu sličniji sa PEG. PAS peptid može imati aminokiselinsku sekvencu SAPSSPSPSAPSSPSPASPSSAPSSPSPSAPSSPSPASPSSAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO:3) ili AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO:4). Druge PAS amino-kiselinske sekvence su poznate u struci, uključujući, na primer, one koje su saopštene u WO 2008155134.
[0025] Objava razmatra LNP koje imaju bilo koju kombinaciju prethodno navedenih karakteristika. Takve LNP se mogu dodatno okarakterisati kao da imaju redukovano vezivanje za B1a ćelije i/ili redukovanu aktivnost aktivacije B1a ćelija. Dopunski ili alternativno, mogu se dodatno okarakterisati kao da imaju redukovanu aktivnost agregacije krvnih pločica, što se može označavati kao redukovana aktivnost aktivacije krvnih pločica.
[0026] Ovo objava dodatno razmatra da se takve LNP mogu upotrebljavati in vivo za isporuku agensa, kao što je protein ili nukleinska kiselina, bez pokretanja ubrzanog klirensa iz krvi (ABC). Stoga, takve LNP se mogu primenjivati subjektu ponovljeno i unutar kratkih vremenskih perioda bez rizika od poboljšanog klirensa od strane imunskog sistema, kao što je ranije saopšteno za različite primenjene agense uključujući agense formulisane sa lipidima. Stoga, LNP i što je još važnije njihov tovar se mogu primenjivati češće, i efikasnije pri većim dozama tokom ovih kratkih vremenskih perioda, nego što je to ranije bilo moguće.
[0027] Na još veće iznenađenje, određene LNP takođe demonstriraju redukovanu toksičnost nakon primene. Opet, iako bez namere da bude vezano bilo kojim posebnim mehanizmom ili teorijom, veruje se da je ovo rezultat redukovane aktivnosti agregacije krvnih pločica ovih LNP. Ova nemogućnost ili redukovana sposobnost agregacije krvnih pločica redukuje verovatnoću i ozbiljnost toksičnosti povezane sa koagulopatijom koja je uočena nakon primene LNP in vivo.
[0028] Bilo je potpuno neočekivano da će određene LNP imati dvostruku korist od redukovane podložnosti ABC i redukovane toksičnosti in vivo. Kao rezultat, ove LNP dozvoljavaju da se subjektu primenjuju veće doze inkapsuliranog agensa, delom zbog redukovanog profila toksičnosti njihove inkapsulirajuće LNP. LNP takođe dovode do dužeg poluživota za LNP i stoga njihov tovar, delimično zbog njihove redukovane podložnosti ABC. Ovo rezultuje višim i stabilnijim nivoima tovara između primena. Štaviše, u slučaju da tovar zahteva ponovljenu čestu primenu, ovde obezbeđene LNP olakšavaju takvu primenu. Ovo služi da poveća efikasnost određenih agenasa omogućavanjem češćeg doziranja nego što bi trenutno bilo moguće. Ovo takođe služi da učini korisnim druge agense koji možda nisu ranije upotrebljavani in vivo zbog ovih ograničenja.
[0029] Ova objava dodatno obezbeđuje druge nove formulacije i postupke upotrebe LNP, uključujući LNP formulacije. Specifično, ovde su obezbeđeni postupci upotrebe LNP i LNP formulacija zajedno sa agensima protiv krvnih pločica uključujući, ali ne ograničavajući se na inhibitore agregacije krvnih pločica. Ova objava razmatra da se takvi agensi mogu primenjivati subjektu pre i/ili suštinski istovremeno sa, i/ili čak i posle primene LNP. Stoga, takvi agensi mogu biti formulisani zajedno sa LNP ili mogu biti formulisani odvojeno, ali primenjeni zajedno, istim putem, i/ili u isto ili suštinski isto vreme. Značajno je da pre-medikacija ili ko-medikacija subjekta sa ovim agensima protiv krvnih pločica rezultuje redukovanom toksičnošću, uključujući toksičnost povezanu sa koagulopatijom, i nižom i manje ozbiljnom incidencom ABC. U skladu sa određenim primerima izvođenja, subjekti mogu biti pre-medicirani ili ko-medicirani sa kombinacijom sekundarnih agenasa uključujući inhibitore agregacije krvnih pločica, antihistaminike, i inhibitore NSAID ili COX enzima. Određeni sekundarni agensi koji se mogu upotrebljavati imaju dvostruku funkcionalnost (tj. mogu da inhibiraju agregaciju krvnih pločica, u celini ili delimično, i takođe imaju opšti antiinflamatorni efekat). Jedan takav primer je aspirin.
[0030] Lipidna nanočestica (LNP) koja inkapsulira iRNK koja kodira protein je obezbeđena u nekim aspektima pronalaska. LNP ima katjonski lipid, nekatjonski pomoćni lipid koji sadrži najmanje jedan lanac masne kiseline od najmanje 8C i najmanje jednu polarnu glavenu funkcionalnu grupu, i pri čemu pomoćni lipid nije fosfatidil holin (PC), PEG lipid, i sterol. U nekim aspektima, LNP dodatno sadrži agens koji inhibira imunske odgovore od strane LNP. U drugim aspektima nekatjonski pomoćni lipid je cviterjonski nekatjonski pomoćni lipid, analog DSPC, oleinska kiselina, analog oleinske kiseline, ili 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DSPC) supstituent.
[0031] U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipidi korisni u predmetnom pronalasku su DSPC analozi pri čemu je funkcionalna grupa fosfoholina zamenjena sa različitom cviterjonskom grupom. U određenim primerima izvođenja, različita cviterjonska grupa nije fosfoholinska grupa. U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipid koristan u predmetnom pronalasku je jedinjenje Formule (II). Ovde su obezbeđena jedinjenja Formule (II):
ili njihove soli pri čemu:
Z je cviterjonska funkcionalna grupa,
pri čemu cviterjonska funkcionalna grupa nije formule:
m je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10;
A je formule:
svaka instanca L<2>je nezavisno veza ili opciono supstituisani C1-6alkilen, pri čemu je jedna metilenska jedinica opciono supstituisanog C1-6alkilena opciono zamenjena sa -O-, -N(R<N>)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, ili -NR<N>C(O)N(R<N>)-;
svaka instanca R<2>je nezavisno opciono supstituisani C1-30alkil, opciono supstituisani C1-30alkenil, ili opciono supstituisani C1-30alkinil; opciono pri čemu su jedna ili više metilenskih jedinica R<2>nezavisno zamenjene sa opciono supstituisanim karbociklilenom, opciono supstituisanim heterociklilenom, opciono supstituisanim arilenom, opciono supstituisanim heteroarilenom, -N(R<N>)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -NR<N>C(O)N(R<N>)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR<N>)-, -C(=NR<N>)N(R<N>)-, NR<N>C(=NR<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)N(R<N>)-, -C(S)-, -C(S)N(R<N>)-, -NR<N>C(S)-, -NR<N>C(S)N(R<N>)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(R<N>)S(O)-, -S(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)N(R<N>)-, -OS(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)O-, -S(O)2-, -N(R<N>)S(O)2-, -S(O)2N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)2N(R<N>)-, -OS(O)2N(R<N>)-, ili -N(R<N>)S(O)2O-; svaka instanca R<N>je nezavisno vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa azota; Prsten B je opciono supstituisani karbociklil, opciono supstituisani heterociklil, opciono supstituisani aril, ili opciono supstituisani heteroaril; i
p je 1 ili 2.
[0032] U određenim primerima izvođenja, Z je amino-kiselina ili njen derivat. U određenim primerima izvođenja, Z je jedne od sledećih formula:
pri čemu je R<o>vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa kiseonika. U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (II) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0033] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (II) je jedne od sledećih formula:
1
ili njihova so.
[0034] Na primer, u određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (II) je jedno od sledećeg:
ili njihove soli.
[0035] Nekatjonski lipidi korisni u predmetnom pronalasku takođe uključuju analoge oleinske kiseline. Kao što je ovde opisano, analog oleinske kiseline može da sadrži modifikovani rep oleinske kiseline, modifikovanu funkcionalnu grupu karboksilne kiseline, ili oba. U određenim primerima izvođenja, analog oleinske kiseline je jedinjenje Formule (IV). Ovde su obezbeđena jedinjenja Formule (IV):
ili njihova so, pri čemu:
R<4>je opciono supstituisan, C10-40alkil; opciono supstituisan, C10-40alkenil; opciono supstituisan, C10-40alkinil; pri čemu je najmanje jedna metilenska grupa R<4>nezavisno zamenjena sa opciono supstituisanim karbociklilenom, opciono supstituisanim heterociklilenom, opciono supstituisanim arilenom, opciono supstituisanim heteroarilenom, -N(R<N>)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -NR<N>C(O)N(R<N>)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR<N>)-, -C(-NR<N>)N(R<N>)-, -NR<N>C(-NR<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)N(R<N>)-, -C(S)-. -C(S)N(R<N>)-, -NR<N>C(S)-, -NR<N>C(S)N(R<N>)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(R<N>)S(O)-, -S(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)N(R<N>)-, -OS(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)O-, -S(O)2-, -N(R<N>)S(O)2-, -S(O)2N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)2N(R<N>)-, -OS(O)2N(R<N>)-, ili -N(R<N>)S(O)2O-; i
svaka instanca R<N>je nezavisno vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa azota.
[0036] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (IV) je jedno od sledećeg:
1
ili njihove soli.
[0037] U određenim primerima izvođenja, analog oleinske kiseline je jedinjenje pri čemu je funkcionalna grupa karboksilne kiseline oleinske kiseline zamenjena sa različitom grupom. U određenim primerima izvođenja, analog oleinske kiseline koristan u predmetnom pronalasku je jedan od sledećog:
ili njihove soli.
[0038] Primeri nekatjonskih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće:
1
�
�
1
[0039] Lipidna nanočestica (LNP) koja inkapsulira iRNK koja kodira protein je obezbeđena u nekim aspektima pronalaska. LNP ima katjonski lipid, nekatjonski pomoćni lipid koji sadrži najmanje jedan lanac masne kiseline od najmanje 8C i najmanje jednu polarnu glavenu funkcionalnu grupu, PEG lipid, i sterol. U nekim aspektima LNP dodatno sadrži agens koji inhibira imunske odgovore od strane LNP. U nekim primerima izvođenja PEG lipid je alkil-PEGilovani lipid, ne-alkil-PEG kao što je hidroksi-PEG, ne-alkil-PEGilovani lipid kao što je hidroksi-PEGilovani lipid, Jed420, Jed396, Jed394, Jed397, Jed395, Jed417, Jed418, ili Jed419, Jed421, Jed422, ili pri čemu PEG lipid sadrži manje od 0,5% molskog odnosa PEG lipida u odnosu na druge komponente. U određenim primerima izvođenja, PEG lipid koristan u predmetnoj objavi je jedinjenje Formule (III). Ovde su obezbeđena jedinjenja Formule (III):
ili njihove soli, pri čemu:
R<3>je -OR<o>;
R<o>je vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa kiseonika;
r je ceo broj između 1 i 100, uključujući;
L<1>je opciono supstituisani C1-10alkilen, pri čemu je najmanje jedan metilen od opciono supstituisanog C1-10alkilena nezavisno zamenjen sa opciono supstituisanim karbociklilenom, opciono supstituisanim heterociklilenom, opciono supstituisanim arilenom, opciono supstituisanim heteroarilenom, -O-, -N(R<N>)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, ili -NR<N>C(O)N(R<N>)-;
D je funkcionalna grupa dobijena klik hemijom ili funkcionalna grupa koja se može isecati pod fiziološkim uslovima;
m je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10;
A je formule:
1
svaka instanca L<2>je nezavisno veza ili opciono supstituisani C1-6alkilen, pri čemu je jedna metilenska jedinica opciono supstituisanog C1-6alkilena opciono zamenjena sa -O-, -N(R<N>)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, ili -NR<N>C(O)N(R<N>)-;
svaka instanca R<2>je nezavisno opciono supstituisani C1-30alkil, opciono supstituisani C1-30alkenil, ili opciono supstituisani C1-30alkinil; opciono pri čemu su jedna ili više metilenskih jedinica R<2>nezavisno zamenjene sa opciono supstituisanim karbociklilenom, opciono supstituisanim heterociklilenom, opciono supstituisanim arilenom, opciono supstituisanim heteroarilenom. -N(R<N>)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -NR<N>C(O)N(R<N>)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR<N>)-, -C(=NR<N>)N(R<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)N(R<N>)-, -C(S)-, -C(S)N(R<N>)-, -NR<N>C(S)-, -NR<N>C(S)N(R<N>)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(R<N>)S(O)-, -S(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)N(R<N>)-, -OS(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)O-, -S(O)2-, -N(R<N>)S(O)2-. -S(O)2N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)2N(R<N>)-, -OS(O)2N(R<N>)-, ili -N(R<N>)S(O)2O-;
svaka instanca R<N>je nezavisno vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa azota; Prsten B je opciono supstituisani karbociklil, opciono supstituisani heterociklil, opciono supstituisani aril, ili opciono supstituisani heteroaril; i
p je 1 ili 2.
[0040] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je PEG-OH lipid (tj. R<3>je -OR<o>, i R<o>je vodonik). U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je Formule (III-OH):
ili njegova so.
[0041] U određenim primerima izvođenja, D je funkcionalna grupa dobijena klik hemijom (npr. triazol). U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je Formule (III-a-1) ili (III-a-2):
2
ili njihova so.
[0042] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so, pri čemu
s je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10.
[0043] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0044] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0045] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0046] U određenim primerima izvođenja, D je funkcionalna grupa koja se može isecati pod fiziološkim uslovima (npr. estar, amid, karbonat, karbamat, urea). U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je Formule (III-b-1) ili (III-b-2):
ili njihova so.
[0047] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je Formule (III-b-1-OH) ili (III-b-2-OH):
ili njihova so.
[0048] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
2
ili njihova so.
[0049] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0050] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0051] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0052] U određenim primerima izvođenja, PEG lipid koristan u predmetnoj objavi je PEGilovana masna kiselina. U određenim primerima izvođenja, PEG lipid koristan u predmetnoj objavi je jedinjenje Formule (V). Ovde su obezbeđena jedinjenja Formule (V):
ili njihove soli, pri čemu:
R<3>je -OR<o>;
R<o>je vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa kiseonika;
r je ceo broj između 1 i 100, uključujući;
R<5>je opciono supstituisani C10-40alkil, opciono supstituisani C10-40alkenil, ili opciono supstituisani C10-40alkinil; i opciono jedna ili više metilenskih grupa R<5>su zamenjene sa opciono supstituisanim karbociklilenom, opciono supstituisanim heterociklilenom, opciono supstituisanim arilenom, opciono supstituisanim heteroarilenom, -N(R<N>)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -NR<N>C(O)N(R<N>)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NRC(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR<N>)-, -C(=NR<N>)N(R<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)N(R<N>)-, -C(S)-, -C(S)N(RN)-, NR<N>C(S)-, -NR<N>C(S)N(R<N>)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(R<N>)S(O)-, -S(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)N(R<N>)-, -OS(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)O-, -S(O)2-, -N(R<N>)S(O)2-, -S(O)2N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)2N(R<N>)-, -OS(O)2N(R<N>)-, ili -N(R<N>)S(O)2O-; i
svaka instanca R<N>je nezavisno vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa azota.
[0053] U primerima izvođenja pronalaska, jedinjenje Formule (V) je Formule (V-OH):
2
ili njegova so.
[0054] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (V) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0055] U drugim aspektima nekatjonski pomoćni lipid je cviterjonski nekatjonski pomoćni lipid, lipid koji nije fosfatidil holin (PC), analog DSPC, oleinska kiselina, analog oleinske kiseline, ili 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DSPC) supstituent.
[0056] U nekim primerima izvođenja agens koji inhibira imunske odgovore od strane LNP sadrži miR vezujuće mesto. U drugim primerima izvođenja, miR vezujuće mesto je odabrano od miR
2
126, miR 155, i miR 1423p. miR vezujuće mesto je inkorporisano u iRNK u nekim primerima izvođenja. U drugim primerima izvođenja, miR vezujuće mesto je odvojeno od iRNK.
[0057] U nekim primerima izvođenja agens koji inhibira imunske odgovore od strane LNP sadrži iRNK koja sadrži miR vezujuće mesto. U različitim primerima izvođenja, iRNK sadrži 1-4, jedno, dva, tri ili četiri miR vezujućih mesta, pri čemu je najmanje jedno od miR vezujućih mesta miR-126 vezujuće mesto. U jednom primeru izvođenja, iRNK, sadrži najmanje dva mikroRNK vezujućih mesta, pri čemu je najmanje jedno od mikroRNK vezujućih mesta miR-126 vezujuće mesto. U jednom primeru izvođenja, iRNK, npr. miRNK, sadrži miR-126 vezujuće mesto i drugo mikroRNK vezujuće mesto za miR odabranu iz grupe koja se sastoji od miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146-3p, miR-146-5p, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24 i miR-27. U sledećem primeru izvođenja, iRNK, sadrži miR-126 (npr. miR-126-3p) vezujuće mesto i miR-142 (npr. miR-142-3p) vezujuće mesto. miR koja se ovde označava brojem može označavati bilo koju od dve zrele mikroRNK koje potiču iz suprotnih krakova iste pre-miRNA (npr. bilo 3p ili 5p mikroRNK). Sve miR koje se ovde označavaju brojevima su namenjene da uključuju i 3p i 5p krake/sekvence. Sada je otkriveno da inkorporisanje najmanje jednog mikroRNK vezujućeg mesta za mikroRNK eksprimiranu u imunskim ćelijama (npr. miR-126, miR-142, miR-155 i njihove kombinacije) u iRNK konstrukt može redukovati ili inhibirati ABC kada se jedinjenje ili kompozicija koje sadrže lipide koje sadrže iRNK primenjuje subjektu. U jednom primeru izvođenja, mehanizam delovanja miRNA vezujućeg(ih) mesta je mikroRNK "sunđer", pri čemu miRNA vezujuće(a) mesto(a) u konstruktu ili LNP "upija" mikroRNK koje se vezuju za vezujuće(a) mesto(a).
[0058] Analog DSPC može imati modifikovanu glavenu grupu koja je modifikovana glavena grupa kvaternarnog amina, modifikovana grupa jezgra, ili modifikovana repna grupa lipida u nekim primerima izvođenja. PEG lipid u drugim primerima izvođenja sadrži najmanje 0,0001%, najmanje 0,0005%, najmanje 0,001%, najmanje 0,005%, najmanje 0,01%, najmanje 0,05%, najmanje 0,1%, najmanje 0,15%, najmanje 0,2%, najmanje 0,25%, najmanje 0,3%, najmanje 0,35%, najmanje 0,4%, najmanje 0,45%, i manje od 0,5% molski odnos PEG lipida prema drugim komponentama.
[0059] U nekim primerima izvođenja LNP može imati molski odnos od oko 45-65% katjonskog lipida, oko 0,15-15% PEG lipida, oko 15-45% holesterola i oko 5-25% nekatjonskog pomoćnog lipida ili molski odnos od oko 55% katjonskog lipida, oko 2,5% PEG lipida, oko 32,5% holesterola i oko 10% nekatjonskog lipida.
[0060] U drugim primerima izvođenja katjonski lipid je odabran od DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA ili DODMA. U drugim primerima izvođenja katjonski lipid je odabran od lipida Jed brojeva koji su ovde obezbeđeni.
2
[0061] Objava obezbeđuje PEG lipid koji sadrži jedinjenje Formule (V):
i njegove soli, pri čemu:
R<3>je -OR<o>;
R<o>je vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa kiseonika;
r je ceo broj između 1 i 100, uključujući;
R<5>je opciono supstituisani C10-40alkil, opciono supstituisani C10-40alkenil, ili opciono supstituisani C10-40alkinil; i opciono jedna ili više metilenskih grupa R<5>su zamenjene sa opciono supstituisanim karbociklilenom, opciono supstituisanim heterociklilenom, opciono supstituisanim arilenom, opciono supstituisanim heteroarilenom, -N(R<N>)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -NR<N>C(O)N(R<N>)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR<N>)-, -C(=NR<N>)N(R<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)N(R<N>)-, -C(S)-, -C(S)N(R<N>)-, -NR<N>C(S)-, -NR<N>C(S)N(R<N>)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(R<N>)S(O)-, -S(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)N(R<N>)-, -OS(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)O-, -S(O)2-, -N(R<N>)S(O)2-, -S(O)2N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)2N(R<N>)-, -OS(O)2N(R<N>)-, ili -N(R<N>)S(O)2O-; i
svaka instanca R<N>je nezavisno vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa azota.
[0062] U primerima izvođenja pronalaska jedinjenje Formule (V) je Formule (V-OH):
ili njegova so.
[0063] U drugim primerima izvođenja jedinjenje Formule (V) je jedne od sledećih formula:
2
ili njihova so.
[0064] U još nekim primerima izvođenja jedinjenje Formule (V) je:
2
ili njegova so.
[0065] Ovi i drugi primeri izvođenja i aspekti biće ovde detaljnije razmotreni.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0066] Sledeće Slike su obezbeđene u nijansama sive.
SL. 1: Fikoeritrin (PE) fluorescencija CD3+ T ćelija i CD19+ B ćelija nakon inkubacije sa PE- LNP, PE+ LNP ili samo medijumom. Podaci pokazuju preuzimanje LNP od strane B ćelija slezine, ali ne i T ćelija pod uslovima ex vivo kulture.
SL. 2A-2B: Fikoeritrin (PE) fluorescencija CD3+ T ćelija i CD19+ B ćelija kao funkcija vremena inkubacije sa PE- LNP, PE+ LNP ili samo medijumom. Podaci pokazuju da se preuzimanje LNP od strane B ćelija, ali ne i T ćelija, dešava brzo u ovim uslovima ex vivo kulture.
SL. 3: EGFP fluorescencija CD19+ ćelija kao funkcija vremena inkubacije sa PE+ LNP koje sadrže EGFP iRNK. Ni u jednoj vremenskoj tački nije uočena ekspresija EGFP od strane B ćelija, uprkos masovnom preuzimanju LNP od strane tih ćelija.
SL. 4A-4B: Koncentracija hEPO i nivoi anti-PEG IgM in vivo nakon primene prve, druge i treće doze (hEPO) i prve i druge (IgM) LNP koje nose hEPO iRNK tovar u CD-1 nesplenektomizovanim (CD-1) i splenektomizovanim miševima.
SL. 5: PE-rodamin fluorescencija u CD19+ cirkulišućim B ćelijama posle inkubacije tokom 2, 4, 6 i 24 sata sa PE+ i PE- LNP
SL. 6A-6B: Preuzimanje LNP (SL.6A) i ekspresija EGFP (SL.6B) od strane cirkulišućih B ćelija kao funkcija vremena inkubacije.
SL. 7: Ekspresija CD86 u B ćelijama slezine i cirkulišućim B ćelijama nakon inkubacije sa PE- i PE+ LNP. Aktiviraju se B ćelije slezine i cirkulišuće B ćelije koje preuzimaju LNP.
SL. 8: Ekspresija CD86 u B ćelijama slezine i cirkulišućim B ćelijama koje preuzimaju ili ne preuzimaju PE+ LNP. Aktiviraju se B ćelije slezine i cirkulišuće B ćelije koje preuzimaju LNP, što dokazuje povećana ekspresija CD86.
SL. 9: Ekspresija CD86 kao funkcija preuzimanja LNP od strane B ćelija slezine u različitim vremenima inkubacije.
SL. 10: Sekrecija IL-6 i TNF-alfa od strane B ćelija inkubiranih sa PE+ i PE- LNP tokom 24 sata.
SL. 11A-11B: Preuzimanje praznih PE+ LNP od strane CD19+ B ćelija na 24 sata (SL.11A) i vremenski tok na 4 i 24 sata (SL.11B).
SL. 12A-12B: Ekspresija CD86 u B ćelijama koje su preuzele prazne PE+ LNP (SL.12A). B ćelije slezine se aktiviraju praznim LNP na dozno zavisan način. Sekrecija IL-6 i TNF-alfa od strane B ćelija inkubiranih sa praznim PE+ LNP (SL. 12B).
SL. 13A-13D: Preuzimanje i sekrecija citokina od strane B ćelija iz miševa divljeg tipa (WT), miševa sa nedostatkom ApoE, i miševa sa nedostatkom LDL receptora kod PE+ LNP (SL. 13A) i PE- LNP (SL. 13B). Takođe su dati procenat CD19+ PE+ ćelija (SL. 13C) i nivoi citokina u pg/ml (SL.13D).
SL. 14: Preuzimanje LNP nakon preinkubacije B ćelija sa slobodnim PEG ili anti-PEG IgG.
SL. 15: Preuzimanje LNP koje sadrže PEG ili PEG-OH ili im nedostaje PEG (bez PEG) od strane B ćelija.
SL. 16: Preuzimanje LNP koje sadrže PEG ili PEG-OH ili im nedostaje PEG (bez PEG) od strane B ćelija.
SL. 17: Ekspresija CD86 u B ćelijama inkubiranim sa LNP bez PEG ili PEG-OH LNP, kao funkcija preuzimanja LNP.
SL. 18: Preuzimanje LNP kao funkcija sadržaja fosfolipida u LNP.
SL. 19: Preuzimanje LNP kao funkcija sadržaja fosfolipida i PEG LNP u CD19+ B ćelijama i CD5+ B ćelijama.
SL. 20: Preuzimanje LNP od strane CD19+, CD19+CD5+ ili CD19+CD5- B ćelija kao funkcija sadržaja fosfolipida i PEG.
SL. 21: Ekspresija EGFP u nekonvencionalnim T (CD3-) i B (CD19-) ćelijama iz slezine 1 i 4 sata posle primene LNP koje sadrže DMG-PEG ili PEG-OH i LNP bez PEG.
SL. 22A-22B: Preuzimanje LNP od strane B ćelija in vivo kao funkcija sadržaja fosfolipida i PEG.
SL. 23A-23E: Nivoi ekspresije CD86 u B ćelijama posle injekcije LNP koje sadrže DMG-PEG (SL.23A) ili Jed418 (SL.23B), ili LNP bez PEG (SL.23C). Nivo ekspresije CD86 je procenjen na 1 sat (SL.23D) i 4 sata (SL.12E) posle injekcije LNP.
SL. 24A-24B: Preuzimanje PE+ LNP od strane B ćelija in vivo 1 sat (SL.24A) i 4 sata (SL.
24B) posle injekcije LNP koje sadrže DMG-PEG ili PEG-OH ili LNP bez PEG.
SL. 25: Preuzimanje LNP u B ćelije kao funkcija sadržaja DMG-PEG u LNP (studija sa intermedijarnim sadržajem).
1
SL. 26: Aktivacija B ćelija posle preuzimanja LNP kao funkcija sadržaja DMG-PEG u LNP. Podaci su predstavljeni u setovima od 4 bara. Četiri bara u svakom setu predstavljaju LNP-PE negativno, LNP-PE pozitivno slabo, LNP-PE pozitivno srednje, i LNP-PE pozitivno veoma, sleva nadesno, respektivno. Stoga, barovi predstavljaju populacije ćelija koje su asocirale ili preuzele rastuću količinu LNP.
SL. 27: Preuzimanje LNP u B ćelije kao funkcija sadržaja DMG-PEG u LNP (studija sa niskim sadržajem).
SL. 28: PE+ bojenje CD19+ B ćelija koje su dovedene u kontakt sa LNP koje sadrže Jed395, Jed404, i oleinsku kiselinu.
SL. 29A-29B: Aktivacija B ćelija izmerena povećanjem populacije aktiviranih B ćelija (CD19+CD86+CD69+). SL.29A pokazuje aktivaciju B ćelija kao funkciju DMG-PEG mol % bez Imikvimoda i SL.29B pokazuje aktivaciju B ćelija kao funkciju DMG-PEG mol % sa Imikvimodom.
SL. 30A-30B: Proinflamatorno oslobađanje citokina (IFN-γ na SL.30A, TNF-α na SL.30B) u ex vivo kulturi humanih B ćelija kao funkcija DMG-PEG mol % u prisustvu ili odsustvu Imikvimoda.
SL. 31A-31D: Fosfolipidni dizajn pomoćnih lipida koji su analozi i supstituenti za fosfatidil holin (PC) i DSPC. Modifikacije redukuju asocijaciju, prepoznavanje, na primer od strane receptora, i/ili preuzimanje LNP preko na primer modifikovanja PC glavene grupe (SL.
31A), PC jezgra (SL. 31B), ili preko redukovanja planarnosti lipida (SL. 31C). Takođe je obezbeđena varijanta oleinske kiseline (SL.31D).
SL. 32A-32C: Primeri PEGilovanih lipida koji sadrže kratke lipidne repove, klik linker, i hidroksi (OH) PEG krajnju grupu. SL. 32A pokazuje Jed394, Jed395, Jed396, i Jed397. SL.
32B pokazuje Jed398 i Jed399. SL.32C pokazuje Jed400-403.
SL. 33: Anti-PEG ili anti-DSPC IgM odgovor izmeren pomoću protočne citometrije (perle) 96 sati posle primene druge doze. IgM odgovori prema DSPC ili PEG su izmereni identično kada su perle upotrebljene same ili zajedno. PEG DMG, PEG DSPE ili Jed430 LNP indukovale su anti-LNP odgovore. Uočeni su i anti-PEG IgM i anti DSPC IgM, što sugeriše da je IgM odgovor prirodni IgM odgovor.
SL. 34: Anti-PEG IgM izmeren pomoću ELISA i anti-PEG ili anti-DSPC IgM izmeren pomoću protočne citometrije (perle) 96 sati posle primene druge doze. Anti-PEG IgM izmereni pomoću ELISA i perli su slični i nisu detektovane značajne razlike.
SL. 35: Asocijacija LNP sa krvnim pločicama kao funkcija vremena i kompozicije LNP. Procenat LNP asocirane sa krvnim pločicama (kao što je naznačeno fluorescencijom fikoeritrina (PE)) je pokazan u tri vremenske tačke (15, 60 i 240 minuta) posle primene PBS,
2
LNP koje sadrže DMG-PEG, LNP koje sadrže PEG-OH, i LNP bez PEG (sleva nadesno za svaku vremensku tačku). Ovi eksperimenti su izvedeni na prečišćenim krvnim pločicama sakupljenim od subjekta u pokazanim različitim vremenskim tačkama.
SL. 36: Aktivacija krvnih pločica kao funkcija kompozicije LNP. Aktivacija krvnih pločica (kao što je naznačeno ekspresijom markera aktivacije krvnih pločica CD62P (MFI)) je izmerena u tri vremenske tačke (15, 60 i 240 minuta) posle primene PBS, DMG-PEG LNP, PEG-OH LNP, i LNP bez PEG (sleva nadesno).
SL. 37A-37B: Prisustvo B220+ B ćelija i F4/80+ makrofaga u agregatima krvnih pločica in vivo kao funkcija vremena i kompozicije LNP. Procenat B ćelija (kao što je naznačeno B220+ bojenjem, SL. 37A) i procenat makrofaga (kao što je naznačeno F4/80+ bojenjem, SL. 37B) pokazani su u tri vremenske tačke (15, 60 i 240 minuta) posle primene PBS, DMG-PEG LNP, PEG-OH LNP, i LNP bez PEG (sleva nadesno).
SL. 38: In vitro aktivacija krvnih pločica procenjena povećanjem ekspresije CD31 i CD62P markera aktivacije, posle kontakta sa LNP.
SL. 39A-39D: In vitro aktivacija krvnih pločica, na šta ukazuje povećana ekspresija CD31 u odnosu na kontrolu (medijum), na 10 minuta (SL.39A), 30 minuta (SL.39B), 60 minuta (SL. 39C), i 120 minuta (SL.39D) posle primene medijuma, LPS i LNP koje sadrže DSPC.
SL. 40A-40B: In vitro agregacija krvnih pločica upotrebom testa pune krvi. Agregirane ćelije su sakupljene i gejtovane na osnovu ekspresije CD41 (prva kolona), velikog rasejanja unapred i bočnog rasejanja (druga kolona) i ekspresije F4/80 (y-osa) i CD11b (x-osa) (treća kolona) posle kontakta sa medijumom (prvi red), LPS (drugi red) i DSPC LNP (treći red). Agregati krvnih pločica su izolovani na osnovu ekspresije CD41+ i visokog FCS i visokog SSC, kao što je pokazano u drugoj koloni za SL.40A. Pokazan je procenat agregiranih ćelija koje su CD11b+ F4/80+ dvostruko pozitivne posle primene medijuma, LPS, i DSPC LNP (sleva nadesno) (SL.40B).
SL. 41A-41B: In vitro agregacija krvnih pločica sa B ćelijama (CD19+) i makrofagima (CD11b+ i F4/80+) posle inkubacije pune krvi sa medijumom, LPS i DSPC LNP (sleva nadesno) tokom 30 minuta (SL.41A) i 120 minuta (SL.41B).
SL. 42A-42C: In vitro agregacija krvnih pločica sa makrofagima (SL. 42A i 42B) i B ćelijama (SL. 42C) posle inkubacije pune krvi sa medijumom, LPS, i DSPC LNP (sleva nadesno) tokom 30 minuta i 120 minuta.
SL. 43A-43B: Povećana ekspresija markera aktivacije krvnih pločica CD31 (SL. 43A) i CD62P (SL. 43B) posle inkubacije krvnih pločica sa medijumom (kontrola), DSPC LNP, DOPC LNP, DOPG LNP, DMG-PEG LNP, i LPS (sleva nadesno) in vitro, tokom 0, 10, 30 i 60 minuta, izmereno pomoću protočne citometrije.
SL. 44A-44B: Povećana ekspresija markera aktivacije CD31 (SL.44A) i CD62P (SL.44B) posle inkubacije krvnih pločica in vitro sa medijumom (kontrola), DSPC LNP, DOPC LNP, DOPG LNP, DMG-PEG LNP i LPS, tokom 0, 10, 30 i 60 minuta, izmereno pomoću protočne citometrije.
SL. 45: Model efekta LNP na krvne pločice. DMG-PEG LNP se fizički asocira sa krvnim pločicama i aktivira ih. DSPC LNP se ne asocira fizički sa krvnim pločicama, ali su ipak u stanju da aktiviraju krvne pločice. Oba tipa LNP izazivaju agregaciju krvnih pločica uz istovremeno regrutovanje B ćelija i makrofaga. PEG-OH LNP i LNP bez PEG se ne asociraju detektabilno sa krvnim pločicama, što sugeriše ulogu DMG-PEG u asocijaciji LNP-krvne pločice. Čak i u odsustvu DMG-PEG, međutim, postoji aktivacija krvnih pločica, što sugeriše interakciju između krvnih pločica i fosfolipidne komponente, i posebno PC glavene grupe, u LNP.
SL. 46A-46B: B1a i B1b ćelije zahtevaju slezinu. SL.46A pokazuje nivoe B1a (gore) i B2b (dole) ćelija nakon splenektomije ili lažne operacije. SL. 46B pokazuje nivoe B1a (gore) i B2b (dole) antitela nakon splenektomija. B1b ćelije gube sposobnost da sekretuju antitela.
SL. 47: Broj retikulocita kod intaktnih i splenektomizovanih ne-humanih primata (NHP).
SL. 48: Hematokrit se održava kod splenektomizovanih NHP.
SL. 49A-49D: Rezultati studije splenektomije NHP. SL. 49A-49B pokazuju rezultate površine ispod krive (AUC) iz hEPO-iRNK-MC3 (SL.49A) i hEPO (SL.49B). Takođe su predstavljene Cmaxvrednosti za hEPO-iRNK-MC3 (SL.49C) i hEPO (SL.49D).
SL. 50A-50B: Supresija aktivacije komplementa u splenektomizovanim NHP kao što je demonstrirano nivoima indikatora aktivacije komplementa, C3a (SL.50A) i C5b9 (SL.50B).
SL. 51A-51B: Ekspresija citokina u splenektomizovanim NHP. Dati su nivoi IL-6 (SL.51A) i IL-10 (SL.51B).
SL. 52A-52B: Nivoi anti-PEG IgM (SL.52A) i anti-PEG IgG (SL.52B) su u velikoj meri redukovani u odsustvu slezine.
SL. 53A-53B su skup grafikona koji oslikavaju proizvodnju anti-PEG IgM nakon primene LNP formulacija.
SL. 54 je šema koja oslikava zamenu fosfolipida sa različitom cviterjonskom grupom. SL. 55A-55B su skup grafikona koji oslikavaju ekspresiju Luc iRNK (SL.55A) i aktivaciju B ćelija (SL. 55B) nakon primene LNP formulacija kod CD-1 miševa. CD-1 miševima je primenjeno 0,05 mg/kg Luc iRNK i ekspresija Luc je izmerena šest sati kasnije.
SL. 56A-56E oslikavaju efekte LNP formulacije na ekspresiju Luc i aktivaciju B ćelija. SL.
56B je grafikon koji oslikava ekspresiju CD86 (aktivacija B ćelija) i SL. 56C je grafikon
4
koji oslikava nivoe ekspresije Luc izmerene pomoću ukupnog fluksa. Strukture su pokazane na SL.56A, 56D, i 56E.
SL. 57A-57C oslikavaju efekte različitih LNP formulacija na B ćelije i krvne pločice. SL.
57A je grafikon koji oslikava učestalosti aktiviranih B-ćelija 24 sata nakon doze. SL.57B je grafikon koji oslikava agregaciju krvnih pločica 15 minuta nakon doze. SL.57C je grafikon koji oslikava regrutovanje ćelija u agregatu krvnih pločica.
SL. 58A-58B oslikava pozitivne efekte oleinske kiseline u LNP. SL. 58A oslikava nivoe ekspresije luciferaze izmerene pomoću ukupnog fluksa 6 sati posle isporuke CD-1 miševima. SL. 58B oslikava in vivo aktivaciju B-ćelija u splenocitima miša 24 sata nakon primene.
SL. 59 je grafikon koji oslikava koncentraciju hEPO tokom vremena. Poboljšana margina ekspresije sa česticom iz pronalaska za razliku od MC3 je demonstrirana sa hemijski modifikovanom iRNK.
SL. 60A-60C su skup grafikona koji oslikavaju poboljšani profil aktivacije imuniteta sa hemijski modifikovanom iRNK u LNP formulacijama iz pronalaska. SL. 60A je grafikon koji oslikava in vivo aktivaciju B-ćelija 24 sata nakon primene čestica napunjenih sa hEPO ili PBS. SL. 60B je grafikon koji oslikava koncentraciju IL-66 sati nakon primene čestica napunjenih sa hEPO ili PBS. SL. 60C je grafikon koji oslikava koncentraciju IP-106 sati nakon primene čestica napunjenih sa hEPO ili PBS.
SL. 61 je grafikon koji oslikava preuzimanje LNP od strane B ćelija izmereno procentom PE+ CD19+ B ćelija.
SL. 62 je grafikon koji oslikava aktivaciju B ćelija od strane LNP izmereno ekspresijom CD86 na D ćelijama.
SL. 63A-63B su skup grafikona koji oslikavaju količinu proizvedenog PEG IgM 96 sati posle druge doze LNP (SL.63A) ili 96 sati posle treće doze LNP (SL.63B).
SL. 64 je grafikon koji oslikava ekspresiju hEPO 6 sati nakon IV primene hEPO iRNK -LNP formulacija jednom nedeljno u nedeljama 1, 2, 3, i 4.
SL. 65 je grafikon koji oslikava proizvodnju anti-PEG IgM 96 sati nakon treće doze hEPO iRNK - LNP formulacija.
SL. 66 je grafikon koji oslikava podatke iz studije sa jednom dozom LNP koja ima različite fosfolipide sa različitim glavenim grupama injektovanih IV u CD-1 miševe. Svaki fosfolipid je izmeren u tri vremenske tačke (3, 6, i 24 sata) nakon injekcije. Fosfolipidne strukture su pokazane na SL.69.
SL. 67A-67C su skup grafikona koji oslikavaju oslobađanje citokina kao meru ex vivo aktivacije humanih B ćelija. Izmereni su nivoi IFN-gama (SL.67A), IL-6 (SL. 67) i TNF-alfa (SL.67C).
SL. 68 je grafikon koji oslikava količinu aktivacije B ćelija kao rezultat različitih LNP formulacija. LNP formulacije koje uključuju oleinsku kiselinu demonstrirale su redukovanu aktivaciju B ćelija slezine.
SL. 69 pokazuje fosfolipidne strukture.
SL. 70 je grafikon koji oslikava nivoe ekspresije Luc nakon primene LUC iRNK inkapsulirane u različitim LNP formulacijama koje se sastoje od novih derivata PC i oleinske kiseline 3, 6 i 24 sata nakon.
SL. 71A-71B su skup grafikona koji oslikavaju interakciju/asocijaciju B ćelija sa različitim LNP formulacijama kao što je procenjeno pomoću procenta CD19+PE+ ćelija. Nekoliko LNP formulacija je oslikano na SL.71A. Oleinska kiselina i Jed125 su oslikani na SL.71B.
SL. 72 su skup grafikona koji oslikavaju aktivaciju B ćelija sa različitim LNP formulacijama, kao što je procenjeno pomoću medijane intenziteta fluorescencije ekspresije CD86. Nekoliko LNP formulacija je oslikano na SL.72A. Oleinska kiselina i Jed125 su oslikani na SL. 72B.
SL. 73A-73C su skup grafikona koji oslikavaju ekspresiju Luc sa različitim LNP formulacijama kao što je procenjeno merenjem ukupnog fluksa na 3 sata (SL.73A), 6 sati (SL. 73B), i 24 sata (SL.73C) nakon doze.
SL. 74A-74B su grafikoni koji oslikavaju ekspresiju hEPO (pg/ml) 6 sati nakon IV primene hEPO iRNK-LNP formulacija jednom nedeljno u nedeljama 1, 2, i 3.
SL. 75 je grafikon koji oslikava proizvodnju anti-PEG IgM (ng/ml) 96 sati nakon primene druge doze LNP formulacija.
SL. 76 je grafikon koji oslikava ekspresiju Luc različitih LNP formulacija. Ekspresija Luc je procenjena merenjem ukupnog fluksa (p/s) 3 sata nakon doze, upotrebom BLI snimanja celog tela.
SL. 77 je grafikon koji oslikava aktivaciju B ćelija. Izmeren je procenat aktiviranih B ćelija (CD86+ CD69+) u CD19+ ćelijama slezine za LNP formulacije.
SL. 78 je grafikon koji oslikava ekspresiju EPO. Koncentracija EPO (ng/ml) je izmerena na pre uzimanja krvi, 6 sati, i 24 sata, svake od 6 nedelja.
SL. 79 je grafikon koji oslikava ekspresiju hEPO (ng/ml) na predoziranju, 2 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, 48 sati, i 72 sata nakon IV primene hEPO iRNK-LNP formulacija jednom nedeljno.
SL. 80 je grafikon koji oslikava nivoe anti-PEG IgM (U/ml) nakon IV primene hEPO iRNK-LNP formulacija jednom nedeljno.
SL. 81 je grafikon koji oslikava nivoe anti-PEG IgG (U/ml) nakon IV primene hEPO iRNK - LNP formulacija jednom nedeljno.
SL. 82 je grafikon koji oslikava aktivaciju B ćelija. Izmeren je procenat aktiviranih B ćelija (CD86+ CD27+) u CD19+ ćelijama za LNP formulacije.
SL. 83 je grafikon koji oslikava aktivaciju monocita izmerenu za LNP formulacije.
SL. 84A-84B su grafikoni koji oslikavaju ekspresiju EPO. Koncentracija EPO (ng/ml) izmerena je na 2 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, i 48 sati nakon prve injekcije i pete injekcije.
SL. 85A-85E su grafikoni koji oslikavaju ekspresiju EPO. Koncentracija EPO (ng/ml) izmerena je na dan 1 i dan 29 na 2 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, i 48 sati za svaku grupu komedikacije.
SL. 86A-86C su grafikoni koji oslikavaju populacije imunskih ćelija. Pokazuje procenat B ćelija (SL.86A), B1a ćelija (SL. 86B), i monocita (SL.86C) u PBMC za svaku grupu komedikacije na dan -7, 24 sata nakon prve injekcije, i 24 sata nakon pete injekcije.
SL. 87 je grafikon koji oslikava aktivaciju B ćelija. Procenat aktiviranih B ćelija u cirkulišućim B ćelijama je izmeren za svaku grupu ko-medikacije na dan -7, 24 sata nakon prve injekcije, i 24 sata nakon pete injekcije.
SL. 88 je grafikon koji oslikava aktivaciju monocita. Procenat aktiviranih monocita/makrofaga u cirkulišućim PBMC izmeren je za svaku grupu ko-medikacije na dan -7, 24 sata nakon prve injekcije, i 24 sata nakon pete injekcije.
SL. 89A-89B su grafikoni koji oslikavaju anti-PEG odgovor. Nivoi anti-PEG IgM (U/ml) (SL. 89A) i nivoi anti-PEG IgG (U/ml) (SL.89B) izmereni su za svaku grupu ko-medikacije na početku, na dan 9 nakon prve injekcije, i dan 34 nakon pete injekcije.
SL. 90A-90B su dva grafikona koji pokazuju nivoe anti-PEG IgM (U/ml) i nivoe EPO (ng/ml) u dve grupe sa SL. 78: C57BI6J (SL.90A) i sIgM-/- (SL.90B). Na SL.90A, nivoi anti-PEG IgM su grafički prikazani kao svetlosivi krugovi; na SL.90B oni su predstavljeni crnim krugovima. Koncentracije EPO su označene crnim krugovima (SL. 90A) i crnim kvadratima (SL.90B).
SL. 91A-91B: Efekat ko-medikacije na ABC kod NHP. Ko-medikacija ublažava proizvodnju citokina (IL-6) kod NHP (SL. 91A), i ko-medikacija sa Gilenijom redukuje proizvodnju anti-PEG IgM, u skladu sa redukovanim ABC (SL.91B).
SL. 92: B ćelije proliferišu u prisustvu DSPC LNP. Ćelije slezine su obojene sa CFSE i posle ispiranja, inkubirane sa IL-6, anti-BCR, DOPC lipozomima, DSPC LNP koje sadrže iRNK, DSPC LNP koje sadrže siRNA ili praznim LNP tokom 4 dana na 37 °C. Na dan 4, ćelije su sakupljene, isprane i obojene za površinske markere (CD19 i CD3) pre nego što su izmerene na BDFortessa protočnom citometru i analizirane pomoću ModFit 4.1 softvera.
SL. 93: DSPC LNP indukuju oslobađanje kalcijuma u B ćelijama. Ćelije slezine su obojene sa Calcium Sensor Dye eFluor<®>514, CD19, i CD3. Posle ispiranja, početna vrednost kalcijuma je dobijena tokom 30 sekundi na BDFortessa protočnom citometru. Odmah posle toga, ćelije su inkubirane sa DSPC LNP koje sadrže iRNK, DOPC lipozomima, oleinskim LNP, ili anti BCR i signal kalcijuma je dobijen tokom 360 sekundi. Zatim je ćelijama dodat koktel za stimulaciju ćelija i signal je dobijan tokom dopunskih 30 sekundi. Analiza je izvršena upotrebom ModFit 4.1 softvera.
DETALJAN OPIS
[0067] Ova objava obezbeđuje jedinjenja i kompozicije koje sadrže lipide koje nisu predmet za ABC i/ili koje imaju redukovanu toksičnost, kao i postupke za isporučivanje LNP subjektu bez promovisanja odgovora na lekove povezane sa LNP, uključujući ABC i LNP-indukovanu toksičnost (npr. koagulopatija, diseminovana intravaskularna koagulacija, vaskularna tromboza, CARPA, APR, ili njihova kombinacija).
[0068] Jedinjenja i kompozicije koje sadrže lipide su jedinjenja i kompozicije koje sadrže ili su konjugovane za jedan ili više lipida. Ovi agensi se ovde mogu označavati kao agensi konjugovani za lipide ili lipidirani agensi. Alternativno, takvi lipidi mogu da inkapsuliraju agense kao što su profilaktički, terapijski i dijagnostički agensi. Ovi agensi se ovde mogu označavati kao agensi inkapsulirani u lipidima ili agensi inkapsulirani u lipidnim nanočesticama (LNP).
[0069] Stoga, treba razumeti da ova objava obezbeđuje poboljšana jedinjenja i kompozicije za redukovanje ili eliminisanje ABC i toksičnosti nakon in vivo primene. Zbog sažetosti, ova objava se može u nekim instancama odnositi na kompozicije ili formulacije kao što su lipidne nanočestice ili LNP. Ovo je namenjeno u svrhu primera i treba razumeti da se različita učenja koja su ovde obezbeđena podjednako primenjuju na pojedinačna jedinjenja, kao što su jedinjenja konjugovana za lipide, osim ukoliko je eksplicitno drugačije navedeno.
Ubrzani klirens iz krvi
[0070] Pronalazak obezbeđuje jedinjenja, kompozicije i postupke njihove upotrebe za redukovanje efekta ABC na aktivni agens koji se ponovljeno primenjuje, kao što je biološki aktivan agens. Kao što će biti očigledno, redukovanje ili potpuno eliminisanje efekta ABC na primenjeni aktivni agens efikasno povećava njegov poluživot i stoga njegovu efikasnost.
[0071] U nekim primerima izvođenja, termin redukovanje ABC označava bilo koje redukovanje ABC u poređenju sa pozitivnom referentnom kontrolom LNP koja indukuje ABC kao što je MC3 LNP. LNP koje indukuju ABC izazivaju redukciju cirkulišućih nivoa aktivnog agensa nakon druge ili sledeće primene unutar datog vremenskog okvira. Stoga redukcija ABC označava manji klirens cirkulišućeg agensa nakon druge ili sledeće doze agensa, u odnosu na standardnu LNP. Redukcija može biti, na primer, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 100%. U nekim primerima izvođenja redukcija je 10-100%, 10-50%, 20-100%, 20-50%, 30-100%, 30-50%, 40%-100%, 40-80%, 50-90%, ili 50-100%. Alternativno, redukcija ABC se može okarakterisati kao najmanje detektabilan nivo cirkulišućeg agensa nakon druge ili sledeće primene ili najmanje 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta povećanje cirkulišućeg agensa u odnosu na cirkulišući agens nakon primene standardne LNP. U nekim primerima izvođenja redukcija je 2-100 puta, 2-50 puta, 3-100 puta, 3-50 puta, 3-20 puta, 4-100 puta, 4-50 puta, 4-40 puta, 4-30 puta, 4-25 puta, 4-20 puta, 4-15 puta, 4-10 puta, 4-5 puta, 5-100 puta, 5-50 puta, 5-40 puta, 5-30 puta, 5-25 puta, 5-20 puta, 5-15 puta, 5-10 puta, 6-100 puta, 6-50 puta, 6-40 puta, 6-30 puta, 6-25 puta, 6-20 puta, 6-15 puta, 6-10 puta, 8-100 puta, 8-50 puta, 8-40 puta, 8-30 puta, 8-25 puta, 8-20 puta, 8-15 puta, 8-10 puta, 10-100 puta, 10-50 puta, 10-40 puta, 10-30 puta, 10-25 puta, 10-20 puta, 10-15 puta, 20-100 puta, 20-50 puta, 20-40 puta, 20-30 puta, ili 20-25 puta.
[0072] Objava obezbeđuje jedinjenja i kompozicije koje sadrže lipide koje su manje podložne klirensu i stoga imaju duži poluživot in vivo. Ovo je posebno slučaj gde su kompozicije namenjene za ponovljenu, uključujući hroničnu primenu, i još preciznije gde se takva ponovljena primena dešava unutar nekoliko dana ili nedelja.
[0073] Značajno, ove kompozicije su manje podložne ili u potpunosti zaobilaze uočeni fenomen ubrzanog klirensa iz krvi (ABC). ABC je fenomen u kome se određeni egzogeno primenjeni agensi brzo uklanjaju iz krvi nakon druge i sledećih primena. Ovaj fenomen je uočen, delimično, za različite kompozicije koje sadrže lipide, uključujući, ali ne ograničavajući se na lipidirane agense, lipozome ili druge vehikulume za isporuku na bazi lipida, i agense inkapsulirane u lipidima. Do sada je osnova ABC bila slabo shvaćena i u nekim slučajevima pripisana humoralnom imunskom odgovoru i u skladu sa tim strategije za ograničavanje njegovog uticaja in vivo, posebno u kliničkom okruženju, ostale su nejasne.
[0074] Ova objava obezbeđuje jedinjenja i kompozicije koje su manje podložne, ukoliko su uopšte podložne, ABC. U nekim važnim aspektima, takva jedinjenja i kompozicije su jedinjenja ili kompozicije koje sadrže lipide. Jedinjenja ili kompozicije koje sadrže lipide iz ove objave, iznenađujuće, ne doživljavaju ABC nakon druge i sledeće primene in vivo. Ova rezistencija na ABC čini ova jedinjenja i kompozicije posebno pogodnim za ponovljenu upotrebu in vivo, uključujući i ponovljenu upotrebu unutar kratkih vremenskih perioda, uključujući dane ili 1-2 nedelje. Ova poboljšana stabilnost i/ili poluživot je zbog, delimično, nesposobnosti ovih kompozicija da aktiviraju B1a i/ili B1b ćelije i/ili konvencionalne B ćelije, pDC i/ili krvne pločice.
[0075] Ova objava prema tome obezbeđuje razjašnjenje mehanizma koji leži u osnovi ubrzanog klirensa iz krvi (ABC). Pronađeno je, u skladu sa ovom objavom i pronalascima koji su ovde obezbeđeni, da je fenomen ABC, barem kada se odnosi na lipide i lipidne nanočestice posredovan, barem delimično urođenim imunskim odgovorom koji uključuje B1a i/ili B1b ćelije, pDC i/ili krvne pločice. B1a ćelije su normalno odgovorne za sekretovanje prirodnog antitela, u obliku cirkulišućeg IgM. Ovaj IgM je polireaktivan, što znači da je u stanju da se veže za različite antigene, iako sa relativno niskim afinitetom za svaki.
[0076] U skladu sa pronalaskom je pronađeno da neki lipidirani agensi ili formulacije koje sadrže lipide, kao što su lipidne nanočestice koje se primenjuju in vivo, pokreću i predmet su za ABC. Sada je pronađeno u skladu sa pronalaskom da nakon primene prve doze LNP, jedna ili više ćelija koje su uključene u generisanje urođenog imunskog odgovora (koji se ovde označavaju kao senzori) vezuju takav agens, aktiviraju se, i zatim iniciraju kaskadu imunskih faktora (koji se ovde označavaju kao efektori) koji promovišu ABC i toksičnost. Na primer, B1a i B1b ćelije mogu da se vežu za LNP, postaju aktivirane (same ili u prisustvu drugih senzora kao što su pDC i/ili efektori kao što je IL6) i sekretuju prirodni IgM koji se vezuje za LNP. Prethodno postojeći prirodni IgM kod subjekta takođe može prepoznati i vezati se za LNP, čime se pokreće fiksacija komplementa. Posle primene prve doze, proizvodnja prirodnog IgM počinje unutar 1-2 sata od primene LNP. Tipično se za oko 2-3 nedelje prirodni IgM uklanja iz sistema zbog prirodnog poluživota IgM. Prirodni IgG se proizvodi počevši oko 96 sati posle primene LNP. Agens, kada se primenjuje u naivnom okruženju, može da ispoljava svoje biološke efekte relativno neopterećeno prirodnim IgM proizvedenim nakon aktivacije B1a ćelija ili B1b ćelija ili prirodnog IgG. Prirodni IgM i prirodni IgG su nespecifični i stoga se razlikuju od anti-PEG IgM i anti-PEG IgG.
[0077] Iako podnosilac prijave nije vezan mehanizmom, predlaže se da LNP pokreću ABC i/ili toksičnost preko sledećih mehanizama. Veruje se da kada se LNP primenjuje subjektu, LNP se brzo transportuje kroz krv do slezine. LNP mogu naići na imunske ćelije u krvi i/ili slezini. Brzi urođeni imunski odgovor se pokreće kao odgovor na prisustvo LNP unutar krvi i/ili slezine. Podnosilac prijave je ovde pokazao da je unutar nekoliko sati od primene LNP nekoliko imunskih senzora reagovalo na prisustvo LNP. Ovi senzori uključuju, ali nisu ograničeni na, imunske ćelije uključene u generisanje imunskog odgovora, kao što su B ćelije, pDC, i krvne pločice. Senzori mogu biti prisutni u slezini, na primer u marginalnoj zoni slezine i/ili u krvi. LNP može fizički da interaguje sa jednim ili više senzora, koji mogu da interaguju sa drugim senzorima. U tom slučaju LNP direktno ili indirektno interaguje sa senzorima. Senzori mogu direktno da interaguju jedan sa
4
drugim kao odgovor na prepoznavanje LNP. Na primer, mnogi senzori su locirani u slezini i mogu lako da interaguju jedan sa drugim. Alternativno, jedan ili više senzora mogu da interaguju sa LNP u krvi i postanu aktivirani. Aktivirani senzor tada može da interaguje direktno sa drugim senzorima ili indirektno (npr. preko stimulacije ili proizvodnje glasnika kao što je citokin, npr. IL6).
[0078] U nekim primerima izvođenja LNP može direktno da interaguje i aktivira svaki od sledećih senzora: pDC, B1a ćelije, B1b ćelije, i krvne pločice. Ove ćelije zatim mogu direktno ili indirektno da interaguju jedna sa drugom kako bi inicirale proizvodnju efektora koji na kraju dovode do ABC i/ili toksičnosti povezane sa ponovljenim dozama LNP. Na primer, podnosilac prijave je pokazao da primena LNP dovodi do aktivacije pDC, agregacije i aktivacije krvnih pločica i aktivacije B ćelija. Kao odgovor na LNP, krvne pločice takođe agregiraju i aktiviraju se i agregiraju sa B ćelijama. pDC ćelije se aktiviraju. Pronađeno je da LNP relativno brzo interaguje sa površinom krvnih pločica i B ćelija. Blokiranje aktivacije bilo kog ili kombinacije ovih senzora kao odgovor na LNP je korisno za prigušivanje imunskog odgovora koji bi se obično javio. Ovo prigušivanje imunskog odgovora rezultuje izbegavanjem ABC i/ili toksičnosti.
[0079] Jednom aktivirani senzori proizvode efektore. Efektor, kao što se ovde upotrebljava, je imunski molekul koji proizvodi imunska ćelija, kao što je B ćelija. Efektori uključuju, ali nisu ograničeni na imunoglobulin kao što je prirodni IgM i prirodni lgG i citokine kao što je IL6. B1a i B1b ćelije stimulišu proizvodnju prirodnih IgM unutar 2-6 sati nakon primene LNP. Prirodni IgG se može detektovati unutar 96 sati. Nivoi IL6 se povećavaju unutar nekoliko sati. Prirodni IgM i IgG cirkulišu u telu od nekoliko dana do nekoliko nedelja. Tokom ovog vremena cirkulišući efektori mogu da interaguju sa novoprimenjenim LNP, pokrećući te LNP da budu uklonjene od strane tela. Na primer, efektor može prepoznati i vezati se za LNP. Fc region efektora može biti prepoznat od strane i pokrenuti preuzimanje dekorisanog LNP od strane makrofaga. Makrofag se zatim transportuje do slezine. Proizvodnja efektora od strane imunskih senzora je prolazni odgovor koji je u korelaciji sa vremenom uočenim za ABC.
[0080] Ukoliko je primenjena doza druga ili sledeća primenjena doza, i ukoliko se takva druga ili sledeća doza primeni pre nego što se prethodno indukovani prirodni IgM i/ili IgG uklone iz sistema (npr. pre vremenskog perioda od 2-3 okvira), onda je takva druga ili sledeća doza ciljana od strane cirkulišućih prirodnih IgM i/ili prirodnih IgG ili Fc koji pokreću aktivaciju alternativnog puta komplementa i sami se brzo uklanjaju. Kada se LNP primenjuje pošto se efektori uklone iz tela ili im se broj smanji, ABC se ne uočava.
[0081] Stoga, korisno je u skladu sa aspektima pronalaska inhibirati interakciju između LNP i jednog ili više senzora, inhibirati aktivaciju jednog ili više senzora od strane LNP (direktno ili indirektno), inhibirati proizvodnju jednog ili više efektora, i/ili inhibirati aktivnost jednog ili više efektora. U nekim primerima izvođenja LNP je dizajnirana da ograniči ili blokira interakciju LNP sa senzorom. Na primer, LNP može imati izmenjeni PC i/ili PEG da spreči interakcije sa senzorima. Alternativno ili dopunski agens koji inhibira imunske odgovore indukovane od strane LNP može se upotrebljavati za postizanje bilo kog ili više od ovih efekata.
[0082] Takođe je utvrđeno da su konvencionalne B ćelije takođe uključene u ABC. Specifično, nakon prve primene agensa, konvencionalne B ćelije, koje se ovde označavaju kao CD19(+), vezuju se za agens i reaguju prema agensu. Međutim, za razliku od B1a i B1b ćelija, konvencionalne B ćelije su u stanju da prvo pokrenu IgM odgovor (koji počinje oko 96 sati posle primene LNP), i zatim IgG odgovor (koji počinje oko 14 dana posle primene LNP) uporedo sa memorijskim odgovorom. Stoga konvencionalne B ćelije reaguju prema primenjenom agensu i doprinose IgM (i na kraju IgG) koji posreduje u ABC. IgM i IgG su tipično anti-PEG IgM i anti-PEG IgG.
[0083] Smatra se da je u nekim instancama većina ABC odgovora posredovana preko B1a ćelija i B1a-posredovanih imunskih odgovora. Dodatno se smatra da je u nekim instancama ABC odgovor posredovan od strane i IgM i IgG, pri čemu i konvencionalne B ćelije i B1a ćelije posreduju u takvim efektima. U još nekim drugim instancama, ABC odgovor je posredovan prirodnim IgM molekulima, od kojih su neki sposobni da se vezuju za prirodni IgM, koji mogu da proizvedu aktivirane B1a ćelije. Prirodni IgM se mogu vezati za jednu ili više komponenti LNP, npr. vezivanje za fosfolipidnu komponentu LNP (kao što je vezivanje za PC funkcionalnu grupu fosfolipida) i/ili vezivanje za PEG-lipidnu komponentu LNP (kao što je vezivanje za PEG-DMG, posebno vezivanje za PEG funkcionalnu grupu PEG-DMG). Pošto B1a eksprimira CD36, za koji je fosfatidilholin ligand, smatra se da CD36 receptor može posredovati u aktivaciji B1a ćelija i stoga u proizvodnji prirodnog IgM. U još nekim drugim instancama, ABC odgovor je posredovan prvenstveno konvencionalnim B ćelijama.
[0084] U skladu sa pronalaskom pronađeno je da se fenomen ABC može redukovati ili poništiti, barem delimično, upotrebom jedinjenja i kompozicija (kao što su agensi, vehikulumi za isporuku, i formulacije) koji ne aktiviraju B1a ćelije. Jedinjenja i kompozicije koje ne aktiviraju B1a ćelije mogu se ovde označavati kao B1a inertna jedinjenja i kompozicije. Dodatno je pronađeno u skladu sa pronalaskom da se fenomen ABC može redukovati ili poništiti, barem delimično, upotrebom jedinjenja i kompozicija koje ne aktiviraju konvencionalne B ćelije. Jedinjenja i kompozicije koje ne aktiviraju konvencionalne B ćelije mogu se u nekim primerima izvođenja ovde označavati kao CD19-inertna jedinjenja i kompozicije. Stoga, u nekim primerima izvođenja koji su ovde obezbeđeni, jedinjenja i kompozicije ne aktiviraju B1a ćelije i ne aktiviraju konvencionalne B ćelije. Jedinjenja i kompozicije koje ne aktiviraju B1a ćelije i konvencionalne B ćelije mogu se u nekim primerima izvođenja ovde označavati kao B1a/CD19-inertna jedinjenja i kompozicije.
[0085] Ovi mehanizmi koji leže u osnovi do sada nisu shvaćeni, i uloga B1a i B1b ćelija i njihovo uzajamno dejstvo sa konvencionalnim B ćelijama u ovom fenomenu takođe nije cenjena.
[0086] U skladu sa tim, ova objava obezbeđuje jedinjenja i kompozicije koje ne promovišu ABC. One se dodatno mogu okarakterisati kao nesposobne da aktiviraju B1a i/ili B1b ćelije, krvne pločice i/ili pDC, i opciono takođe konvencionalne B ćelije. Ova jedinjenja (npr. agensi, uključujući biološki aktivne agense kao što su profilaktički agensi, terapijski agensi i dijagnostički agensi, vehikulumi za isporuku, uključujući lipozome, lipidne nanočestice, i druge inkapsulirajuće strukture na bazi lipida, itd.) i kompozicije (npr. formulacije, itd.) su posebno poželjne za aplikacije koje zahtevaju ponovljenu primenu, i posebno ponovljene primene koje se dešavaju unutar kratkih vremenskih perioda (npr. unutar 1-2 nedelje). Ovo je slučaj, na primer, ukoliko je agens terapeutik na bazi nukleinske kiseline koji se obezbeđuje subjektu u pravilnim, blisko raspoređenim intervalima. Nalazi obezbeđeni ovde mogu se primeniti na ove i druge agense koji se slično primenjuju i/ili koji su predmet za ABC.
[0087] Od posebnog interesa su jedinjenja koja sadrže lipide, čestice koje sadrže lipide, i kompozicije koje sadrže lipide pošto je poznato da su podložne ABC. Takve čestice i jedinjenja koja sadrže lipide, i kompozicije su u velikoj meri upotrebljavane kao biološki aktivni agensi ili kao vehikulumi za isporuku takvih agenasa. Stoga, sposobnost da se poboljša efikasnost takvih agenasa, bilo redukovanjem efekta ABC na sam agens ili na njegov vehikulum za isporuku, je korisna za širok spektar aktivnih agenasa.
[0088] Ovde su takođe obezbeđene kompozicije koje ne stimulišu ili pojačavaju odgovor akutne faze (ARP) asociran sa primenom ponovljene doze jednog ili više biološki aktivnih agenasa.
[0089] Kompozicija, u nekim instancama, možda se ne vezuje za IgM, uključujući ali ne ograničavajući se na prirodni IgM.
[0090] Kompozicija, u nekim instancama, možda se ne vezuje za protein akutne faze kao što je, ali ne ograničavajući se na C-reaktivni protein.
[0091] Kompozicija, u nekim instancama, možda neće pokrenuti CD5(+) posredovan imunski odgovor. Kao što se ovde upotrebljava, CD5(+) posredovan imunski odgovor je imunski odgovor koji je posredovan od strane B1a i/ili B1b ćelija. Takav odgovor može uključivati ABC odgovor, odgovor akutne faze, indukciju prirodnog IgM i/ili IgG, i slično.
[0092] Kompozicija, u nekim instancama, možda neće pokrenuti CD19(+) posredovan imunski odgovor. Kao što se ovde upotrebljava, CD19(+) posredovan imunski odgovor je imunski odgovor koji je posredovan od strane konvencionalnih CD19(+), CD5(-) B ćelija. Takav odgovor može uključivati indukciju IgM, indukciju IgG, indukciju memorijskih B ćelija, ABC odgovor, odgovor antilek antitela (ADA), uključujući anti-proteinski odgovor gde protein može biti inkapsuliran unutar LNP, i slično.
4
[0093] B1a ćelije su podskup B ćelija koje su uključene u urođeni imunitet. Ove ćelije su izvor cirkulišućeg IgM, koji se označava kao prirodno antitelo ili prirodno serumsko antitelo. Prirodna IgM antitela su okarakterisana kao da imaju slab afinitet za više antigena, i prema tome se označavaju kao "poli-specifična" ili "poli-reaktivna", što ukazuje na njihovu sposobnost da se vezuju za više od jednog antigena. B1a ćelije nisu u stanju da proizvode IgG. Pored toga, one se ne razvijaju u memorijske ćelije i stoga ne doprinose adaptivnom imunskom odgovoru. Međutim, one su u stanju da sekretuju IgM nakon aktivacije. Sekretovani IgM se tipično uklanja unutar oko 2-3 nedelje, u kom trenutku imunski sistem postaje relativno naivan za prethodno primenjeni antigen. Ukoliko se isti antigen prezentuje posle ovog vremenskog perioda (npr. oko 3 nedelje posle inicijalnog izlaganja), antigen se ne uklanja brzo. Međutim, značajno, ukoliko se antigen prezentuje unutar tog vremenskog perioda (npr. unutar 2 nedelje, uključujući unutar 1 nedelje, ili unutar nekoliko dana), onda se antigen brzo uklanja. Ovo odlaganje između uzastopnih doza učinilo je određene terapijske ili dijagnostičke agense koji sadrže lipide neprikladnim za upotrebu.
[0094] Kod ljudi, B1a ćelije su CD19(+), CD20(+), CD27(+), CD43(+), CD70(-) i CD5(+). Kod miševa, B1a ćelije su CD19(+), CD5(+), i CD45 B ćelijska izoforma B220(+). To je ekspresija CD5 koja tipično razlikuje B1a ćelije od drugih konvencionalnih B ćelija. B1a ćelije mogu da eksprimiraju visoke nivoe CDS, i na osnovu toga se mogu razlikovati od drugih B-1 ćelija kao što su B-1b ćelije koje eksprimiraju niske ili nedetektabilne nivoe CDS. CDS je glikoprotein površine panT ćelija. B1a ćelije takođe eksprimiraju CD36, takođe poznat kao translokaza masnih kiselina. CD36 je član porodice receptora čistača klase B. CD36 može da vezuje mnoge ligande, uključujući oksidovane lipoproteine male gustine, nativne lipoproteine, oksidovane fosfolipide, i masne kiseline dugog lanca.
[0095] B1b ćelije su sledeći podskup B ćelija koje su uključene u urođeni imunitet. Ove ćelije su još jedan izvor cirkulišućeg prirodnog IgM. Nekoliko antigena, uključujući PS, sposobno je da indukuje imunitet nezavisan od T ćelija preko aktivacije B1b. Ekspresija CD27 je tipično povećana na B1b ćelijama kao odgovor na aktivaciju antigenom. Slično B1a ćelijama, B1b ćelije su tipično locirane na određenim lokacijama u telu kao što su slezina i peritonealna šupljina i u krvi su u veoma maloj količini. Prirodni IgM koji sekretuju B1b se tipično uklanja unutar oko 2-3 nedelje, u kom trenutku imunski sistem postaje relativno naivan za prethodno primenjeni antigen. Ukoliko se isti antigen prezentuje posle ovog vremenskog perioda (npr. oko 3 nedelje posle inicijalnog izlaganja), antigen se ne uklanja brzo. Međutim, značajno, ukoliko se antigen prezentuje unutar tog vremenskog perioda (npr. unutar 2 nedelje, uključujući unutar 1 nedelje, ili unutar nekoliko dana), onda se antigen brzo uklanja. Ovo odlaganje između uzastopnih doza učinilo je određene terapijske ili dijagnostičke agense koji sadrže lipide neprikladnim za upotrebu.
[0096] U nekim primerima izvođenja poželjno je blokirati aktivaciju B1a i/ili B1b ćelija. Jedna strategija za blokiranje aktivacije B1a i/ili B1b ćelija uključuje određivanje koje komponente lipidnih nanočestica promovišu aktivaciju B ćelija i neutralisanje tih komponenti. Ovde je otkriveno da barem PEG i fosfatidilholin (PC) doprinose interakciji B1a i B1b ćelija sa drugim ćelijama i/ili aktivaciji. PEG može da igra ulogu u promovisanju agregacije između B1 ćelija i krvnih pločica, što može dovesti do aktivacije. PC (pomoćni lipid u LNP) takođe je uključen u aktivaciju B1 ćelija, verovatno preko interakcije sa CD36 receptorom na površini B ćelije. Brojne čestice imaju PEG-lipidne alternative, lipidi bez PEG, i/ili PC zamene (npr. oleinska kiselina ili njeni analozi) su dizajnirani i testirani. Podnosilac prijave je utvrdio da je zamena jedne ili više od ovih komponenti unutar LNP koje bi inače promovisale ABC nakon ponovljene primene, korisna u sprečavanju ABC redukovanjem proizvodnje prirodnog IgM i/ili aktivacije B ćelija. Stoga, pronalazak obuhvata LNP koje su redukovale ABC kao rezultat dizajna koji eliminiše uključivanje pokretača B ćelija.
[0097] Sledeća strategija za blokiranje aktivacije B1a i/ili B1b ćelija uključuje upotrebu agensa koji inhibira imunske odgovore indukovane od strane LNP. O ovim vrstama agenasa detaljnije se diskutuje u nastavku. U nekim primerima izvođenja ovi agensi blokiraju interakciju između B1a/B1b ćelija i LNP ili krvnih pločica ili pDC. Na primer, agens može biti antitelo ili drugi vezujući agens koji fizički blokira interakciju. Primer ovoga je antitelo koje se vezuje za CD36 ili CD6. Agens takođe može biti jedinjenje koje sprečava ili onemogućava B1a/B1b ćeliju da signalizira kada se aktivira ili pre aktivacije. Na primer, moguće je blokirati jednu ili više komponenti u B1a/B1b signalnoj kaskadi kao rezultat interakcije B ćelija sa LNP ili drugim imunskim ćelijama. U drugim primerima izvođenja agens može da deluje na jedan ili više efektora koje proizvode B1a/B1b ćelije nakon aktivacije. Ovi efektori uključuju, na primer, prirodne IgM i citokine.
[0098] U skladu sa aspektima pronalaska, demonstrirano je da kada je aktivacija pDC ćelija blokirana, aktivacija B ćelija kao odgovor na LNP je smanjena. Stoga, kako bi se izbegao ABC i/ili toksičnost, može biti poželjno sprečiti aktivaciju pDC. Slično strategijama o kojima se prethodno diskutovalo, aktivacija pDC ćelija može biti blokirana agensima koji ometaju interakciju između pDC i LNP i/ili B ćelija/krvnih pločica. Alternativno, agensi koji deluju na pDC da blokiraju njenu sposobnost da se aktivira ili na njene efektore mogu se upotrebljavati zajedno sa LNP kako bi se izbegao ABC.
[0099] Krvne pločice takođe igraju važnu ulogu u ABC i toksičnosti. Veoma brzo pošto je prva doza LNP primenjena subjektu, krvne pločice asociraju sa LNP, agregiraju i aktiviraju se. U nekim primerima izvođenja poželjno je blokirati agregaciju i/ili aktivaciju krvnih pločica. Jedna strategija za blokiranje agregacije i/ili aktivacije krvnih pločica uključuje određivanje koje komponente
4
lipidnih nanočestica promovišu agregaciju i/ili aktivaciju krvnih pločica i neutralisanje tih komponenti. Ovde je otkriveno da barem PEG doprinosi agregaciji krvnih pločica, aktivaciji i/ili interakciji sa drugim ćelijama. Brojne čestice imaju PEG-lipidne alternative i one bez PEG su dizajnirane i testirane. Podnosilac prijave je utvrdio da je zamena jedne ili više od ovih komponenti unutar LNP koje bi inače promovisale ABC nakon ponovljene primene, korisna u sprečavanju ABC redukovanjem proizvodnje prirodnog IgM i/ili agregacije krvnih pločica. Stoga, pronalazak obuhvata LNP koje su redukukovale ABC kao rezultat dizajna koji eliminiše uključivanje pokretača krvnih pločica. Alternativno, agensi koji deluju na krvne pločice da blokiraju njihovu aktivnost kada se aktiviraju ili na njihove efektore mogu se upotrebljavati zajedno sa LNP kako bi se izbegao ABC.
Merenje ABC aktivnosti i povezanih aktivnosti
[0100] Različita jedinjenja i kompozicije koje su ovde obezbeđene, uključujući LNP, ne promovišu ABC aktivnost nakon primene in vivo. Ove LNP mogu biti okarakterisane i/ili identifikovane bilo kojim od brojnih testova, kao što su, ali ne ograničavajući se na one koji su opisani u nastavku, kao i bilo kojim od testova objavljenih u odeljku Primeri, uključujući pododeljak o postupcima iz Primera.
[0101] U nekim primerima izvođenja, postupci uključuju primenu LNP bez stvaranja imunskog odgovora koji promoviše ABC. Imunski odgovor koji promoviše ABC uključuje aktivaciju jednog ili više senzora, kao što su B1 ćelije, pDC, ili krvne pločice, i jednog ili više efektora, kao što su prirodni IgM, prirodni IgG ili citokini kao što je IL6. Stoga primena LNP bez stvaranja imunskog odgovora koji promoviše ABC, u najmanju ruku uključuje primenu LNP bez značajne aktivacije jednog ili više senzora i značajne proizvodnje jednog ili više efektora. Značajno upotrebljeno u ovom kontekstu označava količinu koja bi dovela do fiziološke posledice ubrzanog klirensa iz krvi cele ili dela druge doze u odnosu na nivo klirensa iz krvi koji se očekuje za drugu dozu LNP koja pokreće ABC. Na primer, imunski odgovor treba da bude prigušen tako da ABC uočen posle druge doze bude niži nego što bi se očekivalo za LNP koja pokreće ABC.
Test B1a ili B1b aktivacije
[0102] Određene kompozicije obezbeđene u ovoj objavi ne aktiviraju B ćelije, kao što su B1a ili B1b ćelije (CD19+ CD5+) i/ili konvencionalne B ćelije (CD19+ CD5-). Aktivacija B1a ćelija, B1b ćelija, ili konvencionalnih B ćelija može se odrediti na više načina, od kojih su neki obezbeđeni u nastavku. Populacija B ćelija može biti obezbeđena kao frakcionisane populacije B
4
ćelija ili nefrakcionisane populacije splenocita ili mononukleusnih ćelija periferne krvi (PBMC). Ukoliko je ovo potonje, ćelijska populacija se može inkubirati sa LNP po izboru tokom vremenskog perioda, a zatim sakupiti za dodatnu analizu. Alternativno, supernatant se može sakupiti i analizirati.
Povećanje ekspresije markera aktivacije ćelijske površine
[0103] Aktivacija B1a ćelija, B1b ćelija, ili konvencionalnih B ćelija može se demonstrirati kao povećana ekspresija markera aktivacije B ćelija uključujući markere kasne aktivacije kao što je CD86. U primeru neograničavajućeg testa, nefrakcionisane B ćelije su obezbeđene kao populacija splenocita ili kao populacija PBMC, inkubirane sa LNP po izboru tokom određenog vremenskog perioda, i zatim obojene za standardni marker B ćelija kao što je CD19 i za marker aktivacije kao što je CD86, i analizirane upotrebom na primer protočne citometrije. Pogodna negativna kontrola uključuje inkubaciju iste populacije sa medijumom, i zatim izvođenje istih koraka bojenja i vizuelizacije. Povećanje ekspresije CD86 u test populaciji u poređenju sa negativnom kontrolom ukazuje na aktivaciju R ćelija.
Oslobađanje proinflamatornog citokina
[0104] Aktivacija B ćelija se takođe može proceniti pomoću testa oslobađanja citokina. Na primer, aktivacija se može proceniti preko proizvodnje i/ili sekrecije citokina kao što su IL-6 i/ili TNF-alfa nakon izlaganja sa LNP od interesa.
[0105] Takvi testovi se mogu izvesti upotrebom rutinskih testova sekrecije citokina koji su dobro poznati u struci. Povećanje sekrecije citokina ukazuje na aktivaciju B ćelija.
Vezivanje/asocijacija LNP za i/ili preuzimanje od strane B ćelija
[0106] Asocijacija ili vezivanje LNP za B ćelije se takođe može upotrebljavati za procenu LNP od interesa i za dodatnu karakterizaciju takve LNP. Asocijacija/vezivanje i/ili preuzimanje/internalizacija mogu se proceniti upotrebom detektabilno obeležene, kao što je fluorescentno obeležena, LNP i praćenjem lokacije takve LNP u ili na B ćelijama nakon različitih perioda inkubacije.
[0107] Pronalazak dodatno razmatra da kompozicije koje su ovde obezbeđene mogu biti sposobne da izbegnu prepoznavanje ili detekciju i opciono vezivanje od strane nizvodnih medijatora ABC
4
kao što su cirkulišući IgM i/ili medijatori odgovora akutne faze kao što su proteini akutne faze (npr. C-reaktivni protein (CRP).
Postupci upotrebe za redukovanje ABC
[0108] Ovde su takođe obezbeđeni postupci za isporučivanje LNP, koje mogu da inkapsuliraju agens kao što je terapijski agens, subjektu bez promovisanja ABC.
[0109] U nekim primerima izvođenja, postupak sadrži primenu bilo koje od LNP koje su ovde opisane, koje ne promovišu ABC, na primer, ne indukuju proizvodnju prirodnog IgM koji se vezuje za LNP, ne aktiviraju B1a i/ili B1b ćelije. Kao što se ovde upotrebljava, LNP koja "ne promoviše ABC" označava LNP koja ne indukuje imunske odgovore koji bi doveli do značajnog ABC ili indukuje značajno nizak nivo imunskog odgovora, koji nije dovoljan da dovede do značajnog ABC. LNP koja ne indukuje proizvodnju prirodnog IgM koji se vezuje za LNP označava LNP koje ili ne indukuje vezivanje prirodnog IgM za LNP ili indukuje značajno nizak nivo prirodnih IgM molekula, koji je nedovoljan da dovede do značajnog ABC. LNP koja ne aktivira B1a i/ili B1b ćelije označava LNP koje ne indukuju nikakav odgovor B1a i/ili B1b ćelija da proizvedu prirodan IgM koji se vezuje za LNP ili indukuje značajno nizak nivo B1a i/ili B1b odgovora, koji je nedovoljan da dovede do značajnog ABC.
[0110] U nekim primerima izvođenja termini ne aktiviraju i ne indukuju proizvodnju predstavljaju relativnu redukciju u odnosu na referentnu vrednost ili stanje. U nekim primerima izvođenja referentna vrednost ili stanje je količina aktivacije ili indukcije proizvodnje molekula kao što je IgM od strane standardne LNP kao što je MC3 LNP. U nekim primerima izvođenja relativna redukcija je redukcija od najmanje 30%, na primer za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100%. U drugim primerima izvođenja termini ne aktiviraju ćelije kao što su B ćelije i ne indukuju proizvodnju proteina kao što je IgM, mogu označavati nedetektabilnu količinu aktivnih ćelija ili specifičnog proteina.
[0111] U nekim instancama, LNP koje su ovde opisane mogu biti bez epitopa koji aktivira B1a ćelije, na primer, bez epitopa koji aktivira ili interaguje sa CD36 ili CD6. Takve LNP ili ne sadrže epitope koji su sposobni da aktiviraju B1a ćelije ili CD36 ili sadrže takve epitope u suštinski maloj količini, što nije dovoljno da aktivira B1a ili CD36 do nivoa dovoljno visokog za indukovanje suštinskog ABC. U drugim primerima izvođenja, LNP koje su ovde opisane mogu biti bez epitopa koji aktivira B1b ćelije. Pod suštinski bez, misli se da LNP uključuje manje od 99% navedenog agensa. U nekim primerima izvođenja LNP može uključivati ni jedan od navedenih agenasa. U nekim instancama, LNP koje su ovde opisane mogu da sadrže jedan ili više pomoćnih lipida kao
4
što je ovde opisano, koji mogu da sadrže najmanje jedan lanac masne kiseline od najmanje 8C i najmanje jednu polarnu funkcionalnu grupu. U nekim primerima, pomoćni lipid ne aktivira B1a i/ili B1b ćelije. U drugim primerima, pomoćni lipid se ne vezuje ili ima nizak afinitet vezivanja za CD36. Alternativno, pomoćni lipid može kompetitivno inhibirati vezivanje fosfatidilholina za CD36.
[0112] Alternativno, LNP se može primenjivati zajedno (primenjivati sa, pre ili posle) ili koformulisati sa agensom koji uklanja ili cilja B ili B1a ćelije. Agens koji uklanja ili cilja B ili B1a ćelije može biti rituksimab. Rituksimab (RITUXAN<®>, GenentechBiogen) je monoklonalno antitelo prema proteinu CD20, koji se prvenstveno nalazi na površini B ćelija imunskog sistema. Rituksimab interaguje sa CD20 na površini B ćelija i uništava B ćelije. Kao što je pokazano u Primerima, kombinacija rituksimaba i LNP je značajno redukovala ABC nakon sledeće primene LNP.
[0113] U drugim primerima izvođenja agens može da vezuje i/ili inhibira CD6 na B1a ćelijama. Primer agensa koji vezuje i/ili inhibira CD6 na B1a ćelijama je anti-CD6 antitelo, kao što je alzumab. Alzumab (itolizumab, biokon) je humanizovano IgG1 monoklonalno antitelo koje selektivno cilja CD6, pan T ćelijski marker uključen u kostimulaciju, adheziju i sazrevanje T ćelija. Alzumab se takođe vezuje za CD6 na površini B1a ćelija.
[0114] U nekim instancama takvi postupci mogu da sadrže
(i) primenu prve doze agensa subjektu,
(ii) primenu druge ili sledeće doze agensa subjektu, pri čemu se druga ili sledeća doza primenjuje unutar 2 nedelje od prve ili prethodne doze, i
(iii) ponavljanje koraka (ii) jedan ili više puta,
pri čemu je agens formulisan sa LNP koja ne promoviše ABC.
[0115] Sledeći postupak za isporučivanje agensa subjektu uključuje
(i) primenu prve doze agensa subjektu,
(ii) primenu druge ili sledeće doze agensa subjektu, pri čemu se druga ili sledeća doza primenjuje unutar 2 nedelje od prve ili prethodne doze, i
(iii) ponavljanje koraka (ii) jedan ili više puta,
pri čemu je poluživot agensa posle druge i sledeće doze najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ili više od poluživota agensa posle prve doze.
[0116] Još jedan postupak za isporučivanje agensa subjektu uključuje
4
(i) primenu prve doze agensa subjektu,
(ii) primenu druge ili sledeće doze agensa subjektu, pri čemu se druga ili sledeća doza primenjuje unutar 2 nedelje od prve ili prethodne doze, i
(iii) ponavljanje koraka (ii) jedan ili više puta,
pri čemu je aktivnost agensa ili koncentracija agensa u krvi posle druge i sledeće doze najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ili više od aktivnosti agensa ili koncentracije agensa u krvi posle prve doze.
[0117] Druga ili sledeće doze mogu se primeniti unutar 1 nedelje, ili unutar 6 dana, ili unutar 5 dana, ili unutar 4 dana, ili unutar 3 dana, ili unutar 2 dana, ili unutar 1 dana od prve ili prethodne doze.
[0118] Agens može biti biološki aktivan agens kao što je dijagnostički agens ili terapijski agens, iako nije toliko ograničeno.
[0119] Agensi se mogu primenjivati dva ili više puta, tri ili više puta, četiri ili više puta, itd. Primena agensa se prema tome može ponoviti jednom, dva puta, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više puta. Agens se može primenjivati hronično ili akutno, u zavisnosti od njegove namene.
[0120] Postupak može biti postupak lečenja subjekta koji ima ili postoji rizik da ima stanje koje ima koristi od biološki aktivnog agensa, posebno ukoliko je biološki aktivan agens terapijski agens. Alternativno, postupak može biti postupak dijagnostikovanja subjekta, u kom slučaju je biološki aktivan agens dijagnostički agens.
[0121] Druga i sledeće doze biološki aktivnog agensa mogu održavati aktivnost od najmanje 50% aktivnosti prve doze, ili najmanje 60% prve doze, ili najmanje 70% prve doze, ili najmanje 75% prve doze, ili najmanje 80% prve doze, ili najmanje 85% prve doze, ili najmanje 90% prve doze, ili najmanje 95% prve doze, ili više, tokom najmanje 1 dana, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, ili 7 dana nakon primene druge ili sledeće doze.
[0122] Kada je biološki aktivan agens iRNK (terapijska iRNK ili iRNK koja kodira antigen vakcine), postupak za redukovanje ABC LNP koje inkapsuliraju iRNK može se izvesti upotrebom male količine LNP za prvu dozu, i/ili drugu dozu (kao i sledeće doze). Niske doze mogu biti jednake sa ili manje od 0,3 mg/kg, npr.0,2 mg/kg, ili 0,1 mg/kg. U nekim instancama, prva doza, druga doza ili obe su u opsegu od 0,1 do 0,3 mg/kg.
[0123] Interval između prve doze i druge doze u bilo kom od postupaka koji su ovde opisani može biti jednak sa ili manji od dve nedelje, na primer, manji od 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 dana. U nekim instancama, subjektu se može primenjivati doza jednom dnevno, svakih 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili 21 dana u bilo kom od postupaka koji su ovde opisani.
[0124] Dodatno, inhibiranje ABC LNP kod subjekta može se postići upotrebom jednog ili više sekundarnih agenasa koji inhibiraju imunske odgovore indukovane od strane LNP, npr. inhibiraju vezivanje za ili aktivnost senzora, npr. proizvodnja prirodnog IgM, proizvodnja prirodnog IgG, aktivacija B1a ćelija, aktivacija B1b ćelija, i/ili aktivacija krvnih pločica i/ili dendritskih ćelija ili aktivnost ili proizvodnja bilo kog efektora. Sekundarni agensi se alternativno označavaju kao agensi koji inhibiraju imunske odgovore indukovane od strane LNP. U nekim instancama, sekundarni agens može da inhibira proizvodnju prirodnog IgM koji vezuje LNP, ili da neutrališe takve prirodne IgM. U drugim instancama, sekundarni agens može da inhibira aktivaciju B1a ćelija ili ukloni B1a ćelije. Na primer, takav sekundarni agens može da inhibira površinski receptor B1a ćelija, uključujući, ali ne ograničavajući se na CD36. Alternativno ili dopunski, sekundarni agens može da ometa vezivanje IgM za njegov cilj. U drugim primerima izvođenja, sekundarni agens može da inhibira proizvodnju prirodnog IgG koji vezuje LNP, ili da neutrališe takve prirodne IgG ili može da ometa vezivanje IgG za njegov cilj. U drugim instancama, sekundarni agens može da inhibira aktivaciju B1b ćelija ili ukloni B1b ćelije.
Efekti na krvne pločice i toksičnost
[0125] Pronalazak se dodatno zasniva delimično na razjašnjavanju mehanizma koji leži u osnovi toksičnosti koja ograničava dozu asociranu sa primenom LNP. Takva toksičnost može uključivati koagulopatiju, diseminovanu intravaskularnu koagulaciju (DIC, koja se takođe označava kao konzumptivna koagulopatija), bilo da je akutna ili hronična, i/ili vaskularnu trombozu. U nekim instancama, toksičnost koja ograničava dozu asocirana sa LNP je odgovor akutne faze (APR) ili psudoalergija povezana sa aktivacijom komplementa (CARPA).
[0126] Kao što se ovde upotrebljava, koagulopatija označava povećanu koagulaciju (zgrušavanje krvi) in vivo. Nalazi saopšteni u ovoj objavi su u skladu sa takvom povećanom koagulacijom i značajno obezbeđuju uvid u mehanizam koji leži u osnovi. Koagulacija je proces koji uključuje niz različitih faktora i tipova ćelija, i do sada odnos između i interakcija LNP i krvnih pločica nije shvaćena u tom pogledu. Ova objava obezbeđuje dokaze o takvoj interakciji i takođe obezbeđuje jedinjenja i kompozicije koje su modifikovane tako da imaju redukovani efekat na krvne pločice, uključujući redukovanu asocijaciju krvnih pločica, redukovanu agregaciju krvnih pločica, i/ili redukovanu agregaciju krvnih pločica. Sposobnost da moduliraju, uključujući poželjno snižavaju, ovakve efekte na krvne pločice može redukovati incidencu i/ili ozbiljnost koagulopatije nakon
1
primene LNP. Ovo će zauzvrat redukovati toksičnost u vezi sa takvim LNP, čime će se omogućiti da se veće doze LNP i što je najvažnije njihov tovar primene pacijentima kojima je to potrebno.
[0127] CARPA je klasa akutne imunske toksičnosti koja se manifestuje u reakcijama preosetljivosti (HSR), koje mogu biti pokrenute nanolekovima i biologicima. Za razliku od alergijskih reakcija, CARPA tipično ne uključuje IgE, već nastaje kao posledica aktivacije sistema komplementa, koji je deo urođenog imunskog sistema koji povećava sposobnost tela da ukloni patogene. Jedan ili više od sledećih puteva, klasični put komplementa (CP), alternativni put (AP), i lektinski put (LP), mogu biti uključeni u CARPA. Szebeni, Molecular Immunology, 61:163-173 (2014).
[0128] Klasični put se pokreće aktivacijom C 1-kompleksa koji sadrži C1q, C1r, C1s ili C1qr2s2. Aktivacija C1-kompleksa se dešava kada se C1q veže za IgM ili IgG kompleksiran sa antigenima, ili kada se C1q veže direktno za površinu patogena. Takvo vezivanje dovodi do konformacionih promena u C1q molekulu, koje dovode do aktivacije C1r, koji zauzvrat, iseca C1s. Komponenta C1r2s2 sada deli C4 i zatim C2, proizvodeći C4a, C4b, C2a, i C2b. C4b i C2b se vezuju kako bi formirali C3-konvertazu klasičnog puta (C4b2b kompleks), koja promoviše isecanje C3 na C3a i C3b. C3b zatim vezuje C3 konvertazu da formira C5 konvertazu (C4b2b3b kompleks). Alternativni put se kontinuirano aktivira kao rezultat spontane hidrolize C3. Faktor P (properdin) je pozitivan regulator alternativnog puta. Oligomerizacija properdina stabilizuje C3 konvertazu, koja onda može da iseca mnogo više C3. Molekuli C3 mogu da se vezuju za površine i regrutuju više aktivnosti B, D, i P, što dovodi do amplifikacije aktivacije komplementa.
[0129] Odgovor akutne faze (APR) je složen sistemski urođeni imunski odgovor za prevenciju infekcije i uklanjanje potencijalnih patogena. Brojni proteini su uključeni u APR i C-reaktivni protein je jedan koji je dobro okarakterisan.
[0130] Pronađeno je, u skladu sa pronalaskom, da su određene LNP u stanju da se fizički asociraju sa krvnim pločicama skoro odmah posle primene in vivo, dok se druge LNP ne asociraju sa krvnim pločicama uopšte ili samo na nivoima pozadine. Značajno, one LNP koje se asociraju sa krvnim pločicama takođe očigledno stabilizuju agregate krvnih pločica koji se formiraju nakon toga. Fizički kontakt krvnih pločica sa određenim LNP je u korelaciji sa sposobnošću takvih krvnih pločica da ostanu agregirane ili da formiraju agregate kontinuirano tokom dužeg vremenskog perioda posle primene. Takvi agregati sadrže aktivirane krvne pločice i takođe urođene imunske ćelije kao što su makrofagi i B ćelije.
[0131] Agregacija krvnih pločica se uočava ubrzo posle primene LNP, i izgleda da se javlja u isto vreme ili potencijalno pre aktivacije krvnih pločica, što se dokazuje povećanom ekspresijom markera aktivacije krvnih pločica kao što su CD31 i CD62P. LNP koje se ne asociraju sa značajnim brojem krvnih pločica, ali koje su u stanju da aktiviraju krvne pločice u manjem stepenu od
2
robusnijih LNP (o kojima se prethodno diskutovalo) takođe izazivaju agregaciju krvnih pločica veoma rano posle primene, i verovatno pre aktivacije krvnih pločica. Stoga, in vivo, čini se da se asocijacija LNP sa krvnim pločicama javlja otprilike u isto vreme kada i agregacija krvnih pločica, i verovatno pre pika aktivacije krvnih pločica.
[0132] Takođe značajno je dodatno zapažanje da je podskup LNP u stanju da aktivira krvne pločice, čak i bez značajne fizičke asocijacije sa krvnim pločicama. Ovaj podskup je takođe u stanju da formira agregate krvnih pločica koji sadrže R ćelije i makrofage.
[0133] Takođe je pokazano da određene LNP stimulišu ranu interakciju između krvnih pločica (bez obzira da li su aktivirane ili ne) i makrofaga i B ćelija, čime se aktiviraju i ove potonje ćelije. Efekat LNP na B ćelije i makrofage je prema tome i direktan i indirektan, ali na kraju može dovesti do povećane aktivacije takvih ćelija.
[0134] Aktivacija krvnih pločica može posredovati u aktivaciji komplementa. Prema tome se smatra da određene LNP mogu indukovati toksičnost koja ograničava dozu kao što su CARPA i APR putem aktivacije krvnih pločica i posledično sistema komplementa. Određene lipidne komponente LNP, kao što je fosfatidilholin, mogu se vezati za i aktivirati CD36 na krvnim pločicama, što bi pokrenulo TLR2/4/6 signalizaciju, dovodeći do agregacije i aktivacije krvnih pločica. Aktivirane krvne pločice eksprimiraju CD62P (P selektin), koji je protein koji se vezuje za C3b i može pokrenuti kaskadu komplementa. Aktivirane krvne pločice takođe regrutuju imunske ćelije kao što su makrofagi i neutrofili, što dovodi do dodatnih imunskih odgovora uključujući sekreciju citokina (npr. IL-6). Dodatno, pronađeno je da se properdin vezuje direktno za aktivirane krvne pločice putem, npr. CD62P i regrutuje C3b ili C3(H2O), stoga pokrećući alternativni put. Saggu et al. J. Immunol.190:6457-6467 (2013).
[0135] U skladu sa tim, upotreba LNP koje ne indukuju aktivaciju i/ili agregaciju krvnih pločica; i/ili ne promovišu aktivaciju sistema komplementa (npr. klasični put i/ili alternativni put) može redukovati rizik od toksičnosti povezane sa LNP. Takve LNP možda uopšte ne indukuju aktivaciju krvnih pločica i/ili sistema komplementa. Alternativno, takve LNP mogu indukovati značajno nizak nivo aktivacije krvnih pločica i/ili aktivacije sistema komplementa, što nije dovoljno da rezultuje značajnom toksičnošću koja ograničava dozu.
[0136] Alternativno ili dopunski, sekundarni agensi koji blokiraju inicijalnu aktivaciju/agregaciju krvnih pločica, inicijalnu aktivaciju sistema komplementa, i/ili nizvodnu kaskadu komplementa, bilo u klasičnom putu ili u alternativnom putu, mogu se upotrebljavati za sprečavanje ili redukovanje toksičnosti povezane sa LNP. U nekim instancama, takav sekundarni agens može da inhibira aktivaciju krvnih pločica, na primer, inhibira aktivaciju CD36 pokrenutu od strane LNP. U drugim instancama, sekundarni agens može da inhibira CARPA ili ARP, na primer, inhibira klasični put i/ili alternativni put. Takav sekundarni agens može da cilja najmanje jednu komponentu u sistemu komplementa ili proteine uključene u ARP, čime blokira reakcionu kaskadu. Na primer, sekundarni agens može biti antagonist TLR receptora (TLR2, TLR4 ili TLR6), CD62P, CD31, properdina, komponente sistema komplementa (npr. C1q, C3a, C3b, C5a, i C5b). U još nekim instancama, sekundarni agens može biti agens koji može da ublaži najmanje jedan simptom toksičnosti povezane sa LNP. Takvi agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, nesteroidni antiinflamatorni lek (NSAID) ili antihistaminski agens, koji može biti blokator histaminskog receptora kao što je H1 antagonist ili H1 inverzni agonist.
[0137] U nekim primerima izvođenja, toksičnost koja ograničava dozu i/ili ABC može se redukovati kod subjekta koji se leči terapijskim režimom koji uključuje LNP posredovanu isporuku leka upotrebom LNP koje ne aktiviraju receptor za trombospondin (npr. CD36), koji može biti eksprimiran na površini imunskih ćelija (npr. B1a ili B1b ćelije); ili druge površinske receptore koji su uključeni u pokretanje imunskih odgovora koji dovode do toksičnosti koja ograničava dozu i/ili ABC. Takve LNP možda uopšte ne aktiviraju receptor za trombospondin, ili mogu samo da indukuju suštinski nizak nivo njegove aktivnosti tako da nije dovoljan da indukuje klinički značajnu toksičnost koja ograničava dozu i/ili ABC. Alternativno ili dopunski, toksičnost koja ograničava dozu i/ili ABC se može redukovati kod subjekta koji se leči terapijskim režimom koji uključuje LNP posredovanu isporuku leka upotrebom jednog ili više sekundarnih agenasa koji inhibiraju aktivnost receptora za trombospondin (npr. CD36) koji se eksprimira na površini imunskih ćelija i krvnih pločica. Trombospondini (TSP) su porodica multifunkcionalnih proteina koji se eksprimiraju na površini, ili ih sekretuju ćelije kao što su krvne pločice. Porodicu čine trombospondini 1-5. TSP-1 je inhibitorni ligand CD36.
[0138] Na osnovu ovih nalaza, ova objava razmatra i obezbeđuje LNP kao i LNP-formulisane aktivne agense koji imaju redukovanu asocijaciju krvnih pločica i/ili redukovanu aktivaciju krvnih pločica i/ili redukovanu aktivnost agregacije krvnih pločica. Upotreba takvih LNP, na primer kao vehikuluma za isporuku aktivnog agensa, redukuje rizik od razvoja koagulopatije, kao što je diseminovana intravaskularna koagulacija (DIC, koja se takođe označava kao konzumptivna koagulopatija), bilo da je akutna ili hronična, i/ili vaskularne tromboze, kao i bilo koju toksičnost u vezi sa tim. Ukoliko takva toksičnost ograničava dozu, onda će upotreba ovih LNP omogućiti primenu većih doza LNP i, što je još važnije, omogućiće isporuku većih doza tovara aktivnog agensa koje nosi takva LNP.
[0139] Umanjenje odgovora krvnih pločica posle primene LNP ima dodatne poželjne efekte, od kojih neki mogu biti sinergistički. Saopšteno je da LNP aktiviraju komplement ubrzo posle primene. Ova aktivacija može biti direktna ili indirektna. Na primer, saopšteno je da aktivirane krvne pločice mogu da aktiviraju komplement. Stoga će LNP koje redukuju ili sprečavaju aktivaciju krvnih pločica takođe indirektno redukovati ili sprečiti aktivaciju komplementa.
4
Aktivacija komplementa takođe može doprineti koagulaciji, na primer putem stvaranja trombina posredovanog komplementom. Trombin konvertuje raspoloživi fibrinogen u fibrin, koji zauzvrat formira ugruške zajedno sa krvnim pločicama. Aktivirane krvne pločice imaju receptore za trombin na svojoj površini i prema tome su u stanju da regrutuju i/ili podignu lokalnu koncentraciju trombina, čime se povećava proizvodnja fibrina i konačno formiranje ugrušaka. Objava prema tome razmatra i obezbeđuje dodatne LNP koje ne aktiviraju komplement ili ne aktiviraju komplement u istom stepenu kao postojeće LNP. Dopunske LNP koje su ovde obezbeđene su one koje ne aktiviraju krvne pločice i ne aktiviraju komplement.
[0140] Slično, ova objava razmatra LNP koje ometaju vezivanje properdina za krvne pločice. Properdin je pozitivan regulator alternativnog puta sistema komplementa. Pokazano je da se vezuje za aktivirane krvne pločice, čime se aktivira alternativni put kao odgovor na i u blizini aktiviranih krvnih pločica. Stoga se dodatno razmatra upotreba inhibitora properdina u kombinaciji sa LNP koje su ovde obezbeđene bez obzira da li takve LNP aktiviraju ili ne aktiviraju krvne pločice, kao što je definisano u nastavku. Inhibitori properdina uključuju DNK i sulfatisane glukokonjugate, oba se vezuju za properdin i mogu da ometaju vezivanje properdina za aktivirane krvne pločice.
[0141] Ova objava prema tome razmatra i obezbeđuje, u nekim aspektima, LNP i LNP formulacije koje imaju redukovane efekte na krvne pločice uključujući redukovanu asocijaciju krvnih pločica i/ili redukovanu aktivaciju krvnih pločica i/ili redukovanu aktivnost agregacije krvnih pločica. Određene LNP mogu uticati na jednu, dve ili sve tri aktivnosti krvnih pločica. Na primer, neke LNP mogu imati redukovanu aktivnost asocijacije krvnih pločica, ili redukovanu aktivnost agregacije krvnih pločica, ili redukovanu aktivnost aktivacije krvnih pločica. Neke LNP mogu imati redukovanu aktivnost asocijacije krvnih pločica i/ili redukovanu aktivnost aktivacije krvnih pločica, ili redukovanu aktivnost asocijacije krvnih pločica i redukovanu aktivnost aktivacije krvnih pločica, ili redukovanu aktivnost agregacije krvnih pločica i redukovanu aktivnost aktivacije krvnih pločica. Neke LNP mogu imati redukovanu aktivnost asocijacije krvnih pločica, redukovanu aktivnost agregacije krvnih pločica, i redukovanu aktivnost aktivacije krvnih pločica.
[0142] Objava razmatra da neke LNP mogu biti univerzalne LNP, sa namerom da će smanjiti (ili neće stimulisati u prvoj instanci) jednu ili više od prethodno navedenih aktivnosti krvnih pločica nakon primene kod većine pacijenata ili kod svih pacijenata.
[0143] Pored toga, objava razmatra da neke LNP mogu u nekim instancama biti definisane i stoga identifikovane kao specifične za pacijenta. To jest, neke LNP mogu biti efikasne u smanjivanju odgovora krvnih pločica, kao što je ovde opisano, kod nekih, ali ne kod svih pacijenata. Stoga, u nekim instancama, neke LNP i LNP formulacije mogu biti identifikovane za određene pacijente i onda se mogu upotrebljavati samo za te određene pacijente.
[0144] U nekim instancama, nalazi koji su ovde obezbeđeni mogu se primeniti direktno na biološki aktivne agense. Na primer, biološki aktivan agens koji je lipid ili je konjugovan za lipid ili koji je direktno ili indirektno konjugovan za PEG funkcionalnu grupu, može biti modifikovan kao što je ovde opisano kako bi učinio agens nesposobnim da stimuliše odgovor krvnih pločica ili kaskadu.
Testovi aktivnosti krvnih pločica
[0145] Ove različite aktivnosti mogu se izmeriti kao što je ovde opisano i/ili kao što se izvodi u stuci. Na primer, aktivacija krvnih pločica može se proceniti povećanom ekspresijom markera aktivacije kao što su CD31 i CD62P. Agregacija krvnih pločica može se proceniti pomoću protočne citometrije. Slično, protočna citometrija se može upotrebljavati za detektovanje tipova ne-krvnih pločica kao što su B ćelije i makrofagi unutar takvih agregata. Treba razumeti da se efekti LNP na krvne pločice mogu proceniti in vivo, na primer u životinjskom modelu, kao i in vitro upotrebom na primer humane krvi. Ovi testovi se mogu upotrebljavati za pregled i/ili identifikaciju LNP koja ima jednu ili više od prethodno navedenih aktivnosti.
Jedinjenja i kompozicije, uključujući LNP
[0146] Objava obezbeđuje kompozicije koje sadrže lipide koje su manje podložne klirensu i stoga imaju duži poluživot in vivo. Ovo je posebno važno gde su kompozicije namenjene za ponovljenu uključujući hroničnu primenu, i još preciznije gde se takva ponovljena primena dešava unutar nekoliko dana ili nedelja.
[0147] Značajno, ove kompozicije su manje podložne ili u potpunosti zaobilaze uočeni fenomen ubrzanog klirensa iz krvi (ABC). ABC je fenomen u kome se egzogeno primenjeni agensi koji sadrže lipide brzo uklanjaju iz krvi nakon druge i sledećih primena. Ovaj fenomen je uočen za različite kompozicije koje sadrže lipide, uključujući, ali ne ograničavajući se na, lipozome, lipidne nanočestice, i agense inkapsulirane u lipidima. Do sada je osnova ABC bila slabo shvaćena i u skladu sa tim strategije za njegovo izbegavanje ostale su nejasne.
[0148] Kompozicije koje sadrže lipide iz ove objave, iznenađujuće, ne doživljavaju ili na njih minimalno utiče ABC nakon druge i sledeće primene in vivo. Ova rezistencija na ABC čini ove kompozicije posebno pogodnim za ponovljenu upotrebu in vivo, uključujući i ponovljenu upotrebu unutar kratkih vremenskih perioda, uključujući dane ili 1-2 nedelje.
[0149] Ova rezistencija na ABC je zbog delimično nesposobnosti ovih kompozicija da aktiviraju B1a ćelije. Prema tome takve kompozicije se ovde označavaju kao B1a inertne kompozicije ili kompozicije koje ne aktiviraju suštinski B1a, sa namerom da ove kompozicije, kada se kombinuju sa B1a ćelijama, ne aktiviraju B1a ćelije. Aktivacija B1a ćelija se može odrediti na više načina uključujući, ali ne ograničavajući se na, povećanu ekspresiju markera aktivacije kao što je CD86, i ekspresiju i/ili sekreciju citokina. Ove kompozicije mogu ili ne moraju da se vezuju za B1a ćelije, i mogu ili ne moraju da se vezuju za cirkulišući IgM. Stoga, ove kompozicije mogu izbeći detekciju od strane cirkulišućih IgM i/ili od strane B1a ćelija.
[0150] B1a ćelije su podskup B ćelija koje su uključene u urođeni imunitet. Ove ćelije su izvor cirkulišućeg IgM, koji se označava kao prirodno antitelo ili prirodno serumsko antitelo. Ova IgM antitela su okarakterisana kao da imaju slab afinitet za više antigena, i prema tome se označavaju kao "poli-specifična" ili "poli-reaktivna", što opisuje njihovu sposobnost da se vezuju za više od jednog antigena. Iako su u stanju da proizvode takav IgM, B1a ćelije nisu sposobne da proizvode IgG. Pored toga, one se ne razvijaju u memorijske ćelije i stoga ne doprinose adaptivnom imunskom odgovoru. Međutim, one su u stanju da sekretuju IgM nakon aktivacije. Sekretovani IgM se tipično uklanja unutar oko 12 dana (poluživot IgM u serumu je oko 5-8 dana, Nature Review Drug Discovery 2, 52-62. januar 2003.), u kom trenutku imunski sistem postaje relativno naivan za prethodno primenjeni antigen. Ukoliko se isti antigen prezentuje posle ovog vremenskog perioda (npr. oko 2 nedelje posle inicijalnog izlaganja), antigen se ne uklanja brzo. Međutim, značajno, ukoliko se antigen prezentuje unutar tog vremenskog perioda (npr. unutar 2 nedelje, uključujući unutar 1 nedelje, ili unutar nekoliko dana), onda se antigen brzo uklanja. Ovo odlaganje između uzastopnih doza učinilo je određene terapijske ili dijagnostičke kompozicije koje sadrže lipide neprikladnim za ponovljenu upotrebu.
[0151] Jedinjenja, čestice, i kompozicije koje su ovde opisane prevazilaze ova ograničenja, transformišući na taj način različite kompozicije koje sadrže lipide u efikasne terapijske i dijagnostičke agense. B1a lipidne kompozicije koje su ovde obezbeđene ne podležu ubrzanom klirensu iz krvi nakon ponovljene primene i stoga se mogu ponovljeno primenjivati subjektu, uključujući unutar kratkih vremenskih perioda, bez gubitka aktivnosti.
[0152] Rezistencija na ABC takođe može biti zbog delimično nesposobnosti ovih kompozicija da aktiviraju B1b ćelije, pDC i/ili krvne pločice. Takve kompozicije se prema tome ovde označavaju kao B1b pDC i/ili krvne pločice inertne kompozicije ili kompozicije koje ne aktiviraju suštinski B1b pDC i/ili krvne pločice, sa namerom da ove kompozicije, kada se kombinuju sa B1b ćelijama pDC i/ili krvnim pločicama, ne aktiviraju B1b ćelije pDC i/ili krvne pločice, respektivno. Aktivacija B1b ćelija, pDC i/ili krvnih pločica može se odrediti na više načina uključujući, ali ne ograničavajući se na, povećanu ekspresiju markera aktivacije kao što je CD11b (za B1b ćelije), i ekspresiju i/ili sekreciju citokina, i sposobnost da aktiviraju B ćelije (pDC). Ove kompozicije mogu ili ne moraju da se vezuju za B1b ćelije, pDC i/ili krvne pločice, i mogu ili ne moraju da se vezuju za cirkulišući IgM ili IgG. Stoga, ove kompozicije mogu izbeći detekciju od strane cirkulišućih IgM, IgG i/ili B1a ćelija pDC i/ili krvnih pločica.
[0153] Čestice, kao što je LNP, tipično sadrže jednu ili više od sledećih komponenti: lipide (koji mogu uključivati katjonske lipide, pomoćne lipide koji mogu biti neutralni lipidi, cviterjonski lipid, anjonski lipidi, i slično), strukturne lipide kao što su holesterol ili analozi holesterola, masne kiseline, polimere, stabilizatore, soli, pufere, rastvarač, i slično.
[0154] Određene LNP koje su ovde obezbeđene sadrže katjonski lipid, pomoćni lipid, strukturni lipid, i stabilizator koji može ili ne mora biti obezbeđen konjugovan za drugi lipid.
[0155] Katjonski lipid može biti ali nije ograničen na DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA i DODMA. Katjonski lipid može biti jonizujući lipid.
[0156] Strukturni lipid može biti, ali nije ograničen na sterol, kao što je na primer holesterol.
[0157] Pomoćni lipid je nekatjonski lipid. Pomoćni lipid može sadržati najmanje jedan lanac masne kiseline od najmanje 8C i najmanje jednu polarnu glavenu funkcionalnu grupu.
[0158] Određenim LNP nedostaju bilo koji fosfatidil holin (PC) lipidi (tj. one su bez fosfatidil holina (PC)). Određenim LNP koje su ovde obezbeđene nedostaju specifične fosfatidil holin lipidi kao što su, ali ne ograničavajući se na DSPC. Određene LNP sadrže analog fosfatidil holina, pri čemu takvi analozi sadrže modifikovane glavene grupe (npr. modifikovanu glavenu grupu kvaternarnog amina), modifikovanu grupu jezgra i/ili modifikovanu repnu grupu lipida. Takvi analozi mogu da sadrže cviterjonsku grupu koja je ne-PC cviterjonska grupa. Pomoćni lipid može biti lipid bilo koje ili bilo koje kombinacije Formula I, I-a, I-b, I-b-1, I-b-2, I-b-3, I-b-4, I-c, I-c-1, I-c-2, I-c-3, ili II kao što je ovde obezbeđeno.
[0159] Određene LNP mogu uključivati 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DSPC) supstituent ili uključivati minimalnu količinu DSPC. U određenim primerima izvođenja, DSPC supstituent je lipid koji nije fosfolipid.
[0160] Određene LNP sadrže druge pomoćne nekatjonske lipide uključujući na primer oleinsku kiselinu ili analoge oleinske kiseline. Pomoćni lipid može biti lipid Formule IV kao što je ovde obezbeđeno. Oleinska kiselina može biti supstituent ili može biti dodatak drugom lipidu u LNP. Kao što će ceniti onaj sa iskustvom u struci, mogu se upotrebljavati i modifikovane verzije oleinske kiseline ili srodnih masnih kiselina.
[0161] U nekim instancama, LNP sadrži PEGilovane lipide ili lipide konjugovane za druge stabilizujuće funkcionalne grupe (ili stabilizatore) kao što su, ali ne ograničavajući se na XTEN i PAS polipeptidi. Stoga, objava razmatra i obezbeđuje LNP ili njihove formulacije koje ne uključuju PEG. U određenim primerima izvođenja, LNP uključuju HO-PEG. U drugim primerima izvođenja, LNP uključuju PEG supstituent kao što je drugačiji polimer.
[0162] Kada se PEG upotrebljava kao stabilizator, on može biti konjugovan za lipid i stoga može biti obezbeđen kao PEG-c-DOMG ili PEG-DMG, na primer. Stabilizator, bilo da je obezbeđen u konjugovanom ili nekonjugovanom obliku, može da sadrži 1,5 mol % LNP, ili može da sadrži manje od 0,5 mol % LNP. Na primer, može da sadrži manje od 0,4 mol %, manje od 0,3 mol %, manje od 0,2 mol %, ili manje od 0,1 mol %.
[0163] U još nekim primerima izvođenja, LNP mogu da sadrže manje od 0,5% molskog odnosa PEG lipida prema drugim komponentama. Stoga, LNP može da sadrži najmanje 0,0001%, najmanje 0,0005%, najmanje 0,001%, najmanje 0,005%, najmanje 0,01%, najmanje 0,05%, najmanje 0,1%, najmanje 0,15%, najmanje 0,2%, najmanje 0,25%, najmanje 0,3%, najmanje 0,35%, najmanje 0,4%, najmanje 0,45%, i manje od 0,5% (izraženo kao molski procenat) PEGilovanog lipida.
[0164] LNP može da sadrži PEGilovani lipid Formule III, uključujući Formule III-OH, III-a-1, III-a-2, III-b-1, IIII-b-2, III-b-1-OH, III-b-2-OH, V, V-OH.
[0165] Određene LNP koje su ovde obezbeđene ne sadrže ili sadrže niske nivoe PEGilovanih lipida, uključujući da ne sadrže ili sadrže niske nivoe alkil-PEGilovanih lipida, i mogu se ovde označavati kao da su bez PEG ili PEGilovanog lipida. Stoga, neke LNP sadrže manje od 0,5 mol % PEGilovanog lipida. U nekim instancama, PEG može biti alkil-PEG kao što je metoksi-PEG. Još druge LNP sadrže ne-alkil-PEG kao što je hidroksi-PEG, i/ili ne-alkil-PEGilovane lipide kao što su hidroksi-PEGilovani lipidi.
[0166] PEGilovani lipid može biti Jed420, Jed396, Jed394, Jed397, Jed395, Jed417, Jed418, ili Jed419.
[0167] U nekim instancama, LNP može da sadrži oko 50 mol %, 10 mol % pomoćnog lipida, 1,5 mol % PEGilovanog lipida, i 38,5 mol % strukturnog lipida.
[0168] U nekim instancama, LNP može da sadrži oko 50 mol %, 10 mol % pomoćnog lipida, manje od 0,5 mol % PEGilovanog lipida, i 39,5 mol % strukturnog lipida.
[0169] U nekim primerima izvođenja, stabilizator je ne-PEG funkcionalna grupa kao što je XTEN peptid koji može ili ne mora biti konjugovan za lipid. XTEN peptid je sposoban da formira hidratizovanu školjku oko LNP zbog svoje hidrofilne prirode. Dodatno služi da poveća poluživot LNP, u poređenju sa LNP kojoj nedostaje (ili je bez) bilo kakvog stabilizatora. Za razliku od PEG, međutim, on je biorazgradiv i sopšteno je da je neimunogen. XTEN peptid može imati aminokiselinsku sekvencu MAEPAGSPTSTEEGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGS (SEQ ID NO:1) ili MAEPAGSPTSTEEGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGS (SEQ ID NO:2). Druge XTEN amino-kiselinske sekvence su poznate u struci, uključujući, na primer, one koje su saopštene u S.A.D. patentu br.9,062,299. Primeri XTEN konjugovanih lipida uključuju ali nisu ograničeni na Jed431, i Jed432 i Jed433. Klik hemija se može upotrebljavati za konjugovanje XTEN peptida za lipid.
[0170] U nekim primerima izvođenja, stabilizator je ne-PEG funkcionalna grupa kao što je PAS peptid. PAS peptid je peptid koji sadrži prvenstveno ukoliko ne isključivo prolin, alanin i serin. Kao PEG i XTEN peptidi, PAS peptid je sposoban da formira hidratizovanu školjku oko LNP. On takođe služi da poveća poluživot LNP, u poređenju sa LNP kojoj nedostaje (ili je bez) stabilizatora. Za razliku od XTEN peptida, međutim, PAS peptidi imaju tendenciju da budu neutralnog naelektrisanja, i stoga su barem u ovom pogledu sličniji sa PEG. PAS peptid može imati aminokiselinsku sekvencu SAPSSPSPSAPSSPSPASPSSAPSSPSPSAPSSPSPASPSSAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO:3) ili AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO:4). Druge PAS amino-kiselinske sekvence su poznate u struci, uključujući na primer, one koje su saopštene u WO 2008155134.
[0171] Agensi koji inhibiraju imunske odgovore indukovane od strane LNP takođe mogu da se upotrebljavaju u postupcima iz objave, zajedno sa standardnim LNP koje indukuju ABC ili sa modifikovanim LNP iz pronalaska. Agensi koji inhibiraju imunske odgovore indukovane od strane LNP su jedinjenja koja inhibiraju aktivaciju senzora, inhibiraju interakciju između LNP i senzora ili između senzora (npr. blokiraju interakciju između pDC i B ćelija), i/ili inhibiraju proizvodnju ili aktivnost efektora. U nekim instancama agens će biti specifičan za određeni senzor ili efektor. U drugim primerima izvođenja agens koji inhibira imunske odgovore indukovane od strane LNP funkcioniše tako da spreči aktivaciju više senzora opštijim mehanizmom, tipično delujući indirektno na druge ćelijske komponente koje mogu da utiču na senzore. Primer agensa koji indirektno funkcioniše na više senzora je miR vezujuće mesto.
[0172] Otkriveno je u skladu sa pronalaskom da će isporuka miR vezujućeg mesta inhibirati imunski odgovor povezan sa ABC i može se upotrebljavati da obezbedi ponovljeno doziranje subjekta sa LNP tokom perioda osetljivosti na ABC. miR vezujuće mesto može biti inkorporisano u terapijsku nukleinsku kiselinu koja se isporučuje u LNP. Alternativno, miR vezujuće mesto može biti odvojeno inkorporisano u istu LNP koja inkorporiše terapijsku nukleinsku kiselinu ili u drugu LNP. miR vezujuće mesto može se primenjivati subjektu u odvojenom vehikulumu u isto ili različito vreme kao LNP i može ili ne mora biti inkorporisano u LNP. U nekim primerima izvođenja, miR vezujuće mesto može biti miR sunđer.
[0173] Iako podnosilac prijave nije vezan mehanizmom, veruje se da miR vezujuće mesto deluje tako da upije endogenu, ciljanu miRNA od interesa, sprečavajući tu miRNA da funkcioniše u ćeliji. Moguće je ciljati miRNA koja igra pozitivnu ulogu u regulaciji funkcije imunskih ćelija. Inhibiranjem funkcije endogene miRNA, miR vezujuće mesto deluje kao inhibitor da blokira funkciju miRNA i druge nizvodne efekte koji su rezultat ove ciljane inhibicije. miRNA vezujući agens može takođe ili alternativno da funkcioniše tako što sprečava translaciju proteina u specifičnim tkivima ili ćelijama, kao što su slezina ili imunske ćelije. Sprečavanjem translacije, na primer, iRNK terapeutika inkapsuliranog u LNP, u specifičnim tkivima sa visokim sadržajem imunskih ćelija, imunski odgovor u tim tkivima će biti smanjen, dok pritom neće imati uticaj na ekspresiju iRNK u drugim tkivima.
[0174] Demonstrirano je da introdukcija miR vezujućih mesta kao što je miR 126 (veoma zastupljeno kod pDC) rezultuje redukcijom aktivacije B ćelija, redukcijom aktivacije pDC, redukcijom ekspresije citokina, kao što su IL6 i IFN-gama, i redukcijom IgM u odnosu na odgovor koji isporučuje odgovarajuća LNP bez miR vezujućeg mesta.
[0175] U nekim primerima izvođenja, miR vezujuće mesto je miR 126, miR 155, i/ili miR 142.3p vezujuće mesto. U nekim primerima izvođenja, iRNK može da sadrži najmanje jedno miR vezujuće mesto kako bi na taj način redukovala ili inhibirala ABC. miR vezujuće mesto se može naći u, na primer, 3' UTR iRNK. Na primer, u jednom primeru izvođenja, iRNK sadrži miR-122 vezujuće mesto, kako bi na taj način omogućila povećanu ekspresiju polipeptida kodiranog od strane iRNK u ćeliji kancera jetre (npr. ćeliji hepatocelularnog karcinoma) u poređenju sa normalnom ćelijom jetre, i takođe sadrži jedno ili više miR vezujućih mesta, npr. odabranih iz grupe koja se sastoji od miR-142, miR-146, miR-155, miR-126, miR-16, miK-21, miR-223, miR-24, miR-27.
[0176] Jedinjenje koje inhibira interakciju između LNP i senzora kao što se ovde upotrebljava će poremetiti interakciju između LNP i B1 ćelije, krvne pločice ili pDC. Na primer, neke interakcije između LNP i B1 ćelija su posredovane preko CD36 receptora na B1 ćeliji i PC na LNP. Jedinjenje može da blokira i neutrališe PC ili CD36. U nekim primerima izvođenja jedinjenje je antitelo koje prepoznaje i vezuje CD36, ili njegov antigen-vezujući fragment ili derivat ili CD36 antagonist. CD36 antagonist može biti odabran iz grupe koja se sastoji od antitela ili aptamera koji se vezuju za CD36 ili njegove fragmente; solubilnih liganada koji se vezuju za CD36 ili njegove fragmente; solubilnih CD36 koji se vezuju za svoje ligande; fuzionih polipeptida, peptida, malih molekula, peptidomimetika koji inhibiraju aktivnost CD36; i molekula nukleinske kiseline koji specifično ometaju ekspresiju CD36. Takav CD36 antagonist je poželjno antagonist koji, poželjno specifično, prepoznaje i vezuje se za CD36 molekul ili njegov fragment, i poželjno je odabran iz grupe koja se sastoji od antitela ili aptamera koji specifično prepoznaje i vezuje se za CD36 ili njegov fragment, molekula nukleinske kiseline koji specifično ometa ekspresiju CD36, i malog molekula koji inhibira aktivnost CD36. Poželjnije, navedeni CD36 antagonist je monoklonalno antitelo prema CD36 koje blokira njegovu funkciju. U drugim primerima izvođenja, navedeni CD36 antagonist je mali molekul odabran iz grupe koja se sastoji od salvijanolne kiseline B, rozmarinske
1
kiselina, natrijum danšensu, 3-cinamoil indola, 13 pentil berberina, heksarelina, nanoblokatora, statina ili antioksidanasa kao što su alfa-tokoferol i SS peptidi, sulfo-N-sukcinimidil oleata i ursolne kiseline, i bilo koje njihove kombinacije. Alternativno, CD36 antagonist može sadržati antitelo koje prepoznaje i vezuje CD36, ili njegov antigen-vezujući fragment ili derivat. Poželjno, navedeno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ili derivat, usmereno je prema vanćelijskom domenu CD36. Navedeno antitelo može biti antitelo pune dužine. Poželjno, navedeno antitelo je monoklonalno antitelo. Antitelo može biti tipa IgG, IgE ili IgD, poželjno tipa IgG. Antitelo može biti humanizovano, himerno ili humano antitelo. Antitelo takođe može biti antitelo teškog lanca kamelida, i posebno humanizovano antitelo teškog lanca kamelida. Poželjno, navedeno antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment ili derivat, je bivalentno. Posebno, antigenvezujući fragment je odabran iz grupe koja se sastoji od F(ab')2 di-scFvs, sc(Fv)2fragmenta, (VHH)2fragmenta i diatela.
[0177] Jedinjenje koje inhibira aktivnost efektora je jedinjenje koje sprečava da efektor bude proizveden od strane senzora ili da funkcioniše. Na primer, agens može da inhibira proizvodnju prirodnog IgM koji vezuje LNP ometajući put sinteze u B1 ćeliji. Alternativno, agens može da neutrališe takve prirodne IgM ili IgG. Agens može biti antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, koji se vezuje za prirodni IgM ili IgG i neutrališe ga. Alternativno, agens može da ometa vezivanje IgM ili IgG za svoj cilj. U drugim primerima izvođenja, agens koji inhibira imunske odgovore indukovane od strane LNP je agens koji inhibira aktivnost IL6. Agensi koji inhibiraju aktivnost IL6 uključuju, na primer, antitela, njihove fragmente, specifična humanizovana antitela i njihove fragmente i varijante sposobne da se vezuju za IL-6 i/ili IL-6/IL-6R kompleks. Ova antitela mogu da vezuju solubilni IL-6 ili IL-6 koji se eksprimira na površini ćelije.
Lipidne nanočestice, generalno
[0178] U nekim primerima izvođenja, lipidna nanočestica sadrži katjonski lipid, PEG-modifikovani lipid, sterol i nekatjonski lipid. U nekim primerima izvođenja, nosač lipidna nanočestica sadrži molski odnos od oko 20-60% katjonskog lipida; 5-25% nekatjonskog lipida; 25-55% sterola; i 0,5-15% PEG-modifikovanog lipida. U nekim primerima izvođenja, katjonski lipid je jonizujući katjonski lipid. U nekim primerima izvođenja, nekatjonski lipid je neutralni lipid. U nekim primerima izvođenja, sterol je holesterol. U nekim primerima izvođenja, katjonski lipid se odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksotana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-I-il)9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319). U nekim primerima izvođenja, lipidna nanočestica ima vrednost polidiverziteta manju od 0,4. U nekim primerima izvođenja, lipidna
2
nanočestica ima neto neutralno naelektrisanje pri neutralnoj pH. U nekim primerima izvođenja, lipidna nanočestica ima srednji prečnik od 50-200 nm.
[0179] Lipidne nanočestice mogu da sadrže jednu ili više vrsta lipida, uključujući, ali ne ograničavajući se na, katjonske/jonizujuće lipide, nekatjonske lipide, strukturne lipide, fosfolipide, i pomoćne lipide. Bilo koji od ovih lipida može biti konjugovan za polietilen glikol (PEG) i stoga mogu biti označeni kao PEGilovani lipidi ili PEG-modifikovani lipidi.
[0180] Formiranje lipidnih nanočestica (LNP) može se postići postupcima koji su poznati u struci i/ili kao što je ovde opisano u S.A.D. publ. br.2012/0178702.
[0181] Na formulaciju lipidnih nanočestica može uticati, ali nije ograničeno na, odabir katjonske lipidne komponente, stepen zasićenosti katjonskih lipida, odabir nekatjonske lipidne komponente, stepen zasićenosti nekatjonskih lipida, odabir strukturne lipidne komponente, prirodu PEGilacije, odnos svih komponenti i biofizičkih parametara kao što je veličina. U određenim neograničavajućim primerima, LNP sadrži četiri osnovne komponente: (1) katjonski lipid; (2) nekatjonski lipid (npr. fosfolipid kao što je DSPC); (3) strukturni lipid (npr. sterol kao što je holesterol); i (4) PEG ili PEG-modifikovani lipid. U jednom primeru u Semple el al. (Nature Biotech. 2010 28:172-176), formulacija lipidnih nanočestica se sastoji od sledećih molskih odnosa: 57,1% katjonskog lipida, 7,1% dipalmitoilfosfatidilholina, 34,3% holesterola, i 1,4% PEG-c-DMA. Kao sledeći primer, promena sastava katjonskog lipida može efikasnije da isporuči siRNA u različite antigen prezentujuće ćelije (Basha el al. Mol Ther.2011 19:2186-2200).
[0182] Lipidne nanočestice koje su ovde opisane sadrže jedan ili više lipida. U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži katjonski lipid i nekatjonski lipid. U određenim primerima izvođenja, LNP formulacija sadrži katjonski lipid i DSPC supstituent. U određenim primerima izvođenja, LNP formulacija sadrži katjonski lipid i masnu kiselinu. U određenim primerima izvođenja, LNP formulacija sadrži katjonski lipid i oleinsku kiselinu. U određenim primerima izvođenja, LNP formulacija sadrži katjonski lipid i analog oleinske kiseline.
[0183] Katjonski lipidi su pozitivno naelektrisani lipidi koji se mogu asocirati sa nukleinskim kiselinama u sistemima za isporuku zasnovanim na lipidu/LNP. Pozitivno naelektrisanje na LNP promoviše asocijaciju sa negativno naelektrisanom ćelijskom membranom kako bi se poboljšalo ćelijsko preuzimanje. Katjonski lipidi se takođe mogu kombinovati sa negativno naelektrisanim lipidima da indukuju nedvoslojne strukture koje olakšavaju unutarćelijsku isporuku. Pogodni katjonski lipidi za upotrebu u pravljenju LNP koje su ovde objavljene mogu biti jonizujući katjonski lipidi, na primer, amino lipid, i oni koji su ovde objavljeni.
[0184] U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži katjonski lipid, nekatjonski lipid, i strukturni lipid. U određenim primerima izvođenja, LNP formulacija sadrži katjonski lipid, masnu kiselinu, i strukturni lipid. U određenim primerima izvođenja, LNP formulacija sadrži katjonski lipid, oleinsku kiselinu, i strukturni lipid. U određenim primerima izvođenja, LNP formulacija sadrži katjonski lipid, analog oleinske kiseline, i strukturni lipid. U određenim primerima izvođenja, LNP formulacija sadrži katjonski lipid, masnu kiselinu, i sterol. U određenim primerima izvođenja, LNP formulacija sadrži katjonski lipid, oleinsku kiselinu, i sterol. U određenim primerima izvođenja, LNP formulacija sadrži katjonski lipid, oleinsku kiselinu, i holesterol.
[0185] U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži katjonski lipid, nekatjonski lipid, i PEG ili PEG lipid. U određenim primerima izvođenja, LNP formulacija sadrži katjonski lipid, nekatjonski lipid, i PEG lipid. U određenim primerima izvođenja, LNP formulacija sadrži katjonski lipid, nekatjonski lipid, i PEG-OH lipid. U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži katjonski lipid, nekatjonski lipid, i PEG-OH lipid. U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži katjonski lipid, masnu kiselinu, i PEG-OH lipid. U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži katjonski lipid, oleinsku kiselinu, i PEG-OH lipid. U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži katjonski lipid, analog oleinske kiseline, i PEG-OH lipid.
[0186] U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži katjonski lipid, nekatjonski lipid (npr. fosfolipid ili masnu kiselinu), strukturni lipid, i PEG lipid. U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži katjonski lipid, nekatjonski lipid (npr. fosfolipid ili masnu kiselinu), strukturni lipid, i PEG-OH lipid. U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži katjonski lipid, nekatjonski lipid (npr. fosfolipid ili masnu kiselinu), i strukturni lipid. U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži katjonski lipid, masnu kiselinu (npr. oleinsku kiselinu ili njen analog), strukturni lipid, i PEG lipid. U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži katjonski lipid, masnu kiselinu (npr. oleinsku kiselinu ili njen analog), strukturni lipid, i PEG-OH lipid. U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži katjonski lipid, oleinsku kiselinu, strukturni lipid (npr. sterol), i PEG-OH lipid. U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži katjonski lipid, oleinsku kiselinu, i strukturni lipid (npr. holesterol). U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži jedan ili više katjonskih ili nekatjonskih lipida, masnu kiselinu (npr. oleinsku kiselinu), i PEG lipid. U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži jedan ili više katjonskih ili nekatjonskih lipida, masnu kiselinu (npr. oleinsku kiselinu), i PEG-OH lipid.
[0187] U nekim primerima izvođenja, LNP sadrži masnu kiselinu. U određenim primerima izvođenja, masna kiselina je mononezasićena masna kiselina. U određenim primerima izvođenja, masna kiselina je polinezasićena masna kiselina. U nekim primerima izvođenja, LNP sadrži
4
oleinsku kiselinu. U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži jedan ili više katjonskih ili nekatjonskih lipida, i masnu kiselinu (npr. oleinsku kiselinu). U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži jedan ili više katjonskih ili nekatjonskih lipida, i oleinsku kiselinu. U određenim primerima izvođenja, kada LNP uključuje oleinsku kiselinu, LNP ne uključuje fosfolipid. U određenim primerima izvođenja, kada LNP uključuje oleinsku kiselinu, LNP ne uključuje DSPC. U određenim primerima izvođenja, kada LNP uključuje masnu kiselinu, LNP ne uključuje fosfolipid. U određenim primerima izvođenja, kada LNP uključuje masnu kiselinu, TNP ne uključuje DSPC.
[0188] U nekim primerima izvođenja, LNP sadrži PEG-OH lipide. U određenim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica sadrži jedan ili više katjonskih ili nekatjonskih lipida, i PEG-OH lipid.
[0189] U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica mogu da sadrže, u molskim procentima, 35 do 45% katjonskog lipida, 40% do 50% katjonskog lipida, 50% do 60% katjonskog lipida i/ili 55% do 65% katjonskog lipida. U nekim primerima izvođenja, odnos lipida prema nukleinskoj kiselini (npr. iRNK) u lipidnim nanočesticama može biti 5:1 do 20:1, 10:1 do 25:1, 15:1 do 30:1 i/ili najmanje 30:1.
[0190] U nekim primerima izvođenja, odnos PEG u formulacijama lipidnih nanočestica može biti povećan ili smanjen i/ili dužina ugljeničnog lanca PEG lipida može biti modifikovana od C14 do C18 kako bi se izmenila farmakokinetika i/ili biodistribucija formulacija lipidnih nanočestica. U određenim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica mogu da sadrže 0,5% do 3,0%, 1,0% do 3,5%, 1,5% do 4,0%, 2,0% do 4,5%, 2,5% do 5,0%, i/ili 3,0% do 6,0% molskog odnosa lipida PEG lipida prema drugim komponentama. Kao neograničavajući primer, formulacije lipidnih nanočestica mogu da sadrže 0,5% do 3,0%, 1,0% do 3,5%, 1,5% do 4,0%, 2,0% do 4,5%, 2,5% do 5,0%, i/ili 3,0% do 6,0% molskog odnosa lipida PEG-c-DOMG (R-3-[(ω-metoksipoli(etilenglikol)2000)karbamoil)]-1,2-dimiristiloksipropil-3-amina) (ovde se takođe označava kao PEG-DOMG) u poređenju sa katjonskim lipidima, DSPC, i holesterolom. U nekim primerima izvođenja, PEG-c-DOMG može biti zamenjen sa PEG lipidom kao što je, ali nije ograničeno na, PEG-DSG (1,2-distearoil-sn-glicerol, metoksipolietilen glikol), DMG-PEG (1,2-dimiristoii-snglicerol) i/ili PEG-DPG (1,2-dipalmitoil-sn-glicerol, metoksipolietilen glikol). Katjonski lipid može biti odabran od bilo kog lipida koji je poznat u struci, kao što su, ali ne ograničavajući se na, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C12-200, i DLin-KC2-DMA. U određenim primerima izvođenja, lipidna nanočestica ne sadrži PEG lipid. U određenim primerima izvođenja, lipidna nanočestica sadrži PEG lipidni supstituent kao što je PEG-OH lipid. Inkorporacija PEG-OH lipida u formulaciju nanočestica može poboljšati farmakokinetiku i/ili biodistribuciju formulacije lipidnih nanočestica. Na primer, inkorporacija PEG-OH lipida u formulaciju nanočestica može redukovati ABC efekat. U određenim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica mogu da sadrže 0,5% do 3,0%, 1,0% do 3,5%, 1,5% do 4,0%, 2,0% do 4,5%, 2,5% do 5,0%, i/ili 3,0% do 6,0% molski odnos lipida PEG-OH lipida prema drugim komponentama (npr. katjonski, neutralni, i strukturni lipidi).
[0191] U nekim primerima izvođenja, LNP formulacija je nanočestica koja sadrži najmanje jedan lipid. U određenim primerima izvođenja, lipidi su odabrani od katjonskih/jonizujućih lipida, nekatjonskih lipida (npr. masnih kiselina i fosfolipida), PEG lipida, strukturnih lipida (npr. sterola), i PEG-OH lipida. Lipid se može odabrati od, ali nije ograničen na, DLin-DMA, DLin-K-DMA, 98N12-5, C12-200, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, PLGA, PEG, PEG-DMG, PEGilovane lipide, i lipide amino alkohola. U nekim primerima izvođenja, lipid može biti katjonski lipid, kao što je, ali ne ograničavajući se na, DLin-DMA, DLin-D-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, DODMA, i lipide amino alkohola. Katjonski lipidi amino alkohola mogu biti lipidi koji su opisani u i/ili napravljeni pomoću postupaka koji su opisani u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US2013/0150625. Kao neograničavajući primer, katjonski lipid može biti 2-amino-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-I-iloksi]-2-([(9Z,27,)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]metil)propan-1-ol (Jedinjenje 1 u US2013/0150625); 2-amino-3-[(9Z)-oktadek-9-en-1-iloksi]-2-{[(9Z)-oktadek-9-en-1-iloksi]metil}propan-1-ol (Jedinjenje 2 u US20130150625); 2-amino-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-2-[(oktitoksi)metil]propan-1-ol (Jedinjenje 3 u US2013/0150625); i 2-(dimetilamino)-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-2-{[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]metil}propan-1-ol (Jedinjenje 4 u US2013/0150625); ili bilo koja njihova farmaceutski prihvatljiva so ili stereoizomer.
[0192] Formulacije lipidnih nanočestica mogu da sadrže lipid, posebno, jonizujući katjonski lipid, na primer, 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolan (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirat (DLin-MC3-DMA), ili di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioat (L319), i dodatno sadržati nekatjonski lipid (npr. fosfolipid ili masnu kiselinu), strukturni lipid (npr. sterol kao što je holesterol), i molekul sposoban da redukuje agregaciju čestica, na primer, PEG ili PEG-modifikovani lipid (npr. PEG-OH lipid). U određenim primerima izvođenja, formulacija ne sadrži PEG lipid.
[0193] U nekim primerima izvođenja, LNP formulacija se suštinski sastoji od molskog odnosa od 20-60% katjonskog lipida; 5-25% nekatjonskog lipida; 25-55% sterola; 0,5-15% PEG lipida. U nekim primerima izvođenja, LNP formulacija se suštinski sastoji od molskog odnosa od 20-60% katjonskog lipida; 5-25% nekatjonskog lipida; 25-55% sterola; 0,5-15% PEG-OH lipida. U nekim primerima izvođenja, LNP formulacija se suštinski sastoji od molskog odnosa od 20-60% katjonskog lipida; 5-25% nekatjonskog lipida; i 25-55% sterola. U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipid je masna kiselina. U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipid je oleinska kiselina ili njen analog. U određenim primerima izvođenja, PEG lipid je PEG-OH lipid.
[0194] U nekim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica se suštinski sastoji od (i) najmanje jednog lipida koji je odabran iz grupe koja se sastoji od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi) heptadekandioata (L319); (ii) nekatjonskog lipida koji je odabran od DSPC, DPPC, POPC, DOPE, i SM; (iii) sterola, npr. holesterola; i (iv) PEG-lipida, npr. PEG-DMG ili PEG-cDMA, u molskom odnosu od 20-60% katjonskog lipida; 5-25% nekatjonskog lipida; 25-55% sterola; 0,5-15% PEG-lipida.
[0195] U nekim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica se suštinski sastoji od (i) najmanje jednog lipida koji je odabran iz grupe koja se sastoji od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319); (ii) nekatjonskog lipida kao DSPC supstituenta (npr. drugi fosfolipid, ili masna kiselina); (iii) strukturnog lipida (npr. sterol kao što je holesterol); i (iv) PEG-lipida ili PEG-OH lipida (npr. PEG-DMG ili PEG-cDMA), u molskom odnosu od 20-60% katjonskog lipida; 5-25% DSPC supstituenta; 25-55% strukturnog lipida; 0,5-15% PEG-lipida.
[0196] U nekim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica uključuje 25% do 75% na molskoj osnovi katjonskog lipida. Katjonski lipid može biti odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319), npr.35 do 65%, 45 do 65%, 60%, 57,5%, 50% ili 40% na molskoj osnovi.
[0197] U nekim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica uključuje 0,5% do 15% na molskoj osnovi nekatjonskog lipida, npr.3 do 12%, 5 do 10% ili 15%, 10%, ili 7,5% na molskoj osnovi. U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipid je fosfolipid. U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipid je DSPC supstituent (npr. fosfolipid koji nije DSPC, ili masna kiselina). U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipid je masna kiselina (npr. oleinska kiselina ili njen analog). Drugi primeri nekatjonskih lipida uključuju, bez ograničenja, POPC, DPPC, DOPE i SM. U nekim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica uključuje 0,5% do 15% na molskoj osnovi masne kiseline, npr.3 do 12%, 5 do 10% ili 15%, 10%, ili 7,5% na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica uključuje 0,5% do 15% na molskoj osnovi oleinske kiseline, npr. 3 do 12%, 5 do 10% ili 15%, 10%, ili 7,5% na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica uključuje 0,5% do 15% na molskoj osnovi analoga oleinske kiseline, npr.3 do 12%, 5 do 10% ili 15%, 10%, ili 7,5% na molskoj osnovi.
[0198] U nekim primerima izvođenja, formulacija uključuje 5% do 50% na molskoj osnovi strukturnog lipida, npr.15 do 45%, 20 do 40%, 40%, 38,5%, 35%, ili 31% na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacija uključuje 5% do 50% na molskoj osnovi sterola, npr.15 do 45%, 20 do 40%, 40%, 38,5%, 35%, ili 31% na molskoj osnovi. Neograničavajući primer sterola je holesterol.
[0199] U nekim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica uključuje 0,5% do 20% na molskoj osnovi PEG ili PEG-modifikovanog lipida, npr. 0,5 do 10%, 0,5 do 5%, 1,5%, 0,5%, 1,5%, 3,5%, ili 5% na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, PEG ili PEG-modifikovani lipid sadrži PEG molekul prosečne molekulske težine od 2.000 Da. U nekim primerima izvođenja, PEG ili PEG modifikovani lipid sadrži PEG molekul prosečne molekulske težine manje od 2.000, na primer, oko 1.500 Da, oko 1.000 Da, ili oko 500 Da. Neograničavajući primeri PEG-modifikovanih lipida uključuju PEG-distearoil glicerol (PEG-DMG) (ovde se takođe označava kao Jed422), PEG-cDMA (dodatno razmatrano u Reyes et al. J. Controlled Release, 107, 276-287 (2005)). Kao što je ovde opisano, bilo koji PEG lipidi ili PEG-modifikovani lipidi mogu biti PEG-OH lipidi. U nekim primerima izvođenja, formulacija lipidnih nanočestica uključuje 0,5% do 20% na molskoj osnovi PEG-OH lipida, npr.0,5 do 10%, 0,5 do 5%, 1,5%, 0,5%, 1,5%, 3,5%, ili 5% na molskoj osnovi.
[0200] U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 25-75% katjonskog lipida, 0,5-15% nekatjonskog lipida; 5-50% strukturnog lipida, i 0,5-20% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 25-75% katjonskog lipida, 0,5-15% nekatjonskog lipida; 5-50% strukturnog lipida, i 0,5-20% PEG-OH lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 25-75% katjonskog lipida, 0,5-15% nekatjonskog lipida, i 5-50% strukturnog lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 25-75% katjonskog lipida koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319).
[0201] U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 35-65% katjonskog lipida, 3-12% nekatjonskog lipida, 15-45% strukturnog lipida, i 0,5-10% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 35-65% katjonskog lipida, 3-12% nekatjonskog lipida, 15-45% strukturnog lipida, i 0,5-10% PEG-OH lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 35-65% katjonskog lipida, 3-12% nekatjonskog lipida, i 15-45% strukturnog lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 35-65% katjonskog lipida koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319).
[0202] U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 45-65% katjonskog lipida, 5-10% nekatjonskog lipida, 25-40% strukturnog lipida, i 0,5-10% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 45-65% katjonskog lipida, 5-10% nekatjonskog lipida, 25-40% strukturnog lipida, i 0,5-10% PEG-OH lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 45-65% katjonskog lipida, 5-10% nekatjonskog lipida, i 25-40% strukturnog lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 45-65% katjonskog lipida koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319).
[0203] U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 60% katjonskog lipida, 7,5% nekatjonskog lipida, 31% strukturnog lipida, i 1,5% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 60% katjonskog lipida, 7,5% nekatjonskog lipida, 31% strukturnog lipida, i 1,5% PEG-OH lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 60% katjonskog lipida, 9% nekatjonskog lipida, i 31% strukturnog lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 60% katjonskog lipida koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319).
[0204] U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 50% katjonskog lipida, 10% nekatjonskog lipida, 38,5% strukturnog lipida, i 1,5% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 50% katjonskog lipida, 10% nekatjonskog lipida, 38,5% strukturnog lipida, i 1,5% PEG-OH lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 50% katjonskog lipida, 10% nekatjonskog lipida, i 40% strukturnog lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 50% katjonskog lipida koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319).
[0205] U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 40% katjonskog lipida, 15% nekatjonskog lipida, 40% strukturnog lipida, i 5% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 40% katjonskog lipida, 15% nekatjonskog lipida, 40% strukturnog lipida, i 5% PEG-OH lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 40% katjonskog lipida, 20% nekatjonskog lipida, 40% strukturnog lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 40% katjonskog lipida koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleilmetil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319).
[0206] U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 57,2% katjonskog lipida, 7,1% nekatjonskog lipida, 34,3% sterola, i 1,4% PEG ili PEG-modifikovanog lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 57,2% katjonskog lipida, 7,1% nekatjonskog lipida, 34,3% strukturnog lipida, i 1,4% PEG-OH lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 57,2% katjonskog lipida, 8,5% nekatjonskog lipida, i 34,3% strukturnog lipida na molskoj osnovi. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica uključuju 57,2% katjonskog lipida koji je odabran od 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirata (DLin-MC3-DMA), i di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oksi)heptadekandioata (L319).
[0207] U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica suštinski se sastoje od smeše lipida u molskim odnosima od 20-70% katjonskog lipida; 5-45% nekatjonskog lipida; 20-55% strukturnog lipida; 0,5-15% PEG-modifikovanog lipida. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica suštinski se sastoje od smeše lipida u molskim odnosima od 20-70% katjonskog lipida; 5-45% nekatjonskog lipida (npr. fosfolipida ili masne kiseline); 20-55% strukturnog lipida; i 0,5-15% PEG-OH lipida. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica suštinski se sastoje od smeše lipida u molskim odnosima od 20-70% katjonskog lipida; 5-45% nekatjonskog lipida (npr. fosfolipida ili masne kiseline); 20-55% strukturnog lipida (npr. sterola); i 0,5-15% PEG-OH lipida. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica suštinski se sastoje od smeše lipida u molskim odnosima od 20-70% katjonskog lipida; 5-45% nekatjonskog lipida (npr. fosfolipida ili masne kiseline); i 20-55% strukturnog lipida (npr. sterola). U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica suštinski se sastoje od smeše lipida u molskim odnosima od 20-70% katjonskog lipida; 5-45% masne kiseline (npr. oleinske kiseline ili njenog analoga); 20-55% strukturnog lipida (npr. sterola); i 0,5-15% PEG-OH lipida. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica suštinski se sastoje od smeše lipida u molskim odnosima od 20-70% katjonskog lipida; 5-45% masne kiseline (npr. oleinske kiseline ili njenog analoga); i 20-55% strukturnog lipida (npr. sterola). U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica suštinski se sastoje od smeše lipida u molskim odnosima od 20-70% katjonskog lipida; 5-45% oleinske kiseline; 20-55% strukturnog lipida (npr. sterola); i 0,5-15% PEG-OH lipida. U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica suštinski se sastoje od smeše lipida u molskim odnosima od 20-70% katjonskog lipida; 5-45% oleinske kiseline; i 20-55% strukturnog lipida (npr. sterola).
[0208] U nekim primerima izvođenja, molski odnos lipida je 50/10/38,5/1,5 (mol % katjonski lipid/nekatjonski lipid/strukturni lipid/PEG lipid). U nekim primerima izvođenja, molski odnos lipida je 57,2/7,1/34,3/1,4 (mol % katjonski lipid/nekatjonski lipid/strukturni lipid/PEG lipid). U nekim primerima izvođenja, molski odnos lipida je 40/15/40/5 (mol % katjonski lipid/nekatjonski lipid/strukturni lipid/PEG lipid). U nekim primerima izvođenja, molski odnos lipida je 50/10/35/4,5/0,5 (mol % katjonski lipid/nekatjonski lipid/strukturni lipid/PEG lipid). U nekim primerima izvođenja, molski odnos lipida je 50/10/35/5 (mol % katjonski lipid/nekatjonski lipid/strukturni lipid/PEG lipid). U nekim primerima izvođenja, molski odnos lipida je 40/10/40/10 (mol % katjonski lipid/nekatjonski lipid/strukturni lipid/PEG lipid). U nekim primerima izvođenja, molski odnos lipida je 35/15/40/10 (mol % katjonski lipid/nekatjonski lipid/strukturni lipid/PEG lipid). U nekim primerima izvođenja, molski odnos lipida je 52/13/30/5 (mol % katjonski lipid/nekatjonski lipid/strukturni lipid/PEG lipid). Kao što je ovde opisano, bilo koji nekatjonski lipid može biti DSPC supstituent kao što je ne-DSPC fosfolipid ili masna kiselina (npr. oleinska kiselina). Kao što je ovde opisano, bilo koji PEG lipid može biti PEG-OH lipid.
[0209] Neograničavajući primeri kompozicija lipidnih nanočestica i postupci njihovog pravljenja opisani su, na primer, u Semple et al. (2010) Nat. Biotechnol.28:172-176; Jayarama et al. (2012), Angew. Chem. Int. Ed, 51: 8529-8533; i Maier el al. (2013) Molecular Therapy 21, 1570-1578.
[0210] U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica mogu da sadrže katjonski lipid, PEG lipid (npr. PEG-OH lipid) i opciono sadrže nekatjonski lipid (npr. fosfolipid ili masnu kiselinu). U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica mogu da sadrže katjonski lipid, PEG lipid (npr. PEG-OH lipid) i strukturni lipid (npr. sterol) i opciono sadrže nekatjonski lipid (npr. fosfolipid ili masnu kiselinu).
[0211] Lipidne nanočestice koje su ovde opisane mogu da sadrže 2 ili više komponenti (npr. lipide), ne uključujući korisni tovar. U određenim primerima izvođenja, LNP sadrži dve komponente (npr. lipide), ne uključujući korisni tovar. U određenim primerima izvođenja, lipidna nanočestica sadrži 5 komponenti (npr. lipide), ne uključujući korisni tovar. U određenim primerima izvođenja, LNP sadrži 6 komponenti (npr. lipide), ne uključujući korisni tovar.
1
[0212] U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica koje su ovde opisane mogu biti četvorokomponentne lipidne nanočestice.4-komponentna LNP može da sadrži četiri različita lipida odabrana od bilo kog koji je ovde opisan. Četiri komponente ne uključuju korisni tovar. Lipidna nanočestica može da sadrži katjonski lipid, nekatjonski lipid, PEG lipid, i strukturni lipid. U određenim primerima izvođenja, lipidna nanočestica sadrži katjonski lipid, masnu kiselinu, PEG lipid, i strukturni lipid. U određenim primerima izvođenja, lipidna nanočestica sadrži katjonski lipid, masnu kiselinu, PEG-OH lipid, i strukturni lipid.
[0213] U nekim primerima izvođenja, formulacije lipidnih nanočestica koje su ovde opisane mogu biti trokomponentne lipidne nanočestice. Trokomponentna LNP može da sadrži tri različita lipida koji su ovde opisani. Lipidna nanočestica može da sadrži katjonski lipid, nekatjonski lipid (npr. fosfolipid ili masnu kiselinu), i strukturni lipid. U određenim primerima izvođenja, lipidna nanočestica sadrži katjonski lipid, masnu kiselinu, i strukturni lipid. U određenim primerima izvođenja, lipidna nanočestica sadrži katjonski lipid, fosfolipid, i strukturni lipid.
[0214] U nekim primerima izvođenja, nanočestica (npr. lipidna nanočestica) ima srednju vrednost prečnika od 10-500 nm, 20-400 nm, 30-300 nm, ili 40-200 nm. U nekim primerima izvođenja, nanočestica (npr. lipidna nanočestica) ima srednju vrednost prečnika od 50-150 nm, 50-200 nm, 80-100 nm, ili 80-200 nm.
[0215] U jednom primeru izvođenja, LNP formulacija može biti formulisana pomoću postupaka koji su opisani u Međunarodnim publikacijama br. WO2011127255 ili WO2008103276. Kao neograničavajući primer, LNP formulacije kao što je opisano u WO2011127255 i/ili WO2008103276.
[0216] U jednom primeru izvođenja, lipidna nanočestica može biti formulisana pomoću postupaka koji su opisani u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US2013/0156845 ili Međunarodnim publikacijama br. WO2013/093648 ili WO2012024526.
[0217] Lipidne nanočestice koje su ovde opisane mogu biti napravljene u sterilnom okruženju pomoću sistema i/ili postupaka koji su opisani u S.A.D. patentnoj publikaciji br. US20130164400.
[0218] U jednom primeru izvođenja, LNP formulacija može biti formulisana u nanočestici kao što je čestica nukleinska kiselina-lipid koja je opisana u S.A.D. patentu br.8,492,359.
[0219] Kao neograničavajući primer, lipidna čestica može da sadrži jedan ili više aktivnih agenasa ili terapijskih agenasa (npr. RNK); jedan ili više katjonskih lipida koji čine od oko 50 mol % do oko 85 mol % ukupnog lipida koji je prisutan u čestici; jedan ili više nekatjonskih lipida koji čine od oko 13 mol % do oko 49,5 mol % ukupnog lipida koji je prisutan u čestici; i jedan ili više strukturnih lipida koji inhibiraju agregaciju čestica koji čine od oko 0,5 mol % do oko 2 mol % ukupnog lipida koji je prisutan u čestici.
2
[0220] U jednom primeru izvođenja, LNP formulacija može biti formulisana pomoću postupaka koji su opisani u Međunarodnim publikacijama br. WO2011127255 ili WO2008103276. Kao neograničavajući primer, LNP formulacije kao što je opisano u WO2011127255 i/ili WO2008103276; sadržaj svake od njih je ovde inkorporisan kao referenca u celosti. U jednom primeru izvođenja, LNP formulacije koje su ovde opisane mogu da sadrže polikatjonsku kompoziciju. Kao neograničavajući primer, polikatjonska kompozicija može biti odabrana od formule 1-60 iz S.A.D. patentne publikacije br. US20050222064.
[0221] U nekim primerima izvođenja, LNP sadrže lipid KL52 (amino-lipid koji je objavljen u S.A.D. prijavnoj publikaciji br.2012/0295832). Aktivnost i/ili bezbednost (izmerena ispitivanjem jednog ili više od ALT/AST, broja belih krvnih zrnaca i indukcije citokina) primene LNP mogu se poboljšati inkorporacijom takvih lipida. LNP koje sadrže KL52 mogu se primenjivati intravenski i/ili u jednoj ili više doza. U nekim primerima izvođenja, primena LNP koje sadrže KL52 rezultuje jednakom ili poboljšanom ekspresijom iRNK i/ili proteina u poređenju sa LNP koje sadrže MC3.
[0222] Kao neograničavajući primer, LNP može uključivati katjonski peptid ili polipeptid kao što su, ali bez ograničenja na, polilizin, poliornitin i/ili poliarginin i katjonske peptide koji su opisani u Međunarodnoj publ. br. WO2012013326 ili S.A.D. patentnoj publ. br. US20130142818. U nekim primerima izvođenja, lipidna nanočestica uključuje nekatjonski lipid kao što je, ali nije ograničen na, holesterol ili dioleoil fosfatidiletanolamin (DOPE).
[0223] U nekim primerima izvođenja, lipidne nanočestice koje su ovde opisane mogu imati prečnik od ispod 0,1 um do 100 nm kao što je, ali nije ograničen na, manje od 0,1 um, manje od 1,0 um, manje od 5 um, manje od 10 um, manje od 15 um, manje od 20 um, manje od 25 um, manje od 30 um, manje od 35 um, manje od 40 um, manje od 50 um, manje od 55 um, manje od 60 um, manje od 65 um, manje od 70 um, manje od 75 um, manje od 80 um, manje od 85 um, manje od 90 um, manje od 95 um, manje od 100 um, manje od 125 um, manje od 150 um, manje od 175 um, manje od 200 um, manje od 225 um, manje od 250 um, manje od 275 um, manje od 300 um, manje od 325 um, manje od 350 um, manje od 375 um, manje od 400 um, manje od 425 um, manje od 450 um, manje od 475 um, manje od 500 um, manje od 525 um, manje od 550 um, manje od 575 um, manje od 600 um, manje od 625 um, manje od 650 um, manje od 675 um, manje od 700 um, manje od 725 um, manje od 750 um, manje od 775 um, manje od 800 um, manje od 825 um, manje od 850 um, manje od 875 um, manje od 900 um, manje od 925 um, manje od 950 um, manje od 975 um.
[0224] U sledećem primeru izvođenja, LNP mogu imati prečnik od oko 1 nm do oko 100 nm, od oko 1 nm do oko 10 nm, oko 1 nm do oko 20 nm, od oko 1 nm do oko 30 nm, od oko 1 nm do oko 40 nm, od oko 1 nm do oko 50 nm, od oko 1 nm do oko 60 nm, od oko 1 nm do oko 70 nm, od oko 1 nm do oko 80 nm, od oko 1 nm do oko 90 nm, od oko 5 nm do oko od 100 nm, od oko 5 nm do oko 10 nm, oko 5 nm do oko 20 nm, od oko 5 nm do oko 30 nm, od oko 5 nm do oko 40 nm, od oko 5 nm do oko 50 nm, od oko 5 nm do oko 60 nm, od oko 5 nm do oko 70 nm, od oko 5 nm do oko 80 nm, od oko 5 nm do oko 90 nm, oko 10 do oko 50 nM, od oko 20 do oko 50 nm, od oko 30 do oko 50 nm, od oko 40 do oko 50 nm, od oko 20 do oko 60 nm, od oko 30 do oko 60 nm, od oko 40 do oko 60 nm, od oko 20 do oko 70 nm, od oko 30 do oko 70 nm, od oko 40 do oko 70 nm, od oko 50 do oko 70 nm, od oko 60 do oko 70 nm, od oko 20 do oko 80 nm, od oko 30 do oko 80 nm, od oko 40 do oko 80 nm, od oko 50 do oko 80 nm, od oko 60 do oko 80 nm, od oko 20 do oko 90 nm, od oko 30 do oko 90 nm, od oko 40 do oko 90 nm, od oko 50 do oko 90 nm, od oko 60 do oko 90 nm i/ili od oko 70 do oko 90 nm. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0225] Kompozicija nanočestica može biti relativno homogena. Indeks polidisperznosti može se upotrebiti da ukaže na homogenost kompozicije nanočestica, npr. distribuciju veličine čestica kompozicije nanočestica. Mali (npr. manje od 0,3) indeks polidisperznosti generalno ukazuje na usku distribuciju veličine čestica. Kompozicija nanočestica može imati indeks polidisperznosti od oko 0 do oko 0,25, kao što je 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17, 0,18, 0,19, 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24, ili 0,25. U nekim primerima izvođenja, indeks polidisperznosti kompozicije nanočestica može biti od oko 0,10 do oko 0,20. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0226] Zeta potencijal kompozicije nanočestica može se upotrebljavati da ukaže na elektrokinetički potencijal kompozicije. Na primer, zeta potencijal može da opiše površinsko naelektrisanje kompozicije nanočestica. Kompozicije nanočestica sa relativno niskim naelektrisanjem, pozitivnim ili negativnim, generalno su poželjne, pošto visoko naelektrisane vrste mogu da interaguju nepoželjno sa ćelijama, tkivima, i drugim elementima u telu. U nekim primerima izvođenja, zeta potencijal kompozicije nanočestica može biti od oko -10 mV do oko 20 mV, od oko -10 mV do oko 15 mV, od oko -10 mV do oko 10 mV, od oko -10 mV do oko 5 mV, od oko -10 mV do oko 0 mV, od oko -10 mV do oko -5 mV, od oko -5 mV do oko 20 mV, od oko -5 mV do oko 15 mV, od oko -5 mV do oko 10 mV, od oko -5 mV do oko 5 mV, od oko -5 mV do oko 0 mV, od oko 0 mV do oko 20 mV, od oko 0 mV do oko 15 mV, od oko 0 mV do oko 10 mV, od oko 0 mV do oko 5 mV, od oko 5 mV do oko 20 mV, od oko 5 mV do oko 15 mV, ili od oko 5 mV do oko 10 mV. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0227] Efikasnost inkapsulacije terapijskog agensa opisuje količinu terapijskog agensa koji je inkapsuliran ili na drugi način asociran sa kompozicijom nanočestica posle pripreme, u odnosu na inicijalnu obezbeđenu količinu. Efikasnost inkapsulacije je poželjno visoka (npr. blizu 100%).
4
Efikasnost inkapsulacije se može izmeriti, na primer, upoređivanjem količine terapijskog agensa u rastvoru koji sadrži kompoziciju nanočestica pre i posle razbijanja kompozicije nanočestica sa jednim ili više organskih rastvarača ili deterdženata. Fluorescencija se može upotrebljavati za merenje količine slobodnog terapijskog agensa (npr. nukleinskih kiselina) u rastvoru. Za kompozicije nanočestica koje su ovde opisane, efikasnost inkapsulacije terapijskog agensa može biti najmanje 50%, na primer 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100%. U nekim primerima izvođenja, efikasnost inkapsulacije može biti najmanje 80%. U određenim primerima izvođenja, efikasnost inkapsulacije može biti najmanje 90%. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0228] Kompozicija nanočestica može opciono da sadrži jednu ili više obloga. Na primer, kompozicija nanočestica može biti formulisana u kapsuli, filmu, ili tableti koja ima oblogu. Kapsula, film, ili tableta koja uključuje kompoziciju koja je ovde opisana mogu imati bilo koju korisnu veličinu, zateznu čvrstoću, tvrdoću, ili gustinu.
[0229] U nekim primerima izvođenja, takve LNP se sintetišu upotrebom postupaka koji sadrže mikrofluidne miksere. Primeri mikrofluidnih miksera mogu uključivati, ali nisu ograničeni na prorezni interdigitalni mikromikser, uključujući, ali ne ograničavajući se na one koje proizvodi Microinnova (Allerheiligen bei Wildon, Austrija) i/ili mikromikser sa rasporedom riblje kosti (SHM) (objavljeni su Zhigaltsev, I.V. et al., Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixingLangmuir, 2012. 28:3633-40; Belliveau, N.M. et al., Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 2012. 1:e37; Chen, D. et al., Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. J Am Chem Soc. 2012.
134(16):6948-51).
[0230] U nekim primerima izvođenja, postupci generisanja LNP koji sadrže SHM, dodatno sadrže mešanje najmanje dva ulazna toka pri čemu se mešanje dešava haotičnom advekcijom indukovanom mikrostrukturom (MICA). U skladu sa ovim postupkom, tokovi fluida teku kroz kanale prisutne u obrascu riblje kosti izazivajući rotacioni tok i savijanje fluida jednog oko drugog. Ovaj postupak takođe može da sadrži površinu za mešanje tečnosti pri čemu površina menja orijentaciju tokom kruženja fluida. Postupci generisanja LNP upotrebom SHM uključuju one koji su objavljeni u S.A.D. prijavnim publikacijama br.2004/0262223 i 2012/0276209.
[0231] U jednom primeru izvođenja, lipidne nanočestice se mogu formulisati upotrebom mikromiksera kao što je, ali ne ograničavajući se na, prorezni interdigitalni mikrostrukturirani mikser (SIMM-V2) ili standardni prorezni interdigitalni mikromikser (SSIMM) ili Caterpillar (CPMM) ili Impinging-jet (IJMM) sa Institut für Mikrotechnik Mainz GmbH, Mainz, Nemačka.
[0232] U jednom primeru izvođenja, lipidne nanočestice su kreirane upotrebom mikrofluidne tehnologije (videti Whitesides, George M. The Origins and the Future of Microfluidics. Nature, 2006 442: 368-373; i Abraham et al. Chaotic Mixer for Microchannels. Science, 2002295: 647-651). Kao neograničavajući primer, kontrolisana mikrofluidna formulacija uključuje pasivni postupak za mešanje tokova vođenih stabilnim pritiskom u mikro kanalima na niskom Rejnoldsovom (Raynolds) broju (videti npr. Abraham et al. Chaotic Mixer for Microchannels. Science, 2002295: 647-651).
[0233] U jednom primeru izvođenja, iRNK iz predmetnog pronalaska može biti formulisana u lipidnim nanočesticama kreiranim upotrebom mikromikser čipa, kao što su, ali bez ograničenja na, one iz Harvard Apparatus (Holliston, MA) ili Dolomite Microfluidics (Royston, UK). Mikromikser čip se može upotrebljavati za brzo mešanje dva ili više tokova fluida sa podeli i rekombinuj (split and recombine) mehanizmom.
[0234] U jednom primeru izvođenja, lipidne nanočestice mogu imati prečnik od oko 10 do oko 100 nm kao što je, ali nije ograničeno na, oko 10 do oko 20 nm, oko 10 do oko 30 nm, oko 10 do oko 40 nm, oko 10 do oko 50 nm, oko 10 do oko 60 nm, oko 10 do oko 70 nm, oko 10 do oko 80 nm, oko 10 do oko 90 nm, oko 20 do oko 30 nm, oko 20 do oko 40 nm, oko 20 do oko 50 nm, oko 20 do oko 60 nm, oko 20 do oko 70 nm, oko 20 do oko 80 nm, oko 20 do oko 90 nm, oko 20 do oko 100 nm, oko 30 do oko 40 nm, oko 30 do oko 50 nm, oko 30 do oko 60 nm, oko 30 do oko 70 nm, oko 30 do oko 80 nm, oko 30 do oko 90 nm, oko 30 do oko 100 nm, oko 40 do oko 50 nm, oko 40 do oko 60 nm, oko 40 do oko 70 nm, oko 40 do oko 80 nm, oko 40 do oko 90 nm, oko 40 do oko 100 nm, oko 50 do oko 60 nm, oko 50 do oko 70 nm, oko 50 do oko 80 nm, oko 50 do oko 90 nm, oko 50 do oko 100 nm, oko 60 do oko 70 nm, oko 60 do oko 80 nm, oko 60 do oko 90 nm, oko 60 do oko 100 nm, oko 70 do oko 80 nm, oko 70 do oko 90 nm, oko 70 do oko 100 nm, oko 80 do oko 90 nm, oko 80 do oko 100 nm i/ili oko 90 do oko 100 nm. U jednom primeru izvođenja, lipidne nanočestice mogu imati prečnik od oko 10 do 500 nm. U jednom primeru izvođenja, lipidne nanočestice mogu imati prečnik veći od 100 nm, veći od 150 nm, veći od 200 nm, veći od 250 nm, veći od 300 nm, veći od 350 nm, veći od 400 nm, veći od 450 nm, veći od 500 nm, veći od 550 nm, veći od 600 nm, veći od 650 nm, veći od 700 nm, veći od 750 nm, veći od 800 nm, veći od 850 nm, veći od 900 nm, veći od 950 nm ili veći od 1000 nm. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0235] U nekim primerima izvođenja, lipidna nanočestica ima vrednost polidiverziteta manju od 0,4. U nekim primerima izvođenja, lipidna nanočestica ima neto neutralno naelektrisanje pri neutralnoj pH. U nekim primerima izvođenja, lipidna nanočestica ima srednju vrednost prečnika od 50-200 nm.
Lipidi
[0236] Kao što je ovde generalno definisano, termin "lipid" označava mali molekul koji ima hidrofobna ili amfifilna svojstva. Lipidi mogu biti oni koji se javljaju u prirodi ili sintetički. Primeri klasa lipida uključuju, ali nisu ograničeni na, masti, voskove, metabolite koji sadrže sterol, vitamine, masne kiseline, glicerolipide, glicerofosfolipide, sfingolipide, saharolipide, i poliketide, i prenol lipide. U nekim instancama, amfifilna svojstva nekih lipida dovode ih do formiranja lipozoma, vezikula, ili membrana u vodenom medijumu.
Katjonski/jonizujući lipidi
[0237] Kompozicija nanočestica može uključivati jedan ili više katjonskih i/ili jonizujućih lipida (npr. lipide koji mogu imati pozitivno ili delimično pozitivno naelektrisanje pri fiziološkoj pH). Katjonski i/ili jonizujući lipidi mogu biti odabrani iz neograničavajuće grupe koja se sastoji od 3-(didodecilamino)-N1,N1,4-tridodecil-1-piperazinetanamina (KL10), N1-[2-(didodecilamino)etil]N1,N4,N4-tridodecil-1,4-piperazindietanamina (KL22), 14,25-diuidecil-15,18,21,24-tetraaza-oktatriakontana (KL25), 1,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetilaminopropana (DLin-DMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioksolana (DLin-K-DMA), heptatriakonta-6,9,28,31-tetraen-19-il-4-(dimetilamino)butanoata (DLin-MC3-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2 dimetilaminoetil)-[1,3]-dioksolana (DLin-KC2-DMA), 1,2-dioleiloksi-N,N-dimetilaminopropana (DODMA), 2-({8[(3β)-holest-5-en-3- iloksi]oktil}oksi) N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-1-amina (oktil-CLinDMA), (2R)-2-((B-[(3β)-holest-5-en-3-iloksi]oktil}oksi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-1-amina (oktil-CLinDMA (2R)), i (2S) 2-({8-[(3β)-holest-5-en-3-iloksi]oktil}oksi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-1-amina (oktil-CLinDMA (2S)). Pored ovih, katjonski lipid može takođe biti lipid koji uključuje cikličnu amino grupu. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0238] U jednom primeru izvođenja, katjonski lipid može biti odabran od, ali nije ograničen na, katjonski lipid koji je opisan u Međunarodnim publikacijama br. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865, WO2008103276 WO2013086373 i WO2013086354, S.A.D. patentima br.7,893,302, 7,404,969, 8,283,333, i 8,466,122 i S.A.D. patentnim publikacijama br. US20100036115, US20120202871, US20130064894, US20130129785, US20130150625, US20130178541 i S20130225836.
[0239] U sledećem primeru izvođenja, katjonski lipid može biti odabran od, ali nije ograničen na, formulu A koja je opisana u Međunarodnim publikacijama br. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638 i WO2013116126 ili S.A.D. patentnim publikacijama br. US20130178541 i US20130225836. U još jednom primeru izvođenja, katjonski lipid može biti odabran od, ali nije ograničen na, formulu CLI-CLXXIX iz Međunarodne publikacije br. WO2008103276, formulu CLI-CLXXIX iz S.A.D. patenta br. 7,893,302, formulu CLI-CLXXXXII iz S.A.D. patenta br. 7,404,969 i formulu I-VI iz S.A.D. patentne publikacije br. US20100036115, formulu I iz S.A.D. patentne publikacije br. US20130123338.
[0240] Kao neograničavajući primer, katjonski lipid može biti odabran od (20Z,23Z)-N,N-dimetitnonakoza-20,23-dien-10-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimemilheksakoza-17,20-dien-9-amina, (1Z,19Z)-N5N-dimetilpentakoza-16,19-dien-8-amina, (13Z,16Z)-N,N-dimetildokoza-13, 16-dien-5-amina, (12Z,15Z)-N,N dimetilhenikoza-12,15-dien-4-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltrikoza-14,17-dien-6-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetrakoza-15,18-dien-7-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptakoza-18,21-dien-10-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetrakoza-15,18-dien-5-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltrikoza-14, 17-dien-4-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimetiloktakoza-19,22-dien-9-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptakoza-18,21-dien-8-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimetilheksakoza-17,20-dien-7-amina, (16Z,19Z)-N,N-dimetilpentakoza-16,19-dien-6-amina, (22Z,25Z)-N,N-dimetilhentriakonta-22,25-dien-10-amina, (21Z,24Z)-N,N-dimetiltriakonta-21,24-dien-9-amina, (18Z)-N,N-dimetilheptakos-18-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilheksakos-17-en-9-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimetiloktakoza-19,22-dien-7-amina, N,N-dimetilheptakoza-10-amina, (20Z,23Z)-N-etil-N-metilnonakoza-20,23-dien-10-amina, 1-[(11Z,14Z)-1-nonilikoza-11,14-dien-1-il] pirolidina, (20Z)-N,N-dimetilheptakos-20-en-10-amina, (15Z)-N,N-dimetileptakos-15-en-10-amina, (14Z)-N,N-dimetilnonakos-14-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilnonakos-17-en-10-amina, (24Z)-N,N-dimetiltritriakont-24-en-10-amina, (20Z)-N,N-dimetilnonakos-20-en-1 0-amina, (22Z)-N,N-dimetilhentriakont-22-en-10-amina, (16Z)-N,N-dimetilpentakos-16-en-8-amina, (12Z,15Z)-N,N-dimetil-2-nonilhenikoza-12,15-dien-1-amina, (13Z,16Z)-N,N-dimetil-3-nonildokoza-13,16-dien-1-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-oktilciklopropil] eptadekan-8-amina, 1-[(1S,2R)-2-heksilciklopropil]-N,N-dimetilnonadekan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-oktilciklopropil]nonadekan-10-amina, N,N-dimetil-21-[(1S,2R)-2-oktilciklopropil]henikozan-10-amina,N,N-dimeti]-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciklopropil)metil}ciklopropil]nonadekan-10-amina,N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2oktilciklopropil]heksadekan-8-amina, N,N-dimetil-[(1R,2S)-2-undecilciklopropil]tetradekan-5-amina, N,N-dimetil-3-{7-[(1S,2R)-2-oktilciklopropil]heplil}dodekan-1-amina, 1-[(1R)2S)-2-heptilciklopropil]-N,N-dimetiloktadekan-9-amina, 1-[(1S,2R)-2-decilciklopropil]-N,N-dimetilpentadekan-6-amina, N,N-dimeti)-1-[(1S,2R)-2-oktilciklopropil]pentadekan-8-amina, R-N,N-dimetil(-1-[(9Z, 12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-3-(oktiloksi)propan-2-amina, S-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-3-(oktiloksi)propan-2-amina, 1-{2-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-1-[(oktiloksi)metil]etil}pirolidina, (2S)-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-3-[(5Z)-okt-5-en-1-iloksi]propan-2-amina, 1-{2-[(9Z,12Z)-oktadeka-9, 12-dien-1-iloksi]-1-[(oktiloksi)metil]etil}azetidina, (2S)-1-(heksiloksi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, (2S)-1-(heptiloksi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(noniloksi)-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-[(9Z)-oktadek-9-en-1-itoksi]-3-(oktitoksi)propan-2-amina; (2S)-N,N-dimetil-1-[(6Z,9Z,12Z)-oktadeka-6,9,12-trien-1-iloksi]-3-(oktiloksi)propan-2-amina, (2S)-1-[(11Z,14Z)-ikoza-11,14-dien-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(pentiloksi)propan-2-amina, (2S)-1-(heksiloksi)-3-[(11Z,14Z)-ikoza-11,14-dien-1-iloksi]-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(11Z,14Z)-ikoza-11,14-dien-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(oktiloksi)propan-2-amina, 1-[(13Z,16Z)-dokoza-13,16-dien-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(oktiloksi)propan-2-amina, (2S)-1-[(13Z,16Z)-dokoza-13,16-dien-1-iloksi]-3-(heksiloksi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, (2S)-1-[(13Z)-dokos-13-en-1-iloksi]-3-(heksiloksi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(13Z)-dokos-13-en-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(oktiloksi)propan-2-amina, 1-[(9Z)-heksadek-9-en-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(oktiloksi)propan-2-amina, (2R)-N,N-dimetil-H(1-metoiloktil)oksi]-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propon-2-amina, (2R)-1-[(3,7-dimetiloktil)oksi]-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(oktiloksi)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciklopropil]metil}ciklopropil]oktil}oksi)propan-2-amina, N,N-dimetil-1-{[8-(2-oktilciklopropil)okti)]oksi}-3-(oktitoksi)propan-2-amina i (11E,20Z,23Z)-N,N-dimetilnonakoza-11,20,2-trien-10-amina ili njihove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomera. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0241] Dopunski primeri katjonskih lipida uključuju sledeće:
[0242] U jednom primeru izvođenja, lipid može biti lipid koji se može isecati, kao što su oni koji su opisani u Međunarodnoj publikaciji br. WO2012170889. U sledećem primeru izvođenja, lipid može biti katjonski lipid kao što je, ali nije ograničen na, Formulu (1) iz S.A.D. patentne prijave br. US20130064894. U jednom primeru izvođenja, katjonski lipid može biti sintetisan postupcima koji su poznati u struci i/ili kao što je opisano u Međunarodnoj publikaciji br. WO2013086354. U sledećem primeru izvođenja, katjonski lipid može biti trialkil katjonski lipid. Neograničavajući primeri trialkil katjonskih lipida i postupci pravljenja i upotrebljavanja trialkil katjonskih lipida opisani su u Međunarodnoj patentnoj publikaciji br. WO2013126803.
[0243] U nekim primerima izvođenja, dopunski lipidi mogu da sadrže jedinjenje Formule (X):
ili njegovu so ili izomer, pri čemu:
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-30alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR'', -YR'', i -R''M'R'; R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR'', -YR", i -R<∗>OR'', ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, -CQ(R)2, i nesupstituisanog C1-6alkila, gde je Q odabran od karbocikla, heterocikla, -OR, -O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -N(R)2, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, i -C(R)N(R)2C(O)OR, i svaki n je nezavisno odabran od 1, 2, 3, 4, i 5; svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
R8je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla i heterocikla;
1
R9je odabran iz grupe koja se sastoji od H, CN, NO2, C1-6alkila, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, C2-6alkenila, C3-6karbocikla i heterocikla;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR'', -YR'', i H;
svaki R'' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabran od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13.
[0244] U nekim primerima izvođenja, podskup jedinjenja Formule (X) uključuje ona u kojima kada je R4-(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR ili -CQ(R)2, tada (i) Q nije -N(R)2kada je n 1, 2, 3, 4, ili 5, ili (ii) Q nije 5, 6, ili 7-člani heterocikloalkil kada je n 1 ili 2.
[0245] U nekim primerima izvođenja, sledeći podskup jedinjenja Formule (X) uključuje ona u kojima
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-30alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR'', -YR'', i -R''M'R'; R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR'', -YR", i -R<∗>OR'', ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla, -(CH2)nQ,
-(CH2)nCHQR,
-CHQR, -CQ(R)2, i nesupstituisanog C1-6alkila, gde je Q odabran od C3-6karbocikla, 5- do 14-članog heteroarila koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S, -OR,
-O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8, -O(CH2)nOR, -N(R)C(-NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)N(R)2, -C(=NR9)R,
-C(O)N(R)OR, i 5- do 14-članog heterocikloalkila koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S koji je supstituisan sa jednim ili više supstituenata koji
2
su odabrani od okso (=O), OH, amino, mono- ili di-alkilamino, i C1-3alkila, i svaki n je nezavisno odabran od 1, 2, 3, 4, i 5;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
R8je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla i heterocikla;
R9je odabran iz grupe koja se sastoji od H, CN, NO2, C1-6alkila, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, C2-6alkenila, C3-6karbocikla i heterocikla;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR'', -YR'', i H;
svaki R'' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabran od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihovih soli ili izomera.
[0246] U nekim primerima izvođenja, sledeći podskup jedinjenja Formule (X) uključuje ona u kojima
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-30alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR'', -YR'', i -R''M'R'; R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR'', -YR", i -R<∗>OR'', ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR,
-CHQR, -CQ(R)2, i nesupstituisanog C1-6alkila, gde je Q odabran od C3-6karbocikla, 5- do 14-članog heterocikla koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S, -OR,
-O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8,
-O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, -N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2, -N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, i
-C(=NR9)N(R)2, i svaki n je nezavisno odabran od 1, 2, 3, 4, i 5; i kada je Q 5- do 14-člani heterocikl i (i) R4je -(CH2)nQ u kome je n 1 ili 2, ili (ii) R4je -(CH2)nCHQR u kome je n 1, ili (iii) R4je -CHQR, i -CQ(R)2, tada je Q ili 5- do 14-člani heteroaril ili 8- do 14-člani heterocikloalkil;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
R8je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla i heterocikla;
R9je odabran iz grupe koja se sastoji od H, CN, NO2, C1-6alkila, -OR, -S(O)2R, -S(O)2N(R)2, C2-6alkenila, C3-6karbocikla i heterocikla;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR'', -YR'', i H;
svaki R'' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabran od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihovih soli ili izomera.
[0247] U nekim primerima izvođenja, sledeći podskup jedinjenja Formule (X) uključuje ona u kojima
4
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-30alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR'', -YR'', i -R''M'R'; R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, C2-14alkenila, -R∗ YR'', -YR", i -R<∗>OR'', ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla, -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR,
-CHQR, -CQ(R)2, i nesupstituisanog C1-6alkila, gde je Q odabran od C3-6karbocikla, 5- do 14-članog heteroarila koji ima jedan ili više heteroatoma koji su odabrani od N, O, i S, -OR,
-O(CH2)nN(R)2, -C(O)OR, -OC(O)R, -CX3, -CX2H, -CXH2, -CN, -C(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(R)C(S)N(R)2, -CRN(R)2C(O)OR, -N(R)R8,
-O(CH2)nOR, -N(R)C(=NR9)N(R)2, -N(R)C(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR,
-N(OR)C(O)R, -N(OR)S(O)2R, -N(OR)C(O)OR, -N(OR)C(O)N(R)2, -N(OR)C(S)N(R)2,
-N(OR)C(=NR9)N(R)2, -N(OR)C(=CHR9)N(R)2, -C(=NR9)R, -C(O)N(R)OR, i -C(=NR9)N(R)2, i svaki n je nezavisno odabran od 1, 2, 3, 4, i 5;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-,
-N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
R8je odabran iz grupe koja se sastoji od C3-6karbocikla i heterocikla;
R9je odabran iz grupe koja se sastoji od H, CN, NO2, C1-6alkila, -OR, -S(O)2R, -S(O)3N(R)2, C2-6alkenila, C3-6karbocikla i heterocikla;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR'', -YR'', i H;
svaki R'' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabran od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihovih soli ili izomera.
[0248] U nekim primerima izvođenja, sledeći podskup jedinjenja Formule (X) uključuje ona u kojima
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-30alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR'', -YR'', i -R''M'R'; R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C2-14alkila, C2-14alkenila, -R∗ YR'', -YR", i -R<∗>OR'', ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4je -(CH2)nQ ili -(CH2)nCHQR, gde je Q -N(R)2, i n je odabran od 3, 4, i 5;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR'', -YR'', i H;
svaki R'' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C1-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabran od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihovih soli ili izomera.
[0249] U nekim primerima izvođenja, sledeći podskup jedinjenja Formule (X) uključuje ona u kojima
R1je odabran iz grupe koja se sastoji od C5-30alkila, C5-20alkenila, -R<∗>YR'', -YR'', i -R''M'R'; R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od C1-14alkila, C2-14alkenila, -R<∗>YR'', -YR'', i -R<∗>OR'', ili R2i R3, zajedno sa atomom za koji su prikačeni, formiraju heterocikl ili karbocikl;
R4je odabran iz grupe koja se sastoji od -(CH2)nQ, -(CH2)nCHQR, -CHQR, i -CQ(R)2, gde je Q -N(R)2, i n je odabran od 1, 2, 3, 4, i 5;
svaki R5je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R6je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -N(R')C(O)-, -C(O)-, -C(S)-, -C(S)S-, -SC(S)-, -CH(OH)-, -P(O)(OR')O-, -S(O)2-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe;
R7je odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H;
svaki R je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-3alkila, C2-3alkenila, i H; svaki R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-18alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR'', -YR'', i H;
svaki R'' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; svaki R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C1-12alkenila; svaki Y je nezavisno C3-6karbocikl;
svaki X je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od F, Cl, Br, i I; i
m je odabran od 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, i 13,
ili njihovih soli ili izomera.
[0250] U nekim primerima izvođenja, podskup jedinjenja Formule (X) uključuje ona Formule (XA):
ili njihovu so ili izomer, pri čemu je | odabrano od 1, 2, 3, 4, i 5; m je odabrano od 5, 6, 7, 8, i 9; M1je veza ili M'; R4je nesupstituisani C1-3alkil, ili -(CH2)nQ, u kome je Q OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroaril ili heterocikloalkil; M i M' su nezavisno odabrani od C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe; i R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, i C2-14alkenila.
[0251] U nekim primerima izvođenja, podskup jedinjenja Formule (X) uključuje ona Formule (XI):
(II) ili njihovu so ili izomer, pri čemu je | odabran od 1, 2, 3, 4, i 5; M1je veza ili M'; R4je nesupstituisani C1-3alkil, ili -(CH2)nQ, u kome je n 2, 3, ili 4, i Q je OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, -NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroaril ili heterocikloalkil; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe; i R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, i C2-14alkenila.
[0252] U nekim primerima izvođenja, podskup jedinjenja Formule (X) uključuje ona Formule (XIa), (XIb), (XIc), ili (XIe):
ili
ili njihovu so ili izomer, pri čemu je R4kao što je ovde opisano.
[0253] U nekim primerima izvođenja, podskup jedinjenja Formule (X) uključuje ona Formule (XId):
ili njihovu so ili izomer, pri čemu je n 2, 3, ili 4; i m, R', R'', i R2do R6su kao što je ovde opisano. Na primer, svaki od R2i R3može biti nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C5-14alkila i C5-14alkenila.
[0254] U nekim primerima izvođenja, podskup jedinjenja Formule (X) uključuje ona Formule (XIa), (XIb), (XIc), ili (XIe):
ili njihovu so ili izomer, pri čemu je R4kao što je ovde opisano.
[0255] U nekim primerima izvođenja, podskup jedinjenja Formule (X) uključuje ona Formule (XId):
ili njihovu so ili izomer, pri čemu je n 2, 3, ili 4; i m, R', R'', i R2do R6su kao što je ovde opisano. Na primer, svaki od R2i R3može biti nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C5-14alkila i C5-14alkenila.
[0256] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (X) je odabrano iz grupe koja se sastoji od:
�
�
�
[0257] U dodatnim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (X) je odabrano iz grupe koja se sastoji od:
1
[0258] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (X) je odabrano iz grupe koja se sastoji od:
1 1
��
�
��
�
�
�
�
�
11
11
11
11
11
11
11
��
��
��
��
i njihovih soli i izomera.
[0259] U nekim primerima izvođenja, nanočestica sadrži sledeće jedinjenje:
12
ili njegove soli i izomere.
[0260] U nekim primerima izvođenja, objavu odlikuje kompozicija nanočestica koja uključuje lipidnu komponentu koja sadrži jedinjenje kao što je ovde opisano (npr. jedinjenje u skladu sa Formulom (X), (XA), (XI), (XIa), (XIb), (XIc), (XId) ili (XIe)).
Nekatjonski lipidi, uključujući nekatjonske pomoćne lipide
[0261] Lipidna komponenta nanočestice može uključivati bilo koji neutralni i/ili nekatjonski lipid (npr. lipide koji su neutralni ili nekatjonski lipid pri fiziološkoj pH). Nekatjonski lipidi mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, masne kiseline, glicerolipide, i prenol lipide. U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipid je masna kiselina. Masna kiselina može biti zasićena ili nezasićena. Primeri nezasićenih masnih kiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, miristoleinsku kiselinu, palmitoleinsku kiselinu, sapiensku kiselinu, oleinsku kiselinu, elaidinsku kiselinu, vakcensku kiselinu, linolnu kiselinu, linoelaidinsku kiselinu, alfa-linoelaidinsku kiselinu, arahidonsku kiselinu, eikozapentaenoinsku kiselinu, erukinsku kiselinu, doksaheksanoinsku kiselinu, ili bilo koji njihov cis/trans izomer sa dvostrukom vezom. U određenim primerima izvođenja, lipid je oleinska kiselina. U određenim primerima izvođenja, lipid je izomer oleinske kiseline (npr. dvostruka veza je na različitoj lokaciji duž alifatičnog lanca u odnosu na oleinsku kiselinu). U određenim primerima izvođenja, lipid je analog oleinske kiseline (npr. alifatični lanac je 1-10 ugljenika duži ili 1-10 ugljenika kraći od alifatičnog lanca oleinske kiseline). Primeri zasićenih masnih kiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, kaprilnu kiselinu, kaprinsku kiselinu, laurinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, arahidnu kiselinu, behensku kiselinu, lignocerinsku kiselinu, i kerotinsku kiselinu. U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipid je glicinski derivat masne kiseline (npr. N-palitoilglicin ili N-oleoglicin). U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipid je glicerolipid (npr. monoglicerid, diglicerid, triglicerid). U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipid je monoglicerid. U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipid je diglicerid. U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipid je triglicerid. U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipid sadrži funkcionalnu grupu šećera (npr. saharid, disaharid, polisaharid). Primeri nekatjonskih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće:
12
��
�
[0262] Primeri nekatjonskih lipida koji sadrže šećere uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće:
1 1
Cviterjonski nekatjonski lipidi
[0263] U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipidi korisni u predmetnom pronalasku su DSPC analozi u kojima je fosfoholinska funkcionalna grupa zamenjena sa različitom cviterjonskom grupom.
[0264] DSPC ima sledeću strukturu:
[0265] Zamena sa različitom cviterjonskom grupom je oslikana na SL.73.
1 2
[0266] U određenim primerima izvođenja, različita cviterjonska grupa nije fosfoholinska grupa. U određenim primerima izvođenja, nekatjonski lipid koristan u predmetnom pronalasku je jedinjenje Formule (II). Ovde su obezbeđena jedinjenja Formule (II):
ili njihove soli, pri čemu:
Z je cviterjonska funkcionalna grupa,
pri čemu cviterjonska funkcionalna grupa nije formule:
m je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10;
[0267] A je formule:
svaka instanca L<2>je nezavisno veza ili opciono supstituisani C1-6alkilen, pri čemu je jedna metilenska jedinica opciono supstituisanog C1-6alkilena opciono zamenjena sa -O-, -N(R<N>)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, ili -NR<N>C(O)N(R<N>)-;
svaka instanca R2je nezavisno opciono supstituisani C1-30alkil, opciono supstituisani C1-30alkenil, ili opciono supstituisani C1-30alkinil; opciono pri čemu su jedna ili više metilenskih jedinica R2nezavisno zamenjene sa opciono supstituisanim karbociklilenom, opciono supstituisanim heterociklilenom, opciono supstituisanim arilenom, opciono supstituisanim
1
heteroarilenom, -N(R<N>)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -NR<N>C(O)N(R<N>)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR<N>)-, -C(=NR<N>)N(R<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)N(R<N>)-, -C(S)-, -C(S)N(R<N>)-, -NR<N>C(S)-, -NR<N>C(S)N(R<N>)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(R<N>)S(O)-, -S(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)N(R<N>)-, -OS(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)O-, -S(O)2-, -N(R<N>)S(O)2-, -S(O)2N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)2N(R<N>)-, -OS(O)2N(R<N>)-, ili -N(R<N>)S(O)2O-;
svaka instanca R<N>je nezavisno vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa azota; Prsten B je opciono supstituisani karbociklil, opciono supstituisani heterociklil, opciono supstituisani aril, ili opciono supstituisani heteroaril; i
p je 1 ili 2.
[0268] U određenim primerima izvođenja, Z je amino-kiselina ili njen derivat. U određenim primerima izvođenja, Z je jedne od sledećih formula:
pri čemu je R<O>vodonik, opciono supstituisani alkil ili zaštitna grupa kiseonika. U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (II) je jedne od sledećih formula:
1 4
ili njihova so.
[0269] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (II) je jedne od sledećih formula:
1
ili njihova so.
[0270] Na primer, u određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (II) je jedno od sledećih:
1
�
ili njihove soli.
Analozi oleinske kiseline
[0271] Kao što je ovde opisano, nekatjonski lipidi korisni u predmetnom pronalasku uključuju analoge oleinske kiseline. Kao što je ovde opisano, analog oleinske kiseline može da sadrži modifikovani rep oleinske kiseline, modifikovanu funkcionalnu grupu karboksilne kiseline, ili oba. U određenim primerima izvođenja, analog oleinske kiseline je jedinjenje Formule (IV). Ovde su obezbeđena jedinjenja Formule (IV):
ili njihova so, pri čemu:
R<4>je opciono supstituisan, C10-40alkil; opciono supstituisan, C10-40alkenil; opciono supstituisan, C10-40alkinil; pri čemu je najmanje jedna metilenska grupa R<4>nezavisno zamenjena sa opciono supstituisanim karbociklilenom, opciono supstituisanim
1
heterociklilenom, opciono supstituisanim arilenom, opciono supstituisanim heteroarilenom, -N(R<N>)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -NR<N>C(O)N(R<N>)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR<N>)-, -C(=NR<N>)N(R<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)N(R<N>)-, -C(S)-, -C(S)N(R<N>)-, -NR<N>C(S)-, -NR<N>C(S)N(R<N>)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(R<N>)S(O)-, -S(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)N(R<N>)-, -OS(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)O-, -S(O)2-, -N(R<N>)S(O)2-, -S(O)2N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)2N(R<N>)-, -OS(O)2N(R<N>)-, ili -N(R<N>)S(O)2O-; i
svaka instanca R<N>je nezavisno vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa azota.
[0272] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (IV) je jedno od sledećih:
ili njihove soli.
1
[0273] U određenim primerima izvođenja, analog oleinske kiseline je jedinjenje u kome je funkcionalna grupa karboksilne kiseline oleinske kiseline zamenjena različitom grupom. U određenim primerima izvođenja, analog oleinske kiseline koristan u predmetnom pronalasku je jedan od sledećih:
14
ili njihove soli.
[0274] U određenim primerima izvođenja, analog oleinske kiseline koristan u predmetnom pronalasku je:
PEGilovani lipidi
[0275] Lipidna komponenta kompozicije nanočestica može uključivati jedan ili više PEG ili PEG-modifikovanih lipida. Takve vrste mogu se naizmenično označavati kao PEGilovani lipidi. PEG lipid je lipid modifikovan sa polietilen glikolom. PEG lipid može biti odabran iz neograničavajuće grupe koja se sastoji od PEG-modifikovanih fosfatidiletanolamina, PEG-modifikovanih fosfatidinskih kiselina, PEG-modifikovanih ceramida, PEG-modifikovanih dialkilamina, PEG-modifikovanih diacilglicerola, PEG-modifikovanih dialkilglicerola, i njihovih smeša. Na primer, PEG lipid može biti PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, ili PEG-DSPE lipid.
[0276] U nekim primerima izvođenja PEG-modifikovani lipidi su modifikovani oblik PEG DMG. PEG-DMG ima sledeću strukturu:
[0277] U jednom primeru izvođenja, PEG lipidi korisni u predmetnoj objavi mogu biti PEGilovani lipidi koji su opisani u Međunarodnoj publikaciji br. WO2012099755. Bilo koji od ovih primera PEG lipida koji su ovde opisani može biti modifikovan da sadrži hidroksilnu grupu na PEG lancu. U određenim primerima izvođenja, PEG lipid je PEG-OH lipid. Kao što je ovde generalno definisano, "PEG-OH lipid" (koji se ovde takođe označava kao "hidroksi-PEGilovani lipid") je PEGilovani lipid koji ima jednu ili više hidroksilnih (-OH) grupa na lipidu. U određenim primerima izvođenja, PEG-OH lipid uključuje jednu ili više hidroksilnih grupa na PEG lancu. U određenim primerima izvođenja, PEG-OH ili hidroksi-PEGilovani lipid sadrži -OH grupu na terminusu PEG lanca.
PEG i PEG-OH lipidi
[0278] U određenim primerima izvođenja, PEG lipid koristan u predmetnoj objavi je jedinjenje Formule (III). Ovde su obezbeđena jedinjenja Formule (III):
ili njihove soli, pri čemu:
R3je -OR<O>;
R<O>je vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa kiseonika;
r je ceo broj između 1 i 100, uključujući;
L<1>je opciono supstituisani C1-10alkilen, pri čemu je najmanje jedan metilen opciono supstituisanog C1-10alkilena nezavisno zamenjen sa opciono supstituisanim karbociklilenom, opciono supstituisanim heterociklilenom, opciono supstituisanim arilenom, opciono supstituisanim heteroarilenom, -O-, -N(R<N>)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, ili -NR<N>C(O)N(R<N>)-;
D je funkcionalna grupa dobijena klik hemijom ili funkcionalna grupa koji se može isecati pod fiziološkim uslovima;
m je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10;
A je formule:
svaka instanca L<2>je nezavisno veza ili opciono supstituisani C1-6alkilen, pri čemu je jedna metilenska jedinica opciono supstituisanog C1-6alkilena opciono zamenjena sa O, N(R<N>)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, ili -NR<N>C(O)N(R<N>)-;
svaka instanca R2je nezavisno opciono supstituisani C1-30alkil, opciono supstituisani C1-30alkenil, ili opciono supstituisani C1-30alkinil; opciono pri čemu su jedna ili više metilenskih jedinica R<2>nezavisno zamenjene sa opciono supstituisanim karbociklilenom, opciono supstituisanim heterociklilenom, opciono supstituisanim arilenom, opciono supstituisanim heteroarilenom, -N(R<N>)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -NR<N>C(O)N(RN)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR<N>)-, -C(=NR<N>)N(R<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)N(R<N>)-, -C(S)-, -C(S)N(R<N>)-, -NR<N>C(S)-, -NR<N>C(S)N(R<N>)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(R<N>)S(O)-, -S(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)N(R<N>)-, -OS(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)O-, -S(O)2-, -N(R<N>)S(O)2-, -S(O)2N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)2N(R<N>)-, -OS(O)2N(R<N>)-, ili -N(R<N>)S(O)2O-;
svaka instanca R<N>je nezavisno vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa azota; Prsten B je opciono supstituisani karbociklil, opciono supstituisani heterociklil, opciono supstituisani aril, ili opciono supstituisani heteroaril; i
p je 1 ili 2.
[0279] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je PEG-OH lipid (tj. R<3>je -OR<O>, i R<O>je vodonik). U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je Formule (III-OH):
ili njegova so.
14
[0280] U određenim primerima izvođenja, D je funkcionalna grupa dobijena klik hemijom (npr. triazol). U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je Formule (III-a-1) ili (III-a-2):
ili njihova so.
[0281] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so, pri čemu
s je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.9, ili 10.
[0282] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0283] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0284] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
14
ili njihova so.
[0285] U određenim primerima izvođenja, D je funkcionalna grupa koji se može isecati pod fiziološkim uslovima (npr. estar, amid, karbonat, karbamat, urea). U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je Formule (III-b-1) ili (III-b-2):
ili njihova so.
[0286] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je Formule (III-b-1-OH) ili (III-b-2-OH):
14
ili njihova so.
[0287] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0288] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0289] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
14
ili njihova so.
[0290] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (III) je jedne od sledećih formula:
ili njihove soli.
[0291] U određenim primerima izvođenja, PEG lipid koristan u predmetnoj objavi je PEGilovana masna kiselina. U određenim primerima izvođenja, PEG lipid koristan u predmetnoj objavi je jedinjenje Formule (V). Ovde su obezbeđena jedinjenja Formule (V):
ili njihove soli, pri čemu:
14
R<3>je -OR<O>;
R<O>je vodonik, opciono supstituisani alkil ili zaštitna grupa kiseonika;
r je ceo broj između 1 i 100, uključujući;
R<5>je opciono supstituisani C10-40alkil, opciono supstituisani C10-40alkenil, ili opciono supstituisani C10-40alkinil; i opciono jedna ili više metilenskih grupa R<5>su zamenjene sa opciono supstituisanim karbociklilenom, opciono supstituisanim heterociklilenom, opciono supstituisanim arilenom, opciono supstituisanim heteroarilenom, -N(R<N>)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -NR<N>C(O)N(R<N>)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR<N>)-, -C(=NR<N>)N(R<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)N(R<N>)-, -C(S)-, -C(S)N(R<N>)-, -NR<N>C(S)-, -NR<N>C(S)N(R<N>)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(R<N>)S(O)-, -S(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)N(R<N>)-, -OS(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)O-, -S(O)2-, -N(R<N>)S(O)2-, -S(O)2N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)2N(R<N>)-, -OS(O)2N(R<N>)-, ili -N(R<N>)S(O)2O-; i
svaka instanca R<N>je nezavisno vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa azota.
[0292] U primerima izvođenja pronalaska, jedinjenje Formule (V) je Formule (V-OH):
ili njegova so.
[0293] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (V) je jedne od sledećih formula:
14
ili njihova so.
[0294] Brojne LNP formulacije koje imaju različite PEG-lipide su pripremljene i testirane za aktivnost, kao što je demonstrirano u Primerima uključenim u nastavku.
Fosfolipidi, uključujući pomoćne fosfolipide
[0295] Fosfolipidi, kao što je ovde definisano, su bilo koji lipidi koji sadrže fosfatnu grupu. Fosfolipidi su podskup nekatjonskih lipida. Lipidna komponenta kompozicije nanočestica može uključivati jedan ili više fosfolipida, kao što je jedan ili više (poli)nezasićenih lipida. Fosfolipidi se mogu asemblirati u jedan ili više lipidnih dvoslojeva. Generalno, fosfolipidi mogu uključivati fosfolipidnu funkcionalnu grupu i jednu ili više funkcionalnih grupa masne kiseline. Fosfolipidna funkcionalna grupa može biti odabrana iz neograničavajuće grupe koja se sastoji od fosfatidil holina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil glicerola, fosfatidil serina, fosfatidinske kiseline, 2-lizofosfatidil foholina, i sfingomijelina. Funkcionalna grupa masne kiseline može biti odabrana iz neograničavajuće grupe koja se sastoji od laurinske kiseline, miristinske kiseline, miristoleinske
1
kiseline, palmitinske kiseline, palmitoleinske kiseline, stearinske kiseline, oleinske kiseline, linolne kiseline, alfa-linolenske kiseline, erukinske kiseline, fitanske kiseline, arahidne kiseline, arahidonske kiseline, eikozapenatenoinske kiseline, behenske kiseline, dokozapentaenoinske kiseline, i dokozaheksaenoinske kiseline. Ne-prirodne vrste uključujući prirodne vrste sa modifikacijama i supstitucijama uključujući grananje, oksidaciju, ciklizaciju, i alkine su takođe razmatrane. Na primer, fosfolipid može biti funkcionalizovan sa ili umrežen sa jednim ili više alkina (npr. alkenil grupa u kojoj je jedna ili više dvostrukih veza zamenjeno trostrukom vezom). Pod odgovarajućim reakcionim uslovima, alkin grupa može biti podvrgnuta cikloadiciji katalizovanoj bakrom nakon izlaganja azidu. Takve reakcije mogu biti korisne u funkcionalizaciji lipidnog dvosloja kompozicije nanočestica kako bi se olakšala membranska permeacija ili ćelijsko prepoznavanje ili u konjugovanju kompozicije nanočestica za korisne komponente kao što je funkcionalna grupa za ciljno delovanje ili snimanje (npr. boja). Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0296] Fosfolipidi korisni u kompozicijama i postupcima mogu biti odabrani iz neograničavajuće grupe koja se sastoji od 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholina (DSPC), 1,2-diolkoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoholina (DLPC), 1,2-dimirisloil-snglicero-fosfoholina (DMPC), 1,2 dioleoil-sn-gliero-3-fosfoholina (DOPC), 1,2-dipalmitoil-snglicero-3-fosfoholina (DPPC), 1,2-diundekanoil-sn-glicero-fosfoholina (DUPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholina (POPC), 1,2-di-O-oktadecenil-sn-glicero-3-fosfoholina (18:0 Dieter PC), 1-oleoil-2-holesterilhemisukcinoil-sn-glicero-3-fosfoholina (OChemsPC), 1-heksadecil-sn-glicero-3-fosfoholina (C16 Lyso PC), 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoholina, 1,2-diarahidonoil-sn-glicero-3-fosfoholina, 1,2-didokozaheksaenoil-sn-glicero-3-fosfoholina, 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (ME 16.0 PE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-diarahidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-didokozaheksaenoil-snglicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fos-fo-rak-(1-glicerol) natrijumova so (DOPG), i sfingomijelin. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0297] U nekim primerima izvođenja, kompozicija nanočestica uključuje DSPC. U određenim primerima izvođenja, kompozicija nanočestica uključuje DOPE. U nekim primerima izvođenja, kompozicija nanočestica uključuje i DSPC i DOPE. Primeri fosfolipida uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće:
1 1
��
[0298] U određenim primerima izvođenja, fosfolipid koristan u predmetnom pronalasku je analog ili varijanta DSPC. U određenim primerima izvođenja, fosfolipid koristan u predmetnom pronalasku je jedinjenje Formule (I):
1
ili njegova so, pri čemu:
svaki R<1>je nezavisno opciono supstituisani alkil; ili opciono dva R<1>su spojena zajedno sa posredujućim atomima da formiraju opciono supstituisani monociklični karbociklil ili opciono supstituisani monociklični heterociklil; ili opciono tri R<1>su spojena zajedno sa posredujućim atomima da formiraju opciono supstituisani biciklični karbociklil ili opciono supstituisani biciklični heterociklil;
n je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10;
m je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10;
A je formule:
svaka instanca L<2>je nezavisno veza ili opciono supstituisani C1-6alkilen, pri čemu je jedna metilenska jedinica opciono supstituisanog C1-6alkilena opciono zamenjena sa -O-. -N(R<N>)-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, ili -NR<N>C(O)N(R<N>)-;
svaka instanca R<2>je nezavisno opciono supstituisani C1-30alkil, opciono supstituisani C1-30alkenil, ili opciono supstituisani C1-30alkinil; opciono pri čemu su jedna ili više metilenskih jedinica R<2>nezavisno zamenjene sa opciono supstituisanim karbociklilenom, opciono supstituisanim heterociklilenom, opciono supstituisanim arilenom, opciono supstituisanim heteroarilenom, -N(R<N>)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -NR<N>C(O)N(R<N>)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR<N>)-, -C(=NR<N>)N(R<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)N(R<N>)-, -C(S)-, -C(S)N(R<N>)-, -NR<N>C(S)-, -NR<N>C(S)N(R<N>)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(R<N>)S(O)-, -S(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)N(R<N>)-, -OS(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)O-,
1 4
-S(O)2-, -N(R<N>)S(O)2-, -S(O)2N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)2N(R<N>)-, -OS(O)2N(R<N>)-, ili -N(R<N>)S(O)2O-;
svaka instanca R<N>je nezavisno vodonik, opciono supstituisani alkil, ili zaštitna grupa azota; Prsten B je opciono supstituisani karbociklil, opciono supstituisani heterociklil, opciono supstituisani aril, ili opciono supstituisani heteroaril; i
p je 1 ili 2;
pod uslovom da jedinjenje nije formule:
pri čemu je svaka instanca R<2>nezavisno nesupstituisani alkil, nesupstituisani alkenil, ili nesupstituisani alkinil.
Modifikacije glave fosfolipida
[0299] U određenim primerima izvođenja, fosfolipid koristan u predmetnom pronalasku sadrži modifikovanu glavu fosfolipida (npr. modifikovanu grupu holina). U određenim primerima izvođenja, fosfolipid sa modifikovanom glavom je DSPC, ili njegov analog, sa modifikovanim kvaternarnim aminom. Na primer, u primerima izvođenja Formule (I), najmanje jedan od R<1>nije metil. U određenim primerima izvođenja, najmanje jedan od R<1>nije vodonik ili metil. U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I) je jedne od sledećih formula:
1
ili njegova so, pri čemu:
svako t je nezavisno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10;
svako u je nezavisno 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10; i
svako v je nezavisno 1, 2, ili 3.
[0300] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0301] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I) je jedno od sledećih:
1
�
ili njihova so.
Modifikacije jezgra fosfolipida
[0302] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I) je Formule (I-a):
ili njegova so.
[0303] U određenim primerima izvođenja, fosfolipidi korisni u predmetnom pronalasku sadrže modifikovano jezgro (videti, npr. SL. 47B). U određenim primerima izvođenja, fosfolipid sa modifikovanim jezgrom koji je ovde opisan je DSPC, ili njegov analog, sa modifikovanom
1
strukturom jezgra. Na primer, u određenim primerima izvođenja Formule (I-a), grupa A nije sledeće formule:
[0304] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I-a) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0305] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I) je jedno od sledećih:
1
ili njihove soli.
[0306] U određenim primerima izvođenja, fosfolipid koristan u predmetnom pronalasku sadrži cikličnu funkcionalnu grupu umesto gliceridne funkcionalne grupe. U određenim primerima izvođenja, fosfolipid koristan u predmetnom pronalasku je DSPC, ili njegov analog, sa cikličnom funkcionalnom grupom umesto gliceridne funkcionalne grupe. U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I) je Formule (I-b):
ili njegova so.
[0307] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I-b) je Formule (I-b-1):
1
ili njegova so, pri čemu:
w je 0, 1, 2, ili 3.
[0308] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I-b) je Formule (I-b-2):
ili njegova so.
[0309] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I-b) je Formule (I-b-3):
ili njegova so.
[0310] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I-b) je Formule (I-b-4):
ili njegova so.
[0311] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I-b) je jedno od sledećih:
1 1
ili njihove soli.
Modifikacije repa fosfolipida
[0312] U određenim primerima izvođenja, fosfolipid koristan u predmetnom pronalasku sadrži modifikovani rep. U određenim primerima izvođenja, fosfolipid koristan u predmetnom pronalasku je DSPC, ili njegov analog, sa modifikovanim repom. Kao što je ovde opisano, "modifikovani rep" može biti rep sa kraćim ili dužim alifatičnim lancima, alifatični lanci sa introdukovanim grananjem, alifatični lanci sa introdukovanim supstituentima, alifatični lanci u kojima je jedan ili više metilena zamenjeno cikličnim ili heteroatom grupama, ili bilo koja njihova kombinacija. Na primer, u određenim primerima izvođenja, jedinjenje (I) je Formule (I-a), ili njegova so, pri čemu je najmanje jedna instanca R<2>svaka instanca R<2>je opciono supstituisani C1-
30alkil, pri čemu su jedna ili više metilenskih jedinica R<2>nezavisno zamenjene sa opciono supstituisanim karbociklilenom, opciono supstituisanim heterociklilenom, opciono supstituisanim arilenom, opciono supstituisanim heteroarilenom, -N(R<N>)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)-, -NR<N>C(O)N(R<N>)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(C))N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR<N>)-, -C(-NR<N>)N(R<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>)N(R<N>)-, -C(S)-, -C(S)N(R<N>)-, -NR<N>C(S)-, -NR<N>C(S)N(R<N>)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(R<N>)S(O)-, -S(O)N(R<N>)-. -N(R<N>)S(O)N(R<N>)-, -OS(O)N(R<N>)-, N(R<N>)S(O)O-, -S(O)2-, -N(R<N>)S(O)2-, -S(O)2N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)2N(R<N>)-, -OS(O)2N(R<N>)-, ili -N(R<N>)S(O)2O-.
[0313] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I-a) je Formule (I-c):
1 2
ili njegova so, pri čemu:
svako x je nezavisno ceo broj između 0-30, uključujući; i
svaka instanca G je nezavisno odabrana iz grupe koja se sastoji od opciono supstituisanog karbociklilena, opciono supstituisanog heterociklilena, opciono supstituisanog arilena, opciono supstituisanog heteroarilena, -N(R<N>)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R<N>)-, - NR<N>C(O)-, -NR<N>C(O)N(R<N>)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -OC(O)O-, -OC(O)N(R<N>)-, -NR<N>C(O)O-, -C(O)S-, -SC(O)-, -C(=NR<N>)-, -C(=NR<N>)N(R<N>)-, -NR<N>C(=NR<N>}-, -NR<N>C(=NR<N>)N(R<N)>-, -C(S)-, -C(S)N(R<N>)-, -NR<N>C(S)-, -NR<N>C(S)N(R<N>)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O-, -OS(O)O-, -OS(O)2-, -S(O)2O-, -OS(O)2O-, -N(R<N>)S(O)-, -S(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)N(R<N>)-, -OS(O)N(R<N>)-, -N(R<N>)S(O)O-, -S(O)2-, -N(R<N>)S(O)2-, -S(O)2N(R<N>)-, N(R<N>)S(O)2N(R<N>)-, -OS(O)2N(R<N>)-, ili -N(R<N>)S(O)2O-. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0314] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I-c) je Formule (I-c-1):
ili njegova so, pri čemu:
svaka instanca v je nezavisno 1, 2, ili 3.
[0315] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I-c) je Formule (I-c-2):
1
ili njegova so.
[0316] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I-c) je sledeće formule:
ili njegova so.
[0317] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I-c) je sledeće:
ili njegova so.
[0318] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I-c) je Formule (I-c-3):
ili njegova so.
[0319] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I-c) je sledeće formule:
1 4
ili njegova so.
[0320] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I-c) je sledeće:
ili njegova so.
Modifikacije fosfoholin linkera
[0321] U određenim primerima izvođenja, fosfolipid koristan u predmetnom pronalasku sadrži modifikovanu funkcionalnu grupu fosfoholina, pri čemu alkil lanac koji povezuje kvaternarni amin sa fosforil grupom nije etilen (npr. n nije 2). Prema tome, u određenim primerima izvođenja, fosfolipid koristan u predmetnom pronalasku je jedinjenje Formule (I), pri čemu je n 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10. Na primer, u određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I) je jedne od sledećih formula:
ili njihova so.
[0322] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje Formule (I) je jedno od sledećih:
1
�
�
ili njihove soli.
[0323] Brojne LNP formulacije koje imaju fosfolipide koji nisu DSPC pripremljene su i testirane za aktivnost, kao što je demonstrirano u primerima u nastavku. Primeri fosfolipida su pokazani na Slikama, uključujući SL.75A, 75D i 75E.
[0324] Sledeća Tabela obezbeđuje sažetak fosfolipida i ukazuje koji primeri uključuju podatke o fosfolipidima.
1
1
Strukturni lipidi
[0325] Lipidna komponenta kompozicije nanočestica može uključivati jedan ili više strukturnih lipida. Inkorporacija strukturnih lipida u lipidne nanočestice može pomoći u ublažavanju agregacije drugih lipida u čestici. Strukturni lipidi se mogu odabrati iz grupe koja se sastoji od, ali nisu ograničeni na, holesterol, fekosterol, sitosterol, ergosterol, kampesterol, stigmasterol, brasikasterol, tomatidin, tomatin, ursolnu kiselinu, alfa-tokoferol, hopanoide, fitosterole, steroide, i njihove smeše. U nekim primerima izvođenja, strukturni lipid je sterol. Kao što je ovde definisano, "steroli" su podgrupa steroida koji se sastoje od steroidnih alkohola. U određenim primerima izvođenja, strukturni lipid je steroid. U određenim primerima izvođenja, strukturni lipid je holesterol. U određenim primerima izvođenja, strukturni lipid je analog holesterola. U određenim primerima izvođenja, strukturni lipid je alfa-tokoferol. Primeri strukturnih lipida uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće:
1
Hemijske definicije
[0326] Definicije specifičnih funkcionalnih grupa i hemijskih termina detaljnije su opisane u nastavku. Hemijski elementi su identifikovani u skladu sa periodnim sistemom elemenata, verzija CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75<th>Ed., unutrašnja korica, i specifične funkcionalne grupe su generalno definisane kao što je tamo opisano. Pored toga, opšti principi organske hemije, kao i specifične funkcionalne grupe i reaktivnost, opisani su u Organic Chemistry. Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; i Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987.
[0327] Jedinjenja koja su ovde opisana mogu da sadrže jedan ili više asimetričnih centara, i stoga mogu postojati u različitim stereoizomernim oblicima, npr. enantiomeri i/ili dijastereomeri. Na primer, jedinjenja koja su ovde opisana mogu biti u obliku pojedinačnog enantiomera, dijastereomera ili geometrijskog izomera, ili mogu biti u obliku smeše stereoizomera, uključujući racemske smeše i smeše obogaćene sa jednim ili više stereoizomera. Izomeri se mogu izolovati iz smeša postupcima koji su poznati onima sa iskustvom u struci, uključujući hiralnu tečnu
1 1
hromatografiju visokog pritiska (HPLC) i formiranje i kristalizaciju hiralnih soli; ili se poželjni izomeri mogu pripremiti asimetričnim sintezama. Videti, na primer, Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E.L. Stereochemistry of Karbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); i Wilen, S.H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p.268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972). Pronalazak dopunski obuhvata jedinjenja kao pojedinačne izomere suštinski bez drugih izomera, i alternativno, kao smeše različitih izomera.
[0328] U formuli, je jednostruka veza gde stereohemija funkcionalnih grupa koje su neposredno prikačene za nju nije specificirana, --- je odsutna ili je jednostruka veza, i ili je jednostruka ili dvostruka veza.
[0329] Osim ukoliko nije drugačije navedeno, strukture koje su ovde oslikane takođe su zamišljene da uključuju jedinjenja koja se razlikuju samo u prisustvu jednog ili više izotopski obogaćenih atoma. Na primer, jedinjenja koja imaju predmetnu strukturu osim zamene vodonika deuterijumom ili tricijumom, zamene<19>F sa<18>F, ili zamene<12>C sa<13>C ili<14>C su unutar obima objave. Takva jedinjenja su korisna, na primer, kao analitički alati ili probe u biološkim testovima.
[0330] Kada je naveden opseg vrednosti, namenjen je da obuhvata svaku vrednost i podopseg unutar opsega. Na primer, "C1-6alkil" je namenjen da obuhvata C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-3, i C5-6alkil.
[0331] Termin "alifatični" označava alkil, alkenil, alkinil, i karbociklične grupe. Slično, termin "heteroalifatični" označava heteroalkil, heteroalkenil, heteroalkinil, i heterociklične grupe.
[0332] Termin "alkil" označava radikal ravnolančane ili razgranate zasićene ugljovodonične grupe koji ima od 1 do 10 atoma ugljenika ("C1-10alkil"). U nekim primerima izvođenja, alkil grupa ima 1 do 9 atoma ugljenika ("C1-9alkil"). U nekim primerima izvođenja, alkil grupa ima 1 do 8 atoma ugljenika ("C1-8alkil"). U nekim primerima izvođenja, alkil grupa ima 1 do 7 atoma ugljenika ("C1-
7alkil"). U nekim primerima izvođenja, alkil grupa ima 1 do 6 atoma ugljenika ("C1-6alkil"). U nekim primerima izvođenja, alkil grupa ima 1 do 5 atoma ugljenika ("C1-5alkil"). U nekim primerima izvođenja, alkil grupa ima 1 do 4 atoma ugljenika ("C1-4alkil"). U nekim primerima izvođenja, alkil grupa ima 1 do 3 atoma ugljenika ("C1-3alkil"). U nekim primerima izvođenja, alkil grupa ima 1 do 2 atoma ugljenika ("C1-2alkil"). U nekim primerima izvođenja, alkil grupa ima 1 atom ugljenika ("C1alkil") U nekim primerima izvođenja, alkil grupa ima 2 do 6 atoma ugljenika ("C2-6alkil"). Primeri C1-6alkil grupa uključuju metil (C1), etil (C2), propil (C3) (npr. npropil, izopropil), butil (C4) (npr. n-butil, terc-butil, sek-butil, izo-butil), pentil (C5) (npr. n-pentil, 3-pentanil, amil, neopentil, 3-metil-2-butanil, tercijarni amil), i heksil (C6) (npr. n-heksil). Dopunski primeri alkil grupa uključuju n-heptil (C7), n-oktil (C8), i slično. Osim ukoliko nije drugačije specificirano, svaka instanca alkil grupe je nezavisno nesupstituisana ("nesupstituisani
1 2
alkil") ili supstituisana ("supstituisani alkil") sa jednim ili više supstituenata (npr. halogen, kao što je F). U određenim primerima izvođenja, alkil grupa je nesupstituisani C1-10alkil (kao što je nesupstituisani C1-6alkil, npr. -CH3(Me), nesupstituisani etil (Et), nesupstituisani propil (Pr, npr. nesupstituisani n-propil (n-Pr), nesupstituisani izopropil (i-Pr)), nesupstituisani butil (Bu, npr. nesupstituisani n-butil (n-Bu), nesupstituisani terc-butil (terc-Bu ili t-Bu), nesupstituisani sek-butil (sek-Bu), nesupstituisani izobutil (i-Bu)). U određenim primerima izvođenja, alkil grupa je supstituisani C1-10alkil (kao što je supstituisani C1-6alkil, npr. -CF3, Bn).
[0333] Termin "haloalkil" je supstituisana alkil grupa, pri čemu je jedan ili više atoma vodonika nezavisno zamenjeno halogenom, npr. fluoro, bromo, hloro, ili jodo. U nekim primerima izvođenja, haloalkil funkcionalna grupa ima 1 do 8 atoma ugljenika ("C1-8haloalkil"). U nekim primerima izvođenja, haloalkil funkcionalna grupa ima 1 do 6 atoma ugljenika ("C1-6haloalkil"). U nekim primerima izvođenja, haloalkil funkcionalna grupa ima 1 do 4 atoma ugljenika ("C1-4haloalkil"). U nekim primerima izvođenja, haloalkil funkcionalna grupa ima 1 do 3 atoma ugljenika ("C1-3haloalkil"). U nekim primerima izvođenja, haloalkil funkcionalna grupa ima 1 do 2 atoma ugljenika ("C1-2haloalkil"). Primeri haloalkil grupa uključuju -CHF2, -CH2F, -CF3, -CH2CF3, -CF2CF3, -CF2CF2CF3, -CCl3. -CFCl2, -CF2Cl, i slično.
[0334] Termin "heteroalkil" označava alkil grupu, koja dodatno uključuje najmanje jedan heteroatom (npr. 1, 2, 3, ili 4 heteroatoma) odabran od kiseonika, azota, ili sumpora unutar (tj. inseriran između susednih atoma ugljenika) i/ili postavljen na jednu ili više terminusnih pozicija roditeljskog lanca. U određenim primerima izvođenja, heteroalkil grupa označava zasićenu grupu koja ima od 1 do 10 atoma ugljenika i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC1-
10alkil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkil grupa je zasićena grupa koja ima 1 do 9 atoma ugljenika i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC1-9alkil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkil grupa je zasićena grupa koja ima 1 do 8 atoma ugljenika i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC1-8alkil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkil grupa je zasićena grupa koja ima 1 do 7 atoma ugljenika i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC1-7alkil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkil grupa je zasićena grupa koja ima 1 do 6 atoma ugljenika i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC1-
6alkil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkil grupa je zasićena grupa koja ima 1 do 5 atoma ugljenika i 1 ili 2 heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC1-5alkil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkil grupa je zasićena grupa koja ima 1 do 4 atoma ugljenika i 1 ili 2 heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC1-4alkil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkil grupa je zasićena grupa koja ima 1 do 3 atoma ugljenika i 1 heteroatom unutar roditeljskog lanca ("heteroC1-3alkil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkil grupa je zasićena grupa koja ima 1 do 2 atoma ugljenika i 1 heteroatom unutar roditeljskog lanca ("heteroC1-2alkil"). U nekim
1
primerima izvođenja, heteroalkil grupa je zasićena grupa koja ima 1 atom ugljenika i 1 heteroatom ("heteroC1alkil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkil grupa je zasićena grupa koja ima 2 do 6 atoma ugljenika i 1 ili 2 heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-6alkil"). Osim ukoliko nije drugačije specificirano, svaka instanca heteroalkil grupe je nezavisno nesupstituisana ("nesupstituisani heteroalkil") ili supstituisana ("supstituisani heteroalkil") sa jednim ili više supstituenata. U određenim primerima izvođenja, heteroalkil grupa je nesupstituisani heteroC1-10alkil. U određenim primerima izvođenja, heteroalkil grupa je supstituisani heteroC1-10alkil.
[0335] Termin "alkenil" označava radikal ravnolančane ili razgranate ugljovodonične grupe koja ima od 2 do 10 atoma ugljenika i jednu ili više ugljenik-ugljenik dvostrukih veza (npr.1, 2, 3, ili 4 dvostruke veze). U nekim primerima izvođenja, alkenil grupa ima 2 do 9 atoma ugljenika ("C2-
9alkenil"). U nekim primerima izvođenja, alkenil grupa ima 2 do 8 atoma ugljenika ("C2-8alkenil"). U nekim primerima izvođenja, alkenil grupa ima 2 do 7 atoma ugljenika ("C2-7alkenil"). U nekim primerima izvođenja, alkenil grupa ima 2 do 6 atoma ugljenika ("C2-6alkenil"). U nekim primerima izvođenja, alkenil grupa ima 2 do 5 atoma ugljenika ("C2-5alkenil"). U nekim primerima izvođenja, alkenil grupa ima 2 do 4 atoma ugljenika ("C2-4alkenil"). U nekim primerima izvođenja, alkenil grupa ima 2 do 3 atoma ugljenika ("C2-3alkenil"). U nekim primerima izvođenja, alkenil grupa ima 2 atoma ugljenika ("C2alkenil"). Jedna ili više ugljenikugljenik dvostrukih veza mogu biti unutrašnje (kao što je u 2-butenil) ili terminusne (kao što je u 1-butenil). Primeri C2-4alkenil grupa uključuju etenil (C2), 1-propenil (C3), 2-propenil (C3), 1-butenil (C4), 2-butenil (C4), butadienil (C4), i slično. Primeri C2-6alkenil grupa uključuju prethodno pomenute C2-4alkenil grupe kao i pentenil (C5), pentadienil (C8), heksenil (C6), i slično. Dopunski primeri alkenila uključuju heptenil (C7), oktenil (C8), oktatrienil (C8), i slično. Osim ukoliko nije drugačije specificirano, svaka instanca alkenil grupe je nezavisno nesupstituisana ("nesupstituisani alkenil") ili supstituisana ("supstituisani alkenil") sa jednim ili više supstituenata. U određenim primerima izvođenja, alkenil grupa je nesupstituisani C2-10alkenil. U određenim primerima izvođenja, alkenil grupa je supstituisani C2-10alkenil. U alkenil grupi, C=C dvostruka veza za koju stereohemija nije specificirana (npr. -CH=CHCH3ili
može biti (E)- ili (Z)-dvostruka veza.
[0336] Termin "heteroalkenil" označava alkenil grupu, koja dodatno uključuje najmanje jedan heteroatom (npr. 1, 2, 3, ili 4 heteroatoma) odabran od kiseonika, azota, ili sumpora unutar (tj. inseriran između susednih atoma ugljenika) i/ili postavljen na jednu ili više terminusnih pozicija
1 4
roditeljskog lanca. U određenim primerima izvođenja, heteroalkenil grupa označava grupu koja ima od 2 do 10 atoma ugljenika, najmanje jednu dvostruku vezu, i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-10alkenil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkenil grupa ima 2 do 9 atoma ugljenika, najmanje jednu dvostruku vezu, i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-9alkenil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkenil grupa ima 2 do 8 atoma ugljenika, najmanje jednu dvostruku vezu, i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-8alkenil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkenil grupa ima 2 do 7 atoma ugljenika, najmanje jednu dvostruku vezu, i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-7alkenil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkenil grupa ima 2 do 6 atoma ugljenika, najmanje jednu dvostruku vezu, i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-6alkenil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkenil grupa ima 2 do 5 atoma ugljenika, najmanje jednu dvostruku vezu, i 1 ili 2 heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-5alkenil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkenil grupa ima 2 do 4 atoma ugljenika, najmanje jednu dvostruku vezu, i 1 ili 2 heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-4alkenil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkenil grupa ima 2 do 3 atoma ugljenika, najmanje jednu dvostruku vezu, i 1 heteroatom unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-3alkenil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkenil grupa ima 2 do 6 atoma ugljenika, najmanje jednu dvostruku vezu, i 1 ili 2 heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-6alkenil"). Osim ukoliko nije drugačije specificirano, svaka instanca heteroalkenil grupe je nezavisno nesupstituisana ("nesupstituisani heteroalkenil") ili supstituisana ("supstituisani heteroalkenil") sa jednim ili više supstituenata. U određenim primerima izvođenja, heteroalkenil grupa je nesupstituisani heteroC2-10alkenil. U određenim primerima izvođenja, heteroalkenil grupa je supstituisani heteroC2-10alkenil.
[0337] Termin "alkinil" označava radikal ravnolančane ili razgranate ugljovodonične grupe koja ima od 2 do 10 atoma ugljenika i jednu ili više ugljenik-ugljenik trostrukih veza (npr.1, 2, 3, ili 4 trostruke veze) ("C2-10alkinil"). U nekim primerima izvođenja, alkinil grupa ima 2 do 9 atoma ugljenika ("C2-9alkinil"). U nekim primerima izvođenja, alkinil grupa ima 2 do 8 atoma ugljenika ("C2-8alkinil"). U nekim primerima izvođenja, alkinil grupa ima 2 do 7 atoma ugljenika ("C2-7alkinil"). U nekim primerima izvođenja, alkinil grupa ima 2 do 6 atoma ugljenika ("C2-6alkinil"). U nekim primerima izvođenja, alkinil grupa ima 2 do 5 atoma ugljenika ("C2-5alkinil"). U nekim primerima izvođenja, alkinil grupa ima 2 do 4 atoma ugljenika ("C2-4alkinil"). U nekim primerima izvođenja, alkinil grupa ima 2 do 3 atoma ugljenika ("C2-3alkinil"). U nekim primerima izvođenja, alkinil grupa ima 2 atoma ugljenika ("C2alkinil"). Jedna ili više ugljenik-ugljenik trostrukih veza mogu biti unutrašnje (kao što je u 2-butinil) ili terminusne (kao što je u 1-butinil). Primeri C2-4alkinil grupa uključuju, bez ograničenja, etinil (C2), 1-propinil (C3), 2-propinil (C3), 1-botinil (C4),
1
2-butinil (C4), i slično. Primeri C2-6alkenil grupa uključuju prethodno pomenute C2-4alkinil grupe kao i pentinil (C8), heksinil (C6), i slično. Dopunski primeri alkinila uključuju heptinil (C7), oktinil (C8), i slično. Osim ukoliko nije drugačije specificirano, svaka instanca alkinil grupe je nezavisno nesupstituisana ("nesupstituisani alkinil") ili supstituisana ("supstituisani alkinil") sa jednim ili više supstituenata. U određenim primerima izvođenja, alkinil grupa je nesupstituisani C2-10alkinil. U određenim primerima izvođenja, alkinil grupa je supstituisani C2-10alkinil.
[0338] Termin "heteroalkinil" označava alkinil grupu, koja dodatno uključuje najmanje jedan heteroatom (npr. 1, 2, 3, ili 4 heteroatoma) odabran od kiseonika, azota, ili sumpora unutar (tj. inseriran između susednih atoma ugljenika) i/ili postavljen na jednu ili više terminusnih pozicija roditeljskog lanca. U određenim primerima izvođenja, heteroalkinil grupa označava grupu koja ima od 2 do 10 atoma ugljenika, najmanje jednu trostruku vezu, i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-10alkinil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkinil grupa ima 2 do 9 atoma ugljenika, najmanje jednu trostruku vezu, i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-9alkinil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkinil grupa ima 2 do 8 atoma ugljenika, najmanje jednu trostruku vezu, i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-8alkinil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkinil grupa ima 2 do 7 atoma ugljenika, najmanje jednu trostruku vezu, i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-7alkinil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkinil grupa ima 2 do 6 atoma ugljenika, najmanje jednu trostruku vezu, i 1 ili više heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-6alkinil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkinil grupa ima 2 do 5 atoma ugljenika, najmanje jednu trostruku vezu, i 1 ili 2 heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-5alkinil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkinil grupa ima 2 do 4 atoma ugljenika, najmanje jednu trostruku vezu, i 1 ili 2 heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-4alkinil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkinil grupa ima 2 do 3 atoma ugljenika, najmanje jednu trostruku vezu, i 1 heteroatom unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-3alkinil"). U nekim primerima izvođenja, heteroalkinil grupa ima 2 do 6 atoma ugljenika, najmanje jednu trostruku vezu, i 1 ili 2 heteroatoma unutar roditeljskog lanca ("heteroC2-6alkinil"). Osim ukoliko nije drugačije specificirano, svaka instanca heteroalkinil grupe je nezavisno nesupstituisana ("nesupstituisani heteroalkinil") ili supstituisana ("supstituisani heteroalkinil") sa jednim ili više supstituenata. U određenim primerima izvođenja, heteroalkinil grupa je nesupstituisani heteroC2-10alkinil. U određenim primerima izvođenja, heteroalkinil grupa je supstituisani heteroC2-10alkinil.
[0339] Termin "karbociklil" ili "karbociklični" označava radikal nearomatične ciklične ugljovodonične grupe koja ima od 3 do 14 atoma ugljenika u prstenu ("C3-14karbociklil") i nula heteroatoma u sistemu nearomatičnog prstena. U nekim primerima izvođenja, karbociklil grupa
1
ima 3 do 10 atoma ugljenika u prstenu ("C3-10karbociklil"). U nekim primerima izvođenja, karbociklil grupa ima 3 do 8 atoma ugljenika u prstenu ("C3-8karbociklil"). U nekim primerima izvođenja, karbociklil grupa ima 3 do 7 atoma ugljenika u prstenu ("C3-7karbociklil"). U nekim primerima izvođenja, karbociklil grupa ima 3 do 6 atoma ugljenika u prstenu ("C3-6karbociklil"). U nekim primerima izvođenja, karbociklil grupa ima 4 do 6 atoma ugljenika u prstenu ("C4-6karbociklil"). U nekim primerima izvođenja, karbociklil grupa ima 5 do 6 atoma ugljenika u prstenu ("C5-6karbociklil"). U nekim primerima izvođenja, karbociklil grupa ima 5 do 10 atoma ugljenika u prstenu ("C5-10karbociklil"). Primeri C3-6karbociklil grupa uključuju, bez ograničenja, ciklopropil (C3), ciklopropenil (C3), ciklobutil (C4), ciklobutenil (C4), ciklopentil (C3), ciklopentenil (C8), cikloheksil (C6), cikloheksenil (C6), cikloheksadienil (C6), i slično. Primeri C3-
8karbociklil grupa uključuju, bez ograničenja, prethodno pomenute C3-6karbociklil grupe, kao i cikloheptil (C3), cikloheptenil (C7), cikloheptadienil (C7), cikloheptatrienil (C7), ciklooktil (C5), ciklooktenil (C8), biciklo[2.2.1]heptanil (C7), biciklo[2.2.2]oktanil (C8), i slično. Primeri C3-10karbociklil grupa uključuju, bez ograničenja, prethodno pomenute C3-8karbociklil grupe, kao i ciklononil (C9), ciklononenil (C9), ciklodecil (C10), ciklodecenil (C10), oktahidro-1H-indenil (C9), dekahidronaftalenil (C10), spiro[4.5]dekanil (C10), i slično. Kao što prethodni primeri ilustruju, u određenim primerima izvođenja, karbociklil grupa je ili monociklična ("monociklični karbociklil") ili policiklična (npr. sadrži sistem fuzionisanih, premošćenih ili spiro prstena kao što je biciklični sistem ("biciklični karbociklil") ili triciklični sistem ("triciklični karbociklil")) i može biti zasićena ili može da sadrži jednu ili više ugljenik-ugljenik dvostrukih ili trostrukih veza. "Karbociklil" takođe uključuje sisteme prstena u kojima je karbociklil prsten, kao što je prethodno definisano, fuzionisan sa jednom ili više aril ili heteroaril grupa pri čemu je tačka prikačinjanja na karbociklil prstenu, i u takvim instancama, broj ugljenika nastavlja da označava broj ugljenika u sistemu karbocikličnog prstena. Osim ukoliko nije drugačije specificirano, svaka instanca karbociklil grupe je nezavisno nesupstituisana ("nesupstituisani karbociklil") ili supstituisana ("supstituisani karbociklil") sa jednim ili više supstituenata. U određenim primerima izvođenja, karbociklil grupa je nesupstituisani C3-14karbociklil. U određenim primerima izvođenja, karbociklil grupa je supstituisani C3-14karbociklil.
[0340] U nekim primerima izvođenja, "karbociklil" je monociklična, zasićena karbociklil grupa koja ima od 3 do 14 atoma ugljenika u prstenu ("C3-14cikloalkil"). U nekim primerima izvođenja, cikloalkil grupa ima 3 do 10 atoma ugljenika u prstenu ("C3-10cikloalkil"). U nekim primerima izvođenja, cikloalkil grupa ima 3 do 8 atoma ugljenika u prstenu ("C3-8cikloalkil"). U nekim primerima izvođenja, cikloalkil grupa ima 3 do 6 atoma ugljenika u prstenu ("C3-6cikloalkil"). U nekim primerima izvođenja, cikloalkil grupa ima 4 do 6 atoma ugljenika u prstenu ("C4-6cikloalkil"). U nekim primerima izvođenja, cikloalkil grupa ima 5 do 6 atoma ugljenika u prstenu
1
("C5-6cikloalkil"). U nekim primerima izvođenja, cikloalkil grupa ima 5 do 10 atoma ugljenika u prstenu ("C5-10cikloalkil"). Primeri C5-6cikloalkil grupa uključuju ciklopentil (C5) i cikloheksil (C5). Primeri C3-6cikloalkil grupa uključuju prethodno pomenute C5-6cikloalkil grupe, kao i ciklopropil (C3) i ciklobutil (C4). Primeri C3-8cikloalkil grupa uključuju prethodno pomenute C3-6cikloalkil grupe, kao i cikloheptil (C7) i ciklooktil (C5). Osim ukoliko nije drugačije specificirano, svaka instanca cikloalkil grupe je nezavisno nesupstituisana ("nesupstituisani cikloalkil") ili supstituisana ("supstituisani cikloalkil") sa jednim ili više supstituenata. U određenim primerima izvođenja, cikloalkil grupa je nesupstituisani C3-14cikloalkil. U određenim primerima izvođenja, cikloalkil grupa je supstituisani C3-14cikloalkil.
[0341] Termin "heterociklil" ili "heterociklični" označava radikal 3- do 14-članog sistema nearomatičnog prstena koji ima atome ugljenika u prstenu i 1 do 4 heteroatoma u prstenu, pri čemu je svaki heteroatom nezavisno odabran od azota, kiseonika, i sumpora ("3-14-člani heterociklil"). U heterociklil grupama koje sadrže jedan ili više atoma azota, tačka prikačinjanja može biti atom ugljenika ili azota, kao što dozvoljava valenca. Heterociklična grupa može biti ili monociklična ("monociklični heterociklil") ili policiklična (npr. sistem fuzionisanih, premošćenih ili spiro prstena kao što je biciklični sistem ("biciklični heterociklil") ili triciklični sistem ("triciklični heterociklil")), i može biti zasićena ili može da sadrži jednu ili više ugljenik-ugljenik dvostruke ili trostruke veze. Sistemi heterociklil policikličnih prstena mogu uključivati jedan ili više heteroatoma u jednom ili oba prstena. "Heterociklil" takođe uključuje sisteme prstena u kojima je heterociklil prsten, kao što je prethodno definisano, fuzionisan sa jednom ili više karbociklil grupa pri čemu je tačka prikačinjanja ili na karbociklil ili heterociklil prstenu, ili sistemu prstena u kojima je heterociklil prsten, kao što je prethodno definisano, fuzionisan sa jednom ili više aril ili heteroaril grupa, pri čemu je tačka prikačinjanja na heterociklil prstenu, i u takvim instancama, broj članova prstena nastavlja da označava broj članova prstena u sistemu heterociklil prstena. Osim ukoliko nije drugačije specificirano, svaka instanca heterociklila je nezavisno nesupstituisan ("nesupstituisani heterociklil") ili supstituisan ("supstituisani heterociklil") sa jednim ili više supstituenata. U određenim primerima izvođenja, heterociklil grupa je nesupstituisani 3-14 člani heterociklil. U određenim primerima izvođenja, heterociklil grupa je supstituisani 3-14 člani heterociklil.
[0342] U nekim primerima izvođenja, heterociklil grupa je 5-10 člani sistem nearomatičnog prstena koji ima atome ugljenika u prstenu i 1-4 heteroatoma u prstenu, pri čemu je svaki heteroatom nezavisno odabran od azota, kiseonika, i sumpora ("5-10 člani heterociklil"). U nekim primerima izvođenja, heterociklil grupa je 5-8 člani sistem nearomatičnog prstena koji ima atome ugljenika u prstenu i 1-4 heteroatoma u prstenu, pri čemu je svaki heteroatom nezavisno odabran od azota, kiseonika, i sumpora ("5-8 člani heterociklil"). U nekim primerima izvođenja,
1
heterociklil grupa je 5-6 člani sistem nearomatičnog prstena koji ima atome ugljenika u prstenu i 1-4 heteroatoma u prstenu, pri čemu je svaki heteroatom nezavisno odabran od azota, kiseonika, i sumpora ("5-6 člani heterociklil"). U nekim primerima izvođenja, 5-6 člani heterociklil ima 1-3 heteroatoma u prstenu odabrana od azota, kiseonika, i sumpora. U nekim primerima izvođenja, 5-6-člani heterociklil ima 1-2 heteroatoma u prstenu odabrana od azota, kiseonika, i sumpora. U nekim primerima izvođenja, 5-6 člani heterociklil ima 1 heteroatom u prstenu odabran od azota, kiseonika, i sumpora. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0343] Primeri 3-članih heterociklil grupa koje sadrže 1 heteroatom uključuju, bez ograničenja, azirdinil, oksiranil, i tiiranil. Primeri 4-članih heterociklil grupa koje sadrže 1 heteroatom uključuju, bez ograničenja, azetidinil, oksetanil, i tietanil. Primeri 5-članih heterociklil grupa koje sadrže 1 heteroatom uključuju, bez ograničenja, tetrahidrofuranil, dihidrofuranil, tetrahidrotiofenil, dihidrotiofenil, pirolidinil, dihidropirolil, i pirolil-2,5-dion. Primeri 5-članih heterociklil grupa koje sadrže 2 heteroatoma uključuju, bez ograničenja, dioksolanil, oksatiolanil i ditiolanil. Primeri 5-članih heterociklil grupa koje sadrže 3 heteroatoma uključuju, bez ograničenja, triazolinil, oksadiazolinil, i tiadiazolinil. Primeri 6-članih heterociklil grupa koje sadrže 1 heteroatom uključuju, bez ograničenja, piperidinil, tetrahidropiranil, dihidropiridinil, i tianil. Primeri 6-članih heterociklil grupa koje sadrže 2 heteroatoma uključuju, bez ograničenja, piperazinil, morfolinil, ditianil, i dioksanil. Primeri 6-članih heterociklil grupa koje sadrže 2 heteroatoma uključuju, bez ograničenja, triazinanil. Primeri 7-članih heterociklil grupa koje sadrže 1 heteroatom uključuju, bez ograničenja, azepanil, oksepanil i tiepanil. Primeri 8-članih heterociklil grupa koje sadrže 1 heteroatom uključuju, bez ograničenja, azokanil, oksekanil i tiokanil. Primeri bicikličnih heterociklil grupa uključuju, bez ograničenja, indolinil, izoindolinil, dihidrobenzofuranil, dihidrobenzotienil, tetrahidrobenzotienil, tetrahidrobenzofuranil, tetrahidroindolil, tetrahidrokvinolinil, tetrahidroizokvinolinil, dekahidrokvinolinil, dekahidroizokvinolinil, oktahidrohromenil, oktahidroizohromenil, dekahidronaftiridinil, dekahidro-1,8-naftiridinil, oktahidropirolo[3,2-b]pirol, indolinil, ftalimidil, naftalimidil, hromanil, hromenil, 1H-benzo[e][1,4]diazepinil, 1,4,5,7-tetrahidropirano[3,4-b]pirolil, 5,6-dihidro-4H-furo[3,2-b]pirolil, 6,7-dihidro-5H-furo[3,2-b]piranil, 5,7-dihidro-4H-tieno[2,3-c]piranil, 2,3-dihidro-1H-pirolo[2,3-b]piridinil, 2,3-dihidrofuro[2,3-b]piridinil, 4,5,6,7-tetrahidro-1H-pirolo[2,3-b]piridinil, 4,5,6,7-tetrahidrofuro[3,2-c]piridinil, 4,5,6,7-tetrahidrotieno[3,2-b]piridinil, 1,2,3,4-tetrahidro-1,6-naftiridinil, i slično.
[0344] Termin "aril" označava radikal monocikličnog ili policikličnog (npr. bicikličnog ili tricikličnog) 4n+2 sistema aromatičnog prstena (npr. koji ima 6, 10, ili 14 π elektrona koji se dele u cikličnom nizu) koji ima 6-14 atoma ugljenika u prstenu i nula heteroatoma obezbeđena u
1
sistemu aromatičnog prstena ("C6-14aril"). U nekim primerima izvođenja, aril grupa ima 6 atoma ugljenika u prstenu ("C6aril"; npr. fenil). U nekim primerima izvođenja, aril grupa ima 10 atoma ugljenika u prstenu ("C10aril"; npr. naftil kao što su 1-naftil i 2-naftil). U nekim primerima izvođenja, aril grupa ima 14 atoma ugljenika u prstenu ("C14aril"; npr. antracil). "Aril" takođe uključuje sisteme prstena u kojima je aril prsten, kao što je prethodno definisano, fuzionisan sa jednom ili više karbociklil ili heterociklil grupa pri čemu je radikal ili tačka prikačinjanja na aril prstenu, i u takvim instancama, broj atoma ugljenika nastavlja da označava broj atoma ugljenika u sistemu aril prstena. Osim ukoliko nije drugačije specificirano, svaka instanca aril grupe je nezavisno nesupstituisana ("nesupstituisani aril") ili supstituisana ("supstituisani aril") sa jednim ili više supstituenata. U određenim primerima izvođenja, aril grupa je nesupstituisani C6-14aril. U određenim primerima izvođenja, aril grupa je supstituisani C6-14aril.
[0345] Termin "heteroaril" označava radikal 5-14 članog monocikličnog ili policikličnog (npr. bicikličnog, tricikličnog) 4n+2 sistema aromatičnog prstena (npr. koji ima 6, 10, ili 14 π elektrona koji se dele u cikličnom nizu) koji ima atome ugljenika u prstenu i 1-4 heteroatoma u prstenu obezbeđena u sistemu aromatičnog prstena, pri čemu je svaki heteroatom nezavisno odabran od azota, kiseonika, i sumpora ("5-14 člani heteroaril"). U heteroaril grupama koje sadrže jedan ili više atoma azota, tačka prikačinjanja može biti atom ugljenika ili azota, kao što dozvoljava valenca. Sistemi heteroaril policikličnog prstena mogu uključivati jedan ili više heteroatoma u jednom ili oba prstena. "Heteroaril" uključuje sisteme prstena u kojima je heteroaril prsten, kao što je prethodno definisano, fuzionisan sa jednom ili više karbociklil ili heterociklil grupa pri čemu je tačka prikačinjanja na heteroaril prstenu, i u takvim instancama, broj članova prstena nastavlja da označava broj članova prstena u sistemu heteroaril prstena. "Heteroaril" takođe uključuje sisteme prstena u kojima je heteroaril prsten, kao što je prethodno definisano, fuzionisan sa jednom ili više aril grupa pri čemu je tačka prikačinjanja ili na aril ili heteroaril prstenu, i u takvim instancama, broj članova prstena označava broj članova prstena u sistemu fuzionisanog policikličnog (aril/heteroaril) prstena. Policiklične heteroaril grupe u kojima jedan prsten ne sadrži heteroatom (npr. indolil, kvinolinil, karbazolil, i slično) tačka prikačinjnanja može biti na bilo kom prstenu, tj. bilo prstenu koji sadrži heteroatom (npr.2-indolil), ili prstenu koji ne sadrži heteroatom (npr. 5-indolil).
[0346] U nekim primerima izvođenja, heteroaril grupa je 5-10 člani sistem aromatičnog prstena koji ima atome ugljenika u prstenu i 1-4 heteroatoma u prstenu koji su obezbeđeni u sistemu aromatičnog prstena, pri čemu je svaki heteroatom nezavisno odabran od azota, kiseonika, i sumpora ("5-10 člani heteroaril"). U nekim primerima izvođenja, heteroaril grupa je 5-8 člani sistem aromatičnog prstena koji ima atome ugljenika u prstenu i 1-4 heteroatoma u prstenu koji su obezbeđeni u sistemu aromatičnog prstena, pri čemu je svaki heteroatom nezavisno odabran od
1
azota, kiseonika, i sumpora ("5-8 člani heteroaril"). U nekim primerima izvođenja, heteroaril grupa je 5-6 člani sistem aromatičnog prstena koji ima atome ugljenika u prstenu i 1-4 heteroatoma u prstenu koji su obezbeđeni u sistemu aromatičnog prstena, pri čemu je svaki heteroatom nezavisno odabran od azota, kiseonika, i sumpora ("5-6 člani heteroaril"). U nekim primerima izvođenja, 5-6 člani heteroaril ima 1-3 heteroatoma u prstenu odabrana od azota, kiseonika, i sumpora. U nekim primerima izvođenja, 5-6 člani heteroaril ima 1-2 heteroatoma u prstenu odabrana od azota, kiseonika, i sumpora. U nekim primerima izvođenja, 5-6 člani heteroaril ima 1 heteroatom u prstenu odabran od azota, kiseonika, i sumpora. Osim ukoliko nije drugačije specificirano, svaka instanca heteroaril grupe je nezavisno nesupstituisana ("nesupstituisani heteroaril") ili supstituisana ("supstituisani heteroaril") sa jednim ili više supstituenata. U određenim primerima izvođenja, heteroaril grupa je nesupstituisani 5-14 člani heteroaril. U određenim primerima izvođenja, heteroaril grupa je supstituisani 5-14 člani heteroaril.
[0347] Primeri 5-članih heteroaril grupa koje sadrže 1 heteroatom uključuju, bez ograničenja, pirolil, furanil, i tiofenil. Primeri 5-članih heteroaril grupa koje sadrže 2 heteroatoma uključuju, bez ograničenja, imidazolil, pirazolil, oksazolil, izoksazolil, tiazolil, i izotiazolil. Primeri 5-članih heteroaril grupa koje sadrže 3 heteroatoma uključuju, bez ograničenja, triazolil, oksadiazolil, i tiadiazolil. Primeri 5-članih heteroaril grupa koje sadrže 4 heteroatoma uključuju, bez ograničenja, tetrazolil. Primeri 6-članih heteroaril grupa koje sadrže 1 heteroatom uključuju, bez ograničenja, piridinil. Primeri 6-članih heteroaril grupa koje sadrže 2 heteroatoma uključuju, bez ograničenja, piridazinil, pirimidinil, i pirazinil. Primeri 6-članih heteroaril grupa koje sadrže 3 ili 4 heteroatoma uključuju, bez ograničenja, triazinil i tetrazinil, respektivno. Primeri 7-članih heteroaril grupa koje sadrže 1 heteroatom uključuju, bez ograničenja, azepinil, oksepinil, i tiepinil. Primeri 5,6-bicikličnih heteroaril grupa uključuju, bez ograničenja, indolil, izoindolil, indazolil, benzotriazolil, benzotiofenil, izobenzotiofenil, benzofuranil, benzoizofuranil, benzimidazolil, benzoksazolil, benzizoksazolil, benzoksadiazolil, benztiazolil, benzizotiazolil, benztiadiazolil, indolizinil, i purinil. Primeri 6,6-bicikličnih heteroaril grupa uključuju, bez ograničenja, naftiridinil, pteridinil, kvinolinil, izokvinolinil, cinolinil, kvinoksalinil, ftalazinil, i kvinazolinil. Primeri tricikličnih heteroaril grupa uključuju, bez ograničenja, fenantridinil, dibenzofuranil, karbazolil, akridinil, fenotiazinil, fenoksazinil i fenazinil.
[0348] Termin "nezasićena veza" označava dvostruku ili trostruku vezu. Termin "nezasićen" ili "delimično nezasićen" označava funkcionalnu grupu koja uključuje najmanje jednu dvostruku ili trostruku vezu. Termin "zasićen" označava funkcionalnu grupu koja ne sadrži dvostruku ili trostruku vezu, tj. funkcionalna grupa sadrži samo jednostruke veze.
[0349] Dodavanje sufiksa "-en" grupi ukazuje na to da je grupa dvovalentna funkcionalna grupa, npr. alkilen je dvovalentna funkcionalna grupa alkila, alkenilen je dvovalentna funkcionalna grupa
1 1
alkenila, alkinilen je dvovalentna funkcionalna grupa alkinila, heteroalkilen je dvovalentna funkcionalna grupa heteroalkila, heteroalkenilen je dvovalentna funkcionalna grupa hetereoalkenila, heteroalkinilen je dvovalentna funkcionalna grupa heteroalkinila, karbociklilen je dvovalentna funkcionalna grupa karbociklila, heterociklilen je dvovalentna funkcionalna grupa heterociklila, arilen je dvovalentna funkcionalna grupa arila, i heteroarilen je dvovalentna funkcionalna grupa heteroarila.
[0350] Grupa je opciono supstituisana osim ukoliko nije izrazito obezbeđeno drugačije. Termin "opciono supstituisan" označava da je supstituisan ili nesupstituisan. U određenim primerima izvođenja, alkil, alkenil, alkinil, heteroalkil, heteroalkenil, heteroalkinil, karbociklil, heterociklil, aril, i heteroaril grupe su opciono supstituisane. "Opciono supstituisana" označava grupu koja može biti supstituisana ili nesupstituisana (npr. "supstituisani" ili "nesupstituisani“ alkil, "supstituisani" ili "nesupstituisani“ alkenil, "supstituisani" ili "nesupstituisani“ alkinil, "supstituisani" ili "nesupstituisani“ heteroalkil, "supstituisani" ili "nesupstituisani" heteroalkenil, "supstituisani" ili "nesupstituisani" heteroalkinil, "supstituisani" ili "nesupstituisani" karbociklil, "supstituisani" ili "nesupstituisani" heterociklil, "supstituisani" ili "nesupstituisani" aril, ili "supstituisana" ili "nesupstituisana" heteroaril grupa). Generalno, termin "supstituisan" znači da je najmanje jedan vodonik prisutan u grupi zamenjen sa dozvoljenim supstituentom, npr. supstituentom koji nakon supstitucije rezultuje stabilnim jedinjenjem, npr. jedinjenjem koje ne podleže spontano transformaciji kao što je npr. rearanžiranjem, ciklizacijom, eliminacijom, ili drugom reakcijom. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, "supstituisana" grupa ima supstituent na jednoj ili više zamenljivih pozicija grupe, i kada je više od jedne pozicije u bilo kojoj datoj strukturi supstituisano, supstituent je ili isti ili različit na svakoj poziciji. Termin "supstituisan" podrazumeva da uključuje supstituciju sa svim dozvoljenim supstituentima organskih jedinjenja, i uključuje bilo koji od supstituenata koji su ovde opisani koji rezultuju formiranjem stabilnog jedinjenja. Predmetni pronalazak razmatra bilo koju i sve takve kombinacije kako bi se došlo do stabilnog jedinjenja. Za potrebe ovog pronalaska, heteroatomi kao što je azot mogu imati vodonične supstituente i/ili bilo koji pogodan supstituent kao što je ovde opisano koji zadovoljavaju valence heteroatoma i rezultuju formiranjem stabilne funkcionalne grupe. Pronalazak nije namenjen da bude ograničen na bilo koji način ovde opisanim primerima supstituenata.
[0351] Primeri supstituenata atoma ugljenika uključuju, ali nisu ograničeni na, halogen, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -OR<aa>, -ON(R<bb>)2, -N(R<bb>)2, -N(R<bb>)3<+>X-, -N(OR<cc>)R<bb>, -SH, -SR<aa>, -SSR<cc>, -C(=O)R<aa>, -CO2H, -CHO, -C(OR<cc>)2, -CO2R<aa>, -OC(=O)R<aa>, -OCO2R<aa>, -C(=O)N(R<b>)2, -OC(=O)N(R<bb>)2, -NR<bb>C(=O)R<aa>, -NR<bb>CO2R<aa>, -NR<bb>C(=O)N(R<bb>)2, -C(=NR<bb>)R<aa>, -C(=NR<bb>)OR<aa>, -OC(=NR<bb>)R<aa>, -OC(=NR<bb>)OR<aa>, -C(=NR<bb>)N(R<bb>)2, -OC(=NR<bb>)N(R<bb>)2, -
1 2
NR<bb>C(=NR<bb>)N(R<bb>)2, -C(=O)NR<bb>SO2R<aa>, -NR<bb>SO2R<aa>, -SO2N(R<bb>)2, -SO2R<aa>, -SO2OR<aa>, -OSO2R<aa>, -S(=O)R<aa>, -OS(=O)R<aa>, -Si(R<aa>)3, -OSi(R<aa>)3-C(=S)N(R<bb>)2, -C(=O)SR<aa>, -C(=S)SR<aa>, -SC(=S)SR<aa>, -SC(=O)SR<aa>. -OC(=O)SR<aa>, -SC(=O)OR<aa>, -SC(=O)R<aa>, -P(=O)(R<aa>)2. -P(=O)(OR<cc>)2, -OP(=O)(R<aa>)2, -OP(=O)(OR<cc>)2. -P(=O)(N(R<bb>)2)2, -OP(=O)(N(R<bb>)2)2, -NR<bb>P(=O)(R<aa>)2, -NR<bb>P(=O)(OR<cc>)2, -NR<bb>P(=O)(N(R<bb>)2)2, -P(R<cc>)2, -P(OR<cc>)2, -P(R<cc>)3<+>X-, -P(OR<cc>)3<+>X-, -P(R<cc>)4, -P(OR<cc>)4, -OP(R<cc>)2, -OP(V)3<+>X-, -OP(OR<cc>)2, -OP(OR<cc>)3<+>X-, -OP(R<cc>)4, -OP(OR<cc>)4, -B(R<aa>)2, -B(OR<cc>)2, -BR<aa>(OR<cc>), C1-10alkil, C1-10perhaloalkil, C2-10alkenil, C2-10alkinil, heteroC1-10alkil, heteroC2-10alkenil, heteroC2-10alkinil, C3-10karbociklil, 3-14 člani heterociklil, C6-14aril, i 5-14 člani heteroaril, pri čemu je svaki alkil, alkenil, alkinil, heteroalkil, heteroalkenil, heteroalkinil, karbociklil, heterociklil, aril, i heteroaril nezavisno supstituisan sa 0, 1, 2, 3, 4, ili 5 R<dd>grupa; pri čemu je X kontrajon;
ili dva geminalna vodonika na atomu ugljenika su zamenjena sa grupom =O, =S, =NN(R<bb>)2, =NNR<bb>C(=O)R<aa>, =NNR<bb>C(=O)OR<aa>, =NNR<bb>S(=O)2R<aa>, =NR<bb>, ili =NOR<cc>;
svaka instanca R<aa>je, nezavisno, odabrana od C1-10alkila, C1-10perhaloalkila, C2-10alkenila, C2-10alkinila, heteroC1-10alkila, heteroC2-10alkenila, heteroC2-10alkinila, C3-10karbociklila, 3-14 članog heterociklila, C6-14arila, i 5-14 članog heteroarila, ili su dve R<aa>grupe spojene da formiraju 3-14 člani heterociklil ili 5-14 člani heteroaril prsten, pri čemu je svaki alkil, alkenil, alkinil, heteroalkil, heteroalkenil, heteroalkinil, karbociklil, heterociklil, aril, i heteroaril nezavisno supstituisan sa 0, 1, 2, 3, 4, ili 5 R<dd>grupa;
svaka instanca R<bb>je, nezavisno, odabrana od vodonika, -OH, -OR<aa>, -N(R<cc>)2, -CN, -C(=O)R<aa>, -C(=O)N(R<cc>)2, -CO2R<aa>, -SO2R<aa>, -C(=NR<cc>)OR<aa>, -C(=NR<cc>)N(R<cc>)2, -SO2N(R<cc>)2, -SO2R<cc>, -SO2OR<cc>, -SOR<aa>, -C(=S)N(R<cc>)2, -C(=O)SR<cc>, -C(=S)SR<cc>, -P(=O)(R<aa>)2, -P(=O)(OR<cc>)2, -P(=O)(N(R<cc>)2)2, C1-10alkila, C1-10perhaloalkila, C2-10alkenila, C2-10alkinila, heteroC1-10alkila, heteroC2-10alkenila, heteroC2-10alkinila, C3-10karbociklila, 3-14 članog heterociklila, C6-14arila, i 5-14 članog heteroarila, ili su dve R<bb>grupe spojene da formiraju 3-14 člani heterociklil ili 5-14 člani heteroaril prsten, pri čemu je svaki alkil, alkenil, alkinil, heteroalkil, heteroalkenil, heteroalkinil, karbociklil, heterociklil, aril, i heteroaril nezavisno supstituisan sa 0, 1, 2, 3, 4, ili 5 R<dd>grupa; pri čemu je X<->kontrajon;
svaka instanca R<cc>je, nezavisno, odabrana od vodonika, C1-10alkila, C1-10perhaloalkila, C2-
10alkenila, C2-10alkinila, heteroC1-10alkila, heteroC2-10alkenila, heteroC2-10alkinila, C3-10karbociklila, 3-14 članog heterociklila, C6-14arila, i 5-14 članog heteroarila, ili su dve R<cc>grupe spojene da formiraju 3-14 člani heterociklil ili 5-14 člani heteroaril prsten, pri čemu
1
je svaki alkil, alkenil, alkinil, heteroalkil, heteroalkenil, heteroalkinil, karbociklil, heterociklil, aril, i heteroaril nezavisno supstituisan sa 0, 1, 2, 3, 4, ili 5 R<dd>grupa; svaka instanca R<dd>je, nezavisno, odabrana od halogena, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -OR<ee>, -ON(R<ff>)2, -N(R<ff>)2, -N(R<ff>)3<+>X-, -N(OR<ee>)R<ff>, -SH, -SR<ee>, -SSR<ee>, -C(=O)R<ee>, -CO2H, -CO2R<ee>, -OC(=O)R<ee>, -OCO2R<ee>, -C(=O)N(R<ff>)2, -OC(=O)N(R<ff>)2, -NR<ff>C(=O)R<ee>, -NR<11>CO2R<ee>, -NR<ff>C(=O)N(R<ff>)2, -C(=NR<ff>)OR<cc>, -OC(=NR<ff>)R<ee>, -OC(=NR<ff>)OR<ee>, -C(=NR<ff>)N(R<ff>)2, -OC(=NR<ff>)N(R<ff>)2, -NR<ff>C(-NR<ff>)N(R<ff>)2, -NR<ff>SO2R<ee>, -SO2N(R<ff>)2, -SO2R<ee>, -SO2OR<22>, -OSO2R<ee>. -S(=O)R<ee>, -Si(R<ee>)3, -OSi(R<ee>)3, -C(=S)N(R<ff>)2, -C(-O)SR<ee>, -C(=S)SR<ee>, -SC(=S)SR<ee>, -P(=O)(OR<ee>)2, -P(=O)(R<ee>)2, -OP(=O)(R<ee>)2, -OP(=O)(OR<ee>)2, C1-6alkila, C1-6perhaloalkila, C2-6alkenila, C2-6alkinila, heteroC1-6alkila, heteroC2-6alkenila, heteroC2-6alkinila, C3-10karbociklila, 3-10 članog heterociklila, C6-10arila, 5-10 članog heteroarila, pri čemu je svaki alkil, alkenil, alkinyl, heteroalkil, heteroalkenil, heteroalkinil, karbociklil, heterociklil, aril, i heteroaril nezavisno supstituisan sa 0, 1, 2, 3, 4, ili 5 R<gg>grupa, ili dva geminalna R<dd>substituenta mogu biti spojena da formiraju =O ili =S; pri čemu je X<->kontrajon;
svaka instanca R<ee>je, nezavisno, odabrana od C1-6alkila, C1-6perhaloalkila, C2-6alkenila, C2-6alkinila, heteroC1-6alkila, heteroC2-6alkenila, heteroC2-6alkinila, C3-10karbociklila, C6-
10arila, 3-10 članog heterociklila, i 3-10 članog heteroarila, pri čemu je svaki alkil, alkenil, alkinil, heteroalkil, heteroalkenil, heteroalkinil, karbociklil, heterociklil, aril, i heteroaril nezavisno supstituisan sa 0, 1, 2, 3, 4, ili 5 R<gg>grupa;
svaka instanca R<ff>je, nezavisno, odabrana od vodonika, C1-6alkila, C1-6perhaloalkila, C2-6alkenila, C2-6alkinila, heteroC1-6alkila, heteroC2-6alkenila, heteroC2-6alkinila, C3-10karbociklila, 3-10 članog heterociklila, C6-10arila i 5-10 članog heteroarila, ili su dve R<ff>grupe spojene da formiraju 3-10 člani heterociklil ili 5-10 člani heteroaril prsten, pri čemu je svaki alkil, alkenil, alkinil, heteroalkil, heteroalkenil, heteroalkinil, karbociklil, heterociklil, aril, i heteroaril nezavisno supstituisan sa 0, 1, 2, 3, 4, ili 5 R<gg>grupa; i svaka instanca R<gg>je, nezavisno, halogen, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -OC1-6alkil, -ON(C1-6alkil)2, -N(C1-6alkil)2, -N(C1-6alkil)3<+>X-, -NH(C1-6alkil)2<+>X-, -NH2(C1-6alkil)<+>X-, -NH3<+>X-, -N(OC1-6alkil)(C1-6alkil), -N(OH)(C1-6alkil), -NH(OH), -SH, -SC1-6alkil, -SS(C1-6alkil), -C(=O)(C1-6alkil), -CO2H, -CO2(C1-6alkil), -OC(=O)(C1-6alkil), -OCO2(C1-
6alkil), -C(=O)NH2, -C(=O)N(C1-6alkil)2, -OC(=O)NH(C1-6alkil), -NHC(=O)(C1-6alkil), -N(C1-6alkil)C(=O)(C1-6alkil), -NHCO2(C1-6alkil), -NHC(=O)N(C1-6alkil)2, -NHC(=O)NH(C1-6alkil), -NHC(=O)NH2, -C(=NH)O(C1-6alkil), -OC(=NH)(C1-6alkil), -OC(-NH)OC1-6alkil, -C(=NH)N(C1-6alkil)2, -C(=NH)NH(C1-6alkil), -C(=NH)NH2, -OC(=NH)N(C1-6alkil)2, -OC(NH)NH(C1-6alkil), -OC(NH)NH2, -NHC(NH)N(C1-6alkil)2, -
1 4
NHC(=NH)NH2, -NHSO2(C1-6alkil), -SO2N(C1-6alkil)2, -SO2NH(C1-6alkil), -SO2NH2, -SO3C1-6alkil, -SO2OC1-6alkil, -OSO2C1-6alkil, -SOC1-6alkil, -Si(C1-6alkil)3, -OSi(C1-6alkil)3-C(=S)N(C1-6alkil)2, C(=S)NH(C1-6alkil), C(=S)NH2, -C(=O)S(C1-6alkil), -C(=S)SC1-6alkil, -SC(=S)SC1-6alkil, -P(=O)(OC1-6alkil)2, -P(=O)(C1-6alkil)2, -OP(=O)(C1-
6alkil)2, -OP(=O)(OC1-6alkil)2, C1-6alkil, C1-6perhaloalkil, C2-6alkenil, C2-6alkinil, heteroC1-6alkil, heteroC2-6alkenil, heteroC2-6alkinil, C3-10karbociklil, C6-10aril, 3-10 člani heterociklil, 5-10 člani heteroaril; ili dva geminalna R<gg>substituenta mogu biti spojena da formiraju =O ili =S; pri čemu je X<->kontrajon.
[0352] Termin "halo" ili "halogen" označava fluor (fluoro, -F), hlor (hloro, -Cl), brom (bromo, -Br), ili jod (jodo, -I).
[0353] Termin "hidroksil" ili "hidroksi" označava grupu -OH. Termin "supstituisani hidroksil" ili "supstituisani hidroksil", po ekstenziji, označava hidroksilnu grupu u kojoj je atom kiseonika koji je direktno prikačen za roditeljski molekul supstituisan sa grupom koja nije vodonik, i uključuje grupe odabrane od -OR<aa>, -ON(R<bb>)2, -OC(=O)SR<aa>, -OC(=O)R<aa>, -OCO2R<aa>, -OC(=O)N(R<bb>)2, -OC(=NR<bb>)R<aa>, -OC(=NR<bb>)OR<aa>, -OC(=NR<bb>)N(R<bb>)2, -OS(=O)R<aa>, -OSO2R<aa>, -OSi(R<aa>)3, -OP(R<cc>)2, -OP(R<aa>)3<+>X-, -OP(OR<cc>)2, -OP(OR<cc>)3<+>X-, -OP(=O)(R<aa>)2, -OP(=O)(OR<cc>)2, i -OP(=O)(N(R<bb>))2, pri čemu su X-, R<aa>, R<bb>, i R<cc>kao što je ovde definisano.
[0354] Termin "amino" označava grupu -NH2. Termin "supstituisani amino", po ekstenziji, označava monosupstituisani amino, disupstituisani amino, ili trisupstituisani amino. U određenim primerima izvođenja, "supstituisani amino" je monosupstituisana amino ili disupstituisana amino grupa.
[0355] Termin "monosupstituisana amino" označava amino grupu u kojoj je atom azota koji je direktno prikačen za roditeljski molekul supstituisan sa jednim vodonikom i jednom grupom koja nije vodonik, i uključuje grupe odabrane od -NH(R<bb>), -NHC(=O)R<aa>, -NHCO2R<aa>, -NHC(O)N(R<bb>)2, -NHC(=NR<bb>)N(R<bb>)2, -NHSO2R<aa>, -NHP(=O)(OR<cc>)2, i -NHP(=O)(N(R<bb>)2)2, pri čemu su R<aa>, R<bb>, i R<cc>kao što je ovde definisano, i pri čemu R<bb>iz grupe -NH(R<bb>) nije vodonik.
[0356] Termin "disupstituisana amino" označava amino grupu u kojoj je atom azota koji je direktno prikačen za roditeljski molekul supstituisan sa dve grupe koje nisu vodonik, i uključuje grupe odabrane od -N(R<bb>)2, -NR<bb>C(=O)R<aa>, -NR<bb>CO2R<aa>, -NR<bb>C(=O)N(R<bb>)2, -NR<bb>C(=NR<bb>)N(R<bb>)2, -NR<bb>SO2R<aa>, -NR<bb>P(=O)(OR<cc>)2, i -NR<bb>P(=O)(N(R<bb>)2)2, pri čemu su R<aa>, R<bb>, i R<cc>kao što je ovde definisano, pod uslovom da atom azota koji je direktno prikačen za roditeljski molekul nije supstituisan sa vodonikom.
1
[0357] Termin "trisupstituisana amino" označava amino grupu u kojoj je atom azota koji je direktno prikačen za roditeljski molekul supstituisan sa tri grupe, i uključuje grupe odabrane od -N(R<bb>)3i -N(R<bb>)3<+>X-, pri čemu su R<bb>i X<->kao što je ovde definisano.
[0358] Termin "sulfonil" označava grupu odabranu od -SO2N(R<bb>)2, -SO2R<aa>, i - SO2OR<aa>, pri čemu su R<aa>i R<bb>kao što je ovde definisano.
[0359] Termin "sulfinil" označava grupu -S(=O)R<aa>, pri čemu je R<aa>kao što je ovde definisano.
[0360] Termin "acil" označava grupu koja ima opštu formulu -C(=O)R<XI>, -C(=O)OR<XI>, -C(=O)-O-C(=O)R<XI>, -C(=O)SR<XI>, -C(=O)N(R<XI>)2, -C(=S)R<XI>, -C(=S)N(R<XI>)2, i -C(=S)S(R<XI>), -C(=NR<XI>)R<XI>, -C(=NR<XI>)OR<XI>, -C(=NR<XI>)SR<XI>, i -C(=NR<XI>)N(R<XI>)2, pri čemu je R<XI>vodonik; halogen; supstituisani ili nesupstituisani hidroksil; supstituisani ili nesupstituisani tiol; supstituisani ili nesupstituisani amino; supstituisani ili nesupstituisani acil, ciklični ili aciklični, supstituisani ili nesupstituisani, razgranati ili nerazgranati alifatik; ciklični ili aciklični, supstituisani ili nesupstituisani, razgranati ili nerazgranati heteroalifatik; ciklični ili aciklični, supstituisani ili nesupstituisani, razgranati ili nerazgranati alkil; ciklični ili aciklični, supstituisani ili nesupstituisani, razgranati ili nerazgranati alkenil; supstituisani ili nesupstituisani alkinil; supstituisani ili nesupstituisani aril, supstituisani ili nesupstituisani heteroaril, alifatikoksi, heteroalifatikoksi, alkiloksi, heteroalkiloksi, ariloksi, heteroariloksi, alifatiktioksi, heteroalifatiktioksi, alkiltioksi, heteroalkiltioksi, ariltioksi, heteroariltioksi, mono- ili dialifatikamino, mono- ili di-heteroalifatikamino, mono- ili di-alkilamino, mono- ili diheteroalkilamino, mono- ili di-arilamino, ili mono- ili di-heteroarilamino; ili dve R<XI>grupe uzete zajedno formiraju 5- do 6-člani heterociklični prsten. Primeri acil grupa uključuju aldehide (-CHO), karboksilne kiseline (-CO2H), ketone, acil halide, estre, amide, imine, karbonate, karbamate, i uree. Acil supstituenti uključuju, ali nisu ograničeni na, bilo koji od supstituenata koji su ovde opisani, koji rezultuju formiranjem stabilne funkcionalne grupe (npr. alifatične, alkil, alkenil, alkinil, heteroalifatične, heterociklične, aril, heteroaril, acil, okso, imino, tiookso, cijano, izocijano, amino, azido, nitro, hidroksil, tiol, halo, alifatikamino, heteroalifatikamino, alkilamino, heteroalkilamino, arilamino, heteroarilamino, alkilaril, arilalkil, alifatikoksi, heteroalifatikoksi, alkiloksi. heteroalkiloksi, ariloksi, heteroariloksi, alifatiktioksi, heteroalifatiktioksi, alkiltioksi, heteroalkiltioksi, ariltioksi, heteroariltioksi, aciloksi, i slično, od kojih svaka može ili ne mora biti dodatno supstituisana).
[0361] Termin "karbonil" označava grupu u kojoj je ugljenik koji je direktno prikačen za roditeljski molekul sp<2>hibridizovan, i supstituisan sa atomom kiseonika, azota ili sumpora, npr. grupu odabranu od ketona (-C(=O)R<aa>), karboksilnih kiselina (-CO2H), aldehida (-CHO), estara (-CO2R<aa>, -C(=O)SR<aa>, -C(=S)SR<aa>), amida (-C(=O)N(R<bb>)2, - C(=O)NR<bb>SO2R<aa>, -C(=S)N(R<b>)2), i
1
imina (-C(=NR<bb>)R<aa>, -C(=NR<bb>)OR<aa>), -C(=NR<bb>)N(R<bb>)2), pri čemu su R<aa>i R<bb>kao što je ovde definisano.
[0362] Atomi azota mogu biti supstituisani ili nesupstituisani kao što dozvoljava valenca, i uključuju primarne, sekundarne, tercijarne, i kvaternarne atome azota. Primeri supstituenata atoma azota uključuju, ali nisu ograničeni na, vodonik, OH, -OR<aa>, -N(R<cc>)2. -CN, -C(=O)R<aa>, -C(=O)N(R<cc>)2, -CO2R<aa>, -SO2R<aa>, -C(=NR<bb>)R<aa>, -C(=NR<cc>)OR<aa>, -C(=NR<cc>)N(R<cc>)2, -SO2N(R<cc>)2, -SO3R<cc>, -SO2OR<cc>, -SOR<aa>, -C(-S)N(R<cc>)2, -C(=O)SR<cc>, -C(=S)SR<cc>, -P(=O)(OR<cc>)2, -P(=O)(R<aa>)2, -P(=O)(N(R<cc>)2)2, C1-10alkil, C1-10perhaloalkil, C2-10alkenil, C2-10alkinil, heteroC1-
10alkil, heteroC2-10alkenil, heteroC2-10alkinil, C3-10karbociklil, 3-14-člani heterociklil, C6-14aril, i 5-14 člani heteroaril, ili dve R<cc>grupe prikačene za N atom su spojene da formiraju 3-14 člani heterociklil ili 5-14 člani heteroaril prsten, pri čemu je svaki alkil, alkenil, alkinil, heteroalkil, heteroalkenil, heteroalkinil, karbociklil, heterociklil, aril, i heteroaril nezavisno supstituisan sa 0, 1, 2, 3, 4, ili 5 R<dd>grupa, i pri čemu su R<aa>, R<bb>, R<cc>, i R<dd>kao što je prethodno definisano.
[0363] U određenim primerima izvođenja, supstituent prisutan na atomu azota je zaštitna grupa azota (koja se ovde takođe označava kao "amino zaštitna grupa"). Zaštitne grupe azota uključuju, ali nisu ograničene na, -OH, -OR<aa>, -N(R<cc>)2, -C(=O)R<aa>, -C(=O)N(R<cc>)2, -CO2R<aa>, -SO2R<aa>, -C(=NR<cc>)R<aa>, -C(-NR<cc>)OR<aa>, -C(-NR<cc>)N(R<cc>)2, -SO2N(R<cc>)2, -SO2R<cc>, -SO2OR<cc>, -SOR<aa>, -C(=S)N(R<cc>)2, -C(=O)SR<cc>, -C(=S)SR<cc>, C1-10alkil (npr. aralkil, heteroaralkil), C2-10alkenil, C2-10alkinil, heteroC1-10alkil, heteroC2-10alkenil, heteroC2-10alkinil, C3-10karbociklil, 3-14 člani heterociklil, C6-14aril, i 5-14 člane heteroaril grupe, pri čemu je svaki alkil, alkenil, alkinil, heteroalkil, heteroalkenil, heteroalkinil, karbociklil, heterociklil, aralkil, aril, i heteroaril nezavisno supstituisan sa 0, 1, 2, 3, 4, ili 5 R<dd>grupa, i pri čemu su R<aa>, R<bb>, R<cc>, i R<dd>kao što je ovde definisano. Zaštitne grupe azota su dobro poznate u struci i uključuju one koje su detaljno opisane u Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999.
[0364] Na primer, zaštitne grupe azota kao što su amido grupe (npr. -C(=O)R<aa>) uključuju, ali nisu ograničene na, formamid, acetamid, hloroacetamid, trihloroacetamid, trifluoroacetamid, fenilacetamid, 3-fenilpropanamid, pikolinamid, 3-piridilkarboksamid, derivat N-benzoilfenilalanila, benzamid, p-fenilbenzamid, o-nitofenilacetamid, o-nitrofenoksiacetamid, acetoacetamid, (N'-ditiobenziloksiacilamino)acetamid, 3-(p-hidroksifenil)propanamid, 3-(onitrofenil)propanamid, 2-metil-2-(o-nitrofenoksi)propanamid, 2-metil-2-(ofenilazofenoksi)propanamid, 4-hlorobutanamid, 3-metil-3-nitrobutanamid, o-nitrocinamid, derivat N-acetilmetionina, o-nitrobenzamid i o-(benzoiloksimetil)benzamid.
[0365] Zaštitne grupe azota kao što su karbamat grupe (npr. -C(=O)OR<aa>) uključuju, ali nisu ograničene na, metil karbamat, etil karbamat, 9-fluorenilmetil karbamat (Fmoc), 9-(2-
1
sulfo)fluorenilmetil karbamat, 9-(2,7-dibromo)fluoroenilmetil karbamat, 2,7-di-t-butil-[9-(10,10-diokso-10,10,10,10-tetrahidrotioksantil)]metil karbamat (DBD-Tmoc), 4-metoksifenacil karbamat (Phenoc), 2,2,2-trihloroetil karbamat (Troc), 2-trimetilsililetil karbamat (Teoc), 2-feniletil karbamat (hZ), 1-(1-adamantil)-1-metiletil karbamat (Adpoc), 1,1-dimetil-2-haloetil karbamat, 1,1-dimetil-2,2-dibromoetil karbamat (DB-t-BOC), 1,1-dimetil-2,2,2-trihloroetil karbamat (TCBOC), 1-metil-t-(4-bifenilil)etil karbamat (Bpoc), 1-(3,5-di-t-butilfenil)-1-metiletil karbamat (t-Bumeoc), 2-(2'- i 4'-piridil)etil karbamat (Pyoc), 2-(N,N-dicikloheksilkarboksamido)etil karbamat, t-butil karbamat (BOC ili Boc), 1-adamantil karbamat (Adoc), vinil karbamat (Voc), alil karbamat (Alloc), 1-izopropilalil karbamat (Ipaoc), cinamil karbamat (Coc), 4-nitrocinamil karbamat (Noc), 8-kvinolil karbamat, N-hidroksipiperidinil karbamat, alkilditio karbamat, benzil karbamat (Cbz), p-metoksibenzil karbamat (Moz), pnitobenzil karbamat, p-bromobenzil karbamat, p-hlorobenzil karbamat, 2,4-dihlorobenzil karbamat, 4-metilsulfinilbenzil karbamat (Msz), 9-antrilmetil karbamat, difenilmetil karbamat, 2-metiltioetil karbamat, 2-metilsulfoniletil karbamat, 2-(p-toluensulfonil)etil karbamat, [2-(1,3-ditianil)]metil karbamat (Dmoc), 4-metiltiofenil karbamat (Mtpc), 2,4-dimetiltiofenil karbamat (Bmpc), 2-fosfonioetil karbamat (Peoc), 2-trifenilfosfonioizopropil karbamat (Ppoc), 1,1-dimetil-2-cijanoetil karbamat, m-hloro-p-aciloksibenzil karbamat, p-(dihidroksiboril)benzil karbamat, 5-benzizoksazolilmetil karbamat, 2-(trifluorometil)-6-hromonilmetil karbamat (Tcroc), m-nitrofenil karbamat, 3,5-dimetoksibenzil karbamat, o-nitrobenzil karbamat, 3,4-dimetoksi-6-nitrobenzil karbamat, fenil(o-nitrofenil)metil karbamat, t-amil karbamat, S-benzil tiokarbamat, p-cijanobenzil karbamat, ciklobutil karbamat, cikloheksil karbamat, ciklopentil karbamat, ciklopropilmetil karbamat, p-deciloksibenzil karbamat, 2,2-dimetoksiacilvinil karbamat, o-(N,N-dimetilkarboksamido)benzil karbamat, 1,1-dimetil-3-(N,N-dimetilkarboksamido)propil karbamat, 1,1-dimetilpropinil karbamat, di(2-piridil)metil karbamat, 2-furanilmetil karbamat, 2-jodoetil karbamat, izoborinil karbamat, izobutil karbamat, izonikotinil karbamat, p-(p'-metoksifenilazo)benzil karbamat, 1-metilciklobutil karbamat, 1-metilcikloheksil karbamat, 1-metil-1-ciklopropilmetil karbamat, 1-metil-1-(3,5-dimetoksifenil)etil karbamat, 1-metil-1-(pfenilazofenil)etil karbamat, 1-metil-1-feniletil karbamat, 1-metil-1-(4-piridil)etil karbamat, fenil karbamat, p-(fenilazo)benzil karbamat, 2,4,6-tri-t-butilfenil karbamat, 4-(trimetilamonijum)benzil karbamat, i 2,4,6-trimetilbenzil karbamat.
[0366] Zaštitne grupe azota kao što su sulfonamid grupe (npr. -S(=O)2R<aa>) uključuju, ali nisu ograničene na, p-toluensulfonamid (Ts), benzensulfonamid, 2,3,6-trimetil-4-metoksibenzensulfonamid (Mtr), 2,4,6-trimetoksibenzensulfonamid (Mtb), 2,6-dimetil-4-metoksibenzensulfonamid (Pme), 2,3,5,6-tetrametil-4-metoksibenzensulfonamid (Mte), 4-metoksibenzensulfonamid (Mbs), 2,4,6-trimetilbenzensulfonamid (Mts), 2,6-dimetoksi-4-
1
metilbenzensulfonamid (iMds), 2,2,5,7,8-pentametilhroman-6-sulfonamid (Pmc), metansulfonamid (Ms), β-trimetilsililetansulfonamid (SES), 9-antracensulfonamid, 4-(4',8'-dimetoksinaftilmetil)benzensulfonamid (DNMBS), benzilsulfonamid, trifluorometilsulfonamid, i fenacilsulfonamid.
[0367] Druge zaštitne grupe azota uključuju, ali nisu ograničene na, derivat fenotiazinil-(10)-acila, derivat N'-p-toluensulfonilaminoacila, derivat N'-fenilaminotioacila, derivat N-benzoilfenilalanila, derivat N-acetilmetionina, 4,5-difenil-3-oksazolin-2-on, N-ftalimid, N-ditiasukcinimid (Dts), N-2,3-difenilmaleimid, N-2,5-dimetilpirol, adukt N-1,1,4,4-tetrametildisililazaciklopentana (STABASE), 5-supstituisani 1,3-dimetil-1,3,5-triazacikloheksan-2-on, 5-supstituisani 1,3-dibenzil-1,3,5-triazacikloheksan-2-on, 1- supstituisani 3,5-dinitro-4-piridon, N-metilamin, N-alilamin, N-[2-(trimetilsilil)etoksi]metilamin (SEM), N-3-acetoksipropilamin, N-(1-izopropil-4-nitro-2-okso-3-piroolin-3-il)amin, kvaternarne amonijumove soli, N-benzilamin, N-di(4-metoksifenil)metilamin, N-5-dibenzosuberilamin, N-trifenilmetilamin (Tr), N-[(4-metoksifenil)difenilmetil]amin (MMTr), N-9-fenilfluorenilamin (PhF), N-2,7-dihloro-9-fluorenilmetilenamin, N-ferocenilmetilamino (Fcm), N-2-pikolilamino N'-oksid, N-1,1-dimetiltiometilenamin, N-benzilidenamin, N-p-metoksibenzilidenamin, N-difenilmetilenamin, N-[(2-piridil)mezitil]metilenamin, N-(N',N'-dimetilaminometilen)amin, N,N'-izopropilidendiamin, N-p-nitrobenzilidenamin, N-salicilidenamin, N-5-hlorosalicilidenamin, N-(5-hloro-2-hidroksifenil)fenilmetilenamin, N-cikloheksilidenamin, N-(5,5-dimetil-3-okso-1-cikloheksenil)amin, derivat N-borana, derivat N-difenilborinske kiseline, N-[fenil(pentaacilhromijum- ili tungsten)acil]amin, N-bakar helat, N-cink helat, N-nitroamin, N-nitrozoamin, amin N-oksid, difenilfosfinamid (Dpp), dimetiltiofosfinamid (Mpt), difeniltiofosfinamid (Ppt), dialkil fosforamidati, dibenzil fosforamidat, difenil fosforamidat, benzensulfenamid, o-nitrobenzensulfenamid (Nps), 2,4-dinitrobenzensulfenamid, pentahlorobenzensulfenamid, 2-nitro-4-metoksibenzensulfenamid, trifenilmetilsulfenamid, i 3-nitropiridinsulfenamid (Npys).
[0368] U određenim primerima izvođenja, supstituent prisutan na atomu kiseonika je zaštitna grupa kiseonika (koja se ovde takođe označava kao "hidroksil zaštitna grupa"). Zaštitne grupe kiseonika uključuju, ali nisu ograničene na, -R<aa>, -N(R<bb>)2, -C(=O)SR<aa>, -C(=O)R<aa>, -CO2R<aa>, -C(=O)N(R<bb>)2, -C(=NR<bb>)R<aa>, -C(=NR<bb>)OR<aa>, -C(=NR<bb>)N(R<bb>)2, -S(=O)R<ee>, -SO2R<aa>, -Si(R<aa>)3, -P(R<cc>)2, -P(R<cc>)3<+>X-, -P(OR<cc>)2, -P(OR<cc>)3<+>X-, -P(=O)(R<aa>)2, -P(=O)(OR<cc>)2, i -P(=O)(N(R<bb>)2)2, pri čemu su X-, R<aa>, R<bb>, i R<cc>kao što je ovde definisano. Zaštitne grupe kiseonika su dobro poznate u struci i uključuju one koje su detaljno opisane u Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999.
1
[0369] Primeri zaštitnih grupa kiseonika uključuju, ali nisu ograničene na, metil, metoksilmetil (MOM), metiltiometil (MTM), t-butiltiometil, (fenildimetilsilil)metoksimetil (SMOM), benziloksimetil (BOM), p-metoksibenziloksimetil (PMBM), (4-metoksifenoksi)metil (p-AOM), guaiakolmelhil (GUM), t-butoksimetil, 4-penteniloksimetil (POM), siloksimetil, 2-metoksietoksimetil (MEM), 2,2,2-trihloroetoksimetil, bis(2-hloroetoksi)melhil, 2-(trimetilsilil)etoksimetil (SEMOR), tetrahidropiranil (THP), 3 bromotetrahidropiranil, tetrahidrotiopiranil, 1-metoksicikloheksil, 4-metoksitetrahidropiranil (MTHP), 4-metoksitetrahidrotiopiranil, 4-metoksitetrahidrotiopiranil S,S-dioksid, 1-[(2-hloro-4-metil)fenil]-4-metoksipiperidin-4-il (CTMP), 1,4-dioksan-2-il, tetrahidrofuranil, tetrahidrotiofuranil, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-oktahidro-7,8,8-trimetil-4,7-metanobenzofuran-2-il, 1-etoksietil. 1-(2-hloroetoksi)etil, 1-metil-1-metoksietil, 1-metil-1-benziloksietil, 1-metil-1-benziloksi-2-fluoroetil, 2,2,2-trihloroetil, 2-trimetilsililetil, 2-(fenilselenil)etil, t-butil, alil, p-hlorofenil, p-metoksifenil, 2,4-dinitrofenil, benzil (Bn), p-metoksibenzil, 3,4-dimetoksibenzil, o-nitrobenzil, p-nitrobenzil, phalobenzil, 2,6-dihlorobenzil, p-cijanobenzil, p-fenilbenzil, 2-pikolil, 4-pikolil, 3-metil-2-pikolil N-oksid, difenilmetil, p,p'-dinitrobenzhidril, 5-dibenzosuberil, trifenilmetil, α-naftildifenilmetil, pmetoksifenildifenilmetil, di(p-metoksifenil)fenilmetil, tri(p-metoksifenil)metil, 4-(4'-bromofenaciloksifenil)difenilmetil, 4,4',4"-tris(4,5-dihloroftalimidofenil)metil, 4,4',4"-tris(levulinoiloksifenil)metil, 4,4',4"-tris(benzoiloksifenil)metil, 3-(imidazol-1-il)bis(4',4"-dimetoksifenil)metil, 1,1-bis(4-metoksifenil)-1'-pirenilmetil, 9-antril, 9-(9-fenil)ksantenil, 9-(9-fenil-10-okso)antril, 1,3-benzoditiolan-2-il, benzizotiazolil S,S-dioksido, trimetilsilil (TMS), trietilsilil (TES), triizopropilsilil (TIPS), dimetilizopropilsilil (IPDMS), dietilizopropilsilil (DEIPS), dimetilteksilsilil, t-butildimetilsilil (TBDMS), t-butildifenilsilil (TBDPS), tribenzilsilil, tri-p-ksililsilil, trifenilsilil, difenilmetilsilil (DPMS), t-butilmetoksifenilsilil (TBMPS), format, benzoilformat, acetat, hloroacetat, dihloroacetat, trihloroacetat, trifluoroacetat, metoksiacetat, trifenilmetoksiacetat, fenoksiacetat, p-hlorofenoksiacetat, 3-fenilpropionat, 4-oksopentanoat (levulinat), 4,4-(etilenditio)pentanoat (levulinoilditioacetal), pivaloat, adamantoat, krotonat, 4-metoksikrotonat, benzoat, p-fenilbenzoat, 2,4,6-trimetilbenzoat (mezitoat), metil karbonat, 9-fluorenilmetil karbonat (Fmoc), etil karbonat, 2,2,2-trihloroetil karbonat (Troc), 2-(trimetilsilil)etil karbonat (TMSEC), 2-(fenilsulfonil) etil karbonat (Psec), 2-(trifenilfosfonio) etil karbonat (Peoc), izobutil karbonat, vinil karbonat, alil karbonat, t-butil karbonat (BOC ili Boc), p-nitrofenil karbonat, benzil karbonat, p-metoksibenzil karbonat, 3,4-dimetoksibenzil karbonat, o-nitrobenzil karbonat, p-nitrobenzil karbonat, S-benzil tiokarbonat, 4-etoksi-1-naftil karbonat, metil ditiokarbonat, 2-jodobenzoat, 4-azidobutirat, 4-nitro-4-metilpentanoat, o-(dibromometil)benzoat, 2-formilbenzensulfonat, 2-(metiltiometoksi)etil, 4-(metiltiometoksi)butirat, 2-(metiltiometoksimetil)benzoat, 2,6-dihloro-4-metilfenoksiacetat, 2,6-dihloro-4-(1,1,3,3-
1
tetrametilbutil)fenoksiacetat, 2,4-bis(1,1-dimetilpropil)fenoksiacetat, hlorodifenilacetat, izobutirat, monosukcinoat, (E)-2-metil-2-butenoat, o-(metoksiacil)benzoat, a-naftoat, nitrat, alkil N,N,N',N'-tetrametilfosforodiamidat, alkil N-fenilkarbamat, borat, dimetilfosfinotioil, alkil 2,4-dinitrofenilsulfenat, sulfat, metansulfonat (mezilat), benzilsulfonat, i tozilat (Ts).
[0370] U određenim primerima izvođenja, supstituent prisutan na atomu sumpora je zaštitna grupa sumpora (takođe se označava kao "tiol zaštitna grupa"). Zaštitne grupe sumpora uključuju, ali nisu ograničene na, -R<aa>, -N(R<bb>)2, -C(=O)SR<aa>, -C(=O)R<aa>, -CO2R<aa>, -C(=O)N(R<bb>)2, -C(=NR<bb>)R<aa>, -C(=NR<bb>)OR<aa>, -C(=NR<bb>)N(R<bb>)2, -S(=O)R<ee>, -SO2R<aa>, -Si(R<aa>)3, -P(R<cc>)2, -P(R<cc>)3<+>X-, -P(OR<cc>)2, -P(OR<cc>)3<+>X-, -P(=O)(R<aa>)2, -P(=O)(OR<cc>)2, i -P(=O)(N(R<bb>)2)2, pri čemu su R<aa>, R<bb>, i R<cc>kao što je ovde definisano. Zaštitne grupe sumpora su dobro poznate u struci i uključuju one koje su detaljno opisane u Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999.
[0371] "Kontrajon" ili "anjonski kontrajon" je negativno naelektrisana grupa asocirana sa pozitivno naelektrisanom grupom kako bi se održala električna neutralnost. Anjonski kontrajon može biti monovalentan (tj. koji uključuje jedno formalno negativno naelektrisanje). Anjonski kontrajon takođe može biti multivalentan (tj. koji uključuje više od jednog formalnog negativnog naelektrisanja), kao što je dvovalentan ili trovalentan. Primeri kontrajona uključuju halogenidne jone (npr. F-, Cl-, Br-, I-), NO3-, ClO4-, OH-, H2PO4-, HCO3-, HSO4-, sulfonatne jone (npr. metansulfonat, trifluorometansulfonat, p-toluensulfonat, benzensulfonat, 10-kamfor sulfonat, naftalen-2-sulfonat, naftalen-1-sulfonska kiselina-5-sulfonat, etan-1-sulfonska kiselina-2-sulfonat, i slično), karboksilatne jone (npr. acetat, propanoat, benzoat, glicerat, laktat, tartarat, glikolat, glukonat, i slično), BF4-, PF4-, PF6-, AsF6-, SbF6-, B[3,5-(CF3)2C6H3]4]-, B(C6F5)4-, BPh4-, Al(OC(CF3)3)4-, i karboran anjone (npr. CB11H12<->ili (HCB11Me5Br6)-). Primeri kontrajona koji mogu biti multivalentni uključuju CO3<2->, HPO4<2->, PO4<3->, B4O7<2->, SO4<2->, S2O3<2->, karboksilatne anjone (npr. tartarat, citrat, fumarat, maleat, malat, malonat, glukonat, sukcinat, glutarat, adipat, pimelat, suberat, azelat, sebakat, salicilat, ftalate, aspartat, glutamat, i slično), i karborane.
[0372] Kao što se ovde upotrebljava, upotreba fraze "najmanje jedna instanca" označava 1, 2, 3, 4, ili više instanci, ali takođe obuhvata opseg, npr. od 1 do 4, od 1 do 3, od 1 do 2, od 2 do 4, od 2 do 3. ili od 3 do 4 instance, uključujući.
[0373] Ovi i drugi primeri supstituenata su detaljnije opisani širom objave. Nije namenjeno da pronalazak bude ograničen na bilo koji način prethodnim navođenjem primera supstituenata.
[0374] Kao što se ovde upotrebljava, termin "so" označavaa bilo koju i sve soli, i obuhvata farmaceutski prihvatljive soli.
[0375] Termin "farmaceutski prihvatljiva so" označava one soli koje su, u okviru zdrave medicinske procene, pogodne za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudi i nižih životinja bez
1 1
nepotrebne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora, i slično, i srazmerne su razumnom korist/rizik odnosu. Farmaceutski prihvatljive soli su dobro poznate u struci. Na primer, Berge et al. detaljno opisuju farmaceutski prihvatljive soli u J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19. Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja iz ovog pronalaska uključuju one izvedene iz pogodnih neorganskih i organskih kiselina i baza. Primeri farmaceutski prihvatljivih, netoksičnih kiselih adicionih soli su soli amino grupe formirane sa neorganskim kiselinama, kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, fosforna kiselina, sumporna kiselina, i perhlorna kiselina ili sa organskim kiselinama, kao što su sirćetna kiselina, oksalna kiselina, maleinska kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, jantarna kiselina, ili malonska kiselina ili upotrebom drugih postupaka koji su poznati u struci, kao što je jonska razmena. Druge farmaceutski prihvatljive soli uključuju adipat, alginat, askorbat, aspartat, benzensulfonat, benzoat, bisulfat, borat, butirat, kamforat, kamforsulfonat, citrat, ciklopentanpropionat, diglukonat, dodecilsulfat, etansulfonat, format, fumarat, glukoheptonat, glicerofosfat, glukonat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, hidrojodid, 2-hidroksi-etansulfonat, laktobionat, laktat, laurat, lauril sulfat, malat, maleat, malonat, metansulfonat, 2-naftalensulfonat, nikotinat, nitrat, oleat, oksalat, palmitat, pamoat, pektinat, persulfat, 3-fenilpropionat, fosfat, pikrat, pivalat, propionat, stearat, sukcinat, sulfat, tartarat, tiocijanat, p-toluensulfonat, undekanoat, soli valerata, i slično. Soli izvedene iz odgovarajućih baza uključuju soli alkalnih metala, zemnoalkalnih metala, amonijuma, i N<+>(C1-4alkil)4<->soli. Reprezentativne soli alkalnih ili zemnoalkalnih metala uključuju natrijum, litijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, i slično. Dodatno farmaceutski prihvatljive soli uključuju, kada je prikladno, netoksični amonijum, kvaternarni amonijum, i amin katjone formirane upotrebom kontrajona kao što su halid, hidroksid, karboksilat, sulfat, fosfat, nitrat, niži alkil sulfonat, i aril sulfonat.
Biološki aktivni agensi
[0376] Ova objava razmatra da LNP koje su ovde obezbeđene i/ili različite kombinovane terapije koje su ovde obezbeđene mogu da se upotrebljavaju za isporuku različitih agenasa subjektu. Takvi agensi će tipično biti biološki aktivni agensi. Biološki aktivni agensi su agensi koji imaju efekat in vivo, i poželjno koristan efekat, kao što je poželjna imunska modulacija, imunska stimulacija, imunska inhibicija, ubijanje ćelija, očuvanje ćelija, modifikovana ekspresija gena, zamena proteina, i slično. Biološki aktivni agensi uključuju ali nisu ograničeni na profilaktičke agense, terapijske agense, i dijagnostičke agense. Biološki aktivni agensi uključuju imunomodulatorne agense kao što su imunostimulatorni ili imunoinhibitorni agensi, antigeni, antitela i fragmenti antitela kao što su antigen-vezujući fragmenti antitela, adjuvansi, citokini kao što su interleukini,
1 2
antibakterijski agensi, antivirusni agensi, antigljivični agensi, antiparazitski agensi, antikancerski agensi, antiinflamatorni agensi, i slično.
[0377] Takvi agensi mogu biti, bez ograničenja, nukleinske kiseline, proteini ili peptidi, mala organska jedinjenja, ugljeni hidrati i/ili polisaharidi, i slično. Mogu se upotrebljavati za ekspresiju nukleinskih kiselina i/ili proteina u ćelijama, posebno u ćelijama koje imaju nedostatak takvih nukleinskih kiselina ili proteina ili imaju mutirane verzije takvih nukleinskih kiselina ili proteina. Mogu se upotrebljavati za introdukovanje i ekspresiju nukleinskih kiselina ili proteina koji nisu nativni za ćeliju ili organizam, kao što se može učiniti na primer u kontekstu protokola imunizacije ili vakcinacije. U tom pogledu, nukleinska kiselina ili protein mogu biti strani subjektu kome se primenjuju (npr. ne javljaju se u prirodi kod takvog subjekta, ili se uopšte ne javljaju u prirodi), i primenjuju se subjektu da indukuju i/ili pojačaju imunski odgovor na takvu nukleinsku kiselinu ili protein. Nukleinske kiseline koje su ovde obezbeđene mogu se upotrebljavati u tu svrhu.
[0378] Drugi biološki aktivni agensi se mogu upotrebljavati sami ili zajedno sa takvim nukleinskim kiselinama ili proteinima, uključujući formulisane zajedno sa takvim nukleinskim kiselinama ili proteinima, uključujući formulisane u LNP iz ove objave.
Nukleinske kiseline
[0379] Kao što se ovde upotrebljava, termin "nukleinska kiselina" označava jedinjenje koje sadrži nukleobazu i kiselu funkcionalnu grupu, npr. nukleozid, nukleotid, ili polimer nukleotida. Tipično, polimerne nukleinske kiseline, npr. molekuli nukleinske kiseline koji sadrže tri ili više nukleotida su linearni molekuli, u kojima su susedni nukleotidi međusobno povezani putem fosfodiestarske veze. U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" označava pojedinačne ostatke nukleinske kiseline (npr. nukleotide i/ili nukleozide). U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" označava oligonukleotidni lanac koji sadrži tri ili više pojedinačnih nukleotidnih ostataka. Kao što se ovde upotrebljava, termini "oligonukleotid" i "polinukleotid" mogu se upotrebljavati naizmenično da označe polimer nukleotida (npr. niz od najmanje tri nukleotida). U nekim primerima izvođenja, "nukleinska kiselina" obuhvata RNK kao i jednolančanu i/ili dvolančanu DNK. Sekvenca nukleinske kiseline je predstavljena u smeru od 5' do 3' osim ukoliko nije drugačije naznačeno.
[0380] Nukleinske kiseline uključuju bilo koje jedinjenje i/ili supstancu koja sadrži polimer nukleotida. Ovi polimeri se označavaju kao polinukleotidi. Nukleinske kiseline mogu biti ili mogu uključivati, na primer, ribonukleinske kiseline (RNK), dezoksiribonukleinske kiseline (DNK), treozne nukleinske kiseline (TNA), glikolne nukleinske kiseline (GNA), peptidne nukleinske kiseline (PNA), zaključane nukleinske kiseline (LNA, uključujući LNA koja ima β-D-ribo
1
konfiguraciju, α-LNA koja ima α-L-ribo konfiguraciju (dijastereomer LNA), 2'-amino-LNA koja ima 2'-amino funkcionalizaciju, i 2'-amino-α-LNA koja ima 2'-amino funkcionalizaciju), etilenske nukleinske kiseline (ENA), cikloheksenilne nukleinske kiseline (CeNA) ili njihove himere ili kombinacije.
[0381] Nukleinske kiseline se mogu javljati u prirodi, na primer, u kontekstu genoma, transkripta, iRNK, tRNK, rRNK, siRNA, snRNA, plazmida, kozmida, hromozoma, hromatida, ili drugog molekula nukleinske kiseline koji se javlja u prirodi. S druge strane, molekul nukleinske kiseline može biti molekul koji se ne javlja u prirodi, npr. rekombinantna DNK ili RNK, veštački hromozom, projektovani genom, ili njegov fragment, ili sintetička DNK, RNK, DNK/RNK hibrid, ili onaj koji uključuje nukleotide ili nukleozide koji se ne javljaju u prirodi. Nukleinske kiseline mogu biti prečišćene iz prirodnih izvora, proizvedene upotrebom rekombinantnih sistema ekspresije i opciono prečišćene, hemijski sintetisane, itd.
[0382] Pored toga, termini "nukleinska kiselina", "DNK", "RNK" i/ili slični termini uključuju analoge nukleinske kiseline, tj. analoge koji imaju drugu, a ne fosfodiestarsku okosnicu.
[0383] Tamo gde je prikladno, npr. u slučaju hemijski sintetisanih molekula, nukleinske kiseline mogu da sadrže analoge nukleozida kao što su analozi koji imaju hemijski modifikovane baze ili šećere, i modifikacije okosnice. U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je ili sadrži prirodne nukleozide (npr. adenozin, timidin, guanozin, citidin, uridin, dezoksiadenozin, dezoksitimidin, dezoksiguanozin, i dezoksicitidin); analoge nukleozida (npr.2-aminoadenozin, 2-tiotimidin, inozin, pirolo-pirimidin, 3-metil adenozin, 5-metilcitidin, 2-aminoadenozin, C5-bromouridin, C5-fluorouridin, C5-jodouridinil, C5-propinil-uridin, C5-propinil-citidin, C5-metilcitidin, 2-aminoadenozin, 7-deazaadenozin, 7-deazaguanozin, 8-oksoadenozin, 8-oksoguanozin, O(6)-metilguanin, i 2-tiocitidin); hemijski modifikovane baze; biološki modifikovane baze (npr. metilovane baze); interkalirane baze; modifikovane šećere (npr. 2'-fluororiboza, riboza, 2'-dezoksiriboza, arabinoza, i heksoza); i/ili modifikovane fosfatne grupe (npr. fosforotioati i 5'-N-fosforamiditne veze).
[0384] "Nukleozid" označava jedinjenje koje sadrži molekul šećera (npr. pentozu ili ribozu) ili njegov derivat u kombinaciji sa organskom bazom (npr. purinom ili pirimidinom) ili njenim derivatom (koja se ovde takođe označava kao "nukleobaza"). "Nukleotid" označava nukleozid, uključujući fosfatnu grupu. Modifikovani nukleotidi se mogu sintetisati bilo kojim korisnim postupkom, kao što je, na primer, hemijski, enzimski, ili rekombinantno, da uključi jedan ili više modifikovanih ili neprirodnih nukleozida. Polinukleotidi mogu da sadrže region ili regione povezanih nukleozida. Takvi regioni mogu imati promenljive veze okosnice. Veze mogu biti standardne fosfdioestarske veze, u kom slučaju bi polinukleotidi sadržali regione nukleotida.
1 4
[0385] Modifikovano sparivanje baza nukleotida obuhvata ne samo standardne bazne parove adenozin-timin, adenozin-uracil, ili guanozin-citozin, već i bazne parove formirane između nukleotida i/ili modifikovanih nukleotida koji sadrže nestandardne ili modifikovane baze, pri čemu aranžman donora vodonične veze i akceptora vodonične veze dozvoljava vodoničnu vezu između nestandardne baze i standardne baze ili između dve komplementarne nestandardne bazne strukture. Jedan primer takvog nestandardnog sparivanja baza je sparivanje baza između modifikovanog nukleotida inozina i adenina, citozina ili uracila. Bilo koja kombinacija baze/šećera ili linkera može biti inkorporisana u polinukleotide iz predmetne objave.
[0386] Stručnjak sa iskustvom će ceniti da će, osim tamo gde je drugačije naznačeno, polinukleotidne sekvence navedene u trenutnoj prijavi navoditi "T" u reprezentativnoj DNK sekvenci, ali će tamo gde sekvenca predstavlja RNK, "T" biti zamenjeni sa "U".
[0387] Modifikacije polinukleotida (npr. RNK polinukleotida, kao što su iRNK polinukleotidi) koje su korisne u terapijskim agensima koji su ovde opisani uključuju, ali nisu ograničene na sledeće: 2-metiltio-N6-(cis-hidroksiizopentenil)adenozin; 2-metiltio-N6-metiladenozin; 2-metiltio-N6-treonil karbamoiladenozin; N6-glicinilkarbamoiladenozin; N6-izopenteniladenozin; N6-metiladenozin; N6-treonilkarbamoiladenozin; 1.2'.O-dimetiladenozin; 1-metiladenozin; 2'-O-metiladenozin; 2'-O-riboziladenozin (fosfat); 2-metiladenozin; 2-metiltio-N6 izopenteniladenozin; 2-metiltio-N6-hidroksinorvalil karbamoiladenozin; 2'-O-metiladenozin; 2'-O-riboziladenozin (fosfat); izopenteniladenozin; N6-(cis-hidroksiizopentenil)adenozin; N6,2'-O-dimetiladenozin; N6,2'-O-dimetiladenozin; N6,N6,2-O-trimetiladenozin; N6,N6-dimetiladenozin; N6-acetiladenozin; N6-hidroksinorvalilkarbamoiladenozin; N6-metil-N6-treonilkarbamoiladenozin; 2-metiladenozin; 2-metiltio-N6-izopenteniladenozin; 7-deazaadenozin; N1-metiladenozin; N6, N6 (dimetil)adenin; N6-cis-hidroksi-izopentenil-adenozin; αtio-adenozin; 2 (amino)adenin; 2 (aminopropil)adenin; 2 (metiltio) N6 (izopentenil)adenin; 2-(alkil)adenin; 2-(aminoalkil)adenin; 2-(aminopropil)adenin; 2-(halo)adenin; 2-(halo)adenin; 2-(propil)adenin; 2'-amino-2'-dezoksi-ATP; 2'-azido-2'-dezoksi-ATP; 2'-dezoksi-2'-aaminoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-a-azidoadenozin TP; 6 (alkil)adenin; 6 (metil)adenin; 6-(alkil)adenin; 6-(metil)adenin; 7 (deaza)adenin; 8 (alkenil)adenin; 8 (alkinil)adenin; 8 (amino)adenin; 8 (tioalkil)adenin; 8-(alkenil)adenin; 8-(alkil)adenin; 8-(alkinil)adenin; 8-(amino)adenin; 8-(halo)adenin; 8-(hidroksil)adenin; 8-(tioalkil)adenin; 8-(tiol)adenin; 8-azidoadenozin; aza adenin; deaza adenin; N6 (metil)adenin; N6-(izopentil)adenin; 7-deaza-8-azaadenozin; 7-metiladenin; I-deazaadenozin TP; 2'fluoro-N6-Bz-dezoksiadenozin TP; 2'-OMe-2-amino-ATP; 2'O-metil-N6-Bz-dezoksiadenozin TP; 2'-a-etiniladenozin TP; 2-aminoadenin; 2-aminoadenozin TP; 2-amino-ATP; 2'-a-trifluorometiladenozin TP; 2-azidoadenozin TP; 2'-betiniladenozin TP; 2-bromoadenozin TP; 2'-b-trifluorometiladenozin TP; 2-hloroadenozin TP; 2'-
1
dezoksi-2',2'-difluoroadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-a-merkaptoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-atiometoksiadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-aminoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-azidoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-bromoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-hloroadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-bfluoroadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-jodoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-merkaptoadenozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-tiometoksiadenozin TP; 2-fluoroadenozin TP; 2-jodoadenozin TP; 2-merkaptoadenozin TP; 2-metoksi-adenin; 2-metiltio-adenin; 2-trifluorometiladenozin TP; 3-deaza-3-bromoadenozin TP; 3-deaza-3-hloroadenozin TP; 3-deaza-3-tluoroadenozin TP; 3-deaza-3-jodoadenozin TP; 3-deazaadenozin TP; 4'-azidoadenozin TP; 4'-karbociklični adenozin TP; 4'-etiniladenozin TP; 5'-homo-adenozin TP; 8-aza-ATP; 8-bromo-adenozin TP; 8-trifluorometiladenozin TP; 9-deazaadenozin TP; 2-aminopurin; 7-deaza-2,6-diaminopurin; 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurin; 7-deaza-8-aza-2-aminopurin; 2,6-diaminopurin; 7-deaza-8-azaadenin, 7-deaza-2-aminopurin; 2-tiocitidin: 3-metilcitidin; 5-formilcitidin; 5-hidroksimetilcitidin; 5-metilcitidin; N4-acetilcitidin; 2'-O-metilcitidin; 2'-O-metilcitidin; 5.2'-O-dimetilcitidin; 5-formil-2'-O-metilcitidin; lizidin; N4,2'-O-dimetilcitidin; N4-acetil-2'-O-melhilcitidin; N4-metilcitidin; N4,N4-dimetil-2'-OMe-citidin TP; 4-metilcitidin; 5-aza-citidin; pseudo-izo-citidin; pirolo-citidin; α-tio-citidin; 2-(tio)citozin; 2'-amino-2'-dezoksi-CTP; 2'-azido-2'-dezoksi-CTP; 2'-dezoksi-2'-a-aminocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-a-azidocitidin TP; 3 (deaza) 5 (aza)citozin; 3 (metil)citozin; 3-(alkil)citozin; 3-(deaza) 5 (aza)citozin; 3-(metil)citidin; 4,2'-0-dimetilcitidin; 5 (halo)citozin; 5 (metil)citozin; 5 (propinil)citozin; 5 (trifluorometil)citozin; 5-(alkil)citozin; 5-(alkinil)citozin; 5-(halo)citozin; 5-(propinil)citozin; 5-(trifluorometil)citozin; 5-bromo-citidin; 5-jodo-citidin; 5-propinil citozin; 6-(azo)citozin; 6-aza-citidin; aza citozin; deaza citozin; N4 (acetil)citozin; 1-metil-1-deaza-pseudoizocitidin; 1-metil-pseudoizocitidin; 2-metoksi-5-metilcitidin; 2-metoksi-citidin; 2-tio-5-metil-citidin; 4-metoksi-1-metil-pseudoizocitidin; 4-metoksipseudoizocitidin; 4-tio-1-metil-1-deaza-pseudoizocitidin; 4-tio-1-metil-pseudoizocitidin; 4-tiopseudoizocitidin; 5-aza-zebularin; 5-metil-zebularin; pirolo-pseudoizocitidin; zebularin; (E)-5-(2-bromo-vinil)citidin TP; 2,2'-anhidro-citidin TP hidrohlorid; 2'fluor-N4-bz-citidin TP; 2'fluoro-N4-acetil-citidin TP; 2'-O-metil-N4-acetil-citidin TP; 2'O-metil-N4-bz-citidin TP; 2'-a-etinilcitidin TP; 2'-a-trifluorometilcitidin TP; 2'-b-etinilcitidin TP; 2'-b-trifluorometilcitidin TP; 2'-dezoksi-2',2'-difluorocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-a-merkaptocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-a-tiometoksicitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-aminocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-azidocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-bromocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-hlorocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-fluorocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-jodocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-merkaptocitidin TP; 2'-dezoksi-2'-b-tiometoksicitidin TP; 2'-O-metil-5-(1-propinil)citidin TP; 3'-etinilcitidin TP; 4'-azidocitidin TP; 4'-karbociklični citidin TP; 4'-etinilcitidin TP; 5-(1-propinil)ara-citidin TP; 5-(2-hloro-fenil)-2-tiocitidin TP; 5-(4-amino-fenil)-2-tiocitidin TP; 5-aminoalil-CTP; 5-cijanocitidin TP; 5-etinilara-citidin TP; 5-etinilcitidin TP; 5'-
1
homo-citidin TP; 5-metoksicitidin TP; 5-tritluorometil-citidin TP; N4-amino-citidin TP; N4-benzoil-citidin TP; pseudoizocitidin; 7-metilguanozin; N2,2'-O-dimetilguanozin; N2-metilguanozin; viozin; 1,2-O-dimetiiguanozin; 1-metilguanozin; 2'-O-metilguanozin; 2'-O-ribozilguanozin (fosfat); 2'-O-metilguanozin; 2'-O-ribozilguanozin (fosfat); 7-aminometil-7-deazaguanozin; 7-cijano-7-deazaguanozin; arhaeozin; metilviozin; N2,7-dimetilguanozin; N2,N2,2'-O-trimetilguanozin; N2,N2,7-trimetilguanozin; N2,N2-dimetilguanozin; N2,7,2'-O-trimetilguanozin; 6-tio-guanozin; 7-deaza-guanozin; 8-okso-guanozin; N1-metil-guanozin; α-tioguanozin; 2 (propil)guanin; 2-(alkil)guanin; 2'-amino-2'-dezoksi-GTP; 2'-azido-2'-dezoksi-GTP; 2'-dezoksi-2'-a-aminoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-a-azidoguanozin TP; 6 (metil)guanin; 6-(alkil)guanin; 6-(metil)guanin; 6-metil-guanozin; 7 (alkil)guanin; 7 (deaza)guanin; 7 (metil)guanin; 7-(alkil)guanin; 7-(deaza)guanin; 7-(metil)guanin; 8 (alkil)guanin; 8 (alkinil)guanin; 8 (halo)guanin; 8 (tioalkil)guanin; 8-(alkenil)guanin; 8-(alkil)guanin; 8-(alkinil)guanin; 8-(amino)guanin; 8-(halo)guanin; 8-(hidroksil)guanin; 8-(tioalkil)guanin; 8-(tiol)guanin; aza guanin; deaza guanin; N (metil)guanin; N-(metil)guanin; 1-metil-6-tio-guanozin; 6-metoksi-guanozin; 6-tio-7-deaza-8-aza-guanozin; 6-tio-7-deaza-guanozin; 6-tio-7-metilguanozin; 7-deaza-8-aza-guanozin; 7-metil-8-okso-guanozin; N2,N2-dimetil-6-tio-guanozin; N2-metil-6-tio-guanozin; 1-Me-GTP; 2'fluoro-N2-izobutil-guanozin TP; 2'O-metil-N2-izobutilguanozin TP; 2-a-etinilguanozin TP; 2'-a-trifluorometilguanozin TP; 2'-b-etinilguanozin TP; 2'-btrifluorometilguanozin TP; 2'-dezoksi-2',2'-difluoroguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-amerkaptoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-a-tiometoksiguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-aminoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-azidoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-bromoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-bhloroguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-fluoroguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-jodoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-merkaptoguanozin TP; 2'-dezoksi-2'-b-tiometoksiguanozin TP; 4'-azidoguanozin TP; 4'-karbociklični guanozin TP; 4'-etinilguanozin TP; 5'-homo-guanozin TP; 8-bromo-guanozin TP; 9-deazaguanozin TP; N2-izobutil-guanozin TP; 1-metilinozin; inozin; 1,2'-O-dimetilinozin; 2'-O-metilinozin; 7-metilinozin; 2'-O-metilinozin; epoksikveuozin; galaktozil-kveuozin; manozilkveuozin; kveuozin; aliamino-timidin; aza timidin; deaza timidin; dezoksi-timidin; 2'-O-metiluridin; 2-tiouridin; 3-metiluridin; 5-karboksimetiluridin; 5-hidroksiuridin; 5-metiluridin; S-taurinometil-2-tiouridin; 5-taurinometiluridin; dihidrouridin; pseudouridin; (3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin; 1-metil-3-(3-amino-5-karboksipropil)pseudouridin; 1-metilpseduouridin; 1-metil-pseudouridin; 2'-O-metiluridin; 2-O-metilpseudouridin; 2'-O-metiluridin; 2-tio-2'-O-metiluridin; 3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin; 3.2'-O-dimetiluridin; 3-metil-pseudo-uridin TP; 4-tiouridin; 5-(karboksihidroksimetil)uridin; 5-(karboksihidroksimetil)uridin metil estar; 5,2'-O-dimetiluridin; 5,6-dihidro-uridin; 5-aminomelhil-2-tiouridin; 5-karbamoilmetil-2-O-metiluridin; 5-karbamoilmetiluridin; 5-karboksihidroksimetiluridin; 5-karboksihidroksimetiluridin metil estar;
1
5-karboksimetilaminometil-2'-O-metiluridin; 5-karboksimetilaminometil-2-tiouridin; 5-karboksimetilaminometil-2-tiouridin; 5-karboksimetilaminometiluridin; 5-karboksimetilaminometiluridin; 5-karbamoilmetiluridin TP; 5-metoksikarbonilmetil-2'-O-metiluridin; 5-metoksikarbonilmetil-2-tiouridin; 5-metoksikarbonilmetiluridin; 5-metiluridin, 5-metoksiuridin; 5-metil-2-tiouridin; 5-metilaminometil-2-selenouridin; 5-metilaminometil-2-tiouridin; 5-metilaminometiluridin; 5-metildihidrouridin; 5-oksisirćetna kiselina-uridin TP; 5-oksisirćetna kiselina-metil estar-uridin TP; N1-metil-pseudouridin; uridin 5-oksisirćetna kiselina; uridin 5-oksisirćetna kiselina metil estar; 3-(3-amino-3-karboksipropil)-uridin TP; 5-(izopentenilaminometil)-2-tiouridin TP; 5-(izo-pentenilaminometil)-2'-O-metiluridin TP; 5-(izopentenilaminometil)uridin TP; 5-propinil uracil; α-tio-uridin; 1 (aminoalkilaminokarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracil; 1 (aminoalkilaminokarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracil; 1 (aminoalkilaminokarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracil; 1 (aminoalkilaminokarboniletilenil)-pseudouracil; 1 (aminokarboniletilenil)-2(tio)-pseudouracil; 1 (aminokarboniletilenil)-2,4-(ditio)pseudouracil; 1 (aminokarboniletilenil)-4 (tio)pseudouracil; 1 (aminokarboniletilenil)-pseudouracil; 1 supstituisani 2(tio)-pseudouracil; 1 supstituisani 2,4-(ditio)pseudouracil; 1 supstituisani 4 (tio)pseudouracil; 1 supstituisani pseudouracil; 1-(aminoalkilaminokarboniletilenil)-2-(tio)-pseudouracil; 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil) pseudouridin TP; 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil)pseudo-UTP; 1-metil-pseudo-UTP; 2 (tio)pseudouracil; 2' dezoksi uridin; 2' fluorouridin; 2-(tio)uracil; 2,4-(ditio)psuedouracil; 2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-guanozin; 2'-amino-2'-dezoksi-UTP; 2'-azido-2'-dezoksi-UTP; 2'-azido-dezoksiuridin TP; 2'-O-metilpseudouridin; 2' dezoksi uridin; 2' fluorouridin; 2'-dezoksi-2'-a-aminouridin TP; 2'-dezoksi-2'-a-azidouridin TP; 2-metilpseudouridin; 3 (3 amino-3 karboksipropil)uracil; 4 (tio)pseudouracil; 4-(tio)pseudouracil; 4-(tio)uracil; 4-tiouracil; 5 (1,3-diazol-1-alkil)uracil; 5 (2-aminopropil)uracil; 5 (aminoalkil)uracil; 5 (dimetilaminoalkil)uracil; 5 (guanidiniumalkil)uracil; 5 (metoksikarbonilmetil)-2-(tio)uracil; 5 (metoksikarbonil-metil)uracil; 5 (metil) 2 (tio)uracil; 5 (metil) 2.4 (ditio)uracil; 5 (metil) 4 (tio)uracil; 5 (metilaminometil)-2 (tio)uracil; 5 (metilaminometil)-2,4 (ditio)uracil; 5 (metilaminometil)-4 (tio)uracil; 5 (propinil)uracil; 5 (trifluorometil)uracil; 5-(2-aminopropil)uracil; 5-(alkil)-2-(tio)pseudouracil; 5-(alkil)-2,4 (ditio)pseudouracil; 5-(alkil)-4 (tio)pseudouracil; 5-(alkil)pseudouracil; 5-(alkil)uracil; 5-(alkinil)uracil; 5-(alilamino)uracil; 5-(cijanoalkil)uracil; 5-(dialkilaminoalkil)uracil; 5-(dimetilaminoalkil)uracil; 5-(guanidinijumalkil)uracil; 5-(halo)uracil; 5-(1,3-diazol-1-alkil)uracil; 5-(metoksi)uracil; 5-(metoksikarbonilmetil)-2-(tio)uracil; 5-(metoksikarbonil-metil)uracil; 5-(metil) 2(tio)uracil; 5-(metil) 2,4 (ditio)uracil; 5-(metil) 4 (tio)uracil; 5-(metil)-2-(tio)pseudouracil; 5-(metil)-2,4 (ditio)pseudouracil; 5-(metil)-4 (tio)pseudouracil; 5-(metil)pseudouracil; 5-(metilaminometil)-2 (tio)uracil; 5-(metilaminometil)-2,4(ditio)uracil; 5-
1
(metilaminometil)-4-(tio)uracil; 5-(propinil)uracil; 5-(trifluorometil)uracil; 5-aminoalil-uridin; 5-bromo-uridin; 5-jodo-uridin; 5-uracil; 6 (azo)uracil; 6-(azo)uracil; 6-aza-uridin; aliamino-uracil; aza uracil; deaza uracil; N3 (metil)uracil; pseudo-UTP-1-2-etanska kiselina; pseudouracil; 4-tiopseudo-UTP; 1-karboksimetil-pseudouridin; 1-metil-1-deaza-pseudouridin; 1-propinil-uridin; 1-taurinometil-1-metil-uridin; 1-taurinometil-4-tio-uridin; 1-taurinometil-pseudouridin; 2-metoksi-4-tio-pseudouridin; 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridin; 2-tio-1-metil-pseudouridin; 2-tio-5-azauridin; 2-tio-dihidropseudouridin; 2-tio-dihidrouridin; 2-tio-pseudouridin; 4-metoksi-2-tiopseudouridin; 4-metoksi-pseudouridin; 4-tio-1-metil-pseudouridin; 4-tio-pseudouridin; 5-azauridin; dihidropseudouridin; (±)1-(2-hidroksipropil)pseudouridin TP; (2R)-1-(2-hidroksipropil)pseudouridin TP; (2S)-1-(2-hidroksipropil)pseudouridin TP; (E)-5-(2-bromovinil)ara-uridin TP; (E)-5-(2-bromo-vinil)uridin TP; (Z)-5-(2-bromo-vinil)ara-uridin TP; (Z)-5-(2-bromo-vinil)uridin TP; t-(2,2,2-triftuoroeti))-pseudo-UTP; 1-(2,2,3,3,3-pentafluoropropil)pseudouridin TP; 1-(2,2-dietoksietil)pseudouridin TP; 1-(2,4,6-trimetilbenzil)pseudouridin TP; 1-(2,4,6-trimetil-benzil)pseudo-UTP; 1-(2,4,6-trimetilfenil)pseudo-UTP; 1-(2-amino-2-karboksietil)pseudo-UTP; 1-(2-aminoetil)pseudo-UTP; 1-(2-hidroksietil)pseudouridin TP; 1-(2-metoksietil)pseudouridin TP; 1-(3,4-bistrifluorometoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(3,4-dimetoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(3-amino-3-karboksipropil)pseudo-UTP; 1-(3-amino-propil)pseudo-UTP; 1-(3-ciklopropil-prop-2-inil)pseudouridin TP; 1-(4-amino-4-karboksibutil)pseudo-UTP; 1-(4-amino-benzil)pseudo-UTP; 1-(4-amino-butil)pseudo-UTP; 1-(4-amino-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-azidobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-bromobenzilpseudouridin; TP; 1-(4-hlorobenzil)pseudouridn TP; 1-(4-fluorobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-jodobenzil)pseudoundin TP; 1-(4-metansulfonilbenzil)pseudouridin TP; 1-(4-metoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(4-metoksibenzil)pseudo-UTP; 1-(4-metoksi-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-metilbenzil)pseudouridin TP; 1-(4-metil-benzil)pseudo-UTP; 1-(4-nitrobenzil)pseudouridin TP; 1-(4-nitro-benzil)pseudo-UTP; 1(4-nitro-fenil)pseudo-UTP; 1-(4-tiometoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(4-trifluorometoksibenzil)pseudouridin TP; 1-(4-trifluorometilbenzil)pseudouridin TP; 1-(5-aminopentil)pseudo-UTP; 1-(6-amino-heksil)pseudo-UTP; 1,6-dimetil-pseudo-UTP; 1-[3-(2-{2-[2-(2-aminoetoksi)-etoksi]-etoksi}-etoksi)-propionil]pseudouridin TP; 1-{3-[2-(2-aminoetoksi)-etoksi]-propionil}pseudouridin TP; I-acetilpseudouridin TP; 1-alkil-6-(1-propinil)-pseudo-UTP; 1-alkil-6-(2-propinil)-pseudo-UTP; 1-alkil-6-alil-pseudo-UTP; 1-alkil-6-etinil-pseudo-UTP; 1-alkil-6-homoalil-pseudo-UTP; 1-alkil-6-vinil-pseudo-UTP; 1-alilpseudouridin TP; 1-aminometilpseudo-UTP; 1-benzoilpseudouridin TP; 1-benziloksimetilpseudouridin TP; 1-benzil-pseudo-UTP; 1-biotinil-PEG2-pseudouridin TP; 1-biotinilpseudouridin TP; 1-butil-pseudo-UTP; 1-cijanometilpseudouridin TP; I-ciklobutilmetil-pseudo-UTP; 1-ciklobutil-pseudo-UTP; 1-
1
cikloheptilmetil-pseudo-UTP; 1-cikloheptil-pseudo-UTP; 1-cikloheksilmetil-pseudo-UTP; 1-cikloheksil-pseudo-UTP; 1-ciklooktilmetil-pseudo-UTP; 1-ciklooktil-pseudo-UTP; 1-ciklopentilmetil-pseudo-UTP; 1-ciklopentil-pseudo-UTP; 1-ciklopropilmetil-pseudo-UTP; 1-ciklopropil-pseudo-UTP; 1-etil-pseudo-UTP; 1-heksil-pseudo-UTP; 1-homoalilpseudouridin TP; 1-hidroksimetilpseudouridin TP; 1-izo-propil-pseudo-UTP; 1-Me-2-tio-pseudo-UTP; 1-Me-4-tiopseudo-UTP; 1-Me-alfa-tio-pseudo-UTP; 1-metansulfonilmetilpseudouridin TP; 1-metoksimetilpseudouridin TP; 1-metil-6-(2,2,2-trifluoroetil)pseudo-UTP; 1-metil-6-(4-morfolino)-pseudo-UTP; 1-metil-6-(4-tiomorfolino)-pseudo-UTP; 1-metil-6-(supstituisani fenil)pseudo-UTP; 1-metil-6-amino-pseudo-UTP; 1-metil-6-azido-pseudo-UTP; 1-metil-6-bromo-pseudo-UTP; 1-metil-6-butil-pseudo-UTP; 1-metil-6-hloro-pseudo-UTP; 1-metil-6-cijano-pseudo-UTP; 1-metil-6-dimetilamino-pseudo-UTP; 1-metil-6-etoksi-pseudo-UTP; 1-metil-6-etilkarboksilat-pseudo-UTP; 1-metil-6-etil-pseudo-UTP; 1-metil-6-fluoro-pseudo-UTP; 1-metil-6-formil-pseudo-UTP; 1-metil-6-hidroksiamino-pseudo-UTP; 1-metil-6-hidroksi-pseudo-UTP; 1-metil-6-jodo-pseudo-UTP; 1-metil-6-izo-propil-pseudo-UTP; 1-metil-6-metoksi-pseudo-UTP; 1-metil-6-metilamino-pseudo-UTP; 1-metil-6-fenil-pseudo-UTP; 1-metil-6-propil-pseudo-UTP; 1-metil-6-terc-butil-pseudo-UTP; 1-metil-6-trifluorometoksi-pseudo-UTP; 1-metil-6-trifluorometil-pseudo-UTP; 1-morfolinometilpseudouridin TP; 1-pentil-pseudo-UTP; 1-fenilpseudo-UTP; 1-pivaloilpseudouridin TP; 1-propargilpseudouridin TP; 1-propil-pseudo-UTP; 1-propinil-pseudouridin; 1-p-tolil-pseudo-UTP; 1-terc-butil-pseudo-UTP; 1-tiometoksimetilpseudouridin TP; 1-tiomorfolinometilpseudouridin TP; 1-trifluoroacetilpseudouridin TP; 1-trifluorometil-pseudo-UTP; 1-vinilpseudouridin TP; 2,2'-anhidro-uridin TP; 2'-bromodezoksiuridin TP; 2'-F-S-metil-2'-dezoksi-UTP; 2'-OMe-5-Me-UTP; 2'-OMe-pseudo-UTP; 2'-a-etiniluridin TP; 2'-a-trifluoromelhiluridin TP; 2'-b-etiniluridin TP; 2'-b-trifluorometiluridin TP; 2'-dezoksi-2',2'-difluorouridin TP; 2'-dezoksi-2'-a-merkaptouridin TP; 2'-dezoksi-2'-a-tiometoksiuridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-aminouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-azidouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-bromouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-hlorouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-fluorouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-jodouridin TP; 2'-dezoksi-2'-b-merkaptouridin TP; 2'-dezoksi-2'-btiometoksiuridin TP; 2-metoksi-4-tio-uridin; 2-metoksiuridin; 2'-O-metil-S-(1-propinil)uridin TP; 3-alkil-pseudo-UTP; 4'-azidouridin TP; 4'-karbociklični uridin TP; 4'-etiniluridin TP; 5-(1-propinil)ara-uridin TP; 5-(2-furanil)uridin TP; 5-cijanouridin TP; 5-dimetilaminouridin TP; 5'-homo-uridin TP; 5-jodo-2'-fluoro-dezoksiuridin TP; 5-feniletiniluridin TP; 5-trideuterometil-6-deuterouridin TP; 5-trifluorometil-uridin TP; 5-vinilarauridin TP; 6-(2,2,2-trifluoroetil)-pseudo-UTP; 6-(4-morfolino)-pseudo-UTP; 6-(4-tiomorfolino)-pseudo-UTP; 6-(supstituisani fenil)-pseudo-UTP; 6-amino-pseudo-UTP; 6-azido-pseudo-UTP; 6-bromo-pseudo-UTP; 6-butilpseudo-UTP; 6-hloro-pseudo-UTP; 6-cijano-pseudo-UTP; 6-dimetilamino-pseudo-UTP; 6-
2
etoksi-pseudo-UTP; 6-etilkarboksilat-pseudo-UTP; 6-etil-pseudo-UTP; 6-fluoro-pseudo-UTP; 6-formil-pseudo-UTP; 6-hidroksiamino-pseudo-UTP; 6-hidroksi-pseudo-UTP; 6-jodo-pseudo-UTP; 6-izo-propil-pseudo-UTP; 6-metoksi-pseudo-UTP; 6-metilamino-pseudo-UTP; 6-metilpseudo-UTP; 6-fenil-pseudo-UTP; 6-fenil-pseudo-UTP; 6-propil-pseudo-UTP; 6-terc-butilpseudo-UTP; 6-trifluorometoksi-pseudo-UTP; 6-triftuorometil-pseudo-UTP; alfa-tio-pseudo-UTP; pseudouridin 1-(4-metilbenzensulfonska kiselina) TP; pseudouridin 1-(4-metilbenzoeva kiselina) TP; pseudouridin TP 1-[3-(2-etoksi)]propanska kiselina; pseudouridin TP 1-[3-{2-(2-[2-(2-etoksi)-etoksi]-etoksi)-etoksi}]propanska kiselina; pseudouridin TP 1-[3-{2-(2-[2-{2(2-etoksi)-etoksi}-etoksi]-etoksi)-etoksi}]propanska kiselina; pseudouridin TP 1-[3-(2-(2-[2-etoksi]-etoksi)-etoksi}]propanska kiselina; pseudouridin TP 1-[3-{2-(2-etoksi)-etoksi}) propanska kiselina; pseudouridin TP 1-metilfosfonska kiselina; pseudouridin TP 1-metilfosfonska kiselina dietil estar; pseudo-UTP-N1-3-propanska kiselina; pseudo-UTP-NI-4-buterna kiselina; pseudo-UTP-N1-5-pentanska kiselina; pseudo-UTP-N1-6-heksanska kiselina; pseudo-UTP-N 1-7-heptanska kiselina; pseudo-UTP-N 1-metil-p-benzoeva kiselina; pseudo-UTP-N 1-p-benzoeva kiselina; vibutozin; hidroksivibutozin; izoviozin; peroksivibutozin; nemodifikovani hidroksivibutozin; 4-demetilviozin; 2,6-(diamino)purin;1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazin-1-il: 1,3-(diaza)-2-(okso)-fentiazin-1-il;1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il;1,3,5-(triaza)-2,6-(dioksa)-naftalen; 2 (amino)purin; 2,4,5-(trimetil)fenil; 2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-citidin; 2' metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-adenin; 2'metil, 2'amino, 2'azido, 2'fluro-uridin; 2'-amino-2'-dezoksiriboza; 2-amino-6-hloro-purin; 2-aza-inozinil; 2'-azido-2'-dezoksiriboza; 2'fluoro-2'-dezoksiriboza; 2'.fluoro-modifikovane baze; 2'-O=metil-riboza; 2-okso-7-aminopiridopirimidin-3-il; 2-okso-piridopirimidin-3-il; 2-piridinon; 3 nitropirol; 3-(metil)-7-(propinil)izokarbostirilil; 3-(metil)izokarbostirilil; 4-(fluoro)-6-(metil)benzimidazol; 4-(metil)benzimidazol; 4-(metil)indolil; 4,6-(dimetil)indolil; 5 nitroindol; 5 supstituisani pirimidini; 5-(metil)izokarbostirilil; 5-nitroindol; 6-(aza)pirimidin; 6-(azo)timin; 6-(metil)-7-(aza)indolil; 6-hloro-purin; 6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; 7-(aminoalkilhidroksi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-1-il; 7-(aminoalkilhidroksi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazin-1-il; 7-(aminoalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il, 7-(aminoalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fentiazin-1-il; 7-(aminoalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il; 7-(aza)indolil; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazinl-il; 7-(guanidinijumatkilhidroksi)-1-(aksa)-2-(tio)-3-(aza)-fentiazin-1-il; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazin-1-il; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il; 7-(guanidinijumalkil-hidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fentiazin-1-il; 7-(guanidinijumalkilhidroksi)-1,3-(diaza)-2-(okso)-fenoksazin-1-il; 7-(propinil)izokarbostirilil; 7-(propinil)izokarbostirilil, propinil-7-(aza)indolil; 7-deaza-inozinil; 7-supstituisani 1-(aza)-2-(tio)-3-(aza)-fenoksazin-1-il; 7-supstituisani 1,3-(diaza)-
2 1
2-(okso)-fenoksazin-1-il; 9-(metil)-imidizopiridinil; aminoindolil; antracenil; bis-orto-(aminoalkilhidroksi)-6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; bis-orto-supstituisani-6-fenil-pirolopirimidin-2-on-3-il; difluorotolil; hipoksantin; imidizopiridinil; inozinil; izokarbostirilil; izoguanizin; N2-supstituisani purini; N6-metil-2-amino-purin; N6-supstituisani purini; N-alkilovani derivat; naftalenil; nitrobenzimidazolil; nitroimidazolil; nitroindazolil; nitropirazolil; nubularin; O6-supstituisani purini; O-alkilovani derivat; orto-(aminoalkilhidroksi)-6-fenil-pirolopirimidin-2-on-3-il; orto-supstituisani-6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; oksoformicin TP; para-(aminoalkilhidroksi)-6-fenil-pirolo-pirimidin-2-on-3-il; para-supstituisani-6-fenil-pirolopirimidin-2-on-3-il; pentacenil; fenantracenil; fenil; propinil-7-(aza)indolil; pirenil; piridopirimidin-3-il; piridopirimidin-3-il, 2-okso-7-amino-piridopirimidin-3-il; pirolo-pirimidin-2-on-3-il; pirolopirimidinil; pirolopirizinil; stilbenzil; supstituisani 1,2,4-triazoli; tetracenil; tubercidin; ksantin; ksantozin-5'-TP; 2-tio-zebularin; 5-aza-2-tio-zebularin; 7-deaza-2-aminopurin; piridin-4-on ribonukleozid; 2-amino-ribozid-TP; formicin A TP; formicin B TP; pirolozin TP; 2'-OH-ara-adenozin TP; 2'-OH-ara-citidin TP; 2'-OH-ara-uridin TP; 2'-OH-ara-guanozin TP; 5-(2-karbometoksivinil)uridin TP; i N6-(19-amino-pentaoksanonadecil)adenozin TP.
[0388] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) uključuje kombinaciju od najmanje dve (npr. 2, 3, 4 ili više) od prethodno navedenih modifikovanih nukleobaza.
[0389] U nekim primerima izvođenja, modifikovane nukleobaze u polinukleotidu (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) su odabrane iz grupe koja se sastoji od pseudouridina (ψ), N1-metilpseudouridina (m1ψ), N1-etilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilcitozina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-azauridina, 2-tio-dihidropseuduridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoksi-2-tiopseudouridina, 4-metoksi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-azauridina, dihidropseudouridina, 5-metiluridina, 5-metoksiuridina i 2'-O-metil uridina. U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) uključuje kombinaciju od najmanje dve (npr. 2, 3, 4 ili više) od prethodno navedenih modifikovanih nukleobaza. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0390] U nekim primerima izvođenja, modifikovane nukleobaze u polinukleotidu (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) su odabrane iz grupe koja se sastoji od 1-metilpseudouridina (m1ψ), 5-metoksi-uridina (mo5U), 5-metil-citidina (m5C), pseudouridina (ψ), αtio-guanozina i α-tio-adenozina. U nekim primerima izvođenja, polinukleotid uključuje kombinaciju od najmanje dve (npr. 2, 3, 4 ili više) od predhodno navedenih modifikovanih
2 2
nukleobaza. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0391] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži pseudouridin (ψ) i 5-metil-citidin (m5C). U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 1-metilpseudouridin (m1ψ). U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 1-metil-pseudouridin (m1ψ) i 5-metil-citidin (m5C). U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 2-tiouridin (s2U). U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 2-tiouridin i 5-metil-citidin (m5C). U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži metoksiuridin (mo5U). U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 5-metoksi-uridin (mo5U) i 5-metil-citidin (m5C). U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 2'-O-metil uridin. U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži 2'-O-metil uridin i 5-metil-citidin (m5C). U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži N6-metiladenozin (m6A). U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) sadrži N6-metil-adenozin (m6A) i 5-metil-citidin (m5C). Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0392] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid (npr. RNK polinukleotid, kao što je iRNK polinukleotid) je uniformno modifikovan (npr. potpuno modifikovan, modifikovan duž cele sekvence) za određenu modifikaciju. Na primer, polinukleotid može biti uniformno modifikovan sa 5-metil-citidinom (m5C), što znači da su svi ostaci citozina u iRNK sekvenci zamenjeni sa 5-metil-citidinom (m5C). Slično, polinukleotid može biti uniformno modifikovan za bilo koju vrstu nukleozidnog ostatka koji je prisutan u sekvenci zamenom sa modifikovanim ostatkom kao što je bilo koji od onih koji su prethodno navedeni. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0393] U nekim primerima izvođenja, modifikovana nukleobaza je modifikovani citozin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani citozin uključuju N4-acetil-citidin (ac4C), 5-metil-citidin (m5C), 5-halo-citidin (npr. 5-jodo-citidin), 5-hidroksimetil-citidin (hm5C), 1-metilpseudoizocitidin, 2-tio-citidin (s2C), 2-tio-5-metil-citidin.
[0394] U nekim primerima izvođenja, modifikovana nukleobaza je modifikovani uridin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani uridin uključuju 5-cijano uridin ili 4'-tio uridin. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
2
[0395] U nekim primerima izvođenja, modifikovana nukleobaza je modifikovani adenin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani adenin uključuju 7-deaza-adenin, 1-metiladenozin (m1A), 2-metil-adenin (m2A), N6-metil-adenozin (m6A), i 2,6-diaminopurin. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0396] U nekim primerima izvođenja, modifikovana nukleobaza je modifikovani guanin. Primeri nukleobaza i nukleozida koji imaju modifikovani guanin uključuju inozin (I), 1-metil-inozin (m 11), viozin (imG), metilviozin (mimG), 7-deaza-guanozin, 7-cijano-7-deaza-guanozin (preQ0), 7-aminometil-7-deaza-guanozin (preQ1), 7-metil-guanozin (m7G), 1-metil-guanozin (m1G), 8-okso-guanozin, 7-metil-8-okso-guanozin. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0397] U nekim primerima izvođenja, polinukleotidi funkcionišu kao informaciona RNK (iRNK). "Informaciona RNK“ (iRNK) označava bilo koji polinukleotid koji kodira (najmanje jedan) polipeptid (koji se javlja u prirodi, koji se ne javlja u prirodi, ili modifikovani polimer aminokiselina) i može se translatirati da proizvede kodirani polipeptid in vitro, in vivo, in situ ili ex vivo. Osnovne komponente iRNK molekula tipično uključuju najmanje jedan kodirajući region, 5' netranslatirani region (UTR), 3' UTR, 5' kapu i poli-A rep. Polinukleotidi mogu da funkcionišu kao iRNK, ali se mogu razlikovati od iRNK divljeg tipa po svojim funkcionalnim i/ili strukturnim svojstvima dizajna koja služe da se prevaziđu postojeći problemi efikasne ekspresije polipeptida upotrebom terapeutika zasnovanih na nukleinskim kiselinama.
[0398] iRNK, kao što je ovde obezbeđeno, sadrži najmanje jedan (jedan ili više) polinukleotid ribonukleinske kiseline (RNK) koji ima otvoreni okvir čitanja koji kodira najmanje jedan polipeptid od interesa. U nekim primerima izvođenja, RNK polinukleotid iRNK kodira 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-10, 7-9, 7-8, 8-10, 8-9 ili 9-10 polipeptida. U nekim primerima izvođenja, RNK polinukleotid iRNK kodira najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 polipeptida. U nekim primerima izvođenja, RNK polinukleotid iRNK kodira najmanje 100 ili najmanje 200 polipeptida.
[0399] U nekim primerima izvođenja, nukleinske kiseline su terapijske iRNK. Kao što se ovde upotrebljava, termin "terapijska iRNK" označava iRNK koja kodira terapijski protein. Terapijski proteini posreduju u različitim efektima u ćeliji domaćinu ili subjektu u cilju lečenja bolesti ili ublažavanja znakova i simptoma bolesti. Na primer, terapijski protein može zameniti protein koji je deficitaran ili abnormalan, povećati funkciju endogenog proteina, obezbediti novu funkciju ćeliji (npr. inhibirati ili aktivirati endogenu ćelijsku aktivnost, ili delovati kao agens za isporuku drugog terapijskog jedinjenja (npr. antitelo-lek konjugat). Terapijska iRNK može biti korisna za
2 4
lečenje sledećih bolesti i stanja: bakterijske infekcije, virusne infekcije, parazitske infekcije, poremećaji proliferacije ćelija, genetički poremećaji, i autoimunski poremećaji.
[0400] Stoga, strukture pronalaska se mogu upotrebljavati kao terapijski ili profilaktički agensi. Oni su obezbeđeni za upotrebu u medicini. Na primer, iRNK struktura koje su ovde opisane može biti primenjena subjektu, pri čemu se polinukleotidi translatiraju in vivo kako bi se proizveo terapijski peptid. Obezbeđene su kompozicije, postupci, kompleti, i reagensi za dijagnozu, lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja kod ljudi i drugih sisara. Aktivni terapijski agensi iz pronalaska uključuju strukture, ćelije koje sadrže strukture ili polipeptide translatirane sa polinukleotida sadržanih u strukturama.
[0401] Strukture se mogu indukovati za translaciju u ćeliji, tkivu ili organizmu. Takva translacija može biti in vivo, ex vivo, u kulturi, ili in vitro. Ćelija, tkivo ili organizam se dovodi u kontakt sa efikasnom količinom kompozicije koja sadrži strukturu koja sadrži polinukleotide iRNK od kojih svaki ima najmanje jedan translatabilni region koji kodira peptid.
[0402] "Efikasna količina" struktura je obezbeđena na osnovu, barem delimično, ciljnog tkiva, tipa ciljne ćelije, načina primene, fizičkih karakteristika polinukleotida (npr. veličine, i obima modifikovanih nukleozida) i drugih komponenti nukleinske kiseline, i drugih determinanti. Generalno, efikasna količina nukleinskih kiselina obezbeđuje indukovanu ili pojačanu proizvodnju peptida u ćeliji.
[0403] iRNK iz predmetnog pronalaska može biti dizajnirana da kodira polipeptide od interesa odabrane od bilo koje od nekoliko ciljnih kategorija uključujući, ali ne ograničavajući se na, biologike, antitela, vakcine, terapijske proteine ili peptide, peptide koji penetriraju u ćelije, sekretovane proteine, proteine ćelijske membrane, citoplazmatske ili citoskeletne proteine, unutarćelijske proteine vezane za membranu, nukleusne proteine, proteine asocirane sa humanom bolešću, ciljno delujuće funkcionalne grupe ili one proteine koji su kodirani humanim genomom za koje nije identifikovana terapijska indikacija, ali koji su ipak korisni u oblastima istraživanja i otkrića. "Terapijski protein" označava protein koji, kada se primenjuje ćeliji, ima terapijski, dijagnostički, i/ili profilaktički efekat i/ili izaziva željeni biološki i/ili farmakološki efekat.
[0404] iRNK koja je ovde objavljena može da kodira jedan ili više biologika. Kao što se ovde upotrebljava, "biologik" je molekul na bazi polipeptida koji je proizveden ovde obezbeđenim postupcima i koji se može upotrebljavati za lečenje, izlečenje, ublažavanje, preveniranje, ili dijagnostikovanje ozbiljne ili po život opasne bolesti ili medicinskog stanja. Biologici, u skladu sa predmetnim pronalaskom uključuju, ali nisu ograničeni na, alergene ekstrakte (npr. za alergijske injekcije i testove), komponente krvi, proizvode genske terapije, humano tkivo ili ćelijske proizvode koji se upotrebljavaju u transplantaciji, vakcine, monoklonalna antitela, citokine. faktore rasta, enzime, trombolitike, i imunomodulatore, između ostalog.
2
[0405] U skladu sa predmetnim pronalaskom, jedan ili više biologika koji se trenutno nalaze u prodaji ili su u razvoju mogu biti kodirani od strane iRNK iz predmetnog pronalaska. Iako ne želimo da budemo vezani teorijom, veruje se da će inkorporacija kodirajućih polinukleotida poznatog biologika u iRNK iz pronalaska rezultovati poboljšanom terapijskom efikasnošću barem zbog specifičnosti, čistoće i/ili selektivnosti dizajna konstrukta.
[0406] iRNK koja je ovde objavljena može da kodira jedno ili više antitela ili njihovih fragmenata. Termin "antitelo" uključuje monoklonalna antitela (uključujući antitela pune dužine koja imaju Fc region imunoglobulina), kompozicije antitela sa poliepitopskom specifičnošću, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela, dijatela, i jednolančane molekule), kao i fragmente antitela. Termin "imunoglobulin" (Ig) se ovde upotrebljava naizmenično sa "antitelo". Kao što se ovde upotrebljava, termin "monoklonalno antitelo" označava antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim za moguće mutacije koje se javljaju u prirodi i/ili posttranslacione modifikacije (npr. izomerizacije, amidacije) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela su veoma specifična, i usmerena su prema jednom antigenskom mestu.
[0407] Monoklonalna antitela ovde specifično uključuju "himerna" antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja su poreklom od određene vrste ili pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je(su) ostatak(ci) lanca(aca) identični sa ili homologni sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja su poreklom od druge vrste ili pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost. Himerna antitela od interesa ovde uključuju, ali nisu ograničena na, "primatizovana" antitela koja sadrže antigenvezujuće sekvence varijabilnog domena poreklom od ne-humanog primata (npr. majmun starog sveta, bezrepi majmun itd.) i sekvence humanog konstantnog regiona.
[0408] "Fragment antitela" sadrži deo intaktnog antitela, poželjno antigen vezujući i/ili varijabilni region intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab'. F(ab')2 i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; nanotela; molekule jednolančanog antitela i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.
[0409] Bilo koja od pet klasa imunoglobulina, IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, može biti kodirana od strane iRNK iz pronalaska, uključujući teške lance označene kao alfa, delta, epsilon, gama i mu, respektivno. Takođe su uključene polinukleotidne sekvence koje kodiraju podklase, gama i mu. Dakle bilo koja od podklasa antitela može biti kodirana delimično ili u celini i uključuje sledeće podklase: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. U skladu sa predmetnim pronalaskom, jedno ili više antitela ili fragmenata koji se trenutno nalaze u prodaji ili su u razvoju mogu biti kodirani od strane iRNK iz predmetnog pronalaska.
2
[0410] Antitela kodirana u iRNK iz pronalaska mogu se koristiti za lečenje stanja ili bolesti u mnogim terapijskim oblastima kao što su, ali ne ograničavajući se na, krv, kardiovaskularnu, CNS, trovanja (uključujući antivenome), dermatologiju, endokrinologiju, gastrointestinalnu, medicinsko snimanje, muskuloskeletnu, onkologiju, imunologiju, respiratornu, senzornu i antiinfektivnu.
[0411] U jednom primeru izvođenja, iRNK koja je ovde objavljena može da kodira monoklonalna antitela i/ili njihove varijante. Varijante antitela mogu takođe uključivati, ali nisu ograničene na, supstitucione varijante, konzervativnu supstituciju amino-kiselina, insercione varijante, delecione varijante i/ili kovalentne derivate. U jednom primeru izvođenja, iRNK koja je ovde objavljena može da kodira Fc region imunoglobulina. U sledećem primeru izvođenja, iRNK može da kodira varijantni Fc region imunoglobulina.
[0412] iRNK koja je ovde objavljena može da kodira jedan ili više antigena za vakcine. Kao što se ovde upotrebljava, "antigen za vakcine" je biološki preparat koji poboljšava imunitet na određenu bolest ili infektivni agens. U skladu sa predmetnim pronalaskom, jedan ili više antigena za vakcine koji se trenutno nalaze u prodaji ili su u razvoju mogu biti kodirani od strane iRNK iz predmetnog pronalaska. Antigeni za vakcine kodirani u iRNK iz pronalaska mogu se koristiti za lečenje stanja ili bolesti u mnogim terapijskim oblastima kao što su, ali ne ograničavajući se na, kancer, alergiju i infektivnu bolest.
[0413] iRNK iz predmetnog pronalaska može biti dizajnirana da kodira jedan ili više antimikrobnih peptida (AMP) ili antivirusnih peptida (AVP). AMP i AVP su izolovani i opisani iz širokog spektra životinja kao što su, ali ne ograničavajući se na, mikroorganizme, beskičmenjake, biljke, vodozemce, ptice, ribe, i sisare. Ovde opisani antimikrobni polipeptidi mogu blokirati fuziju ćelija i/ili ulazak virusa pomoću jednog ili više virusa sa omotačem (npr. HIV, HCV). Na primer, antimikrobni polipeptid može da sadrži ili da se sastoji od sintetičkog peptida koji odgovara regionu, npr. uzastopne sekvence od najmanje oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, ili 60 amino-kiselina transmembranske podjedinice proteina virusnog omotača, npr. HIV-1 gp120 ili gp41. Amino-kiselinske i nukleotidne sekvence HIV-1 gp120 ili gp41 su opisane u, npr. Kuiken et al., (2008). "HIV Sequence Compendium", Los Alamos National Laboratory.
[0414] U nekim primerima izvođenja, antimikrobni polipeptid može imati najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% homologije sekvence sa odgovarajućom sekvencom virusnog proteina. U nekim primerima izvođenja, antimikrobni polipeptid može imati najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100% homologije sekvence sa odgovarajućom sekvencom virusnog proteina.
[0415] U drugim primerima izvođenja, antimikrobni polipeptid može da sadrži ili da se sastoji od sintetičkog peptida koji odgovara regionu, npr. uzastopne sekvence od najmanje oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, ili 60 amino-kiselina vezujućeg domena kapsid vezujućeg proteina. U
2
nekim primerima izvođenja, antimikrobni polipeptid može imati najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100% homologije sekvence sa odgovarajućom sekvencom kapsid vezujućeg proteina.
[0416] Antimikrobni polipeptidi koji su ovde opisani mogu blokirati dimerizaciju proteaze i inhibirati isecanje virusnih proproteina (npr. HIV Gag-pol obrada) u funkcionalne proteine, čime se sprečava oslobađanje jednog ili više virusa sa omotačem (npr. HIV, HCV). U nekim primerima izvođenja, antimikrobni polipeptid može imati najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% homologije sekvence sa odgovarajućom sekvencom virusnog proteina.
[0417] U drugim primerima izvođenja, antimikrobni polipeptid može da sadrži ili da se sastoji od sintetičkog peptida koji odgovara regionu, npr. uzastopne sekvence od najmanje oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, ili 60 amino-kiselina vezujućeg domena proteaza vezujućeg proteina. U nekim primerima izvođenja, antimikrobni polipeptid može imati najmanje oko 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% homologije sekvence sa odgovarajućom sekvencom proteaza vezujućeg proteina.
[0418] Neograničavajuća lista infektivnih bolesti koje iRNK antigeni za vakcine ili antimikrobni peptidi mogu da leče je predstavljena u nastavku: virus humane imunodeficijencije (HIV), HIV koji rezultuje mikobakterijskom infekcijom, kaheksija povezana sa AIDS, citomegalovirus infekcija povezana sa AIDS, nefropatija povezana sa HIV, lipodistrofija, kriptokokni meningitis povezan sa AID, neutropenija povezana sa AIDS, Pneumocysitis jiroveci (Pneumocystis carinii) infekcije, toksoplazmoza povezana sa AID, hepatitis A, B, C, D ili E, herpes, herpes zoster (ovčije boginje), nemačke boginje (virus rubella), žuta groznica, denga groznica itd. (virusi flavi), grip (virusi gripa), hemoragijske infektivne bolesti (Marburg ili Ebola virusi), bakterijske infektivne bolesti kao što su legionarska bolest (Legionella), čir na želucu (Helicobacter), kolera (Vibrio), E. coli infekcije, stafilokokne infekcije, infekcije salmonelom ili streptokokne infekcije, tetanus (Clostridium tetani), protozojske infektivne bolesti (malarija, bolest spavanja, lajšmanijaza, toksoplazmoza, tj. infekcije izazvane plazmodijumom, tripanozomama, lajšmanijom i toksoplazmom), difterija, guba, boginje, pertusis, besnilo, tetanus, tuberkuloza, tifus, varičela, dijarejne infekcije kao što su amebijaza, dijareja povezana sa Clostridium difficile (CDAD), kriptosporidioza, đardijaza, ciklosporijaza i rotavirusni gastroenteritis, encefalitis kao što je japanski encefalitis, Vester konjski encefalitis i krpeljni encefalitis (TBE), gljivične kožne bolesti kao što je kandidijaza, onihomikoza, Tinea captis/lišaj na sklapu, Tinea corporis/lišaj na telu, Tinea cruris/lišaj na preponama, sporotrihoza i Tinea pedis/atletsko stopalo, meningitis kao što je Haemophilus influenza tipa b (Hib), meningitis, virusne, meningokokne infekcije i pneumokokne infekcije, zapostavljene tropske bolesti kao što su argentinska hemoragijska groznica, lajšmanijaza, infekcije nematodama/valjkastim crvima, virusna infekcija reke Ros i bolest virusa
2
Zapadnog Nila (WNV), ne-HIV polno prenosive bolesti kao što su trihomonijaza, infekcije humanim papiloma virusom (HPV), polno prenosive hlamidijske bolesti, šankroid i sifilis, neseptičke bakterijske infekcije kao što su celulitis, lajmska bolest, MRSA infekcija, pseudomonas, stafilokokne infekcije, botonaze (Boutonneuse) groznica, leptospiroza, reumatska groznica. botulizam, rikecioza i mastoiditis, parazitske infekcije kao što su cisticerkoza, ehinokokoza, infekcije trematodama/metiljima, trihineloza, babezioza, hipodermijaza, difilobotriaza i tripanosomijaza, respiratorne infekcije kao što su adenovirusna infekcija, infekcije aspergiloze, ptičiji (H5N1) grip, grip, RSV infekcije, teški akutni respiratorni sindrom (SARS), sinusitis, legioneloza, kokcidioidomikoza i svinjski (H1N1) grip, sepsa kao što je bakteremija, sepsa/septički šok, sepsa kod nedonoščadi, infekcija urinarnog trakta kao što su vaginalne infekcije (bakterijske), vaginalne infekcije (gljivične) i gonokokne infekcije, virusne kožne bolesti kao što su B19 parvovirusne infekcije, bradavice, genitalni herpes, orofacijalni herpes, šingle, infekcije unutrašnjeg uha, fetalni citomegalovirus sindrom, bolesti koje se prenose hranom kao što su bruceloza (Brucella vrste), Clostridium perfringens (epsilon toksin), E. Coli 0157:H7 (Escherichia coli), salmoneloza (Salmonella vrste), šingeloza (Shingella), vibrioza i listerioza, bioterorizam i potencijalne epidemijske bolesti kao što su ebola hemoragijska groznica, Lassa groznica, marburška hemoragijska groznica, kuga, antraks, bolest Nipah virusa, Hanta virus, male boginje, sakagija (Burkholderia mallei), melioidoza (Burkholderia pseudomallei), psitakoza (Chlamydia psittaci), Q groznica (Coxiella burnctii), tularemija (Fancisella tularensis), rubeola, zauške i polio.
[0419] iRNK koja je ovde objavljena može da kodira jedan ili više validiranih ili "u testiranju" terapijskih proteina ili peptida. U skladu sa predmetnim pronalaskom, jedan ili više terapijskih proteina ili peptida koji se trenutno nalaze u prodaji ili su u razvoju mogu biti kodirani od strane iRNK iz predmetnog pronalaska. Terapijski proteini i peptidi kodirani u iRNK iz pronalaska mogu se koristiti za lečenje stanja ili bolesti u mnogim terapijskim oblastima kao što su, ali ne ograničavajući se na, krv, kardiovaskularnu, CNS, trovanja (uključujući antivenome), dermatologiju, endokrinologiju, genetičku, genitourinarnu, gastrointestinalnu, muskuloskeletnu, onkologiju, i imunologiju, respiratornu, senzornu i antiinfektivnu.
[0420] iRNK koja je ovde objavljena može da kodira jedan ili više polipeptida koji penetriraju u ćeliju. Kao što se ovde upotrebljava, "polipeptid koji penetrira u ćeliju" ili CPP označava polipeptid koji može olakšati ćelijsko preuzimanje molekula. Polipeptid koji penetrira u ćeliju iz predmetnog pronalaska može da sadrži jedan ili više detektabilnih obeleživača. Polipeptidi mogu biti delimično obeleženi ili potpuno obeleženi u celini. iRNK može da kodira detektabilni obeleživač u potpunosti, delimično ili nimalo. Peptid koji penetrira u ćeliju može takođe uključivati signalnu sekvencu. Kao što se ovde upotrebljava, "signalna sekvenca" označava sekvencu amino-kiselinskih ostataka vezanih na amino terminusu nascentnog proteina tokom
2
translacije proteina. Signalna sekvenca se može upotrebljavati da signalizira sekreciju polipeptida koji penetrira u ćeliju.
[0421] U jednom primeru izvođenja, iRNK takođe može da kodira fuzioni protein. Fuzioni protein se može kreirati operativnim povezivanjem naelektrisanog proteina sa terapijskim proteinom. Kao što se ovde upotrebljava, "operativno povezan" označava terapijski protein i naelektrisani protein koji su povezani na takav način da dozvoljavaju ekspresiju kompleksa kada se introdukuju u ćeliju. Kao što se ovde upotrebljava, "naelektrisani protein" označava protein koji nosi pozitivno, negativno ili ukupno neutralno električno naelektrisanje. Poželjno, terapijski protein može biti kovalentno povezan za naelektrisani protein u formaciji fuzionog proteina. Odnos površinskog naelektrisanja prema ukupnim ili površinskim amino-kiselinama može biti približno 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 ili 0,9.
[0422] Polipeptid koji penetrira u ćeliju kodiran od strane iRNK može formirati kompleks pošto je translatiran. Kompleks može da sadrži naelektrisani protein povezan, npr. kovalentno povezan, za polipeptid koji penetrira u ćeliju.
[0423] U jednom primeru izvođenja, polipeptid koji penetrira u ćeliju može da sadrži prvi domen i drugi domen. Prvi domen može da sadrži supernaelektrisani polipeptid. Drugi domen može da sadrži protein-vezujućeg partnera. Kao što se ovde upotrebljava, "protein-vezujući partner" uključuje, ali nije ograničen na, antitela i njihove funkcionalne fragmente, proteine skele, ili peptide. Polipeptid koji penetrira u ćeliju može dodatno da sadrži unutarćelijskog vezujućeg partnera za protein-vezujućeg partnera. Polipeptid koji penetrira u ćeliju može biti sposoban da se sekretuje iz ćelije u koju se može introdukovati iRNK. Polipeptid koji penetrira u ćeliju takođe može biti sposoban da penetrira u prvu ćeliju.
[0424] U jednom primeru izvođenja, iRNK može da kodira polipeptid koji penetrira u ćeliju koji može da sadrži protein-vezujućeg partnera. Potein-vezujući partner može uključivati, ali nije ograničen na, antitelo, supernaelektrisano antitelo ili funkcionalni fragment. iRNK se može introdukovati u ćeliju gde je introdukovan polipeptid koji penetrira u ćeliju koji sadrži proteinvezujućeg partnera.
[0425] Neki primeri izvođenja predmetne objave obezbeđuju terapijsku iRNK koja uključuje najmanje jedan polinukleotid ribonukleinske kiseline (RNK) koji ima otvoreni okvir čitanja koji kodira najmanje jedan antigenski polipeptid, u kome RNK polinukleotid RNK uključuje najmanje jednu hemijsku modifikaciju. U nekim primerima izvođenja, hemijska modifikacija je odabrana od pseudouridina, N1-metilpseudouridina, N1-etilpseudouridina, 2-tiouridina, 4'-tiouridina, 5-metilejtozina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-5-azauridina, 2-tio-dihidropseuduridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-pseudouridina, 4-metoksi-2-tiopseudouridina, 4-metoksi-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 4-tio-pseudouridina, 5-aza-
21
uridina, dihidropseuduridina, 5-metiluridina, 5- metoksiuridina, i 2'-O-metil uridina. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0426] Bilo koji od prethodnih polinukleotida iz predmetne objave, u nekim primerima izvođenja, su kodon optimizovani. Postupci kodon optimizacije su poznati u struci i mogu se upotrebljavati kao što je ovde obezbeđeno. Kodon optimizacija, u nekim primerima izvođenja, može se upotrebljavati za usklađivanje učestalosti kodona u ciljnim i organizmima domaćina kako bi se obezbedilo pravilno savijanje; pristrasnost GC sadržaja za povećanje stabilnosti iRNK ili redukovanje sekundarnih struktura; minimalizovanje tandem ponavak kodona ili baznih nizova koji mogu narušiti konstrukciju ili ekspresiju gena; prilagođavanje regiona kontrole transkripcije i translacije; inseriranje ili uklanjanje sekvenci za transport proteina; uklanjanje/dodavanje posttranslacionih modifikacionih mesta u kodiranom proteinu (npr. mesta za glikozilaciju); dodavanje, uklanjanje ili mešanje domena proteina; inseriranje ili delecija restrikcionih mesta; modifikacija vezujućih mesta ribozoma i mesta degradacije iRNK; prilagođavanje stopa translacije kako bi se omogućilo da se različiti domeni proteina pravilno savijaju; ili da se redukuju ili eliminišu problematične sekundarne strukture unutar polinukleotida. Alati, algoritmi i usluge za kodon optimizaciju su poznati u struci - neograničavajući primeri uključuju usluge od GeneArt (Life Technologies), DNA2.0 (Menlo Park CA) i/ili postupke u vlasništvu. U nekim primerima izvođenja, sekvenca otvorenog okvira čitanja (ORF) je optimizovana upotrebom algoritama optimizacije.
[0427] U nekim primerima izvođenja, kodon optimizovana sekvenca deli manje od 95% identičnosti sekvence sa sekvencom koja se javlja u prirodi ili sekvencom divljeg tipa (npr. iRNK sekvenca koja se javlja u prirodi ili sekvenca divljeg tipa koja kodira polipeptid ili protein od interesa (npr. antigeni protein ili polipeptid. U nekim primerima izvođenja, kodon optimizovana sekvenca deli manje od 90% identičnosti sekvence sa sekvencom koja se javlja u prirodi ili sekvencom divljeg tipa (npr. iRNK sekvenca koja se javlja u prirodi ili sekvenca divljeg tipa koja kodira polipeptid ili protein od interesa (npr. antigeni protein ili polipeptid. U nekim primerima izvođenja, kodon optimizovana sekvenca deli manje od 85% identičnosti sekvence sa sekvencom koja se javlja u prirodi ili sekvencom divljeg tipa (npr. iRNK sekvenca koja se javlja u prirodi ili sekvenca divljeg tipa koja kodira polipeptid ili protein od interesa (npr. antigeni protein ili polipeptid. U nekim primerima izvođenja, kodon optimizovana sekvenca deli manje od 80% identičnosti sekvence sa sekvencom koja se javlja u prirodi ili sekvencom divljeg tipa (npr. iRNK sekvenca koja se javlja u prirodi ili sekvenca divljeg tipa koja kodira polipeptid ili protein od interesa (npr. antigeni protein ili polipeptid. U nekim primerima izvođenja, kodon optimizovana sekvenca deli manje od 75% identičnosti sekvence sa sekvencom koja se javlja u prirodi ili sekvencom divljeg tipa (npr. iRNK sekvenca koja se javlja u prirodi ili sekvenca divljeg tipa koja kodira polipeptid ili protein od interesa (npr. antigeni protein ili polipeptid.
[0428] U nekim primerima izvođenja, kodon optimizovana sekvenca deli između 65% i 85% (npr. između oko 67% i oko 85% ili između oko 67% i oko 80%) identičnosti sekvence sa sekvencom koja se javlja u prirodi ili sekvencom divljeg tipa (npr. iRNK sekvenca koja se javlja u prirodi ili sekvenca divljeg tipa koja kodira polipeptid ili protein od interesa (npr. antigeni protein ili polipeptid. U nekim primerima izvođenja, kodon optimizovana sekvenca deli između 65% i 75 ili oko 80% identičnosti sekvence sa sekvencom koja se javlja u prirodi ili sekvencom divljeg tipa (npr. iRNK sekvenca koja se javlja u prirodi ili sekvenca divljeg tipa koja kodira polipeptid ili protein od interesa (npr. antigeni protein ili polipeptid.
[0429] U nekim primerima izvođenja, kodon optimizovana RNK može, na primer, biti ona u kojoj su nivoi G/C povećani. G/C-sadržaj molekula nukleinske kiseline može uticati na stabilnost RNK. RNK koja ima povećanu količinu ostataka guanina (G) i/ili citozina (C) može biti funkcionalno stabilnija od nukleinskih kiselina koje sadrže veliku količinu nukleotida adenina (A) i timina (T) ili uracila (U). WO02/098443 objavljuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži iRNK stabilizovanu modifikacijama sekvence u translatiranom regionu. Zbog degeneracije genetičkog koda, modifikacije funkcionišu tako što zamenjuju postojeće kodone onima koji promovišu veću stabilnost RNK bez promene rezultujuće amino-kiseline. Pristup je ograničen na kodirajuće regione RNK.
[0430] Kao što se ovde upotrebljava, kada se poziva na polipeptide, termini "mesto" koji se odnose na primere izvođenja bazirane na amino-kiselinama upotrebljavaju se kao sinonim za "aminokiselinski ostatak" i "bočni lanac amino-kiseline". Kao što se ovde upotrebljava kada se poziva na polinukleotide termini "mesto" koji se odnose na primere izvođenja bazirane na nukleotidima upotrebljavaju se kao sinonim za "nukleotid". Mesto predstavlja poziciju unutar peptida ili polipeptida ili polinukleotida koja može biti modifikovana, manipulisana, izmenjena, derivatizovana ili varirana unutar molekula baziranih na polipeptidu ili polinukleotidu.
[0431] Kao što se ovde upotrebljava termini "terminusi" ili "terminus" kada se poziva na polipeptide ili polinukleotide označavaju ekstremnost polipeptida ili polinukleotida, respektivno. Takva ekstremnost nije ograničena samo na prvo ili krajnje mesto polipeptida ili polinukleotida, već može uključivati dodatne amino-kiseline ili nukleotide u terminusnim regionima. Molekuli bazirani na polipeptidima mogu se okarakterisati kao da imaju i N-terminus (završen aminokiselinom sa slobodnom amino grupom (NH2)) i C-terminus (završen amino-kiselinom sa slobodnom karboksilnom grupom (COOH)). Proteini su u nekim slučajevima napravljeni od više polipeptidnih lanaca spojenih disulfidnim vezama ili nekovalentnim silama (multimeri, oligomeri). Ovi proteini imaju više N- i C-terminusa. Alternativno, terminusi polipeptida mogu biti modifikovani tako da počinju ili završavaju, u zavisnosti od slučaja, sa funkcionalnom grupom koja nije bazirana na polipeptidu, kao što je organski konjugat.
[0432] Kao što prepoznaju oni sa iskustvom u struci, takođe se smatra da su proteinski fragmenti, funkcionalni proteinski domeni, i homologni proteini unutar okvira polipeptida od interesa. Na primer, ovde je obezbeđen bilo koji proteinski fragment (što znači polipeptidna sekvenca najmanje jedan amino-kiselinski ostatak kraća od referentne polipeptidne sekvence, ali inače identična) referentnog proteina dužine 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ili više od 100 amino-kiselina. U sledećem primeru, bilo koji protein koji uključuje niz od 20, 30, 40, 50, ili 100 amino-kiselina koje su 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ili 100% identične bilo kojoj od ovde opisanih sekvenci može se koristiti u skladu sa objavom. U nekim primerima izvođenja, polipeptid uključuje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više mutacija kao što je pokazano u bilo kojoj od sekvenci koje su ovde obezbeđene i na koje se poziva. U sledećem primeru, bilo koji protein koji uključuje niz od 20, 30, 40, 50, ili 100 amino-kiselina koje su više od 80%, 90%, 95%, ili 100% identične bilo kojoj od sekvenci koje su ovde opisane, pri čemu protein ima niz od 5, 10, 15, 20, 25, ili 30 amino-kiselina koje su manje od 80%, 75%, 70%, 65% ili 60% identične bilo kojoj od sekvenci koje su ovde opisane mogu se koristiti u skladu sa objavom.
[0433] Molekuli polipeptida ili polinukleotida iz predmetene objave mogu deliti određeni stepen sličnosti ili identičnosti sekvence sa referentnim molekulima (npr. referentnim polipeptidima ili referentnim polinukleotidima), na primer, sa molekulima opisanim u struci (npr. projektovanim ili dizajniranim molekulima ili molekulima divljeg tipa). Termin "identičnost" kao što je poznat u struci, označava odnos između sekvenci dva ili više polipeptida ili polinukleotida, kao što je određeno poređenjem sekvenci. U struci, identičnost takođe znači međusobni stepen srodnosti sekvenci određen brojem podudaranja između nizova dva ili više amino-kiselinskih ostataka ili ostataka nukleinske kiseline. Identičnost meri procenat identičnih podudaranja između manje od dve ili više sekvenci sa poravnanjima praznina (ukoliko ih ima) kojima se bavi određeni matematički model ili računarski program (npr. "algoritmi"). Identičnost srodnih peptida može se lako izračunati pomoću poznatih postupaka. "% identičnosti" kao što se primenjuje na polipeptidne ili polinukleotidne sekvence je definisan kao procenat ostataka (amino-kiselinskih ostataka ili ostataka nukleinske kiseline) u kandidat amino-kiselinskoj sekvenci ili sekvenci nukleinskih kiselina koji su identični sa ostacima u amino-kiselinskoj sekvenci ili sekvenci nukleinskih kiselina druge sekvence posle poravnanja sekvenci i introdukovanja praznina, ukoliko je potrebno, kako bi se postigao maksimalni procenat identičnosti. Postupci i računarski programi za poravnanje su dobro poznati u struci. Podrazumeva se da identičnost zavisi od izračunavanja procenta identičnosti, ali može da se razlikuje u vrednosti zbog praznina i penala introdukovanih u kalkulaciju. Generalno, varijante određenog polinukleotida ili polipeptida imaju najmanje 40%,
21
45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ali manje od 100% identičnosti sekvence sa tim određenim referentnim polinukleotidom ili polipeptidom kao što je određeno pomoću programa i parametara za poravnanje sekvenci koji su ovde opisani i poznati onima sa iskustvom u struci. Takvi alati za poravnanje uključuju one iz BLAST paketa (Stephen F. Altschul, et al (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res.
25:3389-3402). Sledeća popularna tehnika lokalnog poravnanja zasnovana je na Smit-Vaterman (Smith-Waterman) algoritmu (Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) "Identification of common molecular subsequences." J. Mol. Biol. 147:195-197). Opšta tehnika globalnog poravnanja zasnovana na dinamičkom programiranju je Nidlman-Vunš (Needleman-Wunsch) algoritam (Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins." J. Mol. Biol.48:443-453). Nedavno je razvijen algoritam brzog optimalnog globalnog poravnanja sekvenci (FOGSAA) koji navodno proizvodi globalno poravnanje nukleotidnih i proteinskih sekvenci brže od drugih postupaka optimalnog globalnog poravnanja, uključujući Nidlman-Vunš algoritam. Ostali alati su ovde opisani, specifično u definiciji "identičnosti" u nastavku.
[0434] Kao što se ovde upotrebljava, termin "homologija" označava sveukupnu srodnost između polimernih molekula, npr. između molekula nukleinske kiseline (npr. molekula DNK i/ili molekula RNK) i/ili između molekula polipeptida. Polimerni molekuli (npr. molekuli nukleinske kiseline (npr. molekuli DNK i/ili molekuli RNK) i/ili molekuli polipeptida) koji dele granični nivo sličnosti ili identičnosti određen poravnanjem odgovarajućih ostataka nazivaju se homologni. Homologija je kvalitativni termin koji opisuje odnos između molekula i može se zasnivati na kvantitativnoj sličnosti ili identičnosti. Sličnost ili identičnost je kvantitativni termin koji definiše stepen podudaranja sekvenci između dve upoređene sekvence. U nekim primerima izvođenja, smatra se da su polimerni molekuli međusobno "homologni" ukoliko su njihove sekvence najmanje 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% identične ili slične. Termin "homologan" nužno označava poređenje između najmanje dve sekvence (polinukleotidne ili polipeptidne sekvence). Dve polinukleotidne sekvence se smatraju homolognim ukoliko su polipeptidi koje kodiraju najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ili čak 99% za najmanje jedan niz od najmanje 20 amino-kiselina. U nekim primerima izvođenja, homologne polinukleotidne sekvence se karakterišu sposobnošću da kodiraju niz od najmanje 4-5 jedinstveno specificiranih amino-kiselina. Za polinukleotidne sekvence dužine manje od 60 nukleotida, homologija se određuje sposobnošću da kodiraju niz od najmanje 4-5 jedinstveno specificiranih amino-kiselina. Dve proteinske sekvence se smatraju homolognim ukoliko su proteini najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% identični za najmanje jedan niz od najmanje 20 amino-kiselina.
[0435] Homologija implicira da su upoređene sekvence u evoluciji divergirale od zajedničkog porekla. Termin "homolog" označava prvu amino-kiselinsku sekvencu ili sekvencu nukleinske kiseline (npr. gen (DNK ili RNK) ili proteinska sekvenca) koja je srodna sa drugom aminokiselinskom sekvencom ili sekvencom nukleinske kiseline poreklom od zajedničke predačke sekvence. Termin "homolog" se može primeniti na odnos između gena i/ili proteina razdvojenih događajem specijacije ili na odnos između gena i/ili proteina razdvojenih događajem genetičke duplikacije. "Ortolozi" su geni (ili proteini) u različitim vrstama koji su evoluirali iz zajedničkog predačkog gena (ili proteina) specijacijom. Tipično, ortolozi zadržavaju istu funkciju tokom evolucije. "Paralozi" su geni (ili proteini) srodni duplikacijom unutar genoma. Ortolozi zadržavaju istu funkciju tokom evolucije, dok paralozi razvijaju nove funkcije, čak i ukoliko su one srodne sa originalnom.
[0436] Termin "identičnost" označava sveukupnu srodnost između polimernih molekula, na primer, između molekula polinukleotida (npr. molekula DNK i/ili molekula RNK) i/ili između molekula polipeptida. Izračunavanje procenta identičnosti dve sekvence polinukleinske kiseline, na primer, može da se izvede poravnanjem dve sekvence u svrhe optimalnog poređenja (npr. praznine se mogu introdukovati u jednu ili obe od prve i druge sekvence nukleinske kiseline za optimalno poravnanje i neidentične sekvence se mogu zanemariti u svrhe poređenja). U određenim primerima izvođenja, dužina sekvence koja je poravnata u svrhe poređenja je najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, na najmanje 95%, ili 100% dužine referentne sekvence. Zatim se porede nukleotidi na odgovarajućim pozicijama nukleotida. Kada poziciju u prvoj sekvenci zauzima isti nukleotid kao odgovarajuću poziciju u drugoj sekvenci, onda su molekuli identični na toj poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje sekvence dele, uzimajući u obzir broj praznina, i dužinu svake praznine, koje je potrebno introdukovati za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići upotrebom matematičkog algoritma. Na primer, procenat identičnosti između dve sekvence nukleinske kiseline može se odrediti upotrebom postupaka kao što su oni koji su opisani u Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey. 1994; i Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press. New York, 1991. Na primer, procenat identičnosti između dve sekvence nukleinske kiseline može
21
se odrediti upotrebom algoritma Majersa i Milera (Meyers and Miller) (CABIOS, 1989, 4:11-17), koji je inkorporisan u ALIGN program (verzija 2.0) upotrebom PAM120 tabele ostataka težine, penala za dužinu praznine od 12 i penala za prazninu od 4. Procenat identičnosti između dve sekvence nukleinske kiseline može se, alternativno, odrediti upotrebom GAP programa u GCG softverskom paketu upotrebom NWSgapdna.CMP matrice. Postupci koji se uobičajeno koriste za određivanje procenta identičnosti između sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na one koji su objavljeni u Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988). Tehnike za određivanje identičnosti kodifikovane su u javno dostupnim računarskim programima. Primeri računarskog softvera za određivanje homologije između dve sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na, GCG programski paket, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, and FASTA Altschul, S. F. et al, J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)).
[0437] Imunomodulatorni agens može biti imunostimulatorni agens ili imunoinhibitorni agens.
[0438] Imunostimulatorni agens je agens koji stimuliše imunski odgovor (uključujući pojačavanje prethodno postojećeg imunskog odgovora) kod subjekta kome se primenjuje, bilo sam ili u kombinaciji sa drugim agensom. Primeri uključuju antigene, adjuvanse (npr. TLR ligandi kao što su imikvimod, imidazokvinolin, nukleinske kiseline koje sadrže nemetilovani CpG dinukleotid, monofosforil lipid A ili drugi derivati lipopolisaharida, jednolančana ili dvolančana RNK, flagelin, muramil dipeptid), citokine uključujući interleukine (npr. IL-2, IL-7, IL-15 (ili superagonistički/mutantni oblici ovih citokina), IL-12, IFN-gama, IFN-alfa, GM-CSF, FLT3-ligand, itd.), imunostimulatorna antitela (npr. anti-CTLA-4, anti-CD28, anti-CD3, ili fragmenti jednog lanca/antitela ovih molekula), i slično.
[0439] Imunoinhibitorni agens je agens koji inhibira imunski odgovor kod subjekta kome se primenjuje, bilo sam ili u kombinaciji sa drugim agensom. Primeri uključuju steroide, retinoičnu kiselinu, deksametazon, ciklofosfamid, anti-CD3 antitelo ili fragment antitela, i druge imunosupresive.
[0440] Adjvansi su agensi koji pojačavaju imunski odgovor. Adjuvans može biti bez ograničenja alum (npr. aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat); saponini prečišćeni iz kore drveta Q. saponaria kao što je QS21 (glikolipid koji eluira u 21. piku sa HPLC frakcionisanjem; Antigenics, Inc., Worcester, Mass.); poli[di(karboksilatofenoksi) fosfazen (PCPP polimer; Virus Research Institute, SAD), Flt3 ligand, faktor elongacije Leishmania (prečišćeni protein Leishmania; Corixa Corporation, Seattle, Wash.), ISCOMS (imunostimulišući kompleksi koji sadrže mešavine saponina, lipida i formiraju čestice veličine virusa sa porama koje mogu da drže antigen; CSL, Melburn, Australija), Pam3Cys, SB-AS4 (SmithKline Beecham adjuvantni sistem #4 koji sadrži alum i MPL; SBB, Belgija), nejonski blok kopolimeri koji formiraju micele kao što je CRL 1005 (oni sadrže linearni lanac hidrofobnog polioksipropilena okružen lancima polioksietilena, Vaxcel,
21
Inc., Norcross, Ga.), i Montanide IMS (npr. IMS 1312, nanočestice na bazi vode kombinovane sa solubilnim imunostimulansom, Seppic).
[0441] Adjuvansi mogu biti TLR ligandi. Adjuvansi koji deluju preko TLR3 uključuju bez ograničenja dvolančanu RNK. Adjuvansi koji deluju preko TLR4 uključuju bez ograničenja derivate lipopolisaharida kao što su monofosforil lipid A (MPLA; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.) i muramil dipeptid (MDP; Ribi) i treonil-muramil dipeptid (t-MDP;Ribi); OM-174 (glukozamin disaharid srodan sa lipidom A; OM Pharma SA, Meyrin, Švajcarska). Adjuvansi koji deluju preko TLR5 uključuju bez ograničenja flagelin. Adjuvansi koji deluju preko TLR7 i/ili TLR8 uključuju jednolančanu RNK, oligoribonukleotide (ORN), sintetička jedinjenja male molekulske težine kao što su imidazokvinolinamini (npr. imikvimod, resikvimod). Adjuvansi koji deluju preko TLR9 uključuju DNK virusnog ili bakterijskog porekla, ili sintetičke oligodezoksinukleotide (ODN), kao što je CpG ODN. Sledeća klasa adjuvansa su molekuli koji sadrže fosforotioat kao što su analozi fosforotioatnih nukleotida i nukleinske kiseline koje sadrže fosforotioatne veze u okosnici.
[0442] Antigen može biti bez ograničenja kancerski antigen, samo-antigen, mikrobni antigen, alergen, ili antigen životne sredine. Antigen može biti po prirodi peptid, lipid, ili ugljeni hidrat, ali nije toliko ograničen.
[0443] Kancerski antigen je antigen koji se prvenstveno eksprimira u kancerskim ćelijama (tj. eksprimira se na višim nivoima u kancerskim ćelijama nego u nekancerskim ćelijama), i u nekim instancama eksprimira se isključivo u kancerskim ćelijama. Kancerski antigen može biti eksprimiran unutar ćelije kancera ili na površini ćelije kancera. Kancerski antigen može biti MART-1/Melan-A, gp100, adenozin deaminaza-vezujući protein (ADAbp), FAP, ciklofilin b, kolorektalno asocirani antigen (CRC)--C017-1A/GA733, karcinoembrionalni antigen (CEA), CAP-1, CAP-2, etv6, AMLI, antigen specifičan za prostatu (PSA), PSA-1, PSA-2, PSA-3, membranski antigen specifičan za prostatu (PSMA), T ćelijski receptor/CD3-zeta lanac, i CD20. Kancerski antigen može biti odabran iz grupe koja se sastoji od MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5). Kancerski antigen može biti odabran iz grupe koja se sastoji od GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9. Kancerski antigen može biti odabran iz grupe koja se sastoji od BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirozinaze, p53, MUC porodice, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-fetoproteina, E-kadherina, α-katenina, β-katenina, γkatenina, p120ctn, gp100Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, koli protein adenomatozne polipoze (APC), fodrina, koneksina 37, Ig-idiotipa, p15, gp75, GM2 gangliozida, GD2
21
gangliozida, proteina humanog papiloma virusa, Smad porodice tumorskih antigena, lmp-1, P1A, EBV-kodiranog nukleusnog antigena (EBNA)-1, glikogen fosforilaze mozga, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 i CT-7, CD20, i c-erbB-2. Svaka mogućnost predstavlja odvojen primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0444] Mikrobni antigeni su antigeni poreklom iz mikrobnih vrsta kao što su bez ograničenja bakterijske, virusne, gljivične, parazitske i mikobakterijske vrste. Kao takvi, mikrobni antigeni uključuju bakterijske antigene, virusne antigene, gljivične antigene, parazitske antigene, i mikobakterijske antigene. Ovde su obezbeđeni primeri bakterijskih, virusnih, gljivičnih, parazitskih i mikobakterijskih vrsta. Mikrobni antigen može biti deo mikrobne vrste ili može biti ceo mikrob.
[0445] Antikancerski agens je agens koji barem delimično inhibira razvoj ili progresiju kancera, uključujući inhibiranje u celini ili delimično simptoma povezanih sa kancerom, čak i samo kratkotrajno. Nekoliko antikancerskih agenasa može se kategorisati kao agensi koji oštećuju DNK, i oni uključuju inhibitore topoizomeraze (npr. etopozid, ramptotecin, topotekan, tenipozid, mitoksantron), DNK alkilujuće agense (npr. cisplatin, mehloretamin, ciklofosfamid, ifosfamid, melfalan, hlorambucil, busulfan, tiotepa, karmustin, lomustin, karboplatin, dakarbazin, prokarbazin), agense koji indukuju prekid DNK lanca (npr. bleomicin, doksorubicin, daunorubicin, idarubicin, mitomicin C), anti-mikrotubula agense, (npr. vinkristin, vinblastin), antimetaboličke agense (npr. citarabin, metotreksat, hidroksiurea, 5-fluorouracil, floksuridin, 6-tioguanin, 6-merkaptopurin, fludarabin, pentostatin, hlorodezoksiadenozin), antracikline, vinka alkaloide, ili epipodofilotoksine.
[0446] Primeri antikancerskih agenasa uključuju bez ograničenja acivicin; aklarubicin; akodazol hidrohlorid; akronin; adozelesin; aldesleukin; altretamin; ambomicin; ametantron acetat; aminoglutetimid; amsakrin; anastrozol; antramicin; asparaginazu; asperlin; azacitidin; azetepu; azotomicin; batimastat; benzodepu; bikalutamid; bisantren hidrohlorid; bisnafid dimezilat; bizelesin; bleomicin sulfat; bortezomib (VELCADE); brekuinar natrijum; bropirimin; busulfan; kaktinomicin; kalusteron; karacemid; karbetimer; karboplatin (režim koji sadrži platinu); karmustin; karubicin hidrohlorid; karzelesin; cedefingol; hlorambucil; cirolemicin; cisplatin (režim koji sadrži platinu); kladribin; krisnatol mezilat; ciklofosfamid; citarabin; dakarbazin; daktinomicin; daunorubicin; decitabin; deksormaplatin; dezaguanin; diazikuon; docetaksel (TAXOTERE); doksorubicin; droloksifen; dromostanolon; duazomicin; edatreksat; eflornitin; elsamitrucin; enloplatin; enpromat; epipropidin; epirubicin; erbulozol; erlotinib (TARCEVA), esorubicin; estramustin; etanidazol; etopozid; etoprin; fadrozol; fazarabin; fenretinid; floksuridin; fludarabin; 5-fluorouracil; flurocitabin; foskvidon; fostricin; gefitinib (IRESSA), gemcitabin; hidroksiurea; idarubicin; ifosfamid; ilmofozin; imatinib mezilat (GLEEVAC); interferon alfa-2a;
21
interferon alfa-2b; interferon alfa-n1; interferon alfa-n3; interferon beta-I a; interferon gama-I b; iproplatin; irinotekan; lanreotid; lenalidomid (REVLIMID, REVIMID); letrozol; leuprolid; liarozol; lometreksol; lomustin; losoksantron; masoprokol; majtanzin; mehloretamin; megestrol; melengestrol; melfalan; menogaril; merkaptopurin; metotreksat; metoprin; meturedepa: mitindomid; mitokarcin; mitokromin; mitogilin; mitomalcin; mitomicin; mitosper; mitotan; mitoksantron; mikofenolna kiselina; nokodazol; nogalamicin; ormaplatin; oksisuran; paklitaksel; pemetreksed (ALIMTA), pegaspargazu; peliomicin; pentamustin; pentomon; peplomicin; perfosfamid; pipobroman; piposulfan; piritreksim izetionat; piroksantron; plikamicin; plomestan; porfimer; porfiromicin; prednimustin; prokarbazin; puromicin; pirazofurin; riboprin; rogletimid; safingol; semustin; simtrazen; sitogluzid; sparfosat; sparsomicin; spirogermanijum; spiromustin; spiroplatin; streptonigrin; streptozocin; sulofenur; talisomicin; tamsulozin; taksol; taksoter; tekogalan; tegafur; teloksantron; temoporfin; temozolomid (TEMODAR); tenipozid; teroksiron; testolakton; talidomid (THALOMID) i njegovi derivati; tiamiprin; tioguanin; tiotepa; tiazofurin; tirapazamin; topotekan; toremifen; trestolon; triciribin; trimetreksat; triptorelin; tubulozol; uracil mustard; uredepa; vapreotid; verteporfin; vinblastin; vinkristin; vindezin; vinepidin; vinglicinat; vinleurozin; vinorelbin; vinrosidin; vinzolidin; vorozol; zeniplatin; zinostatin; zorubicin.
[0447] Antikancerski agens može biti inhibitor enzima uključujući bez ograničenja inhibitor tirozin kinaze, inhibitor CDK, inhibitor MAP kinaze, ili inhibitor EGFR. Inhibitor tirozin kinaze može biti bez ograničenja genistein (4'.5,7-trihidroksiizoflavon), tirfostin 25 (3,4,5-trihidroksifenil), metilen]-propandinitril, herbimicin A, daidzein (4',7-dihidroksiizoflavon), AG-126, trans-1-(3'-karboksi-4'-hidroksifenil)-2-(2",5"-dihidroksi-fenil)etan, ili HDBA (2-hidroksi5-(2,5-dihidroksibenzilamino)-2-hidroksibenzoeva kiselina. Inhibitor CDK može biti bez ograničenja p21, p27, p57, p15, p16, p18, ili p19. Inhibitor MAP kinaze može biti bez ograničenja KY12420 (C23H24O8), CNI-1493, PD98059, ili 4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinil fenil)-5-(4-piridil) 1H-imidazol. Inhibitor EGFR može biti bez ograničenja erlotinib (TARCEVA), gefitinib (IRESSA), WHI-P97 (derivat kvinazolina), LFM-A12 (analog metabolita leflunomida), ABX-EGF, lapatinib, kanertinib, ZD-6474 (ZACTIMA), AEE788, i AG1458.
[0448] Antikancerski agens može biti inhibitor VEGF uključujući bez ograničenja bevacizumab (AVASTIN), ranibizumab (LUCENTIS), pegaptanib (MACUGEN), sorafenib, sunitinib (SUTENT), vatalanib, ZD-6474 (ZACTIMA), anekortav (RETAANE), skvalamin laktat, i semaforin.
[0449] Antikancerski agens može biti antitelo ili fragment antitela uključujući bez ograničenja antitelo ili fragment antitela uključujući ali bez ograničenja na bevacizumab (AVASTIN), trastuzumab (HERCEPTIN), alemtuzumab (CAMPATH, indikovan za hroničnu B ćelijsku limfocitnu leukemiju), gemtuzumab (MYLOTARG, hP67.6, anti-CD33, indikovan za leukemiju
21
kao što je akutna mijeloidna leukemija), rituksimab (RITUXAN), tositumomab (BEXXAR, anti-CD20, indikovan za B ćelijski malignitet), MDX-210 (bispecifično antitelo koje se vezuje istovremeno za HER-2/neu onkogenski proteinski proizvod i Fc receptore tipa 1 za imunoglobulin G (IgG) (Fc gama RI)), oregovomab (OVAREX, indikovan za kancer jajnika), edrekolomab (PANOREX), daklizumab (ZENAPAX), palivizumab (SYNAGIS, indikovan za respiratorna stanja kao što je RSV infekcija), ibritumomab tiuksetan (ZEVALIN, indikovan za ne-Hočkinov (non-Hodgkin's) limfom), cetuksimab (ERBITUX), MDX-447, MDX-22, MDX-220 (anti-TAG-72), IOR-C5, IOR-T6 (anti-CD1), IOR EGF/R3, celogovab (ONCOSCINT OV103), epratuzumab (LYMPHOCIDE), pemtumomab (THERAGYN), i Gliomab-H (indikovan za kancer mozga, melanom).
[0450] Dijagnostički agens, koji se ovde može označiti kao agens za snimanje, je agens koji direktno ili indirektno emituje signal i na taj način omogućava njegovu detekciju in vivo. Dijagnostički agensi kao što su kontrastni agensi i radioaktivni agensi mogu se detektovati upotrebom tehnika medicinskog snimanja kao što su skeniranje nuklearne medicine i snimanje magnetnom rezonancom (MRI). Agensi za snimanje magnetnom rezonancom (MRI) uključuju Gd(DOTA), gvožđe oksid ili nanočestice zlata; agensi za snimanje za nuklearnu medicinu uključuju<201>TI gama-emitujući radionuklid 99 mTc; agensi za snimanje za pozitron-emisionu tomografiju (PET) uključuju izotope koji emituju pozitron, (18)F-fluorodezoksiglukozu ((18)FDG), (18)F-fluorid, bakar-64, gadoamid, i radioizotope Pb(II) kao što su 203 Pb, i 11In; agensi za snimanje za in vivo fluorescentno snimanje kao što su fluorescentne boje ili nanočestice konjugovane za boju. U drugim primerima izvođenja, agens koji se isporučuje je konjugovan, ili fuzionisan sa, ili pomešan ili kombinovan sa dijagnostičkim agensom.
[0451] Jedinjenja i kompozicije se mogu primenjivati praktično svakom tipu subjekta za koji je verovatno da će imati koristi od isporuke agenasa kao što je ovde razmatrano. Humani subjekti su poželjni subjekti u nekim primerima izvođenja pronalaska. Subjekti takođe uključuju životinje kao što su kućni ljubimci (npr. psi, mačke, zečevi, feretke, itd.), stoka ili životinje na farmi (npr. krave, svinje, ovce, kokoške i druga živina), konji kao što su rasni konji, laboratorijske životinje (npr. miševi, pacovi, zečevi, itd.), i slično. Subjekti takođe uključuju ribe i druge vodene vrste.
[0452] Subjekti kojima se isporučuju agensi mogu biti normalni subjekti. Alternativno oni mogu imati ili mogu biti izloženi riziku od razvoja stanja koje se može dijagnostikovati ili koje može imati koristi od lokalizovane isporuke jednog ili više određenih agenasa. Takva stanja uključuju kancer (npr. čvrsti tumor kanceri), infekcije (posebno infekcije lokalizovane na određenim regionima ili tkivima u telu), autoimunske poremećaje, alergije ili alergijska stanja, astmu, odbacivanje transplantata, i slično. U nekim primerima izvođenja, subjektima je dijagnostikovan genetički defekt i primenjen im je terapeutik na bazi nukleinske kiseline.
22
[0453] Agensi se mogu primenjivati sistemski ili lokalno. Agensi se mogu primenjivati u efikasnim količinama. Efikasna količina je doza agensa dovoljna da obezbedi medicinski poželjan rezultat. Efikasna količina će varirati u zavisnosti od određenog stanja koje se leči, starosti i fizičkog stanja subjekta koji se leči, ozbiljnosti stanja, trajanja lečenja, prirode istovremene ili kombinovane terapije (ukoliko postoji), specifičnog puta primene i sličnih faktora unutar znanja i stručnosti zdravstvenog radnika. Generalno je poželjno da se upotrebljava maksimalna doza, to jest najveća bezbedna doza u skladu sa zdravom medicinskom procenom.
[0454] Pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije. Farmaceutske kompozicije su sterilne kompozicije koje sadrže agense i mogu da sadrže vehikulume za isporuku, nanočestice i slično, poželjno u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Termin "farmaceutski prihvatljiv nosač" znači jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih filera, razblaživača ili inkapsulirajućih supstanci koje su pogodne za primenu humanom ili drugom subjektu koji je razmatran pronalaskom. Termin "nosač" označava organski ili neorganski sastojak, prirodan ili sintetički, sa kojim su ćelije, nanočestice i agens(i) kombinovani kako bi se olakšala primena. Komponente farmaceutskih kompozicija su pomešane na način koji onemogućava interakciju koja bi suštinski narušila njihovu željenu farmaceutsku efikasnost.
[0455] Jedinjenja i kompozicije, kada je poželjno da se isporučuju sistemski, mogu se formulisati za parenteralnu primenu injekcijom, npr. bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Formulacije za injekcije mogu biti predstavljene u obliku jedinične doze, npr. u ampulama ili u kontejnerima sa više doza. Farmaceutske parenteralne formulacije uključuju vodene rastvore sastojaka. Vodene suspenzije za injekcije mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol, ili dekstran. Alternativno, suspenzije sastojaka mogu se pripremiti kao suspenzije na bazi ulja, kao što su poznate u struci ili koje će biti očigledne onima sa prosečnim iskustvom u struci na osnovu ove objave.
[0456] Ova objava dodatno razmatra upotrebu LNP zajedno sa jednim ili više sekundarnih agenasa, uključujući agense koji bi normalno bili indikovani za subjekta.
[0457] U nekim instancama, LNP se mogu primeniti suštinski istovremeno sa sekundarnim agensima. Pod suštinski istovremeno, podrazumeva se da se LNP primenjuje subjektu vremenski blizu sa primenom sekundarnog agensa, uključujući na primer unutar 1 sata, unutar 30 minuta, unutar 10 minuta, ili unutar 5 minuta.
[0458] U nekim instancama, sekundarni agens(i) se može(gu) primenjivati pre LNP. Na primer, sekundarni agens(i) se može(gu) primenjivati pre i unutar 24 sata, ili unutar 18 sati, ili unutar 12 sati, ili unutar 6 sati, ili unutar 3 sata, ili unutar 2 sata od primene LNP. Sekundarni agens(i) se može(gu) primenjivati 18-24 sata pre primene LNP, ili 12-18 sati pre primene LNP, ili 6-12 sati pre primene LNP, ili 2-6 sati pre primene LNP.
[0459] Subjekti kojima je primenjen jedan ili više sekundarnih agenasa 2 ili više sati pre primene LNP mogu se označavati kao da su pre-medikovani sa takvim agensom(ima). Subjekti kojima je primenjen jedan ili više sekundarnih agenasa unutar 1 sata pre primene LNP mogu se označavati kao ko-medikovani sa takvim agensom(ima).
[0460] U nekim instancama, sekundarni agens(i) se može(gu) primenjivati subjektu kontinuirano, po potrebi ili po redovnom rasporedu (npr. svaki dan, svaka dva dana, itd.).
[0461] U drugim instancama, sekundarni agens se može primenjivati pre ili posle primene LNP.
[0462] Takvi sekundarni agensi mogu uključivati ali nisu ograničeni na antihistaminike, agense protiv krvnih pločica, i nesteroidne antiinflamatorne lekove. U određenim primerima izvođenja, LNP nisu formulisane sa i subjekti nisu pre- ili ko-medikovani sa kortikosteroidom, kao što je, ali nije ograničeno na deksametazon.
[0463] U određenim primerima izvođenja, upotrebljavaju se pojedinačni sekundarni agensi koji imaju antiinflamatorne i efekte protiv krvnih pločica. Primer takvog agensa je aspirin.
[0464] U određenim primerima izvođenja, upotrebljava se kombinacija aspirina, klopidrogrela (Plavix<®>), i antihistaminika kao što su ali nije ograničeno na difenhidramin (benadril), feksofenadin (alegra), loratadin (klaritin), ili cetirizin. Jedan ili više sekundarnih agenasa mogu se primeniti jednom po primeni LNP dok se drugi mogu primenjivati češće. Na primer, klopidrogrel (Plavix<®>) se može primeniti jednom po primeni LNP, dok se aspirin i/ili antihistaminik mogu primenjivati dnevno.
[0465] Antihistaminici uključuju antagoniste H1 receptora i inverzne agoniste H1 receptora.
[0466] Primeri antagonista H1 receptora uključuju ali nisu ograničeni na akrivastin, alimemazin, alimemazin tartarat, antazolin, astemizol, azatadin, azatadin maleat, azelastin, bamipin, benzkvinamid, bepotastin, bepotastin bezilat, bilastin bromazin, bromofeniramin, buklizin, karbinoksamin, hlorfenoksamin, hlorciklizin, cinopentazon histapirodin, hlorodifeinhidramin, hloropiramin, hlorofenamin, hlorpromazin, cinarizin, klemastin, klemizol, klokinizin, ciklizin, ciproheptadin, desloratadin, deptropin, dekshlorfeniramin, deksbromfenirain, dimenhidrinat, dimetinden, dimetotiazin, difenhidramin (benadril), pifenilpiralin, doksepin, doksilamin, ebastin, efletirizin, embramin, emedastin, epinastin, feksofenadin (alegra), flunarizin, homohlorciklizin, hidroksizin, izotipendil, ketotifen, levokabastin (2. generacija), loratadin (klaritin), mebhidrolin, meklozin, mepiramin, mekvitazin, metdilazin, mirtazapin, mizolastin, niaprazin, olopatadin, orfenadrin, oksatomid, oksomemazin, pemirolast, fenindamin, feniramin, feniltoloksamin, pimetiksen, piprinhidrinat, prometazin, propiomazin, pirobutamin, kvetiapin, kvifenadin, rupatadin, setastin, terfenadin, tenildiamin, tietilperazin, tonzilamin, tolpropamin, trimetobenzamin, tripelenamin, triprolidin i tritokvalin.
[0467] Primeri inverznih agonista H1 receptora uključuju ali nisu ograničeni na pirilamin, cetirizin, levocetirizin, i desloratadin.
[0468] Agensi protiv krvnih pločica uključuju ali nisu ograničeni na inhibitore aktivacije, inhibitore agregacije, antagoniste adhezije, antikoagulacione lekove (koji ne ciljaju direktno krvne pločice), i agense koji redukuju količinu ili brojeve krvnih pločica.
[0469] Primeri inhibitora aktivacije uključuju ali nisu nisu ograničeni na (1) inhibitore trombin receptora PAR-1 kao što su SCH 530348 (vorapaxar), E-5555 (atopaxar), SCH79797, FR 171113, RWJ 56110, BMS-200661, RWJ-58259, SCH205831, Pipal-7 pepducin, P1pal-12 pepducin; (2) inhibitore trombin receptora PAR-4 kao što su ML 354, tcY-NH2, P4pal-10 pepducin, P4pal-i1 pepducin; (3) FSLLRY-NH2 (antagonist PAR-2 peptida); (4) antagoniste TxA2 receptora kao što su AH 23,848, SQ 29,548, ili R 68,070, S-1452, iosartan, seratrodast; (5) antagoniste tromboksan receptora kao što je terutroban; (6) inhibitore ADP P2Y12 receptora kao što su tiklopidin, klopidogrel, prasugrel, tikagrelor, kangrelor, elinogrel, AZD6140, AR-C69931, CoA; (7) inhibitore ADP P2Y1 receptora kao što su A2P5P, A3P5P, MRS2179, MRS2279, MRS2500, palmitoil-CoA (takođe deluje na P2Y12), i druga jedinjenja iz SAR studije od strane Thalji et al.
2010; (8) antagoniste 5-HT2A kao što su R-1012444, naftidrofuril, sarpogrelat, AT-1015; (9) inhibitore tromboksan sintaze kao što su dazoksiben, CS-518 (inhibitor TXA2 sintaze), SB 203580, U63557A, imidazo (1,5-2) piridin-5-heksanska kiselina; (10) inhibitore COX-1 kao što su aspirin, NCX-4016, ridogrel, S18886, pikotamid, ramatroban (takođe antagonist TXA2 receptora), SC-560, FR122047, mofezolak, P6, TFAP, ibuprofen i naproksen (takođe inhibitori Cox-2); (11) inhibitore COX-2 kao što su trifluzal (takođe inhibitor COX-1 i PDE), etorikoksib, rofekoksib, celekoksib, meloksikam; i (12) inhibitore PI3K kao što je AZD6482.
[0470] Primeri inhibitora agregacije uključuju ali nisu ograničeni na (1) inhibitore GPIa/IIa kao što je EMS16; (2) inhibitore GPVI kao što su monoklonalna antitela i Fab fragmenti mAb 12A5; (3) inhibitore GPIIb/IIIa kao što su abciksimab, eptifibatid, tirofiban; (4) inhibitore PDE kao što su dipiridamol (takođe inhibitor ponovnog preuzimanja adenozina), cilostazol (inhibitor PDE3 koji rezultuje povećanim cAMP, i aktiviranom PKA), i (5) antagoniste ADP receptora. Drugi inhibitori agregacije krvnih pločica uključuju aspirin, klopidrogrel (Plavix<®>), aspirin/pravastatin, cilostazol, prasugrel, aspirin/dipiridamol, tikagrelor, kangrelor, elinogrel, dipiridamol, i tiklopidin.
[0471] Primeri antagonista adhezije (za fibrinogen) uključuju ali nisu ograničeni na protein-1 srodan sa C1qTNF, DZ-697b, RG 12986.
[0472] Primeri antikoagulacionih agenasa koji ne ciljaju direktno krvne poločice uključuju ali nisu ograničeni na varfarin; inhibitore Xa kao što su rivaroksaban, apiksaban, edoksaban, betriksaban, dareksaban, otamiksaban; inhibitore trombina kao što su bivalirudin, hirudin, dabigatran,
22
lepirudin, desirudin, argatroban, melagatran, dabigatran, CDSO3, FDSO3, SDSO3, i alorsteričke inhibitore dodatnih sulfatnih benzofurana koji su saopšteni u radu od strane Sidhu et al.
[0473] Primeri agenasa koji redukuju količinu ili broj krvnih pločica uključuju, ali nisu ograničeni na (1) inhibitore cAMP fosfodiesteraze (npr. anagrelid), 6,7-dihloro-1,5-dihidroimidazo-[2,1-b]kvinazolin-2(3H)-on ili 6,7-dihloro-1,2,3,5-tetrahidroimidazo[2,1-b]kvinazolin-2-on (S.A.D. patenti 3,932,407; 4,146,718; RE31,617, Haematologica 1992-77:40-3), (2) antitela za receptore na ćelijskoj površini koji se specifično eksprimiraju na krvnim pločicama ili megakariocitima kao što su antitela za receptore za glikoprotein IIb/IIIa, (3) većinu hemioterapijskih antikancerskih lekova kao što je busulfan (Br. J. Haematol.1986 62:229-37), hidroksiurea (N Engl J Med 1995 332:1132-6), hepsulfan, fosfor-32 (Br J Radiol 199770:1169-73), pipobroman (Scand J. Haematol 1986 37:306-9), ciklofosfamid (J Cell Physiol 1982 112:222-8), određeni alkilujući agensi i određeni antimetaboliti, (4) citokine, faktore rasta i interleukine kao što su alfa-interferon (Cancer Immunol Immunother 1987 25:266-73), gama-interferon, transformišući faktor rasta-beta, neutrofil aktivirajući peptid-2 i njegovi analozi (S.A.D. patent 5,472,944), inflamatorni protein makrofaga i njegovi analozi (S.A.D. patent 5,306,709), (5) jedinjenja sekretovana od strane bilo krvnih pločica ili megakariocita, kao što je faktor krvnih pločica 4 (S.A.D. patent 5,185,323), transformišući faktor rasta-beta, glikoprotein od 12-17 kD koji proizvode megakariociti, trombin i trombospondin i njegov amino (1-174 amino-kiselina) terminusni fragment (J Lab Clin Med 1997 129:231-8), i (6) druge agense uključujući antiheloidne agense kao što je tranilast (rizaben) (J Dermatol 199825:706-9); forskolin i faktor protiv sazrevanja slezine (S.A.D. patent 4,088,753).
[0474] Agensi protiv krvnih pločica se takođe mogu okarakterisati kao antitrombotički agensi, fibrinolitički agensi, direktni inhibitori trombina, inhibitori receptora za glikoprotein IIb/IIIa, agensi koji se vezuju za molekule ćelijske adhezije i inhibiraju sposobnost belih krvnih zrnaca da se prikače za takve molekule, blokatori kalcijumskih kanala, blokatori beta-adrenergičkih receptora, inhibitori ciklooksigenaze-2, i inhibitori angiotenzinskog sistema.
[0475] Antitrombotički agensi se definišu kao agensi koji sprečavaju stvaranje krvnog tromba putem brojnih potencijalnih mehanizama i uključuju fibrinolitičke agense, antikoagulantne agense, i inhibitore funkcije krvnih pločica.
[0476] Fibrinolitički agensi se definišu kao agensi koji liziraju tromb (npr. krvni ugrušak), obično disolucijom fibrina enzimskim delovanjem. Primeri trombolitičkih agenasa uključuju ali nisu ograničeni na ankrod, anistreplazu, bisobrin laktat, brinolazu, fragmente Hagemanovog faktora (tj. faktora XII), molsidomin, aktivatore plazminogena kao što je streptokinaza, tkivni aktivator plazminogena (TPA) i urokinazu, i plazmin i plazminogen. Antikoagulantni agensi takođe uključuju inhibitore faktora Xa, faktora TFPI, faktora VIIa, faktora IXc, faktora Va, faktora VIIIa kao i inhibitore drugih faktora koagulacije.
[0477] Antikoagulantni agensi su agensi koji inhibiraju put koagulacije tako što negativno utiču na proizvodnju, depoziciju, isecanje i/ili aktivaciju faktora esencijalnih za formiranje krvnog ugruška. Antikoagulantni agensi uključuju ali nisu ograničeni na antagoniste vitamina K kao što su kumarin i derivati kumarina (npr. varfarin natrijum); glikozoaminoglikane kao što su heparini i u nefrakcionisanom obliku i u obliku male molekulske težine; ardeparin natrijum, bivalirudin, bromindion, kumarin dalteparin natrijum, desirudin, dikumarol, lijapolat natrijum, nafamostat mezilat, fenprokumon, sulfatid, i tinzaparin natrijum.
[0478] Drugi "antikoagulantni" i/ili "fibrinolitički" agensi uključuju plazminogen; streptokinazu; urokinazu: anizoilirani plazminogen-streptokinaza aktivatorski kompleks; pro-urokinazu; (Pro-UK); rTPA (alteplaza ili aktivaza; r označava rekombinantnu); rPro-UK; abokinazu; eminazu; streptazu; anagrelid hidrohlorid; bivalirudin; dalteparin natrujum; danaparoid natrijum; dazoksiben hidrohlorid; efegatran sulfat; enoksaparin natrijum; ifetroban; ifetroban natrijum; tinzaparin natrijum; retaplazu; trifenagrel; varfarin; dekstrane.
[0479] Još drugi antikoagulantni agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, ankrod; antikoagulantni rastvor citrat dekstroze; antikoagulantni rastvor citrat fosfat dekstroza adenina; antikoagulantni rastvor citrat fosfat dekstroze; antikoagulantni rastvor heparina; antikoagulantni rastvor natrijum citrata; ardeparin natrijum; bromindion; desirudin; dikumarol; heparin kalcijum; heparin natrijum; lijapolat natrijum; nafamostat mezilat; fenprokoumon.
[0480] Agensi za liziranje ugruška uključuju, ali nisu ograničeni na, tkivni aktivator plazminogena, streptokinazu, i nimodipin.
[0481] Inhibitori funkcije krvnih pločica su agensi koji narušavaju sposobnost zrelih krvnih pločica da obavljaju svoje normalne fiziološke uloge (tj. svoju normalnu funkciju). Krvne pločice su normalno uključene u brojne fiziološke procese kao što je adhezija, na primer, za ćelijske i nećelijske entitete, agregacija, na primer, u svrhu formiranja krvnog ugruška, i oslobađanje faktora kao što su faktori rasta (npr. faktor rasta poreklom od krvnih pločica (PDGF)) i komponente iz granula krvnih pločica. Jedna podkategorija inhibitora funkcije krvnih pločica su inhibitori agregacije krvnih pločica koji su jedinjenja koja redukuju ili zaustavljaju sposobnost krvnih pločica da se fizički asociraju jedne sa drugima ili sa drugim ćelijskim i nećelijskim komponentama, čime se isključuje sposobnost krvnih pločica da formiraju tromb.
[0482] Primeri korisnih inhibitora funkcije krvnih pločica uključuju ali nisu ograničeni na akadesin, anagrelid, anipamil, argatroban, aspirin, klopidogrel, inhibitore ciklooksigenaze kao što su nesteroidni antiinflamatorni lekovi i sintetičko jedinjenje FR-122047, danaparoid natrijum, dazoksiben hidrohlorid, analozi diadenozin 5',5‴-P1,P4-tetrafosfata (Ap4A), difibrotid, dilazep dihidrohlorid, 1,2- i 1,3-gliceril dinitrat, dipiridamol, dopamin i 3-metoksitiramin, efegatran sulfat, enoksaparin natrijum, glukagon, antagonisti glikoproteina IIb/IIIa kao što su Ro-43-8857 i L-
22
700,462, ifetroban, ifetroban natrijum, iloprost, izokarbaciklin metil estar, izosorbid-5-mononitrat, itazigrel, ketanserin i BM-13.177, lamifiban, lifarizin, molsidomin, nifedipin, oksagrelat, PGE, antagonisti faktora aktiviranja krvnih pločica kao što su leksipafant, prostaciklin (PGI2), pirazini, piridinol karbamat, ReoPro (tj. abciksimab), sulfinpirazon, sintetička jedinjenja BN-50727, BN-52021, CV-4151, E-5510, FK-409, GU-7, KB-2796, KBT-3022, KC-404, KF-4939, OP-41483, TRK-100, TA-3090, TFC-612 i ZK-36374, 2,4,5,7-tetratiaoktan, 2,4,5,7-tetratiaoktan 2,2-dioksid, 2,4,5-tritiaheksan, teofilin pentoksifilin, tromboksan i inhibitori tromboksan sintetaze kao što su pikotamid i sulotroban, tiklopidin, tirofiban, trapidil i tiklopidin, trifenagrel, trilinolein, 3-supstituisani 5,6-bis(4-metoksifenil)-1,2,4-triazini, i antitela za glikoprotein IIb/IIIa, kao i ona koja su objavljena u S.A.D. patentu 5,440,020, i anti-serotonin lekovi, klopridogrel; sulfinpirazon; aspirin; dipiridamol; klofibrat; piridinol karbamat; PGE; glukagon; antiserotoninski lekovi; kofein; teofilin pentoksifilin; tiklopidin.
[0483] "Direktni inhibitori trombina" uključuju hirudin, hirugen, hirulog, agatroban, PPACK, trombin aptamere.
[0484] "Inhibitori receptora za glikoprotein IIb/IIIa" su i antitela i ne-antitela, i uključuju ali nisu ograničeni na ReoPro (abciksamab), lamifiban, tirofiban.
[0485] "Blokatori kalcijumskih kanala" su hemijski raznolika klasa jedinjenja koja imaju važnu terapijsku vrednost u kontroli raznih bolesti (Fleckenstein, Cir. Res. v. 52, (suppl. 1), p. 13-16 (1983); Fleckenstein, Experimental Facts and Therapeutic Prospects, John Wiley, New York (1983); McCall, D., Curr Pract Cardiol, v. 10, p.1-11 (1985)). Blokatori kalcijumskih kanala su heterogena grupa lekova koji sprečavaju ili usporavaju ulazak kalcijuma u ćelije regulacijom ćelijskih kalcijumskih kanala. (Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Edition, Mack Publishing Company, Eaton, PA, p.963 (1995)). Većina trenutno dostupnih blokatora kalcijumskih kanala, i korisnih u skladu sa predmetnim pronalaskom, pripadaju jednoj od tri glavne hemijske grupe lekova, dihidropiridinima, kao što je nifedipin, fenil alkil aminima, kao što je verapamil, i benzotiazepinima, kao što je diltiazem. Drugi blokatori kalcijumskih kanala korisni u skladu sa pronalaskom, uključuju, ali nisu ograničeni na, amrinon, amlodipin, benciklan, felodipin, fendilin, flunarizin, isradipin, nikardipin, nimodipin, perheksilen, galopamil, tiapamil i analoge tiapamila (kao što je 1993RO-11-2933), fenitoin, barbiturate, i peptide dinorfin, omegakonotoksin, i omega-agatoksin, i slično i/ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.
[0486] "Blokirajući agensi beta-adrenergičkih receptora" su klasa lekova koji antagonizuju kardiovaskularne efekte kateholamina kod angine pektoris, hipertenzije, i srčanih aritmija. Blokatori beta-adrenergičkih receptora uključuju, ali nisu ograničeni na, atenolol, acebutolol, alprenolol, befunolol, betaksolol, bunitrolol, karteolol, celiprolol, hedroksalol, indenolol, labetalol, levobunolol, mepindolol, metipranol, metindol, metoprolol, metrizoranolol, oksprenolol, pindolol,
22
propranolol, praktolol, praktolol, sotalolnadolol, tiprenolol, tomalolol, timolol, bupranolol, penbutolol, trimepranol, 2-(3-(1,1-dimetilelhil)-amino-2-hidroksipropoksi)-3-piridenkarbonitrilHCl, 1-butilamino-3-(2,5-dihlorofenoksi)-2-propanol, 1-izopropilamino-3-(4-(2-ciklopropilmetoksietil)fenoksi)-2-propanol, 3-izopropilamino-1-(7-metilindan-4-iloksi)-2-butanol, 2-(3-t-butilamino-2-hidroksi-propiltio)-4-(5-karbamoil-2-tienil)tiazol,7-(2-hidroksi-3-tbutilaminpropoksi)ftalid. Prethodno identifikovana jedinjenja se mogu upotrebljavati kao izomerne smeše, ili u njihovom odgovarajućem levorotirajućem ili desnorotirajućem obliku.
[0487] Ciklooksigenaza-2 (COX-2) je nedavno identifikovan oblik ciklooksigenaze. "Ciklooksigenaza" je enzimski kompleks koji je prisutan u većini tkiva koji proizvodi različite prostaglandine i tromboksane od arahidonske kiseline. Nesteroidni, antiinflamatorni lekovi ispoljavaju najveći deo svoje antiinflamatorne, analgetičke i antipiretičke aktivnosti i inhibiraju kontrakcije materice indukovane hormonima i određene vrste rasta kancera preko inhibicije ciklooksigenaze (takođe poznate kao prostaglandin G/H sintaza i/ili prostaglandin-endoperoksid sintaza). U početku je bio poznat samo jedan oblik ciklooksigenaze, "konstitutivni enzim" ili ciklooksigenaza-1 (COX-1). Prvobitno je identifikovan u goveđim semenim vezikulama.
[0488] Ciklooksigenaza-2 (COX-2) je klonirana, sekvencirana i okarakterisana inicijalno iz pilećih, murinskih i humanih izvora (videti, npr. S.A.D. patent 5,543,297, koji je izdat 6. avgusta 1996. u korist Cromlish, et al., i dodeljen kompaniji Merck Frosst Canada, Inc., Kirkland, CA, pod naslovom: "Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity").
[0489] Brojni selektivni "inhibitori COX-2" su poznati u struci. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibitore COX-2 koji su opisani u S.A.D. patentu 5,474,995 "Phenyl heterocycles as cox-2 inhibitors"; S.A.D. patentu 5,521,213 "Diaryl bicyclic heterocycles as inhibitors of cyclooxygenase-2"; S.A.D. patentu 5,536,752 "Phenyl heterocycles as COX-2 inhibitors"; S.A.D. patentu 5,550,142 "Phenyl heterocycles as COX-2 inhibitors"; S.A.D. patentu 5,552,422 "Aryl substituted 5,5 fused aromatic nitrogen compounds as anti-inflammatory agents"; S.A.D. patentu 5,604,253 "N-benzylindol-3-yl propanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors"; S.A.D. patentu 5,604,260 "5-methanesulfonamido-1-indanones as an inhibitor of cyclooxygenase-2"; S.A.D. patentu 5,639,780 "N-benzyl indol-3-yl butanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors"; S.A.D. patentu 5,677,318 "Diphenyl-1,2-3-thiadiazoles as anti-inflammatory agents"; S.A.D. patentu 5,691,374 "Diaryl-5-oxygenated-2-(5H) -furanoncs as COX-2 inhibitors"; S.A.D. patentu 5,698,584 "3,4-diaryl-2-hydroxy-2,5-dihydrofurans as prodrugs to COX-2 inhibitors"; S.A.D. patentu 5,710,140 "Phenyl heterocycles as COX-2 inhibitors"; S.A.D. patentu 5,733,909 "Diphenyl stilbenes as prodrugs to COX-2 inhibitors"; S.A.D. patentu 5,789,413 "Alkylated styrenes as prodrugs to COX-2 inhibitors"; S.A.D. patentu 5,817,700 "Bisaryl cyclobutenes
22
derivatives as cyclooxygenase inhibitors"; S.A.D. patentu 5,849,943 "Stilbene derivatives useful as cyclooxygenase-2 inhibitors"; S.A.D. patentu 5,861,419 "Substituted pyridines as selective cyclooxygenase-2 inhibitors"; S.A.D. patentu 5,922,742 "Pyridinyl-2-cyclopenten-1-ones as selective cyclooxygenase-2 inhibitors"; S.A.D. patentu 5,925,631 "Alkylated styrenes as prodrugs to COX-2 inhibitors"; koji su svi zajedno dodeljeni kompaniji Merck Frosst Canada, Inc. (Kirkland, CA). Dodatni inhibitori COX-2 su takođe opisani u S.A.D. patentu 5,643,933, dodeljenom kompaniji G. D. Searle & Co. (Skokie, IL), pod naslovom: "Substituted sulfonylphenylheterocycles as cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase inhibitors". Aspirin je primer inhibitora COX-2.
[0490] Brojni prethodno identifikovani inhibitori COX-2 su prolekovi selektivnih inhibitora COX-2, i ispoljavaju svoje delovanje konverzijom in vivo u aktivne i selektivne inhibitore COX-2. Aktivni i selektivni inhibitori COX-2 formirani od prethodno identifikovanih prolekova inhibitora COX-2 su detaljno opisani u WO 95/00501, koji je objavljen 5. januara 1995., WO 95/18799, koji je objavljen 13. jula 1995. i u S.A.D. patentu 5,474,995, koji je izdat 12. decembra 1995. Imajući u vidu učenja iz S.A.D. patenta 5,543,297, pod naslovom: ""Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity", osoba sa prosečnim veštinama u struci bi mogla da odredi da li je agens selektivni inhibitor COX-2 ili prekursor inhibitora COX-2, i prema tome deo predmetnog pronalaska.
[0491] Nesteroidni antiinflamatorni lekovi uključuju ali nisu ograničeni na naproksen natrijum, diklofenak, sulindak, oksaprozin, diflunisal, aspirin, piroksikam, indometocin, etodolak, ibuprofen, fenoprofen, ketoprofen, mefenaminsku kiselinu, nabumeton, tolmetin natrijum, i ketorolak trometamin.
[0492] U nekim primerima izvođenja, sekundarni agens može biti agens koji inhibira proizvodnju prirodnog IgM, IgG, i/ili aktivaciju B1a i/ili B1b ćelija od strane LNP. Takvi agensi mogu biti antagonisti površinskog receptora B1a ćelija (npr. CD36 i C5a) ili B1b ćelija, na primer, antitela ili inhibitori malog molekula koji vezuju površinski receptor i ometaju njegovo vezivanje za njemu srodne ligande (npr. lipidna komponenta kao što je fosfatidilholin u određenim LNP).
[0493] U drugim primerima izvođenja, sekundarni agens može biti agens koji inhibira aktivaciju krvnih pločica i/ili sistema komplementa (klasični put ili alternativni put) od strane LNP. Takvi agensi mogu biti antagonisti CD36, antagonisti TLR, ili antagonisti bilo koje komponente u kaskadi komplementa. Takvi antagonisti mogu biti antagonistička antitela specifična za jedan od ciljeva. U nekim primerima, antagonisti mogu biti inhibitori proteaze koji ciljaju jednu ili više komponenti serin proteaze u sistemu komplementa. Drugi antagonisti CD36 uključuju, ali nisu ograničeni na, salvijanolnu kiselinu ili njene metabolite (npr. RA i DSS), 3-cinamoil indol, 13-pentil berberin, heksarelin, ili određene masne kiseline kao što je DHA.
22
[0494] Podrazumeva se da objava razmatra upotrebu jednog ili više od prethodnih sekundarnih agenasa sa bilo kojom od LNP koja je ovde obezbeđena, uključujući na primer one koje sadrže katjonski lipid kao što je MC3, pomoćni lipid kao što je DSPC ili DOPE, i strukturni lipid kao što je holesterol, i metoksi-PEGilovani lipid kao što je DMG-PEG, uključujući kada se takav metoksi-PEGilovani lipid upotrebljava u molskom procentu većem od 0,5% uključujući 1,5%. Stoga, objava razmatra da LNP koje bi inače pokrenule odgovor krvnih pločica mogu da se upotrebljavaju zajedno sa sekundarnim agensima koji uključuju jedan ili više sekundarnih agenasa protiv krvnih pločica. Takve kombinacije su namenjene da redukuju učestalost i/ili ozbiljnost ABC i toksičnost povezane sa upotrebom LNP in vivo.
[0495] Ovde su takođe obezbeđeni postupci za redukovanje odgovora na lekove, uključujući ABC i toksičnost koja ograničava dozu, povezane sa LNP koje inkapsuliraju iRNK.
[0496] ABC je fenomen praga, što znači da doza agensa kao što su LNP mora da dostigne prag kako bi indukovala klinički značajan ABC (znatan). U skladu sa tim, razmatra se da upotreba doze niže od praga može redukovati ABC ili sprečiti njegovu pojavu. Alternativno, LNP koje su ovde opisane mogu sniziti stimulatornu aktivnost B1a i/ili B1b i/ili prirodni IgM i stoga povećati prag doziranja.
[0497] U nekim primerima izvođenja, postupak za redukovanje ABC lipidnih LNP koje inkapsuliraju iRNK može se izvesti najmanje (i) primenjivanjem subjektu kome je to potrebno prve doze LNP, i (ii) primenjivanjem subjektu druge doze LNP; pri čemu su prva doza, druga doza, ili obe jednake ili manje od oko 0,3 mg/kg. Na primer, prva doza, druga doza, ili obe mogu biti jednake ili manje od 0,2 mg/kg ili 0,1 mg/kg. U nekim primerima, prva doza, druga doza, ili obe mogu biti u opsegu od oko 0,1-0,3 mg/kg. Interval između prve doze i druge doze može biti manji od 2 nedelje, npr. manji od 10 dana, manji od 1 nedelje, manji od 4 dana, ili manji od 2 dana. Kada su neophodne sledeće doze, mogu se upotrebljavati iste niske doze koje su ovde opisane. Interval između dve uzastopne doze može biti manji od 2 nedelje, na primer, manji od 10 dana, manji od 1 nedelje, manji od 4 dana, ili manji od 2 dana.
[0498] Toksičnost koja ograničava dozu, kao što je CARPA, označava neželjene efekte leka ili drugog lečenja koji su dovoljno ozbiljni da spreče povećanje doze ili nivoa lečenja. Razmatra se da bi upotreba režima lečenja koji bi mogli da održe nivo LNP u serumu ispod praga za pokretanje klinički značajne toksičnosti koja ograničava dozu redukovala takvu toksičnost ili sprečila njenu pojavu.
[0499] U skladu sa tim, ovde je obezbeđen postupak za isporučivanje lipidnih nanočestica (LNP) koje inkapsuliraju iRNK subjektu bez promovisanja toksičnosti povezane sa LNP. Takav postupak sadrži primenu određene količine LNP subjektu tokom perioda, pri čemu nivo LNP u serumu kod subjekta tokom perioda primene nije dovoljan da indukuje toksičnost povezanu sa LNP.
22
Toksičnost povezana sa LNP može biti koagulopatija, diseminovana intravaskularna koagulacija (DIC), vaskularna tromboza, pseudoalergija povezana sa aktivacijom (CARPA), odgovor akutne faze (APR), ili njihova kombinacija.
[0500] Unutar znanja onih sa iskustvom u struci je da odaberu pogodne doze LNP koje inkapsuliraju iRNK i trajanje primene (npr. infuzije) kako bi se nivo LNP u serumu održao ispod praga. Na primer, kada je potrebna velika doza kako bi se postigao predviđeni terapijski efekat, može se upotrebljavati duži period primene. Pojava bilo koje toksičnosti koja ograničava dozu može se pratiti putem konvencionalnih pristupa u medicinskoj praksi. Doza i period primene mogu se podesiti kada se pokaže bilo koji simptom povezan sa toksičnošću. U nekim primerima, doza LNP može biti niža od 1 mg/kg, npr. 0,5 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,2 mg/kg, ili 0,1 mg/kg. U drugim primerima, doza LNP može biti u opsegu od 0,5 do 1 mg/kg (npr. 0,3 do 0,5 mg/kg). Period primene može biti u opsegu od 30 minuta do 3 sata, na primer 1-2 sata. U nekim instancama, period primene nije manji od 1 sata, na primer, nije manji od 1,5 sata, nije manji od 2 sata, nije manji od 2,5 sata, ili nije manji od 3 sata.
[0501] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, iRNK koja je inkapsulirana u LNP može biti terapijska iRNK, koja može kodirati terapijski protein. iRNK inkapsulirana u LNP može takođe biti iRNK koja kodira antigen za vakcine. U nekim instancama, iRNK inkapsulirana u LNP može kodirati više proteina. U nekim primerima izvođenja, LNP koje se upotrebljavaju u ovom postupku mogu biti bilo koje od LNP koje su ovde opisane.
PRIMERI
Primeri test postupaka:
1. Testovi sa perlama pomoću protočne citometrije:
[0502] Streptavidin CML lateks perle (Polysciences Inc) su kuplovane sa biotinilovanim DSPC (6 mm perle) ili biotinilovanim PEG (10 mm perle) prema preporukama proizvođača. Kuplovane perle (DSPC kuplovane i PEG kuplovane) su inkubirane sa razblaženim serumom iz miševa kojima su injektirane različite LNP tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja, perle su zatim inkubirane sa pacovskim anti-mišjim IgM IgG (BD Biosciences) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja, ćelije su resuspendovane u PBS 2% BSA i analizirane pomoću protočne citometrije sa BD Fortessa (BD Biosciences). Titri anti LNP IgM su izračunati na osnovu standardne krive dobijene sa anti-PEG IgM monoklonalnim antitelom. Analiza je izvedena sa FlowJo i Prism softverom.
2
2. Test in vitro aktivacije krvnih pločica sa LNP ili LNP komponentama
[0503] Uzorci krvi su sakupljeni u BD Vacutainer od 6 ml koji sadrži 1 ml antikoagulanta citrat dekstroze (BD Biosciences) i centrifugirani bez ubrzanja i kočenja na 200 × g, 22 °C, tokom 20 minuta. Gornji, providni sloj plazme bogat krvnim pločicama (PRP) prebačen je u konusnu tubu od 15 ml i ispran u PBS+2% fetalnog telećeg seruma. Posle brojanja, 10<5>ćelija je inkubirano na sobnoj temperaturi tokom različitih vremenskih tačaka sa različitim LNP ili LPS ili različitim LNP komponentama i obojeno sa anti-CD41, CD31 i CD62P fluorescentno obeleženim tokom 20 min na ledu. Posle ispiranja ćelije su fiksirane i analizirane pomoću protočne citometrije sa BD Fortessa (BD Biosciences). Analiza je izvedena sa FlowJo i Prism softverom.
3. In vitro agregacija krvnih pločica sa makrofagima, B ćelijama
[0504] Uzorak krvi je sakupljen u BD Vacutainer od 6 ml koji sadrži 1 ml antikoagulanta citrat dekstroze (BD Biosciences). 10-25 ml krvi je inkubirano na sobnoj temperaturi tokom različitih vremenskih tačaka na sobnoj temperaturi sa različitim LNP ili LPS i obojeno sa anti-CD41, CD11b, CD19 i F4/80 fluorescentno obeleženim tokom 20 min na ledu. Posle ispiranja ćelije su fiksirane i analizirane pomoću protočne citometrije sa BD Fortessa (BD Biosciences). Analiza je izvedena sa FlowJo i Prism softverom.
4. Test in vivo aktivacije krvnih pločica
[0505] Miševima su intravenski injektirane različite LNP. Posle različitih vremenskih tačaka, uzorak krvi je sakupljen u BD Vacutainer od 6 ml koji sadrži 1 ml antikoagulanta citrat dekstroze (BD Biosciences) i centrifugiran bez ubrzanja i kočenja na 200 × g, 22 °C, tokom 20 minuta. Gornji, providni sloj plazme bogat krvnim pločicama (PRP) prebačen je u konusnu tubu od 15 ml i ispran u PBS+2% fetalnog telećeg seruma. Posle brojanja, 10<5>ćelija je obojeno sa anti-CD41, CD31 i CD62P fluorescentno obeleženim tokom 20 min na ledu. Posle ispiranja ćelije su fiksirane i analizirane pomoću protočne citometrije sa BD Fortessa (BD Biosciences). Analiza je izvedena sa FlowJo i Prism softverom.
5. In vivo agregacija krvnih pločica sa makrofagima, B ćelijama
2 1
[0506] Miševima su intravenski injektirane različite LNP. Posle različitih vremenskih tačaka, uzorak krvi je sakupljen u BD Vacutainer od 6 ml koji sadrži 1 ml antikoagulanta citrat dekstroze (BD Biosciences). 10-25 ml krvi je obojeno sa anti-CD41, CD11b, CD19 i F4/80 fluorescentno obeleženim tokom 20 min na ledu. Posle ispiranja ćelije su fiksirane i analizirane pomoću protočne citometrije sa BD Fortessa (BD Biosciences). Analiza je izvedena sa FlowJo i Prism softverom.
6. Test in vivo aktivacije B ćelija slezine:
[0507] Slezina životinja injektiranih sa fluorescentnim LNP sakupljena je u fiziološkom puferu. Suspenzija ćelija splenocita je pripremljena blagim pritiskanjem slezine kroz ćelijsku cediljku sa sitom od 70-µM (Fisher Scientific). Posle ispiranja, crvena krvna zrnca su lizirana i ćelije su resuspendovane u PBS+2% fetalnog telećeg seruma. Posle ispiranja i brojanja, 10<5>ćelija je obojeno sa anti-CD19, CD86 i CD69 fluorescentno obeleženim tokom 20 min na ledu. Posle ispiranja ćelije su fiksirane i analizirane pomoću protočne citometrije sa BD Fortessa (BD Biosciences). Analiza je izvedena sa FlowJo i Prism softverom.
7. In vivo interakcija LNP sa B ćelijama:
[0508] Slezina životinja injektiranih sa fluorescentnim LNP sakupljena je u fiziološkom puferu. Suspenzija ćelija splenocita je pripremljena blagim pritiskanjem slezine kroz ćelijsku cediljku sa sitom od 70-µM (Fisher Scientific). Posle ispiranja, crvena krvna zrnca su lizirana i ćelije su resuspendovane u PBS+2% fetalnog telećeg seruma. Posle ispiranja i brojanja, 10<5>ćelija je obojeno sa anti-CD19 i CD5 fluorescentno obeleženim tokom 20 min na ledu. Posle ispiranja ćelije su fiksirane i analizirane pomoću protočne citometrije sa BD Fortessa (BD Biosciences). Analiza je izvedena sa FlowJo i Prism softverom.
8. Test in vitro aktivacije B ćelija slezine:
[0509] Slezina životinja injektiranih sa fluorescentnim LNP sakupljena je u fiziološkom puferu. Suspenzija ćelija splenocita je pripremljena blagim pritiskanjem slezine kroz ćelijsku cediljku sa sitom od 70-µM (Fisher Scientific). Posle ispiranja, crvena krvna zrnca su lizirana i ćelije su resuspendovane u PBS+2% fetalnog telećeg seruma. Posle brojanja, 10<5>ćelija je inkubirano na 37 °C tokom naznačenih vremenskih tačaka sa različitim LNP ili medijumom. Posle inkubacije, ćelije su obojene sa anti-CD19, CD86 i CD69 fluorescentno obeleženim tokom 20 min na ledu. Posle
2 2
ispiranja ćelije su fiksirane i analizirane pomoću protočne citometrije sa BD Fortessa (BD Biosciences). Analiza je izvedena sa FlowJo i Prism softverom.
9. In vitro interakcija LNP sa B ćelijama:
[0510] Slezina životinja injektiranih sa fluorescentnim LNP sakupljena je u fiziološkom puferu. Suspenzija ćelija splenocita je pripremljena blagim pritiskanjem slezine kroz ćelijsku cediljku sa sitom od 70-µM (Fisher Scientific). Posle ispiranja, crvena krvna zrnca su lizirana i ćelije su resuspendovane u PBS+2% fetalnog telećeg seruma. Posle brojanja, 10<5>ćelija je inkubirano na 37 °C tokom naznačenih vremenskih tačaka sa različitim LNP ili medijumom. Posle inkubacije, ćelije su obojene sa anti-CD19 i CD5 fluorescentno obeleženim tokom 20 min na ledu. Posle ispiranja ćelije su fiksirane i analizirane pomoću protočne citometrije sa BD Fortessa (BD Biosciences). Analiza je izvedena sa FlowJo i Prism softverom.
10. Test aktivacije humanih B ćelija:
[0511] Humane PBMC su izolovane nakon odvajanja na Ficoll gradijentu. Posle brojanja, 10<5>ćelija je inkubirano na 37 °C tokom naznačenih vremenskih tačaka sa različitim LNP ili medijumom. Posle inkubacije, ćelije su isprane i obojene sa anti-CD19, CD86 i CD69 fluorescentno obeleženim tokom 20 min na ledu. Posle ispiranja ćelije su fiksirane i analizirane pomoću protočne citometrije sa BD Fortessa (BD Biosciences). Analiza je izvedena sa FlowJo i Prism softverom.
[0512] Anti-PEG IgM: Na nekoliko slika terminologija anti-PEG IgM je generalno upotrebljena za označavanje IgM. Ukoliko je IgM detektovan u vremenskoj tački pre 96 sati nakon isporuke LNP, IgM je prirodni IgM. Ukoliko je IgM izmeren posle 96 sati, IgM može biti anti-PEG IgM i/ili prirodni IgM. Prirodni IgM vezuju fosfoholin motiv rađe nego PEG.
Primer 1.
[0513] 2 × 10<5>sterilnih nefrakcionisanih splenocita je inkubirano sa 200 ng EGFP iRNK formulisane sa PE+ ili PE- LNP PE-rodaminom. LNP je sadržala MC3, DMG-PEG (1,5%), DSPC i holesterol, iRNK koja eksprimira EGFP, i PE za vizuelizaciju prisustva LNP. Posle 2, 4, 6, 24, 48 ili 120 h, ćelije su obojene na CD3 i CD19 i analizirane pomoću protočne citometrije na preuzimanje PE i ekspresiju EGFP. Paralelno, 10<5>HeLa ćelija je inkubirano sa 100 ng EGFP iRNK formulisane sa LNP PE-rodaminom, i ekspresija EGFP je praćena pomoću mikroskopa sa
2
IncuCyte tehnologijom. PE = fikoeritrin, fluorescira na 562 nm. PE fluorescencija demonstrira prisustvo LNP. Pojačani zeleni fluorescentni protein (EGFP) kada se jednom translatira ima maksimalnu talasnu dužinu emisije od 509 nm. EGFP fluorescencija demonstrira da je LNP teret translatiran.
[0514] LNP asociraju sa ili ih preuzimaju prvenstveno B ćelije (CD19+ ćelije) i ne T ćelije (CD3+ ćelije) u uslovima ex vivo kulture, kao što je pokazano na SL. 1. Splenociti inkubirani sa LNP kojima nedostaje PE ili samo sa medijumom ne pokazuju PE-rodamin fluorescenciju, kao što je očekivano.
[0515] Vremenski tokovi za LNP asocijaciju ili preuzimanje od strane CD3+ T ćelija ili CD19+ B ćelija su obezbeđeni na SL. 2A i 2B, respektivno. CD19+ B ćelije asociraju sa i/ili preuzimaju LNP brzo nakon inkubacije u ex vivo kulturi, i to u mnogo većoj meri nego CD3+ T ćelije. Oko 20% CD19+ B ćelija je pozitivno obojeno na PE do oko 48 sati inkubacije. Samo oko 5% CD3+ T ćelija obojeno je sa PE, i to tek posle 48 sati inkubacije. Stoga, čini se da B ćelije asociraju sa i/ili preuzimaju LNP u mnogo većoj meri i brže nego T ćelije.
[0516] Međutim, CD19+ B ćelije ne eksprimiraju LNP iRNK teret, kao što je demonstrirano na SL. 3. Nije uočena fluorescencija EGFP iz CD19+ B ćelija. Testirana vremena odgovaraju vremenskom periodu u kojem je uočena maksimalna asocijacija LNP i/ili preuzimanje od strane CD19+ (tj. do i uključujući 48 sati). Stoga, čini se da B ćelije asociraju sa i/ili preuzimaju LNP, ali ne eksprimiraju LNP iRNK teret.
[0517] Kako bi se procenio integritet tereta EGFP iRNK u ovim eksperimentima, izveden je kontrolni eksperiment u kome su HeLa ćelije inkubirane sa PE+ i PE- LNP, obe sadrže EGFP iRNK, i testirana je PE i EGFP fluorescencija. Slike su dobijene upotrebom IncuCyte. Kao što je očekivano, ćelije inkubirane sa PE+ LNP pokazale su crvenu fluorescenciju, dok ćelije inkubirane sa PE- LNP nisu. Obe ćelijske populacije; međutim, fluorescirale su zeleno, što ukazuje da je LNP iRNK teret bio eksprimiran u obe populacije.
Primer 2.
[0518] U sledećem eksperimentu, analiziran je efekat slezine i populacije splenocita na preuzimanje LNP i ekspresiju iRNK tereta. CD-1 miševi su splenektomizovani i zatim je LNP injektirana intravenski (i.v.). LNP je nosila teret hEPO iRNK i sadržala je MC3, DMG-PEG (1,5%), DSPC i holesterol. Koncentracija hEPO proteina u krvi izmerena je posle prve, druge i treće doze LNP, kao što je pokazano na SL. 4A. Nivo hEPO se smanjivao sa uzastopnim primenama, i kod miševa koji nisu splenektomizovani i kod splenektomizovanih miševa. Podaci podsećaju na fenomen ubrzanog klirensa iz krvi.
2 4
[0519] Nivo anti-PEG IgM antitela je takođe izmeren kod ovih miševa posle prve i druge doze LNP, kao što je pokazano na SL. 4B. Nivo anti-PEG IgM se smanjio između prve i druge doze, ali samo kod miševa bez splenektomije. Splenektomizovani miševi, s druge strane, imali su niže nivoe anti-EPG IgM u obe vremenske tačke i nisu pokazali takvo smanjenje nivoa IgM nakon druge doze.
Primer 3.
[0520] 2 × 10<5>Ficoll prečišćenih mononukleusnih ćelija periferne krvi (PBMC) inkubirano je sa 200 ng EGFP iRNK formulisane sa LNP PE-rodaminom. Posle 2, 4, 6, 24 sata, ćelije su obojene na CD3 i CD19 i analizirane pomoću protočne citometrije na preuzimanje PE i ekspresiju EGFP. LNP je sadržala MC3, DMG-PEG (1,5%), DSPC i holesterol.
[0521] Povećani nivoi preuzimanja PE+ LNP od strane cirkulišućih CD19+ B ćelija uočeni su posle 2 do 24 sata inkubacije, kao što je pokazano na SL.5. Kao što je očekivano, nije uočena PE fluorescencija u ćelijama inkubiranim sa PE- LNP ili samo sa medijumom. Vremenski tok je ilustrovan na SL.6A koja pokazuje da se LNP asocijacija i/ili preuzimanje stalno povećavalo od 2 sata do 24 sata. Preuzimanje LNP od strane cirkulišućih B ćelija je slično onom koje je uočeno u B ćelijama slezine. SL. 6B pokazuje da se ekspresija EGFP ne javlja u cirkulišućim CD191 B ćelijama, slično kao kod B ćelija slezine.
Primer 4.
[0522] 2 × 10<5>splenocita ili PBMC inkubirano je sa 200 ng EGFP iRNK formulisane sa LNP koje sadrže PE-rodamin ili LNP kojima nedostaje PE-rodamin ("ne-PE-rodamin"). Posle 24 h, ćelije su obojene na CD3, CD19 i CD86 i analizirane pomoću protočne citometrije na preuzimanje PE i povećanje ekspresije CD86. Ekspresija CD86 je upoređena između B ćelija inkubiranih sa PE+ LNP i PE- LNP i između B ćelija koje su preuzele PE+ LNP i B ćelija koje nisu preuzele PE+ LNP. Sekrecija IL-6 i TNF-alfa u supernatant ćelijske kulture je izmerena pomoću ELISA testa posle 24 h kulture.
[0523] B ćelije slezine i cirkulišuće B ćelije koje preuzimaju LNP su aktivirane kao što je izmereno pomoću povećanja ekspresije CD86. SL. 7 pokazuje da su B ćelije slezine i cirkulišuće B ćelije aktivirane posle inkubacije sa ili PE+ ili PE- LNP. SL. 8 na sličan način pokazuje da povećana ekspresija CD86 korelira sa LNP asocijacijom ili preuzimanjem od strane B ćelija slezine i cirkulišućih B ćelija. SL.9 pokazuje da su B ćelije slezine koje preuzimaju LNP aktivirane na LNP dozno zavisan način. Aktivacija je prolazan fenomen i počinje da se smanjuje posle 24 sata. B
2
ćelije inkubirane sa PE+ ili PE- LNP tokom 24 sata sekretuju povećane nivoe inflamatornih citokina IL-6 i TNF-alfa (SL.10).
Primer 5.
[0524] 2 × 10<5>splenocita je inkubirano sa PE+ LNP. Posle 4 i 24 h, ćelije su obojene na CD3, CD19 i CD86 i analizirane pomoću protočne citometrije na preuzimanje PE i povećanje ekspresije CD86. Sekrecija IL-6 i TNF-alfa u supernatant ćelijske kulture je izmerena pomoću ELISA testa posle 24 h kulture.
[0525] B ćelije slezine preuzimaju prazne PE+ LNP na 4 sata (SL.11B) i 24 sata (SL.11A i 11B). Preuzimanje praznih PE+ LNP od strane B ćelija slezine je slično onom koje je uočeno sa PE+ LNP koje nose EGFP iRNK teret. Prazne PE+ LNP su bile sposobne da aktiviraju B ćelije, što je dokazano povećanom ekspresijom CD86. B ćelije slezine su aktivirane praznim PE+ LNP na dozno zavisan način, kao što je pokazano na SL.12A. Slično, prazne PE+ LNP su bile sposobne da indukuju sekreciju IL-6 i TNF-alfa iz B ćelija slezine, kao što je pokazano na SL.12B.
Primer 6.
[0526] 2 × 10<5>splenocita iz miševa divljeg tipa (WT), i ApoE-/- ili LDL-R-/- nokaut miševa inkubirano je sa 200 ng EGFP iRNK formulisane sa PE+ ili PE- LNP. Posle 24 h, ćelije su obojene na CD3, CD19 i analizirane pomoću protočne citometrije na preuzimanje PE. Sekrecija IL-1alfa, KC-GRO i TNF-alfa u supernatant ćelijske kulture je izmerena pomoću ELISA testa.
[0527] Kao što je pokazano na SL.13A-13C, preuzimanje LNP na 24 sata je delimično ukinuto u odsustvu ApoE ili u odsustvu LDL receptora. SL. 13D ilustruje da B ćelije divljeg tipa i Apo deficijentne B ćelije sekretuju slične nivoe TNF-alfa i KC/GRO koji su viši od nivoa koje sekretuju LDLR deficijentne B ćelije nakon inkubacije sa LNP. Međutim, B ćelije divljeg tipa sekretuju više nivoe IL-1beta nego i Apo deficijentne i LDL receptor deficijentne B ćelije nakon inkubacije sa LNP.
Primer 7.
[0528] 2 × 10<5>splenocita je preinkubirano tokom 2 h sa slobodnim PEG ili sa anti-PEG IgG, i zatim inkubirano sa 200 ng EGFP iRNK formulisane sa PE+ ili PE- LNP. Posle 24 h LNP inkubacije, ćelije su obojene na CD3, CD19 i analizirane pomoću protočne citometrije na preuzimanje PE.
2
[0529] Preuzimanje LNP se i dalje dešavalo čak i posle pre-inkubacije B ćelija sa slobodnim PEG ili sa anti-PEG IgG antitelom, kao što je pokazano na SL. 14. Stoga, ne čini se da je takva preinkubacija bila u kompeticiji sa LNP koja sadrži PEG za vezivanje za B ćelije. Takođe se ne čini da je preinkubacija sa anti-PEG antitelom ometala sposobnost LNP da se veže za B ćelije.
Primer 8.
[0530] Splenociti su inkubirani sa 200 ng EGFP iRNK formulisane sa PE+ LNP koja sadrži ili PEG, PE-OH ili je bez PEG (bez PEG). Posle 24 h ćelije su obojene na CD3, CD19 i analizirane pomoću protočne citometrije na preuzimanje PE.
[0531] Preuzimanje LNP kojima je nedostajao PEG (LNP "bez PEG") ili LNP koje sadrže hidroksi-PEG (PEG-OH) je delimično ukinuto u poređenju sa LNP koje sadrže metoksi-PEG, kao što je pokazano na SL.15 i 16. LNP bez PEG i PEG-OH LNP, međutim, još uvek aktiviraju malu frakciju B ćelija, kao što je očigledno na SL.17. Očigledna je aktivacija B ćelija posredovana bez PEG. Aktivacija zasnovana na ekspresiji CD86 takođe izgleda da je dozno zavisna pošto B ćelije koje preuzimaju veće količine LNP pokazuju više nivoe ekspresije CD86.
Primer 9.
[0532] Splenociti su inkubirani sa 200 ng EGFP iRNK formulisane sa različitim PE+ ili PE- LNP. Ovim LNP je nedostajao fosfolipid ("bez fosfolipida"), ili su sadržale DSPC, oleinsku kiselinu, DOPC ili DOPE kao pomoćni lipid. U drugim eksperimentima, LNP su sadržale ili PEG, PE-OH, DOPE PEG ili su bile bez PEG (bez PEG). Posle 24 sata, ćelije su obojene na CD3, CD19, i CD5 i analizirane pomoću protočne citometrije na preuzimanje LNP.
[0533] SL.18 pokazuje preuzimanje LNP za LNP koje sadrže DSPC, oleinsku kiselinu, DOPC i DOPE kao pomoćni lipid, ili im nedostaje pomoćni lipid. Preuzimanje od strane B ćelija bilo je najveće za LNP koje sadrže DOPE, zatim LNP koje sadrže DOPC, i LNP koje sadrže DSPC. Najmanje preuzimanje od strane B ćelija viđeno je za LNP koje sadrže oleinsku kiselinu ili kojima nedostaje pomoćni lipid. Ovi podaci ukazuju da preuzimanje LNP od strane B ćelija delimično zavisi od sadržaja fosfolipida u LNP.
[0534] SL.19 ukazuje da je preuzimanje LNP bez PEG ili PEG-OH LNP uglavnom zbog prisustva CD19+ CD5+ B ćelija slezine. Ova populacija CD5+ B ćelija predstavlja B1a ćelije. Ove ćelije su odgovorne za proizvodnju prirodnog IgM. Preostalo preuzimanje uočeno sa LNP bez PEG i PEG-OH LNP je uglavnom zbog CD19+ CD5- konvencionalnih B ćelija. Ovi podaci sugerišu da
2
kombinovana upotreba hidroksi-PEG ili odsustvo PEG sa oleinskom kiselinom kao pomoćnim lipidom može dovesti do nepreuzimanja ili niskog preuzimanja LNP od strane B ćelija.
[0535] SL. 20 ukazuje da su CD5+ B ćelije odgovorne za preuzimanje većine LNP koje sadrže PEG-OH, DSPE i PEG, ili koje su bez PEG. CD5- ćelije su bile odgovorne za preuzimanje većine LNP koje sadrže DMG-PEG. Prezimanje LNP bez PEG ili PEG-OH LNP uglavnom je zbog prisustva CD19+ CD5+ B ćelija slezine murina.
Primer 10.
[0536] In vivo studija različitih LNP je preduzeta kako bi se procenio efekat različitih fosfolipida i PEG kombinacija na preuzimanje LNP od strane B ćelija slezine. Kontrolne i test grupe su sažete u Tabeli 2 u nastavku. Različite LNP sadržale su DMG-PEG i DSPC, PEG-OH i DSPC, ili DSPC bez PEG (bez PEG). Sve LNP su dodatno sadržale katjonski lipid MC3, i takođe su nosile EGFP iRNK. Primenjena je pojedinačna doza od 0,1 ml doze od 0,1 mg/kg (koncentracija 0,02 mg/ml).
Tabela 2. Sažetak eksperimentalnih grupa
[0537] SL.21 pokazuje da je ekspresija EGFP uočena u nekonvencionalnim T (CD3-) i B ćelijama (CD19-) u slezini tako rano kao što je 1 sat posle primene DMG-PEG, PEG-OH LNP i LNP bez PEG. 4 sata nakon primene, nivoi ekspresije EGFP su porasli u odnosu na nivo od 1 sata u svim test grupama. Međutim, ekspresija je bila najniža u grupi bez PEG.
[0538] SL.22A i 22B pokazuju da je preuzimanje od strane B ćelija in vivo slično preuzimanju koje je uočeno ex vivo i delimično zavisi od DMG-PEG. Preuzimanje od strane B ćelija je izmereno 1 sat nakon injekcije (SL. 22A) i 4 sata nakon injekcije (SL. 22B) sa PBS ili LNP koje sadrže DMG-PEG ili PEG OH, ili LNP kojima nedostaje PEG (LNP bez PEG).
[0539] SL.23A-23C pokazuju da preuzimanje od strane B ćelija LNP koje sadrže DMG-PEG (SL.
23A) ili Jed418 (SL. 23B) ili LNP bez PEG (SL. 23C) rezultuje aktivacijom B ćelija, kao što
2
ukazuje ekspresija CD86, na LNP dozno zavisan način. Preuzimanje LNP je izmereno 1 sat nakon injekcije (SL.23D) i 4 sata nakon injekcije (SL.23E) PBS ili LNP koje sadrže DMG-PEG ili PEG OH ili LNP bez PEG. Preuzimanje od strane B ćelija je takođe analizirano pomoću protočne citometrije (SL. 23A-23C). Nivoi aktivacije su 1 sat nakon injekcije bili slični između različitih LNP. Na 4 sata nakon injekcije LNP koje sadrže PEG OH ili kojima nedostaje PEG bili su manje stimulatorne nego LNP koje sadrže DMG-PEG.
[0540] CD19+ B ćelije su obojene i analizirane pojedinačno. Ispitivano je bojenje LNP (PE, crveno) i preklapanje između LNP i CD19 bojenja (zeleno). LNP su uglavnom locirane u membrani B ćelija. Manje LNP bez PEG i LNP koje sadrže Jed418 uočeno je na membrani u poređenju sa LNP koje sadrže DMG-PEG.
[0541] Sledeće, analizirano je preuzimanje LNP od strane CD5+ B ćelija. Rezultati su pokazani na SL.24A-24B. Preuzimanje LNP od strane CD5+ B ćelija in vivo je blago smanjeno kada LNP sadrži PEG-OH ili kada LNP nedostaje PEG. Preuzimanje LNP je izmereno 1 sat nakon injekcije (SL. 24A) i 4 sata nakon injekcije (SL.24B) PBS, ili LNP koja sadrži DMG-PEG ili PEG OH ili LNP bez PEG.
[0542] CD5+ B ćelije su obojene i analizirane pojedinačno. Ispitivano je bojenje LNP (PE, crveno) i preklapanje između LNP i CD19 bojenja (zeleno). LNP su uglavnom locirane u membrani B ćelija. Manje LNP bez PEG i LNP koje sadrže PEG-OH uočeno je na membrani u poređenju sa LNP koje sadrže DMG-PEG.
Primer 11.
[0543] Tabela 3 prikazuje studiju dizajniranu da analizira efekte LNP koje sadrže različite količine DMG-PEG. Sve test LNP su sadržale katjonski lipid MC3, pomoćni lipid DSPC, strukturni lipid holesterol i nosile hEPO iRNK teret. LNP su se razlikovale po svom sadržaju DMG-PEG sa sadržajem DMG-PEG u opsegu od 0%, 0,25%, 0,5%, 0,75%, 1%, 1,25%, i 1,5%. Procenti odražavaju teoretski mol %. Treća kolona tabele obezbeđuje lipidnu kompoziciju LNP izraženu kao teoretski mol %.
Tabela 3. Dizajn studije
2
[0544] Sledeći eksperimenti su izvedeni kako bi se odredio efekat povećanja sadržaja DMG-PEG u LNP na splenocite murina i aktivaciju B ćelija murina i na preuzimanje LNP od strane B ćelija murina. Uočeno je PE+ bojenje (i stoga asocijacija i/ili preuzimanje) B ćelija. Preuzimanje LNP je značajno redukovano kada je procenat DMG-PEG manji od 0,25%. Postoji povećanje PE veoma obojenih ćelija (povećano preuzimanje LNP) kada je procenat DMG-PEG veći od 0,5%. Kompletan skup podataka je obezbeđen na SL.25, koja pokazuje da je preuzimanje LNP značajno redukovano kada je procenat DMG-PEG manji od 0,5%. Ukupan procenat PE+ B ćelija je relativno konstantan za LNP koje sadrže jednako ili više od 0,5% DMG-PEG.
24
[0545] Sledeće, analizirana je aktivacija B ćelija, izmerena ekspresijom CD86, posle preuzimanja LNP koje imaju različite količine DMG-PEG. Ovi podaci su pokazani na SL.26. Ekspresija CD86 je povećana na površini B ćelija kako se povećao molski procenat DMG-PEG. Aktivacija B ćelija je u skladu sa preuzimanjem od strane B ćelija. Pored toga, najaktiviranije ćelije su one koje su se asocirale sa ili preuzele najviše LNP (označeno kao LNP PE veoma obojene).
Primer 12.
[0546] Tabela 4 prikazuje studiju dizajniranu da analizira efekte LNP koje sadrže različite količine DMG-PEG. Neke od testiranih LNP su sadržale katjonski lipid MC3, pomoćni lipid DSPC, strukturni lipid holesterol, i nosile su hEPO iRNK teret. Neke od testiranih LNP su sadržale katjonski lipid MC3, pomoćni lipid DOPE konjugovan za rodamin, strukturni lipid holesterol, i nosile su hEPO iRNK teret. Sa svakim podskupom LNP, količina DMG-PEG je varirala od 0%, 0,05%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, i 0,25%. Procenti odražavaju teoretski mol %. Treća kolona tabele obezbeđuje lipidnu kompoziciju LNP izraženu kao teoretski mol %.
Tabela 4. Dizajn studije
[0547] Sledeći eksperimenti su izvedeni kako bi se odredio efekat smanjenja sadržaja DMG-PEG u LNP na preuzimanje LNP od strane B ćelija i aktivaciju B ćelija. Ispitivano je PE+ bojenje (i stoga asocijacija i/ili preuzimanje) B ćelija. Preuzimanje LNP je značajno redukovano pri svim testiranim koncentracijama DMG-PEG (tj. sve ispod 0,5%). Kompletan skup podataka je obezbeđen na SL.27, koja pokazuje da je preuzimanje LNP značajno redukovano na svim DMG-PEG mol % koji su testirani (tj.0-0,25 mol %). Postoji odsustvo ili značajna redukcija preuzimanja LNP od strane B ćelija na ovim nižim DMG-PEG mol %. Postoji značajna redukcija aktivacije B ćelija, kao što je izmereno ekspresijom CD86, za sve LNP koje su testirane u poređenju sa LNP koje imaju 1,5 mol % DMG-PEG. Ekspresija CD86 u populacijama B ćelija je pokazala nimalo, nisko, srednje, i visoko preuzimanje LNP koje sadrže 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, i 0,25 mol % DMG-PEG (podaci nisu pokazani).
Primer 13.
24
[0548] Tabela 5 prikazuje studiju dizajniranu da analizira efekat LNP koje sadrže različite pomoćne lipide i različite hemije konjugacije PEG na preuzimanje takve LNP od strane B ćelija. Sve testirane LNP sadržale su katjonski lipid MC3 i strukturni lipid holesterol. LNP su se razlikovale u svojim pomoćnim lipidima sa nekim LNP koje sadrže oleinsku kiselinu, DSPC, DOPE (konjugovan za rodamin), oleinsku kiselinu i DOPE, ili DSPC i DOPE. LNP su se takođe razlikovale u PEGilovanoj lipidnoj komponenti sa nekim LNP koje sadrže DMG-PEG i drugim koje sadrže varijantu Jed395. Druga kolona obezbeđuje detalje u vezi sa kompozicijom lipida LNP. Treća kolona obezbeđuje detalje u vezi sa mol % svake LNP komponente. Struktura varijante Jed395 je obezbeđena na SL.31A.
Tabela 5. Dizajn studije
[0549] PE+ bojenje (i stoga asocijacija i/ili preuzimanje) CD19+ B ćelija za LNP koje sadrže oleinsku kiselinu, Jed395, i Jed404. LNP kompozicije su identifikovane na SL. 40. Kompletan skup podataka je obezbeđen na SL. 28. Čini se da LNP koja sadrži varijantu Jed395 ima veće preuzimanje od strane B ćelija. Ekspresija CD86 u populacijama B ćelija je pokazala nimalo, nisko, srednje, i visoko preuzimanje LNP koje sadrže Jed395, Jed404, i oleinsku kiselinu, respektivno. Nije bilo aktivacije u prisustvu oleinske kiseline.
Primer 14.
[0550] Ovaj eksperiment je procenio procenat aktivirane populacije B ćelija definisane kao (CD19+CD86+CD69+) kao funkciju sadržaja DMG-PEG u LNP, u prisustvu i odsustvu imikvimoda. DMG-PEG mol % bili su 0, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,25 i 1,5 mol %. Podaci su pokazani na SL.29A (bez imikvimoda) i 29B (sa imikvimodom). Aktivacija B ćelija se povećava kada se poveća procenat DMG-PEG. Čini se da 0,5% DMG-PEG čini prag, ispod kog B ćelije nisu aktivirane ili su minimalno aktivirane. Proinflamatorno oslobađanje citokina indukovano ovim istim LNP u ex vivo kulturi je pokazano na SL.30A (IFN-gama) i SL.30B (TNF-alfa). Podaci o sekreciji citokina su u skladu sa podacima o aktivaciji B ćelija. Povećana sekrecija citokina je uočena kada je DMG-PEG mol % povećan, pri čemu se 0,5% čini kao prag ispod kog nije uočen nikakav ili je uočen nizak nivo sekrecije citokina.
Primer 15.
[0551] Varijacije dizajna fosfolipida i supstitucije za PC, uključujući DSPC, lipide obezbeđene su na SL. 31A-31D. Modifikacije mogu da funkcionišu tako da redukuju asocijaciju LNP sa B ćelijama, prepoznavanje LNP od strane receptora, i konačno preuzimanje od strane B ćelija. Predviđene varijacije uključuju, ali nisu ograničene na modifikovanje glavene grupe PC (SL.
24
31A), jezgra PC (SL.31B), ili preko redukovanja planarnosti lipida (SL.31C). Druge varijante ili supstituenti uključuju modifikovanu oleinsku kiselinu, kao što je pokazano na SL.31D.
[0552] Varijacije DMG-PEG takođe su razmatrane i one uključuju, na primer, varijante koje imaju kraće lipidne repove, klik linker, i/ili hidroksi krajnju grupu na PEG funkcionalnoj grupi (PEG-OH, ili hidroksi-PEG). SL.32A pokazuje strukture za varijante Jed394, Jed395, Jed396, i Jed397. SL. 32B pokazuje primere Jed 398 i Jed 399.
[0553] Tabela parametara za studiju FFLuc ponovljenih doza sa različitim PEG lipidima i/ili alternativama za PEG kod miša pokazana je u Tabeli 6. Ova studija je dizajnirana da testira efekat različitih LNP komponenti koje stabilizuju površinu na proizvodnju IgG. Sve LNP koje su testirane sadržale su katjonski lipid MC3, pomoćni lipid DSPC i strukturni lipid holesterol u istim razmerama. Takođe su sve sadržale teret Luc iRNK. LNP se razlikovala u PEGilovanom lipidu. Anti-PEG ili anti-DSPC IgM odgovor izmeren pomoću protočne citometrije (perle) 96 sati posle primene druge doze pokazan je na SL.33. PEG DMG, PEG DSPE ili PEG DSG LNP indukovale su anti-LNP odgovore. Podaci predstavljeni na SL. 34 pokazuju anti-PEG IgM izmeren pomoću ELISA testa i anti-PEG ili anti-DSPC IgM izmerene pomoću protočne citometrije (perle) 96 sati posle primene druge doze. Anti-PEG IgM izmereni pomoću ELISA testa i perli su slični i nisu detektovane značajne razlike.
24
Primer 16.
[0554] Dopunske analize su izvedene upotrebom dizajna studije koji je prikazan u Tabeli 7 kako bi se procenilo vezivanje različitih LNP za krvne pločice in vivo. Testirane LNP su označene kao DMG-PEG LNP (koja sadrži DMG-PEG, pomoćni lipid DSPC, katjonski lipid MC3, i strukturni lipid holesterol), PEG-OH LNP (koja sadrži PEG-OH, pomoćni lipid DSPC, katjonski lipid MC3, i strukturni lipid holesterol), i LNP bez PEG (koja sadrži pomoćni lipid DSPC, katjonski lipid MC3, i strukturni lipid holesterol, ali joj nedostaje PEG).
[0555] Asocijacija LNP sa krvnim pločicama pokazana je na SL. 35. Procenat LNP asociran sa krvnim pločicama (kao što je naznačeno fikoeritrin (PE) fluorescencijom) pokazan je u tri vremenske tačke (15, 60 i 240 minuta) posle primene PBS, LNP koja sadrži DMG-PEG, LNP koja
24
sadrži PEG-OH, i LNP bez PEG (sleva nadesno za svaku vremensku tačku). Ovi eksperimenti su izvedeni na prečišćenim krvnim pločicama sakupljenim od subjekta u različitim vremenskim tačkama. Posle intravenske injekcije, LNP koje sadrže DMG-PEG su asocirale sa krvnim pločicama. Ova asocijacija je bilo brza, ali prolazna; posle 60 minuta više nije bila vidljiva. DMG-PEG, i specifičnije metoksi-PEG funkcionalna grupa, verovatno je bila odgovorna za uočenu asocijaciju LNP, pošto se asocijacija nije desila kada je hidroksi-PEG (PEG-OH) upotrebljen umesto DMG-PEG, niti se desila u odsustvu bilo kakvog PEG (koji se označava kao bez PEG).
[0556] Aktivacija krvnih pločica posle primene LNP pokazana je na SL. 36. Aktivacija krvnih pločica (kao što je naznačeno ekspresijom markera aktivacije krvnih pločica CD62P (MFI)) izmerena je u tri vremenske tačke (15, 60 i 240 minuta) posle primene PBS, DMG-PEG LNP, PEG-OH LNP, i LNP bez PEG (sleva nadesno). LNP su kao što je opisano u Tabeli 7. Primena LNP je dovela do povećane ekspresije CD62P. Aktivacija je najveća u DMG-PEG grupi, ali je takođe merljiva u PEG-OH i bez PEG grupama. Aktivacija je detektabilna na 15 minuta posle injekcije i maksimalna je na 60 minuta posle injekcije. Kao i kod asocijacije LNP sa krvnim pločicama, aktivacija je prolazna i smanjuje se sa vremenom.
[0557] Stoga, izgleda da se krvne pločice prvo asociraju sa injektiranim LNP, nakon čega se takve krvne pločice aktiviraju. LNP koje sadrže DMG-PEG mogu da se asociraju sa krvnim pločicama unutar 15 minuta od primene i zatim aktiviraju krvne pločice unutar 60 i 240 minuta od primene. LNP koje sadrže PEG-OH i LNP bez PEG, s druge strane, ne demonstriraju značajnu asocijaciju sa krvnim pločicama a ipak su još uvek u stanju da aktiviraju krvne pločice u vremenskim tačkama od 60 i 240 minuta. Nivo aktivacije krvnih pločica uočen sa PEG-OH LNP i LNP bez PEG je nešto niži od onog koji je uočen sa DMG-PEG LNP. Stoga je moguće da se krvne pločice aktiviraju čak i bez značajne asocijacije sa primenjenim LNP. Može biti da je asocijacija DMG-PEG LNP za krvne pločice stabilnija nego što je asocijacija drugih tipova LNP za krvne pločice, i da dok su asocirani in vivo takva asocijacija se raspada tokom testa.
[0558] Takođe je procenjeno prisustvo drugih ćelija u agregatima krvnih pločica. SL.37A i 37B pokazuju procenat B220+ B ćelija i F4/80+ makrofaga prisutnih u agregatima krvnih pločica nakon intravenske injekcije DMG-PEG LNP, PEG-OH LNP i LNP bez PEG. Prikazani su procenat B ćelija (kao što je naznačeno B220+ bojenjem, SL.37A) i procenat makrofaga (kao što je naznačeno F4/80+ bojenjem, SL.37B) u tri vremenske tačke (15, 60 i 240 minuta) posle primene PBS, DMG-PEG LNP, PEG-OH LNP, i LNP bez PEG (sleva nadesno). B ćelije i makrofagi su bili asocirani sa agregatima krvnih pločica. Makrofagi i B ćelije asocirane sa agregatima krvnih pločica nakon primene sva tri tipa LNP (DMG-PEG LNP, PEG-OH LNP i LNP bez PEG). Asocijacija B ćelija bila je slična između tri tipa LNP, što sugeriše da je PEG igrao minimalnu ili nikakvu ulogu u ovom fenomenu. Asocijacija makrofaga je neznatno varirala između tri tipa LNP,
24
pri čemu je najveća asocijacija makrofaga uočena sa LNP koje sadrže DMG-PEG. Značajnije razlike su uočene u vremenskoj tački od 240 minuta za oba tipa ćelija. Bez obzira na kompoziciju LNP i sadržaj PEG, asocijacija je bila prolazna i vremenom se smanjivala. Zanimljivo je da čak i u odsustvu uočljive 'LNP asocijacije' sa krvnim pločicama u prisustvu PEG-OH LNP i LNP bez PEG (videti SL. 35), postoji detektabilno prisustvo B ćelija i makrofaga u agregatima krvnih pločica.
[0559] Dopunski eksperimenti su sprovedeni in vitro kako bi se istražile ove interakcije krvnih pločica. Krvne pločice su inkubirane in vitro sa medijumom, LPS ili LNP koje sadrže pomoćni lipid DSPC (koje dodatno sadrže katjonski lipid MC3, DMG-PEG, i strukturni lipid holesterol). Aktivacija krvnih pločica je procenjena ekspresijom CD31 i CD62P u CD41+ populaciji krvnih pločica. Krvne pločice su se brzo i snažno aktivirale, kao što je naznačeno povećanom ekspresijom markera aktivacije CD31 i CD62P, posle kontakta sa LNP. Pik aktivacije krvnih pločica uočena je na 15 minuta, u poređenju sa 60 minuta kada su LNP primenjene in vivo. DSPC LNP je stimulisala krvne pločice u većem stepenu nego LPS i medijum u svakoj testiranoj vremenskoj tački. Podaci su pokazani na SL.38 i 39A-39D.
[0560] Zatim je određena sposobnost LNP da indukuje agregaciju krvnih pločica u testu pune krvi. Podaci su obezbeđeni na SL. 40A-40B. Agregirane ćelije su sakupljene i gejtovane na osnovu ekspresije CD41 (prva kolona), velikog rasejanja unapred i bočnog rasejanja (druga kolona) i ekspresije F4/80 (y-osa) i CD11b (x-osa) (treća kolona) posle kontakta sa medijumom (prvi red), LPS (drugi red) i DSPC LNP (treći red). Agregati krvnih pločica su izolovani na osnovu ekspresije CD41+ i visokog FCS i visokog SSC, kao što je pokazano u drugoj koloni za SL.40A. Pokazan je procenat agregiranih ćelija koje su CD11b+ F4/80+ dvostruko pozitivne (makrofagi) posle primene medijuma, LPS, i DSPC LNP (sleva nadesno) (SL.40B). DSPC LNP su rezultovale većim procentom makrofaga u agregatima krvnih pločica.
[0561] SL.41A-41B pokazuju stepen CD19+ B ćelija, CD11b+ makrofaga i F4/80+ makrofaga koji su vezani za krvne pločice nakon inkubacije pune krvi sa medijumom, LPS i DSPC LNP tokom 30 minuta (SL.41A) i 120 minuta (SL.41B). Podaci su takođe predstavljeni na SL.42A i 42B (makrofagi) i SL.42C (B ćelije).
[0562] Dodatni eksperiment je sproveden kako bi se procenila aktivacija krvnih pločica, kao što je naznačeno ekspresijom CD31 i CD62P kao što je izmereno pomoću protočne citometrije, kao funkcija sadržaja lipida LNP. SL.43A-43B pokazuju aktivaciju na osnovu ekspresije CD31 (SL.
43A) i CD62P (SL.43B) posle inkubacije LNP krvnih pločica tokom 0, 10, 30 i 60 minuta (sleva nadesno) sa medijumom (kontrola), DSPC LNP, DOPC LNP, DOPG LNP, DMG-PEG LNP, i LPS (sleva nadesno). Prisustvo DSPC i DOPC snažno aktivira krvne pločice in vitro. DMG-PEG aktivira krvne pločice, ali je aktivacija niža nego aktivacija sa DSPC ili DOPC. Odsustvo aktivacije
24
sa DOPG, posebno u poređenju sa aktivacijom uočenom sa DOPC, snažno sugeriše da je PC motiv odgovoran za aktivaciju od strane DOPC i DSPC. Podaci su takođe predstavljeni na SL.44A-44B.
Primer 17.
[0563] Dodatne analize su izvedene upotrebom dizajna studije koji je prikazan u Tabeli 8 kako bi se procenili farmakokinetički i farmokodinamički parametri splenektomizovanih ne-humanih primata (NHP).
Tabela 8. Dizajn studije
<a>Doze će biti primenjene kao 60-minutna infuzija sa stopom infuzije od 5 mL/kg/h.
[0564] Generalno, slezina je jedina lokacija gde krvne pločice dolaze u kontakt sa limfocitima. Nakon kontakta sa lipidnim nanočesticama (LNP), krvne pločice se brzo i snažno aktiviraju, kao što je demonstrirano povećanom ekspresijom i CD31 i CD62, dva markera aktivacije krvnih pločica (SL. 38, 39A-39D). Analiza pune krvi je ilustrovala da se krvne pločice agregiraju sa makrofagima u prisustvu LNP (SL.40A-40B, 42A-42B). U slezini je pokazano da se preuzimanje LNP od strane B ćelija odvija brzo na kinetički način u uslovima ex vivo kulture, dok nije uočeno specifično preuzimanje LNP od strane T ćelija (SL.2A-2B). Štaviše, pokazano je da su B ćelije, posebno B1 podskup, dozno-zavisno aktivirane praznim LNP (SL. 12A-12B). Pokazano je da i B1a i B2b ćelije zahtevaju slezinu, pošto se B1a ćelije gube i B1b ćelije gube sposobnost da sekretuju antitelo nakon splenektomije (SL.46A-46B).
[0565] Eksperimenti su izvedeni kako bi se uporedio nivo modifikovanog iRNK lečenja i njegove proizvodnje eritropoetina u prisustvu intaktne, funkcionalne slezine (kontrolna grupa) i splenektomizovanih ne-humanih primata (NHP) (Tabela 8). Životinje (n=3 po grupi) su podvrgnute 60-minutnim infuzijama rhEPO iRNK-LNP pri stopi od 5 ml/kg/h (koncentracija doze od 0,04 mg/ml), ukupno 0,20 mg/kg/nedeljno. Uzorci krvi su sakupljeni pre i posle završetka
2
infuzije (do 48 sati) tokom 29 dana. Nivoi PKPD iRNK i proizvodnja hEPO izmereni su upotrebom bDNK i proteinskog ELISA testa.
[0566] Prvo, istražen je efekat splenektomije na broj retikulocita. Retikulociti, nezrela crvena krvna zrnca, prolaze kroz eritropoezu kako bi se razvili u zrela crvena krvna zrnca, proces koji je kontrolisan hormonom eritropoetinom (EPO). Slezina filtrira krv, uklanja inficirane ćelije i crvena krvna zrnca iz cirkulacije, ali nije vitalna; splenektomizovani subjekti pokazuju adaptaciju organa, što rezultuje povećanom sposobnošću za borbu protiv infekcije i uklanjanje starih crvenih krvnih zrnaca iz cirkulacije. Posle tretmana sa LNP-modRNA-hEPO kao što je prethodno opisano (dani 1, 8, 15, i 29), nivo retikulocita se povećao sa infuzijom iRNK, dok se nivo smanjio u intaktnoj NHP (kontrolnoj) grupi posle dana 15. U splenektomizovanoj grupi nivo se postepeno smanjivao posle 15 dana (SL.47). Pronađeno je da se hematokrit održava u splenektomizovanoj grupi kao i pod istim uslovima lečenja (SL.48).
[0567] iRNK i hEPO vrednosti površine ispod krive (AUC) i Cmaxsu određene tokom 29 dana i 5 doza iRNK-hEPO-LNP. AUC, mera bioraspoloživosti merene supstance tokom vremena, demonstrirala je da postoji sistemska izloženost supstanci (SL. 49A-49B). Cmaxpredstavlja pik koncentraciju supstance ili proizvoda supstance posle primene (SL. 49C-49D). Kod splenektomizovanih NHP, nivoi iRNK i hEPO se održavaju sistemski uz ponovljeno doziranje (IV infuzija) tokom studije. Za razliku od intaktne (kontrolne) grupe, NHP iRNK i hEPO značajno opadaju počevši od dana 15 (SL.49A-49D).
[0568] Aktivacija komplementa je takođe izmerena i upoređena između dve grupe. Pronađeno je da splenektomizovani NHP pokazuju suprimiranu aktivaciju komplementa u poređenju sa intaktnim (kontrolnim) NHP, kao što je izmereno pomoću indikatora aktivacije komplementa, C3a (SL. 50A) i C5b9 (SL. 50B). Štaviše, pronađeno je da je ekspresija citokina skoro odsutna kod splenektomizovanih NHP (IL-6, SL.51A i IL-10, SL.51B). Takođe je pronađeno da su anti-PEG IgM (SL.52A) i anti-PEG IgG (SL.52B) u velikoj meri redukovani u odsustvu slezine.
[0569] Ukratko, LNP imaju više ćelijskih interakcija in vivo koje pokreću efekat ABC, koje verovatno uključuju događaj osećanja kvoruma koji uključuje krvne pločice, monocite, granulocite, i B ćelije. Čini se da je ključni čvor slezina, što u velikoj meri podržava hipotezu da je ABC pokrenut od strane funkcije B1 ćelija. B1 ćelije su odgovorne za prirodne IgM, i mogu da prepoznaju PEG, fosfolipide, i možda kristale holesterola, između ostalog. B1b ćelije takođe mogu da proizvode IgG kada su stimulisane. Kao što je prethodno demonstrirano, uklanjanje slezine sprečava aktivaciju B ćelija (uključujući B1 ćelije) koje najverovatnije značajno doprinose ABC. Splenektomizovane životinje su pokazale nizak ili nikakav IgM/IgG na PEG, nikakav klirens RNK ili proteina, i nisku ili nikakvu aktivaciju citokina/komplementa, pokazujući da B1 ćelije pokreću ubrzani klirens iz krvi.
2 1
Primer 18
[0570] Primer 18 pokazuje LNP formulacije dizajnirane da redukuju vezivanje CD36 i proizvodnju anti-PEG IgM. Brojne nove LNP formulacije napunjene sa hEPO pripremljene su i testirane kako bi se odredio efekat promena lipida na nivoe ekspresije, aktivaciju B ćelija (npr. preko CD36) i proizvodnju anti-PEG IgM. Komercijalno dostupni prirodni fosfolipidi i masne kiseline su inkorporisane u LNP i pregledane paralelno sa dizajnom i sintezom neprirodnih analoga DSPC. SL.54 je šema koja oslikava zamenu fosfolipida sa različitom cviterjonskom grupom.
[0571] CD-1 miševi su nedeljno dozirani sa Jed405, Jed396, Jed406, Jed394, Jed407, Jed403, Jed434, Jed406, Jed405, i Jed407 LNP. Ponovljena doza je primenjena na 3 nedelje.
[0572] U studiji ekspresija hEPO je izmerena na 6 sati (pg/ml), i anti-PEG IgM je izmeren na nedelju 2. Podaci su pokazani na SL. 53A-53B. SL. 53A-53B su skup grafikona koji oslikavaju proizvodnju anti-PEG IgM nakon primene LNP formulacija. PEG-lipid ima efekat na količinu anti-PEG IgM koji je generisan in vivo nakon ponovljene doze. Četiri PEG-lipida su demonstrirala niske nivoe anti-PEG IgM sa umerenim nivoima ekspresije hEPO. Jed396, Jed416, Jed403, i Jed405. Jed413 proizvode relativno visok PEG IgM. Generalno govoreći, PEG lipidi sa hidroksiterminusom i bržom difuzijom daju redukovane nivoe anti-PEG IgM.
[0573] Nekoliko LNP formulacija je dizajnirano kako bi se odredilo koja bi vrsta DSPC modifikacija redukovala prepoznavanje LNP od strane CD36 na imunskim ćelijama. Veruje se u skladu sa aspektima pronalaska da je aktivacija imunskog sistema pomoću DSPC uzrokovana interakcijom sa CD36 na krvnim pločicama i B-ćelijama i/ili glicerol jezgrom. Glavena grupa i planarnost repa lipida na DSPC mogu igrati ulogu u sposobnosti molekula da interaguje sa CD36 ligandima. U skladu sa tim, generisano je nekoliko modifikovanih DSPC, koji su inkorporisani u lipide i testirani na efekte na B ćelije i krvne pločice.
[0574] Testiran je efekat prirodnih analoga PC na aktivaciju ćelija i nivoe ekspresije. SL. 55A-55B oslikavaju ekspresiju Luc iRNK (SL. 55A) i aktivaciju B ćelija (SL. 55B) nakon primene LNP formulacija kod CD-1 miševa. Prirodni analozi PC rezultuju aktivacijom B-ćelija i čini se da neki ometaju ekspresiju (DOPG i DOPA) u izvedenom testu. Međutim, oleinska kiselina demonstrira značajno redukovanu aktivaciju B ćelija, dok održava dovoljne nivoe ekspresije Luc.
[0575] Nekoliko derivata oleinske kiseline je sintetisano i testirano na efekte na nivoe ekspresije, aktivaciju B ćelija i agregaciju krvnih pločica. Podaci su pokazani na SL. 56A-56E i 57A-57C. Strukture su pokazane na SL.56A. SL.56B je grafikon koji oslikava ekspresiju CD86 (aktivacija B ćelija) i SL. 56C je grafikon koji oslikava nivoe ekspresije Luc kao što je izmereno pomoću ukupnog fluksa. SL. 57A je grafikon koji oslikava učestalosti aktiviranih B-ćelija 24 sata nakon
2 2
doze. SL.57B je grafikon koji oslikava agregaciju krvnih pločica 15 minuta nakon doze. SL.57C je grafikon koji oslikava regrutaciju ćelija u agregatu krvnih pločica. Derivati oleinske kiseline pokazuju dobru ekspresiju i nižu in vitro aktivaciju B-ćelija u odnosu na DSPC, kao što je pokazano na SL. 56B (grafikon koji oslikava ekspresiju CD86) i SL.56C (grafikon koji oslikava ukupan fluks).
[0576] Ispitani su profili imunske aktivacije za Jed18 LNP koje sadrže derivate oleinske kiseline. Derivati oleinske kiseline su demonstrirali poboljšane profile imunske aktivacije. Podaci su pokazani na SL.58A-58B, 59, i 60A-60C. Pozitivni efekti oleinske kiseline održavani su sa Jed18. SL. 58A oslikava nivoe ekspresije luciferaze kao što je izmereno pomoću ukupnog fluksa 6 sati posle isporuke CD-1 miševima. SL.58B oslikava in vivo aktivaciju B-ćelija u mišjim splenocitima 24 sata nakon primene. SL. 59 je grafikon koji oslikava koncentraciju hEPO tokom vremena. Poboljšana margina ekspresije sa česticom iz pronalaska za razliku od MC3 je demonstrirana sa hemijski modifikovanom iRNK. SL.60A-60C su skup grafikona koji oslikavaju poboljšani profil imunske aktivacije sa hemijski modifikovanom iRNK u LNP formulacijama iz pronalaska. SL.
60A je grafikon koji oslikava in vivo aktivaciju B-ćelija 24 sata nakon primene čestica napunjenih sa hEPO ili PBS. SL.60B je grafikon koji oslikava koncentraciju IL-66 sati nakon primene čestica napunjenih sa hEPO ili PBS. SL.60C je grafikon koji oslikava koncentraciju IP-106 sati nakon primene čestica napunjenih sa hEPO ili PBS.
[0577] Podaci demonstriraju da nekoliko DSPC alternativa, uključujući oleinsku kiselinu i analoge oleinske kiseline, može biti formulisano u LNP i rezultovati redukovanom aktivacijom B-ćelija in vivo. Pored toga, identifikovane su alternative PEG-lipida (PEG-DMG) koje imaju redukovana svojstva indukcije anti-PEG IgM preko brže difuzije i redukovanu površinsku hidrofobnost.
Primer 19
[0578] Asocijacija B ćelija i aktivacija upotrebom novih LNP formulacija koje sadrže oleinsku kiselinu i derivate PC pokazane su u Primeru 19. Studija za određivanje efekta inkorporacije oleinske kiseline i derivata PC u LNP na B ćelije kao što je postavljeno upotrebom materijala koji su pokazani u Tabeli 9. Karakteristike rezultujućih čestica su takođe pokazane u Tabeli 9.
Tabela 9
2
24
2
[0579] Podaci su predstavljeni na SL.61-62. SL.61 je grafikon koji oslikava preuzimanje LNP od strane B ćelija kao što je izmereno pomoću procenta PE+ CD19+ B ćelija. SL.62 je grafikon koji oslikava aktivaciju B ćelija pomoću LNP kao što je izmereno ekspresijom CD86 na B ćelijama.
Primer 20
2
[0580] In vivo procena LNP formulacija koje sadrže hEPO koje su sačinjene od novih PEG lipida pokazana je u Primeru 20. Sprovedena je in vivo studija za ispitivanje efekata različitih PEG lipida na nivoe ekspresije i proizvodnju anti-PEG IgM. Studija je uključivala poređenje različitih dužina repa lipida (difuzije) i terminusnih grupa - npr, -OH (nasuprot OMe) sa klik linkerima ili amido grupom. Strukture i eksperimentalni dizajn koji su testirani pokazani su u Tabeli 10.
2
[0581] Nivoi ekspresije hEPO iz iRNK koja je isporučena u LNP izmereni su u nedeljama 1, 2, 3, i 4 nakon IV primene LNP. hEPO je eksprimiran pomoću svake od iRNK-LNP formulacija. Nivoi ekspresije su smanjeni u DSG PEG OMe LNP u odnosu na druge formulacije.
[0582] Nivoi anti-PEG IgM su takođe detektovani 96 sati nakon druge i treće doze LNP. SL.63A-63B su skup grafikona koji oslikavaju količinu proizvedenog PEG IgM 96 sati posle druge doze LNP (SL.63A) ili 96 sati posle treće doze LNP (SL.63B). Testirana jedinjenja odgovaraju trakama u sledećem redosledu sleva nadesno na obe SL. 63A i 63B: PBS, bez PEG, Jed408, Jed405, Jed406, Jed409, Jed410, Jed411, Jed412, Jed413, i Jed414. DSG i DMG služe kao relativno poznate kontrole. DMG kontrola je povećana od strane treće doze. Mnoge od novih formulacija proizvele su manje IgM nego DMG kontrola. Jed405, Jed396, Jed403 (pojedinačni C18 rep), Jed416 (di-lipidni rep), sva su pokazala nisku anti-PEG IgM indukciju. Jed405 i Jed396 posle obe doze su pokazala samo minimalan PEG IgM. Činilo se da je Jed396 najbolji kandidat testiran na proizvodnju minimalnog PEG IgM.
[0583] Dok je ekspresija hEPO generalno održavana za sve grupe, OH terminusni PEG su pokazali redukovane nivoe anti-PEG IgM. C10 PEG lipidi su takođe demonstrirali redukovanu proizvodnju anti-PEG IgM.
Primer 21
[0584] Podaci titracije su generisani kako bi se odredio efekat titracije sa oleinskom kiselinom i DSPC na imunske komponente ABC/toksičnosti. Nivoi oleinske kiseline i DSPC u MC3 LNP su redukovani (npr. obezbeđivanje redukovanih nivoa holina). LNP su napunjene sa hEPO i formulisane kao što je pokazano u Tabeli 11. LNP su primenjivane miševima IV jednom nedeljno tokom 4 nedelje.
2
[0585] Podaci su pokazani na SL.64-65. SL.64 je grafikon koji oslikava ekspresiju hEPO 6 sati nakon jednom nedeljno IV primene hEPO iRNK - LNP formulacija na nedelje 1, 2, 3, i 4. Rezultati ukazuju na dozni odgovor pre nego binarnu promenu. Za oleinsku kiselinu, čini se da je 10-20% optimalno. Povećanje količine oleinske kiseline može obezbediti dodatne prednosti u proizvodnji stabilnih čestica pošto je samo oko polovine veličine DSPC. SL. 65 je grafikon koji oslikava proizvodnju anti-PEG IgM 96 sati nakon treće doze hEPO iRNK-LNP formulacija.
Primer 22
[0586] LNP koje sadrže fosfolipide koji imaju različite glavene grupe pripremljene su i testirane u studiji sa jednom dozom. Cilj studije je bio da se proceni ekspresija za različite fosfolipidne
2
glavene grupe u odnosu na standardnu DSPC formulaciju. Pojedinačna doza MC3 LNP koje imaju različite fosfolipide sa različitim glavenim grupama primenjivana je IV CD-1 miševima. Na 3, 6, i 24 sata nakon injekcije sakupljeno je 100 ul krvi 15 minuta.
[0587] Rezultati su pokazani na SL.66. Svaki fosfolipid je izmeren u tri vremenske tačke (3, 6, i 24 sata) nakon injekcije. Fosfolipidne strukture su pokazane na SL. 69. Sve formulacije su bile dobro eksprimirane (DOPA i DOPG su imali najnižu ekspresiju).
[0588] Nekoliko novih LNP je sintetisano kako bi se testirala aktivacija B1a/B ćelija. Formulacije su pokazane u Tabeli 12.
Tabela 12
[0589] Sve formulacije su rezultovale povećanjem populacije aktiviranih B ćelija (CD19+CD86+CD69+) u poređenju sa negativnom kontrolom. Međutim, supstituisanje DSPC oleinskom kiselinom dovelo je do smanjenog nivoa aktivacije B ćelija. Ex vivo aktivacija humanih B ćelija je takođe procenjena pomoću merenja oslobađanja citokina. SL. 67A-67C su skup
2
grafikona koji oslikavaju oslobađanje citokina kao meru ex vivo aktivacije humanih B ćelija. Izmereni su nivoi IFN-gama (SL.67A), IL-6 (SL.67B) i TNF-alfa (SL.67C). Na SL.67A, uočene su značajne razlike u oslobađanju IFNg sa ne-DSPC LNP. Supstitucija DSPC oleinskom kiselinom dovodi do značajnog smanjenja oslobađanja IFN-g. Na SL.67B, uočene su značajne razlike u IL-6 sa ne-DSPC LNP. Supstitucija DSPC oleinskom kiselinom dovela je do značajnog smanjenja sekrecije IL-6. Supstitucija DSPC oleinskom kiselinom takođe je dovela do značajnog smanjenja sekrecije TNF-a (SL. 67C). Ovo smanjenje je bilo značajnije nego smanjenja uočena sa IFN-g i IL-6.
[0590] Takođe je procenjena aktivacija B ćelija slezine. Rezultati su pokazani na SL.68. SL.68 je grafikon koji oslikava količinu aktivacije B ćelija kao rezultat različitih LNP formulacija. LNP formulacije koje uključuju oleinsku kiselinu demonstrirale su redukovanu aktivaciju B ćelija slezine.
Primer 23
[0591] LNP koje sadrže nove derivate PC i oleinske kiseline pripremljene su i testirane na uticaj na ekspresiju Luc, agregaciju krvnih pločica i aktivaciju B ćelija. LNP su formulisane kao što je navedeno u Tabeli 13 i primenjene IV kao pojedinačna doza CD-1 miševima. Lipidi su bili DSPC zamene koje imaju strukture kao što je pokazano na SL.56A. Neki od lipida imaju modifikovanu glavenu grupu sličnu PC. Drugi imaju modifikovane repove kako bi se testirala stabilizacija. Jed125 ima cviterjonsku glavenu grupu.
2 1
RNK su modifikovane sa N1-metilpseudouridinom. Lipidne strukture su pokazane na SL.56A.
[0592] Rezultati su pokazani na SL. 70. SL. 70 je grafikon koji oslikava nivoe ekspresije Luc nakon primene LUC iRNK inkapsulirane u različitim LNP formulacijama koje se sastoje od novih derivata PC i oleinske kiseline 3, 6 i 24 sata nakon primene. Nivoi ekspresije su varirali. Kako su molekuli postali sterički ometeniji, izgledalo je da se ekspresija smanjuje. Nivoi ekspresije za oleinsku kiselinu i njene derivate su ostali visoki.
2 2
[0593] Takođe su procenjene in vitro interakcija i aktivacija Jed-LNP i B ćelija. Podaci su pokazani na SL.71A-71B i 72A-72B.
[0594] SL.71A-71B su skup grafikona koji oslikavaju interakciju/asocijaciju B ćelija sa različitim LNP formulacijama kao što je procenjeno pomoću procenta CD19+PE+ ćelija. Nekoliko LNP formulacija je pokazano na SL.71A. Oleinska kiselina i Jed125 su pokazani na SL.71B. SL.72A-72B su skup grafikona koji oslikavaju aktivaciju B ćelija sa različitim LNP formulacijama, kao što je procenjeno pomoću medijane intenziteta fluorescencije ekspresije CD86. Nekoliko LNP formulacija je pokazano na SL.72A. Oleinska kiselina i Jed 125 su pokazani na SL.72B.
Primer 24
[0595] LNP koje sadrže nove derivate PC i oleinske kiseline pripremljene su i testirane na ekspresiju, aktivaciju krvnih pločica, i aktivaciju B ćelija u studiji sa jednom dozom u odnosu na standardnu DSPC formulaciju. LNP su formulisane kao što je navedeno u Tabeli 14 i primenjene IV kao pojedinačna doza CD-1 miševima.
2
[0596] RNK su modifikovane sa N1-metilpseudouridinom. Strukture testiranih lipida su pokazane na SL.56D.
[0597] Podaci su pokazani na SL.73A-73C. Ekspresija Luc sa različitim LNP formulacijama je procenjena pomoću merenja ukupnog fluksa na 3 sata (SL.73A), 6 sati (SL.73B), i 24 sata (SL.
73C) nakon doze.
2 4
Primer 25
[0598] Majmunima je primenjena hEPO iRNK (hemijski modifikovana) u MC3-LNP 1X nedeljno tokom 4 nedelje. Režim ko-medikacije oralnog deksametazona u jednakoj mg/kg dozi humanog, inhibitora COX-2 (vet), ranitidina, i cetirizina primenjen je kao što je opisano u literaturi. Metotreksat je primenjivan nedeljno kako bi se procenila ciljana inhibicija B ćelija. Eksperimentalni dizajn je pokazan u Tabeli 15.
Tabela 15
[0599] Podaci su pokazani na SL. 91A-91B. SL. 91A je grafikon koji oslikava proizvodnju citokina (IL-6) kod NHP na dan 1 i dan 22 režima ko-medikacije. SL.91B je grafikon koji ilustruje da ko-medikacija sa Gilenijom redukuje proizvodnju anti-Peg IgM, u skladu sa redukovanim ABC. Rezultati pokazuju da se čini da prethodno tretirane životinje imaju visok početni pozitivan IgM ili IgG titar. Međutim, neke životinje nisu pokazale povećanje IgM i/ili IgG nakon primene LNP. NHP pokazuju visoku učestalost anti-PEG odgovora, bilo IgM ili IgG (-50%). Čini se da nekoliko režima ko-medikacije poboljšava ABC kod primata, uključujući Gileniju i anti-krvne pločice/Syk/Dex/PI3Kdelta. Ovo rezultuje redukovanom proizvodnjom IL-6 i redukovanim anti-PEG Ig odgovorima kao što je pokazano na SL. 91A-91B. Čini se da ko-medikacija poboljšava ekspresiju dana 1, što ukazuje da se javljaju osnovni odgovori ABC (SL.91A). Rezultati režima ko-medikacije pokazani su u Tabeli 16.
2
Tabela 16
Primer 26
1. CFSE test
[0600] Ćelije su izolovane iz slezine drobljenjem tkiva kroz filter od 70 nm u prisustvu PBS. Posle ispiranja, crvena krvna zrnca su lizirana pomoću ACK pufera. Posle dopunskog ispiranja sa PBS, 2 × 10<6>ćelija po uzorku je obojeno sa CFSE u PBS na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. Odmah posle inkubacije, reakcija bojenja je ugašena sa 15 ml medijuma na sobnoj temperaturi. Ćelije su zatim centrifugirane i isprane dva puta sa medijumom. Ćelije su zatim inkubirane tokom 3 dana na 37 °C u prisustvu različitih stimulusa. Analiza je izvršena upotrebom ModFit 4.1 softvera. SL.
92 pokazuje da B ćelije proliferišu u prisustvu DSPC LNP.
2. Fluks kalcijuma
[0601] Ćelije su izolovane iz slezine drobljenjem tkiva kroz filter od 70 nm u prisustvu PBS. Posle ispiranja, crvena krvna zrnca su lizirana pomoću ACK pufera. Posle dopunskog ispiranja, 2 × 10<6>ćelija po uzorku je obojeno sa 5 uM Calcium Sensor Dye eFluor<®>514 (#65-0959-39, ebioscience) tokom 30 minuta na 37 °C. Posle dopunskog ispiranja, ćelije su obojene sa CD19 na ledu tokom 20 minuta. Ćelije su zatim analizirane pomoću protočne citometrije. Početna vrednost je dobijena tokom 30 sekundi, zatim posle dodavanja stimulusa, signal je meren tokom 360 sekundi. Posle dodavanja pozitivnog stimulusa (koktel za stimulaciju ćelija #00-4970-03 ebioscience), signal je
2
sniman tokom dopunskih 30 sekundi. Analiza je izvedena upotrebom FlowJo softvera. SL. 93 pokazuje da DSPC LNP indukuju oslobađanje kalcijuma u B ćelijama.
Primer 27
[0602] Prethodne studije su detaljno okarakterisale redukovanu efikasnost PEGilovanih nanočestica nakon ponovljenog doziranja, poznatu kao fenomen ABC. Anti-PEG IgM generisani kao odgovor na primenu LNP, prepoznaju PEG lipidnu komponentu LNP, vezuju se za LNP, i uklanjaju ih iz cirkulacije. Fosfolipidna komponenta LNP, posebno DSPC, aktivira i krvne pločice i B ćelije uzrokujući oslobađanje citokina i "prirodnog IgM" koji dodatno potenciraju imunski odgovor na primenjene LNP, doprinoseći ABC. Oleinska kiselina je identifikovana kao DSPC alternativa. Zamena DSPC sa oleinskom kiselinom rezultuje uporedivom ekspresijom proteina iz inkapsulirane iRNK, ali obezbeđuje redukovanu aktivaciju B ćelija u poređenju sa standardnom LNP formulacijom, npr. LNP formulacijom zasnovanom na MC3. Takođe prethodno su identifikovani novi PEG lipidi koji se mogu upotrebljavati kao PEG-lipid, npr. PEG DMG alternative. Bez ograničavanja teorijom, veruje se da takvi novi PEG-lipidi obezbeđuju redukciju generacije anti-PEG IgM preko brže difuzije (kraći lipidni repovi) i redukovane površinske hidrofobnosti (-OH nasuprot -OMe).
[0603] Nedavne studije sa više doza na miševima sa hEPO identifikovale su PEG-lipide koji daju dobre nivoe ekspresije proteina i niske nivoe anti-PEG IgM. Ova studija je dizajnirana kako bi testirala takve lipide u studiji ponovljene primene kod miševa, opciono u kombinaciji sa novim katjonskim amino lipidima, u LNP-formulacijama za primenu iRNK. Specifični parametri kao što su ekspresija proteina, anti-PEG IgM, in vivo aktivacija B-ćelija i ekspresija citokina testirani su kako bi se razlikovale LNP na osnovu željene efikasnosti.
[0604] Tronedeljna studija novih kombinacija PEG/Jed18 i PEG/MC3 intravenskom (IV) primenom sa hEPO sprovedena je na miševima. Konkretno, MC3 nove PEG LNP i Jed18 nove PEG LNP pripremljene su i testirane direktno na ekspresiju, anti-PEG IgM, in vivo aktivaciju B ćelija, i ekspresiju citokina u studiji sa više doza. LNP formulacije su primenjivane IV u tri fiksne zapreminske doze CD-1 miševima. Veličina u prečniku (nm), indeks polidisperznosti (PDI), efikasnost inkapsulacije (EE), koncentracija iRNK (ug/ml), i koncentracija endotoksina (EU/ml) su izmereni za nove LNP. Tabela 1 pokazuje prethodna merenja MC3 i Jed18 LNP sa novim PEG lipidima posle primene prve doze. Kao što pokazuju podaci u Tabeli 17, LNP su imale veličinu, PDI, i EE dovoljne za in vivo primenu.
2
Tabela 17. Nedelja 1 Podaci
[0605] Veličina u prečniku (nm), indeks polidisperznosti (PDI), efikasnost inkapsulacije, koncentracija iRNK (ug/ml), i koncentracija endotoksina MC3 novih PEG LNP i SM86 novih PEG LNP takođe su izmereni tri nedelje posle doziranja. Ovi podaci su pokazani u Tabeli 18 u nastavku. Podaci u Tabelama 17 i 18 pokazuju da su fizičkohemijske karakteristike i za MC3 i za Jed18 LNP ostale konstantne tokom studije. Pored toga, EE i veličina novih LNP koje su pokazane u Tabelama 17 i 18 su unutar opsega koji su prepoznati u struci.
Tabela 18 (Nedelja 3)
2
[0606] Dopunski podaci su pokazani na SL. 74A-74B. SL.74A-74B oslikavaju ekspresiju hEPO 6 sati nakon jednom nedeljno IV primene hEPO iRNK - LNP formulacija u nedeljama 1, 2, i 3. Podaci pokazuju superiornu ekspresiju za LNP zasnovane na Jed 18 i dodatno dokazuju značajnu ekspresiju proteina sa nekoliko novih PEG lipida koji su testirani.
[0607] Ekspresija citokina u MC3 i Jed 18 LNP je pokazana u Tabelama 19-22. IFN-γ-inducibilni protein 10 (IP-10) je hemokin uključen u inflamaciju i interlukin 6 (IL-6) je proinflamatorni citokin. Date su koncentracije (pg/ml) IP-10 (Tabela 19) i IL-6 (Tabela 20) 6 sati nakon primene MC3 i Jed 18 LNP u nedelji 1.
2
[0608] Koncentracije (pg/ml) IP-10 i IL-66 sati nakon primene MC3 i SM86 LNP u nedelji 2 date su u Tabelama 21 i 22, respektivno. Ovi podaci demonstriraju da nekoliko novih PEG lipida koji su testirani obezbeđuje niske nivoe ekspresije inflamatornih hemokina/citokina, posebno, kada su određeni novi PEG lipidi formulisani u kombinaciji sa Jed 18 kao katjonskim amino lipidom.
2
[0609] Na SL. 75, izmereni su nivoi anti-PEG IgM (ng/ml) 96 sati posle druge doze. Podaci na ovom grafikonu pokazuju redukovane nivoe anti-PEG IgM generisanih za nove PEG lipide. Podaci o kojima je prethodno diskutovano pokazuju da ubrzani klirens iz krvi nije uočen kada su određeni novi PEG lipidi upotrebljeni u LNP formulacijama. Zanimljivo, većina MC3 grupa zadržala je ekspresiju, dok je većina Jed18 grupa povećala ekspresiju tokom 3 nedelje studije. Od novih PEG lipida koji su testirani, Jed405, Jed396 i Jed403 su imala najniže nivoe anti-PEG IgM. Prilično je iznenađujuće uočeno u ovoj studiji, kao i u prethodno opisanim studijama, da je Jed160, koje se razlikuje od DSPC samo po jednoj metil grupi u glavenoj grupi bilo suštinski imunski tiho kada je testirano u LNP koje su primenjene IV in vivo.
Primer 28
[0610] LNP koje sadrže nove derivate DSPC i/ oleinske kiseline pripremljene su i testirane na ekspresiju luciferaze (m1 ψ-modifikovanom iRNK-kodirana luciferaza) i aktivaciju B ćelija u studiji sa jednom dozom u odnosu na standardnu DSPC formulaciju. Testirani DSPC/oleinski analozi su pokazani u Tabeli 23 u nastavku.
2 1
22
�
[0611] Kao što je pokazano u Tabeli 23, LNP su primenjene IV kao pojedinačna doza miševima. Podaci su pokazani na SL.76 i 77. Ekspresija Luc sa različitim LNP formulacijama je procenjena pomoću merenja ukupnog fluksa (p/s) 3, 6, i 9 sati nakon doziranja, upotrebom BLI snimanja celog tela (videti SL. 76). Takođe je izmeren procenat aktiviranih B ćelija (CD86<+>CD69<+>) u CD19<+>ćelijama slezine. Ove učestalosti aktiviranih B ćelija su pokazane na SL.77.
[0612] Generalno, fluks se povećao od tri do šest sati, pokazujući pad ekspresije do 24 sata. Sve formulacije koje su testirane pokazale su značajnu ekspresiju luciferaze in vivo, iako je uočena izvesna varijabilnost u ekspresiji. Procenat CD86<+>CD69<+>B ćelija u CD19<+>ćelijama slezine (B limfociti) u slezini je takođe izmeren za LNP formulacije kao indikator aktivacije B ćelija. Sve formulacije koje su testirane pokazale su aktivaciju B ćelija na nivoima ispod, i često i značajno ispod nivoa, formulacija DSCP kontrole.
Primer 29
[0613] Ponovljena doza hEPO iRNK u LNP koje sadrže Jed18 sa modifikovanim PEG lipidima je zatim izvedena kod ne-humanih primata. Ukratko, cinomolgus majmuni su tretirani sa LNP-inkapsuliranom iRNK koja je primenjena intravenskom (IV) infuzijom. LNP koje sadrže oleinsku kiselinu i Jed403 analizirane su kako bi se odredio njihov efekat na ubrzani klirens iz krvi (ABC). Konkretno, cilj je bio da se odredi da li zamene DSPC i PEG-lipida demonstriraju nisku aktivaciju B ćelija, nizak anti-PEG IgM, i održavanje ekspresije proteina kod viših vrsta. Upoređene su sledeće četiri grupe: MC3/DSPC/Hol/Jed422 (kontrola), Jed18/DSPC/Hol/Jed422 (kontrola), Jed18/DSPC/Hol/Jed403 (test grupa), i Jed18/Oleinska kiselina/Hol/Jed422 (test grupa). Majmunima je primenjeno nedeljno doziranje pseudouridin modifikovane hEPO iRNK (0,2 mg/kg) u prethodnim LNP tokom 6 nedelja.
[0614] Farmakokinetički parametri uključujući AUC su određeni za kombinacije Jed 18: Jed 403. Konstitutivna AUC je viđena tokom vremena sa uočenim početnim nivoima komplementa i citokina i niskim ili bez nivoa IgM.
2 4
[0615] Karakteristike čestica za svaku od formulacija pokazane su u Tabeli 24 u nastavku. iRNK koja je upotrebljena za ovu studiju bila je m1 ψ-modifikovana iRNK koja kodira EPO. Formulacije uključuju komponente u sledećem mol % - 50:10:38,5:1,5. Tabela 24 pokazuje veličinu, efikasnost inkapsulacije (EE) i indeks polidisperznosti (PDI). Čestice su imale karakteristike unutar prihvatljivih granica za in vivo testiranje.
Tabela 24
[0616] Tokom 6 nedelja eksperimentisanja, mereni su ekspresija proteina hEPO, nivoi anti-PEG IgM i IgG, IgM, IgG i nivoi citokina i komplementa za nove LNP. SL. 79 pokazuje ekspresiju hEPO (ng/ml) na predozi, 2 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, 48 sati, i 72 sata nakon jednom nedeljno IV primene hEPO iRNK - LNP formulacija na dan 1, dan 8, dan 15, dan 22, dan 29, dan 36, i dan 43.
[0617] Na SL. 80, nivoi anti-PEG IgM (U/ml) su izmereni nakon jednom nedeljno IV primene hEPO iRNK - LNP formulacija na dan 1, dan 8, dan 15, dan 22, dan 29, dan 36, i dan 43. SL.81 pokazuje nivoe anti-PEG IgG (U/mL) izmerene nakon jednom nedeljno IV primene hEPO iRNK - LNP formulacija na dan 1, dan 8, dan 15, dan 22, dan 29, dan 36, i dan 43. Grupa Jed403 je demonstrirala održavanje ekspresije proteina tokom 6 nedelja, održavanje početnih nivoa anti-PEG IgM i anti-PEG IgG, bez aktivacije komplementa, i minimalnu aktivaciju citokina. Čini se da su nivoi anti-PEG IgM i IgG, komplementa, i povišenja citokina u obrnutoj korelaciji sa gubitkom ekspresije proteina. MC3 i Jed18 kontrole i grupa oleinske kiseline su pokazale
2
redukovanu ekspresiju proteina hEPO u nedelji 6. Grupa oleinske kiseline je demonstrirala najviše nivoe inicijalne proizvodnje proteina. MC3 i Jed18 kontrole i grupa Jed403 su pokazale slične nivoe ekspresije hEPO. Jed18/DSPC pri 0,2 mg/kg nije pokazala povećanu ekspresiju hEPO u odnosu na MC3/DSPC; međutim, Jed18/oleinska kiselina je pokazala povećanu ekspresiju proteina (3 puta) u odnosu na MC3/DSPC i Jed18/DSPC. Tabela 25 pokazuje ekspresiju hEPO kao što je izmereno pomoću AUC za četiri LNP grupe. Konkretno, hEPO AUC (ng/ml∗h) je izmerena svake nedelje šestonedeljne studije.
Tabela 25
[0618] Čestice formulisane sa Jed18 kao katjonskim amino lipidom nadmašile su standardne LNP zasnovane na MC3 u pogledu ekspresije proteina tokom ponovljenih doziranja kod primata. Oleinska kiselina kao zamena za DSPC rezultovala je u inicijalnoj visokoj ekspresiji proteina, ali nije u potpunosti poboljšala ABC tokom studije. Jedinjenje 403 kao zamena PEG-lipida rezultovalo je redukovanim ABC, što je dokazano održavanjem hEPO AUC tokom studije. Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da uklanjanje B ćelija dovodi do odsustva ABC posle 5 injekcija. Konkretno, jedna injekcija anti CD20, 7 dana pre injekcije LNP, dovodi do (1) niskog/bez IgM/IgG na PEG; (2) nema klirensa RNK ili proteina; i (3) niskog/bez citokina/aktivacije komplementa, što ovo čini atraktivnim kandidatom za režime istovremene primene koji sadrže LNP-inkapsulirane iRNK.
[0619] SL. 82 pokazuje procenat aktiviranih B ćelija (CD86<+>CD27<+>) u CD 19<+>ćelijama pre uzimanja krvi, na dan 1, dan 22, dan 43, i dan 44 studije. Kao što je pokazano na SL.82, sve LNP grupe su demonstrirale nisku aktivaciju B ćelija. Skoro svi subjekti kojima su primenjene Jed
2
18/DSPC/Hol/Jed403 ili Jed18/Oleinska kiselina/Hol/Jed422 imali su manje od 5% aktivacije B ćelija u CD19<+>ćelijama i demonstrirali su prosečan procenat aktivacije B ćelija blizu 2,5%, što se održavalo tokom studije. Procenat aktivacije monocita je takođe izmeren pre uzimanja krvi, na dan 1, dan 22, dan 43, i dan 44 studije. Ovi rezultati su pokazani na SL. 83. Sve LNP grupe su demonstrirale nisku aktivaciju monocita i svi subjekti kojima su primenjene Jed 18/DSPC/Hol/Jed403 ili Jed18/Oleinska kiselina/Hol/Jed422 održavali su u proseku manje od 3% aktivacije monocita tokom studije.
Primer 30
[0620] Prethodni podaci pokazuju da je aktivacija B ćelija ključni faktor koji doprinosi fenomenu ABC kod životinja kojima su primenjenje LNP-inkapsulirane nukleinske kiseline, npr. iRNK. Studije iz stanja tehnike su pokušale da ublaže fenomen ABC sa jedinjenjima kao što su deksametazon i/ili kortikosteroidi. Trenutni pronalazači su obezbedili detaljno mehanističko razumevanje fenomena ABC, posebno koji se odnosi na primenu LNP-inkapsulirane iRNK. LNP imaju više ćelijskih interakcija in vivo za koje je demonstrirano da pokreću efekat ABC. IV injekcija LNP dovodi do povećane sekrecije anti PC IgM (prirodnog IgM) i indukovanog razvoja anti-PEG IgM odgovora. Štaviše, ponovljena IV injekcija LNP dovodi do povećanja nivoa prirodnog IgM. Čini se da je ključni čvor slezina i u velikoj meri podržava hipotezu da je ABC pokrenut od strane funkcije B1 ćelija. Ove ćelije su odgovorne za sekretovanje "prirodnih IgM" (npr. B1a ćelije), ali B1b ćelije takođe mogu da proizvode IgG kada su stimulisane. Ovi imunoglobulini prepoznaju PEG, fosfolipide, i najverovatnije domene holesterola, prisutne na površini LNP. Ovde je pokazano da prirodni IgM verovatno prepoznaje PC motiv prisutan na površini standardne LNP (npr. LNP koje sadrže DSPC).
[0621] IV injekcija LNP dovodi do brze aktivacije B1a ćelija što rezultuje povećanom sekrecijom anti-PC IgM (prirodnog IgM) i ponovljena IV injekcija LNP dovodi do povećanja nivoa prirodnog IgM. Uklanjanje slezine sprečava aktivaciju B ćelija (specifično B1) koje verovatno značajno doprinose ABC. Konkretno, splenektomizovane životinje pokazuju (1) nizak/bez IgM/IgG na PEG; (2) nema klirensa RNK ili proteina; i (3) nizak/bez citokina/aktivacije komplementa. Na osnovu mehanizama i tipova ćelija koji su ovde uključeni u efekat ABC, trenutni pronalazači su hipotezirali da bi određeni režimi istovremene primene ciljani na B ćelije mogli biti korisni za lečenje subjekata sa LNP-inkapsuliranim iRNK, posebno kada je potrebno ponavljanje hroničnog doziranja za željeni terapijski indeks.
[0622] Studija ponovljenih doza hEPO iRNK IV infuzijom uz istovremenu primenu sprovedena je na cinomolgus majmunima. Majmunima je primenjivana hEPO iRNK u MC3-LNP u skladu sa
2
eksperimentalnim dizajnom koji je pokazan u Tabeli 26 i istovremeno im je primenjivan jedan od rituksimaba, idelalisiba, fostamatiniba, ili fingolimoda u skladu sa režimom koji je pokazan u Tabeli 27.
Tabela 26
[0623] Eksperimentalni podaci su pokazani na SL. 84A-90. SL. 84A i 84B pokazuju ekspresiju EPO posle prve injekcije i posle pete injekcije. Konkretno, koncentracija EPO (ng/ml) je izmerena
2
2 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, i 48 sati nakon prve injekcije i pete injekcije. SL.85A-85E pokazuju ekspresiju EPO za svaku od ko-medikacija na dan 1 i dan 29 studije. Konkretno, koncentracija EPO (ng/ml) je izmerena na dan 1 i dan 29 na 2 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, i 48 sati za svaku grupu ko-medikacije. Takođe su izmerene populacije imunskih ćelija. Specifično, procenat B ćelija (SL.86A), B1a ćelija (SL.86B), i monocita (SL.86C) u PBMC je izmeren za svaku grupu ko-medikacije na dan -7, 24 sata nakon prve injekcije, i 24 sata nakon pete injekcije. Aktivacija B ćelija je pokazana na SL.87. Procenat aktiviranih B ćelija u cirkulišućim B ćelijama izmeren je za svaku grupu ko-medikacije na dan -7, 24 sata nakon prve injekcije, i 24 sata nakon pete injekcije.
[0624] U kontrolnoj grupi, procenat aktiviranih B ćelija se povećao 24 sata nakon prve injekcije i ponovo 24 sata nakon pete injekcije, stoga, pokazujući da više injekcija LNP dovodi do veće aktivacije B ćelija. Procenat aktiviranih B ćelija je drastično redukovan u grupi rituksimaba 24 sata nakon prve injekcije, zbog činjenice da su B ćelije uklonjene kod subjekata iz ove grupe. Uklanjanje B ćelija je korelisalo sa redukcijom anti-PEG IgM i IgG, čak i na dan 34 (posle 5. injekcije). Uklanjanje B ćelija takođe je dobro korelisalo sa održavanjem ekspresije proteina. Konkretno, uklanjanje B ćelija je obezbedilo gubitak ekspresije posle 5 injekcija što ukazuje da nije bilo ABC i uklanjanje B ćelija je dodatno obezbedilo da nema anti PEG odgovora. Aktivacija B ćelija nije uočena u grupi idelalisiba i učestalosti B ćelija su bile blago redukovane (videti SL.
86A). Grupe fostamatiniba i fingolimoda su pokazale normalnu aktivaciju B ćelija sličnu onoj u kontrolnoj grupi. Što se tiče B1a ćelija, učestalosti B1a ćelija su bile normalne pre injekcije u svim grupama ko-medikacije (videti SL. 86B). Osim grupe rituksimaba gde je učestalost B1a ćelija blago opala, sve grupe ko-medikacije su pokazale povećanu učestalost B1a ćelija posle injekcije LNP, što znači da injekcija LNP dovodi do aktivacije i proliferacije B1a.
[0625] Aktivacija monocita je pokazana na SL. 88. Procenat aktiviranih monocita/makrofaga u cirkulišućim PBMC je izmeren za svaku grupu ko-medikacije na dan -7, 24 sata nakon prve injekcije, i 24 sata nakon pete injekcije. Kao što je pokazano na SL.86C, učestalosti monocita se bile normalne u svim grupama ko-medikacije osim za fingolimod, gde je uočeno značajno smanjenje. Povećanje procenta aktiviranih monocita/makrofaga nakon injekcije uočeno je samo u grupi ko-medikacije fingolimodom. Kako je frekvencija monocita u grupi fingolimoda značajno opala nakon injekcije, podaci sugerišu aktivaciju monocita pre apoptoze.
[0626] SL.89A i 89B pokazuju anti-PEG odgovor. Nivoi anti-PEG IgM (U/ml) (SL.89A) i nivoi anti-PEG IgG (U/ml) (SL.89B) izmereni su za svaku grupu ko-medikacije na početku, na dan 9 nakon prve injekcije, i dan 34 nakon pete injekcije.
Primer 31
2
[0627] Kako bi se dodatno proučila uloga IgM u fenomenu ABC, LNP-inkapsulirana iRNK koja kodira EPO je primenjena kontrolnim miševima i onima kojima nedostaje sekretovani IgM (sIgM-/- miševi). SL. 78 pokazuje uticaj uklanjanja cirkulišućeg IgM na ekspresiju EPO EPO tokom trajanja 6-nedeljne studije. Konkretno, koncentracija EPO (ng/ml) je izmerena pre uzimanja krvi, na 6 sati, i 24 sata, u svakoj od 6 nedelja. U dve grupe negativne kontrole, c57Bl6J/PBS i sIgM-/-PBS, nivoi EPO su ostali na početnoj vrednosti tokom studije, dok su u grupama iRNK tretmana, koncentracije EPO dostigle pik 6 sati nakon doze, a zatim su se vratile na početnu vrednost za dve nedelje nakon primene iRNK. Zapazite da je u nedelji 1 koncentracija EPO bila približno ista kod c57Bl6J miševa i sIgM-/- miševa u vremenskoj tački od 6 sati (pik ekspresija nakon doze). Međutim, tokom eksperimenta, uočen je fenomen ABC, kao što dokazuje smanjenje AUC za ekspresiju EPO kod c57Bl6J miševa. Nasuprot tome, sIgM-/- miševi su proizvodili konzistentno visoke nivoe EPO nakon svake ponovljene primene LNP-inkapsulirane iRNK tokom trajanja eksperimenta. Stoga, u odsustvu cirkulišućeg IgM, nije uočen gubitak ekspresije čak ni posle pet injekcija iRNK što je dokaz potpunog nedostatka ABC.
[0628] SL.90 dodatno demonstrira važnost anti-PEG IgM u fenomenu ABC. SL.90A-90B su dva grafikona koji pokazuju nivoe anti-PEG IgM (U/ml) i nivoe EPO (ng/ml) u dve grupe sa SL.78: C57Bl6J (SL. 90A) i sIgM-/- miševi (SL. 90B). Nivoi anti-PEG IgM su grafički prikazani kao svetlosivi krugovi na SL.90A i povećanje anti-PEG IgM korelira sa početkom ABC. Kod sIgM-/- miša ovo je pokazano crnim krugovima koji ostaju na početnoj vrednosti (SL. 90B). Koncentracije EPO su označene crnim krugovima (SL.90A) i crnim kvadratima (SL.90B). Podaci jasno demonstriraju obrnutu korelaciju između ekspresije proteina i nivoa anti-PEG IgM. Kada su nivoi IgM visoki, ekspresija EPO je suprimirana, što ukazuje da se javlja ABC. Kada su nivoi IgM suprimirani, na primer kod nokaut miševa, ekspresija EPO je značajno pojačana i ABC je redukovan. Stoga, u odsustvu cirkulišućeg IgM, nije uočen gubitak ekspresije (bez ABC) što korelira sa odsustvom anti-PEG odgovora.
Primer 32
[0629] Sledi primer sinteze jedinjenja:
Jedinjenje 393: N-(2-(didodecilamino)etil)-N-dodecilglicin
Metil N-(terc-butoksikarbonil)-N-dodecilglicinat
[0630]
2
Rastvor N-(terc-butoksikarbonil)glicin metil estra (7,7 g, 40,7 mmol) u DMF (100 ml) na 0 °C je tretiran sa NaH (60%, 1,71 g, 42,7 mmol) i smeši je omogućeno da se meša tokom 30 minuta. Rastvoru je omogućeno da se vrati na sobnu temperaturu pre nego što je dodat 1-bromododekan (15,2 g, 61,0 mmol) i reakciji je omogućeno da se meša preko noći. Reakcija je ugašena vodom i ekstrahovana sa EtOAc. Organske supstance su isprane slanim rastvorom, osušene preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirane, i koncentrovane in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0-20% EtOAc/heksani) obezbedilo je metil N-(tercbutoksikarbonil)-N-dodecilglicinat (4,03 g, 28%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,01-3,84 (br. m, 2H); 3,75 (s, 3H); 3,27 (br. m, 2H); 1,67-1,39 (br. m, 11H); 1,28 (br.18H); 0,90 (t, 3H).
Metil dodecilglicinat
[0631]
[0632] Rastvoru metil N-(terc-butoksikarbonil)-N-dodecilglicinata (4,03 g, 11,3 mmol) u DCM (17 ml) na 0 °C kap po kap je dodata TFA (17 ml, 226 mmol). Reakciji je omogućeno da se vrati na sobnu temperaturu i meša tokom 6 sati. Reakciona smeša je koncentrovana in vacuo i sirovi materijal je rastvoren u DCM. Rastvor je ispran sa 10% NaOH, slanim rastvorom, osušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran, i koncentrovan in vacuo kako bi obezbedio metil dodecilglicinat (2,84 g, 98%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,75 (s, 3H); 3,44 (s, 2H); 2,62 (t, 2H); 1,70 (br. 1H); 1,51 (m, 2H); 1,29 (br.18H); 0,90 (t, 3H).
2 1
2-(didodecilamino)etan-1-ol
[0633]
[0634] Rastvoru 1-bromododekana (10 g, 40,1 mmol) u MeCN (84 ml) dodati su etanolamin (1,10 ml, 18,2 mmol), K2CO3(11,1 g, 80,1 mmol), i KI (302 mg, 1,82 mmol). Reakciji je omogućeno da se meša na 82 °C tokom 48 sati. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature, filtrirana, i čvrste supstance su isprane sa heksanima. Filtrat je ekstrahovan sa heksanima, i kombinovani ekstrakti su koncentrovani in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0-20% MeOH/DCM) obezbedilo je 2-(didodecilamino)etan-1-ol (3,87 g, 53%).
UPLC/ELSD: RT = 2,69 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 398,56 za C26H55NO
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,57 (t, 2H); 2,63 (t, 2H); 2,49 (br. m, 4H); 1,48 (br. m, 4H); 1,29 (br.36H); 0,91 (t, 6H).
N-(2-hloroetil)-N-dodecildodekan-1-amin
[0635]
[0636] Rastvoru 2-(didodecilamino)etan-1-ola (3,87 g, 9,73 mmol) i trietilamina (1,76 ml, 12,6 mmol) u DCM (50 ml) na 0 °C kap po kap je dodat rastvor metansulfonil hlorida (0,941 ml, 12,2 mmol) u DCM (5 ml). Reakciji je omogućeno da se vrati na sobnu temperaturu i meša tokom 16
2 2
sati. Smeša je ugašena dodavanjem vode i ekstrahovana sa DCM. Organski sloj je ispran sa zasićenim NaHCO3, slanim rastvorom, osušen preko anhidrovanog Na2SO4, filtriran, i koncentrovan in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0-10% EtOAc/heksani) obezbedilo je N-(2-hloretil)-N-dodecildodekan-1-amin (1,92 g, 47%).<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,51 (t, 2H); 2,78 (t, 2H); 2,47 (br. m, 4H); 1,44 (br. m, 4H); 1,28 (br.36H); 0,90 (t, 6H).
Metil N-(2-(didodecilamino)etil)-N-dodecilglicinat
[0637]
[0638] Rastvoru metil dodecilglicinata (425 mg, 1,65 mmol) u MeCN (10 ml) dodati su N-(2-hloroetil)-N-dodecildodekan-1-amin (825 mg, 1,98 mmol), K2CO3(457 mg, 3,30 mmol), i KI (27 mg, 0,165 mmol). Reakciji je omogućeno da se meša na 82 °C tokom 72 sata. Reakciona smeša je filtrirana i čvrste supstance su isprane sa heksanima. Filtrat je koncentrovan in vacuo da obezbedi sirovi proizvod. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0-20% MeOH/DCM) obezbedilo je metil N-(2-(didodecilamino)etil)-N-dodecilglicinat (652 mg, 62%).
UPLC/ELSD: RT = 3,77 min, MS (ES): m/z (MH<+>) 638,18 za C41H84N2O2
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,72 (s, 3H); 3,41 (s, 2H); 2,90-2,20 (br. m, 10H); 1,60-1,00 (br. m, 60H); 0,90 (t, 9H).
N-(2-(didodecilamino)etil)-N-dodecilglicin
Jedinjenje 393
[0639]
2
[0640] Rastvoru metil N-(2-(didodecilamino)etil)-N-dodecilglicinata (652 mg, 1,02 mmol) u THF (6 ml) i 1M LiOH (5 ml, 5 mmol) je omogućeno da se meša na 65 °C tokom 16 sati. Reakcija je ohlađena do sobne temperature i zakišeljena sa 10% HCl. Smeša je ekstrahovana sa hloroformom, i organske supstance su isprane slanim rastvorom, osušene preko anhidrovanog Na2SO4, filtrirane, i koncentrovane in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0-20% MeOH/DCM) obezbedilo je N-(2-(didodecilamino)etil)-N-dodecilglicin (153 mg, 24%).
UPLC/ELSD: RT = 3,60 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 624,07 za C40H82N2O2
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,02-3,40 (br. m, 6H); 3,16 (br. 6H); 1,78 (br. 6H); 1,46-1,01 (br. m, 54H); 0,90 (t, 9H).
Jedinjenje 125: 3-((8-(heptadekan-9-iloksi)-8-oksooktil)(8-(noniloksi)-8-oksooktil)amino)propanska kiselina
Heptadekan-9-il 8-bromooktanoat
[0641]
[0642] Rastvoru 8-bromooktanske kiseline (1,04 g, 4,6 mmol) i heptadekan-9-ola (1,5 g, 5,8 mmol) u dihlorometanu (20 ml) dodati su N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidrohlorid (1,1 g, 5,8 mmol), N,N-diizopropiletilamin (3,3 ml, 18,7 mmol) i DMAP (114 mg, 0,9 mmol). Reakciji je omogućeno da se meša na rt tokom 18 h. Reakcija je razblažena sa dihlorometanom i isprana zasićenim natrijum bikarbonatom. Organski sloj je odvojen i ispran
2 4
slanim rastvorom, i osušen preko MgSO4. Organski sloj je filtriran i evaporisan in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-10% etil acetata u heksanima) kako bi se dobio heptadekan-9-il 8-bromooktanoat (875 mg, 1,9 mmol, 41%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,89 (m, 1H); 3,42 (m, 2H); 2,31 (m, 2H); 1,89 (m, 2H); 1,73-1,18 (br. m, 36H); 0,88 (m, 6H).
Nonil 8-bromooktanoat
[0643]
[0644] Rastvoru 8-bromooktanske kiseline (5 g, 22 mmol) i nonan-1-ola (6,46 g, 45 mmol) u dihlorometanu (100 ml) dodati su N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidrohlorid (4,3 g, 22 mmol) i DMAP (547 mg, 4,5 mmol). Reakciji je omogućeno da se meša na rt tokom 18 h. Reakcija je razblažena sa dihlorometanom i isprana zasićenim natrijum bikarbonatom. Organski sloj je odvojen i ispran slanim rastvorom, osušen preko MgSO4. Organski sloj je filtriran i evaporisan pod vakuumom. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-10% etil acetat u heksanima) kako bi se dobio nonil 8-bromooktanoat (6,1 g, 17 mmol, 77%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,06 (t, 2H); 3,40 (t, 2H); 2,29 (t, 2H); 1,85 (m, 2H); 1,72-0,97 (m, 22H); 0,88 (m, 3H).
Heptadekan-9-il 8-((3-hidroksipropil)amino)oktanoat
[0645]
2
[0646] Rastvor 8,87 g (19,2 mmol) heptadekan-9-il 8-bromooktanoata i 29 ml (384 mmol) 3-aminopropanola u 250 ml etanola je zagrevan do 50 °C i mešan tokom 20 sati, posle čega nije ostalo početnog bromida pomoću LC/MS. Rastvoru je omogućeno da se ohladi do sobne temperature, konc. i ostatak je rastvoren u DCM. Rastvor je dva puta ispran sa 5% vodenim rastvorom natrijum bikarbonata, osušen (Na2SO4), filtriran i filtrat je konc. do bezbojnog ulja. Ovo je hromatografisano na silicijum dioksidu sa 100% DCM koji ide do 10% DCM / 90% 80:20:1 DCM/MeOH/NH4OH kako bi dalo heptadekan-9-il 8-((3-hidroksipropil)amino)oktanoat (7,98 g, 17,5 mmol 91%) kao bezbojno ulje.
UPLC/ELSD: RT= 2,52 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 456,8 za C28H57NO3.
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,86 (kvint., 1H, J = 6 Hz); 3,81 (t, 2H, J = 7,5 Hz); 2,88 (t, 2H, J= 7,5 Hz); 2,60 (t, 2H, J = 7,5 Hz); 2,44 (br. s, 1H); 2,27 (t, 2H, J= 7,5 Hz); 1,70 (m, 2H); 1,61 (m, 2H); 1,49 (m, 6H); 1,25 (br. m, 31H); 0,88 (t, 6H, J = 7,5 Hz).
Heptadekan-9-il 8-((3-hidroksipropil)(8-(noniloksi)-8-oksooktil)amino) oktanoat
[0647]
2
[0648] Smeši 7,98 g (17,5 mmol) heptadekan-9-il 8-((3-hidroksipropil)amino)oktanoata i 6,12 g (17,5 mmol) nonil 8-bromooktanoata u 100 ml suvog acetonitrila pod suvim azotom dodato je 3,2 g (19,3 mmol) kalijum jodida, zatim 9,7 g (70 mmol) kalijum karbonata i smeša je razblažena sa 25 ml suvog ciklopentil metil etra. Rezultujuća bela smeša je zagrevana do 90 °C i mešana tokom 28 sati, zatim je omogućeno da se ohladi do sobne temp., filtrirana, čvrsta supstanca sa filtera je isprana sa DCM i filtrat konc. Ostatak je podeljen između 5% vodenog rastvora natrijum bikarbonata i DCM, faze su razdvojene i vodena je dva puta ekstrahovana sa DCM. Organske supstance su kombinovane, osušene (MgSO4), filtrirane i filtrat konc. do žutog ulja. Ovo je hromatografisano na silicijum dioksidu sa 100% DCM koji ide do 50% DCM / 50% 80:20:1 DCM:MeOH:NH4OH kako bi dalo heptadekan-9-il 8-((3-hidroksipropil)(8-(noniloksi)-8-oksooktil)amino)oktanoat (10,14 g, 14 mmol, 80%) kao bledožuto ulje.
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,86 (p, 1H); 4,05 (t, 2H); 3,80 (m, 2H); 2,92-2,36 (br. m, 5H); 2,29 (m, 4H); 1,89-1,42 (br. m, 16H): 1,42-1,02 (br. m, 50H); 0,88 (m, 9H), UPLC/ELSD: RT = 4,51 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 725,19 za C45H89NO5.
Heptadekan-9-il 8-((8-(noniloksi)-8-oksooktil)amino)oktanoat
[0649]
[0650] Na -78 °C, rastvoru oksalil hlorida (0,25 ml, 3,0 mmol) u 3 ml dihlorometana kap po kap je dodat rastvor DMSO (0,43 ml, 6,0 mmol) u 2 ml dihlorometana, i zatim je odmah dodat rastvor heptadekan-9-il 8-((3-hidroksipropil)(8-(noniloksi)-8-oksooktil)amino)oktanoata (1,45 g, 2,0 mmol) u dihlorometanu (10 ml). Pošto je mešano tokom 30 min na ovoj temperaturi, dodat je trietilamin (1,45 ml, 10,4 mmol) i reakciona smeša je zagrejana do sobne temperature. TLC i MS su pokazale završenu reakciju (M+1: 722,7), i reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana heksanima (2X). Kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom. Posle sušenja preko natrijum sulfata, filtrat je koncentrovan i ostatak je prečišćen pomoću ISCO (SiO2: EtOAc/heksani/0,5% Et3N 0 do 50%) kako bi se dobio proizvod kao braon ulje (810 mg, 61%).
2
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,85 (p, 1H, J = 6,0 Hz); 4,05 (t, 2H, J = 6,9 Hz); 2,56 (t, 4H, J = 7,1 Hz); 2,31-2,24 (m, 4H); 1,67-1,19 (m, 63H); 0,87 (m, 9H).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 666,7.
Heptadekan-9-il 8-((3-(benziloksi)-3-oksopropil)(8-(noniloksi)-8-oksooktil)amino)oktanoat
[0651]
[0652] Rastvor heptadekan-9-il 8-((8-(noniloksi)-8-oksooktil)amino)oktanoata (798 mg, 1,2 mmol) i benzil akrilata (293 mg, 1,8 mmol) u dihlorometanu (20 ml) je mešan na sobnoj temperaturi tokom 16 h. TLC i MS su pokazale skoro nikakvu reakciju, dodato je 10 ml McOH i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. MS je pokazala proizvod sa malom količinom metil estra (M+1: 829,8, 752,7): Reakciona smeša je koncentrovana do suvog i prečišćena pomoću ISCO (SiO2: EtOAc/heksani 0 do 35%) kako bi se dobio proizvod kao bezbojno ulje (280 mg, 28%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,36-7,32 (m, 5H); 5,10 (s, 2H); 4,85 (p, 1H, J= 6,0 Hz); 4,04 (t, 2H, J = 6,9 Hz); 2,78 (t, 2H, J= 6,9 Hz); 2,46 (t, 2H, J = 7,0 Hz); 2,36 (t, 4H, J = 6,9 Hz); 2,30-2,24 (m, 4H); 1,67-1,19 (m, 62H); 0,87 (m, 9H).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 829,8.
3-((8-(heptadekan-9-iloksi)-8-oksooktil)(8-(noniloksi)-8-oksooktil)amino)propanska kiselina
[0653]
2
[0654] Smeša heptadekan-9-il 8-((3-(benziloksi)-3-oksopropil)(8-(noniloksi)-8-oksooktil)amino)oktanoata (280 mg, 0,34 mmol) i Pd/C (10%, 28 mg) u 20 ml EtOAc je mešana pod balonom vodonika tokom 1 h. MS je pokazala završenu reakciju. Reakciona smeša je filtrirana i filtrat je koncentrovan. Ostatak je prečišćen pomoću ISCO (SiO2: MeOH/CH1Cl20 do 10%) kako bi se dobio proizvod kao bezbojno ulje (230 mg, 91%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,85 (p, 1H, J = 6,0 Hz); 4,04 (t, 2H, J = 6,6 Hz); 2,85 (t, 2H, J = 6,0 Hz); 2,65 (t, 4H, J= 7,7 Hz); 2,48 (t, 2H, J = 6,0 Hz); 2,32-2,24 (m, 4H); 1,67-1,17 (m, 63H); 0,87 (m, 9H). LC/UV (214 nm): RT = 12,38 min.
MS (APCI): m/z (MW<+>) 838,7.
Jedinjenje 1543-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)propan-1,2-diil dipalmitat
[0655] 4-((benziloksi)metil)-2,2-dimetil-1,3-dioksolan (Ref: EP1916255 A2, str. 29)
[0656] Na 0 °C, smeši NaH (60%, 4,4 g, 0,11 mol) u THF/DMF (25 ml/120 ml), kap po kap je dodat rastvor (2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metanola (13,2 g, 0,1 mol) u THF/DMF (25 ml/25 ml). Posle dodavanja, smeša je mešana tokom 1 h, i zatim je dodat benzil hlorid (12,6 ml, 0,11 mol). Smeša je zagrejana do sobne temperature i mešana tokom 16 h. Pošto je TLC potvrdila završetak, reakcija je ugašena zasićenim amonijum hloridom (300 ml) i ekstrahovana sa etrom (2
2
X 300 ml). Kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pomoću vakuuma, 4-((benziloksi)metil)-2,2-dimetil-1,3-dioksolan je dobijen kao braon ulje (23,3 g, kvant.) koje je upotrebljeno za sledeći korak bez dodatnog prečišćavanja.
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,25-7,41 (m, 5H), 4,52-4,61 (m, 2H), 4,25-4,34 (m, 1H), 4,02-4,08 (m, 1H), 3,71-3,78 (m, 1H), 3,43-3,58 (m, 2H), 1,41 (s, 3H), 1,35 (s, 3H).
[0657] 3-(benziloksi)propan-1,2-diol (Ref: EP1916255 A2, str.30)
[0658] Rastvoru 4-((benziloksi)metil)-2,2-dimetil-1,3-dioksolana (23,3 g, 0,1 mol) u 150 ml MeOH, dodata je 1N HCl (40 ml), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Posle potvrde završetka pomoću TLC, reakciona smeša je neutralizovana zasićenim natrijum bikarbonatom do pH = 7, i ekstrahovana sa dihlorometanom (4 X 300 ml). Kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen natrijum sulfatom. Posle filtriranja i koncentrovanja pomoću vakuuma, sirovi proizvod je prečišćen sa ISCO (330 g SiO2: EtOAc/heksani 0 do 100%) kako bi se dobio 3-(benziloksi)propan-1,2-diol kao svetložuto ulje (13,39 g, 73%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,25-7,38 (m, 5H), 4,55 (s, 2H), 3,54-3,75 (m, 4H), 3,85-3,95 (m, 1H), 2,62 (t, 1H, J = 4,7 Hz), 2,12 (m, 1H).
[0659] 3-(benziloksi)propan-1,2-diil dipalmitat (Ref: EP1916255 A2, str.30)
[0660] Smeša 3-(benziloksi)propan-1,2-diola (7,57 g, 41,5 mmol), palmitinske kiseline (21,3 g, 83 mmol), EDCI (17,5 g, 91,4 mmol) i DMAP (1,02 g, 8,3 mmol) u 150 ml dihlorometana je mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 h. Reakciona smeša je razblažena vodom, ekstrahovana sa dihlorometanom (2 X 500 ml), i kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, sirovi proizvod je
2
prečišćen rastvaranjem u heksanima i filtriranjem kroz jastuče silika gela, i zatim eluiran sa EtOAc/heksanima 0 do 20% kako bi dao 3-(benziloksi)propan-1,2-diil dipalmitat kao bezbojno ulje (21,0 g, 76%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,27-7,33 (m, 5H), 5,31-5,36 (m, 1H),5,29 (s, 2H), 5,21-5,26 (m, 1H),4,53 (dd, 2H, J= 12,3 Hz, 15,8 Hz), 4,33 (dd, 1H, J = 11,8 Hz, 3,8 Hz), 4,18 (dt, 1H, J = 12,0 Hz, 6,4 Hz), 3,58 (d, 2H, J = 5,2 Hz), 2,24-2,33 (m, 4H), 1,95-2,02 (m, 2H), 1,55-1,63 (w, 3H), 1,24 (bs, 44H), 0,87 (t, 6H, J= 6,8 Hz).
3-hidroksipropan-1,2-diil dipalmitat
[0661]
[0662] Smeša 3-(benziloksi)propan-1,2-diil dipalmitata (5,14 g, 7,8 mmol) i Pd/C (5%, Degaussa E10002U/W, Aldrich 330124, 514 mg) u 100 ml EtOAc je pročišćena azotom i vodonikom 3 puta, respektivno, i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi sa balonom tokom 16 h. Suspenzija je filtrirana kroz celit, isprana dihlorometanom (300 ml). Posle koncentrovanja pod vakuumom, ostatak je prečišćen sa ISCO (80 g SiO1: EtOAc/heksani 0 do 40% kako bi dao 3-hidroksipropan-1,2-diil dipalmitat kao belu čvrstu supstancu (3,17 g, 71%).
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.07 (pent, 1H, J= 5.2 Hz), 4.27 (ddd, 2H, J = 4.4 Hz, 11.9 Hz, 24.9 Hz), 3.72 (t, 2H, J = 4.9 Hz), 2.33 (q, 4H, J = 7.1 Hz), 1.99 (t, 1H, J= 6.6 Hz), 1.56-1.66 (m, 4H), 1.24 (bs, 48H), 0.87 (t, 6H, J = 6.8 Hz).
Korak 5: 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)propan-1,2-diil dipalmitat
[0663]
2 1
[0664] Rastvoru 3-hidroksipropan-1,2-diil dipalmitata (2,70 g, 4,75 mmol) i tetrazola (0,45 M u MeCN, 21 ml, 9,490 mmol) u 80 ml dihlorometana, kap po kap je dodat rastvor 3-((hloro(diizopropilamino)fosfino)oksi)propannitrila (3,0 ml, 9,49 mmol) u 20 ml dihlorometana i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Smeša je koncentrovana i prečišćena pomoću ISCO (80 g SiO2: EtOAc/heksani (1% Et3N) 0 do 10%) kako bi dala 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)propan-1,2-diil dipalmitat kao belu čvrstu supstancu (3,22 g, 88%). Prinos se može poboljšati pre-eluiranjem kolone sa u višku heksana/1% Et3N.<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,14-5,21 (m, 1H), 4,33 (dt, 1H, J= 11,2 Hz, 3,8 Hz), 4,11-4,20 (m, 1H), 3,56-3,87 (m, 5H), 2,62 (t, 2H, J= 6,6 Hz), 2,29 (t, 4H, J = 7,9 Hz), 1,55-1,64 (m, 3H), 1,24 (bs, 50H), 1,17 (d, 6H, J= 6,8 Hz), 1,16 (d, 6H, J = 6,8 Hz), 0,87 (t, 6H, J = 6,3 Hz).
[0665] 3-hidroksi-N,N,N-trimetilpropan-1-aminijum tozilat (Ref: Eur. J. Med. Chem. 2013, 66.
46)
Rastvor 3-(dimetilamino)propan-1-ola (2,27 g, 22 mmol) i metil tozilata (3,0 ml, 20 mmol) u 20 ml MeCN je zagrevan do refluksa tokom 4 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i istaložena u acetonu kako bi dala 3-hidroksi-N,N,N-trimetilpropan-1-aminijum tozilat kao belu čvrstu supstancu (5,50 g, 86%).
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7,47 (d, 2H, J = 7,9 Hz), 7,11 (d, 2H, J = 7,9 Hz), 4,80 (t, 1H, J =4,9 Hz), 3,47 (q, 2H, J = 5,8 Hz), 3,34 (m, 2H), 3,04 (s, 9H), 2,28 (s, 3H), 1,79-1,85 (m, 2H).
2 2
3-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-trimetilpropan-1-aminijum hlorid
[0666]
[0667] Rastvoru 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)propan-1,2-diil dipalmitata (769 mg, 1,0 mmol) i 3-hidroksi-N,N,N-trimetilpropan-1-aminijum tozilata (289 mg, 1,0 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor tetrazola u MeCN (0,45 M, 2,2 ml, 1,0 mmol), i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Pošto je potvrđen nestanak 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)propan-1,2-diil dipalmitata, dodat je 'BuOOH (0,80 ml, 4,0 mmol) i smeša je mešana tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% natrijum bisulfatom i slanim rastvorom, i zatim osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, ostatak u vidu žute pene je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 10%) kako bi dao 3-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-trimetilpropan-1-aminijum hlorid kao belu čvrstu supstancu (407 mg, 48%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,20-5,28 (m, 1H), 4,15-4,35 (m, 4H), 3,71-3,82 (m, 2H), 3,31 (s, 9H), 2,83 (m, 2H), 2,20-2,36 (m, 7H), 1,98 (s, 3H), 1,53-1,65 (m, 4H), 1,24 (bs, 48H), 0,87 (t, 6H, J = 6,6 Hz).
2,3-bis(palmitoiloksi)propil (3-(trimetilamonio)propil) fosfat Jedinjenje 154
[0668]
2
[0669] Rastvor 3-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-trimetilpropan-1-aminijum hlorida (407 mg, 0,48 mmol) i diizopropiletilamina (0,62 ml, 3,5 mmol) u 20 ml MeCN je zagrevan na 60 °C tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena pomoću ISCO (zlato 24 g SiO2:MeOH/dihlorometan 0 do 60%) kako bi obezbedila željeni proizvod, 2,3-bis(palmitoiloksi)propil (3-(trimetilamonio)propil) fosfat kao belu čvrstu supstancu (280 mg, 78%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,20 (m, 1H), 4,40 (dd, 1H, J = 12,2 Hz, 2,7 Hz), 4,13 (dd, 1H, J = 11,7 Hz, 7,1 Hz), 3,93-4,03 (m, 4H), 3,82-3,88 (m, 2H), 3,28 (s, 9H), 2,23-2,30 (m, 4H), 2,13 (m, 2H), 1,56 (m, 4H), 1,24 (bs, 48H), 0,87 (t, 6H, J= 6,6 Hz).
Jedinjenje 155: 2,3-bis(patmitoiloksi)propil (2-(4-metilmorfolino-4-ijum)etil) fosfat
[0670] S4-(2-hidroksietil)-4-metilmorfolin-4-ijum 4-metilbenzensulfonat (Ref: Eur. J. Med. Chem. 2009, 44, 4970)
[0671] Rastvor 2-morfolinoetan-1-ola (2,7 ml, 22 mmol) i metil tozilata (3,0 ml, 20 mmol) u 20 ml MeCN je zagrevan do refluksa tokom 4 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i istaložena u acetonu kako bi dala 3-hidroksi-4-metilmorfolin-4-ijum 4-metilbenzensulfonat kao braonkastu čvrstu supstancu (5,57 g, 87%).
2 4
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7,47 (d, 2H, J= 8,0 Hz), 7,11 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 5,32 (t, 1H, J= 4,8 Hz), 3,86-3,96 (m, 6H), 3,38-3,58 (m, 6H), 3,19 (s, 3H), 2,28 (s, 3H).
4-(2-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)etil)-4-metilmorfolin-4-ijum hlorid
[0672]
[0673] Rastvoru 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)propan-1,2-diil dipalmitata (769 mg, 1,0 mmol) i 3-hidroksi4-metilmorfolin-4-ijum 4-metilbenzensulfonata (317 mg, 1,0 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor tetrazola u MeCN (0,45 M, 2,2 ml, 1,0 mmol), i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 h. Pošto je potvrđen nestanak 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)propan-1,2-diil dipalmitata, dodat je 'BuOOH (0,80 ml, 4,0 mmol) i smeša je mešana tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% natrijum bisulfatom i slanim rastvorom, i zatim osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, ostatak u vidu žute pene je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 10%) kako bi dao 4-(2-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)etil)-4-metilmorfolin-4-ijum hlorid kao belu čvrstu supstancu (713 mg, 86%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,24 (m, 1H), 4,73 (m, 2H), 4,11-4,38 (m, 7H), 4,02 (m, 3H), 3,67 (m, 3H), 3,48 (m, 2H), 2,58-2,83 (m, 5H), 2,27-2,34 (m, 5H), 1,58 (m, 4H), 1,19-1,34 (bs, 48H), 0,87 (t, 6H, J= 6,6 Hz).
2,3-bis(palmitoiloksi)propil (2-(4-metilmorfolino-4-ijum)etil) fosfat Jedinjenje 155
[0674]
2
[0675] Rastvor 4-(2-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)etil)-4-metilmorfolin-4-ijum hlorida (713 mg, 0,86 mmol) i diizopropiletilamina (1,05 ml, 6,0 mmol) u 20 ml MeCN je zagrevan na 60 °C tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena pomoću ISCO (zlato 24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 60%) kako bi obezbedila željeni proizvod, 2,3-bis(palmitoiloksi)propil (2-(4-metilmorfolino-4-ijum)etil) fosfat kao belu čvrstu supstancu (446 mg, 67%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,20 (m, 1H), 4,36-4,42 (m, 3H), 4,10 (dd, 1H, J = 12,1 Hz, 7,4 Hz), 3,90-4,02 (m, 6H), 3,69 (m, 4H), 3,50 (m, 1H), 2,28 (q, 8H, J= 6,8 Hz), 1,52-1,61 (m, 4H), 1,24 (bs, 48H), 0,87 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
Jedinjenje 156: 2,3-bis(palmitoiloksi)propil (4-(trimetilamonio)butil) fosfat
[0676] 4-hidroksi-N,N,N-trimetilbutan-1-aminijum 4-metilbenzensulfonat (Ref: Eur. J. Med. Chem. 2013, 66, 46)
[0677] Rastvor 4-(dimetilamino)butan-1-ola (2,58 g, 22 mmol) i metil tozilata (3,0 ml, 20 mmol) u 20 ml MeCN je zagrevan do refluksa tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod
2
vakuumom i istaložena u acetonu kako bi dala 4-hidroksi-N,N,N-trimetilbutan-1-aminijum 4-metilbenzensulfonat kao belu čvrstu supstancu (5,13 g, 84%).
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7,46 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,11 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 4,58 (t, 1H, J = 4,9 Hz), 3,43 (q, 2H, J = 5,2 Hz), 3,24-3,30 (m, 2H), 3,02 (s, 9H), 2,28 (s, 3H), 1,64-1,73 (m, 2H), 1,36-1,45 (m, 2H).
4-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-trimetilbutan-1-aminijum hlorid
[0678]
[0679] Rastvoru 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropi)amino)fosfino)oksi)propan-1,2-diil dipalmitata (769 mg, 1,0 mmol) i 34-hidroksi-N,N,N-trimetilbutan-1-aminijum 4-metilbenzensulfonata (303 mg, 1,0 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor tetrazola u MeCN (0,45 M, 2,2 ml, 1,0 mmol), i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Pošto je potvrđen nestanak 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)propan-1,2-diil dipalmitata, dodat je 'BuOOH (0,80 ml, 4,0 mmol) i smeša je mešana tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% natrijum bisulfatom i slanim rastvorom, i zatim osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, ostatak u vidu žute pene je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 10%) kako bi dao 4-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-trimetilbutan-1-aminijum hlorid kao belu čvrstu supstancu (531 mg, 65%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,22-5,26 (m, 1H), 4,11-4,35 (m, 8H), 3,62-3,68 (m, 2H), 3,31 (s, 9H), 2,78-2,84 (m, 2H), 2,32 (q, 4H, J= 7,6 Hz), 1,52-2,01 (m, 8H), 1,15-1,32 (m, 48H), 0,87 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
2,3-bis(palmitoiloksi)propil (4-(trimetilamonio)butil) fosfat Jedinjenje 156
2
[0681] Rastvor 4-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-trimetilbutan-1-aminijum hlorida (531 mg, 0,65 mmol) i diizopropiletilamin (0,79 ml, 4,56 mmol) u 20 ml MeCN je zagrevan na 60 °C tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena pomoću ISCO (zlato 24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 60%) kako bi obezbedila željeni proizvod, 2,3-bis(palmitoiloksi)propil (4-(trimetilamonio)butil) fosfat kao belu čvrstu supstancu (383 mg, 77%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,20 (m, 1H), 4,40 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 2,7 Hz), 4,15 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 6,8 Hz), 3,89-3,98 (m, 4H), 3,65-3,72 (m, 2H), 3,29 (s, 9H), 2,22-2,34 (m, 6H), 1,94-2,02 (m, 2H), 1,69-1,73 (m, 2H), 1,15-1,61 (m, 2H), 1,24 (bs, 48H), 0,87 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
Jedinjenje 150: 2,3-bis(palmitoiloksi)propil (2-(trietilamonio)etil) fosfat
2-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosfanil)oksi)-N,N,N-trietiletan-1-aminijum hlorid
[0682]
2
[0683] Rastvoru 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)propan-1,2-diil dipalmitata (769 mg, 1,0 mmol) i N,N,N-trietil-2-hidroksietanaminijum jodida (126 mg, 0,46 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor tetrazola u MeCN (0,45 M, 1,03 ml, 0,46 mmol), i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Pošto je potvrđen nestanak 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)propan-1,2-diil dipalmitata, dodat je 'BuOOH (0,37 ml, 1,84 mmol) i smeša je mešana tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% natrijum bisulfatom i slanim rastvorom, i zatim osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, ostatak u vidu žute pene je prečišćen pomoću ISCO (12 g SiO2:MeOH/dihlorometan 0 do 50%) kako bi obezbedio 2-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi))fosfanil)oksi)-N,N,N-trietiletan-1-aminijum hlorid kao žutu penu (180 mg, 45%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,26 (m, 1H), 4,70 (m, 2H), 4,05-4,45 (m, 6H), 3,56 (q, 6H, J = 7,1 Hz), 2,87 (m, 2H), 2,28-2,36 (m, 4H), 1,70 (m, 2H), 1,58 (m, 4H), 1,41 (t, 9H, J = 7,1 Hz), 1,24 (bs, 48H), 0,87 (t, 6H, 7,1 Hz).
2,3-bis(palmitoiloksi)propil (2-(trietilamonio)etil) fosfat Jedinjenje 150
[0684]
[0685] Rastvor 2-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosfanil)oksi)-N,N,N-trietiletan-1-aminijum hlorida (180 mg, 0,21 mmol) i diizopropiletilamina (0,27 ml, 1,53 mmol) u 5 ml MeCN je zagrevan na 60 °C tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena pomoću ISCO (zlato 12 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 60%) kako bi se dobio željeni proizvod, 2,3-bis(palmitoiloksi)propil (2-(trietilamonio)etil) fosfat kao bela čvrsta supstanca (114 mg, 70%).
2
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,21 (m, 1H), 4,41 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 2,7 Hz), 4,31 (m, 2H), 4,15 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 6,8 Hz), 4,01 (t, 2H, J = 6,6 Hz), 3,51 (q, 8H, J = 7,4 Hz), 2,28 (q, 4H, J= 6,3 Hz), 1,71 (m, 4H), 1,37 (t, 9H, J= 7,4 Hz), 1,24 (bs, 48H), 0,87 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
Jedinjenje 151: 2,3-bis(palmitoiloksi)propil (2-(tripropilamonio)etil) fosfat
[0686] N-(2-hidroksietil)-N,N-dipropilpropan-1-aminijum bromid (Ref: Dalton Trans. 2015, 44, 16680)
[0687] Rastvor tripropilamina (3,8 ml, 20 mmol) i 2-bromoetanola (1,42 ml, 20 mmol) u 20 ml MeCN je zagrevan do refluksa tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana i ostatak je istaložen u smeši heksani/EtOAc kako bi se dobio N-(2-hidroksietil)-N,N-dipropilpropan-1-aminijum bromid kao bela čvrsta supstanca (3,81 g, 71%).
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 5,25 (t, 1H, J = 5,2 Hz), 3,77 (m, 2H), 3,33 (t, 2H, J= 7,1 Hz), 3,17-3,23 (m, 6H), 1,56-1,68 (m, 6H), 0,88 (t, 9H, J = 7,1 Hz).
N-(2-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosfanil)oksi)etil)-N,N-dipropilpropan-1-aminijum hlorid
[0688]
[0689] Rastvoru 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)propan-1,2-diil dipalmitata (769 mg, 1,0 mmol) i N-(2-hidroksietil)-N,N-dipropilpropan-1-aminijum bromida (268 mg, 1,0 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor tetrazola u MeCN (0,45 M, 2,2 ml, 1,0 mmol), i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Pošto je potvrđen nestanak 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfino)oksi)propan-1,2-diil dipalmitata, dodat je 'BuOOH (0,80 ml, 4,0 mmol) i smeša je mešana tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% natrijum bisulfatom i slanim rastvorom, i zatim osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, ostatak u vidu žute pene je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO1: MeOH/dihlorometan 0 do 50%) kako bi obezbedio N-(2-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosfanil)oksi)etil)-N,N-dipropilpropan-1-aminijum hlorid kao belu penu (520 mg, 60%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,26 (m, 1H), 4,64 (m, 2H), 4,10-4,42 (m, 6H), 3,97 (m, 2H), 3,31 (m, 6H), 2,87 (m, 2H), 2,32 (g, 4H, J = 7,7 Hz), 1,54-2,00 (m, 10H), 1,24 (m, 48H), 1,03 (t, 9H, J= 7,1 Hz), 0,87 (t, 6H, J= 7,1 Hz).
2,3-bis(palmitoiloksi)propil (2-(tripropilamonio)etil) fosfat
Jedinjenje 151
[0690]
[0691] Rastvor N-(2-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosfanil)oksi)etil)-N,N-dipropilpropan-1-aminijum hlorida (520 mg, 0,60 mmol) i diizopropiletilamina (0,75 ml, 4,29 mmol) u 20 ml MeCN je zagrevan na 60 °C tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena pomoću ISCO (zlato 24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 60%) kako bi se dobio željeni proizvod, 2,3-bis(palmitoiloksi)propil (2-(tripropilamonio)etil) fosfat kao bela čvrsta supstanca (360 mg, 73%).
1
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,20 (m, 1H), 4,41 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 2,7 Hz), 4,28 (m, 2H), 4,13 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 6,8 Hz), 4,00 (t, 2H, J = 6,6 Hz), 3,62 (m, 2H), 3,31-3,38 (m, 6H), 2,27 (dd, 4H, J = 7,0 Hz), 1,66-1,80 (m, 6H), 1,52-1,61 (m, 4H), 1,24 (bs, 48H), 1,04 (t, 9H, J = 7,4 Hz), 0,87 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
Jedinjenje 152: 2,3-bis(palmitoiloksi)propil (2-(1-metilpiperidin-1-ijum-1-il)etil) fosfat
[0692] 4-(2-hidroksietil)-4-metilmorfolin-4-ijum 4-metilbenzensulfonat (Ref: Eur. J. Med Chem.
2009, 44, 4970)
[0693] Rastvor 2-morfolinoetan-1-ola (2,7 ml, 22 mmol) i metil tozilata (3,0 ml, 20 mmol) u 20 ml acetonitrila je zagrevan do refluksa tokom 4 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i istaložena u acetonu kako bi dala 3-hidroksi-4-metilmorfolin-4-ijum 4-metilbenzensulfonat kao braonkastu čvrstu supstancu (5,57 g, 87%).
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7,47 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,11 (d, 2H, J= 8,0 Hz), 5,27 (t, 1H, J = 4,8 Hz), 3,79-3,86 (m, 2H), 3,36-3,46 (m, 6H), 3,06 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 1,72-1,83 (m, 4H), 1,46-1,55 (m, 2H).
1-(2-((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosfanil)oksi)etil)-1-metilpiperidin-1-ijum hlorid
[0694]
2
[0695] Rastvoru 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil dipalmitata (769 mg, 1,0 mmol) i 1-(2-hidroksietil)-1-metilpiperidin-1-ijum 4-metilbenzensulfonata (315 mg, 1,0 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor tetrazola u MeCN (0,45 M, 2,2 ml, 1,0 mmol), i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Pošto je potvrđen nestanak 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil dipalmitata, dodat je 'BuOOH (0,80 ml, 4,0 mmol) i smeša je mešana tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% natrijum bisulfatom i slanim rastvorom, i zatim osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, ostatak u vidu žute pene je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 50%) kako bi obezbedio 1-(2-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosfanil)oksi)etil)-1-metilpiperidin-1-ijum hlorid kao belu penu (690 mg, 84%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,25 (m, 1H),4,66 (m, 2H), 4,05-4,32 (m, 7H), 3,48 (s, 2H), 3,52-3,70 (m, 3H), 3,32 (s, 3H), 2,84 (m, 2H), 2,32 (q, 4H, J = 8,0 Hz), 1,92 (m, 4H), 1,77 (m, 2H), 1,59 (m, 4H), 1,19-1,34 (bs, 48H), 0,87 (t, 6H, J = 6,8 Hz).
2,3-bis(palmitoiloksi)propil (2-(1-metilpiperidin-1-ijum-1-il)etil) fosfat
Jedinjenje 152
[0696]
[0697] Rastvor 1-(2-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosfanil)oksi)etil)-1-metilpiperidin-1-ijum hlorida (690 mg, 0,83 mmol) i diizopropiletilamina (1,02 ml, 5,83 mmol) u 20 ml MeCN je zagrevan na 60 °C tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena pomoću ISCO (zlato 24 g SiO2:MeOH/dihlorometan 0 do 60%) kako bi se dobio željeni proizvod, 2,3-bis(palmitoiloksi)propil (2-(1-metilpiperidin-1-ijum-1-il)etil)fosfat kao bela čvrsta supstanca (495 mg, 77%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,18-5,20 (m, 1H), 4,30-4,42 (m, 3H), 4,12 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 7,1 Hz), 3,98 (t, 2H, J= 5,7 Hz), 3,82 (m, 2H), 3,60-3,71 (m, 2H), 3,46-3,55 (m, 2H), 3,33 (s, 3H), 2,27 (q, 4H, J = 7,4 Hz), 2,10 (m, 2H), 1,84-1,96 (m, 4H), 1,66-1,76 (m, 2H), 1,50-1,63 (m, 2H), 1,24 (bs, 48H), 0,87 (t, 6H, J = 6,6 Hz).
Jedinjenje 153: 2,3-bis(palmitoiloksi)propil (2-(4-metilmorfolino-4-ijum)etil) fosfat
[0698] 1-(2-hidroksietil)kvinuklidin-1-ijum bromid (Ref: Org. Bioorg. Chem.2010, 425)-
[0699] Rastvor kvinuklidina (2,22 g, 20 mmol) i 2-bromoetanola (1,42 ml, 20 mmol) u 20 ml THF je zagrevan na 50 °C tokom 5 h. Posle hlađenja do sobne temperature, čvrsta supstanca je filtrirana i isprana sa etrom kako bi dala 1-(2-hidroksietil)kvinuklidin-1-ijum bromid kao belu čvrstu supstancu (4,61 g, 97%).
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 5,24 (t, 1H, J= 4,6 Hz), 3,76-3,83 (m, 2H), 3,46 (t, 6H, J = 7,6 Hz), 3,21 (t, 2H, J= 5,5 Hz), 2,01-2,08 (m, 1H), 1,81-1,88 (m, 6H).
1-(2-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosfanil)oksi)etil)kvinuklidin-1-ijum hlorid
[0700]
4
[0701] Rastvoru 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil dipalmitata (769 mg, 1,0 mmol) i 1-(2-hidroksietil)kvinuklidin-1-ijum bromida (236 mg, 1,0 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor tetrazola u MeCN (0,45 M, 2,2 ml, 1,0 mmol), i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Pošto je potvrđen nestanak 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil dipalmitata, dodat je 'BuOOH (0,80 ml, 4,0 mmol) i smeša je mešana tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% natrijum bisulfatom i slanim rastvorom, i zatim osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, ostatak u vidu žute pene je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 10%) kako bi obezbedio 1-(2-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosfanil)oksi)etil)kvinuklidin-1-ijum hlorid kao belu čvrstu supstancu (646 mg, 76%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,25 (m, 1H),4,63 (m, 2H), 4,13-4,44 (m, 6H), 3,85 (m, 2H), 3,65 (m, 6H), 3,27 (m, 4H), 2,87 (m, 2H), 2,32 (q, 4H, J = 7,6 Hz), 2,19 (m, 1H), 2,04 (m, 4H), 1,59 (m, 2H), 1,18-1,42 (m, 48H), 0,87 (t, 6H, J= 7,0 Hz).
2,3-bis(palmitoiloksi)propil (2-(4-metilmorfolino-4-ijum)etil) fosfat
Jedinjenje 153
[0702]
[0703] Rastvor 1-(2-(((2,3-bis(palmitoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosfanil)oksi)etil)kvinuklidin-1-ijum hlorida (646 mg, 0,76 mmol) i diizopropiletilamina (0,94 ml, 5,38 mmol) u 20 ml MeCN je zagrevan na 60 °C tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena pomoću ISCO (zlato 24 g SiO2: McOH/dihlorometan 0 do 60%) kako bi se dobio željeni proizvod, 2,3-bis(palmitoiloksi)propil (2-(4-metilmorfolino-4-ijum)etil) fosfat kao bela čvrsta supstanca (444 mg, 74%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,22 (m, 1H), 4,40 (dd, 1H, J= 11,6 Hz, 2,8 Hz), 4,30 (m, 2H), 4,12 (dd, 1H, J= 11,8 Hz, 7,0 Hz), 3,98 (m, 2H), 3,63-3,73 (m, 8H), 2,15-2,34 (m, 8H), 2,00 (m, 5H), 1,50-1,62 (m, 2H), 1,18-1,42 (m, 48H), 0,87 (t, 6H, J = 7,0 Hz).
Jedinjenje 160: 2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(trietilamonio)etil) fosfat
[0704] 3-(benziloksi)propan-1,2-diil distearat (Ref: EP 1916255 A2, str.30)
Smeša 3-(benziloksi)propan-1,2-diola (13,39 g, 73,5 mmol), stearinske kiseline (41,8 g, 0,147 mol), EDCI (31,0 g, 0,161 mol), i DMAP (1,80 g, 14,7 mmol) u 300 ml dihlorometana je mešana na sobnoj temperaturi tokom 40 h. Reakciona smeša je razblažena vodom, ekstrahovana sa dihlorometanom (2 X 500 ml), i kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, sirovi proizvod je prečišćen rastvaranjem u heksanima i filtriranjem kroz jastuče silika gela, i zatim eluiran sa EtOAc/heksanima 0 do 30% kako bi obezbedio 3-(benziloksi)propan-1,2-diil distearat kao belu čvrstu supstancu (48,2 g, 91%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,27-7,34 (m, 5H), 5,21-5,25 (m, 1H), 4,53 (m, 2H), 4,34 (dd, 1H, J = 3,8 Hz, 11,8 Hz), 4,18 (dd, 1H, J = 6,6 Hz, 11,8 Hz), 3,58 (d, 2H, J = 6,0 Hz), 2,24-2,34 (m, 4H), 1,54-1,63 (m, 4H), 1,24 (s, 56H), 0,87 (t, 6H, J= 6,3 Hz).
3-hidroksipropan-1,2-diil distearat
[0705]
[0706] Smeša 3-(benziloksi)propan-1,2-diil distearata (48,2 g, 67,4 mmol) i Pd/C (5%, Degaussa E10002U/W, Aldrich 330124, 4,8 g) u 1 l EtOAc je pročišćena azotom i vodonikom 3 puta, respektivno, i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi sa balonom tokom 16 h. Suspenzija je filtrirana kroz celit, isprana dihlorometanom (3 l). Posle koncentrovanja pod vakuumom, čvrsta supstanca je istaložena u dihlorometanu kako bi obezbedila 3-hidroksipropan-1,2-diil distearat kao belu čvrstu supstancu (40,67 g, 96%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,05-5,11 (m, 1H), 4,31 (dd, 1H, J= 4,6 Hz, 11,9 Hz), 4,23 (dd, 1H, J = 5,7 Hz, 11,9 Hz), 3,70-3,74 (m, 2H), 2,33 (q, 4H, J = 7,1 Hz), 2,00 (t, 1H, J = 6,3 Hz), 1,57-1,62 (m, 4H), 1,24 (s, 56H), 0,87 (t, 6H, J i= 7,1 Hz).
3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearat
[0707]
[0708] Rastvoru 3-hidroksipropan-1,2-diil distearata (5,00 g, 8,0 mmol) i tetrazola (0,45 M u MeCN, 35,6 ml, 16,0 mmol) u 150 ml dihlorometana, kap po kap je dodat rastvor 3-((hloro(diizopropilamino)fosfino)oksi)propannitrila (5,1 ml, 16,0 mmol) u 100 ml dihlorometana i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 h. Smeša je koncentrovana i prečišćena pomoću ISCO (120 g SiO2:EtOAc/heksani (1% Et3N) 0 do 10%) kako bi dala 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearat kao belu čvrstu supstancu (3,73 g, 56%). Prinos se može poboljšati pre-eluiranjem kolone sa u višku heksana/1% Et3N.
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,16-5,20 (m, 1H), 4,28-4,37 (m, 1H), 4,11-4,17 (m, 1H), 2,62 (t, 2H, J= 6,3 Hz), 2,26-2,32 (m, 8H), 1,57-1,64 (m, 6H), 1,24 (s, 56H), 1,14-1,19 (m, 12H), 0,87 (t, 6H, J= 6,3 Hz).
2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi) fosforil)oksi)-N,N,N-trietiletanaminijum hlorid
[0709]
[0710] Rastvoru 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearata (700 mg, 0,848 mmol) i N,N,N-trietil-2-hidroksietanaminijum jodida (232 mg, 0,848 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor tetrazola u MeCN (0,45 M, 1,9 ml, 0,848 mmol), i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Pošto je potvrđen nestanak 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearata, dodat je<t>BuOOH (0,68 ml, 3,39 mmol) i smeša je mešana tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% natrijum bisulfatom i slanim rastvorom, i zatim osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, ostatak u vidu žute pene je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 10%) kako bi obezbedio 2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-trietiletanaminijum hlorid kao žućkastu penu (332 mg, 43%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,29 (m, 1H), 4,67 (m, 1H), 4,14-4,44 (m, 7H), 3,98 (m, 1H), 3,51 (q, 6H, J = 7, 2 Hz), 2,87 (m, 2H), 2,28-2,37 (m, 4H), 1,60 (m, 5H), 1,41 (t, 9H, J = 7,1 Hz), 1,24 (s, 56H), 0,87 (t, 6H, J = 7,2 Hz).
2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(trietilamonio)etil) fosfat Jedinjenje 160
[0712] Rastvor 2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-trietiletanaminijum hlorida (332 mg, 0,374 mmol) i diizopropiletilamina (0,46 ml, 2,62 mmol) u 10 ml MeCN je zagrevan na 60 °C tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena pomoću ISCO (zlato 24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 60%) kako bi obezbedila željeni proizvod, 2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(trietilamonio)etil) fosfat kao belu čvrstu supstancu (200 mg, 64%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,18-5,25 (m, 1H), 4,41 (dd, 1H, J =2,7 Hz, 11,8 Hz), 4,29 (m, 2H), 4,13 (dd, 1H, J =7,0 Hz, 11,8 Hz), 4,00 (t, 2H, J= 6,6 Hz), 3,57-3,62 (m, 2H), 3,52 (q, 6H, J = 7,4 Hz), 2,27 (q, 4H, J = 6,6 Hz), 1,52-1,62 (m, 4H), 1,37 (t, 9H, J = 7,1 Hz), 1,24 (s, 56H), 0,87 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
Jedinjenje 161: 2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(1-metilpiperidin-1-ijum-1-il)etil) fosfat
1-(2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)etil)-1-metilpiperidin-1-ijum hlorid
[0713]
[0714] Rastvoru 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearata (700 mg, 0,848 mmol) i 1-(2-hidroksietil)-1-metilpiperidin-1-ijum 4-metilbenzensulfonata (267 mg, 0,848 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor tetrazola u MeCN (0,45 M, 1,9 ml, 0,848 mmol), i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Pošto je potvrđen nestanak 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearata, dodat je<t>BuOOH (0,68 ml, 3,39 mmol) i smeša je mešana tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% natrijum bisulfatom i slanim rastvorom, i zatim osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, ostatak u vidu žute pene je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 10%) kako bi obezbedio 1-(2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)etil)-1-metilpiperidin-1-ijum hlorid kao belu čvrstu supstancu (470 mg, 62%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,25 (m, 1H), 4,67 (m, 2H), 4,12-4,42 (m, 7H), 3,48 (s, 2H), 3,55-3,70 (m, 3H), 3,32 (s, 3H), 2,77-2,85 (m, 2H), 2,32 (q, 4H, J = 8,0 Hz), 1,93 (m, 4H), 1,70-1,78 (m, 2H), 1,59 (m, 4H), 1,19-1,34 (bs, 56H), 0,87 (t, 6H, J = 6,8 Hz).
2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(1-metilpiperidin-1-ijum-1-il)etil) fosfat Jedinjenje 161
[0715]
[0716] Rastvor 1-(2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-ejanoetoksi)fosforil)oksi)etil)-1-metilpiperidin-1-ijum hlorida (470 mg, 0,53 mmol) i diizopropiletilamina (0,65 ml, 3,72 mmol) u 15 ml MeCN je zagrevan na 60 °C tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena pomoću ISCO (zlato 24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 60%) kako bi se dobio željeni proizvod, 2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(1-metilpiperidin-1-ijum-1-il)etil) fosfat kao bela čvrsta supstanca (269 mg, 61%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,18-5,24 (m, 1H), 4,40 (dd, 1H, J = 12,1 Hz, 3,0 Hz), 4,34 (m, 2H), 4,12 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 7,1 Hz), 3,99 (t, 2H, J = 5,7 Hz), 3,82 (m, 2H), 3,62-3,71 (m, 2H),
1
3,46-3,55 (m, 2H), 3,34 (s, 3H), 2,27 (q, 4H, J = 7,4 Hz), 1,84-1,96 (m, 4H), 1,68-1,76 (m, 2H), 1,52-1,63 (m, 4H), 1,24 (bs, 56H), 0,87 (t, 6H, J = 6,6 Hz).
Jedinjenje 162: 2,3-bis(stearoiloksi)propil (3-(trimetilamonio)propil) fosfat
3-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-trimetilpropan-1-aminijum hlorid
[0717]
[0718] Rastvoru 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearata (700 mg, 0,848 mmol) i 3-hidroksi-N,N,N-trimetilpropan-1-aminijum tozilata (245 mg, 0,848 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor tetrazola u MeCN (0,45 M, 1,9 ml, 0,848 mmol), i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Pošto je potvrđen nestanak 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearata, dodat je<t>BuOOH (0,68 ml, 3,39 mmol) i smeša je mešana tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% natrijum bisulfatom i slanim rastvorom, i zatim osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, ostatak u vidu žute pene je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 10%) kako bi obezbedio 3-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-trimetilpropan-1-aminijum hlorid kao belu penu (502 mg, 68%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,25 (m, 1H), 4,15-4,35 (m, 7H), 3,78 (m, 2H), 3,31 (s, 9H), 2,83 (m, 2H), 2,27-2,35 (m, 10H), 1,98 (m, 3H), 1,59 (m, 4H), 1,24 (s, 50H), 0,87 (t, 6H, J = 6,0 Hz).
2,3-bis(stearoiloksi)propil (3-(trimetilamonio)propil) fosfat Jedinjenje 162
11
[0720] Rastvor 3-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-trimetilpropan-1-aminijum hlorida (502 mg, 0,58 mmol) i diizopropiletilamina (0,71 ml, 4,1 mmol) u 15 ml MeCN je zagrevan na 60 °C tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena pomoću ISCO (zlato 24 g SiO2: MeOR/dihlorometan 0 do 60%) kako bi se dobio željeni proizvod, 2,3-bis(stearoiloksi)propil (3-(trimetilamonio)propil) fosfat kao bela čvrsta supstanca (385 mg, 82%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,02 (m, 1H), 4,40 (dd, 1H, J = 3,0 Hz, 11,8 Hz), 4,13 (dd, 1H, J = 7,2 Hz, 11,8 Hz), 3,91-4,00 (m, 4H), 3,77-3,83 (m, 2H), 3,28 (s, 9H), 2,07-2,32 (m, 10H), 1,24 (s, 56H), 0,87 (t, 6H, J= 6,0 Hz).
Jedinjenje 163: 2,3-bis(stearoiloksi)propil (3-(trimetilamonio)butil) fosfat
4-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-trimetilbutan-1-aminijum hlorid
[0721]
[0722] Rastvoru 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearata (700 mg, 0,848 mmol) i 3-hidroksi-N,N,N-trimetilbutan-1-aminijum 4-metilbenzensulfonata (257
12
mg, 0,848 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor tetrazola u MeCN (0,45 M, 1,9 ml, 0,848 mmol), i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Pošto je potvrđen nestanak 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearata, dodat je 'BuOOH (0,68 ml, 3,39 mmol) i smeša je mešana tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% natrijum bisulfatom i slanim rastvorom, i zatim osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, ostatak u vidu žute pene je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 10%) kako bi obezbedio 3-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-trimetilbutan-1-aminijum hlorid kao belu čvrstu supstancu (648 mg, 87%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,19-5,27 (m, 1H), 4,11-4,34 (m, 8H), 3,60-3,68 (m, 2H), 3,32 (s, 9H), 2,77-2,85 (m, 2H), 2,31 (q, 4H, J = 6,8 Hz), 1,90-2,00 (m, 2H), 1,78-1,86 (m, 2H), 1,54-1,64 (m, 4H), 1, 19-1,35 (m, 56H), 0,86 (t, 6H, J= 6,8 Hz).
2,3-bis(stearoiloksi)propil (3-(trimetilamonio)butil) fosfat Jedinjenje 163
[0723]
[0724] Rastvor 3-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-trimetilbutan-1-aminijum hlorida (648 mg, 0,74 mmol) i diizopropiletilamina (0,91 ml, 5,2 mmol) u 20 ml MeCN je zagrevan na 60 °C tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena pomoću ISCO (zlato 24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 60%) kako bi se dobio željeni proizvod, 2,3-bis(stearoiloksi)propil (3-(trimetilamonio)butil) fosfat kao bela čvrsta supstanca (330 mg, 54%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,18-5,24 (m, 1H), 4,40 (dd, 1H, J= 12,0 Hz, 3,0 Hz), 4,15 (dd, 1H, J= 11,9 Hz, 6,8 Hz), 3,90-3,98 (m, 4H), 3,94-3,98 (m, 2H), 3,28 (s, 9H), 1,94-2,32 (m, 6H), 1,68-1,73 (m, 2H), 1,52-1,62 (m, 4H), 1,24 (bs, 56H), 0,87 (t, 6H, J= 6,6 Hz).
Jedinjenje 164: 2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(kvinuklidin-1-ijum-1-il)etil) fosfat
1
1-(2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)etil)kvinuklidin-1-ijum hlorid
[0725]
[0726] Rastvoru 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearata (700 mg, 0,848 mmol) i 1-(2-hidroksietil)kvinuklidin-1-ijum bromida (200 mg, 0,848 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor tetrazola u MeCN (0,45 M, 1,9 ml, 0,848 mmol), i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Pošto je potvrđen nestanak 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearata, dodat je<t>BuOOH (0,68 ml, 3,39 mmol) i smeša je mešana tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% natrijum bisulfatom i slanim rastvorom, i zatim osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, ostatak u vidu žute pene je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 10%) kako bi obezbedio 1-(2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)etil)kvinuklidin-1-ijum hlorid kao belu čvrstu supstancu (572 mg, 75%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,26 (m, 1H), 4,62 (m, 2H), 4,16-4,42 (m, 6H), 3,85 (m, 2H), 3,63-3,73 (m, 6H), 2,84-2,92 (m, 2H), 2,32 (q, 4H, J= 8,0 Hz), 2,20 (m, 1H), 2,04 (m, 6H), 1,52-1,84 (m, 10H), 1,18-1,33 (m, 50H), 0,87 (t, 6H, J= 6,8 Hz).
2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(kvinuklidin-1-ijum-1-il)etil) fosfat Jedinjenje 164
[0727]
14
[0728] Rastvor 1-(2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)etil)kvinuklidin-1-ijum hlorida (572 mg, 0,64 mmol) i diizopropiletilamina (0,78 ml, 4,47 mmol) u 15 ml MeCN je zagrevan na 60 °C tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena pomoću ISCO (zlato 24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 60%) kako bi obezbedila željeni proizvod, 2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(kvinuklidin-1-ijum-1-il)etil) fosfat kao belu čvrstu supstancu (387 mg, 72%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,17-5,23 (m, 1H), 4,40 (dd, 1H, J= 11,9 Hz, 2,6 Hz), 4,32 (m, 2H), 4,12 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 7,1 Hz), 3,99 (t, 2H, J = 6,4 Hz), 3,64-3,73 (m, 9H), 2,52 (m, 4H), 2,28 (q, 4H, J= 7,7 Hz), 2,14-2,21 (m, 1H), 2,01 (m, 3H), 1,52-1,60 (m, 4H), 1,36-1,46 (m, 4H), 1,19-1,32 (bs, 50H), 0,87 (t, 6H, J = 6,6 Hz).
Jedinjenje 165: 2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(tripropilamonio)etil) fosfat
N-(2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)etil)-N,N-dipropilpropan-1-aminijum hlorid
[0729]
1
[0730] Rastvoru 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearata (700 mg, 0,848 mmol) i N-(2-hidroksietil)-N,N-dipropilpropan-1-aminijum bromida (227 mg, 0,848 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor tetrazola u MeCN (0,45 M, 1,9 ml, 0,848 mmol), i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Pošto je potvrđen nestanak 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearata, dodat je<t>BuOOH (0,68 ml, 3,39 mmol) i smeša je mešana tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% natrijum bisulfatom i slanim rastvorom, i zatim osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, ostatak u vidu žute pene je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 10%) kako bi obezbedio N-(2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)etil)-N,N-dipropilpropan-1-aminijum hlorid kao žućkastu penu (535 mg, 68%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,82 (bs, 1H), 5,18-5,27 (m, 1H), 4,64 (m, 1H), 4,12-4,42 (m, 4H), 3,98 (m, 1H), 3,27-3,34 (m, 4H), 2,84-2,91 (m, 1H), 2,27-2,35 (m, 3H), 1,69-1,82 (m, 4H), 1,52-1,64 (m, 5H), 1,39 (d, 12H, J = 6,3 Hz), 1,19-1,33 (bs, 56H), 0,99-1,06 (m, 5H), 0,87 (t, 6H, J = 6,8 Hz).
2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(tripropilamonio)etil) fosfat Jedinjenje
[0731]
[0732] Rastvor 2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)-N,N,N-tripropiletanaminijum hlorida (535 mg, 0,57 mmol) i diizopropiletilamina (0,70 ml, 4,03 mmol) u 20 ml MeCN je zagrevan na 60 °C tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena pomoću ISCO (zlato 24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 60%) kako bi obezbedila željeni proizvod, 2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(tripropilamonio)etil) fosfat kao belu čvrstu supstancu (472 mg, 94%).
1
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,16-5,23 (m, 1H), 4,41 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 3,3 Hz), 4,26 (m, 2H), 4,13 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 7,1 Hz), 4,02 (t, 2H, J= 6,3 Hz), 3,60 (m, 2H), 3,228-3,37 (m, 6H), 2,22-2,31 (m, 4H), 1,33-1,96 (m, 15H), 1,24 (bs, 51H), 1,04 (t, 9H, J= 7,1 Hz), 0,87 (t, 6H, J= 6,6 Hz).
Jedinjenje 166: 2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(4-metilmorfolino-4-ijum)etil) fosfat
4-(2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)etil)-4-metilmorfolin-4-ijum hlorid
[0733]
[0734] Rastvoru 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearata (700 mg, 0,848 mmol) i 3-hidroksi-4-metilmorfolin-4-ijum 4-metilbenzensulfonata (269 mg, 0,848 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor tetrazola u MeCN (0,45 M, 1,9 ml, 0,848 mmol), i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Pošto je potvrđen nestanak 3-(((2-cijanoetoksi)(diizopropilamino)fosfanil)oksi)propan-1,2-diil distearata, dodat je 'BuOOH (0,68 ml, 3,39 mmol) i smeša je mešana tokom 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom, isprana sa 10% natrijum bisulfatom i slanim rastvorom, i zatim osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja pod vakuumom, ostatak u vidu žute pene je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 10%) kako bi obezbedio 4-(2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)etil)-4-metilmorfolin-4-ijum hlorid kao žućkastu penu (456 mg, 60%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,26 (m, 1H), 4,72 (m, 2H), 4,12-4,40 (m, 8H), 3,96-4,08 (m, 4H), 3,72 (m, 4H), 3,52 (s, 3H), 2,84 (m, 2H), 2,32 (q, 6H, J= 7,9 Hz), 1,59 (m, 4H), 1,14-1,31 (m, 54H), 0,87 (t, 6H, J = 6,6 Hz).
1
2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(4-metilmorfolino-4-ijum)etil) fosfat Jedinjenje 166
[0735]
[0736] Rastvor 4-(2-(((2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)(2-cijanoetoksi)fosforil)oksi)etil)-4-metilmorfolin-4-ijum hlorida (456 mg, 0,51 mmol) i diizopropiletilamina (0,63 ml, 4,03 mmol) u 15 ml MeCN je zagrevan na 60 °C tokom 16 h. Reakciona smeša je koncentrovana pod vakuumom i prečišćena pomoću ISCO (zlato 24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 60%) kako bi obezbedila željeni proizvod, 2,3-bis(stearoiloksi)propil (2-(4-metilmorfolino-4-ijum)etil) fosfat kao belu čvrstu supstancu (360 mg, 84%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,21 (m, 1H), 4,36-4,42 (m, 3H), 4,10 (dd, 1H, J = 12,1 Hz, 7,4 Hz), 3,93-4,06 (m, 8H), 3,66-3,72 (m, 4H), 3,52 (s, 3H), 2,27 (q, 4H, J= 7,1 Hz), 1,92-2,06 (m, 2H), 1,52-1,62 (m, 4H), 1,24 (m, 54H), 0,87 (t, 6H, J = 6,6 Hz).
N-((2-aminoetil)sulfonil)oleamid trifluoroacetat
[0737] terc-butil (2-sulfamoiletil)karbamat (Ref: WO2007/041634)
[0738] Smeša 2-aminoetan-1-sulfonamida (3,37 g, 21 mmol), di-terc-butil dikarbonata (6,87 g, 31,5 mmol), trietilamina (11,7 ml, 84 mmol) i N,N-dimetilpiridin-4-amina (260 mg, 2,1 mmol) u 120 ml dihlorometana je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa dihlorometanom. Kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom
1
i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja, ostatak je prečišćen pomoću ISCO (80 g SiO2: EtOAc/heksani 0 do 100%) kako bi obezbedio terc-butil (2-sulfamoiletil)karbamat kao belu čvrstu supstancu (1,40 g, 30%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,08 (bs, 1H), 4,87 (bs, 1H), 3,67 (q, 2H, J= 6,0 Hz), 3,28 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 1,44 (s, 9H).
[0739] terc-butil (2-(N-oleoilsulfamoil)etil)karbamat (Ref: WO2008/087190)
[0740] Smeša terc-butil (2-sulfamoiletil)karbamata (1,40 g, 6,24 mmol), oleinske kiseline (2,0 ml, 6,24 mmol), 1,1'-karbonildiimidazola (1,01 g, 6,24 mmol) i 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undek-7-ena (2,0 ml, 13,7 mmol) u 60 ml N,N-dimetilformamida je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. TLC je pokazala formiranje proizvoda. Reakciona smeša je zakišeljena sa 4N rastvorom HCl do pH = 2, i zatim ekstrahovana sa etrom. Posle sušenja preko natrijum sulfata, rastvor je filtriran i koncentrovan. Ostatak je prečišćen pomoću ISCO (80 g SiO2: EtOAc/heksani, 0 do 10%) kako bi obezbedio terc-butil (2-(N-oleoilsulfamoil)etil)karbamat (2,34 g, 76%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,29-5,34 (m, 2H), 5,07 (bs, 1H), 3,60 (bs, 4H), 2,33 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 1,97-2,03 (m, 4H), 1,62-1,68 (m, 3H), 1,43 (s, 9H), 1,23-1,30 (m, 20 H), 0,87 (t, 3H, J= 5,8 Hz).
N-((2-aminoetil)sulfonil)oleamid trifluoroacetat
[0741]
[0742] Rastvoru terc-butil (2-(N-oleoilsulfamoil)etil)karbamata (378 mmol, 0,77 mmol) u 10 ml dihlorometana, polako je dodata trifluorosirćetna kiselina (2 ml), i mešano je na sobnoj temperaturi
1
tokom 4 h. TLC je pokazala nestanak terc-butil (2-(N-oleoilsulfamoil)etil)karbamata. Reakciona smeša je koncentrovana do suvog i triturisana je sa heksanima kako bi obezbedila N-((2-aminoetil)sulfonil)oleamid trifluoroacetat kao belu čvrstu supstancu (344 mg, 88%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,85 (bs, 2H), 5,28-5,36 (m, 2H), 3,84 (bs, 2H), 3,48 (bs, 2H), 2,30-2,40 (m, 2H), 1,94-2,04 (m, 4H), 1,18-1,36 (m, 20H), 0,87 (t, 6H, J= 6,8 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 389,3, 371,3.
N-((2-(dimetilamino)etil)sulfonil)oleamid
[0743]
[0744] (Ref: WO2008/087190) Rastvoru 2-(dimetilamino)etan-1-sulfonamida (500 mg, 3,28 mmol), trietilamina (0,92 ml, 6,57 mmol) i N,N-dimetilpiridin-4-amina (40 mg, 0,33 mmol) u 30 ml dihlorometana, kap po kap je dodat oleoil hlorid (1,3 ml, 3,94 mmol) i reakciona smeša je zagrejana do sobne temperature. MS je pokazala završenu reakciju. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa dihlorometanom. Kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja, ostatak je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 10%) kako bi obezbedio N-((2-(dimetilamino)etil)sulfonil)oleamid kao belu čvrstu supstancu (437 mg, 32%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,28-5,34 (m, 2H), 3,44 (t, 2H, J = 6,3 Hz), 3,03 (t, 2H, J = 6,3 Hz), 2,48 (s, 6H), 2,32 (t, 2H, J = 7,6 Hz), 1,95-2,02 (m, 4H), 1,56-1,64 (m, 2H), 1,20-1,38 (m, 20H), 0,87 (t, 3H, J= 6,6 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 417,3.
N,N,N-trimetil-2-(N-oleoilsulfamoil)etan-1-aminijum jodid
2
[0746] Rastvor N-((2-(dimetilamino)etil)sulfonil)oleamida (172 mg, 0,41 mmol) i jodometana (3 ml) u 15 ml dimetoksietana je mešan na sobnoj temperaturi tokom 16 h. TLC je pokazala završenu reakciju. Posle koncentrovanja, sirovi proizvod je prečišćen pomoću Zlato ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 20%) kako bi se dobio N,N,N-trimetil-2-(N oleoilsulfamoil)etan-1-aminijum jodid kao svetložuta pena (217 mg, 94%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,28-5,38 (m, 2H), 4,24 (bs, 4H), 3,45 (s, 9H), 2,54-2,64 (m, 2H), 1,94-2,06 (m, 4H), 1,56-1,68 (m, 2H), 1,20-1,38 (m, 20H), 0,87 (t, 3H, J = 6,6 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 417,3, 391,3.
N-((3-(dimetilamino)propil)sulfonil)oleamid
3-hloro-N,N-bis(4-metoksibenzil)propan-1-sulfonamid
[0747]
[0748] Na 0 °C, rastvoru 3-hloropropan-1-sulfonil hlorida (2,68 ml, 22 mmol) i trietilamina (7,8 ml, 56 mmol) u 80 ml dihlorometana, polako je dodat rastvor bis(4-metoksibenzil)amina (5,15 g, 20 mmol) u 20 ml dihlorometana, i zatim je reakcija zagrejana do sobne temperature tokom 16 h. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa dihlorometanom. Kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Rastvor je filtriran kroz jastuče
21
silika gela i eluiran sa 30% EtOAc u heksanima. Posle koncentrovanja, sirovi proizvod je prečišćen sa ISCO (120 g SiO2: EtOAc/heksani 0 do 30%) kako bi obezbedio 3-hloro-N,N-bis(4-metoksibenzil)propan-1-sulfonamid kao braon ulje (4,95, 62%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,20-7,25 (m, 4H), 6,85-6,90 (m, 4H), 4,27 (s, 4H), 3,81 (s, 6H), 3,60 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 2,99 (t, 2H, J = 7,1 Hz), 2,19-2,28 (m, 2H).
3-(dimetilamino)-N,N-bis(4-metoksibenzil)propan-1-sulfonamid
[0749]
[0750] U zapečaćenoj tubi smeša 3-hloro-N,N-bis(4-metoksibenzil)propan-1-sulfonamida (4,95 g, 12,4 mmol) u rastvoru dimetilamina u THF (2,0 M, 30 ml, 60 mmol) je zagrevana na 70 °C tokom 16 h. MS je pokazala proizvod. Posle hlađenja do sobne temperature, reakciona smeša je filtrirana i isprana dihlorometanom. Filtrat je koncentrovan i sirovi proizvod je prečišćen sa ISCO (120 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 7%) kako bi obezbedio 3-(dimetilamino)-N,N-bis(4-metoksibenzil)propan-1-sulfonamid kao braon ulje (4.04.80%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,15-7,25 (m, 4H), 6,82-6,89 (m, 4H), 4,25 (s, 4H), 3,80 (s, 6H), 2,85-2,95 (m, 2H), 2,28 (t, 2H, J= 6,6 Hz), 2,17 (s, 6H), 1,87-1,96 (m, 2H).
[0751] 3-(dimetilamino)propan-1-sulfonamid (Ref: WO2015/112441)
[0752] Rastvoru 3-(dimetilamino)-N,N-bis(4-metoksibenzil)propan-1-sulfonamida (1,22 g, 3,0 mmol) i anizola (3,3 ml) u 15 ml dihlorometana, kap po kap je dodato 22 ml trifluorosirćetne kiseline, i zatim je mešan na sobnoj temperaturi tokom 16 h. MS je pokazala proizvod. Reakciona smeša je koncentrovana do suvog kako bi dala 3-(dimetilamino)propan-1-sulfonamid kao
22
polučvrstu supstancu (1,00 g, kvant.), koja je upotrebljena za sledeći korak bez dodatnog prečišćavanja.
<1>H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 3,28-3,34 (m, 2H), 3,18 (t, 2H, J = 6,6 Hz), 2,90 (s, 6H), 2,17-2,29 (m, 2H).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 167,1.
N-((3-(dimetilamino)propil)sulfonil)oleamid
[0753]
[0754] Rastvoru 3-(dimetilamino)propan-1-sulfonamida (1,00 g, 3,0 mmol), trietilamina (1,26 ml, 9,0 mmol) i N,N-dimetilpiridin-4-amina (37 mg, 0,3 mmol) u 60 ml dihlorometana, kap po kap je dodat rastvor oleoil hlorida (1,2 ml, 3,6 mmol), i zatim je mešano na sobnoj temperaturi tokom 16 h. MS je pokazala proizvod. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa dihlorometanom. Kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja, ostatak je prečišćen pomoću ISCO (40 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 10%) kako bi obezbedio N-((3-(dimetilamino)propil)sulfonil)oleamid kao belu čvrstu supstancu (255 mg, 20%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,31-5,36 (m, 2H), 3,37 (t, 2H, J = 7,1 Hz), 2,99 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 2,82 (bs, 1H), 2,68 (s, 6H), 2,37 (t, 2H, J = 7,6 Hz), 2,21-2,29 (m, 2H), 1,96-2,02 (m, 4H), 1,57-1,66 (m, 2H), 1,20-1,36 (m, 20H), 0,87 (t, 3H, J = 6,6 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 431,3.
N,N,N-trimetil-3-(N-oleoilsulfamoil)propan-1-aminijum jodid
2
[0756] Rastvoru N-((3-(dimetilamino)propil)sulfonil)oleamida (389 mg, 0,90 mmol) u 20 ml dimetoksietana, dodat je jodometan (5 ml) i reakciona smeša je mešana na sobnoj tokom 16 h. Bilo više jodometana ili duže vreme nisu poboljšali prinos. Reakciona smeša je koncentrovana i prečišćena sa zlato ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 30%) kako bi obezbedila N,N,N-trimetil-3-(N-oleoilsulfamoil)propan-1-aminijum jodid kao žutu penu (237 mg, 46%).
<1>H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 5,32-5,36 (m, 2H), 3,48-3,57 (m, 4H), 3,17 (s, 9H), 2,28-2,37 (m, 4H), 1,99-2,06 (m, 4H), 1,57-1,66 (m, 2H), 1,24-1,37 (m, 20H), 0,87 (t, 3H, J = 6,6 Hz).
2-oktadecilikozanoična kiselina
[0757] Dietil 2,2-dioktadecilmalonat (Ref: WO2014/195432)
[0758] Na 0 °C, NaH (1,20 g, 30 mmol) je dodat u rastvor dietil malonata (1,52 ml, 10 mmol) u 60 ml N,N-dimetilformamida. Posle mešanja tokom 30 min, polako je dodat rastvor 1-bromooktadekana (8,33 g, 25 mmol) u 60 ml THF, i reakciona smeša je zagrejana do sobne temperature i zatim zagrevana na 50 °C tokom 6 h. Pošto je reakcija ohlađena do sobne temperature, dodati su MeOH, sirćetna kiselina i ledeno hladna voda (5 ml svaki) kako bi se reakcija ugasila. Posle ekstrakcije sa dihlorometanom, kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom (teško za odvajanje). Posle sušenja preko natrijum sulfata, rastvor je filtriran i koncentrovan, i sirovi proizvod je prečišćen sa ISCO (220 SiO2: etar/heksani 0 do 5%) kako bi obezbedio dietil 2,2-dioktadecilmalonat kao belu čvrstu supstancu (5,96 g, 85%).
24
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 4,16 (q, 4H, J = 7,1 Hz), 1,81-1,87 (m, 4H), 1,06-1,33 (m, 70H), 0,87 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
2,2-dioktadecilmalonska kiselina
[0759]
[0760] Rastvoru dietil 2,2-dioktadecilmalonata (3,39 g, 5,1 mmol) u 60 ml<i>PrOH, dodat je rastvor kalijum hidroksida (11,0 g) u 60 ml vode, i smeša je zagrevana do refluksa tokom 48 h. TLC je pokazala nestanak početnog materijala sa malom količinom mono-estra. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i razblažena vodom. Dodata je 47% sumporna kiselina kako bi se podesila pH = 2, i uočen je talog. Suspenzija je filtrirana i isprana vodom i dihlorometanom. Čvrsta supstanca je rastvorena u etru i osušena preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja, 2,2-dioktadecilmalonska kiselina je dobijena kao bela čvrsta supstanca (2,13 g, 68%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 1,89-1,94 (m, 4H), 1,09-1,32 (m, 66H), 0,88 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
[0761] Smeša 2,2-dioktadecilmalonske kiseline (2,13 g, 3,5 mmol) u 60 ml n-dekana je zagrevana do refluksa tokom 16 h. Posle uklanjanja isparljivih materija pod vakuumom, sirovi proizvod je istaložen u hloroformu kako bi dao 2-oktadecilikozanoičnu kiselinu kao belu čvrstu supstancu (1,76 g, 89%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 2,28-2,36 (m, 1H), 1,40-1,56 (m, 4H), 1,08-1,33 (m, 64H), 0,87 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
2
N-(metilsulfonil)-2-oktadecilikozanamid
[0762]
[0763] Na 0 °C, oksalil hlorid (85 µl, 1 mmol) je polako dodat u suspenziju 2-oktadecilikozanoične kiseline (565 mg, 1 mmol) u 20 ml dihlorometana i praćeno sa 5 kapi N,N-dimetilformamida, i zatim je reakciona smeša zagrevana do sobne temperature tokom 1 h dok se nije pretvorila u bistar rastvor. Dodati su trietilamin (0,56 ml, 4 mmol), metansulfonamid (95 mg, 1 mmol) i N,N-dimetilpiridin-4-amin (12 mg, 0,1 mmol), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 h. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa dihlorometanom. Kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja, sirovi proizvod je istaložen u dihlorometanu kako bi obezbedio N-(metilsulfonil)-2-oktadecilikozanamid kao belu čvrstu supstancu (502 mg, 78%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3,30 (s, 3H), 2,10-2,16 (m, 1H), 1,40-1,62 (m, 4H), 1,24 (m, 64H), 0,87 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
N-(metilsulfonil)stearamid
[0764]
(Ref: WO2008/087190). Rastvoru metansulfonamida (380 mg, 4,0 mmol), trietilamina (1,1 ml, 8,0 mmol) i N,N-dimetilpiridin-4-amina (49 mg, 0,4 mmol) u 30 ml dihlorometana, kap po kap je dodat rastvor stearoil hlorida (1,21 g, 4 mmol), i zatim je mešano na sobnoj temperaturi tokom 16
2
h. MS je pokazala proizvod. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa dihlorometanom. Kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja, sirovi proizvod je istaložen u dihlorometanu kako bi obezbedio N-(metilsulfonil)stearamid kao belu čvrstu supstancu (580 mg, 40%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 3,30 (s, 3H), 2,32 (t, 2H, J = 7,4Hz), 1,60-1,69 (m, 2H), 1,24 (m, 28II), 0,87 (t, 3II, J - 6,8 Hz).
(Z)-2-((Z)-oktadek-9-en-1-il)ikos-11-enojska kiselina
(Z)-1-bromooktadek-9-en
[0765]
Smeša (Z)-oktadek-9-en-1-il metansulfonata (3,40 g, 9,81 mmol) i LiBr (4,00 g, 45 mmol) u 40 ml acetona je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h, i zatim zagrevana do refluksa tokom 4 h. TLC je pokazala završenu reakciju. Posle filtriranja, filtrat je razblažen vodom i dihlorometanom. Organski sloj je odvojen i ispran slanim rastvorom. Posle sušenja preko natrijum sulfata i filtriranja, filtrat je koncentrovan kako bi dao (Z)-1-bromooktadek-9-en (3,74 g, kvant.).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,32-5,36 (m, 2H), 3,40 (t, 2H, J= 6,8 Hz), 1,97-2,02 (m, 4H), 1,82-1,88 (m, 2H), 1,10-1,44 (m, 22H), 0,87 (t, 3H, J = 7,1 Hz).
Dietil 2,2-di((Z)-oktadek-9-en-1-il)malonat
[0766]
2
[0767] Rastvoru dietil malonata (0,6 ml, 3,92 mmol) u 40 ml N,N-dimetilformamida, dodat je NaH (470 mg, 11,76 mmol) na 0 °C. Posle 45 min, polako je dodat rastvor (Z)-1-bromooktadek-9-ena (3,74 g, 9,8 mmol), i zatim je zagrevano do sobne temperature tokom 16 h. TLC je pokazala željeni proizvod sa mono-supstituisanim proizvodom. Reakcija je ugašena sa MeOH/AcOH/voda (5 ml svaki), i zatim je ekstrahovana sa dihlorometanom. Kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentovanja, sirovi proizvod je prečišćen pomoću ISCO (80 g SiO2: etar/heksani 0 do 100%) kako bi obezbedio dietil 2,2-di((Z)-oktadek-9-en-1-il)malonat (1,68 g, 64%) i dietil (Z)-2-(oktadek-9-en-1-il)malonat (0,91 g).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,28-5,35 (m, 4H), 4,16 (q, 4H, J = 7,1 Hz), 1,94-2,04 (m, 8H), 1,80-1,87 (m, 4H), 1,06-1,36 (m, 54H), 0,87 (t, 6H, J= 7,1 Hz).
2,2-di((Z)-oktadek-9-en-1-il)malonska kiselina
[0768]
[0769] Rastvoru dietil 2,2-di((Z)-oktadek-9-en-1-il)malonata (1,68 g, 2,54 mmol) u 40 ml<i>PrOH, dodat je rastvor kalijum hidroksida (6 g) u 40 ml vode i smeša je zagrevana do refluksa tokom 48 h. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i razblažena vodom, zakišeljena sa 47% sumpornom kiselinom do pH = 2, nije formirana čvrsta supstanca. Smeša je ekstrahovana sa etrom, i kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle
2
filtriranja i koncentrovanja, ostatak je prečišćen sa ISCO (40 g SiO2: EtOAc/heksani 0 do 35%) kako bi obezbedio 2,2-di((Z)-oktadek-9-en-1-il)malonsku kiselinu kao bezbojno ulje (1,36 g, 88%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,30-5,34 (m, 4H), 1,88-2,02 (m, 12H), 1,13-1,32 (m, 48H), 0,87 (t, 6H, J= 7,1 Hz).
(Z)-2-((Z)-oktadek-9-en-1-il)ikos-11-enojska kiselina
[0770]
[0771] Rastvor 2,2-di((Z)-oktadek-9-en-1-il)malonske kiseline (1,36 g, 2,24 mmol) u 40 ml ndekana je zagrevan do refluksa tokom 16 h. TLC je pokazala završenu reakciju. Posle koncentrovanja, sirovi proizvod je prečišćen pomoću ISCO (40 g SiO2:EtOAc/heksani 0 do 20%) kako bi dao (Z)-2-((Z)-oktadek-9-en-1-il)ikos-11-enojsku kiselinu kao bezbojno ulje (0,96 g, 76%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,30-5,34 (m, 4H), 2,28-2,36 (m, 1H), 1,97-2,02 (m, 8H), 1,40-1,65 (m, 4H), 1,26 (m, 48H), 0,87 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 561,6.
(Z)-N-(metilsulfonil)-2-((Z)-oktadek-9-en-1-il)ikos-11-enamid
[0772]
2
[0773] Na 0 °C, oksalil hlorid (70 µl, 0,82 mmol) je kap po kap dodat u rastvor (Z)-2-((Z)-oktadek-9-en-1-il)ikos-11-enojske kiseline 462 mg, 0,82 mmol) u 20 ml dihlorometana i praćeno sa 5 kapi N,N-dimetilformamida, i zatim je zagrevano do sobne temperature tokom 1,5 h. Dodati su metansulfonamid (78 mg, 0,82 mmol), trietilamin (0,46 ml, 3,29 mmol) i N,N-dimetilpiridin-4-amin (20 mg, 0,16 mmol) i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. TLC je pokazala završenu reakciju. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa dihlorometanom, i kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja, sirovi proizvod je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: EtOAc/heksani 0 do 60%) kako bi obezbedio (Z)-N-(metilsulfonil)-2-((Z)-oktadek-9-en-1-il)ikos-11-enamid kao belu penu.
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,30-5,34 (m, 4H), 3,30 (s, 3H), 2,08-2,15 (m, 1H), 1,97-2,02 (m, 8H), 1,40-1,62 (m, 4H), 1,26 (m, 48H), 0,87 (t, 6H, J= 6,6 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 638,5.
Litijum ditetradecilglicinat
Metil ditetradecilglicinat
[0774]
[0775] Rastvoru hidrohlorid glicin metil estra (564 mg, 4,49 mmol) i trietilamina (0,93 ml, 6,74 mmol) u DCE (11 ml) je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi. Posle 15 minuta, dodat je tetradekanal (2,1 g, 9,89 mmol) u DCE (11 ml) i smeša je ohlađena na 0 °C pre dodavanja natrijum triacetoksiborohidrida (2,1 g, 9,89 mmol) i sirćetne kiseline (0,6 ml, 9,89 mmol). Reakciji je omogućeno da se vrati na sobnu temperaturu i mešana je tokom 16 sati. Reakcija je ugašena sporim dodavanjem zasićenog natrijum bikarbonata, i zatim ekstrahovana sa DCM. Kombinovani ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtrirani, i koncentrovani in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0-30% EtOAc/heksani) dalo je metil ditetradecilglicinat (1,93 g, 89%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,72 (s, 3H); 3,34 (s, 2H); 1,56 (t, 4H); 1,60-1,03 (br. m, 48H); 0,91 (t, 6H).
Litijum ditetradecilglicinat
[0776]
[0777] Rastvoru metil ditetradecilglicinata (1,93 g, 4,0 mmol) u THF (100 ml) dodat je 1M LiOH (90 ml, 90 mmol), i reakciji je omogućeno da se meša na 65 °C tokom 16 sati. Posle hlađenja do sobne temperature, reakcija je koncentrovana in vacuo do belog praha. Prah je suspendovan u vodi, filtriran, ispran vodom i dietil etrom, i osušen pod vakuumom kako bi se dobio litijum ditetradecilglicinat (1,81 g, 97%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,17 (s, 2H); 2,64 (t, 4H); 1,52 (br. m, 4H); 1,31 (br. m, 44H); 0,93 (t, 6H).
Jedinjenje: 9-(nonan-2-iloksi)-9-oksononanska kiselina
[0778]
1
[0779] Rastvor nonandioične kiseline (500 mg, 2,66 mmol), nonan-2-ola (556 µl, 3,19 mmol) i DMAP (65 mg, 0,53 mmol) u DCM (13 ml) tretiran je sa EDC HCl (509 mg, 2,66 mmol). Reakciji je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi pod azotom tokom 20 sati. Reakcija je ugašena sa H2O i ekstrahovana tri puta sa DCM. Organski slojevi su isprani zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3praćeno 10% limunskom kiselinom i slanim rastvorom. Organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-20% MeOH u DCM) kako bi se dobila 9-(nonan-2-iloksi)-9-oksononanska kiselina (350 mg, 1,11 mmol, 42%).
UPLC/ELSD: RT = 2,21 min. MS (ES): m/z (MH-) 313,0 za C18H34O4
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 6,27 (br. s, 1H); 4,87 (m, 1H); 2,27 (m, 4H); 1,60-1,39 (br. m, 6H); 1,31-1,25 (br. m, 16H); 1,17 (d, 3H); 0,86 (m, 3H).
9-(oktiloksi)-9-oksononanska kiselina
[0780]
[0781] Rastvor nonandioične kiseline (500 mg, 2,66 mmol), oktan-1-ola (418 µl, 3,19 mmol) i DMAP (65 mg, 0,53 mmol) u DCM (13 ml) tretiran je sa EDC•HCl (509 mg, 2,66 mmol). Reakciji je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi pod azotom tokom 20 sati. Reakcija je ugašena sa H2O i ekstrahovana tri puta sa DCM. Organski slojevi su isprani zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3praćeno 10% limunskom kiselinom i slanim rastvorom. Organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-20% MeOH u DCM) kako bi se dobila 9-(oktiloksi)-9-oksononanska kiselina (350 mg, 1,16 mmol, 44%).
UPLC/ELSD: RT = 2,05 min. MS (ES): m/z (MH-) 299,0 za C17H32O4
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,88 (br. s, 1H); 3,99 (t, 2H); 2,24 (m. 4H); 1,57-1,53 (br. m, 6H); 1,26-1,21 (br. m, 16H); 0,86 (m, 3H).
Jedinjenje : N-(metilsulfonil)oleamid
2
Oleoil hlorid
[0782]
[0783] Rastvoru oleinske kiseline (5 g, 17,70 mmol) u DCM (60 ml) na 0 °C dodat je oksalil hlorid (1,65 ml, 19,47 mmol) praćen DMF (13,8 μl, 0,177 mmol). Reakcionoj smeši je omogućeno da se zagreje do sobne temperature i mešana je tokom 20 sati na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je koncentrovana in vacuo i nastavljeno je bez daljeg prečišćavanja kako bi se dobio oleoil hlorid (5,5 g, 18,28 mmol, >99%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,37 (m, 2H); 2,90 (t, 2H); 2,04 (m, 4H); 1,73 (m, 2H); 1,34-1,29 (br. m, 20H); 0,91 (m, 3H).
N-(metilsulfonil)oleamid
[0784]
[0785] Rastvoru oleoil hlorida (500 mg, 1,66 mmol) u DCM (8,3 ml) dodati su DMAP (305 mg, 2,49 mmol) i metansulfonamid (237 mg, 2,49 mmol). Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi tokom 24 sata pod azotom. Reakciona smeša je ugašena sa 1N HCl i ekstrahovana sa EtOAc. Organski slojevi su isprani zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3praćeno slanim rastvorom. Organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani in vacuo. Filtrat je triturisan sa EtOAc i koncentrovan in vacuo kako bi se dobio N-(metilsulfonil)oleamid (75 mg, 0,209 mmol, 13%).
UPLC/ELSD: RT = 2,67 min. MS (ES): m/z (M+Na) 382,0 za C19H37NO3S
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,70 (br s, 1H); 5,37 (m, 2H); 3,33 (s, 3H); 2,35 (t, 2H); 2,04 (m, 4H); 1,69 (m, 2H); 1,34-1,29 (br. m, 20H); 0,90 (m, 3H).
N-(ciklopropilsulfonil)oleamid
[0786]
[0787] Smeša oleoil hlorida (500 mg, 1,66 mmol), DIPEA (868 µl, 4,99 mmol), ciklopropansulfonamida (242 mg, 1,99 mmol) i DMAP (102 mg, 0,83 mmol) rastvorena je u DCM (8,3 ml) i omogućeno je da se meša na sobnoj temperaturi tokom 24 sata pod azotom.
[0788] Reakciona smeša je ugašena sa 1N HCl i ekstrahovana sa EtOAc. Organski slojevi su isprani zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3praćeno slanim rastvorom. Organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-100% EtOAc u heksanima) kako bi se dobio N-(ciklopropilsulfonil)oleamid (315 mg, 0,82 mmol, 42%).
UPLC/ELSD: RT = 2,83 min. MS (ES): m/z (MH-) 384,0 za C21H39NO3S
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 8,66 (br. s, 1H); 5,35 (m, 2H); 2,98 (m, 1H); 2,34 (t.
2H); 2,02 (m, 4H); 1,66 (m, 2H); 1,37-1,28 (br. m, 22H); 1,13 (m, 2H); 0,89 (m, 3H).
9-(heptadekan-9-iloksi)-9-oksononanska kiselina
[0789]
[0790] Rastvor nonandioične kiseline (500 mg, 2,66 mmol), heptadekan-9-ola (681 mg, 2,66 mmol) i DMAP (65 mg, 0,53 mmol) u DCM (13 ml) tretiran je sa EDC•HCl (509 mg, 2,66 mmol).
4
Reakciji je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi pod azotom tokom 20 sati. Reakcija je ugašena sa H2O i ekstrahovana tri puta sa DCM. Organski slojevi su isprani zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3praćeno 10% limunskom kiselinom i slanim rastvorom. Organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-20% MeOH u DCM) kako bi se dobila 9-(heptadekan-9-iloksi)-9-oksononanska kiselina (350 mg, 1,05 mmol, 40%).
UPLC/ELSD: RT = 3,49 min. MS (ES): m/z (MH-) 425,0 za C26H50O4
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 11,02 (br. s, 1H); 4,89 (m, 1H); 2,33 (m, 4H); 1,66-1,64 (br. m, 4H); 1,53-1,51 (br. m, 4H); 1,35-1,28 (br. m, 30H); 0,90 (m, 6H).
Dioktadecilglicin
Metil dioktadecilglicinat
[0791]
[0792] Rastvoru metil glicinata (1 g, 11,22 mmol) i I-bromooktadekana (9,36 g, 28,06 mmol) u 1:1 CPME (10 ml):MeCN (10 ml) dodati su K2CO3(9,31 g, 67,35 mmol) i KI (4,66 g, 28,06 mmol). Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na 81 °C tokom 72 sata. Sirovoj reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature, filtrirana je i koncentrovana in vacuo. Ostatak je rastvoren u EtOAc i ispran vodom. Vodeni sloj je ekstrahovan tri puta sa EtOAc. Organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-40% (smeša 1% NH4OH, 20% MeOH u dihlorometanu) u dihlorometanu) kako bi se dobio metil dioktadecilglicinat (1,80 g, 3,03 mmol, 27%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,72 (s, 3H); 3,35 (s, 2H); 2,57 (m, 4H); 1,48-1,44 (br. m, 4H); 1,30-1,26 (br. m, 60H); 0,90 (m, 6H).
Dioktadecilglicin
[0794] Rastvoren je metil dioktadecilglicinat (1,8 g, 3,03 mmol) u EtOH (7,6 ml) i dodato je 7,6 ml 2M NaOH u reakcionu smešu i reakciji je omogućeno da se meša na 80 °C tokom 2 sata. Reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i koncentrovana je in vacuo. Reakciona smeša je zakišeljena do pH 1 sa 10% HCl. Ostatak je ekstrahovan tri puta sa heksanima i koncentrovan in vacuo kako bi se dobio dioktadecilglicin (305 mg, 0,526 mmol, 17%). UPLC/ELSD: RT = 3,81 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 581,0.0 za C38H77NO2<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,95 (s, 2H); 3,28 (m, 4H); 1,81 (m, 4H); 1,34-1,28 (br. m, 60H); 0,90 (m, 6H).
3-(dioktadecilamino)propanska kiselina
Metil 3-(dioktadecilamino)propanoat
[0795]
[0796] Rastvoru metil 3-aminopropanoat hidrohlorida (1 g, 7,16 mmol) i 1-bromooktadekana (5,97 g, 17,91 mmol) u 1:1 CPME (10 ml):MeCN (10 ml) dodati su K2CO3(5,94 g, 42,99 mmol)i KI (2,97 g, 17,91 mmol). Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na 81 °C tokom 18 sati. Sirovoj reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature, filtrirana je i koncentrovana in vacuo. Ostatak je rastvoren u EtOAc i ispran vodom. Vodeni sloj je ekstrahovan tri puta sa EtOAc. Organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-20% (smeša 1% NH4OH, 20% MeOH u dihlorometanu) u dihlorometanu) kako bi se dobio metil 3-(dioktadecilamino)propanoat (5,01 g, 8,24 mmol, >99%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,69 (s, 3H); 2,80 (t, 2H); 2,49-2,38 (br. m, 6H); 1,46-1,41 (br. m, 4H); 1,32-1,28 (br. m, 60H); 0,90 (m, 6H).
3-(dioktadecilamino)propanska kiselina
[0797]
[0798] Rastvoren je metil 3-(dioktadecilamino)propanoat (5,01 g, 8,24 mmol) u EtOH (20,6 ml) i reakcionoj smeši je dodato 20,6 ml 2M NaOH i reakciji je omogućeno da se meša na 80 °C tokom 2 sata. Reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i koncentrovana je in vacuo. Reakciona smeša je zakišeljena do pH 1 sa 10% HCl. Ostatak je ekstrahovan tri puta sa heksanima i koncentrovan je in vacuo kako bi se dobila 3-(dioktadecilamino)propanska kiselina (305 mg, 0,513 mmol, 6%).
UPLC/ELSD: RT = 3,75 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 595,0 za C39H79NO2
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 11,48 (br s, 1H); 3,34 (m, 2H); 3,07 (m, 6H); 1,80 (m, 4H); 1,35-1,28 (br. m, 60H); 0,90 (m, 6H).
3-(bis(8-(2-oktilciklopropil)oktil)amino)propanska kiselina
8-(2-oktilciklopropil)oktan-1-ol
[0799]
Rastvoru dietil cinka (20 ml, 20 mmol, 1M u heksanima) u dihlorometanu (20 ml), reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi na -40 °C tokom 5 min. Rastvor dijodometana (3,22 ml, 40 mmol) u dihlorometanu (10 ml) je dodat kap po kap. Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša tokom 1 sata na -40 °C i dodat je rastvor trihlorosirćetne kiseline (0,327 mg, 2 mmol) i DME (1 ml, 9,6 mmol) u dihlorometanu (10 ml). Reakcionoj smeši je omogućeno da se zagreje na -15 °C i omogućeno je da se meša na temperaturi od -15 °C tokom 1 sata. Dodat je rastvor (Z)-oktadek-9-en-1-ola (2,68, 10 mmol) u dihlorometanu (10 ml) na -15 °C. Reakcionoj smeši je omogućeno da se polako zagreje do sobne temperature i omogućeno je da se meša tokom 18 sati. Reakciona smeša je isprana zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (200 ml) i ekstrahovana je sa dihlorometanom tri puta. Organski slojevi su isprani slanim rastvorom, osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-20% etil acetat u heksanima). Rastvarači su koncentrovani in vacuo i ostatak je ponovo prečišćen pomoću hromatografije na C18 silika gelu (50-100% [MeCN sa 0,1% TFA)/ [voda sa 0,1% TFA]) kako bi se dobio 8-(2-oktilciklopropil)oktan-1-ol (1,6 g, 5,7 mmol, 57%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,67 (t, 2H); 1,60 (m, 2H); 1,50-1,06 (m, 27H); 0,90 (m, 3H); 0,63 (m, 3H); -0,31 (m, 1H).
1-(8-bromooktil)-2-oktilciklopropan
[0800]
[0801] Rastvoru PPh3(1,33 g, 5,1 mmol) i 8-(2-oktilciklopropil)oktan-1-ola (1,35 g, 4,7 mmol) u DCM (15 ml) na 0 °C dodat je NBS (0,986 g, 5,5 mmol) u jednom obroku. Reakciji je omogućeno da se meša na 0 °C tokom 1 sata i zatim je zagrejana do sobne temperature i omogućeno je da se meša tokom 1 sata.300 ml heksana je dodato u reakcionu smešu, filtrirano kroz čep od silika gela i koncentrovano in vacuo. 200 ml heksana je dodato u reakcionu smešu, filtrirano kroz čep od silika gela i koncentrovano in vacuo kako bi se dobio 1-(8-bromooktil)-2-oktilciklopropan (1,44 g, 4,2 mmol, 89%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,43 (t, 2H); 1,88 (m, 2H); 1,57-1,06 (m, 26H); 0,91 (m, 3H); 0,66 (m, 3H); -0,30 (m, 1H).
Metil 3-((8-(2-oktilciklopropil)oktil)amino)propanoat
[0802]
[0803] Rastvoru metil 3-aminopropanoat hidrohlorida (200 mg, 1,45 mmol) i 1-(8-bromooktil)-2-oktilciklopropana (1,26 g, 3,63 mmol) u 1:1 CPME (2 ml):MeCN (2 ml) dodati su K2CO3(1,21 g, 8,72 mmol) i KI (603,35 mg, 17,91 mmol). Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na 81 °C tokom 6 sati. Sirovoj reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature, filtrirana je i koncentrovana in vacuo. Ostatak je rastvoren u EtOAc i ispran vodom. Vodeni sloj je ekstrahovan tri puta sa EtOAc. Organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-20% DCM u MeOH) kako bi se dobio metil 3-((8-(2-oktilciklopropil)oktil)amino)propanoat (700 mg, 1,11 mmol, 76%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,71 (s, 3H); 2,92 (t, 2H); 2,64 (t, 2H); 2,57 (t, 2H); 1,98 (br. s, 1H); 1,53-1,14 (br. m, 28H); 0,90 (m, 3H); 0,68-0,54 (br. m, 3H); -0,32 (m, 1H).
Metil 3-(bis(8-(2-oktilciklopropil)oktil)amino)propanoat
[0804]
[0805] Rastvoru metil 3-((8-(2-oktilciklopropil)oktil)amino)propanoata (700 mg, 1,9 mmol) i 1-(8-bromooktil)-2-oktilciklopropana (280 mg, 0,82 mmol) u 1:1 CPME (7 ml):MeCN (7 ml) dodati su K3CO3(0,23 mg, 1,63 mmol) i KI (135,47 mg, 0,82 mmol). Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na 81 °C tokom 6 sati. Sirovoj reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature, filtrirana je i koncentrovana in vacuo. Ostatak je rastvoren u EtOAc i ispran vodom. Vodeni sloj je ekstrahovan tri puta sa EtOAc. Organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-20% DCM u MeOH) kako bi se dobio metil 3-(bis(8-(2-oktilciklopropil)oktil)amino)propanoat (145 mg, 0,23 mmol, 28%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,70 (s, 3H); 2,91 (m, 2H); 2,67-2,52 (br. m, 6H); 1,51-1,14 (br. m, 56H); 0,91 (m, 6H); 0,68-0,55 (br. m, 6H); -0,32 (m, 2H).
3-(bis(8-(2-oktilciklopropil)oktil)amino)propanska kiselina
[0806]
[0807] Rastvoren je metil 3-(dioktadecilamino)propanoat (145 mg, 0,23 mmol) u EtOH (0,6 ml) i u reakcionu smešu je dodat 2M NaOH (0,6 ml) i reakciji je omogućeno da se meša na 40 °C tokom 2 sata. Reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i koncentrovana je in vacuo. Reakciona smeša je zakišeljena do pH 1 sa 2N HCl. Ostatak je ekstrahovan tri puta sa heksanima i koncentrovan in vacuo kako bi se dobila 3-(bis(8-(2-oktilciklopropil)oktil)amino)propanska kiselina (140 mg, 0,23 mmol, 98%).
UPLC/ELSD: RT = 3,67 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 619,0 za C41H79NO2
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 11,10 (br. s, 1H); 3,37 (m, 2H); 3,04 (br. m, 6H); 1,79 (br. m, 4H); 1,38-1,13 (br. m, 52H); 0,90 (m, 6H) 0,66-0,55 (br. m, 6H), -0,32 (m, 2H).
Metil 3(di((Z)-oktadek-9-en-1-il)amino)propanoat
(Z)-1-bromooktadek-9-en
[0808]
4
[0809] Rastvoru (Z)-oktadek-9-en-1-ola (5 g, 18,62 mmol) i PPh3(5,18 g, 19,74 mmol) u DCM (60 ml) na 0 °C, dodat je NBS (3,85 g, 21,60 mmol) u jednom obroku. Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na 0 °C tokom 1 sata, i zatim je omogućeno da se polako zagreje do sobne temperature i omogućeno je da se meša tokom 1 sata.240 ml heksana je dodato u reakcionu smešu, filtrirano kroz čep od silika gela i koncentrovano in vacuo. 200 ml heksana je dodato u reakcionu smešu, filtrirano kroz čep od silika gela i koncentrovano in vacuo kako bi se dobio (Z)-1-bromooktadek-9-en (4,70 g, 14,18 mmol, 76%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,37 (m, 2H); 3,43 (t, 2H); 2,04 (m, 4H); 1,87 (m, 2H); 1,47-1,30 (br. m, 22H); 0,91 (m, 3H).
Metil 3-(di((Z)-oktadek-9-en-il)amino)propanoat
[0810]
[0811] Rastvoru metil 3-aminopropanoat hidrohlorida (100 mg, 0,72 mmol) i (Z)-1-bromooktadek-9-ena (594 mg, 1,79 mmol) u 1:1 CPME (2 ml):MeCN (2 ml) dodati su K2CO3(598 mg, 4,30 mmol) i KI (297 mg, 1,79 mmol). Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na 81 °C tokom 18 sati. Sirovoj reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature, filtrirana je i koncentrovana in vacuo. Ostatak je rastvoren u EtOAc i ispran vodom. Vodeni sloj je ekstrahovan tri puta sa EtOAc. Organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-20% (smeša 1% NH4OH, 20% MeOH u dihlorometanu) u dihlorometanu) kako bi se dobio metil 3-(di((Z)-oktadek-9-en-il)amino)propanoat (56 mg, 0,09 mmol, 13%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,37 (m, 4H); 3,69 (s, 3H); 2,80 (t, 2H); 2,48-2,38 (br. m, 6H); 2,06-2,00 (br. m, 8H); 1,48-1,29 (br. m, 48H); 0,90 (m, 6H).
3-(di((Z)-oktadek-9-en-il)amino)propanska kiselina
[0812]
41
[0813] Rastvoren je metil 3-(di((Z)-oktadek-9-en-il)amino)propanoat (56 mg, 0,09 mmol) u EtOH (0,23 ml) i u reakcionu smešu je dodat 2M NaOH (0,23 ml) i reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na 30 °C tokom 30 min. Reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i koncentrovana je in vacuo. Reakciona smeša je zakišeljena do pH 1 sa 2N HCl. Ostatak je ekstrahovan tri puta sa heksanima i koncentrovan in vacuo kako bi se dobila 3-(di((Z)-oktadek-9-en-il)amino)propanska kiselina (54 mg, 0,09 mmol, >99%).
UPLC/ELSD: RT = 3,55 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 591,0 za C39H75NO2
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,28 (m, 4H); 2,83 (m, 2H); 2,64 (m, 4H); 2,43 (m, 2H); 1,95-1,91 (br. m, 8H); 1,50 (m, 4H); 1,28-1,20 (br. m, 44H); 0,90 (m, 6H).
(Z)-3-(oktadek-9-en-1-ilamino)propanska kiselina
Metil (Z)-3-(oktadek-9-en-1-ilamino)propanoat
[0814]
[0815] Rastvoru metil 3-aminopropanoat hidrohlorida (100 mg, 0,72 mmol) i (Z)-1-bromooktadek-9-ena (594 mg, 1,79 mmol) u 1:1 CPME (2 ml):MeCN (2 ml) dodati su K2CO3(598 mg, 4,30 mmol) i KI (297 mg, 1,79 mmol). Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na 81 °C tokom 18 sati. Sirovoj reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature, filtrirana je i koncentrovana in vacuo. Ostatak je rastvoren u EtOAc i ispran vodom. Vodeni sloj je ekstrahovan tri puta sa EtOAc. Organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-20% MeOH
42
u dihlorometanu) kako bi se dobio metil (Z)-3-(oktadek-9-en-1-ilamino)propanoat (64 mg, 0,18 mmol, 25%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,36 (m, 2H); 3,70 (s, 3H); 2,90 (t, 2H); 2,62 (t, 2H); 2,54 (t, 2H); 2,18 (br. s, 1H); 2,05-1,98 (br. m, 4H); 1,52-1,45 (br. m, 2H); 1,36-1,28 (br. m, 22H); 0,89 (m, 3H)
(Z)-3-(oktadek-9-en-1-ilamino)propanska kiselina
[0816]
[0817] Rastvoren je metil (Z)-3-(oktadek-9-en-1-ilamino)propanoat (64 mg, 0,18 mmol) u EtOH (0,91 ml) i u reakcionu smešu je dodat 2M NaOH (0,91 ml) i reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i koncentrovana je in vacuo. Reakciona smeša je zakišeljena do pH 1 sa 2N HCl. Ostatak je ekstrahovan tri puta sa heksanima i koncentrovan in vacuo kako bi se dobila (Z)-3-(oktadek-9-en-1-ilamino)propanska kiselina (60 mg, 0,18 mmol, 98%).
UPLC/ELSD: RT= 1,85 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 340,3 za C21H41NO2
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 8,59 (br. s, 1H); 5,27 (m, 2H); 4,88 (br. s, 1H); 3,18 (m, 2H); 2,98-2,92 (br. m, 4H); 1,97-1,90 (br. m, 4H); 1,78 (m, 2H); 1,26-1,19 (br. m, 22H); 0,81 (m, 3H).
3-(di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-il)amino)propanska kiselina (6Z,9Z)-18-bromooktadeka-6,9-dien
[0818]
4
[0819] Rastvoru (9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-ola (5 g, 18,76 mmol) i PPh3(5,22 g, 19,89 mmol) u DCM (60 ml) na 0 °C, dodat je NBS (3,87 g, 21,77 mmol) u jednom obroku. Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na 0 °C tokom 1 sata i zatim je omogućeno da se polako zagreje do sobne temperature i omogućeno je da se meša tokom 1 sata. 240 ml heksana je dodato u reakcionu smešu, filtrirano kroz čep od silika gela i koncentrovano in vacuo. 200 ml heksana je dodato u reakcionu smešu, filtrirano kroz čep od silika gela i koncentrovano in vacuo kako bi se dobio (6Z,9Z)-18-bromooktadeka-6,9-dien (4,06 g, 12,33 mmol, 66%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,45-5,31 (br. m, 4H); 3,43 (t, 2H); 2,80 (m, 2H); 2,11-2,04 (br. m, 4II); 1,88 (m, 2H); 1,47-1,33 (br. m, 16H); 0,92 (m, 3H).
Metil 3-(di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-il)amino)propanoat
[0820]
[0821] Rastvoru metil 3-aminopropanoat hidrohlorida (100 mg, 0,72 mmol) i (6Z,9Z)-18-bromooktadeka-6,9-diena (590 mg, 1,79 mmol) u 1:1 CPME (2 ml):MeCN (2 ml) dodati su K2CO3(600 mg, 4,30 mmol) i KI (300 mg, 1,79 mmol). Reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na 50 °C tokom 18 sati, a zatim na 60 °C tokom 24 sata. Sirovoj reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature, filtrirana je i koncentrovana in vacuo. Ostatak je rastvoren u EtOAc i ispran vodom. Vodeni sloj je ekstrahovan tri puta sa EtOAc. Organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani in vacuo. Ostatak je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-15% MeOH u dihlorometanu) kako bi se dobio metil 3-(di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-il)amino)propanoat (56 mg, 0,09 mmol, 13%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,38 (m, 8H); 3,69 (s, 3H); 2,83-2,77 (br. m, 6H); 2,50-2,39 (br. m, 6H); 2,11-2,04 (br. m, 8H); 1,46-1,30 (br. m, 36H); 0,91 (m, 6H).
44
3-(di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-il)amino)propanska kiselina
[0822]
[0823] Rastvoren je metil 3-(di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-il)amino)propanoat (113 mg, 0,19 mmol) u EtOH (0,94 ml) i u reakcionu smešu je dodat 2M NaOH (0,94 ml) i reakcionoj smeši je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi tokom 1 sata i koncentrovana je in vacuo. Reakciona smeša je zakišeljena do pH 1 sa 1N HCl. Ostatak je ekstrahovan tri puta sa heksanima i koncentrovan in vacuo kako bi se dobila 3-(di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-il)amino)propanska kiselina (106 mg, 0,18 mmol, 95%).
UPLC/ELSD: RT = 3,32 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 586,8 za C39H71NO2
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,38 (m, 8H); 2,88-2,77 (br. m, 6H); 2,65 (m, 4H); 2,47 (m, 2H); 2,11-2,04 (br. m, 8H); 1,58-1,52 (br. m, 4H); 1,43-1,28 (br. m, 32H); 0,91 (m, 6H).
N-metiloleamid
[0824]
[0825] Rastvoru oleinske kiseline (500 mg, 1,77 mmol) u THF (8 ml) dodati su metilamin (885 μl, 1,77 mmol), HATU (673 mg, 1,77 mmol) i DIPEA (617 μl, 3,54 mmol). Reakciji je omogućeno da se meša na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Reakcija je ugašena sa 1N limunskom kiselinom i ekstrahovana tri puta sa dietil etrom. Organski slojevi su isprani vodom i slanim rastvorom. Organski slojevi su osušeni preko Na2SO4, filtrirani i koncentrovani in vacuo. Ostatak je prečišćen
4
pomoću hromatografije na silika gelu (10-100% EtOAc u heksanima) kako bi se dobio N-metiloleamid (495 mg, 1,67 mmol, 95%).
UPLC/ELSD: RT = 2,67 min. MS (ES): m/z (MH<+>) 295,9 za C19H37NO
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,36 (m, 2H); 3,26 (br. s, 1H); 2,83 (d, 3H); 2,18 (t, 2H); 2,05-2,00 (br. m, 4H); 1,66-1,62 (br. m, 4H); 1,37-1,29 (br. m, 18H); 0,90 (m, 3H).
3-amonio-4-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-4-oksobutanoat
4-benzil 1-(2,3-bis(stearoiloksi)propil) (terc-butoksikarbonil)aspartat
[0826]
[0827] Smeša 3-hidroksipropan-1,2-diil distearata (625 mg, 1,0 mmol), 4-(benziloksi)-2-((tercbutoksikarbonil)amino)-4-oksobutanske kiseline (647 mg, 2,0 mmol), EDCI (384 mg, 2,0 mmol) i DMAP (12 mg, 0,1 mmol) u 40 ml dihlorometana je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. TLC je pokazala završenu reakciju. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa dihlorometanom, i kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja, sirovi proizvod je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: EtOAc/heksani 0 do 40%) kako bi obezbedio 4-benzil 1-(2,3-bis(stearoiloksi)propil) (tercbutoksikarbonil)aspartat kao belu čvrstu supstancu (918 mg, 98%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,31-7,36 (m, 5H), 5,48 (m, 1H), 5,21 (m, 1H), 5,17 (s, 2H), 4,58-4,63 (m, 1H), 4,19-4,26 (m, 2H), 4,05-4,13 (m, 2H), 2,95-3,08 (m, 1H), 2,78-2,87 (m, 1H), 2,29 (dt, 4H, J = 7,4 Hz, 1,9 Hz), 1,55-1,64 (m, 6H), 1,42 (s, 9H), 1,24 (bs, 54H), 0,87 (t, 6H, J= 6,8 Hz).
4
MS (APCI): m/z (MH<+>) 830,6.
4-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-3-((terc-butoksikarbonil)amino)-4-oksobutanska kiselina
[0828]
[0829] Smeša 4-benzil 1-(2,3-bis(stearoiloksi)propil) (terc-butoksikarbonil)aspartata (918 mg, 0,98 mmol) i Pd/C (5%, 300 mg) u 80 ml EtOAc je mešana tokom 16 h pod balonom vodonika. TLC je pokazala završenu reakciju. Reakciona smeša je filtrirana kroz celit i isprana sa dihlorometanom. Filtrat je koncentrovan kako bi obezbedio 4-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-3-((terc-butoksikarboni])amino)-4-oksobutansku kiselinu kao belu čvrstu supstancu (805 mg, kvant.), koja je upotrebljena za sledeći korak bez prečišćavanja.
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,46-5,52 (m, 1H), 5,26 (m, 1H), 4,58 (m, 1H), 4,07-4,44 (m, 4H), 2,76-3,06 (m, 2H), 2,30 (t, 4H, J = 7,4 Hz), 1,54-1,64 (m, 4H), 1,44 (s, 9H), 1,24 (bs, 56H), 0,87 (t, 6H, J= 6,8 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 740,6.
3-amonio-4-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-4-oksobutanoat
[0830]
4
[0831] 4-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-3-((terc-butoksikarbonil)amino)-4-oksobutanska kiselina (800 mg, 0,98 mmol) je rastvorena u 4M HCl u dioksanu (5 ml), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 h. TLC je pokazala nestanak početnog materijala. U reakcionu smešu su dodati heksani i triturisana je kako bi obezbedila željeni proizvod, 3-amonio-4-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-4-oksobutanoat kao belu čvrstu supstancu (701 mg, 92%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,23 (bs, 2H), 5,31 (m, 1H), 4,08-4,54 (m, 5H), 3,14-3,36 (m, 2H), 2,31 (q, 4H, J = 7,4 Hz), 1,58 (m, 4H), 1,24 (bs, 56H), 0,87 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 740,6
1-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-4-karboksi-1-oksobutan-2-aminijum hlorid
5-benzil 1-(2,3-bis(stearoiloksi)propil) (terc-butoksikarbonil)glutamat
[0832]
[0833] Smeša 3-hidroksipropan-1,2-diil distearata (625 mg, 1,0 mmol), 5-(benziloksi)-2-((tercbutoksikarbonil)amino)-5-oksopentanske kiseline (674 mg, 2,0 mmol), EDCI (384 mg, 2,0 mmol) i DMAP (12 mg, 0,1 mmol) u 40 ml dihlorometana je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. TLC je pokazala završenu reakciju. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa
4
dihlorometanom, i kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja, sirovi proizvod je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: EtOAc/heksani 0 do 40%) kako bi obezbedio 5-benzil 1-(2,3-bis(stearoiloksi)propil) (tercbutoksikarbonil)glutamat kao belu čvrstu supstancu (950 mg, kvant.).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,34 (m, 5H), 5,25 (m, 1H), 5,04-5,11 (m, 3H), 4,09-4,37 (m, 6H), 2,43-2,49 (m, 2H), 2,26-2,32 (m, 4H), 2,14-2,20 (m, 2H), 1,88-2,02 (m, 2H), 1,58 (m, 3H), 1,42 (s, 9H), 1,24 (bs, 54H), 0,87 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 844,6.
5-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-4-((terc-butoksikarbonil)amino)-5-oksopentanska kiselina
[0834]
[0835] Smeša 5-benzil 1-(2,3-bis(stearoiloksi)propil) (terc-butoksikarbonil)glutamata (950 mg, 1,0 mmol) i Pd/C (5%, 300 mg) u 80 ml EtOAc je mešana tokom 16 h pod balonom vodonika. TLC je pokazala završenu reakciju. Reakciona smeša je filtrirana kroz celit i isprana sa dihlorometanom. Filtrat je koncentrovan kako bi obezbedio 5-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)4-((terc-butoksikarbonil)amino)-5-oksopentansku kiselinu kao belu čvrstu supstancu (848 mg, 99%), koja je upotrebljena za sledeći korak bez prečišćavanja.
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6,39 (m, 0,5H), 6,25 (m, 0,5H), 5,10-5,29 (m, 2H), 4,06-4,34 (m, 3H), 3,74 (m, 1H), 3,25 (m, 1H), 2,44-2,52 (m, 2H), 2,31 (q, 2H, J= 6,8 Hz), 2,00-2,21 (m, 5H), 1,54-1,66 (m, 4H), 1,44 (s, 9H), 1,24 (bs, 54H), 0,87 (t, 6H, J = 6,8 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 754,6.
4
1-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-4-karboksi-1-oksobutan-2-aminijum hlorid
[0836]
[0837] 4-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-3-((terc-butoksikarbonil)amino)-4-oksobutanska kiselina (848 mg, 0,99 mmol) je rastvorena u 4M HCl u dioksanu (20 ml), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. TLC je pokazala nestanak početnog materijala. U reakcionu smešu su dodati heksani i triturisana je kako bi obezbedila željeni proizvod, 1-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-4-karboksi-1-oksobutan-2-aminijum hlorid kao belu čvrstu supstancu (740 mg, 94%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,32 (m, 2H), 4,17-4,44 (m, 6H), 2,72 (m, 2H), 2,28-2,36 (m, 5H), 1,55-1,64 (m, 4H), 1,20-1,37 (bs, 58H), 0,88 (t, 6H, J= 6,8 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 754,6.
3-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-1-karboksi-3-oksopropan-l-aminijum hlorid
1-benzil 4-(2,3-bis(stearoiloksi)propil) (terc-butoksikarbonil)aspartat
[0838]
[0839] Smeša 3-hidroksipropan-1,2-diil distearata (625 mg, 1,0 mmol), 4-(benziloksi)-3-((tercbutoksikarbonil)amino)-4-oksobutanske kiseline (647 mg, 2,0 mmol), EDCI (384 mg, 2,0 mmol) i DMAP (12 mg, 0,1 mmol) u 40 ml dihlorometana je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. TLC je pokazala završenu reakciju. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa dihlorometanom, i kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja, sirovi proizvod je prečišćen pomoću ISCO (40 g SiO2: EtOAc/heksani 0 do 20%) kako bi obezbedio 1-benzil 4-(2,3-bis(stearoiloksi)propil) (tercbutoksikarbonil)aspartat kao belu čvrstu supstancu (942 mg, kvant.).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,28-7,37 (m, 5H), 5,46-5,53 (m, 1H), 5,21 (m, 1H), 5,17 (s, 2H), 4,56-4,64 (m, 1H), 4,20-4,25 (m, 2H), 4,05-4,12 (m, 2H), 2,94-3,04 (m, 1H), 2,78-2,87 (m, 1H), 2,29 (dt, 4H, J = 7,6 Hz, 1,9 Hz), 1,56-1,64 (m, 4H), 1,42 (s, 9H), 1,24 (bs, 56H), 0,87 (t, 6H, J =6,8 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 830,6.
4-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-4-oksobutanska kiselina
[0840]
[0841] Smeša 1-benzil 4-(2,3-bis(stearoiloksi)propil) (terc-butoksikarbonil)aspartata (942 mg, 1,0 mmol) i Pd/C (5%, 300 mg) u 80 ml EtOAc je mešana tokom 16 h pod balonom vodonika. TLC je pokazala završenu reakciju. Reakciona smeša je filtrirana kroz celit i isprana sa dihlorometanom. Filtrat je koncentrovan kako bi obezbedio 4-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-4-oksobutansku kiselinu kao belu čvrstu supstancu (800 mg, 95%), koja je upotrebljena za sledeći korak bez prečišćavanja.
1
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,56 (m, 1H), 5,23-5,28 (m, 1H), 4,56 (m, 1H), 4,12-4,32 (m, 5H), 2,98-3,07 (m, 2H), 2,81-2,89 (m, 2H), 2,28-2,35 (m, 4H), 1,60 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,24 (bs, 54H), 0,87 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 740,6.
3-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-1-karboksi-3-oksopropan-1-aminijum hlorid
[0842]
[0843] 4-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-4-oksobutanska kiselina (800 mg, 0,95 mmol) je rastvorena u 4M HCl u dioksanu (20 ml), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. TLC je pokazala nestanak početnog materijala. U reakcionu smešu su dodati heksani i triturisana je kako bi obezbedila željeni proizvod, 3-(2,3-bis(stearoiloksi)propoksi)-1-karboksi-3-oksopropan-1-aminijum hlorid kao belu čvrstu supstancu (718 mg, 97%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,29 (m, 1H), 4,53 (m, 1H), 4,12-4,38 (m, 5H), 3,28 (m, 2H), 2,32 (q, 4H, J = 7,7 Hz), 1,60 (m, 4H), 1,24 (bs, 59H), 0,88 (t, 6H, J= 6,6 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 740,6.
1-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-4-karboksi-1-oksobutan-2-aminijum hlorid
3-((metilsulfonil)oksi)propan-1,2-diil distearat
2
[0845] Rastvoru 3-hidroksipropan-1,2-diil distearata (6,25 g, 10 mmol) i trietilamina (1,81 ml, 12,5 mmol) u 100 ml dihlorometana, kap po kap je dodat metansulfonil hlorid (0,97 ml, 12,5 mmol) na 0 °C, i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 h. TLC je pokazala završenu reakciju, i reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa dihlorometanom. Kombinovani organski sloj je ispran rastvorom zasićenog natrijum bikarbonata i slanim rastvorom. Posle sušenja preko natrijum sulfata, filtrat je koncentrovan kako bi obezbedio 3-((metilsulfonil)oksi)propan-1,2-diil distearat kao belu čvrstu supstancu (7,07 g, kvant.), NMR je pokazala smešu mezilata i hlorida, koja je upotrebljena za sledeći korak bez dodatnog prečišćavanja.
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,23-5,30 (m, 1H), 4,29-4,41 (m, 3H), 4,17 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 5,7 Hz), 2,43 (q, 4H, J = 7,6 Hz), 1,61 (m, 3H), 1,24 (bs, 60H), 0,87 (t, 6H, J = 6,8 Hz).
3-azidopropan-1,2-diildistearat
[0846]
[0847] U zapečaćenoj tubi, smeša 3-((metilsulfonil)oksi)propan-1,2-diil distearata (7,07 g, 10 mmol) i natrijum azida (3,26 g, 50 mmol) u 40 ml DMF je zagrevana do 100 °C tokom 16 h. Posle hlađenja do sobne temperature, reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa smešom heksani/etar. Organski sloj je ispran vodom i slanim rastvorom. Posle sušenja preko natrijum sulfata, filtrat je koncentrovan i prečišćen pomoću ISCO (120 g SiO2: EtOAc/heksani 0 do 50%) kako bi obezbedio 3-azidopropan-1,2-diil distearat kao belu čvrstu supstancu (5,40 g, 83%).<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,17 (pent, 1H, J = 4,9 Hz), 4,29 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 4,6 Hz), 4,14 (dd, 1H, J = 11,9 Hz, 5,5 Hz), 3,45 (t, 2H, J = 3,3 Hz), 2,34 (dt, 4H, J = 10,2 Hz, 7,4 Hz), 1,57-1,65 (m, 4H), 1,24 (bs, 56H), 0,87 (t, 6H, J= 7,1 Hz).
3-aminopropan-1,2-diil distearat
[0848]
[0849] Smeša 3-azidopropan-1,2-diil distearata (3,71 g, 5,7 mmol) i Pd/C (5%, Degaussa E10002U/W, Aldrich 330124, 370 mg) u 100 ml EtOAc je pročišćena azotom i vodonikom 3 puta, respektivno, i zatim je reakcija mešana na sobnoj temperaturi sa balonom tokom 16 h. TLC je pokazala završenu reakciju. Reakciona smeša je filtrirana kroz celit i isprana sa vrelim dihlorometanom kako bi obezbedila 3-aminopropan-1,2-diil distearat kao belu čvrstu supstancu (2,20 g, 62%). Ovo jedinjenje ima nisku solubilnost u većini rastvarača na sobnoj temperaturi.
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,90 (m, 0,5H), 5,74 (m, 0,5H), 3,91-4,20 (m, 2H), 3,12-3,70 (m, 2H), 2,30-2,36 (m, 3H), 2,18-2,25 (m, 1H), 1,53-1,66 (m, 6H), 1,24 (bs, 56H), 0,87 (t, 6H, J = 7,1 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 624,6.
3-(5-(benziloksi)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-5-oksopentanamido)propan-1,2-diil distearat
[0850]
4
[0851] Smeša 3-aminopropan-1,2-diil distearata (624 mg, 1,0 mmol), 5-(benziloksi)-2-((tercbutoksikarbonil)amino)-5-oksopentanske kiseline (674 mg, 2,0 mmol), EDCI (384 mg, 2,0 mmol) i DMAP (12 mg, 0,1 mmol) u 70 ml/70 ml dihlorometan/THF zagrevana je na 45 °C tokom 16 h. TLC je pokazala završenu reakciju. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa dihlorometanom, i kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja, sirovi proizvod je prečišćen pomoću ISCO (40 g SiO2: EtOAc/heksani 0 do 20%) kako bi obezbedio 3-(5-(benziloksi)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-5-oksopentanamido)propan-1,2-diil distearat kao belu čvrstu supstancu (840 mg, 89%).
<1>M NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,31-7,39 (m, 5H), 6,25 (m, 1H), 5,39-5,44 (m, 1H), 5,12-5,22 (m, 3H), 4,08-4,53 (m, 4H), 2,44-2,49 (m, 4H), 2,20-2,38 (m, 2H), 2,30 (m, 4H), 2,16 (m, 1H), 1,95 (m, 1H), 1,55-1,64 (m, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,24 (bs, 56H), 0,87 (t, 6H, J = 6,8 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 943,7, 843,7.
5-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-4-((terc-butoksikarbonil)amino)-5-oksopentanska kiselina
[0852]
[0853] Smeša 3-(5-(benziloksi)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-5-oksopentanamido)propan-1,2-diil distearata (840 mg, 0,89 mmol) i Pd/C (5%, 250 mg) u 80 ml EtOAc je mešana tokom 16 h pod balonom vodonika. TLC je pokazala završenu reakciju. Reakciona smeša je filtrirana kroz celit i isprana sa dihlorometanom. Filtrat je koncentrovan kako bi obezbedio 5-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-4-((terc-butoksikarbonil)amino)-5-oksopentansku kiselinu kao belu čvrstu supstancu (722 mg, 84%), koja je upotrebljena za sledeći korak bez prečišćavanja.
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,23-5,29 (m, 1H), 5,12-5,16 (m, 1H), 4,08-4,42 (m, 6H), 2,44-2,49 (m, 4H), 2,20-2,38 (m, 2H), 2,30 (t, 4H, J= 7,6 Hz), 2,16 (m, 1H), 1,95 (m, 1H), 1,55-1,64 (m, 2H), 1,43 (s, 9H), 1,24 (bs, 54H), 0,87 (t, 6H, J = 6,8 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 853,7, 753,6.
1-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-4-karboksi-1-oksobutan-2-aminijum hlorid
[0854]
[0855] 5-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-4-((terc-butoksikarbonil)amino)-5-oksopentanska kiselina (722 mg, 0,84 mmol) je rastvorena u 4M HCl u dioksanu (20 ml), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. TLC je pokazala nestanak početnog materijala, i reakciona smeša je bistar rastvor. Posle koncentrovanja, sirovi proizvod je prečišćen pomoću Zlato ISCO (24 g SiO2: MeOH/dihlorometan 0 do 50%) kako bi obezbedio željeni proizvod, 1-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-4-karboksi-1-oksobutan-2-aminijum hlorid kao belu čvrstu supstancu (610 mg, 91%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,43 (bs, 2H), 5,21 (m, 1H), 4,18-4,38 (m, 3H), 3,36-3,75 (m, 3H), 2,68 (m, 2H), 2,20-2,35 (m, 6H), 1,57 (m, 4H), 1,24 (bs, 56H), 0,87 (t, 6H, J = 6,8 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 753,6.
3-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-1-karboksi-3-oksopropan-1-aminijum hlorid
3-(4-(terc-butoksi)-3-((terc-butoksikarbonil)amino)-4-oksobutanamido)propan-1,2-diil distearat
[0856]
[0857] Smeša 3-aminopropan-1,2-diil distearata (500 mg, 0,80 mmol), 4-(terc-butoksi)-3-((tercbutoksikarbonil)amino)4-oksobutanske kiseline (463 mg, 1,60 mmol), EDCI (307 mg, 1,60 mmol) i DMAP (10 mg, 0,08 mmol) u 70 ml/70 ml dihlorometan/THF je zagrevana na 45 °C tokom 16 h. TLC je pokazala završenu reakciju. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa dihlorometanom, i kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja, sirovi proizvod je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO3: EtOAc/heksani 0 do 40%) kako bi obezbedio 3-(4-(terc-butoksi)-3-((terc-butoksikarbonil)amino)-4-oksobutanamido)propan-1,2-diil distearat kao belu čvrstu supstancu (685 mg, 76%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6,48 (m, 0,5H), 6,20 (m, 0,5H), 5,38 (m, 1H), 5,08-5,14 (m, 1H), 4,42-4,54 (m, 1H), 4,06-4,28 (m, 2H), 3,60-3,68 (m, 0,5H), 3,46-3,53 (m, 1H), 3,26-3,34 (m, 0,5H), 2,74-2,92 (m, 2H), 2,31 (dt, 2H, J = 7,5 Hz, 1,9 Hz), 2,19 (t, 2H, J = 7,7 Hz), 1,56-1,66 (m, 2H), 1,47 (s, 9H), 1,41-1,45 (m, 9H), 1,24 (bs, 58H), 0,87 (t, 6H, J = 6,8 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 895,7, 795,6.
3-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-1-karboksi-3-oksopropan-1-aminijum hlorid
[0858]
[0859] 3-(4-(terc-butoksi)-3-((terc-butoksikarbonil)amino)-4-oksobutanamido)propan-1,2-diil distearat (685 mg, 0,76 mmol) je rastvoren u 4M HCl u dioksanu (10 ml), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. TLC je pokazala nestanak početnog materijala. U reakcionu smešu su dodati heksani i triturisana je kako bi obezbedila željeni proizvod, 3-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-1-karboksi-3-oksopropan-1-aminijum hlorid kao belu čvrstu supstancu (520 mg, 88%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,26 (bs, 2H), 5,15 (m, 1H), 4,50 (m, 1H), 4,22 (m, 2H), 3,16-3,54 (m, 4H), 2,20-2,38 (m, 4H), 1,58 (m, 4H), 1,24 (bs, 56H), 0,87 (t, 6H, J= 6,8 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 739,6.
1-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-3-karboksi-1-oksopropan-2-aminijum hlorid
3-(4-(benziloksi)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-4-oksobutanamido)propan-1,2-diil distearat
[0860]
[0861] Smeša 3-aminopropan-1,2-diil distearata (320 mg, 0,51 mmol), 4-(benziloksi)-2-((tercbutoksikarbonil)amino)-4-oksobutanske kiseline (332 mg, 1,02 mmol), EDCI (197 mg, 1,02 mmol) i DMAP (6 mg, 0,05 mmol) u 30 ml/30 ml dihlorometan/THF zagrevani su na 50 °C tokom 16 h. TLC je pokazala proizvod. Reakciona smeša je razblažena vodom i ekstrahovana sa dihlorometanom, i kombinovani organski sloj je ispran slanim rastvorom i osušen preko natrijum sulfata. Posle filtriranja i koncentrovanja, sirovi proizvod je prečišćen pomoću ISCO (24 g SiO2: EtOAc/heksani 0 do 40%) kako bi obezbedio 3-(4-(benziloksi)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-4-oksobutanamido)propan-1,2-diil distearat kao belu čvrstu supstancu (310 mg, 64%).
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7,31-7,39 (m, 5H), 6,24 (m, 1H), 5,39-5,43 (m, 1H), 5,11-5,22 (m, 3H), 4,53 (m, 1H), 4,06-4,22 (m, 2H), 3,72-3,80 (m, 1H), 2,88-3, 10 (m, 2H), 2,26-2,32 (m, 2H), 2,12-2,17 (m, 2H), 1,53-1,64 (m, 9H), 1,44 (s, 9H), 1,24 (bs, 50H), 0,87 (t, 6H, J = 6,8 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 929,7, 829,6.
4-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-3-((terc-butoksikarbonil)amino)-4-oksobutanska kiselina
[0862]
[0863] Smeša 3-(4-(benziloksi)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)4-oksobutanamido)propan-1,2-diil distearata (310 mg, 0,33 mmol) i Pd/C (5%, 100 mg) u 45 ml EtOAc je mešana tokom 16 h pod balonom vodonika. TLC je pokazala završenu reakciju. Reakciona smeša je filtrirana kroz celit i isprana sa dihlorometanom. Filtrat je koncentrovan kako bi obezbedio 4-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-3-((terc-butoksikarbonil)amino)-4-oksobutansku kiselinu kao belu čvrstu supstancu (248 mg, 88%), koja je upotrebljena za sledeći korak bez prečišćavanja.
<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6,29 (m, 1H), 5,54 (m, 1H), 5,17 (m, 1H), 4,52 (m, 1H), 4,128-4,26 (m, 1H), 4,11 (q, 2H, J= 6,8 Hz), 3,72 (m, 1H), 3,25 (m, 1H), 2,85-3,08 (m, 2H), 2,262,34 (m, 2H), 2,12-2,20 (m, 2H), 2,04(s, 2H), 1,59 (m, 4H), 1,44 (s, 9H), 1,24 (bs, 52H), 0,87 (t, 6H, J = 6,6 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 839,7, 739,6.
1-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-3-karboksi-1-oksopropan-2-aminijum hlorid
[0864]
[0865] 4-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-3-((terc-butoksikarbonil)amino)-4-oksobutanska kiselina (248 mg, 0,29 mmol) je rastvorena u 4M HCl u dioksanu (20 ml), i smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. TLC je pokazala nestanak početnog materijala. U reakcionu smešu su dodati heksani i triturisana je kako bi obezbedila željeni proizvod, 1-((2,3-bis(stearoiloksi)propil)amino)-3-karboksi-1-oksopropan-2-aminijum hlorid kao belu čvrstu supstancu (170 mg, 78%).
<1>HNMR (300 MHz, CDCl3) δ 8,32 (bs, 2H), 5,19 (m, 1H), 4,24 (m, 2H), 3,14-3,65 (m, 4H), 2,20-2,38 (m, 4H), 1,58 (m, 4H), 1,44 (s, 9H), 1,24 (bs, 50H), 0,87 (t, 6H, J = 6,8 Hz).
MS (APCI): m/z (MH<+>) 739,6.
Reprezentativna procedura 1:
[0866]
(2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metil 4-metilbenzensulfonat
[0867]
[0868] Rastvoru Solketala (2,0 g, 15,1 mmol) na 0 °C u piridinu (30 ml) dodat je tozil hlorid (3,2 g, 16,6 mmol), i reakciji je omogućeno da se vrati na RT i mešana je tokom 12 sati. Smeša je koncentrovana, i azeotropovana dva puta sa toluenom. Sirovi materijal je uzet u DCM i ispran vodom, zasićenim amonijum hloridom, slanim rastvorom, osušen preko anhidrovanog Na3SO4, filtriran, i koncentrovan in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0-30% EtOAc/heksani) obezbedilo je (2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metil 4-metilbenzensulfonat (4,18 g, 96%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,82 (d, 2H); 7,38 (d, 2H); 4,30 (m, 1H); 4,03 (m, 3H); 3,78 (m, 1H); 2,489 (s, 3H); 1,35 (m, 6H).
4-(azidometil)-2,2-dimetil-1,3-dioksolan
[0869]
[0870] Rastvoru (2,2-dimetil-1,3-dioksolan-4-il)metil 4-metilbenzensulfonata (4,18 g, 14,6 mmol) u DMF (36 ml) dodat je natrijum azid (2,37 g, 36,5 mmol) i reakciji je omogućeno da se meša na 80 °C tokom 12 sati. Posle hlađenja do RT, reakcija je ugašena sa zasićenim natrijum bikarbonatom i suspenzija je filtrirana. Rastvor je ekstrahovan x3 sa etrom, i kombinovani etarski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni preko anhidrovanog MgSO4filtrirani, i
1
koncentrovani in vacuo u odsustvu spoljne toplote kako bi obezbedili 4-(azidometil)-2,2-dimetil-1,3-dioksolan sa rezidualnim DMF (3,37 g, 146%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,29 (m, 1H); 4,08 (m, 1H); 3,79 (m, 1H); 3,50-3,26 (br. m, 2H); 1,49 (s, 3H); 1,38 (s, 3H).
3-azidopropan-1,2-diol
[0871]
[0872] Rastvoru 4-(azidometil)-2,2-dimetil-1,3-dioksolana (2,29 g, 14,6 mmol) u MeOH (75 ml) dodat je monohidrat tozilne kiseline (1,39 g, 7,3 mmol) i reakciji je omogućeno da se meša na RT. Posle 4 sata, dodat je čvrsti natrijum karbonat (3 g) i smeši je omogućeno da se meša tokom 20 minuta. Suspenzija je filtrirana i koncentrovana in vacuo u odsustvu spoljne toplote. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (50-100% EtOAc/heksani) obezbedilo je 3-azidopropan-1,2-diol (1,35 g, 79%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,90 (m, 1H); 3,80-3,57 (br. m, 2H); 3,44 (m, 2H); 2,42 (br.
2H).
3-azidopropan-1,2-diil bis(dekanoat)
[0873]
2
[0874] Rastvoru 3-azidopropan-1,2-diola (100 mg, 0,854 mmol) i dekanske kiseline (368 mg, 2,13 mmol) u DCM (4 ml) dodati su DCC (440 mg, 2,13 mmol) i DMAP (260 mg, 2,13 mmol), i reakciji je omogućeno da se meša na RT tokom 48 sati. Smeša je filtrirana, i čvrste supstance su isprane sa DCM. Filtrat je ispran sa 10% limunskom kiselinom, zasićenim natrijum bikarbonatom, slanim rastvorom, osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0-30% EtOAc/heksani) obezbedilo je 3-azidopropan-1,2-diil bis(dekanoat) (318 mg, 88%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,20 (kvint, 1H); 4,37-4,12 (br. m, 2H); 3,49 (m, 2H); 2,35 (m, 4H); 1,65 (m, 4H); 1,42-1,10 (br. m, 24H); 0,90 (t, 6H).
3-azidopropan-1,2-diil ditetradekanoat
[0875]
[0876] Na isti način kao 3-azidopropan-1,2-diil bis(dekanoat), 3-azidopropan-1,2-diil ditetradekanoat je sintetisan iz 3-azidopropan-1,2-diola (300 mg, 2,56 mmol), miristinske kiseline (1,46 g, 6,40 mmol), DCC (1,32 g, 6,40 mmol), i DMAP (782 mg, 6,40 mmol) u DCM (12 ml). Prinos (1,21 g, 88%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,20 (kvint, 1H); 4,37-4,12 (br. m, 2H); 3,49 (m, 2H); 2,35 (m, 4H); 1,65 (m, 4H); 1,42-1,10 (br. m, 40H); 0,90 (t, 6H).
Jedinjenje metoksi-PEG2000-estar-klik-glicerol C10
[0878] Rastvoru O-(2-azidoetil)-O'-metilpolietilen glikola 2000 (587 mg, 0,29 mmol) i 3-azidopropan-1,2-diil bis(dekanoata) (150 mg, 0,35 mmol) u t-butanolu (1,5 ml) i vodi (1,5 ml) dodati su CuSO4(12 mg, 0,07 mmol) i natrijum askorbat (29 mg, 0,15 mmol). Reakciji je omogućeno da se meša na RT tokom 24 sata i zatim je koncentrovana in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0-20% MeOH/DCM) obezbedilo je željeni proizvod (205 mg, 29%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,46 (s, 1H); 5,39 (kvint, 1H); 4,58 (m, 2H); 4,38-4,20 (br. m, 4H); 4,09 (m, 2H); 3,89 (m, 2H); 3,67 (br. m, 170-200H); 3,40 (s, 3H); 3,07 (m, 2H); 2,77 (m, 2H); 2,33 (m, 4H); 1,86 (br.4,6H, voda); 1,60 (m, 4H); 1,29 (br. m, 24H); 0,90 (t, 6H).
Jedinjenje metoksi-PEG2000-estar-klik-glicerol C8
[0879]
[0880] Na isti način kao C10, C8 je sintetisan iz O-(2-azidoetil)-O'-metilpolietilen glikola 2000 (250 mg, 0,125 mmol), 3-azidopropan-1,2-diil dioktanoata (56 mg, 0,15 mmol), CuSO4(5 mg, 0,03 mmol) i natrijum askorbata (13 mg, 0,06 mmol) u t-butanolu (1,5 ml) i vodi (1,5 ml). Prinos (73 mg, 25%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,44 (s, 1H); 5,39 (kvint, 1H); 4,58 (m, 2H); 4,38-4,20 (br. m, 4H); 4,09 (m, 2H); 3,89 (m, 2H); 3,67 (br. m, 170-200H); 3,40 (s, 3H); 3,07 (m, 2H); 2,77 (m, 2H); 2,33 (m, 4H); 1,86 (br.3H, voda); 1,60 (m, 4H); 1,29 (br. m, 16H); 0,90 (t, 6H).
Jedinjenje metoksi-PEG2000-estar-klik-glicerol C14
4
[0882] Na isti način kao C10, C14 je sintetisan iz 3-azidopropan-1,2-diil ditetradekanoata.
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,57 (s, 1H); 5,39 (kvint, 1H); 4,62 (m, 2H); 4,42-3,85 (br. m, 8H); 3,77-3,49 (br. m, 170-200H); 3,40 (s, 3H); 3,11 (m, 2H); 2,80 (m, 2H); 2,33 (m, 4H); 1,87-1,45 (br. m, 4H 20H voda); 1,42-1,16 (br. m, 40H); 0,90 (t, 6H).
Jedinjenje metoksi-PEG2000-estar-klik-glicerol C13/C14
[0883]
[0884] Na isti način kao C10, C13/14 je sintetisan iz 1-azido-3-(tridekanoiloksi)propan-2-il tetradekanoata.
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,55 (s, 1H); 5,39 (kvint, 1H); 4,61 (m, 2H); 4,39-3,81 (br. m, 8H); 3,79-3,49 (br. m, 170-200H); 3,40 (s, 3H); 3,10 (m, 2H); 2,80 (m, 2H); 2,33 (m, 4H); 1,75-1,47 (m, 4H); 1,42-1,16 (br. m, 38H); 0,90 (t, 6H).
Jedinjenje metoksi-PEG2000-estar-klik-glicerol C13
[0885]
[0886] Na isti način kao C10, C13 je sintetisan iz 3-azidopropan-1,2-diil ditridekanoata.
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,68 (s, 1H); 5,33 (kvint, 1H); 4,65 (m, 2H); 4,36-3,85 (br. m, 8H); 3,78-3,55 (br. m, 170-200H); 3,40 (s, 3H); 3,15 (m, 2H); 2,80 (m, 2H); 2,33 (m, 4H); 1,78-1,38 (m, 4H 24H voda); 1,38-1,20 (br. m, 36H); 0,90 (t, 6H).
Jedinjenje metoksi-PEG2000-estar-klik-glicerol C12
[0887]
[0888] Na isti način kao C10, C12 je sintetisan iz 3-azidopropan-1,2-diil didodekanoata.
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,59 (s, 1H); 5,40 (kvint, 1H); 4,62 (m, 2H); 4,37-3,83 (br. m, 8H); 3,78-3,48 (br. m, 170-200H); 3,40 (s, 3H); 3,12 (m, 2H); 2,82 (m, 2H); 2,33 (m, 4H); 2,09-1,82 (br. m, 7H voda); 1,60 (m, 4H); 1,39-1,17 (br. m, 32H); 0,90 (t, 6H)
Jedinjenje: 3-((1H-imidazol-1-karbonil)oksi)propan-1,2-diil ditetradekanoat
[0889]
[0890] Rastvoru 3-hidroksipropan-1,2-diil ditetradekanoata (0,10 g, 0,2 mmol), CDI (65 mg, 0,40 mmol) i Et3N u DCM (1 ml) je omogućeno da se meša na RT tokom 2 h. Posle ovog vremena reakcija je ugašena sa 10% limunskom kiselinom i slojevi su razdvojeni. Organske supstance su isprane slanim rastvorom, osušene preko MgSO4, filtrirane i koncentrovane kako bi se dobio 3((1H-imidazol-1-karbonil)oksi)propan-1,2-diil ditetradekanoat (97 mg, 80%) sa kojim je nastavljeno bez prečišćavanja.
Metoksi-PEG2000-karbamat-glicerol C14
[0891]
[0892] 3-((1H-imidazol-1-karbonil)oksi)propan-1,2-diil ditetradekanoat (97 mg, 0,16 mmol) MeO-PEG2K-NH2(100 mg, 0,053 mmol), DMAP (2 mg, 0,011 mmol) i Hanigova (Hunig's) baza (0,055 ml, 0,32 mmol) su kombinovani u THF i omogućeno je da se mešaju na 65 °C tokom 6 h, i zatim na RT tokom 48 h. Reakcija je koncentrovana i rastvorena u DCM radi prečišćavanja. Sirovi materijal je prečišćen pomoću hromatografije na silika gelu (0-20% MeOH u DCM sa 1% NH4OH) kako bi obezbedio 107 mg željenog proizvoda.
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,26 (m, 1H); 4,36-4,06 (br. m, 4H); 3,93-3,42 (br. m, 170-200H); 3,39 (s, 3H); 3,30 (m, 2H); 2,32 (t, 4H); 1,78 (m, 4H); 1,61 (br. m, 5H voda); 1,42-1,20 (br. m, 40H); 0,89 (t, 6H).
Reprezentativna procedura 2
[0893]
3-(benziloksi)propan-1,2-diil ditetradekanoat
[0894]
[0895] Rastvoru 3-(benziloksi)propan-1,2-diola (1,0 g, 5,5 mmol) i miristinske kiseline (3,1 g, 13,7 mmol) u DCM (26 ml) dodati su DCC (2,8 g, 13,7 mmol) i DMAP (1,7 g, 13,7 mmol), i reakciji je omogućeno da se meša na RT tokom 72 sata. Smeša je filtrirana, i čvrste supstance su isprane sa DCM. Filtrat je ispran sa 10% limunskom kiselinom, zasićenim natrijum bikarbonatom, slanim rastvorom, osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0-30% EtOAc/heksani) obezbedilo je 3-(benziloksi)propan-1,2-diil ditetradekanoat (2,78 g, 84%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,34 (br. m, 5H); 5,27 (kvint, 1H); 4,56 (m, 2H); 4,44-4,14 (br. m, 2H); 3,61 (m, 2H); 2,32 (m, 4H); 1,62 (m, 4H); 1,40-1,06 (br. m, 40H); 0,90 (t, 6H).
3-hidroksipropan-1,2-diil ditetradekanoat
[0896]
[0897] U azotom napunjen flask koji sadrži paladijum na ugljeniku (10 tež. %, 490 mg, 0,461 mmol) dodati su 3-(benziloksi)propan-1,2-diil ditetradekanoat (2,78 g, 4,61 mmol) i EtOH (22 ml). Flask je evakuisan i ponovo napunjen sa H2tri puta, i omogućeno je da se meša na RT i 1 atm H2tokom 12 sati. Smeša je filtrirana kroz celit, isprana sa EtOAc, i filtrat je koncentrovan in vacuo kako bi obezbedio 3-hidroksipropan-1,2-diil ditetradekanoat (1,50 g, 64%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,11 (kvint, 1H); 4,30 (m, 2H); 3,75 (m, 2H); 2,36 (m, 4H); 1,72-1,10 (br. m, 44H); 0,91 (t, 6H).
5-(2,3-bis(tetradekanoiloksi)propoksi)-5-oksopentanska kiselina
[0898]
[0899] Rastvoru 3-hidroksipropan-1,2-diil ditetradekanoata (300 mg, 0,585 mmol) i glutarne kiseline (77 mg, 0,585 mmol) u DCM (4 ml) dodati su DCC (121 mg, 0,585 mmol) i DMAP (71 mg, 0,585 mmol), i reakciji je omogućeno da se meša na RT tokom 12 sati. Smeša je filtrirana i čvrste supstance su isprane sa DCM. Filtrat je ispran sa 10% limunskom kiselinom, slanim rastvorom, osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0-20% MeOH/DCM) obezbedilo je 5-(2,3-bis(tetradekanoiloksi)propoksi)-5-oksopentansku kiselinu (93 mg, 25%).<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,29 (kvint, 1H); 4,41-4,11 (br. m, 4H); 2,46 (m, 4H); 2,34 (m, 4H); 1,99 (m, 2H); 1,63 (m, 4H); 1,40-1,10 (br. m, 40H); 0,90 (t, 6H).
4-(2,3-bis(tetradekanoiloksi)propoksi)-4-oksobutanska kiselina
[0900]
[0901] Na isti način kao 5-(2,3-bis(tetradekanoiloksi)propoksi)-5-oksopentanska kiselina, 4-(2,3-bis(tetradekanoiloksi)propoksi)-4-oksobutanska kiselina je sintetisana iz 3-hidroksipropan-1,2-diil ditetradekanoata (300 mg, 0,585 mmol), glutarne kiseline (69 mg, 0,585 mmol), DCC (121 mg, 0,585 mmol) i DMAP (71 mg, 0,585 mmol) u DCM (4 ml). Prinos (267 mg, 75%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,29 (kvint, 1H); 4,41-4,11 (br. m, 4H); 2,69 (m, 41-1); 2,34 (m, 4H); 1,63 (m, 4H); 1,46-1,10 (br. m, 10H); 0,90 (t, 6H).
Jedinjenje metoksi-PEG2000-estar-propil-estar-glicerol C14
[0902]
[0903] Rastvoru metoksi-PEG2000(247 mg, 0,124 mmol) i 5-(2,3-bis(tetradekanoiloksi)propoksi)-5-oksopentanske kiseline (93 mg, 0,148 mmol) u DCM (2 ml) dodati su DCC (31 mg, 0,148 mmol) i DMAP (19 mg, 0,148 mmol) i reakciji je omogućeno da se meša na 40 °C tokom 12 sati. Smeši je omogućeno da se ohladi do RT i koncentrovana je in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO C18 fleš hromatografije (50-100% [MeCN 0,1% TFA]/[voda 0,1% TFA]) obezbedilo je željeni proizvod (75 mg, 23%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,28 (kvint, 1H); 4,38-4,07 (br. m, 6H); 3,90 (m, 2H); 3,79-3,48 (br. m, 170-200H); 3,40 (s, 3H); 2,48-1,89 (br. m, 10H); 1,64 (br. m, 4H 7,25H voda); 1,41-1,08 (br. m, 40H); 0,90 (t, 6H).
Jedinjenje: metoksi-PEG2000-estar-etil-estar-glicerol C14
[0904]
[0905] Na isti način kao u reprezentativnoj proceduri 2, jedinjenje je sintetisano iz metoksi-PEG2000(272 mg, 0,136 mmol), 4-(2,3-bis(tetradekanoiloksi)propoksi)-4-oksobutanske kiseline (100 mg, 0,163 mmol), DCC (34 mg, 0,163 mmol), i DMAP (20 mg, 0,163 mmol) u DCM (2 ml). Prinos (134 mg, 38%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,28 (m, 1H); 4,39-4,10 (br. m, 6H); 3,89 (m, 2H); 3,79-3,48 (br. m, 170-200H); 3,40 (s, 3H); 2,67 (m, 4H); 2,33 (m, 4H); 1,63 (m, 4H 7,25 H voda); 1,42-1,16 (br. m, 40H); 0,90 (t, 6H).
Jedinjenje metoksi-PEG2000-estar-C18
Reprezentativna procedura 3
Metoksi-PEG2000-estar-C18
[0906]
[0907] Rastvoru metoksi-PEG2000(1,0 g, 0,50 mmol) i stearinske kiseline (171 mg, 0,60 mmol) u DCM (10 ml) dodati su DCC (124 mg, 0,60 mmol) i DMAP (73 mg, 0,60 mmol) i reakciji je omogućeno da se meša na RT tokom 48 sati. Reakcija je koncentrovana in vacuo, i prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0-20% MeOH/DCM) obezbedilo je željeni proizvod (620 mg, 55%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,24 (t, 2H); 3,94-3,52 (br. m, 170-200H); 3,40 (s, 3H); 2,34 (t, 2H); 1,65 (m, 4H); 1,28 (br. m, 2H 2H voda); 0,90 (t, 3H).
Jedinjenje: metoksi-PEG2000-estar-C18:1 (9)
[0908]
1
[0909] Na isti način kao reprezentativna procedura 3, jedinjenje je sintetisano iz metoksi-PEG2000(1,0 g, 0,50 mmol), oleinske kiseline (169 mg, 0,60 mmol), DCC (124 mg, 0,60 mmol), i DMAP (73 mg, 0,60 mmol) u DCM (10 ml). Prinos (298 mg, 26%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,37 (m, 2H); 4,24 (t, 2H); 3,94-3,46 (br. m, 170-200H); 3,40 (s, 3H); 2,34 (t, 2H); 2,04 (m, 4H); 1,68 (m, 2H 3H voda); 1,46-1,18 (br: m, 20H); 0,90 (t, 3H).
Jedinjenje metoksi-PEG2000-estar-C18:2 (9,12)
[0910]
[0911] Na isti način kao reprezentativna procedura 3, jedinjenje je sintetisano iz metoksi-PEG2000(10 g, 0,50 mmol), linolne kiseline (168 mg, 0,60 mmol), DCC (124 mg, 0,60 mmol), i DMAP (73 mg, 0,60 mmol) u DCM (10 ml). Prinos (451 mg, 40%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,38 (br. m, 4H); 4,24 (t, 2H); 3,94-3,50 (br. m, 170-200H); 3,40 (s, 3H); 2,79 (t, 2H); 2,34 (t, 2H); 2,06 (m, 4H); 1,67 (br. m, 2H 2H voda); 1,47-1,21 (br. m, 14H); 0,91 (t, 3H).
Jedinjenje: metoksi-PEG2000-estar-C20
[0912]
[0913] Na isti način kao reprezentativna procedura 3, jedinjenje je sintetisano iz metoksi-PEG2000(1,0 g, 0,50 mmol), arahidinske kiseline (188 mg, 0,60 mmol), DCC (124 mg, 0,60 mmol), i DMAP (73 mg, 0,60 mmol) u DCM (10 ml). Prinos (739 mg, 64%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,24 (t, 2H); 3,96-3,50 (br. m, 170-200H); 3,40 (s, 3H); 2,34 (t, 2H); 1,63 (br. m, 2H 1H voda); 1,44-1,10 (32H); 0,90 (t, 3H).
2
Benzil-PEG2000-OH
[0914]
[0915] Rastvoru PEG2000(6,0 g, 3,0 mmol) u THF (30 ml) dodat je kalijum terc-butoksid (168 mg, 1,50 mmol) i rastvoru je omogućeno da se meša tokom 30 minuta pre dodavanja benzil bromida (180 µl, 1,50 mmol) u THF (6 ml) tokom 12 sati (0,125 mmol/h). Pošto je dodavanje završeno, reakciji je omogućeno da se meša na RT tokom 4 sata i zatim je koncentrovana in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO C18 fleš hromatografije (0-100% [MeCN 0,1% TFA]/[voda 0,1% TFA]) obezbedilo je željeni proizvod (1,80 g, 29%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,35 (br. m, 5H); 4,59 (s, 2H); 3,94-3,37 (br. m, 170-200H); 2,07-1,78 (br.3,5H voda).
Jedinjenje: benzil-PEG2000-estar-C18
[0916]
[0917] Na isti način kao reprezentativna procedura 3, jedinjenje je sintetisano iz benzil-PEG2000-OH (218 mg, 0,104 mmol), stearinske kiseline (36 mg, 0,125 mmol), DCC (26 mg, 0,125 mmol), i DMAP (16 mg, 0,125 mmol) u DCM (2 ml). Prinos (150 mg, 61%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,35 (br. m, 5H); 4,59 (s, 2H); 4,24 (m, 2H); 3,95-3,31 (br. m, 170-200H); 2,34 (t, 2H); 1,64 (br. m, 2H 2H voda); 1,41-1,15 (br. m, 28H); 0,90 (t, 3H).
Jedinjenje: benzil-PEG2000-estar-C18:2 (9,12)
[0918]
[0919] Na isti način kao reprezentativna procedura 3, jedinjenje je sintetisano iz benzil-PEG2000-OH (200 mg, 0,095 mmol), linolne kiseline (32 mg, 0,114 mmol), DCC (24 mg, 0,114 mmol), i DMAP (14 mg, 0,114 mmol) u DCM (2 ml). Prinos (110 mg, 49%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,36 (br. m, 5H); 5,46-5,26 (br. m, 4H); 4,59 (s, 2H); 4,24 (t, 2H); 3,94-3,39 (br. m, 170-200H; 2,79 (t, 2H); 2,34 (t, 2H); 2,06 (m, 4H); 1,68 (br. m, 2H 5H voda); 1,48-1,23 (br. m, 14H); 0,91 (t, 3H).
Jedinjenje: benzil-PEG2000-estar-C18:1 (9)
[0920]
[0921] Na isti način kao reprezentativna procedura 3, jedinjenje je sintetisano iz benzil-PEG2000-OH (200 mg, 0,095 mmol), oleinske kiseline (32 mg, 0,114 mmol), DCC (24 mg, 0,114 mmol), i DMAP (14 mg, 0,114 mmol) u DCM (2 ml). Prinos (94 mg, 42%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,36 (br. m, 5H); 5,36 (m, 2H); 4,59 (s, 2H); 4,24 (t, 2H); 3,95-3,35 (br. m, 170-200H); 2,35 (t, 2H); 2,03 (m, 4H); 1,64 (m, 2H); 1,48-1,16 (br. m, 20H); 0,90 (t, 3H).
4
Jedinjenje: benzil-PEG2000-estar-C20
[0922]
[0923] Na isti način kao reprezentativna procedura 3, jedinjenje je sintetisano iz benzil-PEG2000-OH (200 mg, 0,095 mmol), arahidinske kiseline (36 mg, 0,114 mmol), DCC (24 mg, 0,114 mmol), i DMAP (14 mg, 0,114 mmol) u DCM (2 ml). Prinos (101 mg, 44%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,36 (br. m, 5H); 4,59 (s, 2H); 4,24 (t, 2H); 3,95-3,35 (br. m, 170-200H); 2,34 (t, 2H); 1,78 (br.3H voda); 1,63 (m, 2H); 1,40-1,17 (br. m, 34H); 0,90 (t, 3H).
Jedinjenje: HO-PEG2000-estar-C18
[0924]
[0925] U azotom napunjen flask koji sadrži paladijum na ugljeniku (10 tež. %, 74 mg, 0,070 mmol) dodati su benzil-PEG2000-estar-C18 (822 mg, 0,35 mmol) i MeOH (20 ml). Flask je evakuisan i ponovo napunjen sa H2tri puta, i omogućeno je da se meša na RT i 1 atm H2tokom 12 sati. Smeša je filtrirana kroz celit, isprana sa DCM, i filtrat je koncentrovan in vacuo kako bi obezbedio željeni proizvod (692 mg, 88%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 4,24 (t, 2H); 3,95-3,34 (br. m, 170-200H); 2,34 (t, 2H); 1,63 (m, 2H); 1,40-1,17 (br. m, 28H); 0,90 (t, 3H).
Jedinjenje: benzil-PEG2000-estar-etil-alkin
[0926]
[0927] Rastvoru benzil-PEG2000-OH (1,0 g, 0,48 mmol) i 4-pentinske kiseline (70 mg, 0,71 mmol) u DCM (10 ml) dodati su DCC (147 mg, 0,71 mmol) i DMAP (87 mg, 0,71 mmol), i reakciji je omogućeno da se meša na RT tokom 12 sati. Smeša je filtrirana, čvrsta supstanca je isprana sa DCM, i koncentrovana in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0-100% DCM/[DCM 20% MeOH 1% NH4OH]) obezbedilo je željeni proizvod (436 mg, 42%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,36 (br. m, 5H); 4,59 (s, 2H); 4,29 (t, 2H); 3,95-3,35 (br. m, 170-200H); 2,67-2,47 (br. m, 4H); 2,01 (m, 1H); 1,67 (br.3H voda).
Jedinjenje: benzil-PEG2000-estar-klik-glicerol C10
[0928]
[0929] Rastvoru benzil-PEG2000-estar-etil-alkina (175 mg, 0,080 mmol) i 3-azidopropan-1,2-diil bis(dekanoata) (51 mg, 0,119 mmol) u terc-butanolu (2 ml) i vodi (2 ml) dodati su CuSO4(7 mg, 0,040 mmol) i natrijum askorbat (16 mg, 0,080 mmol) i reakciji je omogućeno da se meša na RT tokom 12 sati. Smeša je koncentrovana in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0,100% DCM/[DCM 20% MeOH 1% NH4OH]) obezbedilo je željeni proizvod (161 mg, 77%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 8,08 (m, 1H); 7,53-7,30 (br. m, 5H); 5,39 (m, 1H); 4,59 (s, 2H); 4,54-3,98 (br. m, 4H); 3,94-3,36 (br. m, 170-200H); 3,06 (t, 2H); 2,78 (t, 2H); 2,34 (m, 4H); 2,01-1,75 (br, 2H voda); 1,62 (m, 4H); 1,45-1,12 (br. m, 24H); 0,90 (t, 6H).
Benzil-PEG2000-estar-klik-glicerol C10
[0930]
[0931] Na isti način kao benzil-PEG2000-estar-klik-glicerol C10, benzil-PEG2000-estar-klik-glicerol C10 je sintetisan iz benzil-PEG2000-estar-etil-alkina (175 mg, 0,080 mmol), 3-azidopropan-1,2-diil ditetradekanoata (64 mg, 0,119 mmol), CuSO4(7 mg, 0,040 mmol) i natrijum askorbata (16 mg, 0,080 mmol) u terc-butanolu (2 ml) i vodi (2 ml). Prinos (156 mg, 72%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 8,07 (s, 1H); 7,57-7,30 (br. m, 5H); 5,39 (m, 1H); 4,59 (s, 2H); 4,54-4,00 (br. m, 4H); 3,97-3,38 (br. m, 170-200H); 3,08 (t, 2H); 2,78 (t, 2H); 2,33 (m, 4H); 1,97-1,44 (br. m, 4H 8H voda); 1,44-1,16 (br. m, 40H); 0,90 (t, 6H).
HO-PEG2000-estar-klik-glicerol-C10
[0932]
[0933] Na isti način kao HO-PEG2000-estar-C18, HO-PEG2000-estar-klik-glicerol-C10 je sintetisan iz benzil-PEG2000-estar-klik-glicerola C10 (161 mg, 0,061 mmol) i paladijuma na ugljeniku (10 tež. %, 7 mg, 0,061 mmol) pod 1 atm H2u MeOH (2 ml). Prinos (58 mg, 37%).<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,45 (s, 1H); 5,39 (m, 1H); 4,59 (m, 2H); 4,39-4,03 (br. m, 4H); 3,95-3,37 (br. m, 170-200H); 3,06 (t, 2H); 2,78 (t, 2H); 2,33 (m, 4H); 2,04 (br. 4H voda); 1,61 (m, 4H); 1,44-1,19 (br. m, 24H); 0,90 (t, 6H).
HO-PEG2000-estar-klik-glicerol-C14
[0934]
[0935] Na isti način kao HO-PEG2000-estar-C18, HO-PEG2000-estar-klik-glicerol-C14 je sintetisan iz benzil-PEG2000-estar-klik-glicerola C14 (156 mg, 0,057 mmol) i paladijuma na ugljeniku (10 tež. %, 6 mg, 0,057 mmol) pod 1 atm H2u MeOH (2 ml). Prinos (42 mg, 28%).<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,45 (s, 1H); 5,39 (m, 1H); 4,59 (m, 2H); 4,39-4,03 (br. m, 4H); 3,95-3,37 (br. m, 170-200H); 3,06 (t, 2H); 2,78 (t, 2H); 2,33 (m, 4H); 2,04 (br. 4H voda); 1,61 (m, 4H); 1,44-1,19 (br. m, 40H); 0,90 (t, 6H).
O-PEG2000-estar-klik-glicerol-C14
[0936]
[0937] Rastvoru 3-hidroksipropan-1,2-diil ditetradekanoata (78 mg, 0,15 mmol), DCC (31 mg, 0,15 mmol) i DMAP (19 mg, 0,15 mmol), u DCM (4 ml) dodat je HO-PEG2000, COOH u DCM (2 ml) pri stopi od 50 mg/h tokom 5 sati. Pošto je dodavanje završeno, reakciji je omogućeno da nastavi da se meša na RT tokom 12 sati. Reakcija je filtrirana, čvrsta supstanca je isprana sa DCM, i filtrat je koncentrovan in vacuo. Prečišćavanje pomoću ISCO fleš hromatografije na silicijum dioksidu (0-100% [MeCN 0,1% TFA]/[voda 01% TFA]).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 5,30 (m, 1H); 4,45-4,10 (br. m, 6H); 3,95-3,34 (br. m, 170-200H); 2,33 (t, 4H); 1,81 (br. 4H voda); 1,63 (m, 4H); 1,39-1,16 (br. m, 40H); 0,90 (t, 6H).
Benzil-PEG2000-estar-etil-alkin
[0938]
[0939] Rastvoru HO-PEG2000-NH2(250 mg, 0,125 mmol) i 4-pentinske kiseline (12 mg, 0,125 mmol) u THF (4 ml) dodati su (benzotriazol-1-iloksi)tripirolidinofosfonijum heksafluorofosfat (228 mg, 0,438 mmol) i trietilamin (61 μl, 0,438 mmol) i reakciji je omogućeno da se meša na RT tokom 12 sati. Smeša je koncentrovana in vacuo. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću ISCO C18 fleš hromatografije (0-100% [MeCN 0,1% TFA]/[voda 0,1% TFA]). Proizvod je prenet u DCM i ispran sa 5% natrijum karbonatom, slanim rastvorom, osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan in vacuo. Prinos (91 mg, 35%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 3,98-3,30 (br. m, 170-200H); 2,55 (m, 2H); 2,44 (m, 2H); 2,06-1,73 (br. m, 3H 5H voda).
HO-PEG2000-estar-klik-glicerol-C14
[0940]
[0941] Rastvoru benzil-PEG2000-estar-etil-alkina (91 mg, 0,043 mmol) i 3-azidopropan-1,2-diil ditetradekanoata (28 mg, 0,052 mmol) u terc-butanolu (1,5 ml) i vodi (1,5 ml) dodati su CuSO4(4 mg, 0,022 mmol) i natrijum askorbat (9 mg, 0,043 mmol). Reakciji je omogućeno da se meša na RT preko noći. Smeša je koncentrovana in vacuo. Sirovi proizvod je prečišćen pomoću ISCO C18 fleš hromatografije (0-100% [MeCN 0,1% TFA]/[voda 0,1% TFA]). Proizvod je prenet u DCM i ispran sa 5% natrijum karbonatom, slanim rastvorom, osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran, i koncentrovan in vacuo. Prinos (34 mg, 30%).
<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: ppm 7,52 (s, 1H); 5,38 (m, 1H); 4,65-3,98 (br. m, 6H); 3,95-3,30 (br. m, 170-200H); 3,09 (t, 2H); 2,63 (t, 2H); 1,76 (m, 4H); 1,82-1,52 (br. m, 4H 2H voda); 1,41-1,16 (br. m, 40H); 0,90 (t, 6H).
EKVIVALENTI
[0942] Sve definicije, kao što su ovde definisane i upotrebljene, treba razumeti da imaju prvenstvo u odnosu na definicije iz rečnika, i/ili uobičajena značenja definisanih termina.
[0943] Neodređene članove, kao što se ovde upotrebljavaju u specifikaciji i u patentnim zahtevima, osim ukoliko nije jasno naznačeno suprotno, treba razumeti da znače "najmanje jedan".
[0944] Frazu "i/ili", kao što se ovde upotrebljava u specifikaciji i u patentnim zahtevima, treba razumeti da znači "bilo jedan ili oba" tako spojenih elemenata, tj. elemente koji su spojeno prisutni u nekim slučajevima i razdvojeno prisutni u drugim slučajevima. Više elemenata navedenih sa "i/ili" treba tumačiti na isti način, tj. "jedan ili više" tako spojenih elemenata. Drugi elementi mogu opciono biti prisutni osim elemenata koji su specifično identifikovani klauzulom "i/ili", bilo da su srodni ili nesrodni sa onim elementima koji su specifično identifikovani. Stoga, kao neograničavajući primer, pozivanje na "A i/ili B", kada se upotrebljava u sprezi sa otvorenim jezikom, kao što je "sadrži", može označavati, u jednom primeru izvođenja, samo A (opciono uključujući elemente koji nisu B); u sledećem primeru izvođenja, samo B (opciono uključujući elemente koji nisu A); u još jednom primeru izvođenja, i A i B (opciono uključujući druge elemente); itd. Kao što se ovde upotrebljava u specifikaciji i u patentnim zahtevima, "ili" treba razumeti da ima isto značenje kao "i/ili" kao što je prethodno definisano. Na primer, kada se odvajaju stavke na listi, "ili" ili "i/ili" će se tumačiti kao inkluzivno, tj. uključivanje najmanje jednog, ali takođe uključivanje više od jednog, od broja ili liste elemenata, i, opciono, dodatne stavke koje nisu na listi. Samo termini koji su jasno naznačeni u suprotnosti, kao što su "samo jedan od" ili "tačno jedan od", ili, kada se upotrebljava u patentnim zahtevima, "sastoji se od", označavaće uključivanje tačno jednog elementa od broja ili liste elemenata. Generalno, termin "ili" kao što se ovde upotrebljava će se tumačiti samo kao označavanje isključivih alternativa (tj. "jedan ili drugi, ali ne oba") kada mu prethode termini isključivosti, kao što su "bilo jedan", "jedan od", "samo jedan od", ili "tačno jedan od". "Sastoji se suštinski od", kada se upotrebljava u patentnim zahtevima, imaće svoje uobičajeno značenje kao što se upotrebljava u oblasti patentnog prava.
[0945] Kao što se ovde upotrebljava u specifikaciji i u patentnim zahtevima, frazu "najmanje jedan", u odnosu na listu jednog ili više elemenata, treba razumeti da znači najmanje jedan element odabran od bilo kog ili više elemenata na listi elemenata, ali ne mora nužno da uključuje najmanje jedan od svakog elementa koji je specifično naveden unutar liste elemenata i ne isključujući bilo koju kombinaciju elemenata na listi elemenata. Ova definicija takođe dozvoljava da drugi elementi mogu opciono biti prisutni osim elemenata koji su specifično identifikovani unutar liste elemenata na koje se odnosi fraza "najmanje jedan", bilo da su srodni ili nesrodni sa onim elementima koji su specifično identifikovani. Stoga, kao neograničavajući primer, "najmanje jedan od A i B" (ili, ekvivalentno, "najmanje jedan od A ili B", ili, ekvivalentno "najmanje jedan od A i/ili B") može označavati, u jednom primeru izvođenja, najmanje jedan, opciono uključujući više od jednog, A, bez prisustva B (i opciono uključujući elemente koji nisu B); u sledećem primeru izvođenja, najmanje jedan, opciono uključujući više od jednog, B, bez prisustva A (i opciono uključujući elemente koji nisu A); u još jednom primeru izvođenja, najmanje jedan, opciono uključujući više od jednog, A, i najmanje jedan, opciono uključujući više od jednog, B (i opciono uključujući druge elemente); itd. Svaka mogućnost predstavlja odvojeni primer izvođenja predmetnog pronalaska.
[0946] Takođe treba razumeti da, osim ukoliko nije jasno naznačeno suprotno, u bilo kom postupku za koji se ovde traži patentna zaštita koji uključuje više od jednog koraka ili radnje, redosled koraka ili radnji postupka nije nužno ograničen na redosled u kom su koraci ili radnje iz postupka nabrojani.
[0947] U patentnim zahtevima, kao i u prethodno navedenoj specifikaciji, sve prelazne fraze kao što su "sadrži", "uključuje", "nosi", "ima", "koji sadrži", "koji uključuje", "drži", "sačinjeno od", i slično treba razumeti kao otvorene, tj. da podrazumevaju uključujući ali ne ograničavajući se na. Samo prelazne fraze "sastoji se od" i "sastoji se suštinski od" biće zatvorene ili poluzatvorene prelazne fraze, respektivno, kao što je izneto u Priručniku za procedure ispitivanja patenata Kancelarije za patente Sjedinjenih Država, odeljak 2111.03.
1

Claims (19)

  1. Patentni zahtevi 1. Lipidna nanočestica (LNP) koja inkapsulira iRNK koja kodira terapijski protein, naznačena time što LNP sadrži katjonski lipid, pomoćni lipid, strukturni lipid, i stabilizator, pri čemu je katjonski lipid jonizujući lipid, pri čemu je stabilizator PEG lipid, i pri čemu je PEG lipid jedinjenje Formule (V-OH):
    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu: r je ceo broj između 1 i 100, uključujući; i R<5>je opciono supstituisani C10-40alkil, opciono supstituisani C10-40alkenil, ili opciono supstituisani C10-40alkinil; i pri čemu LNP ne pokreće ubrzani klirens iz krvi.
  2. 2. LNP prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što je jonizujući lipid Formule (XI):
    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu: 1 je odabran od 1, 2, 3, 4, i 5; M i M' su nezavisno odabrani od -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)N(R')-, -P(O)(OR')O-, -S-S-, aril grupe, i heteroaril grupe; M1je veza ili M'; R2i R3su nezavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od H, C1-14alkila, i C2-14alkenila; R4je nesupstituisani C1-3alkil, ili -(CH2)nQ, u kome je n odabrano od 2, 3, ili 4 i Q je OH, -NHC(S)N(R)2, -NHC(O)N(R)2, -N(R)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(R)R8, - 2 NHC(=NR9)N(R)2, -NHC(=CHR9)N(R)2, -OC(O)N(R)2, -N(R)C(O)OR, heteroaril ili heterocikloalkil; R' je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-8alkila, C2-18alkenila, -R<∗>YR", -YR", i H; R" je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C3-14alkila i C3-14alkenila; R<∗>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od C1-12alkila i C2-12alkenila; i Y je nezavisno C3-6karbocikl.
  3. 3. LNP prema patentnom zahtevu 2, naznačena time što jedinjenje Formule (XI) ima strukturu jedinjenja 18:
    ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.
  4. 4. LNP prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačena time što je jedinjenje Formule (V-OH):
    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
  5. 5. LNP prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačena time što PEG lipid sadrži PEG molekul prosečne molekulske težine od: (i) 2.000 Da; ili (ii) manje od 2.000 Da, opciono oko 1.500 Da, oko 1.000 Da, ili oko 500 Da.
  6. 6. LNP prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2, naznačena time što je jedinjenje Formule (V-OH) HO-PEG2000-estar-C18.
  7. 7. LNP prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačena time što je jedinjenje Formule (V-OH):
    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
  8. 8. LNP prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačena time što je pomoćni lipid nekatjonski pomoćni lipid i strukturni lipid je holesterol, i pri čemu LNP ima molski odnos od oko 45-65% katjonskog lipida, oko 0,15-15% PEG lipida, oko 15-45% holesterola i oko 5-25% nekatjonskog pomoćnog lipida.
  9. 9. LNP prema patentnom zahtevu 8, naznačena time što LNP sadrži manje od 0,5% (tež./tež.) PEG lipida.
  10. 10. LNP prema patentnom zahtevu 8, naznačena time što LNP sadrži manje od 0,25% (tež./tež.) PEG lipida.
  11. 11. LNP prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačena time što je pomoćni lipid: (i) nekatjonski pomoćni lipid koji sadrži najmanje jedan lanac masne kiseline od najmanje 8C i najmanje jednu polarnu glavenu funkcionalnu grupu; (ii) cviterjonski nekatjonski pomoćni lipid; (iii) lipid koji nije fosfatidil holin (PC); ili (iv) 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DSPC).
  12. 12. LNP prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 ili 11, naznačena time što pomoćni lipid: (i) kompetitivno inhibira vezivanje fosfatidilholina za CD36; ili 4 (ii) ne vezuje se ili ima nisku aktivnost vezivanja za CD36.
  13. 13. LNP prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačena time što je strukturni lipid sterol, na primer holesterol.
  14. 14. LNP prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što iRNK sadrži (a) hemijski modifikovane baze ili šećere, i modifikacije okosnice; i/ili (b) miR vezujuće mesto, opciono pri čemu miR vezujuće mesto: (i) je odabrano od miR 126, miR 155 i miR 1423p; ili (ii) sadrži miR-122 vezujuće mesto i takođe sadrži jedno ili više miR vezujućih mesta odabranih iz grupe koja se sastoji od miR-142, miR-146, miR-155, miR-126, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27.
  15. 15. LNP prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što je LNP okarakterisana kao da ima redukovano vezivanje za B1a ćelije i/ili redukovanu aktivnost aktivacije B1a ćelija.
  16. 16. Lipidna nanočestica (LNP) za upotrebu u postupku isporučivanja terapijskog nivoa proteina od interesa subjektu, pri čemu je LNP LNP prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu postupak sadrži primenu prve doze i druge doze LNP subjektu; i pri čemu prva doza LNP ne indukuje imunski odgovor koji promoviše ubrzani klirens iz krvi (ABC) nakon primene druge doze LNP.
  17. 17. LNP za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, naznačeno time što je imunski odgovor anti-PEG IgM ili anti-PEG IgG odgovor.
  18. 18. LNP za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 16-17, naznačeno time što prva doza LNP ne aktivira CD36-zavisan signalni put u imunskoj ćeliji nakon primene druge doze LNP.
  19. 19. LNP za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 16-18, naznačeno time što je interval između prve doze i druge doze oko 21 dan ili manji, i/ili pri čemu postupak dodatno sadrži primenu subjektu dopunskog agensa koji inhibira imunske odgovore.
RS20220606A 2015-12-10 2016-12-10 Kompozicije i postupci za isporuku terapijskih agenasa RS63336B1 (sr)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562265973P 2015-12-10 2015-12-10
US201562266581P 2015-12-12 2015-12-12
US201662311386P 2016-03-21 2016-03-21
US201662311388P 2016-03-21 2016-03-21
US201662311380P 2016-03-21 2016-03-21
US201662350172P 2016-06-14 2016-06-14
US201662350165P 2016-06-14 2016-06-14
US201662413027P 2016-10-26 2016-10-26
US201662413050P 2016-10-26 2016-10-26
EP16873489.5A EP3386484B1 (en) 2015-12-10 2016-12-10 Compositions and methods for delivery of therapeutic agents
PCT/US2016/000129 WO2017099823A1 (en) 2015-12-10 2016-12-10 Compositions and methods for delivery of therapeutic agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63336B1 true RS63336B1 (sr) 2022-07-29

Family

ID=59013888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220606A RS63336B1 (sr) 2015-12-10 2016-12-10 Kompozicije i postupci za isporuku terapijskih agenasa

Country Status (17)

Country Link
US (5) US10556018B2 (sr)
EP (2) EP3964200A1 (sr)
JP (2) JP7080172B2 (sr)
AU (2) AU2016366978B2 (sr)
CA (1) CA3007955A1 (sr)
CY (1) CY1125308T1 (sr)
DK (1) DK3386484T3 (sr)
ES (1) ES2924407T3 (sr)
HR (1) HRP20220652T1 (sr)
LT (1) LT3386484T (sr)
MD (1) MD3386484T2 (sr)
PL (1) PL3386484T3 (sr)
PT (1) PT3386484T (sr)
RS (1) RS63336B1 (sr)
SI (1) SI3386484T1 (sr)
SM (1) SMT202200358T1 (sr)
WO (1) WO2017099823A1 (sr)

Families Citing this family (306)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3052521A1 (en) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
PL4023249T3 (pl) 2014-04-23 2025-03-10 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
MA42502A (fr) 2015-07-21 2018-05-30 Modernatx Inc Vaccins contre une maladie infectieuse
MA42543A (fr) 2015-07-30 2018-06-06 Modernatx Inc Arn épitope peptidiques concatémériques
US11564893B2 (en) 2015-08-17 2023-01-31 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
JP6948313B6 (ja) 2015-09-17 2022-01-14 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療剤の細胞内送達のための化合物および組成物
AU2016341309A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Cancer vaccines
EP4011451A1 (en) 2015-10-22 2022-06-15 ModernaTX, Inc. Metapneumovirus mrna vaccines
AU2016342045A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
WO2017070601A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Nucleic acid vaccines for varicella zoster virus (vzv)
WO2017070624A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
AU2016342376A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Sexually transmitted disease vaccines
PL3386484T3 (pl) 2015-12-10 2022-07-25 Modernatx, Inc. Kompozycje i sposoby dostarczania środków terapeutycznych
LT3394030T (lt) 2015-12-22 2022-04-11 Modernatx, Inc. Junginiai ir kompozicijos terapinei medžiagai teikti intraceliuliniu būdu
US10465190B1 (en) 2015-12-23 2019-11-05 Modernatx, Inc. In vitro transcription methods and constructs
US20190298657A1 (en) * 2016-05-18 2019-10-03 Modernatx, Inc. Polynucleotides Encoding Acyl-CoA Dehydrogenase, Very Long-Chain for the Treatment of Very Long-Chain Acyl-CoA Dehydrogenase Deficiency
IL263079B2 (en) 2016-05-18 2024-05-01 Modernatx Inc Polynucleotides encoding relaxin
WO2017201342A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding jagged1 for the treatment of alagille syndrome
KR101916652B1 (ko) * 2016-06-29 2018-11-08 올릭스 주식회사 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도
CA3036831A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Modernatx, Inc. High purity rna compositions and methods for preparation thereof
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
MA46766A (fr) 2016-11-11 2019-09-18 Modernatx Inc Vaccin antigrippal
WO2018107088A2 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
US11384352B2 (en) 2016-12-13 2022-07-12 Modernatx, Inc. RNA affinity purification
MA47515A (fr) 2017-02-16 2019-12-25 Modernatx Inc Compositions immunogènes très puissantes
EP3595713A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS Vaccine
WO2018170322A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Crystal forms of amino lipids
WO2018170256A1 (en) * 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
WO2018170270A1 (en) * 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
CA3055653A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
WO2018170245A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
EP4186888B1 (en) 2017-03-15 2025-11-26 ModernaTX, Inc. Compound and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
EP3595676A4 (en) 2017-03-17 2021-05-05 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZOONOSES
JP2020514370A (ja) 2017-03-17 2020-05-21 キュアバック アーゲー 組合せ抗癌療法のためのｒｎａワクチン及び免疫チェックポイント阻害剤
US11905525B2 (en) 2017-04-05 2024-02-20 Modernatx, Inc. Reduction of elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
WO2018232120A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
SG11201911430PA (en) 2017-07-04 2020-01-30 Curevac Ag Novel nucleic acid molecules
CN107266677B (zh) * 2017-07-06 2019-09-13 中国科学院长春应用化学研究所 一种氧化响应性peg化脂质材料、其制备方法及其应用
EP3668979A4 (en) 2017-08-18 2021-06-02 Modernatx, Inc. METHOD OF HPLC ANALYSIS
WO2019036682A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. RNA VARIANTS POLYMERASE
MA49914A (fr) 2017-08-18 2021-04-21 Modernatx Inc Procédés analytiques par hplc
US11602557B2 (en) 2017-08-22 2023-03-14 Cure Vac SE Bunyavirales vaccine
US11813333B2 (en) 2017-08-28 2023-11-14 The University Of North Carolina At Chapel Hill Use of high molecular weight polyethylene glycol compositions to restore the efficacy of pegylated therapeutic compositions
EP3675817A1 (en) 2017-08-31 2020-07-08 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
WO2019055807A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZIKA VIRUS
CN107589193B (zh) * 2017-10-25 2020-05-05 南京工业大学 一种利用微反应装置筛选蛋白抑制剂的方法
TWI894123B (zh) * 2017-12-27 2025-08-21 日商武田藥品工業有限公司 含核酸之脂質奈米粒子及其用途
EP3746090A4 (en) 2018-01-29 2021-11-17 ModernaTX, Inc. RSV RNA Vaccines
US20190314291A1 (en) 2018-01-30 2019-10-17 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of agents to immune cells
MA52074A (fr) 2018-03-19 2021-01-27 Bayer Healthcare Llc Nouveaux systèmes d'endonucléase à arn programmable et leurs utilisations
CN108484667A (zh) * 2018-03-21 2018-09-04 江苏正大清江制药有限公司 一种新化合物磷酯酰3-羟基丙腈的合成工艺
WO2019193183A2 (en) 2018-04-05 2019-10-10 Curevac Ag Novel yellow fever nucleic acid molecules for vaccination
AU2019254591B2 (en) 2018-04-17 2025-12-11 CureVac SE Novel RSV RNA molecules and compositions for vaccination
WO2019226650A1 (en) * 2018-05-23 2019-11-28 Modernatx, Inc. Delivery of dna
EP3813874A1 (en) 2018-06-27 2021-05-05 CureVac AG Novel lassa virus rna molecules and compositions for vaccination
CA3111836A1 (en) * 2018-09-13 2020-03-19 Modernatx, Inc. Modified mrna for the treatment of progressive familial intrahepatic cholestasis disorders
JP7556848B2 (ja) 2018-09-14 2024-09-26 モデルナティエックス インコーポレイテッド ｍＲＮＡ治療薬を使用したがんを治療するための方法及び組成物
WO2020061295A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. High-purity peg lipids and uses thereof
WO2020061367A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
CA3113025A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Peg lipids and uses thereof
WO2020061457A1 (en) 2018-09-20 2020-03-26 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
HRP20240586T1 (hr) 2018-10-09 2024-07-19 The University Of British Columbia Sastavi i sustavi koji sadrže transfekcijske sposobne vezikle bez organskih otapala i deterdženta i s njim povezanim postupcima
CN113710799B (zh) 2018-11-28 2024-11-12 克里斯珀医疗股份公司 用于在LNP中使用的编码CAS9的优化mRNA
BR112021009422A2 (pt) 2018-12-21 2021-10-26 Curevac Ag Rna para vacinas contra malária
KR20210133218A (ko) 2019-01-31 2021-11-05 모더나티엑스, 인크. 볼텍스 믹서 및 연계된 방법, 시스템 및 이의 장치
US20220133908A1 (en) 2019-02-08 2022-05-05 Curevac Ag Coding rna administered into the suprachoroidal space in the treatment of ophthalmic diseases
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
AU2020224103A1 (en) 2019-02-20 2021-09-16 Modernatx, Inc. Rna polymerase variants for co-transcriptional capping
US11851694B1 (en) 2019-02-20 2023-12-26 Modernatx, Inc. High fidelity in vitro transcription
CN113874502A (zh) 2019-03-11 2021-12-31 摩登纳特斯有限公司 补料分批体外转录方法
SG11202109741VA (en) 2019-03-12 2021-10-28 Crispr Therapeutics Ag Novel high fidelity rna-programmable endonuclease systems and uses thereof
US12070495B2 (en) 2019-03-15 2024-08-27 Modernatx, Inc. HIV RNA vaccines
EP3959314A4 (en) * 2019-04-26 2023-02-08 Genevant Sciences Gmbh LIPIDNANOPARTICLES
US11026973B2 (en) * 2019-04-30 2021-06-08 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered phagocytic receptor compositions and methods of use thereof
MA55896A (fr) 2019-05-07 2022-03-16 Modernatx Inc Polynucléotides servant à perturber l'activité de cellule immunitaire et procédés pour les utiliser
MA55887A (fr) 2019-05-07 2022-03-16 Modernatx Inc Microarn de cellules immunitaires exprimés de manière différentielle pour la régulation de l'expression de protéines
EP3986452A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 CureVac AG Rotavirus mrna vaccine
JP7759311B2 (ja) 2019-07-19 2025-10-23 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー リコンビナーゼ組成物及び使用方法
US20220280639A1 (en) 2019-07-31 2022-09-08 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of rna interference agents to immune cells
EP4009955A1 (en) 2019-08-07 2022-06-15 ModernaTX, Inc. Compositions and methods for enhanced delivery of agents
KR20220044816A (ko) * 2019-08-12 2022-04-11 인티그레이티드 나노테라퓨틱스 아이엔씨. 하전 물질 전달을 위한 지질, 이의 제형 및 그 제조 방법
CN114502204A (zh) 2019-08-14 2022-05-13 库尔维科公司 具有降低的免疫刺激性质的rna组合和组合物
WO2021046265A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions comprising closed-ended dna and cleavable lipids and methods of use thereof
WO2021050986A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 Modernatx, Inc. Lnp-formulated mrna therapeutics and use thereof for treating human subjects
CA3155015A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Modernatx, Inc. Carbonate containing lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
AU2020350759A1 (en) 2019-09-19 2022-03-31 Modernatx, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
EP4031662A1 (en) 2019-09-20 2022-07-27 Translate Bio, Inc. Mrna encoding engineered cftr
JP2022552378A (ja) 2019-10-15 2022-12-15 モデルナティエックス インコーポレイテッド パーキンソン病を治療するための顆粒球マクロファージコロニー刺激因子をコードするｍＲＮＡ
JP2023502576A (ja) 2019-11-22 2023-01-25 ジェネレーション バイオ カンパニー イオン化可能な脂質およびそれらのナノ粒子組成物
US10980836B1 (en) 2019-12-11 2021-04-20 Myeloid Therapeutics, Inc. Therapeutic cell compositions and methods of manufacturing and use thereof
CN114901360A (zh) 2019-12-20 2022-08-12 库瑞瓦格股份公司 用于递送核酸的新型脂质纳米颗粒
AU2021205337A1 (en) 2020-01-10 2022-07-21 Modernatx, Inc. Methods of making tolerogenic dendritic cells
EP4093373A1 (en) * 2020-01-21 2022-11-30 eTheRNA Immunotherapies NV Lipid nanoparticles
KR20220144416A (ko) 2020-02-04 2022-10-26 큐어백 아게 코로나바이러스 백신
CN116209756A (zh) 2020-03-04 2023-06-02 旗舰先锋创新Vi有限责任公司 调控基因组的方法和组合物
KR20220156933A (ko) 2020-03-23 2022-11-28 에이치디티 바이오 코포레이션 Rna의 전달을 위한 조성물 및 방법
US20230138409A1 (en) 2020-03-24 2023-05-04 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing factor ix therapeutics
JP2023520763A (ja) 2020-03-24 2023-05-19 ジェネレーション バイオ カンパニー ゴーシェ治療薬を発現するための非ウイルス性ｄｎａベクター及びその使用
JP7746280B2 (ja) 2020-03-27 2025-09-30 ジェネレーション バイオ カンパニー 新規脂質及びそれらのナノ粒子組成物
CN115667207B (zh) * 2020-04-01 2025-09-16 翻译生物公司 基于酚酸脂质的阳离子脂质
FI20215508A1 (en) 2020-04-09 2021-10-10 Niemelae Erik Johan Mimetic nanoparticles to prevent the spread of new coronaviruses and reduce the rate of infection
US12194157B2 (en) 2020-04-09 2025-01-14 Finncure Oy Carrier for targeted delivery to a host
MX2022012683A (es) 2020-04-09 2023-01-11 Verve Therapeutics Inc Edicion de bases de pcsk9 y metodos de uso de la misma para el tratamiento de enfermedades.
IL297419B2 (en) 2020-04-22 2025-02-01 BioNTech SE Coronavirus vaccine
IL298362A (en) 2020-05-20 2023-01-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Coronavirus antigen compositions and their uses
EP4153223A1 (en) 2020-05-20 2023-03-29 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Immunogenic compositions and uses thereof
KR20230029685A (ko) 2020-05-29 2023-03-03 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 Trem 조성물 및 이에 관련된 방법
CA3170740A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Curevac Ag Nucleic acid based combination vaccines
WO2021243301A2 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc. Trem compositions and methods relating thereto
BR112023000568A2 (pt) * 2020-07-17 2023-01-31 Sanofi Pasteur Compostos lipídicos cliváveis, composições contendo os mesmos, e usos dos mesmos
JP2023535632A (ja) 2020-07-27 2023-08-18 アンジャリウム バイオサイエンシズ エージー Ｄｎａ分子の組成物、その作製方法、及びその使用方法
WO2022023559A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 Curevac Ag Nucleic acid encoded antibody mixtures
JP7849049B2 (ja) * 2020-08-21 2026-04-21 ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティー オブ テキサス システム 機能性のイオン化可能なリン脂質
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
EP4157344A2 (en) 2020-08-31 2023-04-05 CureVac SE Multivalent nucleic acid based coronavirus vaccines
AU2021336976A1 (en) 2020-09-03 2023-03-23 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
JP7518909B2 (ja) 2020-09-14 2024-07-18 富士フイルム株式会社 脂質組成物
JP2023549011A (ja) 2020-09-15 2023-11-22 ヴァーヴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 遺伝子編集のための脂質製剤
EP4228658A4 (en) 2020-10-14 2025-02-19 George Mason Research Foundation, Inc. IONIZABLE LIPIDS AND METHODS FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
WO2022099003A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Sanofi Lipid nanoparticles for delivering mrna vaccines
WO2022115645A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use
AU2021403156A1 (en) * 2020-12-18 2023-07-13 Genevant Sciences Gmbh Peg lipids and lipid nanoparticles
CA3171051A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Pharmaceutical composition comprising lipid-based carriers encapsulating rna for multidose administration
US11918643B2 (en) 2020-12-22 2024-03-05 CureVac SE RNA vaccine against SARS-CoV-2 variants
IL303886A (en) 2020-12-23 2023-08-01 Flagship Pioneering Inc Compositions of modified trems and uses thereof
WO2022150485A1 (en) * 2021-01-06 2022-07-14 Oncorus, Inc. Encapsulated rna polynucleotides and methods of use
EP4274607A1 (en) 2021-01-11 2023-11-15 ModernaTX, Inc. Seasonal rna influenza virus vaccines
CA3208643A1 (en) 2021-01-18 2022-07-21 Conserv Bioscience Limited Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof
US20240102065A1 (en) 2021-01-27 2024-03-28 CureVac SE Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
CA3212653A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions
CA3171429A1 (en) 2021-03-31 2022-09-30 Alexander SCHWENGER Syringes containing pharmaceutical compositions comprising rna
EP4313109A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
JP2024517427A (ja) 2021-04-20 2024-04-22 アンジャリウム バイオサイエンシズ エージー アミロ－α－１，６－グルコシダーゼ、４－α－グルカノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子の組成物、その作製の方法、及びその使用の方法
AU2022264509A1 (en) 2021-04-27 2023-12-14 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing therapeutic antibodies and uses thereof
US20240216535A1 (en) 2021-04-27 2024-07-04 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing anti-coronavirus antibodies and uses thereof
EP4334446A1 (en) 2021-05-03 2024-03-13 CureVac SE Improved nucleic acid sequence for cell type specific expression
AU2022268465A1 (en) * 2021-05-06 2023-03-09 Stemirna Therapeutics Co., Ltd. A lipid
US20220363937A1 (en) 2021-05-14 2022-11-17 Armstrong World Industries, Inc. Stabilization of antimicrobial coatings
KR20240013087A (ko) 2021-05-24 2024-01-30 쑤저우 아보젠 바이오사이언시스 컴퍼니 리미티드 지질 화합물 및 지질 나노입자 조성물
AU2022290382A1 (en) 2021-06-11 2023-11-23 Bayer Aktiengesellschaft Type v rna programmable endonuclease systems
EP4101928A1 (en) 2021-06-11 2022-12-14 Bayer AG Type v rna programmable endonuclease systems
AU2022291742A1 (en) 2021-06-14 2023-12-21 Generation Bio Co. Cationic lipids and compositions thereof
EP4377457A1 (en) 2021-07-26 2024-06-05 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Trem compositions and uses thereof
WO2023009422A1 (en) 2021-07-26 2023-02-02 Modernatx, Inc. Processes for preparing lipid nanoparticle compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium
WO2023009421A1 (en) 2021-07-26 2023-02-02 Modernatx, Inc. Processes for preparing lipid nanoparticle compositions
TW202320842A (zh) * 2021-07-29 2023-06-01 德商拜恩技術股份公司 用於治療黑色素瘤之組合物及方法
JP2024534066A (ja) * 2021-08-17 2024-09-18 モナシュ ユニバーシティー 脂質ナノ粒子製剤
AU2022337146A1 (en) 2021-09-03 2024-03-14 Tacit Therapeutics, Inc. Rna editing via recruitment of spliceosome components
US20240398940A1 (en) 2021-09-03 2024-12-05 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
CA3229889A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Substitution of nucleotide bases in self-amplifying messenger ribonucleic acids
US20240398933A1 (en) 2021-09-03 2024-12-05 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids comprising phosphatidylserine
EP4144841A1 (en) 2021-09-07 2023-03-08 Bayer AG Novel small rna programmable endonuclease systems with impoved pam specificity and uses thereof
AU2022343268A1 (en) 2021-09-08 2024-03-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Methods and compositions for modulating a genome
MX2024003262A (es) 2021-09-17 2024-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Composiciones y metodos para producir poliribonucleotidos circulares.
WO2023048760A1 (en) 2021-09-22 2023-03-30 Hdt Bio Corp. Rna vaccines against infectious diseases
EP4404919A4 (en) 2021-09-22 2025-08-20 Hdt Bio Corp DRIED NANOPARTICLE COMPOSITIONS
JP2024535354A (ja) * 2021-09-22 2024-09-30 エイチディーティー バイオ コーポレーション がん治療組成物およびその使用
CA3232719A1 (en) 2021-09-22 2023-03-30 Steven Gregory REED Sars-cov-2 rna vaccine compositions and methods of use
WO2023064469A1 (en) 2021-10-13 2023-04-20 Modernatx, Inc. Compositions of mrna-encoded il15 fusion proteins and methods of use thereof
CA3235625A1 (en) 2021-10-18 2023-04-27 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
EP4422698A1 (en) 2021-10-29 2024-09-04 CureVac SE Improved circular rna for expressing therapeutic proteins
WO2023080753A1 (ko) * 2021-11-05 2023-05-11 주식회사 지투지바이오 비경구 병용투여용 약학적 키트
TW202334080A (zh) 2021-11-08 2023-09-01 美商歐納醫療公司 用於遞送環狀聚核苷酸之脂質奈米粒子組合物
EP4436984A1 (en) 2021-11-24 2024-10-02 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Coronavirus immunogen compositions and their uses
IL312965A (en) 2021-11-24 2024-07-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Immunogenic compositions and their uses
CN118401544A (zh) 2021-11-24 2024-07-26 旗舰创业创新六公司 水痘-带状疱疹病毒免疫原组合物及其用途
US12186387B2 (en) 2021-11-29 2025-01-07 BioNTech SE Coronavirus vaccine
KR20240118174A (ko) 2021-12-17 2024-08-02 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 변성 조건 하에서의 원형 rna의 풍부화를 위한 방법
US12529047B1 (en) 2021-12-21 2026-01-20 Modernatx, Inc. mRNA quantification methods
EP4453201A1 (en) 2021-12-22 2024-10-30 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
KR20240118881A (ko) 2021-12-23 2024-08-05 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 항푸소제닉 폴리펩티드를 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드
EP4453191A1 (en) 2021-12-23 2024-10-30 Bayer Aktiengesellschaft Novel small type v rna programmable endonuclease systems
JP2025504404A (ja) 2022-01-14 2025-02-12 アンジャリウム バイオサイエンシズ エージー Ｖｉｉｉ因子をコードするｄｎａ分子の組成物、それを作製する方法、及びその使用方法
US20250099614A1 (en) 2022-01-28 2025-03-27 CureVac SE Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors
CN119072330A (zh) 2022-03-14 2024-12-03 世代生物公司 异源初免加强疫苗组合物和使用方法
KR20240166554A (ko) 2022-03-25 2024-11-26 세일 바이오메디슨스, 인크. 신규한 이온화 가능 지질 및 지질 나노입자, 및 이를 사용하는 방법
WO2023196634A2 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
WO2023205628A1 (en) * 2022-04-18 2023-10-26 City Of Hope Lipid nanoparticles, nucleic acids, and methods of use
AU2023260227A1 (en) 2022-04-27 2024-11-21 Shanghai Regenelead Therapies Co., Ltd Nucleic acid construct and use thereof
CA3257006A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc TREM COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR TREATING PROLIFERATIVE DISORDERS
TW202400784A (zh) 2022-05-13 2024-01-01 大陸商上海瑞宏迪醫藥有限公司 包含utr的核酸構建體及其應用
TW202409283A (zh) 2022-05-13 2024-03-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 雙股ｄｎａ組合物及相關方法
US20250345407A1 (en) 2022-05-25 2025-11-13 CureVac SE Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide
CA3256897A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for the administration of nucleic acids and their methods of use
EP4536197A1 (en) 2022-06-07 2025-04-16 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof
CN119403922A (zh) 2022-06-10 2025-02-07 拜耳公司 新的小型v型rna可编程内切核酸酶系统
WO2023242817A2 (en) 2022-06-18 2023-12-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Recombinant rna molecules comprising untranslated regions or segments encoding spike protein from the omicron strain of severe acute respiratory coronavirus-2
US20250179492A1 (en) 2022-06-22 2025-06-05 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
US12297285B2 (en) 2022-06-24 2025-05-13 Orna Therapeutics, Inc. Circular RNA encoding chimeric antigen receptors targeting BCMA
WO2024002985A1 (en) 2022-06-26 2024-01-04 BioNTech SE Coronavirus vaccine
AU2023316579A1 (en) 2022-07-29 2025-02-13 Fujifilm Corporation COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF THE SIGNAL REGULATORY PROTEIN ALPHA (SIRPα) GENE
EP4565604A2 (en) 2022-08-01 2025-06-11 Flagship Pioneering Innovations VII, LLC Immunomodulatory proteins and related methods
WO2024035952A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
US20260055426A1 (en) 2022-08-19 2026-02-26 Generation Bio Co. CLEAVABLE CLOSED-ENDED DNA (ceDNA) AND METHODS OF USE THEREOF
US20260060926A1 (en) 2022-08-31 2026-03-05 Sail Biomedicines, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
WO2024057237A1 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Pfizer Inc. Lipid nanoparticles
EP4342460A1 (en) 2022-09-21 2024-03-27 NovoArc GmbH Lipid nanoparticle with nucleic acid cargo
AU2023353931A1 (en) 2022-09-26 2025-03-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
US20240174732A1 (en) 2022-10-05 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer
EP4608442A1 (en) 2022-10-28 2025-09-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Nucleic acid based vaccine
EP4612296A1 (en) 2022-10-31 2025-09-10 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
TW202434728A (zh) 2022-11-08 2024-09-01 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 用於產生環狀多核糖核苷酸的組成物和方法
WO2024102730A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102677A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2024102762A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
KR20240072023A (ko) * 2022-11-16 2024-05-23 주식회사 삼양홀딩스 양이온성 지질 및 이의 제조방법
WO2024119103A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids and lipid-anchored polymers
AU2023406303A1 (en) 2022-12-01 2025-05-29 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids, ionizable lipids, sterols, lipid anchored polymers and helper lipids, their uses
EP4626400A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 Generation Bio Co. Novel polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same
WO2024119074A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Stealth lipid nanoparticle compositions for cell targeting
IL321270A (en) 2022-12-13 2025-08-01 Bayer Ag Engineered RNA-type programmable endonucleases and their uses
TW202430215A (zh) 2022-12-14 2024-08-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 用於將治療劑遞送至骨之組成物和方法
WO2024125597A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Providence Therapeutics Holdings Inc. Compositions and methods for infectious diseases
WO2024133160A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis b compositions
AU2023414262B2 (en) 2022-12-29 2025-08-14 Rinuagene Biotechnology Co., Ltd. Polynucleotide molecule for preventing or treating hpv infection-related diseases
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
WO2024151673A2 (en) 2023-01-09 2024-07-18 President And Fellows Of Harvard College Recombinant nucleic acid molecules and their use in wound healing
WO2024151583A2 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
US20240252520A1 (en) 2023-01-09 2024-08-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Therapeutic agents and their use for treating chronic wounds
WO2024155415A1 (en) * 2023-01-20 2024-07-25 Serina Therapeutics, Inc. Targeting of antigen-presenting cells by nanoparticles containing polyoxazoline-lipid conjugates
WO2024160936A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rna formulation
WO2024167885A1 (en) 2023-02-06 2024-08-15 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory compositions and related methods
CN121263425A (zh) 2023-02-13 2026-01-02 旗舰创业创新第七有限责任公司 含可裂解接头的可电离脂质和用于治疗性组合物的脂质载体
GB202302092D0 (en) 2023-02-14 2023-03-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Analytical method
IL322378A (en) 2023-02-17 2025-09-01 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc DNA compositions containing modified cytosine
EP4665405A1 (en) 2023-02-17 2025-12-24 Flagship Pioneering Innovations VII, LLC Dna compositions comprising modified uracil
WO2024178305A1 (en) 2023-02-24 2024-08-29 Modernatx, Inc. Compositions of mrna-encoded il-15 fusion proteins and methods of use thereof for treating cancer
WO2024184500A1 (en) 2023-03-08 2024-09-12 CureVac SE Novel lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
CN121358494A (zh) 2023-03-15 2026-01-16 旗舰创业创新第六有限责任公司 免疫原性组合物及其用途
EP4680750A1 (en) 2023-03-15 2026-01-21 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Compositions comprising polyribonucleotides and uses thereof
EP4683666A1 (en) 2023-03-23 2026-01-28 ModernaTX, Inc. Peg targeting compounds for delivery of therapeutics
EP4683665A1 (en) 2023-03-23 2026-01-28 ModernaTX, Inc. Peg targeting compounds for delivery of therapeutics
WO2024197310A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Modernatx, Inc. Peg targeting compounds for delivery of therapeutics
WO2024205657A2 (en) 2023-03-29 2024-10-03 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
EP4687991A1 (en) 2023-03-30 2026-02-11 Ose Immunotherapeutics Lipid-based nanoparticle targeted at activated immune cells for the expression of immune cell enhancing molecule and use thereof
WO2024200820A1 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Ose Immunotherapeutics Method of synthesis of targeted lipid nanoparticle and uses thereof
EP4695393A1 (en) 2023-04-12 2026-02-18 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Modified trems, compositions, and related methods thereof
EP4695391A1 (en) 2023-04-12 2026-02-18 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Trems for use in correction of missense mutations
WO2024220746A2 (en) 2023-04-21 2024-10-24 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Rnai agents targeting fatty acid synthase and related methods
WO2024223724A1 (en) 2023-04-27 2024-10-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
AU2024260120A1 (en) 2023-04-27 2025-11-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
EP4705481A2 (en) 2023-05-05 2026-03-11 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
WO2024230934A1 (en) 2023-05-11 2024-11-14 CureVac SE Therapeutic nucleic acid for the treatment of ophthalmic diseases
AU2024279278A1 (en) 2023-05-31 2025-12-18 Capstan Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations and compositions
WO2024258829A1 (en) 2023-06-12 2024-12-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Sars-cov-2 vaccine compositions and related methods
WO2025006799A1 (en) 2023-06-27 2025-01-02 Capstan Therapeutics, Inc. Extracorporeal and ex vivo engineering of select cell populations from peripheral blood
WO2025006684A1 (en) 2023-06-28 2025-01-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides
WO2025011529A2 (en) 2023-07-07 2025-01-16 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd. Circular rna vaccines for seasonal flu and methods of uses
KR20260044217A (ko) 2023-07-25 2026-04-01 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 Vii, 엘엘씨 Cas 엔도뉴클레아제 및 관련 방법
CN119371455A (zh) * 2023-07-27 2025-01-28 上海医药工业研究院有限公司 一种二棕榈酰磷脂酰胆碱的制备方法及其中间体
WO2025027116A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 Institut Curie Nanoparticles comprising nucleic acid sequences encoding cyclic gmp-amp synthase
WO2025042786A1 (en) 2023-08-18 2025-02-27 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising circular polyribonucleotides and uses thereof
WO2025049690A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Orna Therapeutics, Inc. Circular polyethylene glycol lipids
WO2025045142A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd. Circular rna encoding vegf polypeptides, formulations, and methods of uses
WO2025049606A1 (en) * 2023-08-29 2025-03-06 Earli Inc. Nucleic acid delivery compositions
IL326647A (en) 2023-09-01 2026-04-01 Novoarc Gmbh Lipid nanoparticles with a nucleic acid charge and an ionizable lipid
WO2025054236A2 (en) 2023-09-06 2025-03-13 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Sars-cov-2 vaccine compositions and related methods
WO2025052180A2 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Axelyf ehf. Lipids and lipid nanoparticles
WO2025051994A1 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Coave Therapeutics Ionizable lipid nanoparticles
WO2025064475A2 (en) 2023-09-18 2025-03-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Ionizable lipidoid compositions and therapeutic uses thereof
WO2025072331A1 (en) 2023-09-26 2025-04-03 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas nucleases and related methods
WO2025073054A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Nanovation Therapeutics Inc. Method of delivery of dna or rna cargo using unshielded lipid nanoparticles
WO2025076291A1 (en) 2023-10-06 2025-04-10 Bluerock Therapeutics Lp Engineered type v rna programmable endonucleases and their uses
WO2025085691A1 (en) 2023-10-18 2025-04-24 Tacit Therapeutics, Inc. Trans-splicing nucleic acid molecules and methods of use
WO2025090417A1 (en) 2023-10-24 2025-05-01 Generation Bio Co. Bispecific stealth lipid nanoparticle compositions for cell targeting
WO2025090138A1 (en) * 2023-10-24 2025-05-01 Generation Bio Co. Stealth lipid nanoparticle compositions for cell targeting
WO2025096807A2 (en) 2023-10-31 2025-05-08 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Novel therapeutic dna forms
WO2025096940A1 (en) * 2023-11-01 2025-05-08 Spark Therapeutics, Inc. Lipid compounds
WO2025101501A1 (en) 2023-11-07 2025-05-15 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2025106670A1 (en) 2023-11-14 2025-05-22 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Ionizable lipidoid compositions and therapeutic uses thereof
US20250161347A1 (en) 2023-11-22 2025-05-22 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods and compositions for treating non-alcoholic fatty liver disease
WO2025114520A1 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Coave Therapeutics Ionizable lipid nanoparticles
WO2025117877A2 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas nucleases and related methods
WO2025133115A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Ose Immunotherapeutics Lipid-based nanoparticles comprising il-35
WO2025132839A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
WO2025144938A1 (en) 2023-12-26 2025-07-03 Emmune, Inc. Systems for nucleic acid transfer
KR20250104719A (ko) * 2023-12-29 2025-07-08 주식회사 삼양홀딩스 약물전달용 나노입자의 조성물
WO2025157978A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Merck Patent Gmbh Ionizable lipids for use in lipid nanoparticles
TW202545974A (zh) 2024-01-26 2025-12-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 免疫受體抑制蛋白及相關方法
FI131999B1 (en) * 2024-02-13 2026-04-02 Helsingin Yliopisto Lipopolymers and their synthesis
WO2025194019A1 (en) 2024-03-14 2025-09-18 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods for treating liver fibrosis and non-alcoholic fatty liver disease
GB202404607D0 (en) 2024-03-29 2024-05-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNA formulation
WO2025217275A2 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immune cell targeted compositions and related methods
WO2025229572A1 (en) 2024-05-01 2025-11-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Epstein-barr virus antigen-encoding messenger ribonucleic acid and antigen protein vaccines
US20250353881A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunoreceptor inhibitory proteins and related methods
WO2025245188A2 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Methods of treating liver steatosis and non-alcoholic fatty liver disease
WO2025245111A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunoreceptor targeting proteins and related methods
WO2025259931A1 (en) 2024-06-14 2025-12-18 Orbital Therapeutics, Inc. Compositions and methods for rna circularization
WO2026006203A2 (en) 2024-06-24 2026-01-02 Orbital Therapeutics, Inc. Compositions and methods for making circular rna
US20260000702A1 (en) 2024-06-26 2026-01-01 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Therapeutic circular dna forms
WO2026003582A2 (en) 2024-06-27 2026-01-02 Axelyf ehf. Lipids and lipid nanoparticles
WO2026025031A1 (en) * 2024-07-26 2026-01-29 Modernatx, Inc. Mrna encoding mageb2 tcer molecule
WO2026039780A1 (en) 2024-08-16 2026-02-19 Modernatx, Inc. Stable lipid nanoparticle compositions prepared without polymeric lipids and uses thereof
WO2026055543A1 (en) 2024-09-06 2026-03-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Modified dna compositions and related methods
WO2026055547A1 (en) 2024-09-06 2026-03-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Dna compositions and related methods
WO2026064313A1 (en) 2024-09-17 2026-03-26 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Rna compositions and related methods
WO2026064512A1 (en) 2024-09-18 2026-03-26 Generation Bio Co. Polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same
WO2026068705A1 (en) 2024-09-26 2026-04-02 Ose Immunotherapeutics Lipid-based nanoparticles comprising non-glycosylated fc domains and uses thereof
WO2026085300A1 (en) 2024-10-16 2026-04-23 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods
WO2026085495A1 (en) 2024-10-18 2026-04-23 Generation Bio Co. Synthetic partially single-stranded nucleic acid compositions and uses and methods therefor

Family Cites Families (289)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US7288266B2 (en) 1996-08-19 2007-10-30 United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Liposome complexes for increased systemic delivery
US20030083272A1 (en) 1997-09-19 2003-05-01 Lahive & Cockfield, Llp Sense mrna therapy
ATE550042T1 (de) 1997-11-20 2012-04-15 Vical Inc Behandlung von krebs mithilfe cytokin- exprimierender polynukleotide und zusammensetzungen dafür
US6432925B1 (en) 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
EP1156781B1 (en) 1999-02-26 2005-06-08 Chiron Corporation Microemulsions with adsorbed macromolecules and microparticles
AU7725500A (en) 1999-09-30 2001-04-30 National Jewish Medical And Research Center Method for inhibition of pathogenic microorganisms
US7060291B1 (en) 1999-11-24 2006-06-13 Transave, Inc. Modular targeted liposomal delivery system
US6696038B1 (en) 2000-09-14 2004-02-24 Expression Genetics, Inc. Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent
US20040142474A1 (en) 2000-09-14 2004-07-22 Expression Genetics, Inc. Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent
US7708915B2 (en) 2004-05-06 2010-05-04 Castor Trevor P Polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins therein
US6652886B2 (en) 2001-02-16 2003-11-25 Expression Genetics Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
DE10109897A1 (de) 2001-02-21 2002-11-07 Novosom Ag Fakultativ kationische Liposomen und Verwendung dieser
RU2294192C2 (ru) 2001-05-30 2007-02-27 Дзе Скриппс Рисерч Инститьют Система доставки нуклеиновых кислот
DE10207178A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Komponenten für die Herstellung amphoterer Liposomen
US20050152980A1 (en) 2002-03-13 2005-07-14 Michael Ausborn Pharmeutical microparticles
EP1519714B1 (en) 2002-06-28 2010-10-20 Protiva Biotherapeutics Inc. Method and apparatus for producing liposomes
CA2542099A1 (en) * 2003-10-11 2005-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Methods and compositions for enhancing innate immunity and antibody dependent cellular cytotoxicity
US20050143336A1 (en) * 2003-12-30 2005-06-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for improved non-viral gene therapy
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
JP4764426B2 (ja) 2004-06-07 2011-09-07 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド カチオン性脂質および使用方法
CA2571292C (en) 2004-06-30 2013-05-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor ix moiety conjugates
PL2578685T3 (pl) 2005-08-23 2020-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna zawierający zmodyfikowane nukleozydy i sposoby jego zastosowania
US20120021042A1 (en) 2005-09-15 2012-01-26 Steffen Panzner Efficient Method For Loading Amphoteric Liposomes With Nucleic Acid Active Substances
EP2012751A4 (en) 2006-03-21 2010-11-24 Morehouse School Of Medicine NEW NANOPARTICLES FOR THE ACTIVE COMPOSITION
CA2648099C (en) 2006-03-31 2012-05-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc System for targeted delivery of therapeutic agents
JP5630998B2 (ja) 2006-05-15 2014-11-26 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 機能的粒子のためのポリマー
CA2927045A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Muthiah Manoharan Lipid containing formulations
US8313777B2 (en) 2006-10-05 2012-11-20 The Johns Hopkins University Water-dispersible oral, parenteral, and topical formulations for poorly water soluble drugs using smart polymeric nanoparticles
WO2008109712A2 (en) 2007-03-05 2008-09-12 Washington University Nanoparticle delivery systems for membrane-integrating peptides
HUE040417T2 (hu) 2007-05-04 2019-03-28 Marina Biotech Inc Aminosavlipidek és alkalmazásuk
US20090042825A1 (en) 2007-08-06 2009-02-12 Majed Matar Composition, method of preparation & application of concentrated formulations of condensed nucleic acids with a cationic lipopolymer
US9144546B2 (en) 2007-08-06 2015-09-29 Clsn Laboratories, Inc. Nucleic acid-lipopolymer compositions
CA2695420A1 (en) 2007-08-23 2009-02-26 Novartis Ag Methods for detecting oligonucleotides
JP2011500569A (ja) 2007-10-12 2011-01-06 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー ワクチンナノテクノロジー
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
US8697098B2 (en) 2011-02-25 2014-04-15 South Dakota State University Polymer conjugated protein micelles
JP2011525180A (ja) 2008-06-16 2011-09-15 バインド バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 治療的標的化ナノ粒子の製作に用いるためのジブロックコポリマーで官能化された標的薬の製造方法
EA020954B1 (ru) 2008-06-16 2015-03-31 Бинд Терапьютикс, Инк. Загруженные лекарственным средством полимерные наночастицы, фармацевтическая композиция и способ лечения рака
CA2740000C (en) 2008-10-09 2017-12-12 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
EP3269395A1 (en) 2008-11-07 2018-01-17 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
CN111808084A (zh) 2008-11-10 2020-10-23 阿布特斯生物制药公司 用于递送治疗剂的新型脂质和组合物
US8563041B2 (en) 2008-12-12 2013-10-22 Bind Therapeutics, Inc. Therapeutic particles suitable for parenteral administration and methods of making and using same
JP2012512175A (ja) 2008-12-15 2012-05-31 バインド バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 治療薬を徐放するための長時間循環性ナノ粒子
EP3243504A1 (en) 2009-01-29 2017-11-15 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation
US20140141089A1 (en) 2009-02-11 2014-05-22 Colorado School Of Mines Nanoparticles, Compositions Thereof, and Methods of Use, and Methods of Making the Same
US8460696B2 (en) 2009-03-20 2013-06-11 Egen, Inc. Polyamine derivatives
US8715736B2 (en) 2009-04-30 2014-05-06 Florida Agricultural And Mechanical University Nanoparticle formulations for skin delivery
SG10201911942UA (en) 2009-05-05 2020-02-27 Muthiah Manoharan Lipid compositions
BRPI1010175A2 (pt) 2009-06-02 2016-03-29 Keller Brian Charles "composição química que inclui um conjugado de lipídio-peg e lipossoma"
KR101766408B1 (ko) 2009-06-10 2017-08-10 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
US8353800B2 (en) 2009-06-12 2013-01-15 Eaton Corporation Limited slip differential using face gears and a pinion housing
JP5894913B2 (ja) 2009-06-15 2016-03-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓｒｎａ
US8569256B2 (en) 2009-07-01 2013-10-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
WO2011000107A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
ES2605625T3 (es) * 2009-07-27 2017-03-15 Auspex Pharmaceuticals, Inc. Moduladores de ciclopropilo del receptor P2Y12
US20120157500A1 (en) 2009-08-24 2012-06-21 Weikang Tao Jak inhibition blocks rna interference associated toxicities
EP3318248B1 (en) 2009-12-01 2019-04-10 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
EP3296398A1 (en) 2009-12-07 2018-03-21 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
DK2509634T3 (en) 2009-12-11 2019-04-23 Pfizer Stable formulations for lyophilization of therapeutic particles
EP3494963A1 (en) 2009-12-18 2019-06-12 The University of British Columbia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
CA3009891C (en) 2009-12-23 2020-09-15 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
US9149432B2 (en) 2010-03-19 2015-10-06 Massachusetts Institute Of Technology Lipid vesicle compositions and methods of use
WO2011119262A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for generating nanoparticles
US20130037977A1 (en) 2010-04-08 2013-02-14 Paul A. Burke Preparation of Lipid Nanoparticles
US20130156845A1 (en) 2010-04-29 2013-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated single stranded rna
WO2011143230A1 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Alnylam Pharmaceuticals Methods and compositions for delivery of active agents
US20130123338A1 (en) 2010-05-12 2013-05-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel cationic lipids and methods of use thereof
WO2011141704A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use
US8802863B2 (en) 2010-05-24 2014-08-12 Sirna Therapeutics, Inc. Amino alcohol cationic lipids for oligonucleotide delivery
DK2575767T3 (en) 2010-06-04 2017-03-13 Sirna Therapeutics Inc HOWEVER UNKNOWN LOW MOLECULAR CATIONIC LIPIDS TO PROCESS OIGONUCLEOTIDES
JP5635690B2 (ja) 2010-07-01 2014-12-03 ポステック アカデミー‐インダストリー ファウンデーション 細菌由来マイクロベシクルを用いた癌治療及び癌診断方法
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
MX342608B (es) 2010-07-06 2016-10-06 Novartis Ag * Particulas de suministro similares a viriones para moleculas de arn de autorreplicacion.
ES2557382T3 (es) 2010-07-06 2016-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomas con lípidos que tienen un valor de pKa ventajoso para el suministro de ARN
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
SI4043040T1 (sl) 2010-08-31 2023-04-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali liposomi za dostavo imunogen-kodirajoče RNA
LT4226941T (lt) 2010-08-31 2025-01-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilintos liposomos, skirtos imunogeną koduojančios rnr pristatymui
MX2013002332A (es) 2010-08-31 2013-03-18 Novartis Ag Lipidos apropiados para suministro liposomal del arn que codifica la proteina.
US9549901B2 (en) 2010-09-03 2017-01-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lipid-polymer hybrid particles
US8466122B2 (en) 2010-09-17 2013-06-18 Protiva Biotherapeutics, Inc. Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
CA2809858C (en) 2010-09-20 2019-11-12 Sirna Therapeutics, Inc. Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
CA2811430A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
EP2625189B1 (en) 2010-10-01 2018-06-27 ModernaTX, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3485913A1 (en) 2010-10-21 2019-05-22 Sirna Therapeutics, Inc. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
CA2824526C (en) 2011-01-11 2020-07-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pegylated lipids and their use for drug delivery
CN102068701B (zh) * 2011-01-18 2012-11-07 沈阳药科大学 可断裂peg脂质衍生物在制剂中的应用
US20140065172A1 (en) 2011-01-26 2014-03-06 Cenix Bioscience Gmbh Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes
US10363309B2 (en) 2011-02-04 2019-07-30 Case Western Reserve University Targeted nanoparticle conjugates
WO2012116715A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in newborns and infants
WO2012112730A2 (en) 2011-02-15 2012-08-23 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for delivering nucleic acid to a cell
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
CN102204920B (zh) * 2011-03-18 2013-03-20 海南本创医药科技有限公司 阿司匹林钠普伐他汀钠药物组合物固体制剂
WO2012129483A1 (en) 2011-03-24 2012-09-27 Novartis Ag Adjuvant nanoemulsions with phospholipids
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2013158127A1 (en) 2012-04-16 2013-10-24 Molecular Transfer, Inc. Agents for improved delivery of nucleic acids to eukaryotic cells
MX374963B (es) 2011-04-29 2025-03-06 Selecta Biosciences Inc Nanoportadores sintéticos tolerogénicos para reducir las respuestas de anticuerpos.
ES2762224T3 (es) 2011-05-12 2020-05-22 Yissum Res Dev Co Of Hebrew Univ Jerusalem Ltd Liposomas que comprenden lípidos conjugados con polímero y usos relacionados
CA2835428A1 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof for non-human vertebrates
US8691750B2 (en) 2011-05-17 2014-04-08 Axolabs Gmbh Lipids and compositions for intracellular delivery of biologically active compounds
EP2714017B1 (en) 2011-06-02 2018-08-01 The Regents of The University of California Membrane encapsulated nanoparticles and method of use
RU2013154295A (ru) 2011-06-08 2015-07-20 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. КОМПОЗИЦИИ ЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ И СПОСОБЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ мРНК
ES2795110T3 (es) 2011-06-08 2020-11-20 Translate Bio Inc Lípidos escindibles
CN102813929B (zh) * 2011-06-09 2014-04-09 沈阳药科大学 低浓度peg脂质衍生物及其应用
EP2729165B1 (en) 2011-07-06 2017-11-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic combination compositions and uses thereof
EP4115875A1 (en) 2011-07-06 2023-01-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
CA2841047A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof
JP6059220B2 (ja) 2011-07-06 2017-01-18 ノバルティス アーゲー 核酸を含む水中油型エマルジョン
MX350258B (es) 2011-07-06 2017-08-31 Novartis Ag Emulsiones cationicas de aceite en agua.
MX366055B (es) 2011-08-31 2019-06-26 Novartis Ag Liposomas pegilados para admistracion de acido ribonucleico (arn) que codifica para inmunogeno.
US9126966B2 (en) 2011-08-31 2015-09-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods of use thereof
JP2014527071A (ja) 2011-08-31 2014-10-09 マリンクロッド エルエルシー Ｈ−ホスホネートによるナノ粒子ｐｅｇの改変
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2013039861A2 (en) 2011-09-12 2013-03-21 modeRNA Therapeutics Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3456317B1 (en) 2011-09-27 2025-09-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
EP2765997A4 (en) 2011-10-14 2015-06-24 Stc Unm POROUS NANOPARTICLE-SUPPORTED LIPID DOUBLE LAYERS (PROTOCOLS) FOR THE TARGETED RELEASE BY TRANSDERMAL RELEASE AND USE METHOD THEREFOR
CN107266391B (zh) 2011-10-18 2020-04-17 迪克纳制药公司 胺阳离子脂质及其用途
EP2768528A1 (en) 2011-10-20 2014-08-27 Novartis AG Adjuvanted influenza b virus vaccines for pediatric priming
WO2013059922A1 (en) 2011-10-25 2013-05-02 The University Of British Columbia Limit size lipid nanoparticles and related methods
CN104023793B (zh) 2011-10-31 2017-11-24 马林克罗特有限公司 用于治疗癌症的联合脂质体组合物
US9579338B2 (en) 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
EP3485875A1 (en) 2011-11-04 2019-05-22 Nitto Denko Corporation Single use system for sterelily producing lipid-nucleic acid particles
US9872870B2 (en) 2011-11-04 2018-01-23 University Of Notre Dame Du Lac Multifunctional micellar nanoparticle-based drug and targeting agent system
JP2015500241A (ja) 2011-12-02 2015-01-05 ペガサス ラボラトリーズ インコーポレイテッド 両親媒性脂質をベースとする徐放性組成物
WO2013086373A1 (en) * 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids for the delivery of active agents
AU2012347605B2 (en) 2011-12-07 2017-09-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Branched alkyl and cycloalkyl terminated biodegradable lipids for the delivery of active agents
WO2013086354A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
EP2787977A4 (en) 2011-12-09 2015-05-06 Univ California LIPOSOMAL ACTIVE INVERTING
JP6182457B2 (ja) 2011-12-12 2017-08-16 協和発酵キリン株式会社 カチオン性脂質を含有するドラックデリバリーシステムのための脂質ナノ粒子
KR20140111272A (ko) 2011-12-12 2014-09-18 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 양이온성 지질의 조합을 함유하는 지질 나노 입자
WO2013130161A1 (en) 2011-12-14 2013-09-06 modeRNA Therapeutics Methods of responding to a biothreat
WO2013090186A1 (en) 2011-12-14 2013-06-20 modeRNA Therapeutics Modified nucleic acids, and acute care uses thereof
WO2013087083A1 (en) 2011-12-15 2013-06-20 Biontech Ag Particles comprising single stranded rna and double stranded rna for immunomodulation
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
CN104968354A (zh) 2011-12-21 2015-10-07 现代治疗公司 增加器官或器官外植体的活力或寿命的方法
CN104245745B (zh) 2012-02-09 2017-03-29 生命技术公司 亲水性聚合物颗粒及其制备方法
US20130243867A1 (en) 2012-02-23 2013-09-19 University Of South Florida (A Florida Non-Profit Corporation) Micelle compositions and methods for their use
US10322089B2 (en) 2012-03-14 2019-06-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nanoparticles, nanoparticle delivery methods, and systems of delivery
AU2013231638B2 (en) 2012-03-16 2017-10-12 Merck Patent Gmbh Targeting aminoacid lipids
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
US9717685B2 (en) 2012-03-26 2017-08-01 President And Fellows Of Harvard College Lipid-coated nucleic acid nanostructures of defined shape
AU2013240051B2 (en) 2012-03-27 2017-11-30 Sirna Therapeutics, Inc. Diether based biodegradable cationic lipids for siRNA delivery
AU2013237874B2 (en) 2012-03-29 2018-01-18 Translate Bio, Inc. Lipid-derived neutral nanoparticles
US10501513B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
WO2013151665A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
AU2013249548A1 (en) 2012-04-19 2014-11-06 Sirna Therapeutics, Inc. Novel diester and triester based low molecular weight, biodegradable cationic lipids for oligonucleotide delivery
AU2013256008B2 (en) 2012-05-04 2016-02-25 The Johns Hopkins University Lipid-based drug carriers for rapid penetration through mucus linings
WO2013173693A1 (en) 2012-05-18 2013-11-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Nanoparticles with enhanced entry into cancer cells
EP2852380A4 (en) 2012-05-23 2016-01-20 Univ Ohio State LIPID-COATED ALBUMIN NANOPARTICLE COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE PREPARATION AND METHOD OF USE THEREOF
HRP20181855T1 (hr) 2012-06-08 2018-12-28 Nitto Denko Corporation Lipidi za formulacije namijenjene unosu terapijskog sredstva
EP2858679B2 (en) 2012-06-08 2024-06-05 Translate Bio, Inc. Pulmonary delivery of mrna to non-lung target cells
WO2014008334A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Stable non-aggregating nucleic acid lipid particle formulations
WO2014028487A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
WO2014028429A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Moderna Therapeutics, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of rna
CA2881605A1 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Aaron FROESE Internal structured self assembling liposomes
WO2014093924A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
US20150202153A1 (en) 2012-10-04 2015-07-23 University Of The Witwatersrand, Johannesburg Liposomal drug delivery system
WO2014071072A2 (en) 2012-11-02 2014-05-08 Pungente Michael D Novel cationic carotenoid-based lipids for cellular nucleic acid uptake
US9669104B2 (en) 2012-11-07 2017-06-06 Council Of Scientific And Industrial Research Nanocomplex containing amphipathic peptide useful for efficient transfection of biomolecules
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
WO2014093574A1 (en) 2012-12-13 2014-06-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for altering cell phenotype
US20160032316A1 (en) 2013-03-14 2016-02-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and Purity Assessment of RNA Molecules Synthesized with Modified Nucleosides
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
BR112015022855A2 (pt) 2013-03-14 2017-11-07 Shire Human Genetic Therapies composições e método para produção de um anticorpo in vitro
WO2014152027A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
EP3388834B1 (en) * 2013-03-15 2020-04-15 Translate Bio, Inc. Synergistic enhancement of the delivery of nucleic acids via blended formulations
US10590161B2 (en) 2013-03-15 2020-03-17 Modernatx, Inc. Ion exchange purification of mRNA
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
CN105143456A (zh) * 2013-03-15 2015-12-09 不列颠哥伦比亚大学 用于转染的脂质纳米粒子和相关方法
WO2014144039A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
WO2014182661A2 (en) * 2013-05-06 2014-11-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc Dosages and methods for delivering lipid formulated nucleic acid molecules
WO2014210356A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Massachusetts Institute Of Technology Multi-tailed lipids and uses thereof
EP3052511A4 (en) 2013-10-02 2017-05-31 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
EP3052521A1 (en) * 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
AU2014337156A1 (en) 2013-10-18 2016-05-12 Modernatx, Inc. Compositions and methods for tolerizing cellular systems
EP3083556B1 (en) 2013-12-19 2019-12-25 Novartis AG Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
US10821175B2 (en) 2014-02-25 2020-11-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems
US20170143848A1 (en) * 2014-03-24 2017-05-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for the treatment of ocular diseases
PL4023249T3 (pl) * 2014-04-23 2025-03-10 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
WO2015164786A1 (en) * 2014-04-25 2015-10-29 University Of Massachusetts Recombinant aav vectors useful for reducing immunity against transgene products
WO2015196128A2 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
HUE060907T2 (hu) * 2014-06-25 2023-04-28 Acuitas Therapeutics Inc Új lipidek és lipid nanorészecske formulációk nukleinsavak bevitelére
US20170204152A1 (en) 2014-07-16 2017-07-20 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
CA2955375A1 (en) 2014-07-17 2016-01-21 Modernatx, Inc. Terminal modifications of polynucleotides
US10125092B2 (en) 2014-09-05 2018-11-13 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
CN104644555A (zh) * 2014-11-18 2015-05-27 中国科学院过程工程研究所 一种避免加速血液清除现象的长循环脂质体、制备方法及应用
US11191727B2 (en) 2014-12-31 2021-12-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Multivalent nanoparticle-based vaccines
EP3247363A4 (en) * 2015-01-21 2018-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
EP3247398A4 (en) * 2015-01-23 2018-09-26 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2016164762A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor egf-a and intracellular domain mutants and methods of using the same
WO2016169903A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Koninklijke Philips N.V. Model-based segmentation of an anatomical structure
AU2016253972B2 (en) * 2015-04-27 2020-01-02 Acuitas Therapeutics Inc. Nucleoside-modified RNA for inducing an adaptive immune response
WO2016201377A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Moderna Therapeutics, Inc. Targeted adaptive vaccines
MA42502A (fr) 2015-07-21 2018-05-30 Modernatx Inc Vaccins contre une maladie infectieuse
WO2017015457A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 Modernatx, Inc. Ebola vaccine
US20190008887A1 (en) 2015-07-30 2019-01-10 ModernaTX Inc. Multimeric mrna
MA42543A (fr) 2015-07-30 2018-06-06 Modernatx Inc Arn épitope peptidiques concatémériques
WO2017031241A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Modernatx, Inc. Rna mapping/fingerprinting
US11564893B2 (en) 2015-08-17 2023-01-31 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
JP6948313B6 (ja) 2015-09-17 2022-01-14 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療剤の細胞内送達のための化合物および組成物
EP3359670B2 (en) 2015-10-05 2024-02-14 ModernaTX, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
WO2017066789A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Mrna cap analogs with modified sugar
AU2016342376A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Sexually transmitted disease vaccines
JP7384512B2 (ja) 2015-10-22 2023-11-21 モデルナティエックス インコーポレイテッド 広域インフルエンザウイルスワクチン
AU2016342045A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
EP3365009A4 (en) 2015-10-22 2019-07-03 ModernaTX, Inc. VACCINES AGAINST HERPES SIMPLEX VIRUS
EA201891000A1 (ru) 2015-10-22 2018-12-28 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. Вакцина против респираторно-синцитиального вируса
EP4011451A1 (en) 2015-10-22 2022-06-15 ModernaTX, Inc. Metapneumovirus mrna vaccines
AU2016341309A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Cancer vaccines
WO2017070624A1 (en) * 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
WO2017070601A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Nucleic acid vaccines for varicella zoster virus (vzv)
HRP20230209T1 (hr) * 2015-10-28 2023-04-14 Acuitas Therapeutics Inc. Novi lipidi i lipidne formulacije nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina
PL3386484T3 (pl) * 2015-12-10 2022-07-25 Modernatx, Inc. Kompozycje i sposoby dostarczania środków terapeutycznych
MA43568A (fr) 2015-12-17 2018-11-14 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour la méthylmalonyl-coa mutase
US10465190B1 (en) 2015-12-23 2019-11-05 Modernatx, Inc. In vitro transcription methods and constructs
EP3405579A1 (en) 2016-01-22 2018-11-28 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
JP2019519601A (ja) 2016-05-18 2019-07-11 モダーナティエックス・インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ， Ｉｎｃ． 急性間欠性ポルフィリン症の治療のためのポルホビリノゲン脱アミノ酵素をコードするポリヌクレオチド
WO2017201328A1 (en) * 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. POLYNUCLEOTIDES ENCODING α-GALACTOSIDASE A FOR THE TREATMENT OF FABRY DISEASE
JP2019519516A (ja) 2016-05-18 2019-07-11 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド がんの治療のためのｍＲＮＡ併用療法
US11001861B2 (en) 2016-05-18 2021-05-11 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding galactose-1-phosphate uridylyltransferase for the treatment of galactosemia type 1
WO2017201317A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polyribonucleotides containing reduced uracil content and uses thereof
EP3458108A4 (en) 2016-05-18 2020-04-22 ModernaTX, Inc. POLYNUCLEOTIDES ENCODING A CYSTIC FIBROSIS TRANSMEMBRANE CONDUCTANCE REGULATOR FOR THE TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS
US20190298657A1 (en) 2016-05-18 2019-10-03 Modernatx, Inc. Polynucleotides Encoding Acyl-CoA Dehydrogenase, Very Long-Chain for the Treatment of Very Long-Chain Acyl-CoA Dehydrogenase Deficiency
US12123030B2 (en) 2016-05-18 2024-10-22 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding lipoprotein lipase for the treatment of hyperlipidemia
WO2017201342A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding jagged1 for the treatment of alagille syndrome
MA45036A (fr) * 2016-05-18 2019-03-27 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour la citrine pour le traitement de la citrullinémie de type 2
IL263079B2 (en) 2016-05-18 2024-05-01 Modernatx Inc Polynucleotides encoding relaxin
WO2017218704A1 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
CA3036831A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Modernatx, Inc. High purity rna compositions and methods for preparation thereof
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
WO2018081462A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Modernatx, Inc. Methods and compositions for rna mapping
CA3040337A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Curevac Ag Lipid nanoparticle mrna vaccines
CN110402145A (zh) 2016-10-26 2019-11-01 莫得纳特斯公司 用于增强免疫应答的信使核糖核酸及其使用方法
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
MA46766A (fr) 2016-11-11 2019-09-18 Modernatx Inc Vaccin antigrippal
WO2018107088A2 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
US11384352B2 (en) 2016-12-13 2022-07-12 Modernatx, Inc. RNA affinity purification
US20180243225A1 (en) 2017-01-25 2018-08-30 Modernatx, Inc. Ebola/marburg vaccines
US20190351040A1 (en) 2017-02-01 2019-11-21 Modernatx, Inc. Rna cancer vaccines
BR112019015797A2 (pt) 2017-02-01 2020-03-17 Modernatx, Inc. Composições de mrna terapêuticas imunomoduladoras que codificam peptídeos de mutação de oncogene de ativação
EP3577221A4 (en) 2017-02-01 2020-12-23 ModernaTX, Inc. Polynucleotide secondary structure
MA47515A (fr) 2017-02-16 2019-12-25 Modernatx Inc Compositions immunogènes très puissantes
WO2018157009A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Modernatx, Inc. Nucleic acid-based therapy of muscular dystrophies
WO2018170256A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
EP4186888B1 (en) 2017-03-15 2025-11-26 ModernaTX, Inc. Compound and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
EP3595713A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS Vaccine
WO2018170245A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
EP3595676A4 (en) 2017-03-17 2021-05-05 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZOONOSES
WO2018175783A1 (en) 2017-03-22 2018-09-27 Modernatx, Inc. Rna bacterial vaccines
US11905525B2 (en) 2017-04-05 2024-02-20 Modernatx, Inc. Reduction of elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
WO2018200737A1 (en) 2017-04-26 2018-11-01 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
WO2018232355A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 Modernatx, Inc. Rna antibodies
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
WO2019036682A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. RNA VARIANTS POLYMERASE
US20200254086A1 (en) 2017-08-18 2020-08-13 Moderna TX, Inc. Efficacious mrna vaccines
MA49914A (fr) 2017-08-18 2021-04-21 Modernatx Inc Procédés analytiques par hplc
EP3668979A4 (en) 2017-08-18 2021-06-02 Modernatx, Inc. METHOD OF HPLC ANALYSIS
WO2019055807A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZIKA VIRUS
US20190192646A1 (en) 2017-11-03 2019-06-27 Modernatx, Inc. Salmonella vaccines
MA50813A (fr) 2017-11-21 2020-09-30 Modernatx Inc Vaccins contre le virus d'epstein-barr
EP3746090A4 (en) 2018-01-29 2021-11-17 ModernaTX, Inc. RSV RNA Vaccines
AU2019293244B2 (en) 2018-06-27 2026-04-02 Modernatx, Inc. Personalized cancer vaccine epitope selection
CA3111836A1 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Modernatx, Inc. Modified mrna for the treatment of progressive familial intrahepatic cholestasis disorders
WO2020061295A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. High-purity peg lipids and uses thereof
CA3113025A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Peg lipids and uses thereof
WO2020061367A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
MA54192A (fr) 2018-11-07 2021-09-15 Modernatx Inc Vaccins à arn contre le cancer
AU2020224103A1 (en) 2019-02-20 2021-09-16 Modernatx, Inc. Rna polymerase variants for co-transcriptional capping
CN113874502A (zh) 2019-03-11 2021-12-31 摩登纳特斯有限公司 补料分批体外转录方法
US12070495B2 (en) 2019-03-15 2024-08-27 Modernatx, Inc. HIV RNA vaccines
US20220236253A1 (en) 2019-05-31 2022-07-28 Modernatx, Inc. Expanded t cell assay
CN114269918A (zh) 2019-08-14 2022-04-01 摩登纳特斯有限公司 用于纯化体外转录的下游产物的方法
CA3154082A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
WO2021055811A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Modernatx, Inc. Cap guides and methods of use thereof for rna mapping
EP4088281A4 (en) 2020-01-10 2024-02-21 ModernaTX, Inc. VARIOUS AUTOCECODER FOR GENERATING BIOLOGICAL SEQUENCE
US20210228707A1 (en) 2020-01-28 2021-07-29 Modernatx, Inc. Coronavirus rna vaccines
JP2023513073A (ja) 2020-01-30 2023-03-30 モデルナティエックス インコーポレイテッド 呼吸器系ウイルス免疫化組成物
BR112022015565A2 (pt) 2020-02-07 2022-09-27 Modernatx Inc Vacinas de domínio de mrna para sars-cov-2
WO2021211343A1 (en) 2020-04-13 2021-10-21 Modernatx, Inc. Zika virus mrna vaccines
WO2021222304A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 Modernatx, Inc. Sars-cov-2 rna vaccines
EP4149485A4 (en) 2020-05-15 2024-10-23 ModernaTX, Inc. RNA FORMULATIONS FOR HIGH VOLUME DISTRIBUTION AND METHODS OF USE THEREOF FOR THE TREATMENT OF COVID-19
WO2021159130A2 (en) 2020-05-15 2021-08-12 Modernatx, Inc. Coronavirus rna vaccines and methods of use
EP4153238A4 (en) 2020-05-21 2024-12-18 ModernaTX, Inc. METHYLENE BLUE STABILIZED MRNA COMPOSITIONS
CA3185855A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Modernatx, Inc. Bacterial strains for dna production
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
EP4217371A1 (en) 2020-09-25 2023-08-02 ModernaTX, Inc. Multi-proline-substituted coronavirus spike protein vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
US20180028664A1 (en) 2018-02-01
EP3386484A4 (en) 2019-07-31
MD3386484T2 (ro) 2022-11-30
ES2924407T3 (es) 2022-10-06
JP7080172B2 (ja) 2022-06-03
CA3007955A1 (en) 2017-06-15
JP2022031359A (ja) 2022-02-18
EP3386484A1 (en) 2018-10-17
AU2016366978A1 (en) 2018-06-28
JP2019504002A (ja) 2019-02-14
DK3386484T3 (da) 2022-07-04
EP3964200A1 (en) 2022-03-09
SI3386484T1 (sl) 2022-06-30
US10556018B2 (en) 2020-02-11
AU2022259750A1 (en) 2022-12-08
CY1125308T1 (el) 2025-03-28
US12491260B2 (en) 2025-12-09
AU2022259750B2 (en) 2023-03-02
US11285222B2 (en) 2022-03-29
PT3386484T (pt) 2022-08-01
HRP20220652T1 (hr) 2022-06-24
SMT202200358T1 (it) 2022-11-18
US20190117798A1 (en) 2019-04-25
EP3386484B1 (en) 2022-03-30
US20180147298A1 (en) 2018-05-31
JP7412840B2 (ja) 2024-01-15
LT3386484T (lt) 2022-06-10
AU2016366978B2 (en) 2022-07-28
WO2017099823A1 (en) 2017-06-15
PL3386484T3 (pl) 2022-07-25
US10207010B2 (en) 2019-02-19
US10485885B2 (en) 2019-11-26
US20220265857A1 (en) 2022-08-25
US20200206362A1 (en) 2020-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12491260B2 (en) Compositions and methods for delivery of agents
JP7526168B2 (ja) Ｐｅｇ脂質及びそれらの使用
US20260034071A1 (en) High-purity peg lipids and uses thereof
EP3607074A1 (en) Reduction or elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
AU2023203042A9 (en) Compositions and methods for delivery of therapeutic agents
HK1262230B (en) Compositions and methods for delivery of therapeutic agents