RS63408B1 - Antitela, upotrebe i metode - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na antihumana OX40L antitela, nove medicinske upotrebe i metode kao što je definisano u patentnim zahtevima. Svi drugi vidovi, konfiguracije ili otelotvorenja utvrđeni u ovom dokumentu koji ne spadaju u obim patentnih zahteva su samo informativnog karaktera.

STANJE TEHNIKE

[0002] OX40 ligand (OX40L) je član TNF porodice; 34 kDa tip II transmembranski protein. Kristalizovani kompleks humanog OX40 i OX40L je trimerna konfiguracija jednog OX40L (trimer) i tri OX40 monomera. Humani ekstracelularni domen je 42% homologan mišjem OX40L.

[0003] OX40L nije konstitutivno eksprimiran, ali se može indukovati na profesionalnim APC-ima kao što su B-ćelije, dendritske ćelije (DCi) i makrofagi. Druge vrste ćelija kao što su Langerhans-ove ćelije, endotelne ćelije, glatke mišićne ćelije, mastociti i urođenoubilačke ćelije (NK) mogu biti indukovane da eksprimiraju OX40L. T-ćelije takođe mogu da eksprimiraju OX40L. OX40L receptor, OX40, je eksprimiran na aktiviranim T ćelijama (CD4 i CD8 T ćelije, Th2, Th1 i Th17 ćelije) i CD4<+>Foxp3<+>ćelijama, čak i u odsustvu aktivacije.

[0004] Interakcija između OX40 i OX40L se javlja tokom interakcije T-ćelija-DC 2 ili 3 dana nakon prepoznavanja antigena. Nakon napuštanja DC, T-ćelija koja eksprimira OX40 može stupiti u interakciju sa ćelijom koja eksprimira OX40L različitom od DC i primiti OX40 signal iz ove ćelije, što može pružiti bitne signale za generisanje memorijskih T-ćelija, poboljšanje Th2 odgovora i produženje inflamatornih odgovora. OX40 signali u T-ćelije respondere čine ih otpornim na supresiju posredovanu Tregom.

[0005] Bolest 'kalem protiv domaćina' (GvHD) je glavni uzrok smrtnosti nakon alogenog tretmana kostne srži. U akutnoj verziji bolesti, zrele T-ćelije prisutne u kalemu kostne srži prepoznaju donorsko tkivo kao strano u okruženju oštećenog tkiva, koje putem APC domaćina izaziva aktivaciju i proliferaciju donorskih T-ćelija, sa naknadnom migracijom T-ćelija u jetru, slezinu, creva, kožu i pluća, uzrokujući oštećenje tkiva odgovorom CTL efektora i inflamatornim oslobađanjem citokina/hemokina. Početak akutne bolesti je obično u prvih 100 dana nakon transplantacije (Hill-Ferrara, Blood May 1, 2000 vol.95 no.9 2754-275, Reddy-Ferrara Blood, Volume 17, Issue 4, December 2003).

[0006] Hronična GvHD se obično pojavljuje 100 dana nakon transplantacije i smatra se da je uključeno nekoliko faktora, uključujući oštećenja timusa uzrokovana prethodnim akutnim GvHD koja rezultiraju smanjenim klirensom patogenih T-ćelija (Zhang et al, September 1, 2007. vol.179 no.5 3305-3314), povećanjem TGF-β, koja uzrokuje fibrozu (McCormick et al J Immuno, November 15, 1999. vol.163 no.

10 5693-5699), i komponentom B-ćelija koju pokreće povišeni faktor aktiviranja B-ćelija (BAFF) (Sarantopoulos et al, Clin Cancer Res October 15, 200713; 6107), kao i auto-antitelima protiv receptora faktora rasta koji potiče od trombocita (Svegliati et al, Blood July 1, 2007. vol.110 no. 1237-241).

[0007] Kliničke studije su pokazale da je OX40 povećan i u akutnoj (Morante et al, Clinical and Experimental Immunology,145: 36-43) i u hroničnoj GvHD (Kotani et al, Blood November 15, 2001 vol.98 no.10 3162-3164). Primena antagonističkog anti-OX40L pojačanog preživljavanja u modelu mišjeg letalnog akutnog GvHD, sa 70% preživljavanja u tretiranoj grupi u poređenju sa netretiranim koji su svi umrli do 43. dana (Tsukada et al, Blood, 1 April 2000, Volume 95, Number 7), dok je tretman agonističkim anti-OX40 Ab ubrzao bolest i smrtnost (Blazar et al Blood May 1, 2003 vol. 101 no.9 3741-3748). Pokazalo se da je blokada OX40-OX40L interakcije efikasna kod nekoliko drugih upalnih bolesti, pri čemu se anti-OX40L Ab koristi za tretman modela mišjeg kolitisa (Totsuka et al., AJP - GI April 1, 2003 vol.284 no.4 G595-G603), i da bi anti-OX40L Ab mogao da blokira razvoj dijabetesa kod NOD miševa (Pakala et al European Journal of Immunology Volume 34, Issue 11, pages 3039-3046, November 2004).

[0008] WO 2006/029879 se odnosi na anti-OX40L antitela, a posebno na anti-OX40L antitela koja ne vezuju komplementarni faktor C1q.

Reference

[0009] Lamb, L.S., Abhyankar, S.A., Hazlett, L., O'Neal, W., Folk, R.S., Vogt, S., Parrish, R.S., Bridges, K., Henslee-Downey, P.J. and Gee, A. P. (1999), Expression of CD134 (0X-40) on T-cells during the first 100 days following allogeneic bone marrow transplantacijetion as a marker for lymphocyte activation and therapyresistant graft-versus-host disease. Cytometry, 38: 238-243.

[0010] Xupeng Ge, Julia Brown, Megan Sykes, Vassiliki A. Boussiotis, CD134-Allodepletion Allows Selective Elimination of Alloreactive Human T-cells without Loss of Virus-Specific and Leukemia-Specific Effectors, Biology of Blood and Marrow Transplantacijetion, Volume 14, Issue 5, May 2008, Pages 518-530.

[0011] Naoto Ishii, Takeshi Takahashi, Pejman Soroosh, Kazuo Sugamura, Chapter 3 - OX40-OX40 Ligand Interaction in T-Cell-Mediated Immunity and Immunopathology, In: Frederick W. Alt, Editor(s), Advances in Immunology, Academic Press, 2010, Volume 105, Pages 63-98.

[0012] Croft, M., So, T., Duan, W. and Soroosh, P. (2009), The significance of OX40 and OX40L to T-cell biology and immune disease. Immunological Reviews, 229: 173-191.

SAŽETAK PRONALASKA

[0013] Pronalazak pruža anti-humana OX40L (hOX40L) antitela i fragmente i nove medicinske primene za tretman ili prevenciju bolesti ili stanja posredovanih hOX40L-om kod ljudi kako je definisano u patentnim zahtevima. U tu svrhu, opis pruža:-

U prvoj konfiguraciji

[0014] Antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za hOX40L za tretman ili sprečavanje bolesti ili stanja posredovanih hOX40L-om kod ljudi metodom kojom se antitelo ili fragment primenjuje na navedenom čoveku, pri čemu se antitelo ili fragment koristi za tretman ili sprečavanje navedene bolesti ili stanja posredovanih hOX40L-om smanjenjem jednog ili više ili svih od

a. sekrecija citokina izabranog iz grupe koju čineTNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES i interferon gama kod čoveka; b. proliferacija leukocita kod čoveka; i

c. vezivanje hOX40 receptora koji eksprimiraju humane T-ćelije sa hOX40L koji eksprimiraju endotelijske ćelije.

U drugoj konfiguraciji

[0015] Antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za hOX40L i takmiči se za vezivanje za navedeni hOX40L sa antitelom izabranim iz grupe koju čine 02D10, 10A07, 09H04 i 19H01.

U trećoj konfiguraciji

[0016] Upotreba antitela ili njegovog fragmenta, koji se specifično vezuje za hOX40L u proizvodnji leka za primenu na čoveku, za tretiranje ili sprečavanje bolesti ili stanja posredovanih hOX40L-om kod čoveka, smanjenjem jednog, više ili svih od

a. sekrecija citokina izabranog iz grupe koju čine TNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9,IL-10, IL-13, IL-17, RANTES i interferon gama u čoveku;

b. proliferacija leukocita kod čoveka; i

c. vezivanje hOX40 receptora koji eksprimiraju humane T-ćelije sa hOX40L koji eksprimiraju endotelijske ćelije.

U četvrtoj konfiguraciji

[0017] Metoda tretiranja ili sprečavanja bolesti ili stanja posredovanih hOX40L-om kod čoveka smanjenjem jednog ili više ili svih od

a. sekrecija citokina izabranog iz grupe koju čine TNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9,IL-10, IL-13, IL-17, RANTES i interferon gama u čoveku;

b. proliferacija leukocita kod čoveka; i

c. vezivanje hOX40 receptora koji eksprimiraju humane T-ćelije sa hOX40L koji eksprimiraju endotelijske ćelije.

pri čemu metoda obuhvata primenu terapeutski efikasne količine antitela ili fragmenta koji se specifično vezuje za hOX40L.

U petoj konfiguraciji

[0018] Antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za hOX40L i takmiči se za vezivanje za navedeni hOX40L sa antitelom 02D10, gde antitelo ili njegov fragment sadrže VH domen koji se sastoji od HCDR3 koji obuhvata motiv VRGXYYY, gde je X bilo koja aminokiselina.

U šestoj konfiguraciji

[0019] Antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za hOX40L i takmiči se za vezivanje za navedeni hOX40L sa antitelom 02D10, pri čemu antitelo ili njegov fragment sadrže VH domen koji se sastoji od HCDR3 sekvence SEQ ID NO:40 ili 46 ili HCDR3 sekvence SEQ ID NO:40 ili 46 koja se sastoji od manje od 5 supstitucija aminokiselina.

U sedmoj konfiguraciji

[0020] Humano antitelo ili njegov fragment koji sadrži HCDR3 od 16 do 27 aminokiselina i koji potiče od rekombinacije segmenta humanog VH gena, segmenta humanog D gena i segmenta humanog JH gena, gde je segment humanog JH gena IGHJ6, koji se specifično vezuje za hOX40L za tretman ili sprečavanje autoimune bolesti izabrane iz grupe koju čine autoimuna bolest ili stanje, sistemska upalna bolest ili stanje, ili odbacivanje transplantacije.

U osmoj konfiguraciji

[0021] Upotreba humanog antitela ili njegovog fragmenta koji sadrži HCDR3 od 16 do 27 aminokiselina i koji potiče od rekombinacije segmenta humanog VH gena, segmenta humanog D gena i segmenta humanog JH gena, gde je segment humanog JH gena IGHJ6, koji se specifično vezuje za hOX40L u proizvodnji leka za primenu kod čoveka za tretiranje ili sprečavanje bolesti ili stanja posredovanih hOX40L-om kod čoveka, izabrane iz grupe koju čine autoimuna bolest ili stanje, sistemska upalna bolest ili stanje, ili odbacivanja transplantacije.

U devetoj konfiguraciji

[0022] Metoda tretmana ili sprečavanja bolesti ili stanja posredovanog hOX40L-om, izabrane iz grupe koju čine autoimune bolest ili stanje, sistemska upalna bolest ili stanje, ili odbacivanje transplantacije, koja obuhvata primenu navedene terapeutski efikasne količine humanog antitela ili njegovog fragmenta, koja obuhvata HCDR3 od 16 do 27 aminokiselina i koja potiče od rekombinacije segmenta humanog VH gena, segmenta humanog D gena i segmenta humanog JH gena, pri čemu je segment humanog JH gena IGHJ6, koji se specifično vezuje za hOX40L, pri čemu se bolest ili stanje posredovano hOX40L-om time tretira ili sprečava.

[0023] Pronalazak takođe pruža farmaceutske sastave, komplete, nukleinske kiseline, vektore i ćelije domaćina kako je definisano u patentnim zahtevima.

KRATAK OPIS SLIKA

[0024]

Slika 1: Profilisanje kompletno humanih rekombinantnih anti-OX40L antitela u testu HTRF Ligand/receptor neutralizacija. Prikazani podaci su reprezentativni za tri ponovljena eksperimenta.

Slika 2: Utvrđivanje efekta anti-OX40L antitela u reakciji alogeni PBMC/T mešani limfociti. Podaci su prikazani iz tri nezavisna uparivanja donora gde se pretpostavlja da je svaki donor različita individua.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0025] Pronalazak pruža anti-humana OX40L (hOX40L) antitela i fragmente i nove medicinske primene za tretman ili prevenciju bolesti ili stanja posredovanih hOX40L-om kod ljudi kako je definisano u patentnim zahtevima. Opis pruža sledeće vidove. Ovde opisana antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu biti korisni, na primer, za tretman ili sprečavanje odbacivanja transplantacije, npr. bolesti 'kalem protiv domaćina' (GvHD) ili odbacivanja alogene transplantacije. Ovde opisana antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu biti korisni, na primer, za tretman ili sprečavanje upalne bolesti creva, npr. UC ili CD, ili za tretman ili sprečavanje upalne bolesti ili stanja disajnih puteva. U jednom primeru ovde opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu biti korisni za tretman ili sprečavanje astme. Ovde opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu biti korisni, na primer, za tretman ili sprečavanje fibroze. Ovde opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu biti korisni, na primer, za tretman ili sprečavanje dijabetesa. Ovde opisana antitela ili antigenvezujući fragmenti mogu biti korisni, na primer, za tretman ili sprečavanje uveitisa. Ovde opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu biti korisni, na primer, za tretman ili sprečavanje gangrenozne piodermije. Ovde opisana antitela ili antigenvezujući fragmenti mogu biti korisni, na primer, za tretman ili sprečavanje arteritisa džinovskih ćelija. Ovde opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu biti korisni, na primer, za tretman ili sprečavanje Šniclerovog sindroma. Ovde opisana antitela ili antigen-vezujući fragmenti mogu biti korisni, na primer, za tretman ili sprečavanje neinfektivnog skleritisa.

U prvom vidu

[0026] Antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za hOX40L za tretman ili sprečavanje bolesti ili stanja posredovanih hOX40L-om kod čoveka metodom gde se antitelo ili fragment primenjuje na navedenom čoveku, gde se antitelo ili fragment koristi za tretman ili sprečavanje navedenih bolesti ili stanja posredovanih hOX40L-om smanjenjem jednog, više ili svih od

a. sekrecija citokina izabranog iz grupe koju čineTNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9,IL-10, IL-13, IL-17, RANTES i interferon gama u čoveku;

b. proliferacija leukocita kod čoveka; i

c. vezivanje hOX40 receptora koji eksprimiraju humane T-ćelije sa hOX40L koji eksprimiraju endotelijske ćelije.

[0027] Pronalazači su tako po prvi put identifikovali smanjenje (a), (b) i (c) kao načine tretiranja i/ili sprečavanja bolesti i stanja kod ljudi posredovanih OX40L-om i opisuju antitela i fragmente antitela za tu svrhu.

[0028] U jednom primeru, sekrecija je sekrecija leukocita. U jednom primeru, (a) je naznačeno značajno povišenim nivoom citokina u ljudskoj krvi, plazmi ili serumu.

[0029] U jednom primeru, citokin je izabran iz grupe koju čine (i) TNF alfa, (ii) IL-2 i (iii) interferon gama. Na primer, citokin TNF alfa. Na primer, citokin je IL-2. U jednom primeru, citokin je interferon gama. U jednom primeru, citokini su (i) i (ii); ili (i) i (iii); ili (ii) i (iii); ili (i)-(iii).

[0030] U jednom primeru, smanjenje (a), (b) ili (c) ili bilo koje drugo smanjenje obelodanjeno ovde je smanjenje za najmanje 10 ili 20% u poređenju sa nivoom kod čoveka sa rizikom ili obolelog od bolesti ili stanja posredovanog hOX40L-om. U jednom primeru, potonji je čovek naveden u vidu 1 pre primene antitela ili fragmenta; u drugom primeru, navedeni čovek je različiti čovek. U jednom primeru, navedeno smanjenje je najmanje 10, 20, 30, 40, 50 ili 60%.

(i) U jednom primeru, antitelo ili fragment je sposoban da smanji sekreciju relevantnog citokina iz leukocita (npr. humanih T-ćelija) u in vitro testu (kao što je objašnjeno u daljem tekstu), i tako primena takvog antitela ili fragmenta na čoveka dovodi do smanjenja (a).

(ii) U jednom primeru, antitelo ili fragment je u stanju da sprovede smanjenje proliferacije leukocita (npr. humanih PBMC i/ili humanih T-ćelija) u in vitro testu (kao što je objašnjeno u daljem tekstu), i tako primena takvog antitela ili fragmenta na čoveka dovodi do smanjenja (b).

(iii) U jednom primeru, antitelo ili fragment je u stanju da smanji vezivanje receptora hOX40 koji eksprimiraju humane T-ćelije sa hOX40L koji eksprimiraju endotelijske ćelije u in vitro testu (kao što je objašnjeno u daljem tekstu), i tako primena takvog antitela ili fragmenta na čoveka dovodi do smanjenja (c).

[0031] U jednom primeru, primenjuju se (i) i (ii); ili (i) i (iii); ili (ii) i (iii); ili (i)-(iii).

[0032] Dodatno ili alternativno, procena navedenih smanjenja može se izvršiti korišćenjem uzoraka tretiranog čoveka. Na primer, upućuje se na J. Clin. Immunol., 2004 Jan, 24(1):74-85; "Increased expression of CCL20 in human inflammatory bowel disease"; Kaser A et al. Ova publikacija pruža primer opšte primenljive tehnike korišćenja biopsije tkiva i očitavanja smanjenih nivoa citokina koji su indikativni za smanjenje sekrecije citokina nakon tretmana antitelima in vivo. Slične metode se mogu koristiti za određivanje smanjenja sekrecije jednog ili više citokina u čoveku koji je primio antitelo pronalaska. Stručnjak će biti upoznat sa tehnikama za procenu nivoa citokina u pacijentima i uzorcima pacijenata, na primer, primenom jedne ili više biopsija tkiva, imunohistohemije, imunofluorescencije, bojenja tkiva, kvantifikacije citokinske mRNK (npr. korišćenjem PCR, kao što je Taqman<™>PCR), detekcije i kvantifikacije citokinskih proteina (npr. korišćenjem antitela specifičnih za citokin i kvantifikacijom, kao što je ELISA ili drugom standardnom tehnikom kvantifikacije proteina). Na primer, kada je bolest ili stanje jednog od GI trakta (npr. IBD), može se izvršiti biopsija relevantnog crevnog tkiva od pacijenta koji je primio antitelo pronalaska, nakon čega sledi kvantifikacija citokinske mRNK i/ili citokinskog proteina (npr., korišćenjem kvantitativnog PCR). Rezultat se može uporediti sa kvantifikacijom citokina u biopsiji relevantnog tkiva kod istog pacijenta pre primene antitela ili sa drugim humanim pacijentom koji boluje od iste bolesti ili stanja, ali ne prima anti-OX40L tretman ili bez tretmana za bolest ili stanje. Na taj način stručnjak može da utvrdi da antitelo pronalaska smanjuje sekreciju citokina u humanom primaocu.

Umesto procene nivoa crevnog tkiva, može se koristiti različito tkivo ili uzorak od humanog pacijenta u zavisnosti od prirode i lokacije bolesti ili stanja. Na primer, ako je bolest ili stanje jedan od disajnih puteva (npr. pluća), moguće je uzeti uzorak plućnog ili drugog tkiva disajnih puteva za procenu citokina. Alternativno, može se koristiti uzorak bronhoalveolarne lavaže (BAL), kao što će biti vidljivo stručnjaku. U drugom primeru, za neku bolest ili stanje može se proceniti smanjenje citokina u krvi, serumu ili uzorku plazme uzetom od čoveka koji je primio antitelo pronalaska, a zatim upoređivanje sa nivoom pre primanja antitela ili upoređivanje sa nivoom kod netretiranog čoveka, kao što je gore navedeno.

[0033] Kao što je poznato u stanju tehnike, izraz "leukociti" uključuje, na primer, jednu ili više vrsta limfocita, polimorfonuklearnih leukocita i monocita. Kao što je takođe lako vidljivo stručnjaku, izraz "monociti" uključuje, na primer, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) ili ćelije izvedene iz monocita, npr. dendritske ćelije (DC). Vidi, na primer, Immunobiology, 2013 Nov, 218(11):1392-401. doi:

10.1016/j.imbio.2013.07.005. Epub 2013 Jul 25; Leukoreduction system chambers are an efficient, valid, and economic source of functional monocyte-derived dendritic cells and lymphocytes", Pfeiffer IA et al.

[0034] Proliferacija leukocita, npr. limfocita lamina propria-e (LPL), može se proceniti biopsijom tkiva, bojenjem i histologijom, kao što će biti očigledno stručnjaku. Bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E boja ili HE boja) se, na primer, obično koristi u histologiji za traženje infiltrirajućih limfocita u čitavom nizu humanih tkiva i jedna je od glavnih boja u histologiji. To je najčešće korišćena boja u medicinskoj dijagnozi i često je zlatni standard, i kao takva se može koristiti za procenu proliferacije leukocita. Na primer, tkivo gastrointestinalnog trakta (npr. crevno tkivo) čoveka koji boluje od ili je pod rizikom od bolesti ili stanja posredovanog hOX40L-om može biti dobijeno, obojeno i procenjeno na iznos infiltracije LPL. Može se izvršiti poređenje između takvog tkiva od čoveka koji je primio antitelo pronalaska u poređenju sa

1

obimom infiltracije u tkivu dobijenom od istog čoveka pre primene antitela ili od drugog čoveka koji nije primio terapiju i u opasnosti je od bolesti ili stanja ili od njega boluje. Na primer, poređenje je između humanih crevnih tkiva uzetih od istih (ili različitih) ljudi koji pate od IBD.

[0035] Može se, na primer, utvrditi da li antitelo ili fragment mogu da smanje vezivanje receptora hOX40 koji eksprimiraju humane T-ćelije sa hOX40L koji eksprimiraju endotelijske ćelije koristeći standardne testove vezivanja koji su poznati stručnjaku, npr. korišćenje ELISA ili SPR.

[0036] Zapaljenska bolest creva (IBD) je hronični inflamatorni poremećaj koji utiče na gastrointestinalni trakt sa naizgled sve većom incidencom i tendencijom ka težim kliničkim fenotipovima. Bolest karakteriše preterana imunološka reakcija na luminalnu floru, što ukazuje na to da mogu biti uključeni nedostaci u odbrambenoj funkciji crevne flore, a studije podržavaju ovaj utisak (Cucchiara et al., 2012; Jostins et al., 2012; Manichanh et al., 2012; Salzman et al., 2007, svi navedeni u: Deuring et al., " The cell biology of the intestinal epithelium and its relation to inflammatory bowel disease", The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 45 (2013) 798-806). IBD obuhvata dve glavne grupe: Kronovu bolest (CD) i ulcerozni kolitis (UC). CD pacijenti mogu imati upalne lezije u celom gastrointestinalnom traktu, dok je upala kod UC pacijenata ograničena na debelo crevo. Pominje se i "Immune aspects of the pathogenesis of inflammatorybowel disease", Pharmacology & Therapeutics 137 (2013) 283-297) i dokumenti navedeni u njima.

[0037] Formacija granuloma je jedna od najvažnijih patoloških karakteristika humane Kronove bolesti. Mizoguchi et al su pokazali da F4/80-pozitivne nezrele

CD11c<+>dendritske ćelije (DC) proizvode IL-23 i doprinose formiranju granuloma u modelu mišjeg kolitisa (Mizoguchi et al., 2007). Imunski odgovor Th1 je dominantan kod Kronove bolesti. Zaista, CD4<+>T-ćelije u LP Kronove bolesti su eksprimirale T-bet i proizvele velike količine interferona (IFN)-γ (Matsuoka et al., 2004). Sakuraba et al su pokazali da DC u mezentričnim limfnim čvorovima pacijenata sa Kronovom bolešću snažno promovišu Th1 i Th17 imunološki odgovor (Sakuraba et al., 2009). Mezenterijalni limfni čvorovi DC doprinose IBD patogenezi, posebno onoj Kronove bolesti.

Uloga citokina u bolesti i stanjima

[0038] Upućuje se na Muzes et al, World J Gastroenterol 2012 November 7; 18(41): 5848-5861 ISSN 1007-9327 (print) ISSN 2219-2840 (online), "Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel Diseases".

[0039] Citokini su neizostavni signali imunog sistema povezanog sa sluznicom za održavanje normalne homeostaze creva. Neravnoteža njihovog profila u korist inicijacije zapaljenja može dovesti do bolesnih stanja, kao što je to primećeno kod upalnih bolesti creva (IBD), npr. Kronove bolesti (CD) i ulceroznog kolitisa (UC). Uloga proinflamatornih citokina kao što su IL-1α, IL-1β, IL-2, -6, -8, -12, -17, -23, IFN-gama ili TNF alfa u IBD je povezana sa inicijacijom i progresijom UC i CD. CD se često opisuje kao prototip bolesti posredovanih pomoćničkim T-ćelijama (Th) 1, jer su primarni inflamatorni posrednici Th1 citokini kao što su interleukin (IL)-12, interferon (IFN) -γ i faktor nekroze tumora (TNF)-α.

[0040] Vezivanje liganda sličnih TNF za njihove receptore pokreće intracelularne puteve koji su direktno uključeni u proliferaciju ćelija, diferencijaciju i preživljenje. Većina članova TNF/TNF-receptorskih proteinskih nadporodica su eksprimirani na imunim ćelijama i igraju kritičnu ulogu u višestrukim komponentama imunskog odgovora. TNF-α je master citokin u patogenezi IBD. Svoje pleiotropne efekte ostvaruje putem ekspresije adhezionih molekula, proliferacije fibroblasta, prokoagulantnih faktora, kao i pokretanjem citotoksičnih, apoptotičkih i odgovora akutne faze. Izvor TNF-α u IBD su delimično urođene imunološke ćelije, kao što su makrofagi ili monociti, a takođe i diferencirane Th1 ćelije. Nivoi seruma TNF-α koreliraju sa kliničkom aktivnošću UC i CD[31]. On ima orkestrirajuću ulogu u zapaljenju debelog creva kod IBD. Uloga TNF-α u CD je široko istražena. Vezivanje TNF-α za serumski rastvorni TNF receptor 1 i 2 (sTNFR1 i 2) pokreće proinflamatornu signalizaciju. Nivoi sTNFR1 i 2 su povišeni u CD.

[0041] Faktor sličan faktoru tumorske nekroze (TL1A), još jedan član TNF porodice, stimuliše sekreciju IFN-γ vezivanjem za receptor smrti 3 (DR3). DR3 eksprimira visoki procenat ćelija iz biopsija sluzokože UC i CD, a porast nivoa IFN-γ primećen je kod IBD pacijenata sa aktivnošću bolesti. Sistem TL1A/DR3 učestvuje u patogenezi CD. Makrofagi lamina proprija su glavni proizvođač TL1A, čija ekspresija je izrazito pojačana u CD. Utvrđeno je da TL1A i IL-23 sinergijski podstiču proizvodnju IFN-γ putem mukoznih T-ćelija. FN-Y: proizvode TH1 T-ćelije. Nakon što započne zapaljenje, IFN-γ se proizvodi i nakon toga deluje kroz različite molekule i puteve imunog sistema kako bi se intenzivirao proces zapaljenja. Postoji ogromna literatura koja opsežno dokumentuje proinflamatornu prirodu IFN-γ, što je dovelo do uvreženog mišljenja da je IFN-γ glavni proinflamatorni citokin kod zapaljenja i autoimune bolesti. Interferon-gama je uzročno uključen u eksperimentalnu upalnu bolest creva kod miševa (Ito et al, Clinical and Experimental Immunology (2006), 146:330-338). Studija je jasno pokazala da su IFN-γ<-/->miševi manifestovali atenuirani kolitis nakon stimulacije sa DSS, u pogledu stepena gubitka telesne težine, DAI, histološkog skora i aktivnosti MPO. IFN-γ se sve više proizvodio u debelom crevu WT miševa tretiranih sa DSS, koji su pokazivali teške simptome slične IBD.

[0042] Interleukin-2 (IL-2) proizvode T-ćelije i uglavnom je važno da se T-ćelije diferenciraju u efektorske T-ćelije. IL-2 je takođe važan za proliferaciju T-ćelija. Ovo je važno za IBD, jer se smatra da su efektorske T-ćelije glavni tip ćelija koje uzrokuju oštećenja u IBD.

[0043] IL-8 (interleukin-8; poznat i kao CXCL8) prvenstveno posreduje aktivaciju i migraciju neutrofila u tkivo iz periferne krvi i na mesta zapaljenja. Utvrđeno je da je nivo IL-8 u tkivu viši u aktivnom UC u poređenju sa normalnim tkivom debelog creva, a njegova koncentracija u serumu je povezana sa endoskopskom i histološkom ozbiljnošću UC. IL-8 je važan za zapaljenska okruženja i rak (videti, npr., " The Chemokine CXCL8 in Carcinogenesis and Drug Response", ISRN Oncol.2013 Oct 9;2013:859154; Gales D et al., and Future Oncol., 2010 Jan;6(1):111-6. doi:

10.2217/fon.09.128; "CXCL8 and its cognate receptors in melanoma progression and metastasis", Singh S et al.). Posebno se kod raka smatra da IL-8 doprinosi i podrškom angiogenezi.

[0044] U bilo kojoj konfiguraciji, vidu ili primeru opisa antitelo ili fragment antagoniziraju vezivanje hOX40L za OX40 receptor.

1

[0045] U bilo kojoj konfiguraciji, vidu ili primeru opisa, antitelo ili fragment antagonizuje vezivanje hOX40L za OX40.

[0046] U bilo kojoj konfiguraciji, vidu ili primeru opisa, OX40L receptor može biti humani OX40.

[0047] U bilo kojoj konfiguraciji, vidu ili primeru opisa čovek pati od ili je izložen riziku od astme i antitelo ili fragment smanjuje IgE kod čoveka.

[0048] U bilo kojoj konfiguraciji, vidu ili primeru opisa čovek pati od ili je izložen riziku od astme i antitelo ili fragment je za smanjenje IgE kod čoveka.

U drugom vidu

[0049] Antitelo ili fragment prvog vida opisa, gde antitelo ili fragment smanjuje vezivanje receptora hOX40 koji eksprimiraju humane T-ćelije sa hOX40L koji eksprimiraju endotelijske ćelije i smanjuje proliferaciju humanih T-ćelija; pri čemu antitelo ili fragment služi za tretman ili sprečavanje navedene bolesti ili stanja posredovanih hOX40L-om, smanjenjem sekrecije citokina izabranog iz grupe koju čine TNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, RANTES i interferon gama.

[0050] U jednom primeru, citokin je izabran iz grupe koju čine (i) TNF alfa, (ii) IL-2 i (iii) interferona gama. U jednom primeru, citokin je TNF alfa. U jednom primeru, citokin je IL-2. U jednom primeru, citokin je interferon gama. U jednom primeru, citokini su (i) i (ii); ili (i) i (iii); ili (ii) i (iii); ili (i)-(iii).

U trećem vidu

[0051] Antitelo ili fragment prvog vida opisa, gde su leukociti izabrani iz grupe koju čine polimorfonuklearni leukociti, monociti, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), limfociti, T-ćelije, antigen-prezentirajuće ćelije (APC), dendritske ćelije (DC ćelije) i ćelije prirodne ubice (NK ćelije).

[0052] U jednom otelotvorenju, leukociti su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i T-ćelije (npr. PBMC).

U četvrtom vidu

[0053] Antitelo ili fragment trećeg vida opisa, gde leukociti obuhvataju lamina propria limfocite (LPL) i bolest ili stanje predstavljaju bolest ili stanje gastrointestinalnog trakta (GI trakta).

U petom vidu

[0054] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde ćelije epitela čine ćelije izabrane iz grupe koju čine ćelije gastrointestinalnog trakta, ćelije debelog creva, ćelije creva i ćelije disajnih puteva (npr. ćelije pluća).

[0055] U drugom otelotvorenju, epitelne ćelije sadrže ćelije izabrane iz grupe koju čine gastrointestinalne ćelije, ćelije debelog creva, ćelije creva, ćelije čula vida i ćelije disajnih puteva (npr. ćelija pluća). U drugom otelotvorenju, epitelne ćelije čine ćelije izabrane iz grupe koju čine gastrointestinalne ćelije, ćelije debelog creva, ćelije creva i ćelije oka. U daljem otelotvorenju, epitelne ćelije se sastoje od očnih ćelija.

U šestom vidu

[0056] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, za tretman ili sprečavanje navedene hOX40L-posredovane bolesti ili stanja kod navedenog čoveka smanjenjem proliferacije T-ćelija u navedenom čoveku.

[0057] U jednom primeru, antitelo ili fragment je sposoban da izvrši smanjenje proliferacije T-ćelija u in vitro testu (npr. u in vitro testu humana DC ćelija/T-ćelija, na primer kao što je dalje objašnjeno u nastavku), i tako primena takvog antitela ili fragmenta na čoveka dovodi do smanjenja proliferacije T-ćelija u navedenom čoveku.

U sedmom vidu

[0058] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, za tretman ili sprečavanje navedene hOX40L-posredovane bolesti ili stanja kod navedenog čoveka antagonizovanjem interakcije između hOX40L i leukocita čoveka, gde je smanjena proliferacija leukocita.

1

[0059] U jednom primeru, antitelo ili fragment je sposoban da izvrši smanjenje proliferacije leukocita (npr. monokuklearnih ćelija) u in vitro testu (npr., u MLR in vitro testu, na primer kao što je dalje objašnjeno u nastavku), i tako primena takvog antitela ili fragmenta na čoveka dovodi do smanjenja proliferacije leukocita u navedenom čoveku.

U osmom vidu

[0060] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, za tretman ili sprečavanje pomenute hOX40L-posredovane bolesti ili stanja kod navedenog čoveka smanjenjem proliferacije leukocita čoveka antagonizovanjem interakcije OX40L/OX40L receptora posredovane T-ćelijama kod navedenog čoveka.

[0061] U jednom primeru, antitelo ili fragment je u stanju da izvrši smanjenje proliferacije leukocita (npr. monokuklearnih ćelija) u in vitro testu gde antitelo ili fragment antagonizuje interakciju OX40L/OX40L receptora posredstvom T-ćelija u pomenutom testu, i tako primena takvog antitela ili fragmenta na čoveka dovodi do smanjenja proliferacije leukocita kod navedenog čoveka.

U devetom vidu

[0062] Antitelo ili fragment bilo kog od prethodnih vidova opisa, za tretman ili sprečavanje pomenute hOX40L-posredovane bolesti ili stanja kod navedenog čoveka smanjenjem sekrecije citokina izabranog iz grupe koju čineTNF alfa, IL-2 i interferona gama u čoveku.

[0063] U jednom primeru, antitelo ili fragment služi za tretman ili sprečavanje pomenute bolesti, stanja ili oštećenja epitelnih ćelija posredovanih hOX40L-om u navedenom čoveku smanjenjem sekrecije (i) IL-2 i interferona gama, (ii) IL-2 i TNF alfa ili (iii) interferona gama i TNF alfa u čoveku.

[0064] U jednom primeru, antitelo ili fragment je sposoban da izvrši smanjenje sekrecije citokina izabranog iz grupe koju čine IL-2, TNF alfa i interferon gama u in vitro testu (npr. u MLR in vitro testu, kao što je dalje objašnjeno u nastavku), i tako primena takvog antitela ili fragmenta na čoveka dovodi do smanjenja sekrecije pomenutog odabranog citokina(ova) u navedenom čoveku.

1

[0065] U jednom primeru, antitelo ili fragment je sposoban da izvrši smanjenje sekrecije IL-8 u in vitro testu (npr. u MLR in vitro testu, na primer, kao što je dalje objašnjeno u nastavku), i tako primena takvog antitela ili fragmenta na čoveka dovodi do smanjenja sekrecije IL-8 u navedenom čoveku.

U desetom vidu

[0066] Antitelo ili fragment devetog vida opisa, za tretman ili sprečavanje navedene bolesti ili stanja smanjenjem sekrecije pomenutog citokina posredovane interakcijom dendritskih ćelija (DC ćelija) sa T-ćelijama u čoveku.

[0067] U jednom primeru, antitelo ili fragment je u stanju da izvrši smanjenje sekrecije pomenutog(ih) citokina u in vitro testu DC ćelija/T-ćelija (na primer, kao što je dalje objašnjeno u nastavku), i tako primena takvog antitela ili fragmenta na čoveka dovodi do smanjenja sekrecije pomenutog(ih) citokina u navedenom čoveku.

U jedanaestom vidu

[0068] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde je oštećenje gastrointestinalne ćelije, ćelije debelog creva, ćelije creva ili disajnih puteva (npr. ćelija pluća) simptom ili uzrok navedene bolesti ili stanja kod ljudi.

[0069] U drugom otelotvorenju, epitelne ćelije sadrže ćelije izabrane iz grupe koju čine gastrointestinalne ćelije, ćelije debelog creva, ćelije creva, očne ćelije i ćelije disajnih puteva (npr. ćelija pluća). U drugom otelotvorenju, epitelne ćelije sadrže ćelije izabrane iz grupe koju čine gastrointestinalne ćelije, ćelije debelog creva, ćelije creva i ćelije oka. U daljem otelotvorenju, epitelne ćelije se sastoje od očnih ćelija.

U dvanaestom vidu

[0070] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde čovek pati od ili je pod rizikom od zapaljenske bolesti creva (IBD), odbacivanja alogene transplantacije, bolesti 'kalem-protiv-domaćina' (GvHD), dijabetesa ili zapaljenja disajnih puteva i pomenuta metoda tretira ili sprečava IBD, odbacivanje alogene transplantacije, GvHD, dijabetes ili zapaljenje disajnih puteva u čoveku.

1

U dvanaestom (a) vidu

[0071] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde čovek pati od ili je pod rizikom od zapaljenske bolesti creva (IBD), odbacivanja alogene transplantacije, bolesti 'kalem-protiv-domaćina' (GvHD), uveitisa, pioderme gangrenosum, arteritisa gigantskih ćelija, Šniclerovog sindroma, neinfektivnog skleritisa, dijabetesa ili zapaljenja disajnih puteva i pomenute metode tretiraju ili sprečavaju IBD, odbacivanje alogene transplantacije, GvHD, uveitis, pioderma gangrenosum, arteritis gigantskih ćelija, Šniclerov sindrom, neinfektivni skleritis, dijabetes ili zapaljenje disajnih puteva kod čoveka.

[0072] U jednom primeru bilo kog prethodnog vida opisa, čovek pati od ili je izložen riziku od zapaljenjske ili autoimune bolesti ili stanja ili je kao takav dijagnostikovan.

[0073] U jednom primeru, autoimuna bolest ili stanje je izabrano iz grupe koju čine sledeće:-Akutni diseminovani encefalomijelitis (ADEM)

Adisonova bolest

Alergijska granulomatoza i angiitis ili Čurg-Štrausov sindrom (CSS) Alopecija ili Alopecija Areata (AA)

Anklozirajući spondilitis

Autoimuni hronični aktivni hepatitis (CAH)

Autoimuna hemolitička anemija

Autoimuni pankreatitis (AIP)

Autoimuna retinopatija (AR) vidi Retinopatija

Autoimuna trombocitopenijska purpura

Autoimuna neutropenija

Autoimuna bolest unutrašnjeg uha (AIED)

Antifosfolipidni sindrom (APS)

Autoimuni limfoproliferativni sindrom (ALPS)

Behčtov sindrom

Bulozni pemfigoid

Celijakija

Čarg-Štrausov sindrom (CSS) ili Alergijska granulomatoza i angiitis Hronična junkcionalna bulozna epidermoliza

1

Hronična inflamatorna demijelinizaciona poliradikuloneuropatija (CIDP) Ožiljavajući pemfigoid (CP)

Vaskulitis centralnog nervnog sistema

Kronova bolest

Krioglobulinemija

Dermatitis herpetiformis (DH)

Diskoidni eritematozni lupus (DLE)

Encefalomijelitis

Epidermoliza buloza akvizita (Eba)

Arteritis džinovskih ćelija vidi Privremeni arteritis

Bolest 'kalem-protiv-domaćina'

Graveova bolest.

Gullain-Barre-ov sindrom

Hanotov sindrom vidi primarna bilijarna ciroza

Hašimotov tireoiditis takođe nazvan autoimuni tireoiditis i hronični limfocitni tireoiditis

Preosetljivost na vaskulitis (HV) ili vaskulitis malih krvnih sudova Imunološki posredovana neplodnost

Zapaljenska bolest creva

Šećerna bolest zavisna od insulina

Izolovani vaskulitis centralnog nervnog sistema ili vaskulitis CNS Ajzaksov sindrom: Neuromiotonija

Kawasaki bolest (KD)

Lambert-Eatonov mijastenični sindrom (LEMS)

Linearna IgA bolest

Lupus - vidi Sistemski eritematozni lupus

Meniere-ova bolest

Mikroskopski poliangiitis (MPA)

Bolest mešovitog vezivnog tkiva ili MCTD

Monoklonalna gamopatija

Miastenija Gravis

Multipla skleroza

Multifokalna motorna neuropatija

Neuromiotonija ili Isakov sindrom

1

Neutropenija vidi Autoimuna Neutropenija

Ooforitis

Opsoclonus-myoclonus sindrom

Oritis

Paraneoplastični neurološki poremećaji

Pemphigus vulgaris

Pemphigus follaceus (PF)

Pemfigoid gestationis (PG)

Perniciozna anemija

Paraneoplastični pemfigus (PNP)

Poliangiitis - vidi Mikroskopski poliangiitis

Poliarteritis nodosa (PAN)

Polimiozitis/dermatomiozitis

Polimialgia reumatika

Primarna bilijarna ciroza (PBC) takođe nazvana i Hanotov sindrom Primarni sklerozantni holangitis

Rejnodov fenomen

Retinopatija asocirana sa rekoverinom (RAR) vidi Retinopatija Reaktivni artritis poznat kao Reiterov sindrom

Retinopatija

Reumatoidni artritis (RA)

Sarkoidoza

Sklerozirajući holangitis vidi Primarni sklerozirajući holangitis Sjogren-ov sindrom

Sistemski nekrotizirajući vaskolitidi

Sindrom ukočenog čoveka ili Moersch-Woltmannov sindrom Sistemski lupus eritematozus

Sistemska skleroza (skleroderma)

Privremeni arteritis ili gigantocelularni arteritis (GCV) Takajasuov arteritis

Tromboangiitis obliterans ili Buerger-ova bolest

Tiroiditis sa hipotiroidizmom

Tiroiditis sa hipertiroidizmom

Tip I autoimuni poliglandularni sindrom (PAS)

2

Tip II autoimuni poliglandularni sindrom

Vaskulitis

Vegenerova granulomatoza

[0074] Pacijent možda pati od uveitisa. Na primer, uveitis je neinfektivni i/ili autoimun po prirodi, tj. neinfektivni uveitis ili je autoimuni uveitis. Na primer, neinfektivni/autoimuni uveitis je uzrokovan i/ili je povezan sa Behčetovom bolešću, Fuksovim heterohromnim iridociklitisom, granulomatozom sa poliangiitisom, uveitisom povezanim sa HLA-B27, juvenilnim idiopatskim artritisom, sarkoidozom, spondiloartritisom, simpatetičkom oftalmijom, tubulointersticijskim nefritisom ili uveitis sindromom. U jednom primeru, uveitis je sistemske prirode, tj. sistemski uveitis. Na primer, sistemski uveitis je uzrokovan i/ili povezan sa ankilozantnim spondilitisom, Behčetovom bolešću, hroničnom granulomatoznom bolešću, entezitisom, upalnom bolešću creva, juvenilnim reumatoidnim artritisom, Kavasakijevom bolešću, multiplom sklerozom, poliarteritisom nodoza, psorijatičnim artritisom, reaktivnim artritisom, sarkoidozom, sistemskim eritematoznim lupusom, Vogt-Koyanagi-Harada sindromom ili Whipple-ovom bolešću.

[0075] Čovek možda pati od pioderme gangrenozum, arteritisa džinovskih ćelija, Šniclerovog sindroma ili neinfektivnog skleritisa. U jednom primeru primer, čovek pati od pioderma gangrenozum. U jednom primeru, čovek pati od arteritisa džinovskih ćelija. U jednom primeru, čovek pati od Šniclerovog sindroma. U jednom primeru, čovek pati od neinfektivnog skleritisa.

[0076] Čovek može patiti od bolesti ili stanja posredovanog hOX40L-om izabranog iz grupe koju čine autoimuna bolest ili stanje, sistemska upalna bolest ili stanje ili odbacivanje transplantacije; na primer, upalna bolest creva (IBD), Kronova bolest, reumatoidni artritis, odbacivanje transplantacije, alogeno odbacivanje transplantacije, bolest kalem-protiv-domaćina (GvHD), ulcerozni kolitis, sistemski eritematozni lupus (SLE), dijabetes, uveitis, ankilozantni spondilitis, kontaktna preosetljivost, multipla skleroza i ateroskleroza, posebno GvHD. U drugom otelotvorenju, čovek pati od ili je u opasnosti od odbacivanja multivisceralno transplantiranog organa.

U trinaestom vidu

[0077] Antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za hOX40L i takmiči se za vezivanje za navedeni hOX40L sa antitelom izabranim iz grupe koju čine 02D10, 10A07, 09H04 i 19H01.

[0078] Kompeticija se može odrediti rezonancijom površinskog plazmona (SPR), pri čemu su takve tehnike lako vidljive stručnjaku. SPR se može sprovesti pomoću Biacore<™>, Proteon<™>ili druge standardne SPR tehnike. Takva kompeticija može biti, na primer, zbog antitela/fragmenata koji se vezuju za identične ili preklapajuće epitope hOX40L. Kompeticija se može odrediti pomoću ELISA, pri čemu su takve tehnike lako vidljive stručnjaku. Kompeticija može biti određena pomoću homogene vremenski razložene fluorescencije (HTRF), pri čemu su takve tehnike lako vidljive stručnjaku. Kompeticija se može odrediti pomoću fluorescentno-aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS), pri čemu su takve tehnike lako vidljive stručnjaku. U jednom vidu opisa, HTRF, ELISA i/ili FACS metode se sprovode kako je opisano u dole navedenim primerima.

U četrnaestom vidu

[0079] Antitelo ili fragment trinaestog vida, gde je antitelo ili fragment kao što je opisano u bilo kom od prvog do dvanaestog vida opisa.

U petnaestom vidu

[0080] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, koji obuhvata varijabilne domene lambda lakog lanca (opciono koji su humani).

[0081] Varijabilni domeni antitela ili fragmenta mogu biti humani ili humanizovani. Pored toga, opciono antitelo ili fragment dalje obuhvata humane ili humanizovane konstantne regione (npr. humani Fc i/ili humani CL). U primeru bilo kog vida ovog opisa, varijabilne domene antitela ili fragmenta proizvodi transgena životinja (npr. glodar, miš, pacov, zec, kokoška, ovca, kamelid ili ajkula). U primeru bilo kog vida ovog opisa, varijabilni domeni antitela ili fragmenta su proizvedeni ili identifikovani prikazom faga, prikazom ribosoma ili prikazom kvasca.

[0082] Antitelo ili fragment mogu biti rekombinantni.

[0083] Antitelo ili fragment može biti proizveden od strane rekombinantne ćelije sisara, bakterija, insekata, biljaka ili kvasca. U jednom primeru, ćelija sisara je ćelija CHO ili HEK293, a antitelo ili fragment obuhvata glikozilaciju ćelija CHO ili HEK293.

[0084] Antitelo ili fragment mogu biti izolovani.

U šesnaestom vidu

[0085] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, koji se sastoji od VH domena koji se sastoji od HCDR1 sekvence izabrane iz grupe koju čini HCDR1: a. 02D10, i gde antitelo ili fragment takmiči se sa 02D10 za vezivanje za navedeni hOX40L;

b. 10A07, i gde antitelo ili fragment takmiči se sa 10A07 za vezivanje za navedeni hOX40L;

c. 09H04, i gde antitelo ili fragment takmiči se sa 09H04 za vezivanje za navedeni hOX40L; i

d. 19H01, i gde antitelo ili fragment takmiči se sa 19H01 za vezivanje za navedeni hOX40L.

U sedamnaestom vidu

[0086] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, koji se sastoji od VH domena koji se sastoji od HCDR2 sekvence izabrane iz grupe koju čini HCDR2: a. 02D10, i gde antitelo ili fragment takmiči se sa 02D10 za vezivanje za navedeni hOX40L;

b. 10A07, i gde antitelo ili fragment takmiči se sa 10A07 za vezivanje za navedeni hOX40L;

c. 09H04, i gde antitelo ili fragment takmiči se sa 09H04 za vezivanje za navedeni hOX40L; i

d. 19H01, i gde antitelo ili fragment takmiči se sa 19H01 za vezivanje za navedeni hOX40L.

U osamnaestom vidu

[0087] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, koji se sastoji od VH domena koji se sastoji od HCDR3 sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od HCDR3:

2

a. 02D10, i gde antitelo ili fragment takmiči se sa 02D10 za vezivanje za navedeni hOX40L;

b. 10A07, i gde antitelo ili fragment takmiči se sa 10A07 za vezivanje za navedeni hOX40L;

c. 09H04, i gde antitelo ili fragment takmiči se sa 09H04 za vezivanje za navedeni hOX40L; i

d. 19H01, i gde antitelo ili fragment takmiči se sa 19H01 za vezivanje za navedeni hOX40L.

U devetnaestom vidu

[0088] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, koji obuhvata VH domen koji se sastoji od (i) CDR1 i 2, (ii) CDR1 i 3, (iii) CDR2 i 3 ili (iv) CDR1, 2 i 3 sekvence:

a. nabrojano u tački a) šesnaestog do osamnaestog vida opisa, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 02D10 za vezivanje za navedeni hOX40L;

b. nabrojano u tački b) šesnaestog do osamnaestog vida opisa i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 10A07 za vezivanje za navedeni hOX40L;

c. nabrojano u tački c) šesnaestog do osamnaestog vida opisa i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 09H04 za vezivanje za navedeni hOX40L; ili

d. nabrojano u tački (d) šesnaestog do osamnaestog vida opisa, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 19H01 za vezivanje za navedeni hOX40L.

U dvadesetom vidu

[0089] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, koji se sastoji od VH domena koji se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine VH aminokiselinske sekvence u spisku sekvenci.

[0090] U jednom vidu, opis pruža anti-HOX40L antitelo ili fragment (opciono prema bilo kom drugom ovde nabrojanom vidu) koji se sastoji od VH domena koji se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine VH aminokiselinske sekvence u spisku sekvenci. U jednom vidu, VH domen se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine Seq ID NO:2, Seq ID NO:34, Seq ID NO:66, Seq ID NO:94, Seq ID NO:122, Seq ID NO: 124, Seq ID NO:126, Seq ID NO: 128, Seq ID NO: 132 ili Seq ID NO: 134.

[0091] U drugom primeru, antitelo ili fragment sadrži aminokiselinsku sekvencu VH domena utvrđene u spisku sekvenci u nastavku. Dodatno ili alternativno, antitelo ili fragment se sastoji od aminokiselinske sekvence domena HCDR1 utvrđene u spisku sekvenci u nastavku (tj. Seq ID No:4, Seq ID No:10, Seq ID No:36, Seq ID No:42, Seq ID No:68, Seq ID No:74, Seq ID No:96 or Seq ID No: 102, posebno, Seq ID No:36 ili Seq ID No:42). Dodatno ili alternativno, antitelo ili fragment se sastoji od aminokiselinske sekvence domena HCDR2, utvrđene u spisku sekvenci u nastavku (tj. Seq ID No:6, Seq ID No: 12, Seq ID No:38, Seq ID No:44, Seq ID No:70, Seq ID No:76, Seq ID No:98 ili Seq ID No: 104, posebno Seq ID No:38 ili Seq ID No:44). Dodatno ili alternativno, antitelo ili fragment se sastoji od aminokiselinske sekvence domena HCDR3 utvrđene u spisku sekvenci u nastavku (tj. Seq ID No:8, Seq ID No: 14, Seq ID No:40, Seq ID No:46, Seq ID No:72, Seq ID No:78, Seq ID No:100 ili Seq ID No: 106, posebno Seq ID No:40 ili Seq ID No:46).

[0092] U jednom primeru, antitelo ili fragment se sastoji od aminokiselinske sekvence VL domena, utvrđene u spisku sekvenci u nastavku. Pored toga ili alternativno, antitelo ili fragment se sastoji od aminokiselinske sekvence domena LCDR1 utvrđene u spisku sekvenci u nastavku (tj. Seq ID No:18, Seq ID No:24, Seq ID No:50, Seq ID No:56, Seq ID No:82, Seq ID No:88, Seq ID No: 110 ili Seq ID No: 116, posebno Seq ID No:50 ili Seq ID No:56). Dodatno ili alternativno, antitelo ili fragment se sastoji od aminokiselinske sekvence domena LCDR2 utvrđene u spisku sekvenci u nastavku (tj. Seq ID No:20, Seq ID No:26, Seq ID No:52, Seq ID No:58, Seq ID No:84, Seq ID No:90, Seq ID No: 112 ili Seq ID No: 118, posebno Seq ID No:52 ili Seq ID No:58). Dodatno ili alternativno, antitelo ili fragment se sastoji od aminokiselinske sekvence domena LCDR3, utvrđene u spisku sekvenci u nastavku (tj. Seq ID No:22, Seq ID No:28, Seq ID No:54, Seq ID No:60, Seq ID No:86, Seq ID No:92, Seq ID No: 114 ili Seq ID No:120, posebno Seq ID No:54 ili Seq ID No:600).

[0093] U primeru bilo kog vida opisa, antitelo ili fragment se sastoji od teškog lanca koji sadrži konstantni region izabran iz grupe koju čini konstantni region teškog lanca SEQ ID NOi u spisku sekvenci (tj. bilo koji od Seq ID No: 126, 128, 132, ili 134, posebno konstantni region od Seq ID No: 128); i opciono domen VH kako je nabrojano u vidu 19 ili 20. U jednom primeru, antitelo ili fragment se sastoji od dve

2

kopije takvog teškog lanca. U drugom primeru, teški lanac obuhvata konstantni region glodara, pacova, miša, čoveka, zeca, kokoške, kamelida, ovce, goveda, nehumanih primata ili ajkule (npr. Fc), posebno konstantni region miša.

[0094] U primeru bilo kog vida opisa, antitelo ili fragment obuhvata teški lanac koji sadrži gama (npr. humani gama) konstantni region, npr. humani gama1 konstantni region. U drugom primeru bilo kog vida opisa, antitelo fragmenta obuhvata humani gama 4 konstantni region. U drugom otelotvorenju opisa, konstantni region teškog lanca ne vezuje Fc-y receptore, i npr. obuhvata mutaciju Leu235Glu (tj. gde je ostatak divljeg tipa leucina mutiran u ostatak glutaminske kiseline). U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca obuhvata mutaciju Ser228Pro kako bi se povećala stabilnost. U drugom otelotvorenju opisa, konstantni region teškog lanca je IgG4 koji obuhvata i mutaciju Leu235Glu i mutaciju Ser228Pro. Ovaj konstantni region teškog lanca se ovde naziva "IgG4-PE".

[0095] U primeru bilo kog vida opisa, antitelo ili fragment je himeričan, npr. obuhvata humane varijabilne domene i ne-humane (npr. glodar, miš ili pacov, kao što je miš) konstantne regione.

U dvadeset prvom vidu

[0096] Antitelo ili fragment kao što je opisano u bilo kom od šesnaestog do dvadesetog vida, sadrži prvu i drugu kopiju pomenutog VH domena.

U dvadeset drugom vidu

[0097] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog aspekta opisa, koji sadrži VL domen koji sadrži LCDR1 sekvencu izabranu iz grupe koju čini LCDR1 od:

a. 02D10, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 02D10 za vezivanje za navedeni hOX40L;

b. 10A07, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 10A07 za vezivanje za navedeni hOX40L;

c. 09H04, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 09H04 za vezivanje za navedeni hOX40L; i

d. 19H01, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 19H01 za vezivanje za navedeni hOX40L.

2

U dvadeset trećem vidu

[0098] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, koji sadrži VL domen koji sadrži LCDR2 sekvencu izabranu iz grupe koju čini LCDR2 od:

a. 02D10, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 02D10 za vezivanje za navedeni hOX40L;

b. 10A07, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 10A07 za vezivanje za navedeni hOX40L;

c. 09H04, i pri čemu se antitelo ili fragment takmiči sa 09H04 za vezivanje za navedeni hOX40L; i

d. 19H01, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 19H01 za vezivanje za navedeni hOX40L.

U dvadeset četvrtom vidu

[0099] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, koji sadrži VL domen koji sadrži LCDR3 sekvencu izabranu iz grupe koju čini LCDR3 od:

a. 02D10, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 02D10 za vezivanje za navedeni hOX40L;

b. 10A07, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 10A07 za vezivanje za navedeni hOX40L;

c. 09H04, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 09H04 za vezivanje za navedeni hOX40L; i

d. 19H01, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 19H01 za vezivanje za navedeni hOX40L.

U dvadeset petom vidu

[0100] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, koji obuhvata VL domen koji sadrži (i) CDR1 i 2, (ii) CDR1 i 3, (iii) CDR2 i 3 ili (iv) CDR1, 2 i 3 sekvence:

a. nabrojano u (a) od dvadeset drugog do dvadeset četvrtog vida opisa, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 02D10 za vezivanje za navedeni hOX40L;

b. nabrojano u (b) od dvadeset drugog do dvadeset četvrtog vida opisa, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 10A07 za vezivanje za navedeni hOX40L;

c. nabrojano u (c) od dvadeset drugog do dvadeset četvrtog vida opisa, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 09H04 za vezivanje za navedeni hOX40L; ili

2

d. nabrojano u (d) od dvadeset drugog do dvadeset četvrtog vida opisa, i gde se antitelo ili fragment takmiči sa 10A07 za vezivanje za navedeni hOX40L;

U dvadeset šestom vidu

[0101] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, koji sadrži VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine VL aminokiselinske sekvence u spisku sekvenci.

[0102] U jednom vidu opisa, predviđeno je anti-HOX40L antitelo ili fragment (opciono prema bilo kom drugom vidu opisanom u ovom dokumentu), koji obuhvata VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine VL aminokiselinske sekvence u spisku sekvenci (tj. Seq ID No: 16, Seq ID No:48, Seq ID No:80 ili Seq ID No: 108, posebno Seq ID No:48).

[0103] U jednom primeru, antitelo ili fragment sadrži laki lanac (npr. lambda laki lanac) koji sadrži konstantni region izabran iz grupe koju čine sekvence konstantnog regiona lakog lanca u spisku sekvenci (tj. Seq ID No: 136, Seq ID No: 138, Seq ID No: 140, Seq ID No: 142, Seq ID No: 144, Seq ID No: 146, Seq ID No:148, Seq ID No: 152, Seq ID No: 154, Seq ID No: 156, Seq ID No: 158, Seq ID No: 160, Seq ID No: 162, Seq ID No: 164 or Seq ID No: 166); i opciono VL domen (npr. lambda VL) kako je nabrojano u vidu 25 ili 26. U jednom primeru, antitelo ili fragment sadrži dve kopije takvog lakog lanca (opciono i dve kopije gore opisanog teškog lanca). U drugom primeru, laki lanac obuhvata konstantni region glodara, pacova, miša, čoveka, zeca, kokoške, kamelida, ovce, goveda, ne-humanih primata ili ajkule.

[0104] U jednom primeru, antitelo ili fragment sadrži laki lanac (npr. kapa laki lanac) koji sadrži konstantni region izabran iz grupe koju čine sekvence konstantnog regiona lakog lanca u spisku sekvenci (tj. Seq ID No: 136, Seq ID No: 138, Seq ID No: 140, Seq ID No: 142, Seq ID No: 144, Seq ID No: 146, Seq ID No:148, Seq ID No: 152, Seq ID No: 154, Seq ID No: 156, Seq ID No: 158, Seq ID No: 160, Seq ID No: 162, Seq ID No: 164 ili Seq ID No: 166); i opciono VL domen (npr. kapa VL) kako je nabrojano u vidu 25 ili 26. U jednom primeru, antitelo ili fragment sadrži dve kopije takvog lakog lanca (opciono i dve kopije gore opisanog teškog lanca). U

2

drugom primeru, laki lanac obuhvata konstantni region glodara, pacova, miša, čoveka, zeca, kokoške, kamelida, ovce, goveda, ne-humanih primata ili ajkule.

[0105] U jednom primeru, antitelo ili fragment sadrži lambda laki lanac koji se sastoji od konstantnog regiona izabranog iz grupe koju čine sekvence konstantnog regiona llakog lanca u spisku sekvenci (tj. Seq ID No: 146, Seq ID No: 148, Seq ID No: 152, Seq ID No: 154, Seq ID No: 156, Seq ID No: 158, Seq ID No:160, Seq ID No: 162, Seq ID No:164 ili Seq ID No: 166); i opciono lambda VL domen.

[0106] U jednom primeru, antitelo ili fragment sadrži kapa laki lanac koji se sastoji od konstantnog regiona izabranog iz grupe koju čine sekvence konstantnog regiona lakog lanca u spisku sekvenci (tj. Seq ID No: 136, Seq ID No: 138, Seq ID No: 140, Seq ID No: 142 ili Seq ID No:144); i opciono kapa VL domen.

[0107] U jednom primeru, VL domeni antitela ili fragmenta su lambda varijabilni domeni lakog lanca. U jednom primeru, VL domeni antitela ili fragmenta su varijabilni domeni kapa lakog lanca.

U dvadeset sedmom vidu

[0108] Antitelo ili fragment kao što je opisano u bilo kom od dvadeset drugog do dvadeset šestog vida opisa, sadrži prvu i drugu kopiju navedenog VL domena.

U dvadeset osmom vidu

[0109] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde je hOX40L površinski eksprimirani hOX40L u humanim ćelijama, npr. na endotelnim ćelijama (npr. endotelnim ćelijama disajnih puteva ili ćelijama gastrointestinalnog trakta).

[0110] Epitelne ćelije mogu obuhvatiti ćelije izabrane iz grupe koju čine gastrointestinalne ćelije, ćelije debelog creva, ćelije creva, očne ćelije i epitelne ćelije disajnih puteva (npr. ćelije pluća). Epitelne ćelije obuhvataju ćelije izabrane iz grupe koju čine gastrointestinalne ćelije, ćelije debelog creva, ćelije creva i ćelije oka.

Epitelne ćelije se mogu sastojati od očnih ćelija.

2

U dvadeset devetom vidu

[0111] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde antitelo ili fragment smanjuju proliferaciju humanih PBMC ili T-ćelija u prisustvu hOX40L u in vitro testu reakcije mešovitih limfocita (MLR) za najmanje 20, 30, 40, 50 ili 60% u poređenju sa proliferacijom humanih PBMC ili T-ćelija u prisustvu hOX40L u in vitro kontrolnom MLR testu u odsustvu antitela koje je specifično za hOX40L. Ilustracija odgovarajućeg testa data je u primerima u nastavku.

U tridesetom vidu

[0112] Antitelo ili fragment kao što je opisano u dvadeset devetom vidu opisa, pri čemu je hOX40L u testu površinski eksprimiran na humanim dendritskim ćelijama (DC ćelijama).

[0113] Ilustracija odgovarajućeg testa data je u primerima u nastavku.

U trideset prvom vidu

[0114] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde antitelo ili fragment smanjuje aktivnost NF-κB u humanim HT-1080 ćelijama koje eksprimiraju hOX40 receptor in vitro u prisustvu hOX40L.

[0115] U jednom primeru, smanjenje aktivnosti NF-κB antitela ili fragmenta se određuje detekcijom smanjenja sekrecije IL-8 od strane HT-1080 ćelija (ATCC<®>CCL-121) (opciono transfektovanih sa hOX40 receptorom, u prisustvu hOX40) in vitro.

U trideset drugom vidu

[0116] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde antitelo ili fragment smanjuje sekreciju IL-8 iz humanih HT-1080 ćelija koje eksprimiraju hOX40 receptor in vitro u prisustvu hOX40L.

U trideset trećem vidu

[0117] Antitelo ili fragment kao što je opisano u trideset drugom vidu opisa, gde antitelo ili fragment smanjuje sekreciju IL-8 za najmanje 20, 30, 40, 50 ili 60% u poređenju sa produkcijom IL-8 od strane ćelija HT-1080 koje eksprimiraju receptor hOX40 in vitro u prisustvu hOX40L u odsustvu antitela specifičnog za hOX40L.

U trideset četvrtom vidu

[0118] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde antitelo ili fragment smanjuje proliferaciju humanih T-ćelija stimulisanih hOX40L-om in vitro.

U trideset petom vidu

[0119] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde antitelo ili fragment smanjuje sekreciju IL-2 iz humanih T-ćelija in vitro, stimulisanih hOX40L-om.

U trideset šestom vidu

[0120] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde antitelo ili fragment smanjuje izlučivanje citokina posredovano interakcijom humanih dendritskih ćelija (DC ćelija) sa humanim T-ćelijama, gde je citokin iz grupe koju čine jedan, dva, više ili svi TNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9,IL-10, IL-13, IL-17, RANTES i interferon gama.

[0121] Ovo se može proceniti, na primer, pomoću testa MLR in vitro (npr., test MLR in vitro DC/T-ćelija). Ilustracija odgovarajućeg testa data je u primerima u nastavku.

[0122] U jednom primeru, DC ćelije se ne podudaraju sa T-ćelijama, npr. MHC se ne podudaraju, kao što je moguće na primer kada su DC ćelije od čoveka koji je različit od humanog izvora T-ćelija. U jednom primeru, DC ćelije su produkovane in vitro indukcijom humanih monocita sa GMCSF i IL-4.

U trideset sedmom vidu

[0123] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde antitelo ili fragment smanjuje sekreciju interferona gama za najmanje 20, 30, 40, 50 ili 60% u poređenju sa produkcijom interferona gama posredovanu interakcijom humanih dendritskih ćelija (DC ćelija) sa humanim T ćelijama u odsustvu antitela specifičnog za hOX40L.

1

U trideset osmom vidu

[0124] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde antitelo ili fragment smanjuje sekreciju TNF alfa za najmanje 20, 30, 40, 50 ili 60% u poređenju sa proizvodnjom TNF alfa posredovanom interakcijom humanih dendritskih ćelija (DC ćelija) sa humanim T-ćelijama u odsustvu antitela specifičnog za hOX40L.

U trideset devetom vidu

[0125] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde antitelo ili fragment smanjuje sekreciju IL-2 za najmanje 20, 30, 40, 50 ili 60% u poređenju sa proizvodnjom IL-2 posredovanom interakcijom humanih dendritskih ćelija (DC ćelija) sa humanim T ćelijama u odsustvu antitela specifičnog za hOX40L.

U četrdesetom vidu

[0126] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde antitelo ili fragment smanjuje sekreciju citokina (npr. izlučivanje citokina iz leukocita) u testu mešovitih limfocita (MLR) mononuklearne ćelije humane periferne krvi (PBMC), gde je citokin izabran iz grupe koju čine jedan, dva, više ili svi TNF alfa, IL-2, IL-4, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, RANTES i interferon gama.

U četrdeset prvom vidu

[0127] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde antitelo ili fragment smanjuje sekreciju interferona gama za najmanje 20, 30, 40, 50 ili 60% u poređenju sa proizvodnjom interferona gama u MLR testu humane PBMC u odsustvu antitela koje je specifično za hOX40L.

[0128] Poređenje može biti sa proizvodnjom interferona gama u MLR testu humane PBMC u odsustvu antitela.

U četrdeset drugom vidu

[0129] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde antitelo ili fragment smanjuje TNF alfa sekreciju za najmanje 20, 30, 40, 50 ili 60% u poređenju sa proizvodnjom TNF alfa u MLR testu humane PBMC u odsustvu antitela koje je specifično za hOX40L.

2

U četrdeset trećem vidu

[0130] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde antitelo ili fragment smanjuje sekreciju IL-2 za najmanje 20, 30, 40, 50 ili 60% u poređenju sa proizvodnjom IL-2 u MLR testu humane PBMC u odsustvu antitela koje je specifično za hOX40L.

U četrdeset četvrtom vidu

[0131] Antitelo ili fragment kao što je opisano u bilo kom od trideset šestog do četrdeset trećeg vida opisa, gde su ćelije primarne ćelije.

[0132] „Primarna ćelija“ se odnosi na ćeliju u ljudskom organizmu ili takvu ćeliju koja je uzeta od pacijenta radi vezivanja in vitro za antitelo ili fragment opisan ovde (što može biti korisno, na primer, u metodi dijagnostike statusa OX40L ili statusa bolesti/stanja u ljudskom organizmu). Primarne ćelije koje se ovde koriste nisu ćelije humanih ćelijskih linija, koje su tipično bile podvrgnute mnogim kulturama in vitro. Sposobnost antitela ili fragmenta opisanog u ovom dokumentu da specifično inhibira vezivanje hOX40L za receptor u ovom otelotvorenju je povoljna, jer pruža direktnu indikaciju korisnosti za obraćanje ćelijama kod humanih pacijenata koji pate ili su izloženi riziku od bolesti ili stanja posredovanog hOX40L-om.

U četrdeset petom vidu

[0133] Antitelo ili fragment bilo kog prethodnog vida opisa, gde antitelo ili fragment inhibira vezivanje hOX40L za hOX40L receptor (npr. hOX40) sa IC50 od 1×10<-8>ili manje u HTRF (homogena vremenski razložena fluorescencija) testu.

[0134] U jednom primeru, IC50 je u rasponu od 1×10<-8>do 1× 10<-11>ili u rasponu od 1×10<-9>do 1× 10<-10>.

U četrdeset šestom vidu

[0135] Farmaceutski sastav za tretman i/ili prevenciju stanja ili bolesti posredovane OX40L-om, sastav koji se sastoji od antitela ili fragmenta bilo kog prethodnog vida i razblaživača, ekscipijensa ili nosača; i opciono dodatno sadrži antiinflamatorni lek.

[0136] U jednom primeru, antiinflamatorni lek nezavisno izabran iz grupe koju čine kortikosteroidi (npr. metilprednizolon), anti-IL12/IL-23 antitela (npr. ustekinumab), antiVLA4 antitela (npr. natalizumab), anti-LFA1 antitela, anti-komplement C5 antitela (npr. ekulizumab), anti-a4b7 integrinh antitela (npr. vedolizumab), anti-IL6 antitela (npr. tocilizumab), anti-IL2R antitela (npr. baziliksumab) ili antitela TNFa/TNFa-Fc molekuli (npr. etanercept, adalimumab, infliksimab, golimumab, certolizumab pegol). U jednom primeru, antiinflamatorni je nezavisno izabran iz grupe koju čine kortikosteroidi (npr. metilprednizolon) i anti-LFA1 antitela.

U četrdeset sedmom vidu

[0137] Farmaceutski sastav ili komplet za tretman i/ili prevenciju stanja ili bolesti posredovanih OX40L-om, sastav ili komplet koji sadrži antitelo ili fragment pronalaska (i opciono antiinflamatorni lek) opciono u kombinaciji sa oznakom ili uputstvom za upotrebu za tretman i/ili prevenciju navedene bolesti ili stanja kod čoveka; opciono gde oznaka ili uputstvo obuhvataju broj odobrenja za stavljanje u promet (npr. broj odobrenja FDA ili EMA ); opciono gde komplet obuhvata IV ili injekciono sredstvo koje sadrži antitelo ili fragment.

U četrdeset osmom vidu

[0138] Nukleinska kiselina koja kodira HCDR3 antitela nabrojanog u bilo kom od prvog do četrdeset petog vida opisa.

[0139] U jednom otelotvorenju, ovde navedeni HCDR su prema Kabat nomenklaturi. U drugom otelotvorenju, ovde navedeni HCDR su prema IMGT nomenklaturi.

U četrdeset devetom vidu

[0140] Nukleinska kiselina četrdesetosmog vida opisa obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična ili je 100% identična sa HCDR3 sekvencom u spisku sekvenci.

[0141] Jedan vid opisa pruža nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira VH domen anti-HOX40L antitela, gde nukleotidna sekvenca sadrži HCDR3 sekvencu koja je najmanje 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična ili je

4

100% identična sa HCDR3 sekvencom u spisku sekvenci. Opciono, antitelo je prema bilo kom drugom vidu opisa.

[0142] U drugom vidu opisa, data je nukleinska kiselina kako je opisano u četrdesetosmom vidu opisa koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je 100% identična sekvenci HCDR3 u spisku sekvenci, osim 1, 2 ili 3 supstitucije nukleotida, gde svaka supstitucija ne proizvodi promenu aminokiseline ili proizvodi konzervativnu promenu aminokiseline (tj. supstitucija nukleotida je sinonimska supstitucija) u odgovarajućoj proteinskoj sekvenci. Stručnjaku će biti poznata konzervativna promena aminokiseline.

[0143] Supstitucije aminokiselina uključuju promene u kojima je aminokiselina zamenjena različitim aminokiselinskim ostacima koji se javljaju u prirodi. Takve supstitucije se mogu klasifikovati kao "konzervativne", u kom slučaju se aminokiselinski ostatak sadržan u polipeptidu zamenjuje drugom prirodno prisutnom aminokiselinom sličnog karaktera, bilo u pogledu polariteta, funkcionalnosti bočnog lanca ili veličine. Takve konzervativne supstitucije su dobro poznate u stanju tehnike. Supstitucije takođe mogu biti "nekonzervativne", u kojima se aminokiselinski ostatak koji je prisutan u peptidu supstituiše aminokiselinom koja ima različita svojstva, kao što je prirodno prisutna aminokiselina iz druge grupe (npr. supstitucija naelektrisane ili hidrofobne aminokiseline sa alaninom), ili alternativno, u kojima se prirodno prisutna aminokiselina supstituiše sa nekonvencionalnom aminokiselinom.

[0144] Dodatno ili alternativno, data je nukleinska kiselina četrdeset devetog vida opisa koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je 100% identična sekvenci HCDR3 u spisku sekvenci, osim 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 supstitucija sinonimskih nukleotida i bez, 1, 2 ili 3 supstitucije nukleotida koje proizvode konzervativne promene aminokiselina u odgovarajućoj proteinskoj sekvenci.

U pedesetom vidu

[0145] Nukleinska kiselina koja kodira HCDR2 antitela nabrojanog u bilo kom od prvog do četrdeset petog vida; opciono, gde je nukleinska kiselina kao što je opisano u četrdeset osmom ili četrdeset devetom vidu opisa.

U pedeset prvom vidu

[0146] Nukleinska kiselina pedesetog vida opisa koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična ili je 100% identična sa HCDR2 sekvencom u spisku sekvenci.

[0147] Jedan vid opisa pruža nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira VH domen anti-hOX40L antitela, gde nukleotidna sekvenca sadrži HCDR2 sekvencu koja je najmanje 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična ili je 100% identična HCDR2 sekvenci u spisku sekvenci. Opciono, antitelo je prema bilo kom drugom vidu opisa.

[0148] U drugom vidu opisa, pružena je nukleinska kiselina kako je opisano u pedesetprvom vidu opisa koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je 100% identična HCDR2 sekvenci u spisku sekvenci, izuzev za 1, 2 ili 3 supstitucije nukleotida, gde svaka supstitucija ne proizvodi promenu aminokiseline proizvodi ili konzervativnu promenu aminokiseline (tj. supstitucija nukleotida je sinonimna supstitucija) u odgovarajućoj proteinskoj sekvenci. Stručnjak će biti upoznat sa konzervativnim promenama aminokiselina.

[0149] Dodatno ili alternativno, pružena je nukleinska kiselina 50. vida opisa koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je 100% identična sekvenci HCDR2 u spisku sekvenci, osim 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 supstitucija sinonimnih nukleotida i bez, 1, 2 ili 3 supstitucije nukleotida koje proizvode konzervativne promene aminokiselina u odgovarajućoj proteinskoj sekvenci.

U pedeset drugom vidu

[0150] Nukleinska kiselina koja kodira HCDR1 antitela nabrojan u bilo kom od prvog do četrdeset petog vida; opciono, gde je nukleinska kiselina opisana u bilo kom od četrdeset osmog do pedeset prvog vida opisa.

U pedeset trećem vidu

[0151] Nukleinska kiselina pedeset drugog vida opisa koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična ili je 100% identična HCDR1 sekvenci u spisku sekvenci.

[0152] U jednom vidu opisa pružena je nukleinska kiselina koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira VH domen anti-hOX40L antitela, gde nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu HCDR1 koja je najmanje 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična ili je 100% identična sekvenci HCDR1 u spisku sekvenci. Opciono, antitelo je prema bilo kom drugom vidu ovde.

[0153] U drugom vidu opisa, pružena je nukleinska kiselina kako je opisano u pedeset drugom vidu opisa koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je 100% identična sekvenci HCDR1 u spisku sekvenci, osim 1, 2 ili 3 supstitucije nukleotida, pri čemu svaka supstitucija ne proizvodi promenu aminokiselina ili proizvodi konzervativnu promenu aminokiselina (tj. supstitucija nukleotida je sinonimna supstitucija) u odgovarajućoj proteinskoj sekvenci. Stručnjak će biti upoznat sa konzervativnim promenama aminokiselina.

[0154] Dodatno ili alternativno, pružena je nukleinska kiselina pedeset drugog vida opisa koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je 100% identična sekvenci HCDR1 u spisku sekvenci, osim 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 supstitucija sinonimnih nukleotida i bez, 1, 2 ili 3 supstitucije nukleotida koje proizvode konzervativne promene aminokiselina u odgovarajućoj proteinskoj sekvenci.

U pedeset četvrtom vidu

[0155] Nukleinska kiselina koja kodira VH domen i/ili VL domen antitela nabrojanog u bilo kom od prvog do četrdeset petog vida opisa.

U pedeset petom vidu

[0156] Nukleinska kiselina pedeset četvrtog vida opisa koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična ili je 100% identična nukleotidnoj sekvenci VH domena u spisku sekvenci.

[0157] U drugom vidu opisa, pružena je nukleinska kiselina pedeset četvrtog vida opisa koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je 100% identična nukleotidnoj sekvenci VH domena u spisku sekvenci, osim 1, 2 ili 3 supstitucije nukleotida, gde svaka supstitucija ne proizvodi promenu aminokiselina ili proizvodi konzervativnu promenu aminokiselina (tj. supstitucija nukleotida je sinonimna supstitucija) u odgovarajućoj proteinskoj sekvenci. Stručnjak će biti upoznat sa konzervativnim promenama aminokiselina.

[0158] Dodatno ili alternativno, pružena je nukleinska kiselina pedeset četvrtog vida opisa koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je 100% identična nukleotidnoj sekvenci VH domena u spisku sekvenci, osim 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 supstitucija sinonimnih nukleotida i bez, 1, 2 ili 3 supstitucije nukleotida koje proizvode konzervativne promene aminokiselina u odgovarajućoj proteinskoj sekvenci.

U pedeset šestom vidu

[0159] Nukleinska kiselina pedeset četvrtog ili pedeset petog vida opisa koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99% identična ili je 100% identična nukleotidnoj sekvenci VL domena u spisku sekvenci.

[0160] U drugom vidu opisa, pružena je nukleinska kiselina pedeset četvrtog ili pedeset petog vida opisa koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je 100% identična sekvenci nukleotidnoj sekvenci VL domena u spisku sekvenci, osim 1, 2 ili 3 supstitucije nukleotida, gde svaka supstitucija ne proizvodi promenu aminokiselina ili proizvodi konzervativnu promenu aminokiselina (tj. supstitucija nukleotida je sinonimna supstitucija) u odgovarajućoj proteinskoj sekvenci. Stručnjak će biti upoznat sa konzervativnim promenama aminokiselina.

[0161] Dodatno ili alternativno, pružena je nukleinska kiselina pedeset četvrtog ili pedeset petog vida opisa koja obuhvata nukleotidnu sekvencu koja je 100% identična nukleotidnoj sekvenci VL domena u spisku sekvenci, osim 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 supstitucija sinonimnih nukleotida i bez, 1, 2 ili 3 supstitucije nukleotida koje proizvode konzervativne promene aminokiselina u odgovarajućoj proteinskoj sekvenci.

U pedeset sedmom vidu

[0162] Nukleinska kiselina koja kodira teški lanac ili laki lanac antitela nabrojan u bilo kom od prvog do četrdeset petog vida opisa.

U pedeset osmom vidu

[0163] Nukleinska kiselina pedeset sedmog vida, koja obuhvata nukleotidnu sekvencu kao što je nabrojano u bilo kom od četrdeset osmog do pedeset šestog vida opisa.

U pedeset devetom vidu

[0164] Vektor (npr. ekspresioni vektor kod sisara) koji sadrži nukleinsku kiselinu bilo kog od četrdesetosmog do pedesetosmog vida opisa; opciono gde je vektor CHO ili HEK293 vektor. U jednom primeru, vektor je vektor kvasca, npr., Saccharomycesor Pichia vektor.

U šezdesetom vidu

[0165] Domaćin koji obuhvata nukleinsku kiselinu bilo kog od četrdeset osmog do pedeset osmog vida opisa ili vektor pedeset devetog vida opisa. U jednom primeru, domaćin je ćelijska linija sisara (npr. čovek, npr. CHO ili HEK293) ili ćelijska linija kvasca ili bakterija.

U šezdeset prvom vidu

[0166] Upotreba antitela ili njegovog fragmenta, koji se specifično vezuje za hOX40L u proizvodnji leka za primenu na čoveku, za tretman ili sprečavanje bolesti ili stanja posredovanog hOX40L-om kod čoveka smanjenjem jednog, više ili svih

a. sekrecija citokina izabranog iz grupe koju čine TNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9,IL-10, IL-13, IL-17, RANTES i interferon gama u čoveku;

b. proliferacija leukocita u ljudskom organizmu; i

c. vezivanje hOX40 receptora koji eksprimiraju humane T-ćelije sa hOX40L koji eksprimiraju endotelne ćelije

[0167] Karakteristike bilo kog od prethodnih vidova, konfiguracije, primera ili otelotvorenja opisa opciono primenjuju mutatis mutandis na ovu upotrebu.

[0168] U jednom primeru, čovek pati od ili je izložen riziku od astme, a antitelo ili fragment služi za smanjenje IgE u čoveku, čime se tretira, sprečava ili smanjuje astma kod čoveka.

U šezdeset drugom vidu

[0169] Metoda tretiranja ili prevencija bolesti ili stanja kod čoveka posredovanog hOX40L–om smanjenjem jednog ili više ili svih

a. sekrecija citokina izabranog iz grupe koju čine TNF alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9,IL-10, IL-13, IL-17, RANTES i interferon gama u čoveku;

b. proliferacija leukocita u ljudskom organizmu; i

c. vezivanje hOX40 receptora koji eksprimiraju T-ćelije sa hOX40L koji eksprimiraju endotelne ćelije

gde metoda obuhvata primenu terapeutski efikasne količine antitela ili fragmenta koji se specifično vezuje za hOX40L na navedenom čoveku.

[0170] Karakteristike bilo kog od prethodnih vidova, primera ili otelotvorenja opisa opciono primenjuju mutatis mutandis na ovu metodu.

[0171] Metoda opisana u ovom dokumentu tretira ili sprečava navedenu bolest ili stanje kod čoveka. "Terapijski efikasna količina" antitela ili fragmenta je ta količina (koja se daje u jednoj ili nekoliko doza, koje mogu biti vremenski razmaknute, npr., suštinski mesečna primena) koja je efikasna da bi dovela do pomenutog tretmana ili prevencije. Ovo će biti lako vidljivo stručnjaku i može se razlikovati u zavisnosti od određenog humanog pacijenta i bolesti ili stanja koje se obrađuje.

[0172] U jednom primeru, čovek pati od ili je izložen riziku od astme i antitelo ili fragment smanjuje IgE u čoveku, čime se tretira, sprečava ili smanjuje astma kod čoveka.

U šezdeset trećem vidu

[0173] Metoda ili upotreba šezdeset prvog ili šezdeset drugog vida opisa, za tretman ili sprečavanje navedenog hOX40L-om posredovanog oboljenja, stanja ili oštećenja epitelnih ćelija kod navedenog čoveka smanjenjem proliferacije T-ćelija kod navedenog čoveka.

U šezdeset i četvrtom vidu

[0174] Metoda ili upotreba bilo kog od šezdeset prvog do šezdeset trećeg vida opisa, za tretman ili sprečavanje pomenute bolesti, stanja ili oštećenja epitelnih ćelija

4

kod navedenog čoveka antagonizovanjem interakcije između hOX40L i leukocita čoveka, gde je smanjena proliferacija leukocita.

U šezdeset petom vidu

[0175] Metoda ili upotreba bilo kog od šezdeset prvog do šezdeset četvrtog vida opisa, za tretman ili sprečavanje pomenute hOX40L-om posredovane bolesti, stanja ili oštećenja epitelnih ćelija kod navedenog čoveka putem smanjenja proliferacije leukocita čoveka antagonizovanjem interakcije OX40L/OX40L receptor, koja je posredovana T-ćelijama kod navedenog čoveka.

U šezdeset šestom vidu

[0176] Metoda ili upotreba bilo kog od šezdeset prvog do šezdeset petog vida opisa, za tretman ili sprečavanje pomenute hOX40L-om posredovane bolesti, stanja ili oštećenja epitelnih ćelija kod navedenog čoveka smanjenjem sekrecije IL-8 citokina u čoveku.

U šezdeset sedmom vidu

[0177] Metoda šezdeset šestog vida opisa, za tretman ili sprečavanje navedenog oboljenja, stanja ili oštećenja epitelnih ćelija smanjenjem sekrecije navedenog IL-8 posredovane interakcijom dendritskih ćelija (DC ćelija) sa T-ćelijama u čoveku.

U šezdeset osmom vidu

[0178] Metoda ili upotreba bilo kog od šezdeset prvog do šezdeset sedmog vida opisa, gde je oštećenje gastrointestinalnih ćelija, ćelija debelog creva, ćelija creva ili ćelija disajnih puteva (npr. ćelija pluća) simptom ili uzrok navedene bolesti ili stanja kod ljudi.

[0179] Epitelne ćelije mogu sadržati ćelije izabrane iz grupe koju čine gastrointestinalne ćelije, ćelije debelog creva, ćelije creva, očne ćelije i ćelije disajnih puteva (npr. ćelije pluća). Epitelne ćelije mogu sadržati ćelije izabrane iz grupe koju čine gastrointestinalne ćelije, ćelije debelog creva, ćelije creva i očne ćelije. Epitelne ćelije mogu sadržati očne ćelije.

U šezdeset devetom vidu

[0180] Metoda ili upotreba bilo kog od šezdeset prvog do šezdeset osmog vida opisa, gde čovek pati od ili je pod rizikom od upalne bolesti creva (IBD), odbacivanja alogene transplantacije, bolesti 'kalem-protiv-domaćina' (GvHD), dijabetesa ili upale disajnih puteva i pomenuta metoda tretira ili sprečava IBD, odbacivanje alogene transplantacije, GvHD, dijabetes ili upalu disajnih puteva kod čoveka.

U šezdeset devetom (a) vidu

[0181] Antitelo ili fragment bilo kog od šezdeset prvog do šezdeset osmog vida opisa, gde čovek pati od ili je pod rizikom od zapaljenske bolesti creva (IBD), odbacivanja alogene transplantacije, bolesti 'kalem-protiv-domaćina' (GvHD), uveitisa, pioderme gangrenosum, arteritisa gigantskih ćelija, Šniclerovog sindroma, neinfektivnog skleritisa, dijabetesa ili zapaljenja disajnih puteva i pomenuta metoda tretira ili sprečava IBD, odbacivanje alogene transplantacije, GvHD, uveitis, pioderma gangrenosum, arteritis gigantskih ćelija, Šniclerov sindrom, neinfektivni skleritis, dijabetes ili zapaljenje disajnih puteva kod čoveka.

[0182] U jednom vidu,konfiguraciji ili otelotvorenju čovek može patiti od ili je u riziku od bolesti ili stanja posredovanih hOX40L-om, izabranih iz grupe koju čine autoimuna bolest ili stanje, sistemske upalne bolesti ili stanja ili odbacivanje transplantacije; na primer, upalna bolest creva (IBD), Kronova bolest, reumatoidni artritis, odbacivanje transplantacije, odbacivanje alogene transplantacije, bolest 'kalem- protiv-domaćina' (GvHD), ulcerozni kolitis, sistemski eritematozni lupus (SLE), dijabetes, uveitis, ankilozantni spondilitis, kontaktna preosetljivost, multipla skleroza i ateroskleroza, posebno GvHD.

U sedamdesetom vidu

[0183] Metoda ili upotreba bilo kog od šezdeset prvog do šezdeset devetog (a) vida opisa, gde je antitelo ili fragment prema bilo kom od prvog do četrdeset petog vida opisa ili bilo kojim primerom, konfiguracijom, vidom ili otelotvorenjem opisa opisanog u ovom dokumentu.

U sedamdeset prvom vidu

[0184] Antitelo, fragment, sastav, komplet, metoda ili upotreba bilo kog prethodnog vida opisa, za tretman ili sprečavanje upalne ili automimune bolesti ili stanja kod čoveka ili za smanjenje ili sprečavanje angiogeneze kod čoveka.

U sedamdeset drugom vidu

[0185] Antitelo, fragment, sastav, komplet, metoda ili upotreba bilo kog prethodnog vida opisa, gde je bolest ili stanje izabrano iz grupe koju čine zapaljenske bolesti creva (IBD), Kronova bolest, reumatoidni artritis, psorijaza, bronhiolitis, gingivitis, odbacivanje transplantacije, odbacivanje alogene transplantacije, bolest 'kalemprotiv–domaćina' (GvHD), astma, sindrom respiratornog distresa kod odraslih (ARDS), septički šok, ulcerozni kolitis, Sjorgenov sindrom, upala disajnih puteva, sistemski eritematozni lupus (SLE), dijabetes, kontaktna preosetljivost, multipla skleroza i ateroskleroza.

U sedamdeset drugom (a) vidu

[0186] Antitelo, fragment, sastav, komplet, metoda ili upotreba bilo kog prethodnog vida opisa, gde je bolest ili stanje izabrano iz grupe koju čine zapaljenske bolesti creva (IBD), Kronova bolest, reumatoidni artritis, psorijaza, bronhiolitis, gingivitis, odbacivanje transplantacije, odbacivanje alogene transplantacije, bolest 'kalemprotiv-domaćina' (GvHD), astma, sindrom respiratornog distresa kod odraslih (ARDS), septički šok, ulcerozni kolitis, Sjorgenov sindrom, upala disajnih puteva, sistemski eritematozni lupus (SLE), uveitis, pioderma gangrenozum, arteritis džinovskih ćelija, Šniclerov sindrom, neinfektivni skleritis, dijabetes, kontaktna preosetljivost, multipla skleroza i ateroskleroza.

[0187] U jednom vidu, konfiguraciji ili otelotvorenju opisa, čovek može patiti od bolesti ili je u riziku od hOX40L-om posredovane bolesti ili stanja izabranog iz grupe koju čine autoimuna bolest ili stanje, sistemska zapaljenska bolest ili stanje, ili odbacivanje transplantacije, npr., zapaljenske bolesti creva (IBD), Kronova bolest, reumatoidni artritis, odbacivanje transplantacije, odbacivanje alogene transplantacije, bolest 'kalem-protiv–domaćina' (GvHD), ulcerativni kolitis, sistemski eritematozni lupus (SLE), dijabetes, uveitis, ankilozni spondilitis, kontaktna preosetljivost, multipla skleroza i ateroskleroza, posebno GvHD.

4

[0188] U jednom primeru, bolest ili stanje je bolest ili stanje posredovano OX40L-om obelodanjeno u patentima SAD 7812133 ili EP1791869.

[0189] U jednom primeru, bolest ili stanje je upalna ili autoimuna bolest ili stanje. U jednom primeru, bolest ili stanje je odbacivanje transplantacije.

[0190] Kao što se ovde koristi, upalna bolest ili stanje se odnosi na patološka stanja koja rezultiraju upalom, na primer izazvanom hemotaksom neutrofila. Primeri takvih poremećaja uključuju upalne bolesti kože, uključujući psorijazu; reakcije povezane sa upalnom bolešću creva (kao što su Kronova bolest i ulcerozni kolitis); ishemijsku reperfuziju; sindrom respiratornog distresa odraslih; dermatitis; meningitis; encefalitis; uveitis; autoimune bolesti kao što su reumatoidni artritis, Sjorgenov sindrom, vaskulitis; bolesti koje uključuju diapedezu leukocita; inflamatorni poremećaj centralnog nervnog sistema (CNS), sindrom višestrukih povreda organa kao posledica septikemije ili traume; alkoholni hepatitis, bakterijska pneumonija, bolesti posredovane kompleksom antigen-antitelo; zapaljenje pluća, uključujući pleurizitis, alveolitis, vaskulitis, pneumoniju, hronični bronhitis, bronhiektaziju i cističnu fibrozu; itd. Poželjne indikacije su bakterijsko zapaljenje pluća i zapaljenska bolest creva kao što je ulcerozni kolitis. Ovde opisani fragmenti koji vezuju antitela ili antigene predstavljaju primer predviđen za tretman ili sprečavanje jednog ili više takvih stanja.

[0191] U jednom primeru, bolest ili stanje je rak.

[0192] U jednom primeru, bolest je uveitis, kao što je sistemski uveitis ili autoimuni/neinfektivni uveitis.

U sedamdeset trećem vidu

[0193] Antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za hOX40L i takmiči se za vezivanje za navedeni hOX40L sa antitelom 02D10, gde antitelo ili fragment sadrže VH domen koji se sastoji od HCDR3 koji se sastoji od motiva VRGXYYY, gde je X bilo koja aminokiselina.

[0194] Karakteristike antitela bilo kog vida, konfiguracije, primera ili otelotvorenja opisa opisanog u ovom dokumentu se opciono primenjuju mutatis mutandis na ova antitela, npr. antitelo može biti humano antitelo ili himerno antitelo koje ima funkcionalne karakteristike kako je opisano u ovom dokumentu. Kompeticija se može utvrditi kako je opisano u bilo kom vidu, otelotvorenju, primeru ili konfiguraciji opisanoj u ovom dokumentu, npr. kako je utvrđeno putem SPR, ELISA, HTRF ili FACS.

[0195] U jednom otelotvorenju, antitelo ili fragment se takmiči sa varijabilnim regionima 02D10 (npr. takmiči se sa antitelom koje obuhvata varijabilni region teškog lanca SEQ ID No: 34 i varijabilni region lakog lanca SEQ ID No:48). U drugom otelotvorenju, antitelo ili fragment se takmiči sa 02D10 IgG4-PE koji ima aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID No:62 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID No:64. Tako, na primer, sposobnost antitela ili fragmenta da se takmiči za vezivanje za hOX40L sa antitelom 02D10 može se utvrditi pomoću SPR (kao što je opisano u ovom dokumentu) koristeći IgG4-PE antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID No:62 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID No:64 kao referentno 02D10 antitelo.

[0196] U drugom otelotvorenju, antitelo ili fragment se dodatno ili alternativno takmiče sa 10A7. U jednom otelotvorenju, antitelo ili fragment se takmiči sa varijabilnim regionima 10A7 (npr. takmiči se sa antitelom koje obuhvata varijabilni region teškog lanca SEQ ID No: 2 i varijabilni region lakog lanca SEQ ID No: 16). U drugom otelotvorenju, antitelo ili fragment se takmiči sa 02D10 IgG4-PE koji ima aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID No:30 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID No:32.

[0197] U jednom otelotvorenju, aminokiselina je bilo koja prirodno prisutna aminokiselina.

U sedamdeset četvrtom vidu

[0198] Antitelo ili fragment prema sedamdeset trećem vidu opisa, gde je X neutralna aminokiselina, opciono P ili G.

4

[0199] U jednom otelotvorenju, X je P ili G. U jednom otelotvorenju, X je izabran iz grupe koju čine P, N, A ili G. U drugom otelotvorenju, X je izabran iz grupe koju čine P, G ili N. U drugom otelotvorenju, X je izabran iz grupe koju čine P, G ili A.

U sedamdeset petom vidu

[0200] Antitelo ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za hOX40L i takmiči se za vezivanje za navedeni hOX40L sa antitelom 02D10, pri čemu antitelo ili njegov fragment čine VH domen koji sadrži HCDR3 sekvencu od SEQ ID NO:40 ili 46 ili HCDR3 sekvencu od SEQ ID NO:40 ili 46 koji se sastoji od manje od 5 supstitucija aminokiseline.

[0201] Karakteristike antitela bilo kog od vidova, konfiguracija, primera ili otelotvorenja opisa opisanog u ovom dokumentu se opciono primenjuju mutatis mutandis na ova antitela, npr. antitelo može biti humano antitelo ili himerno antitelo koje ima funkcionalne karakteristike kako je opisano u ovom dokumentu. Kompeticija se može utvrditi kako je opisano u bilo kom vidu, otelotvorenju, primeru ili konfiguraciji opisanoj u ovom dokumentu, npr. kako je utvrđeno pomoću SPR, ELISA, HTRF ili FACS.

[0202] HCDR3 sekvenca od SEQ ID NO:40 ili 46 može da sadrži manje od 4 supstitucije aminokiselina (tj.3 ili manje). HCDR3 sekvenca SEQ ID NO:40 ili 46 može da sadrži manje od 3 supstitucije aminokiselina (tj.2 ili 1 supstituciju). HCDR3 sekvenca SEQ ID NO:40 ili 46 može da sadrži manje od 2 supstitucije aminokiselina (tj. jedna supstitucija).

[0203] U jednom otelotvorenju, antitelo ili fragment se takmiči sa varijabilnim regionima 02D10 (npr. takmiči se sa antitelom koje obuhvata varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 34 i varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO:48). U drugom otelotvorenju, antitelo ili fragment se takmiči sa 02D10 IgG4-PE koji ima aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID No:62 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:64.

[0204] U drugom otelotvorenju, antitelo ili fragment se dodatno ili alternativno takmiče sa 10A7. U jednom otelotvorenju, antitelo ili fragment se takmiči sa

4

varijabilnim regionima 10A7 (npr. takmiči se sa antitelom koje obuhvata varijabilni region teškog lanca SEQ ID No: 2 i varijabilni region lakog lanca SEQ ID No: 16). U drugom otelotvorenju, antitelo ili fragment se takmiči sa 02D10 IgG4-PE koji ima aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID No:30 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID No:32.

U sedamdeset šestom vidu

[0205] Antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do sedamdeset petog vida, VH domen koji se sastoji od HCDR3 od 16 do 27 aminokiselina i koji je izveden iz rekombinacije segmenta humanog VH gena, segmenta himanog D gena i segmenta humanog JH gena, gde segment humanog JH gena je IGHJ6 (npr. IGHJ6 02).

[0206] Segment humanog JH gena može biti izabran iz grupe koju čine IGHJ6<∗>01, IGHJ6<∗>02, IGHJ6<∗>03 i IGHJ6<∗>04. Segment humanog JH gena može biti izabran iz grupe koju čine IGHJ6<∗>01, IGHJ6<∗>02 i IGHJ6<∗>04. Segment JH gena može biti IGHJ6*02.

[0207] Segment humanog VH gena može biti IGHV3-23, na primer, izabran iz grupe koju čine IGHV3-23<∗>01, IGHV3-23<∗>02, IGHV3-23<∗>03, IGHV3-23<∗>04 ili IGHV3-23<∗>05. Segment humanog VH gena može biti IGHV3-23*01ili IGHV3-23*04, posebno IGHV3-23*04.

[0208] Segment humanog DH gena može biti IGHD3-10, na primer izabran iz grupe koju čine IGHD3-10<∗>01 ili IGHD3-10<∗>02. Segment humanog DH gena može biti IGHD3-10*01. Segment humanog DH gena može biti IGHD3-10*02.

U sedamdeset sedmom vidu

[0209] Antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do sedamdeset šestog vida opisa, VH domen koji obuhvata HCDR1 sekvencu SEQ ID NO:36 ili 42 ili HCDR1 sekvencu SEQ ID NO:36 ili 42 koja obuhvata manje od 4 supstitucije aminokiselina.

4

[0210] Sekvenca HCDR1 broja SEQ ID:36 ili 42 može da sadrži manje od 3 supstitucije aminokiselina (tj.2 ili 1 supstitucija). HCDR3 sekvenca SEQ ID br.:40 ili 46 može da sadrži manje od 2 supstitucije aminokiselina (tj. jedna supstitucija).

U sedamdeset osmom vidu

[0211] Antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do sedamdeset sedmog vida opisa, VH domen koji obuhvata HCDR2 sekvencu SEQ ID NO:38 ili 44, ili HCDR2 sekvencu SEQ ID NO:38 ili 44 koja obuhvata manje od 5 supstitucija aminokiselina.

[0212] Sekvenca HCDR2 od SEQ ID NO:38 ili 44 može da sadrži manje od 4 supstitucije aminokiselina (tj.3 ili manje). HCDR2 sekvenca od SEQ ID NO:38 ili 44 može da sadrži manje od 3 supstitucije aminokiselina (tj.2 ili 1 supstituciju). HCDR2 sekvenca SEQ ID NO:38 ili 44 može da sadrži manje od 2 supstitucije aminokiselina (tj. jedna supstitucija).

U sedamdeset devetom vidu

[0213] Antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do sedamdeset osmog visa opisa, VH domen koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 34, ili aminokiselinske sekvence varijabilnog domena teškog lanca koja je najmanje 80% (npr. najmanje 85%) identična sekvenci SEQ ID NO:34.

[0214] Aminokiselinska sekvenca varijabilnog domena teškog lanca može biti najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična sa SEQ ID NO:34.

U osamdesetom vidu

[0215] Antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do sedamdeset devetog vida opisa koji obuhvata prvu i drugu kopiju navedenog VH domena.

U osamdeset prvom vidu

[0216] Antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdesetog vida opisa, koji obuhvata VL domen koji obuhvata LCDR1 sekvencu SEQ ID NO:54

4

ili 60, ili LCRD3 sekvencu SEQ ID NO:54 ili 60 koja obuhvata manje od 5 supstitucija aminokiselina.

[0217] LCRD3 sekvenca SEQ ID NO:54 ili 60 može da sadrži manje od 4 supstitucije aminokiselina (tj.3 ili manje). LCRD3 sekvenca SEQ ID NO:54 ili 60 može da sadrži manje od 3 supstitucije aminokiselina (tj.2 ili 1 supstituciju). LCRD3 sekvenca SEQ ID NO:54 ili 60 može da sadrži manje od 2 supstitucije aminokiselina (tj. jedna supstitucija).

U osamdeset drugom vidu

[0218] Antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset prvog vida opisa, koji obuhvata ili navedeni VL domen, koji VL domen obuhvata LCDR2 sekvencu SEQ ID NO:52 ili 58, ili LCRD2 sekvencu SEQ ID NO:52 ili 58 koja obuhvata manje od 2 supstitucije aminokiselina.

U osamdeset trećem vidu

[0219] Antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset drugog vida opisa, koji obuhvata ili navedeni VL domen koji VL domen obuhvata LCDR1 sekvencu SEQ ID NO:54 ili 60, ili LCRD1 sekvencu SEQ ID NO:54 ili 60 koja obuhvata manje od 5 supstitucija aminokiselina.

[0220] LCDR1 sekvenca SEQ ID NO:54 ili 60 može da sadrži manje od 3 supstitucije aminokiselina (tj.2 ili 1 supstituciju). LCDR1 sekvenca SEQ ID NO:54 ili 60 može da sadrži manje od 2 supstitucije aminokiselina (tj. jedna supstitucija).

U osamdeset četvrtom vidu

[0221] Antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset trećeg vida opisa, koji obuhvata ili pomenuti VL domen, koji VL domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 48, ili aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca koja je najmanje 80% (npr. najmanje 85%) identična sa SEQ ID NO:48.

4

[0222] Aminokiselinska sekvenca varijabilnog domena lakog lanca može biti najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična sa SEQ ID NO:48.

U osamdeset petom vidu

[0223] Antitelo ili fragment prema bilo kom od osamdeset prvog do osamdeset četvrtog vida opisa, koji obuhvata prvu i drugu kopiju navedenog VL domena.

U osamdeset šestom vidu

[0224] Antitelo ili fragment prema bilo kom od osamdeset prvog do osamdeset petog vida opisa, gde antitelo ili fragment sadrži kapa laki lanac.

[0225] U drugom otelotvorenju, VL domen je kapa VL domen. U jednom otelotvorenju, kapa VL domen je izveden iz rekombinacije segmenta humanog VL gena, i segmenta humanog JL gena, gde je segment humanog VL gena IGKV1D-39. U drugom otelotvorenju, segment VL gena je IGKV1D-39*01.

[0226] Segment humanog JL gena može biti IGKJ1 ili IGKJ3. Segment JL gena može biti IGKJ1*01. Segment JL gena može biti IGKJ3*01.

U osamdeset sedmom vidu

[0227] Antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset petog do osamdeset šestog vida opisa gde su supstitucije aminokiselina konzervativne aminokiselinske supstitucije, opciono gde su konzervativne supstitucije iz jedne od šest grupa (svaka grupa sadrži aminokiseline koje su međusobno konzervativne supstitucije) izabrane iz grupe koju čine:

1) Alanin (A), serin (S), treonin (T);

2) Asparaginska kiselina (D), glutaminska kiselina (E);

3) Asparagin (N), glutamin (Q);

4) Arginin (R), lizin (K);

5) Izoleucin (I), leucin (L), metionin (M), valin (V); i

6) Fenilalanin (F), tirozin (Y), triptofan (W)

[0228] Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu biti kako je ovde opisano. Na primer, supstitucija može biti Y sa F, T sa S ili K, P sa A, E sa D ili Q, N sa D ili G, R sa K, G sa N ili A, T sa S ili K, D sa N ili E, I sa L ili V, F sa Y, S sa T ili A, R sa K, G sa N ili A, K sa R, A sa S, K ili P. U drugom otelotvorenju, konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu biti gde je Y supstituisan sa F, T sa A ili S, I sa L ili V, W sa Y, M sa L, N sa D, G sa A, T sa A ili S, D sa N, I sa L ili V, F sa Y ili L, S sa A ili T i A sa S, G, T ili V.

Osamdeset osmi vid

[0229] Antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset sedmog vida opisa, gde antitelo ili fragment obuhvata konstantni region, npr. IgG4 konstantni region, pri čemu je konstantni region IgG4-PE (Seq ID No:128).

[0230] U drugom primeru bilo kog vida ovde, antitelo fragmenta obuhvata humani gama 4 konstantni region. U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca ne vezuje Fc-y receptore, i npr. obuhvata mutaciju Leu235Glu (tj. gde je ostatak leucina divljeg tipa mutiran u ostatak glutaminske kiseline). U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca obuhvata mutaciju Ser228Pro kako bi se povećala stabilnost.

U osamdeset devetom vidu

[0231] Antitelo prema bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset osmog vida opisa, gde antitelo obuhvata teški lanac i laki lanac, aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO:62 i aminokiselinske sekvence lakog lanca koja se sastoji od sekvence SEQ ID NO:64.

U devedesetom vidu

[0232] Antitelo ili fragment kao što je definisano u bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset devetog, devedeset osmog, devedeset devetog, sto prvog ili sto drugog vida opisa za upotrebu u tretmanu ili sprečavanju bolesti ili stanja posredovanog hOX40L-om, izabranih iz grupe koju čine autoimune bolesti ili stanja, sistemske zapaljenske bolesti ili stanja, ili odbacivanja transplantacije; na primer, zapaljenska bolest creva (IBD), Kronova bolest, reumatoidni artritis, odbacivanje transplantacije, odbacivanja alogene transplantacije, bolest 'kalem-protiv-domaćina' (GvHD),

1

ulcerozni kolitis, sistemski eritematozni lupus (SLE), dijabetes, uveitis, ankilozantni spondilitis, kontaktna preosetljivost, multipla skleroza ili ateroskleroza, posebno GvHD.

[0233] Karakteristike antitela i hOX40L-om posredovana bolest bilo kog vida, konfiguracije, primera ili otelotvorenja opisa opciono primenjuju se mutatis mutandis na ovu upotrebu. Bilo koji od sastava, rasporeda doziranja ili načina primene kako je opisano u bilo kom vidu, konfiguraciji, primeru ili otelotvorenju opisa opciono se primenjuje mutatis mutandis na ovu upotrebu.

U devedeset prvom vidu

[0234] Upotreba antitela ili fragmenta kao što je definisano u bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset devetog, devedeset osmog, devedeset devetog, sto prvog ili stotinu drugog vida opisa u proizvodnji lleka za upotrebu na čoveku za tretiranje ili sprečavanje bolesti ili stanja posredovanih hOX40L-om kod čoveka, izabranih iz grupe koju čine autoimuna bolest ili stanje, sistemska zapaljenska bolest ili stanje, ili odbacivanja transplant/domaćin; na primer, zapaljenska bolest creva (IBD), Kronova bolest, reumatoidni artritis, odbacivanje transplantacije, odbacivanje alogene transplantacije, bolest 'kalem-protiv-domaćina' (GvHD), ulcerozni kolitis, sistemski eritematozni lupus (SLE), dijabetes, uveitis, ankilozantni spondilitis, kontaktna preosetljivost, multipla skleroza ili ateroskleroza, posebno GvHD.

[0235] Karakteristike antitela i hOX40L-om posredovana bolest bilo kog vida, konfiguracije, primera ili otelotvorenja opisa primenjuju se opciono mutatis mutandis na ovu upotrebu. Bilo koji od sastava, rasporeda doziranja ili načina primene kako je opisano u bilo kom vidu, konfiguraciji, primeru ili otelotvorenju opisa opciono se primenjuje mutatis mutandis na ovu upotrebu.

U devedeset drugom vidu

[0236] Metoda tretiranja ili sprečavanja bolesti ili stanja posredovanog hOX40L-om, izabranih iz grupe koju čine autoimuna bolest ili stanje, sistemska zapaljenska bolest ili stanje, ili odbacivanja transplantacije; na primer, zapaljenska bolest creva (IBD), Kronova bolest, reumatoidni artritis, odbacivanje transplantacije, odbacivanje alogene transplantacije, bolest 'kalem-protiv-domaćina' (GvHD), ulcerozni kolitis,

2

sistemski eritematozni lupus (SLE), dijabetes, uveitis, ankilozantni spondilitis, kontaktna preosetljivost, multipla skleroza ili ateroskleroza, posebno GvHD kod čoveka, koja obuhvata davanje pomenutom humanom pacijentu terapeutski efikasne količine antitela ili fragmenta kako je definisano u bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset devetog, devedeset osmog, devedeset devetog, sto prvog ili sto drugog vida opisa gde je hOX40L-om posredovana bolest ili stanje time tretirana ili prevenirana.

[0237] Karakteristike antitela i hOX40L-om posredovana bolest bilo kog vida, konfiguracije, primera ili otelotvorenja opisa opciono primenjuju se mutatis mutandis na ovu upotrebu. Bilo koji od sastava, rasporeda doziranja ili načina primene kako je opisano u bilo kom vidu, konfiguraciji, primeru ili otelotvorenju opisa opciono se primenjuje mutatis mutandis na ovu metodu.

U devedeset trećem vidu

[0238] Antitelo ili fragment prema devedesetom vidu opisa, upotreba prema devedeset prvom vidu opisa ili metoda prema devedeset drugom vidu opisa, pri čemu hOX40L-om posredovana bolest ili stanje je GvHD.

[0239] Antitelo ili fragment mogu biti u stanju da tretira ili prevenira GvHD.

U devedeset četvrtom vidu

[0240] Antitelo ili fragment, upotreba ili metoda prema bilo kom od devedesetog do devedeseti trećeg vida opisa, pri čemu se antitelo primenjuje profilaktički.

[0241] U jednom otelotvorenju, profilaksa sprečava nastanak bolesti ili stanja ili simptome bolesti ili stanja. U jednom otelotvorenju, profilaktički tretman sprečava pogoršanje, ili nastanak bolesti ili stanja. U jednom otelotvorenju, profilaktički tretman sprečava pogoršanje bolesti ili stanja.

[0242] U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se daje intravenski. U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se primenjuje u dozi od oko 5-10 mg/kg (npr. u dozi od oko 8 mg/kg). U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se daje u dozi od oko 0,1 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 30 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 50 mg/kg, oko 60 mg/kg, oko 70 mg/kg, oko 80 mg/kg, oko 90 mg/kg ili oko 100 mg/kg, posebno oko 1 mg/kg, ili oko 3 mg/kg.

[0243] U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se daje 1-4 dana pre transplantacije, npr.1-3 dana pre transplantacije ili 1-2 dana pre transplantacije. U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se primenjuje nedeljno, dvonedeljno ili mesečno nakon transplantacije, npr. dvonedeljno. U daljem otelotvorenju, pomenuto antitelo se daje intravenski profilaktički 1-3 dana pre transplantacije u dozi od oko 5-10 mg/kg (npr. oko 8 mg/kg), a zatim intravenski, dvonedeljno u dozi od oko 5-10 mg/kg (npr. oko 8 mg/kg).

[0244] U drugom otelotvorenju, pacijent se periodično prati nakon transplantacije, na prisustvo biomarkera koji predviđa razvoj GvHD (npr. akutni GvHD), a anti-OX40L antitelo pronalaska se primenjuje kada su nivoi biomarkera takvi da je utvrđeno da je pacijent u riziku od razvoja GvHD (npr. akutni GvHD). Ova strategija bi izbegla nepotrebno doziranje leka i nepotrebnu supresiju imunog sistema. Primeri biomarkera koji mogu biti korisni kao prediktivni biomarkeri akutnog GvHD mogu biti oni koji su identifikovani u Levine et al., "A prognostic score for acute graft-versushost disease based on biomarkers: a multicentre study", Lancet Haematol 2015; 2:e21-29. Ovi biomarkeri uključuju, ali nisu ograničeni na TNFR1, ST-2, elafin i IL2Rα i Reg3α.

U devedeset petom vidu

[0245] Humano antitelo ili njegov fragment koji se sastoji od HCDR3 od 16 do 27 aminokiselina i koji potiče od rekombinacije humanog VH genskog segmenta, humanog D genskog segmenta i humanog JH genskog segmenta, pri čemu humani JH genski segment je IGHJ6 (npr. IGHJ6<∗>02), koji se specifično vezuje za hOX40L za tretiranje ili sprečavanje hOX40L-om posredovane bolesti ili stanja izabranih iz grupe koju čine autoimuna bolest ili stanje, sistemska zapaljenska bolest ili stanje, ili odbacivanja transplantacije; na primer, zapaljenska bolest creva (IBD), Kronova bolest, reumatoidni artritis, odbacivanje transplantacije, odbacivanje alogene transplantacije, bolest 'kalem-protiv-domaćina' (GvHD), ulcerozni kolitis, sistemski eritematozni lupus (SLE), dijabetes, uveitis, ankilozantni spondilitis, kontaktna

4

preosetljivost, multipla skleroza ili ateroskleroza, posebno GvHD (npr., gde antitelo je za sprečavanje GvHD).

[0246] Karakteristike antitela i hOX40L-om posredovane bolesti bilo kog vida, konfiguracije, primera ili otelotvorenja opisa opciono se primenjuju mutatis mutandis na ovu upotrebu. Bilo koji od sastava, rasporeda doziranja ili načina primene kako je opisano u bilo kom vidu, konfiguraciji, primeru ili otelotvorenju opisa opciono se primenjuje mutatis mutandis na ovu upotrebu.

U devedeset šestom vidu

[0247] Upotreba humanog antitela ili njegovog fragmenta koji se sastoji od HCDR3 od 16 do 27 aminokiselina i koji potiče od rekombinacije humanog VH genskog segmenta, humanog D genskog segmenta i humanog JH genskog segmenta , pri čemu humani JH genski segment je IGHJ6 (npr. IGHJ6<∗>02), koji se specifično vezuje za hOX40L u proizvodnji leka za primenu kod čoveka za tretman ili sprečavanje bolesti ili stanja posredovanog hOX40L-om kod čoveka, izabranih iz grupe koju čine autoimuna bolest ili stanje, sistemska zapaljenska bolest ili stanje, ili odbacivanje transplantacije; na primer, zapaljenska bolest creva (IBD), Kronova bolest, reumatoidni artritis, odbacivanje transplantacije, odbacivanje alogene transplantacije, bolest 'kalem-protiv-domaćina' (GvHD), ulcerozni kolitis, sistemski eritematozni lupus (SLE), dijabetes, uveitis, ankilozantni spondilitis, kontaktna preosetljivost, multipla skleroza ili ateroskleroza, posebno GvHD.

[0248] Karakteristike antitela i hOX40L-om posredovane bolesti bilo kog vida, konfiguracije, primera ili otelotvorenja opcionog opisa primenjuju se mutatis mutandistoovu upotrebu. Bilo koji od sastava, rasporeda doziranja ili načina administracije kako je opisano u bilo kom vidu, konfiguraciji, primeru ili otelotvorenju opisa opciono se primenjuje mutatis mutandis na ovu upotrebu.

U devedeset i sedmom vidu

[0249] Metoda tretmana ili sprečavanja bolesti ili stanja posredovanog hOX40L-om, izabrane iz grupe koju čine autoimuna bolest ili stanje, sistemska zapaljenska bolest ili stanje, ili odbacivanja transplantacije; na primer, zapaljenska bolest creva (IBD), Kronova bolest, reumatoidni artritis, odbacivanje transplantacije, odbacivanje alogene transplantacije, bolest 'kalem-protiv-domaćina' (GvHD), ulcerozni kolitis, sistemski eritematozni lupus (SLE), dijabetes, uveitis, ankilozantni spondilitis, kontaktna preosetljivost, multipla skleroza ili ateroskleroza, posebno GvHD kod čoveka, koja obuhvata davanje pomenutom čoveku terapeutski efikasne količine humanog antitela ili njegovog fragmenta koji obuhvata HCDR3 od 16 do 27 aminokiselina i koji potiče od rekombinacije VH genskog segmenta, humanog D genskog segmenta i humanog JH genskog segmenta, gde humani JH genski segment je IGHJ6 (npr. IGHJ6<∗>02), koji se specifično vezuje za hOX40L, gde je bolest ili stanje posredovano hOX40L-om time tretirano ili prevenirano.

[0250] Karakteristike antitela i hOX40L-om posredovana bolest bilo kog vida, konfiguracije, primera ili otelotvorenja opisa opciono se primenjuju mutatis mutandis na ovu upotrebu. Bilo koji od sastava, rasporeda doziranja ili načina primene kako je opisano u bilo kom vidu, konfiguraciji, primeru ili otelotvorenju opisa opciono se primenjuje mutatis mutandis na ovu upotrebu.

[0251] U bilo kom od devedeset petog do devedeset sedmog vida opisa, humani JH genski segment je izabran iz grupe koju čine IGHJ6<∗>01, IGHJ6<∗>02, IGHJ6<∗>03 i IGHJ6<∗>04. U bilo kom od devedeset petog do devedeset sedmog vida opisa, humani JH genski segment je izabran iz grupe koju čine IGHJ6<∗>01, IGHJ6<∗>02 i IGHJ6<∗>04. U bilo kom od devedeset petog do devedeset sedmog vida opisa, JH genski segment je IGHJ6<∗>02.

[0252] U bilo kom od devedeset petog do devedeset sedmog vida opisa, humani VH genski segment je IGHV3-23, na primer izabran iz grupe koju čine IGHV3-23<∗>01, IGHV3-23<∗>02, IGHV3-23<∗>03, IGHV3-23<∗>04 ili IGHV3-23<∗>05. U bilo kom od devedeset petog do devedeset sedmog vida opisa, humani VH genski segment IGHV3-23<∗>01 ili IGHV3-23<∗>04, posebno IGHV3-23<∗>04.

[0253] U bilo kom od devedeset petog do devedeset sedmog vida opisa, humani DH genski segment je IGHD3-10, na primer izabran iz grupe koju čine IGHD3-10<∗>01 ili IGHD3-10<∗>02. U bilo kom od devedeset petog do devedeset sedmog vida opisa, humani DH genski segment je IGHD3-10*01. U bilo kom od devedeset petog do devedeset sedmog vida opisa, humani DH genski segment je IGHD3-10*02.

[0254] U bilo kom od devedesetog do devedeset sedmog vida opisa, antitelo je sposobno da tretira ili spreči GvHD. U bilo kom od devedesetog do devedeseti sedmog vida opisa, antitelo ili fragment se koristi za tretiranje ili prevenciju bolesti različite od GvHD, ali antitelo ili fragment je sposoban da tretira ili spreči GvHD.

U devedeset osmom vidu

[0255] Antitelo ili fragment prema osamdeset šestom vidu opisa, ili antitelo ili fragment prema devedeset petom vidu opisa, upotreba prema devedeset šestom vidu opisa, ili metoda prema devedeset sedmom vidu opisa, gde antitelo ili fragment sadrži kapa laki lanac, npr. gde je VL domen lakog lanca izveden iz rekombinacije humanog VL genskog segmenta i humanog JL genskog segmenta, gde humani VL genski segment je IGKV1D-39 (npr. IGKV1D-39*01), a opciono humani JL genski segment je IGKJ1 (npr. IGKJ1*01) ili IGKJ3 (npr. IGKJ3*01).

[0256] U drugom otelotvorenju, VL domen je kapa VL domen. U jednom otelotvorenju, kapa VL domen je izveden iz rekombinacije humanog VL genskog segmenta i humanog JL genskog segmenta, humani VL genski segment je IGKV1D-39. U drugom otelotvorenju, VL genski segment je IGKV1D-39*01.

[0257] U daljem otelotvorenju, humani JL genski segment je IGKJ1. U drugom otelotvorenju, JL genski segment je IGKJ1*01. U daljem otelotvorenju, humani JL genski segment je IGKJ3. U drugom otelotvorenju, JL genski segment je IGKJ3*01.

U devedeset devetom vidu

[0258] Antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset devetog, devedeset osmog, sto prvog ili sto drugog vida opisa ili upotreba antitela ili fragmenta ili metode prema bilo kom od devedesetog do devedeset osmog vida opisa, gde antitelo ili fragment omogućava više od 80% himerizma matičnih ćelija donora do 12. dana u Rezus makaki modelu haploidentične transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija, opciono gde antitelo služi za prevenciju GvHD.

[0259] U drugom vidu opisa, pruženo je antitelo ili fragment, upotreba ili metoda prema bilo kom od devedeset petog do devedeset osmog vida opisa, gde antitelo ili fragment služi za tretman ili prevenciju odbacivanja transplantacije (npr. GvHD) kod čoveka tako što omogućava više od 80% himerizma matičnih ćelija donora do 12. dana kod navedenog čoveka nakon transplantacije humanih hematopoetskih matičnih ćelija donora.

[0260] U drugom vidu opisa, pruženo je antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset devetog, devedeset osmog, sto prvog ili sto drugog vida opisa gde antitelo ili fragment omogućava više od 80% himerizma matičnih ćelija donora do 12. dana u rezus makaki modelu haploidentične transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija.

[0261] U jednom otelotvorenju, himerizam je T-ćelijski (CD3<+>/CD20-) himerizam. U drugom otelotvorenju, himerizam je himerizam periferne krvi. U drugom otelotvorenju, himerizam je himerizam periferne krvi ili T-ćelija (CD3<+>/CD20-).

[0262] U jednom otelotvorenju, himerizam donora matičnih ćelija (npr. himerizam periferne krvi ili T ćelija (CD3<+>/CD20-)) je određen pomoću divergentnih donorskih i recipijent-specifičnih MHC-vezanih mikrosatelitskih markera, upoređujući visine pikova amplikona specifičnih za davaoca i primaoca. U drugom otelotvorenju, himerizam matičnih ćelija donora se određuje kako je opisano u Kean, LS, et al., "Induction of chimerism in rhesus macaques through stem cell transplant and costimulation blockade-based immunosuppression", Am J Transplant.2007 Feb;7(2):320-35. U drugom otelotvorenju, himerizam matičnih ćelija donora je određen kako je opisano u primeru 7.

[0263] U jednom otelotvorenju, Rezus makaki model haploidentičnih hematopoetskih matičnih ćelija izvode životinje primaoci transplantacije (HSCT) koje su podvrgnute postupku kondicioniranja zajedno sa davanjem anti-OX40L antitela, nakon čega sledi infuzija proizvoda periferne krvi izolovanog iz polu-podudarnog animalnog donora, nakon čega životinje nastavljaju da primaju nedeljne doze anti-OX40L antitela pronalaska, a uzorci krvi se uzimaju i analiziraju na himerizam.

[0264] U drugom otelotvorenju, u HSCT modelu, životinje primaoci dobijaju dozu kondicionog zračenja od 1020 cGy u 4 frakcije doze tokom 2 dana (eksperimentalni dan -2 i dan -1) radi ablacije hematopoetskog sistema domaćina pre intravenske primene anti-OX40L antitela pronalaska (dan -2, sa naknadnim intravenskim dozama 5, 12, 19, 26, 33, 40, 47. dana) i transplantacijeciju periferne krvi obogaćene belim krvnim zrncima i matičnim ćelijama od napola podudarne životinje davaoca MHC-a za rekonstituciju imunog sistema primaoca, zajedno sa pružanjem kontinuirane suportivne nege, uzorkovanjem krvi i praćenjem znakova GVHD.

[0265] U jednom otelotvorenju, antitelo ili fragment, upotreba ili metoda je za prevenciju GvHD.

[0266] U jednom otelotvorenju, anti-HOX40L antitelo pronalaska se primenjuje profilaktički. U jednom otelotvorenju, profilaktičko lečenje sprečava pogoršanje, ili nastanak bolesti ili stanja.

[0267] U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se daje intravenski. U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se primenjuje u dozi od oko 5-10 mg/kg (npr. u dozi od oko 8 mg/kg). U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se daje intravenski. U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se primenjuje u dozi od oko 5-10 mg/kg (npr. u dozi od oko 8 mg/kg). U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se daje u dozi od oko 0,1 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 30 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 50 mg/kg, oko 60 mg/kg, oko 70 mg/kg, oko 80 mg/kg, oko 90 mg/kg ili oko 100 mg/kg, posebno oko 1 mg/kg, ili oko 3 mg/kg.

[0268] U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se daje 1-4 dana pre transplantacije, npr.1-3 dana pre transplantacije ili 1-2 dana pre transplantacije. U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se primenjuje nedeljno, dvonedeljno ili mesečno nakon transplantacije, npr. dvonedeljno. U daljem otelotvorenju, pomenuto antitelo se daje intravenski profilaktički 1-3 dana pre transplantacije u dozi od oko 5-10 mg/kg (npr. oko 8 mg/kg), a zatim intravenski, dvonedeljno u dozi od oko 5-10 mg/kg (npr. oko 8 mg/kg).

[0269] U drugom otelotvorenju, pacijent se periodično prati nakon transplantacije, na prisustvo biomarkera koji predviđa razvoj GvHD (npr. akutni GvHD), a anti-OX40L antitelo pronalaska se primenjuje kada su nivoi biomarkera takvi da je utvrđeno da pacijent ima rizik od razvoja GvHD (npr. akutni GvHD). Ova strategija bi izbegla nepotrebno doziranje leka i nepotrebno suzbijanje imunog sistema. Primeri biomarkera koji mogu biti korisni kao prediktivni biomarkeri akutnog GvHD mogu biti oni identifikovani u Levine et al., "A prognostic score for acute graft-versus-host disease based on biomarkers: a multicentre study", Lancet Haematol 2015; 2:e21-29. Ovi biomarkeri uključuju, ali nisu ograničeni na TNFR1, ST-2, elafin i IL2Rα i Reg3α.

[0270] U daljem otelotvorenju, HSCT model se sprovodi kako je opisano u Miler, Veston P., et al. "GVHD after haploidentical transplantacijetion: a novel, MHC-defined rhesus macaque model identifies CD28- CD8+ T cells as a reservoir of breakthrough T-cell proliferation during costimulation blockade and sirolimus-based immunosuppression." Blood, 116, 24(2010):5403-5418. U daljem otelotvorenju, HSCT model se sprovodi kako je opisano u primeru 7.

U stotom vidu

[0271] Antitelo ili fragment, upotreba ili metoda prema bilo kom od devedeset petog do devedeset devetog vida opisa, pri čemu je antitelo definisano u bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset devetog, devedeset osmog, devedeset devetog, sto prvog ili sto drugog vida opisa.

U sto prvom vidu

[0272] Antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset devetog, devedeset osmog, devedeset devetog ili sto drugog vida opisa, ili antitelo ili fragment, upotreba ili metoda prema bilo kom od devedesetog do stotog vida opisa, gde antitelo ili fragment eksprimira kao stabilno transfektovani bazen u Lonza GS-XceedTM na nivou većem od 1,5g/L u kulturu prekomernog rasta pomoću Lonza verzije 8 sistema za hranjenje sa periodom prekomernog rasta od 14 dana.

[0273] U jednom otelotvorenju, nivo ekspresije je veći od 1,0g/L, veći od 1,1g/L, veći od 1,2g/L, veći od 1,3g/L ili veći od 1,4g/L.

U sto drugom vidu

[0274] Antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset devetog, devedeset osmog, devedeset devetog, ili sto prvog vida opisa ili antitelo ili fragment, upotreba ili metoda prema bilo kom od devedesetog do sto prvog vida opisa, gde antitelo ili fragment održava naivnu populaciju CD4<+>T ćelija od >20% ukupne populacije CD4<+>T ćelija na dan 12 u Rezus makaki modelu haploidentične transplantacije matičnih ćelija hematopoeze.

[0275] U drugom vidu opisa, obezbeđeno je antitelo ili fragment prema bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset devetog, devedeset osmog, devedeset devetog ili sto prvog vida opisa, ili antitelo ili fragment, upotreba ili metoda prema bilo kom od devedesetog do sto prvog vida opisa, gde antitelo ili fragment služi za tretiranje ili sprečavanje odbacivanja transplantacije kod čoveka održavanjem naivne populacije CD4<+>T ćelija davaoca od >20% ukupne populacije CD4<+>T ćelija na dan 12 u navedenom čoveku nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija humanog donora.

[0276] U jednom otelotvorenju, HSCT model je opisan u bilo kom otelotvorenju koje se ovde razmatra, npr. kao što je opisano u vezi sa devedeset devetim vidom opisa.

[0277] U drugom otelotvorenju, naivna populacija se meri procenom relativnog udela specifičnih fenotipova T ćelija pomoću protočne citometrije gde su podskupovi ćelija identifikovani označavanjem sa fluorescentnim sondama za antitela i gde su naivne CD4 ili CD8 T ćelije označene sa CD4<+>/CD28<+>/CD95- ili CD8<+>/CD28<+>/CD95-, odnosno, centralne memorijske CD4 ili CD8 T ćelije označene sa CD4<+>/CD28<+>/CD95<+>ili CD8<+>/CD28<+>/CD95 , a efektorske memorijske CD4 ili CD8 T ćelije označene sa CD4<+>/CD28-/CD95<+>ili CD8<+>/CD28-/CD95<+>.

U sto trećem vidu

[0278] Antitelo ili fragment, upotreba ili metoda prema bilo kom od devedesetog do sto drugog vida opisa, koji dalje obuhvataju davanje ljudskom telu daljeg terapijskog sredstva, opcionoi gde je dalje terapijsko sredstvo nezavisno izabrano iz grupe koju čine rapamicin (sirolimus), takrolimus, ciklosporin, kortikosteroid (npr.

1

metilprednizolon), metotreksat, mikofenolat mofetil, anti-CD28 antitela, anti-IL12/IL-23 antitela (npr. ustekinumab), anti-CD20 antitela (npr.rituksimab), anti-CD30 antitela (npr. brentuksimab), CTLA4-Fc molekuli (npr. abatacept), antagonisti CCR5 receptora (npr. maravirok), anti-CD40L antitela, anti-VLA4 antitela (npr. natalizumab), anti-LFA1 antitela, fludarabin, anti-CD52 antitela (npr. alemtuzumab), anti-CD45 antitela, ciklofosfamid, anti-timocit globulini, anti-komplement C5 antitela (npr. ekulizumab), anti-a4b7 integrin antitela (npr. vedolizumab), anti-IL6 antitela (npr. tocilizumab), anti-IL2R antitela (npr. basiliksumab), anti-CD25 antitela (npr. daklizumab), anti-TNFa / TNFa-Fc molekuli (npr. etanercept, adalimumab, infliksimab, golimumab ili certolizumab pegol) i Vorinostat, posebno rapamicin (sirolimus), takrolimus, ciklosporin, kortikosteroidi (npr. metilprednizolon), metotreksat, mikofenolat mofetil, anti-CD28 antitela, CTLA4-Fc molekuli (npr. abatacept), anti-CD40L antitela, anti-LFA1 antitela, anti-CD52 antitela (npr. alemtuzumab), ciklofosfamid i anti-timocit globulini.

[0279] U jednom otelotvorenju, dalji terapeutski agens je antiinflamatorni lek. U drugom otelotvorenju, antiinflamatorni lek je nezavisno izabran iz grupe koju čine kortikosteroidi (npr. metilprednizolon), anti-IL12/IL-23 antitela (npr. ustekinumab), anti-VLA4 antitela (npr. natalizumab), anti-LFA1 antitela, anti-komplement C5 antitela(npr. ekulizumab), anti-a4b7 integrin antitela (npr. vedolizumab), anti-IL6 antitela (npr. tocilizumab), anti-IL2R antitela (npr. basiliksumab) ili anti-TNFa antitela/TNFa-Fc molekuli (npr. etanercept, adalimumab, infliksimab, golimumab, certolizumab pegol). U jednom primeru, antiinflamatorni lek je izabran nezavisno iz grupe koju čine kortikosteroidi (npr. metilprednizolon) i anti-LFA1 antitela.

U sto četvrtom vidu

[0280] Antitelo ili fragment, upotreba ili metoda prema sto trećem vidu opisa, gde se dalje terapeutsko sredstvo primenjuje sekvencijalno ili istovremeno sa anti-hOX40L antitelom ili fragmentom.

U sto petom vidu

[0281] Antitelo ili fragment, upotreba ili metoda kao što je definisano u bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset devetog, devedeset osmog, devedeset devetog, sto prvog ili sto drugog vida opisa i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, razblaživač ili

2

nosač i opciono gde je dalje terapeutsko sredstvo nezavisno izabrano iz grupe koju čine rapamicin (sirolimus), takrolimus, ciklosporin, kortikosteroidi (npr. metilprednizolon), metotreksat, mofetilmikofenolat, anti-CD28 antitela, anti-IL12/IL-23 antitela (npr. ustekinumab), anti-CD20 antitela (npr.rituksimab), anti-CD30 antitela (npr. brentuksimab), CTLA4-Fc molekuli (npr. abatacept), antagonisti CCR5 receptora (npr. maravirok), anti-CD40L antitela, anti-VLA4 antitela (npr. natalizumab), anti-LFA1 antitela, fludarabin, anti-CD52 antitela (npr. alemtuzumab), anti-CD45 antitela, ciklofosfamid, anti-timocit globulini, anti-komplement C5 antitela (npr. ekulizumab), anti-a4b7 integrin antitela (npr. vedolizumab), anti-IL6 antitela (npr. tocilizumab), anti-IL2R antitela (npr. basiliksumab), anti-CD25 antitela (npr. daklizumab), anti-TNFa / TNFa-Fc molekuli (npr. etanercept, adalimumab, infliksimab, golimumab ili certolizumab pegol) i Vorinostat, posebno rapamicin (sirolimus), takrolimus, ciklosporin, kortikosteroidi (npr. metilprednizolon), metotreksat, mikofenolat mofetil, anti-CD28 antitela, CTLA4-Fc molekuli (npr. abatacept), anti-CD40L antitela, anti-LFA1 antitela, anti-CD52 antitela (npr. alemtuzumab), ciklofosfamid i anti-timocit globulini.

[0282] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi, razblaživači ili nosači kako je opisano u ovom dokumentu primenjuju se mutatis mutandis na ove sastave.

[0283] U jednom otelotvorenju, dalje terapeutsko sredstvo je antiinflamatorni lek. U drugom otelotvorenju, anti-inflammatorni lek je nezavisno izabran iz grupe koju čine kortikosteroidi (npr. metilprednizolon), anti-IL12/IL-23 antitela (npr. ustekinumab), anti-VLA4 antitela (npr. natalizumab), anti-LFA1 antitela , anti-komplementarna C5 antitela (npr. ekulizumab), anti-a4b7 integrin antitela (npr. vedolizumab), anti-IL6 antitela (npr. tocilizumab), anti-IL2R antitela (npr. basiliksumab) ili anti-TNFa antitela/TNFa-Fc molekuli (npr. etanercept, adalimumab, infliksimab, golimumab, certolizumab pegol). U jednom primeru, antiinflamatorni lek je nezavisno izabran iz grupe koju čine kortikosteroidi (npr. metilprednizolon) i anti-LFA1 antitela.

U sto šestom vidu

[0284] Farmaceutski sastav prema sto petom vidu opisa, ili komplet koji obuhvata farmaceutski sastav kako je definisan u sto petom vidu opisa, gde je sastav namenjen za tretman i/ili sprečavanje stanja ili bolesti posredovane hOX40L-om, izabrane iz grupe koju čine autoimuna bolest ili stanje, sistemska zapaljenska bolest ili stanje, ili odbacivanja transplantacije; na primer, zapaljenska bolesti creva (IBD), Kronova bolest, reumatoidni artritis, odbacivanje transplantacije, alogeno odbacivanje transplantacije, bolest 'kalem-protiv-domaćina' (GvHD), ulcerozni kolitis, sistemski eritematozni lupus (SLE), dijabetes, uveitis, ankilozantni spondilitis, kontaktna preosetljivost, multipla skleroza i ateroskleroza, posebno GvHD.

[0285] Bolesti posredovane hOX40L-om bilo kog vida, konfiguracije, primera ili otelotvorenja opisa opciono se primenjuju mutatis mutandis na ovu kombinaciju.

U sto sedmom vidu

[0286] Farmaceutski sastav prema sto petom vidu ili sto šestom vidu opisa u kombinaciji sa, ili komplet prema vidu 106 koji obuhvata etiketu ili uputstva za upotrebu za tretiranje i/ili sprečavanje navedene bolesti ili stanja kod čoveka; opciono, gde etiketa ili uputstvo obuhvataju broj dozvole za stavljanje u promet (npr. broj dozvole FDA ili EMA); opciono, gde komplet obuhvata uređaj za infuziju ili injekciju koji sadrže antitelo ili fragment.

[0287] Oznake, uputstva, bolesti posredovane hOX40L-om i stanja bilo kog vida, konfiguracije, primera ili otelotvorenja opisa opciono se primenjuju mutatis mutandis na ovu kombinaciju.

U sto osmom vidu

[0288] Nukleinska kiselina koja kodira HCDR3 antitela ili fragmenta kako je definisano u bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset devetog, devedeset osmog, devedeset devetog, sto prvog, ili sto drugog vida opisa.

U sto devetom vidu

[0289] Nukleinska kiselina koja kodira VH domen i/ili VL domen antitela ili fragmenta kako je definisano u bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset devetog, devedeset osmog, devedeset devetog, sto prvog ili sto drugog vida opisa.

4

U sto desetom vidu

[0290] Nukleinska kiselina prema sto devetom vidu opisa koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje 80% identična sekvenci SEQ ID NO: 33 i/ili SEQ ID NO: 47.

[0291] U jednom primeru, sekvenca nukleotida je najmanje 85% identična, najmanje 90% identična, najmanje 95% identična, najmanje 96% identična, najmanje 97% identična, najmanje 98% identična ili najmanje 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 33 i/ili SEQ ID NO: 47.

U sto jedanaestom vidu

[0292] Nukleinska kiselina koja kodira teški lanac ili laki lanac antitela naveden u bilo kom od sedamdeset trećeg do osamdeset devetog, devedeset osmog, devedeset devetog, sto prvog ili sto drugog vida opisa.

U sto dvanaestom vidu

[0293] Vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu bilo kog od sto osmog do sto jedanaestog vida opisa; opciono, pri gde je vektor CHO ili HEK293 vektor.

U sto trinaestom vidu

[0294] Domaćin koji obuhvata nukleinsku kiselinu bilo kog od sto osmog do sto jedanaestog vida opisa ili vektor od sto dvanaestog vida opisa.

[0295] Kao što je objašnjeno u primerima, pronalazači su osmislili skup kriterijuma koji su posebno korisni za identifikaciju antitela i fragmenata pronalaska, a ti kriterijumi su:-a) sposobnost antitela ili fragmenta da veže ćelijsko-površinski hOX40L na ćelijama CHO-S (opciono transfektovane sa humanim OX40L pune dužine) i/ili veže rekombinantni hOX40L u HTRF testu;

b) sposobnost antitela ili fragmenta da neutrališu humani OX40 (npr. neutrališu vezivanje humanog OX40L za receptor humanog OX40) u HTRF testu neutralizacije receptora i/ili testu neutralizacije receptora protočne citometrije; i c) sposobnost antitela ili fragmenta da specifično veže i humani OX40L i OX40L rezus majmuna (korisno tako da se PK, PD, efikasnost i drugi parametri antitela ili fragmenta mogu proceniti u rezus modelu kao surogat za ljude).

[0296] Dakle, u primeru pronalaska antitelo ili fragment ispunjavaju kriterijume (a), (b) i (c).

[0297] U jednom primeru, kriterijum (a) je postavljen tako da antitelo ili fragment pokazuje <70% vezivanja receptora od strane FACS za hOX40L koji eksprimiraju CHO-S ćelije.

[0298] U jednom primeru, kriterijum (a) je postavljen tako da antitelo ili fragment pokazuje <90% vezivanja receptora za OX40L u HTRF testu.

[0299] U jednom primeru, kriterijum (a) je postavljen tako da antitelo ili fragment pokazuje najmanje 20% efekta u HTRF testu.

[0300] U jednom primeru, OX40 se koristi u kriterijumu (b).

[0301] U jednom otelotvorenju, ispitivanje ili testiranje antitela ili fragmenta pronalaska vrši se na ili u suštini na pH7 (npr., za in vitro testove i oglede) i na ili u suštini na rtp (sobnoj temperaturi i pritisku).

[0302] Opciono, antitelo ili fragment specifično vezuje hOX40L sa afinitetom (prividni afinitet, Kd) manjim od 1 mikroM, 1000 nM do 100 nM, 100 nM do 10 nM, 10 nM do 1 nM, 1000 pM do 500 pM, 500 pM do 200 pM, manje od 200 pM, 200 pM do 150 pM, 200 pM do 100 pM, 100 pM do 10 pM, 10 pM do 1 pM, npr., u rasponu od 1mM do 1pM (npr.1mM do 100pM; 10nM do 100pM; 1nM do 10pM; ili 100pM do 1pM) kako je utvrđeno putem SPR, npr., pod uslovima SPR koji su ovde obelodanjeni). Dodatno ili alternativno, antitelo ili fragment specifično vezuje OX40L rezus majmuna sa afinitetom (prividni afinitet, Kd) manjim od 1 mikroM, 1000 nM do 100 nM, 100 nM do 10 nM, 10 nM do 1 nM, 1000 pM do 500 pM, 500 pM do 200 pM, manje od 200 pM, 200 pM do 150 pM, 200 pM do 100 pM, 100 pM do 10 pM, 10 pM do 1 pM, npr., u rasponu od 1mM do 1pM (npr.1mM do 100pM; 10nM do 100pM; 1nM do 10pM; ili 100pM do 1pM) kako je utvrđeno putem SPR, npr., pod uslovima SPR koji su ovde obelodanjeni). Takva merenja vezivanja mogu se izvršiti pomoću različitih testova vezivanja poznatih u struci, npr. pomoću rezonancije površinskih plazmona (SPR), kao što je Biacore<™>ili pomoću ProteOn XPR36<™>(Bio-Rad<®>), koristeći KinExA<®>(Sapidyne Instruments, Inc) ili koristeći ForteBio Octet (Pall ForteBio Corp.).

[0303] Sposobnost vezivanja OX40L, specifičnost i afinitet (Kd, Koff i/ili Kon) mogu se odrediti bilo kojom rutinskom metodom u struci, npr. rezonancijom površinskih plazmona (SPR). Izraz "Kd", kako se ovde koristi, ima za cilj da se odnosi na konstantu ravnoteže disocijacije određene interakcije antitela i antigena.

[0304] U jednom otelotvorenju, rezonanca površinskih plazmona (SPR) se vrši na 25°C. U drugom otelotvorenju, SPR se izvodi na 37°C.

[0305] U jednom otelotvorenju, SPR se sprovodi pri fiziološkom pH, kao što je oko pH 7 ili pH 7,6 (npr. korišćenjem Hepes puferisanog fiziološkog rastvora pri pH 7,6 (koji se takođe naziva HBS-EP)).

[0306] U jednom otelotvorenju, SPR se izvodi na nivou fiziološke soli, npr.150mM NaCl.

[0307] U jednom otelotvorenju, SPR se izvodi na nivou detergenta ne većem od 0,05% vol., npr. u prisustvu P20 (polisorbat 20; npr. Tween-20<™>) na 0,05% i EDTA na 3mM.

[0308] U jednom primeru, SPR se izvodi na 25°C ili 37°C u puferu na pH7,6, 150mM NaCl, 0,05% detergenta (npr. P20) i 3mM EDTA. Pufer može da sadrži 10mM Hepes. U jednom primeru, SPR se izvodi na 25°C ili 37°C u HBS-EP. HBS-EP je dostupan od Teknova Inc (California; catalogue number H8022).

[0309] U jednom primeru, afinitet antitela ili fragmenta se određuje korišćenjem SPR purtem

1. Kuplovanje anti-mišjeg (ili drugog relevantnog konstantnog regiona antitela humanog, pacova ili ne-humanog kičmenjaka podudarne vrste) IgG (npr.

Biacore<™>BR-1008-38) za čip biosenzora (npr. GLM čip) kao što je putem kuplovanja primarnog amina.

2. Izlaganje anti-mišjeg IgG (ili drugog antitela podudarne vrste) ispitnom IgG antitelu da bi se uhvatilo ispitno antitelo na čipu;

3. Prolazak ispitnog antigena preko površine hvatanja čipa na 1024nM, 256nM, 64nM, 16nM, 4nM sa 0nM (tj. samo pufer); i

4. I određivanje afiniteta vezivanja test antitela za test antigen koristeći rezonancu površinskog plazmona, npr., pod prethodno navedenim SPR uslovom (npr., na 25°C u fiziološkom puferu). SPR se može izvesti pomoću bilo kog standardnog SPR aparata, kao što je Biacore<™>ili pomoću ProteOn XPR36<™>(Bio-Rad<®>).

[0310] Regeneracija površine hvatanja može se izvršiti sa 10mM glicinom pri pH 1,7. Ovo uklanja uhvaćeno antitelo i omogućava da se površina koristi za drugu interakciju. Vezujući podaci se mogu ugraditi u 1:1 model svojstven standardnim tehnikama, npr. koristeći model svojstven softveru za analizu ProteOn XPR36<™>.

[0311] U jednom primeru, antitelo ili fragment pronalaska se nalazi u medicinskom kontejneru, npr. bočici, špricu, IV kontejneru ili uređaju za injektiranje (npr. intraokularnom ili intravitrealnom uređaju za injektiranje). Na primer, antitelo ili fragment je in vitro, npr. u sterilnom kontejneru. U jednom primeru, pronalazak pruža komplet koji sadrži antitelo ili fragment pronalaska, ambalažu i uputstvo za upotrebu u tretiranju ili sprečavanju ili dijagnostikovanju bolesti ili stanja posredovanog OX40L-om kod čoveka. U jednom primeru, uputstva ukazuju da čovek treba da bude genotipiziran za sekvencu OX40L varijante pre nego što se antitelo ili fragment primeni na čoveka. U jednom primeru, uputstva ukazuju da čoveka treba fenotipizirati za OX40L varijantu pre davanja antitela ili fragmenta čoveku. U jednom primeru, čovek je kineske (npr., Han ili CHS) etničke pripadnosti i uputstva su na kineskom (npr., mandarinskom).

[0312] U jednom primeru, mesto(a) vezivanja antitela ili fragmenta je(su) izabrana iz mnoštva (npr. biblioteke) mesta vezivanja. Na primer, mnoštvo mesta vezivanja sadrži ili se sastoji od mnoštva antitela sa 4 lanca ili njihovih fragmenata, npr., dAb, Fab ili scFv. Prikladne metode za proizvodnju mnoštva mesta vezivanja za skrining uključuju prikaz faga (izrada biblioteke prikaza faga mesta vezivanja za antitela), prikaz ribosoma (izrada biblioteke prikaza ribosoma mesta vezivanja za antitela), prikaz kvasca (izrada biblioteke prikaza kvasca mesta vezivanja za antitela) ili imunizaciju ne-humanog kičmenjaka (npr. glodara, npr. miša ili pacova, npr.

Velocimouse™, Kymouse<™>, Xenomouse<™>, Aliva Mouse<™>, HuMab Mouse<™>, Omnimouse<™>, Omnirat<™>ili MeMo Mouse<™>) sa hOX40L ili hOX40L epitopom i izolacijom repertoara ćelija koje proizvode antitela (npr. B-ćelija, plazma ćelija ili plazmablast repertoara) i/ili repertoara izolovanih antitela, fragmenata ili mesta vezivanja.

[0313] Izraz "epitop" je region antigena koji je vezan antitelom ili fragmentom. Epitopi se mogu definisati kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su generalno podskup strukturnih epitopa i imaju one rezidue koji direktno doprinose afinitetu interakcije. Epitopi takođe mogu biti konformacioni, odnosno sastavljeni od nelinearnih aminokiselina. U određenim otelotvorenjima, epitopi mogu uključivati determinante koje su hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforilne grupe ili sulfonilne grupe, i, u određenim otelotvorenjima, mogu imati karakteristike specifične trodimenzionalne strukture i/ili karakteristike specifičnog naelektrisanja.

[0314] Izraz „izolovan“ u odnosu na bilo koji vid, npr. antitelo ili fragment, znači da je predmetno antitelo ili fragment itd. (1) bez najmanje nekih drugih proteina sa kojima bi se obično nalazilo, (2) u suštini bez drugih proteina iz istog izvora, npr. od iste vrste, (3) eksprimirano od strane ćelije iz druge vrste, (4) odvojeno od najmanje 50 procenata polinukleotida, lipida, ugljenih hidrata ili drugih materijala sa kojima je povezano u prirodi, (5) operativno je asocirano (kovalentnom ili nekovalentnom interakcijom) sa polipeptidom sa kojim nije asocirano u prirodi, ili (6) ne javlja se u prirodi. Obično, „izolovano“ antitelo, fragment itd., čini najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, ili najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ili >99% datog uzorka. Genomska DNK, cDNK, mRNK ili druga RNK, sintetičkog porekla, ili bilo koja njihova kombinacija može da kodira takvo izolovano antitelo, fragment itd. Poželjno, izolovano antitelo, fragment itd. je u znatnoj meri bez proteina ili polipeptida ili drugih kontaminanata koji se nalaze u njegovom prirodnom okruženju koji bi ometali njegovu terapeutsku, dijagnostičku, profilaktičku, istraživačku ili drugu upotrebu.

[0315] Na primer, „izolovano“ antitelo je ono koje je identifikovano, separisano i/ili rekuperirano iz komponente svog produkcionog okruženja (npr. prirodno ili rekombinantno). Poželjno, izolovani polipeptid nije asociran sa svim drugim komponentama iz svog produkcionog okruženja, npr., tako da je antitelo izolovano na odobrenom ili standardu koji odobrava FDA. Kontaminantne komponente njegovog produkcionog okruženja, kao što su one koje su rezultat rekombinantnih transfektovanih ćelija, su materijali koji obično ometaju istraživačku, dijagnostičku ili terapijsku upotrebu antitela, i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvorke. U poželjnim otelotvorenjima, polipeptid će biti prečišćen: (1) do više od 95% tež. antitela kako je utvrđeno, na primer, Lowry metodom, a u nekim otelotvorenjima do više od 99% tež.; (2) u dovoljnom stepenu da se dobije najmanje 15 rezidua N-terminalne ili interne aminokiselinske sekvence korišćenjem Edmanovog proteinskog sekvenatora, ili (3) do homogenosti putem SDS-PAGE u ne-redukcionim ili redukcionim uslovima koristeći Coomassie plavo ili, poželjno, srebrno bojenje. Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ unutar rekombinantnih ćelija jer najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Međutim, obično će izolovani polipeptid ili antitelo biti pripremljeni najmanje jednim korakom prečišćavanja.

Imunokonjugati

[0316] Pronalazak obuhvata antitelo ili fragment, kako je definisano u patentnim zahtevima, konjugovanim za terapeutski deo ("imunokonjugat"), kao što su citotoksin, hemoterapeutski lek, imunosupresiv ili radioizotop. Citotoksin agensi uključuju bilo koji agens koji je štetan za ćelije. Primeri odgovarajućih citotoksin agenasa i hemoterapeutskih agenasa za formiranje imunokonjugata poznati su u struci, vidi na primer, WO 05/103081.

Bispecifičnosti

[0317] Antitela i fragmenti ovog pronalaska mogu biti monospecifični, bispecifični ili multispecifični. Multispecifična mAb mogu biti specifična za različite epitope jednog ciljnog polipeptida ili mogu sadržati antigen-vezujuće domene specifične za više od jednog ciljnog polipeptida. Vidi, npr., Tutt et al., (1991) J. Immunol.147:60-69.

Humana anti-hOX40L antitela ili fragmenti mogu biti povezani ili ko-eksprimirani sa drugim funkcionalnim molekulom, npr. drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili njegov fragment mogu biti funkcionalno povezani (npr. hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili na drugi način) sa jednim ili više drugih molekularnih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela, kako bi se proizvelo bispecifično ili multispecifično antitelo sa drugom specifičnošću vezivanja.

[0318] Jedan egzemplarni format bi-specifičnog antitela koji se može koristiti u kontekstu ovog pronalaska uključuje upotrebu prvog CH3 domena imunoglobulina (Ig) i drugog Ig CH3 domena, gde se prvi i drugi Ig CH3 domen međusobno razlikuju za najmanje jednu aminokiselinu, i gde razlika najmanje jedne aminokiseline redukuje vezivanje bispecifičnog antitela za protein A u poređenju sa bi-specifičnim antitelima kojima nedostaje razlika aminokiselina. U jednom otelotvorenju, prvi Ig CH3 domen vezuje protein A, a drugi domen Ig CH3 sadrži mutaciju koja redukuje ili ukida vezivanje za protein A, kao što je modifikacija H95R (po IMGT numeraciji eksona; H435R po numeraciji EU). Drugi CH3 može dodatno sadržati modifikaciju Y96F (po IMGT; Y436F po EU). Dalje modifikacije koje se mogu naći u okviru drugog CH3 uključuju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M i V821 (po IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I po EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N i V82I (po IMGT; N384S, K392N i V422I po EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q i V82I (po IMGT; Q355R, N3845, K392N, V397M, R409K, E419Q i V422I po EU) u slučaju IgG4 antitela. Razmotrene su varijacije u gore opisanom formatu bi-specifičnog antitela.

[0319] U određenim otelotvorenjima, antitelo ili njegov fragment koji vezuje OX40L sastoji se od manje od šest CDR-a. U nekim otelotvorenjima, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži ili se sastoji od jednog, dva, tri, četiri ili pet CDR-a izabranih iz grupe koju čine HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3. U specifičnim otelotvorenjima, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži ili se sastoji od jednog, dva, tri, četiri ili pet CDR izabranih iz grupe koju čineHCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvenci u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:4, Seq ID No:10, Seq ID No:36, Seq ID No:42, Seq ID No:68, Seq ID No:74, Seq

1

ID No:96 ili Seq ID No:102, posebno, Seq ID No:36 ili Seq ID No:42 za HCDR1; Seq ID No:6, Seq ID No:12, Seq ID No:38, Seq ID No:44, Seq ID No:70, Seq ID No:76, Seq ID No:98 ili Seq ID No:104, posebno Seq ID No:38 ili Seq ID No:44 za HCDR2; Seq ID No:8, Seq ID No:14, Seq ID No:40, Seq ID No:46, Seq ID No:72, Seq ID No:78, Seq ID No:100 ili Seq ID No:106, posebno Seq ID No:40 ili Seq ID No:46 za HCDR3; Seq ID No:18, Seq ID No:24, Seq ID No:50, Seq ID No:56, Seq ID No:82, Seq ID No:88, Seq ID No:110 ili Seq ID No:116, posebno Seq ID No:50 ili Seq ID No:56 za LCDR1; Seq ID No:20, Seq ID No:26, Seq ID No:52, Seq ID No:58, Seq ID No:84, Seq ID No:90, Seq ID No:112 ili Seq ID No:118, posebno Seq ID No:52 ili Seq ID No:58 za LCDR2; i Seq ID No:22, Seq ID No:28, Seq ID No:54, Seq ID No:60, Seq ID No:86, Seq ID No:92, Seq ID No:114 ili Seq ID No:120, posebno Seq ID No:54 ili Seq ID No:60 za LCDR3).

[0320] U specifičnim otelotvorenjima, antitelo pronalaska je potpuno humano antitelo, monoklonsko antitelo, rekombinantno antitelo, antitelo antagonista, antitelo koje neutrališe hOX40L ili bilo koja njihova kombinacija ili pronalazak pruža njegov fragment koji vezuje hOX40L. U jednom primeru, antitelo je himerno antitelo koje sadrži humane varijabilne domene i ne-humane konstantne domene (npr. miša ili pacova ili zeca). U posebnim otelotvorenjima, antitelo je potpuno humano antitelo, kao što je potpuno humano monoklonsko antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, i koji se specifično vezuje za hOX40L. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo je antagonist antitelo. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo je neutrališuće antitelo.

[0321] U jednom primeru, antitelo ili fragment je antitelo ili fragment tipa lambda (tj., čiji su varijabilni domeni lambda varijabilni domeni). Opciono, antitelo ili fragment takođe obuhvata lambda konstantne domene.

[0322] U određenim otelotvorenjima, antitelo se takmiči (npr. na način zavisan od doze) sa OX40 ili njegovim fuzionim proteinom (npr. Fc: OX40), za vezivanje za hOX40L, kao što je ćelijski površinski-eksprimirani hOX40L ili rastvorljivi hOX40L. Primeri testova kompetitivnog blokiranja su dati ovde u Primerima.

[0323] U drugom vidu, date su ovde izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju antitela koja se specifično vezuju za hOX40L polipeptid (npr. ćelijski površinski-

2

eksprimirani ili rastvorljivi hOX40L), hOX40L polipeptidni fragment ili hOX40L epitop. U određenim otelotvorenjima, nukleinska kiselina kodira VH lanac, VL lanac, VH domen, VL domen, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 kako je obelodanjeno u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:30 ili Seq ID No:62 za VH lance; Seq ID No:32 ili Seq ID No:64 za VL lance; Seq ID No: Seq ID No:2, Seq ID No:34, Seq ID No:66 ili Seq ID No:94, posebno Seq ID No:34 za VH domene; Seq ID No:16, Seq ID No:48, Seq ID No:80, ili Seq ID No:108, posebno Seq ID No:48 za VL domene; Seq ID No:4, Seq ID No:10, Seq ID No:36, Seq ID No:42, Seq ID No:68, Seq ID No:74, Seq ID No:96 ili Seq ID No:102, posebno, Seq ID No:36 ili Seq ID No:42 za HCDR1; Seq ID No:6, Seq ID No:12, Seq ID No:38, Seq ID No:44, Seq ID No:70, Seq ID No:76, Seq ID No:98 ili Seq ID No:104, posebno Seq ID No:38 ili Seq ID No:44 za HCDR2; Seq ID No:8, Seq ID No:14, Seq ID No:40, Seq ID No:46, Seq ID No:72, Seq ID No:78, Seq ID No:100 ili Seq ID No:106, posebno Seq ID No:40 ili Seq ID No:46 za HCDR3; Seq ID No:18, Seq ID No:24, Seq ID No:50, Seq ID No:56, Seq ID No:82, Seq ID No:88, Seq ID No:110 ili Seq ID No:116, posebno Seq ID No:50 ili Seq ID No:56 za LCDR1; Seq ID No:20, Seq ID No:26, Seq ID No:52, Seq ID No:58, Seq ID No:84, Seq ID No:90, Seq ID No:112 ili Seq ID No:118, posebno Seq ID No:52 ili Seq ID No:58 za LCDR2; i Seq ID No:22, Seq ID No:28, Seq ID No:54, Seq ID No:60, Seq ID No:86, Seq ID No:92, Seq ID No:114 ili Seq ID No:120, posebno Seq ID No:54 ili Seq ID No:60 za LCDR3).

[0324] U drugom vidu, dati su ovde vektori i ćelije domaćina koje se sastoje od nukleinskih kiselina koje kodiraju antitela ili fragmente pronalaska.

[0325] U određenim otelotvorenjima, antitelo se specifično vezuje za jednu ili više varijanti hOX40L mononukleotidnog polimorfizma (SNP). U primeru bilo kog vida, hOX40L je trimer monomera.

[0326] U jednom vidu, ovde je opisana metoda za smanjenje (npr. za najmanje 20, 30, 4050 ili 60%, ili 70%, 80%, 90%, 95% ili >90%) ili potpuno inhibiranje vezivanja hOX40L za OX40 kod ispitanika (npr. humanog ispitanika), što obuhvata primenu ispitaniku efektivne količine antitela ili njegovog fragmenta u pronalasku, koji se specifično vezuje za hOX40L (npr. ćelijski površinski-eksprimirani ili rastvorljivi hOX40L).

[0327] U jednom vidu, ovde je opisana metoda tretiranja ili prevencije bolesti ili stanja posredovanog hOX40L-om kod ispitanika (npr. humanog ispitanika), metoda koja obuhvata primenu efektivne količine antitela ili njegovog fragmenta u pronalasku, koji se specifično vezuje za hOX40L (npr. površinski-eksprimirani ili rastvorljiv hOX40L na ćeliji), gde se bolest ili stanje tretira ili sprečava putem antitela ili fragmenta. U jednom primeru, metoda se sastoji od smanjenja ili inhibicije biološke aktivnosti hOX40L, kao što je sekrecija jednog, više ili svih IL-2, IL-8, TNF alfa i interferona gama, u ispitaniku. U jednom primeru, biološka aktivnost je izabrana iz sekrecije jednog, više ili svih IL-2, TNF alfa i interferona gama. U jednom primeru, biološka aktivnost je izabrana iz sekrecije jednog, više ili svih IL-8, CCL20 i RANTES.

[0328] U jednom vidu, opisana ovde je metoda smanjenja ili inhibicije biološke aktivnosti hOX40L, kao što je sekrecija jednog, više ili svih IL-2, IL-8, TNF alfa i interferona gama, kod ispitanika (npr. kod humanog ispitanika), metoda koja obuhvata primenu efektivne količine antitela ili njegovog fragmenta u pronalasku, koji se specifično vezuje za hOX40L (npr. ćelijski površinski-eksprimirani ili rastvorljivi hOX40L), gde je biološka aktivnost hOX40L smanjena putem antitela ili njegovog fragmenta. U jednom primeru, biološka aktivnost je izabrana iz grupe koju čine sekrecija jednog, više ili svih IL-2, TNF alfa i interferona gama. U jednom primeru, biološka aktivnost je izabrana iz sekrecije jednog, više ili svih IL-8, CCL20 i RANTES.

[0329] Izrazi "oko" ili "približno" označava unutar 20%, poželjno unutar 10%, a poželjnije unutar 5% (ili 4%, ili 3% ili 2%, ili, na primer, 1% ili manje) date vrednosti ili raspona.

[0330] Kao što se ovde koristi, "primeniti" ili "primena" odnosi se na čin injektiranja ili na drugi način fizičkog dopremanja supstance koja postoji van tela (npr., anti-HOX40L antitelo koje je ovde dato) u pacijenta, kao što je putem sluzokože, intradermalnog, intravenskog, intramuskularnog dopremanja i/ili bilo kog drugog načina fizičkog dopremanja opisanog ovde ili poznatog u struci. Kada se bolest, ili njen simptom, tretira, primena supstance se obično javlja nakon početka bolesti ili

4

njenih simptoma. Kada se bolest ili njeni simptomi preveniraju, primena supstance obično nastupa pre početka bolesti ili njenih simptoma.

[0331] Da bi se utvrdio procentualna identičnost dve aminokiselinske sekvence ili dve sekvence nukleinske kiseline, sekvence se poravnaju radi optimalnog poređenja (npr. praznine se mogu uvesti u sekvencu prve aminokiseline ili sekvencu nukleinske kiseline radi optimalnog poravnanja sa drugom sekvencom aminokiseline ili nukleinske kiseline). Zatim se upoređuju aminokiselinski ostaci ili nukleotidi na odgovarajućim pozicijama aminokiselina ili pozicijama nukleotida. Kada je pozicija u prvoj sekvenci zauzeta istim aminokiselinskim ostatkom ili nukleotidom kao odgovarajuća pozicija u drugoj sekvenci, onda su molekuli identični na toj poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence (tj. % identičnosti = broj identičnih preklapajućih pozicija/ukupan broj pozicijax100%). U jednom otelotvorenju, dve sekvence su iste dužine.

[0332] Određivanje procentualne identičnosti između dve sekvence (npr. sekvence aminokiselina ili sekvence nukleinskih kiselina) takođe se može postići korišćenjem matematičkog algoritma. Poželjni, neograničavajući primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje dve sekvence je algoritam Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.87:2264 2268, modifikovano kao u Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90:5873 5877. Takav algoritam je ugrađen u NBLAST i XBLAST programe Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol.215:403. BLAST pretrage nukleotida se mogu izvršiti sa setom parametara nukleotidnog programa NBLAST, npr., za skor=100, dužina reči =12 da bi se dobile nukleotidne sekvence homologne molekulima nukleinske kiseline opisanim ovde. BLAST pretrage proteina se mogu izvršiti sa postavljenim parametrima XBLAST programa, npr., za skor 50, dužina teksta =3 da bi se dobile sekvence aminokiselina homologne ovde opisanom molekulu proteina. Da bi se dobila praznina poravnanja za potrebe poređenja, može se koristiti Gapped BLAST kao što je opisano u Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402. Alternativno, PSI BLAST se može koristiti za obavljanje iterirane pretrage koja detektuje udaljene relacije između molekula (Id.). Kada se koriste BLAST, Gapped BLAST i PSI Blast programi, mogu se koristiti podrazumevani parametri odgovarajućih programa (npr. XBLAST i NBLAST) (pogledajte npr.

National Center for Biotechnology Information (NCBI) na svetskoj mreži, ncbi.nlm.nih.gov). Drugi poželjni, neograničavajući primer matematičkog algoritma koji se koristi za poređenje sekvenci je algoritam Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Takav algoritam je ugrađen u program ALIGN (verzija 2.0) koji je deo softverskog paketa za poravnanje GCG sekvenci. Kada se koristi program ALIGN za poređenje sekvenci aminokiselina, može se koristiti tabela PAM120 težinskih reziduma, kazna za dužinu praznine od 12, i kazna za praznine od 4.

[0333] Procentualna identičnost između dve sekvence može se utvrditi korišćenjem tehnika sličnih gore opisanim, sa ili bez dozvoljenih praznina. U izračunavanju procentualne identičnosti, obično se računaju samo tačna poklapanja.

[0334] Kao što se ovde koristi, "antagonist" ili "inhibitor" hOX40L odnosi se na ligand (npr. antitelo ili fragment) koji je sposoban da inhibira ili na drugi način smanji jednu ili više bioloških aktivnosti hOX40L, kao što je u ćeliji koja eksprimira hOX40L ili u ćeliji koja eksprimira hOX40L ligand. Na primer, u određenim otelotvorenjima, antitela pronalaska su antagonistička antitela koja inhibiraju ili na drugi način smanjuju sekreciju CCL20, IL-8 i/ili RANTES iz ćelije koja ima površinski eksprimiran OX40 kada pomenuto antitelo kontaktira sa navedenom ćelijom. U nekim otelotvorenjima, antagonist hOX40L (npr. antagonističko antitelo pronalaska) može, na primer, delovati tako što inhibira ili na drugi način smanjuje aktivacione i/ili signalne puteve ćelije koja eksprimira OX40L, čime inhibira biološku aktivnost ćelije posredovanu hOX40L-om u odnosu na biološku aktivnost posredovanu hOX40L-om u odsustvu antagonista. U određenim otelotvorenjima, ovde navedena antitela su potpuno humana, antagonistička anti-hOX40L antitela, poželjno potpuno humana, monoklonska, antagonistička anti-hOX40L antitela.

[0335] Izraz "antitelo" i "imunoglobulin" ili "Ig" mogu se koristiti naizmenično u ovom dokumentu. Antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za hOX40L antigen može biti unakrsno reaktivan sa srodnim antigenima. Poželjno, antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za hOX40L antigen ne reaguje unakrsno sa drugim antigenima (ali može opciono unakrsno reagovati sa OX40L različitih vrsta, npr. rezus ili mišji). Antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za antigen hOX40L može se identifikovati, na primer, imunološkim testovima, BIAcore<™>ili drugim tehnikama poznatim stručnjacima. Antitelo ili njegov fragment se vezuje specifično za hOX40L antigen kada se vezuje za hOX40L antigen sa većim afinitetom od bilo kog unakrsno reaktivnog antigena kako je utvrđeno eksperimentalnim tehnikama, kao što su radioimunološki testovi (RIA) i enzimski imunosorbentni testovi (ELISA). Obično će specifična ili selektivna reakcija biti najmanje dva puta pozadinski signal ili šum i obično više od 10 puta pozadinski. Vidi, npr., Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York na stranicama 332-336 za diskusiju o specifičnosti antitela.

[0336] Antitela pronalaska uključuju, ali nisu ograničena na, sintetička antitela, monoklonska antitela, rekombinantno proizvedena antitela, multispecifična antitela (uključujući bi-specifična antitela), humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, intratela, jednolančana Fvs (scFv) (npr. uključujući monospecifična, bispecifična itd.), kamelizovana antitela, fragmente Fab, fragmente F(ab'), disulfidlinkovana Fvs (sdFv), anti-idiotipska antitela (anti-Id) i fragmente bilo čega od gore navedenog, koji vezuju epitop. Konkretno, antitela ovog pronalaska uključuju molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, tj. domene ili molekule koji vezuju antigen, i koji sadrže antigen-vezujuće mesto za vezivanje antigena, koje se specifično vezuje za antigen hOX40L (npr. jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) anti-hOX40L antitela). Antitela pronalaska mogu biti bilo kog tipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), bilo koje klase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2, posebno IgG4), ili bilo koje potklase (npr. IgG2a i IgG2b) molekula imunoglobulina. U poželjnim otelotvorenjima, hOX40L antitela su potpuno humana, kao što su potpuno humana monoklonska hOX40L antitela. U određenim otelotvorenjima, antitela pronalaska su IgG antitela, ili njegove klase (npr. humani IgG1 ili IgG4) ili potklase. U određenim otelotvorenjima, antitela pronalaska sadrže konstantni region humanog gama 4. U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca ne vezuje Fc-y receptore, i npr. obuhvata mutaciju Leu235Glu. U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca obuhvata mutaciju Ser228Pro kako bi se povećala stabilnost. U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca je IgG4-PE.

[0337] Izraz "domen vezivanja antigena", "region vezivanja antigena", "fragment vezivanja antigena" i slični izrazi odnose se na onaj deo antitela koji obuhvata rezidume aminokiselina koji su u interakciji sa antigenom i daju vezivu njegovu specifičnost i afinitet prema antigenu (npr. regioni koji određuju komplementarnost (CDR)). Region vezivanja antigena može biti izveden iz bilo koje životinjske vrste, kao što su glodari (npr. zec, pacov ili hrčak) i ljudi. Poželjno, region vezivanja antigena će biti humanog porekla.

[0338] Kao što se ovde koristi, izraz "sastav" je namenjen da obuhvati proizvod koji sadrži navedene sastojke (npr. antitelo pronalaska) u, opciono, navedenim količinama, kao i bilo koji proizvod koji proizlazi, direktno ili indirektno, iz kombinacije navedenih sastojaka u, opciono, navedenim količinama.

[0339] U kontekstu polipeptida, izraz "derivat" koji se ovde koristi odnosi se na polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu hOX40L polipeptida, fragmenta hOX40L polipeptida ili antitela koje se specifično vezuje za hOX40L polipeptid koji je izmenjen uvođenjem supstitucija, delecija ili adicija aminokiselinskog reziduma. Izraz "derivat" koji se ovde koristi takođe se odnosi na hOX40L polipeptid, fragment hOX40L polipeptida, ili antitelo koje se specifično vezuje za hOX40L polipeptid koji je hemijski modifikovan, npr. kovalentnim vezivanjem bilo koje vrste molekula za polipeptid. Na primer, ali ne putem ograničenja, hOX40L polipeptid, fragment hOX40L polipeptida ili hOX40L antitelo mogu biti hemijski modifikovani, npr. glikozilacijom, acetilacijom, pegilacijom, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim cepanjem, povezivanjem sa ćelijskim ligandom ili drugim proteinima, itd. Derivati su modifikovani na način koji se razlikuje od prirodno prisutnog ili početnog peptida ili polipeptida, bilo po tipu ili lokaciji privezanih molekula. Derivati dalje uključuju deleciju jedne ili više hemijskih grupa koje su prirodno prisutne na peptidu ili polipeptidu. Derivat hOX40L polipeptida, fragment hOX40L polipeptida ili hOX40L antitelo može biti hemijski modifikovan hemijskim modifikacijama koristeći tehnike poznate stručnjacima, uključujući, ali ne ograničavajući se na specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formulaciju, metaboličku sintezu tunikamicina, itd. Dalje, derivat hOX40L polipeptida, fragment hOX40L polipeptida ili hOX40L antitelo može da sadrži jednu ili više neklasičnih aminokiselina. Polipeptidni derivat poseduje sličnu ili identičnu funkciju kao polipeptid hOX40L, fragment polipeptida hOX40L ili ovde opisano antitelo hOX40L.

[0340] Izraz "efikasna količina" kako se koristi ovde, odnosi se na količinu terapije (npr. antitela ili farmaceutskog sastava predviđenog ovde) koja je dovoljna da smanji i/ili ublaži težinu i/ili trajanje date bolesti i/ili simptoma u vezi sa njom. Ovaj izraz takođe obuhvata količinu neophodnu za smanjenje ili poboljšanje napretka ili progresije date bolesti, smanjenje ili poboljšanje recidiva, razvoja ili početka date bolesti i/ili za poboljšanje ili unapređenje profilaktičkog ili terapeutskog efekta(ata) druge terapije (npr. terapije različite od anti-HOX40L antitela koja je ovde data). U nekim otelotvorenjima, efikasna količina antitela pronalaska je od oko 0,1 mg/kg (mg antitela po kg težine ispitanika) do oko 100 mg/kg. U nekim otelotvorenjima, efikasna količina antitela koja se u njoj nalazi je oko 0,1 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 30 mg/kg, oko 35 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 45 mg/kg, oko 50 mg/kg, oko 60 mg/kg, oko 70 mg/kg, oko 80 mg/kg, oko 90 mg/kg ili oko 100 mg/kg (ili raspon u njima). U nekim otelotvorenjima, "efikasna količina" koja se ovde koristi takođe se odnosi na količinu antitela pronalaska da bi se postigao određeni rezultat (npr. inhibicija hOX40L biološke aktivnosti ćelije, kao što je inhibicija sekrecije CCL20, IL-8 ili RANTES, ili INF-γ, TNF-α ili IL-2, posebno INF-γ iz ćelije).

[0341] Izraz "epitop" koji se ovde koristi odnosi se na lokalizovani region na površini antigena, kao što je hOX40L polipeptid ili hOX40L polipeptidni fragment, koji je sposoban da se veže za jedan ili više antigen vezujućih regiona antitela, i koji ima antigensku ili imunogenu aktivnost kod životinje, poželjno sisara, a najpoželjnije kod čoveka, koja je sposobna da izazove imunološki odgovor. Epitop koji ima imunogenu aktivnost je deo polipeptida koji izaziva reakciju antitela kod životinje. Epitop sa antigenskom aktivnošću je deo polipeptida za koji se antitelo specifično vezuje kako je utvrđeno bilo kojom metodom koja je dobro poznata u struci, na primer, imunološkim testovima opisanim u ovom dokumentu. Antigenski epitopi ne moraju nužno biti imunogeni. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupisanja molekula kao što su aminokiseline ili šećerni bočni lanci i imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Region polipeptida koji doprinosi epitopu može biti susedne aminokiseline polipeptida ili se epitop može spojiti iz dva ili više ne-susedna regiona polipeptida. Epitop može ili ne mora biti trodimenzionalna površinska karakteristika antigena. U određenim otelotvorenjima, hOX40L epitop je trodimenzionalna površinska karakteristika hOX40L polipeptida (npr. u trimernom obliku hOX40L polipeptida). U drugim otelotvorenjima, hOX40L epitop je linearna karakteristika hOX40L polipeptida (npr. u trimernom ili monomernom obliku hOX40L polipeptida). Ovde navedena antitela mogu se posebno vezati za epitop monomernog (denaturisanog) oblika hOX40L, epitop trimernog (nativnog) oblika hOX40L, ili i monomernog (denaturiranog) oblika i trimernog (nativnog) oblika hOX40L. U specifičnim otelotvorenjima, ovde navedena antitela se specifično vezuju za epitop trimernog oblika hOX40L, ali se specifično ne vezuju za monomerni oblik hOX40L.

[0342] Izraz "ekscipijens" (inertni punilac) koji se ovde koristi odnosi se na inertne supstance koje se obično koriste kao razblaživač, nosač, konzervansi, veziva ili stabilizatorska sredstva za lekove i uključuje, ali nije ograničen na, proteine (npr. serumski albumin, itd.), aminokiseline (npr. aspartinska kiselina, glutaminska kiselina, lizin, arginin, glicin, histidin, itd.), masne kiseline i fosfolipide (npr. alkil sulfonati, kaprilat, itd.), površinski aktivne supstance (npr. SDS, polisorbat, nejonski surfaktant, itd.), saharide (npr. saharoza, maltoza, trehaloza, itd.) i poliole (npr. manitol, sorbitol, itd.). Vidi, takođe, Remington 's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa.

[0343] U kontekstu peptida ili polipeptida, izraz "fragment" koji se ovde koristi odnosi se na peptid ili polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence manje od pune dužine. Takav fragment može nastati, na primer, od skraćivanja na aminokiselinskom terminusu, skraćivanja na karboksi terminusu i/ili unutrašnje delecije reziduma iz aminokiselinske sekvence. Fragmenti mogu, na primer, biti rezultat alternativnog spajanja RNK ili aktivnosti proteaze in vivo. U određenim otelotvorenjima, fragmenti hOX40L uključuju polipeptide koji sadrže aminokiselinsku sekvencu od najmanje 5 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 10 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 15 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 20 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 25 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 40 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 50 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 60 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 70 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 80 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 90 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 100 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 125 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 150 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 175 susednih aminokiselinskih ostataka, najmanje 200 susednih aminokiselinskih ostataka, ili najmanje 250 susednih aminokiselinskih ostataka, aminokiselinske sekvence hOX40L polipeptida ili antitela koje se specifično vezuje za hOX40 polipeptid. U određenom otelotvorenju, fragment polipeptida hOX40L ili antitela koji se specifično vezuje za hOX40L antigen zadržava najmanje 1, najmanje 2 ili najmanje 3 funkcije polipeptida ili antitela.

[0344] Izrazi "potpuno humano antitelo" ili "humano antitelo" koriste se ovde naizmenično i odnose se na antitelo koje se sastoji od humanog varijabilnog regiona i, najpoželjnije, humanog konstantnog regiona. U specifičnim otelotvorenjima, izrazi se odnose na antitelo koje se sastoji od varijabilnog regiona i konstantnog regiona humanog porekla. "Potpuno humana" anti-hOX40L antitela, u određenim otelotvorenjima, takođe mogu da obuhvate antitela koja vezuju hOX40L polipeptide i kodirana su sekvencama nukleinskih kiselina koje se prirodno javljaju u somatskim varijantama sekvence nukleinskih kiselina imunoglobulina humane nasledne linije. U određenom otelotvorenju, anti-hOX40L antitela koja su ovde data su potpuno humana antitela. Izraz "potpuno humano antitelo" uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione koji odgovaraju sekvencama imunoglobulina humane nasledne linije, kao što je opisano u Kabat et al. (Vidi Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242). Naveden je primer metoda produkcije potpuno humanih antitela, npr., ovde u odeljku Primeri, ali se može koristiti bilo koja metoda poznata u struci.

[0345] Fraza "rekombinantno humano antitelo" uključuje humana antitela koja su pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana rekombinantnim sredstvima, kao što su antitela eksprimirana korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćina, antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela, antitela izolovana iz životinje (npr. miša ili krave) koja su transgenska i/ili transhromozomska za gene humanog imunoglobulina (videti npr. Taylor, D. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res.20:6287-6295) ili antitela preparirana, eksprimirana, kreirana ili izolovana bilo kojim drugim sredstvima koja uključuju spajanje sekvenci gena humanog imunoglobulina sa drugim DNK

1

sekvencama. Takva rekombinantna humana antitela mogu imati varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci imunoglobulina humane nasledne linije (Vidi Kabat, E. A. Et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.

91-3242). Međutim, u određenim otelotvorenjima, takva rekombinantna humana antitela podvrgnuta su in vitro mutagenezi (ili, kada je korišćena životinja transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatska mutageneza), a time i aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako izvedene iz i povezane sa sekvencama VH i VL humane nasledne linije, ne moraju postojati prirodno u okviru repertoara antitela humane nasledne linije in vivo.

[0346] Izraz "fuzioni protein" kako se ovde koristi odnosi se na polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu antitela i aminokiselinsku sekvencu heterolognog polipeptida ili proteina (tj. polipeptid ili protein koji obično nije deo antitela (npr. ne-anti-hOX40L antigen antitelo)). Izraz „fuzija“ kada se koristi u vezi sa hOX40L ili anti-hOX40L antitelima odnosi se na spajanje peptida ili polipeptida, ili njegovog fragmenta, varijante i/ili derivata, sa heterolognim peptidom ili polipeptidom. Poželjno, fuzioni protein zadržava biološku aktivnost hOX40L ili anti-HOX40L antitela. U određenim otelotvorenjima, fuzioni protein obuhvata VH domen hOX40L antitela, VLdomen, VH CDR (jedan, dva ili tri VH CDR) i/ili VL CDR (jedan, dva ili tri VL CDR), gde se fuzioni protein specifično vezuje za epitop hOX40L.

[0347] Izrazn "teški lanac" kada se koristi u vezi sa antitelima odnosi se na pet različitih tipova, koji se nazivaju alfa (α), delta (δ), epsilon (ε), gama (γ) i mi (µ), na bazi aminokiselinske sekvence konstantnog domena teškog lanca. Ovi različiti tipovi teških lanaca su dobro poznati i dovode do pet klasa antitela, IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, uključujući četiri podklase IgG, i to IgG1, IgG1, IgG3 i IgG4. Poželjno, teški lanac je humani teški lanac. U jednom primeru, teški lanac je izotip onesposobljenog IgG, npr. onesposobljen IgG4. U određenim otelotvorenjima, antitela pronalaska sadrže konstantni region humanog gama 4. U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca ne vezuje Fc-y receptore, i npr. obuhvata mutaciju Leu235Glu. U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca obuhvata mutaciju Ser228Pro kako bi se povećala stabilnost. U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca je IgG4-PE.

2

[0348] Izraz "domaćin" koji se ovde koristi odnosi se na životinju, poželjno sisara, i najpoželjnije, čoveka.

[0349] Izraz "ćelija domaćin" kako se ovde koristi odnosi se na određenu ćeliju ispitanika transfektovanu molekulom nukleinske kiseline i potomstvo ili potencijalno potomstvo takve ćelije. Potomstvo takve ćelije ne može biti identično matičnoj ćeliji transfektovanoj sa molekulom nukleinske kiseline zbog mutacija ili uticaja okoline koji se mogu javiti u narednim generacijama ili integraciji molekula nukleinske kiseline u genom ćelije domaćina.

[0350] Izraz "imunomodulatorni agens" i njegove varijacije, uključujući, ali ne ograničavajući se na, imunomodulatorne agense, kako se ovde koristi, odnose se na agens koji modulira imuni sistem domaćina. U određenim otelotvorenjima, imunomodulatorni agens je imunosupresivni agens. U određenim drugim otelotvorenjima, imunomodulatorni agens je imunostimulatorni agens.

Imunomodulatorni agens koji se koristi u kombinovanim terapijama ne sme da sadrži anti-hOX40L antitelo ili fragment koji vezuje antigen. Imunomodulatorni agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, male molekule, peptide, polipeptide, proteine, fuzione proteine, antitela, neorganske molekule, mimetičke agense i organske molekule.

[0351] Kao što se ovde koristi, izraz „u kombinaciji“ u kontekstu primene drugih terapija odnosi se na upotrebu više od jedne terapije. Upotreba izraza „u kombinaciji“ ne ograničava redosled primene terapija kod ispitanika sa infekcijom. Prva terapija se može primeniti pre (npr.1 minut, 45 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 sat, 2 sata, 4 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata, 96 sati, 1 nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 8 nedelja ili 12 nedelja), istovremeno ili nakon (npr.1 minut, 45 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 sat, 2 sata, 4 sata, 6 sati, 12 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata, 96 sati, 1 nedelja, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 8 nedelja ili 12 nedelja) primene druge terapije ispitaniku koji je imao, ima ili je podložan bolesti posredovanoj hOX40L-om. Svaka dodatna terapija može se primeniti u bilo kom redosledu sa ostalim dodatnim terapijama. U određenim otelotvorenjima, antitela pronalaska mogu se primeniti u kombinaciji sa jednom ili više terapija (npr. terapije koje nisu antitela pronalaska koja se trenutno primenjuju za sprečavanje, tretiranje, upravljanje i/ili poboljšanje bolesti posredovane hOX40L-om. Neograničavajući primeri terapija koje se mogu primeniti u kombinaciji sa antitelima pronalaska uključuju analgetska sredstva, anestetike, antibiotike ili imunomodulatorna sredstva ili bilo koje drugo sredstvo navedeno u the U.S.

Pharmacopoeia and/or Physician's Desk Reference.

[0352] "Izolovano" ili "prečišćeno" antitelo je, na primer, u znatnoj meri bez ćelijskog materijala ili drugih kontaminantnih proteina iz ćelijskog ili tkivnog izvora iz koga je antitelo izvedeno, ili u znatnoj meri bez hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada je hemijski sintetisano. Izraz „u znatnoj meri bez ćelijskog materijala“ uključuje preparate antitela u kojima je antitelo odvojeno od ćelijskih komponenti ćelija iz kojih je izolovano ili rekombinantno proizvedeno. Dakle, antitelo koje je u suštini bez ćelijskog materijala uključuje preparate antitela koji imaju manje od oko 30%, 20%, 10% ili 5% (suve težine) heterolognog proteina (koji se ovde naziva i „kontaminantni protein“). Kada je antitelo rekombinantno proizvedeno, poželjno je i znatno bez hranljive podloga, tj. hranljiva podloga predstavlja manje od oko 20%, 10%, ili 5% zapremine proteinskog preparata. Kada je antitelo proizvodeno hemijskom sintezom, ono je poželjno u znatnoj meri bez hemijskih prekursora ili drugih hemikalija, tj. separisano je od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija koje učestvuju u sintezi proteina. Shodno tome, takvi preparati antitela imaju manje od oko 30%, 20%, 10%, 5% (suve težine) hemijskih prekursora ili jedinjenja koja nisu antitela od interesa. U poželjnom otelotvorenju, antitela pronalaska su izolovana ili prečišćena.

[0353] "Izolovani" molekul nukleinske kiseline je onaj koji je odvojen od drugih molekula nukleinske kiseline koji su prisutni u prirodnom izvoru molekula nukleinske kiseline. Štaviše, "izolovani" molekul nukleinske kiseline, kao što je molekul cDNK, može biti u znatnoj meri bez drugog ćelijskog materijala, ili hranljive podloge kada je proizveden rekombinantnim tehnikama, ili u znatnoj meri bez hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada je hemijski sintetisan. U određenom otelotvorenju, molekul(i) nukleinske kiseline koji kodiraju antitelo pronalaska je izolovan ili prečišćen.

[0354] Izraz "humani OX40L", "hOX40L" ili "hOX40L polipeptid" i slični izrazi se odnose na polipeptide ("polipeptidi", "peptidi" i "proteini" se ovde koriste

4

naizmenično) koji obuhvataju aminokiselinsku sekvencu u spisku sekvenci i srodne polipeptide, uključujući njihove SNP varijante. Srodni polipeptidi uključuju alelne varijante (npr. SNP varijante); splajs varijante; fragmente; derivate; varijante supstitucije, delecije i insercije; fuzione polipeptide; i homologe međuvrsta, poželjno, koji zadržavaju aktivnost hOX40L i/ili su dovoljni za generisanje anti-hOX40L imunog odgovora. Obuhvaćene su i rastvorljive forme hOX40L koje su dovoljne za generisanje anti-hOX40L imunološkog odgovora. Kao što će stručnjaci ceniti, antihOX40L antitelo pronalaska može se vezati za hOX40L polipeptid, polipeptidni fragment, antigen i/ili epitop, jer je epitop deo većeg antigena, koji je deo većeg polipeptidnog fragmenta, koji pak, kao deo većeg polipeptidnog hOX40L može postojati u trimernom (nativnom) ili monomernom (denaturisanom) obliku.

[0355] Izrazi "Kabat numerisanje" i slični izrazi prepoznati su u struci i odnose se na sistem numerisanja aminokiselinskih ostataka koji su varijabilniji (tj. hipervarijabilni) od ostalih aminokiselinskih ostataka u varijabilnim regionima teškog lanca antitela, ili njihov antigen-vezujući deo (Kabat et al. (1971) En. NY Acad. Sci.190:382-391 i Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242). Za varijabilni region teških lanaca, hipervarijabilni region se obično kreće od pozicija aminokiselina 31 do 35 za CDR1, pozicija aminokiselina 50 do 65 za CDR2 i pozicija aminokiselina 95 do 102 za CDR3.

[0356] Izraz "monoklonsko antitelo" se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije homogenih ili suštinski homogenih antitela, i svako monoklonsko antitelo će obično prepoznati jedan epitop na antigenu. U poželjnim otelotvorenjima, „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, je antitelo proizvedeno od jednog hibridoma ili druge ćelije, gde se antitelo specifično vezuje samo za hOX40L epitop kako je određeno, npr. pomoću ELISA ili drugim antigen-vezujućim ili konkurentno-vezujućim testom koji je poznat u struci ili u primerima navedenim ovde. Izraz "monoklonski" nije ograničen na bilo koji poseban metod za stvaranje antitela. Na primer, monoklonska antitela mogu biti napravljena metodom hibridoma kako je opisano u Kohler et al.; Nature, 256:495 (1975) ili može biti izolovan iz biblioteka faga koristeći tehnike opisane ovde, na primer. Druge metode za preparaciju klonskih ćelijskih linija i monoklonskih antitela eksprimiranih u njima su dobro poznate u struci (videti, na primer, Poglavlje 11 u: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York). Druge primerne metode proizvodnje drugih monoklonskih antitela dati su u Primerima ovde.

[0357] Izraz „prirodno prisutan“ ili „nativni“ kada se koristi u vezi sa biološkim materijalima kao što su molekuli nukleinske kiseline, polipeptidi, ćelije domaćina i slično, odnosi se na one koje se nalaze u prirodi i kojima ljudsko biće ne manipuliše.

[0358] Izraz "farmaceutski prihvatljivo" koji se ovde koristi znači da ga odobrava regulatorna agencija Savezne ili državne uprave, ili je naveden u Američkoj farmakopeji, Evropskoj farmakopeji ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu kod životinja, a posebno kod ljudi.

[0359] "Poliklonska antitela", kako se ovde koriste, odnose se na populaciju antitela generisanu imunogenim odgovorom na protein koji ima mnogo epitopa i stoga uključuje varijetet različitih antitela usmerenih na isti i na različite epitope unutar proteina. Metode za proizvodnju poliklonskih antitela su poznate u struci (Vidi, na primer, Poglavlje 11 u: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York).

[0360] Kao što se ovde koristi, izraz "polinukleotid", "nukleotid", "nukleinska kiselina", "molekul nukleinske kiseline" i drugi slični izrazi se koriste alternativno i uključuju DNK, RNK, mRNK i slično.

[0361] Kao što se ovde koristi, izrazi „sprečava“, „sprečavanje“ i „prevencija“ odnose se na potpunu ili delimičnu inhibiciju razvoja, recidiva, početka ili širenja bolesti posredovane hOX40L-om i/ili simptoma u vezi sa tim, koji je rezultat primene terapije ili kombinacije terapija predviđenih u ovom dokumentu (npr. kombinacija profilaktičkih ili terapijskih sredstava, kao što je antitelo pronalaska).

[0362] Kao što se ovde koristi, izraz "profilaktičko sredstvo" odnosi se na bilo koje sredstvo koje može u potpunosti ili delimično inhibirati razvoj, recidiv, početak ili širenje bolesti posredovane hOX40L-om i/ili simptoma u vezi sa tim kod ispitanika. U određenim otelotvorenjima, izraz "profilaktičko sredstvo" se odnosi na antitelo pronalaska. U određenim drugim otelotvorenjima, izraz "profilaktičko sredstvo" se odnosi na sredstvo koje je različito od antitela pronalaska. Poželjno, profilaktičko sredstvo je agens za koji se zna da je upotrebiv ili je bio ili se trenutno koristi za sprečavanje bolesti posredovane hOX40L-om i/ili simptoma u vezi sa tim ili da ometa početak, razvoj, progresiju i/ili težinu bolesti posredovane hOX40L-om i/ili simptoma u vezi sa tim. U specifičnim otelotvorenjima, profilaktičko sredstvo je potpuno humano anti-hOX40L antitelo, kao što je potpuno humano anti-hOX40L monoklonsko antitelo.

[0363] U jednom otelotvorenju, profilaksa sprečava nastanak bolesti ili stanja ili simptoma bolesti ili stanja. U jednom otelotvorenju, profilaktički tretman sprečava pogoršanje, ili nastanak bolesti ili stanja. U jednom otelotvorenju, profilaktički tretman sprečava pogoršanje bolesti ili stanja.

[0364] U drugom otelotvorenju, anti-OX40L antitelo pronalaska se daje intravenski (npr. pre ili istovremeno sa transplantacijom, npr. transplantacijom krvi ili organa). U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se primenjuje u dozi od oko 5-10 mg/kg (npr. u dozi od oko 8 mg/kg). U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se daje u dozi od oko 0,1 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 30 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 50 mg/kg, oko 60 mg/kg, oko 70 mg/kg, oko 80 mg/kg, oko 90 mg/kg ili oko 100 mg/kg, posebno oko 1 mg/kg, ili oko 3 mg/kg.

[0365] U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se daje 1-4 dana pre transplantacije (npr. krvi ili organa), npr.1-3 dana pre transplantacije ili 1-2 dana pre transplantacije. U drugom otelotvorenju, pomenuto antitelo se primenjuje nedeljno, dvonedeljno ili mesečno nakon transplantacije, npr. dvonedeljno. U daljem otelotvorenju, pomenuto antitelo se daje intravenski profilaktički 1-3 dana pre transplantacije u dozi od oko 5-10 mg/kg (npr. oko 8 mg/kg), a zatim intravenski, dvonedeljno u dozi od oko 5-10 mg/kg (npr. oko 8 mg/kg).

[0366] U drugom otelotvorenju, pacijent se periodično prati nakon transplantacije, na prisustvo biomarkera koji je prediktivan za odbacivanje transplantacije ili GvHD (npr. akutni GvHD), a anti-OX40L antitelo pronalaska se primenjuje kada su nivoi biomarkera takvi da je utvrđeno da je pacijent u riiziku od razvoja odbacivanja transplantacije ili GvHD (npr. akutni GvHD). Ova strategija bi izbegla nepotrebno doziranje leka i nepotrebnu supresiju imunog sistema. Primeri biomarkera koji mogu biti korisni kao prediktivni biomarkeri akutnog GvHD mogu biti oni identifikovani u Levine et al., "A prognostic score for acute graft-versus-host disease based on biomarkers: a multicentre study", Lancet Haematol 2015; 2:e21-29. Ovi biomarkeri uključuju, ali nisu ograničeni na TNFR1, ST-2, elafin i IL2Rα i Reg3α.

[0367] Region hOX40L koji doprinosi epitopu može biti susedne aminokiseline polipeptida ili se epitop može spojiti iz dva ili više nesusednih regiona polipeptida. Epitop može ili ne mora biti trodimenzionalna površinska karakteristika antigena. Lokalizovani region na površini hOX40L antigena koji je sposoban da izazove imunološki odgovor je hOX40L epitop. Epitop može ili ne mora biti trodimenzionalna površinska karakteristika antigena.

[0368] "Bolest posredovana hOX40L-om" i "stanje posredovano hOX40L-om" koriste se naizmenično i odnose se na bilo koju bolest ili stanje koje je u potpunosti ili delimično uzrokovano ili je rezultat hOX40L. U određenim otelotvorenjima, hOX40L je nenormalno (npr. visoko) eksprimiran na površini ćelije. U nekim otelotvorenjima, hOX40L može biti nenormalno regulisan naviše na određenom tipu ćelije. U drugim otelotvorenjima, normalna, aberantna ili preterana ćelijska signalizacija je uzrokovana vezivanjem hOX40L za hOX40L ligand. U nekim otelotvorenjima, hOX40L ligand je OX40, na primer, koji je eksprimiran na površini ćelije, kao što je epitelna ćelija debelog creva. Bolest posredovana hOX40L-om može biti zapaljenska bolest creva (IBD), kao što je Kronova bolest (CD) ili ulcerozni kolitis (UC). U drugim otelotvorenjima, bolest posredovana hOX40L-om je bolest 'kalem-protiv-domaćina' (GVHD). Bolest posredovana hOX40L-om može biti izabrana iz grupe koju čine pioderma gangrenosum, gigantocelularni arteritis, Šniclerov sindrom, neinfektivni skleritis i uveitis (neinfektivni/autoimuni i/ili sistemski). Bolest posredovana hOX40L-om ili stanje može biti izabrana iz grupe koju čine autoimuna bolest ili stanje, sistemska zapaljenska bolest ili stanje, ili odbacivanja transplant/domaćin; na primer, zapaljenska bolest creva (IBD), Kronova bolest, reumatoidni artritis, odbacivanje transplantacije, odbacivanje alogene transplantacije, bolest 'kalem-protiv-domaćina' (GvHD), ulcerozni kolitis, sistemski eritematozni lupus (SLE), dijabetes, uveitis, ankilozantni spondilitis, kontaktna preosetljivost, multipla skleroza ili ateroskleroza, posebno GvHD.

[0369] Izrazi "hOX40L receptor" ili "hOX40L vezujući receptor" se ovde koriste naizmenično i odnose se na receptorski polipeptid koji se vezuje za hOX40L. U specifičnim otelotvorenjima, hOX40L receptor je Hox40. U nekim otelotvorenjima, hOX40L receptor je eksprimiran na površini ćelije, kao što je epitelna ćelija debelog creva; ili na tkivu kalema ili transplantacije ili na tkivu domaćina.

[0370] Kao što se ovde koristi, izrazi "ispitanik" i "pacijent" se koriste naizmenično. Kao što se ovde koristi, ispitanik je poželjno sisar, kao što je ne-primat (npr. krave, svinje, konji, mačke, psi, pacovi itd.) ili primat (npr. majmun i čovek), najpoželjnije čovek. U jednom otelotvorenju, ispitanik je sisar, poželjno čovek, sa hOX40L posredovanom bolešću. U drugom otelotvorenju, ispitanik je sisar, poželjno čovek, sa rizikom od razvoja bolesti posredovane hOX40L-om.

[0371] Kao što se ovde koristi "suštinski sve" odnosi se na najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili oko 100%.

[0372] Izraz „znatno bez surfaktanta“ kako se ovde koristi odnosi se na formulaciju antitela koja se specifično vezuje za hOX40L antigen, navedenu formulaciju koja sadrži manje od 0,0005%, manje od 0,0003% ili manje od 0,0001% surfaktanata i/ili manje od 0,0005%, manje od 0,0003% ili manje od 0,0001% surfaktanata.

[0373] Izraz "znatno bez soli" kako se ovde koristi odnosi se na formulaciju antitela koja se specifično vezuje za hOX40L antigen, navedenu formulaciju koja sadrži manje od 0,0005%, manje od 0,0003% ili manje od 0,0001% neorganskih soli.

[0374] Izraz "površinski aktivna supstanca" koji se ovde koristi odnosi se na organske supstance koje imaju amfipatične strukture; naime, one su sastavljene od grupa suprotstavljenih tendencija rastvorljivosti, obično lanca ugljovodonika rastvorljivog u ulju i jonske grupe rastvorljive u vodi. Površinski aktivne supstance mogu se, u zavisnosti od naelektrisanja površinski aktivnog dela, klasifikovati u anjonske, katjonske i nejonske površinski aktivne supstance. Površinski aktivne supstance se često koriste kao sredstva za kvašenje, emulzifikovanje, solubilizaciju i dispergovanje raznih farmaceutskih sastava i preparata od bioloških materijala.

[0375] Kao što se ovde koristi, izraz "obeleživač" se odnosi na bilo koju vrstu delova koji su vezani za, npr., polipeptid i/ili polinukleotid koji kodira hOX40L ili hOX40L antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. Na primer, polinukleotid koji kodira hOX40L, hOX40L antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen može da sadrži jednu ili više dodatnih nukleotidnih sekvenci koje kodiraju, npr. detektabilni deo ili deo koji pomaže u afinitetnom prečišćavanju. Kada su translirani, obeleživač i antitelo mogu biti u obliku fuzionog proteina. Izraz "detektabilno" ili "detektovanje" u vezi sa obeleživačem odnosi se na bilo koji obeleživač koji je sposoban da se vizualizuje ili gde se prisustvo obeleživača na drugi način može odrediti i/ili izmeriti (npr. kvantitativno). Neograničavajući primer detektabilnog obeleživača je fluorescentni obeleživač.

[0376] Kao što se ovde koristi, izraz "terapeutsko sredstvo" odnosi se na bilo koje sredstvo koje se može koristiti u tretmanu, upravljanju ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om i/ili simptoma u vezi sa tim. U određenim otelotvorenjima, izraz "terapeutsko sredstvo" se odnosi na antitelo pronalaska. U određenim drugim otelotvorenjima, izraz "terapeutsko sredstvo" se odnosi na sredstvo koje je različito od antitela pronalaska. Poželjno, terapeutsko sredstvo je agens za koji se zna da je koristan za, ili je bio ili se trenutno koristi za tretman, upravljanje ili poboljšanje bolesti posredovane hOX40L-om ili jednog ili više simptoma povezanih sa tim. U specifičnim otelotvorenjima, terapeutsko sredstvo je potpuno humano anti-HOX40L antitelo, kao što je potpuno humano anti-hOX40L monoklonsko antitelo.

[0377] Kombinacija terapija (npr. primena profilaktičkih ili terapeutskih sredstava) koja je efikasnija od aditivnih efekata bilo koje dve ili više pojedinačnih terapija. Na primer, sinergijski efekat kombinacije profilaktičkih i/ili terapijskih agenasa dozvoljava korišćenje manjih doza jednog ili više agenasa i/ili ređu primenu navedenih agenasa ispitaniku sa bolešću posredovanom hOX40L-om. Sposobnost korišćenja manjih doza profilaktičkih ili terapijskih terapija i/ili primene navedenih terapija ređe, smanjuje toksičnost povezanu sa primenom navedenih terapija na ispitanika bez smanjenja efikasnosti navedenih terapija u prevenciji, upravljanju, tretiranju ili poboljšanju bolesti posredovane hOX40L-om. Pored toga, sinergijski efekat može rezultirati poboljšanjem efikasnosti terapija u prevenciji, ili u upravljanju, tretmanu ili poboljšanju bolesti posredovane hOX40L-om. Konačno, sinergijski efekat kombinacije terapija (npr. profilaktičkih ili terapijskih agenasa) može izbeći ili smanjiti štetne ili neželjene sporedne efekte povezane sa primenom bilo koje pojedinačne terapije.

[0378] U jednom otelotvorenju, kombinacija se sastoji od anti-OX40L antitela pronalaska i daljih terapijskih sredstava nezavisno izabranih iz grupe koju čine rapamicin (sirolimus), takrolimus, ciklosporin, kortikosteroidi (npr. metilprednizolon), metotreksat, mofetilmikofenolat, anti-CD28 antitela, anti-IL12/IL-23 antitela (npr. ustekinumab), anti-CD20 antitela (npr.rituksimab), anti-CD30 antitela (npr. brentuksimab), CTLA4-Fc molekuli (npr. abatacept), CCR5 receptor antagonisti (npr. maravirok), anti-CD40L antitela, anti-VLA4 antitela (npr. natalizumab), anti-LFAl antitela, fludarabin, anti-CD52 antitela (npr. alemtuzumab), anti-CD45 antitela, ciklofosfamid, anti-timocit globulini, anti-komplementarna C5 antitela (npr. ekulizumab), anti-a4b7 integrin antitela(npr. vedolizumab), anti-IL6 antitela (npr. tocilizumab), anti-IL2R antitela (npr. basiliksumab), anti-CD25 antitela (npr. daklizumab), anti-TNFa / TNFa-Fc molekuli (npr. etanercept, adalimumab, infliksimab, golimumab ili certolizumab pegol) i Vorinostat. U drugom otelotvorenju kombinacija sadrži anti-OX40L antitelo pronalaska i dalje terapeutsko sredstvo nezavisno izabrano iz grupe koju čine rapamicin (sirolimus), takrolimus, ciklosporin, kortikosteroidi (npr. metilprednizolon), metotreksat, mikofenolat mofetil, anti-CD28 antitela, CTLA4-Fc molekuli (npr. abatacept), anti-CD40L antitela, anti-LFAl antitela, anti-CD52 antitela (npr. alemtuzumab), ciklofosfamid i anti-timocit globulini.

[0379] Kao što se ovde koristi, izraz "terapija" se odnosi na bilo koji protokol, metodu i/ili agens koji se može koristiti u prevenciji, upravljanju, tretmanu i/ili poboljšanju bolesti posredovane hOX40L-om (npr. IBD ili GVHD). U određenim otelotvorenjima, izrazi "terapije" i "terapija" odnose se na biološku terapiju, suportivnu terapiju i/ili druge terapije korisne u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili poboljšanju bolesti

1

posredovane hOX40L-om koje je poznato stručnjacima, kao što je medicinsko osoblje.

[0380] Kao što se ovde koristi, izrazi „tretirati“, „tretman“ i „tretiranje“ odnose se na smanjenje ili poboljšanje progresije, težine i/ili trajanja bolesti posredovane hOX40L-om (npr. IBD ili GVHD) koja je rezultat primene jedne ili više terapija (uključujući, ali ne ograničavajući se na, primenu jednog ili više profilaktičkih ili terapijskih sredstava, kao što je antitelo pronalaska). U specifičnim otelotvorenjima, takvi izrazi se odnose na smanjenje ili inhibiciju vezivanja hOX40L za OX40, smanjenje ili inhibiciju proizvodnje ili sekrecije CCL20 iz ćelije koja eksprimira hOX40 ili hOX40L, smanjenje ili inhibiciju proizvodnje ili sekrecije IL-8 iz ćelije koja eksprimira hOX40 ili hOX40L, smanjenje ili inhibiciju proizvodnje ili sekrecije RANTES iz ćelije koja eksprimira hOX40 ili hOX40L i/ili inhibiciju ili smanjenje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću posredovanom hOX40L-om, kao što su IBD ili GVHD. U specifičnim otelotvorenjima, takvi izrazi se odnose na smanjenje ili inhibiciju vezivanja hOX40L za OX40, smanjenje ili inhibiciju proizvodnje ili sekrecije INF-γ iz ćelije koja eksprimira hOX40 ili hOX40L, smanjenje ili inhibiciju proizvodnje ili sekrecije TNF-α iz ćelije koja eksprimira hOX40 ili hOX40L, smanjenje ili inhibiciju proizvodnje ili sekrecije IL-2 iz ćelije koja eksprimira hOX40 ili hOX40L i/ili inhibiciju ili smanjenje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću posredovanom hOX40L-om, kao što su IBD ili GVHD (posebno GvHD). Na primer, ćelija je humana ćelija. U specifičnim otelotvorenjima, profilaktičko sredstvo je potpuno humano anti-hOX40L antitelo, kao što je potpuno humano anti-hOX40L monoklonsko antitelo.

[0381] Izraz "varijabilni region" ili "varijabilni domen" odnosi se na deo OX40L i teških lanaca, obično oko amino-terminala 120 do 130 aminokiselina u teškom lancu i oko 100 do 110 aminokiselina u lakom lancu, koje se opsežno razlikuju u sekvenci među antitelima i koriste se u vezivanju i specifičnosti svakog određenog antitela za njegov određeni antigen. Varijabilnost u sekvenci koncentrisana je u onim regionima koji se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (CDR), dok se visoko očuvani regioni u varijabilnom domenu nazivaju okvirni regioni (FR). CDRi od OX40L i teški lanci su prvenstveno odgovorni za interakciju antitela sa antigenom.

Numerisanje pozicija aminokiselina koje se ovde koriste je prema EU Indeksu, kao u Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. (U.S.

2

Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5th ed. ("Kabat et al."). U poželjnim otelotvorenjima, varijabilni region je humani varijabilni region.

Antitela

[0382] Antitela pronalaska uključuju, ali nisu ograničena na, sintetička antitela, monoklonska antitela, rekombinantno proizvedena antitela, multispecifična antitela (uključujući bi-specifična antitela), humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, intratela, jednolančana Fvs (scFv) (npr. uključujući monospecifična, bispecifična itd.), kamelizovana antitela, Fab fragmente, F(ab') fragmente, disulfidnovezana Fvs (sdFv), anti-idiotipska antitela (anti-Id) i fragmente epitopa koji vezuju bilo šta od gore navedenog.

[0383] Ovde navedena antitela naročito uključuju molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, tj. molekule koji sadrže mesto vezivanja za antigen koje se specifično vezuje za antigen hOX40L. Imunoglobulinski molekuli navedeni ovde mogu biti bilo kog tipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase molekula imunoglobulina. U određenom otelotvorenju, antitelo koje je ovde navedeno je IgG antitelo, poželjno IgG1 ili IgG4. U određenim otelotvorenjima, antitela pronalaska sadrže humani gama 4 konstantni region. U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca ne vezuje Fc-y receptore, i npr. obuhvata mutaciju Leu235Glu. U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca obuhvata mutaciju Ser228Pro kako bi se povećala stabilnost. U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca je IgG4-PE.

[0384] Varijante i derivati antitela uključuju fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za epitop. Poželjni fragmenti uključuju fragmente Fab; Fab' (fragment antitela koji sadrži jedan anti-vezujući domen koji sadrži Fab i dodatni deo teškog lanca kroz region šarke); F(ab') 2 (dva molekula Fab' spojena međulančanim disulfidnim vezama u regionima šarke (zgloba) teških lanaca; Fab' molekuli mogu biti usmereni ka istom ili različitim epitopima); bispecifični Fab (molekul Fab koji ima dva domena vezivanja antigena, od kojih svaki može biti usmeren ka različitom epitopu); jednolančani Fab lanac koji se sastoji od varijabilnog regiona, poznatog i kao, sFv; disulfidno vezani Fv, ili dsFv; kamelizovani VH (varijabilni, antigen-vezujući deterministički region jednog teškog lanca antitela u kome su neke aminokiseline na VH interfejsu one koje se nalaze u teškom lancu prirodno prisutnih kamiljih antitela); bispecifični sFv (sFv ili dsFv molekul koji ima dva antigen-vezujuća domena, od kojih svaki može biti usmeren na drugi epitop); dijatelo (dimerizovani sFv koji je formiran kada se VH domen prvog sFv sastavi sa VL domenom drugog sFv i VL domen prvog sFv sastavi sa VH domenom drugog sFv; dva antigen-vezujuća regiona dijatela mogu biti usmerena ka istim ili različitim epitopima); i trijatelo (trimerizovani sFv, formiran na način sličan dijatelu, ali u kome se tri antigen-vezujuća domena stvaraju u jednom kompleksu; tri antigen-vezujuća domena mogu biti usmerena ka istim ili različitim epitopima). Derivati antitela takođe uključuju jednu ili više CDR sekvenci mesta kombinovanja antitela. CDR sekvence mogu biti povezane na skeletu kada su prisutne dve ili više CDR sekvence. U određenim otelotvorenjima, antitelo koje se koristi sa pronalaskom sastoji se od jednolančanog Fv ("scFv"). scFvs su fragmenti antitela koji se sastoje od VH i VL domena antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, scFv polipeptid se dodatno sastoji od polipeptidnog linkera između VH i VL domena koja omogućava scFv da formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled scFvs vidi Pluckthun u: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, str. 269-315 (1994).

[0385] Antitela mogu biti bilo kog životinjskog porekla, uključujući ptice i sisare (npr. humana, mišja, magarca, ovce, zeca, koze, zamorca, kamile, konja ili kokoške). U određenim otelotvorenjima, antitela pronalaska su humana ili humanizovana monoklonska antitela. Kao što se ovde koristi, "humana" antitela uključuju antitela koja imaju aminokiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina i uključuju antitela izolovana iz biblioteka humanog imunoglobulina ili iz miševa koji eksprimiraju antitela iz humanih gena.

[0386] U poželjnim otelotvorenjima, antitela mogu biti potpuno humana antitela, kao što su potpuno humana antitela koja specifično vezuju hOX40L polipeptid, hOX40L polipeptidni fragment ili hOX40L epitop. Takva potpuno humana antitela bi bila povoljnija u odnosu na potpuno mišija (ili druga puna ili delimična antitela nehumanih vrsta), humanizovana antitela ili himerna antitela kako bi se minimalizovao

4

razvoj neželjenih ili nepotrebnih sporednij efekata, kao što su imunološki odgovori usmereni ka ne-potpuno humanim antitelima (npr., anti-hOX40L antitela koja potiču od drugih vrsta) kada se daju ispitaniku.

[0387] Antitela mogu biti monospecifična, bispecifična, trispecifična ili veće multispecifičnosti. Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope hOX40L polipeptida ili mogu biti specifična i za hOX40L polipeptid, kao i za heterologni epitop, kao što je heterologni polipeptid ili čvrsti suportivni materijal. U poželjnim otelotvorenjima, ovde navedena antitela su monospecifična za dati epitop hOX40L polipeptida i ne vezuju se specifično za druge epitope.

[0388] Ovde se takođe navodi B-ćelija (npr. besmrtna B-ćelija) ili hibridom koji proizvodi anti-hOX40L antitelo ili fragment opisan ovde.

[0389] U određenim otelotvorenjima, ovde je navedeno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop hOX40L, pri čemu je vezivanje za hOX40L epitop od strane antitela kompetitivno blokirano (npr. na način zavisan od doze) antitelom ili fragmentom pronalaska. Antitelo može ili ne mora biti potpuno humano antitelo. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo je potpuno humano monoklonsko anti-hOX40L antitelo, a još poželjnije potpuno humano, monoklonsko, antagonističko anti-hOX40L antitelo. Primeri testova kompetitivnog blokiranja su dati u Primerima ovde.

[0390] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili fragment pronalaska se takmiči (npr. na način zavisan od doze) sa OX40 receptorom (ili njegovim fuzionim proteinom) za vezivanje za površinski eksprimirani hOX40L ćelije. U drugim otelotvorenjima, antitelo ili fragment pronalaska se takmiči (npr. na način zavisan od doze) sa OX40 receptorom (ili njegovim fuzionim proteinom) za vezivanje na rastvorljivi hOX40L. Primeri testova kompetitivnog vezivanja koji se mogu koristiti navedeni su u odeljku Primeri u ovom dokumentu. U jednom otelotvorenju, antitelo ili fragment delimično ili potpuno inhibira vezivanje hOX40 za površinski eksprimirane OX40L, kao što je hOX40L. U drugom otelotvorenju, antitelo delimično ili potpuno inhibira vezivanje hOX40 za rastvorljivi hOX40L. U nekim otelotvorenjima, antitelo ili fragment delimično ili potpuno inhibira sekreciju CCL20, IL-8 i/ili RANTES, ili INF-γ, TNF-α ili IL-2, posebno INF-γ iz ćelije koja ima površinski eksprimiran OX40. U određenim otelotvorenjima, ćelija koja eksprimira OX40 je epitelna ćelija debelog creva.

[0391] Poželjno, antitela pronalaska su potpuno humana, monoklonska antitela, kao što su potpuno humana, monoklonska antitela antagonista, koja se specifično vezuju za hOX40L.

[0392] U nekim otelotvorenjima, antitelo ili fragment koji se ovde nalazi vezuje se za epitop hOX40L koji je trodimenzionalna površinska karakteristika polipeptida hOX40L (npr. u trimernom obliku polipeptida hOX40L). Region polipeptida hOX40L koji doprinosi epitopu može biti susedna aminokiselina polipeptida ili epitop može biti spojen iz dva ili više nesusedna regiona polipeptida. hOX40L epitop može biti prisutan u (a) trimernom obliku ("trimerni hOX40L epitop") hOX40L, (b) monomernom obliku ("monomerni hOX40L epitop ") hOX40L, (c) i trimernom i monomernom obliku hOX40L, (d) u trimernom obliku, ali ne i monomernom obliku hOX40L, ili (e) monomernom obliku, ali ne i u trimernom obliku hOX40L.

[0393] Na primer, u nekim otelotvorenjima, epitop je samo prisutan ili dostupan za vezivanje u trimernom (nativnom) obliku, ali nije prisutan ili dostupan za vezivanje u monomernom (denaturisanom) obliku anti-HOX40L antitela. U drugim otelotvorenjima, hOX40L epitop je linearna karakteristika hOX40L polipeptida (npr. u trimernom ili monomernom obliku hOX40L polipeptida). Ovde navedena antitela mogu se specifično vezati za (a) epitop monomernog oblika hOX40L, (b) epitop trimernog oblika hOX40L, (c) epitop monomernog, ali ne i trimernog oblika hOX40L, (d) epitop trimernog, ali ne i monomernog oblika hOX40L, ili (e) i monomernog i trimernog oblika hOX40L. U specifičnim otelotvorenjima, ovde navedena antitela se specifično vezuju za epitop trimernog oblika hOX40L, ali se specifično ne vezuju za apitop monomernog oblika hOX40L.

[0394] Ovaj pronalazak takođe pruža antitela koja se specifično vezuju za epitop hOX40L, antitela koja sadrže derivate VH domena i VL domene koji se specifično vezuju za antigen hOX40L. Antitela se mogu sastojati od derivata antitela pronalaska koji su obelodanjeni u Primerima, pri čemu se navedena antitela specifično vezuju za hOX40L epitop. Standardne tehnike poznate stručnjacima mogu se koristiti za uvođenje mutacija u nukleotidnoj sekvenci koja kodira molekul pronalaska, uključujući, na primer, mutagenezu usmerenu ka mestu i PCR-posredovanu mutagenezu, što rezultira supstitucijama aminokiselina. Poželjno, derivati uključuju manje od 25 supstitucija aminokiselina, manje od 20 supstitucija aminokiselina, manje od 15 supstitucija aminokiselina, manje od 10 supstitucija aminokiselina, manje od 5 supstitucija aminokiselina, manje od 4 supstitucije aminokiselina, manje od 3 supstitucije aminokiselina ili manje od 2 supstitucije aminokiselina u odnosu na prvobitni molekul. U drugom otelotvorenju, derivati imaju konzervativne aminokiselinske supstitucije. U poželjnom otelotvorenju, derivati imaju konzervativne aminokiselinske supstitucije koje su učinjene na jednom ili više predviđenih neesencijalnih aminokiselinskih ostataka. Alternativno, mutacije se mogu uneti nasumično duž celog ili dela sekvence kodiranja, kao što je saturaciona mutageneza, a rezultirajući mutanti se mogu pregledati na biološku aktivnost kako bi se identifikovali mutanti koji zadržavaju aktivnost. Nakon mutageneze, kodirani protein može biti eksprimiran i može se odrediti aktivnost proteina.

[0395] Antitelo koje se specifično vezuje za epitop hOX40L može se sastojati od aminokiselinske sekvence varijabilnog domena koja je najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog domena u spisku sekvenci.

[0396] U specifičnim otelotvorenjima, antitelo je potpuno humano anti-humano antitelo, kao što je potpuno humano monoklonsko antitelo. Potpuno humana antitela se mogu proizvesti bilo kojom metodom poznatom u stanju tehnike. Primerne metode uključuju imunizaciju sa antigenom hOX40L (bilo kojim polipeptidom hOX40L koji može izazvati imunološki odgovor, a opciono konjugovan sa nosačem) transgenih životinja (npr. miševa) koje mogu proizvesti repertoar humanih antitela u odsustvu proizvodnje endogeneogimunoglobulina; videti, npr. Jakobovits et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., 90:2551; Jakobovits et al., (1993) Nature, 362:255258 (1993); Bruggermann et al., (1993) Year in Immunol., 7:33. Druge metode stvaranja potpuno humanih anti-HOX40L antitela mogu se naći u ovde navedenim primerima.

[0397] Alternativno, potpuno humana antitela mogu biti generisana in vitro skriningom biblioteka antitela za prikaz faga; videti npr. Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks etal., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Opisane su različite biblioteke za prikaz faga koje sadrže antitela i mogu ih lako pripremiiti stručnjaci. Biblioteke mogu da sadrže različite sekvence humanih antitela, kao što su humani Fab, Fv i scFv fragmenti, koji se mogu proveriti prema odgovarajućoj meti.

[0398] Antitela i fragmenti pronalaska uključuju antitela i fragmente koji su hemijski modifikovani, tj. kovalentnim vezivanjem bilo koje vrste molekula za antitelo. Na primer, ali ne kao ograničenje, derivati antitela uključuju antitela koja su hemijski modifikovana, npr. glikozilacijom, acetilacijom, pegilacijom, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom pomoću poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičkim cepanjem, povezivanjem sa ćelijskim ligandom ili drugim proteinima, itd. Svaka od brojnih hemijskih modifikacija može se izvršiti poznatim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formulaciju, metaboličku sintezu tunikamicina, itd. Pored toga, antitelo može sadržati jednu ili više ne-klasičnih aminokiselina.

[0399] Antitela koja se specifično vezuju za hOX40L antigen mogu da obuhvataju okvirni region poznat stručnjacima (npr. humani ili ne-humani fragment). Okvirni region može, na primer, biti prirodno prisutan ili konsenzus okvirnih regiona.

Najpoželjnije, okvirni region ovde opisanog antitela je humani (vidi, npr., Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol.278: 457-479 za popis humanih okvirnih regiona.

(Vidi Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (U.S.

Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5th ed.

[0400] Antitela koja se specifično vezuju za hOX40L antigen, mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu jednog ili više CDR u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:4, Seq ID No:10, Seq ID No:36, Seq ID No:42, Seq ID No:68, Seq ID No:74, Seq ID No:96 or Seq ID No:102, posebno, Seq ID No:36 ili Seq ID No:42 za HCDR1; Seq ID No:6, Seq ID No:12, Seq ID No:38, Seq ID No:44, Seq ID No:70, Seq ID No:76, Seq ID No:98 ili Seq ID No:104, posebno Seq ID No:38 ili Seq ID No:44 za HCDR2; Seq ID No:8, Seq ID No:14, Seq ID No:40, Seq ID No:46, Seq ID No:72, Seq ID No:78, Seq ID No:100 ili Seq ID No:106, posebno Seq ID No:40 ili Seq ID No:46 za HCDR3; Seq ID No:18, Seq ID No:24, Seq ID No:50, Seq ID No:56, Seq ID No:82, Seq ID No:88, Seq ID No:110 ili Seq ID No:116, posebno Seq ID No:50 ili Seq ID No:56 za LCDR1; Seq ID No:20, Seq ID No:26, Seq ID No:52, Seq ID No:58, Seq ID No:84, Seq ID No:90, Seq ID No:112 ili Seq ID No:118, posebno Seq ID No:52 ili Seq ID No:58 za LCDR2; i Seq ID No:22, Seq ID No:28, Seq ID No:54, Seq ID No:60, Seq ID No:86, Seq ID No:92, Seq ID No:114 ili Seq ID No:120, posebno Seq ID No:54 ili Seq ID No:60 za LCDR3) i humane okvirne regione sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednom, dva, tri ili više sledećih ostataka: (a) retki okvirni ostaci koji se razlikuju između okvira mišjeg antitela (tj. okvir donorskog antitela) i okvira za humana antitela (tj. okvir za antitela primaoca); (b) ostaci Vernijeove zone kada se razlikuju između okvira za antitela za davaoce i okvira za antitela za primaoca; (c) ostaci međulančanog pakovanja na interfejsu VH/VL koji se razlikuju između okvira za antitela za davaoce i okvira za antitela za primaoce; (d) kanonski ostaci koji se razlikuju između okvira za antitela za davaoce i sekvenci okvira za antitela za primaoce, posebno okvirne regione ključne za definiciju kanonske klase petlji CDR mišjeg antitela; (e) ostaci koji su susedni CDR-u; (g) ostaci koji su sposobni za interakciju sa antigenom; (h) ostaci koji su sposobni za interakciju sa CDR; i (i) kontaktni ostaci između VH domena i VL domena. U određenim otelotvorenjima, antitela koja se specifično vezuju za hOX40L antigen koji se sastoji od humanih okvirnih regiona sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija na jednom, dva, tri ili više gore identifikovanih ostataka su antagonistička hOX40L antitela.

[0401] Antitela koja se specifično vezuju za antigen hOX40L, mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu VH domena i/ili VL domena u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:2, Seq ID No:34, Seq ID No:66 ili Seq ID No:94, posebno Seq ID No:34 za VH domene; Seq ID No:16, Seq ID No:48, Seq ID No:80, ili Seq ID No:108, posebno Seq ID No:48 za VL domene), ali imaju mutacije (npr. jedna ili više aminokiselinskih supstitucija) u okvirnim regionima. Antitela koja se specifično vezuju za antigen hOX40L mogu da obuhvataju aminokiselinsku sekvencu VH domena i/ili VL domena ili njihov antigen-vezujući fragment antitela obelodanjenog u Primerima sa jednom ili više supstitucija aminokiselinskih ostataka u okvirnim regionima VH i/ili VL domena.

[0402] U nekim otelotvorenjima, antitela koja su navedena ovde smanjuju ili inhibiraju vezivanje hOX40L hOX40, i/ili smanjuju ili inhibiraju biološku aktivnost hOX40L, kao što je sekrecija CCL20, IL8 i/ili RANTES, ili INF-γ, TNF-α ili IL-2, posebno INF-γ, kod ispitanika (npr. humanog ispitanika). U određenim otelotvorenjima, antitela koja su navedena u ovom dokumentu, kao što je humano monoklonsko anti-hOX40L antitelo, smanjuju ili inhibiraju vezivanje rastvorljivog ili hOX40L eksprimiranog sa površine ćelije, za hOX40, i/ili smanjuju ili inhibiraju sekreciju CCL20 i/ili RANTES, ili INF-γ, TNF-α ili IL-2, posebno INF-γ nakon kontakta sa rastvorljivim ili OX40L eksprimiranog sa površine ćelije, u ispitaniku. Aktivnost blokiranja antitela navedenog u ovom dokumentu vezivanja hOX40L za hOX40 može se detektovati pomoću testa kao što je opisano u Primerima. Inhibicija biološke aktivnosti ćelija koje eksprimiraju OX40 putem hOX40L antitela koja su ovde navedena može se detektovati pomoću testa kao što je opisano u Primerima.

[0403] Opisani su fuzioni proteini koji sadrže antitelo navedeno u ovom dokumentu koje se specifično vezuje za antigen hOX40L i heterologni polipeptid. Heterologni polipeptid za koji se antitelo može fuzionisati je koristan za ciljanje antitela na ćelije koje imaju hOX40L eksprimiran sa površine ćelije.

Konjugati antitela i fuzioni proteini

[0404] Sledeća diskusija o konjugatima i fuzionim proteinima takođe se odnosi na fragmente tako da se obelodanjivanje antitela može takođe primeniti mutatis mutandis na fragmente pronalaska.

[0405] U nekim otelotvorenjima, antitela pronalaska su konjugovana ili rekombinantno fuzionisana sa dijagnostičkim, detektabilnim ili terapeutskim agensom ili bilo kojim drugim molekulom. Konjugovana ili rekombinantno fuzionisana antitela mogu biti korisna, npr. za praćenje ili prognoziranje nastanka, razvoja, progresije i/ili težine bolesti posredovane hOX40L-om kao deo kliničke procedure testiranja, kao što je određivanje efikasnosti određene terapije.

[0406] Takva dijagnoza i detekcija mogu se postići, na primer, kuplovanjem antitela sa detektabilnim supstancama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, različite enzime, kao što su, ali ne ograničavajući se na, ren-peroksidazu, alkalnu fosfatazu,

1

beta-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu; protetičke grupe, kao što su, ali ne ograničavajući se na, streptavidin/biotin i avidin</>biotin; fluorescentne materijale, kao što su, ali ne ograničavajući se na, umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocinat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid ili fikoeritrin; luminiscentne materijale, kao što je, ali ne ograničavajući se na, luminol; bioluminiscentne materijale, kao što su, ali ne ograničavajući se na, luciferaza, luciferin i aekvorin; radioaktivne materijale, kao što su, ali ne ograničavajući se na jod (<131>I,<125>I,<123>I, i<121>I), ugljenik (<14>C), sumpor (<35>S), tricijum (<3>H), indijum (<115>In,<113>In,<112>In, i<111>In), tehnecijum (<99>Tc), talijum (<201>Ti), galijum (<68>Ga,<67>Ga), paladijum (<103>Pd), molibden (<99>Mo), ksenon (<133>Xe), fluor

(<18>F),<153>Sm,<177>Lu,<159>Gd,<149>Pm,<140>La,<175>Yb,<166>Ho,<90>Y,<47>Sc,<186>Re,<188>Re,<142>Pr,<105>Rh,<97>Ru,<68>Ge,<57>Co,<65>Zn,<85>Sr,<32>P,<153>Gd,<169>Yb,<51>Cr,<54>Mn,<75>Se,<113>Sn, i<117>Sn; i metali koji emituju pozitrone koristeći različite pozitron emisione tomografije i radioaktivne paramagnetične jone metala.

[0407] Opisane su upotrebe antitela pronalaska konjugovanog ili rekombinantno fuzionisanog sa terapeutskim delom (ili jednim ili više terapeutskih delova). Antitelo može biti konjugovano ili rekombinantno fuzionisano sa terapeutskim delom, kao što je citotoksin, npr. citostatik ili citocidni agens, terapeutski agens ili radioaktivni metalni jon, npr., alfa-emiteri. Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan za ćelije. Terapeutski delovi uključuju, ali nisu ograničeni na, antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tiogvanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin); alkilirajuće agense (npr. mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BCNU) i lomustin (CCNU), ciklotofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C i cisdihlorodiamin platina (II) (DDP), i cisplatin); antracikline (npr. daunorubicin (bivši daunomicin) i doksorubicin); antibiotike (npr. daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC)); Auristatin molekule (npr., auristatin PHE, briostatin 1, i solastatin 10; vidi Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother.46:3802-8 (2002), Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother.45:3580-4 (2001), Mohammad et al., Anticancer Drugs 12:735-40 (2001), Wall et al., Biochem. Biophys. Res. Commun 266:76-80 (1999), Mohammad et al., Int. J. Oncol.15:367-72 (1999); hormone (npr., glukokortikoidi, progestini, androgeni, i estrogeni), inhibitori enzima za reparaciju DNK (npr., etopozid ili topotekan),inhibitori kinaze (npr., jedinjenje ST1571, imatinib

1 1

mesilat (Kantarjian et al., Clin Cancer Res.8(7):2167-76 (2002)); citotoksične agense (npr. paklitaksel, citohalasin B, gramicidin D, etidium bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksiantracindion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukortikoidi, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, i puromicin i njihovi analozi ili homolozi i ona jedinjenja koja su obelodanjena u SAD. Pat. Br. 6,245,759, 6,399,633, 6,383,790, 6,335,156, 6,271,242, 6,242,196, 6,218,410, 6,218 ,372, 6,057,300, 6,034,053, 5,985,877, 5,958,769, 5,925,376, 5,922,844, 5,911,995, 5,872,223, 5,863,904, 5,840,745, 5,728,868, 5,648,239, 5,587,459); inhibitori farnesil transferaze (npr., R115777, BMS-214662, i ona obelodanjena u, na primer, SAD. Pat. Br.

6,458,935, 6,451,812, 6,440,974, 6,436,960, 6,432,959, 6,420,387, 6,414,145, 6,410 ,541, 6,410,539, 6,403,581, 6,399,615, 6,387,905, 6,372,747, 6,369,034, 6,362,188, 6,342,765, 6,342,487, 6,300,501, 6,268,363, 6,265,422, 6,248,756, 6,239,140, 6,232 ,338, 6,228,865, 6,228,856, 6,225,322, 6,218,406, 6,211,193, 6,187,786, 6,169,096, 6,159,984, 6,143,766, 6,133,303, 6,127,366, 6,124,465, 6,124,295, 6,103,723, 6,093 ,737, 6,090,948, 6,080,870, 6,077,853, 6,071,935, 6,066,738, 6,063,930, 6,054,466, 6,051,582, 6,051,574, i 6,040,305); inhibitori topoizomeraze (npr., kamptotecin; irinotekan; SN-38; topotekan; 9-aminokamptotecin; GG-211 (GI 147211); DX-8951f; IST-622; rubitekan; pirazoloakridin; XR-5000; saintopin; UCE6; UCE1022; TAN-1518A; TAN 1518B; KT6006; KT6528; ED-110; NB-506; ED-110; NB-506; i rebekamicin); bulgarein; veziva malih žlebova DNK kao što je Hehst boja 33342 i Hehst boja 33258; nitidin; fagaronin; epiberberin; koralin; betalapahon; BC-4-1; bisfosfonati (npr., alendronat, cimadront, klodronat, tiludronat, etidronat, ibandronat, neridronat, olpandronat, risedronat, piridronat, pamidronat, zolendronat) HMG-CoA inhibitori reduktaze, (npr., lovastatin, simvastatin, atorvastatin, pravastatin, fluvastatin, statin, cerivastatin, leskol, lupitor, rosuvastatin i atorvastatin); antisens oligonukleotidi (npr., oni obelodanjeni u SAD. Pat. br.

6,277,832, 5,998,596, 5,885,834, 5,734,033, i 5,618,709); inhibitori adenozin deaminaze (npr., Fludarabin fosfat i 2-hlorodeoksiadenozin); ibritumomab tiuksetan (Zevalin<®>); tositumomab (Bexxar<®>)) i farmaceutski prihvatljive soli, solvati, klatrati, i njihovi pro-lekovi.

1 2

[0408] Dalje, antitelo pronalaska može biti konjugovano ili rekombinantno fuzionisano sa terapeutskim delom ili delom leka koji modifikuje dati biološki odgovor. Terapeutske delove ili delove leka ne treba tumačiti kao ograničena na klasična hemijska terapeutska sredstva. Na primer, deo leka može biti protein, peptid ili polipeptid koji poseduje željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu uključivati, na primer, toksin kao što su abrin, ricin A, pseudomonas egzotoksin, toksin kolere ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora, γ-interferon, α-interferon, faktor rasta nerava, faktor rasta izveden iz trombocita, aktivator plazminogena tkiva, apoptotički agens, npr., TNF-γ, AIM I (vidi, Međunarodna publikacija br. WO 97/33899), AIM II (vidi, Međunarodna publikacija br.WO 97/34911), Fas Ligand (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6: 1567-1574) i VEGF (vidi, Međunarodna publikacija br.WO 99/23105), anti-angiogeni agens, npr., angiostatin, endostatin ili komponenta puta koagulacije (npr. faktor tkiva); ili, modifikator biološkog odgovora kao što je, na primer, limfokin (npr. interferon gama, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-5 ("IL-5"), interleukin-6 ("IL-6"), interleukin-7 ("IL-7"), interleukin 9 ("IL-9"), interleukin-10 ("IL-10"), interleukin-12 ("IL-12"), interleukin-15 ("IL-15"), interleukin-23 ("IL-23"), faktor stimulacije kolonija granulocta i makrofaga ("GM-SCF") i faktor stimulacije kolonije granulocita ("G-SCF")), ili faktor rasta (npr., hormon rasta ("GH")), ili agens koagulacije (npr., kalcijum, vitamin K, faktori tkiva, kao što su, ali ne ograničeni na, Hageman faktor (faktor XII), kininogen visoke molekulske težine (HMWK), prekalikrein (PK), koagulacijski proteini – faktori II (protrombin), faktor V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, Xia, IX, IXa, X, fosfolipid i fibrin monomer).

[0409] Antitela pronalaska mogu biti rekombinantno fuzionisana ili hemijski konjugovana (kovalentne ili nekovalentne konjugacije) sa heterolognim proteinom ili polipeptidom (ili njegovim fragmentom, poželjno sa polipeptidom od oko 10, oko 20, oko 30, oko 40, oko 50, oko 60, oko 70, oko 80, oko 90 ili oko 100 aminokiselina) za generisanje fuzionih proteina. Konkretno, fuzioni proteini koji se sastoje od antigenski vezujućeg fragmenta antitela pronalaska (npr., Fab fragment, Fv fragment, F(ab)2 fragment) i heterolognog proteina, polipeptida ili peptida. U jednom otelotvorenju, heterologni protein, polipeptid ili peptid sa kojim je antitelo fuzionisano je koristan za ciljanje antitela na određeni tip ćelije, kao što je ćelija koja eksprimira hOX40L ili hOX40L receptor. Na primer, antitelo koje se specifično vezuje za ćelijski

1

površinski receptor koji eksprimira određeni tip ćelije (npr. imunska ćelija), može biti fuzionisano ili konjugovano sa modifikovanim antitelom pronalaska.

[0410] Konjugovani ili fuzioni protein može se sastojati od antitela pronalaska i heterolognog polipeptida. U jednom otelotvorenju, konjugovani ili fuzioni protein opisan ovde obuhvata varijabilne domene antitela obelodanjenog u Primerima i heterologne polipeptide.

[0411] Pored toga, antitelo pronalaska može biti konjugovano sa terapeutskim delovima kao što je radioaktivni metalni jon, kao što su alfa-emiteri kao što su<213>Bi ili makrociklični helatori korisni za konjugaciju radiometalnih jona, uključujući, ali ne ograničavajući se na,<131>In,<131>Lu,<131>Y,<131>Ho,<131>Sm, polipeptide. U određenim otelotvorenjima, makrociklični helator je 1,4,7,10-tetraazaciklododekan-N,N',N",N"' -tetrasirćetna kiselina (DOTA) koja se može vezati za antitelo putem linker molekula. Takvi linker molekuli su opšte poznati u struci i opisani u Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res.4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem.10(4):553-7; i Cimerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol., 26(8):943-50.

[0412] Pored toga, antitela pronalaska mogu biti fuzionisana u sekvence markera, kao što je peptid za olakšavanje prečišćavanja. Kod poželjnih otelotvorenja, marker aminokiselinska sekvenca je heksa-histidinski peptid, kao što je obeleživač dat u pQE vektoru (QIAGEN, Inc.), između drugih, od kojih su mnogi komercijalno dostupni. Kao što je opisano u Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, na primer, heksa-histidin obezbeđuje pogodno prečišćavanje fuzionog proteina. Ostali peptidni obeleživači korisni za prečišćavanje uključuju, ali nisu ograničeni na, obeleživač hemaglutinina ("HA"), koji odgovara epitopu izvedenom iz proteina hemaglutinina gripa (Wilson et al, 1984, Cell 37:767), i "FLAG" obeleživač.

[0413] Metode za fuzionisanje ili konjugovanje terapeutskih delova (uključujući polipeptide) sa antitelima su dobro poznate, vidi, npr. Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc.

1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al (eds.), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc.1987); Thorpe,

1 4

"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985), Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev.62:119-58; SAD. Pat. br.

5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 5,723,125, 5,783,181, 5,908 ,626, 5,844,095, and 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; PCT publikacije WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631, i WO 99/04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539, 1991; Traunecker et al., Nature, 331:84-86, 1988; Zheng etal., J. Immunol., 154:5590-5600, 1995; Vil etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341, 1992.

[0414] Fuzioni proteini mogu biti generisani, na primer, tehnikama mešanja gena, mešanja motiva, mešanja eksona i/ili mešanja kodona (zajedno se nazivaju „mešanje DNK“). Mešanje DNK može se koristiti kako bi se izmenile aktivnosti antitela (npr. antitela sa većim afinitetima i manjim stopama disocijacije). Vidite, generalno, SAD Pat. Br.5.605.793 , 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252

i 5.837.458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol.8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol.16(2):76-82; Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol.287:265-76; i Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313. Antitela, ili kodirana antitela, mogu se menjati tako što se podvrgavaju nasumičnoj mutagenezi putem PCR sklonog greškama, nasumičnoj inserciji nukleotida ili drugim metodama pre rekombinacije. Polinukleotid koji kodira antitelo pronalaska može se rekombinovati sa jednom ili više komponenti, motiva, sekcija, delova, domena, fragmenata itd. jednog ili više heterolognih molekula.

[0415] Antitelo pronalaska takođe može biti konjugovano sa drugim antitelom da formira heterokonjugat antitela kako je opisano u SAD Pat. br.4.676.980.

[0416] Terapeutski deo ili lek konjugovan ili rekombinantno fuzionisan sa antitelom pronalaska koji se specifično vezuje za hOX40L antigen treba izabrati da bi se postigao željeni profilaktički ili terapeutski efekat(i). U određenim otelotvorenjima, antitelo je modifikovano antitelo. Kliničar ili drugo medicinsko osoblje treba da

1

razmotri sledeće pri odlučivanju o tome koji terapeutski deo ili lek da konjuguje ili rekombinantno fuzioniše sa antitelom pronalaska: prirodu bolesti, težinu bolesti i stanje ispitanika.

[0417] Antitela pronalaska takođe mogu biti pričvršćena na čvrste nosače, koji su posebno korisni za imunološke testove ili prečišćavanje ciljnog antigena. Takvi čvrsti nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, staklo, celulozu, poliakrilamid, najlon, polistiren, polivinil hlorid ili polipropilen.

Farmaceutski sastavi

[0418] Sledeća diskusija o sastavima takođe se odnosi na fragmente tako da se obelodanjivanje pominjućih antitela može primeniti mutatis mutandis na fragmente pronalaska.

[0419] Terapeutske formulacije koje sadrže jedno ili više antitela ovog pronalaska mogu se pripremiti za skladištenje mešanjem antitela sa željenim stepenom čistoće sa opcionim fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington 's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa.), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosioci, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoce pri dozama i koncentracijama koje se koriste, i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide niske molekulske mase (manje od 10 ostataka); proteine, kao što su serumski album, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što su polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, ili lizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljovodonike uključujući glukozu, manozu, ili dekstrine; helatni agensi kao što je EDTA; šećere kao što je sukroza, manitol, trehaloza ili sorbitol; protivjone koji formiraju soli kao što je natrijum; kompleksi metala (npr., Zn-protein kompleksi); i/ili ne-jonske surfaktante kao što su TWEEN<™>, PLURONICS<™>ili poletilen glikol (PEG).

1

[0420] Antitela ovde navedenog pronalaska takođe se mogu, na primer, formulisati u liposomima. Liposomi koji sadrže molekul od interesa se pripremaju metodama poznatim u struci, kao što je opisano u Epstajn et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030; i SAD Pat. Br. 4.485.045 i 4.544.545. Liposomi sa pojačanim vremenom cirkulacije su obelodanjeni u SAD Pat. br.5.013.556.

[0421] Posebno korisni imunoliposomi mogu se generisati metodom isparavanja u obrnutoj fazi sa lipidnim sastavom koji sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivirani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Liposomi se ekstrudiraju kroz filtere definisane veličine pora da bi se dobili liposomi sa željenim prečnikom. Fab' fragmenti antitela koji su ovde dati mogu se konjugovati sa liposomima kako je opisano u Martin et al. (1982) J. Biol. Chem.257:286-288 putem reakcije disulfidne razmene.Hemoterapeutski agens (kao što je Doksorubicin) je opciono sadržan u liposomu; Vidi Gabizon et al., (1989) J. National Cancer Inst.81(19): 1484.

[0422] Formulacije, kao što su one opisane ovde, takođe mogu da sadrže više od jednog aktivnog jedinjenja po potrebi za određenu indikaciju koja se tretira. U određenim otelotvorenjima, formulacije se sastoje od antitela pronalaska i jednog ili više aktivnih jedinjenja sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču nepovoljno jedna na drugu. Takvi molekuli su na odgovarajući način prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za predviđenu namenu. Na primer, antitelo pronalaska može se kombinovati sa jednim ili više drugih terapeutskih agenasa. Takva kombinovana terapija može se davati pacijentu serijski ili istovremeno ili u nizu.

[0423] U jednom otelotvorenju, kombinacija se sastoji od anti-OX40L antitela pronalaska i daljih terapeutskih agenasa nezavisno izabranih iz grupe koju čine rapamicin (sirolimus), takrolimus, ciklosporin, kortikosteroidi (npr. metilprednizolon), metotreksat, mofetilmikofenolat, anti-CD28 antitela, anti-IL12/IL-23 antitela (npr. ustekinumab), anti-CD20 antitela (npr.rituksimab), anti-CD30 antitela (npr. brentuksimab), CTLA4-Fc molekuli (npr. abatacept), antagonisti CCR5 receptora (npr. maravirok), anti-CD40L antitela, antiVLA4 antitela (npr. natalizumab), anti-LFAI antitela, fludarabin, anti-CD52 antitela (npr. alemtuzumab), anti-CD45 antitela, ciklofosfamid, anti-timocit globulini, anti-komplementarna C5 antitela (npr.

1

ekulizumab), anti-a4b7 integrin antitela (npr. vedolizumab), anti-IL6 antitela (npr. tokilizumab), anti-IL2R antitela (npr. baziliksumab), anti-CD25 antitela (npr. daklizumab), anti-TNFa / TNFa-Fc molekuli (npr. etanercept, adalimumab, infliksimab, golimumab ili certolizumab pegol) i Vorinostat. U drugom otelotvorenju kombinacija sadrži anti-OX40L antitelo pronalaska i dalje terapeutske agense nezavisno izabrane iz grupe koju čini rapamicin (sirolimus), takrolimus, ciklosporin, kortikosteroidi (npr. metilprednizolon), metotreksat, mikofenolat mofetil, anti-CD28 antitela, CTLA4-Fc molekuli (npr. abatacept), anti-CD40L antitela, anti-LFAl antitela, anti-CD52 antitela (npr. alemtuzumab), ciklofosfamid i anti-timocit globulini.

[0424] Antitelo pronalaska se takođe može zarobiti u mikrokapsuli pripremljenoj, na primer, tehnikama koacervacije ili međufaznom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloze ili želatin-mikrokapsulom i poli-(metilmetacilat) mikrokapsulom, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, liposomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su obelodanjene u Remington 's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa.

[0425] Formulacije koje se koriste za primenu in vivo mogu biti sterilne. To se lako postiže filtriranjem kroz npr. sterilne filtracione membrane.

[0426] Takođe se mogu pripremiti preparati sa trajnim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa trajnim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antagonist, koje su matrice u obliku oblikovanih članaka, npr. filmova ili mikrokapsula. Primeri matrica sa trajnim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogele (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat) ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (SAD Pat. Br.3,773,919), kopolimeri L-glutaminske kiseline i etil-L-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradivi kopolimeri mlečne kiseline-glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT<™>(injektivne mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečne kiseline-glikolne kiseline i leuprolid acetata) i poli-D-(-)-3-hidroksibutirna kiselina. Dok polimeri kao što su etilen-vinil acetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula tokom više od 100 dana, određeni hidrogeli oslobađaju proteine za kraće vremenske periode. Kada inkapsulirana antitela ostaju u telu duže vreme, mogu se denaturisati ili agregirati

1

kao rezultat izlaganja vlazi na 37° C, što rezultira gubitkom biološke aktivnosti i mogućim promenama imunogenosti. Racionalne strategije se mogu osmisliti za stabilizaciju u zavisnosti od uključenog mehanizma. Na primer, ako se otkrije da je mehanizam agregacije međumolekularno formiranje S-S veze putem tio-disulfidne razmene, stabilizacija se može postići modifikacijom sulfhidrilnih ostataka, liofilizacijom iz kiselih rastvora, kontrolom sadržaja vlage, korišćenjem odgovarajućih aditiva i razvojem specifičnih sastava polimerne matrice.

[0427] Farmaceutski sastavi navedeni u ovom dokumentu sadrže terapeutski efikasne količine jednog ili više antitela ovog pronalaska, a opciono i jedno ili više dodatnih profilaktičkih terapijskih sredstava, u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Takvi farmaceutski sastavi su korisni u prevenciji, tretiranju, upravljanju ili poboljšanju bolesti posredovane hOX40L-om, kao što su upalna bolest creva, odbacivanje transplantacije, GvHD ili jedan ili više njihovih simptoma.

[0428] Farmaceutski nosači pogodni za primenu jedinjenja koja su ovde navedena uključuju sve takve nosače koji su poznati stručnjacima da budu pogodni za određeni način primene.

[0429] Pored toga, antitela pronalaska mogu se formulisati kao jedini farmaceutski aktivan sastojak u sastavu ili se mogu kombinovati sa drugim aktivnim sastojcima (kao što je jedan ili više drugih profilaktičkih ili terapeutskih agenasa).

[0430] Sastavi mogu da sadrže jedno ili više antitela pronalaska. U jednom otelotvorenju, antitela su formulisana u odgovarajuće farmaceutske preparate, kao što su rastvori, suspenzije, tablete, disperzibilne tablete, tablete, pilule, kapsule, praškovi, formulacije ili eliksiri sa trajnim oslobađanjem, za oralnu primenu ili u sterilnim rastvorima ili suspenzijama za parenteralnu primenu, kao i transdermalni flaster preparati i inhalatori sa suvim praškom. U jednom otelotvorenju, gore opisana antitela su formulisana u farmaceutske sastave koristeći tehnike i postupke dobro poznate u stanju tehnike (videti, npr. Ansel (1985) Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4th Ed., p.126).

1

[0431] U sastavima, efikasne koncentracije jednog ili više antitela ili njihovih derivata su pomešane sa odgovarajućim farmaceutskim nosačem. Koncentracije jedinjenja u sastavima su efikasne za isporuku količine, nakon primene, koja tretira, sprečava ili poboljšava hOX40L-om posredovanu bolest ili njen simptom.

[0432] U jednom otelotvorenju, sastavi su formulisani za jednokratnu primenu doze. Da bi se formulisao sastav, težinska frakcija jedinjenja se rastvara, suspenduje, disperguje ili na drugi način meša u izabranom nosaču u efikasnoj koncentraciji tako da se tretirano stanje ublažava, sprečava ili jedan ili više simptoma poboljšava.

[0433] Antitelo pronalaska uključeno je u farmaceutski prihvatljiv nosač u efikasnoj količini dovoljnoj da izvrši terapeutski koristan efekat u odsustvu neželjenih sporednih efekata na tretiranog pacijenta. Terapeutski efikasna koncentracija može se odrediti empirijski testiranjem jedinjenja u in vitro i in vivo sistemima koristeći rutinske metode i zatim ekstrapolirati iz njih na doze za ljude.

[0434] Koncentracija antitela u farmaceutskom sastavu zavisiće od, npr., fizičkohemijskih karakteristika antitela, rasporeda doziranja i primenjene količine, kao i od drugih faktora poznatih stručnjacima.

[0435] U jednom otelotvorenju, terapeutski efikasna doza proizvodi serumsku koncentraciju antitela od oko 0,1 ng/ml do oko 50-100 µg/ml. Farmaceutski sastavi, u drugom otelotvorenju, obezbeđuju dozu od oko 0,001 mg do oko 2000 mg antitela po kilogramu telesne težine dnevno. Obrasci farmaceutskih jedinica za doziranje mogu se pripremiti za obezbeđivanje od oko 0,01 mg, 0,1 mg ili 1 mg do oko 500 mg, 1000 mg ili 2000 mg, a u jednom otelotvorenju od oko 10 mg do oko 500 mg antitela i/ili kombinacije drugih opcionih esencijalnih sastojaka po jediničnom obliku za doziranje.

[0436] Antitelo se može primeniti odjednom ili se može podeliti na brojne manje doze koje se primenjuju u vremenskim intervalima. Podrazumeva se da je precizno doziranje i trajanje tretiranja funkcija bolesti koja se tretira i može se odrediti empirijski pomoću poznatih protokola ispitivanja ili ekstrapolacijom iz podataka in vivo ili in vitro testova. Treba napomenuti da koncentracije i vrednosti doza takođe

11

mogu varirati u zavisnosti od težine stanja koje treba ublažiti. Dalje se podrazumeva da se za bilo kog određenog ispitanika specifični režimi doziranja mogu vremenom prilagođavati u skladu sa individualnom potrebom i profesionalnom procenom lica koje primenjuje ili nadgleda primenu sastava, kao i da su ovde navedeni rasponi koncentracije samo za primer.

[0437] Nakon mešanja ili dodavanja antitela, dobijena mešavina može biti rastvor, suspenzija, emulzija ili slično. Oblik nastale mešavine zavisi od više faktora, uključujući predviđeni način primene i rastvorljivost jedinjenja u izabranom nosaču ili mediju. Efikasna koncentracija je dovoljna za ublažavanje simptoma bolesti, poremećaja ili stanja koji se tretiraju i može se empirijski utvrditi.

[0438] Farmaceutski sastavi su predviđeni za primenu na ljudima i životinjama u obliku jediničnih doza, kao što su tablete, kapsule, pilule, praškovi, granule, sterilni parenteralni rastvori ili suspenzije, i oralni rastvori ili suspenzije, i emulzije ulja i vode koje sadrže odgovarajuće količine jedinjenja ili njihovih farmaceutski prihvatljivih derivata. Antitelo je, u jednom otelotvorenju, formulisano i primenjeno u jediničnim doznim oblicima ili višestrukim doznim oblicima. Oblici jediničnih doza koji se ovde koriste odnose se na fizički diskretne jedinice pogodne za ljude i životinje i pakuju se pojedinačno kao što je poznato u struci. Svaka doza sadrži unapred određenu količinu antitela dovoljnu da proizvede željeni terapijski efekat, u vezi sa potrebnim farmaceutskim nosačem, medijumom ili razblaživačem. Primeri oblika jediničnih doza uključuju ampule i špriceve i pojedinačno upakovane tablete ili kapsule. Oblici jediničnih doza mogu se primeniti u frakcijama ili njihovim umnošcima. Oblik višestrukih doza je mnoštvo identičnih oblika jediničnih doza upakovanih u jedan kontejner koji se primenjuju u odvojenom obliku jediničnih doza. Primeri oblika višestrukih doza uključuju ampule, bočice ili tablete ili kapsule ili boce od pinte ili galona. Otuda, višestruka doza je oblik više jediničnih doza koje nisu odvojene u ambalaži.

[0439] U poželjnim otelotvorenjima, jedno ili više anti-hOX40L antitela pronalaska nalaze se u tečnoj farmaceutskoj formulaciji. Tečni farmaceutski sastavi za primenu mogu se, na primer, pripremiti rastvaranjem, dispergovanjem ili na drugi način mešanjem aktivnog jedinjenja kako je gore definisano i opcionih farmaceutskih adjuvansa u nosaču, kao što su, na primer, voda, fiziološki rastvor, vodena dekstroza, glicerol, glikoli, etanol i slično, kako bi se time formirao rastvor ili suspenzija. Po želji, farmaceutski sastav koji će se primeniti takođe može sadržati manje količine netoksičnih pomoćnih supstanci kao što su sredstva za kvašenje, emulgatori, sredstva za solubilizaciju, puferska sredstva za pH i slično, na primer, acetat, natrijum citrat, derivati ciklodekstrina, sorbitan monolaurat, trietanolamin natrijum acetat, trietanolamin oleat i druga takva sredstva.

[0440] Stvarni načini pripreme takvih oblika doziranja poznati su ili će biti vidljivi stručnjacima; na primer, viidite Remington 's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa.

[0441] Mogu se pripremiti dozirni oblici ili sastavi koji sadrže antitela u rasponu od 0,005% do 100% sa ravnotežom napravljenom od netoksičnog nosača. Metode za pripremu ovih sastava poznate su stručnjacima.

[0442] Oblici oralnog farmaceutskog doziranja su čvrsto, gel ili tečnost. Čvrsti oblici doziranja su tablete, kapsule, granule i praškovi. Vrste oralnih tableta uključuju komprimovane, žvakaće pastile i tablete koje mogu biti obložene enterikom, šećerom ili filmom. Kapsule mogu biti tvrde ili meke želatinske kapsule, dok se granule i praškovi mogu obezbediti u ne-šumećem ili šumećem obliku uz kombinaciju drugih sastojaka poznatih stručnjacima.

[0443] U određenim otelotvorenjima, formulacije su čvrsti oblici doziranja. U određenim otelotvorenjima, formulacije su kapsule ili tablete. Tablete, pilule, kapsule, pastile za grlo i slično mogu da sadrže jedan ili više sledećih sastojaka ili jedinjenja slične prirode: vezivo; lubrikant; razblaživač; glidant; sredstvo za dezintegraciju; bojilo; zaslađivač; sredstvo za aromatizaciju; sredstvo za kvašenje; emetički premaz; i filmski premaz. Primeri veziva uključuju mikrokristaličnu celulozu, tragant gumu, rastvor glukoze, akacijevu sluz, rastvor želatina, melasu, poliinilpirolidin, povidon, krospovidone, saharozu i skrobnu pastu. Lubrikanti uključuju talk, skrob, magnezijum ili kalcijum stearat, likopodijum i stearinsku kiselinu. Razređivači uključuju, na primer, laktozu, saharozu, skrob, kaolin, so, manitol i dikalcijum fosfat. Glidanti uključuju, ali nisu ograničeni na, koloidni silicijum dioksid. Sredstva za dezintegraciju uključuju natrijum-karmelozu, natrijum-skrob, glikolat, alginsku kiselinu, kukuruzni skrob, krompirov skrob, bentonit, metilcelulozu, agar i karboksimetilcelulozu. Sredstva za bojenje uključuju, na primer, bilo koju od odobrenih sertifikovanih FD i C boja rastvorljivih u vodi, njihove mešavine; i FD i C boja nerastvorljivih u vodi suspendovanih na aluminijum hidrat. Sredstva za zaslađivanje uključuju saharozu, laktozu, manitol i veštačka sredstva za zaslađivanje kao što je saharin, kao i bilo koji broj aroma sušenih raspršivanjem. Aromatična sredstva uključuju prirodne arome ekstrahovane iz biljaka kao što je voće i sintetičke mešavine jedinjenja koje proizvode prijatan osećaj, kao što su, ali ne ograničavajući se na, pepermint i metil salicilat. Sredstva za vlaženje uključuju propilen glikol monoostearat, sorbitan monooleat, dietilen glikol monolaurat i polioksietilen laural eter. Emetički premazi uključuju masne kiseline, masti, voskove, šelak, amonirani šelak i celulozni acetat ftalate. Filmski premazi uključuju hidroksietilcelulozu, natrijum karboksimetilcelulozu, polietilen glikol 4000 i celulozni acetat ftalat.

[0444] Antitela pronalaska mogu se dati u sastavu koji ga/ih štiti od kiselog okruženja želuca. Na primer, sastav se može formulisati u enteričkom premazu koji održava svoj integritet u želucu i oslobađa aktivno jedinjenje u crevima. Sastav se može formulisati i u kombinaciji sa antacidom ili drugim takvim sastojkom.

[0445] Kada je jedinična dozirna forma kapsula, ona može da sadrži, pored materijala gore navedenog tipa, tečni nosač kao što je masno ulje. Pored toga, jedinične dozirne forme mogu sadržati razne druge materijale koji menjaju fizički oblik dozirne jedinice, na primer, premaze šećera i drugih enteričkih agenasa.

Jedinjenja se takođe mogu primeniti kao komponenta eliksira, suspenzije, sirupa, posipa, žvakaće gume ili slično. Sirup može da sadrži, pored aktivnih jedinjenja, saharozu kao zaslađivač i određene konzervanse, boje i kolorante i arome.

[0446] Antitelo se takođe može pomešati sa drugim aktivnim materijalima koji ne narušavaju željeno delovanje, ili sa materijalima koji dopunjuju željeno delovanje, kao što su antacidi, H2 blokatori i diuretici. Aktivni sastojak je antitelo ili njegov farmaceutski prihvatljiv derivat kako je opisano u ovom dokumentu. Može se uključiti veća koncentracija, do oko 98% težine aktivnog sastojka.

11

[0447] U svim otelotvorenjima, formulacije tableta i kapsula mogu biti premazane, kao što je poznato stručnjacima, kako bi se modifikovala ili održala disolucija aktivnog sastojka. Tako, na primer, oni mogu biti premazani konvencionalnim enterično svarljivim premazom, kao što su fenilisalicilat, voskovi i celulozni acetat ftalat.

[0448] U poželjnim otelotvorenjima, formulacije su tečni oblici doziranja. Tečni oralni oblici doziranja uključuju vodene rastvore, emulzije, suspenzije, rastvore i/ili suspenzije rekonstituisane iz ne-šumećih granula i šumećih preparata rekonstituisanih iz šumećih granula. Vodeni rastvori uključuju, na primer, eliksire i sirupe. Emulzije su ili ulje u vodi ili voda u ulju.

[0449] Eliksiri su bistri, zaslađeni, hidroalkoholni preparati. Farmaceutski prihvatljivi nosači koji se koriste u eliksirima uključuju rastvarače. Sirupi su koncentrovani vodeni rastvori šećera, na primer, saharoze, i mogu da sadrže konzervans. Emulzija je dvofazni sistem u kome se jedna tečnost disperguje u obliku malih globula kroz drugu tečnost. Farmaceutski prihvatljivi nosači koji se koriste u emulzijama su nevodene tečnosti, emulgatori i konzervansi. Suspenzije koriste farmaceutski prihvatljiva sredstva za suspendovanje i konzervanse.

[0450] Farmaceutski prihvatljive supstance koje se koriste u ne-šumećim granulama koje se rekonstituišu u tečni oralni oblik doziranja, uključuju razređivače, zaslađivače i sredstva za kvašenje. Farmaceutski prihvatljive supstance koje se koriste u šumećim granulama, koje se rekonstituišu u tečni oralni oblik doziranja, uključuju organske kiseline i izvor ugljendioksida. Sredstva za bojenje i aromatizaciju se koriste u svim gore navedenim oblicima doziranja.

[0451] Rastvarači uključuju glicerin, sorbitol, etil alkohol i sirup. Primeri konzervansa uključuju glicerin, metil- i propilparaben, benzoevu kiselinu, natrijum benzoat i alkohol. Primeri nevodenih tečnosti koje se koriste u emulzijama uključuju mineralno ulje i ulje semenki pamuka. Primeri emulgatora uključuju želatin, bagrem, tragakant, bentonit i surfaktante kao što su polioksietilen sorbitan monooleat. Suspendujući agensi uključuju natrijum karboksimetilcelulozu, pektin, tragakant, Veegum (smektit) i bagrem. Sredstva za zaslađivanje uključuju saharozu, sirupe, glicerin i veštačka sredstva za zaslađivanje kao što je saharin. Sredstva za kvašenje uključuju propilenglikol monostearat, sorbitan monooleat, dietilenglikol monoolaurat i polioksietilen lauril eter. Organske kiseline uključuju limunsku i vinsku kiselinu. Izvori ugljen-dioksida uključuju natrijum bikarbonat i natrijum karbonat. Sredstva za bojenje uključuju bilo koju od odobrenih sertifikovanih FD i C boja rastvorljivih u vodi i njihove mešavine. Aromatična sredstva uključuju prirodne arome ekstrahovane iz biljaka kao što je voće i sintetičke mešavine jedinjenja koje proizvode prijatan osećaj ukusa.

[0452] Za čvrsti oblik doziranja, rastvor ili suspenzija, na primer u propilen karbonatu, biljnim uljima ili trigliceridima, je, u jednom otelotvorenju, inkapsulirana u želatinskoj kapsuli. Takvi rastvori, kao i njihova priprema i inkapsulacija, obelodanjeni su u SAD Pat. Br.4.328.245; 4.409.239; i 4.410.545. Za tečni oblik doziranja, rastvor, npr. u polietilen glikolu, može se razblažiti dovoljnom količinom farmaceutski prihvatljivog tečnog nosača, npr. vodom, koja se lako meri za primenu.

[0453] Alternativno, tečne ili polučvrste oralne formulacije mogu se pripremiti rastvaranjem ili dispergovanjem aktivnog jedinjenja ili soli u biljnim uljima, glikolima, trigliceridima, propilenglikol estrima (npr. propilen karbonat) i drugim takvim nosačima, i inkapsuliranjem ovih rastvora ili suspenzija u tvrde ili meke želatinske kapsule. Ostale korisne formulacije uključuju one navedene u SAD Pat. Br.

RE28.819 i 4.358.603. Ukratko, takve formulacije uključuju, ali nisu ograničene na, one koje sadrže jedinjenje navedeno u ovom dokumentu, dialkilirani mono- ili polialkilen glikol, uključujući, ali ne ograničavajući se na, 1,2-dimetoksimetan, diglim, triglim, tetraglim, polietilen glikol-350-dimetil eter, polietilen glikol-550-dimetil eter, polietilen glikol-750-dimetil eter, pri čemu se 350, 550 i 750 odnose na približnu prosečnu molekulsku masu polietilen glikola, i jedan ili više antioksidansa, kao što su butilirani hidroksitoluen (BHT), butilirani hidroksianizol (BHA), propil galat, vitamin E, hidrohinon, hidroksikumarini, etanolamin, lecitin, cefalin, askorbinska kiselina, jabučna kiselina,sorbitol, fosforna kiselina, tiodipropionska kiselina i njeni estri i ditiokarbamati.

[0454] Ostale formulacije uključuju, ali nisu ograničene na, vodene alkoholne rastvore, uključujući farmaceutski prihvatljiv acetal. Alkoholi koji se koriste u ovim formulacijama su bilo koji farmaceutski prihvatljivi rastvarači koji se mešaju sa

11

vodom i koji imaju jednu ili više hidroksilnih grupa, uključujući, ali ne ograničavajući se na, propilen glikol i etanol. Acetali uključuju, ali nisu ograničeni na, di(niži alkil) acetale nižih alkil aldehida kao što su acetaldehid i dietil acetal.

[0455] Parenteralna primena, u jednom otelotvorenju, karakterisana putem injektiranja, bilo supkutano, intramuskularno ili intravenski, takođe se razmatra ovde. Injekcioni preparati se mogu pripremiti u konvencionalnim oblicima, bilo kao tečni rastvori ili suspenzije, čvrsti oblici pogodni za rastvor ili suspenziju u tečnosti pre ubrizgavanja, ili kao emulzije. Injekcioni preparati, rastvori i emulzije takođe sadrže jednu ili više ekscipijenasa (pomoćnih supstanci). Pogodni ekscipijensi su, na primer, voda, fiziološki rastvor, dekstroza, glicerol ili etanol. Pored toga, po želji, farmaceutski sastavi koji se primenjuju takođe mogu da sadrže manje količine netoksičnih pomoćnih supstanci kao što su sredstva za kvašenje ili emulgovanje, puferska sredstva za pH, stabilizatori, pojačivači rastvorljivosti i druga takva sredstva, kao što su, na primer, natrijum acetat, sorbitan monoolaurat, trietanolamin oleat i ciklodekstrini.

[0456] Implantacija sistema sa sporim ili trajnim oslobađanjem, tako da se održava konstantan nivo doziranja (videti, npr. SAD Pat. Br.3,710,795) se takođe razmatra ovde. Ukratko, jedinjenje navedeno u ovom dokumentu je dispergovano u čvrstoj unutrašnjoj matrici, npr., polimetilmetakrilat, polibutilmetakrilat, plastifikovani ili neplastifikovani polivinilhlorid, plastifikovani najlon, plastifikovani polietilentereftalat, prirodna guma, poliizopren, poliizobutilen, polibutadien, polietilen, etilen-vinilacetat kopolimeri, silikonske gume, polidimetilsiloksani, silikonski karbonat kopolimeri, hidrofilni polimeri kao što su hidrogeli estera akrilne i metakrilne kiseline, kolagen, umreženi polivinilkohol i umreženii delimično hidrolizirani polivinil acetat, koji je okružen spoljašnjom polimernom membranom, npr., polietilen, polipropilen, etilen/propilen kopolimeri, etilen/etil akrilat kopolimeri, etilen/vinilacetat kopolimeri, silikonske gume, polidimetil siloksani, neopren guma, hlorovani polietilen, polivinilhlorid, vinilhlorid kopolimeri sa vinil acetatom, viniliden hlorid, etilen i propilen, jonomer polietilen tereftalat, butil guma epihlorohidrin gume, etilen/vinil alkohol kopolimer, etilen/vinil acetat/vinil alkohol terpolimer, i etilen/viniloksietanol kopolimer, koji je nerastvoran u telesnim tečnostima. Antitelo difunduje kroz spoljnu polimernu membranu u kontrolnom koraku brzine otpuštanja. Količina antitela koja se nalazi u

11

takvim parenteralnim sastavima u velikoj meri zavisi od njihove specifične prirode, kao i od aktivnosti jedinjenja i potreba ispitanika.

[0457] Preparati za parenteralnu primenu uključuju sterilne rastvore spremne za injektiranje, sterilne suve rastvorljive proizvode, kao što su liofilizovani praškovi, spremni za kombinovanje sa rastvaračem neposredno pre upotrebe, uključujući hipodermične tablete, sterilne suspenzije spremne za ubrizgavanje, sterilne suve nerastvorljive proizvode spremne za kombinovanje sa nosačem neposredno pre upotrebe i sterilne emulzije. Rastvori mogu biti vodeni ili nevodeni.

[0458] Ako se primenjuje intravenski, odgovarajući nosači uključuju fiziološki rastvor ili fiiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS) i rastvore koji sadrže sredstva za zgušnjavanje i solubilizaciju, kao što su glukoza, polietilen glikol i polipropilen glikol i njihove mešavine.

[0459] Farmaceutski prihvatljivi nosači koji se koriste u parenteralnim preparatima uključuju vodene prenosnike, nevodene prenosnike, antimikrobna sredstva, izotonična sredstva, pufere, antioksidanse, lokalne anestetike, suspenzione i disperzione agense, emulgatore, sekvestrirajuće ili helatne agense i druge farmaceutski prihvatljive supstance.

[0460] Primeri vodenih prenosilaca uključuju ubrizgavanje natrijum hlorida, ubrizgavanje Ringerovog rastvora, ubrizgavanje izotonične dekstroze, ubrizgavanje sterilne vode, ubrizgavanje Ringerovog rastvora sa dekstrozom i laktozom. Nevodeni parenteralni prenosioci uključuju fiksirana ulja biljnog porekla, ulje semenki pamuka, kukuruzno ulje, susamovo ulje i ulje od kikirikija. Antimikrobna sredstva u bakteriostatskim ili fungistatskim koncentracijama mogu se dodati parenteralnim preparatima upakovanim u kontejnere sa više doza koje uključuju fenole ili krezole, živina jedinjenja, benzil alkohol, hlorobutanol, metil i propil estre p-hidroksibenzoeve kiseline, timerosal, benzalkonijum hlorid i benzetonijum hlorid. Izotonični agensi uključuju natrijum hlorid i dekstrozu. Puferi uključuju fosfat i citrat. Antioksidansi uključuju natrijum bisulfat. Lokalni anestetici uključuju prokain-hidrohlorid. Sredstva za suspendovanje i dispergovanje uključuju natrijum karboksimetilcelulozu, hidroksipropil metilcelulozu i polivinilpirolidon. Emulgatori uključuju Polisorbat 80

11

(TWEEN<®>80). Sekvestrirajući ili helatni agens jona metala uključuje EDTA.

Farmaceutski nosioci takođe uključuju etil alkohol, polietilen glikol i propilen glikol za prenosioce koji se mešaju sa vodom; i natrijum hidroksid, hlorovodoničnu kiselinu, limunsku kiselinu ili mlečnu kiselinu za podešavanje pH.

[0461] Koncentracija farmaceutski aktivnog jedinjenja se podešava tako da injekcija obezbeđuje efikasnu količinu za postizanje željenog farmakološkog efekta. Tačna doza zavisi od starosti, težine i stanja pacijenta ili životinje kao što je poznato u struci.

[0462] Parenteralni preparati u jediničnoj dozi mogu se upakovati u ampulu, bočicu ili špric sa iglom. Svi preparati za parenteralnu primenu mogu biti sterilni, kao što je poznato i praktikovano u struci.

[0463] Ilustrativno, intravenska ili intraarterijska infuzija sterilnog vodenog rastvora koji sadrži aktivno jedinjenje je efikasan način primene. Drugo otelotvorenje je sterilni vodeni ili uljani rastvor ili suspenzija koja sadrži aktivni materijal ubrizgan po potrebi kako bi se postigao željeni farmakološki efekat.

[0464] Injekcioni preparati su dizajnirani za lokalnu i sistemsku primenu. U jednom otelotvorenju, terapijski efikasna doza je formulisana tako da sadrži koncentraciju od najmanje oko 0,1% tež./tež- do oko 90% tež./tež. ili više, u određenim otelotvorenjima više od 1% tež./tež. aktivnog jedinjenja u tretiranom tkivu(ima).

[0465] Antitelo se može suspendovati u mikronizovanom ili drugom odgovarajućem obliku. Oblik nastale mešavine zavisi od više faktora, uključujući predviđeni način primene i rastvorljivost jedinjenja u izabranom nosaču ili prenosiocu. Efikasna koncentracija je dovoljna za ublažavanje simptoma stanja i može se empirijski odrediti.

[0466] U drugim otelotvorenjima, farmaceutske formulacije su liofilizovani praškovi, koji se mogu rekonstituisati za primenu kao rastvori, emulzije i druge smeše. Takođe se mogu rekonstituisati i formulisati kao čvrste materije ili gelovi.

11

[0467] Liofilizovani prah se priprema rastvaranjem antitela navedenog u ovom dokumentu, ili njegovog farmaceutski prihvatljivog derivata, u odgovarajućem rastvaraču. U nekim otelotvorenjima, liofilizovani prah je sterilan. Rastvarač može da sadrži pomoćnu supstancu koja poboljšava stabilnost ili drugu farmakološku komponentu praška ili rekonstituisanog rastvora, pripremljenog iz praška. Pomoćne supstance koje se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničene na, dekstrozu, sorbital, fruktozu, kukuruzni sirup, ksilitol, glicerin, glukozu, saharozu ili drugo odgovarajuće sredstvo. Rastvarač takođe može da sadrži pufer, kao što su citrat, natrijum ili kalijum fosfat ili drugi takav pufer poznat stručnjacima, u jednom otelotvorenju, oko neutralnog pH. Naknadna sterilna filtracija rastvora praćena liofilizacijom pod standardnim uslovima poznatim stručnjacima obezbeđuje željenu formulaciju. U jednom otelotvorenju, dobijeni rastvor će biti raspoređen u bočice za liofilizaciju. Svaka bočica će sadržati jednu dozu ili više doza jedinjenja. Liofilizovani prah se može čuvati u odgovarajućim uslovima, kao što je na oko 4° C do sobne temperature.

[0468] Rekonstitucija ovog liofilizovanog praška vodom za injekciju obezbeđuje formulaciju za upotrebu u parenteralnoj primeni. Za rekonstituciju, liofilizovani prah se dodaje u sterilnu vodu ili drugi odgovarajući nosač. Precizna količina zavisi od izabranog jedinjenja. Takav iznos se može empirijski odrediti.

[0469] Lokalne (topikalne) smeše se pripremaju kako je opisano za lokalnu i sistemsku primenu. Rezultirajuća smeša može biti rastvor, suspenzija, emulzije ili slično i može se formulisati kao krema, gelovi, masti, emulzije, rastvori, eliksiri, losioni, suspenzije, tinkture, paste, pene, aerosoli, irigatori, sprejevi, supozitoriji, zavoji, dermalni flasteri ili bilo koje druge formulacije pogodne za topikalnu primenu.

[0470] Antitela pronalaska mogu se formulisati kao aerosoli za lokalnu primenu, kao što je inhalacija (videti, npr. SAD Pat. Br.4.044.126, 4.414.209 i 4.364.923, koji opisuju aerosole za isporuku steroida korisnog za tretiranje upalnih bolesti, posebno astme). Ove formulacije za primenu u respiratornom traktu mogu biti u obliku aerosola ili rastvora za nebulizator, ili kao mikrofini prah za insuflaciju, samostalno ili u kombinaciji sa inertnim nosiocem kao što je laktoza. U tom slučaju, čestice

11

formulacije će, u jednom otelotvorenju, imati prečnike manje od 50 mikrona, u jednom otelotvorenju manje od 10 mikrona.

[0471] Jedinjenja se mogu formulisati za lokalnu ili topikalnu primenu, kao što je za lokalnu primenu na koži i sluzokoži, kao što je u oku, u obliku gelova, krema i losiona i za primenu na oku ili za intracisternalnu ili intraspinalnu primenu. O lokalnoj primeni se razmišlja za transdermalnu isporuku, kao i za primenu na očima ili sluzokoži, ili za inhalacione terapije. Mogu se primeniti i nazalni rastvori aktivnog jedinjenja samog ili u kombinaciji sa drugim farmaceutski prihvatljivim pomoćnim supstancama.

[0472] Ovi rastvori, posebno oni namenjeni za oftalmološku upotrebu, mogu se formulisati kao 0,01%-10% izotonični rastvori, pH oko 5-7, sa odgovarajućim solima.

[0473] Ovde se takođe razmatraju i drugi putevi primene, kao što su transdermalni flasteri, uključujući jontoforetičke i elektroforetičke uređaje, i rektalna primena.

[0474] Transdermalni flasteri, uključujući jotoforetičke i elektroforetičke uređaje, dobro su poznati stručnjacima. Na primer, takvi flasteri su obelodanjeni u SAD Pat.. Br.

6,267,983, 6,261,595, 6,256,533, 6,167,301, 6,024,975, 6,010715, 5,985,317, 5,983, 134, 5,948,433, i 5,860,957.

[0475] Na primer, farmaceutski oblici doziranja za rektalnu primenu su rektalni čepići, kapsule i tablete za sistemski efekat. Rektalni supozitoriji se ovde koriste kao čvrsta tela za ubacivanje u rektum, koja se tope ili omekšavaju pri telesnoj temperaturi, oslobađajući jedan ili više farmakološki ili terapijski aktivnih sastojaka. Farmaceutski prihvatljive supstance koje se koriste u rektalnim čepićima su baze ili prenosioci i agensi za podizanje tačke topljenja. Primeri baza uključuju kakao puter (teobromno ulje), glicerin-želatin, karbovaks (polioksietilen glikol) i odgovarajuće mešavine mono-, di- i triglicerida masnih kiselina. Mogu se koristiti kombinacije različitih baza. Sredstva za podizanje tačke topljenja čepića uključuju spermaceti i vosak. Rektalni čepići se mogu pripremiti bilo metodom komprimovanja ili kalupovanjem. Težina rektalnog supozitorija, u jednom otelotvorenju, iznosi oko 2 do 3 gm.

12

[0476] Tablete i kapsule za rektalnu primenu mogu se proizvesti korišćenjem iste farmaceutski prihvatljive supstance i istim metodama kao za formulacije za oralnu primenu.

[0477] Antitela i drugi sastavi dati u ovom dokumentu takođe mogu biti formulisani tako da budu usmereni na određeno tkivo, receptor ili drugi deo tela ispitanika koji se tretira. Mnoge takve metode targetiranja su dobro poznate stručnjacima. Sve takve metode targetiranja su ovde predviđene za upotrebu u instant sastavima. Za neograničavajuće primere metoda targetiranja, vidite, npr., SAD Pat. Br.6,316,652, 6,274,552, 6,271,359, 6,253,872, 6,139,865, 6,131,570, 6,120,751,

6,071,495, 6,060,082, 6,048,736, 6,039,975, 6,004,534, 5,985,307, 5,972,366, 5,900 ,252, 5,840,674, 5,759,542 i 5,709,874. U nekim otelotvorenjima, anti-hOX40L antitela pronalaska su ciljana (ili na drugi način primenjena) na debelo crevo, kao što je kod pacijenta koji ima ili je pod rizikom da ima IBD. U nekim otelotvorenjima, antihOX40L antitela pronalaska su ciljana (ili na drugi način primenjena) na oko, kao što je kod pacijenta koji ima ili je pod rizikom od uveitisa.

[0478] U jednom otelotvorenju, liposomalne suspenzije, uključujući liposome ciljane na tkivo, kao što su liposomi ciljani na tumor, takođe mogu biti pogodne kao farmaceutski prihvatljivi nosači. Oni se mogu pripremiti prema metodama poznatim stručnjacima. Na primer, formulacije liposoma se mogu pripremiti kako je opisano u SAD Pat. br.4,522,811. Ukratko, liposomi kao što su multilamelarne vezikule (MLV) mogu se formirati sušenjem fosfatidil holina iz jaja i moždanog fosfatidil serina (molski odnos 7:3) u unutrašnjosti tikvice. Dodaje se rastvor jedinjenja navedenog ovde u fosfatnom puferskom fiziološkom rastvoru bez dvovalentnih katjona (PBS) i tikvica se trese dok se lipidni film ne disperguje. Rezultirajuće vezikule su isprane kako bi se uklonila inkapsulirana jedinjenja, centrifugiranjem se peletuju, a zatim resuspenduju u PBS.

Metode primene i doziranja

[0479] Opisani su sastavi koji se sastoje od jednog ili više antitela ili fragmenata za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanjui bolesti posredovane hOX40L-om (ili njihovih simptoma). Diskusija u vezi sa antitelima se takođe mutatis mutandis primenjuje na fragmente pronalaska. Alternativno, sastojci koji obuhvataju jedno ili više antitela ili fragmenata za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane OX40L-om (ili njihovih simptoma) u ispitaniku, pri čemu je OX40L ne-humani (npr. pseći, mačji, konjski, goveđi, ovčiji ili svinjski), a ispitanik je pas, mačka, konj, krava, ovca ili svinja. Opisani ovde su sastavi koji obuhvataju jedno ili više antitela opisanih ovde za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om, kao što je IBD (npr. ulcerozni kolitis ili Kronova bolest), ili njihov simptom. Simptomi IBD mogu biti u rasponu od blagih do teških i generalno zavise od dela crevnog trakta koji je u pitanju. Primeri simptoma IBD uključuju grčeve u stomaku i bol, krvavi proliv, tešku urgenciju pražnjenja creva, temperaturu, gubitak apetita, gubitak težine, anemiju, umor i/ili ranice na potkolenicama, gležnjevima, listovima, butinama i rukama.

Primerne crevne komplikacije IBD uključuju obilno krvarenje iz čira, perforaciju ili rupturu creva, strikture i opstrukcije, fistule (abnormalan prolaz) i perianalnu bolest, toksični megakolon (npr. akutna neopstruktivna dilatacija debelog creva) i/ili maligniteti (npr. rak debelog creva ili tankog creva). Primerne ekstraintestinalne komplikacije IBD uključuju artritis, kožna stanja, upalu oka, poremećaje jetre i bubrega i/ili gubitak koštanog tkiva. Svaka kombinacija ovih simptoma može se sprečiti, upravljati, tretirati i/ili ublažiti korišćenjem sastava i metoda navedenih u ovom dokumentu.

[0480] Ovde opisani su sastojci koji obuhvataju jedno ili više antitela opisanih u ovom dokumentu za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om, kao što je GVHD, ili njen simptom. GVHD se obično javlja nakon alogenih ili nepodudarnih transplantacijecija kostne srži (BMT).

[0481] U nekim otelotvorenjima, GVHD je akutni GVHD. Simptomi akutnog GVHD mogu se pojaviti brzo i mogu biti blagi ili teški. U određenim slučajevima, akutni GVHD se razvija u roku od oko tri meseca nakon transplantacije, na primer kada se krvna slika oporavi nakon transplantacije. U određenim slučajevima, akutni GVHD utiče na kožu, gastrointestinalni (GI) trakt i/ili jetru. Na primer, kod nekih pacijenata akutni GVHD kože počinje sa osipom, na primer, na dlanovima pacijenta, tabanima ili ramenima. Međutim, osip može postati široko rasprostranjen, i može biti sa svrabom i bolan i/ili može imati plikove i ljuštenje. Akutni GVHD jetre može uticati na normalne funkcije jetre, kao što su enzimi jetre, i zauzvrat može izazvati žuticu. Akutni GVHD jetre takođe može dovesti do toga da pacijentov abdomen postane otečen i bolan ako se jetra poveća. Konačno, simptomi akutnog GVHD creva (ili GVHD digestivnog sistema) mogu uključivati dijareju, sluz ili krv u stolici, grčeve ili bol u stomaku, probavne smetnje, mučninu i/ili gubitak apetita. Drugi opšti simptomi akutnog GVHD mogu uključivati anemiju, groznicu niske temperature i/ili sklonost infekcijama. Svaka kombinacija ovih simptoma akutnog GVHD može se sprečiti, upravljati, tretirati i/ili ublažiti korišćenjem sastava i metoda navedenih u ovom dokumentu.

[0482] U drugim otelotvorenjima, GVHD je hronični GVHD. Hronični GVHD se može javiti od oko tri meseca do oko godinu dana ili duže nakon transplantacije. Hronični GVHD može biti blag ili težak i generalno uključuje simptome slične onima kod akutnog GVHD. Hronični GVHD može uticati na kožu i digestivni sistem, uključujući jetru, ali može uključivati i druge organe i imuni sistem (npr. čineći pacijenta sklonijim infekcijama) i/ili vezivna tkiva. Simptomi hroničnog GVHD kože uključuju osip, suvu kožu, zategnutu kožu, kožu koja svrbi, tamnjenje boje kože, zadebljanje kože i/ili mogu uticati na kosu (npr. opadanje kose, posedelost) ili nokte (npr. tvrdi ili lomljivi nokti). Hronični GVHD creva može uticati na probavni sistem, usta, jednjak, sluznicu želuca i/ili sluznicu creva, a simptomi mogu uključivati proliv, suva ili bolna usta, bolno gutanje, nisku apsorpciju hranljivih materija u želucu, nadutost, grčeve u stomaku. Hronični GVHD jetre može izazvati oštećenje i ožiljke na jetri (ciroza). Hronični GVHD očiju može uticati na žlezde koje stvaraju suze, uzrokujući da oči postanu suve, pekuće i bolne ili teško podnose jarko svetlo. Hronični GVHD pluća može izazvati nedostatak vazduha, šištanje pri disanju, uporan kašalj i/ili sklonost ka infekcijama grudnog koša. Hronični GVHD utiče na tetive (npr. upale) koje povezuju mišić sa kostima, što uzrokuje poteškoće u ispravljanju ili savijanju ruku i nogu. Svaka kombinacija ovih simptoma hroničnog GVHD može se sprečiti, upravljati, tretirati i/ili ublažiti korišćenjem sastava i metoda navedenih u ovom dokumentu.

[0483] Opisani ovde su sastavi koji obuhvataju jedno ili više antitela opisanih ovde za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om, kao što je uveitis, ili njegov simptom.

12

[0484] Opisani ovde su sastavi koji obuhvataju jedno ili više ovde opisanih antitela za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om, kao što su pioderma gangrenosum, gigantocelularni arteritis, Šniclerov sindrom ili neinfektivni skleritis.

[0485] Opisani ovde su sastavi koji obuhvataju jedno ili više antitela opisanih ovde za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti ili stanja posredovanog hOX40L-om, izabranih iz grupe koju čine autoimuna bolest ili stanje, sistemska zapaljenska bolest ili stanje, ili odbacivanje transplantacije; na primer, zapaljenska bolest creva (IBD), Kronova bolest, reumatoidni artritis, odbacivanje transplantacije, odbacivanje alogene transplantacije, bolest 'kalem-protiv-domaćina' (GvHD), ulcerozni kolitis, sistemski eritematozni lupus (SLE), dijabetes, uveitis, ankilozantni spondilitis, kontaktna preosetljivost, multipla skleroza ili ateroskleroza, posebno GvHD.

[0486] Sastav za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om obuhvata mesta vezivanja OX40L antitela opisana u ovom dokumentu, npr. antitelo obelodanjeno u Primerima.

[0487] Opisan je sastav za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om, koji obuhvata jedno ili više antitela koja obuhvataju jedan ili više VH domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu VH domena u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:2, Seq ID No:34, Seq ID No:66 ili Seq ID No:94, posebno Seq ID No:34). Opisan je sastav za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om, koji se sastoji od jednog ili više antitela koja sadrže jedan ili više VH CDR1 koji imaju aminokiselinsku sekvencu VH CDR1 u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:4, Seq ID No: 10, Seq ID No:36, Seq ID No:42, Seq ID No:68, Seq ID No:74, Seq ID No:96 ili Seq ID No: 102, posebno, Seq ID No:36 ili Seq ID No:42). Opisan je sastav za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om, koji se sastoji od jednog ili više antitela koja sadrže jedan ili više VH CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom VH CDR2 u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:6, Seq ID No: 12, Seq ID No:38, Seq ID No:44, Seq ID No:70, Seq ID No:76, Seq ID No:98 ili Seq ID No: 104, posebno Seq ID No:38 ili Seq ID No:44). Opisan je sastav za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om, koji se sastoji od jednog ili više antitela koja sadrže jedan ili više VH CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom VH CDR3 u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:8, Seq ID No: 14, Seq ID No:40, Seq ID No:46, Seq ID No:72, Seq ID No:78, Seq ID No: 100 ili Seq ID No: 106, posebno Seq ID No:40 ili Seq ID No:46).

[0488] Opisan je sastav za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om, koji obuhvata jedno ili više antitela koja obuhvataju jedan ili više VL domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu aVL domena u spisku sekvenci (tj. Seq ID No: 16, Seq ID No:48, Seq ID No:80, ili Seq ID No: 108, posebno Seq ID No:48) (opciono sadrži i srodni VH domen kako je navedeno u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:2/16, Seq ID No:34/48, Seq ID No:66/80 ili Seq ID No:94/108, posebno Seq ID No:34/48). Opisan je sastav za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanja bolesti posredovane hOX40L-om, koji se sastoji od jednog ili više antitela koja se sastoje od jednog ili više VL CDRl sa aminokiselinskom sekvencom VL CDR1 u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:18, Seq ID No:24, Seq ID No:50, Seq ID No:56, Seq ID No:82, Seq ID No:88, Seq ID No: 110 ili Seq ID No: 116, posebno Seq ID No:50 ili Seq ID No:56). Opisan je sastav za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om, koji se sastoji od jednog ili više antitela koja sadrže jedan ili više VL CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom VL CDR2 u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:20, Seq ID No:26, Seq ID No:52, Seq ID No:58, Seq ID No:84, Seq ID No:90, Seq ID No: 112 ili Seq ID No: 118, posebno Seq ID No:52 ili Seq ID No:58). Opisan je sastav za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om, koji se sastoji od jednog ili više antitela koja sadrže jedan ili više VL CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom VL CDR3 u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:22, Seq ID No:28, Seq ID No:54, Seq ID No:60, Seq ID No:86, Seq ID No:92, Seq ID No:114 ili Seq ID No:120, posebno Seq ID No:54 ili Seq ID No:60).

[0489] Opisan je sastav za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om, koji obuhvata jedno ili više antitela koja obuhvataju jedan ili više VH domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu VH domena u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:2, Seq ID No:34, Seq ID No:66 ili Seq ID No:94, posebno Seq ID No:34) i jedan ili više VL domena koji imaju aminokiselinsku

12

sekvencu VL domena u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:16, Seq ID No:48, Seq ID No:80, ili Seq ID No:108, posebno Seq ID No:48).

[0490] Opisan je sastav za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om, koji se sastoji se od jednog ili više antitela koja sadrže jedan ili više VH CDRl koji imaju aminokiselinsku sekvencu VH CDR1 u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:4, Seq ID No:10, Seq ID No:36, Seq ID No:42, Seq ID No:68, Seq ID No:74, Seq ID No:96 ili Seq ID No:102, posebno, Seq ID No:36 ili Seq ID No:42) i jedan ili više VL CDRl koji imaju aminokiselinsku sekvencu VL CDR1 u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:18, Seq ID No:24, Seq ID No:50, Seq ID No:56, Seq ID No:82, Seq ID No:88, Seq ID No:110 ili Seq ID No:116, posebno Seq ID No:50 ili Seq ID No:56). Opisan je sastav za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanja bolesti posredovane hOX40L-om, koji se sastoji se od jednog ili više antitela koja sadrže jedan ili više VH CDRI koji imaju aminokiselinsku sekvencu VH CDR1 u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:4, Seq ID No:10, Seq ID No:36, Seq ID No:42, Seq ID No:68, Seq ID No:74, Seq ID No:96 ili Seq ID No:102, posebno, Seq ID No:36 ili Seq ID No:42) i jednog ili više VL CDR2 koji imaju aminokiselinsku sekvencu VL CDR2 u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:20, Seq ID No:26, Seq ID No:52, Seq ID No:58, Seq ID No:84, Seq ID No:90, Seq ID No:112 ili Seq ID No:118, posebno Seq ID No:52 ili Seq ID No:58). Opisan je sastav za upotrebu u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanju bolesti posredovane hOX40L-om, koji se sastoji od jednog ili više antitela koja sadrže jedan ili više VH CDRI koji imaju aminokiselinsku sekvencu VH CDR1 u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:4, Seq ID No:10, Seq ID No:36, Seq ID No:42, Seq ID No:68, Seq ID No:74, Seq ID No:96 ili Seq ID No:102, posebno, Seq ID No:36 ili Seq ID No:42) i jedan ili više VL CDR3 koji imaju aminokiselinsku sekvencu VL CDR3 u spisku sekvenci (tj. Seq ID No:22, Seq ID No:28, Seq ID No:54, Seq ID No:60, Seq ID No:86, Seq ID No:92, Seq ID No:114 ili Seq ID No:120, posebno Seq ID No:54 ili Seq ID No:60).

[0491] Kao što je detaljnije objašnjeno na drugom mestu ovde, sastav pronalaska može se koristiti sam ili u kombinaciji sa drugim jedinjenjima ili sastavima. Štaviše, antitela mogu dalje biti rekombinantno fuzionisana sa heterolognim polipeptidom na N- ili C-terminusu ili hemijski konjugovana (uključujući konjugacije kovalentno i nekovalentno) sa polipeptidima ili drugim sastavima. Na primer, antitela ovog

12

pronalaska mogu biti rekombinantno fuzionisana ili konjugovana sa molekulima korisnim kao oznake u testovima detekcije i efektorskim molekulima kao što su heterologni polipeptidi, lekovi, radionukleotidi ili toksini. Vidi, npr. PCT publikacije WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; SAD Pat. Broj 5.314.995; i EP 396.387.

[0492] Ovde opisane su metode za smanjenje ili inhibiciju vezivanja hOX40L za OX40L receptor ili srodni ligand (npr. OX40) u ispitaniku (npr. humanom ispitaniku), koje obuhvataju primenu efikasne količine antitela koja se specifično vezuje za hOX40L polipeptid (npr. ćelijski površinski-eksprimiran ili rastvorljiv hOX40L ćeliji). U nekim otelotvorenjima, biološka aktivnost hOX40L, kao što je lučenje CCL20, IL8 i/ili RANTES, ili INF-γ, TNF-α ili IL-2, posebno INF-γ ili drugog citokina obelodanjenog ovde, takođe je smanjena kod ispitanika, na primer smanjena za najmanje 10, 20, 30, 40, 50 ili 60%, ili 70%, ili 80%, ili 90% ili 95% ili >95%.

[0493] Opisane u ovom dokumentu su metode za smanjenje ili inhibiciju biološke aktivnosti hOX40L, kao što je sekrecija interferona gama, IL-2, CCL20, IL8 i/ili RANTES ili drugog citokina, ili INF-γ, TNF-α ili IL-2, posebno INF-γ u ispitaniku (npr. humani ispitanik), koji obuhvata davanje efikasne količine antitela koja se specifično vezuje za polipeptid hOX40L (npr. površinski eksprimiran hOX40L na ćeliji), pri čemu je biološka aktivnost hOX40L smanjena putem antitela.

[0494] Opisane ovde su metode za smanjenje ili inhibiciju vezivanja hOX40L za OX40L receptor ili srodni ligand (npr. OX40) u ćeliji koja ima površinski eksprimiran hOX40L, kontaktirajući ćeliju sa efikasnom količinom antitela koje se specifično vezuje za hOX40L polipeptid (npr. površinski eksprimiran ili rastvorljiv hOX40L), kao što je polipeptid hOX40L, fragment hOX40L polipeptida ili hOX40L epitop. U nekim otelotvorenjima, biološka aktivnost hOX40L, kao što je sekrecija interferona gama, IL-2, CCL20, IL8 i/ili RANTES, ili INF-γ, TNF-α ili IL-2, posebno INF-γ ili drugog citokina oobelodanjenog ovde, takođe je smanjena u ćeliji.

[0495] Opisane ovde su metode za smanjenje ili inhibiciju biološke aktivnosti hOX40L, kao što je sekrecija interferona gama, IL-2, CCL20, IL8 i/ili RANTES ili drugog ovde obelodanjenog citokina, u ćeliji sa površinski eksprimiranim receptorom

12

hOX40L (kao što je OX40), kontaktirajući ćeliju sa efikasnom količinom antitela koje se specifično vezuje za polipeptid hOX40L (npr. površinski eksprimiran ili rastvorljiv hOX40L), pri čemu se biološka aktivnost hOX40L smanjuje putem antitela.

[0496] Antitela ovog pronalaska mogu se koristiti, na primer, za prečišćavanje, otkrivanje i ciljanje antigena hOX40L, i in vitro i in vivo dijagnostičkih i terapijskih metoda. Na primer, modifikovana antitela imaju primenu u imunološkim testovima za kvalitativno i kvantitativno merenje nivoa hOX40L u biološkim uzorcima. Vidi, npr. Harlow et al., Antitela: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988).

[0497] Ovde opisane su metode sprečavanja, upravljanja, tretiranja i/ili ublažavanja bolesti posredovane hOX40L-om, primenom ispitaniku efikasne količine antitela ili farmaceutskog sastava koji se sastoji od antitela pronalaska. U jednom vidu, antitelo je u znatnoj meri prečišćeno (tj. u znatnoj meri bez supstanci koje ograničavaju njegovo dejstvo ili proizvode neželjene nuspojave). Antitelo može biti potpuno humano monoklonsko antitelo, kao što je potpuno humano antitelo monoklonskog antagonista. Ispitanik koji primenjuje terapiju je poželjno sisar, kao što je ne-primat (npr. krave, svinje, konji, mačke, psi, glodari, miševi ili pacovi) ili primat (npr. majmun, kao što su rezus ili javanski makaki majmun ili čovek). Ispitanik može biti čovek. Ispitanik može biti ljudsko novorođenče ili prevremeno rođeno ljudsko novorođenče. Ispitanik može biti čovek sa hOX40L-om posredovanom bolešću.

[0498] Poznati su različiti sistemi isporuke i mogu se koristiti za primenu profilaktičkog ili terapijskog sredstva (npr. antitelo pronalaska), uključujući, ali ne ograničavajući se na, enkapsulaciju u liposomima, mikročesticama, mikrokapsulama, rekombinantnim ćelijama sposobnim da eksprimiraju antitelo, endocitozu posredovanu receptorima (videti, npr. Wu and Wu, J. Biol. Chem.262: 4429-4432 (1987)), izgradnju nukleinske kiseline kao dela retrovirusnog ili drugog vektora, itd. Metode primene profilaktičkog ili terapijskog sredstva (npr. antitela pronalaska) ili farmaceutskog sastava uključuju, ali nisu ograničene na, parenteralnu primenu (npr. intradermalna, intramuskularna, intraperitonealna, intravenska i potkožna), epiduralnu i sluzokožu (npr. intranazalni i oralni putevi). U određenom otelotvorenju, profilaktičko ili terapijsko sredstvo (npr. antitelo ovog pronalaska), ili farmaceutski

12

sastav se daje intranazalno, intramuskularno, intravenski ili supkutano. Profilaktička ili terapijska sredstva ili sastavi mogu se primenjivati na bilo koji pogodan način, na primer infuzijom ili bolus injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili sluzokožne obloge (npr. oralna sluznica, intranazalna sluznica, rektalna i crevna sluznica itd.) i mogu se primenjivati zajedno sa drugim biološki aktivnim sredstvima. Primena može biti sistemska ili lokalna. Pored toga, može se koristiti i pulmonalna primena, npr. upotrebom inhalatora ili nebulizatora, i formulacija sa aerosolizacionim agensom. Vidite, npr. SAD Pat. Br.6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540 i 4.880.078; i PCT Publikacije br. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 i WO 99/66903.

[0499] U konkretnom otelotvorenju, može biti poželjno da se profilaktički ili terapijski agens, ili farmaceutski sastav pronalaska primeni lokalno na područje koje treba tretirati. To se može postići, na primer, a ne putem ograničenja, lokalnom infuzijom, lokalnom primenom (npr. putem intranazalnog spreja), injekcijom ili putem implantata, koji navedeni implantat je od poroznog, neporoznog ili želatinoznog materijala, uključujući membrane, kao što su sijalastične membrane ili vlakna.

Poželjno, prilikom primene antitela pronalaska, mora se voditi računa o upotrebi materijala na koji se antitelo ne apsorbuje.

[0500] U drugom otelotvorenju, profilaktički ili terapeutski agens, ili sastav pronalaska može biti isporučen u vezikuli, posebno liposomu (vidi Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al., in Liposomes in Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp.317-327; vidi generalno ibid.).

[0501] U drugom otelotvorenju, profilaktičko ili terapijsko sredstvo, ili sastav pronalaska može se isporučiti u sistemu kontrolisanog otpuštanja ili sa trajnim oslobađanjem. U jednom otelotvorenju, pumpa se može koristiti za postizanje kontrolisanog ili trajnog oslobađanja (vidi Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med.321:574). U drugom otelotvorenju, polimerni materijali se mogu koristiti za postizanje kontrolisanog ili trajnog oslobađanja profilaktičkog ili terapijskog sredstva (npr. antitela pronalaska) ili sastava pronalaska (videti

12

npr. Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem.23:61; vidi takođe Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol.25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); SAD Pat. br.5,679,377; SAD Pat. br.5,916,597; SAD Pat. br.

5,912,015; SAD Pat. br.5,989,463; SAD Pat. br.5,128,326; PCT Publikacija br. WO 99/15154; i PCT Publikacija br. WO 99/20253. Primeri polimera koji se koriste u formulacijama sa trajnim oslobađanjem uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(2-hidroksi etil metakrilat), poli(metil metakrilat), poli(akrilna kiselina), poli(etilen-kovinil acetat), poli(metakrilna kiselina), poliglikolide (PLG), polianhidride, poli(N-vinil pirolidon), poli(vinil alkohol), poliakrilamid, poli(etilen glikol), polilaktide (PLA), poli(laktid-ko-glikolidi) (PLGA) i poliortoestre. U poželjnom otelotvorenju, polimer koji se koristi u formulaciji sa trajnim oslobađanjem je inertan, bez izluživih nečistoća, stabilan pri skladištenju, sterilan i biorazgradiv. U drugom otelotvorenju, sistem kontrolisanog ili trajnog oslobađanja može biti postavljen u blizini terapeutskog cilja, tj. nazalnih puteva ili pluća, što zahteva samo deo sistemske doze (videti,

npr. Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp.115-138 (1984)). Sistemi sa kontrolisanim oslobađanjem su razmatrani u pregledu od strane Langer-a (1990, Science 249:1527-1533). Svaka tehnika poznata stručnjaku može se koristiti za proizvodnju formulacija za trajno oslobađanje koje se sastoje od jednog ili više antitela pronalaska. Vidi, npr. SAD Pat. Br.4,526,938, PCT publikacija WO 91/05548, PCT publikacija WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater.24:853-854, i Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater.24:759-760.

[0502] U specifičnom otelotvorenju, gde je sastav nukleinska kiselina koja kodira profilaktički ili terapijski agens (npr. antitelo pronalaska), nukleinska kiselina se može

1

primeniti in vivo kako bi se promovisala ekspresija njenog kodiranog profilaktičkog ili terapijskog agensa, konstruišući ga kao deo odgovarajućeg vektora ekspresije nukleinske kiseline i primenjujući ga tako da postane unutarćelijski, npr. korišćenjem retrovirusnog vektora (vidi SAD Pat. Br.4,980,286), ili direktnim ubrizgavanjem, ili korišćenjem bombardovanja mikročesticama (npr., genski pištolj; Biolistic, Dupont), ili premazom lipidima ili receptorima ćelijske površine ili transfektivnim agensima, ili davanjem u povezivanje sa homeoboksu sličnim peptidom za koji se zna da ulazi u nukleus (vidi npr. Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), itd. Alternativno, nukleinska kiselina se može uneti intracelularno i inkorporirati u DNK ćelije domaćina za ekspresiju putem homologne rekombinacije.

[0503] U specifičnom otelotvorenju, sastav pronalaska obuhvata jedno, dva ili više antitela ili fragmenata pronalaska. U drugom otelotvorenju, sastav pronalaska obuhvata jedno, dva ili više antitela ili fragmenata pronalaska i profilaktičko ili terapijsko sredstvo koje nije antitelo pronalaska. Poželjno, poznato je da su agensi korisni za ili su bili ili se trenutno koriste za prevenciju, upravljanje, tretman i/ili ublažavanje bolesti posredovane hOX40L-om. Pored profilaktičkih ili terapijskih sredstava, sastav pronalaska može da sadrži i nosač.

[0504] Sastavi pronalaska obuhvataju neupakovane sastave lekova korisne u proizvodnji farmaceutskih sastava (npr. sastavi koji su pogodni za primenu ispitaniku ili pacijentu) koji se mogu koristiti u pripremi jediničnih doznih formi. U poželjnom otelotvorenju, sastav pronalaska je farmaceutski sastav. Takvi sastavi obuhvataju profilaktički ili terapijski efikasnu količinu jednog ili više profilaktičkih ili terapijskih sredstava (npr. antitelo pronalaska ili drugo profilaktičko ili terapijsko sredstvo) i farmaceutski prihvatljiv nosač. Poželjno, farmaceutski sastavi su formulisani da budu pogodni za put primene ispitaniku.

[0505] U specifičnom otelotvorenju, izraz "nosač" se odnosi na razblaživač, adjuvans (npr., Freundov adjuvans (kompletan i nekompletan)), pomoćnu supstancu ili prenosilac sa kojim se daje terapijski lek. Takvi farmaceutski prenosioci mogu biti sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući one naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, ulje susama i slično. Voda je poželjni nosač kada se farmaceutski sastav daje

1 1

intravenski. Fiziološki rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerola takođe se mogu koristiti kao tečni nosači, posebno za rastvore koji se ubrizgavaju. Odgovarajući farmaceutski ekscipijesi (pomoćne materije) uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silikagel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Sastav, po želji, takođe može da sadrži manje količine sredstava za kvašenje ili emulgovanje ili sredstva za pH puferisanje. Ovi sastavi mogu biti u obliku rastvora, suspenzija, emulzije, tableta, pilula, kapsula, praška, formulacija sa trajnim oslobađanjem i slično. Oralna formulacija može uključivati standardne nosioce kao što su farmaceutski kvaliteti manitola, laktoze, skroba, magnezijum stearata, natrijum saharina, celuloze, magnezijum karbonata itd. Primeri odgovarajućih farmaceutskih nosača opisani su u Remington 's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa. Takvi sastavi će sadržati profilaktički ili terapijski efikasnu količinu antitela, poželjno u prečišćenom obliku, zajedno sa odgovarajućom količinom nosača kako bi se obezbedio oblik za pravilnu primenu pacijentu. Formulacija treba da odgovara načinu primene.

[0506] U poželjnom otelotvorenju, sastav je formulisan u skladu sa rutinskim procedurama kao farmaceutski sastav prilagođen za intravensku primenu na ljudima. Tipično, sastavi za intravensku primenu su rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Po potrebi, sastav takođe može uključivati sredstvo za rastvaranje i lokalni anestetik kao što je lidokain za ublažavanje bola na mestu uboda. Međutim, takvi sastavi se mogu primeniti na drugi način osim intravenoznim putem.

[0507] Generalno, sastojci sastava pronalaska isporučuju se odvojeno ili se mešaju u obliku pojedinačne doze, na primer, kao suvi liofilizovani prah ili bezvodni koncentrat u hermetički zatvorenom kontejneru, kao što je ampula ili kesica koja označava količinu aktivnog sredstva. Kada se sastav daje infuzijom, može se izdati sa bocom za infuziju koja sadrži sterilnu vodu ili fiziološki rastvor farmaceutsog stepena čistoće. Kada se sastav daje injekcijom, može se obezbediti ampula sterilne vode za injekciju ili fiziološki rastvor tako da se sastojci mogu pomešati pre primene.

[0508] Antitelo pronalaska može se zapakovati u hermetički zatvoreni kontejner kao što je ampula ili kesica koja označava količinu antitela. Antitelo se može isporučiti

1 2

kao suvi sterilisani liofilizovani prah ili bezvodni koncentrat u hermetički zatvorenom kontejneru i može se rekonstituisati, npr. sa vodom ili fiziološkim rastvorom do odgovarajuće koncentracije za davanje ispitaniku. Poželjno, antitelo se isporučuje u vidu suvog sterilnog liofilizovanog praška u hermetički zatvorenom kontejneru u dozi od najmanje 0,1 mg, najmanje 0,5 mg, najmanje 1 mg, najmanje 2 mg ili najmanje 3 mg, a poželjno najmanje 5 mg, najmanje 10 mg, najmanje 15 mg, najmanje 25 mg, najmanje 30 mg, najmanje 35 mg, najmanje 45 mg, najmanje 50 mg, najmanje 60 mg, najmanje 75 mg, najmanje 80 mg, najmanje 85 mg, najmanje 90 mg, najmanje 95 mg ili najmanje 100 mg. Liofilizovano antitelo se može čuvati na temperaturi između 2 i 8° C u originalnom kontejneru i antitelo se može primeniti u roku od 12 sati, poželjno u roku od 6 sati, u roku od 5 sati, u roku od 3 sata ili u roku od 1 sata nakon rekonstituisanja. Antitelo se može dostaviti u tečnom obliku u hermetički zatvorenom kontejneru sa naznakom količine i koncentracije antitela. Poželjno, tečni oblik antitela se isporučuje u hermetički zatvorenom kontejneru od najmanje 0,1 mg/ml, najmanje 0,5 mg/ml, ili najmanje 1 mg/ml, a poželjno najmanje 5 mg/ml, najmanje 10 mg/ml, najmanje 15 mg/ml, najmanje 25 mg/ml, najmanje 30 mg/ml, najmanje 40 mg/ml, najmanje 50 mg/ml, najmanje 60 mg/ml, najmanje 70 mg/ml, najmanje 80 mg/ml, najmanje 90 mg/ml ili najmanje 100 mg/ml.

[0509] Sastavi pronalaska mogu se formulisati kao neutralni ili u obliku soli.

Farmaceutski prihvatljive soli uključuju one koje su formirane sa anjonima kao što su oni izvedeni iz hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline itd., i one formirane sa katjonima kao što su oni dobijeni od natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma, feri hidroksida, izopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina itd.

[0510] Količina profilaktičkog ili terapijskog agensa (npr. ovde opisanog antitela) ili ovde opisanog sastava koji će biti efikasan u prevenciji, upravljanju, tretiranju i/ili ublažavanjui bolesti posredovane hOX40L-om može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama.

[0511] Shodno tome, doza antitela ili sastava koja rezultira titrom seruma od oko 0,1 µg/ml do oko 450 µg/ml, a u nekim otelotvorenjima najmanje 0,1 µg/ml, najmanje 0,2 µg/ml, najmanje 0,4 µg/ml, najmanje 0,5 µg/ml, najmanje 0,6 µg/ml, najmanje 0,8

1

µg/ml, najmanje 1 µg/ml, najmanje 1,5 µg/ml, a poželjno najmanje 2 µg/ml, najmanje 5 µg/ml, najmanje 10 µg/ml, najmanje 15 µg/ml, najmanje 20 µg/ml, najmanje 25 µg/ml, najmanje 30 µg/ml, najmanje 35 µg/ml, najmanje 40 µg/ml, najmanje 50 µg/ml, najmanje 75 µg/ml, najmanje 100 µg/ml, najmanje 125 µg/ml, najmanje 150 µg/ml, najmanje 200 µg/ml, najmanje 250 µg/ml, najmanje 300 µg/ml, najmanje 350 µg/ml, najmanje 400 µg/ml ili najmanje 450 µg/ml se može dati humanom ispitaniku za prevenciju, upravljanje, tretiranje i/ili ublažavanje bolesti posredovane hOX40L-om. Pored toga, in vitro testovi mogu se koristiti opciono kako bi se identifikovali optimalni rasponi doza. Precizna doza koja će se koristiti u formulaciji takođe će zavisiti od puta primene i ozbiljnosti bolesti posredovane hOX40L-om, i treba da bude određena prema proceni lekara i okolnostima svakog pacijenta.

[0512] Efikasne doze se mogu ekstrapolisati iz krivih odgovora na doze dobijenih iz sistema ispitivanja in vitro ili životinjskog modela.

[0513] Za antitela pronalaska, doza koja se daje pacijentu obično iznosi 0,1 mg/kg do 100 mg/kg telesne težine pacijenta. U nekim otelotvorenjima, doza koja se daje pacijentu je oko 1 mg/kg do oko 75 mg/kg telesne težine pacijenta. Poželjno, doza koja se daje pacijentu je između 1 mg/kg i 20 mg/kg pacijentove telesne težine, poželjnije 1 mg/kg do 5 mg/kg pacijentove telesne težine. Generalno, humana antitela imaju duže vreme poluraspada u ljudskom telu od antitela drugih vrsta zbog imunog odgovora na strane polipeptide. Tako su često moguće manje doze gumanih antitela i ređa primena. Dalje, doza i učestalost primene antitela pronalaska mogu se smanjiti povećanjem apsorpcije i prodiranja antitela u tkiva putem modifikacija kao što je, na primer, lipidacija.

[0514] U jednom otelotvorenju, približno 100 mg/kg ili manje, približno 75 mg/kg ili manje, približno 50 mg/kg ili manje, približno 25 mg/kg ili manje, približno 10 mg/kg ili manje, približno 5 mg/kg ili manje, približno 1 mg/kg ili manje, približno 0,5 mg/kg ili manje, ili približno 0,1 mg/kg ili manje antitela ili fragmenta pronalaska se primenjuje 5 puta, 4 puta, 3 puta, 2 puta ili, poželjno, 1 put za upravljanje bolešću posredovanom hOX40L-om. U nekim otelotvorenjima, antitelo pronalaska se daje oko 1-12 puta, pri čemu se doze mogu primenjivati po potrebi, npr. nedeljno, dvonedeljno, mesečno, dvomesečno, tromesečno, itd., kako odredi lekar. U nekim

1 4

otelotvorenjima, niža doza (npr.1-15 mg/kg) može se primenjivati češće (npr.3-6 puta). Kod drugih otelotvorenja, veća doza (npr.25-100 mg/kg) može se primenjivati ređe (npr.1-3 puta). Međutim, kao što će biti očigledno stručnjacima, druge količine i rasporedi doziranja su lako utvrdivi i u okviru pronalaska.

[0515] U određenom otelotvorenju, približno 100 mg/kg, približno 75 mg/kg ili manje, približno 50 mg/kg ili manje, približno 25 mg/kg ili manje, približno 10 mg/kg ili manje, približno 5 mg/kg ili manje, približno 1 mg/kg ili manje, približno 0,5 mg/kg ili manje, približno 0,1 mg/kg ili manje antitela ili fragmenta pronalaska u formulaciji sa trajnim oslobađanjem daje se ispitaniku, poželjno čoveku, radi sprečavanja, upravljanja, tretiranja i/ili ublažavanja bolesti posredovane hOX40L-om. U drugom specifičnom otelotvorenju, približno 100 mg/kg, približno 75 mg/kg ili manje, približno 50 mg/kg ili manje, približno 25 mg/kg ili manje, približno 10 mg/kg ili manje, približno 5 mg/kg ili manje, približno 1 mg/kg ili manje, približno 0,5 mg/kg ili manje, ili približno 0,1 mg/kg ili manje bolusa antitela pronalaska koji nije u formulaciji sa trajnim oslobađanjem daje se ispitaniku, poželjno čoveku, kako bi se sprečila, upravljala, tretirala i/ili ublažila bolest posredovana hOX40L-om, i nakon određenog vremenskog perioda, približno 100 mg/kg, približno 75 mg/kg ili manje, približno 50 mg/kg ili manje, približno 25 mg/kg ili manje, približno 10 mg/kg ili manje, približno 5 mg/kg ili manje, približno 1 mg/kg ili manje, približno 0,5 mg/kg ili manje, ili približno 5 mg/kg ili manje antitela pronalaska u trajnom oslobađanju daje se navedenom ispitaniku (npr. intranazalno ili intramuskularno) dva, tri ili četiri puta (najbolje jednom). U skladu sa ovim otelotvorenjem, određeni vremenski period može biti 1 do 5 dana, nedelju, dve nedelje ili mesec dana.

[0516] U nekim otelotvorenjima, pacijentu se daje jedna doza antitela ili fragmenta pronalaska kako bi se sprečila, upravljala, tretirala i/ili ublažila hOX40L-om posredovana bolest dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest puta, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest, dvadeset, dvadeset jedan, dvadeset dva, dvadeset tri, dvadeset četiri, dvadeset pet ili dvadeset šest puta u dvonedeljnim (npr. oko 14 dana) intervalima tokom godine, pri čemu se doza bira iz grupe koju čine oko 0,1 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 30 mg/kg, oko 35 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 45 mg/kg, oko 50 mg/kg,

1

oko 55 mg/kg, oko 60 mg/kg, oko 65 mg/kg, oko 70 mg/kg, oko 75 mg/kg, oko 80 mg/kg, oko 85 mg/kg, oko 90 mg/kg, oko 95 mg/kg, oko 100 mg/kg, ili njihova kombinacija (tj. svaka doza mesečno može ili ne mora biti identična).

[0517] U drugom otelotvorenju, pacijentu se daje jedna doza antitela pronalaska radi sprečavanja, upravljanja, tretiranja i/ili ublažavanja bolesti posredovane hOX40L-om dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest ili dvanaest puta mesečno (npr. oko 30 dana) u intervalima tokom godine, pri čemu se doza bira iz grupe koja se sastoji od oko 0,1 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 30 mg/kg, oko 35 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 45 mg/kg, oko 50 mg/kg, oko 55 mg/kg, oko 60 mg/kg, oko 65 mg/kg, oko 70 mg/kg, oko 75 mg/kg, oko 80 mg/kg, oko 85 mg/kg, oko 90 mg/kg, oko 95 mg/kg, oko 100 mg/kg ili njihova kombinacija (tj. svaka doza mesečne doze može ili ne mora biti identična).

[0518] U jednom otelotvorenju, pacijentu se daje jedna doza antitela ili fragmenta pronalaska radi sprečavanja, upravljanja, tretiranja i/ili ublažavanja bolesti posredovane hOX40L-om dva, tri, četiri, pet ili šest puta u dvomesečnim intervalima (npr. oko 60 dana) tokom godine, pri čemu se doza bira iz grupe koja se sastoji od oko 0,1 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 30 mg/kg, oko 35 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 45 mg/kg, oko 50 mg/kg, oko 55 mg/kg, oko 60 mg/kg, oko 65 mg/kg, oko 70 mg/kg, oko 75 mg/kg, oko 80 mg/kg, oko 85 mg/kg, oko 90 mg/kg, oko 95 mg/kg, oko 100 mg, ili njihova kombinacija (tj. svaka dvomesečna doza može biti ili ne mora biti identična).

[0519] U nekim otelotvorenjima, jednokratna doza antitela ili fragmenta pronalaska daje se pacijentu radi sprečavanja, upravljanja, tretiranja i/ili ublažavanja bolesti posredovane hOX40L-om, dva, tri ili četiri puta u intervalima od oko tri meseca (npr. oko 120 dana) tokom godine, pri čemu se doza bira iz grupe koja se sastoji od oko 0,1 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 30 mg/kg, oko 35 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 45 mg/kg, oko 50 mg/kg, oko 55 mg/kg, oko 60 mg/kg, oko 65 mg/kg, oko 70 mg/kg, oko 75 mg/kg, oko 80 mg/kg, oko 85 mg/kg, oko 90 mg/kg, oko 95 mg/kg, oko 100

1

mg/kg, ili njihova kombinacija (tj. svaka tromesečna doza može biti identična ili ne mora biti identična).

[0520] U određenim otelotvorenjima, put primene doze antitela ili fragmenta pronalaska kod pacijenta je intranazalan, intramuskularan, intravenozan ili njihova kombinacija, ali su prihvatljivi i drugi putevi opisani u ovom dokumentu. Kod određenih otelotvorenja, put primene je intraokularan. Svaka doza se može ili ne mora primenjivati na identičan način primene. U nekim otelotvorenjima, antitelo ili fragment pronalaska može se primeniti na više načina primene istovremeno ili naknadno na druge doze istog ili drugog antitela ili fragmenta pronalaska.

[0521] U nekim otelotvorenjima, antitela ili fragmenti pronalaska se daju profilaktički ili terapijski ispitaniku. Antitela ili fragmenti pronalaska mogu se profilaktički ili terapijski primeniti na ispitaniku kako bi se sprečila, smanjila ili ublažila bolest posredovana hOX40L-om ili njen simptom.

Genska terapija

[0522] Sekvence nukleinske kiseline ili nukleotida opisa se primenjuju za sprečavanje, upravljanje, tretiranje i/ili ublažavanje bolesti posredovane hOX40L-om putem genske terapije. Genska terapija se odnosi na terapiju koja se vrši putem primene ispitaniku eksprimirane ili ekspresibilne nukleinske kiseline. Nukleinske kiseline mogu proizvesti svoje kodirano antitelo, a antitelo posreduje u profilaktičkom ili terapijskom dejstvu.

[0523] Može se koristiti bilo koja od metoda za gensku terapiju dostupnih u stanju tehnike.

Dijagnostička upotreba antitela

[0524] Iako se antitela pominju u pogledu dijagnostičke upotrebe, ovo obelodanjivanje se takođe mutatis mutandis primenjuje na fragmente pronalaska.

[0525] Označena antitela ili pronalaska i njihovi derivati i analozi, koji se specifično vezuju za antigen hOX40L, mogu se koristiti u dijagnostičke svrhe za otkrivanje,

1

dijagnostikovanje ili praćenje bolesti posredovane hOX40L-om. Ovde opisane su metode za otkrivanje bolesti posredovane hOX40L-om koje obuhvataju: (a) testiranje ekspresije antigena hOX40L u ćelijama ili uzorku tkiva ispitanika koristeći jedno ili više antitela koja se specifično vezuju za antigen hOX40L; i (b) poređenje nivoa antigena hOX40L sa kontrolnim nivoom, npr. nivoima u normalnim uzorcima tkiva (npr. od pacijenta koji nema bolest posredovanu hOX40L-om ili od istog pacijenta pre nastanka bolesti), pri čemu povećanje testnog nivoa antigena hOX40L u poređenju sa kontrolnim nivoom antigena hOX40L ukazuje na bolest posredovanu hOX40L-om.

[0526] Opisano ovde je dijagnostički test za dijagnostiku bolesti posredovane hOX40L-om koji obuhvata: (a) testiranje nivoa antigena hOX40L u ćelijama ili uzorku tkiva pojedinca koristeći jedno ili više antitela koja se specifično vezuju za antigen hOX40L; i (b) poređenje nivoa antigena hOX40L sa kontrolnim nivoom, npr. nivoima u uzorcima normalnog tkiva, pri čemu je povećanje testiranog nivoa antigena hOX40L u poređenju sa kontrolnim nivoom antigena hOX40L indikativno za bolest posredovanu hOX40L-om. Definitivnija dijagnoza bolesti posredovane hOX40L-om može omogućiti zdravstvenim radnicima da primene preventivne mere ili agresivno tretiranje ranije, čime se sprečava razvoj ili dalje napredovanje bolesti posredovane hOX40L-om.

[0527] Antitela pronalaska mogu se koristiti za testiranje nivoa hOX40L antigena u biološkom uzorku koristeći klasične imunohistološke metode opisane ovde ili poznate stručnjacima (npr., vidi Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol.101:976-985; i Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096). Druge metode zasnovane na antitelima korisne za otkrivanje ekspresije proteinskih gena uključuju imunotestove, kao što su enzimski imunosorbentni test (ELISA) i radioimunološki test (RIA).

Odgovarajuće oznake testa antitela su poznate u stanju tehnike i uključuju enzimske oznake, kao što su glukoza oksidaza; radioizotopi, kao što su jod (<125>I,<121>I) ugljenik (<14>C), sumpor (<35>S), tricijum (<3>H), indijum (<121>In) i tehnecijum (<99>Tc); luminiscentne oznake, kao što je luminol; i fluorescentne oznake, kao što su fluorescein i rodamin, i biotin.

1

[0528] Jedan vid opisa je detekcija i dijagnostika bolesti posredovane hOX40L-om kod čoveka. Dijagnoza može da sadrži: a) davanje (na primer, parenteralno, supkutano ili intraperitonealno) ispitaniku efikasne količine obeleženog antitela koje se specifično vezuje za hOX40L antigen; b) čekanje na vremenski interval nakon davanja dozvoljavajući da se obeleženo antitelo preferencijalno koncentriše na mestima u ispitaniku gde je eksprimiran antigen hOX40L (i da nevezani obeleženi molekul bude očišćen do nivoa pozadine); c) određivanja nivoa pozadine; i d) detekcije obeleženog antitela u ispitaniku, tako da detekcija obeleženog antitela iznad nivoa pozadine ukazuje da ispitanik ima bolest posredovanu hOX40L-om. Pozadinski nivo se može odrediti različitim metodama, uključujući poređenje količine detektovanog obeleženog molekula sa standardnom vrednošću koja je prethodno određena za određeni sistem.

[0529] U struci će se razumeti da će veličina ispitanika i korišćenog sistema za snimanje odrediti kvantitet dela koji se snima, a koji je potreban za izradu dijagnostičkih slika. U slučaju radioaktivnog izotopa, za humanog ispitanika, količina ubrizgane radioaktivnosti će se obično kretati od oko 5 do 20 milicuries<99>Tc.

Označeno antitelo će se zatim preferencijalno akumulirati na lokaciji ćelija koje sadrže određeni protein. In vivo snimanje tumora je opisano u S. W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Poglavlje 13 u Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S. W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc.

[0530] U zavisnosti od nekoliko promenljivih, uključujući tip oznake koja se koristi i način primene, vremenski interval nakon primene za omogućavanje označenom antitelu da se preferencijalno koncentriše na mestima u ispitaniku i da se nevezano označeno antitelo očisti na nivo pozadine je 6 do 48 sati ili 6 do 24 sata ili 6 do 12 sati. U drugom otelotvorenju, vremenski interval nakon primene je 5 do 20 dana ili 5 do 10 dana.

[0531] Praćenje bolesti posredovane hOX40L-om može se sprovesti ponavljanjem metode za dijagnostikovanje bolesti posredovane hOX40L-om, na primer, mesec dana nakon početne dijagnoze, šest meseci nakon početne dijagnoze, godinu dana nakon početne dijagnoze, itd.

1

[0532] Prisustvo obeleženog molekula može se detektovati kod ispitanika metodama poznatim u struci za skeniranje in vivo. Ove metode zavise od vrste oznake koja se koristi. Kvalifikovani stručnjaci će moći da odrede odgovarajuću metodu za detekciju određene oznake. Metode i uređaji koji se mogu koristiti u ovde opisanim dijagnostičkim metodama uključuju, ali nisu ograničeni na, kompjuterizovanu tomografiju (CT), skeniranje celog tela kao što je poziciona emisiona tomografija (PET), magnetna rezonanca (MRI) i sonografija.

[0533] Molekul može biti obeležen radioizotopom i detektovan je kod pacijenta pomoću hirurškog instrumenta koji reaguje na zračenje (Thurston et al. SAD Pat. Br.

5,441,050). Molekul može biti obeležen fluorescentnim jedinjenjem i detektuje se kod pacijenta pomoću instrumenta za skeniranje koji reaguje na fluorescenciju. Molekul može biti obeležen pozitronom koji emituje metal i detektuje se kod pacijenta pomoću pozitronske emisione tomografije. Molekul može biti obeležen paramagnetskim obeleživačem i detektuje se kod pacijenta pomoću magnetne rezonance (MRI).

Metode proizvodnje antitela

[0534] Antitela i fragmenti pronalaska koji se specifično vezuju za antigen (OX40L) mogu se proizvesti bilo kojom metodom poznatom u struci za sintezu antitela, posebno hemijskom sintezom ili, poželjno, tehnikama rekombinantne ekspresije. Praksa opisa koristi, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike u molekularnoj biologiji, mikrobiologiji, genetskoj analizi, rekombinantnoj DNK, organskoj hemiji, biohemiji, PCR, sintezi i modifikaciji oligonukleotida, hibridizaciji nukleinskih kiselina i srodnim poljima u okviru stanja tehnike. Ove tehnike su opisane u ovde navedenim referencama i u potpunosti su objašnjene u literaturi. Vidi, npr. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984)

14

Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al.

(eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

[0535] Poliklonska antitela koja se specifično vezuju za antigen mogu se proizvesti različitim procedurama poznatim u stanju tehnike. Na primer, humani antigen se može primeniti na različitim životinjama domaćinima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, zečeve, miševe, pacove, itd. kako bi se indukovala proizvodnja seruma koji sadrže poliklonska antitela specifična za humani antigen. Razni adjuvansi se mogu koristiti za povećanje imunološkog odgovora, u zavisnosti od vrste domaćina, i uključuju, ali nisu ograničeni na, Freund-ove (kompletan i nekompletan), mineralne gelove kao što je aluminijum hidroksid, površinski aktivne supstance kao što su lizolecitin, pluronski polioli, polianjoni, peptidi, emulzije ulja, hemocijanini u obliku ključaonice, dinitrofenol, i potencijalno korisni humani adjuvansi kao što su BCG (bacil Calmette-Guerin) i corynebacterium parvum. Takvi adjuvansi su takođe dobro poznati u struci.

[0536] Monoklonska antitela mogu se pripremiti korišćenjem najrazličitijih tehnika poznatih u struci, uključujući upotrebu hibridoma, rekombinantnih tehnologija i tehnologija prikaza faga, ili njihove kombinacije. Na primer, monoklonska antitela se mogu proizvesti korišćenjem hibridomskih tehnika, uključujući one poznate u struci i navedene, na primer, u Harlou et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988); Hammerling et al., u: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563681 (Elsevier, N.Y., 1981) . Izraz "monoklonsko antitelo" kao što se ovde koristi nije ograničen na antitela proizvedena tehnologijom hibridoma. Druge primerne metode stvaranja monoklonskih antitela se razmatraju na drugim mestima, kao što je npr. upotreba KM Mouse<™>. Dodatne primerne metode stvaranja monoklonskih antitela date su u Primerima ovde.

[0537] Metode za proizvodnju i skrining specifičnih antitela koristeći hibridom tehnologiju su rutinske i dobro poznate u struci. Ukratko, miševi se mogu imunizovati antigenom hOX40L i kada se detektuje imuni odgovor, npr. u serumu miša se detektuju antitela specifična za antigen hOX40L, uzima se slezina miša i izoluju splenociti. Splenociti se zatim spajaju dobro poznatim tehnikama sa bilo kojim odgovarajućim ćelijama mijeloma, na primer ćelijama iz ćelijske linije SP20 dostupnim iz ATCC. Hibridomi se biraju i kloniraju ograničenim razblaživanjem.

[0538] Pored toga, tehnika RIMMS (repetitivna imunizacija na više mesta) može se koristiti za imunizaciju životinje (Kilptrack et al., 1997 Hybridoma 16:381-9). Klonovi hibridoma se zatim testiraju metodama poznatim u struci za ćelije koje luče antitela sposobna da vežu polipeptid opisan ovde. Tečnost u abdomenu, koja generalno sadrži visok nivo antitela, može biti generisana imunizacijom miševa sa klonovima pozitivnih hibridoma.

[0539] Shodno tome, ovde su opisane metode generisanja antitela kultivišući ćeliju hibridoma koja luči modifikovano antitelo, pri čemu, poželjno, hibridom nastaje fuzijom splenocita izolovanih iz miša imunizovanog hOX40L antigenom sa ćelijama mijeloma, a zatim skriningom hibridoma koji su rezultat fuzije za klonove hibridoma koji izlučuju antitelo sposobno da se veže za hOX40L antigen.

[0540] Fragmenti antitela koji prepoznaju specifične antigene hOX40L mogu se generisati bilo kojom tehnikom poznatom stručnjacima. Na primer, Fab i

F(ab')2 fragmenti pronalaska mogu biti proizvedeni proteolitičkim cepanjem molekula imunoglobulina, koristeći enzime kao što su papain (za proizvodnju Fab fragmenata) ili pepsin (za proizvodnju F(ab')2 fragmenata). F(ab')2 fragmenti sadrže varijabilni region, konstantni region lakog lanca i domen CH1 teškog lanca. Dalje, antitela ovog pronalaska se takođe mogu generisati pomoću različitih metoda prikaza faga poznatih u struci.

[0541] Na primer, antitela se takođe mogu generisati različitim metodama prikaza faga. U metodama prikaza faga, funkcionalni domeni antitela su prikazani na površini čestica faga koje nose polinukleotidne sekvence koje ih kodiraju. Konkretno, sekvence DNK koje kodiraju VH i VL domene se pojačavaju iz biblioteka cDNK životinja (npr. humane ili mišje cDNK biblioteke zahvaćenih tkiva). DNK koja kodira VH i VL domene se rekombiniraju zajedno sa scFv linkerom pomoću PCR i kloniraju u fagemid vektor. Vektor je elektropermeabilizovan u E. coli, a E. coli je zaražena helper fagom. Fagi koji se koriste u ovim metodama su obično filamentozni fagi uključujući fd i M13 i VH i VL domeni su obično rekombinantno fuzionisani ili sa genom faga III ili genom VIII. Fag koji eksprimira antigen vezujući domen koji se vezuje za određeni antigen može biti izabran ili identifikovan sa antigenom, npr. korišćenjem obeleženog antigena ili antigena vezanog ili zarobljenog za čvrstu površinu ili perlu. Primeri metoda prikaza faga koji se mogu koristiti za stvaranje antitela ovog pronalaska uključuju ona koja su obelodanjena u Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol.24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280; PCT prijava br. PCT/GB91/01134; Međunarodna objava br. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, i WO97/13844; i SAD. Pat. br.

5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571 ,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 i 5,969,108;.

[0542] Kao što je opisano u gornjim referencama, nakon odabira faga, regioni za kodiranje antitela iz faga mogu biti izolovani i korišćeni za generisanje celih antitela, uključujući humana antitela, ili bilo koji drugi željeni fragment koji vezuje antigen, i eksprimira u bilo kom željenom domaćinu, uključujući ćelije sisara, ćelije insekata, biljne ćelije, kvasac i bakterije, npr., kao što je opisano u nastavku. Tehnike za rekombinantnu proizvodnju Fab, Fab' i F(ab')2 fragmenata takođe se mogu koristiti metodama poznatim u struci kao što su one objavljene u PCT publikaciji br. WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6): 864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34; i Better et a/., 1988, Science 240: 1041-1043.

[0543] Za generisanje celih antitela, PCR prajmeri, uključujući VH ili VL nukleotidne sekvence, mesto ograničenja i sekvenca bokova za zaštitu mesta ograničenja mogu se koristiti za pojačavanje VH ili VL sekvenci kod klonova scFv. Koristeći tehnike kloniranja poznate stručnjacima, PCR pojačani VH domeni mogu biti klonirani u vektore koji eksprimiraju VH konstantni region, npr. humani gama 4 konstantni region, a PCR pojačani VL domeni mogu biti klonirani u vektore koji eksprimiraju VL konstantni region, npr. humane kapa ili lambda konstantne regione. VH i VL domeni takođe mogu biti klonirani u jedan vektor koji eksprimira neophodne konstantne regione. Vektori konverzije teških lanaca i vektori konverzije lakih lanaca se zatim

14

ko-transferuju u ćelijske linije kako bi se generisale stabilne ili tranzijentne ćelijske linije koje eksprimiraju antitela pune dužine, npr. IgG, koristeći tehnike poznate stručnjacima.

[0544] Za neke upotrebe, uključujući in vivo upotrebu antitela kod ljudi i testove detekcije in vitro, može biti poželjno koristiti humana ili himerna antitela. Potpuno humana antitela su posebno poželjna za terapijsko lečenje humanih ispitanika.

Humana antitela se mogu napraviti različitim metodama poznatim u struci, uključujući gore opisane metode prikaza faga koristeći biblioteke antitela dobijenih iz sekvenci humanog imunoglobulina. Vidi i SAD Pat. Br.4.444.887 i 4.716.111; i Međunarodna publikacija br. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 i WO 91/10741.

[0545] U poželjnim otelotvorenjima, stvaraju se humana antitela. Humana antitela i/ili potpuno humana antitela mogu se proizvesti bilo kojom metodom poznatom u struci, uključujući primere navedene u ovom dokumentu. Na primer, transgeni miševi koji su nesposobni da eksprimiraju funkcionalne endogene imunoglobuline, ali koji mogu da eksprimiraju gene humanog imunoglobulina. Na primer, kompleksi gena teških i lakih lanaca humanog imunoglobulina mogu biti uneti nasumično ili homolognom rekombinacijom u embrionalne matične ćelije miša. Alternativno, humani varijabilni region, konstantni region i region diverziteta mogu se uvesti u embrionalne matične ćelije miša pored teških i lakih lanaca humanih gena. Teški i laki lanac imunoglobulinskih gena miša mogu se učiniti nefunkcionalnim odvojeno ili istovremeno sa uvođenjem lokusa humanog imunoglobulina homolognom rekombinacijom. Konkretno, homozigotna delecija JH regiona sprečava proizvodnju endogenih antitela. Modifikovane embrionalne matične ćelije su ekspandirane i mikroinjektirane u blastociste da bi se proizveli himerični miševi. Himerični miševi se zatim uzgajaju tako da proizvode homozigotno potomstvo koje eksprimira humana antitela. Transgeni miševi su imunizovani na normalan način sa izabranim antigenom, npr., celim ili delom polipeptida pronalaska. Monoklonska antitela usmerena protiv antigena mogu se dobiti od imunizovanih, transgenih miševa koristeći konvencionalnu hibridomsku tehnologiju. Humani transnoglobulinski transgeni koje gaje transgeni miševi se preuređuju tokom diferencijacije B-ćelija, a nakon toga prolaze klasnu promenu i somatsku mutaciju. Dakle, primenom takve tehnike moguće je proizvesti terapeutski korisna IgG, IgA, IgM i IgE antitela. Za pregled ove tehnologije za proizvodnju humanih antitela, videti Lonberg i Huszar (1995, Int. Rev. Immunol.13:65-93). Za detaljnu diskusiju o ovoj tehnologiji za proizvodnju humanih antitela i humanih monoklonskih antitela i protokolima za proizvodnju takvih antitela, videti, npr., PCT publikacija br. WO 98/24893, WO 96/34096 i WO 96/33735; i SAD Pat. Br.5.413.923 , 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318 i 5.939.598. Ostale metode su detaljno opisane u ovde navedenim primerima. Pored toga, kompanije kao što su Abgenix, Inc/Amgen. (Thousand Oaks, Calif.) OMT (San Paolo Alto, Calif.), Argen-x (Breda, Netherlands), Ablexis (San Francisco, Calif.) ili Harbour Antibodies (Cambridge, Mass.) mogu biti angažovana da obezbede humana antitela usmerena protiv izabranog antigena koristeći tehnologiju sličnu onoj koja je gore opisana.

[0546] Himeričko antitelo je molekul u kome su različiti delovi antitela dobijeni iz različitih molekula imunoglobulina. Metode za proizvodnju himernih antitela su poznate u struci. Vidi, npr., Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et a/., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; i SAD Pat. Br.5.807.715, 4.816.567, 4.816.397 i 6.331.415.

[0547] Humanizovano antitelo je antitelo ili njegova varijanta ili fragment koji je sposoban da se veže za unapred određeni antigen i koji obuhvata okvirni region koji u suštini ima aminokiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina i CDR koji u suštini ima aminokiselinsku sekvencu ne-humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo obuhvata u suštini sve od najmanje jednog, i obično dva, varijabilna domena (Fab, Fab', F(ab)2, Fabc, Fv) u kojima svi ili u suštini svi CDR regioni odgovaraju onima nehumanog imunoglobulina (tj. donorskog antitela) i svi ili u suštini svi okvirni regioni su oni konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Poželjno, humanizovano antitelo takođe obuhvata najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično humanog imunoglobulina. Obično, antitelo će sadržati i laki lanac, kao i najmanje varijabilni domen teškog lanca. Antitelo takođe može uključivati CH1, šarku, CH2, CH3 i CH4 regione teškog lanca. Humanizovano antitelo se može izabrati iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo kog izotipa, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Obično konstantni domen je konstantni domen fiksiranja komplementa gde se želi da humanizovano antitelo ispoljava citotoksičnu

14

aktivnost, a klasa je obično IgG1. Ako takva citotoksična aktivnost nije poželjna, konstantni domen može biti klase IgG2. U određenim otelotvorenjima, antitela pronalaska čine humani gama 4 konstantni region. U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca ne vezuje Fc-y receptore, i npr. obuhvata mutaciju Leu235Glu. U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca obuhvata mutaciju Ser228Pro kako bi se povećala stabilnost. U drugom otelotvorenju, konstantni region teškog lanca je IgG4-PE. Primeri VL i VH konstantnih domena koji se mogu koristiti u određenim otelotvorenjima pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, C-kapa i C-gama-1 (nG1m) opisane u Johnson et al. (1997) J. Infect. Dis. 176, 1215-1224 i oni opisani u SAD Pat. br.5.824.307. Humanizovano antitelo može da sadrži sekvence iz više od jedne klase ili izotipa, a odabir određenih konstantnih domena za optimizaciju željenih efektorskih funkcija je u okviru uobičajene stručnosti. Okvirni i CDR regioni humanizovanog antitela ne moraju da odgovaraju precizno roditeljskim sekvencama, npr. donorski CDR ili konsenzus okvir mogu biti mutagenizovani supstitucijom, insercijom ili delecijom najmanje jednog ostatka tako da CDR ili okvirni ostatak na tom mestu ne odgovaraju ni konsenzus ni importovanom antitelu. Međutim, takve mutacije neće biti obimne. Obično, najmanje 75% ostataka humanizovanih antitela će odgovarati ostacima roditeljskih sekvenci FR i CDR, češće 90%, i najpoželjnije više od 95%. Humanizovana antitela se mogu proizvesti korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, CDR-presađivanje (Evropski patent br. EP 239.400;

Međunarodna publikacija br. WO 91/09967; i SAD Pat. Br.5.225.539, 5.530.101 i 5.585.089), fasetiranje ili oblaganje (Evropski patent br. EP 592,106 i EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; i Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973), mešanje lanca (SAD Pat. br.5,565,332), i tehnike obelodanjene u , npr., SAD Pat. br. 6,407,213, SAD Pat. br.5,766,886, WO 9317105, Tan et al., J. Immunol.

169:1119 25 (2002), Caldas et al., Protein Eng.13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):26779 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem.272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng.9(10):895 904 (1996), Couto et al., Cancer Res.

55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res.55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene 150(2):409-10 (1994), i Pedersen et al., J. Mol. Biol.

235(3):959-73 (1994). Vidi takođe SAD Patent Pub. br. US 2005/0042664 A1 (Feb.

24, 2005). Često će okvirni ostaci u okvirnim regionima biti supstituisani

14

odgovarajućim ostacima iz CDR antitela donora kako bi se izmenilo, poželjno poboljšalo, vezivanje antigena. Ove okvirne supstitucije su identifikovane metodama dobro poznatim u struci, npr. modeliranjem interakcija CDR i okvirnih ostataka za identifikaciju okvirnih ostataka važnih za vezivanje antigena i poređenje sekvenci za identifikaciju neobičnih okvirnih ostataka na određenim pozicijama. (Vidi, npr., Queen et al. SAD Pat. br.5,585,089; i Reichmann et al., 1988, Nature 332:323.

[0548] Antitela jednog domena, na primer, antitela kojima nedostaju laki lanci, mogu se proizvesti metodama dobro poznatim u struci. Vidi Riechmann et al., 1999, J. Immunol. 231:25-38; Nuttall et al., 2000, Curr. Pharm. Biotechnol.1(3):253-263; Muylderman, 2001, J. Biotechnol.74(4):277302; SAD Pat. Br.6,005,079; i Međunarodna publikacija br. WO 94/04678, WO 94/25591 i WO 01/44301.

[0549] Dalje, antitela koja se specifično vezuju za hOX40L antigen mogu se koristiti za generisanje anti-idiotipskih antitela koja "oponašaju" antigen koristeći tehnike dobro poznate stručnjacima. (Vidi, npr., Greenspan & Bona, 1989, FASEB J.

7(5):437-444; i Nissinoff, 1991, J. Immunol., 147(8):2429-2438).

Kompleti

[0550] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsko ili dijagnostičko pakovanje ili komplet koji se sastoji od jednog ili više kontejnera napunjenih jednim ili više sastojaka farmaceutskog sastava pronalaska, kao što su jedno ili više antitela ili fragmenata datih u ovom dokumentu. Opciono povezano sa takvim kontejnerom(ima) može biti obaveštenje u obliku koji propisuje državna agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih ili bioloških proizvoda, koje obaveštenje odražava odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za humanu primenu, npr. broj odobrenja.

[0551] Ovaj pronalazak pruža komplete koji se mogu koristiti u gore navedenim metodama. U jednom otelotvorenju, komplet se sastoji od antitela pronalaska, poželjno prečišćenog antitela, u jednom ili više kontejnera. U određenom otelotvorenju, kompleti ovog pronalaska sadrže znatno izolovani antigen hOX40L kao kontrolu. Poželjno, kompleti ovog pronalaska se dalje sastoje od kontrolnog antitela koje ne reaguje sa antigenom hOX40L. U drugom specifičnom otelotvorenju,

14

kompleti ovog pronalaska sadrže sredstvo za detekciju vezivanja modifikovanog antitela za antigen hOX40L (npr. antitelo može biti konjugovano sa supstratom koji se može detektovati, kao što je fluorescentno jedinjenje, enzimski supstrat, radioaktivno jedinjenje ili luminiscentno jedinjenje, ili drugo antitelo koje prepoznaje prvo antitelo može biti konjugovano sa supstratom koji se može detektovati). U specifičnim otelotvorenjima, komplet može uključivati rekombinantno proizveden ili hemijski sintetisan hOX40L antigen. Antigen hOX40L koji se nalazi u kompletu takođe može biti pričvršćen na čvrstu potporu. U specifičnijem otelotvorenju, sredstvo za detekciju gore opisanog kompleta uključuje čvrstu potporu na koju je prikačen antigen hOX40L. Takav komplet takođe može uključivati nepriključeno reporter-obeleženo anti-humano antitelo. U ovom otelotvorenju, vezivanje antitela za hOX40L antigen može se detektovati vezivanjem pomenutog antitela sa obeležjem reportera.

[0552] „Konzervativne aminokiselinske supstitucije“ nastaju zamenom jedne aminokiseline drugom koja ima slična strukturna i/ili hemijska svojstva, kao što je zamena leucina izoleucinom ili valinom, aspartata glutamatom ili treonina serinom. Dakle, "konzervativna supstitucija" određene aminokiselinske sekvence odnosi se na supstituciju onih aminokiselina koje nisu kritične za aktivnost polipeptida ili supstituciju aminokiselina sa drugim aminokiselinama koje imaju slična svojstva (npr. kisele, bazne, pozitivno ili negativno naelektrisane, polarne ili nepolarne, itd.) tako da supstitucija čak i kritičnih aminokiselina ne smanjuje aktivnost peptida (tj. sposobnost peptida da penetrira krvno-moždanu barijeru (BBB)). Tabele konzervativne supstitucije koje pružaju funkcionalno slične aminokiseline su dobro poznate u struci. Na primer, sledećih šest grupa sadrže aminokiseline koje su konzervativne supstitucije međusobno: 1) Alanin (A), Serin (S), Treonin (T); 2) Asparaginska kiselina (D), Glutaminska kiselina (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lizin (K); 5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V); i 6) Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W). (Vidi takođe Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984)). U nekim otelotvorenjima, pojedinačne supstitucije, delecije ili adicije koje menjaju, dodaju ili brišu jednu aminokiselinu ili mali procenat aminokiselina mogu se takođe smatrati "konzervativnim supstitucijama" ako promena ne smanjuje aktivnost peptida. Insercije ili delecije su obično u rasponu od oko 1 do 5 aminokiselina. Izbor konzervativnih aminokiselina može se izabrati na

14

osnovu lokacije aminokiseline koja se supstituiše u peptidu, na primer ako se aminokiselina nalazi na spoljašnjosti peptida i izložena je rastvaračima, ili u unutrašnjosti i nije izložena rastvaračima.

[0553] Može se izabrati aminokiselina koja će supstituisati postojeću aminokiselinu na osnovu lokacije postojeće aminokiseline, tj. njene izloženosti rastvaračima (tj. ako je aminokiselina izložena rastvaračima ili je prisutna na spoljnoj površini peptida ili polipeptida u poređenju sa interno lokalizovanim aminokiselinama koje nisu izložene rastvaračima). Izbor takvih konzervativnih aminokiselinskih supstitucija je dobro poznat u struci, na primer kao što je objavljeno u Dordo et al, J. Mol Biol, 1999, 217, 721-739 i Taylor et al., Theor J. Biol.119(1986); 205-218 i S. French i B. Robson, J. Mol. Evol., 19(1983)171. Shodno tome, mogu se izabrati konzervativne aminokiselinske supstitucije pogodne za aminokiseline na spoljašnosti proteina ili peptida (tj. aminokiseline izložene rastvaraču), na primer, mogu se koristiti, ali ne ograničavajući se na, sledeće supstitucije: supstitucija Y sa F, T sa S ili K, P sa A, E sa D ili Q, N sa D ili G, R sa K, G sa N ili A, T sa S ili K, D sa N ili E, I sa L ili V, F sa Y, S sa T ili A, R sa K, G sa N ili A, K sa R, A sa S, K ili P.

[0554] Mogu se izabrati i konzervativne aminokiselinske supstitucije koje su pogodne za aminokiseline u unutrašnjosti proteina ili peptida, na primer mogu se koristiti odgovarajuće konzervativne supstitucije za aminokiseline koje su u unutrašnjosti proteina ili peptida (tj. aminokiseline nisu izložene rastvaraču), na primer, ali ne ograničavajući se na, mogu se koristiti sledeće konzervativne supstitucije: gde se Y zamenjuje sa F, T sa A ili S, I sa L ili V, W sa Y, M sa L, N sa D, G sa A, T sa A ili S, D sa N, I sa L ili V, F sa Y ili L, S sa A ili T i A sa S, G, T ili V. Nekonzervativne aminokiselinske supstitucije takođe mogu biti obuhvaćene u okviru izraza varijanti.

[0555] Kao što se ovde koristi, "antitelo" se odnosi na IgG, IgM, IgA, IgD ili IgE molekule ili njihove fragmente antitela specifičnih za antigen (uključujući, ali ne ograničavajući se na, Fab, F(ab')2, Fv, disulfidno povezan Fv, scFv, antitelo jednog domena, multispecifično antitelo zatvorene konformacije, disulfidno povezano scfv, dijatelo), bilo da potiče od bilo koje vrste koja prirodno proizvodi antitelo ili je stvoreno tehnologijom rekombinantne DNK; bilo da je izolovano iz seruma, B-ćelija,

14

hibridoma, transfektoma, kvasca ili bakterija. Antitela se mogu humanizovati koristeći rutinsku tehnologiju.

[0556] Kao što je ovde opisano, „antigen“ je molekul koji je vezan mestom vezivanja na agens antitela. Tipično, antigeni su vezani ligandima antitela i sposobni su da podignu odgovor antitela in vivo. Antigen može biti polipeptid, protein, nukleinska kiselina ili drugi molekul ili njegov deo. Izraz "antigenska determinanta" odnosi se na epitop na antigenu koji je prepoznat od strane antigen-vezujućeg molekula, a posebno od strane antigen-vezujućeg mesta pomenutog molekula.

[0557] Kao što se ovde koristi, izraz "fragment antitela" se odnosi na polipeptid koji uključuje najmanje jedan varijabilni domen imunoglobulina ili sekvencu varijabilnog domena imunoglobulina i koji specifično vezuje dati antigen. Fragment antitela se može sastojati od antitela ili polipeptida koji se sastoji od antigen-vezujućeg domena antitela. U nekim otelotvorenjima, fragment antitela može da se sastoji od monoklonskog antitela ili polipeptida koji se sastoji od antigen-vezujućeg domena monoklonskog antitela. Na primer, antitelo može uključivati varijabilni region teškog (H) lanca (skraćeno ovde kao VH) i varijabilni region OX40L (L) lanca (skraćeno ovde kao VL). U drugom primeru, antitelo uključuje dva varijabilna regiona teškog (H) lanca i dva varijabilna regiona OX40L (L) lanca. Izraz "fragment antitela" obuhvata fragmente antitela koji vezuju antigen (npr. fragmente Fab i sFab, fragmente F(ab')2, fragmente Fd, fragmente Fv, fragmente scFv jednolančanog antitela i fragmente domena antitela (dAb) (videti, npr. de Wildt et al., Eur J.

Immunol., 1996; 26(3): 629-39) kao i kompletna antitela. Antitelo može imati strukturne karakteristike IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (kao i podtipove i njihove kombinacije). Antitela mogu biti iz bilo kog izvora, uključujući miša, zeca, svinju, pacova i primata (humani i ne-humani primat) i primatizovana antitela. U antitela spadaju i miditela, humanizovana antitela, himerna antitela i slično.

[0558] Kao što se ovde koristi, "varijabilni domen antitela" se odnosi na delove OX40L i teške lance molekula antitela koji uključuju aminokiselinske sekvence regiona određivanja komplementarnosti (CDRi; tj. CDR1, CDR2 i CDR3) i okvirnih regiona (FRi). VH se odnosi na varijabilni domen teškog lanca. VL se odnosi na varijabilni domen lakog lanca. Prema ovde opisanim metodama, pozicije

1

aminokiselina dodeljene CDR i FR mogu se definisati prema Kabatu (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)) ili prema IMGT nomenklaturi.

[0559] Kao što se ovde koristi, izraz "mesto vezivanja antitela" se odnosi na polipeptid ili domen koji se sastoji od jednog ili više CDR antitela i koji je u stanju da veže antigen. Na primer, polipeptid se sastoji od CDR3 (npr. HCDR3). Na primer, polipeptid se sastoji od CDR 1 i 2 (npr. HCDR1 i 2) ili CDR 1-3 varijabilnog domena antitela (npr. HCDR 1-3). U jednom primeru, mesto vezivanja antitela je obezbeđeno jednim varijabilnim domenom (npr. domenom VH ili VL). U drugom primeru, mesto vezivanja obuhvata VH/VL par ili dva ili više takvih parova.

[0560] Kao što se ovde koristi, "genotipizacija" se odnosi na proces određivanja specifičnog alelnog sastava ćelije i/ili ispitanika na jednoj ili više pozicija unutar genoma, npr. određivanjem sekvence nukleinske kiseline na toj poziciji.

Genotipizacija se odnosi na analizu nukleinske kiseline i/ili analizu na nivou nukleinske kiseline. Kao što se ovde koristi, "fenotipizacija" se odnosi na proces određivanja identiteta i/ili sastava proizvoda ekspresije ćelije i/ili ispitanika, npr. određivanjem polipeptidne sekvence proizvoda ekspresije. Fenotipizacija se odnosi na analizu proteina i/ili analizu na nivou proteina.

[0561] Kao što se ovde koristi, izrazi "tretirati", "tretman", "tretiranje" ili "ublažavanje" odnose se na terapijske tretmane, pri čemu je cilj da se obrne, ublaži, poboljša, inhibira, uspori ili zaustavi progresija ili težina stanja povezanog sa bolešću ili poremećajem. Izraz „tretiranje“ uključuje smanjenje ili ublažavanje najmanje jednog štetnog efekta ili simptoma stanja, bolesti ili poremećaja. Tretiranje je generalno "efikasno" ako se smanji jedan ili više simptoma ili kliničkih markera. Alternativno, tretiranje je "efikasno" ako je progresija bolesti smanjena ili zaustavljena. Odnosno, „tretman“ obuhvata ne samo poboljšanje simptoma ili markera, već i prestanak, ili barem usporavanje simptoma progresije ili pogoršanja u odnosu na ono što bi se očekivalo u odsustvu tretiranja. Povoljni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, ublažavanje jednog ili više simptoma, smanjenje obima bolesti, stabilizovano (tj. ne pogoršavajuće) stanje bolesti, odlaganje ili usporavanje progresije bolesti, poboljšanje ili ublažavanje stanja bolesti, remisiju (bilo delimičnu ili

1 1

ukupnu) i/ili smanjenu smrtnost, bilo da se može detektovati ili ne. Izraz „tretman“ bolesti takođe uključuje pružanje olakšanja od simptoma ili neželjenih efekata bolesti (uključujući palijativno lečenje). Da bi tretman bio efikasan, ne razmišlja se o potpunom izlečenju. Metoda može u određenim aspektima uključivati i izlečenje.

[0562] Kao što se ovde koristi, izraz "farmaceutski sastav" odnosi se na aktivno sredstvo u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, npr. nosačem koji se obično koristi u farmaceutskoj industriji. Fraza "farmaceutski prihvatljivo" se ovde koristi da se odnosi na ona jedinjenja, materijale, sastave i/ili oblike doziranja koji su, u okviru ispravne medicinske procene, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudskih bića i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugog problema ili komplikacija, srazmerno razumnom odnosu koristi i rizika.

[0563] Kao što se ovde koristi, izraz "primena" se odnosi na plasman jedinjenja kako je ovde obelodanjeno u ispitanika metodom ili putem koji rezultira barem delimičnom isporukom agensa na željenu lokaciju. Farmaceutski sastavi koji obuhvataju jedinjenja koja su ovde obelodanjena mogu se primeniti na bilo koji odgovarajući način koji rezultira efikasnim tretmanom u ispitaniku.

[0564] Višestruki sastavi mogu se primeniti odvojeno ili istovremeno. Odvojena primena se odnosi na dva sastava koja se primenjuju u različito vreme, npr. u razmaku od najmanje 10, 20, 30 ili 10-60 minuta, ili u razmaku od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 časova. Takođe se mogu primenjivati sastavi u razmaku od 24 časa, ili čak i duže. Alternativno, dva ili više sastava mogu se primeniti istovremeno, npr. u razmaku manjem od 10 ili manjem od 5 minuta. Sastavi koji se primenjuju istovremeno mogu se, u nekim vidovima, primeniti kao mešavina, sa ili bez sličnog ili različitog mehanizma vremenskog oslobađanje za svaku od komponenti.

[0565] Kao što se ovde koristi, „broj dozvole“ ili „broj dozvole za stavljanje u promet“ odnosi se na broj koji je izdala regulatorna agencija nakon što je ta agencija utvrdila da određeni medicinski proizvod i/ili sastav mogu biti stavljeni u promet i/ili ponuđeni na prodaju u oblasti koja je u nadležnosti agencije. Kao što se ovde koristi, "regulatorna agencija" se odnosi na jednu od agencija odgovornih za procenu, npr. bezbednosti i efikasnosti medicinskog proizvoda i/ili sastava i kontrolu

1 2

prodaje/prometa takvih proizvoda i/ili sastava u određenoj oblasti. Uprava za hranu i lekove (FDA) u SAD i Evropska agencija za lekove (EPA) u Evropi su samo dva primera takvih regulatornih agencija. Drugi primeri bez ograničenja mogu da uključuju SDA, MPA, MHPRA, IMA, ANMAT, Kancelariju za lekove u Hong Kongu, CDSCO, Medsafe i KFDA.

[0566] Kao što se ovde koristi, "uređaj za injektiranje" se odnosi na uređaj koji je projektovan za sprovođenje injektiranja, injektiranje koje uključuje korake privremenog povezivanja fluida uređaja za injektiranje sa tkivom lica, obično potkožnim tkivom. Injekcija dalje uključuje davanje određene količine tečnog leka u tkivo i razdvajanje ili uklanjanje uređaja za injektiranje iz tkiva. U nekim otelotvorenjima, uređaj za injektiranje može biti intravenski uređaj ili IV uređaj, koji je vrsta uređaja za injektiranje koji se koristi kada je ciljno tkivo krv u sistemu cirkulacije, npr. krv u veni. Česti, ali neograničavajući primer uređaja za injektiranje su igla i špric.

[0567] Kao što se ovde koristi, „pufer“ se odnosi na hemijski agens koji je u stanju da apsorbuje određenu količinu kiseline ili baze bez većeg variranja pH.

[0568] Kao što se ovde koristi, „pakovanje“ se odnosi na način na koji su komponente organizovane i/ili ograničene u jedinicu koja odgovara za distribuciju i/ili upotrebu. Pakovanje može uključivati, npr. kutije, kese, špriceve, ampule, bočice, epruvete, preklopno pakovanje, barijere i/ili kontejnere za održavanje sterilnosti, etiketiranje itd.

[0569] Kao što se ovde koristi, "uputstvo" se odnosi na prikaz pisane, štampane ili grafičke materije na neposrednom kontejneru artikla, na primer pisanog materijala prikazanog na bočici koja sadrži farmaceutski aktivno sredstvo, ili detalja o sastavu i upotrebi proizvoda od interesa koji je uključen u komplet koji sadrži sastav od interesa. Uputstvo navodi način tretmana za koji se smatra da se primenjuje ili sprovodi.

[0570] Kao što se ovde koristi, izraz „koji obuhvata“ ili „obuhvata“ se koristi u vezi sa antitelima, fragmentima, upotrebama, sastavima, metodama i odgovarajućim

1

komponentama, koje su od suštinskog značaja za metodu ili sastav, ali su ipak otvorene za uključivanje neodređenih elemenata, bilo da su od suštinskog značaja ili ne.

[0571] Izraz "koji se sastoji od" odnosi se na antitela, fragmente, upotrebe, sastave, metode i njihove odgovarajuće komponente kako je opisano u ovom dokumentu, koji su isključeni od bilo kog elementa koji nije nabrojan u tom opisu otelotvorenja.

[0572] Kao što se ovde koristi, izraz "koji se u suštini sastoji od" odnosi se na one elemente koji su potrebni za dato otelotvorenje. Izraz dozvoljava prisustvo elemenata koji ne utiču materijalno na osnovne i nove ili funkcionalne karakteristike tog otelotvorenja.

[0573] Izrazi u jednini "jedan", i "jednom" uključuju referente množine, osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Slično tome, reč "ili" ima za cilj da uključi "i", osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Iako se metode i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim u ovom dokumentu mogu koristiti u praksi ili testiranju ovog obelodanjivanja, odgovarajuće metode i materijali su opisani u nastavku.

Skraćenica, "npr.", izvedena je iz latinske reči exempli gratia, i ovde se koristi za označavanje primera koji ne ograničava. Tako je skraćenica "npr." sinonim za izraz "na primer".

[0574] Definicije zajedničkih izraza u biologiji ćelija i molekularnoj biologiji mogu se naći u "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) i Current Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., eds.

[0575] Ukoliko nije drugačije navedeno, ovaj pronalazak je izveden korišćenjem standardnih procedura, kao što je opisano, na primer u Sambrook et al., Molecular

1 4

Cloning: A Laboratory Manual (4 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995); ili Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmel Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), i Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol.57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998).

PRIMERI

Primer 1

Priprema antigena, postupci imunizacije i generisanje hibridoma

[0576] Sledeći primer pruža detaljan opis generisanja i identifikacije panela antihumanih OX40L monoklonskih antitela koristeći KyMouse<™>sistem (videti,

npr. WO2011/004192). U tu svrhu, genetski inženjerirani miševi koji sadrže veliki broj gena humanog imunoglobulina imunizovani su rastvorljivim rekombinantnim humanim OX40L (komercijalnim ili internim proizvodima) ili površinski eksprimiranim humanim OX40L prikazanim na ćelijama mišjih embrionalnih fibroblasta (MEF).

Uspostavljeni su različiti režimi imunizacije, uključujući konvencionalne intraperitonealne injekcije, kao i režim brze imunizacije na više lokacija, što je podstaklo životinje tokom nekoliko nedelja. Na kraju svakog režima uklonjeno je sekundarno limfoidno tkivo kao što je slezina, a u nekim slučajevima i limfni čvorovi. Tkiva su pripremljena u jednoćelijskoj suspenziji i fuzionisana sa SP2/0 ćelijama kako bi se generisala stabilna ćelijska linija hibridoma.

Materijali i metode

Klonska ekspresija i prečišćavanje rekombinantnog Rhesus i humanog OX40L [0577] cDNK koja kodira ekstracelularni domen humanog OX40L je klonirana u PREP4 ekspresijski plazmid (Invitrogen) koristeći standardne tehnike molekularne biologije. Konstrukti su takođe sadržali motiv FLAG peptida za pomoć u

1

prečišćavanju i motiv izoleucinskog patent-zatvarača za pomoć u trimeraciji.

Konstrukti su sekvencirani da bi se osigurao njihov pravilan sastav sekvenci.

[0578] Rezus (Macaca mulatta) OX40L je proizveden korišćenjem humanog OX40L plazmida proizvedenog kao prethodno kao templata i korišćenjem lokaciono usmerene mutageneze za uvođenje aminokiselinskih promena.

[0579] Humani OX40L izvor kao i OX40L rezus majmuna su tranzijentno eksprimirani za proizvodnju rekombinantnog proteina koristeći ćelijsku liniju Invitrogen FreeStyle<™>CHO-S u suspenziji. Plazmidi su transfekovani u ćelije pomoću PEI (polietilenimin MW 40000) i ostavljeni da prekomerno rastu u periodu od 13 dana pre žetve supernatanta za prečišćavanje. Ćelije su hranjene tokom procesa prekomernog rasta sa ActiCHO<™>Feeds A i B iz GE Healthcare kako bi se povećala produktivnost i promovisala dugotrajnost ćelija. Tokom procesa prekomernog rasta uzorci su uzimani redovno radi praćenja razvoja i vijabilnosti ćelija.

[0580] FLAG-obeleženi OX40L proteini su prečišćeni u dvostepenom procesu; prvo, izbistreni supernatanti kulture tkiva iz CHO-S ekspresije su prečišćeni pomoću afinitetne hromatografije M2 anti-FLAG. Eluirane frakcije koje sadrže protein OX40L su zatim podvrgnute dimenziono ekskluzivnoj hromatografiji i procenjene na čistoću SDS-PAGE analizom i kvantifikovane spektrofotometarskim očitavanjem na OD280nm.

Klonska ekspresija i prečišćavanje rekombinantnog humanog OX40 receptora [0581] cDNK koja kodira ekstracelularni domen humanog OX40 receptora je klonirana u pREP4 ekspresijski plazmid (Invitrogen) koristeći standardnu digestiju restrikcionim enzimima i ligaciju. Konstrukt je sadržao humani Fc deo za pomoć u prečišćavanju. Konstrukti su sekvencirani da bi se osigurao njihov pravilan sastav sekvenci.

[0582] Humani OX40 receptor je tranzijentno eksprimiran da proizvodi rekombinantni protein koristeći ćelijsku liniju Invitrogen FreeStyle<™>CHO-S u suspenziji. Plazmidi su transfekovani u ćelije pomoću PEI (polietilenimin MW 40000) i ostavljeni da rastu u periodu od 13 dana pre žetve supernatanta za prečišćavanje. Ćelije su hranjene

1

tokom procesa prekomernog rasta sa ActiCHO<™>Feeds A i B iz GE Healthcare da pomogne povećanje produktivnosti i promoviše dugotrajnost ćelija. Tokom procesa prekomernog rasta, uzorci su uzimani redovno kako bi se pratio rast i vijabilnost ćelija.

[0583] Fc obeleženi protein OX40 receptora je prečišćen u dvostepenom procesu; prvo izbistreni supernatanti kulture tkiva iz CHO-S ekspresije su prečišćeni pomoću afinitetne hromatografije proteina G. Eluirane frakcije koje sadrže protein OX40 receptora su zatim podvrgnute dimenziono ekskluzivnoj hromatografiji i procenjene na čistoću putem SDS-PAGE analize i kvantifikovane spektrofotometrijskim očitavanjem na OD280nm.

Generisanje stabilno transfektovanih MEF i CHO-S ćelija koje eksprimiraju humani OX40L

[0584] Kompletno humane OX40L sekvence su optimizovane kodonom (Seq ID No: 173) za ekspresiju sisara i klonirane u ekspresijski vektor ispod CMV promotora okružen 3' i 5' piggiBac specifičnim terminalnim ponavljajućim sekvencama koje olakšavaju stabilnu integraciju u ćelijski genom (vidi: "A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications"; Yusa K, Zhou L, Li MA, Bradley A, Craig NL. Proc Natl Acad Sci U S A.2011 Jan 25). Štaviše, vektor ekspresije je sadržao kasetu za odabir puromicina ili neomicina kako bi se olakšalo stvaranje stabilne ćelijske linije. Plazmid hOX40L ekspresije je ko-transfektovan sa plazmidom koji kodira piggyBac transpozazu u interno izvedenu embrionalnu fibroblastnu (MEF) ćelijsku liniju miša (embrioni koji se koriste za generisanje ove linije su dobijeni iz 129S5 ukrštenog sa C57BL6 ženke miša) i CHO-S ćelijama koristeći FreeStyle Max transfekcioni reagens (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača.24 časa nakon transfekcije, medijum je dopunjen sa G418 ili neomicinom i uzgajan najmanje 2 nedelje za odabir stabilne ćelijske linije, pri čemu je medijum razmenjivan svaka 3-4 dana. Ekspresija hOX40L je procenjena protočnom citometrijom koristeći antihumano OX40L-PE konjugovano antitelo (eBioscience). Kompletan MEF medijum je sačinjen od Dulbecco-vog Modified Eagle's Medium (Gibco) dopunjenog sa 10% v/v fetalnog goveđeg seruma (Gibco). Kompletni CHO-S mediji sačinjeni su od CD-CHO medija dopunjenih 8mM glutamaksom (Gibco).

1

Generisanje HT1080 koji eksprimira OX40R i NF-Kapa reporter gen

[0585] Sekvenca potpuno humanog OX40 receptora je optimizovana kodonom (Seq ID No: 175) za sisarsku ekspresiju i klonirana u vektor ekspresije ispod CMV promotora okružen 3' i 5' piggiBac specifičnim terminalnim ponavljajućim sekvencama koje olakšavaju stabilnu integraciju u ćelijski genom (vidi: "A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications"; Yusa K, Zhou L, Li MA, Bradley A, Craig NL. Proc Natl Acad Sci U S A.2011 Jan 25). Štaviše, vektor ekspresije je sadržao ili kasetu za odabir puromicina kako bi se olakšalo generisanje stabilne ćelijske linije. Plazmid ekspresije hOX40 receptora je ko-transfektovan sa plazmidom koji kodira piggyBac transpozazu u HT1080 ćelije (ATCC<®>CCL-121) koristeći FreeStyle Max transfekcioni reagens (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. 24 časa nakon transfekcije, medijum je dopunjen puromicinom i uzgajan najmanje 2 nedelje kako bi se odabrala stabilna ćelijska linija sa medijumima koji su razmenjivali svaka 3-4 dana. Ekspresija OX40 receptora je procenjena putem protočne citometrije koristeći anti-humano OX40 receptor -PE konjugovano antitelo (R&D, klon 443318). Nakon generisanja stabilne ćelijske linije koja eksprimira receptor OX40, ćelije su transfekovane sa plazmidom pNiFty-2-SEAP (invivogen) koji sadrži 5 ponovljenih mesta vezivanja NFkB faktora transkripcije praćeno izlučenom alkalnom fosfatazom. Stabilne ćelije su izabrane sa dodatkom zeocina medijima sa svežim medijima koji se dodaju svaka 3-4 dana. Kompletan HT1080 medijum je sačinjen od MEM dopunjenog sa 10% fetalnog goveđeg seruma.

Priprema MEF ćelija za imunizaciju miševa:

[0586] Medijum ćelijske kulture je uklonjen i ćelije su isprane jedanput sa 1×PBS. Ćelije su tretirane 5 minuta tripsinom da bi se ćelije oslobodile sa površine kulture tkiva. Ćelije su prikupljene i tripsin neutralizovan dodatkom kompletnih medija koji sadrže 10% v/v fetalnog goveđeg seruma (FCS). Ćelije su zatim centrifugirane pri 300 xg 10 minuta i isprane sa 25 ml 1×PBS. Ćelije su prebrojane i resuspendovane pri odgovarajućoj koncentraciji u 1XPBS.

1

Postupak imunizacije:

[0587] Transgeni Kymice (Kymab miševi) su imunizovani sa hOX40L u ili rastvorljivom rekombinantnom obliku, koji eksprimiraju CHO-S ćelije, ili membranski vezanom obliku, koji eksprimiraju stabilno transfektovane MEF ćelije.

[0588] Prilikom imunizacije ćelijama, adjuvans je pomešan sa ćelijama u odnosu 1:1 v/v i blago mešan pipetiranjem pre injektiranja intraperitonealno. Prilikom imunizacije proteinom, adjuvans je pomešan sa proteinom u odnosu 1:1 v/v i vrtložen više puta. Svim miševima je uzeta krv pre nego što su bili prajmirani i onda stimulisani svake tri nedelje. Najmanje 3 serijska krvarenja u razmaku od najmanje 2 nedelje su prikupljena i analizirana na hOX40L specifični IgG titar pomoću ELISA ili testa baziranog na protočnoj citometriji.

Određivanje serumskih titara pomoću FACS koristeći CHO-S eksprimirani hOX40L

[0589] Ćelije CHO-S koje eksprimiraju hOX40L ili netransfektovane ćelije CHO-S, razblažene u FACS puferu (PBS 1% tež./v BSA 0,1% tež/v NaN3) distribuirane su na ploču sa 96 bunara konusnog dna (Greiner) pri gustini 1×10<5>ćelija po bunaru. Ćelije su isprane sa 150 µL PBS-a i centrifugirane na 300 xg 3 min. Supernatant je aspiriran i dodato je 150 µL PBS. Ovaj korak pranja je ponovljen. Pripremljena je titracija seruma miša, razblažujući uzorke u FACS puferu. Zatim je u ćelijsku ploču dodato 50 µL/bunaru ove titracije. Da bi se utvrdila promena nivoa aktivnosti usled imunizacije, serum svake životinje pre imunizacije razblažen je na 1:100 u FACS puferu i 50 µL/bunaru dodato ćelijama. Pogodno referentno antitelo (anti-OX40L antitelo MAB10541, R&D systems) ili kontrolno antitelo mišjeg IgG1 (Sigma) razblaženi su u FACS puferu (između 1-9 µg/ml) i 50 µL dodato ćelijama. Ćelije su inkubirane na 4 °C 30 minuta. Ćelije su isprane dva puta sa 150 µl PBS, centrifugirajući nakon svakog koraka pranja i aspirirajući supernatant (centrifugiran na 300 xg tokom 3 minuta). Da bi se detektovalo vezivanje za antitela, APC kozjianti-mišji IgG (Jackson ImmunoResearch) je razblažen 1:500 u FACS puferu i dodato je 50 µL ćelijama. Ćelije su inkubirane 30 minuta na 4°C u mraku. Ćelije su oprane dva puta sa 150 µl PBS sa centrifugiranjem nakon svakog koraka pranja i supernatant aspiriran (centrifugiran na 300 xg tokom 3 minuta). Za fiksiranje ćelija dodato je 100 µL 2% v/v paraformaldehida i ćelije inkubirane 30 minuta na 4°C, ćelije su peletirane centrifugiranjem na 300 xg i ploče resuspendovane u 50 µL FACS

1

pufera. Intenzitet signala APC (geomean) meren je protočnom citometrijom koristeći instrument BD FACS Array.

Određivanje serumskih titara DELFIA imunološkim testom koristeći rekombinantni hOX40L

[0590] Titri u uzorcima mišjeg seruma određeni su primenom reverznog OX40L ELISA protokola. Anti-mišje IgG "capture" antitelo (Southern Biotech) (4 µg/mL razblaženo u PBS, 50 µL/bunaru) je adsorbovano na nisko auto-fluorescentnim, visoko protein vezujućim pločama sa 96 bunara (Costar) preko noći na 4° C. Višak IgG je uklonjen pranjem sa PBS-Tween (0,1% v/v) i bunari su blokirani sa 1% tež/v albumina u goveđem serumu (BSA, Sigma) u PBS u toku 1 časa na sobnoj temperaturi, nakon čega su ploče oprane kako je prethodno opisano. Pripremljena je titracija mišjeg seruma, razblažujući uzorke u reagens razblaživaču (0,1% tež/v BSA/PBS). Potom je u ELISA ploče dodato 50 µL/bunaru ove titracije. Da bi se utvrdila promena nivoa aktivnosti usled imunizacije, serum svake životinje pre imunizacije razblažen je na 1:100 u reagensu za razblaživanje i dodato u Elisa ploču 50 µL/bunaru. Kao pozitivna kontrola za biotinilisano OX40L vezivanje, u ploče je dodato 50 µL anti-OX40L antitelo (MAB10541, R&D systems) razblaženo na 1 µg/mL. Izotip kontrola mišjeg IgG1 (Sigma) je uključena kao negativna kontrola i razblažena je na 1 µg/ml u reagensu za razblaživanje i dodato u Elisa ploču 50 µL/bunaru. U nekim slučajevima uzorak seruma iz miša imunizovanog nerelevantnim antigenom je razblažen na 1:1000 i u Elisa ploču je dodato 50 µL/bunaru. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi najmanje 1 sat. Nakon inkubacije, ploče su oprane kao i ranije kako bi se uklonili nevezani proteini.

Biotinilisani OX40L (100 ng/mL u reagensu za razblaživanje; 50 µL/bunaru) je zatim dodan u ploče i inkubiran na sobnoj temperaturi 1 sat. Nevezani biotinilisani OX40L je uklonjen ispiranjem sa PBS-Tween (0,1% v/v), dok je preostali biotinilisani OX40L detektovan pomoću streptavidin-Europium3 konjugat (DELFIA<®>detection, PerkinElmer) razblažen u DELFIA<®>test puferu (Perkin Elmer) ili streptavidin-HRP razblažen u reagensu za razblaživanje.

[0591] U slučaju streptavidin-HRP, ploče su oprane kao što je prethodno opisano i dodato je 50 µL TMB (Sigma) na ploču. Zatim je reakcija zaustavljena dodavanjem

1

50 µL 1M sumporne kiseline (Fluka analytical). OD na 450 nm meren je na čitaču ploča Envision (PerkinElmer).

[0592] U slučaju streptavidin-Europium3, ploče su oprane sa TBS (Tris puferisani fiziološki rastvor) - Tween (0,1% v/v) i na ploču je dodato 200 µL/bunaru DELFIA Enhancement rastvora (Perkin Elmer). Vremenski razložena fluorescencija izmerena je na 615 nm na čitaču ploča Envision (PerkinElmer). Podaci o fluorescenciji su nacrtani kao Europium broj.

Izolacija i preparacija mišjeg tkiva:

[0593] Slezine su ekscizirane iz imunizovanih miševa i oprane u 1×PBS i držane na ledu do dalje obrade. Tkiva su pripremljena u puferu koji sadrži 1×PBS (Invitrogen) i 3% toplotno-inaktiviranog FBS (Invitrogen). Splenociti su dispergovani gnječenjem tkiva kroz 45 µm cedilo (BD Falcon) i ispiranjem sa 30 mL 3%FBS/PBS pufera pre centrifugiranja na 700 g 10 minuta na 4°C. Za uklanjanje crvenih krvnih zrnaca, peletirani splenociti su resuspendovani u 4 ml pufera za lizu crvenih krvnih zrnaca (Sigma). Nakon 4 minuta inkubacije, reakcija lize je zaustavljena dodatkom 3% FBS/1×PBS pufera. Grudve ćelija su filtrirane sa 45 µm cedilom. Preostali splenociti su peletirani za dalje postupke.

Hibridomska fuzija

[0594] Za eksperiment KM055, peletirani splenociti su direktno progresirani u fuziju bez ikakve selekcije ili stimulacije CpG preko noći. Za eksperiment KM040, B-ćelije su podvrgnute metodi pozitivne selekcije koristeći MACS<®>Separacioni sistem. Ćelije su resuspendovane u 80 µL 3% FBS/PBS pufera na 1×10<7>ćelija, pre dodavanja anti-mišjeg IgG1 plus anti-mišjeg IgG2a b Micro perli (Miltenyi Biotec) i inkubirane 15 minuta na 4°C. Mešavina ćelija/mikro perli je zatim naneta na prethodno navlaženu LS kolonu postavljenu u magnetni MACS separator i isprana sa 3% FBS/PBS puferom. IgG pozitivne ćelije su prikupljene u obeleženoj, frakciji vezanoj u koloni u 3% FBS/PBS puferu.

[0595] Za eksperiment KM040, obogaćene B-ćelije su tretirane sa CpG preko noći (finalna koncentracija 25 µM) i sledećeg dana isprane jedanput u BSA fuzionom puferu (0,3M D-Sorbitol, 0,11 mM kalcijum acetat hidrat, 0,5 mM magnezijum acetat

1 1

tetrahidrat i 0,1% BSA (v/tež), podešeno na pH 7,2). Za eksperiment KM055, peletirani splenociti iz lize crvenih krvnih zrnaca isprani su jedanput u BSA fuzionom puferu istog dana kada je i preparacija tkiva. Fuzija se odvijala na isti način za oba eksperimenta nakon ove tačke. Isprane ćelije su resuspendovane u 200 µL BSA fuzionog pufera i određen je broj ćelija. Ćelije SP2/0 tretirane su na isti način, ali su dva puta isprane fuzionim puferom BSA. B-ćelije su fuzionisane u odnosu 3:1 sa SP2/0 ćelijama mijeloma elektrofuzijom pomoću BTX ECM 2001 elektroćelijskog manipulatora (Harvard Apparatus). Svaka fuzija je ostavljena preko noći u medijumu za oporavak (Dulbecco 's Modified Eagle' s Medium – OPI sa visokim sadržajem glukoze (bez fenol crveno, bez L-G) (Sigma), L-Glutamax (Gibco), 20% FBS (Gibco, serijski testiran na hibridom) i 2-merkaptoetanol). Poslednjeg dana, ćelije su peletirane i resuspendovane u 1 delu medijuma za oporavak na 9 delova polučvrstog medijuma (ClonaCell-HY Hibridoma Selection Medium D, Stemcell Technologies), a zatim zasejane na petrijeve posude od 10 cm. Kolonije su ubrane 12 dana kasnije u ploče sa 96 bunara i kultivisane još 2-3 dana pre skrininga.

Primer 2

Skrining supernatanta hibridoma

[0596] Nakon generisanja klonova hibridoma, supernatant hibridoma je procenjen na sekvencijalnom primarnom i sekundarnom skrinu i izabrani su odgovarajući klonovi hibridoma na osnovu kriterijuma vezivanja antitela za CHO eksprimirani hOX40L i aktivnosti neutralizacije receptora (videti detalje u materijalima i metodama) (Tabela 1).

[0597] Za primarni skrin, pronalazači su osmislili sledeće kriterijume za izbor: bunari koji sadrže klonove hibridoma su izabrani ako antitela prisutna u supernatantu mogu da se vežu za nativno prikazani hOX40L eksprimirani na površini ćelije. Ovaj test je postavljen zasejavanjem ćelija CHO-S koje eksprimiraju hOX40L na površini ćelije, nakon čega je usledila inkubacija sa supernatantom hibridoma, nakon čega je usledilo fluorescentna detekcija antitela. Prisustvo anti-OX40L antitela u supernatantu očitano je pomoću čitača ploča koji može da očitava odgovarajuću fluorescenciju. Nadalje, pronalazači su procenili supernatant hibridoma za vezivanje za rekombinantno eksprimirani humani OX40L pomoću HTRF (Homogeno vremenski razložena fluorescencija) testa. Pronalazači su takođe utvrdili da li

1 2

supernatant hibridoma ima sposobnost da smanji vezivanje humanog rekombinantnog OX40L za humani OX40R Fc. Klonovi koji ispunjavaju određene kriterijume za izbor (vidi detaljniji opis u nastavku), koristeći podatke iz gore navedena tri primarna skrin testa, zatim su izabrani i prebačeni na sekundarni skrin gde je određena sposobnost svakog antitela da neutrališe vezivanje hOX40L za svoje receptore, OX40 Receptor (poznat i kao CD134). Pronalazači su odlučili da ovo procene pomoću HTRF testa neutralizacije receptora i testa neutralizacije receptora na bazi protočne citometrije. Na kraju, pronalazači su odlučili da analiziraju supernatant hibridoma pomoću SPR kako bi procenili očigledni afinitet antitela za rekombinantni trimerni humani OX40L, kao i unakrsnu reaktivnost na OX40L rezus majmuna.

[0598] Antitela su definisana kao sekundarni pogodak kada su antitela u supernatantu hibridoma vezana za hOX40L, sa visokim prividnim afinitetom, kao i unakrsnom reakcijom sa rekombinantnim OX40L rezus majmuna. Pored toga, antitela u supernatantu morala su da pokažu sposobnost da neutrališu vezivanje OX40L za njegov receptor, tj. OX40 Receptor (poznat i kao CD134) u HTRF testu ili u testu baziranom na protočnoj citometriji.

Materijali i metode

Primarni skrin - vezivanje za ćeliju koja je eksprimirala humani OX40L [0599] Supernatanti prikupljeni iz ćelija hibridoma testirani su kako bi se procenila sposobnost izlučenih antitela da se vežu za hOX40L eksprimiran na površini ćelija CHO-S. Da bi se utvrdilo vezivanje CHO-S i hOX40L, ćelije su zasejane u bistroj kulturi tretiranog tkiva na pločama sa 384 bunara (Costar ili BRAND) na

2×10<4>ćelije/bunaru u F12 mediju (GIBCO) dopunjenom sa 10% v/v FBS (GIBCO) i kultivisane preko noći. Hranljive podloge su uklonjene iz ploča sa 384 bunara. U svaki bunar je dodato najmanje 40 µL supernatanta hibridoma ili anti-humanog OX40L referentnog antitela pozitivne kontrole (u konačnoj koncentraciji od 1 µg/mL) ili kontrolnog antitela izotipa IgG1 (u nekim slučajevima Cm7, Sigma M9269, u konačnoj koncentraciji od 1 µg/mL) razblaženog u medijumu za održavanje hibridoma (HMM). Medijum za održavanje hibridoma sačinjen je od, Advanced DMEM (Gibco) dopunjen sa 1× Glutamax (Gibco), 20% v/v FBS (Gibco), 0,05 mM β-Merkaptoetanola, 1×HT dodatak (Gibco) i 1×penicilin/streptomicin (Gibco). Ploče su

1

inkubirane 1 sat na 4 °C. Hranljiva podloga je aspirirana i dodato je 50 µL kozjeg anti-mišjeg Alexa Fluor 790 (Jackson ImmunoResearch, 115-655-071) na 1000 ng/mL dopunjeno sa 0,2 µM DRAQ5 (Biostatus) razblaženog u FACS puferu (PBS+1% tež/v BSA+0.1% v/v NaN3). Ploče su ponovo inkubirane 1 sat na 4°C. Supernatant je aspiriran i dodato je 25 µL 4% v/v paraformaldehida i ploče su inkubirane 15 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su dva puta oprane sa 100 µL PBS, a zatim je pufer za pranje u potpunosti uklonjen. Intenzitet fluorescencije očitan je skeniranjem ploča pomoću Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR<®>). Antimišje vezivanje (800 nm kanal) je normalizovano na broj ćelije (700 nm kanal) prema LI-COR<®>preporučenom algoritmu. Procentualni efekat je izračunat kao što je detaljno opisano u nastavku (jednačina 1). Ukupno vezivanje je definisano korišćenjem referentnog antitela pri konačnoj koncentraciji testa od 1 µg/ml.

Nespecifično vezivanje definisano je pomoću kontrole mišjeg IgG1 izotipa (Sigma) pri konačnoj koncentraciji testa od 1 µg/ml. Bunari su definisani kao pogodak tamo gde je procentualni efekat bio veći ili jednak 5%.

Jednačina 1: Izračunavanje procentualnog efekta iz primarnog skrina (LI-COR) i HTRF

(Korišćenje 800% vrednosti odgovora (LI-COR) ili 665/620nm odnosa (videti jednačinu 2) (HTRF)

[0600]

bunar sa uzorkom − nespecifično vezivanje Procentualni efekat =

ukupno vezivanje − nespecifično vezivanje

Nespecifično vezivanje = vrednosti iz bunara koji sadrže izotip kontrolu mišjeg IgG1 ili HMM ili pufer

Ukupno vezivanje (vezivanje HTRF i LICOR) = vrednosti iz bunara koji sadrže referentno antitelo Ukupno vezivanje (OX40L/OX40RFc test) = OX40L i OX40RFc

Primarni skrin: Vezivanje za rekombinantni humani OX40L:

[0601] Paralelno sa skriningom za vezivanje za CHO-S eksprimirani OX40L, supernatanti prikupljeni iz bunara hibridoma takođe su testirani kako bi se procenila sposobnost izlučenih antitela da se vežu za hOX40L eksprimiran kao rekombinantni

1 4

protein (proizveden interno, vidi detalje u Primeru 1). Vezivanje izlučenih antitela za rekombinantni hOX40L identifikovano je pomoću HTRF<®>(Homogeno vremenski razložena fluorescencija, Cisbio) test formata koristeći biotinilisani hOX40L.5 µL supernatanta hibridoma je prebačeno u belu ploču od polistirena bez vezivanja za površinu sa 384 bunara male zapremine (Greiner). Zatim je dodato 5 µL biotinilisanog hOX40L (radna koncentracija 20 nM) razblaženog u HTRF puferu (PBS (Sigma) 0,53 M KF (Sigma) 0,1% tež/v BSA (Sigma). Dodato je 5 µL kombinovanih reagenasa za detekciju Streptavidin D2 (Cisbio) razblaženih 1:100 u HTRF test puferu za konačno razblaženje 1:400 i kozji anti-mišji IgG (Southern Biotech) obeležen evropijum kriptatom (Cisbio) razblaženim 1:100 u HTRF test puferu za konačno razblaženje 1:400. Koncentracija kozjeg anti-mišjeg IgG (Southern Biotech) obeleženog sa evropijum kriptatom bila je zavisna od serije i u nekim slučajevima razblaženje od 1:1000 je izvršeno da bi se postigla konačna test koncentracija od 1:4000. Da bi se ukupna zapremina testa podesila na 20 µL, u sve bunare je dodato je 5 µL pufera HTRF testa. Da bi se definisalo nespecifično vezivanje, dodatak pozitivnog kontrolnog antitela ili medija hibridoma zamenjen je sa HTRF test puferom ili HMM. Ploča je ostavljena da se inkubira u mraku 3 časa pre očitavanja vremenski razložene fluorescencije na 620 nm i 665 nm talasne dužine emisije pomoću EnVision čitača ploča (Perkin Elmer). Više detalja o HTRF<®>test tehnologiji može se naći u Mathis (1995) Clinical Chemistry 41(9), 1391-1397.

Podaci su analizirani izračunavanjem odnosa 665/620 i procentualnog efekta za svaki uzorak prema Jednačini 2 i Jednačini 1.

Jednačina 2: Proračun odnosa 665/620

[0602]

odnos 665/620 = (uzorak 665/vrednost 620 nm) x 1000

[0603] Za klonove izvedene iz KM040-1 i KM055-1, pronalazači su primenili kriterijume za izbor koji su bili veći ili jednaki 20 procentualnog efekta kako bi definisali bunar kao pogodak iz rekombinantnog vezivanja hOX40L kako je opisano u Tabeli 1.

1

Primarni skrin: test vezivanja humani OX40L/humani OX40R Fc:

[0604] Da bi se utvrdilo da li supernatanti prikupljeni iz bunara hibridoma inhibiraju vezivanje OX40L za OX40RFc, izlučena antitela su testirana u HTRF testu vezivanja OX40L/OX40RFc. 5 µL supernatanta hibridoma prebačeno je u belu ploču od polistirena bez vezivanja za površinu sa 384 bunara male zapremine (Greiner). Biotinilisani OX40L je razblažen u HTRF test puferu do radne koncentracije od 2,4 nM i dodato 5 µL. OX40RFc je zatim razblažen do radne koncentracije od 4,8 nM i dodato 5 µL. Nespecifično vezivanje je definisano zamenom OX40RFc sa test puferom ili HMM. Streptavidin kriptat (CISBIO) i antihumani Fc D2 (CISBIO) su razblaženi u HTRF test puferu do radne koncentracije od 1:100, odnosno 5nM. Ploče su bile pokrivene, zaštićene od svetlosti i inkubirane na sobnoj temperaturi 3 sata pre vremena očitavanja vremenski razložene fluorescenciju na 620 nm i 665 nm talasnih dužina emisije pomoću EnVision čitača ploča (Perkin Elmer). Podaci su analizirani izračunavanjem odnosa 665/620 i procentualnog efekta za svaki uzorak prema Jednačini 2 i Jednačini 5.

[0605] Za klonove izvedene iz KM040-1 i KM055-1, pronalazači su primenili kriterijume za izbor koji su bili manji ili jednaki 90 procenata signala testa za vezivanje OX40 receptora Fc za OX40L kako bi se bunar definisao kao pogodak, kako je opisano u Tabeli 1.

Sekundarni skrin: Vezivanje za ćelijski eksprimiran i rekombinantni humani OX40L

[0606] Da bi se utvrdilo da li su bunari izabrani koristeći kriterijume za izbor primarnog skrininga imali zahtevane karakteristike koje su postavili pronalazači, izvršen je niz testova. Klonovi hibridoma izabrani kao pogodak iz primarnog skrininga su kultivisani 3 dana i supernatanti prikupljeni iz ćelija hibridoma su testirani kako bi se procenilo da li se izlučena antitela koja se vezuju za CHO-S eksprimirani hOX40L, u nekom slučaju vezuju za netransfektovane CHO-S ćelije i da li neutrališu vezivanje rekombinantnog OX40R Fc za CHO-S hOX40L i sposobnost da neutrališu vezivanje OX40R za rekombinantni biotinilisani hOX40L.

1

Vezivanje za CHO-S eksprimirani hOX40L i neutralizacija receptora:

[0607] Ćelije CHO-S koje eksprimiraju hOX40L ili netransfektovane ćelije CHO-S, razblažene u FACS puferu (PBS 1% tež/v BSA 0,1% tež/v NaN3) distribuirane su na ploču sa 96 bunara sa V dnom (Greiner) gustine 1×10<3>ćelije po bunaru. Ćelije su oprane sa 150 µl PBS i centrifugirane na 300 xg tokom 3 min. Supernatant je aspiriran i dodato je 150 µL PBS. Ovaj korak pranja je ponovljen.

[0608] 25 µL supernatanta hibridoma ili prečišćenog antitela iz supernatanta hibridoma razblaženog u FACS puferu je dodato u oprane ćelije i inkubirano 10-15 minuta. Referentno antitelo ili kontrolno antitelo mišjeg IgG1 (Sigma) su razblažena u FACS puferu na 20 µg/ml i 25 µL dodato u ćelije. Potom je u bunare dodato 25 µL humanog OX40R Fc (interni) razblaženog na 1000 ng/mL u FACS puferu. Ćelije su inkubirane na 4°C 30 minuta.

[0609] Ćelije su oprane dva puta sa 150 µl PBS sa centrifugiranjem nakon svakog koraka pranja i aspiranjem supernatanta (centrifugiran na 300 xg tokom 3 minuta).

[0610] Za detekciju vezivanja antitela i receptora, ćelijama je dodato 50 µL kozjeg anti-humanog IgG-PE (Jackson ImmunoResearch) i APC anti-mišjeg IgG (Jackson ImmunoResearch) razblaženo 1:500 u FACS puferu. Ćelije su inkubirane 30 minuta na 4°C u mraku.

[0611] Ćelije su oprane dva puta sa 150 µl PBS centrifugirajući nakon svakog koraka pranja i aspirirajući supernatant (centrifugiran na 300 xg tokom 3 minuta).

[0612] Za fiksiranje ćelija 100 µL 2% v/v paraformaldehida je dodato i ćelije inkubirane 30 minuta na 4°C, ćelije su peletirane centrifugiranjem 300 xg i ploče i resuspendovane u 50 µL FACS pufera. Intenzitet PE i APC signala (geomean) meren je protočnom citometrijom pomoću instrumenta BD FACS Array.

[0613] % kontrolnog vezivanja je izračunat korišćenjem fluorescencije geometrijske sredine kako je opisano u jednačini 1, gde je ukupno vezivanje definisano kao referentno antitelo na 10 µg/mL, a ne-specifično vezivanje kao mišje IgG1 antitelo na 10 µg/mL. % receptorskog vezivanja je izračunat korišćenjem Jednačine 3.

1

Jednačina 3: Procenat vezivanja receptora (FACS)

[0614] Na osnovu "geomean" fluorescencije

vrednost uzorka − nespecifično vezivanje x 100 % receptorskog vezivanja =

ukupno vezivanje − nespecifično vezivanje

Nespecifično vezivanje = Bez antitela, bez receptora

Ukupno vezivanje = samo vezivanje receptora (OX40R) (bez inhibitora) izotip kontrola pri 10 μg/mL

Sekundarni skrin – neutralizacija HTRF Ligand/receptor

[0615] Da bi se utvrdilo da li antitela identifikovana iz primarnog skrina neutrališu vezivanje OX40L za OX40RFc, urađen je test vezivanja humani OX40L/humani OX40R Fc, kao što je opisano za primarni skrin.

[0616] Ploče su ostavljene da inkubiraju u mraku 3 časa pre očitavanja vremenski razložene fluorescencije na 620 nm i 665 nm talasnim dužinama emisije pomoću EnVision čitača ploča (Perkin Elmer). Više detalja o HTRF<®>test tehnologiji može se naći u Mathis (1995) Clinical Chemistry 41(9), 1391-1397. Podaci su analizirani izračunavanjem delta F kako je opisano u Jednačini 4 i procenta receptora za svaki uzorak prema Jednačini 5.

Jednačina 5: Procenat vezivanja receptora (HTRF)

[0618] Na osnovu izračunavanja % deltaF (jednačina 4) ili odnosa 665/620 (jednačina 2)

1

vrednost uzorka − nespecifično vezivanje x 100 % receptor vezivanja =

ukupno vezivanje − nespecifično vezivanje

Nespecifično vezivanje = HMM ili pufer OX40L (bez receptora) Ukupno vezivanje = receptor (OX40R) i OX40L (bez inhibitora)

Izbor kriterijuma za pogodak iz sekundarnog skrininga:

[0619] Panel pogodaka je izabran na osnovu testova vezivanja i neutralizacije.

Pogodak u testovima vezivanja CHO-S OX40L pronalazači su definisali kao značajno vezivanje za CHO-S OX40L ćelije i bez vezivanja za CHO-S ćelije putem FACS. Pogodak je dalje definisan kao sposobnost da se značajno smanji OX40RFc vezivanje za rekombinantni OX40L (HTRF) i značajno smanji OX40RFc vezivanje za hOX40L eksprimiran na CHO ćelijama. Podaci su sažeti u Tabeli 1. Razmatrana su i merenja prividnog afiniteta pomoću SPR.

Primer 3

Karakterizacija vodećeg antitela

[0620] Na osnovu skrininga, odabrani bunari su ekspandovani i mišja/humana himerna antitela su prečišćena standardnim prečišćavanjem afinitetnom hromatografijom na bazi G proteina (vidi metodu u nastavku). Antitela su podvrgnuta različitim testovima kako bi se procenila njihova sposobnost da blokiraju vezivanje hOX40L za OX40R receptor, kao i sposobnost svakog antitela da se veže za humani, kao i OX40L rezus majmuna sa visokim prividnim afinitetom. Da bi se dešifrovalo koja antitela su najbolja, odabrani klonovi su testirani koristeći OX40L/OX40RFc HTRF test i OX40L indukovano oslobađanje IL2 iz primarnih humanih T-ćelija.

Tabela 1: Rezime mAb vodeći

1

CNROR= Nije moguće rešiti stopu odstupanja

ICso podaci predstavljaju aritmetičku sredinu /- standardnu grešku srednje vrednosti (SEM) za tri nezavisna eksperimenta ili donora.

Materijali i metode

Prečišćavanje antitela iz supernatanta hibridoma:

[0621] Antitela su prečišćena pomoću afinitetne hromatografije proteina G. Antitela su eluirana iz Protein G medija koristeći IgG Elute reagens (Pierce) i eluirana antitela su puferski zamenjena u PBS pre upotrebe. Čistoća antitela je procenjena SDS-PAGE analizom i kvantifikovana spektrofotometarskim očitavanjem na OD280 nm.

[0622] Vezivanje antitela prečišćenih iz supernatanta hibridoma sprovedeno je kao što je ovde opisano.

HTRF neutralizacija liqand/receptor:

[0623] Sledeće metode su izvedene sa titracijom inhibitora kako bi se utvrdila potencija klonova izmerena IC50 vrednostima u testu. Prečišćeno antitelo iz hibridoma je titrirano razblaživanjem u puferu HTRF testa i 5 µL ove titracije je prebačeno u belu polistirensku ploču ne-vezujuće površine sa 384 bunara niske

1

zapremine (Greiner). Biotinilisani OX40L je razblažen u HTRF test puferu do radne koncentracije od 2,4 nM i dodato 5 µL. OX40RFc je zatim razblažen do radne koncentracije od 4,8 nM i dodato 5 µL. Nespecifično vezivanje je definisano zamenom OX40RFc sa test puferom ili HMM. Streptavidin kriptat (CISBIO) i antihumani Fc D2 (CISBIO) su razblaženi u HTRF test puferu do radne koncentracije od 1:100, odnosno 5 nM. Ploče su bile pokrivene, zaštićene od svetlosti i inkubirane na sobnoj temperaturi 3 časa pre očitavanja vremenski razložene fluorescencije na 620 nm i 665 nm emisionih talasnih dužina pomoću EnVision čitača ploča (Perkin Elmer). Podaci su analizirani izračunavanjem delta F kako je opisano u Jednačini 4 i procenta receptora za svaki uzorak prema Jednačini 5 ili u nekim slučajevima Jednačini 6. Vrednosti IC50 su određene korišćenjem softvera GraphPad Prism pomoću fitovanja krive koristeći logističku jednačinu od četiri parametra (Jednačina 7).

Jednačina 6: Procenat vezivanja receptora (HTRF)

[0624] Na osnovu izračunavanja % DeltaF (Jednačina 8)

vrednost uzorka

% vezivanja receptora = × 100

ukupno vezivanje

[0625] Ukupno vezivanje = receptor (OX40R) i OX40L (bez inhibitora)

Jednačina 7: Logistički proračun četiri parametra

[0626]

Y = Donji (Gornji – Donji)/(1+10^((LogIC50-X)<*>Nagib barijere))

[0627] X = logaritam koncentracije.

[0628] Y = specifično vezivanje (jednačina 6)

[0629] Gornji i donji = platoi u istim jedinicama kao Y (specifično vezivanje)

1 1

[0630] Log ICso u istim jedinicama kao X. Y počinje na Donjem (platou) i ide do Gornjeg (platoa) sa sigmoidnim oblikom. Specifično vezivanje se smanjuje kako se X povećava.

Profil kompletno humanih rekombinantnih anti-OX40L antitela u HTRF testu neutralizacije ligand/receptor

[0631] Da bi se utvrdilo da li rekombinantno eksprimirani kompletno humani prečišćeni IgG inhibiraju vezivanje humanog OX40L za OX40RFc, sprovedena je sledeća metoda. Testirani su prečišćeni kompletno humani IgG ili drugi inhibitor u cilju utvrđivanja potencije klonova mereno IC50 vrednostima u testu. Antitela rekombinantno eksprimirana i prečišćena titrirana su razblaživanjem u HTRF test puferu i 5 µL ove titracije prebačeno je na belu polistirensku ploču ne-vezujuće površine sa 384 bunara niske zapremine (Greiner). Biotinilisani OX40L je razblažen u HTRF test puferu do radne koncentracije od 2,4 nM i dodato je 5 µL. OX40RFc direktno obeležen sa AF647 je zatim razblažen do radne koncentracije od 10 nM i dodato je 5 µL. Nespecifično vezivanje je definisano zamenom OX40RFc-AF647 sa test puferom ili HMM. Streptavidin kriptat (CISBIO) je razblažen u HTRF tetst puferu do radne koncentracije od 1:100 i 5 µL je dodato u sve bunare ploče. Ploče su bile pokrivene, zaštićene od svetlosti i inkubirane na sobnoj temperaturi 3 sata pre očitavanja vremenski razložene fluorescencije na 620 nm i 665 nm emisionih talasnih dužina pomoću EnVision čitača ploča (Perkin Elmer). Podaci su analizirani izračunavanjem delte F kako je opisano u Jednačini 4 i procenta receptora za svaki uzorak prema Jednačini 5 ili u nekim slučajevima Jednačini 6. Vrednosti IC50 su određene korišćenjem softvera GraphPad Prism putem fitovanja krive koristeći logističku jednačinu od četiri parametra (Jednačina 7) (Slika 1).

Određivanje efekta anti-OX40L antitela na oslobađanje IL2 indukovanog rekombinantnim OX40L iz primarno izolovanih T ćelija

[0632] Rekombinantni humani OX40L (interni) je razblažen u kulturi do koncentracije od 400 ng/mL i 50 µL je dodato u kulturu tretiranog tkiva na ploči sa 96 bunara (Costar). Anti-OX40L antitela ili kontrola izotipa odgovarajuće vrste (Sigma ili interni) titrirana su u hranljivoj podlozi u ploči sa 96 bunara (greiner), a zatim je 50 µL titracije preneseno na ploču sa 96 bunara koji sadrže 50 µL OX40L. Titracija antitela je

1 2

inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi sa rekombinantnim OX40L pre nego što su dodate CD3 pozitivne T-ćelije.

[0633] PBMC su izolovani iz komora sistema za leukoredukciju (NHSBT) koristeći Ficoll-Paque plus (GE Healthcare) centrifugiranjem gradijenta gustine. CD3 pozitivne ćelije (T-ćelije) su izolovane iz humanog PBMC negativnom selekcijom pomoću magnetnih mikroperli (Miltenyi Biotech) u skladu sa preporukama proizvođača.

Izolovane ćelije su centrifugirane na 300 xg/5 min, resuspendovane u hranljivoj podlozi (hranljiva podloga je definisana kao ili RPMI (Gibco) 10% v/v FBS ili RPMI 5% v/v humani AB serum) i 50 µL suspenzije ćelija dodate na ploču sa 96 bunara koji sadrže rekombinantni OX40L i titraciju antitela kako bi se postigla krajnja koncentracija od 2×10<3>ćelije/bunaru.

[0634] Zatim je u sve bunare dodato 50 µl PHA pri 8 µg/mL da bi se postigla krajnja koncentracija testa od 2 µg/mL. Ćelije su inkubirane na 37°C 3 dana pre nego što je supernatant ubran i analiziran na koncentraciju IL-2. Maksimalno oslobađanje IL-2 definisano je OX40L stimulacijom u odsustvu inhibitora. Minimalno oslobađanje IL-2 definisano je samo sredinom za razvoj kulture (bez OX40L).

[0635] Nivoi IL-2 u supernatantima određeni su korišćenjem humanog IL-2 Duoset ELISA kompleta (R & D systems) prema preporukama proizvođača. IL-2 "hvatač" antitelo (4 µg/mL razblaženo u PBS, 50 µL/bunaru) adsorbovano je na pločama niske auto-fluorescencije i visokim vezivanjem proteina sa 96 bunara (Costar) preko noći na 4° C. Višak IgG je uklonjen pranjem sa PBS-Tween i bunari su blokirani sa 1% albumina goveđeg seruma (BSA) u PBS na 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega su ploče oprane kako je prethodno opisano. Zatim je dodato 50 µL/bunaru kondicionirane sredine za razvoj kulture IL-2 standarda (od 2000 pg/mL, razblaženje 1:2) u ELISA ploče kao ELISA kontrola i ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi najmanje 1 sat.

[0636] Nakon inkubacije, ploče su oprane kao i ranije kako bi se uklonili nevezani proteini. Biotinilisano IL-2 detektorsko Ab (200 ng/mL u reagens diluentu (0,1% BSA/PBS); 50 µL/bunaru) je zatim dodato na ploče i inkubirano na ST tokom 1h. Nevezano antitelo za detekciju je uklonjeno pranjem sa PBS-Tween (0,1% v/v), dok

1

je preostalo biotinilisano antitelo detektovano pomoću streptavidin-Europium3 konjugat (DELFIA<®>detekcija, PerkinElmer). Vremenski razložana fluorescencija izmerena je na 615 nm na čitaču ploča Envision (PerkinElmer). Podaci o fluorescenciji su prikazani kao brojevi Evropijuma ili koncentracija oslobađanja IL-2 izračunata iz standardne krive linearnom regresijom u skladu sa preporukama proizvođača. Vrednosti IC50 su određene korišćenjem softvera GraphPad Prism pomoću fitovanja krive koristeći logističku jednačinu od četiri parametra (Jednačina 7).

Analiza rezonancije površinskih plazmona:

[0637] SPR analiza je izvedena pomoću ProteOn<™>XPR36 Array System (BioRad). Anti-mišji IgG (GE Healthcare BR-1008-38) je imobilizovan na površini GLM biosenzora pomoću aminskog kuplovanja, površina je zatim blokirana pomoću 1 M etanolamina. Test antitela su uhvaćena na ovoj površini i rekombinantni hOX40L (humani i rezusni) su korišćeni u jednoj koncentraciji od 256 nM, senzogrami vezivanja su dvostruko referencirani uz pomoć injektiranja pufera (tj.0 nM) za uklanjanje početnog drifta i artefakata ubrizgavanja. Prividni afiniteti za interakciju OX40L-antitela određeni su korišćenjem modela 1:1 koji je svojstven softveru za analizu ProteOn XPR36. Test je sproveden koristeći HBS-EP (Teknova) kao radni pufer i izveden na 25 °C.

Primer 4

Sekventni oporavak kandidata za vodeća antitela

[0638] Nakon izbora i karakterizacije vodećih kandidata, njihovi kompletno humani varijabilni domeni su oporavljeni korišćenjem RT-PCR smeše direktnih i reverznih prajmera. Antitela su reformatirana u humanu IgG4 kičmu (IgG4-PE) i eksprimirana pomoću sistema tranzijentne ekspresije u CHO-S ćelijama. Sažetak svih sekvenci prikazan je u Spisku sekvenci.

Izolacija RNK iz ćelija hibridoma:

[0639] Ukupna RNK je ekstrahovana iz ćelija hibridoma koristeći TRIzol<™>Reagens (Invitrogen). Količina i kvalitet izolovane RNK analizirani su spektrofotometrijski.

Oporavak varijabilnog domena antitela RT-PCR:

1 4

[0640] Izabrani klonovi su korišćeni za prieparaciju ukupne RNK, koja je korišćena u RT-PCR reakciji za oporavak V-regiona teških lanaca. Za teške lance korišćeni su setovi prajmera specifičnih za Ig vodeću sekvencu ili alternativno setovi direktnih prajmera specifičnih za sekvencu Ig 5' netransliranog regiona (UTR). Za kapa OX40L lance korišćeni su reverzni prajmeri specifični za kapa konstantni region i setovi prajmera specifičnih za kapa vodeću sekvencu ili alternativno setovi reverznih prajmera specifičnih za kapa konstantni region i setovi direktnih prajmera specifičnih za kapa 5'UTR sekvencu. RT-PCR proizvodi su separisani elektroforezom gel agaroze, pri čemu je DNK predviđene veličine sekvencirana u prednjem i obrnutom smeru. Alternativno, RT-PCR proizvodi su potklonirani u vektor kloniranja i DNK pojedinih kolonija je podneta za sekvenciranje.

Kloniranje rekombinantnih antitela

[0641] DNK koja kodira varijabilni region teškog lanca mAb 10A7 je klonirana u plazmid pREP4 ekspresije (Invitrogen) u okviru sa konstantnim regionom humanog IgG1 i DNK koja kodira varijabilni region lakog lanca mAb 10A7 je klonirana u plazmid za ekspresiju pREP4 u okviru sa humanim kapa konstantnim regionom koristeći standardni restrikcioni enzim za digestiju i ligaciju.

[0642] Varijabilni region teškog lanca koji kodira sekvence mAbs 10A7 i 2D10 u okviru sa konstantnim regionom humanog IgG4-PE su kodon optimizovani za sisarsku ekspresiju i kloniran u plazmid pXC-18.4 ekspresije (Lonza) i laki lanac koji kodira sekvence mAbs 10A7 i 2D10 u okviru sa humanim kapa konstantnim regionom su kodon optimizovani za sisarsku ekspresiju i klonirani u plazmid pXC-17.4 ekspresije (Lonza) koristeći standardni restrikcioni enzim za digestiju i ligaciju. Za istovremenu ekspresiju teških i lakih lanaca, vektori pXC-17.4 i pXC-18.4 su fuzionisani u jedan vektor koristeći standardni restrikcioni enzim za digestiju i ligaciju.

[0643] Svi konstrukti su sekvencirani kako bi se osigurao njihov ispravan sastav sekvenci.

Tranzijentna ekspresija OX40L antitela

[0644] Antitela su tranzijentno eksprimirana za proizvodnju rekombinantnog proteina koristeći Invitrogenovu FreeStyle<™>ćelijsku liniju adaptiranu suspenziji CHO-S.

1

Plazmidi su transfekovani u ćelije pomoću PEI (polietilenimin MW 40000) i ostavljeni da rastu 13 dana pre žetve supernatanta za prečišćavanje. Ćelije su hranjene tokom procesa prekomernog rasta sa ActiCHO<™>Feeds A i B iz GE Healthcare kako bi se povećala produktivnost i promovisala dugotrajnost ćelija. Tokom procesa prekomernog rasta uzorci su uzimani redovno radi praćenja rasta i održivosti ćelija.

Generisanje stabilnih Lonza bazena

[0645] Da bi se proizvele količine u gramima, potrebne za toksikološka ispitivanja, antitela 10A7 i 2D10 OX40L su prebačena u Lonza GS Xceed sistem za stabilnu ekspresiju. HC i LC za svako antitelo je prvo kodon optimizovan za ekspresiju u CHO ćelijama od strane Genewiz. HC kaseta (koja sadrži optimizovani konstantni region) je zatim klonirana u Lonzin vektor pXC18.4 i LC kaseta (koja sadrži optimizovani kapa konstantni region) je klonirana u Lonzin vektor pXC17.4 koristeći standardni restrikcioni enzim za digestiju i ligaciju. Dvostruki genski vektor (DGV) koji kodira i HC i LC sekvence je zatim stvoren restriktivnom enzimskom digestijom i ligacijom i sekvenca potvrđena pre ekspresije.

[0646] Pre stvaranja stabilnog bazena; pojedinačni genski vektori koji zasebno kodiraju HC i LC, kao i DGV koji sadrži oba, bili su eksprimirani u Lonza CHOK1SVKO ćelijskoj liniji tranzijentno koristeći PEI (polietilenimin MW 40000). Ćelije su ostavljene da rastu 13 dana pre žetve supernatanta za prečišćavanje. U tom periodu ćelije su hranjene sa ActiCHO<™>Feeds A i B iz GE Healthcare kako bi se povećala produktivnost i promovisala dugotrajnost ćelija. Tokom procesa prekomernog rasta uzorci su uzimani redovno radi praćenja rasta i vijabilnosti ćelija. Nakon što je potvrđena tranzijentna ekspresija i analiziran prečišćeni materijal, antitela su eksprimirana kao stabilni bazeni.

[0647] Stabilni bazeni su generisani korišćenjem Lonza metoda i medija.4 bazena su kreirana po antitelu i ostavljena da se oporave u periodu od 10-15 dana. Nakon oporavka ćelija, pred-setvene zalihe ćelija (PSS) su zamrznute za kasniji oporavak i kreiranje MCB. Potom je serija prekomernog rasta stavljena u male (50 mL) tikvice za trešenje koristeći Lonza zaštićeni medij. Ćelije su ostavljene da narastu u periodu od 14 dana. Tokom tog perioda ćelije su praćene na rast, vijabilnost i nivo glukoze.

1

Ćelije su u skladu sa tim dopunjene Lonza zaštićenom hranom i 400g/L glukoze. Uzorci su takođe uzimani tokom celog procesa za kvantifikaciju sirovih uzoraka. Na kraju procesa prekomernog rasta, supernatant je ubran za prečišćavanje.

[0648] Stabilni bazeni su generisani korišćenjem Lonza zaštićenih metoda i medija.

4 bazena su kreirana po antitelu i ostavljena da se oporave u periodu od 10-15 dana. Nakon oporavka ćelija, predsetvene zalihe ćelija (PSS) su zamrznute za kasniji oporavak i stvaranje MCB. Potom je hranjena serija prekomernog rasta stavljena u male (50 mL) tikvice za trešenje koristeći Lonza zaštićeni medij. Ćelije su ostavljene da rastu u periodu od 14 dana. Tokom tog perioda ćelije su praćene na rast, vijabilnost i nivo glukoze. Ćelije su u skladu sa tim dopunjene Lonza zaštićenom hranom i 400 g/L glukoze. Uzorci su takođe uzimani tokom celog procesa za kvantifikaciju sirovih uzoraka. Na kraju procesa prekomernofg rasta, supernatant je ubran za prečišćavanje.

[0649] Iako su 2D10 i 10A07 bili slični po sekvenci, njihovi profili ekspresije u stabilnim Lonza bazenima bili su različiti, 10A07 je eksprimiran do veoma niskih titara, dok je 2D10 eksprimiran u mnogo većim titrima (videti Tabelu 2) pod optimalnim uslovima kada se koriste tikvice za trešenje u 4 odvojena generisana stabilna bazena.

Tabela 2 (Koncentracija u mg/L)

1

[0650] Nakon ekspresije, antitelo koje će se koristiti u modelu rezus makaki GvHD je prečišćeno pomoću procesa prečišćavanja u dva koraka. Antitela su prvo prečišćena pomoću MabSelect SuRe (GE Healthcare) afinitetne hromatografije. Antitela su eluirana iz MabSelect SuRe medija koristeći IgG Elute reagens (Pierce) i eluirana antitela su dijalizovana u puferu natrijum acetata (pH 5,5) pre drugog koraka prečišćavanja. Antitela su zatim prečišćena katjonskom izmenom i eluirana sa natrijum hloridom u puferu natrijum acetata. Eluirana antitela su dijalizirana u PBS. Antitela su kvantifikovana spektrofotometarskim očitavanjem na OD280nm i podešena na željenu koncentraciju (10mg/ml). Čistoća antitela je procenjena SDS-PAGE analizom i dimenziono-ekskluzivnom hromatografijom. Koncentracija endotoksina je izmerena sa Endosafe PTS i LAL test patronama (Charles River Laboratories).

Primer 5

Određivanje efekta anti-OX40L antitela u alogenoj PBMC reakciji mešovitih limfocita

[0651] PBMC su izolovani iz komora sistema za leukoredukciju (NHSBT) koristeći Ficoll-Paque plus (GE Healthcare) gradijentno centrifugiranje. PBMC se prethodno inkubiraju mitomicinom C (Sigma) na 10 µg/mL u PBS tokom jednog časa na 37°C. Ćelije su zatim oprane 3 puta u PBS centrifugirajući na 300 xg tokom 3 minuta, aspirirajući supernatant nakon svakog pranja. Alogeni PBMC (netretiran mitomicinom C) se dodaju na ploču sa 96 bunara u RPMI dopunjen sa 10% v/v FBS u koncentraciji od 2×10<6>/ml, 50 µL/bunaru. Anti-OX40L antitela su razblažena u sredini za razvoj kulture i dodata na ploču sa 96 bunara koja sadrži PBMC (netretirana mitomicinom C) pri 50 µL/bunaru. PBMC tretiran mitomicinom C je zatim dodat alogenom PBMC (koji nije tretiran mitomicinom C) u ploču sa 96 bunara u odnosu finalnih ćelija u rasponu od 1:1 do 4:1 za tretiran mitomicinom C prema bez mitomicina C, na bazi broja ćelija/bunaru. Ćelije su inkubirane pet dana na 37°C/5% CO2. Nakon pet dana TNF-α, IFN-γ i IL-2 su mereni putem duoset ELISA (R&D

1

Systems) prema preporukama proizvođača. Proliferacija je merenaputem CFSE razblaživanja u skladu sa preporukama proizvođača.

[0652] PBMC su izolovani iz komora sistema za leukoredukciju (NHSBT) koristeći Ficoll-Paque plus (GE Healthcare) gradijentno centrifugiranje. PBMC su prethodno inkubirani sa mitomicinom C (Sigma) na 10 µg/mL u PBS tokom jednog časa na 37 °C. Ćelije su zatim oprane 3 puta u PBS centrifugirajući na 300 xg tokom 3 minuta, aspirajući supernatant nakon svakog pranja. T-limfociti (T ćelije), u nekim slučajevima CD3 pozitivne, a u drugim slučajevima CD4 i CD8 pozitivne izolovani su iz alogenog PBMC negativnom selekcijom pomoću magnetnih mikroperli (Miltenyi Biotech) prema preporukama proizvođača. U nekim slučajevima, umesto T-ćelija korišćen je PBMC koji nije tretiran mitomicinom C. Izolovane ćelije su centrifugirane na 300 xg/5 min, resuspendovane u sredini za razvoj kulture (sredine za razvoj kulture su definisane ili kao RPMI (Gibco) 10% v/v FBS ili RPMI 5% v/v humani AB serum) i 50 µL suspenzije ćelija dodate na ploču sa 96 bunara koji sadrže titar rekombinantnog OX40L i antitela kako bi se postigla konačna koncentracija od 2×10<3>ćelije/bunaru. Anti-OX40L antitela su razblažena u sredini za razvoj kulture do finalne koncentracije testa od 100nM ili u nekim slučajevima korišćen je titar antitela. Antitela su dodata na ploču sa 96 bunara koji sadrže T ćelije ili PBMC netretiran mitomicinom C pri 50 µL/bunaru. PBMC tretiran mitomicinom C su zatim dodati u ploču sa 96 bunara koji sadrže T ćelije ili PBMC netretiran mitomicinom C u finalnom odnosu ćelija u rasponu od 1:1 do 4:1 za mitomicinom C tretirani PBMC prema T ćelijama (ili PBMC), na bazi broja ćelija/bunaru. Ćelije su inkubirane pet dana na 37 °C/5% CO2. Nakon pet dana, IFN-γ je meren pomoću duoseta ELISA (R&D Systems) u skladu sa preporukama proizvođača.

[0653] Anti-OX40L antitela su definisana kao inhibitori u alogenim PBMC/T ćelije MLR ili PBMC/PBMCI MLR kada je >20% inhibicija (videti Jednačinu 8) faktora otpuštanja (IFN-γ) ili su opservirana u odnosu na kontrolne bunare u odsustvu antitela. Od četiri izvršena eksperimenta, jedan eksperiment je bio tehnički neuspeh, definisan kao bez MLR odziva (IFN-γ oslobađanje) detektovano između alogenih donora. Od preostala tri eksperimenta, sva tri su pokazala inhibiciju (>20% inhibicije faktora oslobađanja (IFN-γ,) opservirano u odnosu na kontrolne bunare u odsustvu antitela) sa 2D10, 10A07 i pozitivnom kontrolom 1, međutim, u jednom od tri

1

eksperimenta, značajna inhibicija je opservirana i kod antitela kontrole izotipa (Slika 2). Za PBMC/PBMC MLR izvršena su tri eksperimenta. Od tri eksperimenta, dva su smatrana tehničkim neuspehom, jer nije bilo ili je bilo nisko IFN-γ oslobađanje.

Međutim, u drugom eksperimentu 10A07 je inhibirao otpuštanje IFN-γ u poređenju sa kontrolom izotipa.

Jednačina 8: Procenat inhibicije (MLR)

[0654] Na osnovu vrednosti iz IFN-γ ili IL2 oslobađanja (pg/mL) određenih na opisani način

vrednost uzorka − bez stimulansa

% inhibicije = 100 − x 100

Bez IgG − bez stimulansa

[0655] Bez stimulansa = bunari u koje su dodate samo T-ćelije ili PBMC netretiran mitomicinom C (PBMC netretiran mitomicinom C)

[0656] Bez IgG = bunari u koje su dodate T-ćelije ili u nekim slučajevima PBMC netretiran mitomicinom C zajedno sa PBMC tretiranim mitomicinom C ali bez IgG

Primer 6

Utvrđivanje efekta anti-OX40L antitela na CD3 prajmovane primarno humane T limfocite

[0657] Da bi se utvrdilo da li anti-OX40L ima sposobnost da indukuje T-ćelijske odgovore u odsustvu OX40L, test u nastavku je izveden metodom prilagođenom od Wang et al., Hybridoma (Larchmt)., 2009 Aug; 28(4): 269-76, u kojoj je opisan agonist anti-OX40L antitela.

[0658] Mišje antihumano CD3 antitelo (Becton Dickinson) razblaženo je na 0,5 µg/mL u sterilnom PBS-u i 50 µL/bunaru dodato u visoko-vezujuću sterilnu ploču sa 96 bunara i inkubirano preko noći na 4°C.

[0659] Nakon noćne inkubacije, ploča je tri puta oprana sa 100 µl sterilnog PBS.

[0660] T-ćelije (CD3 pozitivne) su izolovane iz PBMC izvedenih iz komora sistema leukoredukcije (NHSBT) kako je opisano u Primeru 3. Nakon izolacije, ćelije su

1

dodate u bunare u 100 µL da bi se postigla finalna koncentracija od

1×10<3>ćelije/bunaru.

[0661] Test antitela su razblažena u RPMI+ 10% FBS i 50 µL ili 100 µL/bunaru dodato je u ćelijsku ploču da bi se postigla finalna test koncentracija od 10 µg/mL. U nekim slučajevima, u bunare je takođe dodato mišje antihumano CD28 antitelo (Becton Dickinson) u finalnoj koncentraciji od 1 µg/ml

[0662] Test je inkubiran 5 dana. Nakon 5 dana, žetveni supernatanti i IFN-γ nivoi u supernatantu su određeni kao što je opisano u Primeru 5.

[0663] Test je urađen u četiri nezavisna donora i nije uočen efekat dodavanja 10A07 ili 2D10 u IgG4PE formatu (IFN-γ oslobađanje) u odnosu na onaj koji je uočen sa izotip kontrolom humanog IgG4PE.

Primer 7

Model rezus makaki kalem protiv bolesti domaćina (GvHD)

[0664] Efikasnost antitela 2D10 IgG4PE kao profilaktičke mono-terapije za tretman GvHD ispitana je u rezus makaki modelu haploidentične transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT). Ranije je bilo opisano da majmuni koji se podvrgavaju HSCT-u u ovom modelu imaju vreme preživljavanja od 6-8 dana (Miller, Weston P., i dr. "GVHD after haploidentical transplantacijetion: a novel, MHC-defined rhesus macaque model identifies CD28- CD8+ T cells as a reservoir of breakthrough T-cell proliferation during costimulation blockade and sirolimus-based immunosuppression." Blood, 116, 24(2010):5403-5418.)

[0665] Sve transplantacije su bile između polu-uparenih parova koji se ne podudaraju sa jednim haplotipom MHC ("haploidentični-HCTi"). Životinje primaoci su imale zračenje na bazi pre-mijeloablativnog pre-transplantacionog kondicioniranja koristeći linearni akcelerator. Brzina doze: 7cGy/min. Doza 1020 cGy data u 4 frakcije. Životinja donor leukofereze podvrgnuta je GCSF mobilizaciji i podvrgnuta je leukaferezi pomoću mašine za aferezu Spectra Optia. U tabeli ispod data je doza po kg ukupnih nukleiranih ćelija (TNC) doza CD3<+>ćelija i CD34<+>ćelija za četiri uspešna eksperimenta.

1 1

Tabela 3

[0666] 2D10 IgG4PE je doziran u dozi od 10 mg/kg u skladu sa planiranim doziranjem koje je trebalo da se obavi na dan -2, dan 5, dan 12, dan 19, dan 26, dan 33, dan 40, dan 47 nakon transplantacije. Nisu uočeni ozbiljni neželjeni efekti doziranja kod bilo koje životinje kao rezultat primene 2D10 IgG4PE.

[0667] Uzorci su uzeti tokom ispitivanja za praćenje himerizma donora (Tabela 4) i broja belih krvnih zrnaca. Primarni ishod se zasnivao na preživljavanju, sa preživljavanjem do 15 dana koje se smatra znakom uspešnog profilaktičkog tretiranja (i u poređenju sa dokumentovanim preživljavanjem od 6-8 dana bez profilakse). Iako su planirani kompletna patologija i histologija sa GvHD ocenama, markeri aktivacije T-ćelija (kao što su Ki-67 i granzim B) i analiza gena, oni nisu bili dostupni za uključivanje.

[0668] Metode za ove studije su u suštini kao što je opisano u Miller WP et al., (2010) "GVHD after haploidentical transplantacijetion: a novel, MHC-defined rhesus macaque model identifies CD28- CD8+ T cells as a reservoir of breakthrough T-cell proliferation during costimulation blockade and sirolimus-based immunosuppression", Blood 116:5403-5418.

Klinička faza GvHD

[0669] Ocena kliničkih simptoma bazirana je na opservacijskim procenama i kliničkoj hemiji, klasifikovanoj prema kriterijumima navedenim u Tabeli 5.

1 2

Histopatologija

[0670] Tkiva, uključujući pluća, jetru, kožu i gastrointestinalni trakt, prikupljena su pri nekropsiji i fiksirana u formalinu i ulivena u parafin. Sekcije su isečene, montirane na slajd i obojene hematoksilin/eozinom ili markerima T ćelija za vizuelizaciju infiltracije tkiva limfocitima. Pripremljene slajdove je očitao histopatolog sa specifičnom ekspertizom za GvHD koristeći semikvantitativni sistem bodovanja.

Protočna citometrija

[0671] Uzdužni uzorci periferne krvi prikupljeni su pre i posle transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija i pri obdukciji za protočnu citometrijsku analizu podskupova limfocita. Tkiva pluća, jetre, debelog creva i slezine i limfnih čvorova (aksilarna i ingvinalna) prikupljena su pri obdukciji i disocirana ili enzimski digestirana po potrebi za naknadnu analizu infiltrata limfocita putem protočne citometrije. Uzorci su analizirani pomoću polihromatske protočne citometrije pomoću LSRFortessa ćelijskog analizatora (BD Biosciences) pomoću sledećih sondi markera T limfocita: CD3 (APC-Cy7 oznaka; klon SP34-2, BD Biosciences), CD4 (BV786 oznaka; klon L200, BD Biosciences), CD8 (BUV395 oznaka; klon RPA-T8, BD Bioscences), CD28 (PE-Cy7 oznaka; klon CD28.2, eBioscience), CD95 (BV605 oznaka; klon DX2, Biolegend). Populacije proliferirajućih ćelija identifikovane su pomoću Ki-67 (oznaka FITC, Dako). Pododeljci CD4+ ili CD8+ T ćelija su označeni na sledeći način: naivne T ćelije (CD28+/CD95-), centralne memorijske T ćelije (CD28+/CD95 ), efektorske memorijske T ćelije (CD28-/CD95+).

Himerizam

[0672] Himerizam periferne krvi ili T-ćelija (CD3+/CD20-) je određen korišćenjem divergentnih donor- i recipijent-specifičnih MHC-vezanih mikrosatelitskih markera, upoređivanjem visina pikova donor- i recipijetnt-specifičnih amplikona (Penedo MC et al., (2005) "Microsatellite typing of the rhesus macaque MHC region", Imunogenetics 57:198-209.

1

Tabela 5.

[0673] Ukupno šest životinja je izabrano da primi HSCT. Od ovih 6 životinja, dva eksperimenta su smatrana tehničkim neuspehom, jedna životinja je doživela virusnu reaktivaciju koja je možda otežala usađivanje i uočeno je da se himerizam donora u početku popeo, ali je zatim pao, što ukazuje na to da je druga rekonstitucija bila autologna repopulacija. Jedno očitavanje visokog nivoa citomegalovirusa (CMV) i rezus makaki limfokriptovirusa (rhLCV) primećeno je istovremeno sa padom himerizma i autologne repopulacije. Drugi tehnički neuspeh je rezultat neuspeha mašine za aferezu da proizvede odgovarajući proizvod za transplantacijeciju. Pošto je životinja primalac već bila ozračena, morala je biti žrtvovana. Četiri druge životinje su preživele do primarnog ishoda od 15 dana, pokazujući produženo preživljavanje u poređenju sa istorijskim i savremenim kontrolama bez profilakse. Tabela 6 u nastavku opisuje rezime svake životinje u ovoj studiji.

Primer 8

Farmakokinetika

[0674] Rezus makaki su dozirani sa 10 mg/kg 2D10 ili odgovarajućim nefunkcionalnim antitelom za kontrolu izotipa 0. dana. Uzorkovani su uzorci, nakon 15 minuta, 1 čas, 8 časova, 24-36 časova, 72 časa, 96 časova, 8. dan, 11. dan, 15. dan, 18. dan, 22. dan, 25. dan.29. dana, životinje su dozirane sa 3 mg/kg 2D10 ili odgovarajućim nefunkcionalnim antitelom za kontrolu izoptipa. Uzorci su uzeti 29. dana nakon 15 minuta, 1 čas, 8 časova, a zatim 24-36 časova nakon 29. dana. Uzorci su nastavljeni da se uzimaju na 32. dan, 33. dan,

1 4

+ 36. dan, 39. dan, 43. dan, 46. dan, 50. dan, 53. dan, 57. dan, 60. dan, 64. dan, 67. dan i 71. dan.

[0675] Da bi se odredio PK, antihumani IgG je razblažen na 8 µg/mL u PBS i adsorbovan na niskofluorescentnim, visokoproteinski vezujućim pločama sa 96 bunara (Costar) preko noći na 4°C. Višak IgG je uklonjen pranjem sa PBS - Tween i bunari su blokirani sa 5% tež/v nemasnog osušenog mleka (pufer za blokiranje) u toku 1 čas na sobnoj temperaturi. Nakon perioda inkubacije, ploče su oprane. Uzorci plazme su razblaženi u blokirajućem puferu (više razblaživanja). Standardna kriva je takođe generisana pomoću titracije pozitivnog kontrolnog anti-OX40L antitela razblaženog u blokirajućem puferu od 10 µg/mL (razblaženje1:3). Ploči su dodati ili titracija ili razblaženi uzorak plazme i inkubirani 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim oprane i biotinilisani humani OX40L je razblažen na 500 ng/mL u puferu za blokiranje koji je dodat na 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim oprane i dodat je streptavidin-Europium3 konjugat (DELFIA<®>detekcija, PerkinElmer) razblažen u DELFIA<®>test puferu (Perkin Elmer). Ploče su zatim oprane 3 puta u Tris puferisanom fiziološkom rastvoru 0,1% tween. Zatim je na ploču dodat DELFIA Enhancement rastvor (Perkin Elmer) i vremenski razložena fluorescencija je merena na 615 nm na čitaču ploča Envision (PerkinElmer). Koncentracija anti-OX40L antitela u plazmi je izračunata ekstrapolacijom vrednosti fluorescencije uzorka iz bunara na one dobijene iz standardne krive generisane titracijom pozitivnog kontrolnog anti-OX40L antitela korišćenjem algoritma za fitovanje logističke krive sa četiri parametra.

1

4. a elTab

[0676] Podaci u zagradama ukazuju na eksperimentalni neuspeh usled infekcije (životinja 1) ili tehničkog neuspeha (životinja 3).

Tabela 6.

1

1 SPISAK SEKVENCI [0677]

1

�

11

��

�

��

�

�

�

�

�

�

21

22

�

��

�

�

�

[0678] Numerisanje u tabeli korelacije sekvenci ima prednost nad bilo kojim nekonzistentnim numerisanjem drugde u ovom tekstu.

2

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen i koje se specifično vezuje za hOX40L i inhibira vezivanje hOX40L za hOX40, pri čemu antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži teški lanac i laki lanac i pri čemu teški lanac sadrži VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34 i laki lanac koji sadrži VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:48.

2. Antiitelo ili fragment koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži konstantni region humanog gama 4.

3. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema zahtevu 2, koji se sastoji od konstantnog regiona teškog lanca SEQ ID No:128.

4. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema bilo kom prethodnom zahtevu, pri čemu antitelo ili fragment koji vezuje antigen obuhvata kapa laki lanac koji se sastoji od konstantnog regiona izabranog iz grupe koju čine aminokiselinske sekvence Seq ID No: 136, 138, 140, 142 i 144, posebno Seq ID No:136, konstantnog regiona kapa lakog lanca.

5. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu antitelo obuhvata teški lanac i laki lanac, aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koji se sastoji od sekvence SEQ ID No:62 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koji se sastoji od sekvence SEQ ID No:64.

6. Farmaceutski sastav koji sadrži antitelo ili fragment koji vezuje antigen kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 5, i farmaceutski prihvatljivi ekscipijens, razblaživač ili nosač, opciono formulisan za parenteralnu primenu izabranu od intravenske ili supkutane primene.

7. Farmaceutski sastav prema zahtevu 6, za upotrebu u tretmanu i/ili prevenciji bolesti "kalem protiv domaćina" (GvHD).

8. Farmaceutski sastav prema zahtevu 6, za upotrebu u tretmanu i/ili prevenciji dermatitisa.

2

9. Komplet koji se sastoji od antitela ili fragmenta koji vezuje antigen kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 5, u kombinaciji sa oznakom ili uputstvom za upotrebu za tretiranje i/ili prevenciju navedene bolesti ili stanja kod čoveka; opciono, pri čemu oznaka ili uputstvo sadrže broj dozvole za stavljanje u promet (npr. broj dozvole EMA).

10. Komplet prema zahtevu 9, koji se dalje sastoji od uređaja za injektiranje, opciono uređaja za intravenoznu injekciju.

11. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 5 za upotrebu u terapiji.

12. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 5, za upotrebu u tretmanu ili prevenciju bolesti "kalem protiv domaćina" (GvHD).

13. Antitelo ili fragment koji vezuje antigen kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 5, za upotrebu u tretmanu ili prevenciji dermatitisa.

14. Nukleinska kiselina koja kodira VH domen i VL domen antitela ili fragmenta koji vezuje antigen kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 5.

15. Nukleinska kiselina koja kodira VH domen antitela ili fragmenta koji vezuje antigen kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 5, i nukleinska kiselina koja kodira VL domen antitela ili fragmenta koji vezuje antigen kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 5.

16. Vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu kako je definisano u zahtevu 14 ili nukleinsku kiselinu kako je definisano u zahtevu 15.

17. Ćelija domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu kako je definisano u zahtevu 14 ili nukleinsku kiselinu kako je definisano u zahtevu 15, ili vektor kako je definisano u zahtevu 16.