RS64691B1 - Bispecifična anti-muc16-cd3 antitela i konjugati anti-muc16 sa lekom - Google Patents

Bispecifična anti-muc16-cd3 antitela i konjugati anti-muc16 sa lekom

Info

Publication number
RS64691B1
RS64691B1 RS20230945A RSP20230945A RS64691B1 RS 64691 B1 RS64691 B1 RS 64691B1 RS 20230945 A RS20230945 A RS 20230945A RS P20230945 A RSP20230945 A RS P20230945A RS 64691 B1 RS64691 B1 RS 64691B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antigen
binding
muc16
amino acid
antibody
Prior art date
Application number
RS20230945A
Other languages
English (en)
Inventor
Lauric Haber
Eric Smith
Marcus Kelly
Jessica R Kirshner
Sandra Coetzee
Alison Crawford
Thomas Nittoli
Yashu Liu
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS64691B1 publication Critical patent/RS64691B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
OPIS PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na bispecifična antitela ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji se vezuju za Mucin 16 (MUC16) i CD3, i na postupke za njihovu upotrebu.
STANJE TEHNIKE
[0002] Mucin 16 (MUC16), takođe poznat kao antigen kancera 125, antigen karcinoma 125, antigen ugljenih hidrata 125 ili CA-125, je pojedinačni transmembranski domen visoko glikozilovanog integralnog membranskog glikoproteina koji je visoko eksprimiran kod kancera jajnika. MUC16 se sastoji od tri glavna domena: ekstracelularnog N-terminalnog domena, velikog tandemskog ponavljajućeg domena ispresecanog domenima sperme morskog ježa, enterokinaze i agrina (SEA) i karboksil terminalnog domena koji se sastoji od segmenta transmembranskog regiona i kratkog citoplazmatskog repa. Proteolitičko cepanje dovodi do oslobađanja većeg dela ekstracelularnog dela MUC16 u krvotok. MUC16 je prekomerno eksprimiran kod karcinoma uključujući kancer jajnika, kancer dojke, kancer pankreasa, kancera nemalih ćelija pluća, intrahepatični tip holangiokarcinoma koji formira masu, adenokarcinom grlića materice i adenokarcinom želudačnog trakta, kao i kod bolesti i stanja uključujući u bolesti creva, ciroze jetre, srčane insuficijencije, peritonealne infekcije i abdominalne hirurgije. (Haridas, D. et al., 2014, FASEB J., 28:4183-4199). Pokazano je da ekspresija na ćelijama kancera štiti ćelije tumora od imunog sistema. (Felder, M. et al., 2014, Molecular Cancer, 13:129) Ispitivani su postupci za lečenje kancera jajnika korišćenjem antitela na MUC16. Oregovomab i abgovomab su anti-MUC16 antitela koja su imala ograničen uspeh. (Felder, supra, Das, S. i Batra, S.K.
2015, Cancer Res.75:4660-4674.)
[0003] CD3 je homodimerni ili heterodimerni antigen eksprimiran na T ćelijama u vezi sa kompleksom receptora T ćelija (TCR) i neophodan je za aktivaciju T ćelija. Funkcionalni CD3 se formira iz dimerne asocijacije dva od četiri različita lanca: epsilon, zeta, delta i gama. CD3 dimerni aranžmani uključuju gama/epsilon, delta/epsilon i zeta/zeta. Pokazalo se da antitela protiv CD3 grupišu CD3 na T ćelijama, uzrokujući aktivaciju T ćelija na način sličan angažovanju TCR-a od strane MHC molekula napunjenih peptidima. Stoga su anti-CD3 antitela predložena u terapeutske svrhe koje uključuju aktivaciju T ćelija. Pored toga, bispecifična antitela koja su sposobna da vežu CD3 i ciljni antigen su predložena za terapeutsku upotrebu koja uključuje ciljanje imunoloških odgovora T ćelija na tkiva i ćelije koje eksprimiraju ciljni antigen. Sledeći dokument predstavlja relevantno stanje tehnike: WO2016149368, „Anti-MUC16 antitela i njihova upotreba“, objavljen 22. septembra 2016.
[0004] Molekuli koji vezuju antigen koji ciljaju MUC16, uključujući konjugate antitelo-lek, kao i bispecifični molekuli koji vezuju antigen koji vezuju i MUC16 i CD3 bili bi korisni u terapeutskim okruženjima u kojima je poželjno specifično ciljanje i ubijanje ćelija koje eksprimiraju MUC16 posredovano T ćelijama.
KRATKA SUŠTINA PRONALASKA
[0005] U prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje bispecifična antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji vezuju humani MUC16 i humani CD3. Bispecifična antitela su korisna, između ostalog, za ciljanje T ćelija koje eksprimiraju CD3, i za stimulaciju aktivacije T ćelija, na primer, pod okolnostima u kojima je ubijanje ćelija koje eksprimiraju MUC16 posredovano T ćelijama korisno ili poželjno. Na primer, bispecifična antitela mogu da usmere CD3 posredovanu aktivaciju T ćelija na specifične ćelije koje eksprimiraju MUC16, kao što su ćelije tumora jajnika. Antitela, ili njihovi fragmenti za vezivanje antigena, sadrži antigen vezujući domen koji specifično veže humani MUC16 i sadrži set sekvenci aminokiselina HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCR1-LCDR2-LCDR3 SEQ ID NOs: 20-22-24-28-30-32 (npr. H1 H8767P). Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže bispecifična antitela. Pronalazak je definisan patentnim zahtevima.
SUŠTINA TEHNIČKOG UČENJA
[0006] Tehničke informacije navedene u nastavku mogu u nekim aspektima prevazići pronalazak, koji je definisan isključivo priloženim zahtevima. Dodatne tehničke informacije su date da bi se stvarni pronalazak stavio u širi tehnički kontekst i da bi se ilustrovali mogući povezani tehnički razvoji. Takve dodatne tehničke informacije koje ne spadaju u obim priloženih patentnih zahteva nisu deo pronalaska.
[0007] Izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen iz predmetnog izlaganja vezuje humani MUC16 unutar jednog ili više od pet membransko-proksimalnih SEA domena humanog MUC 16 (SEQ ID NO: 1899). Pet membranski proksimalnih SEA domena odgovaraju ostacima 13791-14451 SEQ ID NO: 1899. U nekim slučajevima, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen vezuje se sa KDmanjim od oko 60 nM, što je mereno u površinskom plazmonskom rezonantnom testu na 23°C. U nekim slučajevima, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen vezuje se za ostatke 14237 do 14290 SEQ ID NO: 1899. Za par HCVR/LCVR par koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 18/26.
[0008] Antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti iz predmetnog izlaganja mogu se koristiti u konjugatima antitelo-lek koji sadrže antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen i terapeutsko sredstvo (npr., citotoksični agens). U nekim slučajevima, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen i citotoksični agens su kovalentno vezani preko linkera, kao što je ovde diskutovano.
[0009] U nekim slučajevima, citotoksični agens se bira između auristatina, maitanzinoida, tubulizina, derivata tomaimicina ili derivata dolastatina. U nekim slučajevima, citotoksični agens je auristatin izabran između MMAE ili MMAF, ili majtansinoid izabran između DM1 ili DM4. U nekim slučajevima, citotoksični agens je maitanzinoid koji ima strukturu Formule (I) ili Formule (II), kako je ovde razmatrano.
[0010] U nekim slučajevima, citotoksični agens je maitanzinoid koji ima strukturu:
[0011] U nekim slučajevima, citotoksični agens je maitanzinoid koji ima strukturu:
[0012] U nekim slučajevima, konjugat antitelo-lek sadrži anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment, i
gde je veza za anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment.
[0013] U nekim slučajevima, konjugat antitelo-lek sadrži anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment, i
gde je veza za anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment.
[0014] U nekim slučajevima, konjugat antitelo-lek sadrži anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment, i
gde je veza za anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment.
[0015] U nekim slučajevima, veza dolazi u kontakt sa antitelom ili njegovim fragmentom preko sumpornog konstituenta ostatka cisteina.
[0016] U nekim slučajevima, konjugat antitelo-lek sadrži anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment, i
ili
ili njihova smeša,
gde veza za anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment.
[0017] U nekim slučajevima, veza dolazi u kontakt sa antitelom ili njegovim fragmentom preko azotnog konstituenta ostatka lizina.
[0018] U bilo kom od različitih slučajeva konjugata antitelo-lek koji su razmatrani gore ili ovde, konjugat antitelo-lek može da sadrži od 1 do 4 citotoksična sredstva po antitelu ili njegovom fragmentu.
[0019] Predmetno izlaganje obezbeđuje bispecifična antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji vezuju MUC16 i CD3. Takvi bispecifični molekuli koji vezuju antigen se ovde takođe nazivaju "anti-MUC16/anti-CD3 bispecifični molekuli", "anti-CD3/anti-MUC16 bispecifični molekuli" ili "MUC16xCD3 bsAt-a". Anti-MUC16 deo bispecifičnog molekula anti-MUC16/anti-CD3 je koristan za ciljanje ćelija (npr. tumorske ćelije) koje eksprimiraju MUC16 (npr. tumori jajnika), a anti-CD3 deo bispecifičnog molekula je koristan za aktiviranje T-ćelija. Istovremeno vezivanje MUC16 na tumorskoj ćeliji i CD3 na T-ćeliji olakšava usmereno ubijanje (lizu ćelije) ciljane tumorske ćelije od strane aktivirane T-ćelije. Anti-MUC16/anti-CD3 bispecifični molekuli iz ovog otkrića su stoga korisni, između ostalog, za lečenje bolesti i poremećaja povezanih sa ili uzrokovanih tumorima koji eksprimiraju MUC16 (npr., kanceri jajnika).
[0020] Bispecifična antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen sadrže prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje humani CD3 i drugi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje MUC16, pri čemu drugi domen za vezivanje antigena obuhvata HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 domeni, tim redom, koji sadrže sekvence aminokiselina SEQ ID NOs: 20-22-24-28-30-32. Ovo izlaganje uključuje anti-MUC16/anti-CD3 bispecifične molekule (npr., bispecifična antitela) gde svaki domen koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) uparen sa varijabilnim regionom lakog lanca (LCVR). U određenim primerima ovog otkrića, domen za vezivanje anti-CD3 antigena i domen za vezivanje anti-MUC16 antigena svaki sadrži različite, različite HCVR uparene sa zajedničkim LCVR. Na primer, kao što je ovde ilustrovano u Primeru 3, konstruisana su bispecifična antitela koja sadrže prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje CD3, pri čemu prvi domen koji se vezuje za antigen sadrži HCVR izveden iz anti-CD3 antitela uparenog sa LCVR izvedenim iz anti-MUC16 antitelo (npr., isti LCVR koji je uključen u domen koji se vezuje za anti-MUC16 antigen); i drugi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje MUC16, pri čemu drugi domen za vezivanje antigena sadrži HCVR/LCVR izveden iz anti-MUC16 antitela. Drugim rečima, u primerima molekula koji su ovde otkriveni, uparivanje HCVR iz anti-CD3 antitela sa LCVR iz anti-MUC16 antitela stvara domen koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za CD3 (tj. MUC16-vezujući domen se vezuje na MUC16, ali CD3-vezujući domen ne vezuje MUC16). U takvim slučajevima, prvi i drugi domeni za vezivanje antigena sadrže različite anti-CD3 i anti-MUC16 HCVR, ali dele zajednički anti-MUC16 LCVR. U drugim slučajevima, bispecifično antitelo i njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrže različite anti-CD3 i anti-MUC16 HCVR, ali dele zajednički LCVR. Genski modifikovani miševi se mogu koristiti za proizvodnju potpuno humanih bispecifičnih molekula za vezivanje antigena koji sadrže dva različita teška lanca koji se povezuju sa identičnim lakim lancem koji sadrži varijabilni domen izveden iz jednog od dva različita segmenta gena varijabilnog regiona lakog lanca čoveka. Alternativno, varijabilni teški lanci mogu biti upareni sa jednim zajedničkim lakim lancem i eksprimirani rekombinantno u ćelijama domaćinima. Kao takva, antitela prema pronalasku mogu sadržati teške lance imunoglobulina povezane sa jednim preuređenim lakim lancem. U nekim slučajevima, laki lanac obuhvata varijabilni domen izveden iz segmenta humanog gena Vk1-39 ili segmenta gena Vk3-20. U drugim slučajevima, laki lanac sadrži varijabilni domen izveden iz segmenta humanog Vk1-39 gena preuređenog sa humanim Jk5 ili humanim Jk1 genskim segmentom.
[0021] U nekim slučajevima, prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata bilo koju od HCVR aminokiselinskih sekvenci, bilo koju od LCVR aminokiselinskih sekvenci, bilo koji od parova HCVR/LCVR aminokiselina, bilo koji od sekvenci aminokiselina CDR1-CDR2 teškog lanca, ili bilo koja od sekvenci aminokiselina CDR1-CDR2-CDR3 lakog lanca kako je navedeno u američkoj publikaciji 2014/0088295 objavljenoj 27. marta 2014. i PCT/US2016/044732 podnetoj 29. jula 2016.
[0022] U nekim slučajevima, prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD3 obuhvata bilo koju od HCVR aminokiselinskih sekvenci kao što je ovde navedeno u Tabelama 16, 18 i 22. Prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje CD3 može takođe da sadrži bilo koju od sekvenci aminokiselina LCVR kao što je ovde navedeno u Tabelama 1, 16, 19 i 23. Prema određenim primerima, prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata bilo koji od parova sekvenci aminokiselina HCVR/LCVR kao što je ovde navedeno u Tabelama 16, 18, 19, 22 i 23. Predmetno izlaganje takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-MUC16 bispecifične molekule, pri čemu prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata bilo koju od sekvenci aminokiselina CDR1-CDR2-CDR3 teškog lanca kao što je ovde navedeno u Tabelama 16, 18 i 22, i/ili bilo koju od sekvenci aminokiselina CDR1-CDR2-CDR3 lakog lanca kao što je ovde navedeno u Tabelama 1, 16, 19 i 23.
[0023] U nekim slučajevima, prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je ovde navedeno u Tabelama 16, 18 i 22 ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična u sekvenci.
[0024] U nekim slučajevima, prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je ovde navedeno u Tabelama 1, 6, 19 i 23, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična u sekvenci.
[0025] U nekim slučajevima, prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje CD3 obuhvata par sekvenci aminokiselina HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) kao što je ovde navedeno u Tabelama 16, 18, 19, 22 i 23.
[0026] U nekim slučajevima, prvi domen koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za CD3 obuhvata CDR3 domen teškog lanca (HCDR3) koji ima aminokiselinsku sekvencu kao što je ovde navedeno u Tabelama 16, 18 i 22, ili suštinski sličnu sekvencu kojoj je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična u sekvenci; i CDR3 (LCDR3) domen lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je ovde dato u Tabelama 1, 16, 19 i 23, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična u sekvenci.
[0027] U određenim slučajevima, prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje CD3 sadrži par sekvenci aminokiselina HCDR3/LCDR3 kao što je ovde navedeno u Tabelama 16, 18, 19, 22 i 23.
[0028] U nekim slučajevima, prvi domen koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za CD3 obuhvata CDR1 domen teškog lanca (HCDR1) koji ima aminokiselinu kao što je ovde navedeno u Tabelama 16, 18 i 22, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je najmanje 90 %, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična u sekvenci; CDR2 (HCDR2) domen teškog lanca koji ima aminokiselinu kako je prikazano u Tabelama 16, 18 i 22, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična u sekvenci; CDR3 (HCDR3) domen teškog lanca koji ima aminokiselinu kako je prikazano u Tabelama 16, 18 i 22, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična u sekvenci; CDR1 (LCDR1) domen lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u Tabelama 1, 16, 19 i 23 ovde, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična u sekvenci; CDR2 (LCDR2) domen lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je ovde dato u Tabelama 1, 16, 19 i 23, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična u sekvenci, i CDR3 (LCDR3) domen lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je ovde navedeno u Tabelama 1, 16, 19 i 23, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična u sekvenci.
[0029] Određeni neograničavajući, primeri anti-CD3/anti-MUC16 bispecifičnih antigen-vezujućih molekula iz ovog izlaganja uključuju prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje CD3 koji sadrži HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCR3 domene, tim redom, koji imaju aminokiselinske sekvence kao što je ovde navedeno u Tabelama 16, 18, 19, 22 i 23.
[0030] U nekim slučajevima, prvi domen za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za humani CD3 obuhvata regione koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) iz varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kako je dato u Tabeli 16, Tabela 18 ili Tabela 22 i regioni koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) iz varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kako je dato u Tabeli 1, Tabeli 16, Tabeli 19 ili Tabeli 23.
[0031] U nekim slučajevima, prvi domen za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za humani CD3 obuhvata regione koji određuju komplementarnost teškog lanca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) iz varijabilnog regiona teškog lanca (HCVR) izabranog iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1730, 1762 , 1778, 1786 i 1866, i regioni koji određuju komplementarnost lakog lanca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) iz varijabilnog regiona lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26.
[0032] U nekim slučajevima, prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje humani CD3 obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3) i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (A1-LCDR1, A1-LCDR2 i A1-LCDR3), pri čemu A1-HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1732, 1764, 1780, 1788 i 1868; A1-HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1734, 1766, 1782, 1790 i 1870; A1-HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1736, 1768, 1784, 1792 i 1872; A1-LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; A1-LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; i A1-LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32.
[0033] U nekim slučajevima, prvi domen za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za humani CD3 obuhvata CDR-ove teškog i lakog lanca para sekvenci aminokiselina HCVR/LCVR izabranog iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 1730/26, 1762/26, 1778/26
[0034] U nekim slučajevima, prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje humani CD3 obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3) i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (A1-LCDR1, A1 -LCDR2 i A1-LCDR3), i pri čemu drugi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje humani MUC16 obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (A2-HCDR1, A2-HCDR2 i A2-HCDR3) i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (A2-LCDR1, A2-LCDR2 i A2-LCDR3); pri čemu A1-HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1732, 1764, 1780, 1788 i 1868; A1-HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1734, 1766, 1782, 1790 i 1870; A1-HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1736, 1768, 1784, 1792 i 1872; A1-LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; A1-LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; i A1-LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32; i gde A2-HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; A2-HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; A2-HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24; A2-LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:28; A2-LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; i A2-LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32.
[0035] Određeni neograničavajući, primeri anti-CD3/anti-MUC16 bispecifičnih antigen-vezujućih molekula iz ovog izlaganja uključuju prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje CD3 koji sadrži teški lanac koji sadrži regione okvira varijabilnog domena koji imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od FR1 (SEQ ID NO: 1903), FR2 (SEQ ID NO: 1904), FR3 (SEQ ID NO: 1905) i FR4 (SEQ ID NO: 1906).
[0036] U više slučajeva, primeri anti-CD3/anti-MUC16 bispecifičnih molekula za vezivanje antigena iz ovog izlaganja uključuju bispecifični molekul koji vezuje antigen pri čemu prvi domen za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za humani CD3 sadrži HCVR koji sadrži HCDR1-HCDR2-HCDR3 koji ima aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs: 1907-1908-1909.
[0037] U nekim slučajevima, drugi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje MUC16 sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 18, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95 %, najmanje 98% ili najmanje 99% identična u sekvenci.
[0038] U nekim slučajevima, drugi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje MUC16 sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID No:26, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 95 %, najmanje 98% ili najmanje 99% identična u sekvenci.
[0039] U nekim slučajevima, drugi domen za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za MUC16 sadrži par sekvenci aminokiselina HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) SEQ ID NOs:18/26.
[0040] Bispecifično antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema izlaganju može imati sledeća svojstva: vezuje humane ćelije koje eksprimiraju humani CD3 i ćelije cinomolgus majmuna koje eksprimiraju cinomolgus CD3; vezuje humane ćelije koje eksprimiraju humani MUC16; inhibira rast tumora kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera jajnika; suprimira rast tumora ustanovljenih tumora kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera jajnika; prvi domen koji se vezuje za antigen specifično vezuje efektorsku ćeliju sa vrednošću EC50većom od oko 4 nM i, a drugi domen za vezivanje antigena specifično vezuje ciljnu humanu ćeliju tumora jajnika sa vrednošću EC50manjom od 3 nM, pri čemu EC50 vrednost vezivanja se meri u in vitro FACS testu vezivanja; drugi domen za vezivanje antigena specifično vezuje ciljnu ćeliju tumora jajnika sa vrednošću EC50manjom od oko 2 nM; prvi domen koji se vezuje za antigen specifično vezuje svaki od humanih CD3 i cinomolgus CD3 sa vrednošću EC50većom od oko 40 nM, većom od oko 100 nM, većom od oko 200 nM, većom od oko 300 nM, većom od oko 400 nM, većom od oko 500 nM, ili većom od oko 1 mM; prvi domen koji se vezuje za antigen specifično vezuje svaki od humanih CD3 i cinomolgus CD3 sa slabim ili nemerljivim vezivanjem ili afinitetom vezivanja; indukuje ubijanje tumorskih ćelija posredovano T ćelijama sa vrednošću EC50vrednošću manjom od oko 31 pM, kao što je mereno in vitro testom ubijanja tumorskih ćelija posredovanim T ćelijama, na primer, gde su tumorske ćelije OVCAR3 ćelije; prvi domen za vezivanje antigena vezuje humani CD3 sa KDvrednošću većom od oko 11 nM, kao što je mereno u in vitro testu vezivanja površinske plazmonske rezonance; prvi domen koji se vezuje za antigen vezuje svaki od humanih CD3 i cinomolgus CD3 sa KDvrednošću većom od oko 15 nM, većom od oko 30 nM, većom od oko 60 nM, većom od oko 120 nM, većom od oko 300 nM, ili većom od oko 500 nM mereno u in vitro testu vezivanja površinske plazmonske rezonance.
[0041] U određenim slučajevima, antitela iz ovog izlaganja i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen, napravljeni su zamenom aminokiselinskih ostataka roditelja na postepen način na osnovu razlika između germinativne sekvence i sekvence roditeljskog antitela.
[0042] U nekim slučajevima, prvi domen koji se vezuje za antigen se takmiči za vezivanje za humani CD3 sa referentnim proteinom koji se vezuje za antigen koji sadrži tri regiona za određivanje komplementarnosti teškog lanca (A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3) i tri regiona za određivanje komplementarnosti lakog lanca (A1-LCDR1, A1-LCDR2 i A1-LCDR3), A1-HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1732, 1764, 1780, 1788 i 1868; A1-HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1734, 1766, 1782, 1790 i 1870; A1-HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1736, 1768, 1784, 1792 i 1872; A1-LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28; A1-LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30; i A1-LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 32. U nekim slučajevima, prvi domen koji se vezuje za antigen se takmiči za vezivanje za humani CD3 sa referentnim proteinom koji vezuje antigen koji sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO: 1730, 1762, 1778, 1786 i 1866, i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26.
[0043] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-MUC16/anti-CD3 bispecifični antigen-vezujući molekul prema izlaganju i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. Izlaganje dalje obezbeđuje anti-MUC16/anti-CD3 bispecifični antigen-vezujući molekul, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, iz izlaganja za upotrebu u postupku za lečenje kancera kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata davanje subjektu farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-MUC16 antigen-vezujući molekul ili anti-MUC16/anti-CD3 bispecifični antigen-vezujući molekul i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. U nekim slučajevima, kancer je odaran iz grupe koja se sastoji iz kancera uključujući kancer jajnika, kancer dojke, kancer pankreasa, kancer nemalih ćelija pluća, intrahepatični holangiokarcinom koji formira masu, adenokarcinom grlića materice i adenokarcinom trakta želuda. U nekim slučajevima, kancer je kancer jajnika. Međutim, postupci za lečenje nisu deo zahtevanog pronalaska za koji se traži zaštita.
[0044] Ovo izlaganje obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCVR, LCVR ili CDR sekvenci anti-CD3/anti-MUC16 bispecifičnih molekula za vezivanje antigena koji su ovde izloženi. Izloženi su molekuli nukleinske kiseline koji se sastoje od polinukleotidnih sekvenci navedenih u Tabelama 2, 17, 20, 21, 23 i 25, kao i molekuli nukleinske kiseline koji sadrže dve ili više polinukleotidnih sekvenci kao što je navedeno u Tabelama 2, 17, 20, 21, 23 i 25 u bilo kojoj funkcionalnoj kombinaciji ili rasporedu. Rekombinantni ekspresioni vektori koji nose nukleinske kiseline iz ovog izlaganja i ćelije domaćini u koje su takvi vektori uvedeni su takođe opisani, kao i postupci za proizvodnju antitela kultivisanjem ćelija domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela i obnavljanje proizvedenih antitela. Međutim, nukleinske kiseline, vektori, ćelije domaćini i postupci za proizvodnju antitela nisu deo pronalaska za koji se traži zaštita.
[0045] Ovo izlaganje uključuje anti-CD3/anti-MUC16 bispecifične molekule za vezivanje antigena koji imaju modifikovani obrazac glikozilacije. U nekim primenama, modifikacija za uklanjanje nepoželjnih mesta glikozilacije može biti korisna, ili antitelo kome nedostaje deo fukoze prisutan u oligosaharidnom lancu, na primer, da bi se povećala funkcija ćelijske citotoksičnosti (ADCC) zavisne od antitela (videti Shield et al. (2002) JBC 277:26733). U drugim primenama, može se izvršiti modifikacija galaktozilacije da bi se modifikovala citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC).
[0046] U drugom aspektu, izlaganje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-CD3/anti-MUC16 bispecifični antigen-vezujući molekul kao što je ovde izloženo i farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovde je takođe opisana kompozicija koja je kombinacija anti-CD3/anti-MUC16 bispecifičnog molekula koji vezuje antigen i drugog terapeutskog agensa. Na primer, drugi terapeutski agens može biti bilo koji agens koji je poželjno kombinovan sa anti-CD3/anti-MUC16 bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen. Primeri agensa koji se mogu povoljno kombinovati sa anti-CD3/anti-MUC16 bispecifičnim antigen-vezujućim molekulom su ovde detaljno razmotreni na drugom mestu.
[0047] U još jednom aspektu, izlaganje obezbeđuje bispecifično antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen iz izlaganja za upotrebu u terapeutskim postupcima za ciljanje/ubijanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju MUC16, pri čemu terapeutski postupci obuhvataju davanje subjektu kome je potrebno terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-CD3/anti-MUC16 bispecifični antigen-vezujući molekul u skladu sa pronalaskom. Terapeutski postupci nisu deo pronalaska za koji se traži zaštita.
[0048] Ovde se opisuju postupci za upotrebu antitela iz ovog izlaganja, uključujući postupak za detekciju MUC16 u biološkom uzorku, koji obuhvata: dobijanje biološkog uzorka od subjekta i otkrivanje da li je MUC16 prisutan u biološkom uzorku tako što se biološki uzorak dovodi u kontakt sa
1
anti-MUC16 antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom i otkrivanje vezivanja između MUC16 i anti-MUC16 antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen. U nekim slučajevima, biološki uzorak je uzorak tkiva ili tečnosti odabran između plazme, seruma, ascita, jajnika, materice, grlića materice, jetre, bešike, pankreasa, želuca, tankog ili debelog creva, žučne kese, dojke, pluća, bubrega, pljuvačke i suzne žlezde, ili bilo koji njihov epitelioidni malignitet.
[0049] Takođe je opisan postupak za detekciju MUC16 kod pacijenta, koji obuhvata: uzimanje uzorka tkiva od pacijenta; i otkrivanje da li je MUC16 prisutan u uzorku tkiva dovođenjem u kontakt uzorka tkiva sa anti-MUC16 antitelom i otkrivanjem vezivanja između MUC16 i anti-MUC16 antitela. U nekim slučajevima, postupak dalje obuhvata dijagnostikovanje raka kod pacijenta kada se otkrije prisustvo MUC16 u uzorku tkiva. U jednom slučaju, uzorak tkiva je tkivo jajnika. Međutim, samo antitela koja su definisana u patentnim zahtevima spadaju u obim pronalaska.
[0050] Takođe je opisan postupak za detekciju MUC16 kod pacijenta, koji obuhvata: dobijanje uzorka plazme od pacijenta; i otkrivanje da li je MUC16 prisutan u uzorku plazme dovođenjem u kontakt uzorka plazme sa anti-MUC16 antitelom i otkrivanjem vezivanja između MUC16 i anti-MUC16 antitela. U nekim slučajevima, postupak dalje obuhvata dijagnostikovanje raka kod pacijenta kada se otkrije prisustvo MUC16 u uzorku plazme. U nekim slučajevima, postupak dalje obuhvata davanje efikasne količine anti-CD3xMUC16 bispecifičnog antitela pacijentu sa dijagnozom. U nekim slučajevima, postupak dalje obuhvata davanje efikasne količine ADC-a koji sadrži anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen i citotoksično sredstvo dijagnostikovanom pacijentu. Međutim, samo antitela koja su definisana u patentnim zahtevima spadaju u obim pronalaska.
[0051] Drugi slučajevi će postati očigledni iz pregleda detaljnog opisa koji sledi u nastavku. Pronalazak je definisan u nezavisnim patentnim zahtevima. Ostali aspekti i poželjna izvođenja su definisana u zavisnim patentnim zahtevima. Bilo koji aspekti, izvođenja i primeri predmetnog izlaganja koji nisu obuhvaćeni obimom priloženih zahteva ne čine deo pronalaska i samo su obezbeđeni u ilustrativne svrhe.
KRATAK OPIS NACRTA
[0052]
Slike 1, 2 i 3 ilustruju farmakokinetičke profile anti-MUC16 x CD3 bispecifičnih antitela kod miševa divljeg tipa (Slika 1), humanizovanih CD3 miševa (Slika 2) ili humanizovanih MUC16 x CD3 miševa (Slika 3).
Slika 4 prikazuje rezultate studije 1 modela OVCAR-3 (Prosečno zračenje [p/s/cm2/sr] na dan 6). Sve grupe su imale slično opterećenje tumorom kako je procenjeno BLI pre početka doziranja. Prikazani podaci predstavljaju opterećenje tumorom prema proceni BLI 6. dana nakon implantacije tumora. Statistička značajnost je određena korišćenjem neparenih neparametarskih Mann-Whitney-ovih t-testova. Nije bilo značajne razlike u opterećenju tumorom između grupa.
Slika 5 prikazuje rezultate studije 1 OVCAR-3 modela (Prosečno zračenje [p/s/cm22/sr] na dan 20). BSMUC16/CD3-001 značajno smanjuje opterećenje tumorom na 0,1 i 0,5 mg/kg. NSG miševima koji su transplantirane humane T ćelije implantirane su humane OVCAR-3/Luc ćelije. Lečenje je počelo 6 dana nakon implantacije tumora. Miševi su tretirani 6., 10., 13., 16. i 21. dana sa 0,01, 0,1 ili 0.5 mg/kg BSMUC16/CD3-001 primenjenim IP ili tretirani kontrolnom ili nevezujućom kontrolom za CD3 (0.5 mg/kg IP). Prikazani podaci predstavljaju opterećenje tumorom prema proceni BLI 20. dana nakon implantacije tumora. Statistička značajnost je određena korišćenjem neparenih neparametarskih Mann-Whitney t-testova. Tretman sa BSMUC16/CD3-001 je upoređen sa neobavezujućom kontrolom (** p < 0.01 za 0.5 mg/kg, # p < 0.05 za 0.1 mg/kg BSMUC16/CD3-001).
Slika 6 prikazuje rezultate studije 1 modela OVCAR-3 (stepen promene kod tumora evidentnih BLI između D6 i D20). BSMUC16/CD3-001 značajno smanjuje kratku promenu u opterećenju tumorom na 0.01, 0.1 i 0.5 mg/kg. NSG miševima kojima su transplantirane humane T ćelijama implantirane su humane OVCAR-3/Luc ćelije. Miševi su tretirani 6., 10., 13., 16. i 21. dana sa 0.01, 0.1 ili 0.5 mg/kg BSMUC16/CD3-001 primenjenim IP ili tretirani kontrolnom ili nevezujućom kontrolom za CD3 (0,5 mg/kg IP) . Prikazani podaci su višestruka promena u opterećenju tumorom od prvog merenja (uzetog pre početka lečenja) i 20. dana na kraju studije. Statistička značajnost je određena korišćenjem neparenih neparametarskih Mann-Whitney t-testova. Tretman sa BSMUC16/CD3-001 je upoređen sa neobavezujućom kontrolom (** p < 0.01 za 0.5 mg/kg, # p < 0.05 za 0.1 mg/kg, $ p < 0.05 za 0.01 mg/kg BSMUC16/CD3- 001).
Slika 7 prikazuje rezultate studije 2 modela OVCAR-3 (Prosečano zračenje [p/s/cm2/sr] na dan 4). Sve grupe su imale slično opterećenje tumorom kako je procenio BLI pre početka doziranja. Prikazani podaci predstavljaju opterećenje tumorom prema proceni BLI 4. dana nakon implantacije tumora. Statistička značajnost je određena korišćenjem neparenih neparametarskih Mann-Whitney t-testova. Nije bilo značajne razlike u opterećenju tumorom 4. dana između grupa.
Slika 8 prikazuje rezultate studije 2 modela OVCAR-3 (Prosečno zračenje [p/s/cm22/sr] na dan 25). BSMUC16/CD3-005 značajno smanjuje opterećenje tumorom na 0.5, 1 i 5 mg/kg. NSG miševima koji su transplantirane humane T ćelijama implantirane su humane OVCAR-3/Luc ćelije. Lečenje je počelo 5 dana nakon implantacije tumora. Miševi su tretirani 5., 8., 12., 15., 19. i 22. dana sa 0.1, 0.5, 1 ili 5 mg/kg REGN4019 primenjenim IV ili im je davana kontrola koja se vezuje za CD3 ili nevezujuća kontrola (5 mg/kg IV). Prikazani podaci predstavljaju opterećenje tumorom prema proceni BLI 25. dana nakon implantacije tumora. Statistička značajnost je određena korišćenjem neparenih neparametarskih Mann-Whitney t-testova. Tretman sa BSMUC16/CD3-005 je upoređen sa neobavezujućom kontrolom (** p < 0,01 za 5 mg/kg, ## p < 0,01 za 1 mg/kg, $$ p < 0,01 za 0,5 mg/kg BSMUC16/ CD3-005).
Slika 9 prikazuje rezultate studije 2 modela OVCAR-3 (stepen promene u BLI-evidentnim tumorima između D4 i D25). BSMUC16/CD3-005 značajno smanjuje rast tumora pri dozama od 0.5, 1 i 5 mg/kg. NSG miševima koji su transplantirane humane T ćelije implantirane su humane OVCAR-3/Luc ćelije. Miševi su tretirani 5., 8., 12., 15., 19. i 22. dana sa 0.1, 0.5, 1 ili 5 mg/kg REGN4019 primenjenim IV ili tretirani kontrolnom ili nevezujućom kontrolom za CD3 (5 mg/kg). IV). Prikazani podaci su višestruka promena u opterećenju tumorom od prvog merenja (uzetog dan pre početka lečenja) i 25. dana, na kraju studije. Statistička značajnost je određena korišćenjem neparenih neparametarskih Mann-Whitney t-testova. Tretman sa BSMUC16/CD3-005 upoređen je sa neobavezujućom kontrolom (** p < 0.01 za 5 mg/kg, ## p < 0.01 za 1 mg/kg, $$ p < 0.01 za 0.5 mg/kg REGN4019).
Slika 10 prikazuje rezultate ID8-VEGF/huMUC16 modela. Veličina tumora 47. dana nakon implantacije
BSMUC16/CD3-001 značajno smanjuje rast tumora u singenom modelu kada tretman počne ili na dan implantacije ili 10 dana nakon implantacije tumora. Miševima koji eksprimiraju humani CD3 umesto mišjeg CD3 i himernog MUC16 molekula implantirana je linija tumora jajnika miša koja eksprimira deo humanog MUC16. Miševima je primenjen BSMUC16/CD3-001 (100 ug IP) na dan implantacije ili 10 dana nakon implantacije ili je primenjena kontrola za vezivanje CD3 (100 ug IP) na dan implantacije. Miševi su tretirani dana 0, 4, 7, 10, 13, 17, 20 ili 24 za grupe sa neposrednim tretmanom i 10, 13, 17, 20 i 24 dana za grupu u kojoj je doziranje počelo na D10. Prikazani podaci su zapremine tumora 47. dana nakon implantacije. Statistička značajnost je određena korišćenjem neparenih neparametarskih Mann-Whitney t-testova. Tretman sa BSMUC16/CD3-001 je upoređen sa kontrolom za vezivanje CD3 (** p < 0.01 počev od D0, * p < 0.05 počev od D10).
Slike 11A-11C ilustruju rezultate protočne citometrijske analize (ili FACS) vezivanja odabranih bispecifičnih antitela za PEO-1, OVCAR3-Luc, Jurkat-ove ćelije i cinomolgus T ćelije. Analiza titracije je urađena testiranjem niza serijskih razblaženja svakog antitela: ili MUC16xCD3 bispecifična antitela BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-002 ili BSMUC16/CD3-003, ili prvo ili drugo antitelo bez kontrole izotipa (koji unakrsna reaktivnost na CD3 ili MUC16).
Slike 12A i 12B prikazuju primere ubijanja ćelija PEO-1 (Slika 12A) ili OVCAR3-Luc (Slika 12B) u 48-časovnom testu citotoksičnosti nakon tretmana anti-MUC16xanti-CD3 u prisustvu humanih PBMC.
DETALJAN OPIS
[0053] Tehničke informacije koje su date nastavku mogu u nekim aspektima ići dalje odizvođenja prikaza, koje je definisano isključivo priloženim patentnim zahtevima. Obezbeđene su dodatne tehničke informacije su date da bi se stvarno obelodanjivanje stavilo u širi tehnički kontekst i da bi se ilustrovale mogući povezani tehnički razvoji. Takve dodatne tehničke informacije koje ne spadaju u obim priloženih patentnih zahteva nisu deo ovog izlaganja.
[0054] Pre nego što se ovo izlaganje opiše, treba razumeti da ovo izlaganje nije ograničeno na određene postupke i opisane eksperimentalne uslove, pošto takvi postupci i uslovi mogu da variraju. Takođe treba razumeti da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisivanja određenih aspekata, i nije namera da bude ograničavajuća, pošto će obim ovog pronalaska biti ograničen samo priloženim zahtevima.
[0055] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su korišćeni ovde imaju isto značenje koje obično razume stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada. Kako se ovde koristi, termin "oko", kada se koristi u odnosu na određenu navedenu numeričku vrednost, znači da vrednost može da varira od navedene vrednosti za najviše 1%. Na primer, kako se ovde koristi, izraz "oko 100" uključuje 99 i 101 i sve vrednosti između (npr.99.1, 99.2, 99.3, 99.4, itd.).
[0056] Iako se bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ili ispitivanju ovog pronalaska, sada su opisani poželjni postupci i materijali.
Definicije
[0057] Izraz "CD3", kako se ovde koristi, odnosi se na antigen koji je eksprimiran na T ćelijama kao deo multimolekularnog T ćelijskog receptora (TCR) i koji se sastoji od homodimera ili heterodimera formiranog iz asocijacije dva od četiri lanca receptora: CD3-epsilon, CD3-delta, CD3-zeta i CD3-gama. Humani CD3-epsilon sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:1897; humani CD3-delta sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:1898. Sve reference na proteine, polipeptide i fragmente proteina ovde su namenjene da se odnose na humanu verziju odgovarajućeg proteina, polipeptida ili proteinskog fragmenta, osim ako nije eksplicitno navedeno da pripada neljudskoj vrsti. Dakle, izraz "CD3" označava humani CD3 osim ako nije navedeno da je iz nehumane vrste, npr. "CD3 miša", "CD3 majmuna" itd.
[0058] Kako se ovde koristi, "antitelo koje vezuje CD3" ili "anti-CD3 antitelo" uključuje antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji specifično prepoznaju jednu CD3 podjedinicu (npr. epsilon, delta, gama ili zeta), kao i antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti koji specifično prepoznaju dimerni kompleks dve CD3 podjedinice (npr., gama/epsilon, delta/epsilon i zeta/zeta CD3 dimeri). Antitela i fragmenti koji se vezuju za antigen mogu da vežu rastvorljivi CD3 i/ili CD3 eksprimiran na površini ćelije. Rastvorljivi CD3 uključuje prirodne CD3 proteine kao i rekombinantne varijante CD3 proteina kao što su, na primer, monomerni i dimerni CD3 konstrukti, kojima nedostaje transmembranski domen ili su na drugi način nepovezani sa ćelijskom membranom.
[0059] Kako se ovde koristi, izraz "CD3 eksprimiran na površini ćelije" označava jedan ili više CD3 proteina koji je/su eksprimirani na površini ćelije in vitro ili in vivo, tako da je barem deo CD3 proteina
1
izložen vanćelijskoj strani ćelijske membrane i dostupan je delu antitela koji vezuje antigen. "CD3 eksprimiran na površini ćelije" uključuje CD3 proteine sadržane u kontekstu funkcionalnog T ćelijskog receptora u membrani ćelije. Izraz "CD3 eksprimiran na površini ćelije" uključuje CD3 protein eksprimiran kao deo homodimera ili heterodimera na površini ćelije (npr. gama/epsilon, delta/epsilon i zeta/zeta CD3 dimeri). Izraz, „ćelijski površinski eksprimirani CD3" takođe uključuje lanac CD3 (npr. CD3-epsilon, CD3-delta ili CD3-gama) koji je eksprimiran sam po sebi, bez drugih tipova CD3 lanaca, na površini ćelije. „ćelijski površinski eksprimirani CD3" može da sadrži ili da se sastoji od CD3 proteina eksprimiranog na površini ćelije koja normalno eksprimira CD3 protein. Alternativno, "CD3 eksprimiran na površini ćelije" može da sadrži ili se sastoji od CD3 proteina eksprimiranog na površini ćelije koja normalno ne eksprimira ekspresuje humani CD3 na svojoj površini, ali je veštački napravljen da eksprimira CD3 na svojoj površini.
[0060] Izraz "MUC16", kako se ovde koristi, odnosi se na mucin 16. MUC16 je pojedinačni transmembranski domen visoko glikozilovanog integralnog membranskog glikoproteina koji je visoko eksprimiran kod kancera jajnika. Aminokiselinska sekvenca humanog MUC16 je navedena u SEQ ID NO:1899.
[0061] Kako se ovde koristi, "antitelo koje vezuje MUC16" ili "anti-MUC16 antitelo" uključuje antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji specifično prepoznaju MUC16.
[0062] Izraz "molekul koji vezuje antigen" uključuje antitela i fragmente antitela koji se vezuju za antigen, uključujući, npr., bispecifična antitela.
[0063] Termin "antitelo", kako se ovde koristi, označava bilo koji molekul koji se vezuje za antigen ili molekularni kompleks koji sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) koji se specifično vezuje za određeni antigen (npr. MUC16 ili CD3) ili je u interakciji sa njim (npr.). Termin "antitelo" obuhvata molekule imunoglobulina koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, kao i njihove multimere (npr. IgM). Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde skraćeno HCVR ili VH) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca obuhvata tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (ovde skraćeno LCVR ili VL) i konstantni region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca obuhvata jedan domen (CL1). VHi VLregioni se mogu dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regionima koji određuju komplementarnost (CDR), ispresecane regionima koji su više konzervirani, nazvanim regionima okvira (FR). Svaki VHi VLse sastoji od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U različitim slučajevima, FR antitela na MUC16 ili anti-CD3 antitela (ili njihovog dela koji se vezuje za antigen) mogu biti identični sekvencama humane germinativne linije, ili mogu biti prirodno ili veštački modifikovane. Konsenzusna sekvenca aminokiselina može biti definisana na osnovu paralelne analize dva ili više CDR-a.
[0064] Termin "antitelo", kako se ovde koristi, takođe uključuje fragmente punih molekula antitela koji se vezuju za antigen. Termini "deo koji se vezuje za antigen" antitela, "fragment koji se vezuje za antigen" i slično, kako se ovde koristi, obuhvataju bilo koji prirodni, enzimski dobijen, sintetički ili genetički modifikovani polipeptid ili glikoprotein koji specifično vezuje antigen da formira kompleks. Fragmenti antitela koji se vezuju za antigen mogu biti izvedeni, npr., iz punih molekula antitela korišćenjem bilo koje odgovarajuće standardne tehnike kao što su proteolitička digestija ili tehnike rekombinantnog genetičkog inženjeringa koje uključuju manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira antitelo varijabilnih i opciono konstantnih domena. Takva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz, na primer, komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uključujući, na primer, biblioteke fag-antitela), ili se može sintetizovati. DNK se može sekvencionirati i manipulisati hemijski ili korišćenjem tehnika molekularne biologije, na primer, da se uredi jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena u odgovarajuću konfiguraciju, ili da se uvedu kodoni, stvore cisteinski ostaci, modifikuju, dodaju ili izbrišu aminokiseline, itd.
[0065] Neograničavajući primeri fragmenata koji se vezuju za antigen uključuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab’)2 fragmenti; (iii) Fd fragmenti; (iv) Fv fragmenti; (v) jednolančani Fv (scFv) molekuli; (vi) dAb fragmenti; i (vii) minimalne jedinice za prepoznavanje koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji oponašaju hipervarijabilni region antitela (npr., izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) kao što je CDR3 peptid), ili ograničeni FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi konstruisani molekuli, kao što su antitela specifična za domen, antitela sa jednim domenom, antitela sa izbrisanim domenom, himerna antitela, CDR-kalemljena antitela, dijatela, trijatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, dvovalentna nanotela itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIP) i varijabilni IgNAR domeni ajkula, takođe su obuhvaćeni izrazom "fragment koji se vezuje za antigen", kako se ovde koristi.
[0066] Fragment antitela koji se vezuje za antigen će uobičajeno sadržati najmanje jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili sastava aminokiselina i generalno će sadržati najmanje jedan CDR koji je susedan ili u okviru sa jednom ili više okvirnih sekvenci. U fragmentima koji se vezuju za antigen koji imaju VHdomen povezan sa VLdomenom, VHi VLdomeni mogu biti locirani jedan prema drugom u bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, varijabilni region može biti dimeran i sadržati VH-VH, VH-VLili VL-VLdimere. Alternativno, fragment antitela koji se vezuje za antigen može da sadrži monomerni VHili VLdomen.
[0067] U određenim slučajevima, fragment antitela koji se vezuje za antigen može da sadrži najmanje jedan varijabilni domen kovalentno vezan za najmanje jedan konstantni domen. Neograničavajući, primeri konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena koji se mogu naći unutar fragmenta antitela koji se vezuje za antigen uključuju: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (k) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uključujući bilo koju od konfiguracija gore navedenih primera, varijabilni i konstantni domeni mogu biti ili direktno povezani jedan sa drugim ili mogu biti povezani potpunim ili delimičnim zglobom ili regionom povezivanja. Zglobni region se može sastojati od najmanje 2 (npr. 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina koje rezultiraju fleksibilnom ili polu-fleksibilnom vezom između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u jednom polipeptidu molekula. Osim toga, fragment antitela koji se vezuje za antigen može da sadrži homo-dimer ili hetero-dimer (ili drugi multimer) bilo koje od konfiguracija varijabilnog i konstantnog domena navedenih gore u nekovalentnoj povezanosti jedan sa drugim i/ili sa jednim ili više monomernog VHili VLdomena (npr. disulfidnom(im) vezom(ama)).
[0068] Kao i sa punim molekulima antitela, fragmenti koji se vezuju za antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr. bispecifični). Multispecifični fragment antitela koji se vezuje za antigen će tipično sadržati najmanje dva različita varijabilna domena, pri čemu je svaki varijabilni domen sposoban da se specifično veže za poseban antigen ili za drugi epitop na istom antigenu. Bilo koji multispecifični format antitela, uključujući primere formata bispecifičnih antitela koji su ovde otkriveni, može se prilagoditi za upotrebu u kontekstu fragmenta antitela koji se vezuje za antitela korišćenjem rutinskih tehnika dostupnih u oblasti tehnike.
[0069] Antitela mogu funkcionisati putem citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC) ili ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC). "Citotoksičnost zavisna od komplementa" (CDC) se odnosi na lizu ćelija koje eksprimiraju antigen antitelom u prisustvu komplementa. "Citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela" (ADCC) se odnosi na ćelijski posredovanu reakciju u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju Fc receptore (FcRs) (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofagi) prepoznaju vezana antitela na ciljnu ćeliju i na taj način dovode do lize ciljne
1
ćelije. CDC i ADCC se mogu meriti korišćenjem testova koji su dobro poznati i dostupni u tehnici. (Vidi, npr., patente SAD br.5,500,362 i 5,821,337, i Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (SAD) 95:652-656). Konstantni region antitela je važan u sposobnosti antitela da fiksira komplement i posreduje u citotoksičnosti zavisnoj od ćelije. Stoga, izotip antitela može biti izabran na osnovu toga da li je poželjno da antitelo posreduje u citotoksičnosti.
[0070] U određenim slučajevima, anti-MUC16 monospecifična antitela ili anti-MUC16/anti-CD3 bispecifična antitela su humana antitela. Termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, treba da obuhvati antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih germinativnih sekvenci imunoglobulina. Humana antitela mogu da obuhvataju aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama humanim germinativnih sekvencama imunoglobulina (npr. mutacije uvedene slučajnom ili specifičnom za mesto mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR-ovima i posebno CDR3. Međutim, termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije namenjeno da obuhvati antitela u kojima su sekvence CDR sekvence izvedene iz germinativnih drugih vrsta sisara, kao što je miš, prenete na sekvence humanog okvira.
[0071] Antitela mogu, u nekim slučajevima, biti rekombinantna humana antitela. Termin "rekombinantno humano antitelo", kako se ovde koristi, treba da obuhvati sva humana antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na rekombinantne načine, kao što su antitela eksprimirana korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćina (opisano dalje u nastavku), antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela (opisano dalje u nastavku), antitela izolovana od životinje (npr. miša) koja su transgena za gene humanog imunoglobulina (videti npr., Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ili antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje sekvenci gena humanog imunoglobulina na druge DNK sekvence. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz germinativnih sekvenci humanog imunoglobulina. Međutim, u određenim slučajevima, takva rekombinantna humana antitela su izložena mutagenezi in vitro (ili, kada se koristi životinja transgena za humane sekvence Ig, in vivo somatskoj mutagenezi) i tako aminokiselinske sekvence VHi VLregiona rekombinantnog antitela su sekvence koje, iako su izvedene i povezane sa humanim germinativnim VHi VLsekvencama, možda prirodno ne postoje unutar in vivo germinativnog repertoara humanih antitela.
[0072] Humana antitela mogu postojati u dva oblika koja su povezana sa heterogenošću zgloba. U jednom obliku, molekul imunoglobulina sadrži stabilan četvorolančani konstrukt od oko 150-160 kDa u kojoj se dimeri drže zajedno disulfidnom vezom međulančanog teškog lanca. U drugom obliku, dimeri nisu povezani preko međulančanih disulfidnih veza i formira se molekul od oko 75-80 kDa sastavljen od kovalentno spregnutog lakog i teškog lanca (polu-antitelo). Ove oblike je bilo izuzetno teško razdvojiti, čak i nakon afinitetnog prečišćavanja.
[0073] Učestalost pojavljivanja drugog oblika kod različitih intaktnih IgG izotipova je zbog, ali nije ograničeno na, strukturne razlike koje su u vezi sa sa izotipom zgloba antitela. Jedna supstitucija aminokiselina u zglobnom regionu zgloba humanog IgG4 može značajno smanjiti pojavu drugog oblika (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) na nivoe koji se tipično uočavaju upotrebom zgloba humanog IgG1. Ovo izlaganje obuhvata antitela koja imaju jednu ili više mutacija u zglobnom, CH2 ili CH3 regionu koje mogu biti poželjne, na primer, u proizvodnji, da bi se poboljšao prinos željenog oblika antitela.
[0074] Antitela mogu biti izolovana antitela. "Izolovano antitelo", kako se ovde koristi, označava antitelo koje je identifikovano i izdvojeno i/ili regenerisano iz najmanje jedne komponente svog prirodnog okruženja. Na primer, antitelo koje je odvojeno ili uklonjeno iz najmanje jedne komponente organizma, ili iz tkiva ili ćelije u kojima antitelo prirodno postoji ili se prirodno proizvodi, je "izolovano
1
antitelo" za potrebe predmetnog izlaganja. Izolovano antitelo takođe obuhvata in situ antitelo unutar rekombinantne ćelije. Izolovana antitela su antitela koja su bila podvrgnuta najmanje jednom koraku prečišćavanja ili izolacije. Prema određenim slučajevima, izolovano antitelo može biti u suštini bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija. Samo izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, kako je definisano u zahtevima, spada u opseg antitela prema pronalasku.
[0075] Takođe su opisana jednokraka antitela koja vezuju MUC16. Kako se ovde koristi, "jednokrako antitelo" označava molekul koji se vezuje za antigen koji sadrži jedan teški lanac antitela i jedan laki lanac antitela. Jednokraka antitela mogu sadržati bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR aminokiselinskih sekvenci kako je navedeno u Tabeli 1. Međutim, jednokraka antitela koja ne spadaju u obim zahteva nisu deo pronalaska.
[0076] Anti-MUC16/anti-CD3 antitela koja su ovde izložena mogu da sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u okvirima i/ili CDR regionima varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih antitela su dobijena. Takve mutacije se mogu lako utvrditi upoređivanjem sekvenci aminokiselina koje su ovde otkrivene sa germinativnim sekvencama koje su dostupne iz, na primer, javnih baza podataka sekvenci antitela. Ovo otkriće uključuje antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od sekvenci aminokiselina koje su ovde otkrivene, pri čemu su jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više okvira i/ili CDR regiona mutirane u odgovarajući ostatak(e) germinativne sekvence iz koje je antitelo izvedeno, ili odgovarajućeg ostatka(a) druge humane germinativne sekvence, ili konzervativne aminokiselinske supstitucije odgovarajućeg(ih) germinativnih ostatka(a) (takve promene sekvence se odnose na ovde zajedno kao "germinativne mutacije"). Osoba sa uobičajenim iskustvom u ovoj oblasti tehnike, počevši od ovde otkrivenih sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, može lako proizvesti brojna antitela i fragmente koji se vezuju za antigen koji sadrže jednu ili više pojedinačnih germinativnih mutacija ili njihovih kombinacija. U određenim slučajevima, svi ostaci okvira i/ili CDR unutar VHi/ili VLdomena su mutirani nazad na ostatke pronađene u originalnoj germinativnoj sekvenci iz koje je antitelo izvedeno. U drugim slučajevima, samo određeni ostaci su mutirani nazad u originalnu germinativnu sekvencu, na primer, samo mutirani ostaci koji se nalaze u prvih 8 aminokiselina FR1 ili u poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci koji se nalaze u CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim slučajevima, jedan ili više ostataka i/ili CDR ostataka su mutirani u odgovarajući ostatak(e) različite germinativne sekvence (tj. germinativnu sekvencu koja se razlikuje od sekvence zametne linije iz koje je antitelo bilo prvobitno izveden). Štaviše, antitela mogu sadržati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija unutar okvira i/ili CDR regiona, na primer, gde su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence, dok se neki drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence se održava ili mutira na odgovarajući ostatak druge germinativne sekvence. Kada se jednom dobiju, antitela i fragmenti koji se vezuju za antigen koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija mogu se lako testirati na jedno ili više željenih svojstava kao što su poboljšana specifičnost vezivanja, povećano vezivanje (npr. kao što je mereno titracijom vezivanja ćelije ili FACS vezivanjem) ili afinitetnim vezivanjem (npr. KD), poboljšana ili poboljšana antagonistička ili agonistička biološka svojstva (u zavisnosti od slučaja), smanjena imunogenost, itd. Antitela i fragmenti koji se vezuju za antigen dobijeni na ovaj opšti način su obuhvaćeni ovim otkrićem. Međutim, samo antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji sadrži prvi domen za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za humani CD3 i drugi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje humani MUC16, pri čemu drugi domen za vezivanje antigena obuhvata HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 domeni, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs: 20-22-24-28-30-32, kako je definisano u zahtevima, nalaze se u opsegu antitela zahtevanog pronalaska.
[0077] Takođe su opisana anti-MUC16 ili anti-MUC16/anti-CD3 antitela koja sadrže varijante bilo koje od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde otkrivene sa jednom ili više
1
konzervativnih supstitucija. Na primer, anti-MUC16 ili anti-MUC16/anti-CD3 antitela koja imaju HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr., 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativna aminokiselinske supstitucije u odnosu na bilo koju od HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1 ovde ili kao što je ovde opisano u Tabelama 16, 18, 19, 22 i 23 ovde.
[0078] Termin "epitop" se odnosi na antigensku determinantu koja stupa u interakciju sa specifičnim mestom vezivanja antigena u varijabilnom regionu molekula antitela poznatog kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Dakle, različita antitela se mogu vezati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop se proizvodi od prostorno postavljenih aminokiselina iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji proizvode susedni aminokiselinski ostaci u polipeptidnom lancu. U određenim okolnostima, epitop može da sadrži delove saharida, fosforil grupe ili sulfonil grupe na antigenu.
[0079] Izraz "suštinski identitet" ili "suštinski identičan", kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, ukazuje na to da, kada je optimalno usklađen sa odgovarajućim nukleotidnim insercijama ili delecijama sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identitet nukleotidne sekvence u najmanje oko 95%, a poželjnije najmanje oko 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, mereno bilo kojim dobro poznatim algoritmom identičnosti sekvence, kao što su FASTA, BLAST ili Gap, kao diskutovano u nastavku. Molekul nukleinske kiseline koji ima suštinski identitet sa referentnim molekulom nukleinske kiseline može, u određenim slučajevima, da kodira polipeptid koji ima istu ili suštinski sličnu aminokiselinsku sekvencu kao polipeptid koji je kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline.
[0080] Kako se primenjuje na polipeptide, termin "značajna sličnost" ili "suštinski sličan" znači da dve peptidne sekvence, kada su optimalno usklađene, kao što je program GAP ili BESTFIT koristeći podrazumevane težine praznina, dele najmanje 95% identiteta sekvence, čak i poželjnije najmanje 98% ili 99% identičnosti sekvence. Poželjno, pozicije ostataka koji nisu identični razlikuju se konzervativnim supstitucijama amino kiselina. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim amino kiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupa) sa sličnim hemijskim svojstvima (npr. naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna supstitucija aminokiselina neće bitno promeniti funkcionalna svojstva proteina. U slučajevima kada se dve ili više sekvenci aminokiselina razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat identiteta sekvence ili stepen sličnosti se može podesiti naviše da bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Sredstva za ovo podešavanje su dobro poznata stručnjacima. Videti, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Primeri grupa amino kiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju (1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; (2) alifatično-hidroksil bočni lanci: serin i treonin; (3) bočni lanci koji sadrže amid: asparagin i glutamin; (4) aromatični bočni lanci: fenilalanin, tirozin i triptofan; (5) osnovni bočni lanci: lizin, arginin i histidin; (6) kiseli bočni lanci: aspartat i glutamat, i (7) bočni lanci koji sadrže sumpor su cistein i metionin. Poželjne konzervativne supstitucione grupe amino kiselina su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparaginglutamin. Alternativno, konzervativna zamena je svaka promena koja ima pozitivnu vrednost u matrici log-verovatnoće PAM250 otkrivenoj u Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. „Umereno konzervativna“ zamena je svaka promena koja ima nenegativnu vrednost u matrici logaritamske verovatnoće PAM250.
[0081] Sličnost sekvenci za polipeptide, koja se takođe naziva i identitet sekvence, obično se meri korišćenjem softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina poklapa slične sekvence koristeći mere sličnosti dodeljene različitim supstitucijama, brisanjem i drugim modifikacijama, uključujući
1
konzervativne supstitucije amino kiselina. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su Gap i Bestfit koji se mogu koristiti sa podrazumevanim parametrima za određivanje homologije sekvence ili identiteta sekvence između blisko povezanih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog muteina. Vidi, na primer, GCG verziju 6.1. Polipeptidne sekvence se takođe mogu uporediti korišćenjem FASTA koristeći podrazumevane ili preporučene parametre, program u GCG verziji 6.1. FASTA (npr. FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procentualni identitet sekvenci regiona najboljeg preklapanja između sekvenci upita i pretrage (Pearson (2000) supra). Drugi poželjni algoritam kada se sekvenca poredi sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, koji koristi podrazumevane parametre. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 i Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.
Germinativne mutacije
[0082] Antitela pronalaska su definisana patentnim zahtevima. Druga antitela su takođe opisana ovde. Anti-CD3 antitela koja su ovde otkrivena mogu da sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u okviru i/ili CDR regiona varijabilnih domena teškog lanca u poređenju sa odgovarajućim sekvencama zametne linije iz kojih su antitela izvedena.
[0083] Ovde su opisana antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od sekvenci aminokiselina koje su ovde otkrivene, pri čemu su jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više okvira i/ili CDR regiona mutirane u odgovarajući ostatak(e) germinativne sekvence iz koje je izvedeno antitelo, ili odgovarajućeg ostatka(a) druge humane germinativne sekvence, ili konzervativne aminokiselinske supstitucije odgovarajućeg(ih) germinativnih ostatka(a) (takve promene u sekvenci se ovde zajedno nazivaju "germinativne mutacije ") i imaju slabo ili nikakvo vezivanje za CD3 antigen. Nekoliko takvih primera antitela koja prepoznaju CD3 su ovde opisani u Tabelama 16, 18, 19, 22 i 23. Međutim, samo antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji sadrži prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje humani CD3 i drugi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje humani MUC16, pri čemu drugi domen za vezivanje antigena obuhvata HCDR1-HCDR2- HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 domene, time redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs: 20-22-24-28-30-32, kako je definisano u zahtevima, su u okviru antitela prema pronalasku.
[0084] Osim toga, antitela mogu sadržati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija unutar okvira i/ili CDR regiona, na primer, gde su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence, dok se neki drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence se održava ili mutira na odgovarajući ostatak druge germinativne sekvence. Kada se jednom dobiju, antitela i fragmenti koji se vezuju za antigen koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija mogu se testirati na jedno ili više željenih svojstava kao što su poboljšana specifičnost vezivanja, slab ili smanjen afinitet vezivanja ili vezivanja, poboljšana ili poboljšana farmakokinetička svojstva, smanjena imunogenost, itd.
[0085] Ovde su takođe opisana anti-CD3 antitela koja sadrže varijante bilo koje od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde otkrivene sa jednom ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, anti-CD3 antitela koja imaju HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr., 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnim supstitucijama amino kiselina u odnosu na bilo koju od HCVR, LCVR i/ili CDR sekvence aminokiselina koje su ovde navedene u tabelama 16, 18, 19, 22 i 23. Antitela i bispecifični molekuli koji se vezuju za antigen mogu da sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u okviru i/ili CDR regiona varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim sekvencama zametne linije iz kojih je pojedinačni antigen -vezujući domeni su izvedeni, uz održavanje ili poboljšanje željenog vezivanja za CD3 antigen
1
od slabog do neotkrivenog. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim amino kiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupa) sa sličnim hemijskim svojstvima (npr. naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna supstitucija aminokiselina neće suštinski promeniti funkcionalna svojstva proteina, tj. supstitucija aminokiselina održava ili poboljšava željeni afinitet vezivanja ili vezivanja koji se slabo ili ne može detektovati u slučaju anti-CD3 vezujućih molekula. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju (1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; (2) alifatično-hidroksil bočni lanci: serin i treonin; (3) bočni lanci koji sadrže amid: asparagin i glutamin; (4) aromatični bočni lanci: fenilalanin, tirozin i triptofan; (5) osnovni bočni lanci: lizin, arginin i histidin; (6) kiseli bočni lanci: aspartat i glutamat, i (7) bočni lanci koji sadrže sumpor su cistein i metionin. Poželjne konzervativne supstitucione grupe amino kiselina su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je svaka promena koja ima pozitivnu vrednost u matrici log-verovatnoće PAM250 otkrivenoj u Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. „Umereno konzervativna“ zamena je svaka promena koja ima nenegativnu vrednost u matrici logaritamske verovatnoće PAM250.
[0086] Ovde su takođe otkriveni molekuli koji se vezuju za antigen koji sadrže domen koji se vezuje za antigen sa HCVR i/ili CDR amino kiselinskom sekvencom koja je suštinski identična bilo kojoj od HCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde otkrivene, dok održavaju ili poboljšavaju željenu slabu afinitet prema CD3 antigenu. Izraz "suštinski identitet" ili "suštinski identičan", kada se odnosi na aminokiselinsku sekvencu, znači da dve sekvence aminokiselina, kada su optimalno usklađene, kao što su programi GAP ili BESTFIT koristeći podrazumevane težine praznina, dele najmanje 95% identiteta sekvence , još poželjnije najmanje 98% ili 99% identičnosti sekvence. Poželjno, pozicije ostataka koji nisu identični razlikuju se konzervativnim supstitucijama amino kiselina. U slučajevima kada se dve ili više sekvenci aminokiselina razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat identiteta sekvence ili stepen sličnosti se može podesiti naviše da bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Sredstva za ovo podešavanje su dobro poznata stručnjacima. Videti, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331.
[0087] Sličnost sekvenci za polipeptide, koja se takođe naziva i identitet sekvence, obično se meri korišćenjem softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina poklapa slične sekvence koristeći mere sličnosti dodeljene različitim supstitucijama, brisanjem i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne supstitucije aminokiselina. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su Gap i Bestfit koji se mogu koristiti sa podrazumevanim parametrima za određivanje homologije sekvence ili identiteta sekvence između blisko povezanih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog muteina. Videti, na primer, GCG verziju 6.1. Polipeptidne sekvence se takođe mogu uporediti korišćenjem FASTA koristeći podrazumevane ili preporučene parametre, program u GCG verziji 6.1. FASTA (npr. FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procentualni identitet sekvenci regiona najboljeg preklapanja između sekvenci upita i pretrage (Pearson (2000) supra). Drugi poželjni algoritam kada se sekvenca poredi sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, koji koristi podrazumevane parametre. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 i Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.
[0088] Jednom kada su dobijeni, antigen-vezujući domeni koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija su ispitani za smanjeno vezivanje ili afinitet vezivanja korišćenjem jednog ili više in vitro testova. Iako je obično izvršen skrining antitela koja prepoznaju određeni antigen za njihovu svrhu ispitivanja za visoko (tj. snažno) vezivanje ili afinitetom vezivanja za antigen, antitela koja ispoljavaju slabo vezivanje ili nema detektabilnog vezivanja. Bispecifični antigen-vezujući molekuli sadrže jedan ili više antigen-vezujućih domena koji su dobijeni na ovaj opšti način su bili korisno kao terapije tumora vođenje aviditetom.
2
[0089] Neočekivani benefiti, na primer, unapređene farmakokinetičke osobine i niska toksičnost pacijetu mogu se ostvariti iz ovde opisanih postupaka.
Osobine vezivanja antitela
[0090] Kao što se ovde koristi, termin "vezivanje" u kontekstu vezivanja antitela, imunoglobulin, fragment koji se vezuje za antitelo, ili protein koji sadrži Fc sa bilo kojim, npr., prethodno definisanim antigenom, kao što je protein ćelijske površine ili njegov fragment, obično se odnosi na interakciju ili povezivanje između minimum dva entiteta ili molekulske strukture, kao što je interakcija antitela sa antigenom.
[0091] Na primer, afinitet vezivanja obično odogovara vrednosti KDod oko 10<-7>M ili manjoj, kao što je oko 10<-8>M ili manjoj, kao što je oko 10<-9>M ili manjoj kada je određena sa, na primer, tehnologijom površinske plazmonske rezonance (SPR) u BIAcore 3000 instrumentu korišćenjem antigena kao liganda i antitela, Ig, fragmenta koji vezuje antitelo, ili proteina koji sadrži Fc-kao analita (ili antiliganda). Strategije vezivanja koje su zasnovane na ćelijama, kao što su fluorecentno aktivirani testovi za vezivanja ćelija za sortiranje (FACS), su takođe rutinski korišćeni, i FACS podaci se nalaze u dobroj korelaciji sa drugim postupcima kao što su radioligandno kompetitivno vezivanje i SPR (Benedict, CA, J Immunol Methods.1997, 201(2):223-31; Geuijen, CA, et al. J Immunol Methods.2005, 302(1-2):68-77).
[0092] Prema tome, antitelo ili antigen vezujući protein vezuje prethodno definisani antigen ili molekul ćelijske površine (receptor) koji ima afinitet koji odgovara vrednosti KDkoja je bar deset puta niža od njegovog afiniteta za vezivanje za ne-specifični antigen (npr., BSA, kazein). Afinitet antitela koji odgovara vrednosti KDkoja je jednaka ili manja u odnosu na deset puta nižu od nespeocifičnog antigena može se smatrati ne-detektabilnim vezivanjem, međutim takvo antitelo se može upariti sa drugim krakom za vezivanje antigena za proizvodnju bispecifičnog antitela.
[0093] Termin "KD" (M) odnosi se na konstantu ravnoteže disocijacije određene interakcije antitela sa antigenom, ili konstante ravnoteže disocijacije antitela ili fragmenta koji se vezuje za antitelo koji se vezuje za antigen. Postoji inverzna veza između KDi afiniteta vezivanja, prema tome što je vrednost KDmanja, veći, tj. jači je, afinitet. Prema tome, termini "viši afinitet" ili "jači afinitet" odnose se na veću sposobnost da se obrazuje interakcija i prema tome manju KDvrednost, i obrnuto termini "niži afinitet" ili "slabiji afinitet" odnose se na nižu sposobnost da se obrazuje interakcija i prema tome veću vrednost KD. U nekim okolnostima, viši afinitet vezivanja (ili KD) određenog molekula (npr. antitela) prema njegovom interaktivnom partnerskom molekulu (npr. antigen X) u poređenju sa afinitetom vezivanja molekula (npr. antitela) sa drugim interaktivnim partnerskim molekulom (npr. antigenom Y) može biti izražen kao odnos vezivanja koji je određen deljenjem veće vrednosti KD(niži, ili slabiji, afinitet) sa manjom KD(veći, ili jači, afinitet), na primer izražen kao 5-struki ili 10-struko veći afinitet vezivanja, kao što može biti slučaj.
[0094] Termin "kd" (sec -1 ili 1/s) se odnosi na konstantu brzine disocijacije određene interakcije antitela sa antigenom, ili konstante brzine disocijacije antitela ili fragmenta koji se vezuje za antitelo. Pomenuta vrednost je takođe označena kao koffvrednost.
[0095] Termin "ka " (M-1 x sec-1 ili 1/M) se odnosi na konstantu brzine asocijacije određene interakcije antitela sa antigenom, ili konstante brzine asocijacije antitela ili fragmenta koji se vezuje za antitelo.
[0096] Termin "KA" (M-1 or 1/M) se odnosi na konstantu ravnoteže vezivanja određene interakcije antitela sa antigenm, ili konstantu ravnoteže vezivanja antitela ili fragmenta koji se vezuje za antitelo. Konstanta ravnoteže vezivanja je dobijena deljenjem kasa kd.
[0097] Termin "EC50" ili "EC50" se odnosi na polovinu maksimalne efikasne koncentracije, koja uključuje koncentraciju antitela koja izaziva odgovor napola između osnovnog nivoa i maksimuma nakon određenog vremena izloženosti. EC50u suštini predstavlja koncentraciju antitela gde je uočeno 50% njegovog maksimalnog efekta. U određenim slučajevima, vrednost EC50jednaka je koncentraciji antitela koja daje polovinu-maksimalnog vezivanja za ćelije koje eksprimiraju CD3 ili antigen povezan sa tumorom, kao što je određeno sa npr. FACS testom vezivanja. Prema tome, smanjeno ili slabije vezivanje je uočeno sa povećanim EC50, ili polovinom maksimalne efikasne vrednosti koncentracije.
[0098] Na primer, smanjeno vezivanje se može definisati kao povećanje EC50koncentracije antitela koja omogućava vezivanje sa polovinom-maksimalne količine ciljnih ćelija.
[0099] U drugom slučaju, vrednost EC50predstavlja koncentraciju antitela koja izazva polovinumaksimalnog iscrpljivanja ciljnih ćelija citotoksičnom aktivnošću T ćelija. Prema tome, povećana citotoksična aktivnost (npr. ubijanje tumorskih ćelija posredstvom T ćelija) je uočeno smanjenjem EC50, ili polovine maksimalne efektivne vrednosti koncentracije.
Bispecifični antigen-vezujući molekuli
[0100] Ovde opisana antitela mogu biti monospecifična, bispecifična, ili multispecifična. Antitela iz pronalaska su bispecifična, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Multispecifična antitela mogu biti bispecifična za različite epitope jednog ciljnog polipeptida ili mogu sadržati antigen-vezujuće domene koji su specifični za više od jednog ciljnog polipeptida. Videti, npr., Tutt et al., 1991, J. Immunol.147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol.22:238-244. Anti-MUC16 monospecifična antitela ili anti-MUC16/anti-CD3 bispecifična antitela mogu biti povezana sa ili zajedno eksprimirana sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili njegov fragment mogu biti funkcionalno povezani (npr., hemijskim kuplovanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnim povezivanjem ili drugačije) za jedan ili više drugih molekulskih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela da bi se proizvelo bispecifično ili multispecifično antitelo sa sekundarnom ili dodatnom specifičnosti vezivanja.
[0101] Upotreba izraza "anti-CD3 antitelo" ili "anti-MUC16 antitelo" ovde je namenjena da uključi i monospecifična anti-CD3 ili anti-MUC16 antitela kao i bispecifična antitela koja sadrže CD3-vezujući krak i MUC16-vezujući krak. Prema tome, predmetno izlaganje se odnosi na bispecifična antitela u kojima jedan krak imunoglobulina vezuje humani CD3, i drugi krak imunoglobulina je specifičan za humani MUC16. CD3-vezujući krak može sadržati bilo koju od sekvenci aminokiselina HCVR/LCVR ili CDR kao što su ovde prikazane u Tabelama 1, 16, 18, 19, 22, i 23.
[0102] U određenim slučajevima, CD3-vezujući krak vezuje humani CD3 i indukuje aktivaciju humanih T ćelija. U određenim slučajevima, CD3-vezujući krak vezuje se slabo za CD3 i indukuje aktivaciju humanih T ćelija. U drugim slučajevima, CD3-vezujući krak veže se slabo za CD3 i indukuje ubijanje ćelija koje eksprimiraju antigen koji je povezan sa tumorom u kontekstu bispecifičnog ili multispecifičnog antitela. U drugim slučajevima, CD3-vezujući krak veže ili se slabo povezuje sa humanim i cinomolgus (majmun) CD3, ali interakcija vezivanja nije detektabilna u in vitro testovima koji su poznati u oblasti tehnike. MUC16-vezujući krak može sadržati bilo koju od aminokiselinskih sekvenci HCVR/LCVR ili CDR kao što su ovde prikazane u Tabeli 1.
[0103] Predmetni pronalazak se odnosi na bispecifična antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji specifično vežu CD3 i MUC16, kao što je ovde definisano u patentim zahtevima. Takvi molekuli ovde mogu biti označeni kao, npr., "anti-CD3/anti-MUC16," ili "anti-CD3xMUC16" ili "CD3xMUC16" bispecifični molekuli, ili se može koristiti slična terminologija (npr., anti-MUC16/anti-CD3). Ovde su opisani antigen-vezujući molekuli koji su konstruisani sa prvim antigen-vezujućim krakom koji vezuje MUC16 i drugim antigen vezujućim krakom koji vezuje CD3. U nekim slučajevima, anti-CD3 krak sadrži težak lanac koji je izveden iz IGHV3-9*01, IGHJ6*02, IGHD5-12*01. U drugim slučajevima, bispecifični antigen-vezujući molekul aktivira humane PBMC ćelije i/ili indukuje citotoksičnu aktivnost na ćelijske linije koje eksprimiraju tumorski antigen.
[0104] Termin "MUC16," kao što je ovde korišćen, odnosi se na humani MUC16 protein osim ukoliko nije specifikovano da je iz nehumanih vrsta (npr., "mišji MUC16," "majmunski MUC16," itd.). Humani MUC16 protein ima aminokiselinsku sekvencu koja je prikazana u SEQ ID NO:1899.
[0105] Prethodno pomenuti bispecifični antigen-vezujući molekuli koji specifično vezuju CD3 i MUC16 mogu sadržati anti-CD3 antigen-vezujući molekul koji se vezuje za CD3 sa slabim afinitetom vezivanja tako da ispoljava KDveću od oko 40 nM, kao što je mereno in vitro testom afinitetnog vezivanja. Prethodno pomenuti bispecifični antigen-vezujući molekuli mogu sadržati anti-CD3 antigen-vezujući molekul koji vezuje CD3 i ispoljava EC50 veću od oko 100 nM, kao što je mereno FACS titracionim testom. Prethodno pomenuti bispecifični antigen-vezujući molekuli mogu sadržati anti-CD3 antigenvezujući molekul koji ne ispoljava merljivo ili uočljivo vezivanje za CD3, kao što je mereno sa in vitro testom afinitetnog vezivanja ili FACS titracionim testom, ali zadržava sposobost aktiviranja humanih PBMC ćelija i/ili indukuje citotoksičnu aktivnost na ćelijskim linijama koje eksprimiraju tumorski antigen.
[0106] Kao što je ovde korišćen, izraz "antigen-vezujući molekul" označava protein, polipeptid ili molekulski kompleks koji sadrži ili se sastoji od bar jednog regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) koji samostalno, ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih CDRs i/ili regiona okvira (FRs), specifično vezuje određeni antigen. U određenim slučajevima, antigen vezujući molekul je antitelo ili fragment antitela, kao što su ovi termini ovde definisani na drugom mestu.
[0107] Kao što se ovde koristi, izraz "bispecifični antigen-vezujući molekul" označava protein, polipeptid ili molekulski kompleks koji sadrži bar prvi domen za vezivanje antigena i drugi domen za vezivanje antigena. Svaki antigen vezujući domen unutar bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula sadrži bar jedan CDR koji zasebno, ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih CDRs i/ili FRs, specifično vezuje određeni antigen. U kontekstu predmentog pronalaska, prvi domen za vezivanje antigena specifično vezuje prvi antigen (CD3), i drugi domen za vezivanje antigena specifično vezuje drugi, različiti antigen (MUC16).
[0108] U predmetnom pronalasku, bispecifični antigen-vezujući molekul je bispecifično antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Svaki antigenvezujući domen bispecifičnog antitela sadrži varijabilni domen teškog lanca (HCVR) i varijabilni region lakog lanca (LCVR). U kontekstu bispecifično antigen-vezujućeg molekula koji sadrži prvi i drugi antigen vezujući domen (npr., bispecifično antitelo), CDR-i iz prvog antigen-vezujućeg domena mogu biti označeni prefiksom "A1" i CDR-i drugog antigen vezujućeg domena mogu biti označeni prefiksom "A2". Prema tome, CDR-i prvog antigen vezujućeg domena mogu ovde biti označeni sa A1-HCDR1, A1-HCDR2, i A1-HCDR3; i CDR-i drugog antigen vezujućeg domena mogu ovde biti označeni sa A2-HCDR1, A2-HCDR2, i A2-HCDR3.
[0109] Prvi antigen vezujući domen i drugi antigen vezujući domen mogu direktno ili indirektno biti povezani jedan sa drugim da bi se obrazovao bispecifični antigen-vezujući molekul. Alternativno, prvi
2
antigen vezujući domen i drugi antigen vezujuići domen mogu svaki biti povezani u odvojenom domenu za multimerizaciju. Povezivanje jednog domena za multimerizaciju sa drugim domenom za multimerizaciju olakšava povezivanje dva antigen-vezujuća domena, time obrazujući bispecifični antigen-vezujući molekul. Kao što se ovde koristi, "domen za multimerizaciju" je bilo koji makromolekul, protein, polipeptid, peptid, ili aminokiselina koja ima sposobnost da se povezuje sa drugim domenom za multimerizaciju iste ili slične strukture ili konstitucije. Na primer, domen za multimerizaciju može biti polipeptid koji sadrži CH3 domen imunoglobulina. Neograničavajući primer komponente za multimerizaciju je deo Fc imunoglobulina (koji sadrži CH2-CH3 domen), npr., domen Fc IgG odabranog od izotipova IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4, kao i bilo koji alotip unutar svake grupe izotipa.
[0110] Bispecifični antigen-vezujući molekuli će obično sadržati dva domena za multimerizaciju, npr., dva Fc domena koji u svaki individualno deo odvojenog teškog lanca antitela. Prvi i drugi domeni za multimerizaciju mogu biti istog izotipa IgG kao što je, npr., IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. Alternativno, prvi i drugi domeni za multimerizaciju mogu biti različitih izotipova IgG kao što su, npr., IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, itd. molekuli za vezivanje antigena. Specifični primeri bispecifičnih formata koji se mogu koristiti uključuju, bez ograničenja, npr., scFv-zasnovane ili diatelo bispecifične formate, IgG-scFv fuzije, dvostruki varijabilni domen (DVD)-Ig, Quadroma, “knobs-into-holes”, zajednički laki lanac (npr., zajednički laki lanac sa “knobs-into-holes”, itd.), CrossMab, CrossFab, (SEED)telo, leucinski zatvarač, Duobody, IgG1/IgG2, Fab sa dvostrukim dejstvom (DAF)-lgG, i Mab2 bispecifični formati (videti, npr., Klein et al.2012, mAbs 4:6, 1-11, i tamo citirane reference, za preglede gore navedenih formata).
[0113] Domeni za multimerizaciju, npr., Fc domeni, mogu sadržati jednu ili više promena aminokiselina (npr., insercije, delecije ili supstitucije) u poređenju sa divljim tipom, verzijom domena Fc koji se nalazi u prirodi. Na primer, bispecifični antigen-vezujući molekuli koji sadrže jednu ili više modifikacija u domenu Fc koje dovode do modifikovanog domena Fc koji ima modifikovanu interakciju vezivanja (npr., povećanu ili umanjenu) između Fc i FcRn. Na primer, bispecifični antigen-vezujući molekul sadrži modifikaciju u regionu CH2 ili CH3, pri čemu modifikacija povećava afinitet Fc domena za FcRn u kiselom okruženju (npr., u endozomu gde su opsezi pH od oko 5.5 do oko 6.0). Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija uključuju, npr., modifikaciju na poziciji 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/Y/F/W ili T), 254 (npr., S ili T), i 256 (npr., S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na poziciji 428 i/ili 433 (npr., L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr., H/F ili Y); ili modifikaciju na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikaciju na poziciji 307 ili 308 (npr., 308F, V308F), i 434. Na primer, modifikacija sadrži 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S) modifikaciju; 428L, 259I (npr., V259I), i 308F (pr., V308F) modifikaciju; 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y) modifikaciju; 252, 254, i 256 (npr., 252Y, 254T, i 256E) modifikaciju; 250Q i 428L modifikaciju (npr., T250Q i M428L); i 307 i/ili 308 modifikaciju (npr., 308F ili 308P).
[0114] Takođe su opisani bispecifični antigen-vezujući molekuli koji sadrže prvi CH3 domen i drugi CH3 domen Ig, pri čemu se prvi i drugi domeni CH3 Ig razlikuju jedan od drugog u bar jednoj aminokiselini, i pri čemu bar jedna razlika u aminokiselini smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za Protein A u poređenju sa bispecifičnim antitelom kome nedostaje razlika u aminokiselini. Na primer, prvi domen CH3 imunoglobulina vezuje Protein A i drugi domen CH3 Ig sadrži mutaciju koja smanjuje ili ukida vezivanje Proteina A kao što je modifikacija H95R (sa IMGT numerisanjem egzona; H435R sa EU numerisanjem). Drugi CH3 može dalje sadržati modifikaciju Y96F (sa IMGT; Y436F od EU). Videti, na primer, US Patent Br.8,586,713. Dalje modifikacije koje se mogu naći u drugom CH3 uključuju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, i V82I (sa IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I sa EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N, i V82I (IMGT; N384S, K392N, i V422I od EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, i V82I (od IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I od EU) u slučaju IgG4 antitela.
[0115] U određenim slučajevima, domen Fc može biti himerni, kombinovanjem sekvenci Fc izvedenih iz više od jednog izotipa imunoglobulina. Na primer, himerni domen Fc može sadržati deo ili celu sekvencu CH2 dobijenu iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 CH2 regiona, i deo ili celu CH3sekvencu dobijenu iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Himerni domen Fc može takođe da sadrži himerni region zgloba. Na primer, himerni zglob može sadržati sekvencu gornjeg zgloba "gornji zglob", izvedenu iz regiona zgloba humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4, kombinovanjem sa sekvencom "donjeg zgloba", koja je izvedena iz regiona zgloba humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Poseban primer himernog domena Fc koji može biti uključen u bilo koji od molekula za vezivanje antigena koji su ovde prikazani sadrži, od N- ka C-kraju: [lgG4 CH1] - [lgG4 gornji zglob] - [lgG2 donji zglob] - [lgG4 CH2] - [lgG4 CH3]. Drugi primer himernog domena Fc koji može biti uključen u bilo koji od molekula za vezivanje antigena koji su ovde prikazani sadrži, od N- ka C-kraju: [IgG1 CH1] - [IgG1 gornji zglob] - [lgG2 donji zglob] - [lgG4 CH2] - [IgG1 CH3]. Ovi i drugi primeri himernih Fc domena koji mogu biti uključeni u bilo koji od molekula za vezivanje antigena opisani su u US objavi 2014/0243504, koja je objavljena 28 avgusta, 2014. Himerini Fc domeni koji imaju ovde generalne strukturalne aranžmane, i njihove varijante, mogu imati izmenjeno vezivanje Fc receptora, koje sa druge strane pogađa efektorsku funkciju Fc.
[0116] Ovde je opisan težak lanac antitela u kome region konstantnog regiona teškog lanca (CH) sadrži aminokiselinsku sekvencu bar 95%, bar 96%, bar 97%, bar 98%, bar 99% identičnu bilo kojoj od SEQ ID NO: 1911, SEQ ID NO: 1912, SEQ ID NO: 1913, SEQ ID NO: 1914, SEQ ID NO: 1915, SEQ ID NO: 1916, SEQ ID NO: 1917, SEQ ID NO: 1918, SEQ ID NO: 1919 ili SEQ ID NO: 1920. U nekim slučajevima, region konstantnog regiona teškog lanca (CH) sadrži amiokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1911, SEQ ID NO: 1912, SEQ ID NO: 1913, SEQ ID NO: 1914, SEQ ID NO: 1915, SEQ ID NO: 1916, SEQ ID NO: 1917, SEQ ID NO: 1918, SEQ ID NO: 1919 i SEQ ID NO: 1920.
[0117] Ovde je takođe opisan težak lanac antitela u kome domen Fc sadrži aminokiselinsku sekvencu bar 95%, bar 96%, bar 97%, bar 98%, bar 99% identičnu bilo kojoj od SEQ ID NO: 1921, SEQ ID NO: 1922, SEQ ID NO: 1923 SEQ ID NO: 1924 SEQ ID NO: 1925, SEQ ID NO: 1926, SEQ ID NO: 1927, SEQ ID NO: 1928, SEQ ID NO: 1929 ili SEQ ID NO: 1930. U nekim slučajevima, domen Fc sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NO: 1921, SEQ ID NO: 1922, SEQ ID NO: 1923 SEQ ID NO: 1924 SEQ ID NO: 1925, SEQ ID NO: 1926, SEQ ID NO: 1927, SEQ ID NO: 1928, SEQ ID NO: 1929 i SEQ ID NO: 1930. Međutim, samo antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji sadrži prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD3, i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani MUC16, gde drugi domen za vezivanje antigena sadrži HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 domene, tim redom, koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs: 20-22-24-28-30-32, kao što je definisano patentnim zahtevima, je obuhvaćeno obimom antitela zahtevanog pronalaska. Varijante sekvenci
[0118] Antitela iz pronalaska su definisana patentnim zahtevima. Ovde su takođe opisana druga antitela. Antitela i ovde opisani bispecifični antigen vezujući molekuli mogu sadržati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u regionu okvira i/ili regionima CDR varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih su izvedeni domeni za vezivanje antigena. Takve mutacije se mogu brzo utvrditi poređenjem ovde prikazanih aminokiselinskih sekvenci sa germinativnim sekvencama dostupnim od, na primer, javnosti dostupnih baza podataka sekveci antitela. Molekuli za vezivanje antigena mogu sadržati domene za vezivanje antigena koji su izvedeni iz bilo kojih od ovde prikazanih aminokiselinskih sekvenci, pri čemu jedna ili više aminokiselina u jednom ili više regionu okvira i/ili regionima CDR su mutirane u odgovarajući(e) ostat(ke)ak germinativne sekvence iz kojih je antitelo dobijeno, ili u odgovarajući(e) ostat(ke)ak druge humane germinativne sekvence, ili u konzervativnu aminokiselinsku supstituciju odgovarajućih germinativnih ostatak(a) (takve promene u sekvenci su ovde grupno nazvane "germinativne mutacije"). Osoba koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, počev od ovde
2
prikazanih sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, može jednostavno proizvesti brojna antitela i fragmente za vezivanje antigena koji sadrže jednu ili više pojedinačnih germinativnih mutacija ili njihovih kombinacija. U određenim slučajevima, svaki od ostataka regiona okvira i/ili CDR ostataka u domenima VHi/ili VLu mutirani nazad u ostatke koji se mogu naći u originalnoj germinativnoj sekvenci iz koje je domen za vezivanje antigena originalno izveden. U drugim slučajevima, samo određeni ostaci su mutirani nazad u originalnu germinativnu sekvencu, npr., samo mutirani ostaci koji su nađeni u prvih 8 aminokiselina FR1 ili u poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci koji su nađeni unutar CDR1, CDR2 i CDR3. U drugim slučajevima, jedan ili više region okvira i/ili CDR ostatak(ci) su mutirani u odgovarajući(e) ostatak(e) različite germinativne sekvence (tj., germinativne sekvence koja se razlikuje od germinativne sekvence iz koje je originalno dobijen domen za vezivanje antigena). Dalje, antigen-vezujući domeni mogu sadržati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija u regionu okvira i/ili regionima CDR, npr., kada su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence dok se određeni drugi ostaci razlikuju od originalne germinativne sekvence su održavani ili su mutirani u odgovarajući ostatak različite germinativne sekvence. Jednom dobijeni, domeni za vezivanje antigena koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija mogu se jednostavno ispitati za jednu ili više željenih osobina, unapređenu specifičnost vezivanja, povećano vezivanje ili afinitet vezivanja, unapređena ili pojačana antagonistička ili agonistitička biološka svojstva (kao što to može biti slučaj), smanjenu imunogenost, itd.
[0119] Ovde su takođe opisani molekuli za vezivanje antigena pri čemu jedan ili oba domena za vezivanje antigena sadrže varijante bilo kojih od ovde prikazanih sekvenci aminokiselina HCVR, LCVR, i/ili CDR koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, antigen vezujući molekuli koji sadrže domen za vezivanje antigena koji imaju sekvence aminokiselina HCVR, LCVR, i/ili CDR sa, npr, 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativne aminokiselinske supstitucije u odnosu na bilo koju od ovde prikazanih sekvenci aminokiselina HCVR, LCVR, i/ili CDR. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom sa bočnim lancem (R grupom) sa sličnim hemijskim osobinama (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Generealno, konzervartivna aminokiselinska supstitucija neće suštinski izmeniti funkcionalne osobine proteina. Primeri grupa aminokiselina koji imaju bočne lance sa sličnim hemijskim osobinama uključuju (1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; (2) alifatične-hidroksil bočne lance: serin i treonin; (3) bočni lanci koji sadrže amid: asparagin i glutamin; (4) aromatični bočni lanci: fenilalanin, tirozin, i triptofan; (5) bazni bočni lanci: lizin, arginin i histidin; (6) kiseli bočni lanci: aspartat i glutamat, i (7) bočni lanci koji sadrže sumpor su cistein i metionin. Poželjne konzervativne supstitucione grupe amino kiselina su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna supstitucija je svaka promena koja ima pozitivnu vrednost u matrici log-verovatnoće PAM250 otkrivenoj u Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. „Umereno konzervativna“ supstitucija je svaka promena koja ima nenegativnu vrednost u matrici logaritamske verovatnoće PAM250.
[0120] Ovde su takođe opisani molekuli koji se vezuju za antigen koji sadrže domen koji se vezuje za antigen sa sekvencom aminokiselina HCVR, LCVR i/ili CDR koja je suštinski identična bilo kojoj od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde otkrivene. Izraz "suštinski identitet" ili "suštinski identičan", kada se odnosi na aminokiselinsku sekvencu, znači da dve sekvence aminokiselina, kada su optimalno poravnate, kao što su programi GAP ili BESTFIT koristeći podrazumevane težine praznina, dele najmanje 95% identiteta sekvence, još poželjnije najmanje 98% ili 99% identičnosti sekvence. Poželjno, pozicije ostataka koji nisu identični razlikuju se konzervativnim supstitucijama aminokiselina. U slučajevima kada se dve ili više sekvenci aminokiselina razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat identiteta sekvence ili stepen sličnosti se može podesiti naviše da bi se
2
korigovala konzervativna priroda supstitucije. Sredstva za ovo podešavanje su dobro poznata stručnjacima. Videti, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331.
[0121] Sličnost sekvenci za polipeptide, koja se takođe naziva i identitet sekvence, obično se meri korišćenjem softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina poklapa slične sekvence koristeći mere sličnosti dodeljene različitim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne supstitucije aminokiselina. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su Gap i Bestfit koji se mogu koristiti sa podrazumevanim parametrima za određivanje homologije sekvence ili identiteta sekvence između blisko povezanih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog muteina. Videti, npr, GCG verziju 6.1. Polipeptidne sekvence se takođe mogu uporediti korišćenjem FASTA koristeći podrazumevane ili preporučene parametre, program u GCG verziji 6.1. FASTA (npr. FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procentualni identitet sekvenci regiona najboljeg preklapanja između sekvenci upita i pretrage (Pearson (2000) supra). Drugi poželjni algoritam kada se sekvenca poredi sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, koji koristi podrazumevane parametre. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 i Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.
Vezivanje zavisno od pH
[0122] Ovde su opisana anti-MUC16 antitela i anti-CD3/anti-MUC16 bispecifični molekuli koji vezuju antigen, sa karakteristikama vezivanja koje su zavisne od pH. Na primer, anti-MUC16 antitelo može da pokaže smanjeno vezivanje za MUC16 pri kiselom pH u poređenju sa neutralnom pH. Alternativno, anti-MUC16 antitela mogu pokazati pojačano vezivanje za MUC16 pri kiseloj pH u poređenju sa neutralnoj pH. Izraz "kisela pH" uključuje pH vrednosti manje od oko 6,2, na primer, oko 6.0, 5.95, 5,9, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0, ili manje. Kako se ovde koristi, izraz "neutralna pH" označava pH od oko 7.0 do oko 7.4. Izraz "neutralna pH" uključuje vrednosti pH od oko 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35 i 7.4.
[0123] U određenim slučajevima, „smanjeno vezivanje... pri kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH“ se izražava u smislu odnosa KDvrednosti antitela koje se vezuje za svoj antigen pri kiselom pH prema KDvrednosti antitela koje se vezuje za svoj antigen. antigen na neutralnom pH (ili obrnuto). Na primer, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen može se smatrati da pokazuje „smanjeno vezivanje za MUC16 pri kiselom pH u poređenju sa neutralnim pH“ ako antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen pokazuje odnos kiseli/neutralni KDod oko 3,0 ili veće. U određenim primerima, a kiselinu / neutralni kdodnos za antitelo ili fragment koji vezuje antigen može biti oko 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.0, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0.25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 ili više.
[0124] Antitela sa karakteristikama vezivanja zavisnih od pH mogu se dobiti, na primer, skriningom populacije antitela na smanjeno (ili pojačano) vezivanje za određeni antigen pri kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH. Pored toga, modifikacije domena za vezivanje antigena na nivou aminokiselina mogu dati antitela sa karakteristikama koje zavise od pH. Na primer, zamenom jedne ili više aminokiselina domena za vezivanje antigena (npr. unutar CDR) sa ostatkom histidina, može se dobiti antitelo sa smanjenim vezivanjem antigena pri kiselom pH u odnosu na neutralni pH.
Antitela koja sadrže varijante Fc
[0125] Anti-MUC16 antitela i anti-CD3/anti-MUC16 bispecifični molekuli koji vezuju antigen, su ovde opisani koji sadrže Fc domen koji sadrži jednu ili više mutacija koje pojačavaju ili smanjuju vezivanje antitela za FcRn receptor, npr. pri kiselom pH u poređenju sa neutralni pH. Na primer, antitela koja
2
sadrže mutaciju u CH2 ili CH3 regionu Fc domena, pri čemu mutacija(e) povećava afinitet Fc domena prema FcRn u kiseloj sredini (npr. u endozomu gde se pH kreće od oko 5.5 do oko 6.0). Takve mutacije mogu dovesti do povećanja poluživota antitela u serumu kada se daju životinji. Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija uključuju, npr., modifikaciju na poziciji 250 (npr. E ili K); 250 i 428 (npr. L ili F); 252 (npr. L/I/F/W ili T), 254 (npr. S ili T) i 256 (npr. S/R/K/E/D ili T); ili modifikacija na poziciji 428 i/ili 433 (npr. H/L/R/S/P/K ili K) i/ili 434 (npr. H/F ili Y); ili modifikacija na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikacija na poziciji 307 ili 308 (npr.308F, V308F) i 434. Na primer, modifikacija sadrži 428L (npr. M428L) i 434S (npr. N434S) modifikaciju; modifikacija 428L, 259I (npr. V259I) i 308F (npr. V308F); 433K (npr. H433K) i 434 (npr. 434Y) modifikacija; modifikacija 252, 254 i 256 (npr. 252I, 254T i 256E); modifikacija 250K i 428L (npr. T250K i M428L); i 307 i/ili 308 modifikacija (npr.308F ili 308P).
[0126] Na primer, anti-MUC16 antitela i anti-CD3/anti-MUC16 bispecifični molekuli koji vezuju antigen, koji sadrže Fc domen koji sadrži jedan ili više parova ili grupa mutacija izabranih iz grupe koju čine: 250K i 248L (npr. T250K i M248L); 252I, 254T i 256E (npr. M252I, S254T i T256E); 428L i 434S (npr. M428L i N434S); i 433K i 434F (npr. H433K i N434F). Predviđene su sve moguće kombinacije prethodnih mutacija Fc domena i drugih mutacija unutar varijabilnih domena antitela koji su ovde otkriveni.
Biološke karakteristike antitela i bispecifičnih molekula koji vezuju antigen
[0127] Ovde su opisana antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen koji vezuju humani MUC16 sa visokim afinitetom (npr. sub-nanomolarne KDvrednosti).
[0128] Prema određenim slučajevima, ovo otkriće uključuje antitela i fragmente antitela koji se vezuju za antigen koji vezuju humani MUC16 (npr., na 25°C) sa KD manjim od oko 60 nM mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 4. U određenim slučajevima, antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen iz ovog otkrića vezuju MUC16 sa KDmanjim od oko 60 nM, manjim od oko 40 nM, manjim od oko 20 nM, manjim od oko 10 nM, manjim od oko 8 nM , manje od oko 7 nM, manjim od oko 6 nM, manjim od oko 5 nM, manjim od oko 4 nM, manjim od oko 3 nM, manjim od oko 2 nM, manjim od oko 1 nM, manjim od oko 800 pM, manjim od oko 700 pM, manjim od oko 500 pM, manjim od oko 400 pM, ili manjim od oko 300 pM, mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr. korišćenjem formata testa kao što je definisano u Primeru 4 ovde (npr., hvatanje mAt ili format za hvatanje antigena), ili suštinski sličnim testom. Ovo otkriće uključuje bispecifične molekule koji se vezuju za antigen (npr., bispecifična antitela koja vezuju MUC16 sa KDmanjim od oko 7 nM, mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr. korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 4 (npr., hvatanje mAt ili format hvatanja antigena), ili suštinski sličnim testom..
[0129] Predmetno izlaganje takođe uključuje antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji vezuju MUC16 sa disocijativnim poluživotom (t<1>/2) većim od oko 10 minuta ili većim od oko 125 minuta, mereno površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C, npr. korišćenjem formata testa kao što je definisano u Primeru 4 ovde, ili suštinski sličnim testom. U određenim slučajevima, antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen vezuju MUC16 sa t<1>/2većim od oko 10 minuta, više od oko 20 minuta, duže od oko 30 minuta, duže od oko 40 minuta, duže od oko 50 minuta, veće od oko 60 minuta, duže od oko 70 minuta, duže od oko 80 minuta, duže od oko 90 minuta, duže od oko 100 minuta, duže od oko 110 minuta ili duže od oko 120 minuta, mereno površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C , npr., korišćenjem formata testa kao što je definisano u Primeru 4 ovde (npr. format za hvatanje mAt ili formata za hvatanje antigena), ili suštinski sličnim testom. Predmetno izlaganje uključuje bispecifične molekule koji se vezuju za antigen (npr., bispecifična antitela koja vezuju MUC16 sa a većim od oko 10 minuta ili većim od oko 20 minuta, mereno površinskom
2
plazmonskom rezonancom na 25°C, npr., korišćenjem formata testa kako je ovde definisano u Primeru 4, ili suštinski sličnim testom.
[0130] Predmetno izlaganje takođe uključuje antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji se specifično vezuju za humane ćelijske linije koje eksprimiraju endogeni MUC16 (npr., OVCAR-3), kao što je određeno testom detekcije zasnovanom na elektrohemoluminiscenciji kao što je navedeno u Primeru 2 ili suštinski sličnom testu.
[0131] Predmetno izlaganje takođe uključuje anti-CD3/anti-MUC16 bispecifične antigen-vezujuće molekule which koji ispoljavaju jednu ili više karakteristika odabranih iz grupe koja obuhvata: (a) inhibiciju tumorskog rasta kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenoransplantate humanog kancera jajnika; i (b); suprimiranje tumorskog rasta ustanovljenih tumora kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenotransplantate humanog kancera jajnika (videti, npr., Primer 8).
[0132] Predmetno izlaganje uključuje antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji vezuju humani CD3 sa visokim afinitetom. Predmetno izlaganje takođe uključuje antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji vezuju humani CD3 sa srednjim ili niskim afinitetom, u zavisnosti od terapijskog konteksta i specifičnih svojstava ciljanja koja su poželjna. U nekim slučajevima, nizak afinitet uključuje antitela koja vezuju CD3 sa KDili EC50(npr., kao što je mereno u testu površinske plazmonske rezonance) veće od 300 nM, veće od 500 nM ili veće od 1 µM. Predmetno izlaganje takođe uključuje antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen koji vezuju humani CD3 bez merljivog afiniteta. Na primer, u kontekstu bispecifičnog molekula za vezivanje antigena, gde jedan krak vezuje CD3, a drugi krak vezuje ciljni antigen (npr. MUC16), može biti poželjno da se ciljni antigen vezuje da veže ciljni antigen sa visokim afinitetom dok anti-CD3 krak vezuje CD3 samo sa umerenim ili niskim afinitetom ili bez afiniteta. Na ovaj način se može postići preferencijalno ciljanje molekula koji vezuje antigen na ćelije koje eksprimiraju ciljni antigen uz izbegavanje opšteg/neciljanog vezivanja CD3 i posledičnih neželjenih nuspojava u vezi sa tim.
[0133] Predmetno izlaganje uključuje bispecifične molekule za vezivanje antigena (npr., bispecifična antitela) koji su sposobni da se istovremeno vežu za humani CD3 i humani MUC16. Vezujući krak koji interaguje sa ćelijama koje eksprimiraju CD3 može imati slabo ili nikakvo vezivanje koje se ne može detektovati kao što je mereno u odgovarajućem in vitro testu vezivanja. Stepen do kojeg bispecifični molekul koji vezuje antigen vezuje ćelije koje eksprimiraju CD3 i/ili MUC16 može se proceniti sortiranjem ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS), kao što je ovde predstavljeno u Primeru 5.
[0134] Na primer, predmetno izlaganje uključuje antitela, fragmente koji se vezuju za antigen i njihova bispecifična antitela koja specifično vezuju humane T-ćelijske linije koje eksprimiraju CD3, ali ne eksprimiraju MUC16 (npr. Jurkat), T-ćelije primata (npr., mononuklearne ćelije [PBMCs] periferne krvi cinomolgusa), i/ili ćelije koje eksprimiraju MUC16.
[0135] Predmetno izlaganje uključuje antitela, fragmente koji se vezuju za antigen i njihova bispecifična antitela koja vezuju humani CD3 sa slabim (tj. niskim) ili čak bez detektabilnog vezivanja ili afiniteta vezivanja.
[0136] Predmetno izlaganje uključuje antitela, fragmente za vezivanje antigena, i njihova bispecifična antitela koja vežu majmunski (tj. cinomolgus) CD3 sa slabim (tj. niskim) ili čak bez detektabilnog vezivanja ili afiniteta vezivanja.
[0137] Predmetno izlaganje uključuje antitela, fragmente koji se vezuju za antigen i njihova bispecifična antitela koja vezuju humani CD3 i indukuju aktivaciju T ćelija.
2
[0138] Predmetno izlaganje uključuje anti-CD3/anti-MUC16 bispecifične molekule za vezivanje antigena koji su sposobni da iscrpe ćelije koje eksprimiraju tumorski antigen kod subjekta (videti, npr., Primer 8, u bioluminiscentom testu, ili suštinski sličnom testu). Na primer, prema određenim slučajevima, obezbeđeni su anti-CD3/anti-MUC16 bispecifični molekuli koji vezuju antigen, pri čemu pojedinačna primena 10 µg bispecifičnog molekula koji vezuje antigen subjektu izaziva smanjenje broja ćelija koje eksprimiraju MUC16 kod subjekta (npr., rast tumora kod subjekta je potisnut ili inhibiran). Osim ako nije drugačije naznačeno, bioluminiscentno zračenje se odnosi na [p/s/cm2<2>/sr].
[0139] Predmetno izlaganje takođe sadrži konjugate lekova anti-MUC16 antitela koji inhibiraju rast tumora u in vivo MUC16 pozitivnim modelima ksenotransplantata kancera jajnika (videti, npr. Referentni primer 2, u u bioluminiscentom testu, ili suštinski sličnom testu). U određenim slučajevima, obezbeđeni su konjugati lekova anti-MUC16 antitela sa jedinjenjem 7 pri čemu su četiri doze jednom nedeljno davane u dozi od 85 µg/kg koje inhibiraju intraperitonealni rast tumora OVCAR3/luc in vivo. U određenim slučajevima, obezbeđeni su konjugati lekova anti-MUC16 antitela sa jedinjenjem 7 pri čemu su četiri doze jednom nedeljno davane u dozi od 85 µg/kg koje inhibiraju potkožni rast tumora OVCAR3/luc in vivo. U određenim slučajevima, obezbeđeni su konjugati lekova anti-MUC16 antitela sa jedinjenjem 10 gde pojedinačna doza u dozi od 85 µg/kg, 170 µg/kg ili 340 µg/kg inhibira intraperitonealni rast tumora OVCAR3/luc in vivo. Osim ako nije drugačije naznačeno, bioluminiscentno zračenje se odnosi na [p/s/cm2<2>/sr].
[0140] Predmetno izlaganje takođe sadrži anti-CD3/anti-MUC16 bispecifične molekule za vezivanje antigena koji pokazuju farmakokinetičke profile kod humanizovanih MUC16 x CD3 miševa (miševi homozigotni za humanu ekspresiju MUC16 i CD3, MUC16<hu/hu>x CD3<hu/hu>), CD3 humanizovanih miševa (miševi homozigotni za humanu ekspresiju CD3, CD3<hu/hu>) i miševi divljeg tipa (WT) usklađeni sa sojem (75% C57BL, 25%129Sv), kao što je opisano u Primeru 7 i prikazano na Slikama 1, 2 i 3.
Mapiranje epitopa i srodne tehnologije
[0141] Epitop na CD3 i/ili MUC16 za koji se vezuju molekuli koji se vezuju za antigen može se sastojati od jedne susedne sekvence od 3 ili više (npr.3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više) aminokiselina CD3 ili MUC16 proteina. Alternativno, epitop se može sastojati od više nesusednih aminokiselina (ili sekvenci aminokiselina) CD3 ili MUC16. Antitela mogu da stupaju u interakciju sa aminokiselinama sadržanim u jednom CD3 lancu (npr. CD3-epsilon, CD3-delta ili CD3-gama), ili mogu da interaguju sa aminokiselinama u dva ili više različitih CD3 lanaca. Termin "epitop", kako se ovde koristi, odnosi se na antigensku determinantu koja stupa u interakciju sa specifičnim mestom vezivanja antigena u varijabilnom regionu molekula antitela poznatog kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Dakle, različita antitela se mogu vezati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop se proizvodi od prostorno postavljenih aminokiselina iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji proizvode susedni aminokiselinski ostaci u polipeptidnom lancu. U određenim okolnostima, epitop može da sadrži delove saharida, fosforil grupe ili sulfonil grupe na antigenu.
[0142] Različite tehnike poznate osobama koje su uobičajeno verzirane u stanje tehnike mogu se koristiti da bi se utvrdilo da li domen antitela koji vezuje antigen "u interakciji sa jednom ili više aminokiselina" unutar polipeptida ili proteina. Primeri postupaka uključuju, npr., rutinski test unakrsnog blokiranja kao što je opisano u Antibodies, Harlov and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), analiza mutacija skeniranja alanina, analiza mrlja peptida (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), i analizu cepanja peptida. Pored toga, mogu se koristiti postupci kao što su ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Drugi postupak koji se može koristiti za identifikaciju aminokiselina unutar polipeptida sa kojima interaguje domen antitela koji vezuje antigen je razmena vodonik/deuterijum detektovana masenom spektrometrijom. Uopšteno govoreći, postupak razmene vodonik/deuterijum sadrži obeležavanje proteina od interesa deuterijumom, nakon čega sledi vezivanje antitela za protein obeležen deuterijumom. Zatim se kompleks protein/antitelo prenosi u vodu kako bi se omogućila razmena vodonik-deuterijum na svim ostacima osim za ostatke koji su zaštićeni antitelom (koji ostaju obeleženi deuterijumom). Nakon disocijacije antitela, ciljni protein se izlaže cepanju proteazom i analizi masenom spektrometrijom, čime se otkrivaju ostaci obeleženi deuterijumom koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama sa kojima antitelo stupa u interakciju. Videti, npr., Ehring (1999) Analitical Biochemistry 267(2):252-259; Engen i Smit (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. Rendgenska kristalografija kompleksa antigen/antitelo se takođe može koristiti u svrhe mapiranja epitopa.
[0143] Antitela prema pronalasku su definisana patentnim zahtevima. Ovde su takođe opisana druga antitela. Predmetno izlaganje uključuje anti-MUC16 antitela koja se vezuju za isti epitop kao bilo koje od specifičnih primera antitela opisanih ovde (npr. antitela koja sadrže bilo koju od aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1). Slično, ovo izlaganje takođe uključuje anti-MUC16 antitela koja su u kompeticiji za vezivanje za MUC16 sa bilo kojim od specifičnih primera ovde opisanih antitela (npr. antitela koja sadrže bilo koju od sekvenci aminokiselina kao što je ovde navedeno u Tabeli 1). Međutim, samo antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji sadrži prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD3 i drugi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje humani MUC16, pri čemu drugi domen za vezivanje antigena obuhvata domene HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20-22-24-28-30-32, kako je definisano u zahtevima, nalaze se u opsegu antitela zahtevanog pronalaska.
[0144] Predmetno izlaganje takođe uključuje bispecifične molekule za vezivanje antigena koji sadrže prvi domen koji se vezuje za antigen koji specifično vezuje humani CD3 i/ili cinomolgus CD3 sa niskim ili bez detektabilnog vezivanja ili afiniteta vezivanja, i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani MUC16, pri čemu prvi domen koji se vezuje za antigen vezuje se za isti epitop na CD3 kao bilo koji od specifičnih primera domena koji vezuju antigen koji su ovde opisani, i/ili pri čemu se drugi domen koji vezuje za antigen vezuje za isti epitop na MUC16 kao bilo koji od specifičnih primera MUC16-specifičnih domena za vezivanje antigena koji su ovde opisani.
[0145] Slično, predmetno izlaganje takođe uključuje bispecifične molekule za vezivanje antigena koji se sastoje od prvog domena za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za humani CD3 i drugog domena za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani MUC16, pri čemu se prvi domen koji se vezuje za antigen takmiči za vezivanje za CD3 sa bilo koji od specifičnih primera CD3-specifičnih domena za vezivanje antigena koji su ovde opisani, i/ili gde se drugi domen za vezivanje antigena takmiči za vezivanje za MUC16 sa bilo kojim od specifičnih MUC16-specifičnih domena za vezivanje antigena koji su ovde opisani.
[0146] Može se jednostavno odrediti da li se određeni molekul koji se vezuje za antigen (npr. antitelo) ili njegov domen koji vezuje antigen vezuje za isti epitop kao, ili je u kompeticiji za vezivanje sa referentnim molekulom koji vezuje antigen, korišćenjem rutinskih postupaka poznatih u oblasti tehnike. Na primer, da bi se utvrdilo da li se ispitivano antitelo vezuje za isti epitop na MUC16 (ili CD3) kao referentni bispecifični molekul koji vezuje antigen, referentnom bispecifičnom molekulu se prvo dozvoljava da se veže za MUC16 protein (ili CD3 protein). Zatim se procenjuje sposobnost ispitivanog antitela da se veže za MUC16 (ili CD3) molekul. Ako je ispitivano antitelo u stanju da se veže za MUC16 (ili CD3) nakon vezivanja zasićenja sa referentnim bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, može se zaključiti da se ispitivano antitelo vezuje za drugačiji epitop MUC16 (ili CD3) od referentnog bispecifičnog antigen vezujućeg molekula. S druge strane, ako ispitivano antitelo nije u stanju da se veže za MUC16 (ili CD3) molekul nakon vezivanja zasićenja sa referentnim bispecifičnim molekulom
1
koji vezuje antigen, tada se ispitivano antitelo može vezati za isti epitop MUC16 (ili CD3) kao epitop vezan referentnim bispecifičnim antigen-vezujućim molekulom. Dodatni rutinski eksperimenti (npr. mutacija peptida i analize vezivanja) se zatim mogu sprovesti da bi se potvrdilo da li je uočeni nedostatak vezivanja ispitivanog antitela u stvari posledica vezivanja za isti epitop kao referentni bispecifični molekul koji vezuje antigen ili ako je sterično blokiranje (ili neki drugi fenomen) odgovorno za nedostatak uočenog vezivanja. Eksperimenti ove vrste se mogu izvesti korišćenjem ELISA, RIA, Biacore, protočne citometrije ili bilo kog drugog kvantitativnog ili kvalitativnog testa vezivanja antitela koji je dostupan u oblasti tehnike. U skladu sa određenim slučajevima, dva proteina koji se vezuju za antigen vezuju se za isti (ili preklapajući) epitop ako, npr. drugi za najmanje 50%, ali poželjno 75%, 90% ili čak 99% izmereno u testu kompetitivnog vezivanja (videti, npr. Junghans et al., Cancer Res.
1990:50:1495-1502). Alternativno, smatra se da se dva proteina koji vezuju za antigen vezuju za isti epitop ako u suštini sve mutacije aminokiselina u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog proteina za vezivanje antigena smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. Smatra se da dva proteina koji vezuju antigen imaju "preklapajuće epitope" ako samo podskup mutacija aminokiselina koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog proteina koji vezuje antigen smanjuje ili eliminiše vezivanje drugog.
[0147] Da bi se utvrdilo da li je antitelo ili njegov domen koji se vezuje za antigen u kompeticiji za vezivanje sa referentnim molekulom koji vezuje antigen, gore opisana metodologija vezivanja se izvodi u dve orijentacije: U prvoj orijentaciji, referentnom molekulu koji vezuje antigen je dozvoljeno da se veže za MUC16 protein (ili CD3 protein) u uslovima zasićenja nakon čega sledi procena vezivanja ispitivanog antitela za MUC16 (ili CD3) molekul. U drugoj orijentaciji, ispitivanom antitelu se dozvoljava da se veže za MUC16 (ili CD3) molekul pod uslovima zasićenja, nakon čega sledi procena vezivanja referentnog molekula koji vezuje antigen za molekul MUC16 (ili CD3). Ako je, u obe orijentacije, samo prvi (zasićeni) molekul koji vezuje antigen sposoban da se veže za MUC16 (ili CD3) molekul, onda se zaključuje da se ispitivano antitelo i referentni molekul koji vezuje antigen takmiče za vezivanje za MUC16 (ili CD3). Kao što će shvatiti osoba koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, antitelo koje je u kompeticiji za vezivanje sa referentnim molekulom koji vezuje antigen ne mora nužno da se veže za isti epitop kao referentno antitelo, ali može sterički da blokira vezivanje referentnog antitela vezivanjem preklapajućeg ili susednog epitopa.
Priprema domena za vezivanje antigena i konstruisanje bispecifičnih molekula
[0148] Domeni za vezivanje antigena specifični za određene antigene mogu se pripremiti bilo kojom tehnologijom za generisanje antitela poznatom u tehnici. Kada se jednom dobiju, dva različita domena za vezivanje antigena, specifična za dva različita antigena (npr. CD3 i MUC16), mogu se na odgovarajući način rasporediti jedan u odnosu na drugi da bi se proizveo bispecifičan molekul koji vezuje antigen korišćenjem rutinskih postupaka. (Razmatranje primera formata bispecifičnih antitela koji se mogu koristiti za konstruisanje bispecifičnih molekula koji vezuju antigen je ovde predstavljeno na drugom mestu). U određenim slučajevima, jedna ili više pojedinačnih komponenti (npr. teški i laki lanci) multispecifičnih molekula koji vezuju antigen su izvedeni iz himernih, humanizovanih ili potpuno humanih antitela. Postupci za pravljenje takvih antitela su dobro poznati u oblasti tehnike. Na primer, jedan ili više teških i/ili lakih lanaca bispecifičnih molekula koji vezuju antigen mogu se pripremiti korišćenjem VELOCIMMUNE<TM>tehnologije. Koristeći VELOCIMMUNE<TM>tehnologiju (ili bilo koju drugu tehnologiju za generisanje humanih antitela), himerna antitela visokog afiniteta na određeni antigen (npr. CD3 ili MUC16) se inicijalno izoluju sa humanim varijabilnim regionom i mišjim konstantnim regionom. Antitela su okarakterisana i odabrana prema poželjnim karakteristikama, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Konstantni regioni miša se zamenjuju željenim humanim konstantnim regionom da bi se generisali potpuno humani teški i/ili laki lanci koji se mogu ugraditi u bispecifične antigen-vezujuće molekule.
2
[0149] Genetički modifikovane životinje mogu se koristiti za pravljenje humanih bispecifičnih molekula koji vezuju antigen. Na primer, može se koristiti genetski modifikovani miš koji nije u stanju da preuredi i eksprimira varijabilnu sekvencu lakog lanca endogenog imunoglobulina miša, pri čemu miš eksprimira samo jedan ili dva varijabilna domena lakog lanca humanog lanca kodirana sekvencama humanog imunoglobulina koje su operativno povezani sa mišjim konstantnim kapa genu na endogenom kapa lokusu miša. Takvi genetički modifikovani miševi mogu da se koriste za proizvodnju potpuno humanih bispecifičnih molekula koji se vezuju za antigen koji sadrže dva različita teška lanca koji se povezuju sa identičnim lakim lancem koji sadrži varijabilni domen izveden iz jednog od dva različita segmenta gena varijabilnog regiona lakog lanca čoveka. (Videti, npr., US 2011/0195454). Potpuno humano se odnosi na antitelo, ili fragment koji se vezuje za antigen ili njegov imunoglobulinski domen, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kodiranu DNK izvedenom iz humane sekvence preko cele dužine svakog polipeptida antitela ili fragmenta koji se vezuje za antigen ili njegovog imunoglobulinskog domena. U nekim slučajevima, potpuno humana sekvenca je izvedena iz proteina endogenog za čoveka. U drugim slučajevima, potpuno humana proteinska ili proteinska sekvenca sadrži himernu sekvencu u kojoj je svaka komponentna sekvence izvedena iz humane sekvence. Iako nisu vezani nijednom teorijom, himerni proteini ili himerne sekvence su generalno dizajnirani da minimiziraju stvaranje imunogenih epitopa u spojevima sekvenci komponenti, npr. u poređenju sa bilo kojim divljim tipom humanih imunoglobulinskih regiona ili domena.
Bioekvivalenti
[0150] Antitela iz pronalaska definisana su patentnim zahtevima. Druga antitela su takođe ovde opisana. Predmetno izlaganje obuhvata antigen-vezujuće molekule sa aminokiselinskim sekvencama koje se razlikuju od onih iz ovde prikazanih primera molekula ali koji zadržavaju sposobnost da vežu CD3 i/ili MUC16. Takve varijante molekula mogu sadržati jednu ili više adicija, delecija, ili supstitucija aminokiselina u poređenju sa roditeljskom sekvencom, ali ispoljavaju biološku aktivnost koja je u suštini evivalentna u odnosu na opisane bispecifične antigen-vezujuće molekule.
[0151] Ovo izlaganje obuhvata antigen-vezujuće molekule koji su bioekvivalenti na bilo koji od ovde prikazanih primera antigen-vezujućih molekula. Dva proteina koji vezuju antigen, ili antitela, smatraju se bioekvivalentnim ukoliko su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija je brzina i obim apsorpcije ne pokazuju značajnu razliku kada se primenjuju u istoj molarnoj dozi pod sličnim eksperimentalnim uslovima, bilo u pojedinačnim dozama ili višestrukim dozama. Neki antigen vezujući proteini će biti smatrani bioekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ukoliko su ekvivalenti u obimu njihove apsorpcije ali ne u brzini njihove apsorpcije a ipak se mogu smatrati bioekvivalentnim zbog toga što su takve razlike u brzini aposorocije namerne i, nisu od suštinskog značaja za postizanje efikasnih koncentracija leka u telu za, npr., hroničnu upotrebu, i smatraju se medicinski beznačajnim za određeni lek koji se proučava. Međutim, samo antitelo ili antigen-vezujući fragment kao što je definisano u patentnim zahtevima je obuhvaćena obimom antitela za koji se traži zaštita.
[0152] Na primer, dva antigen-vezujuća proteina su bioekvivalentni ukoliko ne postoje klinički značajne razlike u njihovoj bezbednosti, čistoći, i potenciji.
[0153] Na primer, dva antigen-vezujuća proteina su bioekvivalentni ukoliko pacijent može jednom ili više puta da se prebaci između referentnog proizvoda i biološkog proizvoda bez očekivanog povećanja u riziku od neželjenih efekata, uključujući klinički značajnu promenu u imunogenosti, ili smanjenu efikasnost, u poređenju sa nastavkom terapije bez takve promene.
[0154] Na primer, two dva antigen-vezujuća proteina su bioekvivalentni ukoliko oba deluju zajedničkim mehanizmom ili mehanizmima delovanja za uslov ili uslove upotrebe, u meri u kojoj su takvi mehanizmi poznati.
[0155] Bioekvivalencija se može dokazati in vivo i in vitro postupcima. Mere bioekvivalencije uključuju, npr., (a) in vivo ispitivanje kod humanih bića ili drugih sisara, u kome je koncetracija antitela ili njegovih metabolita merena u krvi, plazmi, serumu, ili drugoj biološkoj tečnosti kao funkciji vremena; (b) in vitro test koji je u korelaciji sa podacima o bioraspoloživosti kod ljudi in vivo i koji razumno predviđa; (c) in vivo test kod ljudi ili drugih sisara u kojoj se odgovarajući farmakološki efekat antitela (ili njegove mete) meri kao funkcija vremena; i (d) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju koje uspostavlja bezbednost, efikasnost, ili bioraspoloživost ili bioekvivalencija antigen-vezujućih proteina.
[0156] Bioekvivalenti varijante primera bispecifičnih antigen-vezujućih molekula koji su ovde prestavljeni mogu biti konstruisani, na primer, pravljenjem različitih supstitucija ostataka ili sekvenci delecijom terminalnih ili unutrašnjih ostataka ili sekvenci koje nisu potrebne za biološku aktivnost. Na primer, cisteinski ostaci nisu od suštinske važnosti za biološku aktivnost se mogu brisati ili zameniti sa drugim aminokiselinama da se spreči obrazovanje nepotrebnih ili neispravnih intramolekularnih disulfidnih mostova nakon renaturacije. U drugim kontekstima, bioekvivalentni antigen-vezujući proteini mogu obuhvatiti varijante primera bispecifičnih antigen-vezujućih molekula koji su ovde prikazani koji sadrže aminokiselinske promene koje modifikuju karakteristike glikozilacije molekula, npr., mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikozilaciju.
Selektivnost vrsta i unakrsna reaktivnost vrsta
[0157] Prema određenim slučajevima, opisani su antigen-vezujući molekuli koji vezuju CD3 ali ne CD3 iz drugih vrsta. Takođe su obezbeđeni antigen-vezujući molekuli koji se vezuju za humani MUC16. Ovde opisano izlaganje takođe uključuje antigen-vezujuće molekule koji se vezuju za humani CD3 i za CD3 iz jednog ili više ne-humanih vrsta; i/ili antigen-vezujućih molekula koji se vezuju za humani MUC16.
[0158] Prema određenim primerima slučajeva, obezbeđeni su antigen-vezujući molekuli koji se vezuju za humani CD3 i/ili humani MUC16 i mogu vezivati ili ne moraju vezivati, kao što može biti slučaj, sa jednim ili više CD3 i/ili MUC16 miša, pacova, zamorca, hrčka, gerbila, svinje, mačke, psa, zeca, koze, ovce, krave, konja, kamile, cinomolgusa, marmozeta, rezusa ili šimpanze. Na primer, u određenim primerima slučajeva obezbeđeni su bispecifični antigen-vezujući molekuli koji sadrže prvi antigenvezujući domen koji veže humani CD3 i CD3 cinomolgusa, i drugi antigen vezujući domen koji specifično vezuje humani MUC16.
Konjugati antitela sa lekom (ADCs)
[0159] Antitela iz pronalaska su definisana patentnim zahtevima. Takođe su opisani kojugati antitelasa lekom (ADCs) koji obuhvataju anti-MUC16 antitelo ili fragment za vezivanje antigena koji je konjugovan terapijskim ostatkom kao što je citotoksični agens, hemoterapeutski lek, imunosupresant ili radioizotop. U opštim terminima, ADCs obuhvataju: A - [L - P]y, u kome je A antigen-vezujući molekul, npr. anti-MUC16 antitelo, ili njegov fragment (npr., fragment koji sadrži bar HCDR3 odabran od bilo koje od sekvenci HCDR3 aminokiselina koje su navedene u Tabeli 1), L je linker, P je „payload“ ili terapeutski ostatak (npr., citotoksični agens), i y je ceo broj od 1 do 30. U različitim slučajevima, ADC sadrži anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji obuhvata CDRs od HCVR i LCVR koji imaju aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs (npr., SEQ ID NOs: 2 i 10) prikazane u Tabeli 1, ili specifični parovi HCVR/LCVR (npr., SEQ ID NOs: 2/10). U nekim slučajevima, anti-MUC16 antitelo ili fragment obuhvata CDRs sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NOs (npr., SEQ ID NOs: 4-6-8-12-14-
4
16) prikazanim u Tabeli 1. U nekim slučajevima, anti-MUC16 antitelo ili fragment obuhvata HCVR i LCVR koji ima aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs (npr., SEQ ID NOs: 2 i 10) prikazanim u Tabeli 1, ili parove specifičnih aminokiselinskih sekvenci (npr., SEQ ID NOs: 2/10). U nekim slučajevima, anti-MUC16 antitelo je antitelo ili antigen-vezujući fragment koji vezuje humani MUC16 u jednom ili više od pet membransko-proksimalnih SEA domena humanog MUC16 koji odgovara ostacima 13791-14451 SEQ ID NO: 1899. U nekim slučajevima, anti-MUC16 antitelo je antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen koji vezuje humani MUC16 unutar ostataka 13810-14451 SEQ ID NO: 1899. U nekim slučajevima, anti-MUC16 antitelo je antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen koji se vezuje za bilo koji od više od SEA1, SEA2, SEA3, SEA4, SEA5, SEA6, SEA7, SEA8, SEA9, SEA10, SEA11, SEA12, SEA13, SEA14, SEA15 ili SEA16 humanog MUC16. U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuju za SEA1 (ostaci 12074 do 12229 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuju unutar SEA2 (ostaci 12230 do 12387 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuju unutar SEA3 (ostaci 12388 do 12543 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuju za SEA4 (ostaci 12544 do 12698 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuje unutar SEA5 (ostaci 12699 do 12854 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuju za SEA6 (ostaci 12855 do 13010 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuje unutar SEA7 (ostaci 13011 do 13166 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuje unutar SEA8 (ostaci 13167 do 13323 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuju unutar SEA9 (ostaci 13324 do 13478 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuju unutar SEA10 (ostaci 13479 do 13634 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuju unutar SEA11 (ostaci 13635 do 13790 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuju unutar SEA12 (ostaci 13791 do 13923 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuje unutar SEA13 (ostaci 13924 do 14074 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuju unutar SEA14 (ostaci 14075 do 14227 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuju unutar SEA15 (ostaci 14228 do 14320 SEQ ID NO: 1899). U jednom slučaju, anti-MUC16 antitelo ili fragment se vezuje unutar SEA16 (ostaci 14321 do 14464 SEQ ID NO: 1899). Na primer, izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen vezuje humani MUC16 unutar epitopa u rasponu od ostatka 428 do ostatka 481 SEQ ID NO: 1902. U nekim slučajevima, izolovano antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen interaguje sa ostacima aminokiselina 428 -434, 429-434, 453-467, 459-467, 460-467 i/ili 474-481 SEQ ID NO: 1902. U nekim slučajevima, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen interaguje sa ostacima aminokiselina 428-434, 429-434, 453-467, 459-467, 460-467 i 474-481 SEQ ID NO: 1902. U nekim slučajevima izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen vezuje humani MUC16 unutar epitopa u rasponu od ostatka 112 do ostatka 138 SEQ ID NO: 1902. U nekim slučajevima, izolovano antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen interaguje sa ostacima aminokiselina 126-131, 127-131 i/ili 132-138 SEQ ID NO: 1902. U nekim slučajevima, antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen stupa u interakciju sa aminokiselinskim ostacima 126-131, 127-131 i 132-138 SEQ ID NO: 1902. Ovo izlaganje dalje obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji vezuje humani MUC16 unutar epitopa u rasponu od ostatka 357 do ostatka 369 SEQ ID NO: 1902. U nekim slučajevima, izolovano antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen interaguje sa ostacima aminokiselina 357-369, 358-366, 358-369 i/ili 361-369 SEQ ID NO: 1902. U nekim slučajevima, antitelo ili antigen-vezujući fragment interaguje sa aminokiselinskim ostacima 357-369, 358-366, 358-369 i 361-369 SEQ ID NO: 1902. U jednom slučaju, otkriće obezbeđuje anti-CD3/anti-MUC16 bispecifično antitelo, koje sadrži anti-MUC16 vezujući krak koji sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1959 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1960, i anti-CD3 vezujući krak koji sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1961 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1960. U drugom slučaju, izlaganje obezbeđuje anti-CD3/anti-MUC16 bispecifično antitelo, koje sadrži anti-MUC16 vezujući krak koji sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1959 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1960, i antiCD3 vezujući krak koji sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1962 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1960. Međutim, samo antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, kako je definisano u zahtevima, spada u obim antitela prema predmetnom pronalasku.
[0160] Citotoksični agensi uključuju bilo koji agens koji je štetan za rast, vijabilnost ili umnožavanje ćelija. Antigen vezujući molekuli ili antitela isporučuju ove citotoksične agense, ovde naznačene kao "payloads", u ciljne ćelije. U oblasti tehnike su poznati primeri pogodnih citotoksičnih agenasa i hemoterapeutskih agenasa za obrazovanje ADC-a.
[0161] Primeri pogodnih citotoksičnih agenasa i hemoterapeutskih agenasa koji se mogu konjugovati za anti-MUC16 antitela u skladu sa ovim aspektom uključuju, npr., 1-(2hloroetil)-1,2-dimetansulfonil hidrazid, 1,8-dihidroksi-biciklo[7.3.1]trideka-4,9-dien-2,6-diin-13-on, 1-dehidrotestosteron, 5-fluorouracil, 6-merkaptopurin, 6-tiogvanin, 9-amino kamptotecin, aktinomicin D, amanitins, aminopterin, anguidin, antraciklin, antramicin (AMC), auristatini (monometil auristatin E ili monometil auristatin F), bleomicin, busulfan, butanska kiselina, kaliheamicini, kamptotecin, karminomicini, karmustin, cemadotini, cisplatin, kolhicin, kombretastatini, ciklofosfamid, citarabin, citohalasin B, daktinomicin, daunorubicin, dekarbazin, diacetoksipentildoksorubicin, dibromomanitol, dihidroksi antracin dion, disorazoli, dolastatin, doksorubicin, duokarmicin, ehinomicini, eleuterobini, emetin, epotilone, esperamicin, estramustine, etidijum bromid, etopozid, fluorouracile, geldanamoicine, gramicidin D, glukokortikoide, irinotekane, leptomicine, leurosine, lidokain, lomustin (CCNU), majtanzinoide, mehloretamin, melfalan, merkaptopurine, metopterine, metotreksat, mitramicin, mitomicin, mitoksantron, N8-acetil spermidin, podofilotoksine, prokain, propranolol, pteridine, puromicin, rizoksine, streptozotocin, talisomicine, taksol, tenopozid, tetrakain, tioepa hlorambucil, tomaimicine, topotekane, tubulisin, vinblastin, vinkristin, vindesin, vinorelbine, i derivate bilo kojeg od prethodno pomenutih.
[0162] U skladu sa određenim slučajevima, citotoksični agens koji je konjugovan sa anti-MUC16 antitelom je auristatin kao što je monometil auristatin E (MMAE) ili monometil auristatin F (MMAF), tubulisin kao što je TUB-OH ili TUB-OMOM, derivat tomaimicina, derivat dolastatina, ili majtanzinoid kao što je DM1 ili DM4. U nekim slučajevima, citotoksični agens je majtanzinoid koji ima strukturu formule (I), uključujući stereoizomere jedinjenja Formule (I):
gde je A arilen ili heteroarilen.
[0163] U nekim slučajevima, A je divalentni radikal benzena, piridin, naftalena, ili hinolona, koji su po potrebi supstituisani.
[0164] U nekim slučajevima, A je arilen.
[0165] U nekim slučajevima, A je:
gde:
<1>R je, nezavisno na svakom pojavljivanju, alkil, alkenil, alkinil, aril, alkaril, aralkil, halo, heteroaril, heterocikloalkil, hidroksil, cijano, nitro,
ili azido, gde R<A>je alkil ili heteroalkil;
n je ceo broj od 0 do 4;
m je i ceo broj od 0 do 3;
p je ceo broj od 0 do 6; i
q je ceo broj od 0 do 5.
[0166] U nekim slučajevima, jedinjenja Formule I je odabrano iz grupe koja obuhvata:
[0167] Na primer, jedinjenje Formule (I) je:
[0168] U nekim slučajevima, majtanzinoid Formule (I) je konjugovan sa anti-MUC16 antitelom ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena preko linkera, kao što je ispod prikazano u Formuli (IA):
pri čemu:
A je arilen ili heteroarilen, kao što je gore razmotreno u vezi sa Formulom (I);
L je linker;
BA je anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena; i
k je ceo broj od 1 do 30.
[0169] U različitim slučajima, L je:
gde:
4
SP je grupa koja povezuje; je jedna ili više veza na anti-MUC16 antitelu ili njegovom fragmentu; AA<1>je aminokiselina; i
AA<2>je aminokiselina.
[0170] U nekim slučajevima, AA1-AA<2>je: valin-citrulin, citrulin-valin, lizin-fenilalanin, fenilalanin-lizin, valin-asparagin, asparagin-valin, treonin-asparagin, asparagin-treonin, serin-asparagin, asparaginserin, fenilalanin-asparagin, asparagin-fenilalanin, leucin-asparagin, asparagin-leucin, izoleucinasparagin, asparagin-izoleucin, glicin-asparagin, asparagin-glicin, glutaminska kiselina-asparagin, asparagin-glutaminska kiselina, citrulin-asparagin, asparagin-citrulin, alanin-asparagin, ili asparaginalanin.
[0171] U nekim slučajevima, SP je:
gde je veza sa anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment; i
b je ceo broj od 2 do 8.
U drugim slučajevima, L je:
gde: je veza sa anti-MUC16 antitelom ili njegovim fragmentom;
b je ceo broj od 2 do 8.
[0172] U nekim slučajevima, jedinjenje Formule (IA), uključujući linker, koje je vezano sa anti-MUC16 antitelom ili njegov fragment za vezivanje antigena je:
gde je veza sa anti-MUC16 antitelom ili njegovim fragmentom.
U nekim slučajevima, ovaj ostatak je označen sa "Jedinjenje 10."
[0173] Na primer, jedinjenje Formule (IA), uključujući linker, koje je vezano sa anti-MUC16 antitelom ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena je:
gde je veza sa anti-MUC16 antitelom ili njegovim fragmentom. U nekim slučajima, ovaj ostatak je označen sa "Jedinjenje 60."
[0174] U nekim slučajevima, citotoksični agens je majtanzinoid koji ima strukturu Formule (II), uključujući stereoizomere jedinjenja Formule (II):
gde:
A3aje aminokiselina, peptid koji ima 2-20 aminokiselina, alkil, alkinil, alkenil, cikloalkil, aril, heteroaril, heterociklil, -CR5R6-, -O-, -C(=O)-,
-O-C(=O)-, -C(=O)-O-, -O-C(=O)-O-, -C(=O)-(CHx)p1-,-C(=O)-O-(CHx)p1-,
-(CHx)p1-C(=O)-, -(CHx)p1-C(=O)-O-, -(O-(CH2)p2-)p3-,-((CH2)p2-O-)p3-, -C(=S)-,
-C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO2-,
-NR4-,-N(R4)-C(=O)-N(R8)-, -N(R4)-C(=O)O-, -N(R4)-C(=O)-, -C(=O)-N(R4)-,
-C(=O)-N(R4)-C(=O)-, or-O-C(=O)-NR4-, gde alkil, alkinil, alkenil, cikloalkil, aril, heteroaril, i heterociklil su opciono supstituisani; i
p1, p2 i p3 su svaki nezavisno 0, ili broj od 1 do 100;
x je 0, 1 ili 2;
R4, R5, R6i R8su svaki nezavisno H, ili supstituisani ili nesupstituisani: alkil, alkenil, alkinil, aril, heteroaril, ili heterociklil; i
R4aje supstituisani ili nesupstituisani: alkil, alkenil, alkinil, aril, heteroaril, ili heterociklil.
[0175] U nekim slučajevima, jedinjenje Formule (II) je odabrano iz grupe koja se sastoji iz:
[0176] Na primer, jedinjenje Formule (II) je:
[0177] U nekim slučajevima, majtanzinoid Formule (II) je konjugovan sa anti-MUC16 antitelom ili njegovim fragmentom koji se vezuje za antigen preko linkera, kao što je ispod prikazano u Formuli (IIA):
4
gde:
BA je anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen;
a je ceo broj od 1 do 30;
Z2je predstavljen sledećom strukturnom formulom: -Z2A-Z2B-Z2C-Z2D, wherein Z2A, Z2B, Z2Ci Z2Dsu svaki nezavisno odsutni, aminokiselina, peptid sa 2-20 aminokiselina, alkil, alkinil, alkenil, cikloalkil, aril, heteroaril, heterociklil, -CR5R6-, -O-, -C(=O)-, -O-C(=O)-, -C(=O)-O-,-O-C(=O)-O-, -C(=O)-(CHx)p1, -C(=O)-O-(CHx)p1, -(CHx)p1-C(=O)-, -(CHx)p1-C(=O)-O- -(O-(CH2)p2-)p3-, - ((CH2)p2-O-)p3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-
, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO2-, -NR4-, -N(R4)-C(=O)-N(R8)-, -N(R4)-C(=O)O-, -N(R4)-
C(=O)-, C(=O)-N(R4)-, -C(=O)-N(R4)-C(=O)-, -O-C(=O)-N(R4), -O-C(=S)-N(R4)-, -C(=S)-N(R4)-, -N=C=S, -
N=C=O,
A je prirodna ili neprirodna aminokiselina, ili peptid koji sadrži 2-20 aminokiselina;
W je -O-, -S-, -CR5R6-, ili -NR4-;
X je aril, heteroaril, cikloalkil, ili heterociklil, gde su aril, heteroaril, cikloalkil, i heterociklil su opciono supstituisani;
pri čemu A1, A3, i R1su svaki nezavisno aminokiselina, peptid sa 2-20 aminokiselina, alkil, alkinil, alkenil, cikloalkil, aril, heteroaril, heterociklil, -CR5R6-, -O-, -C(=O)-, -O-C(=O)-, -C(=O)-O-,-O-C(=O)-O-, -C(=O)-(CHx)p1-, -C(=O)-O-(CHx)p1-, -(CHx)p1-C(=O)-, -(CHx)p1-C(=O)-O-, -(O-(CH2)p2-)p3-, -((CH2)p2-O-)p3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -S-C(=S)-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO2-, -NR4-,-N(R4)-C(=O)-N(R8)-, -N(R4)-C(=O)O-, -N(R4)-C(=O)-, -C(=O)-N(R4)-, -C(=O)-N(R4)-C(=O)-, ili -O-C(=O)-NR4-,
pri čemu su alkil, alkinil, alkenil, cikloalkil, aril, heteroaril i heterociklil opciono supstituisani;
R17je izabran iz grupe koju čine O, S, NR18i CR5R6;
R18je izabran iz grupe koju čine H, alkil, alkinil, alkenil, cikloalkil, aril, heteroaril, heterociklil i acil, pri čemu su alkil, alkinil, alkenil, cikloalkil, aril, heteroaril, heterociklil i acil opciono supstituisani; R4, R5, R6i R8su svaki nezavisno H, ili supstituisani ili nesupstituisani: alkil, alkenil, alkinil, aril, heteroaril ili heterociklil;
R4aje supstituisani ili nesupstituisani: alkil, alkenil, alkinil, aril, heteroaril ili heterociklil;
p1, p2 i p3 su svaki nezavisno 0, ili ceo broj od 1 do 100; i
x je 0, 1 ili 2.
[0178] U nekim slučajevima Formule (IIA), A je peptid izabran iz grupe koju čine valin-citrulin, citrulinvalin, lizin-fenilalanin, fenilalanin-lizin, valin-asparagin, asparagin-valin, treonin-asparagin, asparagintreonin, serin-asparagin, asparagin-serin, fenilalanin-asparagin, asparagin-fenilalanin, leucinasparagin, asparagin-leucin, izoleucin-asparagin, asparagin-izoleucin, glicin-asparagin-asparaginglicin, glutaminska kiselina-asparagin, aparagin-glutaminska kiselina, citrulin-asparagin, asparagincitrulin, alanin-asparagin i asparagin-alanin.
[0179] Na primer, jedinjenje Formule (IIA) koje je vezano za anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment koji se veže za antigen je:
gde je veza za anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment. U nekim slučajevima, ostatak je označen sa "Jedinjenje 7."
[0180] U nekim slučajevima, citotoksični agens koji je konjugovan sa anti-MUC16 antitelom ili je njegov fragment čisti, ili suštinski čisti, diastereoizomer DM1:
i y je ceo broj 1 do 0.
[0181] U drugom slučaju, ADC sadrži "A - [L - P]y" strukturu u kojoj je A anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za anti en i L - P e:
4
ili
ili
njihova smeša, i
gde y je ceo broj 1 do 30, i
veza za anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment.
[0182] Drugi derivati majtanzinoida su razmatrani u WO 2014/145090, WO2016/160615, i WO 2015/031396.
[0183] U nekim slučajevima, citotoksični agens koji je konjugovan sa anti-MUC16 antitelom ili njegovim fragmentom je MMAE ili MMAF.
[0184] Razmatraju se i drugi citotoksični agensi koji su poznati u oblasti tehnike, uključujući, npr., proteinske toksine kao što su ricin, toksin C. difficile, egzotoksin pseudomonas, toksin difterije, botulinum toksin, briodin, saporin, toksini iz bobica vinobojke (tj., fitolacigenin i drugi), kao što su oni koji se navode u Sapra et al., Pharmacol. & Therapeutics, 2013, 138:452-469.
[0185] Citotoksični agensi („payloads“) mogu biti vezani za anti-MUC16 antigen-vezujući molekul ili antitelo preko hemijskog linkera koji kovalentno vezuje jedinjenje “payload” za proteinski molekul (tj. antitelo). Primeri specifičnih linkera su razmatrani u tekstu iznad. Uopštenije, i kako se ovde koristi, termin "linker" se odnosi na bilo koju dvovalentnu grupu ili ostatak koji povezuje, spaja ili vezuje vezujuće sredstvo (npr. antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen) sa jedinjenjem “payload” koje je ovde prikazano. Generalno, pogodni linkeri vezujućih agenasa za konjugate antitela koji su ovde opisani su oni koji su dovoljno stabilni da iskoriste poluživot antitela u cirkulaciji i, u isto vreme, sposobni da oslobode svoj “payload” nakon internalizacije konjugata posredovane antigenom. Linkeri mogu biti cepivi ili necepivi. Cepivi linkeri su linkeri koji se cepaju intracelularnim metabolizmom nakon internalizacije, npr. cepanjem putem hidrolize, redukcijom ili enzimskom reakcijom. Linkeri koji se ne mogu cepiti su linkeri koji oslobađaju vezani “payload” putem lizozomalne degradacije antitela nakon internalizacije. Pogodni linkeri uključuju, ali nisu ograničeni na, kiselinsko-labilne linkere, linkere labilne na hidrolizu, enzimski cepive linkere, redukciono labilne linkere, samo-destruktivne linkere i linkere koji se ne cepaju. Pogodni linkeri takođe uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji su ili sadrže peptide, glukuronide, sukcinimid-tioetre, jedinice polietilen glikola (PEG), hidrazone, mal-kaproil jedinice, dipeptidne jedinice, valin-citrulinske jedinice i para-aminobenzil (PAB) jedinice. U nekim slučajevima, linker je sposoban da se veže za antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen preko ostatka lizina ili ostatka cisteina (npr., putem cepanja disulfidne grupe antitela ili fragmenta, ili preko ostatka cisteina koji je konstruisan u antitelo ili fragment). U nekim slučajevima, linker je sposoban da se veže za antitelo ili fragment preko glutaminskog ostatka, uključujući one koji se dobijaju konjugacijom posredovanom transglutaminazom.
4
[0186] Primeri linkera koji se mogu koristiti uključuju linkere koji sadrže ili se sastoje od npr. MC (6-maleimidokaproil), MCC (maleimidometil cikloheksan-1-karboksilat), MP (maleimidopropanoil), valcit (valin-citrulin), val-ala (valin-alanin), ala-phe (alanin-fenilalanin), phe-lys (fenilalanin-lizin), dipeptidno mesto u linkeru koji se cepa proteazom, PAB (p-aminobenziloksikarbonil), SPP (N-sukcinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoat), SMCC (N-sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1 karboksilat), SlAB (N-sukcinimidil (4-jodoacetil)aminobenzoat), i njihove varijante i kombinacije. Dodatni primeri linkera koji se mogu koristiti su otkriveni u, npr., US Pat. br. 7,754,681 i u Ducry, Bioconjugate Chem., 2010, 21:5-13, i referencama koje se tamo navode,. U nekim slučajevima, linker je ili sadrži samo-destruktivni spejser, kao što su oni o kojima se raspravlja u Jin, et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2012, 20:3465-3469, i Wu, et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2016, 24:2697-2706.
[0187] “Payloads” mogu biti vezani za anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen preko vezivanja za određenu aminokiselinu unutar antitela ili molekula za vezivanje antigena. Primeri dodataka aminokiselina koji se mogu korisititi u kontekstu ovog aspekta uključuju, npr., lizin (videti, npr., U.S. Pat. Br.5,208,020; US 2010/0129314; Hollander et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19:358-361; WO 2005/089808; U.S. Pat. Br.5,714,586; US 2013/0101546; i US 2012/0585592), cistein (videti, npr., US 2007/0258987; WO 2013/055993; WO 2013/055990; WO 2013/053873; WO 2013/053872; WO 2011/130598; US 2013/0101546; i U.S. Pat. Br. 7,750,116), selenocistein (videti, npr., WO 2008/122039; i Hofer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2008, 105:12451-12456), formil glicin (videti, npr., Carrico et al., Nat. Chem. Biol., 2007, 3:321-322; Agarwal et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2013, 110:46-51, i Rabuka et al., Nat. Protocols, 2012, 10:1052-1067), neprirodne aminokiseline (videti, npr., WO 2013/068874, i WO 2012/166559), i kisele aminokiseline (videti, npr., WO 2012/05982). Linkeri mogu takođe biti konjugovani za antigen vezujući protein preko vezivanja za ugljene hidrate (videti, npr., US 2008/0305497, i Ryan et al., Food & Agriculture Immunol., 2001, 13:127-130) i disulfidne linkere (videti, npr., WO 2013/085925, WO 2010/010324, WO 2011/018611, i Shaunak et al., Nat. Chem. Biol., 2006, 2:312-313).
[0188] Odnos leka i antitela (eng. drug-antibody-ratio, DAR) je prosečan broj lekova konjugovanih sa antitelom ili fragmentom koji se vezuje za antigen, koji ima važan uticaj na efikasnost, potenciju i farmakokinetiku ADC. U različitim slučajevima, DAR je od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 molekula leka po antitelu. U nekim slučajevima, DAR je od 1 do 4. U određenim slučajevima, DAR je od 2 do 4. U nekim slučajevima, DAR je od 2 do 3. U određenim slučajevima, DAR je od 3 do 4. U nekim slučajevima u slučajevima, DAR je od 1 do 10, 1 do 20 ili 1 do 30 (tj. od 1 do 30 molekula leka po antitelu ili njegovom fragmentu koji se vezuje za antigen).
Terapeutska formulacija i davanje
[0189] Ovo izlaganje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže molekule koji se vezuju za antigen iz predmetnog izlaganja. Farmaceutske kompozicije su formulisane sa pogodnim nosačima, ekscipijentima i drugim agensima koji obezbeđuju poboljšani transfer, isporuku, podnošljivost i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija može se naći u formularu poznatom svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije uključuju, na primer, praškove, paste, masti, žele, voskove, ulja, lipide, lipide (katjonske ili anjonske) koje sadrže vezikule (kao što je LIPOFECTIN<TM>, Life Technologies, Carlsbad, CA), konjugate sa DNK, paste za bezvodnu apsorpciju, emulzije ulje vodi i voda u ulju, emulzije carbowax-a (polietilen glikoli različite molekulske težine), polučvrste gelove i polučvrste smeše koje sadrže carbowax. Videti takođe Povell et al. " Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
4
[0190] Doza molekula za vezivanje antigena koja se daje pacijentu može da se razlikuje u zavisnosti od starosti i veličine pacijenta, ciljne bolesti, stanja, načina primene i slično. Poželjna doza se obično izračunava prema telesnoj težini ili površini tela. Kada se bispecifični molekul koji vezuje antigen koristi u terapeutske svrhe kod odraslog pacijenta, može biti korisno da se intravenozno primeni bispecifični molekul koji vezuje antigen normalno u jednoj dozi od oko 0.01 do oko 20 mg/kg telesne težine, poželjnije oko 0.02 do oko 7, oko 0.03 do oko 5, ili oko 0.05 do oko 3 mg/kg telesne težine. U zavisnosti od težine stanja, učestalost i trajanje lečenja mogu se podesiti. Efikasne doze i rasporedi za davanje bispecifičnog molekula koji vezuje antigen mogu se odrediti empirijski; na primer, napredak pacijenta se može pratiti periodičnom procenom, a doza se prilagođava u skladu sa tim. Osim toga, skaliranje doza između vrsta može se izvršiti korišćenjem dobro poznatih postupaka iz oblasti tehnike u struci (npr. Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res.8:1351).
[0191] Poznati su različiti sistemi isporuke i mogu se koristiti za davanje farmaceutske kompozicije, npr., inkapsulacija u lipozome, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne da eksprimiraju mutantne viruse, endocitoza posredovana receptorima (videti, npr., Wu et al., J, 1987 Biol. Chem. 262:4429-4432). Postupci uvođenja uključuju, ali nisu ograničeni na, intradermalni, intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, subkutani, intranazalni, epiduralni i oralni putevi. Kompozicija se može primeniti bilo kojim pogodnim putem, na primer infuzijom ili bolusnom injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili mukokutane ovojnice (npr. oralnu sluzokožu, rektalne i crevne sluzokože, itd.) i može se primeniti zajedno sa drugim biološki aktivnim sredstvima. Primena može biti sistemska ili lokalna.
[0192] Farmaceutska kompozicija se može isporučiti subkutanozno ili intravenozno sa standardnom iglom i špricem. Pored toga, u pogledu subkutanozne isporuke, uređaj za isporuku olovke lako ima primenu u isporuci farmaceutske kompozicije. Takav uređaj za isporuku olovke može biti za višekratnu ili jednokratnu upotrebu. Uređaj za isporuku olovke za višekratnu upotrebu generalno koristi zamenljivi kertridž koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Kada se cela farmaceutska kompozicija unutar kertridža primeni i kertridž je prazan, prazan kertridž se može lako odbaciti i zameniti novim kertridžom koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Uređaj za isporuku olovke se tada može ponovo koristiti. U uređaju za isporuku olovke za jednokratnu upotrebu ne postoji zamenljivi kertridž. Umesto toga, uređaj za isporuku olovke za jednokratnu upotrebu dolazi prethodno napunjen farmaceutskom kompozicijom koja se nalazi u rezervoaru unutar uređaja. Kada se rezervoar isprazni od farmaceutskog sastava, ceo uređaj se odbacuje.
[0193] Brojni uređaji olovke i autoinjektora za isporuku za višekratnu upotrebu imaju primenu u subkutanoj isporuci farmaceutske kompozicije. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na AUTOPENTM (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC<TM>olovka (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25<TM>olovka, HUMA-LOG<TM>olovka, HUMALIN 70/30<TM>olovka (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN<TM>I, II i III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR<TM>(Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD<TM>olovka (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPENTM , OPTIPEN PROTM , OPTIPEN STARLETTM , i OPTICLIK<TM>(sanofi-aventis, Frankfurt, Germany), da navedemo samo neke. Primeri uređaja za isporuku olovke za jednokratnu upotrebu koji imaju TM
primenu u subkutanoj isporuci farmaceutske kompozicije uključuju, ali nisu ograničeni na SOLOSTAR pen (sanofi-aventis), FLEXPEN<TM>(Novo Nordisk), i KWIKPEN<TM>(Eli Lilly), SURECLICK<TM>Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET<TM>(Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), i HUMIRA<TM>Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL), da navedemo samo neke.
[0194] U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija se može isporučiti u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem. Na primer, može se koristiti pumpa (videti Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:201). U drugom slučaju, mogu se koristiti polimerni materijali; videti,
4
Medical Applications of Controlled Release, Langer and Vise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. U još jednom slučaju, sistem sa kontrolisanim otpuštanjem može se postaviti u blizinu cilja kompozicije, što zahteva samo deo sistemske doze (videti, na primer, Goodson, 1984, u Medical Applications of Controlled Release, supra, tom 2, str. 115-138). Drugi sistemi kontrolisanog oslobađanja se razmatraju u pregledu Langer, 1990, Science 249:1527-1533.
[0195] Preparati za injekcije mogu uključivati dozne oblike za intravenske, subkutanozne, intrakutane i intramuskularne injekcije, infuzije ukapavanjem, itd. Ovi preparati za injekcije mogu biti pripremljeni postupcima koji su javno dostupni. Na primer, preparati za injekcije mogu se pripremiti, npr., rastvaranjem, suspendovanjem ili emulgovanjem antitela ili njegove soli opisane gore u sterilnom vodenom medijumu ili uljanom medijumu koji se uobičajeno koristi za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije, postoje, na primer, fiziološki rastvor, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i druge pomoćna sredstva, itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim sredstvom za rastvaranje kao što je alkohol (npr. etanol), polialkohol (npr. propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr. polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljani medijum koriste se npr., susamovo ulje, sojino ulje, itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa sredstvom za rastvaranje kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Tako pripremljena injekcija se poželjno puni u odgovarajuću ampulu.
[0196] Prednost, je da se gore opisane farmaceutske kompozicije za oralnu ili parenteralnu upotrebu pripremaju u doznim oblicima u jediničnoj dozi koja odgovara dozi aktivnih sastojaka. Takvi dozni oblici u jediničnoj dozi obuhvataju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd. Količina prethodno pomenutog antitela sadržana je generalno oko 5 do oko 500 mg po doznom obliku u jedinici doze; posebno u obliku injekcije, poželjno je da se prethodno pomenuto antitelo sadrži u oko 5 do oko 100 mg i u oko 10 do oko 250 mg za druge dozne oblike.
Terapeutske upotrebe antigen vezujućih molekula
[0197] Predmetno izlaganje obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno terapeutske kompozicije koja sadrži anti-MUC16 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, ili bispecifični molekul koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3 i MUC16. Terapeutska kompozicija može da sadrži bilo koje od antitela ili bispecifičnih molekula koji vezuju antigen kako je ovde otkriveno i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. Kako se ovde koristi, izraz "subjekat kome je to potrebno" označava čoveka ili životinju koja nije ljudska bića koja pokazuje jedan ili više simptoma ili indicija kancera (npr. subjekt koji ima tumor ili pati od bilo kog od kancera pomenutih u nastavku), ili koji bi inače imali koristi od inhibicije ili smanjenja aktivnosti MUC16 ili smanjenja broja MUC16+ ćelija (npr. ćelije kancera jajnika). Međutim, postupci terapeutskog lečenja nisu deo zahtevanog postupka.
[0198] Antitela i bispecifični molekuli koji vezuju antigen (i terapeutske kompozicije koje ih sadrže) su korisni, između ostalog, za lečenje bilo koje bolesti ili poremećaja kod kojih bi stimulacija, aktivacija i/ili ciljanje imunog odgovora bilo od koristi. Određenije, anti-MUC16 antitela ili anti-CD3/anti-MUC16 bispecifični molekuli koji vezuju antigen mogu se koristiti za lečenje, prevenciju i/ili poboljšanje bilo koje bolesti ili poremećaja koji su povezani ili posredovani ekspresijom ili aktivnošću MUC16 ili proliferacija MUC16+ ćelija. Mehanizam delovanja kojim se postižu terapijske metode uključuje ubijanje ćelija koje eksprimiraju MUC16 u prisustvu efektorskih ćelija, na primer, CDC, apoptozom, ADCC, fagocitozom, ili kombinacijom dva ili više navedenih mehanizama. Ćelije koje eksprimiraju MUC16 koje se mogu inhibirati ili ubiti upotrebom bispecifičnih molekula koji vezuju antigen uključuju, na primer, ćelije kancera jajnika.
[0199] Molekuli koji se vezuju za antigen mogu se koristiti za lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa ekspresijom MUC16 uključujući, na primer, kancer uključujući kancer jajnika, kancer dojke, kancer
4
pankreasa, karcinom nemalih ćelija pluća, intrahepatični holangiokarcinom - tip koji formira masu, adenokarcinom grlića materice i adenokarcinom želudačnog trakta. Prema određenim slučajevima, anti-MUC16 antitela ili anti-MUC16/anti-CD3 bispecifična antitela su korisna za lečenje pacijenata obolelih od kancera jajnika. Prema drugim srodnim slučajevima, opisani su postupci koji obuhvataju davanje anti-MUC16 antitela ili anti-CD3/anti-MUC16 bispecifičnog molekula koji vezuje antigen, kao što je ovde otkriveno, pacijentu koji boluje od kancera jajnika. Analitičke/dijagnostičke metode poznate u tehnici, kao što je skeniranje tumora, itd., mogu se koristiti da bi se utvrdilo da li pacijent ima tumor jajnika.
[0200] Predmetno izlaganje takođe uključuje postupke za lečenje rezidualnog kancera kod subjekta. Kao što je ovde korišćen, termin "rezidualni kancer" označava postojanje ili istrajnost jedne ili više ćelije kancera kod subjekta nakon tretmana sa terapijom protiv kancera.
[0201] Prema određenim aspektima, predmetno izlaganje obezbeđuje postupke za lečenje bolesti ili poremećaja povezanog sa ekspresijom MUC16 (npr., kancer jajnika) koji obuhvata davanje jednog ili više anti-MUC16 ili bispecifičnih antigen-vezujućih molekule koji su ovde opisani na drugom mestu subjektu nakon što je utvrđeno da subjekt ima kancer prostate. Na primer, predmetno izlaganje uključuje postupke za lečenje kancera jajnika koji obuhvataju davanje anti-MUC16 antitela ili anti-CD3/anti-MUC16 bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula pacijentu 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 1 nedelju, 2 nedelje, 3 nedelje ili 4 nedelje, 2 meseca, 4 meseca, 6 meseci, 8 meseci, 1 godinu, ili više nakon što je subjekt primio hormonsku terapiju (npr., anti-androgenu terapiju).
Kombinovane terapije i formulacije
[0202] Predmetno izlaganje obezbeđuje postupke koji obuhvataju davanje farmaceutske kompozicije koja sadrži bilo koje od primera antitela i ovde opisanih bispecifičnih antigen-vezujućih molekula u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa. Primeri dodatnih terapeutskih agenasa koji se mogu kombinovati sa ili davati u kombinaciji sa antigen-vezujućim molekulom obuhvataju, npr., antagonist EGFR (npr., anti-EGFR antitelo [npr., cetuksimab ili panitumumab] ili mali molekul inhibitor EGFR [npr., gefitinib ili erlotinib]), antagonist drugog člana familije EGFR kao što je Her2/ErbB2, ErbB3 ili ErbB4 (npe., anti-ErbB2, anti-ErbB3 ili anti-ErbB4 antitelo ili mali molekul inhibitor aktivnosti ErbB2, ErbB3 ili ErbB4), antagonist EGFRvIII (npr., antitelo koje specifično veže EGFRvlll), antagonist cMET (npr., anti-cMET antitelo), antagonist IGF1R (npr., anti-IGF1R antitelo), inhibitor B-raf (npr., vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), inhibitor PDGFR-α (npr., anti-PDGFR-α antitelo), PDGFR-β inhibitor (npr., anti-PDGFR-β antitelo), VEGF antagonist (npr., VEGF-Trap, videti, npr., US 7,087,411 (takođe ovde naznačen sa "VEGF-inhibitorni fuzioni protein"), anti-VEGF antitelo (npr., bevacizumab), mali molekul kinazni inhibitor VEGF receptora (npr., sunitinib, sorafenib ili pazopanib)), DLL4 antagonist (npr., anti-DLL4 antitelo prikazano u US 2009/0142354 kao što je REGN421), Ang2 antagonist (npr., anti-Ang2 antitelo prikazano u US 2011/0027286 kao što je H1H685P), FOLH1 (PSMA) antagonist, PRLR antagonist (npr., anti-PRLR antitelo), STEAP1 ili STEAP2 antagonist (npr., anti-STEAP1 antitelo ili anti-STEAP2 antitelo), TMPRSS2 antagonist (npr., anti-TMPRSS2 antitelo), MSLN antagonist (npr., anti-MSLN antitelo), CA9 antagonist (npr., anti-CA9 antitelo), antagonist uroplakina (npr., antiuroplakin antitelo), itd. Drugi agensi koji se pogodno mogu primenjivati u kombinaciji sa antigenvezujućim molekulima uključuju inhibitore citokina, uključujući male molekule inhibitore citokina i antitela koja se vezuju za citokine kao što su IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, ili za njihove odgovarajuće receptore. Farmaceutske kompozicije (npr., farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-CD3/anti-MUC16 bispecifični antigen-vezujući molekul kao što je ovde prikazan) mogu se takođe davati kao deo terapeutskog režima koji sadrži jednu ili više terapeutskih kombinacija odabranih od "ICE": ifosfamid (npr., Ifex<®>), karboplatin (npr., Paraplatin<®>), etopozid (npr., Etopophos<®>, Toposar<®>, VePesid<®>, VP-16); "DHAP": deksametazon (npr., Decadron<®>), citarabin (npr., Cytosar-U<®>, citozin arabinozid, ara-C), cisplatin (npr., Platinol<®>-AQ); i "ESHAP": etopozid (npr., Etopophos<®>, Toposar<®>, VePesid<®>, VP-16), metilprednizolon (npr., Medrol<®>), visoka doza citarabina, cisplatin (npr., Platinol<®>-AQ).
[0203] Predmetni prikaz takođe obuhvata terapeutske kombinacije koji sadrže bilo koje od ovde pomenutih antigen-vezujućih molekula i inhibiro jednog ili više od VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvlll, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-α, PDGFR-β, FOLH1 (PSMA), PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, uroplakin, ili bilo kojeg od prethodno pomenutih citokna, gde je inhibitor aptamer, antisense molekul, ribozim, siRNK (male interferirajuće RNK), peptitelo, nanotelo ili fragment antitela (npr., Fab fragment; F(ab’)2fragment; Fd fragment; Fv fragment; scFv; dAt fragment; ili drugi modifikovani molekuli, kao što su diatela, triatela, tetratela, minitela i minimalne jedinice za prepoznavanje). Antigen-vezujući molekuli mogu se takođe davati i/ili ko-formulisati u kombinaciji sa antivireticima, antibioticima, analgeticima, kortikosteroidima i/ili NSAIDs. Antigen-vezujući molekuli mogu se takođe davati kao deo režima tretmana koji takođe uključuje terapiju zračenjem i/ili konvencionalnom hemioterapijom.
[0204] Dodatne terapeutski aktivne komponent(e) mogu se davati neposredno pre, istovremeno sa, ili ubrzo nakon davanja antigen-vezujućeg molekula; (za svrhe predmetnog izlaganja, takvi režimi davanja su smatrani davanjem antigen-vezujućeg molekula "u kombinaciji sa" dodatnom terapeutsko aktivnom komponentom).
[0205] Predmetno izlaganje obuhvata farmaceutske kompozicije u kojima je antigen-vezujući molekul ko-formulisan sa jednim ili više dodatnim terapeutskim aktivnim komponent(ama) kao što se ovde opisuju na drugom mestu.
Režimi davanja
[0206] Prema određenim slučajima, višestruke doze antigen-vezujućeg molekula (npr., anti-MUC16 antitelo ili bispecifičnog antigen-vezujućeg molekula koji specifično vežu MUC16 i CD3) mogu se davati subjektu tokom određenog vremenskog toka. Postupci obuhvataju sekvencijalno davanje subjektu višestrukih doza antigen-vezujućeg molekula. Kao što se ovde koristi, "sekvencijalno davanje" označava da svaka doza antigen-vezujućeg molekula je davana subjektu u drugom trenutku u vremenu, npr., u različitim danima razdvojenih unapred određenim intervalom (npr., satima, danima, nedeljama ili mesecima). Predmetno izlaganje uključuje postupke koji sadrže sekvencijalno davanje pacijentu jedne pojedinačne doze antigen-vezujućeg molekula, koju prati jedna ili više sekundarnih doza antigen-vezujućeg molekula, i opciono koju prati jedna ili više tercijernih doza antigen-vezujućeg molekula.
[0207] Termini "početna doza," "sekundarne doze," i "tercijerne doze," se odnose na vremensku sekvencu davanja antigen-vezujućeg molekula. Stoga, "početna doza" je doza koja se daje na početku režima tretmana (takođe naznačena kao "osnovna doza"); "sekundarne doze" su doze koje su davane nakon početne doze; i "tercijerne doze" su doze koje su davane posle sekundarnih doza. Početna, sekundarna, i tercijerne doze mogu svaka da sadrže istu količinu antigen-vezujućeg molekula, ali generalno mogu se razlikovati jedan od drugog u terminima učestalosti davanja. U određenim slučajima, međutim, količina antigen-vezujućeg molekula koja se na nalazi u početnim, sekundarnim i/ili tercijernim dozama se razlikuje jedna od druge (npr., podešava se gore ili dole prema potrebi) tokom trajanja tretmana. U određenim slučajevima, dva ili više (npr., 2, 3, 4, ili 5) doza su davane na početku režima tretmana kao "doze opterećenja" praćene narednim dozama koje su davane na manje učestaloj osnovi (npr., "doze održavanja").
[0208] U jednom primeru slučaja, svaka sekundarna i/ili tercijerna doza je davana 1 do 26 (npr., 1, 1<1>/2, 2, 2<1>/2, 3, 3<1>/2, 4, 4<1>/2, 5, 5<1>/2, 6, 6<1>/2, 7, 7<1>/2, 8, 8<1>/2, 9, 9<1>/2, 10, 10<1>/2, 11, 11<1>/2, 12, 12<1>/2, 13, 13<1>/2, 14,
1
14<1>/2, 15, 15<1>/2, 16, 16<1>/2, 17, 17<1>/2, 18, 18<1>/2, 19, 19<1>/2, 20, 20<1>/2, 21, 21<1>/2, 22, 22<1>/2, 23, 23<1>/2, 24, 24<1>/2, 25, 25<1>/2, 26, 26<1>/2, ili više) nedelja neposredno nakon prethodne doze. Fraza "neposredno nakon prethodne doze," kao što se ovde koristi, označava, u sekvenci višestrukih davanja, dozu antigen-vezujućeg molekula koja je davana pacijentu pre primene sledeće doze u seriji bez intervencionih doza.
[0209] Postupci prema ovom aspektu mogu da obuhvate davanje pacijentu bilo kojeg broja sekundarnih i/ili tercijernih doza antigen-vezujućeg molekula (npr., anti-MUC16 antitelo ili bispecifični antigen-vezujući molekul koji specifično veže MUC16 i CD3). Na primer, u određenim slučajima, samo jedna sekundarna doza je davana pacijentu. U određenim slučajima, dve ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) sekundarnih doza su davane pacijentu. Slično tome, u određenim slučajima, samo jedna tercijerna doza je davana pacijentu. U drugim slučajima, dva ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) tercijernih doza su davane pacijentu.
[0210] U slučajevima koji uključuju višestruke sekundarne doze, svaka sekundarna doza može se davati u istoj učestalosti kao druge sekundarne doze. Na primer, svaka sekundarna doza može se davati pacijentu 1 do 2 nedelje odmah neposredno nakon prethodne doze. Slično tome, u slučajevima koji uključuju višestruke tercijerne doze, svaka tercijerna doza može se davati u istoj učestalosti kao druge tercijerne doze. Na primer, svaka tercijerna doza se može davati pacijentu 2 do 4 nedelja neposredno nakon prethodne doze. Alternativno, učestalost na kojoj su pacijentu davane sekundarne i/ili tercijerne doze mogu se razlikovati tokom trajanja režima tretmana. Učestalost davanja može se takođe podesiti tokom trajanja tretmana od strane lekara u zavisnosti od potreba pojedinačnog pacijenta nakon kliničkog ispitivanja.
Dijagnostičke upotrebe antitela
[0211] Anti-MUC16 antitela mogu se takođe koristiti za detekciju i/ili merenje MUC16, ili ćelija koje eksprimiraju MUC16 u uzorku, npr., biološkom uzorku za dijagnostičke svrhe. Na primer, anti-MUC16 antitelo, ili njegov fragment, može se koristiti za dijagnostikovanje stanja ili bolesti koju karakeriše aberantna ekspresija (npr., prekomerna ekspresija, smanjena ekspresija, nedostatak ekspresije, itd.) MUC16. Primeri dijagnostičkih testova za MUC16 mogu sadržati, npr., dovođenja u kontakt uzorka, dobijenog iz pacijenta, sa anti-MUC16 antitelom, pri čemu je anti-MUC16 antitelo obeleženo sa detektabilnim obeleživačem ili reporterskim molekulom. Alternativno, neobeleženo anti-MUC16 antitelo može se koristiti u dijagnostičkim primenama u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje je samo detektabilno obeležno. Detektabilni obeleživač ili reporterski molekul može biti radioizotop, kao što je 3H, 14C, 32P, 35S, ili 125J; fluorescentna ili hemiluminiscentna grupa kao što je fluorescein izotiocijanat, ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza, beta-galaktozidaz, peroksidaza rena, ili luciferaza. Drugi primer dijagnostičke upotrebe anti-MUC16 antitela obuhvata 89Zr-obeležena, kao što 89
su Zr-desferoksamin-obeležena, antitelo za svrhu neinvazivne identifikacije i praćena tumorskih ćelija kod subjekta (npr. snimanje pozitronskom emisionom tomografijom (PET)). (Videti, npr., Tavare, R. et al. Cancer Res.2016 Jan 1;76(1):73-82; i Azad, BB. et al. Oncotarget.2016 Mar 15;7(11): 12344-58.) Specifični primeri testova koji se mogu koristiti za detekciju ili merenje MUC16 u uzorku uključuje enzimski imunosorbentni test (ELISA), radioimunotest (RIA), i sortiranje fluorescentno-aktiviranih ćelija (FACS).
[0212] Uzorci koji se mogu koristiti u dijagnostičkim testovima MUC16 obuhvataju bilo koji uzorak tkiva ili tečnosti koji se može dobiti od pacijenta i koji sadrži detektabilne količine proteina MUC16, ili njegove fragmente, u normalnim ili patološkim uslovima. Generalno, nivoi MUC16 u određenom uzorku dobijenom od zdravog pacijenta (npr. pacijent koji nije oboleo od bolesti ili stanja povezanih sa abnormalnim nivoima ili aktivnošću MUC16) će se meriti da bi se inicijalno utvrdio osnovni ili standardni nivo MUC16. Ovaj osnovni nivo MUC16 se zatim može uporediti sa nivoima MUC16
2
izmerenim u uzorcima dobijenim od pojedinaca za koje se sumnja da imaju bolest povezanu sa MUC16 (npr. tumor koji sadrži ćelije koje eksprimiraju MUC16) ili stanje.
Primeri uzoraka tkiva ili tečnosti uključuju, ali nisu ograničeni na plazmu, serum, ascites, jajnike, matericu, grlić materice, jetru, bešiku, pankreas, želudac, tanko ili debelo crevo, žučnu kesu, dojke, pluća, bubrege, pljuvačku i suzne žlezde ili bilo koji njihov epiteloidni malignitet. Dodatni primeri uzoraka tkiva ili tečnosti uključuju, ali nisu ograničeni na, papilarni serozni karcinom grlića materice, adenokarcinom endometrijuma, adenokarcinom mokraćne bešike, karcinom semenskih vezikula, karcinom želuca, kolorektalni adenokarcinom i epitelioidni epitel. Predviđeno je da svaki uzorak tečnosti ili tkiva koji sadrži detektabilne količine proteina MUC16, ili njegovih fragmenata, može biti podvrgnut metodama detekcije koje su ovde opisane. Opisani metodi se mogu koristiti za praćenje razvoja i progresije malignih bolesti ili za razlikovanje normalnih i bolesnih stanja. Kao takve, opisane metode se mogu koristiti za otkrivanje ili praćenje karcinoma, kao što su rak jajnika, kancer mokraćne bešike, rak dojke, kancer pankreasa, karcinom ne-malih ćelija pluća, intrahepatični holangiokarcinom – tip koji formira masu, adenokarcinom grlića materice, i adenokarcinom želudačnog trakta.
PRIMERI
[0213] Sledeći primeri su predstavljeni tako da onima koji su uobičajeno kvalifikovani u ovoj oblasti pruže potpuno otkrivanje i opis kako da naprave i koriste kompozicije pronalaska, i nemaju za cilj da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Uloženi su napori da bi se osigurala preciznost u odnosu na korišćene brojeve (npr. količine, temperatura, itd.), ali neke eksperimentalne greške i odstupanja treba uzeti u obzir. Osim ako nije drugačije naznačeno, delovi su delovi po težini, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je na ili blizu atmosferskog.
Primer 1: Dobijanje anti-MUC16 antitela
[0214] Anti-MUC16 antitela su dobijena imunizovanjem genetički modifikovanog miša sa humanim MUC16 antigenom ili imunizovanjem modifikovanog miša koji sadrži DNK koja kodira varijabilne regione teškog i kapa lakog lanca humanog imunoglobulina sa humanim MUC16 antigenom.
[0215] Genski modifikovani miševi su imunizovani sa hMUC16.nub (skraćeni format koji obuhvata poslednjih pet SEA domena Mucina-16 (SEQ ID: 1902)), ili imunizovani sa ćelijskom linijom koja eksprimira hMUC16, kao što su OVCAR-3 ćelije. SEQ ID NO: 1902 sadrži ostatke 13810-14451 SEQ ID NO: 1899, kao i C-terminalne tagove. Nakon imunizacije, splenociti su sakupljeni iz svakog miša i ili (1) spojeni sa ćelijama mišjeg mijeloma da se sačuva njihovo preživljavanje i obrazuju ćelije hibridoma i izvrši skrining specifičnosti za MUC16, ili (2) B-ćelije sortirane (kao što je opisano u US 2007/0280945A1) korišćenjem humanog MUC16 fragmenta kao reagensa sortiranja koji vezuje i identifikuje reaktivna antitela (antigen-pozitivne B ćelije).
[0216] Himerna antitela na MUC16 su početno izolovana da imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Antitela su karakterisana i odabrana za željene karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, itd. Ukoliko je potrebno, mišji konstantni regioni su zamenjeni sa željenim humanim konstantnim regionom, na primer divljim tipom ili modifikovanim konstantnim regionom IgG1 ili IgG4, da se dobije potpuno humano anti-MUC16 antitelo. Dok se odabrani konstantni region može razlikovati prema određenoj upotrebi, visok afinitet vezivanja antigena i karakteristike ciljne specifičnosti nalaze se u varijabilnom regionu. Oznake naziva antitela kao što su H1H8755P i H1M7129N označavaju potpuno humana antitela "H1H" ili himerni humani varijabilni/mišji konstantan region antitela "H1M". Antitela identifikovana postupkom hibridoma su označeni ID brojevima antitela koji se završavaju sa "N" ili "N2." Antitela koja su identifikovana postupkom sortiranja B-ćelija su označeni ID brojevima antitela koja se završavaju sa "P" ili "P2".
[0217] Određene biološke osobine primera anti-MUC16 antitela generisanih u skladu sa postupcima iz ovog primera su detaljno opisani u primerima koji se ovde opisuju u nastavku.
Sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina varijabilnog regiona teškog i lakog lanca anti-MUC16 antitela
[0218] Tabela 1 prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona teškog i lakog lanca i CDR-ova odabranog anti-MUC16 antitela. Odgovarajući identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina su prikazani u Tabeli 2.
Tabela 1: Identifikatori sekvenci aminokiselina
(nastavak)
4
Tabela 2: Identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina
(nastavak)
Primer 2: Anti-MUC16 Antitela se specifično vezuju za endogeno eksprimirani hMUC16 na OVCAR-3 ćelijskoj liniji
[0219] Sposobnost anti-MUC16 antitela da se specifično vezuju za endogeno eksprimirani MUC16 na ćelijska linija humanog karcinoma jajnika (OVCAR-3) je procenjena putem testa detekcije zasnovanog na elektrohemiluminiscenciji (Meso Scale Discovery (MSD), Rockville, MD). Ukratko, OVCAR-3 i kontrolna ćelijska linija adenokarcinoma jajnika, SK-OV-3, koja nema detektabilnu ekspresiju hMUC16, su isprane u 1xPBS dopunjenim sa Ca<2+/>Mg2+(Irvine Scientific, Santa Ana, CA) zatim sledi inkubacija u pufera za disocijaciju ćelija bez enzima (Millipore, Billerica, MA) tokom 10 min na 37°C. Odlepljene 2+
ćelije će nakon toga biti isprane jednom u 1xPBS dopunjenom sa Ca /Mg<2+>i izbrojane (Cellometer
Auto T4 brojač ćelija, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). Približno 1.0x10<4>ćelija je zasejano na MULTI-ARRAY pločama sa ugljeničnim elektrodama sa 96-bunarčića (MSD) i inkubirano 1 h na 37°C. Nespecifična mesta vezivanja su zatim blokirana sa 2% BSA (mas/v) u PBS tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Sledeće, serijska razblaženja anti-MUC16 ili kontrolnih antitela (0.85pM-50nM) i puferske kontrole bez antitela su dodate na ćelije koje su vezane za ploču i inkubirane tokom 1 h na sobnoj temperaturi (RT). Ploče su nakon toga isprane da se uklone nevezana antitela korišćenjem AquaMax2000 perača ploča (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA). Antitela vezana za ploču TM
su detektovana sa SULFO-TAG -konjugovanim anti-humanim kapa lakog lanca antitelom (Regeneron)
TM
ili SULFO-TAG -kojugovanim anti-mišjim IgG antitelom (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) za 1h na RT. Nakon ispiranja, ploče su razvijene sa puferom za očitavanje (MSD) u skladu sa protokolom proizvođača i luminiscentni signali su zabeleženi sa SECTOR Imager 6000 (MSD) instrumentom.
[0220] Intenzitet luminescencije, meren u relativnim svetlosnim jedinicama (RLU), za dve ćelijske linije je zabeležen da bi se ukazao na intenzitet vezivanja svakog antitela. Odnos signala detektovan sa 1.9 nM ili 16.7 nM anti-MUC16 antitela vezivanja za OVCAR-3 naspram SK-OV-3 je prijavljen kao indikacija specifičnosti i jačine vezivanja (Tabela 3).
Tabela 3: Odnosi vezivanja za ćelije anti-Muc16 antitela za endogeno eksprimirane hMUC16 OVCAR-3 naspram hMUC16-negativnih SK-OV-3 ćelijskih linija
nastavak
[0221] Kao što pokazuju rezultati u tabeli 3, većina anti-MUC16 antitela iz ovog izlaganja veže se specifično za OVCAR-3 i na visokim (16.7 nM) i niskim (1.9 nM) koncentracijama antitela. mlgG1, mlgG2a i hlgG1 izotop kontrole antitela nisu pokazale specifično vezivanje za ili OVCAR-3 ili SK-OV-3 liniju ćelija. Dodatno, postoji dokaz da je postupak osetljiv obzirom na to da nekoliko antitela nije ispoljilo vezivanje za rastvorljivi monomer humanog MUC16 proteina u testu vezivanja površinske plazmonske rezonance (videti ovde ispod primer 4) koji prikazuje specifično vezivanje za endogeni humani MUC16 koji je eksprimiran na ćelijama OVCAR-3 u ovom testu vezivanja zasnovanom na ćelijama.
Primer 3: Dobijanje Bispecifičnih Antitela koja vezuju (MUC16) specifičan za ćelije jajnika i CD3 [0222] Predmetno izlaganje obezbeđuje bispecifične antigen vezujuće molekule koji vezuju CD3 i MUC16; takvi bispecifični molekuli koji vezuju antigen se ovde takođe pominju kao "anti-MUC16/anti-CD3 ili anti-MUC16xCD3 bispecifični molekuli." Anti-MUC16 deo bispecifičnog molekula anti-MUC16/anti-CD3 je koristan za ciljanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju MUC16 (takođe poznat kao CA-125), a anti-CD3 deo bispecifičnog molekula je koristan za aktiviranje T- ćelije. Istovremeno vezivanje MUC16 na tumorskoj ćeliji i CD3 na T-ćeliji olakšava usmereno ubijanje (lizu ćelije) ciljane tumorske ćelije od strane aktivirane T-ćelije.
[0223] Bispecifična antitela koja sadrže anti-MUC16-specifični vezujući domen i anti-CD3-specifični vezujući domen su konstruisani korišćenjem standardnih metodologija, pri čemu anti-MUC16 antigen vezujući domen i anti-CD3 antigen vezujući domen svaki sadrži drugačije, različite HCVRs uparene sa zajedničkim LCVR. U primerima bispecifičnih antitela, molekuli su konstruisani korišćenjem teškog lanca iz anti-CD3 antitela, teškog lanca iz anti-MUC16 antitela i zajedničkog lakog lanca iz anti-MUC16 antitela. U drugim slučajevima, bispecifična antitela mogu se konstruisati korišćenjem teškog lanca iz anti-CD3 antitela, teškog lanca iz anti-MUC16 antitela i lakog lanca iz anti-CD3 antitela ili lakog lanca antitela poznato da su promiskuitetni ili se uparuju efikasno sa različitim kracima teškog lanca. Bispecifična antitela koja se opisuju u sledećim primerima sastoje se iz anti-CD3 vezujućeg kraka koji ima različite afinitete vezivanja za humani rastvorljivi heterodimerni hCD3ε/δ protein (kao što je ovde opisano u Primeru 13); i humani MUC16 (videti Primere 1-2 gore). Dobiveni su primeri bispecifičnih sa Fc domenom IgG1 Fc (BSMUC16/CD3-001, -002, -003, i - 004) ili modifikovanim (himernim) IgG4 Fc domenom (BSMUC16/CD3-005) kao što je prikazano u objavi US patentne prijave br. US20140243504A1, objavljenoj 28 avgusta, 2014.
[0224] Sažetak sastavnih delova domena za vezivanje antigena različitih konstruisanih anti-MUC16xCD3 bispecifičnih antitela dat je u Tabeli 4.
Tabela 4: Sažetak komponentnih delova odabranih anti-MUC16xCD3 bispecifičnih antitela
[0225] Laki lanci navedeni u Tabeli 4 bili su zajednički i za CD3 i za MUC16 ciljane krakove bispecifičnih antitela. Tabele 1 i 2 daju identifikatore sekvenci aminokiselina i nukleinskih kiselina, redom, za različite varijabilne regione teškog lanca i njihove odgovarajuće CDR-ove anti-MUC16 krakova bispecifičnih antitela iz ovog Primera. Tabela 22 i 23 daje identifikatore sekvenci aminokiselina i nukleinskih kiselina, redom, za različite varijabilne regione teškog lanca i njihove odgovarajuće CDR-ove anti-CD3 krakova bispecifičnih antitela iz ovog Primera.
Primer 4: Afiniteti vezivanja izvedeni iz površinske plazmonske rezonance i kinetičke konstante humanih monoklonskih anti-MUC16 monospecifičnih i anti-MUC16xCD3 bispecifičnih antitela
[0226] Afiniteti vezivanja i kinetičke konstante humanih anti-MUC16 antitela su određene preko površinske plazmonske rezonance u realnom vremenu (SPR; Biacore 4000 ili Biacore T-200, GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) na 25°C. Anti-MUC16 antitela testirana u ovom primeru bila su bivalentna monospecifična vezivanja za MUC16 (izražena sa hlgG1 (H1H), mlgG1 (H1M), mlgG2 (H2M) ili mlgG3 (H3M) konstantnim regionom) ili bispecifična antitela koja se sastoje od anti-MUC16 vezujućeg domena i anti-CD3 vezujućeg domena. Antitela su uhvaćena na CM4 ili CM5 Biacore senzorskoj površini (GE Healthcare Life Sciences) derivatizovana kuplovanjem amina sa monoklonalnim anti-humanim Fc antitelom (GE, # BR-1008-39) ili monoklonskim kozjim anti-mišjim Fc antitelom (GE , # BR-1008-38). Različite koncentracije rastvorljivog monomernog humanog MUC16, u skraćenom formatu koji obuhvata poslednjih pet SEA domena Mucina-16 (hMUC16.mmh, ili MUC16 "nub", SEQ ID: 1902) ubrizgane su preko površine uhvaćene anti-MUC16-antitelom na protok od 50 uL/min (Biacore T-200) ili 30 uL/min (Biacore 4000). Povezivanje antitelo-reagens je praćeno 4 min, a disocijacija je praćena 6-10 min. Sve studije vezivanja su izvedene u HBS-ET puferu (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% v/v Surfaktant P20).
[0227] Konstante brzine kinetičke asocijacije (ka) i disocijacije (kd) određene su uklapanjem senzorgrama u realnom vremenu na model vezivanja 1:1 korišćenjem softvera za podešavanje krive Scrubber 2.0c. Konstante ravnoteže disocijacije vezivanja (KD) i disocijativni poluživoti (t<1>/2) su izračunati iz konstanti kinetičke brzine kao:
[0228] Kinetički parametri vezivanja za monospecifična anti-MUC16 antitela na proteinski fragment monomernog humanog MUC16 su prikazani ispod u Tabelama 5A i 5B. Kinetički parametri vezivanja za anti-MUC16/anti-CD3 bispecifična antitela na monomerni humani MUC16 protein su prikazani ispod u Tabeli 6.
Tabela 5A: Biacore afiniteti vezivanja Anti-MUC16 antitela hibridoma (H1M, H2M i H3M) za hMUC16 fragment na 25 °C
Tabela 5B: Biacore afiniteti vezivanja humanih Fc anti-MUC16 antitela (H1H) za hMUC16 fragment na 25°C
Tabela 6: Biacore afiniteti vezivanja anti-MUC16/ anti-CD3 bispecifičnih antitela za hMUC16 fragment na 25° C
[0229] Kao što rezultati pokazuju, većina anti-MUC16 antitela iz ovog otkrića vezana je za rastvorljivi humani MUC16 protein, a neka pokazuju sub-nanomolarni afinitet. Nekoliko antitela (H1M9519N, H1M9521N, H3M9524N, H3M9525N, H1M9528N, H3M9529N) nije pokazalo vezivanje za skraćeni format koji obuhvata poslednjih pet SEA domena preko površinske plazmonske rezonancije, međutim, ispoljavaju specifično vezivanje za endogeni humani MUC16 eksprimiran na OVCAR-3 ćelijama u testu vezivanja zasnovanom na ćelijama. Anti-MUC16xCD3 bispecifična antitela ovog prikaza takođe su vezana za rastvorljivi skraćeni humani MUC16 protein koji pokazuje nanomolarni afinitet u ovom testu.
Primer 5: Dodatno vezivanje, aktivacija T-ćelija i osobine citotoksičnosti primera bispecifičnih antitela
[0230] U ovom primeru, određena je sposobnost MUC16xCD3 bispecifičnih antitela da se vežu za ćelijske linije koje eksprimiraju CD3 (humane T ćelije), u poređenju sa vezivanjem za ciljne ćelijske linije specifične (MUC16-specifične) putem FACS-a. Pored toga, sposobnost ovih bispecifičnih antitela da aktiviraju ciljno-specifične (MUC16-specifične) ćelijske linije je takođe upoređena u sličnom testu. Titracija vezivanja primera bispecifičnih antitela merena FACS analizom
[0231]
A. Ukratko, protočna citometrijska analiza (tj. fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija, ili FACS) je korišćena za određivanje vezivanja bispecifičnih antitela za Jurkat-ove ćelije ili ćelije koje eksprimiraju humani MUC16, nakon čega je usledila detekcija sa fikoeritrin (PE) obeleženim ili APC obeleženim anti-humanim IgG antitelom. Ukratko, 2x 10<5>ćelija/bunarčiću je inkubirano 30 minuta na 4°C sa serijskim razblaženjem u opsegu od 1.33E-07M do 8.03E-12M svakog ispitivanog antitela ili kontrole izotipa (antitelo istog izotipa koje vezuje drugačiji antigen bez unakrsne reaktivnosti na MUC16 ili CD3). Posle inkubacije, ćelije su isprane dva puta hladnim PBS-om koji sadrži 1% filtriranog FBS-a i PE-konjugovano ili APC-konjugovano anti-humano sekundarno antitelo je dodato ćelijama i inkubirano dodatnih 30 minuta. Bunarčići koji ne sadrže antitelo ili sadrže samo sekundarno su takođe korišćeni kao kontrole. Posle inkubacije, ćelije su isprane, ponovo suspendovane u 200 µL hladnog PBS-a koji sadrži 1% proceđenog FBS-a i analizirane protočnom citometrijom na BD FACS Canto II. Videti Tabelu 7A.
B. U odvojenim eksperimentima sa uslovima analognim onima koji su gore opisani, korišćena je protočna citometrijska analiza (ili FACS) za određivanje vezivanja odabranih bispecifičnih antitela za ćelije Jurkat, PEO-1, OVCAR3-Luc i cinomolgus T ćelije. Za analizu titracije, serijsko razblaživanje odabranih MUC16xCD3 bispecifičnih antitela, prvo kontrolno antitelo izotipa (humano himerno IgG4 antitelo koje vezuje irelevantan humani antigen bez unakrsne reaktivnosti na humani ili cinomolgus CD3) i drugo kontrolno antitelo izotipa (humano himerično IgG4 antitelo koje vezuje irelevantan humani antigen bez unakrsne reaktivnosti na humani MUC16), u rasponu od 66.6 nM do 0.001 nM. Videti Tabelu 7B i slike 11A-11C.
[0232] Za FACS analizu, ćelije su ograničene visinom rasejanja unapred u odnosu na površinu rasejanja unapred za izbor pojedinačnih događaja, nakon čega su usledila bočna i napredna rasejanja. EC50 za titraciju vezivanja ćelija je određen korišćenjem PRISM<TM>softvera (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Vrednosti su izračunate korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize. (Liu, J., et al.
2005, Biotechnol Letters 27:1821-1827). Vrednost EC50 predstavlja koncentraciju testiranog antitela gde je uočeno 50% njegovog maksimalnog vezivanja.
Tabela 7A: Vezivanje FACS-a na ćelijskim linijama specifičnim za CD3 i MUC16
1
Tabela 7B: Vezivanje FACS-a na ćelijskim linijama specifičnim za CD3 i MUC16
[0233] Kao što je prikazano u Tabelama 7A i 7B, CD3 vezujući kraci svakog od MUC16 bispecifičnog antitela ispoljili su opseg vezivanja ćelija za humane i majmunske T ćelije koje eksprimiraju CD3 (npr. od 3.2 nM EC50do veoma slabog vezivanja). BSMUC16/CD3-001 bispecifično antitelo pokazalo je visoke mere vezivanja za ćelije koje eksprimiraju CD3 (tj. <7nM) dok je BSMUC16/CD3-002 bispecifične antitelo pokazalo slabo do bez vezivanja za humane i majmunske ćelije koje eksprimiraju CD3. Vezivanje koje se ne može izmeriti, ili nemerljivo vezivanje, u FACS testu ili ekvivalentnom testu se odnosi na interakciju vezivanja između antitela i njegovog ciljnog antigena koji je iznad granice detekcije testa (npr. na ili iznad 1 µM). Ispitivana bispecifična antitela ispoljila su slično ćelijsko vezivanje na ćelijskim linijama koje eksprimiraju MUC16, potvrđujući da je bispecifično uparivanje sa pojedinačnim krakovima CD3 ispoljilo visoke ili slabe (ili nemerljive) interakcije sa CD3 nije uticalo ili umanjilo specifično vezivanje tumorske mete (MUC16-specifično vezivanje je bilo manje od ili jednako 3 nM (visoko vezivanje) u ovim primerima. Prvo kontrolno antitelo nije se vezalo za CD3+ ćelije, i drugo kontrolno antitelo nije se vezalo za MUC16+ ćelije. Videti takođe slike 11A-11C.
[0234] Antitela koja ispoljavaju slabo do nedetektabilno vezivanje za humani CD3 i dalje se smatraju korisnim za bispecifično uparivanje vođeno aviditetom, i dalje su testirani na citotoksičnost u in vitro (vidi dole) i in vivo testovima (Primer 8).
Aktivacija T-ćelija i tumor-specifična citotoksičnost koju pokazuju bispecifična antitela merena in vitro [0235]
A. Specifično ubijanje ciljnih ćelija tumora koje eksprimiraju MUC16 u prisustvu bispecifičnih antitela zasnovanih na CD3 praćeno je protočnom citometrijom. Kao što je ranije prijavljeno, bispecifična antitela su pokazala različite sposobnosti vezivanja za CD3 protein i ćelijske linije koje eksprimiraju CD3 (tj. veoma slabo ili snažno vezivanje). Ova ista bispecifična antitela su testirana na sposobnost da indukuju naivne ljudske T-ćelije da ponovo usmere ubijanje ka ćelijama koje eksprimiraju cilj. Ukratko, ćelijske linije koje eksprimiraju MUC16 (OVCAR3) su obeležene sa 1 µM fluorescentne boje za praćenje Violet Cell Tracker. Nakon obeležavanja, ćelije su postavljene preko noći na 37°C. Odvojeno, humani PBMC su postavljeni u dodatkom RPMI medijumu na 1x10<6>ćelija/mL i inkubirani preko noći na 37°C da bi se obogatili limfociti iscrpljivanjem prianjajućih makrofaga, dendritskih ćelija i nekih monocita. Sledećeg dana, ciljne ćelije su istovremeno inkubirane sa nestimulisanim PBMC osiromašenim adherentnim ćelijama (odnos efektor/ciljna ćelija 4:1) i serijskim razblaženjem relevantnih bispecifičnih antitela ili kontrolom izotipa (opseg koncentracije: 66,7 nM do 0.25 pM) tokom 48 sati na 37°C. Ćelije su uklonjene sa ploča za ćelijsku kulturu korišćenjem pufera za disocijaciju ćelija bez enzima i analizirane pomoću FACS. Videti rezultate predstavljene u Tabeli 8A.
2
B. U analognim studijama, ćelijske linije koje eksprimiraju MUC16 (PEO-1 ili OVCAR3-Luc) su obeležene, postavljene na pločice i inkubirane preko noći kako je opisano. Serijska razblaženja MUC16xCD3 bispecifičnih antitela ili kontrole izotipa su zajedno inkubirana. Videti rezultate prikazane u Tabelama 8B i 8C i na slikama 12A-12B.
[0236] Za FACS analizu, ćelije su obojene pomoću tragača mrtvih/živih daleko crvenih krvnih zrnaca (Invitrogen).5x10<5>kuglica za brojanje je dodato u svaki bunarčić neposredno pre FACS analize. Za svaki uzorak prikupljeno je 1x10<4>kuglica. Za procenu specifičnosti ubijanja, ćelije su zatvorene na živim populacijama obeleženim Violet. Procenat žive populacije je evidentiran i korišćen za izračunavanje normalizovanog preživljavanja.
[0237] Aktivacija T ćelija je procenjena inkubacijom ćelija sa direktno konjugovanim antitelima na CD2, CD69 i/ili CD25 i prijavljivanjem procenta rano aktiviranih (CD69+) T ćelija i/ili kasno aktiviranih (CD25+) T ćelija od ukupnog broja T ćelije (CD2+).
Kao što pokazuju rezultati u tabelama 8A-8C, primećeno je iscrpljivanje ćelija koje eksprimiraju MUC16 kod anti-MUC16xCD3 bispecifičnosti. Sva ispitivana bispecifična antitela su aktivirala i usmerila humaneT ćelije da iscrpe ciljne ćelije sa EC50u pikomolarnom opsegu. Pored toga, uočena liza ciljne ćelije (deplecija) bila je povezana sa povećanom regulacijom CD69 (ili CD25) na CD2+ T ćelijama, takođe sa pikomolarnim (pM) EC50.
[0238] Važno je da rezultati ovog primera takođe pokazuju da je bispecifično antitelo konstruisano sa CD3 vezujućim krakom koji pokazuje slabo ili nemerljivo vezivanje za CD3 protein ili ćelije koje eksprimiraju CD3 (tj. CD3-VH-G5) i dalje zadržava sposobnost da aktivira T-ćelije i ispoljio snažnu citotoksičnost ćelija koje eksprimiraju tumorski antigen.
Tabela 8A: Citotoksičnost i svojstva aktivacije T-ćelija odabranih MUC16xCD3 bispecifičnih antitela
Tabela 8B: Citotoksičnost i svojstva aktivacije T-ćelija odabranih MUC16xCD3 bispecifičnih antitela
Tabela 8C: Citotoksičnost i svojstva aktivacije T-ćelija odabranih MUC16xCD3 bispecifičnih antitela
Primer 6: Epitopsko mapiranje anti-Muc16 antitela H4sH8767P, H1H8794P2 i H1H8799P2 koje se vezuje za deo C-term domena hMUC16 zasnovano na razmeni vodonika/deuterijuma (H/D)
[0239] Eksperimenti su sprovedeni da bi se odredili MUC16 aminokiselinski ostaci unutar C-terminalnih pet SEA domena (SEQ ID No:1902, u daljem tekstu hMUC16.nub), sa kojima su anti-MUC16 antitela H4sH8767P, H1H8794P97 i H1H8794P interakciju. U tu svrhu korišćeno je mapiranje epitopa razmene vodonik/deuterijum (H/D) sa masenom spektrometrijom (HDKS-MS). Opšti opis metode izmene H/D je iznet u Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; i Engen i Smit (2001) Anal. Chem.73:256A-265A.
[0240] HDKS-MS eksperimenti su izvedeni na integrisanoj Waters HDKS/MS platformi, koja se sastoji od Leaptec HDKS PAL sistema za obeležavanje deuterijuma, Waters Acquity M-Class (upravljač pomoćnim rastvaračima) za digestiju i punjenje uzoraka, Waters Acquity M-Class (µBinary solvent manager) za gradijent analitičke kolone i Synapt G2-Si maseni spektrometar za merenje mase peptičkih peptide.
[0241] Rastvor za obeležavanje je pripremljen u 10 mM PBS puferu u D2O na pD 7.0. Za obeležavanje deuterijumom, 3.8 µL hMUC16.nub (12 pmol/µL) ili hMUC16.nub prethodno pomešanog sa anti-MUC16 antitelom H4sH8767P, H1H8794P2 ili H1H8799P2 u molarnom odnosu 2:1 je inkubiran sa 56.2 µL. Rastvor za obeležavanje D2O za različite vremenske tačke (npr.: nedeuterisana kontrola = 0 sekundi; obeležavanje deuterijumom: 1 min i 20 min). Deuteracija je ugašena prebacivanjem 50 µL uzorka u 50 µL prethodno ohlađenog pufera za gašenje (0.2 M TCEP, 6 M gvanidin hlorida u 100 mM fosfatnog pufera, pH 2.5) i mešani uzorak je inkubiran na 1,0 °C dva minuta. Ugašeni uzorak je zatim ubrizgan u Waters HDX Manager za onlajn digestiju pepsina/proteaze XIII. Digestivni peptidi su zarobljeni na ACQUITY UPLC BEH C181.7-µm, 2.1 x 5 mm VanGuard pre-koloni na 0°C i eluirani u analitičku kolonu ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7-µm, 1,0 x 5 mm) za 590 mm -minutni gradijent razdvajanja od 5%-40% B (mobilna faza A: 0,1% mravlje kiseline u vodi, mobilna faza B: 0,1% mravlje kiseline u acetonitrilu). Maseni spektrometar je koristio konusni napon od 37V, vreme skeniranja od 0,5 s i opseg mase/naelektrisanja od 50-1700 Th.
[0242] Za identifikaciju peptidnih ostataka hMUC16.nub sa kojima su H4sH8767P, H1H8794P2 i H1H8799P2 u interakciji, LC-MSE podaci iz nedeuterisanog uzorka su obrađeni i pretraživani u bazi podataka koja je uključivala sekvence i hMUC16psin. randomizovana sekvenca korišćenjem softvera Waters ProteinLynx Global Server (PLGS). Identifikovani peptidi su uvezeni u DinamX softver i filtrirani prema dva kriterijuma: 1) minimalni proizvodi po aminokiselini: 0.25 i 2) prag datoteke replikacije: 2. DinamX softver je zatim automatski odredio unos deuterijuma za svaki peptid na osnovu vremena zadržavanja i visoke preciznosti mase (<10ppm) u više vremenskih tačaka sa 3 ponavljanja u svakom trenutku.
[0243] Korišćenjem onlajn kolone pepsin/proteaza XIII u kombinaciji sa prikupljanjem podataka o MSE, identifikovano je ukupno 109 peptida iz hMUC16.nub u odsustvu ili prisustvu H4sH8767P, što predstavlja 64% pokrivenosti sekvence. Šest peptida je imalo značajno smanjeno prihvatanje deuteracije (vrednosti centroid delta > 0.5 daltona od najmanje jedne vremenske tačke sa p-
4
vrednostima < 0,05) kada su vezani za H4sH8767P i ilustrovano je u tabeli 9A. Zabeležena peptidna masa odgovara prosečnoj vrednosti MH+ mase centra iz tri ponavljanja. Ovi peptidi, koji odgovaraju aminokiselinama 428-434, 453-467 i 474-481 hMuc16.nub, imali su sporije stope deuteracije kada su se vezali za H4sH8767P. Ovi identifikovani ostaci takođe odgovaraju ostacima 14237-14243, 14262-14276 i 14283-14290 hMUC16 kao što je definisano Uniprot unosom Q8WXI7 (MUC16_HUMAN), SEQ ID NO:1899.
Tabela 9A. hMUC16.nub Peptidi sa izmenjenim stopama deuteracije nakon vezivanja H4sH8767P
[0244] Korišćenjem onlajn kolone pepsin/proteaza XIII u kombinaciji sa prikupljanjem podataka o MSE, identifikovano je ukupno 109 peptida iz hMUC16.nub u odsustvu ili prisustvu H1H8794P2, što predstavlja 64% pokrivenosti sekvence. Tri peptida su imala značajno smanjeno uzimanje deuteracije (vrednosti centroid delta > 0,5 daltona od najmanje jedne vremenske tačke sa p-vrednostima < 0,05) kada su se vezali za H1H8794P2 i ilustrovano je u tabeli 9B. Zabeležena peptidna masa odgovara prosečnoj vrednosti MH+ mase centra iz tri ponavljanja. Ovi peptidi, koji odgovaraju aminokiselinama 126-131, 127-131 i 132-138 hMuc16.nub, imali su sporiju stopu deuteracije kada su se vezali za H1H8794P2. Ovi identifikovani ostaci takođe odgovaraju ostacima 13935-13940, 13936-13940 i 13941-13947 hMUC16 kao što je definisano Uniprot unosom Q8WXI7 (MUC16_HUMAN), SEQ ID NO:1899.
Tabela 9B. hMUC16.nub Peptidi sa izmenjenim stopama deuteracije nakon vezivanja H1H8794P2
[0245] Korišćenjem onlajn kolone pepsin/proteaza XIII u kombinaciji sa prikupljanjem podataka o MSE, identifikovano je ukupno 109 peptida iz hMUC16.nub u odsustvu ili prisustvu H1H8799P2, što predstavlja 64% pokrivenosti sekvence. Četiri peptida su imala značajno smanjeno uzimanje deuteracije (vrednosti centroid delta > 0,5 daltona od najmanje jedne vremenske tačke sa pvrednostima < 0,05) kada su se vezali za H1H8799P2 i ilustrovano je u tabeli 9C. Zabeležena peptidna masa odgovara prosečnoj vrednosti MH+ mase centra iz tri ponavljanja. Ovi peptidi, koji odgovaraju aminokiselinama 357-369, 358-366, 358-369 i 361-369 hMuc16.nub, imali su sporije stope deuteracije kada su se vezali za H1H8799P2. Ovi identifikovani ostaci takođe odgovaraju ostacima 14165-14178, 14166-14176, 14166-14178 i 14170-14178 hMUC16 kao što je definisano Uniprot unosom Q8WXI7 (MUC16_HUMAN):1 SEQ99.
Tabela 9C. hMUC16.nub Peptidi sa izmenjenim stopama deuteracije nakon vezivanja H1H8799P2
Primer 7: Farmakokinetička procena anti-MUC163 CD3 bispecifičnih antitela
[0246] Procena farmakokinetike anti-MUC16 x CD3 bispecifičnih antitela BSMUC16/CD3-001 i BSMUC16/CD3-005 i kontrola izotipa sprovedena je kod humanizovanih MUC16 x CDC3 miševa (miševi homozigotni za humane CD3 i MUC16 ekspresije, homozigotni miševi MUC16<hu/hu>x CD3<hu/hu>), CD3 humanizovanih miševa (miševi homozigotni za humanu ekspresiju CD3, CD3<hu/hu>) i soj koji se podudara (75% C57BL, 25%129Sv) miševi divljeg tipa (WT). Kohorte su sadržale 4-5 miševa po ispitivanom antitelu i po soju miša. Svi miševi su primili jednu intraperitonealnu (i.p.) dozu od 0,4 mg/kg. Uzorci krvi su sakupljeni 3 i 6 sati, 1, 3, 7, 14 i 28 dana nakon doziranja. Krv je prerađena u serum i zamrznuta na -80 °C do analize.
[0247] Koncentracije cirkulišućih antitela su određene analizom ukupnog humanog IgG antitela korišćenjem GyroLabxPlore™ (Giros, Upsala, Švedska). Ukratko, biotinilovano kozje anti-humano IgG poliklonsko antitelo (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) je uhvaćeno na perle obložene streptavidinom na Gyrolab Bioaffy 200 CD (Giros) da bi se uhvatio humani IgG prisutan u serumu. Nakon hvatanja afinitetnom kolonom, vezano humano IgG antitelo u uzorcima je detektovano sa Alexa-647 obeleženim kozjim anti-humanim IgG (Jackson ImmunoResearch). Fluorescentni signal na koloni omogućio je detekciju vezanog IgG i jedinice odgovora (RU) su očitane od strane instrumenta. Koncentracije uzorka su određene interpolacijom sa standardne krive koja je bila prilagođena korišćenjem 5-parametarske logističke krive pomoću softvera Gyrolab Evaluator Software.
PK parametri su određeni ne-kompartmentalnom analizom (NCA) korišćenjem Phoenix®WinNonlin® softerske verzije 6.3 (Certara, L.P., Princeton, NJ) i modelom ekstravaskularnog doziranja. Koristeći odgovarajuće srednje vrednosti koncentracije za svako antitelo, svi PK parametri uključujući uočenu maksimalnu koncentraciju u serumu (Cmax), procenjeni uočeni poluživot (t1/2) i površinu ispod krive koncentracije u odnosu na vreme do poslednje merljive koncentracije (AUClast) su određene korišćenjem linearnog trapezoidnog pravila sa linearnom interpolacijom i uniformnim merenjem.
[0248] Nakon i.p. primena antitela kod miševa divljeg tipa, ukupni IgG koncentracijsko-vremenski profili BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 i kontrola izotipa su svi bili slični, što ih je prvo karakterisala kratka distribucija leka, a zatim jedna faza eliminacije leka tokom ostatka studije. Maksimalne koncentracije u serumu (Cmax) i izračunata izloženost leku (AUClast) tri antitela bile su uporedive (unutar 1.3 puta jedna od druge).
[0249] Nakon i.p. primena antitela kod CD3<hu/hu>miševa, BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 i kontrola izotipa imale su uporedive koncentracije Cmax(4.6, 3.6 i 4.1 µg/mL, tim redom). BSMUC16/CD3-005 i kontrola izotipa su pokazali slične krive eliminacije leka, dok je BSMUC16/CD3-001 pokazao strmiju eliminaciju leka od oba, što sugeriše da ciljno vezivanje humanog CD3 pokreće klirens. Terminalna koncentracija antitela za BSMUC16/CD3-001 bila je 0.03 µg/mL, što je oko 28 puta manje od terminalnih koncentracija antitela utvrđenih za kontrolu izotipa (0.85 µg/mL) i 22 puta manje od BSMUC16/CD3-005 (0.66 µg/mL) koncentracije u serumu.
[0250] Kod MUC16<hu/hu>x CD3<hu/hu>dvostruko humanizovanih miševa, Muc16xCD3 bispecifična i kontrolna antitela izotipa imala su uporedive koncentracije Cmax(Cmak opseg: 4.5-6.9 mg/mL). Oba bispecifična antitela su pokazala strmiju eliminaciju leka od kontrole izotipa, što ukazuje na ciljno posredovan efekat. Terminalne koncentracije antitela za BSMUC16/CD3-001 i BSMUC16/CD3-005 bile su oko 29 puta i 2.9 puta manje, tim redom, od terminalnih koncentracija antitela utvrđenih za kontrolu izotipa (0.86 µg/mL).
[0251] Rezime podataka za ukupna anti-MUC163 CD3 bispecifična antitela i koncentracije kontrolnih antitela izotipa su sumirani u Tabeli 10. Srednji PK parametri su opisani u Tabelama 11A i 11B. Srednje ukupne koncentracije antitela u zavisnosti od vremena prikazane su na slikama 1, 2 i 3. Zaključno, MUC16xCD3 bispecifična antitela su pokazala slične Cmaxi krive eliminacije leka kod miševa divljeg tipa, ali BSMUC16/CD3-001 je pokazao strmiju stopu eliminacije od BSMUC-005 i kontrola izotipa kod CD3 jednostruko-humanizovanih miševa i MUC16/CD3 dvostruko humanizovanih miševa. Pošto se bispecifična antitela primenjena u ovoj PK studiji sastoje od istog anti-MUC16 vezujućeg kraka, rezultati sugerišu da snaga vezivanja CD3 ciljanog kraka može da igra ulogu u nivoima izloženosti leku (AUClast) i stopama eliminacije leka. Ni BSMUC16/CD3-001 ni BSMUC16/CD3-005 ne vezuju MUC16 miša ili CD3 miša.
Tabela 10: Srednje koncentracije ukupnog IgG u serumu nakon jedne intraperitonealne injekcije od 0.4 mg/kg BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 i kontrolnih antitela izotipa kod miševa divljeg tipa, humanizovanih CD3 miševa i humanizovanih MUC16 X CD3 miševa
Tabela 11A: Rezime farmakokinetičkih parametara: CD3<hu/hu>humanizovanih miševa
Tabela 11B: Rezime farmakokinetičkih parametara: MUC16<hu/hu>x CD3<hu/hu>dvostruko humanizovanih miševa
Primer 8: Anti-MUC16/anti-CD3 bispecifična antitela pokazuju snažnu antitumorsku efikasnost in vivo
[0252] Da bi se odredila in vivo efikasnost primera anti-MUC16/anti-CD3 bispecifičnih antitela identifikovanih sa slabim ili nikakvim vezivanjem za CD3 čoveka i cinomolgusa, sprovedene su studije na imunokompromitovanim miševima koji nose ksenotransplantate humanog kancera prostate. Efikasnost odabranih bispecifičnih antitela je testirana i kod modela doziranja neposrednim lečenjem i terapijskim tretmanom.
Efikasnost anti-MUC16/anti-CD3 bispecifičnih antitela u modelima ksenotransplantata humanog tumora
[0253] Da bi se procenila in vivo efikasnost anti-MUC16/anti-CD3 bispecifičnosti u studijama ksenotransplantata humanog tumora, NOD scid gama (NSG) miševima (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) je prethodno implantiran mononuklear iz periferne krvi čoveka ćelije (PBMC; ReachBio LLC., Seattle, VA) i zatim date ćelije ascitesa iz ćelijske linije humanog kancera jajnika OVCAR-3 (American Type Tissue Culture, Manassas, VA) transdukovane sa luciferazom (OVCAR-3/Luc). OVCAR-3 ćelije endogeno eksprimiraju MUC-16.
[0254] Ukratko, NSG miševima je ubrizgano intraperitonealno (i.p.) 5.0 x 10<6>humanih PBMC.8 dana kasnije, 1.5 x 10<6>ćelija ascita iz ćelijske linije OVCAR-3/Luc, prethodno pasiranih in vivo, dato je i.p. na NSG miševe koji su usađeni sa PBMC. U grupi za neposredno lečenje, miševi su tretirani i.p. na dan implantacije OVCAR-3/Luc ćelija sa MUC16/CD3 bispecifičnim antitelima BSMUC16/CD3-001 ili BSMUC16/CD3-005, ili kontrolom izotipa, u dozi od 10 µg/mišu (N=5 miševa/terapijska grupa). U terapeutskom doznom modelu, miševi su tretirani i.p. 7 dana posle implantacije tumora sa MUC16/CD3 bispecifičnim ili kontrolnim antitelima opisanim gore, u dozi od 10 µg/mišu (N=5/grupi za tretman).
[0255] U svim studijama, rast tumora je praćen bioluminiscentnim imidžingom (BLI). Miševima je i.p. brizgan supstrat luciferaze D-luciferinom suspendovanim u PBS (150 mg/kg) i snimljenim pod izofluranskom anestezijom nakon 10 min. BLI je izveden korišćenjem Xenogen IVIS system (Perkin Elmer, Hopkinton, MA) i BLI signali su ekstrahovani korišćenjem Living Image softvera (Xenogen/Perkin Elmer). Regioni od interesa su nacrtani oko svake ćelijske mase, a intenziteti fotona su zabeleženi kao fotoni (p)/sec(s)/cm<2>/steradian(sr). Za grupu koja je odmah lečena, podaci su prikazani kao nivoi BLI 26d nakon implantacije tumora (Tabela 12A). Za grupu sa terapijskim tretmanom, podaci su prikazani kao promena u BLI između 6. dana (1 dan pre tretmana) i krajnje tačke studije (26 dana nakon implantacije tumora; Tabela 12B).
[0256] Kao što rezultati pokazuju, i BSMUC16/CD3-001 i BSMUC16/CD3-005 su pokazali sličnu efikasnost u suzbijanju rasta tumora u poređenju sa kontrolom izotipa kada je BLI meren 26. dana u modelu neposrednog doziranja. Oba anti-MUC16/anti-CD3 bispecifična antitela su takođe potisnula rast ustanovljenih tumora kada su primenjena 7 dana nakon implantacije tumora, u poređenju sa kontrolom. Ukratko, bispecifična anti-MUC16/anti-CD3 antitela iz ovog otkrića pokazuju snažnu antitumorsku efikasnost u nekoliko modela.
Tabela 12A: Efikasnost anti-MUC16/anti-CD3 bispecifičnih antitela u modelu ksenotransplantata sa kompromitovanim imunitetom: trenutno doziranje
Tabela 12B: Efikasnost anti-Muc16/anti-CD3 bispecifičnih antitela kod imunokompromitovanog modela ksenotransplantata: terapeutski tretman
[0257] U daljim eksperimentima, in vivo efikasnost anti-MUC16/anti-CD3 bispecifičnog antitela je procenjena na ksenogenim i singenim modelima tumora. Za prvi ksenogeni model, NSG miševima su intraperitonealno (IP) ubrizgane OVCAR-3/Luc ćelije koje su prethodno pasažirane in vivo (dan 0) jedanaest dana nakon presađivanja humanih PBMC. Miševi su tretirani IP sa 0,01, 0,1 ili 0.5 mg/kg BSMUC16/CD3-001, ili im je davana 0.5 mg/kg nevezujuće kontrole ili kontrole koja se vezuje za CD3 6, 10, 13, 16 i 21 dana. Opterećenje tumorom je procenjeno od strane BLI 6, 14. i 20. dana nakon implantacije tumora. Tretman sa 0.1 ili 0.5 mg/kg BSMUC16/CD3-001 je rezultirao značajnom antitumorskom efikasnošću kao što je utvrđeno BLI merenjima 20. dana, kao što je prikazano u Tabelama 13A-C i na Slikama 4-6. Za drugi ksenogeni model, NSG miševima su ubrizgane OVCAR-3/Luc ćelije koje su prethodno pasažiranje in vivo (dan 0) trinaest dana nakon presađivanja humanim PBMC, a druga serija PBMC je prebačena 4. dana. Miševi su tretirani intravenozno (IV) sa 0.1, 0.5, 1 ili 5 mg/kg BSMUC16/CD3-005 ili primenjenom 5 mg/kg neobavezujuće kontrole ili kontrole koja se vezuje za CD3 5, 8, 12, 15, 19 i 22 dana. Tumor opterećenje je procenjeno pomoću BLI dana 4, 11, 18 i 25. Tretman sa 0.5, 1 ili 5 mg/kg BSMUC16/CD3-005 je rezultirao značajnom antitumorskom efikasnošću kao što je pokazano merenjima BLI i promenama nagiba (Tabele 13D- F i slike 7-9). Da bi se ispitala efikasnost u imunokompetentnom modelu, mišji CD3 gen je zamenjen humanim CD3, a deo mišjeg MUC16 gena je zamenjen humanom sekvencom. Zamene su rezultirale mišem čije T ćelije eksprimiraju humani CD3 i koji eksprimira himerni MUC16 molekul koji sadrži deo humanog MUC16 gde se vezuje BSMUC16/CD3-001 bispecifično antitelo. Za model singenog tumora, korišćene su ID8-VEGF ćelijske linije projektovane da eksprimiraju deo humanog MUC16. Miševima su implantirane ćelije ID8VEGF/huMUC16 subkutano i tretirani sa 100 µg BSMUC16/CD3-001 bilo na dan implantacije ili deset dana nakon implantacije kada su tumori ustanovljeni. Tretman sa 100 µg BSMUC16/CD3-001 je rezultirao značajnom antitumorskom efikasnošću, kao što je prikazano u Tabeli 13G i na Slici 10.
[0258] Implantacija i merenje tumora ksenografta: Ćelije ascita iz ćelijske linije OVCAR-3/Luc, koje su prethodno pasažirane in vivo, davane su IP u NSG miševe kojima su prethodno transplantirani humani PBMC. BLI je meren kao očitavanje rasta tumora nekoliko dana nakon implantacije OVCAR-3/Luc i više puta tokom studije. Nakon početnog merenja BLI za kohorte, miševi su podeljeni u grupe od po 4-6 životinja i davana su im MUC16xCD3 bispecifična ili kontrolna antitela dva puta nedeljno tokom studije.
[0259] Proračun rasta i inhibicije tumora ksenotransplantata: Bioluminiscencijski snimak je korišćen za merenje opterećenja tumorom. Miševima je ubrizgano IP sa 150 mg/kg (kako je određeno telesnom težinom na početku eksperimenta) supstrata luciferaze D-luciferin suspendovanog u PBS. Deset minuta nakon doziranja, BLI snimanje miševa je izvedeno pod anestezijom izofluranom koristeći Xenogen IVIS sistem. Snimanje slike je obavljeno sa vidnim poljem na D, visinom subjekta od 1.5 cm i srednjim nivoom bininga za vreme ekspozicije od 0.5 minuta. BLI signali su ekstrahovani korišćenjem softvera Living Image. Regioni od interesa su nacrtani oko svake tumorske mase, a intenziteti fotona su zabeleženi kao p/s/cm<2>/sr. Statistička analiza je izvršena korišćenjem softvera GraphPad Prism (verzija 6). Statistički značaj za BLI rezultate je određen korišćenjem neparenog neparametarskog Mann-Whitney t-testa. Promene pregiba su izračunate po formuli: (20. dan-6. dan)/6. dan za studiju 1 i (25. dan-4. dan)/4. dan za studiju 2.
[0260] Implantacija i merenje singenih tumora: Miševi koji eksprimiraju humani CD3 i humano-mišju himeru MUC16 u odgovarajućim lokusima miša su implantirani sa 10e6 ID8-VEGF/huMUC16 ćelijama subkutano (SC). Miševima je davan BSMUC16/CD3-001 ili kontrolni IP koji se vezuje za CD3, dva puta nedeljno tokom studije. Tretman je počeo 0 ili 10 dana nakon implantacije. Rast tumora je meren kalibrom dva puta nedeljno. Miševi su žrtvovani 47 dana nakon implantacije tumora.
[0261] Proračun singenog rasta tumora i inhibicije: Za određivanje zapremine tumora spoljašnjim kaliperom, određen je najveći uzdužni prečnik (dužina) i najveći poprečni prečnik (širina). Zapremina tumora na osnovu merenja kaliperom izračunata je po formuli: Zapremina = (dužina x širina<2>)/2. Statistička značajnost je određena korišćenjem neparenog neparametarskog Mann-Whitney t-testa.
[0262] Antitumorska efikasnost BSMUC16/CD3-001 bispecifičnog antitela u ksenogenim i singenim in vivo modelima tumora prikazana je u Tabelama 13A-D u nastavku.
Tabela 13A: Studija modela OVCAR-31. Nivo bioluminiscencije 6. dana nakon implantacije tumora
Tabela 13B: Studija modela OVCAR-31. Nivo bioluminiscencije 20. dana nakon implantacije tumora
1
Tabela 13C: Studija modela OVCAR-31. Preklopna promena BLI između 6. i 20. dana nakon implantacije tumora
Tabela 13D: OVCAR-3 model studija 2. Nivo bioluminiscencije 4. dana nakon implantacije tumora
Tabela 13E: OVCAR-3 model studija 2. Nivo bioluminiscencije 25. dana nakon implantacije tumora
Tabela 13F: Studija modela OVCAR-32. Preklopna promena BLI između 4. i 25. dana nakon implantacije tumora
2
Tabela 13G: ID8-VEGF/huMUC16 model. Veličina tumora (mm3) 47. Dana
Referentni primer 1: Priprema i karakterizacija konjugata
[0263] Sva monoklonska antitela su eksprimirana u CHO ćelijama i prečišćena proteinom A. Kontrola izotipa je takođe pripremljena na sličan način. Nevezujuće kontrolno antitelo izotipa je izvedeno iz imunološkog antigena koji nema veze sa onkologijom.
[0264] Antitelo (10 mg/ml) u 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5, tretirano je sa 1 mM ditiotreitola na 37 °C tokom 30 min. Posle gel filtracije (G-25, pH 4.5 natrijum acetat), jedan od derivata korisnog opterećenja maleimido linkera, Jedinjenje 7 ili Jedinjenje 10 (videti Tabelu 14) (1,2 ekvivalenta/SH grupa) u DMSO (10 mg/ml) je dodat u redukovano antitelo i pH smeše je podešen na 7,0 sa 1 M HEPES (pH 7,4). Jedinjenje 7 i Jedinjenje 10, i postupci za pravljenje jedinjenja, opisani su u PCT publikaciji br. WO2014/145090, objavljenoj 18. septembra 2014. i PCT publikaciji br. WO2016/160615, objavljenoj 6. oktobra 2016. godine. Posle 1 h reakcija je ugašena viškom N-etil maleimida. Konjugati su prečišćeni ekskluzionom hromatografijom i sterilno filtrirani. Koncentracije proteina i veznika su određene UV spektralnom analizom. HPLC sa isključenjem po veličini je utvrdio da su svi korišćeni konjugati >95% monomerni.. Prinosi su prikazani u Tabeli 14 na osnovu određivanja proteina. Sva konjugovana antitela su analizirana UV za vrednosti opterećenja linkera prema Hamblett et al, Cancer Res 200410 7063. Rezultati su sumirani u tabeli 14.
[0265] Konjugat koji sadrži Jedinjenje 60 može se pripremiti korišćenjem sličnog postupka. Jedinjenje 60, i postupci za pravljenje jedinjenja, opisani su u PCT publikaciji br. WO2016/160615 (primer 20), objavljenoj 6. oktobra 2016. Jedinjenje 60 je Majtanzin-N-metil-L-alanin-(3-metoksi-4-amino)benzamido-Cit-Val-Cap-Mal.
Tabela 14: Rezime parametara korisnog opterećenja (hemotoksični lek) i parametara antitelo-lekkonjugat
Referentni primer 2: Konjugati anti-MUC16 antitela sa lekom su potentni inhibitori tumorskog rasta u in vivo MUC16-pozitivnim modelima ksenografta kancera prostate
[0266] Da bi se odredila in vivo efikasnost anti-MUC16 antitela konjugovanih sa Jedinjenjem 7 i Jedinjenjem 10, sprovedena su ispitivanja kod imunokompromitovanih miševa koji nose ksenografte kancera jajnika pozitivnog na MUC16.
[0267] Za ove studije, ženkama SCID miševa (Taconic, Hudson NY) implantirane su OVCAR3 [NIH:OVCAR-3 (OVCAR3, ATCC HTB-161)] ćelije transfektovane luciferazom (OVCAR3/luc) koje endogeno eksprimiraju MUC16. Za intraperitonealne (IP) tumore, miševi su randomizovani u grupe za lečenje i dozirani su ili anti-MUC16 konjugovanim antitelima (videti Referentni primer 1), nevezujućim konjugovanim antitelom ili nosačem nakon detekcije luminiscentnog signala tumora. Za subkutane (SC) ksenotransplantate, kada su tumori dostigli prosečnu zapreminu od 200 mm<3>(~16. dan), miševi su randomizovani u grupe za tretman i dozirani su ili anti-MUC16 konjugovanim antitelima, nevezujućim konjugovanim antitelom ili nosačem. U ovim in vivo studijama, antitela su dozirana i tumori su zatim praćeni sve dok se ne razvije asciti ili dok se ne postigne prosečna veličina tumora od približno 1200 mm<3>u kohorti koja je dozirala samo nosačem. U ovom trenutku je izračunata inhibicija rasta tumora.
[0268] U početnoj intraperitonealnoj (IP) studiji, ispitana je efikasnost primera anti-MUC16 antitela konjugovanih sa jedinjenjem 7 u smanjenju OVCAR3/luc luminiscentnog signala. Miševi su primali četiri doze anti-MUC16 i kontrolnih ADC-a jednom nedeljno po 85 µg/kg ekvivalenta leka na osnovu odnosa ADC lek:antitelo. Kao što je rezimirano u Tabeli 15A, H1H9519N-jedinjenje 7 i H1H9521N-jedinjenje 7 snažno inhibiraju rast tumora ascita. Ovi anti-MUC16 ADC su efikasno smanjili veličinu
4
tumora, sa 100 posto smanjenjem luminescencije tumora u odnosu na kontrolu nosača. Kontrolni ADC nije posredovao u bilo kakvoj inhibiciji rasta tumorskih ćelija OVCAR/luc ascita.
[0269] Dalja studija koja procenjuje efikasnost anti-MUC16 ADC protiv subkutanog (SC) OVCAR3/luc tumora je sažeta u Tabeli 15B. Miševi su primali četiri doze anti-MUC16 i kontrolnih ADC-a jednom nedeljno po 85 µg/kg ekvivalenta leka na osnovu odnosa ADC lek:antitelo. Kada su konjugovani sa jedinjenjem 7, MUC16 ADC-ovi H1H9519N-jedinjenje 7 i H1H9521N-jedinjenje 7 ponovo su proizveli značajan antitumorski efekat; ovog puta protiv subkutanih OVCAR3/luc tumora. Shodno tome, ovi ADC su posredovali u 100% i 109% inhibiciji rasta tumora. Kontrolni ADC nije posredovao u bilo kakvoj inhibiciji rasta OVCAR/luc subkutanog tumora.
[0270] U trećoj studiji, efikasnost anti-MUC16 antitela H1H9521N konjugovanog sa spojnim lekom Jedinjenje 10 je procenjena u IP OVCAR3/luc modelu tumora. Miševi su primali pojedinačne doze anti-MUC16 i kontrolnih ADC-a u dozi od 85 µg/kg, 170 µg/kg i 340 µg/kg ekvivalenta leka na osnovu odnosa ADC lek:antitelo. Kao što je rezimirano u tabeli 15C, H1H9519N-10 snažno inhibira rast tumora ascitesa. Doze H1H9519N-jedinjenja 10 su dovele do 99-100% inhibicije luminescencije tumora u odnosu na kontrolu nosača. Izvesna inhibicija je primećena kod kontrolnog ADC-a korišćenjem jedinjenja 10, iako je to bilo umerenije od one koja je primećena nakon anti-MUC16 H1H9519N-jedinjenja 10.
Tabela 15A: Inhibicija OVCAR3/luc IP rasta tumora 49. dana kod SCID miševa tretiranih anti-MUC16 antitelima konjugovanim sa Jedinjenjem 7
Tabela 15B: Inhibicija OVCAR3/luc SC rasta tumora 37. dana kod SCID miševa tretiranih anti-MUC16 antitelima konjugovanim sa Jedinjenjem 7
Tabela 15C: Inhibicija OVCAR3/luc IP rasta tumora 49. dana kod SCID miševa tretiranih anti-MUC16 antitelima konjugovanim sa Jedinjenjem 10
Primer 9: Dobijanje anti-CD3 antitela
[0271] Anti-CD3 antitela su dobijena imunizovanjem modifikovanog miša koji sadrži DNK koji kodiraju varijabilne regione teškog i kapa lakog lanca humanog imunoglobulina sa ćelijama koje eksprimiraju CD3 ili sa DNK koja kodira CD3. Imuni odgovor antitela je praćen sa CD3-specifičnim imunskim testom. Kada je postignut željeni imunski odogovor, splenociti su sakupljeni i spojeni sa ćelijama mišjeg mijeloma da bi se sačuvala njihova vijabilnost i obrazovale hibridoma ćelijske linije. Sproveden je skrining hibridoma ćelijskih linija i selekcija da bi se identifikovale ćelijske linije koje proizvode CD3-specifična antitela. Upotrebom ovog postupka dobijeno je nekoliko anti-CD3 himernih antitela (tj., antitela koja poseduju humane varijabilne domene i mišje konstantne domene). Dodatno, nekoliko potpuno humanih anti-CD3 antitela je izolovano direktno iz antigen-pozitivnih B ćelija bez fuzije sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u US 2007/0280945A1.
[0272] Određene biološke osobine primera anti-CD3 antitela dobijenih u skladu sa postupcima iz ovog primera su ovde detaljno opisane u primerima.
Primer 10: Sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina varijabilnog regiona teškog i lakog lanca [0273] Tabela 16 prikazuje identifikatore aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca i CDR-ove odabranih anti-CD3 antitela prema izlaganju. Odgovarajući identifikatori sekvence nukleinske kiseline su navedeni u Tabeli 17. Postupci pravljenja anti-CD3 antitela koji su ovde izloženi takođe se mogu naći u US objavi 2014/0088295.
Tabela 16: Identifikatori sekvenci aminokiselina
(nastavak)
(nastavak)
Tabela 17: Identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina
(nastavak)
(nastavak)
[0274] Antitela su ovde obično naznačena prema sledećoj nomenklaturi: prefikc Fc (npe. "H1H," "H1M," "H2M," itd.), praćeno numeričkim identifikatorom (npr. "2712," "2692," itd., kao što je prikazano u Tabeli 1), praćeno sufiksom "P," "N," ili "B". Prema tome, u skladu sa ovom nomenklaturom, antitelo ovde može biti označeno sa, npr., "H1H2712N," "H1M2692N," "H2M2689N," itd. Prefiksi H1H, H1M i H2M za ovde korišćene oznake antitela ukazuju na određeni Fc region izotipa antitela. Na primer, "H1H" antitelo ima humani IgG1 Fc, "H1M" antitelo ima mišji IgG1 Fc, i "H2M" antitelo ima mišji IgG2 Fc, (svi dostupni regioni su potpuno humani kao što je određeno sa prvim ’H’ u oznaci antitela). Kao što će biti jasno osobi koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, antitelo sa određenim izotipom Fc može se konvertovati u antitelo sa različitim izotipom Fc (npr., antitelo sa mišjim IgG1 Fc se može pretvoriti u antitelo sa humanim IgG4, itd.), ali u bilo kom slučaju, varijabilni domeni (uključujući CDRs) – koji su označeni numeričkim identifikatorima prikazanim u Tabeli 1 – će ostati isti, i očekuje se da će svojstva vezivanja biti identična ili u suštini identična bez obzira na prirodu domena Fc.
[0275] Tabele 18 i 19 prikazuju identifikatore aminokiselinskih sekvenci za varijabilne regione teškog lanca (Tabela 18) i varijabilne regione lakog lanca (Tabela 19), i njihove odgovarajuće CDR-e, dodatnih anti-CD3 HCVRs i LCVRs korisnih u anti-MUC16 X anti-CD3 bispecifičnih antitela iz prikaza.
Tabela 18 (Sekvence aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca)
Tabela 19 (Sekvence aminokiselina varijabilnog regiona lakog lanca)
[0276] Varijabilni regioni teškog i lakog lanca CD3-VH-F i CD3-VL-F su dobijeni iz anti-CD3 antitela oznnačeno sa "L2K" kao što je prikazano u WO2004/106380.
[0277] Dodatno, Tabele 20 i 21 prikazuju identifikatore sekvenci za nukleotidne sekvence koje kodiraju varijabilne regione teškog lanca (Tabela 20) i varijabilne regione lakog lanca (Tabela 21), i njihove pripadajuće CDRs, dodatnih anti-CD3 HCVRs i LCVRs korisne u anti-MUC16 x anti-CD3 bispecifičnim antitelima iz prikaza.
Tabela 20 (Nukleotidne sekvence koje kodiraju sekvence varijabilnog regiona teškog lanca)
(nastavak)
Tabela 21 (Nukleotidne sekvence koje kodiraju sekvence varijabilnog regiona lakog lanca)
1
Kontrolni konstrukti korišćeni u sledećim primerima
[0278] Različiti kontrolni konstrukti (anti-CD3 antitela) su uključeni u eksperimentima koji slede za uporedne svrhe: "OKT-3," mišje monoklonsko antitelo protiv površinskih antigena humanih T-ćelija dostupnih od American Type Culture Collection (ATCC) pod kataloškim brojem CRL-8001; i "SP34," komercijalno dostupno mišje monoklonsko antitelo dobijeno, npr., od Biolegend, San Diego, CA (Kat. br. 302914) ili BD Pharmagen, Cat. 55052, reaktivno protiv epsilon lanca kompleksa T3 na ćelijama humanih T limfocita.
Primer 11: Dobijanje Dodatnih anti-CD3 antitela
[0279] Sledeći postupci su imali za cilj da identifikuju antitela koja su specifično prepoznala CD3 (T ćelijski koreceptor) kao antigen.
[0280] Grupa anti-CD3 antitela je dobijena od genetički modifikovanog miša. Ukratko, miševi su imunizovani CD3 antigenom i generisane su B ćelije koje su sadržale raznovrsnost humanih VH rearanžmana kako bi se izrazio raznolik repertoar antitela specifičnih za antigen visokog afiniteta. Antitela koja se opisuju u tabelama 22-25 imaju istu sekvencu lakog lanca VK1-39JK5 (LCVR prikazan u SEQ ID NO: 1890).
[0281] Generisana antitela su ispitana za vezivanje sa humanim i cinomolgus majmuna CD3 antigenom u in vitro testu vezivanja, i npr. jedno CD3 antitelo: označeni CD3-VH-P (HCVR prikazano u SEQ ID NO: 1882) je identifikovano među nekoliko ostalih, za koje je pronađeno da se vezuje i za humani i cinomolgus CD3 sa EC50vezivanja između 1 i 40 nM (ili titracijom ćelijskog vezivanja), kao što je određeno u FACS titraciji Jurkatovih ćelija i T ćelija cinomolgusa, tim redom. Videti takođe, npr., FACS eksperimenti vezivanja koji su prikazani u Primeru 13 i u PCT/US2016/044732 koja je podneta 29 jula 2016.
[0282] Nakon toga su identifikovani germinativni ostaci aminokiselina CD3-VH-P (V-D-J rearanžman za CD3-VH-P je IGHV3-9*01, IGHJ6*02, IGHD5-12*01) i antitelo koje je označeno sa "CD3-VH-G" je modifikovano da sadrži samo germinativne regione okvira. Drugi derivati antitela su modifikovani dobro poznatim postupcima molekularnog kloniranja da se zamene aminokiselinski ostaci na postepen način koji je zasnovan na razlikama između germinativne sekvence i CD3-VH-P sekvnece. Svakom derivatu antitela je data "CD3-VH-G" oznaka. Videti tabelu 18.
[0283] Dok su CD3-VH-G i nekoliko drugih modifikovanih antitela zadržala svoje vezivanje kao što se može videti u FACS testovima, nekoliko anti-CD3 antitela vezanih za humani ili cinomolgus CD3 in vitro sa slabim ili bez merljivog vezivanja, kao što je 40 nM EC50. Afiniteti vezivanja, kinetike vezivanja, i druge biološke osobine kako bi se razjasnila toksičnost i farmakokinetički (pK) profili su naknadno istraživani za bispecifična antitela koja sadrže primere anti-CD3 antitela generisana u skladu sa postupcima iz ovog primera, su ovde detaljno opisani u primerima.
Primer 12: Varijabilni regioni teškog i lakog lanca (Sekvence CDR aminokiselina i nukleinskih kiselina) [0284] Tabela 22 prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca i CDRs odabranih anti-CD3 antitela iz izlaganja. Odgovarajući identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina su prikazani u Tabeli 23.
2
[0285] Sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina su određene za svaku sekvencu teškog lanca antitela. Svakom teškom lancu antitela dobijenom iz germinativne sekvence (SEQ ID NO: 1910) je dodeljena "G" oznaka za doslednu nomenklaturu. Tabela 22 prikazuje identifikatore aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i CDRs modifikovanih anti-CD3 antitela iz izlaganja. Odgovarajući identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina su prikazani u Tabeli 23. Identifikatori sekvenci aminokiselina i nukleinskih kiselina varijabilnog regiona lakog lanca i CDR-a su takođe identifikovani ispod redom u Tabelama 24 i 25.
Tabela 22: Identifikatori sekvenci aminokiselina teškog lanca
Tabela 23: Identifiktori sekvenci nukleinskih kiselina teškog lanca
(nastavak)
Tabela 24: Identifikatori sekvenci aminokiselina lakog lanca
Tabela 25: Identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina lakog lanca
[0286] Kontrolno 1 antitelo označeno sa "CD3-L2K" je konstruisano na osnovu poznatog anti-CD3 antitela (tj., anti-CD3 antitela "L2K" kao što je prikazano u WO2004/106380).
[0287] Izotip kontrolnog antitela, koje je ovde označeno u primerima, je izotip koji odgovara (modifikovano IgG4) antitelu koje interaguje sa irelevantnim antigenom, tj. FelD1 antigenom.
Primer 13: In vitro i in vivo ispitivanja na humanim monoklonskim anti-CD3 antitelima
[0288] In vivo i in vitro ispitivanja na humanim monoklonskim anti-CD3 antitelima su izvedena kao što je opisano u US objavi 2014/0088295 koja je objavljena 27 marta, 2014, i PCT/US2016/044732 podnetoj 29 jula, 2016.
[0289] Neka humana monoklonska anti-CD3 antitela vežu rastvorljivi heterodimerni CD3 protein, u formatima za hvatanje antitela ili hvatanje antigena, sa visokim afinitetom. Rastvorljivi heterodimerni CD3 protein (hCD3-epsilon/hCD3-delta; SEQ ID NOs:1900/1901) je dobiven ili sa humanim Fc tag-om (hFcΔAdp/hFc; SEQ ID NOs:1931/1932) ili mišjim Fc tag-om (mFcΔAdp/mFc; SEQ ID NOs:1933/1934). Heterodimerni CD3 protein je prečišćen upotrebom postupka koji se opisuje kod Davis et al. (US2010/0331527).
[0290] Neka humana monoklonska anti-CD3 antitela vežu humane T-ćelije i indukovanu proliferaciju T-ćelija. Neka humana monoklonska anti-CD3 antitela vezuju CD2+CD4+ T-ćelije majmuna i indujuju njihovu proliferaciju. Neka humana monoklonska anti-CD3 antitela podržavaju preusmereno ubijanje posredovano T-ćelijama preko Fc/FcR interakcije u testu ubijanja U937 zasnovanog na kalceinu. Veruje se da uočeno ubijanje, zavisi od angažovanja Fc antitela sa receptorom Fc na U937 ćelijama dovodeći do grupisanja CD3 na susednim T-ćelijama, je ugušeno dodavanjem nespecifičnog humanog IgG (podaci nisu prikazani). Širok opseg bispecifičnih antitela konstruisanih sa ovde opisanim varijantama anti-CD3 kraka (posebno anti-CD3 kraka zasnovanih na CD3-VH-P teškog lanca izvedenog iz IGHV3-9*01, IGHJ6*02, IGHD5-12*01) aktiviraju humane PBMC ćelije, i PBMC majmuna, i ispoljavaju citotoksičnu aktivnost na ćelijskim linijama koje eksprimiraju tumorski antigen.
4
Referentni primer 3: Skrining i indentifikacija anti-MUC16 monoklonskih antitela pogodnih za imunohistohemiju (IHC) na uzorcima fiksiranim parafinom u formalinu (FFPE).
[0291] Ćelijske linije humanog tumora sa poznatim nivoima ekspresije MUC16 su identifikovane, fiksirane u 10% neutralnom puferovanom formalinu i ugrađene su u parafin. Ove linije su korišćenje za skrining različitih anti-MUC16 antitela da bi se identifikovali kandidati IHC ispitivanja.
[0292] Ćelijske linije su uključivale sledeće MUC16 negativne ćelijske linije
HT29 (Kolon), i PC3/ATCC roditeljski (Prostata); Ćelijske linije pankreasa sa niskim do bez nivoa MUC16: Capan1 (Pankreasni adenokarcinom), HPAC (Pankreasni adenokarcinom).
Ćelijske linije koje endogeno eksprimiraju MUC16 obuhvataju: OVCAR3 (Jajnika) i PEO-1 (Serozni karcinom jajnika).
[0293] Transfektovane ćelijske linije su modifikovane prema sledećem: PC3/ATCC ćelije (roditeljska linija kancera prostate) su transfektovane za dobijanje PC3/MUC16 "kratke" i PC3/MUC16 "visoke" ćelijske linije. Oba konstrukta obuhvataju C-terminalni domen MUC16 iz aminokiselina 13,810-14,507 (SEQ ID NO: 1899), i ovo obuhvata deo SEA12 domena, SEA13, SEA14, SEA15, SEA16, C-terminalni ne-SEA region, transmembranski region i citoplazmatski domen. Dodatno, PC3/MUC visoko ćelije imaju dodatne N-terminalne aminokiseline 12783-13467 (SEQ ID NO: 1899) koje uključuju SEA5 (parcijalno) kroz SEA9 i kratak linker između SEA9 domena i početka MUC16 kratkog konstrukta. Ovo omogućava diferencijaciju između anti-MUC16 antitela koja se vezuju u regionu koji se ponavlja i onih koji se vezuju za "nub" deo MUC16 blizu membrane nakon enzimskog cepanja i oslobađanja regiona koji se ponavljaju (analogno CA125 delu MUC16).
[0294] Sva bojenja su sprovedena na Ventana Discovery XT autostainer korišćenjem standardnih protokola. Ćelijske pelete su deparafinizovane, optimizovano je toplotom indukovano preuzimanje epitopa, endogeni Biotin je blokiran i sprovedeno je blokiranje proteina. Antitela su ručno naneta u početnoj koncentraciji od 10mg/ml i takođe su oborena titracijom da bi se osigurala specifičnost signala. Poređenje je napravljeno protiv komercijalno dostupnog anti-MUC16 antitela (OC-125), koje je specifično za ponavljajuće regione CA-125 (Roche, Ventana Katalog# 760-2610), i negativne kontrole (odsustvo primarnog antitela). Detekcija sa anti-mišjim-biotinom magarca nakon čega sledi streptavidin-peroksidaza rena. Pretvaranje supstrata, di-amino benzidina (DAB) je uočeno kao braon bojenje. Uzorci su kontrabojeni hematoksilinom kako bi se nukleusi vizuelizovali. Rezultati eksperimenata bojenja su prikazani ispod u Tabeli 26.
16
vi elo diln a sikro -p skin bra e
ili 16
ajuir irsp ekje kolije ićeje,li će e vn i ateg -n 16
za a elitant16
-
anti
anjeiv ez
26: a elab T
[0295] Od ispitivanih antitela četiri (H1M7130N, H2aM7128N, H2aM7131N i H2aM7138N) su pokazala pozitivno vezivanje za ćelije koje eksprimiraju "nub" deo MUC16 bez regiona koji se ponavljaju (PC3/MUC16 kratki). Ova antitela su identifikovana kao "nub vezujući." Jedno od ispitivanih antitela (H1M9519N) pokazalo je pozitivno vezivanje za ćelije koje eksprimiraju regione koji se ponavljaju MUC16 (PC3/MUC16 visoko), ali negativno vezivanje za ćelije koje eksprimiraju samo "nub" deo MUC16 (PC3/MUC16 kratki). Ovo antitelo je identifikovano kao "vezujući za ponovak," slično komercijalno dostupnom OC-125 antitelu. Očekivano je da ispitivana antitela vežu tkiva ili ćelije različitog porekla koji imaju eksprimirane proteine i/ili proteinske fragmente kao što je ovde opisano.

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Bispecifično antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji sadrži prvi antigen-vezujući domen koji specifično vezuje humani CD3, i drugi antigen vezujući domen koji specifično vezuje humani MUC16, pri čemu drugi antigen-vezujući domen sadrži domene HCDRI-HCDR2-HCDR3-LCDRI-LCDR2-LCDR3, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs: 20-22-24-28-30-32.
2. Bispecifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema zahtevu 1, koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvenu SEQ ID NO: 18, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26.
3. Bispecifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema zahtevu 1 ili 2, gde prvi domen za vezivanje antigena koji specifično veže humani CD3 sadrži domene HCDRI-HCDR2-HCDR3-LCDRI-LCDR2-LCDR3, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence koje su odabrane iz grupe koja obuhvata SEQ ID NOs: 1732-1734-1736-28-30-32, 1764-1766-1768-28-30-32, 1780-1782-1784-28-30-32, 1788-1790-1792-28-30-32, i 1868-1870-1872-28-30-32.
4. Bispecifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema zahtevu 3, gde prvi domen za vezivanje antigena koji vezuje humani CD3 sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 1730, 1762, 1778, 1786, i 1866, i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26.
5. Bispecifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema zahtevu 3, gde prvi domen za vezivanje antigena sadrži domene HCDRI-HCDR2-HCDR3-LCDRI-LCDR2-LCDR3, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs: 1732-1734-1736-28-30-32 i drugi domen za vezivanje antigena sadrži domene HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs: 20-22-24-28-30-32.
6. Bispecifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema zahtevu 3, gde prvi domen za vezivanje antigena sadrži domene HCDRI-HCDR2-HCDR3-LCDRI-LCDR2-LCDR3, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs: 1868-1870-1872-28-30-32 i drugi domen za vezivanje antigena sadrži domene HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, tim redom, koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs: 20-22-24-28-30-32.
7. Bispecifično antitelo prema zahtevu 5, gde prvi domen za vezivanje antigena sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1730 i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, i gde drugi domen za vezivanje antigena sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26.
8. Bispecifično antitelo prema zahtevu 6, gde prvi domen za vezivanje antigena sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1866 i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, i gde drugi domen za vezivanje antigena sadrži HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26.
9. Bispecifično antitelo prema zahtevu 7, koje sadrži prvi vezujući krak koji sadrži težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1961 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:
4
1960, i drugi vezujući krak koji sadrži težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1959 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1960.
10. Bispecifično antitelo prema zahtevu 8, koje sadrži prvi vezujući krak koji sadrži težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1962 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1960, i drugi vezujući krak koji sadrži težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1959 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1960.
11. Farmacetuska kompozicija koja sadrži bispecifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1-10, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.
12. Bispecifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1-10, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 11, za upotrebu u postupku lečenja kancera koji eksprimira MUC16.
13. Bispecifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu prema zahtevu 12, pri čemu je kancer odabran iz grupe koja se sastoji iz kancera jajnika, kancera dojke, kancera pankreasa, kancera nemalih ćelija pluća, intrahepatičnog holangiokarcinoma-tip koji obrazuje masu, adenokarcinoma cerviksa materice, i adenokarcinoma želudačnog trakta.
14. Bispecifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu prema zahevu 12, gde je kancer kancer jajnika.
RS20230945A 2016-09-23 2017-09-22 Bispecifična anti-muc16-cd3 antitela i konjugati anti-muc16 sa lekom RS64691B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662399249P 2016-09-23 2016-09-23
US201762558711P 2017-09-14 2017-09-14
PCT/US2017/053113 WO2018067331A1 (en) 2016-09-23 2017-09-22 Bi specific anti-muc16-cd3 antibodies and nti-muc16 drug conjugates
EP17784089.9A EP3515487B1 (en) 2016-09-23 2017-09-22 Bi specific anti-muc16-cd3 antibodies and anti-muc16 drug conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64691B1 true RS64691B1 (sr) 2023-11-30

Family

ID=60083442

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220906A RS63660B1 (sr) 2016-09-23 2017-09-22 Anti-muc16 (mucin 16) antitela
RS20230945A RS64691B1 (sr) 2016-09-23 2017-09-22 Bispecifična anti-muc16-cd3 antitela i konjugati anti-muc16 sa lekom

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220906A RS63660B1 (sr) 2016-09-23 2017-09-22 Anti-muc16 (mucin 16) antitela

Country Status (29)

Country Link
US (5) US10941208B2 (sr)
EP (3) EP3515946B1 (sr)
JP (2) JP7066691B2 (sr)
KR (2) KR102531251B1 (sr)
CN (2) CN110214026B (sr)
AU (2) AU2017331363B2 (sr)
BR (2) BR112019005670A2 (sr)
CA (4) CA3287248A1 (sr)
CL (4) CL2019000712A1 (sr)
CO (1) CO2019003967A2 (sr)
CY (1) CY1125577T1 (sr)
DK (2) DK3515487T5 (sr)
ES (2) ES2925563T3 (sr)
FI (1) FI3515487T3 (sr)
HR (2) HRP20221202T1 (sr)
HU (2) HUE059761T2 (sr)
IL (2) IL265309B2 (sr)
LT (2) LT3515487T (sr)
MD (1) MD3515487T2 (sr)
MX (2) MX2019003322A (sr)
MY (2) MY200230A (sr)
PH (2) PH12019500550A1 (sr)
PL (2) PL3515946T3 (sr)
PT (2) PT3515946T (sr)
RS (2) RS63660B1 (sr)
SI (2) SI3515946T1 (sr)
SM (2) SMT202200359T1 (sr)
WO (2) WO2018067331A1 (sr)
ZA (2) ZA201901557B (sr)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
DK3277725T3 (da) 2015-03-30 2021-01-11 Regeneron Pharma Konstante tungkædeområder med reduceret binding til FC-gammareceptorer
EA039859B1 (ru) 2015-07-31 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
MY195059A (en) 2015-09-23 2023-01-05 Regeneron Pharma Optimized Anti-CD3 Bispecific Antibodies and Uses Thereof
US11583593B2 (en) 2016-01-14 2023-02-21 Synthis Therapeutics, Inc. Antibody-ALK5 inhibitor conjugates and their uses
AR107582A1 (es) 2016-02-03 2018-05-16 Amgen Res Munich Gmbh Constructos de anticuerpo biespecíficos para psma y cd3 que se ligan a células t
KR102531251B1 (ko) 2016-09-23 2023-05-15 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 이특이적 항-muc16-cd3 항체 및 항-muc16 약물 접합체
RS67792B1 (sr) 2016-12-01 2026-03-31 Regeneron Pharma Radio-obeležena anti-pd-l1 antitela za imuno-pet snimanje
BR112019016336A2 (pt) * 2017-02-10 2020-03-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Conjugado de anticorpo radiorrotulado, método para imageamento de um tecido que expressa lag3 e para tratar um tumor, e, composto.
RU2747095C2 (ru) * 2018-05-11 2021-04-26 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии" Министерства здравоохранения российской федерации (ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России) Мономолекулярный химерный т-клеточный рецептор к раковому антигену са125
CN108659131B (zh) * 2018-05-28 2021-09-14 长春力太生物技术有限公司 一种抗ceacam-5的单域抗体及其应用
CN119143875A (zh) 2018-06-21 2024-12-17 瑞泽恩制药公司 双特异性抗psma x抗cd28抗体及其用途
TW202504917A (zh) 2018-06-21 2025-02-01 美商再生元醫藥公司 用雙特異性抗CD3xMUC16抗體及抗PD-1抗體治療癌症之方法
TWI838389B (zh) * 2018-07-19 2024-04-11 美商再生元醫藥公司 雙特異性抗-BCMAｘ抗-CD3抗體及其用途
LT4324851T (lt) 2018-07-19 2025-10-10 Chimeriniai antigeno receptoriai, pasižymintys bcma specifiškumu, ir jų panaudojimas
MX2021002165A (es) 2018-08-23 2021-07-16 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-fc épsilon-r1 alfa (fcer1a), moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a fcer1a y cd3 y usos de éstos.
ES3009025T3 (en) 2018-08-31 2025-03-25 Regeneron Pharma Dosing strategy that mitigates cytokine release syndrome for cd3/cd20 bispecific antibodies
CA3116717A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method and system of identifying and quantifying a protein
JP7627216B2 (ja) * 2018-11-16 2025-02-05 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター ムチン－１６に対する抗体およびそれを使用する方法
US11249089B2 (en) 2018-12-12 2022-02-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. System and method of analysis of a protein using liquid chromatography-mass spectrometry
WO2020132024A1 (en) * 2018-12-19 2020-06-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-muc16 x anti-cd28 antibodies and uses thereof
KR20210104836A (ko) 2018-12-19 2021-08-25 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 이중 특이적 항-cd28 x 항-cd22 항체 및 그의 용도
EA202192422A1 (ru) 2019-03-05 2021-12-09 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Человеческий сывороточный альбумин в составах
EP3941941A1 (en) 2019-03-22 2022-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Egfr x cd28 multispecific antibodies
US12617866B2 (en) * 2019-05-08 2026-05-05 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Humanized antibodies to mucin-16 and methods of use thereof
WO2020256721A1 (en) * 2019-06-19 2020-12-24 Synthis, Llc Antib0dy-alk5 inhibitor conjugates and their uses
JP7743314B2 (ja) * 2019-06-21 2025-09-24 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｍｕｃ１６およびｃｄ３に結合する二重特異性抗原結合分子の４－１ｂｂ共刺激と組み合わせての使用
CN114401988A (zh) 2019-07-09 2022-04-26 国家生物技术研究所公司 具有降低的免疫原性的抗体
MX2022001942A (es) * 2019-08-15 2022-07-27 Regeneron Pharma Moléculas de union a antígeno multiespecíficas para el direcciónamiento célular y usos de las mismas.
TW202108631A (zh) * 2019-08-21 2021-03-01 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司 一種抗ｃｄ４７抗原結合蛋白及其應用
EP4025605A1 (en) * 2019-09-06 2022-07-13 Symphogen A/S Anti-cd73 antibodies
CN114340684B (zh) 2019-09-16 2025-09-12 瑞泽恩制药公司 用于免疫pet成像的放射性标记的met结合蛋白
US11814428B2 (en) 2019-09-19 2023-11-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PTCRA antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2021081232A1 (en) 2019-10-23 2021-04-29 Cue Biopharma, Inc. Modified cytotoxic t cells and methods of use thereof
IL309560B2 (en) 2019-12-06 2025-05-01 Regeneron Pharma Anti-VEGF protein preparations and methods for their production
JP7693672B2 (ja) * 2019-12-06 2025-06-17 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 二重特異性抗ｂｃｍａ×抗ｃｄ３抗体により多発性骨髄腫を治療する方法
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
MX2022013812A (es) 2020-05-08 2022-12-15 Regeneron Pharma Trampas y mini-trampas de vegf y metodos para el tratamiento de trastornos oculares y cancer.
EP4267722A1 (en) * 2020-12-22 2023-11-01 Amgen Inc. Diffusion gradient assay for anti-cd3-containing molecules
CA3202891A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Kara Olson Compositions and methods for treating cytokine release syndrome
AU2022221297A1 (en) * 2021-02-09 2023-08-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies targeting the spike protein of coronaviruses
EP4308160A4 (en) * 2021-03-18 2025-07-02 Memorial Sloan Kettering Cancer Center METHODS OF TREATING GYNECOLOGICAL CANCER USING COMBINATION THERAPY WITH MULTISPECIFIC ANTI-MUC16 X CD3 ANTIBODIES AND VEGF INHIBITORS
TW202304507A (zh) * 2021-04-02 2023-02-01 美商再生元醫藥公司 含有抗ｍｕｃ１６ｘ抗ｃｄ３雙特異性抗體之穩定調配物
CN117320700A (zh) * 2021-04-02 2023-12-29 瑞泽恩制药公司 含有抗muc16 x抗cd3双特异性抗体的稳定制剂
EP4355778A1 (en) 2021-06-17 2024-04-24 Boehringer Ingelheim International GmbH Novel tri-specific binding molecules
MX2024006187A (es) 2021-11-24 2024-08-14 Regeneron Pharma Métodos para tratar el cáncer con anticuerpos biespecíficos anti-cd3 x muc16 y anticuerpos anti-ctla-4.
MX2024008055A (es) 2022-01-07 2024-09-06 Regeneron Pharma Métodos para tratar el cáncer ovarico recurrente con anticuerpos biespecificos anti-muc16 x anti-cd3 solos o en combinación con anticuerpos anti-pd-1.
US20250092135A1 (en) * 2022-01-10 2025-03-20 Nanjing Leads Biolabs Co., Ltd. Antibody and use thereof
WO2023133358A2 (en) * 2022-01-10 2023-07-13 2Seventy Bio, Inc. Muc16 chimeric antigen receptors
IL315405A (en) 2022-03-17 2024-11-01 Regeneron Pharma Methods for treating recurrent epithelioid sarcoma using bispecific anti-MUC16 and anti-CD3 antibodies alone or in combination with anti-PD-1 antibodies
AU2023254191A1 (en) 2022-04-11 2024-10-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for universal tumor cell killing
JP2025529310A (ja) * 2022-09-06 2025-09-04 ティージェイ バイオファーマ （シャンハイ） カンパニー， リミテッド 多特異性構築物およびその使用
WO2024123698A1 (en) 2022-12-08 2024-06-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods to characterizing a fragment crystallizable domain of a bispecific antibody
AU2024223918A1 (en) 2023-02-17 2025-09-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Induced nk cells responsive to cd3/taa bispecific antibodies
JP2026508624A (ja) 2023-03-13 2026-03-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 二重特異性抗ｃｄ２２×抗ｃｄ２８分子でがんを治療する方法
CN121399157A (zh) 2023-06-12 2026-01-23 美国安进公司 淋巴毒素β受体激动剂结合蛋白
JP2026524012A (ja) 2023-07-10 2026-07-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 二重特異性ｐｄ－ｌ１×４－１ｂｂ抗体およびそれらの使用方法
JP2026524011A (ja) 2023-07-10 2026-07-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 二重特異性ｐｄ－ｌ１×ｃｄ２８抗体およびそれらの使用方法
WO2025036848A1 (en) 2023-08-11 2025-02-20 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Anti-muc16 antibodies and uses thereof
CN117024596B (zh) * 2023-08-18 2024-02-27 镜像绮点(上海)细胞技术有限公司 肿瘤原代细胞特异性标记与活体成像
EP4791777A1 (en) 2023-10-09 2026-08-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating cancer with a combination of a taaxcd3 bispecific antibody and a targeted immunocytokine
CN119978126A (zh) * 2023-11-10 2025-05-13 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 抗muc16抗体、靶向muc16的嵌合抗原受体及其应用
AR134368A1 (es) * 2023-11-17 2026-01-07 Wuxi Biologics Ireland Ltd Anticuerpos anti-muc16 y usos de los mismos
TW202539732A (zh) 2023-11-29 2025-10-16 美商再生元醫藥公司 以雙特異性抗muc16×抗cd28抗體與抗pd-1抗體之組合或與雙特異性抗muc16×抗cd3抗體之組合治療復發性卵巢癌及子宮內膜癌之方法
TW202542187A (zh) 2023-12-12 2025-11-01 美商再生元醫藥公司 以雙特異性抗muc16x抗cd3抗體單獨或與抗pd-1抗體組合治療子宮內膜癌之方法
TW202617776A (zh) 2024-07-10 2026-05-01 美商再生元醫藥公司 治療ｓｍａｒｃｂ１缺陷型癌症之方法
WO2026037330A1 (en) * 2024-08-14 2026-02-19 Leads Biolabs Inc. Antibodies binding to cd3 and uses thereof
WO2026050255A2 (en) 2024-08-27 2026-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-slc3a2-apis antigen-binding proteins and methods of use thereof
WO2026096576A1 (en) 2024-10-30 2026-05-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules that bind psma and 4-1bb and methods of use thereof

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US20070258987A1 (en) 2000-11-28 2007-11-08 Seattle Genetics, Inc. Recombinant Anti-Cd30 Antibodies and Uses Thereof
AU2002254615A1 (en) 2001-04-17 2002-10-28 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Repeat sequences of the ca125 gene and their use for diagnostic and therapeutic interventions
DE50105971D1 (de) 2001-12-04 2005-05-25 Brahms Ag Verfahren zur Diagnose von Sepsis unter Bestimmung von CA 125
DK1551876T3 (da) 2002-10-16 2011-06-14 Purdue Pharma Lp Antistoffer, der binder til celle-associerede ca 125/0722P og fremgangsmåder til anvendelse deraf
AU2004242845B2 (en) 2003-05-31 2011-06-02 Amgen Research (Munich) Gmbh Human-anti-human CD3 binding molecules
CA2556752C (en) 2004-02-23 2016-02-02 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
TW200539855A (en) 2004-03-15 2005-12-16 Wyeth Corp Calicheamicin conjugates
US7750116B1 (en) 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
ATE537190T1 (de) 2006-06-02 2011-12-15 Regeneron Pharma Hochaffine antikörper gegen den humanen il-6- rezeptor
RU2448979C2 (ru) 2006-12-14 2012-04-27 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека
WO2008122039A2 (en) 2007-04-02 2008-10-09 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Selenocysteine mediated hybrid antibody molecules
PE20090245A1 (es) 2007-05-08 2009-03-17 Genentech Inc Anticuerpos anti-muc16 disenados con cisteina y conjugados de anticuerpos y farmacos
US7985557B2 (en) 2007-05-23 2011-07-26 Ventana Medical Systems, Inc. Polymeric carriers for immunohistochemistry and in situ hybridization
US8187801B2 (en) 2008-04-24 2012-05-29 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and kits to detect and monitor ovarian cancer and preeclampsia
UA108598C2 (xx) 2008-04-30 2015-05-25 Високоефективні кон'югати та гідрофільні зшиваючі агенти (лінкери)
ES2560807T3 (es) 2008-07-21 2016-02-22 Polytherics Limited Nuevos reactivos y procedimiento de conjugación de moléculas biológicas
TWI507525B (zh) 2009-06-26 2015-11-11 Regeneron Pharma 具天然免疫球蛋白形式之易分離的雙專一性抗體
JO3182B1 (ar) 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
DK2889624T3 (en) 2009-08-10 2018-12-10 Ucl Business Plc Reversible covalent bonding of functional molecules
SG183149A1 (en) 2010-02-08 2012-09-27 Regeneron Pharma Common light chain mouse
CA2793753C (en) 2010-03-26 2018-06-05 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antibodies to muc16 and methods of use thereof
PT2528625E (pt) 2010-04-15 2013-10-17 Spirogen Sarl Pirrolobenzodiazepinas e conjugados das mesmas
US20130244905A1 (en) 2010-07-06 2013-09-19 Ed Grabczyk Reporter for RNA Polymerase II Termination
WO2012070029A1 (en) * 2010-11-26 2012-05-31 University Of The Witwatersrand, Johannesburg A pharmaceutical composition
DK2714685T3 (en) 2011-05-27 2017-01-09 Ambrx Inc FORMATIONS CONTAINING, METHODS INVOLVING, AND USES OF NON-NATURAL AMINO ACID BOUND dolastatin
US8815226B2 (en) 2011-06-10 2014-08-26 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates
CA2850375C (en) 2011-10-14 2019-07-02 Seattle Genetics, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and targeted conjugates
AU2012322934B2 (en) 2011-10-14 2016-09-08 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines
JP6166728B2 (ja) 2011-10-14 2017-07-19 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピンの製造に有用な合成方法及び中間体
CA2850373C (en) 2011-10-14 2019-07-16 Seattle Genetics, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and targeted conjugates
WO2013068874A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Pfizer Inc. Antibody-drug conjugates
BR112014013526A8 (pt) 2011-12-05 2017-06-13 Igenica Biotherapeutics Inc conjugados de anticorpo-fármaco e compostos, composições e métodos relacionados
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
EP3964237B1 (en) 2013-03-15 2026-02-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Biologically active molecules, conjugates thereof, and therapeutic uses
AU2014311361B2 (en) 2013-08-26 2018-11-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising macrolide diastereomers, methods of their synthesis and therapeutic uses
HUE050159T2 (hu) * 2013-12-17 2020-11-30 Genentech Inc Anti-CD3 antitestek és alkalmazási eljárások
TWI754319B (zh) * 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
EA201790719A1 (ru) * 2014-09-26 2017-07-31 Макродженикс, Инк. Биспецифические моновалентные диатела, которые способны связывать cd19 и cd3, а также их применения
KR102618312B1 (ko) 2015-03-17 2023-12-28 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 항muc16 항체 및 그의 용도
CA2978340C (en) 2015-03-27 2024-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Maytansinoid derivatives, conjugates thereof, and methods of use
MY195059A (en) 2015-09-23 2023-01-05 Regeneron Pharma Optimized Anti-CD3 Bispecific Antibodies and Uses Thereof
KR102531251B1 (ko) 2016-09-23 2023-05-15 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 이특이적 항-muc16-cd3 항체 및 항-muc16 약물 접합체
JP7743314B2 (ja) * 2019-06-21 2025-09-24 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｍｕｃ１６およびｃｄ３に結合する二重特異性抗原結合分子の４－１ｂｂ共刺激と組み合わせての使用
TW202304507A (zh) * 2021-04-02 2023-02-01 美商再生元醫藥公司 含有抗ｍｕｃ１６ｘ抗ｃｄ３雙特異性抗體之穩定調配物
MX2024006187A (es) * 2021-11-24 2024-08-14 Regeneron Pharma Métodos para tratar el cáncer con anticuerpos biespecíficos anti-cd3 x muc16 y anticuerpos anti-ctla-4.
MX2024008055A (es) * 2022-01-07 2024-09-06 Regeneron Pharma Métodos para tratar el cáncer ovarico recurrente con anticuerpos biespecificos anti-muc16 x anti-cd3 solos o en combinación con anticuerpos anti-pd-1.

Also Published As

Publication number Publication date
IL265309B2 (en) 2024-04-01
NZ751903A (en) 2025-09-26
IL265369B1 (en) 2023-11-01
IL265369A (en) 2019-05-30
KR102531251B1 (ko) 2023-05-15
KR20190067808A (ko) 2019-06-17
US12570764B2 (en) 2026-03-10
CL2021002645A1 (es) 2022-04-29
CN110036032B (zh) 2023-09-05
SI3515946T1 (sl) 2022-09-30
JP7066691B2 (ja) 2022-05-13
LT3515946T (lt) 2022-08-10
MX2019003322A (es) 2019-08-05
CA3287248A1 (en) 2026-03-02
MY200230A (en) 2023-12-15
IL265369B2 (en) 2024-03-01
US10941208B2 (en) 2021-03-09
CA3037536C (en) 2026-02-17
US20260234286A1 (en) 2026-08-13
PT3515946T (pt) 2022-08-04
SMT202200359T1 (it) 2022-11-18
DK3515487T5 (da) 2024-09-02
HRP20231281T1 (hr) 2024-02-02
EP4273172A3 (en) 2024-02-28
CA3037738A1 (en) 2018-04-12
FI3515487T3 (fi) 2023-08-15
CL2023002690A1 (es) 2024-02-02
BR112019005670A2 (pt) 2019-06-04
AU2017339711A1 (en) 2019-04-11
PL3515946T3 (pl) 2022-11-07
JP7066690B2 (ja) 2022-05-13
MD3515487T2 (ro) 2023-11-30
ES2952735T3 (es) 2023-11-03
DK3515487T3 (da) 2023-08-28
PH12019500604A1 (en) 2019-06-03
CA3315142A1 (en) 2026-08-05
IL265309A (en) 2019-05-30
MX2019003326A (es) 2019-09-10
EP3515946A1 (en) 2019-07-31
EP3515946B1 (en) 2022-07-06
CL2019000712A1 (es) 2019-05-31
MY194596A (en) 2022-12-06
CA3037536A1 (en) 2018-03-29
KR102418667B1 (ko) 2022-07-12
CL2019000726A1 (es) 2019-05-31
JP2019533807A (ja) 2019-11-21
AU2017331363A1 (en) 2019-04-11
US20230272111A1 (en) 2023-08-31
US20200317810A1 (en) 2020-10-08
RS63660B1 (sr) 2022-11-30
SI3515487T1 (sl) 2023-09-29
KR20190073377A (ko) 2019-06-26
JP2019536740A (ja) 2019-12-19
EP3515487A1 (en) 2019-07-31
CN110214026B (zh) 2023-12-05
PT3515487T (pt) 2023-08-24
LT3515487T (lt) 2023-08-25
ZA201901557B (en) 2024-08-28
CY1125577T1 (el) 2026-02-25
IL265309B1 (en) 2023-12-01
EP3515487B1 (en) 2023-07-19
AU2017331363B2 (en) 2024-06-13
PH12019500550A1 (en) 2019-05-27
WO2018067331A9 (en) 2018-06-07
HUE063020T2 (hu) 2023-12-28
CN110214026A (zh) 2019-09-06
CO2019003967A2 (es) 2019-05-10
PL3515487T3 (pl) 2024-01-15
HUE059761T2 (hu) 2022-12-28
US20180112001A1 (en) 2018-04-26
DK3515946T5 (da) 2024-09-02
HRP20221202T1 (hr) 2022-12-09
DK3515946T3 (en) 2022-08-01
EP4273172A2 (en) 2023-11-08
CN110036032A (zh) 2019-07-19
ZA201901591B (en) 2024-05-30
WO2018067331A1 (en) 2018-04-12
US10738130B2 (en) 2020-08-11
ES2925563T3 (es) 2022-10-18
SMT202300308T1 (it) 2023-11-13
NZ751907A (en) 2025-09-26
US11485793B2 (en) 2022-11-01
BR112019005697A2 (pt) 2019-07-16
AU2017339711B2 (en) 2024-06-06
US20180118848A1 (en) 2018-05-03
WO2018058003A1 (en) 2018-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12570764B2 (en) Anti-MUC16 antibodies, antibody-drug conjugates, and bispecific antigen-binding molecules that bind MUC16 and CD3, and uses thereof
JP7695420B2 (ja) 抗ｓｔｅａｐ２抗体、抗体－薬物複合体、およびｓｔｅａｐ２とｃｄ３を結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにそれらの使用
HK40102994A (en) Bi specific anti-muc16-cd3 antibodies and anti-muc16 drug conjugates
HK40011846B (en) Bi specific anti-muc16-cd3 antibodies and anti-muc16 drug conjugates
HK40011846A (en) Bi specific anti-muc16-cd3 antibodies and anti-muc16 drug conjugates
HK40011845A (en) Anti-muc16 (mucin 16) antibodies
HK40011845B (en) Anti-muc16 (mucin 16) antibodies
EA045730B1 (ru) Анти-muc16 (mucin16) антитела
EA039842B1 (ru) Биспецифичные анти-muc16-cd3 антитела и конъюгаты анти-muc16-лекарственное средство