RS67621B1 - Postupak i kompozicije za ćelijsku imunoterapiju - Google Patents

Postupak i kompozicije za ćelijsku imunoterapiju

Info

Publication number
RS67621B1
RS67621B1 RS20251321A RSP20251321A RS67621B1 RS 67621 B1 RS67621 B1 RS 67621B1 RS 20251321 A RS20251321 A RS 20251321A RS P20251321 A RSP20251321 A RS P20251321A RS 67621 B1 RS67621 B1 RS 67621B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
cell
chimeric receptor
spacer
ror1
Prior art date
Application number
RS20251321A
Other languages
English (en)
Inventor
Stanley R Riddell
Michael Hudecek
Michael Jensen
Original Assignee
Fred Hutchinson Cancer Center
Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49054932&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS67621(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst filed Critical Fred Hutchinson Cancer Center
Publication of RS67621B1 publication Critical patent/RS67621B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4203—Receptors for growth factors
    • A61K40/4205—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/17—Hinge-spacer domain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Description

[0001] Opis
[0002] Oblast pronalaska
[0003] Ovaj pronalazak odnosi se na oblast biomedicine i određene postupke korisne u terapiji kancera. Određenije, načini ostvarivanja ovog pronalaska odnose se na postupke i kompozicije za izvođenje ćelijske imunoterapije koja obuhvata T ćelije modifikovane receptorima koji ciljaju tumor.
[0004] Pozadina pronalaska
[0005] Adoptivni prenos humanih T limfocita koji su konstruisani prenosom gena da bi se eksprimirali himerni antigeni receptori (himerni receptori) specifični za površinske molekule eksprimirane na tumorskim ćelijama ima potencijal da efektivno leči uznapredovale malignitete. Himerni receptori su sintetički receptori koji uključuju ekstracelularni ligand vezujući domen, najčešće neki jednolančani varijabilni fragment monoklonalnog antitela (scFv) vezanog za intracelularne signalizirajuće komponente, najčešće CD3Z sam ili kombinovan sa jednim ili više kostimulatornih domena. Većina istraživanja u konstrukciji himernih receptora fokusirana je na definisanje scFvs i drugih ligand vezujućih elemenata koji ciljaju maligne ćelije bez izazivanja ozbiljne toksičnosti osnovnim normalnim tkivima, i na definisanje optimalne kompozicije modula intracelularne signalizacije za aktivaciju efektorskih funkcija T ćelija. Međutim, neizvesno je da li će se varijacije u konstrukciji himernih receptora koji posreduju superiornu in vitro funkciju prevesti reproduktivno na poboljšanu in vivo terapijsku aktivnost u kliničkim primenama T ćelija modifikovanih himernim receptorima.
[0006] Postoji potreba da se identifikuju postupci za određivanje elemenata konstrukcije himernih receptora koji su značajni za terapijsku aktivnost i ćelijske populacije radi genetičke modifikacije i adoptivnog prenosa koji obezbeđuju povećano preživljavanje i efikasnost in vivo.
[0007] Koehler et al., Advances in Hematology, 180(9):6365-13, January 2012, odnosi se na konstruisane T-ćelije za adoptivnu terapiju hronične limfocitne leukemije B-ćelija.
[0008] Suština pronalaska
[0009] Ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid himernog receptora koja obuhvata:
[0010] a) ligand vezujući domen, pri čemu se taj ligand vezujući domen vezuje za ligand, gde ligand vezujući domen je jednolančani varijabilni fragment koja specifično vezuje CD19; i gde ligand vezujući domen sadrži aminokiselinsku sekvencu DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIY HTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFG GGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTV SGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYN S ALKSRLTIIKDN
[0011] SKS Q VFLKMN SLQTDDT AIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVS
[0012] S;
[0013] b) spejser dužine koja je specifična za ligand, pri čemu taj je dužine od 12 aminokiselina i obuhvata aminokiselinsku sekvencu: ESKYGPPCPPCP;
[0014] c) transmembranski domen; i
[0015] d) intracelularni signalizirajući domen.
[0016] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje nukleinsku kiselinu himernog receptora koja kodira polipeptid himernog receptora prema ovom pronalasku.
[0017] Pronalazak takođe obezbeđuje ekspresioni vektor koji obuhvata izolovanu nukleinsku kiselinu himernog receptora prema pronalasku.
[0018] Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju domaćina koja obuhvata polipeptid himernog receptora prema pronalasku ili ekspresioni vektor prema pronalasku.
[0019] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata ćeliju domaćina ovog pronalaska u farmaceutski prihvatljivom ekscipijensu.
[0020] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju domaćina ovog pronalaska ili kompoziciju ovog pronalaska, za upotrebu u lečenju kancera.
[0021] Načini ostvarivanja ovog pronalaska opisani su u nekim od primera u nastavku.
[0022] Jedan primer odnosi se na postupke i kompozicije za dodeljivanje i/ili povećanje imunih odgovora posredovanih ćelijskom imunoterapijom, kao što je adoptivnim prenošenjem genetički modifikovanih podskupova CD8+ ili CD4+ T ćelija specifičnih za tumor, sami ili u kombinaciji. U drugim ovde opisanim primerima su nukleinske kiseline himernih receptora, i vektori i ćelije domaćina koji uključuju takve nukleinske kiseline. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni receptor vezuje zajedno brojne modularne komponente koje se mogu izrezati i zameniti drugim komponentama u cilju prilagođavanja himernog receptora za efikasnu T ćelijsku aktivaciju i prepoznavanje specifičnog ciljanog molekula ili epitopa na ciljanom molekulu.
[0023] U primerima, nukleinska kiselina himernog receptora obuhvata polinukleotid koji kodira ligand vezujući domen, gde taj ligand predstavlja molekul eksprimiran na malignim ili inficiranim ćelijama, polinukleotid koji kodira polipeptidni spejser, gde je taj polipeptidni spejser oko 200 aminokiselina ili manje, polinukleotid koji kodira transmembranski domen; i polinukleotid koji kodira intracelularne signalizirajuće domene. U primerima, polipeptidni spejser obuhvata modifikovani IgG4 region šarke koji sadrži aminokiselinsku sekvencu X1PPX2P koja može biti vezana za druge aminokiselinske sekvence uključujući ali neograničavajući se na CH2 i CH3 ili CH3 samo sekvence od Ig Fc. Iznenađujuće je otkriveno da dužina spejser regiona za koji se pretpostavlja da nema sposobnost signalizacije utiče na in vivo efikasnost T ćelija modifikovanih radi eksprimiranja himernog receptora i da ga treba prilagoditi za pojedinačne ciljane molekule za prepoznavanje optimalnog tumora ili ciljanih ćelija.
[0024] [0014] U ostalim primerima ovde je opisana izolovana nukleinska kiselina himernog receptora koja sadrži: polinukleotid koji kodira neki ligand vezujući domen, pri čemu taj ligand predstavlja antigen specifičan za tumor, virusni antigen ili bilo koji drugi molekul eksprimiran na ciljanoj ćelijskoj populaciji koji je pogodan da posreduje u prepoznavanju i eliminisanju limfocitom; polinukleotid koji kodira neki polipeptidni spejser pri čemu je polipeptidni spejser prilagođene dužine koja je specifična za svaki ciljani ligand, gde spejser obezbeđuje poboljšanu proliferaciju T ćelija i/ili proizvodnju citokina u odnosu na referentni himerni receptor; polinukleotid koji kodira neki transmembranski domen; i polinukleotid koji kodira jedan ili više intracelularnih signalizirajućih domena. U primerima, dugi spejser koristi se ako je epitop na ciljanom ligandu u proksimalan membranim položaju, a kratki spejser koristi se ako je epitop na ciljanom ligandu u membranski distalnom položaju. Neki primeri uključuju ekspresione vektore i ćelije domaćina koji obuhvataju izolovani himerni receptor kao što je opisan ovde.
[0025] U ostalim primerima, ovde opisani polipeptid himernog receptora koji obuhvata ligand vezujući domen, pri čemu ligand predstavlja antigen specifičan za tumor, virusni antigen ili bilo koji drugi molekul koji je eksprimiran na ciljanoj ćelijskoj populaciji i može da bude ciljan radi posredovanja u prepoznavanju i eliminisanju limfocitima; polipeptidni spejser, pri čemu je taj polipeptidni spejser oko 10-229 aminokiselina; transmembranski domen; i jedan ili više intracelularnih signalizirajućih domena. U primerima, polipeptidni spejser obuhvata modifikovani IgG region šarke koji sadrži aminokiselinsku sekvencu XiPPX2P.
[0026] U ostalim primerima ovde su opisane kompozicije za dodeljivanje i/ili povećanje imunih odgovora posredovanih ćelijskom imunoterapijom, kao što je adoptivnim prenošenjem podskupspecifičnih genetički modifikovanih CD4+ T ćelija specifičnih za tumor, pri čemu CD4+ T ćelije dodeljuju i/ili povećavaju sposobnost CD8+ T ćelija da održe anti-tumorsku reaktivnost i povećaju i/ili maksimiziraju tumor-specifičnu proliferaciju. U nekim primerima, CD4+ ćelije su genetički modifikovane radi eksprimiranja neke nukleinske kiseline himernog receptora i/ili polipeptida himernog receptora kao što su opisani ovde.
[0027] U ostalim primerima ovde su opisane kompozicije za dodeljivanje i/ili povećanje imunih odgovora posredovanih ćelijskom imunoterapijom, kao što je adoptivnim prenošenjem podskupspecifičnih genetički modifikovanih CD8+ T ćelija specifičnih za tumor. U primerima, CD8+ ćelije eksprimiraju nukleinsku kiselinu himernog receptora i/ili polipeptid himernog receptora kao što su opisani ovde.
[0028] U nekom drugom primeru, kompozicija adoptivne ćelijske imunoterapije koja ima preparat sa genetički modifikovanim CD8+ citotoksičnim T limfocitom za dodeljivanje i/ili povećanje imunih odgovora, pri čemu taj preparat citotoksičnih T limfocita obuhvata CD8+ T ćelije koje eksprimiraju himerni receptor koji obuhvata ligand vezujući domen za ligand povezan sa bolešću ili poremećajem, prilagođen spejser region, transmembranski domen; i intracelularni signalizirajući domen T ćelije ili ostalih receptora, kao što je kostimulatorni domen, i/ili preparat genetički modifikovanih pomoćnih T limfocita, pri čemu taj preparat pomoćnih T limfocita ima CD4+ T ćelije koje eksprimiraju himerni receptor koji obuhvata varijabilni domen antitela specifičan za ligand povezan sa bolešću ili poremećajem, prilagođen spejser region, transmembranski domen; i jedan ili više intracelularnih signalizirajućih domena.
[0029] [0019] U jednom primeru ovde je opisan postupak izvođenja ćelijske imunoterapije na subjektu koji ima neku bolest ili poremećaj davanjem subjektu nekog preparata genetički modifikovanih citotoksičnih T limfocita koji obezbeđuje ćelijski imuni odgovor, pri čemu taj preparat citotoksičnih T limfocita obuhvata CD8+ T ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata polinukleotid koji kodira ligand vezujući domen, pri čemu ligand predstavlja antigen specifičan za tumor, virusni antigen ili bilo koji drugi molekul eksprimiran na ciljanoj ćelijskoj populaciji koji je pogodan da posreduje u prepoznavanju i eliminisanju limfocitom; polinukleotid koji kodira polipeptidni spejser pri čemu je polipeptidni spejser prilagođene dužine koja je specifična za svaki ciljani ligand, gde spejser obezbeđuje poboljšanu proliferaciju T ćelija i/ili proizvodnju citokina u odnosu na referentni himerni receptor; polinukleotid koji kodira transmembranski domen; i polinukleotid koji kodira jedan ili više intracelularnih signalizirajućih domena. U primerima, ligand vezujući domen je ekstracelularni varijabilni domen antitela specifičan za ligand povezan sa bolešću ili poremećajem. Neki primer uključuje preparat genetički modifikovanih pomoćnih T limfocita koji gde preparat pomoćnih T limfocita obuhvata CD4+ T ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata polinukleotid koji kodira ligand vezujući domen, pri čemu ligand predstavlja antigen specifičan za tumor, virusni antigen, ili bilo koji drugi molekul eksprimiran na ciljanoj ćelijskoj populaciji koji je pogodan da posreduje u prepoznavanju i eliminisanju limfocitom; polinukleotid koji kodira polipeptidni spejser pri čemu je polipeptidni spejser prilagođene dužine koja je specifična za svaki ciljani ligand, pri čemu spejser obezbeđuje poboljšanu proliferaciju T ćelija i/ili proizvodnju citokina u odnosu na referentni himerni receptor; polinukleotid koji kodira transmembranski domen; i polinukleotid koji kodira jedan ili više intracelularnih signalizirajućih domena. U primerima, genetički modifikovana CD8+ i genetički modifikovana CD4+ ćelijska populacija zajednički se daju. U primerima, T ćelije su autologne ili alogene T ćelije.
[0030] Različite modifikacije gorepomenutog postupka su moguće. Na primer, himerni receptor koji je eksprimiran CD4+ T ćelijom i CD8+ T ćelijom može biti isti ili različiti.
[0031] U drugom slučaju ovde je opisana proizvodnja kompozicije adoptivne imunoterapije dobijanjem preparata tumor-specifičnih CD8+ citotoksičnih T limfocita modifikovanih himernim receptorom, koji izaziva ćelijski imuni odgovor i eksprimira antigen-reaktivan himerni receptor, pri čemu preparat modifikovanih citotoksičnih T limfocita obuhvata CD8+ T ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata ligand vezujući domen, pri čemu ligand predstavlja antigen specifičan za tumor, virusni antigen ili bilo koji drugi molekul eksprimiran na ciljanoj ćelijskoj populaciji koji je pogodan da posreduje u prepoznavanju i eliminisanju limfocitom; polipeptidni spejser pri čemu je polipeptidni spejser prilagođene dužine koja je specifična za svaki ciljani ligand, gde spejser obezbeđuje poboljšanu proliferaciju T ćelija i/ili proizvodnju citokina u odnosu na referentni himerni receptor; transmembranski domen; i jedan ili više intracelularnih signalizirajućih domena.; i/ili opisano je dobijanje modifikovane naivne ili memorijske CD4+ T pomoćne ćelije, pri čemu preparat modifikovanih pomoćnih T limfocita obuhvata CD4+ ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata ligand vezujući domen, pri čemu ligand predstavlja antigen specifičan za tumor, virusni antigen ili bilo koji drugi molekul eksprimiran na ciljanoj ćelijskoj populaciji koji je pogodan da posreduje u prepoznavanju i eliminisanju limfocitom; polipeptidni spejser pri čemu je polipeptidni spejser prilagođene dužine koja je specifična za svaki ciljani ligand, gde spejser obezbeđuje poboljšanu proliferaciju T ćelija i/ili proizvodnju citokina u odnosu na referentni himerni receptor; transmembranski domen; i jedan ili više intracelularnih signalizirajućih domena.
[0032] Ovi i ostali primeri prema pronalsku su dalje u pratećem opisu, nacrtu i patentnim zahtevima.
[0033] Kratak opis nacrta
[0034]
[0035] Slika 1 Biblioteka spejser sekvenci. Konstruisana je biblioteka plazmida koja sadrži kodon optimizovane DNK sekvence koje kodiraju ekstracelularne komponente uključujući IgG4 šarke samu, IgG4 šarku vezanu za CH2 i CH3 domene, ili IgG4 šarku vezanu za CH3 domen. Bilo koja scFV sekvenca (VH i VL) može biti klonirana 5' u sekvence koje kodiraju ovu biblioteku varijabilnih spejser domena. Spejser domeni su, zauzvrat, vezani za CD28 transmembranske i intracelularne signalizirajuće domene i za CD3 zeta. T2A sekvenca u vektoru razdvaja himerni receptor od selektibilnog markera koji kodira okrnjen humani epidermalni receptor faktora rasta (tEGFR).
[0036] Slika 2: In vitro citotoksičnost, proizvodnja citokina i proliferacija T-ćelija modifikovanih radi eksprimiranja 2A2 ROR1 himernih receptora sa modifikovanom dužinom spejsera. (A) Fenotip prečišćenih CD8+ T<CM>-izvedenih ćelijskih linija modifikovanih svakim od 2A2 ROR1 himernih receptora sa dugim, srednjim i kratkim spejser domenom. Bojenje anti-F(ab) antitelom koje vezuje neki epitop u 2A2 scFV pokazuje površinsku ekspresiju ROR1 himernih receptora sa spejserom pune dužine ili okrnjenim spejserom. (B) Citolitička aktivnost T-ćelija koje eksprimiraju različite 2A2 ROR1 himerne receptore sa dugim (•), srednjim (▲) i kratkim spejserom (◆ ), ili tEGFR kontrolnog lentivirusnog vektora protiv ROR1+ (x) i kontrolnih ciljanih ćelija. Trakasti dijagram sumira podatke o citotoksičnosti iz 3 nezavisna eksperimenta (E:T = 30:1) normalizovane na citolitičku aktivnost sa 2A2 ROR1 himernim receptorom 'dugi' = 1, i analiziran Studentovim t-testom. (C) Rastvor CFSE boje korišćen je da bi se izmerila proliferacija 2A2 ROR1 himernog receptora i tEGFR kontrolnih T-ćelija, 72 sata posle stimulacije sa Raji/ROR1 (levi panel) i primarnim CLL ćelijama (desni panel) bez dodavanja egzogenih citokina. Za analizu, bunaričići u triplikatu su pulovani i proliferacija živih (PI-), CD8+ T-ćelija je analizirana. Brojevi iznad svakog histograma ukazuju na broj deoba ćelija kojima je podvrgnut proliferirajući podskup, i frakcija T-ćelija u svakoj kontroli koja je podvrgnuta ≥ 4/3/2/1 deobama ćelija obezbeđena je pored svakog plota. (D) Složeno ispitivanje citokina supernatanata dobijenih posle 24 sata od ko-kultura u triplikatu 5x10<4>T-ćelija koje eksprimiraju različite 2A2 ROR1 himerne receptore sa Raji/ROR1 i primarnim CLL ćelijama. Složeni podaci za citokine iz 3 nezavisna eksperimenta su normalizovani (oslobađanje citokina od strane 2A2 ROR1 himernog receptora 'dugi' = 1) i analizirani Studentovim t-testom (desni trakasti dijagram).
[0038] Slika 3. R11 himerni receptor zahteva dugi spejser za prepoznavanje ROR1+ tumorskih ćelija. Sekvence koje kodiraju scFV iz R11 monoklonalnog antitela koje je specifično za epitop u Kringl domenu, proksimalnoj membrani, orfanskog receptora nalik tirozin kinazi ROR1 klonirane su ushodno od sekvenci IgG4 šarke samo (kratki), IgG4 šarke/CH3 (srednji), i IgG4 šarke/CH2/CH3 u biblioteci himernih receptora koja sadrži 4-1BB kostimulatorne domene i pripremljene kao lentivirusni vektori. A). Humane CD8+ T ćelije su transdukovane i efikasnost transdukcije sa svakim od kratkih, srednjih i dugih himernih receptora je određena bojenjem tEGFR markera. B). Transdukovane T ćelije koje eksprimiraju kratki (gore), srednji (sredina) i dugi (dole) analizirane su za lizu K562 ćelija leukemije same ili transfektovane radi eksprimiranja ROR1. Samo T ćelije koje eksprimiraju himerni receptor sa dugim spejserom efikasno su ubile ROR1+ K562 ćelije. C). Transdukovane T ćelije koje eksprimiraju kratki (gore), srednji (sredina) i dugi (dole) obeležene su sa CFSE, stimulisane sa K562 ćelijama koje eksprimiraju ROR1 ili CD19 (kontrola) i ispitane za ćelijsku proliferaciju tokom 72 sata. T ćelije koje eksprimiraju himerni receptor sa dugim spejserom proliferisale su specifično na ROR1+ K562 ćelijama. D). Transdukovane T ćelije koje eksprimiraju kratki (gore), srednji (sredina) i dugi (dole) stimulisane su sa Raji limfomnim ćelijama i K562 ćelijama koje su eksprimirale ROR1 ili CD19 (kontrola) i ispitane za izlučivanje interferona gama u supernatant tokom 24 sata. T ćelije koje eksprimiraju himerni receptor sa dugim spejserom proliferisale su i proizvele su najviše nivoe interferona gama kao odgovor na ROR1 pozitivne ciljane ćelije.
[0039] Slika 4: Dizajn ROR1 himernih receptora modifikovane dužine spejsera i izvedenih iz 2A2 i R12 scFV sa različitim afinitetom. (A) Dizajn lentivirusnih transgenih umetaka koji kodiraju grupu ROR1 himernih receptora koji sadrže 2A2 scFV, IgG4-Fc izveden spejser 'Šarka-CH2-CH3' (dugi spejser, 229 AA), 'Šarka-CH3' (srednji, 119 AA), ili 'Šarka' samo (kratki, 12 AA), i modul signalizacije sa CD3Z i CD28. Svaka kaseta himernog receptora sadrži okrnjen EGFR marker kodiran nishodno od T2A elementa. (B) Lentivirusni transgeni umeci koji kodiraju ROR1-specifične himerne receptore izvedene iz R12 i 2A2 scFV sa kratkim IgG4-Fc 'Šarka' spejserom (12 AA), i modul signalizacije koji sadrži CD28 ili 4-1BB i CD3Z respektivno (ukupno: 4 konstrukta).
[0041] Slika 5: Anti-tumorska reaktivnost T-ćelija modifikovanih ROR1 himernim receptorima izvedenim iz mAb R12 sa većim afinitetom od 2A2. (A) tEGFR ekspresija na prečišćenim poliklonalnim CD8+ TcM-izvedenim T-ćelijskim linijama modifikovanim sa svakim od R12 i 2A2 ROR1 himernim receptorima sa kratkim IgG4-Fc 'Šarka' spejserom, i CD28 ili 4-1BB kostimulatornim domenom. (B) Citotoksičnost protiv ROR1+ i kontrolnih ciljanih ćelija od strane T-ćelija koje eksprimiraju R12(28-▲; 4-1BB-Δ) i 2A2 ROR1 himerne receptore (28-•; 4-1BB<o>) ili tEGFR kontrolni vektor (x). Složeno ispitivanje citokina supernatanata dobijenih posle 24 sata iz ko-kultura 5x10<4>T-ćelija koje eksprimiraju različite ROR1 himerne receptore sa Raji/ROR1 tumorskim ćelijama. Srednji/desni trakasti dijagrami pokazuju normalizovane složene podatke iz 3 nezavisna eksperimenta (oslobađanje citokina od strane ROR1 himernog receptora 2A2 = 1) analizirane Studentovim t-testom. (D) Ispitana je proliferacija T-ćelija sa ROR1 himernim receptorom i tEGFR kontrolnih T-ćelija 72 sata posle stimulacije sa Raji/ROR1 ćelijama i bez dodavanja egzogenih citokina pomoću rastvora CFSE boje. Brojevi iznad svakog histograma ukazuju na broj deoba ćelija kojima je podvrgnut proliferirajući podskup, a frakcija T-ćelija u svakoj kontroli koja je podvrgnuta ≥4/3/2/1 deobama ćelija obezbeđena je iznad svakog plota.
[0043] Slika 6: Analiza proizvodnje citokina i proliferacije CD4+ T-ćelijskih linija modifikovanih ROR1 himernim receptorom izvedenim iz mAb R12 sa većim afinitetom od 2A2. (A-B) 2A2 i R12 ROR1 himerni receptori imali su kratki spejser i CD28 kostimulatorni domen. (A) Složena analiza citokina iz supernatanata dobijenih 24 sata posle stimulacije 5x10<4>CD4+T-ćelija koje eksprimiraju 2A2 i R12 ROR1 himerni receptor sa Raji/ROR1 tumorskim ćelijama. (B) Proliferacija CD4+ T-ćelija sa R12 i 2A2 ROR1 himernim receptorima i tEGFR kontrolnih T-ćelija 72 sata posle stimulacije sa Raji/ROR1 ćelijama i bez dodavanja egzogenih citokina ispitana je rastvorom CFSE boje. Brojevi iznad svakog histograma ukazuju na broj deoba ćelija kojima je podvrgnut proliferirajući podskup, a frakcija T-ćelija u svakoj kontroli koja je podvrgnuta ≥5/4/3/2/1 deobama ćelija obezbeđena je iznad histograma.
[0044] Slika 7: Prepoznavanje primarnih CLL od strane T-ćelija modifikovanih 2A2 i R12 ROR1 himernim receptorima sa optimalnim kratkim spejserom i 4-1BB kostimulatornim domenom ili sa CD19-specifičnim himernim receptorom. (A) Ekspresija ROR1/CD19 na primarnim CLL, i CD80/86 na primarnim CLL i Raji/ROR1 tumorskim ćelijama (plotovi sa crnim tačkama) koji može da angažuje CD28 na T-ćelijama sa himernim receptorom (beli histogrami). Bojenje kontrolnim mAb podudarajućeg izotipa prikazano je kao plotovi/histogrami sa sivim tačkama. (B) Citolitička aktivnost T-ćelija koje eksprimiraju 2A2(^) i R12 ROR1 himerni receptor (■), CD19-specifični himerni receptor (▲) i T-ćelija modifikovanih tEGFR kontrolnim vektorom (x) protiv primarnih CLL (levi dijagram) i normalnih B ćelija (desni dijagram) analizirana je testom oslobađanja hroma. Podaci o citotoksičnosti protiv primarnih CLL iz 4 nezavisna eksperimenta (E:T = 30:1) su normalizovani (citolitička aktivnost ROR1 himernim receptorom 2A2 = 1) i analizirani Studentovim t-testom (trakasti dijagram). (C) Složena analiza citokina posle 24-časovne stimulacije 5x10<4>T-ćelija sa himernim receptorom sa primarnim CLL ćelijama. Oslobađanje citokina nestimulisanih T-ćelija sa himernim receptorom bilo je ispod 3.6 pg/ml (granica detekcije) (levi trakasti dijagram). ELISA za IFN-y proizvodnju od strane 5x10<4>T-ćelija sa 2A2 i R12 ROR1 himernim receptorom posle 24-časovne ko-kultivacije sa primarnim CLL. O.G. od 1 odgovara približno 250 pg/ml (desni trakasti dijagram). (D) Proliferacija CD8+T-ćelija modifikovanih 2A2 ROR1, R12 ROR1 i CD19 himernim receptorom, 72 sata posle stimulacije sa primarnim CLL ćelijama. Brojevi iznad svakog histograma ukazuju na broj deoba ćelija, a frakcija T-ćelija u svakoj kontroli koja je podvrgnuta ≥3/2/1 deobama ćelija obezbeđena je pored svakog plota.
[0045] Slika 8: Funkcija CD8+ T-ćelija modifikovanih RORl-himernim receptorom i CD19-himernim receptorom protiv primarnih CLL je povećana pomoću CD4+ pomoćnih T-ćelija modifikovanih himernim receptorom. (A) ELISA za IL-2 proizvodnju od ko-kultura u triplikatu 5x10<4>CD8+ i CD4+ T-ćelija koje eksprimiraju R12 ROR1 i CD19-himerni receptor respektivno, inkubiranih sa primarnim CLL tokom 24-sata. O.G. od 1 odgovara približno 800 pg/ml. (B) Proliferacija CD8+ T- ćelija modifikovanih himernim receptorom kao odgovor na primarne CLL je poboljšana dodavanjem CD4+ T-ćelija modifikovanih himernim receptorom. CFSE-obeležene CD8+ T-ćelije koje eksprimiraju 2A2 ROR1, R12 ROR1 i CD19-himerni receptor respektivno, kokultivisane su sa tumorskim ćelijama i sa 2A2 ROR1, R12 ROR1 i CD19-himerni receptor transdukovanim ili kontrolnim netransdukovanim CD4+ T-ćelijama (CD8+:CD4+ = 1:1). Proliferacija CD8+ podskupa je analizirana 72 sata posle stimulacije. Brojevi iznad svakog histograma ukazuju na broj deoba ćelija, a frakcija T-ćelija u svakoj kontroli koja je podvrgnuta ≥3/2/1 deobama ćelija obezbeđena je iznad svakog plota.
[0046] Slika 9: In vivo anti-tumorska efikasnost T-ćelija sa 2A2 ROR1, R12 ROR1 i CD19 himernim receptorom. Kohorte miševa inokulisane su sa 0.5x10<6>JeKo-1/ffluc MCL injekcijom u repnu venu, i 5x10<6>T-ćelije sa 2A2 ROR1, R12 ROR1 ili CD19 himernim receptorom, ili T-ćelije koje eksprimiraju tEGFR kontrolni vektor date su 7 dana posle inokulacije tumora. Svi konstrukti himernog receptora imali su kratki IgG4 'Šarka-samo spejser i 4-1BB kostimulatorni domen. (A, B) Serijsko bioluminescentno snimanje tumora u kohortama miševa tretiranih T-ćelijama koje eksprimiraju 2A2 ROR1 himerni receptor (▼), R12 ROR1 himerni receptor visokog afiniteta (■), CD19-specifični himerni receptor (▲), sa T-ćelijama transdukovanih sa tEGFR samo (•), i netretiranih miševa. Bioluminescentno snimanje pokazalo je manifestacije tumora u koštanoj srži i grudnom košu i tako, intenzitet signala je izmeren u regionima od interesa koji su obuhvatali celo telo i grudni koš svakog pojedinačnog miša. (C) Kaplan-Meier-ova analiza preživljavanja u pojedinačnim grupama tretiranja i kontrolnim grupama. Statističke analize su izvedene pomoću log-rank testa. Podaci prikazani na A-C reprezentativni su za rezultate dobijene u 2 nezavisna eksperimenta. (D) Proliferacija T-ćelija sa 2A2 ROR1, R12 ROR1 i CD19 himernim receptorom in vivo. NSG/JeKo-1 miševi opterećeni tumorom primili su jednu dozu 5x10<6>CFSE-obeleženih T-ćelija sa 2A2 ROR1, R12 ROR1 ili CD19 himernim receptorom 7. dana posle inokulacije tumora, i 72 h kasnije periferna krv, koštana srž i slezina su prikupljene od svakog pojedinačnog miša. Frekvencija i proliferacija živih (PI-), CD45+ CD8+ tEGFR+ T-ćelija je analizirana. Frekvencija T-ćelija sa 2A2 ROR1, R12 ROR1 i CD19 himernim receptorom, respektivno, obezbeđena je levo od svakog histograma kao procenat živih ćelija, a frakcija T- ćelija koja je podvrgnuta ≥4/3/2/1 deobama ćelija obezbeđena je iznad svakog plota.
[0047] Slika 10 Ekspresija ROR1 i NKG2D liganada na epitelijalnim ćelijskim linijama kancera. (A) Ekspresija ROR1 na trostruko negativanim ćelijskim linijama kancera dojke MDA-MB-231 i 468, i ćelijske linije kancera bubrega FARP, TREP i RWL (crni histogrami). Bojenje kontrolnog antitela podudarajućeg izotipa prikazano je kao sivi histogrami. (B) Ekspresija CD80/86 i NKG2D liganada MICA/B na MDA-MB-231 i Raji/ROR1 tumorskim ćelijama, i NKG2D (CD314) na T- ćelijama sa 2A2 i R12 ROR1-himernim receptorom. Bojenje kontrolnih mAb podudarajućeg izotipa prikazano je kao plotovi/histogrami sa sivim tačkama.
[0048] Slika 11: T-ćelije modifikovane ROR1-himernim receptorom prepoznaju ROR1+ epitelijalne tumorske ćelije in vitro. (A) Test oslobađanja hroma da bi se ocenila citolitička aktivnost T-ćelija modifikovanih R12 ROR1-himernim receptorom (kratki spejser/4-1BB kostimulatorni domen, zatvoreni simboli) i tEGFR kontrolnih T-ćelija (otvoreni simboli) protiv ROR1+ ćelijskih linija kancera dojke i kancera bubrega. (A-D) 2A2 i R12 ROR1-himerni receptori imali su optimalni kratki spejser i 4-1BB kostimulatorni domen. (B) Složena analiza citokina posle stimulacije T- ćelija koje eksprimiraju 2A2 i R12 ROR1-himerni receptor sa MDA-MB-231 i Raji/ROR1 tumorskim ćelijama. (C) Proliferacija CD8+ T-ćelija modifikovanih 2A2 i R12 ROR1-himernim receptorom 72 sata posle stimulacije MDA-MB-231 tumorskim ćelijama. Za analizu, bunarčići u triplikatu su pulovani i proliferacija živih (PI-), CD8+ T-ćelija je analizirana. Brojevi iznad svakog histograma ukazuju na broj deoba ćelija kojima je podvrgnut proliferirajući podskup, a frakcija T- ćelija u svakoj kontroli koja je podvrgnuta ≥4/3/2/1 deobama ćelija obezbeđena je pored svakog histograma. (D) ELISA za IL-2 proizvodnju od strane T-ćelija sa R12 ROR1-himernim receptorom posle 24-časovne ko-kultivacije sa MDA-MB-231 u običnoj podlozi, i posle dodavanja koktela antitela koji blokira NKG2D put [anti-NKG2D (klon 1D11), anti-MICA/B (klon 6D4) i anti-ULBP] ili kontrolnih mAb podudarajućeg izotipa. O.G. od 0.6 odgovara približno 1900 pg/ml.
[0049] Slika 12. Efekat dužine ekstracelularnog spejsera na prepoznavanje i pokretanje lize tumorskih ćelija od strane CD8+ humanih T ćelija koje eksprimiraju HER2-specifični himerni receptor. A.) Prikaz lokacije Herceptin Fab epitopa na epitopu proksimalnom membrani tumorskih ćelija na humanom HER2, B.) Strukturni formati varijanti dužine Herceptin scFv CAR spejsera kao -T2A- vezani polipeptidi sa transmembranskim proteinom EGFRt markera na karboksilnom kraju, C.) Detekcija pomoću Western blot tehnike ekspresije Herceptin-CAR varijanti kratkih, srednjih i dugih spejsera u humanim CD8+ CTL, D.) Detekcija EGFRt protočnom citometrijom pomoću transdukovanih humanih CD8+ CTL transdukovanih sa Herceptin CAR varijantama, zatim imunomagnetno prečišćenih pomoću mikroperli Herceptinbiotina, anti-biotina, E.) Izrazita citolitička funkcija pomoću T ćelija transdukovanih radi eksprimiranja Herceptin CAR varijanti (kratki - S; srednji - M; i dugi - L) protiv HER2+ Med411FH i D283 humanih ćelijskih linija meduloblastoma (D341 je HER2<->kontrolna ćelijska linija meduloblastoma, umetnuti plotovi toka su tumorske ciljane linije obojene anti-HER2 specifičnim mAb). Zelena=ceo IgG4 (Dugi spejser,▼ ), Plavo=IgG4šarka:CH3(Srednji Spejser; ▲), Crveno=IgG4šarka samo (Kratki spejser; ■).
[0050] Slika 13: Vektori CD19-himernog receptora i generacija T ćelija sa CD19-himernim receptorom. (A) Dizajn lentivirusnih transgenih umetaka koji kodiraju grupu CD19-specifičnih himernih receptora koji se razlikuju po dužini ekstracelularnih spejsera i intracelularnoj kostimulaciji. Svaki himerni receptor kodirao je CD19-specifični jednolančani varijabilni fragment izveden iz FMC63 mAb u VL-VH orijentaciji, IgG4-izveden spejser domen od Šarka-CH2-CH3 (dugi spejser, 229 AA) ili Šarka samo (kratki spejser, 12 AA), i modul signalizacije koji sadrži CD3Z sa CD28 ili 4-1BB sam ili u tandemu. Svaka kaseta himernog receptora sadrži okrnjen EGFR marker kodiran nishodno od cepljivog 2A elementa. (B, C) Poliklonalne T ćelijske linije modifikovane svakim od CD19- konstrukata himernog receptora su pripremljene od prečišćenih CD8+ CD45RO+ CD62L+ centralnih memorijskih T ćelija (TCM) normalnih donora. Nakon lentivirusne transdukcije, transgen-pozitivne T ćelije u svakoj ćelijskoj liniji prečišćene su pomoću tEGFR markera i raširene za in vitro i in vivo eksperimente. (D) MFI posle bojenja za tEGFR marker pokazuje ekvivalentnu ekspresiju transgena u T ćelijama modifikovanim svakim od CD19-himernih receptora.
[0051] Slika 14: In vitro citotoksičnost, proizvodnja citokina i proliferacija T ćelija modifikovanih različitim CD19-himernim receptorima. (A) Citolitička aktivnost T ćelija koje eksprimiraju različite CD19-himerne receptore protiv CD19+ i kontrolnih ciljanih ćelija. (B) Složeno ispitivanje citokina supernatanata dobijenih posle 24 sata od ko-kultivisanja u triplikatu T ćelija koje eksprimiraju različite CD19-himerne receptore i K562 ćelija transfektovanih sa CD19, i CD19+ Raji ćelijama. (C) Poređenje proizvodnje citokina pomoću T ćelija koje eksprimiraju različite CD19- himerne receptore. Složeni podaci za citokine iz 6 nezavisnih eksperimenata su normalizovani (oslobađanje citokina od strane CD19-himernog receptora 'kratki/CD28' CTL = 1) i analizirani Studentovim t-testom. (D) Rastvor CFSE boje korišćen je da bi se izmerila proliferacija T ćelija sa CD19-himernim receptorom 72 sata posle stimulacije sa K562/CD19 (gornji panel) i CD19+ Raji tumorskim ćelijama (donji panel) bez dodavanja egzogenih citokina. Za analizu, bunarčići u triplikatu su pulovani i analizirana je proliferacija živih (PI-), CD8+ T ćelija. Brojevi iznad svakog histograma ukazuju na broj deoba ćelija kojima je podvrgnut proliferirajući podskup, a frakcija T ćelija u svakoj kontroli koja je podvrgnuta ≥4/3/2/1 deobama ćelija obezbeđena je gore levo na svakom plotu. (E) PI bojenje izvedeno je na kraju 72-časovnog kokultivisanja T ćelija koje eksprimiraju različite CD19-himerne receptore sa Raji tumorskim ćelijama. Procenat PI+ ćelija unutar T ćelijske linije (CD3+) sa himernim receptorom obezbeđen je u svakom histogramu.
[0052] Slika 15: T ćelije sa CD19-himernim receptorom sa kratkim ekstracelularnim spejser domenom iskorenile su Raji tumore kod NOD/SCID miševa. (A) Kohorte miševa su inokulisane sa Raji-ffluc injekcijom u repnu venu, i T ćelije transdukovane sa CD19-himernim receptorima koji sadrže duge i kratke spejser domene ili sa tEGFR sam date su 2. i 9. dana posle inokulacije tumora injekcijom u repnu venu. Progresija i širenje tumora ocenjeno je serijskim bioluminescentnim snimanjem posle injekcije supstrata luciferina. (B) Serijsko bioluminescentno snimanje tumora u kohortama miševa ili tretiranim T ćelijama koje eksprimiraju CD19-himerne receptore sa kratkim spejser ('kratki/CD28' i 'kratki/4-1BB') i dugim spejser ('dugi/CD28' i 'dugi/4-1BB') domenima, T ćelijama transdukovanim sa tEGFR kontrolnim vektorom, ili netretirani. Svaki dijagram koji predstavlja kohorte miševa tretirane CD19-himernim receptorom ili tEGFR transdukovanim T ćelijama takođe pokazuje srednju vrednost progresije tumora u netretiranim miševima za poređenje (crveni trouglovi). (C) Kaplan-Meier-ove analize preživljavanja netretiranih miševa i miševa tretiranih T ćelijama koje eksprimiraju CD19-himerne receptore sa kratkim spejser ('kratki/CD28' i 'kratki/4-IBB'), dugim spejser ('dugi/CD28' i 'dugi/4-1BB') domenima, i kontrolnim tEGFR. Statističke analize izvedene su pomoću log-rank testa. Podaci prikazani na B i C reprezentativni su za rezultate dobijene u 3 nezavisna eksperimenta.
[0053] Slika 16: T ćelije sa CD19-himernim receptorom sa kratkim spejserom (kratki/4-1BB) iskorenjuju ustanovljene Raji tumore kod NSG miševa na način zavisan od doze. (A) Miševi su inokulisani sa Raji-ffluc injekcijom u repnu venu i prihvatanje kalema tumora potvrđeno je bioluminescentnim snimanjem 6. dana.7. dana, miševi su primili jednu i.v. injekciju različitih doza T ćelija transdukovanih sa CD19-himernim receptorom 'kratki/4-1BB' ili sa tEGFR-kontrolnim lentivirusom. (B, C) Dozno zavisna anti-tumorska efikasnost T ćelija koje eksprimiraju CD19-himerni receptor 'kratki/4-1BB'. Kontrolna kohorta miševa primila je jednu veliku dozu T ćelija modifikovanih sa samim tEGFR. (D) Perzistencija T ćelija sa CD19-himernim receptorom nakon adoptivnog prenosa u NSG/Raji miševe. Analiza protočnom citometrijom periferne krvi (oko krvari) u kohorti miševa tretiranih sa 2.5x10<6>T ćelijama sa CD19-himernim receptorom 'kratki/4-1BB'. Frekvencija CD8+ tEGFR+T ćelija prikazana je kao procenat živih ćelija periferne krvi.
[0054] Slika 17: T ćelije koje eksprimiraju CD19-himerne receptore sa kratkim spejserom i ili CD28 ili 4- 1BB efikasnije su protiv ustanovljenog limfoma od onih koje eksprimiraju CD19-himerne receptore sa dugim spejserom. (A) NSG miševi su inokulisani sa Raji-ffluc 0. dana, i tretirani 7. dana sa jednom dozom 2.5x10<6>T ćelija sa CD19 himernim receptorom koje eksprimiraju kratki ili dugi spejser i ili CD28 ili 4-1BB kostimulatorni domen. (B) Kaplan-Meier-ove analize preživljavanja miševa u svakoj od grupa tretiranja. Statističke analize izvedene su pomoću logrank testa. (C) Bioluminescentno snimanje kohorti miševa tretiranih sa T ćelijama koje eksprimiraju CD19-himerne receptore sa kratkim spejsersom ('kratki/CD28' u 'kratki/4-1BB'), i dugim spejsersom ('dugi/CD28 i 'dugi/4-1BB'). Srednja vrednost opterećenja tumorom posmatrana kod netretiranih miševa u svakoj vremenskoj tački prikazana je u svakom dijagramu za poređenje (trouglovi). (D) In vivo perzistencija T ćelija koje eksprimiraju CD19-himerni receptor sa kratkim spejser domenom je poboljšana u odnosu na T ćelije koje eksprimiraju CD19-himerne receptore sa dugim spejser domenom. Frekvencija CD8+ tEGFR+ T ćelija u perifernoj krvi uzetoj 3. i 10. dana posle prenosa je određena protočnom citometrijom i prikazana je kao procenat živih (PI-) ćelija periferne krvi. Statističke analize izvedene su Studentovim t-testom. Podaci prikazani na B-D su reprezentativni za rezultate dobijene u 3 nezavisna eksperimenti.
[0055] Slika 18: Povećanje doze T ćelija sa himernim receptorom ili povećanje kostimulatorne signalizacije nije poboljšalo anti-tumorsku efikasnost CD19-himernih receptora sa dugim spejser domenom protiv ustanovljenog limfoma. (A) Citolitička aktivnost T ćelija koje eksprimiraju 'dugi/CD28', 'dugi/4-1BB' i 'dugi/CD28_4-1BB' CD19 himerne receptore protiv CD19+ i kontrolnih ciljanih ćelija. (B) Složeno ispitivanje citokina supernatanta dobijenog posle 24 sata od ko-kultivacije u triplikatu K562/CD19 i Raji tumorskih ćelija sa T ćelijama koje eksprimiraju različite CD19-himerne receptore. (C) Ocenjivanje proliferacije T ćelija sa CD19-
[0058] 1
[0059] himernim receptorom 72 sata posle stimulacije sa CD19+ tumorskim ćelijama (K562/CD19 -levi panel; Raji - desni panel) rastvorom CFSE boje. Za analizu, bunarčići u triplikatu su pulovani i proliferacija živih (PI-) CD8+ T ćelija je analizirana. Brojevi iznad svakog histograma ukazuju na broj deoba ćelija kojima je podvrgnut proliferirajući podskup, a frakcija T ćelija u svakoj kontroli koja je podvrgnuta ≥4/3/2/1 deobama ćelija obezbeđena je gore levo od svakog plota.
[0060] (D) Kaplan-Meier-ove analize preživljavanja miševa tretiranih T ćelijama koje eksprimiraju CD19-himerne receptore sa kratkim ('kratki/CD28') i dugim spejser domenom ('dugi/CD28' i 'dugi/CD28_4-1BB'), ili T ćelijama modifikovanim tEGFR-kodirajućim kontrolnim lentivirusnim vektorom. Statističke analize izvedene su pomoću log-rank testa. (E) Bioluminescentno snimanje kohorti miševa tretiranih T ćelijama koje eksprimiraju CD19-himerne receptore sa kratkim spejserom ('kratki/CD28') i dugim spejserima ('dugi/CD28 i 'dugi/CD28_4- 1BB'). Dijagrami prikazuju srednju progresiju tumora u netretiranim miševima za poređenje (crveni trouglovi). (F) In vivo perzistencija T ćelija koje eksprimiraju različite CD19-himerne receptore. Frekvencija CD8+ tEGFR+ T ćelija u perifernoj krvi uzetoj 3. i 10. dana posle prenosa određena je protočnom citometrijom i prikazana je kao procenat živih (PI-) ćelija periferne krvi. Statističke analize izvedene su Studentovim t-testom.
[0061] Slika 19: T ćelije sa CD19-himernim receptorom sa dugim spejser domenom aktivirane su tumorom in vivo, ali nisu dovele do porasta broja ćelija. (A) Ekspresija CD69 i CD25 na T ćelijama modifikovanim sa svakim CD19-himernim receptorom pre prenosa u NSG/Raji miševe. (B) Kohorte miševa su inokulisane Raji-ffluc tumorskim ćelijama i 7 dana kasnije primili su CFSE-obeležene T ćelije transdukovane sa CD19-himernim receptorom ili kontrolne T ćelije. Koštana srž i slezine su prikupljene od podgrupa miševa 24 i 72 sata posle davanja T ćelija. (C,D) Multiparametarska analiza protočnom citometrijom jednojedarnih ćelija koštane srži dobijenih 24 sata (C) i 72 sata (D) posle T ćelijskog prenosa. Tačkasti plotovi prikazuju anti CD3 i anti CD45 bojenje posle kontrole na PI<->ćelijama radi detektovanja vijabilnih humanih T ćelija. CD3<->CD45+ kontrola sadrži Raji tumorske ćelije. Ekspresija CD25 i CD69 na živim (PI-) CD3+ CD45+ T ćelijama prikazana je u histogramima. (E) Frekvencija CD3+ CD45+ T ćelija u slezinama uzetim 24 i 72 sata posle T ćelijskog prenosa. Tačkasti plotovi su kontrole na živim PI<->splenocitima, a procenat CD3+ CD45+ T ćelija prikazan je u svakom plotu. (F) PI bojenje koštane srži i splenocita satima posle T ćelijskog prenosa u NSG/Raji miševe. Brojevi u histogramima označavaju procenat PI+ ćelija unutar CD3+ populacije. (G) Bioluminescentno snimanje kohorti miševa tretiranih T ćelijama koje eksprimiraju CD19-himerne receptore sa kratkim spejserom ('kratki/CD28' i 'kratki/4-1BB'), dugim spejserima ('dugi/CD28 i 'dugi/4-1BB'), ili kontrolnim T ćelijama.
[0062] Slika 20: T ćelije koje eksprimiraju CD19 himerne receptore sa 4-1BB i CD3zeta i modifikovanim IgG4-Fc šarkom pokazuju superiornu in vitro i in vivo funkciju u odnosu na T ćelije koje eksprimiraju CD19 himerne receptore sa 4-1BB i CD3zeta i CD8 alfa šarkom. A.
[0063] Citolitička aktivnost T-ćelija modifikovanih CD19 himernim receptorom sa IgG4 Fc šarkom, CD8 alfa šarkom i kontrolnih T ćelija protiv Cr<51>-obeleženih K562 ćelija transfektovanih sa CD19, Raji limfomnih ćelija koje eksprimiraju CD19, i K562 kontrolnih T ćelija. Liza je prikazana za različite E/T odnose u 4-časovnom testu Cr<51>oslobađanja. B. Proizvodnja interferona gama od strane 5x10<4>T ćelija koje eksprimiraju CD19 himerni receptor sa IgG4 Fc šarkom ili CD8 alfa šarkom posle 24-časovne kokultivacije sa Raji tumorskim ćelijama. O.G. od 1 odgovara ~500 pg/ml interferona gama. C. Test sa rastvorom CFSE boje radi merenja proliferacije T ćelija koje eksprimiraju CD19 himerni receptor sa IgG4 Fc šarkom ili CD8 alfa šarkom i T ćelija koje eksprimiraju tEGFR sam (kontrola) posle 72 sata kokultivacije sa CD19 pozitivnim Raji limfomnim ćelijama. Brojevi iznad svakog histograma ukazuju na broj deoba ćelija koje je pretrpela podvrsta proliferirajućih ćelija. Frakcija T ćelija u svakoj kontroli koja je podvrgnuta >3/2/1 deobama ćelija obezbeđena je pored plota. D. In vivo antitumorska aktivnost T ćelija koje eksprimiraju CD19 himerni receptor sa IgG4 Fc šarkom (grupa 1) ili CD8 alfa šarkom (grupa 2) i T ćelija koje eksprimiraju tEGFR sam (grupa 3) kod NSG miševa inokulisanih Raji tumorskim ćelijama koje eksprimiraju luciferazu svica (ffluc). Miševi su snimljeni 17 dana posle inokulacije tumora i 10 dana posle inokulacije T ćelija. Podaci pokazuju veće opterećenje tumorom kod miševa tretiranih kontrolnim tEGFR T ćelijama (grupa 3) ili T ćelija sa CD19 himernim receptorom sa CD8 alfa šarkom (grupa 2) u odnosu na miševe tretirane T ćelijama sa CD19 himernim receptorom sa IgG4 Fc šarkom (grupa 1).
[0064] Detaljan opis
[0065] Osim ako je drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi korišćeni ovde imaju isto značenje kao što ga obično razume prosečan stručnjak u oblasti na koju se ovaj pronalazak odnosi.
[0066] " Oko" kao što se ovde koristi kada se odnosi na merljivu vrednost treba da obuhvata varijacije ±20% ili ±10%, poželjnije ±5%, čak poželjnije ±1%, i još poželjnije ±0.1% od naznačene vrednosti.
[0067] "Aktivacija", kao što se ovde koristi, odnosi se na stanje T ćelije koja je dovoljno stimulisana da indukuje detektabilnu ćelijsku proliferaciju, proizvodnju citokina ili ekspresiju ćelijskih površinskih markera kao što su CD69 i CD25, ili detektabilne efektorske funkcije.
[0068] "Aktiviranjem izazvana ćelijska smrt" kao što se ovde koristi odnosi se na stanje T ćelije koja je aktivirana ali ne može da se razmnožava više od 2 generacije i ispoljava markere apoptoze.
[0069] "Antigen" ili "Ag" kao što se ovde koristi odnosi se na neki molekul koji izaziva imuni odgovor. Ovaj imuni odgovor može da uključuje ili proizvodnju antitela ili aktivaciju specifičnih imunološki kompetentnih ćelija, ili oba. Jasno je očigledno da antigen može biti generisan sintetisan, proizveden rekombinantno ili može biti izveden iz biološkog uzorka. Takav biološki uzorak može da uključuje, ali nije ograničen na uzorak tkiva, uzorak tumora, ćeliju ili biološki fluid.
[0070] " Anti-tumorski efekat" kao što se ovde koristi, odnosi se na biološki efekat, koji se može manifestovati smanjenjem zapremine tumora, smanjenjem broja tumorskih ćelija, smanjenjem broja metastaza, povećanjem očekivanog trajanja života ili smanjenjem različitih fizioloških simptoma povezanih sa kancerogenim stanjem. "Anti-tumorski efekat" takođe može da se manifestuje smanjenjem recidiva ili povećanjem vremena pre recidiva.
[0071] " Himerni receptor" kao što se ovde koristi odnosi se na sintetički konstruisan receptor koji obuhvata ligand vezujući domen antitela ili druge proteinske sekvence koji se vezuje za molekul povezan sa bolešću ili poremećajem, a vezuje se preko spejser domena sa jednim ili više intracelularnih signalizirajućih domena T ćelije ili drugih receptora, kao što je kostimulatorni domen.
[0072] " Kostimulatorni domen," kao izraz koristi se ovde i odnosi se na signalizirajući ostatak koji obezbeđuje T ćelijama signal koji, pored primarnog signala obezbeđenog od strane, na primer, CD3 zeta lanca TCR/CD3 kompleksa, posreduje T ćelijski odgovor, uključujući, ali bez ograničavanja na, aktivaciju, proliferaciju, diferencijaciju, izlučivanje citokina, i slično. Kostimulatorni domen može da uključuje sve ili deo, ali nije ograničen na, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, , ICOS, antigen-1 povezan sa funkcijom limfocita(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, i ligand koji se specifično vezuje sa CD83. U primerima, kostimulatorni domen je intracelularni signalizirajući domen koji uzajamno deluje sa ostalim intracelularnim posrednicima radi posredovanja ćelijskog odgovora uključujući aktivaciju, proliferaciju, diferencijaciju i izlučivanje citokina, i slično.
[0073] [0032] "Koji kodira" koristi se ovde i odnosi se na svojstvo specifičnih sekvenci nukleotida u polinukleotidu, kao što je gen, cDNK ili mRNK, da služe kao šabloni za sintezu ostalih makromolekula kao što je definisana sekvenca aminokiselina. Tako, gen kodira protein ako transkripcija i translacija mRNK koja odgovara genu proizvodi protein u ćeliji ili drugom biološkom sistemu. "Sekvenca nukleinske kiseline koji kodira polipeptid" uključuje sve nukleotidne sekvence koje su degenerisane verzije jedne drugih i koje kodiraju istu aminokiselinsku sekvencu.
[0074] " Citotoksični T limfocit "(CTL) kao što se ovde koristi odnosi se na T limfocit koji eksprimira CD8 na njegovoj površini (tj., CD8+ T ćelija). U nekim primerima, takve ćelije su poželjno "memorijske" T ćelije (TM ćelije) koje su antigen-iskusne.
[0075] " Centralna memorijska" T ćelija (ili "TCM") kao što se ovde koristi odnosi se na antigen-iskusne CTL koji eksprimiraju CD62L ili CCR-7 i CD45RO na svojoj površini, a ne eksprimiraju ili imaju smanjenu ekspresiju CD45RA u odnosu na naivne ćelije. U primerima, centralne memorijske ćelije su pozitivne za ekspresiju CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO i CD95, i imaju smanjenu ekspresiju CD54RA u odnosu na naivne ćelije.
[0076] " Efektorska memorijska" T ćelija (ili "TEM") kao što se ovde koristi odnosi se na antigen-iskusnu T ćeliju koja ne eksprimira ili ima smanjenu ekspresiju CD62L na svojoj površini u odnosu na centralne memorijske ćelije, a ne eksprimira ili ima smanjenu ekspresiju CD45RA u odnosu na naivnu ćeliju. U primerima, efektorske memorijske ćelije su negativne za ekspresiju CD62L i CCR7, u odnosu na naivne ćelije ili centralne memorijske ćelije, i imaju varijabilnu ekspresiju CD28 i CD45RA.
[0077] " Naivne " T ćelije kao što se ovde koristi odnose se na antigen-neiskusni T limfocit koji eksprimira CD62L i CD45RA, a ne eksprimira CD45RO- u odnosu na centralne ili efektorske memorijske ćelije. U nekim primerima, naivni CD8+ T limfociti karakterišu se ekspresijom fenotipskih markera naivnih T ćelija koje uključuju CD62L, CCR7, CD28, CD127 i CD45RA.
[0078] " Efektorske " "TE" T ćelije kao što se ovde koristi odnosi se na antigen-iskusne citotoksične T limfocite koji ne eksprimiraju ili imaju smanjenu ekspresiju CD62L, CCR7, CD28, i pozitivni su za granzim B i perforin u odnosu na centralne memorijske ili naivne T ćelije.
[0079] "Obogaćen" i "osiromašen" kao što se ovde koristi da opiše količine tipova ćelija u mešavini odnosi se na podvrgavanje mešavine ćelija obradi ili fazi koja rezultuje povećanjem broja "obogaćenog" tipa i smanjenjem broja "osiromašenih" ćelija. Tako, zavisno od izvora originalne populacije ćelija podvrgnutih obradi obogaćivanja, mešavina ili kompozicija može da sadrži oko 60, 70, 80, 90, 95 ili 99 procenata ili više (u broju ili brojanju) "obogaćenih" ćelija i oko 40, 30, 20, 10, 5 ili 1 procenat ili manje (u broju ili brojanju) "osiromašenih" ćelija.
[0080] "Epitop" kao što se ovde koristi odnosi se na deo antigena ili molekula koji je prepoznat od strane imunog sistema koji uključuje antitela, T ćelije i/ili B ćelije. Epitopi obično imaju najmanje 7 aminokiselina i mogu biti linearni ili konformacioni.
[0081] " Izolovan," kada se koristi da opiše različite polipeptide opisane ovde, predstavlja polipeptid ili nukleinsku kiselinu koja je identifikovana i razdvojena i/ili izolovana od komponente njenog prirodnog okruženja. Poželjno, izolovani polipeptid ili nukleinska kiselina je bez povezivanja sa svim komponentama sa kojima je prirodno povezana. Kontaminirajuće komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi obično ometali dijagnostičke ili terapeutske upotrebe polipeptida ili nukleinske kiseline, a mogu da uključuju enzime, hormone i ostale proteinske ili neproteinske rastvorljive materije.
[0082] " Intracelularni signalizirajući domen" kao što se ovde koristi odnosi se na ceo ili deo jednog ili više domena molekula (ovde molekul himernog receptora) koji obezbeđuje aktivaciju nekog limfocita. Intracelularni domeni tih molekula posreduju signal uzajamnim delovanjem sa ćelijskim posrednicima
[0085] 1
[0086] da bi došlo do proliferacije, diferencijacije, aktivacije i ostalih efektorskih funkcija. U primerima, ti molekuli uključuju ceo ili delove CD28, CD3, 4-1BB i njihovih kombinacija.
[0087] "Ligand" kao što se ovde koristi odnosi se na supstancu koja se specifično vezuje za drugu supstancu radi obrazovanja kompleksa. Primer liganada uključuje epitope na antigenima, molekule koji se vezuju za receptore, supstrate, inhibitore, hormone i aktivatore. "Ligand vezujući domen" kao što se ovde koristi odnosi se na supstancu ili deo supstance koji se vezuje za ligand. Primeri ligand vezujućih domena uključuju antigen-vezujuće delove antitela, ekstracelularne domene receptora i aktivna enzimska mesta.
[0088] " Funkcionalno povezan" kao što se ovde koristi odnosi se na funkcionalnu vezu između regulatorne sekvence i heterolognu sekvencu nukleinske kiseline koja dovodi do ekspresije potonje. Na primer, prva sekvenca nukleinske kiseline je funkcionalno povezana sa drugom sekvencom nukleinske kiseline kada se prva sekvenca nukleinske kiseline nalazi u funkcionalnoj vezi sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, promoter je funkcionalno povezan sa kodirajućom sekvencom ako promoter utiče na transkripciju ili ekspresiju kodirajuće sekvence. Uopšteno, funkcionalno povezane DNK sekvence su susedne i, gde je potrebno da se spoje dva regiona koja kodiraju protein, u istom okviru čitanja.
[0089] " Procenat (%) identiteta aminokiselinskih sekvenci" u odnosu na polipeptidne sekvence himernog receptora identifikovane ovde definiše se kao procenat aminokiselinskih ostataka u kandidatnoj sekvenci koji su identični aminokiselinskim ostacima u referentnoj sekvenci za svaki od ligand vezujućeg domena, spejsera, transmembranskog domena, i/ili limfocit aktivirajućeg domena, posle poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, po potrebi, kako bi se postigao najveći procentni identitet sekvenci, a ne uzimajući u obzir bilo koje konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvenci. Poravnanje za svrhe određivanja procenta identiteta aminokiselinskih sekvenci može se postići na različite načine koji su u okviru veštine u tehnici, na primer, korišćenjem javno dostupnog kompjuterskog softvera kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ili Megalign (DNASTAR) softvera. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući bilo koje algoritme potrebne da se postigne maksimalno poravnanje po celoj dužini sekvenci koje se porede. Na primer, % vrednosti identiteta aminokiselinskih sekvenci generisane su pomoću WU-BLAST-2 kompjuterskog programa [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)] koji koristi nekoliko parametara pretrage, od kojih je većina podešena na zadate vrednosti. Oni koji nisu podešeni na zadate vrednosti (tj., podesivi parametri) podešeni su sa sledećim vrednostima: raspon preklapanja =1, frakcija preklapanja=0.125, prag reči (T)=11 i matrica bodovanja=BLOSUM62. % vrednost identiteta aminokiselinskih sekvenci određena je deljenjem (a) broja podudarajućih identičnih aminokiselinskih ostataka između svake ili svih polipeptidnih aminokiselinskih sekvenci sekvence referentnog himernog receptora obezbeđene u Tabeli 2 i poređenje aminokiselinske sekvence od interesa kao što je određeno pomoću WU-BLAST-2 sa (b) ukupan broj aminokiselinskih ostataka polipeptida od interesa.
[0090] [0045]" Polinukleotid varijante himernog receptora" ili "sekvenca nukleinske kiseline varijante himernog receptora" kao što se ovde koristi odnosi se na polipeptid-kodirajući molekul nukleinske kiseline, kao što je definisan dole koji ima najmanje oko 80% identiteta sekvenci nukleinske kiseline sa polinukleotidnom kiselinskom sekvencom prikazanom u Tabeli 1 ili njegovim specifično izvedenim fragmentom, kao što je polinukleotid koji kodira antigen-vezujući domen, polinukleotid koji kodira spejser domen, polinukleotid koji kodira transmembranski domen i/ili polinukleotid koji kodira limfocit stimulatorni domen. Obično, varijanta polinukleotida ili njegovog fragmenta himernog receptora imaće najmanje oko 80% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 81% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 82% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 83% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 84% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 85% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 86% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 87% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 88% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 89% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 90% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 91% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 92% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 93% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 94% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 95% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 96% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 97% identiteta sekvenci nukleinske kiseline, poželjnije najmanje oko 98% identiteta sekvenci nukleinske kiseline i još poželjnije najmanje oko 99% identiteta sekvenci nukleinske kiseline sa sekvencom nukleinske kiseline kao što je prikazana u Tabeli ili njen izveden fragment. Varijante ne obuhvataju nativnu nukleotidnu sekvencu. U vezi s tim, zbog degeneracije genetičkog koda, prosečan stručnjak u ovoj oblasti odmah će prepoznati da veliki broj polinukleotida varijanti himernog receptora koji imaju najmanje oko 80% identiteta sekvenci nukleinske kiseline sa nukleotidnom sekvencom iz Tabele 1 kodiraće polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je identična aminokiselinskoj sekvenci iz Tabele 2.
[0091] " Suštinski prečišćen" odnosi se na molekul koji je suštinski bez drugih vrsta molekula ili ćeliju koja je suštinski bez ostalih vrsta ćelija. Suštinski prečišćena ćelija takođe se odnosi na ćeliju, koja je razdvojena od ostalih vrsta ćelija sa kojima je obično povezana u svom prirodno javljajućem stanju. U nekim primerima, populacija suštinski prečišćenih ćelija odnosi se na homogenu populaciju ćelija.
[0092] " Suštinski se ne nalazi" kada se koristi odnoseći se na prisustvo tumorskog antigena ili drugih molekula na normalnim ćelijama odnosi se na procenat normalne ćelijske vrste koja ima antigen ili molekul, i/ili gustinu antigena na ćelijama. U primerima, suštinski se ne nalazi znači da se antigen ili molekul nalazi na manje od 50% normalne ćelijske vrste i/ili sa 50% manjom gustinom u odnosu na količinu ćelija ili antigen koji se nalazi na tumorskoj ćeliji ili nekoj drugoj oboleloj ćeliji.
[0093] "T ćelije" ili "T limfociti" kao što se ovde koristi mogu biti iz bilo kog sisara, poželjno primata, vrsta, koje uključuju majmune, pse i ljude. U nekim primerima, T ćelije su alogene (iz istih vrsta ali od različitog donora) kao subjekat primalac; u nekim primerima, T ćelije su autologne (donor i primalac su isti); u nekim primerima, T ćelije su singene (donor i primaoci su različiti ali su identični blizanci).
[0094] Načini ostvarivanja
[0095] Nukleinske kiseline himernog receptora, i vektori i ćelije domaćina koji uključuju te nukleinske kiseline su opisani. Nukleinska kiselina himernog receptora obuhvata brojne modularne komponente koje se mogu izrezati i zameniti drugim komponentama u cilju prilagođavanja himernog receptora za specifični ciljani molekul. Primeri uključuju da jedna od modularnih komponenata predstavlja spejser komponentu. Iznenađujuće je otkriveno da dužina spejser regiona za koji se pretpostavlja da nema sposobnost signalizacije, utiče na in vivo efikasnost T ćelija modifikovanih radi eksprimiranja himernog receptora i treba da se prilagodi za pojedinačne ciljane molekule radi poboljšane terapijske aktivnosti.
[0096] U jednom primeru, postupci i konstrukti nukleinske kiseline opisani su radi konstrukcije himernog receptora koji ima poboljšano prepoznavanje tumora, povećanu proliferaciju T ćelija i/ili proizvodnju citokina kao odgovor na ligand u odnosu na referentni himerni receptor. U primerima, biblioteka nukleinskih kiselina je opisana, pri čemu svaka nukleinska kiselina kodira spejser region koji se razlikuje od ostalih po sekvenci i dužini. Svaka od nukleinskih kiselina može se potom koristiti radi obrazovanja konstrukta nukleinske kiseline himernog receptora koji može da se testira in vivo (u životinjskom modelu) i/ili in vitro tako da spejser može da bude odabran da obezbeđuje poboljšano prepoznavanje tumora, povećanu proliferaciju T ćelija i/ili proizvodnju citokina kao odgovor na ligand.
[0099] 1
[0100] U primerima, nukleinska kiselina himernog receptora obuhvata polinukleotid koji kodira ligand vezujući domen, pri čemu ligand predstavlja tumorski ili virusni specifični antigen ili molekul, polinukleotid koji kodira prilagođen polipeptidni spejser, gde spejser obezbeđuje poboljšanu proliferaciju T ćelija; polinukleotid koji kodira transmembranski domen; i polinukleotid koji kodira jedan ili više intracelularnih signalizirajućih domena. U primerima, dugi spejser se koristi ako je epitop ciljanog molekula proksimalan membrani na ciljanoj ćeliji, a kratki spejser koristi se ako je epitop ciljanog molekula distalan membrani na ciljanoj ćeliji.
[0101] Dizajn himernog receptora može biti prilagođen zavisno od tipa tumora ili virusa, ciljanog antigena ili molekula prisutnog na tumoru, afiniteta antitela za ciljani molekul, fleksibilnosti potrebne za antigen-vezujući domen, i/ili intracelularni signalizirajući domen. U primerima, brojni konstrukti himernog receptora testirani su in vitro i u in vivo modelima radi određivanja sposobnosti T ćelija modifikovanih receptorom da bi se ubile tumorske ćelije kod imunodeficijentnih miševa i radi proliferacije i opstanka posle adoptivnog prenosa. U primerima, odabran je himerni receptor koji obezbeđuje sposobnost od najmanje 30% ćelija da se razmnožavaju kroz najmanje dve generacije in vitro i/ili u okviru 72 sata posle uvođenja in vivo. U primerima, nije odabran himerni receptor koji rezultuje sa više od 50% ćelija koje su podvrgnute aktiviranjem izazvanoj ćelijskoj smrti (AICD) u okviru 72 sata in vivo kod imunodeficijentnih miševa, a ne uspeva da iskoreni tumorske ćelije.
[0102] Zavisno od toga da li je ciljani molekul prisutan na tumorskim ćelijama subjekta, himerni receptor uključuje ligand vezujući domen koji se specifično vezuje za taj ciljani molekul. U primerima, tumorske ćelije subjekta karakterišu se za molekule ćelijske površine tumora. Ciljani molekul može biti odabran na osnovu određivanja njegovog prisustva na određenim tumorskim ćelijama subjekta. U primerima, odabran je ciljani molekul koji je molekul ćelijske površine koji se pretežno nalazi na tumorskim ćelijama a ne nalazi se na normalnim tkivima u bilo kom značajnom stepenu. U primerima, antitelo je odabrano da se veže za epitop na ciljanom molekulu ćelijske površine. U nekim slučajevima, epitop je okarakterisan u odnosu na njegovu blizinu ćelijskoj membrani. Epitop je okarakterisan kao proksimalan membrani kada je predviđen ili prepoznat strukturnom analizom da se nalazi bliže ciljanoj ćelijskoj membrani u odnosu na alternativne epitope koji su predviđeni ili prepoznati strukturnom analizom da se nalaze na većoj udaljenosti od ciljane ćelijske membrane. U primerima, afinitet antitela iz kog je scFV konstruisan upoređen je pomoću testova vezivanja, i antitela različitih afiniteta ispitani su u formatima himernih receptora eksprimiranih u T ćelijama da bi se odredilo koji afinitet dodeljuje optimalno prepoznavanje tumora, na osnovu superiorne citotoksičnosti ciljanih ćelija, i/ili T ćelijske proizvodnje citokina i proliferacije.
[0103] Dodatno, spejser region himernog receptora može da se varira radi optimizovanja T ćelijskog prepoznavanja liganda na ciljanoj ćeliji. U primerima, kada se antitelo vezuje za epitop na ciljanoj ćeliji on je veoma proksimalan membrani, izabran je spejser koji je duži od oko 15 aminokiselina. Na primer, u primerima, ako je epitop ili njegov deo na ciljanom antigenu u prvih 100 aminokiselina linearne sekvence ekstracelularnog domena susednog transmembranskom domenu, dugi spejser region može biti odabran. U primerima, kada se antitelo vezuje za epitop na ciljanoj ćeliji koji je distalan membrani, izabran je spejser koji je oko 119 ili 15 aminokiselina ili manje. Na primer, u primerima, kada se epitop ili njegov fragment nalazi u 150 aminokiselina linearne sekvence ekstracelularnog domena od kraja, kratki ili srednji spejser može da se koristi. U primerima, spejser obuhvata aminokiselinsku sekvencu X<1>PPX<2>P.
[0104] Različite kombinacije primarnog i kostimulatornog intracelularnog signalizirajućog domena mogu da se koriste radi poboljšanja in vivo efikasnosti himernog receptora. U primerima, različiti konstrukti himernog receptora mogu da se ispitaju u in vivo životinjskom modelu radi određivanja efikasnosti za ubijanje tumora. U primerima, kostimulatorni intracelularni signalizirajući domen je
[0107] 1
[0108] izabran iz grupe koju čine CD28 i njegove modifikovane verzije, 4-1BB i njegove modifikovane verzije i njihove kombinacije. Ostali kostimulatorni domeni, kao što je OX40, mogu da se inkorporiraju.
[0109] CD8+ centralne memorijske T ćelije imaju unutrašnje programiranje koje im omogućava da opstanu tokom produženih perioda posle davanja, što ih čini poželjnim podskupom CD8+ T ćelija za imunoterapiju. U primerima, citotoksične T ćelije modifikovane CD19 specifičnim himernim receptorom pripremljene od sortiranjem prečišćenih CD8+ centralnih memorijskih T ćelija, date su u prisustvu ili odsustvu CD4+ T ćelija modifikovanih CD19 specifičnim himernim receptorom. U primerima, tumor- specifične CD4+ T ćelije ispoljavaju anti-tumorsku reaktivnost i obezbeđuju pomoć tumor-specifičnim CD8+ T ćelijama in vitro i in vivo. U određenom primeru, tumor-specifične CD4+ T ćelije ili CD4+ T ćelije odabrane od naivnih ili centralnih memorijskih podskupova koriste se same ili u kombinaciji sa CD8+ T<CM>.
[0110] Nukleinske kiseline, vektori i polipeptidi
[0111] Opisana je nukleinska kiselina himernog receptora korisna za transformaciju ili transdukciju limfocita za upotrebu u adoptivnoj imunoterapiji. U primerima, nukleinska kiselina sadrži brojne modularne komponente koje obezbeđuju jednostavnu supstituciju elemenata nukleinske kiseline. Bez namere da se ograniči obim ovog otkrivanja, veruje se da je himerni receptor za svaki tumorski antigen poželjno prilagođen u pogledu komponenti kako bi se obezbedila in vivo efikasnost i efikasna ekspresija u ćelijama sisara. Na primer, u određenom primeru, za efikasnost himernog receptora koji obuhvata scFV koji se vezuje za ROR1 epitop smešten u Ig/Frizzled domenu distalnom membrani, koristi se spejser koji je oko 15 aminokiselina ili manje. U nekom drugom posebnom primeru, za efikasnost himernog receptora koji obuhvata scFV koji se vezuje za ROR1 epitop smešten u Kringl domenu proksimalanom membrani, koristi se spejser koji je duži od 15 aminokiselina. U nekom drugom primeru, za efikasnost himernog receptora koji obuhvata scFV koji se vezuje za CD19, koristi se spejser koji je 15 aminokiselina ili manje.
[0112] U primerima, izolovana nukleinska kiselina himernog receptora obuhvata polinukleotid koji kodira ligand vezujući domen, pri čemu ciljani molekul predstavlja tumor specifični antigen, polinukleotid koji kodira polipeptidni spejser pri čemu je polipeptidni spejser oko 229 aminokiselina ili manje; polinukleotid koji kodira transmembranski domen; i polinukleotid koji kodira intracelularni signalizirajući domen. U primerima, ekspresioni vektor obuhvata himernu nukleinsku kiselinu kao što je opisana ovde. Polipeptidi kodirani svim ili delom nukleinskih kiselina himernog receptora takođe su uključeni ovde.
[0113] Ligand vezujući domen
[0114] U primerima, nukleinska kiselina himernog receptora obuhvata polinukleotid koji kodira ligand vezujući domen. U primerima, ligand vezujući domen specifično se vezuje za tumor ili virus specifičan antigen. U primerima, ligand vezujući domen je neko antitelo ili njegov fragment. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili fragment antitela može jednostavno da se odredi. U određenom primeru, polinukleotid kodira jednolančani Fv koji specifično vezuje CD19. U ostalim posebnim primerima, polinukleotid kodira jednolančani Fv koji specifično vezuje ROR1. Sekvence ovih antitela poznate su ili se mogu jednostavno odrediti od strane stručnjaka u ovoj oblasti.
[0115] Tumorski antigeni su proteini koji se proizvode od strane tumorskih ćelija koje izazivaju imuni odgovor. Izbor ligand vezujućeg domena zavisiće od tipa kancera koji se tretira, i može da cilja tumorske antigene ili ostale molekule ćelijske površine tumora. Uzorak tumora iz subjekta može da se okarakteriše za prisustvo određenih biomarkera ili ćelijskih površinskih markera. Na primer, ćelije kancera dojke iz subjekta mogu biti pozitivne ili negativne za svaki od Her2Neu, estrogenski receptor
[0118] 1
[0119] i/ili progesteronski receptor. Izabran je tumorski antigen ili molekul ćelijske površine koji se nalazi na tumorskim ćelijama pojedinačnog subjekta. Tumorski antigeni i molekuli ćelijske površine dobro su poznati u tehnici i uključuju, na primer, karcinoembrionski antigen (CEA), prostata specifičan antigen, PSMA, Her2/neu, estrogenski receptor, progesteronski receptor, efrinB2, CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, mezotelin, c-Met, GD-2 i MAGE A3 TCR. U primerima, ciljani molekul je molekul ćelijske površine koji se nalazi na tumorskim ćelijama, a suštinski se ne nalazi na normalnim tkivima, ili je ograničen u svojoj ekspresiji na nevitalna normalna tkiva.
[0120] Ostali ciljani molekuli uključuju, ali nisu ograničeni na, antigene izvedene iz infektivnih patogena kao što su HIV (virus humane imunodeficijencije), HBV (virus hepatitisa B), HPV (humani papiloma virus) i virus hepatitisa C.
[0121] U jednom primeru, ciljani molekul na tumoru obuhvata jedan ili više epitopa povezanih sa malignim tumorom. Maligni tumori eksprimiraju brojne proteine koji mogu da služe kao ciljani antigeni za prepoznavanje posredovano T ćelijskim receptorom ili himernim receptorom. Ostali ciljani molekuli pripadaju grupi molekula povezanih sa ćelijskom transformacijom kao što je onkogeni HER-2/Neu/ErbB2. U primerima, tumorski antigen je selektivno eksprimiran ili prekomerno eksprimiran na tumorskim ćelijama u odnosu na kontrolne ćelije iste vrste tkiva. U ostalim primerima, tumorski antigen je ćelijski površinski polipeptid.
[0122] Kada se identifikuje molekul ćelijske površine tumora koji može da se cilja himernim receptorom, epitop ciljanog molekula je izabran i okarakterisan. U primerima, izabran je epitop koji je u blizini membrane tumorske ćelije. U ostalim primerima, izabran je epitop koji je distalno od membrane tumorske ćelije. Epitop je okarakterisan kao proksimalan membrani kada je predviđen ili prepoznat strukturnom analizom da se nalazi bliže membrani ciljane ćelije u odnosu na alternativne epitope koji su predviđeni ili prepoznati strukturnom analizom da se nalazi na većoj udaljenosti od membrane ciljane ćelije.
[0123] Antitela koja se specifično vezuju za molekul ćelijske površine tumora može biti pripremljen pomoću postupaka dobijanja monoklonalnih antitela, postupaka prikaza faga, postupaka za generisanje humanih ili humanizovanih antitela, ili postupaka koji koriste transgene životinje ili biljke modifikovane da proizvode humana antitela. Biblioteke prikaza faga delimično ili potpuno sintetičkih antitela dostupne su i mogu se pregledati za neko antitelo ili njegov fragment koji može da se veže za ciljani molekul. Biblioteke prikaza faga humanih antitela takođe su dostupne. U primerima, antitela se specifično vezuju za neki molekul ćelijske površine tumora i ukršteno ne reaguju sa nespecifičnim komponentama kao što su goveđi serum albumin ili ostali nepovezani antigeni. Jednom identifikovana, aminokiselinska sekvenca ili polinukleotidna sekvenca koja kodira antitelo može da se izoluje i/ili odredi.
[0124] Antitela ili antigen-vezujući fragmenti uključuju sve ili deo poliklonalnih antitela, monoklonalno antitelo, humano antitelo, humanizovano antitelo, sintetičko antitelo, himerno antitelo, bispecifično antitelo, minitelo, i linearno antitelo. Fragmenti antitela" obuhvataju deo netaknutog antitela, poželjno antigen-vezujući ili varijabilni region netaknutog antitela i mogu se jednostavno pripremiti. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')<2>i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela; i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.
[0125] U primerima, veći broj različitih antitela koja se vezuju za određene molekule ćelijske površine tumora može biti izolovan i okarakterisan. U primerima, antitela se karakterišu na osnovu epitopskoj specifičnosti ciljanog molekula. Dodatno, u nekim slučajevima, antitela koja se vezuju za isti epitop mogu biti izabrana na osnovu afiniteta antitela za taj epitop. U primerima, antitelo ima afinitet od najmanje 1 mM, a poželjno <50 nM. U primerima, izabrano je antitelo koje ima veći afinitet za epitop
[0128] 1
[0129] u odnosu na ostala antitela. Na primer, izabrano je antitelo koje ima najmanje 2 puta, najmanje 5 puta, najmanje 10 puta, najmanje 20 puta, najmanje 30 puta, najmanje 40 puta, ili najmanje 50 puta veći afinitet od referentnog antitela koje se vezuje za isti epitop.
[0130] U primerima, ciljani molekuli su izabrani iz grupe koju čine CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, mezotelin, Her2, c-Met, PSMA, GD-2, MAGE A3 TCR i njihove kombinacije.
[0131] U posebnim primerima, ciljani antigen je CD19. Brojna antitela specifična za CD19 poznata su stručnjacima u tehnici i mogu biti jednostavno okarakterisana za sekvencu, vezivanje epitopa i afinitet. U određenom primeru, konstrukt himernog receptora uključuje scFV sekvencu iz FMC63 antitela. U ostalim primerima, scFV je humani ili humanizovani ScFv koji obuhvata varijabilni laki lanac koji obuhvata CDRL1 sekvencu RASQDISKYLN, CDRL2 sekvencu SRLHSGV, i CDRL3 sekvenci GNTLPYTFG. U ostalim primerima, scFV je humani ili humanizovani ScFv koji obuhvata varijabilni teški fragment koji obuhvata CDRH1 sekvencu DYGVS , CDRH2 sekvencu VIWGSETTYYNSALKS, i CDRH3 sekvencu YAMDYWG. Prikaz takođe razmatra varijabilne regione koji imaju najmanje 90% identiteta aminokiselinskih sekvenci sa onom od scFv za FMC63 i koji imaju najmanje isti afinitet za CD19. U primerima, himerni receptor ima kratki ili srednji spejser od 119 aminokiselina ili manje, ili 12 aminokiselina ili manje. U određenom primeru, spejser je 12 aminokiselina ili manje i ima sekvencu SEQ ID NO:4.
[0132] U primerima, CDR regioni nalaze se unutar regiona antitela numerisana po Kabatu kao što sledi: za laki lanac; CDRL1 aminokiseline 24-34;CDRL2 aminokiseline 50-56; CDRL3 na aminokiselinama 89-97; za teški lanac na CDRH1 na aminokiselinama 31-35; CDRH2 na aminokiselinama 50-65; i za CDRH3 na aminokiselinama 95-102. CDR regioni u antitelima mogu se jednostavno odrediti.
[0133] U posebnim primerima, ciljani antigen je ROR1. Brojna antitela specifična za ROR1 poznata su stručnjacima u tehnici mogu biti jednostavno okarakterisana za sekvencu, vezivanje epitopa i afinitet. U određenom primeru, konstrukt himernog receptora uključuje scFV sekvencu iz R12 antitela. U ostalim primerima, scFV je humani ili humanizovani ScFv koji obuhvata varijabilni laki lanac koji obuhvata CDRL1 sekvencu ASGFDFSAYYM, CDRL2 sekvencu TIYPSSG i CDRL3 sekvencu ADRATYFCA. U ostalim primerima, scFV je humani ili humanizovani ScFv koji obuhvata varijabilni teški lanac koji obuhvata CDRH1 sekvencu DTIDWY, CDRH2 sekvencu VQSDGSYTKRPGVPDR i CDRH3 sekvencu YIGGYVFG. Primerima su takođe razmatrani varijabilni regioni koji imaju najmanje 90% identiteta aminokiselinskih sekvenci sa onom iz scFv za R12 i koji imaju najmanje isti afinitet za ROR1. U primerima, himerni receptor ima kratki ili srednji spejser od 119 aminokiselina ili manje ili 12 aminokiselina ili manje. U određenom primeru, spejser je 12 aminokiselina ili manje i ima sekvencu SEQ ID NO:4.
[0134] U posebnim primerima, ciljani antigen je ROR1. Brojna antitela specifična za ROR1 poznata su stručnjacima u tehnici i mogu biti jednostavno okarakterisana za sekvencu, vezivanje epitopa i afinitet. U određenom primeru, konstrukt himernog receptora uključuje scFV sekvencu iz R11 antitelo. U ostalim primerima, scFV je humani ili humanizovani ScFv koji obuhvata varijabilni laki lanac koji obuhvata CDRL1 sekvencu SGSDINDYPIS, CDRL2 sekvencu INSGGST i CDRL3 sekvencu YFCARGYS. U ostalim primerima, scFV je humani ili humanizovani ScFv koji obuhvata varijabilni teški lanac koji obuhvata CDRH1 sekvencu SNLAW, CDRH2 sekvencu RASNLASGVPSRFSGS i CDRH3 sekvencu NVSYRTSF. Primerima su takođe predviđeni varijabilni regioni koji imaju najmanje 90% identiteta aminokiselinskih sekvenci sa onima iz scFv za R11 i koji imaju najmanje isti afinitet za ROR1. U primerima, himerni receptor ima dugi spejser od 229 aminokiselina ili manje. U određenom primeru, spejser je 229 aminokiselina i ima sekvencu SEQ ID NO:50.
[0135] U posebnim primerima, ciljani antigen je Her2. Brojna antitela specifična za Her2 poznata su
[0138] 1
[0139] stručnjacima u tehnici i mogu biti jednostavno okarakterisana za sekvencu, vezivanje epitopa i afinitet. U određenom primeru, konstrukt himernog receptora uključuje scFV sekvencu iz Herceptin antitela. U ostalim primerima, scFV je humani ili humanizovani ScFv koji obuhvata varijabilni laki lanac koji obuhvata CDRL1 sekvencu, CDRL2 sekvencu i CDRL3 sekvencu Herceptin antitela. U ostalim primerima, scFV je humani ili humanizovani ScFv koji obuhvata varijabilni teški lanac koji obuhvata CDRH1 sekvencu, CDRH2 i CDRH3 sekvencu Herceptina. CDR sekvence mogu jednostavno biti određene iz aminokiselinske sekvence Herceptina. Primerima su takođe predviđeni varijabilni regioni koji imaju najmanje 90% identiteta aminokiselinskih sekvenci sa onim iz scFv za Herceptin i koji imaju najmanje isti afinitet za Her2. U primerima, himerni receptor ima dugi spejser od 229 aminokiselina ili manje. U određenom primeru, spejser je 229 aminokiselina i ima sekvencu SEQ ID NO:50.
[0140] U primerima, polinukleotid koji kodira ligand vezujući domen je funkcionalno povezan sa polinukleotidom koji kodira spejser region. U primerima, polinukleotid koji kodira ligand vezujući domen može takođe da ima jedan ili više restrikcionih enzimskih mesta na 5' i/ili 3' krajevima kodirajuće sekvence radi obezbeđivanja lakog izrezivanja i zamene polinukleotida drugim polinukleotidom koji kodira ligand vezujući domen koji kodira različiti antigen ili koji ima različite vezujuće karakteristike. Na primer, restrikciono mesto, NheI, je kodirano ushodno od vodeće sekvence; a 3' RsrII smešteno unutar regiona šarke omogućava subkloniranje bilo kog poželjnog scFv u vektor himernog receptora. U primerima, polinukleotid je kodon optimizovan za ekspresiju u ćelijama sisara.
[0141] U primerima, polinukleotid koji kodira ligand vezujući domen je funkcionalno povezan sa signalnim peptidom. U primerima, signalni peptid je signalni peptid za faktor stimulisanja kolonije granulocita. Mogu da se koriste polinukleotidi koji kodiraju ostale signalne peptide kao što je CD8 alfa.
[0142] U primerima, polinukleotid koji kodira ligand vezujući domen je funkcionalno povezan sa promoterom. Promoter je izabran da obezbeđuje ekspresiju receptora himernog antigena u ćeliji sisara. U određenom primeru promoter je produženi promoter faktora rasta (EF-1). Drugi primer pogodnog promotera je sekvenca neposredno ranog citomegalovirusnog (CMV) promotera. Međutim, ostale konstitutivne sekvence promotera mogu takođe da se koriste, uključujući, ali bez ograničavanja na, rani promoter simijan virusa 40 (SV 40), virus tumora mlečne žlezde miša (MMTV), dugi terminalni ponavljajući (LTR) promoter virusa humane imunodeficijencije (HIV), MuMoLV promoter, promoter ptičjih virusa leukemije, neposredno rani promoter Epstein-Barr-ovog virusa, promoter Rausovog virusa sarkoma, kao i humane genske promotere kao što su, ali bez ograničenja na, aktin promoter, miozin promoter, hemoglobin promoter i kreatin kinaza promoter. Inducibilni promoteri takođe su razmatrani. Primeri inducibilnih promotera uključuju, ali nisu ograničeni na, metalotionin promoter, glukokortikoid promoter, progesteron promoter i tetraciklin promoter.
[0143] Poseban primer polinukleotida koji kodira ligand vezujući domen je prikazan u Tabeli 1 kao scFv iz antitela koje specifično vezuje CD19, kao što je FMC63. Polinukleotid koji kodira fleksibilni linker koji uključuje aminokiseline GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:36) razdvaja VH i VL lance u scFV. Aminokiselinska sekvenca iz scFv koja uključuje linker je prikazana u Tabeli 2.(SEQ ID NO:11) Ostala CD19-ciljajuća antitela kao što su SJ25C1 i HD37 su poznata. (SJ25C1: Bejcek et al. Cancer Res 2005, PMID 7538901; HD37: Pezutto et al. JI 1987, PMID 2437199).
[0144] Spejser
[0145] U primerima, nukleinska kiselina himernog receptora obuhvata polinukleotid koji kodira spejser region. Iznenađujuće je otkriveno da dužina spejser regiona za koji se smatra da nema sposobnost signalizacije utiče na in vivo efikasnost T ćelija modifikovanih radi eksprimiranja himernog receptora i da treba da bude prilagođen za pojedinačne ciljane molekule za prepoznavanje optimalnog
[0148] 2
[0149] tumora ili ciljanih ćelija. U primerima, nukleinska kiselina himernog receptora obuhvata polinukleotid koji kodira prilagodljiv spejser region izabran iz biblioteke polinukleotida koji kodiraju spejser regione. U primerima, dužina spejsera je izabran na osnovu mesta epitopa, afiniteta antitela za epitop i/ili sposobnosti T ćelija koje eksprimiraju himerni receptor da proliferišu in vitro i/ili in vivo kao odgovor na prepoznavanje antigena.
[0150] Obično, spejser region se nalazi između ligand vezujućeg domena i transmembranskog domena himernog receptora. U primerima, spejser region obezbeđuje fleksibilnost ligand vezujućeg domena, omogućava visoke nivoe ekspresije u limfocitima. CD19-specifični himerni receptor koji ima spejser domen od oko 229 aminokiselina imao je manju antitumorsku aktivnost nego CD19-specifični himerni receptor sa kratkim spejser regionom koji se sastoji samo od modifikovane IgG4 šarke. Ostali himerni receptori, kao što su oni konstruisani od R12 ili 2A2 scFvs takođe zahtevaju kratki spejser za optimalno pokretanje T ćelijskih efektorskih funkcija, dok himerni receptor konstruisan sa R11 ROR1 scFv zahteva dugi spejser domen od oko 229 aminokiselina za prepoznavanje tumora.
[0151] U primerima, spejser region ima najmanje oko 10 do 229 aminokiselina, oko 10 do 200 aminokiselina, oko 10 do 175 aminokiselina, oko 10 do 150 aminokiselina, oko 10 do 125 aminokiselina, oko 10 do 100 aminokiselina, oko 10 do 75 aminokiselina, oko 10 do 50 aminokiselina, oko 10 do 40 aminokiselina, oko 10 do 30 aminokiselina, oko 10 do 20 aminokiselina ili oko 10 do 15 aminokiselina, a uključujući bilo koji ceo broj između krajnjih tačaka bilo kog od navedenih opsega. U primerima, spejser region ima oko 12 aminokiselina ili manje, oko 119 aminokiselina ili manje ili oko 229 aminokiselina ili manje.
[0152] U nekim primerima, spejser region je izveden iz regiona šarke nekog molekula poput imunoglobulina. U primerima, spejser region obuhvata ceo ili deo regiona šarke iz humanog IgG1, humanog IgG2, humanog IgG3 ili humanog IgG4, i može da sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija. Primerne sekvence regiona šarke obezbeđene su u Tabeli 8. U primerima, deo regiona šarke uključuje gornje aminokiseline šarke koje se nalaze između varijabilnog teškog lanca i jezgra, i jezgarne aminokiseline šarke koje uključuju poliprolin region. Obično, gornji region šarke ima oko 3 do 10 aminokiselina. U nekim slučajevima, spejser region obuhvata aminokiselinsku sekvencu X<1>PPX<2>P (SEQ ID NO:1). U primerima, X<1>je cistein, glicin ili arginin i X2 je cistein ili treonin.
[0153] U primerima, sekvence regiona šarke mogu biti modifikovane u jednu ili više aminokiselina kako bi se izbegle neželjene strukturne interakcije kao što je dimerizacija. U određenom primeru, spejser region obuhvata deo modifikovanog humanog regiona šarke iz IgG4, na primer, kao što je prikazano u Tabeli 2 ili Tabeli 8(SEQ ID NO:21). Predstavnik polinukleotida koji kodira deo modifikovanog IgG4 regiona šarke obezbeđen je u Tabeli 1. (SEQ ID NO:4)U primerima, region šarke može da ima najmanje oko 90%, 92%, 95% ili 100% identiteta sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom regiona šarke identifikovanoj u Tabeli 2 ili Tabeli 8. U određenom primeru, deo humanog regiona šarke iz IgG4 ima aminokiselinsku supstituciju u jezgarnim aminokiselinama od CPSP do CPPC.
[0154] U nekim primerima, ceo ili deo regiona šarke je kombinovan sa jednim ili više domena konstantnog regiona imunoglobulina. Na primer, deo regiona šarke može biti kombinovan sa celim ili delom CH2 ili CH3 domena ili njegovom varijantom. U primerima, spejser region ne uključuje 47-48 aminokiselinsku sekvencu regiona šarke iz CD8apha ili spejser region koji se sastoji od ekstracelularnog dela CD28 molekula.
[0155] [0083] U primerima, kratki spejser region ima oko 12 aminokiselina ili manje i obuhvata ceo ili deo IgG4 sekvence regiona šarke ili njene varijante, srednji spejser region ima oko 119 aminokiselina ili manje i obuhvata ceo ili deo IgG4 sekvence regiona šarke i CH3 regiona ili njihovu varijantu, a dugi spejser ima oko 229 aminokiselina ili manje i obuhvata ceo ili deo IgG4 sekvence regiona šarke, CH2 regiona i CH3 regiona ili njihovu varijantu.
[0156] Polinukleotid koji kodira spejser region može biti jednostavno pripremljen sintetičkim ili rekombinantnim postupcima iz aminokiselinske sekvence. U primerima, polinukleotid koji kodira spejser region je funkcionalno povezan sa polinukleotidom koji kodira transmembranski region. U primerima, polinukleotid koji kodira spejser region može takođe da ima jedan ili više restrikcionih enzimskih mesta na 5' i/ili 3' krajevima kodirajuće sekvence radi obezbeđivanja lakog izrezivanja i zamene polinukleotida drugim polinukleotidom koji kodira različiti spejser region. U primerima, polinukleotid koji kodira spejser region je kodon optimizovan za ekspresiju u ćelijama sisara.
[0157] U primerima, obezbeđena je biblioteka polinukleotida, pri čemu svaki kodira različiti spejser region. U jednom primeru, spejser region je izabran iz grupe koju čine sekvenca regiona šarke iz IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 ili njen fragment, sekvenca regiona šarke iz IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 u kombinaciji sa celim ili delom CH2 regiona ili njegove varijante, sekvenca regiona šarke iz IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 u kombinaciji sa celim ili delom CH3 regiona ili njegove varijante, i sekvenca regiona šarke iz IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 u kombinaciji sa celim ili delom CH2 regiona ili njegove varijante, i CH3 regiona ili njegove varijante. U primerima, kratki spejser region je modifikovana IgG4 sekvenca šarke (SEQ ID NO:4) koja ima 12 aminokiselina ili manje, srednja sekvenca je IgG4 sekvenca šarke sa CH3 sekvencom koja ima 119 aminokiselina ili manje(SEQ ID NO:49); ili IgG4 sekvenca šarke sa CH2 i CH3 regionom koji ima 229 aminokiselina ili manje (SEQ ID NO:50).
[0158] U primerima, ovde je opisan postupak selekcije spejser regiona za himerni receptor. Iznenađujuće, neki konstrukti himernog receptora, iako efektivni da aktiviraju T ćelije i usmere njihovo ubijanje tumorskih ćelija in vitro, nisu bili efektivni in vivo. Dodatno, profil neželjenih dejstava T ćelija modifikovanih himernim receptorom može biti takav da rezultuje sa više ćelija koje su podvrgnute aktiviranjem izazvanoj ćelijskoj smrti ili izazivanjem povećanja in vivo citokina. U primerima, postupak obuhvata obezbeđivanje većeg broja nukleinskih kiselina himernih receptora, pri čemu se nukleinske kiseline himernih receptora razlikuju samo u spejser regionu; uvođenje svake od nukleinskih kiselina himernih receptora u odvojenu T limfocitnu populaciju; širenje svake odvojene limfocitne populacije in vitro, i uvođenje svake limfocitne populacije u životinju koja je opterećena tumorom radi određivanja anti-tumorske efikasnosti svakog od himernih receptora kada se eksprimira u T ćelijama, i izbor himernog receptora koji obezbeđuje anti-tumorsku efikasnost u odnosu na svaku od ostalih odvojenih limfocitih populacija modifikovanih svakim od ostalih himernih receptora.
[0159] Životinjski modeli različitih tumora su poznati. Anti-tumorska efikasnost može se izmeriti identifikovanjem smanjenja zapremine tumora, određivanjem smrti životinja, perzistencije genetički modifikovanih T ćelija in vivo, aktivacije genetički modifikovanih T ćelija (na primer, detektovanjem povećanja ekspresije CD25 i/CD69) i/ili proliferacije genetički modifikovanih T ćelija in vivo. U jednom primeru, himerni receptor je izabran tako da obezbeđuje najbolju anti-tumorsku efikasnost in vivo kao što je određeno pomoću jednog ili više ovih parametara. Nedostatak anti-tumorske efikasnosti može biti određen nedostatkom perzistencije genetički modifikovanih limfocita in vivo, smrti životinje, povećanjem apoptoze kao što se meri povećanjem indukcije kaspaze -3, i/ili smanjenjem proliferacije genetički modifikovanih limfocita.
[0160] U ostalim primerima, postupak za selekciju spejsera obuhvata selekciju epitopa ciljanog molekula i karakterisanje lokacije epitopa u odnosu na ćelijsku membranu, izbor spejser regiona koji je dugi ili kratki zavisno od lokacije epitopa u odnosu na ćelijsku membranu, izbor antitela ili njegovog fragmenta koji ima afinitet za epitop koji je veći ili manji u odnosu na referentno antitelo, i određivanje da li konstrukt himernog receptora obezbeđuje poboljšanu proliferaciju T ćelija ili proizvodnju citokina in vitro i/ili in vivo.
[0161] U nekim primerima, ako je ciljani epitop ili njegov fragment smešten proksimalno membrani on se nalazi u prvih 100 aminokiselina linearne sekvence ekstracelularnog domena susednog transmembranskom domenu. Ako je epitop smešten proksimalno membrani, dugi spejser (npr. 229 aminokiselina ili manje i više od 119 aminokiselina) je izabran. U nekim primerima, ako je ciljani epitop smešten distalno membrani, on se nalazi u prvih 150 aminokiselina linearne sekvence kraja ekstracelularnog domena. Ako je epitop smešten distalno membrani, srednji ili kratki spejser je izabran (npr. 119 aminokiselina ili manje ili 12-15 aminokiselina ili manje). Alternativno, bilo da je epitop proksimalno ili distalno membrani, on može biti određen modelovanjem trodimenzionalne strukture ili na osnovu analize kristalne strukture.
[0162] U nekim primerima, himerni receptor je izabran da obezbeđuje najmanje 30% ćelijske proliferacije kroz dve generacije in vitro i/ili in vivo. U ostalim primerima, himerni receptor nije odabran ako rezultuje sa najmanje 50% ćelija koje su podvrgnute aktiviranjem izazvanoj ćelijskoj smrti u okviru 72 sata. U primerima, kratki spejser (npr.15 aminokiseline ili manje) je izabran ako je epitop distalan membrani. U primerima, dugi spejser (npr. 229 aminokiselina ili manje i više od 119 aminokiselina) je izabran ako je epitop proksimalan membrani.
[0163] U primerima, obezbeđivanje većeg broja nukleinskih kiselina himernih receptora, pri čemu se nukleinske kiseline himernih receptora razlikuju samo u spejser regionu, obuhvata obezbeđivanje konstrukta himernog receptora koji obuhvata polinukleotid koji kodira ligand vezujući domen, pri čemu ligand predstavlja antigen specifičan za tumor, virusni antigen ili bilo koji drugi molekul eksprimiran na ciljanoj ćelijskoj populaciji koji je pogodan da posreduje u prepoznavanju i eliminisanju limfocitom; polinukleotid koji kodira prvi polipeptidni spejser koji ima definisano restrikciono mesto na 5' i 3' kraju kodirajuće sekvence za prvi polipeptidni spejser; polinukleotid koji kodira transmembranski domen; i polinukleotid koji kodira jedan ili više intracelularnih signalizirajućih domena.
[0164] U primerima, postupak dalje obuhvata obezbeđivanje jednog ili više polinukleotida, pri čemu svaki kodira različiti spejser region. U primerima, različiti spejser regioni su izabrani iz grupe koju čine sekvenca regiona šarke iz IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 ili njegove varijante ili njegovog fragmenta, sekvenca regiona šarke iz IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 u kombinaciji sa celim ili delom CH2 regiona ili njegove varijante, sekvenca regiona šarke iz IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 u kombinaciji sa celim ili delom CH3 regiona ili njegove varijante, i sekvenca regiona šarke iz IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 u kombinaciji sa celim ili delom CH2 regiona ili njegove varijante i CH3 regiona ili njegove varijante. U primerima, CH2 ili CH3 regioni mogu biti modifikovani sa jednom ili više delecija ili aminokiselinskih supstitucija radi obezbeđivanja ekspresije u limfocitima i/ili radi minimizovanja interakcije sa ostalim molekulima. U primerima, deo regiona šarke obuhvata najmanje gornje aminokiseline i jezgarnu sekvencu. U primerima, region šarke obuhvata sekvencu X<1>PPX<2>P.
[0165] U primerima, postupak dalje obuhvata zamenu polinukleotida koji kodira spejser region polinukleotidom koji kodira različiti spejser region radi obrazovanja nukleinske kiseline himernog receptora sa različitim spejser regionom. Postupak se može ponoviti radi obrazovanja bilo kog broja nukleinskih kiselina himernih receptora, pri čemu se svaki razlikuje u spejser regionu. U primerima, nukleinske kiseline himernih receptora međusobno se razlikuju samo u spejser regionu.
[0166] Transmembranski domen
[0167] U primerima, nukleinska kiselina himernog receptora obuhvata polinukleotid koji kodira transmembranski domen. Transmembranski domen obezbeđuje učvršćenje himernog receptora u membranu.
[0170] 2
[0171] U jednom primeru, koristi se transmembranski domen koji je prirodno povezan sa jednim od domena u himernom receptoru. U nekim slučajevima, transmembranski domen može biti odabran ili modifikovan aminokiselinskom supstitucijom da bi se izbeglo vezivanje tih domena za transmembranske domene istih ili različitih površinskih membranskih proteina radi minimiziranja interakcija sa ostalim članovima receptorskog kompleksa.
[0172] Transmembranski domen može se izvesti ili iz prirodnog ili iz sintetičkog izvora. Kada je izvor prirodan, domen može biti izveden iz bilo kog membrana-vezanog ili transmembranskog proteina. Transmembranski regioni obuhvataju najmanje transmembranski region(e) od) alfa, beta ili zeta lanca T- ćelijskog receptora, CD28, CD3, CD45, CD4, CD8, CD9, CD16, CD22; CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 i CD154. U određenom primeru, transmembranski domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu CD28 transmembranskog domena kao što je prikazan u Tabeli 2. Reprezentativna polinukleotidna sekvenca koja kodira CD28 transmembranski domen prikazan je u Tabeli 1(SEQ ID NO:5).
[0173] Transmembranski domen može biti sintetički ili varijanta prirodno javljajućeg transmembranskog domena. U primerima, sintetički ili varijantni transmembranski domeni obuhvataju predominantne hidrofobne ostatke kao što su leucin i valin. U primerima, transmembranski domen može da ima najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identiteta aminokiselinskih sekvenci sa transmembranskim domenom kao što je prikazano u Tabeli 2 ili Tabeli 6. Varijantni transmembranski domeni poželjno imaju hidrofobni rezultat od najmanje 50 kao što je izračunato pomoću Kyte Doolittle.
[0174] Polinukleotid koji kodira transmembranski domen može biti jednostavno pripremljen sintetičkim ili rekombinantnim postupcima. U primerima, polinukleotid koji kodira transmembranski domen funkcionalno je povezan sa polinukleotidom koji kodira intracelularni signalizirajući region. U primerima, polinukleotid koji kodira transmembranski domen može takođe da ima jedan ili više restrikcionih enzimskih mesta na 5' i/ili 3' krajevima kodirajuće sekvence radi obezbeđivanja lakog izrezivanja i zamene polinukleotida koji kodira transmembranski domen drugim polinukleotidom koji kodira različiti transmembranski domen. U primerima, polinukleotid koji kodira transmembranski domen je kodon optimizovan za ekspresiju u ćelijama sisara.
[0175] Intracelularni signalizirajući domen
[0176] U primerima, nukleinska kiselina himernog receptora obuhvata polinukleotid koji kodira intracelularni signalizirajući domen. Intracelularni signalizirajući domen obezbeđuje aktivaciju jedne funkcije transdukovane ćelije koja eksprimira himerni receptor usled vezivanja za ligand eksprimiran na tumorskim ćelijama. U primerima, intracelularni signalizirajući domen sadrži jedan ili više intracelularnih signalizirajućih domena. U primerima, intracelularni signalizirajući domen je deo i/ili varijanta intracelularnog signalizirajućeg domena koja obezbeđuje aktivaciju najmanje jedne funkcije transdukovane ćelije.
[0177] [0100] Primeri intracelularnih signalizirajućih domena za upotrebu u himernom receptoru kao što je opisan uključuju citoplazmatične sekvence CD3 zeta lanca, i/ili koreceptore koji deluju u dogovoru da pokrenu signalnu transdukciju nakon angažovanja himernog receptora, kao i bilo koji derivat ili varijantu ovih sekvenci i bilo koju sintetičku sekvencu koja ima istu funkcionalnu sposobnost. T ćelijska aktivacija može se reći da je posredovana dvema različitim klasama citoplazmatične signalizirajuće sekvence: onima koje pokreću antigen-zavisnu primarnu aktivaciju i obezbeđuju signal poput T ćelijskog receptora (primarne citoplazmatične signalizirajuće sekvence) i onima koje deluju na antigennezavisan način radi obezbeđivanja sekundarnog ili kostimulatornog signala (sekundarne citoplazmatične signalizirajuće sekvence). Primarne citoplazmatične signalizirajuće sekvence koje deluju na stimulatorni način mogu da sadrže signalizirajuće motive koji su poznati kao receptor tirozinbazirani aktivirajući motivi ili ITAM. Primeri ITAM koji sadrže primarne citoplazmatične signalizirajuće sekvence uključuju one izvedene iz CD3 zeta, FcR gama, CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b i CD66d. U primerima, primarni signalizirajući intracelularni domen može da ima najmanje oko 80%, 85%, 90% ili 95% identiteta sekvenci sa CD3zeta koji ima sekvencu obezbeđenu u Tabeli 2. U primerima, varijante CD3 zeta zadržavaju najmanje jedan, dva, tri ili sve ITAM regione kao što su prikazani u Tabeli 7.
[0178] U nekom poželjnom primeru, intracelularni signalizirajući domen himernog receptora može biti konstruisan da obuhvata CD3-zeta signalizirajući domen sam ili kombinovan sa bilo kojim drugim poželjnim citoplazmatičnim domenom(ima). Na primer, intracelularni signalizirajući domen himernog receptora može da obuhvata CD3zeta lanac i kostimulatorni signalizirajući region.
[0179] Kostimulatorni signalizirajući region odnosi se na deo himernog receptora koji obuhvata intracelularni domen kostimulatornog molekula. Kostimulatorni molekul je molekul ćelijske površine drugačiji od antigenog receptora ili njegovih liganada koji je potreban kao odgovor limfocita na antigen. Primeri tih molekula uključuju CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), OX40, CD30, CD40, limfocitna funkcija- povezan antigen-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, i ligand koji se specifično vezuje za CD83. U primerima, kostimulatorni signalizirajući domen može da ima najmanje oko 80%, 85%, 90% ili 95% identiteta aminokiselinskih sekvenci sa intracelularnim domenom CD28 kao što je prikazano u Tabeli 5 ili sa 4-1BB koji ima sekvencu obezbeđenu u Tabeli 2. U jednom primeru, varijanta CD28 intracelularnog domena obuhvata neku aminokiselinsku supstituciju na položajima 186-187, pri čemu je LL supstituisano sa GG.
[0180] Intracelularne signalizirajuće sekvence himernog receptora mogu biti međusobno vezane za nasumičnim ili određenim redosledom. Opciono, kratki oligo- ili polipeptidni linker, poželjno između 2 i 10 aminokiselina po dužini može da obrazuje vezu. U jednom primeru, intracelularni signalizirajući domeni obuhvataju ceo ili deo signalizirajućeg domena CD3-zeta ili njegove varijante i ceo ili deo signalizirajućeg domena CD28 ili njegove varijante. U nekom drugom primeru, intracelularni signalizirajući domen obuhvata ceo ili deo signalizirajućeg domena CD3-zeta ili njegove varijante i ceo ili deo signalizirajućeg domena 4-1BB ili njegove varijante. U još nekom drugom primeru, intracelularni signalizirajući domen obuhvata ceo ili deo signalizirajućeg domena CD3-zeta ili njegove varijanta, ceo ili deo signalizirajućeg domena CD28 ili njegove varijante, i ceo ili deo signalizirajućeg domena 4-1BB ili njegove varijante. U određenom primeru, aminokiselinska sekvenca intracelularnog signalizirajućeg domena koji obuhvata varijantu CD3zeta i deo 4-1BB intracelularnog signalizirajućeg domena obezbeđena je u Tabeli 2. Reprezentativna sekvenca nukleinske kiseline obezbeđena je u Tabeli 1(SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7).
[0181] U jednom primeru, polinukleotid koji kodira intracelularni signalizirajući domen obuhvata 4-1BB intracelularni domen vezan za deo CD3zeta domena. U ostalim primerima, 4-1BB intracelularni domen i CD28 intracelularni domen vezani su za deo CD3 zeta domena.
[0182] Polinukleotid koji kodira intracelularni signalizirajući domen može biti jednostavno pripremljen sintetičkim ili rekombinantnim postupcima iz aminokiselinske sekvence. U primerima, polinukleotid koji kodira intracelularni signalizirajući domen može takođe da ima jedno ili više restrikcionih enzimskih mesta na 5' i/ili 3' krajevima kodirajuće sekvence radi obezbeđivanja lakog izrezivanja i zamene polinukleotida koji kodira intracelularni signalizirajući domen drugim polinukleotidom koji kodira različiti intracelularni signalizirajući domen. U primerima, polinukleotid koji kodira neki intracelularni signalizirajući domen je kodon optimizovan za ekspresiju u ćelijama sisara.
[0185] 2
[0186] Sekvence markera
[0187] U primerima, nukleinska kiselina himernog receptora opciono dalje obuhvata polinukleotidnu sekvencu koji kodira sekvencu markera. Sekvenca markera može da obezbedi selekciju transdukovanih ćelija, i identifikaciju transdukovanih ćelija. U primerima, sekvenca markera je funkcionalno povezana sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira sekvencu linkera. U primerima, sekvenca linkera je cepljiva sekvenca linkera.
[0188] Brojne različite sekvence markera mogu da se koriste. Obično, sekvenca markera ima funkcionalnu karakteristiku da omogućava selekciju transdukovanih ćelija i/ili detekciju transdukovanih ćelija. U primerima, sekvenca markera je kompatibilna sa transdukcijom humanih limfocita.
[0189] Pozitivni selektibilni marker može biti neki gen, koji nakon uvođenja u ćeliju domaćina, eksprimira dominantni fenotip dozvoljavajući pozitivnu selekciju ćelija koje nose taj gen. Geni ovog tipa poznati su u tehnici, i uključuju, inter alia, higromicin-B fosfotransferaza gen (hph) koji dodeljuje rezistentnost na higromicin B, amino glukozid fosfotransferaza gen (neo ili aph) iz Tn5 koji kodira rezistentnost na antibiotik G418, dihidrofolat reduktaza (DHFR) gen, adenozin deaminaza gen (ADA), i gen višestruke rezistencije na lekove (MDR).
[0190] U jednom primeru, nukleinska kiselina himernog receptora dalje obuhvata polinukleotid koji kodira sekvencu markera. U jednom primeru, sekvenca markera je okrnjen receptor epidermalnog faktora rasta kao što je prikazan u Tabeli 2. Primerni polinukleotid za okrnjen receptor epidermalnog faktora rasta prikazan je u Tabeli 1. (SEQ ID NO:9)U primerima, polinukleotid koji kodira sekvencu markera je funkcionalno povezan sa polinukleotidom koji kodira sekvencu linkera. U određenom primeru, sekvenca linkera je cepljiva sekvenca linkera T2A kao što je prikazana u Tabeli 2. Primerna polinukleotidna sekvenca koja kodira T2A linker obezbeđena je u Tabeli 1.(SEQ ID NO:8)
[0191] Polinukleotid koji kodira sekvencu markera može biti jednostavno pripremljen sintetičkim ili rekombinantnim postupcima iz aminokiselinske sekvence. U primerima, polinukleotid koji kodira sekvencu markera je funkcionalno povezan sa polinukleotidom koji kodira intracelularni signalizirajući domen. U primerima, polinukleotid koji kodira sekvencu markera može takođe da ima jedan ili više restrikcionih enzimskih mesta na 5' i/ili 3' krajevima kodirajuće sekvence radi obezbeđivanja lakog izrezivanja i zamene polinukleotida koji kodira sekvencu markera drugim polinukleotidom koji kodira različitu sekvencu markera. U primerima, polinukleotid koji kodira sekvencu markera je kodon optimizovan za ekspresiju u ćelijama sisara.
[0192] Vektori, ćelije i postupci transdukcije ćelija
[0193] Selekcija i sortiranje T limfocitnih populacija
[0194] Kompozicije opisane ovde obezbeđuju CD4+ i/ili CD8+ T limfocite. T limfociti mogu biti prikupljeni u skladu sa poznatim tehnikama i obogaćeni ili osiromašeni poznatim tehnikama kao što je afinitetno vezivanje za antitela kao što je protočna citometrija i/ili imunomagnetna selekcija. Posle faza obogaćivanja i/ili deplecije, in vitro ekspanzija željenih T limfocita može se izvoditi u skladu sa poznatim tehnikama (uključujući ali neograničavajući se na one opisane u US Patentu Br.6,040,177 od Riddell et al.), ili njihovim varijacijama koje će biti očigledne stručnjacima u tehnici. U primerima, T ćelije su autologne T ćelije dobijene iz pacijenta.
[0195] Na primer, željena T ćelijska populacija ili subpopulacija može biti raširena dodavanjem
[0198] 2
[0199] inicijalne T limfocitne populacije podlozi za kulturu in vitro, a zatim dodavanjem hraniteljskim ćelijama podloge za kulturu, kao što su jednojedarne ćelije periferne krvi koje se ne dele (PBMC), (npr., tako da dobijena populacija ćelija sadrži najmanje oko 5, 10, 20 ili 40 ili više PBMC hraniteljskih ćelija za svaki T limfocit u inicijalnoj populaciji koja treba da se raširi); i inkubiranjem kulture (npr. tokom vremena dovoljnog da se raširi veliki broj T ćelija). Hraniteljske ćelije koje se ne dele mogu da obuhvataju gamaozračene PBMC hraniteljske ćelije. U nekim primerima, PBMC ozračene su gama zracima u opsegu od oko 3000 do 3600 rad da bi se sprečila ćelijska deoba. Redosled dodavanja T ćelija i hraniteljskih ćelija podlozi za kulturu može biti obrnuto po potrebi. Kultura obično može da bude inkubirana pod uslovima temperature i slično koji su pogodni za rast T limfocita. Za rast humanih T limfocita, na primer, temperatura će uopšteno biti najmanje oko 25 stepeni Celzijusa, poželjno najmanje oko 30 stepeni, poželjnije oko 37 stepeni.
[0200] Rašireni T limfociti uključuju CD8+ citotoksične T limfocite (CTL) i CD4+ pomoćne T limfocite koji mogu biti specifični za neki antigen prisutan na humanom tumoru ili neki patogen.
[0201] Opciono, postupak ekspanzije može dalje da obuhvata fazu dodavanja EBV-transformisanih limfoblastoidnih ćelija koje se ne dele (LCL) kao hraniteljske ćelije. LCL mogu biti ozračene gama zracima u opsegu od oko 6000 do 10000 rad. LCL hraniteljske ćelije mogu biti obezbeđene u bilo kojoj pogodnoj količini, kao što je odnos LCL hraniteljskih ćelija prema inicijalnim T limfocitima od najmanje oko 10:1.
[0202] Opciono, postupak ekspanzije može dalje da obuhvata fazu dodavanja anti-CD3 i/ili anti CD28 antitela podlozi za kulturu (npr., u koncentraciji od najmanje oko 0.5 ng/ml). Opciono, postupak ekspanzije može dalje da obuhvata fazu dodavanja IL-2 i/ili IL-15 podlozi za kulturu (npr., pri čemu je koncentracija IL-2 najmanje oko 10 jedinica/ml).
[0203] Posle izolovanja T limfocita, i citotoksični i pomoćni T limfociti mogu da se sortiraju u naivne, memorijske i efektorske T ćelijske subpopulacije ili pre ili posle ekspanzije.
[0204] CD8+ ćelije mogu biti dobijene pomoću standardnih postupaka. U nekim primerima, CD8+ ćelije dalje su sortirane u naivne, centralne memorijske i efektorske memorijske ćelije identifikovanjem ćelijskih površinskih antigena koji su povezani sa svakim od tih vrsta CD8+ ćelija. U primerima, memorijske T ćelije prisutne su i u CD62L+ i u CD62L-podskupovima CD8+ limfocita periferne krvi. PBMC su sortirane u CD62L-CD8+ i CD62L+CD8+ frakcije posle bojenja anti-CD8 i anti-CD62L antitelima. U nekim primerima, ekspresija fenotipskih markera centralnih memorijskih TCM uključuje CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 i CD127 i negativne su ili niske za granzim B. U nekim primerima, centralne memorijske T ćelije su CD45RO+, CD62L+, CD8+ T ćelije. U nekim primerima, efektorske TE su negativne za CD62L, CCR7, CD28 i CD127, a pozitivne za granzim B i perforin. U nekim primerima, naivni CD8+ T limfociti karakterišu se ekspresijom fenotipskih markera naivnih T ćelija koje uključuju CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 i CD45RA.
[0205] Da li je ćelija ili ćelijska populacija pozitivna za određeni ćelijski površinski marker može se odrediti protočnom citometrijom pomoću bojenja specifičnim antitelom za površinski marker i izotipski podudarnim kontrolnim antitelom. Ćelijska populacija negativna za marker odnosi se na odsustvo značajnog bojenja ćelijske populacije specifičnim antitelom iznad izotipske kontrole, pozitivna se odnosi na uniformno bojenje ćelijske populacije iznad izotopske kontrole. U nekim primerima, smanjenje ekspresije jednog ili markera odnosi se na gubitak od 1 log10 srednje vrednosti intenziteta fluorescencije i/ili smanjenje procenta ćelija koje pokazuju marker od najmanje oko 20% ćelija, 25% ćelija, 30% ćelija, 35% ćelija, 40% ćelija, 45% ćelija, 50% ćelija, 55% ćelija, 60% ćelija, 65% ćelija, 70% ćelija, 75% ćelija, 80% ćelija, 85% ćelija, 90% ćelija, 95% ćelija, i 100% ćelija i bilo koji % između 20 i 100% u odnosu na referentnu ćelijsku populaciju. U nekim primerima, ćelijska populacija
[0208] 2
[0209] pozitivna za jedan ili markere odnosi se na procenat ćelija koje pokazuju marker od najmanje oko 50% ćelija, 55% ćelija, 60% ćelija, 65% ćelija, 70% ćelija, 75% ćelija, 80% ćelija, 85% ćelija, 90% ćelija, 95% ćelija i 100% ćelija i bilo koji % između 50 i 100% u odnosu na referentnu ćelijsku populaciju.
[0210] CD4+ T pomoćne ćelije sortirane su u naivne, centralne memorijske i efektorske ćelije identifikovanjem ćelijskih populacija koje imaju ćelijske površinske antigene. CD4+ limfociti mogu se dobiti standardnim postupcima. U nekim primerima, naivni CD4+ T limfociti su CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T ćelije. U nekim primerima, centralne memorijske CD4+ ćelije su CD62L+ i CD45RO+. U nekim primerima, efektorske CD4+ ćelije su CD62L- i CD45RO-.
[0211] U primerima, populacije CD4+ i CD8+ koje su antigen-specifične mogu se dobiti stimulisanjem naivnih ili antigen-specifičnih T limfocita antigenom. Na primer, antigen-specifične T ćelijske linije ili klonovi mogu se generisati u antigene citomegalovirusa izolovanjem T ćelija iz inficiranih subjekata i stimulisanjem ćelija in vitro istim antigenom. Naivne T ćelije mogu takođe da se koriste. Bilo koji broj antigena iz tumorskih ćelija može da se koristi kao mete za izazivanje T ćelijskih odgovora. U nekim primerima, kompozicije adoptivne ćelijske imunoterapije korisne su u lečenju neke bolesti ili poremećaja koji uključuju čvrst tumor, hematološki malignitet, kancer dojke ili melanom.
[0212] Modifikacija T limfocitnih populacija
[0213] U nekim primerima može biti poželjno da se uvedu funkcionalni geni u T ćelije koje će se koristiti u imunoterapiji. Na primer, uvedeni gen ili geni mogu poboljšati efikasnost terapije promovisanjem vijabilnosti i/ili funkcije prenetih T ćelija; ili oni mogu da obezbede genetički marker da dozvole selekciju i/ili evaluaciju in vivo preživljavanja ili migracije; ili oni mogu da inkorporiraju funkcije koje poboljšavaju bezbednost imunoterapije, na primer, čineći ćeliju osetljivom na negativnu selekciju in vivo kao što je opisano od strane Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); i Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); videti takođe objave PCT/LTS91/08442 i PCT/US94/05601 od strane Lupton et al. koje opisuju upotrebu bifunkcionalnih selektibilnih fuzionih gena izvedenih fuzijom dominantnog pozitivnog selektibilnog markera sa negativnim selektibilnim markerom. Ovo se može izvesti u skladu sa poznatim tehnikama (videti, npr., US Patent Br.6,040,177 od Riddell et al. u kolonama 14-17) ili njihovim varijacijama koje su očigledne stručnjacima u tehnici na osnovu ovog otkrivanja.
[0214] U primerima, T ćelije su modifikovane himernim receptorima kao što su opisani ovde. U nekim primerima, T ćelije su dobijene iz subjekta koji se tretira, a u ostalim primerima, limfociti su dobijeni iz alogenih humanih donora, poželjno zdravi humani donori.
[0215] U nekim primerima, himerni receptori obuhvataju ligand vezujući domen koji se specifično vezuje za molekul ćelijske površine tumora, polipeptidni spejser region, transmembranski domen i intracelularni signalizirajući domen kao što je opisan ovde. U primerima, ligand vezujući domen je jednolančani fragment antitela (scFv) koji je izveden iz varijabilnih teških (VH) i varijabilnih lakih (VL) lanaca monoklonalnog antitela (mAb). Kostimulatorni signali mogu takođe biti obezbeđeni kroz himerni receptor fuzijom kostimulatornog domena CD28 i/ili 4-1BB sa CD3Z lancem. Himerni receptori su specifični za molekule ćelijske površine nezavisne od HLA, čime se prevazilaze ograničenja TCR-prepoznavanja uključujući HLA-restrikciju i niske nivoe HLA-ekspresije na tumorskim ćelijama.
[0216] Himerni receptori mogu biti konstruisani sa specifičnošću za bilo koji ćelijski površinski marker korišćenjem antigen-vezujućih fragmenata ili varijabilnih domena antitela od, na primer, molekula antitela. Antigen-vezujući molekuli mogu biti vezani za jedan ili više modula ćelijske signalizacije. U primerima, moduli ćelijske signalizacije uključuju CD3 transmembranski domen, CD3 intracelularne signalizirajuće domene i CD28 transmembranske domene. U primerima, intracelularni signalizirajući
[0219] 2
[0220] domen obuhvata CD28 transmembranski i signalizirajući domen vezan za CD3 zeta intracelularni domen. U nekim primerima, himerni receptor može takođe da uključuje transdukcioni marker kao što je tEGFR.
[0221] U primerima, isti ili različiti himerni receptor može biti uveden u svaku populaciju od CD4+ i CD8+ T limfocita. U primerima, himerni receptor u svakoj od ovih populacija ima ligand vezujući domen koji se specifično vezuje za isti ligand na tumorskoj ili inficiranoj ćeliji. Moduli ćelijske signalizacije mogu da se razlikuju. U primerima, intracelularni signalizirajući domen CD8+ citotoksičnih T ćelija je isti kao intracelularni signalizirajući domen CD4+ pomoćnih T ćelija. U ostalim primerima, intracelularni signalizirajući domen CD8+ citotoksičnih T ćelija razlikuje se od intracelularnog signalizirajućeg domena CD4+ pomoćnih T ćelija.
[0222] U primerima svaki od CD4 ili CD8 T limfocita može biti sortiran u naivne, centralne memorijske, efektorske memorijske ili efektorske ćelije pre transdukcije kao što je opisano ovde. U alternativnim primerima, svaki od CD4 ili CD8 T limfocita može biti sortiran u naivne, centralne memorijske, efektorske memorijske ili efektorske ćelije posle transdukcije.
[0223] Razvijene su različite tehnike transdukcije koje koriste rekombinantne infektivne virusne čestice za dostavu gena. Ovo predstavlja trenutno poželjan pristup transdukciji T limfocita. Virusni vektori koji se koriste na ovaj način uključuju virusne vektore izvedene iz simijan virusa 40, adenovirusa, adeno- povezanih virusa (AAV), lentivirusnih vektora i retrovirusa. Tako, prenos gena i postupci ekspresije su brojni ali suštinski funkcionišu da uvode i eksprimiraju genetički materijal u ćelijama sisara. Nekoliko prethodnih tehnika korišćeno je da transdukuje hematopoetske ili limfoidne ćelije, uključujući transfekciju kalcijumfosfata, fuziju protoplasta, elektroporaciju i infekciju rekombinantnim adenovirusnim, adeno-povezanim virusnim i retrovirusnim vektorima. Primarni T limfociti uspešno su transdukovani elektroporacijom i retrovirusnom ili lentivirusnom infekcijom.
[0224] Retrovirusni i lentivirusni vektori obezbeđuju visokoefikasan postupak za prenos gena u eukariotske ćelije. Štaviše, retrovirusna ili lentivirusna integracija odvija se na kontrolisan način i rezultuje stabilnom integracijom jedne ili nekoliko kopija nove genetičke informacije po ćeliji.
[0225] Razmatrano je da li prekomerna ekspresija stimulatornog faktora (na primer, limfokin ili citokin) može biti toksična za tretiranog pojedinca. Prema tome, mogu da budu uključeni segmenti gena koji uzrokuju da T ćelije budu osetljive na negativnu selekciju in vivo. "Negativna selekcija" znači da uvedena ćelija može biti eliminisana kao rezultat promene u in vivo stanju pojedinca. Negativni selektibilni fenotip može da rezultuje od umetanja gena koji dodeljuje osetljivost na dati agens, na primer, neko jedinjenje. Negativni selektibilni geni poznati su u tehnici, i uključuju, inter alia sledeće: gen timidin kinaze herpes simpleks virusa tipa I (HSV-I TK), koji dodeljuje osetljivost na ganciklovir; gen ćelijske hipoksantin fosforiboziltransferaze (HPRT), gen ćelijske adenin fosforiboziltransferaze (APRT) i bakterijsku citozin deaminazu.
[0226] U nekim primerima može biti korisno da uključuju u T ćelijama pozitivni marker koji omogućava selekciju ćelija negativnog selektibilnog fenotipa in vitro. Pozitivan selektibilni marker može biti gen koji nakon uvođenja u ćeliju domaćina eksprimira dominantni fenotip koji dozvoljava pozitivnu selekciju ćelija koje nose taj gen. Geni ovog tipa poznati su u tehnici, i uključuju, inter alia, gen higromicin-B fosfotransferaze (hph) koji dodeljuje otpornost na higromicin B, gen amino glukozid fosfotransferaze (neo ili aph) iz Tn5 koji kodira otpornost na antibiotik G418, gen dihidrofolat reduktaze (DHFR), gen adenozin deaminaze (ADA) i gen višestruke rezistencije na lekove (MDR).
[0227] Razni postupci mogu da se koriste za transdukciju T limfocita, kao što je dobro poznato u tehnici. U primerima, transdukcija se izvodi pomoću lentivirusnih vektora.
[0230] 2
[0231] U primerima, CD4+ i CD8+ ćelije svaka mogu odvojeno biti modifikovane nekim ekspresionim vektorom koji kodira himerni receptor radi obrazovanja definisanih populacija. U primerima, ove ćelije zatim su dalje sortirane u subpopulacije naivnih, centralnih memorijskih i efektorskih ćelija kao što je prethodno opisano sortiranjem ćelijskih površinskih antigena jedinstvenih za ove ćelijske populacije. Dodatno, CD4+ ili CD8+ ćelijske populacije mogu biti odabrane prema njihovom profilu citokina ili proliferativnim aktivnostima. Na primer, mogu se odabrati CD4+ T limfociti koji imaju poboljšanu proizvodnju citokina kao što su IL-2, IL-4, IL-10, TNFa i IFNy u odnosu na lažne transdukovane ćelije ili transdukovane CD8+ ćelije kada su stimulisani antigenom. U ostalim primerima, odabrane su naivne ili centralne memorijske CD4+ T ćelije koje imaju poboljšanu proizvodnju IL-2 i/ili TNFa. Slično, CD8+ ćelije koje imaju poboljšanu IFNy proizvodnju odabrane su u odnosu na lažne transdukovane CD8+ ćelije.
[0232] U primerima, CD4+ i CD8+ćelije koje proliferišu kao odgovor na antigenske ili tumorske mete su odabrane. Na primer, odabrane su CD4+ ćelije koje proliferišu snažno kada se stimulišu antigenskim ili tumorskim metama u odnosu na lažne transdukovane ćelije ili CD8+ transdukovane ćelije. U nekim primerima, odabrane su CD4+ i CD8+ ćelije koje su citotoksične za antigen-noseće ćelije. U primerima, očekuje se da su CD4+ slabo citotoksične u odnosu na CD8+ ćelije.
[0233] U nekom poželjnom primeru, odabrani su transdukovani limfociti, kao što su CD8+ centralne memorijske ćelije, koji obezbeđuju ubijanje tumorskih ćelija in vivo pomoću životinjskog modela ustanovljenog za određeni tip kancera. Takvi životinjski modeli poznati su stručnjacima u tehnici i isključuju ljudska bića. Kao što je opisano ovde, ne dodeljuju svi konstrukti himernog receptora transdukovani u limfocite sposobnost ubijanja tumorskih ćelija in vivo uprkos sposobnosti da postanu aktivni i da ubijaju tumorske ćelije in vitro. Određenije, za neke ciljane molekule, T ćelije koje imaju konstrukte himernog receptora sa dugim spejser regionom manje su efektivne u ubijanju tumorskih ćelija in vivo u odnosu na T ćelije koje imaju himerni receptor sa kratkim spejser regionom. Za ostale ciljane molekule, T ćelije koje imaju konstrukte himernog receptora sa kratkim spejser regionom bile su manje efektivne u ubijanju tumorskih ćelija in vivo u odnosu na T ćelije koje imaju himerne receptore sa dugim spejser regionom.
[0234] U još nekim drugim primerima, transdukovane T ćelije koje eksprimiraju himerni receptor odabrane su da mogu da opstanu in vivo pomoću životinjskog modela ustanovljenog za određeni tip kancera. U primerima, pokazalo se da CD8+ centralne memorijske ćelije transdukovane himernim receptorom sa kratkim spejser regionom opstaju in vivo posle uvođenja u životinju tokom oko 3 dana ili više, 10 dana ili više, 20 dana ili više, 30 dana ili više, 40 dana ili više ili 50 dana ili više.
[0235] Razmatrano je da će se kombinacije CD4+ i CD8+ T ćelija koristiti u kompozicijama kao što je opisano. U jednom primeru, kombinacije CD4+ ćelija transdukovanih himernim receptorom mogu biti kombinovane sa CD8+ ćelijama transdukovanim himernim receptorom iste specifičnosti za ligand ili kombinovane sa CD8+ T ćelijama koje su specifične za drugačiji tumorski ligand. U ostalim primerima, CD8+ ćelije transdukovane himernim receptorom kombinovane su sa CD4+ ćelijama transdukovanim himernim receptorom specifičnim za različiti ligand eksprimiran na tumoru. U još nekom drugom primeru, kombinovane su CD4+ i CD8+ ćelije modifikovane himernim receptorom. U primerima CD8+ i CD4+ ćelije mogu biti kombinovane u različitim odnosima na primer, 1:1 odnos CD8+ i CD4+, odnos 10:1 CD8+ prema CD4+, ili odnos 100:1 CD8+ prema CD4+. U primerima, kombinovana populacija testirana je za ćelijsku proliferaciju in vitro i/ili in vivo, a odnos ćelija koji obezbeđuje proliferaciju ćelija je izabran.
[0236] [0137] Razmatrano je da CD4+ i CD8+ ćelije mogu biti dalje razdvojene u subpopulacije, kao što su naivne, centralne memorijske, i efektorske memorijske ćelijske populacije. Kao što je opisano ovde, u nekim primerima, naivne CD4+ ćelije su CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ pozitivne T ćelije. U nekim primerima, centralne memorijske CD4+ ćelije su CD62L pozitivne i CD45RO pozitivne. U nekim primerima, efektorske CD4+ ćelije su CD62L negativne i CD45RO pozitivne. Svaka od ovih populacija može biti nezavisno modifikovana nekim himernim receptorom.
[0237] Kao što je opisano ovde, u primerima, memorijske T ćelije prisutne su i u CD62L+ i u CD62L-podskupovima CD8+ limfocita periferne krvi. PBMC su sortirane u CD62L-CD8+ i CD62L+CD8+ frakcije posle bojenja anti-CD8 i anti-CD62L antitelima. U nekim primerima, ekspresija fenotipskih markera centralnih memorijskih T ćelija (TCM) uključuje CD62L, CCR7, CD28, CD3 i CD127 i negativne su ili slabe za granzim B. U nekim primerima, centralne memorijske T ćelije su CD45RO+, CD62L+, CD8+ T ćelije. U nekim primerima, efektorske T ćelije (TE) su negativne za CD62L, CCR7, CD28 i CD127, a pozitivne za granzim B i perforin. U nekim primerima, naivni CD8+ T limfociti karakterišu se sa CD8+, CD62L+, CD45RO+, CCR7+, CD28+ CD127+ i CD45RO+. Svaka od ovih populacija može biti nezavisno modifikovana nekim himernim receptorom.
[0238] Posle transdukcije i/ili selekcije za ćelije koje nose himerni receptor, ćelijske populacije su poželjno raširene in vitro dok nije postignut dovoljan broj ćelija da obezbedi najmanje jednu infuziju u humani subjekat, obično oko 10<4>ćelija/kg do 10<9>ćelija/kg. U primerima, transdukovane ćelije su kultivisane u prisustvu antigen-nosećih ćelija, anti CD3, anti CD28 i IL 2, IL-7, IL 15, IL-21 i njihovih kombinacija.
[0239] Svaka od subpopulacija CD4+ i CD8+ ćelija može biti međusobno kombinovana. U određenom primeru, modifikovane naivne ili centralne memorijske CD4+ ćelije kombinovane su sa modifikovanim centralnim memorijskim CD8+ T ćelijama radi obezbeđivanja sinergističkog citotoksičnog efekta na antigen-nosećim ćelijama, kao što su tumorske ćelije.
[0240] Kompozicije
[0241] Opisana je kompozicija adoptivne ćelijske imunoterapije koja obuhvata preparat genetički modifikovanih T limfocita kao što je opisan ovde.
[0242] U primerima, preparat T limfocita obuhvata CD4 T ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata ekstracelularni varijabilni domen antitela specifičan za ligand povezan sa bolešću ili poremećajem, prilagodljiv spejser region, transmembranski domen i intracelularni signalizirajući domen T ćelijskog receptora ili drugih receptora kao što je opisano ovde. U ostalim primerima, kompozicija adoptivne ćelijske imunoterapije dalje obuhvata preparat tumor-specifičnih CD8+ citotoksičnih T limfocita modifikovanih himernim receptorom koji obezbeđuje ćelijski imuni odgovor, pri čemu taj preparat citotoksičnih T limfocita obuhvata CD8+ T ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata ekstracelularno jednolančano antitelo specifično za ligand povezan sa bolešću ili poremećajem, prilagodljiv spejser region, transmembranski domen i intracelularni signalizirajući domen T ćelijskog receptora kao što je opisano ovde. U primerima, T ćelijska populacija iz prikaza modifikovana himernim receptorom može da opstane in vivo tokom najmanje oko 3 dana ili duže.
[0243] U nekim primerima, kompozicija adoptivne ćelijske imunoterapije obuhvata preparat tumorspecifičnih CD8+ citotoksičnih T limfocita modifikovanih himernim receptorom koji obezbeđuje ćelijski imuni odgovor, pri čemu taj preparat citotoksičnih T limfocita obuhvata CD8+ T ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata ekstracelularno jednolančano antitelo specifično za ligand povezan sa bolešću ili poremećajem, prilagodljiv spejser region, transmembranski domen i intracelularni signalizirajući domen T ćelijskog receptora, u kombinaciji sa naivnom CD4+ T pomoćnom ćelijom modifikovanom antigen- reaktivanim himernim receptorom koja je izvedena iz CD45RO- CD62L+ CD4+ T ćelija, i farmaceutski prihvatljivi nosač.
[0246] 1
[0247] U ostalim primerima, kompozicija adoptivne ćelijske imunoterapije obuhvata preparat antigen specifičnih CD8+ citotoksičnih T limfocita koji obezbeđuju ćelijski imuni odgovor dobijen od pacijenta kombinovan sa naivnom CD4+ T pomoćnom ćelijom modifikovanom antigen-reaktivnim himernim receptorom koja povećava CD8+ imuni odgovor, pri čemu preparat pomoćnih T limfocita obuhvata CD4 T ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata ekstracelularni varijabilni domen antitela specifičan za antigen povezan sa bolešću ili poremećajem, prilagodljiv spejser region, transmembranski domen i intracelularni signalizirajući domen T ćelijskog receptora.
[0248] U nekom daljem primeru, kompozicija adoptivne ćelijske imunoterapije obuhvata naivnu CD4+ T pomoćnu ćeliju modifikovanu antigen-reaktivanim himernim receptorom koja povećava CD8+ imuni odgovor, pri čemu preparat pomoćnih T limfocita obuhvata CD4 T ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata ekstracelularni varijabilni domen antitela specifičan za ligand povezan sa nekom bolešću ili poremećajem, prilagodljiv spejser region, transmembranski domen i intracelularni signalizirajući domen T ćelijskog receptora.
[0249] U primerima, CD4+ T pomoćni limfocit izabran je iz grupe koju čine naivne CD4+ T ćelije, centralne memorijske CD4+ T ćelije, efektorske memorijske CD4+ T ćelije ili rasute CD4+ T ćelije. U nekim primerima, CD4+ pomoćni limfocit je naivna CD4+ T ćelija, pri čemu ta naivna CD4+ T ćelija obuhvata CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ CD4+ T ćeliju. U primerima, CD8+ T citotoksični limfocit je izabran iz grupe koju čine naivne CD8+ T ćelije, centralne memorijske CD8+ T ćelije, efektorske memorijske CD8+ T ćelije ili rasute CD8+ T ćelije. U nekim primerima, CD8+ citotoksični T limfocit je centralna memorijska T ćelija, pri čemu ta centralna memorijska T ćelija obuhvata CD45RO+, CD62L+, CD8+ T ćeliju. U još nekim drugim primerima, CD8+ citotoksični T limfocit je centralna memorijska T ćelija, a CD4+ pomoćni T limfocit je naivna ili centralna memorijska CD4+ T ćelija.
[0250] Postupci
[0251] Opisani su postupci izrade kompozicija adoptivne imunoterapije i koristi ili postupke upotrebe ovih kompozicija za izvođenje ćelijske imunoterapije na subjektu koji ima neku bolest ili poremećaj. U primerima, T ćelije modifikovane himernim receptorom kao što su opisane ovde mogu da opstanu in vivo tokom najmanje 3 dana ili najmanje 10 dana. U primerima, T ćelije modifikovane himernim receptorom kao što su opisane ovde mogu da proliferišu in vivo kroz najmanje 2, ili najmanje 3 generacije kao što je određeno pomoću rastvora CFSE boje. Proliferacija i perzistencija T ćelija modifikovanih himernog receptora može biti određena pomoću životinjskog modela bolesti ili poremećaja i davanjem ćelija i određivanjem kapaciteta perzistencije i/ili proliferacije prenetih ćelija. U ostalim primerima, proliferacija i aktivacija mogu da se testiraju in vitro prolaskom kroz višestruke cikluse aktivacije antigen-nosećim ćelijama.
[0252] U primerima, postupak proizvodnje kompozicija obuhvata dobijanje modifikovane naivne CD4+ T pomoćne ćelije, pri čemu preparat modifikovanih pomoćnih T limfocita obuhvata CD4+ T ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata ligand vezujući domen specifičan za molekul ćelijske površine tumora, prilagođen spejser domen, transmembranski domen i intracelularni signalizirajući domen kao što je opisan ovde.
[0253] U nekom drugom primeru, postupak dalje obuhvata dobijanje modifikovane CD8+ citotoksične T ćelije, pri čemu preparat modifikovanih citotoksičnih T limfocita obuhvata CD8+ ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata ligand vezujući domen specifičan za molekul ćelijske površine tumora, prilagođen spejser domen, transmembranski domen i intracelularni signalizirajući domen kao što je opisan ovde.
[0254] U nekom drugom primeru, postupak obuhvata dobijanje modifikovane CD8+ citotoksične T ćelije, pri čemu preparat modifikovanih citotoksičnih T limfocita obuhvata CD8+ T ćelije koje imaju
[0257] 2
[0258] himerni receptor koji obuhvata ligand vezujući domen specifičan za molekul ćelijske površine tumora, prilagođen spejser domen, transmembranski domen i intracelularni signalizirajući domen kao što je opisan ovde, a koji dalje obuhvata kombinovanje modifikovanih CD8+ citotoksičnih T ćelija sa ćelijskim preparatom CD4+ pomoćnog limfocita.
[0259] Preparat CD4+ i CD8+ ćelija koje su modifikovane himernim receptorom opisan je gore kao i u primerima. Antigen-specifični T limfociti mogu se dobiti od pacijenta koji ima bolest ili poremećaj ili mogu se pripremiti in vitro stimulacijom T limfocita u prisustvu antigena. Subpopulacije CD4+ i CD8+ T limfocita koje nisu odabrane za antigensku specifičnost mogu se takođe izolovati kao što je opisano ovde i kombinovati u postupcima proizvodnje. U primerima, kombinacija ćelijskih populacija može se oceniti za uniformnost ćelijskih površinskih makera, sposobnost da proliferuju kroz najmanje dve generacije, da imaju uniformni status ćelijske diferencijacije. Kontrola kvaliteta može se izvesti kokultivisanjem ćelijske linije koja eksprimira ciljani ligand sa T ćelijama modifikovanih himernim receptorom radi određivanja da li T ćelije modifikovane himernim receptorom prepoznaju ćelijsku liniju pomoću testova citotoksičnosti, proliferacije ili proizvodnje citokina koji su poznati u ovoj oblasti. Status ćelijske diferencijacije i ćelijski površinski markeri na T ćelijama modifikovanim himernim receptorom može se odrediti protočnom citometrijom. U primerima, markeri i status ćelijske diferencijacije na CD8+ ćelijama uključuju CD3, CD8, CD62L, CD28, CD27, CD69, CD25, PD-1, CTLA-4, CD45RO i CD45RA. U primerima, markeri i status ćelijske diferencijacije na CD4+ ćelijama uključuju CD3, CD4, CD62L, CD28, CD27, CD69, CD25, PD-1, CTLA-4 CD45RO i CD45RA.
[0260] U primerima, postupak selekcije spejser regiona za himerni receptor opisan je ovde. Iznenađujuće, neki konstrukti himernog receptora, iako efektivni da aktiviraju T ćelije in vitro, nisu bili efektivni in vivo. U primerima, postupak obuhvata obezbeđivanje većine nukleinskih kiselina himernog receptora, pri čemu se nukleinske kiseline himernog receptora razlikuju samo u spejser regionu; uvođenje svake od nukleinskih kiselina himernog receptora u odvojenu T limfocitnu populaciju; širenje svake odvojene limfocitne populacije in vitro, i uvođenje svake limfocitne populacije u neku životinju koja ima tumor radi određivanja anti-tumorske efikasnosti svake od T ćelija modifikovanih himernim receptorom, i selekcija himernog receptora koji obezbeđuje anti-tumorsku efikasnost u odnosu na svaku od ostalih odvojenih limfocitnih populacija modifikovanih sa svakom od ostalih T ćelija modifikovanih himernim receptorom.
[0261] Životinjski modeli različitih tumora su poznati. Anti-tumorska efikasnost može se izmeriti identifikovanjem smanjenja zapremine tumora, određivanjem smrti životinja, perzistencije genetički modifikovanih T ćelija in vivo, aktivacije genetički modifikovanih T ćelija (na primer, detektovanjem povećanja ekspresije CD25 i/CD69), i/ili proliferacije genetički modifikovanih T ćelija in vivo. U jednom primeru, izabran je himerni receptor koji obezbeđuje najbolju anti-tumorsku efikasnost in vivo kao što je određeno pomoću jednog ili više ovih parametara. Nedostatak anti-tumorske efikasnosti može biti određen nedostatkom perzistencije genetički modifikovanih limfocita in vivo, smrti životinja, povećanja apoptoze kao što je izmereno porastom indukcije kaspaze -3, i/ili smanjenjem proliferacije genetički modifikovanih limfocita.
[0262] U primerima, koji obezbeđuju većinu nukleinskih kiselina himernog receptora, pri čemu se nukleinske kiseline himernog receptora razlikuju samo u spejser regionu obuhvata obezbeđivanje konstrukta himernog receptora koji obuhvata polinukleotid koji kodira ligand vezujući domen, pri čemu ligand predstavlja antigen specifičan za tumor, virusni antigen ili bilo koji drugi molekul eksprimiran na ciljanoj ćelijskoj populaciji koja je pogodna da posreduje u prepoznavanju i eliminisanju limfocitom; polinukleotid koji kodira prvi polipeptidni spejser koji ima definisano restrikciono mesto na 5' i 3' kraju kodirajuće sekvence za prvi polipeptidni spejser; polinukleotid koji kodira transmembranski domen; i polinukleotid koji kodira intracelularni signalizirajući domen.
[0263] Opisani su postupci izvođenja ćelijske imunoterapije na subjektu koji ima neku bolest ili poremećaj koji obuhvataju: davanje kompozicije limfocita koji eksprimiraju himerni receptor. U ostalim primerima, postupak obuhvata davanje subjektu preparata genetički modifikovanih citotoksičnih T limfocita koji obezbeđuje ćelijski imuni odgovor, pri čemu taj preparat citotoksičnih T limfocita obuhvata CD8 T ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata ligand vezujući domen specifičan za molekul ćelijske površine tumora, prilagođen spejser domen, transmembranski domen, i intracelularni signalizirajući domen kao što je opisan ovde, i preparat genetički modifikovanih pomoćnih T limfocita koji izaziva direktno prepoznavanje tumora i povećava sposobnost preparata genetički modifikovanih citotoksičnih T limfocita da posreduju ćelijski imuni odgovor, pri čemu preparat pomoćnih T limfocita obuhvata CD4+ T ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata ligand vezujući domen specifičan za molekul ćelijske površine tumora, prilagođen spejser domen, transmembranski domen i intracelularni signalizirajući domen kao što je opisan ovde.
[0264] Bez ograničenja obima ovog otkrivanja, veruje se da se selekcijom T ćelijske populacije modifikovane himernim receptorom koja može da opstane i proliferiše in vivo pre davanja može postići mogućnost da se koristi niža doza T ćelija i obezbedi uniformnija terapijska aktivnost. U primerima, doza T ćelija može se smanjiti najmanje 10%, 20% ili 30% ili više. Smanjenje doze T ćelija može biti korisno da se smanji rizik ili sindrom lize tumora i citokinska oluja.
[0265] U nekom drugom primeru, postupak izvođenja ćelijske imunoterapije kod subjekta koji ima neku bolest ili poremećaj obuhvata: davanje subjektu preparata genetički modifikovanih pomoćnih T limfocita, pri čemu taj preparat modifikovanih pomoćnih T limfocita obuhvata CD4+ T ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata ligand vezujući domen specifičan za molekul ćelijske površine tumora, prilagođen spejser domen, transmembranski domen i intracelularni signalizirajući domen kao što je opisano ovde. U nekim primerima, postupak dalje obuhvata davanje subjektu preparata genetički modifikovanih citotoksičnih T limfocita, pri čemu taj preparat modifikovanih citotoksičnih T limfocita obuhvata CD8+ ćelije koje imaju himerni receptor koji obuhvata ligand vezujući domen specifičan za molekul ćelijske površine tumora, prilagođen spejser domen, transmembranski domen i intracelularni signalizirajući domen kao što je opisano ovde.
[0266] Drugi primer opisuje postupak izvođenja ćelijske imunoterapije na subjektu koji ima neku bolest ili poremećaj koji obuhvata: analiziranje biološkog uzorka subjekta na prisustvo ciljanog molekula povezanog sa bolešću ili poremećajem i davanje kompozicija adoptivne imunoterapije opisanih ovde, pri čemu se himerni receptor specifično vezuje za taj ciljani molekul.
[0267] U nekim primerima, CD4+ T pomoćni limfocit je izabran pre uvođenja himernog receptora iz grupe koju čine naivne CD4+ T ćelije, centralne memorijske CD4+ T ćelije, efektorske memorijske CD4+ T ćelije ili rasute CD4+ T ćelije. U određenom primeru, CD4+ pomoćni limfocit je naivna CD4+ T ćelija, pri čemu ta naivna CD4+ T ćelija obuhvata CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ CD4+ T ćeliju. U još nekim drugim primerima, CD8+ T citotoksični limfocit je izabran pre uvođenja himernog receptora iz grupe koju čine naivne CD8+ T ćelije, centralne memorijske CD8+ T ćelije, efektorske memorijske CD8+ T ćelije ili rasute CD8+ T ćelije. U određenom primeru, CD8+ citotoksični T limfocit je centralna memorijska T ćelija pri čemu ta centralna memorijska T ćelija obuhvata CD45RO+, CD62L+, CD8+ T ćeliju. U određenom primeru, CD8+ citotoksični T limfocit je centralna memorijska T ćelija, a CD4+ pomoćni T limfocit je naivna CD4+ T ćelija.
[0268] U primerima, CD8+ T ćelija i CD4+ T ćelija su obe genetički modifikovane nekim himernim receptorom koji obuhvata neki domen teškog lanca antitela koji specifično vezuje tumor-specifični molekul ćelijske površine. U ostalim primerima, intracelularni signalizirajući domen CD8 citotoksičnih T ćelija je isti kao intracelularni signalizirajući domen CD4 pomoćnih T ćelija. U još nekim drugim primerima, intracelularni signalizirajući domen CD8 citotoksičnih T ćelija razlikuje se od intracelularnog
[0271] 4
[0272] signalizirajućog domena CD4 pomoćnih T ćelija.
[0273] Subjekti koji mogu biti tretirani, uopšteno, humani subjekti i ostali primati, kao što su majmuni i čovekoliki majmuni za svrhe veterinarske medicine. Subjekti mogu biti mužjaci ili ženke i mogu biti bilo koje pogodne starosti, uključujući odojčad, maloletnike, adolescente, zrele i gerijatrijske subjekte.
[0274] Postupci su korisni u lečenju, na primer, hematološkog maligniteta, melanoma, kancera dojke i ostalih epitelijalnih maligniteta ili čvrstih tumora. U nekim primerima, molekul povezan sa bolešću ili poremećajem izabran je iz grupe koju čine orfanski receptor nalik tirozin kinazi ROR1, Her2, CD19, CD20, CD22, mezotelin, CEA i površinski antigen hepatitisa B.
[0275] Subjekti koji mogu biti tretirani uključuju subjekte pogođene kancerom, uključujući, ali neograničavajući se na, kancer kolona, pluća, jetre, dojke, bubrega, prostate, jajnika, kože (uključujući melanom), kosti i mozga, itd. U nekim primerima tumor povezani antigeni ili molekuli poznati su, kao što su melanom, kancer dojke, karcinom skvamoznih ćelija, kancer kolona, leukemija, mijelom i kancer prostate. U ostalim primerima tumor povezani molekuli mogu biti ciljani genetički modifikovanim T ćelijama koje eksprimiraju konstruisani himerni receptor. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, B ćelijski limfom, kancer dojke, kancer prostate i leukemiju.
[0276] Ćelije pripremljene kao što je prethodno opisano mogu se koristiti u postupcima i kompozicijama za adoptivnu imunoterapiju u skladu sa poznatim tehnikama, ili njihovim varijacijama koje će biti očigledne stručnjacima u tehnici na osnovu ovog otkrivanja.
[0277] U nekim primerima, ćelije su formulisane njihovim prvim prikupljanjem iz njihove podloge za kulturu, i zatim ispiranjem i koncentrovanjem tih ćelija u sistemu podloge i posude pogodnom za davanje ("farmaceutski prihvatljivi" nosač) u efektivnoj količini za tretiranje. Pogodni medijum za infuziju može biti bilo koja izotonična formulacija medijuma, obično normalni fiziološki rastvor, Normosol R (Abbott) ili Plasma-Lyte A (Baxter), ali takođe 5% dekstroza u vodi ili Ringerovom laktatu može da se koristi. Medijum za infuziju može biti dopunjen humanim serumom albuminom, fetalnim goveđim serumom ili ostalim komponentama humanih seruma.
[0278] Terapijska efektivna količina ćelija u kompoziciji je najmanje 2 ćelijska podskupa (na primer, 1 podskup CD8+ centralnih memorijskih T ćelija i 1 podskup CD4+ pomoćnih T ćelija) ili je obično više od 10<2>ćelija, i do 10<6>, sve do i uključujući 10<8>ili 10<9>ćelija i može biti više od 10<10>ćelija. Brojne ćelije zavisiće od ultimativne upotrebe za koju je kompozicija namenjena jer će vrsta ćelija biti uključena u njoj. Na primer, ako su ćelije koje su specifične za određeni antigen poželjne, onda će populacija sadržati više od 70%, uopšteno više od 80%, 85% i 90-95% tih ćelija. Za upotrebe opisane ovde, ćelije su uopšteno u zapremini od litar ili manje, mogu biti 500 ml ili manje, čak 250 ml ili 100 ml ili manje. Stoga, gustina poželjnih ćelija obično je veća od 10<4>ćelija/m1 i uopšteno veća je od 10<7>ćelija/ml, uopšteno 10<8>ćelija/ml ili više. Klinički relevantni broj imunih ćelija može se podeliti u višestruke infuzije koje su kumulativno jednake ili prelaze 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<8>, 10<9>, 10<10>ili 10<11>ćelija.
[0279] U nekim primerima, limfociti mogu da se koriste za dodeljivanje imuniteta pojedincima. "Imunitet" znači umanjenje jednog ili više fizičkih simptoma povezanih sa odgovorom na infekciju nekim patogenom, ili na tumor, na koji je odgovor limfocita usmeren. Količina datih ćelija obično je u opsegu prisutnih kod normalnih pojedinaca sa imunitetom na patogen. Tako, ćelije se obično daju infuzijom, pri čemu je svaka infuzija u opsegu od 2 ćelije, sve do najmanje 10<6>do 3x10<10>ćelija, poželjno u opsegu od najmanje 10<7>do 10<9>ćelija. T ćelije mogu da se daju jednom infuzijom, ili putem višestrukih infuzija tokom nekog vremenskog okvira. Međutim, budući da se očekuje da će različiti pojedinci različito da reaguju, vrsta i količina datih ćelija, kao i broj infuzija i vremenski okvir tokom kog se višestruke infuzije daju određeni su od strane lekara, i mogu biti određeni rutinskim ispitivanjem.
[0280] Generacija dovoljnih nivoa T limfocita (uključujući citotoksične T limfocite i/ili pomoćne T limfocite) je jednostavno dostižna pomoću postupka brze ekspanzije, kao što je ovde prikazano. Videti, npr., US Patent Br.6,040,177 od Riddell et al. u koloni 17.
[0281] U primerima, kompozicije kao što su opisane ovde daju se intravenozno, intraperitonealno, intratumoralno, u koštanu srž, u limfni čvor, i /ili u cerebrospinalnu tečnost. U primerima, kompozicije sa konstruisanim himernim receptorom dostavljaju se u mesto tumora. Alternativno, kompozicije kao što su opisane ovde mogu biti kombinovane sa nekim jedinjenjem koje cilja ćelije na tumor ili delove imunog sistema i izbegava mesta kao što su pluća.
[0282] U primerima, kompozicije kao što su opisane ovde daju se sa hemoterapeutskim agensima i/ili imunosupresantima. U jednom primeru, pacijent je prvo tretiran nekim hemoterapeutskim agensom koji inhibira ili uništava ostale imune ćelije praćeno kompozicijama opisanim ovde. U nekim slučajevima, hemoterapija može biti u potpunosti izbegnuta.
[0283] Drugi slučajevi prikazani su u primerima izloženim u nastavku.
[0284] EKSPERIMENTALNI DEO
[0285] Primer I. Prilagođavanje dužina spejser domena i scFv afinitet za optimalno prepoznavanje ROR1 sa T ćelijama modifikovanim himernim receptorom
[0286] Konstruisani su himerni receptori specifični za ROR1 molekul koji se eksprimira na velikom broju humanih maligniteta uključujući hroničnu limfocitnu leukemiju, limfom mantle ćelija, akutnu limfoblastnu leukemiju, u kancer dojke, pluća prostate, pankreasa i jajnika. ROR1 himerni receptori konstruisani su iz ROR1 specifičnih scFV sa različitim afinitetima i koji sadrže ekstracelularni IgG4-Fc spejser domene različite dužine. Analizirana je sposobnost T-ćelija koje eksprimiraju svaki ROR-1 specifični himerni receptor za prepoznavanje ROR1+ hematopoetskih i epitelijalnih tumora in vitro, i za eliminisanje humanog limfoma mantle ćelija graftovanog kod imunodeficijentnih miševa.
[0287] Materijali i postupci
[0288] Humani subjekti
[0289] Jednojedarne ćelije periferne krvi (PBMC) dobijene su od zdravih donora i pacijenata posle pisane saglasnosti o informisanju o protokolima istraživanja odobrenom od strane Institutional Review Board iz the Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC).
[0290] Ćelijske linije
[0291] K562, Raji, JeKo-1, MDA-MB-231, MDA-MB-468 i 293T ćelijske linije dobijene su od American Type Culture Collection. Dr. Edus H. Warren (FHCRC) koji su ljubazno obezbedili ćelijske linije kancera bubrega FARP, TREP i RWL. K562/ROR1 i Raji/ROR1 generisani su lentivirusnom transdukcijom sa ROR1- genom pune dužine. Da bi se dobile JeKo-1/ffluc, nativne JeKo-1 ćelije su transdukovane sa lentivirusnim vektorom koji kodira gen luciferaze svica (ffluc) ushodno od T2A sekvence i eGFP. Transdukovane JeKo-1 ćelije sortirane su za eGFP ekspresiju, i raširene za in vivo eksperimente. Imunofenotipizacija
[0292] [0174] PBMC i ćelijske linije obojene su sledećim konjugovanim mAb: CD3, CD4, CD5, CD8, CD19, CD28, CD45RO, CD62L, CD314 (NKG2D), MICA/B i kontrolama podudarajućeg izotipa (BD Biosciences). Bojenje propidijum jodidom (PI) izvedeno je za ćelijsku diskriminaciju žive/mrtve. Ćelijska površinska ekspresija ROR1 analizirana je pomoću poliklonalnog kozjeg anti-humanog-RORl antitela (R&D Systems).
[0293] Površinska ekspresija 2A2 ROR1 himernog receptora analizirana je pomoću poliklonalnog kozjeg anti-mišjeg-IgG antitela (Fab-specifično) (Jackson ImmunoResearch). Protočne analize izvedene su na FACSCanto®, sortiranje-prečišćavanje na FACSAriaII® (Becton Dickinson) i podaci su analizirani pomoću FlowJo® softvera (Treestar).
[0294] Konstrukcija vektora i priprema lentivirusa koji kodira himerni receptor
[0295] ROR1-specifični i CD19-specifični himerni receptori konstruisani su pomoću segmenata VL i VH lanca 2A2, R12 i R11 mAb (ROR1) i FMC63 mAb (CD19). (Sekvence varijabilnog regiona za R11 i R12 obezbeđene su u Yang et al, Plos One 6(6):e21018, 15. jun 2011.) Svaki scFV je vezan (G4S)3(SEQ ID NO:12) peptidom za spejser domen izveden iz IgG4-Fc (Uniprot baza podataka: P01861, SEQ ID NO:13) koji obuhvata ili 'Šarka-CH2-CH3' (229 AA, SEQ ID NO:), 'Šarka-CH3' (119 AA,SEQ ID NO:) ili 'Šarka' samo (12 AA,SEQ. ID NO:4) sekvence (Slika 1). Svi spejseri imali su S^P supstituciju unutar 'Šarka' domena smeštenu na položaju 108 nativnog IgG4-Fc proteina, i bili su vezani za 27 AA transmembranski domen humanog CD28 (Uniprot: P10747, SEQ ID NO:14) i za modul signalizacije koji obuhvata ili (i) 41 AA citoplazmatični domen humanog CD28 sa LL^GG supstitucijom koja se nalazila na položajima 186-187 nativnog CD28 proteina (SEQ ID NO:14)ili (ii) 42 AA citoplazmatični domen humanog 4-1BB (Uniprot: Q07011, SEQ ID NO:15), od kojih je svaki vezan za 112 AA citoplazmatični domen izoforme 3 humanog CD3Z (Uniprot: P20963, SEQ ID NO;16). Konstrukt je kodirao T2A element preskakanja ribozoma (SEQ ID NO:8)) i tEGFR sekvencu (SEQ ID NO:9) nishodno od himernog receptora. Kodon-optimizovane nukleotidne sekvence koje kodiraju svaki transgen su sintetisane (Life Technologies) i klonirane u epHIV7 lentivirusni vektor.
[0296] RORl-himerni receptor, CD19-himerni receptor ili tEGFR-kodirajući lentivirusi proizvedeni su u 293T ćelijama pomoću vektora pakovanja pCHGP-2, pCMV-Rev2 i pCMV-G, i Calphos® reagensa za transfekciju (Clontech).
[0297] Generacija T-ćelijskih linija koje eksprimiraju ROR1 i CD19-himerne receptore
[0298] CD8+ CD45RO+ CD62L+ centralne memorijske T-ćelije (T<CM>) ili rasute CD4+ T-ćelije sortirane su iz PBMC normalnih donora, aktivirane anti-CD3/CD28 perlama (Life Technologies), i transdukovane 3. dana posle aktivacije centrifugiranjem sa 800 g za 45 min na 32°C sa lentivirusnim supernatantom (MOI = 3) dopunjenim sa 1 pg/mL polibrena (Millipore). T-ćelije su raširene u RPMI sa 10% humanim serumom, 2 mM L-glutamina i 1% penicilin-streptomicina (CTL podloga), dopunjene rekombinantnim humanim IL-2 do krajnje koncentracije od 50 U/mL. tEGFR+ podskup svake T-ćelijske linije obogaćen je imunomagnetnom selekcijom sa biotin-konjugovanim anti-EGFR mAb (ImClone Systems) i streptavidin- perlama (Miltenyi). ROR1-himerni receptor i tEGFR kontrolne T-ćelije raširene su pomoću protokola brze ekspanzije (Riddell SR, Greenberg PD,The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells J Immunol Methods.1990;128(2):189-201. Epub 1990/04/17.), i T-ćelije modifikovane CD19-himernim receptorom raširene su stimulacijom sa ozračenim (8000 rad) B-LCL u odnosu T-ćelija:LCL od 1:7. T-ćelije su kultivisane u CTL podlozi sa 50 U/mL IL-2.
[0299] Testovi citotoksičnosti, izlučivanja citokina i proliferacije
[0300] [0179] Ciljane ćelije obeležene su sa<51>Cr (PerkinElmer), isprane i inkubirane u triplikatu pri 1- 2x10<3>ćelija/bunarčić sa efektorskim T-ćelijama modifikovanim himernim receptorom u različitim odnosima efektor prema meta (E:T). Supernatanti su prikupljeni za y-brojanje posle 4-časovne inkubacije i specifična liza izračunata je standardnom formulom. Za analizu izlučivanja citokina, 5x10<4>T-ćelija je zasejano u triplikatu sa ciljanim ćelijama u E:T odnosu od 1:1 (primarne CLL), 2:1 (Raji/ROR1; JeKo-1), 4:1 (K562/ROR1, K562/CD19 i K562) ili 10:1 (MDA-MB-231), i IFN-y, TNF-α i IL-2 izmereni pomoću ELISA ili višestrukim imunotestom citokina (Luminex) u supernatantu uklonjeni su posle 24-h inkubacije. U eksperimentima blokiranje NKG2D signalizacije, anti-NKG2D (klon 1D11), anti-MICA/B (klon 6D4, svi od BD) i anti-ULBP (ljubatno obezbeđeni od Dr. Veronika Groh, FHCRC) korišćeni su u zasićenim koncentracijama. Za analizu proliferacije, T-ćelije obeležene su sa 0.2 µM sukcinimidil estra karboksifluoresceina (CFSE, Invitrogen), isprane i zasejane u triplikatu sa stimulatornim ćelijama u podlozi bez egzogenih citokina. Posle 72-h inkubacije, ćelije su obeležene sa anti-CD8 mAb i PI, i analizirane protočnom citometrijom da bi se ocenila ćelijska deoba živih CD8+ T-ćelija.
[0301] Eksperimenti na NOD/SCID/YC<-/->(NSG) miševima
[0302] The Institutional Animal Chimeric receptor and Use Committee odobrio je sve eksperimente na miševima. NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ (NSG) ženke miševa stare šest do 8 nedelja dobijene su od Jackson Laboratory ili uzgajane. Miševi su injektirani sa 0.5x10<6>JeKo-1/ffluc tumorskih ćelija u repnu venu i primili su naknadnu injekciju himerni receptor-modifikovanih ili kontrolnih T-ćelija u repnu venu.
[0303] Za bioluminescentno snimanje rasta tumora, miševi su primili intraperitonealne injekcije luciferin supstrata (Caliper Life Sciences) resuspendovanog u PBS (15 µg/g telesne mase). Miševi su anestezirani izofluranom i snimljeni korišćenjem Xenogen IVIS sistema snimanja (Caliper) 10, 12 i 14 minuta posle injekcije luciferina u režimu malog bininga za vreme akvizicije od 1 s do 1 min da bi se dobile nezasićene slike. Aktivnost luciferaze je analizirana pomoću Living Image softvera (Caliper) i fluks fotona analiziran je unutar regiona od interesa koji su obuhvatali celo telo ili grudni koš svakog pojedinačnog miša.
[0304] Statističke analize
[0305] Statističke analize izvedene su pomoću Prism softvera (GraphPad®). Studentov t-test izveden je kao dvostrani upareni test sa intervalom pouzdanosti od 95%, a rezultati sa p-vrednošću od p<0.05 smatrani su značajnim. Statistička analiza preživljavanja izvedena je pomoću log-rank testa, a rezultati sa p-vrednošću od p<0.05 smatrani su značajnim.
[0306] Rezultati
[0307] Skraćivanje spejser domena 2A2 ROR1-himernog receptora dodeljuje superiorno prepoznavanje ROR1<+>tumora
[0308] Prethodno je prijavljen dizajn ROR1-specifičnog himernog receptora koji koristi 2A2 scFV, koji se vezuje za epitop na NH2-kraju, distalan membrani Ig-sličan/Frizzled deo ROR1-1. Inicijalni 2A2 ROR1- himerni receptor imao je dugi 229 AA spejser koji je uključivao 'Šarka-CH2-CH3' region od IgG4-Fc, i inkorporirani su CD28 kostimulatorni i CD3Z signalizirajući domeni (Hudecek M et al. Blood, 2010). Ovaj himerni receptor je dodelio specifično prepoznavanje ROR1+ tumora, ali je pretpostavka da će zbog lokacije ROR1 epitopa distalno membrani, skraćivanje spejser domena možda poboljšati prepoznavanje tumora i T-ćelijsku signalizaciju. Prema tome, konstruisana su 2 dodatna himerna receptora u kojima je IgG4-Fc spejser domen sekvencijalno obrisan da bi se dobile 'Šarka-CH3' (119 AA, srednji), i 'Šarka-samo' (12 AA, kratki) varijante. Svaki od novih receptora imao je identične 2A2 scFV, i CD28 i CD3Z module signalizacije. Transgena kaseta obuhvatala je okrnjen EGFR (tEGFR) da bi služio kao marker transdukcije, selekcije i in vivo praćenja za himerni receptor-modifikovane T-ćelije.
[0309] Transdukovane su prečišćene CD8+ T<CM>sa 2A2 ROR1-himernim receptorima koji sadrže pune dužine ili okrnjene IgG4-Fc spejsere, i sa tEGFR kontrolnim vektorom. Srednja vrednost efikasnosti transdukcije bila je 15% (opseg 9-22%), i transgen-pozitivne T-ćelije obogaćene su do ravnomerne čistoće (>90%) 10. dana selekcijom za tEGFR ekspresiju, i raširene (Slika 2A). Površinska ekspresija svakog od himernih receptora potvrđena je bojenjem F(ab)-specifičnim antitelima (Slika 2A).
[0310] Analiza in vitro funkcije CD8+ T-ćelija modifikovanih radi eksprimiranja svakog od 2A2 ROR1-himernih receptora demonstrirala je da je svaki receptor dodelio specifičnu lizu JeKo-1 MCL i primarnih CLL ćelija koje prirodno eksprimiraju ROR1, i K562 ćelija koje su transdukovane sa ROR1, ali nisu dodelile prepoznavanje kontrolnih ROR1<->meta (Slika 2B). T-ćelije koje eksprimiraju kratki 'Šarka-samo' 2A2 ROR1- himerni receptor imale su maksimalnu citolitičku aktivnost, a hijerarhija (kratki>srednji>>dugi) lize tumora bila je jasno vidljiva protiv svih ROR1+ tumorskih meta (Slika 2B), što ilustruje značaj dužine spejser domena za prepoznavanje ROR1+ tumorskih ćelija.
[0311] Anti-tumorska efikasnost adoptivne T-ćelijske terapije u korelaciji je sa proliferacijom i preživljavanjem prenetih T-ćelija, koja može da se izmeni signalizacijom kroz himerni receptor. Korišćeni testovi sa CFSE rastvorom radi analize proliferacije T-ćelija modifikovanih sa svakim od 2A2 ROR1- himernih receptora posle angažovanja Raji/ROR1 ili CLL, i otkriveno je da je konstrukt kratkog spejsera promovisao najbolju T-ćelijsku proliferaciju nakon stimulacije (Slika 2C). Da bi se osiguralo da poboljšana proliferacija nije bila povezana sa većim aktiviranjem izazvanom ćelijskom smrti (AICD), takođe je analiziran odnos T-ćelija modifikovanih 2A2 ROR 1 himernim receptorom koje su obojene propidijum jodidom (PI) posle stimulacije sa Raji/ROR1, i JeKo-1 tumorskih ćelija. Detektovana je mnogo manja frekvencija PI+ CD8+ T-ćelija u T-ćelijskoj liniji modifikovanoj kratkim (Raji/ROR1: 17.2%/JeKo-1: 20.2%) u odnosu na srednje (41.6%/42.4%) i duge (44.5%/48.5%) spejsere.
[0312] Kvantitativna analiza proizvodnje citokina kao odgovor na stimulaciju sa Raji/ROR1 i primarnim CLL ćelijama pokazala je proizvodnju IFN-y, TNF-α i IL-2 od strane T-ćelija koje eksprimiraju svaki od 2A2 ROR1 himernih receptora. Kao što je primećeno u testovima citotoksičnosti, konstrukt kratkog spejsera bio je superioran u posredovanju izlučivanja citokina posle prepoznavanja tumora (Slika 2D). Tako, ova analiza pokazuje da skraćivanje ekstracelularnog IgG4-Fc spejser domena 2A2 ROR1-himernog receptora dovodi do značajnog porasta citotoksičnosti, proliferaciji i in vitro efektorskih funkcija posle prepoznavanja tumora.
[0313] R11 scFv koji je specifičan za epitop proksimalan membrani u ROR1 Kringl domenu zahteva dugi ekstracelularni spejser domen.
[0314] Transdukovane su prečišćene CD8+ T ćelije sa ROR1-himernim receptorima koji sadrže R11 scFv koji je specifičan za Kringl domen od ROR1 i koji sadrže pune dužine ili okrnjene IgG4-Fc spejsere (CH3 i šarka samo). Efikasnost transdukcije sa svakim od kratkih (IgG4 šarka samo), srednjih (IgG4 šarka/CH3), i dugih (IgG4 šarka/CH2/CH3) vektora bila je uporediva (45-51%) kao što je izmereno EGFR ekspresijom. (Slika 3A). T ćelije transdukovane sa svakim od vektora analizirane su za citolizu (Slika 3 B), proliferaciju (Slika 3C), i proizvodnju citokina (Slika 3D) kao odgovor na leukemiju ili limfomne ćelije koje jesu ili nisu eksprimirale ROR1. Kao što je prikazano, samo T ćelije transdukovane sa R11 himernim receptorom koji sadrži sekvencu dugog spejsera mogle su da efikasno prepoznaju ROR1+ tumore i posreduju efektorske funkcije.
[0315] ROR1 himerni receptori izvedeni iz mAb R12 sa većim afinitetom od 2A2 posreduju superiornu antitumorsku reaktivnost
[0316] [0189] Dalje je ispitano da li povećanje afiniteta scFV korišćenog za konstruktciju ROR1 himernog receptora može da utiče na prepoznavanje tumora i T-ćelijsku funkciju. Generisani su ROR1-specifični himerni receptori od mAb R12 koji se poput 2A2, vezuju za neki epitop na NH2-terminalnom Ig/Frizzled domenu od ROR1, ali sa >50-puta većim monovalentnim afinitetom vezivanja.
[0317] R12 ROR1 himerni receptori konstruisani su i sa dugim i sa kratkim IgG4-Fc spejserima radi određivanja da li se optimalni spejser dizajn za ovaj veći afinitet scFV razlikuje od onog za manji afinitet scFV. Otkriveno je da je slično sa 2A2, R12 ROR1 himerni receptor sa kratkim spejserom dodelio poboljšanu citolitičku aktivnost, izlučivanje citokina i proliferaciju (podaci nisu prikazani), što ukazuje da kraća dužina spejsera obezbeđuje superiorno prostorno sprezanje T-ćelije i ROR1+ ciljane ćelije za T- ćelijsku aktivaciju.
[0318] Zatim su konstruisani R12 i 2A2 ROR1 himerni receptori koji su imali optimalni (kratki) ekstracelularni spejser, i ili CD28 ili 4-1BB kostimulatorni domen u tandemu sa CD3Z (4 konstrukta) radi poređenja (Slika 4A.B). Ovi ROR1-konstrukti himernog receptora su eksprimirani u prečišćenim CD8+ TCM zdravih donora, i potvrđena je ekvivalentna ekspresija transgena pomoću tEGFR bojenja (Slika 5A). T-ćelije modifikovane svakim od 2A2 i R12 ROR1-himernih receptora specifično su lizirale K562/ROR1 i Raji/ROR1 tumorske ćelije sa približno ekvivalentnom efikasnošću (Slika 5B). Međutim, analiza proizvodnje citokina pokazala je da su R12 ROR1 himerni receptori visokog afiniteta koji su obuhvatali CD28 ili 4-1BB dodelili značajno veću IFN-y, TNF-α i IL-2 proizvodnju u odnosu na odgovarajuće 2A2 konstrukte (Slika 5C). Otkriveno je da su T-ćelije koje eksprimiraju himerne receptore sa CD28 kostimulatornim domenom proizvele više IFN-y, TNF-a i IL-2 u odnosu na one sa 4-1BB.
[0319] Eksperimenti za analizu proliferacije T-ćelija sa ROR1 himernim receptorom pokazali su veći procenat proliferišućih T-ćelija i veći broj deoba ćelija kod T-ćelija koje eksprimiraju R12 ROR1 himerne receptore visokog afiniteta sa CD28 i 4-1BB domenom u odnosu na T-ćelije koje eksprimiraju odgovarajuće 2A2 pandane (Slika 4D). Došlo je do snažnije proliferacije kod T-ćelija koje su eksprimirale himerne receptore sa CD28 domenom, u skladu sa većom IL-2 proizvodnjom indukovanom ovim receptorima. Došlo je do niže frekvencije AICD kao što je izmereno PI bojenjem kod T-ćelijskih linija modifikovanih sa R12 u odnosu na 2A2 RORl-himerne receptore posle stimulacije sa Raji/RORl i JeKo-1 tumorskim ćelijama, respektivno (R12: 5.6%/6.9% vs.2A2: 10%/9.65%). T-ćelijske linije koje su eksprimirale himerne receptore sa CD28 domenom takođe su imale manju AICD u odnosu na 4-1BB kao odgovor na Raji/ROR1 i JeKo-1 tumorske ćelije, respektivno (R12: 16.4%/18.4% vs.2A2 38.1%/39.6%).
[0320] Radi određivanja da li je poboljšana funkcija primećena sa R12 ROR1 himernim receptorima kod CD8+ T-ćelija proširena na CD4+ T-ćelije, transdukovane su rasute CD4+ T-ćelije sa 2A2 i R12 ROR1 himernim receptorima koji sadrže kratki spejser i CD28 kostimulatorni domen. Kao odgovor na Raji/ROR1+ tumorske ćelije, CD4+ T-ćelije koje su eksprimirale R12 scFV visokog afiniteta proizvele su više nivoe IFN-y, TNF-a, IL-2, IL-4 i IL-10, i pretrpele su veću proliferaciju od CD4+ T-ćelija koje su eksprimirale 2A2 (Slika 5A,B). I proizvodnja citokina i proliferacija bili su superiorni kod CD4+ u odnosu na CD8+ T-ćelije modifikovane istim ROR1 himernim receptorima. Ukratko, podaci demonstriraju da su kreiranje i dužina ne-signalizirajućeg ekstracelularnog spejser domena himernog receptora i scFV afinitet nezavisni parametri koji utiču na funkciju T-ćelija sa ROR1-himernim receptorom.
[0321] D8+ T-ćelije modifikovane ROR1 himernim receptorom visokog afiniteta imaju uporedivu aktivnost sa CD19 himernim receptorom protiv primarnih CLL in vitro
[0322] ROR1 i CD 19 su oba uniformno eksprimirana na svim primarnim CLL (Slika 6A), međutim, apsolutni broj ROR1-molekula po tumorskoj ćeliji ocenjeno je da je 10-puta manji od onog od CD19, koji je uspešno ciljan u kliničkim probama sa T-ćelijama sa CD19 himernim receptorom. Upoređeno je prepoznavanje primarnih CLL od strane CD8+ T-ćelija koje eksprimiraju optimizovane R12 i 2A2 ROR1
[0325] 4
[0326] himerne receptore, i CD19 himerni receptor izveden iz FMC63 scFV. Korišćene su prečišćene CD8+ TCM za modifikaciju himernim receptorom da bi se obezbedio ravnomerni ćelijski proizvod, a svaki himerni receptor imao je kratki IgG4-Fc 'Šarka-samo' spejser i 4-1BB kostimulatorni domen. Potvrđeno je da je CD19 himerni receptor (IgG4 Šarka) bio najmanje kao i efektivniji u prepoznavanju CD19+ tumora u odnosu na CD19 himerni receptor sa CD8a Šarka spejserom i 4-1BB kostimulatornim domenom koji je korišćen u tekućim kliničkim probama. (Slika 20). T ćelije koje eksprimiraju CD19 himerne receptore sa 4- 1BB i CD3zeta i modifikovanim IgG4-Fc šarka pokazuju superiornu in vitro i in vivo funkciji u odnosu na T ćelije koje eksprimiraju CD19 himerne receptore sa 4-1BB i CD3zeta i CD8 alfa šarka. Na Slici 20D, in vivo antitumorska aktivnost T ćelija koje eksprimiraju CD19 himerni receptor sa IgG4 Fc šarka (grupa 1) ili CD8 alfa šarka (grupa 2) i T ćelija koje eksprimiraju tEGFR sam (grupa 3) kod NSG miševa inokulisanih Raji tumorskim ćelijama koje eksprimiraju luciferazu svica (ffluc) upoređene su. Miševi su snimljeni 17 dana posle inokulacije tumora i 10 dana posle T ćelijske inokulacije. Podaci pokazuju veće opterećenje tumorom kod miševa tretiranih kontrolnim tEGFR T ćelijama (grupa 3) ili T ćelijama sa CD19 himernim receptorom sa CD8 alfa šarka (grupa 2) u odnosu na miševe tretirane T ćelijama sa CD19 himernim receptorom sa IgG4 Fc šarka (grupa 1).
[0327] Citolitička aktivnost T-ćelija sa R12 ROR1 himernim receptorom protiv primarnih tumorskih ćelija iz više CLL pacijenata (n=4) bila je veća u odnosu na T-ćelije modifikovane 2A2 ROR1 himernim receptorom nižeg afiniteta, i ekvivalentna lizi primećenoj sa T-ćelijama sa CD19 himernim receptorom (Slika 6B). Složena analiza citokina pokazala je skoro ekvivalentnu proizvodnju IFN-y i TNF-a, ali manju IL-2 proizvodnju od strane CD8+ T-ćelija koje eksprimiraju R12 ROR1 u odnosu na one koje eksprimiraju CD19-himerni receptor posle ko-kultivacije sa primarnim CLL (Slika 6C). T-ćelije sa 2A2 ROR1 himernim receptorom proizvele su manje količine svih citokina u odnosu na T-ćelije sa R12 ROR1 himernim receptorom kao što je prethodno naznačeno. Proizvodnja citokina od strane svih himerni receptortransdukovanih T-ćelija posle stimulacije sa CLL bila je suštinski manja u odnosu na sa Raji/ROR1, koji za razliku od CLL eksprimira i CD80 i CD86 koji može da angažuje CD28 eksprimiran na T-ćelijama sa himernim receptorom (Slika 6A, C).
[0328] Primećena je manja proliferacija T-ćelija koje eksprimiraju R12 i 2A2 ROR1 himerni receptor u odnosu na CD19 himerni receptor posle stimulacije sa CLL (CD19>R12>2A2) (Slika 6D). Pretpostavljeno je da proliferacija T-ćelija sa CD8+ ROR1 himernim receptorom kao odgovor na CLL može biti povećana u prisustvu himerni receptor-modifikovanih CD4+ T-ćelija zbog njihovog većeg izlučivanja IL-2 u odnosu na CD8+ TCM (Slika 4A; Slika 8A). Da bi se ispitala ova mogućnost, izvedeni su eksperimenti in vitro ko-kultivacije gde su CD4+ i CD8 TCM odvojeno modifikovane R12 ROR1, 2A2 ROR1 i CD19 himernim receptorima, respektivno, obogaćene za ekspresije himernih receptora, i kombinovane u odnosu 1:1 da bi se osigurali ekvivalentni odnosi CD8+ i CD4+ T-ćelija modifikovanih svakim od vektora. Ove ćelije su CFSE-obeležene i stimulisane sa primarnim CLL. Primećeno je dramatično povećanje proliferacije CD8+ T-ćelija sa R12 ROR1 himernim receptorom posle dodavanja himerni receptortransdukovanih, ali ne netransdukovanih CD4+ T-ćelija (Slika 8B). Značajno, kada je obezbeđena CD4-pomoć, primećena je ekvivalentna proliferacija CD8+ T-ćelija sa R12 ROR1 i CD19 himernim receptorima kao odgovor na CLL, dok je proliferacija CD8+ T-ćelija koje eksprimiraju 2A2 ROR1 himerni receptor nižeg afiniteta ostala manja. Zbirno, podaci pokazuju da R12 ROR1 himerni receptor visokog afiniteta dodeljuje superiornu reaktivnost u odnosu na 2A2 protiv primarnih CLL ćelija in vitro.
[0329] T-ćelije sa RORl-himernim receptorom posreduju in vivo anti-tumorsku aktivnost u mišjem modelu sistemskog limfoma mantle ćelija
[0330] [0197] Ostalo je neizvesno da li će se superiorna in vitro aktivnost T-ćelija modifikovanih R12 himernim receptorom višeg afiniteta prevesti u poboljšanu anti-tumorsku aktivnost in vivo, i kako će se ciljanje ROR1 uporediti sa ciljanjem CD19. Da bi se dobio odgovor na ova pitanja, inokulisane su kohorte imunodeficijentnih NSG miševa sa JeKo-1/ffluc humane MCL linije injekcijom u repnu venu, i sedam dana kasnije kada je tumor diseminiran, tretirani su miševi jednom intravenoznom dozom CD8+ T-ćelija sa R12 ROR1, 2A2 ROR1 ili CD19 himernim receptorima. Kontrolni miševi su tretirani tEGFR T-ćelijama ili netretirani. Svi himerni receptori imali su optimalni kratki spejser i 4-1BB kostimulatorni domen. Netretirani NSG/JeKo-1 miševi razvili su brzo napredujući sistemski limfom koja zahteva eutanaziju približno 4 nedelje posle inokulacije tumora (Slika 9A-C).
[0331] Primećena je regresija tumora i poboljšanje preživljavanja svih miševa tretiranih T-ćelijama sa R12 ROR1, 2A2 ROR1 i CD19 himernim receptorima. Miševi tretirani T-ćelijama sa R12 ROR1 himernim receptorom imali su superiorni anti-tumorski odgovor i preživljavanje u odnosu na miševe tretirane T-ćelijama sa 2A2 ROR1 himernim receptorom (p<0.01), u uporedivu anti-tumorsku aktivnost sa miševima tretiranim T-ćelijama sa CD19 himernim receptorom (Slika 9A-C).
[0332] Analizirana je frekvencija T-ćelija sa himernim receptorom u perifernoj krvi nakon adoptivnog prenosa i detektovanja većeg broja tEGFR+ T-ćelija kod miševa tretiranih sa R12 ROR1 himernim receptorom u odnosu na 2A2 ROR1 himerni receptor, što ukazuje da je snažnija proliferacija in vivo poboljšala kontrolu tumora. Da bi se ovo potvrdilo, date su CFSE-obeležene T-ćelije sa CD19 himernim receptorom, R12 i 2A2 ROR1 himernim receptorom kohortama NSG miševa koji nose JeKo- 1/ffluc, i analizirana je T-ćelijska proliferacija u perifernoj krvi, koštanoj srži i slezini 72 sata posle prenosa. Veći procenat T-ćelija sa R12 i CD19 himernim receptorima proliferiso je i podlegao većem broju deoba ćelija u odnosu na T-ćelije sa 2A2 ROR1 himernim receptorom (Slika 9D). JeKo-1 tumor vremenom se vratio kod svih miševa tretiranih T-ćelijama sa ROR1 ili CD 19 himernim receptorom (Slika 9A-C). Recidiv tumora nije bio rezultat selekcije varijanti bez ROR1 ili CD19, jer su recidivni tumori bili pozitivni za oba molekula.
[0333] Radi poređenja, analizirana je anti-tumorska efikasnost T-ćelija sa CD19 himernim receptorom kod NSG miševa graftovanih sa Raji tumorima i primećeno je potpuno iskorenjivanje tumora, što ukazuje da recidiv JeKo-1 odražava poteškoće u iskorenjivanju ovog tumora (podaci nisu prikazani). Ukratko, ovi podaci su prvi pokazali da T-ćelije sa ROR1 himernim receptorom imaju anti-tumorsku efikasnost in vivo, i ukazuju na to da za malignitete B-ćelija, optimizovani ROR1 himerni receptor kao što je R12 može biti efektivan i da štedi normalne CD19+ B-ćelije sa nedostatkom ROR1 ekspresije.
[0334] T-ćelije koje eksprimiraju R12 ROR1 himerni receptor imaju superiornu reaktivnost u odnosu na 2A2 protiv ROR1<+>epitelijalnih tumorskih ćelija
[0335] ROR1 je detektovan na mnogim epitelijalnim tumorima, iako nije poznato da li je ROR1 ekspresija dovoljna za prepoznavanje od strane T-ćelija sa ROR1 himernim receptorom. Pomoću protočne citometrije, potvrđena je ROR1 ekspresija na linijama kancera dojke MDA-MB-231 i 468, i na linijama karcinoma bubrežnih ćelija FARP, TREP i RWL (Slika 10A). Zatim je analizirano prepoznavanje tumora od strane CD8+ T-ćelija transdukovanih R12 ROR1 himernim receptorima sa optimalnim kratkim spejserom i 4-1BB domenom, i primećeno je efikasno prepoznavanje MDA-MB-231, MDA-MB-468, FARP, TREP i RWL (Slika 11A). Analizirano je izlučivanje citokina i proliferacija T-ćelija modifikovanih R12 i 2A2 ROR1- himernim receptorima posle ko-kultivacije sa MDA-MB-231, i primećena je veća proizvodnja citokina i proliferacija sa R12 ROR1 himernim receptorom (Slika 11 B, C). Slično onome što je primećeno sa ROR1+ B ćelijskim malignitetima, superiorna aktivacija T ćelija sa R12 ROR1 himernim receptorom posle stimulacije sa MDA-MB-231 nije bila povezana sa povećanom AICD (R12: 9.8% vs.2A2: 10.9%).
[0336] Diskusija
[0337] [0202] ROR1 je privukao interesovanje kao potencijalna meta za imunoterapiju kancera zbog njegove ekspresije na površini mnogih B-limfoidnih i epitelijalnih kancera, uključujući podskupove kancera pluća, kolorektalnih i bubrežnih ćelija. Prethodno je pokazano da su CLL i MCL specifično prepoznate od strane T-ćelija modifikovanih radi eksprimiranja ROR1-specifičnog himernog receptora (Hudecek M, et al. Blood.2010;116(22):4532-41. Epub 2010/08/13). Dizajn i funkcija ROR1-himernih receptora poboljšani su modifikacijom ekstracelularnog spejser domena i izvođenjem himernog receptora iz scFV višeg afiniteta, i demonstrirano je da T-ćelije modifikovane konstruisanim ROR1 himernim receptorima imaju in vivo aktivnost protiv ROR1+ B-ćelijskog limfoma i in vitro aktivnost protiv širokog spektra epitelijalnih tumora.
[0338] Upoređene su funkcija T-ćelija modifikovanih ROR1 himernim receptorima izvedenim iz 2A2 mAb koje je obuhvatalo ili originalni dugi IgG4-Fc 'Šarka-CH2-CH3' spejser za koji se pokazalo da omogućuje ćelijsku površinsku ekspresiju visokog nivoa, ili okrnjene srednje 'Šarka-CH3' i kratke 'Šarka-samo' spejser varijante. Sačuvan je 12 AA Šarka domen u konstruktu kratkog spejsera na osnovu prethodnih podataka koji su bili potrebni za fleksibilni spejser za odvajanje scFV iz T-ćelijske membrane i omogućavanje antigenskog prepoznavanja na tumorskim ćelijam (Fitzer-Attas CJ, et al.,Harnessing Syk family tyrosine kinases as signaling domains for chimeric single chain of the variable domain receptors: optimal design for T cell activation. J Immunol.1998;160(1):145-54. Epub 1998/04/29.)
[0339] Studije sa 2A2 ROR1 himernim receptorom pokazuju da su T-ćelijsko izlučivanje citokina i proliferacija posle prepoznavanja tumorskih ćelija superiorni sa konstruktima srednjih i kratkih spejsera u odnosu na konstrukt dugog spejsera. Bojenje sa anti-F(ab) Ab pokazalo je ekvivalentnu ekspresiju himernog receptora sva tri receptora, čime je demonstrirano da poboljšana T-ćelijska funkcija sa himernim receptorom sa kratkim spejserom nije bila zbog razlika u gustini himernih receptora. Ovi podaci podržavaju princip da dizajn ekstracelularnih spejsera treba da bude izveden za svaki ciljani molekul i epitop.
[0340] Afinitet scFV odabranog za konstruisanje nekog himernog receptora je dodatni parametar koji može da utiče na T-ćelijsko prepoznavanje. Generisan je i okarakterisan panel ROR1-specifičnih mAb različitih afiniteta i odabran je R12 mAb, koji prepoznaje neki epitop u Ig-poput/Frizzled regionu kao 2A2. R12 ima viši afinitet za ROR1-protein zbog mnogo manje disocijacije. R12 himerni receptor, poput 2A2 himernog receptora dodelio je optimalno T-ćelijsko prepoznavanje i funkciju kada je konstruisan sa kratkim ekstracelularnim spejserom. Direktno poređenje proliferacije i proizvodnje citokina posle tumorskog angažovanja od strane T-ćelija modifikovanih 2A2 i R12 himernim receptorima demonstriralo je da je R12 himerni receptor izveden iz mAb višeg afiniteta bio superioran. Postoji zabrinutost da sporija disocijacija R12 iz ROR1 može da produži T-ćelijsku aktivaciju i dodeli povećanu osetljivost na AICD. Međutim, detektovana je manja stopa AICD kod T-ćelija modifikovanih R12 ROR1-himernim receptorom u odnosu na 2A2, što demonstrira da povećani afinitet R12 nije imao štetan efekat na preživljavanje T- ćelija u prekliničkim modelima.
[0341] ROR1 ima potencijalnu prednost nad CD19 kao metu za CLL i MCL budući da nije eksprimiran na normalnim zrelim naivnim i memorijskim B-ćelijama. Međutim, postoji manji broj ROR1 molekula na B- ćelijskim tumorima u odnosu na CD19 i neizvesno je da li će optimizovani ROR1 himerni receptor biti toliko efektivan kao CD19 himerni receptor sličnog dizajna onima koji su korišćeni na klinici. Nažalost, ksenograft modeli B-ćelijskih tumora korišćeni prethodno kod NSG miševa za ocenu funkcije T-ćelija sa CD19 himernim receptorom uključujući Raji, Daudi i Nalm-6, nisu izvedeni iz CLL ili MCL i nisu konstitutivno eksprimirali ROR1. Tako, radi poređenja ciljanja CD19 i ROR1 in vivo, korišćena je JeKo-1 MCL ćelijska linija, koja prirodno eksprimira i CD19 i ROR1 i graftuje kod NSG miševa. Kako bi model bio klinički relevantan, inokulisane su JeKo-1 limfomne ćelije intravenozno radi generisanja sistemskih tumora, i tretirani su miševi sa T-ćelijskim proizvodima ravnomerne konzistencije kada su tumori ustanovljeni. Otkriveno je da su T-ćelije koje eksprimiraju R12 himerni receptor visokog afiniteta dodelile ekvivalentnu anti-tumorsku aktivnost in vivo kao T-ćelije sa CD19 himernim receptorom. U skladu sa in vitro analizom, R12 ROR1 himerni receptor takođe je posredovao
[0344] 4
[0345] superiornu aktivnost in vivo u odnosu na optimalni 2A2 ROR1-himerni receptor. Ove rezultate treba tumačiti oprezno budući da mišji modeli tumora mogu da ne predvide efikasnost adoptivne terapije u kliničkim podešavanjima. Međutim, rezultati ukazuju da ROR1 opravdava razmatranje kao alternativa za CD19, ili da pruža dodatni cilj kako bi se minimizirao potencijal za pojavu varijanti bez CD19.
[0346] ROR1 izgleda ima presudnu ulogu u preživljavanju nekih epitelijalnih tumora. Tako, prednost ciljanja ROR1 je da pojedinačan himerni receptor može biti koristan za lečenje pacijenata sa velikim brojem hematopoetskih i ne-hematopoetskih tumora.
[0347] Podaci pokazuju, prvi put, da T-ćelije koje eksprimiraju konstruisani ROR1 himerni receptor efikasno prepoznaju epitelijalne kancere in vitro. Izlučivanje citokina i T-ćelijska proliferacija indukovani od strane ROR1+ ćelija kancera dojke bili su veći od onih indukovanih ćelijama leukemije, uprkos odsustvu CD80/86 kostimulatornog liganda. Studije prijavljene ovde demonstriraju da su dizajn ekstracelularnog spejser domena i afinitet himernih receptora parametri koji se mogu modulisati da bi se poboljšalo prepoznavanje ROR1+ hematoloških i epitelijalnih tumora in vitro i in vivo od strane T-ćelija modifikovanih ROR1-himernim receptorom. Razvoj ROR1-himernih receptora sa poboljšanom tumorskom reaktivnošću obezbeđuje priliku za kliničke primene kod raznih humanih kancera.
[0348] Primer 2
[0349] Efekat dužine ekstracelularnog spejser domena na pokretanje lize tumorskih ćelija sa Her2-specifičnim himernim receptorom koji prepoznaje epitop koji se nalazi proksimalno tumorskoj ćelijskoj membrani.
[0350] Efekat dužine CAR spejsera na prepoznavanje i pokretanje prepoznavanja tumorskih ćelija od strane CD8+ humanih T limfocita koji su eksprimirali HER2-specifični himerni receptor ispitano je pomoću postupaka sličnih onima prethodno opisanim za ROR1. HER2-specifični himerni receptori su konstruisani pomoću segmenata VL i VH lanaca HER2-specifičnog mAb koje je prepoznalo epitop proksimalan membrani na HER2 (Slika 12A), i scFVs su vezani za ekstracelularne spejser domene IgG4 šarka/CH2/CH3, IgG4 šarka/CH3 i IgG4 šarka samo i za CD28 transmembranski domen, 4-1BB i CD3 zeta signalizirajuće domene (Slika 12B). Primarne CD8+ T ćelije su transdukovane sa svakim od HER2 himernih receptora i odabrane za ekspresiju EGFR transdukcionog markera (Slika 12D). Ekspresija HER2 himernih receptora i veličina svakog receptora potvrđena je pomoću Western Blot-a (Slika 12C). T ćelije su zatim raširene sa anti CD3 mAb i hraniteljskim ćelijama i ispitana je njihova sposobnost da prepoznaju HER2+ tumorske ćelije. Kako je primećeno sa R11 ROR 1 specifičnim himernim receptorom, HER2 himerni receptor koji je sadržavao dugi ekstracelularni spejser domen dodelio je superiorno T ćelijsko prepoznavanje HER2+ tumorskih ćelija (Slika 12E).
[0351] Diskusija
[0352] [0210] Ovaj primer efekta dužine ekstracelularnog spejsera na prepoznavanje tumorskih ćelija od strane T ćelija modifikovanih himernim receptorom koristio je himerni receptor koji obuhvata scFv građen od VH+L sekvenci Herceptin himernog mAb. Studije od Cho et al (Nature 421:756, 2003) lokalizovane su na epitopsku lokaciju Herceptina u odnosu na lokaciju proksimalnu membrani na HER2 (ERRB2) ekstracelularnom domenu (Slika 12A). Na osnovu razumevanja strukture humanih IgG4 šarka:Fc varijanti (Slika 12B), pretpostavljeno je da će lokacija proksimalno membrani ciljajućeg epitopa na ekstracelularnom antigenu tumorske ćelije najbolje da se prepozna efektorskim T ćelijama koje eksprimiraju himerni receptor koji kodira dugi spejser. Podaci demonstriraju gradijent citolitičke aktivnosti od blizu krajnje aktivnosti pomoću T ćelija koje eksprimiraju himerni receptor sa kratkim spejserom Herceptinom, do srednje aktivnosti pomoću T ćelija koje eksprimiraju himerni receptor sa spejserom srednje dužine, i maksimalnu lizu T ćelijama koje su eksprimirale himerni receptor sa dugim spejserom. Tako, ekstracelularni spejser ima definitivne efekte na prepoznavanje tumora od strane T ćelija, a ovi podaci obezbeđuju dalju podršku za potrebu izrade dizajna himernih receptora na osnovu epitopske lokacije tumorski eksprimiranih ciljanih molekula.
[0353] Primer 3 –
[0354] Prilagođavanje dužine spejsera i sekvenca za optimalno prepoznavanje i in vivo efikasnost CD19 sa T ćelijama modifikovanim himernim receptorom.
[0355] Materijali i postupci
[0356] Humani subjekti
[0357] Uzorci krvi su dobijeni od zdravih donora koji su obezbedili pisanu informisanu saglasnost da će učestvovati u protokolima istraživanja odobrenim od strane Institutional Review Board iz Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC). Jednojedarne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su centrifugiranjem preko Ficoll-Hypaque (Sigma, St.Louis, MO), i kriokonzervirane u RPMI, 20% humanom serumu i 10% dimetil sulfoksidu.
[0358] Ćelijske linije
[0359] K562, Raji, JeKo-1 i 293T ćelijske linije su dobijene od American Type Culture Collection (Manassas, VA) i kultivisane prema uputstvima. Lentivirus koji kodira ffluc-gen ushodno od T2A sekvence i eGFP je proizveden u 293T ćelijama i korišćen za transdukciju Raji i JeKo-1 tumorskih ćelija. Raji i JeKo-1 ćelije su raširene posle lentivirusne transdukcije i prečišćene sortiranjem eGFP pozitivnih podvrsta.
[0360] Imunofenotipizacija
[0361] PBMC i T-ćelijske linije su obojene jednim ili više sledećih konjugovanih monoklonalnih antitela: CD3, CD4, CD8, CD25, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69 i kontrolama podudarajućeg izotipa (BD Biosciences). Bojenje propidijum jodidom (PI, BD Biosciences) je izvedeno za diskriminaciju živih/mrtvih ćelija prema uputstvima proizvođača. Protočne analize izvedene su na FACSCanto, sortirajuća prečišćavanja na FACSAriaII (Becton Dickinson) i podaci su analizirani pomoću FlowJo softvera (Treestar).
[0362] Konstrukcija vektora i priprema lentivirusa koji kodira CD19 himerni receptor
[0363] CD19 specifični himerni receptori su konstruisani pomoću: (1) segmenata VL i VH lanca CD19-specifičnog mAb FMC63 (SEQ ID NO:3), vezani (G4S)3 linker (SEQ ID NO:12)peptidom (VL-linker-VH); (2) spejser domen izveden je iz IgG4-Fc (Uniprot baza podataka: P01861, (SEQ ID NO:13)) koji obuhvata ili Šarka-CH2- CH3 deo (229 AA, (SEQ ID NO:)) ili Šarka samo (12 AA; (SEQ ID NO:4)). Oba spejsera obuhvatala su S ^ P supstituciju unutar Šarka domena koja se nalazila na položaju 108 nativnog IgG4-Fc proteina; 27 AA transmembranski domen humanog CD28 (Uniprot baza podataka: P10747, (SEQ ID NO:14)); (4) modul signalizacije koji obuhvata ili (i) 41 AA citoplazmatični domen humanog CD28 sa LL → GG supstitucijom koja se nalazi na položaju 186-187 nativnog CD28 proteina (SEQ ID NO:14); i/ili (ii) 42 AA citoplazmatični domen humanog 4-1BB (Uniprot baza podataka: Q07011, (SEQ ID NO:15)); vezan za (iii) 112 AA citoplazmatični domen izoforme 3 humanog CD3Z (Uniprot baza podataka: P20963, (SEQ ID NO: 16)); samocepajuću T2A sekvencu (SEQ ID NO:8); i (6) sekvencu okrnjenog receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR) (SEQ ID NO:9).
[0366] 4
[0367] Kodon-optimizovane nukleotidne sekvence koje kodiraju svaki trans gen, sintetisane su (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) i klonirane u epHIV7 lentivirusni vektor korišćenjem NheI i Not1 restrikcionih mesta. epHIV7 lentivirusni vektor izveden je iz pHIV7 vektora zamenom citomegalovirusnog promotera od pHIV7 sa EF-1 promoterom.
[0368] CD19 himerni receptor ili tEGFR-kodirajući lentivirus proizveden je u 293T ćelijama kotransfektovanim sa lentivirusnim vektorom i vektorima pakovanja pCHGP-2, pCMV-Rev2 i pCMV-G pomoću Calphos reagensa za transfekciju (Clontech). Podloga je zamenjena 16 h posle transfekcije, i lentivirus je prikupljen posle 24, 48 i 72 h.
[0369] Generacija T -ćelijskih linija koje eksprimiraju CD19 himerne receptore
[0370] Sortiranjem-prečišćene CD8+ CD45RA<->CD45RO+ CD62L+ centralne memorijske T -ćelije (TCM) normalnih donora aktivirane su anti-CD3/ CD28 perlama (Life Technologies) prema uputstvima proizvođača, i transdukovane sa lentivirusnim supernatantom (MOI = 3) dopunjenim sa 1 pg/mL polibrenom (Millipore) 3. dana posle aktivacije centrifugiranjem sa 2100 o/min tokom 45 min na 32°C. T ćelije su raširene u RPMI, 10% humanom serumu, 2 mM L-glutaminu i 1 % penicilin-streptomicinu (CTL podloga), dopunjivanoj sa rekombinantnim humanim (rh) IL-2 do krajnje koncentracije od 50 U/mL svakih 48 h. Posle ekspanzije, alikvot svake transdukovane T ćelijske linije obojen je biotinkonjugovanim anti-EGFR (epitelijalni receptor faktora rasta) antitelom i streptavidin-perlama (Miltenyi), i tEGFR+ T ćelije su izolovane imunomagnetnom selekcijom.
[0371] tEGFR+ T-ćelijski podskup je zatim stimulisan sa ozračenim (8000 rad) TM EBV-LCL u odnosu T ćelija: LCL od 1:7, i raširen tokom 8 dana u CTL podlozi uz dodavanje 50 U/mL rh IL-2 svaka 48 h. Testovi oslobađanja hroma, izlučivanja citokina i CFSE proliferacije
[0372] Ciljanje ćelije obeležene su sa<51>Cr (PerkinEImer) preko noći, isprane i inkubirane u triplikatu pri 1-2x 10<3>ćelija/bunarčiću sa efektorskim T ćelija u različitim odnosima efektor prema meta (E:T). Supernatanti su prikupljeni za y brojanje posle 4-časovne inkubacije i izračunata je specifična liza pomoću standardne formule. Za analize izlučivanja citokina, ciljane i efektorske ćelije zasejane su u bunarčićima u triplikatu u odnosu E:T od 2: 1 (Raji) ili 4: 1 (K562/CDI9 i K562), i INF-y, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6 i IL-10 izmereni su višestrukim imunotestom citokina (Luminex) u supernatantu uklonjenom posle 24-časovne inkubacije.
[0373] Za analizu proliferacije, T ćelije obeležene su sa 0.2 pM karboksifluorescein sukcinimidil estrom (CFSE, Invitrogen), isprane i zasejane u bunarčićima u triplikatu sa stimulatornim ćelijama u odnosu od 2: 1 (Raji) ili 4: 1 (K562/CD19 i K562) u CTL podlozi bez egzogenih citokina. Posle 72 h inkubacije, ćelije su obeležene sa anti-CD3 mAb i propidijum jodidom (PI) da bi se isključile mrtve ćelije iz analize. Uzorci su analizirani protočnom citometrijom i ocenjena je ćelijska deoba živih CD3+ T-ćelija pomoću CFSE rastvora.
[0374] Eksperimenti na NOD/SCID i NOD/SCID/YC<7>' (NSG) miševima
[0375] Svi eksperimenti na miševima su odobreni od strane FRCRC Institutional Animal Chimeric receptore and Use Committee. NOD.CBI7-Prkdc<scid>/J (NOD/SCID) i NOD.Cg-Prkdc<scid>N2rg<tmlWjl>/SzJ (NSG) ženke miševa stare šest do 8 nedelja dobijene su od Jackson Laboratory ili uzgajane (FRCRC. Miševi su injektirani intravenozno (i. v.) sa 0.5 x 10<6>Raji-ffluc tumorskim ćelijama injekcijom u repnu venu, i primili su injekcije himerni receptor-modifikovanih T ćelija, kontrolnih T ćelija ili PBS injekcijom u repnu venu kao što je naznačeno.
[0378] 4
[0379] Za bioluminescentno snimanje, miševi su primili intraperitonealne (i.p.) injekcije sveže pripremljenog supstrata luciferina (Caliper Life Sciences, MA) resuspendovanog u PBS (15 pg/g telesne mase) i zatim su anestezirani izofluranom u indukcionoj komori. Posle indukcije duboke anestezije, miševi su snimljeni pomoću Xenogen IVIS In Vivo sistema snimanja (Caliper Life Sciences, MA) 10, 12 i 14 minuta posle i.p. injekcije luciferina pri akvizicionom vremenu od 1 sekunde do 1 minuta u režimu malog bininga da bi se dobile nezasićene slike. Aktivnost luciferaze je analizirana pomoću Living Image softvera (Caliper Life Sciences, MA) i fluks fotona analiziran je unutar regiona od interesa koji su obuhvatali celo telo svakog pojedinačnog miša.
[0380] Statističke analize
[0381] Statističke analize izvedene su pomoću Prism softvera (GraphPad, CA). Studentov t-test je izveden kao dvostrani test sa intervalom pouzdanosti od 95% i rezultati su smatrani značajnim sa pvrednošću od p<0.05. Statistička analiza preživljavanja izvedena je Log-rank testiranjem i rezultati su smatrani značajnim sa p-vrednošću od p<0.05.
[0382] Rezultati
[0383] Priprema poliklonalnih CD8+ TcM-izvedenih ćelijskih linija koje eksprimiraju CD19 himerne receptore sa dugim i kratkim ekstracelularnim spejserima
[0384] Konstruisani su pojedinačni lentivirusni vektori koji kodiraju panel kodon-optimizovanih gena CD 19 himernih receptora da bi se ispitao uticaj dužine ekstracelularnog spejsera na in vitro funkciju i in vivo antitumorsku aktivnost CD 19 himerni receptor-modifikovanih T ćelija. Svaki himerni receptor obuhvatao je jednolančani varijabilni fragment koji odgovara sekvenci CD19-specifičnog mAb FMC63 (scFv: VL-VH), spejser izveden iz IgG4-Fc koji uključuje ili 'Šarka-CH2-CH3' domen (229 AA, dugi spejser) ili 'Šarka' domen samo (12 AA, kratki spejser), i modul signalizacije od CD3Z sa CD28 ili 4-1 BB kostimulatornim domenima proksimalnim membrani, ili sam ili u tandemu (Slika 13A). Transgena kaseta obuhvatala je okrnjen EGFR (tEGFR) nishodno od gena himernog receptora i razdvojen cepljivim T2A elementom, da služi kao marker transdukcije, selekcije i in vivo praćenja za himerni receptormodifikovane T ćelije.
[0385] Izolovana je ćelijska populacija CD8+ CD45RO+ CD62L+ centralnih memorijskih T ćelija (TCM) ćelijskim sortiranjem iz krvi normalnih donora za transdukciju i ekspanziju, zbog superiorne sposobnosti TCM da opstanu in vivo posle adoptivnog prenosa. CD8+ T ćelije su stimulisane anti CD3/28 perlama, transdukovane sa svakim od lentivirusnih vektora, i raširene u kulturi tokom 18 dana pre njhovog korišćenja za in vitro i in vivo eksperimente. (Slika 13B) Slične efikasnosti transdukcije postignute su sa svakim od lentivirusnih vektora (srednja vrednost 25%) i transgen-pozitivne T ćelije su obogaćene do ravnomerne čistoće imunomagnetnom selekcijom pomoću biotinilatovanog anti-EGFR mAb i perli streptavidina. Nakon tEGFR-obogaćivanja, svaka od T ćelijskih linija sa CD19 himernim receptorima je raširena jednom stimulacijom sa CD19+B-LCL, bez očiglednih razlika u in vitro kinetici rasta između T ćelijskih linija koje eksprimiraju različite CD 19 konstrukte himernog receptora. Posle ekspanzije, tEGFR marker je eksprimiran u ekvivalentnim nivoima na >90% T ćelija transdukovanih sa svakim od vektora (Slika 13C).
[0386] CD19 himerni receptori sa dugim i kratkim ekstracelularimn spejser domenom dodeljuju specifičnu anti-tumorsku reaktivnost in vitro
[0387] Upoređena je efektorska funkcija TcM-izvedenih T ćelijskih linija modifikovanih radi eksprimiranja CD19 himernih receptora sa CD28 i 4-1BB kostimulatornim signalizirajućim grupama, i ili kratkim ('kratki/CD28';'kratki/4-1BB') ili dugim ('dugi/CD28'; 'dugi/4-1BB') ekstracelularnim spejser
[0390] 4
[0391] domenom respektivno. T ćelije koje eksprimiraju svaki od 4 CD19 konstrukata himernog receptora dodelile su specifičnu citolitičku aktivnost protiv CD19<h>Raji i JeKo-1 limfomnih ćelija, i protiv K562 ćelija koje su stabilno transfektovane sa CD19, ali ne nativne CD19<->K562 ćelije (Slika 14A). Kvantitativne analize proizvodnje citokina kao odgovor na stimulaciju sa K562/CD19 ili Raji tumorskim ćelijama složenim ispitivanjem citokina (Luminex) pokazale su proizvodnju IFN-y, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6 i IL-10 od strane T ćelija koje eksprimiraju svaki od CD19 himernih receptora (Slika 14B). T ćelije koje eksprimiraju CD19 himerne receptore sa CD28 kostimulatornim domenom proizvele su značajno veće nivoe IFN-y, TNF-α, IL-2 i IL-10 u odnosu na odgovarajuće konstrukte sa 4-1BB kostimulatornim domenom (Slika 14B, C). Došlo je do značajno veće IFN-y proizvodnje i značajno manje IL-4 proizvodnje od strane T ćelija koje eksprimiraju CD19 'dugi/CD28' himerni receptor u odnosu na one koje eksprimiraju 'kratki/CD28' himerni receptor. Među CD19 himernim receptorima sa 4-1BB kostimulatornim modulom signalizacije, detektovani su značajno veći nivoi IFN-y, TNF-α, IL-2, IL-4 i IL-10 izlučivanja u T ćelijama koje eksprimiraju konstrukt sa kratkim spejser domenom (Slika 14B, C).
[0392] Korišćen je rastvor CFSE boje za analizu proliferacije T ćelija modifikovanih sa svakim od CD 19 himernih receptora posle angažovanje CD 19+ tumorskih ćelija. Specifična i snažna proliferacija svake od T ćelijskih linija sa CD19 himernim receptorom je primećena 72 sata nakon stimulacije ili sa K562/CD19 ili sa Raji. Prosečan broj deoba ćelija bio je veći za T ćelije sa CD19 himernim receptorom sa CD28 kostimulatornim domenom u odnosu na one sa 4-1BB, u skladu sa većom IL-2 proizvodnjom od strane T ćelija koje eksprimiraju CD28 koji sadrži himerni receptor (Slika 14B-D). Takođe je analiziran odnos T ćelija sa himernim receptorom koje su pretrpele aktiviranjem izazvana ćelijsku smrt posle stimulacije sa K562/CD19 i Raji tumorskim ćelijama na kraju 72-sata kobojenjem kulture sa CD3+ i PI. Detektovana je viša frekvencija CD3+ CD8+ PI+T ćelija u 'dugi/4-1 BB' CD-19 himernog receptora ćelijske linije, ali nekoliko PI+ ćelija primećeno je sa ostalim CD19 himernim receptorima. (Slika 14E).
[0393] Ova analiza in vitro efektorskih funkcija bila je u skladu sa prethodnim studijama koje su poredile CD28 i 4-1BB kostimulatorne domene, i nije otkrila razlike u T ćelijskoj funkciji koje bi ukazale da bi odgovarajućem CD19 konstruktu himernog receptora iz ovog panela nedostajala anti-tumorska efikasnost in vivo.
[0394] T ćelije koje eksprimiraju CDI9 himerne receptore sa kratkim ekstracelularnim spejser domenima ali ne sa dugim ekstracelularnim spejser domenima iskorenile su Raji tumore kod imunodeficijentnih mišjih modela
[0395] Dalje je ocenjena in vivo antitumorska efikasnost T ćelija modifikovanih svakim od CD19 himernih receptora kod imunodeficijentnih (NOD/SCID) miševa graftovanih Raji ćelijima transfektovanim luciferazom svica (Raji-ffluc), koji omogućava naknadne kvantitativne analize opterećenja tumorom i distribuciju pomoću bioluminescentnog snimanja. NOD/SCID miševi inokulisani sa 0.5x10<6>Raji-ffluc ćelijama injekcijom u repnu venu razvili su diseminirani limfom, koji ako je netretiran dovodi do paralize zadnjih ekstremiteta posle približno 3.5 nedelja, što zahteva eutanaziju. Miševi koji nose tumor tretirani su sa 2 doze CD8+ T<CM>-izvedenih T ćelija modifikovanih svakim od CD 19 himernih receptora ili tEGFR kontrolnim vektorom datim 2. dana i 9. dana posle inokulacije tumora (Slika 15A).
[0396] Iznenađujuće, samo T ćelije modifikovane radi eksprimiranja CD19 himernih receptora sa kratkim ekstracelularnim spejser domenom ('kratki/CD28' i 'kratki/4-1BB') iskorenile su Raji tumore u ovom modelu, dok su miševi tretirani T ćelijama koje eksprimiraju CD19 himerne receptore sa dugim spejserom ('dugi/CD28' i '10ng/4-1BB') razvili sistemski limfom i paralizu zadnjih ekstremiteta sa skoro identičnim kinetičkim parametrima kao netretirani miševi ili miševi tretirani kontrolnim tEGFR+ T ćelijama (Slika 15B, C). Upečatljiva razlika antitumorske aktivnosti između CD19 himernih receptore sa kratkim i dugim spejser domenima bila je veoma značajna i ponovljiva u višestrukim
[0399] 4
[0400] eksperimentima sa T ćelijskim linijama sa himernim receptorima generisanim iz 3 različita normalna donora.
[0401] NOD/SCID model limfoma može biti suboptimalan za predviđanje anti-tumorske aktivnosti u kliničkom podešavanju zbog kratkog intervala između inokulacije tumora i T ćelijskog davanja i veće otpornosti na prihvatanje kalema humanih ćelija u odnosu na više imunodeficijentne mišje sojeve kao što je NOD/SGD/yc<-/->(NSG). Tako, ocenjena je antitumorska aktivnost adoptivne terapije kod više klinički relevantnog modela u kom je Raji-ffluc limfom ustanovljen kod NSG miševa, a T ćelije sa CD19 himernim receptorom date su posle 7 dana kada je tumor bio jednostavno detektabilan u koštanoj srži bioluminescentnim snimanjem (Slika 16A). Izvedeni su eksperimenti titracije inicijalnim dozama radi određivanja minimalne doze T ćelija transdukovanih sa CD19 'kratki/4-1BB' himernim receptorom koji je bio potreban za iskorenjivanje ustanovljenih Raji tumora. Jedna doza 2.5x10<6>T ćelija koje eksprimiraju CD19-himerni receptor 'kratki/4-1BB' promovisala je potpunu regresiju ustanovljenih Raji tumora i dovela je do dugotrajnog preživljavanja bez tumora kod 100% miševa (Slika 16B,C). Sa doznim nivoom od 2.5x10<6>, T-ćelije su lako detektovane u perifernoj krvi NSG miševa tokom najmanje 3 nedelje nakon adoptivnog prenosa i iskorenjivanja tumora. Tako, ovaj model omogućio je uporedive studije i antitumorske aktivnosti i perzistencije T ćelija modifikovanih svakim od CD19-himernih receptora u panelu (Slika 16D).
[0402] Zatim su tretirane kohorte NSG miševa koje su graftovane sa Raji limfomom sa samim PBS, sa jednom dozom od 2.5x10<6>T ćelija koje eksprimiraju svaki od CD19 himernih receptora ili sa T ćelijama modifikovanim tEGFR kodirajućim kontrolnim vektorom (Slika 17A). U ovom modelu ustanovljenog limfoma, T ćelije koje eksprimiraju CD19 himerne receptore sa kratkim ekstracelularnim spejser domenom i ili 4- 1BB ili CD28 kostimulatornim domenima ('kratki/CD28' i 'kratki/4-1BB') posredovale su potpunu regresiju tumora tokom 7-10 dana i svi miševi su preživeli bez tumora tokom >56 dana. Nasuprot tome, miševi tretirani T ćelijama modifikovanim radi eksprimiranja CD19 himernih receptora sa dugim spejser domenom ('dugi/CD28' i 'dugi/4-1BB') pokazali su progresiju tumora i morali su biti žrtvovani u slično vreme kao miševi koji su primili kontrolne tEGFR T ćelije (Slika 17B, C). Nedostatak in vivo antitumorske aktivnosti konstrukata himernog receptora sa dugim spejserima neočekivano je dao sposobnost T ćelija koje eksprimiraju ove konstrukte da liziraju tumorske ćelije in vitro, i poboljšanu IL-2 proizvodnju i proliferaciju posle angažovanje T ćelija koje eksprimiraju 'dugi/CD28' CD19 himerni receptor u odnosu na 4-1BB konstrukte.
[0403] Da bi se pružio uvid u osnovu za nedostatak efikasnosti, izvedena je naknadna protočna citometrija na uzorcima periferne krvi miševa u intervalima posle T ćelijske infuzije. Svi miševi tretirani T ćelijama koje eksprimiraju 'kratki/CD28' i 'kratki/4-1BB' CD19 himerne receptore imali su značajno više nivoe prenetih T ćelija u krvi u svim vremenskim tačkama posle adoptivnog prenosa, u odnosu na miševe tretirane T ćelijama koje su eksprimirale odgovarajuće CD19 himerne receptore sa dugim ekstracelularnim spejserom (p<0.01) (Slika 17D). Nisu primećene značajne razlike u T-ćelijskoj perzistenciji u perifernoj krvi miševa koji su primili T ćelije koje eksprimiraju CD19 himerne receptore sa CD28 ili 4-1BB kostimulatornim domenima i kratkim spejser domenima (Slika 17D).
[0404] In vivo anti-tumorska efikasnost CD19 himernih receptora sa dugim spejserima nije poboljšana povećanjem T ćelijske doze ili obezbeđivanjem dodatnog kostimulatornog domena
[0405] Nedostatak in vivo anti-tumorske efikasnosti i nižeg nivoa opstanka T ćelija sa himernim receptorom kod miševa tretiranih T ćelijama modifikovanim CD19 himernim receptorima sa dugim spejser domenima ukazao je da efikasnost može biti poboljšana povećanjem T ćelijske doze sa himernim receptorom ili uključivanjem i CD28 i 4-IBB domena u himerni receptor da bi se povećala kostimulatorna signalizacija. Da bi se ocenila ova mogućnost, modifikovane su CD8+ T<CM>sa vektorima 'dugi/CD28', 'kratki CD28' i 'dugi/CD28_4-1BB' CD19 himernih receptora i potvrđeno je da je
[0408] 4
[0409] dugi/CD28_4-1BB' CD19 himerni receptor dodelio specifičnu lizu i proizvodnju citokina in vitro posle prepoznavanja CD19+ ciljanih ćelija (Slika 18A-C). U skladu sa prethodnim studijama CD19 himernih receptora, nivo proizvodnje citokina i proliferacije in vitro u T ćelijama koje eksprimiraju CD28_ 4-IBB' CDI9 himerni receptor bio je inferioran u odnosu na identični konstrukt sa samo CD28, i superioran u odnosu na T ćelije koje eksprimiraju 'dugi 4-IBB' CD19 himerni receptor (Slika 18B, C).
[0410] Grupe NSG miševa sa ustanovljenim Raji tumorima su zatim tretirane visokom dozom T ćelija (10x10<6>) T ćelija koje eksprimiraju 'dugi/CD28' CD19 himerni receptor, 'dugi/CD28_ 4-IBB' CDI9 himerni receptor, 'kratki/CD28' CD19-himerni receptor, i samo tEGFR. Opterećenje tumorom je izmereno bioluminescentnim snimanjem i serijske analize protočnom citometrijom uzoraka periferne krvi izvedene su radi određivanja frekvencije prenetih T ćelija. U skladu sa rezultatima prethodnih eksperimenata pomoću mnogo manjih doza T ćelija, Raji tumori su potpuno iskorenjeni kod miševa tretiranih T ćelijama koje eksprimiraju 'kratki/CD28' CD19-himerni receptor. Međutim, čak i sa 4-puta većom T ćelijskom dozom, tretiranje T ćelijama koje eksprimiraju 'dugi/CD28' CD19 himerni receptor ili 'dugi/CD28_4-1BB' CD19 himerni receptor nije obezbedilo primetan antitumorski efekat (Slika 18D,E).
[0411] Tako, sa povećanjem doze T ćelija sa himernim receptorom i dodavanjem 4-1BB kostimulatornog domena CD19 himernim receptorima nije se uspelo prevazići negativni uticaj dužih spejser domena na antitumorsku aktivnost in vivo. Tako, u ovom modelu, anti-tumorska reaktivnost CD19 himernih receptora diktirana je u velikoj meri dužinom ekstracelularnog spejser domena, a ne kostimulatornim modulima intracelularne signalizacije.
[0412] T ćelije modifikovane CD19 himernim receptorima koji imaju duge ekstracelularne spejsere podvrgnute aktiviranjem izazvanoj ćelijskoj smrti in vivo
[0413] Nastojano je da se odrede mogući mehanizmi koji su u osnovi inferiorne in vivo antitumorske aktivnosti T ćelija koje eksprimiraju CD19 himerne receptore sa dugim spejser domenima. Zato što je manji broj prenetih T ćelija modifikovanih radi eksprimiranja CD19 himernih receptora sa dugim spejser domenima bio u krvi, razmatrana je mogućnost da T ćelije nisu efikasno aktivirane tumorskim ćelijama in vivo ili obrnuto, da su one podvrgnute aktiviranjem indukovanoj T ćelijskoj smrti in vivo. Prema tome, obeležene su CD19 himerni receptor-modifikovane i odgovarajuće kontrolne T ćelije sa CFSE i date su ove T ćelije NSG/Raji miševima koji nose tumor radi ispitivanja aktivacija, proliferacije i preživljavanja T ćelija modifikovanih svakim od konstrukata CD19 himernog receptora na tumor mestima in vivo (Slika 19A). Na kraju njihove in vitro ekspanzije i neposredno pre CFSE obeležavanja i infuzije u NSG miševe koji nose ustanovljene Raji tumore, T ćelije transdukovane sa svakim od CD19 himernih receptora eksprimirale su niske nivoe markera aktivacije CD69 i CD25 (Slika 19B).
[0414] Koštana srž je dobijena od podgrupa miševa 24 i 72 sata posle T ćelijske infuzije radi ispitivanja frekvencije, aktivacije i proliferacije prenetih T ćelija. U 24. satu, tumorske ćelije (CD45+ CD3-) bile su prisutne u koštanoj srži u svim grupama tretiranja i veliki deo T ćelija sa himernim receptorom, ali ne kontrolne T ćelije, ushodno je regulisao CD69 i CD25. Nije bilo merljivog rastvaranja CFSE u prenetim T ćelijama sa himernim receptorom. (Slika 19C) I CD69 i CD25 su eksprimirane u većem odnosu T ćelija modifikovanih CD19 himernim receptorima sa 'dugim spejserom', što ukazuje da su ove ćelije možda primile jači stimulans u odnosu na T ćelije sa CD19 himernim receptorima sa 'kratkim spejserom' (Slika _C). Uprkos dokazu T ćelijske aktivacije u 24. satu, postojao je značajno manji broj T ćelija sa himernim receptorom u koštanoj srži miševa tretiranih T ćelijama modifikovanim CD28 i 4-IBB konstruktima 'dugog spejsera' u odnosu na one modifikovane CD28 i 4-IBB konstruktima 'kratkog spejsera', ili kontrolnim tEGFR vektorom (Slika 19C, E).
[0415] [0239] 72. sata posle T ćelijskog prenosa, T ćelije koje eksprimiraju CD19 himerne receptore sa 'kratki/CD28' i 'kratki/4-1BB' imale su povećanu 3 do > 10 puta frekvenciju u koštanoj srži i slezini, i pretrpele su nekoliko deoba ćelija (Slika 19D,E). Kontrolne tEGFR+ T ćelije ostale su prisutne u koštanoj srži i slezini u 72. satu u nivou sličnom onom primećenom u 24. satu, i nisu se delile kao što je izmereno pomoću CFSE rastvora. Nasuprot tome, brojne T ćelije koje eksprimiraju CD19 himerne receptore sa 'dugi/CD28' i 'dugi/4-IBB' nisu povećane u koštanoj srži i slezini. (Slika 19D, E) U skladu sa nižim brojevima ćelija, analiza CFSE bojenja kod vijabilnih PI- T ćelija sa CD19 himernim receptorima sa 'dugi/CD28' i 'dugi/4-IBB' demonstrirala je da su ove ćelije pretrpele mnogo manji broj deoba ćelija u odnosu na T ćelije sa CD19 himernim receptorima sa 'kratki/CD28' i 'kratki/4-IBB'. (Slika 19D)Kada su analizirani protočni podaci da uključe PI+ T ćelije, detektovana je mnogo viša frekvencija PI+ CD3+ T ćelija u koštanoj srži i slezini miševa koji su primili T ćelije sa CD19 himernim receptorima sa 'dugi spejser' domenima, što ukazuje da je značajan odnos T ćelija, uprkos što su aktivirane tumorom in vivo pretrpeo ćelijsku smrt (Slika 19F). U skladu sa bioluminescentnim snimanjem, CD45+ CD3- Raji tumorske ćelije bile su prisutne u većim brojevima u koštanoj srži miševa tretiranim T ćelijama koje eksprimiraju CD19 himerne receptore sa dugim spejser domenima ili koje eksprimiraju tEGFR samo u odnosu na miševe tretirane CD19 himernim receptorima sa kratkim spejser domenima (Slika 19D,E, G).
[0416] Zbirno, podaci obezbeđuju dokaz da CD19 himerni receptori sa dugim ekstracelularnim spejser domenom, uprkos posredovanju ekvivalentne ili superiorne efektorske funkcije in vitro i prepoznavanju tumora in vivo, indukuju visok nivo aktiviranjem izazvane ćelijske smrti in vivo, a ne mogu da iskorene ustanovljeni limfom.
[0417] Diskusija
[0418] Himerni receptori su veštački receptori koji uključuju ekstracelularni antigen-vezujući scFv, spejser domen koji obezbeđuje separaciju scFv iz ćelijske membrane i modul intracelularne signalizacije koji posreduje T ćelijsku aktivaciju. Himerni receptori koji sadrže scFv izveden iz CD19-specifičnog FMC63 mAb izučavanog ovde, napredovali su u testiranju u kliničkim probama kod pacijenata sa B-ćelijskim malignitetima. Antitumorska aktivnost i T ćelijska perzistencija varirali su suštinski u različitim probama. Svaka od ovih kliničkih proba razlikovala se u potencijalno kritičnim promenljivima, uključujući različite vektore za prenos gena, metodologije ćelijske kulture i režime kondicioniranja pre prenosa T ćelija sa CD 19 himernim receptorima.
[0419] Ispitana je mogućnost da li ekstracelularni spejser domen CD19 himernih receptora može biti značajna determinanta anti-tumorske aktivnosti in vivo, nezavisno od kostimulatorne signalizacije obezbeđene himernim receptorom. Izvedeni su spejser domeni iz IgG4-Fc, koji omogućavaju visoke nivoe površinske ekspresije ćelija sa himernim receptorom i za koje je manje verovatno da će izazvati prepoznavanje urođene imune ćelije u odnosu na ostale IgG izotipove. Korišćen je IgG4 'Šarka-CH2-CH3' u dizajnu dugih (229 AA) spejser konstrukata i IgG4 'Šarka' domen u himernim receptorima sa kratkim (12 AA) spejserom. Radi poređenja pojedinačnih konstrukata himernog receptora, korišćene su prečišćene (>90%) pozitivne CD8+ T<CM>-izvedene T ćelije sa himernim receptorima radi uklanjanja razlika u ćelijskoj kompoziciji i frekvenciji transdukcije kao potencijalni izvor pristrasnosti u analizi in vitro i in vivo funkcije. Pokazalo se da CD8+ TCM imaju superiorna svojstva za adoptivnu imunoterapiju, u odnosu na ostale više preovlađujuće T ćelijske podskupove u krvi koji malo opstaju i inefektivni su u terapiji tumora. T ćelije sa CD19 himernim receptorom generisane su pomoću standardizovanog protokola kultivacije koji je sličan onom korišćenom za dobijanje T ćelija sa himernim receptorima za kliničke probe. Podaci pokazuju da su CD 19 himerni receptori sa kratkim IgG4 'Šarka' spejserom dodelili potentnu anti- tumorsku reaktivnost in vitro i in vivo, dok odgovarajući CD19 himerni receptori sa dugim spejserom IgG4 'Šarka-CH2-CH3', uprkos ekvivalentnoj ili superiornoj reaktivnosti in vitro, nisu uspeli da dodele značajne anti-tumorske efekte u mišjim modelima limfoma. Iznenađujuće, dužina spejser domena pokazala se presudnim elementom za in vivo antitumorsku aktivnost, a
[0422] 1
[0423] nedostatak efikasnosti himernog receptora sa 'dugim spejserom' nije mogla da se prevaziđe povećanjem T ćelijske doze.
[0424] Takođe su primećene glavne razlike u izlučivanju citokina i proliferaciji in vitro između T ćelija koje eksprimiraju CD19 himerne receptore koji sadrže CD28 i 4-1BB kostimulatorne domene, sa CD28 povećanjim izlučivanjem IFN-y, IL-2 i TNF-a u odnosu na 4-1BB. CD19 himerni receptori koji su posedovali tandem CD28_4-1BB takođe su proizveli više nivoe ovih citokina u odnosu na himerne receptore koji kodiraju samo 4-1BB. Međutim, podaci pokazuju da ove razlike u in vitro funkciji nisu bile prediktivne u in vivo anti-tumorskoj efikasnosti, budući da su CD 19 himerni receptori ili sa CD28 ili sa 4- 1BB kostimulatornim domenom i kratkim spejserom bili slično efektivni u iskorenjivanju uznapredovalih ustanovljenih Raji tumora kod NSG miševa. Nasuprot tome, CD19 himerni receptori sa suboptimalnom dužinom spejsera i CD28, 4-1BB, ili oba kostimulatorna domena, uprkos dodeljivanju slične in vitro funkcije kao identičan konstrukt himernog receptora sa kratkim spejser domenom, nisu imali značajnu anti-tumorsku aktivnost in vivo, što demonstrira doprinos dužine spejsera in vivo funkciji T ćelija sa himernim receptorima.
[0425] Ove studije obezbeđuju uvid u mehanizam odgovoran za nedostatak in vivo efikasnosti CD19 himernih receptora sa dugim spejser domenima. T ćelije koje eksprimiraju CD19 himerne receptore i sa dugim i sa kratkim spejser domenima mogle su biti detektovane u koštanoj srži i slezini posle adoptivnog prenosa u NSG miševe koji nose ustanovljeni Raji limfom, a većina je bila aktivirana kao što je prikazano ushodnom regulacijom CD25 i CD69. Međutim, T ćelije modifikovane radi eksprimiranja CD19 himernog receptora sa dugim spejser domenom pokazale su strmi pad u broju ćelija, nasuprot znatnoj in vivo ekspanziji T ćelija koje eksprimiraju CD19 himerne receptore sa kratkim spejser domenom. Pad broja T ćelija bio je posledica mnogo viših nivoa ćelijske smrti u prva 72 sata posle adoptivnog prenosa u odnosu na T ćelije sa kratkim spejser domenima, a kontrolne T ćelije nisu eksprimirale CD19 himerni receptor. Zbirno, ovi podaci ukazuju da je prepoznavanje tumorskih ćelija in vivo rezultovalo smrću T ćelija koje eksprimiraju CD19-himerne receptore sa dugim spejser domenima. Sličan mehanizam može da objasni kratko trajanje i niske nivoe T ćelijske perzistencije u kliničkim probama koje su koristile CD19-himerne receptore sa dugim spejserom (14).
[0426] Studije ovde prijavljene su prve koje prikazuju da spejser domeni CD19 himernih receptora kojima nedostaju suštinska svojstva signalizacije imaju dramatične efekte na in vivo antitumorsku aktivnost nezavisno od kostimulatorne signalizacije, i identifikuju značaj ispitivanja optimalne kompozicije ove oblasti u dizajnu himernih receptora za kliničke primene.
[0429] 2
[0430] Tabela 1
[0431] Sekvenca himernog receptora sa anti-CD19 kratkim spejserom GMCSFRss-CD19scFv-IgG4šarka-CD28tm-41BB-Zeta-T2A-EGFRt
[0433]
[0435] Gaatctaagtacggaccgccctgccccccttgccct (IgG4šarka) (SEQ ID NO:4)
[0437]
[0438]
[0441] 
[0442]
[0443]
[0444]
[0446] Tabela 3
[0447] ZXR-014 Nukleotidne i aminokiselinske sekvence (mapa sekcija) GMCSFRss: nt2084-2149
[0448] CD19scFv: nt2150-2884
[0449] Igg4Šarka: nt2885-2920
[0450] CD28tm: nt2921-3004
[0451] 41BB: nt3005-3130
[0452] Zeta: nt3131-3466
[0453] T2A: nt3467-3538
[0454] EGFRt: nt3539-4612
[0455] Prajmeri za sekvenciranje:
[0456]
[0457] Oligo naziv Sekvenca Region
[0458] oJ02649 ATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGT pre-U5(SEQ ID NO:22) oJ02648 CCGTACCTTTAAG ,ACCAATGACTTAC delU3(SEQ ID NO:23) oJ02650 TTGAGAGTTTTCGCCCCG mid-Ampr(SEQ ID NO:24) oJ02651 AATAGACAGATCGCTGAGATAGGT post-Ampr(SEQ ID NO:25) oJ02652 CAGGTATCCGGTAAGCGG CoE1 ori(SEQ ID NO:26) oJ02653 CGACCAGCAACCATAGTCC SV40(SEQ ID NO:27) oJ02654 TAGCGGTTTGACTCACGG CMV(SEQ ID NO:28) oJ02655 GCAGGGAGCTAGAACGATTC psi(SEQ ID NO:29) oJ02656 ATTGTCTGGTATAGTGCAGCAG RRE(SEQ ID NO:30) oJ02657 TCGCAACGGGTTTGCC EF1p(SEQ ID NO:31) oJ02658 AGGAAGATATCGCCACCTACT CD19Rop(SEQ ID NO:32) oJ02601 CGGGTGAAGTTCAGCAGAAG Zeta(SEQ ID NO:33) oJ02735 ACTGTGTTTGCTGACGCAAC WPRE(SEQ ID NO:34) oJ02715 ATGCTTCTCCTGGTGACAAG EGFRt(SEQ ID NO:35)
[0459]
[0460]
[0463] 
[0464]
[0466] Tabela 8 Primerne sekvence regiona šarke Humani IgG1 EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:17)
[0467] Humani IgG2 ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:18)
[0468] Humani IgG3 ELKTPLGDTHTCPRCP (EPKSCDTPPPCPRCP)<3>(SEQ ID NO:19) Humani IgG4 ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO:20)
[0469] Modifikovani Humani IgG4 ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO:21) Modifikovani Humani IgG4 YGPPCPPCP (SEQ ID NO:51) Modifikovani Humani IgG4 KYGPPCPPCP (SEQ ID NO:52) Modifikovani Humani IgG4 EVVKYGPPCPPCP (SEQ ID NO:53)
[0471] Tabela 9
[0472] R12 dugi spejser CAR: PJ_R12-CH2-CH3-41BB-Z-T2A-tEGFR (SEQ ID NO:37)
[0475] 2
[0476]
[0477]
[0480] IgG4 spejser TACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT CH2
[0482]
[0485] 4-1BB
[0488]
[0492] 4
[0493] CD3 zeta
[0494]
[0496] tEGFR
[0497]
[0498]
[0499]
[0502] Tabela 10
[0503] Vodeća_R12- Šarka-CH2-CH3-CD28tm/41BB-Z-T2A-tEGFR (SEQ ID NO:38) Vodeća
[0504] MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
[0506] R12 scFv
[0509]
[0512] Šarka Spejser
[0513] ESKYGPPCPPCP CH2
[0516]
[0519] CH3
[0520]
[0523] MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
[0524] 4-1BB
[0525] KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL CD3 zeta
[0528]
[0531] T2A
[0532] LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
[0533] tEGFR
[0535]
[0538] Tabela 11
[0539] R12 srednji spejser CAR: PJ_R12-CH3-41BB-Z-T2A-tEGFR (SEQ ID NO:39)
[0540]
[0543] Šarka Spejser TACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT CH3
[0545]
[0548] CD3zeta
[0551]
[0555] 1
[0556] T2A
[0557]
[0560] 2
[0561]
[0562]
[0565] 
[0566]
[0569] Tabela 12
[0570] Vodeća_R12-Šarka-CH3-CD28tm/41BB-Z-T2A-tEGFR (SEQ ID NO:40) Vodeća
[0571] MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
[0572] R12 scFV
[0575]
[0578] Šarka Spejser
[0579] ESKYGPPCPPCP CH3
[0582]
[0585] CD28tm
[0586] MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
[0587] 4-1BB
[0588] KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL CD3 zeta
[0589]
[0591] LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
[0592] tEGFR
[0593]
[0594]
[0595]
[0596]
[0597]
[0599] Tabela 14 Vodeća_R12 -CD28tm/41BB-Z-T2A-tEGFR(SEQ ID NO:42) Vodeća
[0600] MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
[0601] scFv R12
[0602]
[0605] Šarka/spejser
[0606] ESKYGPPCPPCP CD28tm
[0607] MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
[0608] 4-1BB KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL CD3zeta
[0611]
[0614] T2A
[0615] LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
[0616] tEGFR
[0618]
[0622] 1
[0623]
[0626] 
[0627]
[0628]
[0631] 
[0632]
[0633]
[0635] Tabela 16
[0636] Vodeća _R11-Šarka-CH2-CH3-CD28tm/41BB-Z-T2A-tEGFR (SEQ ID NO:44) Vodeća
[0637] MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
[0638] R1 scFv
[0641]
[0644] Šarka/Spejser
[0645] ESKYGPPCPPCP CH2
[0648]
[0649] CD28tm
[0650] MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
[0651] 4-1BB
[0652] KRGRKKLL YIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL CD3zeta
[0655]
[0658] T2A
[0659] LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
[0660] tEGFR
[0662]
[0663]
[0664]
[0665]
[0666]
[0669] 
[0670]
[0672] Tabela 18
[0673] Vodeća_R11-Šarka-CH3-CD28tm/41BB-Z-T2A-tEGFR (SEQ ID NO:46) Vodeća
[0674] MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
[0675] scFV R1
[0678]
[0681] Šarka/spejser
[0682] ESKYGPPCPPCP CH3
[0685]
[0688] CD28tm
[0689] MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
[0690] 4-1BB
[0691] KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
[0694] 2
[0695] CD3zeta
[0698]
[0701] T2A LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPRM
[0702] tEGFR
[0704]
[0705]
[0708] 
[0709]
[0710]
[0711]
[0713] Tabela 20
[0714] Vodeća _R11- Šarka-CD28tm/41BB-Z-T2A-tEGFR (SEQ ID NO:48) Vodeća
[0715] MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
[0716] ScFv R1
[0719]
[0722] Spejser/Šarka
[0723] ESKYGPPCPPCP CD28tm
[0724] MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
[0725] 4-1BB
[0726] KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL CD3zeta
[0729]
[0732] T2A
[0733] LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
[0734] tEGFR
[0735]
[0738] Tabela 21
[0739] Srednji Spejser (SEQ ID NO:49)
[0740] Šarka/spejser
[0741] ESKYGPPCPPCP CH3
[0744]
[0747] Dugi spejser (SEQ ID NO:50)
[0748] Šarka
[0749] ESKYGPPCPPCP CH2
[0752]
[0755] Tabela 22 Her2 konstrukt-kratki spejser (SEQ Id No:54) GMCSFss-Her2scFv-IgG4šarka-CD28tm-41BB-Zeta-T2A-EGFRt
[0756] Vodeća
[0757] Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca
[0758] Her2scFV
[0760]
[0763] Šarka spejser
[0764] Gagagcaagtacggaccgccctgccccccttgccct
[0765] CD28tm atgttctgggtgctggtggtggtcggaggcgtgctggcctgctacagcctgctggtcaccgtggccttcatcatcttttgggtg 4-1BB
[0767]
[0770] T2A
[0771] Ctcgagggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgac gtggaggagaatcccggccctagg tEGFR
[0774] 1
[0775]
[0778] Tabela 23
[0779] Her2 konstrukt-srednji spejser (SEQ Id No:55 )
[0780] Vodeća
[0781] Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacaccca
[0782] Her2scFv
[0784]
[0787] CD28tm Atgttctgggtgctggtggtggtcggaggcgtgctggcctgctacagcctgctggtcaccgtggccttcatcatcttttgggtg 4-1BB
[0790] 1 1
[0791]
[0794] T2A
[0795] Ctcgagggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgac gtggaggagaatcccggccctagg tEGFR
[0797]
[0800] Tabela 24
[0801] Her2 konstrukt-dugi spejser (SEQ Id No:56)
[0802] vodeća
[0803] Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacaccca
[0804] Her2scFV
[0807] 1 2
[0808]
[0811] CD28tm atgttctgggtgctggtggtggtgggcggggtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtg 4-1BB
[0813]
[0816] T2A Ctcgagggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctagg tEGFR
[0819] 1
[0820]
[0823] 

Claims (15)

1. Patentni zahtevi
1. Polipeptid himernog receptora koji obuhvata:
a) ligand vezujući domen, gde se taj ligand vezujući domen vezuje za neki ligand, pri čemu ligand vezujući domen je jednolančani varijabilni fragment koji se specifično vezuje za CD19 pri čemu ligand vezujući domen ima aminokiselinsku sekvencu:
b) spejser dužine koja je specifična za ligand, spejser ima dužinu od 12 aminokiselina i sadrži aminokiselinsku sekvencu: ESKYGPPCPPCP;
c) transmembranski domen; i
d) intraćelijski signalni domen.
2. Polipeptid himernog receptora prema patentnom zahtevu 1, pri čemu transmembranski domen sadrži aminokiselinsku sekvencu MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 transmembranskog domena.
3. Polipeptid himernog receptora prema patentnom zahtevu 1, gde intracelularni signalni domen sadrži signalni domen CD3 zeta i signalni domen 4‑1BB, gde intracelularni signalni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu:
4. Nukleinska kiselina himernog receptora koja kodira polipeptid himernog receptora prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3.
5. Ekspresioni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 4.
6. Ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 5,
(a) gde ekspresioni vektor je vektor simijan virusa 40, vektor adenovirusa, vektor adeno povezanog virusa (AAV), lentivirusnog vektora ili retrovirusnog vektora; i/ili
(b) dalje obuhvata polinukleotid koji kodira marker sekvencu, opciono gde
(i) marker sekvenca je skraćeni receptor epidermalnog faktora rasta koji ima aminokiselinsku sekvencu:
i/ili
(ii) polinukleotidno kodiranje za marker sekvencu je operativno vezano za polinukleotidno kodiranje za linker sekvencu; opciono gde je linker sekvenca linker sekvenca T2A koja se cepa koja sadrži aminokiselinsku sekvencu LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR.
7. Ćelija domaćina koja sadrži polipeptid himernog receptora prema bilo kom patentnom zahtevu 1 – 3, nukleinska kiselina himernog receptora prema patentnom zahtevu 4 ili ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 5 ili patentnom zahtevu 6.
8. Ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je ćelija domaćina autologna ili alogena T ćelija.
9. Ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 7 ili patentnom zahtevu 8, gde je ćelija domaćina proširena T ćelija, opciono gde je T ćelija proširena in vitro.
10. Ćelija domaćina prema bilo kojem od patentnih zahteva 7‐9, pri čemu je ćelija domaćina transformisani ili transdukovani limfocit.
11. Ćelija domaćina prema bilo kom od patentnih zahteva 7-10, pri čemu je ćelija domaćina CD8+ T citotoksična limfocitna ćelija, opciono gde je CD8+ T citotoksična limfocitna ćelija odabrana iz grupe koju čine naivne CD8+ T ćelije, centralne memorijske CD8+ T ćelije, efektorske memorijske CD8+ T ćelije i rasute CD8+ T ćelije, opciono gde je centralna memorijska T ćelija pozitivna za CD45RO+, CD62L+, i CD8+.
12. Ćelija domaćina prema bilo kom od patentnih zahteva 7-10, pri čemu je ćelija domaćina CD4+ T pomoćnička limfocitna ćelija, opciono gde je CD4+ T pomoćnička limfocitna ćelija odabrana iz grupe koju čine naivne naivne CD4+ ćelije, centralne memorijske CD4+ T ćelije, efektorske memorijske CD4+ T ćelije, i rasute CD4+ T ćelije, opciono pri čemu naivna CD4+ T ćelija je pozitivna za CD45RA+, CD62L+ i CD4+ i negativna za CD45RO.
13. Kompozicija koja sadrži ćeliju domaćina prema bilo kojem od patentnih zahteva 7‐12 u farmaceutski prihvatljivom ekscipijensu, opciono:
(a) sadrži ćeliju domaćina CD4+ T ćeliju i/ili ćeliju domaćina CD8+ T ćeliju;
(b) sadrži ćeliju domaćina prema patentnom zahtevu 11 i ćeliju domaćina prema patentnom zahtevu 12; ili
(c) sadrži ćelijski preparat koji ima CD8+ T citotoksičnu limfocitnu ćeliju prema patentnom zahtevu 11 i/ili ćelijski preparat koji ima CD4+ T pomoćničku limfocitnu ćeliju prema patentnom zahtevu 12.
14. Ćelija domaćina prema bilo kojem od patentnih zahteva 7‐12 ili kompozicija prema zahtevu 13 za upotrebu u lečenju kancera.
1
15. Ćelija domaćina ili kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, gde
(a)kancer je solidan tumor ili hematološki malignitet; i/ili
(b) postupak obuhvata davanje ćelijskog preparata koji sadrži CD8+ T citotoksičnu limfocitnu ćeliju prema patentnom zahtevu 11 i davanje ćelijskog preparata koji sadrži CD4+ T pomoćničku limfocitnu ćeliju prema patentnom zahtevu 12, opciono gde ćelijski preparat sadrži CD8+ T citotoksičnu limfocitnu ćeliju prema patentnom zahtevu 11 i ćelijski preparat koji sadrži CD4+ T pomoćničku limfocitnu ćeliju prema patentnom zahtevu 12.
1
RS20251321A 2012-08-20 2013-08-20 Postupak i kompozicije za ćelijsku imunoterapiju RS67621B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261691117P 2012-08-20 2012-08-20
EP25150326.4A EP4537839B1 (en) 2012-08-20 2013-08-20 Method and compositions for cellular immunotherapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67621B1 true RS67621B1 (sr) 2026-02-27

Family

ID=49054932

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20251321A RS67621B1 (sr) 2012-08-20 2013-08-20 Postupak i kompozicije za ćelijsku imunoterapiju
RS20201559A RS61345B2 (sr) 2012-08-20 2013-08-20 Postupak i kompozicije za ćelijsku imunoterapiju
RS20250322A RS66657B1 (sr) 2012-08-20 2013-08-20 Postupak i kompozicije za ćelijsku imunoterapiju

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201559A RS61345B2 (sr) 2012-08-20 2013-08-20 Postupak i kompozicije za ćelijsku imunoterapiju
RS20250322A RS66657B1 (sr) 2012-08-20 2013-08-20 Postupak i kompozicije za ćelijsku imunoterapiju

Country Status (26)

Country Link
US (5) US10780118B2 (sr)
EP (4) EP4537839B1 (sr)
JP (4) JP6574381B2 (sr)
KR (4) KR102264290B1 (sr)
CN (1) CN104780939B (sr)
AU (4) AU2013305838A1 (sr)
BR (3) BR122020002986A8 (sr)
CA (2) CA3177394A1 (sr)
CY (1) CY1123959T1 (sr)
DK (3) DK3824905T3 (sr)
ES (3) ES3015267T3 (sr)
FI (3) FI4537839T3 (sr)
HR (3) HRP20210011T4 (sr)
HU (2) HUE053439T2 (sr)
IL (3) IL237315B (sr)
LT (3) LT4537839T (sr)
MX (3) MX380109B (sr)
PH (2) PH12019550223A1 (sr)
PL (3) PL2884999T5 (sr)
PT (3) PT3824905T (sr)
RS (3) RS67621B1 (sr)
RU (2) RU2700765C2 (sr)
SG (2) SG11201501259QA (sr)
SI (3) SI4537839T1 (sr)
SM (3) SMT202500495T1 (sr)
WO (1) WO2014031687A1 (sr)

Families Citing this family (487)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013035099A1 (en) 2011-09-08 2013-03-14 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment
ES3011307T3 (en) 2012-02-23 2025-04-07 Juno Therapeutics Gmbh Chromatographic isolation of cells and other complex biological materials
BR122020002986A8 (pt) 2012-08-20 2023-04-18 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Método e composições para imunoterapia celular
EP4282419A1 (en) 2012-12-20 2023-11-29 Purdue Research Foundation Chimeric antigen receptor-expressing t cells as anti-cancer therapeutics
JP6647868B2 (ja) 2013-02-20 2020-02-14 ノバルティス アーゲー ヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗原受容体を用いたがんの処置
US9573988B2 (en) 2013-02-20 2017-02-21 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-CD123 chimeric antigen receptor engineered T cells
WO2014145252A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Milone Michael C Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
ES2918501T3 (es) 2013-12-19 2022-07-18 Novartis Ag Receptores de antígenos quiméricos de mesotelina humana y usos de los mismos
EP3087101B1 (en) 2013-12-20 2024-06-05 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
NZ759969A (en) 2013-12-20 2022-12-23 Fred Hutchinson Cancer Center Tagged chimeric effector molecules and receptors thereof
WO2015112626A1 (en) 2014-01-21 2015-07-30 June Carl H Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
AU2015244039B2 (en) 2014-04-07 2021-10-21 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-CD19 chimeric antigen receptor
US10611837B2 (en) * 2014-04-10 2020-04-07 Seattle Children's Hospital Transgene genetic tags and methods of use
SI3132247T1 (sl) 2014-04-16 2021-12-31 Juno Therapeutics Gmbh Postopki, kompleti in naprava za povečanje populacije celic
CA2946312A1 (en) 2014-04-23 2015-10-29 Juno Therapeutics, Inc. Methods for isolating, culturing, and genetically engineering immune cell populations for adoptive therapy
HUE049514T2 (hu) 2014-04-25 2020-09-28 Bluebird Bio Inc Javított eljárások adoptív sejtterápiák kialakítására
PL3134432T3 (pl) * 2014-04-25 2020-10-19 Bluebird Bio, Inc. Promotor mnd chimeryczne receptory antygenowe
SI3151672T1 (sl) 2014-06-06 2021-03-31 Bluebird Bio, Inc. Izboljšani T-celični sestavki
KR20170032406A (ko) 2014-07-15 2017-03-22 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 입양 세포 치료를 위한 조작된 세포
SG10201913782UA (en) 2014-07-21 2020-03-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a cll-1 chimeric antigen receptor
BR112017001183A2 (pt) 2014-07-21 2017-11-28 Novartis Ag tratamento de câncer usando receptor de antígeno quimérico anti-bcma humanizado
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
TWI719942B (zh) 2014-07-21 2021-03-01 瑞士商諾華公司 使用ｃｄ３３嵌合抗原受體治療癌症
ES2878449T3 (es) 2014-07-24 2021-11-18 2Seventy Bio Inc Receptores antigénicos quiméricos de BCMA
CN113846062B (zh) * 2014-07-25 2025-02-21 赛拉福柯蒂斯公司 用于嵌合抗原受体分子的调控表达的慢病毒载体
WO2016016344A1 (en) 2014-07-29 2016-02-04 Cellectis Ror1(ntrkr1)specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
US10544201B2 (en) 2014-07-31 2020-01-28 Cellectis ROR1 specific multi-chain chimeric antigen receptor
KR102387122B1 (ko) * 2014-08-19 2022-04-14 밀테니 비오텍 비.브이. & 씨오. 케이지 Ssea4 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체
MX2017002205A (es) 2014-08-19 2017-08-21 Novartis Ag Receptor quimerico de antigeno (car) anti-cd123 para uso en el tratamiento de cancer.
TWI751102B (zh) 2014-08-28 2022-01-01 美商奇諾治療有限公司 對ｃｄ１９具專一性之抗體及嵌合抗原受體
EP3189073B2 (en) 2014-09-04 2025-06-11 Cellectis Trophoblast glycoprotein (5t4, tpbg) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
JP6839074B2 (ja) 2014-09-17 2021-03-03 ノバルティス アーゲー 養子免疫療法のためのキメラ受容体での細胞毒性細胞のターゲティング
BR112017005631A2 (pt) 2014-09-19 2018-06-26 City Of Hope células t com receptor de antígeno coestimulador quimérico direcionadas à il13ra2
KR20170068504A (ko) 2014-10-08 2017-06-19 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 요법에 대한 치료 반응성을 예측하는 바이오마커 및 그의 용도
MX392487B (es) 2014-10-20 2025-03-21 Juno Therapeutics Inc Métodos y composiciones para dosificación en terapia celular adoptiva.
ES2987570T3 (es) 2014-11-05 2024-11-15 Juno Therapeutics Inc Métodos para la transducción y el procesamiento de células
ES2819553T3 (es) 2014-12-03 2021-04-16 Juno Therapeutics Inc Métodos y composiciones para terapia celular adoptiva
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
HRP20191873T1 (hr) 2014-12-12 2020-01-24 Bluebird Bio, Inc. Kimerni antigenski receptori
WO2016094873A2 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 Emergent Product Development Seattle, Llc Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 binding proteins and related compositions and methods
FI3240805T3 (fi) 2014-12-15 2025-02-17 Univ California Cd19- ja cd20-vasteellinen bispesifinen tai-veräjän kimeerinen antigeenireseptori
EP3234120B1 (en) 2014-12-15 2025-09-03 The Regents of the University of California Cytotoxic molecules responsive to intracellular ligands for selective t cell mediated killing
RU2021118125A (ru) 2014-12-29 2022-04-06 Новартис Аг Способы получения экспрессирующих химерный антигенный рецептор клеток
MA41346A (fr) 2015-01-12 2017-11-21 Juno Therapeutics Inc Eléments régulateurs post-transcriptionnels d'hépatite modifiée
US11459390B2 (en) 2015-01-16 2022-10-04 Novartis Ag Phosphoglycerate kinase 1 (PGK) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
ES2818103T3 (es) 2015-01-16 2021-04-09 Juno Therapeutics Inc Anticuerpos y receptores de antígenos quiméricos específicos para ROR1
WO2016126608A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
CN105985444B (zh) * 2015-02-05 2024-02-13 博生吉安科细胞技术有限公司 一种嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体的方法及应用
JP6961490B2 (ja) 2015-04-08 2021-11-05 ノバルティス アーゲー Ｃｄ２０療法、ｃｄ２２療法、およびｃｄ１９キメラ抗原受容体（ｃａｒ）発現細胞との併用療法
WO2016166568A1 (en) 2015-04-16 2016-10-20 Juno Therapeutics Gmbh Methods, kits and apparatus for expanding a population of cells
AU2016249005B2 (en) 2015-04-17 2022-06-16 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
EP3288570A4 (en) 2015-04-29 2018-11-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified stem cells and uses thereof
BR112017023692A2 (pt) * 2015-05-01 2018-07-17 The Regents Of The University Of California moléculas imunoterapêuticas glican-dependentes
PL3298033T5 (pl) 2015-05-18 2023-10-30 TCR2 Therapeutics Inc. Kompozycje i zastosowania medyczne do reprogramowania TCR z zastosowaniem białek fuzyjnych
US10752670B2 (en) 2015-05-20 2020-08-25 Cellectis Anti-GD3 specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
WO2016196384A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions for cellular immunotherapy
WO2016196388A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Juno Therapeutics, Inc. Composition and methods for regulating inhibitory interactions in genetically engineered cells
HK1255161A1 (zh) 2015-07-15 2019-08-09 Juno Therapeutics, Inc. 用於过继性细胞治疗的工程细胞
EP3322424B1 (en) * 2015-07-16 2023-10-11 Yeda Research and Development Co., Ltd. Use of anti third party central memory t cells
CA2992551A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
CA2992989A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 City Of Hope T cells for expression of chimeric antigen receptors and other receptors
GB2592821B (en) 2015-07-31 2022-01-12 Univ Minnesota Modified cells and methods of therapy
AU2016306209B2 (en) 2015-08-07 2023-07-06 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Bispecific CAR T-cells for solid tumor targeting
US11667691B2 (en) 2015-08-07 2023-06-06 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins
CN106467906B (zh) * 2015-08-20 2019-09-27 北京马力喏生物科技有限公司 构建体、转基因淋巴细胞及其制备方法和用途
WO2017040529A1 (en) * 2015-08-31 2017-03-09 Bluebird Bio, Inc. Anti-sialyl tn chimeric antigen receptors
WO2017040930A2 (en) 2015-09-03 2017-03-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Biomarkers predictive of cytokine release syndrome
EP3347026A4 (en) 2015-09-09 2019-05-08 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) GENEMANIPULATION OF MACROPHAGES FOR IMMUNOTHERAPY
CN117659160A (zh) * 2015-09-11 2024-03-08 小利兰·斯坦福大学托管委员会 生物相关正交细胞因子/受体对
JP6955487B2 (ja) 2015-09-24 2021-10-27 アブビトロ， エルエルシー Ｈｉｖ抗体組成物および使用方法
MX2018003534A (es) 2015-09-25 2019-04-25 Abvitro Llc Proceso de alto rendimiento para identificacion de blanco de receptor de celula t de secuencias de receptor de celula t apareadas de manera natural.
EP3359574B1 (en) 2015-10-06 2020-04-22 City of Hope Chimeric antigen receptors targeted to psca
MX2018004875A (es) 2015-10-22 2018-08-01 Juno Therapeutics Gmbh Metodos para cultivar celulas y kits y aparatos para ello.
EP3365453A2 (en) 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics GmbH Methods, kits, agents and apparatuses for transduction
AU2016341529B2 (en) 2015-10-22 2023-03-30 Juno Therapeutics Gmbh Methods for culturing cells and kits and apparatus for same
CN108289913A (zh) 2015-10-30 2018-07-17 儿童国家医疗中心 从未致敏t细胞群体产生hpv抗原特异性t细胞
SG11201803098VA (en) 2015-10-30 2018-05-30 Nbe Therapeutics Ag Anti-ror1 antibodies
PL3368571T3 (pl) 2015-10-30 2023-05-02 The Regents Of The University Of California Polipeptydy odpowiadające na transformujący czynnik wzrostu beta i sposoby ich zastosowania
KR20180083874A (ko) * 2015-11-04 2018-07-23 사울 제이. 프라이스맨 Her2를 표적화하는 키메라 항원 수용체
US11020429B2 (en) 2015-11-05 2021-06-01 Juno Therapeutics, Inc. Vectors and genetically engineered immune cells expressing metabolic pathway modulators and uses in adoptive cell therapy
BR112018008442A2 (pt) 2015-11-05 2018-11-06 Juno Therapeutics Inc receptores quiméricos contendo domínios induto-res de traf e composições e métodos relacionados
EP4212166A1 (en) 2015-12-03 2023-07-19 Juno Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing immune responses against cell therapies
EP4212547A1 (en) 2015-12-03 2023-07-19 Juno Therapeutics, Inc. Modified chimeric receptors and related compositions and methods
WO2017093969A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Novartis Ag Compositions and methods for immunooncology
US11815514B2 (en) 2015-12-04 2023-11-14 Juno Therapeutics, Inc. Methods and compositions related to toxicity associated with cell therapy
US11479755B2 (en) 2015-12-07 2022-10-25 2Seventy Bio, Inc. T cell compositions
EP4643874A3 (en) 2015-12-22 2026-02-11 Novartis AG Mesothelin chimeric antigen receptor (car) and antibody against pd-l1 inhibitor for combined use in anticancer therapy
RU2018127657A (ru) 2015-12-30 2020-01-31 Новартис Аг Виды терапии на основе иммуноэффекторных клеток с улучшенной эффективностью
EP3402495A4 (en) * 2016-01-15 2019-06-19 Etubics Corporation METHOD AND COMPOSITIONS FOR T-CELL IMMUNOTHERAPY
CN106978442B (zh) * 2016-01-18 2020-06-19 爱康得生物医学技术（苏州）有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞的制备方法
UA125718C2 (uk) 2016-01-20 2022-05-25 Зе Скріппс Ресеарч Інстітьют Композиції антитіл до ror1 і пов'язані з ними способи
EP4006056A1 (en) 2016-02-02 2022-06-01 Fred Hutchinson Cancer Research Center Anti-ror1 antibodies and uses thereof
KR20180118175A (ko) 2016-03-04 2018-10-30 노파르티스 아게 다중 키메라 항원 수용체 (car) 분자를 발현하는 세포 및 그에 따른 용도
EP3430548A1 (en) 2016-03-16 2019-01-23 Juno Therapeutics, Inc. Methods for determining dosing of a therapeutic agent and related treatments
WO2017161212A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Juno Therapeutics, Inc. Methods for adaptive design of a treatment regimen and related treatments
JP7065782B2 (ja) 2016-03-18 2022-05-12 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター Ｃｄ２０免疫療法のための組成物および方法
MX2018011480A (es) 2016-03-22 2019-03-28 Seattle Children´S Hospital Dba Seattle Children´S Res Institute Metodos de intervencion temprana para prevenir o aminorar toxicidad.
EP3432924A1 (en) 2016-03-23 2019-01-30 Novartis AG Cell secreted minibodies and uses thereof
KR20190006952A (ko) * 2016-03-31 2019-01-21 라이언 티씨알 피티이. 리미티드 외인성 바이러스-특이적 t 세포 수용체 (tcr)를 발현하는 비-활성화된 t 세포
EP3439675A4 (en) 2016-04-08 2019-12-18 Purdue Research Foundation METHOD AND COMPOSITIONS FOR CAR-T CELL THERAPY
CN109715808A (zh) 2016-04-15 2019-05-03 诺华股份有限公司 用于选择性蛋白质表达的组合物和方法
WO2017189526A1 (en) * 2016-04-25 2017-11-02 Musc Foundation For Research Development Activated cd26-high immune cells and cd26-negative immune cells and uses thereof
US20190136230A1 (en) 2016-05-06 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Genetically engineered cells and methods of making the same
CA3025523A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Aadigen, Llc Peptides and nanoparticles for intracellular delivery of genome-editing molecules
EP4011381A1 (en) 2016-06-03 2022-06-15 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Adoptive cell therapies as early treatment options
CA3024725A1 (en) * 2016-06-06 2017-12-14 Juno Therapeutics, Inc. Methods for the treatment of b cell malignancies using adoptive cell therapy
SG10202012157QA (en) * 2016-06-07 2021-01-28 Max Delbrueck Centrum Fuer Molekulare Medizin Helmholtz Gemeinschaft Chimeric antigen receptor and car-t cells that bind bcma
CN107522786A (zh) * 2016-06-20 2017-12-29 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种分子、表达其的细胞及其制备方法和用途
WO2017221850A1 (ja) * 2016-06-21 2017-12-28 国立大学法人名古屋大学 Ｔ細胞機能向上のためのアダプター分子
US20200182884A1 (en) 2016-06-27 2020-06-11 Juno Therapeutics, Inc. Method of identifying peptide epitopes, molecules that bind such epitopes and related uses
EP3475706B1 (en) 2016-06-27 2021-08-11 Juno Therapeutics, Inc. Mhc-e restricted epitopes, binding molecules and related methods and uses
WO2018014001A1 (en) * 2016-07-14 2018-01-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Multiple bi-specific binding domain constructs with different epitope binding to treat cancer
MA45783A (fr) 2016-07-29 2019-06-05 Juno Therapeutics Inc Procédés d'évaluation de la présence ou de l'absence d'un virus compétent pour la réplication
JP7062640B2 (ja) 2016-07-29 2022-05-06 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 抗ｃｄ１９抗体に対する抗イディオタイプ抗体
US12304935B2 (en) 2016-07-29 2025-05-20 Juno Therapeutics, Inc. Immunomodulatory polypeptides and related compositions and methods
BR112019002035A2 (pt) 2016-08-01 2019-05-14 Novartis Ag tratamento de câncer usando um receptor de antígeno quimérico em combinação com um inibidor de uma molécula pró-macrófago m2
CA3032498A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
BR112019004662A2 (pt) 2016-09-12 2019-05-28 Juno Therapeutics Inc conjuntos de sacos de biorreator de perfusão
CN109996868A (zh) 2016-09-23 2019-07-09 弗雷德哈钦森癌症研究中心 特异性用于次要组织相容性(h)抗原ha-1的tcr及其用途
AU2017335634A1 (en) 2016-09-27 2019-03-14 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric engulfment receptor molecules
EP3518943A4 (en) 2016-09-28 2020-04-22 Atossa Therapeutics, Inc. METHOD FOR ADAPTIVE CELL THERAPY
MX2019003768A (es) 2016-10-03 2019-06-24 Juno Therapeutics Inc Moleculas de enlace especificas de hpv.
WO2018067993A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for t-cell receptors reprogramming using fusion proteins
BR112019006781A2 (pt) 2016-10-07 2019-07-30 Novartis Ag receptores de antígeno quiméricos para o tratamento de câncer
JP7623784B2 (ja) 2016-10-13 2025-01-29 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド トリプトファン代謝経路調節剤を含む免疫療法の方法および組成物
CN110520530A (zh) 2016-10-18 2019-11-29 明尼苏达大学董事会 肿瘤浸润性淋巴细胞和治疗方法
EP3532497B1 (en) * 2016-10-26 2024-07-24 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Modified immunoglobulin hinge regions to reduce hemagglutination
JP2019532997A (ja) * 2016-11-03 2019-11-14 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｔ細胞療法とｂｔｋ阻害剤との併用療法
WO2018093591A1 (en) 2016-11-03 2018-05-24 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a cell based therapy and a microglia inhibitor
WO2018085690A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Bluebird Bio, Inc. Anti-bcma car t cell compositions
JP7291396B2 (ja) 2016-11-22 2023-06-15 ティーシーアール２ セラピューティクス インク． 融合タンパク質を用いたｔｃｒの再プログラミングのための組成物及び方法
US11793833B2 (en) 2016-12-02 2023-10-24 Juno Therapeutics, Inc. Engineered B cells and related compositions and methods
CA3045339A1 (en) 2016-12-03 2018-06-07 Juno Therapeutics, Inc. Methods and compositions for use of therapeutic t cells in combination with kinase inhibitors
CN110248678A (zh) 2016-12-03 2019-09-17 朱诺治疗学股份有限公司 调节car-t细胞的方法
BR112019011065A2 (pt) 2016-12-03 2019-10-01 Juno Therapeutics Inc métodos para determinação da dosagem de células t car
KR20190098747A (ko) 2016-12-05 2019-08-22 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 입양 세포 치료법을 위한 조작된 세포의 제조방법
US11408005B2 (en) 2016-12-12 2022-08-09 Seattle Children's Hospital Chimeric transcription factor variants with augmented sensitivity to drug ligand induction of transgene expression in mammalian cells
EP3567049A4 (en) 2016-12-28 2020-08-26 Green Cross Lab Cell Corporation CHEMERICAL ANTIGENIC RECEPTOR AND NATURAL KILLER CELLS EXPRESSING THE SAME
EP3565830B1 (en) * 2017-01-09 2021-03-10 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-mesothelin immunotherapy
MX2019008227A (es) 2017-01-10 2020-08-17 Juno Therapeutics Inc Analisis epigenetico de terapia celular y metodos relacionados.
CA3048648A1 (en) * 2017-01-10 2018-07-19 The General Hospital Corporation T cells expressing a chimeric antigen receptor
EP3568416A4 (en) 2017-01-13 2020-07-08 Celdara Medical, LLC TIM-1 TARGETED CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS
WO2018136606A1 (en) * 2017-01-18 2018-07-26 Thalia Papayannopoulou Compositions and methods for transplant recipient conditioning
ES3064681T3 (en) 2017-01-18 2026-04-28 Yeda Res And Development Co Ltd Genetically modified veto cells and use of same in immunotherapy
CA3050085A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Juno Therapeutics Gmbh Cell surface conjugates and related cell compositions and methods
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
RU2674894C2 (ru) * 2017-01-30 2018-12-13 Общество с ограниченной ответственностью "ПЛАНТА" Новые люциферазы и способы их использования
US11649288B2 (en) 2017-02-07 2023-05-16 Seattle Children's Hospital Phospholipid ether (PLE) CAR T cell tumor targeting (CTCT) agents
CN108395482B (zh) 2017-02-08 2021-02-05 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种靶向cd20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化t细胞的活性鉴定
MX2019009552A (es) 2017-02-17 2019-10-02 Hutchinson Fred Cancer Res Terapias de combinacion para el tratamiento de canceres relacionados con el antigeno de maduracion de celulas b (bcma) y trastornos autoinmunitarios.
BR112019017767A2 (pt) 2017-02-27 2020-04-07 Juno Therapeutics Inc composições, artigos de fabricação e métodos relacionados à dosagem em terapia celular
WO2018160622A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Endocyte, Inc. Compositions and methods for car t cell therapy
MX2019010906A (es) 2017-03-14 2020-02-12 Juno Therapeutics Inc Metodos para almacenamiento criogenico.
JP7037577B2 (ja) 2017-03-15 2022-03-16 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 高親和性ｍａｇｅ－ａ１特異的ｔｃｒ及びその使用
KR20230166145A (ko) 2017-03-15 2023-12-06 옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드 방법
WO2018175636A2 (en) 2017-03-22 2018-09-27 Novartis Ag Compositions and methods for immunooncology
MX2019012017A (es) 2017-04-07 2020-02-12 Juno Therapeutics Inc Celulas modificadas que expresan antigeno de membrana especifico de prostata (psma) o una forma modificada del mismo y metodos relacionados.
CA3059584A1 (en) 2017-04-14 2018-10-18 Juno Therapeutics, Inc. Methods for assessing cell surface glycosylation
SG11201909331UA (en) 2017-04-18 2019-11-28 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Antigen-specific immune effector cells
JP7339160B2 (ja) 2017-04-27 2023-09-05 ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー オリゴマー粒子試薬およびその使用方法
CN118948892A (zh) 2017-05-01 2024-11-15 朱诺治疗学股份有限公司 细胞疗法与免疫调节化合物的组合
CN118374493A (zh) * 2017-05-17 2024-07-23 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 生成哺乳动物t细胞活化诱导型合成启动子(syn+pro)以改善t细胞疗法
CA3064000A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Effector Therapeutics, Inc. Methods and compositions for cellular immunotherapy
CA3063563A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Effector Therapeutics, Inc. Compositions and methods for an improved antitumor immune response
MA48781A (fr) 2017-06-02 2020-04-08 Juno Therapeutics Inc Articles de fabrication et procédés liés à la toxicité associée à la thérapie cellulaire
AU2018275894B2 (en) 2017-06-02 2025-04-24 Juno Therapeutics, Inc. Articles of manufacture and methods for treatment using adoptive cell therapy
BR112019027133B8 (pt) 2017-06-20 2022-08-09 Inst Curie Uso de uma célula imune modificada deficiente para suv39h1
CA3068286A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing regulatory immune cells and uses thereof
JP2020526194A (ja) 2017-06-29 2020-08-31 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 免疫療法薬と関連する毒性を評価するためのマウスモデル
EP3645021A4 (en) 2017-06-30 2021-04-21 Intima Bioscience, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY
GB201710835D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Antibodies
GB201710838D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc Bispecific antibodies
GB201710836D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc ROR1 Car T-Cells
SG11202000606TA (en) 2017-07-29 2020-02-27 Juno Therapeutics Inc Reagents for expanding cells expressing recombinant receptors
KR20230008269A (ko) 2017-08-07 2023-01-13 엔비이-테라퓨틱스 아게 생체 내 내성이 높은 항체 약물 결합체
KR20250016455A (ko) 2017-08-09 2025-02-03 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 유전자 조작된 세포 조성물 및 관련 조성물의 제조 방법
EP3664835B1 (en) 2017-08-09 2024-10-23 Juno Therapeutics, Inc. Methods and compositions for preparing genetically engineered cells
US12398191B2 (en) 2017-08-11 2025-08-26 Fred Hutchinson Cancer Center BRAF-specific TCRs and uses thereof
WO2019046832A1 (en) 2017-09-01 2019-03-07 Juno Therapeutics, Inc. GENE EXPRESSION AND EVALUATION OF RISK OF DEVELOPMENT OF TOXICITY FOLLOWING CELL THERAPY
EP3678689A1 (en) 2017-09-06 2020-07-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Strep-tag specific binding proteins and uses thereof
CN111051349A (zh) 2017-09-06 2020-04-21 弗雷德哈钦森癌症研究中心 Strep-tag特异性嵌合受体及其用途
US12350312B2 (en) * 2017-09-06 2025-07-08 Fred Hutchinson Cancer Center Methods for improving adoptive cell therapy
MA50079A (fr) 2017-09-07 2020-07-15 Juno Therapeutics Inc Procédés d'identification de caractéristiques cellulaires relatives à des réponses associées à une thérapie cellulaire
CN109517820B (zh) 2017-09-20 2021-09-24 北京宇繁生物科技有限公司 一种靶向HPK1的gRNA以及HPK1基因编辑方法
CN107641615A (zh) * 2017-09-22 2018-01-30 苏州大学 一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法
EP4714966A2 (en) 2017-09-26 2026-03-25 Cero Therapeutics Holdings, Inc. Chimeric engulfment receptor molecules and methods of use
JP2020537515A (ja) 2017-10-03 2020-12-24 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｈｐｖ特異的結合分子
JP2021500878A (ja) 2017-10-12 2021-01-14 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 免疫療法のためのｔ細胞受容体
CN107759699A (zh) * 2017-10-18 2018-03-06 银丰生物工程集团有限公司 靶向cd30抗原的转基因t细胞及其制备方法与应用
AU2018351050B2 (en) 2017-10-18 2025-09-18 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
US11771718B2 (en) 2017-10-18 2023-10-03 Precigen, Inc. Polypeptide compositions comprising spacers
US20210069241A1 (en) 2017-10-20 2021-03-11 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods of immunotherapy targeting tigit and/or cd112r or comprising cd226 overexpression
SG11202003501XA (en) 2017-11-01 2020-05-28 Juno Therapeutics Inc Antibodies and chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
WO2019089858A2 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Methods of assessing or monitoring a response to a cell therapy
US12258580B2 (en) 2017-11-01 2025-03-25 Juno Therapeutics, Inc. Process for generating therapeutic compositions of engineered cells
WO2019089884A2 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Editas Medicine, Inc. Methods, compositions and components for crispr-cas9 editing of tgfbr2 in t cells for immunotherapy
US11851679B2 (en) 2017-11-01 2023-12-26 Juno Therapeutics, Inc. Method of assessing activity of recombinant antigen receptors
PT3703750T (pt) * 2017-11-01 2025-01-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recetores de antigénio quimérico específicos para o antigénio de maturação das células b e polinucleótidos codificantes
US11564946B2 (en) 2017-11-01 2023-01-31 Juno Therapeutics, Inc. Methods associated with tumor burden for assessing response to a cell therapy
EP3704229B1 (en) 2017-11-01 2023-12-20 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing a t cell composition
EP3703711A4 (en) * 2017-11-03 2021-01-13 Lentigen Technology, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF CANCER WITH ANTI-MMR1 IMMUNOTHERAPY
MX2020004568A (es) 2017-11-06 2020-10-05 Juno Therapeutics Inc Combinación de una terapia celular y un inhibidor de gamma secretasa.
EP3707258A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Editas Medicine, Inc. Methods, compositions and components for crispr-cas9 editing of cblb in t cells for immunotherapy
CN111315405A (zh) * 2017-11-09 2020-06-19 免疫医疗有限责任公司 双特异性融合多肽及其使用方法
JP2021502094A (ja) 2017-11-10 2021-01-28 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 閉鎖系極低温容器
CN111683962B (zh) * 2017-11-10 2025-05-16 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向肿瘤抗原的嵌合抗原受体
US11649294B2 (en) 2017-11-14 2023-05-16 GC Cell Corporation Anti-HER2 antibody or antigen-binding fragment thereof, and chimeric antigen receptor comprising same
KR102774451B1 (ko) * 2017-11-14 2025-02-28 앱클론(주) 항-her2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체
MA51210A (fr) 2017-12-01 2020-10-07 Juno Therapeutics Inc Procédés de dosage et de modulation de cellules génétiquement modifiées
US20220267403A1 (en) 2017-12-01 2022-08-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Binding proteins specific for 5t4 and uses thereof
US12161670B2 (en) 2017-12-08 2024-12-10 Juno Therapeutics, Inc. Phenotypic markers for cell therapy and related methods
MX2020005907A (es) 2017-12-08 2020-10-19 Juno Therapeutics Inc Formulacion de medio libre de suero para cultivar celulas y metodos de uso de la misma.
CN119193493A (zh) 2017-12-08 2024-12-27 朱诺治疗学股份有限公司 生产工程化t细胞组合物的过程
MA51184A (fr) 2017-12-15 2020-10-21 Juno Therapeutics Inc Molécules de liaison à l'anti-cct5 et procédés d'utilisation associés
US12570958B2 (en) * 2017-12-22 2026-03-10 Cell Design Labs, Inc. Single- and multi-chain chimeric antigen receptors
CN109971837A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 上海细胞治疗研究院 一种外源抗体基因拷贝数的检测方法和试剂盒
US12539308B2 (en) 2018-01-08 2026-02-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immune-enhancing RNAs for combination with chimeric antigen receptor therapy
WO2019139972A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Board Of Regents, The University Of Texas System T cell receptors for immunotherapy
WO2019140278A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting core binding factor antigens
US11311576B2 (en) 2018-01-22 2022-04-26 Seattle Children's Hospital Methods of use for CAR T cells
JP2021511802A (ja) 2018-01-31 2021-05-13 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 複製可能ウイルスの存在または非存在を評価するための方法および試薬
JP7383620B2 (ja) 2018-01-31 2023-11-20 セルジーン コーポレイション 養子細胞療法およびチェックポイント阻害剤を使用する併用療法
US12312416B2 (en) * 2018-02-06 2025-05-27 Seattle Children's Hospital Fluorescein-specific cars exhibiting optimal t cell function against FL-PLE labelled tumors
AU2019218397A1 (en) 2018-02-12 2020-10-01 Fred Hutchinson Cancer Center Cyclin A1 specific T cell receptors and uses thereof
AU2019225174B2 (en) 2018-02-23 2025-11-20 Endocyte, Inc. Sequencing method for CAR T cell therapy
AU2019224051A1 (en) 2018-02-26 2020-09-03 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
EP3762012A1 (en) 2018-03-09 2021-01-13 Ospedale San Raffaele S.r.l. Il-1 antagonist and toxicity induced by cell therapy
EP3765041A4 (en) 2018-03-14 2021-12-22 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) IL-13 CHIMERIC RECEPTOR ALPHA 2 (IL13RA2) ANTIGEN RECEPTOR FOR T-CELL T-CELL IMMUNOTHERAPY
EA202091984A1 (ru) 2018-03-14 2021-02-18 Сиэтл Чилдрен'С Хоспитал (Дба Сиэтл Чилдрен'С Ресёрч Инститьют) Направленная дзетакинами т-клеточная иммунотерапия, нацеленная на рецептор il-13 альфа 2
US10751399B2 (en) * 2018-03-20 2020-08-25 Cho Pharma Usa, Inc. Chimeric antigen receptors that bind to SSEA4 and uses thereof
EP3774906A1 (en) 2018-03-28 2021-02-17 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric tim4 receptors and uses thereof
WO2019191332A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric engulfment receptors and uses thereof for neurodegenerative diseases
MX2020010241A (es) 2018-03-28 2020-10-16 Cero Therapeutics Inc Composiciones de inmunoterapia celular y usos de las mismas.
CA3093969A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Cero Therapeutics, Inc. Expression vectors for chimeric engulfment receptors, genetically modified host cells, and uses thereof
MA52207A (fr) 2018-04-05 2021-02-17 Editas Medicine Inc Lymphocytes t exprimant un récepteur recombinant, polynucléotides et procédés associés
CA3094468A1 (en) 2018-04-05 2019-10-10 Juno Therapeutics, Inc. Methods of producing cells expressing a recombinant receptor and related compositions
EP3773908A1 (en) 2018-04-05 2021-02-17 Juno Therapeutics, Inc. T cell receptors and engineered cells expressing same
WO2019200347A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for adoptive cell therapy targeting ror1
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3788369A1 (en) 2018-05-01 2021-03-10 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
KR20210044736A (ko) 2018-05-03 2021-04-23 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 키메라 항원 수용체(ｃａｒ) ｔ세포 요법과 키나제 억제제의 조합요법
EP3801769A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Novartis AG Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
CN108441505B (zh) * 2018-05-28 2023-07-07 上海恒润达生生物科技股份有限公司 一种靶向ror1的嵌合抗原受体及其用途
US20210223248A1 (en) 2018-06-01 2021-07-22 Fred Hutchinson Cancer Research Center Biomarkers, uses thereof for selecting immunotherapy intervention, and immunotherapy methods
WO2019237035A1 (en) 2018-06-08 2019-12-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
TWI890660B (zh) 2018-06-13 2025-07-21 瑞士商諾華公司 Bcma 嵌合抗原受體及其用途
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020018964A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors
US12516099B2 (en) 2018-08-09 2026-01-06 Juno Therapeutics, Inc. Processes for generating engineered cells and compositions thereof
CN112805378A (zh) 2018-08-09 2021-05-14 朱诺治疗学股份有限公司 用于评估整合核酸的方法
EP3834833A4 (en) * 2018-08-10 2022-05-18 Eutilex Co., Ltd. CANCER ANTIGEN-SPECIFIC CYTOTOXIC T-CELLS
CN113039206A (zh) * 2018-08-31 2021-06-25 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 包含b7h3嵌合抗原受体的方法和组合物
MX2021002316A (es) 2018-08-31 2021-07-15 Invectys SA Receptores de antígeno quimérico frente a múltiples isoformas de hla-g.
SG11202102108QA (en) 2018-09-11 2021-04-29 Juno Therapeutics Inc Methods for mass spectrometry analysis of engineered cell compositions
WO2020056170A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Fred Hutchinson Cancer Research Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
US20240165232A1 (en) 2018-09-24 2024-05-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Chimeric receptor proteins and uses thereof
NL2021789B1 (en) 2018-10-10 2020-05-14 Academisch Ziekenhuis Leiden Binding proteins specific for HA-1H and uses thereof
US20220002674A1 (en) * 2018-10-31 2022-01-06 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. T cells with suicide switch
SG11202104355SA (en) 2018-10-31 2021-05-28 Juno Therapeutics Gmbh Methods for selection and stimulation of cells and apparatus for same
MA54078A (fr) 2018-11-01 2021-09-15 Juno Therapeutics Inc Méthodes pour le traitement au moyen de récepteurs antigéniques chimériques spécifiques de l'antigene de maturation des lymphocytes b
EP3873937A2 (en) * 2018-11-01 2021-09-08 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for g protein-coupled receptor class c group 5 member d (gprc5d)
ES2968737T3 (es) 2018-11-06 2024-05-13 Juno Therapeutics Inc Proceso para producir células T manipuladas genéticamente
CA3117978A1 (en) 2018-11-08 2020-05-14 Juno Therapeutics, Inc. Methods and combinations for treatment and t cell modulation
IL283218B2 (en) 2018-11-16 2025-11-01 Juno Therapeutics Inc Dosing methods of engineered T cells for the treatment of malignant B cells
WO2020102779A1 (en) 2018-11-16 2020-05-22 Albert Einstein College Of Medicine MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST IgV DOMAIN OF B7-H3 AND USES THEREOF
EP3883955A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 Board of Regents, The University of Texas System A modular, polycistronic vector for car and tcr transduction
CA3120563A1 (en) 2018-11-26 2020-06-04 Nkarta, Inc. Methods for the simultaneous expansion of multiple immune cell types, related compositions and uses of same in cancer immunotherapy
MX2021006208A (es) 2018-11-28 2021-10-01 Univ Texas Edición por multiplexación del genoma de células inmunitarias para mejorar la funcionalidad y resistencia al entorno supresor.
MX2021006393A (es) 2018-11-29 2021-10-13 Univ Texas Metodos para expansion ex vivo de celulas exterminadoras naturales y uso de las mismas.
CN113692285A (zh) 2018-11-30 2021-11-23 朱诺治疗学股份有限公司 在过继细胞疗法中给药和治疗b细胞恶性肿瘤的方法
PT3886875T (pt) 2018-11-30 2024-06-27 Juno Therapeutics Inc Métodos para tratamento utilizando terapia celular adotiva
EP4219688B1 (en) * 2018-12-19 2026-01-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Mucosal-associated invariant t (mait) cells expressing chimeric antigen receptors
KR20210106437A (ko) 2018-12-20 2021-08-30 노파르티스 아게 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체를 포함하는 투약 요법 및 약학적 조합물
MX2021008739A (es) 2019-01-24 2021-10-13 Valorisation Hsj Lp Secuencias reguladoras de la transcripción específicas de células y usos de estas.
SG11202107976SA (en) 2019-01-29 2021-08-30 Juno Therapeutics Inc Antibodies and chimeric antigen receptors specific for receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1 (ror1)
CN113490528B (zh) 2019-02-15 2024-12-03 诺华股份有限公司 3-(1-氧代-5-(哌啶-4-基)异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
CA3123519A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
CN114026116A (zh) 2019-02-20 2022-02-08 弗雷德哈钦森癌症研究中心 Ras新抗原特异性结合蛋白及其用途
EP3773918A4 (en) 2019-03-05 2022-01-05 Nkarta, Inc. CD19 DIRECTED CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND THEIR USES IN IMMUNOTHERAPY
CA3136742A1 (en) 2019-05-01 2020-11-05 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified cd247 locus, related polynucleotides and methods
WO2020223535A1 (en) 2019-05-01 2020-11-05 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a recombinant receptor from a modified tgfbr2 locus, related polynucleotides and methods
CN114450395A (zh) 2019-05-16 2022-05-06 华盛顿大学 Lockr介导的car t细胞募集
JP7489407B2 (ja) 2019-05-21 2024-05-23 ノバルティス アーゲー Ｃｄ１９結合分子及びその使用
CN114207136A (zh) 2019-06-07 2022-03-18 朱诺治疗学股份有限公司 自动化t细胞培养
KR20220034782A (ko) 2019-06-12 2022-03-18 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 세포 매개 세포 독성 요법 및 친생존 ｂｃｌ2 패밀리 단백질 억제제의 병용 요법
WO2020254591A1 (en) * 2019-06-19 2020-12-24 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Ultramodular igg3-based spacer domain and multi-function site for implementation in chimeric antigen receptor design
SG11202111943UA (en) 2019-07-02 2021-11-29 Hutchinson Fred Cancer Res Recombinant ad35 vectors and related gene therapy improvements
KR20220038399A (ko) * 2019-07-23 2022-03-28 웬 양 차용 면역치료법을 위한 조성물 및 방법
BR112022001148A2 (pt) * 2019-07-23 2022-03-15 Inst Nat Sante Rech Med Células imunes modificadas, composição farmacêutica, kit, uso de uma célula imune modificada e invenção de produto
CN114555112A (zh) 2019-08-22 2022-05-27 朱诺治疗学股份有限公司 T细胞疗法和zeste增强子同源物2(ezh2)抑制剂的组合疗法及相关方法
KR20220073738A (ko) 2019-08-30 2022-06-03 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 세포 분류를 위한 기계 학습 방법
JP7711045B2 (ja) 2019-09-02 2025-07-22 アンスティテュ・クリー 腫瘍ネオアンチゲンペプチドを標的とする免疫療法
WO2021050601A1 (en) 2019-09-09 2021-03-18 Scribe Therapeutics Inc. Compositions and methods for use in immunotherapy
CN114829402B (zh) * 2019-09-27 2024-11-05 南京艾美斐生物医药科技有限公司 抗ror1抗体及其制备方法与应用
EP4038097A1 (en) 2019-10-03 2022-08-10 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric tim4 receptors and uses thereof
WO2021078910A1 (en) 2019-10-22 2021-04-29 Institut Curie Immunotherapy targeting tumor neoantigenic peptides
KR20220101641A (ko) 2019-10-30 2022-07-19 주노 테라퓨틱스 게엠베하 세포 선택 및/또는 자극 장치 및 사용 방법
JP2022554348A (ja) 2019-11-05 2022-12-28 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 治療用ｔ細胞組成物の属性を決定する方法
IL292667B1 (en) 2019-11-07 2026-02-01 Juno Therapeutics Inc Combination of T-cell therapy and (s)-3-[4-(4-morpholin-4-ylmethyl-benzyloxy)-l-oxo-3,l-dihydro-isoindol-2-yl]-piperidine-6,2-dione
IL293215A (en) 2019-11-26 2022-07-01 Novartis Ag Chimeric antigen receptors that bind bcma and cd19 and their uses
EP4065157A1 (en) 2019-11-26 2022-10-05 Novartis AG Cd19 and cd22 chimeric antigen receptors and uses thereof
EP4069742A1 (en) 2019-12-06 2022-10-12 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to gprc5d-targeted binding domains and related compositions and methods
CN115916817A (zh) 2019-12-06 2023-04-04 朱诺治疗学股份有限公司 针对bcma靶向结合结构域的抗独特型抗体及相关组合物和方法
MX2022006715A (es) 2019-12-06 2022-09-23 Juno Therapeutics Inc Metodos relacionados con toxicidad y respuesta asociada con terapia celular para tratar neoplasias malignas de celulas b.
BR112022011902A2 (pt) 2019-12-20 2022-09-06 Novartis Ag Terapias de combinação
EP4093433A1 (en) 2020-01-24 2022-11-30 Juno Therapeutics, Inc. Methods for dosing and treatment of follicular lymphoma and marginal zone lymphoma in adoptive cell therapy
JP2023512209A (ja) 2020-01-28 2023-03-24 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｔ細胞形質導入のための方法
CN115210252A (zh) 2020-02-04 2022-10-18 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 抗二硝基苯酚的嵌合抗原受体
IL295381B1 (en) 2020-02-12 2026-04-01 Juno Therapeutics Inc BCMA-directed chimeric T-cell antigen receptor compounds and methods and uses thereof
IL295384B1 (en) 2020-02-12 2026-04-01 Juno Therapeutics Inc T-cell preparations with chimeric antigen receptor directed against CD19 and methods and uses thereof
CA3168337A1 (en) 2020-02-17 2021-08-26 Marie-Andree Forget Methods for expansion of tumor infiltrating lymphocytes and use thereof
EP4110823A1 (en) 2020-02-26 2023-01-04 A2 Biotherapeutics, Inc. Polypeptides targeting mage-a3 peptide-mhc complexes and methods of use thereof
CA3175123A1 (en) * 2020-03-12 2021-09-16 City Of Hope Targeted chimeric antigen receptor modified t cells for treatment of il13r.alpha.2 positive malignancies
CN113402612A (zh) 2020-03-17 2021-09-17 西比曼生物科技（香港）有限公司 靶向cd19和cd20的联合嵌合抗原受体及其应用
JP2023522857A (ja) 2020-04-10 2023-06-01 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｂ細胞成熟抗原を標的とするキメラ抗原受容体によって操作された細胞療法に関する方法および使用
CA3172092A1 (en) * 2020-04-23 2021-10-28 David Cheresh Compositions and methods for treating cancer
CA3158133A1 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells
US20230165872A1 (en) 2020-04-28 2023-06-01 Juno Therapeutics, Inc. Combination of bcma-directed t cell therapy and an immunomodulatory compound
US20230212243A1 (en) 2020-05-12 2023-07-06 Institut Curie Neoantigenic Epitopes Associated with SF3B1 Mutations
BR112022022953A2 (pt) * 2020-05-12 2023-03-21 Lyell Immunopharma Inc Espaçadores de receptores de antígenos quiméricos
KR20230024283A (ko) 2020-05-13 2023-02-20 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 임상 반응과 관련된 특징을 식별하는 방법 및 이의 용도
CN115835873A (zh) 2020-05-13 2023-03-21 朱诺治疗学股份有限公司 用于产生表达重组受体的供体分批细胞的方法
AU2021275239A1 (en) 2020-05-21 2022-12-15 Board Of Regents, The University Of Texas System T cell receptors with VGLL1 specificity and uses thereof
EP4153635A4 (en) * 2020-05-22 2024-06-26 GC Cell Corporation ANTI-HER2 ANTIBODY OR ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF, AND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR COMPRISING SAME
JP2023529211A (ja) 2020-06-11 2023-07-07 ノバルティス アーゲー Ｚｂｔｂ３２阻害剤及びその使用
KR20230027056A (ko) 2020-06-23 2023-02-27 노파르티스 아게 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체를 포함하는 투약 요법
JP2023531531A (ja) 2020-06-26 2023-07-24 ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー 組換え受容体を条件付きで発現する操作されたｔ細胞、関連ポリヌクレオチド、および方法
JP2023535371A (ja) 2020-07-17 2023-08-17 シミュレックス インコーポレイテッド 免疫抑制シグナル伝達をリダイレクトするためのキメラＭｙＤ８８受容体ならびに関連する組成物および方法
EP4188395A1 (en) 2020-07-30 2023-06-07 Institut Curie Immune cells defective for socs1
JP7819176B2 (ja) 2020-08-03 2026-02-24 ノバルティス アーゲー ヘテロアリール置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
EP4192868A1 (en) 2020-08-05 2023-06-14 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to ror1-targeted binding domains and related compositions and methods
WO2022036287A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Cero Therapeutics, Inc. Anti-cd72 chimeric receptors and uses thereof
WO2022036265A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric tim receptors and uses thereof
WO2022036285A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Cero Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating cancer with chimeric tim receptors in combination with inhibitors of poly (adp-ribose) polymerase
WO2022036458A1 (en) 2020-08-21 2022-02-24 12343096 Canada Inc. Modular assembly receptors and uses thereof
CN112111014A (zh) * 2020-09-22 2020-12-22 廖文强 一种抗氧化嵌合型抗原受体和免疫细胞
WO2022066973A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting pbk or oip5 antigens
CN116724053A (zh) 2020-09-24 2023-09-08 弗雷德哈钦森癌症中心 靶向sox2抗原的免疫治疗
NL2026614B1 (en) 2020-10-02 2022-06-03 Academisch Ziekenhuis Leiden T cell receptors directed against bob1 and uses thereof
WO2022076353A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for treating mage-a1-expressing disease
KR20230112632A (ko) 2020-10-23 2023-07-27 애셔 바이오테라퓨틱스, 인크. 면역 세포 기능을 조절하기 위한 cd8 항원 결합 분자와의 융합
EP4240756A1 (en) 2020-11-04 2023-09-13 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods
WO2022098797A1 (en) * 2020-11-04 2022-05-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Therapeutic targeting of mesothelin in acute myeloid leukemia with chimeric antigen receptor t cell therapy
IL302412A (en) 2020-11-06 2023-06-01 Novartis Ag Anti-CD19 and B-cell targeting agent combination therapy for the treatment of B-cell malignancies
EP4243839A1 (en) 2020-11-13 2023-09-20 Catamaran Bio, Inc. Genetically modified natural killer cells and methods of use thereof
EP4247856A4 (en) * 2020-11-18 2024-10-30 Carina Biotech Pty Ltd CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T CELL AND METHODS
KR20230118887A (ko) 2020-12-03 2023-08-14 센츄리 쎄라퓨틱스 인코포레이티드 유전자 조작 세포 및 이의 용도
CN116981685A (zh) * 2020-12-03 2023-10-31 世纪治疗股份有限公司 基因工程化细胞及其用途
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
CN112481284B (zh) * 2020-12-07 2023-07-25 深圳瑞吉生物科技有限公司 一种编码CAR基因的mRNA、组合mRNA、构建方法、CAR-T细胞和应用
JP2023552810A (ja) * 2020-12-08 2023-12-19 シアトル チルドレンズ ホスピタル （ディービーエイ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート） 抗ｅｇｆｒキメラ抗原受容体
WO2022132836A2 (en) 2020-12-14 2022-06-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2022132985A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Juno Therapeutics, Inc. Threshold gating for flow cytometry methods
WO2022133030A1 (en) 2020-12-16 2022-06-23 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a cell therapy and a bcl2 inhibitor
MX2023008081A (es) 2021-01-11 2023-09-12 Sana Biotechnology Inc Uso de vectores virales dirigidos a cd8.
US12144827B2 (en) 2021-02-25 2024-11-19 Lyell Immunopharma, Inc. ROR1 targeting chimeric antigen receptor
AU2022227021A1 (en) 2021-02-26 2023-09-21 Kelonia Therapeutics, Inc. Lymphocyte targeted lentiviral vectors
CN117693508A (zh) 2021-03-03 2024-03-12 朱诺治疗学股份有限公司 T细胞疗法和dgk抑制剂的组合
AU2022233019A1 (en) 2021-03-11 2023-09-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Tumor neoantigenic peptides
US20250352577A1 (en) 2021-03-11 2025-11-20 Mnemo Therapeutics Tumor neoantigenic peptides and uses thereof
KR20240006721A (ko) 2021-03-11 2024-01-15 엥스띠뛰 퀴리 막 형질 전환 네오 안티젠 펩타이드
AU2022241654A1 (en) 2021-03-22 2023-09-28 Juno Therapeutics, Inc. Methods of determining potency of a therapeutic cell composition
CN117321200A (zh) 2021-03-22 2023-12-29 朱诺治疗学股份有限公司 评估病毒载体颗粒效力的方法
MX2023011370A (es) 2021-03-29 2023-11-24 Juno Therapeutics Inc Combinacion de una terapia con celulas t con receptores de antigenos quimericos (car) y un compuesto inmunomodulador para el tratamiento de linfoma.
CN117858719A (zh) 2021-03-29 2024-04-09 朱诺治疗学股份有限公司 使用检查点抑制剂疗法和car t细胞疗法的组合进行给药和治疗的方法
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
JP2024517413A (ja) 2021-04-16 2024-04-22 セルジーン コーポレーション 以前に幹細胞移植を受けた患者におけるｔ細胞療法
CN118201618A (zh) 2021-04-16 2024-06-14 细胞基因公司 与bcma定向t细胞疗法的组合疗法
CA3217028A1 (en) 2021-04-22 2022-10-27 Baylor College Of Medicine Methods of engineering immune cells having reduced fratricidal activity
CN113735978B (zh) * 2021-04-22 2023-06-30 河北森朗生物科技有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体、制备方法及其应用
JP2024517863A (ja) 2021-05-06 2024-04-23 ジュノ・セラピューティクス・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング 細胞を刺激し、形質導入する方法
TW202317602A (zh) 2021-07-15 2023-05-01 福瑞德哈金森腫瘤中心 嵌合多肽
EP4376874B1 (en) 2021-07-28 2026-03-04 Cero Therapeutics Holdings, Inc. Chimeric tim4 receptors and uses thereof
IL310550A (en) 2021-08-04 2024-03-01 Univ Colorado Regents LAT-activating chimeric antigen receptor T cells and methods of using them
EP4381081A1 (en) 2021-08-04 2024-06-12 Sana Biotechnology, Inc. Use of cd4-targeted viral vectors
AU2022330106A1 (en) 2021-08-16 2024-03-21 Hemogenyx Pharmaceuticals Llc Anti-flt3 antibodies, cars, car t cells and methods of use
EP4722239A2 (en) * 2021-08-20 2026-04-08 Christopher E. Rudd Compositions and methods for anti-virus chimeric antigen receptor
JP2024537991A (ja) 2021-10-14 2024-10-18 アーセナル バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 共発現されるｓｈＲＮＡと論理ゲートシステムとを有する免疫細胞
IL312204A (en) * 2021-10-28 2024-06-01 Lyell Immunopharma Inc Methods for culturing cells expressing ror1-binding protein
US20260083848A1 (en) 2021-11-03 2026-03-26 Viracta Therapeutics, Inc. Combination of car t-cell therapy with btk inhibitors and methods of use thereof
KR20240112994A (ko) 2021-11-03 2024-07-19 셀진 코포레이션 골수종을 치료하는 데 사용하기 위한 b-세포 성숙 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체
EP4444874A1 (en) 2021-12-09 2024-10-16 Zygosity Limited Vector
WO2023115041A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae attachment glycoproteins
US20250059239A1 (en) 2021-12-17 2025-02-20 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae fusion glycoproteins
JP2025501272A (ja) 2021-12-28 2025-01-17 ムネモ・セラピューティクス 不活性化されたｓｕｖ３９ｈ１及び改変ｔｃｒを有する免疫細胞
WO2023139269A1 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Mnemo Therapeutics Modulation of suv39h1 expression by rnas
KR20240137075A (ko) 2022-01-28 2024-09-19 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 세포 조성물의 제조 방법
EP4472646A1 (en) 2022-02-01 2024-12-11 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
US20250144211A1 (en) * 2022-02-07 2025-05-08 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Recombinant proteins that stimulate an immune response in the presence of naturally inhibitory ligand binding
NL2030990B1 (en) 2022-02-17 2023-09-01 Academisch Ziekenhuis Leiden T cell receptors directed against jchain and uses thereof
EP4479143A1 (en) 2022-02-18 2024-12-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Use of tcr-deficient car-tregs in combination with anti-tcr complex monoclonal antibodies for inducing durable tolerance
IL314801A (en) 2022-02-22 2024-10-01 Juno Therapeutics Inc Proteinase 3 (PR3) Chimeric Autoantigen Receptor T Cells and Related Methods and Uses
NL2031118B1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Academisch Ziekenhuis Leiden T cell receptors directed against transcription factor wt1 and uses thereof
US20250195573A1 (en) 2022-03-18 2025-06-19 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Genetically engineered t-cell co-receptors and methods of use thereof
US20250302930A1 (en) 2022-03-24 2025-10-02 Institut Curie Immunotherapy targeting tumor transposable element derived neoantigenic peptides in glioblastoma
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
WO2023196921A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Granzyme expressing t cells and methods of use
US20250304913A1 (en) 2022-04-06 2025-10-02 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Chimeric antigen receptor t cells and methods of use thereof
EP4514382A1 (en) 2022-04-28 2025-03-05 Musc Foundation for Research Development Chimeric antigen receptor modified regulatory t cells for treating cancer
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
US20250297282A1 (en) 2022-05-05 2025-09-25 Juno Therapeutics Gmbh Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
US20250295771A1 (en) 2022-05-11 2025-09-25 Celgene Corporation Methods and uses related to t cell therapy and production of same
WO2023220655A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Celgene Corporation Methods to overcome drug resistance by re-sensitizing cancer cells to treatment with a prior therapy via treatment with a t cell therapy
WO2023225569A1 (en) 2022-05-17 2023-11-23 Umoja Biopharma, Inc. Manufacturing viral particles
EP4279085A1 (en) 2022-05-20 2023-11-22 Mnemo Therapeutics Compositions and methods for treating a refractory or relapsed cancer or a chronic infectious disease
US20250345432A1 (en) 2022-05-25 2025-11-13 Celgene Corporation Method for predicting response to a t cell therapy
EP4532695A1 (en) 2022-05-25 2025-04-09 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies
US20250319130A1 (en) * 2022-06-01 2025-10-16 Seattle Children’s Hospital d/b/a Seattle Children’s Research Institute Recombinant receptors binding b cell activation factor receptor and uses thereof
WO2023237663A1 (en) 2022-06-09 2023-12-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Use of the f359l missense irf4 variant for increasing the stability of regulatory t cells
NL2032130B1 (en) 2022-06-10 2023-12-18 Academisch Ziekenhuis Leiden T cell receptors directed against melanoma-associated antigen and uses thereof
EP4543923A1 (en) 2022-06-22 2025-04-30 Juno Therapeutics, Inc. Treatment methods for second line therapy of cd19-targeted car t cells
EP4547230A1 (en) 2022-06-29 2025-05-07 Juno Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
JP2025525937A (ja) 2022-08-05 2025-08-07 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｇｐｒｃ５ｄおよびｂｃｍａに特異的なキメラ抗原受容体
WO2024044779A2 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for delta-like ligand 3 (dll3)
EP4580658A1 (en) 2022-08-31 2025-07-09 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to generate more efficient car-t cells
EP4583876A1 (en) 2022-09-08 2025-07-16 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a t cell therapy and continuous or intermittent dgk inhibitor dosing
WO2024062138A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Mnemo Therapeutics Immune cells comprising a modified suv39h1 gene
EP4598565A1 (en) 2022-10-07 2025-08-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to generate improving car-t cells
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells
WO2024097905A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 Celgene Corporation Methods of treatment with t cell therapy and immunomodulatory agent maintenance therapy
CN120152991A (zh) 2022-11-03 2025-06-13 南京蓬勃生物科技有限公司 靶向人源ror1的单域抗体
TW202434735A (zh) 2022-11-04 2024-09-01 美商烏莫賈生物製藥股份有限公司 展示黏著分子融合的顆粒
KR20250121163A (ko) 2022-11-04 2025-08-11 우모자 바이오파마 인코포레이티드 융합 분자를 디스플레이하는 렌티바이러스 입자 및 이의 용도
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells
NL2033510B1 (en) 2022-11-11 2024-05-28 Academisch Ziekenhuis Leiden T cell receptors directed against cancer-associated antigens and uses thereof
WO2024102948A1 (en) 2022-11-11 2024-05-16 Celgene Corporation Fc receptor-homolog 5 (fcrh5) specific binding molecules and bispecific t-cell engaging antibodies including same and related methods
CN115725001A (zh) * 2022-12-08 2023-03-03 湖南光琇高新生命科技有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体、核酸、重组载体及car-t细胞
WO2024124132A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Juno Therapeutics, Inc. Machine learning methods for predicting cell phenotype using holographic imaging
KR20250135354A (ko) 2022-12-13 2025-09-12 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Baff-r 및 cd19에 특이적인 키메라 항원 수용체 및 그의 방법 및 용도
EP4634216A1 (en) 2022-12-16 2025-10-22 Repertoire Immune Medicines, Inc. T cell receptors binding hpv-16 epitopes
WO2024145599A1 (en) * 2022-12-29 2024-07-04 Kelonia Therapeutics, Inc. Recombinant retrovirus, compositions, and methods of use
KR20250127134A (ko) 2022-12-29 2025-08-26 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤 조작된 자연 살상 세포 및 관련 방법
JP2026504491A (ja) 2023-02-03 2026-02-05 ツェー３エス２ ゲーエムベーハー 操作された免疫細胞の非ウイルス的製造のための方法
CN121127253A (zh) 2023-02-28 2025-12-12 朱诺治疗学股份有限公司 治疗系统性自身免疫性疾病的细胞疗法
IL322949A (en) 2023-03-03 2025-10-01 Arsenal Biosciences Inc Systems targeting PSMA and CA9
IL322838A (en) 2023-03-13 2025-10-01 Arsenal Biosciences Inc Synthetic pathway operators
KR20250131823A (ko) 2023-03-31 2025-09-03 아벨제타 인크. Cd20 및 bcma를 표적화하는 이중특이적 키메라 항원 수용체
WO2024215987A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Sotio Biotech Inc. IMMUNE CELLS FOR TREATING CANCER IN COMBINATION WITH IL-15/IL-15Rα CONJUGATES
EP4698666A1 (en) 2023-04-18 2026-02-25 Sana Biotechnology, Inc. Universal protein g fusogens and adapter systems thereof and related lipid particles and uses
WO2024220598A2 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Lentiviral vectors with two or more genomes
WO2024220560A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered protein g fusogens and related lipid particles and methods thereof
WO2024220588A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Juno Therapeutics, Inc. Cytotoxicity assay for assessing potency of therapeutic cell compositions
NL2034658B1 (en) 2023-04-21 2024-10-28 Academisch Ziekenhuis Leiden TIMP3-derived TEIPP neoantigens and uses thereof
NL2034657B1 (en) 2023-04-21 2024-10-28 Academisch Ziekenhuis Leiden RCN1-derived TEIPP neoantigens and uses thereof
AU2024260837A1 (en) 2023-04-25 2025-10-16 Arsenal Biosciences, Inc. Novel receptors for transcription regulation
WO2024226858A1 (en) 2023-04-26 2024-10-31 Juno Therapeutics, Inc. Methods for viral vector manufacturing
KR20260026101A (ko) 2023-05-23 2026-02-25 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 T 세포의 활성화 마커 및 t 세포 활성화를 평가하는 방법
PE20252789A1 (es) 2023-05-24 2025-12-22 Kumquat Biosciences Inc Compuestos heterociclicos y usos de estos
AU2024303521A1 (en) 2023-06-14 2026-01-15 Arsenal Biosciences, Inc. Non-viral cell engineering
WO2025054202A1 (en) 2023-09-05 2025-03-13 Sana Biotechnology, Inc. Method of screening a sample comprising a transgene with a unique barcode
EP4520334A1 (en) 2023-09-07 2025-03-12 Mnemo Therapeutics Methods and compositions for improving immune response
WO2025052001A1 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Mnemo Therapeutics Methods and compositions for improving immune response
WO2025059362A1 (en) 2023-09-13 2025-03-20 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapies with a cell therapy expressing a gprc5d-targeting car and related methods and uses
WO2025076472A1 (en) 2023-10-06 2025-04-10 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapies with a cell therapy expressing a gprc5d-targeting car and related methods and uses
WO2025081123A1 (en) 2023-10-12 2025-04-17 Fred Hutchinson Cancer Center Methods and compositions for improving t cell immunotherapy
WO2025082603A1 (en) 2023-10-18 2025-04-24 Institut Curie Engineered immune cells overexpressing cd74 molecule
WO2025096975A1 (en) 2023-11-02 2025-05-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods of enhancing immune cell therapies by runx2 modulation
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
CN117535324B (zh) * 2023-11-24 2025-05-23 上海恩凯细胞技术有限公司 多功能基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用
WO2025125363A1 (en) 2023-12-11 2025-06-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Host cells engineered to bypass the cd28 co-stimulation pathway and uses thereof for inducing durable immune responses under non-inflammatory conditions
WO2025147545A1 (en) 2024-01-03 2025-07-10 Juno Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids and related methods and uses
WO2025151838A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Sana Biotechnology, Inc. Safety switches to control in vitro and in vivo proliferation of cell therapy products
NL2036854B1 (en) 2024-01-22 2025-08-01 Academisch Ziekenhuis Leiden Haematopoietic-restricted Minor Histocompatibility Antigens and uses thereof
NL2036853B1 (en) 2024-01-22 2025-08-01 Academisch Ziekenhuis Leiden Haematopoietic-restricted minor histocompatibility antigens and uses thereof
WO2025163107A1 (en) 2024-02-01 2025-08-07 Institut Gustave Roussy Immune cells defective for znf217 and uses thereof
WO2025184421A1 (en) 2024-02-28 2025-09-04 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors and antibodies specific for delta-like ligand 3 (dll3) and related methods
WO2025191531A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cd19 targeting car nk cells in treating systemic lupus erythematosus and lupus nephritis
WO2025199346A1 (en) 2024-03-20 2025-09-25 Arsenal Biosciences, Inc. Antigen binding proteins that bind tmprss4 and methods of use thereof
US20250297255A1 (en) 2024-03-20 2025-09-25 Arsenal Biosciences, Inc. Systems targeting tmprss4 and slc34a2
WO2025231174A1 (en) 2024-04-30 2025-11-06 Umoja Biopharma, Inc. Manufacturing viral particles
WO2025235604A1 (en) 2024-05-08 2025-11-13 Umoja Biopharma, Inc. Fusion protein for use as immune cell engager
US20250345431A1 (en) 2024-05-10 2025-11-13 Juno Therapeutics, Inc. Genetically engineered t cells expressing a cd19 chimeric antigen receptor (car) and uses thereof for allogeneic cell therapy
US20260022170A1 (en) 2024-05-10 2026-01-22 Adaptam Therapeutics S.L Anti-siglec-9 antibodies and uses thereof
WO2025242732A1 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Pan antibodies against sars-cov-2 spike protein and uses thereof for therapeutical purposes
WO2025245381A1 (en) 2024-05-23 2025-11-27 The Trustrees Of Dartmouth College Methods and compositions for enhancing the persistence of car expressing tregs in the cns and other tissues
NL2037811B1 (en) 2024-05-29 2025-12-12 Univ Oslo Treatment for Cancer
WO2025264864A1 (en) * 2024-06-18 2025-12-26 Fred Hutchinson Cancer Center Human anti-cd45 antibodies and uses thereof
WO2026002973A1 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Host immune cells engineered to overexpress a foxk1 polypeptide
WO2026020055A2 (en) 2024-07-18 2026-01-22 Juno Therapeutics, Inc. Methods for assessing exosomes in a cell composition and related uses
WO2026020171A2 (en) * 2024-07-19 2026-01-22 Aera Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor constructs
WO2026025092A1 (en) 2024-07-26 2026-01-29 Juno Therapeutics, Inc. Synthetic promoters for t cell expression
WO2026050426A2 (en) 2024-08-28 2026-03-05 Juno Therapeutics, Inc. Cd19-directed chimeric antigen receptor cell therapy for treating autoimmune and neurological diseases
WO2026055342A1 (en) 2024-09-04 2026-03-12 Arsenal Biosciences, Inc. Synthetic pathway activators
WO2026062222A1 (en) 2024-09-20 2026-03-26 Institut Curie Novel protein isoforms and uses

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE913929A1 (en) 1990-11-13 1992-05-20 Immunex Corp Bifunctional selectable fusion genes
US5851828A (en) * 1991-03-07 1998-12-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
IE920716A1 (en) 1991-03-07 1992-09-09 Gen Hospital Corp Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
AU6953394A (en) 1993-05-21 1994-12-20 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
ATE338124T1 (de) * 2000-11-07 2006-09-15 Hope City Cd19-spezifische umgezielte immunzellen
US20030148982A1 (en) * 2001-11-13 2003-08-07 Brenner Malcolm K. Bi-spcific chimeric T cells
EP2338511A3 (en) 2004-05-14 2012-07-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Prolongation of survival of an allograft by inhibiting complement activity
US20080131415A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Riddell Stanley R Adoptive transfer of cd8 + t cell clones derived from central memory cells
WO2009097119A2 (en) 2008-01-29 2009-08-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Identification of cd8+ t cells that are cd161hi and/or il18r(alpha)hi and have rapid drug efflux capacity
EP2331566B1 (en) 2008-08-26 2015-10-07 City of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
TR201904484T4 (tr) 2009-11-03 2019-05-21 Hope City Transdüse T hücre seçimine yönelik kesik epiderimal büyüme faktörü reseptörü (EGFRt).
US9163258B2 (en) 2010-07-23 2015-10-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method for the treatment of obesity
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
US9987308B2 (en) * 2011-03-23 2018-06-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method and compositions for cellular immunotherapy
CN103917319B (zh) 2011-09-06 2017-09-08 艾默生电气公司 便携式紧凑型攻丝机
CA2861491C (en) * 2012-02-13 2020-08-25 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
CA3285826A1 (en) 2012-02-22 2026-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for generating a persisting population of t cells useful for the treatment of cancer
BR122020002986A8 (pt) 2012-08-20 2023-04-18 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Método e composições para imunoterapia celular
CN104781789B (zh) 2012-12-20 2018-06-05 三菱电机株式会社 车载装置
US9108442B2 (en) 2013-08-20 2015-08-18 Ricoh Company, Ltd. Image forming apparatus

Also Published As

Publication number Publication date
EP3824905A1 (en) 2021-05-26
HRP20251655T1 (hr) 2026-02-13
MX2020012742A (es) 2021-02-22
JP6574381B2 (ja) 2019-09-11
SI4537839T1 (sl) 2026-02-27
US20180200298A1 (en) 2018-07-19
JP2024074937A (ja) 2024-05-31
KR20150048783A (ko) 2015-05-07
CA2881981A1 (en) 2014-02-27
NZ745375A (en) 2020-09-25
ES2842102T3 (es) 2021-07-12
AU2018204209A1 (en) 2018-07-05
ES3015267T3 (en) 2025-04-30
MX2015002101A (es) 2015-07-14
HRP20210011T1 (hr) 2021-04-30
IL269270B (en) 2022-07-01
BR112015002816A8 (pt) 2023-04-18
IL237315B (en) 2022-07-01
BR122020002988A2 (sr) 2017-11-28
CN104780939B (zh) 2024-05-28
KR102362240B1 (ko) 2022-02-14
AU2018204209B2 (en) 2020-10-15
NZ745376A (en) 2020-09-25
JP2019193676A (ja) 2019-11-07
HUE070701T2 (hu) 2025-06-28
SI2884999T2 (sl) 2026-01-30
RS61345B1 (sr) 2021-02-26
SMT202100005T1 (it) 2021-05-07
DK2884999T3 (da) 2021-01-04
SI2884999T1 (sl) 2021-05-31
ES3056763T3 (en) 2026-02-24
KR20220025161A (ko) 2022-03-03
HRP20210011T4 (hr) 2026-01-16
JP2015527070A (ja) 2015-09-17
SMT202500495T1 (it) 2026-03-09
NZ745372A (en) 2020-09-25
PH12019550223A1 (en) 2024-02-19
US20150306141A1 (en) 2015-10-29
US10869889B2 (en) 2020-12-22
PL3824905T3 (pl) 2025-05-05
RU2015109631A (ru) 2016-10-10
PT4537839T (pt) 2025-12-15
US10736918B2 (en) 2020-08-11
US20240390491A1 (en) 2024-11-28
EP3824905B1 (en) 2025-01-08
NZ745374A (en) 2020-09-25
EP2884999B1 (en) 2020-11-04
KR20200089337A (ko) 2020-07-24
EP4537839A2 (en) 2025-04-16
DK2884999T4 (da) 2025-12-08
KR102135239B1 (ko) 2020-07-17
IL269270A (en) 2019-11-28
PL2884999T5 (pl) 2026-01-26
DK4537839T3 (da) 2026-01-12
HRP20250397T1 (hr) 2025-05-23
RU2019126655A (ru) 2019-11-12
SMT202500121T1 (it) 2025-05-12
FI2884999T4 (fi) 2025-12-12
SG11201501259QA (en) 2015-03-30
EP4537839B1 (en) 2025-11-26
CY1123959T1 (el) 2022-03-24
SG10201701339RA (en) 2017-03-30
RS61345B2 (sr) 2026-02-27
EP2884999A1 (en) 2015-06-24
RU2700765C2 (ru) 2019-09-19
SI3824905T1 (sl) 2025-06-30
US20200078405A1 (en) 2020-03-12
KR102264290B1 (ko) 2021-06-10
AU2021200249A1 (en) 2021-03-18
HUE053439T2 (hu) 2021-06-28
PT2884999T (pt) 2021-01-05
BR112015002816A2 (pt) 2017-11-28
IL293944A (en) 2022-08-01
RS66657B1 (sr) 2025-05-30
PL4537839T3 (pl) 2026-03-16
LT4537839T (lt) 2026-02-10
PL2884999T3 (pl) 2021-07-05
EP4706776A2 (en) 2026-03-11
DK3824905T3 (da) 2025-03-17
CA3177394A1 (en) 2014-02-27
BR122020002986A2 (sr) 2017-11-28
KR20210070402A (ko) 2021-06-14
IL237315A0 (en) 2015-04-30
FI4537839T3 (fi) 2026-01-12
US10780118B2 (en) 2020-09-22
AU2013305838A1 (en) 2015-02-26
US20210052649A1 (en) 2021-02-25
JP6997744B2 (ja) 2022-02-04
PH12015500325A1 (en) 2015-04-06
EP4537839A3 (en) 2025-07-16
JP2022033775A (ja) 2022-03-02
AU2018204209C1 (en) 2022-08-18
ES2842102T5 (en) 2026-02-17
MX380109B (es) 2025-03-12
LT3824905T (lt) 2025-04-25
HK1212205A1 (en) 2016-06-10
BR122020002988A8 (pt) 2023-04-25
PT3824905T (pt) 2025-03-21
LT2884999T (lt) 2021-04-12
MX2020012744A (es) 2021-02-22
BR122020002986A8 (pt) 2023-04-18
AU2023266352A1 (en) 2023-12-14
CN104780939A (zh) 2015-07-15
WO2014031687A1 (en) 2014-02-27
FI3824905T3 (fi) 2025-03-31
EP2884999B2 (en) 2025-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240390491A1 (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
HK40125168A (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
HK40051816B (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
HK40051816A (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
RU2822461C1 (ru) Трансгенные генетические метки и способы применения
HK1212205B (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
NZ738636A (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
NZ738636B2 (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
NZ745372B2 (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
NZ745376B2 (en) Method and compositions for cellular immunotherapy
NZ745375B2 (en) Method and compositions for cellular immunotherapy