TWI741992B - 因子ｉｘ融合蛋白以及其製備及使用方法 - Google Patents

因子ｉｘ融合蛋白以及其製備及使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供包含至少一個諸如XTEN之異源部分的因子IX(FIX)融合蛋白。本發明另外揭示製備及使用該等FIX融合蛋白之方法。

Description

因子IX融合蛋白以及其製備及使用方法 〔對以電子方式提交之序列表之參照〕
與本申請案一起提交之ASCII正文檔案(名稱：2159_466PC03_SeqListing_ST25.txt；大小：688,114位元組；且創建日期：2016年8月2日)中以電子方式提交之序列表之內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明關於因子IX融合蛋白以及其製備及使用方法。
B型血友病(亦稱為克里斯馬斯病(Christmas disease))係世界上最常見的一種遺傳性出血病症。其導致活體內及活體外血液凝結活性降低且需要受影響個體終生進行廣泛醫學監測。在不存在干預情況下，患病個體將經受自發性關節出血，由此產生嚴重疼痛且逐漸衰弱而行動不便；肌肉內出血導致血液在該等組織中累積；咽喉及頸部自發性出血若不立即治療，則會引起窒息；腎出血；且 在手術、微小意外損傷或拔牙之後嚴重出血亦相當普遍。
正常活體內血液凝固最少需要絲胺酸蛋白酶因子II(凝血酶原(prothrombin))、因子VII、因子IX、因子X及因子XI(可溶血漿蛋白)；輔因子，包括跨膜蛋白組織因子及血漿蛋白因子V及因子VIII；纖維蛋白原、轉麩醯胺酶(transglutaminase)因子XIII、磷脂(包括活性血小板)及鈣。一些活體外凝結測試需要包括血管舒素、高分子量激肽原及因子XII在內之其他蛋白質，且其可在病理條件下在活體內起作用。
就血友病而言，血液凝結由於缺乏某些血漿血液凝結因子而受到干擾。B型血友病係由因子IX(FIX)之缺乏引起，因子IX之缺乏可由FIX蛋白合成減少或不存在，或者活性降低之缺陷分子導致。血友病係藉由用高度富含FIX之外源性因子濃縮物替代缺失之凝血因子進行治療。然而，如下所述，自血液產生此類濃縮物存在技術難題。
自血漿純化FIX(血漿源性FIX；pdFIX)幾乎僅得到全-γ-羧基化之FIX。然而，此種自血漿純化FIX極為困難，因為FIX僅以低濃度存在於血漿中(5μg/mL)。Andersson,Thrombosis Research 7：451459(1975)。另外，自血液進行純化需要將諸如HIV及HCV之感染源移除或去活。此外，pdFIX之半衰期短且因此需要頻繁給藥。重組因子IX(rFIX)亦為可用的，但與pdFIX一樣，其半衰期短且需要頻繁給藥(例如就預防而言，每週2-3 次)。
死亡率降低、關節損傷之預防及生活品質之改善係由開發血漿源性FIX及重組FIX帶來的重要成就。長期防止出血將代表治療B型血友病受試者之另一關鍵進步。因此，仍需要具有較長半衰期，同時保持有效活性的改良之重組FIX。
本發明揭示包括至少一個XTEN之特定因子IX融合蛋白。在一個態樣中，本發明提供一種因子IX(FIX)融合蛋白，其包含FIX多肽及至少一個XTEN，該XTEN插入該FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：2之胺基酸103、SEQ ID NO：2之胺基酸105、SEQ ID NO：2之胺基酸142、SEQ ID NO：2之胺基酸149、SEQ ID NO：2之胺基酸162、SEQ ID NO：2之胺基酸166、SEQ ID NO：2之胺基酸174、SEQ ID NO：2之胺基酸224、SEQ ID NO：2之胺基酸226、SEQ ID NO：2之胺基酸228、SEQ ID NO：2之胺基酸413及其任何組合，且其中該FIX融合蛋白展現促凝血活性。
本發明亦提供一種FIX融合蛋白，其包含FIX多肽及包含XTEN之異源部分，其中該XTEN與該FIX多肽之C末端融合且包含長度超過42個胺基酸且少於144個胺基酸的胺基酸序列。
本發明之FIX融合蛋白具有若干用途，包括提供一種預防、治療、改善或管理有需要患者之凝血疾病或病症之方法。在一個實施例中，該方法包括投與有效量的本文所描述之FIX融合蛋白(例如藉由皮下投與)之步驟。
本發明亦提供一種延長FIX多肽之半衰期的方法，其包含將XTEN插入該FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：2之胺基酸103、SEQ ID NO：2之胺基酸105、SEQ ID NO：2之胺基酸142、SEQ ID NO：2之胺基酸149、SEQ ID NO：2之胺基酸162、SEQ ID NO：2之胺基酸166、SEQ ID NO：2之胺基酸174、SEQ ID NO：2之胺基酸224、SEQ ID NO：2之胺基酸226、SEQ ID NO：2之胺基酸228、SEQ ID NO：2之胺基酸413及其任何組合，由此構築FIX融合蛋白，且其中該FIX融合蛋白展現促凝血活性。
自以下說明及附圖將易於瞭解其他發明實施例。
〔以引用方式之併入〕
本文中揭示之所有出版物、專利及專利申請案均以引用之方式併入本文中，其引用程度就如同具體且個別地指示每一個別出版物、專利或專利申請案以引用之方式併入本文中一般。
圖1為描繪FIX融合蛋白之活性的圖，該等FIX融合蛋白包含插入各種插入位點(例如，胺基酸52、胺基酸59、胺基酸66、胺基酸80、胺基酸85、胺基酸89、胺基酸103、胺基酸105、胺基酸113、胺基酸129、胺基酸142、胺基酸149、胺基酸162、胺基酸166、胺基酸174、胺基酸188、胺基酸202、胺基酸224、胺基酸226、胺基酸228、胺基酸230、胺基酸240、胺基酸257、胺基酸265、胺基酸277、胺基酸283、胺基酸292、胺基酸316、胺基酸341、胺基酸354、胺基酸392、胺基酸403及胺基酸413，對應於SEQ ID NO：2之胺基酸)或與該FIX多肽之C末端(C-terminus)(C末端(C-term))融合的具有42個胺基酸(例如AE42)之XTEN。C末端融合之XTEN在FIX與C末端融合物之間含有凝血酶可裂解位點。Y軸顯示FIX活性，以藉由發色分析測定的基礎構築體(FIX-R338L)在條件培養基中之活性百分比表示。X軸以胺基酸編號(對應於SEQ ID NO：2)及單字母胺基酸縮寫顯示具體插入位點。FIX之相應結構域(例如，GLA、EGF1、EGF2、連接子、AP及催化結構域)、連接子區及C末端(C-terminus)(「C末端(C-term)」)在X軸下方指出。
圖2係描繪FIX融合蛋白之活性的圖，該等FIX融合蛋白包含插入各種插入位點(例如，胺基酸103、胺基酸105、胺基酸142、胺基酸149、胺基酸162、胺基 酸166、胺基酸174、胺基酸224及胺基酸413，對應於SEQ ID NO：2之胺基酸)或與FIX多肽之C末端(C-terminus)(C末端(C-term)，胺基酸415)融合的具有42個胺基酸(AE42)、72個胺基酸(AE72)、144個胺基酸(AE144)、288個胺基酸(AE288)及864個胺基酸(AE864)之XTEN。Y軸顯示FIX活性，以藉由發色分析測定的基礎構築體(FIX-R338L)在條件培養基中之活性百分比表示。X軸以胺基酸編號(對應於SEQ ID NO：2)顯示每個插入位點之結構域(例如EGF2、AP及催化結構域)或區域(例如，連接子及C末端)及具體插入位點。箭頭指示選擇用於進一步實驗(參見圖3A-3B)之插入位點。
圖3A為R338L FIX變異體之區域及結構域之示意性表示。突出顯示作為潛在異源部分(例如XTEN)插入位點之特定胺基酸殘基(例如N105、D166及E224)及C末端。圖3B顯示自三個不同角度得到的豬FIX(PDB：1PFX)之三維結構的圖解。標出插入位點N105、D166及E224；C末端；及R338L突變(例如在R338L FIX變異體中)之位置。
圖4概述包含一個或兩個XTEN(例如，具有42個、72個、144個及288個胺基酸之XTEN)，或包含一個XTEN及一個Fc結構域或FIXFc之FIX融合蛋白的相對活性。Y軸顯示FIX活性，以藉由發色分析測定的基礎構築體(FIX-R338L)在條件培養基中之活性百分比表示。X軸顯示構築體編號，且X軸下方之表格顯示所測試 的每一構築體中XTEN及Fc之組成。EGF2(105)、AP(166)、60環(224)及C末端XTEN或Fc指示XTEN或Fc插入或融合之位置。X軸下方之表格中每一格中之數字(例如，42、72、144及288，指示XTEN之大小)及「Fc」指示哪一部分插入FIX多肽內或與FIX多肽之C末端融合。
圖5A提供描繪如在B型血友病小鼠中單次靜脈內推注給藥後所量測，相較於rFIX及rFIXFc，對於具有各種長度之凝血酶可裂解C末端XTEN融合之各種FIX融合蛋白(例如，FIX-CT.288(具有288個胺基酸之XTEN，例如AE288)及FIX-CT.864(具有864個胺基酸之XTEN，例如AE864)，給予FIX凝血活性劑之血漿百分含量隨時間變化的圖。圖5B提供描繪如在B型血友病小鼠中單次靜脈內推注給藥之後所量測，相較於rFIX及rFIXFc，對於在活化肽(AP)結構域中插入各種長度之XTEN的各種FIX融合蛋白(例如，FIX-AP.144、FIX-AP.72及FIX-AP.42)，給予之FIX凝血活性劑之血漿百分含量隨時間變化的圖。圖5C提供圖5A及5B中所示之單次靜脈內推注給予FIX融合蛋白的藥物動力學參數計算值之圖解編輯。Y軸上指示每一指定分子之血漿活性劑回收百分含量。X軸顯示平均滯留時間(MRT，以小時為單位)計算值，且圓點區域表示在劑量曲線下面積之相對計算值(AUC/D，以h/kg/mL為單位)。
圖6A提供描繪如在B型血友病小鼠中單次靜 脈內推注給藥之後所量測，相較於rFIX及rFIXFc，對於在活化肽(AP)結構域(例如FIXFc-AP.72及FIXFc-AP.42)或EGF2結構域(例如FIXFc-EGF.42)中插入各種長度之XTEN融合物的各種FIX融合蛋白，給予之FIX凝血活性劑之血漿百分含量隨時間變化的圖。圖6B提供圖6A中所示之單次靜脈內推注給予FIX融合蛋白的藥物動力學參數計算值之圖解編輯。Y軸上指示每一指定分子之血漿活性劑回收百分含量。X軸指示平均滯留時間(MRT，以小時為單位)計算值。圓點區域表示在劑量曲線下面積之相對計算值(AUC/D，以h/kg/mL為單位)。
圖7A提供描繪如在B型血友病小鼠中單次皮下推注給藥之後所量測，相較於rFIX及rFIXFc，對於包含與FIX多肽之C末端融合的具有288個胺基酸之凝血酶可裂解XTEN之FIX融合蛋白(rFIX-CT.288)、包含插入FIX多肽之AP結構域內的具有72個胺基酸之XTEN之FIX融合蛋白(rFIXFc-AP.72)及包含插入FIX多肽之EGF2結構域內的具有42個胺基酸之XTEN之FIX融合蛋白(rFIXFc-EGF2.42)，給予之FIX凝血活性劑之血漿百分含量隨時間變化的圖。圖7B提供圖7A中所示之單次皮下推注給予FIX融合蛋白的藥物動力學參數計算值之圖解編輯。Y軸上指示每一指定分子之生物利用率百分含量。X軸指示平均滯留時間(MRT，以小時為單位)計算值。圓點區域表示在劑量曲線下面積之相對計算值(AUC/D，以h/kg/mL為單位)。
圖8A提供在人B型血友病血液中藉由旋轉式血栓彈力測定法(rotational thromboelastometry，ROTEM)量測的rFIXFc及包含插入FIX之AP結構域內的具有72個胺基酸的XTEN之FIX融合蛋白(例如rFIXFc-AP-XTEN.72)之凝血時間(以秒為單位)的圖解描繪。圖8B提供在人B型血友病血液中rFIXFc及FIX融合蛋白(例如rFIXFc-AP-XTEN.72)之α角(以度為單位)的圖解描繪。圖8C提供在人B型血友病血液中rFIXFc及FIX融合蛋白(例如rFIXFc-AP-XTEN.72)之最大凝塊強度(以mm為單位)的圖解描繪。
圖9係顯示rFIXFc-AP.72與rFIXFc在尾截割出血模型中之急性功效之比較的圖。呈現之結果為在30分鐘治療期內給藥後5分鐘之個別及平均失血量(μl)及所指示之劑量。星號指示媒劑相對於所有其他治療組之顯著性p值。資料指示相較於rFIXFc，給予小鼠rFIXFc-AP.72具有類似或改善之功效。
圖10係顯示HemB小鼠存活率百分比(Y軸)隨尾靜脈切斷後時間(以小時為單位；X軸)之變化的圖。所有小鼠在尾靜脈切斷之前72小時以指定IU/kg經靜脈內預先給予FIXFc(點劃線)或皮下預先給予FIXFc-AP.72(FIXFc-AP.72：100IU/kg(實心黑色圓圈)、50IU/kg(實心灰色三角形)及15IU/kg(實心倒轉之灰色三角形)；rFIXFc：100IU/kg(空心圓圈)、50IU/kg(空心三角形)及15IU/kg(空心倒轉三角形))；及媒劑(實心灰色圓 圈)。當與媒劑治療之小鼠相比較時，給予rFIXFc或FIXFc-AP.72之小鼠的存活率曲線均顯著不同(p<0.0001，對數秩(Mantel-Cox)測試)。
圖11A係顯示在藉由靜脈內(虛線)或皮下注射(實線)給予單次推注(200IU/kg)之rFIX(灰色)或rFIXFc-AP.72融合蛋白(黑色)之B型血友病小鼠中如藉由一級血漿分析量測之FX活性劑之血漿含量隨時間變化的圖。圖11B顯示如使用非房室分析(NCA)，使用Phoenix WinNonLin 6.2.1軟體(Pharsight,Certara)測定的藥物動力學參數。
圖12A係說明rFIXFc-AP.72單鏈Fc之結構域結構的示意圖。圖12B係說明rFIXFc-AP.72雙鏈Fc之結構域結構的示意圖。「FIX HC」係指FIX之重鏈；「FIX LC」係指FIX之輕鏈，其包括FIX之EGF及GLA結構域；且AP係指FIX之活化肽。
圖13係概述實例中使用之FIX-XTEN構築體及相配之序列標識符、說明及質體代碼之表格。
本發明提供一種包含FIX多肽及至少一個異源部分之FIX融合蛋白以及其製備及使用方法。在某些態樣中，FIX融合蛋白包含插人FIX多肽內、與FIX多肽之C末端融合或兩者之至少一個異源部分，其中FIX融合蛋白展現促凝血活性。在一特定態樣中，該異源部分為 XTEN。
I. 定義
在本發明通篇，術語「一個(種)」實體係指一或多個(種)該實體；舉例而言，「一個聚核苷酸」應理解為表示一或多個聚核苷酸。因此，術語「一個(種)」、「一或多個(種)」及「至少一個(種)」在本文中可互換使用。
此外，「及/或」在本文中使用時應視為對兩個指定特徵或組分中之每一者在存在或不存在另一者之情況下的具體揭示。因此，如本文中在諸如「A及/或B」之片語中使用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣，如在諸如「A、B及/或C」之片語中使用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。
應理解，當在本文中用語言「包含」描述各態樣時，亦提供以「由...組成」及/或「實質上由...組成」之術語描述之其他相似態樣。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語皆具有與本發明所屬領域之一般技術人員通常所理解相同的含義。舉例而言，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show，第2 版，2002,CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology，第3版，1999,Academic Press；及Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press，向技術人員提供本發明所使用之許多術語的大體解釋。
單位、前綴及符號皆以其國際單位制(Système International de Unites,(SI))公認形式表示。數字範圍包括界定該範圍之數字在內。除非另外指明，否則胺基酸序列係自左至右以胺基至羧基取向書寫。本文中提供之標題不限制本發明之各種態樣，該等態樣可藉由參考整個說明書得出。因此，即將在下文定義之術語藉由參照說明書全文進行更完整地定義。
術語「約」在本文中用於意謂近似、大致、大約或在......左右。當術語「約」與數字範圍結合使用時，其藉由使邊界擴展高於及低於所陳述之數字來修飾該範圍。一般而言，術語「約」可藉由例如向上或向下(增大或降低)10%之變化來修飾高於或低於所述值之數值。
術語「聚核苷酸」或「核苷酸」意欲涵蓋單個核酸以及複數個核酸，且係指分離之核酸分子或構築體，例如信使RNA(mRNA)或質體DNA(pDNA)。在某些實施例中，聚核苷酸包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如在肽核酸(PNA)中所發現的之醯胺鍵)。術語「核酸」係指聚核苷酸中存在的任一個或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。「分離之」核酸或聚核苷酸意欲 指已自其天然環境移出之核酸分子，即DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，載體中所包含的編碼FIX多肽之重組聚核苷酸被視為分離之聚核苷酸。分離之聚核苷酸之其他實例包括維持在異源宿主細胞中或在溶液中自其他聚核苷酸純化(部分或實質上純化)之重組聚核苷酸。分離之RNA分子包括本發明之聚核苷酸之活體內或活體外RNA轉錄物。根據本發明之分離之聚核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生的此等分子。此外，聚核苷酸或核酸可包括調控元件，諸如啟動子、增強子、核糖體結合位點或轉錄終止信號。
如本文所用之「編碼區」或「編碼序列」為由可轉譯成胺基酸之密碼子組成的聚核苷酸之一部分。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)通常不轉譯成胺基酸，但其可被視為編碼區之一部分，不過任何側接序列，例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子及其類似序列，不為編碼區之一部分。編碼區之邊界通常由在5'末端處之編碼所得多肽之胺基末端的起始密碼子及在3'末端處編碼所得多肽之羧基末端之轉譯終止密碼子來確定。本發明之兩個或超過兩個編碼區可存在於單個聚核苷酸構築體中，例如在單個載體上；或存在於獨立聚核苷酸構築體中，例如在獨立(不同)載體上。單個載體又可僅含有單個編碼區，或包含兩個或超過兩個編碼區，例如單個載體可獨立地編碼如下文所描述之結合結構域A及結合結構域B。此外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼融 合或未融合至編碼本發明結合結構域之核酸的異源編碼區。異源編碼區包括(但不限於)特殊元件或基元，諸如分泌信號肽或異源功能結構域。
哺乳動物細胞分泌之某些蛋白質與分泌信號肽締合，一旦逐漸增長之蛋白質鏈開始跨粗糙內質網輸出，該信號肽即自成熟蛋白質裂解。一般熟習此項技術者應明白，信號肽一般與多肽之N末端融合，且自完整或「全長」多肽裂解以產生該多肽之分泌或「成熟」形式。在某些實施例中，使用天然信號肽、或該序列之保留引導與其可操作地締合之多肽分泌之能力的功能性衍生物。或者，可使用異源哺乳動物信號肽，例如人類組織纖維蛋白溶酶原活化物(TPA)或小鼠β-葡萄醣醛酸酶信號肽，或其功能性衍生物。
術語「下游」係指位於參考核苷酸序列之3'方向之核苷酸序列。在某些實施例中，下游核苷酸序列係針對在轉錄起始點之後之序列。舉例而言，基因之轉譯起始密碼子位於轉錄起始位點之下游。「下游」亦可指位於參考肽序列之C末端的肽序列。
術語「上游」係指位於參考核苷酸序列之5'方向之核苷酸序列。在某些實施例中，上游核苷酸序列係針對位於編碼區或轉錄起始點之5'側之序列。舉例而言，大多數啟動子位於轉錄起始位點之上游。「上游」亦可指位於參考肽序列之N末端的肽序列。
如本文所用，術語「調控區」係指位於編碼 區之上游(5'非編碼序列)、內部或下游(3'非編碼序列)，且影響所締合之編碼區之轉錄、RNA加工、穩定性或轉譯之核苷酸序列。調控區可包括啟動子、轉譯前導序列、內含子、聚腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應物結合位點及莖-環結構。若編碼區意欲在真核細胞中表現，則聚腺苷酸化信號及轉錄終止序列通常將位於編碼序列之3'方向。
編碼基因產物(例如多肽)之聚核苷酸可包括與一或多個編碼區可操作地締合之啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件。在一可操作締合中，基因產物(例如多肽)之編碼區以將該基因產物之表現置於調控區之影響或控制下的方式與一或多個調控區締合。舉例而言，若誘導啟動子功能引起編碼由編碼區編碼之基因產物之mRNA的轉錄，且若啟動子與編碼區之間之鍵聯的性質不干擾啟動子引導基因產物表現之能力或不干擾轉錄DNA模板之能力，則編碼區及啟動子係「可操作地締合」。除啟動子之外的其他轉錄控制元件，例如增強子、操縱子、阻遏子及轉錄終止信號，亦可與編碼區可操作地締合以引導基因產物表現。
熟習此項技術者已知多個轉錄控制區。該等轉錄控制區包括(但不限於)，在脊椎動物細胞中起作用之轉錄控制區，諸如但不限於，來自細胞巨大病毒(立即早期啟動子與內含子A之組合)、猿猴病毒40(早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒)之啟動子及增強子區 段。其他轉錄控制區包括源於脊椎動物基因，諸如肌動蛋白(actin)、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-球蛋白之彼等控制區，以及能夠控制真核細胞中之基因表現之其他序列。其他適合的轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子，以及淋巴因子(lymphokine)誘導性啟動子(例如可由干擾素或介白素誘導之啟動子)。
類似地，一般熟習此項技術者已知多種轉譯控制元件。該等元件包括(但不限於)，核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，及源自於細小核糖核酸病毒之元件(特別是內部核糖體進入位點，或IRES，又稱為CITE序列)。
如本文所用，術語「表現」係指聚核苷酸藉以產生基因產物(例如RNA或多肽)之過程。其包括(但不限於)，聚核苷酸轉錄成信使RNA(mRNA)、轉移RNA(tRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(siRNA)或任何其他RNA產物，及mRNA轉譯成多肽。表現產生「基因產物」。如本文所用，基因產物可為核酸(例如藉由基因轉錄產生之信使RNA)或自轉錄物轉譯之多肽。本文所述之基因產物進一步包括具有轉錄後修飾(例如聚腺苷酸化或剪接)之核酸，或具有轉譯後修飾(例如甲基化、糖基化、添加脂質、與其他蛋白質次單元締合，或蛋白水解裂解)之多肽。
「載體」係指用於將核酸選殖及/或轉移至宿主細胞中之任何媒介物。載體可為可與另一核酸區段連接 以使所連接區段複製之複製子。「複製子」係指在活體內充當自主複製單元，亦即，能夠在自身控制下複製之任何遺傳元件(例如質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒)。術語「載體」包括用於在活體外、離體或在活體內將核酸引入細胞中之病毒載體與非病毒載體。此項技術中已知且使用許多載體，包括例如質體、經修飾真核病毒或經修飾細菌病毒。將聚核苷酸插入適合載體中可藉由將適當聚核苷酸片段連接至具有互補黏性末端之所選載體中來達成。
載體可經工程改造以編碼提供對已併有載體之細胞之選擇或鑑別的可選擇標記物或報導體。可選擇標記或報導體之表現允許鑑別及/或選擇併有且表現載體上含有之其他編碼區之宿主細胞。此項技術中已知且使用之可選擇標記物基因之實例包括：提供對胺苄青黴素(ampicillin)、鏈黴素(streptomycin)、健他黴素(gentamycin)、康黴素(kanamycin)、潮黴素(hygromycin)、新黴素(neomycin)、嘌呤黴素(puromycin)、雙丙胺膦(bialaphos)除草劑、磺醯胺及其類似物之抗性之基因；及用作表型標記物之基因，亦即，花青素(anthocyanin)調控基因、異戊基轉移酶基因及其類似物。此項技術中已知且使用之報導體之實例包括：螢光素酶(luciferase，Luc)、綠色螢光蛋白(GFP)、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、-半乳糖苷酶(galactosidase，LacZ)、-葡糖醛酸酶(glucuronidase，Gus)及其類似物。可選擇標記物亦可視為報導體。
術語「質體」係指染色體外元件，其常攜帶 不為細胞之重要代謝之部分的基因，且通常呈環狀雙股DNA分子形式。此等元件可為源於任何來源之具有單股或雙股DNA或RNA之線性、環狀或超螺旋自主複製序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中許聚核苷酸序列已接合或重組成能夠將啟動子片段及所選基因產物之DNA序列連同適當3'未轉譯序列一起引入細胞中之獨特構造。
可使用之真核病毒載體包括(但不限於)腺病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺相關病毒載體及痘病毒(例如牛痘病毒)載體、桿狀病毒載體或皰疹病毒載體。非病毒載體包括質體、脂質體、帶電荷脂質(細胞轉染劑)、DNA-蛋白質複合物及生物聚合物。
「選殖載體」係指一種「複製子」，其為依序複製且包含複製起點的單位長度之核酸(諸如質體、噬菌體或黏質體)，另一核酸區段可與其連接以達成所連接區段之複製。某些選殖載體能夠在一個細胞類型(例如細菌)中複製且在另一細胞類型(例如真核細胞)中表現。選殖載體通常包含一或多種可用於選擇包含載體之細胞之序列及/或一或多個用於插入相關核酸序列之多選殖位點。
術語「表現載體」係指設計成使插入之核酸序列能夠在插入宿主細胞中之後表現之載體。插入之核酸序列係以與如上所述之調控區可操作締合之方式置放。
藉由此項技術中熟知之方法將載體引入宿主細胞中，該等方法例如轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、 細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沈澱、脂質體轉染(溶酶體融合)、使用基因槍、或DNA載體轉運體(transporter)。
如本文所用之「培養」意謂在允許細胞生長或分裂之活體外條件下培育細胞或意謂使細胞維持存活狀態。如本文所用之「培養細胞」意謂在活體外繁殖之細胞。
如本文所用，術語「多肽」意欲涵蓋單數「多肽」以及複數「多肽」，且係指由醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性聯結之單體(胺基酸)所組成的分子。術語「多肽」係指具有兩個或超過兩個胺基酸之任何一或多條鏈，且不指代特定長度的產物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或用於表示具有兩個或超過兩個胺基酸之一或多個鏈之任何其他術語均包括在「多肽」之定義內且術語「多肽」可替代任何此等術語使用或可與任何此等術語互換使用。術語「多肽」亦意欲代表具有多肽之表現後修飾之產物，該等修飾不加限制地包括糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、由已知保護/阻隔基團達成之衍生化、蛋白水解裂解、或由非天然存在之胺基酸達成之修飾。多肽可源於天然生物來源或藉由重組技術產生，但未必自指定核酸序列轉譯。其可以任何方式產生，包括藉由化學合成產生。
「經分離」多肽或其片段、變異體或衍生物係指不在天然環境中之多肽。不要求特定純化程度。舉例 而言，經分離多肽可僅自其原生或天然環境移除。出於本發明之目的，在寄主細胞中表現的重組產生之多肽及蛋白質視為分離的，已藉由任何適合技術分離、分餾或部分地或實質上純化之天然或重組多肽亦視為分離的。
如本文所用，術語「宿主細胞」係指帶有或能夠帶有重組核酸之細胞或細胞群體。宿主細胞可為原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli ))，或者，宿主細胞可為真核細胞，例如真菌細胞(例如酵母細胞，諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )、畢赤酵母(Pichia pastoris )或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe ))，及各種動物細胞，諸如昆蟲細胞(例如Sf-9)或哺乳動物細胞(例如HEK293F、CHO、COS-7、NIH-3T3)。
本發明中亦包括多肽之片段或變異體及其任何組合。術語「片段」或「變異體」在關於本發明之多肽結合結構域或結合分子時包括保留參照多肽之至少一些特性(例如對FcRn結合結構域或Fc變異體之FcRn結合親和力或FIX變異體之凝血活性)之任何多肽。除在本文中其他地方論述之特定抗體片段之外，多肽之片段亦包括蛋白水解片段以及缺失片段，但不包括天然存在之全長多肽(或成熟多肽)。本發明之多肽結合結構域或結合分子之變異體包括如上所述之片段以及胺基酸序列歸因於胺基酸取代、缺失或插入而改變之多肽。變異體可為天然存在的或非天然存在的。非天然存在之變異體可使用此項技術已知之突變誘發技術來產生。變異多肽可包含保守或非保守胺 基酸取代、缺失或添加。本文所揭示之一個特定FIX變異體為R338L FIX(Padua)變異體(SEQ ID NO：2)。參見例如，Simioni,P.等人，「X-Linked Thrombophilia with a Mutant Factor IX(Factor IX Padua),」NEJM 361 ：1671-75(2009年10月)，以全文引用之方式併入本文中。
「保守胺基酸取代」為用具有相似側鏈之胺基酸殘基置換胺基酸殘基的取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族已在此項技術中加以定義，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電荷極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如酥胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，若多肽中之胺基酸用來自同一側鏈家族之另一胺基酸置換，則將取代視為保守的。在另一實施例中，可將一連串胺基酸用側鏈家族成員之順序及/或組成不同的結構上相似的胺基酸串保守地置換。
兩個聚核苷酸或多肽序列之間使用的術語「序列一致性百分比」係指在比較窗口上由該等序列共用的一致匹配位置數，其考慮到為進行兩個序列之最佳比對必須引入的添加或缺失(亦即間隙)。匹配位置為靶序列及參考序列二者中存在相同核苷酸或胺基酸的任何位置。靶 序列中存在的間隙不做計數，因為間隙不為核苷酸或胺基酸。同樣，參考序列中存在的間隙不做計數，因為對靶序列核苷酸或胺基酸計數，而不對來自參考序列之核苷酸或胺基酸計數。
藉由以下方式來計算序列一致性百分比：測定兩個序列中存在相同胺基酸殘基或核酸鹼基之位置的數目以產生匹配位置之數目，用匹配位置之數目除以比較窗中位置之總數且將結果乘以100以產生序列一致性百分比。兩個序列之間序列之比較及序列一致性百分比的測定可使用供線上使用與下載兩者之可易於得到之軟體完成。適合軟體程式可自各種來源獲得，且可用於比對蛋白質及核苷酸序列。一種適於測定序列一致性百分比之程式為bl2seq，其為可自美國政府之國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)BLAST網站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)獲得之BLAST程式套件之一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法進行兩個序列之間的比較。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。其他適合程式為例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其為生物資訊程式之EMBOSS套件之部分，且亦可獲自歐洲生物資訊研究所(EBI)之www.ebi.ac.uk/Tools/psa。
與聚核苷酸或多肽參考序列比對的單個聚核苷酸或多肽靶序列內的不同區可各自具有其自身的序列一致性百分比。應注意，將序列一致性百分比值捨入至最接 近的十分位。舉例而言，將80.11、80.12、80.13及80.14向下捨入至80.1，而將80.15、80.16、80.17、80.18及80.19向上捨入至80.2。亦注意，長度值將始終為整數。
熟習此項技術者將理解，產生用於計算序列一致性百分比的序列比對不限於唯一地由原始序列資料驅動之二進制序列-序列比較。序列比對可來源於多重序列比對。一種產生多序列比對之適合程式為ClustalW2，可獲自www.clustal.org。另一適合程式為MUSCLE，可獲自www.drive5.com/muscle/。ClustalW2及MUSCLE可替代地獲自例如EBI。
亦應理解，序列比對可藉由序列資料與異質來源之資料的整合產生，該等異質來源之資料諸如結構資料(例如結晶蛋白結構)、功能資料(例如突變位置)或譜系學資料。整合異質資料以產生多重序列比對的適合程式為T-Coffee，其獲自www.tcoffee.org且可替代地獲自例如EBI。亦應瞭解用於計算序列一致性百分比之最終比對可自動或手動策劃。
如本文所用，在因子IX蛋白質序列中「對應於......之胺基酸」、「對應於......之位點」或「等效胺基酸」係藉由對準以使第一FIX序列與第二FIX序列之間之一致性或相似性最大來鑑別。用於鑑別第二FIX序列中之等效胺基酸之編號係基於用於鑑別第一FIX序列中之相應胺基酸之編號。
如本文所用，術語「插入位點」係指aFIX多 肽(通常為成熟FIX多肽)或其片段、變異體或衍生物中緊靠可插入異源部分之位置之上游的位置。以編號指定「插入位點」，該編號為R388L FIX(Padua)變異體(SEQ ID NO：2)中由插入位點所對應之胺基酸的編號，該胺基酸緊靠插入位置之N末端。舉例而言，片語「EGF2結構域在對應於SEQ ID NO：2之胺基酸105之插入位點處包含XTEN」指示異源部分位於對應於SEQ ID NO：2之胺基酸105及胺基酸106之兩個胺基酸之間。然而，熟習此項技術者將能夠容易地鑑別任何FIX變異體中之相應位置，且本發明不局限於僅在R338L FIX(Padua)變異體中進行之插入。相反，本文所揭示之插入可在任何FIX變異體或其具有促凝血活性之片段中對應於R338L FIX變異體之位置處進行。
如本文所用，片語「緊靠胺基酸之下游」係指緊接於胺基酸之末端羧基之位置。類似地，片語「緊靠胺基酸之上游」係指緊接於胺基酸之末端胺基之位置。因此，如本文所用，片語「在插入位點之兩個胺基酸之間」係指XTEN或任何其他多肽插入在兩個相鄰胺基酸之間所處之位置。
如本文所用，術語「插入」、「經插入」、「插入...中」或語法相關術語係指相對於R338L FIX(Padua)變異體(SEQ ID NO：2)中之類似位置，XTEN在融合多肽中之位置。本領域技術人員應理解如何鑑別與其他FIX多肽序列(如SEQ ID NO：1所示之序列)相應之插 入位置。如本文所用，該等術語係指重組FIX多肽相對於R338L FIX(Padua)變異體之特徵，且不指示、暗示或意指製備融合多肽之任何方法或過程。舉例而言，對於本文提供之融合多肽，片語「將XTEN插入緊鄰FIX多肽之殘基105下游之EGF2結構域中」意謂該融合多肽在緊鄰對應於R338L FIX變異體(SEQ ID NO：2)中之胺基酸105之胺基酸的下游包含XTEN，其例如由對應於R338L FIX變異體之胺基酸105及106之胺基酸所界定。
「融合」或「嵌合」蛋白包含第一胺基酸序列連接於在自然界中其未天然連接之第二胺基酸序列。通常存在於各別蛋白質中之胺基酸序列可集合在一起形成融合多肽，或通常存在於同一蛋白質中之胺基酸序列可以新排列安置在融合多肽中，該融合多肽例如為本發明之FIX結構域與Ig Fc結構域之融合物。融合蛋白係例如藉由化學合成，或藉由產生並轉譯肽區域以所需關係編碼之聚核苷酸來產生。融合蛋白可進一步包含藉由共價非肽鍵或非共價鍵與第一胺基酸序列締合之第二胺基酸序列。
術語「異源」及「異源部分」意謂聚核苷酸、多肽或其他部分源於與其所比較之實體不同之實體。舉例而言，異源多肽可為合成多肽，或源於不同物種、個體之不同細胞類型或不同個體之相同或不同類型之細胞。在一個態樣中，異源部分係與另一多肽融合以產生融合多肽或蛋白質之多肽。在另一態樣中，異源部分係與多肽或蛋白質偶聯之非多肽部分，諸如PEG。
如本文所用，術語「半衰期」係指特定多肽在活體內之生物半衰期。半衰期可由向個體投與之一半數量自動物中之循環及/或其他組織清除所需的時間表示。當構築既定多肽隨時間而變之清除曲線時，曲線通常為雙相的，即快速α相及較長β相。α相通常表示投與之多肽在血管內空間與血管外空間之間達到平衡且部分地由多肽之尺寸決定。β-相通常表示多肽於血管內空間中的分解代謝。在一些實施例中，FIX及包含FIX之融合蛋白為單相的，且因此不具有α相，而僅具有單一β相。因此，在某些實施例中，如本文所用，術語半衰期係指多肽在β相中之半衰期。人體中人類抗體之典型β相半衰期為21日。
如本文所用，術語「連接」及「融合」係指第一胺基酸序列或核苷酸序列分別共價或非共價接合至第二胺基酸序列或核苷酸序列。第一胺基酸或核苷酸序列可直接接合或相鄰於第二胺基酸或核苷酸序列，或者介入序列可將第一序列共價接合於第二序列。術語「連接」不僅意謂第一胺基酸序列在C末端或N末端融合於第二胺基酸序列，而且亦包括將整個第一胺基酸序列(或第二胺基酸序列)插入第二胺基酸序列(或相應地第一胺基酸序列)中之任何兩個胺基酸中。在一個實施例中，第一胺基酸序列係藉由肽鍵或連接子連接至第二胺基酸序列。第一核苷酸序列可藉由磷酸二酯鍵或連接子連接於第二核苷酸序列。連接子可為肽或多肽(用於多肽鏈)或核苷酸或核苷酸鏈(用於核苷酸鏈)或任何化學部分(用於多肽與聚核苷酸鏈兩 者)。術語「連接」亦藉由連字符(-)加以指示。
如本文所用，術語「與...締合」係指第一條胺基酸鏈與第二條胺基酸鏈之間形成的共價鍵或非共價鍵。在一個實施例中，術語「與...締合」意謂共價非肽鍵或非共價鍵。此締合可由冒號，亦即(：)指示。在另一實施例中，其意謂除肽鍵之外的共價鍵。舉例而言，胺基酸半胱胺酸包含可與第二半胱胺酸殘基上之硫醇基形成二硫鍵或二硫橋之硫醇基。在大多數天然存在之IgG分子中，CH1區與CL區藉由二硫鍵締合且兩個重鏈藉由兩個二硫鍵在對應於239及242之位置處締合，該等位置係使用Kabat編號系統(位置226或229，EU編號系統)。共價鍵之實例包括(但不限於)肽鍵、金屬鍵、氫鍵、二硫鍵、ζ鍵、π鍵、δ鍵、糖苷鍵、抓氫鍵、彎曲鍵、偶極鍵、π反向鍵、雙鍵、參鍵、四鍵、五鍵、六鍵、結合、超結合、芳香性、哈普托數(hapticity)或反鍵結。非共價鍵之非限制性實例包括離子鍵(例如陽離子π鍵或鹽鍵)、金屬鍵、氫鍵(例如二氫鍵、二氫複合物、低障壁氫鍵或對稱氫鍵)、凡得瓦力(van der Walls force)、倫敦分散力(London dispersion force)、機械鍵(mechanical bond)、鹵素鍵、親金作用(aurophilicity)、嵌入、堆積作用、熵力(entropic force)或化學極性。
如本文所用，術語「裂解位點」或「酶促裂解位點」係指由酶識別之位點。某些酶促裂解位點包含細胞內加工位點。在一個實施例中，多肽具有由在凝結級聯 期間活化之酶裂解之酶促裂解位點，因此此等位點之裂解發生在凝塊形成之部位處。示範性此類位點包括例如由凝血酶、因子XIa或因子Xa識別者。示範性FXIa裂解位點包括例如TQSFNDFTR(SEQ ID NO：166)及SVSQTSKLTR(SEQ ID NO：167)。示範性凝血酶裂解位點包括例如DFLAEGGGVR(SEQ ID NO：168)、TTKIKPR(SEQ ID NO：169)、LVPRG(SEQ ID NO：170)及ALRPR(SEQ ID NO：171)。其他酶促裂解位點在此項技術中為已知的。
如本文所用，術語「加工位點」或「細胞內加工位點」係指多肽中一種類型之酶促裂解位點，其為在該多肽轉譯之後起作用之酶的目標。在一個實施例中，此等酶在自高爾基體腔(Golgi lumen)轉運至反面高爾基體(trans-Golgi)區室期間起作用。細胞內加工酶在蛋白質自細胞分泌之前裂解多肽。此等加工位點之實例包括例如由內肽酶之PACE/弗林蛋白酶(furin)(其中PACE為成對鹼性胺基酸裂解酶(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)之頭字語)家族所靶向者。此等酶定位於高爾基體膜且在序列基元Arg-[任何殘基]-(Lys或Arg)-Arg之羧基端側上裂解蛋白質。如本文所用，「弗林蛋白酶」酶家族包括例如PCSK1(亦稱為PC1/Pc3)、PCSK2(亦稱為PC2)、PCSK3(亦稱為弗林蛋白酶或PACE)、PCSK4(亦稱為PC4)、PCSK5(亦稱為PC5或PC6)、PCSK6(亦稱為PACE4)、或PCSK7(亦稱為PC7/LPC、PC8或SPC7)。其他加工位點係此項技術中已知的。本文中提及之術語「可 加工連接子」意謂包含細胞內加工位點之連接子。
在包括一個以上加工或裂解位點之構築體中，應瞭解此等位點可相同或不同。
如本文所用，「可加工連接子」係指包含至少一個在本文中其他地方描述之細胞內加工位點的連接子。
如本文所用，「基線」為在投與劑量之前受試者中之最低量測血漿FIX含量。FIX血漿含量可在給藥之前之兩個時間點量測：在篩檢訪視時及即將給藥之前。或者，(a)治療前FIX活性<1%、不具有可偵測FIX抗原且具有無意義基因型之受試者之基線可定義為0%，(b)治療前FIX活性<1%且具有可偵測FIX抗原之受試者之基線可設置為0.5%，(c)治療前FIX活性在1-2%之間的受試者之基線為Cmin(在整個PK研究期間之最低活性)，及(d)治療前FIX活性
Figure 105124637-A0202-12-0029-370
2%之受試者之基線可設置為2%。
如本文所用之「受試者」意謂人類。如本文所用之受試者包括以下個體：已知發生過至少一次不受控制之出血事件；已診斷有與不受控制之出血事件相關之疾病或病症例如出血疾病或病症，例如B型血友病；易患不受控制之出血事件例如血友病；或其任何組合。受試者亦可包括在某一活動例如手術、運動活動或任何劇烈活動之前處於一或多個不可控制出血事件之危險中的個體。受試者之基線FIX活性可小於1%、小於0.5%、小於2%、小於2.5%、小於3%或小於4%。受試者亦包括兒童。兒童 受試者之年齡為出生至20歲、較佳為出生至18歲、出生至16歲、出生至15歲、出生至12歲、出生至11歲、出生至6歲、出生至5歲、出生至2歲、及2至11歲。
如本文所用之治療係指例如減輕疾病或病狀之嚴重性；降低疾病病程之持續時間；改善與疾病或病狀相關之一或多種症狀；向患有疾病或病狀之個體提供有益效應，未必治癒該疾病或病狀；或防治與疾病或病狀相關之一或多種症狀。在一個實施例中，術語「治療(treating/treatment)」意謂藉由投與本發明之融合蛋白來使受試者之FIX谷底含量維持在至少約1IU/dL、2IU/dL、3IU/dL、4IU/dL、5IU/dL、6IU/dL、7IU/dL、8IU/dL、9IU/dL、10IU/dL、11IU/dL、12IU/dL、13IU/dL、14IU/dL、15IU/dL、16IU/dL、17IU/dL、18IU/dL、19IU/dL或20IU/dL。在另一實施例中，治療意謂維持FIX谷底含量在以下之間：約1與約20IU/dL、約2與約20IU/dL、約3與約20IU/dL、約4與約20IU/dL、約5與約20IU/dL、約6與約20IU/dL、約7與約20IU/dL、約8與約20IU/dL、約9與約20IU/dL、或約10與約20IU/dL。治療疾病或病狀亦可包括維持受試者體內之FIX活性在相當於非血友病受試者體內FIX活性之至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%水準。治療所需之最小谷底含量可藉由一或多種已知方法加以量測且可針對每個人加以調整(增加或減 少)。
如本文所用之止血障礙意謂特徵在於由於形成纖維蛋白凝塊之能力受損或不能形成纖維蛋白凝塊而有自發出血或由於創傷而出血之傾向的基因遺傳性或獲得性病狀。此等病症之實例包括血友病。三種主要形式為A型血友病(因子VIII缺乏)、B型血友病(因子IX缺乏或「克雷司馬斯病(Christmas disease)」)及C型血友病(因子XI缺乏，輕度出血傾向)。其他止血障礙包括例如範威爾邦德病；因子XI缺乏症(PTA缺乏症)；因子XII缺乏症；纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII缺乏症或結構異常；伯納德-蘇里爾症候群(Bernard-Soulier syndrome)，其為一種GPIb缺陷症或缺乏症。VWF之受體GPIb可為有缺陷的且導致缺乏初級凝塊形成(初級止血)及流血傾向增加、以及格蘭茨曼(Glanzman)及內格利(Naegeli)血小板無力症(thrombasthenia)(格蘭茨曼血小板無力症)。在肝衰竭(急性及慢性形式)中，由肝產生之凝血因子存在不足；此可增加流血風險。
如本文所用，術語「急性流血」係指無論潛伏原因如何之流血事件。舉例而言，受試者可具有創傷、尿毒症、遺傳性出血病症(例如因子VII缺乏症)、血小板病症，或由於產生針對凝血因子之抗體而具有抗性。
II. FIX融合蛋白
本發明係針對一種包含FIX多肽及至少一個異源部分之FIX融合蛋白，該至少一個異源部分插入該FIX多肽內、與該FIX多肽之C末端融合或兩者。在異源部分插入或與異源部分融合之後，FIX融合蛋白可保持一或多種FIX活性。在一個實施例中，FIX活性為促凝血活性。「促凝血活性」意謂本發明之FIX蛋白能夠替代原生FIX參與血液中之凝血級聯。舉例而言，當本發明之重組FIX蛋白在因子VIII(FVIII)存在下將因子X(FX)轉化成活化因子X(FXa)時具有促凝血活性，如例如在發色分析中所測試。在另一實施例中，FIX活性係產生因子X活化酶(tenase)複合體的能力。在其他實施例中，FIX活性係產生凝血酶(或凝塊)的能力。
本發明之重組FIX蛋白無需展現原生成熟人類FIX之100%促凝血活性。實際上，在某些態樣中，插入本發明之FIX多肽中之異源部分可使蛋白質之半衰期顯著延長或穩定性顯著增強，因此較低活性係完全可接受。因此，在某些態樣中，本發明之FIX融合蛋白具有原生FIX之至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約100%促凝血活性。然而，在本發明之一些實施例中，對於含有FIX Padua R338L高活性變異體之蛋白質，本發明之重組FIX蛋白可具有超過100%之原生FIX活性，例如該活性之至少約105%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%或200%。
促凝血活性可藉由任何適合之活體外或活體內分析加以量測。FIX之活性可在凝血級聯之下游藉由監測凝塊產生(凝血分析)或在上游藉由直接量測FX在藉由FVIII-FIX複合物活化之後的酶活性(發色分析)來加以量測(參見例如Barrowcliffe等人，Semin.Thromb.Haemost. 28：247-56(2002)；Lee等人，Thromb.Haemost. 82：1644-47(1999)；Lippi等人，Clin.Chem.Lab.Med. 45：2-12(2007)；Matsumoto等人，J.Thromb.Haemost. 4：377-84(2006))。因此，促凝血活性可使用發色受質分析、凝血分析(例如單級或兩級凝血分析)或兩者加以量測。發色分析機制係基於凝血級聯之原理，其中活化之FIX在活化FVIII、磷脂及鈣離子存在下將FX轉化成FXa 。藉由使針對FXa 具有特異性之對硝基醯苯胺(pNA)受質水解來評估FXa 活性。在405nM下量測的對硝基苯胺之初始釋放速率與FXa 活性成正比且因此與樣品中之FIX活性成正比。顯色分析由國際血栓暨止血學會(ISTH)之科學及標準化委員會(SSC)之因子VIII及因子IX小組委員會所推薦。
適用於測定促凝血活性之其他適合分析包括例如Scheiflinger及Dockal之美國申請公開案第2010/0022445號中所揭示者，該公開案以全文引用的方式併入本文中。
在某些態樣中，將本發明之重組FIX蛋白之促凝血活性與原生成熟FIX相比較，在某些態樣中，將其與國際標準相比較。
該至少一個異源部分(如以下更詳細地描述)可包含任何異源部分，或可為能使FIX蛋白具有改善之特性的部分。舉例而言，在一個態樣中，可用於本發明之異源部分可為能夠延長FIX蛋白之半衰期的部分，或能夠改善FIX蛋白之穩定性的部分。本發明之FIX融合蛋白可具有超過一個異源部分插入FIX多肽中或與FIX多肽融合。在一個實施例中，該超過一個異源部分係相同的。在另一實施例中，該超過一個異源部分係不同的。在其他實施例中，該異源部分係選自由以下組成之群：XTEN、白蛋白、白蛋白結合肽、白蛋白小結合分子、Fc結構域、FcRn結合搭配物、PAS、CTP、PEG、HES、PSA或其任何組合。
在一些實施例中，將至少一個異源部分插入FIX多肽的一個結構域內，而非多個結構域之間。FIX多肽包含多個結構域，例如，γ-羧基麩胺酸(GLA)結構域、類表皮生長因子1(EGF1)結構域、類表皮生長因子2(EGF2)結構域、活化肽(AP)結構域、在EGF2結構域與AP結構域之間之連接子，及催化結構域(例如，絲胺酸蛋白酶結構域)。FIX酶原包含461個胺基酸：胺基酸1-28(對應於SEQ ID NO：3)為信號肽；胺基酸29-46(對應於SEQ ID NO：3)為前肽；隨後為415個胺基酸之FIX蛋白質序列。此具有415個胺基酸之經加工FIX包含胺基酸1-145(對應於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)為FIX輕鏈；胺基酸146-180為活化肽；且胺基酸181至415(對 應於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)為催化性FIX重鏈。在輕鏈及重鏈內，GLA結構域對應於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸1至46；EGF1結構域對應於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸47至84；EGF2結構域對應於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸85至127；在EGF2結構域與AP結構域之間之連接子對應於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸128至145；AP結構域對應於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸146至180；且催化結構域對應於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸181至415。
在某些實施例中，將至少一個異源部分插入FIX多肽之一或多個結構域內。舉例而言，至少一個異源部分，例如XTEN，可插入選自由以下組成之群之結構域內：GLA結構域、EGF1結構域、EGF2結構域、AP結構域、在EGF2結構域與AP結構域之間之連接子、催化結構域及其任何組合。在一個特定實施例中，將該至少一個異源部分，例如XTEN，插入GLA結構域內，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸1至46內。在一個特定實施例中，將該至少一個異源部分，例如XTEN，插入EGF1結構域內，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸47至83內。在一個特定實施例中，將該至少一個異源部分，例如XTEN，插入EGF2結構域內，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸84至125內。在一些實施例中，將該至少一個異源部分，例如XTEN，插入在 EGF2結構域與AP結構域之間之連接子內，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸132至145內。在一個特定實施例中，將該至少一個異源部分，例如XTEN，插入AP結構域內，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸146至180內。在一些實施例中，將該至少一個異源部分，例如XTEN，插入催化結構域內，例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸181至415內。
在一些實施例中，可將一或多個異源部分插入各種插入位點內。在某些實施例中，在該等位點中之一或多個處插入至少一個異源部分，例如XTEN，不會引起FIX活性之損失及/或誘導FIX蛋白質特性之改善。舉例而言，可將至少一個異源部分插入FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：2之胺基酸103(亦即，緊靠對應於SEQ ID NO：2之胺基酸103之胺基酸的下游)、SEQ ID NO：2之胺基酸105(亦即，緊靠對應於SEQ ID NO：2之胺基酸105之胺基酸的下游)、SEQ ID NO：2之胺基酸142(亦即，緊靠對應於SEQ ID NO：2之胺基酸142之胺基酸的下游)、SEQ ID NO：2之胺基酸149(亦即，緊靠對應於SEQ ID NO：2之胺基酸149之胺基酸的下游)、SEQ ID NO：2之胺基酸162(亦即，緊靠對應於SEQ ID NO：2之胺基酸162之胺基酸的下游)、SEQ ID NO：2之胺基酸166(亦即，緊靠對應於SEQ ID NO：2之胺基酸166之胺基酸的下游)、SEQ ID NO：2之胺基酸174(亦即，緊靠對應於SEQ ID NO：2之 胺基酸174之胺基酸的下游)、SEQ ID NO：2之胺基酸224(亦即，緊靠對應於SEQ ID NO：2之胺基酸224之胺基酸的下游)、SEQ ID NO：2之胺基酸226(亦即，緊靠對應於SEQ ID NO：2之胺基酸226之胺基酸的下游)、SEQ ID NO：2之胺基酸228(亦即，緊靠對應於SEQ ID NO：2之胺基酸228之胺基酸的下游)、SEQ ID NO：2之胺基酸413(亦即，緊靠對應於SEQ ID NO：2之胺基酸413之胺基酸的下游)及其任何組合，其中FIX融合蛋白展現促凝血活性。
在一個實施例中，將異源部分，例如XTEN，插入FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸149、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸162、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸166、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸174，及其任何組合。在一個實施例中，將異源部分，例如XTEN，插入FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：.1或SEQ ID NO：2之胺基酸224、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸226、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸228、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸413，及其任何組合。在其他實施例中，將異源部分，例如XTEN，插入FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸103、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸105及 二者。在另一實施例中，將異源部分，例如XTEN，插入FIX多肽內對應於SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之胺基酸142的插入位點。
如以下更詳細地論述，異源部分可為具有不同長度之XTEN。舉例而言，XTEN可包含至少約42個胺基酸、至少約72個胺基酸、至少約144個胺基酸、至少約288個胺基酸或至少約864個胺基酸。在一些實施例中，XTEN係選自由以下組成之群：AE42、AG42、AE72、AG72、AE144、AG144、AE288、AG288、AE864及AG864。可插入FIX多肽中或與FIX多肽融合之XTEN的非限制性實例包括在本文別處。
在一些實施例中，將包含42個胺基酸之XTEN，例如AE42或AG42，插入FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：1或2之胺基酸103、SEQ ID NO：1或2之胺基酸105、SEQ ID NO：1或2之胺基酸142、SEQ ID NO：1或2之胺基酸149、SEQ ID NO：1或2之胺基酸162、SEQ ID NO：1或2之胺基酸166、SEQ ID NO：1或2之胺基酸174、SEQ ID NO：1或2之胺基酸224、SEQ ID NO：1或2之胺基酸226、SEQ ID NO：1或2之胺基酸228、SEQ ID NO：1或2之胺基酸413及其任何組合，其中FIX融合蛋白展現促凝血活性。
在一些實施例中，將包含72個胺基酸之XTEN，例如AE72或AG72，插入FIX多肽內對應於選自 由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：1或2之胺基酸149、SEQ ID NO：1或2之胺基酸162、SEQ ID NO：1或2之胺基酸166、SEQ ID NO：1或2之胺基酸174、SEQ ID NO：1或2之胺基酸224、SEQ ID NO：1或2之胺基酸226、SEQ ID NO：1或2之胺基酸228、SEQ ID NO：1或2之胺基酸413及其任何組合，或XTEN與C末端融合，其中FIX融合蛋白展現促凝血活性。
在一些實施例中，將包含144個胺基酸之XTEN，例如AE144或AG144，插入FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：1或2之胺基酸149、SEQ ID NO：1或2之胺基酸162、SEQ ID NO：1或2之胺基酸166、SEQ ID NO：1或2之胺基酸174、SEQ ID NO：1或2之胺基酸224、SEQ ID NO：1或2之胺基酸226、SEQ ID NO：1或2之胺基酸228、SEQ ID NO：1或2之胺基酸413及其任何組合，其中FIX融合蛋白展現促凝血活性。
在一些實施例中，將包含288個胺基酸之XTEN，例如AE288或AG288，插入FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：1或2之胺基酸149、SEQ ID NO：1或2之胺基酸162、SEQ ID NO：1或2之胺基酸166、SEQ ID NO：1或2之胺基酸174、SEQ ID NO：1或2之胺基酸224、SEQ ID NO：1或2之胺基酸226、SEQ ID NO：1或2之胺基酸228、SEQ ID NO：1或2之胺基酸413及其任何組合，其中FIX融合 蛋白展現促凝血活性。
在又其他實施例中，將包含864個胺基酸之XTEN，例如AE864或AG8648，插入FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：1或2之胺基酸149、SEQ ID NO：1或2之胺基酸162、SEQ ID NO：1或2之胺基酸166、SEQ ID NO：1或2之胺基酸174、SEQ ID NO：1或2之胺基酸224、SEQ ID NO：1或2之胺基酸224、SEQ ID NO：1或2之胺基酸226、SEQ ID NO：1或2之胺基酸228、SEQ ID NO：1或2之胺基酸413及其任何組合，其中FIX融合蛋白展現促凝血活性。
本發明之FIX融合蛋白可另外包含插入FIX內、與FIX之C末端融合或兩者的第二異源部分，例如第二XTEN。該第二異源部分可插入FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：1或2之胺基酸103、SEQ ID NO：1或2之胺基酸105、SEQ ID NO：1或2之胺基酸142、SEQ ID NO：1或2之胺基酸149、SEQ ID NO：1或2之胺基酸162、SEQ ID NO：1或2之胺基酸166、SEQ ID NO：1或2之胺基酸174、SEQ ID NO：1或2之胺基酸224、SEQ ID NO：1或2之胺基酸226、SEQ ID NO：1或2之胺基酸228、SEQ ID NO：1或2之胺基酸413及其任何組合，或其中該第二XTEN與FIX多肽之C末端融合。在一些實施例中，將第一XTEN及第二XTEN分別插入FIX多肽內對應於選自由以下組成 之群的SEQ ID NO：1或2之胺基酸的插入位點及/或與FIX多肽之C末端融合：SEQ ID NO：1或2之胺基酸105及SEQ ID NO：1或2之胺基酸166；SEQ ID NO：1或2之胺基酸105及SEQ ID NO：1或2之胺基酸224；SEQ ID NO：1或2之胺基酸105及與C末端融合；SEQ ID NO：1或2之胺基酸166及SEQ ID NO：1或2之胺基酸224；SEQ ID NO：1或2之胺基酸166及與C末端融合；以及SEQ ID NO：1或2之胺基酸224及與C末端融合。在一個實施例中，將第一XTEN插入FIX多肽內對應於SEQ ID NO：1或2之胺基酸166的插入位點，且第二XTEN與FIX多肽之C末端融合。
該第二XTEN可包含至少約6個胺基酸、至少約12個胺基酸、至少約36個胺基酸、至少約42個胺基酸、至少約72個胺基酸、至少約144個胺基酸或至少約288個胺基酸。在一些實施例中，該第二XTEN包含6個胺基酸、12個胺基酸、36個胺基酸、42個胺基酸、72個胺基酸、144個胺基酸或288個胺基酸。該第二XTEN可選自由以下組成之群：AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、AG144及其任何組合。在一特定實施例中，該第二XTEN為AE72或AE144。
在一特定實施例中，該第二XTEN包含與選自由以下組成之群之氨基酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約 97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列：SEQ ID NO：34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53及其任何組合。
在一些實施例中，FIX融合蛋白另外包含第三、第四、第五及/或第六XTEN。
在一些實施例中，FIX融合蛋白包含與選自由不含信號肽及前肽序列之SEQ ID NO：54至SEQ ID NO：153組成之群的序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在某些實施例中，FIX融合蛋白包含選自由不含信號肽及前肽序列之SEQ ID NO：54至SEQ ID NO：153組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，FIX融合蛋白包含與選自由不含信號肽及前肽序列之SEQ ID NO：119、120、121及123組成之群的序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。在另一實施例中，FIX融合蛋白包含選自由不含信號肽及前肽序列之SEQ ID NO：119、120、123、121及226或122組成之群的胺基酸序列。在一些實施例中，FIX融合蛋白係選自由以下組成之群：FIX-AP.72、FIX-AP.144、FIX-CT.72、FIX-CT.144、FIX-AP.288及FIX-CT.288，該等融合蛋白不含信號肽及前肽序列。
在一些實施例中，FIX融合蛋白包含兩種不同類型之異源部分。在一些實施例中，FIX融合蛋白包含FIX多肽、XTEN及Fc結構域(或FcRn結合搭配物)或其片段。在一些實施例中，XTEN插入FIX內，且Fc結構域(或FcRn結合搭配物)或其片段與FIX之C末端融合。在一些實施例中，XTEN插入FIX多肽內選自表3中所列插入位點之一或多個插入位點。在一個實施例中，XTEN插入FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：1或2之胺基酸103、SEQ ID NO：1或2之胺基酸105、SEQ ID NO：1或2之胺基酸142、SEQ ID NO：1或2之胺基酸149、SEQ ID NO：1或2之胺基酸162、SEQ ID NO：1或2之胺基酸166、SEQ ID NO：1或2之胺基酸174、SEQ ID NO：1或2之胺基酸224、SEQ ID NO：1或2之胺基酸226、SEQ ID NO：1或2之胺基酸228、SEQ ID NO：1或2之胺基酸413及其任何組合；且Fc結構域(或FcRn結合搭配物)或其片段與FIX之C末端融合。在某些實施例中，XTEN插入FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：1或2之胺基酸105、SEQ ID NO：1或2之胺基酸166及SEQ ID NO：1或2之胺基酸224；且Fc結構域(或FcRn結合搭配物)或其片段與FIX之C末端融合。在一些實施例中，XTEN係選自AE42、AE72及AE144。
在本發明某些態樣中，FIX融合蛋白包含一條或兩條多肽鏈。在一個實施例中，FIX融合蛋白包含兩條 多肽鏈，其中第一多肽鏈包含與Fc結構域(或FcRn結合搭配物)融合之FIX多肽，且第二多肽鏈包含第二Fc結構域，其中第一Fc結構域(或FcRn結合搭配物)與第二Fc結構域(或FcRn結合搭配物)藉由共價鍵締合。
在另一實施例中，FIX融合蛋白包含單一多肽鏈，該多肽鏈包含FIX多肽及Fc結構域(或FcRn結合搭配物)。在一特定實施例中，FIX融合蛋白另外包含連接子，該連接子連接FIX多肽及Fc結構域(或FcRn結合搭配物)。在另一實施例中，FIX融合蛋白包含FIX多肽、Fc結構域及第二Fc結構域(或FcRn結合搭配物)。在一特定實施例中，FIX融合蛋白另外包含連接子，該連接子連接Fc結構域(或FcRn結合搭配物)與第二Fc結構域(或FcRn結合搭配物)。在另一實施例中，FIX融合蛋白包含FIX多肽、Fc結構域(或FcRn結合搭配物)及第二Fc結構域(或FcRn結合搭配物)，其中FIX多肽藉由連接子連接至Fc結構域(或FcRn結合搭配物)。在另一實施例中，FIX融合蛋白包含FIX多肽、Fc結構域(或FcRn結合搭配物)及第二Fc結構域(或FcRn結合搭配物)，其中FIX多肽藉由第一連接子連接至Fc結構域(或FcRn結合搭配物)，且其中該Fc結構域(或FcRn結合搭配物)藉由連接子連接至第二Fc結構域(或FcRn結合搭配物)。在某些實施例中，FIX融合蛋白包含選自由以下組成之群之式：(i)FIX(X)-F1；(ii)FIX(X)-L1-F1； (iii)FIX(X)-F1-F2；(iv)FIX(X)-L1-F1-F2；(v)FIX(X)-L1-F1-L2-F2；(vi)FIX(X)-F1-I1-F2；(vii)FIX(X)-F1：F2；(viii)FIX(X)-L1-F1：F2；及(ix)其任何組合，其中FIX(X)為具有XTEN插入一或多個本文所描述之插入位點之FIX多肽；L1及L2各自為連接子；F1為Fc結構域或FcRn結合搭配物；F2為第二Fc結構域或第二FcRn結合搭配物；(-)為肽鍵或者一或多個胺基酸；且(：)為共價鍵，例如二硫鍵。
該等連接子(L1及L2)可相同或不同。連接子可為可裂解或不可裂解連接子，且連接子可包含一或多個細胞內加工位點。連接子之非限制性實例在本文中其他地方描述。可使用任何連接子將FIX與異源部分(例如XTEN或Fc)組合或將第一異源部分(例如第一Fc)與第二異源部分(例如第二Fc)組合。
在某些實施例中，連接子包含凝血酶裂解位點。在一特定實施例中，凝血酶裂解位點包含XVPR，其中X為任何脂族胺基酸(例如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸)。在一特定實施例中，凝血酶裂解位點包含LVPR。在一些實施例中，連接子包含PAR1外結合位點相互作用基元，其包含SFLLRN(SEQ ID NO： 190)。在一些實施例中，PAR1外結合位點相互作用基元另外包含選自以下之胺基酸序列：P、PN、PND、PNDK(SEQ ID NO：191)、PNDKY(SEQ ID NO：192)、PNDKYE(SEQ ID NO：193)、PNDKYEP(SEQ ID NO：194)、PNDKYEPF(SEQ ID NO：195)、PNDKYEPFW(SEQ ID NO：196)、PNDKYEPFWE(SEQ ID NO：197)、PNDKYEPFWED(SEQ ID NO：198)、PNDKYEPFWEDE(SEQ ID NO：199)、PNDKYEPFWEDEE(SEQ ID NO：200)、PNDKYEPFWEDEES(SEQ ID NO：201)或其任何組合。在其他實施例中，連接子包含FXIa裂解位點LDPR。
在一特定實施例中，FIX融合蛋白包含FIX多肽及異源部分，該異源部分包含XTEN，其中XTEN在存在或不存在連接子(該連接子可為可裂解或不可裂解的)情況下與FIX多肽之C末端融合，且包含長度超過42個胺基酸且短於864個胺基酸，較佳長度短於144個胺基酸之胺基酸序列。XTEN包含的胺基酸序列可超過42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或71個胺基酸且短於140、139、138、137、136、135、134、133、132、131、130、129、128、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、115、114、113、112、111、110、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100、99、98、97、 96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、76、75、74或73個胺基酸等，或其任何組合。在一些實施例中，XTEN為72個胺基酸長。在一特定實施例中，XTEN為AE72。在另一實施例中，XTEN包含與SEQ ID NO：35具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，FIX融合蛋白包括含有至少一個插入之XTEN序列之FIX多肽及包含XTEN之異源部分，其中XTEN在存在或不存在連接子(該連接子可為可裂解或不可裂解的)情況下與FIX多肽之C末端融合。在一些實施例中，XTEN之長度短於864個胺基酸，較佳短於144個胺基酸。在其他實施例中，XTEN包含長度短於244、140、130、120、110、100、90、80或75個胺基酸之胺基酸序列。
在其他實施例中，FIX融合蛋白包含選自由以下組成之群之式：(i)FIX-X(ii)FIX-L1-X(iii)FIX(X)-X(iv)FIX(X)-L1-X(v)FIX(X)-L1：X(vi)其任何組合， 其中FIX為FIX多肽；FIX(X)為具有至少一個XTEN插入一或多個本文所描述之插入位點之FIX多肽；(X)為超過42個胺基酸且短於144個胺基酸之XTEN；X為超過42個胺基酸且短於864個胺基酸，諸如288個胺基酸，較佳短於144個胺基酸之XTEN(例如具有72個胺基酸之XTEN)；L1為連接子；(-)為肽鍵或者一或多個胺基酸；且(：)為共價鍵，例如二硫鍵。
連接子(L1)可相同或不同。必要時，連接子可為可裂解或不可裂解連接子，且連接子可包含一或多個細胞內加工位點。連接子之非限制性實例在本文中其他地方描述。可使用任何連接子將FIX與異源部分(例如XTEN或Fc)組合。以下為適於許多發明實施例之連接子的，非限制性實例：a)GPEGPSKLTRAET GAGSPGAETAEQKLISEEDLSPATGHHHHHHHH(SEQ ID NO：219，凝血酶)；b)GAGSPGAETALVPR GAGSPGAETAG(SEQ ID NO：220，凝血酶-PAR1)；c)GAGSPGAETALVPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEE SGAGSPGAETA(SEQ ID NO：221)；d)GPEGPSKLTRAET GAGSPGAETA(SEQ ID NO：222)e)GGGGALRPRV VGGAGSPGAETA(SEQ ID NO：223)f)GGGGTLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEE KGGAGSPGAETA(SEQ ID NO：224)g)GGAGSPGAETA(SEQ ID NO：225)
在某些實施例中，連接子包含凝血酶裂解位點。在一特定實施例中，凝血酶裂解位點包含XVPR，其中X為任何脂族胺基酸(例如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸)。在一特定實施例中，凝血酶裂解位點包含LVPR。在一些實施例中，連接子包含PAR1外結合位點相互作用基元，其包含SFLLRN(SEQ ID NO：190)。在一些實施例中，PAR1外結合位點相互作用基元另外包含選自以下之胺基酸序列：P、PN、PND、PNDK(SEQ ID NO：191)、PNDKY(SEQ ID NO：192)、PNDKYE(SEQ ID NO：193)、PNDKYEP(SEQ ID NO：194)、PNDKYEPF(SEQ ID NO：195)、PNDKYEPFW(SEQ ID NO：196)、PNDKYEPFWE(SEQ ID NO：197)、PNDKYEPFWED(SEQ ID NO：198)、PNDKYEPFWEDE(SEQ ID NO：199)、PNDKYEPFWEDEE(SEQ ID NO：200)、PNDKYEPFWEDEES(SEQ ID NO：201)或其任何組合。在某些其他實施例中，連接子包括含LDPR之FXIa裂解位點，其可與PAR1外結合位點相互作用基元組合。
在某些實施例中，在C末端與XTEN融合之FIX多肽可另外包含第二XTEN。該第二XTEN可融合於或插入FIX融合蛋白之任何部分，包括(但不限於)本文所揭示之插入位點。FIX融合蛋白可另外包含第三XTEN、第四XTEN、第五XTEN或第六XTEN。
本發明之FIX融合蛋白保持與原生FIX相當之活性水準。在一些實施例中，FIX融合蛋白具有原生 FIX之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或100%之促凝血活性。促凝血活性可藉由此項技術中已知之任何方法量測，包括(但不限於)發色基質分析、單級凝結分析或兩者。
II.A. 因子IX
人因子IX(FIX)係一種絲胺酸蛋白酶，其為血液凝固級聯之固有路徑中的重要組分。如本文所用，「因子IX」或「FIX」係指凝血因子蛋白質及其種類及序列變異體，且包括(但不限於)人FIX前體多肽之具有461個胺基酸之單鏈序列(「前原」)、成熟人FIX之具有415個胺基酸之單鏈序列(SEQ ID NO：1)及R338L FIX(Padua)變異體(SEQ ID NO：2)。FIX包括具有凝血FIX之典型特徵的任何形式之FIX分子。如本文所用，「因子IX」及「FIX」意欲涵蓋包含結構域Gla(含有γ-羧基麩胺酸殘基之區域)、EGF1及EGF2(含有與人表皮生長因子同源之序列的區域)、活化肽(「AP」，由成熟FIX之殘基R136-R180形成)及C末端蛋白酶結構域(「Pro」)，或此項技術中已知的該等結構域之同義詞，或可為保持原生蛋白質之至少一部分生物活性的截短片段或序列變異體。FIX或序列變異體已經選殖，如美國專利第4,770,999號及第7,700,734號中所描述，且編碼人因子IX之cDNA已經分離，表徵且被選殖至表現載體中(參見例如，Choo等人， Nature 299：178-180(1982)；Fair等人，Blood 64：194-204(1984)；及Kurachi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.79：6461-6464(1982))。一個特定FIX變異體為由Simioni等人，2009表徵之R338L FIX(Padua)變異體(SEQ ID NO：2)，其包含功能獲得突變，該突變與Padua變異體活性相對於原生FIX有近8倍增加相關(表1)。FIX變異體亦可包括具有一或多個保守胺基酸取代之任何FIX多肽，該一或多個取代不會影響FIX多肽之FIX活性。
Figure 105124637-A0202-12-0052-834
FIX多肽為55kDa，以由以下三個區構成之前體多肽原鏈(SEQ ID NO：1)形式合成：具有28個胺基酸之信號肽(SEQ ID NO：3之胺基酸1至28)、麩胺酸殘基γ-羧基化所需的具有18個胺基酸之前肽(胺基酸29至46)及具有415個胺基酸之成熟因子IX(SEQ ID NO：1或2)。前肽係在γ-羧基麩胺酸結構域N末端之具有18個胺基酸殘基之序列。前肽結合維生素K依賴性γ羧化酶，且接著經內源蛋白酶，最可能是PACE(成對鹼性胺基酸裂解酶，又稱為弗林蛋白酶(furin)或PCSK3)自FIX之前體多肽裂解。若不發生γ羧基化，則Gla結構域無法結合鈣以呈現將蛋白質錨定於帶負電之磷脂表面所需之正確構形，由此使因子IX沒有功能。即使其經羧基化，Gla結構域亦取決於前肽之裂解而獲得適當功能，因為保留之前肽干擾Gla結構域與鈣及磷脂最佳結合所需之構形變化。在人體中，所得成熟因子IX係由肝細胞以無活性酶原形式分泌至血流中，該酶原為以重量計含有約17%碳水化合物的具有415個胺基酸殘基之單鏈蛋白質(Schmidt,A.E.等人(2003)Trends Cardiovasc Med,13：39)。
成熟FIX係由若干結構域構成，該等結構域以N末端至C末端配置為：GLA結構域、EGF1結構域、EGF2結構域、活化肽(AP)結構域及蛋白酶(催化)結構域。短連接子將EGF2結構域與AP結構域相連接。FIX含有分別由R145-A146及R180-V181形成之兩個活化肽。活化後，單鏈FIX變為具有2條鏈之分子，其中該兩 條鏈係藉由二硫鍵連接。凝血因子可藉由置換其活化肽引起活化特異性之改變來進行工程改造。在哺乳動物中，成熟FIX必須由活化因子XI活化以得到因子IXa。在FIX活化成FIXa之後，蛋白酶結構域提供FIX之催化活性。活化因子VIII(FVIIIa)係完整表現FIXa活性之特定輔因子。
在其他實施例中，FIX多肽包含血漿源性因子IX之Thr148等位基因形式且具有與內源因子IX類似之結構及功能特徵。
已知許多功能性FIX變異體。國際公開案第WO 02/040544 A3號在第4頁第9-30列及第15頁第6-31列揭示了對肝素抑制作用之展現較高抗性的突變體。國際公開案第WO 03/020764 A2號在表2及表3(第14-24頁)中及在第12頁第1-27列揭示T細胞免疫原性降低之FIX突變體。國際公開案第WO 2007/149406 A2號在第4頁第1列至第19頁第11列揭示展現較高蛋白質穩定性、較長活體內及活體外半衰期及較高的對蛋白酶之抗性的功能性突變FIX分子。WO 2007/149406 A2亦在第19頁第12列至第20頁第9列揭示嵌合及其他變異體FIX分子。國際公開案第WO 08/118507 A2號在第5頁第14列至第6頁第5列揭示展現較高凝血活性之FIX突變體。國際公開案第WO 09/051717 A2號在第9頁第11列至第20頁第2列揭示具有使半衰期及/或回收率增加之增加數目之N-連接及/或O-連接糖基化位點的FIX突變體。國際公開案第 WO 09/137254 A2號亦在第2頁第[006]段至第5頁第[011]段及第16頁第[044]段至第24頁第[057]段揭示糖基化位點數增加之因子IX突變體。國際公開案第WO 09/130198 A2號在第4頁第26列至第12頁第6行揭示具有使半衰期增加之增加數目之糖基化位點的功能性突變FIX分子。國際公開案第WO 09/140015 A2號在第11頁第[0043]段至第13頁第[0053]段揭示可用於聚合物(例如PEG)偶聯之Cys殘基之數目增加的功能性FIX突變體。2011年7月11日申請且在2012年1月12日以WO 2012/006624公開之國際申請案第PCT/US2011/043569號中所述之FIX多肽亦以全文引用的方式併入本文中。
此外，已在血友病受試者中鑑別出數百種FIX非功能性突變，其中許多揭示於國際公開案第WO 09/137254 A2號第11-14頁之表5中。此等非功能性突變不包括在本發明中，但提供有關哪些突變很可能或不太可能產生功能性FIX多肽之額外指導。
在一個實施例中，FIX多肽(或融合多肽之因子IX部分)包含與SEQ ID NO：1或2中所陳述之序列(SEQ ID NO：1或2之胺基酸1至415)具有至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列，或者具有前肽序列，或具有前肽及信號序列(全長FIX)。在另一實施例中，FIX包含與SEQ ID NO：2中所陳述之序列具有至少70%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致性的胺基酸序列。
因子IX凝血活性係以國際單位(IU)表示。一個IU之FIX活性近似對應於一毫升正常人類血漿中FIX之量。若干分析可用於量測因子IX活性，包括單級凝結分析(部分活化凝血激酶時間；aPTT)、凝血酶產生時間(TGA)及旋轉式血栓彈力分析儀(ROTEM® )。本發明涵蓋與FIX序列具有同源性之序列、天然序列片段(諸如來自人類；非人類靈長類動物；哺乳動物，包括家養動物)，及保持FIX之至少一部分生物活性或生物功能及/或可用於預防、治療、介導或改善凝血因子相關疾病、缺乏、病症或病狀(例如與外傷、手術或凝血因子缺乏相關之出血事件)的非天然序列變異體。與人FIX同源之序列可藉由標準同源性搜索技術，諸如NCBI BLAST發現。
II.B. 異源部分
本發明之FIX融合蛋白可包含插入FIX多肽內之一或多個位點、與C末端融合或兩者之至少一個異源部分，其中FIX融合蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中活體內或活體外表現。「異源部分」可包含異源多肽或非多肽部分或兩者。在某些態樣中，異源部分為XTEN。在一些態樣中，本發明之FIX融合蛋白包含插入FIX多肽內之一或多個位點的至少一個XTEN。在其他態樣中，FIX融合蛋白包含插入FIX多肽內之一或多個位點的至少 一個異源部分，其中該異源部分為半衰期延長部分(例如活體內半衰期延長部分)。
咸信FIX保留至少一部分其促凝血活性之插入位點的發現亦將允許將具有與在融合於FIX蛋白時延長半衰期相關之非結構化或結構化特徵的其他肽及多肽插入於彼等位點中之一或多者中。異源部分(例如半衰期延長部分)之非限制性實例包括白蛋白；白蛋白片段；免疫球蛋白之Fc片段；FcRn結合搭配物；人類絨毛膜促性腺素β次單位之C末端肽(CTP)；HAP序列；轉鐵蛋白(transferrin)；美國專利申請案第20100292130號之PAS多肽；聚甘胺酸連接子；聚絲胺酸連接子；具有6-40個選自甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)之兩種類型胺基酸之胺基酸且具有小於50%至大於50%之不同程度之二級結構的肽及短多肽，將尤其適於插入於所鑑別之FIX活性插入位點中。
在某些態樣中，異源部分使重組FIX蛋白之活體內或活體外半衰期延長。在其他態樣中，異源部分有助於可視化或定位FIX融合蛋白。FIX融合蛋白之可視化及/或定位可在活體內、活體外、離體或以其組合方式進行。在其他態樣中，異源部分使FIX融合蛋白之穩定性增強。如本文所用，術語「穩定性」係指FIX融合蛋白響應於環境條件(例如溫度升高或降低)而保持一或多種物理特性的此項技術公認之量度。在某些態樣中，物理特性為維持FIX融合蛋白之共價結構(例如不存在蛋白水解裂解、 不必要之氧化或脫醯胺)。在其他態樣中，物理特性亦可為呈適當折疊狀態之FIX融合蛋白之存在(例如不存在可溶性或不溶性聚集物或沈澱物)。在一個態樣中，藉由分析FIX融合蛋白之生物物理特性，例如熱穩定性、pH展開型態、聚醣之穩定移除、溶解性、生物化學功能(例如結合至另一蛋白質之能力)等及/或其組合來量測FIX融合蛋白之穩定性。在另一態樣中，生物化學功能係藉由相互作用之結合親和力來說明。在一個態樣中，蛋白質穩定性之量度為熱穩定性，亦即，對熱激發之抗性。穩定性可使用此項技術中已知之方法量測，諸如HPLC(高效液相層析)、SEC(尺寸排阻層析)、DLS(動態光散射)等。量測熱穩定性之方法包括(但不限於)差示掃描量熱法(DSC)、差示掃描螢光測定法(DSF)、圓偏光二色性(CD)及熱激發分析。
在一特定態樣中，插入FIX融合蛋白中一或多個插入位點中之異源部分保留FIX融合蛋白之生物化學活性。在某些實施例中，異源部分為XTEN。在一個實施例中，生物化學活性為可藉由發色分析量測之FIX活性。
在一些實施例中，至少一個異源部分係經由位於異源部分之N末端、C末端或N末端與C末端兩者處之連接子間接插入於插入位點中。在異源部分之N末端及C末端處之連接子可相同或不同。在一些實施例中，多個連接子可串聯側接異源部分之一個或兩個末端。在一些實施例中，連接子為「Gly-Ser肽連接子」。術語「Gly- Ser肽連接子」係指包含甘胺酸及絲胺酸殘基之肽。
示範性Gly/Ser肽連接子包括(但不限於)胺基酸序列(Gly4 Ser)n (SEQ ID NO：161)，其中n為與以下相同或高於以下的整數1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、46、50、55、60、70、80、90或100。在一個實施例中，n=1，亦即連接子為(Gly4 Ser)(SEQ ID NO：161)。在一個實施例中，n=2，亦即，連接子為(Gly4 Ser)2 (SEQ ID NO：162)。在另一實施例中，n=3，亦即，連接子為(Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO：172)。在另一實施例中，n=4，亦即，連接子為(Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO：173)。在另一實施例中，n=5，亦即，連接子為(Gly4 Ser)5 (SEQ ID NO：174)。在另一實施例中，n=6，亦即，連接子為(Gly4 Ser)6 (SEQ ID NO：175)。在另一實施例中，n=7，亦即，連接子為(Gly4 Ser)7 (SEQ ID NO：176)。在另一實施例中，n=8，亦即，連接子為(Gly4 Ser)8 (SEQ ID NO：177)。在另一實施例中，n=9，亦即，連接子為(Gly4 Ser)9 (SEQ ID NO：178)。在另一實施例中，n=10，亦即，連接子為(Gly4 Ser)10 (SEQ ID NO：179)。
另一示範性Gly/Ser肽連接子包含胺基酸序列Ser(Gly4 Ser)n (SEQ ID NO：180)，其中n為與以下相同或高於以下的整數1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、46、50、55、60、70、80、90或100。在一個實施例中，n=1，亦即，連接子為Ser(Gly4 Ser)(SEQ ID NO：180)。在一個實施例中，n=2， 亦即，連接子為Ser(Gly4 Ser)2 (SEQ ID NO：181)。在另一實施例中，n=3，亦即，連接子為Ser(Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO：182)。在另一實施例中，n=4，亦即，連接子為Ser(Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO：183)。在另一實施例中，n=5，亦即，連接子為Ser(Gly4 Ser)5 (SEQ ID NO：184)。在另一實施例中，n=6，亦即，連接子為Ser(Gly4 Ser)6 (SEQ ID NO：185)。在另一實施例中，n=7，亦即，連接子為Ser(Gly4 Ser)7 (SEQ ID NO：186)。在另一實施例中，n=8，亦即，連接子為Ser(Gly4 Ser)8 (SEQ ID NO：187)。在另一實施例中，n=9，亦即，連接子為Ser(Gly4 Ser)9 (SEQ ID NO：188)。在另一實施例中，n=10，亦即，連接子為Ser(Gly4 Ser)10 (SEQ ID NO：189)。
在某些態樣中，FIX融合蛋白包含插入表7中所列之插入位點的一個異源部分。在其他態樣中，FIX融合蛋白包含插入表7中所列兩個插入位點中之兩個異源部分。在一特定實施例中，該兩個異源部分插入表8中所列之兩個插入位點中。在某些態樣中，FIX融合蛋白包含插入表7中所列三個個插入位點中之三個異源部分。在某些態樣中，FIX融合蛋白包含插入表7中所列四個個插入位點中之四個異源部分。在某些態樣中，FIX融合蛋白包含插入表7中所列五個個插入位點中之五個異源部分。在某些態樣中，FIX融合蛋白包含插入表7中所列六個個插入位點中之六個異源部分。在一些態樣中，所有插入之異源部分皆相同。在其他態樣中，至少一個插入之異源部分不 同於其餘插入之異源部分。
FIX多肽與至少一個異源部分(例如XTEN)融合可影響本發明之融合蛋白的物理或化學特性，例如藥物動力學。在一特定實施例中，連接至FIX蛋白之異源部分增加藥物動力學特性，諸如延長終末半衰期或增加曲線下面積(AUC)，以使本文所述之融合蛋白在活體內停留之時間相較於野生型FIX或缺乏異源部分之相應FIX有所增加。在其他實施例中，用於本發明中之XTEN序列增加至少一種藥物動力學特性，例如增加終末半衰期、增加回收率及/或增加皮下給藥之生物利用率、增加曲線下面積(AUC)，以使FIX蛋白在活體內停留之時間相較於野生型FIX或缺乏異源部分之相應FIX有所增加。
在某些態樣中，使本發明之FIX融合蛋白之半衰期延長的異源部分包含(但不限於)異源多肽，諸如白蛋白、免疫球蛋白Fc區、XTEN序列、人類絨毛膜促性腺素β次單位之C末端肽(CTP)、PAS序列、HAP序列、轉鐵蛋白、白蛋白結合部分，或此等多肽之任何片段、衍生物、變異體或組合。在某些態樣中，本發明之FIX融合蛋白包含使半衰期延長之異源多肽，其中該異源多肽為XTEN序列。在其他相關態樣中，異源部分可包括諸如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、聚唾液酸或此等部分之任何衍生物、變異體或組合之非多肽部分的連接位點。
在其他實施例中，本發明之FIX融合蛋白與一或多種聚合物偶聯。聚合物可為水溶性的或非水溶性 的。聚合物可共價或非共價連接至FIX或連接至與FIX偶聯之其他部分。聚合物之非限制性實例可為聚(氧化烯)、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉或聚(丙烯醯基嗎啉)。
在某些態樣中，本發明之FIX融合蛋白包含一個、兩個、三個或多於三個異源部分，該等異源部分可各自為相同或不同分子。在一些實施例中，FIX融合蛋白包含一或多個XTEN。在其他實施例中，FIX融合蛋白包含一或多個XTEN及一或多個Fc結構域。在一特定實施例中，FIX融合蛋白可包含插入FIX內之XTEN及與FIX之C末端融合之Fc。
本發明之FIX融合蛋白相較於原生FIX、rFIXFc或FIX R338L可惡具有增加之活體內半衰期。在一些實施例中，該FIX融合蛋白之活體內半衰期可為缺乏異源部分之原生FIX或缺乏異源部分之FIX R338L的至少約1.5倍、至少約2倍、至少約3倍或至少約4倍。在一特定實施例中，FIX融合蛋白的活體內半衰期為不含異源部分之FIX多肽之超過2倍。
在其他實施例中，FIX融合蛋白之活體內半衰期可比缺乏異源部分之FIX多肽之活體內半衰期長至少約5小時、至少約6小時、至少約7小時、至少約8小時、至少約9小時、至少約10小時、至少約11小時、至少約12小時、至少約13小時、至少約14小時、至少約15小時、至少約16小時、至少約17小時、至少約18小時、 至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約小時或至少約34小時。
II.B.1. XTEN
在一些實施例中，至少一個異源部分為XTEN。如此處所用，「XTEN序列」係指具有非天然存在、實質上非重複、主要由小親水性胺基酸組成之序列的長度延長之多肽，該序列在生理條件下具有較低程度之二級或三級結構或無二級或三級結構。作為融合蛋白搭配物，XTEN可充當載體，以在連接至本發明之FIX序列以產生融合蛋白時，賦予某些合乎需要之藥物動力學、物理化學及醫藥特性。該等合乎需要之特性包括(但不限於)增強的藥物動力學參數及可溶性特徵。如本文所用，「XTEN」明確排除抗體或抗體片段，諸如單鏈抗體，或者輕鏈或重鏈之Fc片段。
在某些態樣中，本發明之FIX融合蛋白包含至少一個插入FIX中之XTEN或其片段、變異體或衍生物，其中該FIX融合蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中在活體內或活體外表現。在某些態樣中，該等異源部分中之兩者為XTEN序列。在一些態樣中，該等異源部分中 之三者為XTEN序列。在一些態樣中，該等異源部分中之四者為XTEN序列。在一些態樣中，該等異源部分中之五者為XTEN序列。在一些態樣中，該等異源部分中之六者或六者以上為XTEN序列。
在一些實施例中，可用於本發明之XTEN序列為具有超過約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000個胺基酸殘基之肽或多肽。在某些實施例中，XTEN為具有超過約20至約3000個胺基酸殘基、超過30至約2500個殘基、超過40至約2000個殘基、超過50至約1500個殘基、超過60至約1000個殘基、超過70至約900個殘基、超過80至約800個殘基、超過90至約700個殘基、超過100至約600個殘基、超過110至約500個殘基或超過120至約400個殘基之肽或多肽。在一特定實施例中，XTEN包含長度超過42個胺基酸且短於144個胺基酸之氨基酸序列。
本發明之XTEN序列可包含一或多個具有5至14個(例如9至14個)胺基酸殘基之序列基元或與該序列基元至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，其中該基元包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：選自由甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)組成之群的4至6種類型之胺基酸(例如5個胺 基酸)。參見US 2010-0239554 A1。
在一些實施例中，XTEN包含不重疊序列基元，其中約80%、或至少約85%、或至少約90%、或約91%、或約92%、或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%、或約99%或約100%之序列由多個選自由表2A選擇之單一基元家族之不重疊序列之單元組成，從而產生家族序列。如本文所用，「家族」意謂XTEN具有僅選自表2A中之單一基元類別的基元；亦即，AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD XTEN，且選擇XTEN中之不來自家族基元之任何其他胺基酸以達成所需特性，諸如允許藉由編碼核苷酸併入限制位點、併入裂解序列，或達成與FIX之更佳連接。在XTEN家族之一些實施例中，XTEN序列包含以下者之非重疊序列基元之多個單元：AD基元家族、或AE基元家族、或AF基元家族、或AG基元家族、或AM基元家族、或AQ基元家族、或BC家族、或BD家族，所得XTEN顯示上文所述之同源性範圍。在其他實施例中，XTEN包含來自表2A之兩個或超過兩個基元家族之多個基元序列單元。此等序列可經選擇以達成所需物理/化學特徵，包括諸如淨電荷、親水性、缺乏二級結構或缺乏重複性之特性，該等特性係由基元之胺基酸組成賦予，下文將更全面地描述。在以上本段描述之實施例中，併入XTEN中之基元可使用本文所述之方法選擇及組裝以獲得具有約36至約3000個胺基酸殘基之XTEN。
Figure 105124637-A0202-12-0066-835
XTEN可具有不同長度以供插入FIX中或與FIX連接。在一個實施例中，基於欲在融合蛋白中達成之特性或功能選擇XTEN序列之長度。取決於預期特性或功能，XTEN可為可充當載劑的短或中等長度序列或較長序列。在某些實施例中，XTEN包括具有約6至約99個胺基酸殘基的短區段、具有約100至約399個胺基酸殘基的中等長度區段，及具有約400至約1000個且高達約3000個胺基酸殘基的長度較長之區段。因此，插入FIX中或連接至FIX之XTEN之長度可為約6、約12、約36、約40、約42、約72、約96、約144、約288、約400、約500、約576、約600、約700、約800、約864、約900、約1000、約1500、約2000、約2500或至多約3000個胺基酸殘基長。在其他實施例中，XTEN序列長度為約6至約50、約50至約100、約100至150、約150至250、約250至400、約400至約500、約500至約900、約900至1500、約1500至2000或約2000至約3000個胺基酸殘基。插入FIX中或連接至FIX之XTEN之精確長度可不同，而不會不利地影響FIX之活性。在一個實施例中，本文使用之一或多個XTEN具有42個胺基酸、72個胺基酸、144個胺基酸、288個胺基酸、576個胺基酸或864個胺基酸長度且可選自一或多個XTEN家族序列；亦即，AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD。
在一些實施例中，本發明中使用之XTEN序列與選自由以下組成之群之序列至少60%、70%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致：AE42、AG42、AE48、AM48、AE72、AG72、AE108、AG108、AE144、AF144、AG144、AE180、AG180、AE216、AG216、AE252、AG252、AE288、AG288、AE324、AG324、AE360、AG360、AE396、AG396、AE432、AG432、AE468、AG468、AE504、AG504、AF504、AE540、AG540、AF540、AD576、AE576、AF576、AG576、AE612、AG612、AE624、AE648、AG648、AG684、AE720、AG720、AE756、AG756、AE792、AG792、AE828、AG828、AD836、AE864、AF864、AG864、AM875、AE912、AM923、AM1318、BC864、BD864、AE948、AE1044、AE1140、AE1236、AE1332、AE1428、AE1524、AE1620、AE1716、AE1812、AE1908、AE2004A、AG948、AG1044、AG1140、AG1236、AG1332、AG1428、AG1524、AG1620、AG1716、AG1812、AG1908、AG2004及其任何組合。參見US 2010-0239554 A1。在一特定實施例中，XTEN包含AE42、AE72、AE144、AE288、AE576、AE864、AG42、AG72、AG144、AG288、AG576、AG864或其任何組合。
在一個實施例中，XTEN序列與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致：AE36(SEQ ID NO：217)、AE42(SEQ ID NO：34)、AE72(SEQ ID NO：35)、 AE78(SEQ ID NO：218)、AE144(SEQ ID NO：36)、AE144_2A(SEQ ID NO：37)、AE144_3B(SEQ ID NO：38)、AE144_4A(SEQ ID NO：39)、AE144_5A(SEQ ID NO：40)、AE144_6B(SEQ ID NO：41)、AG144(SEQ ID NO：42)、AG144_A(SEQ ID NO：43)、AG144_B(SEQ ID NO：44)、AG144_C(SEQ ID NO：45)、AG144_F(SEQ ID NO：46)、AE288(SEQ ID NO：47)、AE288_2(SEQ ID NO：48)、AG288(SEQ ID NO：49)、AE576(SEQ ID NO：50)、AG576(SEQ ID NO：51)、AE864(SEQ ID NO：52)、AG864(SEQ ID NO：53)、XTEN_AE72_2A_1(SEQ ID NO：202)、XTEN_AE72_2A_2(SEQ ID NO：203)、XTEN_AE72_3B_1(SEQ ID NO：204)、XTEN_AE72_3B_2(SEQ ID NO：205)、XTEN_AE72_4A_2(SEQ ID NO：206)、XTEN_AE72_5A_2(SEQ ID NO：207)、XTEN_AE72_6B_1(SEQ ID NO：208)、XTEN_AE72_6B_2(SEQ ID NO：209)、XTEN_AE72_1A_1(SEQ ID NO：210)、XTEN_AE72_1A_2(SEQ ID NO：211)、XTEN_AE144_1A(SEQ ID NO：212)、AE150(SEQ ID NO：213)、AG150(SEQ ID NO：214)、AE294(SEQ ID NO：215)、AG294(SEQ ID NO：216)及其任何組合。
在一些實施例中，XTEN中少於100%之胺基酸係選自甘胺酸(G)、丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)、麩胺酸(E)及脯胺酸(P)，或少於100%之序列由來自表2A之序列基元或表2B之XTEN序列組成。在此類實 施例中，XTEN之其餘胺基酸殘基係選自其他14個天然L-胺基酸中之任一個，但可優先選自親水性胺基酸，以使XTEN序列含有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少約99%之親水性胺基酸。偶聯構築體中使用之XTEN中疏水性胺基酸之含量可低於5%，或低於2%，或低於1%之疏水性胺基酸含量。較少用於構築XTEN之疏水性殘基包括色胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸及甲硫胺酸。另外，XTEN序列可含有少於5%，或少於4%，或少於3%，或少於2%，或少於1%，或無以下胺基酸：甲硫胺酸(例如用以避免氧化)，或天冬醯胺及麩醯胺酸(用以避免脫醯胺)。
在另一實施例中，XTEN序列係選自由以下組成之群：AE36(SEQ ID NO：217)、AE42(SEQ ID NO：34)、AE72(SEQ ID NO：35)、AE78(SEQ ID NO：218)、AE144(SEQ ID NO：36)、AE144_2A(SEQ ID NO：37)、AE144_3B(SEQ ID NO：38)、AE144_4A(SEQ ID NO：39)、AE144_5A(SEQ ID NO：40)、AE144_6B(SEQ ID NO：41)、AG144(SEQ ID NO：42)、AG144_A(SEQ ID NO：43)、AG144_B(SEQ ID NO：44)、AG144_C(SEQ ID NO：45)、AG144_F(SEQ ID NO：46)、AE288(SEQ ID NO：47)、AE288_2(SEQ ID NO：48)、AG288(SEQ ID NO：49)、AE576(SEQ ID NO：50)、AG576(SEQ ID NO：51)、AE864(SEQ ID NO：52)、AG864(SEQ ID NO：53)、 XTEN_AE72_2A_1(SEQ ID NO：202)、XTEN_AE72_2A_2(SEQ ID NO：203)、XTEN_AE72_3B_1(SEQ ID NO：204)、XTEN_AE72_3B_2(SEQ ID NO：205)、XTEN_AE72_4A_2(SEQ ID NO：206)、XTEN_AE72_5A_2(SEQ ID NO：207)、XTEN_AE72_6B_1(SEQ ID NO：208)、XTEN_AE72_6B_2(SEQ ID NO：209)、XTEN_AE72_1A_1(SEQ ID NO：210)、XTEN_AE72_1A_2(SEQ ID NO：211)、XTEN_AE144_1A(SEQ ID NO：212)、AE150(SEQ ID NO：213)、AG150(SEQ ID NO：214)、AE294(SEQ ID NO：215)、AG294(SEQ ID NO：216)及其任何組合。在一特定實施例中，XTEN序列係選自由以下組成之群：AE72、AE144及AE288。本發明之某些XTEN序列之胺基酸序列顯示於表2B中。
Figure 105124637-A0202-12-0072-836
Figure 105124637-A0202-12-0073-837
Figure 105124637-A0202-12-0074-838
Figure 105124637-A0202-12-0075-839
Figure 105124637-A0202-12-0076-840
Figure 105124637-A0202-12-0077-841
Figure 105124637-A0202-12-0078-842
在其他實施例中，本發明中使用之XTEN序列影響本發明之融合蛋白之物理或化學特性，例如藥物動力學特性。用於本發明中的XTEN序列可顯示以下一或多個有利特性：構形可撓性、增強的水溶解性、高程度的蛋白酶抗性、低免疫原性、對哺乳動物受體的較低結合或增加的流體動力學(或Stokes)半徑。在一特定實施例中，連接至本發明中之FIX蛋白之XTEN序列增加藥物動力學特性，諸如延長終末半衰期或增加曲線下面積(AUC)，以使本文所述之蛋白質在活體內停留之時間相較於野生型FIX有所增加。在其他實施例中，本發明中使用之XTEN序列增加藥物動力學特性，諸如延長終末半衰期或增加曲線下面積(AUC)，以使FIX蛋白質在活體內停留之時間相較於野生型FIX有所增加。
在一些實施例中，FIX蛋白質展現的活體內半衰期為原生FIX、rFIXFc、FIX R338L或缺乏XTEN之相應FIX蛋白質的至少約1.5倍、至少約2倍、至少約3倍 或至少約4倍。在一特定實施例中，FIX融合蛋白的活體內半衰期可為不含異源部分之FIX多肽之超過2倍。
在其他實施例中，FIX融合蛋白展現的活體內半衰期比缺乏異源部分之FIX多肽之活體內半衰期長至少約5小時、至少約6小時、至少約7小時、至少約8小時、至少約9小時、至少約10小時、至少約11小時、至少約12小時、至少約13小時、至少約14小時、至少約15小時、至少約16小時、至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約小時或至少約34小時。
多種方法及分析可用於測定包含XTEN序列之蛋白質之物理/化學特性。該等方法包括(但不限於)分析性離心、EPR、HPLC-離子交換、HPLC-尺寸排阻、反相HPLC、光散射、毛細管電泳、圓偏光二色性、差示掃描量熱法、螢光、HPLC-離子交換、HPLC-尺寸排阻、IR、NMR、拉曼光譜、折射量測法及UV/可見光譜學。其他方法揭示於Amau等人，Prot Expr and Purif 48,1-13(2006)中。
可根據本發明使用之XTEN序列的其他實例揭示於美國專利公開案號2010/0239554 A1、2010/0323956 A1、2011/0046060 A1、2011/0046061 A1、2011/0077199 A1或2011/0172146 A1；或國際專利公開案號WO 2010091122 A1、WO 2010144502 A2、WO 2010144508 A1、WO 2011028228 A1、WO 2011028229 A1、WO 2011028344 A2、WO 2014/011819 A2或WO 2015/023891中。
在一些態樣中，FIX融合蛋白包含插入FIX內、與FIX之C末端融合或兩者的一或多個XTEN序列。在一個實施例中，一或多個XTEN序列插入GLA結構域內。在另一實施例中，一或多個XTEN序列插入EGF1結構域內。在其他實施例中，一或多個XTEN序列插入EGF2內。在又其他實施例中，一或多個XTEN序列插入AP內。在其他實施例中，一或多個XTEN序列插入催化結構域內。在一些實施例中，一或多個XTEN序列與FIX之C末端融合。
在某些態樣中，FIX融合蛋白包含插入表7中所列之插入位點之一個XTEN序列。在其他態樣中，FIX融合蛋白包含插入表7中所列兩個插入位點中之兩個XTEN序列。在一特定實施例中，兩個XTEN序列插入表8中所列之兩個插入位點中。在某些態樣中，FIX融合蛋白包含插入表7中所列三個插入位點中之三個XTEN序列。在某些態樣中，FIX融合蛋白包含插入表7中所列四個插入位點中之四個XTEN序列。在某些態樣中，FIX融合蛋白包含插入表7中所列五個插入位點中之五個XTEN 序列。在某些態樣中，FIX融合蛋白包含插入表7中所列六個插入位點中之六個XTEN序列。在一些態樣中，所有插入之XTEN序列皆相同。在其他態樣中，至少一個插入之XTEN序列不同於其餘插入之XTEN序列。
在一些態樣中，FIX融合蛋白包含插入FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸之插入位點的一個XTEN序列：SEQ ID NO：2之胺基酸103、SEQ ID NO：2之胺基酸105、SEQ ID NO：2之胺基酸142、SEQ ID NO：2之胺基酸149、SEQ ID NO：2之胺基酸162、SEQ ID NO：2之胺基酸166、SEQ ID NO：2之胺基酸174、SEQ ID NO：2之胺基酸224、SEQ ID NO：2之胺基酸226、SEQ ID NO：2之胺基酸228、SEQ ID NO：2之胺基酸413及其任何組合，其中該FIX融合蛋白展現促凝血活性。在一些態樣中，FIX融合蛋白包含在FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸之插入位點的第二XTEN序列：SEQ ID NO：2之胺基酸103、SEQ ID NO：2之胺基酸105、SEQ ID NO：2之胺基酸142、SEQ ID NO：2之胺基酸149、SEQ ID NO：2之胺基酸162、SEQ ID NO：2之胺基酸166、SEQ ID NO：2之胺基酸174、SEQ ID NO：2之胺基酸224、SEQ ID NO：2之胺基酸226、SEQ ID NO：2之胺基酸228、SEQ ID NO：2之胺基酸413及其任何組合，或其中該第二XTEN與FIX多肽之C末端融合，其中該FIX融合蛋白展現促凝血活性。在一特定態樣中，FIX融合蛋白包含與FIX之C末端融合的一個 XTEN序列，其中XTEN包含長度超過42個胺基酸且短於144個胺基酸之胺基酸序列。
II.B.2 Fc區或FcRn結合搭配物
在一些實施例中，該至少一個異源部分為Fc區(例如FcRn結合搭配物)或其片段。在某些態樣中，本發明之FIX融合蛋白包含插入於FIX內、與FIX之C末端融合或兩者之至少一個Fc區(例如FcRn結合搭配物)，其中該FIX融合蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中在活體內或活體外表現。除非另外規定，否則如本文所用，「Fc」或「Fc區」可為包含Fc結構域、其變異體或片段之功能性新生兒Fc受體(FcRn)結合搭配物。FcRn結合搭配物為可由FcRn受體特異性結合，從而藉由FcRn結合搭配物之FcRn受體主動運輸之任何分子。因此，術語Fc包括IgG Fc之任何功能性變異體。IgG之Fc部分中結合至FcRn受體的區域已基於X-射線結晶學進行描述(Burmeister等人，Nature 372 ：379(1994)，其以全文引用之方式併入本文中)。Fc與FcRn之主要接觸區域接近CH2結構域與CH3結構域之接合點。Fc-FcRn接觸區全部在單一Ig重鏈內。結合搭配物的FcRn包括(但不限於)完整IgG、IgG之Fc片段及IgG中包括FcRn之完整結合區之其他片段。Fc可包含免疫球蛋白中具有或不具有免疫球蛋白鉸鏈區之CH2域及CH3域。亦包括融合蛋白中維持Fc區之所需特性(例如延長半衰期，例如活體內半衰 期)之Fc片段、變異體或衍生物。許多突變體、片段、變異體及衍生物描述於例如PCT公開案第WO 2011/069164 A2號、第WO 2012/006623 A2號、第WO 2012/006635 A2號或第WO 2012/006633 A2號中，皆以全文引用的方式併入本文中。
該一或多個Fc結構域可插入FIX多肽內、與該多肽之C末端融合或兩者。在一些實施例中，Fc結構域與FIX多肽融合。在一些實施例中，Fc結構域與另一異源部分，諸如XTEN融合，Fc結構域插入FIX內或與XTEN之C末端融合。在一些實施例中，FIX融合蛋白包含第二Fc結構域。該第二Fc結構域可例如經由一或多個共價鍵與第一Fc結構域締合。
II.B.3. 白蛋白
在一些實施例中，該至少一個異源部分為白蛋白、白蛋白結合結構域或白蛋白結合小分子，或者其變異體、衍生物或片段。在某些態樣中，本發明之FIX融合蛋白包含至少一個插入FIX內、與FIX之C末端融合或兩者之白蛋白多肽或其片段、變異體或衍生物，其中該FIX融合蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中在活體內或活體外表現。人血清白蛋白(HAS或HA)係呈全長形式時具有609個胺基酸之蛋白質，其負責顯著比例的血清滲透壓且亦充當內源性及外源性配位體之載劑。如本文所用，術語「白蛋白」包括全長白蛋白或其功能性片段、變 異體、衍生物或類似物。白蛋白或其片段或變異體之實例揭示於美國專利公開案第2008/0194481A1號、第2008/0004206 A1號、第2008/0161243 A1號、第2008/0261877 A1號或第2008/0153751 A1號或PCT申請公開案第2008/033413 A2號、第2009/058322 A1號或第2007/021494 A2號中，該等公開案以全文引用的方式併入本文中。
白蛋白結合多肽(ABP)可包含(但不限於)可結合白蛋白之細菌白蛋白結合結構域、白蛋白結合肽或白蛋白結合抗體片段。如Kraulis等人，FEBS Lett.378：190-194(1996)及Linhult等人，Protein Sci.11：206-213(2002)所揭示的來自鏈球菌蛋白質G之結構域3為細菌白蛋白結合結構域的一個實例。白蛋白結合肽之實例包括一系列具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO：163)之肽。參見例如Dennis等人，J.Biol.Chem.2002,277：35035-35043(2002)。白蛋白結合抗體片段之實例揭示於Muller及Kontermann,Curr.Opin.Mol.Ther. 9：319-326(2007)；Roovers等人，Cancer Immunol.Immunother. 56：303-317(2007)；及Holt等人，Prot.Eng.Design Sci.,21：283-288(2008)中，該等參考文獻以全文引用的方式併入本文中。
在某些態樣中，本發明之FIX融合蛋白包含可結合至插入FIX中、與FIX之C末端融合或兩者之白蛋白(例如白蛋白結合小分子)之非多肽小分子、其變異體或衍生物的至少一個連接位點，其中該FIX融合蛋白具有 促凝血活性且可在宿主細胞中在活體內或活體外表現。舉例而言，本發明之FIX融合蛋白可包括連接於FIX內之一或多個插入位點中，或與FIX之C末端融合，或兩者的一或多個有機白蛋白結合部分，其中該FIX融合蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中在活體內或活體外表現。此等白蛋白結合部分之實例為如由Trusselet等人，Bioconjugate Chem.20：2286-2292(2009)所揭示之2-(3-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁醯胺基)己酸酯(「Albu」標籤)。
在一些實施例中，白蛋白結合多肽序列係藉由Gly-Ser肽連接子序列側接在C末端、N末端或兩端處。在一些實施例中，Gly-Ser肽連接子為Gly4 Ser(SEQ ID NO：161)。在其他實施例中，Gly-Ser肽連接子為(Gly4 Ser)2 (SEQ ID NO：162)。
II.B.4. CTP
在一些實施例中，至少一個異源部分為人類絨毛膜促性腺素β次單位之C末端肽(CTP)或其片段、變異體或衍生物。在某些態樣中，本發明之FIX融合蛋白包含至少一個插入FIX中、與FIX之C末端融合或兩者之CTP或其片段、變異體或衍生物，其中該FIX融合蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中在活體內或活體外表現。已知一或多個插入重組蛋白中之CTP肽會延長彼蛋白質之半衰期。參見例如美國專利第5,712,122號，以全文引 用之方式併入本文中。示範性CTP肽包括DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO：164)或SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO：165)。參見例如，美國專利申請公開案第US 2009/0087411 A1號，以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，CTP序列係藉由Gly-Ser肽連接子序列側接在C末端、N末端或兩個末端處。在一些實施例中，Gly-Ser肽連接子為Gly4 Ser(SEQ ID NO：161)。在其他實施例中，Gly-Ser肽連接子為(Gly4 Ser)2 (SEQ ID NO：162)。
II.B.5. PAS
在一些實施例中，至少一個異源部分為PAS肽。在某些態樣中，本發明之FIX融合蛋白包含至少一個插入FIX中、與FIX之C末端融合或兩者之PAS肽或其片段、變異體或衍生物，其中該FIX融合蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中在活體內或活體外表現。如本文所用，「PAS肽」或「PAS序列」意謂主要包含丙胺酸及絲胺酸殘基或主要包含丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸殘基之胺基酸序列，該胺基酸序列在生理條件下形成無規捲曲構形。因此，PAS序列為包含丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸；基本上由丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸組成或由丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸組成的可用作融合蛋白中之異源部分之一部分的構築嵌段、胺基酸聚合物或序列卡匣。當除丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸以外之殘基作為次要組分添加於PAS序列中時， 胺基酸聚合物亦可形成無規捲曲構形。「次要組分」意謂除丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸以外之胺基酸可在某種程度上添加於PAS序列中，例如佔該等胺基酸至多約12%，亦即PAS序列之100個胺基酸中有約12個彼等胺基酸；至多約10%；至多約9%；至多約8%；約6%；約5%；約4%；約3%；亦即，約2%或約1%。不同於丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸之胺基酸可選自由以下組成之群：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr及Val。在生理條件下，PAS肽形成無規捲曲構形且藉此可介導本發明重組蛋白之活體內及/或活體外穩定性增強，且具有促凝血活性。
PAS肽之非限制性實例包括ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO：154)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO：155)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO：156)、APSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO：157)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO：158)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO：159)、ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO：160)或其任何變異體、衍生物、片段或組合。PAS序列之其他實例根據例如美國專利公開案第2010/0292130 A1號及PCT申請公開案第WO 2008/155134 A1號可知。歐洲頒布之專利EP2173890。
在一些實施例中，PAS序列係藉由Gly-Ser肽連接子序列側接在C末端、N末端或兩個末端處。在一些實施例中，Gly-Ser肽連接子為Gly4 Ser(SEQ ID NO： 161)。在其他實施例中，Gly/Ser肽連接子為(Gly4 Ser)2 (SEQ ID NO：162)。
II.B.6 HAP
在一些實施例中，該至少一個異源部分為高胺基酸聚合物(HAP)肽或其片段、變異體或衍生物。在某些態樣中，本發明之FIX融合蛋白包含至少一個插入FIX內、與FIX之C末端融合或兩者之高胺基酸聚合物(HAP)肽或其片段、變異體或衍生物，其中該FIX融合蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中在活體內或活體外表現。HAP肽可包含甘胺酸重複序列，其長度為至少50個胺基酸、至少100個胺基酸、120個胺基酸、140個胺基酸、160個胺基酸、180個胺基酸、200個胺基酸、250個胺基酸、300個胺基酸、350個胺基酸、400個胺基酸、450個胺基酸或500個胺基酸。HAP序列能夠延長融合於或連接至HAP序列之部分的半衰期。HAP序列之非限制性實例包括(但不限於)(Gly)n 、(Gly4 Ser)n 或S(Gly4 Ser)n ，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一個實施例中，n為20、21、22、23、24、25、26、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在一個實施例中，n為50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200。參見例如Schlapschy M等人，Protein Eng.Design Selection,20：273-284 (2007)。
II.B.7. 有機聚合物
在一些實施例中，該至少一個異源部分為有機聚合物，例如聚乙二醇、聚唾液酸或羥乙基澱粉。在某些態樣中，本發明之FIX融合蛋白包含插入FIX中、與FIX之C末端融合或兩者之非多肽異源部分或其片段、變異體或衍生物的至少一個連接位點，其中該FIX融合蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中在活體內或活體外表現。舉例而言，本發明之FIX融合蛋白可包括連接於FIX序列內、連接至FIX之C末端，或兩者的一或多個聚乙二醇(PEG)部分，其中該FIX融合蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中在活體內或活體外表現。
聚乙二醇化FIX可指FIX與至少一個聚乙二醇(PEG)分子之間形成的偶聯物。可購得在多種分子量及平均分子量範圍內的PEG。PEG平均分子量範圍之典型實例包括(但不限於)約200、約300、約400、約600、約1000、約1300-1600、約1450、約2000、約3000、約3000-3750、約3350、約3000-7000、約3500-4500、約5000-7000、約7000-9000、約8000、約10000、約8500-11500、約16000-24000、約35000、約40000、約60000及約80000道爾頓。此等平均分子量僅作為實例提供且不意欲以任何方式具有限制性。
本發明之FIX融合蛋白可經聚乙二醇化以包 括單個或多個(例如2-4個)PEG部分。聚乙二醇化可藉由此項技術中已知之聚乙二醇化反應中之任一種進行。製備聚乙二醇化蛋白質產物之方法一般將包括(i)使多肽與聚乙二醇(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在使本發明之肽連接至一或多個PEG基團之條件下反應；及(ii)獲得反應產物。一般而言，反應之最佳反應條件將基於已知參數及所需結果根據具體情況來確定。
存在許多可為熟習此項技術者可利用的PEG連接方法，例如Malik F等人，Exp.Hematol. 20：1028-35(1992)；Francis,Focus on Growth Factors 3(2)：4-10(1992)；歐洲專利公開案第EP0401384號、第EP0154316號及第EP0401384號；及國際專利申請公開案第WO92/16221號及第WO95/34326號。作為非限制性實例，FIX變異體可在如本文所述之一或多個插入位點處或其附近含有半胱胺酸取代，且半胱胺酸可進一步與PEG聚合物偶聯。參見Mei等人，Blood 116：270-279(2010)及美國專利第7,632,921號，其以全文引用的方式併入本文中。
在其他實施例中，有機聚合物為聚唾液酸(PSA)。PSA為由某些細菌菌株及在哺乳動物中於某些細胞中產生之唾液酸之天然存在之未分支聚合物。參見例如，Roth J.等人(1993)Polysialic Acid：From Microbes to Man ,Roth J.,Rutishauser U.,Troy F.A.編(BirkhäuserVerlag,Basel,Switzerland)，第335-348頁。PSA可藉由有限酸水 解或藉由用神經胺糖酸苷酶(neuraminidase)消化或藉由份化聚合物之天然細菌源性形式來以自n=約80個或80個以上唾液酸殘基至n=2之各種聚合度產生。存在許多可為熟習此項技術者所用之PSA連接方法，例如上述相同PEG連接方法。在某些態樣中，活化PSA亦可連接至FIX上之半胱胺酸胺基酸殘基。參見例如美國專利第5846951號。
在其他實施例中，有機聚合物為羥乙基澱粉(HES)聚合物。在某些態樣中，本發明之FIX融合蛋白包含至少一個偶聯於FIX內之一或多個位點、與FIX之C末端融合或兩者之HES聚合物，其中該重組FIX蛋白具有促凝血活性且可在宿主細胞中在活體內或活體外表現。
III. 聚核苷酸、載體、宿主細胞及製備方法
本發明另外提供一種編碼本文所描述之FIX融合蛋白之聚核苷酸、包含該聚核苷酸之表現載體、包含該聚核苷酸或該載體之宿主細胞，或製備該FIX融合蛋白之方法。
編碼FIX融合蛋白之聚核苷酸可為單一核苷酸序列、兩個核苷酸序列、三個核苷酸序列或更多核苷酸序列。在一個實施例中，單一核苷酸序列編碼包含FIX多肽及異源部分(例如XTEN)之FIX融合蛋白，例如包含FIX多肽及插入FIX多肽內之XTEN、與FIX多肽之C末端融合之Fc結構域及藉由可選連接子與FIX多肽融合之 第二Fc結構域的FIX融合蛋白。在另一實施例中，多核苷酸包含兩個核苷酸序列，第一核苷酸序列編碼FIX多肽及插入FIX多肽內之XTEN，且第二核苷酸序列編碼異源部分，例如Fc。在其他實施例中，多核苷酸包含兩個核苷酸序列，第一核苷酸序列編碼FIX多肽、插入FIX多肽內之XTEN及與FIX多肽融合之Fc結構域，且第二核苷酸序列編碼第二Fc結構域。編碼的Fc結構域可在表現後形成共價鍵。
在一些實施例中，編碼FIX融合蛋白之多核苷酸經密碼子優化。
如本文所用，表現載體係指含有在引入適當宿主細胞中時插入之編碼序列轉錄及轉譯所必需之元件，或在RNA病毒載體之情況下複製及轉譯所必需之元件的任何核酸構築體。表現載體可包括質體、噬菌粒、病毒及其衍生物。
如本文所用之基因表現控制序列為有助於可操作地連接之編碼核酸之高效轉錄及轉譯的任何調控性核苷酸序列，諸如啟動子序列或啟動子-增強子組合。基因表現控制序列可例如為哺乳動物或病毒啟動子，諸如組成性或誘導性啟動子。組成性哺乳動物啟動子包括(但不限於)以下基因之啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)、腺苷去胺酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子及其他組成性啟動子。在真核細胞中組成性起作用之示範性病毒啟動子包括例如來自細胞巨大病毒(CMV)、猿猴病毒 (例如SV40)、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、細胞巨大病毒、莫洛尼白血病病毒(Moloney leukemia virus)之長末端重複序列(LTR)及其他反轉錄病毒之啟動子、及單純性皰疹病毒之胸苷激酶啟動子。一般熟習此項技術者已知其他組成性啟動子。可用作本發明之基因表現序列之啟動子亦包括誘導性啟動子。誘導性啟動子在誘導劑存在下表現。舉例而言，誘導金屬硫蛋白啟動子以促進在某些金屬離子存在下之轉錄及轉譯。其他誘導性啟動子為一般熟習此項技術者所知。
出於本發明之目的，可採用眾多表現載體系統。該等表現載體通常可在宿主生物體中作為游離基因體或作為宿主染色體DNA之整體部分複製。表現載體可包括表現控制序列，包括但不限於，啟動子(例如天然締合或異源啟動子)、增強子、信號序列、剪接信號、增強子元件及轉錄終止序列。較佳地，表現控制序列為在能夠轉型或轉染真核宿主細胞之載體中的真核啟動子。表現載體亦可利用來源於動物病毒，諸如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、桿狀病毒、反轉錄病毒(RSV、MMTV或MOMLV)、細胞巨大病毒(CMV)或SV40病毒之DNA元件。其他涉及使用具有內部核糖體結合位點之多順反子系統。
通常，表現載體含有選擇標記物(例如胺苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性或新黴素抗性)以容 許偵測經所需DNA序列轉型之細胞(參見例如，Itakura等人，美國專利第4,704,362號)。將DNA整合至染色體中之細胞可藉由引入一或多個允許選擇經轉染宿主細胞之標記物來進行選擇。標記物可向具有生物殺滅劑抗性(例如抗生素)或對諸如銅之重金屬具有抗性的營養缺陷型宿主提供原營養。可選擇標記物基因可直接連接至待表現之DNA序列，或藉由共轉型引入該細胞中。
可用於表現優化之FIX序列之載體的實例為NEOSPLA(美國專利第6,159,730號)。該載體含有細胞巨大病毒啟動子/增強子、小鼠β球蛋白主要啟動子、SV40複製起點、牛生長激素聚腺苷酸化序列、新黴素磷酸轉移酶外顯子1及外顯子2、二氫葉酸還原酶基因及前導序列。已發現，該載體在併入可變區及恆定區基因、在細胞中轉染隨後在含G418之培養基中選擇並進行甲胺喋呤擴增後以極高水準表現抗體。載體系統亦於美國專利第5,736,137號及第5,658,570號中教示，其各自以全文引用之方式併入本文中。該系統提供高表現水準，例如>30皮克/細胞/天。其他示範性載體系統揭示於例如美國專利第6,413,777號中。
在其他實施例中，本發明之多肽可使用多順反子構築體表現。在此等表現系統中，可自單個多順反子構築體產生多個所關注基因產物，諸如多聚體結合蛋白質之多個多肽。此等系統宜使用內部核糖體入口位點(IRES)以在真核宿主細胞中提供相對較高含量之多肽。適用 IRES序列揭示於美國專利第6,193,980號，該案亦併入本文中。
更一般而言，一旦製備出編碼多狀之載體或DNA序列，即可將該表現載體引入適當宿主細胞中。亦即，宿主細胞可經轉型。將質體引入宿主細胞中可藉由如以上所論述的熟習此項技術者熟知之各種技術實現。轉型之細胞在適於產生FIX多肽之條件下生長，且針對FIX多肽合成進行分析。示範性分析技術包括酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或螢光活化細胞分選器分析(FACS)、免疫組織化學及其類似技術。
在對用於自重組寄主分離多肽之方法的描述中，除非另外清楚地指明，否則術語「細胞」及「細胞培養物」可互換使用以指示多肽之來源。換言之，自「細胞」回收多肽可意謂自短暫離心之完整細胞或自含有培養基及懸浮細胞之細胞培養物中回收。
用於表現蛋白質之宿主細胞較佳為哺乳動物來源；最佳為人類或小鼠來源。示範性宿主細胞株已於上文描述。在產生具有FIX活性之多肽之方法的一個實施例中，宿主細胞為HEK293細胞。在產生具有FIX活性之多肽之方法的另一實施例中，宿主細胞為CHO細胞。
編碼本發明多肽之基因亦可在非哺乳動物細胞，諸如細菌或真菌或植物細胞中表現。就這一點而言，應理解，各種單細胞非哺乳動物微生物，諸如細菌，亦可經轉型；亦即，能夠在培養或發酵時生長之該等微生物。 易於轉型之細菌包括腸桿菌科成員，諸如大腸桿菌或沙門氏菌屬菌株；芽孢桿菌科，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )；肺炎球菌屬；鏈球菌屬，及流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae )。另外，應理解，當在細菌中表現時，多肽通常變為包涵體之一部分。該等多肽必須加以分離、純化且隨後組裝成功能性分子。
或者，本發明之聚核苷酸序列可併入轉殖基因中以引入轉殖基因動物之基因組中且隨後在轉殖基因動物之乳汁中表現(參見例如，Deboer等人，US 5,741,957；Rosen,US 5,304,489；及Meade等人，US 5,849,992)。適合轉殖基因包括與來自乳腺特異性基因，諸如酪蛋白或β乳球蛋白之啟動子及增強子可操作連接之多肽編碼序列。
活體外產生允許按比例擴大以得到大量所需多肽。關於在組織培養條件下培養哺乳動物細胞之技術在此項技術中為已知的，且包括均勻懸浮培養，例如在氣升式反應器中或在連續攪拌反應器中的均勻懸浮培養；或固定或截留細胞培養，例如在中空纖維、微囊中，在瓊脂糖微珠或陶瓷匣筒上的培養。必要時及/或需要時，可藉由慣用層析法，例如凝膠過濾、離子交換層析法、經DEAE-纖維素層析或(免疫)親和層析法，例如在合成鉸鏈區多肽之優先生物合成之後或在本文所描述之HIC層析步驟之前或之後，純化多肽之溶液。親和標籤序列(例如His(6)標籤)可視情況連接或包括在多肽序列內以促進下游純化。
一旦表現，即可根據此項技術之標準程序， 包括硫酸銨沉澱、親和管柱層析、HPLC純化、凝膠電泳及其類似方法純化FIX蛋白質(一般參見Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,(1982))。對於醫藥應用，均勻性為至少約90%或95%的實質上純之蛋白質較佳，且98%至99%或更高均勻性最佳。
在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞。如本文所用，真核細胞係指具有胚乳原核之任何動物或植物細胞。動物之真核細胞包括脊椎動物(例如哺乳動物)之細胞，及無脊椎動物(例如昆蟲)之細胞。植物之真核細胞特定言之可包括而不限於酵母細胞。真核細胞不同於例如細菌之原核細胞。
在某些實施例中，真核細胞為哺乳動物細胞。哺乳動物細胞為源於哺乳動物之任何細胞。哺乳動物細胞特定言之包括(但不限於)哺乳動物細胞株。在一個實施例中，哺乳動物細胞為人類細胞。在另一實施例中，哺乳動物細胞為HEK 293細胞，其為一種人類胚腎細胞株。HEK 293細胞可以CRL-1533自Manassas,VA之美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)及以293-H細胞(目錄編號11631-017)或293-F細胞(目錄編號11625-019)自Invitrogen(Carlsbad,Calif.)獲得。在一些實施例中，哺乳動物細胞為PER.C6® 細胞，其為一種源於視網膜之人類細胞株。PER.C6® 細胞可自Crucell(Leiden,The Netherlands)獲得。在其他實施例中，哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。CHO細胞可自美國典 型培養物保藏中心(Manassas,VA.)獲得(例如CHO-K1；CCL-61)。在其他實施例中，哺乳動物細胞為幼小倉鼠腎(BHK)細胞。BHK細胞可自美國典型培養物保藏中心(Manassas,Va.)獲得(例如CRL-1632)。在一些實施例中，哺乳動物細胞為HKB11細胞，其為HEK293細胞與人類B細胞株之雜交細胞株。Mei等人，Mol.Biotechnol.34(2)：165-78(2006)。
在其他實施例中，所轉染細胞經穩定轉染。使用熟習此項技術者已知之習知技術，此等細胞可經選擇且維持為穩定細胞株。
含有蛋白質之DNA構築體之宿主細胞生長在適當生長培養基中。如本文所用，術語「適當生長培養基」意謂含有為細胞生長所需之養分之培養基。為細胞生長所需之養分可包括碳源、氮源、必需胺基酸、維生素、礦物質及生長因子。視情況，培養基可含有一或多種選擇因子。視情況，培養基可含有小牛血清或胎牛血清(FCS)。在一個實施例中，培養基實質上不含有IgG。生長培養基將通常藉由例如藥物選擇或缺乏必需養分來選擇含有DNA構築體之細胞，該必需養分由DNA構築體上或與DNA構築體共轉染之可選擇標記補充。所培養哺乳動物細胞通常生長在市售含血清或不含血清培養基(例如MEM、DMEM、DMEM/F12)中。在一個實施例中，培養基為CD293(Invitrogen,Carlsbad,CA.)。在另一實施例中，培養基為CD17(Invitrogen,Carlsbad,CA.)。對適於所用特 定細胞株之培養基之選擇屬於一般熟習此項技術者之水準。
在一些實施例中，核酸、載體或宿主細胞進一步包含編碼蛋白質轉化酶之另一核苷酸。蛋白質轉化酶可選自由以下組成之群：前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 5型(PCSK5或PC5)、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 7型(PCSK7或PC5)、酵母Kex 2、前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 3型(PACE或PCSK3)及其兩種或兩種以上組合。在一些實施例中，蛋白質轉化酶為PACE、PC5或PC7。在一特定實施例中，蛋白質轉化酶為PC5或PC7。參見國際申請公開案第WO 2012/006623號，其以引用的方式併入本文中。在另一實施例中，蛋白質轉化酶為PACE/弗林蛋白酶。
在某些態樣中，本發明係關於藉由本文所述之方法產生之FIX融合蛋白。
在某些態樣中，本發明之宿主細胞可在活體內或活體外表現FIX融合蛋白。活體外生產允許按比例擴大以得到大量本發明所需之改變之多肽。可藉由在表現FIX融合蛋白之條件下培養本文所描述之宿主細胞來產生FIX融合蛋白。有關在組織培養條件下培養哺乳動物細胞之技術在此項技術中為已知的，且包括均勻懸浮培養，例如在氣升式反應器中或在連續攪拌反應器中的均勻懸浮培養；或固定或截留細胞培養，例如在中空纖維、微囊中，在瓊脂糖微珠或陶瓷匣筒上的培養。必要及/或需要時， 多肽之溶液可藉由慣用層析方法，例如凝膠過濾、離子交換層析、疏水性相互作用層析(HIC)、經DEAE-纖維素層析或親和層析純化。在其他態樣中，宿主細胞在活體內表現FIX融合蛋白。
在一個實施例中，本發明包括一種製備FIX融合蛋白之方法，其包含如本文所描述將異源部分插入於插入位點中、使異源部分與FIX之C末端融合，或兩者，其中該FIX融合蛋白展現促凝血活性。
在另一實施例中，本發明包括一種增加FIX蛋白質之半衰期，同時不消除或降低FIX蛋白質之促凝血活性的方法，其包含如本文所描述將異源部分插入於插入位點中、使異源部分與FIX之C末端融合，或兩者，其中該FIX融合蛋白展現促凝血活性且半衰期相較於不含異源部分之FIX蛋白質有所增加。
在其他實施例中，本發明提供一種構築FIX融合蛋白之方法，其包含設計編碼FIX融合蛋白之核苷酸序列，該FIX融合蛋白包含如本文所描述的在插入位點中、與FIX之C末端融合或二者之至少一個異源部分。
在某些實施例中，本發明包括一種增加FIX融合蛋白之表現的方法，其包含如本文所描述將異源部分插入於插入位點中、使異源部分與FIX之C末端融合，或兩者，其中該FIX融合蛋白展現促凝血活性。
在又其他實施例中，本發明包括一種保持FIX融合蛋白之促凝血活性的方法，其包含如本文所描述將異 源部分插入於插入位點中、使異源部分與FIX之C末端融合，或兩者，其中該FIX融合蛋白展現促凝血活性。
IV. 醫藥組合物及治療方法
本發明另外提供一種使用包含本發明之FIX融合蛋白之醫藥組合物預防、治療、改善或管理有需要之人類受試者之凝血疾病或病狀或者出血病狀的方法。示範性方法包含括向有需要之受試者投與治療有效量的包含本發明之FIX融合蛋白的醫藥組合物/調配物。在其他態樣中，可向有需要之受試者投與包含編碼本發明之融合蛋白之DNA的組合物。在本發明之某些態樣中，可向有需要之受試者投與表現本發明之FIX融合蛋白之細胞。在本發明之某些態樣中，醫藥組合物包含(i)FIX融合蛋白、(ii)編碼FIX融合蛋白之分離之核酸、(iii)包含編碼FIX融合蛋白質核酸的載體、(iv)包含編碼FIX融合蛋白之分離之核酸及/或包含編碼FIX融合蛋白之核酸之載體的細胞，或(v)其組合，且醫藥組合物進一步包含可接受之賦形劑或載劑。
本發明之FIX融合蛋白可靜脈內、皮下或經口投與患者。在某些實施例中，FIX融合蛋白係藉由靜脈內注射投與受試者。在其他實施例中，FIX融合蛋白係藉由皮下注射投與受試者。注射可包含單次推注。受試者可接受超過一次注射。
本發明之融合蛋白可用於防治目的。如本文 所用，術語「防治性治療」係指在流血事件之前投與分子。在一個實施例中，需要一般性止血劑之個體正經歷或即將經歷手術。本發明之融合蛋白可在手術之前或之後作為防治劑投與。本發明之融合蛋白可在手術期間或之後投與以控制急性出血事件。手術可包括(但不限於)肝移植、肝切除、牙齒程序或幹細胞移植。
本發明之融合蛋白亦用於按需治療。術語「按需治療」係指響應於出血事件之症狀或在可能導致出血之活動之前投與融合蛋白。在一個態樣中，按需治療係在出血開始時(諸如在損傷之後)或在預期會出血時(諸如在手術之前)給與個體。在另一態樣中，按需治療係在增加出血風險之活動(諸如接觸性運動)之前給與。
在其他實施例中，使用融合蛋白控制、改善或治療急性出血事件。在其他實施例中，相較於不含異源部分之相應FIX蛋白質，FIX融合蛋白展現一或多個藥物動力學參數。PK參數可基於FIX抗原含量(本文中常附帶表示為「抗原」)或FIX活性水準(本文中常附帶表示為「活性」)。由於一些受試者之血漿中存在內源性、非活性FIX，其干擾使用針對FIX之抗體量測所投與之(亦即外源性)FIX之能力，故在文獻中，PK參數常基於FIX活性水準。然而，當如本文所提供將FIX作為Fc融合蛋白之一部分投與時，所投與之(亦即外源性)FIX抗原可使用異源性多肽之抗體準確地量測。此外，某些PK參數可基於經模型預測之資料(在本文中常附帶表示為「經模型預 測之」)或經觀測之資料(在本文中常附帶表示為「經觀測之」)，且較佳基於經觀測資之料。
FIX融合蛋白可經由此項技術中已知之任何方式投與受試者。舉例而言，FIX融合蛋白可經由局部(例如經皮或眼部)、經口、經頰、經鼻、經陰道、經直腸或非經腸(例如皮下、皮內、血管內/靜脈內、肌肉內、經脊椎、經顱內、經鞘內、經眼內、眼周、眶內、滑膜內及腹膜內注射)投與。在一特定實施例中，FIX融合蛋白係經由皮下注射投與。皮下注射可包括一或多次推注，包括例如單次推注一劑FIX融合蛋白。或者，FIX融合蛋白可經由靜脈內注射投與。
FIX融合蛋白之劑量可取決於特定融合蛋白之性質及受試者病狀之性質而變化。在一些實施例中，FIX融合蛋白之劑量可包含介於1與1000IU/kg之間之FIX融合蛋白。
出血病狀可由凝血病症引起。凝血病症亦可稱為凝血病。在一個實例中，可用本發明之醫藥組合物治療之凝血病症為血友病。在另一實例中，可用本發明之醫藥組合物治療之凝血病症為B型血友病。
在一些實施例中，與出血病狀相關之出血類型係選自關節積血、肌肉出血、口腔出血、失血、向肌肉內失血、口腔失血、創傷、頭創傷、胃腸出血、顱內失血、腹內失血、胸內失血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙中出血、腹膜後間隙中出血及髂腰肌鞘中出血。
在其他實施例中，罹患出血病狀之受試者需要手術治療，包括例如手術預防或圍手術期處理。在一個實例中，手術係選自小手術及大手術。示範性手術程序包括拔牙、扁桃體切除術、腹股溝疝切開術、滑膜切除術、開顱術、骨縫合術、創傷手術、顱內手術、腹內手術、胸內手術、關節置換手術(例如全膝關節置換術、髖關節置換術及其類似置換手術)、心臟手術及剖腹生產術。
在另一實例中，受試者係用因子VIII並行治療。因為本發明化合物能夠活化FIXa，所以其可用於在向受試者投與FIXa之前將FIXa多肽預活化。
本發明方法可對需要防治性治療或按需治療之受試者實施。
包含本發明之FIX融合蛋白之醫藥組合物可經調配以用於任何適當投藥方式，包括例如局部(例如經皮或眼部)、經口、經頰、經鼻、經陰道、經直腸或非經腸投藥。
如本文所用，術語非經腸包括皮下、皮內、血管內(例如靜脈內)、肌肉內、經脊椎、顱內、鞘內、眼內、眼周、眶內、滑膜內及腹膜內注射以及任何類似注射或輸注技術。特定言之，包含本發明之FIX融合蛋白之醫藥組合物可經調配以用於皮下投與。組合物亦可為例如懸浮液、乳液、持續釋放調配物、乳膏劑、凝膠劑或散劑。組合物可用傳統黏合劑及載劑(諸如三酸甘油酯)調配成栓劑。
在一個實例中，醫藥調配物為液體調配物，例如緩衝等張水溶液。在另一實例中，醫藥組合物具有生理性或接近於生理性之pH值。在其他實例中，水性調配物具有生理性或接近於生理性之容積莫耳滲透濃度及鹽度。其可含有氯化鈉及/或乙酸鈉。在一些實例中，本發明之組合物經凍乾。
本發明之融合蛋白可在哺乳動物(例如人類患者)體內活體內產生，使用基因療法方法來治療出血疾病或病症將具有治療上之益處，該出血疾病或病症選自由以下組成之群：出血凝血病症、關節積血、肌肉出血、口腔出血、失血、向肌肉內失血、口腔失血、創傷、頭創傷、胃腸出血、顱內失血、腹內失血、胸內失血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙中出血、腹膜後間隙中出血及髂腰肌鞘中出血。在一個實施例中，出血疾病或病症為血友病。在另一實施例中，出血疾病或病症為B型血友病。此方法涉及投與可操作地連接至適合表現控制序列之適合融合蛋白編碼核酸。在某些實施例中，此等序列併入病毒載體中。適用於此基因療法之病毒載體包括腺病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體、艾伯斯坦巴爾病毒載體、乳多泡病毒載體(papovaviral vector)、牛痘病毒載體、單純性皰疹病毒載體、及腺相關病毒(AAV)載體。病毒載體可為複製有缺陷之病毒載體。在其他實施例中，腺病毒載體在其E1基因或E3基因中具有缺失。當使用腺病毒載體時，哺乳動物可不暴露於編碼可選擇標記基因之核酸。在其他 實施例中，序列併入熟習此項技術者已知之非病毒載體中。
除非另外指示，否則本發明之實踐將採用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉殖基因生物學、微生物學、重組DNA及免疫學之習知技術，該等技術係在此項技術之技能範圍內。此類技術完整解釋於文獻中。參見例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，Sambrook等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press：(1989)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Sambrook等人編，Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1992),DNA Cloning,D.N.Glover編，第I及II卷(1985)；Oligonucleotide Synthesis,M.J.Gait ed.,(1984)；Mullis等人，美國專利號4,683,195；Nucleic Acid Hybridization,B.D.Hames & S.J.Higgins編(1984)；Transcription And Translation,B.D.Hames & S.J.Higgins編(1984)；Culture Of Animal Cells,R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,(1987)；Immobilized Cells And Enzymes,IRL Press,(1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；論文Methods In Enzymology,Academic Press,Inc.,N.Y.；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,J.H.Miller及M.P.Calos編，Cold Spring Harbor Laboratory(1987)；Methods In Enzymology，第154及155卷(Wu等人編)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology,Mayer及Walker 編，Academic Press,London(1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷，D.M.Weir及C.C.Blackwell編(1986)；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；及Ausubel等人， Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)。
陳述免疫學之基本原理之參考文獻包括Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,New York；Klein,J.,Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination,John Wiley & Sons,New York(1982)；Roitt,I.,Brostoff,J.及Male D.,Immunology，第6版，London：Mosby(2001)；Abbas A.,Abul,A.及Lichtman,A.,Cellular and Molecular Immunology，第5版，Elsevier Health Sciences Division(2005)；及Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988)。
現已詳細描述本發明，藉由參考以下實例將更明確地瞭解本發明，該等實例係僅出於說明目的包括於此且不意欲限制本發明。
實例 實例1 ：鑑別活性FIX-XTEN變異體
構築FIX融合蛋白，其包含FIX多肽及一或 多個XTEN插入以改善FIX蛋白質之活性。不過，可容易地變化XTEN修飾之位置、長度、組成及數量，且可評價該等修飾對FIX活性及清除率之影響。
本實例旨在鑑別FIX中可引入XTEN而不消除FIX活性之位點且將此方法應用於其他未修飾之FIX及重組FIX-Fc融合蛋白。
方法
在緊鄰編碼起始Met殘基之ATG密碼子5'端引入Kozak轉譯起始序列(GCCGCCACC)之後，將FIX多肽編碼序列連接至表現載體pcDNA4/myc-His C(INVITROGENTM ,Carlsbad,CA)中BsiWI與PmeI位點之間。
使用聚乙烯亞胺(PEI,Polysciences Inc.,Warrington,PA)，用質體轉染HEK293F細胞(INVITROGENTM ,Carlsbad,CA)。使短暫轉染之細胞在FREESTYLETM 293培養基或FREESTYLETM 293與CD OPTICHOTM 培養基(INVITROGENTM ,Carlsbad,CA)之混合物中生長。轉染5天後，收集細胞培養基並藉由發色分析或aPTT FIX活性分析來分析FIX活性。
使用來自Aniara之BIOPHEN因子IX套組量測發色FIX活性且在震盪下，於37℃板加熱器上進行所有培育。使用Tris-BSA稀釋緩衝液(R4)將自6孔盤中含FIX-XTEN變異體之短暫轉染培養基收集的細胞培養物稀 釋至所需FIX活性範圍。亦在Tris-BSA稀釋緩衝液中製備FIX標準物。將標準物、稀釋之細胞培養物樣品及彙集之正常人類血漿分析對照物(50微升/孔)一式兩份添加至IMMULON® 2HB 96孔培養盤中。隨後將人類因子X、FVIII：C及纖維蛋白聚合抑制劑(50μL)、50μL的因子XIa與凝血酶、磷脂及鈣之混合物，及50μL因子Xa特異性發色基質(SXa-11)添加至每一孔中，其中在每次添加之間培育2分鐘。在與受質一起培育之後，添加50μL 20%乙酸以終止顯色反應，且用SPECTRAMAX® plus(MOLECULAR DEVICES® )儀器量測在405nm下之吸光度。使用SOFTMAX® Pro軟體(第5.2版)進行資料分析。
採用單級部分活化凝血激酶時間(aPTT)凝固分析來評估FIX活性。使用SYSMEX® CA-1500儀器(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.,Tarrytown,NY)量測FIX-XTEN aPTT活性。為了建立該分析之標準曲線，用具有匹配之培養基濃度的模擬轉染培養基作為測試樣品稀釋WHO因子IX標準物。使用模擬轉染培養基將自6孔盤中含FIX-XTEN變異體之短暫轉染培養基收集的細胞培養物稀釋至所需FIX活性範圍。在稀釋之後，使用Sysmex儀器如下進行aPTT分析：將50μl稀釋之標準物及樣品與50μl Siemens人類FIX清除之血漿混合且接著與50μl Siemens Actin FSL(鞣花酸)活化劑混合。培育混合物1分鐘。隨後，將50μl Siemens CaCl2 添加至混合物中並培育該混合物240秒。在此培育之後立即量測凝結時 間。為了測定測試樣品之FIX活性，使用log標度繪製標準物之凝結時間曲線以外推凝結時間與FIX活性之間的等式，且接著針對該標準曲線計算FIX-XTEN活性。
選擇插入位點
分析來自Protein Data Bank之FIX結構1PFX、1IXA、1CFI、1CFH,1EDM、3LC3、3LC5、1RFN、1X7A及3KCG，以選出FIX中供XTEN插入之位點。由於GLA結構域在將FIX錨定於磷脂表面及內皮下IV型膠原蛋白方面之重要作用，避免將XTEN插入GLA結構域內。藉由結合以下標準分析Protein Data Bank中之可用FIX結構來選擇XTEN插入位點：1)藉由算法軟體ASA View(http：//www.abren.net/asaview/)及Get Area(http：//curie.utmb.edu/getarea.html)計算之可及表面積；2)藉由氫/氘交換質譜法(H/DX-MS)評估之溶劑可及性；3)排除確定之二級結構元件內之位點；4)優先選擇具有顯著種間蛋白質序列變化性之位置；及5)排除鄰近已知B型血友病突變之位點。
選出EGF1結構域中之四個位點、EGF2結構域中之5個位點、在AP結構域與EGF2結構域之間之連接子區中的2個位點、AP(活化肽)結構域中之4個位點及催化結構域中之18個位點插入XTEN(表6)。
Figure 105124637-A0202-12-0111-843
具有42個胺基酸之XTEN插入及C末端融合之活性篩選
使用高活性FIX Padua變體(R338L)作為支架以計算由引入XTEN引起之活性降低導致的潛在FIX活性損失。將具有42個殘基之XTEN元件(AE42)插入使用以上標準選擇之位點或在FIX之C末端融合。在含經轉染HEK293細胞中之條件培養基中評價如以上所描述之該等變異體之FIX活性。FIX-AE42之FIX活性係以不含XTEN之基礎構築體FIX-R338L的百分含量顯示(圖1)。
如藉由FIX發色分析所測定，在有限位點處插入XTEN係容許的(圖1及表7)。選出FIX中總計33個位點並藉由插入AE-42進行評價。其中，EGF2結構域中之兩個、在EGF2結構域與AP結構域之間之連接子區中的一個、AP結構域中之四個及催化結構域中之四個，包括C末端在內，經FIX活性分析鑑別為容許的位點(圖1及表7)。
Figure 105124637-A0202-12-0112-844
較長XTEN插入及C末端融合之活性
接著，以類似方式測試在經顯示容許AE42插入之位點處的較長XTEN(AE-72、AE-144及AE-288)。如先前所描述測定FIX活性且以不含XTEN之基礎構築體FIX-R338L的百分含量顯示(圖2)。
僅AP中之位點以及在FIX之C末端處或其附近之位點容許較長XTEN(AE144、AE288或AE864)(圖2)。在條件培養基中偵測到的FIX活性與引入之XTEN之長度反相關(圖2，表7)。選出FIX之不同結構域中的四個容許插入位點以產生組合文庫。
多個XTEN插入
基於用單一XTEN變體得到的結果，藉由aPTT分析，在含經轉染HEK293細胞之條件培養基中評價在四個不同位置(參見圖4及表8)插入多個長度不同之XTEN的FIX變異體之FIX活性(表8-10)。FIX活性係以不含XTEN之基礎構築體FIX-R338L的百分含量顯示(圖4)。
Figure 105124637-A0202-12-0114-845
Figure 105124637-A0202-12-0115-846
Figure 105124637-A0202-12-0115-847
三個組，即具有單一XTEN之FIX、插入兩個XTEN之FIX及插入單個XTEN之FIX-Fc，顯示可偵測之活性，而在三個或超過三個位點處插入/融合之組合消除FIX活性(圖4)。
總之，在FIX中存在若干容許XTEN插入之位點且選定之XTEN插入變異體組合保持FIX活性。此處鑑別之活性FIX-XTEN變異體為在B型血友病小鼠中進行藥物動力學表徵之候選物。
實例2 ：FIX融合蛋白以及其血漿回收率及AUC/D
因子IX缺陷型(HemB,B6.129P2-F9tm1Dws/J,MGI：1932297)小鼠(Lin.等人，1997)最初係自Dr.Darrel Stafford(University of North Carolina,Chapel Hill)得到。在t=0小時，以10mL/kg之劑量體積藉由單次靜脈內推注對雄性/雌性HemB小鼠分別靜脈內注射50或200IU/kg FIX融合蛋白(例如FIX-CT.288(AE288 XTEN與FIX多肽之C末端融合)、FIX-CT.864(AE864 XTEN與FIX多肽之C末端融合)、FIX-AP.144(AE144 XTEN插入FIX多肽之AP結構域內的D166後)、FIX-AP.72(AE72 XTEN插入FIX多肽之AP結構域內的D166後)、FIX-AP.42(AE42 XTEN插入FIX多肽之AP結構域內的D166後)、FIXFc及FIX)。給藥後5分鐘至給藥後168小時(7天)，收集血液。對於每一指定時間點，每一時間點藉由眶後或末段大靜脈抽血自3-4只小鼠收集約100μl檸檬酸鹽血液。每只小鼠產生最多3個時間點。藉由以5000rpm離心8分鐘來分離血漿，且在乾冰乙醇浴中速凍血漿樣品，並在-80℃下儲存，直至在Sysmex-CA1500凝固分析儀上，使用Dade Behring試劑及肌動蛋白FSL作為活化劑並以給藥物質作為活性標準物，利用單極部分活化凝血激酶時間(aPTT)分析對其進行分析。在圖5A-5B中，將血漿活性隨注射劑量%變化作圖。使用非房室模型，利用Phoenix WinNonlin 6.2.1(Pharsight,Certera by NCA analysis)計算平均滯留時間(MRT)及其他藥物動力學(PK)參數。圖5C描繪相對血漿回收率(Y軸)隨MRT(X軸)之變化。加點區域表示劑量曲線下面積(AUC/D，以h/kg/mL表示)且顯示，FIX血漿活性回收率及AUC/D隨XTEN長 度增加而增加(圖5C)。該等圖顯示，具有較長XTEN長度(在C末端處288及864，或在AP結構域中144、72及42)之FIX融合蛋白在靜脈內推注給藥後，展現血漿回收率之尺寸依賴性增加，最多達60%，及AUC/D增加。
實例3 ：FIX融合蛋白及其半衰期
對FIX缺陷型小鼠靜脈內給與50或200IU/kg以下FIX融合蛋白：FIX與具有288個胺基酸之XTEN(例如AE288)之融合物；具有72個胺基酸之XTEN(例如AE72)插入AP結構域之D166後的FIX-Fc；具有42個胺基酸之XTEN(例如AE42)插入AP結構域之D166後的FIX-Fc；及對照物(FIXFc及FIX)。收集血漿並以與實例5中所描述之方法相同之方式進行FIX活性及PK分析。圖6A繪出血漿活性隨注射劑量%之變化。使用WinNonlin 6.2.1(Pharsight,Certera by NCA analysis)計算藥物動力學(PK)參數且圖6B描繪相對血漿回收率(Y軸)隨MRT(X軸)之變化。加點區域表示劑量曲線下面積(AUC/D，以h/kg/mL表示)且顯示，相較於FIX，在FIXFc之活化肽(AP)結構域中插入XTEN序列延長平均滯留時間長於單獨rFIXFc(圖6B)。此外，血漿活性回收率及AUC/D隨XTEN長度增加而提高(圖6A-6B)。相較於rFIXFc，rFIX-CT.288(SEQ ID NO：226)及rFIXFc-AP.72(SEQ ID NO：151)之AUC/D分別提高3.4倍及4.5倍(圖6A-6B)。此與其AUC/D相較於靜脈內給與之rFIX分別有 8.5倍及14.5倍提高相符(圖6A-6B)。因此，相較於rFIX及rFIXFc，AP結構域中XTEN之插入與rFIXFc-R338L中Fc介導之半衰期延長的組合使半衰期延長並增加血漿回收率及AUC/劑量。
實例4 ：藉由皮下遞送改善FIX融合蛋白之藥物動力學。
t=0時，對FIX缺陷型小鼠皮下給與50或200IU/kg以下FIX融合蛋白：FIX與具有288個胺基酸之XTEN(例如AE288)在C末端之融合物(FIX-CT.288)；在AP結構域中具有72個胺基酸之XTEN(例如AE72)的FIXFc(FIXFc-AP.72)；在EGF2結構域中具有42個胺基酸之XTEN(例如AE42)的FIXFc(例如FIXFc-EGF.42)；及對照物(FIXFc及FIX)。收集血漿並以與實例1中所描述之方法相同之方式進行FIX活性及PK分析。圖7A繪出血漿活性隨注射劑量%之變化。使用WinNonlin 6.2.1(Pharsight,Certera by NCA analysis)計算藥物動力學(PK)參數且圖7B描繪相對生物利用率(Y軸)隨MRT(X軸)之變化。加點區域表示劑量曲線下面積(AUC/D，以h/kg/mL表示)且顯示，在rFIX之羧基末端融合XTEN多肽序列或在FIXFc之活化肽(AP)結構域或EGF2結構域中插入XTEN序列大幅改善FIX融合蛋白之皮下給藥型態(圖7B)。在皮下給藥之HemB小鼠中，相較於rFIXFc，rFIXFc-AP.72及rFIX-CT.288具有6至9倍之AUC/D改善、1.5至2倍之生物利用率改善及3至10倍之Cmax /D 改善。當與rFIX相比較時，FIXFc-AP.72及rFIX-CT.288相較於rFIX之藥物動力學參數改善分別為28至40倍之AUC/D改善、3倍之生物利用率增加及15至30倍之Cmax /D改善(圖7A-7B)。
總體而言，當與靜脈內給與rFIXFc相比較時，FIX融合蛋白(例如rFIX-CT.288及rFIXFc-AP.72)對於皮下給與顯示2.6倍及1.9倍之AUC/D改善，rFIXFc在人類中支持每週一次或更不頻繁之靜脈內給藥用於防治目的。
實例5 ：FIX融合蛋白之活體外功效
向人B型血友病血液中加入3、10及30IU/dL之指定劑量之rFIXFc(空心圓圈、點劃線)或FIX融合蛋白(例如rFIXFc-AP.72)(實心點、實線)或媒劑(空心三角形)(圖8A-8C)。使用旋轉式血栓彈力測定法(ROTEM)測定全血凝結特徵且藉由使血液再鈣化(NATEM)來起始凝固。在B型血友病血液中，rFIXFc-AP.72在凝結時間(CT，以秒表示)、α角(以度表示)及最大凝塊強度(MCF，以mm表示)方面顯示與rFIXFc類似之活性(圖8A-8C)。每一時間點之資料為4至5個重複樣品之平均值+/-標準差(圖8A-8C)。
相較於rFIX及rFIXFc，rFIXFc-AP.72及rFIX-CT.288在HemB小鼠中顯示皮下藥物動力學之大幅改善。正在進行其他研究以瞭解在臨床前動物模型中之功 效及異速生長尺度規律。
實例6 ：rFIXFc-AP.72在急性鼠類尾截割出血模型中之活體內功效
如先前所描述(Dumont等人，Blood,119(13)：3024-3030,2012)，在失明鼠類尾截割出血模型中研究急性功效，其中在尾尖切斷術後量測給藥小鼠之總失血量。簡言之，用50mg/kg克他命(ketamine)及0.5mg/kg右美托咪定(dexmedetomidine)之混合液使8-15週齡之雄性B型血友病小鼠(Lin等人，Blood(1997)90：3962-3966)麻醉。將尾部浸入37℃生理食鹽水中10分鐘，以使側靜脈擴張，隨後經靜脈內對尾靜脈注射50、100及200IU/kg的媒劑(3.88g/L L-組胺酸、23.8g/L甘露糖醇、11.9g/L蔗糖、3.25g/L氯化鈉、0.01%(w/v)聚山梨醇酯20(pH 7.1)、3%人血清白蛋白)、rFIXFc-AP.72或rFIXFc。給藥後5分鐘，截割尾部遠端5mm之尾尖，並將其浸沒於含有13mL生理食鹽水的預先稱重之管中，保持30分鐘。藉由重量定量失血量。使用非成對雙尾t檢驗，在GraphPad Prism 6中計算統計學顯著性。此類雙尾t檢驗顯示，50、100及200IU/kg劑量之rFIXFc-AP.72與媒劑顯著不同(p值<0.0001)。此外，資料顯示，較低劑量(例如50IU/kg)之rFIXFc-AP.72使失血量相較於相同低劑量，即50IU/kg之rFIXFc顯著降低。該等結果證實，在此出血模型中，相較於rFIXFc，rFIXFc-AP.72具有相 同或改善之急性功效。
實例7 ：FIXFc-AP.72在防治性鼠類尾靜脈切斷出血模型中之活體內功效
如先前所描述(Toby等人，PLOS One ,DOI：10.1371/journal.pone.0148255,2016；Pan等人，Blood 114 ：2802-2822(2009))，在失明鼠類尾靜脈切斷(TVT)出血模型中研究長期功效，其中在切斷單側尾靜脈之後量測經給藥之B型血友病小鼠之存活時間。簡言之，對8-15週齡之雄性B型血友病小鼠(Lin等人，Blood 90 ：3962-3966(1997))經靜脈內預先給與含15、50、100IU/kg FIX活性劑之rFIXFc或相配皮下劑量之FIXFc-AP.72，並與接受推注劑量媒劑之小鼠相比較。給藥後72小時，將所有小鼠麻醉，並在2.7mm尾直徑處切斷單側尾靜脈。在TVT後立即9至11小時及隨後在24小時之隔夜時間點期間，監測定性終點並每小時記錄，包括再出血及死亡時間(定義為實施安樂死之時間，如在動物瀕死時測定)。在24小時研究結束時，對所有小鼠實施安樂死，同時確定未死亡或瀕死之動物在24小時的時候存活。
使用GraphPad Prism 6將資料對在TVT之後之存活率百分比作圖。小鼠皮下給與媒劑(點劃線)、皮下給與FIXFc-AP.72(實線，實心符號)或靜脈內給與FIXFc(虛線，空心符號)(15IU/kg、50IU/kg、100IU/kg；n=20只/劑，媒劑劑量除外；n=30)(圖10)。比 較用相配IU/kg劑量皮下給與FIXFc-AP.72及靜脈內給與rFIXFc治療的小鼠的存活曲線顯示，皮下給與FIXFc-AP.72的HemB小鼠在所有測試劑量下之存活率相較於等效靜脈內給與rFIXFc改善(圖10)。
實例8 ：在HemB小鼠中FIXFc-AP.72(FIX-216，雙鏈Fc)相較於rFIX之靜脈內及皮下藥物動力學參數改善。
給與B型血友病小鼠200IU/kg FIXFc-AP.72(FIX-216，雙鏈Fc)或rFIX。在指定時間，藉由眶後抽血來收集血液。使用給藥物質作為活性標準物，藉由單級凝血分析活性來測定FIX之血漿含量。在圖11A中，將血漿活性對%注射劑量作圖。圖11B顯示使用Phoenix WinNonLin 6.2.1(Pharsight,Certara)，藉由NCA(非房室)分析計算之藥物動力學參數的表格。所顯示的FIX-216相對於rFIX之藥物動力學參數的改善包括平均滯留時間(MRT)、AUC/劑量及其他參數。
皮下給與FIXFc-AP.72顯示在小鼠中給藥後約20小時為tmax ，且血漿活性劑含量相較於類似(IU/kg)靜脈內給與之rFIX或rFIXFc有所改善。在HemB小鼠中使用TVT出血模型顯示，給藥後72小時，皮下給與FIXFc-AP.72在所有測試劑量下的活體內功效相較於靜脈內給與之rFIXFc有所改善。類似地，在HemB小鼠尾截割出血模型中進行的急性功效測試顯示，靜脈內給與FIXFc-AP.72的功效相較於rFIXFc有所改善。該等資料支 持在人類中每週一次或更不頻繁之皮下防治性給與FIXFc-AP.72的潛力。
具體實施例之前文描述將充分地揭露本發明之一般性質，以使得其他人藉由應用此項技術中之知識，在無不當實驗且不背離本發明之一般概念的情況下，可輕易地針對各種應用對此等特定實施例進行修改及/或改變。因此，基於本文呈現之教示及指導，此等改變及修改意欲在所揭示實施例之等效物的含義及範圍內。應瞭解，本文之措辭或術語係出於描述而非限制之目的，以使得本說明書之術語或措辭應由熟習此項技術者根據教示及指導進行解釋。
自本文所揭示的本發明之說明書及實踐的考慮，本發明之其他實施例對熟習此項技術者而言將為顯而易見的。意欲將說明書及實例視為僅具示範性，且本發明之真實範疇及精神藉由以下申請專利範圍指示。
本申請案要求2015年8月3日申請之美國臨時申請案第62/200,590號及2016年1月22日申請之第62/281,993號的權益，其以全文引用之方式併入本文中。
實施例
E1. 一種因子IX(FIX)融合蛋白，其包含FIX多肽及至少一個XTEN，該XTEN插入該FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：2之胺基酸103、SEQ ID NO：2之胺基酸105、SEQ ID NO：2之胺基酸142、SEQ ID NO：2之胺基酸149、SEQ ID NO：2之胺基酸162、SEQ ID NO：2之胺基酸166、SEQ ID NO：2之胺基酸174、SEQ ID NO：2之胺基酸224、SEQ ID NO：2之胺基酸226、SEQ ID NO：2之胺基酸228、SEQ ID NO：2之胺基酸413及其任何組合，且其中該FIX融合蛋白展現促凝血活性。
E2. 如E1之FIX融合蛋白，其中該插入位點對應於選自由以下組成之群之胺基酸：SEQ ID NO：2之胺基酸149、SEQ ID NO：2之胺基酸162、SEQ ID NO：2之胺基酸166、SEQ ID NO：2之胺基酸174及其任何組合。
E3. 如E1或E2之FIX融合蛋白，其中該插入位點對應於選自由以下組成之群之胺基酸：SEQ ID NO：2之胺基酸224、SEQ ID NO：2之胺基酸226、SEQ ID NO：2之胺基酸228、SEQ ID NO：2之胺基酸413及其任何組合。
E4. 如E1至E3中任一項之FIX融合蛋白，其中該插入位點對應於選自由SEQ ID NO：2之胺基酸103、SEQ ID NO：2之胺基酸105及二者組成之群之胺基酸。
E5. 如E1至E4中任一項之FIX融合蛋白，其中該插入位點對應於SEQ ID NO：2之胺基酸142。
E6. 如E1至E5中任一項之FIX融合蛋白，其中該XTEN包含至少約6個胺基酸、至少約12個胺基酸、至少約36個胺基酸、至少約42個胺基酸、至少約 72個胺基酸、至少約144個胺基酸或至少約288個胺基酸。
E7. 如E1至E6中任一項之FIX融合蛋白，其中該XTEN包含AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、AG144或其任何組合。
E8. 如E1至E7中任一項之FIX融合蛋白，其中該XTEN包含與選自由以下組成之群之胺基酸至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53及其任何組合。
E9. 如E7或E8之FIX融合蛋白，其中該XTEN包含AE72或AE144。
E10. 如E1至E9中任一項之FIX融合蛋白，其另外包含第二XTEN。
E11. 如E10之FIX融合蛋白，其中該第二XTEN插入該FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：2之胺基酸103、SEQ ID NO：2之胺基酸105、SEQ ID NO：2之胺基酸142、SEQ ID NO：2之胺基酸149、SEQ ID NO：2之胺基酸162、SEQ ID NO：2之胺基酸166、SEQ ID NO：2之胺基酸174、SEQ ID NO：2之胺基酸224、SEQ ID NO：2之胺基 酸226、SEQ ID NO：2之胺基酸228、SEQ ID NO：2之胺基酸413及其任何組合，或其中該第二XTEN與該FIX多肽之C末端融合或連接子與該FIX多肽之C末端融合。
E12. 如E10或E11之FIX融合蛋白，其中該XTEN及該第二XTEN分別插入該FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點及/或與該FIX多肽之C末端融合：i. SEQ ID NO：2之胺基酸105及SEQ ID NO：2之胺基酸166；ii. SEQ ID NO：2之胺基酸105及SEQ ID NO：2之胺基酸224；iii. SEQ ID NO：2之胺基酸105及與該C末端融合；iv. SEQ ID NO：2之胺基酸166及SEQ ID NO：2之胺基酸224；v. SEQ ID NO：2之胺基酸166及與該C末端融合；及vi. SEQ ID NO：2之胺基酸224及與該C末端融合。
E13. 如E10或E11之FIX融合蛋白，其中該XTEN插入該FIX多肽內對應於SEQ ID NO：2之胺基酸166之插入位點，且其中該第二XTEN與該FIX多肽之C末端融合。
E14. 如E10至E13中任一項之FIX融合蛋 白，其中該第二XTEN包含至少約6個胺基酸、至少約12個胺基酸、至少約36個胺基酸、至少約42個胺基酸、至少約72個胺基酸、至少約144個胺基酸或至少約288個胺基酸。
E15. 如E10至E14中任一項之FIX融合蛋白，其中該第二XTEN係選自由以下組成之群：AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288、AG144及其任何組合。
E16. 如E15之FIX融合蛋白，其中該第二XTEN為AE72或AE144。
E17. 如E10至E16中任一項之FIX融合蛋白，其中該第二XTEN包含與選自由以下組成之群之胺基酸至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53及其任何組合。
E18. 如E10至E17中任一項之FIX融合蛋白，其另外包含第三、第四、第五或第六XTEN。
E19. 一種FIX融合蛋白，其包含FIX多肽及包含XTEN之異源部分，其中該XTEN與該FIX多肽之C末端融合且包含長度超過42個胺基酸且短於144個胺基酸之胺基酸序列。
E20. 如E19之FIX融合蛋白，其中該XTEN 包含長於50、55、60、65或70個胺基酸且短於140、130、120、110、100、90或80個胺基酸或其任何組合之胺基酸序列。
E21. 如E20之FIX融合蛋白，其中該XTEN為72個胺基酸長度。
E22. 如E21之FIX融合蛋白，其中該XTEN為AE72。
E23. 如E19之FIX融合蛋白，其中該XTEN包含與SEQ ID NO：35至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之胺基酸序列。
E24. 如E1至E23中任一項之FIX融合蛋白，其另外包含Fc結構域。
E25. 如E24之FIX融合蛋白，其中該Fc結構域與該FIX多肽或該XTEN融合。
E26. 如E24或E25之FIX融合蛋白，其包含第二Fc結構域。
E27. 如E26之FIX融合蛋白，其中該第二Fc結構域與該第一Fc結構域締合。
E28. 如E26或E27之FIX融合蛋白，其包含兩個多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含與該Fc結構域融合之該FIX多肽，且該第二多肽鏈包含該第二Fc結構域，其中該第一Fc結構域與該第二Fc結構域藉由共價鍵締合。
E29. 如E26或E27之FIX融合蛋白，其為單一多肽鏈，該多肽鏈包含該FIX多肽、該Fc結構域、該第二Fc結構域及連接該Fc結構域與該第二Fc結構域之連接子。
E30. 如E29之FIX融合蛋白，其中該連接子另外包含一或多個細胞內加工位點。
E31. 如E29或E30之FIX融合蛋白，其中該連接子包含(Gly4 Ser)n ，其中n為選自1至100之整數。
E32. 如E1至E31之FIX融合蛋白，其包含與選自由不含信號肽及前肽序列之SEQ ID NO：54至SEQ ID NO：153組成之群之序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之胺基酸序列。
E33. 如E1至E32中任一項之FIX融合蛋白，其具有原生FIX至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或100%的促凝血活性。
E34. 如E33之FIX融合蛋白，其中該促凝血活性係藉由發色基質分析、單極凝血分析或兩者量測。
E35. 如E1至E34中任一項之FIX融合蛋白，其中該FIX多肽為R338L FIX變異體。
E36. 如E35之FIX融合蛋白，其中該R338L FIX變異體包含與SEQ ID NO：2至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約 97%、至少約98%、至少約99%或100%一致之胺基酸序列。
E37. 一種分離之聚核苷酸，其包含編碼如E1至E36中任一項之FIX融合蛋白的序列。
E38. 一種表現載體，其包含如E37之聚核苷酸。
E39. 一種宿主細胞，其包含如E37之聚核苷酸或如E38之載體。
E40. 如E39之宿主細胞，其中該FIX融合蛋白係在活體內表現。
E41. 如E39之宿主細胞，其中該FIX融合蛋白係在活體外表現。
E42. 一種產生FIX融合蛋白之方法，其包含在使該FIX融合蛋白表現之條件下培養如E39之宿主細胞。
E43. 一種組合物，其包含如E1至E36中任一項之FIX融合蛋白、如E37之聚核苷酸、如E38之表現載體或如E39至E41中任一項之宿主細胞，及醫藥學上可接受之載劑。
E44. 一種預防、治療、改善或管理有需要患者之凝血性疾病或病狀之方法，其包括投與有效量的如E1至E36中任一項之FIX融合蛋白、如E37之聚核苷酸、如E38之表現載體、如E39至E41中任一項之宿主細胞或如E43之組合物。
E45. 如E44之方法，其中該投與包括向該患者皮下投與。
E46. 一種對受試者之凝血性疾病或病狀進行診斷或獲取圖像之方法，其包括使如E1至E36中任一項之FIX融合蛋白、如E37之聚核苷酸、如E38之表現載體或如E39至E41中任一項之宿主細胞與該受試者之樣品接觸。
E47. 一種延長FIX多肽之半衰期的方法，其包括將XTEN插入該FIX多肽內對應於選自由以下組成之群之胺基酸的插入位點：SEQ ID NO：2之胺基酸103、SEQ ID NO：2之胺基酸105、SEQ ID NO：2之胺基酸142、SEQ ID NO：2之胺基酸149、SEQ ID NO：2之胺基酸162、SEQ ID NO：2之胺基酸166、SEQ ID NO：2之胺基酸174、SEQ ID NO：2之胺基酸224、SEQ ID NO：2之胺基酸226、SEQ ID NO：2之胺基酸228、SEQ ID NO：2之胺基酸413及其任何組合，由此構築FIX融合蛋白，其中該FIX蛋白展現促凝血活性。
E48. 一種因子IX(FIX)融合蛋白，其包含第一鏈及第二鏈，其中：a. 該第一鏈包含：i. FIX多肽；ii. 至少一個XTEN，其中該至少一個XTEN插入該FIX多肽內對應於SEQ ID NO：2之胺基酸166的插入位點，且其中該至少一個XTEN包含具有至少約72個胺基 酸之胺基酸序列；及iii. 第一Fc結構域，其中該第一Fc結構域與該FIX多肽中該至少一個XTEN融合；且b. 該第二鏈包含第二Fc結構域其中該第一Fc結構域與該第二Fc結構域藉由共價鍵締合；且其中該FIX融合蛋白展現促凝血活性。
E49. 如E48之FIX融合蛋白，其中該至少一個XTEN包含與SEQ ID NO：35之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%一致之胺基酸序列。
E50. 如E48或E49之FIX融合蛋白，其中該FIX融合蛋白之第一鏈包含與SEQ ID NO：227之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之胺基酸序列；且其中該FIX融合蛋白之第二鏈包含與SEQ ID NO：228之胺基酸序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致之胺基酸序列。
E51. 如E48至E50中任一項之FIX融合蛋白，其中FIX融合蛋白之第一鏈包含SEQ ID NO：227之胺基酸序列；且其中該FIX融合蛋白之第二鏈包含SEQ ID NO：228之胺基酸序列。
前述實例及本申請案別處提及以下載體序 列。以下關鍵詞將有助於瞭解資訊：
關鍵詞：
信號肽(前肽)
前肽
具有或不具有蛋白質標籤之連接子
裂解位點
XTEN及/或Fc之插入或融合
SEQ ID NO：54 E0113_AE42；PNL118
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SEQ ID NO：56 A0103_AE42 pNL117
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SEQ ID NO：59 V0149_AE42 pNL121
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SEQ ID NO：97 D0166_AE288 pNL178
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SEQ ID NO：99 S0174_AE144 pNL180
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Figure 105124637-A0202-12-0145-903
SEQ ID NO：100 S0174_AE288 pNL181
Figure 105124637-A0202-12-0145-904
SEQ ID NO：101 E0224_AE72 pNL182
Figure 105124637-A0202-12-0145-905
SEQ ID NO：102 E0224_AE144 pNL183
Figure 105124637-A0202-12-0145-906
SEQ ID NO：103 E0224_AE288 pNL184
Figure 105124637-A0202-12-0145-907
Figure 105124637-A0202-12-0146-908
SEQ ID NO：104 K0413_AE72 pNL185
Figure 105124637-A0202-12-0146-909
SEQ ID NO：105 K0413_AE144 pNL186
Figure 105124637-A0202-12-0146-910
SEQ ID NO：106 K0413_AE288 pNL187
Figure 105124637-A0202-12-0146-911
Figure 105124637-A0202-12-0147-912
SEQ ID NO：107 A0103_AE72 pNL188
Figure 105124637-A0202-12-0147-913
SEQ ID NO：108 A0103_AE144 pNL189
Figure 105124637-A0202-12-0147-914
SEQ ID NO：109 A0103_AE288 pNL190
Figure 105124637-A0202-12-0147-915
SEQ ID NO：110 G0226_AE42 pNL195
Figure 105124637-A0202-12-0147-916
Figure 105124637-A0202-12-0148-917
SEQ ID NO：111 K0228_AE42 pNL196
Figure 105124637-A0202-12-0148-918
SEQ ID NO：112 T0230_AE42 pNL197
Figure 105124637-A0202-12-0148-919
SEQ ID NO：113 N0105_AE42 pNL198
Figure 105124637-A0202-12-0148-920
SEQ ID NO：114 S0283_AE42 pNL199
Figure 105124637-A0202-12-0148-921
SEQ ID NO：115 CT_AE72 pNL202
Figure 105124637-A0202-12-0149-922
SEQ ID NO：116 C-末端-AE864 FIX-092
Figure 105124637-A0202-12-0149-923
SEQ ID NO：117 C-末端-AE144 pJH0131
Figure 105124637-A0202-12-0149-924
SEQ ID NO：118 N105-AE42 pJH44
Figure 105124637-A0202-12-0150-925
SEQ ID NO：119 D166-AE72 pJH46
Figure 105124637-A0202-12-0150-926
SEQ ID NO：120 D166-AE144 pJH47
Figure 105124637-A0202-12-0150-927
SEQ ID NO：121 C-末端-AE144 pJH50
Figure 105124637-A0202-12-0150-928
SEQ ID NO：122 C-末端-AE288 pJH51
Figure 105124637-A0202-12-0151-929
SEQ ID NO：123 C-末端-AE72 pJH52
Figure 105124637-A0202-12-0151-930
SEQ ID NO：124 E224-AE42 pJH54
Figure 105124637-A0202-12-0151-931
SEQ ID NO：125 D166-AE42 pJH55
Figure 105124637-A0202-12-0151-932
SEQ ID NO：126 D166-AE42,C-末端-AE72 pJH59
Figure 105124637-A0202-12-0151-933
Figure 105124637-A0202-12-0152-934
SEQ ID NO：127 D166-AE42,C-末端-AE144 pJH60
Figure 105124637-A0202-12-0152-935
SEQ ID NO：128 D166-AE42,C-末端-AE288 pJH61
Figure 105124637-A0202-12-0152-936
SEQ ID NO：129 D166-AE72,C-末端-AE72 pJH62
Figure 105124637-A0202-12-0152-937
Figure 105124637-A0202-12-0153-938
SEQ ID NO：130 D166-AE72,C-末端-AE144 pJH63
Figure 105124637-A0202-12-0153-939
SEQ ID NO：131 D166-AE72,C-末端-AE288 pJH64
Figure 105124637-A0202-12-0153-940
SEQ ID NO：132 D166-AE144,C-末端-AE72 pJH65
Figure 105124637-A0202-12-0153-941
SEQ ID NO：133 D166-AE144,C-末端-AE144 pJH66
Figure 105124637-A0202-12-0154-942
SEQ ID NO：134 D166-AE144,C-末端-AE288 pJH67
Figure 105124637-A0202-12-0154-943
SEQ ID NO：135 N105-AE42,D166-AE42 pJH68
Figure 105124637-A0202-12-0154-944
SEQ ID NO：136 N105-AE42,D166-AE72 pJH69
Figure 105124637-A0202-12-0154-945
Figure 105124637-A0202-12-0155-946
SEQ ID NO：137 N105-AE42,D166-AE144 pJH70
Figure 105124637-A0202-12-0155-947
SEQ ID NO：138 N105-AE42,C-末端-AE72 pJH71
Figure 105124637-A0202-12-0155-948
SEQ ID NO：139 N105-AE42,C-末端-AE144 pJH72
Figure 105124637-A0202-12-0155-949
SEQ ID NO：140 N105-AE42,C-末端-AE288 pJH73
Figure 105124637-A0202-12-0155-950
Figure 105124637-A0202-12-0156-951
SEQ ID NO：141 N105-AE42,E224-AE42 pJH74
Figure 105124637-A0202-12-0156-952
SEQ ID NO：142 D166-AE42,E224-AE42 pJH75
Figure 105124637-A0202-12-0156-953
SEQ ID NO：143 D166-AE72,E224-AE42 pJH76
Figure 105124637-A0202-12-0156-954
SEQ ID NO：144 D166-AE144,E224-AE42 pJH77
Figure 105124637-A0202-12-0156-955
Figure 105124637-A0202-12-0157-956
SEQ ID NO：145 E224-AE42,C-末端-AE72 pJH78
Figure 105124637-A0202-12-0157-957
SEQ ID NO：146 E224-AE42,C-末端-AE144 pJH79
Figure 105124637-A0202-12-0157-958
SEQ ID NO：147 E224-AE42,C-末端-AE288 pJH80
Figure 105124637-A0202-12-0157-959
Figure 105124637-A0202-12-0158-960
SEQ ID NO：148 N105-AE42,C-末端-Fc pJH81
Figure 105124637-A0202-12-0158-961
SEQ ID NO：149 E224-AE42,C-末端-Fc pJH82
Figure 105124637-A0202-12-0158-962
SEQ ID NO：150 D166-AE42,C-末端-Fc pJH83
Figure 105124637-A0202-12-0158-963
Figure 105124637-A0202-12-0159-964
SEQ ID NO：151 D166-AE72,C-末端-Fc pJH84
Figure 105124637-A0202-12-0159-965
SEQ ID NO：152 D166-AE144,C-末端-Fc pJH85
Figure 105124637-A0202-12-0159-966
SEQ ID NO：153 C-末端-Fc pJH56
Figure 105124637-A0202-12-0160-967
SEQ ID NO：226 C-末端-AE288 pSYN-FIX-102
Figure 105124637-A0202-12-0160-968
SEQ ID NO：227雙鏈D166-AE72,C-末端-Fc pSYN-FIX-216
Figure 105124637-A0202-12-0160-969
SEQ ID NO：228雙鏈D166-AE72,C-末端-Fc pSYN-FIX-216-Fc鏈部分
Figure 105124637-A0202-12-0160-970
<110> 美商百歐維拉提夫治療公司(BIOVERATIV THERAPEUTICS INC.)
<120> 因子IX融合蛋白以及其製備及使用方法
<150> 62/200,590
<151> 2015-08-03
<150> 62/281,993
<151> 2016-01-22
<160> 228
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 415
<212> PRT
<213> 人類FIX多肽
<400> 1
Figure 105124637-A0305-02-0163-1
Figure 105124637-A0305-02-0164-2
Figure 105124637-A0202-12-0163-973
<210> 2
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Padua FIX多肽
<400> 2
Figure 105124637-A0202-12-0164-974
Figure 105124637-A0202-12-0165-975
Figure 105124637-A0202-12-0166-976
<210> 3
<211> 46
<212> PRT
<213> 人類FIX信號肽及前肽
<400> 3
Figure 105124637-A0202-12-0166-977
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AD
<400> 4
Figure 105124637-A0202-12-0167-978
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AD
<400> 5
Figure 105124637-A0202-12-0167-979
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AD
<400> 6
Figure 105124637-A0202-12-0167-980
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AD
<400> 7
Figure 105124637-A0202-12-0168-981
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE、AM
<400> 8
Figure 105124637-A0202-12-0168-982
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE、AM、AQ
<400> 9
Figure 105124637-A0202-12-0168-983
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE、AM、AQ
<400> 10
Figure 105124637-A0202-12-0169-984
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE、AM、AQ
<400> 11
Figure 105124637-A0202-12-0169-985
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AF、AM
<400> 12
Figure 105124637-A0202-12-0169-986
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AF、AM
<400> 13
Figure 105124637-A0202-12-0170-987
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AF、AM
<400> 14
Figure 105124637-A0202-12-0170-988
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AF、AM
<400> 15
Figure 105124637-A0202-12-0170-989
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG、AM
<400> 16
Figure 105124637-A0202-12-0171-990
<210> 17
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG、AM
<400> 17
Figure 105124637-A0202-12-0171-991
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG、AM
<400> 18
Figure 105124637-A0202-12-0171-992
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG、AM
<400> 19
Figure 105124637-A0202-12-0172-993
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AQ
<400> 20
Figure 105124637-A0202-12-0172-994
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AQ
<400> 21
Figure 105124637-A0202-12-0172-995
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AQ
<400> 22
Figure 105124637-A0202-12-0172-996
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AQ
<400> 23
Figure 105124637-A0202-12-0173-997
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AQ
<400> 24
Figure 105124637-A0202-12-0173-998
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AQ
<400> 25
Figure 105124637-A0202-12-0173-999
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC
<400> 26
Figure 105124637-A0202-12-0174-1000
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC
<400> 27
Figure 105124637-A0202-12-0174-1001
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC
<400> 28
Figure 105124637-A0202-12-0174-1002
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BC
<400> 29
Figure 105124637-A0202-12-0175-1003
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BD
<400> 30
Figure 105124637-A0202-12-0175-1004
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BD
<400> 31
Figure 105124637-A0202-12-0175-1005
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BD
<400> 32
Figure 105124637-A0202-12-0176-1006
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BD
<400> 33
Figure 105124637-A0202-12-0176-1007
<210> 34
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE42
<400> 34
Figure 105124637-A0202-12-0176-1008
<210> 35
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE72
<400> 35
Figure 105124637-A0202-12-0177-1009
<210> 36
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE144
<400> 36
Figure 105124637-A0202-12-0177-1010
Figure 105124637-A0202-12-0178-1011
<210> 37
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE144_2A
<400> 37
Figure 105124637-A0202-12-0179-1012
<210> 38
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE144_3B
<400> 38
Figure 105124637-A0202-12-0180-1013
<210> 39
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE144_4A
<400> 39
Figure 105124637-A0202-12-0181-1014
<210> 40
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE144_5A
<400> 40
Figure 105124637-A0202-12-0182-1015
<210> 41
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE144_6B
<400> 41
Figure 105124637-A0202-12-0183-1016
<210> 42
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG144
<400> 42
Figure 105124637-A0202-12-0184-1017
<210> 43
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG144_A
<400> 43
Figure 105124637-A0202-12-0185-1018
Figure 105124637-A0202-12-0186-1019
<210> 44
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG144_B
<400> 44
Figure 105124637-A0202-12-0186-1020
Figure 105124637-A0202-12-0187-1021
<210> 45
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG144_C
<400> 45
Figure 105124637-A0202-12-0187-1022
Figure 105124637-A0202-12-0188-1023
<210> 46
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG144_F
<400> 46
Figure 105124637-A0202-12-0188-1024
Figure 105124637-A0202-12-0189-1025
<210> 47
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE288
<400> 47
Figure 105124637-A0202-12-0189-1026
Figure 105124637-A0202-12-0190-1027
Figure 105124637-A0202-12-0191-1028
<210> 48
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE288_2
<400> 48
Figure 105124637-A0202-12-0191-1029
Figure 105124637-A0202-12-0192-1030
<210> 49
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG288
<400> 49
Figure 105124637-A0202-12-0193-1031
Figure 105124637-A0202-12-0194-1032
<210> 50
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE576
<400> 50
Figure 105124637-A0202-12-0195-1033
Figure 105124637-A0202-12-0196-1034
Figure 105124637-A0202-12-0197-1035
Figure 105124637-A0202-12-0198-1036
<210> 51
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG576
<400> 51
Figure 105124637-A0202-12-0198-1037
Figure 105124637-A0202-12-0199-1038
Figure 105124637-A0202-12-0200-1039
Figure 105124637-A0202-12-0201-1040
<210> 52
<211> 864
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE864
<400> 52
Figure 105124637-A0202-12-0202-1041
Figure 105124637-A0202-12-0203-1042
Figure 105124637-A0202-12-0204-1043
Figure 105124637-A0202-12-0205-1044
Figure 105124637-A0202-12-0206-1045
<210> 53
<211> 864
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG864
<400> 53
Figure 105124637-A0202-12-0207-1046
Figure 105124637-A0202-12-0208-1047
Figure 105124637-A0202-12-0209-1048
Figure 105124637-A0202-12-0210-1049
Figure 105124637-A0202-12-0211-1050
Figure 105124637-A0202-12-0212-1051
<210> 54
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL118
<400> 54
Figure 105124637-A0202-12-0212-1052
Figure 105124637-A0202-12-0213-1053
Figure 105124637-A0202-12-0214-1054
Figure 105124637-A0202-12-0215-1055
<210> 55
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL116
<400> 55
Figure 105124637-A0202-12-0215-1056
Figure 105124637-A0202-12-0216-1057
Figure 105124637-A0202-12-0217-1058
Figure 105124637-A0202-12-0218-1059
<210> 56
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL117
<400> 56
Figure 105124637-A0202-12-0219-1060
Figure 105124637-A0202-12-0220-1061
Figure 105124637-A0202-12-0221-1062
Figure 105124637-A0202-12-0222-1063
<210> 57
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL119
<400> 57
Figure 105124637-A0202-12-0222-1064
Figure 105124637-A0202-12-0223-1065
Figure 105124637-A0202-12-0224-1066
Figure 105124637-A0202-12-0225-1067
<210> 58
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL120
<400> 58
Figure 105124637-A0202-12-0225-1068
Figure 105124637-A0202-12-0226-1069
Figure 105124637-A0202-12-0227-1070
Figure 105124637-A0202-12-0228-1071
Figure 105124637-A0202-12-0229-1072
<210> 59
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL121
<400> 59
Figure 105124637-A0202-12-0229-1073
Figure 105124637-A0202-12-0230-1074
Figure 105124637-A0202-12-0231-1075
Figure 105124637-A0202-12-0232-1076
<210> 60
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL122
<400> 60
Figure 105124637-A0202-12-0232-1077
Figure 105124637-A0202-12-0233-1078
Figure 105124637-A0202-12-0234-1079
Figure 105124637-A0202-12-0235-1080
<210> 61
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL123
<400> 61
Figure 105124637-A0202-12-0236-1081
Figure 105124637-A0202-12-0237-1082
Figure 105124637-A0202-12-0238-1083
Figure 105124637-A0202-12-0239-1084
<210> 62
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL124
<400> 62
Figure 105124637-A0202-12-0239-1085
Figure 105124637-A0202-12-0240-1086
Figure 105124637-A0202-12-0241-1087
Figure 105124637-A0202-12-0242-1088
<210> 63
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL125
<400> 63
Figure 105124637-A0202-12-0243-1089
Figure 105124637-A0202-12-0244-1090
Figure 105124637-A0202-12-0245-1091
Figure 105124637-A0202-12-0246-1092
<210> 64
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL126
<400> 64
Figure 105124637-A0202-12-0246-1093
Figure 105124637-A0202-12-0247-1094
Figure 105124637-A0202-12-0248-1095
Figure 105124637-A0202-12-0249-1096
<210> 65
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL127
<400> 65
Figure 105124637-A0202-12-0249-1097
Figure 105124637-A0202-12-0250-1098
Figure 105124637-A0202-12-0251-1099
Figure 105124637-A0202-12-0252-1100
<210> 66
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL128
<400> 66
Figure 105124637-A0202-12-0253-1101
Figure 105124637-A0202-12-0254-1102
Figure 105124637-A0202-12-0255-1103
Figure 105124637-A0202-12-0256-1104
<210> 67
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL129
<400> 67
Figure 105124637-A0202-12-0256-1105
Figure 105124637-A0202-12-0257-1106
Figure 105124637-A0202-12-0258-1107
Figure 105124637-A0202-12-0259-1108
<210> 68
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL130
<400> 68
Figure 105124637-A0202-12-0260-1109
Figure 105124637-A0202-12-0261-1110
Figure 105124637-A0202-12-0262-1111
Figure 105124637-A0202-12-0263-1112
<210> 69
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL131
<400> 69
Figure 105124637-A0202-12-0263-1113
Figure 105124637-A0202-12-0264-1114
Figure 105124637-A0202-12-0265-1115
Figure 105124637-A0202-12-0266-1116
<210> 70
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL132
<400> 70
Figure 105124637-A0202-12-0266-1117
Figure 105124637-A0202-12-0267-1118
Figure 105124637-A0202-12-0268-1119
Figure 105124637-A0202-12-0269-1120
<210> 71
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL133
<400> 71
Figure 105124637-A0202-12-0270-1121
Figure 105124637-A0202-12-0271-1122
Figure 105124637-A0202-12-0272-1123
Figure 105124637-A0202-12-0273-1124
<210> 72
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL134
<400> 72
Figure 105124637-A0202-12-0273-1125
Figure 105124637-A0202-12-0274-1126
Figure 105124637-A0202-12-0275-1127
Figure 105124637-A0202-12-0276-1128
<210> 73
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL135
<400> 73
Figure 105124637-A0202-12-0277-1129
Figure 105124637-A0202-12-0278-1130
Figure 105124637-A0202-12-0279-1131
Figure 105124637-A0202-12-0280-1132
<210> 74
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL136
<400> 74
Figure 105124637-A0202-12-0280-1133
Figure 105124637-A0202-12-0281-1134
Figure 105124637-A0202-12-0282-1135
Figure 105124637-A0202-12-0283-1136
<210> 75
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL137
<400> 75
Figure 105124637-A0202-12-0283-1137
Figure 105124637-A0202-12-0284-1138
Figure 105124637-A0202-12-0285-1139
Figure 105124637-A0202-12-0286-1140
Figure 105124637-A0202-12-0287-1141
<210> 76
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL138
<400> 76
Figure 105124637-A0202-12-0287-1142
Figure 105124637-A0202-12-0288-1143
Figure 105124637-A0202-12-0289-1144
Figure 105124637-A0202-12-0290-1145
<210> 77
<211> 575
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL140
<400> 77
Figure 105124637-A0202-12-0290-1146
Figure 105124637-A0202-12-0291-1147
Figure 105124637-A0202-12-0292-1148
Figure 105124637-A0202-12-0293-1149
<210> 78
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL141
<400> 78
Figure 105124637-A0202-12-0294-1150
Figure 105124637-A0202-12-0295-1151
Figure 105124637-A0202-12-0296-1152
Figure 105124637-A0202-12-0297-1153
<210> 79
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL142
<400> 79
Figure 105124637-A0202-12-0297-1154
Figure 105124637-A0202-12-0298-1155
Figure 105124637-A0202-12-0299-1156
Figure 105124637-A0202-12-0300-1157
<210> 80
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL143
<400> 80
Figure 105124637-A0202-12-0301-1158
Figure 105124637-A0202-12-0302-1159
Figure 105124637-A0202-12-0303-1160
Figure 105124637-A0202-12-0304-1161
<210> 81
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL144
<400> 81
Figure 105124637-A0202-12-0304-1162
Figure 105124637-A0202-12-0305-1163
Figure 105124637-A0202-12-0306-1164
Figure 105124637-A0202-12-0307-1165
<210> 82
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL145
<400> 82
Figure 105124637-A0202-12-0307-1166
Figure 105124637-A0202-12-0308-1167
Figure 105124637-A0202-12-0309-1168
Figure 105124637-A0202-12-0310-1169
<210> 83
<211> 683
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL164
<400> 83
Figure 105124637-A0202-12-0311-1170
Figure 105124637-A0202-12-0312-1171
Figure 105124637-A0202-12-0313-1172
Figure 105124637-A0202-12-0314-1173
Figure 105124637-A0202-12-0315-1174
<210> 84
<211> 827
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL165
<400> 84
Figure 105124637-A0202-12-0315-1175
Figure 105124637-A0202-12-0316-1176
Figure 105124637-A0202-12-0317-1177
Figure 105124637-A0202-12-0318-1178
Figure 105124637-A0202-12-0319-1179
Figure 105124637-A0202-12-0320-1180
<210> 85
<211> 1403
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL166
<400> 85
Figure 105124637-A0202-12-0320-1181
Figure 105124637-A0202-12-0321-1182
Figure 105124637-A0202-12-0322-1183
Figure 105124637-A0202-12-0323-1184
Figure 105124637-A0202-12-0324-1185
Figure 105124637-A0202-12-0325-1186
Figure 105124637-A0202-12-0326-1187
Figure 105124637-A0202-12-0327-1188
Figure 105124637-A0202-12-0328-1189
<210> 86
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL167
<400> 86
Figure 105124637-A0202-12-0328-1190
Figure 105124637-A0202-12-0329-1191
Figure 105124637-A0202-12-0330-1192
Figure 105124637-A0202-12-0331-1193
Figure 105124637-A0202-12-0332-1194
<210> 87
<211> 657
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL168
<400> 87
Figure 105124637-A0202-12-0332-1195
Figure 105124637-A0202-12-0333-1196
Figure 105124637-A0202-12-0334-370
Figure 105124637-A0202-12-0335-371
Figure 105124637-A0202-12-0336-372
<210> 88
<211> 801
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL169
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Figure 105124637-A0202-12-0336-373
Figure 105124637-A0202-12-0337-374
Figure 105124637-A0202-12-0338-376
Figure 105124637-A0202-12-0339-377
Figure 105124637-A0202-12-0340-378
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL170
<400> 89
Figure 105124637-A0202-12-0341-379
Figure 105124637-A0202-12-0342-380
Figure 105124637-A0202-12-0343-381
Figure 105124637-A0202-12-0344-382
<210> 90
<211> 657
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL171
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Figure 105124637-A0202-12-0344-383
Figure 105124637-A0202-12-0345-384
Figure 105124637-A0202-12-0346-385
Figure 105124637-A0202-12-0347-386
Figure 105124637-A0202-12-0348-387
<210> 91
<211> 801
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL172
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Figure 105124637-A0202-12-0348-388
Figure 105124637-A0202-12-0349-389
Figure 105124637-A0202-12-0350-390
Figure 105124637-A0202-12-0351-391
Figure 105124637-A0202-12-0352-392
Figure 105124637-A0202-12-0353-393
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 105124637-A0202-12-0353-394
Figure 105124637-A0202-12-0354-395
Figure 105124637-A0202-12-0355-396
Figure 105124637-A0202-12-0356-397
Figure 105124637-A0202-12-0357-398
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 105124637-A0202-12-0357-399
Figure 105124637-A0202-12-0358-400
Figure 105124637-A0202-12-0359-401
Figure 105124637-A0202-12-0360-402
Figure 105124637-A0202-12-0361-403
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 105124637-A0202-12-0361-404
Figure 105124637-A0202-12-0362-405
Figure 105124637-A0202-12-0363-406
Figure 105124637-A0202-12-0364-407
Figure 105124637-A0202-12-0365-408
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<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> pNL176
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Figure 105124637-A0202-12-0366-409
Figure 105124637-A0202-12-0367-410
Figure 105124637-A0202-12-0368-411
Figure 105124637-A0202-12-0369-412
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 105124637-A0202-12-0369-413
Figure 105124637-A0202-12-0370-414
Figure 105124637-A0202-12-0371-415
Figure 105124637-A0202-12-0372-416
Figure 105124637-A0202-12-0373-417
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> pNL178
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Figure 105124637-A0202-12-0373-418
Figure 105124637-A0202-12-0374-419
Figure 105124637-A0202-12-0375-420
Figure 105124637-A0202-12-0376-421
Figure 105124637-A0202-12-0377-422
Figure 105124637-A0202-12-0378-423
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL179
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Figure 105124637-A0202-12-0378-424
Figure 105124637-A0202-12-0379-425
Figure 105124637-A0202-12-0380-426
Figure 105124637-A0202-12-0381-427
Figure 105124637-A0202-12-0382-428
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL180
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Figure 105124637-A0202-12-0382-429
Figure 105124637-A0202-12-0383-430
Figure 105124637-A0202-12-0384-431
Figure 105124637-A0202-12-0385-433
Figure 105124637-A0202-12-0386-434
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 105124637-A0202-12-0386-435
Figure 105124637-A0202-12-0387-436
Figure 105124637-A0202-12-0388-437
Figure 105124637-A0202-12-0389-438
Figure 105124637-A0202-12-0390-440
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<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL182
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Figure 105124637-A0202-12-0391-441
Figure 105124637-A0202-12-0392-442
Figure 105124637-A0202-12-0393-443
Figure 105124637-A0202-12-0394-444
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL183
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Figure 105124637-A0202-12-0394-445
Figure 105124637-A0202-12-0395-446
Figure 105124637-A0202-12-0396-447
Figure 105124637-A0202-12-0397-448
Figure 105124637-A0202-12-0398-449
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<211> 801
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL184
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Figure 105124637-A0202-12-0398-450
Figure 105124637-A0202-12-0399-451
Figure 105124637-A0202-12-0400-452
Figure 105124637-A0202-12-0401-453
Figure 105124637-A0202-12-0402-454
Figure 105124637-A0202-12-0403-455
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<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL185
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Figure 105124637-A0202-12-0403-456
Figure 105124637-A0202-12-0404-457
Figure 105124637-A0202-12-0405-458
Figure 105124637-A0202-12-0406-459
Figure 105124637-A0202-12-0407-460
<210> 105
<211> 657
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL186
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Figure 105124637-A0202-12-0407-461
Figure 105124637-A0202-12-0408-462
Figure 105124637-A0202-12-0409-463
Figure 105124637-A0202-12-0410-464
Figure 105124637-A0202-12-0411-465
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL187
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Figure 105124637-A0202-12-0411-466
Figure 105124637-A0202-12-0412-467
Figure 105124637-A0202-12-0413-468
Figure 105124637-A0202-12-0414-469
Figure 105124637-A0202-12-0415-470
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<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL188
<400> 107
Figure 105124637-A0202-12-0416-471
Figure 105124637-A0202-12-0417-472
Figure 105124637-A0202-12-0418-473
Figure 105124637-A0202-12-0419-474
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<211> 657
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL189
<400> 108
Figure 105124637-A0202-12-0419-475
Figure 105124637-A0202-12-0420-476
Figure 105124637-A0202-12-0421-477
Figure 105124637-A0202-12-0422-479
Figure 105124637-A0202-12-0423-480
<210> 109
<211> 801
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL190
<400> 109
Figure 105124637-A0202-12-0423-481
Figure 105124637-A0202-12-0424-482
Figure 105124637-A0202-12-0425-483
Figure 105124637-A0202-12-0426-484
Figure 105124637-A0202-12-0427-485
Figure 105124637-A0202-12-0428-486
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL195
<400> 110
Figure 105124637-A0202-12-0428-487
Figure 105124637-A0202-12-0429-488
Figure 105124637-A0202-12-0430-489
Figure 105124637-A0202-12-0431-490
<210> 111
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL196
<400> 111
Figure 105124637-A0202-12-0432-491
Figure 105124637-A0202-12-0433-492
Figure 105124637-A0202-12-0434-493
Figure 105124637-A0202-12-0435-494
<210> 112
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL197
<400> 112
Figure 105124637-A0202-12-0435-495
Figure 105124637-A0202-12-0436-496
Figure 105124637-A0202-12-0437-497
Figure 105124637-A0202-12-0438-499
<210> 113
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL198
<400> 113
Figure 105124637-A0202-12-0439-500
Figure 105124637-A0202-12-0440-501
Figure 105124637-A0202-12-0441-502
Figure 105124637-A0202-12-0442-503
<210> 114
<211> 549
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL199
<400> 114
Figure 105124637-A0202-12-0442-504
Figure 105124637-A0202-12-0443-505
Figure 105124637-A0202-12-0444-506
Figure 105124637-A0202-12-0445-507
<210> 115
<211> 611
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pNL202
<400> 115
Figure 105124637-A0202-12-0445-508
Figure 105124637-A0202-12-0446-509
Figure 105124637-A0202-12-0447-510
Figure 105124637-A0202-12-0448-511
Figure 105124637-A0202-12-0449-512
<210> 116
<211> 1345
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIX-092
<400> 116
Figure 105124637-A0202-12-0449-513
Figure 105124637-A0202-12-0450-514
Figure 105124637-A0202-12-0451-515
Figure 105124637-A0202-12-0452-516
Figure 105124637-A0202-12-0453-517
Figure 105124637-A0202-12-0454-518
Figure 105124637-A0202-12-0455-519
Figure 105124637-A0202-12-0456-520
Figure 105124637-A0202-12-0457-521
<210> 117
<211> 655
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH0131
<400> 117
Figure 105124637-A0202-12-0457-522
Figure 105124637-A0202-12-0458-523
Figure 105124637-A0202-12-0459-524
Figure 105124637-A0202-12-0460-525
Figure 105124637-A0202-12-0461-526
<210> 118
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH44
<400> 118
Figure 105124637-A0202-12-0461-527
Figure 105124637-A0202-12-0462-528
Figure 105124637-A0202-12-0463-529
Figure 105124637-A0202-12-0464-530
<210> 119
<211> 539
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH46
<400> 119
Figure 105124637-A0202-12-0464-531
Figure 105124637-A0202-12-0465-532
Figure 105124637-A0202-12-0466-533
Figure 105124637-A0202-12-0467-534
<210> 120
<211> 611
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH47
<400> 120
Figure 105124637-A0202-12-0468-535
Figure 105124637-A0202-12-0469-536
Figure 105124637-A0202-12-0470-537
Figure 105124637-A0202-12-0471-538
<210> 121
<211> 655
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH50
<400> 121
Figure 105124637-A0202-12-0471-539
Figure 105124637-A0202-12-0472-540
Figure 105124637-A0202-12-0473-541
Figure 105124637-A0202-12-0474-542
Figure 105124637-A0202-12-0475-543
<210> 122
<211> 799
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH51
<400> 122
Figure 105124637-A0202-12-0475-544
Figure 105124637-A0202-12-0476-545
Figure 105124637-A0202-12-0477-546
Figure 105124637-A0202-12-0478-547
Figure 105124637-A0202-12-0479-548
Figure 105124637-A0202-12-0480-549
<210> 123
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH52
<400> 123
Figure 105124637-A0202-12-0480-550
Figure 105124637-A0202-12-0481-551
Figure 105124637-A0202-12-0482-552
Figure 105124637-A0202-12-0483-553
<210> 124
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH54
<400> 124
Figure 105124637-A0202-12-0484-554
Figure 105124637-A0202-12-0485-555
Figure 105124637-A0202-12-0486-556
<210> 125
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH55
<400> 125
Figure 105124637-A0202-12-0487-557
Figure 105124637-A0202-12-0488-558
Figure 105124637-A0202-12-0489-559
Figure 105124637-A0202-12-0490-560
<210> 126
<211> 625
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH59
<400> 126
Figure 105124637-A0202-12-0490-561
Figure 105124637-A0202-12-0491-562
Figure 105124637-A0202-12-0492-563
Figure 105124637-A0202-12-0493-564
<210> 127
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH60
<400> 127
Figure 105124637-A0202-12-0494-565
Figure 105124637-A0202-12-0495-566
Figure 105124637-A0202-12-0496-567
Figure 105124637-A0202-12-0497-568
Figure 105124637-A0202-12-0498-569
<210> 128
<211> 841
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH61
<400> 128
Figure 105124637-A0202-12-0498-570
Figure 105124637-A0202-12-0499-571
Figure 105124637-A0202-12-0500-572
Figure 105124637-A0202-12-0501-573
Figure 105124637-A0202-12-0502-574
Figure 105124637-A0202-12-0503-575
<210> 129
<211> 661
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH62
<400> 129
Figure 105124637-A0202-12-0503-576
Figure 105124637-A0202-12-0504-577
Figure 105124637-A0202-12-0505-578
Figure 105124637-A0202-12-0506-579
Figure 105124637-A0202-12-0507-580
<210> 130
<211> 733
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH63
<400> 130
Figure 105124637-A0202-12-0507-581
Figure 105124637-A0202-12-0508-582
Figure 105124637-A0202-12-0509-583
Figure 105124637-A0202-12-0510-584
Figure 105124637-A0202-12-0511-585
<210> 131
<211> 877
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH64
<400> 131
Figure 105124637-A0202-12-0512-586
Figure 105124637-A0202-12-0513-587
Figure 105124637-A0202-12-0514-588
Figure 105124637-A0202-12-0515-589
Figure 105124637-A0202-12-0516-590
<210> 132
<211> 733
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH65
<400> 132
Figure 105124637-A0202-12-0517-591
Figure 105124637-A0202-12-0518-592
Figure 105124637-A0202-12-0519-593
Figure 105124637-A0202-12-0520-594
Figure 105124637-A0202-12-0521-595
<210> 133
<211> 805
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH66
<400> 133
Figure 105124637-A0202-12-0521-596
Figure 105124637-A0202-12-0522-597
Figure 105124637-A0202-12-0523-598
Figure 105124637-A0202-12-0524-599
Figure 105124637-A0202-12-0525-600
Figure 105124637-A0202-12-0526-601
<210> 134
<211> 949
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH67
<400> 134
Figure 105124637-A0202-12-0526-602
Figure 105124637-A0202-12-0527-603
Figure 105124637-A0202-12-0528-604
Figure 105124637-A0202-12-0529-605
Figure 105124637-A0202-12-0530-606
Figure 105124637-A0202-12-0531-607
<210> 135
<211> 545
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH68
<400> 135
Figure 105124637-A0202-12-0532-608
Figure 105124637-A0202-12-0533-609
Figure 105124637-A0202-12-0534-610
Figure 105124637-A0202-12-0535-611
<210> 136
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH69
<400> 136
Figure 105124637-A0202-12-0535-612
Figure 105124637-A0202-12-0536-613
Figure 105124637-A0202-12-0537-614
Figure 105124637-A0202-12-0538-615
<210> 137
<211> 653
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH70
<400> 137
Figure 105124637-A0202-12-0539-616
Figure 105124637-A0202-12-0540-617
Figure 105124637-A0202-12-0541-618
Figure 105124637-A0202-12-0542-620
<210> 138
<211> 625
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH71
<400> 138
Figure 105124637-A0202-12-0543-621
Figure 105124637-A0202-12-0544-622
Figure 105124637-A0202-12-0545-623
Figure 105124637-A0202-12-0546-624
<210> 139
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH72
<400> 139
Figure 105124637-A0202-12-0547-625
Figure 105124637-A0202-12-0548-626
Figure 105124637-A0202-12-0549-627
Figure 105124637-A0202-12-0550-628
<210> 140
<211> 841
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH73
<400> 140
Figure 105124637-A0202-12-0551-629
Figure 105124637-A0202-12-0552-630
Figure 105124637-A0202-12-0553-631
Figure 105124637-A0202-12-0554-632
Figure 105124637-A0202-12-0555-633
<210> 141
<211> 545
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH74
<400> 141
Figure 105124637-A0202-12-0556-634
Figure 105124637-A0202-12-0557-635
Figure 105124637-A0202-12-0558-636
Figure 105124637-A0202-12-0559-637
<210> 142
<211> 545
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH75
<400> 142
Figure 105124637-A0202-12-0559-638
Figure 105124637-A0202-12-0560-639
Figure 105124637-A0202-12-0561-640
Figure 105124637-A0202-12-0562-641
<210> 143
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH76
<400> 143
Figure 105124637-A0202-12-0563-642
Figure 105124637-A0202-12-0564-643
Figure 105124637-A0202-12-0565-644
Figure 105124637-A0202-12-0566-645
<210> 144
<211> 653
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH77
<400> 144
Figure 105124637-A0202-12-0566-646
Figure 105124637-A0202-12-0567-647
Figure 105124637-A0202-12-0568-648
Figure 105124637-A0202-12-0569-649
Figure 105124637-A0202-12-0570-650
<210> 145
<211> 625
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH78
<400> 145
Figure 105124637-A0202-12-0570-651
Figure 105124637-A0202-12-0571-652
Figure 105124637-A0202-12-0572-653
Figure 105124637-A0202-12-0573-654
Figure 105124637-A0202-12-0574-655
<210> 146
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH79
<400> 146
Figure 105124637-A0202-12-0574-656
Figure 105124637-A0202-12-0575-657
Figure 105124637-A0202-12-0576-658
Figure 105124637-A0202-12-0577-659
Figure 105124637-A0202-12-0578-660
<210> 147
<211> 841
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH80
<400> 147
Figure 105124637-A0202-12-0578-661
Figure 105124637-A0202-12-0579-662
Figure 105124637-A0202-12-0580-663
Figure 105124637-A0202-12-0581-664
Figure 105124637-A0202-12-0582-665
Figure 105124637-A0202-12-0583-666
<210> 148
<211> 977
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH81
<400> 148
Figure 105124637-A0202-12-0583-667
Figure 105124637-A0202-12-0584-668
Figure 105124637-A0202-12-0585-669
Figure 105124637-A0202-12-0586-670
Figure 105124637-A0202-12-0587-671
Figure 105124637-A0202-12-0588-672
Figure 105124637-A0202-12-0589-673
<210> 149
<211> 977
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH81
<400> 149
Figure 105124637-A0202-12-0589-674
Figure 105124637-A0202-12-0590-675
Figure 105124637-A0202-12-0591-676
Figure 105124637-A0202-12-0592-677
Figure 105124637-A0202-12-0593-678
Figure 105124637-A0202-12-0594-679
Figure 105124637-A0202-12-0595-680
<210> 150
<211> 977
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH82
<400> 150
Figure 105124637-A0202-12-0595-681
Figure 105124637-A0202-12-0596-682
Figure 105124637-A0202-12-0597-683
Figure 105124637-A0202-12-0598-684
Figure 105124637-A0202-12-0599-685
Figure 105124637-A0202-12-0600-686
Figure 105124637-A0202-12-0601-687
<210> 151
<211> 1013
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH84
<400> 151
Figure 105124637-A0202-12-0601-688
Figure 105124637-A0202-12-0602-689
Figure 105124637-A0202-12-0603-690
Figure 105124637-A0202-12-0604-691
Figure 105124637-A0202-12-0605-692
Figure 105124637-A0202-12-0606-693
Figure 105124637-A0202-12-0607-694
<210> 152
<211> 1085
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH85
<400> 152
Figure 105124637-A0202-12-0607-695
Figure 105124637-A0202-12-0608-696
Figure 105124637-A0202-12-0609-697
Figure 105124637-A0202-12-0610-698
Figure 105124637-A0202-12-0611-699
Figure 105124637-A0202-12-0612-700
Figure 105124637-A0202-12-0613-701
<210> 153
<211> 935
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pJH56
<400> 153
Figure 105124637-A0202-12-0613-702
Figure 105124637-A0202-12-0614-703
Figure 105124637-A0202-12-0615-704
Figure 105124637-A0202-12-0616-705
Figure 105124637-A0202-12-0617-706
Figure 105124637-A0202-12-0618-707
Figure 105124637-A0202-12-0619-708
<210> 154
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽
<400> 154
Figure 105124637-A0202-12-0619-709
<210> 155
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽
<400> 155
Figure 105124637-A0202-12-0619-710
Figure 105124637-A0202-12-0620-711
<210> 156
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽
<400> 156
Figure 105124637-A0202-12-0620-712
<210> 157
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽
<400> 157
Figure 105124637-A0202-12-0620-713
<210> 158
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽
<400> 158
Figure 105124637-A0202-12-0621-714
<210> 159
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽
<400> 159
Figure 105124637-A0202-12-0621-715
<210> 160
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽
<400> 160
Figure 105124637-A0202-12-0621-716
Figure 105124637-A0202-12-0622-717
<210> 161
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 161
Figure 105124637-A0202-12-0622-718
<210> 162
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 162
Figure 105124637-A0202-12-0622-719
<210> 163
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白結合肽核心序列
<400> 163
Figure 105124637-A0202-12-0623-720
<210> 164
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP肽
<400> 164
Figure 105124637-A0202-12-0623-721
<210> 165
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP肽
<400> 165
Figure 105124637-A0202-12-0623-722
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FXIa裂解位點
<400> 166
Figure 105124637-A0202-12-0624-723
<210> 167
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FXIa裂解位點
<400> 167
Figure 105124637-A0202-12-0624-724
<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝血酶裂解位點
<400> 168
Figure 105124637-A0202-12-0624-725
<210> 169
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝血酶裂解位點
<400> 169
Figure 105124637-A0202-12-0625-726
<210> 170
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝血酶裂解位點
<400> 170
Figure 105124637-A0202-12-0625-727
<210> 171
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 凝血酶裂解位點
<400> 171
Figure 105124637-A0202-12-0625-728
<210> 172
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 172
Figure 105124637-A0202-12-0626-729
<210> 173
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 173
Figure 105124637-A0202-12-0626-730
<210> 174
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 174
Figure 105124637-A0202-12-0626-731
<210> 175
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 175
Figure 105124637-A0202-12-0627-732
<210> 176
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 176
Figure 105124637-A0202-12-0627-733
<210> 177
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 177
Figure 105124637-A0202-12-0627-734
Figure 105124637-A0202-12-0628-735
<210> 178
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 178
Figure 105124637-A0202-12-0628-736
<210> 179
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 179
Figure 105124637-A0202-12-0628-737
Figure 105124637-A0202-12-0629-738
<210> 180
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 180
Figure 105124637-A0202-12-0629-739
<210> 181
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 181
Figure 105124637-A0202-12-0629-740
<210> 182
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 182
Figure 105124637-A0202-12-0629-741
<210> 183
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 183
Figure 105124637-A0202-12-0630-742
<210> 184
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 184
Figure 105124637-A0202-12-0630-743
<210> 185
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 185
Figure 105124637-A0202-12-0631-744
<210> 186
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 186
Figure 105124637-A0202-12-0631-745
<210> 187
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 187
Figure 105124637-A0202-12-0631-746
Figure 105124637-A0202-12-0632-747
<210> 188
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 188
Figure 105124637-A0202-12-0632-748
<210> 189
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gly-Ser肽連接子
<400> 189
Figure 105124637-A0202-12-0632-749
Figure 105124637-A0202-12-0633-750
<210> 190
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1連接子基元
<400> 190
Figure 105124637-A0202-12-0633-751
<210> 191
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1連接子基元
<400> 191
Figure 105124637-A0202-12-0633-752
<210> 192
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1連接子基元
<400> 192
Figure 105124637-A0202-12-0634-753
<210> 193
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1連接子基元
<400> 193
Figure 105124637-A0202-12-0634-754
<210> 194
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1連接子基元
<400> 194
Figure 105124637-A0202-12-0634-755
<210> 195
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1連接子基元
<400> 195
Figure 105124637-A0202-12-0635-756
<210> 196
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1連接子基元
<400> 196
Figure 105124637-A0202-12-0635-757
<210> 197
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1連接子基元
<400> 197
Figure 105124637-A0202-12-0635-758
<210> 198
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1連接子基元
<400> 198
Figure 105124637-A0202-12-0635-759
<210> 199
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1連接子基元
<400> 199
Figure 105124637-A0202-12-0636-760
<210> 200
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1連接子基元
<400> 200
Figure 105124637-A0202-12-0636-761
<210> 201
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAR1連接子基元
<400> 201
Figure 105124637-A0202-12-0636-762
<210> 202
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN_AE72_2A_1
<400> 202
Figure 105124637-A0202-12-0637-763
<210> 203
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN_AE72_2A_2
<400> 203
Figure 105124637-A0202-12-0637-764
Figure 105124637-A0202-12-0638-765
<210> 204
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN_AE72_3B_1
<400> 204
Figure 105124637-A0202-12-0638-766
<210> 205
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN_AE72_3B_2
<400> 205
Figure 105124637-A0202-12-0639-767
<210> 206
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN_AE72_4A_2
<400> 206
Figure 105124637-A0202-12-0639-768
Figure 105124637-A0202-12-0640-769
<210> 207
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN_AE72_5A_2
<400> 207
Figure 105124637-A0202-12-0640-770
Figure 105124637-A0202-12-0641-771
<210> 208
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN_AE72_6B_1
<400> 208
Figure 105124637-A0202-12-0641-772
<210> 209
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN_AE72_6B_2
<400> 209
Figure 105124637-A0202-12-0642-773
<210> 210
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN_AE72_1A_1
<400> 210
Figure 105124637-A0202-12-0642-774
Figure 105124637-A0202-12-0643-775
<210> 211
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN_AE72_1A_2
<400> 211
Figure 105124637-A0202-12-0643-776
<210> 212
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> XTEN_AE144_1A
<400> 212
Figure 105124637-A0202-12-0644-777
<210> 213
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE150
<400> 213
Figure 105124637-A0202-12-0645-778
<210> 214
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG150
<400> 214
Figure 105124637-A0202-12-0646-779
Figure 105124637-A0202-12-0647-780
<210> 215
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE294
<400> 215
Figure 105124637-A0202-12-0647-781
Figure 105124637-A0202-12-0648-782
Figure 105124637-A0202-12-0649-783
<210> 216
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AG294
<400> 216
Figure 105124637-A0202-12-0649-784
Figure 105124637-A0202-12-0650-785
<210> 217
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE36
<400> 217
Figure 105124637-A0202-12-0651-786
<210> 218
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AE78
<400> 218
Figure 105124637-A0202-12-0651-787
Figure 105124637-A0202-12-0652-788
<210> 219
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 219
Figure 105124637-A0202-12-0652-789
<210> 220
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 220
Figure 105124637-A0202-12-0652-790
Figure 105124637-A0202-12-0653-791
<210> 221
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 221
Figure 105124637-A0202-12-0653-792
<210> 222
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 222
Figure 105124637-A0202-12-0653-793
<210> 223
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 223
Figure 105124637-A0202-12-0654-794
<210> 224
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 224
Figure 105124637-A0202-12-0654-795
<210> 225
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 225
Figure 105124637-A0202-12-0655-796
<210> 226
<211> 798
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN-FIX-102
<400> 226
Figure 105124637-A0202-12-0655-797
Figure 105124637-A0202-12-0656-798
Figure 105124637-A0202-12-0657-799
Figure 105124637-A0202-12-0658-800
Figure 105124637-A0202-12-0659-801
<210> 227
<211> 763
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN-FIX-216
<400> 227
Figure 105124637-A0202-12-0660-802
Figure 105124637-A0202-12-0661-803
Figure 105124637-A0202-12-0662-804
Figure 105124637-A0202-12-0663-805
Figure 105124637-A0202-12-0664-806
<210> 228
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pSYN-FIX-216-Fc
<400> 228
Figure 105124637-A0202-12-0664-807
Figure 105124637-A0202-12-0665-808
Figure 105124637-A0202-12-0666-809

Claims (21)

  1. 一種因子IX(FIX)融合蛋白，其包含FIX多肽及插入該FIX多肽內的XTEN，其中該FIX融合蛋白包含SEQ ID NO：2之FIX多肽胺基酸序列，其具有該XTEN插入在選自由以下組成之群組的插入位點：SEQ ID NO：2之胺基酸149、SEQ ID NO：2之胺基酸162、SEQ ID NO：2之胺基酸166及SEQ ID NO：2之胺基酸174，其中該XTEN為約42個胺基酸至約288個胺基酸長度，且其中該FIX融合蛋白展現促凝血活性。
  2. 如申請專利範圍第1項之FIX融合蛋白，其中當與缺乏該XTEN插入之R338L FIX(Padua)變異體多肽相較，該FIX融合蛋白能夠展現大於至少1.5倍的活體內半衰期。
  3. 如申請專利範圍第1項之FIX融合蛋白，其中該插入位點為SEQ ID NO：2之胺基酸166。
  4. 如申請專利範圍第1項之FIX融合蛋白，其中該XTEN包含約72個胺基酸。
  5. 如申請專利範圍第1項之FIX融合蛋白，其中該XTEN包含約144個胺基酸或約288個胺基酸。
  6. 如申請專利範圍第1項之FIX融合蛋白，其另外包含第一Fc結構域，其具有SEQ ID NO：228之胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第6項之FIX融合蛋白，其另外包含第二Fc結構域，其具有SEQ ID NO：228之胺基酸序 列。
  8. 如申請專利範圍第7項之FIX融合蛋白，其包含兩條多肽鏈，其中：a.該第一多肽鏈包含該第一Fc結構域，該第一Fc結構域融合至含有該XTEN之該FIX多肽的N末端或C末端，且b.該第二多肽鏈包含該第二Fc結構域，其中該第一Fc結構域與該第二Fc結構域藉由共價鍵締合，其中該共價鍵為二硫鍵。
  9. 如申請專利範圍第8項之FIX融合蛋白，其中該第一Fc結構域與該第二Fc結構域藉由兩個二硫鍵締合。
  10. 如申請專利範圍第1項之FIX融合蛋白，其中該FIX融合蛋白包含SEQ ID NO：227之胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第1項之FIX融合蛋白，其中該FIX融合蛋白包含SEQ ID NO：227之胺基酸序列，且無信號肽及無前肽(胺基酸1-46)。
  12. 一種因子IX(FIX)融合蛋白，其包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中：a.該第一多肽鏈包含：i.FIX多肽及插入該FIX多肽內的XTEN，其中該FIX融合蛋白包含SEQ ID NO：2之FIX多肽胺基酸序列，其具有該XTEN插入在SEQ ID NO：2之胺基酸166，且其中該XTEN包含具有約76個胺基酸之胺基酸序列；及 ii.第一Fc結構域，其具有SEQ ID NO：228之胺基酸序列，其中該第一Fc結構域融合至含有該XTEN之該FIX多肽的C末端；且b.該第二多肽鏈包含具有SEQ ID NO：228之胺基酸序列的第二Fc結構域，其中該第一Fc結構域與該第二Fc結構域藉由共價鍵締合；其中該共價鍵為二硫鍵；且其中該FIX融合蛋白展現促凝血活性。
  13. 如申請專利範圍第12項之FIX融合蛋白，其中該第一Fc結構域與該第二Fc結構域以兩個二硫鍵締合。
  14. 如申請專利範圍第12項之FIX融合蛋白，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：227之胺基酸序列，且其中該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：228之胺基酸序列。
  15. 如申請專利範圍第14項之FIX融合蛋白，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：227之胺基酸序列，且無信號肽及無前肽(胺基酸1-46)，及其中該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：228之胺基酸序列。
  16. 一種經分離之聚核苷酸，其包含編碼如申請專利範圍第1-15項任一項之FIX融合蛋白的序列。
  17. 一種表現載體，其包含如申請專利範圍第16項之聚核苷酸。
  18. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第17項之表現載體。
  19. 一種有效量之如申請專利範圍第1-15項任一項之FIX融合蛋白於製造用於降低人類受試者中出血事件頻率之藥物的用途，其中該受試者具有B型血友病。
  20. 一種有效量之如申請專利範圍第1-15項任一項之FIX融合蛋白於製造用於人類受試者中出血預防性治療之藥物的用途，其中該受試者具有B型血友病。
  21. 一種有效量之如申請專利範圍第1-15項任一項之FIX融合蛋白於製造用於人類受試者中出血需要性(on-demand)治療之藥物的用途，其中該受試者具有B型血友病。
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