UA125432C2 - Оптимізовані варіанти анти-vegf антитіл - Google Patents

Оптимізовані варіанти анти-vegf антитіл Download PDF

Info

Publication number
UA125432C2
UA125432C2 UAA201800443A UAA201800443A UA125432C2 UA 125432 C2 UA125432 C2 UA 125432C2 UA A201800443 A UAA201800443 A UA A201800443A UA A201800443 A UAA201800443 A UA A201800443A UA 125432 C2 UA125432 C2 UA 125432C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
amino acid
mese
acid sequence
fact
Prior art date
Application number
UAA201800443A
Other languages
English (en)
Inventor
Патрік Кеніг
Патрик КЕНИГ
Чінгвей Вівіан Лі
Чингвей Вивиан ЛИ
Картікан Раджагопал
Картикан РАДЖАГОПАЛ
Амін Фемілі
Амин Фемили
Жермен Фух
Original Assignee
Дженентек, Інк.
Дженентек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дженентек, Інк., Дженентек, Инк. filed Critical Дженентек, Інк.
Publication of UA125432C2 publication Critical patent/UA125432C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Description

Перелік послідовностей
У поточному додатку міститься перелік послідовностей, який був представлений в електронному вигляді в форматі АЗСІЇ і повністю включений в цей опис за допомогою посилання. Зазначена копія АБСІЇ, створена 21 вересня 2016 року, називається 50474- 110У/03 Зедциепсе і ібйіпуд 9 21 16 5125 і має розмір 41 764 байт.
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ
Винахід відноситься в цілому до анти-МЕСЕ антитіл, а також до композицій, які включають анти-
МЕСЕ антитіла (наприклад, кон'югати антитіл, злиті білки і полімерні склади), з корисними властивостями для дослідницьких, терапевтичних та діагностичних цілей. Винахід також відноситься до способів ідентифікації варіантів антитіл з покращеними властивостями, наприклад, з підвищеною афінністю зв'язування, стабільністю і/або експресією.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Ангіогенез - це строго регульований процес, за допомогою якого нові кровоносні судини формуються з раніше існуючих кровоносних судин. Хоча ангіогенез важливий під час розвитку для забезпечення адекватного кровообігу, велика кількість розладів пов'язана з патологічним ангіогенезом, таким як окулярні розлади (наприклад, вікова дегенерація жовтої плями, АМО) і клітинні проліферативні розлади (наприклад, рак). Фактор росту ендотелію судин (МЕСЕ) є клінічно обгрунтованим драйвером ангіогенезу і нейтралізації МЕС, наприклад, з використанням анти-МЕСЕ блокуючого антитіла, може використовуватися для лікування розладів, пов'язаних з патологічним ангіогенезом.
Залишається потреба в антитілах, таких як анти-МЕСЕ антитіла, з поліпшеною афінністю зв'язування, стабільністю, фармакокінетикою і/або експресією, наприклад, для використання при лікуванні розладів, пов'язаних з патологічним ангіогенезом. Зокрема, існує потреба в композиціях антитіл для доставляння тривалої дії для лікування окулярних розладів (наприклад, АМО (наприклад, вологої АМО), діабетичного макулярного набряку (ОМЕ), діабетичної ретинопатії (ОК) і оклюзії сітківки (ЕМО)). Крім того, існує незадоволена потреба в поліпшених способах ідентифікації таких антитіл з покращеними властивостями (наприклад, поліпшеною афінністю зв'язування, стабільністю, фармакокінетикою і/або експресією).
СУТЬ ВИНАХОДУ
В даному винаході запропоновано анти-МЕСЕ антитіла, композиції, які включають анти-МЕСЕ антитіла (наприклад, кон'югати антитіл, злиті білки і полімерні склади) і способи їх застосування, наприклад, для лікування розладів, пов'язаних з патологічним ангіогенезом (наприклад, окулярні розлади і клітинні проліферативні розлади). Винахід також відноситься до способів ідентифікації варіантів антитіл з покращеними властивостями, наприклад, з поліпшеною афінністю зв'язування, стабільністю, фармакокінетикою і/або експресією.
В одному аспекті винахід включає ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту ендотелію судин (МЕСЕ), причому антитіло містить наступні шість гіперваріабельних ділянок (НМЕ): (а) НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМН (ЗЕО ІЮ МО: 1); (В) НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність ХІТ РХ»аахХ» х «Хо уХвОБУХ» х в (ЗЕО ІЮ МО: 2), де Хі являє собою Пе або Ні, Х»2 являє собою Аїа або Агуд, Хз являє собою Туг або Гу, Х4 являє собою Тпг або Сім, Хо являє собою Аго, Туг, СіІп або Сіи, Хв являє собою Аїа або Сім, Х7 являє собою І ух або Сіш, а Хв являє собою Су або Сіи; (с) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО 10 МО: 3); (4) НМК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність КАБОХ1МЗТАМА (ЗЕО ІО МО: 4), де Хі являє собою Ар або Аго; (е) НМЕ-1І2, що містить амінокислотну послідовність Х"АЗЕЇ 5 (ЗЕО ІЮ МО: 5), де Хі: являє собою 5ег або Мей і () НУВ-І3, що містить амінокислотну послідовність ХІ0СМ(аХОРЕТ (ЗЕО ІО МО: 6), де Хі являє собою сп, Азп або Тпг ії Х» являє собою Аа, Азп, СіІп або Агод. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло містить наступні шість НМЕ: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМН (5ЕБЕО ІЮ МО: 1); (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність
СІТРАСИУТАМАрБУКИ (5ЕБО ІО МО: 7) СІТРАССУЕММАОЗМКО (ЗЕБЕО ІЮ МО: 21) або
СІТРАВИаМЕММАОЗМЕС (5ЕО ІО МО: 22); (с) НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність
ЕМЕРГРМАМОМ (5ЕО 10 МО: 3); (4) НМВ-Ї71, що містить амінокислотну послідовність
ВАБОЮМУ5ЗТАМА (5ЕО ІО МО: 8); (е) НУВ-І2, що містить амінокислотну послідовність ЗАБЕРЕ УЗ (ЗЕО ІЮ МО: 9); і (3 НМА-І3, що містить амінокислотну послідовність О0ОСУСАРЕТ (5ЕО ІЮ МО: 19) або ООФСМСОМРЕТ (ЗЕО ІЮ МО: 23).
У деяких варіантах здійснення вищевказаного аспекту, антитіло містить наступні шість НМА: (а)
НМВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМІН (ЗЕО ІЮ МО: 1); (5) НМЕА-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОІТРАСОУТКУАОЗМКО (5ЕО ІО МО: 7); (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО І МО: 3); (4) НМК-І1, що містить 60 амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (ЗЕБО ІЮ МО: 8); (є) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність БАРІ! 5 (5ЕБО ІЮ МО: 9); і () НМАК-І3З, що містить амінокислотну послідовність О0ОСУСАРЕТ (ЗЕО ІЮ МО: 10). У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло додатково містить наступні каркасні ділянки (ЕК) варіабельного (УН) домену важкого ланцюга: (а) ЕВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕМОЇ МЕ5БОСОІ МОРОСОБІ КІ ЗСААБОБЕТІЗ (5ЕОІО МО: 13); (в) ЕВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність МММКОАРИЕКИГЕММА (ЗЕО
ІО МО: 14); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність
ЕЕТІЗАОТЗКМТАМІ ОМеЕ5І КАЕОТАМУУСАК (БО 10 МО: 15); і (4) ЕК-Н4, що містить амінокислотну послідовність МОСТІ МТУ (5ЕО ІО МО: 16). У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло додатково містить наступні ЕК варіабельного (МІ) домену легкого ланцюга: (а) ЕК-І1, що містить амінокислотну послідовність ОІЮМТОЗРБЗБІ БАЗБМООКМТІТС (5ЕО ІЮ МО: 17); (Б) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність М/МООКРОКАРКИІЇ ІМ (5ЕО ІЮ МО: 18); (с) ЕК-І3, що містить амінокислотну послідовність ЗМРЗКЕЗОБОЗОТОЕТІ ТІЗБІОРЕОААТУУС (ЗЕО ІЮО МО: 19); і (й) ЕК-1.4, що містить амінокислотну послідовність ЕЄОСТКМЕЇК (ЗЕО ІЮ МО: 20).
У деяких варіантах здійснення вищевказаного аспекту, антитіло містить наступні шість НМЕ: (а)
НМВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМІН (ЗЕО ІЮ МО: 1); (5) НМЕА-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОІТРАСОУЕУУАОБМЕС (5ЕО ІО МО: 22); (с) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО І МО: 3); (4) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (ЗЕБО ІЮ МО: 8); (є) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність БАРІ! 5 (5ЕБО ІЮ МО: 9); і () НМАК-І3З, що містить амінокислотну послідовність О0СУСМРЕТ (ЗЕО ІЮО МО: 23). У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло додатково містить наступні ЕК ділянки МІ домену: (а) ЕК-Ї1, що містить амінокислотну послідовність БІОМТО5БРБЗБЗІ ЗАЗМООКМТІТС (ЗЕБЕО І МО: 17); (5) ЕК-І2, що містить амінокислотну послідовність МУМООКРОКАРКІ ІМ (5ЕБО ІЮ МО: 18); (с) ЕК-І3, що містить амінокислотну послідовність ЗМРЗКЕЗОЗОЗСОТОНЕТІ ТІЗЗІ ОРЕОБАТУМС (ЗЕО ІО МО: 24); і (9)
ЕВ-14, що містить амінокислотну послідовність ЕБОСТКМЕЇК (5ЕО ІЮ МО: 20).
У деяких варіантах здійснення вищевказаного аспекту, антитіло містить наступні шість НМЕ: (а)
НМВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМІН (ЗЕО ІЮ МО: 1); (5) НМЕА-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОІТРАСОУЕУУАОБМЕС (5ЕО ІО МО: 22); (с) НМК-НЗ, що містить
Зо амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО І МО: 3); (4) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (ЗЕБО ІЮ МО: 8); (є) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність БАРІ! 5 (5ЕБО ІЮ МО: 9); і () НМАК-І3З, що містить амінокислотну послідовність О0ОСУСАРЕТ (ЗЕО ІЮ МО: 10). У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло додатково містить наступні ЕК-ділянки МІ домену: (а) ЕК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність ОІЮОМТОЗРББІ БАЗМООРМТІТС (ЗЕО ІЮ МО: 17), ВІОМТО5РЕЗБІ ЗАБМОРЕМТІТС (ЗЕО ІЮ МО: 25) або ОІОМТО5ЗРББІ ЗАЗМООЕМТІТС (ЗЕО ІЮО МО: 26); (5) ЕК-12, що містить амінокислотну послідовність М/МООКРОКАРКІ ІМ (ЗЕО ІЮО МО: 18) або МУМООКРОЕАРК У (ЗЕО ІО МО: 21); (с) ЕК-І3, що містить амінокислотну послідовність
СМРЗКЕЗОБОБОТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕСБААТУУС (ЗЕО ІО МО: 19) або
СМРЗКЕЗОБОБОТОЕТІ ТЕЗ ОРЕСААТУМС (ЗЕБО 10 МО: 28); і (4) ЕБ-14, що містить амінокислотну послідовність ЕОСОСОСТКМЕІК (ЗЕБО ІО МО: 20). У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло додатково містить наступні ЕК-ділянки МН домену: (а) ЕК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕЕОЇ МЕЕСОСІ МОРСЕЗБІ ЕІ ЗСААЗСОРЕБЕІЗ (5ЕБО І МО: 29) або
ЕЕОЇ МЕЕВСОСІ МОРСОЕБІ ВІ ЗСААБОЕЕІЗ (БО 10 МО: 51); (Б) БЕВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСІ ЕММА (5ЕБО ІЮ МО: 30); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТЗЕМТАМ ОММЕСКАЕОТАМУУСАК (5ЕО ІЮ МО: 31); і (а)
ЕВ-НА, що містить амінокислотну послідовність МЗОСЕЇ МТУ55 (5ЕО ІО МО: 32).
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (ад домен МН, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІО МО: 11, 40 або 42; (В) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 12, 41 або 46; або (с) домен МН, як в (а), і домен МІ, як в (Б). У деяких варіантах здійснення винаходу, домен УН додатково містить наступні ЕК: (а) БЕК-НІ, що містить амінокислотну послідовність
ЕМО! МЕЗССІ МОРОЗІ ВІЗСААБОЕТІВ (5БО 10 МО: 13); (5) БЕВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність МЛ/КОАРОКОЇ ЕМ/МА (5ЕО ІЮО МО: 14) або ММКОЕРСОСКОЇ ЕМУМА (ЗЕО ІО МО: 39); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність
ЕЕТІЗАОТЗКМТАМІ ОМеЕ5І КАЕОТАМУУСАК (БО 10 МО: 15); і (4) ЕК-Н4, що містить амінокислотну послідовність МОСТІ МТУ (5ЕБО ІО МО: 16). У деяких варіантах здійснення 60 винаходу, домен МН містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 11. У деяких варіантах здійснення винаходу, домен Мі додатково містить наступні ЕК: (а) ЕК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність ОІОМТОЗРЗБІБЗАЗМООКМТІТС (ЗБЕО ОО МО: 17) або
РІОМТО5РБЗБІ БАЗМОИОВМТІОС (5ЕБО 10 МО: 45); (Б) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність МІМООКРОКАРКІ ІМ (5ЕБО ІО МО: 18); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність СМРУОУКЕБОБОБОТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕОААТУХС (ЗЕО ІО МО: 19),
СМРБУВБЕБОБОБСОТОВЕТІ ТІ ОРЕОБАТУУС (ЗЕО ІО МО: 44) або
СМРУКЕЗОБОБОТОБЕТІ ІЗ ОРЕЮМАТУМС (5БО ІО МО: 54); ії (4) ЕК-14, що містить амінокислотну послідовність ЕБОСТКМЕЇК (ЗЕО ІЮ МО: 20) або ЕСЄОСТКМЕМК (ЗЕО ІО МО: 55).
У деяких варіантах здійснення винаходу, домен МІГ. містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 12.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 11 і (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 40 і (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 42 і (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 42 і (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 41.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (ад домен МН, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 33 або 51; (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 12, 34, 35, 36, 37 або 38; або (с) домен МН, як в (а), і домен М, як в (Б). У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло додатково містить наступні ЕК-ділянки: (а) ЕК-НІ, що містить амінокислотну послідовність
Зо ЕЕОЇ МЕЕСОСІ МОРСЕБІ ЕІ ЗСААЗОРЕЕЇІ5 (ЗЕО ІО МО: 29) або
ЕЕОЇ МЕЕВСОСІ МОРСОЕБІ ВІ ЗСААБОЕЕІЗ (БО 10 МО: 52); (Б) БЕВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСІ ЕММА (5ЕБО ІЮ МО: 30); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТЗЕМТАМІ ОММЕГКАЕОТАМУУСАК (ЗЕО ІЮ МО: 31); і (а)
ЕВ-Н4, що містить амінокислотну послідовність МЗОСЕЇ МТУ (5ЕБО ІЮО МО: 32). У деяких варіантах здійснення винаходу, домен МН містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 33. У деяких варіантах здійснення винаходу, домен МН містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 51. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло додатково містить наступні ЕК- ділянки: (а) ЕК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність ОІЮМТОЗРБОБІ БАЗМООРЕМТІТС (ЗБЕО І МО: 17), БІОМТО5РЕБІ5БАЗБМООЕМТІТС (5БО ОО МОЇ 25) або пІОМТО5БРБОБІ БАБМООСЕМТІТС (5БО 10 МО: 26); (Б) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність МІМООКРОКАРКІІМ (5ЕО ІЮ МО: 18) або М'УООКРОЕАРКИІИІМ (5ЕО ІО МО: 27); (с) ЕК-І3, що містить амінокислотну послідовність ЗМРЗКЕЗОБОЗОТОЕТІ ТІЗБІОРЕОААТУУС (ЗЕБЕО 10 МО: 19), СМРЗКЕЗО5ОЗОТОБТІТІЗБІОРЕОБАТУУС (5БО 10 МО: 24) або
СУРОНЕБаБавОаТОЕ ТІ ТЕЗ ОРЕСААТУУС (5БО ІО МО: 28); і (4) ЕК-14, що містить амінокислотну послідовність ЕОСОСОСТКМЕІК (ЗЕБО ІО МО: 20). У деяких варіантах здійснення винаходу, домен МІ. містить амінокислотну послідовність 5600 ІО МО: 34. У деяких варіантах здійснення винаходу, домен МІ. містить амінокислотну послідовність ЕЕ ІЮО МО: 35. У деяких варіантах здійснення винаходу, домен МІ. містить амінокислотну послідовність з«ЕО ІЮО МО: 36. У деяких варіантах здійснення винаходу, домен Мі. містить амінокислотну послідовність БЗЕО ІЮ
МО: 37. У деяких варіантах здійснення винаходу, домен МГ. містить амінокислотну послідовність
ЗБО ІЮ МО: 12. У деяких варіантах здійснення винаходу, домен МІ. містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 38.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 33 і (б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 38.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 33 і (б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 34.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 33 і (б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 35.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 33 і (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 36.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 33 і (б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 37.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 33 і (б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 12.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 51 і (б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 38.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 51 і (б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 35.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 51 і (б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 37.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 51 і (б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 12.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСБЕ, причому антитіло містить (а) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ
МО: 48 і (Б) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 50.
В іншому аспекті винахід відноситься до ізольованого антитіла, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому антитіло містить (а) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ
Зо МО: 49 і (Б) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 50.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, антитіло здатне пригнічувати зв'язування МЕСЕ з рецептором МЕСЕ. У деяких варіантах здійснення винаходу, рецептор
МЕСЕ являє собою рецептор 1 МЕСЕ (РН-1). У деяких варіантах здійснення винаходу, рецептор
МЕСЕ являє собою рецептор 2 МЕСЕ (КОК).
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, антитіло зв'язує МЕСЕ людини (НМЕСРБ) з Ка близько 2 нМ або нижче. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло зв'язує
ПМЕСЕ з Ка між близько 75 пМ і близько 2 нМ. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло зв'язує НЛМЕСЕ з Ка між близько 75 пМ і близько 600 пМ. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло зв'язує ПМЕСЕ з Ка між близько 75 пМ і близько 500 пМ. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло зв'язує ПМЕСЕ з Ка близько 80 пМ. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло зв'язує ПМЕСЕ з Ка близько 60 пМ.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, антитіло має температуру плавлення (Тт) більш ніж близько 83,5 "С. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло має Тт від близько 85 С до близько 91 "С. У деяких варіантах здійснення антитіло має Тт близько 89 "С.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів антитіло має ізоелектричну точку (рі) нижче ніж 8. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло має рі від близько 5 до близько 7. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло має рі від близько 5 до близько 6.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів антитіло є моноклональним, людським, гуманізованим або химерним.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів антитіло являє собою фрагмент антитіла, який зв'язує МЕСЕ. У деяких варіантах здійснення винаходу, фрагмент антитіла обрано з групи, що складається з фрагментів Раб, РГаб-С, РарД5Н, Ем, зсеЕм і (Гар)». У деяких варіантах здійснення винаходу, фрагмент антитіла являє собою РЕар.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів антитіло являє собою моноспецифічне антитіло. В інших варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів антитіло являє собою мультиспецифічне антитіло. У деяких варіантах здійснення винаходу, мультиспецифічне антитіло являє собою біспецифічне антитіло. У деяких варіантах здійснення винаходу, біспецифічне антитіло зв'язує МЕСЕ і другу біологічну молекулу, обрану з групи, що бо складається з інтерлейкіну 18 (І--1р); інтерлейкіну-б (1-6); рецептора інтерлейкіну-б (1І-6Н);
інтерлейкіну-13 (1-13); рецептора 1-13 (1. -13К); РОСБЕ; ангіопоетина; ангіопоетина 2; Тіе2; 51Р; інтегринів амрВ3, амр5 і «581; бетацеллюліна; апеліна/АРУ); еритропоетину; фактора комплементу р; тМРа; НТКАТ; рецептора МЕСЕ; рецептора 5-2; і білка, генетично зв'язаного з ризиком вікової макулярної дегенерації (АМО). У деяких варіантах здійснення рецептор МЕСЕ являє собою МЕСЕКІ, МЕСЕК2, МЕСЕКЗ, мембранно-зв'язаний МЕСЕ-рецептор (пПрУЕСЕР) або розчинний рецептор МЕСЕ (5МЕСОЕК). У деяких варіантах здійснення винаходу, білок, генетично пов'язаний з ризиком АМО, обраний з групи, що складається з компонентів шляху комплементу
С2, фактора В, фактора Н, СЕНКЗ, СЗ3Б, С5, Сб5а і СЗа; НТКАТ; АКМ52; ТІМРЗ; НГА; інтерлейкіну-8 (1-8); СХЗСМК1; ТІ КЗ; ТІ К4; СЕТР; ПІРС, СОЇ 10А1; ії ТМЕКЗЕ1ОА.
В іншому аспекті винахід відноситься до полінуклеотиду (наприклад, ізольованому полінуклеотиду), що кодує будь-яке з описаних в цьому документі антитіл. В іншому аспекті, винахід відноситься до вектору (наприклад, вектору експресії), який містить полінуклеотид для експресії антитіла. В іншому аспекті винахід відноситься до клітин-хазяїв, які містять попередні полінуклеотиди і/або вектори. У деяких варіантах здійснення винаходу, клітина-хазяїн являє собою клітину ссавця. У деяких варіантах здійснення винаходу, клітина ссавця являє собою клітину 293, клітину яєчника китайського хом'ячка (СНО), дріжджову клітину або рослинну клітину. У деяких варіантах здійснення клітина-хазяїн являє собою прокаріотичну клітину. У деяких варіантах здійснення винаходу, прокаріотична клітина являє собою Е. сої).
В іншому аспекті винахід відноситься до способу отримання будь-якого з описаних в цьому документі антитіл, причому спосіб включає культивування клітини-хазяїна, яка містить будь- який з попередніх векторів (наприклад, вектори експресії), в культуральному середовищі. У деяких варіантах здійснення винаходу, спосіб додатково включає виділення антитіла з клітини- хазяїна або культурального середовища. У деяких варіантах здійснення винаходу, клітина ссавця являє собою клітину 293, клітину яєчника китайського хом'ячка (СНО), дріжджову клітину або рослинну клітину. У деяких варіантах здійснення винаходу, клітина-хазяїн являє собою прокаріотичну клітину. У деяких варіантах здійснення винаходу, прокаріотична клітина являє собою Е. соїї.
В іншому аспекті винахід відноситься до способу зменшення або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, який включає введення
Зо суб'єкту ефективної кількості будь-якого з попередніх антитіл, тим самим зменшуючи або інгібуючи ангіогенез у суб'єкта. У деяких варіантах здійснення винаходу, розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад або клітинний проліферативний розлад. У деяких варіантах здійснення винаходу, розлад, пов'язаний 3 патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад обирають з групи, яка складається з вікової макулярної дегенерації (АМО), макулярної дегенерації, набряку макули, діабетичного макулярного набряку (ОМЕ) (включаючи фокальний, нецентральний ОМЕ і дифузний, пов'язаний з центром ОМЕ), ретинопатії, діабетичної ретинопатії (ОК) (включаючи проліферативну ОК (РОК), непроліферативну ОРГ (МРОК) і висотну ОК), інших пов'язаних з ішемією ретинопатій, ретинопатії недоношених (КОР), оклюзії вени сітківки (ЕМО) (включаючи центральні (СЕМО) і розгалужені (ВЕМО) форми), СММ (включаючи міопічну СММ), неоваскуляризації рогівки, хвороби, пов'язаної з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризацією сітківки, хвороби, пов'язаної з ретинальною/хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічної короткозорістю, хвороби фон Гіппеля-Ліндау, гістоплазмозу ока, сімейної ексудативної вітреоретинопатії (ГЕМЕК), хвороби Коутса, хвороби Норрі, синдрому остеопорозу-псевдогліоми (ОРРС), субкон'юнктивального крововиливу, рубеозу, неоваскулярного захворювання очей, неоваскулярної глаукоми, пігментної дистрофії сітківки (КР), гіпертонічної ретинопатії, ретинальної ангіоматозної проліферації, макулярної телеангіектазії, неоваскуляризації райдужки, внутрішньоочної неоваскуляризації, дегенерації сітківки, кістозного макулярного набряку (СМЕ), васкуліту, набряку диска зорового нерва, ретиніту, кон'юнктивіту (включаючи інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційні (наприклад, алергічний) кон'юнктивіти), вродженого амарозу Лебера, увеїту (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдиту, очного гістоплазмозу, блефариту, сухості очей, травматичного пошкодження очей і хвороби Шегрена. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад являє собою АМО, ОМЕ, ОК або КМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад являє собою АМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, АМО являє собою вологу АМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, є клітинним проліферативним розладом. У деяких варіантах здійснення винаходу, клітинний проліферативний розлад являє собою рак. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак обирають з групи, що складається з раку молочної залози, раку товстої кишки, бо недрібноклітинного раку легені, неходжкінської лімфоми (НХЛ), раку нирки, раку передміхурової залози, раку печінки, раку голови і шиї, меланоми, раку яєчників, мезотеліоми і множинної мієломи.
В іншому аспекті, винахід відноситься до способу лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом, причому спосіб включає введення ефективної кількості будь-якого з попередніх антитіл суб'єкту, який потребує такого лікування. У деяких варіантах здійснення винаходу, розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад або клітинний проліферативний розлад. У деяких варіантах здійснення винаходу, розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад обирають з групи, яка складається з вікової макулярної дегенерації (АМО), макулярної дегенерації, набряку макули, діабетичного макулярного набряку (ОМЕ) (включаючи фокальний, нецентральний ОМЕ і дифузний, пов'язаний з центром ОМЕ), ретинопатії, діабетичної ретинопатії (ОК) (включаючи проліферативну ОК (РОК), непроліферативну ОК (МРОК) і висотну ОК), інших пов'язаних з ішемією ретинопатій, ретинопатії недоношених (КОР), оклюзії вени сітківки (КМО) (включаючи центральні (СКМО) і розгалужені (ВКМО) форми), СММ (включаючи міопічну СММ), неоваскуляризації рогівки, хвороби, пов'язаної з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризацією сітківки, хвороби, пов'язаної з ретинальною/хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічної короткозорістю, хвороби фон Гіппеля-Ліндау, гістоплазмозу ока, сімейної ексудативної вітреоретинопатії (РЕМК), хвороби Коутса, хвороби Норрі, синдрому остеопорозу-псевдогліоми (ОРРО), субкон'юнктивального крововиливу, рубеозу, неоваскулярного захворювання очей, неоваскулярної глаукоми, пігментної дистрофії сітківки (КР), гіпертонічної ретинопатії, ретинальної ангіоматозної проліферації, макулярної телеангіектазії, неоваскуляризації райдужки, внутрішньоочної неоваскуляризації, дегенерації сітківки, кістозного макулярного набряку (СМЕ), васкуліту, набряку диска зорового нерва, ретиніту, кон'юнктивіту (включаючи інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційні (наприклад, алергічний) кон'юнктивіти), вродженого амарозу Лебера, увеїту (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдиту, очного гістоплазмозу, блефариту, сухості очей, травматичного пошкодження очей і хвороби Шегрена. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад являє собою АМО, ЮОМЕ, ОК або КМО.
У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад являє собою АМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, АМО являє собою вологу АМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, є клітинним проліферативним розладом. У деяких варіантах здійснення винаходу, клітинний проліферативний розлад являє собою рак. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак обирають з групи, що складається з раку молочної залози, раку товстої кишки, недрібноклітинного раку легені, неходжкінської лімфоми (НХЛ), раку нирки, раку передміхурової залози, раку печінки, раку голови і шиї, меланоми, раку яєчників, мезотеліоми і множинної мієломи.
В іншому аспекті винахід відноситься до способу інгібування проникності судин у суб'єкта, що страждає розладом, пов'язаним з небажаною проникністю судин, причому спосіб включає введення суб'єкту ефективної кількості будь-якого з попередніх антитіл, тим самим інгібуючи проникність судин у суб'єкта.
В іншому аспекті винахід відноситься до способу лікування розладу, пов'язаного з небажаною проникністю судин, причому спосіб включає введення ефективної кількості будь-якого з попередніх антитіл суб'єкту, який потребує такого лікування.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів розлад, пов'язаний з небажаною проникністю судин, обирається з групи, що складається з набряку, пов'язаного з пухлинами головного мозку, асциту, асоційованого із злоякісними новоутвореннями, синдрому
Мейга, запалення легенів, нефротичного синдрому, перикардіального випоту, плеврального випоту, і проникності, пов'язаної із серцево-судинними захворюваннями.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, спосіб додатково включає введення суб'єкту ефективної кількості другого агента, причому другий агент обраний з групи, що складається з іншого антитіла, хіміотерапевтичного агента, цитотоксичного агента, анти- ангіогенного агента, імунодепресивного агента, проліків, цитокіна, антагоніста цитокінів, цитотоксичної променевої терапії, кортикостероїда, протиблювотного, протиракової вакцини, анальгетика, агента, який інгібує ріст, і сполуки, яка зв'язується з другою біологічною молекулою. У деяких варіантах здійснення винаходу, антиангіогенний агент являє собою антагоніст МЕСЕ. У деяких варіантах здійснення винаходу, антагоніст МЕСЕ являє собою анти-
МЕСЕ антитіло, антитіло проти рецептора МЕСЕ, розчинний злитий білок рецептора МЕСБЕ, аптамери, анти-МЕСЕ ОАКРІіпФ або інгібітор тирозинкінази МЕСЕК. У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-МЕСЕ антитіло являє собою ранібізумаб ((ОСЕМТІЗФ), КТН-258 або бо біспецифічне анти-УЕСЕ антитіло. У деяких варіантах здійснення винаходу, біспецифічне анти- (с;
МЕСЕ антитіло являє собою анти-МЕОЕ/анти-Апд2 антитіло. У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-МЕСЕ/анти-Апд2 антитіло являє собою КО-7716. У деяких варіантах здійснення винаходу, розчинний злитий білок рецептора МЕСЕ являє собою афілберцепт (ЕМ ЕАФ). У деяких варіантах здійснення винаходу, аптамери являє собою пегаптаніб (МАСОСЕМФ). У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-МЕСОЕ БАБРІіпФ являє собою абіципар пегол. У деяких варіантах здійснення винаходу, інгібітор тирозинкінази МЕСЕК обирають з групи, що складається з 4-(4-бром-2-фтораніліно) -6-метокси-7-(1-метілпіперідін-4-ілметоксі) хіназоліна (206474), 4-(4-фтор-2-метиліндол-5-ілокси)-6-метокси-7-(З-піролідин-1-ілпропоксі) хіназоліна (А2О2171), ваталаніба (РТК787), семаксамібіна (505416) і БОТЕМТФ (сунітиніб). У деяких варіантах здійснення винаходу, друга біологічна молекула обрана з групи, яка складається з ЇЇ - 18; 1-6; 11. -6А; 11-13; 11 -13К; РОСБЕ; ангіопоетина; ангіопоетина 2; Тіе2; 51Р; інтегринів смр3, амвВ5 і а5Д1; бетацеллюліна; апеліна/АРУ); еритропоетину; фактора комплементу ОЮ; ТМЕа; НІГА1; рецептора МЕСЕ; рецептора 51-2; і білка, генетично пов'язаного з ризиком АМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, рецептор МЕСЕ являє собою МЕСЕКІ, МЕСЕНК2, МЕСЕКЗ, тТрУЕСЕР або 5МЕСЕРЕ. У деяких варіантах здійснення винаходу, білок, генетично пов'язаний з ризиком АМО, обраний з групи, що складається з компонентів шляху комплементу С2, фактора
В, фактора Н, СЕНКЗ, СЗБ, С5, Сба і СЗа; НТКА1; АКМ52; ТІМРЗ; НГА; І -8; СХЗСВІ1; ТІ ВЗ;
ТІК4; СЕТР; ПІРС, СОЇ 10А1; ії ТМЕКЗЕТОА. У деяких варіантах здійснення винаходу, з'єднання, яке зв'язує другу біологічну молекулу, являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент. У деяких варіантах здійснення антигензв'язуючий фрагмент антитіла обрано з групи, яка складається з Раб, Бар-С, Рар'-5нН, Ем, 5сЕм і (Гар)2 фрагментів.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів антитіло вводять інтравітреально, окулярно, внутрішньоочно, навколосклерально, субтенонально, суперхороїдально, місцево, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно, крізьшкірно, внутрішньоартеріально, внутрішньоочеревно, внутрішньоочагово, інтракраніально, внутрішньосуглобово, внутрішньопростатично, внутрішньоплеврально, інтратрахеально, інтратекально, інтраназально, інтравагінально, інтраректально, місцево, внутрішньопухлинно, внутрішньоочеревно, перитонеально, інтравентрикулярно, підшкірно, субкон'юктивно, інтравезикулярно, крізь слизову, інтраперикардіально, внутрішньопуповінно, інтраорбітально,
Зо перорально, трансдермально, шляхом інгаляції, шляхом ін'єкції, очними краплями, шляхом імплантації, шляхом інфузії, шляхом безперервної інфузії, локалізованими перфузійними ваннами, які діють на клітини безпосередньо, катетером, промиванням, кремами або ліпідними композиціями. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло вводять інтравітреально, окулярно, інтраокулярно, навколосклерально, субтенонально, суперхороїдально або місцево. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло вводять інтравітреально шляхом ін'єкції. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло вводять місцево за допомогою очних крапель або мазі. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло вводиться пристроєм доставки порт.
У деяких варіантах здійснення винаходу, суб'єкт являє собою людину.
В іншому аспекті винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить будь-яке з попередніх антитіл. У деяких варіантах здійснення винаходу, фармацевтична композиція додатково містить полімер. У деяких варіантах здійснення винаходу, полімер являє собою біорозкладаний полімер. У деяких варіантах здійснення винаходу, фармацевтична композиція складена у вигляді депо з полімерного розчинника, полімерного імплантату або полімерної міцели. У деяких варіантах здійснення винаходу, полімер являє собою сополімер полігліколевої кислоти (РІ СА) полімолочної кислоти. У деяких варіантах здійснення винаходу, фармацевтична композиція складена у вигляді стрижня РІСА. У деяких варіантах здійснення винаходу, фармацевтична композиція використовується для лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом, або розладу, пов'язаного з небажаною проникністю судин у ссавця.
У деяких варіантах здійснення винаходу, розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад або клітинний проліферативний розлад. У деяких варіантах здійснення винаходу, розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад обирають з групи, яка складається з вікової макулярної дегенерації (АМО), макулярної дегенерації, набряку макули, діабетичного макулярного набряку (ОМЕ) (включаючи фокальний, нецентральний ОМЕ і дифузний, пов'язаний з центром ОМЕ), ретинопатії, діабетичної ретинопатії (ОК) (включаючи проліферативну ОК (РОК), непроліферативну ОК (МРОК) і висотну ОК), інших пов'язаних з ішемією ретинопатій, ретинопатії недоношених (КОР), оклюзії вени сітківки (КМО) (включаючи центральні (СКМО) і розгалужені (ВКМО) форми), СММ (включаючи міопічну СММ), неоваскуляризації рогівки, хвороби, пов'язаної з неоваскуляризацією рогівки, бо неоваскуляризацією сітківки, хвороби, пов'язаної З ретинальною/хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічної короткозорістю, хвороби фон Гіппеля-Ліндау, гістоплазмозу ока, сімейної ексудативної вітреоретинопатії (ГЕМЕК), хвороби Коутса, хвороби Норрі, синдрому остеопорозу-псевдогліоми (ОРРС), субкон'юнктивального крововиливу, рубеозу, неоваскулярного захворювання очей, неоваскулярної глаукоми, пігментної дистрофії сітківки (КР), гіпертонічної ретинопатії, ретинальної ангіоматозної проліферації, макулярної телеангіектазії, неоваскуляризації райдужки, внутрішньоочної неоваскуляризації, дегенерації сітківки, кістозного макулярного набряку (СМЕ), васкуліту, набряку диска зорового нерва, ретиніту, кон'юнктивіту (включаючи інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційні (наприклад, алергічний) кон'юнктивіти), вродженого амарозу Лебера, увеїту (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдиту, очного гістоплазмозу, блефариту, сухості очей, травматичного пошкодження очей і хвороби Шегрена. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад являє собою АМО, ЮОМЕ, ОК або КМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад являє собою АМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, АМО являє собою вологу АМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, є клітинним проліферативним розладом. У деяких варіантах здійснення винаходу, клітинний проліферативний розлад являє собою рак. У деяких варіантах здійснення винаходу, рак обирають з групи, що складається з раку молочної залози, раку товстої кишки, недрібноклітинного раку легені, неходжкінської лімфоми (НХЛ), раку нирки, раку передміхурової залози, раку печінки, раку голови і шиї, меланоми, раку яєчників, мезотеліоми і множинної мієломи. У деяких варіантах здійснення винаходу, розлад, пов'язаний з небажаною проникністю судин, обирається з групи, що складається з набряку, пов'язаного з пухлинами головного мозку, асциту, асоційованого із злоякісними новоутвореннями, синдрому Мейга, запалення легенів, нефротичного синдрому, перикардіального випоту, плеврального випоту, і проникності, пов'язаної із серцево-судинними захворюваннями. У деяких варіантах здійснення винаходу, фармацевтична композиція додатково містить другий агент, причому другий агент обраний з групи, яка складається з другого антитіла, хіміотерапевтичного агента, цитотоксичного агента, анти-ангіогенного агента, імунодепресивного агента, проліків, цитокіну, антагоніста цитокінів, цитотоксичної променевої терапії, кортикостероїда, протиблювотного, протиракової вакцини, анальгетика, агента, який інгібує ріст, і сполуки, яка зв'язується з другою біологічною молекулою. У деяких варіантах здійснення винаходу, антиангіогенний агент являє собою антагоніст МЕСЕ. У деяких варіантах здійснення винаходу, антагоніст МЕСЕ являє собою анти-
МЕСЕ антитіло, антитіло проти рецептора МЕСЕ, розчинний злитий білок рецептора МЕСБЕ, аптамери, анти-МЕСЕ ОАКРІіпФ або інгібітор тирозинкінази МЕСЕК. У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-МЕСЕ антитіло являє собою ранібізумаб ((ОСЕМТІЗФ), КТН-258 або біспецифічне анти-УЕСЕ антитіло. У деяких варіантах здійснення винаходу, біспецифічне анти-
МЕСЕ антитіло являє собою анти-МЕОЕ/анти-Апд2 антитіло. У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-МЕСЕ/анти-Апд2 антитіло являє собою КО-7716. У деяких варіантах здійснення винаходу, розчинний злитий білок рецептора МЕСЕ являє собою афілберцепт (ЕМ ЕАФ). У деяких варіантах здійснення винаходу, аптамери являє собою пегаптаніб (МАСОСЕМФ). У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-МЕСОЕ БАБРІіпФ являє собою абіципар пегол. У деяких варіантах здійснення винаходу, інгібітор тирозинкінази МЕСЕК обирають з групи, що складається з 4-(4-бром-2-фтораніліно) -6-метокси-7-(1-метілпіперідін-4-ілметоксі) хіназоліна (206474), 4-(4-фтор-2-метиліндол-5-ілокси)-6-метокси-7-(З-піролідин-1-ілпропоксі) хіназоліна (А2О2171), ваталаніба (РТК787), семаксамібіна (505416) і 5ОТЕМТФ (сунітиніб). У деяких варіантах здійснення винаходу, друга біологічна молекула обрана з групи, яка складається з ЇЇ - 18; 1-6; 11. -6А; 11-13; 11 -13К; РОСБЕ; ангіопоетина; ангіопоетина 2; Тіе2; 51Р; інтегринів смр3, амвВ5 і а5Д1; бетацеллюліна; апеліна/АРУ); еритропоетину; фактора комплементу ОЮ; ТМЕа; НІГА1; рецептора МЕСЕ; рецептора 51-2; і білка, генетично пов'язаного з ризиком АМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, рецептор МЕСЕ являє собою МЕСЕКІ, МЕСЕНК2, МЕСЕКЗ, тТрУЕСЕР або 5МЕСЕРЕ. У деяких варіантах здійснення винаходу, білок, генетично пов'язаний з ризиком АМО, обраний з групи, що складається з компонентів шляху комплементу С2, фактора
В, фактора Н, СЕНКЗ, СЗБ, С5, Сба і СЗа; НТКА1; АКМ52; ТІМРЗ; НГА; І -8; СХЗСВІ1; ТІ ВЗ;
ТІК4; СЕТР; ПІРС, СОЇ 10А1; ії ТМЕКЗЕТОА. У деяких варіантах здійснення винаходу, з'єднання, яке зв'язує другу біологічну молекулу, являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент. У деяких варіантах здійснення антигензв'язуючий фрагмент антитіла обрано з групи, яка складається з Раб, Бар-С, Рар'-5нН, Ем, 5сЕм і (Гар)2 фрагментів.
В іншому аспекті винахід включає кон'югат антитіла, який містить (ї) будь-яке з попередніх антитіл і (ії) гідрофільний полімер, ковалентно зв'язаний з антитілом. У деяких варіантах здійснення винаходу, гідрофільний полімер являє собою полімер гіалуронової кислоти (НА) або бо полімер поліетиленгліколю (ПЕГ). У деяких варіантах здійснення винаходу, гідрофільний полімер являє собою НА-полімер. У деяких варіантах здійснення винаходу, полімер НА має молекулярну масу близько 1 мільйона дальтон (МдДа) або нижче. У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, полімер НА має молекулярну масу між близько 25 кДа і близько 500 кДа. У деяких варіантах здійснення винаходу, полімер НА має молекулярну масу між близько 100 кДа і близько 250 кДа. У деяких варіантах здійснення винаходу, полімер НА має молекулярну масу близько 200 кДа. У деяких варіантах здійснення винаходу, полімер НА не є поперечно зшитим. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло являє собою фрагмент антитіла, який зв'язує МЕСЕ. У деяких варіантах здійснення винаходу, фрагмент антитіла обрано з групи, що складається з фрагментів Бар, Бар-С, Раб", Раб'-5Н, Ем, 5сЕм ії (Бар)». У деяких варіантах здійснення винаходу, фрагмент антитіла являє собою Раб, Рар-С або Раб". У деяких варіантах здійснення винаходу, кон'югат антитіла має гідродинамічний радіус між близько 10 нм і близько 60 нм. У деяких варіантах здійснення винаходу, кон'югат антитіла має гідродинамічний радіус між близько 25 нм і близько 35 нм. У деяких варіантах здійснення винаходу, гідродинамічний радіус становить близько 28 нм. У деяких варіантах здійснення винаходу, кон'югат антитіла має окулярний період напіввиведення, який збільшено щодо еталонного антитіла, яке не ковалентно приєднано до гідрофільного полімера. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний період напіввиведення збільшено в щонайменше близько 2 рази відносно еталонного антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний період напіввиведення збільшено в щонайменше близько 4 рази відносно еталонного антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу, оокулярний період напіввиведення являє собою вітреальний період напіввиведення. У деяких варіантах здійснення винаходу, еталонне антитіло ідентично антитілу кон'югата антитіла.
В іншому аспекті винахід відноситься до кон'югату антитіл, що містить (ї) антитіло, яке специфічно зв'язує МЕС і (ії) полімер НА, ковалентно приєднаний до антитіла, причому полімер
НА має молекулярну масу 1 МДа або нижче. У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, полімер НА має молекулярну масу між близько 25 кДа і близько 500 кДа. У деяких варіантах здійснення винаходу, полімер НА має молекулярну масу між близько 100 кДа і близько 250 кДа. У деяких варіантах здійснення винаходу, полімер НА має молекулярну масу близько 200 кДа. У деяких варіантах здійснення винаходу, полімер НА не є поперечно зшитим.
У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло являє собою фрагмент антитіла, який зв'язує
МЕСБ. У деяких варіантах здійснення винаходу, фрагмент антитіла обрано з групи, що складається з фрагментів Бар, Бар-С, Бар, Рар-5Н, Ем, зом і (баб). У деяких варіантах здійснення винаходу, фрагмент антитіла являє собою Рар, Бар-С або Рар'. У деяких варіантах здійснення винаходу, кон'югат антитіла має гідродинамічний радіус між близько 10 нм і близько 60 нм. У деяких варіантах здійснення винаходу, кон'югат антитіла має гідродинамічний радіус між близько 25 нм і близько 35 нм. У деяких варіантах здійснення винаходу, гідродинамічний радіус становить близько 28 нм. У деяких варіантах здійснення винаходу, кон'югат антитіла має окулярний період напіввиведення, який збільшено щодо еталонного антитіла, яке не ковалентно приєднано до гідрофільного полімера. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний період напіввиведення збільшено в щонайменше близько 2 рази відносно еталонного антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу, оокулярний період напіввиведення збільшено в щонайменше близько 4 рази відносно еталонного антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний період напіввиведення являє собою вітреальний період напіввиведення. У деяких варіантах здійснення винаходу, еталонне антитіло ідентично антитілу кон'югата антитіла.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, антитіло ковалентно приєднано до полімеру за допомогою зворотного лінкеру проліків. У деяких варіантах реалізації винаходу, полімер являє собою гідрогель. У деяких варіантах здійснення винаходу, гідрогель являє собою гідрогель на основі ПЕГ. У деяких варіантах здійснення винаходу, гідрогель має форму мікрочастинки сфери.
В іншому аспекті винахід відноситься до злитого білка, який містить будь-яке з попередніх антитіл, ковалентно зв'язаних з НА-зв'язуючим доменом. У деяких варіантах здійснення винаходу, НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу, НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до С-кінця важкого ланцюга або С-кінця легкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення винаходу, НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до С-кінця важкого ланцюга.
У деяких варіантах здійснення винаходу, НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до С- кінця легкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення винаходу, злитий білок додатково містить лінкер, причому лінкер розташований між антитілом і НА-зв'язуючим доменом. У деяких бо варіантах здійснення винаходу, лінкер містить амінокислотну послідовність (0303055 (5ЕО ІЮ
МО: 61). У деяких варіантах здійснення винаходу, лінкер складається з амінокислотної послідовності (30303035 (5ЕО ІЮО МО: 61). У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло являє собою фрагмент антитіла, який зв'язує МЕСБЕ. У деяких варіантах здійснення винаходу, фрагмент антитіла обрано з групи, що складається з фрагментів Раб, Бар-С, Раб", Баб'-5ЗнН, Ем, 5СоЕМм і (Рар)». У деяких варіантах здійснення винаходу, фрагмент антитіла являє собою Раб. У деяких варіантах здійснення винаходу, НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до С-кінця домену СНІ Раб. У деяких варіантах здійснення винаходу, НА-зв'язуючий білок ковалентно приєднаний до С-кінця домену СІ. Раб. У деяких варіантах здійснення винаходу, НА-зв'язуючий домен обрано з групи, яка складається із модуля зв'язку, домену (1 і багатого на лізин олігопептиду. У деяких варіантах здійснення винаходу, НА-зв'язуючий домен є модулем зв'язку.
У деяких варіантах здійснення винаходу, модуль зв'язку обирають з групи, що складається з гена 6, стимульованого фактором некрозу пухлини (15056), СО44, рецептора гіалуронової кислоти ендотелію лімфатичних судин 1 (І УМЕ-1), білка, який зв'язує гіалуронову кислоту і протеоглікан (НАРІМ) 1, НАРІМ2, НАРІМ3, НАРІМ4, аггрекана, бревікана, нейрокана, фосфакана, версікана, САВб61358, КІАО527, стабіліна-1 і стабіліна-2 модулів зв'язку. У деяких варіантах здійснення винаходу, модуль зв'язку є модулем зв'язку 1506. У деяких варіантах здійснення винаходу, модуль зв'язку Т506 є модулем зв'язку Т506 людини або модулем зв'язку
Т5Об6 кролика. У деяких варіантах здійснення винаходу, модуль зв'язку Т50 є модулем зв'язку
Т5Об людини. У деяких варіантах здійснення винаходу, модуль зв'язку 15256 людини містить амінокислотні залишки 36-128 506 людини.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, злитий білок додатково містить щонайменше один додатковий НА-зв'язуючий домен. У деяких варіантах здійснення винаходу, щонайменше один додатковий НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу, щонайменше один додатковий НА-зв'язуючий білок з'єднаний з антитілом за допомогою лінкера. У деяких варіантах здійснення винаходу, лінкер містить амінокислотну послідовність (0303055 (5ЕО ІЮ
МО: 61). У деяких варіантах здійснення винаходу, лінкер складається з амінокислотної послідовності (30300535 (5ЕБЕО ІЮО МО: 61). У деяких варіантах здійснення винаходу, перший НА- зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до важкого ланцюга, а другий НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до легкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення винаходу, перший
НА-зв'язуючий домен з'єднаний з С-кінцем важкого ланцюга, а другий НА-зв'язуючий домен з'єднаний з С-кінцем легкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення винаходу, щонайменше один додатковий НА-зв'язуючий білок обирають з групи, яка складається з модуля зв'язку, домену (31 і багатого на лізин олігопептида. У деяких варіантах здійснення винаходу, щонайменше один додатковий НА-зв'язуючий білок являє собою модуль зв'язку. У деяких варіантах здійснення винаходу, модуль зв'язку є модулем зв'язку 1506. У деяких варіантах здійснення винаходу, модуль зв'язку Т506 є модулем зв'язку Т506 людини або модулем зв'язку
Т506 кролика. У деяких варіантах здійснення винаходу, модуль зв'язку Т5056 є модулем зв'язку
Т5Об людини. У деяких варіантах здійснення винаходу, модуль зв'язку 1526 людини містить амінокислотні залишки 36-128 506 людини.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, злитий білок специфічно зв'язується з МЕСЕ і НА. У деяких варіантах здійснення винаходу, злитий білок зв'язує НА з Ка близько 2 мкМ або нижче. У деяких варіантах здійснення винаходу, злитий білок зв'язує НА з Ка між близько 1 нМ і близько 500 нМ. У деяких варіантах здійснення винаходу, злитий білок зв'язує НА з Ка між близько 1 нМ і близько 50 нМ. У деяких варіантах здійснення винаходу, злитий білок зв'язує НА з Ка близько 10 нМ.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, злитий білок має окулярний період напіввиведення, який збільшений в порівнянні з еталонним антитілом, яке ковалентно приєднано до НА-зв'язуючого домену. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний період напіввиведення збільшено в щонайменше близько 2 рази відносно еталонного антитіла.
У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний період напіввиведення збільшено в щонайменше близько 4 рази відносно еталонного антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний період напіввиведення являє собою вітреальний період напіввиведення. У деяких варіантах здійснення винаходу, еталонне антитіло ідентично антитілу злитого білка.
В іншому аспекті винахід відноситься до способу зменшення або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, який включає введення суб'єкту ефективної кількості будь-якого з попередніх кон'югатів антитіла, тим самим зменшуючи або інгібуючи ангіогенез у суб'єкта.
В іншому аспекті, винахід відноситься до способу лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом, причому спосіб включає введення ефективної кількості будь-якого з попередніх кон'югатів антитіла суб'єкту, який потребує такого лікування.
В іншому аспекті винахід відноситься до способу зменшення або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, який включає введення суб'єкту ефективної кількості будь-якого з попередніх злитих білків, тим самим зменшуючи або інгібуючи ангіогенез у суб'єкта.
В іншому аспекті, винахід відноситься до способу лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом, причому спосіб включає введення ефективної кількості будь-якого з попередніх злитих білків суб'єкту, який потребує такого лікування.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад обирають з групи, що складається з АМО, макулярної дегенерації, набряку макули, ОМЕ (включаючи фокальний, нецентральний ОМЕ і дифузний, пов'язаний з центром ОМЕ), ретинопатії, ОК (включаючи РОК, МРОК і висотну ОК), інших пов'язаних з ішемією ретинопатій, КОР, ЕМО (включаючи СКМО і ВКМО форми), СММ (включаючи міопічну
СММ), неоваскуляризації рогівки, хвороби, пов'язаної з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризації сітківки, хвороби, пов'язаної з ретинальною/ хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічної короткозорості, хвороби фон Гіппеля-Ліндау, гістоплазмозу очей, РЕМЕК, хвороби Коутса, хвороби Норрі, ОРРО, субкон'юнктивального крововиливу, рубеозу, неоваскулярного захворювання очей, неоваскулярної глаукоми, КР, гіпертонічної ретинопатії, ретинальної ангіоматозної проліферації, макулярної телеангіектазії, неоваскуляризації райдужки, внутрішньоочної неоваскуляризації, дегенерації сітківки, СМЕ, васкуліту, набряку диска зорового нерва, ретиніту, кон'юнктивіту (включаючи інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційний (наприклад, алергічний) кон'юнктивіти), вродженого амарозу
Лебера, увеїту (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдиту, очного гістоплазмозу, блефариту, сухості очей, травматичного пошкодження очей і хвороби Шегрена. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад являє собою АМО, ОМЕ, ОК або КМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад являє собою АМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, АМО являє собою вологу АМО.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, спосіб додатково включає введення суб'єкту ефективної кількості другого агента, причому другий агент обирають з групи, яка складається з іншого антитіла, анти-ангіогенного агента, цитокіна, антагоніста цитокінів, кортикостероїда, анальгетика і сполуки, яка зв'язується з другою біологічною молекулою. У деяких варіантах здійснення винаходу, антиангіогенний агент являє собою антагоніст МЕСЕ. У деяких варіантах здійснення винаходу, антагоніст МЕСЕ являє собою анти-МЕСЕ антитіло, антитіло проти рецептора МЕСЕ, розчинний злитий білок рецептора МЕСЕ, аптамери, анти-
МЕСЕ ОАРЕРІпФ або інгібітор тирозинкінази МЕСЕК. У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-МЕСЕ антитіло являє собою ранібізумаб (ОСЕМТІЗФ), ЕТН-258 або біспецифічне анти-
МЕСЕ антитіло. У деяких варіантах здійснення винаходу, біспецифічне анти-МЕСЕ антитіло являє собою анти-МЕсСЕ/анти-Апд2 антитіло. У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-
МЕСРЕ/анти-Апд2 антитіло являє собою КО-7716. У деяких варіантах здійснення винаходу, розчинний злитий білок рецептора МЕСЕ являє собою афілберцепт (ЕМІ ЕАФ). У деяких варіантах здійснення винаходу, аптамери являє собою пегаптаніб (МАСОСЕМФ). У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-МЕСЕ ВАВРіпФ являє собою абіципар пегол. У деяких варіантах здійснення винаходу, інгібітор тирозинкінази МЕСЕК обирають з групи, яка складається з 4-(4-бром-2-фтораніліно)-6-метокси-7-(1-метилпіперідін-4-ілметоксі)хіназоліну (206474), 4-(4-фтор-2-метиліндол-5-ілокси)-б-метокси-7-(З-піролідин-1-ілпропоксі) хіназоліну (А2О2171), ваталаніба (РТК787), семаксамібіна (505416) і БОТЕМТФ (сунітиніб). У деяких варіантах здійснення винаходу, друга біологічна молекула обрана з групи, яка складається з ЇЇ - 18; 1-6; 11. -6А; 11-13; 11 -13К; РОСБЕ; ангіопоетина; ангіопоетина 2; Тіе2; 51Р; інтегринів смр3, амвВ5 і а5Д1; бетацеллюліна; апеліна/АРУ); еритропоетину; фактора комплементу ОЮ; ТМЕа; НІГА1; рецептора МЕСЕ; рецептора 51-2; і білка, генетично пов'язаного з ризиком АМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, рецептор МЕСЕ являє собою МЕСЕКІ, МЕСЕНК2, МЕСЕКЗ, тТрУЕСЕР або 5МЕСЕРЕ. У деяких варіантах здійснення винаходу, білок, генетично пов'язаний з ризиком АМО, обраний з групи, що складається з компонентів шляху комплементу С2, фактора
В, фактора Н, СЕНКЗ, СЗБ, С5, Сба і СЗа; НТКА1; АКМ52; ТІМРЗ; НГА; І -8; СХЗСВІ1; ТІ ВЗ;
ТІК4; СЕТР; ПІРС, СОЇ 10А1; ії ТМЕКЗЕТОА. У деяких варіантах здійснення винаходу, з'єднання, яке зв'язує другу біологічну молекулу, являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент. У деяких варіантах здійснення антигензв'язуючий фрагмент антитіла обрано з групи, яка складається з Раб, Бар-С, Рар'-5нН, Ем, 5сЕм і (Гар)2 фрагментів.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів кон'югат антитіла вводять інтравітреально, окулярно, внутрішньоочно, навколосклерально, субтенонально, суперхороїдально, місцево, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно, черезшкірно, внутрішньоартеріально, внутрішньоочеревно, внутрішньоочагово, інтракраніально, внутрішньосуглобово, внутрішньопростатично, внутрішньоплеврально, інтратрахеально, інтратекально, інтраназально, інтравагінально, інтраректально, місцево, внутрішньопухлинно, внутрішньоочеревно, перитонеально, інтравентрикулярно, підшкірно, субкон'юктивно, інтравезикулярно, крізь слизову, інтраперикардіально, внутрішньопуповінно, інтраорбітально, перорально, трансдермально, шляхом інгаляції, шляхом ін'єкції очними краплями, шляхом імплантації, шляхом інфузії шляхом безперервної інфузії, локалізованими перфузійними ваннами, які діють на клітини безпосередньо, катетером, промиванням, кремами або ліпідними композиціями. У деяких варіантах здійснення винаходу, кон'югат антитіла вводять інтравітреально, окулярно, інтраокулярно, навколосклерально, субтенонально, суперхороїдально або місцево. У деяких варіантах здійснення винаходу, кон'югат антитіла вводять інтравітреально шляхом ін'єкції. У деяких варіантах здійснення винаходу, кон'югат антитіла вводять місцево за допомогою очних крапель або мазі. У деяких варіантах здійснення винаходу, кон'югат антитіла вводиться пристроєм доставки порт.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів злитий білок вводять інтравітреально, окулярно, внутрішньоочно, навколосклерально, субтенонально, суперхороїдально, місцево, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно, черезшкірно, внутрішньоартеріально, внутрішньоочеревно, внутрішньоочагово, інтракраніально, внутрішньосуглобово, внутрішньопростатично, внутрішньоплеврально, інтратрахеально, інтратекально, інтраназально, інтравагінально, інтраректально, місцево, внутрішньопухлинно, внутрішньоочеревно, перитонеально, інтравентрикулярно, підшкірно, субкон'юктивно, інтравезикулярно, крізь слизову, інтраперикардіально, внутрішньопуповінно, інтраорбітально, перорально, трансдермально, шляхом інгаляції, шляхом ін'єкції очними краплями, шляхом імплантації, шляхом інфузії шляхом безперервної інфузії, локалізованими перфузійними ваннами, які діють на клітини безпосередньо, катетером, промиванням, кремами або ліпідними композиціями. У деяких варіантах здійснення винаходу, злитий білок вводять інтравітреально, окулярно, інтраокулярно, навколосклерально, субтенонально, суперхороїдально або місцево. У деяких варіантах здійснення винаходу, злитий білок вводять інтравітреально шляхом ін'єкції. У деяких варіантах здійснення винаходу, злитий білок вводять місцево за допомогою очних крапель або мазі. У деяких варіантах здійснення винаходу, злитий білок вводиться пристроєм доставки порт. У деяких варіантах здійснення винаходу, суб'єкт являє собою людину.
В іншому аспекті винахід відноситься до фармацевтичної композиції, яка містить будь-який з попередніх кон'югатів антитіла.
В іншому аспекті винахід відноситься до фармацевтичної композиції, яка містить будь-який з попередніх злитих білків.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, фармацевтична композиція використовується для лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом у ссавця. У деяких варіантах здійснення винаходу, розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад обирають з групи, що складається з АМО, макулярної дегенерації, набряку макули, ОМЕ (включаючи фокальний, нецентральний ЮОМЕ і дифузний, пов'язаний з центром ЮМЕ), ретинопатії, ОК (включаючи РОК, МРОК і висотну ОК), інших пов'язаних з ішемією ретинопатій, КОР, ЕМО (включаючи СКМО і ВКМО форми), СММ (включаючи міопічну СММ), неоваскуляризації рогівки, хвороби, пов'язаної з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризації сітківки, хвороби, пов'язаної з ретинальною/ хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічної короткозорості, хвороби фон Гіппеля-Ліндау, гістоплазмозу очей, ЕЕМЕК, хвороби Коутса, хвороби Норрі, ОРРО, субкон'юнктивального крововиливу, рубеозу, неоваскулярного захворювання очей, неоваскулярної глаукоми, КР, гіпертонічної ретинопатії, ретинальної ангіоматозної проліферації, макулярної телеангіектазії, неоваскуляризації райдужки, внутрішньоочної неоваскуляризації, дегенерації сітківки, СМЕ, васкуліту, набряку диска зорового нерва, ретиніту, кон'юнктивіту (включаючи інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційний (наприклад, алергічний) кон'юнктивіти), вродженого амарозу Лебера, увеїту (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдиту, очного гістоплазмозу, блефариту, сухості очей, травматичного пошкодження очей і хвороби Шегрена. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад являє собою АМО, ОМЕ, ОК або КМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, окулярний розлад являє собою АМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, АМО являє собою вологу АМО.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів фармацевтична композиція додатково містить другий агент, причому другий агент обирають з групи, яка складається з іншого антитіла, анти-ангіогенного агента, цитокіна, антагоніста цитокінів, кортикостероїда, анальгетика і сполуки, яка зв'язується з другою біологічною молекулою. У деяких варіантах здійснення винаходу, антиангіогенний агент являє собою антагоніст МЕСЕ. У деяких варіантах здійснення винаходу, антагоніст МЕСЕ являє собою анти-МЕСОЕ антитіло, антитіло проти рецептора УЕСРЕ, розчинний злитий білок рецептора ЕСЕ, аптамери, анти-МЕСЕ ОАКРІпФ або інгібітор тирозинкінази МЕСЕК. У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-МЕСЕ антитіло являє собою ранібізумаб (ГОСЕМТІБФ), КТН-258 або біспецифічне анти-МЕОЕ антитіло. У деяких варіантах здійснення винаходу, біспецифічне анти-МЕОЕ антитіло являє собою анти-
МЕСРГ/анти-Апд2 антитіло. У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-МЕСЕ/анти-Апд2 антитіло являє собою КС-7716. У деяких варіантах здійснення винаходу, розчинний злитий білок рецептора МЕСЕ являє собою афілберцепт (ЕМ! ЕАФ). У деяких варіантах здійснення винаходу, аптамери являє собою пегаптаніб (МАСОСЕМФ). У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-МЕСЕ БАКРІіпФ являє собою абіципар пегол. У деяких варіантах здійснення винаходу, інгібітор тирозинкінази МЕСЕК обирають з групи, що складається з 4-(4-бром-2- фтораніліно) -6-метокси-7-(1-метілпіперідін-4-ілметоксі) хіназоліна (206474), 4-(4-фтор-2- метиліндол-5-ілокси)-6-метокси-7-(З-піролідин-1-ілпропоксі) хіназоліна (А2О2171), ваталаніба (РТК787), семаксамібіна (505416) і 5БОТЕМТФ (сунітиніб). У деяких варіантах здійснення винаходу, друга біологічна молекула обрана з групи, яка складається з ІІ -18; 1-6; / -6А; 1-13;
І/-1З3К; РООБЕ; ангіопоетина; ангіопоетина 2; Тіе2; ЗІР; інтегринів смВ3, сомВ5 і са5р1; бетацеллюліна; апеліна/АРУ); еритропоетину; фактора комплементу 0; ТМЕа; НІГА1; рецептора
МЕСЕ; рецептора 5-2; і білка, генетично пов'язаного з ризиком АМО. У деяких варіантах здійснення винаходу, рецептор МЕСЕ являє собою МЕСЕКІ, МЕСЕК2, МЕСЕКЗ, торує або 5МЕСЕК. У деяких варіантах здійснення винаходу, білок, генетично пов'язаний з ризиком АМО, обраний з групи, що складається з компонентів шляху комплементу С2, фактора В, фактора Н,
СЕНЕКЗ, СЗБ, С5, Сба і СЗа; НТКА1; АКМ52; ТІМРЗ; НГА; ІІ -8; СХЗСВ1; ТІ ВЗ; ТІ 84; СЕТР;
ПРС, СОГ/Л1ОА1; і ТМЕКЗЕТ10А. У деяких варіантах здійснення винаходу, з'єднання, яке зв'язує другу біологічну молекулу, являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент. У деяких варіантах здійснення антигензв'язуючий фрагмент антитіла обрано з групи, яка складається з Раб, Бар-С, Рар'-5Н, Гм, 5сЕм і (Гар)2 фрагментів.
В іншому аспекті винахід відноситься до способу ідентифікації зміни амінокислотного залишку, який забезпечує посилення зв'язування антитіла з молекулою-мішенню, причому спосіб включає: (а) забезпечення бібліотеки дисплея, яка містить нуклеїнові кислоти, що кодують варіанти антитіла-кандидата, причому кожен варіант антитіла-кандидата містить зміну амінокислотного залишку в МН або Мі в порівнянні з еталонним антитілом, і в якому зміни амінокислотного залишку в кожному положенні МН або Мі. присутні в бібліотеці дисплея; (Б) сортування бібліотеки дисплея на основі зв'язування варіантів антитіла-кандидата з молекулою- мішенню з утворенням сортованної бібліотеки, причому сортована бібліотека містить варіанти антитіла-кандидата з поліпшеним зв'язуванням з молекулою-мішенню в порівнянні з еталонним антитілом; і (с) порівняння частоти, з якою кожна зміна амінокислотного залишку присутня в бібліотеці дисплея і в сортованій бібліотеці, як визначено за допомогою масового паралельного сіквенування, тим самим визначаючи, чи буде кожна зміна амінокислотного залишку збагачена в сортованій бібліотеці в порівнянні з бібліотекою дисплея в якій зміна амінокислотного залишку ідентифікується як та, що сприяє посиленому зв'язуванню з молекулою-мішенню, якщо вона збагачена в сортованій бібліотеці в порівнянні з бібліотекою дисплея.
В іншому аспекті винахід відноситься до способу ідентифікації зміни амінокислотного залишку, який забезпечує підвищену стабільність антитіла, причому спосіб включає: (а) забезпечення бібліотеки дисплея, яка містить нуклеїнові кислоти, що кодують варіанти антитіла-кандидата, причому кожен варіант антитіла-кандидата містить зміна амінокислотного залишку в МН або Мі. в порівнянні з еталонним антитілом, і в якому зміни амінокислотного залишку в кожному положенні УН або У. присутні в бібліотеці дисплея; (б) сортування бібліотеки дисплея на основі зв'язування варіантів антитіла-кандидата з молекулою-мішенню з утворенням сортованої бібліотеки, причому сортована бібліотека містить варіанти антитіла-кандидата з поліпшеною стабільністю в порівнянні з еталонним антитілом; і (с) порівняння частоти, з якою кожна зміна амінокислотного залишку присутня в бібліотеці дисплея і в сортованій бібліотеці, як визначено за допомогою масового паралельного сіквенування, тим самим визначаючи, чи буде кожна 60 зміна амінокислотного залишку збагачена в сортованій бібліотеці в порівнянні з бібліотекою дисплея в якій зміна амінокислотного залишку ідентифікується як та, що додає підвищену стабільність антитілу, якщо вона збагачена в сортованій бібліотеці в порівнянні з бібліотекою дисплея.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, спосіб додатково включає в себе визначення частоти, з якою кожна зміна амінокислот присутня в бібліотеці дисплея і сортованій бібліотеці шляхом масового паралельного сіквенування на наступному етапі (Б).
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, зміна амінокислотного залишку збагачена щонайменше в 2 рази в сортованій бібліотеці в порівнянні з бібліотекою дисплея.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів бібліотека дисплея обирається з групи, яка складається з бібліотеки фагового дисплея, бібліотеки дисплея бактерій, бібліотеки дисплея дріжджів, бібліотеки дисплея ссавців, бібліотеки дисплея рибосом і бібліотеки дисплея
МРНК. У деяких варіантах здійснення винаходу, бібліотека дисплея являє собою бібліотеку фагового дисплея.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, зміна амінокислотного залишку кодується набором вироджених кодонів. У деяких варіантах здійснення винаходу, набір вироджених кодонів являє собою набір ММК або ММ5 кодону, де М являє собою А, С, б або Т; К являє собою с або Т; і 5 являє собою С або 0. У деяких варіантах здійснення винаходу, набір вироджених кодонів являє собою набір кодонів ММК.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, сортування етапу (б) включає контакт бібліотеки дисплея з іммобілізованою молекулою-мішенню або епітопом.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, сортування етапу (б) включає контакт бібліотеки дисплея з розчинною молекулою-мішенню або епітопом.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, бібліотека дисплея містить щонайменше 1 х 105 варіантів антитіла-кандидата. У деяких варіантах здійснення винаходу, бібліотека дисплея містить щонайменше 1 х 108 варіантів антитіл. У деяких варіантах здійснення винаходу, бібліотека дисплея містить щонайменше 1 х 107 варіантів антитіл.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, масове паралельне сіквенування включає в себе глибоке сіквенування, ультра-глибоке сіквенування і/або сіквенування наступного покоління.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів антитіло являє собою моноклональне антитіло.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів антитіло являє собою антитіло ща.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів антитіло являє собою фрагмент антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу, фрагмент антитіла обирають з групи, яка складається з Раб, 5сЕм, Ем, Раб Раб-5Н, К(аб):г і діатіла. У деяких варіантах здійснення винаходу, фрагмент антитіла являє собою ГЕар.
У деяких варіантах здійснення будь-якого з попередніх аспектів, спосіб додатково включає в себе генерацію антитіла, яке містить зміну амінокислотного залишку, ідентифіковану стадіями способу.
У деяких аспектах будь-яке з попередніх антитіл може бути використано при виготовленні лікарського засобу для зменшення або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом.
У деяких аспектах будь-яке з попередніх антитіл може бути використано при виготовленні лікарського засобу для лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом у суб'єкта, що потребує такого лікування.
У деяких аспектах будь-яке з попередніх антитіл може бути використано при виготовленні лікарського засобу для інгібування проникності судин у суб'єкта, що страждає розладом, пов'язаним з небажаною проникністю судин.
У деяких аспектах будь-яке з попередніх антитіл може бути використано в способі зниження або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом.
У деяких аспектах будь-яке з попередніх антитіл може бути використано в способі лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом у суб'єкта, що потребує такого лікування.
У деяких аспектах будь-яке з попередніх антитіл може бути використано в способі інгібування проникності судин у суб'єкта, що страждає розладом, пов'язаним з небажаної проникністю судин.
В іншому аспекті винахід відноситься до композиції, що містить будь-яке з попередніх антитіл для використання в способі зменшення або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом.
В іншому аспекті винахід відноситься до композиції, що містить будь-який з попередніх антитіл для використання в способі лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом у суб'єкта, що потребує такого лікування.
В іншому аспекті винахід відноситься до композиції, що містить будь-який з попередніх антитіл для використання в способі інгібування проникності судин у суб'єкта, що страждає розладом, пов'язаним з небажаною проникністю судин.
У деяких аспектах будь-який з попередніх кон'югатів антитіл може бути використаний при виготовленні лікарського засобу для зменшення або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом.
У деяких аспектах будь-який з попередніх кон'югатів антитіла може бути використаний при виготовленні лікарського засобу для лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом у суб'єкта, що потребує такого лікування.
У деяких аспектах будь-який з попередніх кон'югатів антитіла може бути використаний в способі зниження або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом.
У деяких аспектах будь-який з попередніх кон'югатів антитіла може бути використаний в способі лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом у суб'єкта, що потребує такого лікування.
В іншому аспекті винахід відноситься до композиції, що містить будь-який з попередніх кон'югатів антитіла для використання в способі зменшення або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом.
В іншому аспекті винахід відноситься до композиції, що містить будь-який з попередніх кон'югатів антитіла для використання в способі лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом у суб'єкта, що потребує такого лікування.
У деяких аспектах будь-який з попередніх злитих білків може бути використаний при виготовленні лікарського засобу для зменшення або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом.
У деяких аспектах будь-який з попередніх злитих білків може бути використаний при виготовленні лікарського засобу для лікування розладу, пов'язаного 3 патологічним
Зо ангіогенезом у суб'єкта, що потребує такого лікування.
У деяких аспектах будь-який з попередніх злитих білків може бути використаний в способі зниження або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом.
У деяких аспектах будь-який з попередніх злитих білків може бути використаний в способі лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом у суб'єкта, що потребує такого лікування.
В іншому аспекті винахід відноситься до композиції, що містить будь-який з попередніх злитих білків для використання в способі зменшення або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом.
В іншому аспекті винахід відноситься до композиції, що містить будь-який з попередніх злитих білків для використання в способі лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом у суб'єкта, що потребує такого лікування.
Слід розуміти, що будь-який з варіантів здійснення винаходу, описаних вище, щодо способів лікування (наприклад, щодо властивостей антитіл, додаткових терапевтичних агентів, розладів, пов'язаних з патологічним ангіогенезом (наприклад, окулярних розладів, таких як АМО, ОМЕ,
РК або КМО), шляхів введення (наприклад, інтравітреальної ін'єкції тощо) можуть бути використані в контексті лікарських засобів, застосувань і композицій, описаних вище.
Короткий опис графічних матеріалів
ФІГ. 1А-1Е являють собою теплові мапи, що показують Іод2 коефіцієнта збагачення (також який називають Іод2 коефіцієнта збагачення) для всіх мутацій в пеннінгах, отриманих з проходження
ММК МН (фіг. ТА-1С) ї МІ. (фіг. 10-1ЕР) бібліотек проти анти-д90О мітки антитіла (анти-д90), білка Ї або білка А. Послідовність амінокислот 6.31 дикого типу МН (фіг. ТА-1С) або МІ. (фіг. 10-16), починаючи з положення 2, показана нижче кожної теплової мапи. На фіг. ТА показані результати, отримані при пеннінгі проходження МНК бібліотеки МН проти анти-90. На фіг. 18 показані результати, отримані при пеннінгі проходження ММК МН бібліотеки проти білка Ї. На фіг. 1С показані результати, отримані при пеннінгі проходження ММК бібліотеки МН проти білка
А. На фіг. 10 показані результати, отримані при пеннінгі проходження ММК бібліотеки МІ. проти анти-д90. На фіг. 1Е показані результати, отримані при пеннінгі проходження ММК бібліотеки МІ. проти білка Ї. На фіг. 1 показані результати, отримані при пеннінгі проходження ММК 60 бібліотеки МІ. проти білка А.
ФІГ. 2А-28 представляють собою серію графіків і таблиць, що показують кореляцію між Іода2 коефіцієнтів збагачення від пеннінга МН (фіг. 2А) і МІ. (фіг. 28) проти анти-4О-мітки антитіла ("907"), білка А ("білок А") і білка ГІ. ("білок І"). В таблицях показано коефіцієнт кореляції Пірсона (17; "Кор") для порівняння між (ї) 90 і білком А; (ії) 90 і білком І; і (ії) білком А і білком І.
Кореляція для коефіцієнтів збагачення мутацій в позиціях, класифікованих як ті, що належать до гідрофобного ядра ("ядро"), розширеного гідрофобного ядра ("розширене ядро"), поверхні
МНЛ/. (Споверхня") або положенням, які утворюють важливі водневі зв'язки, сольові мости або іншим чином представляють інтерес ("інше"). Ці цифри показують, що використання анти-90 антитіла, білка А або білка Ї для виявлення згортання Рар-молекули у фага дає аналогічні результати. Єдиними мутаціями, які значно відрізнялися за своїми коефіцієнтами збагачення в різних пеннінгах, є ті, які розташовані безпосередньо в сайтах зв'язування білка А або білка І. Ці залишки маркуються як "білок А", "білок ЇЇ 1" ї "білок Ї 2" (існують два сайти зв'язування для білка І), відповідно. Сайти зв'язування для білка І описані в сгайе еї аїЇ. бШмисіиге 9 (8): 679-687, 2001, що включена в цей опис за допомогою посилання у всій її повноті. Зв'язуючі сайти для білка С описані в ОгаїНе еї аї. Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 97(10): 5599-5404, 2000, що включена в цей опис за допомогою посилання у всій її повноті.
ФІГ. ЗА-ЗВ - графіки, що показують Іод2 коефіцієнта збагачення для всіх мутацій в заданому положенні в МН (фіг. ЗА) і МІ. (фіг. ЗВ). Позиції затінені в залежності від того, чи знаходяться вони в гідрофобному ядрі (темно-сірий), в розширеному гідрофобному ядрі (сірий) або в інтерфейсі МН/Л/. (світло-сірий). Позиції, які зберігаються і не переносять мутації (І0д2 коефіцієнта збагачення 2-бали «-0,5), позначені.
ФІГ. 30-30 являють собою візуалізацію кристалічної структури антиген-вільного 56 Раб (код банку даних білка (РОВ): 2ЕОБ), що показує місце розташування збережених позицій в структурі
МН (фіг. 3С) і МІ. (фіг. 30), відповідно. Схема затінення така ж, як на фіг. ЗА-3В. Крім того, вказуються збережені позиції, які утворюють важливі водневі зв'язки, сольові містки або мають важливе значення.
ФІГ. 4А-4В8 являють собою теплові мапи, що показують І0д2 коефіцієнта збагачення всіх окремих амінокислотних заміщень, отриманих шляхом пеннінга проходження МНК бібліотеки
МН (фіг. 4А) і МІ. (фіг. 48) проти МЕСБЕ.
Зо ФІГ. 5БА-58 являють собою графіки, що показують, що Іод2 коефіцієнтів збагачення, отримані шляхом пеннінга МЕСЕ бібліотек МН (фіг. 5А) і МІ (фіг. 58), мають бімодальний розподіл.
Мутації, які були виснажені за межею виявлення, були встановлені на максимальне виснаження, яке спостерігається, для конкретного експерименту. Мутації пофарбовані відповідно до їх розташування в НМК, в консервативній рамці, як визначено за допомогою пеннінга дО, або іншої частини рамки.
ФІГ. 50-50 являють собою графіки, що показують порівняння між Іод2 коефіцієнта збагачення від пеннінга МЕСЕ обраних мутацій зі зміною Ка відносно до батьківського антитіла (36.31 (фіг. 5С) або зміни температури плавлення (Тт) відносно до 6.31 (фіг. 50). Використана та ж схема затінення, що і на фіг. БА-58.
ФІГ. 5Е-5Е являють собою візуалізацію кристалічної структури МЕСЕ-зв'язаної форми МН (фіг.
БЕ) і МІ. (фіг. 5Е) 6 Раб (код РОВ 2ЕС), що показує розташування обраних мутацій у вигляді сфер. Поверхня МЕСЕ показана як представлення поверхні. Використана та ж схема затінення, що і на фіг. 5А-5В. На етикетці показана зміна в Тт (С) і кратна зміна в афінності зв'язування (Ка) в порівнянні з 56.31.
ФІГ. бА являє собою накладені візуалізації молекул, присутніх в кристалічній структурі антиген- вільного 56 Раб (РОВ 2ЕРЕ), що показують різні кути вигину Бар, демонстровані молекулами.
ФІГ. 68-6С являє собою візуалізацію, яка демонструє детальний вид поверхні МІ-МН і конформації бічного ланцюга І С-83Е і | С-106І в молекулах з невеликим кутом вигину Раб (фіг. 68, темно-сірий) і з молекулами з великим кутом вигину Раб (фіг. 6С, світло-сірий), відповідно.
Для ясності видалені Вр-нить Е, спіраль а-1 і петля, що з'єднує обидва елементи.
ФІГ. 7А являє собою графік (права вставка), що показує кут спі! (Х1) положення І С-Е83 з 319 структур антитіл людини з РОВ. Візуалізація (ліва вставка) показує положення І С-Е83 в конформаціях "в" і "назовні".
ФІГ. 7В являє собою графік (права вставка), що показує кут вигину остову конформації для псі (У) кута в положенні 105 і фі (Ф) кута в положенні 106. Структури затінені відповідно до їх кута спії, як показано на фіг. 7А. Візуалізація (ліва вставка) показує положення 103-108 легкого ланцюга (І С) в конформаціях "в" і "назовні".
ФІГ. 7С являє собою серію графіків, що показують кут вигину (справа вгорі) і площа контакту
М/С (внизу праворуч) для структур антитіл з І С-Е83 в "в"-конформації і "назовні»-конформації. бо Результати порівнюються з кутом вигину Раб ії розміром поверхні М/СІ 319 людських Еар-
структур з РОВ, які несуть І С-Е83 їі 22 людських структур, які несуть І С-83А. На лівій вставці показані накладені візуалізації молекули зб, що мають великий кут вигину і невеликий кут вигину. Площа контакту М/С. позначається колом.
ФІГ. ВА являє собою графік, що показує кут спі! для І С-Е83 для кристалічної структури 6 Раб з великим кутом вигину (ланцюга 56 МИ, (з6-М) і кристалічної структури з малим кутом вигину (ланцюга 6 ВА, 56-ВА).
ФІГ. 8В являє собою графік, який показує результати імітації молекулярної динаміки для зазначених молекул. Кут вигину будується як функція часу.
ФІГ. 8С являє собою графік, який показує результати імітації молекулярної динаміки, яка зображує кут вигину аб як функції від кута крутіння МН/ЛЛ ("Ні-кут"). Графік розсіювання/контурний графік показує кут крутіння МНЛ/. і кут вигину, який МО.Е83 (темно-сірий) і МО.Е8ЗА (світло-сірий) приймають під час імітації молекулярної динаміки. Дві різні популяції видно для двох молекул.
ФІГ. 9А являє собою графік, що показує розподіл кута вигину Раб для молекул ВА-Е83 (І С-Е83 в "назовні"-конформації), ВА-ЕВЗА, МО-Р93 (І10-Е83 в "в»-конформації) і МО-Е8ЗА, отриманий за останні 75 нс із 100 нс імітації молекулярної динаміки. Всі зразки значно відрізнялися (р «0,001), за винятком ВА-Е83 і ВА-Е83ЗА, як визначено аналізом дисперсії (АМОМА)/прямим тестом Т'юки достовірної відмінності (НО).
ФІГ. 9В являє собою графік, що показує крутіння МНЛ/І. для п'яти молекул Сб'е пов'язаний З ЇС-Е8З в "назовні" конформації (чорний) і п'яти молекул з (Збне пов'язаний З І С-Е83 в "в" конформації (темно-сірий) як кут крутіння МН//. МЕСЕ-зв'язаних 6 структур (Ас зв'язок", світло-сірий).
ФІГ. 9С являє собою графік, який показує розподіл кутів крутіння МНЛ/І. тих же молекул, що і на фіг. 9А, під час тієї ж 100 нс імітації молекулярної динаміки. Всі зразки істотно відрізнялися (р «0,001), за винятком ВА-Е8ЗА і МО-Е8ЗА, як визначено дисперсійним аналізом АМОМА/гестом
Тюки НБО.
ФІГ. 90 являє собою візуалізацію кристалічної структури незв'язаного (6, показує області, які мають різні схеми обміну водень-дейтерію між 6.31 і (56.311 с-євзл. Ділянки, пофарбовані темно- сірим, мали більш повільний обмін в (36.311с-євзд в порівнянні з (56.31, тоді як ділянки, пофарбовані сірим, мали більш швидкий обмін в (36.311с-євзд в порівнянні з (36.31. Позиції
Зо мутації Е8ЗА і петлі ОЕ позначені лініями.
ФІГ. 10А являє собою графік, що показує розподіл соматичних мутацій для зазначених положень МІ послідовностей антитіл, що походять з зародкових ліній ЗКМ1. Мутаційний розподіл на верхній вставці було отримано з використанням загальнодоступних послідовностей людських антитіл з сепрапкК, бази даних протеїнів (РОВ), бази даних Кабат, бази даних Абсіс і бази даних ІМОТ ("Рибіїс дагазе). Мутаційний розподіл на нижній вставці було отримано з використанням сіквенування однієї молекули кДНК в реальному часі (ЗМЕТ), отриманої з більш ніж 1000 окремих лімфоїдних тканин людини. Високі швидкості мутацій на М-кінці загальнодоступних послідовностей, ймовірно, відбуваються через клонування артефактів.
ФІГ. 108 являє собою графік, що показує найбільш поширені мутації в положенні І! С-83 для послідовностей ІЗКМ1.39 із Загального набору даних, описаного на фіг. 10А і Прикладі 8 (Запдег) або набору даних ЗМЕТ (РасВіо). ІСКМ1.39 несе фенілаланін в положенні І С-83. Точки фарбуються відповідно до розміру амінокислоти. Великі амінокислоти пофарбовані в жовтий колір, а маленькі амінокислоти пофарбовані в темно-червоний колір.
ФІГ. 10С являє собою графік, що показує найбільш поширені мутації в позиції ЇС-106 для всіх послідовностей ІСК.), виявлених в Загальному наборі даних (Запдег) або в наборі даних ЗМЕТ (РасВіо). Точки затінені відповідно до розміру амінокислоти. Великі амінокислоти пофарбовані в світло-сірий колір, а маленькі амінокислоти пофарбовані в темно-сірий колір.
ФІГ. 100 являє собою серію графіків, що показують спорідненість (Ка) обраних варіантів мутантів 56.31, як виміряно за допомогою поверхневого плазмонного резонансу ВІАСОКЕФ (ліва вставка) і температури плавлення Тт для обраних варіантів мутантів 56.31, як визначено диференціальною скануючою флюорометрією (О5Е) (права вставка). Кола на лівій вставці представляють середнє з трьох повторів з відповідним стандартним відхиленням, показаним смужками помилок. Кола на правій вставці представляють середнє з трьох повторів і відповідне стандартне відхилення, показане смужками помилок.
ФІГ. 11А являє собою графік, що показує фармакокінетику рідини і склоподібного тіла для кожного з (36.31 ААЕЕ, 06.31 ДТ і 06.31 ААКК після інтравітреального введення (ІМТ) відповідного Раб в очі кролика, як описано в прикладі 11.
ФІГ. 118 являє собою графік, що показує коефіцієнт розпаду в сироватці кожного з (56.31 ААЕБЕ,
Оо6.31 ДТ ї 66.31 ААКК після інтравітреального введення відповідного Бар в очі кролика, як 60 описано в прикладі 11.
ФІГ. 12 являє собою таблицю, яка показує аналіз фрагментації капілярним електрофорезом - додецилсульфатом натрію (СЕ-505) для зазначених клонів антитіл. Фрагментація являє собою відсоток низькомолекулярних об'єктів (95 НМВ) через 4 тижні, 12 тижнів і 24 тижні при 37 "С в
РВ5. Фрагментація послідовно знижується в усіх варіантах М94А в порівнянні з (36.31 дикого типу. Об'єкти з високою молекулярною масою (96 ВМВ) вказують на домішки або агрегати.
Основний розмір піку в цьому аналізі безпосередньо не корелює зі ступенем фрагментації, але залежить від розміру і об'єму фрагмента барвника. Анти-МЕСЕ Раб ранібізумаба слугував в якості контролю.
ФІГ. 13 являє собою графік, що показує графік інгібування міграції НОМЕС, індукованої МЕСБЕ, варіантом 06.31 І С-МУ4А в порівнянні з вихідним 56.31 при різних концентраціях Рар, як описано в прикладі 12.
ФІГ. 14 являє собою графік, що показує гель-фільтраційну хроматографію (ЗЕС) ї аналіз багатокутового розсіювання світла з коефіцієнтом заломлення (КІ) (МАГ 5) (ЗЕС-ВІ-МАЇГ 5) для
НА4ОК-гаргар, НА2гООК-гаргаь і НАбООК-гаргРар з перекриттям средньомасової молярної маси (Мв).
ФІГ. 15 являє собою графік, що показує, що гіалуронова кислота (НА), яка кон'югована із габгаб, зберігає ферментативну сприйнятливість до перетравлювання гіалуронідазами-2 (НХУАЇ 2), як оцінюється аналізом 5ЗЕС-МАЇ З з НУАЇ 2-інкубованою НА і НАТООК-гарЕБар. Для зразків НА- гаргаб права вісь Мв виражається як Мв компонента НА тільки кон'югату.
ФІГ. 16 являє собою графік, що показує виведення ранібізумаба, габбаб ії НАТООК-гаргар ("лінійний НА-гарбар") з склоподібного тіла кролика після інтравітреальної ін'єкції. НАТООК- гаргаб показав період напіввиведення приблизно 11,9 днів, у порівнянні з приблизно 2,5 днями для гаргЕар.
ФІГ. 17 являє собою графік, що показує, що час вітреального перебування лінійно корелює з гідродинамічним радіусом (Кі, який позначено як "Кн" на графіку) в склоподібному тілі кролика.
Для передбачення періодів напіврозпаду для НА1Т00К-56.31 ААКК (незабарвлене коло),
НА2ООК-06.31 ААКК (незабарвлений квадрат) і НАЗООК-О6.31 (незабарвлений трикутник) можна використовувати історичні дані (пофарбовані кола) для гарБаб, гарРар-2о0кДа ПЕГ, гарРар-40кДа ПЕГ і НАТООК-гаргаб на основі виміряних значень КИ.
Детальний опис винаходу
Ї. ВИЗНАЧЕННЯ
Використовуваний в цьому документі термін "близько" відноситься до звичайного діапазону помилок для відповідного значення, добре відомого фахівцю в цій галузі техніки. Посилання на "близько" значення або параметра в даному документі включає (і описує) варіанти здійснення винаходу, які спрямовані на це значення або параметр рег 5е. "Акцепторний каркас людини" для цілей цього документа являє собою каркас, що містить амінокислотну послідовність каркаса варіабельного домену легкого ланцюга (МІ) або каркаса варіабельного домену важкого ланцюга (МН), які отримано з каркаса імуноглобуліну людини або каркаса консенсусу людини, як визначено нижче. Акцепторний каркас людини, "отриманий з" каркаса імуноглобуліну людини або консенсусної послідовності каркаса людини, може містити амінокислотну послідовність, яка збігається з ними, або може містити зміни амінокислотної послідовності. У деяких варіантах здійснення винаходу, кількість змін амінокислоти становить 10 або менше, 9 або менше, 8 або менше, 7 або менше, 6 або менше, 5 або менше, 4 або менше, З або менше або 2 або менше. У деяких варіантах здійснення винаходу, каркас мі - акцептора людини ідентичний в послідовності каркаса МІ імуноглобуліну людини або послідовності консенсусного каркаса людини. "Афінність" відноситься до сили сумарної кількості нековалентних взаємодій між одним сайтом зв'язування молекули (наприклад, антитілом) і її партнером зв'язування (наприклад, антигеном).
Якщо не вказано інше, як використовується в цьому документі, "аффинность зв'язування" відноситься до афінності власного зв'язування, яка відображає взаємодію 1:1 між членами пари зв'язування (наприклад, антитілом і антигеном). Афінність молекули Х для її партнера У зазвичай може бути представлена константою дисоціації (Ка). Афінність може бути виміряна звичайними методами, відомими в цій галузі, включаючи описані в даному документі. Конкретні ілюстративні та ілюстративні варіанти здійснення винаходу для вимірювання афінності зв'язування описано нижче.
Антитіло з "афінністю, яка дозріла" відноситься до антитіла з одним або більше змінами в одній або більше гіперваріабельних ділянках (НМ) і/або каркасних ділянках (ЕК) в порівнянні з вихідним антитілом, яке не володіє такими змінами, причому такі зміни призводять до поліпшення спорідненості антитіла до антигену.
Термін "фактор росту ендотелію судин" або "МЕСЕ" відноситься до білка А фактору росту ендотелію судин, як показано в 5ЕО ІЮ МО: 47 (див. також 5м/із55 Ргої Ассеззіоп Мо Р15692, Сепе
ІО (СВІ): 7422). Термін "МЕСЕ" охоплює білок, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ
МО: 47, а також його гомологи та ізоформи. Термін "МЕСЕ" також відповідає відомим ізоформами, наприклад ізоформами зрощування, МЕСЕ, наприклад МЕСЕ 11, МЕС 21, МЕС 145,
МЕСЕїв5, МЕСЕтво і МЕСЕговб, разом з їх природними алельними та обробленими формами, включаючи 110-амінокислотний фактор росту ендотеліальних клітин людини, отриманий розщепленням плазміном МЕСЕ 65, як описано в Реїтага Мої. Віої. СеїІ. 21:687 (2010), Ї еипа єї а!І., Зсіепсе, 246:1306 (1989), та Ноиск еї а!., Мої. Епаостіп., 5: 1806 (1991). Термін "УМЕСЕ" також відноситься до МЕСЕ від нелюдських видів, таких як миша, щур або примат. Іноді МЕСЕ від певного виду позначають за допомогою таких термінів, як ЛИМЕСЕ для МЕСЕ людини, туУЕСЕ для МЕСЕ миші тощо. Термін "МЕСЕ" також використовується для позначення усічених форм поліпептиду, що містять амінокислоти від 8 до 109 або від 1 до 109 з 165-амінокислотного фактора росту ендотеліальних клітин людини. Посилання на будь-які такі форми МЕСЕ може бути ідентифіковано в цій заявці, наприклад, за допомогою "МЕСЕ оо", "ЕСЕ (8-109)», "МЕСЕ (1- 109)» або "УМЕСЕ:65. Положення амінокислот для "усіченого" нативного МЕСЕ нумеруються, як зазначено в нативній послідовності МЕСЕ. Наприклад, положення амінокислоти 17 (метіонін) в усіченому нативному МЕСЕ є також положенням 17 (метіонін) в нативному МЕСЕ. Усічений нативний МЕСЕ має афінність зв'язування з рецепторами КОК і ЕК-1, яку можна порівняти з нативним МЕСЕ. Використовуваний в цьому документі термін "варіант МЕСЕ" відноситься до поліпептиду МЕСЕ, який включає одну або більше амінокислотних мутацій в нативній послідовності МЕСЕ. Необов'язково, одна або більше амінокислотних мутацій включають амінокислотну заміну(и). Для цілей скороченого позначення варіантів МЕСЕ, описаних в цьому документі, зазначається, що числа відносяться до положення амінокислотного залишку амінокислотної послідовності передбачуваного нативного МЕСЕ (представлено в І еипад еї аї., зирга і Ноиск еї аї., вище). Якщо не вказано інше, термін "МЕСЕ", який використовується в цьому документі, означає МЕСРЕ-А.
Терміни "анти-МЕСЕ антитіло", "антитіло, яке зв'язується з МЕСЕ", і "антитіло, яке специфічно зв'язується з МЕСЕ", відносяться до антитілу, яке здатне зв'язувати МЕСЕ з достатньою
Зо афінністю, так що антитіло корисно в якості діагностичного і/або терапевтичного агента при націлюванні на МЕСР. В одному варіанті здійснення винаходу, ступінь зв'язування анти-МЕСЕ антитіла з непов'язаним не-МЕСЕ білком становить менш ніж близько 10 95 від зв'язування антитіла з МЕСЕ, як виміряно, наприклад, радіоіїмуноаналізом (КІА). У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло, яке зв'язується з МЕСЕ, має константу дисоціації (Ка) х 1 мкМ, хх 100 НМ, 1О НМ, 1 НМ, «0,1 НМ, х 0,01 нМ або «х 0,001 нМ (наприклад, 108 М або менше, наприклад, від 1038 М до 10-33 М, наприклад від 1079 М до 10-33 М). У деяких варіантах здійснення винаходу, анти-МЕСЕ антитіло зв'язується з епітопом МЕСЕ, який зберігається серед МЕСЕ у різних видів.
Термін "антитіло" в цьому документі використовується в самому широкому сенсі і охоплює різні структури антитіл, включаючи, але не обмежуючись ними, моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла) і фрагменти антитіл, за умови, що вони мають бажану антиген-зв'язуючу активністю. "Фрагмент антитіла" відноситься до молекули, відмінної від інтактного антитіла, яка містить частину інтактного антитіла, яка зв'язує антиген з яким зв'язується інтактне антитіло. Приклади фрагментів антитіл включають, але не обмежуються ними, Ем, Раб, Раб", Габ-С, Раб5Н, К(ар»г; димери; лінійні антитіла; молекули одноланцюгових антитіл (наприклад, 5сЕмМ); і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. У деяких випадках приклади фрагментів антитіл включають, але не обмежуються ними, Ем, Раб, Раб Раб'5Н, (авг; димери; лінійні антитіла; молекули одноланцюгових антитіл (наприклад, 5сЕмМ); і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл.
Папаїнове перетравлення антитіл дає два ідентичних антигензв'язуючих фрагмента, які називають фрагментами "Бар", і залишковий фрагмент "Ес", позначення, що відображає здатність легко кристалізуватися. Фрагмент ЕРар складається з цілого легкого (І) ланцюга разом з доменом варіабельної ділянки важкого (Н) ланцюга (МН) і першого константного домену одного важкого ланцюга (СНІ). Обробка антитіла пепсином дає один великий фрагмент Е(аб)», який приблизно відповідає двом зв'язаним з дисульфідом ЕРаб-фрагментами, які мають двовалентну антигензв'язуючу активність і як і раніше здатним до зшивання антигену. Еар' фрагменти відрізняються від ЕРар-фрагментів наявністю декількох додаткових залишків на карбоксильному кінці домену СНІ, включаючи один або більше цистеїнів з ділянки шарніра бо антитіла. Рар-С молекули являють собою Раб молекули, які експресуються таким чином, що послідовність усікається на першому цистеїні шарніра, даючи Бар з вільним цистеїном безпосередньо після експресії (див., наприклад, Зпаї; еї аїЇ., Мої. РНаптасецшійс5 2016; ідентифікатор РибМей (РМІФЮ) 27244474). Наприклад, молекула Бар-С може мати вільний цистеїн в положенні Субх227 важкого ланцюга. В інших випадках молекула Бар-С може мати вільний цистеїн в положенні Суз229 важкого ланцюга. Бар'-5Н є позначенням в цьому документі для Еаб, в якому залишок(и) цистеїну константних доменів несуть вільну тіольну групу.
Фрагменти ЕК(аб)2 антитіла спочатку були отримані у вигляді пар Раб'-фрагментів, які мають цистеїн шарніра між ними. Відомі також інші хімічні сполуки фрагментів антитіл.
Використовуваний в цьому документі термін "Ес-ділянка" використовується для визначення С- кінцевої ділянки важкого ланцюга імуноглобуліну, яка містить щонайменше частину константної ділянки. Термін включає в себе природні послідовності Ес-ділянок та варіанти Ес-ділянок. В одному варіанті здійснення винаходу, Ес-ділянка важкого ланцюга (дО людини простягається від Суз226 або від Рго230 до карбоксильних кінців важкого ланцюга. Однак С-кінцевий лізин (Гуз447) ЕРс-ділянки може бути присутнім або відсутнім. Якщо не вказано інше, нумерація амінокислотних залишків в Ес-ділянці або константній ділянці відповідає системі нумерації ЄС, також званої індексом ЄС, як описано в КаБбаї еї аїЇ., ЗХедиепсе5 ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодісаї
Іптегеві, Бій Ед. Рибіїс Неацй Зегуісе, Майопаї! Іпвійшез ої Неайй, ВешШезаа, МО (1991). "Бм' складається з димеру одного домену варіабельної ділянки важкого і одного легкого ланцюга в щільній, нековалентній асоціації. Зі згортання цих двох доменів походять шість гіперваріабельних петель (по З петлі з кожного Н і І-ланцюга), які вносять амінокислотні залишки для зв'язування антигену і надають антигензв'язуючу специфічність антитіла. Однак навіть один варіабельний домен (або половина Ем, що містить тільки три НУК, специфічних для антигену), має здатність розпізнавати і зв'язувати антиген, хоча часто з більш низькою спорідненістю, ніж весь сайт зв'язування. "Одноланцюговий Ем", також скорочується як "зм" або "5сЕм", є фрагментами антитіл, які містять домени МН і Мі -антитіл, з'єднані в один поліпептидний ланцюг. Переважно, поліпептид 5Ем додатково містить поліпептидний лінкер між доменами МН і Мі, який дозволяє 5Ем формувати бажану структуру для зв'язування антигену. Для огляду про 5Ем див. РійскІйип в Те
Рпагтасоїоду ої Мопосіопаї! Апіїродіеєв, мої. 113, Возепригуд апа Мооге едв., Зргіпдег-Мепад, Мем
Зо УоК, рр. 269-315 (1994).
Термін "діатіла" відноситься до невеликих фрагментів антитіл, які отримано шляхом конструювання 5Ем-фрагментів (див. попередній параграф) за допомогою коротких лінкерів (близько 5-10 залишків) між доменами МН і Мі, так що утворюються міжланцюгово, але не внутрішньоланцюгово М домени, які спаровуються, що призводить до отримання двовалентного фрагмента, тобто фрагмента, що має дві антигензв'язуючі ділянки. Біспецифічні діатіла є гетеродимерами двох "кросоверних" 5Ем-фрагментів, в яких МН і Мі -домени двох антитіл присутні в різних поліпептидних ланцюгах. Діатіла описані більш повно, наприклад, в ЕР 404097; МО 93/11161; і Ноїїїпдег еї а!ї., Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА, 90: 6444-6448 (1993). "Блокуюче" антитіло або антитіло "антагоніст" являє собою антитіло, яке пригнічує або зменшує біологічну активність пов'язаного з ним антигена. Деякі блокуючі антитіла або антагоністичні антитіла по суті або повністю інгібують біологічну активність антигену. "Антитіло, яке зв'язується з одним і тим же епітопом" в якості еталонного антитіла відноситься до антитіла, яке блокує зв'язування еталонного антитіла з його антигеном в конкурентному аналізі на 50 95 або більше, і навпаки, контрольне антитіло блокує зв'язування антитіла з його антигеном в конкурентному аналізі на 5095 і більше. Ілюстративний конкурентний аналіз наведено в цьому документі.
Термін "химерне" антитіло відноситься до антитіла, в якому фрагмент важкого і/або легкого ланцюга походить з конкретного джерела або виду, в той час як інша частина важкого і/або легкого ланцюга походить з іншого джерела або виду. "Клас" антитіла відноситься до типу константного домену або константної області, що міститься в його важкому ланцюгу. Існує п'ять основних класів антитіл: ІдА, дО, ІДЕ, дз і ІДМ, і деякі з них можуть бути далі розділені на підкласи (ізотипи), наприклад Ідс:, дО», ІдСз, ІДС, ІДАт и ІддА».
Константні домени важкого ланцюга, які відповідають різним класам імуноглобулінів, називаються, ,,, і, відповідно.абєурн "Ефекторні функції" відносяться до тієї біологічної активності, яка відноситься до Ес-ділянки антитіла, які варіюються в залежності від ізотипа антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіла включають: С1ід-зв'язуюча і комплемент-залежна цитотоксичність (СОС); зв'язування
Ес-рецептора; антитіло-залежна клітинно-опосередкована цитотоксичність (АЮОСС); фагоцитоз; знижуюча регуляція рецепторів клітинної поверхні (наприклад, рецептор В-клітин); і активації В- бо клітин.
"Каркас" або "каркасна ділянка" або "РК" відноситься до залишків варіабельної ділянки, які відмінні від залишків гіперваріабельної ділянки (НМК). ЕЕ варіабельної ділянки зазвичай складається з чотирьох доменів ЕК: ЕК, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4.
Терміни "повнорозмірне антитіло", "інтактне антитіло" і "ціле антитіло" використовуються в цьому документі як взаємозамінні для позначення антитіла, що має структуру, по суті аналогічну структурі нативного антитіла, або мають важкі ланцюги, які містять Ес-ділянку, як визначено в даному документі. "Людське антитіло" являє собою антитіло людини, яке має амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності антитіла, що продукується людиною або клітиною людини, або отриманої з нелюдського джерела, яке використовує репертуари антитіл людини або інші людські послідовності, що кодують антитіла. Це визначення людського антитіла конкретно виключає гуманізоване антитіло, що містить нелюдські антигензв'язуючі залишки. "Каркас консенсусу людини" являє собою структуру, яка являє собою амінокислотні залишки, які найбільш часто зустрічаються у вибірці послідовностей каркаса Мі або МН людського імуноглобуліну. Як правило, вибір послідовності МІ. або МН людського імуноглобуліну походить з підгрупи послідовностей варіабельних доменів. Як правило, підгрупа послідовностей є підгрупою, як в Кабаї єї аї., Зедиепсез ої Ргоївїіп5 ої Іттипоіодіса! Іпієгев5і, ЕЩИ Еайіоп, МІН
Рибіїсайоп 91-3242, Вештезаа МО (1991), мої. 1-3. В одному варіанті здійснення винаходу, для Мі. підгрупа є підгрупою каппа І, як в Кабаї єї а!., див. вище. В одному варіанті здійснення винаходу, для МН підгрупа є підгрупою І, як в Кабаї єї аі!., див. вище. "Гуманізовані" форми нелюдських (наприклад, гризунів) антитіл являють собою химерні антитіла, які містять мінімальну послідовність, отриману з нелюдського антитіла. Здебільшого гуманізовані антитіла є людськими імуноглобулінами (антитіло-реципієнт), в яких залишки з гіперваріабельної ділянки реципієнта замінюються залишками з гіперваріабельної ділянки нелюдських видів (донорні антитіла), таких як миші, щур, кролик або нелюдський примат, що мають бажану специфічність антитіл, афінність і здатність. В деяких випадках залишки ЕК людського імуноглобуліну замінюються відповідними нелюдськими залишками. Крім того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які не виявлено в антитілі-реципієнті або в донорському антитілі. Ці модифікації зроблені для подальшого поліпшення характеристик антитіл. Загалом, гуманізоване антитіло буде містити по суті все із щонайменше одного і, як правило, двох варіабельних доменів, в яких всі або практично всі гіперваріабельні петлі відповідають нелюдському імуноглобуліну, і всі або практично всі ЕК є тими послідовностями людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло необов'язково також буде містити щонайменше частину константної ділянки (Ес) імуноглобуліну, як правило, імуноглобуліну людини. Більш детально див. ЧЩопез еї аї., Маїиге 321: 522-525 (1986); Віесптапп еї а!., Маїшге 332: 323-329 (1988); і Ргевіа, Ст. Ор. Бігисі. Віо!. 2:593-596 (1992).
Термін "варіабельний" відноситься до того факту, що деякі сегменти варіабельних доменів сильно розрізняються за послідовностям серед антитіл. Варіабельний або "М" домен опосередковує зв'язування антигену і визначає специфічність конкретного антитіла для його конкретного антигену. Однак варіабельність розподіляється нерівномірно по всьому діапазону варіабельних доменів. Замість цього М-ділянки складаються з відносно інваріантних відрізків, які називаються каркасними ділянками (ЕК) з 15-30 амінокислот, розділених більш короткими ділянками екстремальної варіабельності під назвою "гіперваріабельні ділянки", кожна довжиною 9-12 амінокислот. Термін "гіперваріабельна ділянка" або "НМЕК" при використанні в цьому документі відноситься до амінокислотних залишків антитіла, які відповідальні за антиген- зв'язування. Гіперваріабельна ділянка зазвичай містить амінокислотні залишки, наприклад, приблизно близько залишків 24-34 (11), 50-56 (12) і 89-97 (13) в МІ, і приблизно близько залишків 26-35 (НІ), 49-65 (Н2) і 95-102 (НЗ) в МН (в одному варіанті здійснення винаходу, НІ1 приблизно близько залишків 31-35); Кабаї евї а!., Зедоепсев ої Ргоївїн5 ої Іттипоіодісаї! Іпіегезві,
БІ ЕЯ. Рибіїс Неайт Зегмісе, Маїопа! Іпбійшеб5 ої Неанй, ВеШезаа, МО. (1991)), та/або ці залишки з "гіперваріабельної петлі" (наприклад, залишки 26-32 (І 1), 50-52 (12) і 91-96(13) вМі і 26-32 (НІ), 53-55 (Н2) і 96-101 (НЗ) в МН; СпоїШіа апа Гезк, 9. Мої. Віої. 196:901-917 (1987).
Варіабельні домени нативних важких і легких ланцюгів кожен містить чотири ЕК, в основному застосовуючи конфігурацію бета-листка, зв'язану трьома гіперваріабельними ділянками, які утворюють петлі, що з'єднують і в деяких випадках які складають частину структури бета- листка. Гіперваріабельні ділянки в кожному ланцюзі утримуються разом в безпосередній близькості від ЕК і, з гіперваріабельними ділянками з іншого ланцюга сприяють утворенню антигензв'язуючого сайту антитіл (див. Кабраї еї аї., Зедиепсе5 ої Ргоївеїіп5 ої Іттипоіодісаї!
Іпіїегеві, БІШй Ед. Рибіїс Неанй Зегуісе, Маїййопа! Іпбійшев ої Неайй, Веїйезаа, МО. (1991)). 60 Відповідно, послідовності НУЄ. і ЕК зазвичай з'являються в наступній послідовності в МН (або
М): ЕВІ1-НІ(І1)-ЕН2-На(І2)-ЕВЗ3-НІЗ(І3)-ЕК4. Константні домени безпосередньо не пов'язані зі зв'язуванням антитіла з антигеном, але виявляють різні ефекторні функції, такі як участь антитіла в залежній від антитіла клітинної цитотоксичності (АЮОСС).
Термін "нумерація залишків варіабельного домену, як в Кабат" або "нумерація амінокислотного положення, як в Кабат", і їх варіації відноситься до системи нумерації, використовуваної для варіабельних доменів важкого ланцюга або варіабельних доменів легкого ланцюга для компіляції антитіл в Кабаї еї аІ., див. вище. Використовуючи цю систему нумерації, фактична лінійна амінокислотна послідовність може містити менше або додаткові амінокислоти, які відповідають скороченню або вставці в ЕК або НМК варіабельного домену. Наприклад, варіабельний домен важкого ланцюга може включати одну амінокислотну вставку (залишок 52а по Кабат) після залишку 52 з Н2 і вставлені залишки (наприклад, залишки 82а, 8260 і 82с і т. д. згідно Кабат) після залишку 82 важкого ланцюга ЕК. Нумерація залишків по Кабат може бути визначена для даного антитіла шляхом вирівнювання в ділянках гомології послідовності антитіла зі "стандартною" нумерацією послідовності по Кабат.
Система нумерації Кабат зазвичай використовується при зверненні до залишку в варіабельній ділянці (приблизно залишки 1-107 легкого ланцюга і залишки 1-113 важкого ланцюга) (наприклад, Кабаї еї аїЇ,, Зедоепсе5 ої Іттипоїіодіса! Іпіеге5і. 5Ій Ей. Рибіїс Неакй зегмісе,
Маїопа! Іпзійшев ої Неайй, Веїпезаа, МО. (1991)). "Система нумерації ЄС" або "індекс ЄС" зазвичай використовується при зверненні до залишку в константній ділянці важкого ланцюга імуноглобуліну (наприклад, індекс ЄС, зазначений в КаБбаї еї аІ., Вище). "Індекс ЄС як в Кабат" відноситься до нумерації залишків людського Ідо1-антитіла ЄС. Якщо не вказано інше в цьому документі, посилання на номери залишків в варіабельному домені антитіл означають нумерацію залишку по системі нумерації Кабата. Якщо не вказано інше в цьому документі, посилання на номери залишків в константному домені антитіл означають нумерацію залишку по системі нумерації ЄС (наприклад, див. попередню заявку Сполучених Штатів Мо 60/640323, фігури для нумерації ЄС).
Якщо не вказано інше, залишки НМК та інші залишки в варіабельному домені (наприклад, залишки ЕК) пронумеровані в цьому документі відповідно до КарБбаї еї а!., див. вище. "Імунокон'югат" являє собою антитіло, кон'юговане з однією або більше гетерологічними
Зо молекулами(ой), включаючи, але не обмежуючись ними, цитотоксичний агент.
Термін "ізольоване антитіло" при використанні для опису різних антитіл, описаних в цьому документі, означає антитіло, яке було ідентифіковано та виділено і/або виділено з клітини або клітинної культури, з якої вона була експресована. Забруднюючими компонентами його природного середовища є матеріали, які зазвичай перешкоджають діагностичному або терапевтичному застосуванню поліпептиду і можуть включати ферменти, гормони і інші білкові або небілкові розчинені речовини. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло очищають до більш ніж 95 95 або 99 95 чистоти, як визначено, наприклад, електрофоретично (наприклад,
ЗО5-РАСЕ, ізоелектричне фокусування (ІЕЕ), капілярний електрофорез) або хроматографічно (наприклад, іонний обмін або ВЕРХ з оберненою фазою). Для огляду методів оцінки чистоти антитіл див., наприклад, Ріантап еї аї., 9). Спготаїйодг. В 848: 79-87 (2007). У кращих варіантах здійснення винаходу, антитіло буде очищено (1) до ступеня, достатнього для отримання щонайменше 15 залишків М-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності з використанням сіквенатора з обертовою склянкою або (2) до гомогенності за допомогою 505-
РАСЕ в невідновлюваних або відновлюваних умовах, використовуючи забарвлення Кумасі синім або, переважно, сріблом. Ізольоване антитіло включає антитіла іп 5йи в рекомбінантних клітинах оскільки щонайменше один компонент поліпептидного природного середовища не буде присутній. Однак зазвичай ізольований поліпептид отримують за допомогою щонайменше однією стадією очищення.
Використовуваний в цьому документі термін "моноклональне антитіло" відноситься до антитіла, отриманого з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто окремі антитіла, що містяться в популяції, є ідентичними та/або зв'язують один і той же епітоп, за винятком можливих варіантів антитіл, наприклад, що містять природні виникаючі мутації або які виникають при отриманні препарату моноклонального антитіла, причому такі варіанти зазвичай присутні в незначних кількостях. На відміну від препаратів поліклонального антитіла, які зазвичай включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло препарату моноклонального антитіла спрямовано проти одного детермінанта на антигені. Таким чином, модифікатор "моноклональне" вказує на те, що антитіло отримують з практично однорідної популяції антитіл; його не слід інтерпретувати як вимогу щодо продукції антитіла за допомогою будь-якого конкретного способу. Наприклад, моноклональні антитіла, які будуть бо використовуватися відповідно до цього винаходу, можуть бути отримані різними способами,
включаючи, але не обмежуючись ними, гібридомний спосіб, способи рекомбінантної ДНК, способи фагового дисплею і способи, які використовують трансгенних тварин, що містять всі або частину локусів імуноглобуліну людини, такі способи та інші ілюстративні способи отримання моноклональних антитіл, описаних в даному документі.
Термін "мультиспецифічне антитіло" використовується в самому широкому сенсі і конкретно охоплює антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга (МН) і варіабельний домен легкого ланцюга (М), де одиниця МН-МІ. володіє полієпітопічною специфічністю (тобто здатна зв'язуватися з двома різними епітопами на одній біологічній молекулі або на кожному епітопі на іншій біологічній молекулі). Такі мультиспецифічні антитіла включають, але не обмежуються ними, повнорозмірні антитіла, антитіла, що мають два або більше доменів МІ. і МН, фрагменти антитіл, такі як Бар, Бар. ЕАВ-С. Ем, азЕм, зом, діатіла, біспецифічні діатіла і триатіла, фрагменти антитіл, які були зв'язані ковалентно або нековалентно. "Поліепітопічна специфічність" відноситься до здатності специфічно зв'язуватися з двома або більше різними епітопами на одній і тій же або інших цілі(ях). "Подвійна специфічність" або "біспецифічность" відноситься до здатності специфічно зв'язуватися з двома різними епітопами на одній і тій же або інших цілі(ях). Однак, на відміну від біспецифічних антитілах, подвійні специфічні антитіла мають два антигензв'язуючих плеча, які ідентичні в амінокислотної послідовності, і кожне Рар- плече здатне розпізнавати два антигена. Подвійна специфічність дозволяє антитілам взаємодіяти з високою афінністю з двома різними антигенами, як з одним Бар або молекулою
ІЧ. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу, мультиспецифічне антитіло в формі Ідс1 зв'язується з кожним епітопом з афінністю від 5 мкМ до 0,001 пМ, від З мкМ до 0,001 пМ, від 1
МКМ до 0,001 пМ, від 0,5 мкМ до 0,001 пМ або від 0, 1 мкМ до 0,001 пМ. "Моноспецифічність" відноситься до здатності зв'язувати тільки один епітоп. "Нативні антитіла" відносяться до природних молекул імуноглобуліну з різними структурами.
Наприклад, нативні ІдСб-антитіла зазвичай являють собою гетеротетрамерні глікопротеїни з молекулярною масою близько 150000 дальтон, що складаються з двох ідентичних легких ланцюгів і двох ідентичних важких ланцюгів, пов'язаних дисульфідними зв'язками. Кожен важкий ланцюг від М-кінця до С-кінця містить варіабельну ділянку (МН), також який називається важким варіабельним доменом або варіабельним доменом важкого ланцюга, а потім три константних домена (СНІ, СН2 ї СНЗ). Аналогічно, кожен легкий ланцюг від М-кінця до С-кінця містить варіабельну ділянку (МІ), також який називається легким варіабельним доменом або варіабельним доменом легкого ланцюга, а потім константний легкий домен (СІ). Легкий ланцюг антитіла може бути призначено одному з двох типів, який називається каппа (к) і лямбда (5), на основі амінокислотної послідовності його константного домену.
Що стосується зв'язування антитіла з молекулою-мішенню, термін "специфічне зв'язування" або "специфічно зв'язується з" або "специфічний для" конкретного поліпептиду або епітопу на конкретній поліпептидній мішені означає зв'язування, яке помітно відрізняється від неспецифічної взаємодії. Специфічне зв'язування може бути виміряно, наприклад, шляхом визначення зв'язування молекули в порівнянні зі зв'язуванням контрольної молекули.
Наприклад, специфічне зв'язування може бути визначено шляхом конкуренції з контрольною молекулою, яка схожа на мішень, наприклад, надлишок неміченої мішені. В цьому випадку специфічне зв'язування вказується, якщо зв'язування міченої мішені з зондом конкурентно інгібується надлишковою неміченою мішенню. Термін "специфічне зв'язування" або "специфічно зв'язується 3" або "специфічний для" конкретного поліпептиду або епітопу на конкретній поліпептидній мішені, як використовується в цьому документі, може бути представлений, наприклад, за допомогою молекули, що має Ка для мішені 107 М або нижче, альтернативно 1075
М або нижче, альтернативно 105 М або нижче, альтернативно 107 М або нижче, альтернативно 108 М або нижче, альтернативно 109 М або нижче, альтернативно 1070 М або нижче, альтернативно 10-! М або нижче, альтернативно 10-72 М або нижче або Ка в діапазоні від 107 М до 106 М або від 105 М до 1079 М або 10- М до 1079 М. Як буде зрозуміло фахівцю в цій галузі, афінність і значення Ка обернено пропорційні. Висока афінність до антигену вимірюється низьким значенням Ка. В одному варіанті здійснення винаходу, термін "специфічне зв'язування" відноситься до зв'язування, де молекула зв'язується з конкретним поліпептидом або епітопом на конкретному поліпептиді без істотного зв'язування з будь-яким іншим поліпептидним або поліпептидним епітопом. "Нуклеїнова кислота, що кодує анти-МЕСЕ антитіло", відноситься до однієї або більше молекул нуклеїнової кислоти, що кодує важкі і легкі ланцюги антитіла (або їхні фрагменти), включаючи таку молекулу(и) нуклеїнової кислоти в одному векторі окремому векторі, і таку молекулу(и) нуклеїнової кислоти, присутню в одному або більше місцях в клітині-хазяїні.
Використовуваний в цьому документі, термін "вектор" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, здатної поширювати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона зв'язана. Зазначений термін включає вектор, що знаходиться у вигляді нуклеїнової кислоти, що самореплікується, а також вектор, здатний проникати в геном клітини-хазяїна, в яку його вводять. Деякі вектори здатні управляти експресією нуклеїнових кислот, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори згадуються в цьому документі як "вектори експресії".
Терміни "клітина-хазяїн", "лінія клітин-хазяїв" і "культура клітин-хазяїв" використовуються як взаємозамінні і відносяться до клітин, в які була введена екзогенна нуклеїнова кислота, включаючи потомство таких клітин. Клітини-хазяї включають "трансформанти" |і "трансформовані клітини", які включають первинно трансформовані клітини і отримане від них потомство, незалежно від кількості пасажів. Потомство може не бути повністю ідентичним вихідній клітині за змістом нуклеїнових кислот, і може містити мутації. Мутантні потомства, які володіють тією ж функцією або біологічною активністю, що і скриновані або обрані в спочатку трансформованій клітині, включені в цей документ. "Ідентифікація амінокислотної послідовності у відсотках (95)» відносно еталонної поліпептидної послідовності визначається як відсоток амінокислотних залишків в послідовності-кандидаті, які ідентичні амінокислотним залишкам в еталонній поліпептидній послідовності після вирівнювання послідовностей і введення прогалин, якщо необхідно, для досягнення максимального відсотка ідентичності послідовності, і без урахування будь-яких консервативних замін як частини ідентичності послідовності. Вирівнювання для цілей визначення відсотка ідентичності амінокислотної послідовності може бути досягнуто різними способами, які входять до компетенції фахівця в цій галузі, наприклад, з використанням загальнодоступного комп'ютерного програмного забезпечення, такого як ВА5ЗТ, ВГА5Т-2, АГІОМ або Медаїїдн (ОМАЗТАК). Фахівці в цій галузі техніки можуть визначити відповідні параметри вирівнювання послідовностей, включаючи алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання по всій довжині порівнюваних послідовностей. У той же час всі використовувані для цілей цього документа відсоткові значення ідентичності амінокислотних послідовностей отримані із застосуванням комп'ютерної програми для порівняння послідовностей АЇ ЇМ-2. Комп'ютерна програма для порівняння послідовностей АЇІ05М-2 розроблена компанією Сепепіесі, Іпс., а
Зо вихідний код представлений в документації користувача в Бюро з охорони авторських прав
США, Вашингтон, округ Колумбія., 20559, де він зареєстрований відповідно до номера реєстрації авторського права США ТХИ510087. Програма АГІОМ-2 знаходиться у вільному доступі в Сепепіесії, Іпс., Саут-Сан-Франциско, Каліфорнія, або може бути скомпільована з вихідного коду. Програму АГІСМ-2 слід компілювати для застосування в операційній системі
МІХ, включаючи цифрову версію ОМІХ М4. 00. Всі параметри порівняння послідовностей встановлюються програмою АГІСМ-2 і залишаються незмінними.
У ситуаціях, коли АГІСМ-2 використовується для порівняння амінокислотних послідовностей, 90 ідентичності послідовності амінокислот даної амінокислотної послідовності А з або проти даної амінокислотної послідовності В (яка може альтернативно бути виражена як ця амінокислотна послідовність А, яка має або містить певний 95 ідентичності амінокислотної послідовності з або проти цієї амінокислотної послідовності В), розраховується наступним чином: 100 раз на фракцію Х/У, де Х - кількість амінокислотних залишків, порахованих як ідентичні збіги за допомогою програми вирівнювання послідовності АГІСМ-2 в цій програмі вирівнювання А і В, і де У - загальна кількість амінокислотних залишків в В. Буде зрозуміло, що якщо довжина амінокислотної послідовності А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності В, 90 ідентичності амінокислотної послідовності А до В не буде відповідати 95 ідентичності амінокислотної послідовності В з А. Якщо не вказано інше, всі значення 95 ідентичності амінокислотної послідовності, використовувані в цьому документі, отримують, як описано в безпосередньо попередній частині, використовуючи комп'ютерну програму АГІСМ-2.
Використовуваний в цьому документі термін "введення" означає спосіб введення дози сполуки (наприклад, анти-МЕСЕ антитіла по винаходу, кон'югата антитіла по винаходу, злитого білка даного винаходу, полімерної композиції винаходу, або нуклеїнової кислоти, що кодує анти-
МЕСЕ антитіло даного винаходу) або композиції (наприклад, фармацевтичну композицію, наприклад фармацевтичну композицію, що включає анти-МЕСЕ антитіло даного винаходу, кон'югат антитіла по винаходу, злитий білок по винаходу або полімерну композицію по винаходу) суб'єкту. Композиції, які використовуються в описаних в цьому документі способах, можуть бути введені, наприклад, інтравітреально (наприклад, шляхом інтравітреальної ін'єкції), очними краплями, внутрішньом'язово, внутрішньовенно, інтрадермально, черезшкірно, внутрішньоартеріально, внутрішньоочеревно, внутрішньовогнишньо, внутрішньочерепно, бо внутрішньосуглобово, внутрішньопростатно, внутрішньоплеврально, внутрішньотрахеально,
інтратекально, інтраназально, вагінально, інтраректально, місцево, внутрішньопухлинно, перитонеальному, підшкірно, субкон'юнктивно, інтравезикулярно, слизисто, інтраперикардіально, внутрішньопуповинно, внутрішньоочно, інтраорбітально, орально, місцево, трансдермально, шляхом інгаляції, шляхом ін'єкції, шляхом імплантації, шляхом інфузії, шляхом безперервної інфузії, безпосередньо локалізованими перфузійними ваннами клітин-мішеней, катетером, лаважем, кремами або ліпідними композиціями. Композиції, які використовуються в описаних в цих документах способах, також можуть вводитися системно або локально. Спосіб введення може варіюватися в залежності від різних факторів (наприклад, з'єднання, яке вводиться, або композиції і тяжкості стану, захворювання або розлади, які піддаються лікуванню). "Ангіогенез" відноситься до процесу, за допомогою якого нові кровоносні судини формуються з раніше існуючих кровоносних судин. Ангіогенез відрізняється від васкулогенезу, який є утворенням де помо ендотеліальних клітин з попередників клітин мезодерми. Розлади, пов'язані з патологічним ангіогенезом, можуть бути піддані лікуванню композиціями і способами даного винаходу. Ці розлади включають як неопластичні порушення, так і клітинні проліферативні розлади. Клітинні проліферативні розлади включають, але не обмежуються перерахованими нижче. Не-неопластичні розлади включають, але не обмежуються ними, окулярні стани (не обмежуючі окулярні стани включають, наприклад, ретинопатію, включаючи проліферативну діабетичну ретинопатію, хоріоїдальну неоваскуляризацію (СММ), дегенерацію жовтої плями пов'язану з віком (АМО), діабетичну і інші пов'язані з ішемією ретинопатії, діабетичний макулярної набряк (ОМЕ), патологічну короткозорість, хворобу фон Хиппель-Ліндау, гістоплазмоз ока, оклюзію вени сітківки (включаючи центральні (СКМО) і розгалужені (ВКМО) форми), неоваскуляризацію рогівки, неоваскуляризацію сітківки, ретинопатію недоношених (ВОР), родинну ексудативну вітреоретинопатію (РЕМ), хворобу Коутса, хворобу Норрі, синдром остеопорозу і псевдогліому (ОРРО), субкон'юЮюнктивальний крововилив, рубеоз, неоваскулярне захворювання очей, неоваскулярну глаукому і гіпертонічну ретинопатію), аутоїмунні захворювання (наприклад, ревматоїдний артрит (РА), псоріаз, анкілозуючий спондиліт і запальне захворювання кишечника (наприклад, хвороба Крона і виразковий коліт)), небажану або аберрантну гіпертрофію, артрит, псоріатичний артрит, псоріатичні бляшки,
Зо саркоїдоз, атеросклероз, атеросклеротичні бляшки, артеріальний артеріосклероз, судинний рестеноз, артеріовенозні мальформації (АММ), менінгіому, гемангіому, ангіофіброму, гіперплазію щитовидної залози (включаючи хворобу Грейва), трансплантацію рогівки та іншої тканини, запалення легенів, гостру травму легені/гГРДС, сепсис, первинну легеневу гіпертензію, злоякісні виділення з легень, набряк головного мозку (наприклад, пов'язаний з гострим інсультом/закритій травмі голови/травми), синовіальне запалення, формування паннуса в РА, осцифікуючий міозит, утворення гіпертропних кісток, остеоартрит (ОА), рефрактерний асцит, полікістозну хворобу яєчників, ендометріоз, 3-й інтервал флюїдних захворювань (панкреатит, синдром міжфасціального простору, опіки, захворювання кишечника), хронічну астму, міому матки, передчасні пологи, хронічне запалення, таке як ІВО (хвороба Крона і виразковий коліт), запальні захворювання нирок (включаючи гломерулонефрит, особливо месангіопроліферативний гломерулонефрит, гемолітичний уремічний синдром, діабетична нефропатія та гіпертонічний нефросклероз), захворювання, що виникають після трансплантації, відторгнення алотрансплантату нирок, запальні захворювання, нефротичний синдром, небажаний або аберантний ріст маси тканини (не ракові), гемофільні суглоби, гіпертрофічні рубці, інгібування росту волосся, синдром Ослера-Вебера, ретролетальну фіброплазію піогенної гранульоми, склеродермію, трахому, судинні спайки, синовіт, дерматит, прееклампсію, асцит, випіт перикарду (наприклад, пов'язаний з перикардитом) і плевральний випіт. Додаткові окулярні розлади описані нижче.
Інші розлади, які можуть бути пов'язані з патологічним ангіогенезом, включають в себе незрощення переломів (переломи, які не загоюються), піогенну гранульому, трахому, гемофілічну артропатію, судинні спайки і гіпертрофічні рубці, відторгнення трансплантата, фіброваскулярну тканину, акне розацеа, синдром набутого імунного дефіциту, оклюзію артерії, атопічний кератит, бактеріальні виразки, хворобу Бехеті, каротидну обструктивну хворобу, хронічне запалення, хронічне відшарування сітківки, хронічний увеїт, хронічний вітрит, зношування контактних лінз, відторгнення трансплантату рогівки, неоваскуляризацію рогівки трансплантата, хворобу Єлеса, епідемічний кератокон'юнктивіт, грибкові виразки, інфекції
Негре5 зітріеєх, інфекції Негре5 2о5іеї, синдроми гіперв'язкості, саркому Капоші, лейкемію, дегенерацію ліпідів, хворобу Лайма, маргінальний кератоліз, виразку Морен, інфекції
МусоБбасіеєгіа, відмінні від прокази, міопію, ямку диска зорового нерва, остеоартрит, хворобу 60 Педжета, парспланіт, пемфігоїд, Ффліктенульозний кон'юнктивіт, поліартеріїт, постлазерні ускладнення, інфекції простіших, еластичну псевдоксантому, птеригій і синдром сухого ока, радіальну кератотомію, ретролетальну фіброплазію, саркоїдоз, склерит, серповидноклітинну анемію, синдром Шегрена, хворобу Старгарта, хворобу Стівена-Джонсона, верхній лімбальний кератокон'юктивіт, сифіліс, системний вовчак, крайову дегенерацію Террієна, токсоплазмоз, травму, оклюзію вен, дефіцит вітаміну А і саркоїдоз Вегенера, небажаний ангіогенез, пов'язаний з діабетом, паразитарне захворювання, аномальне загоєння ран, гіпертрофію після операції, пошкодження або травму, інгібування росту волосся, інгібування овуляції і утворення жовтого тіла, пригнічення імплантації та інгібування розвитку ембріонів в матці.
Використовуваний в цьому документі термін "окулярний розлад" включає будь-який окулярний розлад (також згадується в цьому документі взаємозамінно як "окулярний стан"), пов'язане з патологічним ангіогенезом. Окулярний розлад може характеризуватися зміненою або нерегульованою проліферацією і/або інвазією нових кровоносних судин в структури очних тканин, таких як сітківка або рогівка. Не обмежуючі окулярні розлади включають, наприклад,
АМО (наприклад, волога АМО, суха АМО, проміжна АМО, прогресуюча АМО і географічна атрофія (СА)), дегенерацію жовтої плями, набряк макули, ОМЕ (наприклад, фокальний, нецентральних ЮМЕ і дифузний, пов'язаний з центром ОМЕ), ретинопатію, діабетичну ретинопатію (ОК) (наприклад, проліферативну ОК (РОК), непроліферативну ОК (МРОК) і висотну ОК), інші пов'язані з ішемією ретинопатії, КОР, оклюзію вени сітківки (КМО) (наприклад, центральну (СКМО) і розгалужену (ВКМО) форми), СММ (наприклад, міопічну СММ), неоваскуляризацію рогівки, захворювання, пов'язані з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризацію сітківки, захворювання, пов'язані з ретинальною/хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічну короткозорість, хворобу фон Хиппель-Ліндау, гістоплазмоз ока, ЕЕМК, хворобу Коутса, хворобу Норрі, ОРРО, субкон'юнктивальний крововилив, рубеоз, неоваскулярне захворювання очей, неоваскулярну глаукому, пігментний ретиніт (КР), гіпертонічну ретинопатію, ангіоматозну проліферацію сітківки, макулярну телеангіектазію, неоваскуляризацію зіниці, внутрішньоочну неоваскуляризацію, дегенерацію сітківки, цістоїдний макулярної набряк (СМЕ), васкуліт, папілломедому, ретиніт, кон'юнктивіт (наприклад, інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційний (наприклад, алергічний) кон'юнктивіт, амавроз Лебера (також відомий як вроджений амароз Лебера або І СА), увеїт (включаючи інфекційний і
Зо неінфекційний увеїт), хоріоїдит (наприклад, багатофокальний хоріоїдит), гістоплазмоз ока, блефарит, сухість очей, травматичне пошкодження очей, хвороба Шегрена і інші офтальмологічні захворювання, які відрізняються тим, що захворювання або розлад пов'язані з неоваскуляризацією очей, пропотіванням рідини крізь судини і/або набряк сітківки. Додаткові ілюстративні окулярні розлади включають захворювання, пов'язані з рубеозом (неоваскуляризацію кута) і захворювання, викликані аномальною проліферацією судинно- волокнистої або фіброзної тканини, включаючи всі форми проліферативної вітреоретинопатії.
Ілюстративні захворювання, пов'язані з неоваскуляризацією рогівки, включають в себе, але не обмежуються ними, епідемічний кератокон'юнктивіт, дефіцит вітаміну А, зношування контактних лінз, атопічний кератит, верхній лімбальний кератокон'юктивіт, птеригій і синдром сухого ока, синдром Шегрена, акне розацеа, фліктенульозний кон'юнктивіт, сифіліс, інфекції Мусобасіегіа, ліпідну дегенерацію, хімічні опіки, бактеріальні виразки, грибкові виразки, інфекції Негрев5 вітрієх, інфекції Негре5 2о51ег, інфекції простіших, саркома Капоші, виразка Морена, маргінальна дегенерація Террієна, маргінальний кератоліз, ревматоїдний артрит, системний червоний вовчак, поліартеріїт, травму, саркоїдоз Вегенера, склерит, синдром Стівенса-
Джонсона, перифігоїдну радіальну кератотомію і відторгнення трансплантата рогівки.
Ілюстративні захворювання, пов'язані з ретинальною/хоріоїдальною неоваскуляризацією, включають, але не обмежуються ними, діабетичну ретинопатію, дегенерацію жовтої плями, серповидноклітинну анемію, саркоїдоз, сифіліс, еластичну псевдоксантому, хворобу Педжета, оклюзію вен, оклюзію артерії, каротидну обструктивну хворобу, хронічний увеїт/вітрит, мікобактеріальні інфекції, хворобу Лайма, системний червоний вовчак, ретинопатію недоношених, пігментну дистрофію сітківки, набряк сітківки (включаючи набряк макули), хворобу Єлеса, хворобу Бехчета, інфекції, що викликають ретиніт або хоріоїдит (наприклад, мультифокальні судинні порушення), синдром передбачуваного гістоплазмозу очей, хворобу
Беста (вітеловидна дегенерація жовтої плями), короткозорість, ямки диска зорового нерва, хвороба Старгарта, парспланітит, відшарування сітківки (наприклад, хронічне відшарування сітківки), синдроми гіперв'язкості, токсоплазмоз, травму і ускладнення після лазера. "Розлади, пов'язані з небажаною судинною проникністю", як використовується в цьому документі, включають, наприклад, набряк, пов'язаний з пухлинами головного мозку, асцит, пов'язаний зі злоякісними новоутвореннями, синдром Мейгса, запалення легенів, нефротичний синдром, перикардіальний випіт, плевральний випіт, проникність, пов'язану з серцево- судинними захворюваннями такими як стан після інфарктів міокарда та інсультів тощо.
Слід розуміти, що описані вище класифікації не є взаємовиключними, і розлад може підпадати під декілька категорій.
Терміни "клітинний проліферативний розлад" і "проліферативний розлад" відносяться до розладів, які пов'язані з деяким ступенем аномальної клітинної проліферації. В одному варіанті здійснення винаходу, клітинний проліферативний розлад являє собою рак.
Терміни "рак", "раковий", "клітинний проліферативний розлад", "проліферативний розлад" і "пухлина" не є взаємовиключними, як зазначено в цьому документі. "Пухлина", як використовується в цьому документі, відноситься до всього росту і поширенню пухлинних клітин, будь то злоякісні або доброякісні, і все передракові і ракові клітини і тканини. "Ангіосенним фактором або агентом" є фактор росту, який стимулює розвиток кровоносних судин, наприклад, сприяє ангіогенезу, росту ендотеліальних клітин, стабілізації кровоносних судин і/або васкулогенез і т. д. Наприклад, ангіогенні чинники включають, але не обмежуються ними, наприклад, МЕСЕ і членів сімейства МЕСЕ, РІСЕ, сімейство РОСЕ, сімейство факторів росту фібробластів (ЕСЕ), ліганди ТІЕЄ (ангіопоетина), ефрин, Ое!І-1, фібробласти факторів зростання: кислий (агБот) і основний (БЕОРЕ), фоллістатин, гранулоцитарний колонієсєтимулюючий фактор (5-С5Е), фактор росту гепатоцитів (НОЕР)/фактор розсіювання (ЗЕ), інтерлейкін-8 (1/-8), лептин, мідкін, плацентарний фактор росту, фактор росту ендотеліальних клітин, отриманий з тромбоцитів (РО-ЕСОЕ), фактор росту, отриманий з тромбоцитів, особливо РОСЕ-ВВ або РОСЕЕ-бета, плейотрофін (РТМ), програнулін, проліферін, трансформуючий фактор росту-альфа (ТОоБ-альфа), трансформуючий фактор росту-бета (ТОБ- бета), фактор некрозу пухлини-альфа (ТМЕ-альфа), фактор росту ендотелію судин (МЕСР)/фактор судинної проникності (МРЕ) і т. д. Вони також включають фактори, які прискорюють загоєння ран, такі як гормон росту, інсуліноподібний фактор росту-І (ІСЕ-І), МІСЕ, епідермальний фактор росту (ЕСЕ), СТОБЕ і члени його сімейства, а також ТОоЕ-альфа і ТОБ- бета. Див., наприклад, Кіадзбгип апа С'Атоге, Аппи. Веу. РНузіо!., 53: 217-39 (1991); Зігеїї апа
Оеїтаг, Опсодепе, 22: 3172-3179 (2003); Регтага є Аїйаю, Маїшге Меадісіпе 5 (12): 1359-1364 (1999); Топіпі єї аІ., Опсодепе, 22: 6549-6556 (2003) (наприклад, в таблиці 1 перераховані відомі ангіогенні фактори); і ато, Іпі. У). Сііп. Опсої., 8: 200-206 (2003). "Агент проти ангіогенезу" або "інгібітор ангіогенезу" відноситься до речовини з невеликою молекулярною вагою, полінуклеотиду, поліпептиду, ізольованому білку, рекомбінантному білку, антитіла або кон'югатів або його злитим білкам, який пригнічує ангіогенез, васкулогенез, або небажану судинну проникність, прямо або побічно. Слід розуміти, що агент проти ангіогенезу включає ті агенти, які пов'язують і блокують ангіогенну активність ангіогенного фактора або його рецептора. Наприклад, агент проти ангіогенезу являє собою антитіло або інший антагоніст до ангіогенного агенту, як визначено вище, наприклад антагоністи МЕСЕ (наприклад, антитіла до
МЕСБ-А або до рецептора МЕСБ-А (наприклад, КОК-рецептора або ЕМЙ-1 рецептора)), антагоністи РОСЕ (наприклад, анти-РОСЕК інгібітори, такі як БІ ЕЄЕЕМЕС "м (іматинібу мезилат)).
Агенти проти ангіогенезу також включають нативні інгібітори ангіогенезу, наприклад ангіостатин, ендостатин і т. д. Див., наприклад, Кіадзбгип апа С'Атоге, Аппи. Неу. РНузіо!., 53: 217-39 (1991); зігеїї апа Оєсїтаг, Опсодепе, 22: 3172-3179 (2003) (наприклад, в Таблиці З перераховані анти- ангіогенні терапії злоякісної меланоми); Реггага 8 АїШаю, Маїйге Медісіпе 5 (12): 1359-1364 (1999); Топіпі єї аІ., Опсодепе, 22: 6549-6556 (2003) (наприклад, в таблиці 2 перераховані відомі антиангіогенні фактори); і Зайо Іпі. 9. СіІй. Опсої., 8: 200-206 (2003) (наприклад, в таблиці 1 перераховані антиангіогенні агенти, які використовуються в клінічних випробуваннях).
Використовуваний в цьому документі термін "антагоніст МЕСЕ" відноситься до молекули, здатної зв'язуватися з МЕСЕ, зменшуючи рівні експресії МЕСЕ або нейтралізуючи, блокуючи, пригнічуючи, анулюючи, зменшуючи або перешкоджаючи біологічної активності МЕСБЕ, включаючи, але не обмежуючись ними, МЕСЕ-зв'язування з одним або більше рецепторами
МЕСЕ, МЕС сигналінг і опосередкований МЕСЕ ангіогенез і виживання або проліферацію ендотеліальних клітин. Наприклад, молекула, здатна нейтралізувати, блокувати, пригнічувати, анулювати, відновлювати або перешкоджати біологічної активності МЕСЕ, може надавати свою дію шляхом зв'язування з одним або більше рецепторами МЕСЕ (МЕСЕК) (наприклад, МЕСЕМКІ,
МЕСЕМК2, МЕСЕКЗ, пов'язаним з мембраною МЕСЕ рецептора (пбуУЕСЕК) або розчиненого рецептора МЕСЕ (5МЕСЕК)). В якості антагоністів МЕОЕ, корисних в способах цього винаходу, виступають поліпептиди, які специфічно зв'язуються з МЕСЕ, антитілом проти МЕСБЕ і їх антигензв'язуючі фрагменти, молекули рецептора і похідні, які специфічно зв'язуються з МЕСЕ, таким чином запобігаючи його зв'язуванню з одним або більше рецепторами, злиті білки 60 (наприклад, МЕСЕ-Тгар (регенерон)) і МЕСЕР:21-гелонін (перегрін). Антагоністи МЕСЕ також включають варіанти антагоністів поліпептидів МЕСЕ, олігомери антисмислових нуклеотидних груп, комплементарні щонайменше фрагменту молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид МЕСЕ; малі РНК, комплементарні щонайменше фрагменту молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид МЕСЕ; рибозими, які націлені на МЕСЕ; пептидні антитіла до
МЕСЕ; і МЕСЕ-аптамери. Антагоністи МЕСЕ також включають поліпептиди, які зв'язуються з
МЕСЕК, антитілами проти МЕСЕК і їх антигензв'язуючими фрагментами, і похідними, які зв'язуються з МЕСЕК, тим самим блокуючи, інгібуючи, анулюючи, зменшуючи або перешкоджаючи біологічній активності МЕСЕ (наприклад, МЕСЕ сигналінг) або злиття білків.
Антагоністи МЕСЕ також включають непептидні малі молекули, які зв'язуються з МЕСЕ або
МЕСЕМК і здатні блокувати, інгібувати, анулювати, зменшувати або заважати біологічної активності МЕСЕ. Таким чином, термін "активність МЕСЕ" конкретно включає в себе МЕСБЕ- опосередковану біологічну активність МЕСЕ. У деяких варіантах здійснення винаходу, антагоніст МЕСЕ знижує або інгібує на щонайменше 10 95, 20 95, 30 95, 40 У, 50 95, 60 бо, 70 95, 80 9, 90 95 або більше, рівень експресії або біологічну активність МЕСЕ. У деяких варіантах здійснення винаходу, УЕСЕ, інгібований специфічним МЕСЕ антагоністом, являє собою МЕСЕ (8-109), МЕСЕЕ (1-109) або МЕС 165.
Використовувані в цьому документі антагоністи МЕСЕ можуть включати, але не обмежуються ними, антитіла проти МЕСЕКЗ і зв'язані з ними молекули (наприклад, рамуцирумаб, танібірумаб, афліберцепт), антитіла проти МЕСЕКІ і пов'язані з ними молекули (наприклад, ікрукумаб, афліберцепт (МЕСЕ Тгар-Еуе; ЕМІЕАФ) і зів-афліберцепт (МЕСЕ Тгар; 2АІЇТКАРФ)), біспецифічні антитіла МЕСЕ (наприклад, МР-0250, вануцизумаб (МЕСЕ-АМО2) і біспецифічні антитіла, описані в О5 2001/0236388), біспецифічні антитіла, включаючи комбінації двох анти-
МЕСБЕ, анти-МЕСЕКІ їі анти-МЕСЕК2 плечі, антитіла проти МЕСЕ (наприклад, бевацизумаб, севацизумаб і ранібізумаб) і антагоністи МЕСЕ з непептгидною малою молекулою (наприклад, пазопаніб, акситиніб, вандетаніб, стиварга, кабозантиніб, ленватиніб, нінтеданіб, орантиніб, телатиніб, довітиніг, цедіраніб, мотесаніб, сульфатиніб, апатиніб, форетиніб, фамітиніб і тівозаніб). Додаткові антагоністи МЕСЕ описані нижче. "Ефективна кількість" агента, наприклад, фармацевтичної композиції, відноситься до кількості, ефективному в дозуваннях і протягом періодів часу, необхідних для досягнення бажаного
Зо терапевтичного або профілактичного результату. "Індивід" або "суб'єкт" являє собою ссавців. Ссавці включають, але не обмежуються ними, домашніх тварин (наприклад, корів, овець, кішок, собак і коней), приматів (наприклад, людей і нелюдських приматів, таких як мавпи), кроликів і гризунів (наприклад, мишей і щурів). У деяких варіантах здійснення винаходу, індивідуум або суб'єкт являє собою людину. "Суб'єкт" може бути "пацієнтом".
Терміни "рак" ії "ракові" відносяться до фізіологічного стану у ссавців або описують їх фізіологічний стан, яке зазвичай характеризується нерегульованим ростом клітин. Приклади раку включають, але не обмежуються ними, карциному, лімфому, бластому, саркому і лейкемію.
Більш конкретні приклади таких раків включають плоскоклітинний рак, дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені, рак шлунково-кишкового тракту, рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчників, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак товстої кишки, колоректальний рак, рак ендометрію, рак слинних залоз, рак нирок, рак нирки, рак передміхурової залози, рак вульви, рак щитовидної залози, гепатокарциному і різні типи раку голови і шиї. "Ссавець" для цілей лікування відноситься до будь-якої тварини, класифікованій як ссавець, включаючи людей, домашніх (Іі сільськогосподарських тварин, нелюдських приматів і тварин зоопарків, спортивних або домашніх тварин, таких як собаки, коні, кішки, корови і т. д. "Розлад" - це будь-який стан, який може бути покращено при лікуванні антитілом. Наприклад, ссавці, які страждають або потребують профілактики від аномального ангіогенезу (надмірний, неадекватний або неконтрольований ангіогенез) або судинної проникності. Це включає хронічні і гострі розлади або захворювання, включаючи ті патологічні стани, які прихиляють ссавців до розладу, який розглядався. Необмежуючі приклади розладів, що підлягають лікуванню, включають в себе розлади, пов'язані з патологічним ангіогенезом (наприклад, окулярні розлади і клітинні проліферативні розлади) і розлади, пов'язані з небажаною проникністю судин.
Термін "протинеопластична композиція" відноситься до композиції, придатної для лікування раку, що містить щонайменше один активний терапевтичний агент, наприклад "протираковий агент". Приклади терапевтичних агентів (протиракових агентів) включають, але обмежуються ними, наприклад, хіміотерапевтичні агенти, агенти інгібітору росту, цитотоксичні агенти, агенти, які використовуються в променевій терапії, агенти проти ангіогенезу, апоптозні агенти, бо протитуберкулінові агенти і інші агенти для лікування раку, такі як антитіла проти НЕК-2, анти-
СбО20-антитіла, антагоніст рецептора епідермального фактора росту (ЕСЕК) (наприклад, інгібітор тирозинкінази), інгібітор НЕКТ/ЕСЕРК. (наприклад, ерлотиніб (ТАКСЕМА "М), інгібітори фактора росту отримані з тромбоцитів (наприклад, С ЕЄЕМЕС "м (іматиніб мезилат)), інгібітор
ЦОГ-2 (наприклад, целекоксиб), інтерферони, цитокіни, антагоністи (наприклад, нейтралізуючі антитіла), які зв'язуються з однією або більше з таких цілей ЕгЬВ2, ЕгОВЗ3, ЕгоВ4, РОСЕК-бета,
Віу5, АРКІЇ, ВСМА або УЕСБЕ, ТКАІАрога і інші біологічно активні та органічні хімічні речовини тощо. Їх комбінації також включені в винахід.
Використовуваний в цьому документі термін "цитотоксичний агент" відноситься до речовини, яка інгібує або запобігає клітинній функції і/або викликає загибель або руйнування клітин.
Цитотоксичні агенти включають, але не обмежуються ними, радіоактивні ізотопи (наприклад,
Ддігт, 31, 25, уво Ве"86, Де88, 53, Віг12, рзг, ррег: і радіоактивні ізотопи І и); хіміотерапевтичні агенти або лікарські засоби (наприклад, метотрексат, адріаміцин, алкалоїди барвінку (вінкристин, вінбластин, етопозид), доксорубіцин, мелфалан, мітоміцин С, хлорамбуцил, даунорубіцин або інші інтеркалюючі агенти); інгібуючі зростання агенти; ферменти і їх фрагменти, такі як нуклеолітичні ферменти; антибіотики; токсини, такі як малі молекулярні токсини або ферментативно активні токсини бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, включаючи фрагменти і/або їх варіанти; і різні протипухлинні або протиракові агенти, описані нижче. "Хіміотерапевтичний агент" являє собою хімічну сполуку, корисне для лікування раку. Приклади хіміотерапевтичних агентів включають хімічні сполуки, корисні для лікування раку. Приклади хіміотерапевтичних агентів включають алкілуючі агенти, такі як тіотепа і циклофосфамід
СУТОХАМЄ); алкілсульфонати, такі як бусульфан, імпросульфан і піпосульфан; азиридин, такі як бензодопа, карбохінон, метуредопа і уредопа; етиленіміни і метиламеламіни, включаючи альтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід і триметилоломеламін; ацетогеніни (особливо буллатацин і буллатацинон); камптотецин (включаючи синтетичний аналог топотекана); бріостатин; каллістатин; СС-1065 (включаючи синтетичні аналоги адозелезину, карцелезину і бізелезину); криптофіцини (зокрема, криптофіцин 1 і криптофіцин 8); доластатин; дуокарміцин (включаючи синтетичні аналоги, КМу- 2189 і СВ1-ТМІ1); елейтеробін; панкратистатин; саркодіктин; спонгістатин; азотисті іприти, такі як
Зо хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамін, гідрохлорид мехлоретамін оксиду, мелфалан, новембічин, фенестерин, преднімусин, трофосфамід, урациловий іприт; нітрозосечовини, такі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин і ранімнустин; антибіотики, такі як ендіїнові антибіотики (наприклад, каліхеаміцин, особливо каліхеаміцин гаммаї! і каліхеаміцин омегаї!! (див., наприклад, Адпем/у, Спет Іпії. Ед. Епаі., 33: 183-186 (1994)); дінеміцин, включаючи дінеміцин А; бісфосфонати, такі як хлодронат; еспераміцин; а також хромофор неокарзиностатина і пов'язані хромофори хромопротеїнів ендіїнових антибіотиків), аклациномізини, актиноміцин, автраміцин, азасерин, блеоміцини, кактіноміцин, карабіцин, карміноміцин, карзинофілін, хромоміцини, дактіноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, б-діазо-5-оксо-Ї-норлейцин, АОКІАМУСІМОе доксорубіцин (включаючи морфоліно-доксорубіцин, цианоморфоліно-доксорубіцин, 2-пірроліно- доксорубіцин і деоксидоксорубіцин), епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцелломіцин, мітоміцини, такі як мітоміцин С, мікофенольна кислота, ногаламіцин, олівоміцини, пепломіцин, потфіроміцин, пуроміцин, келаміцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидін, убенімекс, циностатин, зорубіцин; антиметаболіти, такі як метотрексат і 5-фторурацил (5-Е)); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуринові аналоги, такі як флударабін, б-меркаптопурин, тиаміприн, тіогуанін; піримідинові аналоги, такі як анцитабін, азацитидин, 6б-азаурідін, кармофур, цитарабін, дідезоксіуридин, доксифлуридин, еноцитабін, флоксуридин; андрогени, такі як калустерон, пропіонат дромоностанола, епітіостанол, мепітіостан, тестолактон; антиадренали, такі як аміноглютетимід, мітотан, трилостан; замінник фолієвої кислоти, такої як фролінова кислота; ацеглатон; альдофосфамідглікозид; амінолевулінова кислота; енілурацил; амсакрин; бестрабуцил; бізантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; діазиквон; елфорнітин; еліптиній ацетат; оепотилон; етоглюцид; нітрат галію; гідроксисечовина; лентинан; лонідаїнін; майтансиноїди, такі як майтанин і ансамітоцини; мітогуазон; мітоксантрон; мопіданмол; нітраєрин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; лозоксантрон; подофіллінова кислота; 2- етилгідразид; прокарбазин; полісахаридний комплекс РОКФ (УН5 Маїйшга! Ргодисі5, Юджин,
Орегон); разоксан; різоксин; сизофіран; спірогерманій; тенуазонова кислота; триазиквон; 2,2,27- трихлоротриетиламін; трихотецени (особливо токсин 1-2, верракурін А, роридин А і ангідин); уретан; віндезин; дакарбазин; манномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; 60 арабінозиід ("Ара-С"); циклофосфамід; тіотепи; таксоноїди, наприклад, ТАХОЇ Ф пакситаксел
(ВгізіоІ-Муег5 ЗдпціБр ОпсоіІоду, Прінстон, Нью-Джерсі), АВКАХАМЕ "М без кремофора, альбумін- сконструйована композиція наночастинок з паклітакселу (Атегісап РПагтасеціїса! Рагіпегв5,
Щаумберг, Іллінойс) і доксетаксель ТАХОТЕКЕФ (КПбпе-Роціепс Когег, Ентоні, Франція); хлоранбуцил; СЕМ2АКФ гемцитабін; б-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; платинові аналоги, такі як цисплатин і карбоплатин; вінбластин; платини; етопозид (МР-16); іфосфамід; мітоксантрон; вінкристин; МАМЕЇВІМЕФ вінорелбін; новантрон; теніпозид; едатрексат; дауноміцин; аміноптерин; кселода; ібандронат; іринотекан (Сатріозаг, СРТ-11) (включаючи режим лікування іринотеканом з 5-РО і лейковорином); інгібітор топоїзомерази КЕ5 2000; діфторметилорнітин (ОМЕО); ретиноїди, такі як ретиноєва кислота; капецитабін; комбретастатин; лейковорин (ІМ); оксаліплатин, включаючи режим лікування оксаліплатином (РОГ ЕОХ); інгібітори РКС-альфа, Каї, Н-Ках5, ЕСЕК (наприклад, ерлотиніб (ТАКСЕМА "М)) і
МЕ,Б-А, які зменшують проліферацію клітин і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-якого з вищевказаних.
Також в це визначення включені антигормональні агенти, які діють, щоб регулювати або пригнічувати гормональну дію на пухлини, такі як антиестрогени і селективні модулятори рецепторів естрогенів (ЗЕКМ), включаючи, наприклад, тамоксифен (включаючи тамоксифен
МОГ МАОЕХФ)), ралоксифен, дролоксифен, 4-гідрокситамоксіфен, тріоксифен, кеоксифен,
ЇМ117018, онапристон і БАКЕБТОМФ тореміфен; інгібітори ароматази, які інгібують ферментативну ароматазу, яка регулює вироблення естрогену в надниркових залозах, такі як, наприклад, 4(5)-імідазоли, аміноглютетимід, мегестрола ацетат МЕСА5БЕФ, екземелан
АКОМАБІМФ, форместан, фадрозол, КІМІЗОКФ ворозол, РЕЕМАКАФ летрозол і анастигол
АРІМІОЕХФ;; і антиандрогени, такі як флутамід, нілутамід, бікалютамід, лейпролід і госерелін; а також трокацитабін (аналог 1,3-діоксолан нуклеозидного цитозину); антисмислові олігонуклеотиди, особливо ті, які інгібують експресію генів в сигнальних шляхах, залучених в адренерну проліферацію клітин, такі як, наприклад, РКС-альфа, Каї і Н-Казх; рибозими, такі як інгібітор експресії МЕСЕ (наприклад, рибозим АМОІО2УМЕФ)) і інгібітор експресії НЕК2; вакцини, такі як вакцини генної терапії, наприклад, вакцина АСГГСОМЕСТІМЕ, вакцина ГЕОМЕСТІМО і вакцина МАХІЮОФ; РЕОЇ ЕШКІМФ гі! -2; (ПОКЕТОТЕСАМО інгібітор топоїзомерази 1; АВАКЕГІХФ птн; Вінорелбін і еспераміцини (див. пат. США Мо 4675187) і фармацевтично прийнятні солі,
Ко) кислоти або похідні будь-якого з вищевказаних.
Використовуваний в цьому документі термін "проліки" відноситься до попередника або похідної формі фармацевтично активної речовини, яке менш цитотоксично до пухлинних клітин в порівнянні з вихідним лікарським засобом і може бути ферментативно активовано або перетворено в більш активну батьківську форму. Див., наприклад, Умітап, "Ргодгиде5 іп Сапсег
СпетоїНегару" Віоспетіса! босієїу Ттапзасійопв, 14, рр. 375-382, 615Іп Мевїіпа ВеїГавзі (1986) апа зіеїЇа еї а!., "Ргодгид5: А Спетіса! Арргоасі о Тагдеїед Огид Оеїїмегу, " Оігесівд Огид Овєіїмегу,
Вогснагаї еї а!., (вед.), рр. 247-267, Нитапа Ргезз (1985). Проліки цього винаходу включають, але не обмежуються ними, проліки, що містять фосфат, проліки, що містять тіофосфат, проліки, що містять сульфат, пролікию, що містять пептид, проліки, модифіковані О-амінокислотою, глікозильовані проліки, проліки, що містять р-лактам, необов'язково заміщені проліки, що містять феноксіацетамід, або необов'язково заміщені проліки, що містять фенілацетамід, 5- фторцитозін і інші 5-фторуридинові проліки, які можуть бути перетворені в більш активний цитотоксичний вільний лікарський засіб. Приклади цитотоксичних ліків, які можуть бути дериватизовані в пролікарську форму для використання в цьому винаході, включають, але не обмежуються ними, хіміотерапевтичні агенти, описані вище.
Термін "листок-вкладиш" використовується для позначення інструкцій, зазвичай включаються в комерційні пакети терапевтичних продуктів, які містять інформацію про показання, використання, дозування, введення, комбінованої терапії, протипоказання і/або попередження щодо використання таких терапевтичних продуктів. "Фармацевтично прийнятний носій" відноситься до інгредієнту у фармацевтичній композиції, яка відмінна від активного інгредієнта, яка нетоксична для суб'єкта. Фармацевтично прийнятний носій включає, але не обмежується ними, буфер, ексципієнт, стабілізатор або консервант.
Термін "фармацевтичний склад" відноситься до препарату, який знаходиться в такій формі, щоб забезпечити біологічну активність активного інгредієнта (наприклад, антитіла проти МЕСБЕ, кон'югату антитіла, злитого білка або полімерної композиції), що міститься в ньому, для ефективності, і який не містить додаткових компонентів, які є неприйнятно токсичні для суб'єкта, якому буде вводитися препарат.
Використовуваний в цьому документі, термін "лікування" (і його граматичні варіації, такі як "лікувати" або "лікування") відноситься до клінічного втручання в спробі змінити природній хід 60 лікування індивідуума, і може бути виконано або для профілактики, або під час ходу клінічної
Зо патології. Бажані ефекти лікування включають, але не обмежуються ними, запобігання виникненню або рецидиву захворювання, полегшення симптомів, зменшення будь-яких прямих або непрямих патологічних наслідків захворювання, запобігання метастазів, зниження швидкості прогресування захворювання, поліпшення або ослаблення стану хвороби, ремісія або покращення прогнозу. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіла винаходу або інші композиції, які включають антитіло даного винаходу (наприклад, кон'югат антитіла, злитий білок або полімерну композицію), використовуються для уповільнення розвитку захворювання або уповільнення прогресування захворювання. "Ізольована" молекула нуклеїнової кислоти являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка ідентифікована і відділена від щонайменше однієї молекули нуклеїнової кислоти-забруднювача, з якою вона зазвичай асоціюється в природному джерелі нуклеїнової кислоти. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти відрізняється від форми або конфігурації, в якій вона зустрічається в природі. Таким чином, ізольовані молекули нуклеїнових кислот відрізняються від молекули нуклеїнової кислоти, який вона існує в природних клітинах. Однак ізольована молекула нуклеїнової кислоти включає молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься в клітинах, які зазвичай експресують антитіло, де, наприклад, молекула нуклеїнової кислоти знаходиться в хромосомному положенні, відмінному від положення в природних клітинах.
Вираз "контролюючі послідовності" відноситься до послідовностей ДНК, необхідним для експресії функціонально пов'язаної послідовності, що кодує в конкретному організмі-хазяїні.
Контрольні послідовності, які підходять для прокаріотів, наприклад, включають промотор, необов'язково послідовність оператора і сайт зв'язування рибосом. Відомо, що в еукаріотичних клітинах застосовуються промотори, сигнали поліаденілювання і енхансери.
Нуклеїнова кислота є "функціонально пов'язаною", якщо вона вступає в функціональне взаємовідношення з іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, ДНК предпослідовності або секреторного лідера є функціонально пов'язаною з ДНК поліпептиду, якщо вона експресується як пребілок, який бере участь в секреції цього поліпептиду; промотор або енхансер функціонально пов'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію цієї послідовності, або ділянка зв'язування рибосом функціонально пов'язана з кодуючою послідовністю, якщо вона розташована так, щоб оптимізувати процес трансляції. В
Зо цілому, "функціонально пов'язаний" означає, що послідовності ДНК, будучи пов'язаними, є безперервними і, в разі наявності секреторного лідера, безперервними і в фазі зчитування.
Проте, енхансери не повинні бути безперервними. Зв'язування супроводжується лігуванням по відповідним ділянкам рестрикції. Якщо таких сайтів не існує, синтетичні олігонуклеотидні адаптери або лінкери використовуються відповідно до звичайної практики.
Як використовується в цьому документі, вирази "клітина", "клітинна лінія" і "культура клітин" використовуються як взаємозамінні, і всі такі позначення включають потомство. Таким чином, слова "трансформанти" і "трансформовані клітини" включають в себе первинну клітину індивіда і культури, отримані з неї, без урахування кількості пассажів. Також зрозуміло, що все потомство не може бути точно ідентичним за змістом ДНК через навмисні або ненавмисні мутації. Мутантні потомства, які володіють тією ж функцією або біологічною активністю, що і скриновані в спочатку трансформованій клітині. Там, де призначені різні позначення, це буде зрозуміло з контексту.
Використовуваний в цьому документі термін "бібліотека" відноситься до безлічі антитіл або послідовностей фрагментів антитіла (наприклад, антитіл проти МЕСЕ по винаходу) або нуклеїнових кислот, які кодують ці послідовності, причому послідовності відрізняються одна від одної в комбінації варіантів амінокислот, які вводять в ці послідовності відповідно до способів цього винаходу. "Мутація" являє собою делецію, вставку або заміщення нуклеотиду(ів) відносно встановленої еталонної нуклеотидної послідовності, такий як послідовність дикого типу.
Використовуваний в цьому документі термін "набір кодонів" відноситься до набору різних нуклеотидних триплетних послідовностей, використовуваних для кодування бажаних варіантів амінокислот. Набір олігонуклеотидів може бути синтезовано, наприклад, шляхом твердофазного синтезу, включаючи послідовності, які представляють всі можливі комбінації нуклеотидних триплетів, що надаються набором кодонів, і які будуть кодувати бажану групу амінокислот. Стандартна форма позначення кодонів відноситься до коду ІВ, відомому в цій галузі техніки і описаного в цьому документі. Зазвичай набір кодонів позначений курсивом за допомогою Зх заголовних літер, наприклад, ММК, ММ5, ХМ2, ОМК і т. п. Синтез олігонуклеотидів з обраним нуклеотидним "виродженням" в певних положеннях добре відомий в цій галузі техніки, наприклад, підхід ТЕІМ (Кпаррек еї аї/., 9. Мої. Віої. 296:57-86 (1999)); Са!тага є! а!., бепе 60 128:103(1993)). Такі набори олігонуклеотидів, що мають певні набори кодонів, можуть бути синтезовані з використанням комерційних синтезаторів нуклеїнових кислот (доступні, наприклад, від Арріїей Віозубзіет5, Фостер Сіті, Каліфорнія), або можуть бути отримані комерційно (наприклад, з І їе Тесппоіодіє5х, Роквілль, Меріленд). Отже, набір олігонуклеотидів, синтезованих з конкретним набором кодонів, зазвичай включає в себе безліч олігонуклеотидів з різними послідовностями, відмінності, встановлені набором кодонів в загальній послідовності.
Олігонуклеотиди, використовувані відповідно до винаходу, мають послідовності, які допускають гібридизацію з зразком нуклеїнової кислоти з варіабельною ділянкою, а також можуть, але необов'язково, включати сайти рестрикційних ферментів, придатні, наприклад, для цілей клонування. "Фаговий дисплей" являє собою спосіб, при якому варіантні поліпептиди відображаються у вигляді злитих білків щонайменше на частині білкової оболонки на поверхні фага, наприклад, ниткоподібний фаг, частки. Утиліта фагового дисплея полягає в тому, що великі бібліотеки рандомізованих варіантів білка можуть швидко і ефективно осортуватися для тих послідовностей, які зв'язуються з цільовим антигеном з високою спорідненістю. Відображення бібліотек пептидів і білків на фагові було використано для скринінгу мільйонів поліпептидів для тих, які мають специфічні зв'язуючі властивості. Полівалентні способи фагового дисплея використовувалися для відображення малих випадкових пептидів і малих білків через злиття або з геном І, або з геном МІ! ниткоподібного фага. УМеїї5 апа І ом/лтап, Си. Оріп. Зігисі. Віо!., 3: 355-362 (1992) і посилання, цитовані в ньому. У моновалентному фаговому дисплеї бібліотека білка або пептиду злита з геном Ш або його частиною і експресується на низьких рівнях в присутності білка гена ІЇЇ дикого типу, так що частки фага відображають одну копію або жоден зі злитих білків. Ефекти авідності знижуються в порівнянні з полівалентним фагом, тому сортування засновано на афінності власного ліганда, і використовуються вектори фагемідів, які спрощують маніпуляції з ДНК. Іоултпап апа Умеї5, Меїйод5: А сотрапіоп о Меїнод5 іп
Епгуто!оду, 3:205-0216 (1991). "Фагемід' являє собою плазмідний вектор, який має бактеріальне походження реплікації, наприклад, СО1Е1, і копію міжгенної ділянки бактеріофага. Фагемід можна використовувати на будь-якому відомому бактеріофагу, включаючи філаментний бактеріофаг і лямбдоїдний бактеріофаг. Плазміда також зазвичай буде містити селективний маркер стійкості до
Зо антибіотиків. Сегменти ДНК, клоновані в ці вектори, можуть поширюватися у вигляді плазмід.
Коли клітини, що вкривають ці вектори, забезпечуються всіма генами, необхідними для виробництва фагових часток, спосіб реплікації плазміди змінюється на реплікацію за типом "кільця, що котиться", щоб генерувати копії одного ланцюга плазмідної ДНК і оболонки фагів часток. Фагемід може утворювати інфекційні або неінфекційні частки фага. Цей термін включає в себе фагеміди, які містять ген білка оболонки фага або його фрагмент, пов'язаний з гетерологічним геном поліпептиду в якості гена злиття, так що гетерологічний поліпептид відображається на поверхні фагової частки.
Термін "вектор фага" означає дволанцюгову реплікативну форму бактеріофага, що містить гетерологічний ген і здатний до реплікації. Вектор фага має фагове походження реплікації, що забезпечує реплікацію фага і утворення фагових часток. Фагом переважно є ниткоподібний бактеріофаг, такий як фаг М13, Й, М, РІЗ або його похідне, або лямбдоподібний фаг, такий як лямбда, 21, рпіво, рпів81, 82, 424, 434 і т. д., або його похідне. "Варіант" або "мутант" вихідного або еталонного поліпептиду (наприклад, еталонного антитіла або його варіабельного домену(ів)/НМУК) являє собою поліпептид, який (1) має амінокислотну послідовність, відмінну від амінокислотної послідовності вихідного або еталонного поліпептиду і (2) був отриманий з вихідного або еталонного поліпептиду за допомогою природного або штучного (створеного людиною) мутагенезу. Такі варіанти включають, наприклад, делеції 3, іМабо вставки в, і/або заміни залишків в амінокислотній послідовності поліпептиду, який становить інтерес, позначені в цьому документі як "зміни амінокислотних залишків". Таким чином, варіант НМК відноситься до НМК, який містить варіантну послідовність щодо вихідної або еталонної поліпептидної послідовності (такі як вихідне антитіло або антигензв'язуючий фрагмент). У цьому контексті зміна амінокислотного залишку відноситься до амінокислоти, відмінної від амінокислоти у відповідному положенні у вихідній або еталонній поліпептидній послідовності (таке як еталонне антитіло або його фрагмент). Будь-яка комбінація делеції, вставки і заміни може бути виконана для отримання остаточного варіанту або конструкції мутантів за умови, що кінцева конструкція має бажані функціональні характеристики.
Амінокислотні зміни також можуть змінювати посттрансляційні процеси поліпептиду, такі як зміна кількості або положення сайтів глікозилювання.
Послідовність "дикого типу (ДТ)" або "еталонна" послідовність або послідовність "дикого типу" 60 або "еталонного" білка/поліпептиду, такого як НМА або варіабельний домен еталонного антитіла, може бути контрольною послідовністю з якої варіантні поліпептиди отримують шляхом введення мутацій. Загалом, послідовність "дикого типу" для цього білка є послідовність, яка найбільш поширена в природі. Аналогічно, послідовність гена "дикого типу" являє собою послідовність цього гена, яка найбільш часто зустрічається в природі. Мутації можуть бути введені в ген "дикого типу" (і, отже, білок, який він кодує), або за допомогою природних процесів, або за допомогою штучних способів. Продукти таких процесів є "варіантними" або "мутантними" формами вихідного білка або гена "дикого типу". "Еталонне антитіло", як використовується в цьому документі, відноситься до антитіла або фрагмента, чия антигензв'язуюча послідовність слугує в якості шаблонів послідовності, на якій виконується диверсифікація відповідно до описаних в цьому документі критеріїв.
Антигензв'язуюча послідовність зазвичай включає варіабельну ділянку антитіла, переважно щонайменше один НУЕ, переважно включає каркасні області.
Під "масовим паралельним сіквенуванням" або "масивним паралельним сіквенуванням", також відомим в цій галузі техніки як "сіквенування наступного покоління" або "сіквенування другого покоління", мається на увазі будь-який підхід з високим ступенем пропускної здатності нуклеїнової кислоти. Ці підходи зазвичай включають паралельне сіквенування великої кількості (наприклад, тисяч, мільйонів або мільярдів) просторово розділених, ампліфікованих клонуванням зразків ДНК або одиночних молекул ДНК. Див., наприклад, МеїйКег, Маїиге
Веміем5 Сепеїїсв 11: 31-36, 2010. "Збагачений", як використовується в цьому документі, означає, що сутність (наприклад, зміна амінокислотного залишку) присутня в більш високій частоті в сортованій бібліотеці в порівнянні з відповідною еталонною бібліотекою (наприклад, несортованій бібліотеці або бібліотеці, яка була відсортована для іншого або антигену, що не застосовується). Навпаки, "виснажений" означає, що сутність (наприклад, зміна амінокислотного залишку) присутня в більш низькій частоті в сортованій бібліотеці в порівнянні з відповідною еталонною бібліотекою (наприклад, несортованій бібліотеці або бібліотеці, яка була відсортована для іншого або антигену, що не застосовується). Термін "нейтральний" при використанні щодо способів ідентифікації варіантів амінокислотних залишків означає, що сутність не збагачена і не виснажена, іншими словами, вона присутня приблизно на тій же частоті в сортованій бібліотеці в порівнянні з відповідною
Зо еталонною бібліотекою (наприклад, несортованою бібліотекою або бібліотекою, яка була відсортована для іншого або антигену, що не застосовується).
Під "ізоелектричною точкою (рі)" розуміють рН, при якому молекула (наприклад, білок, такий як антитіло) не несе ніякого електричного заряду, також відомий в цій галузі як "рН (І)» або "ЕР". "
Використовуваний в цьому документі термін "кон'югат антитіла" являє собою антитіло, яке ковалентно приєднано до одного або більше полімерів. Будь-який відповідний полімер може бути кон'югований з антитілом, наприклад гідрофільним полімером (наприклад, гіалуроновою кислотою (НА) або поліетиленгліколем (ПЕГ) або гідрофобним полімером (наприклад, полі(молочно-ко-гліколева кислота) (РІ СА)).
Використовуваний в цьому документі термін "полімер" означає молекулу, яка включає повторювані структурні одиниці (тобто мономери), пов'язані хімічними зв'язками лінійним, круговим, розгалуженим, зшитим або дендримерним способом або їх комбінацією. Полімер може бути синтетичним або природним або їх комбінацією. Слід розуміти, що термін "полімер" охоплює сополімери, які являють собою полімери, які включають два або більше різних мономера. Полімер також може бути гомополімером, який являє собою полімер, який включає тільки мономер одного типу.
Терміни "гіалуронова кислота", "гіалуранон" і "НА", які використовуються в цьому документі як взаємозамінні, належать до полімерного глікозаміноглікану (ЗАС), який містить повторювані дисахаридні ланки М-ацетилглюкозаміна і глюкуронової кислоти. НА являє собою аніонний, несульфатований САС, який можна знайти, наприклад, у позаклітинному матриксі (наприклад, в склоподібному тілі ока), сполучній тканині, епітеліальній і нервовій тканині.
Використовуваний в цьому документі термін "поліетиленгліколь" або "ПЕГ" відноситься до поліефірної сполуки, яка також відома як поліетиленоксид (ПЕО) або поліоксиетилен (ПОЕ) в залежності від його молекулярної маси. ПЕГ може мати структуру Н-У(О-СН2-СНг)-ОН, де п - будь-яке придатне ціле число. ПЕГ може являти собою розгалужений ПЕГ, зірчастий ПЕГ або гребінчастий ПЕГ. ПЕГ може бути, наприклад, тетрамером ПЕГ, гексамером ПЕГ або октамером
ПЕГ.
Використовуваний в цьому документі термін "злитий білок" відноситься до білка, в якому перший пептид, білок або поліпептид, наприклад антитіло (наприклад, антитіло проти МЕСЕ (наприклад, будь-який антитіло проти МЕСЕ, описане в цьому документі, наприклад, 6.31 60 0 ААКК)) безпосередньо або опосередковано пов'язується з другим пептидом, білком або поліпептидом, наприклад, з окулярним зв'язуючим доменом (наприклад, з НА-зв'язуючим доменом). В одному прикладі перший пептид, білок або поліпептид (наприклад, антитіло) може бути пов'язаний з другим пептидом, білююом або поліпептидом (наприклад, окулярним зв'язуючим доменом (наприклад, НА-зв'язуючим доменом)) за допомогою лінкера. В контексті злитих білків терміни "зв'язувати" і "зв'язані" і їх граматичні варіації взаємозамінні з терміном "ковалентно приєднані" і відносяться до прямого або непрямого ковалентного зв'язування (наприклад, пептидного зв'язку) між двома частинами злитого білка. Загалом, злиті білки цього винаходу являють собою злиті білки антитіл. Антитіло може являти собою фрагмент антитіла, наприклад Раб, Раб" або Рар-С. У деяких випадках фрагмент антитіла являє собою ГЕар.
Термін "окулярний зв'язуючий домен" відноситься до пептиду, білку, поліпептиду або їхньому фрагменту, який зв'язується з біологічною речовиною, що знаходиться в оці (наприклад, рогівкою, склоподібним тілом, сітківкою, сітчастим епітелієм сітківки або судинною оболонкою).В якості одного прикладу, в деяких випадках, біологічна речовина, виявлена в оці, являє собою позаклітинний матричний компонент, наприклад, вуглевод (наприклад, заряджений вуглевод (наприклад, глікозаміноглікан)), глікопротеїн (наприклад, фібрилін і оптіцин) або білок (наприклад, колаген (наприклад, колаген І-ХХМІІ, зокрема колаген ЇЇ, колаген ІХ, колаген М, колаген МІ, колаген ХІ і гетеротипічні колагенові фібрили) або інші компоненти позаклітинного матриксу, описані, наприклад, в Ге сої еї аЇ., Еуе 22: 1214-1222, 2008. У деяких випадках компонент позаклітинного матриксу являє собою глікозаміноглікан, наприклад НА або протеоглікан (наприклад, хондроїтинсульфат або сульфат гепарину). В одному прикладі окулярний зв'язуючий домен є зв'язуючим доменом гіалуронової кислоти.
Використовуваний в цьому документі термін "зв'язуючий домен гіалуронової кислоти" або "зв'язуючий домен НА" відноситься до пептиду, білку, поліпептиду або його фрагменту, який зв'язує НА. НА-зв'язуючий домен може бути отриманий з НА-зв'язуючого білка (який також згадується в цій галузі техніки як "гіаладерін"), включаючи, наприклад, ген б стимульованого фактора некрозу пухлин (Т506), ендотеліальний гіалуронановий рецептор лімфатичних судин 1 (ГУМЕ-1), гіалуронановий і протеоглікановий зв'язуючий білок (НАРІ М) 1, НАРІ М2, НАРІМЗ,
НАРІМ4, агрекан, бревікан, нейрокан, фосфакан, версікан, САВб1358, КІАОБ527, стабілін-1, стабілін-2, КНАММ, бактеріальну НА-синтазу і колаген МІ. Інші НА-зв'язуючі білки відомі в цій області. Типові НА-зв'язуючі домени включають в себе зв'язуючі модулі, домени с1 і олігопептиди, багаті на лізин. "Модуль зв'язку" (який також згадується в цій галузі як "домен зв'язку") є структурним доменом, що містить приблизно 100 амінокислот (див., наприклад, Уапод еї аїЇ., ЕМВО .., 13 (23: 286-296;
Мапопвеу 6ї аї., 9. Віої. Снет. 276(25): 22764-22771, 2001; і Віспаеї! еї аї. У. Віої. Снет. 278 (49): 49261-49270, 2003), який зв'язує НА. Типові, не обмежуючі модулі зв'язування включають ті, з таб, 0044, | ММЕ-1, НАРІ МІ, НАРІ М2, НАРІ-М3, НАРІ М4, агрекана, бревікана, нейрокана, фосфакана, версікана, САВб1358, КІАОБ527, стабіліна-1 і стабіліна-2 модулів зв'язування, або їх варіанти. В якості одного з прикладів, модуль зв'язування НА-зв'язуючого білка 15056 може включати амінокислотні залишки 36-128 5056 людини (ОпіРгої Мо доступу РО8066). Варіант модуля зв'язку пов'язує НА і може мати, наприклад, ідентичність щонайменше 80 95 амінокислотної послідовності (наприклад, 80 9, 85 95, 90 Фо, 91 Фо, 92 95, 93 9о, 94 95, 95 Фо, 96 9о, 97 У, 98 У», 99 95 або вищою ідентичністю) до модуля зв'язку дикого типу або еталона, і може включати в себе варіації послідовності, такі як вставки, делеції і заміни (наприклад, консервативні амінокислотні заміни) щодо модуля зв'язування дикого типу або еталона амінокислотної послідовності.
В контексті злитих білків, "лінкер"- може бути пептидом або поліпептидом, який пов'язує (наприклад, ковалентно зв'язує) перший фрагмент (наприклад, антитіло (наприклад, антитіло проти МЕСЕ (наприклад, будь-яке антитіло проти МЕСЕ, описане в цьому документі, наприклад, 6.31 ААКК))) з другим фрагментом (наприклад, окулярним зв'язуючим доменом (наприклад,
НА-зв'язуючим доменом)). Лінкер може включати амінокислотну послідовність будь-якої зручної довжини, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше амінокислотних залишків. У деяких випадках лінкер включає близько 3, близько 4, близько 5, близько 6, близько 7 або близько 8 залишків. У деяких випадках лінкер включає амінокислотну послідовність (0005 (5ЕО ІЮО МО: 61).
Використовуваний в цьому документі термін "гідрогель" відноситься до гідрофільної або амфіфільної полімерної мережі, що складається з гомополімерів або співполімерів, яка нерозчинна через наявність ковалентних хімічних зшивок. Зшивання можуть забезпечувати структуру мережі і фізичну цілісність. Гідрогелі можуть демонструвати термодинамічну сумісність з водою, що дозволяє їм набухати у водних середовищах.
Використовуваний в цьому документі термін "оборотний пролікарський лінкер" означає фрагмент, який приєднаний одним кінцем до біологічно активного фрагмента (наприклад, лікарського засобу, такого як антитіло проти МЕСЕ) через оборотний зв'язок і прикріплений іншим кінцем через постійний зв'язок з носієм (наприклад, гідрогелем), тим самим пов'язуючи біологічно активний фрагмент з носієм. Такі оборотні пролікарські лінкери є такими, що неферментативно гідролізуються, тобто розщеплюється в фізіологічних умовах (наприклад, водним буфером при рнН 7,4, 37 "С) з періодом напіврозпаду від, наприклад, однієї години до дванадцяти місяців. Оборотні зв'язки включають, наприклад, акотили, ацетали, аміди, ангідриди карбонових кислот, складні ефіри, іміни, гідразони, аміди малеїновий кислоти, ортоефіри, фосфаміди, фосфоефіри, складні ефіри фосфосіліла, силілові ефіри, сульфонові ефіри, ароматичні карбамати і їх комбінації. Навпаки, постійні зв'язки є такими, що неферментативно гідролітично розкладаються в фізіологічних умовах (водний буфер при рн 7,4, 37 "С) з періодом напіврозпаду більше дванадцяти місяців. Типові оборотні пролікарські лінкери описані, наприклад, в публікації міжнародної патентної заявки Мо М/О 2014/056923, яка повністю включена в цей опис за допомогою посилання.
Використовуваний в цьому документі термін "кліренс" відноситься до об'єму речовини (наприклад, антитіла проти МЕСЕ, кон'югату антитіла, злитому білку (наприклад, злитому білку
Еаб) або полімерного складу), який видаляється з компартмента (наприклад, очі (наприклад, склоподібного тіла)) в одиницю часу.
Термін "період напіввиведення" відноситься до часу, необхідного для поділу концентрації речовини (наприклад, антитіло проти МЕСЕ, кон'югата антитіла, злитого білка (наприклад, злитого білка Раб) або полімерної композиції), на половину, іп мімо (наприклад, в оці (наприклад, склоподібному тілі)) або іп міїго.
І. КОМПОЗИЦІЇ І СПОСОБИ
Винахід відноситься до нових антитіл, які зв'язуються з МЕСЕ, і до способів отримання і їх використання, наприклад, для діагностичних і терапевтичних цілей. Винахід також відноситься до композицій, які включають антитіла проти МЕСЕ (включаючи будь-яке антитіло проти МЕСБЕ, описане в цьому документі), включаючи кон'югати антитіл, злиті білки і полімерні склади, а також способи їх отримання і їх використання, наприклад, для діагностики та терапевтичного використання. Винахід також відноситься до способів ідентифікації варіантів антитіл з покращеними властивостями, наприклад, з підвищеною афінності зв'язування, стабільністю і/або експресією.
А. Ілюстративні антитіла проти МЕСЕ
В одному аспекті, винахід засновано, зокрема, на антитілах, які специфічно зв'язуються з МЕСЕ.
Антитіла цього винаходу корисні, наприклад, для зменшення ангіогенезу і для лікування або уповільнення прогресування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом (наприклад, окулярними розладами або клітинними проліферативними порушеннями). Антитіла цього винаходу також корисні, наприклад, для інгібування проникності судин і лікування розладів, пов'язаних з небажаною проникністю судин.
У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ може включати щонайменше один, два, три, чотири, п'ять або шість НМК, обраних з: (а) НМЕА-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУ/ЛН (ЗЕБЕО 10 МО: 1); (Б) НМВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОХІТРХ»СаХз х 4аХ5уХвО5МХ» х в (ЗЕО ІЮ МО: 2), де Х: являє собою Де або Ні, Хг2 являє собою Аїйа або Аго, Хз являє собою Туг або І уз, Х. являє собою Тпг або Сім, Хо являє собою Аго, Туг, СіІп або СІМ, Хв являє собою Аїа або Сім, Х7 являє собою І ух або Сім, а Хв являє собою сіу або Си; (С) НМА-
НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРРМАМОМ (ЗЕО ІЮ МО: 3); (4) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність КАБОХІМЗТАМА (ЗЕО ІЮО МО: 4), де Хі являє собою Азр або Аго; (є) НМА-12, що містить амінокислотну послідовність Х'АЗЕЇ 5 (ЗЕО ІЮ МО: 5), де Хі являє собою бег або Меї; і () НМВ-І3, що містить амінокислотну послідовність Х:0С МОаХ»РЕТ
БО (ЗЕО ІО МО: 6), де Хі являє собою Сп, Азп або ТНг і Хо являє собою Аа, Азп, Сіп або Агуд або комбінацію одного або більше з вищевказаних НМК і одного або більше його варіантів, що мають щонайменше близько 80 95 ідентичності послідовності (наприклад, 81 95, 82 95, 83 95, 84 оо, 85 95, 86 95, 87 95, 88 95, 89 9, 90 9, 91 о, 92 95, 93 У, 94 95, 95 У, 96 Фо, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичності) будь-якої з БЕО ІЮ МО: 1-6.
Наприклад, антитіло проти МЕСЕ може включати щонайменше один, два, три, чотири, п'ять або шість НУК, обраних з: (а) НМЕА-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМІН (ЗЕО І МО: 1); (В) НМА-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОПІТРАСОСУТКУАОЗМУКО (5ЕО ІО МО: 7),
СІТРАССМЕУМАЮЗУКО (ЗЕО ІЮО МО: 21) або ОІІТРАСОУЕМУАОЗМЕС (5ЕО ІЮ МО: 22); (с) НМЕ-
НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРРМАМОМ (ЗЕО ІЮ МО: 3); (4) НМК-І1, що (510) містить амінокислотну послідовність КАБОЮМ5ТАМА (5ЕО ІО МО: 8); (є) НМВ-І2, що містить амінокислотну послідовність БАРІ! 5 (5ЕБО ІЮ МО: 9); і () НМАК-І3З, що містить амінокислотну послідовність О0ОСУСАРЕТ (ЗЕО ІЮО МО: 10) або ООСУСМРЕТ (5ЗЕО І МО: 23), або комбінацію одного або більше з вищевказаних НМК і одного або більше його варіантів, що мають щонайменше близько 80 95 ідентичності послідовності (наприклад, 81 95, 82 95, 83 90, 84 95, 8590, 86 У, 87 9о, 88 Зо, 89 9о, 90 Зо, 91 9о, 92 Зо, 93 Уо, 94 ую, 95 90, 96 бо, 97 У, 98 9о або 99 95 ідентичності) будь-якої з зЗЕО ІЮО МО: 1, 3, 7-10 або 21-23.
Наприклад, у деяких випадках антитіло проти МЕСЕ може включати щонайменше один, два, три, чотири, п'ять або шість НМК, обраних з: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМН (5ЕБО ІЮ МО: 1); (5) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність аптРАССУТАМАОЗУКа (5ЕО ІО МО: 7); (с) НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність
ЕМЕРГРМАМОМ (5ЕО 10 МО: 3); (4) НМВ-Ї71, що містить амінокислотну послідовність
ВАБОЮМУ5ТАМА (5ЕО ІО МО: 8); (е) НУВ-І2, що містить амінокислотну послідовність ЗАБЕЗ (ЗЕО ІЮ МО: 9); і (3 НМА-І3, що містить амінокислотну послідовність О0ОСУСАРЕТ (5ЕО ІЮ МО: 10), або комбінацію одного або більше з вищевказаних НМК і одного або більше його варіантів, що мають щонайменше близько 80 95 ідентичності послідовності (наприклад, 81 95, 82 Ов, 83 9, 84 95, 85 У, 86 бо, 87 95, 88 95, 89 У, 90 95, 91 95, 92 У, 93 У, 94 95, 95 95, 96 У, 97 Уо, 98 96 або 99 95 ідентичності) до будь-якої з 5ЕО ІЮ МО: 1, З або 7-10. У конкретному прикладі в деяких випадках антитіло проти МЕСЕ містить наступні шість НМК: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМІН (ЗЕ ІО МО: 1); (Б) НМЕ-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОІІТРАССУТКУАОЗМУКО (5ЕО ІО МО: 7); (с) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІРМАМОМ (5ЕБЕО 10 МО: 3); (4) НМВ-І1, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (БО ІЮ МО: 8); (є) НМК-1І2, що містить амінокислотну послідовність БАЗРЇ УЗ (ЗЕБО ІЮО МО: 9); ї () НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність
ООСУСАРЕТ (ЗЕО ІО МО: 10).
У деяких випадках будь-яка з попередніх анти-МЕСЕ антитіл може включати один, два, три або чотири з наступних каркасних ділянок варіабельного домену важкого ланцюга (ЕК): (а) ЕК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕМОЇ МЕБОСОІЇ МОРООБІ КІ ЗСААБОНЕТІЗ (5ЕБО ІЮ МО: 13); (5) ЕВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність МЛ/КОАРОКОЇ ЕМУМА (ЗЕО ІЮ МО: 14); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТЗКМТАМ ОМЕА5І КАЕОТАМУУСАК
Зо (ЗЕО ІО МО: 15); і (4) ЕБК-НА4, що містить амінокислотну послідовність МОСТІ МТУ (ЗЕО І
МО: 16).
У деяких випадках будь-яка з попередніх анти-МЕСЕ антитіл може включати один, два, три або чотири з наступних ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕК-Ї1, що містить амінокислотну послідовність ОЮМТО5РББІ БАЗМООКМТІТС (БО ІЮ МО: 17); (Б) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність МІМООКРОКАРКІ ІМ (5ЕБО ІО МО: 18); (с) ЕК-І3, що містить амінокислотну послідовність ЗМРОКЕЗОБОЗСОСТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕБААТУМС (5ЕО ІЮО МО: 19); ї (4) ЕК-І 4, що містить амінокислотну послідовність ЕБОСТКМЕЇК (ЗЕО ІЮ МО: 20).
Наприклад, в деяких випадках антитіло проти МЕСЕ містить наступні шість НМЕ: (а) НМА-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЮМУМІН (5ЕБО ІО МО: 1); (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОІТРАСОУТКУАОЗМКО (5ЕО ІО МО: 7); (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО І МО: 3); (4) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (ЗЕБО ІЮ МО: 8); (є) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність БАРІ! 5 (5ЕБО ІЮ МО: 9); і () НМАК-І3З, що містить амінокислотну послідовність О0ОСУСАРЕТ (ЗЕО ІЮО МО: 10). У деяких випадках анти-МЕСЕ антитіло включає в себе наступні чотири ЕК варіабельного домену важкого ланцюга: (а) ЕБК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕМОЇ МЕБОСОІ МОРООСБІ КІ ЗСААБОНЕТІЗ (5ЕО ІО МО: 13); (Б) ЕК-
Н2, що містить амінокислотну послідовність М/КОАРОКСОГ ЕММА (ЗЕО ІО МО: 14); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАЮОТ5КМТАМГ ОМЕБІ КАЕОТАМУУСАК (5ЕО ІЮ
МО: 15); і (8) ЕБ-НА, що містить амінокислотну послідовність МОСТІ МТУ55 (5ЕО ІЮ МО: 16).
В інших випадках анти-МЕСЕ антитіло включає наступні чотири ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕК-І1, що містить амінокислотну послідовність
РІОМТО5РБЗБІ БАЗМООВМТІТО (5БО 10 МО: 17); (Б) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність МІМООКРОКАРКІ ІМ (5БО ІО МО: 18); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗУРЗКЕЗОБОБСОСТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕБСААТУМУС (ЗЕО ІЮ МО: 19); ії (4) ЕК-14, що містить амінокислотну послідовність ЕСОСТКМЕЇїК (ЗЕО ІО МО: 20). У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ включає (а) домен УН, що містить амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 11 ї (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12.
Наприклад, у деяких випадках антитіло проти МЕСЕ може включати щонайменше один, два, три, чотири, п'ять або шість НМК, обраних з: (а) НМВАВ-НІ, що містить амінокислотну 60 послідовність ОМУМН (5ЕБЕО ІЮ МО: 1); (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність
Зб
СІТРАВИаМЕММАОЗМЕС (5ЕО ІО МО: 22); (с) НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність
ЕМЕРГРМАМОМ (5ЕО 10 МО: 3); (4) НМВ-Ї71, що містить амінокислотну послідовність
ВАБОЮМУ5ЗТАМА (5ЕО ІО МО: 8); (е) НУВ-І2, що містить амінокислотну послідовність ЗАБЕРЕ УЗ (ЗЕО ІЮ МО: 9); і (І) НМА-І 3, що містить амінокислотну послідовність О0ОСМУСМРЕТ (ЗЕО ІЮ МО: 23), або комбінацію одного або більше з вищевказаних НУК і одного або більше його варіантів, що мають щонайменше близько 80 95 ідентичності послідовності (наприклад, 81 95, 82 Ов, 83 9, 84 95, 85 У, 86 бо, 87 95, 88 95, 89 У, 90 95, 91 95, 92 У, 93 У, 94 95, 95 95, 96 У, 97 Уо, 98 96 або 99 95 ідентичності) до будь-якої з 5ЕО ІЮ МО: 1, 3, 8, 9, 22 або 23. У конкретному прикладі в деяких випадках антитіло проти МЕСЕ містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМІН (ЗЕ ІО МО: 1); (Б) НМЕ-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОІГТРАБОМЕММАОЗМЕС (5ЕО ІЮО МО: 22); (с) НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО 10 МО: 3); (4) НМК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (БО ІЮ МО: 8); (є) НМК-1І2, що містить амінокислотну послідовність БАЗРЇ УЗ (ЗЕБО ІО МО: 9); ї (І) НМАК-І3, що містить амінокислотну послідовність ОбамМаМРЕТ (5ЕО ІЮ МО: 23).
У деяких випадках будь-яке з попередніх анти-МЕСЕ антитіл може включати один, два, три або чотири з наступних каркасних ділянок варіабельного домену важкого ланцюга (ЕВ): (а) ЕВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕЕОЇ МЕЕССОСІ МОРОЕБІ ЕІ ЗСААЗОЕЕБЇ5 (5ЕО ІЮ МО: 29) або ЕЕОЇ МЕЕСОСІ МОРОСЕЗБІ КІ ЗСААЗСОЕЕЇЗ (ЗЕО ІЮ МО: 51); (5) ЕБ-Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСІ ЕММА (5ЕБО ІЮ МО: 30); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТЗЕМТАМІ ОММЕЇГ КАЕОТАМУМУСАК (ЗЕО ІЮ МО: 31); і (а)
ЕВ-НА, що містить амінокислотну послідовність МЗОСЕЇ МТУ5З5 (5ЕО ІО МО: 32).
У деяких випадках будь-яка з попередніх анти-МЕСЕ антитіл може включати один, два, три або чотири з наступних ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕК-Ї1, що містить амінокислотну послідовність ОЮМТО5РББІ БАЗМООКМТІТС (БО ІЮ МО: 17); (5) ЕК-І2, що містить амінокислотну послідовність МІМООКРОКАРКІ ІМ (5ЕБО ІО МО: 18); (с) ЕК-І3, що містить амінокислотну послідовність ЗМРОКЕЗОЗОЗОТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕОБАТУМС (5ЕО ІО МО: 24); і (8) ЕК-1.4, що містить амінокислотну послідовність ЕБОСТКМЕЇК (ЗЕО ІЮО МО: 20).
Наприклад, в деяких випадках антитіло проти МЕСЕ містить наступні шість НМЕ: (а) НМА-НІ, що
Зо містить амінокислотну послідовність ЮМУМІН (5ЕБО ІО МО: 1); (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОІТРАСОУЕУУАОБМЕС (5ЕО ІО МО: 22); (с) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО І МО: 3); (4) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (5БО ІЮ МО: 8); (є) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність БАРІ! 5 (5ЕБО ІЮ МО: 9); і () НМАК-І3З, що містить амінокислотну послідовність ОС0СУСМРЕТ (ЗЕО ІЮО МО: 23). У деяких випадках анти-МЕСЕ антитіло включає в себе наступні чотири ЕК варіабельного домену важкого ланцюга: (а) ЕБК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕЕОЇ МЕЕССОСІ МОРСЕЗБІ ЕІ ЗСААБОРЕЕЇІЗ (5ЕО ІЮО МО: 29); (5) ЕК-
Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСГ ЕММА (ЗЕО ІО МО: 30); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТ5ЕМТАМ ОММЕЇ! КАЕОТАМУУСАК (5ЕО І
МО: 31); ії (4) ЕБ-НА, що містить амінокислотну послідовність МЗОСЕЇ МТУ55 (5ЕО ІЮ МО: 32).
В інших випадках анти-МЕСЕ антитіло включає наступні чотири ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕВ-М, що містить амінокислотну послідовність
РІОМТО5РБЗБІ БАЗМООВМТІТО (5БО 10 МО: 17); (Б) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність МІМООКРОКАРКІ ІМ (5ЕБО ІО МО: 18); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗУРЗКЕЗОБОБСОСТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕОБАТУМС (5ЕБЕО ІЮО МО: 24); і (8) ЕК-14, що містить амінокислотну послідовність ЕСОСТКМЕЇїК (ЗЕО ІО МО: 20). У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ включає (а) домен МУН, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 33 і (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 38.
В деяких випадках антитіло проти МЕСЕ містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМІН (ЗЕ ІО МО: 1); (Б) НМЕ-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОПІТРАСОУЕУУАОЗМЕС (5ЕО ІЮО МО: 22); (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО 10 МО: 3); (4) НМК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (БО ІЮ МО: 8); (є) НМК-1І2, що містить амінокислотну послідовність БАЗРЇ УЗ (ЗЕБО ІЮ МО: 9); ї () НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність
ООСУСМРЕТ (ЗЕО ІО МО: 23). У деяких випадках анти-МЕСЕ антитіло включає в себе наступні чотири ЕК варіабельного домену важкого ланцюга: (а) ЕК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕЕОЇ МЕЕСОСІ МОРСЕЗІ КІ ЗСААБСЕЕЇЗ (ЗЕО ІЮО МО: 51); (б) ЕВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСІ ЕММА (5ЕБО ІЮ МО: 30); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТЗЕМТАМІ ОММЕЇГ КАЕОТАМУМУСАК (ЗЕО ІЮ МО: 31); і (а) 60 ЕВ-Н4, що містить амінокислотну послідовність ММЗОСЕ! МТМ (ЗБО ІО МО: 32). В інших випадках анти-МЕСЕ антитіло включає наступні чотири ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕК-І1, що містить амінокислотну послідовність ОІЮМТО5РБЗБІ БАЗМООКМТІТС (ЗЕО І МО: 17); (Б) ЕВ-12, що містить амінокислотну послідовність УУМООКРОКАРКИ М (5ЕО
ІО МО: 18); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність ОМРЗКЕБОБОЗОСТОРТІТІЗ5 ОРЕОБАТУМС (БО 10 МО: 24); і (0) ЕБК-14, що містить амінокислотну послідовність ЕБЄОСТКМЕЇК (5ЕО ІО МО: 20). У деяких випадках антитіло проти
МЕСЕ включає (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 51 і (б) домен
МІ,, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 38.
Наприклад, у деяких випадках антитіло проти МЕСЕ може включати щонайменше один, два, три, чотири, п'ять або шість НМК, обраних з: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМН (5ЕБЕО ІЮ МО: 1); (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність
СІТРАВИаМЕММАОЗМЕС (5ЕО ІО МО: 22); (с) НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність
ЕМЕРГРМАМОМ (5ЕО 10 МО: 3); (4) НМВ-ІЇ1, що містить амінокислотну послідовність
ВАБОЮМУ5ЗТАМА (5ЕО ІО МО: 8); (е) НУВ-І2, що містить амінокислотну послідовність ЗАБЕРЕ УЗ (ЗЕО ІЮ МО: 9); і (3 НМА-І3, що містить амінокислотну послідовність О0ОСУСАРЕТ (5ЕО ІЮ МО: 10), або комбінацію одного або більше з вищевказаних НУРМ і одного або більше його варіантів, що мають щонайменше близько 80 95 ідентичності послідовності (наприклад, 81 95, 82 Ов, 83 9, 84 95, 85 У, 86 бо, 87 95, 88 95, 89 У, 90 95, 91 95, 92 У, 93 У, 94 95, 95 95, 96 У, 97 Уо, 98 96 або 99 95 ідентичності) до будь-якої з зЕО ІЮ МО: 1, 3, 8-10 або 22. У конкретному прикладі в деяких випадках антитіло проти МЕС містить наступні шість НМК: (а) НМК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМІН (ЗЕ ІО МО: 1); (Б) НМЕ-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОПІТРАСОУЕУУАОЗМЕС (5ЕБЕО ІЮО МО: 22); (с) НМЕА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО 10 МО: 3); (4) НМК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (БО ІЮ МО: 8); (є) НМК-1І2, що містить амінокислотну послідовність БАЗРЇ УЗ (5ЕБО ІО МО: 9); ї (І) НМАК-І3, що містить амінокислотну послідовність
ООСУСАРЕТ (ЗЕО ІО МО: 10).
У деяких випадках будь-яке з попередніх анти-МЕСЕ антитіл може включати один, два, три або чотири з наступних каркасних ділянок варіабельного домену важкого ланцюга (ЕК): (а) ЕК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕЕОЇ МЕЕССОСІ МОРОЕБІ ЕІ ЗСААЗОЕЕБЇ5 (5ЕО ІЮ МО: 29) або ЕЕБЕОЇ МЕЕСОСІ МОРОЕЗБІ КІ ЗСААЗСОЕЕІЇЗ (ЗЕО ІЮ МО: 51); (5) ЕБ-Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСІ ЕММА (5ЕБО ІЮ МО: 30); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТЗЕМТАМІ ОММЕЇГ КАЕОТАМУМУСАК (ЗЕО ІЮ МО: 31); і (а)
ЕВ-НА, що містить амінокислотну послідовність МЗОСЕЇ МТУ5З5 (5ЕО ІО МО: 32).
У деяких випадках будь-яка з попередніх анти-МЕСЕ антитіл може включати один, два, три або чотири з наступних ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність ОІОМТО5РБЗБІБЗАЗМООКМТІТС (5ЕБЕО ІО МОЇ (17),
РІОМТО5РЕЗБІ ЗАЗМОБЕМТІТС (5ЕО ІО МО: 25) або ОІОМТОЗРБЗБІ БАЗМОРЕМТІТС (ЗЕО І
МО: 26); (5) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність М/МООКРОКАРКИЦ ІМ (5ЕО ІЮ МО: 18) або М/УООКРОЕАРКІ ІМ (ЗЕБЕО 10 МО: 27); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність СЗМУРБЗКЕЗОБОЗОТОБЕТІТІЗБІОРЕОААТУУС (5БЕО ОО МО: 19) або
СМРЗКЕЗОБОБОТОЕТІ ТЕЗ ОРЕСААТУМС (ЗЕБО 10 МО: 28); і (0) ЕВ-14, що містить амінокислотну послідовність ЕБЄОСТКМЕЇК (ЗЕО ІЮО МО: 20).
Наприклад, в деяких випадках антитіло проти МЕСЕ містить наступні шість НМЕ: (а) НМА-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЮМУМІН (5ЕБО ІО МО: 1); (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОІТРАСОУЕУУАОБМЕС (5ЕО ІО МО: 22); (с) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО І МО: 3); (4) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (ЗЕБО ІЮ МО: 8); (є) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність ЗАЗРЇ УЗ (З5ЕБО ІО МО: 9); і () НМАК-І3, що містить амінокислотну послідовність О0ОСУСАРЕТ (ЗЕО ІЮО МО: 10). У деяких випадках анти-МЕСЕ антитіло включає в себе наступні чотири ЕК варіабельного домену важкого ланцюга: (а) ЕБК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕЕОЇ МЕЕООСІ МОРСЕЗБІ ЕІ ЗСААБОРЕЇІ5 (5ЕО ІЮО МО: 29); (Б) ЕК-
Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСГ ЕММА (ЗЕО ІО МО: 30); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТ5ЕМТАМ ОММЕГКАЕОТАМУУСАК (5ЕО ІЮ
МО: 31); ії (4) ЕБ-НА, що містить амінокислотну послідовність МЗОСЕЇ МТУ55 (5ЕО ІЮ МО: 32).
В інших випадках анти-МЕСЕ антитіло включає наступні чотири ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕК-І1, що містить амінокислотну послідовність
РІОМТОЗРЕБІ БАЗМООЕМТІТС (5БО 10 МО: 25); (Б) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність МІМООКРОКАРКІ ІМ (5ЕБО ІО МО: 18); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗУРЗКЕЗОБОБСОСТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕБСААТУМУС (ЗЕО ІЮ МО: 19); ії (4) ЕК-14, що 60 містить амінокислотну послідовність ЕСОСТКМЕЇїК (ЗЕО ІЮО МО: 20). У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ включає (а) домен МУН, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 33 і (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 34.
Наприклад, в інших випадках антитіло проти МЕСЕ містить наступні шість НМЕ: (а) НМА-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЮМУМІН (5ЕБО ІО МО: 1); (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОІТРАСОУЕУУАОБМЕС (5ЕО ІО МО: 22); (с) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО І МО: 3); (4) НМВ-І1, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (ЗЕБО ІЮ МО: 8); (є) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність БАРІ! 5 (5ЕБО ІЮ МО: 9); і () НМАК-І3З, що містить амінокислотну послідовність О0ОСУСАРЕТ (ЗЕО ІЮО МО: 10). У деяких випадках анти-МЕСЕ антитіло включає в себе наступні чотири ЕК варіабельного домену важкого ланцюга: (а) ЕБК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕЕОЇ МЕЕССОСІ МОРСЕЗБІ ЕІ ЗСААБОРЕЕЇІЗ (5ЕО ІЮО МО: 29); (5) ЕК-
Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСГ ЕММА (ЗЕО ІЮО МО: 30); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТ5ЕМТАМ ОММЕГКАЕОТАМУУСАК (5ЕО ІЮ
МО: 31); ії (4) ЕБ-НА, що містить амінокислотну послідовність МЗОСЕЇ МТУ55 (5ЕО ІЮ МО: 32).
В інших випадках анти-МЕСЕ антитіло включає наступні чотири ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕК-І1, що містить амінокислотну послідовність
РІОМТО5РБЗБІ БАБМООЕМТІТС (5БО 10 МО: 26); (Б) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність МІМООКРОЕАРКІ ІМ (5ЕБО ІО МО: 27); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗУРЗКЕЗОБОБСОСТОЕТІ ТІЕБ ОРЕБСААТУМС (ЗЕО ІЮ МО: 28); і (4) ЕК-14, що містить амінокислотну послідовність ЕСОСТКМЕЇїК (ЗЕО ІО МО: 20). У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ включає (а) домен МУН, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 33 і (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 35.
Наприклад, в інших випадках антитіло проти МЕСЕ містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЮМУМІН (5ЕБО ІО МО: 1); (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОІТРАСОУЕУУАОБМЕС (5ЕО ІО МО: 22); (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО І МО: 3); (4) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (ЗЕБО ІЮ МО: 8); (є) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність БАЗЕЇ УЗ (БО ІО МО: 9); і (І) НМА-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність О0ОСУСАРЕТ (ЗЕО ІЮО МО: 10). У деяких випадках анти-МЕСЕ антитіло включає в
Зо себе наступні чотири ЕК варіабельного домену важкого ланцюга: (а) ЕБК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕЕОЇ МЕЕОСООІ МОРОЕЗ5І КІ ЗСААЗОЕБЕЇЗ (ЗЕО ІЮ МО: 51); (Б) ЕК-
Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСГ ЕММА (ЗЕО ІО МО: 30); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТ5ЕМТАМ ОММЕГКАЕОТАМУУСАК (5ЕО ІЮ
МО: 31); ії (4) ЕБ-НА, що містить амінокислотну послідовність МЗОСЕЇ МТУ55 (5ЕО ІО МО: 32).
В інших випадках анти-МЕСЕ антитіло включає наступні чотири ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕК-І1, що містить амінокислотну послідовність
РІОМТО5РБЗБІ БАБМООЕМТІТС (5БО 10 МО: 26); (Б) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність МІМООКРОЕАРКІ ІМ (5ЕБО ІО МО: 27); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗУРЗКЕЗОБОБСОСТОЕТІ ТІЕБ ОРЕВААТУМС (ЗЕО ІЮ МО: 28); і (4) ЕК-14, що містить амінокислотну послідовність ЕСОСТКМЕЇїК (ЗЕО ІО МО: 20). У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ включає (а) домен МУН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 51 і (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 35.
Наприклад, в інших випадках антитіло проти МЕСЕ містить наступні шість НМА: (а) НМВА-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЮМУМІН (5ЕБО ІО МО: 1); (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОІТРАСОУЕУУАОБМЕС (5ЕО ІО МО: 22); (с) НМК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО І МО: 3); (4) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (ЗЕБО ІЮ МО: 8); (є) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність БАРІ! 5 (5ЕБО ІЮ МО: 9); і () НМАК-І3З, що містить амінокислотну послідовність О0ОСУСАРЕТ (ЗЕО ІЮО МО: 10). У деяких випадках анти-МЕСЕ антитіло включає в себе наступні чотири ЕК варіабельного домену важкого ланцюга: (а) ЕБК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕЕОЇ МЕЕССОСІ МОРСЕЗБІ ЕІ ЗСААБОРЕЕЇІЗ (5ЕО ІЮО МО: 29); (5) ЕК-
Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСІГ ЕММА (ЗЕО ІО МО: 30); (с) ЕВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТ5ЕМТАМ ОММЕГКАЕОТАМУУСАК (5ЕО ІЮ
МО: 31); ії (4) ЕБ-НА, що містить амінокислотну послідовність МЗОСЕЇ МТУ55 (5ЕО ІЮ МО: 32).
В інших випадках анти-МЕСЕ антитіло включає наступні чотири ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕК-І1, що містить амінокислотну послідовність
РІОМТОЗРЕБІ БАЗМООЕМТІТС (5БО 10 МО: 25); (Б) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність МІМООКРОЕАРКІ ІМ (5ЕБО ІО МО: 27); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗУРЗКЕЗОЗОЗСОТОНЕТІ ТІ ОРЕБААТУМС (5ЕО ІЮ МО: 19); і (4) ЕК-14, що 60 містить амінокислотну послідовність ЕСОСТКМЕЇїК (ЗЕО ІО МО: 20). У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ включає (а) домен МУН, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 33 і (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 36.
Наприклад, в ще інших випадках антитіло проти МЕСЕ містить наступні шість НМЕ: (а) НМА-НІ1, що містить амінокислотну послідовність ЮОМУМН (ЗЕБЕО ІО МО: 1); (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОВІТРАЙСМЕММАОБМЕС (5ЕО ІЮ МО: 22); (с) НМВ-Н3З, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО І МО: 3); (4) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (ЗЕБО ІЮ МО: 8); (є) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність БАРІ! 5 (5ЕБО ІЮ МО: 9); ії (І) НМА-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність О0ОСУСАРЕТ (ЗЕО ІЮО МО: 10). У деяких випадках анти-МЕСЕ антитіло включає в себе наступні чотири ЕК варіабельного домену важкого ланцюга: (а) ЕБК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕЕОЇ МЕЕССОЇ МОРСЕБІ ЕІ ЗСААБОИЕЕЇ5 (5ЕО ІО МО: 29); (Б) ЕВ-
Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСГ ЕММА (ЗЕО ІО МО: 30); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТ5ЕМТАМ ОММЕГКАЕОТАМУУСАК (5ЕО ІЮ
МО: 31); ії (4) ЕБ-НА, що містить амінокислотну послідовність МИЗОСЕЇ МТУ55 (5ЕО ІО МО: 32).
В інших випадках анти-МЕСЕ антитіло включає наступні чотири ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕК-І1, що містить амінокислотну послідовність
РІОМТО5РБЗБІ БАБМООЕМТІТС (5БО 10 МО: 26); (Б) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність МІМООКРОКАРКІ ІМ (5ЕБО ІО МО: 18); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗУРЗКЕЗОБОБСОСТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕБСААТУМУС (ЗЕО ІЮ МО: 19); ії (4) ЕК-14, що містить амінокислотну послідовність ЕСОСТКМЕЇїК (ЗЕО ІО МО: 20). У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ включає (а) домен МУН, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 33 і (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 37.
В інших випадках антитіло проти МЕСЕ містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМІН (ЗЕ ІО МО: 1); (Б) НМЕ-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОПІТРАСОУЕУУАОЗМЕС (5ЕО ІЮО МО: 22); (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО 10 МО: 3); (4) НМК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (БО ІЮ МО: 8); (є) НМК-1І2, що містить амінокислотну послідовність БАЗРЇ УЗ (ЗЕБО ІЮО МО: 9); ї () НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність
ООСУСАРЕТ (5ЕО ІЮ МО: 10). У деяких випадках анти-МЕСЕ антитіло включає в себе наступні
Зо чотири ЕК варіабельного домену важкого ланцюга: (а) ЕК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕЕОЇ МЕЕСОСІ МОРСЕЗІ КІ ЗСААБСЕЕЇЗ (ЗЕО ІЮО МО: 51); (5) ЕБ-Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСІ ЕММА (5ЕБО ІЮ МО: 30); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТЗЕМТАМІ ОММЕСКАЕОТАМУМСАК (ЗЕО ІЮ МО: 31); і (9)
ЕВ-Н4, що містить амінокислотну послідовність ММЗОСЕ! МТМ (5БО ІО МО: 32). В інших випадках анти-МЕСЕ антитіло включає наступні чотири ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕВ-Ї1, що містить амінокислотну послідовність ОІЮМТО5РБЗБІ БАЗМОБЕМТІТС (5ЕО І МО: 26); (б) ЕВ-12, що містить амінокислотну послідовність МУМООКРОКАРКІ ГІМ (ЗЕО
ІО МО: 18); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність
СуРЗАЕЗаБаЗаТОгТІТІЗ5 ОРЕСААТУМС (ЗБО І МО: 19); і (4) ЕБ-14, що містить амінокислотну послідовність ЕБЄОСТКМЕЇК (5ЕО ІО МО: 20). У деяких випадках антитіло проти
МЕСЕ включає (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 51 і (В) домен
МІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 37.
Наприклад, в інших випадках антитіло проти МЕСЕ містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЮМУМІН (5ЕБО ІО МО: 1); (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОІТРАСОУЕУУАОБМЕС (5ЕО ІО МО: 22); (с) НМВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО І МО: 3); (4) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (ЗЕБО ІЮ МО: 8); (є) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність БАРІ! 5 (5ЕБО ІЮ МО: 9); і () НМАК-І3З, що містить амінокислотну послідовність О0ОСУСАРЕТ (ЗЕО ІЮО МО: 10). У деяких випадках анти-МЕСЕ антитіло включає в себе наступні чотири ЕК варіабельного домену важкого ланцюга: (а) ЕБК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕЕОЇ МЕЕСОСІ МОРСЕБІ ЕІ ЗСААЗСЕБЕЇІ5 (ЗЕО ІО МО: 29); (5) ЕВ-
Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСГ ЕММА (ЗЕО ІО МО: 30); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТ5ЕМТАМ ОММЕГКАЕОТАМУУСАК (5ЕО ІЮ
МО: 31); ї (4) ЕК-НА, що містить амінокислотну послідовність МЗОСЕЇ МТУ55 (5ЕО ІО МО: 32).
В інших випадках анти-МЕСЕ антитіло включає наступні чотири ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕК-І1, що містить амінокислотну послідовність
РІОМТО5РБЗБІ БАЗМООВМТІТО (5БО 10 МО: 17); (Б) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність МІМООКРОКАРКІ ІМ (5ЕБО ІО МО: 18); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗУРЗКЕЗОБОБСОСТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕБСААТУМУС (ЗЕО ІЮ МО: 19); ії (4) ЕК-14, що 60 містить амінокислотну послідовність ЕСОСТКМЕЇїК (ЗЕО ІО МО: 20). У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ включає (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 33 і (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12.
В інших випадках антитіло проти МЕСЕ містить наступні шість НМЕ: (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМІН (5ЕБО ІО МО: 1); (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОПІТРАСОУЕУУАОЗМЕС (5ЕО ІЮО МО: 22); (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО 10 МО: 3); (4) НМК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (5ЕБО ІО МО: 8); (є) НМВ-І2, що містить амінокислотну послідовність БАЗРЇ УЗ (ЗЕБО ІЮО МО: 9); ї () НМК-І3, що містить амінокислотну послідовність
ООСУСАРЕТ (5ЕО ІЮ МО: 10). У деяких випадках анти-МЕСЕ антитіло включає в себе наступні чотири ЕК варіабельного домену важкого ланцюга: (а) ЕК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕЕОЇ МЕЕСОСІ МОРСЕЗІ КІ ЗСААБСЕЕЇЗ (ЗЕО ІЮО МО: 51); (5) ЕБ-Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСІ ЕММА (5ЕБО ІЮ МО: 30); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТЗЕМТАМ ОММЕСКАЕОТАМУУСАК (ЗЕО ІО МО: 31); і (0)
ЕВ-Н4, що містить амінокислотну послідовність ММЗОСЕ! МТМ (5БО ІО МО: 32). В інших випадках анти-МЕСЕ антитіло включає наступні чотири ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕК-І1, що містить амінокислотну послідовність ОЮМТО5БРБОБІ БАЗМООРЕМТІТС (5ЕО ІО МО: 17); (б) ЕВ-12, що містить амінокислотну послідовність МУМООКРОКАРКІ ГІМ (ЗЕО
ІО МО: 18); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність
СУРЗКЕЗОБОБОТОБЕТІТІЗБІ ОРЕБСААТУМС (ЗЕБО 10 МО: 19); ії (4) ЕВ-14, що містить амінокислотну послідовність ЕБЄОСТКМЕЇК (5ЕО ІО МО: 20). У деяких випадках антитіло проти
МЕСЕ включає (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 51 і (В) домен
МІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12.
У деяких випадках, анти-МЕСЕ антитіло містить (а) варіабельний домен важкого ланцюга (МН), що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності (наприклад, щонайменше 91 95, 92 95, 93 Фо, 94 9», 95 Фо, 96 9», 97 Фо, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності) або будь-якій з послідовності ФЕО ІЮ МО: 11, 40 або 42; (б) варіабельний домен легкого ланцюга (МІ), що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95 послідовність (наприклад, щонайменше 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 9», 97 У, 98 96 або 99 95 ідентичності послідовності) або будь-який з послідовності зХЕО ІЮО МО: 12, 41 або 46; або (с) домен МН, як в (а), і домен МІ, як в (Б). Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен
МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕБЕО ІО МО: 11 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 12. Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ОО МО: 40 ї домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 12. Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІО МО: 42 ії домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 12. Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 42 ії домен Мі, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 41. Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІО МО: 11 ї домен МІ, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 46.
У деяких випадках будь-яке з попередніх анти-МЕСЕ антитіл може включати один, два, три або чотири з наступних каркасних ділянок варіабельного домену важкого ланцюга (ЕК): (а) ЕК-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕМОЇ МЕЗБОСОІ МОРОСБІ ВІ БСААБОИЕТІБЗ (5ЕО ІЮ МО: 13); (Б) ЕВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОАРОКОЇ ЕМУМА (5ЕО ІЮ МО: 14) або МЛММКОЕРОКОЇ ЕМУМА (ЗЕО ІЮО МО: 39); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність
ЕЕТІЗАОТЗКМТАМІ ОМеЕ5І КАЕОТАМУУСАК (БО 10 МО: 15); і (4) ЕВ-Н4, що містить амінокислотну послідовність МЗОСТІ МТУ (5ЕБО ІЮ МО: 16).
У деяких випадках будь-яка з попередніх анти-МЕСЕ антитіл може включати один, два, три або чотири з наступних ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕК-Ї1, що містить амінокислотну послідовність ОІОМТОЗРЗБІБЗАЗМООКМТІТС (ЗЕБО 10 МО: 17) або
РІОМТО5РБЗБІ БАЗМОИОВМТІОС (5ЕБО 10 МО: 45); (Б) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність МІМООКРОКАРКІ ІМ (5ЕБО ІО МО: 18); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність СМРЗКЕЗОБОЗОТОНЕТІ ТІЗ5І ОРЕОААТУХС (ЗЕО ІО МО: 19),
СМРЗКЕЗОБОБОТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕОБАТУУС (ЗЕО ІО МО: 44) або
СУРЗКЕЗОБОБОТОБЕТІТІЗБІ ОРЕЮОМАТУМС (ЗЕБО 10 МО: 54); і (й) ЕБ-14, що містить амінокислотну послідовність ЕБОСТКМЕЇК (ЗЕО ІЮ МО: 20) або ЕСОСТКМЕМК (ЗЕО ІО МО: 55).
Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕ 10 МО: 11 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність
РІОМТО5РБОБІ БАБМАО ВМТ СВАБОВУЗТАМАМУУООКРОКАРКІ ПУЗАЗЕЇ У5аУРЗАЕЗОБИа 60 СТОР ТІ ОРЕОМАТУУСООС,ТСИМРЕТЕРИСОСТКМЕЇК (ЗЕО ІО МО: 59).
Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен МН, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 33 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність
ІОМТО5РБОБІ БАБМООВМТІТСВАБОВОМ5ТАМАМУ МООКРОКАРКІ ГПІМЗАБЕІ У50МРОВЕЗО5О5
СТОР ТІ ОРЕОМАТУУСООСС,МСИМРЕТЕРСОСТКМЕЇК (5ЕО І МО: 59).
Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен МН, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 40 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність
ІОМТО5РББІ БАБМООВМТІТСВАБОВОМ5ТАМАМУ МООКРОКАРКИІ ІМ5А5БЕЇ У5БИУРОВЕбОБО5
СТОР ТІ ОРЕОМАТУУСООСС,ТСИМРЕТЕРСОСТКМЕЇК (5ЕО І МО: 59).
Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен МН, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 42 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність
ІОМТО5РБОБІ БАБМООВМТІТСВАБОВОМЗТАМАММООКРОКАРКІ ГІМ5АБРЕІ БО УРОНЕбО5О5
СТОР ТІ ОРЕОМАТУУСООСС,ТСИМРЕТЕРСОСТКМЕЇК (5ЕО І МО: 59).
Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен МН, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 51 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність
ІОМТО5РБОБІ БАБМООВМТІТСВАБОВОМ5ТАМАМУ МООКРОКАРКІ ГПІМЗАБЕІ У50МРОВЕЗО5О5
СТОР ТІ ОРЕОМАТУУСООСС,ТСИМРЕТЕРСОСТКМЕЇК (5ЕО І МО: 59).
Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен МН, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 11 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність
ІОМТО5РБОБІ БАБМООВМТІТСВАБОВОМ5ТАМАМУ МООКРОКАРКІ ГПІМЗАБЕІ У50МРОВЕЗО5О5
СТОР ТІ ОРЕОМАТУУСООСУСАРЕТЕРИ,ОСТКУМЕЇК (ЗЕО ІО МО: 60).
Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен МН, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 33 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність
ІОМТО5РБОБІ БАБМООВМТІТСВАБОВОМ5ТАМАМУ МООКРОКАРКІ ГПІМЗАБЕІ У50МРОВЕЗО5О5
СТОР ТІ ОРЕОМАТУУСООСУСАРЕТЕРИ,ОСТКУМЕЇК (ЗЕО ІО МО: 60).
Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен МН, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 40 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність
ІОМТО5РБОБІ БАБМООВМТІТСВАБОВОМ5ТАМАМУ МООКРОКАРКІ ГПІМЗАБЕІ У50МРОВЕЗО5О5
СТОР ТІ ОРЕОМАТУУСООСУСАРЕТЕРИ,ОСТКУМЕЇК (ЗЕО ІО МО: 60).
Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен МН, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 42 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність
ІОМТО5РБОБІ БАБМООВМТІТСВАБОВОМ5ТАМАМУ МООКРОКАРКІ ГПІМЗАБЕІ У50МРОВЕЗО5О5
СТОР ТІ ОРЕОМАТУУСООСУСАРЕТЕРИ,ОСТКУМЕЇК (ЗЕО ІО МО: 60).
Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен МН, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 51 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність
ІОМТО5РБОБІ БАБМООВМТІТСВАБОВОМ5ТАМАМУ МООКРОКАРКІ ГПІМЗАБЕІ У50МРОВЕЗО5О5
СТОР ТІЗБІ ОРЕОМАТУМСООСМСИАРЕТЕСОСТКМЕЇК (5ЕО ІЮ МО: 60). Наприклад, в деяких випадках антитіло проти МЕСЕ містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності (наприклад, щонайменше 91 95, 92 9, 93 9, 94 Фо, 95 95, 96 Фо, 97 Уо, 98 90 або 99 95 ідентичності послідовності) або послідовності ЗЕО
ІО МО: 11; (В) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовність (наприклад, щонайменше 91 95, 92 95, 93 95, 94 9о, 95 9о, 96 Фо, 97 Фо, 98 95 або 99 95 ідентичність послідовності) або послідовність ЗЕО ІЮ МО: 11; або (с) домен МН, як в (а), і домен МІ, як в (Б). У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ може включати (а) НМА-НІ1, що містить амінокислотну послідовність ЮОМУМН (ЗЕБЕО ІО МО: 1); (Б) НМК-Н2, що містить амінокислотну послідовність ОІТРАСОУТКУАОЗМКО (5ЕО ІО МО: 7); (с) НМА-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРІГРМАМОМ (5БО І МО: 3); (4) НМК-І1, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМЗТАМА (ЗЕБО ІЮ МО: 8); (є) НМК-І2, що містить амінокислотну послідовність ЗАЗРЇ 5 (5ЕБО ІЮ МО: 9); і () НМАК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність ОСС У(ЗАРЕТ (ЗЕО ІЮ МО: 10). У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ включає наступні каркасні ділянки важкого ланцюга: (а) ЕК-НІ1, що містить амінокислотну послідовність
ЕМО! МЕЗССІ МОРОЗІ ВІЗСААБОЕТІВ (5БО 10 МО: 13); (5) БЕВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОАРОКОЇ ЕММА (5ЕБО ІЮ МО: 14); (с) ЕК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІЗАОТЗКМТАМІ ОМАКБІ КАЕОТАМУУСАК (ЗЕО ІЮО МО: 15); і (а)
ЕВ-Н4, що містить амінокислотну послідовність УМЗОСТІ МТМ (БО ІО МО: 16). У деяких випадках анти-МЕСЕ антитіло включає наступні каркасні ділянки легкого ланцюга: (а) ЕК-І1, що містить амінокислотну послідовність ОІОМТО5РББІ БАЗМООМКМТІТС (5ЕО ІО МО: 17); (Б) ЕК-12, що містить амінокислотну послідовність МІМООКРОКАРКІ ІМ (ЗЕБО ІО МО: 18); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність ЗМРОКЕЗОБОЗСОСТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕБААТУМС (5ЕО ІЮО МО: 19); і (а) ЕК-14, що містить амінокислотну послідовність ЕБОСТКМЕЇК (ЗЕО ІЮО МО: 20). У деяких бо випадках антитіло проти МЕСЕ включає зв'язуючий домен, що містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕБО ІЮО МО: 11 ї (Б) домен Мі, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12. У деяких випадках ілюстративний анти-МЕСОЕ являє собою
МО4А.ЕГВЗА.Мвганв.х588.
В деяких випадках антитіло проти МЕСЕ містить (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності (наприклад, щонайменше 9196, 9295, 9395, 9495, 9590, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичності послідовності) або послідовності ЗЕО ІЮО МО: 33 або 51; (б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95 послідовність (наприклад, щонайменше 91 95, 92 95, 93 Уо, 94 Фо, 95 965, 96 9», 97 Фо, 98 95 або 99 95 ідентичність послідовності) або послідовність будь-якої з ЗЕО ІЮ МО: 12, 34, 35, 36, 37 або 38; або (с) домен УН, як в (а), і домен МІ, як в (Б). Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен УН, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 33 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 12. Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен УН, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 33 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 34. Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен УН, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 33 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 35. Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен УН, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 33 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 36. Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен УН, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 33 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО І МО: 37. Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен УН, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 33 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 38. Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен УН, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 51 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 38. Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен УН, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 51 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 35. Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен УН, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮО МО: 51 і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 37. Наприклад, в деяких випадках антитіло містить домен УН, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 51 і
Ко) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12.
У деяких випадках будь-яке з попередніх анти-МЕСЕ антитіл може включати один, два, три або чотири з наступних каркасних ділянок варіабельного домену важкого ланцюга (ЕК): ЕВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕЕОЇ МЕЕООСІ МОРСЕБІ ЕІ ЗСААБОРЕЕЇЗ (ЗЕО ІЮ МО: 29) або ЕЕБОЇ МЕЕСОСсІ МОРСЕБІ КІ ЗСААБСОЕЕБІ!В (5БО 10 МО: 52); (Б) ЕК-Н2, що містить амінокислотну послідовність М//КОЕРСЕСГ ЕММА (5ЕО ІЮО МО: 30) або М/КОЕРСОСКОЇ ЕМУМА (ЗЕБЕО ІО МО: 39); (с) Ев-НЗ, що містить амінокислотну послідовність
КЕТІБАОТЗЕМТАМІ ОММЕГ КАЕОТАМУУСАК (БО ІО МО: 31); ії (4) ЕК-Н4, що містить амінокислотну послідовність МЗОСЕЇ МТУ (ЗЕО ІЮ МО: 32).
У деяких випадках будь-яка з попередніх анти-МЕСЕ антитіл може включати один, два, три або чотири з наступних ЕК варіабельного домену легкого ланцюга: (а) ЕК-Ї71, що містить амінокислотну послідовність ОІОМТО5РБЗБІБЗАЗМООКМТІТС (5ЕБЕО ІО МОЇ (17),
РІОМТО5РЕБІ ЗБАЗБМООЕМТІТС (ЗЕБЕО ІЮ МО: 25) або ОІОМТО5РБ5ОБІ БАЗМООЕМТІТС (5ЕО І
МО: 26); (5) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність М/МООКРОКАРКИЦЇ ІМ (5ЕО ІЮ МО: 18) або М/УООКРОЕАРКІ ІМ (ЗЕБЕО 10 МО: 27); (с) ЕК-ІЗ, що містить амінокислотну послідовність СМРУОУКЕБОБОБОТОЕТІ ТІЗБІ ОРЕОААТУХС (ЗЕО ІО МО: 19),
СМРОНЕБаБаватТоОгТтІ ТІ ОРЕОБАТУМС (5ЗЕО ІО МО: 24) або
СМРОКЕЗОЗО5СОСТОБЕТІТІЕБ ОРЕСААТУУС (5БО ІО МО: 28); і (4) ЕК-14, що містить амінокислотну послідовність ЕБЄОСТКМЕЇК (ЗЕО ІЮО МО: 20).
У деяких випадках винахід забезпечує антитіло, що містить (а) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 48 і/або (Б) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 50. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло являє собою 6.31 ААКК, яке експресоване в форматі Раб.
У деяких випадках винахід забезпечує антитіло, що містить (а) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 49 і/або (р) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 50. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло являє собою варіант версії (56.31 ААКК, яка не володіє реакційною здатністю до анти-людському до.
У наступному аспекті анти-МЕСЕ антитіло відповідно до будь-якого з вищенаведених варіантів здійснення винаходу може включати будь-яку з ознак, окремо або в комбінації, як описано в розділах 1-8 нижче: бо 1. Афінність антитіл
У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло, представлене в даному документі, має константу дисоціації (Ка) х 1 мкМ, х 100 НМ, «: 1О НМ, 1 НМ, 0,1 НМ, х 0,01 нМ або х 0,001 нм (наприклад, 109 М або менше, наприклад, від 109 М до 1073 М, наприклад від 107 М до 10-73 М).
Наприклад, в деяких випадках антитіло, представлене в цьому документі, зв'язує МЕСЕ людини (НМЕСБЕ) з Ка близько 10 нМ або нижче. У деяких випадках антитіло, представлене в цьому документі, зв'язує ПМЕСЕ з Ка близько 5 нМ або нижче. У деяких випадках антитіло, представлене в цьому документі, зв'язує ПМЕОЕ з Ка близько 2 нМ або нижче. Наприклад, в деяких випадках антитіло зв'язує ПМЕСЕ з Ка між близько 25 пМ і близько 2 нМ (наприклад, близько 25 пМ, близько 50 пМ, близько 75 пМ, близько 100 пМ, близько 125 пМ, близько 150 пМ, близько 175 пМ, близько 200 пМ, близько 225 пМ, близько 250 пМ, близько 275 пМ, близько 300
ПМ, близько 325 пМ, близько 350 пМ, близько 375 пМ, близько 400 пМ, близько 425 пМ, близько 450 пМ, близько 475 пМ, близько 500 пМ, близько 525 пМ, близько 550 пМ, близько 575 пМ, близько 600 пМ, близько 625 пМ, близько 650 пМ, близько 675 пМ, близько 700 пМ, близько 725
ПМ, близько 750 пМ, близько 775 пМ, близько 800 пМ, близько 825 пМ, близько 850 пМ, близько 875 пМ, близько 900 пМ, близько 925 пМ, близько 950 пМ, близько 975 пМ, близько 1 нМ, близько 1,1 нМ, близько 1,2 НМ, близько 1,3 НМ, близько 1,4 НМ, близько 1,5 НМ, близько 1,6 нМ, близько 1,7 нМ, близько 1,8 нМ, близько 1,9 нМ або близько 2 нМ). У деяких випадках антитіло зв'язує ПМЕСЕ з Ка між близько 75 пМ і близько 600 пМ (наприклад, близько 75 пМ, близько 100
ПМ, близько 125 пМ, близько 150 пМ, близько 175 пМ, близько 200 пМ, близько 225 пМ, близько 250 пМ, близько 275 пМ, близько 300 пМ, близько 325 пМ, близько 350 пМ, близько 375 пМ, близько 400 пМ, близько 425 пМ, близько 450 пМ, близько 475 пМ, близько 500 пМ, близько 525
ПМ, близько 550 пМ, близько 575 пМ, близько 600 пМ). У деяких випадках антитіло зв'язує
ЯМЕСЕ з Ка між близько 75 пМ і близько 500 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує ПМЕСЕ з Ка між близько 75 пМ і близько 400 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує НМЕСЕ з Ка між близько 75 пМ і близько 300 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує ПМЕСЕ з Ка між близько 75 пМ і близько 200 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує ПМЕСЕ з Ка між близько 75 пМ і близько 150 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує ПМЕСЕ з Ка між близько 75 пМ і близько 125 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує ПМЕСЕ з Ка між близько 75 пМ і близько 100 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує ПМЕСЕ з Ка близько 80 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує ПМЕСЕ з Ка близько 60 пМ. У деяких випадках антитіло зв'язує НМЕСЕ з Ка близько 40 пМ.
В одному варіанті здійснення винаходу, Ка вимірюється за допомогою радіоактивно міченого антигензв'язуючого аналізу (КІА).В одному варіанті здійснення винаходу, КІА виконують з Еар- версією антитіла, яке цікавить, і його антигену. Наприклад, афінність зв'язування розчину Бар для антигену вимірюється шляхом врівноваження Раб з мінімальною концентрацією (7251)- міченого антигену в присутності титрованої серії неміченого антигену, а потім захоплення зв'язаного антигену чашкою, покритої анти-Рар антигеном (див., наприклад, Спеп еї аї., У. Мо).
Віої. 293:865-881(1999)). Щоб встановити умови для аналізу, багатоямкові планшети
МІСКОТІТЕКФ (Тпегто зЗсіепійіс) покривають протягом ночі 5 мкг/мл вловлюючим антитілом проти Рабр (Сарреї І абз) в 50 мМ карбонату натрію (рн 9,6) і потім блокують 2 95 (маса/об'єм) бичачого сироваткового альбуміну (В5А) в натрій-фосфатному буфері (РВ5) протягом двох- п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23 "С). В неадсорбуючому планшеті (Мипс Ж 269620), 100 пМ або 26 пм Г5Ц-антиген змішують з серійними розведеннями Рар, що представляють інтерес (наприклад, відповідно до оцінки антитіла проти МЕСЕ, Рар-12, в Ргезіа еі а!І., Сапсег Рез. 57: 4593-4599 (1997)). Потім Раб, що представляє інтерес, інкубують протягом ночі; однак інкубація може тривати протягом більш тривалого періоду (наприклад, близько 65 годин), щоб забезпечити досягнення рівноваги. Після цього суміші переносяться на захоплюючому планшеті для інкубації при кімнатній температурі (наприклад, протягом однієї години). Потім розчин видаляють, і планшет промивають вісім разів 0,1 95 Полісорбатом 20 (ТМ/ЕЕМ-20Ф) в РВ5. Коли планшети висушують, додають 150 мкл/ямка сцинтіллянта (МІСВОБСІМТ-207М, РасКага) та планшети підраховують на гама-лічильнику ТОРСОШМТ М (РасКага) протягом десяти хвилин. Концентрації кожного Раб, які дають менш ніж або рівні 20 95 максимального зв'язування, обирають для використання в аналізах конкурентного зв'язування.
Згідно з іншим варіантом здійснення винаходу, Ка вимірюється з використанням аналізатора поверхневого плазмонного аналізу ВІАСОКЕФ). Наприклад, аналіз з використанням ВІАСОКЕФ- 2000 або ВІАСОКЕ Ф-3000 (ВіАсоге, Іпс., Піскатуей, Нью-Джерсі) проводиться при 25 С за допомогою імобілізованих антигенів СМ5 в - 10 одиницях відповіді (КШ). В одному варіанті здійснення винаходу, карбоксиметильовані чіпи біодеструктором декстрану (СМ5, ВІАсоге, Іпс.) активуються М-етил-М"- (З-диметиламінопропіл)-карбодіімідгідрохлорідом (ЕОС) і М- гідроксісукцинімідом (МН) відповідно до інструкцій постачальника. Антиген розбавляють 10 мМ 60 ацетатом натрію, рН 4,8, до 5 мкг/мл (- 0,2 мкМ) перед ін'єкцією зі швидкістю потоку 5 мкл/хв,
щоб отримати близько 10 одиниць відповіді (КО) зв'язаного білка. Після ін'єкції антигена вводять 1М етаноламіну для блокування непрореагувавших груп. Для кінетичних вимірів дворазові серійні розведення Раб (0,78 нМ до 500 нМ) ін'єктують в РВ5 за допомогою 0,05 95 поверхнево-активної речовини полісорбату 20 (ТУМЕЕМ-20 М) (РВ5Т) при 25 С зі швидкістю потоку приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (Ког) і швидкості дисоціації (Кох) розраховуються з використанням простої індивідуальної моделі прив'язки Ленгмюра (ВІАСОКЕФ Емаїцчайоп зопПмаге версії 3.2) шляхом одночасної установки сенсорних діаграм асоціації і дисоціації.
Константа рівноважної дисоціації (Ка) розраховується як відношення Кок/Коп. Див., наприклад,
СНнеп еї аї., У. Мої. Віої. 293: 865-881 (1999). Якщо швидкість потоку перевищує 106 М" с" методом поверхневого плазмонного резонансу вище, то швидкість потоку може бути визначена з використанням методу флуоресцентного гасіння, який вимірює збільшення або зменшення інтенсивності флуоресцентного випромінювання (збудження - 295 нм, емісія - 340 нм, смуга пропускання 16 нм) при 25 С 20 нМ антиантигенного антитіла (Гар-форма) в РВ5, рН 7,2, в присутності зростаючих концентрацій антигену, виміряних на спектрометрі, такому як обладнаний стоп-потоком спектрофотометр (Амім Іпбзігитепіє) або спектрофотометр ЗІ М-
АМІМСО "М серії 8000 (Тпеппозресігопіс) з кюветою, яка перемішується. 2. Стабільність антитіл
Винахід забезпечує антитіла з підвищеною стабільністю, наприклад, у порівнянні з антитілом проти МЕСЕ, наприклад (036.31 (див., наприклад, Патент США Мо 7758859 і Публікацію міжнародної заявки Мо УМО 2005/012359, які включені в цей опис за допомогою посилання у всій їх повноті). Стабільність антитіла може бути визначена з використанням будь-якого методу, відомого в цій галузі, наприклад, диференціальної скануючої флуориметрії (О5БЕ), кругового дихроїзму (СО), внутрішньої флуоресценції білка, диференціальної скануючої калориметрії, спектроскопії, світлорозсіювання (наприклад, динамічного розсіювання світла (01 5) і статичного розсіювання світла (51.5), само-взаємодіюча хроматографія (5ІС). Антитіло проти МЕСЕ може мати, наприклад, підвищену температуру плавлення (Тт), температуру агрегації (Таг)у або інші показники стабільності в порівнянні з антитілом проти МЕСЕ, наприклад 6.31.
У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло, представлене в цьому документі, має Тт, яка більше ніж або дорівнює близько 80 "С (наприклад, близько 81 "С, близько 82 "С, близько 83 "С,
Ко) близько 84 "С, близько 85 С, близько 86 "С, близько 87 "С, близько 88 "С, близько 89 с, близько 90 "С, близько 91 "С, близько 92 "С або близько 93 "С). Наприклад, в деяких випадках, антитіло проти МЕСЕ має Тт, яке більше ніж або дорівнює близько 83,5 "С (наприклад, близько 83,5 "С, близько 84 "С, близько 85 "С, близько 86 "С, близько 87 "С, близько 88 "С, близько 89 С, близько 90 "С, близько 91 "С, близько 92С або близько 93 С). У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ має Тт від близько 82 до близько 92 "С (наприклад, близько 82 С, близько 83 "С, близько 84 "С, близько 85 "С, близько 86 С, близько 87 "С, близько 88 С, близько 89 "С, близько 90 "С, близько 91 "С або близько 92 "С). У деяких прикладах анти-МЕСЕ антитіло має Тт близько 82 "С. У деяких випадках будь-яке з попередніх значень Тт антитіла проти МЕСЕ визначають з використанням О5Е. У деяких варіантах здійснення винаходу, значення Тт антитіла проти МЕСЕ визначають, як описано в цьому документі, наприклад, в прикладі 1. 3. Фрагменти антитіл
У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло, представлене в цьому документі, являє собою фрагмент антитіла. Фрагменти антитіла включають, але не обмежуються ними, фрагменти Раб, Раб, Раб-С, РарД5Н, Е(аб)», Ем і зом і інші фрагменти, описані нижче. Для огляду деяких фрагментів антитіл див. Ниазоп еї аї., Маї. Мед. 9:129-134 (2003). Для огляду 5сЕм-фрагментів див., наприклад, Рійскіпйп, в Те РІагтасоїоду ої Мопосіопа! Апіїродіев5, мої. 113, Возеприга апа Мооге еавз., Зргіпдег-Мепад, Мем мок, рр. 269-315 (1994); див. також УМО 93/16185; і патенти США Мо 557894 і 5587458. Для обговорення фрагментів Раб і Е(аб)», що містять залишки епітопів, що зв'язують рецептор зв'язування, і мають збільшений період напіввиведення іп мімо, див. патент США Мо 5660146.
Діатіла являють собою фрагменти антитіл з двома антигензв'язуючими сайтами, які можуть бути двовалентними або біспецифічними. Див., наприклад, ЕР 404097; МО 1993/01161; Нидзхоп еї а!., Маї. Мед. 9:129-134 (2003); і Ноїїїпдег еї аї., Ргос. Маї)!. Асад. бсі. ОБА 90: 6444-6448 (1993).
Триатіла і тетратіла також описані в публікації Ниазоп еї аї., Маї. Мед. 9:129-134 (2003).
Однодоменні антитіла являють собою фрагменти антитіл, які повністю або частково містять варіабельний домен важкого ланцюга або повністю або частково містять варіабельний домен легкого ланцюга антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу, однодоменне антитіло являє собою однодоменне антитіло людини (ЮБотапіїв, Іпс., Уолт, Массачусетс, див., наприклад, 60 патент США Мо 6248516 В1).
Фрагменти антитіл можуть бути отримані різними способами, включаючи, але не обмежуючись ними, протеолітичну перетравлення інтактного антитіла, а також продукування рекомбінантними клітинами-хазяями (наприклад, Е. соїї або фагом), як описано в даному документі. 4. Химерні і гуманізовані антитіла
У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло, представлене в цьому документі, являє собою химерне антитіло. Деякі химерні антитіла описані, наприклад, в патенті США Мо 4816567; і Могтізоп еї аї., Ргос. Май. Асад. сі. ОБА, 81: 6851-6855 (1984). В одному прикладі химерне антитіло містить нелюдську варіабельну ділянку (наприклад, варіабельний домен, отриманий від миші, щура, хом'яка, кролика або не людини, наприклад мавпи) і константний домен людини.
В іншому прикладі химерне антитіло являє собою антитіло з "класом перемикання", в якому клас або підклас був змінений від класу вихідного антитіла. Термін "химерні антитіла" включає антигензв'язуючі фрагменти таких антитіл.
У деяких варіантах реалізації химерне антитіло є гуманізованим антитілом. Як правило, нелюдське антитіло гуманізується для зниження імуногенності у людей, зберігаючи при цьому специфічність і афінність батьківського нелюдського антитіла. Як правило, гуманізоване антитіло містить один або більше варіабельних доменів, в яких НУК, наприклад СОЕ. (або їхні частини), отримують з нелюдського антитіла, і ЕМ (або їхні частини) отримують з послідовностей антитіл людини. Гуманізоване антитіло необов'язково також буде містити щонайменше частину константної ділянки людини. У деяких варіантах здійснення винаходу, деякі ЕВ-залишки в гуманізованому антитілі заміщені відповідними залишками від нелюдського антитіла (наприклад, антитіло, з якого отримані НМК-залишки), наприклад, для відновлення або поліпшення специфічності антитіл або афінності.
Гуманізовані антитіла і способи їх отримання розглядаються, наприклад, в АїЇтадго апа
Екгапвзоп, Егопі. Віозсі. 13: 1619-1633 (2008), і далі описані, наприклад, в Кіесптапп еї аї., Маїшге 332: 323-329 (1988); Ойееп вї аї., Ргос. Маї! Асад. 5сі. ОБА 86: 10029-10033 (1989); патенти США
Мо 5821337, 7527791, 6982321 і 7087409; Казптігі еї аІ., МеїШоаз 36: 25-34 (2005) (описує специфічність, яка визначає щеплення ділянки (50К)); Радіап, Мої. Іттипої!. 28: 489-498 (1991) (описує "зміну поверхні"); баІгАсдпа еї а!., Меїйоа5 36: 43-60 (2005) (описує "переміщення ЕК"); і
Зо О5рошт еї а!., Меїйоа» 36: 61-68 (2005) і Кіїтка еї аї., Вг. У. Сапсег, 83: 252-260 (2000) (описує підхід "відбору, який підганяється" до переміщення ЕК).
Каркасні ділянки людини, які можуть бути використані для гуманізації, включають, але не обмежуються ними: каркасні ділянки, обрані з використанням методу "найкращої відповідності" (див., наприклад, Зіт5 еї аї., У. ІттипоїЇ. 151: 2296 (1993)); каркасні ділянки, отримані з консенсусної послідовності людських антитіл конкретної підгрупи варіабельних ділянок легкого або важкого ланцюга (див., наприклад, Сагіег еї аї., Ргос. Маї)!. Асад. 5сі. США, 89: 4285 (1992); і
Ргезіа еї аї., 9. Іттипої., 151: 2623 (1993)); людські зрілі (соматично мутовані) каркасні ділянки або каркасні ділянки зародкової лінії людини (див., наприклад, АІтадго апа Егап55оп, Егопі.
Віозсі. 13: 1619-1633 (2008)); і каркасні ділянки, отримані зі скринінгу ЕК-бібліотек (див., наприклад, Васа еї аї., У. Віої. Снет. 272:10678-10684 (1997) і Козок еї аї., 9. Віої. Снет. 271: 22611-22618 (1996)). 5. Антитіла людини
У деяких варіантах реалізації винаходу антитіло, запропоноване в цьому документі, являє собою антитіло людини. Людські антитіла можуть бути отримані з використанням різних методів, відомих в цій галузі техніки. Антитіла людини описані в загальних рисах в мап біЇК і мап де М/іпКеї, Си. Оріп. Рнаптасої. 5: 368-74 (2001) і Гопрего, Сцт. Оріп. Іттипої. 20:450-459 (2008).
Людські антитіла можуть бути отримані шляхом введення імуногена трансгенній тварині, яку було модифіковано для отримання інтактних людських антитіл або інтактних антитіл з варіабельними ділянками людини у відповідь на антигенну стимуляцію. Такі тварини зазвичай містять всі або частину локусів імуноглобулінів людини, які замінюють ендогенні локуси імуноглобулінів, або які присутні поза хромосом, або інтегруються випадковим чином в хромосоми тварини. Як правило, у таких трансгенних мишей інактивовані ендогенні локуси імуноглобулінів. Огляд способів отримання антитіл людини з трансгенних тварин див. в І опрега,
Маї. Віоїесп. 23:1117-1125 (2005). Див. також, наприклад, патенти США Мо 6075181 та 6150584, що описують технологію ХЕМОМОИБЕ М; патент США Ме 5770429, що описує технологію
НИМАВФ); патент США Мо 7041870, що описує технологію К-М МОШЗЕФ,, і публікацію патентної заявки США Мо 05 2007/0061900, що описує технологію МЕГОСІМОИЗЕФ)). Варіабельні ділянки людини з інтактних антитіл, які продукуються такими тваринами, можуть бути додатково 60 модифіковані, наприклад, шляхом комбінування з іншою константною ділянкою людини.
Людські антитіла також можуть бути отримані за допомогою заснованих на гібридомі методах.
Описані клітинні лінії людської мієломи і мишачо-людської гетеромієломи для виробництва людських моноклональних антитіл. (Див., наприклад, Ко2рог у). Іттипої., 133: 3001 (1984);
Вгодешцг єї аїЇ., Мопосіопа! Апіїбоду Ргодисіп Тесппідне5 апа Арріїсайоп5, рр. 51-63 (Магсеї!
ОекКкКег, Іпс., Мем/ МогК, 1987); і Воегпег еї аї., У. Іттипої., 147: 86 (1991).) Антитіла людини, отримані за допомогою технології на основі В-клітинної гібридоми людини, також описані в Гі єї аІ.,, Ргос. Маї. Асад. 5сі. ОБА, 103: 3557-3562 (2006). Додаткові способи включають ті, які описані, наприклад, в патенті США Мо 7188926 (описує отримання моноклональних антитіл людини ІДМ з клітинних ліній гібридоми) і Мі, Хіапдаї Міапуїхие, 26 (4): 265-268 (2006) (з описом гібридом людина-людина). Технологія на основі гібридоми людини (Тгіота (есппоЇоду) також описана в статтях МоПтег5 апа Вгапаїйеїп, НіхіоІоду апа Нізіораїйо!іоду, 20 (3): 927-937 (2005) і
МоїІтег5 апа Вгапаїєїп, Меїнодз апа Ріпаїпд5 іп Ехрегітепіа! апа Сіїпіса! Рнаптасоїіоду, 27 (3): 185-91 (2005).
Антитіла людини також можна отримати шляхом ізолювання послідовностей варіабельного домену му-клона, обраних з бібліотек фагового дисплея людського походження. Такі послідовності варіабельного домену потім можна об'єднувати з бажаними константними доменами людини. Методики відбору антитіл людини з бібліотек антитіл описано нижче. 6. Антитіла, отримані з бібліотек
Антитіла відповідно до цього винаходу можна виділити шляхом скринінгу комбінаторних бібліотек на предмет антитіл з бажаною активністю або активностями. Наприклад, в цій галузі відомі різні способи для створення бібліотек відображення фагів і скринінгу таких бібліотек на антитіла, що володіють бажаними характеристиками зв'язування. Такі методи розглядаються, наприклад, в Ноодепроот еї аї., Меїйод5 іп МоїІесшаг Віоіоду 178: 1-37 (О'"Віїєп єї а!., Ед., Нитап
Ргев55, Тоїсула, МУ, 2001) і далі описані, наприклад, в МсоСайегіу еї аїЇ., Маїшге 348: 552-554; Сіасквоп еї аї., Майте 352: 624-628 (1991); Магкз еї аї., у. Мої. Віоі. 222: 581-597 (1992); Магк5 апа Вгадригу, іп Меїнодз5 іп Моїесшіаг Віоіоду 248:161-175 (10, єд., Нитап Ргев5, Тоїожа, МУ, 2003); Біани єї аї., у). Мої. Вісі. 3938(2): 299-310 (2004); І ее еї аї., У. Мої. Віої. 340(5): 1073-1093 (2004); РеПоизе, Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 101(34)3: 12467-12472 (2004); і І ее еї аї., У. Іттипої.
Меїтоаз 284(1-2): 119-132(2004).
Зо У деяких методах фагового дисплея, репертуари МН і Мі-генів окремо клонуються полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР) і безладно рекомбінуються в фагових бібліотеках, які потім можуть бути піддані скринінгу на антигензв'язуючий фаг, як описано в Уміптег еї аї., Апп.
ВеуУ. Іттипої., 12: 433-455 (1994). Фаг зазвичай відображає фрагменти антитіла у вигляді одноланцюгових Ем-фрагментів (5СЕм) або Рар-фрагментів. Бібліотеки з імунізованих джерел забезпечують високоафінні антитіла до імуногену без необхідності створення гібридом.
Альтернативно, наївний репертуар може бути клонований (наприклад, від людини), щоб забезпечити єдине джерело антитіл до широкого спектру несамостійних, а також самостійних антигенів без будь-якої імунізації, як описано сгіййние еї а, ЕМВО у, 12: 725-734 (1993).
Нарешті, наївні бібліотеки можна також отримати шляхом синтезу, клонуючи сегменти М-генів стовбурових клітин, які не піддавалися перебудові, і використовуючи ПЛР-праймери, що містять випадкові послідовності, для кодування гіперваріабельної ділянки СОКЗ і здійснення реаранжирування іп міїго, як описано в статті Ноодепроот апа Уміпіег, У. Мої. Віої!., 227: 381-388 (1992). Патентні публікації, в яких описані фагів бібліотеки антитіл людини, включають, наприклад: Патент США Мо 5750373 і публікації патенту США Мо 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 і 2009/0002360.
Антитіла або фрагменти антитіл, виділені з бібліотек людських антитіл, вважаються людськими антитілами або фрагментами людського антитіла в цьому документі. 7. Мультиспецифічні антитіла
У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло, представлене в цьому документі, являє собою мультиспецифічне антитіло, наприклад біспецифічне антитіло. Мультиспецифічними антитілами є моноклональні антитіла, які мають зв'язуючу специфічність щонайменше для двох різних сайтів. У деяких варіантах здійснення винаходу, одна зі специфічних характеристик зв'язування представлена для МЕСЕ, а інша для будь-якого іншого антигену (наприклад, друга біологічна молекула, наприклад інтерлейкін-ї бета (1-18), інтерлейкін-б (І/-6); рецептор інтерлейкіну-б (ІІ -6К), інтерлейкін-13 (1-13), рецептор 1-13 (1 -13Е), РОСЕ (наприклад, РОСЕ-
ВВ); ангіопоетин; ангіопоетин 2 (Апо2), Тів2, ЗІР, інтегрини амВ3, амр5 ї а5р1, бетацеллюлін, апелін/"АРУ; еритропоетин; фактор комплементу ОЮ; ТМЕа, НІгА1; рецептор МЕСЕ (наприклад,
МЕСЕМ1, МЕСЕНК2, МЕСЕКЗ, мембрано-пов'язаний МЕСЕ-рецептор (ПОМЕСЕК) або розчинний рецептор МЕСЕ (5МЕСЕК)), рецептор 5-2; і білки, генетично пов'язані з ризиком вікової бо макулярної дегенерації (АМО), такі як компоненти комплементу шляху С2, фактор В, фактор Н,
СЕНЕКЗ, СЗБ, С5, Сба і СЗа; НІГА1; АКМ52, ТІМРЗ, НГА, інтерлейкін-8 (І1/-8), СХЗСВІ1, ТІ ВЗ,
ТІК4, СЕТР, ПІРС, СОЇ 1ОАТ1 і ТМЕКЗБЕТОА. Відповідно, біспецифічне антитіло може мати специфічність зв'язування для УЕСЕ і І -1рф; МЕС і 1-6; МЕСБЕ і 1-6Е; МЕС і 1-13; МЕСЕ і - 13Е; МЕСЕ і РОСЕ (наприклад, РОСЕ-ВВ); МЕСЕ і ангіопоетин; МЕСЕ і Апдо2; МЕСБЕ і Тіве2; МЕСЕ і 51Р; МЕСБЕ і інтегрин смд83; МЕСЕ і інтегрин амВ5; МЕСЕ і інтегрин а5Д1; МЕСЕ і бетацеллюлін;
МЕС їі апелін/АРУ); МЕСЕ їі еритропоетин; МЕСЕ і фактор комплементу О; МЕСЕ і ТМЕса; МЕСБЕ і
НІГАТ; МЕСЕ і МЕСЕ-рецептор (наприклад, МЕСЕК!І, МЕСЕК2, МЕСЕКЗ, тЬМЕСЕК або 5МЕСЕК); МЕСБЕ і 51-2 рецептор; МЕСЕ і С2; МЕСЕ і фактор В; МЕСЕ і фактор Н; МЕСЕ і СЕНЕКЗ;
МЕСБЕ ї СЗБ; МЕСБЕ ї С5; МЕСБЕ ї Сба; МЕСЕ і СЗа; МЕСЕ і АКМ52; МЕСЕ і ТІМРЗ; МЕСЕ ії НГА;
МЕСБЕ і 11-68; МЕСЕ і СХЗСР1; МЕС і ТІ КЗ; МЕС і ТІ К4; МЕСЕ і СЕТР; МЕСБЕ і ПІРС; МЕСЕ і
СОІ1ОА1; або МЕСЕ і ТМЕК5ЕТОА. У деяких варіантах здійснення винаходу, біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися з двома різними епітопами МЕСЕ. Біспецифічні антитіла також можуть бути використані для локалізації цитотоксичних агентів в клітинах, які експресують
МЕСБ. Біспецифічні антитіла можуть бути отримані як повнорозмірні антитіла або фрагменти антитіл (наприклад, Раф, Раб або Бар-С фрагменти).
У деяких випадках біспецифічне антитіло являє собою біспецифічне анти-МЕсСБЕ/анти- ангіопоетин 2 (Апд2) антитіло, описане в заявці на патент США Ме 5 2014/0017244, яка включена в цій документі шляхом посилання в усій її повноті. Наприклад, біспецифічне анти-
МЕСР/анти-Апд2 антитіло може включати перший зв'язуючий домен, який пов'язує МЕСЕ (такий як будь-яке з антитіл проти МЕСЕ, описаних в цьому документі), і другий зв'язуючий домен, який зв'язує Апд2, який включає (а) НМЕ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЗУУМН (ЗЕО
ІО МО: 62); (б) НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність МЛМРМЗОСТММАОКРОС (ЗЕО
ІЮ МО: 63); (с) НМАК-НЗ, що містить амінокислотну послідовність БХРІМРУУУО5БЗОУУУРОАЕОІ (ЗЕО ІО МО: 64); (4) НМВ-І1, що містить амінокислотну послідовність ЗОММІОЗКЗМН (ЗЕО ІЮ
МО: 65); (ве) НУВ-12, що містить амінокислотну послідовність ООБОКРЗ (ЗЕО ІЮО МО: 66); і ()
НМУВ-ІЗ3, що містить амінокислотну послідовність ОММ/О5ЗЗОНМУМ (ЗЕО ІЮ МО: 67), або комбінацію одного або більше з вищевказаних НМА і одного або більше його варіантів, що мають щонайменше близько 80 95 ідентичності послідовності (наприклад, 81 95, 82 95, 83 95, 84 95, 85 У, 86 бо, 87 95, 88 95, 89 У, 90 95, 91 95, 92 У, 93 У, 94 95, 95 95, 96 У, 97 Уо, 98 96 або
Ко) 99 95 ідентичності) до будь-якої з ФЕО ІЮ МО: 62-67.
У деяких випадках біспецифічне анти-МЕСЕ/анти-Апд2 антитіло може включати перший зв'язуючий домен, який зв'язує МЕСЕ (такий як будь-яке з анти-МЕСЕ антитіл, описаних в цьому документі), і другий зв'язуючий домен, який зв'язується з Апд2 і включає(ють) МН-домен, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 80 95 ідентичності послідовності (наприклад, 80 95, 81 95, 82 95, 83 9Уо, 84 95, 85 95, 86 9Уо, 87 бо, 88 95, 89 90, 90 о, 91 9о, 92 Об, 93 9, 94 Фо, 95 95, 96 Фо, 97 Уо, 98 90 або 99 95 ідентичності послідовності) або послідовності ЗЕО
ІО МО: 68; (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 80 95 ідентичності послідовності (наприклад, 80 Фо, 81 95, 82 95, 83 95, 84 У, 85 Фо, 86 Уо, 87 Фо, 88 о, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 9895 або 9995 ідентичності послідовності) або послідовності ФЕО ІЮ МО: 69; або (с) домен МН, як в (а), і домен М, як в (Б).
У деяких випадках біспецифічне анти-МЕОЕ/анти-Апд2 антитіло може включати в себе перший зв'язуючий домен, який зв'язує МЕСЕ (такий як будь-яке з анти-МЕСЕ антитіл, описаних в цьому документі), і другий зв'язуючий домен, який специфічно зв'язується з Апд2, причому другий зв'язуючий домен являє собою будь-який зв'язуючий антитіло домен, описаний в публікації міжнародної патентної заявки Мо МО 2010/069532, який включено в цей документ за допомогою посилання в повному обсязі, або його варіант.
В інших випадках біспецифічне анти-МЕСРБ/анти-Апд2 антитіло являє собою будь-який біспецифічне анти-МЕСЕ/анти-Апд2 антитіло, описане в публікації міжнародної патентної заявки
Мо УМО 2016/073157.
У деяких випадках біспецифічне антитіло являє собою біспецифічне анти-МЕСР/анти-1І -6 антитіло. У деяких випадках біспецифічне анти-МЕСЕ/анти-1ІІ -6 антитіло може включати перший зв'язуючий домен, який зв'язує МЕСЕ (такий як будь-яке з антитіл проти МЕСЕ, описаних в цьому документі), і другий зв'язуючий домен, який пов'язує ІІ -6. Другий зв'язуючий домен може бути зв'язуючим доменом будь-якого анти-ЇЇ -6 антитіла, відомого в цій галузі, наприклад, ЕВІ- 031 (ЕІемеп Віоїпегарешіісв, див., наприклад, УМО 2016/073890, який включено в цьому документі за допомогою посилання у всій його повноті), силтуксимаб (ЗМІ МАМТФ), олокізумаб, клазакізумаб, сирукумаб, елсилімомаб, герилімзумаб, ОРК-003, МЕОІ-5117, РЕ-04236921 або їх варіант.
У деяких випадках біспецифічне антитіло являє собою біспецифічне анти-МЕСЕ/анти-1ІІ -68 60 антитіло. У деяких випадках біспецифічне анти-МЕСР/анти-І/.-6К антитіло може включати перший зв'язуючий домен, який зв'язує МЕСЕ (такий як будь-яке з антитіл проти МЕСБЕ, описаних в цьому документі), і другий зв'язуючий домен, який зв'язує ІІ-6К. Другий зв'язуючий домен може бути зв'язуючим доменом будь-якого анти-1Ї-6К антитіла, відомого в цій галузі, наприклад, тоцилізумаб (АСТЕМКАФ)) (див., наприклад, УМО 1992/019579, який включено до цей документ за допомогою посилання у всій його повноті) сарилумаб, вобарилізумаб (АЇХ-0061),
ЗА-237 або його варіант.
Способи отримання мультиспецифічних антитіл включають, але не обмежуються ними, рекомбінантну ко-експресію двох пар важкого-легкого ланцюгів імуноглобуліну, що мають різну специфічність (див. Міїсїеіп апа Спцеїо, Майте 305: 537 (1983)), УМО 93/08829 і Тгаийпескег еї аї.,
ЕМВО .. 10:3655 (1991)) і сконструйовані "виступ-в-западину" (див., наприклад, патент США Мо 5731168). Мультиспецифічні антитіла також можуть бути отримані за допомогою сконструйованих електростатичних керуючих ефектів для отримання Ес-гетеродимерних молекул антитіл (МО 2009/089004А1); зшивання двох або більше антитіл або фрагментів (див., наприклад, патент США Мо 4676980 і Вгеппап еї аї., Зсіепсе, 229: 81 (1985)); з використанням лейцинових блискавок для отримання біспецифічних антитіл (див., наприклад, КовзіеїІпу еї аї.,..
Ітітипої., 148 (5): 1547-1553 (1992)); використовуючи технологію "діатіл" для отримання біспецифічних фрагментів антитіл (див., наприклад, Ноїїпдег еї аї., Ргос. Маї). Асад. 5сі. О5А, 90: 6444-6448 (1993)); і з використанням одноланцюгових димерів Ем (5Ем) (див., наприклад,
Сгибег еї аї., У. Іттипої., 152: 5368 (1994)); і отримання триспецифічних антитіл, як описано, наприклад, в Тий еї аї., у). Іттипої. 147: 60 (1991).
В цей документ також включені сконструйовані антитіла з трьома або більше функціональними сайтами зв'язування антигену, включаючи "антитіла-восьминоги" (див., наприклад, 5 2006/0025576А1).
Антитіло або фрагмент з цього документу також включає "подвійний діючий ЕАБ" або "ОАЕ", що містить сайт зв'язування антигену, який зв'язується з МЕСЕ, а також з іншим, відмінним антигеном (див., наприклад, О5 2008/0069820). 8. Варіанти антитіл
У деяких варіантах здійснення винаходу, пропонуються варіанти амінокислотних послідовностей (наприклад, варіанти антитіл, включаючи одне або більше змін амінокислотних залишків) антитіл, представлених в даному документі. Наприклад, може бути бажаним поліпшити афінність зв'язування і/або інші біологічні властивості антитіла. Варіанти амінокислотних послідовностей антитіла можна отримати шляхом внесення відповідних модифікацій в нуклеотидну послідовність, що кодує антитіло, або шляхом пептидного синтезу.
Такі модифікації включають, наприклад, делеції з, і/або вставки в, і/або заміни залишків в амінокислотних послідовностях антитіла. Будь-яка комбінація делеції, вставки і заміщення може бути виконана для досягнення кінцевої конструкції, за умови, що кінцева конструкція володіє необхідними характеристиками, наприклад, зв'язуванням антигену. а) Варіанти заміни, вставки і делеції
У деяких варіантах здійснення винаходу пропонуються варіанти антитіл, що містять одну або більше амінокислотні заміни. Сайти, що представляють інтерес для замісного мутагенезу, включають НУК і ЕК. Консервативні заміни показані в таблиці 1 під заголовком "кращі заміни".
Більш суттєві зміни наводяться в таблиці 1 під заголовком "ілюстративні заміни" і як додатково описано нижче щодо класів бічного ланцюга амінокислот. Амінокислотні заміни можуть бути введені в антитіло, яке представляє інтерес, а продукти, скриновані для бажаної активності, наприклад, зберігають/локращують зв'язування антигену, зменшують імуногенність або покращують АРСС або СОС.
Таблиця 1
Залишок
Таблиця 1
Оригінальний Ілюстративні заміни Переважні заміни
Залишок
МПе () Ї ем; Маї; Меї; АІа; Ре; норлейцин
Ї ем ()) Норлейцин; Пе; Маї; Меї; Аа; Рпе пе "о ма! (М) Пе; Геи; Меї; Ріє; Аа; норлейцин
Амінокислоти можна згрупувати за загальними властивостями бічного ланцюга: (1) гідрофобні: норлейцин, Меї, Аа, Маї, Гей, Пе; (2) нейтральні гідрофільні: Сувз, Зег, ТНг, Авп, Сп; (3) кислі: Азр, Ом; (4) основні: Ні, Г ув, Ага; (5) залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга: су, Рго; (6) ароматичні: Тгр, Туг, Ріє.
Неконсервативні заміни тягнуть за собою обмін членом одного з цих класів на член іншого класу.
Один тип заміщуючого варіанту включає заміщення одного або більше залишків гіперваріабельної ділянки і/або залишків ЕК з вихідного антитіла (наприклад, гуманізованого або людського антитіла). Як правило, результуючий варіант(и), обрані для подальшого вивчення, матиме модифікації (наприклад, поліпшення) в певних біологічних властивостях (наприклад, підвищена афінність, підвищена стабільність, підвищена експресія, змінений рі іабо знижена імуногенність) щодо вихідного антитіла і/або будуть по суті збережені певні біологічні властивості вихідного антитіла. Типовим варіантом заміщення є афінно дозріле антитіло, яке може бути зручно згенероване, наприклад, з використанням методів дозрівання афінності заснованому на фаговому дисплеї, таких як описані в цьому документі. Якщо коротко, один або більше залишків НМК мутують, а варіанти антитіл відображаються на фагові і піддаються скринінгу на конкретну біологічну активність (наприклад, афінність зв'язування).
Зміни (наприклад, заміни) можуть бути зроблені в НУК, наприклад, для поліпшення афінності антитіла. Такі зміни можуть бути зроблені в "гарячих точках" НМЕ, тобто в залишках, що кодуються кодонами, які піддаються мутації з високою частотою під час процесу соматичного дозрівання (див., наприклад, СпомаВпигу, Меїносдіз Мої. Віої. 207: 179-196 (2008)), або залишки, які контактують з антигеном, причому отриманий варіант МН або Мі. тестують на афінність зв'язування. Дозрівання афінності шляхом побудови і повторного вибору з вторинних бібліотек було описано, наприклад, в Ноодепроот еї аї., Меїпоаз іп МоїІесшіаг Віоіоду 178: 1-37 (О'Віїєп єї аІ.,, Ед., Нитап Ргев5, Тоїома, МУ, (2001)). У деяких варіантах здійснення, дозрівання афінності,
Ко) відмінність вводиться в варіабельні гени, обрані для дозрівання будь-яким з безлічі способів
(наприклад, підвладна помилкам ПЛР, перетасування ланцюгів або олігонуклеотид- спрямований мутагенез). Потім створюється вторинна бібліотека. Потім бібліотеку піддають скринінгу для ідентифікації будь-яких варіантів антитіл з бажаною афінністю. Інший спосіб введення різноманітності включає в себе НМК-орієнтовані підходи, в яких рандомізовано кілька
НУВ-залишків (наприклад, 4-6 залишків за раз). НМЕ-залишки, які беруть участь у зв'язуванні антигену, можуть бути специфічно ідентифіковані, наприклад, з використанням аланін скануючого мутагенезу або моделювання. СОБ-НЗ і СОР-І З, зокрема, часто націлені.
У деяких варіантах здійснення винаходу, заміни, вставки або делеції можуть відбуватися в межах одного або більше НМЕ, поки такі зміни суттєво не зменшують здатність антитіла зв'язувати антиген. Наприклад, консервативні зміни (наприклад, консервативні заміни, як зазначено в цьому документі), які суттєво не зменшують афінність зв'язування, можуть бути зроблені в НМЕК. Такі зміни можуть, наприклад, перебувати поза антигензв'язуючих залишків в
НМК. У деяких варіантах здійснення варіантів МН і МІ послідовностей, представлених вище, кожен НМЕК або не змінюється, або містить не більше однієї, двох або трьох амінокислотних замін.
У деяких варіантах здійснення винаходу, заміни, вставки або делеції можуть відбуватися в межах одного або більше ЕК, поки такі зміни суттєво не зменшують здатність антитіла зв'язувати антиген. Такі зміни можуть, наприклад, покращувати афінність антитіла і/або стабільність (наприклад, відповідно до підвищеної температури плавлення).
Корисний спосіб ідентифікації залишків або ділянок антитіла, які можуть бути націлені на мутагенез, називається "аланіновий скануючий мутагенез", як описано в статті Сиппіпдапат апа
МУєїї5 (1989) 5сіепсе, 244: 1081-1085. У цьому способі залишок або групу цільових залишків (наприклад, заряджені залишки, такі як Аго, Абр, Ні, Гуз і Сім) ідентифікують і замінюють нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (наприклад, аланіном або поліаланіном), щоб визначити чи впливає на взаємодію антитіла з антигеном. Подальші заміни можуть бути введені в місцях амінокислот, які демонструють функціональну чутливість до вихідних замін. В альтернативному або додатковому варіанті формують кристалічну структуру антиген-антитіло для ідентифікації точок контакту між антитілом і антигеном. Такі контактні залишки й сусідні залишки можна піддавати спрямованому впливу або виключати з кандидатів
Зо для заміни. Варіанти можна піддавати скринінгу з метою визначення наявності у них бажаних властивостей.
Вставки в амінокислотну послідовність включають аміно- і/або карбоксил-кінцеві злиття довжиною від одного залишку до поліпептидів, що містять сто або більше залишків, а також вставки одного або безлічі амінокислотних залишків всередині послідовності. Приклади кінцевих вставок включають антитіло з М-кінцевим метіонільним залишком. Інші варіанти вставки молекули антитіла включають злиття з М- або С-кінцем антитіла з ферментом (наприклад, для АОЕРТ) або поліпептидом, які збільшують період напіввиведення антитіла в сироватці.
Юр) Варіанти глікозилювання
У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло, запропоноване в цьому документі, модифікують з метою збільшення або зменшення ступеня глікозилювання антитіла. Додавання або делецію сайтів глікозилювання в антитілі легко здійснити шляхом модифікації амінокислотної послідовності, яка призводить до створення або видалення одного або більше сайтів глікозилювання.
Якщо антитіло містить Ес-ділянку, то можна модифікувати вуглевод, приєднаний до неї. Нативні антитіла, які продукуються клітинами ссавців, зазвичай включають розгалужений біантеннарний олігосахарид, який зазвичай приєднаний М-зв'язком до Азп297 домену СН2 Ес-ділянки. Див., наприклад, Му/гідні еї аі., ТІВТЕСН 15: 26-32 (1997). Олігосахарид може включати різні вуглеводи, наприклад манозу, М-ацетилглюкозамін (сІСМАс), галактозу і сіалову кислоту, а також фукозу, прикріплену до сіІСМАс в "стеблі" біантеннарної олігосахаридної структури. У деяких варіантах здійснення винаходу, модифікації олігосахариду в антитілі винаходу можуть бути зроблені для створення варіантів антитіл з деякими поліпшеними властивостями.
В одному варіанті здійснення винаходу, пропонуються варіанти антитіл, які мають вуглеводну структуру, яка не містить фукозу, прикріплену (прямо чи опосередковано) до Ес-ділянки.
Наприклад, кількість фукози в такому антитілі може становити від 1 905 до 80 905, від 1 95 до 65 95, від 595 до 6595 або від 2095 до 4095. Кількість фукози визначають шляхом розрахунку середньої кількості фукози у вуглеводному ланцюгу при Азп297 по відношенню до суми всіх вуглеводних структур, приєднаних до Ап 297 (наприклад, складних гібридних структур з високим вмістом манози), яка вимірюється за допомогою МАГОІ-ТОЕ-мас-спектрометрії, як 60 описано, наприклад, в М/О 2008/077546. А5п297 відноситься до залишку аспарагіну,
розташованому приблизно в положенні 297 в Ес-ділянці (ЄС-нумерація залишків Ес-ділянок); тим не менш, Азп297 також може бути розташований на відстані близько х З амінокислот до або після положення 297, тобто, між положеннями 294 і 300, з огляду на незначні варіації послідовності в антитілі. Такі варіанти фукозилювання можуть мати поліпшену функцію АОСОС.
Див., наприклад, публікацію патенту США Ме 05 2003/0157108; 005 2004/0093621. Приклади публікацій, що відносяться до варіантів "дефукозильованого" або "фукозо-дефіцитного" антитіла, включають: 05 2003/0157108; УМО 2000/61739; УМО 2001/29246; 05 2003/0115614; 05 2002/0164328; 05 2004/0093621; 05 2004/0132140; 005 2004/0110704; 05 2004/0110282; 5 2004/0109865; МО 2003/085119; МО 2003/084570; МО 2005/035586; УМО 2005/035778;
МО2005/053742; МО2002/031140; ОкКалакі єї аї., У. Мої. ВіоІ. 336:1239-1249 (2004); Матапе-
ОНпикі еї аї., Віоїєсн. Віоєпо. 87: 614 (2004). Прикладами клітинних ліній, здатних продукувати дефукозильовані антитіла, є клітини Гес13 СНО, дефіцитні в фукозилюванні білка (Кірка еї аї.,
Агеп. Віоспет. Віорпуз. 249: 533-545 (1986); заявка на патент США Ме 05 2003/0157108 А1,
Ргезіа, І; ії УМО 2004/056312 АТ, Адатзв еї а!., особливо в прикладі 11), і нокаутні клітинні лінії, такі як ген альфа-1,6-фукозилтрансферази, РОТ8, нокаутні клітини СНО (див., наприклад,
Уатапе-Онпикі еї а!., Віотесн. Віоєпо. 87: 614 (2004); Капаа є! а!., Віоїеснпої. Віоєпа., 94(4):680- 688 (2006); і ММО2003/085107).
Варіанти антитіл додатково представлені розділеними навпіл олігосахаридами, наприклад, в яких біантеннарний олігосахарид, приєднаний до Еос-ділянки антитіла, ділять навпіл за допомогою ІСМАс. Такі варіанти антитіл можуть мати зменшене фукозилювання і/або поліпшену функцію АОСС. Приклади таких варіантів антитіл описані, наприклад, в УМО 2003/011878; Патенті США Мо 6602684; і 05 2005/0123546 (тапа еї а!). Також передбачені варіанти антитіл з щонайменше одним галактозним залишком в олігосахариді, приєднаному до
Ес-ділянки. Такі варіанти антитіл можуть мати поліпшену функцію СОС. Такі варіанти антитіл описані, наприклад, в УМО 1997/30087; УМО 1998/58964; і УМО 1999/22764 (Каїсм, 5.). с) Варіанти Ес-ділянки
У деяких варіантах здійснення винаходу, одна чи більше модифікацій амінокислот можуть бути введені в Ес-ділянку антитіла, представленого в цьому документі, тим самим генеруючи варіант
Ес-ділянки. Варіант Ес-ділянки може містити послідовність Ес-ділянки людини (наприклад, Ес-
Зо ділянку ІДС1, ІдсС2, ДСЗ або ІдсС4 людини), що містить зміну амінокислотного залишку (наприклад, заміщення) в одному або більше положеннях амінокислоти. У деяких варіантах здійснення, винахід розглядає варіант антитіла, яке володіє деякими, але не всіма ефекторними функціями, які роблять його бажаним кандидатом для застосувань в яких період напіввиведення антитіла іп мімо є важливим, але деякі ефекторні функції (такі як комплемент і
З5 АОСС) не потрібні або шкідливі. Аналізи цитотоксичності іп мйго і/або іп мімо можуть проводитися для підтвердження зменшення/виснаження СОС і/або АОСС активності.
Наприклад, можуть бути проведені аналізи зв'язування Ес-рецептора (ЕСЕ), щоб гарантувати, що антитіло не має Есук-зв'язування (отже, ймовірно, не має активності АОСС), але зберігає здатність ЕсКп-зв'язування. Первинні клітини для опосередкування АОСС, МК-клітини, експресують тільки ЕсуКІ, тоді як моноцити експресують ЕсукіІ, Есукі! ї ЕсукІ. Експресія ск на гематопоетичних клітинах приведена в таблиці З на стор. 464 Камеїсі апа Кіпеї, Аппи. Вемх.
Іттипої. 9:457-492 (1991).
Необмежуючі приклади аналізів іп міго для оцінки активності АЛОСС молекули, яка представляє інтерес, описані в патенті США Мо 5500362 (див., наприклад, Неїїбвігот еї аї., Ргос.Маї! Асад. 5сі.
ИБА 83:7059-7063 (1986) і НеїЇбігот, І еї аЇ., Ргос. Маг! Асад. 5сі. ОБА 82:1499-1502 (1985); патенті США Мо 5821337; і Вгиддетапп сеї аїЇ, У. Ехр. Мей. 166:1351-1361 (1987).
Альтернативно, можуть бути використані способи нерадіоактивного аналізу (див., наприклад, аналіз Нерадіоактивної цитотоксичності АСТІ"М для проточної цитометрії (СеПесппо!оду, Іпс.
Моипіаїп Міем/, Каліфорнія; і СУТОТОХ 969 не радіоактивний аналіз цитотоксичності (Рготеда,
Медісон, Вісконсін). Корисні ефекторні клітини для таких аналізів включають мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМСО) і клітини природніх кілерів (МК). Альтернативно або додатково, активність АОСС молекули, яка представляє інтерес, може бути оцінена іп мімо, наприклад, в моделі на тваринах, такій як описана в Сіупе5 еї аї., Ргос. Маї! Асай. 5сі. ОБА 95:652-656 (1998). Аналізи зв'язування Сід також можуть бути проведені для підтвердження того, що антитіло здатне зв'язувати С14 і, отже, не володіє активністю СОС. Див., наприклад,
Ста і СЗс зв'язування в ІФА в М/О 2006/029879 і МО 2005/100402. Для оцінки активації комплементу може бути проведений аналіз СОС (див., наприклад, Са7апо-бапіого 6ї аї., ».
Іттипої. Меїноде 202:163 (1996); Стадо еї а!., Віоса 101:1045-1052 (2003); і Стаду еї аї!., Віосіа 103:2738-2743 (2004)). Зв'язування РоКп і визначення іп мімо кліренсу/напіввиведення також можуть бути виконані з використанням методів, відомих в цій галузі (див., наприклад, Реїкома єї а!., ТИ. Іттипої. 18(12):1759-1769 (2006)).
Антитіла зі зниженою ефекторною функцією включають антитіла з заміною одного або більше залишків 238, 265, 269, 270, 297, 327 і 329 Ес-ділянки (патент США Мо 6737056). Такі Ес-мутанти включають Ес-мутантів з замінами в двох або більше амінокислотних положеннях 265, 269, 270, 297 і 327, включаючи так звані Ес-мутанти "САМА" з заміною залишків 265 і 297 на аланін (патент США Мо 7332581).
Описано деякі варіанти антитіл з поліпшеним або зменшеним зв'язуванням з ЕсЕК.(Див., наприклад, патент США Мо 6737056; УМО 2004/056312 і ЗПієїд5 еї аї., 9. Віої. Спет. 9(2): 6591- 6604 (2001)).
У деяких варіантах здійснення винаходу, варіант антитіла включає Ес-ділянку з однією або більше амінокислотними замінами, які покращують АОСС, наприклад, заміщення в положеннях 298, 333 і/або 334 Ес-ділянці (нумерація залишків ЄС).
У деяких варіантах здійснення винаходу, в Ес-ділянці відбуваються зміни, які призводять до зміни (наприклад, поліпшеному або зменшеному) зв'язування Сід і/або комплементарної залежної цитотоксичності (СОС), наприклад, як описано в патенті США Мо 6195551, МО 99/51642 і Ідизодіє еї аї., У. Іпттипої. 164: 4178-4184 (2000).
Антитіла зі збільшеним періодом напіввиведення і поліпшеним зв'язуванням з неонатальним Ес- рецептором (РсКп), який відповідає за передачу до матері плоду (Спцуег еї аї., 9. Іттипо). 117:587 (1976) і Кіт еї аї., 9). Іттипої!. 24:249 (1994)), описані в 052005/0014934А1 (Ніпоогп еї аї.).
Зазначені антитіла містять Ес-ділянку з однією або більше замінами, які покращують зв'язування Ес-ділянки з ЕсКп. Такі варіанти Ес включають ті, у яких є заміни в одному або більше залишках Ес-ділянки: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 або 434, наприклад, заміщення Ес-ділянки залишку 434 (патент
США Мо 7371826). Див. також Юипсап 5 УмМіпіег, Маїшге 322: 738-400 (1988); патент США Мо 5648260; патент США Мо 5624821; і МО 94/29351 щодо інших прикладів варіантів Ес-ділянки. а) Варіанти антитіл, сконструйованих з цистеїном
У деяких варіантах здійснення винаходу, може бути бажано створити цистеїн-сконструйовані антитіла, наприклад, "(піомМАБбБ»", в яких один або більше залишків антитіла заміщені залишками
Зо цистеїну. У конкретних варіантах реалізації винаходу, заміщені залишки розташовані в доступних сайтах антитіла. В результаті заміщення зазначених залишків цистеїном в доступних ділянках антитіла розташовуються реакційноздатні тіольні групи, які можна використовувати для кон'югування антитіла з іншими групами, наприклад, лікарськими речовинами або групами "лінкер-лікарська речовина" з отриманням імунокон'югата, як додатково описано в цьому документі. У деяких варіантах реалізації винаходу, можна замінити на цистеїн один або більше з таких залишків: М205 (нумерація Кабат) легкого ланцюга; А118 (нумерація ЄС) важкого ланцюга; і 5400 (нумерація ЄС) Ес-ділянки важкого ланцюга. Цистеїн-сконструйовані антитіла можуть бути отримані, як описано, наприклад, в патенті США Мо 7521541. е) Похідні антитіл
У деяких варіантах реалізації винаходу, антитіло, запропоноване в цьому документі, можна додатково модифікувати шляхом введення додаткових небілкових фрагментів, відомих в цій галузі техніки і легко доступних. Групи, які підходять для дериватизації антитіла, включають, але не обмежуються ними, водорозчинні полімери. Необмежуючі приклади водорозчинних полімерів включають, але не обмежуються ними, поліетиленгліколь (ПЕГ), сополімери етиленгліколю/пропіленгліколю, карбоксиметилцелюлози, декстрану, полівінілового спирту, полівінілпіролідону, полі-1, З-діоксолан, полі-1,3,6-тріоксану, сополімер етилену/малеїнового ангідриду, поліамінокислоти (гомополімери або випадкові сополімери) і декстран або полі(н- вінілпірролідон)поліетиленгліколю, гомополімери пропіленгліколю, сополімери проліпропіленоксида/етиленоксида, поліоксиетильовані поліоли (наприклад, гліцерин), полівініловий спирт і їх суміші. Пропіональдегід поліетиленгліколю може мати переваги у виробництві завдяки його стабільності в воді. Зазначений полімер може мати будь-яку молекулярну масу і бути розгалуженим або нерозгалуженим. Кількість полімерів, прикріплених до антитіла, може змінюватися, і якщо до нього прикріплене більше одного полімеру, вони можуть бути однаковими або різними молекулами. Загалом, кількість і/або тип полімерів, використовуваних для дериватизації, можуть бути визначені на основі міркувань, що включають, але не обмежуючись ними, конкретні властивості або функції антитіла, яке поліпшується, незалежно від того, чи буде похідне антитіла використовуватися при терапії в певних умовах і таке інше. Додаткові кон'югати антитіл описані в цьому документі, наприклад, в розділі К нижче і в прикладі 13.
В іншому варіанті здійснення винаходу, передбачені кон'югати антитіла і небілкового фрагмента, які можуть вибірково нагріватися під впливом радіації. В одному варіанті здійснення винаходу, небілюова частина являє собою вуглецеву нанотрубку (Кат еї аї., Ргос. Маї!. Асад.
Зсі. ОБА 102: 11600-11605 (2005)). Випромінювання може мати будь-яку довжину хвилі і включає в себе, але не обмежується ними, довжини хвиль, які не шкодять звичайним клітинам, але які нагрівають небілкову частину до температури, при якій клітини, проксимальні до антитіло-непротеїнових частини, гинуть.
У Варіанти ізоелектричної точки
Винахід пропонує варіанти антитіл зі зміненими ізоелектричними точками. Наприклад, винахід відноситься до варіантів антитіл зі зменшеною ізоелектричною точкою (рі), наприклад, у порівнянні з антитілом проти МЕСЕ, наприклад 06.31. У деяких випадках поверхневий заряд знижується при фізіологічному рН. У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ має рі, рівне або менше ніж близько 8 (наприклад, близько 8, близько 7, близько 6, близько 5 або близько 4). У деяких випадках антитіло має рі від близько 4 до близько 8 (наприклад, близько 4, близько 5, близько 6, близько 7 або близько 8). У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ має рі від близько 5 до близько 7 (наприклад, близько 5, близько б або близько 7). У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ має рі від близько 5 до близько 6 (наприклад, близько 5,1, близько 5,2, близько 5,3, близько 5,4, близько 5,5, близько 5,6, близько 5, 7, близько 5,8, близько 5,9 або близько 6).
Антитіла цього винаходу можуть бути сконструйовані так, щоб мати зменшений рі, наприклад, шляхом заміщення амінокислотних залишків дикого типу в цьому положенні амінокислотою, що має більш низький рі. рі амінокислоти можна визначити на основі значень рКа аміну (-МНг»), карбонової кислоти (-СООН) і амінокислоти з бічним ланцюгом, які відомі в цій галузі. У деяких варіантах здійснення винаходу, амінокислотні залишки, що експонуються на поверхні, можуть бути заміщені для зменшення рі антитіла. В одному варіанті здійснення винаходу, експоновані на поверхні амінокислотні залишки можуть бути заміщені глутаматом (Е). В одному варіанті здійснення винаходу, експоновані на поверхні амінокислотні залишки можуть бути заміщені аспартатом (Е).
В. Рекомбінантні способи і композиції
Будь-яке з антитіл (наприклад, антитіла проти МЕСЕ), описаних в цьому документі, може бути
Зо отримано з використанням рекомбінантних способів і композицій, наприклад, як описано в патенті США Мо 4816567. В одному варіанті здійснення винаходу, надається ізольована нуклеїнова кислота, що кодує антитіло проти МЕСЕ, описане в цьому документі. Така нуклеїнова кислота може кодувати амінокислотну послідовність, яка містить Мі, і/або амінокислотну послідовність, яка містить МН антитіла (наприклад, легкі і/або важкі ланцюги антитіла). У наступному варіанті здійснення винаходу, передбачається один або більше векторів (наприклад, векторів експресії), що містять таку нуклеїнову кислоту. У наступному варіанті здійснення винаходу, пропонується клітина-хазяїн, що містить таку нуклеїнову кислоту.
В одному з таких варіантів здійснення винаходу, клітина-хазяїн містить (наприклад, була перетворена 3): (1) вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, яка містить МІ. антитіла, і амінокислотну послідовність, яка містить УН антитіла, або (2) перший вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, яка містить Мі антитіла, і другий вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, яка містить МН антитіла. В одному варіанті здійснення винаходу, клітина-хазяїн є еукаріотичною, наприклад, клітиною яєчника китайського хом'ячка (СНО) або лімфоїдною клітиною (наприклад, МО, М5О, клітиною 5р20). В одному варіанті здійснення винаходу, пропонується спосіб отримання антитіла проти МЕСЕ, причому спосіб включає культивування клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло, як зазначено вище, в умовах, що підходять для експресії антитіла, і, необов'язково, виділення антитіла з клітини-хазяїна (або середовища культивування клітин-хазяїв).
Для рекомбінантного продукування антитіла проти МЕСЕ, нуклеїнових кислот, що кодує антитіло, наприклад, як описано вище, ізолюють і вставляють в один або більше векторів для подальшого клонування і/або експресії в клітині-хазяїні. Така нуклеїнова кислота може бути легко виділена і сіквенована з використанням звичайних процедур (наприклад, з використанням олігонуклеотидних зондів, які здатні специфічно зв'язуватися з генами, що кодують важкий і легкий ланцюг антитіла).
Відповідні клітини-хазяї для клонування або експресії векторів, що кодують антитіло, включають прокаріотичні або еукаріотичні клітини, описані в цьому документі. Наприклад, антитіла можуть бути отримані в бактеріях, зокрема, коли глікозилювання і Ес-ефекторна функція не потрібні.
Для експресії фрагментів антитіл і поліпептидів в бактеріях див., наприклад, патенти США Мо 60 5648237, 5789199 та 5840523. Див. також Спагюоп, Меїпоаз іп МоїІесшціаг ВіоІоду, Мої. 248 (ВКС
Го, єд., Нитапа Ргез5, Тоїома, МУ, 2003), рр. 245-254, що описує експресію фрагментів антитіл в
Е.соїї. Після експресії антитіло може бути виділено з пасти бактеріальних клітин в розчинній фракції і може бути додатково очищено.
На додаток до прокаріотів, еукаріотичні мікроорганізми, такі як нитчасті гриби або дріжджі, є підходящими хазяями для клонування або експресіївекторів, що кодують антитіло, включаючи гриби і дріжджові штами, чиї шляхи глікозилювання можуть бути "гуманізовані", що призводить до отримання антитіла з частково або повністю людським типом глікозилювання. Див.
Сегпдговв, Маї. Віоїесн. 22:1409-1414 (2004), і | ї еї а!., Маї. Віоїесн. 24: 210-215 (2006).
Придатні для експресії глікозильованого антитіла клітини-хазяї також можна отримати з багатоклітинних організмів (безхребетних і хребетних). Приклади клітин безхребетних включають клітини рослин і комах. Були ідентифіковані численні бакуловірусні штами, які можна використовувати в поєднанні з клітинами комах, особливо для трансфекції клітин б5родорієга
Тгидірегаа.
Культури клітин рослин також можуть бути використані в якості хазяїв. Див., наприклад, патенти
США Мо 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 та 6417429 (описують технологію
РІГАМТІВООІЕ5 М для виробництва антитіл в трансгенних рослинах).
Клітини хребетних можуть також використовуватися в якості хазяїв. Наприклад, можуть бути корисні клітинні лінії ссавців, які пристосовані для росту в суспензії. Іншими прикладами корисних клітинних ліній ссавців є лінія СМ1 нирки мавпи, трансформована за допомогою 5У40 (СО05-7); лінія клітин ембріональної нирки людини (293 або 293 клітини, як описано, наприклад, в сСгабат еї аї., У. беп Мігої. 36:59 (1977)); клітини нирок дитинча хом'яка (ВНК); клітини миші
Сертолі (клітини ТМА4, як описано, наприклад, в Маїнег, Віої. Нергоа. 23: 243-251 (1980)); клітини нирок мавпи (СМ); клітини нирок африканської зеленої мавпи (МЕКО-76); клітини карциноми шийки матки людини (НЕГА); (МОСК, клітини печінки щура-буйвола (ВЕ. ЗА), клітини легенів людини (М/138), клітини печінки людини (Нер 02), пухлина молочної залози миші (ММТ 060562), клітини ТКІ, як описано, наприклад, в Маїнег еї аї., АппаЇ5 М.М. Асай. сі. 383: 44-68 (1982); клітини МКО 5; і клітини Е54. Інші корисні клітинні лінії клітин ссавців включають клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), включаючи клітини ОНЕК-СНО (пацб еї аї., Ргос. Маї!. Асад. 5сі.
БА 77: 4216 (1980)); і клітинні лінії мієломи, такі як МО, М5О ї 5р2/0. Для огляду певних ліній клітин-хазяїв ссавців, придатних для продукування антитіл, див., наприклад, Маакі апа Уми,
Меїподз іп Моїесшіаг Віоіоду, Мої. 248 (ВКС Го, єд., Нитапа Ргевз5, Тоїома, МУ), рр. 255-268 (2003).
С. Аналізи
Запропоновані в цьому документі антитіла проти МЕСЕ, а також композиції, які включають антитіла проти МЕСЕ (наприклад, будь-яке антитіло проти МЕСЕ, представлене в цьому документі), такі як кон'югати антитіл, злиті білки і полімерні препарати, можуть бути ідентифіковані, скриновані або охарактеризовані за їх фізико-хімічними властивостями і/або біологічній активності за допомогою різних аналізів, відомих в цій галузі. 1. Аналізи зв'язування і інші аналізи
В одному аспекті антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок або його полімерний склад випробовують на його антигензв'язуючу активність, наприклад, за допомогою відомих методів, таких як ІФА, Вестерн-блот і т. д.
В іншому аспекті конкурентні аналізи можуть бути використані для ідентифікації антитіла, яке конкурує з антитілом, як описано в цьому документі, або кон'югатом антитіла, злитим білком або його полімерною композицією для зв'язування з МЕСРЕ.У деяких варіантах здійснення винаходу, таке конкуруюче антитіло зв'язується з одним і тим же епітопом (наприклад, лінійним або конформаційним епітопом), який пов'язаний з антитілом, як описано в цьому документі.
Докладні ілюстративні методи картування епітопа, з яким зв'язується антитіло, наведені в Моіїтіб (1996) "Грйоре Марріпа Ргоїосоїв5, " іп МеїШоайв іп МоїІесшіаг Віоіоду мої. 66 (Нитапа Ргевзв,
Тотова, Нью-Джерсі).
В ілюстративному конкурентному аналізі іммобілізований МЕСЕ інкубують в розчині, який містить перше мічене антитіло, яке зв'язується з МЕСЕ, і друге немічене антитіло, яке тестується на його здатність конкурувати з першим антитілом для зв'язування з МЕСЕ. Друге антитіло може бути присутнім в супернатанті гібридоми. В якості контролю іммобілізований
МЕСБЕ інкубують в розчині, який містить перше мічене антитіло, але не друге немічене антитіло.
Після інкубації в умовах, що забезпечують зв'язування першого антитіла з МЕСЕ, надмірне незв'язане антитіло видаляють і вимірюють кількість мітки, зв'язаної з іммобілізованим МЕСБЕ.
Якщо кількість мітки, зв'язаної з іммобілізованим УЕСЕ, істотно зменшується в тестованому зразку щодо контрольного зразка, то це вказує на те, що друге антитіло конкурує з першим антитілом для зв'язування з МЕСЕ. Див. Нагіоу апа І апе (1988). Апііродієв: А І арогаїгу Мапиаї сп.14 (Со Зргіпд Натог І арогаїюгу, Со 5ргіпу Нагбог, МУ). 2. Аналіз активності
В одному аспекті пропонуються аналізи для ідентифікації антитіл проти МЕСЕ або кон'югатів антитіл, злитих білків або їх полімерних композицій, що мають біологічну активність. Біологічна активність може включати, наприклад, зв'язування з МЕСЕ (наприклад, УЕСЕ в потоці крові) або його пептидним фрагментом або іп мімо, іп міго, або ех мімо. У деяких варіантах здійснення винаходу, біологічна активність може включати блокування або нейтралізацію МЕСЕ або запобігання зв'язування МЕСЕ з лігандом, наприклад, рецептором, таким як КОК або ЕН-1.
Також передбачені антитіла або кон'югати антитіл, злиті білки або їхні полімерні склади, що мають таку біологічну активність іп мімо та/або іп міїго. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок або його полімерний склад випробовують на таку біологічну активність. 3. Аналізи стабільності
В одному аспекті представлено аналізи для визначення стабільності (наприклад, термостабільності) антитіла проти МЕСЕ, або кон'югату антитіла, злитого білка або його полімерної композиції. Наприклад, стабільність антитіла або кон'югату антитіла, злитого білка або його полімерного складу може бути визначена з використанням будь-якого методу, відомого в цій галузі техніки, наприклад, диференціальної скануючої флуориметрії (О5Б), круговим дихроїзмом (СО), внутрішньої флуоресценції білка, диференціальної скануючої калориметрії, спектроскопії, світлорозсіювання (наприклад, динамічним розсіюванням світла (0/5) і статичним розсіюванням світла (515), само-взаємодіючою хроматографією (51).
Стабільність аналізу може бути визначена, як описано в цьому документі, наприклад, використовуючи О5БЕ, як описано, наприклад, в прикладах 1 і 2.
О. Імунокон'югати
Винахід також відноситься до імунокон'югатів, що містять антитіло проти МЕСЕ, кон'юговані з одним або більше цитотоксичними агентами, такими як хіміотерапевтичні агенти або лікарські засоби, що інгібують зростання агенти, токсини (наприклад, білкові токсини, ферментативно активні токсини бактеріального, грибного, рослинного або тваринного походження або їхні
Зо фрагменти) або радіоактивні ізотопи.
В одному варіанті здійснення винаходу, імунокон'югат являє собою кон'югат антитіло-лікарський засіб (АБС), в якому антитіло кон'Юптовано з одним або більше лікарськими засобами, включаючи, але не обмежуючись ними, майтансиноїд (див. патенти США Мо 5208020, 5416064 та європейський патент ЕР 0 425 235 В1); аурістатин, такий як фрагменти ОЕ і ОЕ лікарського засобу монометилаурістатина (ММАЕ і ММАР) (див. патенти США Мо 5635483, 5780588 та 71498298); доластатин; каліхеаміцин або його похідне (див. патенти США Мо 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 і 5877296; Ніптап еї аї.,, Сапсег Ке5. 53:3336- 3342 (1993); і І оде еї аІ., Сапсег Вев. 58: 2925-2928 (1998)); антрациклін, такий як дауноміцин або доксорубіцин (див. Кгаїх еї аІ., Сиггепі Мед. Спет. 13:477-523 (2006); дейтеу вї а!., Віоогдапіс а Мед. Спет. І ейеге 16:358-362 (2006); Тогдом єї аї., Віосоп). Спет. 16:717-721 (2005); Маду єї а!І., Ргос. Майї). Асад. сі. ОБА 97:829-834 (2000); Вбиромснік єї аї!., Віоога. 5 Мед. Снет. І ейегтв 12:1529-1532 (2002); Кіпод еї аї., 9). Мед. Снет. 45: 4336-4343 (2002); і патент США Мо 6630579); метотрексат; віндезин; таксани, такий як доцетаксел, паклітаксел, ларотаксел, тезетаксел і ортатаксел; трихотецени; і СС1065.
В іншому варіанті здійснення винаходу, імунокон'югат містить антитіло, як описано в цьому документі, кон'югованих з ферментативно активним токсином або його фрагментом, включаючи, але не обмежуючись ними, А ланцюг дифтерії, які не пов'язують активні фрагменти дифтерійного токсину, А ланцюг екзотоксину (від Роеидотопах аєгидіпоза), А ланцюг ріцину, А ланцюг абрина, А ланцюг модекцина, альфа-сарцин, білки АїІеєнцгіїез Тогаї, білки діантина, білки
Рпуюіаса атегісапа (РАРІ, РАРІЇ ії РАР-5), інгібітор момордіка харантська, курцин, кротин, інгібітор зараопагіа опйісіпаїйє, гелонін, мітогеллін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин і трикотецени.
В іншому варіанті здійснення винаходу, імунокон'югат містить антитіло, як описано в цьому документі, кон'юговано з радіоактивним атомом з утворенням радіокон'югата. Для виробництва радіокон'югатів є безліч радіоактивних ізотопів. Приклади включають Айг!!, 1191, (125, Уз0, Де!в86,
Ве88, Зпт/!»з, Віг212, рзг2, рреги2 і радіоактивні ізотопи и. Коли радіокон'югат використовується для виявлення, він може містити радіоактивний атом для сцинтиграфічних досліджень, наприклад їс99т або 123, або мітку спина для отримання зображення ядерного магнітного резонансу (ЯМР) (також відому як магнітно-резонансна томографія, МРТ), такий як йод-123 знову, йод-131, індій- 60 111, фтор-19, вуглець-13, азот-15, кисень-17, гадоліній, марганець або залізо.
Кон'югати антитіла і цитотоксичного агента можуть бути отримані із застосуванням безлічі біфункціональних, зв'язуючих білок агентів, таких як М-сукцинімідил-3-(2-піріділдитіо) пропіонат (ЗРОР), сукцинімідил-4- (М-малеїмідометил) циклогексан-1-карбоксилат (5МСС), імінотіолан (ІТ), біфункціональні похідні імідоефірів (такі як діметиладіпімідат НС), активні складні ефіри (такі як дисукцинімідил суберат), альдегіди (такі як глутаровий альдегід), біс-азідопоєднання (такі як біс(п-азідобензоїл) гександіамін), похідні біс-діазонію (такі як біс-(п-діазонійбензоїл) - етилендіамін), діїізоцианати (такі як толуол-2,6б-діїззоцианат) і біс-активні сполуки фтору (такі як 1,5-дифтор-2, 4-динітробензол). Наприклад, імунотоксин рицину може бути отриманий, як описано в Мігецна еї аї., Зсіепсе 238: 1098 (1987). Вуглець-14-мічена 1-ізотіоцианатобензіл-3- метілдіетилентриамінпентауксусна кислота (МХ-ОТРА) являє собою ілюстративний хелатуючий агент для кон'югації радіонуклеотиду з антитілом. Див. М/О94/11026. Лінкер може являти собою "відщеплюваний лінкер", який полегшує вивільнення цитотоксичної лікарської речовини в клітині. Наприклад, можна використовувати кислоточутливий лінкер, пептидазочутливий лінкер, фоточутливий лінкер, диметильний лінкер або дисульфід-містячий лінкер (Спагі еї аЇ., Сапсег
Вез. 52: 127-131 (1992); Патент США Мо 5208020).
Імунокон'югати або АОС явно розглядають в цьому документі, але не обмежуються ними, такі кон'югати, отримані за допомогою зшиваючих реагентів, включаючи, але не обмежуючись ними,
ВМРБ5, ЕМО5, СМВ5, НВУ5, 10-5МСС, МВ5, МРВН, 5ВАР, 5ІА, БІАВ, 5МОС, ЗМРВ, ЗМРН, сульфо-ЕМСОС5, сульфо-СМВ5, сульфо-КМО5, сульфо-МВ5, сульфо-5ІАВ, сульфо-5МСОС і сульфо-5МРВ і 5МУ5В (сукциніміділ-(4-вінілсульфон) бензоат), які є комерційно доступними (наприклад, від Ріегсе Віотесппо!Поду, Іпс., Рокфорд, Іллінойс, США).
Е. Способи та композиції для очищення, діагностики і виявлення афінності
Антитіла цього винаходу можуть бути використані в якості агентів афінного очищення. У цьому процесі антитіла імобілізують на твердій фазі, такій як смола БЕРНАОЕХФ або фільтрувальний папір, з використанням способів, добре відомих в цій галузі техніки. Імобілізоване антитіло контактує зі зразком, що містить антиген, який підлягає очищенню, і після цього носій промивають відповідним розчинником, який видаляє по суті весь матеріал в зразку, за винятком антигену, який очищається, який пов'язаний з імобілізованим антитілом. Нарешті, носій промивають іншим відповідним розчинником, таким як гліциновий буфер, рН 5,0, який вивільняє
Зо антиген з антитіла.
У деяких варіантах здійснення винаходу, будь-яке з антитіл проти МЕСЕ, представлених в цьому документі, корисно для виявлення присутності МЕСЕ в біологічному зразку.
Використовуваний в цьому документі термін "виявлення" охоплює кількісне або якісне виявлення. У деяких варіантах здійснення винаходу, біологічний зразок містить клітину або тканину, таку як кров (наприклад, цільна кров, плазма і/або сироватка), зразки тканин (наприклад, зразки пухлин) тощо.
В одному варіанті здійснення винаходу, пропонується анти-МЕСЕ антитіло для використання в способі діагностики або виявлення. У ще одному аспекті представлений спосіб виявлення присутності МЕСЕ в біологічному зразку. У деяких варіантах здійснення винаходу, спосіб включає контактування біологічного зразка з антитілом проти МЕСЕ, як описано в цьому документі, в умовах, які дозволяють зв'язування антитіла проти МЕСЕ з МЕСБЕ, їі визначення того, чи утворюється комплекс між антитілом проти МЕСЕ і МЕСР. Такий спосіб може бути способом іп міго або іп мімо. В одному варіанті здійснення винаходу, антитіло проти МЕСЕ використовують для відбору суб'єктів, які підходять для терапії антитілом проти МЕСБЕ, наприклад, де МЕСЕ являє собою біомаркер для відбору пацієнтів.
Ілюстративні розлади, які можуть бути діагностовані з використанням антитіла по винаходу, включають порушення, пов'язані з патологічним ангіогенезом (наприклад, окулярні порушення і клітинні проліферативні порушення) і/або порушення, пов'язані з небажаною проникністю судин (наприклад, набряк, пов'язаний з пухлинами головного мозку, асцит, пов'язаний зі злоякісними новоутвореннями, синдром Мейга, запалення легенів, нефротичний синдром, перикардіальний випіт, плевральний випіт і проникність, пов'язані з серцево-судинними захворюваннями). У деяких випадках окулярний розлад являє собою АМО (наприклад, волога АМО, суха АМО, проміжна АМО, прогресуюча АМО або географічна атрофія (СА)), дегенерацію жовтої плями, набряк макули, ОМЕ (наприклад, фокальний, нецентральний ОМЕ або дифузний, пов'язаний з центром ЮМЕ), ретинопатію, діабетичну ретинопатію (ОК) (наприклад, проліферативну ОК (РОК), непроліферативну ОК (МРОК) або висотну ОК), інші пов'язані з ішемією ретинопатії,
КОР, оклюзію вени сітківки (КМО) (наприклад, центральну (СКМО) і розгалужену (ВКМО) форми), СММ (наприклад, міопічну СММ), неоваскуляризацію рогівки, захворювання, пов'язані з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризацію сітківки, захворювання, пов'язані з бо ретинальною/ хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічну короткозорість, хворобу фон
Хиппель-Ліндау, гістоплазмоз ока, БЕЕМК, хвороба Коутса, хвороба Норрі, ОРРО, субкон'юнктивальний крововилив, рубеоз, неоваскулярне захворювання очей, неоваскулярне глаукому, пігментний ретиніт (КР), гіпертонічну ретинопатію, ангіоматозну проліферацію сітківки, макулярну телеангіектазію, неоваскуляризацію зіниці, внутрішньоочну неоваскуляризацію, дегенерацію сітківки, цістоїдний макулярний набряк (СМЕ), васкуліт, папілломедому, ретиніт, кон'юнктивіт (наприклад, інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційний (наприклад, алергічний) кон'юнктивіт, амавроз Лебера (також відомий як вроджений амароз
Лебера або І СА), увеїт (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдит (наприклад, багатофокальний хоріоїдит), очний гістоплазмоз, блефарит, сухість очей, травматичне пошкодження очей, хвороба Шегрена. У деяких випадках окулярний розлад являє собою ретинопатію, що включає проліферативну діабетичну ретинопатію, хоріоїдальну неоваскуляризацію (СММ), вікову дегенерацію жовтої плями (АМО), діабетичну і інші пов'язані з ішемією ретинопатії, діабетичний макулярної набряк (ОМЕ), патологічну короткозорість, хворобу фон Хіппель-Ліндау, гістоплазмоз ока, оклюзію вени сітківки (включаючи центральні (СКМО) і розгалужені (ВКМО) форми), неоваскуляризацію рогівки, неоваскуляризацію сітківки, ретинопатію недоношених (КОР), сімейну ексудативну вітреоретинопатію (РЕМК), хворобу
Коутса, хворобу Норрі, синдром остеопороза-псевдогліоми (ОРРС), субкон'юнктивальний крововилив або гіпертонічну ретинопатію. У деяких випадках клітинний проліферативний розлад являє собою рак. У деяких випадках, рак являє собою рак молочної залози, рак товстої кишки, недрібноклітинний рак легені, неходжкінську лімфому (НХЛ), рак нирки, рак передміхурової залози, рак печінки, рак голови та шиї, меланому, рак яєчників, мезотеліому або множинну мієлому.
У деяких варіантах здійснення винаходу, представлено мічені антитіла проти МЕСЕ. Ці мітки включають, але не обмежуються ними, мітки або фрагменти, які виявляються безпосередньо (наприклад, флуоресцентні, хромофорні, електронно-щільні, хемілюмінесцентні і радіоактивні мітки), а також фрагменти, такі як ферменти або ліганди, які виявляються побічно, наприклад, за допомогою ферментативної реакції або взаємодії молекул. Ілюстративні мітки включають, але не обмежуються ними, радіоїзотопи З2Р, 790, 71251. ЗНои І, флуорофори, такі як рідкоземельні хелати або флуоресцеїн, і його похідні, родамін і його похідні, дансил,
Зо умбелліферон, люцериферази, наприклад, люциферази світлячків і бактеріальна люцифераза (патент США Мо 4737456), люциферин, 2,3-дигідрофталазіндіони, пероксидаза хрону (НКР), лужна фосфатаза, р-галактозидаза, глюкоамілаза, лізоцим, сахаридні оксидази, наприклад, глюкозооксидазу, галактозооксидазу і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу, гетероциклічні оксидази, такі як уриказа і ксантиноксидаза, в поєднанні з ферментом, який використовує перикис водню для окислення попередника барвника, такого як НЕР, лактопероксидазу або мікропероксидаза, біотин/авідин, спінові мітки, мітки бактеріофага, стабільні вільні радикали, тощо.
В іншому варіанті здійснення винаходу антитіло необхідно мітити, і його присутність може бути виявлено з використанням міченого антитіла, яке зв'язується з антитілом.
Антитіла цього винаходу можуть бути використані в будь-якому відомому аналітичному методі, такому як аналізи конкурентного зв'язування, прямі і непрямі сендвіч-аналізи і аналізи імунопреципітації. 70Іа, Мопосіопа! Апіїродієв: А Мапиаї ої Тесппіднев, рр.147-158 (СВО Ргезв,
Іпс. 1987).
Аналізи конкурентного зв'язування покладаються на здатність стандарту мічення конкурувати з аналізом тестового зразка для зв'язування з обмеженою кількістю антитіл. Кількість антигену в тестованому зразку обернено пропорційно кількості стандарту, яке стає пов'язаним з антитілами. Щоб полегшити визначення кількості стандарту, який стає зв'язаним, антитіла зазвичай нерозчинні до або після конкуренції, так що стандарт і аналіз, який зв'язується з антитілами, можуть бути зручно відокремлені від стандарту, і проаналізовані, ті які залишаються непов'язаними.
Сендвіч-аналізи включають використання двох антитіл, кожне з яких здатне зв'язуватися з іншою імуногенною частиною або епітопом білка, який повинно бути виявлено. У сендвіч-аналізі тестований зразок речовини, яка аналізується, зв'язується першим антитілом, яке імобілізують на твердій основі, і після цього друге антитіло зв'язується з речовиною, яка аналізується, утворюючи, таким чином, нерозчинний комплекс з трьох частин. Див., наприклад, патент США
Мо 4376110. Друге антитіло саме може бути помічено детектуємою частиною (прямим сендвіч- аналізом) або може бути виміряно з використанням антитіла проти імуноглобуліну, яке позначено детектуємою частиною (непрямий сендвіч-аналіз). Наприклад, один тип сендвіч- аналізу являє собою аналіз ІФА, і в цьому випадку частина, що детектується являє собою фермент.
Для імуногістохімії зразок пухлини може бути свіжим або замороженим або може бути заключено в парафін і зафіксований консервантом, наприклад, таким як формалін.
Антитіла також можуть бути використані для діагностичних тестів іп мімо. Як правило, антитіло мітиться радіонуклідом (таким як "п, 99Те, 120, 191|, 125І, ЗН, ЗР або 355) або барвником, так що пухлина може бути локалізована з використанням імуносцинтіографії.
Е. Діагностичні набори
З метою зручності антитіло даного винаходу може бути надано в наборі, тобто упакованої комбінації реагентів в заздалегідь визначених кількостях з інструкціями для проведення діагностичного аналізу. Якщо антитіло позначено ферментом, в набір входять субстрати і кофактори, необхідні ферментом (наприклад, попередник субстрату, який забезпечує хромофор або флуорофор, що детектуються). Крім того, можуть бути включені інші добавки, такі як стабілізатори, буфери (наприклад, блок-буфер або буфер для лізису) тощо. Відносні кількості різних реагентів можуть широко варіюватися, щоб забезпечити концентрації в розчині реагентів, які суттєво оптимізують чутливість аналізу. Зокрема, реагенти можуть бути представлені у вигляді сухих порошків, зазвичай ліофілізованих, включаючи наповнювачі, які при розчиненні забезпечують розчин реагенту, який має відповідну концентрацію. б. Фармацевтичні склади
Фармацевтичні склади антитіла проти МЕСЕ, як описано в цьому документі, або кон'югат антитіла, злитий білок або його полімерний склад, отримують шляхом змішування такого антитіла, що має бажану ступінь чистоти, з одним або більше необов'язковими, фармацевтично прийнятними носіями (Кетіпдіоп'є Рпаптасешіса! Зсіепсе5, 16-е видання, О5о0ої, А. Еа.(1980)) у формі ліофілізованих складів або водних розчинів. Фармацевтично прийнятні носії, як правило, нетоксичні для реципієнтів при використовуваних дозах і концентраціях і включають, але не обмежуються ними: буфери, такі як фосфат, цитрат і інші органічні кислоти; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту та метіонін; консерванти (такі як октадецилдиметилбензіламонійхлорід, хлорид гексаметонію, хлорид бензалконію, хлорид бензетонію, фенол, бутил або бензиловий спирт, алкілларабени, такі як метил або пропілпарабен, катехол, резорцин, циклогексанол, З-пентанол і м-крезол); низькомолекулярні (менш ніж близько 10 залишків) поліпептиди; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включаючи глюкозу, манозу або декстрини; хелатуючі агенти, такі як ЕДТК; цукри, такі як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; солеутворюючі протиіїони, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, 2п-білкові комплекси); і/або неіонні поверхнево-активні речовини, такі як поліетиленгліколь (ПЕГ). Приклади фармацевтично прийнятних носіїв в цьому документі також включають інстерстиціальні лікарські дисперсійні агенти, такі як розчинні нейтрально-активні гіалуронідазні глікопротеїни (ЗНАБЕСР), наприклад, людські розчинні глікопротеїни РН-20 гіалуронідази, такі як гНнНиИРН2гО (НМ ЕМЕХФО, Вахіег Іпегпайопаї, Іпс.). Деякі ілюстративні 5НАБЕОР і способи використання, включаючи гНиРН2О, описані в публікаціях патенту США Мо 2005/0260186 і 2006/0104968. В одному з аспектів 7ЗНАБЕСР об'єднують з одним або більше додатковими глікозаміногліканазами, наприклад, хондроїтіназами.
Типові ліофілізовані склади антитіл описані в патенті США Мо 6267958. Водні склади антитіл включають композиції, описані в патентах США Мо 6171586 і УМО2006 / 044908, причому останні склади включають гістидин-ацетатний буфер.
Склад цього винаходу також може містити більше одного активної сполуки, якщо необхідно для конкретного показання, що піддається лікуванню, переважно тих, які мають додаткові активності, які не чинять несприятливого впливу друг на друга. Наприклад, може бути бажано додатково забезпечити імуносуперсивний агент. Такі молекули відповідним чином присутні в комбінації в кількостях, ефективних для наміченої мети.
Активні інгредієнти можуть бути захоплені в мікрокапсули, отримані, наприклад, методами коацервації або міжфазною полімеризацією, наприклад, гідроксиметилцделюлозою або желатиновими мікрокапсулами і полі-- метилметакрилатними) мікрокапсулами відповідно в колоїдних систем доставки ліків (наприклад, ліпосоми, мікросфери альбуміну, мікроемульсії, наночастинки і нанокапсули) або в макроемульсіях. Такі методи описані в Кептіпдоп'є
РІНаптасеціїса! Зсієпсез 161п едйіоп, Озої, А. Еа. (1980).
Склади, використовувані для іп мімо-введення, зазвичай є стерильними. Стерильність може бути легко досягнута, наприклад, шляхом фільтрації крізь стерильні фільтруючі мембрани.
У деяких варіантах здійснення винаходу, фармацевтичний склад включає одну або більше додаткових сполук. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова сполука зв'язується з 60 другою біологічною молекулою, обраною з групи, що складається з ІІ -18, 1-6; І -68; 11-13; ІІ -
13К; РООСБЕ; ангіопоетина; ангіопоетина 2; Тіе-2; 51Р; інтегринів сомВ3, сам8В5 і а5р1; бетацеллюліна; апеліна/АРУ; еритропоетину; фактора комплементу 0; ТМЕ-аірна; НТВАТ; рецептора МЕСЕ; рецептора 5-2; і білків, генетично пов'язаних з віковою макулярною дегенерацією (АМО), такі як компоненти комплементу шляху С2, фактор В, фактор Н, СЕНКЗ,
С3р, С5, Сба і СЗа; НТКАТ; АКМ52; ТІМРЗ; НІ А; І -8; СХЗСВ1; ТІ ВЗ; ТІ 84; СЕТР; ПІРС;
СОЇ1ТОА1; і ТМЕКЗЕТОА. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова сполука являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент.
Наприклад, в деяких випадках додаткова сполука являє собою біспецифічне антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло проти МЕСЕ/анти-Апд2, таке як КО-7716 або будь-яке біспецифічне анти-МЕСЕ/анти-Апд2 біспецифічне антитіло, описане в УМО 2010/069532 або УМО 2016/073157.
В іншому прикладі в деяких випадках додаткова сполука являє собою антитіло проти 1-6, наприклад, ЕВІ-0О31 (ЕІемеп Віоїпегарешіс5, див., Наприклад, УМО 2016/073890), силтуксимаб (ЗМІ МАМТФ), олокізумаб, клазакізумаб, сирукумаб, елсилімомаб, герилімзумаб, ОРЕ-003,
МЕБІ-5117, РЕ-04236921 або їх варіант.
У ще одному додатковому прикладі в деяких випадках додаткова сполука являє собою антитіло проти 1І/-6К, наприклад, токілізумаб (АСТЕМЕАФ) (див., наприклад, УМО 1992/019579), сарилумаб, вобарилізумаб (А Х-0061), БА-237 або його варіант.
Н. Терапевтичні способи і композиції
Будь-які антитіла проти МЕСЕ, кон'югати антитіл (наприклад, кон'югати НА, кон'югати ПЕГ і кон'югати пролікарських антитіл), злиті білки і полімерні склади, представлені в цих документах, можуть бути використані в терапевтичних способах.
В одному аспекті забезпечується антитіло проти МЕСЕ для використання в якості лікарського засобу. В іншому аспекті пропонується кон'югат антитіла для використання в якості лікарського засобу. У ще одному аспекті забезпечується злитий білок для використання в якості лікарського засобу. У ще одному аспекті пропонується полімерна композиція для використання в якості лікарського засобу. В інших аспектах винахід забезпечує антитіло проти МЕСОЕ для використання при лікуванні розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом. В іншому аспекті винахід забезпечує кон'югат антитіла для використання при лікуванні розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом. В інших аспектах винахід забезпечує злитий білок для використання при лікуванні розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом. В інших аспектах винахід забезпечує полімерну композицію для використання при лікуванні розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом. У деяких варіантах здійснення винаходу, розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад або клітинний проліферативний розлад. У деяких випадках окулярний розлад являє собою АМО (наприклад, волога АМО, суха
АМО, проміжна АМО, прогресуюча АМО або географічна атрофія (СА)), дегенерацію жовтої плями, набряк макули, ОМЕ (наприклад, фокальний, нецентральний ЮМЕ або дифузний, пов'язаний з центром ОМЕ), ретинопатію, діабетичну ретинопатію (ОК) (наприклад, проліферативну ОК (РОК), непроліферативну ОК (МРОМК) або висотну ОК), інші пов'язані з ішемією ретинопатії, КОР, оклюзію вени сітківки (КМО) (наприклад, центральну (СКМО) і розгалужену (ВКМО) форми), СММ (наприклад, міопічну СММ), неоваскуляризацію рогівки, захворювання, пов'язані з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризацію сітківки, захворювання, пов'язані з ретинальною/ хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічну короткозорість, хворобу фон Хиппель-Ліндау, гістоплазмоз ока, ЕЕМК, хвороба Коутса, хвороба
Норрі, ОРРО, субкон'юнктивальний крововилив, рубеоз, неоваскулярне захворювання очей, неоваскулярне глаукому, пігментний ретиніт (КР), гіпертонічну ретинопатію, ангіоматозну проліферацію сітківки, макулярну телеангіектазію, неоваскуляризацію зіниці, внутрішньоочну неоваскуляризацію, дегенерацію сітківки, цістоїдний макулярний набряк (СМЕ), васкуліт, папілломедому, ретиніт, кон'юнктивіт (наприклад, інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційний (наприклад, алергічний) кон'юнктивіт, амавроз Лебера, увеїт (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдит (наприклад, багатофокальний хоріоїдит), очний гістоплазмоз, блефарит, сухість очей, травматичне пошкодження очей, хвороба Шегрена. У деяких випадках клітинний проліферативний розлад являє собою рак. У деяких випадках, рак являє собою рак молочної залози, рак товстої кишки, недрібноклітинний рак легені, неходжкінську лімфому (НХЛ), рак нирки, рак передміхурової залози, рак печінки, рак голови та шиї, меланому, рак яєчників, мезотеліому або множинну мієлому. В іншому аспекті пропонується анти-МЕСЕ антитіло для використання при лікуванні розладу, пов'язаного з небажаною проникністю судин.
У деяких випадках, розлад, пов'язаний з небажаною проникністю судин, є набряком, пов'язаним з пухлинами головного мозку, асцитом, асоційованим із злоякісними новоутвореннями, бо синдромом Мейга, запаленням легенів, нефротичним синдромом, перикардіальним випотом, плевральним випотом, або проникністю, пов'язаною з серцево-судинними захворюваннями.
В іншому аспекті пропонується антитіло проти МЕСЕ для використання в способі лікування. В іншому аспекті пропонується кон'югат антитіла для використання в способі лікування. У ще одному аспекті забезпечується злитий білок для використання в способі лікування. У ще одному аспекті пропонується полімерна композиція для використання в способі лікування. У деяких випадках винахід забезпечує антитіло проти МЕСЕ для використання в способі лікування суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, що включає введення індивідууму ефективної кількості антитіла проти МЕСЕ. Винахід також забезпечує кон'югат антитіла для використання в способі лікування суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, що включає введення індивідууму ефективної кількості кон'югату антитіла. Винахід також забезпечує злитий білок для використання в способі лікування суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, що включає введення індивідууму ефективної кількості злитого білка. Винахід також забезпечує полімерний склад для використання в способі лікування суб'єкта що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, що включає введення індивідууму ефективної кількості полімерного складу. У деяких випадках окулярний розлад являє собою АМО (наприклад, волога АМО, суха АМО, проміжна АМО, прогресуюча АМО або географічна атрофія (СА)), дегенерацію жовтої плями, набряк макули, ОМЕ (наприклад, фокальний, нецентральний ОМЕ або дифузний, пов'язаний з центром ЮМЕ), ретинопатію, діабетичну ретинопатію (ОК) (наприклад, проліферативну ОК (РОК), непроліферативну ОК (МРОК) або висотну ОК), інші пов'язані з ішемією ретинопатії,
КОР, оклюзію вени сітківки (КМО) (наприклад, центральну (СКМО) і розгалужену (ВКМО) форми), СММ (наприклад, міопічну СММ), неоваскуляризацію рогівки, захворювання, пов'язані з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризацію сітківки, захворювання, пов'язані з ретинальною/ хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічну короткозорість, хворобу фон
Хиппель-Ліндау, гістоплазмоз ока, БЕЕМК, хвороба Коутса, хвороба Норрі, ОРРО, субкон'юнктивальний крововилив, рубеоз, неоваскулярне захворювання очей, неоваскулярне глаукому, пігментний ретиніт (КР), гіпертонічну ретинопатію, ангіоматозну проліферацію сітківки, макулярну телеангіектазію, неоваскуляризацію зіниці, внутрішньоочну
Зо неоваскуляризацію, дегенерацію сітківки, цістоїдний макулярний набряк (СМЕ), васкуліт, папілломедому, ретиніт, кон'юнктивіт (наприклад, інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційний (наприклад, алергічний) кон'юнктивіт, амавроз Лебера, увеїт (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдит (наприклад, багатофокальний хоріоїдит), очний гістоплазмоз, блефарит, сухість очей, травматичне пошкодження очей, хвороба Шегрена. У деяких випадках клітинний проліферативний розлад являє собою рак. У деяких випадках, рак являє собою рак молочної залози, рак товстої кишки, недрібноклітинний рак легені, неходжкінську лімфому (НХЛ), рак нирки, рак передміхурової залози, рак печінки, рак голови та шиї, меланому, рак яєчників, мезотеліому або множинну мієлому.
В інших випадках винахід забезпечує антитіло проти МЕСЕ для використання в способі лікування індивідуума, що має розлад, пов'язаний з небажаною проникністю судин. У деяких випадках, розлад, пов'язаний з небажаною проникністю судин, є набряком, пов'язаним з пухлинами головного мозку, асцитом, асоційованим із злоякісними новоутвореннями, синдромом Мейга, запаленням легенів, нефротичним синдромом, перикардіальним випотом, плевральним випотом, або проникністю, пов'язаною з серцево-судинними захворюваннями.
Будь-яке з попередніх застосувань може додатково включати введення індивідууму ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного агента, наприклад, як описано нижче.
У деяких випадках винахід забезпечує антитіло проти МЕСЕ для використання в зниженні або інгібуванні ангіогенезу у суб'єкта. В іншому аспекті представлений кон'югат антитіла для використання у відновленні або інгібуванні ангіогенезу у суб'єкта. У ще одному аспекті забезпечується злитий білок для використання в зниженні або інгібуванні ангіогенезу у суб'єкта.
У ще одному аспекті пропонується полімерний склад для використання в зниженні або інгібуванні ангіогенезу у суб'єкта. У деяких варіантах здійснення винахід забезпечує антитіло проти МЕСЕ для використання в способі зниження або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що включає введення індивідууму ефективного анти-МЕСОЕ антитіла для зменшення або пригнічення ангіогенезу. Винахід також забезпечує кон'югат антитіла для використання в способі зниження або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що включає введення індивідууму ефективної кількості кон'югату антитіла. Винахід також забезпечує злитий білок для використання в способі зниження або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що включає введення бо індивідууму ефективної кількості злитого білка. Винахід також забезпечує полімерний склад для використання в способі зниження або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що включає введення індивідууму ефективної кількості полімерного складу. В інших випадках винахід забезпечує антитіло проти МЕСЕ для використання в зниженні або інгібуванні проникності судин у суб'єкта.
У деяких варіантах здійснення винахід забезпечує антитіло проти МЕСЕ для використання в зниженні або інгібуванні судинної проникності у суб'єкта, що включає введення індивідууму ефективного анти-МЕСЕ антитіла для зниження або інгібування проникності судин. "Суб'єкт" відповідно до будь-якого з вищевказаних способів використання може бути людиною.
У деяких випадках винахід забезпечує антитіло проти МЕСЕ для використання при лікуванні аутоїмунного захворювання у суб'єкта. У деяких випадках аутоїмунним розладом є ревматоїдний артрит, анкілозуючий спондилоартрит, псоріатичний артрит і хвороба Крона.
Будь-яке з попередніх застосувань може додатково включати введення індивідууму ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного агента, наприклад, як описано нижче.
Винахід відноситься до застосування антитіла проти МЕСЕ при виготовленні або приготуванні лікарського засобу. Винахід також передбачає використання кон'югату антитіла при виготовленні або приготуванні лікарського засобу. Крім того, винахід передбачає використання злитого білка при виготовленні або приготуванні лікарського засобу. Винахід також відноситься до застосування полімерного складу при виготовленні або приготуванні лікарського засобу.
Наприклад, в одному випадку лікарський засіб призначений для лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом. В іншому випадку лікарський засіб призначений для використання в способі лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом, що включає введення суб'єкту, який має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, ефективна кількість лікарського засобу. У деяких випадках окулярний розлад являє собою АМО (наприклад, волога
АМО, суха АМО, проміжна АМО, прогресуюча АМО або географічна атрофія (СА)), дегенерацію жовтої плями, набряк макули, ОМЕ (наприклад, фокальний, нецентральний ОМЕ або дифузний, пов'язаний з центром ОМЕ), ретинопатію, діабетичну ретинопатію (ОК) (наприклад, проліферативну ОК (РОК), непроліферативну ОК (МРОМК) або висотну ОК), інші пов'язані з ішемією ретинопатії, КОР, оклюзію вени сітківки (КМО) (наприклад, центральну (СКМО) і розгалужену (ВКМО) форми), СММ (наприклад, міопічну СММ), неоваскуляризацію рогівки,
Зо захворювання, пов'язані з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризацію сітківки, захворювання, пов'язані з ретинальною/ хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічну короткозорість, хворобу фон Хиппель-Ліндау, гістоплазмоз ока, ЕЕМК, хвороба Коутса, хвороба
Норрі, ОРРО, субкон'юнктивальний крововилив, рубеоз, неоваскулярне захворювання очей, неоваскулярне глаукому, пігментний ретиніт (КР), гіпертонічну ретинопатію, ангіоматозну проліферацію сітківки, макулярну телеангіектазію, неоваскуляризацію зіниці, внутрішньоочну неоваскуляризацію, дегенерацію сітківки, цістоїдний макулярний набряк (СМЕ), васкуліт, папілломедому, ретиніт, кон'юнктивіт (наприклад, інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційний (наприклад, алергічний) кон'юнктивіт, амавроз Лебера, увеїт (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдит (наприклад, багатофокальний хоріоїдит), очний гістоплазмоз, блефарит, сухість очей, травматичне пошкодження очей, хвороба Шегрена. У деяких випадках клітинний проліферативний розлад являє собою рак. У деяких випадках, рак являє собою рак молочної залози, рак товстої кишки, недрібноклітинний рак легені, неходжкінську лімфому (НХЛ), рак нирки, рак передміхурової залози, рак печінки, рак голови та шиї, меланому, рак яєчників, мезотеліому або множинну мієлому. В іншому випадку лікарський засіб призначений для зниження або інгібування ангіогенезу у суб'єкта В іншому випадку лікарський засіб призначений для використання в способі зниження або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що включає введення суб'єкту кількості, ефективного лікарського засобу для зниження або інгібування ангіогенезу. У будь-якому з попередніх застосувань медикаментів спосіб може включати введення індивідууму ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного агента, наприклад, як описано нижче.
В іншому випадку лікарський засіб призначений для лікування розладу, пов'язаного з небажаною судинною проникністю. У деяких випадках, розлад, пов'язаний з небажаною проникністю судин, є набряком, пов'язаним з пухлинами головного мозку, асцитом, асоційованим із злоякісними новоутвореннями, синдромом Мейга, запаленням легенів, нефротичним синдромом, перикардіальним випотом, плевральним випотом, або проникністю, пов'язаною з серцево-судинними захворюваннями. В іншому випадку лікарський засіб призначений для використання в способі лікування розладу, пов'язаного з небажаною судинною проникністю, що включає введення суб'єкту, який має пов'язаний з небажаною судинною проникністю розлад, ефективної кількості лікарського засобу. В іншому випадку лікарський засіб бо призначений для зниження або інгібування проникності судин у суб'єкта. В іншому випадку лікарський засіб призначений для використання в способі зниження або інгібування проникності судин у суб'єкта, що включає введення суб'єкту кількості, ефективного лікарського засобу для зниження або інгібування ангіогенезу. У будь-якому з попередніх застосувань медикаментів, спосіб може включати введення суб'єкту ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного агента, наприклад, як описано нижче. "Суб'єкт" відповідно до будь-яких з вищевказаних способів використання може бути людиною.
В іншому випадку лікарський засіб призначений для лікування аутоїмунного розладу. У деяких випадках аутоїмунним розладом є ревматоїдний артрит, анкілозуючий спондилоартрит, псоріатичний артрит і хвороба Крона. В іншому випадку лікарський засіб призначений для використання в способі лікування аутоїмунного захворювання, що включає введення суб'єкту, який має аутоїмунний розлад, ефективної кількості лікарського засобу. "Суб'єкт" відповідно до будь-якого з вищевказаних способів використання може бути людиною.
Винахід відноситься до способу лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом. В одному варіанті здійснення винаходу, спосіб включає введення індивідууму, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, ефективної кількості антитіла проти МЕСРЕ. В іншому прикладі, спосіб включає введення індивідууму, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, ефективної кількості кон'югату антитіла. В іншому прикладі, спосіб включає введення індивідууму, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, ефективної кількості злитого білка. В іншому прикладі, спосіб включає введення індивідууму, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, ефективної кількості полімерного складу. У деяких випадках окулярний розлад являє собою АМО (наприклад, волога АМО, суха АМО, проміжна АМО, прогресуюча АМО або географічна атрофія (СА)), дегенерацію жовтої плями, набряк макули, ОМЕ (наприклад, фокальний, нецентральний ОМЕ або дифузний, пов'язаний з центром ОМЕ), ретинопатію, діабетичну ретинопатію (ОК) (наприклад, проліферативну ОРГ (РОК), непроліферативну ОК (МРОК) або висотну ОК), інші пов'язані з ішемією ретинопатії,
КОР, оклюзію вени сітківки (КМО) (наприклад, центральну (СКМО) і розгалужену (ВКМО) форми), СММ (наприклад, міопічну СММ), неоваскуляризацію рогівки, захворювання, пов'язані з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризацію сітківки, захворювання, пов'язані з ретинальною/ хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічну короткозорість, хворобу фон
Ко) Хиппель-Ліндау, гістоплазмоз ока, БЕЕМК, хвороба Коутса, хвороба Норрі, ОРРО, субкон'юнктивальний крововилив, рубеоз, неоваскулярне захворювання очей, неоваскулярне глаукому, пігментний ретиніт (КР), гіпертонічну ретинопатію, ангіоматозну проліферацію сітківки, макулярну телеангіектазію, неоваскуляризацію зіниці, внутрішньоочну неоваскуляризацію, дегенерацію сітківки, цістоїдний макулярний набряк (СМЕ), васкуліт, папілломедому, ретиніт, кон'юнктивіт (наприклад, інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційний (наприклад, алергічний) кон'юнктивіт, амавроз Лебера, увеїт (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдит (наприклад, багатофокальний хоріоїдит), очний гістоплазмоз, блефарит, сухість очей, травматичне пошкодження очей, хвороба Шегрена. У деяких випадках клітинний проліферативний розлад являє собою рак. У деяких випадках, рак являє собою рак молочної залози, рак товстої кишки, недрібноклітинний рак легені, неходжкінську лімфому (НХЛ), рак нирки, рак передміхурової залози, рак печінки, рак голови та шиї, меланому, рак яєчників, мезотеліому або множинну мієлому. В інших випадках спосіб додатково включає введення індивідууму ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного агента, як описано нижче. "Суб'єкт" відповідно до будь-якого з вищевказаних способів може бути людиною.
Винахід відноситься до способу лікування розладу, пов'язаного з небажаною проникністю судин.
В одному варіанті здійснення винаходу, спосіб включає введення індивідууму, що має розлад, пов'язаний з небажаною проникністю судин, ефективної кількості антитіла проти МЕСЕ. У деяких випадках, розлад, пов'язаний з небажаною проникністю судин, є набряком, пов'язаним з пухлинами головного мозку, асцитом, асоційованим із злоякісними новоутвореннями, синдромом Мейга, запаленням легенів, нефротичним синдромом, перикардіальним випотом, плевральним випотом, або проникністю, пов'язаною з серцево-судинними захворюваннями. В інших випадках спосіб додатково включає введення індивідууму ефективної кількості щонайменше одного додаткового терапевтичного агента, як описано нижче. "Суб'єкт" відповідно до будь-якого з вищевказаних способів може бути людиною.
Передбачається, що антитіло цього винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок або його полімерний склад можуть використовуватися для лікування ссавця. В одному варіанті здійснення винаходу, антитіло або кон'югат антитіла, злитий білок або його полімерний склад вводять нелюдському ссавцю з метою отримання доклінічних даних, наприклад. Ілюстративні 60 нелюдські ссавці, що підлягають лікуванню, включають нелюдських приматів, собак, кішок,
гризунів (наприклад, мишей і щурів) та інших ссавців, на яких проводяться доклінічні дослідження. Такі ссавці можуть бути встановленими тваринами моделями захворювання, що підлягає лікуванню антитілом, або можуть бути використані для вивчення токсичності або фармакокінетики антитіла, що цікавить. У кожному з цих варіантів здійснення винаходу, дослідження ескалації дози можуть бути виконані у ссавця. Наприклад, антитіло можна вводити хазяїну-гризуна в моделі солідної пухлини. Антитіло або кон'югат антитіла, злитий білок або його полімерний склад можна вводити хазяїну (наприклад, гризуна, наприклад кролику) для окулярних фармакокінетичних досліджень, наприклад, шляхом інтравітреального введення (наприклад, інтравітреальною ін'єкцією) або використовуючи пристрої доставки порт.
У наступному аспекті винахід відноситься до фармацевтичних складів, що містить будь-які антитіла проти МЕСЕ, кон'югати антитіл, злиті білки і/або полімерні склади, представлені в цьому документі, наприклад, для використання в будь-якому з вищевказаних терапевтичних способів. В одному варіанті здійснення винаходу, фармацевтичний склад містить будь-які антитіла проти МЕСЕ, кон'югати антитіл, злиті білки і/або полімерні склади, представлені в цьому документі, і фармацевтично прийнятний носій. В іншому варіанті здійснення винаходу, фармацевтичний склад містить будь-які антитіла проти МЕСЕ, кон'югати антитіл, злиті білки іабо полімерні склади, представлені в цьому документі, і щонайменше один додатковий терапевтичний агент, наприклад, як описано нижче. У деяких варіантах здійснення винаходу, фармацевтичний склад містить одну або більше додаткових сполук. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова сполука зв'язується з другою біологічною молекулою, обраною з групи, що складається з ІІ -1р8, І -6; І -68; І -13; І -13К; РОСБЕ; ангіопоетина; Апд2; Тів-2; 51Р; інтегринів амВ3, амр5 і «581; бетацеллюліна; апеліна/АРУ); еритропоетину; фактора комплементу р; ТМЕ-альфа; НТКА1; рецептора МЕСЕ; рецептора 5-2; і білків, генетично пов'язаних з віковою макулярною дегенерацією (АМО), такі як компоненти комплементу шляху С2, фактора
В, фактора Н, СЕНКЗ, СЗБ, С5, Сба і СЗа; НТКАТ; АКМ52; ТІМРЗ; НІ А; інтерлейкін-8 (ІІ -8); сСХЗСт1; ТІ КЗ; ТІ К.4; СЕТР; ПІРС; СОЇ 10А1; ії ТМЕКЗЕТОА. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова сполука являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент.
Наприклад, в деяких випадках додаткова сполука являє собою біспецифічне антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло проти МЕСЕ/анти-Апд2, таке як КО-7716 або будь-яке
Зо біспецифічне анти-МЕСЕ/анти-Апд2 біспецифічне антитіло, описане в УМО 2010/069532 або УМО 2016/073157, або його варіант) В іншому прикладі в деяких випадках додаткова сполука являє собою антитіло проти І/-6, наприклад, ЕВІ-031 (ЕІемеп Віоїпегарешііс5, див., Наприклад, МО 2016/073890), силтуксимаб (ЗМІЇ МАМТФ)), олокізумаб, клазакізумаб, сирукумаб, елсилімомаб, герилімзумаб, ОРК-003, МЕОІ-5117, РЕ-04236921 або їх варіант. У ще одному додатковому прикладі в деяких випадках додаткова сполука являє собою антитіло проти ІІ -6К, наприклад, токілізумаб (АСТЕМКАФ)) (див., наприклад, УУО 1992/019579), сарилумаб, вобарилізумаб (А Х- 0061), БА-237 або його варіант.
Антитіла винаходу або кон'югати антитіл, злиті білки або їх полімерні склади можуть використовуватися як самостійно, так і в поєднанні з іншими агентами в терапії. Наприклад, антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можуть вводитися спільно з щонайменше одним додатковим терапевтичним агентом. У деяких варіантах здійснення додатковим терапевтичним агентом є інше антитіло, хіміотерапевтичний агент, цитотоксичний агент, антиангіогенний агент, імуносуперсивний агент, проліки, цитокін, антагоніст цитокінів, цитотоксична радіотерапія, кортикостероїд, протинабряковий, протипухлинна вакцина, анальгетик, агент, що інгібує ріст, або їх комбінації.
Наприклад, в деяких варіантах здійснення винаходу, будь-який з попередніх способів додатково включає введення одного або більше додаткових сполук. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло проти МЕСЕ, кон'югат антитіла, злитий білок або полімерний склад вводять одночасно з додатковим з'єднанням(іями). У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло
БО проти МЕСЕ, кон'югат антитіла, злитий білок або полімерний склад вводять до або після додаткового з'єднання(нь). У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова сполука зв'язується з другою біологічною молекулою, обраною з групи, що складається з І -18, І -6; ІІ - бА; 1-13; І -13К; РООБЕ; ангіопоетина; Апд2; Тіе-2; ЗІР; інтегринів смВ3, самВ5 і со5р1; бетацеллюліна; апеліна/АР.); еритропоетину; фактора комплементу Ю; ТМЕ-альфа; НТЕА1; рецептора МЕСЕ; рецептора 5-2; і білків, генетично пов'язаних з ризиком АМО, таких як компоненти комплементу шляху С2, фактора В, фактора Н, СЕНЕКЗ, СЗБ, С5, С5а і СЗа; НТКА!;
АКМ52; ТІМРЗ; НА; інтерлейкін-8 (1/-8); СХЗС1; ТІ КЗ; ТІ К4; СЕТР; ПІРС; СОЇ 10А1; і
ТМЕБНЗЕТ0ОА. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова сполука являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент. У деяких варіантах здійснення винаходу, відповідно до бо (або стосовно до) будь-якого з перерахованих вище варіантів здійснення, окулярний розлад являє собою внутрішньоочне неоваскулярне захворювання, обране з групи, яка складається з проліферативних ретинопатій, хоріоїдальної неоваскуляризації (СММ), пов'язаної з віковою макулярною дегенерацією (АМО), діабетичної і іншої пов'язаної з ішемією ретинопатію, діабетичного макулярного набряку, патологічної короткозорості, хвороби фон Хиппель-Ліндау, гістоплазмоза ока, оклюзії сітківки (КМО), включаючи СКМО і ВКМО, неоваскуляризацію рогівки, неоваскуляризацію сітківки і ретинопатії недоношених (КОР). Наприклад, в деяких випадках додаткова сполука являє собою біспецифічне антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло проти
МЕС /анти-Апд2, таке як КО-7716 або будь-яке біспецифічне анти-МЕСЕ/анти-Апд2 біспецифічне антитіло, описане в УМО 2010/069532 або УМО 2016/073157, або його варіант. В іншому прикладі в деяких випадках додаткова сполука являє собою антитіло проти ІІ -6, наприклад, ЕВІ-0О31 (ЕІемеп Віоїпегарешіс5, див., Наприклад, УМО 2016/073890), силтуксимаб (ЗМІ МАМТФ), олокізумаб, клазакізумаб, сирукумаб, елсилімомаб, герилімзумаб, ОРЕ-003,
МЕОБІ-5117, РЕ-04236921 або їх варіант. У ще одному додатковому прикладі в деяких випадках додаткова сполука являє собою антитіло проти ІЇ/-6К, наприклад, токілізумаб (АСТЕМКАФ) (див., наприклад, УМО 1992/019579), сарилумаб, вобарилізумаб (А Х-0061), 5А-237 або його варіант.
У деяких випадках антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можуть вводитися в комбінації щонайменше з одним додатковим терапевтичним засобом для лікування окулярного розладу, наприклад окулярного розладу описаного в даному документі (наприклад, АМО (наприклад, волога АМО), ОМЕ, ОК або ЕМО). Ілюстративні додаткові терапевтичні агенти для комбінованої терапії для лікування окулярних розладів включають, без обмеження, антиангіогенні агенти, такі як антагоністи МЕСЕ, включаючи, наприклад, анти-МЕСЕ антитіла (наприклад, анти-МЕСЕ Бар ГОСЕМТІЗФ (Ранібізумаб)), злиті білки розчинного рецептора (наприклад, злитий білок рекомбінантного розчинного рецептора
ЕМІ'ЕАФ (афліберцепт, також відомий як МЕСЕ Тгар Еує, Кедепегоп/Амепії5)), аптамери (наприклад, пегильований аптамер проти МЕСЕ МАСИОСЕМФЕУ (пегаптаніб натрію, Мехеаг
Рпагтасешіса!І5/051 Рпагтасеціїіса!5)) і інгібітори тирозинкінази МЕСЕК (наприклад, 4-(4-бром-2- фтораніліно) -6-метокси-7-(1-метилпіперідин-4-ілметоксі)хіназолін (206474), 4-(4 -фторо-2- метиліндол-5-ілоксі)-б-метокси-7-(З-піролідин-1-ілпропоксі) хіназолін (А2О2171), ваталаніб
Зо (РТК787), семаксамібін (505416, БОСЕМ) і ЗОТЕМТФ (сунітиніб)); Триптофаніл-тРНК-синтетаза (Тр5); скваламін; КЕТААМЕФ (ацетат анекортава для суспензії депо, АїЇсоп, Іпс.); проліки комбретастатин А4 (СА4Р); МІРЕРКЕХФ (міфепристон-ги486); субтенон триамцинолону ацетоніду; інтравітреального кристалічний триамцинолон ацетонід; матричні інгібітори металопротеїнази (наприклад, Пріномастат (АС3340, Ріїгег)); фтороцинолон ацетонід (включаючи інтраокулярний імплантат флуоцинолону, системи Ваийзсп 5 Готр/Сопігої Оеїїмегу); ліномід; інгібітори функції інтегрина ВЗ; ангіостатин і їх комбінації. Ці та інші терапевтичні агенти, які можна вводити в комбінації з антитілом даного винаходу, описані, наприклад, в заявці на патент США Мо 05 2014/0017244, яка повністю включена в цей опис за допомогою посилання.
Інші приклади додаткових терапевтичних агентів, які можуть бути використані в комбінації з антитілом даного винаходу, або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад для лікування окулярного розладу (наприклад, АМО, ЮОМЕ, ОК або КМО), включають, але не обмежуються ними, МІЗОЮОММЕФ (вертепорфін, світлоактивний лікарський засіб, який зазвичай використовується в поєднанні з фотодинамічною терапією з нетепловим лазером), РКСА12,
Ендовіон (М5 3728, МеигобЗеагсп А/5), нейротрофічні фактори (наприклад, нейротрофічний фактор гліального походження (СОМЕ) і циліарний нейротрофічний фактор (СМТЕ)), дилтиазем, дорзоламід, РНОТОТКОРФ), 9-цис-ретиналь, лікарські засоби для очей (наприклад, інгібітори йодистого фосфонію, ехотіофата або карбоангідрази), веовастат (АЕ-941, АКіета І арогайогієв,
Іпс.), Сірна-027 (АСЕ-745, біта Тпегарешііс5, Іпс.), нейротрофіни (в тому числі, в якості прикладу, МТ-4/5, Сепепівес!й), Сапаб5 (Асийу РНаптасешіісаІє), ІМ5-37217 (Іпзріге
РПпапгтасеціїгса!5), антагоністи інтегрину (в тому числі від Уегіпі АС і АрБой І арогайюгіе5), ЕО-3306 (АК ТПегарешісх 14.) ВОМ-Е (Віобівт Ца.), талідомід (як використовується, наприклад,
ЕпігеМей, Іпс.), кардіотрофін-1 (Сепепіесі), 2-метоксіестрадіол (АПегдап/Осшех), 0 -8234 (Тогау
Іпдивійев), МТО-200 (Менигоїесі)), тетратіомолібдат (Мічиганський університет), І ММ-002 (І упкеив5
Віотесі)), сполука мікроскопічних водоростей (Адиазеагсп/АІрапу, Мега Рпагтасецшііса!в5), 0-9120 (СеШесн Сгоир ріс), АТХ-510 (Нататаїзи РНоїопісв), ТаЕ-бета 2 (Сепгуте/Сенйгіх), інгібітори тирозинкінази (наприклад, від АПйегдап, ЗИОСЕМ або Ріїге), МХ-278-Ї (МехХзіаг
РіпаптасецшіісаІв/Ссіїєад 5сієпсе5), Орі-24 (ОРТІЗ Егапсе 5А), нейропротекторні клітини ганглія сітківки (Содепі Меигозсіепсев), похідні М-нітропіразола (Техаз А 85. М Опімегзйу Зузіет), КР-102 (Кгтепі5Ку РПпаптасеціїсаІ5), циклоспорин А, терапевтичні агенти, які використовуються в
Ге) фотодинамічній терапії (наприклад, МІЗОЮММЕФ; рецептор-РОТ, ВгівіоІ-Муєтв Бацірр, Со.;
порфімер натрію для ін'єкцій з РОТ; вертепорфін, ОТ Іпс.; ростапорфін з РОТ, Мігамепі Меаісаї
Тесппоодієв; талапорфін з РОТ, Мірроп РеїгоЇІецт; і мотексафін лутетіум, Рпаптасусіїсв, Іпс.), антисмислові олігонуклеотиди (включаючи, наприклад, продукти, перевірені Момадаїї Рпагта ЗА і 1515-13650, Ібі5 Рпагтасеціїсаї!5) і їх комбінації.
Антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можна вводити в поєднанні з терапією або хірургічною процедурою для лікування окулярного розладу (наприклад, АМО, ОМЕ, ОК або КМО), включаючи, наприклад, лазерну фотокоагуляцію (наприклад, панретинальну фотокоагуляцію (РКР)), лазерну генерацію друзів, операцію з макулярними отворами, операцію макулярної транслокації, мініатюрні телескопи, що імплантуються, ангіографію РНІ-руху (також відому як мікролазерна терапія і лікування фідерних судин), протонну променеву терапію, мікростимуляційну терапію, відшарування сітківки і склоподібну хірургію, вдавлення склери, субмакулярну хірургію, транспупіллярну термотерапію, терапію фотосистеми Ї, використання РНК-інтерференції (КМАЇ), екстракорпоральний реофероз (також відомий як мембранна диференціальна фільтрація і реотерапія), імплантацію мікрочіпів, терапію стовбуровими клітинами, замісну терапію генами, терапію генами рибозима (включаючи генну терапію для елемента відповіді гіпоксії, Охіога
Віотедіса, Іепірак, Сепеїйх; і огенну терапію РОЕБЕ, СепМмес), трансплантацію фоторецепторів/ретинальних клітин (включаючи епітеліальні клітини сітківки, які трансплантуються, Оіасгіп, пс, трансплантацію клітин сітківки, Се! Сепевуб, Іпс.), голковколювання і їх комбінації.
У деяких випадках антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можуть вводитися в комбінації з антиангіогенним засобом для лікування окулярного розладу (наприклад, АМО, ОМЕ, ОК, або ЕМО). Будь-який відповідний антиангіогенний агент може бути використаний в комбінації з антитілом цього винаходу, включаючи, але не обмежуючись ними, ті, які перераховані Сагтеїїєї еї а. Маїшге 407: 249-257, 2000. У деяких варіантах здійснення винаходу, антиангіогенний агент являє собою антагоніст МЕСБЕ, включаючи, але не обмежуючись ними, антитіло проти МЕСЕ (наприклад, анти-МЕСЕ Рар
ГОСЕМТІЗФ (Ранібізумаб), ЕТН-258 (раніше Е5ВА-1008, анти-МЕСЕ фрагмент одноланцюгового антитіла, Момагії5) або біспецифічне антитіло проти МЕСЕ (наприклад, біспецифічне антитіло
Зо проти МЕОСБ/антиангіопоетин 2, таке як КО-7716, Коспе)), злитий білок розчиного рекомбінантного рецептора (наприклад, ЕМ ЕАФ (афліберцепт)), варіант МЕСЕ, розчинний фрагмент МЕСЕК, аптамер, здатний блокувати МЕСЕ (наприклад, пегаптаніб) або МЕСЕК, що нейтралізує антитіло проти МЕСЕЕ, інгібітор малих молекул тирозинкіназ МЕСЕК, анти-УЕаЕ рАЕРІпПФ (наприклад, абіципар пегол), малі інтерферуючі РНК, які інгібують експресію МЕСЕ або
МЕСРЕЕ, інгібітор тирозинкінази МЕСЕК (наприклад, 4-(4-бромо-2-фтораніліно) -6-метокси-7-(1- метилпіперідін-4-ілметокси хіназолін (206474), 4- (4-фтор-2-метиліндол-5-ілокси)-6-метокси-7- (З-піролідин-1-ілпропоксі) хіназолін (А2О2171), ваталаніб (РТК 787), семаксамініб (505416;
ЗИСЕМ) і ЗОТЕМТ (сунітиніб)) і їх комбінації. У деяких випадках біспецифічне антитіло проти
МЕСЕ зв'язується з другою біологічною молекулою, включаючи, але не обмежуючись ними, ЇГ-- 18; 1--6; І-6К; РОСЕ (наприклад, РОСЕ-ВВ); ангіопоетин; ангіопоетин 2; Тів-2; З1Р; інтегрини амВ3, ам8В5 і «581; бетацеллюлін; апелін/АР.); еритропоетин; фактор комплементу 0; ТМЕ- альфа; НТКАТ; рецептор МЕСЕ (наприклад, МЕСЕК!І, МЕСЕК2, МЕСЕКЗ, тпруУЕгСЕК або 5МЕСЕК); рецептор 5-2; і білки, генетично пов'язані з ризиком вікової макулярної дегенерації (АМО), такі як компоненти комплементу шляху С2, фактор В, фактор Н, СЕНКЗ, СЗБ, С5, Са і
СЗа; НТАВАТ; АВМ52; ТІМРЗ; НІ А; /-8; СХЗС1; ТІ КЗ; ТІ К4; СЕТР; ПІРС; СОЇІ1ОА; і
ТМЕКБЕТОА. Наприклад, в деяких випадках додаткова сполука являє собою біспецифічне антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло проти МЕСЕ/анти-Апод2, таке як КО-7716 або будь- яке біспецифічне анти-МЕСЕ/анти-Апд2 біспецифічне антитіло, описане в УМО 2010/069532 або
МО 2016/073157, або його варіант.
Інші відповідні антиангіогенні агенти, які можна вводити в комбінації з антитілом даного винаходу, або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад для лікування окулярного розладу (наприклад, АМО, ОМЕ, ОК або КМО) включають кортикостероїди, ангіостатичні стероїди, анкортав ацетату, ангіостатин, ендостатин, інгібітори тирозинкінази, інгібітори матричної металопротеїнази (ММР), інсуліноподібний фактор росту-зв'язуючий білок З (ІСЕВРЗ), антагоністи стромально-доставленого фактора (5ОБ-1) (наприклад, антитіла проти
ЗОБ-1), фактор пігментного епітелію (РЕОЕ), гама-секретази, дельта-подібний ліганд 4, антагоністи інтегрина, антагоністи гіпоксія-індуцібельного фактора (НІБ)-1а, антагоністи СК2 протеїнкінази, агенти, які інгібують стовбурові клітини (наприклад, ендотеліальна клітина- попередник) на місці неоваскуляризації (наприклад, антитіло проти судинного ендотеліального 60 кадгерина (СО-144) і/або антитіло проти ЗОБЕ-1) і їх комбінації.
В іншому прикладі в деяких випадках антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок іМабо його полімерний склад можна вводити в комбінації з агентом, який володіє активністю проти неоваскуляризації для лікування окулярного розладу (наприклад, АМО, ОМЕ, ОК або
ЕМО), такого як протизапальний лікарський засіб, ціль інгібітора рапаміцину (тТОК) ссавця (наприклад, рапаміцин, АРІМІТОКФ (еверолімус) і ТОКІ5БЕСФО (темсиролімус)), циклоспорин, антагоніст фактора некрозу пухлини (ТМЕ) (наприклад, антитіло проти ТМЕса або його антигензв'язуючий фрагмент (наприклад, інфліксимаб, адалімумаб, цертолізумаб пегол і голімумаб) або злитий білок розчинного рецептора (наприклад, етанерцепт)), агент анти- комплементу, нестероїдний протизапальний агент (МАО) або їх комбінації.
У ще одному додатковому прикладі в деяких випадках антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можна вводити в комбінації з агентом, який є нейропротективним і може потенційно зменшувати прогресування сухої АМО до вологої АМО, такого як клас ліків, які називаються "нейростероїдами", які включають такі препарати, як дегідроепіандростерон (ОНЕА) (торгові марки: РЕАБТЕКА М і РІОБСІМЄ», дегідроепіандростерона сульфату і прегненолона сульфату.
Будь-який відповідний терапевтичний агент АМО може вводитися в якості додаткового терапевтичного агента в поєднанні з антитілом винаходу або кон'югатом антитіла, злитим білком і/або його полімерним складом для лікування окулярного розладу (наприклад, АМО,
ОМЕ, ОК, або КМО), включаючи, але не обмежуючись ними, антагоніст МЕСЕ, наприклад анти-
МЕСЕ антитіло (наприклад, ГОСЕМТІБФ (Ранібізумаб), ЕКТН-258 (раніше ЕБВА-1008, одноланцюговий анти-МЕСЕ фрагмент антитіла, Момагпібє) або біспецифічне антитіло проти
МЕСЕ (наприклад, біспецифічне антитіло проти МЕСРЕ/антиангіопоетин 2, таке як КО-7716,
Коспе)), розчинний злитий білок рецептора МЕСЕ (наприклад, ЕМІ ЕАФ (афліберцепт)), анти-
МЕСЕ ОАРКРІпФ (наприклад, абіципар пегол, Моїесціаг Рагіпег5 АС/АПегдап) або анти-МЕСЕ аптамери (наприклад, МАСОСЕМО (пегаптаніб натрію)); антагоніст тромбоцитарного фактора росту (РОСЕ), наприклад анти-РОСЕ антитіло, антитіло проти РОСЕК (наприклад, КЕСМ2176- 3), пегильований аптамер проти РОСЕ-ВВ (наприклад, ЕОМІЗТАФ, Орпіпоїесп/Момагіі5), злитий білок розчинного РОСЕК-рецептора або подвійний антагоніст РОСЕ//ЕСЕ (наприклад, інгібітор малих молекул (наприклад, ОЕ-120 (Запіеєп) або Х-82 (Тугодепех)) або біспецифічні анти-
Зо РОСБГ/анти-МЕСЕ антитіла)); МІЗОЮОММЕФ (вертепорфін) в поєднанні з фотодинамічною терапією; антиоксидант; антагоніст системи комплементу, наприклад антагоніст фактора комплементу С5 (наприклад, інгібітор малих молекул (наприклад, АКС-1905 Орійпоїесі) або анти-С5-антитіло (наприклад, ГЕС-316, Момагіі5), антагоніст пропердина (наприклад, антитіло проти пропердина, наприклад Сі с-561, АЇсоп) або антагоніст фактора комплементу 0 (наприклад, антитіло проти фактора комплементу О, наприклад, лампалізумаб, Коспе)); модифікатор циклу перетворення родопсину (наприклад, гідрохлорид еміксустат); сквуаламін (наприклад, ОНК-102; Рпагт РІПагтасеціїсаї); вітаміни і мінеральні добавки (наприклад, ті, які описані в дослідженні з вивчення захворювань, пов'язаних з віком 1 (АКЕО51, цинк і/або антиоксиданти) і в дослідженні 2 (АКЕО52, цинк, антиоксиданти, лютеїн, зеаксантин і/або омега-3 жирні кислоти)); заснована на клітинах терапія, наприклад, МТ-501 (Непехив); РН- 05206388 (РІї2ег), трансплантація клітин пиИСМ5-5С (5іетсСеїІв), СМТО-2476 (дапв5зеп), ОрВедеп (Мейгозсіепсе Сей СеПиге) або трансплантація клітин МА0ОЗ-ПАРЕ (Осаїа ТНегарешіісв); антагоніст тканинного фактора (наприклад, ПІ-соп1; Ісопіс ТПпегарешісв5); агоніст альфа- адренергічного рецептора (наприклад, бримонідин тартрат); пептидна вакцина (наприклад, 5- 646240; 5Піоподі); антагоніст амілоїду бета (наприклад, анти-бета амілоїдне моноклональне антитіло, наприклад з5К-933776); антагоніст 51Р. (наприклад, анти-51Р антитіло, наприклад,
ІЗОМЕР "М: | рай Іпс); антагоніст КОВО (наприклад, антитіло проти КОВО4, наприклад О5- 7080а, бБаїсні ЗапКуо); лентівірусний вектор, який експресує ендостатин і ангіостатин (наприклад, Кеїїпобіаб; і будь-яку їх комбінацію. У деяких випадках терапевтичні агенти АМО (включаючи будь-який з попередніх терапевтичних агентів АМО) можуть бути спільно складені.
Наприклад, анти-РОСЕК антитіло КЕСМ2176-3 може бути спільно сформульовано з афліберцептом (ЕМ ЕАФ). У деяких випадках такий спільний препарат можна вводити в комбінації з антитілом даного винаходу. У деяких випадках окулярний розлад являє собою АМО (наприклад, волога АМО).
Антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можна вводити в поєднанні з ГОСЕМТІБФ (ранібізумабом) для лікування окулярного розладу (наприклад, АМО, ОМЕ, ОК або КМО). ГОСЕМТІ5О (Ранібізумаб) можна вводити, наприклад, при 0,3 мг/око або 0,5 мг/око інтравітреальною ін'єкцією, наприклад, кожен місяць. У деяких випадках окулярний розлад являє собою АМО (наприклад, волога АМО).
Антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можна вводити в поєднанні з ЕМІ ЕАФ (афліберцепт) для лікування окулярного розладу (наприклад,
АМО, ОМЕ, ОК або ЕМО). ЕМІ ЕАФ (афліберцепт) можна вводити, наприклад, в 2 мг/око інтравітреальною ін'єкцією, наприклад, кожні чотири тижні (24УМ) або 0О4УМ протягом перших трьох місяців з подальшими ін'єкціями один раз в два місяці для підтримки. У деяких випадках окулярний розлад являє собою АМО (наприклад, волога АМО).
Антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можна вводити в поєднанні з МАСОСЕМФ (пегаптаніб натрію) для лікування окулярного розладу (наприклад, АМО, ЮОМЕ, ОК або КМО). МАСИСЕМФ (пегаптаніб натрію) можна вводити, наприклад, в 0,3 мг/око інтравітреальною ін'єкцією кожні шість тижнів. У деяких випадках окулярний розлад являє собою АМО (наприклад, волога АМО).
Антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можна вводити в поєднанні з МІЗООММЕФ (вертепорфін) в поєднанні з фотодинамічною терапією для лікування окулярного розладу (наприклад, АМО, ОМЕ, ОК або ЕМО). МЗОЮММЕФ можна вводити, наприклад, шляхом внутрішньовенної інфузії в будь-якій зручній дозі (наприклад, 6 мг/м? площі поверхні тіла) і доставлятися один раз кожні три місяці (наприклад, більше 10 хвилин інфузії). У деяких випадках окулярний розлад являє собою АМО (наприклад, волога
АМО).
Антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можна вводити в комбінації з антагоністом РОСЕ для лікування окулярного розладу (наприклад, АМО,
ОМЕ, ОК або КМО). Ілюстративні антагоністи РОС, які можуть бути використані в комбінації з антитілом даного винаходу, включають антитіло проти РОСЕ, антитіло проти РОСЕБЕ, інгібітор малих молекул (наприклад, сквуаламін), пегильований аптамер проти РОСЕ-В, такий як
ЕОМІБ5ТАФ (Е10030, Орпнвоїесп/Момагііх) або подвійний антагоніст РОСЕ//ЕСЕ (наприклад, інгібітор малих молекул (наприклад, ОЕ-120 (Запіеп) або Х-82 (Тугодепех)) або біспецифічне антитіло проти РОСГБ/анти-МЕСЕ). Наприклад, ЕОМІЗТАФ можна вводити в якості допоміжної терапії до антитіла по винаходу. ЕОМІЗТАФ можна вводити в будь-якій зручній дозі, наприклад, від 0,1 мг/око до 2,5 мг/око, наприклад, при 0,3 мг/око або 1,5 мг/око, наприклад, шляхом інтравітреальної ін'єкції, наприклад кожні чотири тижні (04УМ). ОНК-102 (офтальмічний розчин кальмаміна лактату, 0,295) можна вводити очними краплями, наприклад, два рази на день.
ОНА-102 можна вводити в комбінації з антагоністами МЕСЕ, такими як ГОСЕМТІЗФ або
ЕМ ЕАФ). У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло даного винаходу можна вводити в комбінації з ОНА-102, ГОСЕМТІБФ і/або ЕМІ ЕАФ. У деяких випадках окулярний розлад являє собою АМО (наприклад, волога АМО).
Антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можна вводити в поєднанні з КТН-258 для лікування окулярного розладу (наприклад, АМО, ОМЕ, ОК або ЕМО). КТН-258 можна вводити, наприклад, шляхом інтравітреальної ін'єкції або інфузії в око. Для інтравітреальної ін'єкції КТН-258 можна вводити в будь-якій зручної дозі (наприклад, З мг/око або 6 мг/око), наприклад, кожні чотири тижні (24МУМ) протягом перших трьох місяців в якості завантаження, після чого кожну ін'єкцію 12 тижнів (912УМ) або кожні вісім тижнів (О8УМ) для підтримки. У деяких випадках окулярний розлад являє собою АМО (наприклад, волога
АМО).
Антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можна вводити в поєднанні з абіципар пеголом для лікування окулярного розладу (наприклад, АМО,
ОМЕ, ОК або КМО). Абіципар пегол можна вводити, наприклад, шляхом інтравітреальної ін'єкції. Абіципар пегол можна вводити в будь-якій зручній дозі (наприклад, 1 мг/око, 2 мг/око, З мг/око, 4 мг/око або 4,2 мг/око), наприклад, кожні чотири тижні (24УМ) для перших трьох місяців в якості завантаження, а потім ін'єкція кожні 12 тижнів (012УМ) або кожні вісім тижнів (О8МУ) для підтримки. У деяких випадках окулярний розлад являє собою АМО (наприклад, волога АМО).
Будь-який відповідний ЮОМЕ та/або терапевтичний агент ОК можна вводити в комбінації з антитілом винаходу або кон'югатом антитіла, злитим білком і/або його полімерним складом для лікування окулярного розладу (наприклад, АМО, ЮМЕ, ОК, або КМО), включаючи, але не обмежуючись ними, антагоніст МЕСЕ (наприклад, ГОСЕМТІБФ або ЕМІ ЕАФ)), кортикостероїд (наприклад, імплантат кортикостероїдів (наприклад, ОЛОКОЕХФ (імплантат дексаметазону) або
ІСОМІЕМФ (флюоцинолон ацетонід інтравітеральний імплантат)) або кортикостероїд, приготований для введення шляхом інтравітеральної ін'єкції (наприклад, триамцинолон ацетонід)) або їх комбінацій. У деяких випадках окулярний розлад являє собою ЮОЮМЕ та/або ОК.
Антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можна вводити в поєднанні з ГОСЕМТІБО (ранібізумабом) для лікування ОМЕ та/або ОРЕ (наприклад,
МРОК або РОК). ГОСЕМТІ5О (Ранібізумаб) можна вводити, наприклад, при 0,3 мг/око або 0,5 мг/око інтравітреальною ін'єкцією, наприклад, кожні чотири тижні (04ММ).
Антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можна вводити в поєднанні з ЕМ ЕАФ (афліберцепт) для лікування ОМЕ та/або ОК (наприклад, МРОК або РОК). ЕМЕАФ (афліберцепт) можна вводити, наприклад, в 2 мг/око інтравітреальної ін'єкції, наприклад, кожні чотири тижні (94УМ) або О4УУ протягом перших чотирьох місяців з подальшими ін'єкціями один раз кожні вісім тижнів (О8УМ) для підтримки.
Антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можна вводити в поєднанні з ОЛОКОЕХФ (інтравітреальний імплантат дексаметазону) для лікування
ОМЕ та/або ОК. О2ОКОЕХФ можна вводити як інтравітреальний імплантат дексаметазону 0,7 мг, який можна вводити кожні шість місяців.
Антитіло винаходу або кон'югат антитіла, злитий білок і/або його полімерний склад можна вводити в поєднанні з ІГОМІЕМФ (інтравітреальний імплантат дексаметазону) для лікування
ОМЕ та/"або ОК. 02ОКОЕХФ можна вводити як інтравітреальний імплантат флюоцинолона ацетоніда 0,19 мг, який можна елюювати зі швидкістю 0,25 мкг/день і може діяти до близько 36 місяців.
У деяких випадках режим лікування ТАО/РЕКМ або режим лікування ТАЕ можна використовувати для введення терапевтичного агента АМО (наприклад, ранібізумаба або афліберцепта) в комбінації з антитілом винаходу або кон'югатом антитіла, злитим білком і/або полімерним складом. Для режиму ТАО/РЕМ після початкових інтравітреальних ін'єкцій кожні чотири тижні (04УМ) (як правило, протягом близько З місяців), суб'єкт контролюється щомісяця або через кожен місяць (або навіть більш тривалі інтервали), при ін'єкціях, що вводяться в разі доведення активності захворювання (наприклад, зниження гостроти зору або рідини на оптичній когерентній томографії (ОКТ)). Для режиму ТАЕ суб'єкт може оброблятися кожні чотири тижні (04ММ) з наступним продовженням інтервалу лікування на фіксоване число тижнів (наприклад, 2 тижні) для кожного наступного відвідування до максимального інтервалу (наприклад, кожні 6 тижнів, кожні 8 тижнів, кожні 10 тижнів або кожні 12 тижнів). Око(очі) можна спостерігати і лікувати при кожному відвідуванні, навіть якщо немає ознак активності хвороби. Якщо макула здається вологою (наприклад, через ОСТ), інтервал для ін'єкцій може бути скорочений
Зо (наприклад, -2 тижні), поки макула знову не стане сухою. У деяких випадках окулярний розлад являє собою АМО (наприклад, волога АМО).
Такі комбіновані терапії, зазначені вище, включають комбіноване введення (де два або більше терапевтичних агентів включені в одні і ті ж або окремі склади) і окреме введення, і в цьому випадку введення антитіла по винаходу може відбуватися до, одночасно і/або в наступне запровадження додаткового терапевтичного агента або агентів. В одному варіанті здійснення винаходу, введення анти-МЕСЕ антитіла, кон'югату антитіл, злитого білка або полімерного складу і введення додаткового терапевтичного агента відбувається протягом близько одного, двох, трьох, чотирьох або п'яти місяців або протягом близько однієї, двох або трьох тижнів або протягом близько одного, двох, трьох, чотирьох, п'яти або шести днів один від одного. Антитіла, кон'югати антитіл, злиті білки і полімерні склади винаходу можуть також використовуватися в поєднанні з променевою терапією.
Антитіло, кон'югат антитіла, злитий білок або полімерний склад даного винаходу (і будь-який додатковий терапевтичний агент) для профілактики або лікування окулярного захворювання або стану можуть вводитися будь-якими відповідними засобами, включаючи, але не обмежуючись ними, наприклад, окулярну, інтраокулярну і/або інтравітреальну ін'єкцію і/або навколосклеральну ін'єкцію, і/або субтенозну ін'єкцію, і/або суперхороїдальну ін'єкцію, і/або місцеве введення у вигляді очних крапель і/або мазі. Такі антитіла, кон'югати антитіл, злиті білки або полімерні склади винаходу можуть бути доставлені різними способами, наприклад, інтравітреально як пристрій і/або депо, яке забезпечує повільне вивільнення сполуки в склоподібне тіло, включаючи описані в таких посиланнях, як Іпігаосцаг Огид Оеїїмегу, Чайне, Чайне,
Азпіоп, апа Реагзоп, еайоге, Тауюг 5 Егапсі5 (Магсп 2006). В одному прикладі пристрій може бути у вигляді міні-насоса, і/або матриці, і/або системи пасивної дифузії, і/'або інкапсульованих клітин, які вивільняють з'єднання протягом тривалого періоду часу (Іпігаосшаг Огид Оеїїмегу,
Уайе, Чайне, А5піоп, апа Реагзоп, еайоге, Тауїог 5 Егапсіз5 (Магсп 2006). Додаткові підходи, які можуть бути використані, описані в розділі К нижче.
Препарати для окулярного, інтраокулярного або інтравітреального введення можуть бути отримані способами і з використанням ексципієнтів, відомих в цій галузі техніки. Важливою особливістю ефективного лікування є правильне проникнення через око. На відміну від захворювань передньої частини ока, коли ліки можуть бути доставлені місцево, захворювання бо сітківки зазвичай виграють від більш сайт-специфічного підходу. Очні краплі і мазі рідко проникають в задню частину ока, а гематоофтальмічний бар'єр перешкоджає проникненню системно вводимих препаратів в очну тканину. Відповідно, спосіб вибору для доставки ліків для лікування захворювання сітківки, такого як АМО і СММ, зазвичай являє собою пряму інтравітреальну ін'єкцію. Інтравітреальні ін'єкції зазвичай повторюються з інтервалами, які залежать від стану пацієнта, а також від властивостей і періоду напіврозпаду доставленого препарату. Додаткові підходи, які можуть бути використані, описані в розділі К нижче.
Кількість антитіла, його варіант антитіла, кон'югат антитіла, злитий білок або його полімерний склад, який буде ефективний при лікуванні конкретного окулярного розладу або стани, буде залежати від характеру розладу або стану і може бути визначений стандартними клінічними методами. Там, де це можливо, бажано спочатку визначити криву доза-реакція і фармацевтичні композиції винаходу іп міїго, а потім в корисних модельних системах тварин перед тестуванням на людях.
Додаткові відповідні засоби для введення включають в себе парентеральне, внутрішньолегеневе і інтраназальне і, при бажанні, для місцевого лікування, внутрішньовенне введення. Парентеральні інфузії включають внутрішньом'язове, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньочеревне або підшкірне введення. Дозування може відбуватися будь-яким підходящим шляхом, наприклад, шляхом ін'єкцій, таких як внутрішньовенні або підшкірні ін'єкції, в залежності від того, чи є введення короткочасним або хронічним. У цьому документі розглядаються різні графіки дозування, включаючи, але не обмежуючись ними, одноразове або множинне введення в різні моменти часу, введення болюсу і пульсову інфузію. У деяких випадках, антитіло проти УЕСЕ, кон'югат антитіла, злитий білок або полімерний склад винаходу можуть вводитися, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно, черезшкірно, внутрішньоартеріально, внутрішньоочеревно, внутрішньоочагово, інтракраніально, внутрішньосуглобово, внутрішньопростатично, внутрішньоплеврально, інтратрахеально, інтратекально, інтраназально, інтравагінально, інтраректально, місцево, внутрішньопухлинно, внутрішньоочеревно, перитонеально, інтравентрикулярно, підшкірно, субкон'юктивно, інтравезикулярно, крізь слизову, інтраперикардіально, внутрішньопуповінно, інтраорбітально, перорально, трансдермально, шляхом інгаляції, шляхом ін'єкції, шляхом імплантації, шляхом інфузії, шляхом безперервної
Зо інфузії, локалізованими перфузійними ваннами, які діють на клітини безпосередньо, катетером, промиванням, кремами або ліпідними композиціями.
Для профілактики або лікування захворювання відповідна доза антитіла, кон'югату антитіла, злитого білка або полімерного складу даного винаходу (при використанні окремо або в поєднанні з одним або більше іншими додатковими терапевтичними агентами) буде залежати від типу захворювання, яке необхідно лікувати, типу антитіла, тяжкості і перебігу захворювання, незалежно від того, чи вводиться антитіло в профілактичних або терапевтичних цілях, попередньої терапії, клінічної історії пацієнта і відповіді на антитіло, а також на думку лікуючого лікаря. Антитіло, кон'югат антитіла, злитий білок або полімерний склад відповідним чином вводять пацієнтові в один час або протягом ряду процедур. Залежно від типу і тяжкості захворювання, від близько 1 мкг/кг до 15 мг/кг (наприклад, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,8 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, З мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, б мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг або 10 мг/кг) антитіла може бути вихідної дозою для введення пацієнтові, незалежно від, наприклад, за допомогою одного або більше окремих введень або шляхом безперервної інфузії. У деяких варіантах здійснення винаходу, антитіло використовується від близько 0,01 мг/кг до близько 45 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 40 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 35 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 30 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 25 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 20 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 15 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 10 мг/кг, від близько 0,01 мг/кг до близько 5 мг/кг або від близько 0,01 мг/кг до близько 1 мг/кг. Одна типова добова доза може варіюватися від близько 1 мкг/кг до 100 мг/кг або більше, в залежності від факторів, згаданих вище. При повторних введеннях протягом декількох днів або довше, залежно від стану, лікування, як правило, має підтримуватися до тих пір, поки не відбудеться бажане пригнічення симптомів хвороби.
У деяких варіантах здійснення винаходу, способи можуть додатково включати додаткову терапію. Додатковою терапією можуть бути променева терапія, хірургія, хіміотерапія, генна терапія, ДНК-терапія, вірусна терапія, РНК-терапія, імунотерапія, трансплантація кісткового мозку, нанотерапія, терапія моноклональними антитілами або комбінація вищевикладеного.
Додаткова терапія може бути у вигляді ад'ювантної або неоад'ювантної терапії. У деяких варіантах здійснення винаходу, додатковою терапією є введення невеликого молекулярного ферментативного інгібітора або антиметастатичного агента. У деяких варіантах здійснення 60 винаходу, додатковою терапією є введення обмежуючих побічні ефекти агентів (наприклад,
агентів, призначених для зменшення виникнення і/або тяжкості побічних ефектів лікування, таких як агенти проти нудоти і т. д.). У деяких варіантах здійснення винаходу, додатковою терапією є променева терапія. У деяких варіантах здійснення винаходу, додатковою терапією є операція. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова терапія являє собою комбінацію променевої терапії і хірургії. У деяких варіантах здійснення винаходу, додатковою терапією є гамма-опромінення. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова терапія може являти собою окреме введення одного або більше терапевтичних агентів, описаних вище.
Зрозуміло, що будь-який з вищевказаних складів або терапевтичних способів може бути виконаний з використанням імунокон'югата по винаходу замість або на додаток до анти-МЕСЕ антитіла.
Зрозуміло, що будь-яка з вищевказаних композицій або будь-який з терапевтичних способів може бути здійснений з використанням кон'югату антитіла, злитого білка або полімерного складу даного винаходу (наприклад, будь-який описаний в даному документі, наприклад, в розділі К нижче) замість або додатково до анти-МЕСЕ антитіла.
Ї. Виріб
У ще одному аспекті винаходу запропоновано виріб, що містить матеріали, придатні для лікування, профілактики і/або діагностики розладів, описаних вище. Виріб включає контейнер і етикетку або вкладиш в упаковку, вкладений або пов'язаний з контейнером. Відповідні контейнери включають, наприклад, пляшки, флакони, шприці, пакети з розчинами для внутрішньовенного введення і т. д. Контейнери можуть бути виготовлені з різних матеріалів, наприклад, скла або пластмаси. Контейнер містить композицію, яка ефективно застосовується при лікуванні, профілактиці та/або діагностиці патологічного стану окремо або в комбінації з іншою композицією, і може мати стерильний вхідний отвір (наприклад, контейнер може являти собою пакет з розчином для внутрішньовенного введення або флакон з пробкою, яку проколюють голкою, для підшкірної ін'єкції). Щонайменше один активний агент в композиції є антитілом відповідно до даного винаходу. На етикетці або на вкладиші в упаковку зазначено, що композиція використовується для лікування обраного патологічного стану. Крім того, виріб може містити (а) перший контейнер з композицією, яка міститься в ньому, який відрізняється тим, що композиція містить антитіло відповідно до даного винаходу; і (Б) другий контейнер з композицією, яка міститься в ньому, яка відрізняється тим, що композиція включає додаткове цитотоксичне або інший терапевтичний засіб. Виріб в цьому варіанті здійснення винаходу може додатково містити вкладиш для упаковки, який вказує, що композиції можуть використовуватися для лікування конкретного стану. Альтернативно або додатково виріб може додатково містити другий (або третій) контейнер, що містить фармацевтично прийнятний буфер, такий як бактеріостатична вода для ін'єкцій (ВМУРІ), натрій-фосфатний буфер, розчин Рінгера та розчин глюкози. Він може також включати інші матеріали, бажані з комерційної та користувальницької точок зору, включаючи інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки і шприци.
Зрозуміло, що будь-який з цих виробів може включати імунокон'югат по винаходу замість або на додаток до анти-МЕСЕ антитіла.
Зрозуміло, що будь-який із зазначених вище виробів може включати в себе кон'югат антитіла, злитий білок або полімерний склад даного винаходу замість або на додаток до анти-МЕСЕ антитіла.
У. Способи ідентифікації варіантів антитіл і поліпшення антитіл
Винахід відноситься до способів поліпшення антитіл і ідентифікації варіантів антитіл. У деяких випадках способи включають в себе ідентифікацію одного або більше змін амінокислотних залишків, які забезпечують посилене зв'язування антитіла з молекулою-мішенню. У деяких випадках способи включають в себе ідентифікацію одного або більше змін амінокислотних залишків, які забезпечують підвищену стабільність (наприклад, термічну стабільність), функціональну експресію і/або згортання білка антитіла. У деяких випадках винахід відноситься до способів поліпшення афінності зв'язування антитіла з молекулою-мішенню. У деяких випадках винахід відноситься до способів поліпшення стабільності (наприклад, термічної стабільності), функціональної експресії і/або згортання білка антитіла. У деяких випадках винахід забезпечує способи поліпшення афінності зв'язування антитіла з молекулою-мішенню і поліпшення стабільності (наприклад, термічної стабільності) антитіла.
Наприклад, винахід відноситься до способів ідентифікації зміни амінокислотного залишку, яке забезпечує посилене зв'язування антитіла з молекулою-мішенню, який включає один або більше (наприклад, 1, 2 або 3) наступних етапів: (а) забезпечення бібліотеки дисплея, що містить нуклеїнові кислоти, що кодують варіанти антитіла-кандидата, який відрізняється тим, що кожен варіант антитіла-кандидата містить зміну амінокислотного залишку в МН або Мі. в бо порівнянні з еталонним антитілом, і причому зміни амінокислотного залишку в кожному положенні УН або У. присутні в бібліотеці дисплея; (б) сортування бібліотеки дисплея на основі зв'язування варіантів антитіла-кандидата з молекулою-мішенню з утворенням сортованної бібліотеки, причому сортована бібліотека містить варіанти антитіла-кандидата з поліпшеним зв'язуванням з молекулою-мішенню в порівнянні з еталонним антитілом; і (с) порівняння частоти, з якою кожна зміна амінокислотного залишку присутня в бібліотеці дисплея і в сортованій бібліотеці, як визначено за допомогою масового паралельного сіквенування, тим самим визначаючи, чи буде кожна зміна амінокислотного залишку збагачена в сортованій бібліотеці в порівнянні з бібліотекою дисплея в якій зміна амінокислотного залишку ідентифікується як та, що сприяє посиленому зв'язуванню з молекулою-мішенню, якщо вона збагачена в сортованій бібліотеці в порівнянні з бібліотекою дисплея. У деяких випадках спосіб додатково включає в себе ідентифікацію амінокислотного залишку, який забезпечує підвищену стійкість до антитіла, наприклад, як описано нижче.
В іншому прикладі, винахід пропонує способи ідентифікації зміни амінокислотного залишку, який забезпечує підвищену стабільність антитіла, який включає один або більше (наприклад, 1, 2 або 3) наступних етапів: (а) забезпечення бібліотеки дисплея, що містить нуклеїнові кислоти, що кодують варіанти антитіла-кандидата, які відрізняються тим, що кожен варіант антитіла- кандидата містить зміну амінокислотного залишку в МН або Мі в порівнянні з еталонним антитілом, і причому зміни амінокислотного залишку в кожному положенні УН або МІ. присутні в бібліотеці дисплея; (Б) сортування бібліотеки дисплея на основі зв'язування варіантів антитіла- кандидата з молекулою-мішенню з утворенням сортованої бібліотеки, причому сортована бібліотека містить варіанти антитіла-кандидата з поліпшеною стабільністю в порівнянні з еталонним антитілом; і (с) порівняння частоти, з якою кожна зміна амінокислотного залишку присутня в бібліотеці дисплея і в сортованій бібліотеці, як визначено за допомогою масового паралельного сіквенування, тим самим визначаючи, чи буде кожна зміна амінокислотного залишку збагачена в сортованій бібліотеці в порівнянні з бібліотекою дисплея в якій зміна амінокислотного залишку ідентифікується як та, що додає підвищену стабільність антитілу, якщо вона збагачена в сортованій бібліотеці в порівнянні з бібліотекою дисплея. У деяких випадках спосіб додатково включає в себе ідентифікацію амінокислотного залишку, який забезпечує посилене зв'язування антитіла з молекулою-мішенню, наприклад, як описано вище.
Будь-який з попередніх способів може додатково включати в себе визначення частоти, з якою кожна зміна амінокислоти присутня в бібліотеці дисплея і сортованій бібліотеці за допомогою послідовного паралельного сіквенування на наступному етапі (Б).
У деяких випадках зміна амінокислотного залишку може бути збагачена щонайменше в 2 рази в сортованій бібліотеці в порівнянні з бібліотекою дисплея. Наприклад, зміна амінокислотного залишку може бути збагачена в 1,25 рази, в 1,5 рази, в 2 рази, в З рази, в 4 рази, в 5 разів, в 6 раз, в 7 разів, в 8 разів, в 9 раз, в 10 разів, в 11 разів, в 12 разів, в 14 разів, в 16 разів або більше в сортованій бібліотеці в порівнянні з бібліотекою дисплея.
Бібліотека дисплея може включати будь-яку придатну кількість варіантів антитіл, наприклад, від близько 1х103 до близько 1х1072 або більше (наприклад, близько 1х10У, близько 1х107, близько 1х105, близько 1х106, близько 1х107, близько 1,5х107, близько 2,5х107, близько 1 х 108, близько 5х108, близько 1х10У, близько 5х10У, близько 1х1079, близько 1х10"! близько 1х1072 або більше) варіантів антитіл. У деяких варіантах здійснення винаходу, бібліотека дисплея може включати в себе близько 3х109 варіантів антитіла. У інших варіантах здійснення винаходу, бібліотека дисплея може включати в себе близько 8х108 варіантів антитіла.
У будь-якому з попередніх способів, зміна амінокислотного залишку може бути кодовано будь- яким підходящим набором кодонів. Наприклад, в деяких випадках зміна амінокислотного залишку кодується набором вироджених кодонів. Способи заміщення обраної амінокислоти в матричної нуклеїнової кислоти добре відомі в цій галузі, деякі з яких описані в даному документі. Див. також патент США Мо 7985840, який включений в цей опис за допомогою
БО посилання у всій його повноті. Наприклад, бібліотеки, описані вище або в розділі "Приклади" нижче, можуть бути створені шляхом заміни амінокислот варіантними амінокислотами з використанням методу Кункеля. Див., наприклад, Кипкеї єї а)Ї., МеїШшоавз Епгутої. 154:367-382, 1987.
Зміна амінокислотного залишку може бути кодовані будь-яким підходящим набором кодонів.
Безліч кодонів являє собою набір різних нуклеотидних триплетних послідовностей, використовуваних для кодування бажаних амінокислот. Набори кодонів можуть бути представлені з використанням знаків для позначення конкретних нуклеотидів або еквімолярних сумішей нуклеотидів, як показано нижче відповідно до коду ІВ.
Коди ІВ а Гуанін
А Аденін
Т Тирамін б Цитозин
В (А або С)
М (С або Т)
М (А або С)
К (б або Т)
З (С або б)
МІ (А або Т)
Н (А або С або Т)
В (С або С або Т)
М (А або С або с)
Р (А або С або Т)
М (А або С або с або Т)
Як ілюстративний приклад, в наборі кодонів ОМК, ЮО може бути нуклеотидами А або с або Т; М може бути А або с або С; і К може бути С або Т. Ця безліч кодонів може містити 18 різних кодонів і може кодувати амінокислоти Аа, Тгр, Туг, Гу, ТАг, Азп, зег, Агоу, А5р, Сім, Су ії Сув.
Олігонуклеотидні або праймерні набори можуть бути синтезовані з використанням стандартних способів. Набір олігонуклеотидів може бути синтезовано, наприклад, шляхом твердофазного синтезу, що містить послідовності, які представляють всі можливі комбінації нуклеотидних триплетів, що надаються набором кодонів, і які будуть кодувати бажану групу амінокислот.
Синтез олігонуклеотидів з обраним нуклеотидним "виродженням" в певних положеннях добре відомий в цій галузі техніки. Такі набори нуклеотидів, що мають певні набори кодонів, можуть бути синтезовані з використанням комерційних синтезаторів нуклеїнових кислот (доступні, наприклад, від Арріїей Віозубзіет5, Фостер Сіті, Каліфорнія), або можуть бути отримані комерційно (наприклад, з І їе Тесппоіодіє5х, Роквілль, Меріленд). Отже, набір олігонуклеотидів, синтезованих з конкретним набором кодонів, зазвичай включає в себе безліч олігонуклеотидів з різними послідовностями, відмінності, встановлені набором кодонів в загальній послідовності.
Олігонуклеотиди, використовувані відповідно до винаходу, мають послідовності, які допускають гібридизацію з зразком нуклеїнової кислоти з варіабельною ділянкою, а також можуть включати сайти рестрикційних ферментів для цілей клонування.
У будь-якому з попередніх способів для кодування змін амінокислотних залишків можна використовувати набір вироджених кодонів. У деяких випадках набір вироджених кодонів являє собою набір ММК або ММ5 кодонів, де М являє собою А, С, с або Т; К являє собою с або Т; і 5 являє собою С або б. В особливих випадках набір вироджених кодонів являє собою набір кодонів ММК.
Слід розуміти, що будь-який відповідний спосіб дисплея, відомий в цій галузі техніки або описаний в даному документі, може використовуватися в поєднанні з будь-яким з попередніх способів. Наприклад, способи можуть включати в себе фаговий дисплей, бактеріальний дисплей, дисплей дріжджів, дисплей ссавців, дисплей рибосом і/або дисплей мРНК. У будь- якому з попередніх способів може використовуватися будь-яка відповідна бібліотека дисплея.
Наприклад, бібліотека відображення може бути обрана з групи, що складається з бібліотеки фанового дисплея, бібліотеки дисплея бактерій, бібліотеки дисплея дріжджів, бібліотеки дисплея ссавців, бібліотеки дисплея рибосом і бібліотеки дисплея мРНК. У конкретних варіантах здійснення зображення, бібліотека дисплея являє собою бібліотеку фагового дисплея.
Злиті поліпептиди варіабельного домену антитіла можуть бути відображені на поверхні клітини, вірусу, фагеміда або інших частинок в різних форматах. Ці формати включають, наприклад, 5СЕм, Раб і багатовалентні форми цих фрагментів. Багатовалентні форми можуть являти собою димер 5сЕм, Раб або Рарб', званий в даному документі (ЗСЕм)», Рар» і К(аб)» відповідно. Способи дисплея злитих поліпептидів, що містять фрагменти антитіл, на поверхні бактеріофага добре відомі в цій галузі, наприклад, як описано в публікації патентної публікації номер УМО 92/01047 і в даному документі. Інші патентні публікації, наприклад, УМО 92/20791; УМО 93/06213;. УМО 93/11236 і УМО 93/19172, описують пов'язані способи. Інші публікації показали ідентифікацію антитіл з штучно перестроєними репертуарами М-гена проти безлічі антигенів, що відображаються на поверхні фага (див., наприклад, Ноодепроот еї аї., У). Мої. Віої. 227: 381-388, 1992; і як описано в УМО 93/06213 і УМО 93/11236).
У будь-якому з попередніх способів бібліотека дисплея може бути відсортована (обрана) і/або скринована, щоб ідентифікувати, наприклад, зв'язування з високою спорідненістю до антигену.
Сортування може виконуватися, як описано в цьому документі, або іншими підходами, відомими в цій галузі техніки. Див., наприклад, патент США 7985840. У деяких варіантах здійснення винаходу, сортування може включати в себе контактування бібліотеки дисплея з імобілізованим антигеном (наприклад, молекулою-мішенню або її епітопом). В інших варіантах здійснення винаходу, сортування може включати контактування бібліотеки дисплея з розчинним антигеном.
Варіанти антитіл, які були обрані, можуть бути додатково піддані скринінгу, щоб охарактеризувати варіант антитіла з точки зору афінності зв'язування (наприклад, за допомогою
ЗОРЕ), стабільності, згортання, структури (наприклад, за допомогою рентгенівської кристалографії) або інших атрибутів.
Будь-який з попередніх способів може включати в себе масове паралельне сіквенування, наприклад, для визначення частоти зміни з якої амінокислотний залишок з'являється в бібліотеці після сортування (званої сортованою бібліотекою) в порівнянні з частотою зміни з якої амінокислотний залишок з'являється в несортованій бібліотеці. Широкий спектр підходів для масового паралельного сіквенування відомий в цій області техніки, і будь-який відповідний підхід може бути використаний в способах даного винаходу. Див., наприклад, МеїгКег, Маїшиге
Веміємв5 Сієпеїйсв5 11: 31-36, 2010, яка включена в цей опис за допомогою посилання в повному обсязі. Типові підходи включають в себе масивно-паралельне розпізнавальне сіквенування (МРБ5), полоні-сіквенування, піросіквенування (454/Коспе Оіадпозіїс5), іонне напівпровідникове сіквенування, одномолекулярне сіквенування в реальному часі, сіквенування шляхом синтезу, сіквенування шляхом лігування. Комерційно доступні масивні паралельні платформи для сіквенування доступні в Коспе Оіадпобвіїсв і інших компаніях. Сіквенування може бути глибоким сіквенуванням, ультра-глибоким сіквенуванням і/або послідовністю наступного покоління.
У будь-якому з попередніх способів, спосіб може включати в себе визначення послідовності щонайменше близько 100 000 зчитувань або більше (наприклад, 100 000 читань, 200 000 читань, 300 000 читань, 400 000 читань, 500 000 читань, 600 000 читань, 700 000 читань, 800 000 читань, 900 000 читання, 1 000 000 читань, 2 х 105 читань, 3 х 105 читань, 4 х 105 читань, 5 х 106 читань, б х 105 читань, 7 х 105 читань, 8 х 105 читань, 9 х 105 читань, 10" читань, 108
Зо читань, 109 читань або 10"92 читань або більше). Спосіб може включати сіквенування на будь- якій зручної глибині.
У будь-якому з попередніх способів антитіло може бути моноклональним антитілом. У будь- якому з попередніх способів антитіло може бути антитілом ІдсС. У будь-якому з попередніх способів антитіло може бути фрагментом антитіла. Фрагмент антитіла може бути обраний з групи, що складається з Рар, зсЕм, Ем, Раб, Бар'-5Н, К(аб): і діатіла. У конкретних випадках фрагмент антитіла являє собою Раб.
У будь-якому з попередніх способів подвійне специфічне антитіло може бути моноклональним антитілом. У будь-якому з попередніх способів, подвійним специфічним антитілом може бути антитіло ДС. У будь-якому з попередніх способів, подвійне специфічне антитіло може бути фрагментом антитіла. Фрагмент антитіла може бути обраний з групи, що складається з Раб, 5сЕмМ, Ем, Бар-С, Раб, Бар'-5Н, Кар)» і діатіла. У конкретних випадках фрагмент антитіла являє собою Раб.
Будь-який з попередніх способів може додатково включати в себе генерацію антитіла, яке було ідентифіковано за допомогою етапів способу. Описані вище способи можуть бути використані з будь-яким з описаних в даному документі антитіл.
К. Окулярні довгострокові підходи до доставки антитіл проти МЕСЕ
Винахід відноситься до композицій для лікування окулярних розладів, які можуть використовуватися для доставки анти-МЕСЕ антитіл тривалої дії (у тому числі будь-яке антитіло проти МЕСЕ, описане в цьому документі, наприклад 6.31 ААКК) в око. Наприклад, винахід забезпечує кон'югати антитіл, які включають антитіло проти МЕСЕ, описане в цьому документі (наприклад, кон'югати Бар або Рар-С антитіла). Винахід також забезпечує злиті білки (наприклад, злиті білки Раб). В інших аспектах винахід забезпечує склади (наприклад, полімерні склади), які включають антитіло проти МЕСЕ, описане в даному документі. Винахід також відноситься до пристроїв, які можуть бути використані для окулярного введення антитіла проти
МЕСЕ, описаного в даному документі. Винахід також відноситься до фармацевтичних композицій, які включають кон'югати антитіл, злиті білки і/або склади (наприклад, полімерні композиції), описані в даному документі. Ці композиції можуть бути використані в будь-якому з описаних в цьому документі терапевтичних способів, наприклад, способи лікування окулярного розладу (наприклад, АМО (наприклад, волога АМО), ОМЕ, ОК (наприклад, МРОК або РОК) або бо ЕМО (наприклад, СЕМО або ВЕМО) ).
1. Кон'югати антитіл
Винахід забезпечує кон'югати антитіл, які включають антитіло проти УЕСЕ і полімер, ковалентно приєднаний до антитіла. Антитіло проти МЕСЕ може бути ковалентно приєднано до полімеру незворотнім чином або оборотним чином. Може бути використаний будь-який відповідний полімер, включаючи описані в цьому документі або інші, відомі в цій області. Полімер може являти собою гідрофільний полімер або гідрофобний полімер. Слід розуміти, що гідрофільний полімер може бути водорозчинним полімером. Може бути використаний будь-який відповідний гідрофільний полімер, наприклад гідрофільний полімер, описаний в публікації міжнародної патентної заявки Ме УМО 2011/066417 і/або РеїІедгі-О'рау еї аї. 9). Ат. Спет. бос. 136: 14323- 14332, 2014 року, які включені в цей документ за допомогою посилання у всій їх повноті.
Ілюстративні необмежуючі гідрофільні полімери, які можуть бути використані, включають гіалуронову кислоту (НА), поліетиленгліколь (ПЕГ, також відомий як полі(етиленгліколь)) (наприклад, ПЕГ з прямим ланцюгом, розгалужений ПЕГ, гребінчастий ПЕГ і дендритний ПЕГ), полі(етиленоксид)-ко--метиленовий етиленоксид)|, полі(полі(етиленгліколь) метиловий ефір метакрилата) (рРРЕСМА), агарозу, альгінат, карагенан, карбоксиметилцелюлозу, целюлозу, похідні целюлози, хітозан, хондроїтинсульфат, колаген, дерматансульфат, декстран, декстрансульфат, фібрин, фібриноген, фібронектин, фукоїдан, желатин, глікозаміноглікани (САС), глікополімери, гепарин, сульфат гепарину, сильно розгалужений полісахарид (наприклад, галактозний дендример), кератансульфат, метил-целюлозу, гідроксипропілметилцелюлозу (НРМС), полі(М-(2-гідроксипропіл) метакриламід) (рРНРМА), пектини, похідні пектину, полісульфат пентозану, крохмаль, гідроксиетилкрохмаль (ГЕК), стирол, вітронектин, полі(акрилову кислоту), полі(метакрилову кислоту), полі(акриламід), полі(акрилову кислоту), полі(аміни), полі(амінокислоти), полі(карбоксибетаїн) (РСВ), поліелектроліти, поли(глутамінову кислоту) (РОСА), полі(гліцерин) (РО) (наприклад, лінійний, середньофункціональний, гіперрозгалужений, або лінійний гіперрозгалужений Ро), полі(малеїнову кислоту), полі(2-оксазолін) (РОЇ), полі(2-етил-2-оксазолін, полісіалова кислота (ПСА), полістирол, похідні полістиролу (наприклад, заряджені похідні полістиролу), полі(стиролсульфонат-со-РЕСМА), полівінілпіролідон (ПВП), полі(М-акрилоїлморфолін) (РМАСМ) і їх сополімери. У деяких випадках полімер являє собою гідрофобний полімер, наприклад,
Зо полі(лакто-со-гліколевую кислоту) (РІ ОА), полілактид (РГА) і полігліколід (РОСА). Полімер може бути біорозкладаним і/або біосумісним.
Як приклад полімер може включати будь-яку придатну кількість мономерів, наприклад, між 2 і близько 1х107 мономерів (наприклад, близько 10, близько 50, 100, близько 200, близько 300, близько 400, близько 500, близько 600, близько 700, близько 800, близько 900, близько 1000, близько 2000, близько 3000, близько 4000, близько 5000, близько 6000, близько 7000, близько 8000, близько 9000 або близько 1х107 мономерів) або більше. Наприклад, полімер може включати між близько 50 і близько 250 мономерів, близько 50 і близько 500 мономерів, між близько 50 і близько 1000 мономерів, між близько 50 і близько 2000 мономерів, між близько 50 і близько 3000 мономерів, між близько 50 і близько 4000 мономерів, між близько 50 і близько 5000 мономерів, між близько 50 і близько 6000 мономерів, між близько 50 і близько 7000 мономерів, між близько 50 і близько 8000 мономерів, між близько 50 і близько 9000 мономерів, між близько 50 і близько 10000 мономерами, між близько 100 і близько 250 мономерів, близько 100 ї близько 500 мономерів, між близько 100 і близько 1000 мономерів, між близько 100 і близько 2000 мономерів, між близько 100 і близько 3000 мономерів, між близько 100 і близько 4000 мономерів, між близько 100 і близько 5000 мономерів, між близько 100 до близько 6000 мономерів, між близько 100 до близько 7000 мономерів, між близько 100 до близько 8000 мономерів, між близько 100 до близько 9000 мономерів, між близько 100 і близько 10000 мономерів, між близько 250 до близько 500 мономерів, між близько 250 до близько 1000 мономерів, між близько 250 до близько 2000 мономерів, між близько 250 до близько 3000
БО мономерів, між близько 250 до близько 4000 мономерів, між близько 250 і близько 5000 мономерів, між близько 250 до близько 6000 мономерів, між близько 250 до близько 7000 мономерів, між близько 250 до близько 8000 мономерів, між близько 250 до близько 9000 мономерів, між близько 250 до близько 10000 мономерів, між близько 500 до близько 1000 мономерів, між близько 500 і близько 2000 мономерами, між близько 500 і близько 3000 мономерами, між близько 500 і близько 4000 мономерами, між близько 500 і близько 5000 мономерами, між близько 500 і близько 6000 мономерами, між близько 500 і близько 7000 мономерів, між близько 500 і близько 8000 мономерів, між близько 500 і близько 9000 мономерів або між близько 500 і близько 10000 мономерів. У деяких випадках полімер може включати близько 500 мономерів.
Винахід забезпечує кон'югат антитіла, який включає антитіло проти МЕСЕ (наприклад, антитіло проти МЕСЕ, описане в цьому документі, таке як 56.31 ААКК), ковалентно приєднаний до НА- полімеру. Такі кон'югати антитіл іноді згадуються в цьому документі як "кон'югати НА". У деяких випадках полімер НА має молекулярну масу близько 2,5 мегадальтона (МДа) або нижче (наприклад, близько 2,5 МДа або нижче, близько 2,4 МДа або нижче, близько 2,3 МДа або нижче, близько 2,2. МДа або нижче, близько 2,1 МДа або нижче, близько 2,0 МДа або нижче, близько 1,9 МдДа або нижче, близько 1,8 МДа або нижче, близько 1,7 МДа або нижче, близько 1,6 МДа або нижче, близько 1,5 МДа або нижче, близько 1,4 МДа або нижче близько 1,3 МДа або нижче, близько 1,2 МДа або нижче, близько 1,1 МДа або нижче, близько 1,0 МДа або нижче, близько 900 кДа або нижче, близько 800 кДа або нижче, близько 700 кДа або нижче, близько 600 кДа або нижче, близько 500 кДа або нижче, близько 400 кДа або нижче, близько 300 кДа або нижче, близько 200 кДа або нижче або близько 100 кДа або нижче). У деяких випадках полімер НА має молекулярну масу близько 1 МДа або нижче (наприклад, близько 1,0 МДа або нижче, близько 900 кДа або нижче, близько 800 кДа або нижче, близько 700 кДа або нижче, близько 600 кДа або нижче, близько 500 кДа або нижче, близько 400 кДа або нижче, близько 300 кДа або нижче, близько 200 кДа або нижче або близько 100 кДа або нижче). У деяких випадках полімер НА має молекулярну масу між близько 25 кДа і близько 2,5 МдДа (наприклад, між близько 25 кДа і близько 2,5 МдДа, між близько 25 кДа і близько 2 МдДа, між близько 25 кДа і близько 1,5 МдДа, між близько 25 кДа і близько 1 МдДа, між близько 25 кДа і близько 900 кДа, між близько 25 кДа і близько 800 кДа, між близько 25 кДа і близько 700 кДа, між близько 25 кДа і близько 600 кДа, між близько 25 кДа і близько 500 кДа, між близько 100 кДа і близько 2,5 МдДа, між близько 100 кДа і близько 2 МдДа, між близько 100 кДа і близько 1,5 МдДа, між близько 100 кДа і близько 1 МдДа, між близько 100 кДа і близько 900 кДа, між про коло 100 кДа і близько 800 кДа, між близько 100 кДа і близько 700 кДа, між близько 100 кДа і близько 600 кДа, між близько 100 кДа і близько 500 кДа, між близько 250 кДа і близько 2,5 МдДа, між близько 250 кДа і близько 2 МдДа, між близько 250 кДа і близько 1,5 МдДа, між близько 250 кДа і близько 1 МдДа, між близько 250 кДа і близько 900 кДа, між близько 250 кДа і близько 800 кДа, між близько 250 кДа і близько 700 кДа, між близько 250 кДа і близько 600 кДа, між близько 250 кДа і близько 500 кДа, між близько 500 кДа і близько 2,5 МдДа, між близько 500 кДа і близько 2 МдДа, між близько 500 кДа і
Зо близько 1,5 МдДа, між близько 500 кДа і близько 1 МдДа, між окол 500 кДа і близько 900 кДа, між близько 500 кДа і близько 800 кДа, між приблизно 500 кДа і близько 700 кДа, між близько 500 кДа і близько 600 кДа, між близько 1 МдДа і близько 2,5 МдДа, між близько 1 МдДа і близько 2 МдДа, між близько 1 МдДа і близько 1,5 МдДа, між близько 1 МдДа їі близько 1,25 МдДа, між близько 1,25
МдДа і близько 2,5 МдДа, між близько 1,25 МДа і близько 2 МдДа, між близько 1,25 МдДа і близько 1,5 МдДа, між близько 1,5 МдДа і близько 2,5 МдДа, між близько 1,5 МдДа і близько 2 МдДа, між близько 1,5 МдДа і близько 1,75 МдДа або між 1,75 Мда і близько 2,5 МдДа).
У деяких випадках полімер НА має молекулярну масу між близько 25 кДа і близько 500 кДа (наприклад, між близько 25 кДа і близько 500 кДа, між близько 25 кДа і близько 450 кДа, між близько 25 кДа і близько 400 кДа, між близько 25 кДа і близько 350 кДа, між близько 25 кДа і близько 300 кДа, між близько 25 кДа і близько 300 кДа, між близько 25 кДа і близько 250 кДа, між близько 25 кДа і близько 200 кДа, між близько 25 кДа і близько 150 кДа, між близько 25 кДа і близько 100 кДа, між близько 25 кДа і близько 50 кДа, між приблизно 40 кДа і приблизно 500 кДа, між близько 40 кДа і близько 450 кДа, між близько 40 кДа близько 400 кДа, між близько 40 кДа і близько 350 кДа, між близько 40 кДа і близько 300 кДа, між близько 40 кДа і близько 300 кДа, між близько 40 кДа і близько 250 кДа, між близько 40 кДа і близько 200 кДа, між близько 40 кДа і близько 150 кДа, між близько 40 кДа і близько 100 кДа, між близько 40 кДа і близько 50 кДа, між близько 50 кДа і близько 500 кДа, між близько 50 кДа і близько 450 кДа, між близько 50 кДа і близько 400 кДа, між близько 50 кДа і близько 350 кДа, між близько 50 кДа і близько 300 кДа, між близько 50 кДа і близько 300 кДа, між близько 50 кДа і близько 250 кДа, між близько 50 кДа і близько 200 кДа, між близько 50 кДа і близько 15 0 кДа, між близько 50 кДа і близько 100 кДа, між близько 50 кДа і близько 75 кДа, між близько 100 кДа і близько 500 кДа, між близько 100 кДа і близько 450 кДа, між близько 100 кДа і близько 400 кДа, між близько 100 кДа і близько 350 кДа, між близько 100 кДа і близько 300 кДа, між близько 100 кДа і близько 300 кДа, між близько 100 кдДа і близько 250 кДа, між близько 100 кДа і близько 200 кДа, між близько 100 кДа і близько 150 кДа, між близько 150 кДа і близько 500 кДа, між близько 150 кДа і близько 450 кДа, між близько 150 кДа і близько 400 кДа, між близько 150 кДа і близько 350 кДа, між близько 150 кДа і близько 300 кДа, між близько 150 кДа і близько 30 0 кДа, між близько 150 кДа і близько 250 кДа, між близько 150 кДа і близько 200 кДа, між близько 175 кДа і близько 500 кДа, між близько 175 кДа і близько 450 кДа, між близько 175 кДа і близько 400 кДа, між близько 175 кДа і близько бо 350 кДа, між близько 175 кДа і близько 300 кДа, між близько 175 кДа і близько 300 кДа, між 175
200 кДа і близько 250 кДа, між близько 175 кДа і близько 225 кДа, між близько 200 кДа і близько 500 кДа, між близько 200 кдДа і близько 450 кДа, між близько 200 кДа і близько 400 кДа, між близько 200 кДа і близько 350 кДа, між близько 200 кДа і близько 300 кДа, між близько 200 кДа і близько 300 кДа, між близько 200 кДа і близько 250 кДа, або між близько 200 кДа і близько 225 кДа).
У деяких випадках полімер НА має молекулярну масу від близько 100 кДа до близько 250 кДа (наприклад, близько 100 кДа, близько 110 кДа, близько 120 кДа, близько 130 кДа, близько 140 кДа, близько 150 кДа, близько 160 кДа, близько 170 кДа, близько 180 кДа, близько 190 кДа, близько 200 кДа, близько 210 кДа, близько 220 кДа, близько 230 кДа, близько 240 кДа або близько 250 кДа). У конкретних випадках полімер НА має молекулярну масу близько 200 кДа.
Будь-яка з попередніх молекулярних мас може являти собою средньомасову молекулярну масу (також відому як средньомасова молярна маса).
У деяких випадках будь-який з попередніх НА-полімерів є лінійним, тобто не зшитим.
В інших випадках винахід забезпечує кон'югат антитіла, який включає антитіло проти МЕСЕ (наприклад, антитіло проти МЕСЕ, описане в цьому документі), ковалентно приєднаний до ПЕГ- полімеру. Такі кон'югати антитіл іноді згадуються як "кон'юЮгати ПЕГ". Може використовуватися будь-який відповідний полімер ПЕГ. ПЕГ може являти собою розгалужений ПЕГ, зірчастий ПЕГ або гребінчастий ПЕГ. ПЕГ-полімер може бути, наприклад, тетрамером ПЕГ, гексамером ПЕГ або октамером ПЕГ. У деяких випадках кон'югат антитіла включає антитіло проти МЕСЕ (наприклад, антитіло проти МЕСЕ, описане в цьому документі, таке як 96.31 ААКК), ковалентно приєднане до ПЕГ-дендримеру. Полімери ПЕГ комерційно доступні, наприклад, від УепКет
Тесппоіоду, Очапіа Віобезідп, МОЕ Атегіса Согрогайоп і інших виробників.
У деяких випадках полімер ПЕГ має молекулярну масу від близько 1 кДа і близько 500 кДа (наприклад, між близько 1 кДа і близько 500 кДа, між близько 1 кДа і близько 450 кДа, між близько 1 кДа і близько 400 кДа, між близько 1 кДа і близько 350 кДа, між близько 1 кДа і близько 300 кДа, між близько 1 кДа і близько 300 кДа, між близько 1 кДа і близько 250 кДа, між близько 1 кДа і близько 200 кДа, між близько 1 кДа і близько 150 кДа, між близько 1 кДа і близько 100 кДа, між близько 1 кДа і близько 50 кДа, між близько 10 кДа і близько 500 кДа, між близько 10 кДа і близько 450 кДа, між близько 10 кДа і близько 400 кДа, між близько 10 кДа і
Зо близько 350 кДа, між близько 10 кДа і близько 300 кДа, між близько 10 кДа і близько 300 кДа, між близько 10 кДа і близько 250 кДа, між близько 10 кДа і близько 200 кДа, між близько 10 кДа і близько 150 кДа, між близько 10 кДа і близько 100 кДа, між близько 10 кДа і близько 50 кДа, між близько 20 кДа і близько 500 кДа, між близько 20 кДа і близько 450 кДа, між близько 20 кДа і близько 400 кДа, між близько 20 кДа і близько 350 кДа, між близько 20 кДа і близько 300 кДа, між близько 20 кДа і близько 300 кДа, між близько 20 кДа і близько 250 кДа, між близько 20 кДа і близько 200 кДа, між близько 20 кДа і близько 150 кДа, між близько 20 кДа і близько 100 кДа, між близько 20 кДа і близько 75 кДа, між близько 30 кДа і близько 500 кДа, між близько 30 кДа і близько 450 кДа, між близько 30 кДа і близько 400 кДа, між близько 30 кДа і близько 350 кДа, між близько 30 кДа і близько 300 кДа, між близько 30 кДа і близько 300 кДа, між близько 30 кДа і близько 250 кДа, між близько 30 кДа і близько 200 кДа, між близько 30 кДа і близько 150 кДа, між близько 40 кДа і близько 500 кДа, між близько 40 кДа і близько 450 кДа, між близько 40 кДа і близько 400 кДа, між близько 40 кДа і близько 350 кДа, між близько 40 кДа і близько 300 кДа, між близько 40 кДа і близько 300 кДа, між близько 40 кДа і близько 250 кДа, між близько 40 кДа і близько 200 кДа, між близько 50 кДа і близько 500 кДа, між близько 50 кДа і близько 450 кДа, між близько 50 кДа і близько 400 кДа, між близько 50 кДа і близько 350 кДа, між близько 50 кДа і близько 300 кДа, між близько 50 кДа і близько 300 кДа, між близько 50 кДа і 200 кДа і близько 250 кДа, або між близько 50 кДа і близько 225 кДа).
У деяких випадках полімер ПЕГ має молекулярну масу від близько 5 кДа до близько 250 кДа (наприклад, близько 1 кДа, близько 5 кДа, близько 10 кДа, близько 15 кДа, близько 20 кДа,
БО близько 25 кДа, близько 30 кДа, близько 35 кДа, близько 40 кДа, близько 50 кДа, близько 60 кДа, близько 70 кДа, близько 80 кДа, близько 90 кДа, 100 кДа, близько 110 кДа, близько 120 кДа, близько 130 кДа, близько 140 кДа, близько 150 кДа, близько 160 кДа, близько 170 кДа, близько 180 кДа, близько 190 кДа, близько 200 кДа, близько 210 кДа, близько 220 кДа, близько 230 кДа, близько 240 кДа або близько 250 кДа). У конкретних випадках полімер ПЕГ має молекулярну масу близько 20 кДа. В інших випадках полімер ПЕГ має молекулярну масу близько 40 кДа.
Будь-яка з попередніх молекулярних мас може являти собою средньомасову молекулярну масу (також відому як средньомасова молярна маса).
У деяких випадках ПЕГ-полімер являє собою тетрамер ПЕГ. ПЕГ-тетрамери комерційно доступні в, наприклад, МОБ Атегіса БОМВЕІСЗНТЯ РТЕ-400МА, РТЕ-20ОМА, РТЕ-100МА і бо УепКет Тесппоїсду БА 4 рукавний ПЕГ малеїімід (кат. Мо ААКМ-МАЇ). У деяких випадках тетрамер ПЕГ має ядро пентаеритритола. Наприклад, в деяких випадках тетрамер ПЕГ включає в себе структуру формули (І), де п незалежно являє будь-яке придатне ціле число:
Формула І: є) (в) о (о) в) ну о оточити
М Н п п Н // в) в)
Ге) (9) (6) (в) (в) иа -У. 03) х М п 9) ої - така у о 9)
В іншому прикладі, в деяких випадках, ПЕГ-полімер являє собою гексамер ПЕГ. Гексамери ПЕГ є комерційно доступними, наприклад, ЧУепКет Тесппоїосду ОБА 6 рукавний ПЕГ амін (кат. Мо бАВМ (ОР)-МН2НСЇ) або гексамери ПЕГ з Оцапіа Віорезідп. У деяких випадках гексамер ПЕГ включає ядро дипентилеритритола.
У деяких випадках ПЕГ-полімер являє собою октамер ПЕГ. ПЕГ-октамер є комерційно доступними, наприклад, серія МОЕ Атегіса ЗОМВКІСНТФ НОЕО або депКет Тесппоїоду ОЗА 8 агпт ПЕГ малеїмідом (кат. Мо ЗАКМ(ТР)-МАЇ). У деяких випадках октамер ПЕГ може включати ядро трипентаеритритола. Наприклад, в деяких випадках октамер ПЕГ включає в себе структуру формули (ІЇ), де п незалежно являє собою будь-яке придатне ціле число:
Формула ІІ: в о з М о
М (е) (в) М / є) (о; Ге!
НИ МН і Х МН кі ве о о о "ме у ; о (в) рю Рева зд ту в) о О г о о 6 (о) () (о) г г
НИ У Нм й ни о о І (о; М. 240 м о 5 ГТ х Ю- ів) -/ о
У ще одному прикладі, в деяких випадках, октамер ПЕГ включає в себе трипентаеритритолове ядро.
Слід розуміти, що будь-який відповідний підхід кон'югації, в тому числі описаний в цьому документі, і інші, відомі в цій галузі, можуть бути використані для кон'югації антитіла проти МЕСЕ по винаходу з полімером. Наприклад, полімер може бути кон'югований з будь-якою зручною функціональною групою білка, включаючи первинну аміногрупу, карбоксильну групу, сульфгідрильні групи або карбонільну групу. Будь-яка підходяща хімічно реакційна група може бути використана для націлювання на функціональну групу білка, наприклад, карбодиїімід (наприклад, ЕЮОС), ефір МН5, імідоефір, пентафторфеніловий ефір, гідроксиметилфосфін, малеїмід, галоацетил (наприклад, бромоацетил або йодоацетил), піридилдисульфід,
тіосульфонат, вінілсульфон, гідразин, алкоксіамін, діазирин, арилазид, ізоцианат або інші, відомі в даній області. Див., наприклад, Непптапзоп, Віосопіцдаїе Тесппідев, Зга Еайоп, 2013.
Будь-який з попередніх кон'югатів антитіл може мати гідродинамічний радіус між близько 5 нм і близько 200 нм (наприклад, близько 5 нм, близько 10 нм, близько 20 нм, близько 30 нм, близько 40 нм, близько 50 нм, близько 60 нм, близько 70 нм, близько 80 нм, близько 90 нм, близько 100 нм, близько 110 нм, близько 120 нм, близько 130 нм, близько 140 нм, близько 150 нм, близько 160 нм, близько 170 нм, близько 180 нм, близько 190 нм або близько 200 нм). У деяких випадках кон'югат антитіла має гідродинамічний радіус між близько 5 нм і близько 150 нм (наприклад, близько 5 нм, близько 10 нм, близько 20 нм, близько 30 нм, близько 40 нм, близько 50 нм, близько 60 нм, близько 70 нм, близько 80 нм, близько 90 нм, близько 100 нм, близько 110 нм, близько 120 нм, близько 130 нм, близько 140 нм або близько 150 нм). У деяких випадках кон'югат антитіла має гідродинамічний радіус між близько 5 нм і близько 100 нм (наприклад, близько 5 нм, близько 10 нм, близько 20 нм, близько 30 нм, близько 40 нм, близько 50 нм, близько 60 нм, близько 70 нм, близько 80 нм, близько 90 нм або близько 100 нм). У деяких випадках кон'югат антитіла має гідродинамічний радіус між близько 5 нм і близько 60 нм (наприклад, близько 5 нм, близько 10 нм, близько 20 нм, близько 30 нм, близько 40 нм, близько 50 нм, близько 60 нм). У деяких випадках кон'югат антитіла має гідродинамічний радіус між близько 25 нм і близько 35 нм (наприклад, близько 25 нм, близько 26 нм, близько 27 нм, близько 28 нм, близько 29 нм, близько 30 нм, близько 31 нм, близько 32 нм, близько 33 нм, близько 34 нм або близько 35 нм). У деяких випадках гідродинамічний радіус становить близько 28 нм.
У деяких випадках кон'югат антитіла має гідродинамічний радіус між близько 10 нм і близько 200 нм, між близько 10 нм і близько 180 нм, між близько 10 нм і близько 160 нм, між близько 10 і близько 140 нм, між близько 10 нм і близько 120 нм, між близько 10 нм і близько 100 нм, між близько 10 нм і близько 80 нм, між близько 10 нм і близько 60 нм, між близько 10 нм і близько 50 нм, між близько 10 нм і близько 40 нм, між близько 10 нм і близько 30 нм, між близько 20 нм і близько 200 нм, між близько 20 нм і близько 180 нм, між близько 20 нм і близько 160 нм, між близько 20 нм і близько 140 нм, між близько 20 нм і близько 120 нм, між близько 20 нм і близько 100 нм, між близько 20 нм і близько 80 нм, між близько 20 нм і близько 60 нм, між близько 20 нм і близько 50 нм, між близько 20 нм і близько 40 нм, між близько 20 нм і близько 30 нм, між
Ко) близько 30 нм і близько 200 нм, між близько 30 нм і близько 180 нм, між близько 30 нм і близько 160 нм, між близько 30 нм і близько 140 нм, між близько 30 нм і близько 120 нм, між близько 30 нм і близько 100 нм, між близько 30 нм і близько 80 нм, між близько 30 нм і близько 60 нм, між близько 30 нм і близько 50 нм, між близько 30 нм і близько 40 нм, між близько 40 нм і близько 200 нм, між близько 40 до близько 180 нм, між близько 40 до близько 160 нм, між близько 40 до близько 140 нм, між близько 40 нм і близько 120 нм, між близько 40 нм і близько 100 нм, між близько 40 нм і близько 80 нм, між близько 40 нм і близько 60 нм, між близько 40 нм і близько 50 нм, між близько 50 нм і близько 200 нм, між близько 50 нм і близько 180 нм, між близько 50 нм і близько 160 нм, між близько 50 нм і близько 140 нм, між близько 50 нм і близько 120 нм, між близько 50 нм і близько 100 нм, між близько 50 нм і близько 80 нм, між близько 50 нм і близько 60 нм, між близько 60 нм і близько 200 нм, між близько 60 нм і близько 180 нм, між близько 60 нм і близько 160 нм, між близько 60 нм і близько 140 нм, між близько 60 нм і між близько 120 нм, між близько 60 нм до близько 100 нм або між близько 60 нм і близько 80 нм.
У деяких випадках кон'югат антитіла являє собою кон'югат антитіл проліків (також званий проліками, пов'язаними з носієм), в якому антитіло проти МЕСЕ (наприклад, антитіло проти
МЕСРЕ, описане в цьому документі, наприклад, 56.31 ААКК) є оборотно кон'югованим з носієм (наприклад, гідрогелем), наприклад, за допомогою лінкера (наприклад, оборотного пролікарського лінкера). Цей підхід описаний далі, наприклад, в публікаціях міжнародної патентної заявки УМО 2006/003014, УМО 2009/095479, УМО 2011/012715, УМО 2013/053856 і УМО 2014/056923, які включені в цей документ за допомогою посилання у всій їх повноті. Такі проліки кон'югатів антитіл комерційно доступні від Авсепаїз Рпапта (наприклад, технологічної платформи ТгапзСоп). Лінкер може мати властиві саморозщеплюючі властивості (наприклад, лінкер може бути не ферментативно гідролізований при введенні в око), що призводить до контрольованого в часі вивільненню антитіла проти УЕЄСЕ в око (наприклад, склоподібне тіло).
Наприклад, в деяких випадках винахід забезпечує проліки кон'югату антитіла, який включає антитіло проти МЕСЕ (наприклад, антитіло проти МЕСЕ, описане в цьому документі, наприклад, 6.31 ААКК), яке ковалентно прикріплюється до носія за допомогою лінкера. У конкретних випадках лінкер являє собою оборотний пролікарський лінкер. У деяких випадках носій включає полімер, наприклад ПЕГ. Наприклад, ПЕГ може бути лінійним, розгалуженим, багаторукавним або дендритним ПЕГ. У деяких випадках носій являє собою гідрогель, що включає 60 біодеградуємий гідрогель. Можна використовувати будь-який відповідний гідрогель, наприклад,
гідрогель на основі ПЕГ. Гідрогель на основі ПЕГ може включати, наприклад, щонайменше 10 95
ПЕГ, щонайменше 20 95 ПЕГ, щонайменше 30 95 ПЕГ або більше. Гідрогель може мати форму кульок мікрочастинок. Такі мікрочастинки можуть мати діаметр від близько 1 мкм до близько 1000 мкм, наприклад, від близько 5 мкм до близько 500 мкм, від близько 10 мкм до близько 100 мкм, від близько 20 мкм до близько 100 мкм або від близько 20 мкм до близько 80 мкм.
Діаметри кульок можна виміряти, коли кульки мікрочастинок суспендують у фізіологічному водному буфері. У деяких випадках гідрогель може бути будь-яким гідрогелем, описаним в УМО 2006/003014 або УМО 2011/012715.
У будь-якому з попередніх кон'югатів антитіла, антитіло може являти собою фрагмент антитіла, який зв'язує МЕСЕ, наприклад, фрагмент антитіла анти-МЕСЕ антитіла, описаного в цьому документі, який пов'язує МЕСЕ. У деяких випадках фрагмент антитіла обирають з групи, що складається з Раб, Рабр', Рар-С, Рар'-5ЗН, Ем, 5оЕм і (Габ)г2 фрагментів. У конкретних випадках фрагмент антитіла являє собою Рар, Бар' або Бар-С. У деяких випадках фрагмент антитіла являє собою Рар-б.
Будь-який з попередніх кон'югатів антитіла може мати період окулярного напіввиведення, який збільшений в порівнянні з контрольним антитілом, яке нековалентно пов'язане з полімером (наприклад, гідрофільним полімером). У деяких випадках період окулярного напіввиведення збільшують, щонайменше близько в 2 рази (наприклад, близько в 2 рази, близько в З рази, близько в 4 рази, близько в 5 разів, близько в 6 разів, близько в 7 разів, близько в 8 разів, близько в 9 разів, близько в 10 разів, близько в 12 разів, близько в 14 разів, близько в 16 разів, близько в 18 разів, близько в 20 разів або більше) щодо еталонного антитіла. У деяких випадках період окулярного напіввиведення збільшується щонайменше близько в 4 рази відносно еталонного антитіла. У деяких випадках період окулярного напіввиведення являє собою життєвий період життя. У деяких випадках, еталонне антитіло ідентично антитілу кон'югату антитіла. В інших випадках еталонне антитіло не ідентичне антитілу кон'югату антитіла.
Будь-який з попередніх кон'югатів антитіл може мати окулярний кліренс, який зменшується, щодо еталонного антитіла, яка не ковалентно пов'язане з полімером (наприклад, гідрофільним полімером). У деяких випадках кліренс зменшується, щонайменше близько в 2 рази (наприклад, близько в 2 рази, близько в З рази, близько в 4 рази, близько в 5 разів, близько в 6 разів,
Ко) близько в 7 разів, близько в 8 разів, близько в 9 разів, близько в 10 разів, близько в 12 разів, близько в 14 разів, близько в 16 разів, близько в 18 разів, близько в 20 разів або більше) щодо еталонного антитіла. У деяких випадках кліренс зменшується, щонайменше на близько в 4 рази відносно еталонного антитіла. У деяких випадках кліренс являє собою кліренс з склоподібного тіла. У деяких випадках, еталонне антитіло ідентично антитілу кон'югату антитіла. В інших випадках еталонне антитіло не ідентичне антитілу кон'югату антитіла.
У деяких випадках період часу між двома внутрішньоочними введеннями (наприклад, інтравітреальною ін'єкцією) будь-якого з попередніх кон'югатів антитіл (наприклад, кон'югатів
НА, кон'югатів ПЕГ ї кон'югатів пролікарських антитіл) становить щонайменше 1 місяць, наприклад, щонайменше 1 місяць, по меншій мере 5 тижнів, щонайменше 6 тижнів, щонайменше 7 тижнів, щонайменше 8 тижнів, щонайменше 9 тижнів, щонайменше 10 тижнів, щонайменше 11 тижнів, щонайменше 12 тижнів, щонайменше 13 тижнів, щонайменше 14 тижнів, щонайменше 15 тижнів, щонайменше 16 тижнів, щонайменше 20 тижнів, щонайменше 24 тижні, щонайменше 28 тижнів, щонайменше 32 тижні, щонайменше 36 тижнів, щонайменше 40 тижнів, щонайменше 44 тижні, щонайменше 48 тижнів, щонайменше 52 тижнів або більше. У деяких випадках максимальний період між двома внутрішньоочними введеннями триває не більше чотирьох років, наприклад, не довше ніж три роки, не довше ніж два роки або довше ніж один рік. Кон'югат антитіла можна вводити, наприклад, кожні два-дванадцять місяців, наприклад кожні чотири-десять місяців. У деяких випадках кон'югат антитіла вводять кожні шість місяців.
Винахід також забезпечує композиції (наприклад, фармацевтичні композиції), які включають будь-які кон'югати антитіл, описані вище (наприклад, кон'югати НА, кон'югати ПЕГ і кон'югати пролікарських антитіл). У деяких варіантах здійснення винаходу, композиція містить одне або більше додаткових сполук. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова сполука зв'язується з другою біологічною молекулою, обраної з групи, що складається з ІІ -18, 11 -6; ІІ - бК; РООБ; ангіопоетина; ангіопоетина 2; Тіб-2; З1Р; інтегринів сомВ3, сомВ5 і а5р1; бетацеллюліна; апеліна/АР.); еритропоетину; фактора комплементу Ю; ТМЕ-альфа; НТЕА1; рецептора МЕСЕ; рецептора 5-2; і білків, генетично пов'язаних з віковою макулярною дегенерацією (АМО), такі як компоненти комплементу шляху С2, фактора В, фактор Н, СЕНКЗ,
СЗ3р, С5, Сба і СЗа; НТКАТ; АКМ52; ТІМРЗ; НГА; інтерлейкіну (1-8); СХЗСВА1; ТІ ВЗ; ТІ Ва;
СЕТР; ПІРС; СОЇ 10А1; і ТМЕКЗЕТОА. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова бо сполука являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент. Наприклад, в деяких випадках додаткова сполука являє собою біспецифічне антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло проти МЕСЕ/анти-Апд2, таке як КО-7716 або будь-яке біспецифічне анти-МЕсЕ/анти-
Апд2 біспецифічне антитіло, описане в УМО 2010/069532 або УМО 2016/073157, або його варіант)
В іншому прикладі в деяких випадках додаткова сполука являє собою антитіло проти ІІ--6, наприклад, ЕВІ-0О31 (ЕІемеп Віоїпегарешіс5, див., Наприклад, УМО 2016/073890), силтуксимаб (ЗМІ МАМТФ), олокізумаб, клазакізумаб, сирукумаб, елсилімомаб, герилімзумаб, ОРК-003,
МЕОБІ-5117, РЕ-04236921 або їх варіант. У ще одному додатковому прикладі в деяких випадках додаткова сполука являє собою антитіло проти ІЇ/-6К, наприклад, токілізумаб (АСТЕМКАФ) (див., наприклад, УМО 1992/019579), сарилумаб, вобарилізумаб (АІЇХ-0061), 5А-237 або його варіант.
Винахід також пропонує композиції (наприклад, фармацевтичні композиції), які включають будь- які кон'югати антитіл, описані вище (наприклад, кон'югати НА, кон'юЮгати ПЕГ їі кон'югати пролікарських антитіл) і додатковий антагоніст МЕСЕ. 2. Злиті білки
Винахід забезпечує злиті білки, які включають антитіло проти МЕСЕ (наприклад, будь-який антитіло проти МЕСЕ, описане в цьому документі, наприклад, (06.31 ААКК) і окулярної- зв'язуючий домен. Окулярний зв'язує домен може зв'язуватися, наприклад, з біологічною речовиною, що знаходиться в оці (наприклад, рогівкою, склоподібним тілом, сітківкою, епітелієм сітківки або судинної оболонки), що може збільшити час утримання в оці (наприклад, вітреального) (наприклад, шляхом збільшення періоду напіввиведення і/або зменшення кліренсу) антитіла. Окулярний зв'язуючий домен може зв'язуватися з будь-яким підходящою біологічною речовиною, включаючи, наприклад, компонент позаклітинного матриксу.
Наприклад, відповідні біологічні речовини в оці (наприклад, склоподібне тіло) можуть включати позаклітинний матричний компонент, такий як вуглевод (наприклад, заряджений вуглевод (наприклад, глікозаміноглікан)), глікопротеїн (наприклад, фібрилін і оптіцин) і білок (наприклад, колаген (наприклад, типи колагену І-ХХМІЇ, зокрема колаген ІЇ, колаген ІХ, колаген У, колаген МІ, колаген ХІ і гетеротипічні фібрили колагену) або інші компоненти позаклітинного матриксу, описані, наприклад, в Ге сої еї аї., Еуе 22: 1214-1222, 2008. У деяких випадках компонент позаклітинного матриксу являє собою глікозаміноглікан, наприклад, гіалуронову кислоту (НА)
Зо або протеоглікан (наприклад, хондроїтинсульфат або сульфат гепарину). У конкретних випадках глікозаміноглікан являє собою НА. Зв'язуючі НА домени, а також злиті білки, які включають НА- зв'язуючі домени, описані, наприклад, в РагкК еї аї., Моіесшаг Рпаптасешіісз 6 (3): 801-812, 2009;
Патенти США Мо 5986052, 7183377, 7723472 та 8846034; публікація патентної заявки США Мо 2004/005277; і міжнародної патентної заявки Мо УУО 1998/052590, УМО 2010/045506, УМО 2014/099997, УМО 2015/198243, УМО 2015/110809, які включені в цей документ шляхом посилання в усій їхній повноті. Окулярний зв'язуючий домен може бути ковалентно приєднаний до антитілу, наприклад, за допомогою рекомбінантно-злитого з антитілом проти МЕСЕ. В інших випадках окулярний зв'язуючий домен може бути ковалентно кон'юговано або нековалентно кон'юговано (наприклад, за допомогою зв'язування біотин-стрепавідин) з антитілом проти МЕСЕ.
Наприклад, винахід забезпечує злитий білок, який включає антитіло проти МЕСЕ (наприклад, будь-яке антитіло проти МЕСЕ, описане в цьому документ, таке як 6.31 ААКЕК), ковалентно приєднано до НА-зв'язуючому домену. У деяких випадках НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла. Наприклад, НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до важкого ланцюга. В іншому прикладі зв'язує домен НА ковалентно приєднаний до легкого ланцюга. НА-зв'язуючий домен може бути ковалентно приєднаний до анти-МЕСЕ антитіла в будь-якому зручному місці, наприклад М-кінці, С-кінці або внутрішньому сайті (наприклад, вставці). НА-зв'язуючий домен може ковалентно приєднуватися до С-кінця важкого ланцюга або до С-кінця легкого ланцюга. Наприклад, в деяких випадках НА- зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до С-кінця важкого ланцюга. В інших випадках НА- зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до С-кінця легкого ланцюга.
У будь-якому з попередніх злитих білків, злитий білок може додатково включати лінкер, причому лінкер розташований між антитілом і НА-зв'язуючим доменом. Будь-який відповідний лінкер може бути використаний, наприклад, (СіІуп-5егп)п або (Зего-СПуп)п-лінкер, де п незалежно являє собою ціле число, що дорівнює або більше ніж 1 (наприклад, 1, 2, 3,4,5,6, 7,8,9, 10,11, 12,13 і більше). У МО 2014/099997 описується ряд лінкерів, кожний з яких може бути використаний в злитих білках даного винаходу. У деяких випадках, лінкер може включати амінокислотну послідовність (3003035 (5БО ІО МО: 61). У деяких випадках, лінкер може складатися з амінокислотної послідовності (3003035 (5БО ІЮ МО: 61). Інші відповідні лінкери включають (Сіу«5егп)я, (СПу«5ег)з тощо. У деяких випадках, серин можна замінити аланіном (наприклад, 60 (СпуАйа) або (СІУузАїа)).
У будь-якому з попередніх злитих білків, антитіло може являти собою фрагмент антитіла, який зв'язує МЕОСРЕ. У деяких випадках фрагмент антитіла обирають з групи, що складається з Раб,
Раб, Рар-С, Рар-5ЗН, Гм, зом ї (Гар)г2 фрагментів. Наприклад, в деяких випадках фрагмент антитіла являє собою Раб, Рар' або Рар-С. У деяких випадках НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до С-кінця СНІ домену Раб. В інших випадках, НА-зв'язуючий білок ковалентно приєднаний до С-кінця СІ. домену Раб.
У будь-якому з попередніх злитих білків НА-зв'язуючий домен може бути обраний з групи, що складається з модуля зв'язку, домену С1, багатого на лізин олігопептида і інших зв'язуючих НА доменів, відомих в цій галузі. Наприклад, НА-зв'язуючий домен може являти собою будь-який зв'язуючий НА домен, описаний в Рагк еї аї., МоІесшаг Рпаптасешііс5 6 (3): 801-812, 2009;
Патенти США Мо 5986052, 7183377, 7723472 та 8846034; Публікація патентної заявки США Мо 2004/005277; і/або міжнародної патентної заявки Мо МУО 1998/052590, УМО 2010/045506, МО 2014/099997, МО 2015/198243, УМО 2015/110809. Наприклад, НА-зв'язуючий домен може бути
НАТО, НА1Т0О.1, НА1ТО.2, НА11 або НА11.1, як описано в МО 2014/099997.
У деяких випадках, НА-зв'язуючий домен є модулем зв'язку. Може використовуватися будь-який відповідний модуль зв'язку. Наприклад, в деяких випадках модуль зв'язку обирають з групи, що складається з 5056, СО44, рецептора 1 гіалуронової кислоти ендотелію лімфатичних судин (ГУМЕ-1), білка, який зв'язує гіалуронову кислоту і протеоглікан (НАРІ М) 1, НАРІ М2, НАРІ ММЗ,
НАРІМ4, аггрекана, бревікана, нейрокана, фосфакана, версікана, САВб1358, КІАОБ527, стабіліна-1 і стабіліна-2 або їх варіантів. У деяких випадках модуль зв'язку є модулем зв'язку
Т5Об, наприклад, людським Т5056-модулем зв'язку. У деяких випадках, модуль зв'язку НА- зв'язуючого білка Т5О6 може включати амінокислотні залишки 36-128 Т506 людини (ОпіРгої Мо доступу РО8Обб).
Будь-який з попередніх злитих білків може додатково включати щонайменше один додатковий
НА-зв'язуючий домен. Наприклад, злитий білок може додатково включати щонайменше 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 додаткових НА-зв'язуючих доменів (домену). У деяких випадках, щонайменше один додатковий НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла. Наприклад, в деяких випадках щонайменше один додатковий НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до важкого ланцюга антитіла. В інших випадках, щонайменше один додатковий НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до легкого ланцюга антитіла. У деяких випадках, щонайменше один додатковий НА-зв'язуючий білок з'єднаний з антитілом лінкером. Може використовуватися будь-який відповідний лінкер, такий як лінкер, описаний вище. У деяких випадках лінкер включає амінокислотну послідовність (005 (ЗЕО ІЮО МО: 61).
У деяких випадках, лінкер складається з амінокислотної послідовності (0505 (ЗЕО ІЮ МО: 61).
У деяких випадках, перший НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до важкого ланцюга, а другий НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до легкого ланцюга. Щонайменше, один додатковий НА-зв'язуючий домен може бути ковалентно приєднаний до анти-МЕСЕ антитіла в будь-якому зручному місці, наприклад М-кінці, С-кінці або внутрішньому сайті (наприклад, вставці) У тих випадках, коли антитіло включає в себе більш ніж один додатковий НА- зв'язуючий домен в антитілі, вставки можуть перебувати в одному сайті в антитілі або в декількох різних сайтах в антитілі. Наприклад, в деяких випадках, перший НА-зв'язуючий домен з'єднаний з С-кінцем важкого ланцюга, а другий НА-зв'язуючий домен з'єднаний з С-кінцем легкого ланцюга. У деяких випадках, щонайменше один додатковий НА-зв'язуючий білок обирають з групи, що складається з модуля зв'язку, домену С і багатого на лізин олігопептида.
Наприклад, в деяких випадках, щонайменше один додатковий НА-зв'язуючий білок являє собою модуль зв'язку. Модуль зв'язку може бути будь-яким модулем зв'язку, описаним в цьому документі або відомим в цій галузі. У деяких випадках модуль зв'язку є модулем зв'язку Т506, наприклад, людським Т506-модулем зв'язку. У деяких випадках, модуль зв'язку НА-зв'язуючого білка Т506 може включати амінокислотні залишки 36-128 Т506 людини (ОпіРгої Мо доступу
РУ8О66).
Будь-який з попередніх злитих білків може специфічно зв'язуватися з МЕСЕ і НА. У деяких випадках злитий білок зв'язує НА з Ка близько 10 мкМ або нижче. Наприклад, в деяких випадках злитий білок зв'язує НА з Ка близько 10 мкМ або нижче, 8 мкМ або нижче, 6 мкМ або нижче, 4
МКМ або нижче, 2 мкМ або нижче, 1 мкМ або нижче, 750 нМ або нижче, 500 нМ або нижче, 250
НМ або нижче, 100 нМ або нижче, 50 нМ або нижче, 10 нм або нижче або 1 нм або нижче. У деяких випадках злитий білок зв'язує НА з Ка близько 2 нМ або нижче. У деяких випадках злитий білок зв'язує НА з Ка між близько 1 нМ і близько 2 мкМ, наприклад, між близько 1 нМ і близько 1,8 мкМ, між близько 1 нМ і близько 1,6 мкМ, між близько 1 нМ і близько 1, 4 мкМ, між близько 1 нМ і близько 1,2 мкМ, між близько 1 нМ і близько 1,0 мкМ, між близько 1 нМ і близько 60 900 нМ, між близько 1 нМ і близько 800 нМ, між близько 1 нМ і близько 700 нМ, між близько 1
НМ і близько 600 нМ, між близько 1 нМ і близько 500 нМ, між близько 1 нМ і близько 400 нМ, між близько 1 нМ і близько 300 нМ, між близько 1 нМ і близько 200 нМ, між близько 1 нМ і близько 100 нМ, між близько 1 нМ і близько 50 нМ, між близько 1 нМ і близько 40 нМ, між близько 1 нМ і близько 30 нМ, між близько 1 нМ і близько 20 нМ, між близько 1 нМ і близько 10 нМ, між близько 5 НМ і близько 100 нМ, між близько 5 НМ і близько 50 нМ, між близько 5 нМ і близько 25 нМ, між близько 5 НМ і близько 15 нМ або між близько 5 НМ і близько 10 нМ. У деяких випадках злитий білок зв'язує НА з Ка близько 10 нМ.
Будь-який з попередніх злитих білків може мати окулярний період напіввиведення, який збільшений у порівнянні з еталонним антитілом, яке ковалентно приєднано до НА-зв'язуючому домену. У деяких випадках період окулярного напіввиведення збільшують, щонайменше близько в 2 рази (наприклад, близько в 2 рази, близько в З рази, близько в 4 рази, близько в 5 разів, близько в 6 разів, близько в 7 разів, близько в 8 разів, близько в 9 разів, близько в 10 разів, близько в 12 разів, близько в 14 разів, близько в 16 разів, близько в 18 разів, близько в 20 разів або більше) щодо еталонного антитіла. У деяких випадках період окулярного напіввиведення збільшується щонайменше близько в 4 рази відносно еталонного антитіла. У деяких випадках період окулярного напіввиведення являє собою вітреальний період напіввиведення. У деяких випадках, еталонне антитіло ідентично антитілу злитого білка. В інших випадках еталонне антитіло не ідентичне антитілу злитого білка.
Будь-який з попередніх злитих білків може мати окулярний кліренс, який зменшується відносно еталонного антитіла, яка не ковалентно приєднано до НА-зв'язуючого домену. У деяких випадках кліренс зменшується, щонайменше близько в 2 рази (наприклад, близько в 2 рази, близько в З рази, близько в 4 рази, близько в 5 разів, близько в б разів, близько в 7 разів, близько в 8 разів, близько в 9 разів, близько в 10 разів, близько в 12 разів, близько в 14 разів, близько в 16 разів, близько в 18 разів, близько в 20 разів або більше) щодо еталонного антитіла. У деяких випадках кліренс зменшується, щонайменше на близько в 4 рази відносно еталонного антитіла. У деяких випадках кліренс являє собою кліренс з склоподібного тіла. У деяких випадках, еталонне антитіло ідентично антитілу злитого білка. В інших випадках еталонне антитіло не ідентичне антитілу злитого білка.
У деяких випадках період часу між двома внутрішньоочними введеннями (наприклад,
Зо інтравітреальною ін'єкцією) будь-якого з попередніх злитих білків становить щонайменше 1 місяць, наприклад, щонайменше 1 місяць, щонайменше 5 тижнів, щонайменше б тижнів, щонайменше 7 тижнів, щонайменше 8 тижнів, щонайменше 9 тижнів, щонайменше 10 тижнів, щонайменше 11 тижнів, щонайменше 12 тижнів, щонайменше 13 тижнів, щонайменше 14 тижнів, щонайменше 15 тижнів, щонайменше 16 тижнів, щонайменше 20 тижнів, щонайменше 24 тижні, щонайменше 28 тижнів, щонайменше 32 тижні, щонайменше 36 тижнів, щонайменше тижнів, щонайменше 44 тижні, щонайменше 48 тижнів, щонайменше 52 тижні або більше. У деяких випадках максимальний період між двома внутрішньоочними введеннями триває не більше ніж чотири роки, наприклад, не більше ніж три роки, не більше ніж два роки або не більше ніж один рік. Злитий білок можна вводити, наприклад, кожні два-дванадцять місяців, 40 наприклад кожні чотири-десять місяців. У деяких випадках злитий білок вводять кожні шість місяців.
Винахід також відноситься до композицій (наприклад, фармацевтичних композицій), які включають будь-який зі злитих білків, описаних вище. У деяких варіантах здійснення винаходу, композиція містить одне або більше додаткових сполук. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова сполука зв'язується з другою біологічною молекулою, обраної з групи, що складається з І-1рД, 1-6; І. -68; РОС; ангіопоетина; ангіопоетина 2; Тів-2; З1Р; інтегринів амр3, амвВ5 і а5Д1; бетацеллюліна; апеліна/АР.У); еритропоетину; фактора комплементу Ю; ТМЕ-альфа;
НТЕА!; рецептора УЕСЕ; рецептора 51-2; і білків, генетично пов'язаних з ризиком АМО, такі як компоненти комплементу шляху С2, фактора В, фактора Н, СЕНЕКЗ, СЗБ, С5, С5а і СЗа; НТКА!;
БО АВМ52; ТІМРЗ; НГ А; ІІ -8; СХЗСР1; ТІ 23; ТІ 4; СЕТР; ПІРС; СОЇ 10А1; і ТМЕЕЗЕ10А. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова сполука являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент. Наприклад, в деяких випадках додаткова сполука являє собою біспецифічне антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло проти МЕСЕ/анти-Апд2, таке як КОо- 71716 або будь-яке біспецифічне анти-МЕсСЕ/анти-Апд2 біспецифічне антитіло, описане в УМО 2010/069532 або УМО 2016/073157, або його варіант) В іншому прикладі в деяких випадках додаткова сполука являє собою антитіло проти ІІ -6, наприклад, ЕВІ-031 (Еіємеп Віоїітегарецшіісв, див., Наприклад, УМО 2016/073890), силтуксимаб (ЗМІ МАМТФ), олокізумаб, клазакізумаб, сирукумаб, елсилімумаб, герилімзумаб, ОРЕ-003, МЕОІ-5117, РЕ-04236921 або їх варіант. У ще одному додатковому прикладі в деяких випадках додаткова сполука являє собою антитіло проти ІЇ/-6К, наприклад, токілізумаб (АСТЕМЕКАФ) (див., наприклад, УМО 1992/019579), сарилумаб, вобарилізумаб (А Х-0061), БА-237 або його варіант.
Винахід також відноситься до композицій (наприклад, фармацевтичних композицій), які включають будь-який зі злитих білків, описаних вище злитих білків і додатковий антагоніст
МЕ. 3. Полімерні склади
Винахід відноситься до складів, які включають антитіло проти МЕСЕ по винаходу і полімер.
Полімерна композиція може являти собою, наприклад, мікросферу, імплантат, гідрогель, органогель, наноагрегат, міцелу, іп 6йи сформоване депо або інший тип полімерної композиції, відомий в цій галузі техніки. Будь-який відповідний полімер може бути використаний в полімерних складах по винаходу. Наприклад, полімер може являти собою гідрофільний полімер або гідрофобний полімер. Слід розуміти, що гідрофільний полімер може бути водорозчинним полімером. Може бути використаний будь-який відповідний гідрофільний полімер, наприклад гідрофільний полімер, описаний в публікації міжнародної патентної заявки Мо УМО 2011/066417 або РеїІєдгі-О'Вау єї а. 9). Ат. Спет. бос. 136:14323-14332, 2014. В інших випадках, наприклад, можуть бути використані гідрофобні полімери. Полімер може бути біорозкладаним і/або біосумісним.
Ілюстративні необмежуючі гідрофільні полімери, які можуть бути використані, включають гіалуронову кислоту (НА), поліетиленгліколь (ПЕГ, також відомий як полі(етиленгліколь)) (наприклад, ПЕГ з прямим ланцюгом, розгалужений ПЕГ, гребінчастий ПЕГ і дендритний ПЕГ), полі(етиленоксид)-ко--метиленовий етиленоксид)|, полі(полі(етиленгліколь) метиловий ефір метакрилата) (рРРЕСМА), агарозу, альгінат, карагенан, карбоксиметилцелюлозу, целюлозу, похідні целюлози, хітозан, хондроїтинсульфат, колаген, дерматансульфат, декстран, декстрансульфат, фібрин, фібриноген, фібронектин, фукоїдан, желатин, глікозаміноглікани (САС), глікополімери, гепарин, сульфат гепарину, сильно розгалужений полісахарид (наприклад, галактозний дендример), кератансульфат, метил-целюлозу, гідроксипропілметилцелюлозу (НРМС), полі(М-(2-гідроксипропіл) метакриламід) (рРНРМА), пектини, похідні пектину, полісульфат пентозану, крохмаль, гідроксиетилкрохмаль (ГЕК), стирол, вітронектин, полі(акрилову кислоту), полі(метакрилову кислоту), полі(акриламід),
Зо полі(акрилову кислоту), полі(аміни), полі(амінокислоти), полі(карбоксибетаїн) (РСВ), поліелектроліти, поли(глутамінову кислоту) (РОСА), полі(гліцерин) (РО) (наприклад, лінійний, середньофункціональний, гіперрозгалужений, або лінійний гіперрозгалужений Ро), полі(малеїнову кислоту), полі(2-оксазолін) (РОЇ), полі(2-етил-2-оксазолін, полісіалова кислота (ПСА), полістирол, похідні полістиролу (наприклад, заряджені похідні полістиролу), полі(стиролсульфонат-со-РЕСМА), полівінілпіролідон (ПВП), полі(М-акрилоїлморфолін) (рРМАсСМ) і їх сополімери. В інших випадках може бути використаний будь-який відповідний гідрофобний полімер, що включає, наприклад, полі(молочно-ко-гликолеву кислоту) (РІ СА), полілактид (РГА) і полігліколід (РОА).
Винахід відноситься до анти-МЕСЕ антитіл, складеним у вигляді депо з полімерним розчинником (також відомим як іп 5зйиш сформовані імплантати). Наприклад, депо полімерного розчинника може включати полімер (наприклад, будь-який з описаних в цьому документі полімерів, наприклад гідрофобний полімер, такий як РІ СА), розчинник (наприклад, органічний розчинник) і анти-МЕСЕ антитіло (наприклад, будь-яке антитіло проти МЕСЕ, описане в даному документі). Розчинник може мати низьку змішуваність з водою. Приклади органічних розчинників, які можуть бути використані, включають триацетин (ацетат гліцерину), М-метіл-2- піролідон, діетиловий ефір полі(етиленгліколю) і етилбензоат. В одному робочому прикладі, депо полімерного розчинника може бути отримано диспергуванням висушеного розпиленням порошку антитіла проти МЕСЕ (наприклад, будь-якого антитіла проти МЕСЕ, описаного в даному документі, наприклад, 56.31 ААКК) в розчині РІ СА-триацетина (див., наприклад, Спапоа еї аї...
Ріпапт. осі. 104 (10): 3404-17, 2015, який включений в цей опис за допомогою посилання в повному обсязі). РІССА може мати молекулярну масу близько 10 кДа, близько 41 кДа, або близько 56 кДа, наприклад. Полімери РІ СА є комерційно доступними, наприклад, КО 7525,
КОо7555 і КО 7565 (Емопік Іпдивігіех, Дармштадт, Німеччина). Концентрація РГСА може становити близько 7,5 95, близько 10 95, близько 12,5 95, близько 15 95, близько 20 95 або більше (мас. 95). Концентрація антитіла може становити близько 1 95, близько 1,5 95, близько 2 95, близько 2,5 95, близько З 95, близько 4 95, близько 5 95 або більше (95 мас.). У деяких випадках концентрація антитіл становить близько 1,595 (мас. 90). Будь-який склад депо полімерних розчинників може бути введений, наприклад, через голку 27 калібру (2705). При введенні (наприклад, шляхом ін'єкції (наприклад, інтравітреальної ін'єкції)) такі склади депо полімерних бо розчинників можуть перетворюватися в гель або тверде депо в оці. Гель або тверде депо можуть утворюватися в результаті розшаровування водної і неводної фаз. Залежно частково від швидкості перенесення розчинника в водній фазі, ін'єктоване депо може перейти в твердий матеріал або гель через осадження полімеру і фізично захоплювати анти-МЕСЕ антитіло (їі будь-які додаткові терапевтичні агенти або сполуки). В інших випадках, наприклад, поперечне зшивання іп 5йш або іп 5йи-застигаючі органогелі можуть бути використані для утворення гелю або твердого депо. Депо полімерного розчинника може забезпечити довгострокову доставку, наприклад, протягом близько 30 днів або більше, наприклад, близько 30 днів, близько 40 днів, близько 50 днів, близько 60 днів, близько 70 днів, близько 80 днів, близько 90 днів, близько 100 днів, близько 110 днів, близько 120 днів, близько 130 днів або більше. У деяких випадках депо полімерних розчинників може забезпечити довгострокову доставку протягом близько 80 днів в оці.
Винахід також відноситься до анти-МЕСЕ антитіла (наприклад, до будь-якого анти-МЕСЕ антитіла, описаного в даному документі), складеним у вигляді полімерної міцели. Полімерна міцела може бути утворена, наприклад, шляхом самозбирання полімеру (наприклад, амфіфільного блоку (наприклад, диблочного або багатоблокового) сополімера) в наночастинку, що має гідрофобну серцевину і гідрофільну оболонку. Полімерна міцела може мати будь-який відповідний діаметр (наприклад, середній діаметр), наприклад, діаметр від близько 1 нм до близько 1000 нм (наприклад, близько 1 нм, близько 10 нм, близько 100 нм, близько 200 нм, близько 300 нм, близько 400 нм, близько 500 нм, близько 600 нм, близько 700 нм, близько 800 нм, близько 900 нм, близько 1000 нм) або більше. У деяких випадках полімерна міцела може мати діаметр (наприклад, середній діаметр) від близько 5 нм до близько 100 нм (наприклад, близько 5, близько 10, близько 20, близько 30, близько 40, близько 50, близько 60, близько 70, близько 80, близько 90 або близько 100 нм). Можна використовувати будь-який відповідний полімер, включаючи, наприклад, амфіфільні блок-сополімери, такі як полі(пропіленоксид) (РРО), полі(О, Г-молочна кислота) (РОГ ГА), полі(є-капролактон) (РСІ), полі(І -аспартат) і полоксамер (наприклад, полі(етиленоксид)-блок-полі(пропіленоксід)-блок-полі(етиленоксид) сополімери (наприклад, Р ОКОМІСВФ)). Інші амфіфільні блок-сополімери відомі в цій галузі У деяких випадках антитіло проти МЕСЕ може бути приєднано до гідрофільної оболонки полімерної міцели, наприклад, шляхом ковалентного приєднання до полімеру. Відповідно, в деяких
Зо випадках кон'югат антитіла, описаний вище, може бути використаний для отримання полімерної міцели, яка включає антитіло проти МЕСЕ.
Винахід також відноситься до анти-МЕСЕ антитіла (наприклад, до будь-якого анти-МЕСЕ антитіла, описаного в цьому документі, наприклад, 06.31 ААКК), складеному у вигляді полімерного імплантату. Полімерний імплантат являє собою жорсткий об'єкт, в якому твердий лікарський препарат (наприклад, антитіло) рівномірно розподіляється всередині гідрофобного полімеру (наприклад, РІ СА). Полімерний імплантат зазвичай має міліметровий розмір (наприклад, 0,1 мм, 0,2 мм, 0,3 мм, 0,4 мм, 0,5 мм, 0,6 мм, 0,7 мм, 0,8 мм, 0, 9 мм, 1 мм, 1,1 мм, 1,2 мм, 1,3 мм, 1,4 мм, 1,5 мм, 1,6 мм, 1,7 мм, 1,8 мм, 1,9 мм, 2 мм, 2,1 мм, 2,2 мм, 2,3 мм, 2,5
ММ, З мм, 4 мм, 5 мм, 6 мм, 7 мм, 8 мм, 9 мм, 10 мм, 11 мм, 12 мм, 13 мм, 14 мм, 15 мм, 16 мм, 17 мм, 18 мм, 19 мм, 20 мм або більше). Полімерний імплантат можна вводити в око, наприклад, хірургічною процедурою (наприклад, мікрохірургії) або шляхом ін'єкції (наприклад, шляхом інтравітреальної ін'єкції) з використанням відповідного пристрою. Полімерний імплантат може бути складений для введення в будь-яку відповідну ділянку в оці, наприклад, в склоподібну, передню або задню камери ока або внутрішньоретинальну, субретинальну, інтрахоридну, супрахоріоїдальну, епісклеральну, субкон'юнктивальну, внутрішньокорнеальну або в епікорнеальну ділянки очей. У конкретних випадках полімерний імплантат готують для введення в склоподібне тіло.
Полімерний імплантат, який включає антитіло проти МЕСЕ (наприклад, будь-яке антитіло проти
МЕСЕ, описане в даному документі, наприклад (6.31 ААКК), може бути отримано з використанням процесу екструзії гарячим розплавом (НМЕ). Теплом впливають на розплав (псевдозрідження) полімеру, а потім механічне зрушення може бути передано для змішування і мікрокомпозиції твердого лікарського складу в фазі рідкого полімеру. Потім суміш лікарського препарату-полімеру може бути екструдована крізь матрицю міліметрового розміру (наприклад, круглу головку). Коли екструдату дають охолонути (наприклад, до кімнатної температури), він утворює стрижні (наприклад, циндрильні стрижні), які можна розрізати на будь-яку бажану довжину. У деяких випадках полімерний імплантат може бути стрижнем РІ СА, який включає антитіло проти МЕСЕ і РІ СА. Полімерні імплантати, які можуть бути використані в контексті цього винаходу, описані, наприклад, в Каіадораї еї аї. 9. Рпаптасеціїса! 5сіепсев 102 (8): 2655- 2666, 2013 їі публікації міжнародної патентної заявки Мо М/О 2006/093758, які включені в цей 60 опис за допомогою посилання у всій їх повноті.
В одному робочому прикладі антитіло проти МЕСЕ (наприклад, будь-яке антитіло проти МЕСБЕ, описане в цьому документі) може бути отримано у вигляді висушеної розпиленням композиції, яка може включати трегалозу і гістидин-НСІ-буфер для стабільності при підвищених температурах, яка може бути додана до гідрофобного полімеру, такого як РІ СА, і схильна до
НМЕ з утворенням полімерного імплантату (див., наприклад, Ка)адораї! еї аІ., вище). Наприклад, висушена розпиленням композиція може включати антитіло в будь-якій зручній концентрації (наприклад, 1 мг/мл, 2 мг/мл, З мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 11 мг/мл, 12 мг/мл, 13 мг/мл, 14 мг/мл, 15 мг/мл, 16 мг/мл, 20 мг/мл, 25 мг/мл, 30 мг/мл), трегалозу в будь-якій зручній концентрації (наприклад, 1 мг/мл, 2 мг/мл, З мг/мл, 3,3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, б мг/мл, 7 мг/мл, 10 мг/мл і/або буфер (наприклад, 10 мМ гістидин НОЇ).
Висушений розпиленням склад може мати будь-який відповідний рН, наприклад, рН близько між близько 5 і близько 8 (наприклад, близько 5, близько 6, близько 7 або близько 8). У деяких випадках висушений розпиленням склад може мати рН близько 6 або близько 6,2. В окремих випадках висушений розпиленням склад включає антитіло проти МЕСЕ, 3,3 мг/мл трегалози і 10
ММ гістидин-НСІЇ, рН 6,2. Полімерний імплантат може бути отриманий за допомогою НМЕ- висушеного розпиленням складу за допомогою гідрофобного полімеру, такого як РІ А.
Наприклад, тверді гранули РІ СА і висушений розпиленням склад можна попередньо змішувати при кімнатній температурі і подавати в конічний, протиобертовий двошнековий екструдер.
Комбінація може бути мікрокомпонентною, а потім екструзією при 100 "С крізь круглу головку діаметром 0,5 мм. У деяких випадках висушений розпиленням склад піддають дії 100" протягом менше 30 хвилин.
Полімерний імплантат може містити, наприклад, від близько 195 до близько 90 95 антитіла проти МЕСЕ (наприклад, близько 1 95, близько 5 95, близько 10 95, близько 20 95, близько 30 95, близько 40 95 близько 50 95, близько 60 95, близько 70 95, близько 80 95 або близько 90 95) за вагою. У деяких випадках полімерний імплантат включає близько 10 95 антитіла проти МЕСЕ за вагою. Полімерний імплантат може мати будь-які відповідні розміри, наприклад, в деяких випадках імплантат має діаметр від близько 0,1 до близько 1 мм (наприклад, близько 0,5 мм) і довжину від близько 1 до близько 30 мм (наприклад, близько 14 мм). Для імплантатів РІ А (наприклад, стрижнів РІ СА) відсоток полімолочної кислоти в РІ зЗА-сополімері може становити
Ко) 0-100 95, наприклад, близько 15-85 95, близько 35-65 956 або 50 95. У деяких випадках РІ СА- імплантат (наприклад, стрижень РІ СА) може додатково включати один або більше додаткових полімерів, наприклад гідроксипропілметилцелюлозу (НРМС).
У будь-якому з попередніх полімерних складів (наприклад, депо полімерних розчинників, полімерні міцели і полімерні імплантати) антитіло може являти собою фрагмент антитіла, який зв'язує МЕСЕ. У деяких випадках фрагмент антитіла обирають з групи, що складається з Раб,
Еар, Бар-С, Раб-5Н, Ем, 5сЕм і (Раб)г фрагментів. Наприклад, в деяких випадках фрагмент антитіла являє собою Раб, Рар' або Рар-б.
Будь-який з попередніх полімерних складів (наприклад, депо полімерних розчинників, полімерних міцел і полімерних імплантатів) може мати період окулярного напіввиведення, який збільшується щодо еталонного антитіла, яке не складено у вигляді полімерного складу. У деяких випадках період окулярного напіввиведення збільшують, щонайменше близько в 2 рази (наприклад, близько в 2 рази, близько в З рази, близько в 4 рази, близько в 5 разів, близько в 6 разів, близько в 7 разів, близько в 8 разів, близько в 9 разів, близько в 10 разів, близько в 12 разів, близько в 14 разів, близько в 16 разів, близько в 18 разів, близько в 20 разів або більше) щодо еталонного антитіла. У деяких випадках період окулярного напіввиведення збільшується щонайменше близько в 4 рази відносно еталонного антитіла. У деяких випадках період окулярного напіввиведення являє собою життєвий період життя. У деяких випадках, еталонне антитіло ідентично антитілу полімерного складу. В інших випадках еталонне антитіло не ідентичне антитілу полімерного складу.
Будь-який з попередніх полімерних складів (наприклад, депо полімерних розчинників, полімерних міцел і полімерних імплантатів) може мати окулярний кліренс, який зменшується відносно еталонного антитіла, яке не складено у вигляді полімерного складу. У деяких випадках кліренс зменшується, щонайменше близько в 2 рази (наприклад, близько в 2 рази, близько в З рази, близько в 4 рази, близько в 5 разів, близько в 6 разів, близько в 7 разів, близько в 8 разів, близько в 9 разів, близько в 10 разів, близько в 12 разів, близько в 14 разів, близько в 16 разів, близько в 18 разів, близько в 20 разів або більше) щодо еталонного антитіла. У деяких випадках кліренс зменшується, щонайменше на близько в 4 рази відносно еталонного антитіла. У деяких випадках кліренс являє собою кліренс з склоподібного тіла. У деяких випадках, еталонне антитіло ідентично антитілу полімерного складу. В інших випадках еталонне антитіло не бо ідентичне антитілу полімерного складу.
У деяких випадках період часу між двома внутрішньоочними введеннями (наприклад, інтравітреальною ін'єкцією) будь-якого з попередніх полімерних складів становить щонайменше 1 місяць, наприклад, щонайменше 1 місяць, щонайменше 5 тижнів, щонайменше 6 тижнів, щонайменше 7 тижнів, щонайменше 8 тижнів, щонайменше 9 тижнів, щонайменше 10 тижнів, щонайменше 11 тижнів, щонайменше 12 тижнів, щонайменше 13 тижнів, щонайменше 14 тижнів, щонайменше 15 тижнів, щонайменше 16 тижнів, щонайменше 20 тижнів, щонайменше 24 тижні, щонайменше 28 тижнів, щонайменше 32 тижні, щонайменше 36 тижнів, щонайменше 40 тижнів, щонайменше 44 тижні, щонайменше 48 тижнів, щонайменше 52 тижні або більше. У деяких випадках максимальний період між двома внутрішньоочними введеннями триває не більше чотирьох років, наприклад, не більше трьох років, не більше двох років або не більше одного року. Полімерний склад можна вводити, наприклад, кожні два-дванадцять місяців, наприклад кожні чотири-десять місяців. У деяких випадках полімерний склад вводять кожні шість місяців.
Винахід також відноситься до композицій (наприклад, фармацевтичних композицій), які включають в себе будь-які полімерні склади (наприклад, депо полімерних розчинників, полімерні міцели і полімерні імплантати), описані вище. У деяких варіантах здійснення винаходу, композиція містить одне або більше додаткових сполук. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова сполука зв'язується з другою біологічною молекулою, обраної з групи, що складається з І/-18, І/-6; І/-6К; РОСОБЕ; ангіопоетина; ангіопоетина 2; Тіе-2; 51Р; інтегринів ауВЗ3, смВ5 і а5Д1; бетацеллюліна; апеліна/АРУ; еритропоетину; фактора комплементу р; ТМЕ-альфа; НТКА1; рецептора МЕСЕ; рецептора 5-2; і білків, генетично пов'язаних з ризиком АМО, такі як компоненти комплементу шляху С2, фактора В, фактора Н, СЕНКЗ, СЗБ,
С5, С5а і СЗа; НТЕАТ; АЕМ552; ТІМРЗ; НГ А; 1-8; СХЗСР1; ТІ 3; ТІ К4; СЕТР; ПІРС; СОЇ 10А1; і
ТМЕБНЗЕТ0ОА. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова сполука являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент. Наприклад, в деяких випадках додаткова сполука являє собою біспецифічне антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло проти МЕСГ/анти-Апд2, таке як да-7716 або будь-яке біспецифічне анти-МЕСЕ/анти-Апд2 біспецифічне антитіло, описане в
МО 2010/069532 або УМО 2016/073157, або його варіант) В іншому прикладі в деяких випадках додаткова сполука являє собою антитіло проти ІІ -6, наприклад, ЕВІ-031 (Еіємеп Віоїітегарецшіісв,
Ко) див., Наприклад, УМО 2016/073890), силтуксимаб (5! МАМТФ), олокізумаб, клазакізумаб, сирукумаб, елсилімомаб, герилімзумаб, ОРК-003, МЕО0І-5117, РЕ-04236921 або їх варіант. У ще одному додатковому прикладі в деяких випадках додаткова сполука являє собою антитіло проти 1І/-6К, наприклад, токілізумаб (АСТЕМЕАФ) (див., наприклад, УМО 1992/019579), сарилумаб, вобарилізумаб (А Х-0061), БА-237 або його варіант.
Винахід також відноситься до композицій (наприклад, фармацевтичних композицій), які включають в себе будь-які полімерні склади (наприклад, депо полімерних розчинників, полімерні міцели і полімерні імплантати), описані вище и додатковий антагоніст МЕСЕ. 4. Прилади
Будь-яку з описаних в цих документах композицій (наприклад, антитіла проти МЕСЕ, кон'югати антитіл, злиті білки і полімерні склади) можна вводити в око за допомогою пристрою доставки порт. Пристрій доставки порт являє собою багаторазовий пристрій, що імплантується, який може випускати терапевтичний агент (наприклад, антитіло проти МЕСЕ) протягом декількох місяців (наприклад, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 і більше місяців). Ілюстративні пристрої доставки порт, які можуть бути використані, включають в себе ті з Рогбідні Гаре, 1 С і/або
Еогб5ідні МІБІОМ4, наприклад, як описано в публікаціях міжнародної патентної заявки Мо УМО 2010/088548, МО 2015/085234, МО 2013/116061, УМО 2012/019176, МО 2013/040247 і УМО 2012/019047, які включені в цей опис за допомогою посилання у всій їх повноті.
Наприклад, винахід відноситься до пристроїв доставки порт, які містять у собі резервуари, що містять будь-які з описаних в цьому документі композицій (наприклад, антитіла проти МЕСБЕ, кон'югати антитіл, злиті білки і полімерні склади). Пристрій доставки порт може додатково містити проксимальний ділянку, трубчастий корпус, з'єднаний з проксимальною ділянкою, з'єднана з текучим середовищем з резервуаром, і один або більше виходів, сполучених по текучому середовищу з резервуаром і виконаних з можливістю впорскування композиції в око.
Трубчастий корпус може мати зовнішній діаметр, який може бути вставлений через розріз або отвір в оці розміром близько 0,5 мм або менше. Довжина пристрою може складати від близько 1 мм до близько 15 мм в довжину (наприклад, близько 1 мм, близько 2 мм, близько 4 мм, близько 5 мм, близько 6 мм, близько 7 мм, близько 9 мм, близько 11 мм, близько 13 мм або близько 15 мм в довжину). Резервуар може мати будь-який відповідний обсяг. У деяких випадках резервуар має обсяг від близько 1 мкл до близько 100 мкл (наприклад, близько 1 мкл, близько 5 60 мкл, близько 10 мкл, близько 20 мкл, близько 50 мкл, близько 75 мкл або близько 100 мкл). Цей пристрій або його складові частини можуть бути виготовлені з будь-якого відповідного матеріалу, наприклад поліїміду.
У деяких випадках пристрій доставки порт включає резервуар, що містить будь-яку з описаних в даному документі композицій (наприклад, антитіла проти УМЕСЕ, кон'югати антитіл, злиті білки і полімерні склади) і одне або більше додаткових з'єднань. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова сполука зв'язується з другою біологічною молекулою, обраної з групи, що складається з ІІ -1рД, 1-6; І -6К; РОСОБЕ; ангіопоетина; ангіопоетина 2; Тів-2; 51Р; інтегринів амр3, амвВ5 і а5Д1; бетацеллюліна; апеліна/АР.У); еритропоетину; фактора комплементу Ю; ТМЕ-альфа;
НТЕА!; рецептора УЕСЕ; рецептора 5-2; і білків, генетично пов'язаних з ризиком АМО, такі як компоненти комплементу шляху С2, фактора В, фактора Н, СЕНЕКЗ, СЗБ, С5, С5а і СЗа; НТКА!;
АВМ52; ТІМРЗ; НІ А; ІІ -8; СХЗСКІ1; ТІ КЗ; ТІ К4; СЕТР; ПІРС; СОЇ 10А1; і ТМЕКЗЕТОА. У деяких варіантах здійснення винаходу, додаткова сполука являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент. Наприклад, в деяких випадках додаткова сполука являє собою біспецифічне антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло проти МЕСЕ/анти-Апд2, таке як КОо- 7716 або будь-яке біспецифічне анти-МЕСЕ/анти-Апд2 біспецифічне антитіло, описане в УУО 2010/069532 або УМО 2016/073157, або його варіант) В іншому прикладі в деяких випадках додаткова сполука являє собою антитіло проти ІІ -6, наприклад, ЕВІ-031 (Еіємеп Віоїітегарецшіісв, див., Наприклад, УМО 2016/073890), силтуксимаб (ЗМІ МАМТФ), олокізумаб, клазакізумаб, сирукумаб, елсилімомаб, герилімзумаб, ОРК-003, МЕО0І-5117, РЕ-04236921 або їх варіант. У ще одному додатковому прикладі в деяких випадках додаткова сполука являє собою антитіло проти 1І/-6К, наприклад, токілізумаб (АСТЕМКАФ) (див., наприклад, УМО 1992/019579), сарилумаб, вобарилізумаб (А Х-0061), БА-237 або його варіант.
У деяких випадках пристрій доставки порт включає в себе будь-яку з описаних в даному документі композицій (наприклад, антитіла проти МЕСЕ, кон'югати антитіл, злиті білки і полімерні склади) і додатковий антагоніст МЕСЕ.
І. Приклади
Нижче наведені приклади способів і композицій відповідно до даного винаходу. Слід розуміти, що з огляду на загальний опис, представлений вище, можна здійснити різні інші варіанти реалізації цього винаходу.
Приклад 1: Глибокий скануючий мутагенез 06.31 визначає позиції, важливі для складання стабільної зібраної ар
О6.31 являє собою високоафінне антитіло проти МЕСЕ (Рий еї аї., У. Віої. Снет. 281(10):6625- 6631 (2006); Папа еї аї!., 9. Віої. Снет. 281(2):951-961 (2006). 56.31 вважається представником людських антитіл, оскільки його варіабельні домени важкого і легкого ланцюгів часто використовуються зародковими лініями ІЗНМЗ3-23 ії ІЄКМ1-39 людського походження, відповідно.
Щоб систематично оцінювати вплив одиночних мутацій в доменах МН і МІ. 36.31, була створена насичена бібліотека мутагенезу одного сайту для кожного варіабельного домену (МІ. положення 2-107 та МН положення 2-113 згідно зі схемою нумерації Кабата). Ці бібліотеки називаються бібліотеками проходження МН і МІ ММК відповідно. Використання цих бібліотек в глибокому мутаційному скануючому експерименті дозволило розрахувати коефіцієнт збагачення (ЕК) для кожної мутації в обох бібліотеках під час відбору, які служать оцінкою впливу мутації на придатність молекули. ЕК специфічної мутації агрегує безліч ефектів, включаючи вплив мутації на функціональну експресію, вплив мутації на стабільність згортання і вплив мутації на зв'язування з селекційним білком (наприклад, анти-д40 (пептидна мітка, злита з С-кінцем легкого ланцюга), білок А, білок Ї або МЕСБЕ).
Щоб оцінити вплив кожної мутації на функціональну експресію і стабільність згортання ГЕарб, бібліотеки МН їі Мі були пенінговані окремо проти анти-90, білка А або білка І. Ці стратегії пенінгування виявляють, чи відображається молекула Раб на фоагі і, в якійсь мірі, чи правильно він згорнутий і зібраний. ЕК для 2331 і 2226 амінокислотних замін (включаючи стопи) і відповідної амінокислоти дикого типу в даному положенні бібліотеки важкого ланцюга і бібліотеки легкого ланцюга, відповідно, визначали для кожного з трьох пенінгів (фіг1А-1 РЕ).
Порівняння трьох стратегій пенінгування важкого ланцюга або трьох пенінгів легкого ланцюга показує, що дуже схожі результати були отримані (фіг.2А-2В). Наприклад, ЕК показують хорошу лінійну залежність (г--0,98) між анті-дО і пенінгуванням білка ГІ. (фіг.2А). Порівняння між набором даних пенінгування білка А і набором даних пенінгування білка І. показало більш низьку лінійну кореляцію (1--0,611), що можна віднести до підмножини мутацій, які безпосередньо впливають на зв'язування білка А і, отже, диференціальне збагачення в двох відборах. Аналогічна картина спостерігалася для легкого ланцюга (фіг. 28).
В одному підході для визначення позицій, які впливають на функціональну експресію і бо стабільність Раб, визначалися положення, які були консервативні і які не переносять мутації під час відбору. Використовуючи набір даних, отриманий з пенінга анті-ч!О як репрезентативного сканування, середній коефіцієнт збагачення всіх мутацій в цій позиції (ЕКроє) був розрахований для кожної позиції як міра консервативності (фіг. ЗА-3В). В обох доменах МН і Мі. центральні залишки ядра, які складаються з пари цистеїну (НС-С22, НО-С93, І 0-С23, І 0-88) між ВД-нитками
В їі ЕР, а також суміжний залишок триптофану (НС-МУ/Зб, І С-М/35) були висококонсервативними (фіг-ЗА-30). Гідрофобне ядро складки імуноглобуліну описано, наприклад, у НаїаБбу еї аї. Ргоївіп
Епаіпеетіпд 12 (7): 563-571, 1999. Поруч з центральним ядром знаходяться кілька гідрофобних залишків, розташованих в нижній половині молекули (коли Бар орієнтований так, що НУК звернені вгору), які є частиною розширеного гідрофобного ядра. Вони були консервативні, але показали менші значення ЕКрох, ніж центральні залишки ядра. Серед цих залишків є тирозин (НОС-М90, НО-86), який, як було показано раніше, важливий для стабільності Ід-складки (див., наприклад, Наптії еї аї., У. Мої. Віо!І. 295(3):641-649 (2000). Третя група консервативних залишків перебувала в інтерфейсі МНЛ/. (НС-І 45, НО-м91, НО-МУ103, І С-Р44, 1 0-У36, І 0-96). Залишки інтерфейсу УНЛ/І. були не тільки консервативні в пенінгі з непрямим вибором (наприклад, дані
МН з пенінга білка І), але також і прямим вибором (наприклад, дані УН з пенінга білка А), що вказує на те, що мутації в згаданих положеннях інтерфейсу привели до зібраного Раб зі зниженою стабільністю. Четверта група консервативних залишків (НС-Е46, НО-НЗ38, НО-О86,
ІЇ6-86б1, 110-082) включає залишки у водневих мережах зв'язку в нижній половині Раб, які важливі для стабільності. Особливо аспартатний залишок в а1-спіралі відноситься до позицій, які показали одну з найвищих консервативних в наборі даних. Мутація в положенні І С-К61 і І С- рва2 була показана раніше, щоб індукувати утворення фібрил та індукувати агрегацію в легких ланцюгах (див. Неїтз еї аї., у. Мої. Віої. 257(1):77-86 (1996)). Нарешті, чотири позиції в НМК-НЗ були ідентифіковані як висококонсервативні: НС-АЗЗ, НО-НУЗ4, НО-РІ100, НО-0101. Оскільки ці стратегії пенінга не були відібрані для зв'язування антигену, ці результати показали, що конформація петлі НМЕЗ пов'язана зі стабільністю Раб.
Таким чином, за винятком того, що кілька позицій варіабельних доменів «є висококонсервативними, багато позицій можуть переносити мутації, не впливаючи на загальну стабільність і експресію молекули Раб в цих селекціях. Крім того, навіть деякі позиції, які мають невеликий ЕкКрозх, можуть переносити консервативні амінокислотні заміни. Наприклад, дані
Зо мутагенезу показали, що гідрофобні залишки нижньої серцевини можуть бути заміщені аналогічним гідрофобним залишком, не впливаючи на стабільність Баб (фіг. Л1А-1Б).
Толерантність МН/Л// стабільності для окремих заміщень контрастує з результатами, отриманими при глибокому скануванні мутагенезу домену СНЗ ІдДО1 людини, в якому більшість залишків не переносять ніяких мутацій (див. ТгахуЇтауг еї аї., У. Мої, Вісі. 423(3):397-412 (2012)).
Матеріали і способи
А. Розробка і створення повного варіабельного домену бібліотеки проходження ММК.
Повні МН (залишки 2-113) і МІ (залишки 2-107) 06.31 піддавалися рандомізації. 10-12 наступних залишків були рандомізовані на кожну суб-бібліотеку. Усередині суб-бібліотеки ТАА кодон вводили в кожну рандомізовану позицію за допомогою мутагенезу Кункеля (Кипкеї, Ргос. Маї).
Асад. 5сі. ОБА 83(2):488-492 (1985)). Було створено 10 МІ. суб-бібліотек і 12 МН суб-бібліотек стоп-зразків. Для проектування бібліотеки кожна позиція була рандомізована олігонуклеотид- спрямованим мутагенезом з кодоном ММК, де М являє собою будь-який з чотирьох природних нуклеотидів, а К являє собою 50 95 Т (тимін) і 50 95 С (гуанін). Кодон ММК може кодувати будь- яку з 20 природних амінокислот. Суб-бібліотеки для легкого ланцюга і важкого ланцюга були зроблені окремо, а потім відповідно бібліотеки для кожного ланцюжка були об'єднані з утворенням бібліотеки У. і бібліотеки МН. Об'єднані бібліотеки також називаються бібліотеками проходження ММК УН або У. Бібліотеки були зроблені в векторі відображення фагового Еар- фрагмента. Бібліотека проходження ММК МН мала розмір З х 109 членів, а бібліотека проходження ММК МІ. мала розмір 8 х 109 членів.
В. Відбір пенінга фага на анти-до, білку І або білку А
Зв'язуючі клони відбирали шляхом інкубації бібліотеки проходження фагового дисплея ММК УНН або МІ. з 5, 0,5, 0,1 нМ біотинільовані МЕСЕ в послідовних раундах відбору, а потім конкурували зі 100 нМ небіотинільованого МЕСЕ при кімнатній температурі або 37 "С для зменшення зв'язування клонів з низькою афінністю до МЕСЕРЕ. Пов'язані клони фіксували на пластинах ІФА, покритих нейтравідином, промивали і елюювали в 100 мМ НСІ протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Елюйований фаг нейтралізували 1/10 об'єму 1 М Трис рН 8,0 і використовували для зараження Е. соїї для ампліфікації для наступного раунду відбору.
Для відбору за допомогою анти-доО, білка І. або білка А клони для зв'язування обирали шляхом інкубації бібліотеки проходження фагового дисплея ММК МН або Мі. на пластинах ІФА, покритих 60 анти-дО, білком І або білком А, промивали і елюювали 100 мМ НС протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Елюйований фаг нейтралізували 1/10 об'єму 1 М Трис рН 8,0 і використовували для зараження Е. соїї для ампліфікації для наступного раунду відбору.
С. Шитіпа сіквенування глибоко мутаційних скануючих бібліотек (36.31
Для глибокого сіквенування, ДНК фагемідів виділяли з клітин ХІ 1 Е. соїї, що переносять вектори фагемідів, або з не обраної, або з обраної бібліотеки проходження ММК МН або МІ. Очищену
ДНК використовували як матрицю для ПЛР на основі обмеженого циклу ампліфікації ділянок МІ. і МН. Продукти ПЛР очищали екстракцією і очищенням за допомогою агарозного гелю (комплект для екстракції гелю Оіадеп). Елюйована ДНК ампліконів використовувалася в якості основи для підготовки бібліотеки глибокого сіквенування зі стандартними методами підготовки бібліотеки
Шиптіпа з використанням зразка проб ДНК ТКОБЗЕС "М (Шиптіпа). Бібліотеки, пов'язані з адаптерами, піддавали однократному циклу ПЛР і сіквенували на Шитіпа МІЗЕОФЄ), парному кінці 300 п.о., щоб покрити всю довжину амплікона. р. Аналіз даних глибинного сканування мутагенезу
Послідовні парні зчитування кінців були об'єднані з використанням РГАБИП (Мадос еї аї.,
Віоіптоптаїйсв 27 (21): 2957-2963 (2011)). Подальший аналіз даних послідовності виконувався з використанням мови статистичного програмування К (Теат КС "ЕК: А Іапдиаде апа епмігоптепі тог зіаїйївіїса!І сотриййпд" А Рошипааїйоп ог еіаїївіїса! Сотрипа (2014)) і пакету ЗпогіКеай (Могдап еї а!., Віоіпоптаїййсвь 25(19):2607-2608 (2009)). Першим кроком у контролі якості була фільтрація для послідовностей, які містили відповідний НС і С штрих-код. На другому етапі фланкуючі ділянки домену МН і Мі були ідентифіковані для кожного об'єднаного зчитування і перевірені на правильну довжину, щоб видалити переважну більшість читань з мутаціями вставки або делеції (іпаеіє). Щоб додатково виправити помилки послідовності, мутації, відмінні від ММК, були перетворені назад в базу дикого типу, і дані, що містять більше двох мутацій ММК, були відфільтровані. Матриці маси позиції були згенеровані шляхом обчислення частоти всіх мутацій кожної рандомізованої позиції. Коефіцієнти збагачення для всіх мутацій розраховувалися шляхом ділення частоти даної мутації в цій позиції у відсортованому зразку з частотою тієї ж самої мутації в несортованому зразку, як описано раніше (Роулег еї а!Ї., Маїшге Меїподз 7 (9)): 7412-746 (2010)).
Приклад 2: Скринінг глибокого скануючого мутагенезу (36.31 ідентифікує варіанти
Зо амінокислотних залишків з підвищеною стабільністю і/або поліпшеною афінністю зв'язування з
ЕСЕ
Щоб отримати вичерпний огляд впливу одиночних заміщень (6.31 на зв'язування антигену, бібліотеки проходження ММК МН і Мі, описані в прикладі 1, були піддані пенінгу проти МЕСЕ (фіг.4А-48). Отримані значення коефіцієнта збагачення (ЕК) показали бімодальний розподіл (фіг.5А-58). Підмножина мутацій сильно негативно вплинуло на функцію зв'язування, тоді як більшість мутацій були нейтральними, і кілька мутацій сильно позитивно вплинули на придатність. Мутації, які негативно впливали на зв'язування, здебільшого перебували або в НС-
НМЕ, так як ці петлі, як вважають, забезпечують більшу частину функції зв'язування 06.31 або в консервативних залишках каркаса, як визначено в пенінгі анти-дО (див. приклад 1). Сильно збагачені мутації були розташовані головним чином в менш консервативному розділі каркасних ділянок ії НС-НМК. Ці результати підтверджують спостереження з д9О-пенінга, описаного вище (див. Приклад 1), що варіабельні домени є надійними і можуть переносити багато одиночних мутацій без істотного впливу на антигензв'язуючу функцію Еаб.
Для підтвердження результатів, отриманих при глибокому скануючому мутагенезі, вибрані мутації були експресовані та очищені, а їх афінність до МЕСЕ була виміряна з використанням поверхневого плазмонного резонансу ВІАСОКЕФ (5РК), і їх термостабільність (відповідно до оцінки температури плавлення Тт) вимірювалася з використанням диференціальної скануючої флуориметрії (О5Е). Було оцінено вплив обраних сильнозбагачених мутацій на зв'язування і фолдінг антигену. Крім того, мутації з високим збагаченням вибиралися виходячи з їх появи в цій позиції в людських антитілах відповідно до бази даних Арбхів. Крім того, деякі мутації, які були сильно виснажені, також тестувалися як негативний контроль. Ка і Тт зазначених варіантів 6.31 показані в таблиці 2. Значення Ка, перераховані в таблиці 2, були виміряні з використанням кінетичного аналізу з одним циклом з використанням пристрою ВІАСОКЕФ 1200.
Таблиця 2
Характеристика варіантів 56.31, ідентифікованих методом глибокого скануючого мутагенезу
Різниця Температура
Клон Коп (1/Мс) Кон (1/с) ка (нм) згортання (щодо плавлення ("С) о с6.31Ддт | 445Ез05 | 68604 | 754 | -- | 834 о с-узба | 225ЕЮЮ5 | 55ВЕ04 | 247 | 06 | 668 о що-т97М | 432ЕО5 | 802Е04 | 186 | 08 | 8 о оно-уБет | 3605 | 974Е304 | 271 | 06 (| 829 2 о НС-АбОМ | 3,86ЕЮО5 | 72904 | 189 | 08 | 828
Використовуючи дані з 34 мутацій (16 на МН і 18 на МІ), не спостерігалося лінійної залежності між коефіцієнтом збагачення і отриманим поліпшенням в афінності або стабільності (фіг.5С-50).
Аби не допустити пов'язувати себе теорією, це може відображати той факт, що на ЕК впливає безліч факторів, включаючи функціональну експресію в Е. сої), стабільність бар на фаговій частці, а також зв'язування з селекційним білком. Одним із прикладів, що ілюструють це, є мутація І С-І 730, яка є частиною гідрофобного ядра легкого ланцюга. Заміна гідрофобного лейцину в цьому положенні гліцином, ймовірно, зменшує упаковку в серцевині і призводить до менш стабільного легкого ланцюга. Тят мутанта І С-І 730 на 14,4 "С нижче, ніж у 56.31 Рар.
Мутація ГС-І730 була виснажена в експерименті по пенінгу МЕСЕ, хоча вона не робила помітного впливу на антигензв'язуючу афінність, як виміряно ВІАСОКЕФ 5РЕ (приблизно в 1,6 рази більше (тобто більш низьке Ка) в афінності в порівнянні з (36.31 дикого типу). Виснаження
С6.31І Сі7зс, ймовірно, було наслідком зменшення відображення мутанта на фагі, і цей ефект домінував над вибором цього мутанта в порівнянні з фактичним вибором антигену. Крім того, вірно і зворотне: мутація, яка збільшує відображення (наприклад, шляхом посилення експресії та/або стабільності), може бути збагачена, хоча фактична функція зв'язування антигену порушена або не змінена в порівнянні з диким типом (генерування помилково позитивно). Тому варіанти, ідентифіковані за допомогою збагачення, можуть бути поліпшені для афінності зв'язування, стабільності, експресії і/або інших властивостей.
Дві мутації в НУК-Н2, ідентифіковані методом глибокого скануючого мутагенезу, НО-Т57Е і НО-
У58К, мали найбільше збільшення афінності (в 8-9 разів) в порівнянні з 56.31 дикого типу (фіг.5Е). Мутація каркасної ділянки, НС-М82ак, призвела до приблизно збільшення афінності в 6,6 разів у порівнянні з (36.31 дикого типу (фіг.5Е). Кілька інших мутацій каркасної ділянки показали збільшення афінності в 2-4 рази в порівнянні з (036.31 дикого типу (фіг.5Е-5Е).
Найбільше збільшення термостабільності було отримано при мутації легкого ланцюга І С-Е8ЗА (ї- 5,4 7С) (фіг.5Е). На додаток до збільшення температури плавлення І С-Е8ЗА збільшував афінність 56.31 до МЕСЕ в З рази. Дивно, але багато з мутацій, які приводили до збільшення афінності, були розташовані дистальніше антигензв'язуючого сайту (фіг.5Е-5Е). Серед них був
НО-М82ав, який розташований в петлі між спіраллю а! і ниткою Д Е, більш ніж на 22А від антигензв'язуючого сайту, і ГС-Е8ЗА, який розташований на кордоні між М. і легеим ланцюгом константного домену (СІ), більш ніж на 25А від НМВ.
Таким чином, глибокий скануючий мутагенез 56.31 з використанням бібліотек проходження
ММК МН і Мі. і сіквенування нового покоління ідентифікували зміни амінокислотних залишків, які збільшували спорідненість зв'язування з МЕСЕ і/або стабільність Раб.
Матеріали і способи
А. Вибір пенінга фагів на МЕСЕ
Зв'язуючі клони відбирали шляхом інкубації бібліотеки проходження фагового дисплея ММК УНН або МІ. (описаної в прикладі 1) з 5, 0,5, 0,1 нМ біотинільованим МЕСЕ в послідовних раундах відбору, а потім конкурували з 100 нМ небіотинільованим УЕСЕ при кімнатній температурі або 37"С для зменшення зв'язування клонів з низькою афінності до МЕС. Пов'язані клони фіксували на пластинах ІФА, покритих нейтравідином, промивали і елюювали в 100 мМ НС протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Елюйований фаг нейтралізували 1/10 об'єму 1 М
Трис рН 8,0 і використовували для зараження Е. соїї для ампліфікації для наступного раунду відбору.
Зо
В. Шитіпа сіквенування глибоко мутаційних скануючих бібліотек (6.31 и аналіз даних
Для глибокого сіквенування, ДНК фагемідів виділяли з клітин Хі 1 Е. соїї, що переносять вектори фагемідів, або з не обраної, або з обраної бібліотеки проходження ММК МН і МІ, підданих впливу МЕСОЕ. Очищену ДНК використовували як матрицю для ПЛР на основі обмеженого циклу ампліфікації ділянок МІ ї МН. Продукти ПЛР очищали екстракцією і очищенням за допомогою агарозного гелю (комплект для екстракції гелю Оіадеп) Елюйована ДНК ампліконів використовувалася в якості основи для підготовки бібліотеки глибокого сіквенування зі стандартними методами підготовки бібліотеки Шитіпа з використанням зразка проб ДНК
ТеКОБЕО м (Шиптіпа). Бібліотеки, пов'язані з адаптерами, піддавали однократному циклу ПЛР і сіквенували на Питіпа МІЗЕОФ, парному кінці 300 п.о., щоб покрити всю довжину амплікона.
Аналіз даних проводили, як в прикладі 1, для розрахунку матриці вагових позицій і коефіцієнтів збагачення.
С. Експресія антитіла
МН ї МІ. послідовності обраних варіантів були клоновані в вектор Раб ссавців для експресії.
Плазміди як для важкого, так і легкого ланцюгів трансфікували (15 мкг) в 30 мл 293Т-клітин протягом 7 днів. Супернатант збирали для очищення за допомогою колонки білка о. р. Визначення афінності антитіл за допомогою ВІАСОКЕФ ЗРК
Для визначення афінності зв'язування обраних варіантів Раб, використовувався вимір 5РЕ. за допомогою приладу ВІАСОКЕФ Т200. Якщо коротко, чіп СМ5 серії З був активований реагентами 1-етил-3- (З-диметиламінопропіл) карбодиімідів (ЕОС) і М-гідроксисукциніміда (МН) відповідно до інструкцій постачальника, а людський МЕСЕ (ПМЕСБЕ) з'єднували для досягнення 50-80 одиниць відповіді (КО), потім слідуючи за блокуванням непрореагувавших груп з 1М етаноламіном.
Були введені триразові серійні розведення Бар в буфері НВЗ-Р (0,01 М НЕРЕ5, рН 7,4, 0,15 М
Масі, 0,005 95 поверхнево-активної речовини Р20) від низьких (0,02 нМ) до високих (50 нМ) (швидкість потоку: 30 мкл/хв). Реакції зв'язування на йПМЕСЕ коректувалися шляхом вирахування КИ з порожньої проточної клітини. Сенсорграма була записана і підлягає оцінці і відніманню з буфера перед оцінкою за допомогою програмного забезпечення ВІАСОКЕФ Т200
Емаїцчайоп Зоїмаге (версія 2.0). Коефіцієнт асоціації (Кол) їі швидкості дисоціації (Кох) були розраховані з використанням простої індивідуальної моделі прив'язки Ленгмюра. Константа рівноважної дисоціації (Ка) розраховувалася як відношення Кон/Коп.
Е. Визначення температури плавлення (Тя) методом диференціальної скануючої флуориметрії
Диференціальна скануюча флуориметрія (05) контролює термічне розгортання білків у присутності флуоресцентного барвника і зазвичай виконується з використанням приладу ПЛР реального часу (наприклад, Віо-Кай СЕХ). БУРКОФ Помаранчевий барвник (Іпийгодеп, кат. Мо 56650) розбавляли 1:20 в натрій-фосфатному буфері (РВ5). 1 мкл розведеного барвника додавали в 24 мкл білка Раб (приблизно 100 мкг/мл) на лунку. Температуру підвищували від 20 до 100 "С з використанням приладу ПЛР реального часу (Віо-Кай СЕХ), і була розрахована інтенсивність флуоресценції, а точку перегину кривої переходу (Тт) розраховували з використанням таких рівнянь, як рівняння Больцмана (див., наприклад, Міезеп еї аї., Маїиге
Ргоосої!з 2 (9): 2212-2221 (2007)).
Приклад 3: Конформаційні зміни Ї.С-Е83 корелюють з конформацією вигину Раб в структурах 56
Щоб зрозуміти, як мутації, просторово віддалені від сайту зв'язування антигену, можуть надавати такий сильний вплив на зв'язування і стабільність антигену, структурний ефект мутації
ЇС-Е8ЗА було розглянуто більш докладно. Батьківське антитіло (56.31, (56, раніше кристалізувалося в МЕСЕ-пов'язуючих і МЕСЕ-вільних формах (Рий еї аї!., вище). (36.31 містить тільки чотири заміни в НМК-ЇЗ в порівнянні з (36. Тому кристалічна структура 06 використовувалася в якості моделі для (36.31. Кристалічна структура вільної від МЕСЕ форми
О6 містить 12 молекул Рар в асиметричній одиниці. Структури Раб можуть бути згруповані у дві різні групи, засновані на орієнтації константних доменів на змінні домени (інтерфейс М-0) (фіг.бА), який є результатом різних конформацій в ділянці вигину Бар і може бути визначений кількісно шляхом вимірювання куту вигину Раб (див., наприклад, З(апієїй еї аї., 9У. Мої. Віо1. 357(5):1566-1574 (2006)).
Гнучкість кута вигину Рар залежить від кульового шарнірного з'єднання в важкому ланцюгу (див., наприклад, І е5К еї аїЇ., Маїшге 335 (6186): 188-190 (1988)), але також і, можливо, більш важливо, де домінує клас легкого ланцюга. Хоча антитіла легкого ланцюга капа, як правило, обмежені по куту вигину, вони можуть адаптуватися і демонструвати бімодальний розподіл, що досягає максимуму приблизно 140" і приблизно 175", рідко перевищує 180", антитіла легкого
Зо ланцюга лямбда можуть приймати більш широкий діапазон кутів (див., наприклад, Зіапієїа еї аі!., вище). Шість молекул 6 в кристалічній структурі мають невеликі кути вигину (143-1557) і щільну упаковку ОЕ-петлі домену СІ. проти с МІ,, тоді як інші шість молекул мають великий кут вигину (170-1877) з вільно упакованим інтерфейсом МІ -СІ (фіг.68-6С). Розподіл області інтерфейсу різних Рар-молекул, що мають слабо упакований або щільно упакований інтерфейс
МІ-СІ, показано на фіг.7С. Щільно упакована площа інтерфейсу становить в середньому близько 600 А, а площа слабо упакованої поверхні становить приблизно 450 А. Подальший і більш детальний аналіз показав, що шість молекул Обвільний мають невеликі кути вигину (143- 1557), які пов'язані з щільно упакованим інтерфейсом МІ-СІ (що включає ОЕ-петлю СІ. домену, упакованого проти «1 МІ, 304248 А"), тоді як інші шість мають великий кут вигину (170-187) з менш щільно упакованим інтерфейсом МІ-СІ (площа інтерфейсу 234229 Аг). Таким чином, кристалічна структура 6 показує, що 6 поводиться як легкий ланцюг капа типового людського антитіла з кутами вигину нижче 1807 (фіг.бА-60).
Конформація бічного ланцюга І С-Е83 корелювала зі змінами кута вигину Бар. У структурах з великим кутом вигину І С-Е83 щільно зв'язаний в гідрофобній кишені (згадується як "в" конформації) в ділянці дистального закупорювання домену УМГ. (фіг.6С). У структурах невеликого вигину ЇС-Е83 виходить (згадується як "поза" конформації) з гідрофобної кишені і частково піддається впливу розчинника (фіг.6В). Незважаючи на те, що І С-Е83 розташований в просторі близько до області вигину Раб, він не є частиною вигину. Однак конформаційні зміни І С-Е8З відображаються змінами положення бічного ланцюга залишку вигину І С-І106. У структурах, в яких ЇС-Е83 є "поза" конформації, бічний ланцюг І С-Е106І переміщається "вгору" і займає гідрофобну кишеню. Навпаки, в структурах, в яких І С-Е83 знаходиться "в" конформації, бічний ланцюг І С-І106 переміщається "вниз" (зверніть увагу, що орієнтації "вгору" і "вниз" описані з посиланням на НМК як "вгору" і константний домен знаходиться "внизу"). На відміну від ГС-Е83, рух ГС-І106 не обмежується бічним ланцюгом і призводить також до конформаційних змін в остові білка (І С-105 Ф-кут, І С-106 у-кут), що, ймовірно, призводить до спостережуваних різних кутів вигину. Таким чином, кристалічні структури Зб припускають, що зміни кута вигину в об вимагають конформаційних змін в положенні І С-1106 і ГГ С-Е83.
Приклад 4: Зв'язок конформацій ГС-83Е з І С-106І є спільною рисою в структурах антитіл людини
(6/56.31 походить з бібліотеки фагів, яка побудована на загальних каркасних ділянках для важкого і легкого ланцюгів (І ее еї аї., У. Мої.Віо!. 340(5):1073-1093 (2004)). Найближчими генами зародкової лінії легкого ланцюга є ІЗКМ1-39 і І5К)1. Найбільш часто використовувані підгрупи
ЇСОКМ людини, згідно з базою даних ІМОТ (І еїтгапс еї аї., п бійїсо Віоіоду 5 (1): 45-60 (2005)),
ІСКМІ1 і ІСКУЗ несуть фенілаланін в положенні І С-83, тоді як інші менш часто використовувані зародкові лінії зазвичай містять валін (ІКМ2 і ІЗКМ4) або аланін (ІСКУМ5 і ІСКМб) в положенні 83. Ізолейцин в положенні І С-106 зберігається у всіх п'яти генах зародкової лінії ІБК) людини.
Щоб визначити, чи є зв'язування конформації бічного ланцюга положення Е83 з конформацією вигину Бар спільною рисою в людських антитілах, конформацію І С-Е83 визначали в 319 кристалічних структурах баб з банку даних о білках (РОВ). Структури були згруповані як структури з ГС-Е83 в "в" конформації (двогранний кут спі1 між -507 ї -1007) і структурами у "поза" конформації (кут спі! в основному між 50" ї 1807) (фіг. 7А). Конформація І С-Е83 корелювала в переважній більшості структур зі змінами в ділянці вигину Рар в положенні І С-106 (фіг.7В). Крім того, дві групи демонстрували значні відмінності у куті вигину (фіг.7С), а також в області інтерфейсу М-С, демонструючи, що структури з великим кутом вигину мають менший, менш щільно упакований інтерфейс М-С, тоді як структури з великим кутом вигину має великий інтерфейс У-С (фіг.7 С).
Так як мутація І С-Е8ЗА приводила до більш високої термостабільності і більш високої афінності до антигену, визначали кут вигину 20 людських Рар-структур, доступних в РОВ, несучих І С-83А і ГС-1061І.Ці структури відображали властивості структур "поза" конформації І С-83Е: вони проявляли невеликий кут вигину і великий інтерфейс М-С (фіг.7С).
Таким чином, ці результати показали, що бімодальний розподіл за кутом вигину Раб антитіл легкого ланцюга капа людини, як спостерігалося раніше (Заптеїга еї аїЇ.,, вище), в основному є результатом різних конформацій бічного ланцюга фенілаланіну в положенні І С-83.Дані далі показали, що тип амінокислоти, яка присутня в положенні ЇС-83, має великий вплив на кут вигину Раб.
Матеріали і способи
Структури людських антитіл були отримані з бази даних структурних антитіл (ЗАрОраб, Юипбаг єї а|І., Мисієїс Асід5 Везвагсі 42: 01140-1146 (2014)). Фільтрування додаткової структури і обробка
Зо структури (зміна нумерації амінокислот, визначення двогранного кута, структурні вирівнювання) виконували з використанням Віоз3О (Стапі еї а!., Віоіпіоптаїйсзв 22 (21): 2695-2696 (2006)). Площа інтерфейсу між константними і змінними доменами розраховувалася з використанням локального прикладу ССРА-Різа (Кгтіввіпеї! еї аї., У. Мої. Віої. 372(3):774-797 (2007)). АВапдіє (ЮОшпраг еї аї.,, Ргоїєїп Епду. Оев5. 5еї. 26 (10): 611-620 (2013)) був використаний для характеристики взаємодії МН-МІ. Для розрахунку кута вигину використовувався Рутої і загальнодоступний скрипт.
Приклад 5: Моделювання молекулярної динаміки підтверджує, що положення /С-83 діє як перемикання до переходу між великою і малою конфігурацією вигину Бар
Молекулярну динаміку використовували для отримання подальшого розуміння ефектів мутації
І С-Е83А, ідентифікованих в структурному мета-аналізі, описаному в прикладі 4. Ефект мутації
ІЇС-Е8ЗА був імітований в двох різних структурних фонах. Використовувалася кристалічна структура 6 Раб з великим кутом вигину (ланцюги 6 МИ, "МО.Е83") і кристалічна структура з невеликим кутом вигину (ланцюга 6 ВА, "ВА.Е83"). Обидві структури на додаток до мутованих структур (МО.Е83ЗА їі ВА.Е83ЗА) були змодельовані протягом 100 нс в воді. Під час моделювання ніяких змін в конформації 83 не спостерігалося: у разі МО.Е83, 1 С-Е83 залишався в "в" конформації, тоді як у разі ВА.Е83 залишок залишався у "поза" конформації (фіг.8А). Порівняння змін кута вигину в часі протягом моделювання показало, що кути вигину всіх чотирьох молекул залишалися досить стабільними під час моделювання після початкової фази врівноважування близько 25 нс (фіг.888). Чи не спостерігалося статистично значущої різниці в розподілі кутів вигину ВА.Е8З і ВА.Е8ЗА. Для обох молекул кут вигину коливався близько 135". Проте, була значна різниця між кутом вигину МО.Е83 ії МО.Е8ЗА під час симулювання. Протягом перших 25 нс симулювання кут вигину МО.Е8ЗА колапсував і коливався близько 140", а кут вигину МО.Е83 залишався стабільним під великим кутом 161" (фіг.9А).
Результати, представлені вище, демонструють важливість "в" конформації ІС-Е83 для стабілізації великого кута вигину Раб. Мутація І С-Е83ЗА призвела до негайного переходу до малого кута вигину і великого інтерфейсу МІ -СІ. в імітуванні молекулярної динаміки. Оскільки не було ніякого переходу бічного ланцюга І С-Е83 від "в" до "поза" конформації і навпаки, ці результати показують, що І С-Е83 накладає значний енергетичний бар'єр на зміни кута вигину молекули.
У сукупності збільшення термостабільності (36.31 с-євзд в порівнянні з 36.31 можна пояснити збільшенням області взаємодії інтерфейсу М-С, яка, в свою чергу, додатково стабілізує складку чотирьох доменів Раб. Крім того, більш щільна упаковка в інтерфейсі М-С знижує розчинність гідрофобних залишків, таких як І С-1106.
Матеріали і способи
Імітація молекулярної динаміки проводилося з використанням атбрег12 (Сазе еї аї., 5.
Сотриї.Спет. 26(16):1668-1688 (2005)). Якщо не вказано інше, 100 нс моделювалися при постійному тиску і 300 К. Перед імітацією, секції в константних доменах структур С6, які не були вирішені через відсутність електронної щільності, були доповнені з використанням РОВ введення 4ПП9. Отримані імітовані структури аналізували з використанням ММО (НитрпПгеу еї аІ., уоштаї ої МоїІесшціаг Старпісв 14 (1): 33-38, 27-38 (1996)), Віоза, СС РА-Різа, Рутої і АВапаіе.
Приклад 6: Динаміка кута вигину 5б Раб впливає на антигензв'язуючий інтерфейс шляхом модуляції кута крутіння МН-МІ.
У той час як зміна кута вигину Гар пояснювало збільшення температури плавлення в варіанті
ІЇС-Е8ЗА, ефект цієї мутації на зв'язування антигену безпосередньо не пояснювався зміною динаміки вигину Раб. Аби не допустити зв'язування себе теорією, мутація І С-Е8ЗА може побічно впливати на антиген-зв'язування за допомогою зміни кута вигину Бар або безпосередньо впливати на антиген-зв'язування, оскільки І С-Е8ЗА знаходиться близько до УН-МІ -інтерфейсу і може впливати на орієнтацію доменів МН і МІ один до одного. Інтерфейс МН-МІ, хоча і не знаходиться в прямому контакті з антигеном, може чинити сильний вплив на афінність антиген- зв'язування (див., наприклад, Мазида еї аї., РЕВ5 9. 273 (10): 2184-2194 (2006), Кнаїга еї аї., доитаї ої МоІесшаг Несодпіоп 13 (3): 127-139 (2000)). Крім того, у вільному від антигену стані,
МН-МІ-інтерфейс Раб зазвичай є гнучким, з антиген-зв'язуванням, що призводить до збільшення жорсткості (Юипбаг еї аї., Ргої. Епд. Юев. 5еї. 26(10):611-620 (2013)). Крім того, орієнтація МН-МІ. може мати відчутні відмінності між ліганд-вільною та антиген-зв'язаною формою (див., наприклад, 5іапіеїйа еї а!., зігисіиге 1 (2): 83-93 (1993)).
Дійсно, кристалічні структури О6 показали гнучкість і суттєві відмінності в кутах крутіння МН/МІ. (кут крутіння НІ) між різними антиген-вільними структурами 6 ((Збнезв'язанний) і МЕСЕ-зв'язаними структурами (Сбзв'язанний). Середній кут крутіння МНЛ/. (кут крутіння НІ) шести Обвільних молекул, які мають великий кут вигину, становить приблизно 60", в той час як для шести молекул, які мають невеликий вигин, приблизно 58". Це, в свою чергу, істотно ближче до середнього кута крутіння НІ. Сбуєсеє, який становить -55"7 (фіг.9В).
Імітування молекулярної динаміки використовувалося для виключення можливості того, що ці зміни кута крутіння були артефактом кристалізації. Середній кут крутіння НІ для МИ.Е83 становить приблизно 62", в той час як для ВА.Е83 був приблизно 59", що відповідає результатам, знайденим в кристалічних структурах Обуезвязан. Більш того, два мутантних Бар (ВА.Е8ЗА ї МО.Е8ЗА) демонстрували ще менший кут крутіння (приблизно 57" і приблизно 577 відповідно), що ще ближче до кута крутіння, що спостерігається в структурах Сб'зв'язані (фіг.9С).
Більш того, мутація в ЇС-Е8ЗА передбачала додатковий ефект мутації на МН-МІ -інтерфейсі, оскільки НіІ-кут ВА.Е8ЗА був значно менше, ніж у ВА.Е83 (р «0,0001)
Ці результати показали, що мутація І С-Е8ЗА впливає на кут крутіння НІ і, в свою чергу, зв'язує антиген двома різними механізмами. По-перше, мутація І! С-Е8ЗА опосередковує це побічно, змінюючи кут вигину ЕРабр. Структурні дані і моделювання молекулярної динаміки показали, що існує кореляція між кутом вигину і кутом НІ. (фіг. 8А-8С і 9А-903). По-друге, І. С-83 безпосередньо впливає на інтерфейс МН-МІ. Спостерігалося додаткове значне збільшення кута крутіння НІ. при введенні ГС-Е8ЗА (фіг.9А-9О0, порівняння молекул ВА.Е83 і ВА.Е8ЗА). Результатом є конфігурація сайту зв'язування антигену в антиген-вільній формі (36.31, с-євзл3, яка ближче до тієї, яка спостерігається в структурі Обуєсєг. Аби не допустити зв'язування себе теорією, перегрупований інтерфейс зв'язування антигену 06.311с-гвзл може призвести до зниження енергетичної вартості для зв'язування УЕСЕ і, отже, до спостережуваного збільшення афінності (зменшення Ка) о6.311 с-євза. Крім того, імовірно краща упаковка інтерфейсу МН-МІ. в 6.311 с-гвзА може забезпечити альтернативний або додатковий механізм стабілізації складок (див., наприклад, КоїПіїзрегдег еї аїЇ., У. Мої. Віої. 347 (4): 773-789 (2005)), щоб пояснити видиме збільшення Тт.
Матеріали і способи
Структурний аналіз і моделювання молекулярної динаміки проводили, як описано в прикладах 3-5.
Приклад 7: Мас-спектрометрія з обміном водню і дейтерієм (НОХ-М5) підтверджує конформаційні зміни в інтерфейсі з постійною змінною, а також в антигензв'язуючий ділянці в
С16.31 євза в порівнянні з (36.31.
НОХ-М5 використовували для демонстрації того, що зміни в міждоменній динаміці молекули
Еар через мутації І С-Е8ЗА, описані в прикладах 3-6, можна спостерігати в розчині. НОХ-М5 вимірює коефіцієнт обмінювання атомів водню остова аміду з дейтерієм. Атоми водню амідного остова зазвичай обмінюються швидше, якщо вони піддаються впливу розчинників і не беруть участь в утворенні водневих зв'язків в порівнянні з тим, коли вони занурені і/або беруть участь в утворенні водневих зв'язків. У декількох ділянках показані відмінності, коли модель обміну водень-дейтерій 56.31 порівнюється з 6.311 с-євзд (фіг.903. ОЕ-петля домену Сі, який формує інтерфейс МІ-СІ. і знаходиться в безпосередній близькості від мутації І С-Е8ЗА, обмінюючись повільніше в (36.311с-євзід в порівнянні з (36.31. Спостерігалися також зміни коефіцієнта обміну петель НМЕ і сусідніх ділянок. Петлі НМА НІ ії 2 обмінювалися повільніше в (6.311с-євзіА. В порівнянні з 36.31, тоді як сусідні ділянки петлі НМЕК-НЗ, які знаходяться в інтерфейсі МН-МІ, обмінювалися швидше. Петлі НМА-12 ї НМЕК-НЗ є частиною інтерфейсу МН-МІ. (див., наприклад,
Магдаз-Майгаго еї аї., дошгттаї! ої МоїІесшаг Несодпійоп 16 (3): 113-120 (2003), Аригаїапі єї аї., 9.
Віоспет. 132(5):775-782 (2002); Радіап, МоїІесшаг Іттипоїіоду 31(3):169-217 (1994)). Тому зміни в схемі обміну, спостерігаються в НМК та інтерфейсі МІ -СЇ в НОХ-М5 між 6.31 і 56.311 с-євзд, незалежно підтвердили результати, отримані в результаті структурного аналізу та імітування молекулярної динаміки.
Матеріали і способи
Зразки мутанта 6.31 ДТ і Е8ЗА (45 мкМ) розбавляли в 15 разів в 20 мМ гістидин-ацетатного буфера при рО 7,0 ї 50 мМ Масі з вмістом О2О » 90 95 для початку реакції мічення при 20 "с.
При шести інтервалах часу з логарифмічним інтервалом, що становить від 30 секунд до 1000 хвилин, реакцію мічення гасили шляхом зниження рН (рн 2,5) і додавання 2 М хлориду гуанідинію (зате) ії 0,25 М трис (2-карбоксіетілуфосфіну (ТСЕР) до ін'єкції в холодну онлайн- систему (див., наприклад, Маупе еї аї., у). Ат. 5ос. Маз5 бресігот. 22(11):1898-1905, 2011).
Якщо коротко, погашенні зразки спочатку пропускали через колонку імобилізованого пепсину (2,1 х 30 мм, Арріїєа Віозузіетв) при 0 "С для протеолізу і потім зв'язували з колонкою-пасткою для знесолення (АСОШІТУ МАМОЦАКО М С8) перед відділенням хроматографією з оберненою фазою (АСОШІТУ ОРІ СФ ВЕН С18, розмір часток 1,7 мкм, 1,0 х 50 мм) і вводиться в мас- спектрометр (ТПегпто ОКВІТКАР ЕГІТЕ М, розширення 120 кГц при т/72 400) для вимірювання вмісту дейтерію. Хроматографічні рухливі фази отримували, як описано раніше (Ум/анег»5 еї аї.,».
Ат. бос. Ма5з5 бресігот. 23 (12): 2132-2139, 2012) з рН 2,25 для максимізації відновлення дейтерію, який становив в середньому 8290 шляхом вимірювання повністю дейтерованих контролів. Експерименти з мутантом і диким типом були тими, що чергуються, а рандомізовані часові точки були зібрані в трьох примірниках; весь процес було автоматизовано робототехничною платформою І ЕАРМІ1 (І еар Тесппоїодієх, Каррборо, Північна Кароліна), яка виконувала всі етапи обробки зразків. Цей процес призвів до 152 унікальним пептидів, послідовно ідентифікованим програмою ЕХМЗ5 (Кап еї аї.,»У. Ат. бос. Маз5 бресітот. 22 (11): 1906-1915, 2011) як для зразків дикого типу, так і для мутантів, забезпечуючи покриття порядку приблизно 9595. Аналіз змісту дейтерію включав використання раніше описаних користувальницьких сценаріїв руїпоп (Кап еї аї!., вище, Умайегв5 еї аІ. Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 110(47)18898-18903, 2013; ї Ни еї аїЇ. Ргос. Маї. Асай. 5сі. ОБА 110 (19): 7684-7689, 2013), і суттєві відмінності в рівнях поглинання дейтерію між диким типом і мутантом були ідентифіковані за допомогою іІ-критерію Ст'юдента як ті, що мають р-значення « 0,05, описане раніше для експериментів НОХ-М5 (І ешгз вї аі. Апа). Спет. 86(23):11734-11741, 2014).
Приклад 8: Соматична гіпермутаційна мішень І С-83 і І С-106 в антитілах людини
Положення І С-83 розташоване поблизу мотиву гарячої точки АЮ (КОМУ, де К являє собою пурин, У являє собою піримідин, а УУ являє собою А або Т) в гені легкого ланцюга зародкової лінії ІЗКМ1-39. Збільшення термостабільності, викликане мутацією І С-Е8ЗА, можна було переносити на інші антитіла, які походять з тих же зародкових ліній, що і 56.31. Тому була оцінена частота соматичних мутацій в положенні Ї.С-83 в людських антитілах. Крім того, ГС-106 також був включений в цей аналіз.
Для вивчення розподілу соматичної гіпермутації (ЗНМ) були використані два підходи в послідовностях легкого ланцюга, що походять з зародкових ліній ЗКМ1. Першим було зіставлення соматичних мутацій 4623 унікальних людських послідовностей легкого ланцюга
ІСКМІ1, доступних в декількох загальнодоступних базах даних (фіг. 10А, верхня вставка). По- друге, шляхом ампліфікації послідовностей ІЗКМІ1 з РНК, що походять з більш ніж 1000 окремих 60 людських лімфоїдних тканин, за якими слідує високоточне одномолекулярного сіквенування в реальному часі (ЗМЕТ) і порівняння ЗНМ. Незважаючи на різне походження двох наборів даних, спостерігався дуже схожий розподіл соматичних мутацій (фіг. 10А-10С). І 0-83 є однією з найбільш часто мутованих позицій в сегменті Мі; 795 ії 1995 всіх послідовностей ІСКМ1 переносять мутацію в ЇС-83 в двох наборах даних, відповідно. Цікаво, що положення 1 С-106 також часто мутувалося в послідовності ІЗКМ1 (9 95 і 20 95 відповідно), а найбільш поширеною мутацією є валін. Найближчими сегментами гена зародкової лінії для 6 МІ. є ІЗКМ1-39 і 1.
Таким чином, були досліджені антитіла до джерела зародкової лінії ІКМ1.39, які показали, що соматичні мутації у ЇС-Е83 в основному призводять до менших бічних ланцюгів (включаючи серин, валін і лейцин) (фіг.10А-10С). Аланінові заміни в антитіла ІЗКМ1.39 не спостерігалися, ймовірно, через те, що мутація аланіна потребувала б заміни на дві основи в кодоні в І С-Е83, які рідко зустрічаються.
Потім були отримані варіанти Бар с6.31, що несуть найбільш часті соматичні мутації для положення /С-83 і | С-106, і їх вплив на зв'язування і термостабільність антигену було визначено (фіг. 1003). Всі варіанти одиночної мутації збільшили Тт на 4,8 "С до 6 "С, імовірно, зменшивши кут вигину Раб і збільшивши площу інтерфейсу МІ-СІ. Закономірно, подвійна мутація І С-Е8ЗА/Л С-І106М не призвела до значного збільшення Тт. Аби не допустити пов'язувати себе теорією, одночасне зменшення розміру обох бічних ланцюгів залишало б порожнечу в гідрофобній порожнини, зазвичай займану /С-Е83 або ІС-І106, і зменшувала здатність МІ стабільно упаковувати проти Сі. Вплив мутації /С-83 на афінність МЕСЕ є змішаним. ГС-Е8З3М призводить до З3-кратного збільшення афінності, аналогічного І С-Е8ЗА, тоді як мутації І. С-Е835 і І С-І106М майже не збільшують афінність. Вплив мутації І С-83 на афінність антигену може бути залежним від контексту. Мутації | С-Е8ЗА вводили в інше антитіло, що походить з тієї ж зародкової лінії що і (36.31, і спостерігалося подібне збільшення термостабільності і афінності. Крім того, повідомлялося, що мутація І С-Е835 збільшує афінність анти-естрадіального антитіла.
Таким чином, ГС-83 і І С-106 часто мутують в людських антитіл. З огляду на вплив цих двох позицій на афінність і стабільність, оптимізація загальної динаміки домену Раб є молекулярним механізмом, який може бути використаний під час дозрівання афінності антитіл іп мімо.
Матеріали і способи
Зо Послідовності легкого ланцюга людини були отримані з різних загальнодоступних джерел: Арзів (доступне на сайті ріоіпі.огд.иК/абувів), база даних Кабат (Магійп, Ргоїеїп5 25 (1): 130-133 (1996)), база даних ІМОТ (І еігапс, Моїіесшаг Віотесппоіоду 40 (1): 101-111 (2008)), сепВапкК (Вепзоп еї аІ., Мисієїс Асід5 Везєагсі 43: Ю30-35 (2015)) і Банк білкових структур (Вептап еї аї., Мисієїс
Асіаз Везєагсиі, 28 (1): 235-242 (2000)). Дубльовані послідовності видаляли, а найближчі гени зародкової лінії були призначені для відповідних У-сегментів з використанням ІСВіабі (Уе еї аї.,
Мисівєїс Асіаз Резєагсі 41: М/34-40 (2013)). Послідовності, для яких була призначена зародкова лінія миші або щура, були видалені з набору даних. Послідовності були пронумеровані по Кабат (див., наприклад, УМи еї аї., у). Ехр. Мед. 132 (2): 211-250 (1970)) і були ідентифіковані соматичні мутації в каркасі М-сегмента. Мутації в ділянках НУК (як визначено схемою нумерації по Кабат) в цьому аналізі не розглядалися.
Друге джерело послідовностей антитіл людини був отриманий з комерційно доступною РНК з людських селезінки, мигдаликів, кісткового мозку і лімфоцитів периферичної крові, отриманих від 1088 індивідуумів (СіопеФесп апа Аютб5бріо). РНК спочатку транскрибували в кДНК з використанням набору для ампліфікації КДНК 5МАКТЕКФО КАСЕ (Сіопеїесі). ІЗКМ-специфічну
ДНК ампліфікували з використанням 5'КАСЕ (Адмапіаде 2 ПЛР Набір, СіІопеїесії) зі звичайним праймером, який відпалює 5'-ділянку ділянки ІСКС (5-
САТСАСАТОССЯВасААаАтТаААСпАСАаАТОасТОаС-3 (ЗЕО ІЮ МО: 56)), тоді як ІСКМ1 сегменти були збагачені в другій стадії ПЛР з використанням праймерів: вперед: 5- ,ССАТОССАСАТИаАСССАСТОСТОС-3 (5ЕО ІЮ МО: 57) і назад: 5-ЧССТаСАССАТСТатстТТо-3 (ЗЕО ІО МО: 58). Продукт ПЛР очищували в гелі і сіквенували з використанням Расіїйс Віозсіепсе
Е5ІЇ (ЕА Сепотіс бегмісе5). Отримано загалом 994,8 Мб. Консенсусна послідовність кожного читання була створена з використанням програмного пакета Расіїйс Віозсіеєпсе 5МЕТ Апаїувзіб 2.3. Анотацію зародкової лінії консенсусних послідовностей проводили з використанням
Мругавіа (СПапуйПе єї а. Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 106(48):20216-20221). Послідовності були пронумеровані по Кабат і ідентифіковані соматичні мутації в каркасі М-сегмента. В цілому 19034 послідовностей були анотовані як ІКМ1, з яких 3796 містили щонайменше три каркасні ділянки і два НМР і були включені для генерації зЗНМ-розподілів.
Приклад 9: Ідентифікація варіантів поверхневого заряду 6.31
Для виділення мутацій, які можна було б використовувати для зниження рі 6.31, розташовані бо на поверхні позиції були ідентифіковані в варіабельних доменах з використанням структурної інформації з кристалічної структури с6.Позиції, для яких заміщення глутаматом показало коефіцієнт збагачення 1 або більше, заснований на пенінгу МЕСЕ в бібліотеках проходження
ММК МН і МІ. (приклад 2), були обрані для перевірки їх впливу на афінність зв'язування ЕСЕ за допомогою одного циклу кінетичного аналізу з використанням ВІАСОКЕФ Т200 системи і термостабільності (О5Е) (таблиця ЗА). Варіанти мутантів, що містять заміни до глутамату, а також інші заряджені залишки (наприклад, аргінін, лізин), були отримані, експресовані і очищені, як описано вище (див. Приклад 2, "Матеріали і способи"). Зверніть увагу, що в деяких випадках загальний Ка, наведений в таблиці ЗА для деяких варіантів, слабкіше в порівнянні з результатами в таблиці 4 через відмінності в підгонці між одним циклом кінетичного аналізу (таблиця ЗА) і множинним циклом кінетичного аналізу (таблиця 4). У таблиці ЗВ показаний вихід, відсоток мономера (95 мономера) і час елюювання для зазначених варіантів.
Таблиця ЗА
Характеристика варіантів з розташованою на поверхні полярною амінокислотою
Ссезідт| зотжнов | визебї | ле 100-001 838 своє | сезенов | аееєої | пвзєа | 72186 толаоє | савенов | авлеої | вва | 09 вав торгує | оловюов | вової | левЕле | 0091 вкб ісдвтв | тлеенов | абоєої | оявеоа | 06 765 тоуває | аетеюв | позеоз | оте | 008180 ссввон | савенов | алеї | пев | 0951 8 сла | алею | аваєоя | пвоєюе | 091 8 нодаоє | тетеюов | витеої | 2взео | 06 | 838
Таблиця ЗА
Характеристика варіантів з розташованою на поверхні полярною амінокислотою нслтеве | гивенов | ямоєої | оовЕ0е | 081 848 новляє | двоє | аюеєої | апа | 081 ва ножтвЕ | гитвююв | ямаєоя | гео | 08 | 82 нот | савенов | яитеої | пезєое | 09 | ва нсовтЕ | аовЕнов | яювЕоя | 22воя | 08185
Таблиця ЗВ
Параметри очищення для варіантів з розташованою на поверхні полярною амінокислотою
Таблиця ЗВ
Параметри очищення для варіантів з розташованою на поверхні полярною амінокислотою
Таблиця ЗВ
Параметри очищення для варіантів з розташованою на поверхні полярною амінокислотою
Вихід (мг)
НОР но-тевк 12,39
Як показано в таблиці ЗА, було ідентифіковано кілька варіантів зарядів з поверхневим розташуванням, які мали яку можна порівняти або поліпшену афінність зв'язування з МЕСЕ в порівнянні з (36.31.
Приклад 10: Генерація та характеристика комбінованих варіантів з поліпшеною афінністю зв'язування з МЕСЕ і поліпшеною стабільністю
А. Генерація варіантів з поліпшеною афінністю зв'язування з МЕСЕ і поліпшеною стабільністю 06.31 містить сайт саморозщеплення в НМК-ІЇЗ3 (М94-РО5), який може вплинути на його стабільність. Комбінації окремих варіантів, описаних в прикладі 2 (див., наприклад, таблиця 2), об'єднували для ідентифікації клонів з підвищеною афінністю зв'язування і підвищеною стабільністю. Чотири мутації, зокрема, були зосереджені на: І С-Е8ЗА (забезпечує поліпшену термостабільність і спорідненість), ЇС-МУО4А (видаляє сайт саморозщеплення), НОС-У58А (покращує афінність) ії НО-М8в2анв (покращує афінність). Було також перевірено кілька інших заміщень в положенні ЇС-М94, призначених для видалення сайту саморозщеплення, для їх впливу на афінність зв'язування з МЕС за допомогою декількох циклів кінетичного вимірювання, а також на стабільність за допомогою О5Е (таблиця 4). Видалення сайту саморозщеплення послідовно зменшувало фрагментацію, як оцінювали за відсотком об'єктів з низькою молекулярною масою, що визначаються з використанням капілярного електрофорезу додецилсульфата натрію в невідновлювальних умовах (СЕ-505) (фіг.12).
Таблиця 4
Афінність і термостабільність варіантів сайту саморозщеплення
Збільшення . о Тт
Варіант Коп (1/Мс) Кон (1/с) ка (нм) Ттос) (відносно до дт с6.31 ДТ тваваов | зеввоє | бБ БО 00000840
Комбінація варіантів І С-Е8ЗА, 10-МО4А, НОС-У58К і НОС-М82аК в один / клон (У58К.МО4А.М82ак.ввЗА", також званий "56.31 ААКК") призвела до значно підвищеної афінності зв'язування для МЕСЕ (Ка-80 пМ), що в 6,6 разів вище в порівнянні з 06.31.
У58К.М94А.М82ак.Е83ЗА також мав помітно поліпшену термостабільність у порівнянні з (56.31 зі збільшенням Тт на 4,8"С. (Таблиця 5). Амінокислотна послідовність МН-домену
У58К.М94А.М82ак.Е8ЗА показана в 5ЕО ІЮ МО: 11, і амінокислотна послідовність домену М. показана в ЗЕО ІЮ МО: 12.
Коо)
Таблиця 5
Комбінований варіант У58К.М94А.М82ан.Р83А має поліпшену афінність зв'язування з МЕОЕ і поліпшену стабільність в порівнянні з (56.31 щен Збільше- . Кон ка Тт ння Тт
Варіант Коп (1/Мс) (1/с) (нм) згортання (с) (відносно (відносно до ДТ) до ДТ) но-мвгав твавзов | лоаво4 | 0077 | вв | 840) 00
УБВА.МУ4А Меган-газА 400Е-06 | З20Б04 | 0080 вв | 88848
УВА МОЯАРЕЗА | 222 о 0 ЗОТЕО4 | оз
В. Генерація варіантів з розташованою на поверхні полярною амінокислотою зі зміненим рі
Для генерації варіантів з більш низьким рі, в послідовність 56.31 вводили кілька глутаматних заміщень. На основі даних про одиничну мутацію варіанту з розташованою на поверхні полярною амінокислотою (Таблиці ЗА-3В) варіанти, які не чинили великого негативного впливу на зв'язування МЕСЕ, були відібрані для подальшого конструювання. Рівень експресії (оцінюваний по врожайності) і зменшена агрегація (відповідно до високого 96 мономера) також враховувалися при виборі мутацій. Ізо-електростатичну поверхню (6.31 розраховували з використанням АРВЗ (Вакег еї аї. Ргос Маї). Асад. 5сі. ОБА 98(18):10037-10041 (2001)). Обрані глутаматні мутації були відображені на електростатичній поверхні, і були обрані комбінації мутацій глутамату, які (ї) уникали мутацій, які були розташовані просторово близько один до одного, і (ії), які сприяли мутаціям, які перебували в сильній позитивно-зарядженій плямі. Для подальшої характеристики були створені два варіанти комбінації важких ланцюгів (з К19Е і без них) і п'ять варіантів комбінації легкого ланцюга (таблиця 6). Всі варіанти комбінації легкого ланцюга містили мутацію ІС-МУ4А для видалення сайту саморозщеплення і мутації ГО-Е8ЗА для поліпшення термостабільності антитіла. Деякі з варіантів показали поліпшену афінність до
МЕСЕ (див. Таблицю б, Таблицю 7 і Таблицю 9). Наприклад, НС! С2 і НС С5 показали поліпшену афінність і помітно зменшений рі в порівнянні з (36.31 (рі 5,3 ї 5,6 відповідно, в порівнянні з рі 8,9 для 6.31) (див. Таблицю 7 і Таблицю 9).
Таблиця 6
Комбінація варіантів з розташованою на поверхні полярною амінокислотою
М2Е, 57Е, В19Е, Т28Е, АЯОЕ, С16Е, КАЗЕ, Т57Е,
М2Е, 57Е, Т28Е, АЯОЕ, С16Е, КАЗЕ, Т57Е, КбЯЕ,
НТЗНОсотро К/БЕ, 582ВЕ, Т107Е
І.Ссотьо! 59Е, НІ8Е, ЕВЗА, МОДА
І. Ссотьог ВІ8Е, КА2Е, 576Е, ЕВЗА, МО4А
І СсотроЗ З59Е, ВІ8Е, КА2Е, ЕВЗА, МО4А
І. Ссотьої ВІ8Е, Е8ЗА, МОДА
Таблиця 7
Кінетика зв'язування поєднання варіантів з розташованою на поверхні полярною амінокислотою з МЕСЕ - Коп Кок ка 2,05Е-06 2,74Е-04 1,84Е-10 6.31 ДТ
НСС 2и12Е-06 6,23Е-04 2,93Е-10 І Ссотьо?2 нНСі.с4 2,03Е-06 6,08Е-04 2,99Е-10 І Ссотьої4
НСБ 1,81Е-06 5,73Е-04 3,16Е-10 І Ссотьоб
НС сЗ 1,84Е--06 6,08Е-04 3,30Б-10 І Ссотроз
НСС 1,37Е-06 6,07Е-04 4,А2Е-10 І Ссотьої 6.31 ДТ 9,99Е--05 5,99Е-04 5,99Е-10 6.31 ДТ 6.31 ДТ
ЇСсотрог2 5,99Е-05 6,67Е-04 1,11Е-09 6.31 ДТ ЇСсотрог2
Ї СсотрозЗ 5,7АЕ--05 7,68Е-04 1,34Е-09 о6.31 ДТ Ї СсотроЗ
ЇСсотроб 5,37Е--05 7,66Е-04 1,43Е-09 о6.31 ДТ ЇСсотроб
Ї Ссотрої4 4,63Е--05 8,08Е-04 1,75Е-09 6.31 ДТ Ї Ссотро4
Ї Ссотрої 4,4А7Е 05 1,01Е-0З3 2,27Е-09 6.31 ДТ ЇСсотрої вІЗНОІ С2 8,89Е--05 4,67Е-05 9,49Б-11 ВІЗ9НСсотро ЇСсотрог2
ВІЗНСОІ СА 2,84Е 405 4,79Е-05 1,69Е-10 ВІЗ9НСсотро Ї Ссотро4
ВІЗНСІ 5 7,07Е--05 4, А1Е-05 б,2АБ-11 ВІЗ9НСсотро ЇСсотроб
Крім того, було створено кілька інших варіантів поєднання, які включали обрані поверхнево- розташовані заміни глутамату і окремі варіанти, які покращували афінність і/або стабільність (таблиця 8).
Таблиця 8
Кінетика зв'язування додаткових варіантів поєднання кхсплмо | ки 1 кам
НО-АЗОЕ, НО-Т57Е 2,96Е--06 8,04Е-04 2,72Е-10
ІС-Е8ЗА, І. С-МО4А 6,48Е-05 111Е-ОЗ 1,71Е-9
І С-Е8ЗА, І С-М94А, І б-т220 1,33Е--06 7. ААЕ-04 5,58Е-10
НО-АЗОЕ, НО-Т157Е
І С-Е8ЗА, І С-МО4А 127Е--06 7,А1Е-04 5,84Е-10
НО-АЗОЕ, НО-Т57Е, І С-Е8ЗА,
І С-М94А, І С-Т220 1,20Е--06 7,18Е-04 5,97Е-10
Таблиця 9 показує резюме афінності зв'язування, стабільності і даних рі для обраних варіантів комбінації. Антитіло рі розраховували з використанням власної програми і шляхом запуску гелю ізоелектричного фокусування (ІЕЕ) зі стандартним контролем рі. У таблиці 10 наведені відповідні амінокислотні послідовності МН і Мі для цих антитіл. У таблиці 11 показані амінокислотні послідовності МІ НМЕК для цих антитіл. У таблиці 12 показані амінокислотні послідовності МН НУК для цих антитіл.
Таблиця 9
Резюме обраних варіантів поєднання - Коп Кон ка Еаб Тт с6.31 7,5АЕз05 3,95Е-04 0525 | 83,8 | 89
ІС-МОдА 1,56Е-06 1,89Е-03 їо6во 1858 | 89
ІС-МО4А. С-Е8ЗА 6,48Е05 їв оЗ | 1,0 | 88 | 89
ІО-МО4А 1 С-Е8ЗА
НС-А4ОЕ.НО-Т57Е 1,27Е-06 7,А1Е-04 0,580 88 8,5
С6.31 ААЕЕ
М94А.ЕВЗА.МВгав. ув
АЕВОА реє | Зоо | оз зоБЕтО6 | 27аво4 | 0184 неСсг 2л2Е-406 6,23Е-04 0,293
НС СА 2,03Е-06 6,08Е-04 0,299
НС С5 1,81Е-06 5,73Е-04 0,316
НС сЗ 1,84Е-06 6,08Е-04 0,330
НС СІ 1,37Е06 6,07Е-04 042 вІЗНСІ Сг 8,89Е05 4,67Е-05 0,095 вІЗНСІ СА 2,84Е-05 4779-05. | 0169
ВІТ9НСІ 5 7,07Е-05 4А1Е-05 бов2 | 0762 |в
Таблиця 10
МН і МІ. амінокислотні послідовності для антитіл з таблиці 9
Варіант МН (ЗЕО ІЮ МО) Варіант МІ. (ЗЕО І МО) с6.31 ДТ 6.31 ДТ (5ЕО І МО: 42) С6.31 ДТ (ЗЕО І МО: 38)
І С-М94А 6.31 ДТ (ЗЕО І МО: 42) МО4А (5ЕО ІЮ МО: 41)
І С-М94А.І С-ЕВЗА Св.31 ДТ (5ЕО І МО: 42) МО4А.ЕВЗА (5ЕО І МО: 12)
ІО-МО4А 1 С-Е8ЗА
НС-А4ОЕ.НО-Т57Е А4ЗОЕ.Т57Е (ЗЕО І МО: 40) МО4А.ЕВЗА (5ЕО ІЮ МО: 12)
С6.31 ААЕЕ
М94А.ЕВЗА.МВгав. ув
С631 ААВН М82аВ.У588 (5ЕО 10 МО-11) МО4А.ЕВЗА (5ЕО ІЮ МО: 12)
НСсотьо (ЗЕО ІО МО: 33) о6.31 ДТ (ЗЕО ІО МО: 38) не с2 Нбсотрбо (ЗЕО ІО МО: 33) ЇСсотрог (5ЕО ІО МО: 35)
НОСІ СА Нбсотрбо (ЗЕО ІО МО: 33) Ї Ссотбво4 (5ЕО ІО МО: 37)
НС С5 НСсотрво (5ЕО І МО: 33) МО4А.ЕВЗА (5ЕО ІЮ МО: 12)
НОСІ З Нбсотрбо (ЗЕО ІО МО: 33) ЇСсотброЗ (5ЕО ІО МО: 36)
НОСІ С1 Нбсотрбо (ЗЕО ІО МО: 33) Їбсотрої (5ЕО ІО МО: 34)
В19НСсотьо В19НСсотбво (ЗЕО 0 МО: 51) | 06.31 ДТ (ЗЕО ІЮ МО: 38) вІЗНОІ С2 ВТ9НОсотбо (5ЕО ІО МО: 51) ЇСсотрог (5ЕО ІО МО: 35)
А19НеСІ СА А19НСсотбво (5ЕО ІО МО: 51) Ї Ссотбро4 (5ЕО ІО МО: 37)
ВНС 5 В19НСсотбво (ЗЕО 0 МО: 51) | МО4А.ЕВЗА (5ЕО І МО: 12)
Таблиця 11
Послідовності МІ. НМК для антитіл з таблиці 9 се Дт ВАБОРУЗТАМА | ЗАЗЕУ5 ООСУСМРЕТ ' 5ЗЕОІЮ МО: 8 ЗЕОО МО: 9 ЗЕО ІЮ МО: 23
С МеТА ВАЗОРУЗТАМА | ЗАЗЕ УЗ ООСУСАРЕТ 5ЗЕОІЮ МО: 8 ЗЕОО МО: 9 ЗЕО ІЮ МО: 10
ВАЗОРУЗТАМА | ЗАЗЕ УЗ ООСУСАРЕТ
ІС-МеаАл-С-ЕВЗА ЗЕО ІО МО: 8 ЗЕОО МО: 9 ЗЕОІО МО: 10 пе Ак НС етЬ ВАЗООУЄТАМА | ЗАЗЕІ У5 ООСУСАРЕТ
СЯ АК (5ЕО ІО МО: 8) (5ЕО ІО МО: 9) (5ЕО 10 МО: 10)
МО4А ВЗА. М8гав у58А | ВАЗОРУБТАМА | ЗАБЕУ5 ООСУСАРЕТ
С8.31 ААВВ 5ЗЕОІЮ МО: 8 ЗЕОО МО: 9 ЗЕО ІЮ МО: 10 нссотьо ВАЗОРУЗТАМА | ЗАЗЕ УЗ ООСУСМРЕТ 5ЗЕОІЮ МО: 8 ЗЕОО МО: 9 ЗЕО ІЮ МО: 23 псго? ВАЗОРУЗТАМА | ЗАЗЕ УЗ ООСУСАРЕТ 5ЗЕОІЮ МО: 8 ЗЕОО МО: 9 ЗЕО ІЮ МО: 10 пса ВАЗОРУЗТАМА | ЗАЗЕ УЗ ООСУСАРЕТ 5ЗЕОІЮ МО: 8 ЗЕОО МО: 9 ЗЕО ІЮ МО: 10 пСІсе ВАЗОРУЗТАМА | ЗАЗЕ УЗ ООСУСАРЕТ
ЗЕОІЮ МО: 8 ЗЕО ІЮ МО: 9 ЗЕО ІЮ МО: 10 псгсз ВАЗООУЗТАМА | ЗАЗЕУ5 ООСУСАРЕТ 5ЗЕОІЮ МО: 8 ЗЕОО МО: 9 ЗЕО ІЮ МО: 10 сс ВАЗОРУЗТАМА | ЗАЗЕ УЗ ООСУСАРЕТ 5ЗЕОІЮ МО: 8 ЗЕОО МО: 9 ЗЕО ІЮ МО: 10
ВАЗОРУЗТАМА | ЗАЗЕ УЗ ООСУСМРЕТ
ВТЗНОсотро ЗЕО ІО МО: 8 ЗЕОО МО: 9 ЗЕО ІО МО: 23 пІвНСі с? ВАЗОРУЗТАМА | ЗАЗЕ УЗ ООСУСАРЕТ 5ЗЕОІЮ МО: 8 ЗЕОО МО: 9 ЗЕО ІЮ МО: 10 пізнСі ся ВАЗОРУЗТАМА | ЗАЗЕ УЗ ООСУСАРЕТ 5ЗЕОІЮ МО: 8 ЗЕОО МО: 9 ЗЕО ІЮ МО: 10 пІвНСТ ся ВАЗОРУЗТАМА | ЗАЗЕ УЗ ООСУСАРЕТ 5ЗЕОІЮ МО: 8 ЗЕОО МО: 9 ЗЕО ІЮ МО: 10
Таблиця 12
Послідовності МН НУК для антитіл з таблиці 9 обі Дт БУМН СПРАССУТУУАООУКС | ЕМЕРГРУАМОУ ' ЗБОЮ МО: 1) (ЗБОЮ МО: 53 ЗЕОЮ МО: З я СМозА ОУН СПРАССУТУУАРОУКС | ЕУЕРГРУАМОУ
ЗБОЮ МО: 1) (ЗБОЮ МО: 53 ЗЕОЮ МО: З
ОУН СПРАССУТУУАРОУКС | ЕУЕРГРУАМОУ
ІС-МеаАл-С-ЕВЗА ЗЕО ІО МО: 1) | (ЗЕО І МО: 53 ЗЕОО МО: З пе Ак НС етЬ оУМІН СІТРАССУЕУУАОЗУКС | ЕМЕБІ РУАМОУ
СЯ АК (5ЕО 10 МО: 1) | (ЗЕО І МО: 21) (5ЕО ІО МО: 3)
МО4А ЕВЗА М8ган БА 1 ОУН СПРАССУТАУАРОУКО | ЕМЕРГРУАМОУ
С8.31 ААВВ ЗБОЮ МО:1) (ЗЕ МО: 7 ЗЕОЮ МО: З
ОМУМН СІТРАСОМЕМУАОБМЕС ЕМЕРІ РХАМОУ
ЗБОЮ МО: 1) 0 (ЗЕО 0 МО: 22 ЗЕОЮ МО: З нс? РУУІН СПРАССХУЕУУАРОМЕС | ЕУЕРГРУАМОУ
ЗБОЮ МО: 1) (ЗБОЮ МО: 22 ЗЕОЮ МО: З
Таблиця 12
Послідовності МН НУК для антитіл з таблиці 9
ЗЕОІЮО МО: 1 ЗЕО ІО МО: 22 ЗЕОЮО МО: З
ЗЕОІЮО МО: 1 ЗЕО ІО МО: 22 ЗЕОЮО МО: З
ЗЕОІЮО МО: 1 ЗЕО ІО МО: 22 ЗЕОЮО МО: З
ЗЕОІЮО МО: 1 ЗЕО ІО МО: 22 ЗЕОЮО МО: З
ЗЕОІЮО МО: 1 ЗЕО ІО МО: 22 ЗЕОЮО МО: З
ЗЕОІЮО МО: 1 ЗЕО ІО МО: 22 ЗЕОЮО МО: З
ЗЕОІЮО МО: 1 ЗЕО ІО МО: 22 ЗЕОЮО МО: З
ЗЕОІЮО МО: 1 ЗЕО ІО МО: 22 ЗЕОЮО МО: З
Верхню шарнірну ділянку важкого ланцюга Бар будь-якого з перерахованих вище антитіл, наприклад, 6.31 ААКК, може бути мутовано для видалення реакційної здатності з шарніром анти-ІдО1 аутоантитіл, про які повідомлялося в літературі. Див., наприклад, Вгез5Кі еї аї., У.
Ітітипої. 181:3183-3192, 2008 і Вгез5Кі еї аїІ.,, тАбБз 2:33, 212-220, 2010. Таким чином, С-кінцева амінокислота важкого ланцюга 6.31 ААКК може бути або Т (версія дикого типу (ДТ)), або Ї. (варіант, який не володіє реакційною здатністю до Бар анти-людського Ід). Повнорозмірна амінокислотна послідовність важкого ланцюга дикого типу 6.31 ААКК являє собою ЗЕО ІЮ МО: 48. Повнорозмірна амінокислотна послідовність важкого ланцюга версії варіанту, яка не володіє реакційною здатністю до Раб анти-людського до, являє собою 5ЕО ІЮ МО: 49. Повнорозмірна амінокислотна послідовність легкого ланцюга як для 6.31 ААКК, так і для версії варіанту, який не володіє реакційною здатністю до Раб анти-людського дО, являє собою ЗЕО ІЮ МО: 50.
Таким чином, комбінації варіантів, ідентифікованих методом глибокого скануючого мутагенезу, призводили до антитіл з покращеними властивостями. У деяких випадках антитіла мали поліпшену афінність зв'язування з МЕСЕ, а також поліпшену стабільність (про що можна судити по помітно збільшеному Тт) в порівнянні з (36.31. Деякі з варіантів (наприклад, антитіла
НСсотрбо, НСІ С1, НОСІ С2, НС С3, НС С4 їі НОСІ С5) мали як поліпшену афінність зв'язування з
МЕСРЕ, так їі помітно зменшену рі. Для варіантів зі зменшеною рі, повернення мутації К19Е у важкого ланцюга назад до вихідного аргініну в положенні 19 (наприклад, як в КІ9НСсотро,
КТ19НСІС2, КІ9НСІС4 і КІ9НСІ С5), призводило до варіантів з подальшим поліпшенням афінності і збільшенням Тт (на близько 2,2 2,8 75).
Приклад 11: Окулярна і системна фармакокінетика варіантів (36.31 після інтравітреального введення у кроликів
Для оцінки фармакокінетичних (ФК) властивостей варіантів (56.31 іп мімо було проведено наступний експеримент з використанням новозеландських білих (МАМ/) кроликів. Період окулярного напіввиведення визначали для двох різних варіантів 6.31, 6.31 ААЕЕ (ІсС-
МО4А.І С-Е8ЗА.НОС-АЯОБЕ.НО-Т57Е) і 06.31 ААКК (У58К.М94А.М82ак.ЕвЗА), а також батьківського 036.31 ДТ. У кожному випадку Бар кожного з антитіл складали в РВ5 в концентрації 10 мг/мл. 50 мкл (0,5 мг) вводили внутрішньовенно анестезованим кроликам.
Зо Кролики (в групах по 10) дозувалися один раз/око. Групі 1 вводили 6.31 ААЕБЕ, групі 2 вводили
С6.31 ДТ, а групі З вводили 6.31 ААРЕК. Тканини (склоподібне тіло, внутрішньоочна рідина і сироватка) збирали перед введенням дози, через 2 години, 6 годин, 1 день, 2 дні, 4 дня, 8 днів, 15 днів і 21 день після прийому. Зразки аналізували на рівні анти-МЕСЕ з використанням
Загального ІФА Рар, описаного нижче.
Результати фармакокінетичного аналізу кожного варіанту і ДТ в кожному зі склоподібного тіла і внутрішньоочної рідини представлені на Фіг.11А. Результати показують, що ФК 6.31 ААЕЕ і
С6.31 ААКК по суті такі ж, як ФК для ДТ 06.31 як в склоподібному тілі, так і у внутрішньоочній рідині. Були розраховані склоподібний і рідинний періоди напіввиведення, і ці результати представлено в таблиці 13 нижче. Період напіввиведення варіанти 56.31 Раб був схожий з ДТ,
а також відповідав періоду окулярного напіввиведення Бар, про який повідомлялося в літературі.
Таблиця 13
Період напіввиведення варіантів (36.31 і (536.31 ДТ й Склоподібний період Рідинний період
Антитіло напіввиведення (дні) напіввиведення (дні) с6.31 ААЕЕ с6.31 Дт 26.31 ААВВ
Системний вплив Раб після інтравітреальної ін'єкції оцінювали шляхом вимірювання рівнів анти-
МЕСЕ в сироватці. Зразки сироватки аналізували для анти-МЕСЕ. Результати показані на фіг.118. Кліренс був обчислений (мл/кг/день), і ці результати показані в таблиці 14 нижче.
Сироватку також аналізували на антитерапевтичні антитіла (АТА). АТА був присутній у всіх тварин з 14-го дня.
Таблиця 14
Кліренс варіантів (36.31 і (536.31 ДТ . Кліренс (нлкбдень 26.31 ААЕЕ 6.31 ДТ 1238 сб.31 ААВВ 2133
Як показують результати, показані в таблиці 14, якщо всі три Раб мають однакову біодоступність, то (36.31 ААКК мав найшвидший кліренс, що вказує на більш низький системний вплив в порівнянні з 56.31 ДТ і 56.31 ААЕЕ. Такий більш низький системний вплив може призвести до кращого профілю безпеки для (36.31 ААКЕ в порівнянні з 056.31 ДТ і с(26.31
ААЕЕ.
Матеріали і способи
А. ІФА загального Бар
Планшети ІФА покривали АйіпеРиге Е(ар')25 фрагментом козячого анти-людського ДО протягом ночі при 4 "С. Потім планшети промивали З рази перед інкубацією з блокуючим буфером (РВ5 рН 7,4, 0,5 95 ВЗА і 15 м.д. РКОСІ ІМ М). Після З промивок, рідинні і склоподібні зразки, зібрані у кроликів МАМ/, яким ввели ДТ 6.31, 56.31 ААКК або 6.31 ААЕБЕ, інкубували в планшетах протягом 2 годин при кімнатній температурі при обережному перемішуванні. Потім молекули
С6.31, зв'язані з покриваючими антитілами, були потім виявлені з кон'югованим Е(аб)»2 пероксидазою козячим анти-людським до протягом 1 години при кімнатній температурі. Після З промивок розчин субстрату ТМВЕ-1000 додавали до планшетів протягом 30 хв і реакцію зупиняли з використанням 1 М НзРОх. Сигнал реєструвався при 450/620 нм.
Концентрації молекул 56.31 визначали з використанням стандартної кривої.
Приклад 12: МЕСЕ-індуковані аналізи міграції НОМЕС
Варіанти 56.31 були протестовані на здатність інгібувати міграцію НОМЕС, індуковану МЕСБЕ.
Аналізи міграції НОМЕС варіантів, зазначених в таблиці 15, були виконані з використанням 24- багатоямкових систем вставки Еаісоп (ВО Віозсіепсе5 кат. 351184). Вставки попередньо покривали 8 мг/мл мишачого ламініну (СТеТесппоїодіеєє 23017-015) протягом ночі. НОМЕС голодували протягом ночі, збирали і ресуспендували в аналітичному середовищі (ЕВМ-2, 0,1 90
ВЗА). Клітини (5 х 107) додавали в верхню камеру і 20 нг/мл МЕСЕ додавали в нижню камеру для стимуляції міграції в присутності або за відсутності різних рівнів дози блокуючих антитіл протягом 16 годин. Після фіксації і скребків з верхньої сторони мембрани, клітини на нижній поверхні фіксували метанолом і фарбували за допомогою ЗУТОХФ зеленого (І Ге ГТесппоіодіе5 57020). Зображення були отримані з використанням інвертованого флуоресцентного мікроскопа, а число клітин було проаналізовано з використанням програмного забезпечення
Ітаде».
На Фіг.13 показаний графік інгібування міграції НОМЕС, індукованої МЕСЕ, за допомогою (6.31
ЇС-МО94А в порівнянні з вихідним 6.31 при різних концентраціях Бар. Як можна бачити з фіг.13, одиночна мутація І С-МО94А була значно менш ефективною, за допомогою близько в п'ять разів, в аналізі НОМЕС міграції, індукованої МЕСЕ, в порівнянні з вихідним ДТ (6.31. Як показано в таблиці 15, подвійний мутант І С-МО4А.І С-Е8ЗА також був близько в п'ять разів менш сильним в цьому аналізі в порівнянні з вихідним ДТ 6.31. Чотириразовий мутант І С-МО4А.І С-Е8ЗА.НО-
А4ЗОЕ.НО-Т57Е (06.31 ААЕЕ) відновлював і трохи поліпшував специфічну активність (Таблиця 15). Дивно, що чотириразовий мутант М94А.Е8ЗА.М82ак.У5вк (06.31 ААКК) значно підвищував специфічну активність близько в два рази в порівнянні з вихідним ДТ (36.31 (таблиця 15).
Таблиця 15
Специфічна активність клітин варіантів (36.31, визначених за допомогою ІС50 в аналізі міграції НОМЕС
І С-М94А.| С-Е8ЗА
НО-АЗОЕ.НО-Т57Е сіб.31 ААЕЕ саб6.31 ААВВ " (ранібізумабї////////777777711111111111111111111111111Ї11111111111111111081111111с1с1
Приклад 13: Кон'югація гіалуронової кислоти (НА) до 06.31 ААКК і інших антитіл
Сучасні підходи до лікування окулярних порушень, пов'язаних з патологічним ангіогенезом (наприклад, АМО (наприклад, вологою АМО), ЮМЕ, ОК або КМО), зазвичай включають інтравітреальну ін'єкцію антагоністів МЕСЕ (наприклад, анти-МЕСЕ Раб ранізумаб). Оскільки сайт дії анти-МЕСЕ Раб знаходиться в задній частині ока в сітківці, а також тому, що Бар може
Зо мати відносно короткий час перебування в оці, максимальна користь для пацієнтів від анти-
МЕСЕ Бар зазвичай досягається за допомогою щодо частих доз (наприклад, О4УМ) за допомогою інтравітреальної ін'єкції. Бажано, щоб тривалі дії анти-МЕСЕ антитіл або фрагментів антитіл (наприклад, Раб) для окулярних порушень були бажаними, щонайменше частково, для зменшення частоти дозування, що призвело до поліпшення зручності і комплаенса пацієнта. У цьому прикладі оцінювали вплив кон'югуючої лінійної, незшитої гіалуронової кислоти (НА) на
О6.31 варіант 6.31 ААКК. Проаналізовано молекулярні властивості кон'югатів, фармакокінетичні параметри (наприклад, життєвий цикл і кліренс), термодинамічна стабільність і інгібуюча активність МЕСБЕ.
Модельний кролячий Раб (гаргбар; паї еї аїЇ,, Мої. Рнаптасешісв 2016 року; ідентифікатор
РибМеа (РМІОЮ) 27244474) був використаний в рамках цього аналізу. Розробка технологій доставки для терапії білками зазвичай включає тестування на відповідних моделях тварин для демонстрації корисності іп мімо. Кролячі моделі зазвичай використовуються під час попередніх досліджень окулярної фармакокінетики. На жаль, більшість людських і гуманізованих антитіл є імуногенними у кроликів, виключаючи оцінку ключових фармакокінетичних параметрів з використанням технологій доставки тривалої дії. Для вирішення цієї проблеми був розроблений сурогатний склад, який представляє собою подібний з кролячим Раб (таргЕар"), який корисний для оцінки технологій доставки в кролячих моделях. гарРарб, описаний в цьому документі, було отримано з моноклонального антитіла кролика, яке зв'язується з фосфо-3-Меї людини. Способи отримання кролячих антитіл, включаючи моноклональні антитіла кролика, добре відомі в даній області. Див., наприклад, патенти США Мо 5675063 та/або 7429487. Ілюстративне моноклональне антитіло кролика, яке зв'язується з людським фосфо-с-Меї, комерційно доступним від Арсат (Кембридж, Массачусетс, США), номер продукту арб8141.
У цих експериментах, молекули (36.31 ААКК або гарбар Рар-С кон'юговані з лінійними незшитими НА різних средньомасових молярних мас (Мв), включаючи 40 кДа (НА4ОК-), 100 кДа (НАТООК-), 200 кДа (НА2гООК-) ії 600 кДа (НАбООК-). Рар-С молекули являють собою Еар молекули, які експресуються таким чином, що послідовність усікається при першому шарнірі цистеїну, в результаті чого Раб з вільним цистеїном безпосередньо з експресії. Можуть також використовуватися молекули Раб", які являють собою Рар-молекули з вільним цистеїном, що утворюються при перетравленні повнорозмірного моноклонального антитіла. Для кон'югатів НА, описаних в цьому прикладі, молекули Раб-С ковалентно приєднані до груп карбонової кислоти на сахаридних одиницях глюкуронової кислоти НА. На першій стадії синтезу певний відсоток цих кислотних груп на НА перетворювали в малеїміди (зазвичай 2-10 905 кислотних груп перетворювали). Потім молекули Рар-С кон'юговані з малеїмідними групами через вільний цистеїн на молекулі Гар-С. Однак невеликі модифікації хімії кон'югації можуть бути використані для кон'югації молекул Раб або інших форматів антитіл з НА.
Комбінація гель-проникаючої хроматографії (5ЕС), багатокутового світлорозсіювання показника заломлення (КІ) (МА 5) і квазіпружного розсіювання світла (ОБЇ 5) (також званого 5ЕС-ВІ-
МАЇ 5-ОЕЇ 5) використовувалася для оцінки НА Мв, кон'югату Мв, процентного завантаження
Еаь (визначається як відсоток груп карбонових кислот НА, які зайняті ковалентно приєднаною
Еаб-молекулою), гідродинамічний радіус (Кі), вільний Раб (визначений як відсоток молекул Раб, які є вільними в розчині, а не ковалентно приєднані до молекули НА) і фракції маси білка (маса білка/маса білка ї- маса НА) обраних кон'югатів НА-Баб (таблиця 16). На Фіг.14 показані ілюстративні результати ЗЕС-ВІ-МАІ 5-ОЕЇ 5 для оцінки средньомасової молярної маси (Мв)
НАЯОК-гарЕар, НА2гООК-гаргар і НАбООК-гаргаь (зверніть увагу, що дані ОБЇ 5 не показані на
Коо) фіг. 14).
Таблиця 16
Властивості обраних кон'югатів НА-Раб, оцінених за допомогою ЗЕС-ВІ-МАЇ 5-ОБЕЇ 5
Зразок НА Мв Кон'югат Му! | 96 Завантаження | КИ (нм) Вільний Масова (кДа) (кДа) Еар Еар частка білка
НАдОК- 45,3 636,2 74 - 10 0,45 95 0,929 гаргар
НАТООК- 110,0 679,3 5,9 17,3 3,71 96 0,838 гаргарт"
НАгООК- 204,3 1805,3 - 30 0,55 95 0,887 гаргар
НАбООК- 619,8 2569,2 3,2 - 50 1,87 96 0,759 гаргар
НАгООК- 204,3 2478,0 11,0 27,7 0,63 95 0,918 с-6.31
ААВН
" Приблизні значення Ей "х Зразок, досліджений в дослідженні ФК кролика (див., наприклад, фіг. 16 і нижче)
Для лікування окулярних порушень, таких як АМО, може знадобитися тривалий період напіввиведення з очей, але короткий системний період напіввиведення, наприклад, для мінімізації системного впливу проти МЕСЕ. Кліренс НА від системної циркуляції опосередковується гіалуронідазою, несучої печінкові клітини. Попередні повідомлення показують, що активність гіалуронідази на нативній НА включає в себе впізнавання через групи карбонової кислоти глюкуронової кислоти. Оскільки ці карбоксильні групи були модифіковані для приєднання до молекул Бар-С, була оцінена здатність кон'югованого НА до ферментативного переварюванню гіалуронідазами. НА-кон'югований сгарЕБар зберіг ферментативну сприйнятливість до перетравлювання гіалуронідазами-2 (НУАЇ 2), як оцінюється аналізом ЗЕС-МАЇ 5 з НУАЇ 2-інкубацією НА і НАТООК-гаргаь (Фіг.15).
Визначали вплив НА-кон'югації ЕРаб-фрагментів на окулярні фармакокінетичні параметри (наприклад, період напіввиведення і кліренсу) в склоподібне тіло кролика після інтравітреального введення. Кон'югація габбаб з НАТООК (НАТООК-1!25-гаргбаб) приводила до значного зменшення кліренсу і значного збільшення вітреального періоду напіввиведення в порівнянні з некон'югованим гарбар або ранібізумабом (фіг.1б6 і таблиця 17). НАТООК- кон'юЮгований гарбар мав приблизно чотириразове збільшення періоду вітреального напіввиведення (ї//г) в порівнянні з некон'югованим гаргаб за історичними даними (11,9 дня проти 3,2 дня відповідно) (фіг.1б6 і таблиця 17). В Таблиці 17 також показані КП для гаргаБб і
НАТООК-1!25-гаргбаб. Ці дані вказують на те, що кон'югація НА збільшувала гідродинамічний радіус Бар і приводила до уповільнення вітреального кліренсу і збільшення періоду вітреального напіввиведення.
Таблиця 17
Кліренс гаргабр і НАТООК-"25І-гарЕабр з кролячого склоподібного тіла після інтравітреального введення
Лінійна кореляція між гідродинамічним розміром (наприклад, з точки зору гідродинамічного радіуса) і вітреальним часом життя (наприклад, з точки зору напіввиведення), а також історичні дані для гаргарб, гаргаб, кон'югованого з поліетиленгліколем 20 кДа (ПЕГ) (гарбаб-20 кДа ПЕГ,, і гаргар, кон'югований з ПЕГ 40 кДа (гарРар-40 кДа ПЕГ), (5паї? еї аї., вище), в поєднанні з даними, описаними вище для НАТО0ОК-гарбар, дозволив передбачити вітреальний період напіввиведення 6.31, кон'юЮгованого з НАТООК або НА2ООК і 6.31, кон'югованого з НАЗООК (фіг.17). НАТО0К-о6.31 має передбачений вітреальний період напіввиведення приблизно 11 днів, в той час як НА2О0К-56.31 має ще більший передбачений вітреальний період напіввиведення приблизно 17 днів (фіг.17). НАЗООК-56.31 має передбачений вітреальний період напіввиведення приблизно 19 днів (фіг.17). Ці результати дають ще один доказ того, що
Зо кон'югація 56.31 ААКК або інших варіантів 56.31, описаних в цих документах, з лінійним незшитим НА призводить до збільшення окулярного часу перебування (наприклад, періоду напіввиведення) і зменшення кліренсу після інтравітреальної ін'єкції.
Був також оцінений ефект кон'югації НА на термодинамічну стабільність Раб (таблиця 18).
Ковалентне приєднання гарЕРаб до НА трьох різних молярних мас змінювало термодинамічну стабільність Габ, що підтверджується аналогічним початком Тт і піком Тт для кон'югатів в порівнянні з вихідною Раб (таблиця 18).
Таблиця 18
Кон'югація Раб до НА істотно не змінює термодинамічну стабільність Бар
Нарешті, оцінювали вплив кон'югації НА на специфічну активність інгібування МЕСЕ (6.31
ААКРК. Несподівано було виявлено, що кон'югація ААКК (6.31 з лінійним незшитим НА призводила до значного підвищення активності в порівнянні з вихідним Бар при порівнянні в рКОВ-аналізі для інгібування МЕСЕ (таблиця 19). Значення ЗДАС5О в таблиці 19 вказують концентрацію, необхідну для отримання 50 95 відгуку в форматі аналізу активності. Значення 4АС50 еквівалентні значенням ІС50. НА-кон'юЮюпгований 56.31 ААКЕ мав приблизно 7-кратне збільшення здатності в порівнянні з некон'юЮгованим батьківським Раб (таблиця 19). Отже, кон'югація 56.31 ААКК і інших варіантів (56.31, описаних в цьому документі, може бути корисна як для поліпшення вітреальних фармакокінетичних параметрів (включаючи період напіввиведення і кліренсу), так і інгібуючу здатність МЕСЕ.
Таблиця 19
Кон'югація (56.31 ААКК до НА призводить до поліпшеної інгібуючої здатності МЕСЕ
Виходячи з вищенаведених експериментальних даних, НА-кон'юговані молекули ААКК 06.31 мають значно поліпшені характеристики для лікування окулярних порушень, в тому числі АМО (наприклад, волога АМО), ОМЕ, ОК ії КМО. Ці поліпшені характеристики включають підвищену здатність і можливість для менш частого дозування через збільшення часу вітреального перебування.
Матеріали і способи
А. Синтез функціоналізованої малеїмідом НА (НА-таї)
Лінійні, незшиті НА-полімери з різними молярними масами отримували з І їГесоге Віотеадіса!. НА модифікували малеїнімідними групами з використанням водної реакції з реагентом зв'язування 4-(4,6-диметокси-1,3,5-тріазин-2-іл) -4-метилморфолінія хлориду (ОМТММ) і лінкером М- (2- аміноетил) малеїміду солі трифторацетата (АЕМ). НА розчиняли в 100 мМ 2-(М- морфоліно)етансульфонової кислоті з рН 5,5 при 2,5 мг/мл і до цього розчину додавали 1,5 молярного надлишку ОМТММ і 3,75 молярного надлишку АЕМ (атомні надлишки розраховували на основі молей карбонової кислоти в НА) при перемішуванні. Розчин нагрівали до 70" протягом 2 годин.
Надлишок АЕМ і ОМТММ видаляли з реакції через процедуру знесолення. Насосна колона
НіРгер"м 26/10 була змонтована на системі очищення АКТА"м і врівноважена з 10 мМ ацетату натрію, рН 4,0 150 мМ Масі. Реакцію вводили акуратно в колонку і пік НА-та! збирали відповідно до абсорбцією при 302 нм і концентрували до більш ніж 5 мг/мл з використанням
Зо відцентрових ультрафільтраційних пристроїв. Малеїмідну концентрацію в вихідному розчині НА- та! вимірювали поглинанням при 302 нм з використанням ультрафіолетового видимого спектрофотометра, а молярне відношення малеїмідних груп на ланцюг НА оцінювали за допомогою гель-фільтраційної хроматографії за розміром з багатокутовим світлорозсіюванням (ЗЕОС-МАЇ 5).
В. Кон'югація Рар-С з НА-таї
Розчин Рар-С доводили до 6,5 за допомогою 1М фосфату рН 6,5 до кінцевої концентрації фосфату 50 мМ. Етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТК) висушували в розчині до кінцевої концентрації 2,5 ММ. Розчин Бар-С перемішували і до нього додавали НА-таї, розведений в реакційний буфер (10 мМ фосфату 150 мМ Масі 2,5 мМ ЕДТК (рн 6,5)). Стехіометрію встановлювали на 1,2 моль Рар-С на моль малеїміду в кінцевій реакції, і обсяг встановлювали для отримання кінцевої концентрації білка 1 мг/мл. Реакцію кон'югування проводили при кімнатній температурі при перемішуванні. Через З години меркаптоетанол додавали при 2 молях на моль малеїміду для покриття непрореагувавших малеїмідних груп. Через 30 хвилин після додавання меркаптоетанола реакційну суміш розбавляли до менш ніж 50 мМ Масі з 10
ММ фосфатом (рн 6,5) для очищення.
Очищення проводили з використанням аніонообмінної хроматографії для відділення вільного димеру Рар-С і Рар від кон'югату. Колонку НіТтар'ї 5) ЕЕ 5 мл встановлювали на системі очищення АКТА "м і врівноважували з 10 мМ НівНСЇї (рН 5,5). Розбавлену реакцію пропускали через колонку, захоплюючи кон'югат НА-Раб і одночасно здійснюючи елюцію вільного Еар-сС і димеру. Після промивання з 10 мМ НізНСІ (рн 5,5) 100 мм Масі кон'югат елюювали ступінчастим градієнтом до 10 мМ НізНСІ (рн 5,5) 500 мМ Масі. Елюйований кон'югат об'єднували і розбавляли з 10 мМ Ні5НеЇ (рн 5,5) до кінцевої композиції 10 мМ НівНнеЇ (рн 5,5) 150 мМ Масі. Кон'югат складу концентрували віддентровою ультрафільтрацією.
С. Аналіз кон'югатів НА-Рар
Залишковий вільний ЕРаб-вміст, загальна молярна маса кон'югату і масова частка білка оцінювалися комбінацією гель-фільтраційної хроматографії (5ЕС) з багатокутовим світлорозсіюванням показника заломлення (КІ) (МА 5) і квазіпружного розсіювання світла (ОЕЇ 5) (також званий ЗЕС-ВІ-МАЇ 5-ОЕЇ 5) на високоефективної рідинної хроматографії Адіепі 1200 (ВЕРХ) з детектором УЛАТ Орійар Т-гЕХ РІ і детектором УЛАГ ЕТ НЕГЕОЗ-Ї МАЇ 5 іп-Іїпе.
Колонка То5оп 56000 РМУХІ використовувалася для аналізу з РВЗ (рН 7,4) в якості робочого буфера. Контроль В5А використовувався для нормалізації детектора МАГ 5 і виправлення для розширення зон між детекторами. Зміст вільного ар вимірювали шляхом інтеграції піків УФ-
Агво, відповідних кон'югату Раб ії НА-БРаб. Молекулярну масу кон'югату брали у вигляді средньомасової молекулярної маси (Мм) (також званої средньомасовою молярною масою) кон'югативного піку. Масова частка білка розраховувалася з використанням аналізу білкового кон'югату з використанням диференціальних КІ (акі) ї ОМ Агво сигналів.
О. Динамічна скануюча калориметрія (055) Дослідження кон'югатів НА-гаргбар
Розчини гаргЕаБб, гаргРаб, кон'юговані з НА, мають середньозважену молярну масу (Мв) 39 кДа (НАЗОК-гаргРаб), гарбар, кон'югованих з НА, мають Мв 100 кДа (НАТООК-гаргЕаб) і гаргаб, кон'юговані з НА, мають Мв 300 кДа (НАЗООК-гаргаб) отримували при концентрації 0,5 мг/мл (концентрація приведена на білковій основі) в 10 мМ НівбНСЇ (рН 5,5) 150 мМ Масі. Дослідження
ОС проводилися на мікрокалориметрі МР-ЮО5С (МісгосСаї, Іпс.) від 15 до 105 "С зі швидкістю 1 "С/хв. Початкове сканування тільки одного буфера віднімалося з кожного вибіркового сканування. Температуру плавлення (Тт) і початок Тт оцінювали з використанням доданого програмного пакету ОКІСІМ.
Е. Аналізи активації фосфорильованого КОК (РКО) рецептора
Клітини СНО, сконструйовані для надекспресії КОЕ. (клітини КОК-СНО, див. Віпеїгиу- Гоигпаїге єї аІ.,, ЕМВО .). 19 (7): 1525-1533, 2000 і Вепгіпдег і ін. ВВА Віотептьгапех5 1466: 71-78, 2000., які включені в цей документ шляхом посилання в усій їхній повноті) висівали на 1х107 клітин/ямка в 80 мкл середовища для висаджування клітин (50:50 ЮОМЕМ з високим вмістом глюкози/Е-12
Хема, 0,2 95 ВБА, 0,25 95 діафільтрованої фетальної бичачої сироватки (ЕВ5), 25 ММ НЕРЕ5 і 2
ММ І-глутамакса) в 96-ямковому планшеті з плоским дном для культивування тканини. Клітини
Зо інкубували протягом ночі при 37 "С. Паралельно на 384-ямковому планшеті ІФА МОМСФ
МАХІЗБОКВО (Тпегто кат. Мо 439454) було покрито 25 мкл анти-90 антитіла (Сепепіесі), розведеного в РВЕ, і інкубували при 4 "С протягом ночі.
На наступний день, за 2 години до стимуляції клітин, планшети для культивування тканин струшували і ущільнювали, а культуральне середовище замінювали на 40 мкл вільного від сироватки середовища для стимуляції клітин (50:50 ЮОМЕМ з високим вмістом глюкози/Е-12
Хема, 0,5 95 В5А і 25 мМ НЕРЕЗФ) і інкубували протягом 2 годин при 37 "С. Три-кратні серійні розведення 6.31 ААКК або НА1Т00К-6.31 ААКК були зроблені в середовищі стимуляції клітин. Розчини людського МЕСЕ:ївє5 (100 нг/мл) також отримували в середовищі стимуляції клітин. Використовуючи чашку з глибокої ямкою, зразки з серійних розведень (36.31 ААКЕ. або
НАТО0К-О6.31 ААРКЕ змішували з розведеними зразками УЕСЕ і інкубували протягом 1 години при 37 "С. 40 мкл отриманих сумішей додавали в кожну ямку клітин для загального об'єму культивування 80 мкл. Ямки, що мають тільки МЕСЕ або без вмісту МЕСЕ, також отримували в якості контролів. Клітини інкубували протягом 15 хв при 37 "С. Культуральне середовище струшували і ущільнювали, а також додавали 25 мкл охолодженого до льоду буфера для лізису клітин (150 мМ Масі, 50 мМ НЕРЕБ, 0,5 95 ТКІТОММ Х-100, їх НАТО протеази і коктейлю інгібітора фосфатази (Тпегто кат. Мо 78444, додавали безпосередньо перед використанням з 100-х вихідного розчину), 52 мМ ЕДТК). Клітини лізували на льоду протягом 15 хв, перш ніж приступати до ІФА.
Ямки планшетів ІФА, вкриті анти-дО, промивали З рази промивочним буфером (РВЗ з 0,05 95
ТУУЕЕМФ 20, рН 7,4). Ямки блокували з 80 мкл блокуючого буфера (РВЗ з 0,5 55 В5А (НО зузіетв5, кат. Мо Ж 0ЮУ995)) протягом 1 години при кімнатній температурі. Потім ямки промивали три рази буфером промивання. Потім до кожної ямки додавали 25 мкл клітинного лизата на ямку і інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі з наступним промиванням ямок чотири рази буфером промивання. 25 мкл розведеного 1:2000 антифосфотирозина (Сіопе 4010) біотин-кон'югованого антитіла (0,5 мкг/мл) (Мійїроге кат. Мо 16-103) додавали в аналітичному буфері (РВ5 з 0,5 95 В5А, такий же, як блокуючий буфер) в кожну ямку і отримані суміші інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі, потім три рази промивали буфером промивання. 25 мкл 1:10000 розведеної пероксидази хрону (НЕР)-5ігерамідіп (СЕ
Неайсаге ОК, кат. Мо КРМ44О0ІМ) додавали в аналітичному буфері в кожну ямку і інкубували бо протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, а потім три додаткових промивання буфером промивання. Потім в кожну ямку додавали 25 мкл ТМВ, і колір залишали для розвитку протягом 20 хв до додавання 25 Н25О: для припинення реакції. Нарешті, оптичну щільність ямок зчитували на планшетному рідері при 450/620 нм.
Е. Перетравлення гіалуронідазами НАТООК-гаргар
Щоб підтвердити, що Рар-кон'югація до 1095 (у відсотках, виражена на основі доступних кислотних груп на НА), не змінювала чутливість гіалуронідази кон'югатів НА-Раб, НА з Мв 100 кДа (НАТООК) і габРаб, кон'югованих з НАТООК (НАТООК-гаргаб) інкубували при 200 мкг/мл НА (концентрація НАТООК-гарбар була доведена до досягнення концентрації 200 мкг/мл по відношенню до НА-остову) за допомогою 4 мкг/мл гіалуронідази-2 в 10 мМ ацетат натрію, рн 4,5. Зразки інкубували при 37 С і відразу ж вводили в ЗЕС-НВІ-МАЇ З з 30-хвилинними інтервалами для аналізу Мм, як описано вище. б. Дослідження ФК для оцінки швидкості кліренсу НА-Раб з склоподібного тіла кролика
Окулярний фармакокінетичний профіль НАТООК-гарбаб ов склоподібному тілі кролика порівнювали з історичними даними для гаргаб, як описано нижче.
НАТООК-гаргаб мітили з !25І за день до дозування. Для приготування складів доз, відповідну кількість НАТООК-гаргаб обмінювали з трис-йодуючим буфером (25 мМ Трис НС, 0,4 М Масі, рН 7,5) з використанням центрифужних фільтрувальних пробірок Мійроге АМІСОМФ ЗОК.
Пробірку Пірса попередньо покриту йодом, змочували Трис-йодуючим буфером і декантували.
Відповідний обсяг Трис-йодуючого буфера додавали до нижньої частини пробірки з подальшою відповідною кількістю Ма"25| (Регкіп ЕІтег). Йоду давали активуватися протягом 15 хв зі збовтуванням кожні 30 секунд. Відповідний об'єм випробуваного зразка, Трис-пйодуючого буфера і активованого йоду додавали в мікроцентрифужну пробірку МОМСФ і перемішували обережним струшуванням протягом приблизно 1-5 хв. Реакцію йодування припиняли додаванням очищуючого буфера (тирозин, 2мг/мл Трис-буфера), і склад змішували і інкубували протягом 5 хв з вібруючим перемішуванням протягом 1 і 4 хв. Для очищення білка, пробірку фільтруючої центрифуги АМІСОМФ З0ОК отримували центрифугуванням при 6000 об/хв протягом 15 хв з РВ5. Вміст пробірки МОМСФ додавали в пробірку фільтруючої центрифуги
АМІСОМФЕ ЗОК і промивали до чотирьох разів в РВ5 для отримання приблизно 400 мкл остаточного обсягу радіоактивно-міченого випробуваного зразка. Визначали радіоактивність,
Зо концентрацію білка і радіохімічну чистоту кожного випробуваного зразка. За допомогою піпетки, вміст пробірки АМІСОМФ переносили в пробірку МОМСФ, і склад доводили до кінцевої концентрації приблизно 10 мг/мл.
НАТООК-гаргРар-25| вводили інтравітреально (500 мкг/око) в очі новозеландських білих кроликів (п-24 ока). Для інтравітреальних ін'єкцій кроликів седували/знеболювали для впливу ізофлураном і поміщали в лежаче положення на боці. Для обох очей застосовували офтальмологічний розчин тропікаміду (дві краплі) і 2,595 фенілефрин НОСІ (одна крапля).
Місцевий пропаракаїн застосовувався до кожного ока безпосередньо перед приготуванням і дозуванням. Кон'юнктивальні склепіння були промиті розведенні 1:50 розчином бетадина, а краї повік були протерті нерозбавленим 595 розчином бетадина. Суперотемпоральну бульбарну кон'юнктиву просочували нерозведеним розчином бетадина. Штангенциркуль Джеймсон використовувався для позначки плями від 1,5 до 2,0 мм ззаду до лімбу на супертемпоральній бульбарній кон'юнктиві. Кон'юнктивальні щипці використовувалися для фіксації положення очного яблука лівою рукою, в той час як голка, прикріплена до ін'єкційного шприца, вставлялася правою рукою в зазначену пляму через склеру і просувалася на 5 мм в склоподібне тіло.
Ін'єкційна голка була розташована так, що вона звернена до задньої осі очного яблука, і вміст було доставлено в середину склоподібного тіла, повільно опускаючи поршень шприца. Голку, прикріплену до ін'єкційного шприца, дезінтегрували, а епісклеральні тканини наближалися до місця введення, захопленого кон'юнктивальними щипцями протягом 30 секунд, щоб зменшити рефлюкс вводимого матеріалу. Місце введення дози було протерто для залишкової радіоактивності. Приготування і введення дози повторювали таким же чином для другого ока.
Відповідний тестовий зразок витримували на мокрому льоду протягом всього часу процедури і вводили один раз при обсязі дози 50 мкл на око. Непрямі офтальмоскопічні дослідження проводилися після ін'єкції, щоб уникнути контакту лінзи або сітківки. Збирають дозу кожного місця ін'єкції і зберігали при кімнатній температурі до аналізу за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника (50) для визначення залишкової радіоактивності. Відновлену радіоактивність віднімали з вводимої кількості, щоб отримати фактичну введену радіоактивну дозу.
Зразки крові збирали з яремної вени тварин в пробірки, які не містять антикоагулянтів при попередній дозі кімнатної температури, через 6 годин після введення дози і 1, 2, 4, 7, 11, 14,11 60 28 днів після введення дози. Аліквоту (приблизно 0,1 мл) цільної крові збирали і обробляли для радіоаналіза. Кров, що залишилася центрифугували при кімнатній температурі для отримання сироватки і обробляли для радіоаналіза.
Дві тварини в момент часу піддавали евтаназії шляхом внутрішньовенної ін'єкції розчину евтаназії з подальшою аускультацією. Термінальні моменти часу: 6 годин після прийому і 2, 7, 14, 21 і 28 днів після прийому. Внутрішньоочна рідина, лінза, склоподібне тіло, сітківка/судинна оболонка і склера були зібрані у призначених тварин. Очі були видалені, і будь-яка стороння тканина була обрізана зовні очного яблука. Внутрішньоочну рідину видаляли шприцом з голкою туберкуліну і збирали в попередньо зважену гамма-пробірку. Око, що залишилося заморожували в рідкому азоті протягом приблизно 30 секунд. На охолодженій ріжучій поверхні були видалені рогівка, райдужна оболонка і лінза. Лінзу промивали невеликою кількістю РВЗ5 і промивку збирали в гама-пробірку. Лінзу промакували насухо і поміщали в попередньо зважену гама-пробірку. Око повторно заморожували в рідкому азоті в міру необхідності. Склера була відрізана і очищена від склоподібного тіла. Склоподібне тіло видаляли і поміщали в попередньо зважений контейнер для солюбілізації. Склеру з прикріпленою сітківкою/судинної оболонкою занурювали в 1 мл РВЗ5 для промивання, який об'єднували з попереднім промиванням, і тканину обережно промакували насухо. Сітківка/судинна оболонка віддалялася зі склери і переносилася в окремі попередньо зважені гама-пробірки. Відповідні поверхні і інструменти були протерті вологою марлею і зібрані в гама-пробірку для підрахунку. Всі тканини, промивання і серветки були зібрані в пластиковий контейнер і оброблені для радіоаналіза.
Одне око в момент часу від обраних тварин (включаючи тварин з тимчасових точок 2, 14 і 28 днів після прийому) обробляли для радіохроматографічного профілювання склоподібного тіла.
Праве око було видалено, а стороння тканина була обрізана зовні очного яблука.
Внутрішньоочну рідину видаляли шприцом з голкою туберкуліну і поміщали в попередньо зважену гамма-пробірку. Максимальна кількість склоподібного тіла була зібрана з використанням 10-мл шприца з голкою 18 калібру. Вміст переносили в попередньо зважений контейнер для аналізу за допомогою ВЕРХ-Сатта-КАМ'М. Зразки склоподібного тіла зберігалися в холодильнику або на мокрому льоду для радіохроматографічного профілювання.
Частину, що залишилася, тканини правого ока поміщали в попередньо зважений контейнер для солюбілізації і обробляли для радіоаналіза.
Одиночні або дубльовані аліквоти складів доз, сироватки і цільної крові добре змішували і відбирали для прямого аналізу радіоактивності через гама-лічильник. Окулярні тканини підраховували безпосередньо, розводили в РВ5 або солюбілізували в інкубаційній печі, встановленої при приблизно 50 "С в розчині ЗМ КОН/метанол/ткІТтОМ мМ Х-100, і відбирали три рази для аналізу радіоактивності через лічильник гама-випромінювання. Всі зібрані радіоактивні зразки підраховувалися протягом як мінімум 5 хвилин або 100 000 відліків в двох примірниках або в трьох примірниках, з урахуванням розміру вибірки. Всі результати вибірки (розраховані за зразком розпадів за хвилину/г), які мали радіоактивність більше 200 розпадів за хвилину, перебували в межах 15 95 від середнього значення.
Радіохроматографічне профілювання проводили на зразках склоподібного тіла з правого ока у однієї тварини через 2, 14 і 28 годин після введення дози. Зразки аналізували відповідно до придатних для використання методом ВЕРХ-Сатта-КАМ "М. Пікові площі і час утримування порівнювали з оцінкою цілісності дослідного зразка з плином часу. Для приготування зразків гомогенізатор РКЕСЕГ УББ! 24 попередньо охолоджений від -10 до 0 Сб з охолодженим потоком азоту. Гранули діоксиду цирконію додавали в відповідну пробірку. При використанні піпетки з позитивним розміщенням в пробірку, що містить гранули діоксиду цирконію, додавали зразок склоподібного тіла. Зразки поміщали в заздалегідь охолоджений гомогенізатор
РАЕСЕЇГ І У5 24 і гомогенізували при 6500 об/хв протягом шести 60-секундних циклів. Пробірки центрифугували протягом 10 хв при 14000 об/хв перед аналізом.
Фармакокінетичні параметри оцінювали з використанням РНОЕМІХФ УміпМопіїпФ версії 6.2.1 (Сепага БА, Іпс., Прінстон, Нью-Джерсі) Для оцінки параметрів використовувався неселективний підхід, який узгоджується з інтравітреальним способом введення. Період напіврозпаду для НАТООК-гарЕар-!25І в склоподібному тілі кролика становив 11,9 дня, в порівнянні з 3,2 дня для гарЕРар за історичними даними (паї? еї аї., Мої. Рнаптасешісв 2016;
РибМеа ідепійіег (РМІО) 27244474).
Хоча вищенаведений винахід було описано більш детально за допомогою ілюстрації та приклади для ясності розуміння, описи і приклади не слід розглядати як обмежуючі обсяг винаходу. Розкриття всієї патентної та наукової літератури, наведені в цьому документі, повністю включені в якості посилання.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 Сепепсесі, Іпс. еїг аї. «1205 ОпПТИМІЗОВАНІ ВАРІАНТИ АНТИ-МЕСЕ АНТИТІЛ «1305 50474-110М03 «1505 США 62/271913 «1515 2015-12-28 «1505 США 62/222698 «1515 2015-09-23 «1605 «69 «1705 РагепсІпПп версія 3.5 «2105 1 «2115 5 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 1
Авр Тут Тгр Ії1е Нівз 1 5 «2105 2 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «2205 «2215» МІ5С РГЕАТОВЕ «2225 (2)..(2) «223» Хаа являє собою І1іе або Ніз «2205 «2215» МІ5С РГЕАТОВЕ «2225 (5)..(5) «223» Хаа являє собою Аїа або Агд «2205 «2215» МІ5С РГЕАТОВЕ «222» (8)..(8)
«223» Хаа являє собою Тут або Гувг «2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «222» (9)..9) «223» Хаа являє собою ТПт або с01чЧ «2205 «2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «222» (10)..(10) «223» Хаа являє собою Атуд, Тут, біп, або біц «2205 «2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «222» (12)..(12) «223» Хаа являє собою Азїа або с01ч «2205 «2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «222» (16)..(16) «223» Хаа являє собою Пув або с1ц «2205 «2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «222» (17)..(17) «223» Хаа являє собою сбіу або с1ц «4005 ЬЯ2
Зо с1у Хаа ТПхг Рго Хаа СсСіу сіу Хаа Хаа Хаа Тут Хаа Авр Бек Уаі1ї! Хаа 1 5 10 15 хаа «2105 3 «2115 11 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 3
Рпе Уаі РіПе Рібе Гей Рго Тут Аїа Ме Авр Туг 1 5 10 «2105 4 «2115 11 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція
«2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «2225 (5)..(5) «223» Хаа являє собою Авр або Ат4д «4005 м4
Аг Аза Бек сіп Хаа Уаі Бех ТПх Аїа Уаї А1а 1 5 10 «2105 5 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «2205 «2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «2225 (1)..11) «223» Хаа являє собою бБет або Меє «4005 щБ)5
Зо ХхХаа А1ї1а бек Рпе Гецп Тукг 5бекг 1 5 «2105 6 «2115 39 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «2205 «2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «2225 (1)..11) «223» Хаа являє собою Ссіп, Авп, або ТПг «2205 «2215 МІ5С РГЕАТОВЕ «2225» (6)..(6) «223» Хаа являє собою Аїа, Авп, Сіп, або Агд «4005 6
Хаа сбіп сіу Тук с1у Хаа Ркго Ропе ТіПг 1 5
«2105 7 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 27 с1у Іїе ТПг Рго Аїа сіу сіу Тут ТПтІ Акуд Тут Аза Авр бБет Уаї Гув 1 5 10 15 у «2105 8 «2115 11 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 8
Атуд Аїа бБет сіп Авр Уаії бБет ТПїІ Аїа Уаї Аза 1 5 10 «2105 39 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 9 зек А1ї1а бек РПе еп Тук бек 1 5 «2105 10 «2115 39 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 10 біп біп с1у Тук с1у Аїа Рко Ропе ТПг 1 5
«2105 11 «2115 1270 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 111 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ І1їе бек Авр Тук 20 ТЕр І1їе Нів Тгр Маї! Агуд сіп Аїа Рго сС1у Пув СсС1у їец Сі Тгр Уаї1ї
Аза сб1у Іїе ТПт Рго Аїа сіу сі1у Тут ТПх Агуд Тугт Аза Авр бБет Уаї 25 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Аза Авр ТПт бБет Гув Авп ТПг Аїа Тук 65 70 75 80
Зо теп сіп Меє Акуд бет Гец Агд Аїа бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
З5
Аза Атуд Рпе Маі! Рпе Рпе Гец Ркго Тут Аїа Мес Авр Тут Тгр С1у сіп 100 105 110 40 с1у ТПх Гей Уа! ТПг Уаї бек 5бег 115 120 «2105 12 45 «2115 107 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 12
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПтІ сіп бет Рко бБетї бБеїт Гей бБег Аїа бБет Уа1ї с1У 1 5 10 15
Авр Атуд УМаії ТПт Іїе ТПт Сув Акуд Аїа бек біп Авр Уаі! бет ТПтІ А1а
20 25 30 уаї Аїа Ттр Тут сіп сіп пув Ркго сбіу пув Аїа Рго Гув Гец Тец І1е 35 40 45
Тук бБет Аїа бет РПе Гецп Тухк бек біу Уа1 Рго бБет Ат9д Рпе Бех щу 50 55 бо бек біу бБек бі1у ТПх Авр Рпе ТПтІ Тецп ТПтІ І1е бБет Бек Гей сіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Аїа Аїа ТПтІ Тут Тут Сув сіп сіп с1у Тух б1у Аза Рго РІе 85 Зо 95
ТПг Рпе сіу біп сі1у ТПг ув Уаї сі Іїе Гуз 100 105 «2105 13 «2115 30 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 0) «223» Синтетична конструкція «4005 13 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гец бек Сув Аїа Аза бехт с1у Рпе ТПї І1е бек 20 25 30 «2105 14 «2115 14 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 14
ТЕр Уаі Акд сіп Азїа Рго Ссіу пув С1у Ге біц Тгр Уаї Аї1а 1 5 10 «2105 15 «2115 32 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність
«223» Синтетична конструкція «4005 15
Атуд Рпе ТПІ Іїе 5егт Аза Авр ТПтІ бБет Гуз Авп о ТПІ Аїа Тут Іецч сіп 1 5 10 15
Ме Агуд бБет Гец Агуд Аїа сіц Авр ТПї Аїа Уаії Тут Тут Сув Аїа Агд 20 25 30 «2105 16 «2115 11 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 16
Тер с1у сіп б1у ТПтї Тецп Уа1! ТПг Уаї бек 5бег 1 5 10 «2105 17 «2115 23 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 17
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПтІ сіп бет Рко бБетї бБеїт Гей бегт Аїа бБет Уа1ї 01Уу 1 5 10 15
Авр Атуд УМаії ТПтІ І1е ТПк Сув 20 «2105 18 «2115 15 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 18
ТЕр Тут сіп сіп пув Ркго бі1у гув Аїа Рго пув їец Тїец Іїе Туг 1 5 10 15
«2105 19 «2115 32 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 19 сіу Маі1і Рго бБегт Агкд РПе бет сіу бБет біу бБет б1у ТПтІ Авр Рпе ТПг 1 5 10 15
Тецп ТПтІ І1ї1е бБет бБет Гей біп Рго бі Авр Аїа Аїа ТПт Тут Тук Сув 20 «2105 20 «2115 10 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність 25 «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 220
Рпе с1у біп б1у ТПкх пувз Уаї бій І1їе Гуз 30 1 5 10 «2105 21 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 21 с1у Іїе ТПІ Рго Аїа сіу сіу Тут сіц Тут Тухт Аза Авр бБет Уаї Гув 1 5 10 15 ов1у «2105 222 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція
«4005 щЩД 22 с1у Іїе ТПІ Рго Аїа сіу сіу Тут сі Тут Тут Аза Авр бБет Уаї с1ц 1 5 10 15 ов1у «2105 23 «2115 1/9 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 23 біп біп сб1у Тук с1у Авп Рко Ропе ТПг 1 5 «2105 24 «2115 32 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність
Зо «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 24 сі1у Ма1і Рко бБег Акд РПе бБет сіу Бек сіу Бек б1у ТПг Авр Рпе ТІПг 1 5 10 15
Те ТПтІ І1ї1е бБет бБет Гей біп Рго бі Авр Рпе Аїа ТПтІ Тут Тут Сув 20 25 30 «2105 25 «2115 23 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 525
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПт сіп бет Рко Сі бек Гей бегт Аїа бБет Уа1ї 01Уу 1 5 10 15
Авр бі Маї ТПтІ І1е ТПк Сув 20
«2105 26 «2115 23 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 26
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПтІ сіп бек Рго бек бБет Гей бБег Аїа бБет Уаї с«1У 1 5 10 15
Авр бі Маї ТПтІ І1е ТПк Сув 20 «2105 -Ми27 «2115 15 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 27
ТЕр Тут сіп сіп пув Рго б1у бі Аза Рго пув їец Тїец Іїе Туг 1 5 10 15 «2105 28 «2115 32 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 228 сі1у Ма1і Рко бБег Акд РПе бБет сіу Бек сіу Бек б1у ТПг Авр Рпе ТІПг 1 5 10 15
Те ТПІ І1е сіц бет Гей біп Рго бі Авр Аїа Аїа ТПтІ Тут Тут Сув 20 25 30 «2105 29 «2115 30 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205
«223» Синтетична конструкція «4005 229 сі бі біп Гец Уаі Сі сі сіу с1у сі1у Гей Уаі1і сбіп Рго сіу сі1ц 1 5 10 15
Ззек Ггецп бі Ггец бек Сув Аїа Аза бехт с1у Рпе сі І1е бек 20 25 30 «2105 30 «2115 14 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 30
ТЕр Уаі Акд сіп сі Рго сі1у бі б1у Ге сіц Ткр Уаї А1а 1 5 10 «2105 31 «2115 32 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 31
Атуд Рпе ТПІ Іїе 5егт Аза Авр ТПтІ бет бій Авп ТПІ Аїа Тут Іец сіп 1 5 10 15
Меєс Авп осі Гей Акуд Аза бій Авр ТПг Аїа Уаї Тух Туг Сув Аїа Агд 20 25 30 «2105 32 «2115 11 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 32
ТЕр сі1у сіп с1у бій Ггецп Уа1 ТПкх Уаі1ї! бек 5бег 1 5 10 «2105 33
«2115 1270 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 33 сі бі біп Гец Уаі Сі сі сіу с1у сі1у Гей Уаі1і сбіп Рго сіу сі1ц 1 5 10 15
Ззек Ггецп бі Ггеп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе с1іцп І1їе бек Авр Тук 20 25 30
Тгр І1е Нів Тгр Уа1ї Агд сіп Сіц Рго бі1у сі сС1у їец б1ц Тгр Уаї 35 40 45
Аза сб1у Іїе ТПтІ Рго Аїа сіу сі1у Тук бі Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї 50 55 бо сі б1у Акд Рпе ТПтІ І1е 5Бехг Аза Авр ТПтг бек біц Авп ТПг Аїа Туг 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп сіц Гец Агд Аза бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув
Зо 85 30 95
Аза Атуд Рпе Маі! Рпе Рпе Гец Ркго Тут Аїа Мес Авр Тут Тгр С1у сіп 100 105 110
З5 сіу бій Гей Маії ТПт Уаї бек 5бег 115 120 «2105 34 «2115 107 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 34
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПт сіп бет Рко Сі бек Гей бегт Аїа бБет Уа1ї 01Уу 1 5 10 15
Авр бі Уа1ї ТПг Іїе ТПтї Сув Агуд Аза бБег біп Авр Уаії бБетг ТПт Аїа 20 25 30 уаї Аїа Ттр Тут сіп сіп пув Ркго сіу гув Аза Рго пув Іїец Іец І1е 35 40 45
Тут Бек Аїа бек РПе Теп Тук бег Сбіу Уаі Рго бБег Агкд Рпе Бех щЩ1У 50 55 бо бек біу бБек бі1у ТПх Авр Рпе ТПтї ТІецй ТПІ Іїе бБет Бек Гей сіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Аїа Аїа ТПтІ Тут Тут Сув сіп сіп с1у Тук б1у Аза Рго РІеє 85 Зо 95
ТПЕ Рпе сіу сіп с1у ТПжї Кпуз Уаі бі Іїе Гуз 100 105 «2105 35 «2115 107 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 35
Зо
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПтІ сіп бет Рко бБетї бБеїт Гей бегт Аїа бБет Уа1ї 01Уу 1 5 10 15
Авр бі Уа1ї ТПг Іїе ТПтї Сув Агуд Аза бБег біп Авр Уаії бБетг ТПг Аїа 20 25 30 уаї Аїа Ттр Тут сіп сіп пув Рго сіу бі Аза Рго пув Іїец Іец І1е 35 40 45
Тук бБет Аїа бет РПе Гецп Тухк бек біу Уа1 Рго бБет Ат9д Рпе Бех щу 50 55 бо бек біу бБек бі1у ТПх Авр Рпе ТПтї Іей ТПІ Іїе сі Бек Гей сіп Рго 65 70 75 80 бі Авр Аїа Аїа ТПтІ Тут Тут Сув сіп сіп с1у Тух б1у Аза Рго РІе 85 Зо 95
ТПг Рпе сіу біп сіу ТПпх Гув Уаї Сіц І1їе Гуз 100 105
«2105 36 «2115 107 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 36
Авр Ії1е сбіп Меєс ТПг біп бет Ркго сі бег Гей бек Аїа Бех Уаі У 1 5 10 15
Авр бі Маї ТПтІ Іїе ТПт Сув Акуд Аїа бек біп Авр Уаі! бет ТПтІ А1а уаї Аїа Ттр Тут сіп сіп пув Рго сіу бі Аза Рго пув Іїец Іец І1е 20
Тук бБет Аїа бет РПе Гецп Тухк бек біу Уа1 Рго бБет Ат9д Рпе Бех щу бо 25 бек біу бБек бі1у ТПх Авр Рпе ТПтї ТІецй ТПІ Іїе бБет Бек Гей сіп Рго 65 70 75 80
Зо бі Авр Аїа Аза ТПтг Тугк Тут Сув біп сіп сіу Ту Сб1у Аза Рго РПе 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу сіп с1у ТПжї Кпуз Уаі бі Іїе Гуз
З5 1600 105 «2105 37 «2115 107 40 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція 45 «4005 37
Авр Іїе сбіп Ме ТПтІ сіп бек Рко бБетї бБеїт Гей бегт Аїа бБет Уа1ї 01Уу 1 5 10 15 50
Авр бі Маї ТПтІ Іїе ТПт Сув Акуд Аїа бек біп Авр Уаі! бет ТПтІ А1а 20 25 30 55 уаї Аїа Ттр Тут сіп сіп пув Ркго сіу гув Аза Рго пув Іїец Іец І1е 35 40 45
Тук бБет Аїа бет РПе Гецп Тухк бек біу Уа1 Рго бБет Ат9д Рпе Бех щу 50 55 бо зек біу Бек біу ТПх Авр Рпе ТПт їец ТПї Іїе бБег бБет Гей біп Рго 65 70 75 80 бі Авр Аїа Аїа ТПтІ Тут Тут Сув сіп сіп с1у Тух б1у Аза Рго РІе 85 Зо 95
ТПЕ Рпе сіу сіп с1у ТПжї Кпуз Уаі бі Іїе Гуз 100 105 «2105 38 «2115 107 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 38
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПтІ сіп бет Рко бБетї бБеїт Гей бБег Аїа бБет Уа1ї с1У 1 5 10 15
Зо
Авр Атуд УМаії ТПт Іїе ТПт Сув Акуд Аїа бек біп Авр Уаі! бет ТПтІ А1а 20 25 30 уаї Аїа Тгр Тут Сіп біп Пув Рго сіу Гув Аїа Рго Гпув Гец Ге Іїе 35 40 45
Тук бБет Аїа бет РПе Гецп Тухк бек біу Уа1 Рго бБет Ат9д Рпе Бех щу 50 зо бо бек біу бБек бі1у ТПх Авр Рпе ТПтІ Тецп ТПтІ І1е бБет Бек Гей сіп Рго 65 70 75 80 біц Авр Рпе Аїа ТПІ Тут Тут Сув сіп сіп с1у Тухк б1у Авп Рго РІе 85 Зо 95
ТПЕ Рпе сіу сіп с1у ТПг Гпув Уаії бій І1їе Гув 100 105 «2105 39 «2115 14 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність
«223» Синтетична конструкція «4005 39
ТЕр Уаі Акд сіп сі Рго сі1у пув с1у Ге біц Тгр Уаї Аї1а 1 5 10 «2105 840 «2115 1270 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 40 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15 зет Гей Агд Пец бек Сув Аїа Аїа бБет сСіу Рпе ТПтІ І1е бБег Авр Туг 20 25 30
Тгр І1е Нів Тгр Уа1ї Агд сіп Сіц Рго сбі1у Ппув С1іу їец б1іц Тгр Уаї
Зо 35 40 45
Аза сб1у Іїе ТПтІ Рго Аїа сіу сі1у Тук бі Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї 50 55 бо
З5
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Аза Авр ТПт бБет Гув Авп ТПг Аїа Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гец Агд Аїа бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Акуд Рпе Уаії Рпе Рпе Пец Рго Тут Аїа Мес Авр Тут Тгр с1у сСіп 100 105 110 сіу ТПг Гей Маії ТПт Уаї бек 5бег 115 120 «2105 41 «2115 107 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція
«4005 241
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПтІ сіп бек Рго бек бБет Гей бБег Аїа бБет Уаї с«1У 1 5 10 15
Авр Атуд УМаії ТПт Іїе ТПт Сув Акуд Аїа бек біп Авр Уаі! бет ТПтІ А1а 20 25 30 уаї Аїа Ттр Тут сіп сіп пув Рго сбіу гув Аза Рго пув їец Іец І1е 35 40 45
Тут Бек Аїа бек РПе Теп Тук бег Сбіу Уаі Рго 5Бег Агд Рпе бБех ШУ 50 55 бо бек біу бБетк бі1у ТПх Авр Рпе ТПтї ТІецй ТПІ Іїе бБет Бек Гей сіп Рго 65 70 75 80 біц Авр Рпе Аїа ТПІ Тут Тут Сув сіп сіп с1у Тух б1у Аза Рго РІе 85 Зо 95
ТПЕ Рпе сіу сіп с1у ТПжї Кпуз Уаі бі Іїе Гуз 100 105
Зо «2105 42 «2115 1270 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність
З5 «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 42 40 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сі1у «1У 1 5 10 15 45 зет Гей Агд Пец бек Сув Аїа Аїа бБет сСіу Рпе ТПтІ І1е бБег Авр Туг 20 25 30
Тгр І1е Нів Тгр Уа1ї Агд сбіп Аїа Рго сбіу Ппув С1іу їец Сі Тгр Уаї1
Аза сб1у Іїе ТПт Ркго Аїа сіу сі1у Тук ТПх Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї 50 55 бо пув с1у Акд РпПе ТПтї Іїе Бек Аза Авр ТПт бБег Гув Авп ТПт Аїа Туг 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гец Агд Аїа бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Акуд Рпе Уаії Рпе Рпе Пец Рго Тут Аїа Ме Авр Тут Тгр с1у сіп 100 105 110 сіу ТПг Гей Маії ТПт Уаї бек 5бег 115 120 «2105 43 «2115 227 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 43 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ І1їе бек Авр Тук 20 25 30
Зо
Тгр І1е Нів Тгр Уа1ї Агд сіп Аїа Рго сСіу Ппув Сіу їец б1іц Тгр Уаї 35 Аза с1у Іїе ТПг Ркго Аїа сіу с1у Тук ТПг Тук Тут Аза Авр бБет Уаї бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Аза Авр ТПт бБет Гув Авп ТПг Аїа Тук 40 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бет Гец Агд Аїа бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 90 95 45
Аза Атуд Рпе Маі! Рпе Рпе Гец Ркго Тут Аїа Мес Авр Тут Тгр С1у сіп 100 105 110 50 сіу ТпПг тей Маї ТПтІ МУМаії бБет бБет Аїа бет ТПт Ггувз бі1іу Рго бБет Уаї 115 120 125 55 Рпе Ркго Гец Аза Рго бек бетг Гув бБет ТПтї бБег с1у сіу ТПг Аїа Аї1а 130 135 140 теп сіу Сув Гец Уаії Гуз Авр Тухк Рпе Рго біц Рго Уаі1і ТПт Уаї1ї бек 145 150 155 160
ТЕр Авп о бек Сіу Аїа Іецй ТПг бет с1у Уа1 Нів ТПК Рібе Рго А1а Уаї1ї 165 170 175 теп сіп бет бБет біу Гей Тук бек Гпецп бет бБет Уаі Уаі1і ТПхг Уаі1ї Рго 180 185 190 бек бек бБет Гец С1у ТПт сіп ТПк Тут І1їе Сув Авп Уа1! Авзп Ніз Гув 195 200 205
Рко Бек Авп о ТПх Кгув Уаі1 Авр Гуз їГув Маії сі Рго Гуз Бек Сув Авр 210 215 220 уз ТрЕ Нів 225 «2105 44 «2115 32 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність
Зо «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 а44 сі1у Ма1і Рко бБег Акд РПе бБет сіу Бек сіу бек с1у ТПг Авр Ропе ТрПг 1 5 10 15
Тецп ТПтІ І1ї1е бБет бБет Гей біп Рго бі Авр бБет Аїа ТПтІ Тут Тут Сув 20 25 30 «2105 45 «2115 23 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 45
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПтІ сіп бет Рко бБетї бБеїт Гей бегт Аїа бБет Уа1ї 01Уу 1 5 10 15
Авр Атуд Уаії ТПтїІ І1ї1е Авр Сувг 20
«2105 46 «2115 107 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 46
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПтІ сіп бет Рко бБетї бБеїт Гей бегт Аїа бБет Уа1ї 01Уу 1 5 10 15
Авр Атуд Уаії ТПтІ Іїе Авр Сув Акгуд Аїа бек біп Авр Уаі! бет ТПтІ А1а 20 уаї Аїа Ттр Тут сіп сіп пув Ркго сіу гув Аза Рго пув Іїец Іец І1е 25 Тут Бек Аїа бек РПе Теп Тук бег Сбіу Уаі Рго 5Бег Агд Рпе бБех ШУ бо бек біу бБек бі1у ТПх Авр Рпе ТПтї ТІецй ТПІ Іїе бБет Бек Гей сіп Рго
Зо 65 70 75 80 бі Авр Аїа Аїа ТПтІ Тут Тут Сув сіп сіп с1у Тух б1у Аза Рго РІе 85 Зо 95 35 ТПг Рпе сіу біп сіу ТПпх Гув Уаї Сіц І1їе Гуз 100 105 «2105 47 40 «2115 232 «2125 БІЛОК «2135» Ното зарієпз «4005 47 45
Меє Авп Рпе Іїєц Іец бег Ткр Уа1ї Нів Ткгр бек Ієц АТа Ієц Ієц Ієц 1 5 10 15 50 Тут гейш Нів Нів Аїа Гуз Тгр Бех сбіп Аїа Аїа Рго Меє Аї1а сі СсС1У 20 25 30 сСіу б1у сб1іп Авзвп Нів Ніз Сі Уаї Уа1ї Ппув Рре Меє Азр Уа1ї Тук Ссіп 55 35 40 45
Атд бБет Тут Сув Нів Рго Іїе сіц ТПїх ІЇец Уаї Азр І1їе Рпбе СсСіп с1ц
50 55 бо
Тук Рго Авр сіц І1е бі Тук Іїе Рпе Пув Рго бБет Сув Уа1ї Рго ГІец 65 70 75 80
Меє Атуд Сув сі1у сіу Сув Сув Авп Авр бі біу еп біц Сув Уаї Ркго 85 Зо 95
ТЕ Сі Сі бБег Авп І1їе ТПт Меє СсСіп І1ї1е Меє Агу І1їе Гув Рго Ніз 100 105 110
Сіп б1у сб1іп Нів І1їе с1у Сі Мес бБег Рібе Гец Сіп Нів Авп Гув Сув 115 120 125 сі Сув Акуд Рго пув Гув Авр Агуд Аїа Агд сіп бій пуз Пув бБетг Уаї 130 135 140
Атуд б1у пув с1у пув сіу сіп пув Агкд Гуз Агуд Гув Гув бБет Акд Туг 145 150 155 160
Туз бБет Тктр бБет Уаії Тухк Уа1 с1у Аїа Агд Сув Сув Гей Меє Рго Тгр 165 170 175
Зо бек Ггец Рго С1у Рго Нів Рго Сув біу Рго Сув бБехг Сі Агд Агд Гув 180 185 190
Нів гец Рпе Уаї сіп Авр Рко СсСіп ТПг Сув Пув Сув Бек Сув Гув Авп 195 200 205
ТПЕ Авр о бБет Акд Сув гув Аза Агд біп їец сід Гец Авп сій Агд Ток 210 215 220
Сув Акд Сув Авр Гуз Рго Аг Агд 225 230 «2105 48 «2115 228 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 48 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПІ І1їе бек Авр Тук 20 25 30
Тгр І1е Нів Тгр Уа1ї Агд сіп Аїа Рго сСіу Ппув Сіу їец б1іц Тгр Уаї 35 40 45
Аза сб1у Іїе ТПт Рго Аїа сіу сі1у Тут ТПх Агуд Тугт Аза Авр бБет Уаї 50 55 бо пув с1у Акд РпПе ТПтї Іїе Бек Аза Авр ТПт бег Гув Авп ТПт Аїа Туг 65 70 75 80 теп сіп Меє Акуд бет Гец Агд Аїа бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 30 95
Аза Атуд Рпе Маі! Рпе Рпе Гец Ркго Тут Аїа Мес Авр Тут Тгр С1у сіп 100 105 110 сіу ТпПг тей Маї ТПтІ МУМаії бБет бБет Аїа бет ТПт Ггувз бі1іу Рго бБет Уаї 115 120 125
Зо
Рпе Рго гей Аза Рго бек бек Ппув бБет ТПтІ бБет с1у с1у ТПх Аїа Аїа 130 135 140
Теш с1у Сув Ггец УМа1ії Гуз Авр Тут РпПе Рго бій Рго Уаі! ТПтї Уаї 5ег 145 150 155 160
Тгр Авп бек б1у Аїа Гец ТПт бек СсСіу Уа1ї Нів ТПт Рібе Рго А1їа Уаї 165 170 175 теп сіп бет бБет біу Гей Тук бек Гпецп бет бБет Уаі Уаі1і ТПхг Уаї Рго 180 185 190 бек бек бБет Гец С1у ТПт сіп ТПк Тут І1їе Сув Авп Уа1! Авзп Ніз Гув 195 200 205
Рко Бек Авп о ТПх Кгув Уаі1 Авр Гуз їГув Маії сі Рго Гуз бек Сув Авр 210 215 220 пув ТіПтг Нів Трг 225
«2105 249 «2115 228 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 49 сі Маї сб1іп Гец УМаі сіц бек сіу сіу с1у Гей Маі біп Рго сб1і1у «1У 1 5 10 15 зет Гей Агд Пец бек Сув Аїа Аїа бБет сСіу Рпе ТПтІ І1е бБег Авр Туг
Тгр І1е Нів Тгр Уа1і! Агд сіп АТа Рго с1у пув Сіу їец с1ц Тгр Уаї 20 35 40 45
Аза сб1у Іїе ТПт Рго Аїа сіу сі1у Тут ТПх Агуд Тугт Аза Авр бБет Уаї 50 55 бо 25
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Аза Авр ТПт бБет Гув Авп ТПг Аїа Тук 65 70 75 80
Зо теп сіп Меє Акуд бет Гец Агд Аїа бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Акуд Рпе Уаії Рпе Рпе Пец Рго Тут Аїа Мес Авр Тут Тгр с1у сСіп 100 105 110 сіу ТпПг тей Маї ТПтІ МУМаії бБет бБет Аїа бет ТПт Ггувз бі1іу Рго бБет Уаї 115 120 125
Рпе Рго гей Аза Рго бек бек Ппув бБет ТПтІ бБет с1у с1у ТПх Аїа Аїа 130 135 140 теп сіу Сув Гец Уаії Гуз Авр Тухк Рпе Рго біц Рго Уаі1і ТПт Уаї1ї бек 145 150 155 160
Тгр Авп бек б1у Аїа Гец ТПт бек СсСіу Уа1ї Нів ТПт Рібе Рго А1їа Уаї 165 170 175
Тецп сіп бБег Бек Сіу Гей Тук бБетг Ггец бБет бБет Уаії Уаі ТПпкг Уаї Рго 180 185 190 бек бек бБет Гец С1у ТПт сіп ТПк Тут І1їе Сув Авп Уа1! Авзп Ніз Гув 195 200 205
Рго Бек Авп ТПтї Гуз Уаі Авр гув пув Маі бій Рго пув Бек Сув Авр 210 215 220 уз Торг Нів Іец 225 «2105 350 «2115 214 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 50
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПтІ сіп бет Рко бБетї бБеїт Гей бегт Аїа бБет Уа1ї 01Уу 1 5 10 15
Авр Атуд УМаії ТПт Іїе ТПт Сув Акуд Аїа бек біп Авр Уаі! бет ТПтІ А1а 20 25 30
Зо уаї Аїа Ттр Тут сіп сіп пув Ркго сіу гув Аза Рго пув Іїец Іец І1е 35 Тут Бек Аїа бек РПе Теп Тук бег Сбіу Уаі Рго 5Бег Агд Рпе бБех ШУ бо бек біу бБек бі1у ТПх Авр Рпе ТПтї ТІецй ТПІ Іїе бБет Бек Гей сіп Рго 40 65 70 75 80 бі Авр Аїа Аїа ТПтІ Тут Тут Сув сіп сіп с1у Тух б1у Аза Рго РІе 85 Зо 95 45
ТПЕ Рпе сі1у сіп с1у ТПх Кгув Уа1і біш Іїе Гув Агтуд ТПїІ Уаі Аза Аза 100 105 110 50
Рко Бек Уаі Рібе Іїе Рпе Рго Рго бБег Авр сіцп сіп Гец Гуз бБех ШУ 115 120 125 55 ТПІ Аїа бБег Уаї Уаї Сув Гец Гей Авп Авп Рпе Тут Рго Агуд бі Аїа 130 135 140 туз Уаії сіп Ткр гуз Уаі Авр Авп Аїа Гей Сбіп бет со1у Авп бек сіп 145 150 155 160 бі бек Уа1ї ТПг сі біп Авр бек Гув Авр бБеїт ТПт Тут Бек Гец 5бег 165 170 175 бек ТПкг Гей ТрПІ Кгец бет Кпуз Аїа Авр Тут Сіцш Гуз Нів Ппув Уа1! Туг 180 185 190
А1ї1а Сув сі Уа1! Трт Нів біп с1іу Гец бет бек Ркго Уа! ТПк Кгув 5бег 195 200 205
Рпе Авп Агуд с1у сіц Сув 210 «2105 Ч«551 «2115 1270 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 чфют51 січ бі б1іп Гец Уаі сіц сі сі1у с1у с1у Гей Уаі біп Рго с1у с1ц
Зо 1 5 19 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе с1іцп І1їе бек Авр Тук 20 25 30
З5
Тгр І1е Нів Тгр Уа1ї Агд сіп Сіц Рго бі1у сі сС1у їец б1ц Тгр Уаї 40
Аза сб1у Іїе ТПтІ Рго Аїа сіу сі1у Тук бі Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї бо 45 сі б1у Акд Рпе ТПтІ І1е 5Бехг Аза Авр ТПтг бек біц Авп ТПг Аїа Туг 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп сіц Гец Агд Аза бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 50 85 90 95
Аза Атуд Рпе Маі! Рпе Рпе Гец Ркго Тут Аїа Мес Авр Тут Тгр С1у сіп 100 105 110 55 сіу бій Гей Маії ТПт Уаї бек 5бег 115 120
«2105 -Б52 «2115 30 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 щД 52 січ бі б1іп Гец Уаі сіц сі сі1у с1у с1у Гей Уаі біп Рго с1у с1ц 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гец бек Сув Аїа Аза бехт с1у Рпе бі Ії1їе бек 20 «2105 53 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність 25 «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 53
Зо с1у Іїе ТПг Рго Аїа сіу сіу Тут ТПтї Тут Тут Аза Авр бБет Уаї Гув 1 5 10 15 у «2105 54 «2115 32 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 54 сіу Маі1і Рго бБегт Агкд РПе бет сіу бБет біу бБет б1у ТПтІ Авр Рпе ТПг 1 5 10 15
Те ТПтІ І1ї1е бБет бБет Гей біп Рго бі Авр Уаі Аїа ТПтІ Тут Тут Сув 20 25 30 «2105 (55 «2115 10
«2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 55
Рпе с1у біп б1у ТПкх пузв Уа1і бі Уаї Гуз 1 5 10 «2105 556 «2115 34 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 Ь56 саєсачаєду сододадаачаєд аадасачаєсд десдс 34 «2105 57 «2115 23 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 Ь57 дссаєсссада Єдасссадсс сс 23 «2105 58 «2115 19 «2125 ДНК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 58 часеЕдсасса ЕсСЕдЕСССС 19 «2105 59 «2115 107 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція
«4005 59
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПтІ сіп бет Рко бБетї бБеїт Гей бегт Аїа бБет Уа1ї 01Уу 1 5 10 15
Авр Атуд УМаії ТПт Іїе ТПт Сув Акуд Аїа бек біп Авр Уаі! бет ТПтІ А1а 20 25 30 уаї Аїа Ттр Тут сіп сіп пув Ркго сіу гув Аза Рго пув Іїец Іец І1е 35 40 45
Тут Бек Аїа бек РПе Теп Тук бег Сбіу Уаі Рго 5Бег Агд Рпе бБех ШУ 50 55 бо бек біу бБек бі1у ТПх Авр Рпе ТПтї ТІецй ТПІ Іїе бБет Бек Гей сіп Рго 65 70 75 80 січ Авр Маії Аїа ТПтІ Тут Тут Сув сіп сіп с1у Тухк б1у Авп Рго РІе 85 90 95
ТПЕ Рпе сіу сіп с1у ТПжї Кпуз Уаі бі Іїе Гуз 100 105
Зо «2105 60 «2115 107 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність
З5 «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 60
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПтІ сіп бет Рко бБетї бБеїт Гей бегт Аїа бБет Уа1ї 01Уу 1 5 10 15
Авр Акуд Уа1і ТПг Іїе ТПтї Сув Агуд Аза бБег біп Авр Уаії бБетг ТПг Аїа 20 25 30 уаї Аїа Ттр Тут сіп сіп пув Ркго сіу гув Аза Рго пув Іїец Іец І1е 35 40 45
Тук бБет Аїа бет РПе Гецп Тухк бек біу Уа1 Рго бБет Ат9д Рпе Бех щу 50 55 бо бек біу бБек бі1у ТПх Авр Рпе ТПтї ТІецй ТПІ Іїе бБет Бек Гей сіп Рго 65 70 75 80 січ Авр Маії Аїа ТПтІ Тут Тут Сув сіп сіп с1у Тух б1у Аза Рго РІе 85 90 35
ТПЕ Рпе сіу сіп с1у ТПжї Кпуз Уаі бі Іїе Гуз 100 105 «2105 61 «2115 5 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 61 сіу б1у с1у о1у 5бБег 1 5 «2105 62 «2115 5 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 М62 сі1у Ту Тук Меє Нів 1 5 «2105 63 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 63
ТЕр І1е Авп Рго Авп бек біу біу ТПхг Авп Тут Аїа сбіп Гуз Рпе сіп 1 5 10 15 ов1у «2105 64 «2115 20
«2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 б64
Зек Рго Авп Рго Тут Тут Тут Авр бБегт бБет сіу Тухк Тух Тух Рго Щ1Уу 1 5 10 15
Аза Рпе Авр І1е 20 «2105 65 «2115 11 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 ммР665 сСіу б1у Авп Азп І1е СсСіу бек Пув бБет Уаї Ніз 1 5 10 «2105 66 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 66
Авр Авр 5ет Авр Агу Рго 5ег 1 5 «2105 67 «2115 11 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 67 сСіп Ма1! Тгр Авр бет бек бет Авр Нів Тгр Уа1 1 5 10
«2105 568 «2115 129 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 568 сбіп Маі сбіп Гец УМаії сіп бехт с1у Аї1а сій Уаї пув пув Рго С1у А1а 1 5 10 15 зетк Уаії пув Ма1ії Бек Сув пув Аїа бек с1у Тут ТПт Рпе ТПк сС1Уу Туг
Тук Меє Нів Тгр Уаії Агд сіп Аїа Рго сіу Сіп сС1у Те Сі Ткгр Меє 20 35 40 45 сіу Тер Іїе Авп Рго Авп бек сіу сіу ТПх Авп Тухт Аїа біп гув РПе 50 55 бо 25 біп б1у Атуд Уаії ТПт Меє ТПІ АкКуд Авр ТБПт бегт Іїе бБет ТПтІ Аїа Туг 65 70 75 80
Зо
Меє біц Гец бБет Акд Гец Акуд бет Авр Авр ТПтІ Аїа Уа1! Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Акуд Бек Рго Авп о Рго Тут Тук Тут Авр бек бек сіу Тут Тук Туг 100 105 110
Рго сб1у Аїа Рпе Авр Іїе Тгр сіу сбіп с1у ТПтІ Ме Уаі1і ТПхКх Уаї1ї бек 115 120 125 зекг «2105 69 «2115 110 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Синтетична конструкція «4005 69 зет Тут Уаії Ппецп ТПк сіп Рко Рго Бех Уаії бБет Уаі Аїа Рго б1у сіп 1 5 10 15
ТПк Аза Акуд І1е ТПїх Сув б1у б1у Авп Авп о І1е с1у Бек Ппув бек Уаї1ї 20 25 30
Нів Тгр Тухк СсСіп сіп Гув Ркго СсС1у сіп Аїа Ркго Уа1! Іец Уа1! Уа1 Туг 35 40 45
Авр Авр бБегт Авр Акуд Ркго бет Ссіу І1е Рго біц Агд Рпе бет с1уУу 5бБег 50 зо бо
Авп обет со1у Авп ТПтІ Аїа ТПт Гей ТПїІ І1е бБегт Агд Уа! біц Аїа 01Уу 65 70 75 80
Авр біц АТа Авр Тут Тут Сув біп Уа1! Тгр Авр бек бетг бБетг Авр Нівз 85 Зо 95
ТЕр Маі Рпе сі1у сі1у сі1у ТПжїх Ггув Ггеп ТПх Уаї їец С1у сіп 100 105 110

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язує фактор росту ендотелію судин (МЕСЕ), причому вказане антитіло містить наступні шість гіперваріабельних ділянок (НУК): (а) НУВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ОМУМН (ЗЕО ІЮ МО: 1); (б) НУВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність ЗІТРАСОУТКМАОЗУКО (ЗЕО ІО МО: 7); (с) НУВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність ЕМЕРРМАМОМ (ЗЕО ІЮО МО: 3); (а) НУВ-11, що містить амінокислотну послідовність КАБОЮМ5ТАМА (5ЕО ІО МО: 8); (є) НУВ-12, що містить амінокислотну послідовність ЗАЗРЕЇ УЗ (ЗЕО ІЮО МО: 9); і (у НУВ-І3, що містить амінокислотну послідовність ОССУСАРЕТ (ЗЕО ІО МО: 10).
2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що антитіло додатково містить наступні каркасні ділянки (ЕК) варіабельного (УН) домену важкого ланцюга: (а) ЕВ-НІЇ, що містить амінокислотну послідовність ЕМОЇ МЕБОССІ МОРОСЗБІ КІ ЗСААЗОЕТІВ (ЗЕО ІО МО: 13); (5) ЕВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність М/КОАРОКОЇ ЕМУМА (ЗЕО ІЮ МО: 14); (с) ЕВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІБАОТЗКМТАМІ ОМЕА5І КАЕОТАУУУСАК (ЗЕО ІЮО МО: 15) і (8) ЕВ-НА, що містить амінокислотну послідовність УМЗОСТІ МТУ55 (5ЕО ІО МО: 16).
3. Антитіло за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що антитіло додатково містить наступні ЕК варіабельного (МІ) домену легкого ланцюга: (а) ЕВ-І1, що містить амінокислотну послідовність ОІЮМТОЗРБЗБІ БАЗБМООКМТІТС (5ЕО ІЮ МО: 17); (5) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність ММООКРОКАРКИІМ (5ЕО ІО МО: 18); (с) ЕВ-І3, що містить амінокислотну послідовність ЗМРОЕКЕ5ЗОЗОБОТОВЕТІ ТІЗБГОРЕБААТУУС (ЗЕО ІЮО МО: 19) і (а) ЕВ-1 4, що містить амінокислотну послідовність ЕБОСТКМЕЇК (ЗЕО ІЮ МО: 20).
4. ІЗзольоване антитіло, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому вказане антитіло містить: Зо (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 99 95 ідентичність послідовності амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО: 11, або (р) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 99 95 ідентичність послідовності амінокислотній послідовності зЗЕО ІЮ МО: 12.
5. Антитіло за п. 4, яке відрізняється тим, що домен МН додатково містить наступні ЕЕ: (а) ЕВ-НІ, що містить амінокислотну послідовність ЕМОЇ МЕ5БОСООІ МОРООБІ КІ ЗСААБОКЕТІЗ (ЗЕО ІО МО: 13); (5) ЕВ-Н2, що містить амінокислотну послідовність М/КОАРОКОЇ ЕМУМА (ЗЕО ІЮ МО: 14); (с) ЕВ-НЗ, що містить амінокислотну послідовність КЕТІБАОТЗКМТАМІ ОМЕА5І КАЕОТАУУУСАК (ЗЕО ІО МО: 15) ;і (8) ЕВ-НА, що містить амінокислотну послідовність МЗОСТІ МУЗ (ЗЕО ІЮ МО: 16).
6. Антитіло за п. 5, яке відрізняється тим, що домен МН містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 11.
7. Антитіло за будь-яким з пп. 4-6, яке відрізняється тим, що домен Мі додатково містить наступні ЕЕ: (а) ЕВ-І1, що містить амінокислотну послідовність ОІЮМТОЗРБЗБІ БАЗБМООКМТІТС (5ЕО ІЮ МО: 17); (5) ЕВ-І2, що містить амінокислотну послідовність ММООКРОКАРКИІМ (5ЕО ІО МО: 18); (с) ЕВ-І3, що містить амінокислотну послідовність ОМРІЗКЕЗОБОЗОТОЕТІ ТІЗБ ОРЕБСААТУХУС (ЗЕО ІО МО: 19; ії (а) ЕВ-І1 4, що містить амінокислотну послідовність ЕБОСТКМЕЇК (ЗЕО ІО МО: 20).
8. Антитіло за п. 7, яке відрізняється тим, що домен Мі. містить амінокислотну послідовність ЗЕО І МО: 12.
9. Ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому вказане антитіло містить: (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 11, (б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 12.
10. Ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому вказане антитіло містить: (а) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 48, і (р) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 50.
11. Ізольоване антитіло, яке специфічно зв'язує МЕСЕ, причому вказане антитіло містить: бо (а) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 49, і
(р) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 50.
12. Антитіло за будь-яким з пп. 1-11, яке відрізняється тим, що антитіло здатне інгібувати зв'язування МЕСЕ з рецептором МЕСЕ.
13. Антитіло за п. 12, яке відрізняється тим, що рецептор МЕСЕ являє собою рецептор 1 МЕСЕ (РП-1).
14. Антитіло за п. 12, яке відрізняється тим, що рецептор МЕСЕ являє собою рецептор 2 МЕСЕ (КОВ).
15. Антитіло за будь-яким з пп. 1-14, яке відрізняється тим, що антитіло зв'язує МЕСЕ людини (НМЕСРБ) з Ка близько 2 нм або нижче.
16. Антитіло за п. 15, яке відрізняється тим, що антитіло зв'язує НМЕСЕ з Ка між близько 75 пМ і близько 2 НМ.
17. Антитіло за п. 16, яке відрізняється тим, що антитіло зв'язує НМЕСЕ з Ка між близько 75 пМ і близько 600 нМ.
18. Антитіло за п. 17, яке відрізняється тим, що антитіло зв'язує НМЕСЕ з Ка між близько 75 пМ і близько 500 НМ.
19. Антитіло за п. 18, яке відрізняється тим, що антитіло зв'язує ПМЕСЕ з Ка близько 60 пМ.
20. Антитіло за будь-яким з пп. 1-19, яке відрізняється тим, що антитіло має температуру плавлення (Тт) більш ніж близько 83,5 "С.
21. Антитіло за п. 20, яке відрізняється тим, що антитіло має Тт від близько 85 "С до близько 9176.
22. Антитіло за п. 21, яке відрізняється тим, що антитіло має Тт близько 89 "С.
23. Антитіло за будь-яким з пп. 1-22, яке відрізняється тим, що антитіло є моноклональним, людським, гуманізованим або химерним.
24. Антитіло за будь-яким з пп. 1-23, яке відрізняється тим, що антитіло являє собою фрагмент антитіла, який зв'язує МЕСЕ.
25. Антитіло за п. 24, яке відрізняється тим, що фрагмент антитіла вибраний з групи, що складається з Раб, Бар-С, Рар'-5Н, Гм, 5сЕм і (Гар)2-фрагментів.
26. Антитіло за п. 25, яке відрізняється тим, що фрагмент антитіла являє собою Гарб.
27. Антитіло за будь-яким з пп. 1-26, яке відрізняється тим, що антитіло являє собою Зо моноспецифічне антитіло.
28. Антитіло за будь-яким з пп. 1-26, яке відрізняється тим, що антитіло являє собою мультиспецифічне антитіло.
29. Антитіло за п. 28, яке відрізняється тим, що мультиспецифічне антитіло являє собою біспецифічне антитіло.
30. Антитіло за п. 29, яке відрізняється тим, що біспецифічне антитіло зв'язує МЕСЕ і другу біологічну молекулу, вибрану з групи, що складається з ІІ -1р; інтерлейкіну-б (1-6); рецептора інтерлейкіну-б (ІІ-6К); інтерлейкіну-13 (1-13); рецептора 1-13 (1/-13К); РОСБЕ; ангіопоетину; ангіопоетину 2; Тіе2; З1Р; інтегринів сомВ3, см8В5 і са5рВ1; бетацелюліну; апеліну/АР); еритропоетину; фактора комплементу Ю; ТМЕРса; НТКАТ1; рецептора МЕСЕ; рецептора 51-2 і білка, генетично пов'язаного з ризиком вікової макулярної дегенерації (АМО).
31. Антитіло за п. 30, яке відрізняється тим, що рецептор МЕСЕ являє собою МЕСЕКІ1, МЕСЕН2, МЕСЕКЗ, мембранно-зв'язаний МЕСЕ-рецептор (ПОМЕСЕК) або розчинний рецептор МЕРЕ (5ХЕСЕВ).
32. Антитіло за п. 30, яке відрізняється тим, що білок, генетично зв'язаний з ризиком АМО, вибраний з групи, що складається з компонентів шляху комплементу С2, фактора В, фактора Н, СЕНКЗ, СЗБ, С5, С5а і СЗа; НТКА1; АКМ52; ТІМРЗ; НГ А; інтерлейкіну-8 (1-8); СХЗСВА1; ТІ ВЗ; ТІ К4; СЕТР; ПІРС, СОЇ 10А1 ії ТМЕНЕЗЕТОА.
33. Полінуклеотид, що кодує антитіло за будь-яким з пп. 1-32.
34. Вектор, що містить полінуклеотид за п. 33.
35. Клітина-хазяїн, що містить вектор за п. 34.
36. Спосіб отримання антитіла за будь-яким з пп. 1-32, що включає культивування клітини- хазяїна, яка містить вектор за п. 34, та виділення антитіла.
37. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що клітина-хазяїн є прокаріотичною.
38. Спосіб за п. 37, який відрізняється тим, що клітина-хазяїн являє собою Езсапегіспіа сої.
39. Спосіб за п. 38, який відрізняється тим, що клітина-хазяїн є еукаріотичною.
40. Спосіб за п. 39, який відрізняється тим, що клітина-хазяїн являє собою клітину 293, клітину СНО, дріжджову клітину або рослинну клітину.
41. Застосування антитіла за будь-яким із пп. 1-32 для зменшення або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом.
42. Застосування за п. 41, яке відрізняється тим, що розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад або клітинний проліферативний розлад.
43. Застосування за п. 42, яке відрізняється тим, що розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад.
44. Застосування за п. 43, яке відрізняється тим, що окулярний розлад вибирають з групи, яка складається з вікової макулярної дегенерації (АМО), макулярної дегенерації, набряку макули, діабетичного макулярного набряку (МЕ) (включаючи фокальний, нецентральний ОМЕ і дифузний, пов'язаний з центром ЮОМЕ), ретинопатії, діабетичної ретинопатії (ОК) (включаючи проліферативну ОК (РОК), непроліферативну ОК (МРОК) і висотну ОК), інших пов'язаних з ішемією ретинопатій, ретинопатії недоношених (КОР), оклюзії вени сітківки (КМО) (включаючи центральні (СКМО) і розгалужені (ВКМО) форми), СММ (хоріоїдальна неоваскуляризація) (включаючи міопічну СММ), неоваскуляризації рогівки, хвороби, пов'язаної з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризацією сітківки, хвороби, пов'язаної з ретинальною/хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічної короткозорістю, хвороби фон Гіппеля-Ліндау, гістоплазмозу ока, сімейної ексудативної вітреоретинопатії (ЕЕМЕ), хвороби Коутса, хвороби Норрі, синдрому остеопорозу-псевдогліоми (ОРРС), субкон'юнктивального крововиливу, рубеозу, неоваскулярного захворювання очей, неоваскулярної глаукоми, пігментної дистрофії сітківки (КР), гіпертонічної ретинопатії, ретинальної ангіоматозної проліферації, макулярної телеангіектазії, неоваскуляризації райдужки, внутрішньоочної неоваскуляризації, дегенерації сітківки, кістозного макулярного набряку (СМЕ), васкуліту, набряку диска зорового нерва, ретиніту, кон'юнктивіту (включаючи інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційні (наприклад, алергічний) кон'юнктивіти), вродженого амарозу Лебера, увеїту (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдиту, очного гістоплазмозу, блефариту, сухості очей, травматичного пошкодження очей і хвороби Шегрена.
45. Застосування за п. 44, яке відрізняється тим, що окулярний розлад являє собою АМО, ОМЕ, ОК або ЕМО.
46. Застосування за п. 44 або 45, яке відрізняється тим, що окулярний розлад являє собою
АМО.
47. Застосування за будь-яким з пп. 44-46, яке відрізняється тим, що АМО являє собою вологу Коо) АМО.
48. Застосування за п. 42, яке відрізняється тим, що розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою клітинний проліферативний розлад.
49. Застосування за п. 48, яке відрізняється тим, що клітинний проліферативний розлад являє собою рак.
50. Застосування за п. 49, яке відрізняється тим, що рак вибирають з групи, що складається з раку молочної залози, раку товстої кишки, недрібноклітинного раку легені, неходжкінської лімфоми (НХЛ), раку нирки, раку передміхурової залози, раку печінки, раку голови і шиї, меланоми, раку яєчників, мезотеліоми і множинної мієломи.
51. Застосування антитіла за будь-яким із пп. 1-32 для лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом.
52. Застосування за п. 51, яке відрізняється тим, що розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад або клітинний проліферативний розлад.
53. Застосування за п. 52, яке відрізняється тим, що розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад.
54. Застосування за п. 53, яке відрізняється тим, що окулярний розлад вибирають з групи, що складається з АМО, макулярної дегенерації, набряку макули, ОМЕ (включаючи фокальний, нецентральний ОМЕ і дифузний, пов'язаний з центром ОМЕ), ретинопатії, ОК (включаючи РОК, МРОК і висотну ОК), інших пов'язаних з ішемією ретинопатій, КОР, КМО (включаючи СЕМО і ВМО форми), СММ (включаючи міопічну СММ), неоваскуляризації рогівки, хвороби, пов'язаної з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризації сітківки, хвороби, пов'язаної з ретинальною/хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічної короткозорості, хвороби фон Гіппеля-Ліндау, гістоплазмозу очей, ЕЕМЕ, хвороби Коутса, хвороби Норрі, ОРРО, субкон'юнктивального крововиливу, рубеозу, неоваскулярного захворювання очей, неоваскулярної глаукоми, КР, гіпертонічної ретинопатії, ретинальної ангіоматозної проліферації, макулярної телеангієктазії, неоваскуляризації райдужки, внутрішньоочної неоваскуляризації, дегенерації сітківки, СМЕ, васкуліту, набряку диска зорового нерва, ретиніту, кон'юнктивіту (включаючи інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційний (наприклад, алергічний) кон'юнктивіти), вродженого амарозу Лебера, увеїту (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдиту, очного гістоплазмозу, блефариту, сухості очей, травматичного пошкодження 60 очей і хвороби Шегрена.
55. Застосування за п. 54, яке відрізняється тим, що окулярний розлад являє собою АМО, ОМЕ, ОК або ЕМО.
56. Застосування за п. 54 або 55, яке відрізняється тим, що окулярний розлад являє собою
АМО.
57. Застосування за будь-яким з пп. 54-56, яке відрізняється тим, що АМО являє собою вологу
АМО.
58. Застосування за п. 52, яке відрізняється тим, що розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою клітинний проліферативний розлад.
59. Застосування за п. 58, яке відрізняється тим, що клітинний проліферативний розлад являє собою рак.
60. Застосування за п. 59, яке відрізняється тим, що рак вибирають з групи, що складається з раку молочної залози, раку товстої кишки, недрібноклітинного раку легені, неходжкінської лімфоми (НХЛ), раку нирки, раку передміхурової залози, раку печінки, раку голови і шиї, меланоми, раку яєчників, мезотеліоми і множинної мієломи.
61. Застосування за будь-яким з пп. 41-60, яке відрізняється тим, що антитіло призначене для введення з другим агентом, причому другий агент вибраний з групи, що складається з другого антитіла, хіміотерапевтичного агента, цитотоксичного агента, антиангіогенного агента, імунодепресивного агента, проліків, цитокіну, антагоніста цитокінів, цитотоксичної променевої терапії, кортикостероїда, протиблювотного, протиракової вакцини, анальгетика, агента, який інгібує ріст, і сполуки, яка зв'язується з другою біологічною молекулою.
62. Застосування за п. 61, яке відрізняється тим, що антиангіогенний агент являє собою антагоніст МЕСЕ.
63. Застосування за п. 62, яке відрізняється тим, що антагоніст МЕСЕ являє собою анти-МЕСЕ антитіло, антитіло проти рецептора МЕСЕ, розчинний злитий білок рецептора МЕСЕ, аптамер, анти-МЕСЕ ВАКРІПФ або інгібітор тирозинкінази МЕСЕВ.
64. Застосування за п. 63, яке відрізняється тим, що анти-МЕСЕ антитіло являє собою ранібізумаб ((ОСЕМТІБФ), ЕТН-258 або біспецифічне анти-МЕСЕ антитіло.
65. Застосування за п. 64, яке відрізняється тим, що біспецифічне анти-МЕСЕ антитіло являє собою анти-МЕСРЕ/анти-Апда2 антитіло. Зо 66. Застосування за п. 65, яке відрізняється тим, що анти-МЕСРБ/анти-Апд2 антитіло являє собою КО-7716.
67. Застосування за п. 63, яке відрізняється тим, що розчинний злитий білок рецептора МЕСЕ являє собою афліберцепт (ЕМ ЕАФ)).
68. Застосування за п. 63, яке відрізняється тим, що аптамер являє собою пегаптаніб (МАСОСЕМФ).
69. Застосування за п. 63, яке відрізняється тим, що анти-МЕСЕ ОАБРіпФ являє собою абіципар пегол.
70. Застосування за п. 63, яке відрізняється тим, що інгібітор тирозинкінази МЕСЕК вибирають з групи, що складається з 4-(4-бром-2-фтораніліно)-б-метокси-7-(1-метилпіперідин-4- ілметокси)хіназоліну (206474), 4-(4-фтор-2-метиліндол-5-ілокси)-б-метокси-7-(З-піролідин-1- ілпропоксі) хіназоліну (А2О2171), ваталанібу (РТК787), семаксамібіну (505416) і БОТЕМТФО (сунітиніб).
71. Застосування за п. 61, яке відрізняється тим, що друга біологічна молекула вибрана з групи, яка складається з ІЇ/-18; 11 -6; / -6А; 11-13; І1/-13К; РОСБЕ; ангіопоетину; ангіопоетину 2; Тіе2; 51Р; інтегринів ам83, амр5 і «5ДрВ1; бетацелюліну; апеліну/АРУ); еритропоетину; фактора комплементу 0; ТМЕа; НІігА1; рецептора МЕСЕ; рецептора 51-2 і білка, генетично пов'язаного з ризиком АМО.
72. Застосування за п. 71, яке відрізняється тим, що рецептор МЕСЕ являє собою МЕСЕНМКІ, МЕСЕМК2, МЕСЕКЗ, тЬУЕСЕК або 5МЕСЕК.
73. Застосування за п. 71, яке відрізняється тим, що білок, генетично зв'язаний з ризиком АМО, вибраний з групи, що складається з компонентів шляху комплементу С2, фактора В, фактора Н, СЕНВАЗ, СЗБ, С5, Сба і СЗа; НТКА1; АКМ52; ТІМРЗ; НГ А; ІІ -8; СХЗСВ1; ТІ ВЗ; ТІ 84; СЕТР; ПРС, СОЇ 10А1 ії ТМЕКЗЕТОА.
174. Застосування за будь-яким з пп. 61 і 71-73, яке відрізняється тим, що сполука, яка зв'язує другу біологічну молекулу, являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент.
75. Застосування за п. 74, яке відрізняється тим, що фрагмент антигензв'язуючого антитіла вибраний з групи, що складається з Раб, РГар-С, Рар'-зЗН, Ем, зем і (Габ)2-фрагментів. 1716. Застосування за будь-яким з пп. 41-75, яке відрізняється тим, що антитіло призначене для введення інтравітреально, окулярно, внутрішньоочно, навколосклерально, субтенонально, бо суперхороїдально, місцево, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньошкірно,
черезшкірно, внутрішньоартеріально, внутрішньочеревно, внутрішньоочагово, інтракраніально, внутрішньосуглобово, внутрішньопростатично, внутрішньоплеврально, інтратрахеально, інтратекально, інтраназально, інтравагінально, інтраректально, місцево, внутрішньопухлинно, внутрішньоочеревно, перитонеально, інтравентрикулярно, підшкірно, субкон'юктивно, інтравезикулярно, крізь слизову, інтраперикардіально, внутрішньопуповинно, інтраорбітально, перорально, трансдермально, шляхом інгаляції, шляхом ін'єкції очними краплями, шляхом імплантації, шляхом інфузії шляхом безперервної інфузії, локалізованими перфузійним ваннами, які діють на клітини безпосередньо, катетером, промиванням, кремами або ліпідними композиціями.
77. Застосування за п. 76, яке відрізняється тим, що антитіло призначене для введення інтравітреально, окулярно, інтраокулярно, навколосклерально, субтенонально, суперхороїдально або місцево.
78. Застосування за п. 77, яке відрізняється тим, що антитіло призначене для введення інтравітреально шляхом ін'єкції.
79. Застосування за п. 77, яке відрізняється тим, що антитіло призначене для введення місцево за допомогою очних крапель або мазі.
80. Застосування за п. 76 або 77, яке відрізняється тим, що антитіло призначене для введення пристроєм доставки - портом.
81. Застосування за будь-яким з пп. 51-80, яке відрізняється тим, що суб'єкт являє собою людину.
82. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за будь-яким з пп. 1-32.
83. Фармацевтична композиція за п. 82, яка додатково містить полімер.
84. Фармацевтична композиція за п. 83, яка відрізняється тим, що полімер являє собою біорозкладаний полімер.
85. Фармацевтична композиція за п. 83, яка відрізняється тим, що фармацевтична композиція складена у вигляді депо полімерного розчинника, полімерного імплантату або полімерної міцели.
86. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 83-85, яка відрізняється тим, що полімер являє собою співполімер полігліколевої кислоти (РІ СА) полімолочної кислоти. Зо 87. Фармацевтична композиція за п. 86, яка відрізняється тим, що фармацевтична композиція складена у вигляді стрижня РІ БА.
88. Застосування фармацевтичної композиції за будь-яким з пп. 82-87 для лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом, або розладу, пов'язаного з небажаною проникністю судин у ссавця.
89. Застосування за п. 88, яке відрізняється тим, що розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад або клітинний проліферативний розлад.
90. Застосування за п. 89, яке відрізняється тим, що розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад.
91. Застосування за п. 90, яке відрізняється тим, що окулярний розлад вибирають з групи, що складається з АМО, макулярної дегенерації, набряку макули, ОМЕ (включаючи фокальний, нецентральний ОМЕ і дифузний, пов'язаний з центром ОМЕ), ретинопатії, ОК (включаючи РОК, МРОК і висотну ОК), інших пов'язаних з ішемією ретинопатій, КОР, КМО (включаючи СЕМО і ВМО форми), СММ (включаючи міопічну СММ), неоваскуляризації рогівки, хвороби, пов'язаної з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризації сітківки, хвороби, пов'язаної з ретинальною/хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічної короткозорості, хвороби фон Гіппеля-Ліндау, гістоплазмозу очей, ЕЕМЕ, хвороби Коутса, хвороби Норрі, ОРРО, субкон'юнктивального крововиливу, рубеозу, неоваскулярного захворювання очей, неоваскулярної глаукоми, КР, гіпертонічної ретинопатії, ретинальної ангіоматозної проліферації, макулярної телеангіектазії, неоваскуляризації райдужки, внутрішньоочної неоваскуляризації, дегенерації сітківки, СМЕ, васкуліту, набряку диска зорового нерва, ретиніту, кон'юнктивіту (включаючи інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційний (наприклад, алергічний) кон'юнктивіти), вродженого амарозу Лебера, увеїту (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдиту, очного гістоплазмозу, блефариту, сухості очей, травматичного пошкодження очей і хвороби Шегрена.
92. Застосування за п. 91, яке відрізняється тим, що окулярний розлад являє собою АМО, ОМЕ, ОК або ЕМО.
93. Застосування за п. 91 або 92, яке відрізняється тим, що окулярний розлад являє собою
АМО.
94. Застосування за будь-яким з пп. 91-93, яке відрізняється тим, що АМО являє собою вологу (510) АМО.
95. Застосування за п. 89, яке відрізняється тим, що розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою клітинний проліферативний розлад.
96. Застосування за п. 95, яке відрізняється тим, що клітинний проліферативний розлад являє собою рак.
97. Застосування за п. 96, яке відрізняється тим, що рак вибирають з групи, що складається з раку молочної залози, раку товстої кишки, недрібноклітинного раку легені, неходжкінської лімфоми (НХЛ), раку нирки, раку передміхурової залози, раку печінки, раку голови і шиї, меланоми, раку яєчників, мезотеліоми і множинної мієломи.
98. Застосування за п. 88, яке відрізняється тим, що розлад, пов'язаний з небажаною проникністю судин, вибирається з групи, що складається з набряку, пов'язаного з пухлинами головного мозку, асциту, асоційованого із злоякісними новоутвореннями, синдрому Мейгена, запалення легенів, нефротичного синдрому, перикардіального випоту, плеврального випоту і проникності, пов'язаної з серцево-судинними захворюваннями.
99. Застосування за будь-яким з пп. 88-98, яке відрізняється тим, що фармацевтична композиція містить другий агент, який відрізняється тим, що другий агент вибраний з групи, що складається з другого антитіла, хіміотерапевтичного агента, цитотоксичного агента, антиангіогенного агента, імунодепресивного агента, проліків, цитокіну, антагоніста цитокінів, цитотоксичної променевої терапії, кортикостероїда, протиблювотного, протиракової вакцини, анальгетика, агента, який інгібує ріст, і сполуки, яка зв'язується з другою біологічною молекулою.
100. Застосування за п. 99, яке відрізняється тим, що антиангіогенний агент являє собою антагоніст МЕСЕ.
101. Застосування за п. 100, яке відрізняється тим, що антагоніст МЕСЕ являє собою анти- МЕСЕ антитіло, антитіло проти рецептора МЕСЕ, розчинний злитий білок рецептора МЕСБЕ, аптамер, анти-МЕСЕ рАКРІпПФ або інгібітор тирозинкінази МЕСЕК.
102. Застосування за п. 101, яке відрізняється тим, що анти-МЕСЕ антитіло являє собою ранібізумаб ((ОСЕМТІБФ), ЕТН-258 або біспецифічне анти-МЕСЕ антитіло.
103. Застосування за п. 102, яке відрізняється тим, що біспецифічне анти-МЕСЕ антитіло являє собою анти-МЕСЕ/анти-Апда2 антитіло. Зо 104. Застосування за п. 103, яке відрізняється тим, що анти-МЕСГЕ/анти-Апд2 антитіло являє собою КО-7716.
105. Застосування за п. 101, яке відрізняється тим, що розчинний злитий білок рецептора МЕСЕ являє собою афліберцепт (ЕМІ ЕАФ)).
106. Застосування за п. 101, яке відрізняється тим, що аптамери являє собою пегаптаніб (МАСОСЕМФ).
107. Застосування за п. 101, яке відрізняється тим, що анти-МЕСЕ ОАКРІіпФ являє собою абіципар пегол.
108. Застосування за п. 101, яке відрізняється тим, що інгібітор тирозинкінази МЕСЕК вибирають з групи, що складається з 4-(4-бром-2-фтораніліно)-6-метокси-7-(1-метилпіперідин-4- ілметокси)хіназоліну (206474), 4-(4-фтор-2-метиліндол-5-ілокси)-б-метокси-7-(З-піролідин-1- ілпропокси)хіназоліну (А2О2171), ваталанібу (РТК787), семаксамібіну (505416) і 6ОТЕМТФ (сунітиніб).
109. Застосування за п. 99, яке відрізняється тим, що друга біологічна молекула вибрана з групи, яка складається з ІЇ/-18; 11 -6; / -6А; 11-13; І1/-13К; РОСБЕ; ангіопоетину; ангіопоетину 2; Тіе2; 51Р; інтегринів ам83, ам8В5 і «5ДрВ1; бетацелюліну; апеліну/АРУ); еритропоетину; фактора комплементу 0; ТМЕа; НІігА1; рецептора МЕСЕ; рецептора 51-2 і білка, генетично пов'язаного з ризиком АМО.
110. Застосування за п. 109, яке відрізняється тим, що рецептор МЕСЕ являє собою МЕСЕМКІ, МЕСЕМК2, МЕСЕКЗ, тЬУЕСЕК або 5МЕСЕК.
111. Застосування за п. 109, яке відрізняється тим, що білок, генетично зв'язаний з ризиком АМО, вибраний з групи, що складається з компонентів шляху комплементу С2, фактора В, фактора Н, СЕНЕЗ, СЗБ, С5, С5а і СЗа; НТКАТ1; АКМ52; ТІМРЗ; НІ А; ІІ -8; СХЗСВІ1; ТІ ВЗ; ТІ ВУ; СЕТР; ПІРС, СОЇ 10А1 ії ТМЕКЗЕТОА.
112. Застосування за будь-яким з пп. 99 і 109-111, яке відрізняється тим, що сполука, яка зв'язує другу біологічну молекулу, являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент.
113. Застосування за п. 112, яке відрізняється тим, що фрагмент антигензв'язуючого антитіла вибраний з групи, що складається з Раб, РГар-С, Рар'-зЗН, Ем, зем і (Габ)2-фрагментів.
114. Кон'югат антитіла, що містить (ї) антитіло за будь-яким з пп. 1-32 і (ії) гідрофільний полімер, ковалентно приєднаний до антитіла.
115. Кон'югат антитіла за п. 114, який відрізняється тим, що гідрофільний полімер являє собою полімер гіалуронової кислоти (НА) або полімер поліеєтиленгліколю (ПЕГ).
116. Кон'югат антитіла за п. 115, який відрізняється тим, що гідрофільний полімер являє собою НА-полімер.
117. Кон'югат антитіла за п. 116, який відрізняється тим, що полімер НА має молекулярну масу близько 1 мільйона дальтон (МдДа) або нижче.
118. Кон'югат антитіла за п. 117, який відрізняється тим, що полімер НА має молекулярну масу між близько 25 кДа і близько 500 кДа.
119. Кон'югат антитіла за п. 118, який відрізняється тим, що полімер НА має молекулярну масу між близько 100 кДа і близько 250 кДа.
120. Кон'югат антитіла за п. 119, який відрізняється тим, що полімер НА має молекулярну масу близько 200 кДа.
121. Кон'югат антитіла за будь-яким з пп. 114-120, який відрізняється тим, що полімер НА не є зшитим.
122. Кон'югат антитіла за будь-яким з пп. 114-121, який відрізняється тим, що антитіло являє собою фрагмент антитіла, який зв'язує МЕСЕ.
123. Кон'югат антитіла за п. 122, який відрізняється тим, що фрагмент антитіла вибрано з групи, що складається з Раб, Бар-С, Бар", Рар'-5Н, Ем, 5сЕм і (Раб)2-фрагментів.
124. Кон'югат антитіла за п. 123, який відрізняється тим, що фрагмент антитіла являє собою Еаб, Рар-С або Раб".
125. Кон'югат антитіла за будь-яким з пп. 114-124 який відрізняється тим, що кон'югат антитіла має гідродинамічний радіус між близько 10 нм і близько 60 нм.
126. Кон'югат антитіла за п. 125, який відрізняється тим, що кон'югат антитіла має гідродинамічний радіус між близько 25 нм і близько 35 нм.
127. Кон'югат антитіла за п. 126, який відрізняється тим, що гідродинамічний радіус становить близько 28 нм.
128. Кон'югат антитіла за будь-яким з пп. 114-127, який відрізняється тим, що кон'югат антитіла має окулярний період напіввиведення, який збільшено щодо еталонного антитіла, яке не ковалентно приєднано до гідрофільного полімера.
129. Кон'югат антитіла за п. 128, який відрізняється тим, що окулярний період напіввиведення збільшений щонайменше близько в 2 рази відносно еталонного антитіла.
130. Кон'югат антитіла за п. 129, який відрізняється тим, що окулярний період напіввиведення збільшений щонайменше близько в 4 рази відносно еталонного антитіла.
131. Кон'югат антитіла за будь-яким з пп. 128-130, який відрізняється тим, що окулярний період напіввиведення являє собою вітреальний період напіввиведення.
132. Кон'югат антитіла за будь-яким з пп. 128-131, який відрізняється тим, що еталонне антитіло ідентичне антитілу кон'югата антитіла.
133. Кон'югат антитіла за п. 114, який відрізняється тим, що антитіло ковалентно приєднано до полімеру за допомогою оборотного пролікарського лінкера.
134. Кон'югат антитіла за п. 133, який відрізняється тим, що полімер являє собою гідрогель.
135. Кон'югат антитіла за п. 134, який відрізняється тим, що гідрогель являє собою гідрогель на основі ПЕГ.
136. Кон'югат антитіла за п. 134 або 135, який відрізняється тим, що гідрогель має форму мікрочастинки сфери.
137. Злитий білок, що містить антитіло за будь-яким з пп. 1-32, ковалентно приєднаний до НА- зв'язуючого домену.
138. Злитий білок за п. 137, який відрізняється тим, що НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла.
139. Злитий білок за п. 138, який відрізняється тим, що НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до С-кінця важкого ланцюга або С-кінця легкого ланцюга.
140. Злитий білок за п. 139, який відрізняється тим, що НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до С-кінця важкого ланцюга.
141. Злитий білок за п. 139, який відрізняється тим, що НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до С-кінця легкого ланцюга.
142. Злитий білок за будь-яким з пп. 137-141, який додатково містить лінкер, при цьому лінкер розташований між антитілом і НА-зв'язуючим доменом.
143. Злитий білок за п. 142, який відрізняється тим, що лінкер містить амінокислотну послідовність (0005 (5ЕО ІЮО МО: 61).
144. Злитий білок за п. 143, який відрізняється тим, що лінкер складається з амінокислотної 60 послідовності (3005035 (5ЕО ІЮ МО: 61).
145. Злитий білок за будь-яким з пп. 137-144, який відрізняється тим, що антитіло являє собою фрагмент антитіла, який зв'язує МЕСЕ.
146. Злитий білок за п. 145, який відрізняється тим, що фрагмент антитіла вибрано з групи, що складається з Раб, Бар-С, Рар", Рар'-5Н, Ем, 5сЕм і (Габ)2-фрагментів.
147. Злитий білок за п. 146, який відрізняється тим, що фрагмент антитіла являє собою Еар.
148. Злитий білок за п. 147, який відрізняється тим, що НА-зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до С-кінця СНІ домену Раб.
149. Злитий білок за п. 147, який відрізняється тим, що НА-зв'язуючий білок ковалентно приєднаний до С-кінця СІ. домену Раб.
150. Злитий білок за будь-яким з пп. 137-149, який відрізняється тим, що НА-зв'язуючий домен вибрано з групи, що складається з модуля зв'язку, домену С11 і багатого на лізин олігопептиду.
151. Злитий білок за п. 150, який відрізняється тим, що НА-зв'язуючий домен є модулем зв'язку.
152. Злитий білок за п. 151, який відрізняється тим, що модуль зв'язку вибирають з групи, що складається з гена б, стимульованого фактором некрозу пухлини (1506), СО44, рецептора гіалуронової кислоти ендотелію лімфатичних судин 1 (ІММЕ-1), білка, який зв'язує гіалуронову кислоту і протеоглікан (НАРІ-М) 1, НАРІ.М2, НАРІ-М3, НАРІ М4, агрекану, бревікану, нейрокану, фосфакану, версикану, САВб61358, КІАО527, модулів зв'язку стабілін-1 і стабілін-2.
153. Злитий білок за п. 152, який відрізняється тим, що модуль зв'язку являє собою модуль зв'язку Т506.
154. Злитий білок за п. 153, який відрізняється тим, що модуль зв'язку Т506 являє собою модуль зв'язку Т506 людини або модуль зв'язку Т506 кролика.
155. Злитий білок за п. 154, який відрізняється тим, що модуль зв'язку Т5О являє собою модуль зв'язку Т5О6б людини.
156. Злитий білок за п. 155, який відрізняється тим, що модуль зв'язку Т506 людини містить амінокислотні залишки 36-128 1506 людини.
157. Злитий білок за будь-яким з пп. 137-156, додатково містить щонайменше один додатковий НА-зв'язуючий домен.
158. Злитий білок за п. 157, який відрізняється тим, що щонайменше один додатковий НА- Зо зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до важкого ланцюга або легкого ланцюга антитіла.
159. Злитий білок за п. 157 або 158, яка відрізняється тим, що щонайменше один додатковий НА-зв'язуючий білок пов'язаний з антитілом за допомогою лінкера.
160. Злитий білок за п. 159, який відрізняється тим, що лінкер містить амінокислотну послідовність (0005 (5ЕО ІЮО МО: 61).
161. Злитий білок за п. 160, який відрізняється тим, що лінкер складається з амінокислотної послідовності (3005035 (5ЕО ІЮ МО: 61).
162. Злитий білок за будь-яким з пп. 157-161, який відрізняється тим, що перший НА- зв'язуючий домен ковалентно приєднаний до важкого ланцюга, а другий зв'язує НА домен ковалентно приєднаний до легкого ланцюга.
163. Злитий білок за п. 162, який відрізняється тим, що перший НА-зв'язуючий домен з'єднаний з С-кінцем важкого ланцюга, а другий НА-зв'язуючий домен з'єднаний з С-кінцем легкого ланцюга.
164. Злитий білок за будь-яким з пп. 157-163, який відрізняється тим, що щонайменше один додатковий НА-зв'язуючий білок вибирають з групи, що складається з модуля зв'язку, домену СІ і багатого на лізин олігопептиду.
165. Злитий білок за п. 164, який відрізняється тим, що щонайменше один додатковий НА- зв'язуючий білок є модулем зв'язку.
166. Злитий білок за п. 165, який відрізняється тим, що модуль зв'язку являє собою модуль зв'язку Т556.
167. Злитий білок за п. 166, який відрізняється тим, що модуль зв'язку Т506 являє собою модуль зв'язку Т506 людини або модуль зв'язку Т506 кролика.
168. Злитий білок за п. 167, який відрізняється тим, що модуль зв'язку Т506 являє собою модуль зв'язку Т5О6б людини.
169. Злитий білок за п. 167 або п. 168, який відрізняється тим, що модуль зв'язку Т5О6б людини містить амінокислотні залишки 36-128 506 людини.
170. Злитий білок за будь-яким з пп. 137-169, який відрізняється тим, що злитий білок специфічно зв'язується з МЕСЕ і НА.
171. Злитий білок за п. 170, який відрізняється тим, що злитий білок зв'язує НА з Ка близько 2 МКМ або нижче.
172. Злитий білок за п. 171, який відрізняється тим, що злитий білок зв'язує НА з Ка між близько 1 нМ і близько 500 нМ.
173. Злитий білок за п. 172, який відрізняється тим, що злитий білок зв'язує НА з Ка між близько 1 нМ і близько 50 НМ.
174. Злитий білок за п. 173, який відрізняється тим, що злитий білок зв'язує НА з Ка близько 10
НМ.
175. Злитий білок за будь-яким з пп. 137-174, який відрізняється тим, що злитий білок має окулярний період напіввиведення, який збільшений в порівнянні з еталонним антитілом, яке ковалентно приєднано до НА-зв'язуючого домену.
176. Злитий білок за п. 175, який відрізняється тим, що період окулярного напіввиведення збільшений щонайменше близько в 2 рази відносно еталонного антитіла.
177. Злитий білок за п. 176, який відрізняється тим, що період окулярного напіввиведення збільшений щонайменше близько в 4 рази відносно еталонного антитіла.
178. Злитий білок за будь-яким з пп. 175-177, який відрізняється тим, що окулярний період напіввиведення являє собою вітреальний період напіввиведення.
179. Злитий білок за будь-яким з пп. 175-178, який відрізняється тим, що еталонне антитіло ідентичне антитілу злитого білка.
180. Застосування кон'югату антитіла за будь-яким із пп. 114-136 для зменшення або інгібування ангіогенезу у суб'єкта, що має розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом.
181. Застосування кон'югату антитіла за будь-яким із пп. 114-136 для лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом.
182. Застосування за п. 180 або 181, яке відрізняється тим, що розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад.
183. Застосування за п. 182, яке відрізняється тим, що окулярний розлад вибирають з групи, що складається з АМО, макулярної дегенерації, набряку макули, ОМЕ (включаючи фокальний, нецентральний ОМЕ і дифузний, пов'язаний з центром ОМЕ), ретинопатії, ОК (включаючи РОК, МРОК і висотну ОК), інших пов'язаних з ішемією ретинопатій, КОР, КМО (включаючи СЕМО і ВМО форми), СММ (включаючи міопічну СММ), неоваскуляризації рогівки, хвороби, пов'язаної з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризації сітківки, хвороби, пов'язаної з Зо ретинальною/хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічної короткозорості, хвороби фон Гіппеля-Ліндау, сгістоплазмозу очей, ЕЕМЕ, хвороби Коутса, хвороби Норрі, ОРРО, субкон'юнктивального крововиливу, рубеозу, неоваскулярного захворювання очей, неоваскулярної глаукоми, КР, гіпертонічної ретинопатії, ретинальної ангіоматозної проліферації, макулярної телеангіектазії, неоваскуляризації райдужки, внутрішньоочної неоваскуляризації, дегенерації сітківки, СМЕ, васкуліту, набряку диска зорового нерва, ретиніту, кон'юнктивіту (включаючи інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційний (наприклад, алергічний) кон'юнктивіти), вродженого амарозу Лебера, увеїту (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдиту, очного гістоплазмозу, блефариту, сухості очей, травматичного пошкодження очей і хвороби Шегрена.
184. Застосування за п. 183, яке відрізняється тим, що окулярний розлад являє собою АМО, ОМЕ, ОК або ЕМО.
185. Застосування за п. 184, яке відрізняється тим, що окулярний розлад являє собою АМО.
186. Застосування за будь-яким з пп. 183-185, яке відрізняється тим, що АМО являє собою вологу АМО.
187. Застосування за будь-яким з пп. 180-186, яке відрізняється тим, що кон'югат антитіла призначений для введення з другим агентом, причому другий агент вибрано з групи, що складається з іншого антитіла, антиангіогенного агента, цитокіну, антагоніста цитокінів, кортикостероїда, анальгетика і з'єднання, яке зв'язується з другою біологічною молекулою.
188. Застосування за п. 187, яке відрізняється тим, що антиангіогенний агент являє собою антагоніст МЕСЕ.
189. Застосування за п. 188, яке відрізняється тим, що антагоніст МЕСЕ являє собою анти- МЕСЕ антитіло, антитіло проти рецептора МЕСЕ, розчинний злитий білок рецептора МЕСБЕ, аптамер, анти-МЕСЕ рАЕРІпПФ або інгібітор тирозинкінази МЕСЕК.
190. Застосування за п. 189, яке відрізняється тим, що анти-МЕСЕ антитіло являє собою ранібізумаб (ОСЕМТІ5Ф), ЕТН-258 або біспецифічне анти-УЕСЕ антитіло.
191. Застосування за п. 190, яке відрізняється тим, що біспецифічне анти-МЕСЕ антитіло являє собою анти-МЕСЕ/анти-Апда2 антитіло.
192. Застосування за п. 191, яке відрізняється тим, що анти-МЕСЕ/анти-Апд2 антитіло являє собою КО-7716.
193. Застосування за п. 189, яке відрізняється тим, що розчинний злитий білок рецептора МЕСЕ являє собою афліберцепт (ЕМІ ЕАФ)).
194. Застосування за п. 189, яке відрізняється тим, що аптамер являє собою пегаптаніб (МАСОСЕМФ).
195. Застосування за п. 189, яке відрізняється тим, що анти-МЕСЕ ОАКРІіпФ являє собою абіципар пегол.
196. Застосування за п. 189, яке відрізняється тим, що інгібітор тирозинкінази МЕСЕК вибирають з групи, що складається з 4-(4-бром-2-фтораніліно)-6-метокси-7-(1-метилпіперідин-4- ілметокси)хіназоліну (206474), 4-(4-фтор-2-метиліндол-5-ілокси)-б-метокси-7-(З-піролідин-1- ілпропоксі) хіназоліну (А2О02171), ваталанібу (РТК787), семаксамібіну (505416) і БОТЕМТФ (сунітиніб).
197. Застосування за п. 187, яке відрізняється тим, що друга біологічна молекула вибрана з групи, яка складається з ІЇ/-18; 11 -6; / -6А; 11-13; І1/-13К; РОСБЕ; ангіопоетину; ангіопоетину 2; Тівє2; 51Р; інтегринів амВ3, амрВ5 і «5Д81; бетацелюліну; апеліну/АРУ); еритропоетину; фактора комплементу ОЮ; ТМЕа; НІГА1; рецептора МЕСЕ; рецептора 51-2 і білка, генетично пов'язаного з ризиком АМО.
198. Застосування за п. 197, яке відрізняється тим, що рецептор МЕСЕ являє собою МЕСЕМКІ, МЕСЕМК2, МЕСЕКЗ, тЬУЕСЕК або 5МЕСЕК.
199. Застосування за п. 197, яке відрізняється тим, що білок, генетично зв'язаний з ризиком АМО, вибраний з групи, що складається з компонентів шляху комплементу С2, фактора В, фактора Н, СЕНЕЗ, СЗБ, С5, С5а і СЗа; НТКАТ1; АКМ52; ТІМРЗ; НІ А; ІІ -8; СХЗСВІ1; ТІ ВЗ; ТІ Ва; СЕТР; ПІРС, СОЇ 10А1 ії ТМЕКЗЕТОА.
200. Застосування за будь-яким з пп. 187 і 197-199, яке відрізняється тим, що сполука, яка зв'язує другу біологічну молекулу, являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент.
201. Застосування за п. 200, яке відрізняється тим, що фрагмент антигензв'язуючого антитіла вибраний з групи, що складається з Раб, РГар-С, Рар'-зЗН, Ем, зем і (Габ)2-фрагментів.
202. Застосування за будь-яким з пп. 180-201, яке відрізняється тим, що кон'югат антитіла призначений для введення інтравітреально, окулярно, внутрішньоочно, навколосклерально, субтенонально, суперхороїдально, місцево, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, Зо внутрішньошкірно, черезшкірно, внутрішньоартеріально, внутрішньоочеревно, внутрішньовогнищево, інтракраніально, внутрішньосуглобово, внутрішньопростатично, внутрішньоплеврально, інтратрахеально, інтратекально, інтраназально, інтравагінально, інтраректально, місцево, внутрішньопухлинно, внутрішньоочеревно, перитонеально, інтравентрикулярно, підшкірно, субкон'юктивно, інтравезикулярно, крізь слизову, інтраперикардіально, внутрішньопуповинно, інтраорбітально, перорально, трансдермально, шляхом інгаляції, шляхом ін'єкції, очними краплями, шляхом імплантації, шляхом інфузії, шляхом безперервної інфузії, локалізованими перфузійним ваннами, які діють на клітини безпосередньо, катетером, промиванням, кремами або ліпідними композиціями.
203. Застосування за п. 202, яке відрізняється тим, що кон'югат антитіла призначений для введення інтравітреально, окулярно, інтраокулярно, навколосклерально, субтенонально, суперхороїдально або місцево.
204. Застосування за п. 203, яке відрізняється тим, що кон'югат антитіла призначений для введення інтравітреально шляхом ін'єкції.
205. Застосування за п. 203, яке відрізняється тим, що кон'югат антитіла призначений для введення місцево за допомогою очних крапель або мазі.
206. Застосування за п. 202 або 203, яке відрізняється тим, що кон'югат антитіла призначений для введення пристроєм доставки - портом.
207. Фармацевтична композиція, яка містить кон'югат антитіла за будь-яким з пп. 114-136.
208. Застосування фармацевтичної композиції за п. 207 для лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом у ссавця.
209. Застосування за п. 208, яке відрізняється тим, що розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад.
210. Застосування за п. 209, яке відрізняється тим, що окулярний розлад вибирають з групи, що складається з АМО, макулярної дегенерації, набряку макули, ОМЕ (включаючи фокальний, нецентральний ОМЕ і дифузний, пов'язаний з центром ЮОМЕ), ретинопатії, ОК (включаючи РОК, МРОК і висотну ОК), інших пов'язаних з ішемією ретинопатій, КОР, КМО (включаючи СЕМО і ВМО форми), СММ (включаючи міопічну СММ), неоваскуляризації рогівки, хвороби, пов'язаної з неоваскуляризацією рогівки, неоваскуляризації сітківки, хвороби, пов'язаної з ретинальною/хоріоїдальною неоваскуляризацією, патологічної короткозорості, хвороби фон 60 Гіппеля-Ліндау, гістоплазмозу очей, ЕЕМЕ, хвороби Коутса, хвороби Норрі, ОРРО,
субкон'юнктивального крововиливу, рубеозу, неоваскулярного захворювання очей, неоваскулярної глаукоми, КР, гіпертонічної ретинопатії, ретинальної ангіоматозної проліферації, макулярної телеангіектазії, неоваскуляризації райдужки, внутрішньоочної неоваскуляризації, дегенерації сітківки, СМЕ, васкуліту, набряку диска зорового нерва, ретиніту, кон'юнктивіту (включаючи інфекційний кон'юнктивіт і неінфекційний (наприклад, алергічний) кон'юнктивіти), вродженого амарозу Лебера, увеїту (включаючи інфекційний і неінфекційний увеїт), хоріоїдиту, очного гістоплазмозу, блефариту, сухості очей, травматичного пошкодження очей і хвороби Шегрена.
211. Застосування за п. 210, яке відрізняється тим, що окулярний розлад являє собою АМО, ОМЕ, ОК або ЕМО.
212. Застосування за п. 210 або 211, яке відрізняється тим, що окулярний розлад являє собою
АМО.
213. Застосування за будь-яким з пп. 210-212, яке відрізняється тим, що АМО являє собою вологу АМО.
214. Застосування за будь-яким з пп. 207-213, яке відрізняється тим, що фармацевтична композиція додатково містить другий агент, причому другий агент вибрано з групи, що складається з іншого антитіла, антиангіогенного агента, цитокіну, антагоніста цитокінів, кортикостероїда, анальгетика і сполуки, яка зв'язується з другою біологічною молекулою.
215. Застосування за п. 214, яке відрізняється тим, що антиангіогенний агент являє собою антагоніст МЕСЕ.
216. Застосування за п. 215, яке відрізняється тим, що антагоніст МЕСЕ являє собою анти- МЕСЕ антитіло, антитіло проти рецептора МЕСЕ, розчинний злитий білок рецептора МЕСБЕ, аптамер, анти-МЕСЕ рАЕРІпПФ або інгібітор тирозинкінази МЕСЕК.
217. Застосування за п. 216, яке відрізняється тим, що анти-МЕСЕ антитіло являє собою ранібізумаб (ОСЕМТІ5Ф), ЕТН-258 або біспецифічне анти-УЕСЕ антитіло.
218. Застосування за п. 217, яке відрізняється тим, що біспецифічне анти-МЕСЕ антитіло являє собою анти-МЕСЕ/анти-Апда2 антитіло.
219. Застосування за п. 218, яке відрізняється тим, що анти-МЕСЕ/анти-Апд2 антитіло являє собою КО-7716. Зо 220. Застосування за п. 216, яке відрізняється тим, що розчинний злитий білок рецептора МЕСЕ являє собою афліберцепт (ЕМ ЕАФ)).
221. Застосування за п. 216, яке відрізняється тим, що аптамери являє собою пегаптаніб (МАСОСЕМФ).
222. Застосування за п. 216, яке відрізняється тим, що анти-МЕСЕ ОАКРІіпФ являє собою абіципар пегол.
223. Застосування за п. 216, яке відрізняється тим, що інгібітор тирозинкінази МЕСЕК вибирають з групи, що складається з 4-(4-бром-2-фтораніліно)-6-метокси-7-(1-метилпіперідин-4- ілметокси)хіназоліну (206474), 4-(4-фтор-2-метиліндол-5-ілокси)-б-метокси-7-(З-піролідин-1- ілпропокси)хіназоліну (А2О2171), ваталанібу (РТК787), семаксамібіну (505416) і БОТЕМТФ (сунітиніб).
224. Застосування за п. 214, яке відрізняється тим, що друга біологічна молекула вибрана з групи, яка складається з ІЇ/-18; 11 -6; / -6А; 11-13; І1/-13К; РОСБЕ; ангіопоетину; ангіопоетину 2; Тівє2; 51Р; інтегринів амВ3, амрВ5 і «5Д81; бетацелюліну; апеліну/АРУ); еритропоетину; фактора комплементу 0; ТМЕа; НІігА1; рецептора МЕСЕ; рецептора 51-2 і білка, генетично пов'язаного з ризиком АМО.
225. Застосування за п. 224, яке відрізняється тим, що рецептор МЕСЕ являє собою МЕСЕНМКІ, МЕСЕМК2, МЕСЕКЗ, тЬУЕСЕК або 5МЕСЕК.
226. Застосування за п. 224, яке відрізняється тим, що білок, генетично зв'язаний з ризиком АМО, вибраний з групи, що складається з компонентів шляху комплементу С2, фактора В, фактора Н, СЕНЕЗ, СЗБ, С5, С5а і СЗа; НТКАТ1; АКМ52; ТІМРЗ; НІ А; ІІ -8; СХЗСВІ1; ТІ ВЗ; ТІ Ва; СЕТР; ПІРС, СОЇ 10А1 ії ТМЕКЗЕТОА.
221. Застосування за будь-яким з пп. 214, 225 або 226, яке відрізняється тим, що сполука, яка зв'язує другу біологічну молекулу, являє собою антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент.
228. Застосування за п. 227, яке відрізняється тим, що фрагмент антигензв'язуючого антитіла вибраний з групи, що складається з Раб, РГар-С, Рар'-зЗН, Ем, зем і (Габ)2-фрагментів.
229. Кон'югат антитіла, що містить (ії) антитіло, яке специфічно зв'язує МЕС, і (ії) полімер НА, ковалентно приєднаний до антитіла, причому полімер НА має молекулярну масу приблизно 200 МдДа і не є зшитим, причому антитіло містить: (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 11; ії 60 (б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 12.
230. Кон'югат антитіла, що містить (ї) антитіло, яке специфічно зв'язує МЕСЕ і (ії) полімер НА, ковалентно приєднаний до антитіла, причому полімер НА має молекулярну масу приблизно 200 МдДа і не є зшитим, причому антитіло містить: (а) важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 48 або 5ЕО ІЮО МО: 49, і (р) легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 50.
231. Кон'югат антитіла, що містить: (Ї) антитіло, яке специфічно зв'язує МЕС, і (ії) полімер НА, ковалентно приєднаний до антитіла, причому полімер НА має молекулярну масу приблизно 100 МдДа і не є зшитим, причому антитіло містить: (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 11; ії (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 12; (ії) антитіло, яке специфічно зв'язує МЕС, і (ії) полімер НА, ковалентно приєднаний до антитіла, причому полімер НА має молекулярну масу приблизно 150 МДа і не є зшитим, причому антитіло містить: (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 11; і (Б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12; або (м) антитіло, яке специфічно зв'язує МЕСЕ і (мі) полімер НА, ковалентно приєднаний до антитіла, причому полімер НА має молекулярну масу приблизно 250 МДа і не є зшитим, причому антитіло містить: (а) домен МН, що містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 11; і (б) домен МІ, що містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 12.
232. Фармацевтична композиція, що містить кон'югат антитіла за будь-яким із пп. 229-231.
233. Застосування фармацевтичної композиції за п. 232 для лікування розладу, пов'язаного з патологічним ангіогенезом.
234. Застосування за п. 233, яке відрізняється тим, що розлад, пов'язаний з патологічним ангіогенезом, являє собою окулярний розлад або клітинний проліферативний розлад.
235. Застосування за п. 233, яке відрізняється тим, що окулярний розлад вибраний із групи, що складається з АМО, ОМЕ, СЕ або ЕМО. Коо)
ФГ. ЗА Анти-аО ши шін ши ш ш ще и шш : ще шин ши шше ш ш- нш шій ши ЕК: ЕХ йо Ка Ж Ж ех ше ш СВК вояк КО МВ ях ш ие ши ше шиє Шк ша че ак шк ж ші шин Її дики ей же и нн и ВК З вивнюноВшеНениНиНи кине Вени иЕн оц Не Ніну іде кожи нта Зрагачання
Фіг В АН іучеи Білок і. ПЕ У - К.. 5 ЩЕ СИ - Кох її МЕ: НЕ З НИ Ж ї Ж п Ж ших БО ШЕ ї КЕ ПЖОЖОВКЖ по Ж Ош Ж ОЖИНИ шо -х Ж ПЕШЕО ОТ зх МОЖ от ї МО КЕ щООЖ Ох ОБ шк : шин. шо и ше ві ше ОХ ія ПИ ЕВ ОКО т шотОош ї Ж ОЖІМБЕ: ш:Ж Ж ях. З х КОЖ - КО її ши й» х ї Я і: Шо т ХО ВЕХ о тЕ. Ще Х І Ко ї Щ ся Х Ж СИЧ пек Й З шк й и Ш з п Й Й МОП ШЕ т МО БОМ ях їх що ї Х КЗ т ї В Е ро» ЗУ шЕ КЕ той ї С Б : Е Бі ЩЕ ШОЕ З Ве шШлЕЦ хх ве ОК ОХ ПИШЕ ЖЖ т тот МЕ п НЯ От ПЕЖО ШО ШОЖО Ж ОЩлтюх її. й - ї ЩЕ Ж а її в Х ї МЕ У ї Б ще ХХ: х Ж ЖЖ пошЕ ДВО КУ ЖОШЖЖХ ПОШИ ЩЕ МОВ Коля я хх Ж ОО ї Ш с СЕУ І ре» н- око ЩЕ т Я ОО, М: і х Х ш ЕК Ж х с зх ї » КЕ ГО пл ЖЕО Хот ПЕ? ж З ї МВ пов МЕ шолот п КЗ я М БУ Пт пт. ТК п КУ Я ОКЯя ШОПЛЮ Ж СХ поту СКУ З - ЕК пт Ж шо щЩЕ ш ие їх п) ЖЕ ХЕОСКОО Ж З: Ж жк ККУ МОЖЕ ЩЕ Х ШИК т Х КУ Я п шо ПО ду Ме о и В ОО В В Б З З НО Пенн о о КВ В В В В ВВ В ЕХО НК З в В З З в ЗВ В в В З ВВ В В ЗК В мохомю мех ККМкхХХХХХМХ квквх. оккккихкх вх во В ВМ ММ сему ххх х х хх У. Бе М е лю - - 15312: 5фІ19211 5215112) 522:2215125 345321 1У212 31132321 251 32921242 5225 31324521 5115212 52Е2114522:5511215 52112215: еВ Я У З Кров КК КАБ ЯЗ КЕН КК На Я ТО ве ЖУК ТЕМНІ ЗЯднена нижня ; встановлене яні ЯМ па ковохинтя ЗолвгвчаМмне. ЩЕ 3 я і -й и а ку уж й ФС БілокА як В ЯК: шОолоОш х ОБЖ тої ХХ ру що ХВ пої х УМ Шо ШИЛО ПЛШСПИЩО ПІДЕ ЛІПШЕ ОО жу щошОт РУК ення КЕ х Шити В СО ЖИ х о в п ЩО. х ЖЕ ХО МО пеня ш ПЗУ ву жо ши СУ ЖЕ МОЖЕ ЗА М ШО ЗЕ ЖОЩЖ ОО ОК ОС ще х Еш ш иши ши в шк: іх не ще Од шо Х ОХ до. тот ЖЕО пшЕ Ж СІЖМЖОЯМ пох МВВ МОМ оси со ИшШЬ ОО пожх Ж дик по и ис. - ЩО ОВ Ван З х З З ! х ах Ши ФК ООЩИЩ я МОЛОЖІ ФО ВЕЖ Ж с шт Ох КЕ ЖЖ с 00 ЖИВ М ЖЖ 0 ОКА МОЖ Ж сит ЛЕО Пелех ЛЕ ОА ВМ ле їх о жен ще о Б Б ИН пОЖЕ пох СЕ ЩЕ Ж з Ж ж с ВИЩ СЕНС ШТАМ по ОМ ий. пе ШО ЩЕЖЬ плжх х док КОХ Я се ЖЕК З 0 ЖК ТА 5 ЛІЖКО Б ОЖОЖ ще її У КВК ШЕ: и 5 ОБ о ШЕ шо Ши ДИ Ж ЦВ 5 Ох КОВО ших яке КЕ що її ОВ, ІЗ щ МЕ КЕ Ку п п ПИШИ подо ля БЖ ОХ ЖЕ п т ОТОЖ ПИАЖМ, ие ЖЖ ОХ х Ж ЕЗ ШЛЕ ИИ ЩО Ж Дт Єх с ши ШЕ БУ ОВК В Ж ше ОО: є ШЕ т и я ой ож 0ОССЕ З п БЕЗ ОІВ ЖЖ па Нх С КЗ ГНЕ Я ОШЕИОХ СОЛО длєе ; ХК Хе ОЗ ІК БОЖЕ ОО МБКОКОМХУ с с ВКВКО БОКОМ З ххх ще У ШЕ ОМС ОЖОАМЕ Ше ХОМ сх ХМК ХА. Ж Ж 00 шов ПЕ шх Ши дню юки жо Кон НК нн Ки З еипонкки ООН я ше ЖИ тиж В я о о З Й ИН ЖОДЕН БНО УВК МЕЖОВИХ МЕЖ КВК С В КК КВ КВК ВВЕ ОКО Ж Тая змо хе и КТ хек о КК М КК М КК ккххуую охо х х х їх о їх в ке к з 25255225 фК3І12502х212 2115 ФХ ХІІІ ВХ 25 УБІК КФК х охо ІК Ем МІХ ВЕ ТВ ЕК ЕК КВК ЕКЗ КЕ В ВК КЕ СКОБ ОККЯ У Я ЕК В ВК ОК У Ов Е БЕЗЕ Ж, сеедимвтих дих хОДдМжЖии ММА ветаксовтюної межі Й ВХ кош муАмх Збгкачення « І
Ка Б ЕІ З
Фіг. ; й Ж ха Дитяча г ПЕ ш ті ШОЕ ож ві п ш ЗВ На СПО т ЩО ком СЕ шОЖ шо ШО Ж ж В шо щ шо ж ХВ ії я х Се З т Я ПИТ поді З х ЖЖ ще Ж ОД од 7 похо я ця щ й ! що ОО т Ж Ех ЯЗ ТЕ х М СА КИЩЖЕНХ ЩО ОЛЕ ак ш ке : ку шо лист по ЖЕ Ж Ж бли х хх ПЛІННОЕ - т а р ЗД: ОО Пов: гЗ ЗХ ТЮОщЕ х ге ПЕТЕИИИ КН ПЕК шиш ЛЕО фол ШОЕ ЩОБ БОС ОКО ШКО пов -к М х Що х п пибоОО СХ ПОЛО СЮ хх ПЕ З ХЕ Х Ех х ОЖО ПИШИ КУ 7 ш п КУ КУ Шо З ПОСЛИ Х ШИ ПТО ООФОФЖОожх ЕІ ЕН, Бе Ж ШО ФОКС по ШО п М ШИНИ шо ПЕ СО хз ОЛЕ вне: п ЖЕ осли ще Ж: ПЕ ще КУЗЯ її Знвня пощожж щи шо М А СУ МЕ ; ї СЗШ: СОННА Я ОГО ш дЕМИШНИМО ЛШ ПИ С пол по Б Я Шк фр дО : : щ Я я х ЗБЕ ЗИ ШОожоня й Бе НИК: Я Ж пт і Я БЖ КОХ ОО ШОВ пло рем ШК Ст КУ КЕ Же ІЗ ШЕ ї шСЖЖЕ жо ОБО ОО В жк Пи ОО Ж ПЕ СД ДОН х ШИ 0 шо Ж Ж 6 її ЗВ ПЕОЖЕЛОТТ ЖЕО ШО СТ ПК Бе и ОМ М МишОВИ І ЩЕ ШО пИИХ 9 ЖИ ШИ ЛОЛНЕНИК ШКОЛО ШИП ОІД ххмжкююх 0 мк лелек лк хукмхххмі мех же хе пев хукесх есе - х Я хм їх е З - ж Ех ЗІЗТ1У ХХХІ 21111551 ІІІ ХХХ ХУ ІІ ХХХ ІФФ ХХХ ХІІІ ІІ сЕХуУХУХхУх хихтхаЕкинс скіни ит тиних вах окіаскипкикикк пікапа крспі кохав ки ОН ВК ЕЕ В І В ЕЕ В В ЕК В ВЕУ днем ниж ; зпивипалюН меж 5-Щщ Кк коеіНента зблгачення З годе Хіти биюкі ШИХ БО ВЕ я я я ші шоОЖ ї ЕЙ Ж опи КЗ шо Ж Я ЩЕ ся по Б и З НН ШУ щЕ жо ЗЕ Живи: ХЕ их ПЕИЖОНІНННИ В Ж МОЛ ШЕ х Ж: МО СК ШО ШИ по ЕК, ЖЕ но С Жов, Ж ОЕХ ее ШНМ пОШШЕ ДО ЩО ПЕОМ Б п ЖЕ БУ МОЖЕ ШЕ ОКУ ЖЖ ит МОЮ Я пи КЕ В Ж ш Й ше шо Ж Я ВАН ЦЕ ШОШЕТЕ ЩО» я ЖЕ ЛЕ МКУ ХЕ т МОШл Би з В ВХ Шдтнниі ША ПОСЛИ ОІВ ПЕВНИХ 01. Ви нн ООДИХ шо ШЕ КУ ПИШИ ШИ ме о З в ВИН НЯ ОН КН ВХ ШК ЕХ ВИ М ЕХ до БЕМНЕЖЕЖ З дО ШЕ ЖЖ ШОДОЕ От ЕК шо ШЕМОХ ШМЖЕЩИЕМ, мох ШЖОСОЖ МИХ ПММ. по Ж. й. ОХ т В Ох ШЕ що ШОН ШЖЖДКЕ их ЕК КОХ «КЕ її Ж ОЖшх ОЖЕ З хо БО ЩЕ шо В ШЕ ОМОХ Ше ТОК ОЕМ п - КУ Жох ШКО Ж хх лОБЕОЖЕ ОХ Шех Ж лоОщох ТИМИ Ж ї ШО пт ЩО Ош ШО ШЕ ях що о ШЕ и ХХ ш ШЕ ЕН Ж ЖЕ ПООДИ лшни КНЯ пов шо СОКУ ї п ся Ше Шо Ж Ко ХО х 5 ПОШИ ит МО т хх ПИШЕ п ЖЕ шодо ШО ш Вннння п ХО ПОШИ. ОО до ША Дня В «КЕ шо. шт В ши ВЕ В ще ОО п п ШО пвх ЖОИ дОгО ЩЕ ее ЕК шо ДЕ п ЩЕ Ж ох ПЕД с: МОЖЕ ШО Ж ою ОБ НН НН НН Я ВН М а А В І ЕВ В В Б В В В В ВВС схюжхюх лою ких хххххюкккх схо ох хккхххху «кхкхккко «ооююю. ххххххххххккю жехххкккккххх К-я х. ж о г ш ке -х х ьо ІІ ХХІ ХХІ, ІіххУХ ІІІ Ух Ісусу ХУ ІІІ ЕХ ВЕЕХУХХ ми коефі нІа агамення В РО Я
Ф.Е Вінок А х я о з Я З : ше НИ: Ух К ї ЖЖ Я ш ох й з її -ох х ї х І її В й В : й | ї и ши Шк по І ЖЕ пи х ро шк щої Я жо : ошош п Щ ї ї Й т п си й 1 но шин и НН и в и и НН ШЕ ШІШИЕШО ЛЕО ЖЕН ШО ВЕНЕЕВНН ПДЖНИ СПВИНКИНННЕИИ ВЕЛИ ДНО ВК ВЕ ПЕ ПИШИ Сх пи ДЕН ЛИПИ ИБП мл ї т: о же с хо мМ ОК Гн со. ж оооюю ОКХ жосж Ж ж У г х її х х: хх В ЗХІХЕХУХХІТЕХУХІ 1: ХХІХ ХУ ІІІ УМІСТ ІХ ХУ ІІІ ХУ ІФІХХХУУУ ІІІ ХУ ВІІХХХУУУІЕХХУ ддмене нокня дитяковленл Мих яке шеаб кофта збагланення У
Фіг. 2А щ щк ПркКор:в а ТК Кову н- уежчмирдни купи ТЯ Бовиношне ни ПЛ що ех дочко що х хкнехНА СОМ ГовоерУма ОБУ і То нац ЯЗ т т т Шини як, ТВА Шк й ЛЕ 0 ше Пер в НЕ Я ЕІ дик п шАЯ я : НН) КО МУ ОН и ОВ : Ко ЕН 5 : НІХ ТРУНІ ПШШИММ ТЕ ПИ КВ зай А - пеонкожтя ПИШЕ ПП КК Ж нний де Шетмун: дути жів ПОТ о о ії дини й ен: НОМ ШПЛПИПИИИИПИИ КК СУКНЯ Її Уімилихкаму Ї1 СК ЛИПИ ШИМИ г ООН, у ІЕМ КОТ т ПТИВИНИНИ НН КК ОК Я й ще ноя о. о що : вами ПО ПО Ж т Я ІННО Оу Кн ПИШНИХ МК С ОО пит м х ч ПИ СКК тет Дно плоді уий по фе ФК ВККС ОК ПИ хх Б м МЕМ ЩО Ех о ВМ ПЕВ ДИ : : мин ПИПИНИПИИИ НИ ММ ІНППИЙИНИИ ПИ Е : : ОО Н : ші и а ПППИШИ НИМВТт КК ХК ї М. ПТК В ВК ПИЖЖВ НИ НИ ПИШИ ПЕК Хр ПКЕЕ В ТІИИКИНИИХ. ; я її пе а - : ПП я КИ ПИЛИ Ж НИНІ у нев - З с п. : ПФИКЦИХНИ ЦИ ПИ п МИЛИ ЗМИТИ У СЛЛЕЛСОНИНИНИ НОВ по ПИ ИН ОККО ОВ щі в о М ЗО В Відок ОХ ПОВНА С Б. оо ПН ий ПЕД с ПЕВ 5 п ДЕ ! ЗЕ п Коен ПЕ о. ОТ ие М М Б В В о о нч 4 х ПЕЛЕТИ ДИТ КК ШИ ПП КК ПИ ПИТИ г ППП ПИШИ ПИ КПИ ПИ ТИМИИИИИини ОПИЕНИШНИИН ПДМ ШИТИ ЛИПИ : нн навня ПМ ти и ПДК КК ЛИ дими ПОЛКИ ТИ :
Фіг. 28 у; Мен ек г БОШ ОВеЗ пу в си КДЖ ТОМИ ЇВ КоВБЧТяя не Фу ній: ДІКИМ Мотя НОВ за ГЕН іме діДКУ МІ м КІиШИТОТІ У очи й РАМ ЕЛНИ срок ки ДЕ іх ювхма по й СУБІІДЕ МЕМ МНН 2 КІ М жежмЕМа п МжТМЄ ЗК І Кв п ВОМ Гри Й УК М Іа попід Гезверхна сей Шик ЦЕ не ішвий поЇд ж жх Філ КОН злотя Кі р УТА Ей - «чкх о НН ін ї 122 деко т зе Я КмМтшаи ОО земне ОО БАТУНО г 5 : ШОК ИН Де вевнн ВН ЖК Яну ПИПИИДИИЛИИХ ОН ПЕЖО їх но ПЕН КОКО хе гукя ЕЕ Пд пи ОЙ о Юо ПЕН ПЕК КК ОО: : й КИ Я ши ОБО . Жов Я шк ОВ п. Кох Бе Ше ЯН ПЕ пк а ОБО я : Кнудципвне й її ОККО КК Ж нео кнй Н до ; ІМЕН КМ С ВИ ВХ МО Вона : Ми Х по ТТ 1 Я ШОЕ па ща ох лк ГфкнмеУкна: пе т КО и пІсЕОВЕ т КОЖНЕ С ше ДЯ пох вна ПЕ : ЕК НН о я нн нин Шлюк ЦК о п ПНО ННЯ : : п Ме Шини ЕД, п ПеПФИИН НД ТУРТКУТНКИНИХ : : бло шк ВВ ПЕН Пенн Й : : с В ПО я І ! ПЕКИ ПИТИ ПИШИ ПИШИ ПОЕМИ ТИ те ПОЛИЦІ ПИТ ПИИ т Шо У я й КЕН В КН ПКЕЕ КИ З З 1 еоавеннньях Пн ПмшИОЇ ПОТЕН поши п ПЕК ЖИ о ПЕК оса КЕНЕ ПЕТ КЛОН МЕКІЕ ЗСУВИ СИ ДКДЛНКИ, ПЕН ОО Хо ШИН ПИ Б ЖЕО ШТ ПИПИДИМИКНИЯ ПШИЛОЦ МЕ КК оо ПІП ПІШКИ ПИЛИ ТОК що ПЕИЛИМИЙО ПІ ЕТНО В ХОМИН я ня Пиши СНІ ППО КОЛИШНІ ПИ ОККО ШИ: ПИШНЕ ВН с МО КОКОН ПИ ДЖ ОХ Зо ПЕВ ПИ ПЕКНН СО ЕЕ ПЕ ЕКОН ЗОВ ПШОНО с ЖК ПЕКТИ ПК и СОН п ВХ І КМ ЕН ПЕД ЕЕНК Он ПЕ ді В 0 ОК я Ве ши : ню по - с пл о ШЕ ПЕВ МЖК а ЖК. ПДМ КЗ МК п НК ННЯ ком т ПО у ПУ СО с ШИХ У ПИШУ ОВ во Б ШО! й ПІ ОЕЕДИК : не й ИИИТІ В дн ме ті СЯ ЕЗЩН - ЕЙ тя шо ЕЕ З «и ре Пот Кк т К х А НЕННЯ Мо пане й 1. пенянянннн няння т у м ее Не УНН г пе ТЕН п пня, Н ї нм МД НН НП. ід її Н ре Н КЕ: Бути свя А НЕ ННВ ча пи ї у 55 У А еННИВ ННЦ поті Бо шив СН НН пиши ня що М ейний ж І 8 ОЗОН, й ПОТ зетн тещі НЕЕНІ мо. : В Мк ШЕ МНН Я я ОВ ; ЖІ - НВО ПЕ ВЕ: Жож ї " ПВ На МОМ ЕН що : Е ІН ще НЕ ОРЕ ЖІ Шк! З я пив ПОБОБІВАєх : ФО : ї - НН Кс пог вим: «Ки сту А ї по Жу РУД НК: : ЗК Е В в жНШ У Ж З Ядре п ГЕ ш й о ух пт х м : й : ї Вомипавне НО: пот Я т я й: г зкнияране здуо НЯ ІЗ се : ом Ж хутрі х ЕМВ поверхня пос і їжи маш их М ника и ке «певевуня К : ре їх хх їх хх 5 грхтутумтокоутх тата М ї й 5 наш вк ве шен те : » Тл, Й Не Е рок и з с : Я азтаовді І й Ж В й тсухруєттукк Фіг, ЗВ звашеанння вижи х 5 зе 5 55 : ВИЗатО панцю ЕЕ З и х рр та ланцюги Мох су в й птн Ж Н п сення пкт нт тро мір пенні д ., МЕНА МІРУ сх щої й шен тОМНТЛОТВН ААУ УУ Ух ї Ж Н а Ме до Ті В, их оо Пе Тож ана ій -ов т що Ж : З 5 ВІ Яна за пи НУ ще : ОО Ж М: ШЕУ і іп НИХ ПІ па щі о : щі З З ЩЕ ПЕВ МН Я пов ІрЧШННЯ Ше: З ВЕ З У ПЕВ ВЕ С з: х 5 я Т5Х х Ще ; НК во -4 Х З В КЗ НН ШЕ ї : З ж О 3» НН я К ще : Ж ж : З З ІЕ ВШ 5 орі дО Я КІ Же ме НЯ х ЩО. ос : З ОО ха ни З з т Де Бе «3 В В НЯ х кВЕ : с : х ж 1 х ї БОКУ : З ї те : і : З І г ПВХ : бе З З лдро ОВ : же ай Х РООШМІВНІ Я НЕ Е Яку дуету кт Ве; пПОВерЖНя пе З і 5 ой ОВ ОК диттртаєтттучтьх де Е ка ; З г 5 ху 7 тус хіхретятутхтхдету ЩА : с гм КУ глин м в пана ЗБК НИ Н Не З й Дт мтусхт тт Кут : ТтУуЖЕтІх Со Й У й Фх. Казгржзуєання пЕгкомо пи м ПЕ МОо пиНМмКН
Я ях
Фу. фіг. Я см ких й щи ее ж У НАННЯ ов ей УМ НУВІЗ де з і пом з к. КЕ БЕ піна як «Ве зве ЗМ : й жа МІХ св КС МИМОХ В су ху х Я сх КО с 5 М ко ще хх хх хх ще КБ поз х Я ЩО н Бе й Я х М Я х Ту в ХНН и В СУМНЕ Не жу У п З ХУ. МЖХМ Х кі НЯ їх ще 3 Пп о є п Ех ОКО ж ХХ й гом . М щи Ку М ОВ КИ : МТА ОК с МУ ща З Я у. ; Б вх В В пох це ЗХ ОБЖ Х « сх З ЖК че Є Я Пт З хх ОКА МОЦЕт. що Пост ех Її бі «в ке и: пи 5. МЕНЕ шо й о в п жах ІК З Ех їх ау ХО ЗЖ ККУ х ія Ко Кк ЕВ У ЩЕ У Ек ЗО Я овен З шо зва ЗО х КК АК М, нн ВК Ж М ШО КК УЮ ее со ЗМ й в Ой с: ИН ЕН Б ОК ще УВНИ оо ВН ЩО Ку п Ж пиши Ж КО США ОК Ш ВВ М КОХ ПК ВК. КУ НК Ж Ж дув ЗАД я М ПЕТ В Ж ее 1 ІІ я М ЗК ЗКУ нич ДОК де са КВ ї НАХ Ка КК ЗАВ щ З зх я ха ПО ОК ХО Я ШПАК -5 Х Е Як Ка Шу дн в АН 5 І У ПОД я ЗВ КН е Кеш М З З НЕО сЕКК ВИ КЕ КЕ у У Си си в; ЕН Я Б Ок КО Я со й ШК ІЗ У Хі ВО Ж ха я ше ь в тА ха з А З Же В АВ Хожодх ЕЕ : Туш я з: о М НН Я їі а КВ Х Ай ше й. ОК Я Е Її КУ їв КВ дими ик їх дра 2 Ко 5 два зо. К. роко, зве яд В В «(Се Бохмиюренеядни о Бе ї повинне Ядро яжа КО МЕцйАя, повЕХНе КЕ Ка с я ММ, ПОБЕНКМЯ ОО ак І я ке МЕМ, поверхня шк Хокей ЗИ ? п КН ЗИ вадий ков паний ший У па В ТА ч хх ч пекти жа г. ще т «жо Уж У я: І ЩЕ о ШОВ СЕ Ж ПЕЖО ДН ТВ Я ком НЯ ЕН З її В ЩО аех ше пиши ЖЕКи ших о (МОЖНО ІНК Ж ОО МО КО ще КОХ їй
ЖЖ. ббоМИМе ЖОВ. Ж шо М пи пе ЩОБ ЖОї Х її . ооо У КОЖ ї по шМ ОшОЖ Я Пил, ЕП ШЕ им ПОтолож ї НА ШКО ще шої ще т.д Тх ХЖОХ пли ВЕК БОЖКО ОКО Ж ОДА За ОО З т ходу ШИ ЩЕ . її ККУ пк Х ОКО хо Ку Ж х З Ох. ХК Е вх Ж пт ЛИ Ж я іх пт МЕЖ СЕ ЖІ ММ в о тини о Мк рення МІЖ Ж кох ОХ пи Ж ЕІ «Вих їй и Б й ШИ с: ЕТ х шОЖ ОК ті. т ШЕЖОСЖМ І КОЗАК ВОНА ХЕ со пло, ОО Ж ЩО 5 АН: ТО ЕНН хоп ОК ММ сли ОК що й ОІВ СОЮ ВО В ва ее НЯ ШОЕ дош Б Я Й ши Б. ій в. ЩЕ БЕ ЗБ, ВО КО ЗЕ ЖЖ СО ОА В 5 В Бош Ж Зо дтв З: и а З ЛИ с В ОЗ КК ХО о БЕК ск Ж Ох НЕ ОАЕ ЖОВ ОО ОО. во ж вв ї шо в За Я пе я 2: БЕ в НИ с: ЗК НН ВШ і А КОКУ Ох : СИ шини й ких й шин її Ох о ин нн Я ОО КХ пОЖЕ ШЛЖНОМОХ ОЦ п ЕЕ ОК ШКО. де ЯКО ЕЕ БЯ Ве ОТ ОН ЕМ сш М ВЕ В КУ
Ба. ти: З шк Бк а а НН В ХХ ЖК ОХ я Ме рН НН НН и НВ нн НН НН ее в шк Не як І. я зе п ПК ШО ОВ що ОБО І БЕ в. У я ( аз т НН І ВВ КН НН ПИ ПОВ КУ ЗА Яни ЖЖ о сжо ЖЖ: с МЖК З 00 Ж ЕК ДН Я ж а А Й о я ж ни ши ще шо х МОЖЕ Мф Пн ши ек о о о КВ КЕ КО хх шо жав» ОХ КК В В КС КК ХХ КК зччззза хх ж сххххююю хх ххмоххххюю сою: пк зеккккеккю хо ооо маковий мехнх зе ке -х ПИ: ши х АЖ стустіфі істоту іх уст гі сегтл залоз пістіхо іо ок тк кіоск Не МН ОВ В ЕН х Ве: п І. око ЖЕ РУКУ БЯНЙ ЕЗЯ и МО Ох, БЯ ях стін КЕ
Фу. А шОЖІВМ ПЕКИ ШКО ВОК сло пове ШО Ж О ше ШО ЖЕ ШОК ОК НК сте ВЕ ДИКЕ т: Еш 5 5 5 в кН ЛЕ Оу щи ве я ПТМ МОЖ ШКО Б ШОВ О ЖЖ ШЕ ЖЕ за Бай ШЖОТХ ох ОВ В В В ОО в ВКМ ЕХ ЖЕ х В ПЕ ПІК В ЗАМ МОНЕ ви МЕОШЕНЕ МЕ шОЖЕОЕВИ КВ В ВЕ ХЕ вен по ШО БОЖЕ ЖЖ Ой ШО ШКО до ол ШМК ШОЕ не Не я ВВ Ето ок я. В я ш Ж Ох З с ЖЖ с хо де же 0 ОХ ОПО БИ з о НК ЗНАК р Х ШО сш ож СОБОЖХАЖХ п ВЖИВ ДЕ МКК ЖЖ ОМ т ОА НВ В п хх шошО М Ж ЩО х г ШО дих ВЕЖ КЗ За ЖЖ ве В КУ 8 "З щх що КЗ ЩЕ Ка -- КУ ВК п З ЖООЖхх |і Бе ки Ш Соя КЗ ї ВВ ще Х МЕ їз Б. ща н те їх ДЕ в В а о а АНЯ ОМ що М дош ЖИВЕ МОМ МЕ В чі |! х кош Ву ще я ОБО В ОО ще її Ж ГУ ОБО МЕ то КЕ 5 В де М ЖЕ Ж ВЕ: ШО Кв ВК ЕЗВОВ Ж сх х р ОКОМ ОМ ОМ 00ОМшО ЖК ОО ЕВ С М пе и ки Ок скох ож Ж ШИК ; Ши Ж Ш: Не я ЩОБИ спиш дп и шини ШИ ЖКи ШИ Ж х ЩОЖО ОВ ОВО ЖЖ ОЇ ВО пИНх їй Й хх : х В шин ЖИ Щ 7 ПОД Ш х Ж тк М Как МО хх БОЖОВЕОС ВОК Б Он ж шин В жо ж в ве о он пав зв З п В В ЩЕ З КУ к ро п ЖЕ ї Б ПЕКІН В Ж ОВ ШЕШНКО ІОВ МИЛИ А ПШОНА ВЖК М п СЛИВИ поли НИКОМ ШО ЖК ве ДАЙ п ЖЖ І КО ЖК пак КВ З Во вояки: зве е КУ ХХ ОО В ни Он в ее ев ов в я КУ вч ех: ж ж жо ох чо кю ооо М кни нин іо х - 2 о ЕІ У ле хм х «ХУхуУІХХУ сс: ху иХУ ІІ УХ ІІ: ХУ ІхУХ ІІІ ХХІ І: 1551122 хіх ххуІзз сих пИЕКВтУ Ес ВІНИК ВНИХ ВВЕ КВК КЕКВ ЕЕ ЗЕ ЕХ ЕК ЕК ЕВ Х : е Е Її ХЕ КУБ Ж Ф с І ШЕ хе ХО ПЕ Е «хх пО0ОСОШКЕ Е ш Щ і чо Нр КЕ
Фіг. А «ріг. 5 і ще що Копосративний : ще : і ВО ВЖК; : ОО : і що : дк: К : ко І ПЕКИ : ле : ОВ : У І ПАНЕ : БУ Я ее : « 1 КО : Ж НАННЯ і ЕЕ 1 о. Ж о Е Хх : ЩЕ ПИВ ї п ж ї ОК ї 7 їж МИИИМИН ї БУ ї ОКХ ї Кі : ЩЕ КА : і : КИЕВ ії Б МЕ Я : Ме : ТУ ОБЖ: ПЕК : о є: БЕ МКК ї ЗЕ : . Зоя : мок ех Хом Її : ЕЕ : які ее : . о : : о : ж Е 8 о !
о. : Б в КОХ вех :
ї ....." : ж 000 з. КО сою са а В З ов є: їЗ з З Ух Х В а 8 КЕ в З КО коеквіцвента збагнення УК генних кос коецмцента зоавчення МЕСМ. пеня тео ЩІ Фі р. 5 Фк. 50 Ф пана а а а а а пен ни нн нн и нн и Н хх І ІЗ З Ії в В і І З і ОО З і х і з: і БЕ з зі Ж в і : в па : аа І. І ; НК зх і я в'є я Е їх В ее з Н : и е Н їй Ех х « Н Я Нео С ек я і Б г щ їж З БУ ї Бах ЗД ї як В ККУ КЗ яд Ж Не х м МВ Її Ще с : С ї ма ще ооо . ОБ 4 5 ЕЙ мі СХ ке ї Ж щ- 5 що : тові їх ї я її йо х у І з Н що і У : З іх я ав во пе ві я Бе ж ї а п КККоноврнатк у В і В І рних гарког ї і ЕчЯ Н Її Не Я . й ран н нн уж У ка - БУ С: -Я КУ З Те Коен щціснетв хепачення МЕ пане Ко ково збочення УКОК пана З ВХ : СЕТ а ч КУ
Янг. БЕ Фіг. БЕ Кс Но п ща з ВО ОО КВК ЗХ КК Ох Ж Пе я Я КЗ ее Ж ЦК в В й о КСО ОЗ ХОЗЛ, Же В ОК "ОО АХ дк МИ ОМ ке КОХ ; КОКОН ск - ИЕ ТУ юр З ЗОМ, КЗ ОХ «Ве КК же: ЖЕ ШЕ - ВОМ ши о дк я о КК КО о о М а ОА о а | З БЕХ ВЕ Я жк щк МК ех КОХ Х КОСОВО ВН НИЄ й 5 ВК ЖІ М, ВК З шк З КК Ж ши х Ж . В й хх Ж КО ЕК БО ФК І КУН брех ПІП со МІмдеком Ж ЖЖ ОХ ОМ ТК ох ШО ох ПИШИ ВУ КИКпЕряИ ДНУ МИ ЧИЯ : ее я ща пн ее МИ оо Ки з Кл ШКО Я Я ЗМК КАЛОМ шт й ЩО «КН, ЗК М ВИ З нЯ х я су МК о В джаи жк і ЗМ В Й т В ВВ й ще С КК В Б: ЗК ит х хх що о ОКО ох - С СХ сх Ж ке з квркоаю ох Мп «ВК х КОХ З хх ге хх КЗ С КМ вай ех КК ОД з т ОХ й ОК ЕК й о ЗВ І З У ОЙ Б аю М х й МЖК І я ОХ ях Б. АМКУ ХХ ЕЕ УК я ЗЕ МЕЖАХ ШОК ШОК ЖК сок ах ун НН МЕ Ман пе. УКХ о й ЗЕ ЗК мое са Й Ман ще ЕК ко ее вк жк М и Кх як іш КЕ о здох БЕК СН й ж вза ї З ще х Зк З ВС НН між МК КК яУХ ЖЖ од СХ М ХЕ КУ хх: КК хх З КЕ М х. х. ХУ вич По КМ ХІМ Ме НК й є ММК х МИТОМ УЮЮ У хх З: ТЕ ин ВН Ех БУЄ КО ЩО а ВН їх й Х : - м ї хх ее З з В КУ ЖАЛЮ Х с. Б пром я газ За БМ Ку КЕ 1 ун Же Зх Я
Те се с : Б ЗК ОМ ак єї б сн вов Ес ОХ А КО ХЕ Х. ЗК х ен г ях еЕ її. Пкопатла с . х Се а КО І з ОБО Б . : ЗХ «І - Є їх о (г: ис ее ши ше ще й ЯЗ з МАХ Е Зх З і. 5 са ВОКЕ ей. Є, ОКХ ОМА М М ХСЗ ОК Я ФО зх, УЗ ОК Й Б й Хо» ОКХ Є : М Ж, ОХ Ох ООН 07 х ОА слу, ВХ. КИ Бк а ех СЕЕчнетня ть 5 Фіг, г А У Я З : ї Н . ші ши . хх 0 "ЩЕ че 0 ші і СВ бе. х й ЕЕ Е . ! ме ООН ПІ, ї 3 шо іо Е | і ше як Е Е Е - я ще Е щи ше: ВЕ: Й і ьо з Я. і. Е «ківзевнів я Ж Е ї НЕ я Н ССЗ газ Е ше ЖІ ЩЕ ОД кочення роннннннннннннннь ВВ вн Мов сря счденлний ГК -З35В МВ й ТК ЕВО . мхо з й ТИ наз З р 7 нхЕ Кох ще СВ БУВ а ЗОЗ | -- ' ОХ А ї ОК 1 кас 5 ВО, : З «М З се й Н і М ї ЗО зе -- і Е вве в с. Б зе | з з ; хх ЖЖ ї ї БЕ ж мні зик В за : ще п - Здене ж зве) ! ОКХ ТИХ че Я ї ї Ве В'єов З. ' са Й ЯК р А Е і. - що ши т КЗ о а а у Є -КЩ5 00 -Ню с З Фсзо
: зва
Фіг. тс : зх ж У з, . СХ Ек ох х Й І Бай х Н пас ща ше фай Па х | вже ше КУ ос ЗИ МКУ х ОЗ й : х Е СХ Ох х М хх рої УКХ ч ї С а о ше КН ОЖИНУ сх т- З хх У с. «в ще о АХ МОМЩЕ «у яв і ї У Як З 1 ж і; Я і й 5 щ рю м: КУН Ж не ДІ І і А ДС . ! її оо МУ НЕТ. ЯКА фен й ій но з Ко о Я х ТКУ ден З щи Зк» З ке 00 ШО 00 УМО мизна я й Е Хе у хатах У плн дитяти С ж І ие какту та РІ М То о где з Я жен, Б ВИ Наженя таз -5 сь Ж вові й З ОКА З Е : і ж ОК З КУ У кое ' В а В Б Х : хх З х Н о В, ще Я Я : Не Зх ! ОК С КОВО ї й х і СО ви а
З с. 5 -Х х 5 ха т ОВ ЕН АХ ше - З Х шо ЗО: КУ ЗКУ Мн І
З в. з ШИ ЩЕ | ше МИ о о и ж ИН Рода 0 хі "її г У Е Н во: "М М: Н ; МУ Х ХК: Ем - і БОМБ. с х ї Н щ а В Ь е Ж -щі М вх і Гн З КБ 5 що ЗІ ВО г Сех Н х5 чи ММ Ж ЗМ ва і СЯ ТднАщ кут ВИРУШТХ до хх Н
Фіг. ВА ши «косому я
(9. : З те з З ка Фе ВА Ед: 8 ВАЕВЗ ей іо МЦЕВЗ ОО БОГ ЕДЗ 3 ЗК КК я опр і юю З ій ; сок Х : я ще хі Ва НАВ ЗВ малекуда
Фк. В о ШИОІЗІ ш дея Хепнних ЕН НН в ЗЕ ШЕ : е ХІІ ТІ: й ї ї ді Ж Іхкюююм: ЩА ту зх ГЕ і. си БАЗ КУ ; ННЯ ї Н Мох Що щу п 5 шт ще ЗЕ УК І ІНН ТІ щи: ЇВ ї : х :жЕЯНИ т ОВО ОМ І: ШІ ОБДІ ОТИТІ й нм х х с ШЕ ТЕ БО В пн и Ж киш піших ни ШЕ нн а НИ ВН Ж ТЕ Я оо 3 з ши ші я й шен се ЖЕ У М КЕ ВИ ї МЕ В НІ 5 ХК ПЕВ ВЕЖУ й Е оо КН А НЕ 0 ши ша НЕ її її З Х х ; З Час іне) ко в
Фіг. ВС пн ннннннонннннонненннонононн, Х і що, 7 ї у ОМ Ме Же Х х ш - ВО . о. ОБ молекула ча . 5 нд шо. КО і я ОХ СО о с о КЕ АХ У СюхКт ЕЕ ОВК ОО Ах З ша КОЮ ще 3 я Ж Ж х ОКУ ЛО Я Я: ХХ КОЖ УК Ж х шій жо у З КЕ НК ЗИ Ох х хв ЯК КВ З Х ї Зквкаой хх х ще ЖЖ й дл Кут вигину
ФЕ. ЗА ві А Фк, ЗВ ; сунтннннтнтис тече - длпкдтядлххчянтхукхкня ) дххучкч ку хєюк мкм, . ї я і Ж ще ! ХМ НО З : І КЗ ш- ще Е Ж Н що ! ї | й х : ср Н г Ши . Ії Ж : де ІВ ОБАКВІ ж Ж з Мої всих х Ж і ЗО. ТЯ Вар 2 ди Н у ; хх ККУ ях ї ХУ таккю м . ! рей ; Р ВЗ Я . Н М ума Ех кюсокююююсой ре кн ж | Ж. ко ся и ЗИ Ж Урреза ш | (Жвоах пе и ох ОТ. ня Ада ші ї. Ех і щш ж І ЗАС аж 3 ш- ї Ж й е Б с ЕУК І ик Жеве І дк : ЩЕ МОМ ИЕ ДЕН зх фе б, ша й Я : з вв ! їж х- і М, Н й дода ДАААКААКАНЯ ВАРЖУ ВАВ УСКВ нео м ВАВ СЕУ УС ЕК ИНазнн ВАВ ! дос ке ще пов ан солекти зсеаві КА ДЮЗЗЯ ВОК. мозакува ог. с ві ФО р Н Й н і . г Н ІД р я, не НН зав док Я Ме не ше х тре | З Зк Я й г: Оу ря, нт. о Я і о ЗХ я БО а ще Не АН во: ЧЕ хі ща ск ОХ Ж з сиу в НИ ЩЕ ке З ОК Я ЗКУ г ша я Я МО в хя ї а Є НИ - ТЯ даевз . Я о і дао Й ДА Ка ке ЩЕ; ще 5 з В чик БЯ ЩЕ р: ви Же ЖК Мой зві ШЕБУХ веж дорос ще : Ж БАНОК 5 х ща Х їх З й З Як ; меш І о "о хх ся т. М ДОК ОНН Ох - зе Не В ж иа зе Що ай в жк ме а У ЕШИ - Ж що "М ти іон: зви Я ши ї м ван ШИ: ? ПК сої З Ум Ж ві У: | з БОщєтетя
0. ее х В, в сих как КІ і . НИ З 5 м 5 МО ши ще і Км Я т ХЕ и «ЖИ МИХ Е і ; шо Б з Н - 4 і ОМА Ме ; ; и Мо и и кт, Х ЗАРЕВІ бБАБЕЗА МК ДЕ ДОА З а ще Нм певіниний би В ЕВ стро . Є г. з повний ЗОМ З А ее щ ; молекула ха СМвке мок Од З КОЗА.
Фіг. ОА нн ї а СОЩИ Я їх ШЕ: Тедимно дими усхи пл В вх Ву ру пу В МКУ і Е 1 : КОТА : Ж Я і ще ИН ї п пу ПЕК ї Ж: - А В а 1 - М пА о ЗВУ дО Ат т х А Ї т КИНЕ х х с 2 В ОС Є за 1 х В КЕ Зх ВК МЕ ЗИ и ж с С що ик КУ Хол Кн де ш З Б х ек 5 З ЩО ех ж Ще Ж з Ж а ож ник М МО С ХХ Ж 5 ок В НН ВХ ЖК ОК ТО В х В З: - и І АВ НЕ ОО М М ЕН хо Ж їх й ДК КВ КО В КН КО ЗК о о З ВЗН КАК в КК ВАВ А що ОО В КО КК Я й по О о В В КВ КК В СК КК З В КУ Ж " ше ОК ПЕК КК С я ІМТ Я ОХ М Ми КЕ ВК Я М и В В М Я ЗК тро ех ЕІ КО СХ о М К ж В и и І В В З к ге КИ дО ж КО У КЕ век В З шо 1 В ще Кк ЖЖ МО ВО Ж Ж -- Ж КЕ КОХ
КЕ. .1 8 5 СЕ и и У ХХ З ще В СК ху роя Х їй ше 8 ВЕ І З щк к ЕЯ СЕ В мо З з щ-ш- Ж Ук ОЗ ІЗ Ж ще ЯН: я спу д. І се 5 з ЗУ Кк х я М ш З Н ЖЖ х як В х ОК 1 НУ х х о В Кк х 1 НК Є х А щі ТЗ Н З х х І м КІ а і їх : сх КЕ М Н х г: У ї Н їх Й Кк вими І Н х: асо : 3 У нн Мо сумі еучк ові хау зи У Мото у щі положення нумерація по казитуз ще -х х Я
Фіг. ТОВ Фіг, ТОсС З ОВ М, с ДУМУ У УУ У У У УУ УК УУУУУУ УУУУУ нн кн мя : І х ї в Н і ї і о ши ШИ ем і : 5 8 х Ух Ї : щ- ЕЗ ї ЕК : ІЗ «-е ї ї - ї ї Ух ї ї - Її ІЗ г х 1 Я Ї ї з х5 сі п х : ІЗ й І і З х ж Ві ! рай з пл в У : шому й й І 5 УМА ОО Ж ду І в В хг ОВ ЩІ Ще ОБР Ва се шк Н - м Тонко В В НУ х с М КК В У ї по, ок в ; що їі КА я: : кі 1 І її х х Я ї ї - ІЗ ї Ж : Ї і : 5 г І 1 - ІЗ 3 Ух І і р : Фі їт І і че Е тра - : Божко ро ; говюр : ї ех. ї СЕ ї Сіон 1 Е : бовеаею 1 ! Яеванкяю і 3 ї анти ї Ко З Мпамцюта З їх : пила З с 2 Н У З ілі ї т Е ія : ідяяння у " Н - сних ми Її 5 ї папства У ї ча доступна для Ї т : дими дя ої З І КУ Ку ї Бай І «ЖЕ і ї ї і К 7 кх 1 З ше Її ЧИ ох І щі і ЖЕ ке м ВИ ЗИ роззнннихе: З її г я ВОМУ Ка;х 1 Фо: Х ІЗ со Аа щ щ БО ЗЕ що ре ЯКО ЩО У но на дО Ще Б З » НИЙ і І що ФМ ЗСЯ БО пшишо б МУ ї я ; ШЕ і а : ШЕ ї і шт ам КУ І ож ШУ ско Ї . Кк Н - СОН | Ка ї КУ з - Й . ОЗ ї | ЕЕ хх : БОБИ ОЇ : В і ге : щоЕе Го : ВЗ : Кай ї М А ж ї ЗВ х хх ї ак ОЇ І ї ок СМ ї її ї ЩО МО І ї ОВС -- Мн тттююксврі сере і ї ї те ник панк землі зазававнк З х « КК їх хх т овУЖ У тех хх ВМ 0 ат ач ог сти ск НО. Од зо ам зо ол ЗО ЕЕЯ ше во ща Я дехекеоуу схеугу ми хх сему іх Ух сего мно кое м зу вк о спиці Частота сокматичкнях ваутаня в ололоженмні Мастота соматичних мутацій вллолпоженні з" гало Не ЦУНюЕ я сеча ОБЛА ! : . ! З : ке ля З ї і до Се І сту. т Рвзв | й ; с Х сталух» З КЗ КА 7 ввзм о - ШОН дід В - со яр Аффінність (Кі Температура плавлення (С
ФГ. А ве Гвула З ААЕЕ - В відні -- Грека З ААЕКЕ «Б екпоподійному ТЯ «ЕЕ ННМІ У шо І ши ее Група 2 ДТ В рідині а зе Крупа 5 ДТ. В склпоподаному чн и у буму т о, Ще : таке Група З ААНК - В відмі де ко Так Кч -ше Гримна З ААВВ - В схлоподіному тв ЕР ех Шо в ! Же 7ткх, Я зо от, ук Я с й САС, ХК Й й В ЕН ІВ В В Чавівні Мао є тварини!
Фі ІВ че х с м х хом хг З . чі Група З ДАБК ке не Го 33 5 З Гоупв ДІ слой - ЧЕ Е Об, сао Група: КУ м ее Грува З АК ТОД а Ж Шари, З тк ща Б ке ї: - тою Х у Вк, ЕІ ся ЗХ Я Б. о - а я з Ж І ї йо од» Ж ; І с її В: | х " жк як с З хх сх - у : 5 є іх ЕеЗ й й х НЕ т и 25 й ; МЕ ше оч секікх М х 4 тварини ФЕ 15 Н ї іїтимю Н йтккві ї З тик Н тиж ї ; а ов зятя мно совввввннся пкжжжяжюяняняжя ДУ пжяжиююююєєюня не зем осів: пня няююнянях дин : Я ї : ОА шах У тпм лаз Міміка З 3 ї ї незава ПЕН ГЕ ММОнсмети ЗМНМ В ТЗМАЯВ ПОМ нсат і МИ УНІВ ТК океті МАМ ЕЗНИВ ММкнимрі ВВЕ І ї їх ї ї ї 1 ї ї Н ЩО ї ї ЩЕ ї М : : т т Я ї 1 ї ї ї ї 1 Н Н пк Те дм - З ддві дю Її ук і ххаді Ж ди «ца тхі дя Худі ЕНН СЯ ЗД ДЕН Ас КН НН с НН ДА СО НК НЕ х х ї ї ІЗ ї ЇЗ х ІЗ ІЗ ІЗ ІЗ ї ї х я У хх х КУ У з з. У х і х ч х ГУ У: х х ж К Ко х У: х і У к т 2. з КОН ї до їх мож е ЯК пли Зк Кажу Ж Усе ПОЛКУ ОИК МН Я ОВ ВОВК НОВ ВВ В ВЗ Ї й ін Н й и У й и т Ти ізн їй ут І ОАЕ АКНЕ р За КО ОВ ЗБ ІВ 1 ЗО 1 ОЗ 883 ЗБ ім М і ними ин пом зи зи золи полю их пом В пи пом ин. В Н 7 7 ї ї Н і ї і у ї : ї 1 ї х ї ї ї ї ї : вах НИРАНН кох ії З ка ОН МИ І КН ог і Баха - ї. : і ЗЕ ім я 1 ОБМО1 З І 5 РФ Р ВНІ ЗБ З В за В ВІ нн в він зн зів зав мив знаю зом вив миня пивні зон знан : Н І Її Її у Н ї : ІЗ Н і у : мч Не ї - ум: Її к У я ії м: Ї ні ох ОК кін пе) ха Її зи Її : НО ОО ої ЗИ 5 8 ОЇ 533 КИ: ЗА РІ ДІЛІ з ар ані що сі : селетю Кі оно зовн знов не мине ай поеми зими ик мин пня пи нини змови зів : - Р а НН 1 пох ЇХ дод ді я Н 5 Ра г їх Коня ПА св см БОМИЕУ КА ї А і ЗВ В МЕ ННМІ ЗА 5 В і НОВІ З В 235 4 В новив зопінн вних змови знн йо мі и звів о зомонвввіни зом зимами ммнвввя зом мом повен Я У І ї І ї ї І ІЗ 3 і ї І Н мок пал Н ше :ї Н і Н ЩІ НІМ і Я Н ! Лизей тка а її фу сухо КГ зу КЕ зді іш Її хх 135 Ні кА їз зе ха 1 їі НЕ ЕЕ М ВЕ В МИ С АК ВАС ДК ВО ВИ ВАК ВЕ З НН З МЕН А ДОКАЗ ШЕ КВН і Я Н : : : і Н і і З і Е і : ВлмиййлумаМ ие ІА м ЗА о ЗД С І у и КД З І а М Вип На ЗИ
; ще
Фіг. 13 яю Ниві ГУК. з ї У и Інпбування УКР Індуковання
Я . ше ззартиь в мтрацй НІК
ІК. Ус 4 дай ТД дроллиеююоюют юю юю і ііі ее юю Оу : т в. Ї га ІЗ Я г ! ! ск ЖК. хх 4 що . є. НИ ох Я У І КЗ ее Ї Ж Х зв ще я Ж шмхщ мона ху є я ях Я Ех ох І Ж У --ч є жк жом, щ Ж . -ОйКВ в: « Ум 5 хх вч В КЕ У Ж Ж ЧО злих Б у 5. Е ії - о куля іч Б шо с: Е ж З 7 з вом й Б оч оо чу З і і- Зух УЖ Ки й .- й кю КУ ВХ Со -З че КУ Ех. г СЯ З Ї З; 19О З З Раб нм
Фіг. А пк НАХ тавКаю ее МАСОЮ ЧЯВЕ ее ВОК еВ ав З : : : : : : Н ї і Я і ї Я х кл, Кх а В і Б СЯ ЗШ: ях Н Б ї і БУ ї зе, Ж хз 5 х х 1 ОК, їх Х ї і у зві п ау ше ! й МОю із Н ж ех З ї ї що Е і ШЕ і в ї ї СЯ з їх ї ду ї ї Ж чо х І : Зк ї і : ї Є 5 ї і в ко х ї Ь у, х Ки» чо З В ОЗ ою КОМОЮ 53 ї ї ї х. "ш хе х ї хх І З и на о | м ї ї З 3 х й ї - МАЯ 2 Ї х ; Ї од : Е Н ї ї їх і ї З. Н В Ї їх ! ї : р і і і шк ше ж я Се ЇХ 3 З х З Х ї Ах Її Ї ЇХ о 4 х В Е Ж х : Я Ї ї ї т ія й ї й С с з ї КУ Її Б ря х ШЕ 5 ки мно С ї а ек нн ДН НН НН чих й КК В 7 Е В з В КУ КЗ 14 де зерня Ву, ХВУІМЧИ боса ,
Фу. 15 ее МАЮ 0 «ЩеНАТОЮТатаВ 150 з ком т як З се Ж ї Хе ЗК - Е З ї
З М. окемх х 3 Ух ха ІЗ х я хх ІЗ З де хх х сток х п З кВ - ве ГЕ : щ - КК х ЖЕ ІЗ сх Се х м оша кк х ль ши: дк х о ІЗ й г КЗ а К. ОЗ щщ ї з КЕ х Ве г В. її є на м з : х Ми У соокссоо хоосо М х ІЗ Х ке Щ ак ше и ОВ сен ШИ «М З г х Ох ее сих дих каже в Теоретична межа по НУЛІ о ІЗ ї Мас,
5. Ех
Фіг. В сін 1 Пеміжний МА-КаМНВІО 5 вени то ОО «де МІВ Банибіжняя (05 ямок - Е шк - Е «ТЕ Мавка» З мене) х х од феюкх м Ж | М і ше кове пн и ЩІ КЗ ХЕ Е ке х г: Пре мо чну. йо з : п - х ЕЕ Не ій ь їі Мо х | Е Зк г і Ото хх ї т зга ГУ ш оо г рез й Ж ІЗ Ку Н Зх зн нн нн п и Ву
З. 7 14 КУ 88 Час дО
UAA201800443A 2015-09-23 2016-09-23 Оптимізовані варіанти анти-vegf антитіл UA125432C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562222698P 2015-09-23 2015-09-23
US201562271913P 2015-12-28 2015-12-28
PCT/US2016/053454 WO2017053807A2 (en) 2015-09-23 2016-09-23 Optimized variants of anti-vegf antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125432C2 true UA125432C2 (uk) 2022-03-09

Family

ID=57043061

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201800443A UA125432C2 (uk) 2015-09-23 2016-09-23 Оптимізовані варіанти анти-vegf антитіл

Country Status (22)

Country Link
US (4) US10072075B2 (uk)
EP (1) EP3353203A2 (uk)
JP (2) JP6959912B2 (uk)
KR (1) KR102725051B1 (uk)
CN (2) CN108137681B (uk)
AU (1) AU2016326666B2 (uk)
CA (1) CA2992602A1 (uk)
CL (2) CL2018000732A1 (uk)
CO (1) CO2018003863A2 (uk)
CR (1) CR20180221A (uk)
IL (1) IL257565B2 (uk)
MA (1) MA42924A (uk)
MX (1) MX2018003537A (uk)
MY (1) MY191756A (uk)
PE (1) PE20181363A1 (uk)
PH (1) PH12018500657A1 (uk)
RU (1) RU2763916C2 (uk)
SG (1) SG10201911226QA (uk)
TW (1) TWI748962B (uk)
UA (1) UA125432C2 (uk)
WO (1) WO2017053807A2 (uk)
ZA (1) ZA201800770B (uk)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101482483B1 (ko) 2006-04-07 2015-01-15 에르피오 세러퓨틱스 인코포레이티드 인간 단백질 타이로신 포스파타아제 베타(ｈｐｔｐ베타)에 결합하는 항체 및 그의 용도
EP2268673B1 (en) 2008-03-28 2017-10-25 The Regents of The University of California Polypeptide-polymer conjugates and methods of use thereof
CA2850830A1 (en) 2011-10-13 2013-04-18 Aerpio Therapeutics, Inc. Methods for treating vascular leak syndrome and cancer
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
JP6959912B2 (ja) 2015-09-23 2021-11-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体の最適化変異体
WO2017075189A1 (en) * 2015-10-27 2017-05-04 University Of Massachusetts Factor h-fc immunotherapy
WO2017100470A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 The Regents Of The University Of California Methods of treating an ocular disease or disorder
KR20250057128A (ko) 2015-12-30 2025-04-28 코디악 사이언시스 인코포레이티드 항체 및 이의 접합체
KR20240052871A (ko) 2016-04-27 2024-04-23 애브비 인코포레이티드 항-il-13 항체를 이용한 il-13 활성이 유해한 질환의 치료 방법
US10253094B2 (en) 2016-07-20 2019-04-09 Aerpio Therapeutics, Inc. Antibodies that target human protein tyrosine phosphatase-beta (HPTP-beta) and methods of use thereof to treat ocular conditions
IL269506B2 (en) 2017-03-22 2024-04-01 Genentech Inc Hydrogel cross-linked hyaluronic acid prodrug compositions and methods
EP3600442A1 (en) 2017-03-22 2020-02-05 Genentech, Inc. Optimized antibody compositions for treatment of ocular disorders
AU2018266324B2 (en) * 2017-05-06 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating eye disorders with APLNR antagonists and VEGF inhibitors
CA3061196A1 (en) * 2017-05-26 2018-11-29 Scott Whitcup A topical composition for treating rosacea and a method for treating rosacea with the same
MX2019014572A (es) * 2017-06-05 2020-07-29 Janssen Biotech Inc Métodos de ingeniería de carga superficial para la producción de anticuerpos biespecíficos.
WO2019094387A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Hydrogel drug delivery systems for the treatment of pediatric growth plate injuries
AU2018375398C1 (en) 2017-11-30 2026-01-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of a VEGF antagonist to treat angiogenic eye disorders
WO2019129679A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for improving vegf-receptor blocking selectivity of an anti-vegf antibody
US12071476B2 (en) 2018-03-02 2024-08-27 Kodiak Sciences Inc. IL-6 antibodies and fusion constructs and conjugates thereof
CA3130653A1 (en) 2018-03-09 2019-09-12 Valitor, Inc. Multivalent peptide conjugates for sustained intra-articular treatment of joint inflammation
IL277333B2 (en) * 2018-03-16 2026-03-01 Novartis Ag VEGF antagonists for use in the treatment of diabetic macular edema
JP7339325B2 (ja) * 2018-03-20 2023-09-05 ナショナル ヘルス リサーチ インスティテューツ 単離抗体、医薬組成物、単離抗体結合体、ダイマー化阻害方法、シグナル伝達阻害方法、管新生阻害方法、治療方法、および断片検出方法
CN108752473B (zh) * 2018-05-03 2021-08-31 陕西师范大学 一种抗c5全人源单链抗体c5b3及其应用
JP7235770B2 (ja) 2018-05-10 2023-03-08 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 高濃度ｖｅｇｆ受容体融合タンパク質を含む製剤
US10894824B2 (en) 2018-09-24 2021-01-19 Aerpio Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antibodies that target HPTP-β (VE-PTP) and VEGF
US12594345B2 (en) 2018-09-26 2026-04-07 Ascendis Pharma A/S Degradable hyaluronic acid hydrogels
JP7526728B2 (ja) * 2018-12-21 2024-08-01 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 抗ｖｅｇｆ抗体のｖｅｇｆ－ｒ１への結合阻害を改善する方法
WO2020180700A1 (en) * 2019-03-01 2020-09-10 Fred Hutchinson Cancer Research Center Protein residue mapping using a combination of deep mutational scanning and phage display high throughput sequencing
CN109942685A (zh) * 2019-03-13 2019-06-28 中山大学附属第五医院 应用细菌展示文库筛选特异结合ddx24解旋酶的多肽
WO2020219497A1 (en) * 2019-04-25 2020-10-29 The University Of Massachusetts Compositions and methods for treatment of angiogenesis related diseases
MA54325A (fr) 2019-06-05 2022-05-11 Regeneron Pharma Dispositifs et procédés pour l'administration précise de doses
MY203236A (en) * 2019-07-19 2024-06-19 Sinocelltech Ltd Humanized anti-vegf fab antibody fragment and use thereof
AU2020364071A1 (en) * 2019-10-10 2022-05-26 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
KR102390931B1 (ko) * 2020-02-07 2022-04-26 한국과학기술원 보체 단백 분해 산물 C3a와 결합할 수 있는 신규한 폴리펩타이드 및 이의 용도
US20230091170A1 (en) * 2020-04-10 2023-03-23 Veravas, Inc. Enrichment of antigen-specific antibodies for analytic and therapeutic use
US11524998B2 (en) 2020-07-16 2022-12-13 Novartis Ag Anti-betacellulin antibodies, fragments thereof, and multi-specific binding molecules
GB202011993D0 (en) 2020-07-31 2020-09-16 Adc Therapeutics Sa ANTI-IL 13Ra2 antibodies
CN112137961A (zh) * 2020-09-30 2020-12-29 严鹏科 一种雷帕霉素组合物及其制备方法
WO2022086501A1 (en) * 2020-10-20 2022-04-28 The Scripps Research Institute Methods and compositions for treating ocular vascular disorders
JP7633397B2 (ja) * 2020-10-21 2025-02-19 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 眼の疾患の処置のための二重特異性抗ＶＥＧＦ及び抗ＴｒｋＢ結合分子
CA3211803A1 (en) * 2021-02-27 2022-09-01 Eluminex Biosciences (Suzhou) Limited Antibody fusion proteins targeting il-6 receptor and angiogenic factors
WO2023001288A1 (zh) * 2021-07-23 2023-01-26 百奥泰生物制药股份有限公司 整合素GPIIb/IIIa拮抗剂及其和抗VEGF抗体联合用药的应用
CU24770B1 (es) * 2021-12-15 2025-09-01 Ct Ingenieria Genetica Biotecnologia Polipéptidos que se unen al factor de crecimiento del endotelio vascular y al factor básico de crecimiento de fibroblastos
CA3251000A1 (en) * 2022-02-10 2023-08-17 Kodiak Sciences Inc. METHODS FOR PURIFYING A PRODUCT
AU2023241824A1 (en) * 2022-03-26 2024-10-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific antibodies to hiv-1 env and their use
EP4514845A1 (en) 2022-04-29 2025-03-05 Broadwing Bio LLC Bispecific antibodies and methods of treating ocular disease
MA68845A1 (fr) 2022-06-17 2025-11-28 Apogee Therapeutics, Inc. Anticorps se liant à l'interleukine 13 et méthodes d'utilisation
USD1120314S1 (en) 2022-11-30 2026-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dose delivery device
WO2024123791A1 (en) * 2022-12-05 2024-06-13 Kodiak Sciences Inc. Formulations for dual vegf/il-6 inhibitors
IL326700A (en) * 2023-09-11 2026-04-01 Hoffmann La Roche Multispecific fusion proteins targeting angiogenic and inflammatory factors

Family Cites Families (186)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
FR2596047B1 (fr) 1986-03-21 1988-05-13 Charbonnages Ste Chimique Procede de production de styrene
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5688666A (en) 1988-10-28 1997-11-18 Genentech, Inc. Growth hormone variants with altered binding properties
ES2052027T5 (es) 1988-11-11 2005-04-16 Medical Research Council Clonacion de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
CA2109602C (en) 1990-07-10 2002-10-01 Gregory P. Winter Methods for producing members of specific binding pairs
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
AU662148B2 (en) 1991-04-10 1995-08-24 Scripps Research Institute, The Heterodimeric receptor libraries using phagemids
US5144088A (en) 1991-04-26 1992-09-01 Aristech Chemical Corporation Manufacture of neopentyl glycol (I)
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
CA2116774C (en) 1991-09-19 2003-11-11 Paul J. Carter Expression in e. coli antibody fragments having at least a cysteine present as a free thiol. use for the production of bifunctional f(ab') 2 antibodies
EP0605522B1 (en) 1991-09-23 1999-06-23 Medical Research Council Methods for the production of humanized antibodies
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69233528T2 (de) 1991-11-25 2006-03-16 Enzon, Inc. Verfahren zur Herstellung von multivalenten antigenbindenden Proteinen
PT1696031E (pt) 1991-12-02 2010-06-25 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
JP3507073B2 (ja) 1992-03-24 2004-03-15 ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミティド 特異的結合対の成員の製造方法
DE69303494T2 (de) 1992-11-13 1997-01-16 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
JP3720353B2 (ja) 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
US5872094A (en) 1993-01-06 1999-02-16 The General Hospital Corporation Method for attaching cartilaginous tissue, cartilage matrix protein or link protein to a surface
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
JPH08511420A (ja) 1993-06-16 1996-12-03 セルテック・セラピューテイクス・リミテッド 抗 体
US5635388A (en) 1994-04-04 1997-06-03 Genentech, Inc. Agonist antibodies against the flk2/flt3 receptor and uses thereof
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5675063A (en) 1995-02-28 1997-10-07 Loyola University Of Chicago Immortalized rabbit hybridoma fusion partner
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
JP4318752B2 (ja) 1996-05-31 2009-08-26 ヘルス・リサーチ・インコーポレーテッド 抗エンドグリンモノクローナル抗体および抗血管新生治療におけるその使用
IL132240A0 (en) 1997-04-07 2001-03-19 Genentech Inc Anti-vegf antibodies
US20070059302A1 (en) 1997-04-07 2007-03-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
CA2205771C (en) 1997-05-22 2002-05-14 Hyal Pharmaceutical Corporation Improved delivery of disease modifiers
WO1998054325A1 (en) 1997-05-29 1998-12-03 The Government Of The United States Of America,Re Presented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human frp and fragments thereof including methods for using them
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
CA2293829C (en) 1997-06-24 2011-06-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
DE69840412D1 (de) 1997-10-31 2009-02-12 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
WO2000034337A1 (en) 1998-12-10 2000-06-15 Tsukuba Research Laboratory, Toagosei Co., Ltd. Humanized monoclonal antibodies against vascular endothelial cell growth factor
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR100940380B1 (ko) 1999-01-15 2010-02-02 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
PT1176195E (pt) 1999-04-09 2013-07-18 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para controlar a actividade de uma molécula funcional sob o ponto de vista imunológico
IL145941A (en) 1999-04-28 2007-08-19 Univ Texas Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
PT1222292E (pt) 1999-10-04 2005-11-30 Medicago Inc Metodo para regulacao da transcricao de genes exogenos na presenca de azoto
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Kyowa Kirin Co., Ltd. The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
ATE315789T1 (de) 1999-11-16 2006-02-15 Genentech Inc Elisa für vegf
EP1240319A1 (en) 1999-12-15 2002-09-18 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
ES2274823T3 (es) 1999-12-29 2007-06-01 Immunogen, Inc. Agentes cototoxicos que comprenden doxorrubicinas y daunorrubicinas y su utilizacion terapeutica.
CN1299833A (zh) 1999-12-30 2001-06-20 华西医科大学口腔医学研究所 抗人血管内皮生长因子单链抗体及其制备方法
AU2001247616B2 (en) 2000-04-11 2007-06-14 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
DK2314686T4 (da) 2000-10-06 2023-08-21 Kyowa Kirin Co Ltd Celler, der danner antistofsammensætninger
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
IL155977A0 (en) 2000-11-30 2003-12-23 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
DE60236646D1 (de) 2001-04-13 2010-07-22 Human Genome Sciences Inc Anti-VEGF-2 Antikörper
AU2002252631A1 (en) 2001-04-13 2002-10-28 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2
NZ581474A (en) 2001-08-03 2011-04-29 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
KR100988949B1 (ko) 2001-10-25 2010-10-20 제넨테크, 인크. 당단백질 조성물
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
CN1187373C (zh) 2002-03-20 2005-02-02 上海中信国健药业有限公司 人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体及其制法和药物组合物
AU2003236017B2 (en) 2002-04-09 2009-03-26 Kyowa Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
US20040110704A1 (en) 2002-04-09 2004-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
EP1502603A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk AN ANTIBODY COMPOSITION CONTAINING MEDICAMENT FOR PATIENTS WITH Fc gamma RIIIa POLYMORPHISM
AU2003236020B2 (en) 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
CN1672160B (zh) * 2002-05-20 2010-06-09 埃博马可西斯公司 基于前导抗体的结构构建抗体文库的方法
CA2488441C (en) 2002-06-03 2015-01-27 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US8956160B2 (en) 2002-07-02 2015-02-17 Ranir, Llc Device and method for delivering an oral care agent
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1944320A1 (en) 2002-12-16 2008-07-16 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
NZ621449A (en) 2003-05-30 2015-07-31 Genentech Inc Treatment with anti-vegf antibodies
US7758859B2 (en) 2003-08-01 2010-07-20 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2005044853A2 (en) * 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
AU2004261980A1 (en) 2003-08-01 2005-02-10 Genentech, Inc. Antibody CDR polypeptide sequences with restricted diversity
AU2004279742A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Fused protein composition
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
PT1692182E (pt) 2003-11-05 2010-05-13 Roche Glycart Ag Anticorpos de cd20 com uma afinidade de ligação acrescida ao receptor fc e uma função efectora acrescida
EP3434275A1 (en) 2003-11-06 2019-01-30 Seattle Genetics, Inc. Assay for cancer cells based on the use of auristatin conjugates with antibodies
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
CA2561686C (en) 2004-03-31 2014-12-02 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
PT1737891E (pt) 2004-04-13 2013-04-16 Hoffmann La Roche Anticorpos anti p-selectina
US20050244472A1 (en) 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Intraocular drug delivery systems containing excipients with reduced toxicity and related methods
US7968085B2 (en) 2004-07-05 2011-06-28 Ascendis Pharma A/S Hydrogel formulations
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
ES2579805T3 (es) 2004-09-23 2016-08-16 Genentech, Inc. Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US7723472B2 (en) 2005-02-28 2010-05-25 The Regents Of The University Of California Extracellular matrix binding chimeric proteins and methods of use thereof
US20060204548A1 (en) 2005-03-01 2006-09-14 Allergan, Inc. Microimplants for ocular administration
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
JP2009508852A (ja) 2006-01-23 2009-03-05 クワンジュ インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジー 薬理活性物質と粘膜粘着性高分子とが共有結合されたコンジュゲート及びこれを用いた薬理活性物質の経粘膜運搬方法
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
DK2059533T3 (da) 2006-08-30 2013-02-25 Genentech Inc Multispecifikke antistoffer
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
US11078262B2 (en) 2007-04-30 2021-08-03 Allergan, Inc. High viscosity macromolecular compositions for treating ocular conditions
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
TWI580694B (zh) 2007-11-30 2017-05-01 建南德克公司 抗-ｖｅｇｆ抗體
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
CA2712224C (en) 2008-02-01 2016-03-08 Ascendis Pharma As Prodrug comprising a drug linker conjugate
WO2009111159A2 (en) 2008-03-03 2009-09-11 New York University Biocompatible materials containing stable complexes of tsg-6 and hyaluronan and method of using same
EP2268673B1 (en) 2008-03-28 2017-10-25 The Regents of The University of California Polypeptide-polymer conjugates and methods of use thereof
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
US8821870B2 (en) 2008-07-18 2014-09-02 Allergan, Inc. Method for treating atrophic age related macular degeneration
RU2547596C2 (ru) 2008-09-03 2015-04-10 Дженентек, Инк. Полиспецифические антитела
EP2349339A4 (en) 2008-10-16 2015-01-07 Kathleen Cogan Farinas EXTENDED MEDICATION DELIVERY SYSTEM
US8133979B2 (en) 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
CA3045436C (en) 2009-01-29 2025-10-07 Forsight Vision4, Inc. ADMINISTRATION OF A MEDICATION IN THE POSTERIOR SEGMENT
AU2010273974B2 (en) * 2009-07-17 2016-01-14 Bioatla, Llc Simultaneous, integrated selection and evolution of antibody/protein performance and expression in production hosts
RU2554854C9 (ru) 2009-07-31 2017-02-03 Асцендис Фарма Ас Биоразлагаемые нерастворимые в воде гидрогели на основе полиэтиленгликоля
US20110082052A1 (en) 2009-08-11 2011-04-07 Academia Sinica Phage displaying system expressing single chain antibody
US8580714B2 (en) 2009-10-14 2013-11-12 Janssen Biotech, Inc. Methods of affinity maturing antibodies
CN102686609A (zh) * 2009-10-23 2012-09-19 加文医学研究所 修饰的可变域分子及其生产和使用方法
WO2011066417A2 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Carnegie Mellon University Antibodies and conjugates for modulators of angiogenesis
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
CA2806252C (en) 2010-07-29 2019-05-14 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
CN103209664A (zh) 2010-08-05 2013-07-17 弗赛特影像4股份有限公司 可植入的治疗装置
WO2012019047A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Forsight Vision4, Inc. Subconjunctival implant for posterior segment drug delivery
US9527925B2 (en) * 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
WO2013022848A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin antibodies and methods of use
SI2755600T1 (sl) 2011-09-16 2021-08-31 Forsight Vision4, Inc. Naprava za izmenjavo tekočine
RU2014118642A (ru) 2011-10-12 2015-11-20 Асцендис Фарма Офтальмолоджи Дивижн А/С Предотвращение и лечение глазных нарушений
AU2012328880B2 (en) 2011-10-24 2017-02-23 Halozyme, Inc. Companion diagnostic for anti-hyaluronan agent therapy and methods of use thereof
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
US10010448B2 (en) 2012-02-03 2018-07-03 Forsight Vision4, Inc. Insertion and removal methods and apparatus for therapeutic devices
LT3495387T (lt) 2012-07-13 2021-11-25 Roche Glycart Ag Bispecifiniai anti-vegf / anti-ang-2 antikūnai ir jų panaudojimas akių kraujagyslių ligoms gydyti
US10519226B2 (en) 2012-10-11 2019-12-31 Ascendis Pharma Opthalmology Division A/S VEGF neutralizing prodrugs for the treatment of ocular conditions
EP2917238A1 (en) 2012-11-08 2015-09-16 Eleven Biotherapeutics, Inc. Il-6 antagonists and uses thereof
US20140154255A1 (en) * 2012-11-30 2014-06-05 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
CA2891686A1 (en) 2012-12-18 2014-06-26 Novartis Ag Compositions and methods that utilize a peptide tag that binds to hyaluronan
CN103204933B (zh) * 2013-03-08 2014-11-05 上海赛伦生物技术有限公司 一种稳定性高的人源抗vegf抗体及其应用
WO2014165513A2 (en) 2013-04-02 2014-10-09 The Regents Of The University Of California Ethylsulfonated hyaluronic acid biopolymers and methods of use thereof
WO2015085234A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Forsight Vision4, Inc. Implantable therapeutic devices
GB201400994D0 (en) 2014-01-21 2014-03-05 Ucl Business Plc Drug delivery system
EP3160990A2 (en) 2014-06-25 2017-05-03 Novartis AG Compositions and methods for long acting proteins
WO2016073157A1 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Anti-ang2 antibodies and methods of use thereof
US11142571B2 (en) 2014-11-07 2021-10-12 Sesen Bio, Inc. IL-6 antibodies
AU2015346460A1 (en) 2014-11-10 2017-03-23 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
CN107108745B (zh) 2014-11-19 2021-01-12 基因泰克公司 抗bace1的抗体和其用于神经疾病免疫疗法的用途
ES2882276T3 (es) * 2015-04-14 2021-12-01 Academia Sinica Anticuerpo humano anti-VEGFR2 para terapia antiangiogénica y terapia dirigida contra el cáncer
JP6959912B2 (ja) 2015-09-23 2021-11-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆ抗体の最適化変異体
WO2017100470A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 The Regents Of The University Of California Methods of treating an ocular disease or disorder

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180053315A (ko) 2018-05-21
CN108137681B (zh) 2024-06-18
CN108137681A (zh) 2018-06-08
AU2016326666A1 (en) 2018-02-08
EP3353203A2 (en) 2018-08-01
US20190031750A1 (en) 2019-01-31
RU2763916C2 (ru) 2022-01-11
PE20181363A1 (es) 2018-08-27
US10072075B2 (en) 2018-09-11
US20210115124A1 (en) 2021-04-22
WO2017053807A2 (en) 2017-03-30
IL257565B1 (en) 2024-04-01
WO2017053807A3 (en) 2017-05-26
US12121586B2 (en) 2024-10-22
PH12018500657A1 (en) 2018-10-15
US20190100581A1 (en) 2019-04-04
US20170096479A1 (en) 2017-04-06
MY191756A (en) 2022-07-14
US10899828B2 (en) 2021-01-26
CA2992602A1 (en) 2017-03-30
MA42924A (fr) 2018-08-01
BR112018005737A2 (en) 2018-10-09
CO2018003863A2 (es) 2018-10-10
CN116987187A (zh) 2023-11-03
JP6959912B2 (ja) 2021-11-05
HK1254198A1 (zh) 2019-07-12
JP2018531005A (ja) 2018-10-25
AU2016326666B2 (en) 2023-06-15
CR20180221A (es) 2018-07-09
SG10201911226QA (en) 2020-01-30
TW201718642A (zh) 2017-06-01
JP2022017288A (ja) 2022-01-25
CL2021000519A1 (es) 2021-07-23
KR102725051B1 (ko) 2024-11-04
RU2018114723A3 (uk) 2020-09-08
RU2018114723A (ru) 2019-10-23
CL2018000732A1 (es) 2019-02-22
TWI748962B (zh) 2021-12-11
US10906968B2 (en) 2021-02-02
IL257565B2 (en) 2024-08-01
IL257565A (en) 2018-04-30
ZA201800770B (en) 2021-05-26
MX2018003537A (es) 2018-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12121586B2 (en) Optimized variants of anti-VEGF antibodies
US11891437B2 (en) Methods of treating ocular disorders by administering a VEGF-binding antibody covalently linked to a hyaluronic acid polymer
JP2018531005A6 (ja) 抗ｖｅｇｆ抗体の最適化変異体
UA122673C2 (uk) Антитіло, що специфічно зв'язується з людським il-6
HK40098460A (zh) 抗-vegf抗体的优化的变体
BR112018005737B1 (pt) Anticorpo isolado, composições farmacêuticas, conjugados de anticorpo, proteína de fusão e usos do anticorpo
HK1254198B (zh) 抗-vegf抗体的优化的变体
HK40016409B (zh) 用於治疗眼部病症的优化的抗体组合物