WO1994012208A1 - Procede pour produire une composition contenant du plasminogene - Google Patents

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phosphate
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virus
trialkyl
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Shinobu Motizuki
Takashi Kobayashi
Kenji Tanaka
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GC Biopharma Corp
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    • A61L2103/00—Materials or objects being the target of disinfection or sterilisation
    • A61L2103/05—Living organisms or biological materials

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a highly active plasminogen-containing thread, which is substantially converted into a virus from a plasminogen-containing neat substance capable of producing a virus.
  • Plasminogen is activated by a plasminogen activator such as perokinase to become plasmin, which dissolves fipurin and results in fibrinolysis. For this reason, plasminogen has been widely accepted for clinical application as a fibrinolytic healing agent (ij ⁇ thrombus dissolving agent). In particular, the usefulness of lysine plasmin, whose end is lysine, is expected.
  • This lysinoplasminogen is glutamic plasminogenes, that is, the lysine between 76 and 77 is cleaved from the N-terminal of plasminogen where the N-terminal is difficult to glitamil.
  • viruses such as the virus A IDS virus
  • a method of heating male protein pirates with a separator Japanese Patent Laid-Open Nos. 55-145615, 56-139422, 56-106594, etc.
  • Japanese Patent Application Laid-Open (JP-A) No. 55-500548, etc. Japanese Patent Application Laid-Open (JP-A) No. 55-500548, etc.
  • a method of contacting and treating a trialkyl phosphate JP-A-60-511116, etc.
  • heat treatment can cause heat-resistant virus fever
  • trialkyl phosphate treatment has a non-enveloped virus-containing edible Itt.
  • the present invention provides a method for minimizing loss of plasminogen activity, efficiently inactivating «viruses, and producing more plasminogen-containing genuine products as products.
  • the present invention provides a method for treating edible plasminogen-containing yarn of a virus with a trialkyl phosphate and a fiber in a 3 ⁇ 43 ⁇ 4 state,
  • the thigh method of the virus-containing plasminogen-containing fiber comprising the virus is the thigh method of the virus-containing plasminogen-containing fiber comprising the virus.
  • the plasminogen to which the method of the present invention is applied is not particularly limited, and may be derived from fiber, derived from fiber, transfected or cultured by fiber.
  • plasminogen-containing product solution state
  • the purity of the plasminogen-containing yarn when the dish is mixed with the trialkyl phosphate of the present invention is not particularly limited, and it can be applied to any fine thread.
  • the dish with the alkyl phosphate may be subjected to an additional step in the separation and purification of plasminogen.
  • the trialkyl phosphate to be ffled in the present invention is not particularly limited, but is preferably a tree (n-butyl) phosphate, a tree (tert-butylinole) phosphate, a tree (n-hexinole) phosphate, Suitable for tri- (2-ethylhexyl) phosphate and tri- (n-decyl) phosphate.
  • Particularly preferred trialkyl phosphate is tree (n-butyl) phosphate (hereinafter referred to as TNB P ).
  • TNB P tree (n-butyl) phosphate
  • 2 «mixing of trialkyl phosphates having different J3 ⁇ 4 ⁇ is possible.
  • the trialkyl phosphates to be converted according to the invention can be used in amounts ranging from 0.1 to 10 (wZv)%, preferably in amounts ranging from about 0.1 to 3 (w / V)%.
  • Trialkyl phosphates can be ⁇ ffl with or without surfactant.
  • the trialkyl phosphate is combined with the surfactant !!
  • This surface activity can be added at any stage before, simultaneously with, or after the trialkyl phosphate is viewed as a brassminogen-containing thread.
  • Surfactant »J's action is plasmino The purpose is to enhance the contact with the trialkyl phosphate.
  • Interfacial activity includes polyoxyethylene for fatty acids, partial esters of sorbitonohydrates such as Tween 80, Tween 20 and Polysorbate 80, and nonionic oils such as Triton X100 (Oxche (Citylated alkylphenol).
  • Triton X100 Oxche (Citylated alkylphenol).
  • Dexicono sodium and Zwittertergens a synthetic ybitterteron detergent known as sulfobetaine ⁇ such as N-dodecyl-N, N-dimethyl-1-ammonio-l-ethane Sulfonate, and the same! ⁇
  • non-ionic lakes such as octyl- ⁇ , D_darcoviranoside.
  • the amount of surfactant used is not critical, for example, it can be shelved in the range of about 0.001% to about 10%, preferably about 0.01% to 3%.
  • Trialkyl phosphate treatment is carried out using envelope coat virus such as BJfF ⁇ : virus, nonAnonBff ⁇ : virus, human immunity ⁇ whole virus (HIV), vesicular yeast virus (Vesicu1arS). to matitis V irus) and Sindbis virus (S indbis virus). Further, by performing the heat treatment in a further state for a sufficient time, heat-sensitive viruses can be inactivated.
  • Treatment of plasminogen-containing extinct products with the trialkyl phosphates of the present invention At a temperature of 0 ° C to 60 ° C, preferably 20 ° C to 40 ° C, preferably 30 minutes or more, more preferably 1 to 30 hours, and still more preferably 3 to 30 hours. Perform for 10 hours. In addition, this treatment is preferably performed under a weak acid condition, and specifically, pH 4 to 6, preferably 4.5 to 5.5.
  • gnoretamino plasminogen whose N-terminal is glutamic acid wisteria, is strong, and corn ffi-alcohol fractionation method II + III fraction, or glutamino and lysino plasminogen in fraction III fraction ⁇ M.
  • glutamino I ⁇ plasminogen it is necessary to convert glutamino I ⁇ plasminogen to lysino.It is necessary to carry out the trialkylphosphotreatment under ⁇ ⁇ p conditions of ⁇ ⁇ .
  • glutamino can be effectively converted to lysyl form.
  • lysino I ⁇ plasminogen can be obtained without impairing the activity of plasminogen by performing the book under the protease ISminded J or under the protease inhibition of the prescribed marrow. it can.
  • Protease inhibition is not particularly limited as long as it is a substance that substantially inhibits protease activity.
  • ⁇ amino acids such as ⁇ -aminocaproic acid (EACA), lysine, and arginine
  • chemicals such as DFP and PMSF
  • proteins such as aprotin
  • the trialkyl phosphate is removed.
  • a surfactant or a stabilizer are also removed. Any method may be used, for example, a method of adsorbing plasminogen by affinity chromatography or ion exchange chromatography, a method of recovering plasminogen by plasminogen, and a method of collecting plasminogen by gel filtration. It can be used to separate things. These methods may combine 2 m ⁇ _b ⁇ or repeat one type of method a number of times. Further, the heat treatment can be performed at the time of removing the trialkyl phosphite.
  • the treatment of the trialkyl phosphate is preferably carried out in the The minogen-containing material is processed by affinity mouth chromatography or gel or ion exchange chromatography.
  • Treatment with affinity chromatography, gel filtration, or ion-exchange chromatography can increase trialkyl phosphate, surfactants, and stabilizers.
  • the presence of extraordinary heat, such as non-enveloped coat virus can be eliminated, if at all, by this affinity chromatography or gel thigh or ion exchange mouth chromatography. is there.
  • Affinity mouth chromatography can be enhanced by chromatographic imaging of plasminogen with fixed lysine.
  • Heating is usually carried out at 30 ° C. to 100 ° C., preferably 55 ° C. to 85 ° C., usually for 3 to 200 hours, preferably 10 to 100 hours. .
  • stable proteins include human serum albumin, sugars, sugar alcohols, and amino acids.
  • This plasminogen-containing sickle has a TN BP concentration of 0.3% and a TNB P (tri- (n-butyl) phosphate) of 80% to be 1%.
  • Tween 80 were added thereto, and 1 ml of the mixture was treated at pH 5 at 30 ° C. for 6 hours.
  • This S removed TNBP and Tween 80.
  • the thus obtained plasminogen was purified to a desired purity, and then divided into a dissolution layer to a predetermined concentration.
  • the ⁇ -treated plasminogen was heat-treated at 60-80 ° C for 72 hours for 72 hours to remove virus- or ⁇ -modified lysino-plasminogen-containing pirates!
  • the supernatant was injected into lysine-sepharose (3 liters) to adsorb plasminogen, then washed with 0.9% glycine II (pH 7.2) containing 0.9% sodium chloride, and further washed with 1M sodium chloride. After washing with 0.9% glycine solution containing 0.25M lysine (pH 7.2), the adsorbed plasminogen was eluted using 0.9% glycine containing 0.25M lysine (pH 7.2).
  • the eluate was subjected to the procedure described above to obtain 250 ml of a liquid.
  • a ⁇ prepared by adding 0.3% TNBP and 1% Tween 80 per 1 ml of the plasminogen-containing solution was prepared, and treated with pH 5.0 at 30 ° C. for 6 hours.
  • the treated plasminogen dish was applied to a Cefacryl S300 column (10 liters), which had been converted to 0.9% glycine II (pH 7.2) containing 0.9% sodium salt and sodium chloride, and gel II was applied. went.
  • Fraction 11 + 111 paste extract residue obtained by the cold ethanol fractionation of corn containing 100 aprotinin and 0.1 M sodium chloride After suspending in Tris-HCl buffer (pH 8.3) and stirring for a short time, the supernatant was separated by centrifugation and filtration.
  • the supernatant is injected into lysine-sepharose (3 liters) to adsorb plasminogen, then washed with 0.9% glycine solution (pH 7.2) containing 0.9% sodium chloride, After washing with a 0.9% glycine dish containing sodium chloride (pH 7.2), the adsorbed plasminogen was eluted using a 0.9% glycine solution containing 0.25M lysine (pH 7.2).
  • aprotinin at a concentration of 100 ii / ml (final release) was added, followed by fibrillation to obtain 220 ml of fibrous solution.
  • a solution was prepared by adding 0.3% TNBP, 1% Tween 80 and 100 iiim1 (final concentration) of aprotinin per 1 ml of the plasminogen-containing ⁇ ⁇ solution, and the solution was prepared at pH 7.2 and 30 ° C. MS for 6 hours.
  • the plasminogen dish after the treatment was applied to a Cefacryl S300 column (10 liters) made up of 0.9% glycine broth (pH 7.2) containing 0.9% sodium chloride, and the gel was tipped.
  • Highly active and virulent A bacteriostat containing 65% glutamine can be prepared.
  • plasminogen-containing extinct material that is efficiently virus-enhanced without disrupting the activity of plasminogen is obtained.
  • the trianolequil phosphate key is weak against viruses without an envelope.
  • the plasminogen-containing composition according to the present invention since the plasminogen-containing composition according to the present invention has a step of attaching to the heating key, it is possible to significantly inactivate the force and the virulent virus by passing through this step.
  • the amount of trialkylphosphate treatment ax should be slightly lower than that of glutamyl-type plasminogen. This can be achieved by converting to lysyl form.
  • the method of the present invention is a very preferable method for industrial production of a plasminogen-containing composition as a product, and is useful for producing a plasminogen-reduced virus. Particularly useful.

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Description

明 細 書
プラスミノ一ゲン含有糸！^物の 方法 技術分野
本発明は、 ウィルス の可^ f生のあるプラスミノ一ゲン含有ネ誠物から実質 的にウィルスか · ^化された高活性のプラスミノ一ゲン含有糸 物の^ 法に 関するものである。 背景技術
プラスミノ一ゲンはゥロキナーゼ等のプラスミノ一ゲン活性化因子によって活 性化されてプラスミンとなり、 これがフィプリンを溶解して線溶 をもたらす。 このため、 プラスミノーゲンは線溶系の治^ ij (ώι栓溶解剤） として臨床応用の 可倉 く認められている。特にその Ν末がリジル麟であるリジ プラスミノ 一ゲンの有用性が期待されて、る。
このリジノ プラスミノーゲンは、 グルタミ プラスミノーゲス即ち、 N 端がグリタミル難であるプラスミノーゲンの N端から 76と 77のリジル 間が切断されて «される。
プラスミノーゲンはヒト ]«に由来するため、 ウィルス、 例えば、 ウィル スゃ A IDSウィルス等がその含有糸賊物中に する恐れがある。 そこで、 こ れらのウィルス伝播を防ぐため、雄蛋白質含 賊物を離機で加熱する方 法（特開昭 55— 145615、 同 56— 139422、 同 56— 106594 等）ヽ 態で加熱する方法（特表昭 55— 500548等）、 トリアルキル ホスフェートを接触'処理する方法（特開昭 60— 51 1 16等）力く知られてい る。 しかし、 加熱処理では熱に強いウィルスカ戰存する可能性があり、 トリアル キルホスフェート処理では非エンベロープウィルス力 存する可食 Ittがある。 ま た、 トリアルキルホスフエ一ト処理中に蛋白質の活性が低下する問題があった。 これらの問題を すべく、 トリアルキルホスフエ一トによる^ i ·処理後に ¾»1態で加^ f 態で加熱処理する方法（EP公開 378208)、 態で トリアルキルホスフエ一トによる接触 ·鍵および加熱処理を同時に行う方法 (特開平 2— 1 8 0 8 3 3 )等が提案されている。
本発明者らは、上記事情を考慮して、 プラスミノーゲン含有糸诚物の^^に適 用すベく検討を行つた。本発明はプラスミノ一ゲンとしての活性の損失を最小限 に止め、 効率よく «ウィルスを不活化し、 品としてより なプラスミノ —ゲン含有 $誠物を製造する方法を するものである。
発明の開示
本発明は、 ウィルス «の可食 生のあるプラスミノーゲン含有糸 物を Φ¾¾ 优態において、 トリアルキルホスフヱ一トと纖 ·処理し、 そして
②トリアルキルホスフエ一トを除去する処理を行う
ことからなるウィルスの ί¾性化されたプラスミノ一ゲン含有繊物の腿方法 t¾ 。
本発明の方法が適用されるプラスミノ一ゲンは特に限定されるものではなく、 纖由来、 纖由来、遣 且換えあるいは纖培養により得られうる。
本発明の方法が適用される出発原料としてのプラスミノ一ゲン含^¾£物 （溶 液状態） には特に制限はな 例えば、血清、 m «抽出液、 mm 織抽出液、 «から得たコーンの低温アルコール分画法の第 II + I II画分あるい は第 I II画分、 その他の、雄または糸職抽出液を各種分画法により擁して得 た画分からなる赚、遣 ^且換え宿主または 培養により得られる培養液、 市販のプラスミノ一ゲン, (. m 力く例示される。
また、 本発明のトリアルキルホスフヱ一トとの皿時のプラスミノ一ゲン含有 糸 ;物の精 s¾gは、特に限定されるものではなく、 任意の精 のものに適用可 能であり、 従ってトリアルキルホスフエ一トとの皿はプラスミノ一ゲンの分離、 精製の 、ずれの段階に删してもよい。
本発明に fflされるトリアルキルホスフエ一トは特に限定されないが、好適に はトリー （n—ブチル） ホスフヱート、 トリー （ t e r t—プチノレ） ホスフエ一 ト、 トリー （n—へキシノレ） ホスフヱ一ト、 トリ一 （2—ェチルへキシル） ホス フェート、 トリ一 （n—デシル） ホスフヱートなど力举げれる。特に好ましいト リアルキルホスフェートは、 トリー （n—プチル） ホスフェート （以下 TNB P と言う） である。 なお、 2 «J¾±の異なるトリアルキルホスフェートの混^ も翻すること力《できる。
本発明に翻されるトリアルキルホスフェートは、 0. 0 1〜1 0 (wZv) %の範囲の量、好ましくは約 0. 1〜 3 (w/ V ) %の範囲の量にぉ ヽて綱さ トリアルキルホスフヱートは界面活 を伴ってまたは伴わないで^ fflするこ と力できる。好ましくは、 トリアルキルホスフヱ一トを界面活 !】と組み合わせ ^fflする。 この界面活 は、 トリアルキルホスフェ一卜がブラスミノ一ゲン含 有糸誠物と観する前、 同時、 または後の任意の段階に添加すること力できる。 界面活 »Jの作用は、 プラスミノ
Figure imgf000005_0001
トリアルキル ホスフエ一トとの接触を強化することである。
界面活翻としては、 脂肪酸のポリオキシエチレン誘稱、 ソルビトーノ 水 物の部分エステル、 たとえばトウィーン 80、 トウイーン 20およびポリソルべ ート 80、 および非イオン性油溶水翻、 たとえばトリトン X 1 00 (ォキシェ チル化アルキルフェノール）力く挙げられる。 さらに、 デォキシコーノ ナトリゥ ム、 およびスルホベタインとして周知の合成ッブイッテルイォン洗剤であるッブ イツタージェント （Zwi t t e r gen t s) ^ たとえば N—ドデシルー N, N—ジメチル一 —アンモニォ一 1ーェタンスルホネート、 およびその同！^ または非イオン性洗湖、 たとえばォクチルー β， D_ダルコビラノシドなどが 挙げられる。
界面活 ilを使用する 、 その量は臨界的ではなく、 たとえば約 0. 00 1 %〜約 1 0%、好ましくは約 0. 0 1%〜 3%の範囲で棚すること力くできる。 トリアルキルホスフエ一ト処理は、 エンベロープコ一トウィルス、 たとえば B JfF^:ウィルス、 nonAnonB ff ^:ウィルス、 ヒト免^^全ウィルス （H I V)、 ベシキユラ一ストマティテイスウィルス （Ve s i c u 1 a r S t o ma t i t i s V i r u s) 、 シンドビスウィルス （S i n d b i s V i r u s)等の 化に特に有用である。 また、 さらに 態で充分な時間加熱処 理することにより、 熱に弱いウイルスも不活ィ匕し得る。
本発明のトリアルキルホスフエ一トによるプラスミノ一ゲン含有糸滅物の処理 は、 0 °C~ 6 0 °C、 好ましくは 2 0 °C~ 4 0 °Cの温度で、 好適には 3 0分以上、 より好適には 1〜3 0時間、 さらに好適には 3〜1 0時間行う。 また、 本処理は 弱酸 件下で行うこと力く好ましく、 具体的には、 p H 4〜6、 好ましくは、 4. 5〜5. 5力，示される。
續、 血清中には N末がグルタミン酸藤であるグノレタミノ プラスミノーゲ ン力く、 コーンの ffiアルコール分画法の第 I I + I I I 画分、 あるいは第 I I I 画分に はグルタミノ およびリジノ の両プラスミノ一ゲンか^ Mする。 リジノ ブラ スミノ一ゲンを得るためには、 グルタミノ I ^ブラスミノーゲンをリジノ に変換 すること力 要である力く、 トリアルキルホスフエ一ト処理を ±ϋの弱隱 p Η条 件下で行うことにより、 グルタミノ を効果的にリジル型に変換できる。 この場 合は、 プロテア一ゼ IS豁 Jの 下または所定の髓のプロテアーゼ阻翻の ί¾下で本 を行うことにより、 プラスミノーゲンの活性を損なうことなくリ ジノ I ^ブラスミノーゲンを得ることができる。
一方、 中性およひ ァルカリ ρ Η条件下で、 本処理を行うことによりリジノ への変換を Plihしたままグルタミノ^ブラスミノーゲンを得ること力できる。 そ の はプロテアーゼ阻翻の 下で行うの力《好ましい。
プロテアーゼ阻割としては、 実質的にプロテアーゼ活性を阻害する物質であ れば特に限定されない。 たとえば、 ε—アミノカプロン酸 (EA CA) , リジン、 アルギニンなどの^ ¾アミノ酸、 D F P、 PMS Fなどの化 質、 ァプロチ 二ンなどの蛋白質などが例示される。
¾¾、 トリアルキルホスフェート処理後、 トリアルキルホスフェートは除去さ れる。 界面活性剤や安定化剤を用いたときはそれらも除去される。 はいずれ の方法によってもよいが、 たとえばァフィ二ティークロマトグラフィーあるいは ィォン交換ク口マトグラフィ一でブラスミノ一ゲンを吸着する方法、 プラスミノ 一ゲンを により回収する方法、 ゲル濾 ϋによりプラスミノ一ゲンとこれらの ものを分離する方法などカ^げられる。 これらの方法は、 2 m¾_b袓み合わせて も、 1種の方法を 回繰り返してもよい。 また、 加熱処理をトリアルキルホス フエ一卜の除去謹時に行うこともできる。
トリアルキルホスフェートの ^処理は、 好ましくは、 最終的には、 該プラス ミノ一ゲン含有 物をァフィ二テイク口マトグラフィ一またはゲル 又はィ オン交換クロマトグラフィーで処理する。 ァフィ二ティクロマトグラフィーまた はゲル濾過又はィォン交換ク口マトグラフィ一で処理することにより、 トリアル キルホスフェート、 界面活性剤、 安定化剤を^すること力くできる。 さらに、 非 エンベロープコートウィルスのような特別熱に強 Lヽゥィルスカ 存して 、たとし ても、 本ァフィ二ティークロマトグラフィーまたはゲル腿又はィォン交換ク口 マトグラフィ一処理で もしくは大部分は除去可能である。 ァフィ二ティーク 口マトグラフィ一は、 プラスミノーゲンの 、固定ィ匕リジンによるクロマトグ ラフィ一で すること力くできる。
ISiしたプラスミノ一ゲン含有糸!^物の加熱処理を ί亍う^、 物はト リアルキルホスフェートなどを除去した後、 プラスミノーゲンを回収、 所定の純 度にまで精製を行った後、 公知の方法で^^して得られる。
加熱麵は、 通常 3 0 °C〜1 0 0 °C、 好ましくは 5 5 °C〜8 5 °Cにおいて、 通 常 3〜2 0 0時間、 好ましくは 1 0〜1 0 0時間難される。 また、 蛋白質を熱 カヽら保護するため、 安定化剤の 下で行ってもよい。安定イ^ 0としては、 たと えば、 ヒト血清アルブミン、 糖、 糖アルコール、 アミノ酸などカ举げられる。 発明を実施するための最良の形態 コーンの冷エタノール分画法で得られた画分 Ι Ι + Π Ι ペースト抽出残渣 ( 1 0 0 g) を、 1 0単位ン m lのァプロチニンと 0. 1 M塩化ナ卜リゥムを含むトリ ス塩酸緩衝液 （p H 8. 3 ) に懸濁し、 少職拌した後、 5 %硫酸アンモニゥム を添加'攪拌し遠心分離により上清を分離した。 更に、 この上清に 3 0 %硫酸ァ ンモニゥムを添加'攪拌し遠心分離により 1 gを分離した。 この; «を 0. 9 %塩化ナトリウムを含む 0. 9 %グリシン 液 （p H 7. 2 ) に懸濁した。 このプラスミノーゲン含有鎌に TN B P濃度が 0. 3 %となるように、 力、つ トウィーン （Tw e e n) 8 0髓が 1 %となるように TNB P (トリ一 （n— プチル） ホスフェート） およびトウィーン 8 0を加えた赚を調製し、 その 1 m 1を用い p H 5で 3 0 °C、 6時間処理した。 プラスミ ノーゲン ¾Mをドイッチ （Deu t s ch)， D. G. ら 〔サイェン X (S c i e n c e) , 170， 1095， （ 1970 ) 〕 の方法に準じて 0. 9%塩化ナトリウムを含む 0. 9%グリシン皿 （ρΗ7. 2)で 化したリ ジンーセファロースカラム （100ml) に注入し、 プラスミノーゲンを吸着さ せ、 次いで 0. 9%塩化ナトリウムを含む 0. 9%グリシン溶液 （pH7. 2) で洗浄、 更に 1M塩化ナトリウムを含む 0. 9%グリシン (pH7. 2) 5 00mlで洗浄後、 0. 25Mリジンを含む 0. 9 %グリシン (pH 7. 2)を用いて吸着したプラスミノ一ゲンを溶出せしめた。
この Sにより TNBP、 Twe en 80は除去された。 こうして得られたプ ラスミノ一ゲンは、 所望の純度にまで精製を行った後、 所定の濃度になるように 溶解レ'ィアルに小分さ; された。 ^^されたプラスミノ一ゲン 翻は 60〜80°C、 72時間 i:の 熱処理を行い、 ウィルス力 ¾もし くは^ ¾化されたリジノ プラスミノーゲン含有糸賊物を! ¾tした。
魏例 2
例 1と同様な TNBP/Twe en 80処理後に、 セフアクリル S— 30
0および展開液として 0. 9%wZv塩化ナトリウムを含む 0. 9%グリシン溶 液 （pH7. 2)を用いてゲル腿を行い、 餓例 1と同様に固定化リジンによ る了フィニティクロマトグラフィー処理を行った。 錢例 1と同様、 高活性で力、 つウイルスの 化されたリジゾ I ^ブラスミノーゲン含有糸誠物を調製すること ができた。
雄例 3
例 1と同様な TNBP/Twe en 80麵時の pH条件とグルタミル 型ブラスミノ一ゲンからリジ ブラスミノ一ゲンへの変換の度合 、を 例 1 と同様に し確 I忍した。 その結果を表 1に示す。 表 1
Figure imgf000009_0001
難例 4
コーンの冷エタノール分画法で得られた画分 Π + ΙΙΙ ペースト抽出残渣 (1. l kg) を、 1 0単 fi^mlのァプロチニンと 0. 1M塩化ナトリウムを含むト リス塩酸緩衝液 (pH8. 3) に懸濁し、 少時攪拌した後、遠心分離、 翻によ り上清を分離した。
この上清をリジンーセファロース （3リットル） に注入し、 プラスミノーゲン を吸着させ、 次いで 0. 9%塩化ナトリウムを含む 0. 9%グリシン赚（pH 7. 2)で洗浄、 更に 1M塩化ナトリウムを含む 0. 9%グリシン溶液（pH7. 2)で洗浄後、 0. 25Mリジンを含む 0. 9%グリシン （pH7. 2) を 用いて吸着したプラスミノーゲンを溶出せしめた。
この溶出液につき を行い、 250mlの 液を得た。
このプラスミノーゲン含有 液 lml当たり、 0. 3%TNBPおよび 1% Twe en80を加えた赚を調製し、 p H 5. 0で 30 °C、 6時間処理した。 処理後のプラスミノーゲン皿を 0. 9%塩ィ匕ナトリウムを含む 0. 9%グリ シン碰 (pH7. 2)で 化したセフアクリル S 300カラム （1 0リット ル） にアプライし、 ゲル脑を行った。諭例 1と同様、 高活性でかつウィルス の 化されたリジノ プラスミノ一ゲン含有繊物を調製すること力できた。 雄例 5
コ一ンの冷エタノ一ル分画法で得られた画分 11 + 111 ペースト抽出残渣 ( 1. 5 kg) を、 1 00単 のァプロチニンと 0. 1M塩化ナトリウムを含む トリス塩酸緩衝液 (pH8. 3) に懸濁し、 少時攪拌した後、 遠心分離、 濾過に より上清を分離した。
この上清をリジン一セファロース （3リッ トノレ） に注入し、 プラスミノーゲン を吸着させ、 次いで 0. 9%塩化ナトリウムを含む 0. 9%グリシン溶液 （pH 7. 2)で洗浄、'更に 1M塩化ナトリウムを含む 0. 9%グリシン皿（pH7. 2)で洗浄後、 0. 25Mリジンを含む 0. 9%グリシン溶液 （pH7. 2) を 用 、て吸着したブラスミノ一ゲンを溶出せしめた。
この溶出液に 100単 ii/ml (終離） のァプロチニンを加え、 纖を行い、 220mlの纖液を得た。
このプラスミノーゲン含有^ ϋ液 lml当たり、 0. 3%TNBP、 1 %Tw e e n 80および 100単 ii m 1 (終濃度） のァプロチニンを加えた溶液を調 製し、 pH7. 2で 30°C、 6時間 MSした。
処理後のプラスミノーゲン皿を 0. 9%塩化ナトリウムを含む 0. 9%グリ シン灘 (pH7. 2)で 化したセフアクリル S 300カラム （10リット ル） にアプライし、 ゲル腿を行った。高活性でかつウィルスの:^化された、 力、つ 65 %がグルタミノ のブラスミノ一ゲン含有糸滅物を調製することができ
1 o 産社の利用可置
本発明の^ t方法によれば、 プラスミノ一ゲンの活性を ί跌することなく、 効 率的にウィルス力 ¾化されたブラスミノ一ゲン含有糸滅物カ^ tされる。
なお、 トリアノレキルホスフエ一ト鍵はエンベロープを持たないウィルスには ィ h¾¾ ^弱い。 ところ力、 本発明によれは のプラスミノーゲン含有組 成物を加熱鍵にィ付ェ程があるので、 力、かるゥィルスも当該工程を経ることに よって有意に不活化すること力《できる。
また、血栓溶解剤としての有用性か期待されているリジノ プラスミノ一ゲン を得るためには、 トリアルキルホスフェ一ト処 ax程を弱 ¾ ^件下で行 グ ルタミル型プラスミノ一ゲンを効率的にリジル型に変換することによって達成で さる。 一方、 本工程をプロテア一ゼ阻 下、 中性またはアルカリ性 p H条件で ¾5¾することにより、 グルタミノ！ ^ブラスミノーゲンを得ること力できる。 よって、 本発明の 方法は,品としてより なプラスミノ一ゲン含有組 成物の工業的製法としてきわめて好ましい方法を^^するものであり、 ウィルス の稀化されたプラスミノ一ゲン翻を製造するのに特に有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. ウイルス 5^1の可肯 1#のあるプラスミノ一ゲン含有糸減物を
0¾¾忧態において、 トリアルキルホスフエ一トと接触 '処理し、 そして ②トリアルキルホスフエ一トを除去する処理を行う
ことからなるウィルスの; f¾性化されたプラスミノーゲン含有糸誠物の^ t方法。
2. トリアルキルホスフエ一トとの接触 ·処理を弱酸 件下で行う請求の範囲 第 1項記載のブラスミノ一ゲン含有キ滅物の^ 方法。
3. 更に、 し、 そして、
態でプラスミノ一ゲン含裕滅物を加熱 maする
ことからなる請求の範囲第 1項記載のプラスミノ一ゲン含有糸！^物の ^^方法。
4. 加熱鍵は非エンベロープ.ウィルスカ^ S化できる離まで行う請求の範 囲第 3項記載のプラスミノーゲン含^；滅物の^ t方法。
5. 加熱 ¾LSは 3 0〜1 0 0°Cで 3〜2 0 0時間行う請求の範囲第 4項記載のプ ラスミノーゲン含^ 物の^^法。
6. 弱^^ p H 4〜6である請求の範囲第 2項記載のプラスミノーゲン含有組 成物の^ t方法。
7. トリアルキルホスフエ一トによる処理を界面活性剤の^ Tに行う請求の範 囲第 1項記載のブラスミノーゲン含 滅物の 方法。
8. 界面活 が脂 のポリオキシエチレン誘 ソルビトーノ 水物の部 分エステル、非ィォン性油溶水 ij、 デォキシコ一ル酸ナトリウム、 合成ッブイ ッテルイォン難 Jおよびその同族 または非ィォン性洗湖である請求項 7記 載のブラスミノ一ゲン含 滅物の^ 法。
9. トリアノレキルホスフェートがトリー （n—ブチル） ホスフェート、 トリ一 ( t e r t—ブチル） ホスフェート、 トリ一 （n—へキシノレ） ホスフェート、 ト リー （2—ェチルへキシル） ホスフェートまたはトリ一 （n—デシル） ホスフエ 一トである請求の範囲第 1項記載のプラスミノ一ゲン含有糸滅物の i¾t方法。
1 0. トリアルキルホスフェートによる処理は、 0〜6 0。Cで 3 0分 行う請 求の範囲第 1項記載ブラスミノーゲン含有糸!^物の製造方法。
1 1. プラスミノ一ゲンがグノレタミノ 、 リジノ またはその混^ 3である請求 の範囲第 1項記載のブラスミノ一ゲン含 ¾¾¾¾物の製造方法。
1 2. ウイルス の可食 ttのあるグルタミノ I ^ブラスミノ一ゲン含有糸!^物を 0)^¾忧態において、 トリアルキルホスフエ一トと弱酸 件下で嫌 ·処理し、 そして
②トリアルキルホスフヱートを除去する処理を行う
ことからなるウィルスの TO性化されたリジノ プラスミノ一ゲン含有糸!^物を $¾ する請求の範囲第 1項記載のブラスミノ一ゲン含有糸!^物の $¾ϋ方法。
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