JPH03218322A - 蛋白質含有組成物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は、ウィルス夾雑の可能性のある蛋白質含有組成
物から実質的にウィルスが不活化された蛋白質含存組成
物を製造する方法に関する。

〔従来技術〕

人血液由来の蛋白質含有組成物には、ウィルス、たとえ
ば肝炎ウィルスやＡＩＤＳウィルスなどが混入してくる
可能性がある。

これらのウィルス伝播を防ぐために蛋白質含有液状組成
物を加熱する方法が知られている（特開昭５５−１４５
６１５号公報、特開昭５６−１３９４２２号公報、特開
昭５６＋−１０６５９４号公報）。

また、蛋白質含有乾燥組成物を加熱する方法も知られて
いる（特表昭５８−５００５４８号公報、特開昭５８−
２１３７２１号公報）。

さらに、蛋白質含有組成物をトリアルキルホスフェート
と接触せしめてウィルスを除去する方法も知られている
（特開昭６０−５１１１６号公報）しかし、加熱処理で
は熱に強いウィルスが残存する可能性があり、トリアル
キルホスフエート処理では非エンベロープウィルスが残
存する可能性がある。

また、トリアルキルホスフエート処理中に蛋白質の活性
が低下する問題があった。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は蛋白質の活性を殆ど失うことなく効率よく夾雑
ウィルスを不活化し、医薬品としてより安全な蛋白質含
有組成物を製造する方法を提供しようとするものである
。

〔課題を解決するための手段〕

本発明はこれら課題を解決するためにウィルス夾雑の可
能性のある蛋白質含有液状組成物をトリアルキルホスフ
ェートと接触させる工程と、乾燥状の蛋白質含有組成物
を加熱する工程を含むことを特徴とするウィルスの不活
化された蛋白質含有組成物の製造方法を提供する。

さらに、本発明はウィルス夾雑の可能性のある蛋白質含
有液状組成物をプロテアーゼ阻害剤の存在下でトリアル
キルホスフェートと接触させることを特徴とするウィル
スの不活化された蛋白質含有組成物の製造方法を提供す
る。

これら発明により、蛋白質の活性を失うことなく効率的
にウィルスの不活化された蛋白質含有組成物が製造され
る。

本発明の方法が適用される蛋白質は特に限定されるもの
ではなく、血漿由来蛋白質、他の組織由来蛋白質、遺伝
子組み換えや組織培養によって得られた蛋白質などが挙
げられる。蛋白質としては、たとえばプラスミノーゲン
、血液凝固第Ｖ因子、血液凝固第■因子、血液凝固第■
因子、血液凝固第■因子、血液凝固第Ｘ■因子、アンチ
トロンビン■、ハブトグロビン、トロンビン、プロトロ
ンビン、免疫グロブリン、フイプリノゲン、フイブロネ
クチン、アルプミン、ヘモグロビン、インターフェロン
、プラスミノーゲン活性化因子などが挙げられる。蛋白
質含有液状組成物は、上記の如き蛋白質を含有するもの
であれば、特に制限されない。

本発明の方法が適用される蛋白質含有液状組成物には特
に制限はなく、たとえば血漿または組織抽出液、血漿ま
たは組織抽出液を各種分画法により処理して得た両分か
らなる溶液、遺伝子組換え宿主または組織の培養により
得られる培養液、市販の蛋白質製剤（液状のもの）また
は溶液としたものなどが挙げられる。

また、本発明のトリアルキルホスフエートとの接触時の
蛋白質含有液状組成物の精製度は特に限定されるもので
はなく、任意の精製度のものに適用可能であり、従って
トリアルキルホスフェートとの接触は蛋白質の分離、精
製のいずれの段階に適用してもよい。

また、トリアルキルホスフェート処理と加熱処理はどち
らを先に行ってもよいが、好ましくは先にトリアルキル
ホスフェート処理を行う。

本発明で使用されるトリアルキルホスフェートは特に限
定されないが、好適にはトリー（ｎ−ブチル）ホスフェ
ート、トリ−（ｔｅｒｔ−ブチル）ホスフェート、トリ
ー（ｎ−ヘキシル）ホスフェート、トリ−（２−エチル
ヘキシル）ホスフェート、トリー（ｎ−デシル）ホスフ
エートなどが挙げられる。特に好ましいトリアルキルホ
スフェートはトリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（以下
ＴＮＢＰと言う）である。なお、２種以上の異なるトリ
アルキルホスフェートの混合物も使用することができる
へ 本発明に使用されるトリアルキルホスフエートは、０．
０　１〜１　０　（Ｗ／Ｖ）％の範囲の量、好ましくは
約０．１〜３　（ｗ／ｖ）％の範囲の量において使用さ
れる。

トリアルキルホスフェートは界面活性剤を伴ってまたは
伴わないで使用することができる。好ましくは、トリア
ルキルホスフエートを界面活性剤と組み合わせて使用す
る。この界面活性剤は、トリアルキルホスフェートが蛋
白質含有液状組成物と接触する前、同時、または後の任
意の段階に添加することができる。界面活性剤の機能は
、蛋白質含有組成物中のウィルスとトリアルキルホスフ
ェートとの接触を強化することである。

界面活性剤としては、脂肪酸のポリオキシエチレン誘導
体、ソルビトール無水物の部分エステル、たとえばポリ
ソルベート８０　（商品名：トウイーン８０など）、ポ
リソルヘート２０（商品名；トゥイーン２０など）およ
び非イオン性油浴水洗剖、たとえばオキシエチル化アル
キルフェノール（商品名：トリトンＸ１００など）が挙
げられる。さらに、デオキシコール酸ナトリウム、およ
びスルホヘタインとして周知の合成ツブイッテルイオン
洗剤である２賀ｉｔｔｅｒｇｅｎｔｓ，たとえばＮ−ド
デシルＮＮ−ジメチル−２−アンモニオ−１−エタンス
ルホネート、およびその同族体、または非イオン性洗浄
、たとえばオクチルーβ．Ｄ−グルコビラノシドなどが
挙げられる。

界面活性剤を使用する場合、その量は臨界的ではなく、
たとえば約０．　０　０　１％〜約１０％、好ましくは
約０．０１％〜３％の範囲で使用することができる。

トリアルキルホスフエート処理は、エンベロープコート
ウィルス、たとえばＢ型肝炎ウィルス、ｎｏｎＡｎｏｎ
Ｂ型肝炎ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、
ヘシキエラーストマティティスウィルス（Ｖｅｓｉｃｕ
ｌａｒ　Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）、シンド
ビスウィルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）等の不活
化に特に有用である。また、さらに乾燥状態で充分な時
間加熱処理することにより、熱に強いウィルスも不活化
し得る。

本発明のトリアルキルホスフェートによる蛋白質含有組
成物の処理は、−５゜Ｃ〜７０″Ｃ１好ましくは０゜Ｃ
〜６０゛Ｃの温度で、好適には３０分以上、より好適に
は１〜３０時間、さらに好適には３〜１０時間行う。

トリアルキルホスフェート処理は、蛋白質の活性低下を
防ぐために、プロテアーゼ阻害剤の存在下で行うのが好
ましい。

プロテアーゼ阻害剤としては、実質的にプロテアーゼの
活性を阻害する物質であれば特に限定されない。たとえ
ば、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）　、リジン、ア
ルギニンなどの塩基性アミノ酸、アプロチニンなどの蛋
白質などが例示される。

普通、トリアルキルホスフェート処理後、トリアルキル
ホスフェートは除去される。界面活性剤や安定化剤を用
いたときはそれらも除去される。

除去はいずれの方法によってもよいが、たとえばアフィ
ニティーク口マトグラフィーで蛋白を吸着する方法、蛋
白を沈澱により回収する方法などが挙げられる。また、
公知の加熱処理を行うこともできる。

乾燥組成物（乾燥状の蛋白質含有組成物）の加熱処理は
トリアルキルホスフェート処理の前後どちらに行っても
よいが、好ましくはトリアルキルホスフェート処理後に
行う。トリアルキルホスフェート処理後に行う場合、乾
燥組成物はトリアルキルホスフェートなどを除去した後
、蛋白質を回収、公知の方法で凍結乾燥して得られる。

乾燥組成物の加熱処理は、通常３０゜Ｃ〜１００゜Ｃ、
好ましくは５５゜Ｃ〜７５゛Ｃにおいて、通常３〜２０
０時間、好ましくは１０〜１００時間実施される。また
、蛋白質を熱から保護するため、安定化剤の存在下で行
ってもよい。安定化剤としては、たとえば、糖、糖アル
コール、アミノ酸などが挙げられる。

尚、乾燥組成物は実質的に水分を含まないものであり、
通常、その水分含量が３％以下、好適には１％以下が望
ましい。

本発明において、プロテアーゼ阻害剤の存在下でトリア
ルキルホスフェート処理を行った場合、液状、乾燥状の
いずれで加熱処理を行ってもよい。

液状での加熱処理は、乾燥組成物の加熱処理の場合と同
様に、トリアルキルホスフェート処理後に行うことが好
ましい。トリアルキルホスフエート処理後に行う場合、
トリアルキルホスフェートなどを除去した後に蛋白質を
回収する。

液状で加熱処理を行う場合、加熱処理は、通常３０゜Ｃ
〜１００゜Ｃ、好ましくは５５゛Ｃ〜７５゜Ｃにおいて
、通常１〜１００時間、好ましくは５〜３０時間実施さ
れる。また、蛋白質を熱から保護するため、安定化剤の
存在下で行ってもよい。安定化剤としては、たとえば、
糖、糖アルコール、アミノ酸などが挙げられる。

〔発明の作用および効果〕

本発明の製造方法によれば、蛋白質の活性を損失するこ
となく、効率的にウィルスが不活化された蛋白質含有組
成物が製造される。

なお、トリアルキルホスフェート処理はエンベロープを
持たないウィルスには不活化効果が弱い。

ところが、本発明によれば乾燥状の蛋白質含有組成物を
加熱処理に付す工程があるので、かかるウィルスも当該
工程を経ることによって有意に不活化することができる
。

また、２５゛Ｃ〜３０゜Ｃでのトリアルキルホスフェー
ト処理ではその温度で長く置くことにより溶液中に混在
するプロテアーゼによる蛋白質の分解が促進される可能
性があるが、プロテアーゼ阻害剤の存在下で処理するこ
とより蛋白質の活性低下を抑制することができる。

よって、本発明の製造方法は医薬品としてより安全な蛋
白質含有組成物の工業的製法としてきわめて好ましい方
法を提供するものであり、ウィルスの不活化された蛋白
質製剤を製造するのに特に有用である。

〔実施例〕

実施例１ 血液凝固第■因子含有組成物の製造方法クリオブレシピ
テートを２０ｍＭ｝リス塩Ｉｌｌ衝液で溶解し、水酸化
アルミニウムゲルを１％Ｖ／Ｖ添加し、脱プロトロンビ
ン溶液を得る。この１ １ 溶液にＴＮＢＰ　（１−リー（ｎ−ブチル）ホスフエー
ト〕を０．３％ｗ　／　ｖ　，　Ｔｗｅｅｎ８０を１％
ｗ　／　ｖになるように添加し、３０゜Ｃで６時間ウィ
ルス不活化処理をする。そして、グリシンを２Ｍになる
ように添加し、遠心してフィブリノゲンを沈澱して除去
し、得られた上清に、塩化ナトリウムを１．５Ｍになる
ように添加し、第■因子を沈澱として回収する。回収し
た第■因子を２０ｍＭ｝リス塩酸緩衝液に溶解し、再度
グリシン分画、塩化ナトリウム分画を行い、残存してい
るＴＮ　Ｂ　Ｐ，　Ｔｗｅｅｎ８０を除去する。こうし
て得られた第■因子の沈澱は、所定の濃度になるように
溶解しバイアルに小分され、凍結乾燥される。凍結乾燥
された第■因子製剤は６０゜Ｃ、７２時間以上の乾燥加
熱処理を行い、ウィルスに対し安全な製剖を製造する。

実施例２ 血液凝固第■因子含脊組成物の製造方法プラズマにＤＥ
ＡＥ−セファデックスを投入し、第■因子をゲルに吸着
させる。そして、０．　１　５　Ｍ塩化ナトリウムを含
む緩衝液でよく洗浄した後、１２ ０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液で第■因子を溶出
させる。この溶出液にＴＮＢＰを０，　３％Ｗ／ｖ，　
Ｔｗｅｅｎ　８０を１％になるように添加し、３０゜Ｃ
、６時間以上のウィルス不活化処理をする。ウィルス不
活化処理をされた第■因子溶液は再度ＤＦ．ＡＥ−セフ
ァデックスを投入し、第■因子を吸着させ、洗浄するこ
とによりＴＮＢ　Ｐ，　Ｔｗｅｅｎ　８０を洗液に除去
することができる。またＤＥＡＥ−セファデックスの代
わりに、第■因子に対するモノクローナル抗体を結合さ
せたゲルに第■因子を結合させ、同様に処理することが
できる。そして、ゲルより第■因子を溶出させた後、所
定のイオン強度、力価に調製され、小分され、凍結乾燥
されて、第■因子製剤を得る。そして、さらに膜のない
ウィルスを不活化するために６０゜Ｃ、７２時間以上の
乾燥加熱が行われ、より安全な製剤を製造する。

実施例３ トロンビン含有組成物の製造方法 コーンのＦｒ、■＋■ペーストまたはＦｒ．ｎｌぺ一ス
トを０．　１　５　Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶解した後
、トロンポプラステン（胎盤抽出液）を添加して、プロ
トロンビンをトロンビンに変換する。そしてＳＰ−セフ
ァデックスでトロンビンを吸着し、０．１５Ｍ塩化ナト
リウム溶液でよく洗浄した後、０．５Ｍ塩化ナトリウム
を含む緩衝液でトロンビンを溶出する。この溶出液にＴ
ＮＢＰを０．３％ｗ　／　ｖ　，　Ｔｗｅｅｎ８０を１
％ｗ／ｖ添加し、３０゜Ｃ、６時間以上のウィルス不活
化処理を行う。ウィルス不活化処理後トロンビンを再度
ＳＰ−セファデツクスまたはヘバリンーゲルに吸着しせ
、よく洗浄して、ＴＮＢＰ．　Ｔｗｅｅｎ　８０を除去
した後、ゲルよりトロンビンを溶出する。こうして得ら
れたトロンビンは、イオン強度、力価を調整し、小分け
され、凍結乾燥した後、６０’Ｃ、７２時間以上の乾燥
加熱処理を行う。

実施例４ フィブリノゲン含有組成物の製造方法 コーンのＦｒ．Ｉペーストを生理食塩液で溶解し、ＴＮ
ＢＰを０．３％ｗ　／　ｖ　，　Ｔｗｅｅｎ　８０をｌ
％Ｗ／■になるように添加し、３０゜Ｃ、６時間以上の
ウィルス不活化処理を行う。そして、グリシンー塩化ナ
トリウム分画またはエタノール分画にて、フィブリノゲ
ンを沈澱させる。得られたフィブリノゲンの沈澱は、生
理食塩液に溶解した後、再度グリシンー塩化ナトリウム
分画またはエタノール分画を行い、フィブリノゲンを沈
澱して回収する。この分画操作は３〜５回行われ、ＴＮ
Ｂ　Ｐ，　Ｔｗｅｅｎ８０は上清に除去される。こうし
て得られたフィブリノゲンの沈澱を所定の濃度に溶解し
、小分、凍結乾燥した後、６０℃、７２時間以上の乾燥
加熱処理が行われる。

実施例５ 血液凝固第■因子含有組成物の製造方法正常ヒト・血漿
を凍結融解して得られたクリオブレシビテートを出発材
料に、これを２０ｍＭ｝リス−１０ｍＭクエン酸緩衝液
（ｐｌ＋７．　０　）で５倍抽出溶解し、水酸化アルミ
ニウムゲルをクリオプレシピテート投入重量の１／１０
容量を添加して３０分間攪拌した。その後ベントナイト
を６ｇ／ｌの割合で添加して１時間攪拌後４０００ｒｐ
ｍ１５ ３０分間遠心分離し、上滑を得、続いてウィルス不活化
のための界面活性剤処理（０．３％Ｉ−　ＩＪ　−　ｎ
ブチルホスフエイト、１％７ｗｅｅｎ　８０の濃度にな
るように添加後、３０″Ｃ、６時間攪拌）を行い、これ
をグリシン分画に供した。グリシン分画の条件は、この
溶液にグリシンを１５０ｇ／ｊ！の割合で添加して３０
゜Ｃ、１時間攪拌後遠心分離（４　０　０　０ｒｐｍ、
３０分間、３０゜ｃ）Ｌて上清を得、この上清に塩化ナ
トリウムを添加（８　７　ｇ／ｌ）後１時間攪拌して第
■因子画分を塩析させ遠心沈澱（４０００ｒｐｍ、３０
分間、３０゜Ｃ）を得た。

その後、塩析沈澱を２０ｍＭ｝リス緩衝液（ｐＨ７．０
）に溶解し、２８０ｎｍ吸光度を２５〜３０に調整した
後ゲル濾過カラムの注入検体とした。

カラムの充填剤はファルマシア製のＳｅｐｈａｃｒｙｌ
　Ｓ４００　｝ＩＲを使用し、検体はカラムヘッド容量
の５〜７％の注入量でカラムより排出された第■因子活
性画分を分取した。その条件は、次の通りである：注入
サンプル：塩析沈澱溶解液 カラム：　Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−４００ＨＲ１６ 溶媒　：　　２　　０ｍＭ　　丁ｒｉｓ（ＨＣＬ）．　
　　１　　０ｄ　　ＣａＣｌ２ＩＭ　ＮａＣＩ　　ｂｕ
ｆｆｅｒ．　　ｐＨ　　７．　０その結果、血液凝固第
■因子はカラムボイド画分に観察され、夾雑蛋白が高度
に分離されていた。

その後、所定のイオン強度、力価に調整され、小分され
、凍結乾燥されて、第■因子製剤を得る。

そして、さらに６０゜Ｃ１７２時間以上の乾燥加熱が行
われ、より安全な製剤を製造する。

実施例６ コーンのＦｒ．１ペーストを０．０２５Ｍ　　ＥＤＴＡ
−２Ｎａおよび１０単位／ｄのアブロチニンを含む０．
　０　５　５　Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．
４で溶解した後、５０℃で３０分加熱しフィブリノゲン
を変性・除去する． この液を濃縮後、濃縮液にアブロチニンを３０単位／ｄ
加え、ＴＮＢＰを０．３％ｗ　／　ｖ　，　Ｔｗｅｅｎ
　８０を１％ｗ　／　ｖ添加し、３０゜Ｃ、６時間以上
のウィルス不活化処理を行う。ウィルス不活化処理後フ
ィブロネクチンをＤＥＡＥ−セファデックスに吸着させ
、よく洗浄して、ＴＮＢ　Ｐ，　Ｔｗｅｅｎ　８０を除
去した後、ゲルよりフィブロネクチンを溶出する。

そしてこの液を濃縮して、ウィルスに対し安全な製剤を
製造する。

実施例７ 実施例６のフィブロネクチンを０．　０　５　Ｍ　トリ
スリン酸緩衝液、ｐｌｌ１３．ｏで３０■／戚となるよ
うに調製した後に、その水溶液１ｉにシＥＩ　Ｉｆ！　
１　ｋｇを添加した。これをよく攪拌した後、６０゜Ｃ
で１０時間加熱した。冷却後、０．９％塩化ナトリウム
溶液に対して透析し、遠心分離して澄明な液を得た。

実施例８ クリオプレシピテートを２０ｍＭ｝リス塩酸緩衝液で溶
解し、水酸化アルミニウムゲルを１％Ｗ／■添加し、脱
プロトロンビン溶液を得る。この溶液にグリシンを２Ｍ
になるように添加し、フイブリノゲンを沈澱として除去
し、得られた上清に塩化ナトリウムを１．５Ｍになるよ
うに添加し、フィブロネクチンを上清に回収する．この
液を脱塩濃縮後、濃縮液にＥＡＣＡ　（ε−アミノカプ
ロン酸）を４％加え、ＴＮＢＰを０．３％Ｗ　／　ｙ　
ＸＴｉ＋ｅｅｎ８０をｌ％ｗ　／　ｖ添加し、３０゜Ｃ
、６時間以上のウィルス不活化処理を行う。ウィルス不
活化処理後、実施例６および７と同様の処理を行い、ウ
ィルスに対し安全な製剤を製造する。

〔実験例〕

実験例１ ウィルス不活化効果 血液凝固第■因子含有組成物、血液凝固第■因子含有組
成物、トロンビン含有組成物およびフイプリノゲン含有
組成物中のウィルスの不活化効果を検討した。

（実験方法） 第■因子ではクリオプレシピテートの溶解液、第■因子
ではＤＥＡＥ−セファデックス溶出液、トロンビンでは
ＳＰ−セファデックス溶出液、フィブリノゲンではＦｒ
．１ペースト溶解液と各製剤の製造工程サンプルに、Ｔ
ＮＢＰを０．３％Ｗ　／　Ｖ、Ｔｗｅｅｎ　８０を１％
Ｗ　／　Ｖになるように添加し、エンベロープのあるウ
ィルスとしてｖＳ■、シンドビスウィルス（ｓｉｎｄｂ
ｉｓ　ｖｉｒｕｓ）、エンベロープのな１９ いウィルスとしてエコーウィルス（［ｉｃｈｏνｉｒｕ
ｓ　）をモニターウィルスとして１０６〜１０７個／ｍ
１添加し、３０″Ｃで加温して経時的にサンプリングし
、残存しているウィルスを第１表の方法により測定した
。その結果は第２〜４表に示す通りであり、いずれの製
剤においてもＶＳＶ，シンドビスウィルスは３０゜Ｃ、
１時間の処理で検出限界以下まで不活化された。一方、
膜のないウィルスであるエコーウィルスは３０゜Ｃ、６
０時間後もほとんど不活化されなかった。

第１表　供試ウィルスと宿主細胞の系ならびに感染価の
測定法 〔以下余白〕 ２０ 実験例２ 蛋白質の安定性 第■因子ではクリオペーストの抽出液にＴＮＢＰＯ．３
％ｗ　／　ｖ　，　Ｔｗｅｅｎ　８０　１％ｗ　／　ｖ
添加し、３０゜Ｃで加温し、経時的にサンプリングして
第■因子活性を測定したが、２４時間後の残存活性が８
０％である（第１図参照）ことより、３０’Ｃ、６時間
ではほとんど第■因子活性のロスがないと判断し、安定
化剤のスクリーニングはしなかった。また、乾燥加熱時
の安定性も６０゜Ｃ、７２時間後で９５％以上の活性を
保持しており、あえて安定化剤のスクリーニングはしな
かった。

第■因子ではＤＥＡＥ溶出液にＴ　Ｎ　Ｂ　Ｐ　０．　
３％ｗ　／　ｖ、Ｔｗｅｅｎ　８０　１％Ｗ　／　Ｖ添
加し、３０’Ｃで加温して経時的にサンプリングして第
■因子活性を測定したが、２４時間後の残存活性が７６
％で若干の活性低下が認められたが、３０゜Ｃ，６時間
ではほとんど問題にする低下でもないことより、安定化
剤の添加はしなかった。（第２図参照）。

また乾燥加熱時の安定性も６０゜Ｃ、７２時間後２４ で９５％以上の活性を保持しており、あえて安定化剤の
スクリーニングはしなかった。

トロンビンではＳＰ−セフプデックス溶出液にＴ　Ｎ　
Ｂ　Ｐ　０．　３％ｗ　／　ｖ　，　Ｔｗｅｅｎ　８０
　１％ｗ／ｖを添加し、３０゜Ｃで加温して経時的にサ
ンブーリングし、トロンビン活性を測定したが、３０時
間後の活性ロスが大きく、３０゜Ｃ、６時間後でも９０
％の活性維持が難しいと判断し、安定化剤のスクリーニ
ングを行った。その結果、ＥＡＣＡ　（ε−アミノカブ
ロン酸）とアルギニンの添加により、トロンビンの活性
低下を防ぐことができ、特にＥＡＣＡでは２％以上の添
加で３０゜Ｃ、３０時間後も９０％以上の活性を維持で
きた（第３図および第４図参照）。

フィブリノゲンはＦｒ．１ペーストの溶解液にＴＮＢＰ
Ｏ、３％Ｗ　／　Ｖ　，　Ｔｉ＋ｅｅｎ　８０　１％Ｗ
／ｖを添加し、３０゜Ｃで加温して、経時的にサンプリ
ングし、フィブリノゲン凝固活性を測定した。その結果
、３０゜Ｃ、２４時間後では、全く凝固活性を認めない
ことが判明し、安定化剤のスクリーニングを行った。そ
の結果、アブロチニンとＥＡＣＡに安定化効果のあるこ
とが判明した。ＥＡＣＡを５％以上添加することにより
３０゜Ｃ、２４時間後も９０％の凝固活性を維持できた
（第５図参照）。

実験例３ 実施例８で得た脱塩濃縮液にＴＮＢＰを０．３％Ｗ　／
　Ｖ、Ｔｗｅｅｎ　８０を１％ｗ／ｖ添加し、３０’Ｃ
で加温して３時間後、６時間後、３０時間後にフィブロ
ネクチンのゼラチン結合活性を測定したところ、６時間
後の活性残存率は８５％であり、３０時間後では５５％
に低下したため、安定化剤のスクリーニングを行った。

その結果、ＥＡＣＡの場合は２％以上、アブロチニンで
は１０単位／ｄ以上添加することにより、フィブロネク
チンの活性低下を防ぐことができた（第５表および第６
表参照）。

〔以下余白〕

第 ５ 表 注：Ｉ》処理前を１００％とする。

第 ６表 注＝１′処理前を１００％とする． 実験例４ 実施例８で得た脱塩濃縮液にアブロチニンを３０単位／
Ｉｄ加え、ＴＮＢＰを０．３％ｗ　／　ｖ、７Ｈｅｅｎ
８０を１％ｗ／ｖになるように添加し、エンベロープの
あるウィルスとしてＶＳＶ，シンドビスウィルス（ｓｉ
ｎｄｂｉｓ　ｖｉｒｕｓ）、エンベロープのないウィル
スとしてエコーウィルス（Ｅｃｈｏ　ｖｉｒｕｓ）をモ
ニタ２７ ーウィルスとして１０６〜１０７個／一添加し、３０゜
Ｃで加温して経時的にサンプリングし、残存しているウ
ィルスを第７表の方法により測定した。

その結果は第８表に示す通りであり、いずれの製剤にお
いてもｖＳ■、シンドビスウィルスは３ｏ゜Ｃ、３０時
間の処理で検出限界以下まで不活化された。一方、膜の
ないウィルスであるエコーウィルスは３０゜Ｃ、６時間
後もほとんど不活化されなかった。

〔以下余白〕

２８

【図面の簡単な説明】

第１図は、血液凝固第■因子の活性残存率に及ぼす界面
活性剤処理の影響を経時的に見たものである。一〇−は
界面活性剤未添加時の場合を、●−は界活性剤添加時の
場合を各々示す。 第２図は血液凝固第■因子の活性残存率に及ぼす界面活
性剤処理の影響を経時的に見たものである。一〇−は界
面活性剤未添加時の場合を、●〜は界面活性剤添加時の
場合を各々示す。 第３図は、トロンビンの界面活性剤処理時の活性残存率
に及ぼすＥＡＣＡの添加効果を経時的に見たものである
。■はＥＡＣＡの未添加時の場合を、一−−一はＥＡＣ
Ａ１％添加時の場合を、はＥＡＣＡ２％添加時の場合を
、一−−−はＥＡＣＡ４％添加時の場合を、一一はＥＡ
ＣＡ８％添加時の場合を各々示す。 第４図は、トロンビンの界面活性剤処理時の活性残存率
に及ぼすアルギニンの添加効果を経時的に見たものであ
る。■はアルギニンの未添加時の場合を、一一一一はア
ルギニン１％添加時の場合を、−一一一−−はアルギニ
ン２％添加時の場合を、はアルギニン４％添加時の場合
を、−一はアルギニン８％添加時の場合を各々示す。 第５図は、フィブリノゲンの界面活性剤処理時の活性残
存率に及ぼすＥＡＣＡの添加効果を経時的に見たもので
ある。 ３１

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ウィルス夾雑の可能性のある蛋白質含有液状組成
   物をトリアルキルホスフェートと接触させる工程と、乾
   燥状の蛋白質含有組成物を加熱する工程を含むことを特
   徴とするウィルスの不活化された蛋白質含有組成物の製
   造方法。
2. （２）ウィルス夾雑の可能性のある蛋白質含有液状組成
   物をプロテアーゼ阻害剤の存在下でトリアルキルホスフ
   ェートと接触させることを特徴とするウィルスの不活化
   された蛋白質含有組成物の製造方法。