WO1995007710A1

WO1995007710A1 - Remedy for wound

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Publication number: WO1995007710A1
Application number: PCT/JP1994/001512
Authority: WO
Inventors: Koji Matsushima; Masanobu Naruto
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1993-09-13
Filing date: 1994-09-13
Publication date: 1995-03-23
Anticipated expiration: 1996-03-13
Also published as: US5646117A; CA2149323A1; JPH0782169A; EP0669134A4; EP0669134A1

Description

,

1 明細書

創傷治療剤

技術分野

本発明は創傷治療剤に関する。

背景技術

単球に対する走化性を有する因子はいくつか知られている。その中で単球走化活性化因子 (monocyte cheraotactic and activating factor (以" bヽ「MCAF」という）は、 MCP— 1 (Monocyte chemoatractant protein- 1 ) や GDC F (glioma - derived monocyte chemotactic factor) tも称され、ァミノ酸 76個からなる蛋白質であり、 4個のシスティン基を持つ。これらは単球に対して強力な走化性および活性化作用を有することが知られている。

MCAFと MCP— 1および GD C Fについてはその同定と遺伝子クローニングが次の論文に、

1) K. Matsushima et al. , J. Exp. Med., 169， 1485-1490， 1989.

2) Y. Furutani et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 159， 249-255, 1989.

3) E. A. Robinson et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1850-1854, 1989.

4) T. Yoshimura et al. , FEBS Letters, 244， 487-493， 1989.

また、総説が次の文献に記載されている。

5) N. Mukaida et al. , Microbiol. Immunol. 36, 773-789, 1992

文献 3) 、 4) に記載された MCP— 1、 GDCFは、文献 1 ) 、 2 ) に記載された MC A Fと同一である。

MC AFが単球に対して強力な走化性および活性化の作用を有することは知られており、免活性化作用ゃ抗腫瘍作用への用途が前記文献などに示唆されている。また、一般的概念として、創傷部位に集まった単球が創傷の自然治癒に役割を果たすことは知られている。しかし MCAFが直接に創傷の治療を促進する作用を有することについては知られていない。 '

幾つかの蛋白性成長因子が創傷の治療を促進する作用を有することが知られている。例えば線維芽細胞成長因子（FGF) 、上皮成長因子（EGF) 、トランスフォーミング成長因子（TGF—ひ、 TGF— ）、血小板由来成長因子 (PDGF) 、内皮細胞成長因子（ECGF) 、ケラチノサイト成長因子などの成長因子は創傷治療効果を持つことが期待されている（文献 6) 。

6) T. A. Mustoe et al. , J. Clin. Invest. , 87， 694-703(1991).

最近インターロイキン 1 ( I L— 1) が創傷治療効果を持つことが米国特許第 52021 18号に記載されている。

発明の開示

本発明の目的はこれら成長因子や成長因子誘発性の蛋白質を使用するのではなく、これらの物質とまったく異なる性質と作用をもち、かつ強力な治療効果を有する創傷治療剤を提供することを目的とする。

すなわち、本発明は、 MC A F若しくは単球走化性を有するその変異体又はそれらの誘導体を有効成分とする創傷治療剤を提供する。

本発明により、創傷、すなわち、熱傷、外傷、手術等の外傷性潰瘍、内因性要因（消化液性）などの基礎疾患性潰瘍等の治療を促進する有用な創傷治療剤が提供された。

図面の簡単な説明

図 1は、切傷をつけた 7日後のサンプル皮膚の引張強度を示す図である。図 2は、切傷をつけた 14日後のサンプル皮膚の引張強度を示す図である。図 3は、 MC A Fの創傷治療効果を他の成長因子による創傷治療効果と比較して示す図である。

図 4は、 MC A Fによる創傷治療効果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

MCAFは、 76個のアミノ酸から成り、単球走化作用及び活性化作用を有する蛋白質であり、具体的には上記文献 1 ) 〜 5) に示されるものである。

MC AFのアミノ酸配列を配列表の配列番号 1に示す。

本発明においては、上記 MC A Fのアミノ酸配列を実質的に有し、かつ、単球走化作用又は活性化作用を有する M C A Fの変異体をも有効成分として用いることができる。ここで、 MCAFの変異体とは、 MC A Fのアミノ酸配列を実質的に有することを意味し、 MCAFの単球走化性を失わない範囲でアミノ酸配列が自然又は人工的に欠失、追加又は置換されたものを含む。特に N末端や C末端の配列は、天然型 MCAFあるいは組換え MCAFにおいて、産生条件によって変化する可能性（アミノ酸残基の増減の可能性）があるが、これらは本発明の MCAFに含まれる。さらに、本発明においては、上記 MCAF又は MCAF変異体を化学的又は生化学的に修飾した誘導体（例えば、ポリエチレングリコール若しくはそ.の類似体を化学的に結合したもの、リン酸化や硫酸化したもの、ェンドぺプチダ一ゼ等のぺプチダ一ゼで処理したもの、シァリダ一ゼ等の糖鎮修飾若しくは糖鎖付加酵素で処理したもの）も有効成分として用いることができる。 MCAFにはそのァミノ酸数とシスティン残基の配置が類似した、 MCAF類縁体が知られている。ヒ卜では R ANT E S、 MC P— 2、 MC P— 3、 LD78、 ACT2、 1—309、マウスでは J E、 M I P— 1ひ、 M I P - 1 β、 TC A— 3などが MCAFの構造的類縁体として知られている（上記の文献 4、 5) 。また最近は MCAF類縁体として MC P— 2、 MCP— 3も知られている（文献 6) J. Van Damme ら、 J. Exp. Med.， 176, 59 - 65, 1992) 。これらの中で単球（モノサイト）やマクロファージに対して走化性又は活性化作用をもつ物質は、本発明でいう MCAF変異体に含まれ、本発明の創傷治療剤の有効成分として用いることができる。特に、 RANTE S、 MC P— 2、 MC P— 3、 J Eは単球（モノサイト) やマクロファージに対して走化性を示すことが既に示されている（前記文献 5、 6) ので、これら若しくはこれらの変異体又はこれらの誘導体は本発明の創傷治療剤の有効成分として用いることができる。

本発明で使用する MCAFの製造方法にはとくに制限はなく、既知の方法で得られる MCAFが好適に使用される。例えば前述の文献 2) 、もしくは 4) に記述された c DNAを適切な発現制御領域遺伝子すなわち SV40やサイ卜メガロウィルスのプロモータ一、バキュロウィルスのプロモータ一、アミノ酸合成代謝遺伝子のプロモーター、糖合成代謝遺伝子のプ口モータ—などの下流に連結して得られた発現ベクターを動物細.胞ゃ、昆虫細胞、真核単細胞、原核細胞などに導入して MCAFを産生させ、親和性担体、ィォン交換担体、疎水性担体あるいは抗体担持担体などのカラムクロマトグラフィ一を組み合わせた適切な精製手段によつて精製 M C A Fが得られる。遺伝子組換え手法による物質の生産は現在多様な方法が知られており、現時点で知られた方法の組み合わせで本発明の M C A F を生産することができる。

また M C A Fを本来的に、またはなんらかの刺激により産生する細胞、すなわち単核白血球、線維芽細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、平滑筋細胞、ァストロサイト、あるいは T H P— 1 (ミエ口モノサイト）、 U— 1 0 5 M G (グリオ一マ）などの株化細胞を培養し、そのままもしくは必要なら適当な刺激によって M C A Fを産生させ、続いて上記精製手段で精製することによつても生産することができる。 M C A Fの産生細胞とその刺激条件については、前記文献 4 ) および 5 ) に記載されている。

なお、配列表の配列番号 1で示されるァミノ酸配列を有するヒト M C A Fは市販されており（下記実施例 1参照）、本発明において、このような市販の M C A Fを好適に用 t、ることができる。

本発明で言う創傷は、皮膚や粘膜を含む組織の損傷を意味し、皮膚潰瘍が含まれる。皮膚潰瘍には、熱傷、外傷、手術等の外傷性潰瘍、褥蒼、下腿潰瘍等の循環障害性潰瘍、皮膚疾患、内因性要因（消化液性）等の基礎疾患性潰瘍等が含まれる。実施例には、ゥサギの皮膚創傷モデルで、本発明の有効性が明確に示されている。実施例に示した創傷における顕著な有効性から、容易に M C A Fの皮膚潰瘍、特に外傷性潰瘍の治療効果を期待することができる。

本発明の目的である創傷を治療するためには、上記 M C A F若しくはその変異体又はそれらの誘導体を有効成分とし、これに医薬的に許容し得る担体に配合して得られる組成物を生体に投与する。投与対照としての創傷は、上述の通り、皮膚ゃ粘膜を含む組織の損傷を意味し、皮膚潰瘍が含まれ、皮膚潰瘍には、熱傷、外傷、手術等の外傷性潰瘍、褥蒼、下腿潰瘍等の循環障害性潰瘍、皮膚疾患、内因性要因（消化液性）等の基礎疾患性潰瘍等が含まれる。

配合する他の成分としては、水や有機溶剤の他に、医薬的に許容しうる一般的な医薬添加物が選ばれる。もちろん添加物が無くとも本発明の目的は達成される。そのような医薬添加物としては、コラーゲン、へパリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビ二ルポリマー、カルボキシメチル /JP 4/01512

5

セルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、ェチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリンラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（H S A) 、マンニトール、ソルビトール、ラクト—ス、医薬添加物として許容され得る界面活性剤などがあげられる。実際の添加物は本発明治療剤の剤形に応じて上記の中から適宜あるいは組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。本発明はまた、 M C A Fと他の薬剤、生物学的製剤や合成医薬製剤などとの、同時もしくは逐次的併用投与をも包含する。他の薬剤としては、抗炎症作用、末梢循環改善作用、血栓生成抑制作用、組織修復作用を有するもの、消化管潰瘍に対して治療効果の知られたもの、へパリン、あるいは本発明の目的である効果を増強もしくは補助するような創傷治療剤の中から選ばれる。

投与方法としては、特に限定するものではないが、本発明の目的から局所投与が望ましい。局所投与形態として外用剤、座剤、注射剤あるいは、消化管の潰瘍に対する処置としての経口投与が好適に実施し得る。外用剤としては、軟膏、ゲル、クリーム、乳液、液剤などの塗布剤、テープ剤、パッチ剤などの貼付剤、あるいはスプレー剤、粉剤などの噴霧剤から選択される。

有効投与量としては、 1 日につき創傷 1部位当たり 0 . 0 0 1 gから 1 0 O m gの範囲で選ばれる。好適には創傷 1部位当たり 0 . 0 1 gから 1 m gの範囲で選ばれる。前述の投与量は創傷部位の大きさや症状によっても異なり、これらの値に限定されるものでは勿論ない。外用剤として使用する場合、製剤中の有効成分量としては 0 . 0 0 0 0 0 1重量％から 1 0重量％、好ましくは 0 . 0 0 0 0 1重量％から 0 . 1重量％の範囲から選ばれる。投与回数としては創傷時に 1回、あるいは 1日 1ないし数回、もしくは 2ないし数日に 1回の範囲で選ばれるがこれに限定されるものではない。

実施例

以下に本発明を実施例によって、より詳細に、より具体的に説明するが、もちろんこれによつて本発明が制限されるものではない。

実施例 1

ゥサギ創傷に対する M C A Fの効果：

I ) 試験方法

ゥサギは NZW (ニュージーランドホワイト）を用い、 1群 4羽とした。

各 7 5m gのペントバルビタールで麻酔後、背部に 5か所 5 cm長の切り傷を与えた。単球走化性活性化因子としては、ぺプロテク社（Pepro tech, Inc. , Rocky Hill, New Jersey 08553, USA)から購入した遺伝子組換えにより調製されたヒト

MC AFを使用した。

局部に次の配合剤（薬剤および対照薬剤）を、 1ケ所の創傷部位につき合計

II) 1を0. 1mlずつ複数に分けて局所注射した。

( 1 ) P B S ( l m l )

(2) P B S (l m l ) +牛コラーゲン（ l mg)

(3) P B S ( l m l ) +牛コラーゲン（ l mg) + I L - 8 ( 5 ^ g)

(4) P B S ( l m l ) +牛コラーゲン（ l mg) + I L— 1 ( 5 β g)

(5) P B S ( l m l ) +牛コラーゲン（l mg) +MCAF (5〃 g)

7日後、および 1 4日後にゥサギを屠殺した。次いで、背部皮膚全面を剥がし、切傷部を直角に含んだ幅 1. 5 cmのテープ状にサンプルを調製し、引っ張り強度を測定した。引っ張り強度測定には島津制作所、 Autograph Tension

Testerを用い、 Watanabe, Y. et al. , Surg. Res. Comm. , 10， 267-277， 1991に記載された方法によった。

2 ) 試験結果

7日後の結果を表 1と図 1に、 1 4日後の結果を表 2と図 2に示す。表 1 ： 7 日後における創傷部皮膚の引っ張り強度

引っ張り強度実測値（グラム）

投与薬剤ゥサギ 1 ゥサギ 2 ゥサギ 3 ゥサギ 4 平均値ネ示準 ί冊

PBS 205 250 130 405 248 116

PBS +牛コラーゲン 165 220 105 440 233 146

PBS +牛コラーゲン +IL- 8 345 485 165 760 439 251

PBS +牛コラーゲン +IL - 1 590 590 250 565 498 166

PBS +牛コラーゲン +MCAF 685 1225 320 1395 906 494

表 2 ： 1 4 日後における創傷部皮膚の引っ張り強度

引っ張り強度実測値（グラム）

投与薬剤ゥサギ 5 ゥサギ 6 ゥサギ 7 ゥサギ 8 平均値ネ¾¾準 ί 2 d

PBS 2250 2300 1060 1480 1772 605

PBS +牛コラーゲン 1170 2900 2560 704 1584 945

PBS +牛コラーゲン +IL - 8 3275 1925 1470 1428 2025 864

PBS +牛コラーゲン +IL - 1 3310 3225 2350 1960 2711 663

PBS +牛コラーゲン +MCAF 4370 4000 4650 1900 3730 1249

表 1は 7日後のサンプル皮膚の引っ張り強度実測値を、表 2は 14日後のサンプル皮膚の引っ張り強度実測値をそれぞれグラムで表示したものである。実測値として示した各 4個の値はそれぞれ左からゥサギ 4匹の個体別に対応するものである。平均値と標準偏差（SD) を右端に示した。

表 1、図 1、表 2、および図 2から、 MC AFを投与したものにおいて、明らかに引っ張り強度の増加が認められ、 MC AFが創傷治療剤として有効であることが結論される。表 1について統計処理（スチューデン卜 t検定）を行ったところ、 MC A F投与群すなわち上記剤型（5) 投与群は、対照群としての PB Sのみ投与群すなわち上記剤型（1) 投与群、およびコラーゲン投与群すなわち上記剤型（2) 投与群に対して 0. 05以下の危険率で有意差を示した。群内の例数の関係で、他の値および表 2の値の間では、本統計処理で有意差は見られなかつたが、表 1および表 2のゥサギ個体別の実測値を詳細に比較すると明らかに、 MC A F投与群に引っ張り強度の増加が認められる。

実施例 2

MCAFの皮膚創傷治療効果を他の成長因子の効果と比較した。また M C A F の用量依存性の効果を調べた。

1 ) 試験方法

原則として実施例 1の方法に従って以下の実験を行った。

MCAFとしてはヒト線維芽細胞をポリ I ：ポリ C 50 mg 1で刺激した培養上清から、疎水性クロマトグラフィ一、陽イオン交換クロマ卜グラフィ一、逆相 HP L Cによって精製したものを用いた。このヒト細胞由来 MCAFは実施例 1 で用いたペブロテク社製 M C A Fと同じ生理作用を示した。

NZWゥサギ雌（体重 2. 5〜3. 5 kg) を使用した。麻酔は 25 mg kg のべントバルビタールを投与した。背部皮膚の切傷は 6 cm長である。傷口は 1. 5cm ずつ離して外科用ステ一プルで閉じた。 MCAFや他の成長因子類を含んだ投与剤はェマルジョン化したコラーゲン（Zyderm Collagen Corp. , Palo Alto, Calif. ) 1 Omg ml を含んだリン酸緩衝液にて調製した。傷口をステ一プルで閉じる時に、 1ケ所の傷口につき 0. 5mlの前記ェマルジヨン溶液を投与した。 7日後にゥサギを殺しテープ状の中央部に直角に傷口が位置するようにした 1. 5 cm 幅の皮膚のテープ状サンプルを調製した。成長因子類として E G F (recombinant human epidermal growth factor) はヽ Becton Dickinson社のものを各 2 gゝ b F G F (recombinant human basic fibroblast growth factor) は (jenzoyme社のものを各 2〃 g、 T G F - α ( recombinant human transforming growth factor- a ) は Becton Dickinson社のものを各 2 g'、 T G F - 3 (human transforming growth factor) はヽ Becton Dickinson社のものを各 2 gを 1ケ所の傷口に対して使用した。

MC A Fの用量依存的効果の試験では、傷口 1ケ所当りの MC A F投与量を 0. 2、 1. 0および 5. O y^ gとした。

いずれの場合もテープ状に調製した皮膚サンプルは実施例 1と全く同じように引張り強度を測定し、 gm (グラム）で表示した。結果は図 3と図 4に示した。結果は平均土 S D (標準偏差）で表示し、統計処理（スチューデント t検定）を行つた。

弓 I張り強度試験とは別に、各試験から得られた皮膚サンプルにっき、フオルマリン固定を行った後、へマトキシリンーェォシン（hematoxylin- eosin ) で染色し、顕微鏡で吻合部の肉芽形成を観察した。

2) 結果

他の成長因子類と MC A Fの効果の比較を図 3に示した。断裂強度は P B Sのみ投与においては 2 6 7. 5 ± 5 9. 6グラム、 b F G F投与においては 3 8 5. 4 ± 1 8 9. 9グラム、 MCAFにおいては 64 5. 0 ± 1 8 8. 8グラムであった。 MC A Fの結果は、 pく 0. 0 5で P B Sに比べて有意であつた。また M C A Fは、 b F G Fよりももつと有効であつた。顕微鏡による観察ではどの例においても病理学的な異常は認められなかった。

MC A Fの用量依存的効果を図 4に示した。断裂強度は、 PB Sのみ投与においては、 2 7 5. 1 ± 9 0. 5グラム、 0. 2 gMC AFにおいては 4 7 1. 0 ± 1 9 3. 3グラム、 1. 0 gMC AFにおいては 5 04. 6 ± 2 3. 7グラム、 5. 0 gMC A Fにおいては 64 4. 0 ± 1 2 8. 2グラムであった。 MC AFの投与量の違 t、に基づく病理学的所見の差は認められなかった。

産業上の禾]]用可能性 O 95/07710

11 上記のように、本発明の創傷治療剤は、創傷に対し優れた治療効果を発揮する。従って、本発明の創傷治療剤は、医療分野において、創傷の治療に大いに貝献するものと期待される。

【配列表】

配列番号： 1

配列の長さ： 76

配列の型：アミノ酸

配列

Gin Pro Asp Ala lie Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr

1 5 10 15

Asn Arg Lys He Ser Val Gin Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg lie Thr

20 25 30

Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val lie Phe Lys Thr lie Val Ala

35 40 45

Lys Glu lie Cys Ala Asp Pro Lys Gin Lys Trp Val Gin Asp Ser Met

50 55 60

Asp His Leu Asp Lys Gin Thr Gin Thr Pro Lys Thr

65 70 75

Claims

請求の範囲

1 . 単球走化性因子若しくは単球走化性を有するその変異体又はそれらの誘導体を有効成分とする創傷治療剤。

2 . 単球走化性活性化因子を有効成分とする請求項 1記載の創傷治療剤。

3 . 創傷が皮膚潰瘍である請求項 1又は 2に記載の創傷治療剤。

4 . 皮膚潰瘍が外傷性潰瘍、循環障害性潰瘍又は基礎疾患性である請求項 3記載の創傷治療剤。

5 . 外傷性潰瘍が外傷又は手術によるものである請求項 4記載の創傷治療剤。

6 . 単球走化性因子若しくは単球走化性を有するその変異体又はそれらの誘導体を医薬的に許容できる担体中に含む創傷治療組成物。

7 . 単球走化性活性化因子を有効成分とする請求項 6記載の組成物。