WO1996039155A1 - Immunopotentiator - Google Patents

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WO1996039155A1
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glucose
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galactose
glucuronic acid
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Yoichi Ooiso
Ryosuke Sugihara
Hitoshi Oomori
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Tayca Corp
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Tayca Corp
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to an immunostimulant, and more particularly, to an immunostimulant comprising a microorganism-produced polysaccharide.
  • Chemotherapy is one of the cancer treatments, but the chemotherapeutic agents used for it are highly toxic and have side effects. Under these circumstances, there is an idea to improve the immune function of the living body itself to prevent and treat cancer, and to prevent and treat bacterial and viral infections. A substance is desired.
  • 3-1 and 3 glucans such as lentinan crestin are known (Japanese Patent Publication No. 55-128886, Japanese Patent Publication No. 56-46). 4 81 No. 1). Since these polysaccharides are obtained by production by basidiomycetes, the productivity is not high when compared with polysaccharides produced by microorganisms, and the yield is usually 10% or less based on the cells.
  • An example of an acidic heteropolysaccharide having an immunostimulatory activity is the polysaccharide A 291-PS described in Japanese Patent Publication No. 11592/83, but its effect is not sufficient. Absent.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide an immunostimulator comprising a polysaccharide produced by a microorganism.
  • an object of the present invention is to provide an immunostimulator comprising a polysaccharide produced by a microorganism.
  • the present inventors have found that a polysaccharide produced by a Klebsiella bacterium has excellent immunostimulatory activity and is obtained with higher productivity than a basidiomycete-produced polysaccharide such as lentin decrestin. And arrived at the present invention.
  • the present invention relates to an immunostimulating agent characterized by comprising a polysaccharide having a ratio of 4 to 3.6: 0.8 to 1.2: 0.8 to 2.4.
  • glucuronic acid, galactose and glucose are usually in D-form, and rhamnose is in L-form.
  • the polysaccharide used in the present invention preferably has the following characteristics in addition to the above-mentioned characteristics.
  • the molecular weight measured using gel filtration chromatography is about 1 ⁇ 10 3 to 10 ⁇ 10 6 .
  • the binding mode of L-rhamnose is (1 ⁇ 2) bond and (1 ⁇ bond)
  • the binding mode of D-glucuronic acid is (1 ⁇ 3) and (1-4)
  • D—galactose binding mode is (1 ⁇ 3)
  • D-glucose binding mode is (1 ⁇ 2)
  • the bond configuration of L-rhamnose, D-glucuronic acid and D-glucose is a, and the bond configuration of D_galactose is ⁇ .
  • the polysaccharide used in the present invention has the following physical properties.
  • the phenol sulfuric acid method, sorbazole sulfuric acid method and m-phenylphenol method are all positive.
  • the molecular weight of the polysaccharide used in the present invention, the type of constituent sugars, the constituent ratio, the binding mode, and the like can be specified by chromatographic analysis after acid hydrolysis, methylation analysis, Smith decomposition, and the like. Specific examples of the specifying method are shown below as an example. Measurement of molecular weight>
  • the same compound as the compound obtained when L-rhamnose, D-galactose and D-glucose are each treated alone is detected respectively.
  • the constituent sugars and constituent molar ratios of the polysaccharide can be determined from the comparison of the ratios of the compounds obtained when the polysaccharide and the polysaccharide obtained by reducing the propyloxyl group of the peronic acid residue are each treated.
  • the above polysaccharide is Klebsiella oxytoca T NM 3 strain described in Japanese Patent Application No. 7-93100 (Accession No. FERM BP-4669Z of Tsukuba City, Ibaraki Pref. Chome 1-3 (Postal code 305), dated: May 18, 1994) or its mutant strain, or Carb ohydrate Research, Vol. 157, Vol. 13 From Klebsiella strain K19, described in pp. 25- (1986).
  • the mutants may be irradiated with ultraviolet rays, X-rays, or other radiation, or chemical mutagens, such as ethyl methanesulfonic acid (EMS), N-methyl-N'-two-row N-nitrosogazine (MN NG), etc. It can be generated by known mutagenesis means such as
  • the culture medium for culturing the microorganism is not particularly limited as long as the microorganism of the genus Klebsiella can grow and contains an appropriate amount of a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and a micronutrient for producing the polysaccharide.
  • glucose, lactose, maltose, xylose, mannit, saccharose, rhamnose, arabinose, trehalose, raffinose and the like are used as the carbon source.
  • nitrogen source synthetic compounds such as nitrate, ammonium salt and urea, natural organic substances such as polybeptone, corn steep liquor, yeast extract, meat extract, defatted soybean extract, peptides and amino acids are used.
  • synthetic compounds such as nitrate, ammonium salt and urea
  • natural organic substances such as polybeptone, corn steep liquor, yeast extract, meat extract, defatted soybean extract, peptides and amino acids are used.
  • inorganic salts phosphates, potassium salts, sulfates, magnesium salts and the like are used.
  • Yeast extract and various vitamins are used as micronutrients.
  • the medium can be supplemented with iron salts, calcium salts, manganese salts, etc., if necessary.
  • the state of the medium may be solid or liquid.
  • static culture may be used, but shaking culture or aeration-agitation culture can obtain polysaccharides with higher yield.
  • the pH during the culture is not particularly limited as long as the microorganism can grow and can produce the polysaccharide used in the present invention, but a pH of 4 to 8 is usually appropriate.
  • the cultivation temperature is not particularly limited, but is usually 20 to 35 ° C. is there.
  • the cultivation time is selected to be the period during which the polysaccharide production reaches the maximum, but usually 1 to 7 is appropriate.
  • a conventionally known method can be employed as a method for collecting a polysaccharide from the culture obtained by the above-described culture method. For example, first, cells are removed from the culture by centrifugation or filtration, and an organic solvent such as methanol, ethanol, isopropanol, or acetone is added to the obtained culture solution to cause precipitation. Then, after dissolving the precipitate in water, dialysis is performed on the water, and the dialysis solution is dried by a method such as ventilation drying, hot air drying, spray drying, drum drying, reduced pressure drying, or freeze drying. Collect the polysaccharide.
  • a method for collecting a polysaccharide from the culture obtained by the above-described culture method. For example, first, cells are removed from the culture by centrifugation or filtration, and an organic solvent such as methanol, ethanol, isopropanol, or acetone is added to the obtained culture solution to cause precipitation. Then, after dissolving the precipitate in water, di
  • a method of removing components other than the polysaccharide from the culture solution by ultrafiltration and subjecting the obtained concentrated solution to the above-described drying step may be adopted.
  • a highly purified product can be obtained by purifying the polysaccharide according to a usual purification method.
  • a purification method various column chromatography such as ion exchange, gel filtration, and affinity, precipitation and salting out with a quaternary ammonium salt, precipitation with an organic solvent, and the like are employed.
  • the degree of polymerization of the polysaccharide used in the present invention can be changed by adjusting conditions such as a medium composition at the time of production and a collecting method. Also, by using TFA, formic acid, hydrochloric acid, etc. and adjusting the conditions, it is also possible to hydrolyze the collected and purified products. Further, as a specific method, a suitable result can be obtained even if the degree of polymerization is changed by performing heating under pressure, sonication, or the like. Therefore, the molecular weight of the polysaccharide can be freely set in the range of about 1 ⁇ 10 ⁇ to 10 ⁇ 10 6 .
  • the polysaccharide thus obtained has an immunostimulatory activity as shown in Examples described later, and the yield is 50% or more on average with respect to glucose used as a raw material. is there.
  • Acute oral toxicity of the above polysaccharides in rats There were no deaths at 5 g / kg, the weight gain was the same as in the control group, and no abnormalities were observed in appearance or necropsy.
  • the polysaccharide has high safety.
  • Cyclophosphide 100 male, 1 18 (female)
  • Vitamin B1 0.0005%
  • Vitamin B1 0.0005% Pyotin 0.00000006% Calcium pantothenate 0.001%
  • the pH of the resulting culture was adjusted to 4.5 with 10% sulfuric acid, sterilized by moist heat at 121 ° C for 60 minutes, and the cells were removed by centrifugation.
  • the obtained culture supernatant was subjected to ultrafiltration using a cross-mouth method until components other than polysaccharides such as residual medium components were removed.
  • an ultrafiltration system “UF-LMSII” molecular weight cutoff: 3 ⁇ 10 6 ) manufactured by Tosoh Corporation was used.
  • the concentrate that had not passed through the ultrafiltration membrane was freeze-dried to obtain about 21 g (yield of about 50% or more of glucose used as a raw material) per liter of the culture medium.
  • the identity of the polysaccharide was confirmed using high-performance liquid chromatography in GPC mode.
  • Asahi Kasei's “As ah ipak GFA-7MF” was used as a column, and the molecular weight of the above polysaccharide was measured using high performance liquid chromatography using a 0.1 M aqueous solution of sodium nitrate as the mobile phase.
  • the retention time at the peak top was a value corresponding to a molecular weight of about 1.5 ⁇ 10 6 in a molecular weight-retention time standard curve prepared using pullulan of a known molecular weight as a standard sample.
  • Production Example 1 except that the moist heat sterilization time from 60 minutes and for 100 minutes, was set to 1 X 10 5 to fractionation molecular weight of the system to be used for ultrafiltration against cultures after aeration agitation culture, production example 1 The same procedure was followed to obtain a polysaccharide.
  • D-glucuronic acid: L-rhamnose: D-galactose: D-glucose 1: 2.8: 1: 1.
  • the molecular weight was 2 ⁇ 10 5 .
  • Vitamin B1 0.0005% Pyotin 0.00000006% Calcium pantothenate 0.001% Nicotine amide 0.0005%
  • the obtained culture was sterilized by moist heat at 121 ° C. for 20 minutes, and the cells were removed by centrifugation.
  • the obtained culture supernatant was subjected to cross-flow ultrafiltration until the components other than polysaccharides such as residual medium components were removed.
  • the ultrafiltration Tosoh one company Ltd., ultrafiltration system "UF- LMSIIJ (fractionation molecular weight: 1 105). Lyophilized concentrate not permeated through the ultrafiltration membrane using a medium 9.6 g of a single polysaccharide was obtained per liter, and the identity of the polysaccharide was confirmed by high performance liquid chromatography in GPC mode.
  • Each polysaccharide obtained in the above production example was converted into an aqueous solution having a concentration of 1% by weight, and a cation exchange resin was added to each aqueous solution to convert the carboxy group of the glucuronic acid residue in the polysaccharide into a hydrogen ion. Thereafter, the mixture was neutralized with sodium hydroxide to replace the ion with sodium ion. Then, after filtration through a membrane filter having a pore size of 0.2 / zm, the mixture was freeze-dried, and the obtained polysaccharides were used in the following Examples.
  • Example 1 Measurement of cancer growth inhibitory effect
  • the inhibition rate of cancer cell growth was calculated as the weight average value of solid tumors when 5 mice with transplanted cancer cells were used, and the solid tumors when a reagent such as polysaccharide was administered. Weight average value of W. It was calculated by the following equation, and the value is shown in Table 14. The higher the value of the cancer cell growth inhibition rate, the greater the ability to inhibit the growth of cancer cells.
  • Lentinan 100 It is an acidic heteropolysaccharide similar to the polysaccharide used in the present invention.
  • the polysaccharide A 29-PS described in JP-A 1-59283 shows a cancer cell growth inhibitory rate of about 30% in the same test as in Example 1 described above.
  • the polysaccharide used in the present invention has excellent immunostimulatory activity.
  • the test samples shown in Table 1 were administered to the above C 3 H mice subcutaneously on the back four times, once a day, from 5 days before immunization, from 2 days after immunization, to 1 time, 5 times OmgZkg or 2 Omg / kg.
  • physiological saline was used instead of the test sample.
  • the spleen lymphocyte suspension was collected from C3H mice.
  • This lymphocyte suspension contains CTL (hereinafter referred to as effector cells, abbreviated as E), and is a myeloma cell line NS-derived from a B ALB Zc mouse transfected with ⁇ -galactosidase (-ga1) of E. coli. 1ZZ (hereinafter abbreviated as T) as target cells, 10 4 NS- 1ZZ the E / T ratio of 30, 60 or as a 120 Mix with effector cells and mix in 0.2 ml RPMI-1640 medium 37. C, kept warm for 4 hours. The / 3-ga1 activity released into the supernatant due to the destruction of the target cells was measured, and the cytotoxicity due to CTL was calculated by the following equation. Table 15 shows the immunostimulatory activity.
  • polysaccharide A N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine
  • polysaccharide B polysaccharide with reduced carboxyl group at the residue
  • schizophyllan available from Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., manufactured by Taisu Co., Ltd.
  • the IL-16 activity was calculated based on the calibration curve obtained by co-testing r Hu IL-16 as a control, using the IL-16-dependent growth stimulating effect of MH60.BSF2 cells as an index. expressed. Table 6 shows the results expressed as the mean ⁇ standard deviation. Table 1 6 Nafuraxi-like reaction Sudden death TNF I L-6
  • the polysaccharide used in the present invention has TNF and IL-16 inducibility that is not found in schizophyllan.
  • the present invention it is possible to provide an immunostimulant that has higher productivity than polysaccharides derived from basidiomycetes such as krestin and lentinan, and has a convenient effect.
  • schizophyllan which has a very low toxicity as compared with conventionally used cancer chemotherapeutic agents and is conventionally known to have immunostimulating ability, was not recognized.
  • An immunostimulant having a function can also be provided. Therefore, the immunostimulator of the present invention can be expected to be applied to the prevention and treatment of cancer, the prevention and treatment of microorganisms such as bacteria and viruses, the treatment of immunity decline after surgery, and the like.

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Description

明 細 書
免疫賦活剤 技術分野
本発明は、 免疫賦活剤に関するものであり、 詳しくは、 微生物生産多糖類か ら成る免疫賦活剤に関するものである。 背景技術
癌治療の一つとして化学療法が挙げられるが、 それに使用される化学療法剤 は毒性が高く、 副作用を有する。 この様な状況下、 生体自身が有する免疫能を 向上させることにより、 癌の予防 ·治療をはじめ、 細菌等やウィルス感染の予 防 ·治療を行なおうとする考えがあり、 免疫賦活能を有する物質が望まれてい る。
ところで、 従来より、 種々の多糖類が医薬、 食品、 化粧品分野で利用されて いる。 天然多糖類には大きく分けて、 植物由来、 動物由来、 微生物由来のもの があるが、 微生物由来のもの （微生物産生多糖類） が供給、 生産性の面から多 用される様になってきている。
免疫賦活剤として利用されている多糖類としては、 レンチナンゃクレスチン 等の 3— 1， 3グルカンが知られている （特公昭 5 5 - 1 2 8 8 6号公報、 特 公昭 5 6— 4 6 4 8 1号公報など） 。 これらの多糖類は、 担子菌類による産生 によって得られため、 微生物が生産する多糖類に比較した場合、 生産性が高い とは言えず、 収率は菌体に対し通常 1 0 %以下である。 酸性へテロ多糖類が免 疫賦活性を有する例としては、 特公平 1一 5 9 2 8 3号公報記載の多糖質 A 2 9 一 P Sが知られているが、 その効果は十分とは言えない。 本発明は、 上記実情に鑑みなされたものであり、 その目的は、 微生物が生産 する多糖類から成る免疫賦活剤を提供することにある。 本発明者らは、 鋭意検 討した結果、 クレブシエラ属細菌が生産する多糖類が優れた免疫賦活能を有し、 レンチナンゃクレスチン等の担子菌類産生の多糖類よりも生産性よく得られる 多糖類であることを見い出し、 本発明に到達した。
発明の開示
すなわち、 本発明の要旨、 構成糖が、 グルクロン酸、 ラムノース、 ガラクトー ス及びグルコースの 4種から成り、 その構成モル比が、 グルクロン酸：ラムノー ス：ガラクトース： グルコース = 0〜 1. 2 : 2. 4〜3. 6 : 0. 8〜1. 2 : 0. 8〜2. 4である多糖類から成ることを特徵とする免疫賦活剤に存す る。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の免疫陚活剤に使用される多糖類において、 通常、 グルクロン酸、 ガ ラク トース及びグルコースは D形、 ラムノースは L形である。 そして、 本発明 で使用される多糖類は、 上述の特徴の他に、 以下の様な特性を有しているのが 好ましい。
(1) 構成糖の好ましい構成モル比が、 グルクロン酸：ラムノース：ガラクトー ス： グルコース: =0. 8〜1. 2 : 2. 4〜3. 6 : 0. 8〜： I. 2 : 0. 8 〜1. 2である。
(2) 分子量
ゲルろ過クロマトグラフィーを使用して測定した分子量が約 1 X 103 〜10 X 106 である。 (3) 結合様式
L一ラムノースの結合様式が （1→2) 結合および （1→ 結合）
(ただし上記結合様式の構成比は、 （1→2) ： (1→ 結合） = 1. 3〜3· 0 ： 1)
D -グルクロン酸の結合様式が （1→3) 結合および （1—4) 結合
D—ガラクトースの結合様式が （1→3) 結合
D—グルコースの結合様式が （1→2) 結合
(4) 結合配置
L一ラムノース、 D—グルクロン酸および D—グルコースの結合配置が aで あり、 D_ガラクトースの結合配置が^である。
(5) 各構成糖残基の主な結合様式とその構成モル比
L-Rha(l→： 2→)L-Rha(l→： 3→)D-Gal(l→： 2→)D-Glc(l→： 3→)D-GlcUA (1→ 4
个 =0.8 〜1.2 ： 1.6 〜2.4 ： 0.8 〜1.2 ： 0.8 〜1.2 ： 0.8 〜1.2
(ただし、 Rh a、 G a 1、 G 1 c及び G 1 c UAは、 それぞれ、 ラムノース 残基、 ガラク トース残基、 グルコース残基およびグルクロン酸残基を示し、 数 字はグリコシド結合の位置を示す。 ） (6) グルクロン酸残基におけるカルボキシル基を還元した場合の各構成糖残 基の主な結合様式とその構成モル比
L-Rha(l→： 2→)L-Rha(l→： 3→)D-Gal(l→： 2→)D-Glc(l→： 3→)D-GlcUA (1→： 3-→)D-Glc(l→ 4
4 个
= 0.8〜1.2 ： 1.6〜2.4 ： 0.8〜1.2 ： 0.8〜1.2 ： 0〜1.2 ： 0 〜1.2 本発明で使用される多糖類は以下の物性を有している。
(7) 性状
白色繊維状 （凍結乾燥物）
(8) 溶解性
水、 希酸、 希アルカリに対して可溶、 メタノール、 エタノール、 アセトンに 対しては不溶である。
(9) 赤外吸収スぺクトル
3 4 0 0 c m_1付近、 1 6 2 0 c π 1付近、 1 1 0 0 c m— 1付近、 1 250 cnT1付近、 2950 c m_1付近のそれぞれに赤外吸収のピークが認 められる。
(10) 呈色反応
フエノール硫酸法、 力ルバゾール硫酸法および m—フヱニルフヱノール法の 何れも陽性である。
そして、 本発明で使用される多糖類の分子量、 構成糖の種類、 構成比、 結合 様式などは、 酸加水分解後のクロマトグラフィー分析、 メチル化分析、 スミス 分解などにより特定が可能である。 特定方法の具体例を一例として下記に示す。 ぐ分子量の測定 >
旭化成社製「As ah i p ak GFA— 7MF」 をカラムとする G PCモー ドの高速液体クロマトグラフィを使用し、 0. 1M NaN03 水溶液を移動 相とし、 分子量既知のプルランを標準サンプルとして作成した分子量一保持時 間標準曲線を使用して測定する。
く構成糖およびその構成比 >
上記多糖類および上記多糖類のゥ口ン酸残基の力ルボキシル基を還元した多 糖類に対し、 それぞれ、 2Mトリフルォロ酢酸 （TFA) を使用し、 100。C、 6時間の条件下に酸加水分解を行い、 アルジトールアセテートに誘導する。 得 られた各誘導体について、 E C N S S— Mコートカラム （和光純薬社製、 「Ga s c h r om Q」 ） を使用してガスクロマトグラフィー分析を行う。 本発明で使用される多糖類の場合には、 結果として、 L一ラムノース、 D—ガ ラク トース及び D—グルコースをそれぞれ単独に処理した場合に得られる化合 物と同一の化合物が各々検出される。 そして、 上記多糖類とゥロン酸残基の力 ルポキシル基を還元した多糖類をそれぞれ処理した場合に得られる化合物の比 率の比較から、 多糖類の構成糖および構成モル比が決定できる。
次に、 本発明の免疫賦活剤に配合される多糖類の製造方法について説明する。 通常、 上記多糖類は、 特願平 7— 93100号記載のクレブシエラ ·ォキシ トカ T NM 3株 （通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号 FERM BP - 4669Z曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番 号 305) 、 日付： 1994年 5月 18曰） 若しくはその変異株、 または、 カー ボノヽィドレイト · リサーチ （C a r b ohyd r a t e Re s e a r c h) 第 1 57巻、 第 1 3〜 25頁 （1 986年） に記載されているクレブシエラ K 19株による微生物培養により、 その培養物から採取される。 上記変異株は、 紫外線、 X線などの放射線、 または、 ェチルメタンスルホン 酸 （E M S ) 、 N—メチルー N ' —二トロー N—二トロソグァ二ジン (MN N G) 等の化学的突然変異誘発物質の様な公知の突然変異誘発手段によ り発生させることが出来る。
上記菌株のうち、 クレブシエラ *ォキシト力 T NM 3株を使用した微生物培 養については、 特願平 7 - 9 3 1 0 0号にも記載されているが、 以下に、 本発 明で使用される多糖類の、 菌株を使用した微生物培養について概要を述べる。 微生物を培養するための培地としては、 上記クレブシエラ属の微生物が生育 でき、 上記多糖類を生産する炭素源、 窒素源、 無機塩類及び微量栄養源を適量 含有するものであれば特に制限されない。
炭素源としては、 グルコース、 ラク トース、 マルトース、 キシロース、 マン ニッ ト、 サッカロース、 ラムノース、 ァラビノース、 トレハロース、 ラフイノー ス等が使用される。
窒素源としては、 硝酸塩、 アンモニゥム塩、 尿素などの合成化合物、 ポリべ プトン、 コーンスティープリカ一、酵母エキス、 肉エキス、 脱脂大豆抽出物、 ペプチド、 アミノ酸などの天然有機物が使用される。 無機塩類としては、 リン 酸塩、 カリウム塩、 硫酸塩、 マグネシウム塩などが使用される。 微量栄養源と しては、 酵母エキス、 各種ビタミン類などが使用される。 培地には、 必要に応 じ、 鉄塩、 カルシウム塩、 マンガン塩などを添加することが出来る。
培地の状態は、 固体でも液体でも構わない。 液体培地を使用する場合には、 静置培養でもよいが、 振盪培養、 通気撹拌培養の方がより高収量に多糖類を得 ることが出来る。 培養時の p Hは、 微生物が生育でき、 本発明で使用される多 糖類を生産し得る p Hであれば特に制限されないが、 通常 4〜 8の p Hが適切 である。 培養温度についても特に制限されないが、 通常 2 0〜3 5 °Cが適切で ある。 培養時間は、 多糖類の生産量が最大に達する期間が選ばれるが、 通常 1 〜 7曰が適切である。
上記の培養方法で得られた培養物から多糖類を採取する方法としては、 従来 公知の方法を採用することが出来る。 例えば、 先ず、 遠心分離やろ過などによ り、 培養物から菌体を除去した後、 得られた培養液にメタノール、 エタノール、 イソプロパノール、 アセトン等の有機溶媒を加えて沈殿を生じさせる。 次いで、 沈殿物を水に溶解させた後、 水に対して透析を行ない、 通風乾燥、 熱風乾燥、 噴霧乾燥、 ドラム乾燥、 減圧乾燥、 凍結乾燥などの方法により、 透析内液を乾 燥して多糖類を回収する。
上記の採取方法の他、 限外ろ過により多糖類以外の成分を培養液から除去し、 得られた濃縮液を上述の乾燥工程に供する方法を採用してもよい。 さらに、 必 要に応じ、 通常の多糖類の精製法に従って精製することにより、 高純度精製品 を得ることも出来る。 精製法としては、 イオン交換、 ゲルろ過、 ァフィ二ティー 等の各種のカラムクロマトグラフィー、 4級アンモニゥム塩による沈殿や塩析、 有機溶媒による沈殿などが採用される。
本発明で使用される多糖類の重合度は、 製造時の培地組成、 採取法などの条 件を調節することよって変化させることが出来る。 また、 T F A、 ギ酸、 塩酸 などを使用し且つ条件を調節することにより、 採取品や精製品を加水分解する ことも出来る。 さらに、 具体的な方法として、 加圧下での加温や、 超音波処理 などを行って重合度を変化させても、 好適な結果が得られる。 従って、 上記多 糖類の分子量は、 約 1 X 1 0 ΰ 〜1 0 X 1 06 の範囲で自由に設定することが 可能である。 この様にして得られる多糖類は、 後述の実施例に示す様に免疫賦 活能を有しており、 しかも、 その収率は、 原料として使用するグルコースに対 し、 平均 5 0 %以上である。 また、 上記多糖類のラッ トにおける経口急性毒性 については、 5 g/kg投与しても死亡例がなく、 体重増加も対照群と同じで あり、 しかも、 外観や剖検上も全く異常が認められなかった。
従って、 上記多糖類は安全性が高いと言える。 このことは、 以下に示す癌化 学療法剤についての LD5。値との比較によって一層明らかで.ある。 市販癌化学療法剤のラット経口投与における LDSn(mg/kg) の例
(「医療薬 曰本医薬品集 第 9版 （ 1985) 財団法人曰本医療情報セン ター糲」 （菜業時報社発行） 記載値)
シクロホスフィ ド 100 (雄） 、 1 18 (雌）
シスブラチン 34. 3 (雄） 、 36. 6 (雌）
マイトマイシン C 67. 4
フルォロウラシル 781
カルボコン 27. 3 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により更に詳細に説明するが、 本発明は、 その要旨を 超えない限り、 以下の実施例に限定されるものではない。
多糖類の製造例 1
先ず、 50 Oml容の坂口フラスコに、 表一 1に示す組成の培地を 100ml 入れ、 121。Cで 20分間湿熱滅菌後、 表一 2に示す組成の培地を使用して試 験管にて 3 日間液体振盪培養していたク レブシエラ * ォキン ト力
(K l e b s i e l l a o x y t o c a ) T匪 3株 （ F E RM BP - 4669) を、 一白金耳分植菌し、 振盪数毎分 1 10ストローク、 28eCで 1 日間レシプロ振遨培養を行つた。 表 - 1
培地組成 （重量％)
グルコース 2 %
ポリペプトン 0. 1 %
リン酸一水素力リウム 0. 15 %
硫酸マグネシウム · 7水和物 0. 05 %
ビタミン B1 0. 0005 %
ピオチン 0. 000006 %
パントテン酸カルシウム 0. 001 %
ニコチンァミ ド 0. 0005 %
PH 6. 5
次に、 表 - 2に示す組成の培地 8リッ トルを入れて前記と同様の滅菌を行つ た 1 5 リ ッ トル容のジャーファーメ ンターに、 上記で得られた培養液、 400mlを接種し、 温度 28 、 通気量 5リットル Zmi nの条件下で、 5M 水酸化ナトリウム水溶液を使用して系中の pHを 7に保ちながら、 95時間 通気撹拌培養を行った。 なお、 回転数は、 培養 24時間目までは 200 r pm、 それ以降 33時間までは 400 r pm、 それ以降 95時間までは 700 r pm とした。 表 - 2
培地組成 （重量％)
グルコース 4 % ポリペプトン 0 2 %
リン酸一水素カリウム 0 15 %
硫酸マグネシウム · 7水和物 0 01 %
ビタミン B1 0. 0005 % ピオチン 0. 000006 % パントテン酸カルシウム 0. 00 1 %
ニコチンァミ ド 0. 0005 %
得られた培養物の pHを 10%の硫酸で 4. 5に調整し、 121°Cで 60分 間湿熱滅菌後、 遠心分離により菌体を除去した。 得られた培養上清分について、 残留培地成分などの多糖類以外の成分が除去されるまでクロスフ口一方式の限 外ろ過を繰り返した。 限外ろ過には、 東ソ一社製、 限外ろ過システム 「UF— LMSII」 （分画分子量： 3 x 106 ) を使用した。 限外ろ過膜を透過しなか つた濃縮液を凍結乾燥し、 培地 1リツ トル当たり、 約 21 g (原料としたグル コースの約 5割強の収量） の単一な多糖類を得た。 なお、 多糖類の単一性の確 認は、 GPCモードの高速液体クロマトグラフィーを使用して行った。
旭化成社製 「As ah i p a k G F A— 7MF」 をカラムとし、 0. 1M 硝酸ナトリゥム水溶液を移動相とした高速液体クロマトグラフィ一を使用し、 上記多糖類の分子量を測定した結果、 多糖類のクロマトグラフのピーク トップ の保持時間は、 分子量既知のプルランを標準サンプルとして作成した分子量 - 保持時間標準曲線において、 分子量約 1. 5 X 106 に相当する値を示した。 また、 上記多糖類および多糖類自身が有するグルクロン酸残基のカルボキシ ル基を還元した多糖類について、 各構成糖まで加水分解を行い、 アルジトール アセテートに誘導した後、 ガスクロマトグラフィー分析を行った。 予め作成し た検量線と各構成糖のピーク面積から求めた、 各構成糖のモル比は、 D—グル クロン酸： L一ラムノース： D—ガラクトース： D—グルコース = 1 : 3 : 1 : 1であった。
多糖類の製造例 2
製造例 1において、 通気撹拌培養後の培養物に対する湿熱滅菌時間を 60分 間から 100分間とし、 限外ろ過に使用するシステムの分画分子量を 1 X 105 と設定した以外は、 製造例 1と同様に処理して多糖類を得た。 得られた多糖類 について、 各構成糖のモル比を求めたところ、 D—グルクロン酸： L—ラムノー ス： D—ガラクトース： D—グルコース = 1 : 2. 8 : 1 : 1であった。 また、 分子量は 2 X 105 であった。
多糖類の製造例 3
先ず、 製造例 1と同様にレシプロ振遨培養を行って培養液を得た。
次に、 表一 3に示す組成の培地 6リッ トルを入れて製造例 1と同様の滅菌を 行った 1 0リッ トル容のジャーファーメンターに、 上記で得られた培養液、 40 Omlを接種し、 温度 28eC、 培養 21時間目までは通気量 3. 6リッ ト ル /mi n、 培養 21時間目以降は 4. 8リッ トル Zm i nの条件下で、 5M 水酸化ナトリウム水溶液を使用して系中の pHを 7に保ちながら、 86時間 通気撹拌培養を行った。 なお、 回転数は、 培養 20時間目までは 250 r pm、 それ以降 36時間までは 500 r pm、 それ以降 86時間までは 650 r pm とした。 表一 3
培地組成 （重量％)
グルコース 2 %
硫酸アンモニゥム 0. 06 % リン酸一水素カリウム 0. 15 %
硫酸マグネシウム · 7水和物 0. 05 %
硫酸鉄 · 7水和物 0. 003 % エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム ' 2水和物
0. 01 % ビタミ ン B1 0. 0005 % ピオチン 0. 000006 % パントテン酸カルシウム 0. 001 % ニコチンアミ ド 0. 0005 %
得られた培養物を、 121°Cで 20分間湿熱滅菌後、 遠心分離により菌体を 除去した。 得られた培養上清分について、 残留培地成分などの多糖類以外の成 分が除去されるまで、 クロスフロー方式の限外ろ過を繰り返した。 限外ろ過に は、 東ソ一社製、 限外ろ過システム 「UF— LMSIIJ (分画分子量： 1 105 ) を使用した。 限外ろ過膜を透過しなかった濃縮液を凍結乾燥し、 培地 1リッ トル当たり、 9. 6 gの単一な多糖類を得た。 なお、 多糖類の単一性の確認は、 GPCモードの高速液体クロマトグラフィーを使用して行った。
そして、 製造例 1と同様にして、 得られた多糖類の分子量と各構成糖のモル 比を測定した。 分子量約 3. 2 x 105 であり、 各構成糖のモル比は、 D -グ ルクロン酸： L一ラムノース： D—ガラク トース ： D—グルコース = 0. 9 ： 2. 8 : 1. 0 : 1. 1であった。 免疫賦活能測定のための多糖類の調製
上記製造例で得られた各多糖類を濃度 1重量％の水溶液とし、 その各水溶液 に陽イオン交換樹脂を添加して多糖類におけるグルクロン酸残基のカルボキシ ル基の対ィォンを水素ィオンとした後、 水酸化ナトリゥムで中和して対ィォン をナトリウムイオンに置換した。 その後、 孔径 0 . 2 /z mのメンブランフィル ターで濾過した後、 凍結乾燥し、 得られた各多糖類を以下の実施例に供した。 実施例 1 (癌増殖抑制効果測定）
測定しょうとする試薬 1種に対し、 各々ザルコーマ 1 8 0癌細胞 5 x 1 0 6 個を皮下に移植した I C Rマウス （雄、 5週齢） 5例を用意し、 製造例 1、 製 造例 2で得た多糖類を、 それぞれ 1日当たりの投与量が 3 O m gZ k gとなる 様に、 癌細胞移植 2 4時間後から 1 0曰間連続して腹腔内に投与を行った。 癌 細胞移植 5週間後に、 各例における固形癌の重量を測定し、 その平均値から癌 細胞増殖抑制率を求めた。 また、 レンチナンについても同様に測定を行った。 なお、 癌細胞増殖抑制率 （％) は、 何も投与していない癌細胞移植マウス 5 例を使用した場合の固形癌の重量平均値を ェ 、 多糖類などの試薬を投与した 場合の固形癌の重量平均値を W。 とし、 下式にて計算し、 その値を表一 4に示 した。 癌細胞増殖抑制率は、 数値が大きいほど、 癌細胞の増殖を抑制する能力 が大きいことを示している。
Wl - W2
癌細胞増殖抑制率 = X 1 0 0
Wl 表一 4 癌細胞増殖抑制率
製造例 1で得た多糖類を投与したマウス 98
製造例 2で得た多糖類を投与したマウス 89
レンチナン 100 なお、 本発明で使用される多糖類と同様に酸性へテロ多糖類である、 特公平
1 - 59283号公報記載の多糖質 A 29 - P Sは、 上記実施例 1と同様な試 験において、 約 3割程度の癌細胞増殖抑制率を示している。
上記に示した結果から、 本発明で使用される多糖類は、 優れた免疫賦活性を 有することが認められる。
実施例 2 (細胞障害性 T細胞 （CTL) 誘導能測定）
H— 2ハプロタイプの異なる C 3 Hマウスと B ALBZcマウスを使用し、 以下の試験を行なった。
C 3Hマウス （1群 4匹： N = 4) に B ALBZcマウスの脾臓リンパ球 （2 X 10' 個） を腹腔に免疫した。 表一 5に示す被検試料は、 上記 C 3 Hマウス に免疫の前日から、 免疫後 2曰まで、 1曰 1回 5 OmgZkg又は 2 Omg/ k gを計 4回背部の皮下に投与した。 対照として被検試料の代わりに生理食塩 水を使用した。 9曰後に C3Hマウスから脾臓リンパ球浮遊液を採取した。 こ のリンパ球浮遊液には CTL (以下エフェクター細胞と呼び Eと略す） が含ま れており、 大腸菌の^一ガラク トシダーゼ （ ー ga 1) を導入した B ALB Zcマウス由来のミエローマ細胞株 NS - 1ZZ (以下 Tと略す） を標的細胞 として、 104 個の NS— 1ZZを E/T比 30、 60又は 120となる様に エフヱクタ一細胞と混合し、 0. 2m 1の RPM I— 1640培地中で 37 。C、 4時間保温した。 標的細胞の破壊により上清中に遊離した /3— g a 1活性 を測定し、 CTLによる細胞障害性を次の式により算出し、 表一 5に免疫陚活 活性を示した。
A - B
細胞障害性 （％) 二 X 100
C-B
A：遊離した — g a 1活性
B ： 自然遊離した ^一 g a 1活性
(エフェクター細胞のない場合にみられる酵素遊離）
C ：全^一 g a 1活性
(使用した Tを 0. 0425%Tr i t on— X 100で溶解し、 含まれる全 酵素活性を測定する。 ）
被検試料を投与した場合の細胞障害性 （％)
免疫賦活活性 =
生理食塩水を投与した場合の細胞障害性 （％)
表一 5
¾ 免疫陚活活性
被検試料 （mg/kg/dav) E/T=30 E/T=60 E/T=120 製造例 1で得た多糖類 50 2. 4 2. 1 2. 5 製造例 3で得た多糖類 50 1. 4 1. 3 1. 5 シゾフイラン 20 5. 5 2. 0 1. 7 実施例 3 (腫瘍壊死因子 （TNF) , インターロイキン （I L一 6) 誘導能 測定）
各群 3匹の C 3 H/H e Nマウス （6〜1 2週齢） を供試し、 MD P (N- acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine) I 00 μ. g/0. 2mlを静脈注射 した 4時間後に、 製造例 3で得た多糖類 （多糖類 Aとする） 及び Taylerらの方 法（BIOCHEMISTRY, Vol.11， No.8， 1383-1388, 1972) によってグルク口ン酸残基に おけるカルボキシル基を還元した多糖類 （多糖類 Bとする） 並びに免疫賦活能 を有する市販品であるシゾフィラン （科研製薬社販売、 台糖社製） を、 1 00 g/0. 2m lで各々静脈注射した。 そして、 アナフィラキシー様反応と急 死の有無を 60分間観察した。 注射 90分後に生存マウスより採血して血清中 の TNFと I L一 6活性を測定した。 TNF活性は、 ァクチノマイシン D処理 した L一 9 2 9細胞に殺作用を指標とし、 対照とした r Hu TN F (Human recombinantTNF)の活性との比に基いて算定し、 n g/m 1で表した。 I L一 6 活性は、 I L一 6依存性の MH60. BS F 2細胞の増殖刺激作用を指標とし、 対照とした r Hu I L一 6を共試した検量線に基いて算定し、 U/m lで表し た。 平均値 ±標準偏差で表した結果を表 - 6に示す。 表一 6 了ナフ ラキシ -様反応 急死 TNF I L- 6
(n g/m 1 ) 丄 U/m 1 ) 多糖類 A 0/3 0/3 507.0± 136.5 825.0 ±588.4 多糖類 B 0/3 0/3 312.0±45.0 731.7±342.2 シゾフィラン 0/3 0/3 0±0 14.1±2.2
上記の表から明らかな通り、 本発明で使用される多糖類には、 シゾフィラン には認められない TNF、 I L一 6誘導能を有することが認められる。
以上説明した本発明によれば、 クレスチンやレンチナン等の担子菌由来の多 糖類よりも生産性が高く、 しかも、 便れた効果を有する免疫賦活剤を提供する ことが出来る。 また、 本発明によれば、 従来より使用されている癌化学療法剤 に比べて、 毒性が非常に低く、 しかも、 従来より免疫賦活能を有することが知 られているシゾフィランには認められなかつた機能をも有する免疫賦活剤を提 供することが出来る。 従って、 本発明の免疫陚活剤は、 癌の予防や治療、 細菌 などの微生物やウィルス感染に対する予防 ·治療、 手術後の免疫低下の回復な どに適用が期待できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 構成糖が、 グルクロン酸、 ラムノース、 ガラク トース及びグルコースの 4 種から成り、 その構成モル比が、 グルクロン酸： L一ラムノース：ガラクトー ス： グルコース =0〜1. 2 : 2. 4〜3. 6 : 0. 8〜1. 2 : 0. 8〜2. 4である多糖類から成ることを特徴とする免疫賦活剤。
2. 構成糖の構成モル比が、 グルクロン酸：ラムノース：ガラク トース：グル コース =0. 8〜1. 2 : 2. 4〜3. 6 : 0. 8〜1. 2 : 0. 8〜1. 2 である請求の範囲 1に記載の免疫賦活剤。
3. ゲルろ過クロマトグラフィーを使用して測定した多糖類分子量が、 約 1 X 103 〜10 X 106 である請求の範囲 1に記載の免疫賦活剤。
4. 構成糖の結合様式が次の通りである請求の範囲 1に記載の免疫陚活剤。
ラムノースの結合様式が （1→2) 結合および （1→ 結合）
(ただし上記結合様式の構成比は、 （1→2) ： (1→ 結合） = 1. 3〜3. 0 : 1)
グルクロン酸の結合様式が （1→3) 結合および （1→4) 結合
ガラク トースの結合様式が （1→3) 結合
グルコースの結合様式が （1→2) 結合
5. ラムノース、 グルクロン酸およびグルコースの結合配置が であり、 ガラ クトースの結合配置が である請求の範囲 1に記載の免疫賦活剤。
6. 各構成糖残基の主な結合様式とその構成モル比が次の通りである請求の範 囲 1に記載の免疫賦活剤。
L-Rha(l→： 2→)L-Rha(l→： 3→)D-Gal(l→： 2→)D-Glc(l→： 3→)D-GlcUA (1→ 4
个
= 0.8〜1.2 ： 1.6〜2.4 ： 0.8〜1.2 ： 0.8〜1.2 ： 0.8〜2.4
(ただし、 Rh a、 G a 1、 G 1 c及び G 1 c UAは、 それぞれ、 ラムノース 残基、 ガラク トース残基、 グルコース残基およびグルクロン酸残基を示し、 数 字はグリコシド結合の位置を示す。 ）
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