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Nouveaux polypeptides ayant une activité de facteur de croissance et séquences d'acides nucléiques codant pour les polypeptides.
Introduction.
Demande technique.
La présente invention concerne de nouvelles compositions polypeptidiques ayant une activité de facteur de croissance, notamment des polypeptides hybrides, outre des procédés pour les préparer suivant les techniques de l'ADN recombinant.
Arrière-plan de l'invention.
Les polypeptides sécrétés par les cellules des mammifères se révèlent en nombre significatif avoir une activité de facteur de croissance. La séquence de ces polypeptides est sensiblement conservée chez une grande variété de mammifères. Une bonne partie de l'intérêt porté à ces composés tient à leur association au pouvoir oncogène. La régulation de la production ces facteurs de croissance et la façon dont ils agissent comme régulateurs de l'activité cellulaire suscitent également de l'intérêt.
Il a été observé aussi que l'infection des cellules des mammifères par les virus induit une croissance proliférative des cellules infectées. Aux fins de l'invention, un intérêt particulier est offert par les virus du groupe de la variole, comme le virus de la variole, le virus de la vaccine et les virus associés à des maladies particulières telles que le virus du fibrome de Shope, le virus de la tumeur de Yaba et le virus du Molluscum contagiosum (MCV).
Il serait intéressant de déterminer si les virus induisant une prolifération cellulaire lors de l'infection produisent des polypeptides qui ont une relation avec les facteurs de croissance en agissant
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comme facteurs de croissance ou bien comme récepteurs d'un facteur de'croissance. Ces composés pourraient alors être utilisés pour des études sur les actions virales, pour des tests de recherche de virus, comme agents mitogènes dans les milieux nutritifs et pour le développement d'agents thérapeutiques pour traiter les infections virales. Il serait intéressant aussi de développer des composés qui pourraient être des agonistes ou antagonistes des facteurs de croissance pour les utiliser in vitro dans des cultures de cellules, dans l'examen des processus mitotiques et à des fins thérapeutiques.
Bibliographie.
Venkatesan et al., J. Virol. (1982) 44 : 637-646 décrivent le séquençage de l'ADN du gène de structure codant pour les protéines du virus de la vaccine, mais il n'y a pas d'indication que l'une quelconque de ces protéines ait une activité de facteur de croissance. Cooper et al., ibib (1981) 37 : 284-294, décrivent la traduction de mARN codés dans la répétition terminale inversée du génome du virus de la vaccine. Des affections prolifératives dues à des virus de la famille de la variole ont été décrites à propos du virus du fibrome de Shope (Shope, J. Exp. Med. (1932) 56 : 793-822), du virus de la tumeur de Yaba (Niven et al., J. Path. Bacteriol. (1961) 81 : 1-14) et du virus du Molluscum contagiosum (MCV) (Postlethwaite, Arch. Environ. Health (1970) 21 : 432-452).
Des descriptions du facteur de croissance épidermique (TGM) peuvent être trouvées dans Scott et al., Science (1983) 221 : 236-240 et Gray et al., Nature (1983) 303 : 722-725. La présence de trois ponts disulfure dans l'EGF et le facteur de croissance transformant (TGF) est indiquée par Savage et al., J. Biol. Chem. (1973) 248 : 7669-7692. Voir aussi Doolittle et al., Nature (1984) 307 : 558-560 et la
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demande de brevet australien nO 85006288. Il a été suggéré que la région de fixation au récepteur de la
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molécule de l'EGF se trouve dans la boucle entre le troisième résidu de cystéine et le quatrième (Komoriya et al., Proc. Natl. Acad. Soi. USA (1983) 8l : 1351- 1355).
De nouvelles descriptions du facteur de croissance du virus de la vaccine (VGF) peuvent être trouvées dans Brown et al., Nature (1985) 313 : 491-492 ; Reisner, Nature (1985) 313 : 801-803 et Blomquist et al., Proc. Natl. Acad. Soi. USA (1984) 8l : 7263-7367. Le facteur de croissance du virus du fibrome de Shope naturel (SFGF) est décrit par Chang W. C. et al. dans Molecular and Cellular Biol. (1987) 7 : 535-540. Shope mentionne dans J. Exp. Med. (1932) 56 : 793-802 que l'infection de lapins adultes par le virus du fibrome de Shope induit une prolifération rapide des fibroblastes menant à un fibrome bénin. L'infection des lapins nouveau-nés ou adultes privés d'immunité provoque une prolifération rapide des fibroblastes menant à un fibrosarcome atypique invasif.
Allison A. C., J. Natl. Cancer Inst. (1966) 36 : 869-876 : Smith et al., J. Natl. Cancer Inst. (1973) 50 : 1529-
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1539 ; Allison A. C., J. Natl. Cancer Inst. (1966) 35 : 859-868.
Le facteur de croissance du virus de la myxomatose naturelle (MGF) est décrit par Upton et al., J. Virol. (1987) 61 : 1271-1275. L'infection des lapins adultes par le virus de la myxomatose provoque une tumeur myxosarcomateuse invasive qui prolifère rapidement. Strayer D. S. et Sell S., J. Natl. Cancer Inst. (1983) 71 : 105-116. Une séquence d'ADN capable de coder pour un facteur de croissance conservé (facteur de croissance du virus du Molluscum contagiosum naturel (MCGF)) a été décelée. Porter C. D. et Archard L. C. J.
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Gen. Virol. (1987) 68 : 673-682. L'infection par le virus du Molluscum contagiosum chez l'être humain induit des tumeurs cutanées bénignes caractérisées par des cellules en prolifération rapide. Brown et al., Sex.
Transm. Dis. (1981) 8 : 227-234. Le virus de la tumeur de Yaba provoque des histocytomes sous-cutanés chez le singe et l'homme, Bearcroft et al., Nature (Londres) (1958) 182 : 195-196, et en raison de sa relation avec le virus du fibrome de Shope, le virus de la myxomatose et le virus du Molluscum contagiosum, il est à prévoir qu'il ait un facteur de croissance apparenté.
L'EGF de la souris (mEGF) (Scott et al., 1983, supra ; Gray et al., 1983) supra) et l'EGF de l'être humain (hEGT) (Gregory et. al., Int. J. Pept. Protein Res. (1977) 9 : 107-118) sont connus comme étant homologues des TGF de l'être humain, de la souris et du rat (Marquardt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80 : 4684-4688) et des résidus 45 à 85 d'un polypeptide de 140 résidus, qui est le facteur de croissance de la vaccine (VGF) codé par le génome du virus de la vaccine (Venkatesan et al., 1982, supra).
L'expression de polypeptides étrangers au moyen d'un baculovirus vecteur dans des cellules d'insectes est décrite par Maedra et al., Nature (1985) 315 : 592-594 et Carbonell et al. ; J. of Virology (1985) 56 : 153-160.
Cette bibliographie est donnée à titre de référence.
Aperçu de l'invention
L'invention a pour objet de nouvelles compositions polypeptidiques ayant une analogie avec des fragments de protéines virales, lesquelles compositions se comportent comme agents mitogènes et peuvent être utilisées dans des milieux nutritifs, comme réactifs pour détecter les récepteurs des
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facteurs de croissance ou la présence des facteurs de croissance, et comme agents compétitifs pour le facteur de croissance transformant et le facteur de croissance épidermique. Ces compositions trouvent une application thérapeutique, par exemple, dans l'aide à la reconstitution de l'épithélium et dans la cicatrisation des brûlures et des plaies. Ces nouvelles compositions peuvent être synthétisées.
Les peptides de l'invention peuvent être formés à l'état d'oligopeptides ou de protéines fusionnées suivant les techniques de recombinaison chez une grande variété d'hôtes.
Description des dessins.
Fig. 1 est une comparaison de la séquence des acides aminés de la protéine du virus de la vaccine avec des facteurs de croissance connus, où l'acide aminé initial du VGF est l'acide aspartique (D) à la position 20 depuis la méthionine, laquelle position correspond à aa-24 des peptides décrits, la légende pour la Fig. 1 étant la suivante :
FAMILLE DES FACTEURS DE CROISSANCE MGF Facteur de croissance du virus de la myxomatose SFGF Facteur de croissance du virus du fibrome de Shope VGF Facteur de croissance du virus de la vaccine hTGF TGF humain rTGF TGF du rat hEGF EGF humain mEGF EGF de la souris rEGF EGF du rat gpEGF EGF du cobaye Amphiréguline.
* Les numéros correspondent aux résidus d'acides aminés dans le VGF, comme indiqué dans le mémoire, et
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Fig. 2 représente la structure proposée du VGF à maturité, avec des remplacements d'asparagine (N), la légende pour la Fig. 2 étant la suivante : + Acide aspartique dans le SFGF.
* Site de glycosylation possible dans SFGF et/ou
MGF.
N L'acide aminé indiqué est remplacé par l'asparagine.
Formes de réalisation spécifiques.
L'invention a pour objet de nouvelles compositions qui peuvent agir comme agonistes ou antagonistes du facteur de croissance épidermique (EGF) ou du facteur de croissance transformant (TGF) et qui trouvent une large variété d'applications dans la culture des cellules, dans les moyens du diagnostic, dans la thérapeutique in vivo et dans la combinaison avec d'autres peptides pour former des polypeptides hybrides servant d'immunogènes pour la production d'anticorps. Des séquences polynucléotidiques peuvent être isolées ou préparées et peuvent être introduites dans un vecteur d'expression aux fins d'exprimer les compositions de l'invention.
Les compositions ont une analogie avec des fragments de protéines virales, en particulier de protéines de virus du groupe de la vaccine. Comme le montre la Fig. l, le VGF comprend des résidus non chargés et hydrophobes près de l'extrémité N-terminale entre les résidus 5 et 15 et près de 11 extrémité c- terminale entre les résidus 100 et 124. Ces résidus peuvent être considérés par analogie avec les glycoprotéines membranaires intégrales comme étant une séquence de signalisation N-terminale hydrophobe qui est éliminée par protéolyse pendant la traduction ou immédiatement après, et une séquence transmembranaire C-terminale qui sert à ancrer la protéine mature dans la membrane. La coupure du polypeptide viral à arg-43
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et arg-90 du peptide mature conduirait au dégagement d'un polypeptide soluble.
Le polypeptide W de 140 résidus peut être considéré comme donnant naissance d'abord à une protéine associée à la membrane d'environ 121 résidus après élimination de la séquence d'acides aminés 19. Après le traitement intracellulaire, un facteur de croissance peptidique soluble d'environ 77 résidus est constitué. Stroobant P. et al. Cell (1985) 42 : 383-393.
La comparaison du facteur de croissance du virus de la myxomatose (MGF) et du facteur de croissance du virus du fibrome de Shope (SFGF) avec les autres facteurs de croissance de cette famille (Fig. 1) révèle quelques différences notables. Le MGF et le SFGF, synthétisés à l'état de molécules précurseurs, comprennent une séquence de signalisation à l'extrémité N-terminale, mais au contraire des autres facteurs de croissance, ne comprennent pas de domaine transmembranaire à l'extrémité C-terminale, ce qui indique que ce sont des molécules sécrétées. L'analyse de la séquence révèle une utilisation significative de l'asparagine dans le MGF et le SFGF. Dans six positions, le MGF et le MSGF comprennent des asparagines conservées où les autres facteurs de croissance n'ont pas d'asparagine.
Parmi ces positions, les asparagines remplacent deux résidus glycine hautement conservés aux positions 8 et 31, où la première cystéine est à la position 2. Ces deux résidus glycine apparaissent en combinaison avec des résidus tyrosine hautement conservés aux positions 9 et 32. En raison de la nature hautement conservée des acides aminés sur cette face de la molécule, l'hypothèse est que les boucles de cystéine présentes sur cette face sont impliquées dans la fixation sur le récepteur et dans la fonction des facteurs de croissance de cette famille.
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La glycine et l'asparagine sont prévues comme ayant le plus haut potentiel de tour bêta (Chou et Fassman, Ann. Rev. Biochem. (1978) 47 : 251-276). Ainsi, il apparaît que la conservation de ce potentiel de tour est extrêmement importante pour l'activité du facteur de croissance. Les facteurs de croissance autres que ceux de la myxomatose et du fibrome de Shope comprennent presque exclusivement de la glycine dans les régions de tour importantes de la molécule. Dans le MGF et le SFGF, ces glycines ont presque toutes été transformées en asparagines (voir Fig. 2). Ceci indique une fonction biologique importante due au remplacement de la glycine hautement conservée par le résidu asparagine.
La possibilité existe que le remplacement de la glycine par l'asparagine dans les régions de tour conservées dans la structure du facteur de croissance puisse conduire à une fonctionnalité accrue du facteur de croissance, soit par accentuation de la fixation sur le récepteur de l'EGF ou sur un récepteur apparenté, ce qui augmente l'effet direct du facteur de croissance dans les cellules affectées, soit par augmentation de la stabilité de la molécule.
Deux des nouvelles apparitions des asparagines dans le MGF et le SFGF offrent des sites de glycosylation N-liés possibles. De surcroît, ces sites existent dans les boucles de cystéine qui tolèrent des nombres variables d'acides aminés. Dès lors, les nouvelles apparitions d'asparagine peuvent offrir des avantages multiples au facteur de croissance en plus de la fonctionnalité accrue. L'un de ceux-ci pourrait être la stabilisation de la protéine in vivo par protection, grâce à la glycosylation, de sites de dégradation ou immunogènes.
Les polypeptides de l'invention sont caractérisés par le fait qu'ils sont capables de
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comprendre au moins une boucle ou un cercle, et habituellement trois boucles ou cercles, à cause de cystéines qui forment des ponts, où la partie physiologiquement active de la molécule exerçant une activité apparentée à celle d'un facteur de croissance compte environ 12 à 65 acides aminés, mais habituellement 15 à 60 acides aminés.
Parmi ces trois boucles, deux sont de 12 à 15 acides aminés (14 à 17 acides aminés annulaires), à l'exclusion du pont cystéine, et plus particulièrement l'une est de 12 ou 13 acides aminés (14 ou 15 acides aminés annulaires) et l'autre est de 15 acides aminés (17 acides aminés annulaires), dont la boucle proximale de l'extrémité Nterminale est habituellement de 12 ou 13 acides aminés et plus habituellement de 12 acides aminés et la boucle médiane est de 15 acides aminés.
La troisième boucle ou boucle C-proximale est de 8 acides aminés (10 acides aminés annulaires) et en y comprenant les acides aminés de flanquement est de la
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formule suivante :
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ou les symboles à une lettre pour les acides aminés ont leur signification traditionnelle, C étant la cystéine, G étant la glycine, N étant l'asparagine, Y étant la tyrosine et R étant l'arginine ; aa25 est un acide aminé neutre qui peut être aliphatique, en particulier de 3 ou 4 atomes de carbone, ou bien aromatique, en particulier de 9 atomes de carbone et comprenant 0 ou 1 radical hydroxyle,
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comme l'alanine, la sérine, la thréonine, la tyrosine ou la phénylalanine ;
aa27 est un acide aminé neutre ou basique, comptant en particulier 3 à 6 atomes de carbone, et, lorsqu'il est neutre, comprenant 0 ou 1 radical carboxamide, par exemple l'arginine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, l'asparagine ou la glutamine ; aa29 est un acide aminé neutre ou basique, qui est aliphatique ou aromatique, dont l'exemple aromatique est l'histidine et l'exemple aliphatique compte 2 à 6 et plus habituellement 3 à 6 atomes de carbone, et comprend 0 ou l radical hydroxyle, par exemple la sérine, la thréonine, la leucine, la valine, l'isoleucine ou l'arginine ; aa30 est un acide aminé neutre, qui est aliphatique ou aromatique, dont l'exemple aromatique est l'histine et l'exemple aliphatique compte 3 à 6 atomes de carbone, et comprend 0 ou 1 radical hydroxyle, en particulier la sérine, l'isoleucine et la valine ;
aa33 désigne un acide aminé aliphatique neutre de 2 à 6 et plus habituellement de 3 à 6 atomes de carbone comprenant 0 ou 1 radical hydroxyle, plus particulièrement la sérine, la thréonine, la valine, la leucine ou l'isoleucine, ou bien un acide aminé acide, par exemple l'acide glutamique ou l'acide aspartique ; aa35 est un acide aminé neutre ou acide de 3 à 6 atomes de carbone, dont un exemple de neutre est l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine ou la sérine, et dont un exemple d'acide est l'acide aspartique ou l'acide glutamique ; aa38 est un acide aminé aliphatique neutre substitué, dont le substituant est un radical carboxamide et qui compte 4 ou 5 atomes de carbone, ou
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0 bien un acide aminé acide, par exemple l'asparagine, la glutamine, l'acide aspartique ou l'acide glutamique ;
aa39 est un acide aminé aromatique ou un acide aminé aliphatique neutre de 3 ou 4 atomes de carbone portant habituellement un radical hydroxyle, de préférence aromatique, par exemple la phénylalanine, l'histidine, la tyrosine, la sérine ou la thréonine ; aa40 est un acide aminé aliphatique neutre substitué ou non substitué de 3 à 6 atomes de carbone, ou bien un acide aminé basique, par exemple l'alanine, la valine, l'isoleucine, la glutamine ou l'arginine ;
m et n représentent 0 ou 1 ;
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3 4 pp3 et pp4 peuvent être identiques ou différents et sont des atomes d'hydrogène indiquant la terminaison du polypeptide, ou sont des chaînes polypeptidiques n'excédant pas un total de 1000 acides aminés et habituellement n'excédant pas un total d'environ 500 acides aminés, de préférence où au moins 90% des acides aminés et plus avantageusement au moins environ 95% des acides aminés présents se trouvent dans l'une des deux chaînes polypeptidiques ; dans certains cas, la chaîne peut comprendre un seul acide aminé et au maximum 100 acides aminés, et fréquemment pas plus d'environ 50 acides aminés, en fonction de l'utilisation du polypeptide et du rôle de la chaîne prolongée ;
les chaînes polypeptidiques peuvent être apparentées aux chaînes polypeptidiques naturelles associées aux facteurs de croissance naturels et aux protéines des virus du groupe de la variole, ou bien elles peuvent être autres que les chaînes naturelles ou parties de celles-ci associées à la chaîne polypeptidique spécifiquement décrite par la formule, et habituellement sans relation.
Les définitions des acides aminés sont données ci-après.
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<tb>
<tb>
Neutres <SEP> (Ne)
<tb> aliphatiques <SEP> (Al)
<tb> non <SEP> substitués <SEP> G, <SEP> A, <SEP> V, <SEP> L, <SEP> I, <SEP> P
<tb> substitués
<tb> oxy <SEP> S, <SEP> T
<tb> thio <SEP> C, <SEP> M
<tb> amido <SEP> N, <SEP> Q
<tb> aromatiques <SEP> (Ar)
<tb> non <SEP> substitués <SEP> F
<tb> substitués <SEP> Y
<tb> hétérocycliques <SEP> H, <SEP> W
<tb> Chargés <SEP> (à <SEP> pH <SEP> 6,0)
<tb> basiques <SEP> (Ba) <SEP> K, <SEP> R
<tb> acides <SEP> (Ac) <SEP> D, <SEP> E
<tb>
Les abréviations entre parenthèses visent les groupes d'acides aminés particuliers. Par non substitué, on entend qu'il n'y a pas d'autres hétérosubstituants que les radicaux carboxyle et amino existant dans la glycine. Les acides aminés sont les acides aminés L naturels.
Les acides aminés neutres peuvent aussi être décrits comme portant des radicaux R non polaires ou polaires (mais non chargés). Les acides aminés qui satisfont à ces définitions sont les suivants :
Acides aminés non polaires A, V, L, I, P, M, F, W
Acides aminés polaires G, S, T, C, Y, N, Q
La boucle entre les cystéines aux positions 28 et 37 dans la formule ci-dessus compte 0 ou 1 acide aminé acide (S). Les acides aminés en flanquement immédiat (c'est-à-dire les acides aminés 27 et 38) des cystéines à l'extérieur de la boucle peuvent comprendre
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au moins un acide aminé chargé et au moins un acide aminé aliphatique amido-substitué.
Parmi les acides aminés de la boucle (28 à 37), de 4 à 6 et habituellement 5 acides aminés seront des acides aminés aliphatiques neutres et au maximum 2, mais habituellement 1, seront des acides aminés aromatiques.
Un intérêt particulier est offert par les composés quand le polypeptide compte moins de 130 acides aminés, en particulier moins de 55 acides aminés, et au moins 44 acides aminés, de préférence au moins environ 53 acides aminés. Un intérêt particulier est offert par les polypeptides comprenant les acides aminés 44 à 88 et leurs fragments du VGF (aal à aa47, voir Fig. 1).
De préférence, aa29 est un acide aminé aliphatique substitué ou non substitué de 3 à 6 atomes de carbone comprenant 0 ou 1 radical hydroxyle, en particulier la sérine ou la valine, ou bien un acide aminé aromatique, en particulier l'histidine ; de préférence, aa30 est l'histidine, la sérine ou un acide aminé aliphatique non substitué de 5 ou 6 atomes de carbone, en particulier l'isoleucine ; de préférence, aa33 est un acide aminé aliphatique substitué ou non substitué comprenant 0 ou 1 radical hydroxyle et 3 à 6 atomes de carbone ; de préférence, aa35 est un acide aminé aliphatique de 3 à 6 atomes de carbone ; de préférence, aa38 est la glutamine ou l'acide glutamique ; de préférence, aa39 est aromatique et est plus avantageusement l'histidine ou la phénylalanine ; de préférence, aa40 est un acide aminé neutre ou basique.
Un intérêt particulier est offert par la présence de deux boucles, avec la boucle C-proximale
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unie à la deuxième boucle, où les acides aminés de la seconde boucle peuvent être très variés. La deuxième boucle compte, de préférence, environ 14 à 16 acides aminés, à l'exclusion du pont cystéine, et plus avantageusement environ 15 acides aminés.
Parmi les acides aminés, 6 à 9 et de préférence 7 à 9, mais plus avantageusement environ 8, sont des acides aminés aliphatiques substitués ou non substitués, la préférence étant que pas plus d'environ 3 des acides aminés soient substitués et plus avantageusement que 1 ou 2 acides aminés soient substitués ; il y aura 2 à 4 acides aminés aromatiques et plus particulièrement 3 acides aminés aromatiques, par préférence l'histidine et la tyrosine ; il y aura 2 à 4 acides aminés acides, de préférence 3 acides aminés acides et plus particulièrement l'acide aspartique ; et il y aura 0 à 2, et plus habituellement 1 acide aminé basique, en particulier l'arginine.
Il est souhaitable que la cystéine formant la boucle envisagée la plus proche de la cystéine de l'autre boucle en soit séparée par 0 à 2 acides aminés, et plus habituellement par 0 ou 1 acide aminé, en particulier l'arginine.
Un intérêt particulier pour certaines applications des composés de l'invention est offert par les composés de la formule suivante :
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ou : les symboles aa25 à aa40 de la formule ont été décrits ; ppl et pp2 sont identiques ou différents et peuvent être des atomes d'hydrogène, indiquant la partie terminale du polypeptide représenté, ou être des polypeptides comptant au total jusqu'à environ 1000 acides aminés, plus habituellement jusqu'à environ 500 acides aminés, et peuvent comprendre au total à peine 1 acide aminé, ou bien peuvent être individuellement ou séparément des polypeptides de 1 à 100 acides aminés, plus habituellement d'environ l à 75 acides aminés et plus particulièrement d'environ 5 à 50 acides aminés ;
ces polypeptides ont des applications spécifiques dans la modification de la séquence décrite spécifiquement dans un but prédéterminé ; Ppl et pp2 peuvent être identiques au polypeptide naturel du virus de la vaccine ou en être différent, et en sont habituellement différents ; aal peut être un acide aminé quelconque, plus particulièrement un acide aminé aliphatique, un acide aminé basique ou un acide aminé acide, de préférence un acide aminé aliphatique non substitué de 2 à 6 atomes
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de carbone, notamment la glycine, la leucine, la valine, la lysine, l'acide glutamique ou l'acide aspartique ; aa3 est un acide aminé neutre, en particulier de 2 à 4 atomes de carbone, et plus particulièrement l'asparagine, la glycine ou la proline ;
aa4 peut être tout acide aminé aliphatique ou aromatique, en particulier de 2 à 6 atomes de carbone, qui peut être neutre ou acide, et plus particulièrement de 3 à 6 atomes de carbone, notamment la proline, l'acide aspartique, l'histidine, la sérine ou la leucine ; aa5 est un acide aminé acide ou un acide aminé aliphatique neutre substitué, en particulier l'acide glutamique ou l'acide aspartique, ou bien un acide aminé hydroxy-substitué de 3 ou 4 atomes de carbone, plus particulièrement la sérine ; aa6 est un acide aminé aliphatique non substitué de 2 à 6 et habituellement de 2 ou 3 atomes de carbone, ou bien un acide aminé aromatique, en particulier la glycine, l'histidine ou la tyrosine ; aa7 est un acide aminé acide, basique ou neutre, en particulier de 3 à 6 atomes de carbone, comme l'acide glutamique, l'acide aspartique, la lysine ou la thréonine ;
aa8 est un acide aminé aliphatique neutre non substitué de 2 ou 3 atomes de carbone, ou bien un acide aminé substitué par un radical carboxamide de 4 ou 5 atomes de carbone, par exemple l'asparagine, la glutamine ou la glycine ; aall est un acide aminé neutre, soit aliphatique, soit aromatique, plus particulièrement aliphatique, comptant spécialement 5 ou 6 atomes de carbone, plus particulièrement la leucine ou la phénylalanine ;
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aal2 est un acide aminé aromatique ou un acide aminé aliphatique carboxamido-substitué de 4 ou 5 atomes de carbone, en particulier l'histidine ou l'asparagine ; aal2a est un acide aminé aliphatique neutre ou un acide aminé acide, plus particulièrement la glycine, l'asparagine ou l'acide aspartique ;
aal4 est un acide aminé acide ou un acide aminé aliphatique neutre substitué ou non substitué de 4 ou 5 atomes de carbone comprenant 0 ou 1 radical hydroxyle, en particulier l'acide aspartique, la thréonine ou la valine ; aal6 est une liaison ou un acide aminé aliphatique neutre ou basique, soit substitué, soit non substitué, de 4 à 6 atomes de carbone, en particulier l'isoleucine, l'arginine ou la méthionine ;
Arl est un acide aminé aromatique qui peut comprendre un carbocycle ou un hétérocycle, notamment l'histidine, la phénylalanine ou la tyrosine ;
aal7a est un acide aminé aliphatique neutre, soit substitué, soit non substitué, de 3 à 6 et habituellement de 3 à 5 atomes de carbone comprenant 0 ou 1 radical hydroxyle, notamment la valine, la leucine, l'isoleucine ou la thréonine : aal7b est un acide aminé neutre non substitué de 5 ou 6 atomes de carbone ou un acide aminé acide, plus particulièrement la valine, l'isoleucine ou l'acide glutamique ; aa18 est un acide aminé aliphatique neutre, substitué ou non substitué, de 2 à 6 et de préférence de 3 à 6 atomes de carbone comprenant 0 ou 1 radical hydroxyle, en particulier l'alanine, la sérine ou la glutamine ;
aa19 peut être un acide aminé quelconque, en particulier un acide aminé aliphatique acide ou
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basique, plus particulièrement de 4 à 6 atomes de carbone et de préférence de 5 ou 6 atomes de carbone, en particulier l'arginine, la leucine, la valine ou l'acide glutamique ; aa20 est un acide aminé acide ou un acide aminé aliphatique carboxamido-substitué, notamment l'acide aspartique, l'asparagine, l'acide glutamique ou la glutamine ; aa2l est un acide aminé aliphatique neutre non substitué ou acide aminé basique de 3 à 6 atomes de carbone comptant 0 ou 1 radical hydroxyle ou carboxamide, notamment l'isoleucine, la leucine, l'asparagine, le sérine, le thréonine, la lysine ou l'arginine ;
aa22 est une liaison ou un acide aminé acide, qui est l'acide aspartique ou l'acide glutamique, ou bien un acide aminé aliphatique neutre, en particulier la valine ; aa22a est un acide aminé aliphatique neutre comprenant 0 ou 1 radical hydroxyle et en particulier un radical hydroxyle, plus spécialement la sérine ; aa22b est un acide aminé aliphatique ou neutre de 4 à 6 atomes de carbone, en particulier la leucine ou l'isoleucine ; aa23 est une liaison ou un acide aminé aliphatique neutre, substitué ou non substitué, de 2 à 6 atomes de carbone comprenant 0 ou un 1 radical hydroxyle, notamment la glycine, la sérine, la thréonine ou l'asparagine ;
aa24 est un acide aminé aliphatique, en particulier un acide aminé aliphatique thio-substitué, plus particulièrement la méthionine ou la proline, ou bien un acide aminé aromatique, en particulier lÅa tyrosine ; aa41 est un acide aminé aliphatique neutre
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substitué ou non substitué ou acide de 4 à 6 atomes de carbone, en particulier la valine, l'asparagine ou l'acide aspartique ; aa43 est un acide aminé aliphatique neutre, acide ou basique, substitué ou non substitué, de 4 à 6 atomes de carbone, notamment la valine, la leucine, l'isoleucine, l'arginine, la lysine ou l'acide aspartique ;
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aa44 aa44 peut être un acide aminé quelconque, en particulier autre qu'un acide aminé basique, et peut être acide, neutre ou aromatique et qui, lorsqu'il n'est pas aromatique, compte 3 à 6 atomes de carbone, en particulier l'acide aspartique, l'alanine, le leucine, le tryptophane ou la thréonine, et p représente 0 ou 1.
Il est d'un intérêt particulier que ppl ait la séquence suivante :
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où : PP-en combinaison avec les symboles des acides aminés suivants dans la séquence ci-dessus est l'équivalent de ppl. La séquence ci-dessus entre dans la définition de ppl, ppl peut représenter un atome d'hydrogène ou une séquence d'acides aminés. Un ou plusieurs des acides aminés, symbolisés par aa-x (x étant un nombre quelconque) peuvent être une liaison, de façon à permettre de réduire le nombre des acides aminés dans la chaîne N-terminale. Par conséquent, tout ou partie de la séquence d'acides aminés représentée
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0 peut être présent.
Lorsqu'une fraction de la séquence est présente, il est préférable que la séquence comprenne des acides aminés contigus, c'est-à-dire les acides aminés dans leur ordre numérique sans délétions.
D'habitude, il y aura au moins un acide aminé, plus habituellement au moins trois, plus habituellement encore au moins six, où les acides aminés d'amont restants peuvent être absents, de sorte que P peut être uni à axa-1, axa-6, et ainsi de suite ; axa-1 peut être un acide aminé quelconque, en particulier aliphatique, d'environ 3 à 6 atomes de carbone, de préférence neutre ou basique, plus particulièrement la lysine, l'arginine, la proline, l'asparagine ou la sérine ; aa-2 peut être un acide aminé quelconque, soit aliphatique, soit aromatique, en particulier aliphatique, plus particulièrement d'environ 3 à 6 atomes de carbone ;
aa-3 peut être un acide aminé aliphatique ou aromatique, en particulier aliphatique, soit polaire, soit non polaire, de 2 à 6 et plus habituellement de 2 à 5 atomes de carbone, comprenant en général 0 ou 1 radical hydroxyle ; aa-4 peut être un acide aminé aliphatique quelconque, neutre ou basique, généralement de 3 à 6 et habituellement de 5 ou 6 atomes de carbone, en particulier l'asparagine, la proline ou la lysine ; ara-S peut être un acide aminé aliphatique quelconque, en particulier neutre, en général de 3 à 6 atomes de carbone, en particulier la valine ou l'isoleucine ; aa-6 est un acide aminé neutre ou acide, lorsqu'il est aliphatique, d'environ 3 à 6 et plus habituellement d'environ 4 à 6 atomes de carbone, plus particulièrement l'isoleucine, la valine ou l'acide
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aspartique ;
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aa-7, aa-8, aa-9, aa-12, aa-14, aa-15, aa-16, aa-17, aa-l9, aa"20 aa-21 et aa-23 sont des acides aminés aliphatiques de 3 à 6 atomes de carbone, soit polaires, soit non polaires, en particulier polaires comprenant 0 ou 1 radical hydroxyle, ou sont des acides aminés aromatiques ; aa-10 et aa-25 sont des acides aminés aliphatiques non polaires ou des acides aminés acides de 2 à 6, et plus habituellement de 2 ou 3 atomes de carbone ; aa", aa-22 et aa-24 sont des acides aminés aliphatiques polaires ou des acides aminés acides de 4 ou 5 atomes de carbone, comprenant en particulier un radical carboxamido ; aa-11 et aa-18 sont des acides aminés aliphatiques, soit polaires, soit non polaires, ou des acides aminés acides.
Un intérêt particulier est offert par un
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fragment N-terminal de aa"-jusqu'à aa" ou de ara-l jusqu'à aa" et plus particulièrement de aa-l jusqu 1 à aa-6 0 aa". Avantageusement, P- peut être une séquence d'acides aminés sans relation qui sert de protéine de fusion, en particulier pour former un peptide immunogène en vue de produire des anticorps contre le composé.
Les principaux aspects des compositions de l'invention sont apportés par la séquence aa25 jusqu'à aa40, en particulier par la séquence de la cystéine à la position 28 jusqu'à la cystéine à la position 37 et les boucles formées par les cystéines aux positions 2 et 10 et les cystéines aux positions 15 et 26. Il est souhaitable que les compositions de l'invention comprennent la boucle créée par les cystéines aux positions 28 et 37 conjointement avec la boucle créée
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par les cystéines aux positions 15 et 26.
Les séquences polypeptidiques hybrides peuvent être préparées en combinant des fragments de divers polypeptides comportant une séquence sensiblement semblable aux chaînes polypeptidiques naturelles associées aux facteurs de croissance naturels et aux protéines naturelles du virus de la vaccine. Les polypeptides chimères résultants compteront environ 40 à 65 acides aminés, habituellement environ 45 à 60 acides aminés et spécialement 49 à 54 acides aminés.
Dans chaque cas, la structure en grille des cystéines se maintient aux ponts de cystéine définissant les boucles des dimensions décrites précédemment. Ainsi, il est possible d'utiliser un fragment provenant d'un facteur de croissance quelconque ayant une homologie sensible avec le VGF (voir, par exemple, la Fig. 1) ou avec un autre facteur de croissance comprenant la même structure en grille que les compositions de l'invention et ayant une activité physiologique semblable. Il en est ainsi indépendamment du mammifère d'origine, comme un primate, par exemple l'être humain, un rongeur, par exemple le rat ou la souris, un bovin, un oiseau, un porcin, etc.
Jusqu'à trois jonctions peuvent être requises suivant l'origine des fragments et la longueur du polypeptide souhaité. Il est souhaitable que les jonctions soient faites à un certain point entre aa-6 et aal ; aal1 et aal5 ; aa25 et aa29 ; et aa42 et aa53. La séquence entre environ aa-6 et environ aal5 est dite séquence N-terminale et celle entre environ aal4 et environ aa29 est dite fragment central, tandis que celle entre environ aa25 et l'extrémité du peptide (généralement aa43 à aa47) est dite domaine C-terminal.
Le point de jonction exact varie avec l'emplacement des sites de restriction, et ainsi de suite. De plus, une
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séquence N-terminale extrême comprenant environ aa-24 jusqu'à aa-7, et plus habituellement aa-23 jusqu'à aa-7 peut être unie également au polypeptide hybride.
Les fragments seront généralement d'environ 15 à 50 et habituellement de 15 à 45 acides aminés du fait que aa20 ne désigne pas le vingtième acide aminé du composé mais uniquement celui de la séquence spécifique qui a été spécifiquement définie (voir Fig. 1).
Divers sites de restriction commodes sont prévus dans les gènes synthétiques utilisés pour construire les polypeptides hybrides. Lorsque la chose est possible, les sites de restriction laissent inaltérée la séquence des acides aminés du gène du facteur de croissance. Toutefois, dans certains cas, l'incorporation des nouveaux sites de restriction donne une séquence d'acides aminés qui est modifiée. Un cas particulièrement intéressant est celui où la séquence codant pour le VGF est modifiée de façon à introduire un site de restriction KpnI en changeant la séquence des acides aminés de aal3 à aal5 de GDC en GTC et introduire un site SphI de aa23 à aa28 en changeant la séquence de GMYCRC en GYACVC. Ces modifications apportent des sites commodes pour assembler des fragments du gène du VGF avec des fragments d'autres facteurs de croissance.
Par exemple, le fragment de
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% 47 peut gène aa26 à aa47 peut être assemblé avantageusement avec un fragment de gène d' -TGF qui code les acides 6 % 25 aminés correspondant aux résidus aa-6 à aa25 pour obtenir un polypeptide hybride TGF/VGF. Ainsi, la séquence du peptide hybride comprendra aa-6 jusqu'à aal3 (partie N-terminale) et aal4 jusqu'à aa25 (fragment central) provenant d'-TGF, ainsi que aa26 jusqu'à aa47 (domaine C-terminal) provenant du VGF, modifiés comme ci-dessus.
La préparation de plasmides capables
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d'exprimer les protéines hybrides ayant les séquences d'acides aminés issues de fragments de plus d'un facteur de croissance ou polypeptide de virus de la vaccine avec des modifications de séquence lorsqu'il en faut pour introduire un site de restriction approprié est décrite en détaill dans la partie expérimentale.
Il est possible aussi de préparer des protéines de fusion où un facteur de croissance ou bien un polypeptide hybride est exprimé uni aux acides aminés N-terminaux d'une séquence de signalisation ou bien aux acides aminés N-terminaux d'un gène de bactérie, de bactériophage ou d'eucaryote fortement exprimé. En outre, un site de coupure enzymatique ou chimique peut être prévu après la séquence signal pour permettre de séparer par coupure le polypeptide mature de la séquence signal. La préparation de plasmides capables d'exprimer ces polypeptides de fusion et les procédés pour la coupure et l'isolement du polypeptide souhaité sont décrits en détail dans la partie expérimentale.
Préparation des facteurs de croissance.
Les compositions de l'invention peuvent être préparées de diverses façon suivant la dimension qu'elles ont. En particulier, au-dessous d'environ 80 et plus spécialement au-dessous d'environ 60 acides aminés, les compositions peuvent être préparées par synthèse suivant les procédés traditionnels, voir, par exemple, Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, "The Peptides Analysis, Synthesis Biology, Spécial Methods in Peptide Synthesis, Partie A, Vol. 2, Gross and Meinhofer eds., Academic Press, NY, 1980, pp. 1 à
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284. Voir aussi brevet E. U. A. no 4 127 526.
En variante, la technologie de l'ADN hybride peut être appliquée, suivant laquelle il est possible d'utiliser des séquences d'ADN qui codent pour le
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0 polypeptide souhaité ou un précurseur de celui-ci. Les séquences d'ADN codant pour le facteur de croissance intéressant peuvent être synthétisées suivant les techniques traditionnelles, comme la superposition de brins simples qui peuvent être unis par ligation pour définir la séquence codante souhaitée. Les extrémités peuvent être conçues pour apporter des sites de restriction ou bien une des extrémités ou les deux peuvent être rendues non cohésives pour la ligation avec les extrémités complémentaires d'un vecteur d'expression. Une méthionine initiale est prévue pour l'expression de la séquence.
Des vecteurs d'expression sont généralement disponibles et ont été décrits en détail dans la littérature.
Au lieu de synthétiser le gène intéressant, il est possible d'isoler le facteur de croissance suivant différentes techniques. Par exemple, lorsque le facteur de croissance est un facteur de croissance viral, il est possible d'isoler du virus le mARN qui code pour le polypeptide comprenant le facteur de croissance, de
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soumettre le mARN à la transcription réverse, d'utiliser l'ADN simple brin (ss) résultant comme matrice pour préparer l'ADN double brin (ds) et d'isoler le gène d'ADN (ds). Une autre technique est d'isoler un fragment de l'ADN viral et en utilisant une sonde, convenablement dégénérée qui comprend une région des séquences les mieux conservées dans un gène de facteur de croissance, d'identifier les séquences codant dans un facteur dans le génome viral.
La sonde peut être considérablement plus courte que la séquence complète, mais doit avoir une longueur d'au moins 10, de préférence d'au moins 14 et plus avantageusement d'au moins 20 nucléotides. Des oligonucléotides plus longs sont utiles aussi, jusqu'à la longueur complète
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du gène de facteur de croissance. Les sondes tant d'ADN ge
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que d'ARN peuvent être utilisées.
Pour l'usage, les sondes sont typiquement marquées d'une façon décelable (par exemple avec du 32p ou des nucléotides biotinylés) et sont incubées avec de l'ARN ou de l'ADN simple brin provenant de l'organisme dans lequel un gène est recherché. L'hybridation est détectée au moyen du marqueur après que les ADN (ou ADN/ARN) simple brin et double brin (hybridés) ont été séparés, typiquement sur du papier de nitrocellulose.
Les techniques d'hybridation convenant pour les oligonucléotides sont bien connues de l'homme de métier.
Bien qu'on utilise normalement des sondes avec un marqueur décelable qui permet une identification aisée, les oligonucléotides non marqués sont utiles aussi, tant comme précurseurs des sondes marquées que pour l'usage dans des procédés qui assurent une protection directe de l'ADN (ou ADN/ARN) double brin.
Dès lors, le terme"oligonucléotide"désigne les formes tant marquées que non marquées.
Lorsque la séquence d'ADN souhaitée a été obtenue, elle peut être manipulée de diverses façons en vue de son expression ; par exemple, des séquences polypeptidiques hybrides peuvent être préparées en combinant des fragments de gènes d'au moins deux polypeptides ayant des séquences qui sont à au moins plus de 30% d'homologie avec les facteurs de croissance naturels qui se fixent sur le récepteur de l'EGF ("les ligands naturels").
Il est hautement souhaitable que la structure tridimensionnelle, spécialement la structure en boucle, du polypeptide se conserve, et il en est particulièrement ainsi de la ou des parties de la structure qui peuvent être responsables de la fixation sur le récepteur de l'EGF et de l'activité biologique des facteurs de croissance naturels qui se fixent sur
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le récepteur de l'EGF.
Suivant l'origine des fragments et la longueur du polypeptide souhaité, des sites de restriction appropriés peuvent être incorporés dans les gènes synthétiques utilisés pour construire les polypeptides hybrides tels que décrit ci-dessus. Lorsque la chose est possible, le ou les sites de restriction laissent inaltérée la séquence des acides aminés du polypeptide.
Néanmoins, dans certains cas, l'incorporation d'un ou plusieurs nouveaux sites de restriction peut mener à une séquence des acides aminés qui est altérée sans que l'activité de la protéine s'en trouve changée.
Lorsque le gène doit être exprimé dans un hôte qui reconnaît les régions régulatrices de traduction et de transcription de type sauvage du facteur de croissance, le gène complet avec ses régions régulatrices 5'et 3'de type sauvage peut être introduit dans un vecteur d'expression approprié. Il existe différents vecteurs d'expression utilisant les systèmes de réplication des virus de mammifères, comme le virus simien 40, l'adénovirus, le virus du papillome bovin, le virus de la vaccine, le baculovirus des insectes, etc. Ces systèmes de réplication ont été développés pour apporter des marqueurs qui permettent la sélection des transfectants, de même que pour procurer des sites de rectriction commodes dans lesquels le gène peut être inséré.
Lorsque le gène doit être exprimé dans un hôte qui ne reconnaît pas les régions régulatrices de traduction et de transcription de type sauvage naturel, une manipulation supplémentaire est nécessaire. On connaît diverses régions régulatrices de transcription 3'qui peuvent être insérées à l'aval des codons de terminaison. La région 5'non codante à l'amont du gène intéressant peut être éliminée par restriction
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avec une endonucléase, résection par Bal31 et ainsi de suite.
En variante, lorsqu'un site de restriction commode existe à proximité de l'extrémité 5'du gène intéressant, ce dernier peut être soumis à la restriction et un adaptateur peut être utilisé pour assembler le gène intéressant avec la région de promotion, auquel cas l'adaptateur remplace les nucléotides perdus du gène intéressant. Différentes stratégies peuvent être mises en jeu pour constituer une cassette d'expression qui, dans la direction 5'-3' de transcription, comprend une région régulatrice de transcription et une région d'initiation de traduction, qui peut aussi comprendre des séquences régulatrices permettant l'induction de la régulation, le gène intéressant sous le contrôle de transcription et de traduction de la région d'initiation ; et une région de terminaison de transcription et de traduction.
Le choix des séquences régulatrices appropriées doit prendre en compte les facteurs suivants qui influencent l'expression. En termes de régulation de la transcription, la quantité et la stabilité de l'ARN messager sont des facteurs importants qui influencent l'expression des produits géniques. La quantité de mARN est déterminée par le nombre des copies du gène particulier, par l'efficacité relative de son promoteur et par les facteurs qui régulent le promoteur, comme les enhances ou les répresseurs. L'initiation se fait, croit-on, dans une région juste à l'amont du début de la séquence codante.
Le promoteur dans les cellules procaryotes comprend des séquences nucléotidiques qui peuvent influencer l'efficacité de transcription. Les séquences comprennent les régions régulatrices à environ-35 et-10 nucléotides à partir du début de la chaîne d'ADN. Des promoteurs efficaces sont notamment ceux
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dans lesquels la séquence nucléotidique des régions régulatrices-35 et-10 est sensiblement la même que les séquences de consensus pour ces régions dans les promoteurs bactériens provenant de gènes hautement efficaces. En général, ces régions ont une longueur d'environ 5 nucléotides et 6 nucléotides, respectivement, et chaque séquence peut varier d'à peu près un nucléotide en longueur et/ou en séquence.
Une séquence préférée pour la séquence régulatrice de consensus-35 s'étend à partir du promoteur trp, à savoir TGACA, et pour la séquence régulatrice de consensus-10 s'étend à partir du promoteur lac, à savoir TATAAT.
Non seulement les séquences nucléotidiques, mais aussi la distance des séquences de consensus des régions régulatrices-35 et-10, l'une par rapport à l'autre, sont importantes pour obtenir une transcription optimale du gène intéressant. De façon générale, les séquences de consensus des régions régulatrices-35 et-10 sont séparées par environ 16 à 18 nucléotides et de préférence environ 17 nucléotides.
Chaque séquence peut varier d'environ 1 nucléotide.
Des exemples de régions régulatrices de transcription ou promoteurs sont notamment, pour les bactéries, le promoteur p-gal, les promoteurs lambda gauche et droit, les promoteurs trp et lac, le promoteur de fusion trp-lac, etc. ; les promoteurs synthétiques qui ont des séquences sensiblement semblables à ces séquences peuvent aussi trouver leur application. Un promoteur préféré pour les bactéries est un promoteur de fusion comprenant la région régulatrice-35 à partir du promoteur trp et la région régulatrice -10 à partir du promoteur lac.
Très avantageusement, le promoteur est un promoteur dans lequel la séquence de consensus trp-35 est située à
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environ 17 nucléotides à l'amont de la séquence de consensus lac-10. Pour les levures, ce sont des promoteurs d'enzymes glycolytiques, comme les promoteurs ADH-I et-II, le promoteur GPK et le promoteur PGI, outre le promoteur trp, etc. ; pour les cellules de mammifères ce sont les promoteurs SV40 précoces et tardifs, les promoteurs majeurs tardifs d'adénovirus, le promoteur I5 ou les séquences enhancers et ainsi de suite.
La région régulatrice de transcription peut comprendre également des séquences régulatrices qui permettent de moduler le temps d'expression du gène intéressant, par exemple sous l'effet de la présence ou de l'absence de nutriments ou produits d'expression dans le milieu de croissance, la température, etc. Par exemple, l'expression du gène intéressant peut être régulée par la température du milieu de croissance des cellules hôtes en recourant à une séquence régulatrice comprenant le promoteur PL du bactériophage lambda,
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l'op'rateur OL l'opérateur OL du bactériophage lambda et le gène CI857 qui code pour le répresseur CI sensible à la température dans le vecteur d'expression.
Ceci permet la régulation du promoteur par une interaction entre le répresseur et l'opérateur aux basses températures, par exemple à environ 30oC. L'élévation de la température jusqu'à environ 42 C inactiverait le répresseur et permettrait l'expression du gène intéressant.
Comme exemple de la modulation au moyen de nutriments dans le milieu de croissance, la régulation du promoteur lac ou du promoteur hybride trp-lac peut se faire au moyen du gène pour le représseur LacI, qui se fixe sur la région du promoteur lac à l'aval de la région régulatrice-10. Le gène du représseur LacI peut être présent sur un épisome, de préférence le mutant LacI sous effet enhancer, ou bien peut être compris
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dans la cassette d'expression elle-même. La présence d'une concentration significative de la molécule du répresseur dans le milieu de croissance inhibe la fonction du promoteur en l'absence d'inducteurs. Ainsi, l'addition d'IPTG ou de lactose au milieu de croissance des cellules hôtes accentue la fonction du promoteur.
Lorsque la souche bactérienne est Lac+, le lactose peut servir d'inducteur au lieu de l'IPTG. Dans les systèmes tant eucaryotes que procaryotes, les régions de terminaison peuvent aussi contenir des séquences ou structures qui augmentent la stabilité du mARN et permettent une expression plus élevée. Ainsi, la région régulatrice de transcription peut comprendre en supplément des séquences régulatrices qui terminent la transcription et qui constituent des séquences ou structures qui inhibent la dégradation du mARN et ainsi augmentent la stabilité du mARN et permettent une expression plus élevée. Divers exemples de séquences procaryotes sont connus, par exemple le terminateur Trp, le terminateur du gène 32 (T4) ou les terminateurs synthétiques qui sont semblables par leur séquence au gène 32.
Dans les sytèmes eucaryotes, les régions de fin de transcription, de coupure d'ARN et de polyadénylation assurent une maturation appropriée des
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mARN transcrits et sont nécessaires pour une expression efficace. La région non traduite 3'native peut suffire, mais le signal de polyadénylation provenant, par exemple, de SV40, en particulier comprenant un site dlépissage qui assure une expression plus efficace, pourrait être utilisé aussi. En variante, la région non traduite 3'provenant d'un gène fortement exprimé dans un type particulier de cellule (par exemple Ig dans des cellules de myélome) pourrait être fusionnée avec le gène intéressant.
De telles séquences 3'pourraient
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être appariées avec des séquences régulatrices 5' provenant du même gène à haute expression et pourraient même comprendre des régions codantes dans un cadre de lecture pour produire des protéines de fusion comme décrit ci-après.
En termes de régulation de traduction, vu la présence du mARN, l'expression peut être régulée en influençant la vitesse d'initiation (fixation du ribosome sur le mARN), la vitesse d'allongement (translocation du ribosome sur le mARN), la vitesse des modifications après traduction et la stabilité du produit génique. La vitesse d'allongement est probablement influencée par l'usage d'un codon et le recours à des codons pour des tARN rares peut faire baisser la vitesse de traduction. Il est dès lors préférable d'utiliser des codons qui apparaissent fréquemment dans les gènes normalement exprimés par la cellule hôte afin d'augmenter la vitesse de traduction.
Chez les procaryotes, à l'aval des régions régulatrices-35 et-10, il existe une séquence nucléotidique de consensus, généralement AGGA, dite séquence de Shine-Dalgarno, qui intervient, croit-on, dans la fixation du ribosome. L'optimum de fixation du ribosome et du début de la traduction peut être obtenu en utilisant un site de fixation du ribosome fonctionnel dans la cellule hôte au départ d'un gène fortement exprimé. Divers indices révèlent la présence de séquences nucléotidiques entourant la séquence de Shine-Dalgarno et de séquences dans la région codante qui peuvent influencer la fixation du ribosome, peut- être par formation de motifs structuraux au moyen desquels le ribosome reconnaît le site d'initiation.
Une modification des séquences nucléotidiques de la région codante peut donc être utilisée pour assurer un optimum de fixation et d'initiation de traduction. La
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séquence des premiers quelque 7 à 30 codons après le codon d'initiation ATG peut aussi influencer la fixation et l'expression. De préférence, la séquence signal et la séquence de Shine-Dalgarno sont obtenues à partir du même gène ou bien, lorsqu'elles ont été obtenues à partir de gènes différents, les codons de la séquence signal peuvent être modifiés par dégénérescence de codons pour se rapprocher de la
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p séquence nucléotidique du gène naturel qui succède à la séquence signal, comme décrit dans la demande de brevet PCT/US88/03972 du 28 octobre 1988.
La position de la séquence AGGA par rapport aux codons d'initiation ATG peut influencer l'expression. Généralement, la séquence de ShineDalgarno est située à environ 5 à 9 nucléotides à l'écart du codon d'initiation, mais de façon inattendue, de hauts niveaux d'expression peuvent être obtenus en utilisant des cassettes d'expression dans lesquelles la séquence de Shine-Dalgarno est située à environ 10 à 13 nucléotides et de préférence 11 ou 12 nucléotides à l'écart du codon d'initiation.
La stabilité du mARN est régie par la sensibilité du mARN aux ribonucléases. En règle générale, la digestion par les exonucléases est inhibée par la présence de motifs structuraux aux extrémités du mARN, par des structures palindromiques, par des nucléotides modifiés ou par des nucléotides spécifiques. La digestion par les endonucléases se fait, croit-on, à des sites de reconnaissance spécifiques à l'intérieur du mARN et un mARN stable serait exempt de tels sites. Certains indices suggèrent aussi que les mARN subissant des taux élevés de traduction sont aussi protégés contre la dégradation par la présence de ribosomes sur le mARN.
La stabilité du produit d'expression peut être
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acquise en réalisant la synthèse d'une protéine de fusion dans laquelle le polypeptide souhaité est exprimé conjointement avec un second polypeptide ou fragment de celui-ci. De préférence, la stabilité du produit d'expression est assurée en effectuant la synthèse d'une protéine de fusion dans laquelle le polypeptide intéressant est exprimé uni à une séquence signal. Une séquence d'ADN codant ou une séquence d'acides aminés N-terminale provenant, par exemple, d'un gène de bactérie ou de bactériophage hautement exprimé, comme le gène de la protéine N du bactériophage lambda, le gène cro ou P-galoctosidase ou un gène d'eucaryote est assemblé à l'amont du gène intéressant et en cadre de lecture avec ce gène.
La séquence signal comprend habituellement environ 8 à environ 50, de préférence environ 15 à environ 45 et plus avantageusement 18 à 25 acides aminés N-terminaux.
L'expression du polypeptide intéressant à l'état de protéine fusionnée avec une séquence signal provenant d'un autre gène offre divers avantages en plus d'assurer la stabilité. Par exemple, la présence des acides aminés N-terminaux constitue un moyen pour appliquer les techniques de purification générales à la purification de l'un quelconque de divers polypeptides.
Par exemple, les acides aminés N-terminaux de la protéine N sont particulièrement antigéniques et, par conséquent, des anticorps spécifiques dirigés contre les acides aminés N-terminaux de la protéine N peuvent être utilisés comme moyen pour purifier les protéines de fusion contenant l'extrémité N-terminale de la protéine N. De plus, l'extrémité N-terminale de la protéine N a une charge fortement positive qui facilite la purification de la protéine recherchée par chromatographie d'échange d'ions ou une technique analogue.
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0 La séquence signal peut aussi être une séquence d'acides aminés hydrophobes pouvant servir de surcroît de séquence de signalisation pour la sécrétion. Une séquence d'ADN codant pour la séquence de signalisation est assemblée à l'amont du gène intéressant et en cadre de lecture avec celui-ci. Typiquement, la séquence de signalisation comprend un site de coupure qui est reconnu par une peptidase de la séquence de signalisation. Ainsi, le positionnement du polypeptide intéressant, directement après le site de coupure de la séquence de signalisation, permet que ce polypeptide intéressant soit spécifiquement séparé de la séquence de signalisation par coupure et sécrété à l'état de polypeptide mature.
Des exemples de séquences d'acides aminés hydrophobes sont notamment la séquence de signalisation de la phosphatase alcaline bactérienne, les séquences de signalisation OMP-A-B-C-
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D-E ou F ; la séquence de signalisation LPP, la séquence de signalisation de la j-lactamase et les séquences de signalisation de toxines et leurs mutants. Dans le cas des cellules eucaryotes, les séquences de signalisation peuvent être la séquence de signalisation de TGF- de singe, du gène P97 (antigène du mélanome humain), la séquence de la toxine tueuse de K. lactis, le facteur de type conjugaison a : et d'autres séquences de signalisation de toxines tueuses ou la séquence de signalisation normale associée au gène intéressant conjointement avec les mutants des séquences de signalisation.
D'autres séquences signal qui peuvent être utilisées sont notamment des séquences hydrophiles, par exemple les 41 résidus d'acides aminés N-terminaux de l'amphiréguline qui peuvent assurer la modification de la fonction du polypeptide intéressant. De plus, un agent cytotoxique, comme un fragment de chaîne A de
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toxine, la chaîne du ricin, le peptide d'arrêt de croissance du venin de serpent ou une molécule de ciblage, comme une hormone ou un anticorps, peut être uni par covalence avec la séquence signal avec, le plus souvent, un effet minimum sur l'activité biologique du produit génétique intéresssant. Comme il a été décrit pour les autres séquences signal, une séquence d'ADN codant pour la séquence signal est unie à l'amont du gène intéressant et en cadre de lecture avec celui-ci.
Lorsque la séquence signal n'est pas une séquence de signalisation ou ne contient pas de site de coupure naturel approprié, des acides aminés supplémentaires peuvent être insérés pour apporter un site de coupure enzymatique ou chimique destiné à la coupure du peptide signal, après la purification de la protéine de fusion, pour permettre la purification ultérieure du polypeptide mature. Par exemple, l'introduction de liaisons aspartyl-proline labiles en milieu acide entre les deux segments de la protéine de fusion facilite leur séparation aux faibles valeurs du pH. Ce procédé ne convient pas si le polypeptide souhaité est labile en milieu acide. Par exemple aussi, la protéine de fusion peut être coupée, au moyen, par exemple, de bromure de cyanogène, lequel est spécifique pour le côté carboxyle des résidus méthionine.
Le positionnement d'une méthionine entre la séquence signal et le polypeptide souhaité permet le dégagement du polypeptide désiré. Ce procédé ne convient pas lorsque le polypeptide souhaité contient des résidus méthionine.
Lorsque la séquence signal comprend une séquence de signalisation, les gènes intéressants avec des séquences signal sécrétoires peuvent être exprimés avec ou sans la séquence signal dans des conditions où la séquence peut être retenue ou coupée. En outre, pour
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obtenir une proportion élevée du polypeptide désiré à l'état de peptide mature coupé et replié sécrété dans le milieu, il est préférable d'utiliser un promoteur, comme le promoteur tac, qui peut agir à une température plus basse, par exemple environ 30oC. De façon inattendue, des niveaux plus élevés de sécrétion peuvent être obtenus aux températures inférieures.
Des niveaux d'expression extrêmement élevés peuvent empêcher que les modifications complètes de traduction de la protéine aient lieu, menant ainsi à une accumulation et une agrégation de précurseur non coupé (c'est-à-dire de protéine de structure et de séquence signal sécrétoire). De façon analogue, la croissance aux températures élevées, par exemple à 42OC, tend aussi à induire une agrégation et une accumulation de précurseur non coupé. La préparation de protéines fusionnées et notamment les procédés de coupure et de repliage du polypeptide intéressant sont décrits plus en détail dans la demande de brevet E. U. A. n"264 098 précitée.
Après chaque manipulation de l'ADN dans le développement de la cassette, le plasmide doit être cloné et isolé et, suivant les besoins, le composé particulier de la cassette doit être analysé pour ce qui est de sa séquence afin de vérifier que la séquence appropriée a été obtenue. Suivant la nature de la manipulation, la séquence désirée peut être excisée hors du plasmide et introduite dans un vecteur différent, ou bien le plasmide peut être soumis à la restriction et le composant de la cassette d'expression peut être manipulé, suivant ce qui convient. Dans certains cas, il est fait usage d'un vecteur navette, ce vecteur étant capable de réplication dans des hôtes différents qui nécessitent des systèmes de réplication différents.
Ceci peut ou non requérir des marqueurs
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supplémentaires qui sont fonctionnels dans les deux hôtes. Lorsque de tels marqueurs sont nécessaires, ils peuvent être inclus dans le vecteur. Le plasmide contenant la cassette, deux systèmes de réplication et le ou les marqueurs, peut être transféré d'un hôte à un autre, suivant les besoins. Tout marqueur utile peut être choisi pour la sélection. La résistance à la néomycine ou à la tétracycline est intéressante.
Néanmoins, bien qu'un marqueur pour la sélection soit hautement souhaitable pour la commodité, d'autres techniques de dépistage des cellules transformées ont été décrites. Voir, par exemple, G. Reipin, et al., Current Genetics, 1982,189 à 193. Les cellules transformées peuvent être aussi triées au moyen des produits spécifiques qu'elles forment, par exemple la synthèse du produit désiré peut être détectée par des procédés immunologiques ou enzymatiques.
La cassette d'expression peut être comprise dans un système de réplication pour le maintien de l'épisome dans un hôte cellulaire approprié ou bien peut être prévue sans système de réplication, auquel elle peut s'intégrer au génome de l'hôte. L'ADN peut être introduit dans l'hôte suivant les techniques connues, comme la transformation, en utilisant un ADN précipité par le phosphate de calcium, la transfection par contact des cellules avec le virus, la microinjection de l'ADN dans les cellules, et ainsi de suite. Lorsque le gène intéressant a été introduit dans l'hôte approprié, ce dernier peut être cultivé pour l'expression du gène intéressant.
Diverses cellules hôtes peuvent être utilisées. Des exemples de cellules hôtes procaryotes sont notamment les organismes Gram-négatifs, comme E. Coli, par exemple JM109, JM101 et JM107, outre HB101, DH1 et DH5. Des organismes particulièrement
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appropriés sont les organismes Gram-positifs tels que B. subtilis qui n'ont pas d'espace périplasmique et peuvent sécréter directement les polypeptides dans le milieu de croissance. Les cellules hôtes eucaryotes peuvent être des cellules de levure, des cellules d'insectes ou des cellules de mammifères, par exemple des cellules COS, des cellules CHO, des cellules rénales de singe et des cellules de ver à soie (sf9).
Le produit construit contenant le gène intéressant et les régions de flanquement assurant la régulation d'expression peut être introduit dans l'hôte d'expression par tout moyen approprié, par exemple la transformation, au moyen, par exemple, d'ADN précipité par le phosphate de calcium, la transfection, la transduction, la conjugaison, la micro-injection, etc. L'hôte peut être ensuite cultïvé jusqu'à une densité élevée dans un milieu nutritif approprié. Lorsque le promoteur est susceptible d'induction, des conditions permissives seront alors utilisées, par exemple un changement de température, un épuisement ou un excès d'un produit métabolique ou d'un nutriment, et ainsi de suite.
Par exemple, lorsque la séquence régulatrice comprend le promoteur PL du bactériophage A, l'opérateur OL du bactériophage A et le répresseur sensible à la température CI857, les cellules hôtes peuvent être cultivées à la température permissive, en général environ 30oC, température à laquelle la transcription à partir du promoteur PL est réprimée et les cellules hôtes peuvent être cultivées sans entrave par les demandes de la synthèse pour le produit génique étranger, qui peut de surcroît être toxique pour l'organisme hôte.
Lorsque les cellules hôtes ont atteint une densité optimale, la température peut être élevée jusqu'à valeur non permissive, par exemple
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environ 42 OC, moment auquel le répresseur CI est rendu inactif, ce qui permet la transcription à partir du promoteur PLI Une sécrétion maximale peut être obtenue en utilisant le promoteur lac ou un promoteur trp-lac, et l'induction avec un inducteur métabolique tel que le lactose pour une souche hôte lac+ avec apport de lac Iq sur un vecteur. Des exemples de cellules hôtes, qui pourraient être utilisées avec un tels systèmes, sont notamment DH1, DH5 et HBlOl.
Lorsque le produit est retenu dans la cellule hôte, les cellules sont récoltées et soumises à la lyse, puis le produit est isolé et purifié par extraction, précipitation, chromatographie, électrophorèse, etc. Lorsque le produit est sécrété, le milieu nutritif peut être collecté et le produit peut être isolé suivant les techniques traditionnelles, par exemple la chromatographie d'affinité. Pour obtenir une protéine active, il peut être nécessaire de laisser la protéine se replier. Si la protéine est exprimée à l'état de protéine de fusion avec la séquence signal, cette dernière peut être éliminée par traitement au moyen, par exemple, d'acide formique ou de bromure de cyanogène. La séquence signal est, de préférence, éliminée après le repliage de la protéine.
Le produit recombinant peut être glycosylé ou ne pas l'être, la glycosylation étant de type sauvage ou autre. En règle générale, la glycosylation ne différera pas de la glycosylation de type sauvage pour plus d'environ 50% et habituellement pour plus d'environ 20%. L'ampleur de la glycosylation dépend pour partie de la séquence du peptide particulier, de même que de l'organisme dans lequel il est produit. Ainsi, l'expression du produit dans E. coli mène à un produit non glycosylé, et l'expression du produit dans des cellules d'un insecte conduit, en général, à une
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glycosylation moins importante que l'expression du produit dans des cellules d'un mammifère.
Utilisation des facteurs de croissance.
Les compositions de l'invention ont une large variété d'applications in vitro et in vivo comme agonistes ou antagonistes des facteurs de croissance, comme le facteur de croissance épidermique (EGF), et le facteur de croissance transformant, en particulier 1'ct-TGF. Une discussion des facteurs de croissance utilisés tels quels ou conjointement avec d'autres compositions, en particulier des compositions polypeptidiques, pour la régulation de la croissance des cellules et pour d'autres activités peut être trouvée, par exemple, dans Handbook of Expérimental Pharmacology, Tissue Growth Factors, éditeur Baseraga, volume 57, Springer-Verlag, Berlin 1981, chapitre 3, en particulier aux pages 98 à 109, et dans Carpenter, Ann.
Rev. Biochem. (1979) 48 : 193-216.
L'EGF humain apparaît identique à l'urogastrone humaine et exerce divers effets sur la croissance des tissus prénataux et néonataux. Ces effets sont notamment l'ouverture précoce des yeux, la cicatrisation des plaies, l'éruption des incisives et la maturation accélérée des poumons. On trouve des récepteurs de l'EGF dans divers tissus adultes. L'EGF se révèle stimuler la phosphorylation de son propre récepteur. L'EGF se révèle aussi en relation avec une résorption osseuse accrue.
Le facteur de croissance transformant, en particulier l'a-TGF, a de nombreuses activités analogues à celle de l'EGF. Le TGF se fixe sur le récepteur de l'EGF et mène à une phosphorylation du récepteur, à une augmentation de son activité de kinase tyrosine-spécifique et à une stimulation de la croissance cellulaire. Voir Cohen dans : Biological
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Response Mediators and Modulators (éditeur :
EMI42.1
a August, J. T.), Academic, New York, 1983, pages 7 à 12 ; Tarn et al., Nature (1984) 309 : 376-378, Ibbotson et al. ; Science (1983) 221 : 1292-1924.
Les virus de la myxomatose et du fibrome de Shope induisent une augmentation significative du potentiel prolifératif des cellules dans la région affectée. Le virus de la vaccine induit une prolifération mineure à l'endroit de l'infection, mais le virus du fibrome de Shope induit une prolifération majeure menant à une formation de tumeur qui est bénigne chez le lapin adulte, mais qui est proliférative et invasive chez le nouveau-né et l'adulte dont l'immunité a été supprimée. Le virus de la myxomatose induit une tumeur myxosarcomateuse à dissémination rapide. Bien que ces événements prolifératifs puissent être dus à d'autres facteurs viraux, les facteurs de croissance viraux apparaissent hautement impliqués dans la prolifération cellulaire induite provoquée par une infection virale.
Les composés de l'invention ont une
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application particulière à titre de médicaments comme agonistes de l'EGF et pour la cicatrisation des plaies, comme la formation d'un épithélium sur les plaies telles que les brûlures, plaies occulaires, incisions chirugicales, et ainsi de suite. Le constituant actif peut être utilisé dans un excipient approprié, par exemple du Silvadene, en une quantité suffisante pour favoriser la formation d'un l'épithélium et/ou la cicatrisation des plaies, généralement en quantités
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d'environ 0, 01 à 10, 0 zig par ml, habituellement d'environ 0, 075 à 5, 0 g par ml, et de préférence de 0, 05 à 5 jug par ml d'équivalents d'EGF. La composition pharmaceutique est étalée sur la plaie pour en assurer la couverture complète.
La fréquence du traitement peut
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être élevée, par exemple quatre fois par jour, ou faible, par exemple tous les deux jours sinon moins, suivant la nature de la plaie, sa réponse au traitement, la concentration du constituant actif, et ainsi de suite.
Les compositions de l'invention peuvent être utilisées comme réactifs pour le diagnostic ou bien pour la préparation de réactifs tels que des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. Comme réactifs, elles peuvent être utilisées pour la détection de facteurs de croissance analogues ou pour la détection d'anticorps contre les facteurs de croissance dans les liquides physiologiques, par exemple le sang.
Suivant le protocole particulier et l'application envisagée pour le réactif, le polypeptide peut être marqué ou non. Une grande variété de marqueurs ont déjà été utilisés pour donner un signal décelable de façon directe ou indirecte. Ces marqueurs sont notamment des radionucléides, des enzymes, des agents fluorescents, des particules, des agents chimiluminescents, des substrats ou cofacteurs pour enzymes, des inhibiteurs enzymatiques, des particules magnétiques, etc. Voir, par exemple, les brevets E. U. A. nO 3 654 090, 3 817 837,3 935 074,3 996 345, 4 277 437,4 374 925 et 4 366 241.
Pour assembler les marqueurs et les polypeptides, il existe de nombreux procédés qui peuvent consister à utiliser le radical amino Nterminal pour fixer une fonction en formant une pyrazolone, tandis que les autres radicaux amino libres sont protégés, la pyrazolone pouvant ensuite être mise en contact avec des réactifs divers, par exemple des radicaux amino, pour fixer le fragment qui engendre le signal détectable. En protégeant les arginines associées à la troisième boucle ou proches de celle-ci,
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il est possible de fonctionnaliser les autres arginines en vue de la conjugaison avec des radicaux amino ou des radicaux thio, suivant des techniques connues.
En variante, le polypeptide peut être mis en contact avec un agent actif, par exemple un acide carboxylique activé, et substitué au hasard, auquel cas, la matière biologiquement active peut être séparée de la matière biologiquement inactivée en conséquence de la substitution au hasard. Enfin, suivant le procédé de synthèse, le polypeptide peut être modifié pour apporter la fonctionnalité souhaitée, comme partie de la technique de synthèse.
Les compositions de l'invention peuvent être utilisées pour la surveillance des récepteurs de l'EGF.
Ces compositions peuvent être utilisées aussi pour surveiller la réponse cellulaire à l'EGF et/ou au TGF en établissant une compétition entre ces facteurs d'origine naturelle et une composition conforme à l'invention. De cette façon, des modifications dans la conformation du récepteur peuvent être surveillées.
Les compositions de l'invention peuvent aussi être utilisées à différentes fins thérapeutiques, notamment la stimulation de la croissance ou la régulation de la formation osseuse. Ces composés peuvent être administrés dans des excipients physiologiques appropriés par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse ou intra-artérielle, ou bien par application à l'endroit voulu. De plus, les compositions de l'invention peuvent être introduites dans des liposomes, ce qui peut impliquer ou non le recours à des anticorps pour l'orientation vers le site. Divers excipients sont notamment la solution physiologique salée tamponnée au phosphate, la solution physiologique salée, l'eau, et ainsi de suite. La concentration du principe actif varie beaucoup avec son
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utilisation finale et son activité.
Les compositions pharmaceutiques peuvent contenir d'autres constituants, comme de l'EGF, du TGF ou d'autres facteurs de croissance, des bactériocides, par exemple des antibiotiques, des bactériostatiques, des tampons, etc.
Pour préparer des anticorps, les polypeptides de l'invention où PP-" représentent des atomes d'hydrogène ou des chaînes oligopeptidiques courtes (moins de cinq acides aminés) peuvent être unis à des polypeptides ou protéines antigéniques en vue de l'injection à des mammifères hôtes. La protéine antigénique doit comprendre au moins environ 60 acides aminés et n'excède habituellement pas 100 kilodaltons (kDal). Il existe de nombreuses techniques pour l'assemblage des polypeptides, soit à un site spécifique, soit au hasard, à l'aide de réactifs bifonctionnels, comme l'acide p-maléimidobenzoique, le glutaraldéhyde, la p, p'-benzidine, etc. Des protéines antigéniques courantes sont notamment l'albumine du sérum de boeuf, l'hémocyanine de fissurelle, le toxoide tétanique, etc.
Les polypeptides de l'invention sont unis à la protéine antigénique en un nombre suffisant pour induire la réponse immunogène souhaitée.
Habituellement, il faut deux injections de rappel ou davantage après la première injection. Pour les antisérums, le sang est prélevé sur l'hôte immunisé et la fraction contenant les immunoglobulines est isolée.
Pour les anticorps monoclonaux, la rate est prélevée et les splénocytes sont fusionnés avec un partenaire de fusion approprié suivant les techniques habituelles.
Les hybridomes résultants sont ensuite triés, le critère étant la fixation des anticorps sur les sites épitopiques du polypeptide de l'invention. Ces anticorps peuvent être utilisés à diverses fins, par
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exemple comme réactifs de diagnostic, comme agents thérapeutiques, etc. Les anticorps utilisés comme réactifs peuvent être marqués ou non marqués, comme il a été décrit pour les polypeptides.
Les exemples ci-après sont donnés à titre illustratif et non limitatif.
Partie expérimentale.
Table des matières.
EXEMPLE I.Préparation de gènes synthétiques intéressants.
A. Oligonucléotides synthétiques du TGF.
B. Oligonucléotides synthétiques du VGF.
C. Oligonucléotides synthétiques de l'EGF.
EXEMPLE II.Description du clonage et de l'expression de plasmides.
A. Le plasmide d'expression pLEBAm.
B. Le plasmide d'expression pBM11.
C. Le plasmide d'expression pBMllM4.
D. Le plasmide d'expression pBMllM5.
E. Le plasmide d'expression pBMIl/NDP.
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F. Le plasmide d'expression pMBMi/PAD.
G. Le plasmide d'expression pBMIl/PAK.
H. Le plasmide d'expression pTCPt.
I. Le plasmide d'expression plac/cro-gal.
J. Le plasmide d'expression ptac/cro-gal.
K. Le plasmide d'expression pRSV.
L. Le plasmide d'expression pAc610.
M. Les plasmides d'expression pToxl et pTox2.
N. TakPak.
EXEMPLE III.- Assemblage de gènes de facteurs de croissance pour l'expression dans des cellules procaryotes.
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A. Préparation du plasmide pLEBam/TVV.
B. Préparation du plasmide pLEBam/TVV avec le VGF et ses fragments.
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EXEMPLE IV.Expression des polypeptides intéressants à l'état de protéine de fusion avec la protéine N.
A. Le TGF synthétique modifié.
B. L'hybride TGF-VGF synthétique modifié.
EXEMPLE V.Préparation du polypeptide intéressant à l'état de protéine de fusion avec la protéine N et un site de coupure.
A. Le VGF synthétique modifié.
B. Les hybrides TGF-VGF synthétiques modifiés.
C. L'EGF synthétique.
EXEMPLE VI.Préparation du polypeptide intéressant à l'état de protéine de fusion avec la séquence de signalisation de la phosphatase alcaline modifiée.
A. Préparation de pBMIl/PAD/EGF.
B. Préparation de pBMll/PAD/nVGFa.
EXEMPLE VII.- Expression du polypeptide intéressant à l'état de protéine de fusion avec une séquence de signalisation de phosphatase alcaline.
A. Préparation de pBMll/PAK/nVGFa (séquence de signalisation de phosphatase alcaline/nVGF/a avec extrémité N-terminale du VGF naturel et séquences GTC et GYACRC).
B. Préparation de pBMIl/PAK/EGF.
C. Préparation de TacPak/EGF (séquence de signalisation de phosphatase alcaline/EGF humain).
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EXEMPLE VIII.Expression d'un polypeptide intéressant à l'état de protéine de fusion avec la séquence de signalisation de phosphatase alcaline, à l'aide d'une cassette d'expression contenant une région de terminaison de transcription.
EMI48.1
A. Préparation de pTCPt/EGF ([ trp-35 2 16pub C lac-10 LiacSD J llpb ATG/séquence de signalisation de phosphatase alcaline/EGF humain/trans. term.-NEO).
B. Préparation de pTCPt/nVGFa trp-35 3 16pb C lac-10 E lacSD croSDj llpb ATG 3/séquences de signalisation de phosphatase alcaline/VGFa-n- terminale avec séquences GTC et GYACRC)/trans. term.-NEO).
EMI48.2
C. Préparation de pTNPt/EGF (C trp-35 J l7pb [Yac-10 nSD J 8 pb [TG/séquence de signalisation de phosphatase alcaline/EGF humain/trans. term.-NEO).
EXEMPLE IX.Assemblage de gènes de facteurs de croissance pour l'expression dans des cellules eucaryotes.
A. Préparation du plasmide PRSV/VGF.
B. Préparation du plasmide pAc/VGF.
C. Préparation du plasmide pAc/SFGF.
EXEMPLE X.Préparation de polypeptides.
A. Synthèse en phase solide du BGF et du TGF.
B. Isolement des polypeptides recombinants préparés dans des cellules procaryotes.
C. Isolement du VGF et du SFGF produits par expression des gènes naturels dans des eucaryotes.
D. L'EGF naturel.
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EXEMPLE XI.- Dosages d'activité.
A. Dosage mitogène.
B. Dosage de la stimulation de croissance de colonies sur gélose molle.
C. Dosage de l'inhibition de la fixation sur le récepteur de l'EGF.
D. Radio-immunodosage.
E. Cicatrisation.
EXEMPLE XII.Activité biologique des facteurs de croissance recombinants préparés dans des cellules procaryotes.
A. Fixation sur le récepteur de l'EGF.
B. Activité mitogène.
C. Cicatrisation.
EXEMPLE XIII.Activité biologique du VGF préparé dans des cellules eucaryotes.
A. Le VGF préparé dans des cellules rénales de singe (BSC-1).
B. Le VGF préparé dans des cellules CHO.
C. Le VGF préparé dans le ver à soie.
D. Comparaison immunologique du VGF et du TGF.
Dépôts biologiques.
Les plasmides d'expression ci-après, tous transformés dans E. Coli HB101, ont été déposés à la date indiquée à l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 et leur identification et désignation ATCT sont les suivantes :
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<tb>
<tb> Identification <SEP> Désignation <SEP> ATCC <SEP> Date <SEP> de <SEP> dépôt
<tb> PBMll <SEP> 67366
<tb> PBM14 <SEP> 67367
<tb> PBMl1/PA/VGF <SEP> 67417 <SEP> 3 <SEP> juin <SEP> 1987
<tb> PBMll/DP/VGFa <SEP> 67418 <SEP> 3 <SEP> juin <SEP> 1987
<tb> PBM11/PA/EGF <SEP> 67419 <SEP> 3 <SEP> juin <SEP> 1987
<tb> PBM1l/M5 <SEP> 67436
<tb> PBM11/C2 <SEP> 67437
<tb> PBMl1/NDP/EGF <SEP> 67547 <SEP> 23 <SEP> octobre <SEP> 1987
<tb>
Procédés.
On a appliqué les techniques générales de clonage décrites par Maniatis et al., 1982 dans "Molecular Cloning : A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, New York. Toutes les enzymes modifiant l'ADN ont été acquises chez des fournisseurs commerciaux. Elles ont été utilisées conformément aux instructions du fabricant. Les agents et appareillages pour la purification et la'séparation de l'ADN ont été utilisés suivant les instructions des fournisseurs.
EXEMPLE I.Préparation de gènes synthétiques intéressants.
On a développé des gènes synthétiques de facteur de croissance utilisant des codons de cellules hôtes optimalisés pour de hauts niveaux d'expression.
De plus, on a agencé divers sites de restriction commodes dans les gènes synthétiques. Lorsque la chose était possible, les nouveaux sites de restriction ont laissé inchangée la séquence des acides aminés du gène de facteur de croissance, mais dans certains cas, l'incorporation du nouveau site de restriction a conduit à une séquence d'acides aminés modifiée. Ces sites divisent en première approximation les gènes synthétiques en tiers donnant un domaine N-terminal, un domaine médian et un domaine C-terminal.
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Le produit du gène du VGF naturel contient un domaine N-terminal extrême qui n'a pas de contrepartie dans le TGF mature. Les fragments du VGF exempts de ce domaine sont appelés tronqués. Les sites des restrictions ont été utilisés pour les constructions initiales des gènes finals à l'aide de fragments oligonucléotidiques synthétiques partiels s'étendant d'un site de restriction jusqu'à un autre. Les oligonucléotides ont été synthétisés sur un appareil pour la synthèse des oligonucléotides Applied Biosystems et ont été purifiés sur un gel d'acrylamide.
Les oligonucléotides ont été phosphorisés à l'extrémité 5'au moyen de polynucléotide kinase de T4 et chaque oligonucléotide a ensuite été renaturé avec son complément.
A. Les oligonucléotides synthétiques du TGF.
1. Le domaine N-terminal du TGF humain :
TGF- >
BssHIINcoI M V V S H F N D C P D
EMI51.1
5'CGCGCCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGA 3'GGTACCAACAAAGAGTGAAATTGCTGACGGGCCT KpnI S H T Q F C F H G T CTCTCATACTCAGTTTTGCTTTCATGGTAC 3'TGF104 GAGAGTATGAGTCAAAACGAAAGTAC 5'TGF103
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2. Le domaine médian du TGF humain modifié avec la séquence humaine QEDK modifiée en QEEK, la séquence observée dans le TGF de rat :
KpnI SphI
C R F L V Q E E K P A C
EMI52.1
5'CTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATG 3'TGF101 3'CATGGACGGCAAAAGACCAAGTCCTTCTTTTTGGCC 5'TGF102 3.
Le domaine C-terminal du TGF humain :
SphI VCHSGYVGARC
EMI52.2
5'CGTTTGCCATTCTGGCTACGTTGGCGCACGTTG 3'GTACGCAAACGGTAAGACCGATGCAACCGCGTGCAAC
BamHI
E H A D L L A Ter
CGAACACGCTGACCTGCTGGCTTAAG 3'TGF205
GCTTGTGCGACTGGACGACCGAATTCCTAG 5'TGF206 B. Les oligonucléotides synthétiques du VGF : 1. Le domaine N-terminal du VGF :
HindIII
E D S G N A I E T T 5'AGCTGACTCTGGTAACGCTATCGAAACTAC 3'CTGAGACCATTGCGATAGCTTTGATG
S P E I T N A T T
TTCTCCGGAAATCACTAACGCTACTACT 3'V
AAGAGGCCTTTAGTGATTGCGATGATGA 5'V
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2.
Le domaine N-terminal du VGF modifié comprenant un
EMI53.1
0 site de coupure Asp-Pro, avec la séquence HGT remplaçant la séquence naturelle HGD :
BamHI
I D P M D I P A I R L C
5'GATCGATCCCATGGACATCCCGGCTATCCGTCTGT 3'CTAGGGTACCTGTAGGGCCGATAGGCAGACA KpnI
EMI53.2
G P E G D G Y C L H G T GCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGCCTGCATGGTAC 3'VGF104a CGCCGGGCCTTCCGCTGCCGATGACGGACGTAC 5'VGF103a 3. Le domaine médian du VGF modifié comprenant la séquence GYAC remplaçant la séquence naturelle GMYC : KpnI SphI T C I H A R D I D G Y A C 5'CTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATG 3'VGFl0la 3'CATGGACGTAGGTACGTGCACTGTAGCTGCCGATGC 5'VGF102a 4. Le domaine C-terminal du VGF, extrémité 5' : SphI EcoRI
C R C S H G Y T G
EMI53.3
5'CCGTTGCTCTCATGGCTACACTGG 3'VGF1A 3'GTACGGCAACGAGAGTACCGATGTGACCTTAA 5'VGF2A 5.
Le domaine C-terminal du VGF modifié, extrémité S', avec la séquence VCS remplaçant la séquence naturelle TCS :
SphI EcoRI
V C S H G Y T G
EMI53.4
5'CGTTTGCTCTCATGGCTACACTGG 3'VGF1 3'GTACGCAAACGAGAGTACCGATGTGACCTTAA 5'VGF2
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6. Le domaine C-terminal du VGF, fragment 3', se terminant à YQR au lieu de PNT, le domaine C-terminal déduit du VGF sécrété naturel :
EcoRI I R C Q H V V L
5'AATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCT 3'GCAACGGTCGTACAACAAGA
BamHI
V D Y Q R Ter
GGTCGACTACCAGCGTTAAGGATC 3'VGF3
CCAGCTGATGGTCGCAATTC 5'VGF4 C.
Les oligonucléotides synthétiques de l'EGF :
On a synthétisé trois séries d'oligonucléotides synthétiques chevauchants l (A, B), 2 (A, B) et 3 (A, B) codant pour l'EGF humain sur un appareil pour la synthèse des oligonucléotides Applied Biosystems et on les a purifiés sur un gel d'acrylamide. On a phosphorylé les oligonucléotides à l'extrémité 5'au moyen de polynucléotides kinase de T4. On a renaturé chaque oligonucléotides avec son complément.
1.
NcoIEcoRI
M N S D S E C P
5'CATGAATTCTGACTCTGAATGCCC 3'TTAAGACTGAGACTTACGGG
L S H D G Y
GCTGTCTCATGACGGCTAC 3'EGF1A
CGACAGAGTACTGCCGATGACGGAC 5'EGF2A
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2. NsiI
C L H D G V C M Y
5'TGCCTGCATGACGGCGTATGCATGTAC 3'GTACTGCCGCATACGTACATG
SphI
EMI55.1
I E A L D K Y A C ATCGAAGCTCTGGACAAGTACGCATG 3'EGF1B TAGCTTCGAGACCTGTTCATGC 5'EGF2B 3.
SphI
N C V V G Y I G E R C Q 5'CAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCA
3'GTACGTTGACGCAACAACCGATGTAGCCGCTTGCAACGGT
BamHI YRDLKWWELR*
GTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTAAG 3'EGF3
CATGGCACTGGACTTTACCACCCTTGACGCAATTCCTAG 5'EGF4 EXEMPLE II.Description du clonage et de l'expression de plasmides.
A. Le plasmide pLEBam a été utilisé pour cloner des fragments oligonucléotidiques synthétiques en raison de ses sites de restriction BssHII et BamHI commodes. Un plasmide avec des sites de restriction NcoI et BamHI comme pBM11 ou pBM1l/NDP (décrits ciaprès) peut être utilisé pour cloner les fragments nucléotidiques synthétiques et d'autres séquences d'ADN intéressantes.
B. Le plasmide pBM11, décrit dans la demande de brevet E. U. A. nO 264 098 du 28 octobre 1988, permet le clonage d'un gène intéressant à l'aval des séquences d'ADN codant pour les 33 acides aminés N-terminaux du gène N du bactériophage lambda à un site de restriction
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BamHI. Lors de l'induction du promoteur PL de lambda par inactivation du répresseur sensible à la température C1857 à 42 C, le produit génique étranger est exprimé comme partie C-terminale d'une protéine de fusion dont la séquence N-terminale est celle du gène N.
C. Le plasmide pBMllM4, décrit dans la demande de brevet E. U. A. n 264 098 du 28 octobre 1988, dérive de pBMll et permet de cloner un gène intéressant à un site de restriction BamHI directement après la
EMI56.1
méthionine d'initiation du gène N. Le plasmide du m e e pBMll/M4 contient aussi un site NcoI dans le gène néomycine.
EMI56.2
D. Le plasmide pBMUMS, décrit dans la demande de brevet E. U. A. n 264 098 du 28 octobre 1988, dérive de pBMll dans lequel un site NcoI présent dans le gène de résistance à la néomycine a été supprimé par une mutagénèse orientée sur le site. Le clonage d'un gène intéressant dans pBMIl/MS n'exige donc pas la digestion partielle du vecteur par Ncol.
E. Le plasmide pBM11/NDP, décrit dans la
EMI56.3
demande de brevet E. U. A. nO 264 098 du 28 octobre 1988, dérive de pBMl1 et comprend des séquences d'ADN codant pour un dipeptide acide aspartique-proline labile en milieu acide inséré entre les séquences codant pour le gène N et un gène intéressant. Le plasmide contient un site Ncol et un site ClaI pour le clonage d'un gène intéressant à l'aval du promoteur PL.
F. Le plasmide pBMll/PAD, décrit dans la demande de brevet E. U. A. no 264 098 du 28 octobre 1988, dérive du plasmide pBMllM4 et permet de cloner un gène intéressant à un site HindIII, SmaI ou BamHI à l'aval d'une séquence de signalisation de phosphatase alcaline modifiée.
* G. Le plasmide pBMll/PAK, décrit dans la
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demande de brevet E. U. A. no 264 098 du 28 octobre 1988, dérive du plasmide pBMllM4 et permet de cloner un gène intéressant à un site HindIII, SmaI ou BamHI à l'aval d'une séquence de signalisation de phosphatase alcaline.
H. Le plasmide pTCPT est conçu pour avoir les éléments du promoteur tac et utilise le cro SD pour exprimer le gène intéressant derrière la séquence de signalisation de phosphatase alcaline. Un exemple de la construction de ce plasmide est donné ci-après par la construction de pTCPt/EGF.
Construction de pTNPt (1 trp-35 117bpl lac-10 H nSD 1 8bpl ATG 1/séquences de signalisation de phosphatase alcaline/segment linker/term. trans.-NEO).
Ce plasmide est conçu pour posséder les éléments du promoteur tac et utilise le SD du gène N pour exprimer un gène donné derrière la séquence de signalisation de phosphatase alcaline. Il comprend une structure de fond de pBR322 avec le gène de résistance à la néomycine. Le plasmide pTNPt a été construit de la façon suivante : (a) Préparation du fragment EcoRI-BamHI de 2,8 kb de pBM16t/VGFa exempt du site HindIII.
On a mis le plasmide pBM16t/VGFa à digérer avec EcoRI et BamHI et on a isolé le fragment de 2,8 kb. On a assemblé par ligation le fragment de 2,8 kb avec un segment linker EcoRI-BamHI et par analyse de restriction, on a isolé un produit construit correct appelé intermédiaire I.
On a supprimé le site HindIII unique proche du gène de résistance à la néomycine du plasmide intermédiaire I par digestion avec HindIII, en créant des bouts francs avec un fragment Klenow et en refaisant la ligation. Il en est résulté le plasmide intermédiaire II exempt du site HindIII.
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On a isolé le fragment EcoRI-BamHI de 2, 8 kb de pBM16t/VGFa exempt du site HindIII en faisant digérer intermédiaire II avec EcoRI et BamHI. On a isolé le fragment de 2,8 kb résultant par électrophorèse sur gel d'agarose.
(b) Préparation du fragment BamHI-BsmI de 150 bp de pBMll/PAk.
Le plasmide pBMll/PAK est identique à pBMll/PAK/EGF, sauf qu'il contient une région de segment linker avec des sites HindIII, SmaI et BamHI à l'aval de la séquence de signalisation de phosphatase alcaline au lieu du gène de l'EGF. On a fait digérer pBMll/PAK par BsmI et BamHI et on a isolé le fragment de 150 bp contenant le SD du gène N, la séquence de signalisation de phosphatase alcaline et la région de segment linker.
(c) Préparation des oligonucléotides TacA+ et TacA-.
On a synthétisé les oligonucléotides TacA+ et TacA-sur un appareil pour la synthèse des oligonucléotides Applied Biosystems et on les a agencés pour qu'ils comprennent un EcoRI en surplomb à l'extrémité. 5', avec la séquence de consensus trp-35 séparée de la séquence de consensus lac-10 par 17 nucléotides parmi lesquels se trouve un site SstI.
La séquence contient aussi l'extrémité 5'du mARN de lac, le site de fixation du répresseur lac et un surplomb BsmI.
TacA+ 5'AATTACTCCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGAGCTC GTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAG 3'
TacA-5'GTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATA
CGAGCTCGATGATTAATTGTCAACAGGGGGATGGGGAGT 3'
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(d) Ligation et isolement de pTNPt.
On a assemblé par ligation le fragment EcoRIBamHI de 2, 8 kb, le fragment BsmI-BamHI de 150 bp et les oligonucléotides TacA+ et TacA-avec de l'ADN ligase et on a utilisé de l'ADN pour transformer JM109 compétent (lacIq). Par analyse de restriction et
EMI59.1
S. séquençage de l'ADN, on a isolé un produit construit correct.
(Site EcoRI de pBMll)
EMI59.2
I GAATTACTCCCCATCC SstI trp-35 (17pb) lac-10 CCCTG [TTGACA] ATTAATCATCGAGCTCG (TATAATG) BsmI 5'lac mRNA- > n mRNA- > TGTGG/AATTGTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGCATTCAAAGCAGAAGGCT TTGGGGTGTGTGATACGAAACGAAGCATTGGCCGTAAGTGCGATTCCGGATTAGC TGCCAATGTGCCAATCGCGGGGGGTTTTCGTTCAGGACTACAACTGCCACACACC PvuI mSD (8pb) Séq. de signa ACCAAAGCTAACTGAC {AGGA} GAATCCAG ATGAAACAATCTACGATCGCCC
M K Q S T I A L
SmaI
HindIII BamHI TCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTTCCCGGGATCCGTG
A L L P L L F T P V T K
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(Site BamHI de pBMll) Term. trans. 1 ACTAATTGGGGACCCTAGAGGTCCCCTTTTTTATTTTAAAACGATCC
I.
Le plasmide plac/cro- consiste en la
EMI60.1
0 eron lactose (lac) région opérateur-promoteur de l'opéron lactose (lac) d'E. coli, de même qu'en les sites de fixation ribosomiques de lac et cro. Le plasmide a été construit comme décrit dans la demande de brevet E. U. A. no 264 098 du 28 octobre 1988. Les protéines de fusion exprimées par ce vecteur consistent en la partie Nterminale de la protéine Cro du bactériophage, la séquence d'acides aminés codés par l'ADN inséré et le domaine C-terminal de P-galactosidase. Les éléments de contrôle de ce vecteur consistent en la région opérateur-promoteur de l'opératon lactose (lac) d'E. Coli, et en les sites de fixation ribosomiques de lac et cro.
K. Le plasmide ptac/cro-6-gal permet de cloner un gène intéressant à l'aval des 21 acides aminés N-terminaux de la protéine Cro bactérienne. Le plasmide a été construit comme décrit dans la demande de brevet E. U. A. nO 624 098 du 28 octobre 1988. Le vecteur d'expression ptac/cro-P-gal est semblable à plac/cro-û-gai, avec l'exception que le promoteur de ptac/cro- f3-gal consiste en la région-35 du promoteur de l'opéron tryptophane et en la boîte Pribnow de l'opéron lac. Ce promoteur hybride permet un plus haut degré d'expression que plac/cro-P-gal.
K. Le plasmide pRSV permet l'expression d'un gène intéressant dans des cellules eucaryotes avec le
EMI60.2
promoteur RSV LTR, Gorman et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1982) 79 : 6777-6781.
L. Le plasmide pAc610, Smith et al., Molec.
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Cell. Biol. (1983) 12 : 2156-2165, permet l'expression d'un gène étranger dans les cellules d'un insecte.
M. Les plasmides pToxl et pTox2 permettent l'expression d'un gène intéressant dans des cellules de levure au moyen de la séquence de signalisation de toxine tueuse de K. lactis (EMBO 6, 229-234 (1987) ; Biochem, Biophys. Res. Comm. 144,613-619 (1987)). Ce produit construit comprend le gène URA3 pour la sélection dans les levures et le gène AMP pour la sélection dans les bactéries. La transcription commence avec le promoteur CYC1 et la"séquence d'activation d'amont"GAL (Methods Enzymol., 101, 181-191 (1983)) et se termine dans l'extrémité 3'du gène FLP (Mol. Cell.
Biol., 5, 2770-2780 (1985)). Le produit construit comprend tant l'origine du plasmide de 2 microns que l'origine de pBR322 pour la réplication dans les levures et E. coli, respectivement. La région Nterminale de toxine tueuse, avec la séquence de signalisation et le site de coupure Kex2, a été introduite sur les oligonucléotides et limitée dans la région riche en A-T immédiatement avant le codon initiateur pour conserver des signaux d'initiation de traduction et d'allongement optimaux. Divers sites de restriction ont été agencés pour permettre l'insertion de gènes intéressants à l'aval du site de coupure de signalisation et du site de coupure Kex2.
1. Préparation du fragment EcoRI-EspI de 3 kb de pBR322 contenant l'origine et le gène de résistance AMP.
On a mis le plasmide pLGSD5 (-ATG), qui est un vecteur d'expression dans les levures (Methods Enzymol. 101 : 181-191 (1983)), à digérer avec EcoRI et EspI et on a isolé le fragment de 3, 0 kb.
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2. Préparation du fragment EcoRI-EspI de 2,1 kb du plasmide de 2 microns contenant l'extrémité 3'du gène FLP et l'origine.
On a mis le plasmide pLGSDS (-ATG) à digérer avec EcoRI et EspI et on a isolé le fragment de 2,1 kb.
3. Ligation et isolement du plasmide intermédiaire I.
On a assemblé par ligation les fragments EcoRI-EspI de 2, 1 kb et de 3 kb en utilisant de l'ADN ligase et on a utilisé l'ADN pour transformer HB101 compétent. Par analyse de restriction, on a isolé un produit construit correct.
4. Préparation du fragment EcoRI-BamHI de 1,8 kb de
EMI62.1
pLGSD5 (-ATG) contenant le gène URA3, la séquence d'activation d'amont GAL et le promoteur CYC1.
On a mis le plasmide pLGSD5 (-ATG) à digérer avec EcoRI et BamHI et on a isolé le fragment de 1,8 kb. Le site BamHI est présent dans un segment linker inséré à 4 paires de bases à l'amont de l'initiateur CYC1.
5. Préparation des oligonucléotides pToxlA+, 2A-, 1B+, 2B-.
On a élaboré des oligonucléotides pour unir les codons pour la séquence de signalisation de la toxine tueuse de K. lactis au site BamHI à l'aval de l'initiateur CYC1. Pour conserver une initiation de traduction optimale, on a inclus 13 paires de bases de la séquence riche A-T à l'amont du codon initiateur de la toxine tueuse. Cette séquence est conforme à la séquence de consensus déterminée pour les codons d'initiation des codons des levures. Un site BG1I a été disposé directement à l'amont de la région A-T pour permettre la mutagénèse de la région d'initiation et de la séquence de signalisation. Un site HindIII a été disposé à 10 nucléotides à l'amont du site de coupure du signal pour permettre la mutagénèse des séquences en
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aval et la ligation d'un gène intéressant.
Dans pToxl, un site AvaI, XhoI était situé directement à l'aval du site de coupure du signal, tandis que dans pTox2, un site NaeI était situé au site de coupure du signal pour un clonage par bouts francs directement au-delà de la coupure du signal qui était modifié de Gly-Leu en AlaGlys. La résolution de l'hétéroduplexe au site de coupure devait mener à la formation de clones contenant la séquence pToxl et de clones contenant la séquence pTox2. Dans les deux produits construits, les séquences ultérieures codent pour le reste de la séquence
EMI63.1
0 précurseur de la toxine tueuse vers l'aval jusqu'au site de coupure Kex2 Lys-Arg, point auquel divers sites de restriction (StuI, SalI, AccI, HincII et BamHI) ont été agencés pour faciliter le clonage d'un gène intéressant.
Le site StuI permet un clonage par bouts francs directement après le codon Arg du site de coupure Kex2. Les oligonucléotides ont un surplomb BamHI à l'extrémité 5'et un surplomb HindIII à l'extrémité 3'pour permettre le clonage dans le vecteur intermédiaire I. La séquence résultante n'a plus aucun des deux sites.
(BamHI) BglII
EMI63.2
M 1A+ 5'GATCAGATCTAATAATTATAAAAT 2A-3'TCTAGATTATTAATATTTTA
HindIII
N I F Y I F L F L L S GAATATATTTTACATATTTTTGTTTTTGCTAAGC CTTATATAAAATGTATAAAAACAAAAACGATTCGAAG
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Site de coupure de sign.
(pToxl)/AvaI, XhoI
F V Q G L E H T H R R
1B+ 5'TTCGTTCAGGGCCTCGAGCATACTCATAGAAG
2B-3'AAGTCCGGCCGCTCGTATGAGTATCTTC
A G (pTox2) NaeI
Site de coupure Kex2 /StuI SalI, AccI BamHl
G S L V K R P L S T D P
AGGCTCCTTAGTCAAAAGGCCTTTGTCGACGGATCC
TCCGAGGAATCAGTTTTCCGGAAACAGCTGCCTAGGTCG
Ces oligonucléotides ont été synthétisés sur un appareil pour la synthèse des oligonucléotides Applied Biosystems et ont été purifiés par électrophorèse sur gel. Ensuite, ils ont été phosphorylés avec de la kinase de T4 et les paires complémentaires ont été renaturées ensemble, unies par ligation et purifiées sur gel.
6. Préparation du vecteur intermédiaire 1 EcoRI-HindIII.
On a mis le vecteur intermédiaire 1 à digérer avec EcoRI et HindIII, puis on l'a traité avec de la phosphatase alcaline de veau. Ce traitement a éliminé un petit fragment EcoRI-HindIII et laissé subsister un site HindIII à l'amont de la séquence FLP3'.
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7. Ligation et isolement de pToxl et pTox2.
On a assemblé par ligation le fragment EcoRIBamHI de 1,8 kb avec le fragment oligonucléotidique en utilisant de l'ADN ligase et on a purifié le fragment résultant sur gel, puis on l'a assemblé par ligation avec le vecteur intermédiaire 1 EcoRI-HindIII et on a utilisé l'ADN pour transformer HB101 compétent. On a identifié les produits construits corrects par une analyse de restriction et un séquençage de l'ADN et on a isolé un clone comprenant la séquence pToxl et un autre comprenant la séquence pTox2. Les deux clones étaient exempts du site BamHI à la jonction des oligonucléotides et du vecteur intermédiaire 1.
EXEMPLE III.- Assemblage de gènes de facteurs de croissance pour l'expression dans des cellules procaryotes.
A. Préparation du plasmide pLEBam/TTV.
On a assemblé dans le vecteur de clonage pLEBam le facteur de croissance hybride synthétique dit TTV (ou TGF/TGF/VGF). Ce facteur de croissance hybride contenait la séquence d'acides aminés du TGF humain dans les deux tiers amino-terminaux du gène, à l'exception de la séquence QEEK qui était modifiée par rapport à la séquence humaine naturelle QEDK.
L'extrémité carboxyle provenant de la séquence d'acides aminés du VGF et était terminée par la séquence YQR à l'amont de la séquence naturelle PNT. On a mis le plasmide pLEBam à digérer avec BssHII et BamHI. On a ensuite assemblé par ligation le fragment BssHII-BamHI de pLEBam avec les oligonucléotides TGF101, 102,103 et 104 et VGF1, 2,3 et 4 en utilisant de l'ADN ligase et on a utilisé les plasmides résultants pour transformer des HB101 compétents. On a sélectionné les transformants sur ampicilline et on les a triés par analyse de restriction en utilisant EcoRI, NcoI et
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BamHI, de même que par séquençage des nucléotides suivant les protocole Maxam-Gilbert. On a isolé un produit construit correct noté pLEBam/TTV.
EMI66.1
TGF NcoI CCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTT M V V S H F N D C P D S H T Q F C F VGF
KpnI SphI
TCATGGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCTCT
H G T C R F L V Q E E K P A C V C S
EcoRI
CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT
H G Y T G I R C Q H V V L V D Y Q R
BamHI
TAAGGATCC
Ter B. Préparation du plasmide pLEBam/TVV.
On a assemblé le facteur de croissance hybride synthétique noté TVV (ou TGF/BGF/VGF) dans le vecteur de clonage pLEBam. Ce facteur de croissance hybride contenait la séquence d'acides aminés du TGF humain dans le domaine N-terminal du gène. Le domaine médian et le domaine C-terminal dérivent de la séquence du VGF tronqué et se terminent avec la séquence YQR à l'amont de la séquence naturelle PNT. De plus, le gène synthétique comprend la modification GYACVC remplaçant GMYCRC.
(a) Préparation d'un fragment KpnI-SphI de 4,3 kb de pLEBam/TTV.
On a mis le plasmide pLEBam/TTV à digérer avec KpnI et SphI et on a purifié sur gel le fragment KpnI- Sph-I de 4,3 kb. Cette digestion élimine le domaine
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médian du TGF hors du gène synthétique TTV dans le plasmide de clonage pLEBam.
(b) Ligation et isolement de pLEBam/TTV.
On a assemblé par ligation les oligonucléotides VGFlOla et 102a avec le fragment KpnISphI de 4,3 kb de pLEBam/TTV au moyen d'ADN ligase et on a utilisé le mélange résultant pour transformer des HB101 compétents. On a sélectionné les transformants sur ampicilline et on les a triés par séquençage des nucléotides suivant le procédé Sanger-didésoxy. On a isolé un produit construit correct noté pLEBam/TTV.
EMI67.1
TGF NcoI CCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTT
M V V S H F N D C P D S H T Q F C F
VGF
KpnI SphI TCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCGTTTGCTCT HGTCIHARDIDGYACVCS
EcoRI CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGCTCGACTACCAGCGT H G Y T G I R C Q H V V L V D Y Q R
BamHI TAAGGATCC Ter EXEMPLE IV.Expression du polypeptide intéressant à l'état de protéine de fusion avec la protéine N.
A. Le TGF synthétique modifié.
1. Préparation de pBMll/N/TGF.
On a exprimé le TGF humain modifié dans ce système comme partie d'une fusion avec les 33 acides
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aminés N-terminaux du gène N ; il comprend la séquence QEEK remplaçant la séquence QEDK humaine.
(a) Préparation d'un fragment SphI-PvuI de 780 pb de PBMll/N/TTV.
On a mis le plasmide pBMll/N/TTV à digérer avec SphI et PvuI et on a purifié sur gel le fragment SphI-PvuI de 780 pb. Ce fragment contient une partie du plasmide de pBMll à l'extrémité PvuI et à l'extrémité SphI, le gène N et les deux tiers N-terminaux du gène du TGF humain.
(b) Préparation du fragment BamHI-PvuI de 5 kb de pBMll/N/TTV.
On a mis le plasmide pBMll/N/TTV à digérer avec BamHI et PvuI et on a purifié sur gel le fragment BamHI-PvuI de 5 kb.
(c) Ligation et isolement de pBMIl/N/TGF.
On a assemblé par ligation les oligonucléotides TGF 206 et 206, le fragment SphI-PvuI de 780 pb et le fragment BamHI-PvuI de 5 kb de pBMll/N/TTV et on a utilisé le produit pour transformer des HB101 compétents. On a sélectionné les transformants sur néomycine et on les a triés par analyse de restriction au moyen d'EcoRI et par
EMI68.1
0 séquençage des nucléotides suivant le procédé Sanger- didésoxy.
On a isolé un produit construit correct noté pBMIl/N/TGF. gène N ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA M D A Q T R R R E R R A E K Q A Q W K
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BamHI AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCCGCAT
A A N P L L V G V S A K P V R I R M
TGF- GGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTTTCAT
V V S H F N D C P D S H T Q F C F H KpnI SphI GGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCCATTCTG G T C R F L V Q E E K P A C V C H S G
BamHI GCTAGGTTGGCGCACGTTGCGAACACGCTGACCTGCTGGCTTAAGGATCC
Y V G A R C E H A D L L A Ter B. L'hybride TGF-VGF synthétique modifié.
1. Préparation de pBMll/NiTTV.
Dans ce produit construit, un gène hybride TTV modifié synthétique a été exprimé comme partie C terminale d'une protéine de fusion comprenant les premiers 33 acides aminés du gène N à 11 extrémité Nterminale. Ce facteur de croissance hybride contenait la séquence des acides aminés du TGF humain dans les deux tiers amino-terminaux du gène, avec l'exception que la séquence QEEK se trouvait modifiée par rapport à la séquence QEDK humaine naturelle. L'extrémité carboxyle était dérivée de la séquence des acides aminés du VGF et terminée par la séquence YQR à l'amont de la séquence naturelle PNT.
(a) Préparation du gène synthétique TTV NcoI (franc)BamHI
On a mis le plasmide pLEBam/TTV à digérer avec NcoI et on a rendu les extrémités franches en complétant les surplombs avec le fragment Klenow de l'ADN polymérase. On a mis l'ADN ensuite à digérer avec BamHI et on a purifié sur gel le fragment Ncol (franc)-
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BamI de 170 pb de TTV.
(b) Préparation de pBMll digéré par BamHI.
On a mis le plasmide pBMll à digérer avec BamHI.
(c) Ligation et isolement de pBMll/N/TTV.
On a assemblé par ligation pBMll digéré par BamHI, le fragment NcoI (franc)-BamI de TTV et les segments linkers BamHI (5'GATCCG3') en utilisant de l'ADN ligase et on a utilisé le mélange résultant pour transformer des HB101 compétents. On a sélectionné les transformants sur néomycine et on les a triés par analyse de restriction et séquençage des nucléotides suivant le procédé Sanger-didésoxy.
On a isolé un produit construit correct pBMll/N/TTV. gène N-p ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA MDAQTRRRERRAEKQAQWK
BamHI AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCCGCAT
A A N P L L V G V S A K P V R I R M
TGFGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTTTCAT
V V S H F N D C P D S H T Q F C F H
KpnI SphI VGFGGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCTCTCATG G T C R F L V Q E E K P A C V C S H G
EcoRI GCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGTTAAG
Y T G I R C Q H V V L V D Y Q R Ter BamHI GATCC
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EXEMPLE 5.Préparation du polypeptide intéressant à l'état de protéine de fusion avec la protéine N et un site de coupure.
A. Le VGF synthétique modifié.
1. Préparation de pBMIl/NDP/VGFA.
La séquence N-terminale du gène du VGFA synthétique est une version tronquée de la séquence du VGF naturel et elle commence avec la séquence DIPAIR.
Dans ce plasmide, le fragment VGFA est situé à l'aval de 32 acides aminés de la protéine N de lambda et du dipeptide acide aspartique-proline. Afin de conserver le site de clonage KpnI, la séquence synthétique se trouvait modifiée de façon à coder pour CLHCGTC au lieu de la séquence CLHGDC du VGF naturel et elle se termine par la séquence YQR à l'amont de la séquence PNT naturelle. De plus, le gène du VGFA code pour la séquence GYACVC qui remplace la séquence naturelle GMYCRC. a. Préparation d'un fragment C-terminal KpnI-BamHI de 80 pb du gène du VGF synthétique.
On a mis le plasmide pLEBam/TVV à digérer avec Kpnl et BamHI et on a purifié sur gel le fragment KpnI- BamHI de 80 pb. Ce fragment contient les deux tiers Cterminaux du gène du VGF synthétique avec le site KpnI à l'extrémité 5'. b. Préparation de pBMll digéré par BamHI et déphosphorylé.
On a mis le plasmide pBMIl/N/TTV à digérer avec BamHI et on a éliminé les 5'-phosphates par traitement avec de la phosphatase alcaline intestinale de veau. On a purifié sur gel le fragment BamHI du 5,6 kb du plasmide.
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c. Ligation et isolement de pBMll/NDP/VGFA.
On a assemblé par ligation les oligonucléotides VGF 103a et 104a, le fragment BamHI de 5,6 kb de pBMll et le fragment Kpnl-BamHI de 80 pb de pLEBam/TVV en utilisant de l'ADN ligase, puis on a utilisé le produit pour transformer des HB101 compétents. On a sélectionné les transformants sur néomycine et on les a triés par analyse de restriction au moyen de ClaI et par séquençage des nucléotides suivant le procédé Sanger-didésoxy. On a isolé un produit construit correct noté pBMll/NDP/VGFA. Ce produit construit comprend les séquence GTC et GYACVC au lieu des séquences GDC et GMYCRC du VGF authentique. gène N.
ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA M D A Q T R R R E R R A E K Q A Q W K ****
Clal
EMI72.1
AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATC A A N P L L V G V S A K P V R I D P NcoI VGF + CCATGGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGCCT M D I P A I R L C G P E G D G Y C L KpnI SphI GCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCGTTTGCTCT
H G T C I H A R D I D G Y A C V C S
EcoRI CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT H G Y T G I R C Q H V V L V D Y Q R
<Desc/Clms Page number 73>
BamHI
TAAGGATCC
Ter 2. Préparation de pBMIl/NDP/VGFa.
La séquence N-terminale du VGFa est une version tronquée de la séquence du VGF naturel et commence par la séquence DIPAIR. De plus, la séquence VGFa contient les séquences modifiées GTC et GYACRC au lieu des séquences GDC et GMYCRC du VGF naturel. Dans ce plasmide, le gène VGFa est situé à l'aval de 32 acides aminés de la protéine N de lambda et du dipeptide acide aspartique-proline. En traitant au moyen d'acide formique la protéine de fusion purifiée, on opère la coupure de la liaison peptidique acide aspartique-proline, qui est labile en milieu acide, ce qui permet de séparer la protéine VGFa de l'extrémité amino de la protéine N de lambda. La coupure est telle que la protéine VGFa subsiste avec le résidu proline à l'extrémité amino. a. Préparation de pBMIl/DP/VGFA digéré par SphI et déphosphorylé.
On a mis le plasmide pBMll/DP/VGFA (lOiLg) à digérer avec 30 unités de SphI et on a éliminé les 5'phosphates par traitement avec de la phosphatase alcaline intestinale de veau. On a recueilli le fragment de plasmide de 5 kb après électrophorèse sur un gel d'agarose. b. Préparation d'un fragment EcoRI-SphI de 70 pb de pBMll/DP/VGFA.
On a mis le plasmide pBMIl/DP/VGFA(10 g) à digérer avec 30 unités d'EcoRI, puis 30 unités de SphI.
<Desc/Clms Page number 74>
Après électrophorèse sur un gel d'agarose, on a recueilli le fragment de 70 pb.
3. Ligation et isolement de pBMll/NDP/VGFa.
On a assemblé par ligation le fragment de 24 pb contenant les oligonucléotides VGF 1A et 2A, le
EMI74.1
fragment SphI de 5 bb et le fragment EcoRI-SphI de 70 pb de pBMll/OP/VGFA et on a utilisé le mélange pour transformer des cellules HB101 d'E. coli compétentes.
On a trié les transformants par séquençage des nucléotides suivant le procédé Sanger-didésoxy. On a isolé un clone correct noté pBMll/NDP/VGFa. gène N ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA M D A Q T R R R E R R A E K Q A Q W K * * * *
Clal AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATCC
A A N P L L V G V S A K P V R I D P NcoI VGFCCATGGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGCCT
M D I P A I R L C G P E G D G Y C L KpnI SphI GCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCCGTTGCTCT HGTCIHARDIDGYACRCS
EcoRI CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT H G Y T G I R C H V V L V D Y Q R
BamHI TAAGGATCC Ter B. Les hybrides TGF-VGF synthétiques modifiés.
1. Préparation de pBMll/NDP/TTV.
<Desc/Clms Page number 75>
Dans ce produit construit, le gène hybride TTV modifié synthétique est exprimé comme partie Cterminale d'une protéine de fusion comprenant les premiers 32 acides aminés du gène N à l'extrémité N. Un dipeptide acide aspartique-proline labile en milieu acide sépare les deux parties du produit de fusion. Le facteur de croissance hybride contient la séquence des acides aminés du TGF humain dans les deux tiers aminoterminaux du gène, avec l'exception que la séquence QEEK se trouve modifiée par rapport à la séquence QEDK du TMR humain naturel. L'extrémité carboxyle provenait de la séquence des acides aminés du VGF et était terminée par la séquence YQR à 11 amont de la séquence PNT naturelle. a. Préparation du fragment NcoI de 5 kb du plasmide pBMll.
On a mis le plasmide pBMIl/NDP/VGFA à digérer
EMI75.1
avec Ncol et on a purifié sur gel le fragment de plasmide col de 5 kb. Ce fragment comprend un surplomb NcoI au site de coupure acide aspartique-proline à l'aval des séquences codant pour les premiers 32 acides aminés du gène N. L'autre site NcoI se trouve dans le gène de résistance à la néomycine. b. Préparation du fragment NcoI-BamHI de 0,6 kb de pBMll.
On a mis le plasmide pBMll/N/TTV à digérer avec NcoI et BamHI et on a purifié sur gel le fragment NcoI-BamI de 0,6 kb du plasmide. Ce fragment comprend le surplomb de NcoI dans le gène de résistance à la néomycine. c. Préparation du fragment TGF/TGF/VGF synthétique de 170 bp.
On a mis le plasmide pLEBam/TTV à digérer avec NcoI et BamHi et on a purifié sur gel le fragment NcoIBamHI de 170 bp contenant le gène synthétique
<Desc/Clms Page number 76>
TGF/TGF/VGF. Ce fragment comprend le surplomb Scot à l'extrémité 5'du gène et le surplomb BamHI à l'extrémité 3'du gène. d. Ligation et isolement de pBMIl/NDP/TTV.
On a assemblé par ligation les fragments de plasmide NcoI de 5 kb et NcoI-BamHI de 0,6 kb avec le fragment NcoI-BamHI de 170 bp du gène TTV en utilisant de l'ADN ligase et on a utilisé le mélange résultant pour transformer des HB101 compétents. On a sélectionné les transformants sur néomycine, de façon que seules les colonies comprenant des gènes de résistance à la néomycine correctement reconstruits puissent survivre.
On a trié les transformants par analyse de restriction avec NcoI et par séquençage des nucléotides suivant le procédé Sanger-didésoxy. On a isolé un produit construit correct noté pBMIl/NDP/TTV. gène N ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA M D A Q T R R R E R R A E K Q A Q W K
ClaI AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATC
A A N P L L V G V S A K P V R I D P NcoI TGFCCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTT
EMI76.1
M V V S H F N D C P D S H T Q F C F KpnI SphI VGFATCATGGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCTCT H G T C R F L V Q E E K P A C V C S
<Desc/Clms Page number 77>
EcoRI CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT H G Y T G I R C Q H V V L V D Y Q R
BamHI TAAGGATCC Ter 2. Préparation de pBMIl/NDP/VTV.
Dans ce produit construit, le gène hybride VTV modifié synthétique a été exprimé comme partie Cterminale d'une protéine de fusion comprenant les premiers 32 acides aminés du gène N à l'extrémité N. Un dipeptide acide aspartique-proline labile en milieu acide sépare les deux parties du produit de fusion. Ce facteur de croissance hybride contenait la séquence d'acides aminés du TGF humain dans le domaine médian avec la séquence d'acides. aminés QEEK remplaçant la
EMI77.1
01 séquence naturelle QEDK. Le domaine N-terminal et le domaine C-terminal étaient issus d'une séquence du VGF tronqué et commençaient par la séquence DIPAIR et se terminaient par la séquence YQR qui est à l'amont de la séquence naturelle PNT. a. Préparation d'un fragment BamHI-NcoI de 5 kb de pBMll.
On a mis le plasmide pBMll/N/TTV à digérer avec BamHI et NcoI et on a purifié sur gel le fragment BamHI-NcoI de 5 kb. Ce fragment contient un surplomb BamHI à l'extrémité 3'des séquences codant pour les premiers 32 acides aminés du gène N et un site NcoI dans le gène de résistance à la néomycine. b. Préparation d'un fragment KpnI-NcoI de 700 bp de pBMll/N/TTV.
On a mis le plasmide pBMll/N/TTV à digérer avec Kpnl et NcoI et on a purifié sur gel le fragment
<Desc/Clms Page number 78>
KpnI-NcoI de 700 bp. Ce fragment est formé d'une partie du plasmide pBMll contenant une partie du gène de résistance à la néomycine au surplomb NcoI, ainsi que du domaine C-terminal de VGF du gène synthétique TTV au surplomb KpnI. c. Ligation et isolement de pBMll/NDP/VTV.
On a assemblé par ligation les oligonucléotides VGF 103a et 104a, le fragment BamHINcoI de 5 kb de pBMll et le fragment KpnI-NcoI de 700 pb de pBMll/N/TTV en utilisant de l'ADN ligase et on a utilisé le produit ensuite pour transformer des HB101 compétents. On a sélectionné les transformants sur néomycine et on les a triés par analyse de restriction à l'aide de Clal et par séquençage de nucléotides suivant le procédé Sanger-didésoxy.
EMI78.1
gène N ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA M D A Q T R R R E R R A E K Q A Q W K ****
Clal AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATC
A A N P L L V G V S A K P V R I D P NcoI VGFCCATGGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGCCT
M D I P A I R L C G P E G D G Y C L KpnI TGF + SphI VGF.
GCATGGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCTCT
H G T C R F L V Q E E K P A C V C S
<Desc/Clms Page number 79>
EcoRI CATGGCTACACTGGAATTCGTTCGCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT H G Y T G I R C Q H V V L V D Y Q R
BamHI TAAGGATCC Ter 3. Préparation de pBM16/NDP/TVV.
Dans ce produit construit, le gène hybride TVV modifié synthétique a été exprimé comme partie Cterminale d'une protéine de fusion contenant les premiers 32 acides aminés du gène N à l'extrémité N. Un dipeptide acide aspartique-proline labile en milieu acide sépare les deux parties du produit de fusion. Le facteur de croissance hybride contenait la séquence des acides aminés du TGF humain dans le domaine N-terminal.
Le domaine médian et le domaine C-terminal étaient issus de la séquence du VGF tronqué et se terminaient par la séquence YQR. De plus, le gène synthétique comprend la modification de GYACVC en GMYCRC. a. Préparation du fragment NcoI-BglII de 4,3 kb de pBMll/NDP/VGFa.
On a mis le plasmide pBMll/NDP/VGFa à digérer avec NcoI et BglII et on a purifié le fragment de 4,3 kb sur un gel. Le surplomb NcoI est positionné au site de coupure acide aspartique-proline juste à l'aval des 32 premiers acides aminés du gène N. b. Préparation du fragment BamHI-BglII de 1,2 kb du pBMllMS.
On a mis le plasmide pBMIlMS à digérer avec
EMI79.1
BamHI et BglII et on a purifié le fragment de 1, 2 kb BamHI et p e sur un gel. Ce fragment diffère du fragment de pBMll normal par le fait que le site NcoI dans le gène de résistance à la néomycine a été éliminé ; tous les
<Desc/Clms Page number 80>
vecteurs ultérieurs exempts de ce site NcoI sont appelés pBM16. c. Préparation du gène synthétique TVV NcoI-BamHI de 170 bp.
On a mis le plasmide pLEBAM/TVV à digérer avec le NcoI et BamHI et on a purifié sur gel le fragment NcoI-BamHI de 170 pb. Ce fragment de gène synthétique comprend le site NcoI à l'extrémité 5'et le site BamHI à l'extrémité 3'. b. Ligation et isolement de pBM16/NDP/TW.
On a assemblé par ligation le fragment NcoI- BglII de 4,3 kb de pBMll/NDP/VGFa et le fragment BamHI- BglII de 1,2 kb de pBMllM5 ainsi que le fragment de gène synthétique TW NcoI-BamHI de 150 bp en utilisant de l'ADN ligase et on a utilisé le mélange résultant pour transformer des HB101 compétents. On a sélectionné les transformants sur néomycine et on les a triés par analyse de restriction et séquençage des nucléotides suivant le procédé Sanger-didésoxy. Le plasmide est noté pBM16 pour indiquer la perte du site de restriction NcoI dans le gène de résistance à la néomycine. gène N.
ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA M D A Q T R R R E R R A E K Q A Q W K **** ClaI
AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATC
A A N P L L V G V S A K P V R I D P Ncol TGF
CCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTT
M V V S H F N D C P D S H T Q F C F
<Desc/Clms Page number 81>
KpnI VGF + SphI TCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCGTTTGCTCT HGTCIHARDIDGYACVCS
EcoRI
CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT
H G Y T G I R C Q H V V L V D Y Q R
BamHI
TAAGGATCC
Ter C. L'EGF synthétique.
1. Préparation de pBMll/NDP/EGF.
Dans ce produit construit, le gène de l'EGF humain est exprimé comme partie d'un produit de fusion avec les 32 acides aminés N-terminaux du gène N qui se trouve à l'aval d'un site de coupure Asp-Pro. a. Préparation d'un fragment NcoI de 5 kb de pBMIl.
On a mis le plasmide pBMll/DP/VGFA à digérer avec Ncol et on a éliminé les S'-phosphates par traitement avec de la phosphatase alcaline intestinale de veau. On a purifié le fragment de plasmide de 5 kb sur un gel. Ce fragment comprend un surplomb NcoI au site de coupure Asp-Pro à l'aval des séquences codant pour les premiers 32 acides aminés du gène N. L'autre site NcoI se trouve dans le gène de résistance à la néomycine. b. Préparation d'un fragment NcoI-BamHI de 0,6 kb de pBMIl.
On a mis le plasmide pBMll/N/TTV à digérer avec NcoI et BamHI et on a purifié sur gel le fragment NcoI-BamHI de 0,6 kb du plasmide. Ce fragment comprend le surplomb NcoI dans le gène de résistance à la néomycine.
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c. Ligation et isolement de pBMIl/DP/EGF.
On a assemblé par ligation les trois jeux d'oligonucléotides de l'EGF renaturés avec un surplomb de Nicol à l'extrémité 5'et un surplomb BamHI à l'extrémité 3', le fragment NcoI de 5 kb de pBMIl et le fragment de NcoI-BamHI de 0, 6 kb de pBMll en utilisant de l'ADN ligase T4 et on a utilisé le mélange résultant pour transformer des E. coli HB101 compétents. On a sélectionné les transformants sur néomycine de façon que seules les colonies comprenant un gène de résistance à la néomycine correctement reconstruit puissent survivre. On a trié les transformants par analyse de restriction avec EcoRI et BamHI et par séquençage de l'ADN, de la façon décrite plus haut. gène N.
ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGCGTCAATGGA
EMI82.1
M D A Q T R R R E R R A E K Q A Q W K ** * AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATCC
A A N P L L V G V S A K P V R I D P EGFl + EcoRI EGF2 + CATGAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGACGGCTACTGCCTGCATGAC
M N S D S E C P L S H D G Y C L H D EGF3 + NsiI SphI GGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGACAAGTACGCATGCAACTGCGTTGTTG G V C M Y I E A L D K Y A C N C V V G GCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTA
Y I G E R C Q Y R D L K W W E L R *
<Desc/Clms Page number 83>
BamHI
AGGATCC EXEMPLE VI.Préparation du polypeptide intéressant à l'état de protéine de fusion avec une séquence de signalisation de phosphatase alcaline modifiée A. Préparation de pBM11/PAD/EGF.
On a conçu des oligonucléotides synthétiques pour permettre l'insertion d'un ADN codant pour un peptide de signalisation de phosphatase alcaline modifié et une région d'élément linker avec 3 sites de clonage (HindIII, SmaI et BamHI) dans le vecteur d'expression pBMIl à l'aval du promoteur PL et du site de fixation ribosomique du gène N. On a optimalisé la séquence nucléotidique pour qu'elle soit aussi semblable que possible à la séquence nucléotidique de l'extrémité amino du gène N de lambda, du fait que la séquence du gène N de lambda s'est dégagée avec la séquence de son site de fixation ribosomique pour une initiation et une traduction efficace du ribosome.
De plus, le deuxième acide aminé de la séquence de signalisation de la phosphatase alcaline, à savoir la lysine, qui est un acide aminé basique, se trouvait remplacé par l'acide aspartique, qui est un acide aminé acide.
1. Préparation du fragment EcoRI-BamHI de 0,17 kb de l'EGF.
EMI83.1
On a mis le plasmide pBM11/NDP/EGF (30 eg) à digérer avec 30 unités de EcoRI, puis on l'a traité au moyen de 4 unités du fragment Klenow de l'ADN polymérase pour obtenir des bouts francs. On a mis l'ADN à digérer complètement avec 30 unités de BamHI et on a recueilli le fragment de 0,17 kb du gène de 11EGF
<Desc/Clms Page number 84>
EMI84.1
% électrophor% ese sur ge après une électrophorèse sur gel d'agarose. L'ADN ainsi purifié comprend ainsi un site EcoRI rendu non collant à l'extrémité 5'et un surplomb BamHI à l'extrémité 3'. 2. Préparation d'un fragment PvuI-HindIII de 0,5 kb de pBMIl/PAD.
EMI84.2
On a mis le plasmide pBMIl/PAD (ISAg) à digérer avec 30 unités de HindIII et on l'a traité ensuite avec le fragment Klenow de l'ADN polymérase pour rendre les bouts non collants. On a ensuite mis l'ADN à digérer avec PvuI et on a recueilli le fragment PvuI-HindIII (franc) de 0,5 kb après une électrophorèse sur gel d'agarose.
3. Préparation du fragment PvuI-BamHI de 5,2 kb de pBMIl/PAD.
On a mis le plasmide pBMIl/PAD (18 g) à digérer avec 30 unités de PvuI, puis 30 unités de BamHI. On a recueilli le fragment de 5,3 kb après une électrophorèse sur gel d'agarose.
4. Ligation et isolement de pBM11/PAD/EGF.
On a assemblé par ligation le fragment EcoRI (franc)-BamHI de 0,17 kb, le fragment PvuI-HindIII (franc) de 0,5 kb et le fragment PvuI-BamHI de 5,2 kb, puis on a utilisé le mélange résultant pour transformer E. coli HB101 compétent. On a trié les transformants par séquençage de l'ADN, comme décrit ci-dessus.
La région désirée séquence de signalisation/EGF a la séquence suivante :
Séq. de signalisation ATGGATCAATCTACAATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACT
M D Q S T I A L A L L P L L F T
<Desc/Clms Page number 85>
EGF CCAGTGACAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGAC
P V T K A N S D S E C P L S H D
NsiI
GGCTACTGCCTGCATGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTG
G Y C L H D G V C M Y I E A L
SphI GACAAGTACGCATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGCGAACGT DKYACNCVVGYIGER
BamHI
TGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTAAGGATCC C Q Y R D L K W W E L R *
L'efficacité de la production de la protéine étrangère dans le système d'expression pBMll/PAD et la possibilité de purifier des protéines étrangères fonctionnellement actives à partir du produit de fusion ont été démontrées au moyen de pBMll/PAD/EGF comme
exemple. Après chromatographie d'exclusion dimensionnelle (TSK-250), on a recueilli 10,3 mg
EMI85.1
op d d'équivalents de polypeptide de fusion d'EGF actif à partir de 23 g (8 litres) de E. coli dé réprimé pour exprimer le gène de l'EGF. Pour 40%, l'activité de l'EGF provenait de l'EDF séparé par coupure de la séquence de signalisation.
B. Préparation de pBMll/PAD/nVGFa.
On a conçu des oligonucléotides synthétiques pour unir le gène synthétique VGFa avec une séquence de signalisation modifiée de phosphatase alcaline pour disposer d'un site de coupure de séquence de signalisation optimale en codant pour les résidus Nterminaux supplémentaires qui se trouvent immédiatement
<Desc/Clms Page number 86>
à l'aval du site de coupure de la séquence de signalisation dans le VGF naturel, noté domaine terminal extrême ci-dessus. La séquence nVGFa contient les séquences modifiées GTC et GYACRC au lieu des séquences GDC et GMYCRC du VGF naturel et se termine par la séquence YQR à l'amont de la séquence naturelle PNT. Dans ce système d'expression, pour la majorité des molécules, la séquence de signalisation reste attachée au nVGFa formant une protéine de fusion avec nVGFa à l'extrémité C.
1. Préparation de pBMIl/PAD digéré par HindIII-PvuI de 0,5 kb.
On a mis le plasmide pBMll/PAD à digérer avec HindIII et Pvul et on a purifié le fragment de 0,5 kb sur un gel. Le site HindIII est situé à l'extrémité C de la séquence de signalisation de phosphatase alcaline modifiée.
2. Préparation du fragment PvuI-BamHI de 5,2 kb du plasmide pBMll.
On a mis le plasmide pBMll/NDP/VGFa à digérer avec PvuI et BamHI et on a purifié le fragment de 5,2 kb du plasmide sur un gel.
3. Préparation du gène VGFa synthétique NcoI (franc)BamHI de 170 bp.
On a mis le plasmide pBMll/PAD/nVGFa à digérer avec NcoI et on a supprimé les surplombs en 5'par traitement avec de la nucléase SI. Ceci a créé une extrémité franche ou non collante au premier codon du gène synthétique tronqué de VGFa. On a mis l'ADN ensuite à digérer avec BamHI et on a purifié le fragment NcoI (franc)-BamHI de 170 bp sur un gel.
4. Ligation et isolement de pBMll/PAD/nVGFa.
On a assemblé par ligation les oligonucléotides VGF105 et 106, le fragment HindIIIPvuI de 0, 5 kb de pBMll/PAD, le fragment PvuI-BamHI de
<Desc/Clms Page number 87>
5,2 kb de pBMll et le gène synthétique VGFa NcoI (franc)-BamHI de 170 pb en utilisant de l'ADN ligase et on a utilisé le mélange résultant pour transformer des HB101 compétents. On a sélectionné les transformants sur néomycine et on les a triés par analyse de restriction et séquençage des nucléotides suivant le procédé Sanger-dodésoxy. On a isolé un produit construit correct contenant la séquence de signalisation de phosphatase alcaline modifiée en cadre avec le gene nVGFa.
Séq. de signe.
ATGGATCAATCTACAATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGA M D Q S T I A L A L L P L L F T P V T
VGFCAAAAGCTGACTCTGGTAACGCTATCGAAACTACTTCTCCGGAAATCACTAACGC
K A D S G N A I E T T S P E I T N A TACTACTGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGC
EMI87.1
T T D I P A I R L C G P E G D G Y C KpnI SphI CTGCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCCGTTGCT LHGTCIHARDIDGYACRCS
EcoRI CTCATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCG HGYTGIRCQHVVLVDYQR
BamHI TTAAGGATCC
Ter
<Desc/Clms Page number 88>
EXEMPLE VII.- Expression du polypeptide intéressant à l'état de protéine de fusion avec une séquence de signalisation de phosphatase alcaline.
A. Préparation de pBMll/PAK/nVGFa (séquence de signalisation de phosphatase alcaline/nVGFa avec extrémité N de VGF naturel et des séquences GTC et GYACRC.
On a soumis le plasmide pBMll/PAD/nVGF à la mutagénèse in vitro (Morinaga et al., Biotechnology (1984) 2 : 636-643) de façon à modifier les codons codant pour le deuxième acide aminé dans la séquence de signalisation, c'est-à-dire à retransformer le codon Asp (D) en le codon Lys (K), ce qui est le résidu qu'on trouve dans la séquence naturelle. Cette mutagénèse a introduit aussi un site PvuI dans la séquence de signalisation.
Séq. de sign.
ATGGATCAATCTACAATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCT M D Q S T I A L A L L P L L nVGFGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTGACTCTGGTAACGCTATCGAAACTAC' F T P V T K A D S G N A I E T T
TTCTCCGGAAATCACTAACGCTACTACTGACATCCCGGCTATCCG SPEITNATTDIPAIR
KpnI
TCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGCCTGCATGGT
L C G P E G D G Y C L H G
<Desc/Clms Page number 89>
SphI
ACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATG
T C I H A R D I D G Y A C
EcoRI
CCGTTGCTCTCATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGT R C 5 H G Y T G l R C Q H V V
BamHI
TCTGGTCGACTACCAGCGTTAAGGATCC
L V D Y Q R Ter B. Préparation de pBMIl/PAK/EGF.
Dans cette cassette d'expression, le gène de l'EGF est une partie d'un produit de fusion avec la séquence de signalisation de phosphatase alcaline.
On a soumis le plasmide pBMll/PAD/EGF à la mutagénèse in vitro de façon à modifier les codons codant pour le deuxième acide aminé dans la séquence de signalisation afin de modifier le codant Asp (D) en le codon pour Lys (K) qui est le résidu qu'on trouve dans la séquence naturelle. Cette mutagénèse a introduit aussi un site PvuI dans la séquence de séquence de signalisation.
<Desc/Clms Page number 90>
PvuI
EMI90.1
Séq. de sign.
ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGA M K Q S T I A L A L L P L L F T P V T EGFCAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGACGGCTACTGCCTGCA
K A N S D S E C P L S H D G Y C L H
NsiI SphI TGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGACAAGTACGCATGCAACTGCGTT
D G V C M Y I E A L D K Y A C N C V GTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGC V G Y I G E R C Q Y R D L K W W E L R
BamHI GTTAAGGATCC * C. Préparation de TacPak/EGF (séquence de signalisation de phosphatase alcaline/EGF humain).
1. Préparation des fragments de plasmide.
Le plasmide pl35-1 dérive du plasmide pDR540 (Pharmacia) et contient le SD du gène Cro et un site BglII à l'aval du SD lac. Le pDR540 est un vecteur d'expression contenant le promoteur hybride trp-lac. On a mis pl35-l à digérer avec BglII et BamHI et on l'a traité au moyen de phosphatase alcaline bactérienne.
On a mis le plasmide cBMll/PAK/EGF à digérer avec PvuII et BamHI et on a isolé le fragment d'environ 230 bp codant pour une partie de la séquence de signalisation de phosphatase alcaline et l'EGF humain.
<Desc/Clms Page number 91>
2. Préparation des oligonucléotides TacPakl et TacPak2.
On a développé les oligonucléotides synthétiques TacPakl et TacPak2 avec un surplomb compatible avec le site BglII de pl35-l et un surplomb PvuII compatible avec le site PvuII dans le fragment PvuII/BamHI de phosphatase alcaline/EGF. On a synthétisé les oligonucléotides dans un appareil pour la synthèse des oligonucléotides Applied Biosystems.
EMI91.1
BglII Pvul i TacPakl 5'GATCTATGAAACAATCTACGAT 3' TacPak2 3'ATACTTTGTTAGATGC 5' 3. Liqation et isolement du clone TacPak/EGF.
On a assemblé par ligation pl35-l digéré par BglII-BamHI, le fragment PAK/EGF de 230 pb et les oligonucléotides TacPakl et TacPak2 en utilisant de l'ADN ligase, puis on a transformé le produit dans des HB101 compétents et on a isolé un produit construit correct par séquençage de l'ADN.
(Site HindIII de pDR540)
EMI91.2
I AAGCTTACTCCC trp-35 (16pb) lac-10 CATCCCCCTG [TTGACA] ATTAATCATCGGCTCG (TATAATG) mRNA 5'Site fix. lacI lacSD TGTGG/AATTGTG AGCGGATAACAATTTCACAC (AGGA) AACAGGATCACTA
<Desc/Clms Page number 92>
PvuI croSD (llpb) BglII (AGGA) GGTTCAGATCT Séq.
de sign.- > ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGA MKQSTIALALLPLLFTPVT
EGF- > CAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGACGGCTACTGCCTGCA
K A N S D S E C P L S H D G Y C L H Nsil SphI TGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGACAAGTACGCATGCAACTGCGTT
D G V C M Y I E A L D K Y A C N C V GTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGC VGYIGERCQYRDLKWWELR
BamHI GTTAAGGATCC * EXEMPLE VIII.Expression d'un polypeptide intéressant à l'état de protéine de fusion avec la séquence de signalisation de phosphatase alcaline en utilisant une cassette d'expression contenant une région de terminaison de transcription.
EMI92.1
A. Préparation de pTCPt/EGF Ç trp-35 16 bpC lac-10 Ç'IacSD Jll bp CATG/séquence de signalisation de phosphatase alcaline/EGF humain/term. trans.-NEO).
Ce plasmide est conçu pour comporter les éléments du promoteur tac et utiliser le SD de cro aux
<Desc/Clms Page number 93>
fins d'exprimer l'EGF humain derrière la séquence de signalisation de phosphatase alcaline. Il comprend un fond de structure de pBR322 avec le gène de résistance à la néomycine.
1. Préparation du fragment HindIII (franc)-BamHI de 420 bp de TacPak/EGF.
On a mis TacPak/EGF à digérer avec HindIII, puis on l'a traité à l'aide du fragment Klenow de l'ADN polymérase pour créer des extrémités franches. On a mis l'ADN à digérer avec BamHI et par électrophorèse sur gel d'agarose, on a isolé le fragment de 420 bp contenant les éléments du promoteur tac et la région codant pour la séquence de signalisation de phosphatase alcaline et l'EGF humain.
2. Préparation du fragment EcoRI (franc)-BamHI de 2,8 kb de pBM16t/NDP/VGFa.
On a mis pBM16t/NDP/VGFa à digérer avec EcoRI, puis on l'a traité au moyen du fragment Klenow pour
EMI93.1
créer des extrémités franches. On a mis l'ADN ensuite à e digérer avec BamHI et on a isolé le fragment de 2,8 kb. Ce fragment d'ADN contient l'origine de pBR322, le gène de résistance à la néomycine dont le site NcoI a été supprimé et le terminateur de transcription analogue au gène 32 à l'aval du site BamHI.
3. Ligation et isolement de pTCPt/EGF.
On a assemblé par ligation le fragment EcoRI (franc)-BamHI de 2,8 kb de pBM16t/NDP/VGFa avec le fragment HindIII (franc)-BamHI de TacPak/EGF et on a utilisé l'ADN résultant pour transformer des cellules JM109 compétentes (lacIq). On a isolé un produit construit correct grâce à sa résistance à la néomycine et par séquençage de l'ADN.
<Desc/Clms Page number 94>
(Site HindIII de pDR540)
EMI94.1
I
AAGCTTACTCCC trp-35 (16pb) lac-10 CATCCCCCTG [TTGACA] ATTAATCATCGGCTCG (TATAATG) mRNA 5'Site fix. lac ! lacSD TGTGG/AATTGTG AGCGGATAACAATTTCACAC (AGGA) AACAGGATCACTA PvuI croSD (llpb) BglII Séq.
de sign.- > (AGGA) GGTTCAGATCT ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTCC
M K Q S T I A L A L L P
EGF- > CACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTC
L L F T P V T K A N S D S E C P L S Nsil TCATGACGGCTACTGCCTGCATGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGAC
H D G Y C L H D G V C M Y I E A L D
SphI AAGTACGCATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGC K Y A C N C V V G Y I G
BamHI GAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTAAGGATCCGTGA ERCQYRDLKWWELR *
Term. trans.
CTAATTGGGGACCCTAGAGGTCCCCTTTTTTATTTTAAAACGATC
<Desc/Clms Page number 95>
B. Préparation de pTCPt/NVGFa u : trp-35 J 16 bp
EMI95.1
Ç lac-lOÇlacSD croSD 11 bpATGJ/séquence de signalisation de phosphatase alcaline/VGFa N-terminal avec séquence GTC et GYACRC)/term. trans.-NEO).
Ce plasmide comprend les éléments du promoteur tac et utilise le SD de cro pour exprimer le gène VGF modifié avec l'extension N-terminale à l'aval de la séquence de signalisation de phosphatase alcaline. Ce plasmide comprend un fond de structure de pBR322 avec le gène de résistance à la néomycine.
1. Préparation du fragment PvuI-BamHI de 350 pb de pBMll/PAK/nVGFa.
On a mis le plasmide pBMll/PAK/nVGFa à digérer avec PvuI et BamHI et par électrophorèse sur gel, on a isolé le fragment de 350 bp. Ce fragment contient la majeure partie de la séquence de signalisation de phosphatase alcaline et le gène nVGFa.
2. Préparation du fragment PvuI-BamHI de 2,8 kb de pTCPt/EGF.
On a mis le plasmide pTCPt/EGF à digérer avec PvuI et BamHI et on a isolé le fragment de 2,8 kb par électrophorèse sur gel.
3. Ligation et isolement de pTCPt/nVGFa.
On a assemblé par ligation le fragment de 2,8 kb et le fragment de 350 bp en utilisant l'ADN ligase et on a utilisé l'ADN pour transformer des cellules JM109 compétentes (lacIq). Par analyse de restriction, on a isolé un produit construit correct.
<Desc/Clms Page number 96>
(Site HindIII de pDR540)
AAGCTTACTCCC trp-35 (16pb) lac-10 CATCCCCCTG [TTGACA] ATTAATCATCGGCTCG (TATAATG) mRNA 5'Site fix. lacI lacSD TGTGG/AATTGTG AGCGGATAACAATTTCACAC {AGGA} AACAGGATCACTA PvuI croSD (llpb) BglII Séq. de sign.- > {AGGA} GGTTCAGATCT ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTCCC M K Q S T I A L A L L P nVGF- > ACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTGACTCTGGTAACGCTATCGAAACTACT
L L F T P V T K A D S G N A I E T T TCTCCGGAAATCACTAACGCTACTACTGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCC S P E I T N A T T D I P A I R L C G P KpnI CGGAAGGCGACGGCTACTGCCTGCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGA EGDGYCLHGTCIHARDID
SphI EcoRI CGGCTACGCATGCCGTTGCTCTCATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTT
G Y A C R C S H G Y T G I R C Q H V
BamHI Term.
GTTCTGGTCGACTACCAGCGTTAAGGATCCGTGACTAATTGGGGACCCTAGAGGT
V L V D Y Q R * Trans.
CCCCTTTTTTATTTTAAAACGATC
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C. Préparation de pTNPt/EGF (Çtrp-35 J 17 pb 1
EMI97.1
lac-10 nSD 0 lac-10 3 nSD 8 pb r, ATG 2/séquence de signalisation de phosphatase alcaline/EGF humain/term. trans.-NEO).
Ce plasmide est conçu pour posséder les éléments du promoteur de tac et utiliser le SD du gène N pour exprimer l'EGF humain derrière la séquence de signalisation de phosphatase alcaline. Il comprend un fond de structure de pBR322 avec le gène de résistance à la néomycine.
1. Préparation du fragment PvuI-BamHI de 2, 8 kb de pTNPt.
On a mis le plasmide pTNPt à digérer avec PvuI et BamHI et par électrophorèse du gel, on a isolé le fragment de 2,8 kb.
2. Préparation du fragment PvuI-BamHI de 300 pb de pBMI1/PAK/EGF.
On a mis le plasmide pBM11/PAK/EGF à digérer avec PvuI et BamHI et on a isolé le fragment de 300 pb.
3. Liqation et isolement de pTNPt/EGF.
On a assemblé par ligation le fragment de 2,8 kb et le fragment de 300 pb en utilisant de l'ADN ligase et on a transformé l'ADN dans des JM109 (LacIq). On a isolé un produit construit correct par analyse de restriction et séquençage de l'ADN.
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(Site EcoRI de pBMll) 1 GAATTACTCCCCATCC SstI trp-35 (17pb) lac-10 5'lac CCCTG [TTGACA] ATTAATCATCGAGCTCG (TATAATG) TGTGG/AATTG
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BsmI mRNA- > n mRNA- > TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGCATTCAAAGCAGAAGGCTTTGGGGTGTGT GATACGAAACGAAGCATTGGCCGTAAGTGCGATTCCGGATTAGCTGCCAATGTGC CAATCGCGGGGGGTTTTCGTTCAGGACTACAACTGCCACACACCACCAAAGCTAA PvuI nSD (8pb) Séq.
de sign.- > CTGAC (AGGA) GAATCCAG ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTC
M K Q S T I A L A L L
EGF- > CCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGT P L L F T P V T K A N S D S E C P L S
NsiI CTCATGACGGCTACTGCCTGCATGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGA
H D G Y C L H D G V C M Y I E A L D
SphI CAAGTACGCATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGT
K Y A C N C V V G Y I G E R C Q Y R BamHI BamHI GACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTAAGGATCCGTGACTAATTGGGGA D L K W W E L R * (Site BamHI de pBMll) Term. trans. 1 CCCTAGAGGTCCCCTTTTTTATTTTAAAACGATCC
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EXEMPLE IX.Assemblage de gènes de facteurs de croissance pour l'expression dans des cellules eucaryotes.
A. Préparation du plasmide pRSV/VGF.
La transfection de ce plasmide dans des cellules d'ovaire de hamster de Chine a conduit à la production du VGF naturel.
(a) Préparation du fragment HindIII (franc)-BglII (franc) de pRSV.
On a mis le plasmide pRSV à digérer avec HindIII et BglII et on a purifié le fragment de 4 kb sur un gel. On a rendu franches les extrémités saillantes avec le fragment Klenow de l'ADN polymérase, puis on a éliminé les 5'-phosphates avec de la phosphatase alcaline intestinale de veau.
(b) Préparation d'un fragment DdeI contenant le gène VGF.
On a soumis un fragment génomique sous-clone de l'ADN de la vaccine à la digestion avec DdeI, on a rendu franches les extrémités saillantes avec le fragment Klenow et on a purifié sur gel un fragment DdeI de 550 pb.
(c) Ligation et isolement de pRSV/VGF.
On a assemblé par ligation le fragment HindIII (franc)-BglII (franc) de 4 bb de pRSV et le fragment DdeI (franc) de 550 pb de l'ADN de la vaccine au moyen d'ADN ligase, puis on a sélectionné les transformants sur ampicilline et on les a triés par analyse de restriction. On a isolé un produit de construction correct noté pRSV/VGF.
(d) Transfection de cellules CHO par pRSV/VGF.
On a cotransfecté le plasmide pRSV/VGF avec un plasmide pRSV par précipitation au phosphate de calcium dans des cellules d'ovaire de hamster de Chine (CHO).
On a trié les transfectants par hybridation Southern
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blot ponctuel et on a isolé un clone positif noté pRSV/VGF52.
B. Préparation du plasmide pAc/VGF.
Un système d'expression supplémentaire qui est utilisé pour la protéine recombinante du VGF est un système avec insecte. Voir Maeda et al. et Carbonell et al., ci-dessus. Dans un tel système, on utilise le virus de la polyhédrose nucléaire d'Autographa californica (AcNPV) comme vecteur pour exprimer des gènes étrangers. Le virus se multiplie dans des cellules de Spodoptera frugiperda. Le gène de l'enveloppe peut être cloné dans des régions non essentielles (par exemple, le gène polyhédrine) du virus et est mis sous le contrôle d'un promoteur d'AcNPV (par exemple le promoteur polyhédrine).
Une insertion efficace du produit construit du gène du VGF se traduit par l'inactivation du gène polyhédrine et par la production de virus recombinant non occlus (c'est-à-dire du virus auquel manque l'enveloppe protéique codée par le gène polyhédrine). Ce virus recombinant sert ensuite à infecter des cellules de Spodoptera frugiperda dans lesquelles le gène inséré est exprimé.
Le gène VGF intéressant est mis sous le contrôle d'un promoteur approprié pour un système à cellule d'insecte. Le plasmide pAc610 contient le gène polyhédrine cloné dans un plasmide vecteur possédant un marqueur de résistance à l'ampicilline. Dans ce gène sont insérés des segments polylinkers qui se trouvent à 50 bases à l'aval du site de début de la transcription du gène polyhédrine et 7 bases avant le premier codon ATG. Le gène VGF est clone dans un site de segment polylinker approprié, de façon qu'il se trouve sous le contrôle du promoteur polyhédrine. Le codon d'initiation ATG méthionine et les codons de fin de
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traduction sont ceux du gène du VGF ; les sites de début de transcription et les signaux de polyadénylation sont ceux du gène polyhédrine.
(a) Préparation de SmaI-BamHI pAc610.
On a mis le plasmide pAc610 à digérer avec SmaI et BamHI.
(b) Préparation du fragment HindIII (franc)-BglII du gène de VGF.
On a mis le plasmide pRSV/VGF à digérer avec HindIII et on a rendu franches les extrémités saillantes à l'aide du fragment Klenow. On a ensuite mis l'ADN à digérer avec BglII et on a purifié le fragment de 560 bp sur un gel.
(c) Ligation et isolement de pAc/VGF.
On a assemblé par ligation le fragment SmaIBamHI de pAc610 et le fragment de 560 pb de pRSV/VGF contenant le gène VGF au moyen d'ADN ligase et on a trié les transformants par analyse de restriction. On a isolé un produit construit correct noté pAc/VGF.
(d) Transfection de cellules Sf9 par pAc/VGF.
On a cotransfecté le plasmide pAc/VGF avec l'ADN de baculovirus de type sauvage AcNPV dans des cellules d'insecte Sf9 (Spodoptera frugiperda). On a trié les transfectants d'après l'occlusion du phénotype négatif dans des dosages sur gélose. On a isolé une plaque d'occlusion négative et après cinq tours succesifs de purification sur plaque, on a préparé un stock de virus recombinant de titre élevé.
C. Préparation de pAc/SFGF.
Expression du facteur de croissance du virus du fibrome de Shope naturel dans un baculovirus.
(a) Préparation de pAc610 digéré par BamHI.
On a mis le plasmide pAc610 à digérer avec BamHI et SmaI. Le site SmaI dans ce plasmide est situé à l'aval du promoteur du gène polyhédrine du
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baculovirus.
(b) Préparation d'un fragment HincII-Sau3a de 430 bp de l'ADN gnomique du virus du fibrome de Shope.
On a cloné le fragment BglII de 3,7 kb du fragment C BamHI de 19 kb de l'ADN gnomique du virus du fibrome de Shope dans un plasmide SP64 digéré par BamHI et on l'a noté SP64/3.7. On a mis le plasmide SP64/3.7 à digérer avec HincII et on a purifié sur un gel le fragment HincII de 1 kb. On a ensuite mis le fragment de 1 kb à digérer avec Sau3a et on a purifié sur un gel le fragment HincII-Sau3a de 430 pb.
(c) Ligation et isolement de pAc/SFGF.
On a assemblé par ligation pAc610 digéré par BamHI-SmaI et le fragment HincII-Sau3a de 430 pb contenant le gène du SFGF, puis on a transformé le mélange résultant dans des E. coli HB101 compétents. On a trié les transformants par analyse de restriction et on a isolé un produit construit correct noté pAc/SFGF.
EXEMPLE X.Préparation de polypeptides.
A. Synthèse en phase solide du VGF et du TGF.
1. Le fragment du VGF synthétique.
Suivant le protocole habituel, on a assemblé sur un appareil pour la synthèse des peptides Applied Biosystems Modèle 430A, la séquence correspondant au VGF tronqué, qui commence par la séquence DIPAIR et se termine par le séquence LVDY. Le traitement de la résine-peptide au stade final avec du HF liquide dans les conditions normales"faible-fort"a donné le peptide déprotégé brut. On a soumis le peptide à la chromatofocalisation sur PBE94 (Pharmacia). On a élue à pH 6,5 le peptide partiellement purifié. Un bref traitement par l'hydroxyde de sodium 0,2N a éliminé les radicaux protecteurs de la cystéine (éthylcarbamoyle) et on a oxydé le peptide en présence de glutathion
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oxydé et réduit.
La purification par filtration sur gel et la HPLC ont donné le VGF hautement purifié ayant la
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0 séquence suivante.
DIPAIRLCGPEGDGYCLHGDCIHARDIDGMYCRCSHGYTGIRCQHVVLVDY 2. Les rGF-1. humain et de rat synthétiques.
On a synthétisé chimiquement les TGF-OL humain et de rat essentiellement comme décrit ci-dessus à propos du VGF et on les a acquis aussi à Penninsula Labs.
B. Isolement de polypeptides recombinants préparés dans des cellules procaryotes.
1. Les facteurs de croissance produits des vecteurs à base pBM au moyen du promoteur PL et du répresseur CI de ts.
On a cultivé E. coli B (HB101) contenant les plasmides pBMll/NDP/facteur de croissance dans du bouillon de Luria à 30"C. On a mesuré la densité de la culture à 550 nm et au moment où la densité a atteint une absorbance de 0,7 à 0,9, on a induit la synthèse de la protéine de fusion du facteur de croissance en élevant la température jusqu'à 42 C. On a incubé la culture à cette température pendant 5 à 20 heures, puis on a isolé les bactéries par centrifugation et on les a congelées à -70OC jusqu'à leur utilisation.
Pour l'isolement de la protéine recombinante, on a décongelé les cellules dans un tampon contenant du NaH2PO4 0,05 M de pH 7,2, du NaCl 0,5 M et de l'EDTA 0,01 M. On a utilisé 150 ml de tampon pour une préparation à partir de 50 g de bactéries. On a rompu les cellules par exposition aux ultrasons sur glace pendant 15 minutes avec une sonde de 6,4 mm à 50% d'impulsions et une puissance de 60 W. Après la rupture des cellules, on a recueilli les protéines insolubles
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par centrifugation à 12.000 tours par minute dans un rotor GSA pendant 90 minutes. On a ensuite remis le culot contenant les protéines insolubles en suspension dans 50 ml de chlorhydrate de guanidine 6 M. On a recueilli la fraction insoluble par centrifugation pendant 2 heures à 25.000 tours par minute dans un rotor d'ultracentrifugation type 30 de Beckman.
On a recueilli le liquide surnageant et on l'a conservé à- 20 C jusqu'à son utilisation.
On a exécuté la purification de la protéine de fusion sur une colonne de Sephacryl S300 ou de Fractogel HW-55 amenée à l'équilibre avec du chlorhydrate de guanidine 1 M. On a identifié les fractions contenant la protéine de fusion comme étant celles contenant un polypeptide d'un poids moléculaire compatible avec le poids moléculaire du polypeptide codé par le gène synthétique, comme déterminé sur un gel à 15% de polyacrylamide-urée.
Pour obtenir une forme active du facteur de croissance recombinant, on a laissé la protéine de fusion se replier en l'incubant dans du tampon au TrisHCl 50 mM de pH 8,7 contenant du chlorhydrate de guanidine 1 M, du glutathion réduit 1,25 mM et du glutathion oxydé 0,25 mM à 40C pendant 3 à 10 jours. On a surveillé l'activité biologique du facteur de croissance par un dosage de la fixation compétitive sur le récepteur, comme il est décrit ci-dessus (voir exemple I. C). Lorsqu'une activité maximale a été atteinte, on a dialysé la protéine contre de l'eau distillée et on l'a lyophilisée jusqu'à siccité.
Lorsqu'il était souhaitable d'éliminer la séquence signal, on a coupé la protéine soit en la remettant en suspension dans de l'acide formique à 70% et en l'incubant à 400C pendant 3 jours, soit en l'incubant jusqu'au lendemain jusqu'à la température
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ambiante dans un excès molaire de 100 fois de bromure de cyanogène. On a dialysé le produit de coupure contre de l'eau distillée et on l'a lyophilisé jusqu'à siccité.
Pour purifier davantage le facteur de croissance recombinant, on a remis celui-ci en suspension dans de l'acétonitrile à 40% avec 0,1% d'acide trifluoroacétique et on l'a purifié par HPLC sur une colonne TSK-250 BioRad. On a rassemblé les fractions contenant le facteur de croissance qu'on a purifié davantage par HPLC avec inversion de phase soit sur jBondapak C-18 Waters, soit sur Dynamax C-8 Rainin. L'éluant formait un gradient linéaire de 20 à 40% d'acétonitrile contenant 0, 1% d'acide trifluoroacétique. On a rassemblé les fractions contenant de l'activité de fixation sur le récepteur, puis on les a lyophilisées et conservées à-20 C jusqu'à leur utilisation.
(a) Le TGF et le TGF modifié.
(i) N/TGF.
Au moyen du plasmide pBM11/N/TGF, on a produit du TGF humain modifié recombinant contenant 33 acides aminés du gène N à l'extrémité N et la séquence QEEK modifiée au lieu de la séquence humaine naturelle QEDK.
(b) Le VGF modifié et tronqué.
(i) PAD/nVGFa.
Au moyen du plasmide pBM11/PAD/nVGFa contenant la séquence N-terminale extrême du VGF et les séquences modifiées GTC et GYACRC au lieu des séquences du VGF naturel GDC et GMYCRC, on a produit du VGF modifié recombinant. On a exprimé le fragment nVGFA à l'état de protéine de fusion avec une séquence de signalisation de phosphatase alcaline modifiée à l'extrémité N et on l'a tronqué à la séquence YQR à l'extrémité C.
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(ii) NDP/VGFa.
On a produit au moyen du plasmide
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pBMll/NDP/VGFa du VGF modifié recombinant commençant à e a la séquence DIPAIR et se terminant à la séquence YKQR dans le VGF. Il comprend les séquences modifiées GTC et GYACRC au lieu des séquences naturelles GDC et GMYCRC du VGF. On a exprimé le fragment VGFa à l'état de protéine de fusion avec 32 acides aminés du gène N à l'extrémité N et le dipeptide acide aspartique-proline labile en milieu acide.
(iii) VGFa.
On a préparé le fragment du VGF, comme décrit en 2. b ci-dessus, et après en avoir séparé la protéine de fusion par coupure par un traitement acide, on l'a purifié davantage par HPLC.
(iv) NDP/VGFA.
Au moyen du plasmide pBMll/NDP/VGFA, on a produit du VGF modifié recombinant commençant à la séquence DIPAIR et se terminant à la séquence YKQR dans le VGF et comprenant les séquences GTC et GYACVC modifiés au lieu des séquences GDC et GMYCRC naturels du VGF. On a exprimé le fragment VGFA à l'état de protéine de fusion avec 32 acides aminés du gène N à l'extrémité N et le dipeptide acide aspartique-proline labile en milieu acide.
(c) Les hybrides TGF/VGF chimères.
(i) N/TTV (TGF/TGF/VGF).
Au moyen de pBMll/N/TTV, on a produit du TTV modifié recombinant contenant la séquence d'acides aminés du TGF humain dans les deux tiers aminoterminaux du gène avec l'exception de la séquence QEEK qui se trouvait modifiée par rapport à la séquence QEDK humaine naturelle. L'extrémité carboxyle provenait de la séquence d'acides aminés du VGF et se terminait par la séquence YQR à l'amont de la séquence naturelle PNT.
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On a exprimé le fragment du TTV à l'état de protéine de fusion avec 33 acides aminés du gène N à l'extrémité N.
(ii) NDP/TTV.
Au moyen du plasmide PBM11/N/TTV, on a produit du TTV recombinant modifié comme décrit en (a), sauf que le fragment TTV était exprimé à l'état de protéine de fusion avec 32 acides aminés du gène N à l'extrémité N et le dipeptide acide aspartique-proline labile en milieu acide.
(iii) NDP/VTV.
Au moyen du plasmide pBMll/NDP/VTV, on a produit du VTV modifié recombinant contenant la séquence d'acides aminés du TGF humain dans le domaine médian avec la séquence d'acides aminés QEEK remplaçant la séquence naturelle QEDK. Le domaine N-terminal et le domaine C-terminal provenaient de la séquence du VGF tronqué, en commençant par la séquence DIPAIR et en se terminant par la séquence YQR. On a exprimé le fragment VTV à l'état de protéine de fusion avec 32 acides aminés du gène N à l'extrémité N et le dipeptide acide aspartique-proline labile en milieu acide.
(iv) NDP/TVV.
Au moyen du plasmide pBMIl/NDP/TW, on a produit du VTV modifié recombinant contenant la séquence d'acides aminés du TGF humain dans le domaine N-terminal du gène. Le domaine médian et le domaine Cterminal provenaient de la séquence du VGF tronqué, se terminant avec la séquence YQR. De plus, le gène synthétique comprend la modification GYACVC au lieu de GMYCRC. On a exprimé le fragment TW à l'état de protéine de fusion avec 32 acides aminés du gène N à l'extrémité N et le dipeptide acide aspartique-proline labile en milieu acide.
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*2. Les facteurs de croissance produits dans des vecteurs comprenant les promoteurs tac ou lac.
On a cultivé des hôtes bactériens contenant des cassettes d'expression qui comprennent des promoteurs tac ou lac de 30 à 370C jusqu'à une densité optique A600 de 0,2 à 0,8 dans du bouillon LB ou dans un milieu chimiquement défini, comme du milieu M9 additionné de thiamine et de glucose. On a ajouté un antibiotique approprié au milieu de croissance pour sélectionner les hôtes contenant la cassette d'expression. On a induit les cultures bactériennes avec une concentration de 100 à 1000 mM en IPTG et on a effectué la culture à 30 C pendant 16 à 24 heures. Pour les cassettes d'expression exemptes du gène lacI, les hôtes bactériens portaient un facteur F avec le gène lacqI, comme JM109, XL1, JM103, etc.
Pour les cassettes d'expression portant le gène lacI, des exemples d'hôtes bactériens sont HB101, DH1, DH5, etc. Dans le cas où l'hôte bactérien comprend un opéron lac fonctionnel (lac+), la cassette d'expression peut être induite par 1% de lactose. Après l'induction, on peut isoler les facteurs de croissance, soit du milieu, soit des cellules rassemblées par centrifugation.
(a) PAK/EGF.
L'EGF humain produit par les cassettes d'expression TacPal/EGF et pTcCPt/EGF a été isolé du milieu sous une forme active débarrassée de la séquence de signalisation de phosphatase alcaline. On a retrouvé environ 85% de l'EGF actif dans le milieu, le reste étant associé au culot de cellules. Ces cassettes d'expression ont produit 4 mg d'EGF actif par litre. On a séparé les cellules du milieu par centrifugation, puis on a fait passer le milieu à travers un filtre spiralé Amicon SY30, opérant une coupure pour un Mr de 30.000, et ensuite dans une colonne de Q-Sepharose,
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après quoi on a élué l'EGF humain purifié dans du NaH2PO4 20 mM de pH 7 avec un gradient de NaCl de 0 jusqu'à 0, 5 M.
En variante, on peut isoler les facteurs de croissance du culot de cellules par choc osmotique ou exposition aux ultrasons, puis le purifier sensiblement de la façon décrite ci-dessus.
(b) PAK/nVGFa.
Au moyen de la cassette d'expression pTCPt/nVGFa, on a produit du nVGFa recombinant. Par exposition aux ultrasons, on a isolé du culot des cellules le nNGFa qui s'est révélé constituer à peu près 40% de la protéine bactérienne totale.
C. Isolement du VGF et du SFGF produits par expression des gènes naturels dans des eucaryotes.
1. Préparation du VGF dans des cellules rénales de singe.
On a produit du VGF naturel par infection de cellules rénales de singe au moyen du virus de la vaccine. On a infecté des monocouches de cellules
EMI109.1
rénales de cercopithèque (BSC-1) avec 15 unités formant plage (pfu) par cellule de W purifié (souche WR cultivée dans des cellules Hela et purifiée par sédimentation sur gradient de densité de saccharose (Moss, B., (1981) dans Gene Amplification and Analysis, éditeurs Chirickjian, J. G. et Papis, T. S.
(Elsevier/North-Holland, NY), volume 2, pages 253- 266)). On a incubé les cellules infectées à 37 GC avec environ 1 ml de milieu de base d'Eagle additionné de 2% de sérum foetal de veau pour 2X106 cellules. On a traité de manière identique des cellules infectées factices. On a clarifié les surnageants des cultures de cellules par centrifugation à faible vitess et on les a lyophilisés. On a ensuite remis le résidu en suspension dans de l'acide acétique IN et on l'a dialysé abondamment contre de l'acide acétique 0,2M. On a
<Desc/Clms Page number 110>
EMI110.1
1 0 séparé l'insoluble par centrifugation et on a lyophilisé le surnageant, puis on l'a remis en suspension dans le centième de son volume initial d'acide acétique 1M et on l'a stocké à 4OC.
2. Préparation du VGF dans des cellules CHO.
On a produit du VGF naturel aussi par transfection du plasmide pRSV/VGF contenant le fragment de gène VGF dans des cellules d'ovaire de hamster de Chine. On a fait se multiplier les cellules transfectées et on a recherché le VGF dans le milieu et le culot de cellules par immunoprécipitation au moyen d'un antisérum contre le peptide N-terminal du VGF.
3. Préparation du VGF dans le ver à soie avec un promoteur de baculovirus.
(a) Transformation.
La cellule hôte pour AcNPV est Spodoptera frugiperda (sf9). Pour produire un stock de virus recombinant, on mélange le plasmide contenant VGF avec de l'ADN d'AcNPV et on opère la transfection dans des cellules sf9 suivant la technique au phosphate de calcium. On isole les virus recombinant du milieu et on les purifie sur plaque avec des cellules sf9. On identifie les plaques recombinantes par hybridation en prenant de l'ADN radiomarqué du VGF comme sonde.
(b) Expression.
Après avoir identifié le virus recombinant, on l'a multiplié sur des cellules sf9. On a utilisé ensuite le stock de virus recombinant pour infecter des cellules sf, puis on a lysé les cellules et recherché dans les surnageants la protéine VGF produite qu'on a purifiée comme décrit ci-dessus à propos des cellules de mammifères infectées par le virus de la vaccine.
La séquence prévue du VGF produit dans des cellules de l'insecte est la suivante :
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DSGNAIETTSPEITNATTDIPAIRLCGP
EGDGYCLHGDCIHARDIDGMYCRCSHGYTGIR
CQHVVLMYQRSENPNTTTSYIPSPGIMLVLVGI
IIITCCLLSVYRFTRRTKLPIQDMVVP Un site de glycosylation possible apparaît à l'asparagine à la position 15 depuis l'extrémité Nterminale du polypeptide.
Cette séquence de 121 résidus débute par la séquence N-terminale qui a été déterminée directement pour le VGF purifié provenant de cellules de singe infectées par VV (c'est-à-dire au résidu 20 du cadre de lecture ouvert du VGF) et se poursuit jusqu'au dernier résidu du cadre de lecture ouvert. Cette séquence est donc exempte du peptide signal (résidus 1 à 19 du cadre de lecture ouvert), mais comprend la séquence transmembranaire (YIPSPGIMLVLVGIIIITCCLLSVY).
Le poids moléculaire prévu du peptide de 121 résidus est de 13.304, sans compter les hydrates de carbone. Le poids moléculaire apparent du VGF produit par le baculovirus est de 17.000, et donc sensiblement plus faible que celui auquel mènent les cellules infectées par VV, ce qui indique que les deux formes ont probablement été traitées différemment. Le VGF produit par le baculovirus peut être exempt d'une fraction supplémentaire de la séquence N-terminale, ou d'une partie de la séquence C-terminale, ou des deux, et/ou pourrait différer par le type et l'ampleur de la glycosylation.
4. Préparation du SFGF dans le ver à soie au moyen d'un promoteur de baculovirus.
(a) Transfection de cellules Sf9 par pAc/SFGF.
On a cotransfecté le plasmide pAc/SFGF avec de l'ADN de baculovirus de type sauvage AcNPV dans des cellules d'insecte Sf9 (Spodoptera frugiperda). On a trié les transfectants après l'occlusion du phénotype
<Desc/Clms Page number 112>
négatif dans des dosages sur gélose. On a isolé une plaque à occlusion négative et après cinq tours successifs de purification sur plaque, on a préparé un stock de virus recombinant de haut titre. Le virus recombinant s'est révélé à l'analyse Southern contenir le gène SFGF.
D. EGF naturel.
1. On a isolé l'EGF naturel des glandes salivaires de la souris ou bien on l'a acquis chez Collaborative Research.
EXEMPLE XI.- Epreuves d'activité.
A. Epreuve mitogène.
On a exécuté les épreuves de mitogénèse de la façon suivante : on a repiqué des fibroblastes humains diploides provenant d'explants du prépuce de nouveau-né à une densité de 3xl04 cellules par cupule (plaques à 96 cupules, Nunclon, Roskilde, Danemark) et on les a cultivés jusqu'à confluence dans du milieu d'Eagle modifié suivant Dulbecco (GIBCO)/10% de sérum de veau nouveau-né. On a introduit les cultures ensuite dans un milieu contenant 0, 2% de sérum de veau nouveau-né et deux jours plus tard, on a ajouté l'EGF (10 ng par ml) ou le facteur de croissance à essayer (10 ng d'équivalents d'EGF par ml).
Après 8 heures, on a marqué les cultures avec de la 5-C 125 ] iodo-2'-désoxy-
EMI112.1
i uridine (Amersham, 10 $Ci par ml, 5 Ci par mg ; 1 Ci = 37 GBq) et on a déterminé la quantité de l'isotope incorporé dans la fraction insoluble dans l'acide trichloroacétique, comme décrit par ailleurs (Twardzik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 182 : 5300-5304).
B. Epreuve de stimulation de la croissance de colonies sur gélose molle.
On a introduit 0,5 ml de couche de base de
<Desc/Clms Page number 113>
gélose à 0,5% (Agar Noble ; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) dans du milieu de croissance dans des plaques pour culture de tissu Costar à 24 cupules. On a appliqué par-dessus la couche de base de gélose 0,5 ml de gélose à 0,3% dans du milieu de croissance contenant 1 à 1, 5x104 cellules par ml de cellules NRK ou d'une autre lignée cellulaire intéressante, outre diverses concentrations du facteur à examiner. On a incubé les plaques à 370C en atmosphère humide à 5% de C02 dans de l'air et on les a réalimentées après 7 jours par addition de 0,5 ml de gélose à 0,3% dans du milieu de croissance contenant les mêmes concentrations en le facteur de croissance à examiner. On a dénombré les colonies non fixées et non colorées.
On a noté le nombre des colonies comptant plus de 6 cellules.
C. Epreuve d'inhibition de la fixation sur le récepteur de l'EGF.
On a exécuté les dosages du récepteur radiomarqué de la façon suivante : on a modifié la fixation de l'EGF marqué au l25I (125I-EGF) sur son récepteur sur des monocouches de cellules A431 par rapport au mode opératoire décrit par Cohen et Carpenter, Proc. Natl. Acad. Soi. USA (1975) 72 : 1317- 1321. On a fixé les cellules (lx103 par cupule) sur des plaques à 24 cupules (Linbro, Flow Laboratories) avec du formaldéhyde à 10% dans de la solution physiologique tamponnée au phosphate avant l'épreuve. Les cellules fixées au formol ne se détachent pas des plaques aussi aisément que les cellules non fixées et les valeurs mesurées à plusieurs reprises sont ainsi plus reproductibles.
Dans ces conditions opératoires, le 125I-EGF (lux1010 coups par minute par nanomole) sature
EMI113.1
0 l'épreuve de fixation à 3 nM ; les épreuves ont été exécutées à 10% de la valeur de saturation. Les concentrations du facteur de croissance sont exprimées
<Desc/Clms Page number 114>
en nanogrammes d'équivalents d'EGF par ml, c'est-à-dire par la quantité requise pour produire une inhibition de la fixation du 125I-EGF qui est équivalente à celle produite par une quantité connue d'EGF.
D. Radio-immunodosage.
Chaque aliquote de 50 pitres de milieu de réaction contient : du phosphate de sodium 20 mM de
EMI114.1
pH 7, 4, du NaCl 200 mM, du dithiothréitol 40 mM, 0, 1% d'albumine de sérum de boeuf, 0, 1% de Nana, du peptide marqué au l25I (2xi 04 coups par minute) correspondant aux 17 résidus carboxy-terminaux de 1' < TGF (Linsley et al., Proc. Natl. Acad. Soi. USA (1985) 82 : 356-369) ; de l'antisérum à une dilution finale de 1 : 5000 et les autres additions spécifiées. On a amorcé la réaction par addition d'antisérum et on a poursuivi l'opération à 230C pendant 90 minutes.
On a ajouté ensuite un volume égal de S. aureus fixé par le formol à 10% (Pansorbin, Calbiochem), puis on a poursuivi l'incubation pendant encore 30 minutes à 23"C. On a séparé l'immunoadsorbant par sédimentation, puis on a mesuré la quantité de peptide fixé marqué au 125I. La quantité de peptide fixé, corrigée pour la fixation non spécifique mesurée en l'absence d'anticorps (moinsde 5% du total), est exprimée en pourcentage de la fixation maximale.
E. Cicatrisation des plaies.
1. Lésion thermique dans la couche moyenne du derme.
On a provoqué des lésions thermiques dans la couche moyenne du derme sur la partie dorsale du thorax de truies de race Yorkshire anesthésiées (15 kg) dont on avait rasé le dos et éliminé le poil avec une crème épilatoire commercialisée. On a amené un bloc de laiton (3 cm x 3 cm, 147 g) à l'équilibre dans un bain-marie à 700C et on l'a posé en contact ferme avec la peau pendant exactement 10 secondes. On a ôté ensuite
<Desc/Clms Page number 115>
l'ampoule résultante. On a réalisé cinq brûlures dans l'épaisseur moyenne du derme de chaque côté de la colonne vertébrale, à une distance d'environ 25 m l'une de l'autre. On a soigné les brûlures deux fois par jour avec environ 3 ml d'un excipient crémeux (Silvadene R), soit tel quel, soit additionné d'un facteur de croissance, tandis qu'on a laissé d'autres sans traitement.
Après 9 ou 10 jours de traitement avec du VGF naturel, on a anesthésié les truies et détaché l'escarre des brûlures. On a prélevé des biopsies à chaque brûlure dans les régions ou l'épithélium s'était reformé.
2. Lésion par greffe donneuse dans la couche moyenne du derme.
Au moyen de 20 mg par kg de kétamine et de 2 mg par kg de Rompum, on a anesthésié des porcs nains
EMI115.1
âgés de 5 moins d'un poids de 20, 5 kg. Après avoir rasé le thorax dans la partie dorsale, on l'a badigeonné à la bétadine et rincé soigneusement avec de la solution physiologique salée. On a réalisé une série de 6 sites donneurs de 5 cm x 5 cm sur chaque flanc de la partie dorsale du thorax au moyen d'un dermatome Padgett à 1, 52 mm en prenant deux passes à 0,76 mm. On a fait le traitement topique avec 1 ml de solution physiologique salée dans 20 g de Silvadene en répartition uniforme entre les six plaies sur le flanc gauche. On a traité le côté droit avec 1 ml du facteur de croissance à examiner dans 20 g de Silvadene en répartition uniforme parmi les six plaies. On a recouvert chaque plaie d'un grand pansement pour brûlure.
On a anesthésié l'animal, comme décrit ci-dessus, aux jours 1, 2,3, 4,7, 8,9, 10 et 11 après l'intervention. On a détaché les pansements. On a ensuite badigeonné les plaies prudemment à la bétadine et on les a rincées soigneusement avec de la solution physiologique salée.
<Desc/Clms Page number 116>
On a appliqué l'agent approprié et on a recouvert les plaies à nouveau, comme décrit précédemment.
EXEMPLE XI.
Activité biologique des facteurs de croissance recombinants préparés dans des cellules procaryotes.
A. Fixation sur le récepteur de l'EGF.
La présente épreuve permet de déterminer l'aptitude d'une molécule à se fixer sur le récepteur de l'EGF en mesurant son aptitude à empêcher l'EGF luimême de se fixer sur ce récepteur. Tous les facteurs de croissance et facteurs de croissance hybrides, modifiés ou tronqués, isolés à ce jour se sont révélés actifs dans l'épreuve d'inhibition de la fixation sur le récepteur de l'EGF. Un résumé des résultats est donné ci-après.
TABLEAU
Fixation des facteurs de croissance recombinants sur le récepteur de l'EGF.
EMI116.1
<tb>
<tb>
Peptide <SEP> Cassette <SEP> Pureté <SEP> Fixation
<tb> d'expression <SEP> sur <SEP> le
<tb> récepteur
<tb> de <SEP> l'EGF
<tb> N/TGF-protéine
<tb> de <SEP> fusion <SEP> tronquée
<tb> modifiée <SEP> pBMIl/N/TGF <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb> PAD/nVGFa-protéine
<tb> de <SEP> fusion <SEP> tronquée
<tb> modifiée <SEP> pBMll/PAD/nVGFa <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb> NDP/VGFa-protéine
<tb> de <SEP> fusion <SEP> tronquée
<tb> modifiée <SEP> pBMll/NDP/VGFa <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb> NDP/VGFA-protéine
<tb> de <SEP> fusion <SEP> tronquée
<tb> modifiée <SEP> pBMll/NDP/VGFA <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb>
<Desc/Clms Page number 117>
EMI117.1
<tb>
<tb> N/TTV-protéine
<tb> de <SEP> fusion <SEP> hybride
<tb> tronquée <SEP> modifiée <SEP> pBMll/N/TTV <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb> NDP/TTV-protéine
<tb> de <SEP> fusion <SEP> hybride
<tb> tronquée <SEP> modifiée <SEP> pBMll/NDP/TTV <SEP> 95%
<SEP> Oui
<tb> NDP/VTV-protéine
<tb> de <SEP> fusion <SEP> hybride
<tb> tronquée <SEP> modifiée <SEP> pBMll/NDP/VTV <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb> NDP/TVV-protéine
<tb> de <SEP> fusion <SEP> hybride
<tb> tronquée <SEP> modifiée <SEP> pBMIl/NDP/TVV <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb> PAK/EGF <SEP> pBMll/PAK/EGF <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb> EGF <SEP> pBMll/PAK/EGF <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb> PAD/EGF <SEP> pBMIl/PAD/EGF <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb> EGF <SEP> pBMll/PAD/EGF <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb> PAK/EGF <SEP> TacPak/EGF <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb> EGF <SEP> TacPak/EGF <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb> PAK/EGF <SEP> pTCPt/EGF <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb> EGF <SEP> pTCPt/EGF <SEP> 95% <SEP> Oui
<tb>
Une comparaison des courbes d'inhibition de la fixation pour l'EGF naturel de la souris et le facteur de croissance N/TTV hybride recombinant exprimé dans une bactérie (polypeptide de fusion des 32
acides aminés N-terminaux du gène N de lambda et du TGF/VGF hybride tronqué modifié) suggère qu'il n'y a pas de différence dans l'activité de fixation.
B. Activité mitogêne.
On a déterminé l'activité de divers facteurs de croissance purifiés, qui s'est révélée dans tous les cas comparable à celle de l'EGF. Les composés envisagés sont indiqués ci-après.
<Desc/Clms Page number 118>
TABLEAU Activité mitogène des facteurs de croissance
EMI118.1
<tb>
<tb> Peptide <SEP> Activité <SEP> mitogène*
<tb> TTV-hybride <SEP> tronqué <SEP> modifié <SEP> Oui
<tb> N/TTV-protéine <SEP> de <SEP> fusion <SEP> hybride
<tb> tronquée <SEP> modifiée <SEP> Oui
<tb>
* Mesurée par incorporation de 3H-thymidine ou de 125IIdu.
C. Cicatrisation des plaies.
1. Lésion dans la couche moyenne du derme.
On a évalué, comme décrit dans l'exemple VEl, l'effet du TGF, de l'EGF et du VGF naturel ou synthétique, ainsi que celui des facteurs de croissance recombinants sur les lésions de la couche moyenne du derme. Par télémétrie assistée par ordinateur, on a mesuré en pour-cent la fraction cicatrisée de l'étendue initiale de la brûlure et on a déterminé le pourcentage de reconstitution de l'épithélium sur la brûlure. La reconstitution de l'épithélium s'élevait à environ 15% pour les brûlures non traitées. Un traitement avec du Silvadene seul ou avec du Silvadene additionné de l'EGF a conduit à une reconstitution d'environ 50% de l'épithélium, tandis que le traitement avec du TGF synthétique ou du VGF naturel a conduit à une reconstitution d'environ 90% de l'épithélium.
La concentration la plus favorable pour la reconstitution de l'épithélium est de 1-10 M, g par ml pour l'EGF, mais le TGF synthétique et le VGF naturel donnent une réponse maximale à 0, 1 kg par ml.
On a exécuté des expériences semblables à celles décrites ci-dessus pour évaluer l'effet cicatrisant du TGF, d'une forme tronquée modifiée du VGF (VGFa), ou d'une forme de fusion hybride tronquée
<Desc/Clms Page number 119>
modifiée du TGF et du VGF (TTV) s'obtenant toutes par technologie de recombinaison dans les bactéries. Ces facteurs de croissance recombinants et facteurs de croissance hybrides ont accéléré la cicatrisation des plaies dans la même mesure que le TGF synthétique ou que le VGF naturel, avec une concentration optimale à 0, 1 g par ml.
2. Lésion par greffe donneuse dans la couche moyenne du derme.
On a évalué l'aptitude du VGFa modifié tronqué
EMI119.1
à accélérer la cicatrisation d'une plaie dans un modèle a acce e e avec greffe donneuse. Ce mode de traitement est celui indiqué ci-dessus (voir exemple I) avec 1 ml de VGFa, à
EMI119.2
5 e 5 1R par ml, dans 20 g de Silvadene. On a photographié les plaies quotidiennement. Le résumé des résultats est le suivant.
<Desc/Clms Page number 120>
TABLEAU Effet du VGFa recombinant sur la cicatrisation des plaies.
EMI120.1
<tb>
<tb>
Etat <SEP> de <SEP> la <SEP> plaie
<tb> Traitement* <SEP> JAI** <SEP> 7 <SEP> JAI <SEP> 8 <SEP> JAI <SEP> 9 <SEP> JAI <SEP> 10
<tb> Solution <SEP> Très <SEP> Ouverte <SEP> Presque <SEP> Cicaphysiologique <SEP> ouverte <SEP> avec <SEP> cica-trisée
<tb> salée <SEP> quelques <SEP> trisée
<tb> cicatrisations
<tb> VGF <SEP> a <SEP> - <SEP> Ouverte <SEP> ; <SEP> Presque <SEP> Cica-Cicatronqué <SEP> formation <SEP> cica-trisée <SEP> trisée
<tb> modifié <SEP> apparente <SEP> trisée
<tb> d'épithélium
<tb>
* L'excipient est le Silvadene.
** JAI = Jour après l'intervention.
Le VGFa tronqué modifié accélère la cicatrisation des plaies, par comparaison avec l'excipient témoin. Les photographies (non jointes) au Sème jour après l'intervention révèlent des différences sensibles entre la solution physiologique salée et le VGFa.
EXEMPLE XXIII.Activité biologique du VGF préparé dans des cellules eucaryotes.
A. Le VGF préparé dans des cellules rénales de singe (BSC-1).
1. On a recherché dans le milieu provenant des cellules BSC-1, 24 heures après l'infection par W, la présence d'une matière qui pourrait entrer en compétition avec le 125I-EGF pour la fixation sur les cellules du carcinome épidermolde humain riche en récepteurs de l'EGF (A431). Les cellules infectées par W dégagent une activité puissante entrant en compétition avec l'EGF, laquelle activité est dite VGF.
<Desc/Clms Page number 121>
Le milieu témoin provenant de cultures témoins de cellules BSC-1 infectées factices a une activité minime dans la compétition avec l'EGF.
La surveillance de la production du VGF au moment le plus précoce envisagé, à savoir deux heures après l'infection, a révélé des taux accrus de VGF dans le milieu de culture. A 12 heures, des quantités maximales de cette activité ont été observées dans le liquide surnageant de la culture, l'augmentation n'étant que faible après 24 heures.
Le taux de production du VGF s'est révélé être une fonction de la multiplicité de l'infection virale, comme il ressort du tableau suivant.
TABLEAU
Effet de la multiplicité de l'infection sur le dégagement du VGF.
EMI121.1
<tb>
<tb>
Multiplicité <SEP> VGF <SEP> dégagé
<tb> virale <SEP> ng <SEP> éq. <SEP> d'EGF <SEP> par <SEP> ml
<tb> upf <SEP> par <SEP> cellule
<tb> 0 <SEP> -
<tb> 10 <SEP> 2,7
<tb> 20 <SEP> 4,5
<tb> 40 <SEP> 6, <SEP> 1
<tb> 80 <SEP> 10,1
<tb>
On a infecté des cultures de cellules BSC-1 au rapport upf-cellules indiqué, et on a récolté les surnageants (environ 1 ml pour 2x106 cellules) 24 heures après l'infection. On a acidifié et lyophilisé chaque échantillon, puis on a dosé en double les récepteurs de l'EGF radiomarqués, comme décrit par ailleurs (Delarco et Todaro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75 : 401- 405). (ng éq. = nanogrammes d'équivalents).
<Desc/Clms Page number 122>
2. Purification partielle du VGF.
On a soumis l'activité compétitive avec l'EGF trouvée dans les cellules BSC-1 infectées par W à une purification partielle à partir des surnageants des liqueurs extraites par un acide, 24 heures après l'infection, comme décrit ci-dessus. On a déposé les polypeptides solubilisés en milieu acide (10,5 mg) provenant des surnageants sur une colonne de BioGel P10 amenée à l'équilibre avec de l'acide acétique 1 M et on a recherché l'activité compétitive avec l'EGF dans des échantillons de toutes les fractions. Le pic actif majeur (fraction 42) s'est élue avec un Mr apparent de 25.000 peu après l'anhydrase carbonique qui est un marqueur d'un Mr de 29.000.
On a confirmé le poids moléculaire en utilisant des colonnes de HPLC dimensionnelle Bio-Sil TSK 250 montées en tandem, où toute l'activité s'est éluée à un pic majeur dans la région du marqueur protéique d'un Mr de. 25.000. Le VGF en quantité de 1 microgramme est l'équivalent de 90 nanogrammes de l'EGF dans une épreuve de compétition pour le récepteur radiomarqué.
3. Purification plus poussée du VGF.
On a concentré des fractions rassemblées de la colonne de filtration sur gel (nO 25 à 35) par centrifugation sous vide, puis on a remis le solide en suspension dans de l'acide trifluoroacétique à 0,05%, on a clarifié le mélange et on l'a injecté dans une colonne de 3,9 mm x 30 cm JLBondapak C18 (Waters, Milford, MA). On a élue les peptides avec un gradient linéaire de 20 à 60% d'acétonitrile dans l'acide trifluoroacétique à 0,05% à un débit de 1,0 ml par minute à 22 C. Dans des aliquotes de chaque fraction, on a dosé l'activité compétitive de l'EGF pour un récepteur radiomarqué.
On a recueilli le peptide correspondant à l'activité de crête et on 11 a dilué
<Desc/Clms Page number 123>
avec de l'acide trifluoroacétique à 0,05%, puis injecté à nouveau dans une colonne LBondapak qu'on a éluée dans des conditions isocratiques. La concentration en acétonitrile était d'environ 22 à 25%.
Le tableau ci-après donne une comparaison du taux de production du VGF par les cellules BSC-1 infectées par 15 upf de W par cellule avec celui de l'ÓTGF produit par des cellules transformées par un rétrovirus.
TABLEAU
EMI123.1
Comparaison de l'activité biologique du VGF P. g q avec celle de l'TGF de l'EGV.
EMI123.2
<tb>
<tb>
Facteur <SEP> Fixation2 <SEP> (a) <SEP> Induction3 <SEP> (b) <SEP> Stimulation4 <SEP> (c)
<tb> de <SEP> croissancel
<tb> Néant-1. <SEP> 779 <SEP> < 20
<tb> VGF <SEP> 2,3 <SEP> 3.760 <SEP> 108
<tb> TGF-Ó <SEP> 0,2 <SEP> NT <SEP> 294
<tb> EGF-8. <SEP> 482 <SEP> 346
<tb>
NT = Non testé
EMI123.3
(a) Fixation sur le récepteur de l'EGF, en ng d'équivalents d'EGF par ml de milieu. (b Induction de la synthèse de l'ADN, en C 125I J Idu incoporé (coups par minute par boîte).
(c) Stimulation de la croissance cellulaire indépendante de l'ancrage, en colonies sur gélose molle par boîte.
1 On a purifié du VGF (90 ng d'équivalents d'EGF par
EMI123.4
microgramme de protéine) par filtration sur gel, puis par élution d'une colonne Ctg Bondapak (Waters Associates). On a purifie TGF de cellules embryonnaires de rats'de Fisher transformées par le virus du sarcome félin de Snyder-Theilen de la façon décrite par Marquardt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80 : 4684- 4688 ; on a purifiél'EGF de la glande sous- maxillaire de souris (Cohen et al., J. Biol. Chem.
(1980) 255 : 41834-41842).
<Desc/Clms Page number 124>
2 La définition quantitative des équivalents d'EGF est basée sur une courbe étalon de compétition de fixation du 125I-EGF, comme décrit.
3 On a exécuté des épreuves de mitogénèse comme décrit ; on a ajouté à des cultures calmes de fibroblastes humains diploldes 10 ng d'EGF purifié par ml ou bien du VGF en le même nombre d'équivalents d'EGF par ml. Les valeurs pour l'incorporation de la C-Iiododésoxyuridine ( 125r ardu) représentent la moyenne de mesures faites en triple.
4 Le nombre de colonies sur gélose molle est le nombre moyen de colonies contenant un minimum de
20 cellules NRK pour six champs à faible grossissement pris au hasard, 10 jours après le repiquage (1, 5 x 104 cellules par ml) avec de l'EGF purifié (5 ng par ml) ou du VGF en le même nombre d'équivalents d'EGF par ml et 2,0 ng de TGF-j par ml purifié à partir de plaquettes humaines, corne décrit par Assoian et al., J. Biol. Chem. (1983) 258 : 7155-7160. Les géloses portant des cellules NRK traitées au moyen du TGF-pn'ont pas donné de colonies.
B. Le VGF préparé dans des cellules CHO.
On a évalué l'activité biologique du VGF préparé dans des cellules CHO en appliquant l'épreuve de fixation sur les récepteurs de l'EGF. On a utilisé le milieu de croissance de la culture sans autre purification. Le facteur de croissance s'est fixé sur les récepteurs de l'EGF.
C. Le VGF préparé dans le ver à soie.
On a évalué l'activité biologique du VGF partiellement purifié (à peu près 50%) préparé dans le ver à soie en appliquant l'épreuve de fixation sur les récepteurs de l'EGF qui a révélé qu'il y a fixation sur les récepteurs de l'EGF.
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TABLEAU
EMI125.1
Pourcentage de reconstitution de l'épithélium g sur les plaies après traitement au moyen du facteur de croissance.
EMI125.2
<tb>
<tb>
Porc <SEP> 1
<tb> (9 <SEP> jours <SEP> après <SEP> la <SEP> brûlure) <SEP> VGF <SEP> naturel
<tb> g <SEP> par <SEP> ml
<tb> Flanc <SEP> droit <SEP> Silvadene <SEP> Non <SEP> traité <SEP> 0,1 <SEP> 1,0
<tb> 15% <SEP> 0% <SEP> 70% <SEP> 65%
<tb> h-EGF
<tb> g <SEP> par <SEP> ml
<tb> Flanc <SEP> gauche <SEP> Silvadene <SEP> Non <SEP> traité <SEP> 0,1 <SEP> 0,5 <SEP> 1,0
<tb> 75% <SEP> 55% <SEP> 60% <SEP> 70% <SEP> 30%
<tb> Porc <SEP> 2
<tb> (10 <SEP> jours <SEP> après <SEP> la <SEP> brûlure) <SEP> VGF*
<tb> 1'- <SEP> 9 <SEP> par <SEP> ml
<tb> Flanc <SEP> droit <SEP> Silvadene <SEP> Non <SEP> traité <SEP> 0,1 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 1,0
<tb> 50% <SEP> 0% <SEP> 70% <SEP> 95% <SEP> 60%
<tb> Flanc <SEP> gauche <SEP> Silvadene <SEP> Non <SEP> traité <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 1,
0
<tb> 50% <SEP> 0% <SEP> 60% <SEP> 75% <SEP> 40%
<tb> Porc <SEP> 3
<tb> (9 <SEP> jours <SEP> après <SEP> la <SEP> brûlure) <SEP> TGF <SEP> de <SEP> rat
<tb> u, <SEP> g <SEP> par <SEP> ml
<tb> Flanc <SEP> droit <SEP> Silvadene <SEP> Non <SEP> traité <SEP> 0,1 <SEP> 1,0 <SEP> 1,0
<tb> 20% <SEP> 15% <SEP> 90% <SEP> 65 <SEP> 90%
<tb> TGF <SEP> humain
<tb> ; <SEP> g <SEP> par <SEP> ml
<tb> Flanc <SEP> gauche <SEP> Silvadene <SEP> Non <SEP> traité <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> 25% <SEP> 5% <SEP> 90% <SEP> 85% <SEP> 65%
<tb>
* VGF : VGF naturel préparé à partir de cellules infectées par le virus de la vaccine.
D. Comparaison immunologique du VGF et du TGF.
Lors du radio-immunodosage décrit ci-dessus,
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on a observé un déplacement d'antigène de 50% de l'anticorps aux 17 acides aminés carboxy-terminaux de la molécule de 1' < C-TGF de rat, à une concentration en antigène d'environ 0,2 à 0,3 ng d'équivalents d'EGF, lorsque l'L-TGF marqué au l25r entre en compétition avec l'CL-TGF. Aucune compétition n'a été observée lors d'un essai avec le VGF en concentration équivalente.
Lors d'un radio-immunodosage compétitif pour l'EGF natif, les préparations du VGF, même prises à 50 ng d'équivalents d'EGF par ml, manifestent un déplacement minime ( < 10%) du 125I-EGF d'un anticorps polyclonal vers l'EGF natif.
Il ressort à l'évidence des résultats cidessus que le VGF est un puissant agent de reconstitution de l'épithélium qui subit de façon satisfaisante la comparaison avec d'autres facteurs de croissance dont des essais antérieurs ont démontré l'activité mitogène. Les polypeptides de l'invention peuvent être utilisés avec différents hôtes pour induire une réponse immunogène, favoriser la prolifération cellulaire, cicatriser les plaies, et ainsi de suite. On observe sur les plaies une formation d'épithélium et une vascularisation, de même qu'une reconstitution rapide de la solidité dans la plaie, c'est-à-dire de la résistance à la séparation ou à la déchirure. Les hôtes peuvent être des mammifères, comme des rongeurs, des animaux domestiques, des primates ou l'être humain.
L'invention a pour objet de nouvelles compositions ayant une large utilité dans de nombreux domaines, par exemple pour le diagnostic, pour exercer des effets in vitro et in vivo sur les cellules, pour agir comme mitogènes, pour servir d'additifs dans les milieux nutritifs, pour servir d'agonistes ou antagonistes pour l'EGF et le TGF, pour agir comme
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immunogènes ou comme agents thérapeutiques, pour aider à la cicatrisation des plaies, et ainsi de suite.
De plus, en raison de la présence d'un petit oligopeptide ayant une activité de fixation, l'oligopeptide peut être utilisé tel quel ou bien conjointement avec d'autres polypeptides, ou être fusionné sur d'autres polypeptides pour modifier les propriétés de ces autres polypeptides, ce qui conduit à la fixation du polypeptide sur des cellules porteuses de récepteurs pour le facteur de croissance. Il est donc possible de fixer réversiblement différents polypeptides sur les cellules porteuses de récepteurs pour le facteur de croissance et de modifier ainsi les propriétés des cellules d'une façon déterminée au préalable.
Bien que divers modes et détails de réalisation aient été décrits pour illustrer l'invention, il va de soi que celle-ci est susceptible de nombreuses variantes et modifications sans sortir de son cadre.