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pour: Procédé de préparation de nouveaux glucosides cristallisés de la digitale.
Le brevet français Ng 712.282 du 27 Février 1931 de la Demanderesse décrit un procédé qui permet d'obtenir à partir de " digitalis lanata" une préparation cardioto- nique de digitale de nature glacosidique. Les cristaux de ce produit présentaient tous las caractères de l'homo- généité puisque des cristallisations répétées, des repré- cipitations réitérées de ses solutions dans des dissolvants variés n'avaient plus modifié les propriétés de ce copps qui pouvait donc à juste titre être considéré - et en fait
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l'avait été par la suite - comme un composé chimique bien caractérisé.
Les recherches ultérieures de la Demanderesse l'ont cependant conduite à la constatation surprenante qae ce corps est en réalité un mélange et du même coup la Demanderesse a trouvé un procédé de fractionnement qui a permis de le séparer en 3 glucosides cardiotoniques dif- férents, inconnus jusqu'à présent et dont les cristaux sont isomorphes, C'est ce procédé qui fait l'objet de la présente invention, On désignera par la suite les trois nouveaux glucosides sous les noms de glucoside A, gluco- side B et glucoside C et leur mélange de départ sous le nom de mélange cristallisé de glucosides,
Le procédé de fractionnement de ce mélange en ses trois composants A,
B et C consiste à le dissoudre d'abord dans un solvant approprié non miscible à l'eau tel que le chloroforme ou l'acétate d'éthyle auquel on ajoute.? pour obtenir des solutions plus concentrées, un deuxième dissolvant organique qui soit miscible à l'eau, tel que l'alcool éthylique, le méthanol ou l'acétone.
On secoue cette solution mixte avec de l'eau et on obtient un système hétérogène à couches superposées; on sépare ces couches et on poursuit, sur chacune d'elles, dans des concentrations convenables, le même procédé bien connu de partage de corps, dissous entre deux liquides non miscibles entre eux dont l'un est l'eau et l'autre un liquide organique, On répète les opérations jusqu'à ce que les propriétés des fractions successivement obtenues ne varient plus,
La séparation d'un mélange de glucosides de la
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digitale en fractions de différente nature par des opét1o
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de partage entre deux liquides non miscibles entre eux, n'est pas nouvelle en soi;
le brevet allemand 514,096 par exemple mentionne qu'en extrayant par du chloroforme la solution dans l'alcool des glucosides de la digitale à l'état natural, or¯ obtient des fractions de composition variable ; seulement on part ici d'un extrait de digitale trop souillé pour pouvoir cristalliser et on le fractiohne jusqu'à ce que l'un des composants commence à cristalliser et puisse alors être séparé par cristallisation.
Le procédé, objet de la présente invention consiste au contraire à fractionner un produit déjà cristallisé, présentant des critères d'nomogénéité qu'on est habitué à trouver suffisants jusqu'à ce que les propriétés des composants soient cons- tantes, Ce procédé n'a pu être trouvé qu'à la suite de l'observation,faite pour la première fois par la Demanderesse, que certains glucosides de la digitale présentent un isomorphisme si complet que leur séparation par cristallisa- tion fractionnée en devient impossible;
cette observation seule pouvait faire concevoir des essais de dédoublement de préparations de digitale cristallisées et paraissant homogènes, par partage entre deux liquides non miscibles. pour la mise en pratique du procédé, ondissou- dra par exemple le mélange cristallisé des glucosides dans un mélangs de chloroforme et de méthanol et on agitera cette solution avec une certaine quantité d'eau après quoi on laissera reposer ; les proportions des trois solvants à utili- ser sont indiquées plus bas à l'exemple 1.
Le mélange se sépare en trois couches, une couche inférieure cnloroformi- que ( Chl), une couche supérieure d'alcool méthylique aqueux (W) et une couche intermédiaire (Z), constituée par un produit
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non dissous en partie liquéfié, On reconnatt à la réaction de coloration de Keller que la concentration en glucoside A a augmenté dans la couche inférieure (Chl); la zone colorée qui se forme au-dessous de la surface de séparation est beaucoup moins rouge quavec la matière initiale.
En renouvelant 3 ou 4 fois la même opération avec la fraction des glucosides extraite de la solution chloroformique et en ne conservant chaque fois pour le traitement ultérieur que les phases chloroformiques, on obtient, finalement, un produit qui, à la réaction de Keller, donne au-dessous de la surface de séparation une zone brun pur, sans trace de rouge et dont les propriétés ne se modifient plus par un traitement subséquent. Les propriétés du glucoside A ainsi préparé sont récapitulées plus bas,
La concentration en glucoside B, reconnaissabie à la forte coloration rouge à la réaction de Keller de la zone sise au-dessous de la surface de séparation a aug- menté dans la couche intermédiaire.
En répétant les opéra- tions de partage 3 ou 4 fois avec cette fraction, en ne conservant chaque fois pour l'opération suivante que la couche insoluble, on obtient en fin de compte un produit dont les propriétés ne se modifient plus par un fractionne- ment plus poussé. Il est caractérisé à la réaction de Keller par un anneau d'un rouge éclatant. Les propriétés du glu- coside B ainsi obtenu sont décrites plus bas.
La couche supérieure soutenant le méthanol aqueux (W) contient la plus grande partie du gluooside C, à côté d'une petite quantité de glucoside A et d'une quanti- té un peu plus forte de glucoside B, On élimine ces deux
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glucosides en secouant plusieurs fois la couche de méthanol dilué avec du chloroforme. Comme le chloroforme extrait le glucoside A plus facilement que le glucoside B, on extrait jusqu'à ce que la réaction de Keller ne montre plus la zone rouge caractéristique du glucoside B; on obtient ainsi à l'état par le glucoside C qui ne se modifie plus par un traitement plus prolongé; il ne se distingue presque pas du glucoside A à la réaction de Keller et donne lieu à la formation, sous la surface de séparation,d'une zone brune, sans trace de rouge. Les propriétés du glucoside C sont décri- tes en détail plus bas.
On peut aussi effectuer autrement le procédé de séparation; on fait dissoudre d'abord le mélange cristalli- sé de glucosides dans un mélange d'acétate d'éthyle et de méthanol qu'on secoue plusieurs fois avec de l'eau jusqu'à ce que la solution d'acétate d'éthyle ne contienne plus que la glucoside A caractérisé par l'absence de la zone rouge lorade la réaction de Keller. L'extrait aqueux contenant à c7té de méthanol les glucosides B et C et de petites quanti- tés de glucoside A est épuisé avec du chloroforme jusqu'à ce qu'il soit exempt de glucosides A et B, c'est-à-dire ne donne plus de zone rouge à la réaction de Keller; il contient alors le glucoside C à l'état pur.
Le mélange des glucosides A et B contenu dans les extraits chloroformiques est débarrassé du chloroforme et séparé en ses composants à l'aide de l'acé- tate d'éthyle avec le contrôle de la réaction de Keller.
On pourra utiliser pour la mise en pratique du procédé d'autres systèmes couplés de dissolvants qu'on mettra en action d'après les directives générales données ci-dessus. On pourra évidement appliquer la procédé de sépa- ration qui vient d'être décrit non seulement à des produits
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préparés d'après les données du brevet français N 712.282 précité, mais aussi à tous autres produits initiaux préparés par un procédé quelconque à partir de digitalis lanata, à condition que ces produits contiennent bien les trois nouveaux glucosides, par ailleurs,
il n'est plus nécessaire que la matière initiale ait le haut degré de pureté requis pour les produits décrits au brevet français N 712.282. Des produits renferpant encore des corps organiques inertes peuvent conve- nir,à condition que ces impuretés ne provoquent pas un déca- lage des coefficients de partage des glucosides dans les systèmes de dissolvants choisis. Il sera alors nécessaire, après la séparation des glucosides, de procéder à une purifi- cation subséquent en les recristallisant par exemple dans l'alcool ou le méthanol.
Description des trois nouveaux glaoosides A, B et C.
Le glucoside A cristallise dans le méthanol et l'alcool en petites tablettes homogènes minces, étroites et incolores dont la longueur peut atteindre 10 mm; séchées à l'air ou dans le vide, elles sont efflorescentes. Une partie du glucoside se dissout à la température ordinaire dans environ 20 parties de méthanol, 40 parties d'alcool absolu, 200 parties d'acétate d'éthyle, 225 parties de chloroforme et 16000 part les d'eau.
Le pouvoir rotatoire spécifique mesuré en solution dans le dioxane est de 20 D + 24,5g ( c = 4); mesuré dans l'alcool à 95 % il est de Ó 20 + 35,7 (c = 1,88) pour la corps séché à 100 dans D le vide de la pompe à mercure, Dans la réaction de coloration de Keller, le glucoside A donne au-dessous de la surface de séparation une zone brune sans trace de rouge; la couleur de la solution dans l'acide acétique glacial va du bleu au. bleu-verdâtre. par hydrolyse avec des acides minéraux diluée
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en solution alcoolique aqueuse,il donne comme aglucone uniquement la digitoxigénine.
Jusqu'à présent, on na connaissait qu'un seul glacoside cristallisé de la digitale qui donnât comme aglucone uniquement la digitoxigénine, CI est la digitoxine.
Le glucoside A en est cependant totalement différent, comme le montre le tableau, de comparaison suivant:
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Le Glucoside B cristallise dans le méthanol et l'alcool en petites tablettes homogènes et incolores, minces et allongées dont la longueur peut atteindre 10 mm; elles perdent leur transparence au séchage à l'air ou dans le vide. 1 partie se dissout à température ordinaire dans 15 parties de méthanol, 40 parties d'alcool absolu, 3,500 par- ties d'acétate d'éthyle.550 parties de chloroforme et 700 parties d'eau. Le pouvoir rotatoire spécifique de la substan- ce séchée à 100 dans le vide de la pompe à meroure est,dans l'alcool à 96% de [[alpha]] 20 /D = + 34,8 ( c = 1,91 ).
@
Par la réaction de Keller, il produit sous la surface de séparation un anneau rouge vif et il se dissout dans l'acide acétique glacial avec une couleur allant du
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bleu au bleu-vert. Par hydrolyse avec des acides dilués en solution alcoolique aqueuse, il donne comme aglucone unique*- ment la gitoxigénine. jusqu'à présent on ne connaissait qu'un seul glucoside cristallisé de la digitale, qui donnât comme aglucons uniquement la gitoxigénine, à savoir la gitoxine ( = bigitalinum).
Le glucoside B en est cependant totalement différent comme le montre le tableau de comparaison suivant:
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<tb> itoxine <SEP> (Bigitalinum) <SEP> Glucoside <SEP> B
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<tb> Solubilité <SEP> dans <SEP> 1 <SEP> partie <SEP> dans <SEP> environ <SEP> 1 <SEP> partie <SEP> dans <SEP> enle <SEP> méthanol <SEP> 4.500 <SEP> parties, <SEP> viron <SEP> 15 <SEP> parties.
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<tb> (1926).
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<tb> aglucone. <SEP> 46,8 <SEP> % <SEP> 37 <SEP> - <SEP> 38 <SEP> % <SEP>
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Le glucoside C cristallise dans le méthanol et l'alcool en petites tablettes homogènes, incolores , minces et allongées, dont la longueur peut atteindre 10 mm.; séchées dans le vide ou à l'air, elles perdent leur transparence, 1 partie se dissout à la température ordinaire dans environ 20 parties de méthanol, 45 parties d'alcool absolu-, 3. 300 parties d'acézate d'éthyle, 1500 parties de chloroforme et 17000 parties d'sau. Le pouvoir rotatoire spécifique de la substance séchée à 1008 dans le vide de la pompe à mercure est, dans l'alcool à 95 %,de Ó 20= + 33,4 ( c = 1,93).
D La réaction de Keller donne sous la surface de séparation une zone brune; dans l'acide acétique glacial, le glucoside C prend une couleur allant du bleu au bleu-vert, L'hydrolyse effectuée avec des acides minéraux en solution alcoolique aqueuse fournit comme aglucons uniquement la lanadigigénine ( digoxigénine).
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on connaissait jusqu'à présent deux glucosides de la digitale dont les aglucones étaient constitués uniquement par la lanadigigénine ( digoxigénine), à savoir la lanadigine (C.mannich, Arch.d. Pharmacie und Berichte der deutschen pharmazeut.
Gesellschaft 268,453) et la digoxine (Smith, Journal of the Chemical Society, March 1930, pag, 508).Le glucoside C est un corps différent de ces deux produits, comme le montre le tableau de comparaison suivant:
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<tb> Lanadigine <SEP> digoxine <SEP> Glucoside <SEP> C
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<tb> Solubilité <SEP> dans <SEP> 1 <SEP> partie <SEP> dans <SEP> presqu'in- <SEP> 1 <SEP> partie <SEP> dans
<tb> le <SEP> chloroforme <SEP> 300 <SEP> parties, <SEP> soluble <SEP> 1500 <SEP> parties.
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Solubilité <SEP> dans <SEP> 1 <SEP> partie <SEP> dans <SEP> --- <SEP> 1 <SEP> partie <SEP> dans
<tb> l'ean <SEP> 600 <SEP> parties. <SEP> 17000 <SEP> parties.
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Teneur <SEP> en <SEP> aglucone <SEP> environ <SEP> 45 <SEP> % <SEP> 49,2 <SEP> % <SEP> 37-38 <SEP> % <SEP>
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Toxicité das trois nouveaux glucosides,
Comme on l'a déjà dit dans le brevet français M 712.282 de la Demanderesse, la méthode de Houghton-Straub ne permet pas de déterminer d'une manière précise la toxicité des produits préparés à partie de la digitale, car las résul- tats obtenus varient très fortement, D'après cette méthode, les valeurs des toxicités suivantes ont été obtenues pour le glucoside A 250.000 à 550.000 F.D, pour 1 g. de subst.pour le glucoside B 200.000 à 500.000 F.D. pour 1 g. de subst.pour le gluoside C 200.000 à 500.000 F,D, pour 1 g. de subst, (F.D. = dose grenouille)..
Des résultats plus précis ont été obtenus par des essais de toxicité sur le chat. Comme dose mortelle minima il a été trouvé: pour le glucoside A 0,37 mg pour 1 kg de chat, pour le " B 0,35 " " 1 " " ' pour le " C 0,26 " 1 il " " pour la digitoxine 0.42 " 1 " " "
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EXEMPLE 1
On fait dissoudre 16 parties du mélange cristallisé de glucosides dans un mélanges de 800 parties de méthanol et de 4000 parties de chloroforme ; onsecoue énergiquement cette solution avec 4000 parties d'eau et on laisse reposer quelque temps ; il se sépare 3 couches, une couche inférieure chlorofor- mique ( Chll), une couche intermédiaire de substance non dissouts en partie liquéfiée ( Zl) et une couche supérieure de méthanol aqueux ( W1).
On concentre la couche inférieure ( Chll) dans le vide jusqu'à la moitié, on ajoute 400 parties de méthanol et on agite avec 2000 parties d'eau, Des 3 couches qui se séparent après un moment de repos, on prélève la couche inférieure (Ch12) qui est de nouveau concentrée à la moitié dans le vide, addition- née de 200 parties de méthanol et agitée avec 1000 parties d'eau., On soumet encore deux fois au même procédé les couches chlorofor- miques ( Chlet Chl ) obtenues; on concentre enfin dans le vide
3 4 la dernière couche obtenue (Ch15) qui fournit le glucoside A exempt des -glucosides B et C, avec les propriétés caractéristi- ques mentionnées dans la description qui en a été faite ci-dessus.
Les couches de méthanol aqueux résultant de ces diverses extractions sont réunies à la première ( W1) et extraites 5 on 6 fois avec un volume égal de chloroforme qui élimine de cette solution les glucosides A et B, On concentre la solution aqueuse dans le vide et on obtient le glucoside C avec toutes ses propri- étés mentionnées dans la description précédente. On évapore à sec dans le vide les extraits chloroformiques et on ajoute l'ex- trait sec à la couche intermédiaire obtenue au début ( Z1).
Le produit obtenu est soumis avec le système chloroforme-méthanol- eau aux opérations da partage indiquée? eu début De cette descrip- tion ; la couche intermédiaire formée (Z2) est traitée de la
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même façon encore 3 ou 4 fois et chaque fois ----------- - -- la couche intermédiaire seule est mise en oeuvre, Arrivé au stade Z5 ou Z6' on a entre les mains le glucoside B exempt des glucosides A et C, avec les propriétés mentionnées dans la description précédente.
Ce procédé laisse des solutions résiduelles de mélanges de glucosides; on les évapora dans le vide et on les soumet à un nouveau cycle d'extractions.
EXEMPLE 2:
On fait dissoudre 10 parties du mélange cristal- lisé de glucosides dans un mélange de 250 parties de méthanol et 5000 parties d'acétate d'éthyle; on secoue cette solution avec 5000 parties d'eau et on laisse reposer. Après séparation des couches, on concentre la solution d'acétate d'éthyle
E1 dans le vide à environ 3500 parties ; on ajoute 150 parties de méthanol et on secoue avec 3500 parties d'eau, Après dé- cantation, on concentre la couche E de nouveau à environ
2 60 % de son volume, on ajoute une quantité correspondante de on méthanol, on secoue à nouveau avec de l'eau et/continue à fractionner d'après le même principe.
Arrivé au stade E5 on
5 évapore l'acétate d'éthyle dans le vide et on obtient un glucoside A exempt des glucosides B et C et en tous points conforme à la description qui en a été donnée plus haut. Les extraits aqueux réunis sont extraits avec du chloroforme de la même manière que dans l'exemple 1 jusqu'à ce qu'ils ne contiennent plus que du glucoside C et évaporés dans le vide; le glucoside C obtenu correspond à la description qui en a été faite. Les extraits chloroformiques réunis sont évaporés dans le vide et le résidu sec soumis au fractionne- ment avec le système chloroforme-méthanol-eau décrit dans
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l'exemple 1, en ne travaillant chaque fois que les couches intermédiaires insolubles (Z1 à Z4).
Aprés la 5 extraction. la couche Z est constituée par du glucoside B par et
5 possède les propriétés indiquées pour ce glucoside, Les solu- tions résiduelles de ces opérations de partage sont évaporées dans le vide et soumises à un nouveau cycle d'extractions, soit d'après l'exemple 1, soit d'après l'exemple 2. Les nouveaux glucosides sont susceptibles d'applications thérapeu- tiques.