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Gyogyszer es Vegyészeti Termékek Gyara R.T. (Dr.KERESZTY & Dr.WOLF)
La préparation de la progesterone par oxydation de stérols ou de dérivés des stérols a déjà été décrite par plusieurs chercheurs. On connait un procédé (Dirscherl- Hannusch, préparation de la progesterone Hoppe-Seyler, vol.252, 49), dans lequel de la cholestenone, dissoute dans de l'acide acétique glacial, est oxydée avec de l'acide chromique, l'androstéendione et la progesterone étant séparés des produits d'oxydation. Dans ce cas, la progesterone se forme seulement en faibles quantités, absolument et par rapport à l'androstènedione.
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La société demanderesse a trouvé que la progeste- rone est formée en quantité beaucoup plusimportante que dans les procédés actuellement connus, si on oxyde de la choleste- none dans de l'acide sulfurique à plus de 50 %. On se sert par exemple d'un acide sulfurique à 60 %. Mais il est plus avantageux d'employer de l'acide sulfurique de concentration plus forte, par exemple de l'acide sulfurique à 80 %, car on obtient dans ce cas de meilleurs rendements en progesterone.
Il semble qu'il se forme en ce cas tout d'abord une combinai- son de cholestenone et d'acide sulfurique, que les demandeurs n'ont pu toutefois séparer jusqu'ici. Mais la cholestenone semble former une combinaison non seulement avec de l'acide sulfurique fort, mais aussi avec de l'acide chromique. Par exemple, lorsqu'on agite de la cholestenone, dissoute dans de l'essence ou du tétrachlorure de carbone, avec un mélange de sulfate de sodium sec et d'anhydride chromique, il se forme un composé de cholestenone et d'acide chromique, qui se dis- sout dans le solvant organique et peut être obtenu, après éva- poration du solvant, sous forme de substance amorphe diffici- lement cristallisable. Ce composé de cholestenone et d'acide chromique, dissout dans de l'acide sulfurique à 80 % comme diluant, se prête également à l'oxydation.
Comme oxydant on se sert d'acide chromique, lui aussi dissous dans de l'acide sulfurique concentré. Hais il est évident qu'on peut aussi utiliser des chromates en solu- tion d'acide sulfurique .
L'oxydation est effectuée au-dessous de la tempé- rature du local ; une température de -5 à = 5 C s'est montrée avantageuse.
Le traitement de préparation du mélange de réac- tion se fait par dilution avec une grande quantité d'eau et agitation avec des solvants non miscibles avec l'eau, par
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exemple avec du benzène. La solution benzènique est parfaite- ment agitée avec des alcalins dilués pour enlever les produits d'oxydation acides. La progesterone peut être séparée de dif- férentes manières de la solution benzénique qui ne contient maintenant que les produits d'oxydation de nature neutre.
Si, par exemple, la solution dèessencen du pro- duit d'oxydation, déjà débarrassée des constituants acides par agitation avec des alcalins, est soumise à un partage avec de l'alcool méthylique queux à 90 %, la quantité princi- pale de la choestenone qui n'a pas changé à l'oxydation, reste dans la couche d@'essence et la solution méthylalcooli- que aqueuse (solution A) contient la progesterone. Le choles- tenone est récupée du résidu de la solution d'essence par cristallisation de l'alcool ou de l'acétone, et le résidu d'évaporation des lessives-mères de cristallisation, dissous dans de l'essence, est agité à plusieurs reprises avec de l'alcool méthylique à 90 %.
Cette solution méthylalcoolique contient encore de la progesterone et, réunie à la solution A précédemment obtenue, elle est évaporée, de nouveau dissoute dans de l'essence et séparée de nouveau avec du méthanol aqueux - la teneur en eaubde l'alcool méthylique étant augmen- tée graduellement jusqu'à 30 % -, et le progesterone est enrichie dans la solution méthanolique qqueuse. La solution méthylalcoolique à 70 % obtenue est diluée maintenant avec de l'eau à une teneur d'alcool de 20 % et est agitée à plu- sieurs reprises avec de l'essence, et à la fin, après satura- tion de la couche aqueuse, avec du sel de cuisine, ce qui donne une meilleure séparation.
On obtient ainsi une épura- tion ultérieure, car avec cette opération la progesteroreest transférée dans la couche d'essence pratiquement sans perte, tandis que des impuretés goudronneuses insolubles dans le méthanol aqueux et dans l'essence sont éliminées.
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Mais on peut aussi procéder de la manière suivan- te : Avant la séparation répétée mentionnée en dernier, entre l'essence et le méthanol gradallement dilué avec de l'eau, on soumet le produit d'oxydation débarrassé pour la plus grande partie de la cholestenone restée inchangée, dans do la solu- tion benzénique à un chromatogramme sur de l'oxyde d'alumi- nium (Broc@@@nn), le progesterone restant dans la solution benzénique qui a passé;
le résidu d'évaporation de cette solu- tion benzénique est dissous dans de l'essence, et est soumis ensuite à un partage ou séparation avec de l'alcool méthyli- que dilué, de manière semblable à ce qui a été décrit précé- de:nment. mais on peut aussi procéder de manière que le chroma- togramme ne soit effectué qu'après le partage exécuté de la manière indiquée ci-dessus.
Le progesterone peut aussi être enrichie de la manière suivante du mélange dtoxydation : La solution benzéni- que levée neutre du produit d'oxydation est évaporée et la cholestenone inchangée est séparée du résidu par cristallisa- tion de l'acétone ou de l'alcool méthylique, La progesterone reste dans la lessive-mère; cette dernière est évaporée; le résidu est dissous dans du benzène et la progestérone est transférée dans la solution aqueuse par agitation avec de l'acide chlorhydrique concentré. Par dilution de la couche chlorhydrique séparée avec beaucoup d'eau et agitation avec du benzène, la progestérone est enrichie dans la couche ben- zénique.
L'enlèvement ultérieur des substances de ballast de la progestérone peut se faire au moyen d'autres mesures, par exemple par chromatographie, par des procédés de partage, etc..; on obtient ainsi finalement des produits fortement concentrés à teneur de progesterone, qui se prêtent aussi
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bien à la production de préparations thérapeutiques qu'à la production de progésterone cristallisée.
Dans le courant des mesures d'enrichissement ci-dessus mentionnées, les diverses opérations peuvent varier dans une.grande mesure en ce qui concerne leur ordre de succession et la fréquence de l'exécution.
Pour la préparation de la progesterone cristalli- sée, on se sert, d'après l'invention, de produits enrichis en progesterone de la manière indiquée ci-dessus, produits qu'on dissout dans un mélange d'essence et de benzène (environ 3 :1) et qu'on chromatographie sur de l'oxyde d'aluminium de Brockmann. Le développement du chromatogramme se fait au début avec le même mélange, ensuite avec un mélange à teneur de benzène plus grande ; fin de compte, on lave avec du benzè- ne pur. Les solutions qui ont passé sont recueillies en plu- sieurs fractions. Les fractions centrales, principalement celles qui sont enlevée par lavage au moyen d'un mélange d'essence et de benzène 1 : 1, sont les plus riches en pro- gesterone.
Les diverses Fractions sont évaporées et sont cristallisées d'un mélange d'éther et d'éther de pétiole. Il existe occasionnellement dans les premières fractions un corps à point de fusion de 126-127 , mais ce corps n'est pas de la progesterone. On obtient des autres fractions la progesterone à point de fusion 125-127 , qui après recristallisation fond à 127-129 et possède un pouvoir rotatoire [alpha]D = + 196 . Les fractions ne cristallisant pas et la lessive mère de la pro- gesterone cristallisée peuvent être réunies et traitées en vue d'obtenir la progesterone par d'autres mesures chromato- graphiques, par distillation dans un vide poussé ou par sépa- ration de la progesterone avec des réactifs cétoniques, de préférence avec de la semi-carbazide.
La semi-carbazone obte- nue est décomposée avec de l'acide pyruvique, auquel cas on
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récupère de la progosterone cristallisée qui peut être épurée par une cristallisation ultérieure, il est évident qu'on peut répéter la chromatographie répétée et laséparation avec de la semi-carbazide non seulement individuellement, mais aussi en combinaison et en ordre de cuccession désiré quelconque, et qu'on peut préparer la progestérone cristallisée.
EXEMPLES.
@ 1- 50 g de cholestenone sont dissous dans 50 g d'acide acétique glacial tout en chauffant, et après refroi- dissement, ils sont introduits dans une solution d'acide sul- furique qui comprend 550 cm3 d'acide sulfurique (poids spé- cifique 1,84) et 150 cm3 d'eau. On obtient une solution rou- geâtre, à fluorescence verte (solution 1). L'emploi d'acide acétique glacial dans la solution ne sert qu'à accélérer le processus de dissolution. Mais cette petite quantité d'acide acétique glacial peut être supprimée.
85 g d'anhydride chromique sont dissous dans 850 cm3 d'eau et mélangés avec 1986 cm3 d'acide sulfurique (poids spécifique 1,84), et on a soin que la température ne s'élève pas au dessus de 90 . On évite aussi un fort refroi- dissement pour que l'acide chromique ne se sépare pas par cristallisation (solution 2).
La solution 1 est refroidie à -5 dans un ballon pourvu d'un mécanisme agitateur, et on y verse la solution 2 tout en agitant et en refroidissant de l'extérieur, en ayant soin que la température interne soit de -2 environ. L'intro- duction en versant dure de 4 à 5 heures environ; puis la masse de réaction est versée sur 8 kg environ de glace. On agite complètement avec du benzène ; les solutions benzéniquos sont réunies et sort extraites avec de la lessive de soude diluée (10 % environ) pour l'enlèvement des constituants acides. La solution benzénique est ensuite lavée avec da l'eau jusqu'à réaction neutre, est séchée avec du sulfate de sodium sec,
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et est ensuite évaporée dans le vdde.
Le résidu det de 14,5 g environ ; il est dissous dans de l'acétone et la cholestenone inchangée est séparée par cristalliation de cette solution par refroidissement. La cholestonono est enlevée par filtra- tion et est lavée avec un peu d'acétone froid et puis avec de l'alcool méthylique. La progesterone est contenue dans le filtré. Ce filtré est évaporé dans le vide; le résidu est dissous dans 150 cm2 de mélange de bencène et d'essence (1:1), et la solution est agitée à cinq reprises chaque fois avec 100 cm2 d'acide chlorhydrique concentré froid (#5 environ).
La couche de benzène-essence contient encore quelque peu de cholestenone, qui peut être encore récupéeée. La progesterone a passé dans les extraits d'acide chlorhydrique réunis, qui sont dilués avec 1500 cm2 d'eau et sont agités avec du benzène ou de l'éther. La progesterone se trouve maintenant dans la solution benzénique ou éthérée, qui est lavée jusqu'à réaction neutre et est ensuite séchée avec du sulfate de sodium. La solution benzénique peut être décolorée par 10 g environ d'oxyde d'aluminium (Brockmann), et donne alors, évaporée, environ 2 g de résidu huileux jaune.
Ce résidu est dissous dans un mélange de benzène et d'éther de pétrole (par exemple 1 partie de benzène + 4 parties d'éther de pétrole) et est conduit à travers une colonne contenant 30 g d'oxyde d'alu- minium (Brockmann); puis on développe le chromatogramme avec un mélange de benzène et d'éther de pétrole de même composi- tion. La solution s'égouttant de la colonne du chromatogramme est recueillie en parties de 10 cm3 environ et les divers filtrés sont évaporés séparément. Les résidus sont dissous dans de l'éther et sontaamenés à cristallisation après addi- tion d'éther de pétrole. D'autres quantités peuvent être sépa- rées des lessives-mères par cristallisation. Les dernières lessives-mères sont évaporées et sont soumises à une distilla- tion fractionnée dans un vide de 0,001 mm.
La fraction obte-
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nae à 180 environ peut être séparée par cristallisation d'éther et d'éther de pétrole et donne d'autres quantités de progesterone. Le rendement est au total de 0,1 g environ à point de fusion de 126,5 .
Les fractions ultérieurement récupérées de l'acide du chromatogramme et les dernières lessives-mères de la cristallisation, qui sont plus difficiles à cristalli- ser, contiennent encore des quantités considérables de pro- gesterone et montrent dans des essais sur des animaux une . forte action de corpus luteum.
Lors de l'oxydation, on peut aussi procéder de la manière suivante : On dissout un composé de cholestenone et d'acide chronique dans du tétrachlorure de carbone, et on introduit cette solution dans de l'acide sulfurique à 70-80% refroidi, dans lequel on laisse couler en même temps une solu- tion d'acide chromique et d'acide sulfurique contenant elle aussi une teneur de 70-80 % de SO4H2. La réaction et le trai- tement sont effectués de manière semblable à ce qui a été expliqué ci-dessus.
2- En s'écartant du premier exemple, on peut procéder de la manièresuivante : On dissout de la cholesteno- ne dans 1 partie d'acide acétique glacial et on introduit cette solution dans un mélange de 15 parties d'acide sulfu- rique à 92,5 % et de 4,2 parties d'eau, à 5 ;on fait couler progressivement dans cette solution deux parties d'anhydride chromique dissous dans un mélange de 80 parties d'acide sul- furique à 92,5 % et de 12,5 parties d'eau. Quant au reste, l'oxydation est exécutée avec agitation et refroidissement de même que dans le premier exemple. Le mélange d'oxydation est versé sur de la glace, est étendu de benzène et la couche benzénique est lavée avec de la lessive de soude, puis avec de l'eau, jusqu!} réaction neutre.
Si on est parti d'un kg de cholestenone, la solution benzénique donne après évapora-
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tion 220 g environ de résidu, qui est dissous dans 1100 cm3 d'éther de pétrole et 220 cm3 de méthanol et est ensuite additionné avec 24 cm3 d'eau en petites portions, après quoi il se forme deux couches. La couche d'éther de pétrole est agitée encore à 4 reprises avec chaque fois 220 cm3 de métha- nom et 24 cm3 d'eau. La cholestone non modifiée lors de l'oxydation reste dans la solution d'essence. Les cinq solu- tions de méthanol à 90 % séparées sont réunies et sont évapo- rées dans un idde au demi-volume environ, ce qui permet de séparer encore quelque peu de cholestenone. Cette cholestenone est aspirée et est lavée avec un peu d'acétone ou de méthanol.
Les lessives-mères sont évaporées et donnent environ 70 g de résidu.'Ce résidu est repris dans 700 cm3 d'essence (point d'ébullition 60-70 ) et 700 cm3 de méthanol, et 78 cm3 d'eau sont ajoutés en petites proportions à la solution. L'addition de l'eau en petites portions est recommandable, car des émul- sions se formeraient facilement en cas d'addition rapide.
Après agitation, la couche d'essence (solution B2) est sépa- rée et la couche méthanolique est de nouveau réunie et agitée avec 700 cm3 d'essence et additionnée de 97 cm3 d'eau par por- tions. Après agitation on sépare la couche d'essence (solution B2) et la couche méthanolique est de nouveau agitée avec 700 cm3 d'essence et additionnée entre temps de 125 cm3 d'eau. La doudhe d'essence {solution B3), ainsi que la couche méthanoli- que (solution M1) sont séparées l'une de l'autre.
La solution d'essence B1 mise de côté est mélangée à 700 cm3 de méthanol et, additionnée de 78 cm2 d'eau en petites portions, elle est agitée, deux couches se formant alors, dont on sépare la cou- che d'essence (solution B1) et dont on agite la couche métha- nolique avec la solution d'essence B2', en mélangeant en agi- tant constamment avec 97 cm3 d'eau. Après agitation, la couche d'essence B2' est séparée et la solution méthanolique est
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mélangée avecnla solution B3 et est ensuite mélangée avec 125 cm3 d'eau en petites portions tout en agitant. Après séparation, la couche d'essence B3' et la couche méthanolique M2 sont mises de côté. On mélange alors la solution d'essence Bl'avec 700 cm3 de méthanol, on agite eton ajoute en peti- tes portions 78 cm3 d'eau.
La solution méthanolique séparée est mélangée à la solution B2' et est mélangée en agitant avec 97 cm3 d'eau en petites portions. Après agitation et séparation, la couche méthanolique est réunie en agitant à la solution d'essence B3' pendant qu'on ajoute par petites fractions 125 cm3 d'eau. Après séparation, la couche méthano- lique est réunie à la solution méthanolique M1 et M2. Après ce procédé de partage ou séparation du mélange, effectué dtaprès le principe du contre-courant, on peut observer parfois une faible quantité de formation d'émulsion ou de séparation, qui n'influence toutefois pas l' exécution. Des séparations de résines, ou des émulsions, éventuelles, peu- vent être enlevées ou éliminées par filtration, pour autant qu'elles ont une action perturbatrice.
Au lieu du système de partage ci-dessus décrit, on peut aussi utiliser éventuelle- ment d'autres séparations systématiques par agitation.
Les solutions mêthanoliques réunies (environ 2800 cm3), qui contiennent encore des impuretés colorantes, sont mélangées avec 4 litres d'essence et on ajoute au mélan- ge, en sept portions égales, au total 7 litres d'eau et fina- lement 500 cm3 d'eau en portions et avec agitation constante.
Il se sépare entre-temps une masse résineuse brune, qui colle aux parois du récipient. On sépare le liquide de cette préci- pitation en le faisant écouler et on sépare les deux couches l'une de l'autre. La couche d'essence (B4) est séparée, la couche aqueuse contenant environ 20% de méthanol est agitée avec 1 litre d'essence et les couches sont séparées l'une de
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l'autre. La couche d'essence (B5) est séparée et la couche méthanolique est additionnée de 3 litres d'une solution de sel de cuisine, et est de nouveau agitée avec 1 litre d'es- sence. Après la séparation, cette couche d'essence est réu- nie avec les couches d'essence B4 et B5, est lavée à l'eau, séchée et évaporée à siccité.
Il reste environ 18 g de résidu amorphe, dont le pouvoir rotatoire spécifique dans le chloro- forme est de + 86 environ.
Pour une épuration ultérieure, cette masse amor- phe est dissoute dans un mélange d'éther de pétrole et d'essence (3:1) et est ensuite chromatographiée dans un tube rempli de 360 g environ d'oxyde d'aluminium (d'après Brook- mann). Le chromatogramme est développé avec un mélange de benzène et d'éther de pétrole de la susdite composition. Les neuf premières fractions (environ 50 cm3 chacune) contiennent 2,3 g de résidu sec qui, après addition d'éther, cristallise immédiatement. Ces cristaux fondent à 126-127 , sont faciles à sublimer dans un vide très poussé, mais sont ineffectifs dans l'essai animal de Clauberg. Dans les 10 et 11 fractions suivantes, le résidu sec diminue rapidement. Le volume de cette fraction est d'environ 100 et 600 cm3.
La colonne du chromatogramme est ensuite éluée avec un mélange de benzène et d'éther de pétrole (1:1), et entre temps 4 fractions (12 à 15) sont recueillies séparé ment. Ces fractions possèdent indivi- duellement un volume de 100, 150, 200 et 400 cm3. LEs frac- tions 10 à 15 sont réunies et donnent à l'évaporation de 3,5 à 4 g de résidu, qui cristallise du mélange d'éther et d'éther de pétrole. La progesterone cristallisée séparée (1,7 à 2 g) fond à 125-127 ; après recristallisation répétée d'éther et éther de pétrole, le point de fusion est 127-129 et [alpha] d 20 + 197 (dans la solution de chloroforme).
On peut ré- cupérer des lessives-mères de cristallisation, ainsi que des fractions précédant et suivant directement la fraction prin- cipale, d'autres quantités de progesterone par répétition des
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mesures d'épuration ci-dessus indiquées.
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1- Procédé de préparation de progestérone, carac- térisé en ce qu'on oxyde de la cholestenone dans de l'acide sulfurique à plus de 50 % etqu'on sépare la progesterone du mélange de réaction.