<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention est relative à un procédé pour l'obten- tion des isomères optiques de la thyroxine, et plus particulièrement pour la production de leurs dérivés N-acétyle.
Des composés particulièrement intéressants obtenus suivant la présente invention sont la N-acétyle-L-thyroxine et la N-acétyle-D-thy- roxine.
On sait que la L-thyroxine est une hormone importante qui reçoit de nombreuses applications et l'invention permet de préparer cette hormone en quantités industrielles.
L'invention permet également de préparer la D-thyroxine, qui à son tour peut recevoir de nombreuses applications.
Les nouvelles substances présentent par rapport aux composés connus, tels les dérivés de thiouracile, l'avantage de la non-toxicité.
La technique existante qui concerne principalement la L-thy- roxine a montré que la réaction "d'accouplement digestif" suivant laquelle la diiodotyrosine donne de la thyroxine, est réalisée d'une manière très avantageuse par incubation en solution alcaline ayant un pH de 8,5-11, et à une température de l'ordre de 60 C en présence d'un catalyseur au manganèse, avec agitation et dans des conditions suivant lesquelles la surface de la solution est exposée à un gaz contenant de l'oxygène ou avec passage d'air dans la solution.
D'autres travaux dans cette technique ont montré que l'incorporation de groupements protecteurs sur le groupement amino ou sur les groupements amino et carboxyle de la diiodotyrosine, peut être désirable. Plus particulièrement, il a été trouvé que la réaction d'accouplement digestif par laquelle la N-acétyle-diiodotyrosine donne la N-acétyle-thyroxine. peut être réalisée d'une manière très avantageuse par incubation dans une solution tampon de borate ayant un pH = 7,6 et à une température de 37 C. On ne possède pas d'autres renseignements sur les autres conditions réactives qui pourraient affecter la réaction d'accouplement digestif en question.
Il existe une confusion considérable dans la littérature existante concernant le sens à donner à l'expression "rendement". Plusieurs chercheurs ont déterminé le rendement en pour cent dans la réaction d'accouplement digestif qui concerne la conversion de la diiodotyrosine en thyroxine, en soustrayant de la quantité de matière de départ la quantité de diiodotyrosine récupérable et en supposant que la différence représente la diiodotyrosine capable d'entrer en réaction d'accouplement digestif.
En fait, et pour tous les buts pratiques, le rendement doit être calculé par rapport à la quantité initiale de diiodotyrosine employée. Tous les rendements mentionnés ci-après sont calculés de cette manière. Ce calcul peut représenter une différence appréciable avec les rendements signalés par les divers chercheurs qui ont utilisé l'autre méthode de calcul; par exemple seon le brevet U.S.A., n .435.947. le rendement net maximum de thyroxine obtenue dans les conditions d'incubation optimum a été de 2,8%.
Un nouveau calcul basé sur la quantité totale de départ de diiodotyrosine a donné un rendement brut de 0,85% seulement.
La seule étude publiée concernant la réaction d'accouplement digestif concernant la conversion de la N-acétyle-diiodotyrosine en N-acétylthyroxine a été basée sur le même type de calcul du rendement que celui décrit ci-dessus, c'est-à-dire, que le rendement net maximum dans les conditions optimum était de 27%, tandis que le rendement brut qui doit être employé pour comparaison avec nos propres données du rendement, a été de 3,6%. De plus, la durée requise pour cette réaction d'accouplement a été de 12 jours.
<Desc/Clms Page number 2>
L'un des objets spécifiques de la présente invention est de pré voir un procédé pour la production de N-acétyle-L-thyroxine, dans lequel la durée requise pour la réaction est réduite de 12 jours à moins de 96 heures, tout en réalisant un rendement de 15 à 20%. Un autre objet, plus général, de l'invention est de prévoir un procédé dans lequel la réaction d'accouplement digestif par laquelle la N-acétyle-diiodotyrosine donne la N-acétylthyroxine, est réalisée en un laps de temps beaucoup plus réduit, par l'emploi de concentrations optimum de catalyseurs, de conditions optimum de température, et de limites optimum du pH.
Un autre objet est de faire usage dans ce procédé d'oxygène pratiquement pur en combinaison avec une concentration optimum de catalyseur, des conditions optimum de température et de limites optimum de pH et d'une durée de réaction optimum choisie. Un autre objet encore de l'invention est de prévoir un procédé perfectionné pour la préparation de la L-thyroxine et de la D-thyrcxine en partant respectivement des isomères L et D de la N-acétyldiiodotyrosine avec une nouvelle combinaison de phases du procédé, qui augmente fortement le rendement dans un laps de temps minimum.
D'autres objets spécifiques et avantages de l'invention apparaîtront de la description qui suit.
Certaines phases du procédé selon l'invention sont illustrées dans le dessin ci-joint, dans lequel ;
Fig. 1 est un diagramme montrant par une courbe le pourcent du rendement en N-acétylthyroxine pour diverses valeurs du pH, et
Fig. 2 est un diagramme similaire montrant par des courbes le pourcent du rendement en N-acétylthyroxine pour diverses durées de la réac- tion.
Suivant un mode de réalisation de l'invention, on met en suspension la N-acétyldiiodotyrcsine dans une solution d'acide borique et la matière solide est dissoute par de l'hydroxyde de sodium, en réglant de préférence le pH à environ 7,0 - 11,0. On ajoute jusque 50% en poids d'un catalyseur, tel que le sulfate de manganèse, l'oxyde de manganèse ou autres sels de manganèse, et on chauffe la solution jusqu'à environ 37 à 65 C durant une période allant jusque 96 heures. Après ce laps de temps, on recueille le sel sodique de la N-acétylthyroxine qui s'est précipité. On peut alors décomposer ce sel par de l'acide dilué pour donner la N-acétylthyroxine.
L'avantage économique et autres avantages réalisés par la réduction de la durée de la réaction à moins de 96 heures, suivant la présente invention, sont évidents, De plus, le procédé décrit, dans lequel on maintient des conditions optimum d'accouplement digestif, donne toujours des rendements de 15 à 20%. Le procédé permet ainsi de réaliser une production d'hormones pures, biologiquement actives, de L-thyroxine avec des rendements élevés, à l'échelle industrielle.
Ainsi qu'il a été déjà mentionné, le procédé suivant la présente invention fournit également une excellente méthode pour la préparation de la D-thyroxine. Lorsqu'on désire obtenir la L-thyroxine. la matière de départ sera la N-acétyle-L-diiodotyrosine, tandis que lorsqu'on désire obtenir la D-thyroxine, la matière de départ sera la N-acétyle-D-diiodotyrosine.
La désirabilité d'agiter le mélange de réaction d'incubation en faisant passer un gaz contenant de !oxygène (air) à travers le mélange est déjà connue, et la condition indiquée précédemment a été qu'il était seulement nécessaire d'agiter la solution digestive avec sa surface exposée à n'importe quel gaz contenant de l'oxygène. Nous avons fait des expériences dans lesquelles au lieu d'employer de l'air et au lieu de soumettre à
<Desc/Clms Page number 3>
l'air une surface de la solution, on fait barboter de l'oxygène pratiquement pur dans la solution de digestion. Lorsqu'on n'emploie pas de catalyseur ou qu'on n'en emploie que de très faibles quantités, il a été trouvé qu'il n'y avait pas de différence sensible entre les rendements;obtenus avec aération et ceux obtenus avec oxygénation.
Cependant, nous avons trouvé que lorsque la quantité de catalyseur était augmentée tout en restant entre les dites limites, l'oxygénation donnait des rendements fortement augmentés.
D'une manière analogue, nous avons trouvé que les rendements était augmentés encore davantage pour des limites choisies de température en combinaison avec emploi d'oxygène et de quantités plus fortes de catalyseur. Cette supériorité de l'oxygénation par rapport à l'aération était entièrement insoup- çonnée parce que les travaux existants, du moins en ce qui concerne la réaction d'accouplement digestif impliquant la formation de thyroxine en partant de diiodotyrosine, montraient qu'il était seulement nécessaire d'agiter la solution digestive avec sa surface exposée à n'importe quel gaz contenant de l'oxygène.
Le tableau d'essais qui suit, dans lequel la réaction d'accouplement digestif dans une solution tampon de borate ayant un pH d'environ 7,6 et dans lequel la N-acétyldiiodityrosine donne la N-acétylthyroxine, constitue la preuve des affirmations ci-dessus concernant l'aération et l'oxygénation sans,emploi de catalyseur ou n'utilisant qu'une très faible quantité de catalyseur
TABLEAU I
Comparaison entre l'air et l'oxygène
EMI3.1
<tb>
<tb> % <SEP> N-acétyleEssai <SEP> N . <SEP> Traitement <SEP> Tempa <SEP> Co <SEP> Catalyseur <SEP> thyroxine
<tb> (24 <SEP> heures).
<tb>
1 <SEP> aération <SEP> 37 <SEP> zéro <SEP> 1,1
<tb> 2 <SEP> oxygénation <SEP> 37 <SEP> zéro <SEP> 1,3
<tb> 3 <SEP> aération <SEP> 37 <SEP> 1.0% <SEP> MnSO4 <SEP> 3,0
<tb> 4 <SEP> oxygénation <SEP> 37 <SEP> 1.0% <SEP> MnSO <SEP> 5,1
<tb> 5 <SEP> aération <SEP> 50 <SEP> zéro <SEP> 2,1
<tb> 6 <SEP> oxygénation <SEP> 50 <SEP> zéro <SEP> 3.5
<tb>
EMI3.2
7 aération 50 10Q% MNSO 4 L, 0
EMI3.3
<tb>
<tb> 8 <SEP> oxygénation <SEP> 50 <SEP> 1.0% <SEP> MnS04 <SEP> 6,3
<tb>
Le tableau qui suit montre l'effet de la température dans des conditions d'oxygénation dans lesquelles on n'emploie pas de catalyseur, dans lesquelles on emploie une faible quantité de catalyseur, et dans lesquelles on emploie une grande quantité de catalyseur
<Desc/Clms Page number 4>
TABLEAU II.
L'effet de la température.
EMI4.1
% N-acétylthyroxine ¯ Essai Température Catalyseur (24 heures avec oxygena-, N . ( C.) tion).
EMI4.2
<tb>
<tb>
9 <SEP> 25 <SEP> zéro <SEP> 0,04
<tb> 10 <SEP> 37 <SEP> zéro <SEP> 0,3
<tb> 11 <SEP> 44 <SEP> zéro <SEP> 2,2
<tb> 12 <SEP> 50 <SEP> zéro <SEP> 3,0
<tb> 13 <SEP> 55 <SEP> zéro <SEP> 3,3
<tb> 14 <SEP> 60 <SEP> zéro <SEP> 0,5
<tb> 15 <SEP> 70 <SEP> zéro <SEP> 0,2
<tb>
EMI4.3
16 26 100';
MnS 4 0,8
EMI4.4
<tb>
<tb> 17 <SEP> 37 <SEP> 1.0% <SEP> MnSO <SEP> 5,1
<tb>
EMI4.5
18 44 10($ MnS04 6,0 19 50 10o,t MnS04 6,9
EMI4.6
<tb>
<tb> 20 <SEP> 55 <SEP> 1.0% <SEP> MnSO4 <SEP> 8,7
<tb>
EMI4.7
21 60 10($ MnS 4 1,1 22 70 1.Qt MnS 4 1,6 23 24 17e5% MnS04 4,7 24 37 1705% MnS04 8,5 25 44 L705% MnS04 12,0
EMI4.8
<tb>
<tb> 26 <SEP> 60 <SEP> 17.5% <SEP> MnSO4 <SEP> 13,3
<tb>
EMI4.9
27 65 1705% MnS04 10,3 28 70 1705% Mnso4 5,0
On peut voir du tableau II qu'on obtient un rendement maximum à 50-55 C lorsqu'il n'y a pas de catalyseur présent (essais 12 et 13).
En augmentant la réaction d'accouplement digestif par l'addition de catalyseur, on élargit un peu les limites permises de la température par exemple, avec 1% de sulfate de manganèse des limites de la température de 37 à 55 C sont favorables (essais 17 à 20). et avec 17,5% de sulfate de manganèse, des li- mites de la température de 37 à 65 C permettent d'obtenir de bons rendements (essais 24 à 26). Il est à noter que les publications existantes, en ce qui
EMI4.10
concerne la réaction d'accouplement digestif suivant laquelle la diiodityrp- sine donne de la thyroxine, exige une incubation à 50-70 C; cependant, la courbe de rendement révèle qu'un rendement maximum est obtenu à 60 C avec les rendements décroissant rapidement pour les limites revendiquées de 50 à 70 C.
Dans le présent procédé cependant, qui implique aussi bien l'oxygénation que l'addition du catalyseur dans une réaction d'accouplement digestif dans laquelle la N-acétyldiiodotyrosine donne la N-acétylthyroxine, des limites de la température de 37 à 65 C sont permises et de plus, les rendements sont uniformément élevés pour toute la gamma de températures. Il est par conséquent possible de préparer le produit final désiré, la N-acétylthyroxine sans la nécessité de contrôler d'une manière très attentive la température pour qu'elle reste entre des limites étroites.
Les publications existantes, en ce qui concerne du moins la réaction d'accouplement digestif dans laquelle la diiodityrosine donne la thyroxine, disent que la concentration du catalyseur employé n'est pas critique. Des résultats aussi satisfaisants les uns et les autres sont revendiqués avec
<Desc/Clms Page number 5>
des additions de catalyseur au manganèse en quantités équivalant à 0,1 jusque 20% en poids de la diiodotyrosine. Nous avons au contraire trouvé que dans la réaction d'accouplement digestif dans laquelle la N-acétylediiodotyrosine donne la N-acétyle-thyroxine, la concentration du catalyseur est critique. Il n'y a pas de publication connae dans cette technique concernant l'effet du catalyseur sur cette dernière réaction. Nos études sur la concentration du catalyseur sont illustrées dans le tableau III ci-dessous.
On doit noter que dans les conditions d'oxygénation et à une température de réaction de 44 C, comme la concentration du catalyseur est augmentée depuis une valeur initiale de 0% par degrés jusque 50% (basés sur le poids de N-acétyldiiodotyrosine employée) les rendements en N-acétyl-thyroxine obtenus augmentent progressivement en atteignant une valeur maximum de 13.4% pour une concentration de catalyseur de 17,5 à 20%, mais une concentration de catalyseur de 10% donne un rendement presqu'aussi bon. Cependant une augmentation de la concentration en catalyseur au-delà de 20% n'améliore pas le rendement (essais 29 à 36) Il est à noter qu'une concentration du catalyseur de 15,6% représente une quantité éqùimolaire, ce qui fait penser que le soi-disant catalyseur n'est en réalité qu'un réactif.
Quand on réalise à 50 C une série analogue d'expériences impliquant des augmentations par étapes de la concentration en catalyseur, on obtient des résultats très similaires (essais 37 à 42).
Si on inscrit les résultats ci-dessus sur un diagramme, on trouve que le rendement en N-acétylthyroxine augmente rapidement lorsque le catalyseur augmente jusqu'à environ 10 à 20% A environ 20%. la courbe s'aplatit et il n'y a pas d'augmentation du rendement lorsque le pourcentage en. catalyseur est augmenté au-dessus de 20% (en poids).
TABLEAU III.
Effets de la concentration en catalyseur.
EMI5.1
<tb>
<tb>
% <SEP> N-acétylthyroxine
<tb> Essai <SEP> Température <SEP> Catalyseur <SEP> (24 <SEP> heures <SEP> avec
<tb> N <SEP> ( C.)(%nSO4)oxydation)
<tb> 29 <SEP> 44 <SEP> 0 <SEP> 2,2
<tb> 30 <SEP> 44 <SEP> 1 <SEP> 6,0
<tb> 31 <SEP> 44 <SEP> 5 <SEP> 9,6
<tb> 32 <SEP> 44 <SEP> 10 <SEP> 12,0
<tb> 33 <SEP> 44 <SEP> 17,5 <SEP> 13.4
<tb> 34 <SEP> 44 <SEP> 20 <SEP> 13,4
<tb> 35 <SEP> 44 <SEP> 35 <SEP> 12,7
<tb> 36 <SEP> 44 <SEP> 50 <SEP> 13,3
<tb> 37 <SEP> 50 <SEP> 0 <SEP> 2,6
<tb> 38 <SEP> 50 <SEP> 1 <SEP> 6,9
<tb> 39 <SEP> 50 <SEP> 5 <SEP> Il.2
<tb> 40 <SEP> 50 <SEP> 10 <SEP> 11,3
<tb> 41 <SEP> 50 <SEP> 20 <SEP> 13.5
<tb> 42 <SEP> 50 <SEP> 35 <SEP> 12,4
<tb>
Il était important de savoir si l'addition de 17,5% de catalyseur (cette quantité étant connue comme donnant des rendements optimum) à la réaction d'accouplement digestif,
modifierait d'une manière quelconque la supériorité de l'oxygénation par rapport à l'aération. De plus, la possibilité d'une agitation mécanique simple, vigoureuse, pour incorporer de l'air de l'espace environnant a été examinée. Les rendements illustrés dans le tableau IV montrent d'une manière certaine que l'oxygénation donne
<Desc/Clms Page number 6>
des résultats très supérieurs.
TABLEAU IV
Comparaison e l'agitation avec l'aération et avec l'oxygénation.
EMI6.1
<tb>
<tb> Essai <SEP> n . <SEP> Conditions <SEP> % <SEP> N-acétylthyroxine <SEP> (X)
<tb> expérimentales
<tb> 43 <SEP> agitation <SEP> 5,3
<tb> 44 <SEP> air <SEP> 7,2
<tb> 45 <SEP> oxygène <SEP> 12,0
<tb>
(x) 24 heures à 44 C en présence de 17,5% MNSO4.
Le catalyseur au manganèse est de préférence du sulfate de manganèse ou autre sel de manganèse capable de fournir des ions manganèse en solution. Cependant, on pourra employer d'autres catalyseurs contenant du manganèse, tels que de l'oxyde de manganèse, etc.
Les publications existantes, en ce qui concerne du moins la réaction d'accouplement digestif dans laquelle la diiodotyrosine donne la thyroxine, indiquent que des limites du pH comprises entre 8,5 et 11,0 sont essentielles. Il a été également signalé que la réaction d'accouplement digestif dans laquelle la N-acétyldiiodotyrosine fournit la N-acétylthy- r oxine donne un rendement brut maximum de 2,3% pour un pH égal à 7,25. Des rendements plus faibles ont été obtenûs lorsque la réaction d'accoupleïnent a été réalisée en dehors des limites favorables du pH comprises entre 7,15 et 7,9.
Dans nos études sur cette dernière réaction d'accouplement, nous avons examiné le pH compris entre 6,5 et Il,0. La nature de la dépendance entre le rendement et le pH dans nos conditions d'accouplement, impliquant l'oxygénation à 44 C en présence de 17,5% de catalyseur pour des périodes de 24 heures, est illustrée dans la fig. 1 des dessins. Il est apparent qu'il y a une augmentation particulièrement rapide du rendement de N-acétylthyroxine lorsque l'accouplement pH est élevé de 7,0 à 7,6. Le rendement diminue ensuite graduellement à mesure que le pH augmente par petites quantités jusque pH = 11,0.
Quoique les meilleurs rendements soient obtenus pour un pH compris entre 7,15 et 10,0 (plus grand que 4%) et surtout pour pH = 7,6 (12 à 14%) les limites acceptables pour la réaction d'accouplement, telle que réalisée dans nos conditions optimum, est de 7,0 jusque 11,0.
Ainsi, il est possible grâce au nouveau procédé de réaliser la réaction pour des limites étendues du pH.
Dans nos diverses études nous avons montré que dans nos conditions d'accouplement optimum, le rendement en N-acétylthyroxine obtenu endéans a heures, augmente avec une augmentation de la quantité de catalyseur jusqu'à une quantité équimolaire de catalyseur. Nous avons de plus étudié l'effet de diverses concentrations de catalyseur sur le rendement en N-acétylthyroxine pouvant être obtenu lorsque la durée de la réaction se prolonge bien au-delà de 24 heures. Les résultats sont illustrés graphiquement dans la fig. 2 des dessins. Les réactions furent conduites dans des conditions im- pliquant une oxygénation avec un pH de 7,6 .et à une température de 44 C. On peut voir qu'aux diverses concentrations de catalyseur on obtient les rendements maximum en 96 heures environ.
(La période d'incubation peut aller jusque 150 heures.). Le meilliur rendement est encore obtenu avec au moins
<Desc/Clms Page number 7>
une concentration équimolaire de catalyseur (19,5% de rendement pour une concentration de catalyseur de 17.5%) Pour les concentrations de cataly- seurs décroissant par étapes depuis une quantité équimolaire, les rende- ments en N-acétylthyroxine diminuent progressivement, mais les maxima se produisent encore après environ 96 heures. On peut voir des courbes que la plus grande partie de la N-acétylthyroxine pouvant être obtenue, se forme dans les premières 48 heures et que le taux de formation diminue dans les 48 heures qui suivent.
Pour les durées de digestion au-delà de 96 heures, le rendement en N-acétylthyroxine descend précipitamment, ce qui est probablement dû à une réaction de décomposition secondaire.
Plusieurs expériences incorporant les meilleures conditions décrites ci-dessus, ont été faites. A une température de 44 C; avec un pH de 7,6, une concentration de catalyseur de 17,5% et dans des conditions d'oxygénation, on obtient des augmentations par étapes du rendement par rapport au tempsl, atteignant un maximum de 15 à 20% en moins de 96 heures.
Ainsi, pour la première fois. on dispose d'une méthode d'accouplement digestif fournissant une méthode pratique de production de l'hormone importante constituée par la thyroxine.
Suivant une expérience typique, 9,5 gr de N-acétyle-L-diiodotyrosine ont été mis en suspension dans 100 ml. d'acide borique (H3BO3) à 0,05 M et la matière solide a été dissoute en réglant le pH jusque 7,6 avec NaOH (de l'hydroxyde de sodium) 2N. Une quantité en poids de 17,5% de sulfate de manganèse fut ajoutée et la soluuin fut chauffée à 44 C dans des conditions d'oxygénation. Après environ 24 heures d'incubation, on a recueilli le sel sodique de la N-acétyle-L-thyroxine qui s'est précipité. Le sel a été décomposé au moyen d'acide dilué pour donner 1,08 gr. (13,4%) de produit (exprimé en N-acétyle-L-thyroxine pure).
Dans une autre expérience typique, 37.0 gr. dé N-acétyle-Ddiiodityrosine ont été mis en suspension dans 400 ml. d'acide borique (h3BO3) à 0.05 M et la matière solide a été dissoute en réglant le pH à 7,6 au moyen de NaOH (hydroxyde sodique) 2N Une quantité en poids de 17,5% de sulfate de manganèse fut ajoutée et la solution fut chauffée à 44 C dans des conditions d'oxygénation. Après une incubation d'environ 48 heures on a recueilli le sel sodique de N-acétyle-D-thyroxine qui s'est précipité.
Le sel fut décomposé au moyen d'acide dilué pour donner 3,73 gr. (12%) de produit (exprimé en N-acétyle-D-thyroxine pure).
Tandis que dans la spécification qui précède, nous avons donné des exemples spécifiques du procédé avec de nombreux détails, afin d'illustrer divers modes de réalisation de l'invention. il est bien entendu qu'on peut faire varier de nombreuses manières ces détails sans sortir de la portée de l'invention.