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" SEPARATION D'ANTIBIOTIQUES DES IMPURETES DE BOUILLIES
DE FERMENTATION ".
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La présente invention est relative à un pro- cédé de séparation,d'isolement et de purification d'an- tibiotiques, en particulier ceux.du groupe de la tétra-. cycline y compris la chlorotétracycline, la tétracycli-
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.ne, ltoxytétracycline, et la bromotétracycline qui con- tiennent des.impuretés des bouillies de fermentation et elle est relative en particulier à la séparation de 'ces antibiotiques d'avec un précipitant organique à partir de suspensions et de solutions aqueuses en conte- nant.
Les bouillies de fermentation et les premier:, stades de purification de bouillies de fermentation impliquent la présence, d'un groupe vague et inconnu d'impuretés qui réagissent les unes avec les autres et avec les antibiotiques de manière assez indéterminée en provoquant fréquemment des difficultés dans la sé- paration des phases. En'présence des impuretés de bouillies de fermentation, il est fréquemment diffici.. le de séparer une forme précipitée de l'antibiotique d'avec une phase aqueuse. Il était nécessaire d'utili ser un appareil centrifuge ou de grandes quantités d'u. adjuvant de filtration pour obtenir une séparation.
Au point de vue du laboratoire,.' la filtration et la- centrifugation sont souvent considérées comme étant
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des opérations interchangeables. Toutefois,,en-prati- que industrielle à grande échelle, il est souvent plus intéressant de pouvoir filtrer une suspension plutôt que de la centrifuger. Malheureusement, dans le raf- finage des antibiotiques, une séparation facile est une exception à la règle.
On a trouvé,selon l'invention, que l'addi-
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tion d'une faible proportion d'un polyélectrolyte poly- mère synthétique à une suspension contenant un sel pré- cipitant organique amorphe insoluble de l'antibiotique provoque une agglomération de la phase solide finement divisée. En conséquence, la vites,se de précipitation des matières solides est fortement'accélérée, ce qui permet la séparation des phases solides et liquides à l'aide d'appareils centrifuges à grande capacité et à faible vitesse que l'on trouve dans le commerce ou de filtres. Cette action d'agglomération est si marquée et la consistance physique de la phase solide est si modifiée qu'il est possible d'effectuer la séparation par filtration plutôt que par centrifugation à grande densité.
Ces effets sont importants au point de vue économie en rendant possibles des opérations considé- rées jusqu'ici comme impraticables, ce qui donne une écohomie sensible. Les agents floculants constitués par des polyélectrolytes polymères synthétiques, con- venant pour la présente invention, ont déjà été utili- sés dans les engrais, les produits de conditionnement de sol, des boues d'addition pour le forage, et d'au- tres applications. Un groupe de polyélectrolytes po- lymères de ce genre est décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 2.625.471 du 13 janvier 1953.
La description et les exemples de ce brevet indiquent tout au long certains des agents floculants de ce gen- re convenant pour aider à la séparation en phases des antibiotiques d'avec une suspension aqueuse. Parmi ce; agents se,trouvent les composés polymères synthétiques.
.qui sont des polymères de l'acide acrylique, des sels des polymères de l'acide acrylique, des sels de poly- mères hydrolysés d'acrylonitrile, des polymères hydro- lysés d'acrylonitrile, des polymères de l'acide métha-
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crylique, des sels de polymères de l'acide méthacrylique, des sels de polymères hydrolysés de méthacrylonitrile, des polymères hydrolysés de méthacrylonitrile, dès sels de copo- lymères d'acides polycarboxyliques non saturés et d'au moins 'un autre monomère monooléfinique, des copolymères d'acides polycarboxyliques non saturés et d'au moins un autre monomè- re monooléfinique, des sels de copolymères hydrolysés d'an- hydrides d'un acide polycarboxylique non saturé et d'au moins un autre monomère monooléfinique,
des copolymères hy- drolysés d'anhydrides d'un acide polycarboxylique non satu- ré et d'au moins un autre monomère monooléfinique, des sels de copolymères d'esters alkylique partiel d'acides polycar- boxyliques non saturés et d!au moins un autre monomère mono. oléfinique, des copolymères d'anhydrides d'acides dicarboxy liques non saturés et d'au moins un autre monomère monoolé- finique, des.copolymères des esters d'alkyle partiel d'acide polycarboxylique non saturé et dtau moins un autre monomère monooléfinique-, des sels de polymères sulfonés d'hydrocar- bures dont la partie aliphatique n'est pas saturée, des po- lymères sulfonésd'hydrocarbures dont la partie aliphatique n'est pas saturée,
des polymères d'aminé dont la partie ali- phatique n'est pas saturée, et des polymères d'amides dont la partie aliphatique n'est pas saturée, ces composés poly- mères provenant sensiblement complètement d'une polymérisa- tion oléfinique.' Il est préférable que le poids moléculaire moyen de ces composés soit d'environ 10.000 et de préférence ne dépasse pas environ 250.000. Ces agents floculants constitués par un polyélectrolyte polymère synthétique sont souvent solubles relativement lentement dans l'eau et on ne peut y ajouter des matières telles que de la terre de dia- tomées, de sorte que ces agents floculants coulent plus facilement à .......
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l'état sec et puissent être conditionnés sous forme de flocons.
On peut ajouter ces agents floculants à l'état acide mais on les ajoute plus commodément comme produits de réaction avec des bases. Des esters de polyoxyalky- lène des acides gras, contenant de 8 à 22 atomes de carbone dans la moitié acide peuvent également être ajoutés pour augmenter la solubilité et la facilité de manutention de ces agents floculants consistant en un polyélectrolyte polymère synthétique.. -
Ces agents ne sont en général solubles dans l'eau que lentement et à moins d'être sous forme de flo cons avec une matière de dispersion appropriée telle que de la terre de diatomées ou de l'argille il faut beaucoup de temps pour les dissoudre.
En conséquence, alors qu'on peut ajouter ces agents floculants consti- tués par un produit électrolyte polymère synthétique sous forme solide à la suspension aqueuse de l'antibio- tique, il est en général préférable qu'un agent de ce genre soit ajouté en solution aqueuse. Une solution à 0,5 % est une concentration commode à utiliser. La concentration peut varier d'environ 1/10 de cette va- leur jusqu'à la limite de solubilité de l'agent flocu- lant ou bien cet agent peut en fait être en suspension partielle.' Une solution plus diluée,de l'agent flocu- lant augmente inutilement le volume de la suspension aqueuse à manutentionner et les suspensions concentrées de cet agent floculant entraînant des difficultés méca.. niques de manutention.
D'autres agents floculants tels que la car- boxyméthylcellulose ou des produits naturels tels que la pestine, la gélatine, l'extrait d'algine, ou la moussa d'Irlande, etc.. sont utilisables mais la sépa- ration de phases en présence des agents floculants
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contenant un polyélectrolyte polymère synthétique est plus commode et économique. -
Parmi les matières que l'on peut trouver dans le commence, on a :
les copolymères d'acétate de vinyle et d'anhydride maléique, vendus sous le nom de "VAMA" par la Monsanto Chemical Uompany; une préparation brute contenant un sel de calcium d'un copolymère d'acétate de vinyle et d'anhydride maléique vendue sous le nom de "KRILIUM", ces deux produits ayant un poids molécu- laire de 50.000 environ, le "KRILIUM" comporte et un agent de mélange qui aide la dispersion du copolymère d'acé- tate de vinyle et d'anhydride maléique,et un polyacry- late de sodium ayant un poids moléculaire d'environ 75.000 avec environ 70 % des groupes de nitrite hydro- lysés avec de la terre de diatomées comme charge qui est vendu sous le nom de "AEROTIL" par l'American Cyanamid Company.
Les compositions exactes de ces pro- duits du commerce ne sont pas nécessairement constantes mais les types commerciaux conviennent pour la présen- te invention.
On peut utiliser d'autres façons de faire, telles que lé chauffage de la suspension ou la modifi- cation du pH en.combinaison avec ces agents floculants à polyélectrolyte polymère pour aider à leur action.
La forme de l'agent floculant constitué par un polyélectrolyte polymère synthétique, c'est-à- dire le degré auquel la composition acide du polyélec- trolyte a été neutralisée par une base alcaline solu- ble, telle que le sodium, le potassium, le calcium, l'ammoniac, etc.. n'est pas important au fait que le pH de la solution au moment de la séparation des pha- ses est réglé normalement à une valeur optimum déter- minée et que dans le réglage du pH, il s'effectue une
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compensation en ce qui concerne l'effet de l'agent floculant constitué par un polyélectrolyte polymère synthétique sur le pH de la suspension de l'antibio- tique.
Etant donné que l'agent floculant,ci-dessus aide à la séparation d'un certain nombre de formes in- solubles de l'antibiotique d'avec une phase aqueuse ,les contenant, on a trouvé que les agents floculants sont particulièrement intéressants en combinaison avec la séparation des antibiotiques du groupe de la tétra- cycline sous forme d'un sel avec un sulfate et un sul- fonate précipitants. On augmente la pureté de l' antibiotique par séparation en présence d'un agent de chélation d'un métal lourd dont le pU pour le calcium est d'au moins 7.
Le précipitant actif par surface peut être un dérivé d'un acide sulfonique organique ou un sul- fate du type R-On-SO2OH dans lequel 0 est zéro ou un et R est un groupe hydrophobe. Le groupe hydrophobe, comme classification commode, peut tre donné comme étant un groupe qui, s'il est attaché à l'hydrogène pour former la molécule R-H a une solubilité dans l' eau inférieure à environ 2% et de préférence inféri- eure à environ 0,25 %. Le poids moléculaire de ces dérivés est généralement au moins 200 et il est assez faible pour que le dérivé soit au moins partiellement soluble dans l'eau.
Les dérivés de l'acide sulfurique organique anionique sont fréquemment vendus dans le commerce comme les sels de sodimm. On peut utiliser un autre métal alcalin, l'ammoniac, ou des sels d'aminé aussi bien que la forme d'acide libre, suivant ce que l'on trouve dans le commerce. En solutions ces formes
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s'ionisent de sorte que suivant le pH de la solution, l'effet est le même. Au cours do l'opération, on peut modifier le pH pour compenser la forme suivant laquelle le porteur est ajouté.
On trouve dans le commerce plusieurs types de dérivés de l'acide sulfurique organiques anioniques appropriés, certains de ceux-ci étant les sulfosuccina- tes dialkyliquesà longue chaîne.. On trouve dans le commerce les sels de.sodium du di-2-éthylhexylsulfo- succinate, le di(2-p-tert-butyl-phénoxyéthyl)sulfosuc- cinate et le di-alkylsulfosuccinate avec environ 13 atomes de carbone dans chaque groupe alkyle et un mé- lange d'isomères à chaîne ramifiée. Les sulfates d'alkyle à longue chaîne en constituent d'autres. Le sulfate heptadédylique de sodium, le sulfate lauryli- que de sodium, et le sulfate 2-éthylheptyle de sodium sont vendus dans le commerce.
On a encore les suli'a- les d'alkyle contenant de 10 à 20 atomes de carbone ou des mélanges de ces corps et des acides sulfoniques d'aryle ou dtaralkyle ou dtalkylaryle contenant de 10 à 20 atomes de carbone, y compris leurs sels alcalino- rerreux, d'ammoniac et d'amine et des mélanges de ces Corps.
Parmi les produits intéressants se trouvent les sulfonates d'alkyle substitués, par exemple l'acide 2,5-dichlorobenzène sulfonique; l'acide para-xylène- Sulfonique; l'acide 4-hydroxy-azobenzène-4'sulfonique; l'acide 2,4-dinitronaphtol-7-sulfonique; l'acide 5-sul- osalicylique; l'acide 2,4-dichlorophénol-6-sulfoni- que; l'acide 2-chlorotoluène-5-sulfonique; l'acide 4-nitrochlorobenzène-2-sulfonique; l'acide 2-naphtalè- ne-sulfonique; l'acide 2,4-dihydroxyazobenzène-4'-sul- fonique et les sels de ces acides et l'huile de Rouge Turque. Ces composés se trouvent dans le commerce
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sous un certain nombre de noms. Ils sont vendus sous ceux de Kreelon, Santomerse, Ultrawets, Igepons, Tergi- tols, Nacconols, Aérosols, ou autres.
L'agent de chélation d'un métal lourd dont le pK pour le calcium est d'au moins environ 7 est un com- posé tel que l'acide éthylènediaminé. tétraacétique;
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l'acide triméthylène-diamino tétraacétique; l'acide trinitrilotriacétique; l'acide Iv. (2-.hydroxyéthyl) éthy1èned;(smine.. N,l"tP-triacétique; l'acide 1,2-dam1- nocyclohecane-1,N,iYt,N-tétraacétique; l'acide dipro- pyléne-1,2-triamine, pentaacétique; l'acide l3-diami no-2-propanoltétraacétique; l'éther 2-biscboxy- méthyl)aminojéthyl:ique; le bis 2-(N,N-carboxyméthyl), mino-éthoxy-7éthanej l'acide 2-aminoéthylphosphonique; l'açide N,N,diacétique; l'acide aminobarbiturique, lita- cide iV,N,diacétique; l'acide 1.2-propylènedîamine té- traacétique; l'acide diéthy1ènetriamine-pentaacétique et les sels alcalins, d'amines et d'ammonium de ces acides.
La vitesse de floculation et la facilité de séparation des sels de l'antibiotique avec le précipi- tant en l'absence de l'agent de chélation sont nette- ment améliorées par l'addition des agents floculants
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Contenant du polydtectrolyte polymère synthétique.
La gamme de pH dans laquelle peut se faire la séparation est assez étendue, allant d'une:valeur inférieure à 2 à plus de 10. La gamme préférée dépend de l'antibiotique, 'du support et de l'agent de chéla- tion. Une gamme de pH d'environ 5 à 8 est une gamme opératoire commode. On opère de préférence en présence d'une quantité de l'agent précipitant constitué par du sulfate ou du sulfonate assurant la réaction avec tout l'antibiotique dans un rapport stoéchiométrique. Il
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est bon d'avoir un excès suffisant pour réagir aussi avec les impuretés qui peuvent être présentes.
La quan tité de l'agent de chélation est de préférence suffisan te pour réagir avec les impuretés qui sont présentes afin de les retirer de l'antibiotique et de libérer ce dernier pour qu'il réagisse avec le'précipitant. La quantité préférée dépend de la quantité présente plutôt que de la quantité d'antibiotique.
Environ 25. ce par litre de bouillie raffinée d'une solution à 0,5 de l'agent floculant constitué par un polyélectrolyte polymère synthétique donne de très bons résultats quoique un cc soit suffisant pour donner une amélioration dans la vitesse de précipita- tion et une quantité allant jusqu'à 250 cc aide à la séparation.
L'invention est intéressante pour la sépara- tion des antibiotiques du groupe de la tétracycline d'avec la bouillie de fermentation mais elle est par- ticulièrement intéressante pour le raffinage des anti- biotiques produits par l'organisme Streptomyces Aureo- faciens y compris la chlorotétracycline, la tétracycli
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ne et 1:a.bromotétracycline.
Les exemples ci-dessous indiqueront certai- nes caractéristiques de l'invention mais rie seront limitées en aucune façon.
EXEMPLE 1
On a réglé à 1,5 au moyen d'acide sulfuri- que le pH de 3 litres de bouillie de fermentation provenant d'une culture'de S.aureofaciens et contenant .de la chlorotétracycline. On a ajouté 60 g de terre de diatomées (Hyflo). On a agité le mélange et on a filtré. On a mis en bouillie le gâteau au moyen de 3 1. d'eau, on a réajusté le pH à 1,5 avec de l'acide
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sulfurique à 25 % et on a filtre à nouveau. On a com- biné les deux filtrats. Les filtrats combines conte- naient 1520 microgrammes de chlorotétracycline par cc.
A 5 litres des filtrats combinés, on a ajou- té 15 g d'une qualité commerciale du sel de,sodium de l'acide éthylènediamine tétraacétique (Versene). On a réglé le pH avec de la soude 10 normale, à 3,5 ce qui nécessite environ 20 cc. On a ajouté 18 ce d'une qualité commerciale du sel de sodium du di-2-éthylhe- xylsulfosuccinate (Aérosol OT), on a agité le mélange pendant 20 minutes et on a ajouté davantage de soude
10 normale pour avoir un pH de 7,0 ce qui a nécessité environ 25 cc.
On a ajouté 100 cc d'une solution à
0,5 % de copolymère d'acétate vinylique et d'anhydride maléique provenant de la polymérisation en portions molaires égales, avec un poids moléculaire d'environ 50.000 (vendus dans le commerce par la Monsanto Chemi- cal Company sous le nom de "VA MA" et on a laissé pré- cipiter le mélange.
Au bout de 2 heures, on a enlevé par siphon- nage 4 litres du liquide se trouvant au-dessus. Au résidu, on a ajouté 5 g de terre de diatomées, on a agité le mélange pendant 10 min., puis on a filtré dans un entonnoir Buchner enduit de 5 g de terre de diatomées. On a agité le gâteau de filtrage ainsi ob- tenu et on y a ajouté de l'acide chlorhydrique 6-Nor- mal jusqu'à ce que le pH soit de 2,0, ce qui a nécessi- té 5 ce. On a filtré à nouveau le mélange. On a dis- sout le gâteau de filtration acidifié dans 48 cc de 2-éthoxyéthanol. On a filtré la solution dans le 2-éthoxyéthanol dans un entonnoir Buchner et on a lavé le gâteau à l'aide de 12 ce de 2-éthoxyéthanol.
On a combiné les filtrats et on a ajouté do l'acide chlor-
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hydrique concentré pour avoir un pH de 0,5, ce qui a demandé environ 3 cc. On a ajouté à la solution 0,8 g de chlorure de sodium et on a agité le mélange pendant trente-six heures pour provoquer une cristallisation . complète. Les cristaux de chlorhydrate de chlorotétra- cycline formés ont été séparés par filtration, on a lavé successivement avec du 2-éthoxyéthanol, de l'eau, 'et de l'éthanol et on a séché. Les cristaux, à l'ana- lyse 960 microgrammès par milligramme, avaient un coefficient d'extinction de 0,334 à 460 millimicrons
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et ils étaient recouverts.diune quantité totale de 66% ,de bouillie de fermentation.
EXEMPLE2
Trois parties aliquotes de 500 cc de filtrat de bouillie acide et de produit de lavage préparées comme dans l'exemple précédent, et contenant 1. 520 microgrammes par cc de chlorotétracycline ont été trai. tées chacune par 1,5 g d'une qualité commerciale d'un sel de sodium de l'acide éthylènediaminetétraacétique.
On a réglé le pH de chacune d'elles à 3,5 avec de la soude-10 Normale et à chacune on a ajouté 3 cc du sel
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de sodium dU-di-2-éthYlheXYlsuliosuccinate de qualité commerciale. On a agité les mélanges pendant 20 min., et on les a réglés à un pH de 7, 0 au moyen de soude.
La première partie aliquote a servi comme contrôle.
A la deuxième partie on a ajouté 12,5 cc d'une solution à 0,5 % de "KRILIUM" (un copolymère d'acétate vinylique et d'anhydride maléique de qualité commerciale, ayant un poids moléculaire de 50.000 en- viron et contenant une charge inerte du type de l'ar- gile).
A la troisième partie aliquote, on a ajouté
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12,5 cc d'une solution à 5% d' "Aerotil" (un polymère
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1 d'acrylonitrile hydrolyse à 70 %, se trouvant dans le commerce, dont le poids moléculaire est d'environ 75.000 et qui contient de la terre de diatomées comme charge). On a agité chacune dès parties et 'on les a mises simultanément dans des cylindres contenant 500 cc et;on les a laissé déposer.
On a constaté que les ni- veaux supérieurs des matières déposées étaient de
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<tb> Temps <SEP> de <SEP> dépôt <SEP> en <SEP> Volume <SEP> des <SEP> précipités
<tb> min. <SEP> partie(l) <SEP> partie <SEP> (2) <SEP> partie(3,
<tb>
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--¯¯¯-----------------¯-----..¯¯-------------------------
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<tb> 2 <SEP> 500 <SEP> cc; <SEP> 260 <SEP> cc <SEP> 375 <SEP> cc
<tb>
<tb> 5 <SEP> 465 <SEP> 175 <SEP> 210
<tb>
<tb> 10 <SEP> 405 <SEP> 130 <SEP> 155
<tb>
<tb> 20 <SEP> 325 <SEP> 105 <SEP> 125
<tb>
<tb> 30 <SEP> 230 <SEP> 95 <SEP> 110
<tb>
<tb> 60 <SEP> 150 <SEP> 80 <SEP> 90
<tb>
<tb> 120 <SEP> 115 <SEP> 70 <SEP> 80
<tb>
EXEMPLE 3
On a réglé à l'aide d'environ 32,6 cc d'aci- de sulfurique à' 25%, à 1,35 le pH de 2 litres d'une bouillie de chlorotétracycline contenant 3.300 micro- grammes.par cc.
On a agité la bouillie acidifiée pen- dant 30 min., et on a filtré à l'aide de 40 g de terre de diatomées. On a mis le gâteau en, suspension dans 4 litres d'eau à 55 pendant 20 min., et on a filtré.
On a combiné les filtrats et on a refiltré. ,On a divi-,' sé le filtrat (5. 600 cc; 1.120 microgrammes par cc) en deux parties aliquotes A et B. On a réglé le pH de chacune d'elles à 3,5 avec 16,0 cc de soude 10 Nor- male. On a ajouté 8,4 g du sel de sodium de l'acide éthylènediamine tétraacétique de qualité commerciale et on a agité la solution pendant 15 min. On a ajouté 9,0 ce d'une solution aqueuse à 75% de di-2-éthyl-hexyl-
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sulfosuccinate de3 sodium et on a f1lt le rt:;l.a.E:l,;i,3 pendant 30 min. On a réglé le pH à 7,1 au moyen de 8,0 cc do soude 10 Normale.
A la partie A, on a ajouté 0,28 g d'un copo-
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lymère commercial d'éther ril5thylviliyliquc et cz' anhy- dride maléique (PVM/MA), on a agité le mélange pendant 30 min., et on l'a laissé reposer pendant 2 heures.
A la partie B, on a ajouté 0,28 g d'un copo- lymère dû-commerce d'éther méthylvinylique et de maléa- mate d'ammonium; on a agité le mélange pendant 30 min., et on a laissé reposer pendant 2 heures.
Dans les deux cas, on a décanté et on a cen- trifugé les précipités. On a réglé à 2,0 le pH du précipité centrifugé au moyen de 2,1 cc d'acide chlor- hydrique concentré, on a agité penaant 30 min., et on
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a centrifugé: On a ajouté du 2-étijoxyéthanol au préci- pité déshydraté pour porter le volume à 28 cc et on a agité le mélange pour avoir une solution complète.
On a ajouté du chlorure de sodium (0,61 g) et on a agité la solution pendant 15 min. On a réglé le.pH à 0,40 à l'aide de 2,4 cc d'acide chlorhydrique concen- tré et on a laissé vieillir pendant 24 h. On a séparé les cristaux par filtration et on a lavé successivement à l'aide de volumes de 3 cc de 2-éthoxyéthanol, eau et éthanol. On a séché les cristaux lavés sous vide pen- dant 4 h., à 40 .
La partie A a donné 2,11 g de chlorhydrate de chlorotétracycline contenant à l'analyse 935 micro-
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gr&PInaS par milligramme El, ,(0 mu 09477.
La partie B a donné 1,98 g de chlorhydrate
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de Ch1 r tétracycl)ne ayant donné à l'analyse 946 micr grammes par milligramme et Ell,.. cm, 60 zou JL.A', 460 mu '-''-* i j
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EXEMPLE 4
On a réglé à 1,4 le pH de 2 litres de bouil- lie de chlorotétracycline, contenant 4.250 microgram- mes par cc, au- moyen de 41,5 cc d'acide suif unique à
25% et on a agité pendant 30 minutes. On a filtré la bouillie en utilisant 40 g d'un adjuvant de filtration.
On a mis en 'bouillie le gâteau au moyen de 4 litres ,d'eau à 55 pendant 20 minutes et on a filtré. On a divisé en.deux parties égales A et B les filtrats com- binés contenant 5. 625 cc donnant à l'analyse 1.400 mi- crogrammes par ce. On a ajouté à chacune des parties de l'éthylènediamine tétraacétate de sodium (8,4 g) et on a réglé le pH à 3,5 au moyen de 18 cc de soude
9 Normale. On a ajouté à chacune d'elles 11,3 cc d'u- ne solution aqueuse à 75 % de di-2-éthylhexylsulfosuc- cinate de sodium et on a'agité le mélange pendant 30 minutes. On a réglé le pH de chacune d'elles à 7,2 au moyen des 11,3 millilitres de soude 9 Normale.
A la partie A, on a ajouté 42 cc d'une solu- tion à 0,5 % de copolymère d'acétate vinylique et d'anhydride maléique, on a agité pendant 10 minutes et On a laissé reposer pendant 1 heures.
A la partie B, on a ajouté 42 cc d'une solu- tion à 0,5 % de polyacrylonitrile hydrolysé à 70 % de poids moléculaire 75.000 (Aerotil), on a agité"pendant 10 minutes, et on a laissé reposer pendant 2. heures.
On a décanté et le précipité a été centrifu- gé. On a réglé à 2,0 le pH de chacun des précipités centrifugés, au moyen de 2,4 cc d'acide chlorhydrique ,concentré, on a agité pendant 30 minutes et on a cen- trifugé. Le précipité, après décantation, a été porté à 35 cc au moyen de 2-éthoxyéthanol et on a agité les mélanges pour avoir une solution complète. On a ajou-
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té du chlorure de sodium (0,7 g) et on a agité la solu- tion pendant 15 minutes. On a réglé le pH à 0,40 au moyen de 2,7 cc d'acide chlorhydrique concentré et on a laissé vieillir le mélange pendant 30 heures. On a séparé les cristaux par filtration et on a lavé suc- cessivement avec des portions de 5 cc de 2-éthoxyétha- nol, eau et éthanol.
La partie A a donné 2,71 g de chlorhydrate de chlorotétracycline contenant aux essais 962 micro- grammes par milligramme et E11 %, cm 460 mu = 0,494.
La partie B contenait 2,63 g de chlorhydrate de chlorotétracycline contenant aux essais 971 micro-
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grammes par milligrammeel 1 Cm 460 mu - 0,478.
EXEMPLE 5
On a acidifié 2 litres d'une bouillie de chlorotétracycline contenant aux essais 5. 100 micro- grammes par cc pour lui donner un pH de 1,5, au moyen de 46,5 cc d'acide sulfurique à 25 %. On a agité' la bouillie pendant 30 minutes et on a filtré en utili- sant 40 g d'un adjuvant de filtration à terre de diato- mées., On a mélangé le gâteau avec 4,0 litres d'eau à 55 , on a agité pendant 20 minutes et on a filtré. Les filtrats combinés, 5,92 litres, titrant 1.550 micro, grammes par ce ont été divisés en deux parties égales A et B. On a ajouté à chacune d'elles 9 g du sel de
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scdium de l'acide "'(2hYdr XYéthYl)éthylénl-diamine, N,N,Nt-triacétique et on a agité les solutions pendant 10 minutes. Le pH de la partie A a été réglé à 2,5 à l'aide de 6,5 cc de soude 9 Normale.
On a réglé le pH -de la partie B à 3,5 avec 15,2 cc de soude 9 Normale.
On a ajouté à chacune d'elles 9,88 g du sel de sodium de di-2-éthylhexyl-sulfosuccinate et on a agité les mélanges pendant 30 minutes. On a ajouté 15 cc d'une
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solution aqueuse à 4,5 % du copâ . x ra' d ;'ir , nh f k; if i'tlv 4 x - ' Y ¯Fcw"e vinylique et d'anhydride maléique et on a continué à
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..tE .F. ',> ,'" agiter pendant 15 min. On a laies6,ropbeerlla partie A pendant 2 h. On a réglé le pH de la partie B à 10,1 j l'aide de 2lu8 ce de soude 9 Normale ei'µé a laissé reposer le mélange pendant 2 h. On a décanté et on a centrifugé les précipités. On a réglé'le pH de ces ' précipités centrifugés à 2,0 au moyen d'acide chlorhy- drique et on a centrifugé.
Les précipités lavés à
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l'acide ont été dissous dans du 2-6thoxyé thano'l et on réglé les volumes à 41.ce avec du 2-éthô,yéthano,.
On a ajouté du chlorure de sodium (123 g) à chaque partie et on a agité les solutions pendant 10 min ;
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a réglé le pH à z0 au moyen de 2,9 oc d'acide chior- onhydrique 12 Normal et on a laissé reposer pendant 30 H.
On a séparé les cristaux par filtration, on a lavé successivement avec des portions de 5 cc de 2-éthoxy-.
. éthanol, d'eau et d'éthanol et on a séché sous vide à 40 .
La partie A a donné 2,52 g de chlorhydrate
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de.chloxotétracycline titrant 910 mierogrammes par milligramme de El 1 , cm 160 mu 0,471.
La partie B a donné 3,75 g de chlorhydrate de chlorotétracycline, titrant 890 microgrammes par
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milligramme Ei m mu 0'l$.
EXEMPLE 6
On a réglé 600 ce d'une bouillie de tétracy= cline'à un pH de 1,5, au moyen, d'acide sulfurique 18
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Normal, On a agité pendant 1/2 Hf, on a mélangé avec z12 g de terre de diatomées, on a chauffé à 550 et'on immédiatement filtré, On a rincé le gteau ai"rvtnoyara de 120 ce d'eau et on à filtré à nouveau les filtrats combinés après avoir laissé reposer pendant 16 H. Dans
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un appareil réfrigérateur. On a réglé le pH à 2,9, on a ajouté 16 g d'éthylènediamine tétraacétate de sodium en agitant puis 7 g du sel de sodium d'acide dodécyl- benzène sulfonique brut ("Ultrawet K"). On a continué à agiter pendant 1 H.
On a réglé le pH à 6,5 on a ajou té 50 g de chlorure de sodium et 14 cc d'une solution aqueuse à 0,5'% d'un copolymère d'acétate de-.vinyle et d'anhydridemaléique (qualité commerciale "KRILIUM") et on a continué à agiter pendant encore 1 H. On a centrifugé la suspension, séparé les produits solides et séché sous vide.ce qui a donné le sel de tétracycli- ne de l'acide dodécylbenzènesulfonique. Les matières solides séchées sous vide représentaient 70 % de l'ac- tivité de la bouillie et avaient une pureté de 28 % d'après l'analyse microbiologique.
REVENDICATIONS 1. Procédé de séparation des antibiotiques que constituent la chlorotétracycline, la tétracycline, l'oxytétracycline, et la bromotétracycline, des impu- retés d'une bouillie de fermentation, dans lequel pro- cédé on sépare la phase solide de la phase aqueuse d'une suspension aqueuse d'une forme insoluble de cet antibiotique en présence d'un agent floculant contenant un polyélectrolyte polymère synthétique soluble-dans l'eau, ayant un poids moléculaire moyen d'au moins 10.000 et une structure provenant de la polymérisation sensiblement linéaire d'au moins un composé monooléfi- nique dans le groupe aliphatique non saturé.