Page 40, ligne 3 du paragraphe A# du résumé, il y a lieu d'ajouter "aqueux" après nutritif".
**ATTENTION** fin du champ CLMS peut contenir debut de DESC **.
La présente invention se rapporte à un procédé de production de dihydrostreptomycine par fermentation et à des procédés de récupération de la dihydrostreptomycine à partir des bouillons de culture.
La dihydrostreptomycine est une substance très utile en thérapeutique en raison de son spectre antibacté- rien énergiquement et étendu, analogue à la streptomycine, et d'autre part à cause de sa moindre toxicité et de sa plus grande stabilité. On sait également que la dihydro- streptomycine, qui ressemble à la streptomycine par ses propriétés antibactériennes, est supérieure à celle-ci en raison de sa neuro-toxicité moindre. On a jusqu'ici obtenu
<Desc/Clms Page number 4>
la dihydrostreptomycine par hydrogénation du radical carbo- nylique d.e la streptomycine ; elle se trouve dans le commer- ce sous forme de sulfate ou de chlorhydrate. Ses sels sont cristallisés, incolores ou blancs, ou à l'état; pulvérulent.
Ils sont inodores ou presque, d'une saveur légèrement amère, et leurs solutions aqueuses sont lévogyres. Une solution
EMI4.1
aqueuse du sulfate cristallisé à 1 ip donne une valeur ( ct- de -88 -¯. On sait que la dihydrostreptomycine manifeste un large spectre antibacterien à la fois contre les bac-
EMI4.2
ttries gram-positives, gram-négatives et celles résistantes aux acides.
Comme on l'a dit, la dihydrostreptoiliycine a été préparée exclusivement par réduction de la streptomycine
EMI4.3
isolée du bouillon de culture de Streptomyces g,riseus,. etc. (brevet des Etats-Unis d'Amérique na 2 498 5r14\dU21 Février 1950 mais ce procédé exige une str.ptoiaycine très pure sous peine de pertes inévitables à la réduction.
On n'a publié aucun rapport sur la préparation
EMI4.4
directe de la dihydrostreptomycine par culture de micro- organisme producteurs de dihydrostreptomycine. La découver- te d'un tel procédé simplifierait la préparation de la dihy-
EMI4.5
drostreptomycine, en élèverait le rendement et en abaisse- rait le prix de rev ent.
Les études étendues effectuées sur la production des antibiotiques à l'aide ae divers microorganisines qui ont conduit à la présente invention ont donné les résultats remarquables suivants :
EMI4.6
(1) La dlLyctrostreptomycine se forme, directement dans le bouillon de culture a 'un certain microorganisme.
(2) Ce microorgonisme est une souche du type des Streptomyces.
(3) La culture ae la souche dans des conditions appropriées produit de la dihyaroetreptomycine qui
<Desc/Clms Page number 5>
s'accumule dans le bouillon de culture en quantité suffi- . sante pour être recueillie.
(4) La dihydrostreptomycine ainsi produite peut être récupérée du bouillon de fermentation.
La présente invention est fondée sur ces décou- vertes et se rapporte à un procédé de préparation de la dihydrostreptomycine, caractérisé par l'ensemencement à l'aide d'une souche productrice de dihydrostreptomycine du type des Streptomyces sur un milieu liquide et la culture de ce microorganisme dans des conditions aérobies de maniè- re à produire la dihydrostreptomyine en quantité suffisante pour être recueillie.
Selon l'invention, on peut utiliser une souche quelconque de Streptomyces à la conditions qu'elle produise de la dihydrostreptomycine. On peut par exemple utiliser à cette fin une espèce nouvelle séparée et désignée par le numéro 23 572. Cette espèce présente les caractéristiques indiquées dans le tableau suivant dans lequel le nom des couleurs marqué Rdg est tiré de "Rdigway's Color Standards and Nomenclature-
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EMI6.1
<tb> Souche <SEP> ng <SEP> 23 <SEP> 572
<tb>
<tb>
<tb> Caractéristiques <SEP> de <SEP> culture
<tb>
<tb>
<tb> Dév.
<SEP> Mycélium <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb>
<tb> Milieu <SEP> mycelium <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb>
<tb> spores
<tb>
<tb>
<tb> Agar <SEP> de
<tb>
<tb> Czapeck <SEP> Incolore <SEP> Blanc <SEP> Néant
<tb>
<tb> Glucose-aspara- <SEP> Blanc <SEP> à <SEP> Néant <SEP> Abondamment <SEP> entremêlé
<tb>
EMI6.2
gin.e.-agas Incolore gris fumée de petites tachetures
EMI6.3
<tb> (Rdg <SEP> XXX, <SEP> noires <SEP> moîtes <SEP> qui <SEP> en-
<tb>
EMI6.4
19u-r) ou vahissent progressive-
EMI6.5
<tb> chamois <SEP> vi- <SEP> ment <SEP> toute <SEP> la <SEP> surface
<tb>
<tb> neux <SEP> (RDG <SEP> Revers <SEP> chamois-crème
<tb>
EMI6.6
iI,,171t¯d (Rdg XXX 1911-d) ou
EMI6.7
<tb> chamois <SEP> cartouche
<tb>
EMI6.8
(Rdg XXX 19't-f), deve-
EMI6.9
<tb> nant <SEP> ensuite <SEP> chamois
<tb>
EMI6.10
(Rdg XXX 19 -b)
EMI6.11
<tb> Ami <SEP> don-agar <SEP> Incolore <SEP> Blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> Revers <SEP> chamois-crème
<tb>
<tb> fumée <SEP> pâ- <SEP> Néant <SEP> (Rdg <SEP> XXX <SEP> 19"-b) <SEP> Hy-
<tb>
<tb> le <SEP> (Rd <SEP> drolyse <SEP> légère.
<tb>
EMI6.12
XLVI 2lutt -f) Galate de cal- Incoloi-e Lég blanc ï éant
EMI6.13
<tb> cium-agar <SEP> devenait
<tb> jaune <SEP> chamois <SEP> (Rdg
<tb> 19-d)
<tb>
<tb> Glycérine-ni- <SEP> Incolore <SEP> Lég. <SEP> blanc <SEP> Néant
<tb> trate-agar
<tb>
EMI6.14
Dextr6se-nïtra-
EMI6.15
<tb> te <SEP> agar <SEP> Incolore <SEP> Lég.
<SEP> blanc <SEP> Néant
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bouillon- <SEP> Incolore <SEP> Néant <SEP> Néant
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> agar
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Gélatine <SEP> Incolore <SEP> Néant <SEP> Néant <SEP> Liquéfaction <SEP> modérée
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Tranche <SEP> de <SEP> Incolore <SEP> Blanc <SEP> à <SEP> Néant <SEP> Tachetures <SEP> noires
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pomme <SEP> de <SEP> gris <SEP> fu- <SEP> moites
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> terre <SEP> mes <SEP> (Rdg
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> XLVI <SEP> 21"
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> "-d)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Tranche <SEP> de <SEP> Incolore <SEP> Blanc <SEP> à <SEP> Néant
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> carotte <SEP> gris <SEP> fu-
<tb>
EMI6.16
mé e (reg
EMI6.17
<tb> XLVI <SEP> 2111
<tb> "-d)
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> Incolore <SEP> Blanc <SEP> à <SEP> Néant <SEP> Partiellement <SEP> humilevure-agar <SEP> gris <SEP> sa- <SEP> difié
<tb> le <SEP> (Rdg
<tb>
EMI6.18
XLVI 1 ?il !
EMI6.19
<tb> "-b)
<tb>
<tb> Oeuf <SEP> entier <SEP> Incolore <SEP> Blanc <SEP> Néant
<tb>
<Desc/Clms Page number 7>
Caracteristiques de culture
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<tb> Milieu. <SEP> Dév;
<SEP> Mycélium <SEP> Pignent <SEP> Remarques
<tb>
<tb>
<tb> mycélium <SEP> aérien <SEP> et <SEP> soluble
<tb>
<tb> spores
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Laie <SEP> Incolore <SEP> Blanc <SEP> Néant <SEP> Peptonisation <SEP> lente
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Asparaginate <SEP> Incolore <SEP> Blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> Néant
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> glycérine <SEP> fumée <SEP> (Rdg
<tb>
<tb>
<tb> -agar <SEP> XLVI <SEP> 21""-d)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Peptonne-bouil-
<tb>
<tb> lon <SEP> nitrate <SEP> Réduction <SEP> du <SEP> nitrate
<tb>
Le mycélium aérien de cette souche montre des spirales, 0, 8, 1,2 , des conidies ovales 1-1, 5 Ux 1, 2 - 2 ou
L'utilisation du carbone par la souche n 23 572, mesurée par la méthode de Pridham est la suivante :
EMI7.2
<tb> d(+)-xylose <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> l(+)-arabinose <SEP> +++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> (+) <SEP> -rhammose <SEP> +++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d-fructose <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d-galactose <SEP> +++ <SEP> - <SEP> = <SEP> pas <SEP> de <SEP> développement
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> saccharose <SEP> - <SEP> + <SEP> = <SEP> développement <SEP> médiocre
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Maltose <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> = <SEP> assez <SEP> bon <SEP> développement
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Lactose <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> = <SEP> bon <SEP> développement
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d(+)
-raffinose <SEP> - <SEP> ¯ <SEP> = <SEP> développement <SEP> douteux
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Inuline
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d-manni <SEP> te <SEP> ++¯
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d-sorbite
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> dulcite <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> dl-inosite <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> salicine <SEP> ++
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acétate <SEP> Na <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> citrate <SEP> Na
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> témoin
<tb>
Les caractéristiques mentionnées ci-dessus mon- trent que l'espèce en cause est nouvelle ; elle a été
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
dénoaîiiée par Nakazawa et Shibata Streptowyces hwnidus.
La comparaison taxonomique de cette espèce avec Streptomyces hygroscooicus. dont ,les propriétés sont voisines; est nentrée ar le tableau suivant.
Comparaison de Streotomyces. humidus et de Streptomyces Hygroscopi eus
EMI8.2
St. humiuus St. hygroscopicu
EMI8.3
<tb> Agar <SEP> nutritif <SEP> Incolore <SEP> Couleur <SEP> crème, <SEP> devenant
<tb> gris <SEP> jaunâtre <SEP> avec <SEP> revers <SEP> brun <SEP> jaunâtre
<tb>
<tb> Glucose- <SEP> Revers <SEP> chamois-crème <SEP> Couleur <SEP> crème <SEP> à <SEP> jaune
<tb> asparagine <SEP> ou <SEP> chamois <SEP> cartouche <SEP> paille <SEP> devenant <SEP> jaune
<tb> devenant <SEP> chamois* <SEP> my- <SEP> de <SEP> chrome <SEP> foncé <SEP> a, <SEP> oran-
<tb>
EMI8.4
celium aérien blanc g-brunatre. 1iycélium
EMI8.5
<tb> à <SEP> gris <SEP> fumée <SEP> ou <SEP> cha- <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> jaumois <SEP> vineux <SEP> nâtre <SEP> pâle
<tb>
<tb> Tranche <SEP> de <SEP> Incolore.
<SEP> Mycélium <SEP> Couleur <SEP> crème <SEP> devenant'
<tb> pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> gris <SEP> jaunâtre <SEP> à <SEP> brunâ-
<tb>
EMI8.6
fumée tre foncé. Ldycélium axe-
EMI8.7
<tb> rien <SEP> absent <SEP> ou <SEP> trace
<tb> de <SEP> blanc.
<tb>
EMI8.8
Streptomyces hy,:.roscopicus produit de l'hygro- scopine conformément à J. Agir. Chem. Soc. (Japon), 28. 296 (1954) et Antibiotics and Cïieirrotherapy 3 1868 (1953), de la carbomycine selon Antibiotics and Ghe1l10ther'apy ¯3, 899 (1953), ae l'e-ngstutycine conîormç !Ent à J. Aatibiotics, Japan, J7, 113 (1954) et de 1 hygrmreine selon Antibiotics and Cheinotnerapy, 1L 1S68 (1953) alors que Streutomyces humidas prouuit de la cLik.yàxostrptomycine.
La souche ci-uecsus appartenant à Streptomyces h guidas est hyroscopiqae mais certaines so uches apparte- nant à la même espèce ne mûnifcstelit pas celte propriété* Certaines tonnes ne aonnent pas de mycélium aérien et d'au- tres produisent des piments.
La souche ci-aeswas nc représente qu'un exemple des souches utilisables dans la présente invention. Les
EMI8.9
couches appartenant à atoutr;s espèces peuvent également ttre utilisccc aux lutuics fins pour- ce qui concerne la
<Desc/Clms Page number 9>
production de la dihydrostreptomycine comme produit du métabolisme, même si leurs propriétés ne ressemblent pas
EMI9.1
beaucoup à celles de Streptomyces Lmnidus raov. sp.
Comme on l'observe dans les microorganismes et en particulier les Streptomyces, leurs propriétés en milieu de culture changent facilement de manière spontanée ou provoquée. Par suite, l'identification d'une espèce est si difficile qu'une description quelconque de ses propriétés .n'en permet guère une identification précise. Ainsi, la présente invention comprend, indépendamment de l'espèce ci- dessus, ses variantes isolées du sol et ses produits de mutation obtenus à l'aide d'agents tels que les rayons X, les ultra-violets et des agents chimiques, et toute souche isolée du sol selon les découvertes de l'invention et dans la mesure où elle satisfait aux desiderata.
Les caractéristiques taxonomiques de certaines espèces mutées obtenues à l'aide de Streptomyces humidus par action des agents mutants tels que les ultra violets et la séparation des spores sont indiquées dans le tableau suivant.
EMI9.2
Produits de mutation du¯¯n8 23 572
EMI9.3
93 572 G 23 5'72 Y 23 572
EMI9.4
<tb> Glucose-asparagi- <SEP> Vert <SEP> thé <SEP> Jaune-orangé <SEP> pâle <SEP> Blanc
<tb> ne-agar
<tb>
<tb> Agar-amidon <SEP> Blanc <SEP> d <SEP> d
<tb>
<tb> Dextrose-hydra- <SEP> dg <SEP> Crème <SEP> d
<tb> te-agar
<tb>
<tb> Pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> Vert <SEP> thé <SEP> Chamois-capucine <SEP> de
<tb> puis <SEP> jaune <SEP> orangé
<tb>
<tb> Glycérine-aspara- <SEP> Blanc <SEP> Jaune <SEP> orangé <SEP> pâle <SEP> d
<tb> gus-agar
<tb>
La plupart des souches satisfaisantes pour l'invention ne
EMI9.5
ressemblent taxonomiquement pas à 8-breptouiy¯ces griseus et sont résistantes à la fois à la diliyurostr-bptouiyeine et à
<Desc/Clms Page number 10>
la streptomycine. Contrairement aux souches
productrices de streptomycine, les antibiotiques bruts obtenus à l'aide de
EMI10.1
ces - Duc--i es sont généralement négatifs à la réaction du maltol. Ces propriétés peuvent être avantageusement mises à profit pour séparer les souches désirées des autres sou- ches. Prenant par exemple pour critère les propriétés, on
EMI10.2
sé9re sélectivement les souches par dilution ou culture sur du milieu, contenant de la dihydrostreptomyoine.
L'invention montre clairement que la dihyaros trep- tomycine est produite et accumulée par la culture en milieu. liquide de ladite souche dans des conditions aérobies pen-
EMI10.3
dant un taups suffisant. Que la rlydrostreptomycine soit produite comme produit de métabolisme par culture d'un microorganistlls dans des conditions aérobies consti tue une découverte remarquable.
EMI10.4
On peut utiliser dl-iis le présent procédé les di- verses substances que l'on utilise pour la culture des microor;jcjiistji&.s en ,¯.teral. Comiiie source de carbone on uti- lise par exemple l'amidon, le lactose, le saccharose, la
EMI10.5
dexbrine, la glycérine et le maltose. Comme source d'azote, on peut avoir recours à une source organique ou minérale comme la farine de soja, l'extrait de viande, la peptone,
EMI10.6
l'arachide pulvérisée, la caséine, les amino# acides, la le- vure, le son, la liqueur de trempage du mais, la pondre de graines de coton, les nitrates, 1'urée et les composés d'ammonium.
On peut également ajouter au milieu une petite quantité de sels minéraux et de substences favorisant le développement. Comme autres sources nutritives, on utilise les mycélium d'une souche appartenant au Pénicillium ou ses bouillons de fermentation par exemple. Tout milieu de culture
EMI10.7
propre à la culture de Strep bomvces frîseus convient au présent procédé. On peut également ajouter si nécessaire
<Desc/Clms Page number 11>
un précurseur approprié.
Le milieu de culture peut être solide ou liquide- mais une culture aérobie-submergée est préférable du point de vue industriel.
Quand on utilise Streptomyces humidus comme micro. organisme producteur de dihydrostreptomycine et quand on effectue la culture dans des conditions aérobies submergées, la culture peut être de préférence conduite à une 'températu- re d'environ 24 à 30 C pendant trois à huit jours mais la température et la période doivent être réglées selon les autres conditions de culture. Bien entendu, quand on utilise d'autres microorganismes, on doit appliquer les conditions qui leur conviennent le,mieux.
La dihydrostreptomyeine ainsi produite peut être recueillie sous un état plus ou moins pur à l'aide de divers procédés physiques ou chimiques fondés sur les pro- priétés de la dihydrostreptomycine.
L'isolement de la dihydrostreptomycine d'un bouillon de culture contenant de la dihydrostreptomycine ou de sa substance traitée a été effectué pour la première 'fois par la demanderesse.
On entend ici par "récolte" ou "récupération" un moyen d'obtention de la dihydrostreptomycine sous un état variable de pureté, mais plus pur que la matière dont on est parti.
Il existe divers procédés physiques et chimiques de purification de la dihydrostreptomycine, par exemple ceux fondés sur les différences entre la dihydrostreptomycine ou ses sels et les impuretés quant à l'adsorbabilité, la solubilité, le coefficient de distribution entre deux solvants et la solidité de la liaison ionique.
Dans le cas des cultures liquides, l'accumulation
<Desc/Clms Page number 12>
de la dihydrostreptomycine atteint dix à plusieurs milliers de microgrammes par centimètre cube mais la présenta demanderesse a découvert que la dihydrostreptomycine peut être efficacement séparée même d'une solution d'environ 10 gamma par centimètre cube.
La matière peut être traitée par les procédés ci- dessus après élimination d'une partie ou de la totalité des impuretés par des procédés tels que la modification, du pH ou de la composition, la formation de sels, la précipi- tation, l'élimination des matières solides, l'adsorption et l'extraction au moyen d'un solvant.
L'isolement de la dihydrostreptomycine du bouil- lon de culture d'un micro organisme producteur de dihydro- streptomycine ou de sa substance traitée n'a jamais été signalée. Cette matière contient naturellement des impuretés diverses comme des hydrates de carbone, des substances pro- téiques, des sels, des substances animales'et végétales, des mycéliums d'autres microorganismes et leurs métabolites.
Ces impuretés comprennent les substances suivantes : Hidrates de carbone : amidon, sucres, hydrates de carbone solubles dans l'eau, etc.
Substances protéiques : amino-acides, caséine, extrait de viande, proteine, peptone, . etc.
Substances animales substances protéiques, corps gras, et végétales acides gras, lipides, celluloses, etc.
Métabolites du mi- : enzymes, substances protéiques, sucres, croorganisme alcools polyvalents, acides gras, etc.
Sels : Sels d'ammonium et d'aminés, de métaux alcalins de calcium, magnésium, fer, manganèse, cuivre, zinc, etc.
Peuvent figurer indépendamment de ces substances des compo- sés de synthèse comme l'urée.
<Desc/Clms Page number 13>
Ainsi, la composition des impuretés présentes dans la matière est très complexes mais les impuretés qui figurent dans la matière préalablement traitée varient de quantité et de qualité selon le degré et la nature du procédé appli- qué. Toutefois, dans ce dernier cas, peuvent figurer d'au- . tres impuretés telle que l'agent de réglage du pH, les agents précipitants, adsorbants, etc.
Selon l'invention, la dihydrostreptomycine est récupérée des matières par divers moyens fondés sur la dif- férence de propriétés physico-chimiques de la dihydrostrepto- mycine et des impuretés co-existantes.
Un des moyens est fondé sur la différence de solu- bilité de la dihydrostreptomycine et de ses impuretés. En culture liquide, on obtient une solution de dihydrostrepto- mycine en filtrant le boiuillage l'antibiotique s'accumulant surtout dans la partie liquis Toutefois une faible partie du composé actif figure dans la partie solide, de laquelle on peut le recueillir par un épuisement au moyen d'eau chaude. Dans ce cas les impuretes du type protéique peuvent être éliminées par réglage du pH au point isoélectrique de la protéine ou par addition de matières qui précipitent ces impuretés, en même temps, avant ou après l'enlèvement du mycélium. Si le pH du bouillon de culture est élevé, il est commode de précipiter les protéines par l'addition d'une substance acide.
Si la concentration de la dihydrostrepto- mycine dans la solution est convenable, on peut simplement précipiter l'antibiotique par l'addition d'un agent préci- pitant approprié.
Quand la concentration de la dihydrostreptomycine n'est pas suffisante, on chasse une partie du solvant par évaporation. On utilise à titre d'agent précipitant par exemple l'acide phosphotungstique, l'hélianthine, les
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acides alcoyl- ou aralcoyl-sulfoniques, les composés azoï- ques acides et les composés polyhalophénoliques. Tous ces composés forment des sels avec la dihydrostreptomycine. On peut avoir recours à de nombreux autres agents précipitants et la plupart d'entre eux sont des composés acides possédant un radical carboxylique. Dans certains cas le sel de dihydro- streptomycine ainsi formé peut être un sel double ou com- plexe. Comme on le verra, on peut également utiliser à titre d'agent précipitant une résine d'échange d'ions.
Pour accélérer la précipitation du composé actif ou des impuretés on peut, si nécessaire, effectuer un salage.
Dans le cas d'une culture solide, celle-ci est épuisée à l'aide d'eau, d'un solvant aqueux ou d'un autre solvant approprié de manière à obtenir une solution de 'di- hydrostreptomcine Si le bouillon de culture est traité au préalable de manière à donner un produit solide, celui-ci peut être traité comme ci-dessus, mais dans ce cas l'ex- traction est effectuée au pH voulu.
Un autre moyen de séparer la dihydrostreptomycine consiste à utiliser la différence d'adsorbabilité entre la dihydrostreptomycine et les impuretes. La dihydrostreptomy- cine présente dans le filtrat de culture est par exemple adsorbée par l'addition d'un agent adsorbant convenable.
On peut appliquer l'adsorption chromatographique Des adsorbants convenables sont le charbon actif, l'alumine et le gel de silice. La séparation de l'absorbant laisse la majeure partie des impuretés dans la partie liquide. On soumet alors l'adsorbant à l'élution à l'aide d'un solvant convenable, ce qui laisse sur l'adsorbant les impuretés non susceptibles d'Être enlevées par élution. L'élution est généralement effectuée à l'aide d'un solvant acide. La chromatographie assure une séparation plus précise, mais
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ce procédé exige des opérations plus compliquées.
On tire également parti pour la séparation de la différence du coefficient de répartition dans deux solvants du exposé actif et-des impuretés. On utilise comme solvant de l'eau ou un solvant aqueux et un solvant organique immiscible à l' eau. Le composé actif peut alors passer dans le solvant aqueux s'il est fortement acide. Si d'autre part les solvants sont neutres ou basiques, et.en présence d'un acide gras supérieur;) de l'acide picrique, etc., le composé actif passe dans la phase organique. Il est ainsi possible de faire passer le composé actif d'une matière dans un sol- vant organique, puis de la transférer dans de l'eau ou un solvant aqueux.
Comme solvant organique on utilise par exemple le butanol, les pentanols, les phénols, les esters d'acides gras inférieurs, la méthyl-iso-butyl-cétone, l'é- ther diéthylique et les hydrocarbures halogénés comme le chloroforme, le tétrachlorure de carbone. Ce procédé peut être conduit sous forme d'une distribution chromatographique ou en contre-co urant.
On peut également effectuer la séparation en uti- lisant la différence de solidité de la liaison ionique entre le composé actif et les impuretés. Ceci s'effectue par exemple en amenant au contact d'un échangeur d'ions une solution du composé actif. Dans ce cas, un échangeur d'anions adsorbe les impuretés anioniques en laissant le composé actif en solution, alors qu'un échangeur de cations adsorbe le composé,actif. Dans ce dernier cas, les impuretés ca- tioniques sont également adsorbées mais on réduit cet incon- vénient en utilisant un échangeur d'ions approprié.
Les résines du type acide sulfonique adsorbent aisément les im- puretés, mais les résines type acide carboxylique manifes- tent peu cette tendance. L'addition de l'échangeur d'ions
<Desc/Clms Page number 16>
peut être effectuée par charges séparées, mais l'usage d'une colonne de résine est très souvent commode. Ce procédé peut être appliqué à une solution étendue du composé actif, comme un filtrat de culture.
On peut appliquer la dialyse à l'élimination des impuretés de poids moléculaire élevé, mais ce procédé exige des opérations compliquées.
On utilise les moyens ci-dessus isolément ou associés selon la qualité de la matière et l'usage auquel est destiné le produit.'On peut effectuer d'autres opéra- tions entre, avant ou après les moyens ci-dessus. Par exemple, si la matière Est un bouillon de culture, on le filtre pour en enlever la matière solide ou les substances ' précipitées après culture. Le composé actif présent dans le filtrat est adsorbé sur un échangeur de cations, puis soumis à l'élution à l'aide d'un solvant acide. On obtient ainsi une solution concentrée du composé actif contenant une petite quantité d'impuretes. La solution est en outre concen- trée, si nécessaire, et soumise à l'adsorption chromatogra- phiquè pour éliminer la majeure partie des impuretés.
D'autre part, le composé actif présent dans la solution con- centrée peut être précipité à l'aide d'un agent précipitant approprié. Le précipité est alors dissous dans un solvant organique appropriée la solution est additionnée d'un acide et on obtient ainsi le sel correspondent de la dihydrostrep- tomycine. La cristallisation donne un sel à peu près pur.
Dans tous ces moyens, on peut appliquer des procédés tels que la filtration, le lavage, le chauffage, le refroidissement, le mélsn,je, la distillation, l'ovaporation. le séchage, isolément ou associés
Pour éviter la décomposition du composé actif, toutes les opérations sont effectuées dans des conditions
<Desc/Clms Page number 17>
qui ne soient pas exagérément acides ou basiques. On peut . chauffer si nécessaire, mais il est préférable de ne pas chauffer trop longtens Contrairement à de nombreux autres antibiotiques, la dihydorostreptomylcine est relativement stable dans le bouillon de culture, de sorte que toutes les opérations peuvent être effectuées sans difficulté.
La dihydrosteptomycinen ainsi obtenue est identi- fiée comme suit.
A- Propriétés physiques et chimiques.
1) On observe le spectre d'absorption des infra- rouges des dérivés suivants obtenus à l'aide du produit préparé par le procédé selon l'invention (dit dans la suite antibiotique 23 572) et de dihydrostreptomycine.
I. Sulfate
II. Picrate de streptidine
III. Alpha-métnyl-penta-acéthyl-dihydrostrepto- biosaulinide.
Comme le montrent les dessins annexés, c'est-à- dire les figures 1, 2 et 3 correspondant respectivement aux. composés I, II et III, tous les spectres sont en accord complet avec ceux des échantillons authentifiés. Dans ces dessins, le spectre en ligne pleine est celui du dérivé de l'antibiotique 23 572 et le spectre en ligne pointillée celui d'un dérivé de la dihydrostreptomycine. Tous les spectres sont mesurés en bouillie de "Ujol" et prisme de chlorure de sodium.
2) Les spectre des ultra-violets du sulfate de l'antibiotique 23 572 et d'un échantillon authentifié de sulfate de streptomycine sont en bon accord; on n'observe pas d'adsorpti.on spécifique.
3) Les résultats de l'analyse élémentaire de l'antibiotique 23 572 sont en accord avec les résultats
<Desc/Clms Page number 18>
théoriques pour le sulfate de dihydrostreptomycine.
EMI18.1
Calculé pour (C21h41,12h)2. 3 S04H2 : a = 3 , 42; H = 6,05; N = 13,38; S = 6,58 fa.
Trouvé : C = 34, 45; 34,11; H = 6,42;6,54; N = 12,98; S = 6,43 %
4) Le sulfate de l'antibiotique 23 572 montre une
EMI18.2
valeur ( tt.., )2 de -8724 (cono. - 1 Iq dans H20) et le sulfate de dihydrostreptomycine du commerce une valeur ( C ) 17 de 62
Le pouvoir rotatoire de la dihydrostreptomycine
EMI18.3
est indiqué par I.A. Solomons et autres, Science, L09., 515 (1949) comme étant ( a 25 = -88¯ et par F.J. Wolf et autres J. am. Chem. Soc., 68, 2163 (1946) ae -8885.
5)' Le sulfate de l'antibiotique 2 572 fond à
EMI18.4
250--255QC en se décomposant et noircissant et le sulfate de dihydrostreptomycine du commerce à 250-255gC en se décom- posent et noircissant.
6) L'antibiotique 23 572 et la dihydrostrepto- mycine du commerce sont négatifs à la réaction du mal bol, mais la streptomycine est positive.
EMI18.5
7) L'antibiotique 23 572, la dihy:irostrei.toraycine du commerce et la streptomycine sont tous trois positifs à
EMI18.6
la réaction de Sakagachi. 8) On abandonne au reos à la température ambiante pendant 24 à 48 heures des solutions ae sulfate ue l'anti- biotique 23 572, de sulfate de dihydrostreptomycine du com- merce et de sulfate de streptomycine du commerce dans NaOB/ N/10 à une concentration de 5 mg/cm3 et on évalue l'activité antibactérienne de chacun de ces antibiotiques contre B. subtilis par le procéda de dilution. On obtient les résultat suivants.
<Desc/Clms Page number 19>
EMI19.1
<tb>
Immédiatement; <SEP> Après <SEP> 24 <SEP> Après <SEP> 48
<tb> après <SEP> dissolu- <SEP> heures <SEP> heures
<tb> tion
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> 1'
<tb> antibiotique
<tb>
EMI19.2
23 w72 10 000 glem3 >10 000 u/cm3 15 000 u/cm3
EMI19.3
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> dihydrostrepto-
<tb>
EMI19.4
mycine 15 000 u/cm3 10 000 u/cxn3 15 000 u/cm3
EMI19.5
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> strep-
<tb>
EMI19.6
tomycine 10 000 u/an.3 < 100 u/cm3 75 u/cm3
Ainsi, dans les conditions alcalines, le sulfate de l'antibiotique 23 572 est aussi stable que le sulfate de dihydrostreptomycine du commerce.
9) On ajoute 30 mg/cm3 de semicarbaide à des
EMI19.7
solutions aqueuses respectivement de sulfate de l'antbioti que 23 572, de sulfate de dihydrostreptomycine du commerce et de sulfate de streptomycine, et après repos à la tempéra- ture ambiante pendant quatre heures on essaie l'activité
EMI19.8
anti bactérienne contre B. subtilis de chacun des antibioti- ques et on titre par le procédé de dilution. On obtient les résultats.suivants.
EMI19.9
<tb>
Pas <SEP> de <SEP> semi- <SEP> 4 <SEP> heures <SEP> après
<tb> carbazide <SEP> addition <SEP> de <SEP> se-
<tb>
EMI19.10
- m1-carbazide
EMI19.11
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> l'antibiotique
<tb>
EMI19.12
23 572 10 mg/cm3 35 000 u/cm3 35 000 u/cm3
EMI19.13
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> dihydrostrepto-
<tb>
EMI19.14
mycine 10 mg/Ctn3 35 000 u/cm3 50 000 u/cm3
EMI19.15
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> streptomycine
<tb>
<tb> 10 <SEP> mg/cm3 <SEP> 35 <SEP> 000 <SEP> u/cm3 <SEP> < <SEP> 5 <SEP> 000 <SEP> u/cm3
<tb>
EMI19.16
Une solution de semicarbazide à 30 mg/ciû3 manifes- te une activité de 75 u/em3.
EMI19.17
10) On ajoute 1 mg/cill3 de cystéine à des solutions aqueuses de sulfate d'antibiotique 3, 5'72, et de sulfate de dihydrostreptomycine du commerce et de sulfate de streptomy- cine et après repos à la température ambiante pendant quatre heures on évalue la puissance de chacun des antibiotiques
<Desc/Clms Page number 20>
contre B. subtilis par le procédé de dilution ; obtient les résultats suivants.
EMI20.1
<tb>
Pas <SEP> de <SEP> cystéi- <SEP> Quatre <SEP> heures <SEP> ane <SEP> près <SEP> l'addition
<tb> de <SEP> cystéine
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> d'antibiotique <SEP> 000 <SEP> D/CM3 <SEP> ooo <SEP> U/GM3
<tb> 23 <SEP> 572 <SEP> 5 <SEP> mg/cm3 <SEP> 15 <SEP> 000 <SEP> u/cm2 <SEP> 15 <SEP> 000 <SEP> u/cm3
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> dihydrostreptomycine <SEP> 5 <SEP> mg/cm3 <SEP> 15 <SEP> 000 <SEP> u/cm3 <SEP> 15 <SEP> 000 <SEP> u/cm3
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> streptomycine
<tb> 5 <SEP> mg/cm3 <SEP> 15 <SEP> 000 <SEP> u/cm3 <SEP> 7 <SEP> 500 <SEP> u/cm3
<tb>
Une solution de cystéine à 1 mg/cm3 manifeste une activité de 100 u/cm3.
Le sulfate de l'antibiotique 23 572 ne perd pas d'activité par l'addition de semi-carbazide ou de cystéine, tout comme le sulfate de dihydrostreptomycine.
11) La réaction qualitative du radical carbonyle est négative, comme le montre le tableau ci-après.
EMI20.2
<tb>
Liqueur <SEP> de <SEP> Phénol, <SEP> 8002 <SEP> Réaction <SEP> au
<tb> Fehling <SEP> coone. <SEP> miroir <SEP> d'argent
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> antibiotique <SEP> Négatif <SEP> Pas <SEP> de <SEP> colora- <SEP> Brun, <SEP> lim-
<tb> 23 <SEP> 572 <SEP> tion <SEP> pide
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> dihydro- <SEP> Négatif <SEP> Pas <SEP> de <SEP> colora- <SEP> Brun, <SEP> limstreptomycine <SEP> tion <SEP> pide
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> strepto- <SEP> ppté, <SEP> brun <SEP> Couleur <SEP> brun- <SEP> ppté. <SEP> brun <SEP>
<tb> mycine <SEP> foncé <SEP> noirâtre
<tb>
12) On prépare le picrate de streptidine de l'an- tibiotique 23 572 par le procédé de F.H. Stodola et autres, J. Amer. Chem. Soc., 73. 2290 (1951) de la manière suivante.
On dissout 2 g du chlorhydrate de l'antibiotique 23 572 dans 100 cm3 de méthanol anhyare contenant 1 % d'acide chlorhy- drique. Après quarante-huit heures de repos à la température ambiante on ajoute 200 cm3 d'éther à la solution, en agitant, et on sépare par centrifugeage les cristaux blancs ainsi obtenus de chlorhydrate de streptidine. On dissout les cristaux dans 20 cm3 d'eau et on ajoute une solution saturée d'acide picrique. Au bout de plusieurs heures de repos on
<Desc/Clms Page number 21>
sépare les cristaux précipités et on les fait recristalliser au sein d'eau de manière à obtenir 400 mg de picrate de streptidine sous forme d'aiguilles jaunâtres fondant à
EMI21.1
271-? Abalyse. Calculé pour CH1804N6.
C6H3307 : C = 33, 34; H = 3, 36; N = 23, 33 % Trouvé C = 33,46; H = , 9 23,49 .
Le spectre d'absorption du picrate dans l'infra- rouge est en accord avec celui du picrate'préparé à l'aide
EMI21.2
de dihydI'ostIoeptomycine du commerce comme décrit dans l'exem- ple 1.
On neutralise la couche surnageante du chlorhydrate de streptidine ci-dessus au moyen d'hyuroxyde de sodium tné-
EMI21.3
thanolique, on sépare le chlorure de sodL'!.1m formé par cet- trifugeage et on classe par distillation le solvant sous pression réduite, on obtient une poudre blanche* On dissout le résidu dans 20 cm3 de pyridine et on ajoute 7 cm3 d'anhy- dride acétique. Au bout de seize heures environ de repos on ajoute de l'eau au mélange réactionnel et on chasse le solvant par distillation. On fait recristalliser le résidu
EMI21.4
au sein de méthanol et l'on obtient l'alpha-'iaéthyl-pbnta- acétyl-dihydrostrepto-biosacinide sous forme d'aiguilles incolore fondant à 1945C. Le rendement est de 700 mg.
Analyse. Calculé pour ClH19NOa(Ch3CO)5(OCH3) : C = 51,15; Ho 6, 62; N = 2,49 %<.
Trouvé t C = 51, 09; H = 6,13; N , 40 jo.
( U )17 = -1209 (cône. 1 % chloroforme). Le spectre d'absor- ption de; infra-rouges est en bon accord avec celui de l' alpha-ta6tLyl--penta-acétyl-dîllydrostrepto-biosaijiî iiide obtenue à partir de la dihydrostreptomycine du commerce comme il est décrit en 1.
13) On hydrolyse l'antibiotique 23 572 à l'aide d'une base dans des conditions similaires 'de celles de
<Desc/Clms Page number 22>
EMI22.1
l'hydroxy-streptomycine décd tes par F.H. Stodola tU/' autres dans J. Am. Chem. Soc., 73, 2290 (1951). On chauffe une solution de 2 g du chlorhydrate de l'antibiotique 25372
EMI22.2
dan:- po cm3 de soude caustique N à J 30ëC pendant trois heu- res.
On acidifie le mélange réactiornel au moyen d'acide chlorhydrique et on traite comme précédement, mais on n'obtient pas de substance positive à l'essai au maltol, non plus que de substance extractible dans des conditions
EMI22.3
acbde, c'est-à-dire que l'antibiotique 23 572 donne un résultat différent de celui donné dans cette expérience par la streptomycine et l'hydroxystreptomycine. On obtient éga- lement le même résultat avec la dihydrostreptomycine du commerce.
EMI22.4
14) A une solution aqueuse de 50 000 gamma/ cm<5 d'antibiotique 23 572 on ajoute une solution chaude de mé0 thyl-orange jusqu'à ce qu'il ne se forme plus de précipité.
On filtre le précipité et on le fait recristalliser au sein de méthanol et d'eau (1: 3) de manière à obtenir l'hélian-
EMI22.5
thate sous forme d'écailles fondant à 2fc2-2i;5kC. (puissance, 340 unités de streptomycine par milligramme).
/nalyse. Calculé pour l'hélianthate de dihydrostreptomycine
EMI22.6
C63BS6021N16Sa : C = 50,46, H = 5,79; N 14,94, S = 6,40 /.
Trouvé . C = 50,19; 50, 84; Ha 5, 9 3; 5, 9 5; N 14,93; S ' 7,01 .
15) On effectue la cliroillat06raplii8 sur papier sur de la streptomycine et de la dihylirostreptowycine selon Fez.
Stodola et autres, J. Am. Chem. Soc., 73, 22980 (1951), à l'aide de butanol saturé d'eau contenant 2% d'acide ptoluène sulfonique et 2% de pipéridine à titre de solvant
EMI22.7
et on compare les deux composas par bioautogr81Jl,l1e. A l'aide du même procodt., on 6r1'E:ct ue la chromato- graphie sur papier à l'aide des deux composes ci-dessus et
<Desc/Clms Page number 23>
EMI23.1
de l'antibiotique 23 572 et on examine les bioautogrèmmes .en utilisant B. subtilis comme micro-organisme d'essai. On cens bâte que l'antibiotique 23 572 donne une zone d'inhibi- tion au lieu correspondant à celui de la dihydrostreptomyci- ne.
16) On a observé les constantes cristallographi-
EMI23.2
ques du sulfate de l'antibiotique 23 72., comparées à celles du sulfate de dihydrostreptomycine indiquées par F.J. wolf et autres, Science, 109. 515 (1949).
On obtient les résultats suivants,.
EMI23.3
Sulfate de l'antibiotique Sulfate de dibydro-
EMI23.4
<tb> 23 <SEP> 572 <SEP> streptomycine <SEP>
<tb>
EMI23.5
alpha 1,545 t 0,002 l, 552 '' û, OC72 bêta 1,556l 0,005 1, 558 " 0, 004 gaa 1,564 + 0, 002 1, 566 o, oa2
EMI23.6
B- Effet ciiimîotlérapique. L'action inhibitrice exercée par l'antibiotique 23 572 sur le développement de la souche sensible à la
EMI23.7
streptomycine h3?Rv du bacille tuberculeux de l'houme est presque la tatoue que celle exercée par 1. dihydrostreptomy" cine, l'inhibition étant effective à la concentration de 1 à 2 gamma par ml in vitro. Cet antibiotique ne manifeste pas d'action iJJ:1i..: bi trioE: sur le développaient des souches de bacille tuberculeux résistant à la streptomycine.
L'activité .r7.fL,Lt.rimne de l'antibiotique 23 5'72 sur le bacille tuberculeux in vitro est très elevee; on a donc re- cherche coûtée indiqua ci-dessous l'effet, ciiiuiiouiérapique sur la tub. rculos8 expérimentale de la. sourie et du cobaye.
1) Effet sur la tuberculose ex- périmentale chez la souris (I)
EMI23.8
On infecte uos souris par voie intrapéritonéale 1 "idc de 0,1 ing (poids humide) de la souche du bacille
<Desc/Clms Page number 24>
tuberculeux de l'homme H37Rv ensuspension dans uu serum physiologique (unités viables 8 x 106). Le jour qui suit l'infection on commence le traitement de ces animaux à l'aide de 3 3 de sulfate d'antibiotique 23 572 par jour et 1,5 mg de sulfate de dihydrostreptomycine par jour. On administre 18 doses au total à la cadence d'une par jour par injection sous-cutanée.
Trois semaines après l'infection, on sacrifie tous les animaux et on ensemence un milieu solide à base d'oeuf une quantité déterminée de chacun des tissus pulmo- naire, hépatique et de la rate de chacun des animaux en vue de la culture du bacille tuberculeux. On effectue la numération des colonies dt bacille développées sur les mi- lieux quatre semaines plus tard, ce qui permet d'évaluer les. activités antituberculeuses des médicaments.
Le tableau suivant donne les résultats obtenus.
Groupe témoin non traité
EMI24.1
<tb> Animal <SEP> N <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Poumons <SEP> 0 <SEP> 29 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 13 <SEP> 16 <SEP> 30 <SEP> 57
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Foie <SEP> 0 <SEP> 26 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 8 <SEP> 2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Rate <SEP> 8 <SEP> # <SEP> 60 <SEP> 2 <SEP> 34 <SEP> 228 <SEP> 70 <SEP> 5>600 <SEP> 247
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Groupe <SEP> :
<SEP> Sulfate <SEP> de <SEP> dihydrostreptomycine <SEP> (1,5 <SEP> mg)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> animal <SEP> N <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> b <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Poumons <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Foie <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Rate <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Groupe <SEP> :
<SEP> Sulfate <SEP> d'antibiotique <SEP> 23 <SEP> 572 <SEP> (3mg)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Animal <SEP> Ng <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Poumons <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Foie <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Rate <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 9 <SEP> 4 <SEP> 21 <SEP> 18 <SEP> 0
<tb>
Le tableau ci-dessus montre que l'administration par voie hypodermique du sulfate de l'antibiotique 23572
<Desc/Clms Page number 25>
la dose de 54 mg se traduit par un effet thérapeutique re- merquable sur la tuberculose expérimentale de la souris et est aussi efficace que celle du sulfate de dihydrostrep-
tomycine, par la même voie, à la dose de 27 mg.
2) Effet chimiothérapique sur la tuberculose ex- périmentale chez la souris (II).
On infecte des souris, par voie intraveineuse au moyen de 0,001 mg (poids humide) de la souche H37Rv du bacille tuberculeux de l'homme en' suspension dans 0,25 cm3 de sérum physiologique (unités viables 24 x 104). Le second jour de l'infection on commence le traitement de ces animaux.
On procède à l'administration des médicaments à dix-huit reprises en l'espace de trois semaines de la manière suivante; Tous les animaux sont sacrifiés vingt-cinq jours après l'in- fection et l'effet chimiothérapique est évalué comme il a été dite Midication Sulfate de l'antibiotique 23 572 1,5 mg/jour 18 fois hypo- dermique
EMI25.1
<tb> Sulfate- <SEP> de]..
<SEP> tibiotique <SEP> 23 <SEP> 572 <SEP> 3,0 <SEP> mg/jour <SEP> d <SEP> d
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> dihydrostreptomycin <SEP> 1,5 <SEP> mg/joufr <SEP> d <SEP> de
<tb>
<tb> Groupe <SEP> témoin <SEP> non <SEP> traité
<tb>
<tb> Animaux <SEP> ng <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14
<tb>
<tb> Poumons <SEP> 198 <SEP> 221 <SEP> >600 <SEP> 88 <SEP> 113 <SEP> 310 <SEP> 72 <SEP> 166 <SEP> 338
<tb>
<tb> Foie <SEP> 2 <SEP> 14 <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 20 <SEP> 44 <SEP> 24 <SEP> 32 <SEP> 4
<tb>
<tb> Rate <SEP> 17 <SEP> 57 <SEP> 549 <SEP> 110 <SEP> 372 <SEP> 103 <SEP> 83>600 <SEP> 235
<tb>
<tb> Groupe <SEP> :
<SEP> Sulfate <SEP> de <SEP> dihydrostreptomycine <SEP> (1,5 <SEP> mg)
<tb>
<tb> Animal <SEP> n <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>
<tb> Poumons <SEP> 7 <SEP> 61 <SEP> 5 <SEP> 58 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 44 <SEP> 10 <SEP> 0
<tb> Foie <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 5
<tb>
<tb>
<tb> Rate <SEP> 31 <SEP> 63 <SEP> 95 <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 43 <SEP> 68 <SEP> 8
<tb>
<Desc/Clms Page number 26>
Groupe :
Sulfate de l'antibiotique 23 572 (1,5mg)
EMI26.1
<tb> Animal <SEP> N <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb>
<tb> Poumons <SEP> 19 <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 38 <SEP> 1 <SEP> 102 <SEP> 1 <SEP> 5
<tb>
<tb> Foie <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Rate <SEP> 155 <SEP> 29 <SEP> 7 <SEP> 14 <SEP> 75 <SEP> 29 <SEP> 48 <SEP> 16 <SEP> 76
<tb>
<tb> Groupe <SEP> :
<SEP> Sulfate <SEP> de <SEP> l'antibiotique <SEP> 23 <SEP> 572 <SEP> (3 <SEP> mg)
<tb>
<tb> Animal <SEP> Ng <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP>
<tb>
<tb> Poumons <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 43 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 16 <SEP> 6
<tb>
<tb> Foie <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb>
<tb> Rate <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> 12 <SEP> 11 <SEP> 11 <SEP> 7 <SEP> 0
<tb>
Le tableau ci-dessus montre l'effet thérapeutique remarquable exercé par l'antibiotique 23 572 sur la tuberculose expérimen- tale de la souris, qui équivaut à celui de la dihydrostrepto- mycine.
3) Effet chimiothérapique sur la tuberculose expé- rimentale du cobaye.
On infecte des cobayes en bonne santé, négatifs à la réaction à la tuberculine (OT, 1/10, 0,1 cm3, intradermi- que, 48 heures) par voie hypodermique au moyen de 0,01 mg (poids humide) de la souche H37Rv du bacille tuberculeux de l'homme en suspension dans le sérum physiologique (unités viables 35 x 105). Environ un mois après l'infection tous ces animaux manifestent une réaction positive à la tubercu- line. On choisit à ce moment 5 animaux au hasard et on les autopsie, on constate de grosses lésions tuberculeuses dans les organes de chacun des animaux. On divise alors le reste des animaux en quatre groupes que l'on traite comme indiqué ci-après.
Après avoir administré les médicomments par voie hypodermique trente et soixante fois (soit environ 10 et 15 semaines après l'infection) on soumet à l'autopsie des animaux de chacun des groupes et on tue le reste des animaux six semaines après le traitement, soit 21 semaines après
<Desc/Clms Page number 27>
l'infection.
On évalue la quantité des grosses lésions tu- berculeuses des organes de ces animaux et d'autre part on brei finement une quantité déterminée de glandes lymphati- que,3 au lieu de la primo-infection, de poumons, de foie et de rate de chacun des animaux à l'aide desquels on ensemence un milieu solide à base d'oeuf en vue de la culture du bacil- le tuberculeux, puis on procède à la numération des colonies qui se développent au cours de six semaines d'incubation* ('Il évalue ainsi les effets chimiothérapiques du médicament anti-tuberculeux sur le cobaye.
Médication Groupe 1 Sulfate d'antibiotique 23 572 10 mg/jour hypodermi- que Groupe 2 d 20 mg/jour d Groupe 3 Sulfate de dihydrostreptomy- cine 10 mg/jour d Groupe 4 Témoin non traité
Le nombre de colonies obtenu par culture du bacil- le tuberculeux est indiqué dans les tableaux suivants.
Nombre de colonies de bacille tuberculeux après six semaines de culture (10 mg de glande lymphatique dans la région d'in- fection, de poumons, de foie et de rate ensemencés sur milieu solide d'oeuf) Culture au moment de l'autopsie juste avant le début du traitement
EMI27.1
<tb> An <SEP> n <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5
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<tb>
<tb>
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<tb> Poumons <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 2
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<tb>
<tb>
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<tb> Foie <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> 8 <SEP> 13 <SEP> 1
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<tb>
<tb>
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<tb> Rate <SEP> 224 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 142 <SEP> 6
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<tb>
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<tb> Glande <SEP> lhmphtaiqeu <SEP> # <SEP> 600 <SEP> > <SEP> 600 <SEP> > <SEP> 600 <SEP> > <SEP> 600 <SEP> > <SEP> 600 <SEP>
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<tb>
<tb>
<tb> Culture <SEP> au <SEP> moment <SEP> de <SEP> l'autopsie <SEP> après <SEP> 30 <SEP> doses <SEP> de <SEP>
traitement
<tb>
<tb>
<tb> (Groupe <SEP> 4)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Animal <SEP> N <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Posons <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 97 <SEP> 18 <SEP> 83 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Foie <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Rate <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 19 <SEP> 91 <SEP> 56 <SEP> 8 <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Gl <SEP> lymph.
<SEP> 0 <SEP> 141 <SEP> 518 <SEP> 315 <SEP> 209 <SEP> 352 <SEP> 188
<tb>
<Desc/Clms Page number 28>
Groupe 3
EMI28.1
<tb> Animaux <SEP> N <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 12
<tb>
<tb> Poumons <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 93 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Foie <SEP> 5 <SEP> 62 <SEP> 1 <SEP> 21 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Rate <SEP> 23 <SEP> 17 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb>
<tb> G1. <SEP> lymph.
<SEP> 62 <SEP> 32 <SEP> 22 <SEP> 118 <SEP> 2 <SEP> 102 <SEP> 110 <SEP> 0
<tb>
<tb> Groupe <SEP> 1
<tb>
EMI28.2
AnimauxNg 2 3 4 fi 6 7 8 9
EMI28.3
<tb> Poumons <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Foie <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Rate <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 21 <SEP> 28 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> G1. <SEP> lymph. <SEP> 5 <SEP> 52 <SEP> 13 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 19 <SEP> 134 <SEP> 40
<tb>
<tb> Groupe <SEP> 2
<tb>
EMI28.4
Animaux N8 4 5 6 7 8 9 z 10 11
EMI28.5
<tb> Poumons <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Foie <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Rate <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Gl. <SEP> Lymph.
<SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 36 <SEP> 0 <SEP> 35
<tb>
<tb> Culture <SEP> au <SEP> moment <SEP> de <SEP> l'autopsie <SEP> après <SEP> 60 <SEP> doses <SEP> de <SEP> traitement
<tb>
<tb> Groupe <SEP> 4
<tb>
EMI28.6
Animaux US 25 26 27 ' 28 29
EMI28.7
<tb> Poumons <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 134 <SEP> 10 <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Foie <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Rate <SEP> 333 <SEP> 1 <SEP> 13 <SEP> 293 <SEP> 3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> G1 <SEP> lymph.
<SEP> 195 <SEP> 325 <SEP> 187 <SEP> 89 <SEP> 138
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Groupe <SEP> 3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Animal <SEP> Ni <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 20
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Poumons <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Foie <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Rate <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Gl <SEP> . <SEP> lymph.
<SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<Desc/Clms Page number 29>
Groupe 1
EMI29.1
Animal Ng il 13 13 14 15 16 17 i.ojjns 0 0 0 0 3 0 0
EMI29.2
<tb> Foie <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Rate <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Gl. <SEP> lymph. <SEP> 5 <SEP> 89 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 0
<tb>
<tb> Groupe <SEP> 2
<tb>
EMI29.3
.@1fH<Ü Ng 14 15 16 17 18 19 20
EMI29.4
<tb> Pouvons <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Foie <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Rate <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Gl. <SEP> lymph.
<SEP> 2 <SEP> 20 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 17 <SEP> 0
<tb>
<tb> Culture <SEP> au <SEP> moment <SEP> de <SEP> l'autopsie <SEP> six <SEP> semaines <SEP> après <SEP> la <SEP> fin
<tb>
<tb> du <SEP> traitement
<tb>
EMI29.5
Groupe 4 :i.
Animal M8 32 33 34 .35 j6 --. 3'7¯- Poumons e4 4 > 600 il 173 0 Foie .s6' 0AA 88 2 > 600 0 Rate 131 48 >600 CÜ > 600 1 Gl. lymphe >600 8 > 600 87 >600 182
EMI29.6
'L trc des six animaux meurent au cours des trois dernières semaines de Inexpérience lui C indique la contsnina.tion
EMI29.7
<tb> Groupe <SEP> 3
<tb>
EMI29.8
fm l tILt' ux ml 23 24 25 26 27
EMI29.9
<tb> Poumons <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb> Foie <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb> Rate <SEP> 47 <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 66
<tb>
EMI29.10
&1. lyrnpb.
32 140 21 283 il Groupe 1 Animal Ne 19 3C I 2 23 z4 2S wu
EMI29.11
<tb> Po <SEP> unions <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
<tb> Foie <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
<tb> Rate <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 9 <SEP> 212
<tb>
EMI29.12
Cl. lymph. ':
1.& 34 4 1 98 190 7 60 116
<Desc/Clms Page number 30>
Groupe 2
EMI30.1
<tb> Animal <SEP> N <SEP> 21 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 24 <SEP> 25 <SEP> 26 <SEP> 27
<tb>
<tb> Poumons <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
<tb>
<tb> Foi. <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb> Rate <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 87
<tb>
<tb>
<tb> G1. <SEP> lymph. <SEP> 1 <SEP> 30 <SEP> 2 <SEP> 10 <SEP> 18 <SEP> 2 <SEP> 35
<tb>
4) Toxicité La dose léthale à 50 % de mortalité chez la souris
EMI30.2
(081) du sulfate de l'antibiotique 23 572 et du sulfate de dihydrostreptomycine est calculée par la méthode de Litch- field et ilcoxon. Comme on le voit ci-dessous, on ne cons- tate pas de différence significative.
EMI30.3
<tb>
Sulfate <SEP> de <SEP> l'anti- <SEP> Sulfate <SEP> de <SEP> dihy-
<tb>
EMI30.4
biotique 23 572 drostreptoinycine Injection intraveineuse 250(219-285)mg/kg 240(215-268)mg/ Injection hypodermique 2000(1710-2350)mg/kg 1800(1450-2250)
EMI30.5
<tb> mg/kg
<tb>
<tb> Injection <SEP> intrapérito-
<tb>
<tb> neale <SEP> 1900(1500-2390)mg/kg <SEP> 1700(1430-2030)
<tb>
<tb> mg/kg
<tb>
c- Spectre antibacterien
On compare l'antibiotique 23 572 avec le sulfate de dihydrostreptomycine du commerce, en poids, pour obtenir
EMI30.6
une inhibition complète des microorganiswes d'essai; on obtient les résultats suivants.
Spectre ante bactérien
EMI30.7
Microorganisme Sulfate de Sulfate de dï- 1 anti bi o ti- hydrostreptomy- que 2.572 cine du commerce me cal mcg/ml
EMI30.8
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> Terajima <SEP> 1 <SEP> 1
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> (PCI-219) <SEP> 0,5 <SEP> 0,5
<tb>
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 64 <SEP> 64
<tb>
EMI30.9
Shigella uepenteriae 1 1
EMI30.10
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> 8 <SEP> 8
<tb>
<tb>
<tb> Proteus <SEP> vulgarias <SEP> 8 <SEP> 8
<tb>
<tb>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 4
<tb>
<Desc/Clms Page number 31>
EMI31.1
!,.iCI'OOru1"lsille Sulfate de Sulfate de dihy- 1 ' antibio- arosGr6ptomycine tique ;do.?72 du couerce - mC,id tIll l1lc";/ m.l l'y ou u .....0J.l<:
-.8 aeruginosa 3ki à'à, 4\spe-0ill1s niger > 100 > 100 !\micilllWX1 otatuln > 100 > 100 Saccl1aroJ1Yoes oerevisiae > 100 > 100 Cendida albica11s >.100 100 x..ycobacterium 607 2 ....,,?'0otA'.cterilJll1 avium 1 1
Les procèdes ci-dessus sont- décrits plus en détail dans les exemples suivants mais sont donnés à titre d'illus- tration et non de limitation. Dans tous les exemples la puis- sence de l'antibiotique est essayée par le procède d'essai à la plaque et au cylindre à l'aide de Bacillus subtilis
EMI31.2
(PCI 219) COt.t1ille mieroorganisme d'essai, sauf le cas où on indique particulièrement le procède suivi.
Exemple 1-
EMI31.3
glucose 2/c
EMI31.4
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> 0,6 <SEP> %
<tb>
<tb> Peptone <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb>
<tb> Sel <SEP> ordinaire <SEP> 0,6 <SEP> %
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,6 <SEP> %
<tb>
On stérilise b00 litres d'un milieu de culture contenant les composants ci-aessus par chauffage dans un récipient de culture. On ensemence à l'aide d'une soche
EMI31.5
de Stpeptolilvc8S hwiidlis et on effectue la culture à 27-28ëC pendent quatre-vingt-seize heures dans des conditions aéro- bies, avec agitation.
Le bouillon de culture contracte pen-
EMI31.6
dfjat cette période une activité 8l1tibe.ct,-.rielUle de 56 niez ml contre Fss subtïlisr Exemple 2 -
EMI31.7
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> trempage <SEP> du <SEP> maïs <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> %
<tb>
EMI31.8
lni dox2 ùt 0 z
<Desc/Clms Page number 32>
EMI32.1
<tb> Peptone <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb> Phosphate <SEP> monopotassique <SEP> 0,1 <SEP> %
<tb>
<tb> Suif' <SEP> le <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> 0,05 <SEP> %
<tb>
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> %
<tb>
On sterilise 50 cm3 d'un milieu de culture contenant les composants ci-dessus dans un ballon secoué par un procédé courant.
On ensemence à l'aide d'une souche appartenant à
EMI32.2
l'espace Streptomyces humiaus et on cultive à 2? Z. 19C pen- dant quatre jours, en secouant, la puissance du bouillon
EMI32.3
atteint alors 1200 mcg/ml contre B. -subtilis.
Exemple 3 -
On cultive la souche H-120 du type Streptomyces humidus en divers milieux de culture tamisés. Le tableau suivant montre les résultats obtenus. Chacune des cultures des exemples 3 à 8 est effectuée en secouant à 26-28ëC 50 cm3 de milieu dans un ballon de 300 cm3.
EMI32.4
<tb>
Milieu <SEP> Puissance <SEP> maximum <SEP> Temps <SEP> pour <SEP> obtenir
<tb>
<tb> de <SEP> dihydrostreptomy- <SEP> la <SEP> puissance <SEP> maxi-
<tb>
<tb> cine <SEP> mim
<tb>
EMI32.5
Mag/rai heures
EMI32.6
<tb> Bouillon <SEP> amylacé <SEP> 78 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb> Bouillon <SEP> glucose <SEP> 225 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb> Bouillon.amylacé <SEP> + <SEP> 3 <SEP> % <SEP> C03Ca <SEP> 211 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> B.
<SEP> glucosé <SEP> + <SEP> 3 <SEP> % <SEP> C03Ca <SEP> 286 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb> 1) <SEP> 227 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb> 2) <SEP> 246 <SEP> 96
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3) <SEP> 329 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb> 4) <SEP> 242 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 2) <SEP> plus <SEP> extrait <SEP> de <SEP> levure
<tb>
<tb> 0, <SEP> 5 <SEP> % <SEP> 315 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb> 1) <SEP> Glucose <SEP> 1% <SEP> 2) <SEP> Liqueur <SEP> de <SEP> trem-
<tb>
<tb> page <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 3,0 <SEP> %
<tb>
EMI32.7
Farine de so j als.
Amidon 3 10 Peptone Peptone 0, 5 -}<> Peptone 0,5 % P04ii 0,1 ,0 SOg. 7 H20 0,05/i NaCl 0, 5 CoCa. 7l12O 0 3 j
EMI32.8
<tb> COCa <SEP> 0,3 <SEP> %
<tb>
<Desc/Clms Page number 33>
EMI33.1
<tb> 3) <SEP> Glucose <SEP> 2,0 <SEP> % <SEP> 4) <SEP> Amidon <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb>
EMI33.2
Extrait de viande,16 % Extrait de viande 0,3 bzz
EMI33.3
<tb> Peptone <SEP> 1,0 <SEP> % <SEP> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb>
EMI33.4
D)a.Cl 0,6 % Peptone ou 5 %
EMI33.5
<tb> C03Ca <SEP> 0,6 <SEP> % <SEP> Glucose <SEP> 1,0 <SEP> % <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 0,3 <SEP> %
<tb>
EMI33.6
JfeiiiaijLJl #
EMI33.7
<tb> milie <SEP> de <SEP> base <SEP> :
<SEP> .Amidon <SEP> 3 <SEP> %
<tb>
EMI33.8
P04K2H f,1 % S04MG.. 1"/ H20 005% 'coca z 3 nô
EMI33.9
<tb> pH <SEP> 7
<tb>
On ajoute au milieu de base de la liqueur de trem- page du maïs et de la farine de soja à des taux variés cornue sources d'azotes on ensemence au moyen de la souche
EMI33.10
H-120 de Streptomyces humidus et on cultive de manière à obtenir les résultats montrés dans le tableau ci-dessous.
EMI33.11
<tb>
Source <SEP> d'azote <SEP> Puissance <SEP> maximum <SEP> Temps <SEP> pour <SEP> obte-
<tb>
<tb> Liq <SEP> trempa.- <SEP> Farine <SEP> de <SEP> de <SEP> dihydrostrepto- <SEP> nir <SEP> la <SEP> puissance
<tb>
<tb> ga <SEP> miïs <SEP> soja <SEP> mycine <SEP> maximum
<tb>
EMI33.12
/,0 1 mcg?m1 heures
EMI33.13
<tb> 3,0 <SEP> 1,0 <SEP> 468 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,0 <SEP> 288 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,0 <SEP> 2,0 <SEP> 499 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1, <SEP> 5 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 417 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,0 <SEP> 0,5 <SEP> 372 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3,0 <SEP> 10, <SEP> 968 <SEP> 144
<tb>
A La farine de soja est hydrolyses par chauffage à 100 C pendant une heure à l'aide de dix fois son volume d'acide chlorhydrique à 5 % .
Exemple 5 -
EMI33.14
<tb> Lillieu <SEP> de <SEP> base <SEP> ; <SEP> Amidon <SEP> 3,0 <SEP> %
<tb>
EMI33.15
P04.l(H 0,1% 50,1:. r Ha0 0,05,.. COCa ...5 fD
EMI33.16
<tb> pH <SEP> 7
<tb>
<Desc/Clms Page number 34>
On cultive la souche H-120 de Streptomyces humi- dus en divers milieux contenant, indépendamment des compo- sants de base, de la liqueur de trempage du mais et de la farine de soja cornue sources principales d'azote et d'autres sources d'azote organique ou minéral. Dans certains cas on supprime la farine de soja. Les résultats sont indiqués dans le tableau suivant.
EMI34.1
<tb>
Source <SEP> d'azote <SEP> Puissance <SEP> Temps <SEP> pour
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> Hydroly- <SEP> Autres <SEP> maximum <SEP> de <SEP> obtenir <SEP> puis.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> trempage <SEP> sat <SEP> chlo- <SEP> la <SEP> dihydro- <SEP> sauce <SEP> ma-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> du <SEP> maïs <SEP> rhydrique <SEP> streptomy- <SEP> ximum
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> farine <SEP> cine
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> soja
<tb>
EMI34.2
yo mc ml heures
EMI34.3
<tb> 3 <SEP> 1 <SEP> mycélium <SEP> humide <SEP> de <SEP> 660 <SEP> 144
<tb>
EMI34.4
23 . r:
1 2 %
EMI34.5
<tb> 3 <SEP> 1 <SEP> NO3NH4 <SEP> 0,1 <SEP> 326 <SEP> 120
<tb> 3 <SEP> 1 <SEP> CO(NH2)2 <SEP> 0,1 <SEP> 55 <SEP> 96
<tb>
<tb> 3 <SEP> 1 <SEP> CO <SEP> (NH2)2 <SEP> 0,1 <SEP> 60 <SEP> 96
<tb> huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> 1,0
<tb>
EMI34.6
3 1 P04(NH4) tfl 0,1 411 120
EMI34.7
<tb> 3 <SEP> 1 <SEP> NO3K <SEP> 0,1 <SEP> ' <SEP> 600 <SEP> 96
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 1 <SEP> NHRCL <SEP> 0,1 <SEP> 327 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3 <SEP> 1 <SEP> SO4(NH4)2 <SEP> 0,1 <SEP> 396 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3- <SEP> Caséine <SEP> 1,0 <SEP> 500 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 3- <SEP> Caséine <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 1000 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> 1 <SEP> Balle <SEP> de <SEP> riz <SEP> 2,
<SEP> 0 <SEP> 30 <SEP> 168
<tb>
a Caséine hydrolysée une heure à 100 C à l'aide d'environ dix fois son volume de HCl à 5 % Exemple 6 - Milieu de base :
EMI34.8
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> trempage <SEP> du <SEP> mais <SEP> 3 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> (hydrolysat <SEP> HCL) <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb>
EMI34.9
PCgi2H 0,1 % S04r,ag. 7 H20 0 QSj
EMI34.10
<tb> C03Ca <SEP> 0,3 <SEP> %
<tb> PH <SEP> 7
<tb>
<Desc/Clms Page number 35>
EMI35.1
On cultive la souche Q-97 de Strcptomyoes hualious sur le milieu de base dont on modifie de facon variée la source de carbone.
Le tableau suivent montre les résultats boteins
EMI35.2
<tb> Source <SEP> de <SEP> carbone <SEP> Puissance <SEP> maxi- <SEP> Temps <SEP> pour <SEP> ob-
<tb>
EMI35.3
mUID de la diby- tenir le maxi- drostreototuveine timmde paiss.
EMI35.4
<tb> mog/ml
<tb>
EMI35.5
Dextl'ine 3 jo 1127 120 '
EMI35.6
<tb> Amidon <SEP> 1 <SEP> % <SEP> 600 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> .Amidon <SEP> 3 <SEP> % <SEP> 844 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 1 <SEP> % <SEP> 592 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 3 <SEP> % <SEP> 440 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glycérine <SEP> 3 <SEP> % <SEP> 1050 <SEP> 114
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Lactose <SEP> 3 <SEP> % <SEP> 90 <SEP> 96
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> annose <SEP> 3 <SEP> % <SEP> 1368 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Maltose <SEP> 3 <SEP> % <SEP> 90 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Galactose <SEP> 3 <SEP> % <SEP> 1870 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Fructose <SEP> 3 <SEP> % <SEP> 1390 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> 3 <SEP> % <SEP> 63 <SEP> 144
<tb>
Exemple 7 -
EMI35.7
On cultive la souche Q-97 de Streptomyces, humides sur divers milieux à base de liqueur de trempsge de maïs et de farine de soja, de source de carbone à base de dextrine, mais dont la composition des sels minéraux est modifiée. Le tableau ci-dessous montre les résultats obtenus.
Milieu de base
EMI35.8
<tb> Dextrine <SEP> . <SEP> 3 <SEP> %
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> trempage <SEP> du <SEP> maïs <SEP> 3 <SEP> %
<tb>
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> (hydrolysat
<tb> CHL) <SEP> 1 <SEP> %
<tb>
<tb> PH <SEP> 7
<tb>
<Desc/Clms Page number 36>
EMI36.1
<tb> Sels <SEP> minéraux <SEP> Puissance <SEP> max <SEP> Temps <SEP> obt.
<tb>
EMI36.2
Sels Min' dihydrostrepto- puiss .max.
P04ÀZH S04g,' H20 COgCa Autres mycine ;, 1" ë. mcg/ml heures
EMI36.3
<tb> 0,05 <SEP> 0,3 <SEP> - <SEP> 717 <SEP> 120
<tb>
<tb> 0,1 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 675 <SEP> 120
<tb>
<tb> 0,1 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> - <SEP> 1230 <SEP> 144
<tb>
<tb> 0,1 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> A <SEP> 700 <SEP> 144
<tb>
<tb> 0,1 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 1 <SEP> 1260 <SEP> 120
<tb>
<tb> 0,1 <SEP> 0,05 <SEP> 0,3 <SEP> SO4Zn <SEP> 7H2O
<tb> 0,001 <SEP> % <SEP> 639 <SEP> 144
<tb>
EMI36.4
S04. 7ki2 0 0,1 z 05 0, 3 0,002 ;0 555 144 SO te.'I20 1165
EMI36.5
<tb> 0,1 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0,3 <SEP> 0,002 <SEP> 1165 <SEP> 120
<tb>
<tb> 0,01 <SEP> % <SEP> anb..
<tb>
EMI36.6
0,1 0, 05 0$3 0$ Yi>. 1099 144 so OU-Eli2o 0,1 0, 3 0, 02 7. 1038 120 a Neutralisation de l'hydrolysat de farine de soja et règla-
EMI36.7
ge du pH effectué au moyen à'lyàroxyde de potassium Exemple 8 -
EMI36.8
<tb> milieu. <SEP> : <SEP>
<tb>
<tb> Dextrine <SEP> 3 <SEP> %
<tb>
<tb> Liqueur <SEP> de <SEP> trempage <SEP> du <SEP> maïs <SEP> 3 <SEP> %
<tb>
<tb> Hydrolysat <SEP> chlor. <SEP> farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 1 <SEP> %
<tb>
EMI36.9
PO 'XJ:\.;}1 0,1 % SO,Ë-g. 7 H20 po
EMI36.10
<tb> C03Ca <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP> %
<tb> pH <SEP> 7
<tb>
On cultive dans le milieu, ci-dessus aes produits
EMI36.11
de mutation obtenus en traitent.
Strc"tol1lYces hWl1ÍdllS de diverses manieras. Le tableau. ci-de:, ous montre les résultats obtenus.
<Desc/Clms Page number 37>
EMI37.1
<tb>
Souche <SEP> Puissance <SEP> maximum <SEP> en <SEP> Temps <SEP> pour <SEP> obte-
<tb>
<tb> dihydrostreptomycine <SEP> nir <SEP> la <SEP> puissance
<tb>
<tb> . <SEP> maximum <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 23 <SEP> 572 <SEP> (originale) <SEP> 660 <SEP> mcg/ml <SEP> 144 <SEP> heures
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 8-9 <SEP> 460 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> A-113 <SEP> 846 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> C-46 <SEP> 792 <SEP> r <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> E-96 <SEP> 433 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> H- <SEP> 106 <SEP> 1220 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> K-34 <SEP> 1248 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> JD-1 <SEP> 1308 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Q-97 <SEP> 1296 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> VD <SEP> 886 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> N <SEP> 931 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Tu <SEP> 574 <SEP>
120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Vp <SEP> 976 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Vu <SEP> 1235 <SEP> 144
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> L <SEP> 840 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> y <SEP> 966 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> G <SEP> 374 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Q <SEP> 1085 <SEP> 120
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Exemple <SEP> 9 <SEP> - <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Milieu <SEP> :
<SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Glucose <SEP> 2 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> 0,6 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Peptone <SEP> 1,0 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> NaCL <SEP> 0,6 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> CO3Ca <SEP> 0,6 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> 7
<tb>
On soumet une souche de Strestomyces humidus à une culture en réservoir dans des conditions aérobies pen- dent quatre-vingt-seize heures. A 700 litres de filtrat de culture (pH 8,5, puissance 35 U cm3 (unité de dilution) con- tre E Coli) on ajoute 7 kg D %) de charbon actif et on
<Desc/Clms Page number 38>
agite le mélange pen ant trente minutes pour adsorber le compose actif.
On soumet le charbon actif à relation au moyen de dix fols son volume d'acide chlorhydrique méthano- ligue pendant trente minutes à pH 2 de manière à obtenir
140 litres d'éluat (puissance 100 u/cm3) (unités de dilu- tion). On recommence l'élution de manière à obtenir environ
70 litres d'éluat (puissance 35 u/cm3) (unité de dilution).
On neutralise le mélange des éluats au moyen de NaOH normal à pH 6,5 et on concentre sous vide à basse température à environ 300 cm3. Au cours du procéde, on enlève de temps à autre le chlorure de sodium qui se sépare. On ajoute 3 li- tres d'acétone anhydre à la solution concentrée et on sèche le précipité de composé actif sous vide; on obtient une poudre blanche. Le rendement est de 147 g (60 %) puissance 100 u/mg (unité de dilution). Le produit est négatif à la réaction du maltol mais positif à la réaction de Sakaguchi.
Exemple 10 -
Purification par échangeur d'ions a) On fait passer 500 litres de filtrat de cultu- re (pH 7,7, puissance 350 u/cm3 (unité de dilution) contre E. Coli, obtenu comme dans l'exemple 9, dans une colonne garnie au moyen de 30 litres d'Anberlite IRC-50 (type hydrogène) suivant un débit de 1,8 litre par minute. La puissance de l'effluent est inférieure à 10 u/cm3 (unité de dilution) contre E. coli On lave la résine à l'eau, on soumet à l'élution au moyen d'acide chlorhydrique 0,5 N et on recueille 36 litres d'éluat coloré (puissance 3500 u/cm3 (unité de dilution) contre E. coli.
On règle l'éluat à pH 6,5 au moyen de NaOH normal et on concentre à 1 litre (puissance 160 000 u/cm3 (unité de dilution) (91,5 %)¯ à basse température sous pression réduite en enlevant à l'oc- casion le chlorure de sodium qui se sépare.
<Desc/Clms Page number 39>
b) A 748 litres du filtrat de culture (contenant. environ 2 200 mcg/ml de dihyarostreptomycine) obtenus comme dans l'exemple 9 on ajoute 4,1 kg d'acide oxalique et on enleva, le précipité ainsi obtenu à l'aide d'un séparateur de De Laval. On règle le pH à 7 environ au moyen d'une solu- tion d'hydroxyde de sodium et on enlève à nouveau le préci- pité.
On fait alors passer la solution dans une colonne garnie au moyen de 6, 3 litres d'Anberlite IRC-50 (type so- dium) selon un débit de 40 litres par heure; la puissance de l'effluent n'est plus que de 12-6 mcg/ml. On lave la résine à l'eau et on retire par élution le composé actif à l'aide d'acide chlorhydrique à 4 % traversant la colonne selon un débit de 3 litres par heure.
On neutralise 20 litres de l'éluat ainsi ootenu par addition d'Amberlite IR-45 (type hydroxyle) ou d'am-
EMI39.1
berlite TFt-00 (type hydroxyle) et on concentre à 2, 5 litres (puissance 368 0.0 mcg/cm3) à basse tempe rature sous pression réduite.
Exemple 11 -
EMI39.2
E.-.'... cion à l'aide d'un solvant orgrJ1ique A 1 litre du filtrat de culture (puissance 1001 mog/Lal contre 1?...ê,uút< lis) obtenu comme u,--ns l'exeù1ple 10(b) on ajoute 400 cm de n-butanol (ou iso-amylol) contenant 6 le d'acide 15.\11' Le u>::>, oX.t rwl: a.a couche aqueuse à pH , 5 et on secoue la culture pot2a.rlt 20 minutes. Après séparation de la couche bu-Gnnolique ou iso# a&iylique, on r8COtlJrllenCe l'extrac- tion. On secoue le des solutions butanolique ou isoemyliqu8 avec de 111-cide sulfurique étendu et de l'eau de manière ;1 obtuiir 120 cui,5 de couche aqueuse,ae pli 2. On recOUJI1E:.nCE: encore une fois l'extraction et on secoue le 1I.l0- lange des extraits D.1Tc..c: de pour en enlever l'acide lr:..urÍtl1e.
La puissance des la solution ainsi obtenue (250 cmS) est de 2 891 mciyrill contre te. subtilis, soit un rendement de 72,5 6 /CI
<Desc/Clms Page number 40>
Exemple 12 -
Chromatographie sur charbon actif
On règle à pH 3,5 au moyen d'acide chlorhydrique normal 1 litre d'une solution obtenue comme dans l'exemple 10(a) (puissance 160 000 u/cm3 (unité de dilution) contre E coli) et on fait passer la solution dans une colonne de 8 cm de diamètre et de 50 cm de haut garnie de 500 g de.carbone actif imprègne d'eau à pH 3, 5. On divise l'effluent en por- tions de 300 cm3. Les fractions 1 à 11 contiennent du chlo- rure de sodium et des impuretés et les autres le composant actif comme montré ci-dessous.
EMI40.1
<tb>
Fraction <SEP> N <SEP> Réaction <SEP> de <SEP> Sakaguchi <SEP> Puissance <SEP> contre <SEP> E
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> coli <SEP> (u/cm3) <SEP> (u. <SEP> dil.).
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
12 <SEP> ++ <SEP> 15 <SEP> 000 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 13
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 21 <SEP> J <SEP> +++ <SEP> 30 <SEP> 000 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 22 <SEP> +++ <SEP> 5 <SEP> 000 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 23)
<tb>
<tb>
<tb> 1 <SEP> +++ <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 27)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 28)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 29 <SEP> x+ <SEP> 3 <SEP> 000 <SEP>
<tb>
On mélange les fractions 13 à 21, on les règle à pH 6,5 par addition d'"Amberilte Ira-400" (type hydroxyle) et on concentre à basse température sous pression réduite.
A la solution concentrée on ajoute dix fois son volume d'acétone anhydre et on sépare le précipité ainsi obtenu par décantation et on sèche de manière à obtenir 101 g du chlorhydrate sous forme d'une substance amorphe (783,3 mcg/ mg en dihydrostreptomycine). A une solution de 10 g du pro- duit dans 50 cm3 d'eau on ajoute une solution de 6 g de SOMg. 7 H20 dans 7 cm3 d'eau.
On règle le mélange à pH 6 au moyen d'acide sulfurique étendu et on filtre, puis on ajou- te goutte à goutte du méthanol en agitant jusqu'à
<Desc/Clms Page number 41>
apparition d'un louche en maintenant la température du mé-. lange à 50-55 C On ajoute quelques cristaux .de sulfate de dihydrostreptomycien à la solution trouble et on laisse rer. er à 50-55 C la solution précipite rapidement des cristaux (environ 5 minutes) et se clarifie. On rajoute du méthanol jusqu'à ce que la solution se trouble légèrement et on laisse reposer le mélange comme ci-dessus. On répète l'opération jusqu'à ce que la quantité de méthanol ajoutée atteigne 100 cm3 et que le mélange devienne limpide.
On abaisse alors la température du mélange à l'ambiance et on filtre les cristaux, puis on agite dans le méthanol pendant cinq minutes. On sépare les cristaux par filtration, on les lave à l'aide de méthanol et on les sèche à 55 C sous, pression réduite. Le rendement est de 8,9 g (738 mcg/mg en dihydrostreptomycine) Plusieurs recristallisations portent la puissance à 780 mcg/mg environ en dihydrostreptomycine Dans le procédé ci-dessus, le sulfate de magnésium détruit la substance à action histaminique contenue dens la matière.
Exemple 13 -
On étend à 50 cm3 au moyen d'eau 5 cm3 du concen- tré du composé actif obtenu dans l'exemple 10 (b) (puissance 368 OCO mcg/ml) et on ajoute une solution saturée chaude de métahyl-orange jusqu'à ce qu'il ne se forme plus de préci- pité. Après refroidissement on sépare le précipité par fil- tration et on le fait recristalliser à plusieurs reprises au sein de méthanol aqueux, ce aui donne 2,1 g d'hélianthate du composé actif. On règle une suspension de l'hélianthate dans une petite quantité d'eau à pH 2 au moyen d'acide sulfurique étendu; le couiposb actif passe à l'état de sulfa- te soluble.
On filtre la solution pour enlever le méthyl- orange séparé et on la traite au moyen d'une petite quantité de chrobon actif. A la solution incolore ainsi obtenue on ajoute dix fois son volume d'actone anhydre; il se sépare
<Desc/Clms Page number 42>
alors 0,6 g de sulfate du composé actif.
Résumé.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
/ Procédé de production de dihydrostreptomycine et de ses sels, caractérise par les points suivants, séparément ou en combinaisons :
1- On cultive une souche d'un micro organisme pro- ducteur de dihydrostreptomycine du type des Streptomyces au sein d'un milieu nutritif, dans des conditions aérobies, jusqu'à ce que le milieu ait acquis une activité substan- tielle de dihydrostreptomycine;
2- La quantité de dihydrostreptomycine produite dans le bouillon est d'au moins 10 gamma par centimètre cube;
3- La culture est effectuée dans des conditions aérobies submergées,
4- Le microorganisme est une souche de STreptomy- ces humidus ou de ses variantes de mutation naturelles ou provoquées;
5- La température de la culture est de 24 à 30 C et sa durée est de trois à huit jours;
6- La récupération de la dihydrostreptomycine ou de ses sels est effectuée à l'aide d'un adsorbant;
7- La récupération comprend l'extraction de l'antibiotique au moyen d'un solvant immiscible à l'eau;
8- La récupération de la dihydrostreptomycine s'effectue en formant un composé insoluble de l'antibiotique;
9- La récupération de la dihydrostroptomycine est effectuée par séparation chromatographique;
10- Ladite séparation est effectuée à l'aide d'un échangeur d'ions;
11- L'agent adsorbant utilisé est le charbon actif;
12- L'extraction est effectuée dans des conditions légèrement alcalines ;
<Desc/Clms Page number 43>
13- Le solvant organique est le butanol ou l'isoamylol ;
14- L'agent de formation d'un sel insoluble de l'antibiotique est leméthyl-orange.
B- Bouillon de culture ou filtrat de bouillon conte- nant de la dihydrostreptomhcine, obtenu par culture d'une souche de Streptomyces productrice de dihydrostreptomycine, et singulièrement de strsptomyces humidus ou de ses variétés de mutation naturelles ou provoquées.