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PERFECTIONNEMENTS APPORTES AUX PROCEDES DE FABRICATION D'ANTIBIOTIQUES.
L'invention est relative à la fabrication d'un antibiotique dénommé carbomycine (appelé initialement P.A.97); et elle concerne, plus par- ticulièrement, la préparation de ce produit par fermentation, les méthodes pour sa récupération et sa concentration à partir de solutions brutes telles que des bouillons de fermentation, des procédés pour sa purification et des procédés pour la préparation de ses sels. L'antibiotique peut être utilisé tel quel, sous la forme de ses sels dans des solutions diluées, sous la forme de produits concentrés bruts et à l'état cristallisé pur. Ces produits sont particulièrement intéressants, in vitro, comme désinfectants ou par application locale ou interne comme agents thérapeutiques pour combattre les mycobactéries pathogéniques et divers micro-organismes gram-positifs.
L'antibiotique est formé pendant la culture dans des conditions convenablement réglées, d'une souche qui n'a pas été décrite jusqu'ici et qui appartient à une espèce de micro-organismes connus sous le nom de Streptomyces halstedii. Cette culture a été plantée et essayée sur un milieu utilisé normalement pour l'identification d'actinomycètes et, en se basant sur les résultats obtenus, elle a été identifiée comme étant une nouvelle souche de Streptomyces halstedii en se servant de la description des actinomycètes qui se trouve dans.le traité de Bergey : of Determinative Bacterio- logy" 6ème édition (1948). Les caractéristiques de cette souche diffèrent, en certains points, de la description des Streptomyces halstedii donnée par Bergey.
Des cultures vivantes de la nouvelle souche ont été déposées auprès de la Division de Fermentation du North Regional Research Laboratory à Peoria (Illinois) aux E.U.A. et ont été ajoutées à sa collection permanente de micro-organismes sous le n NRRL-2331.
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Les caractéristiques culturelles de la nouvelle souche, désignée ci-après par NRRL-2331 (initialement on la désignait par "souche isolée n 13040-30 A) sont indiquées dans le tableau. suivant. (Les couleurs accom-- pagnées de la lettre R sont celles de Hidgway, Color Standards and Nomencla- ture).Les indications sont basées sur celles obtenues avec six éprouvettes à moins qu'on le spécifie autrement.
TABLEAU Streptamyces Halstedii
NRRL - 2331
EMI2.1
<tb>
<tb> Couleur
<tb> Culture <SEP> Degré <SEP> mycélium <SEP> Pigment
<tb> de <SEP> aérien <SEP> et <SEP> Remarques
<tb> culture <SEP> sporula- <SEP> soluble
<tb> tion
<tb> Glucose <SEP> modéré <SEP> Bonne <SEP> sporu- <SEP> aucun <SEP> Bord <SEP> de <SEP> la <SEP> colonie
<tb> aspara- <SEP> lation; <SEP> gris <SEP> lisse; <SEP> colonie <SEP> légègine <SEP> souris <SEP> (R) <SEP> à <SEP> rament <SEP> en <SEP> saillie; <SEP> engris <SEP> olive <SEP> vers <SEP> blanc <SEP> à <SEP> brun <SEP> très
<tb> foncé <SEP> (R), <SEP> clair <SEP> ; <SEP> spores <SEP> gram-poquelques <SEP> sec- <SEP> sitives; <SEP> tiges <SEP> mesurant
<tb> teurs <SEP> de <SEP> my- <SEP> 2,27 <SEP> x <SEP> 1,95/u; <SEP> quelques
<tb> celium <SEP> aérien <SEP> spirales <SEP> libres;
<SEP> chaines
<tb> blanc, <SEP> séparées <SEP> recourbées <SEP> au
<tb> bout.. <SEP> Plaques <SEP> en <SEP> dilution. <SEP> Colonies <SEP> semblables <SEP> excepté <SEP> qu'elles
<tb> ont <SEP> des <SEP> degrés <SEP> variables
<tb> de <SEP> couleur <SEP> depuis <SEP> le
<tb> gris <SEP> olive <SEP> (R) <SEP> jusqu-,au
<tb> gris <SEP> olive <SEP> foncé <SEP> (R).
<tb>
Glucose <SEP> modéré <SEP> mycélium <SEP> aé- <SEP> aucun <SEP> Colonie <SEP> plissée <SEP> envers
<tb> Agar <SEP> rien <SEP> blanc; <SEP> blanc <SEP> crémeux
<tb> pas <SEP> de <SEP> spores; <SEP> bord <SEP> lichénique
<tb> Agar <SEP> pauvre <SEP> mycélium <SEP> aé- <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc <SEP> crè@eux
<tb> nutri- <SEP> à <SEP> rien <SEP> blanc;
<tb> tif <SEP> modéré <SEP> un <SEP> peu <SEP> de
<tb> sporulation
<tb> blanche <SEP> autour <SEP> du <SEP> bord
<tb> de <SEP> la <SEP> colonne; <SEP> un <SEP> peu <SEP> de
<tb> colonies <SEP> cireuses
<tb> Morceaux <SEP> pauvre <SEP> mycélium <SEP> aé- <SEP> gris
<tb> de <SEP> pom- <SEP> à <SEP> rien <SEP> blanc;
<SEP> clair
<tb> mes <SEP> de <SEP> modéré <SEP> aucune <SEP> spo- <SEP> brun
<tb> terre <SEP> rulation
<tb> Malate <SEP> pauvre <SEP> Bonne <SEP> sporu- <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc <SEP> crèmeux
<tb> de <SEP> à <SEP> lation <SEP> gris
<tb> calcium <SEP> modéré <SEP> souris <SEP> foncé
<tb> (R) <SEP> colonies
<tb> étalées.
<tb>
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TABLEAU l (Suite)
EMI3.1
<tb>
<tb> Plaques <SEP> modéré <SEP> mycelium <SEP> aé- <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc; <SEP> hydrolyse
<tb> d'ami- <SEP> rien <SEP> blanc; <SEP> pauvre.
<tb> don <SEP> sporulation
<tb> pauvre <SEP> ;
<tb> blanc <SEP> grisâtre
<tb> Agar <SEP> bon <SEP> bonne <SEP> sporu- <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> gris <SEP> foncé <SEP> à <SEP> gris
<tb> synthé- <SEP> lation <SEP> gris <SEP> clair <SEP> ;
<SEP> de <SEP> spirales <SEP> en
<tb> tique <SEP> souris <SEP> (R) <SEP> présence.
<tb> à <SEP> gris <SEP> souris <SEP> foncé <SEP> (R)
<tb> Cellu- <SEP> pauvre
<tb> lose
<tb> Emerson <SEP> brun <SEP> sur <SEP> oertai- <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc <SEP> crémeux
<tb> nes <SEP> parties
<tb> du <SEP> tube <SEP> aucune <SEP> sporulation; <SEP> mycelium <SEP> aérien
<tb> blanc <SEP> ; <SEP> sur
<tb> d'autres <SEP> parties <SEP> une <SEP> sporulation <SEP> gris
<tb> souris <SEP> (R)
<tb> Bouil- <SEP> modéré <SEP> nitrates <SEP> réduits
<tb> lon <SEP> à
<tb> la <SEP> dextrose
<tb> et <SEP> au
<tb> nitrate
<tb> Gélati- <SEP> bon <SEP> mycélium <SEP> aé- <SEP> aucun <SEP> liquéfaction <SEP> pauvre <SEP> ;
<tb> ne <SEP> à <SEP> 21 <SEP> rien <SEP> blanc <SEP> ;
<SEP> blanc.
<tb> aucune <SEP> sporulation
<tb> -lait <SEP> modéré <SEP> aucun <SEP> lait <SEP> coagulé <SEP> dans <SEP> 2 <SEP> éprou-
<tb> écrémé <SEP> vettes <SEP> ; <SEP> lait <SEP> non <SEP> changé <SEP> dans
<tb> (15 <SEP> 2 <SEP> éprouvettes; <SEP> aucune <SEP> pepjours) <SEP> tonisation <SEP> ; <SEP> protéolysetrès
<tb> faible
<tb>
La nouvelle souche de Streptomyces halstedii NRRL-2331 diffère de la descritpion donnée dans le traité de Bergey à plusieurs points de vue.
Les différences sont indiquées dans le tableau suivant :
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TABLEAU II
EMI4.1
<tb>
<tb> Milieu <SEP> Souche <SEP> NRRL-2331 <SEP> Description <SEP> de <SEP> Bergey
<tb> Amidon <SEP> Croissance <SEP> modérée; <SEP> Croissance'abondante; <SEP> croisAgar <SEP> mycelium <SEP> aérien <SEP> blanc; <SEP> sance <SEP> brunâtre <SEP> et <SEP> brillant
<tb> sporulation <SEP> pauvre
<tb> d'un <SEP> blanc <SEP> grisâtre.
<tb>
Glucose <SEP> Bord <SEP> lichénique, <SEP> res- <SEP> Bord <SEP> de <SEP> la <SEP> colonie <SEP> lichénique <SEP> deveAgar <SEP> te <SEP> blanc, <SEP> nant <SEP> brun.
<tb>
Morceaux <SEP> Croissance <SEP> pauvre <SEP> à <SEP> Croissance <SEP> abondante; <SEP> croissance
<tb> de <SEP> pom- <SEP> modérée <SEP> avec <SEP> du <SEP> my- <SEP> humide, <SEP> plissée, <SEP> de <SEP> couleur <SEP> crème
<tb> mes <SEP> de <SEP> celium <SEP> blanc <SEP> ; <SEP> pas <SEP> de <SEP> teintée <SEP> de <SEP> vert.
<tb> terre <SEP> spores.
<tb>
Agar <SEP> syn- <SEP> Spirales <SEP> en <SEP> présence <SEP> Pas <SEP> de <SEP> spirales.
<tb> thétique <SEP> mais <SEP> pas <SEP> nombreuses.
<tb>
Il est à noter que, pour la production de carbomycine, l'inven- tion n'est pas limitée à cet organisme particulier ou à des organismes qui correspondent entièrement à la description donnée ci-dessus et qui n'est indiquée qu'à titre d'exemple. En réalité, il est spécialement désiré et envisagé d'inclure l'usage de dérivés obtenus à partir de l'organisme décrit par des méthodes ou agents tels qu'une exposition aux rayons X ou aux rayons ultraviolets, des moutardes à l'azote et analogues.
La carbomycine montre une activité élevée contre plusieurs micro-organismes. Comme indiqué plus haut, elle est particulièrement remarquable pour son action sur des mycobactéries et les micro-organismes gram-positifs. Elle montre une certaine activité contre les micro-organismes gram-négatifs mais à un degré moins élevé. Le tableau ci-dessous donne le spectre antibiotique de la carbomycine contre une variété de micro-organismes gramnégatifs et gram.-positifs. Les essais ont été faits en inoculant du bouillon nutritif contenant diverses concentrations de l'antibiotique pur avec l'organisme particulier essayé. Les chiffres marqués dans la colonne "croissance" indiquent la concentration la plus élevée qui a été essayée (en mcg/ml) pour laquelle la croissance des micro-organismes a encore lieu.
L'essai a été fait dans les conditions normalisées, les éprouvettes étant incubées pendant une période normalisée.
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TABLEAU III
EMI5.1
<tb>
<tb> Croissance <SEP> Pas <SEP> de
<tb> croissance
<tb>
EMI5.2
----¯--4---<='-oCI...A1..:>Q."I8:I--" --q''''- ........-}aMl----¯......."".b....,. - Á.-- 1 J - 'T ...---..-..
EMI5.3
<tb>
<tb> Strep. <SEP> faecalis <SEP> - <SEP> 0,19 <SEP> mcg/ml
<tb> Brucella <SEP> bronchiseptica <SEP> 6,25 <SEP> mcg/ml <SEP> 12,5
<tb> A. <SEP> aerogenes <SEP> 2 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 21 <SEP> 100
<tb> Proteus <SEP> Sp. <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Ps. <SEP> aeruginosa <SEP> 173 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> M.- <SEP> albicans <SEP> 8 <SEP> 100
<tb> E. <SEP> typhosa <SEP> 344 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 132 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 134 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> S.
<SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 139 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes
<tb> var.aureus <SEP> 5 <SEP> 0,19 <SEP> 0,39
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> 219 <SEP> 0,39 <SEP> 0,78
<tb>
En plus des micro-organismes susdits, certaines souches ré- sistantes ont été utilisées pour déterminer l'activité de l'antibiotique.
Par exemple, en se servant d'une souche de Auromyces aerogenes, qui résiste à l'auréomycine et au chloramphénicol, on constate que la croissance se pro- duit à une concentration de 25 mcg de carbomycine par ml de bouillon nutri- tif mais qu'une croissance n'a pas lieu pour une concentration de 50 mcg/ml.
Pour un deuxième essai de ce genre, une souche de A. aerogenes, résistant à la fois à la streptomycine et à la streptothricine, on a constaté également une croissance de cette souche en présence de 25 mcg/ml de carbomy@ine alors qu'aucune croissance n'a lieu pour une concentration de 50 mcg/ml. Par ail- leurs, pour montrer l'efficacité de l'antibiotique contre des souches résis- tantes de ce genre, cet essai prouve également que l'antibiotique est nette- ment différent de l'auréomycine, le chloramphénicol, la streptothricine et -la streptomycine. Il est également à noter que la carbomycine est même plus active contre les souches résistant au A. aerogenes qu'il l'est contre la souche normale de A. aerogenes, comme visible dans le Tableau III susdit.
On a constaté qu'une souche de staphylococcus aureus est résis- tante in vitro à l'action de pénicilline à une concentration de 100 unités/ml; à la dihydrostreptomycine avec 100 unités/ml; à la polymixine avec 100 unités/ ml; alors qu'elle est sensible à l'action du chloramphénicol avec 100 mcg/ml et à l'auréomycine avec 12,5 mcg/ml. La croissance de l'organisme en question est empêchée par une concentration de 3,1 mcg/ml de carbomycine.
La carbomycine est très efficace contre une variété de types de mycobactéries. Le tableau ci-dessous donne les résultats de ces essais. Dans ces cas, des éprouvettes, contenant un milieu liquide de Dubos avec 0,5 % d'al- bumine, sont utilisées pour les essais. La carbomycine est ajoutée au milieu avec des concentrations différentes comme montré dans la première colonne du tableau suivant. Des éprouvettes du milieu contenant plusieurs concentrations de l'antibiotique, comme indiqué, sont ensuite inoculées avec des cultures de diverses mycobactéries. Le nom de l'espèce est indiqué en tête de chacune des colonnes du tableau. Sous le nom des espèces on donne les résultats de l'essai. Celui-ci a lieu en incubant les tubes dans des conditions stériles pendant 18 heures.
Le manque de croissance dans les éprouvettes à la fin de
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la période d'essai normalisée est indiqué par (-), une croissance douteuse par (¯) et une croissance par (+).
TABLEAU IV
EMI6.1
<tb>
<tb> Activité <SEP> de <SEP> la <SEP> carbomycine <SEP> contre <SEP> les <SEP> mycobactéries
<tb> mcg/ml <SEP> rande <SEP> phlei <SEP> smegmatis <SEP> 607 <SEP> berolinen- <SEP> butyrise <SEP> cum
<tb> 12,5 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 6,25 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 3,12 <SEP> ¯ <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 1,56 <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 0,78 <SEP> + <SEP> ¯ <SEP> - <SEP> ¯ <SEP> -
<tb> 0,39 <SEP> + <SEP> +- <SEP> ¯ <SEP> ¯
<tb> 0,19 <SEP> + <SEP> + <SEP> ¯ <SEP> + <SEP> ¯ <SEP> +
<tb>
Le tableau ci-dessus montre que la carbomycine présente un degré d'activité extraordinaire contre ces mycobactéries.
On a constaté que la carbomycine a un niveau relativement bas de toxicité quand elle est utilisée pour des essais sur des animaux. Par exemple la valeur LDo, quand l'antibiotique est administré en étant injecté dans les veines de souris sous la forme d'une solution dans de l'eau acidulée, est approximativement égale à 7 mg/20g de souris. La toxicité pour d'autres es- meces et pour d'autres méthodes d'administration est comparable.
L'invention a pour objet, entre autres, un procédé pour cultiver la souche,qui n'a pas encore été décrite jusqu'ici, de S. halstedii. La culture de ce micro-organisme a lieu, de préférence, dans un milieu nutritif aqueux à une température d'environ 24 - 30 et à l'état submergé en ce qui concerne l'agitation et l'aération. Des milieux nutritifs qui sont utiles pour ce procédé, comprennent des hydrates de carbone, tels que des sucres, de.l'amidon, du glycerol, de la farine de mais et une source d'azote organi- que, telle que la caséine, la farine de soja, la farine d'arachides, le gluten de blé, la farine de graines de coton, l'albumine du lait, l'extrait enzymatique de caséine, le trypton.
Une source d'agents favorisant la croissance, tels que des produits de macération solubles fournis par les distilleries, l'extrait de levure,les résidus de fermentation des mélasses ainsi que des sels minéraux, tels que le chlorure de sodium, le phosphate de potassium, le nitrate de sodium, le sulfate de mangéisum et des traces de matières inorganiques telles que le cuivre, le zinc et le fer peuvent également être utilisés avec des résultats avantageux. Si une production excessive de mousse est obtenue pendant la fermentation, des agents anti-mousse, tels que des huiles végétales, peuvent être ajoutés au milieu de fermentation. Le pH de la fermentation tend à rester plus constant mais, si des variations se produisent, un agent tampon tel que le carbonate de calcium peut également être ajouté au milieu.
Un inoculum pour la préparation de carbomycine, pour la croissance de la souche de S. Halstedii, peut être obtenu en utilisant des cultures fournies par des germes de cette souche sur des milieux tels que l'agar d'Emerson ou le lactose de boeuf. Les cultures peuvent être utilisées pour inoculer des flacons secoués ou des cuves d'inoculation pour la culture submergée. Suivant une variante on peut également ensemencer des cuves d'inoculation avec le contenu de flacons secoués. La croissance du micro-organisme atteint généralement son maximum en environ 2 à 3 jours. Toutefois, la constitution particulière des appareils utilisés, le degré d'aération, l'importance de l'a-
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gitation, etc. peuvent influencer la vitesse à laquelle l'activité maximum est atteinte.
En général, une période comprise entre environ 24 heures et-4 jours est une période désirable pour obtenir l'antibiotique. L'aération du milieu dans des cuves pour la culture submergée est poursuivie avec un débit d'environ un demi à deux volumes d'air frais par volume de bouillon et par minute. L'agitation peut être effectuée par des agitateurs appropriés bien connus de ceux qui s'occupent de l'industrie de fermentation. Des conditions aseptiques doivent, évidemment, être maintenues pendant le transfert de l'ino- culum et pendant toute la croissance du micro-organisme.
Après la croissance" du micro-organisme, le mycelium, qui est généralement très abondant et fin, peut être séparé du bouillon de fermenta- tion en se servant de divers appareils normalisés, tels que des filtres-pres- ses, des centrifuges, etc.. On a trouvé qu'en diminuant le pH de l'ensemble du bouillon de fermentation jusqu'à environ 3,0 on facilite la filtration.
Comme l'antibiotique n'est pas très stable dans des conditions acides, le bouillon de fermentation est réglé de manière à être à peu près neutre quand il a été filtré. La carbomycine peut être séparée du bouillon de fermenta- tion par un grand nombre de procédés différents. Suivant une variante, tout le bouillon peut être utilisé tel quel ou il peut être séché. L'antibiotique peut être purifié davantage de différentes manières. Par exemple, le composé peut être extrait hors de la solution aqueuse à des pH neutres ou légèrement alcalins, compris de préférence entre environ 6 et environ 10 par divers solvants organiques non miscibles à l'eau, ces solvants comprenant des éthers, des hydrocarbures aromatiques, des esters, des cétones, des alcools inférieurs et des hydrocarbures halogénés.
Parmi ces solvants, on peut citer à titre d'exemples l'éther diéthylique, le benzène, le toluène, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, la méthyl-isobutyle-cétone, le butanol et le chlorofor- me. Même pour des pH acides, certains de ces solvants extraient une quantité appréciable de l'antibiotique. Ceci est surtout vrai pour des alcools nonmiscibles à l'eau, tels que le butanol, les pentanols, etc. L'antibiotique peut être extrait hors de la plupart des solutions dans le solvant et après dans de l'eau acidulée, de préférence à un pH inférieur à environ 2,5. Si on le désire, l'extrait dans le solvant peut être concentré avant l'extraction dans l'eau acidulée. En réglant le pH pour la neutralité ou l'alcalinité, l'antibiotique peut être extrait à nouveau dans un des solvants.
Après l'évaporation du solvant et concentration de la solution, l'antibiotique forme des cristaux. Il cristallise généralement sous la forme d'aiguilles blanches épointées. Toutefois, dans certains cas, on obtient des cristaux en paillettes. Le produit peut être recristallisé à nouveau hors du benzène, de l'éther, des cétones inférieurs ou d'alcools inférieurs. Si on le désire, une solution dans un des alcools ou cétones miscibles à des cétones est concentrée et de l'eau est ajoutée pour faciliter la cristallisation. Suivant une variante, l'antibiotique peut être récupéré par adsorption du bouillon ou des produits concentrés par du charbon activé. Une reprise dans de l'acide ou dans l'eau, en même temps qu'un solvant miscible à l'eau contenant de l'acide, permet d'obtenir le composé sous une forme purifiée.
La carbomycine est un composé organique blanc et faiblement basique qui est soluble dans des acides aqueux dilués mais elle est seulement légèrement soluble dans l'eau (environ 0,5 mg/ml). Elle est extrêmement soluble das plusieurs solvants organiques tels que l'acétone, l'éther, le benzène, le chloroforme et le dioxane et un peu moins soluble dans le méthanol et l'éthanol. Elle est insoluble dans l'hexane. En concentrant une solution de carbomycine dans un solvant, on tend à former des solutions sursaturées et les cristaux qui se forment ont une tendance à retenir un peu du solvant utilisé. La stabilité du composé diminue dans des solutions fortement acides et basiques, même à la température ambiante.
Le composé est très instable après chauffage dans des solutions acides et alcalines et sa stabilité est maximum avec un pH compris entre 3 et 7. Sa stabilité à l'état sec ou après dissolution dans des solvants secs est bonne.
Un produit de base à la carbomycine cristallisée et fortement purifiée, comme celui obtenu par quatre recristallisations hors de solvants
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tels que l'éthanol, le benzène, etc., tend à se former à 1?état de cristaux imprégnés de solvants dont on peut séparer le solvant, dune manière plus ou moins complète, par un séchage sous vide à 100 . Quand une telle matière est séchée dans ces conditions pendant trois heures, elle 1 un point de fu- sion de 217 - 218 avec une légère décomposition. L'échantillon est intro- duit à 196 dans le bain,qui sert à la détermination du point de fusion et la température du bain est augmentée à une vitesse de 3,6 .par minute.
La matière anhydre cristallisée forme un monohydrate quand elle est exposée à ' l'humidité atmosphérique. Ce monohydrate analysé a la composition suivante : carbone = 59,01; hydrogène = 8,35; azote = 1,66; oxygène (par différence) = 30,98.
Le produit de base cristallisé, fortement purifié et séché sous vide à 100 , pendant trois heures, est analysé et on trouve qu'il a la com- position suivante : carbone : 60,04 ; hydrogène = 8,24; azote = 1,55; oxygène (par différence) = 30,17.
La rotation optique de la matière est d'environ [a] = -55 (solution à 1% dans du chloroforme). en titrant le composé dans un mélange de deux volumes de formamide de diméthyle et un volume d'eau on obtient un pKa = 6,4 et un poids moléculaire d'environ 866. Le spectre d'absorption ul- traviolet du produit de base, quand il est dissous dans l'éthanol, a deux maxima, dont un-se présente à 240 m /u (# = 16.080) et l'autre à 327,5 m /u. (# = 113). Quand le produit de case cristallisé et anhydre est dissous dans le chloroforme, il a un certain nombre de sommets caractéristiques dans la région de l'infra-rouge.
Parmi ces sommets on peut citer les fréquences suivantes (en cm-1) : 3510, 2920, 1732, 1690, 1630, 1460, 1375, 1300, 1230, 1160, 1122, 1077, 1052, 1025, 1015, 976, 916, 910, 873 et 837. Le spectre infra-rouge est montré sur la figure 1 des dessins ci-annexés. Le diagramme de la figure 1 indique en abscisses supérieures les fréquences f en cm-1 avec en abscisses inférieures les longueurs d'ondes \ en microns /u et en ordonnées les valeurs de transmittance en %.
Les sels de la carbomycine, obtenus à l'aide d'acides, peuvent être préparés en traitant le produit de base avec l'acide approprié. Par exemple, si la base est dissoute dans l'éther et si on fait barboter un cou- rant d'acide chlorhydrique dans la solution, le chlorhydrate de carbomycine précipite immédiatement. D'autres acides peuvent être utilisés pour des pro- cédés identiques ou similaires en vue d'obtenir les sels acides de l'anti- biotique. Le traitement de la base avec l'acide peut être effectué dans un milieu aqueux dans lequel le sel acide formé est soluble. Le sel peut alors être récupéré par évaporation du milieu aqueux.
Toutefois, comme indiqué plus haut, la carbomycine n'est pas très stable dans des solutions acides aqueu- ses de sorte que l'on doit procéder avec soin.
Le chlorhydrate cristallisé et séché de carbomycine, qui est dissous dans le chloroforme, présente, entre autres, les sommets caractéris- tiques dans la région de l'infra-rouge (en cm-1) : 3220, 2870, 1715, 1670, 1610, 1450, 1358, 1296, 1230, 1160, 1140, 1120, 1100, 1074, 1060, 975, 914, 890 et 860. Le spectre d'absorption dans l'infra-rouge de ce sel est montré sur la figure 2 avec les mêmes coordonnées que celles de la figure 1.
Plusieurs micro-organismes différents peuvent être utilisés pour déterminer l'activité des préparations de carbomycine. Ils comprennent le K. pneumoniae, le B. subtilis, le Staph. aureus et d'autres organismes d'es- sais normalisés. Quand on utilise le K. pneumoniae, on peut se servir de l'es- sai pour la mesure de la turbidité ou de l'essai à la plaque. Du chloramphé- nicol cristallisé peut être utilisé comme repère en accordant 'une valeur de 1000 unités/mg à cet antibiotique. Sur cette base, la carbomycine cristalli- sée a une activité de 750 à 850 unités de chloramphénicol par mg. Quand on prépare la carbomycine par fermentation on obtient une activité d'environ 15 à environ 100 unités/ml.
La carbomycine se distingue des autres antibiotiques par ses propriétés. Celles qui ont été utilisées pour cette comparaison sont celles
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indiquées plus haut ainsi que les mesures faites avec du papier chromographi- que, ces mesures montrant une différence très nette. Des comparaisons ont également été faites avec des micro-organismes résistant à divers autres an- tibiotiques.
Les exemples ci-dessous n'ont qu'un caractère illustratif et ne limitent en rien la portée de la protection de l'invention.
EXEMPLE l
Des spores d'un germe de S. halstedii NRRL-2331, obtenu sur de l'agar d'Emerson, sont transférés, dans des conditions aseptiques, dans un milieu nutritif ayant la composition suivante : cérélose 10 g farine de soja 10 chlorure de sodium 5 solubles de distillerie 5 carbonate de calcium 1
Le mélange est dilué jusqu'à avoir le volume d'un litre et son pH est réglé jusqu'à être égal à 7 avec de la potasse caustique avant la stérilisation. Quand le milieu a refroidi, on ajoute les spores. On cultive -l'organisme dans des flacons secoués pendant deux jours à environ 28 .
Le bouillon contenant le mycélium est ensuite-transféré dans un milieu stérile, ayant un volume vingt fois plus grand et la composition suivante : amidon 20 g caséine 10 farine de soja 15 carbonate de calcium 1
Ce mélange est dilué jusqu'à faire un litre et son pH est réglé à 7 avant l'introduction dans l'autoclave et l'ensemencement. Après agitation et aération, dans des conditions stériles pendant deux jours, l'activité du bouillon est de 100 unités/ml. Le pH du mélange est réglé à 3,0 et le mycelium est enlevé par filtration. Le pH du filtrat est réglé à 6,5 et il est ensuite extrait deux fois avec un quart de volume de méthyl isobutyle cétone.
Les phases de solvant mélangées sont concentrées à un dizième de volume sous vide. L'antibiotique est ensuite extrait dans l'eau à un pH d'environ 2,0 en se servant d'acide,sulfurique pour régler le pH. La phase aqueuse est séparée, lavée avec un petit volume de benzène pour enlever la méthyl isobutyle cétone dissoute et le pH de la phase aqueuse est réglé à 6,5. L'antibiotique est extrait plusieurs fois à l'éther et les phases d'éther séparées sont séchées sur du sulfate de sodium anhydre. Le solvant est enlevé par distillation et l'antibiotique cristallise sous forme d'aiguilles blanches. Le produit est recristallisé en le dissolvant dans l'acétone, il est filtré et concentré, après quoi on ajoute de l'eau.
Un schéma du traitement, basé sur le procédé d'extraction susdit, est montré sur le tableau V.
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EMI10.1
1 Mi /jeu Culf .5. tlasf dc'É R d gf9 Acide pH 3.0 '#####' Mycellum Fiffre. p H ,5 ' Cétone 9 ' ârbomyci ,e MetYl C<Tb "Y'n6 150bulyl orssol. Aqueuse 2 X El. XL rac t. &Ons µ xtraj[ H2 504 Céto11e Carbomycine pH2.o hors du solvant ####### L qvage 1 ±)e '(')2 ènel Phase '####### 8enzene C cetone Aqueuse N ev l'r8ti5 é p H 6.5 tir&H:####! r Et he,... l caroomyctne '######' Ether Secé sur Na 2 504 . Dist il lé carbo-rnycine Acit 01') e solides' ######t impure t'e nïe impure tés ######' Carbom ytin
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Le produit obtenu est très efficace contre une variété de mycobactéries et de micro-organismes gram-positifs.
EXEMPLE II
Un milieu est préparé ayant la composition suivante : amidon 20 g solubles de distillerie 10 g farine de soja 15 g Le mélange de ces matières est ajouté à un litre d'eau et le pH est réglé à 7 avant l'addition d'un gramme de carbonate de calcium. Le milieu est alors introduit dans un autoclave et est ensemencé avec un inoculum S. halstedii NRRL-2331 dans des conditions stériles. Le mélange est soumis à une aération et à une agitation dans des conditions stériles à environ 28 pendant deux jours. On constate, à 1'essai, que le bouillon filtré contient 25 unités de carbomycine par millilitre de solution.
L'antibiotique sera mis sur le marché sous la marque déposée "MAGNAMYCINE".
REVENDICATIONS.
1. Procédé de fabrication d'un antibiotique, dans lequel on cultive du streptomyces halstedii NRRL-2331 ou un micro-organisme équivalent capable de fournir de la carbomycine dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies et en submersion jusqu'à ce qu'une quantité suffisante de carbomycine (telle que spécifiée plus haut) soit produite pour procurer une activité antibactérienne audit milieu.