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Il est connu de faire cristalliser l'insuline à partir d'un milieu aqueux contenant un métal promoteur de cristallisa- tion, de préférence du zinc, en ajustant le milieu aqueux à une valeur de pH située dans l'intervalle de 5 à 7. Dans le but de fixer la valeur du pH durant la cristallisation on utilise une substance tampon, d'ordinaire du phosphate de sodium, du citrate de sodium, de l'acétate d'ammonium ou de l'acétate de sodium.
En ce qui concerne l'utilisation du phosphate de sodium et de l'acétate d'ammonium on se rapportera au brevet américain' N 2.143.590 et, en ce qui concerne l'usage de citrate de sodium, on se rapportera au brevet américain N 2. 626.228. On utilise parfois aussi une addition de solvants organiques capables de
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prévenir la précipitation d'insuline amorphe. Des exemples sont l'acétone, l'alcool propylique, butylique et amylique.
Les cristaux d'insuline obtenus par ces procédés contien- nent des ions de métaux promoteurs de cristallisation chimique- ment liés dans la structure cristalline elle-même; leur quantité varie suivant les conditions de cristallisation employées. On peut l'exprimer comme étant le nombre d'atomes de métal par cellule unitaire, une cellule unitaire étant définie comme étant l'unité cristallographique contenant 390 atomes d'azote proté- ique. On peut également l'exprimer en pourcentage de métal dans les cristaux secs ou par,le nombre de milli-équivalents de métal par gramme des cristaux secs. Par cristaux secs on entend des cristaux ayant une teneur en eau telle qu'ils montrent une te- neur en azote protéique d'environ 14,2%.
Lorsqu'il est fait usage de tampon citrate, comme révélé dans le brevet américain ? 2. 626.228, on obtient des cristaux contenant 2 atomes de métal par cellule unitaire, ce qui corres- pond à 0,34% de zinc. Lorsqu'on utilise le procédé suivant le brevet américain ? 2.143.590, dans lequel la cristallisation est effectuée en présence de tampon phosphate de sodium et la recristallisation en présence de tampon acétate d'ammonium, sans addition d'ions zinc, on'obtient des cristaux recristallisés contenant 3 atomes de métal par cellule unitaire des cristaux, ce qui correspond à 0,52% de zinc.
Lorsque l'insuline est cristallisée à partir d'une solutio en l'absence de substances précipitant le zinc, comme les tam- pons phosphates, ou en l'absence de substances, comme les tampons citrates, formant des composés de zinc fortement complexes, en utilisant par exemple le tampon acétate de sodium, et lorsqu'on utilise une teneur suffisamment élevée en ions de métaux promo- teurs de cristallisation dans le milieu de cristallisation, on obtient des cristaux contenant jusqu'à 5 atomes de métal par
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cellule unitaire, ce qui dans le cas du zinc correspond à une teneur en zinc d'environ 0,8%
Si le milieu de cristallisation a une concentration ionique tellement élevée en métaux promoteurs de cristallisation qu'un cristal d'insuline, après avoir été mis en suspension dans ce milieu,
contienne plus d'environ 6 atomes de métal par cellule unitaire, il n'y aura qu'une formation très lente de cristaux d'insuline, ou même il ne s'en formera pas du tout.
Les cristaux d'insuline obtenus par les procédés décrits plus haut sont de structure rhomboédrique; très souvent ils n'apparaitront pas sous la forme de rhomboèdres à arêtes vives l'imités par des faces cristallines planes. Lorsque l'insuline contient des impuretés préalablement à la cristallisation, les cristaux résultants apparaitront sous la forme de corps cristal- lins arrondis dans le cas où on prend comme matière de départ de l'insuline dérivant des glandes pancréatiques du porc; lorsque l'insuline dérive de glandes pancréatiques bovines, les cristaux ' résultants ont toujours la.forme de macles, d'étoiles" ou de rhomboèdres déformés, même après recristallisation.
Lorsque des cristaux d'insuline comme décrit dans le brevet américain ? 2. 143.590 sont mis-en suspension dans de l'eau distillée et injectés dans des lapins, l'action biologique obte- nue peut à peine être distinguée de l'action rapide et courte d'une solution de cristaux d'insuline (insuline ordinaire), voir à ce sujet J.
Pharm. 58, 93-104, 1936., D'un autre côté, lorsqu'un sel soluble dans l'eau d'un métal promoteur de cristallisation est ajouté à ladite suspension de cristaux d'insuline, on obtient un effet fortement prolongé, en ce sens que les cristaux en sus- pension à réaction neutre (pH du sang) se combineront avec les ions des métaux promoteurs de cristallisation avec formation d'un composé insuline-métal légèrement soluble et lentement résorbable montrant une teneur en métal d'au moins 6 atomes de
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métal par cellule unitaire, ce qui correspond à une teneur en métal d'au moins 0,35 mini-équivalent par gramme de cristaux secs ; voir à ce sujet Science, vol. 116, N 3015, pages 394-398 (1952), et la demande de brevet hollandais imprimée NI 160. 281.
On vient de découvrir avec surprise que, sans l'emploi d'une addition supplémentaire d'un métal promoteur de cristalli- sation à une suspension de cristaux d'insuline, il est possible d'obtenir des préparations d'insuline convenant à l'usage clini- que et ayant un effet prolongé, en utilisant seulement un type spécial de cristaux d'insuline qui sont mis en suspension dans un milieu aqueux injectable ayant un degré d'acidité tel (pH 5 à 8) que les cristaux n'entrent pas en solution. En d'autres termes, il n'est pas nécessaire de prévoir dans le milieu de suspension aqueux des conditions telles que les cristaux d'insu- line à réaction neutre soient capables ie prélever du métal pro- moteur de cristallisation à partir du milieu.
Le type de cristaux d'insuline utilisé suivant la présente invention provient entièrement ou en partie de glandes pancréa- tiques bovines; ces cristaux ont la forme de rhomboèdres à arêtes vives avec faces cristallines planes. Lorsque ces cris- taux sont en suspension dans de l'eau et injectés de la manière usuelle, ils donneront un effet prolongé prononcé convenant aux applications cliniques; l'effet prolongé sera également obtenu lorsque le milieu de suspension aqueux conjointement avec des métaux promoteurs de cristallisation de l'insuline contient des substances telles que des substances tampons, dont les anions lient le métal promoteur de cristallisation à réaction neutre;
il n'est donc pas possible ainsi que les cristaux d'insuline en suspension absorbent le métal promoteur de cristallisation lorsque le milieu de suspension possède un pH de 7. -
Les cristaux d'insuline utilisés selon l'invention ne sont pas nouveaux en soi, mais, jusqu'à présent, on ne s'était pas
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encore rendu compte que lorsqu'ils sont en suspension dans de l'eau ils diffèrent thérapeutiquement des autres cristaux d'in- suline.
On peut obtenir ces cristaux par cristallisation dans un milieu aqueux contenant de l'halogène sous une forme ionogène à une concentration de plus de 0,2 mole par litre, sans dépasser 4 moles par litre. La teneur requise en ion halogène du milieu de cristallisation est obtenue le plus facilement en ajoutant des sels solubles dans l'eau de chlore, brome ou iode, ou de leurs mélanges. Les.sels préférés sont les sels de métaux alca- lins, d'ammonium et des métaux alcaline-terreux. Suivant l'inven- tion on préfère utiliser des cristaux d'insuline obtenue suivant ce mode, mais les cristaux peuvent aussi être obtenus en effec- tuant la cristallisation en présence de chlorhydrate de'triétha- nolamine, d'urée ou de formamide.
Lorsque les cristaux d'insuline bovine sont obtenus par ces procédés, ils montrent une teneur en ions de métaux promo- teurs de cristallisation chimiquement liés dans le réseau cris- tallin, cette teneur étant au moins de 4 atomes de métal par cellule unitaire, ce qui correspond à une teneur en zinc d'envi- ron 0,7% Toutefois, la. teneur en métal peut être enlevée après que les cristaux ont été formés, si bien que les cristaux utili- sés selon la présente invention ne montrent pas nécessairement une teneur quelconque en ion métallique.
Ainsi, si les cristaux d'insuline contenant 4 atomes de métal par cellule unitaire sont mis en suspension dans de l'eau contenant du tampon citrate de sodium (pH 6-7), les cristaux en suspension ne contiendront seulement que 2 atomes de métal par cellule unitaire et, si les cristaux sont lavés avec une solution à 20% de chlorure de so- dium acidifiée (pH de 2,5), tous les ions métalliques seront éliminés des cristaux.
Conformément avec ce qui est mentionné plus haut, le procé-
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dé selon l'invention se caractérise en ce que des cristaux d'in- suline provenant entièrement ou en partie de glandes pancréati- @ ques bovines et ayant la forme de rhomboèdes à arêtes vives, limités par des faces cristallines planes, sont en suspension dans un milieu aqueux injectable qui au préalable est exempt de toute teneur en métaux promoteurs de cristallisation de l'insu- line, ou qui montre une teneur telle en ces métaux, au besoin conjointement avec des substances telles que des substances tampons dont les anions lient le métal promoteur de cristalli- sation à réaction neutre, que les cristaux d'insuline en suspen- sion pour un pH 7 du milieu de suspension contiennent, chimique- ment liés dans le réseau cristallin,
moins de 6 atomes et de préférence 2 à 5 atomes de métaux promoteurs de cristallisation par oellule unitaire.
Du point de vue clinique il est avantageux de pouvoir dis- poser de préparations d'insuline ayant des modes d'action diffé- ,rente. On peut obtenir ce résultat de diverses manières suivant l'invention.
En premier lieu, le mode d'action des suspensions produites peut être changé par l'emploi de cristaux d'insuline d'origine différente, ceci tenant à ce que des suspensions de cristaux d'insuline dérivant de glandes pancréatiques porcines, même sous la forme de rhomboèdres à arêtes vives délimités par des faces cristallines planes, montrent une durée d'action relativement courte. Par conséquent, il est possible d'obtenir un effet ini- tial désiré par l'emploi de cristaux d'insuline dont un pourcen- tage prédéterminé provient du pancréas du porc. En faisant va- rier la proportion en poids dans les cristaux entre insuline provenant du pancréas du porc et insuline provenant du pancréas du boeuf, il est possible de faire varier dans de larges limites le mode d'action biologique de la suspension finale.
En deuxième lieu, le milieu aqueux peut avoir une teneur
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en cristaux d'insuline ayant la forme d'étoiles, de rhomboèdres déformés, de rhomboèdres maclés, de citrons et autres corps cristallins arrondis similaires qui, étant seuls en suspension aqueuses, ne montreraient pas d'effet prolongé notable. En chan- geant la teneur de ces cristaux d'insuline en suspension il est possible de modifier l'effet initial et l'effet prolongé de la suspension. Ces cristaux d'insuline à action rapide peuvent être obtenus de manière connue en soi, comme mentionné plus 'haut.
En troisième lieu, la durée d'action des suspensions cris- tallines produites augmente avec un accroissement de la dimen- sion des cristaux. Lorsqu'on utilise de petits cristaux, par exemple d'environ 3 , et de plus grands cristaux, par exemple de 30 , en faisant varier les proportions en poids, il est possible de faire varier le taux de résorption.et par conséquent le mode d'action biologique des suspensions, qui est d'autant plus long que les cristaux sont plus grands. C'est pourquoi se- lon l'invention il convient d'utiliser des cristaux d'insuline ayant une distribution de dimensions prédéterminée.
@ Donc, à l'aide de la présente invention il est possible de manière extrêmement simple, reposant seulement sur les cristaux d'insuline eux-même, sans l'intervention de substances addition- nelles auxiliaires, de produire des préparations d'insuline ayant un effet polyphasé, à savoir contenant à la fois des con- stituants à action rapide et à action lente. L'effet prolongé peut être obtenu seul au moyen de cristaux ayant la configuration de rhomboèdres à arêtes vives avec faces cristallines planes, tandis que, si on le désire, on peut obtenir un effet initial pal la présence dans la suspension de cristaux d'insuline déformés connus.
En fait, à l'aide de la présente invention, on est par- venu pour la première fois, sans substances additionnelles d'un genre quelconque, à mettre à la disposition de la thérapie du diabète des préparations d'insuline consistant en une suspension
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de cristaux d'insuline ayant un effet prolongé, mélangeable en toute proportion avec une suspension de cristaux d'insuline à action rapide, et avec l'insuline dissoute.
La préparation des suspensions de cristaux se fait dans des conditions aseptiques. Il est préférable de rendre le milieu de suspension isotonique, par exemple au moyen de chlorure de sodium, et l'on peut ajouter un agent de conservation, par exem- ple du p-hydroxybenzoate de méthyle et, au besoin, une substance tampon, par exemple un tampon acétate, phosphate ou citrate.
Etant donné la faible solubilité voulue des cristaux d'insuline, la valeur du pH de la suspension doit se situer entre 5 et 8.
Cependant, on préfère conférer aux suspensions de cristaux d'in- suline une valeur de pH voisine de 7 (6,5 à 7,5), parce que les suspensions sont les plus stables dans cet intervalle de pH limité. Les cristaux employés sont de préférence obtenus avec emploi de zinc en tant que métal promoteur de cristallisation.
Conjointement avec le zinc, ou au lieu de celui-ci, on peut auss. toutefois utiliser d'autres métaux promoteurs de cristallisation, par exemple du nickel, du cadmium, du cobalt et du cuivre.
Exemple 1.
On réalise un mélange stérile contenant 1,7% d'insuline de pancréas de boeuf, 0,013% de zinc sous la forme de chlorure de zinc, 0,1 M d'acétate de sodium et 7% de chlorure de sodium conjointement avec une quantité suffisante d'acide chlorhydrique stérile pour que la valeur du pH du mélange soit de 5,5. Les cristaux ainsi produits ont la forme de rhomboèdres à arêtes vives avec faces cristallines planes et contiennent environ 0,7% de zinc, ce qui correspond à environ 0,21 milli-équivalent de zinc par gramme; ils ont une activité biologique d'environ 23 unités internationales par mg.
Une partie de la suspension de cristaux d'insuline ainsi obtenue est diluée avec 9 parties d'eau stérile contenant 0,11%
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de p-hydroxybenzoate de méthyle, après quoi la valeur du pH de) la suspension est portée à 7,0 par l'addition d'hydroxyde de sodium 1 N. Les cristaux d'insuline dans cette suspension finale montrent une teneur en zinc d'environ 0,7%.
Exemple 2.
Les cristaux d'insuline obtenus comme dans l'exemple 1 sont éliminés par succion du milieu de cristallisation et sèches, après quoi 174 mg de ceux-ci sont mis en suspension dans 100 cm3 d'eau stérile contenant 0,7% de chlorure de sodium. Les cristaux . demeurent non dissous. La valeur du pH de la suspension est d'environ 6.
Exemple 3.
On prépare un mélange stérile contenant 1,7% d'insuline de pancréas de boeuf, 0,13% de zinc sous la forme de chlorure de zinc, 0,05 M de citrate de sodium et 7% de chlorure de sodium; à partir de ce mélange l'insuline est amenée à cristalliser par addition d'une quantité suffisante d'acide chlorhydrique stérile pour que la valeur du pH du mélange soit de 6. Les cristaux pro- duits ont la forme de rhomboèdres à arêtes vives avec faces cristallines planes ; ils contiennent environ 0.7% de zinc, ce qui correspond à environ 0,21 milli-équivalent de zinc par gramme.
La suspension de cristaux d'insuline ainsi préparée est diluée avec une quantité suffisante d'eau stérile, contenant 0,11% de p-hydroxybenzoate de méthyle, pour que la suspension de cristaux finale contienne 40 unités internationale d'insuline par cm3 après que la suspension a été réglée à un pH de 7 par l'addition d'hydroxyde de sodium 1 N. A cause de la teneur en tampon citrate dans le milieu de cristallisation, la teneur en zinc des cristaux en suspension ne sera pas augmentée lorsque la suspension est portée à un pH de 7.
La suspension de cristaux d'insuline ainsi obtenue a un
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effet prolongé correspondant à celui de la suspension obtenue suivant l'exemple 1.
Exemple 4.
On procède de la même manière que dans le premier paragra- phe de 1-'exemple 1; la suspension de cristaux d'insuline produite est diluée avec de l'eau stérile contenant suffisamment de zinc sous la forme de chlorure de zinc et suffisamment de p-hydroxy- benzoate de méthyle pour que la suspension finale, après avoir été ajustée à un pH de 7,4, contienne 8,6 mg de zinc par 100 cm3 et 0,1% de p-hydroxybenzoate de méthyle. Lorsque la suspension est réglée à pH 7,4, les cristaux d'insuline absorbent du zinc du milieu, si bien qu'ils contiennent environ 2,3% de.zinc, -ce qui correspond à environ 0,7 milli-équivalent par gramme.
On en- lève alors les cristaux par succion et on les sèche; ensuite on met 174 mg de ces cristaux en suspension dans 100 cm3 d'eau sté- rile contenant 0,7% de chlorure de sodium, 1/100 M de phosphate de sodium et 0,1% de p-hydroxybenzoate de méthyle. Par suite de la présence du tampon phosphate, la teneur en zinc,des cristaux diminuera en-dessous de 0,8% sans que les cristaux entrent en solution. La suspension finale a un degré de retard correspon- dant à celui de la suspension obtenue suivant l'exemple 1.
En vue d'illustrer davantage l'invention, on se rapporte au dessin dans lequel :
La figure 1 montre à une échelle agrandie un cristal d'insu- line utilisé conformément à l'invention et, la figure 2 montre des courbes du sucre sanguin de lapins à jeun auxquels on a administré une injection de différentes suspensions de cristaux d'insuline, et d'insuline ordinaire, c'est-à-dire d'insuline cristalline en solution.
Le cristal représenté dans la figure 1 est obtenu de la manière indiquée dans l'exemple 1. Le cristal apparait sous la forme d'un rhomboèdre à arêtes vives délimité par des faces cris-
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tallines planes. L'angle obtu dans chacun des losanges du cristal est de 114 1/2 .
Les courbes de sucre sanguin montrées dans la figure 2 sont des courbes moyennes obtenues à partir d'une série d'expériences dans lesquelles des lapins à jeun ont reçu une injection sous- cutanée de la même dose d'insuline (2 unités) de diverses pré- parations d'insuline.
La courbe 1 est obtenue en injectant une solution d'insuli- ne cristalline. Cette solution est une solution d'insuline chlor- hydrique (pH d'environ 3) avec une teneur de 2,7 mg de zinc par
100 cm3 et avec une teneur en glucose de 5%.
La courbe 2 est obtenue en injectant une suspension de cristaux d'insuline en forme d'étoiles, connus en soi, dans un milieu aqueux sans teneur en chlorure de sodium ajouté, mais avec l'emploi de tampon-acétate et d'une valeur de pH de 5,5.
La teneur totale en zinc de la suspension est de 1,3 mg par
100 cm3. Les cristaux employés sont obtenus à partir d'un milieu de cristallisation aqueux contenant 0,5% d'insuline, 40 mg de zinc (sous forme de chlorure) par 100 cm3, 0,05 M de citrate de sodium et 15% d'acétone, sans l'addition de chlorure de sodium.
La cristallisation est effectuée à un pH de 6,2 ; lescristaux obtenus sont séparés du milieu de cristallisation, lavés et séchés.
La courbe 3 est obtenue en injectant une suspension de cristaux à insuline obtenue de la même manière que dans l'exem- ple 1, sauf que la suspension a un pH de 5,5 et qu'on a utilisé une teneur de 0,7% de chlorure de sodium au lieu de 7% dans la cristallisation. La conséquence de ceci est que les cristaux obtenus ont une forme défectueuse et n'apparaissent pas sous forme de rhomboèdres à arêtes vives avec faces cristallines pla- nes.
On voit qu'il n'y a pas de différence notable dans l'effet
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entre la solution d'insuline cristalline et les deux suspensions de cristaux d'insuline des courbes 2 et 3.
La courber est obtenue en injectant la suspension de cris- taux d'insuline obtenue dans l'exemple 1, suspension dans la- quelle les cristaux apparaissent en rhomboèdres à arêtes vives avec faces cristallines planes, sauf que la suspension a un pH de 5,5. L'effet est nettement retardé, les valeurs de sucre sanguin environ huit heures après l'injection montrant seulement environ la moitié de la valeur d'avant l'injection.
La figure 2 montre ainsi clairement qu'il n'est pas néces- saire, comme celà était supposé jusqu'ici, en vue de produire un effet retardé des suspensions de cristaux d'insuline, qu'il' existe dans le milieu de suspension des conditions telles que les cristaux d'insuline en suspension puissent absorber du zinc à partir du milieu de suspension pour former des cristaux d'in- suline avec teneur accrue en zinc. Il suffit que les cristaux d'insuline bovine apparaissent sous la forme de rhomboèdres à arêtes vives avec faces cristallines planes. Ceci est vrai aussi lorsqu'on utilise au lieu du zinc d'autres métaux promoteurs de cristallisation.
REVENDICATIONS.
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