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On sait que l'on prépare de l'insuline cristalline en ajoutant une .substance tampon à une solution aqueuse d'insuline contenant un ou plusiers des ions métalliques prérequis pour la cristallisation de l'insuline, tels que zinc, cadmium, cobalt, nickel et cuivre, de préférence le zinc, et en ajoutant la va- leur du pH à 5,5 - 6,5. Dans le but d'éviter une précipitation temporaire de 1' insuline à l'étattamorphe au cours de la cristallisation on peut ajouter des sol- vants organiques tels que l'acétone, laquelle prévient la précipitation de l'in- suline amorphe mais non celle des cristaux.
Comme substances tampons on a utilisé des phosphates alcalins qui, toutefois, offrent l'inconvénient de précipiter une partie des ions zinc sous la forme de phosphate de zinc très peu soluble, polluant les cristaux. Dans la re- cristallisation ultérieure du précipité d'insuline à partir d'une solution qui a été tamponnée avec de l'acétate d'ammonium il est possible de se débarrasser'de la pollution par le phosphate de zinc et'les cristaux ainsi produits s'avèrent contenirr 0,52% de zinc, ce qui soit dit en passant correspond à 3 atomes de zinc dans la cellule unitaire rhomboédrique des cristaux. Comme substance tampon on peut aussi faire usage de tampon borate, diéthylbarbiturate ou maléate, lesquels ne sont pas précipités et ne lient pas d'une autre manière les ions zinc de la- solution.
Lorsqu'on utilise ce genre de substance tampons, on doit seulement veil- ler à ce qu'il n'y ait pas de zinc, ou autres ions métalliques analogues en une quantité telle que 1(insuline, lorsqu'elle est liée au métal, soit rendue peu so- luble et soit empêchée de cristalliser. Un tampon particulièrement approprié est le citrate de sodium qui lie les ions zinc en un composé fortement complexe, qui. a juste la force qu'il faut pour que la quantité de zinc prérequise pour la cris- tallisation de l'insuline (0,35% ou 2 atomes de zinc par cellule Unitaire) soit liée à l'insuline. Les cristaux d'insuline obtenus avec le tampon citrate con- .tiennent ainsi 0,35% de zinc ou une quantité équimolaire d'autres métaux promo- teurs de cristallisation (Cd, Co, Ni, etc.).
La cristallisation de l'insuline peut constituer un stade dans la fabrication aseptique de préparations pharmaceutiques d'insuline, à savoir les suspensions dites d'insuline-zinc, qui sont des suspensions, stériles et conte- nant du zinc, de cristaux d'insuline, et qui possèdent une action d'insuline prolongée. Dans ce cas on n'effectue pas ordinairement une isolation des cris- taux à partir de la liqueur'mère,mais on dilue la suspension'cristalline de ma- nière appropriée pour obtenir la composition désirée de la préparation finale.
Dans tous les autres cas les cristaux d'insuline apparaissent en tant que pro- duit intermédiaire dans la fabrication, raison pour laquelle ils sont isolés, si on le désire lavés et séchés pour qu'ils ne contiennent seulement que 2 à 8% d' eau. Les teneurs en zinc et métaux analogues dans les cristaux d'insuline, com- me mentionné plus haut et ci-après ont donc été calculées par rapport au poids des cristaux sèches. Les cristaux non séchés sont estimés contenir environ 60% de matière solide.
Lorsque les cristaux d'insuline obtenus conformément aux méthodes'de cristallisation-mentionnées plus haut sont mis en suspension dans de l'eau distil- lée et que la suspension est injectée par voie sous-cutanée, on obtient une ac- tion d'insuline qui ne sera pas substantiellement différente de l'action brève de l'insuline dissoute.
Pendant de nombreuses années l'opinion a prévalu qu'en vue d'obtenir une action d'insuline prolongéë' d'importance pratique il est nécessaire d'injec- ter l'insuline conjointement avec des substances auxiliaires qui sont étrangères au corps humain, telles protamine, globin, surfen, etc., lesquelles ont pour ef- fet de retarder la résorption de l'insuline.
On réalisa plus tard que l'emploi de telles substances étrangères n'est pas nécessaire. Ainsi, il est possible d'obtenir une action d'insuline prolongée au moyen de suspensions aqueuses de cristaux d'insuline auxquelles on a donné une composition telle que, si le milieu de suspension est ajusté à un
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pH de 7, les cristaux d'insuline en suspension montrent une teneur particulière- ment élevée en les métaux mentionnés plus haut, supérieure à. 0,25 milliéquivalent par gramme, de préférence au moins 0,35 milliéquivalent par gramme, les cristaux demeurant pratiquement non dissous à ce pH.
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La présente invention se rapporte à un procédé pour traiter des cris- taux d'insuline, par lequel il est possible de conférer aux cristaux des proprié- tés telles que par injection parentérale après mise en suspension dans un milieu aqueux ils donnent une action d'insuline prolongée sans qu(il soit nécessaire de conférer au préalable au milieu aqueux une certaine teneur minima en métaux pro- moteurs de cristallisation, et une composition telle que les cristaux absorbent -du métal à partir du milieu à réaction neutre, ou sans devoir donner d'avance aux cristaux d'insuline une teneur accrue en métal.
Le procédé selon l'invention se caractérise en ce que des cristaux, qui ont été obtenus totalement ou partiellement a partir de glandes pancréatiques bovines, sont soumis à un traitement thermique à une température telle et durant un temps tel qu'après suspension dans un milieu aqueux injectable et injection sous-cutanée ultérieure, les cristaux montrent une action d'insuline qui est pro- longée comparativement à l'action de cristaux non traités dans les mêmes condi- tions.
L'action d'insuline prolongée sera d'autant plus prolongée que la tem- pérature est plus élevée et que la période de temps est plus longue. Si on uti- lise comme matière première des cristaux d'insuline de boeuf, on peut obtenir une action d'insuline extraordinairement prolongée quand on entrepose les cristaux à 20 C durant environ un an, ou qu'on les entrepose à 45 C pendant 3 semaines, ou à 70 C pendant 24 heures. Suivant l'invention on préfère soumettre les cris-. taux à une température .supérieure à la température ambiante, avantageusement de 40 à 70 C. Les températures au-dessus d'environ 70 C ne conviennent normalement pas parce que les cristaux ont tendance à coller entre eux, tandis que l'emploi de températures inférieures à environ 40 C nécessite un laps de temps inadéquat pour une fabrication pratique.
On peut obtenir avec facilité tout degré désiré de prolongation de l'action d'insuline en faisant varier la température et la durée de l'action thermique. Quand on mélange des suspensions ayant des actions différentes il est possible d'obtenir un nombre infini d'actions combinées dif- férentes .
Il convient que le traitement à chaud des cristaux selon l'invention ait lieu tandis que les cristaux sont en suspension, par exemple tels qu'ils sont obtenus lors d'une cristallisation. Dans- cet état les cristaux contiennent, ain- si qu'on l'a mentionné précédemment, environ 60% de matière solide. L'effet du traitement thermique est affaibli lorsque la teneur en eau des cristaux est dimi- nuée. Si durant le traitement thermique la teneur en eau des cristaux est d'en- viron 20%, on estime qu'il faut employer deux fois le temps de traitement des cristaux en vue d'obtenir le même effet prolongé que dans le cas de cristaux non' séchés, les autres conditions restant égales. L'insuline cristalline sèche or- dinaire, contenant environ 2 à 8% d'eau, n'est pratiquement pas influencée par le traitement à chaud.
Suivant l'invention on a découvert que la valeur du pH du milieu avec lequel les cristaux sont ou ont été en équilibre exerce une influence dé- cisive sur l'effet thérapeutique de l'action thermique. Ainsi, des essais ont montré que l'action prolongée des cristaux traités sera d'autant plus longue que la valeur du pH est basse, dans l'intervalle de 5 à 8. Si la valeur du pH est au voisinage du.pH du sang (7,4) l'action thermique est pratiquement sans effet.
Par conséquent, dans la fabrication des cristaux ayant une action lente, suivant l'invention, on utilise une valeur de pH qui est inférieure à 7, par exemple de 5,55,5 ou 6.
Comme milieu de suspension pour les cristaux lorsque ceux-ci sont
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soumis au traitement thermique, on peut par exemple utiliser la liqueur-mère de la cristallisation. On peut cependant employer d'autres milieux à la condition que, en faisant usage des connaissances courantes relatives à l'insuline, on veille à ce que les cristaux n'entrent. pas en solution dans le milieu, lequel en outre ne peut pas contenir de substances exerçant une action préjudiciable à l' activité, biologique de l'insuline.
En'vue de fixer la valeur du pH du milieu..il. est commode de se servir d'une substance tampon, dont exemples sont donnés ci- après, On signalera que les substances tampons telles que le citrate qui, rsqu'el- les sonts liées aux ions zinc, peuvent abolir l'action prolongée des suspensions d'insuline cristalline-zinc, n'empêchent pas l'effet du traitement thermique.
Le milieu peut également contenir des solvants qui sont miscibles à l'eau, comme l'acétone, ce qui arrivera justement lors que ce.milieu est par exemple la li- queur-mère d'une cristallisation suivant la méthode au citrate. En pratique il est des plus avantageux'que le milieu dans lequel l'action thermique a lieu ait une composition qui convient pour les applications en injection.
Dans ce cas il est possible par une dilution appropriée, etc... et en réglant le pH à 7 de convertir la suspension en une''préparation d'insuline @ prête à l'emploi, lorsqu'on opère dans des conditions de stérilité.
Les cristaux d'insuline obtenus suivant l'invention ne diffèrent pas des cristaux,tels qu'ils sont avant le traitement thermique, ni en apparence, ni en composition d'amino-acide, mais ils ont une c solùbilité quelque peu plus fai- ble dans une solution chlorhydrique de chlorure de sodium et dans un tampon phos- phate neutre. D'aptitude à la cristallisation de l'insuline est diminuée au cours du traitement thermique, ce qui peut être mis aisément en évidence par recristal- lisation des cristaux traités.
Dans la mise en oeuvre du procédé selon l'invention on peut employer des cristaux d'insuline obtenus au moyen d'une méthode quelconque de cristalli- sation. Une méthode de cristallisation spéciale, mentionnée dans le 'brevet danois n 78.069, convient particulièrement.
En vue de l'application thérapeutique il convient que les cristaux ne soient pas trop grands. Afin d'éviter une sédimentation dans les ampoules, la dimension de cristal ne doit pas dépasser 40 . L'activité biologique des suspensions cristallines est dans une certaine mesure fonction de la dimension des cristaux, étant donné que la prolongation de l'activité augmente pour un . accroissement de la dimension des cristaux. Par conséquent, il est avantageux que les cristaux soient préparés avec la même distribution de dimensions d'une charge de cristaux à l'autre.
Le procédé selon l'invention peut aussi être appliqué à des cris- taux d'insuline ayant une teneur particulièrement élevée en métal (supérieure à 0,25 milliéquivalent par gramme) car. on peut ainsi conférer à ceux-ci un effet plus prolongé en suspension aqueuse qu'en l'absence du'traitement thermique se- lon l'invention.
L'invention se rapporte également à un procédé pour la fabrication de préparations d'insuline à effet prolongé, procédé qui est du type dans lequel on met des cristaux'd'insuline stériles en suspension dans des conditions stéri- les 4ans un milieu aqueux stérile convenant'pour des injections, le trait carac- téristique de ce procédé étant que l'on se sert des cristaux d'insuline obtenus suivant l'invention, et que le milieu aqueux a ou acquiert une valeur de pH d' environ 7 (6,5-7,5), Comme on peut le voir par ce qui précède, ces préparations neutres sont complètement stables, même,quand on les entrepose pendant une lon- gue période, ceci étant dû à ce que le milieu aqueux possède une valeur de pH d'environ 7.
Si dans les préparations on ne se sert pas de substances auxiliaires, désormais superflues, telles que protamine, zinc, etc., ces préparations sont miscibles avec des solutions d'insuline ordinaire à action rapide tout en con-
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servant l'action rapide de l'insuline ordinaire et l'action prolongée des cris- taux, Il est même possible dans la fabrication des préparations de leur donner une teneur en insuline dissoute à action rapide en vue d'obtenir un effet initial puissant.
Dans une telle éventualité on peut utiliser dans la fraction dissoute de l'insuline de porc, laquelle possède une solubilité relativement élevée à réac- tion neutre, Finalement, on peut fabriquer des préparations composites conte- nant des cristaux ayant différentes étendues d'activité, si. bien qu'on dispose
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pratigpemQmià4l'.mn nombre illimité de possibilités d'obtention d'actions polypha- sées appropriées.
Par conséquent, la nouvelle découverte et les méthodes de pro- duction développées conformément a l'invention non seulement représentent un nou- veau mode d'obtention d'une action d'insuline prolongée, mais forment la base d' une thérapie à l'insuline qui est plus flexible et qui peut être individualisée dans une mesure beaucoup plus grande que cequi était possible auparavent et, cho- se qui vaut la peine d'être rappelée, sans l'usage de substances auxiliaires.
Rien ne s'oppose à ce que l'on confère à de telles suspensions une teneur par exemple en ions zinc, ce qui permet d'obtenir une action d'insuline encore plus prolongée, mais ceci n'est pas nécessaire parce que, tout en restant
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à la portée de l'invention, il est possible àleboutir à des suspensions de cris- taux d'insuline qui ont une action d'insuline encore plus prolongée que celle que l'on pouvait obtenir antérieurement avec les cristaux d'insuline connus jusqu'ici dans des suspensions contenant du zinc à des concentrations applicables pour les besoins thérapeutiques.
Les exemples de mise en oeuvre di-dessous sont destinés à illustrer davantage les procédés selon l'invention.
Dans les exemples suivants on s'est servi d'un suspension concentrée (S1) ayant la composition suivante : 40 unités par cm3 de cristaux d'insuline provenant de glandes pancréatiques de boeuf
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l,4 mg de Zn++ par 100 cm3 (à l'état de chlorure) 0,01 M d'acétate de sodium
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07%. de NaCl 0,1% de p-hydroxybenzoate de méthyle et du HC1 jusqu'à obtention d'un pH de 5,5
On obtient la suspension par dilution d'un volume de suspension concentrée de cristaux avec 9 volumes de solution de p-hydroxybenzoate de méthyle
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contenant 0,11% defhyûroxy.benzoate de'méthyle.
La suspension concentrée de cristaux est obtenue en mélangeant les solutions ci-dessous A et B, en agitant ensuite tandis que l'insuline cristallise : A. - 3,48 g de cristaux d'insuline de boeuf contenant 0,78% de.Zn sont mis en suspension dans 100cm3 d'eau et dissous en ajoutant 4 cm3 de HC1 1 n. La solution est filtrée à stérilité et diluée jusqu'à 150 cm30
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B. - On dissout 1/50 mole d'acétate de sodium et 14 g de NaCl'dans de l'eau, jus- quà 50 cm3, avec une quantité suffisante de NaOH pour que le mélange de A 1 : .>+ B ait un pH = 55- Exemple 1 -
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On entrepose la suspension S à 45 C pendant 2 semaines. Par injec- tion chez des lapins il se manifeste un effet de retard ressemblant à celui du zinc#protamine#insuline. On sépare les cristaux par succion et on les sèche.
Exemple 2 -
Les cristaux séchés de l'exemple précédent sont mis en suspension dans un milieu injectable stérile ayant la même composition que celle du milieu dans lequel les cristaux reçoivent l'action thermique. Après suspension des cristaux, . la valeur du pH est ajustée; à 7,0 avec de la soude caustique ln. La préparation a presque le même effet que le zinc-protamine-insuline. L'action prolongée de la
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préparation ne change pas dans les conditions courantes d'entreposage pour 'les préparations de l'insuline.
Exemple 3 - On entrepose la suspension S1 à 45 C pendant 4 semaines. De cette manière l'activité des cristaux devient si retardée qu'après injection ultérieure de la suspension chez des lapins,on observe à peine une action quelconque durant les 8 premières heures après l'injection. L'activité biologique de l'insuline est par contre intacte, ce qui peut être vérifié en dissolvant les cristaux dans de l'acide chlorhydrique et en effectuant une détermination de puissance biolo- gique courante. temple 4 -*
A la suspension 31 on ajoute 1,8 mg de Zn++ par 1000 unités sous la forme de chlorure de zinc,'et on ajuste le pH à 5,0 avec du HCl 1 n.
sans que le volume soit-substantiellement accrue Après repos durant une année à 20 C, l'ef- fet retard de la suspension est énorme et il a une action beaucoup plus lente que le zinc-protamine-insuline.
Exemple 5 -
A une suspension S1 on ajoute du phosphate de sodium et de l'acide chlorhydrique sans que le volume en soit substantiellement augmenté, si bien que la suspension devient 0,01 M en ce qui concerne le phosphate et acquiert un pH de-5. Après repos de 2 semaines à 45 C, les cristaux ont acquis une activité for- tement retardée; on peut les isoler et les sécher si on le désire.
Exemple 6 -
A une suspension S1 on ajoute du HCl 1 n. jusqu'à obtention d'un pH ,de 5,0. Après repos de 7 heures à 70 C, les cristaux ont changé au point que la suspension a acquis une activité fortement retardée.
Exemple 7 -
On prépare un mélange de cristallisation ayant la composition suivan= te : 0,8% d'insuline de boeuf
0,040% de Zn++ (à l'état de chlorure)
0,05 M de citrate de sodium
15% d'acétone et
HC1 jusqu'à obtention d'un pH de 6,0
La cristallisation se produit tout en agitant, pendant plusieurs peu- res, après quoi on évapore l'acétone,tout en continuant à agiter pendant 24 heu- res à 45 C. On dilue ensuite la suspension avec une solution de chlorure de so- dium et de p-hydroxybenzoate de méthyle, obtenant ainsi la composition suivante :
40 unités de cristaux d'insuline par cm3 97 [alpha] de Zn++ par cm3
0,01 M de citrate de sodium
0,7% de NaCl
0,1% de p-hydroxybenzoate de méthyle puis on ajuste le pH à 5,5 avec du HC1 1 n.
Après entreposage durant 2 semaines à 45 C, la suspension montre une action d'insuline fortement retardée, et on,sé- pare les cristaux.
Exemple 8 -
On exécute une cristallisation comme dans l'exemple précédent, mais on sépare les cristaux par succion, on les lave avec de l'acétone à 60% et on les sèche avant le traitement thermique. Les cristaux séchés sont mis suspension dans un milieu de suspension, de manière à obtenir une suspension ayant la même
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composition chimique que S1. Après repos de 2 semaines à 45 C, la suspension mon- tre une action fortement prolongée et on sépare les cristaux, ou bien on ajuste le pH de la suspension à 7, obtenant ainsi directement une préparation d'insuli- ne ayant un effet retard.
Exemple 9 -
On prépare une suspension (S2), le procédé étant le même que pour S1 si ce n'est que l'addition de NaCl est omise. Après repos de 2 semaines, S2 s'1 avère posséder une action d'insuline fortement prolongée: Exemple 10 -
On effectue une cristallisation comme décrit pour S1 mais, au lieu de diluer ,la suspension cristalline, on sépare les cristaux et on les séché. On met ensuite les cris taux séchés en suspension dans un milieu aqueux de manière à obtenir une suspension ayant la même composition chimique que S1. Après re- pos de 2 semaines à 45 C, la suspension montre un effet fortement retardé et on peut alors séparer les cristaux.
Dans les exemples plus haut on a utilisé des cristaux d'insuline au zinc. Le procédé selon l'invention peut toutefois être appliqué aussi à des cristaux d'insuline contenant d'autres métaux tels que cobalt, cadmium, nickel ou cuivre. En vue de démontrer ceci, on se rapportera à l'exemple ci-dessous :. dans lequel on se sert de cristaux d'unsuline au cuivre.
Exemple 11 -
On prépare un mélange de cristallisation ayant la composition sui- vante ;
0,8% d'insuline de boeuf exempte de zinc 0,040% de Cu++ (sous forme de chlorure)
0,05 M de citrate de sodium 15% d'acétone et
HCl jusqu'à pH = 6,0.
La cristallisation a lieu tout en agitant jusqu'au jour suivant, a- près quoi on évapore l'acétone et on dilue la suspension comme décrit dans l'exem- ple 7. La suspension acquiert ainsi la composition suivante.:
40 unités de cristaux d'insuline par cm3
87 gamma de Cu++ par cm3 0,01 M de citrate de sodium
0,7% de NaCl
0,1% de p-hydroxybenzoate de méthyle @ après quoi on ajuste le pH à 5,5 avec du HC1 1 n. Après repos de 2 semaines à 45 C, la suspension montre une action d'insuline fortement retardée.
Au lieu de soumettre les cristaux d'insuline au traitement thermi- que en suspension, les cristaux tels quels peuvent être soumis au traitement tout en veillant à ce que les cristaux ne se dessèchent pas au cours du trai- tement. Ceci peut se faire en entreposant les cristaux séparés dans un récipient, par exemple un exsiocateur dans lequel notamment au moyen d'une solution saline aqueuse on maintient une pression de vapeur d'eau telle que la teneur en eau des cristaux est maintenue constante, par exemple dans l'intervalle de 20 à 40%.
Dans la mise en oeuvre du procédé selon l'invention on peut par exem- ple procédércomme suit Exemple 12 - Des cristaux de la suspension S sont séparés par succion et pésés sur un filtre de verre taré, après quoi on les place sous vide (1-2 mm de Hg) dans un exsic cateur contenant une solution de chlorure de sodium à 5%. Après 3
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