BE517522A - - Google Patents

Description

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  PROCEDE DE PREPARATION D'INSULINE CRISTALLISEE. 



   L'insuline a été préparée pour la première fois sous forme cristalline par Abel, voir par exemple Proco Nat. Acad. Scie 12.132 (1926), en utilisant un mélange d'acétate d'ammonium? de brucine et de pyridine comme milieu de cristallisation et, plus tard, en 1929, par Harrington et Scott, voir Biochem. J.,   230384     (1929),   à partir d'insuline amorphe en utilisant un tampon d'acétate d'ammonium contenant de la saponine, la valeur du pH de la solution d'insuline dans les deux cas étant changée pour atteindre approximativement le point isoélectrique de l'insuline en vue de produire la cristallisation..

   Ces méthodes de cristallisation? qui donnent des rendements assez modestes de cristaux relativement impurs, ont été abandonnées par la suite en faveur de la méthode de cristallisation mise au point par Scott, voir Biochem, J. 28, 1952 (1934) et le brevet américain ?   2014305900   
La méthode de cristallisation de Scott repose sur l'observation surprenante qu'il est nécessaire, en vue d'obtenir une cristallisation absolument reproductible et des rendements élevés, qu'une certaine quantité d'un des métaux zinc, cadmium, cobalt et nickel soit présente dans le milieu de cristallisationo Lorsqu'on réussissait autrefois à faire cristalliser l'insuline, la raison en était que le milieu de cristallisation contenait par nature du zinc,

   et Scott a trouvé qu'il était requis préalablement pour la cristallisation que le milieu de cristallisation contienne A x 0,007 g d'un des métaux mentionnés par 100 g   d'insuline   sèche,, "A" représentant le poids atomique du métalo
La présente invention, se rapportant à un procédé du type dans lequel on fait cristalliser de l'insuline à partir d'un milieu contenant des cations dont la présence préalable est requise pour la cristallisation, en changeant la valeur du pH du milieu pour atteindre approximativement le point isoélectrique de l'insuline, repose sur l'observation que le zinc, le cadmium, le cobalt et le nickel ne sont pas les seuls métaux dont la présence est 

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 préalablement nécessaire pour la cristallisation de l'insuline, mais   qu'ega-   lement les métaux cuivre,

   manganèse et fer possèdent cette propriété, lorsqu'ils sont présents sous la forme divalente. 



   Le procédé de l'invention est donc caractérisé en ce qu'on emploie des ions cuivriques, des ions manganeux ou des ions ferreux, ou des mélanges de tels ions, comme cations dont la présence préalable est requise pour la cristallisationo
Alors que jusqu'à présent il était nécessaire de faire cristalliser l'insuline au moyen des métaux mentionnés par Scott, pratiquement au moyen de zinc exlusivement ,la présente invention permet d'effectuer la cristallisation avec d'autres métaux, ce qui augmente les possibilités dans ce domaine
Comme cela est bien connu, les métaux mentionnés par Scott sont fixés par les cristaux d'insuline qui sont donc ainsi amenés à contenir du zinc, du cadmium, du cobalt ou du   nickelo   De manière correspondante, les cristaux d'insuline préparés conformément à l'invention seront amenés à contenir du cuivre,

   du manganèse ou du fer, et, à partir de ces nouveaux cristaux, il est possible de produire des préparations d'insuline avec une activité thérapeutique   modifiéeo  
A la condition que la solution d'insuline employée ne contienne pas à l'avance des cations dont la présence préalable est requise pour la cristallisation, par exemple du zinc qui, comme cela est bien connu, est présent dans le pancréas, à partir duquel on retire l'insuline, les ions métalliques employés conformément à l'invention doivent être présents dans le milieu de cristallisation en quantités dépassant   0,5 %   du poids de l'insulineo Cependant, au voisinage de cette limite inférieure la cristallisation s'effectue comparativement lentement,

   tandis que le rendement en cristaux est également moins satisfaisante D'où il est préférable en pratique d'employer des quantités de métaux considérablement plus grandeso 
Si la cristallisation se fait exclusivement en se basant sur du cuivre, le milieu de cristallisation doit montrer une concentration en ions cuivriques d'au moins 0,01 %. Le chiffre correspondant pour les ions manganeux est de 0,1 % et pour les ions ferreux de 0,05 %
Cependant, les meilleurs résultats s'obtiennent avec des quantités de métal un peu plus grandes, c'est-à-dire 0,05-0,1 % de cuivre, 0,1- 0,2   %   de fer et   0,2-0,5 %   de manganèse, respectivement.. Les concentrations d'ions métalliques qui sont deux à trois fois plus grandes que celles qui viennent d'être mentionnées, sont en général désavantageuses.

   En pratique, la concentration de cuivre ne doit pas dépasser 0,5 %. Le chiffre correspondant est de 0,8 % pour le manganèse et de   0,5 %   pour le fera A la condition que plus d'un des métaux en question soient présents dans le milieu de cristallisation, ou que ce dernier contienne par nature ou bien, au moment de sa préparation, soit amené à contenir des cations dont la présence préalable est requise pour la cristallisation, on peut évidemment réduire de manière correspondante la quantité de chaque métal ajoutée. 



   La concentration d'insuline peut varier dans de larges limites, bien que cependant il soit le plus approprié d'employer une concentration d'insuline comprise entre   0,1 %   et 1 %. La forme sous laquelle les métaux de l'invention sont ajoutés au milieu de cristallisation n'est'pas critique pour l'invention, pourvu seulement que les métaux soient présents sous une forme ionogène dans les conditions de cristallisationo D'habitude, il est des plus commode d'ajouter les métaux sous forme de leurs sels, tels que sulfates, nitrates, chlorures, acétates, citrates, etco Si lemilieu de cristallisation est acide au moment de 1'addition, on peut également employer les métaux sous forme de leurs hydroxydes ou autres composés à partir desquels les métaux sont libérés sous une forme ionogène dans un milieu acide. 



  De plus, on notera que les métaux peuvent également être présents à l'état d'ions complexes pourvu seulement que le métal puisse être retenu par l'insuline au cours de la   cristallisation.   

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   En effectuant le procédé conformément à l'invention, la solu- tion, qui résulte de la récupération technique de l'insuline, et qui jusqu'ici a été employée pour la production d'insuline cristallisée en présence d'ions zinc, peut servir comme solution d'insuline. Toutefois, il est aussi possible   de partir d'insuline amorphe, telle qu'on la trouve sur le marche ; ce   cas, on dissout de la manière hacituelle l'insuline amorphe dans une solu- tion aqueuse d'un acide, par exeuple de l'acide chlorhydrique, de l'acide sulfurique ou de l'acide   phosphcr@que.   



   Comme cela est bien connu, les solutions d'insuline technique et l'insuline amorphe produite a partir de celles-ci, contiennent de petites quantités de zinc provenant du pancréas. Par conséquente si on désire obte- nir des cristaux d'insuline exempts de zinc, on doit tout d'abord éliminer le zinc qui y est présent par nature, notamment par dialyseo 
Il est préférable que la solution d'insuline employée ait une valeur de pH en-dessous du point isoélectrique de l'insuline (pH voisin de   5,5),   mais on peut également employer des solutions   d'insuline   ayant une va- leur de pH au-dessus du point isoélectrique, par exemple un pH 8. 



   Les rendements obtenus par le procédé de l'invention sont fonc- tions du degré de pureté de l'insuline employéeo Les solutions d'insuline, dans lesquelles l'insuline montre une activité biologique inférieure à 15 unités internationales par mg, donnent en général un rendement:moins satis- faisant.

   Les meilleurs rendements s'obtiennent lorsque l'insuline est complè- tement pure,c'est-à-dire lorsqu'elle montre une activité biologique de 22 à
23 unités internationales par mgo 
Comme cela est bien connu, la cristallisation de l'insuline se fait d'habitude en présence d'une substance tampon pour maintenir la valeur de pH la plus favorable pendant la cristallisation., Il est avantageux de se servir également de substances tampons pour effectuer le procédé de l'invention Comme exemples de substances tampons utiles, on peut mentionner le tampon à l'acétate, le tampon au borate, le tampon au citrate, le tampon au barbiturate de diéthyle, le tampon au   phosphate,   le tampon au maléate ou des mélanges de ceux-ci.

   Parmi toutes ces substances tampons, il est préférable d'employer les tampons au citrate vu qu'avec eux on obtient une cristallisation rapide et que les cristaux d'insuline se forment avec une teneur moindre en cendres et en impuretés   orgàniques   colorées qu'avec l'emploi des autres substances tamponso 
Dans la cristallisation de l'insuline connue   jusque ici   on a également fait usage d'une addition de solvants organiques promoteurs de cristallisation, tels que acétone, alcool propylique, alcool butylique ou alcool amylique.

   Dans le procédé de la présente invention, il est également avantageux de faire une addition de 1 ou plusieurs de tels solvants organiques, de l'acétone de préférenceo 
Dans la préparation de la solution d'insuline contenant un métal, on incorpore les matières premières requises à l'état solide ou dissous, tandis qu'on peut ajouter la quantité nécessaire d'une solution basique ou acide pour mettre en solution l'insuline, si on le désireo Cependant, il sera généralement des plus pratique d'employer les substances de départ à l'état dissous, du moins en ce qui concerne les métaux et les substances tampons, ce qui facilite le dosage de ces   substanceso   
Lorsqu'on a préparé une solution d'insuline contenant un ou plusieurs des ions métalliques mentionnés, de même que, si on le désire,

   une substance tampon et un solvant organique promoteur de cristallisation, on effectue la   cristallisation   de l'insuline en changeant la valeur du pH de la solution pour atteindre approximativement le point isoélectrique de l'insulineo L'intervalle des valeurs de pH dans lequel on peut faire cristalliser l'insuline est compris entre pH 5 et pH 7. 



   Dans le cas d'une solution d'insuline avec une valeur de pH inférieure à l'intervalle mentionné plus hauts par exemple une valeur de 

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 pH de 2 à 4, on accroît la valeur du pH par   l'addition   d'une solution aqueu- se   d'une   substance à réaction alcaline;; de préférence un hydroxyde, plus par- ticulièrement un hydroxyde d'un métal alcalino Dans le cas   d'une   solution d'insuline avec une valeur de pH supérieure à l'intervalle de pH,mentionnée plus haut, on diminue la valeur du pH de la solution par l'addition d'une so- lution acide aqueuse, par exemple in acide dilué tel que de l'acide acétique, de l'acide chlorhydrique, de 19 acide sulfurique ou de l'acide phosphorique. 



   Les exemples suivants d'exécution servent à expliquer de maniè- re plus détaillée le procédé conforme à   l'inventiono     Exemple 10 -   On ajoute 300   cm3   d'une solution de chlorure cuivrique, conte-   nant 1,34 g de CuCl2.2H2O, à 5 g d9insuline amorphe (approximativement à 23 unités internationales par mg), après quoi on fait entrer en solution l'in-   suline par l'addition de 5 cm3 diacide chlorhydrique 1N.

   On ajoute alors 150 cm3 d'acétone et 500 cm3 de tampon au citrate, contenant 10 g d'acide citri- que et 5,6 g de soude caustique, après quoi on ajuste la valeur du pH de la solution à 6,0, approximativemento Au bout de quelques heures, la cristalli- sation est terminéeOn enlève les cristaux d'insuline par succion et on les lave tout d'abord avec de   Peau.9   ensuite avec de l'acétone, puis on sèche. 



  Les cristaux contiennent environ 0,37 % de Cu. 



  Exemple 2.- Le procédé est comme dans l'exemple 1 en employant 300 cm3 d'une solution de chlorure de manganèse., contenant 7,22 g de MnCl2.4H2O, au lieu de la solution de chlorure cuivriqueo Les cristaux d'insuline secs contien- nent environ   0,38 %   de Mno   Exemple 30 -   Le procédé est le même que dans l'exemple   1,   en employant tou-   tefois   300 cm3 de chlorure ferreux, contenant 5,37 g de FeCl2.4H2O.

   au lieu de la solution de chlorure cuivriqueo Les cristaux   d9insuline   secs contien- nent environ 0,30 % de fero   Exemple 4.0 =   On prépare les solutions de base suivantes A une solution aqueuse (pH approximatif de 6,5) d'insuline amorphe brute de pancréas de pores, contenant approximativement 7,5 g d'insuline par litre,   16-17 %   d'acétone et 1,1 % d9acide citriqueo B Une solution aqueuse contenant 0,56% de NuSO4.4H2O C : Une solution aqueuse contenant 0,70 % de FeSO4.7H2O D : Une solution aqueuse contenant 0,63 % de CuSO4.5H2O. 



  E Une solution aqueuse contenant 4 % d'acide citrique,ajustée à un pH approximatif de 7 avec de la soude caustique. 



   1) On ajoute 4 cm3 d'acétone, 20 cm3 de la solution B et 7 cm3 de solution E à 50 cme de solution Ao On réduit la valeur du pH approximati- vement à 6,4 avec de l'acide chlorhydrique, et on conserve le mélange pendant 15 heures à une température voisine de 4 C. 



   On sépare les cristaux   d'insuline   formés par succion, on les lave tout d'abord à   Peau   ensuite à   1?acétone,   puis on les sèche. 



   2) On ajoute 4 cm3   d'acétone,   20 cm3 de solution C et 7 cm3 de solution E à 50 cm3 de solution Ao On réduit la valeur du pH de la solution à 6,05 avec de 19acide chlorhydrique et on laisse reposer la composition pen- dant 15 heures à 4  C. On sépare les cristaux d'insuline ainsi formés, on les lave tout d'abord à   1-'eau,   ensuite à   l'acétone   puis on sècheo 
3) On ajoute 4 cm3 d'acétone, 20 cm3 de solution D et 7 cm3 de solution E à 50   cm3   correspondant à la solution A, mais obtenus en partant d'insuline pure amorphe exempte de zinco On réduit la valeur du pH de la so- lution à 6,03 avec de   l'acide   chlorhydrique,

   et laisse ensuite reposer la composition pendant 15 heures vers 4  C   environo   On sépare les cristaux d'in- 

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 ,suline ainsi formés, on les lave d'abord avec de   l'eau,   ensuite avec de l'acétone, puis on sècheo Les cristaux d'insuline contiennent approximativement 0,34 % de cuivre, et pas de   zinco   Exemple 5.

   On ajoute 2000 cm3   d9eau   distillée et 200 cm3 diacide chlorhydrique normal à 2500 cm3 de tampon   a@     phosphate,   produit par dissolution de 335 g de NaHPO4,12H2O et de 55 g de Kl2PO4 dans 20 litres d'eau distillée, après quoi on ajoute 200 cm3 d'une solution d'insuline contenant 30 mg d'insuline par cm3, et 500 cm3 d'une solution de chlorure cuivrique, produite par   disso-   lution de 26,8 g de CuCl2.2HO dans 1 litre d'eau distillée, et 500   cm3   d'acétone. On ajuste alors la valeur du pH de la composition à 6,2 en ajoutant approximativement 230 cm3 de   NHOH   normale La cristallisation de l'insuline se produit au bout de quelques heures, et on sépare les cristaux après quelques jourso 
REVENDICATIONS . 



    @  
1/ Procédé de préparation dinsuline cristallisée, dans lequel on fait cristalliser l'insuline à partir   d'un   agent contenant des cations dont la présence préalable est requise pour la cristallisation, en changeant la valeur du pH de l'agent pour atteindre approximativement le point iso- électrique de   l'insuline,   caractérisé en.ce qu'on utilise des ions cuivriques, des ions manganeux ou des ions ferreux ou des mélanges de tels ions comme cations dont la présence préalable est requise pour la cristallisation.

Claims (1)

1. 2/ Procédé suivant la revendication l, caractérisé en ce que ces ions sont présents à raison d'environ 0,5 % du poids de l'insuline.

   3/ Procédé suivant les revendications 1 et 2, caractérisé par l'emploi d'un agent de cristallisation contenant du cuivre à raison d'au moins 0,01 %, de préférence 0,05-0,1 %.

   4/ Procédé suivant les revendications 1 et 2, caractérisé par l'emploi d'un agent de cristallisation contenant du manganèse à raison d'au moins 091 %, de préférence 0,2-0,5 %.

   5/ Procédé suivant les revendications 1 et 2, caractérisé par l'emploi d'un agent de cristallisation contenant du fer à raison d'au moins 0,05 %, de préférence 0,1 -0,2 %.

   La revendication 2 doit se lire comme suit ; "Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ces ions sont présents en quantités dépassant 0,5 % du poids de l'insuline" au lieu de " ...à raison d9 environ 0,5 % ..."