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" Compositions antiandrogènes "
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r10r1té de trois de.mdes de brevet déposées aux Etats-Unis d'Amérique le 2 mars g65 sous le N 4'6.671 au nom de James
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?-rancio KERWIN;
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le 3 mai 965 Boue le N 452-878. aux noms de Louis Riehsrd IARE, Kennath Gearge HO?aT7EN st Joseph Ronald VAIENTA; le 6 août 96 sous le N 477.949 au no de Kenneth
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George HOLDEN,
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est ::\:/ utiles que Quatre demandes de 1... 19 été déposées aux Etat8-TJnis d'Amérique le 10 mars 1964 sous es N 35o.6i2, 350.642p 350.671 et 350-641, toutes quatre aux noti de Louis Richard 1A.EE, Kenneth George HOThN E3t Joseph Ronr d VALENT!.
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La présente intention est relative à des
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dérivée de Bnortestoet6rone possédant une activité
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dépressive sur le système nerveux central ainsi qu'une
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activité antiazidrogène. En particulier, la présente invention mnt relative à des éthers cyclopentênylîquen et des éthers têtrahydropyranyliquesde B-nortestostèrone#
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éventuellement substitués par un groupe 4-halo ; à des
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B-nortestolo;1onee et à la 19-nor-B"nortestololaotone; à des 11-hydroxy-B-nortestostéronest à des 2-alkyl-B- nortestostérones et à des 6-halo et 6-hydroxv-B-nortestos- téxones ; ainsi QUI aux analogues 49(il) et à 14 de ceux-ci.
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Les composés selon la présente invention se représentent par les formules de structures suivantes :
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dans laquelle X est H, 01 ou'Br ; et R eat un radical 1-cyclopentenyle, 1-cyclohexényle ou 2-tétrahydropyranyle ;
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dans laquelle R est H ou OH3 ; et l'analogue A1 du compose dans lequel R est OH3 ;
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dans laquelle R2 est H, CH3 ou a2H5; n'est Kt le radical acyle d'un aoide car- boxylique ou lorsque R 2 est H, Rx peut être un groupe 1-oyolopentènyle# 1-cyolohex4nyle ou 2-tétrahydropyranYle R4 est H, 01, Br ou OH ; L 5 H ou
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R est/un groupe alkyle inférieur contenant
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jusqu'à 4 atomes de carbone ;
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.
R6 est H ou OH
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et lea analogues A9(1') et A14 de ce compo- * née, o B4t R5 et R sont H ; avec la condom tion qu'un des lubutituanta B4, R et Ha doit 6tre ''autre que H, excepté dans un ana- logue à9(il) ou A14.
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La 17 -méthyl-Al-B- nortestostérone fait égale- ment partie de la présente invention. lies composée de formule I dans laquelle R est un groupe 1-cyolopentényle pu 1-cyclohexényle sont prépa-
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rés en chauffant le 17P-hydroxy-B-norstéroide approprié avec un diéthyle ou diméthyl cétal de cyclopentanone ou de cyolohexanone à une température d'environ 13p.-180$C pendant une période allant de 30 minutes # h 3 heures.
On distille lentement la matièr; volatile , de manière à amener la réaction à se terminer. On peut aussi utiliser
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un solvant à point d'ébullition odérément élevé, tel que le benzène, en même tempe qu'un catalyseur acide. On peut aussi chauffer le 1?h,ydraxy-naretéxode av reflux avec le cétal dans un solvant à point d'ébullition peu élevé,.tel que le chloroforme, ca présence d'un cataly-
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seur acide tel que l'acide p-toluéneaultonique. Le 1?-('1-a7 koxycycloallocyj intermédiaire ainsi obtenu est ensuite fondu à 190-200 C en présence d'une petite quantité d'une base organique, telle que la quinoléine ou la pyri- dine de manière à former le dérivé cycloalkényloxy de formule I.
Lee composés de formule I dans lesquels R est un grçupe 2-tétrahydropyranyle se préparent en traitant l'alcool en position 17 par du dihydropyrane en présence
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d'un catalyseur acide, tel que l'acide p-toluènesulfonique.
La Bnarteetoetérone de départ est décrite dans
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l'ouvrage "Chemistry and Industry, 1 t"8, 1665".
Les composés de formule II se préparent par des procédés miorobiologiques ou chimiques ou par une combinaison de ces deux méthodes. La B-nortestololaotone (II, R1= CH, ) se prépare par un procédé microbiologique.
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La ¯1-B-nortestololactone se prépare à partir de B-nortes- tololaotone par des moyens chimiques ou microbiologiques.
La 19-nor-B-nortestololactone (II, R =-H ) se prépare par un procédé chimique.
La B-norteetololactone est obtenue en soumettant de la B-norprogestérone à l'action d'enzymes de Pénicil- lium oitrinum ATCC 16040. Après la fermentation, la fil- tration et l'extraction, le solide résiduel qui est uh mélange de B-nortestololactone et d'acide B-norteatolique (IV) intermédiaire à chaîne ouverte, est chauffé au re- flux dans une base afin d'obtenir la transformation com- plète en acide B-nortestolique de formule :
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Le traitement de l'intermédiaire par un acide fort tel que l'acide perchlorique donne lieu à une fermeture de cycle de façon à obtenir la B-norteetololaotone. L'in- troduction de la double liaison est effectuée en soumet- tant la B-nortestololactone à l'action d'enzymes de Arthrobaoter simplex ATCC 6946 ou de Protaminobacter ruber ATCC 8457.
Le composé ¯1 se prépare aussi par traitement de B-nortestololactone avec de la 2,3-dichloro-5,6- dioy- anobenzoquinone.
La 19-nor-B-nortestololactone se prépare par le procédé chimique illustré et décrit ci-dessous :
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La 5,6-lactone de l'acide 3p<15-diacétoxy-5P'- hydroxy-17-oxo-B-norandroBtane-6-caarboxylique (V) est oxy- Idée en dilactone VI à l'aide d'acide peraoétique. La dilao-
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tonne est chauffée à une température supérieure à son point de fusion, de manière à réaliser sa décarboxylation An
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composé VII. L'hydrolyse basique avec, par exemple, de l'hydroxyde de sodium permet d'obtenir l'acide trihydroxy seco carboxylique VIII.
L'acidification avec un acide fort, tel que l'a- cide perchlorique, reforme la lactone IX. Le groupe 3- hydroxy est oxydé en un groupe cétone par le procédé
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d'Oppenauer, en utilisant la oyclohexanone et l'iaopropoxy- de d'aluminium, l'atome de carbone en position 19 portant un groupe hydroxy est oxydé en un groupe acide carboxyli-
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que avec le réactif de Jona, (trioxyde de chrome et acide sulfurique dans de 1'acétone} et ce groupe carboxyle est éliminé en chauffant l'acide au reflux avec le réactif T de Girard dans de l'acide acétique et du méthanol. Le
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produit ainsi obtenu est la 19-nor-B-nprteetololactone (XII).
La. B-norprogent6rone de départ pour la prépara- tion des B. naxteatola3.actones est décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 3.072.681. La 5,6..lactone de l'acide 3p, 19-diaoétoxy.-5-hydroxy-1? axoH-norandroe- tane-6p-carboxylique de départ pour la préparation de la 19-nor-B-norteatololactone se prépare de la manière eui. vante : de la 3°, 19-acétoxyandrost--en-.1'î.-on L-J. Kalvoda et al., Helv. Chim. Acta, 46, 1361 t193)p7 et époxydde avec de l'acide m-chloroperbenzoïque. L'acide chromique transforme oe composé en 35,19-diacétoxy.a-hydxoxyandro- tane-6,17--dione.
Le noyau B est ensuite ouvert par trai- tement avec de l'acide m-chloroperbenzoïque de manière à obtenir de l'acide 3,19-a:étcxy-5,17-dioxa,6-secoardroa tan-6¯oTque, Ce composé est ensuite dissous dans de la pyridine et traité par du chlorure de benzoyle de manière à obtenir la 5,6-laotone de l'acide 30919-diaodtoxy-50-
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hydroxy-17-oxo-B-norandres ane-6ss-carboxylique.
Lorsque l'on utilise des procédés miccobiologi- ques, les microorganismes sent d'abord cultiver dans ou sur un milieu favorable à leur développement.
On préfère utiliser des milieux liquides pour 'des fermentations submergées. Pour la moisissure P. citrinum, des milieux tels un bouillon d'extrait de malt, de la liqueur de macération de mais, un bouillon de fari- ne de soja, un bouillon de farine d'arachide eu un bouil- lon Czapek-Dox se sont tous régies donner entière satis- faction. Pour les espèces bactériennes susmentionnées, un simple bouillon nutritif, le bou@@ion du type trypticase
Soy (Baltimore Biolo?ical Laboratories) ou un bouillon d'extrait de levure donnent le plus de satisfaction . Les milieux doivent contenir des sources de matières minérales, d'azote et de carbone disponibles.
Des oarbohydrates, telsque les amidons, les dextrines et les sueres, y compris les hexoaes et les pen- toses, peuvent être utilisés pour fournir les besoins en énergie et carbone des microorganismes. Cependant, on peut également utiliser d'autres sources de carbone, par exemple, l'acide citrique et ses sels, l'acétate de sodium ou les sels de sodium ou de potassium d'autres acides gras ou alcools à poids moléculaire peu élevé.
Comme sources d'azote sous forme assimilable, on peut citer des protéines végétales ou animales solubles ou insolubles ou des dérivés de protéines,tels que la li- queur de macération de mais, la farine de soja, la farine d'arachide, la caséine, les extraits de viandes, les pep- tones et l'extrait de levure.
On peut également utiliser à cette fin des amino acides, des sels d'ammonium ou des < nitrate$,
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Les minéraux naturellement présente dans les scurces de carbone et d'azote complexes susmentionnées, sont habituellement suffisants pour satisfaire les besoins en substances minérales des microorganismes, Si des mi- lieux déficients en substances minérales, sont utilisés, on peut employer n'importe laquelle des solutions minera- ..les physiologiquescouramment utilisées pour pallier avec succès les déficiences chimiques du milieu.
Une amenée d'air stérile doit être maintenue au cours de la fermentation. Ceci peut être effectué en exposant une grande surface du milieu de culture 4 l'atmos- phère avec agitation constante ou encore par l'emploi de dispositifs d'aération submergée. L'aération à un débit d'environ 0,5 à 2,0 volumes d'air par volume de milieu de culture et par minute donne des résultats satisfaisants.
Au cours de la fermentation, la température doit être maintenue entre environ 23 C et 32 C, de préférence entre environ 25 C à 30 C.
'La croissante optimale des micvroorganismes e,t la transformation des stéroïdes substrats sont obtenues lorsque le pH de la fermentation est maintenu à une valeur allant de* 6,0 à 6,8. Ceci peut être réalisé par l'addition intermittente d'acides ou de bases minérales afin d'ajus- ter le pH ou encore en incorporant des agents tampons dans le milieu de fermentation. On peut utiliser des agents tampons tels que le carbonate de calcium ou le phosphate bi-acide de potassium.
Le stérolde substrat à transformer est ajouté à la culture du microorganisme sous forme d'un solide fine- ¯ ment divisé ou bien on l'ajoute en solution dans un solvant approprié, tel que l'éthanol, le méthanol ou J'acétone.
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L'addition du stéroïde substrat à la culture microbienne doit se faire dans des conditions aseptiques. L'incubation et l'aération de la culture se poursuivent afin de réali- ser la transformation du stéroïde substrat. te stéroïde substrat peut également être ajouté au milieu de fermenta- tion au moment où le milieu est pour la première fois inoculé avec la culture du microorganisme.
La fermentation ou la biotraneformation se poursuit jusqu'à ce que le maximum de produit se soit accumulé. Ceci s'opère habituellement en l'espace d'envi- ron 24-48 heures et est le plus facilement déterminé par l'analyse périodique du système de fermentation. Cette analyse peut le mieux être réalisée par voie chromatogra- phique et ce prodé donne une représentation rapide et sûre des types et des concentrations relatives des composés stéroïdes présents. La demanderesse a utilisé à la fois des techniques de chromatographie sur papier et en couche mince afin de réaliser l'analyse susmentionnée. Les procé- dés utilisés tels que cités dans les exemples ci-dessous, sont bien connus des spécialistes.
Lorsque la transformation du stéroïde a progressé jusqu'à son stade optimal, la fermentation est terminée et les composés stéroïdes, c'est-à-dire le substrat non trant- formé et les produits obtenus par la transformation, sont récupérés. Ceci est le plus communément effectué par extrac- tion du bouillon de fermentation aqueux par des solvants pas organiques qui ne sont miscibles à l'eau. On utilise aveo le plus de satisfaction à cette fin le chloroforme, le chlo- rure de méthylène ou la méthyl isobutyl cétone.
Le bouillon de fermentation entier, y compris les cellules microbienne et le liquide surnageant aqueux, peuvent être extraits
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on bien la masse cellulaire du microorganisme peut être d'abord séparée du liquide surnageant aqueux par oentrifu- gation ou filtration. Dans oe dernier cas, l'extraction des composée stéroïdes de la masse cellulaire microbienne est effectuée de la meilleure manière par un mélange de solvants, l'un de ceux-ci étant miscible à l'eau et l'autre n'étant pas miscible à l'eau. La demanderesse a découvert qu'un mélange 1; 1 de chlorure de méthylène et d'éthanol donne le plus de satisfaction.
En extrayant séparément les cellules et le bouillon surnageant aqueux, on évite souvent la formation d'émulsions gênantes,
Les extraits au solvant sont réunis et on en élimine des traces d'eau résiduelles par l'utilisation d'a- gents de séchage appropriés, tels que le sulfate de sodium anhydre.. L'extrait au solvant séché est ensuite concentré sous vide jusqu'à siccité à des températures ne dépassant généralement pas 60 C. On obtient ainsi un résidu bxunâtre qui contient les composée stéroïdes intéressants aussi bien que de nombreux composés divers axtractiblespar solvante pro- duits par le métabolisme microbien.
Il est nécessaire d'éli- miner ces matières contaminantes en vue d'obtenir les com- * posés stéroïdes à l'état purifié,
Dans certains cas où le produit stéroïde voulu est présent en concentration élevée, on.peut réaliser la purification par cristallisation directe avec des solvants.
On utilise souvent à cette fin des mélanges d'acétone et d'hexane.
Cependant, ai un mélange de produits stéroïdes est obtenu par le procédé de fermentation ou bien si une quantité importante de stéroïde substrat non transformé sub- siste, il faut utiliser des procédés de purification plus élaborés. La demanderesse a utilisé de la manière la plus satisfaisante, la ohromatographie en colonne pour opérer ces purifications. Les procédés utilisés sont connus des
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spécialistes et constatent, en générait en l'élution graduelle des stéroïdes d'une colonne de matière adsor- bante (telle que la silice ou l'alumine) par des mélange* de solvants organiques.
Le présence des composé* stéroï- des séparés dans les fractions de solvant obtenue* après la chromatographie de ces oolonnee est le plus aisément déterminée par analyse ohromatographique sur papier ou en couche mince d'échantillons de ces fractions. Les frac- tions appropriée* contenant les stéroïdes purifiée sont réunies,concentrées sous vide et les stéroîdes purifiée sont cristallisée dans des mélanges solvants convenables.
Les composés d formale III dans laquelle R5 est un groupe alkyle,inférieur sont préparés en agitant le B-norstéroïde non substitué en position 2a correspondant avec de l'oxalate d'éthyle à la température ambiante en présence d'un catalyseur fortement basique, tel que l'hy- drure de sodium dans un solvant inerte tel que le benzène, le toluène, le chloroforme ou l'éther. Le composé 2- éthoxalylique énolique ainsi obtenu est ensuite dissous dans un solvant tel que l'acétone ou l'éthanol et chauffé pendant une période d'environ 6 à 50 heures avec un halo- génure d'alkyle en présence d'une base faible telle que le carbonate de potassium ou le carbonate de sodium. Le oom- -posé 2-alkyl-2-éthoxalylique ainsi produit est laissé au repos dans une,solution alcoolique d'un alcoolate.
Une condensation inverse d'oxalate donne le 2Ó-alkyl-B-norsté- rolde.
L'expression "alkyle inférieur" telle qu'elle est utilisée pour définir le substituant en position 2 vise à inclure les groupes alkyle possédant jusqu'à envi- ron 4 atomes de carbone* Parmi les halogénures alkyle
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que l'on peut, par conséquent, utiliser pour la préparation des composée selon la présente invention, on peut mention- ner l'iodure de méthyle, l'iodure d'éthyle, l'iodure de propyle et le bromure de butyle.
Parmi les stéroïdes non substitués en position 2 de départ qui peuvent être utilisée pour la condensation à l'oxalate d'éthyle et le procédé d'alkylation subséquente sont la B-nortestostérone, la 17Ó-méthyl-B-nortestostérone et la 17Ó-éthyl-B-nortestostérone. La préparation de ce B-norstéroïdes de départ eet soit décrite dans le présent mémoire,soit décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amé- rique N 3.072.681, soit encore décrite dans l'ouvrage Coll. Czech. Cem. Comm. 25, 1086-90 (1960),
L'expression radical acyle d'un acide oarboxy- lique" vise principalement à inclure les' groupes acyle possédant jusqu'à environ 6 atomes de carbone, en particu- lier, les groupea acétvle, propionyle, butyryle et valéryle.
Les composés de formule III dans laquelle R est un groupe acyle sont préparés en traitant le composé 17ss- hydroxy correspondant avec l'anhydride ou l'halogénure d'aQyle approprié en présence d'une base telle que la pyridine, Des composée dans lequela R3 est un groupe 1-cyolopentényle,
1-oyclohexényle ou 2-tétrahydropyranyle sont préparés en traitant le 17p-ol avec du cyclopentanone ou du cyclohexa- none diéthyl cétal ou avec du dihydropyrane en présence d'un catalyseur acide tel que l'acide P-toluènesulfonique.
La configuration Ibérique du groupe 2-alkyle dans les composée préparée décrits dans le présent mémoire est a plutôt que p croit-on. Les composés sont, par consé- quent, appelés "composés 2Ó-alkyle". Il est, c pendant, bien évident que l'invention est relative aux composée actuellement
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obtenus par les procédés décrits dans le présent mémoire, quelle que soit la configuration que le substituant en position 2 puisse posséder.
Les composés de formule III où R6 est un groupe
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OH se préparent en soumettant le D--n.orstéroàe substitué en position 11 à l'action microbiologique de cellules d'une moisissure du genre Trichoteoium (voir le brevet des Etats-
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Unis d'Amérique I 2.925-366 pour des exemples d'#pces)t de l'ordre Mhcoralee (voir brevet des Etats-Unis ± 'Amérique 2.671.096 pour les espèces), ou lespèoe Aepeil1l ocra- ceu¯s- (voir le brevet des Etats-Unis d'Amérique N 2.802.775).
Les moisissures préférées sont Trichothec1uE ro-3f-ui, et Rhizopus arrhizus. Les fermentations sont effectuée par des techniques lles décrites plus haut.
Les Ha-hydroxy-B-norstéroïdes sent oxydés par l'acide chromique dans un solvant approprié tel qu'un mélange d'acétone et de chloroforme à une température com- prise entre environ 0 et environ 10 C afin de produire les composés 11-oxo. La réduction du groupe 11-céto des
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11.-aéto-E--norteatostéxanes par de l'hydrure de lithium aluminium donne un 3t 11, 1?-trihydroxy-B. narar3rast=4.aet qui est oxydé en position 3 par de la 2i;-dichloro-5.6-d1- oyanobenzoquinone en 11.hydroxy-E-narteetostéxane.
Les composés de formule III où R4 est du chlore, du brome ou un groupe hydroxy, sont préparée par des procé-
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dés mierobiologiquee et/ou chimiques. La 17a¯méthyl ou éthy3.-E.mortestostérane (voir le brevet des Etats-Unis d'Amérique NO 3.072.681) est biotranaformée en utilisant des organismes Trlchotnecium roseum, ou de préférence Rhizopus arrhizus, en composé 6a-hydroxy, en composé 6ss- hydroxy ou en ces deux composés à la foie.
Chacun des iso
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mères 6-hydroxy est traité par du chlorure de p-toluenewul-
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toluène
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fonyle ou du bromure de p-7ôûlfonyle dans de la pyridine à la température ambiante pour donner le dérivé 6-halo de configuration opposée,
Les composés de formule III possédant une double
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liaison A9(11) sont préparés en formant le toeylate d'un 11o{-hydroxy-B-norsteroIde par traitement avec du chlorure de p-toluènesulfonyle dans de a pyridine et en décomposant ensuite le tosylate en présence d'une base telle qu'un mé- lange de chlorure de lithium et de carbonate de lithium dans un solvant tel que la diméthyltormamide.
Le composé ¯9(11) est ainsi obtenu,
Les composés de formule III possédant une double liaison ë14 sont préparés en soumettant d'abord un B-noraté- roide non substitué en position 15 à l'action des cellules entière de la moisissure oxygénante Aspergillus ochraceus pour former un dérivé 15a-hydroxy.
Le dérivé tosylique est préparé en faisant réa-
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gir le 15a-hydroxy-B-norstéroide avec du chlorure de p-tolu- èneaulfonyle (chlorure de toeyls) dans un excès de pyridine à la température ambiante, habituellement jusqu'au lende- main. Le refroidissement brusque permet de séparer le
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toaylate ester- Le 15a-toeyloxy-.noratdro'ide est décompo- sé de manière à former le A'4 B-noret6roide déairé par réac- tion avec une base, comme une combinaison du chlorure de lithium et du carbonate de lithium, dans un solvant tel que
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de la diméthyltormamide ou de la diméthylacétamide au reflux pendant plusieurs heures.
La i7a-méthyl¯A 1-B-nortestoctérone est préparée par déshydrogénation avec dee mioroorganiem#du genre Septomyxa, tels que Septomyxa aesculio Septomyxa oorni et en particulier, Septomyxa affina.
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Certains des dérivée B-noret6roide selon la présente invention, sont le mieux préparée en utilisant comme matières de départ des 179- acYloxy-B-noretdrolde ou des 17a-alkyl infér1eur17-hydroxy-B-norBtéro!des. Ce% dérivés acylda sont préparés par la technique courante qui consiste à traiter l'alcool par un anhydride'ou un
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halogëaure dlecyle dans une base- Le produit de l'acylation peut être hydrolyse dans une base,ai on le délire, en uti- lisant des techniques courantes*
Lorsque les matière*:
! de départ 170-hydrojcy non alkyléea ou non estérifiées sont utilisées, certaines de* réactions subséquentes peuvent affecter les groupes 17ss- hydroxy d'une manière indésirable. Si cela se produit,
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on utilise des rëaot.' 'na habituelles pour régénérer ce groupe.
Les composés de la présente invention sont! uti-
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lisés pour diminuer ou éliminer Z -\ .)';'éponla androgène ou les effets des androgènes ainsi que pour soumettre le sys-
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tème nerveux central une dèvxvejsion Les composés préférés de la présente invention sont les suivants 2#,17#-dméthyl-B..norte8tost6rone,'ther i-cyclopenténylique da 13-norteotoetérona, 17a-méthyl-69(11)- B-r,ortesto4'idrone, 11-hydroxy-'7a-méthyl-B-nortstostérone, i7o-aiéthyl-A B-nortestostérone 6a-chloro-17a-méthyl-B- nortesto3têroiie, 6a-bromo'7"-méthylB-nortestoetérone et 6"Jhydroxy...1'1a...méthyl-D...norta2 to.térone.
Ces composés uxeroeht une activité antlaridrogène puissante chez les at. oii les poucc1n auxquels ils Mont administrés par la voie orale, ouboutanuo et topique, en doses de 20*100 mg/kg. île Mont préférence, sous forme de solutions ou de suspem:d.o.h13 dana de l'huile de aésaae, mais ils peu- vent aussi être formules en diverse formes de dosage bien
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connues du monde pharmaceutique .
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Les composés suivants : 17a¯méthyl¯A 11)-B.... nortestostéronep 11-hydroxy-17#-méthYl-B-norteBtoetéronet .
'7-méthyl-A -B-nortestostérone, e-nortestololactone et iB-norteatololactone sont également des composés préférés, se distinguant par leur activité en tant que dépressifdu système nerveux central. Ils sont actifs chez la souris par voie orale en des doses de 100-200 mg/kg. Ils peuvent être formulé: d'une manière habituelle,
Les exemples suivants illustrent la préparation des composés de la présente invention sans pour autant limiter celle-ci,
EXEMPLE 1
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Ether 1-e c1o en én 1i ue de B-nortestoatérone.
Un mélange de 5 g de B-norteatoatérone et de 10 ml de cyclopentanone diéthyl cétl est chauffé à 140- 145 C pendant 45 minutes. La température est ensuite ame- née à 160-170 C et la matière volatile est lentement dis- tillée en une période d'environ 2 heures. On recueille environ 6 ml de distillât. On refroidit le mélange réao- tionnel, on le dilue avec du méthanol aqueux contenant plusieurs gouttes de pyridine et on poursuit le refroidis- sement. Le solide est recueilli et recristallisé dans du méthanol contenant une petite quantité de pyridine de manière à obtenir le produit indiqué en rubrique, possédant un point de fusion de 114-116 C.
EXEMPLE 2 B-nortestololactone
L'inoculum est préparé de la manière suivante 50 ml de glucose à 0,5 dans de la liqueur de macération
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de mais à 2% sont stérilisés dans un flacon de 250 ml en le passant à l'autoclave pendant 15 minutes à une pression d'environ 1,05 kg/cm2 et à une température de 121 C. On introduit ensuite dans ce flacon une culture végétative (0,5 ml) de Pénicillium oitrinum ATCC 16040 et le système un est ensuite incubé pendant 24 heures à 30 C. sur/secoueur gyrorotatif à 200 tours par minute.
Le milieu de fermentation est prépare de la manière suivante :
65 litres de liqueur de macération de mâle à 2 56 avec 0,5 % de dextrose sont passés à l'autroclave à 125 C, sous une pression d'environ 1,40 kg/cm2 pendant environ 30 nutea dans un appareil de fermentation du type " New
Brunswick Batch de 130 litres.
'Le pourcentage de l'inoculum est ensuite intro- duit dans le milieu de fermentation, la vitesse de l'agi- tation est réglée à 200 t/mn,la vitesse d'aération est réglée à 0,5 VVM et la température est maintenue à 30 C.
De l'huile d'Ucon est utilisée comme agent antimousse.
Le milieu de fermentation est ensuite Incubé pendant 6 à
24 heures.
Le milieu de fermentation est ajouté à une solu- tion de 65 g de B-norprogestérone dans 500 ml d'éthanol et la fermentation se déroule pendant environ 16 heures après l'addition de la B-norprogestérone.
Le bouillon de fermentation est ensuite filtré à travers du Supercel, le bouillon est ensuite extrait par du chlorure de méthylène) et les cellules filtrées sont extraites avec un mélange de chlorure de méthylène et d'éthanol. Les solvants sont évaporés de manière à donner un résidu solide.
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Le résidu est dissous dans 800 ml d'éthanol, traité par 100 ml d'une solution aqueuse à 40% d'hydroxy- de de sodium et l'on chauffe ensuite au reflux sous atmos- phère d'azote pendant 3 heures, La solution refroidie est diluée avec 3 litres d'eau froide et extraite.par du chlorure de méthylène. La phase aqueuse est acidifiée avec de l'aoide chlorhydrique concentré et extraite avec du chlorure d'éthylène, L'évaporation de cet extrait au chlorure de méthylène séché donne de l'acide B-nortesto- lique.
Cet acide est dissous dans 300 ml de tétrahydro-
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furanne contenant 1 ml d'acide perchlorique à 70 et on le laisse ensuite reposer pendant 1 heure à la température ambiante. Après dilution jusqu'à 3 litres aveo de l'eau froide, le mélange réactionnel est extrait par du chlorure de méthylène et les extraits au chlorure de méthylène sont lavés avec,une solution aqueuse à 2 % d'hydroxyde de sodium.
Les extraits au chlorure de méthylène séchés sont filtrés à travers 125 g d'alumine du type Woelm d'activité III et le filtrat est évaporé de manière à donner de la B-nortes- tololactone quia après cristallisation dans un mélange d'acétone et d'hexane et ensuite dans un mélange ae méthanol-
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eau fond à 150-15200, UV : i Xmax 240 mp 15.00).
EXEMPLE 3 1- B-nortestololaatone De la B-nortestololaotone (4t35 g) est dissoute dans 100 ml de dioxanne et traitée par 3t7 g de 2,3-diohloro- *5,6.dicyanobenzoquïnone. Après chauffage au reflux à la température ambiante pendant 16 heures, le mélange réao- tionnel est filtré et le filtrat est évaporé de manière à
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brut¯ donner B-norteetololactone/. brutlne purification plue donner de la A -B-norteatoJ.olactonw. Une purification plus poussée est effectuée par chromatographie sur alumine, suivie de la recristallisation dans un mélange d'acétone et d'hexane.
EXEMPLE 4
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A 1 -Bnorteatololactone
1 ml d'un bouillon de culture d'Arthrobacter simplex ATCC 6946 est inoculé dans 50 ml de besillon stérile du
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type 2rypticaaB Soy (Baltimore Biological laboratories, contenus dans un flacon de 250 ml et incubés pendant 24 heures à 25 C sur un appareil agitateur gyrorotatif décri- vant un cercle d'environ 5 em à 200 t/mn. La culture ci- dessus est à son tour utilisée pour inoculer 500 ml du même milieu dans un façon d'une contenance de 2 litres que l'on a secoué pendant 24 heures à 25 C. Cette culture est utilisée pour le procédé de transformation.
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1 g de 3.nortesta.olac .'r.: est dissous dans 10 ml d'éthanol et ajouté à la culture de 24 heures ci. dessus dans des conditions stériles. L'incubation de la culture contenant le stéroïde est poursuivie pendant 24 heures supplémentaires.
La réaction est vérifiée en prenant des échantil-
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lons de 1 ml au cours de la bifltrans'arnation et en extrayant: ces échantillons avec 0,2 ml de méthyl isobutyl cétone
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(MIBK). 5 microlitres de l'extrait MIBK sont portée sous forme de taches sur des plaques de chromatographie en couche mince de silica gel G, qui sont ensuite développées dans de l'acétate 1'éthyle. On pulvérise âpres développe- ment our les plaques séchées de l'acide sulfurique à 40 dans de l'éthanol, de manière à détecter la présence et les concentrations relatives des composés stéroïdes.
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La transformation est terminée 24 heures après
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l'addition du etérolde à la culture et les cellules bac" tériellee sont séparées du bouillon surnageant par cen- trifugation. Le centrifugat est acidifié jusqu'à un pH
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d'environ bzz avec de l'acide phosphorique et extrait à deux reprises aveo des volumes égaux de chlorure de méthy- lène. Les cellules bactériennes séparées sont extraites par 100 ml d'un mélange de volumes égaux d'éthanol et de chlorure de méthylène. Ces extraite sont combinée, sèches avec du sulfate de sodium anhydre et évaporés jusqu'à sic- cité.
Le résidu séché est dissous dans du benzène et appliqué à une colonne d'alumine (Woelm qualité III). Pour séparer le produit du stéroïde substrat non transformé, on utilise la série suivante de solvants d'élution ; benzène, benzène / chlorure de méthylène, chlorure de méthylène et finalement méthanol à 1% dans du chlorure de méthylène.
Des fractions de 15 ml sont recueillies au cours du procé-
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dé d'élution, 5 à 10 microl1 t:c"-a de chaque fraction sont portés sous forme de taches aur des plaques de chromatogra" phie en couche mince de silica gel G pour analyse.
Les fractions contenant le produit à savoir la
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A1-B-nortestololaotonet sont réunies et évaporées de manière à être portées à siccité sous vide. Le produit purifié est cristallisé dans un mélange d'acétone et d'hexane et pos-
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ede un point de fusion de 1'T6-hBC G.
EXEMPLE 5 19-norB-nortestolole.etone A une solution de 43<6 g de 30,19-diacdtoxyan- drost-5-on-17-one "voir J. Kalvoda et al., Helv. Chim.
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Acta., 46, 1361 (1963)7 dans 300 ml de chloroforme on ajoute 25,8 g d'acide m-chloroperbenzoïque dans 150 ml de chloroforme. L'addition s'effectue tout en agitant si bien que la température du mélange réactionnel est mainte- nue à 25-30 C Des que l'addition est terminée, le mélange réactionnel est laissé au repos pendant 3 heures et il est ensuite lavé avec une solution aqueuse de sulfite de so- dium et ensuite avec une solution aqueuse de carbonate de sodium. Le séchage et l'évaporation de la phase chlorofor- mique donnent un résidu qui est cristallisé dans un mélange d'acétone et d'hexane pour donner de la 3ss,19-diacétoxy- 5,6-époxyandrostan-17-one, P.F. 128-129 C.
A une solution agitée de 3ss-19- diacétoxy-5,6- époxyandrostan017-one (42 g) dans 1200 ml de méthyl éthyl cétone on ajoute de l'acide chromique aqueux (50 g de trioxyde de chrome danc 100 ml d'eau) à une vitesse telle que la température du mélange réactionnel n'excède pas 40 C.
Dès que l'addition est terminée, le mélange réactionnel est maintenu à 40 C pendant 1 heure et il est ensuite versé dans 2500 ml d'eau. L'extraction avec du chlorure de méthylène suivie du séchage et de l'évaporation des extraits organiques, donne de la 38,19-diacétoxy-5Ó-hydroxy- androstan -6, 17-dione brute qui peut être utilisée dans le stade suivant sans purification.
A une solution de 42 g de la dione brute dans 200 ml de chloroforme, on ajoute 50 g d'acide m-chloroper- benzoïque dans 350 ml de chloroforme. L'addition s'effec- tue lentement et tout en agitant si bien que la température réactionnelle ne dépasse pas 30 C. Après agitation à la température ambiante pendant 24 heures, le mélange réaction- nel est lavé avec une solution aqueuse à 10% de sulfite de sodium (500 ml) et ensuite avec une solution aqueuse à 5% de
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bicarbonate de sodium (700 ml).
La phase au bicarbonate de sodium est acidifiée aveo de l'acide phosphorique et extraite aveo du chloroforme pour donner, après séchage et évaporation du chloroforme, un mélange d'acide m-chlo-
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robenzotque et d'acide 3Ptl9-diaodtoxy-5,17-dioxo-5,6-seco- androetan-6-oIque.
Le mélange ci-dessus est dissous dans 150 ml de pyridine et traité par 50 ml de chlorure de benzoyle tout en le refroidissant. Après un repos de 24 heures dans la température ambiante, le mélange réactionnel est versé dans 1500 ml d'eau et extrait par du chlorure de méthylène.
Après lavage avec de l'acide phosphorique en solution aqueuse froide et des solutions de carbonate de sodium, les extraits au chlorure de méthylène sont réunis, séchéa et évaporés. Le résidu est cristallisé dans de l'éther
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pour donner de la 5,6-lactone de l'acide 3S, 19-.diaeétoxy.. 5-hydroxy-17-oxo-B-norandrostane-6-carboxylique possédant un point de fusion de 170 0.
A une solution de 5,0 g de 5,6-lactone d'acide
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6-Q-carbnxyllque 3P, 19-diacétoxy¯5p¯hydroxy-i7-oxo¯B--noràndrostan/dans 5 ml d'acide acétique glacial contenant 0,5 g d'acide p-toluène- sulfonique, on ajoute 5,0 ml d'acide péracétique dans 20 ml d'acide acétique glacial. On maintient la solution à la température ambiante au noir pendant 24 heures et elle est ensuite versée dans 300 ml d'eau glacée. Le précipité est recueilli par filtration et est purifié par recristallisa- tion dans un mélange d'acétone et d'hexane pour donner la
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5,6-.13,1'diaotane de l'acide , 1g-.diaadtoxy.-5r lâadihy. droxy..nor h3, 1? eeooandrostane 65, 1?.sâi.car.boxyl.que.
La dilaotone (23,2 g) est chauffée à une tempé- rature supérieure à son point de fusion sous atmosphère
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d'azote pendant 15 minutes, refroidie et recristallisée dans un mélange d'acétone et d'hexane pour donner la 13,17-
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lactone d'acide 3Pt19*-diacétoxy-13'x-'hydroxy-B-nor-'13t17-' 6ecoandrost--5--en--17-oïque.
Une solution de 18,5 g de la lactone dans 250 ml d'éthanol est chauffée au reflux avec 20 ml d'une solution aqueuse à 40 % d'hydroxyde de sodium pendant 3 heures sous atmosphère d'azote. Le mélange réaotionnel refroidi est dilué avec 1,51 d'eau, ajusté à un pH de 3 avec de l'acide phos- phorique et extrait avec du chlorure de méthylène. Les
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extraits au chlorure de méthylfeu- réunis et séchés sont évaporés sous pression réduite pour donner de l'acide 3, 13a, 1-trihydroxy. Bnor- 3, *7'<V coandroat-5-en- 17-oIque.
Une solution de 14,3 g de l'acide dans 100 ml de tétrahydrofuranne contenant 0,5 ml d'acide perchlorique la
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à 70 % est maintenue à7Température ambiante pendant 1 heure.
La solution est diluée avec 500 ni! d'eau froide et le pré- cipité de 3,17-lactone d'acide 3,13a, 19-trihydroxy-B-nor- 13, 17-seooardr.ostw5e.*.z-17oque est recueilli par filtra- tion et purifié par recriatallisation dans un mélange d'a- cétone et d'hexane.
Un mélange de 12,1g de la lactone, de 60 ml de cyclohexanone et de 200 ml de toluène est lentement distil- lé jusqu'à ce qu'environ 10 ml de distillât soient recueillis.
On ajoute ensuite 3,0 g d'isopropoxyde d'aluminium et l'on poursuit la distillation jusqu'à ce que 140 ml de distillât soient recueillie. Le mélange réactionnel refroidi est verse dans 300 ml d'acide chlorhydrique dilué froid et oat extrait par du benzène. Des extraits benzéniques
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rI;, A..J.8 sont distillés à la vapeur jusqu'à ce que le distil- lat soit clair. La fraction non volatile refroidie est extraite par du chlorure de méthylène. Après séchage et
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évaporation des extraite au chlorure de méthylène, le ré-
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sidu de, 19¯kydroxy¯B-nort îstololactone est purifié par cristallisation dans un mélange d'acétone et d'hexane.
A une solution de 8,7 g de la lactone dans 160 ml d'acétone, on ajoute 24 ml du réaotif de Jones (trioxyde de chrome et acide sulfurique dans l'acétone) pendant 20 minutes à 5 C. Après 15 minutes supplémentaires à 5 C. le mélange réactionnel est versé dans 1 litre d'eau glacée et est extrait par du chlorure de méthylène. Les extraits au chlorure de méthylène sont extraits par une solution à 5% de carbonate de sodium (5 x 100 ml). Les solutions au carbonate de sodium réunies sont ajustées à pH 3 avec de l'acide phosphorique et sont extraites par du chlorure de méthylène. L'évaporation des extraits au chlorure de
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méthylène donne l'acide B-norteetololactone19-oIque.
Une solution de 7,1 g de l'acide et de 13,5 g du réactif T de Girard dans 160 ml d'acide acétique et 300 ml de méthanol est chauffée au reflux pendant 2 heures.
La solution refroidie est traitée par 17,8 g de carbonate de sodium dans 2,5 litres d'eau et la solution est ensuite extraite par du.. chlorure de méthylène. La couche aqueuse est acidifiée jusqu'à pH 1 aveo de l'acide chlorhydrique et on la laisse reposer à température ambiante pendant 2 heures. L'extraction avec du chlorure de méthylène donne, après séchage et évaporation des extraits, de la 19-nor-B- nortestololactone qui est cristallisée dans un mélange d'a- cétone et d'hexane.
EXEMPLE 6
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2a, 17a-diméthyl.-.B-nortestoatérone Un mélange de 12,0 g (0,042 mole) de 17a-méthyl- B-nortestostéronelde 6,8 g d'hydrure de sodium (suspension
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à 53% dans une huile minérale), et de 12 ml d'oxalate d'éthyle dans 300 ml de benzène exempt de thiophène anhy- dre est agité pendant 4 heures. Le mélange est filtré, le gâteau de filtration étant vigoureusement lavé avec du benzène et de l'hexane. Le gâteau de filtration est séché sous vide et on l'ajoute ensuite par fractions à une solu- tion glacée de 40 ml d'acide chlorhydrique à 35% dans 500 ml d'eau.
Le mélange est extrait par du chlorure de méthylène et les extraits organiques combinés sont lavés, séchée et évaporés sous vide, de manière à donner l'énol de la 2-éthoxalyl-17a-méthyl-B-nortestostérone, P.F. 151-
152 C.
Le composé 2-éthoxalylique ci-dessus est dissous dans 400 ml d'élétone et la solution est traitée par 37,5 ml d'iodure de méthyle et 12,5 g de carbonate de potas- sium anhydre. Le mélange est chauffé au reflux modéré pen- dant 12 heures, après quoi on ajoute encore 20 ml d'iodure de méthyle et le chauffage au reflux est poursuivi pendant
36 autres heures. Le mélange réactionnel est filtré et le filtrat est concentré sous vide presque jusqu'à siccité*
La dilution avec de l'eau donne une huile qui est extraite par du chlorure de méthylène.
Les extraits organiques sont lavés avec de l'hydroxyie de sodium à 1 % et avec de l'eau, séchés et évaporés sous vide pour donner de la 2-méthyl-2-' éthoxyalyl-17Ó-méthyl-B-nortestostérone sous forme d'une huile.
L'huile est traitée par une solution de 1 g de sodium métallique dans 100 ml d'alcool absolu et on la laisse ensuite reposer à la température ambiante pendant plus de 48 heures Cette solution est alors diluée avec
10 volumes d'eau et le précipité ainsi obtenu est extrait par du chlorure de méthylène. Les extraits organiques
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sont lavés, séchés et évaporés. Le résidu est chromato- graphié sur 200 g d'alumine (aotivité III), l'élution étant effectuée avec des fraotionb de 500 ml de benzène.
La matière obtenue par l'évaporation des trois premières fractions est rechromatographiée, l'élution s'effectuant avec un mélange de benzène et d'éther de pétrole (1 1).
Les fractions N 4 à 7 de la rechromatographie sont réu- ' aqueux nies et recristallisées dans du méthanol de manière à
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donner de la 2a,1?a-diméthyl-B-nortestostérone.
EXEMPLE 7 6a et 6-hydroxY-17a-méthyl-B-norte8toBtérone et 1'a- hydroxy-17a-méth,yl-B-nortestostérone.
Le milieu de fermentation est constitué de 10 litres de liqueur de macération de maïs à 2 % ajustés à pH 6,5 avec de l'hydroxyde de sodium, qui ont été passée à l'autoclave sous une pression d'environ 1,05 kg/om 2 à 121 C. La fermentation est effectuée dans des récipients à agitation avec une température de bain-marie de 28-30 C à une vitesse d'aération de 3 litres d'air par minute par 10 litres de milieu. La vitesse de l'agitateur est de 200 t/mn.
L'inoculum est préparé en utilisant Rhizopus arrhizus ATCC 11145 par des procédés courants. 5 g de
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1?a-méthyZ-.B-nortestostérare dans 50 ml d'éthanol à 95 sont ajoutée au milieu en dessous de sa surface après une croissance de 48 heures : 1 g après 48 heures, 2 g après
55 heures, 1 g après 72 heures et 1 g après 78 heures.
La fermentation est terminée 24 heures après l'addition du dernier substrat.
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Les solides sont enlevés par centrifugation.
Le bouillon effluent est clarifié 'davantage par! filtration.
La matière recueillie est lavée avec un litre d'éthanol qui est ajouté à la phase aqueuse.
Le bouillon aqueux est extrait de manière exhaus- tive par du chlorure de méthylène. L'extrait organique séché est évaporé sous vide à 50 C. Le résidu est prit dans du benzène et est amené à passer sur une colonne d'alumine neutre (Woelm,III). L'élution avec des quanti- tés croissantes de chlorure de méthylène à du chlorure de méthylène pur à du méthanol dans du chlorure de méthylène
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donne les produits suivant' : 6hydroxy-.17a-méthyl.-B- nortestostérone, P.I. 196-199OCe 6a-hydroxy¯17,a-méthyl- B-nortestoetérone, P,'. 204-201 C, et 11a-hydroxy-i7cc- m6thyl-B-nortestostérone, P.P, 202-205*0.
EXEMPLE @8
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####!# wiirwiwuii #i>liwf<c*> 11a-hydroxy et 1 a--h drox -1?a-méth 1-H-nortestoetérone
Un milieu de fermentation est préparé en utili- sant 20 g de produit de digestion enzymatique d'édamine , de lactalbumine (Sheffield Co.), 50 g de dextrose commer- ciale (cérélose), 5 g de liqueur de macération de mais
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et de l'eau jusqu'à'Ioxmer 1 litre, 10 litres de ce milieu sont ajustés à pH 6,3-6,5 avec de l'hydroxyde de sodium puis sont passés à l'autoclave pendant 1 heure et demie
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à 12190 soue une pression d'environ 1,
05 kg/cm * On es- fectue la fermentation de la manière décrite plus haut avec une vitesse d'aération de 5 litres d'air par minute par 10 litres et à une vitesse de l'agitateur de 200 t/mn.
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Le milieu est inoculé par du triohotheoium roseum ATCC 12543, préparé et est fermenté pendant 48 heures. Les
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cellules de 10 litres de milieu sont recueillies par cen- trifugation, lavées avec de l'eau distillée et mises en suspension dans 10 litres d'un tampon de trishydroxhméthyl- amino méthane de 0,1 M (pH 9,0), puis réintroduites dans un récipient agitateur. On ajoute une solution concentrée stérile de glucose jusqu'à obtenir une concentration de 0,5 %.
La vitesse d'aération pour la bioconversion est de 4 litres d'air par minute par 10 litres de suspension tamponnée à 250 t/mn. Une solution de 17a-méthyl-B- nortestostérone dans de l'éthanol à 95 (1 g/10 ml) est ajoutée de la manière suivante : 2,5 g d'un coup, 2,5/10 litres après 18 heures, 2,5 g après 42 heures à un total de 52 g de substrat. On ajoute du glucose stérile pour maintenir la concentration à 0,5 %. La fermentation se termine 65 heures après la dernière addition de substrat.
Après la fermentation, on sépare les cellules.
L'extraction séparée des cellules et du bouillon est ef- fectuée par du chlorure de méthylène, de la manière décrite à l'exemple 7 afin de donner un résidu brut après évapora- tiqn. Ce produit est traité par de l'acétone à l'ébulli- tion.
La matière insoluble est séparée et recristalli- sée dans un mélange de chloroforme et de méthanol, de manière à donner de la 15Ó-hydroxy-17Ó-méthyl-b-nortesto- stérone (21 ).
La fraction soluble dans l'acétone est évaporée et le résidu est chromatographié sur de l'alumine neutre (Woelm, III), L'élution avec un mélange de'benzène et de chlorure de méthylène donne de la 6Ó-hydroxy-17Ó-méthyl- B-norteetostérone (4 %). L'élution avec du chlorure de méthylène et un mélange de' chlorure de méthylène et de méthanol
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donne un solide qui est .purifie par recristallieation dans un mélange d'acétone et d'hexane pour donner de la Ilot- hydroxy-17a-méthyl-B-nortestostérone, p.. 202-205*0.
EXEMPLE 9 j1ê.-hydroxy-17a-méthyl-B-norteatoetérone A une solution de 4,0 g de 11 ¯hydroxy-17a- méthyl-B-nortestostérone dans un mélange d'acétone (75 ml) et de chloroforme (25 ml) on ajoute 6,8 ml d'acide chro- mique normal (26,72 g de trioxyde de chrome, 23 ml.d'aci-
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de sulfurie)et de l'eau jusqu'à 100 ml). L'addition est effectuée en l'espace d'une minute, cependant que le mélange réactionnel est agité et maintenu à 0 C. L'agi-
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tation est poulivie pendant deux minutes encore après l'addition. Le mélange réaotionnel est ensuite versé dans de l'eau froide et est extrait à trois reprises par du chlorure de méthylène.
L'évaporation des extraits com- binés et séchés donne un produit brut qui est purifié par cristallisation dans. un mélange d'acétone et d'hexane.
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Le produit pur fond à 16°--165 C après sublimation et est de la ll-çxo-17e-méthyl-.D-nortestoetérone.
Au mélange, agité de 1, 25 g d'hydrure de lithium aluminium et de 50 ml d'éther, on. ajoute une solution de
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2,5 g de 11-oxa-1améthyl-B.-nortestoatérone dans 20 ml de tétrahydrofuranne.
L'addition s'effectue goutte à goutte à 0 sous atmosphère d'azote. On laisse le mélange -réactionnel se réchauffer jusqu'à la température ambiante et il est ensuite chauffé au reflux pendant 2 heures. Après refrei- dissement jusqu'à 0 C. on traite le mélange réactionnel avec précaution par 5 ml d'eau sous agitation rapide. Le
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précipita blanqui se forme est séparé par filtration et le filtrat est vaporé jusqu'à siccité. le résidu cris-
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tallin qui est a ,11, 1'. v,rihydroxy.1"Taméthy..P rorandoet4e4; 1 brut est utilisé dans la réaction sui- vante sans au ve purification.
Les.;, 65 g de triol brut sont dissous dans 25 ml de dioxanne et traité par une solution de 2,27 g
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de 2,3.-diahlao-5,6-dicyanobenzaquinone dans 25 ml de dioxannpç Après un repos de 18 heures à 25 0, le mélange réactionnel st évaporé jusqu'à siooité. Le résidu est dissous dan du ohloroforme-mét lanol (9 1) et versé dans une colonne de 60 g d'alumine du type Woelm d'aotivité III, Le filtrat est évaporé jusqu'à siccité et recristallisé dans un mélange d'acétone et de méthanpl pour donner de la
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11S-hydroxy--17a--mdthyl.B-nortestoatéronc, P.F. 253-258 C.
EXEMPLE 10 17a-méthl-A -B-nortestoetérone A une solution de 0,70 g de 11a¯hydroxy-i7a méthyl-B-nortestostérone dans 10 ml de pyridine on ajoute 0,70 g de chlorure de p-toluènesulfonyle dans 5 ml de pyridine. Après un repos de 18 heures à 25 C, le mélange réactionnel est versé dans de l'eau et extrait àntrois reprisespar du chlorure de méthylène, les extraits organi- ques étaht lavée avec de l'acide phosphorique dilué froid.
L'évaporation des extraits combinés et séchés donne une brute
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etosylate7qûi est purifiée par cristallisation dans un mélange d'acétone et d'hexane. Le produit purifié est de la 11o-tusyloxy. 17a-.méthyl$.noxtestaatdxons, P.1. 185-
186 C.
Un mélange de 0,30 g de tosylate, de 0,3 g de chlorure de lithium anhydre et de 0,3 g de carbonate de
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lithium en OueqPe2-LIQU dans 5 ml de diméth;Ylformam:1.de est chauffé au reflu. sous atmosphère d'azote tout en agitant pendant 2 heures. Le'mélange réactionnel refroidi est versé dans une solution diluée de carbonate de sodium et est extrait par du benzène. Le séchage et l'évaporation
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des extraits benépqu'r6uniB donnent un produit brut qui après cristallisation dans un mélange d'acétone et d'hexane et une sublimation fond à 18?-.18 C et est d la A911- 17a-mdthyl-B-.nortestosté.-one..
EXEMPLE 11
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...,....... 6--chlôro-.1?a-méthl-B- nortestoe+,drone Une solution de .,5 I, 6a-hydroxy-.17e-méthyl'- B- nortestostérone et',de 1,12 g de chlorure de p-toluène- sulfonyle dans 10 ml de pyridine est laissée au repos à la température ambiante pendant 72 heures* Le mélange réac- tionnel est versé dans de l'eau et est extrait par du chlorure de méthylène, Les extraitsorganiques sont réunis, lavés avec de l'acide phosphorique dilué, séchés et évaporés, de manière à donner un résidu qui est purifié par ohromatographie sur 60 g d'alumine (Woelm, III) aveo du benzène servant de solvant*, de développement de manière
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à obtenir de la 6p¯chloro-i7a¯méthyl B¯norte8tostérone, P.'. 2?-.129 .
L'isomère 6a. ehloro est préparé de manière ana- logue en utilisant un isomère 6p-hydroxy comme matière de départ. Lee autres analogues 6-halo peuvent être préparés en utilisant l'halogénure de tosyle correspondant tel que du bromure de toayle ou en ajoutant un excès de l'halo- génure de sodium ou de potassium particulier au mélange réactionnel.
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EXEMPLE 12
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17oc-méthyl'-A -B-nortestostérone '#
Un milieu de fermentation constitué de 10 litres de liqueur de macération de mais ajustés à pH 6.3-6,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium,est passé à l'auto- clave pendant 2 heures à une pression de 1,05 kg/cm2 à une température de 121 C. Le milieu est inoculé par une préparation normale de Septomyxa affinis NRRL 2746. On laisse la fomentation se poursuivre pendant 48 heures avec une aération de 3 litres d'air par minute par 10 litres et une vitesse d'agitateur de 200 t/mn.
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5 g de 11a-méthyl-B-norteatoatérone sont dissous ! dans 50 ml d'éthanol à 95 % et sont ajoutés en dessous de la surface du milieu : 1 g après 48 heures, 2 g après 55 heures, 1 g après 72 heures et 1 g après 78 heures.
Dès que la transformation est complète, le mélan. ge est centrifugé, Les solides sont récupérés et extraits par-de l'éthanol et ensuite par un mélange d'éthanol et de chlorure de méthylène. Les extraits sont filtrés et ajoutés au bouillon clarifié qui est extrait de manière exhaustive par du chlorure de méthylène, Après séchage, les extraits sont évaporés sous vide à 50 C.
Le résidu est repris dans un mélange d'éther de et est pétrole et de benzène/chromatographié sur de l'alumine (Woelm, III), Les fractions éludes avec du benzène-éther de pétrole (1 : 1) à travers du benzène-chlorure de méthy- lène (1 : 1) sont réunies et évaporées.
Le résidu solide est recristallisé,dans de l'acétone-hexane pour donner
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de la 1..17a-méthyl-B--norteatostérone (48 ad), P.P. 140- 141 C après sublimation.
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EXEMPLE EXEMPhE 1 15a.h drox -.17a.méth 1-B-no estostérone Le milieu de fermentation est constitué de 20 g
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d'un produit de digestion,enzymatique commercial de lactalbumine (examine, hfiela.Co, de 50 g de dextrose commerciale (cérélose, Corn Products), de 5 g de liqueur de macération de mais et d'eau pour faire 1 litre* 10 li- tres de ce milieu sont préparés, ajustés à pH 6,3-6,5
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avec une solution d'hydr"yde de sodium et sont passés à l'autoclave pendant 1 heure et demie 4 121 C sous une pres- sion de 1,05 kg/cm2.
-La réaction de fermentation s'effectue dans des récipients agitateurs d'un litre d'ensembles de fermenta-
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tion du type N :",¯Erunawick avec une température de bain- marie de 28-30 C avec une vitesse d'aération d'un litre d'air par minute par litre agité à une vitesse d'agitateur de 200 t/mn, un agent anti-mousse habituel étant ajouté.
L'inoculum est préparé en utilieant 100 ml du milieu dans des flacons d'Erlenmeyer de 500 ml sur un agitateur rotatif à 200 t/mn, à la température ambiante, en utilisant Aspergillus ochraceus ATCC 12337. 200 ml d'inoculum sont utilisés pour'10 litres de fermentation.
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Une solution de substrat de 17ot-méthyl-B-nortes- tostérone dans de l'éthanol à 95 %, à raison de 1 g par 16 ml, est préparée. Après une croissance de 48 heures, la solution de substrat contenant 1 g de substrat est pom- pée en dessous de la surface du milieu liquide à des inter- valles de 4 heures jusqu'à ce que 10 g de substrat soient utilisés.
La formation du produit'est périodiquement sui- vie en utilisant la chromatographie en couche mince avec . un système solvant d'acétate d-'éthyle. La fermentation est terminée 6 heures après l'addition du dernier substrat.
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Les cellules sont séparées par filtration à tra- vers de, la musline et sont ensuite extraites par un mélange 1 : 1 d'éthanol à 95% et de chlorure de méthylène. Après filtration, les extraits sont réunie au bouillon clarifié qui est alors extrait avec du chlorure de méthylène. Les extraits organiques séchés sont évaporés jusqu'à sicoité sous vide à 50 C.
La cristallisation du résidu dans un mélange de chlorure de méthylène et de méthanol donne 57% de 15a-
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hydroxy-17a-méthyl-B-nortestostérone, P.F. 243-249 C.
La recristallisation dans de l'acétone du-résidu des liqueurs- mères donne une quantité mineure de na-hydroxy-17a-méthyl- B-nortestostérone.
EXEMPLE 14
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1ia-méthyl.- 14-B-nortestostérone Une solution de 8,22 g de 15a.-hydroxy 1?a-méthyl- B-nortestostérone dans 70 ml de pyridine est mélangée à 6,76 g de chlorure de p-toluènesulfonyle. Après un repos de 18 heures à la température ambiante, le-mélange est versé dans 500 ml d'eau glacée. Le précipité qui se forme est recueilli par filtration pour donner, après reoristallisa- tion dans un mélange d'acétone et d'hexane, de la 15a-tosyl-
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oxy-17K-méthyl-B-nortestostérone, P.'. 90-9300. Un mélange de 5 g de 15a-tooyloxy 17o-méthyl-B- nortestostérone, de 1,5 g de chlorure de lithium anhydre, de 1,5 g de carbonate de lithium et de 50 ml de N,N-dimé- thylformamide est chauffé au reflux sous atmosphère d'azote pendant 3 heures. Le mélange est versé dans de l'eau.
L'extraction avec du benzène donne, après recristallisation
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dans un mélange d'acétone et d'hexane de la A 14- 17a-méthylH.-nortestastérone, PP', 160-16800,