BG62337B1 - Биосензорен метод на базата на генна сонда - Google Patents

Биосензорен метод на базата на генна сонда Download PDF

Info

Publication number
BG62337B1
BG62337B1 BG98660A BG9866094A BG62337B1 BG 62337 B1 BG62337 B1 BG 62337B1 BG 98660 A BG98660 A BG 98660A BG 9866094 A BG9866094 A BG 9866094A BG 62337 B1 BG62337 B1 BG 62337B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
oligonucleotide
dna
immobilized
complementary
rna
Prior art date
Application number
BG98660A
Other languages
English (en)
Other versions
BG98660A (bg
Inventor
David J. Squirrell
Original Assignee
The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland filed Critical The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland
Publication of BG98660A publication Critical patent/BG98660A/bg
Publication of BG62337B1 publication Critical patent/BG62337B1/bg

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/7703—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Description

Изобретението се отнася до метод за установяване, идентифициране и/или количествено определяне на свободна РНК или ДНК, както и такава от растителни или животински клетки и микроорганизми, както и до реагенти и апаратура за провеждане на тези изследвания. Методът използва главно тотална вътрешна флуоресценция на отражение (ТВФО) за измерване на хибридизация на изследваната РНК или ДНК с РНК- или ДНК-свързани вълновод и детектор на краткотрайни (бързопреходни) вълни.
Изпитванията с генна сонда, в основата на които лежи хибридизация на нуклеиновите киселини, са всъщност алтернатива на имунологичните методи за установяване и идентификация на биологични материали. Спецификата на гениите сонди за техните мишени може да се контролира много по-лесно, отколкото когато се използват методите, базирани на феномена на белтъчното свързване, и когато се дублира с полимеразната верижна реакция за преамплификация на мишенния материал, може да бъде постигната изключителна чувствителност. Използваните досега техники на базата на генни сонди са бавни и отнемат от часове до дни, за да се получи даден резултат. Биосензорите предлагат алтернативен път за бързо получаване на резултати (Evans & Charles, 1990, Abstracts of 1st World Congress of DNA probes and immunoassay; Pollard-Knight et al., 1990, Ann. Biol. Chem., 48, 642-646).
Краткотрайни (бързопреходни) вълнови биосензори, които се базират на явлението ТВФО (Sutherland & Dahne, 1987, J. Immunol. Meth., 74, 253 - 265), са използвани c белтъци като елемент за биологично разпознаване. Антитела са използвани за установяване свързването на флуоресцентно-белязан антиген (Elderfrawi et al., 1991, Biosensors & Bioelectronics, 6, 507 - 516), използвайки ацетилхолинови рецептори за изучаване свързването на ацетилхолина с холинестеразни инхибитори. Други изследователи (Poglitsch & Thompson, 1990, Biochemistry, 29, 248 - 254) са измервали свързването на антитела с Fc епитопи.
Изобретението представлява метод за провеждане на изследвания, при използване на генни сонди с биосензор за краткотрайни (бързопреходни) вълни и осигурява ТВФО вълновод, който прави този метод използваем в съответни биосензорни съоръжения.
Детекторите на бързопреходни вълни се базират на ТВФО-явления като осигуряват чувствителни методи за регистриране на реакции на повърхността на вълновода.
Вълноводът може да приема различни форми, но обикновено той е с формата на призма или нишка. Реакцията, която се използва за измерване на молекулата мишена, може да се наблюдава, например, чрез измерване на промените във флуоросценцията при свързване или отделяне на флуоросцентни сонди или чрез генериране на флуоресцентни видове по ензимен или химичен път.
Известни са патенти, при които се използват краткотрайни вълнови детектори с имунологични системи като биологичен елемент (например US 4582809), но съществуващите ограничения в имунологичните реагенти не позволяват да се използват всички възможности на използвания сензор.
Изобретението осигурява метод за установяване, идентификация и/или количествено определяне на свободна ДНК или РНК, както и такива от растителни или животински тъкани, микроорганизми. Методът включва следните етапи:
i/ осигуряване на олигонуклеотид, комплементарен на цялата или на част от олигонуклеотидната секвенция, характерна за РНК или ДНК в материала, имобилизирана на повърхността на въдновод към детектор на краткотрайни вълни;
й/ поставяне на имобилизирания олигонуклеотид от етап i/ в контакт с пробата (съдържаща ДНК или РНК) при условия, при които ДНК или РНК, имащи съответната олигонуклеотидна секвенция, ще хибридизират с него;
iii/ асоцииране на имобилизирания олигонуклеотид от етап i/ или нуклеотидния материал от пробата с флуоресцентен агент преди, по време на и след завършването на хибридизацията с ДНК или РНК, както е описано в етап ii/, така че флуоресцентният агент се оказва свързан с хибридизирания продукт, но не и с нехибридизирания имобилизиран олигонуклеотид.
iv/ измерване на флуоресцентния агент, свързан съгласно етап iii/ чрез детектор за краткотрайни вълни, и съпоставяне на получените резултати с вида и количеството на материала.
В един от вариантите от изобретението флуоресцентният агент е всъщност флуоресцентно интеркалиращо багрило, което е в състояние да се инкорпорира в продукта на хибридизация. В този случай, багрилото не се свързва с нехибридизираните имобилизирани олигонуклеотиди. Такъв метод за определяне наличието на хибридизиран продукт се използва отлично при достатъчно дълги имобилизирани секвенции, при които може да се получи специфична хибридизация. Изследваната проба може да има непроменено съдържание на ДНК/РНК или може да бъде обогатена чрез специфична секвенциална амплификация чрез т.нар. полимеразна верижна реакция (PCR) или лигазна верижна реакция (LCR).
Във втори вариант на метода флуоресцентният агент е всъщност флуоресцентен олигонуклеотид, който е в състояние да се хибридизира с наличната секвенция или е специфичен секвенциален амплификатор-праймер, например като PCR праймер, в резултат на което се получава флуоресцентно установим амплификационен продукт.
В модификация на втория вариант, използващ олигонуклеотиди, този метод дава възможност за установяване, идентификация и/или количествено определяне на материал, подбран от растителни и животински тъкани, микроорганизми или свободни РНК или ДНК. В този метод са включени следните етапи:
i/ осигуряване на олигонуклеотид, комплементарен на част от олигонуклеотидната секвенция на РНК или ДНК на изследвания материал, имобилизиран върху вълновода към детектор на бързопреходни вълни;
й/ осигуряване флуоресцентен олигонуклеотид, комплементарен на цялата или на част от остатъка на известната секвенция;
iii/ осъществяване на контакт между имобилизирания олигонуклеотид от подточка i/ и разтвор, съдържащ изследвания материал или ДНК/РНК материал, при условия, при които олигонуклеотидната секвенция ще хибридизира с него;
iv/ заместване на разтвора, съдържащ материала от етап iii / с разтвор, съдържащ флуоресцентен комплементарен олигонуклеотид от етап й/ и ν/ измерване количеството на свързания флуоресцентен олигонуклеотид с помощта на кратковременния вълнов детектор на бързопреходни вълни и съпоставянето му с идентичността и/или количеството на изследвания материал.
В един подобрен вариант на изобретението методът за установяване, идентификация и/или количествено определяне на свободни РНК или ДНК, както и такива от растителни и животински тъкани или микроорганизми, се състои от следните етапи:
i/ осигуряване на олигонуклеотид, комплементарен на част от дадена олигонуклеотидна секвенция, характерна за РНК или ДНК на изследвания материал, имобилизиран върху вълновод към детектор на бързопреходни вълни;
й/ осигуряване на флуоресцентен олигонуклеотид, идентичен с целия или с част от остатъка на дадена характерна секвенция;
iii/ провеждане на специфична реакция за секвенциална амплификация върху изследвания материал, използвайки флуоресцентния олигонуклеотид от етап й/, като един от праймерите за амплификация на присъстващата секвенция, докато инкорпорира флуоресцентния агент;
iv/ поставяне в контакт на имобилизирания комплементарен олигонуклеотид от етап i/ с реакционната среда от етап ш/ при условия, при които е възможна хибридизация между амплифицирания продукт и имобилизирания олигонуклеотид;
ν/ измерване на флуоресцентния олигонуклеотид чрез детектор на краткотрайни вълни и съпоставяне на резултатите с количеството на амплифицирания материал, който първоначално е присъствал в пробата.
За предпочитане е специфична амплификационна реакция на етап iii/ да е полимеразната верижна реакция, но е възможно да бъдат използвани и други подобни реакции, например лигазната верижна реакция.
Във всички варианти на изобретението вълноводът се разполага в температурно контролирана среда, например камера с регулируема температура, така че точността на хибридизация на комплементарните секвенции и съ ответните РНК и ДНК може да бъде контролирана или така, че PCR, хибридизацията и удължаването да могат да бъдат проведени.
Флуоресцентните олигонуклеотиди могат да бъдат в различни форми, например като олигонуклеотид, свързан с флуоресцентен маркер или с ензим, способен да генерира флуоресцентен агент.
Комплементарна секвенция от етап i/ може да е достатъчно дълга, за да се свърже специфично с мишената РНК или ДНК, оставайки достатъчно несвързани секвенции от мишенните РНК или ДНК, за да се свържат с олигонуклеотида от етап iii/. Обикновено имобилизираната секвенция обхваща около половината от дължината на секвенцията мишена, но увеличението дължината на последната би позволило да се използват по-малки пропорции.
Добре е имобилизираният олигонуклеотид да е комплементарен на дадена секвенция в единия край на секвенцията мишена, докато флуоресцентната секвенция е комплементарна на дадена секвенция в другия край. Рестрикционните ендонуклеази могат да бъдат използвани преди хибридизация с цел да се отреже (отцепи) РНК или ДНК от сондата, за да има по-добър достъп до тези краища. Аналогично, във втория вариант изследваната секвенция трябва само да бъде достатъчно дълга, за да може да се използва като PCR праймер. Във всички случаи предпочитаната дължина е 5 - 30 бази най-добре 15 - 20 бази.
В процеса на работа става ясно, че комплементарните секвенции може да не са комплементарни за всяка двойка бази, подлежащи на хибридизация. Следователно, опитният експериментатор бързо ще определи ограниченията за статистически допустимо използване на несъответстващи олигомери (например при 90 % комплементарни секвенции).
Изискванията за точна комплементарност може да варират в зависимост от уникалността на изследваните секвенции. Така например за една секвенция, която има висок % общи бази с други потенциално присъстващи секвенции, е необходима по-пълна комплементарност, отколкото при секвенции, които се различават по-рязко. Следователно, когато изучаваната секвенция не е напълно изучена или варира, опитният експериментатор може да определи статистически приемливи олигомери за стъпки i и iii.
Втори аспект на това изобретение е, че то може да се използва като опитен кит при осъществяване на метода, като китът се състои от олигонуклеотид, комплементарен на цялата или на част от олигонуклеотидната секвенция, характерна за РНК или ДНК в изследвания материал, и от флуоресцентно определяем олигонуклеотид, комплементарен или идентичен с част от или с цялата секвенция.
Трети аспект на изобретението се състои в това, че се предлага удобен за използване вълновод към биосензор за затихващи вълни, един олигонуклеотид, който е комплементарен на цялата или на част от олигонуклеотидната секвенция, характерна за РНК или ДНК в изследвания материал. Експериментални китове, съдържащи такива вълноводи, могат да се предложат за използване, както е посочено в претенциите.
Четвъртият аспект на изобретението предлага детектор на затихващи вълни, съдържащ вълновод, който има имобилизиран върху повърхността си олигонуклеотид, който е комплементарен на цялата или на част от олигонуклеотидната секвенция, характерна за РНК или ДНК в изследвания материал. Този вълновод може да бъде призма, плочка или нишка.
Чрез предлаганото изобретение могат да се изследват едновременно повече от една нуклеотидни секвенции чрез използване на повече от един тип имобилизирани нуклеотиди и свързани флуоресцентни реагенти.
Предимствата съгласно изобретението пред имунологичните изследвания се състоят в следното:
Опаковането на имобилизирания компонент на повърхността на вълновода е поплътно, поради което се подобрява чувствителността на метода и се улеснява конструирането на мултиспецифичните повърхности. Свързването между анализираната проба и имобилизираните олигонуклеотиди може да се регулира чрез напасване на условията за хибридизация и дължините на олигонуклеотидите, като по този начин се постига фина регулация на специфичността и чувствителността на даден анализ. Имунологичните опити се ограничават от достъпността на реагентите, тяхната стабилност, антигенна вариабилност, от маскирането на антигенните места и дисоциационните константи на комплексите антитя ло/антиген. Съгласно изобретението са отстранени изброените проблеми. Флуоресцентните имунологични методи се влияят от замърсявания от средата, а по-високите температури, необходими при метода съгласно изобретението (над 60°С в сравнение с 37°С) намаляват нежеланата адсорбция на контаминанти на повърхността на детектора. Като резултат от пониските дисоциационни константи, получени при комплексите на нуклеиновите киселини в сравнение с имунните комплекси, може да се реализира на практика цялата чувствителност на метода на затихващите вълни.
Изследваните проби могат да се намират в средата (например свободни РНК или ДНК олигонуклеотиди) или може да са претретирани например с методи, лизиращи клетките, с амплифициране или концентриране на ДНК/РНК (например PCR) или с рестриктази, за да се получат олигонуклеотиди с подходяща дължина.
Възможностите на метода съгласно изобретението са пояснени чрез следните фигури и опити.
Описание на приложените фигури
Фигура 1 показва главните елементи на детектора на бьрзопреходната затихваща вълна, използван в примерите.
Фигура 2 показва отношението волтаж/ време, получено при хибридизация на флуоресцеин белязан 20-тег с комплементарна секвенция, ковалентно свързана с оптичен нишков вълновод.
Фигура 3 показва кривата концентрация/ответна реакция, показваща специфична хибридизиция между комплементарен и контролен олигонуклеотид; сигнал (mV/min) срещу концентрация на олигомера в пМ.
Фигура 4 показва ефекта на скоростта на изтичане на разтвора на пробата в камера с контролирана температура, съдържаща вълновода за хибридизационния сигнал, сигнала (mV/ min) и се чертае срещу скоростта (ml/min).
Фигура 5 показва влиянието на температурата върху скоростта на хибридизация, сигналът (mV/min) се изчертава срещу температурата за 50 ng/ml проба, белязан с флуоресцеин 20-mer.
Фигура 6 показва pH профила на олигонуклеотидната хибридизация върху оптичен нишков вълновод; сигнал (mV/min) срещу pH.
Фигура 7 показва свързването на 8 пМ разтвор на олигомери, комплементарни на проксималния или дисталния край на ковалентно свързан 204-базов олигонуклеотид.
Фигура 8 показва диаграмна схема на молекулни бази на два от вариантите на метода от изобретението.
Методи
Тъй като олигонуклеотидите са дълговерижни молекули с дължина, която може да се сравнява с дълбочината на бързозатихващите вълнови зони, са проведени изследвания, при които се хибридизират къси флуоресцеин белязани олигонуклеотиди към един от краищата на 204-базов олигомер, фрагмент, амплифициран от ген на Bacillus anthracis, за да се изучи влиянието на дължината на пробата върху сигнала.
Материали
Глутаралдехид 3-аминопропил триетоксисилан (APTS), Tween 20, Ficoll, формамид, поливинил пиралидон, говежди серумен албумин V (BSA), стерптавидин, белязан с пероксидаза от хрян (HRP-SA), 2,2-азино-бис(3етилбензтиазолин-6-сулфонова киселина) (ABTS), натриев хлорид и тринатриев цитрат (Sigma Chemical Company, Pool, UK). Натриев дихидроген ортофосфат, двунатриев хидроген фосфат, натриев додецилсулфат (SDS), солна киселина, ацетон (BDH, Poole, UK).
Амониев хидроокис е доставен от Aldrich, Gillingham, Dorset, UK, а етанол от Hayman Ltd., Witham, Essex, UK.
Стрептовидин, имобилизиран на агарозни зърна, е доставен от Pierce & Wasriner, Chester, UK.
Синтетични ДНК-олигонуклеотиди с С6свързан флуоресцеин, амино- или биотин-модифицирани краища е доставен от British BioTechnology, Ltd., Abingdon, UK (изброени на табл. 1).
Таблица 1
Използвани олигонуклеотиди (5' към 3')
ID No СскВспция
4946 CACGITGIOGAClVHTGGA-aMiino
4947 TCXIAAACAGTCCACAACGTGфлуорссцип
4949 СЛЛСЛСАССТГГААСЛС-амипо
4950 GTG'lTAAGGTGTUITG<t>Ayopecuun
5453 aMuiio-CnTAA'ITG'10G(?GAG'l'G'IT
5805 флуорссцсип-ААСАСТССССАСААЛТЛААС
6097 6uomun-AATIGAAGTAC(5GTCGCAAT
5452 флуорссцсип-ЛАГГСАЛПТЛСПСИСЮСАЛГ
За да се проведе опитът, оптичната нишка с имобилизиран олигонуклеотид се промива с дейонизирана вода, подсушава се и се поставя в камерата за изследване. След оптимизира- 20 не се използват условията, описани от Андерсон и Янг (1985) “Хибридизация на нуклеиновите киселини - практически подход”, изд. Хеймс и Хигинс; IRL Press, Oxford, стр. 73 - 111 при температура 65°С. 25
Прехибридизационен разтвор (200 ml 20 х SSC, 50 ml 100 х разтвор на Denhard, 50 ml, 0,1 М фосфатен буфер е 1 nb Tween 20,600 ml стерилна дейонизирана вода, pH 6,8) се вкарва чрез перисталтична помпа в камерата при зо скорост 0,5 ml/min до получаване на стабилна базова линия. Добавя се белязаният с флуоресцеин олигонуклеотид при същата скорост. След няколко min температурата се повишава на 80°С. След 10-15 min целият свързан олиго- 35 нуклеотид се десорбира и температурата се понижава до 65°С.
Първоначално се закачват само къср олигонуклеотиди (16 - 20-mer) към нишките. За да се изследва възможността за използване на 40 по-дълги сонди се синтезира 204-mer с аминокрай, използвайки PCR върху секвенцията мишена с един праймер от 20-mer, белязан накрая с биотин олиго. 1222. Неинкорпорираният амино-белязан праймер се отстранява чрез 45 стрептавидин, имобилизиран върху агарозни зърна, за да се извлече двойноверижният продукт от полимеразната верижна реакция, от неинкорпорирания праймер с аминокрай. Аминобелязаната 204-базова верига се освобожда- 50 ва от комплементарната верига и от агарозните зърна чрез нагряване на 95°С за 10 min, следвано от бързо охлаждане с лед и премахване на зърната чрез центрофугиране. Количеството на получения 204-mer е достатъчно за приготвяне на 0,85 Hg/ml разтвор за свързване на нишките.
Изследване на олигомерите
При първоначални опити с 20-mer се използват високи концентрации на контролните и изследваните олигонуклеотиди. 200 пМ разтвор на флуоресцеин белязан контролен олигонуклеотид (олиго.4950) се въвежда с 1 ml/min при 60яС в камерата, съдържаща имобилизиран олиго.4946. Веднага се наблюдава изместване на базовата линия от 80 mV, след което остава постоянно до въвеждането на прехибридизационен разтвор. Обратно, когато олиго. 4947, който е комплементарен на олиго.4946, се въвежда при 160 пМ (1 gg/ml) се наблюдава един постоянно увеличаващ се сигнал с начален наклон от около 350 mV/min. Достига се до плато след около 14 min при 1,140 mV над базовата линия. За да се потвърди, че свързването е специфично, е показано, че контролният олиго.4950 се свързва към оптичната нишка с неговия комплимент олиго.4949, който е ковалентно свързан с повърхността.
Времето за хибридизация на 8 пМ флуоресцеин белязан олиго.4947 към имобилизиран олиго.4946 е показано на фиг. 2. Кривата концентрация/отговор за флуоресцеин белязан олиго.4950, хибридизиращ с имобилизиран олиго.4949 /с олиго.4947 като контрола/, е показана на фиг. 3.
Наклонът на кривата се измерва 1 min след като пробата влезе в камерата.
Резултатите от оптимизиране на условията са показани на фигурите от 4 до 6. Ефектът на скоростта на изтичане се изследва с 50 ng/ml разтвор на олиго.4947. Резултатите са показани на фиг. 4. Зависимостта на скоростта на хибридизация от температурата и pH са показани на фиг, 5 и 6. Максимална скорост се наблюдава при 65°С и pH 6,8.
Кривите на свързване на 50 пМ разтвор на флуоресцеин белязани олигонуклеотиди, комплементарни на един от краищата на 204базов олигонуклеотид, ковалентно свързани с единия край на вълновода, са показани на фиг.
7. И в двата случая се наблюдава бързо достигане до плато от 48 mV (проксимално) и 56 mV (дистално) след около 3 min, следвано от понижение на сигнала, когато прехибридизационният разтвор е въведен отново в камерата. Не се наблюдава свързване на олиго.4947 (като контрола) при концентрация 500 пМ.
Отчитането е в наномолен диапазон с линейна връзка между наклона на кривата и концентрацията. Подобни резултати са получени и с имунологични опити.
Когато е необходима висока чувствителност на метода, може да се направят следните подобрения.
Белязаните олигомери се получават от олигонуклеотиди, белязани с множество флуорофори, или се използват флуоресцентни проникващи багрила за установяване на хибридизацията.
Този метод може да се комбинира с техника за ДНК амплификация, например PCR, което може да се проведе преди хибридизацията. Възможно е също така директно да се проследи PCR реакцията, като се използва биосензорът. 60-те секунди, необходими за биосензора, са с една степен по-бързи от конвенционалните опити, които се провеждат (Engelberg 1991, ASM, News 57, 4, 183 - 186).
Бързото рециклиране на повърхността на детектора чрез премахване на свързаните нуклеинови киселини посредством нагряване, решава един от главните проблеми на имунологичните тестове и с 60-те секунди, които са необходими, я прави удобна за военни и други критични ситуации, изискващи бърза идентификация. Някои оптични нишки могат да се използват дори по няколко дни.
Използването и на 5'- и на Забелязани олигонуклеотиди не повлиява значително върху получените резултати. Олигонуклеотидите се свързват или с проксималния или с дисталния край на 204 - базовия олигонуклеотид. Неговата дължина би могла да бъде от 70 nm (използвайки стойността от 3,4 nm за дължина на стъпката на двойноверижната ДНК, която има по 10 бази на спирала), до 200 nm (използвайки разстоянията между повторенията -ОР-О-С-С-С- по дължината на гръбнака на молекулата. Дълбочината на зоната на бързозатихващите вълни, дефинирана като разстояние, необходимо на интензитета на светлината да падне до 1/е от максималната си стойност, би могла да се определи на около 100 nm. Тъй като се получават подобни сигнали при хибридизация на олигонуклеотиди, белязани с флуоросцеин на дисталния или на проксималния край (малко по-силен е сигналът при дисталните олигонуклеотиди), ориентацията на дългите олигонуклеотидни вериги вероятно не е перпендикулярна на повърхността на вълновода.
Неголям брой от получените чрез PCR олигонуклеотиди (204-шег) могат да се свържат с оптичните нишки, което води до ниска концентрация на олигонуклеотиди върху вълновода. Това обяснява бързото получаване на плато на получения сигнал (фиг. 7) в сравнение с постепенното усилване на сигнала, показано на фиг. 2, където имобилизираната проба е в много по-висока концентрация. Ако трябва да се избира височината на платото пред скоростта на промяна на сигнала като мярка за свързване, то ограничаване на количеството на имобилизираната проба би позволило да се постигне по-бързо насищане.
Молекулната база на изобретението е илюстрирана на фигура 8, където 8а-с и 8d-f се отнасят до първия и втория предпочитани варианти на това изобретение. В 8а една олигонуклеотидна секвенция (А), комплементарна на част от олигонуклеотидната секвенция, характерна за дадената ДНК секвенция (В), е имобилизирана върху вълновода към детектора на бързопреходни вълни по описания погоре начин. В 8Ь имобилизираният олигонуклеотид се поставя в контакт с разтвор, съдържащ изследваните проби и ДНК-секвенцията (В), хибридизирана със секвенция (А) при условия, подходящи за хибридизация. В 8с пробата се заменя с разтвор, съдържащ флуорос7 центно белязан олигонуклеотид (С), който е комплементарен на нехибридизирания остатък от олигонуклеотида мишена, също при условия, подходящи за хибридизация. При хибридизация се получава флуоресцентен сигнал, който преминава през вълновода и се регистрира от детектора.
В 8d комплементарната секвенция (А) се имобилизира върху вълновода, както вече е описано. В 8е разтворът на пробата се третира в условията на PCR (полимеразна верижна реакция) с два праймера (D) и (Е), като всеки един от тях отговаря на една известна секвенция на един от двата края на секвенцията мишена (В).
Праймерът, предназначен за този край на секвенцията, който е противоположен на края, който се хибридизира с имобилизирания олигонуклеотид (А), е белязан с флуоресцеин и следователно продуктът на тази реакция е флуоресцеин белязана секвенция мишена (F). В 8f имобилизираната секвенция (А) се поставя в контакт с пробата в условия за хибридизация, където флуоресцеин белязаната секвенция (F) се хибридизира със секвенция (А) и получената флуоресценция се регистрира с детектора.
В един вариант на метода (фиг. 8), удобен за използване на PCR или друг специфичен амплификационен метод, имобилизираният олигонуклеотид (А) се подбира така, че да не може да се свърже с праймерите (D) и (Е). По този начин олигонуклеотидът (А’) хибридизира с част от (F), разположен централно в секвенция (В), в сравнение спраймера (D), като краят (F), който няма флуорофор, изглежда като на фиг. 8g.
Различните варианти на метода, в който е използвано интеркалиращото багрило, са проведени, както е показано на фигури 8а и 8Ь, като отделните етапи са проведени в присъствието или с допълнителната добавка на багрилото. Информация за подходящи флуоресцентни багрила и условия за техните взаимодействия има в следните лит. източници: Latt and Wohlleb; Chromosoma (Berl) 52, 297 - 316 (1975), Jorgensen et al., Chromosoma (Berl) 68, 287 - 302 (1987) and Jennings and Ridler, Biophysics of Structure and Mechanism 10. 71 - 79 (1983).

Claims (24)

1. Метод за установяване, идентификация и/или количествено определяне на материал, подбран от растителна или животинска тъкан, микроорганизми или свободна РНК или ДНК, включващ следните етапи:
i/ получаване на олигонуклеотид, комплементарен на цялата или на част от една олигонуклеотидна секвенция от РНК или ДНК от съответен материал, имобилизиран на повърхността на вълновод към детектор на краткотрайни (бързопреходни) вълни.
ii/ поставяне на имобилизирания олигонуклеотид от етап i/ в контакт с разтвор, съдържащ пробата РНК или ДНК, в условия, в които ДНК и РНК, имащи известни нуклеотидни секвенции, се хибридизират с него.
iii/ свързване на имобилизирания олигонуклеотид от етап i/ или на нуклеиновата киселина от пробата с флуоросцентен агент преди, по време на или при завършване на хибридизацията с ДНК или ДНК, получени в етап ii/, така че флуоресцентният агент да се свърже с хибридизирания продукт, но не с нехибридизирания олигонуклеотид.
iv/ измерване на флуоресцентния сигнал, индуциран от свързания флуоресцентен агент съгласно iii/ чрез детектор на краткотрайни вълни и отнасяне на този сигнал към присъствието, вида и количеството на материала.
2. Метод, в който може да се проведе специфична секвенционна амплификация в разтвор в контакт с вълновод, свързан с детектор на краткотрайни вълни.
3. Метод съгласно претенции 1 и 2, в който флуоросцентният агент е флуоресцентно интеркалиращо багрило, което може да бъде инкорпорирано в хибридизационния продукт, но не може да се свърже с нехибридизирани имобилизирани олигонуклеотиди.
4. Метод съгласно претенция 3, в който специфична секвенциална амплификация се прави чрез полимеразна верижна реакция (PCR) или чрез лигазна верижна реакция (LCR).
5. Метод, при който флуоресцентният агент представлява един флуоресцентно белязан олигонуклеотид, който е в състояние да се хибридизира с известна олигонуклеотидна секвенция (от етап ii/.
6. Метод, при който флуоресцентно белязаният агент е в състояние,да действа като праймер, амплифициращ специфичната секвенция, като при това се получава флуоресцентно установим амплифициран продукт, който може да се изследва, когато е хибридизиран с олигонуклеотида, имобилизиран на вълновода.
7. Метода, при който амплифицираният праймер на специфичната секвенция е праймерът на полимеразната верижна реакция (PCR).
8. Метод съгласно претенции 1 и 5, който се състои от следните етапи:
i/ обезпечаване на олигонуклеотид, комплементарен на част от известна олигонуклеотидна секвенция от РНК и ДНК, имобилизиран върху повърхността на вълновод към апарат за бързопреходни вълни;
ii/ обезпечаване на флуоросцентно установим олигонуклеотид, комплементарен на цялата или на част от известна секвенция;
iii/ поставяне на имобилизирания олигонуклеотид от етап i/ в разтвор, съдържащ материала, който трябва да се изследва (или ДНК, или РНК, получени от този материал) в условия, при които известната олигонуклеотидна секвенция ще се хибридизира с нея;
iv/ заместване на разтвора, съдържащ материала от етап iii/ с разтвор, съдържащ флуоресцентния комплементарен олигонуклеотид от етап ii/ и v/ измерване на количеството свързан флуоресцентен олигонуклеотид чрез детектор на бързопреходни вълни и отнасяне на получения сигнал към присъствието, идентичността и/или количеството на изследвания материал в пробата.
9. Метод съгласно претенциите 1, 6 или 7, който се състои от следните етапи:
i/ обезпечаване на олигонуклеотид, комплементарен на част от олигонуклеотидната секвенция на РНК или ДНК на изследвания материал, имобилизиран върху повърхността на вълновод към детектор на бързопреходни вълни;
ii/ обезпечаване на флуоросцентно установим олигонуклеотид, идентичен на цялата или част от известната секвенция;
iii/ провеждане на реакция, която амплифицира специфичната секвенция на проба от изследвания материал, използвайки флуоресцентно белязания олигонуклеотид от етап й/ като един от праймерите, за да се амплифицират съществуващите секвенции;
iv/ поставяйки имобилизирания върху вълновода комплементарен олигонуклеотид от етап i/ в реакционната смес от етап iii/ при условия, при които ще протече хибридизация на амплифицирания продукт с имобилизирания олигонуклеотид;
v/ измерване на някакъв флуоресцентно белязан олигонуклеотид, хибридизиран с имобилизирания олигонуклеотид, използвайки детектор на бързопреходни вълни, и отнасяне на получения резултат към количеството на амплифицирания материал, присъстващ в пробата.
10. Метод, при който вълновод всъщност представлява призма, плочка или нишка.
11. Метод, при който вълноводът е разположен в среда с контролирана температура.
12. Метод, при който, както е посочено в претенция 11, средата е камера с регулирана температура.
13. Метод, при който температурата се контролира по такъв начин, че прецизността на хибридизация на комплементарните секвенции на изследваните РНК и ДНК може да бъде контролирана или да бъде оптимална за контролираното протичане на PCR, денатурация, хибридизация или амплификация.
14. Метод, при който флуоресцентно белязаните комплементарни олигонуклеотида се закачат за съответни олигонуклеотиди, съдържащи флуоресцентен маркер.
15. Метод съгласно претенция 14, при който комплементарният олигонуклеотид е свързан с флуоресцеин.
16. Метод съгласно претенция 14, при който олигонуклеотидът се свързва с ензим или катализатор, с помощта на който се получават флуоресцентно белязани видове и, преди да се изследва флуоресценцията чрез детектора на бързопреходни вълни, се добавя субстрат за този ензим или катализатор.
17. Метод, при който, както е посочено в предходните претенции, материалът се третира предварително с рестрикционни ендонуклеази, за да се отцепи съответната РНК или ДНК.
18. Метод съгласно предходните претенции, при който комплементарните или иден9 тични олигонуклеотиди се подбират независимо една от друга с дължини между 5 и 30 бази.
19. Метод съгласно претенция 18, при който за предпочитане е олигонуклеотидите да са с дължина между 10 и 25 бази.
20. Метод съгласно претенция 19, при който за предпочитане е олигонуклеотидите да са с дължина между 15 и 20 бази.
21. Експериментален кит за прилагане на метода съгласно претенциите 1, 2, 3, 4, 14, 15, 16 или 17, съдържащ олигонуклеотид, комплементарен на част от известна олигонуклеотидна секвенция от РНК или ДНК в изследвания материал, идентифицирана и/или количествено определена, имобилизирана върху повърхността на вълновод, свързан с детектор на бързопреходни вълни, и флуоресцентно интеркалиращо багрило.
22. Експериментален кит за осъществяване на метода съгласно претенциите 1, 3, 4, 5, 8, 14, 15, 16 или 17, съдържащ олигонуклеотид, комплементарен на част от известна олигонуклеотидна секвенция на ДНК или РНК от изследвания материал, идентифицирана и/ или установена, имобилизирана на повърхността на вълновод, свързан с детектор на бързоп- реходни вълни, и флуоресцентен олигонуклеотид, комплементарен на цялата или на част от известната секвенция.
23. Експериментален кит за осъществяване на метода съгласно претенциите 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 14, 15, 16 или 17, който кит се състои от олигонуклеотид, комплементарен на известната олигонуклеотидна секвенция от РНК или ДНК от изследвания материал, изследван и/или регистриран, имобилизиран на повърхността на вълновод, свързан с детектор на бързопреходни вълни, и от флуоресцентно белязан олигонуклеотид, идентичен с цялата или с част от известната секвенция.
24. Експериментален кит за приложение във всеки един метод от претенциите от 1 до 20, съдържащ олигонуклеотиди, комплементарни на цялата или на част от известните олигонуклеотидни секвенции на РНК или ДНК от изследвания материал, идентифициран и/ или определен количествено, заедно с реагентите, необходими за имобилизирането им към вълновод, свързан с детектор на бързопреходни вълни.
BG98660A 1991-09-16 1994-03-15 Биосензорен метод на базата на генна сонда BG62337B1 (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB919119735A GB9119735D0 (en) 1991-09-16 1991-09-16 Gene probe biosensor method
PCT/GB1992/001698 WO1993006241A1 (en) 1991-09-16 1992-09-16 Gene probe biosensor method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG98660A BG98660A (bg) 1995-03-31
BG62337B1 true BG62337B1 (bg) 1999-08-31

Family

ID=10701461

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG98660A BG62337B1 (bg) 1991-09-16 1994-03-15 Биосензорен метод на базата на генна сонда

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5750337A (bg)
EP (1) EP0604506B1 (bg)
JP (1) JP3324607B2 (bg)
KR (1) KR100249288B1 (bg)
AT (1) ATE174968T1 (bg)
AU (1) AU665369B2 (bg)
BG (1) BG62337B1 (bg)
CA (1) CA2116239C (bg)
CZ (1) CZ286927B6 (bg)
DE (1) DE69227997T2 (bg)
DK (1) DK0604506T3 (bg)
ES (1) ES2125272T3 (bg)
FI (1) FI108463B (bg)
GB (2) GB9119735D0 (bg)
GR (1) GR3029722T3 (bg)
HU (1) HU218596B (bg)
NO (1) NO315380B1 (bg)
RU (1) RU2116349C1 (bg)
SK (1) SK280713B6 (bg)
WO (1) WO1993006241A1 (bg)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993020240A1 (en) * 1992-04-06 1993-10-14 Abbott Laboratories Method and device for detection of nucleic acid or analyte using total internal reflectance
WO1995026416A1 (en) * 1994-03-25 1995-10-05 Research Corporation Technologies, Inc. Nucleic acid biosensor diagnostics
US5599668A (en) * 1994-09-22 1997-02-04 Abbott Laboratories Light scattering optical waveguide method for detecting specific binding events
EP0795032A2 (en) * 1994-12-22 1997-09-17 Abbott Laboratories Methods of immobilizing oligonucleotides to solid support materials and methods of using support bound oligonucleotides
US5690894A (en) 1995-05-23 1997-11-25 The Regents Of The University Of California High density array fabrication and readout method for a fiber optic biosensor
SE9502608D0 (sv) * 1995-07-14 1995-07-14 Pharmacia Biosensor Ab Method for nucleic acid senquencing
WO1997032212A1 (en) * 1996-03-01 1997-09-04 Beckman Instruments, Inc. System for simultaneously conducting multiple ligand binding assays
US5832165A (en) * 1996-08-28 1998-11-03 University Of Utah Research Foundation Composite waveguide for solid phase binding assays
AU755913B2 (en) 1997-06-18 2003-01-02 Masad Damha Nucleic acid biosensor diagnostics
DE19730359A1 (de) * 1997-07-15 1999-01-21 Boehringer Mannheim Gmbh Integriertes Verfahren und System zur Amplifizierung und zum Nachweis von Nukleinsäuren
DK1017848T3 (da) * 1997-07-28 2003-02-10 Medical Biosystems Ltd Nucleinsyresekvensanalyse
GB2335035B (en) * 1998-03-03 2003-05-28 Brax Genomics Ltd Screening for functional antisense agents
GB9805935D0 (en) * 1998-03-19 1998-05-13 Ciba Geigy Ag Organic compounds
EP0957354A3 (en) * 1998-03-20 2000-03-22 IA Inc. Method and apparatus for measuring binding between biological molecules
US6429023B1 (en) 1998-07-20 2002-08-06 Shayda Technologies, Inc. Biosensors with polymeric optical waveguides
DE60045059D1 (de) * 1999-04-20 2010-11-18 Nat Inst Of Advanced Ind Scien Verfahren und Sonden zur Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäure-Molekülen und Verfahren zur Analyse der gewonnenen Daten
RU2182708C2 (ru) * 2000-04-17 2002-05-20 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Способ множественного параллельного скрининга специфичности связывания биологически активных соединений с нуклеиновыми кислотами с использованием биочипа (варианты)
US7205347B2 (en) * 2000-10-19 2007-04-17 Trans Photonics, Llc. Substituted-polyaryl chromophoric compounds
AR031640A1 (es) * 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
US6597499B2 (en) 2001-01-25 2003-07-22 Olympus Optical Co., Ltd. Total internal reflection fluorescence microscope having a conventional white-light source
RU2194761C2 (ru) * 2001-03-15 2002-12-20 Гематологический научный центр РАМН Способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения днк методом конкурентной полимеразной цепной реакции
US20040241699A1 (en) * 2001-10-04 2004-12-02 Giovanni Zocchi Detection of polynucleotide hybridization
RU2206615C1 (ru) * 2001-10-22 2003-06-20 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Способ частичного секвенирования днк для определения мутаций в коротких фрагментах одноцепочечной днк с использованием микрочипа
DE102004016247A1 (de) * 2004-04-02 2005-10-20 Chromeon Gmbh Feste Trägersysteme zum homogenen Nachweis von Wechselwirkungen von Biomolekülen ohne Waschschritte
RU2270254C2 (ru) * 2004-04-30 2006-02-20 Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук Способ идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа
US20060088844A1 (en) * 2004-10-22 2006-04-27 Honeywell International Inc. Real-time PCR microarray based on evanescent wave biosensor
RU2315999C2 (ru) * 2004-11-24 2008-01-27 Александр Иванович Арчаков Нанодиагностическая тест-система для выявления вируса гепатитов
GB0522310D0 (en) * 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
GB0524069D0 (en) * 2005-11-25 2006-01-04 Solexa Ltd Preparation of templates for solid phase amplification
JP5429962B2 (ja) * 2006-03-16 2014-02-26 国立大学法人秋田大学 核酸検出方法及び核酸検出キット
EP2021503A1 (en) * 2006-03-17 2009-02-11 Solexa Ltd. Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays
US7824902B2 (en) * 2006-11-03 2010-11-02 Mark Selker Optical interface for disposable bioreactors
EP1935496A1 (en) 2006-12-22 2008-06-25 Eppendorf Array Technologies SA Device and/or method for the detection of amplified nucleotides sequences on micro-arrays
WO2008092291A1 (en) * 2007-01-17 2008-08-07 Honeywell International Inc. Microarray reader based on evanescent wave detection and method of reading a microarray
WO2008093098A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
WO2009079856A1 (en) * 2007-12-24 2009-07-02 Honeywell International Inc. A programmable oligonucleotme micro array
US9480982B2 (en) * 2007-12-24 2016-11-01 Honeywell International Inc. Reactor for the quantitative analysis of nucleic acids
JP5542067B2 (ja) 2008-02-04 2014-07-09 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ エバネセント照射及び蛍光に基づく分子診断システム
WO2011088588A1 (en) 2010-01-20 2011-07-28 Honeywell International, Inc. Reactor for quantitative analysis of nucleic acids
WO2013003849A2 (en) * 2011-06-30 2013-01-03 Bioquanta Sa Process and apparatus for quantifying nucleic acid in a sample
JP6997775B2 (ja) * 2016-10-27 2022-01-18 バナディス ダイアグノスティクス ローリングサークル増幅産物を処理する方法
EP3930576A1 (en) * 2019-03-01 2022-01-05 Vidya Holdings Ltd Improvements in or relating to an optical element

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1180647A (en) * 1981-07-17 1985-01-08 Cavit Akin Light-emitting polynucleotide hybridization diagnostic method
US4582809A (en) * 1982-06-14 1986-04-15 Myron J. Block Apparatus including optical fiber for fluorescence immunoassay
EP0144914A3 (en) * 1983-12-12 1986-08-13 Miles Inc. Hybridization assay employing labeled pairs of hybrid binding reagents
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5242797A (en) * 1986-03-21 1993-09-07 Myron J. Block Nucleic acid assay method
EP0245206A1 (en) * 1986-05-05 1987-11-11 IntraCel Corporation Analytical method for detecting and measuring specifically sequenced nucleic acid
BE1000572A4 (fr) * 1987-05-20 1989-02-07 Block Myron J Cellule rta, appareil et procede pour titrer un polynucleotide dans un liquide.
AU622426B2 (en) * 1987-12-11 1992-04-09 Abbott Laboratories Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
GB8902689D0 (en) * 1989-02-07 1989-03-30 Ici Plc Assay method
GB8910880D0 (en) * 1989-05-11 1989-06-28 Amersham Int Plc Sequencing method
GB8919411D0 (en) * 1989-08-25 1989-10-11 Amersham Int Plc Assay method
CA2032203C (en) * 1989-12-29 2009-05-19 Christine L. Brakel Amplification capture assay
EP0478319B1 (en) * 1990-09-28 1997-04-02 Kabushiki Kaisha Toshiba Gene detection method
USH1398H (en) * 1990-12-28 1995-01-03 Campbell; James R. DNA-based fluourescent sensor

Also Published As

Publication number Publication date
CZ52194A3 (en) 1994-07-13
HU218596B (hu) 2000-10-28
AU665369B2 (en) 1996-01-04
NO315380B1 (no) 2003-08-25
ATE174968T1 (de) 1999-01-15
FI108463B (fi) 2002-01-31
JP3324607B2 (ja) 2002-09-17
EP0604506B1 (en) 1998-12-23
HU9400770D0 (en) 1994-06-28
AU2564192A (en) 1993-04-27
KR100249288B1 (ko) 2000-04-01
DE69227997D1 (de) 1999-02-04
GB2274710A (en) 1994-08-03
RU94019336A (ru) 1996-09-27
WO1993006241A1 (en) 1993-04-01
CA2116239A1 (en) 1993-04-01
GB9119735D0 (en) 1991-10-30
DE69227997T2 (de) 1999-05-12
GR3029722T3 (en) 1999-06-30
GB2274710B (en) 1995-09-06
CA2116239C (en) 2008-11-18
HUT68771A (en) 1995-07-28
CZ286927B6 (cs) 2000-08-16
JPH06510670A (ja) 1994-12-01
US5750337A (en) 1998-05-12
NO940901L (no) 1994-05-16
SK30694A3 (en) 1994-07-06
BG98660A (bg) 1995-03-31
ES2125272T3 (es) 1999-03-01
SK280713B6 (sk) 2000-06-12
EP0604506A1 (en) 1994-07-06
GB9402823D0 (en) 1994-04-27
FI941220A0 (fi) 1994-03-15
RU2116349C1 (ru) 1998-07-27
FI941220L (fi) 1994-03-15
DK0604506T3 (da) 1999-08-23
NO940901D0 (no) 1994-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG98660A (bg) Биосензорен метод на базата на генна сонда
Graham et al. Gene probe assays on a fibre-optic evanescent wave biosensor
KR100809171B1 (ko) 염기서열 결정법
EP0914467B1 (en) Method for nucleic acid analysis
JP2825976B2 (ja) 均質検定システム
US6908736B1 (en) DNA sequencing method
CN113564158B (zh) 一种DNA引物、包括该引物的CRISPR/Cas12a系统及试剂盒
Vo-Dinh et al. Development of a multiarray biosensor for DNA diagnostics
EP3899035B1 (en) Detection of target nucleic acid by solid-phase molography
WO1995023245A1 (en) Real time in-gel assay
JP3705499B2 (ja) ターゲット核酸断片の分析方法及びターゲット核酸断片の分析キット
JPH09168400A (ja) 核酸の定量方法
CN118159666A (zh) 核酸检测
CN118272500A (zh) 基于CRISPR/Cas12a与AlphaLisa联用的DNA检测分析方法
JP4398062B2 (ja) 転写調節因子とｄｎａの結合を検出するための蛍光プローブおよび転写調節因子とｄｎａの結合を検出する方法
KR20200042511A (ko) 핵산을 분석하기 위한 방법 및 장치
JPH06261800A (ja) Ｒｎａウィルスの検出方法
CN111172236A (zh) 一种基于以碱性磷酸酶为开关的路径选择器的碱性磷酸酶测定方法、试剂盒及其应用