BG98660A

BG98660A - Биосензорен метод на базата на генна сонда

Info

Publication number: BG98660A
Application number: BG98660A
Authority: BG
Inventors: David Squirrell
Original assignee: The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majestry's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Nor
Priority date: 1991-09-16
Filing date: 1994-03-15
Publication date: 1995-03-31
Also published as: CZ52194A3; HU218596B; AU665369B2; NO315380B1; BG62337B1; ATE174968T1; FI108463B; JP3324607B2; EP0604506B1; HU9400770D0; AU2564192A; KR100249288B1; DE69227997D1; GB2274710A; RU94019336A; WO1993006241A1; CA2116239A1; GB9119735D0; DE69227997T2; GR3029722T3

Abstract

Изобретението се отнася до метод за установяване,идентифициране и/или количествено определяне на свободна рнк или днк, както и на такава от растителни и животински клетки и микроорганизми, и до детекторна апаратура, адаптирана за осъществяване на метода. Използва се главно тоталната вътрешна флуоресценция на отражение за измерване на хибридизацията на анализираните рнк или днк с рнк или днк с вълноводен детектор на затихваща вълна.

Description

Биосензорен метод на базата на генни проби

Настоящото изобретение касае метод за установяване, идентифициране и/или количествено определяне на свободна РНК или ДНК, както и такава от растителни или животински клетки и микроорганизми , както и за реагенти и апаратура за провеждане на тези изследвания. Този метод използува главно тотална вътрешна флуоресценция на отражение (ТВфО) за измерване на хибридизация на изследваната РНК или ДНК с РНК- или ДНК-свързани вълновод и детектор на краткотрайни (бързопреходни) вълни.

Тези методи, в основата на които лежи хибридизация на нуклеиновите киселини, са всъщност една алтернатива на имунологичните методи за установяване и идентификация на техните мишени може да се контролира много по-лесно отколкото, когато се използват методи, базирани на белтъчно свързване. Използуваните досега техники на базата на генни проби са бавни. Необходими са от часове до дни за да се получи даден резултат. Биосензорите предлагат алтернативен път за бързо получаване на резултати (Evans & Charles, 1990, Abstracts of 1st World Congress of DNA probes and immunoassay; PollardKnight et al. 1990, Ann. Biol. Chem. 48,642-646).

Краткотрайни (бързопреходни) вълнови биосензори, които се базират на явлението ТВфО (Sutherland & Dahne, 1987, J. Immunol. Meth. 74, 253-265) са били използвани с белтъци като елемент за биологично разпознаване. Антитела са били използвани за установяване свързването на флуоресцентнобелязан антиген (Elderfrawi et al. 1991, Biosensors & Bioelectronics 6,507-516) използвайки ацетилхолинови рецептори за изучаване свързването па ацетилхолина с холинестеразни инхибитори. Други изследователи (Poglitsch & Thompson, 1990, Biochemistry 29,248-254) са измервали свързването на антитела с Fc епитопи. Настоящото изобретение представлява метод за провеждане на изследвания, използувайки генни сонди с биосензор за краткотрайни (бързопреходни) вълни и осигурява един ТВфО вълновод, който прави този метод използваем в съответни биосензорни съоръжения.

Детекторите на бързопреходни вълни се базират на ТВфОявления като обезпечават чувствителни методи за регистриране на реакции на повърхността на вълновода.

Вълноводът може да приема различни форми, но типично той е призмовиден или нишковиден. Реакцията, която се използува за измерване на молекулата-мишена, може да се наблюдава, например, чрез измерване на промените във флуоресценцията при свързване или отделяне на флуоресцентни сонди или чрез генериране на флуоресцентни видове по ензимен или химичен път.

Няколко патенти са били публикувани, които покриват използването на краткотрайни вълнови детектори с имунологични системи като биологичен елемент (например US 4582809), но съществуващите ограничения в имунологичните реагенти не позволяват да се използуват всички възможности на използвания сензор.

Настоящото изобретение осигурява метод за установяване, идентификация и/или количествено определяне на свободна ДНК или РНК, както и такива от растителни или животински тъкани, микроорганизми и съдържащ:

(i) обезпечаване на олигонуклеотид, комплементарен на цялата или на част от олигонуклеотидната секвенция, характерна за РНК или ДНК в материала, имобилизирана на повърхността на вълновод към детектор на краткотрайни вълни.

(п) поставяне на имобилизирания олигонуклеотид от етап (i) в контакт с пробата (съдържаща ДНК или РНК) при условия, при които ДНК или РНК, имащи съответната олигонуклеотидна секвенция, ще хибридизират с него.

(iii) асоцииране на имобилизирания олигонуклеотид от етап (i) или нуклеотидния материал от пробата с флуоресцентен агент, преди, по време и след завършването на хибридизацията с ДНК или РНК, както е описано в етап (п), така че флуоресцентния агент се оказва свързан с хибридизирания продукт, но не и с нехибридизирания имобилизиран олигонуклеотид.

(iv) измерване на флуоресцентния агент свързан съгласно етап (iii) чрез детектор за краткотрайни вълни и съпоставяне на получените резултати с вида и количеството на материала.

В един от вариантите на настоящото изобретение флуоресцентния агент е всъщност флуоресцентно интеркалиращо багрило, което е в състояние да се инкорпорира в продукта на хибридизация. В този случай, багрилото не се свързва с нехибридизираните имобилизирани олигонуклеотиди. Такъв метод за определяне наличието на хибридизиран продукт се използува отлично при достатъчно дълги имобилизирани секвенции, при които може да се получи специфична хибридизация. Изследваната проба може да има непроменено съдържание на ДНК/РНК или може да бъде обогатена чрез специфична секвенциална амплификация чрез т.н. полимеразна верижна реакция (PCR) или лигазна верижна реакция (LCR).

В един втори вариант на метода, флуоресцентния агент е всъщност флуоресцентен олигонуклеотид, който е в състояние да се хибридизира с наличната секвенция или се явява като специфичен секвенциален амплификатор-праймерщапример като PCR-праймер, в резултат на което се получава флуоресцентно установим амплификационен продукт.

В един подобрен подвид на втория вариант, използващ олигонуклеотиди, този метод дава възможност за установяване, идентификация и/или количествено определяне на материал подбран от растителни и животински тъкани, микроорганизми или свободни РНК или ДНК и се състои от:

(i) осигуряване на олигонуклеотид, комнлементарен на част от олигонуклеотидната секвенция на РНК или ДНК на изследвания материал, имобилизиран върху вълновода към детектор на бързопреходни вълни.

(й) осигуряване флуоресцентен олигонуклеотид, комплементарен на цялата или на част от остатъка на известната секвенция.

(iii) осъществяване на контакт между имобилизирания олигонуклеотид от (i) и разтвор, съдържащ изследвания материал или ДНК/РНК-материал при условия, при които олигонуклеотидната секвенция ще хибридизира с него.

(iv) заместване на разтвора съдържащ материала от (iii) с разтвор, съдържащ флуоресцентен комплементарен олигонуклеотид от (й) и (ν) измерване количеството на свързания флуоресцентен олигонуклеотид с помощта на кратковременния вълнов детектор на бързопреходни вълни и съпоставянето му с идентичността и/или количеството на изследвания материал.

В една подобрена модификация настоящото изобретение предлага метод за установяване, идентификация и/или количествено определяне на свободни РНК или ДНК, както и такива от растирелни и животински тъкани или 'микроорганизми и състоящ се от:

(i) осигуряване на олигонуклеотид, комплементарен на част от дадена олигонуклеотидна секвенция характерна за РНК или ДНК на изследвания материал, имобилизиран върху вълновод към детектор на бързопреходни вълни;

(й) осигуряване на флуоресцентен олигонуклеотид, идентичен с целия или с част от остатъка на дадена характерна секвенция;

(iii) провеждане на специфична реакция за секвенциална амплификация върху изследвания материал, използвайки флуоресцентния олигонуклеотид от етап (п), като един от праймерите за амплификация на присъстващата секвенция, докато инкорпорира флуоресцентния агент, (iv) поставяне в контакт на имобилизирания комплементарен олигонуклеотид от етап (i) с реакционната среда от етап (iii) при условия, при които е възможна хибридизация между амплифицирания продукт и имобилизирания олигонуклеотид, (ν) измерване на флуоресцентния олигонуклеотид, хибридизиран с имобилизирания олигонуклеотид чрез детектор на краткотрайни вълни и съпоставяне на резултатите с количеството на амплифицирания материал, който първоначално е присъствал в пробата.

За предпочитане е специфична амплификационна реакция на етап (iii) да е полимеразната верижна реакция, но е възможно да бъдат използвани и други подобни реакции като например лигазната верижна реакция.

Във всички варианти на изобретението вълновода се разполага в температурно контролирана среда - например камера с регулируема температура, така че точността на хибридизация на комплементарните секвенции и съответните РНК и ДНК може да бъде контролирана или така че PCR, хибридизацията и удължаването да могат да бъдат проведени.

флуоресцентните олигонуклеотиди могат да бъдат в различни форми - например като олигонуклеотид, свързан с флуоресцентен маркер или с ензим, способен да генерира флуоресцентен агент.

Комплементарна секвенция от етап (i) може да е достатъчно дълга за да се свърже специфично с мишената РНК или днк, оставайки достатъчно несвързани секвенции от мишенните РНК или ДНК за да се свържат с олигонуклеотида от етап (iii). Обикновенно имобилизираната секвенция обхваща около половината от дължината на секвенцията-мишена, но увеличението дължината на последната би позволило да се използуват по-малки пропорции.

Добре е имобилизираният олигонуклеотид да е комплементарен на дадена секвенция в единия край на секвенцията мишена, докато флуоресцентната секвенция е комплементарна на дадена секвенция в другия край. Рестрикционните ендонуклеази могат V да бъдат използвани преди хибридизация с цел да се отреже (отцепи) РНК или ДНК от пробата за да има по-добър достъп до тези краища. Аналогично, във втория вариант изследваната секвенция трябва само да бъде достатъчно дълга за да може да се използва като PCR праймер. Във всички случаи предпочитаната дължина е 5-30 бази - най добре 15-20 бази.

В процеса на работа става ясно, че комплементарните секвенции може да не са комплементарни за всяка двойка бази подлежащи на хибридизация. Следователно, опитният експериментатор бързо ще определи ограниченията за статистически допустимо използване на несъответстващи олигомери (например при 90% комплементарни секвенции).

Изискванията за точна комплементарност може да варира в зависимост от уникалността на изследваните секвенции. Така например, за една секвенция, която има висок % общи бази с други потенциално присъстващи секвенции е необходима попълна комплементарност отколкото при секвенции, които се различават по-рязко. Следователно, когато изучаваната секвенция не е напълно изучена или варира, опитният

Star

експериментатор може да определи статистически приемливи олигомери за стъпки (i) и (ш).

Един втори аспект на това изобретение е, че то може да се използва като опитен кит при метод състоящ се от:

(1) олигонуклеотид, комплементарен на цялата или част от олигонуклеотидната секвенция характерна за РНК или ДНК в изследвания материал и (2) флуоресцентно - определяем олигонуклеотид комплементарен или идентичен с част или с цялата секвенция. Един трети аспект на изобретението се състои в това, че се предлага един удобен за използване вълновод към биосензор за затихващи вълни, един олигонуклеотид, който е комплементарен на цялата или на част от олигонуклеотидната секвенция, която е характерна за РНК или ДНК в изследвания материал. Експериментални китове, съдържащи такива вълноводи, могат да се предложат за използване, както е споменато в претенциите.

Като четвърти аспект на това изобретение може да се посочи, че се предлага един детектор на затихващи вълни, съдържащ вълновод, който има имобилизиран върху повърхността си един олигонуклеотид, който е комплементарен на цялата или на част от олигонуклеотидната секвенция характерна за РНК или ДНК в изследвания материал. Този вълновод може да бъде призма, плочка или нишка.

Чрез предлаганото изобретение могат да се изследват едновременно повече от една нуклеотидна секвенция чрез използване на повече от един тип имобилизирани нуклеотиди и свързани флуоресцентни реагенти.

Предимства на този метод пред имунологичните изследвания:

(a) по-плътна опаковка на имобилизирания компонент на повърхността на вълновода, което позволява по-голяма чувствителност и прави конструкцията на мултиспецифичните повърхности по-лесна.

(b) свързването между анализираната проба и имобилизираните олигонуклеотиди може да се регулира чрез напасване на условията за хибридизация и дължините на олигонуклеотидите, като по този начин се постига фина регулация на специфичността и чувствителността на даден анализ.

(c) имунологичните опити се ограничават от достъпността на реагентите, тяхната стабилност, антигенна вариабилност, от маскирането на антигенните места и дисоциационните константи на комплексите антитяло/антиген. Нашето изобретение няма нито един от изброените проблеми.

(d) флуоресцентните имунологични постановки се влияят от замърсявания от средата, докато по-високите температури, необходими при нашия метод (над 60 °C в сравнение с 37 °C) намаляват нежеланата адсорбция на контаминанти на повърхността на детектора.

(e) като резултат от по-ниските дисоциационни константи, получени при комплексите на нуклеиновите киселини в сравнение с имунните комплекси, може да се реализира на практика цялата чувствителност на метода на затихващите вълни.

Изследваните проби могат да се намират в средата (например свободни РНК или ДНК олигонуклеотиди) или може да са претретирани например, с методи лизиращи клетките, с амплифициране или концентриране на ДНК/РНК (например

PCR) или c рестриктази за да се получат олигонуклеотиди с подходяща дължина.

Възможностите на метода и установката на предлаганото изобретение ще бъдат илюстрирани чрез следните фигури и опити:

фиг. 1. Показва главните елементи на детектора на бързопреходната затихваща вълна, използван в Примерите.

фиг. 2. Показва отношението волтаж/време, получено при хибридизация на флуоресцеин-белязан 20-mer с комплементарна секвенция, ковалентно свързана с оптичен нишков вълновод.

фиг. 3. Показва кривата концентрация/ответна реакция, показваща специфична хибридизация между комплементарен и контролен олигонуклеотиди; сигнал (mV/min) срещу концентрация на олигомера в пМ.

фиг. 4. Показва ефекта на скоростта на изтичане на разтвора на пробата в камера с контролирана температура, съдържаща вълновода за хибридизационния сигнал, сигнала (mV/min) и се чертае срещу скоростта (ml/min).

фиг. 5. Показва влиянието на температурата върху скоростта на хибридизация, сигнал (mV/min) се изчертава срещу температурата за 50 ng/ml проба, белязан с флуоресцеин 20-mer.

фиг. 6. Показва pH профила на олигонуклеотидната хибридизация върху оптичен нишков вълновод; сигнал (mV/min) срешу pH.

фиг. 7. Показва свързването на 8 пМ разтвор на олигомери комплементарни на проксималния или дисталния краища на ковалентно-свързан 204-базов олигонуклеотид.

фиг. 8. Показва диаграмна схема на молекулни бази на два от вариантите на метода в настоящето изобретение.

Методи

Тъй като олигонуклеотидите са дълговерижни молекули с дължина, която може да се сравнява с дълбочината на бързозатихвагците вълнови зони, бяха проведени изследвания, при които се хибридизират къси, флуоресцеин-белязани олигонуклеотиди към един от краищата на 204-базов олигомер, фрагмент, амплифициран от ген на Bacillus anthracis, с цел да се изучи влиянието на дължината на пробата върху сигнала.

Материали

Глутаралдехид 3-аминопропил триетоксисилан (APTS), Tween 20, Ficoll, формамид, поливинил пиролидон, говежда серумен албумин V (BSA), стерптавидин белязан с пероксидаза от хрян (HRP-SA), 2,2-азино-бис(3-етилбензтиазолин-6-сулфонова киселина) (ABTS), натриев хлорид и тринатриев циграт (Sigma Chemical Company, Pool, UK). Натриев дахидроген ортофосфат, двунатриев хидроген фосфат, натриев додецилсулфат (SDS), солна киселина, ацетон (BDH, Poole, UK).

Амониев хидроокис беше купен от Aldrich, Gillingham, Dorset, UK, а етанол от Hayman LTD, Witham, Essex, UK.

Стрептовидин имобилизиран на агарозни зърна беше купен от Pierce & Wasriner, Chester, UK.

Синтетични ДНК-олигонуклеотиди с Сб-свързан флуоресцеин, амино- или биотин-модифицирани краища бяха купени от British Bio-Technology, Ltd, Abingdon, UK (изброени на табл. 1).

Таблица 1 Използвани олигонуклеотиди (5' към 3') ID No Секвеиция

4946	CACGTTGTGGACTGTTTGGA-амино
4947	TCCAAACAGTCCACAACGTG-флуоресцеин
4949	СААСАСАССТТААСАС-амино
4950	GTGTTAAGGTGTGTTG-флуоресцеин
5453	aMHHo-CTTTAA.TTGTCGCGAGTGTT
5805	флуоресцеин-AACACTCGCGACAATTAAAG
6097	биотин-AATTCAAGTACGGTCGCAAT
5452	флуоресцеин-AATTCAAGTACGGTCGCAAT

Установката за оптични фибри за бързопреходни вълни (прототип Nol9) и 1 mm х 65 mm кварцови оптични нишки бяха купени от ORD, North Salem, New Hampshire, USA (виж фиг. 1).

Един 6-ватов тунгстенов филаментен източник (1) обезпечава светлина, която минава през три лещи (2), между които има 485 nm син филтър (3) и 0.8 mm точковидна маска (4), намираща се пред устройство, регулиращо лъчите (5) и насочващо светлината през фокусиращи лещи (6) и към вълново да (7). флуоресцентната светлина емитирана от някакъв хибридизиран или интеркалиран флуоресцентен материал се пренасочва навън от вълновода (7) чрез лещите (6) и преминава към 530 nm зелен филтър (8). Оттук светлинния лъч преминава през затварящото устройство (9) и през фокусиращи лещи (10) към детектора (11), свързан с измерващо устройство - волтметър (непоказан на схемата).

Волтметъра е свързан с рекордер, модел фармация 482. Оптичните фибри се съхраняват в стъклени капилярни тръби с капачки от неръждаема стомана. Температурата се корегира чрез циркулираща вода от водна баня през стъклен кожух.

Температурата се следи чрез термодвойки

почистват и се свързват ковалентно с глутаралдехид по метода на Tigssen (1985), Практика и теория на ензимните имунологични изследвания, стр. 322 до 323, том 15., Лабораторни техники в Биохимията и Молекулярната биология, Ed. Burdon and Van Knippenburg, Изд. Elsevier.

фибрите се третират с 2% пазтвор на APTS в ацетон за 24 часа на стайна температура, мият се с ацетон, сушат се при 50 °C, потопяват се в 1% глутаралдехид във вода за 1 час, изплакват се с PBS и се оставят за една нощ при 4 °C в 4 μτ/мл разтвор на олигонуклеотида с аминотерминал. За да се проведе опита, оптичната нишка с имобилизиран олигонуклеотид се промива с дейонизирана вода, подсушава се и се поставя в камерата за изследване. След оптимизиране, бяха използвани условията описани от Андерсон и Янг (1985) Хибридизация на нуклеиновите киселини - практически подход: Изд. Хеймс и Хигинс; IRL Press, Oxford, стр. 73-111 при температура 65 °C.

Прехибридизационен разтвор (200 ml 20xSSC, 50 ml ЮОх разтвор на Denhard, 50 ml 0.1 М фосфатен буфер и 1 ml Tween 20, 600 ml стерилна дейонизирана вода, pH 6.8) се вкарва чрез перисталтична помпа в камерата при скорост 0.5 ml/min. до получаване на стабилна базова линия. Добавя се белязания с флуоресцеин олигонуклеотид при същата скорост. След няколко минути температурата се повишава на 80 °C. След 10-15 min целият свързан олигонуклеотид се десорбира и температурата се понижава до 65 °C.

Първоначално се закачат само къси олигонуклеотиди (16-20 mer) към нишките. За да се изследва възможността за използване на по-дълги проби, беше синтезиран 204-mer с амино-край, използвайки PCR върху секвенцията-мишена с един праймер от 20-mer, белязан накрая с биотин олиго. 1222.

Неинкорпорирания амино-белязан праймер беше премахнат чрез стрептавидин имобилизиран върху агарозни зърна, за да се извлече двойно-верижния продукт от полимеразната верижна реакция, от неинкорпорирания праймер с аминокрай. Аминобелязаната 204-базова верига беше освободена от комплементарната верига и от агарозните зърна чрез нагряване С на 95 ОС за 10 мин., следвано от бързо охлаждане с лед и премахване на зърната чрез центрофугиране. Количеството на получения 204-mer беше достатъчно за приготвяне на 0.85 мкг/мл разтвор за свързване на нишките.

Изследване на олигомерите.

При първоначални опити с 20-mer бяха използвани високи концентрации на контролните и изследваните олигонуклеотиди. 200 пМ разтвор на флуоресцеин-белязан контролен олигонуклеотид (олиго. 4950) се въвежда с 1 ml/min при 60 °C в камерата, съдържаща имобилизиран олиго .4946. Веднага се наблюдава изместване на базовата линия от 80 mV след което остава постоянно до въвеждането на прехибридизационен разтвор. Обратно, когато олиго 4947, който е комплементарен на олиго.4946, се въвежда при 160 пМ (1 ц§/т1) се наблюдава един постоянно увеличаващ се сигнал с начален наклон от около 350 mV/min. Достига се до плато след около 14 min, при 1,140 mV над базовата линия. За да се потвърди че свързването е специфично, беше показано, че контролния олиго 4950 се свързва към оптичната нишка с неговия комплимент олиго.4949, който е ковалентно свързан с повърхността.

Времето за хибридизация на 8 пМ флуоресцеин-белязан олиго 4947 към имобилизиран олиго 4946 е показано на фиг. 2. Кривата концентрация/отговор за флуресцеин-белязан олиго.4950, хибридизиращ с имобилизиран олиго.4949 /с олиго 4947 като контрола/, е показана на фиг. 3.

Наклона на кривата се измерва 1 min след като пробата влезе в камерата.

Резултатите от оптимизиране на условията са показани на фиг.

4-6. Ефектът на скоростта на изтичане се изследва с 50 ng/ml разтвор на олиго 4947. Резултатите са показани на фиг. 4. Зависимостта на скоростта на хибридизация от температурата и pH са показани на фиг. 5 и 6. Максимална скорост се наблюдава при 65 °C и pH 6.8.

Кривите на свързване на 50 пМ разтвор на флуоресцеинбелязани олигонуклеотиди, комплементарни на един от краищата на 204-базов олигонуклеотид ковалентно свързани с единия край на вълново да са показани на фиг. 7. И в двата случая се наблюдава бързо достигане до плато от 48mV (проксимално) и 56mV (дистално) след около 3 минути, следвано от понижение на сигнала, когато прехибридизационния разтвор беше въведен отново в камерата. Не беше наблюдавано свързване на олиго 4947 (като контрола) при концентрация 500пМ.

Отчитането е в наномолен диапазон с линейна връзка между наклона на кривата и концентрацията. Подобни резултати бяха получени и с имунологични опити.

Когато е необходима висока чувствителност на метода, може да се направят следните подобрения:

Белязаните олигомери се получават от олигонуклеотиди, белязани с множество флуорофори или се използват флуоресцентни проникващи багрила за установяване на хибридизацията.

Този метод може да се комбинира с техника за ДНКамплификация, като например PCR, което може да се проведе преди хибридизацията. Възможно е също така директно да се **<* проследи PCR реакцията като се използва биосензора. 60-те секунди, необходими за биосензора са на порядък по-бързи от конвенционалните опити, които се провеждат (Engelberg 1991, ASM, News 57, 4,183-186).

Бързото рециклиране на повърхността на детектора, чрез премахване на свързаните нуклеинови киселини посредством нагряване, решава един от главните проблеми на имунологичните тестове и с 60~те секунди, които са необходими, я прави удобна за военни и други критични ситуации, изискващи бърза идентификация. Някои оптични нишки могат да се w използват дори по няколко дни.

Използването и на 5' и на 3' - белязани олигонуклеотиди не повлия значително върху получените резултати. Олигонуклеотидите се свързваха или с проксималния или с дисталния край на 204 - базовия олигонуклеотид. Неговата дължина би могла да бъде от 70nm (използвайки стойността от

3.4 nm за дължина на стъпката на двойноверижната ДНК, която има по 10 бази на спирала), до 200 nm (използвайки разстоянията между повторенията -Ο-ΡΌ-С-С-С- по дължината на гръбнака на молекулата. Дълбочината на зоната на бързозатихващите вълни, дефинирана като разстояние, необходимо на интензитета на светлината да падне до 1/е от максималната си стойност, би могла да се определи на около ЮОпт. Тъй като се получават подобни сигнали при хибридизация на олигонуклеотиди, белязани с флуоресцеин на дисталния или на проксималния край (малко по-силен е сигнала при дисталните олигонуклеотиди:), ориентацията на дългите олигонуклеотидни вериги вероятно не е перпендикулярна на повърхността на вълновода.

Неголям брой от получените чрез PCR олигонуклеотиди (204mer) могат да се свържат с оптичните нишки, което води до ниска концентрация на олигонуклеотиди върху вълновода. Това обяснява бързото получаване на плато на получения сигнал (фиг. 7) в сравнение с постепенното усилване на сигнала, показано на фиг. 2, където имобилизираната проба е в много повисока концентрация. Ако трябва да се избира височината на платото пред скоростта на промяна на сигнала като мярка за свързване, то ограничаване на количеството на имобилизираната проба би позволило да се постигне по-бързо насищане.

Молекулната база на изобретението е илюстрирана на фигура 8, където 8а-с и 8d-f се отнасят до първия и втория предпочитани варианти на това изобретение. В 8а, една олигонуклеотидна секвенция (А), комплементарна на част от олигонуклеотидната секвенция характерна за дадената ДНК секвенция (В) беше имобилизирана върху вълновода към детектора на бърз опреходни вълни по описания по-горе начин. В 8Ь, имобилизираният олигонуклеотид се поставя в контакт с разтвор, съдържащ изследваните проби и ДНК-секвенцията (В), хибридизирана със секвенция (А) при условия подходящи за хибридизация. В 8с, пробата се заменя с разтвор, съдържащ флуоресцентно белязан олигонуклеотид (С), който е комплементарен на нехибридизирания остатък от олигонуклеотида-мишена също при условия, подходящо за хибридизация. При хибридизация се получава флуоресцентен сигнал, който преминава през вълновода и се регистрира от детектора.

В 8d, комплементарната секвенция (А) се имобилизира върху вълновода, както вече беше описано ; в 8е разтвора на пробата се третира в условията на PCR (полимеразна верижна реакция) с два праймера (D) и (Е) като всеки един от тях отговаря на една известна секвенция на един от двата края на секвенциятамишена (В).

Праймерът, предназначен за този край на секвенцията, който е противоположен на края, който се хибридизира с имобилизирания олигонуклеотид (А) е белязан с флуоресцеин и следователно продукта на тази реакция е флуоресцеин-белязана секвенция-мишена (F). В 8f имобилизираната секвенция (А) се поставя в контакт с пробата в условия за хибридизация, където флуоресцеин-белязаната секвенция (F) се хибридизира със секвенция (А) и получената флуоресценция се регистрира с детектора.

В един вариант на метода (фиг. 8), удобен за използване на PCR или друг специфичен амплификационен метод, имобилизирания олигонуклеотид (А) се подбира така, че да не може да се свърже с праймерите (D) и (Е). По този начин олигонуклеотидът (А') хибридизира с част от (F), разположен по-централно в секвенция (В), отколкото праймера (D), като краят (F), който няма флуорофор изглежда като на фиг. 8g.

Различните варианти на метода, в който е използувано интеркалиращото багрило, са проведени както е показано на фигури 8а и 8Ь като отделните етапи са проведени в присъствието или с допълнителната добавка на багрилото. Информация за подходящи флуоресцентни багрила и условия за техните взаимодействия има в следните източници:

Latt and Wolilleb; Chromosoma (Berl) 52, 297-316 (1975), Jorgensen et al. Chromosoma (Berl) 68, 287-302 (1987) and Jennings and Ridler, Biophysics of Structure and Mechanism 10. 71-79 (1983).

Claims

Патентни претенции

1. Метод за установяване, идентификация и/или количествено определяне на материал, подбран от растителна или животинска тъкан, микроорганизми или свободна РНК или ДНК, състоящ се от:

(i) получаване на олигонуклеотид, комплементарен на цялата или на част от една олигонуклеотидна секвенция от РНК или ДНК от съответен материал, имобилизиран на повърхността на w вълновод към детектор на краткотрайни (бързопреходни) вълни.

(й) поставяне на имобилизирания олигонуклеотид от етап (i) в контакт с разтвор, съдържащ пробата РНК или ДНК, в условия в които ДНК и РНК имащи известни нуклеотидни секвенции ще хибридизират с него.

(iii) свързване на имобилизирания олигонуклеотид от етап (i) или на нуклеиновата киселина от пробата с флуоресцентен агент, преди, по време или при завършване на хибридизацията с

....... ДНК или ДНК, получени от етап (п), така че флуоресцентния *** агент да се свърже с хибридизирания продукт, но не с нехибридизирания олигонуклеотид.

(iv) измерване на флуоресцентния сигнал индуциран от свързания флуоресцентен агент съгласно (iii) чрез детектор на краткотрайни вълни и отнасяне на този сигнал към присъствието, вида и количеството на материала.
2. Метод, в който може да се проведе специфична секвенционна амплификация в разтвор в контакт с вълновод, свързан с детектор на краткотрайни вълни.
3. Метод, в който (съгласно претенции 1 и 2) флуоресцентният агент е едно флуоресцентно интеркалиращо багрило, което може да бъде инкорпорирано в хибридизационния продукт, но не може да се свърже с нехибридизирани имобилизирани олигонуклеотиди.
4. Метод, в който (съгласно претенция 3) специфична секвенциална амплификация се прави чрез полимеразна верижна реакция (PCR) или чрез лигазна верижна реакция (LCR).
5. Метод, при който флуоресцентният агент представлява един флуоресцентно-белязан олигонуклеотид, който е в състояние да се хибридизира с известна олигонуклеотидна секвенция (от етап и)·
6. Метод, при който флуоресцентно-белязания агент е в състояние да действа като праймер, амплифициращ специфичната секвенция като при това се получава флуоресцентно установим амплифициран продукт, който може да се изследва, когато е хибридизиран с олигонуклеотида имобилизиран на вълновода.
7. Метод, при който амплифицирания праймер на специфичната секвенция е праймера на полимеразната верижна реакция (PCR).
8. Метод, който (съгласно претенции 1 и 5) се състои от:

(i) обезпечаване на олигонуклеотид, комплементарен на част от известна олигонуклеотидна секвенция от РНК и ДНК, имобилизиран върху повърхността на вълновод към апарат за бързопреходни вълни, (ii) обезпечаване на флуоресцентно установим олигонуклеотид комплементарен на цялата или на част от известна секвенция, (iii) поставяне на имобилизирания олигонуклеотид от (i) в разтвор съдържащ материала, който трябва да се изследва (или ДНК или РНК получени от този материал) в условия, при които известната олигонуклеотидна секвенция ще се хибридизира с нея.

(iv) заместване на разтвора, съдържащ материала от (iii) с разтвор, съдържащ флуоресцентния комплементарен олигонуклеотид от (й) и (ν) измерване на количеството свързан флуоресцентен олигонуклеотид чрез детектор на бързопреходни вълни и отнасяне на получения сигнал към присъствието, идентичността и/или количеството на изследвания материал в пробата.
9. Метод, който (съгласно претенции 1,6 или 7) се състои от:

(i) обезпечаване на олигонуклеотид, комплементарен на част от олигонуклеотидната секвенция на РНК или ДНК на изследвания материал, имобилизиран върху повърхността на вълновод към детектор на бързопреходни вълни, (п) обезпечаване на флуоресцентно-установим олигонуклеотид, идентичен на цялата или част от известната секвенция, (iii) провеждане на реакция, която амплифицира специфичната секвенция на проба от изследвания материал, използвайки флуоресцентно-белязания олигонуклеотид от етап (ii) като един от праймерите, с цел да се амплифицират съществуващите секвенции, (iv) поставяйки имобилизирания върху вълновода комплементарен олигонуклеотид от етап (i) в реакционната смес от етап (iii) при условия, при които ще протече хибридизация на амплифицирания продукт с имобилизирания олигонуклеотид, (ν) измерване на някакъв флуоресцентно-белязан олигонуклеотид, хибридизиран с имобилизирания олигонуклеотид, използвайки детектор на бързопреходни вълни и отнасяне на получения резултат към количеството на амплифицирания материал, присъстващ в пробата.
10. Метод, при който вълновода всъщност представлява призма, плочка или нишка.
11. Метод, при който вълновода е разположен в среда с контролирана температура.
12. Метод, при който както е посочено в претенция 11, средата представлява камера с регулирана температура.
13. Метод, при който температурата се контролира по такъв начин, че прецизността на хибридизация на комплементарните секвенции на изследваните РНК и ДНК може да бъде контролирана или да бъде оптимална за контролираното протичане на PCR, денатурация, хибридизация или амплификация.
14. Метод, при който флуоресцентно-белязаните комплементарни олигонуклеотиди се закачат за съответни олигонуклеотиди, съдържащи флуоресцентен маркер.
15. Метод, при който, съгласно претенция 14 комплементарният олигонуклеотид е свързан с флуоресцеин.
16. Метод, при който, както е посочено и в претенция 14, олигонуклеотида се свързва с ензим или катализатор, с помощта на който се получават флуоресцентно белязани видове и преди да се изследва флуоресценцията чрез детектора на бързопреходни вълни се добавя субстрат за този ензим или катализатор.
17. Метод, при който, както е посочено в предходните претенции, материалът се третира предварително с рестрикционни ендонуклеази за да се отцепи съответната РНК или ДНК.
18. Метод, при който, съгласно предходните претенции, комплементарните или идентични олигонуклеотиди се подбират независимо една от друга с дължини между 5 и 30 бази.
19. Метод, при който, съгласно претенция 18, за предпочитане е олигонуклеотидите да са с дължина между 10 и 25 бази.
20. Метод, при който, съгласно претенция 19, за предпочитане е олигонуклеотидите да са с дължина между 15 и 20 бази.
21. Експериментален кит за прилагане на метода съгласно претенции 1,2, 3,4,14,15,16 или 17, съдържащ:

А) олигонуклеотид, комплементарен на част от известна олигонуклеотидна секвенция от РНК или ДНК в изследвания материал, идентифицирана и/или количествено определена, имобилизирана върху повърхността на вълновод, свързан с детектор на бързопреходни вълни и

Б) флуоресцентно интеркалиращо багрило.
22. Експериментален кит за приложение на метода, съгласно претенции 1, 3, 4, 5, 8, 14, 15,16 или 17, съдържащ:

А) олигонуклеотид, комплементарен на част от известна олигонуклеотидна секвенция на ДНК или РНК от изследвания материал, идентифицирана и/или установена, имобилизирана на повърхността на вълновод, свързан с детектор на бързопреходни вълни и

Б) флуоресцентен олигонуклеотид, комплементарен на цялата или на част от известната секвенция.
23. Експериментален кит за приложение на метода, който съгласно претенции 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 14, 15, 16 или 17 се състои от:

А) олигонуклеотид, комплементарен на известната олигонуклеотидна секвенция от РНК или ДНК от изследвания материал, изследван и/или регистриран, имобилизиран на повърхността на вълновод, свързан с детектор на бързопреходни вълни и

Б) флуоресцентно белязан олигонуклеотид, идентичен с цялата или с част от известната секвенция.
24. Експериментален кит за приложение всяка една от претенциите 1-20, съдържащ олигонуклеотиди, комплементарни на цялата или на част от известните олигонуклеотидни секвенции на РНК или ДНК от изследвания материал, идентифициран и/или определен количествено, заедно с реагентите, необходими за имобилизирането им към вълновод, свързан с детектор на бързопреходни вълни.
25. Вълновод, подходящ за използване в биосензор на бързопреходни вълни, характерен с това, че съдържа имобилизиран на повърхността олигонуклеотид, който е комплементарен на цялата или на част от олигонуклеотидната секвенция на РНК или ДНК от изследвания материал.
26. Биосензорен детектор на бързопреходни вълни,за който е характерно това, че съдържа среда с контролирана температура, в която се намира вълновода на бързопреходни вълни, подходящ за контрол на хибридизацията и/или повлияващи температурните цикли на полимеразна верижна реакция (PCR).
27. Биосензорен детектор на бързопреходни вълни, съгласно претенция 26, характерен с това, че върху вълновода има имобилизиран олигонуклеотид, който е комплементарен на цялата или на част от нуклеотидната секвенция на РНК или ДНК, която трябва да се изследва, идентифицира и/или да се определи количествено.