JPH06510670A - 遺伝子プローブバイオセンサー法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子プローブバイオセンサー法 本発明は、植物若しくは動物組織、微生物または細胞を含まないＲＮＡ若しくは ＤＮＡの検出、識別及び／または定量法並びに前記方法を実施するために適用す る試薬及び検出装置に関する。本方法は特に、消失性液検出器導波管についたＲ ＮＡまたはＤＮＡへの被分析物質ＲＮＡまたはＤＮＡのハイブリダイゼーシヨン を測定する為に全内部鏡映蛍光［Ｔｏｔａｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｒｅｆｌｅｃ ｔｉｏｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ（ＴＩＲＦ）］を使用する。

核酸ハイブリダイゼーションを使用する遺伝子プローブアッセイは、生物学的物 質の検出及び識別に於けるイムノアッセイとは別の方法である。ターゲットに対 する遺伝子プローブの特異性は、タンパク質をベースとする結合現象を利用する 場合よりもずっと容易に制御可能で、ターゲット物質を予備増幅させるためにポ リメラーゼ連鎖反応で結合させると、非常に高い感度を得ることができる。遺伝 子プローブを使用する現行の技術では時間がかかり、結果を得るには数時間から 数口を要する。バイオセンサーは迅速な遺伝子プローブアッセイとは別経路を提 供するが、遺伝子プローブバイオセンサーアッセイに関する報告は、表面プラズ モン共鳴を利用する例しかない［Ｅｖａｎｓ　＆　Ｃｈａｒｌｅｓ（１９９０） ：Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　１ｓｔ　Ｗｏｒｌｄ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　 ＤＮＡ　ｐｒｏｂｅｓａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　；　Ｐｏｌｌａｒｄ− Ｋｎｉｇｈｔら、　（１９９０）＾ｎｎ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃ１１ｎ、　４８．６４２−６４６１゜検出にＴＩＲＦ現象を使用する消失性波 バイオセンサー［５ｕｔｈｅｒｌａｎｄ　＆　Ｄａｈｎｅ、（１９８７）　Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、７４．２５３−２６５］は、従来、生物学的識別 素子としてタンパク質を使用していた。アセチルコリンとコリンエステラーゼ阻 害剤の結合を研究するためにアセチルコリンレセプターを用いて蛍光−標識抗原 ［Ｅｌｄｅｆｒａｖｉら（１９９１）　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ　ｇｔ　Ｂｉｏ− ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、　６．５０７−５１６１の結合を検出するために抗体 を使用した。他のグループ［Ｐｏｇｌｉｔｓｃｈ　＆　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（１９ ９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２９．２４８−２５４１では、Ｆｃエピト ープに対する抗体の結合を測定した。

本発明は、消失性波バイオセンサーを使用して遺伝子プローブアッセイを実施す るための方法を提供し、且つ消失性波バイオセンサー装置内に組み込んで前記方 法を実施するために適用するＴＩＲＦ導波管を提供する。

消失性波検出器は、導波管の表面の反応を検出するための高感度な方法を提供す るためにＴＩＲＦ現象を活用する。導波管は種々の形を取り得るが、通常プリズ ム、スラブまたはファイバーである。ターゲット分子を測定するのに使用すべき 反応は、例えば、蛍光成分の結合若しくは脱着時の蛍光の変化または酵素若しく は化学的手段により蛍光成分の発生を測定することによりモニターし得る。幾つ かの特許では、生物学的センサ素子（例えば、米国特許第４５８２８０９号）と してイムノアッセイ系を用いる消失性波検出器の使用について開示しているが、 免疫試薬が個々に限定されており、活用すべきセンサーの性能が十分に得られな かった。

本発明は、 （ｉ）消失性波検出装置導波管の表面に固定化された、物質のＲＮＡまたはＤＮ Ａの特徴的なオリゴヌクレオチド配列の全体または一部に相補的なオリゴヌクレ オチドを提供し；（ｉｆ）特徴的なオリゴヌクレオチド配列をもつＤＮＡまたは ＲＮＡがこれにハイブリダイズする条件下で、段階（ｉ）の固定化オリゴヌクレ オチドをサンプルまたはこれから誘導したＤＮＡ若しくはＲＮＡ物質に暴露し； （坦）段階（ｉｆ）で提供されたＤＮＡ若しくはＩ？Ｎ＾との任意の／％イブリ ダイゼーション前、ハイブリダイゼーション中または完了時、蛍光検出可能な薬 剤がハイブリダイズ化生成物に結合するが、未ハイブリダイズの固定化オリゴヌ クレオチドには結合しないように、段階（ｉ）の固定化オリゴヌクレオチドまた はサンプルから誘導した核酸物質を蛍光検出可能な薬剤と結合させ： （汁）消失性波検出装置を使用して段階（伍）により結合した蛍光検出可能な薬 剤を測定し、物質の存在９．識別及び／または量とその量を関連させる 段階を含む、植物若しくは動物組織、微生物または細胞を含まないＲＮＡ若しく はＤＮＡから選択された物質の検出、識別及び／または定量方法を提供する。

本発明の１つの好ましい形では、蛍光検出可能な薬剤とは、ハイブリダイゼーシ ョン生成物の二重鎖に含まれ得る蛍光検出可能な挿入染料である。本方法のこの 形では、染料は未ハイブリダイズの固定化オリゴヌクレオチドに対して結合しな い染料である。ハイブリダイゼーション生成物の存在を検出するこのような方法 では、理想的には、使用するハイブリダイゼーション条件下で特異的なハイブリ ダイゼーションを提供するために十分な長さの固定化配列と共に使用する。この ようにして分析されたサンプルは、ＤＮＡ／ＲＮＡ含量が不変であるか、特異的 な配列増幅［例えば、ポリガ−ゼ連鎖反応増幅（ＰＣＲ）またはりガーゼ連鎖反 応（ＬＣＲ）］により増えたＤＮＡ／ＲＮＡ含量を含み得る。

第２の好ましい形では、蛍光検出可能な薬剤は、導波管固定化オリゴヌクレオチ ドにハイブリダイズする時に消失性を利用して検出可能である蛍光検出可能な増 幅生成物を産生ずるために、ハイブリダイズした特徴的な配列にハイブリダイズ し得るかまたは特異的な配列増幅プライマー（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応プ ライマー）として作用し得る蛍光検出可能なオリゴヌクレオチドである。

第２の形の好ましい態様に於いては、検出可能なオリゴヌクレオチドを使用して 、本発明は、 （ｉ）消失性検出装置導波管の表面に固定化した、検出すべき物質のＲＮＡまた はＤＮＡの特徴的なオリゴヌクレオチド配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチ ドを提供し。

（ｊｉ）特徴的な配列の残りの全体または一部に相補的な蛍光検出可能なオリゴ ヌクレオチドを提供し。

（ｆｆｌ）特徴的なオリゴヌクレオチド配列がハイブリダイズする条件下、調査 すべき物質またはこれから誘導したＤＮＡ若しくはＲＮＡ物質を含む溶液に段階 （ｉ）からの固定化オリゴヌクレオチドを暴露し； （ｉｖ）段階（ｉｉ）からの蛍光検出可能な相補的オリゴヌクレオチドを含む溶 液と段階（ＩＩＩｉ）からの物質の溶液を置換し９次いで （ｖ）消失性波検出装置を使用して結合した蛍光検出可能なオリゴヌクレオチド 量を測定し、サンプル中のターゲット物質の存在、識別及び／または量と結合量 を関連させる段階を含む、植物若しくは動物組織、微生物または細胞を含まない ＲＮＡ若しくはＤＮＡから選択した物質の検出、識別及び／または定量法を提供 する。

さらに好ましい態様に於いては、本発明は、（ｉ）消失性液検出装置導波管の表 面に固定化された、検出すべき物質のＲＮＡまたはＤＮＡの特徴的なオリゴヌク レオチド配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチドを提供し；（ｉｉ）特徴的な 配列の残りの全体または一部と同一の蛍光検出可能なオリゴヌクレオチドを提供 し；（ｉｆｉ）プライマーの一つとして段階（ｉｆ）からの蛍光検出可能なオリ ゴヌクレオチドを使用して被験物質のサンプル上で特異的な配列増幅反応を実施 し、これにより蛍光検出可能な薬剤を配合する際に存在する任意の特徴的な配列 を増幅し： （ｉｖ）前記固定化オリゴヌクレオチドと増幅生成物とのハイブリダイゼーショ ンが起きるような条件下で、段階（出）からの反応混合物に段階（ｉ）の導波管 固定化相補的オリゴヌクレオチドを暴露し。

（Ｖ）消失外波検出器を使用して固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし た任意の蛍光検出可能なオリゴヌクレオチドを測定し、サンプル中に最初に存在 した増幅した物質量と結合量を関連させる 段階を含む、植物若しくは動物組織、微生物または細胞を含まないＲＮＡ及びＤ ＮＡの検出、識別及び／または定量法を提供する。

好ましく且つ好都合には、段階（ｉｉｉ）の特異的増幅反応はポリメラーゼ連鎖 反応であるが、当業者には公知の如く他の反応（例えば、リガーゼ連鎖反応）も 通常使用し得る。

本発明の全ての態様に於いて、導波管は、ターゲットＲＮＡ若しくはＤＮＡへの 相補的な配列のハイブリダイゼーションのストリンジエンシー（ｓｔｒｉｎｇｅ ｎｃｙ）を調節し得るように、またはポリメラーゼ連鎖反応変性、ハイブリダイ ゼーション及び伸長温度サイクルを実施し得るように、温度調節可能な環境（例 えば、温度調節チャンバ）内に設置されるのが好ましい。

蛍光検出可能な相補的オリゴヌクレオチドは、種々の形、例えば、蛍光標識、蛍 光成分が結合し得る部分または蛍光成分を生成し得る酵素若しくは触媒のいずれ かに付いたオリゴヌクレオチドとして提供し得る。従って、測定段階は基本的な 蛍光検出段階の前に追加の段階、例えば、蛍光成分が結合し得る部分にこのよう な成分を暴露する段階または、酵素若しくは触媒反応に基買を暴露する段階が必 要である。

段階（１）の相補的配列は、ターゲットＲＮ＾またはＤＮＡに特異的に結合する のに十分な長さであるが、段階（伍）の検出可能なオリゴヌクレオチドと結合す るのに十分量の未結合ターゲットＲＮＡまたはＤＮＡ配列が残っている。通常、 固定化配列はターゲット配列の長さの約半分であるが、ターゲット配列の長さが 長くなると使用する割合は低くなり得る。

検出可能なオリゴヌクレオチドを使用する好ましい態様に於いて、検出可能な配 列はターゲット配列の残りの全体または殆ど全体に相補的であるが、これは特徴 的なターゲット配列の長さが増加するにつれ同様に割合が減少し得る。

固定化オリゴヌクレオチドは、ターゲット配列の一端またはその近くの配列に相 補的であり、一方蛍光検出可能な配列が他方の末端またはその近くの配列に相補 的であると都合がよい。従って、特徴的なターゲット配列のこれらの末端により アクセスし易（するためにサンプル物質のＲＮＡまたはＤＮＡを切断するために 、ハイブリダイゼーション前に制限エンドヌクレアーゼを都合よく使用し得る。

第２の好ましい態様でも同様に、検出可能な配列は、必要な特異性のＰＣＲプラ イマーとして有用であるように十分な長さが必要なだけであるが、もっと長くて もよい。両方のＰＣＲプライマーが蛍光検出可能であるとよく、これにより導波 管表面に提供される蛍光が増加し、対応する消失性効果の効率も増加する。全て の場合に於いて、好ましい試薬の塩基長は５〜３０であり、１０〜２５がより好 ましく、例えば１５〜２０塩基である。

当業者には、相補的配列は、ハイブリダイズする全塩基対で相補的である必要が ないことは公知である。従って当業者には、食い違ったオリゴマー（例えば、９ ０％相補的配列）の統計的に許容可能な使用に関するストリンジエンシー要求性 を直ちに決定し得、このように食い違った配列を使用する場合にハイブリダイゼ ーション温度を調節することにより有用な結果を得ることが可能である。

正確な相補的配列を使用する必要性は、ユーザーがアッセイする配列の特異性に 応じて変動し得る。従って、他の潜在的に存在する配列と高い割合で塩基を共有 する配列は、比較的具なる配列よりもより完全に相補的な配列を使用しなければ ならない。従って、アッセイする配列が十分に明らかでないかまたは変動し得る 場合、当業者には、段階（ｉ）及び（ｔｉｔ）に関して統計的に許容可能なオリ ゴマーを決定し得る。

本発明の第２の態様では、 （１）検出すべき物質のＲＮＡ若しくはＤＮＡの特徴的なオリゴヌクレオチド配 列の全体または一部に相補的なオリゴヌクレオチド及び （２）特徴的な配列の残りの一部または全体に相補的または同一の蛍光検出可能 なオリゴヌクレオチドを含む本発明の方法で使用するためのアッセイキットを提 供する。

成分（１）及び（２）の追加の例としては、上記及び請求項に記載のものがあり 、これらの成分は場合により、導波管上のオリゴマー（１）の固定化に必要なこ れらの試薬によりキット中に補足され得る。好適な試薬の例としては以下の方法 の説明中に参照されるものが挙げられる。

本発明の第３の態様では、検出すべき物質のＲＮＡまたはＤＮＡ配列に特徴的な オリゴヌクレオチド配列の全体または一部に相補的であるその表面に固定化され たオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、消失性波バイオセンサー中で使 用するのに好適な導波管を提供する。さらにこのような導波管を含むキットは、 請求項に記載の如く本発明の方法で使用するために提供される。

本発明の第４の態様では、検出すべき物質のＲＮＡまたはＤＮＡ配列に特徴的な オリゴヌクレオチド配列の全体または一部に相補的であるオリゴヌクレオチドを その表面に固定化した導波管を含むことを特徴とする、消失性波検出器バイオセ ンサーを提供する。このような導波管としては、例えばプリズム、スラブまたは ファイバーであってもよい。

本発明の全ての態様に於いて、１つ以上の特徴的な配列は、これを実施するのに 使用する装置及び方法に於いて１種類以上の固定化オリゴヌクレオチド及び関連 する蛍光検出可能な結合試薬を使用することにより同時にターゲット化し得る。

同類のイムノアッセイ系よりも優れている本発明の方法の優れている点としては ； （ａ）導波管表面の固定化成分をより密にバッキングすると感度及びダイナミッ クレンジが上がり、多重特異的表面が構築し易くなること。

（ｂ）ハイブリダイゼーション温度及びオリゴヌクレオチド長を調節することに より、被分析物質と固定化且つ誘導体化オリゴヌクレオチドとの間の結合を調節 し得、これにより、所与の試験の特異性及び感度を要求性に合わせるために微調 節できること。

（Ｃ）イムノアッセイは試薬の入手性、試薬の安定性、抗原の変動性、抗原部位 のマスキング及び抗体／抗原錯体の解離定数より制限される。遺伝子プローブア ッセイは、これらの全ての点に於いて非常に優れていること；（ｄ）蛍光イムノ アッセイは、環境汚染及び非特異的結合の妨害を受けるが、遺伝子プローブアッ セイに必要な高温（即ち、３７℃よりむしろ６０℃以上）により導波管表面の予 想外の汚染吸着が減少できること；及び （ｅ）免疫複合体と比較して核酸複合体により得られる解離定数が低いため、消 失性波検出技術に十分な感度が得られること が挙げられる。

被験サンプルは、環境中に知見されるまま（例えば、遊ｔｌＲＮ＾またはＤＮＡ オリゴヌクレオチド）であってもよく、または細胞溶解技術、ＤＮＡ／ＲＮ＾濃 縮若しくは増幅（例えば、Ｔａｑポリメラーゼを使用するポリメラーゼ連鎖反応 により）または制限酵素介在分解（例えば、より取り扱い易い大きさのオリゴヌ クレオチドを得るために）などにより前処理されていてもよい。

本発明の方法、キット及び装置の重要性を、以下の図面及び実験を参照とする実 施例により説明する。当業者にはこれらの範囲内で他の態様が考えられよう。

図面の説明 図１は、実施例で使用した消失外波検出器の主要要素を示す図である。

図２は、光学素子ファイバー導波管に共有結合した相補的配列に蛍光標識した２ ０量体をハイブリダイゼーションして得られた電圧／時間の関係を示す図である 。

図３は、相補的及び対照オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを 示す濃度／応答曲線を示す図である。信号（ｍＶ／ｗｉｎ）はオリゴマー濃度（ ｎＭ）に対してプロットした。

図４は、ハイブリダイゼーション信号に於ける導波管を含む温度制御チャンバ内 を通るサンプル溶液の流速の効果を示す図である。信号（ｍＶ／ｍ１ｎ）は流速 （ｎ＋１／ｗｉｎ）に対してプロットしである。

図５は、ハイブリダイゼーション速度に於ける温度の影響を示す図である。信号 （ｍＶ／ｍ１ｎ）は、フルオレセン標識した２０量体の５０ｎｇ／ｍｌサンプル に関する温度（℃）に対してプロットしである。

図６は、光学素子ファイバー導波管上のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーシ ョンのｐＨプロフィールを示す図である。信号（ｍＶ／ｍ１ｄ）はｐＨに対して プロットしである。

図７は、共有結合した２０４塩基のオリゴヌクレオチドの近位端または遠位端に 相補的なオリゴマーの８０Ｍ溶液由来の結合を示す図である。

図８は、本発明の方法の態様の２つの分子主薬の図式を示す図である。

亙迭 オリゴヌクレオチドは消失性領域の深度と匹敵し得る長さをもった長鎖分子であ るので、検出時にプローブ長の影響を調べるために導波管表面に一端で繋いだ２ ０４−塩基オリゴマー、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓの保護抗原遺伝 子から増幅したフラグメントのいずれかの末端に短いフルオレセン標識才＋７ゴ ヌクレオチドをハイブリダイズして実施した。

物質 グルタルアルデヒド、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（＾ＰＴＳ）、Ｔ ｗｅｅｎ　２０、Ｆｉｃｏｌｌ、ホルムアミド、ポリビニルピロリドン、ウシ血 清アルブミン画分Ｖ　（ＢＳＡ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ストレ プトアビジン（ＩＩＲＰ−ＳＡ）、２，２−アジノービス（３−エチルベンズチ アゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、塩化ナトリウム及びクエン酸三ナト リウムはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ から入手した。オルトリン酸二水素ナトリウム、オルトリン酸水素二ナトリウム 、ドデンルスルホン酸ナトリウム（ｓＤｓ）、過酸化水素、塩酸及びアセトンは 、ＢＤＪ（、Ｐｏｏｌｅ、　ＵＫのＡＲグレードを使用した。水酸化アンモニウ ムはＡｌｄｒｉｃｈ、　Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ、　Ｄｏｒｓｅｔ、　ＵＫから、 及びエタノールは、ｌａｙｍａｎ　Ｌｔｄ、、ＩＦｉｔｈａｍ、Ｅｓ５ｅｘ。

ＵＫから入手した。寒天ビード上に固定化したストレプトアビジンは、Ｐｉｅｒ ｃｅ　ａｎｄ　ｆａｒｒｉｎｅｒ、Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫから入手した。

Ｃ６−結合フルオレセン−、アミノ−またはビオチン−修飾末端をもつ合成りＮ Ａオリゴヌクレオチドは、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌ ｔｄ、　Ａｂｉｎｇｄｏｎ、　ＵＫから入手した。これらを表１に列記する。

ファイバー光学素子消失性導波管（プロトタイプ　Ｎｏ、　１９）及び１　ｍｍ Ｘ　６５ｍｍのクォーツ光学素子ファイバーは、ＯＲＤ、　Ｎ。

ｒｔｈ　Ｓａｌｅｍ、Ｎｅｗ　Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、ＵＳＡから入手した。図１ 参照。

６ワツトタングステンフイラメント源（１）は光を供給し、光は４８５ｍｍ＋ブ ルーフイルター（３）及び０．８ｍｍ＋ピンホールマスク（４）が間に入った３ 枚の規準レンズ（２）を通過して、５゜：５０ビ一ム分割装置（５）上に衝突し 、焦点レンズ（６）を介してオリゴヌクレオチドを保持した導波管（７）に断続 的に光を向ける。入射光に対応する任意の結合（例えば、ハイブリダイズまたは 挿入された蛍光物質）から誘導された蛍光は、導波管（７）から出てレンズ（６ ）を介して向は直されて、ビーム分割装置を介して５３０ｎｍグリーンフィルタ ー（８）に入る。ここから光はシャッターアセンブリ（９）及び焦点レンズ（１ ０）を介して通過し、その後例えば、電圧計（示されていない）などの測定装置 に接続された検出器（１１）に衝突する。

電圧計からの出力電圧は、Ｐｈａｒｍａｃｉａモデル４８２チャートレコーダー に都合よく接続されている。光学素子ファイバーはステンレススチールエンドキ ャップとシリコーンガスケットのついたガラスキャピラリーチューブからできた ジャケットのついたフローセル中に保持した。温度はガラスジャケットを介して 水浴からの循環水により制御した。温度を熱電対でモニターした。光学素子ファ イバーを洗浄し、次いでＴｉｊｓｓｅｎ、　（１９８５）、　Ｐｒａｃｔｉｃｅ 　ａｎｄ　ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅｉｍＩＩｌｕｎｏａｓｓａｙｓ　 ：　ｐ３２２−３２３．Ｖｏｌ　１５　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈ ｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｂｕｒｄｏｎ及びｖａｎ　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｕｒｇ編：　 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ出版に記載の方法をベースとする方法を使用してグルタルアル デヒドと共有結合させた。

ファイバーをアセトン中入ＰＴ５２％溶液中、室温で２４時間シラン化（ｓｉｌ ａｎｉｚｅ）　Ｌ／、アセトンで洗浄し、５０℃で洗浄し、水中１％グルタルア ルデヒド中に１時間浸漬させ、ＰＨ３中で洗浄し、最終的にアミノ末端をもつオ リゴヌクレオチドの１０μｇ／ｍｌ溶液中４℃で一晩放置した。アッセイを実施 するために固定化オリゴヌクレオチドのついた光学素子ファイバーを脱イオン水 で濯ぎ、乾燥プロットし、フローセル中に挿入した。最適化時、以下の条件［Ａ −ｎｄｅｒｓｏｎ　＆　Ｙｏｕｎｇ。

（１９８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　−ａ 　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｅｄ、　Ｈａａ＋ｅｓ　ａｎｄ　Ｈ ｉｇｇｉｎｓ；　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｉ）Ｉ）　７３−１ １１］を使用した。ウォータージャケットの温度は６５℃に調節した。

プレハイブリダイゼーション溶液（２５０ｍｌ　２０ｘＳＣＣ，＋　５０ｍ１１ ００ｘデンハート溶液、５０ｍ１０．１Ｍリン酸塩緩衝液及びｌｏｌＴｗｅｅｎ 　２．０を６００Ｉｎｌ滅菌脱イオン水に添加したもの、最終ｐ＋（６，８）を 、安定したベースラインが得られるまで、０．５ｍ１１分で２５μｍフローセル 中のファイバーに嬬動性ポンプを使用して汲み上げた。次いで、プレハイブリダ イゼーション溶液中のフルオレセン末端標識したターゲットオリゴヌクレオチド を同一流速で導入し、ハイブリダイゼーションを実施すると、チャートレコーダ ーの出力が増加した。数分後、プレハイブリダイゼーション溶液をフローセルに スイッチバックし、温度を８０℃に上げた。１０〜１５分後、全ての結合オリゴ ヌクレオチドを脱着し、次操作のために温度を６５℃に下げた。

最初にほんの短い（１６−〜２ｏ−量体）のオリゴヌクレオチドがファイバーに 付着した。長いプローブの使用について調査するために、アミノ末端２０４−量 体をアミノ基−オリゴマ−−５４５３−で末端標識した１つのプライマー、２ｏ −量体とビオチンオリゴマー１２２２で末端標識した他のプライマー、２゜−量 体でターゲット配列上ＰＣＲを使用して合成した。取り込まれなかったアミノ− 標識プライマーを寒天ビーズ上の固定化ストレプトアビジンを使用して除去し、 取り込まれなかったアミノ−末端プライマーから二重鎖Ｐｃｔ？産物を引き出し た。９５℃で１０分加熱し、次いで水／水混合物中で急冷し、その後遠心分離に よりビードを除去して相補的鎖及びビーズからアミノ−標識２０４−塩基鎖を放 出させた。産生じた２０４−量体の量は、ファイバーに結合させるために使用す る０、８５μｇ／ｍｌ溶液に十分であった。

最初の２０−量体の実験では、高レベルのターゲット及び対照オリゴヌクレオチ ドを使用した。フルオレセン−標識オリゴヌクレオチド対照（オリゴマー４９５ ０）の２００ｎＭ（１μｇ／ｍｌ）溶液をＩｎ＋１／分及び６０℃でオリゴマー ４９４６を固定化したファイバーを含むフローセルに導入した。すぐにベースラ インが８０ｍＶにシフトし、その後、出力が元のレベルに戻ったとされ、プレハ イブリダイゼーション溶液が再導入されるまで出力は一定になった。対照的に、 ファイバー上のオリゴマー４９４６に相補的なオリゴ７−４９４７を１６０ｎＭ （１μｇ／＋１）　テ導入すると、約３５０ｍＶ／分の最初の勾配をもつ連続的 な上昇信号が得られた。１４分後に、ベースラインレベル以上の出力１．１４０ ｍＶで平坦域になった。プレハイブリダイゼーション溶液を９０℃でフローセル を通過させると、出力は再び低下した。この結合が特異的であることを確認する ために、対照オリゴマー４９５０は表面に共有結合したその相補体、オリゴマー ４９４９のついた光学素子ファイバーに結合することを示した。

オリゴマー４９４６を固定化するための８ｎＭフルオレセンー標識オリゴマー４ ９４７のハイブリダイゼーションのタイムコースを図２に示し、対照としてオリ ゴマー４９４７で固定化したオリゴマー４９４９にハイブリダイズするフルオレ セン−標識オリゴマー４９５０に関する濃度／応答曲線を図３に示す。

サンプルをフローセルに入れて１分後の曲線の勾配を測定した。

条件の最適化の結果を図４〜６に示す。流速の効果をオリゴマー４９４７の５０ ｎｇ／ｌｌ１ｌ溶液で評価した。結果を図４に示す。温度及びｐ■に於けるハイ ブリダイゼーションの速度依存性を評価し、結果を各々図５及び６に示す。最大 結合速度は６５℃及びｐ＋（１３，８で観察された。

導波管表面に一端が共有結合した２０４−塩基オリゴヌクレオチドの近位端また は遠位端のいずれかに相補的なフルオレセン−標識オリゴヌクレオチドの５Ｑｎ Ｍ溶液の結合曲線を図７に示す。応答の間には殆ど差はなく、両方とも約３分後 には４３ｍＶ（近位端）または５６ｍＶ（遠位端）の平坦域レベルに上昇し、続 いてプレハイブリダイゼーション溶液をフローセルに再導入すると出力が少し低 下した。２種類のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する初期勾 配を使用する濃度／応答曲線は、これらの間に殆ど差のないことを示した（結果 は示されていない）。対照としての５０００Ｖのオリゴマー４９４７は２０４− 量体には結合しなかった。

応答及び濃度の勾配の間に直線関係があるナノモル範囲に於いて検出した。この バイオセンサーを使用するイムノアッセイを使用して同様の結果が得られた。

高感度の必要なアッセイに関しては、以下の装置改良及び増幅技術を都合よく使 用し得る。

標識オリゴマーは、多重蛍光体（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ ）若しくは蛍光ビーズで標識したオリゴヌクレオチドを使用して製造するか、ま たは蛍光挿入染料を使用してハイブリダイゼーションを検出する。

バイオセンサーアッセイは、導波管上でハイブリダイゼーション前に、生成物の 検出を改良するために好ましくは（上記本発明の方法の好ましい態様の１つと同 様に）蛍光体−標識プライマーを使用してサンプル上で実施し得る、ＰＣＨなど のＤＮＡ増幅法と組み合わせ得る。バイオセンサーを使用してＰＣＲ反応を直接 モニターすることも可能である。バイオセンサーアッセイにかがる大体６０秒と いう時間は、実施するのに約１時間かかる試験よりもずっと迅速であり、且つ通 常の遺伝子プローブアッセイよりもずっと早い［Ｅｎｇｌｅｂｅｒｇ、（１９９ １）　ＡＳＭ　Ｎｅｗｓ　５７　（４）　１８３−１８６コ。

加熱することによって結合した核酸を除去して検出器の表面を容易にリサイクル することによりこの系でイムノアッセイに関与する問題の１つを取り除き、迅速 な識別が必要な軍事的または他の重要な危険な環境に於いて有用な６０秒の応答 時間とすることができる。幾つかの光学素子ファイバーは、応答に全く損失を与 えずに数日間にわたって有用であることが知見された。

５′−及び３−の両方を標識したオリゴヌクレオチドをこの因子に関して使用し たが、結果に明らかな効果はでなかった。オリゴヌクレオチドは２０４−塩基オ リゴヌクレオチドの近位端及び遠位端にも結合した。この長さは７０ｎｍ（螺旋 １つ当たり１０塩基を有する二重鎖ＤＮＡのピ・ソチに関して３．４ｎｍの値を 使用する）〜２０Ｏｒ＋ｍ（分子の主鎖に沿って−ｏ−ｐ−ｏ−ｃ−ｃ−Ｃ−の 繰り返しの内部結合距離を使用する）であった。その初期値の１／ｅに減少する 光強度に関して取られる距離として定義される消失性領域の深度は、２０４−量 体の長さと匹敵する約１１００ｎであった。遠位及び近位フルオレセン−標識オ リゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関して同様の信号が得られた（封 オリゴヌクレオチドに関してはやや高い信号が得られた）ので、長いオリゴヌク レオチド鎖の配向は、恐らく導波管表面に対して垂直ではなかったのだるう。

大きなターゲット配列からＰＣＨにより製造した２０４−量体のほんの限定量し か光学素子ファイバーに結合できなかったが、恐らくこれにより導波管表面上の 濃度は比較的低くなったのだろう。これは、（固定化遺伝子プローブが高濃度、 ＞ｔｏｏｘ以上に濃縮された溶液から共有結合されている場合）図２に示されて いる等しいタイムスケールで信号が連続して上昇するのと比較して図７ではすぐ に平坦化応答となることを説明している。出力の変化の速度よりも平坦域の高さ が結合の尺度として選択される場合、固定化プローブ量が限定されて飽和がより 早く達成されるだろう。

本発明の分子主薬（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂａｓｉｓ）は図８に示されており、 図中、８ａ−ｃ及び８　ｄ−ｆは各々本発明の方法の第１及び第２の好ましい態 様を指す。図８ａでは、ターゲットＤＮＡ配列（Ｂ）の特徴的なオリゴヌクレオ チド配列の一部に相補的なオリゴヌクレオチド配列（Ａ）を上記方法により消失 性波検出器導波管に固定化した。図８ｂでは、固定化オリゴヌクレオチドを、ハ イブリダイゼーション条件下で被験サンプル溶液に暴露し、その中でターゲット ＤＮＡ配列（Ｂ）は配列（Ａ）にハイブリダイズする。図８０では、サンプル溶 液を、ハイブリダイゼーション条件下でターゲットオリゴヌクレオチドのハイブ リダイズしていない残りと相補的なフルオレセン標識オリゴヌクレオチド（Ｃ） を含む溶液と置き換えると、これも同様にハイブリダイズする。ハイブリダイゼ ーション時、フルオし・センは導波管の消失性領域で光により蛍光を発する。

図８ｄでは、相補的配列（Ａ）を前述の如く消失外波検出器導波管に固定化する 。図８ｅでは、サンプル溶液をＰＣＲ条件下で、各々がターゲット特徴的配列（ Ｂ）の２つの末端の一方の特徴的な配列と対応する２つのプライマー（Ｄ）及び （Ｅ）で処理する。固定化オリゴヌクレオチド（Ａ）にハイブリダイズする末端 と反対の配列の末端のプライマーをフルオレセンで標識すると、反応生成物はフ ルオレセン標識ターゲット配列（Ｆ）となる。図８ｆでは、固定化配列（Ａ）は ハイブリダイゼーション条件下でサンプル溶液に暴露され、フルオレセン標識タ ーゲット配列（Ｆ）が配列（Ａ）にハイブリダイズし、これを消失性波検出器誘 導蛍光により検出し得る。

図８の方法の好ましい形では、特にＰＣＲまたは他の特異的な増幅方法を含む方 法を使用する場合には、固定化オリゴヌクレオチド（Ａ）は、これがプライマー （Ｄ）及び（Ｅ）に結合しないように選択されるので、これらの過剰分は固定化 部位をブロッキングしないだろう。従ってこの形では、オリゴヌクレオチド（Ａ ′）はプライマー（Ｄ）よりも配列（Ｂ）のより中央の（Ｆ）の部分にハイブリ ダイズし、（Ｆ）の非蛍光体保持末端は図８ｇに示されているようになる。

本明細書中には特に例示していないが、本発明の方法の態様を使用する挿入染料 は、図８８及び図８ｂにより説明されているように実施する。これらの段階は、 染料の存在下、または後添加により実施する。これらの相互作用に好適な染料及 び条件は、従来技術［Ｌａｔｔ及びＷｏｈｌｌｅｂ；Ｃｈｒｏｓｏｓｏｍａ（Ｂ ｅｒｌ、　）５２，２９７−３１６（１９７５）、Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎら、　Ｃ ｈｒｍｏｓｏ＋ｗａ（Ｂｅｒｌ、　）６８、２８７−３０２（１９７８）及びＪ ｅｎｎｉｎｇｓ及びＲｉｄｌｅｒ；Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　ｏｆＳｔｒｕｃｔｕ ｒｅ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、　１０．７１−７９．　（１９８３）コに 開示されている。

才りパメ７しｆナビ清Ａ　ｌｎＭｌ 洟、１　１ｍｌ　／　ｍ１ｎ１ ６．０　６．５　７．０　７．５　８．ＯＨ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成６年３月１５司シ

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．（ｉ）消失性波検出装置導波管の表面に固定化された、物質のＲＮＡまたは ＤＮＡの特徴的なオリゴヌクレオチド配列の全体または一部に相補的なオリゴヌ クレオチドを提供し；（ｉｉ）特徴的なオリゴヌクレオチド配列をもつＤＮＡま たはＲＮＡがハイブリダイズする条件下で、段階（ｉ）の固定化オリゴヌクレオ チドをサンプルまたはこれから誘導したＤＮＡ若しくはＲＮＡ物質に暴露し； （ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で提供されたＤＮＡ若しくはＲＮＡとの任意のハイブリ ダイゼーション前、ハイブリダイゼーション中またはハイブリダイゼーション完 了時に、蛍光検出可能な薬剤がハイブリダイズ化生成物に結合するが、未ハイブ リダイズの固定化オリゴヌクレオチドには結合しないように、段階（ｉ）の固定 化オリゴヌクレオチドまたはサンプルから誘導した核酸物質を蛍光検出可能な薬 剤と結合させ；（ｉｖ）消失性波検出装置を使用して段階（ｉｉｉ）により結合 した蛍光検出可能な薬剤を測定し、物質の存在、識別及び／または量とその量を 関連させる 段階を含む、植物若しくは動物組織、徴生物または細胞を含まないＲＮＡ若しく はＤＮＡから選択された物質の検出、識別及び／または定量法。
2. ２．蛍光検出可能な薬剤がハイブリダイゼーション生成物の二重鎖に含まれ得る 蛍光検出可能な挿入染料であり、染料はハイブリダイズしていない固定化オリゴ ヌクレオチドに結合しないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．特徴的な配列の含量を特異的配列増幅により増やすことを特徴とする請求項 １または２に記載の方法。
4. ４．特異的配列増幅をポリメラーゼ連鎖反応増幅（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖 反応（ＬＣＲ）により実施することを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. ５．蛍光検出可能な薬剤が、段階（ｉｉ）のハイブリダイズした特徴的な配列に ハイブリダイズし得る蛍光検出可能なオリゴヌクレオチドであることを特徴とす る請求項１、３または４に記載の方法。
6. ６．蛍光検出可能な薬剤が、導波管固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズ する際に消失性により検出可能な蛍光検出可能な増幅産生物を産生するために、 特異的な配列増幅プライマーとして作用し得ることを特徴とする請求項１、３、 ４または５に記載の方法。
7. ７．特異的配列増幅プライマーがポリメラーゼ連鎖反応プライマーであることを 特徴とする請求項６に記載の方法。
8. ８．（ｉ）消失性検出装置導波管の表面に固定化された、検出すべき物質のＲＮ ＡまたはＤＮＡの特徴的なオリゴヌクレオチド配列の全体または一部に相補的な オリゴヌクレオチドを提供し； （ｉｉ）特徴的な配列の残りの全体または一部に相補的な蛍光検出可能なオリゴ ヌクレオチドを提供し；（ｉｉｉ）特徴的なオリゴヌクレオチドがハイブリダイ ズする条件下、調査すべき物質またはこれから誘導されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ 物質を含む溶液に、段階（ｉ）の固定化オリゴヌクレオチドを暴露し； （ｉｖ）段階（ｉｉ）の蛍光検出可能な相補的オリゴヌクレオチドを含む溶液と 段階（ｉｉｉ）からの物質溶液を置換し、次いで；（ｖ）消失性波検出装置を使 用して蛍光検出可能なオリゴヌクレオチドの結合量を測定し、サンプル中のター ゲット物質の存在、識別及び／または量とそれを関連させる段階を含む、請求項 １または５に記載の方法。
9. ９．（ｉ）消失性波検出装置導波管の表面に固定化された、検出すべき物質のＲ ＮＡまたはＤＮＡの特徴的なオリゴヌクレオチド配列の一部に相補的なオリゴヌ クレオチドを提供し；（ｉｉ）特徴的な配列の残りの全体または一部に同一な蛍 光検出可能なオリゴヌクレオチドを提供し；（ｉｉｉ）プライマーの一つとして 段階（ｉｉ）からの蛍光検出可能なオリゴヌクレオチドを使用して被験物質のサ ンプル上で特異的な配列増幅反応を実施し、これにより蛍光検出可能な薬剤を含 みつつ、存在する特徴的な任意の配列を増幅し（ｉｖ）前記固定化オリゴヌクレ オチドと増幅生成物とのハイブリダイゼーションが起きるような条件下で、段階 （ｉｉｉ）からの反応混合物に段階（ｉ）の導波管固定化相補的オリゴヌクレオ チドを暴露し； （ｖ）消失性波検出器を使用して固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし た任意の蛍光検出可能なオリゴヌクレオチドを測定し、サンプル中に最初に存在 する増幅した物質量とそれを関連させる 段階を含む、請求項１、６または７に記載の方法。
10. １０．導波管がプリズム、スラブまたはファイバーを含むことを特徴とする請求 項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. １１．導波管が温度調節可能な環境内に設置されていることを特徴とする請求項 １〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. １２．前記環境が温度調節チャンバであることを特徴とする請求項１１に記載の 方法。
13. １３．ターゲットＲＮＡ着しくはＤＮＡに相補的配列のハイブリダイゼーション のストリンジェンシーを制御し得るように、またはポリメラーゼ連鎖反応変性、 ハイブリダイゼーション及び伸長温度サイクルを実施し得るように温度が制御可 能であることを特徴とする請求項に記載の方法。
14. １４．蛍光検出可能な相補的オリゴヌクレオチドが、個々のオリゴヌクレオチド を蛍光標識、蛍光成分が結合し得る部分または蛍光成分を生成し得る酵素若しく は触媒につけることにより提供されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれ か１項に記載の方法。
15. １５．相補的オリゴヌクレオチドをフルオレセンにつけることを特徴とする請求 項１４に記載の方法。
16. １６．オリゴヌクレオチドを蛍光成分を生成し得る酵素または触媒につけ、消失 性波検出装置で蛍光を読み取る前にこの酵素または触媒に関する基質を添加する ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
17. １７．そのＲＮＡまたはＤＮＡを切断するために物質を制限エンドヌクレアーゼ で前処理することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. １８．相補的または同一オリゴヌクレオチドを５〜３０塩基の塩基長から独立し て選択することを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. １９．オリゴヌクレオチドが１０〜２５塩基長であることを特徴とする請求項１ ８に記載の方法。
20. ２０．オリゴヌクレオチドが１５〜２０塩基長であることを特徴とする請求項１ ９に記載の方法。
21. ２１．（Ａ）消失性波検出装置の導波管表面に固定化された、検出、識別及び／ または定量すべき物質のＲＮＡまたはＤＮＡの特徴的なオリゴヌクレオチド配列 の一部に相補的なオリゴヌクレオチド及び （Ｂ）蛍光検出可能な挿入染料 を含むことを特徴とする１、２、３、４、１４、１５、１６または１７に記載の 方法で使用するためのアッセイキット。
22. ２２．（Ａ）消失性波検出装置の導波管の表面に固定化された、検出、識別及び ／または検出すべき物質のＲＮＡまたはＤＮＡの特徴的なオリゴヌクレオチド配 列の一部に相補的なオリゴヌクレオチド及び （Ｂ）特徴的な配列の残りの全体または一部に相補的な蛍光検出可能なオリゴヌ クレオチド を含むことを特徴とする請求項１、３、４、５、８、１４、１５、１６または１ ７に記載の方法で使用するためのアッセイキット。
23. ２３．（Ａ）消失性波検出装置の導波管の表面に固定化された、検出、識別及び ／または検出すべき物質のＲＮＡまたはＤＮＡの特徴的なオリゴヌクレオチド配 列の一部に相補的なオリゴヌクレオチド及び （Ｂ）特徴的な配列の残りの全体または一部と同一の蛍光検出可能なオリゴヌク レオチド を含むことを特徴とする請求項１、３、４、５、６、７、９、１４、１５、１６ または１７に記載の方法で使用するためのアッセイキット。
24. ２４．消失性波検出装置の導波管にこれを固定するのに必要な試薬と一緒に、検 出、識別及び／または定量すべき物質のＲＮＡまたはＤＮＡの特徴的なオリゴヌ クレオチド配列の全体または一部に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことを特 徴とする請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法で使用するためのアッセイ キット。
25. ２５．その表面に固定化された、検出、識別及び／または定量すべき物質のＲＮ ＡまたはＤＮＡ配列に特徴的なオリゴヌクレオチド配列の全体または一部に相補 的なオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする消失性波バイオセンサーで使用 するのに好適な導波管。
26. ２６．ハイブリダイゼーションストリンジェンシーを制御及び／またはポリメラ ーゼ連鎖温度サイクルを実施するのに好適な消失性導波管を入れるための温度制 御可能な環境を含むことを特徴とする消失性波検出バイオセンサー。
27. ２７．導波管が、その表面に固定化された、検出、識別及び／または定量すべき 物質のＲＮＡまたはＤＮＡの特徴的なオリゴヌクレオチド配列の全体または一部 に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２６に記載の消失 性波検出バイオセンサー。