BRPI0307702B1

BRPI0307702B1 - Formulations of solution containing antibody

Info

Publication number: BRPI0307702B1
Application number: BRPI0307702-0A
Authority: BR
Inventors: Kakuta Masaya; Kikuchi Jun; Mizushima Hidefumi; Imaeda Yoshimi
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2002-02-14
Filing date: 2003-02-14
Publication date: 2018-02-06
Also published as: ES2353496T3; US20050214278A1; JP2010174042A; ES2536709T3; PL372097A1; NZ534542A; EP1475100B1; KR20110091822A; CN101721362A; AU2003211990A1; JP2004292455A; PL213311B1; EP1475101A4; JP4364645B2; CO5611163A2; KR101080021B1; ZA200406230B; JPWO2003068259A1; CN101066450A; ATE485835T1

Abstract

"formulações de solução contendo anticorpo". a presente invenção refere-se a formulações de solução contendo anticorpo, incluindo um açúcar como um estabilizador. as referidas formulações de solução podem também incluir um tensoativo como um estabilizador.

Description

(54) Título: FORMULAÇÕES DE SOLUÇÃO CONTENDO ANTICORPO (51) Int.CI.: A61K 39/395; A61K 9/08; A61K 47/26; A61K 47/34 (30) Prioridade Unionista: 14/02/2002 JP 2002-36244 (73) Titular(es): CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA (72) Inventor(es): MASAYA KAKUTA; JUN KIKUCHI; HIDEFUMI MIZUSHIMA; YOSHIMI IMAEDA

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para FORMULAÇÕES DE SOLUÇÃO CONTENDO ANTICORPO.

CAMPO DA TÉCNICO

A presente invenção refere-se às formulações de solução con5 tendo anticorpo estável.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

Com o desenvolvimento da tecnologia de engenharia genética, tem tornado-se possível usar anticorpos tais como imunoglobulinas, anticorpos monoclonais e anticorpos humanizados como produtos farmacêuticos.

Para fornecê-los em quantidades estáveis, é necessário estabelecer condições de preparação e condições de armazenagem sob as quais a estrutura e atividade dos anticorpos podem ser mantidas.

Quando as proteínas são armazenadas em soluções de alta concentração, elas normalmente passam por deterioração tal como a forma15 ção de agregados insolúveis, que deve ser prevenida. Especialmente, as formulações de anticorpo têm a desvantagem de que elas tendem a formar multímeros induzindo a agregados insolúveis durante a armazenagem em soluções.

Por exemplo, constatou-se que os anticorpos de receptor anti-IL20 6 têm um efeito terapêutico sobre as células de mieloma imaturas (JPA HEI

8-99902) e sucederam em produção em massa um anticorpo humanizado remodelado, anticorpo de hPM-1, como um anticorpo de receptor anti-IL-6, e tem-se tentado formular este anticorpo de receptor anti-IL-6 purificado em produtos farmacêuticos. O anticorpo de receptor anti-IL-6 humanizado é uma proteína instável sujeita à alterações físicas ou químicas tal como associação ou agregação sob as tensões de filtração, concentração, aquecimento e luz para remover viroses e outros micróbios durante os processos de purificação.

Quando os anticorpos devem ser obtidos por técnicas de enge30 nharia genéticas, as células de produção de anticorpo são cultivadas em grandes quantidades e purificadas para produzirem uma solução contendo anticorpo, que é em seguida armazenada congelada e descongelada antes

da formulação. Entretanto, o teor de anticorpo restante em uma tal solução diminuiu quando dímeros de anticorpo ou partículas insolúveis foram formados durante repetidos ciclos de congelamento/desoongelamento ou anticorpos foram degradados para formar produtos de degradação durante armazenagem à longo prazo.

Muitos esforços foram feitos para fornecer um método para armazenar proteínas em soluções, e um efeito de estabilização foi constatado adicionando-se polímeros incluindo proteínas tais como albumina sérica humana ou gelatina purificada ou oligômeros tais como polióis, aminoácidos e tensoativos como estabilizadores para prevenir alterações químicas ou físicas. Entretanto, a adição de biopolímeros tais como proteínas como estabilizadores foi inconveniente, por exemplo, requereu uma etapa muito complicada para eliminar contaminantes tais como viroses e príons. Quanto à adição de oligômeros, deve preferivelmente ser minimizada.

As formulações de anticorpo secas por congelamento estabilizadas com açúcares ou aminoaçúcares, aminoácidos e tensoativos foram também mencionados (JPA HEI2001 - 503781).

Entretanto, as formulações de solução contendo anticorpo estáveis foram procuradas por causa da grande demanda de formulações de solução fáceis de usar que não podem ser dissolvidas/reconstituídas antes do uso.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

O objetivo da presente invenção é fornecer formulações de solução contendo anticorpo nas quais o teor de anticorpo permanece alto, e que são estáveis mesmo após armazenagem a longo prazo inibindo-se a formação de partículas insolúveis e multímeros durante a preparação ou armazenagem das formulações de solução contendo anticorpo e também inibindo a formação de produtos de degradação.

Como um resultado de estudos cuidadosos para atingir o objetivo acima, executou-se a presente invenção com base na descoberta de que a formação dos dímeros durante os ciclos de congelamento/descongelamento ou a formação de multímeros e produtos de degradação durante a

armazenagem a longo prazo podem ser inibidas adicionando-se um açúcar, e de que a formação de partículas insolúveis durante os ciclos de congelamento/descongelamento pode ser notavelmente inibida adicionando-se um tensoativo.

Conseqüentemente, a presente invenção fornece :

(1) uma formulação de solução contendo anticorpo incluindo um açúcar como um estabilizador;

(2) a formulação de solução como definido em (1) também incluindo um tensoativo como um estabilizador;

(3) a formulação de solução como definido em (1) ou (2) onde o açúcar é um álcool de açúcar ou um oligossacarídeo de não-redução;

(4) a formulação de solução como definido em (1) ou (2) onde o açúcar é um oligossacarídeo de não-redução;

(5) a formulação de solução como definido em (1) ou (2) onde o açúcar é manitol, sacarose, trealose ou rafinose;

(6) a formulação de solução como definido em (1) ou (2) onde o açúcar é sacarose, trealose ou rafinose;

(7) a formulação de solução como definido em (1) ou (2) onde o açúcar é manitol, sacarose ou trealose;

(8) a formulação de solução como definido em (1) ou (2) onde o açúcar é sacarose;

(9) a formulação de solução como definido em qualquer uma dentre (2) a (8) onde o tensoativo é Polissorbato 80 ou 20;

(10) a formulação de solução como definido em qualquer uma dentre (1) a (9) onde o anticorpo é um anticorpo recombinante;

(11) a formulação de solução como definido em (10) onde o anticorpo é um anticorpo quimérico, anticorpo humanizado ou anticorpo humano;

(12) a formulação de solução como definido em qualquer uma dentre (1) a (11) onde o anticorpo é um anticorpo de classe de IgG;

(13) a formulação de solução como definido em (12) onde o anticorpo de classe de IgG é um anticorpo de classe de lgG1;

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.....\ (14) a formulação de solução como definido em qualquer uma dentre (1) a (13) onde o anticorpo é um anticorpo de receptor antiinterleucina-6 ou anticorpo anti-HM1.24;

(15) um método para inibir a formação de moléculas de multímero de anticorpo em uma formulação de solução contendo anticorpo, compreendendo adicionar um açúcar à solução;

(16) um método para inibir a formação de moléculas de multímero de anticorpo durante os ciclos de congelamento/descongelamento de uma solução contendo anticorpo, compreendendo adicionar um oligossacarídeo à solução;

(17) um método para inibir a formação de moléculas de multímero de anticorpo durante os ciclos de congelamento/descongelamento de uma solução contendo anticorpo, compreendendo adicionar um dissacarídeo de não-redução ou trissacarídeo de não-redução na solução;

(18) um método para inibir a formação de moléculas de partículas insolúveis durante os ciclos de congelamento/descongelamento de uma solução contendo anticorpo, compreendendo adicionar um tensoativo; e (19) um método para estabilizar um anticorpo durante os ciclos de congelamento/descongelamento de uma solução contendo o anticorpo, compreendendo adicionar um açúcar de não-redução e um tensoativo.

AS MODALIDADES MAIS PREFERIDAS DA INVENÇÃO

Como aqui empregado, formulação de solução contendo anticorpo significa uma formulação de solução contendo um anticorpo como um ingrediente ativo e preparada para administração a animais tais como seres humanos, preferivelmente sem incluir quaisquer etapas de congelamento/descongelamento no processo de preparação.

Como aqui empregado, solução contendo anticorpo pode ser uma solução contendo qualquer anticorpo, seja derivada biologicamente ou recombinante, preferivelmente um meio de cultura no qual as células mamíferas tais como células CHO contendo um anticorpo foram cultivadas, ou uma solução obtida submetendo-se um tal meio de cultura a um dado tratamento tal como purificação parcial (solução volumosa), ou a formulação de

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solução para administração a animais tais como humanos como anteriormente definido.

Como aqui empregado, o termo partículas insolúveis significa matérias em partículas insolúveis de 10 μιτι ou mais como definido na seção de Teste de Matéria Em Partículas Insolúveis para Injeções na parte de Testes Gerais, Processos e Mecanismos na Farmacopéia Japonesa. As partículas insolúveis podem ser avaliadas empregando-se microscópios, filtros de coleta de partícula insolúvel e filtros de membrana analítica, ou convenientemente empregando-se contadoras de partícula de obscuração de luz automáticas.

Como aqui empregado, matérias insolúveis significam matérias insolúveis facilmente detectáveis das quais as injeções devem estar livres e limpas quando inspecionadas em recipientes a olho nu com uma intensidade de luz de aproximadamente 1000 luxes sob uma lâmpada incandescente como definido na seção de Teste de Matéria Insolúvel Estranha para Injeções na parte de Testes Gerais, Processos e Mecanismos na Farmacopéia Japonesa.

Como aqui empregado, multímeros e produtos de degradação significam multímeros e produtos de degradação respectivamente de moléculas de anticorpo constituindo ingredientes ativos de formulações, e seus teores podem ser determinados pelo método de porcentagem de área de pico com base na cromatografia de permeação em gel descrita mais tarde.

Os anticorpos usados nas formulações de solução da presente invenção não são especifícamente limitados ao ponto em que eles ligam-se a um antígeno desejado, e anticorpos de camundongo, anticorpos de rato, anticorpos de coelho, anticorpos de carneiro, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos e similares podem ser usados quando apropriado. Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, porém preferivelmente monoclonais porque anticorpos homogêneos podem ser estavelmente produzidos. Os anticorpos policlonais ou monoclonais podem ser preparados por processos bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

Os hibridomas produzindo anticorpos monoclonais podem ser basicamente construídos por técnicas conhecidas como segue. Um antígeno desejado ou uma célula expressando um antígeno desejado é usado como um antígeno de imunização para imunizar células hospedeiras de acordo com uma técnica de imunização padrão, e as células imunizadas resultantes são fundidas às células origem conhecidas por uma técnica de fusão de célula padrão, e em seguida as células fundidas são avaliadas quanto às células de produção de anticorpo monoclonal (hibridomas) por um método de avaliação padrão. A construção de hibridomas pode ser executada de acordo com o método de por exemplo, Milstein e outros (Kohler. G. e Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3 - 46). Se o antígeno tem baixa imunogenicidade, ele pode ser ligado a uma macromolécula imunogênica tal como albumina e usado para imunização.

Anticorpos recombinantes podem ser usados, os quais são produzidos transformando-se um hospedeiro com um vetor adequado contendo um gene de anticorpo clonado a partir de um hibridoma usando técnicas de engenharia genética (observe por exemplo Carl, A . K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Especificamente, as seqüências de cDNA para as regiões variáveis (regiões V) de um anticorpo são sintetizadas de mRNA de um hibridoma usando uma transcriptase reversa. Uma vez que as seqüências de DNA codificando as regiões V do anticorpo de interesse tenham sido obtidas, elas podem ser ligadas às seqüências de DNA codificando as regiões constantes (regiões C) do anticorpo de interesse e integradas em um vetor de expressão. Alternativamente, as seqüências de DNA codificando as regiões V do anticorpo podem ser integradas em um vetor de expressão contendo as seqüências de DNA para as regiões C do anticorpo. Elas são integradas no vetor de expressão de uma tal maneira que elas podem ser expressas sob o controle de regiões reguladoras tais como realçadoras e promotoras. Em seguida, uma célula hospedeira pode ser transformada com este vetor de expressão para ex7

pressar o anticorpo.

Na presente invenção, os anticorpos recombinantes, isto é anticorpos artificialmente modificados para reduzir a antigenicidade em humanos ou para alcançar outros propósitos, tais como os anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados podem ser usados. Estes anticorpos modificados podem ser preparados por processos conhecidos. Os anticorpos quiméricos consistem nas regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo de um mamífero não-humano tal como um camundongo e das regiões constantes de cadeia pesada e leve de um anticorpo humano e podem ser obtidos ligando-se as seqüências de DNA codificando as regiões variáveis do anticorpo de camundongo às seqüências de DNA para as regiões constantes do anticorpo humano e transformando um hospedeiro com um vetor de expressão contendo as seqüências ligadas para permití-lo produzir um anticorpo quimérico.

Anticorpos humanizados são também chamados anticorpos humanos remodelados e obtidos enxertando-se as regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de um anticorpo de um mamífero não-humano tal como um camundongo nas regiões de determinação de complementaridade de um anticorpo humano e técnicas de recombinação de gene típicas para prepará-los são também conhecidas. Especificamente, as seqüências de DNA designadas para ligar as CDRs de um anticorpo de camundongo às regiões de estrutura (FRs) de um anticorpo humano são sintetizadas por PCR de diversos oligopeptídeos preparados por terem regiões de sobreposição terminais. As seqüências de DNA resultantes são ligadas às seqüências de DNA codificando as regiões constantes do anticorpo humano e então integradas em um vetor de expressão, que é transformado em um hospedeiro para permiti-las produzir um anticorpo remodelado (observe Publicação de Patente Européia N° EP 239400, Publicação Internacional N° WO 96/02576). As FRs do anticorpo humano ligadas pelas CDRs são selecionadas de uma tal maneira que as regiões de determinação de complementaridade formam um sítio de ligação de antígeno apropriado. Se necessário, os anticorpos humanizados remodelados podem ter algumas mudanças de • ··· · ····

aminoácidos nas regiões de estrutura das regiões variáveis de modo que as regiões de determinação de complementaridade formem um sítio de ligação de antígeno (Sato, K. e outro, Câncer Res. (1993) 53, 851 - 856).

Métodos para obter anticorpos humanos são também conhecidos. Por exemplo, um anticorpo humano desejado tendo uma atividade de ligação para um antígeno desejado pode ser obtido por imunização in vitro linfócitos humanos com o antígeno desejado ou uma célula expressando o antígeno desejado e fundindo os linfócitos imunizados à células de mieloma humanas tal como U266 (observe JPB N° HEI1 - 59878). Um anticorpo humano desejado pode também ser obtido imunizando-se um animal transgênico tendo todos os repertórios de gene de anticorpo humano com um antígeno (observe Publicações Internacionais Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735). Métodos para obter um anticorpo humano por paniculação empregando-se uma biblioteca de anticorpo humano são também conhecidos. Por exemplo, ligação de fagos a um antígeno pode ser selecionada expressando-se as regiões variáveis de um anticorpo humano como fragmentos de anticorpo de cadeia simples (scFv) sobre superfícies de fago por um método de exibição de fago. As seqüências de DNA codificando as regiões variáveis do anticorpo humano ligando-se ao antígeno podem ser determinadas analisando-se os genes dos fagos selecionados. Um anticorpo humano inteiro pode ser obtido preparando-se um vetor de expressão adequado com base nas seqüências de DNA determinadas dos fragmentos de scFv ligando-se ao antígeno. Estes métodos já são bem conhecidos de WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388.

Quando um anticorpo deve ser preparado transformando-se um gene de anticorpo preliminarmente isolado em um hospedeiro adequado, um hospedeiro adequado pode ser usado em combinação com um vetor de expressão. Células eucarióticas adequadas usadas como hospedeiros incluem células animais, células de planta e células fúngicas. Células animais conhecidas incluem (1) células mamíferas tais como CHO, COS, mieloma,

BHK (rim de hamster filhote), células HeLa e Vero; (2) células de anfíbios tais como oócitos Xenopus; ou (3) células de inseto tais como sf9, sf21 e Tn5. Células de planta conhecidas incluem células de Nicotiana tal como Nicotiana tabacum, que podem ser usadas como culturas de calosidade. Células fúngicas conhecidas incluem leveduras tal como Saccharomyces spp., por exemplo, Saccharomyces serevisiae e fungos filamentosos tal como Aspergillus spp., por exemplo Aspergillus niger. Células procarióticas podem ser usadas como sistemas de produção usando células bacterianas. Células bacterianas conhecidas incluem E. coli e Bacillus subtilis. Anticorpos podem ser obtidos transformando-se estas células com um gene de anticorpo de interesse e cultivando-se as células transformadas in vitro.

Anticorpos contidos em formulações estabilizadas da presente invenção incluem, porém não são limitados a, anticorpos de receptor anti-IL6, anticorpos monoclonais de antígeno anti-HM1.24, anticorpos de peptídeo relacionados ao antiparatormônio (anticorpos anti-PTHrP), etc.

Anticorpos humanizados remodelados preferidos para uso na presente invenção incluem anticorpos de receptor anti-IL-6 humanizados (hPM-1) (observe Publicação Internacional N° WO 92-19759), anticorpos monoclonais de antígeno anti-HM1.24 humanizados (observe Publicação Internacional N° WO98-14580) e anticorpos de peptídeo relacionados com o hormônio antiparatiróide humanizado (anticorpos anti-PTHrP) (observe Publicação Internacional N° WO98-13388).

Anticorpos contidos em formulações de solução da presente invenção podem pertencer qualquer classe de imunoglobulina, preferivelmente IgG tal como lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4, mais preferivelmente lgG1.

Formulações de solução contendo anticorpo na presente invenção preferivelmente não mostram nenhum aumento em multímeros e contêm 50 ou menos partículas solúveis por ml após o ciclo de congelamento/descongelamento.

Em soluções contendo anticorpo ou formulações de solução da presente invenção, a formação de dímeros durante os ciclos de congelamento/descongelamento pode ser inibida adicionando-se os açúcares. Os açúcares que podem ser usados incluem oligossacarídeos de não-redução, por exemplo dissacarídeos de não-redução tais como sacarose e trealose ou trissacarídeos de não-redução tal como rafinose, e especialmente preferidos são os oligossacarídeos de não-redução. Os oligossacarídeos de nãoredução preferidos são os dissacarídeos de não-redução, mais preferivelmente sacarose e trealose.

Em soluções contendo anticorpo ou formulações de solução da presente invenção, a formação de multímeros e produtos de degradação durante a armazenagem à longo prazo pode ser inibida adicionando-se açúcares. Os açúcares que podem ser usados incluem álcoois de açúcar tais como manitol e sorbitol; e oligossacarídeos de não-redução, por exemplo dissacarídeos de não-redução tal como sacarose e trealose ou trissacarídeos de não-redução tal como rafinose, entre os quais oligossacarídeos de não-redução são especialmente preferidos. Oligossacarídeos de nãoredução preferidos são dissacarídeos de não-redução, mais preferivelmente sacarose e trealose.

Os açúcares devem ser adicionados em 0,1 - 500 mg/ml, preferivelmente 10 - 300 mg/ml, mais preferivelmente 25-100 mg/ml.

Na presente invenção, a formação de partículas insolúveis durante os ciclos de congelamento/descongelamento de formulações de solução de anticorpo pode ser muito notavelmente inibida adicionando-se tensoativos. Exemplos típicos de tensoativos incluem:

tensoativos não-iônicos, por exemplo, ésteres de ácido graxo de sorbitan tal como monocaprilato de sorbitan, monolaurato de sorbitan, monopalmitato de sorbitan; ésteres de ácido graxo de glicerina tais como monocaprilato de glicerina, monomiristato de glicerina, monoestearato de glicerina; ésteres de ácido graxo de poliglicerina tais como monoestearato de decaglicerila, diestearato de decaglicerila, monolinoleato de decaglicerila; ésteres de ácido graxo de sorbitan de polioxietileno tais como monolaurato de sorbitan de polioxietileno, monooleato de sorbitan de polioxietileno, monoestearato de sorbitan de polioxietileno, monopalmitato de sorbitan de polioxietileno, trioleato de sorbitan de polioxietileno, triestearato de sorbitan de

Ja polioxietileno; ésteres de ácido graxo de sorbitol de polioxietileno tais como tetraestearato de sorbitol de polioxietileno, tetraoleato de sorbitol de polioxietileno; ésteres de ácido graxo de glicerina de polioxietileno tal como monoestearato de glicerila de polioxietileno; ésteres de ácido graxo de polietileno glicol tal como diestearato de polietileno glicol; éteres de alquila de polioxietileno tal como éter de laurila de polioxietileno; éteres de alquila de polioxipropileno de polioxietileno tais como éter de polioxipropileno glicol de polioxietileno, éter de propila de polioxipropileno de polioxietileno, éter de cetila de polioxipropileno de polioxietileno; éteres de fenila de alquila de polioxietileno tal como éter de fenila de nonila de polioxietileno; óleos de rícino endurecido de polioxietileno tal como óleo de rícino de polioxietileno, óleo de rícino endurecido de polioxietileno (óleo de rícino hidrogenado de polioxietileno); derivados de cera de abelha de polioxietileno tal como cera de abelha de sorbitol de polioxietileno; derivados de lanolina de polioxietileno tal como lanolina de polioxietileno; amidas de ácido graxo de polioxietileno tal como amida de ácido esteárico de polioxietileno tendo um HLB de 6-18;

tensoativos aniônicos, por exemplo, sulfatos de alquila tendo um grupo de C10 -18 alquila tais como sulfato de cetila de sódio, sulfato de laurila de sódio, sulfato de oleíla de sódio; sulfatos de éter de alquila de polioxietileno tendo um número de mol de EO médio de 2 - 4 e um grupo de C10 18 alquila tal como sulfato de laurila de polioxietilenode sódio; sais de éster de ácido sulfossucínico de alquila tendo um grupo de C8 - 18 alquila tal como laurilssulfossucinato de sódio; e tensoativos naturais, por exemplo, lecitina; glicerofosfolipídeos; esfingofosfolipídeos tal como esfingomielina; ésteres de ácido graxo de sacarose de ácidos graxos de C12 - 18. Formulações da presente invenção podem conter um ou mais destes tensoativos em combinação. Tensoativos preferidos para uso em formulações de solução da presente invenção são ésteres de ácido graxo de sorbitan de polioxietileno tal como Polissorbato 20, 40, 60 ou 80, especialmente Polissorbatos 20 e 80. Os polioxipropileno glicóis de polioxietileno tal como poloxâmeros (por exemplo, Pluronic® F-68) são também preferidos.

A quantidade de tensoativos a ser adicionada varia com o tipo do tensoativo particular usado, porém é tipicamente 0,001 - 100 mg /ml, preferivelmente 0,003 - 50 mg/mL, mais preferivelmente 0,005 - 2 mg /ml no caso de Polissorbato 20 ou Polissorbato 80.

Preferivelmente, formulações de solução contendo anticorpo da presente invenção são substancialmente livres de proteínas tal como albumina sérica humana ou gelatina purificada como estabilizadores.

Formulações de anticorpo da presente invenção preferivelmente têm um pH de 4 - 8, mais preferivelmente 5-7, ainda mais preferivelmente 6 - 6,5. Entretanto, o pH depende do anticorpo contido e não está limitado a estes valores.

Formulações da presente invenção podem também conter agentes isotonizantes, por exemplo, polietileno glicol; e açúcares tais como dextrana, manitol, sorbitol, inositol, glicose, frutose, lactose, xilose, manose, maltose, sacarose, trealose e rafinose.

Formulações de solução contendo anticorpo da presente invenção podem também conter diluentes, agentes solubilizantes, excipientes, modificadores de pH, agentes suavizantes, tampões, agentes de redução contendo súlfur, antioxidantes ou similares, se desejado. Por exemplo, agentes de redução contendo súlfur incluem N-acetilcisteína, Nacetilhomocisteína, ácido tióctico, tiodiglicol, tioetanolamina, tioglicerol, tiossorbitol, , ácido tioglicólico e sais destes, tiossulfato de sódio, glutationa, e compostos contendo sulfidrila tal como ácido tioalcanóico tendo 1 a 7 átomos de carbono. Antioxidantes incluem ácido eritórbico, dibutilidroxitolueno, butilidroxianisol, α-tocoferol, acetato de tocoferol, ácido L-ascórbico e sais destes, palmitato de L-ascorbila, estearato de L-ascorbila, bissulfito de sódio, sulfito de sódio, gaiato de triamila, gaiato de propila ou agentes de quelação tal como tetraacetato de etilenodiamina de dissódio (EDTA), pirofosfato de sódio e metafosfato de sódio. Outros aditivos comuns podem também ser contidos, por exemplo, sais inorgânicos tal como cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, fosfato de sódio, fosfato de potássio e bicarbonato de sódio; e sais orgânicos tais como citrato de sódio, citrato de potássio e acetato de sódio.

Formulações da presente invenção podem ser preparadas dissolvendo-se estes componentes em um tampão aquoso conhecido no campo de formulações de solução tal como um tampão de fosfato (preferivelmente sistema de fosfato de monohidrogênio de sódio - fosfato de dihidrogênio de sódio) e/ou um tampão de citrato (preferivelmente tampão de citrato de sódio) e/ou tampão de acetato para preparar uma formulação de solução. A concentração do tampão é tipicamente 1 - 500 mm, preferivelmente 5-100 mm, mais preferivelmente 10-20 mm.

Formulações de solução contendo anticorpo da presente invenção são normalmente administradas por meio de rotinas parenterais tal como injeção (por exemplo, injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal) ou administração percutânea, mucosal, nasal ou pulmonar, porém podem também ser oralmente administradas.

As formulações de solução contendo anticorpo da presente invenção podem ser normalmente fornecidas em recipientes de vidro ou plástico esterilizados e selados tendo um volume definido tais como frasconetes, ampolas ou seringas ou um volume grande tal como garrafas. Em termos de conveniência, seringas pré-enchidas são preferidas.

A quantidade de anticorpos contidos em formulações da presente invenção é tipicamente 0,1 - 200 mg /ml, preferivelmente 1-120 mg/ml, mais preferivelmente 2 - 22,5 mg /ml, dependendo do tipo da doença a ser tratada, da gravidade da doença, da idade do paciente e outros fatores.

Em formulações de solução da presente invenção, a formação de partículas insolúveis especialmente durante os ciclos de congelamento/descongelamento pode ser notavelmente inibida e a formação de matérias insolúveis durante os testes de estabilidade a longo prazo pode também ser notavelmente inibida adicionando-se tensoativos, como mostrado nos exemplos abaixo. Foi também constatado que a formação de multímeros tais como dímeros assim como a formação de produtos de degradação poderia ser notavelmente inibida e os teores de monômero de anticorpo res14

tantes poderíam ser aumentados adicionando-se açúcares.

Os seguintes exemplos também ilustram a presente invenção sem, entretanto, limitar o escopo da invenção a eles. Várias mudanças e modificações podem ser feitas por aqueles versados na técnica com base na descrição da invenção, e tais mudanças e modificações são também incluídas na presente invenção.

EXEMPLOS

Amostras de anticorpo

Um anticorpo hPM-1 foi usado como um anticorpo receptor antiIL-6 humanizado. O anticorpo hPM-1 foi um anticorpo hPM-1 humanizado preparado pelo método descrito no exemplo de Referência 2 de JPA HEI 899902 usando o promotor de fator Ia de alongamento humano no Exemplo 10 da Publicação de Patente Internacional n° WO92/19759.

Um anticorpo preparado pelo método descrito no exemplo de Referência 2 da Publicação de Patente Internacional n° WO98-35698 (a seguir referido como anticorpo anti-HM1.24) foi usado como um anticorpo monoclonal de antígeno anti-HM1.24 humanizado.

O anticorpo hPM-1 e anticorpo anti-HM1.24 usados nos seguintes exemplos são ambos antígenos de classe de lgG1.

Métodos de teste (A) Testes em anticorpo hPM-1 (1) Cromatografia de permeação de gel (GPC)

Cada amostra é diluída com a fase móvel para conter hPM-1 em uma quantidade equivalente a cerca de 1 mg em 1 ml e testada sob as seguintes condições de HPLC em 30-60 μΙ.

Coluna: Gel TSK G3000SW_XL(TOSOH)

Coluna Guard: Coluna guard TSK SW_XL (TOSOH)

Temperatura de coluna: constante em torno de 25°C

Fase móvel: 50 mm de tampão de fosfato (pH 7,0) - 300 mm de cloreto de sódio.

Taxa de fluxo : em tomo de 1,0 ml/min Medido em comprimento de onda: 280 nm

A área de pico foi determinada por integração automática para calcular o conteúdo de hPM-1 da área de pico de um produto hPM-1 padrão e a percentagem de hPM-1 restante dos resultados de avaliação inicial empregando-se as seguintes equações.

Conteúdo de hPM-1 (mg/ml) =

Concentração de produto hPM-1 padrão x Área de Pico de amostra de teste

Área de pico de produto hPM-1 padrão Percentagem hPM-1 restante (%) =

Conteúdo de hPM-1 após aceleração térmica e ciclos de oongelamento/desoongelamento x 100

Conteúdo de hPM-1 inicial

As percentagens de dímeros, outros multímeros e produtos de degradação foram calculadas pelo método de percentagem de área empregandose a seguinte equação :

Dímeros (ou outros multímeros ou produtos de degradação) (%) =

Área de pico de dímeros (ou outros multímeros ou produtos de degradação) x 100

Área de pico total (2) Avaliação do número de partículas insolúveis por uma contadora de partícula automática de obscuração de luz (HIAC)

A avaliação foi feita de acordo com o método empregando-se uma contadora de partícula de obscuração de luz automática como descrito na seção de Teste para Injeções de Matéria em Partículas Insolúveis na parte de Testes Gerais, Processos e Mecanismos na Farmacopéia Japonesa.

(3) Inspeção visual automática.

A inspeção visual automática foi realizada de acordo com o método como descrito na seção de Teste para Injeções de Matéria Insolúvel Estranha na parte de Testes Gerais, Processos e Mecanismos na Farmacopéia Japonesa.

Sistema de inspeção visual: Tipo E422 (Eisai).

(B) Testes sobre o anticorpo antí-HM1.24 (1) Cromatografia de permeação de gel (GPC); medida em N=3 para avaliar a percentagem restante (%) para o conteúdo inicial e também avaliar multímeros e produtos de degradação em percentagens.

• ·	• · · · · ·	•		• · · · ·
···	• * · · · ·	•	•	• · ·
	• · · · · · ·	•	•	• · ·
	··· ·· ·· ··	•	•	·· ····

Coluna: Gel de TSK G3000SW_XL(TOSOH)

Coluna Guard: Coluna guard TSK SW^ (TOSOH)

Temperatura de coluna: constante em tomo de 25°C

Taxa de fluxo : em torno de 0,5 ml/min.

Medida em comprimento de onda: 280 nm Método para calcular a concentração Conteúdo de anticorpo anti-HM1.24 (mg/ml) =

Concentração de padrão x área de pico de anticorpo arrtH-IMI 24 x Quantidade de padrão aplicada.

Área de pico total de padrão x Quantidade de amostra de teste aplicada. Percentagem de anticorpo anti-HM1.24 restante (%) =

Conteúdo de anticorpo anti-HM1.24 após a aceleração térmica x 100

Conteúdo de anticorpo anti-HM1.24 inicial

As percentagens de multímeros e os produtos de degradação foram calculados pelo método de percentagem de área.

Multímeros (ou produtos de degradação) (%) =

Área de pico de multímeros (ou produtos de degradação) x 100

Área de pico total

Exemplo 1: Efeitos de adição de um tensoativo (1)

A influência de um tensoativo (Polissorbato 80) sobre a estabilidade ao aquecimento e estabilidade em congelamento/descongelamento foi testada. Amostras contendo o Polissorbato 80 em várias concentrações mostradas na Tabela 1 foram preparadas e testadas como segue.

(1) A estabilidade em aceleração térmica (50°C - 2W) foi avaliada da percentagem de hPM-1 restante e a formação de multímeros e produtos de degradação como determinado por cromatografia de permeação de gel (GPC). O número de partículas insolúveis por ml foi avaliado por uma contadora de partícula de obscuração de luz automática (HIAC).

(2) Estabilidade em ciclo de congelamento/descongelamento (3 ciclos de estocagem a -20°C durante 3 dias e em seguida 5°C durante um dia) foi avaliada da percentagem de hPM-1 restante e a formação de multí17 • · ·

meros e produtos de degradação como determinado por cromatografia de permeação de gel (GPC). O número de partículas insolúveis por ml foi avaliado por uma contadora de partícula de obscuração de luz automática (HlAC).

Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1

<Amostras de teste e resultados>	Amostra 1	Amostra 2	Amostra 3	Amostra 4
hPM-1 (mg/ml)	20	20	20	20
Polissorbato 80 (mg/ml)	0	0,25	0,5	0,75
Fosfato de sódio (mm)	15	15	15	15
PH	6,5	6,5	6,5	6,5
Inicial	conteúdo de hPM-1 (mg/ml)	20,1	20,3	20,3	20,4
	Dímeros (%)	0,21	0,22	0,22	0,23
Outros multímeros (%)	0	0	0	0
Produtos de degradação (%)	0	0	0	0
Número de partículas de 10 pm ou mais (partículas/ml)	0	0	2	0
Número de partículas de 25 pm ou mais (partículas/ml)	0	0	0	0
Acelera- ção Térmica (50°C 2W)	hPM-1 restante (%)	99,4	98,2	98,1	98,0
Dímeros (%)	1,38	1,39	1,39	1,41
Outros multímeros (%)	0	0	0	0
Produtos de degradação (%)	0,94	0,91	0,90	0,90
Número de partículas de 10 pm ou mais (partículas/ml)	0	0	0	0
Número de partículas de 25 pm ou mais (partículas/ml)	0	0	0	0
Congelamento/desco ngelamento (20°C^ 5°C, 3 ciclos)	hPM-1 restante (%)	99,7	99,6	99,4	99,3
Dímeros (%)	0,60	0,56	0,52	0,49
Outros multímeros (%)	0	0	0	0
Produtos de degradação (%)	0	0	0	0
Número de partículas de 10 pm ou mais (partículas/ml)	3287	7	1	4
Número de partículas de 25 pm ou mais (partículas/ml)	539	3	0	0

Foi descoberto que a formação de partículas insolúveis durante os ciclos de congelamento/descongelamento é notavelmente inibido pela

adição de Polissorbato 80. Nenhuma variação significante em estabilidade com a concentração de Polissorbato 80 foi encontrada.

Exemplo 2: Efeitos da adição de um tensoativo (2)

A influência de um tensoativo (Polissorbato 80) sobre a estabili5 dade em ciclo de congelamento/descongelamento e agitação foi testada. Amostras contendo o Polissorbato 80 em várias concentrações mostradas na Tabela 2 foram preparadas e testadas como segue.

A estabilidade em ciclo de congelamento/descongelamento (2 ciclos de estocagem a -20°C durante 8 horas e em seguida 5°C durante 8 horas) foi avaliada do número de partículas insolúveis por ml quando avaliada por uma contadora de partícula de obscuração de luz automática (HIAC). A presença ou ausência de matérias insolúveis foi avaliada por inspeção visual automática.

Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2

Amostra 10	20	0,75	50	m	6,5	O	o	Não	-	o	Não
Amostra 9	20	0,5	50	m	6,5	O	o	Não	o	o	Não
Amostra 8	20	0,25	50	m	6,5	O	o	Não	o	o	Não
Amostra 7	20	0,05	50	in	6,5	O	o	Não	o	o	Não
Amostra θ	20	0,005	I 50	LO	6,5	O	o	Não	oo	o	Sim
Amostra 5	20	o	50	m V	6,5	O V“	CM	Sim	7020	601	Sim
<Amostras de teste e resultados>	hPM-1 (mg/ml)	Polissorbato 80 (mg/ml)	Sacarose (mg/ml)	Fosfato de sódio (mm)	Q.	Número de partículas de 10 pm ou mais (partículas/ml)	Número de partículas de 25 pm ou mais (partículas/ml)	Matérias insolúveis	Número de partículas de 10 pm ou mais (partículas/ml)	Número de partículas de 25 pm ou mais (partículas/ml)	Matérias insolúveis
Inicial	Congelamento/descongelame nto (-20°C -» 5°C, 2 ciclos)

Foi descoberto que a formação de partículas insolúveis e matérias insolúveis durante os ciclos de congelamento/descongelamento é notavelmente inibida pela adição de Polissorbato 80. O efeito contra a formação de matérias insolúveis foi descoberto ser dependente da concentração de

Polissorbato 80.

Exemplo 3: Efeitos de adição de açúcares.

A influência da adição de açúcares sobre a estabilidade de congelamento/descongelamento foi testada. Amostras contendo vários açúcares mostradas na Tabela 3 (sacarose, manitol, trealose) foram preparadas e avaliadas quanto à estabilidade do ciclo de congelamento/descongelamento (22 ciclos de estocagem a -20°C durante 2 horas e em seguida 5°C durante 2 horas) como determinado por cromatografia de permeação de gel (GPC) da quantidade de dímeros formada.

Tabela 3 • 15 <Amostras de Testes e resultados>

	Amostra 11	Amostra 12	Amostra 13	Amostra 14	Amostra 15
hPM-1 (mg/mL)	20	20	20	20	20
Sacarose (mg/ml)	0	50	0	0	0
Manitol (mg/ml)	0	0	50	94	0
Trealose (mg/ml)	0	0	0	0	0
Polissorbato 80 (mg/ml)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Fosfato de sódio (mm)	15	15	15	15	15
PH	6,5	6,5	6,5	6,5	6,5
Inicial	Dímeros (%)	0,42	0,43	0,41	0,38	0,42
Congelamento/descongelame nto (-20°C -> 5°C, 22 ciclos)	Dímeros (%)	0,67	0,43	0,89	2,60	0,41

Foi descoberto que a formação de dímeros é inibida pela adição de sacarose e trealose.

Exemplo 4: Influência de sacarose sobre a estabilidade ao calor e estabilidade ao congelamento/descongelamento.

A influência da sacarose sobre a estabilidade ao aquecimento e estabilidade ao congelamento/descongelamento foi testada. Amostras contendo sacarose em várias concentrações mostradas na Tabela 4 foram pre21

paradas e testadas como segue.

(1) Estabilidade em aceleração térmica (50°C - 2W) foi avaliada da percentagem de hPM-1 restante e a formação de multímeros e produtos de degradação como determinado por cromatografia de permeação de gel (GPC). O número de partículas insolúveis por ml foi avaliado por uma contadora de partícula de obscuração de luz automática (HIAC).

(2) Estabilidade ao ciclo de congelamento/desoongelamento (3 ciclos de estocagem a -20°C durante 3 dias e em seguida 5°C durante um dia) foi avaliada da percentagem de hPM-1 restante e a formação de multí10 meros e produtos de degradação como determinado por cromatografia de permeação de gel (GPC). O número de partículas insolúveis por ml foi avaliado por uma contadora de partícula de obscuração de luz automática (HIAC).

Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 4.

* 15 Tabela 4 <Amostras de teste e resultados>

	Amostra 16	Amostra 17	Amostra 18	Amostra 19
hPM-1 (mg/mL)	20	20	20	20
Sacarose (mg/ml)	0	25	50	100
Polissorbato 80 (mg/ml)	0,5	0,5	0,5	0,5
Fosfato de Sódio (mm)	15	15	15	15
pH	6,5	6,5	6,5	6,5
Inicial	Conteúdo hPM-1 (mg/ml)	19,2	19,2	19,3	19,3
Dímeros (%)	0,18	0,16	0,15	0,15
Outros multímeros (%)	0	0	0	0
Produtos de degradação (%)	0	0	0	0
Número de partículas de 10 pm ou mais (partículas/ml)	0	0	12	0
Número de partículas de 25 pm ou mais (partículas/ml)	0	0	1	0

Continuação

	Amostra 16	Amostra 17	Amostra 18	Amostra 19
Aceleração térmica (50% -2W)	hPM-1 restante (%)	98,2	98,5	97,8	97,8
Dímèros (%)	1,37	1,47	1,36	1,41
Outros multímeros (%)	0	0	0	0
Produtos de degradação (%)	0,92	0,89	0,89	0,89
Número de partículas de 10 pm ou mais (partículas/ml)	0	0	0	0
Número de partículas de 25 pm ou mais (partículas/ml)	0	0	0	0
Congelamento/descongela mento (-20°C —> 5°C, 3 cicios)	hPM-1 restante (%)	100,2	100,8	100,4	100,2
Dímeros (%)	0,36	0,18	0,17	0,15
Outros multímeros (%)	0	0	0	0
Produtos de degradação (%)	0	0	0	0
Número de partículas de 10 pm ou mais (partículas/ml)	1	3	5	2
Número de partículas de 25 pm ou mais (partículas/ml).	1	0	0	0

Foi constatado que a formação de dímeros durante os ciclos de congelamento/descongelamento é notavelmente inibida pela adição de sacarose. Nenhuma variação em estabilidade com a concentração de sacaro5 se foi encontrada.

Exemplo 5: Influência de concentração de anticorpo,

A influência da concentração de hPM-1 sobre a estabilidade ao aquecimento foi testada. Amostras contendo hPM-1 em várias concentrações mostradas na Tabela 5 foram preparadas e testadas como segue.

A estabilidade em aceleração térmica (50% - 2W) foi avaliada da percentagem de hPM-1 restante e a formação de multímeros e produtos de degradação como determinado por cromatografia de permeação de gel (GPC). O número de partículas insolúveis por ml foi avaliado por uma contadora de partícula de obscuração de luz automática (HIAC).

·· ···· ·· ········

Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5 <Amostras de teste e resultados>

	Amostra 20	Amostra 21	Amostra 22
hPM-1 (mg/mL)	17,5	20	22,5
Sacarose (mg/ml)	50	50	50
Polissorbato 80 (mg/ml)	0,5	0,5	0,5
Fosfato de Sódio (mm)	15	15	15
PH	6,5	6,5	6,5
Inicial	conteúdo hPM-1 (mg/ml)	17,0	19,3	21,4
Dímeros (%)	0,16	0,16	0,18
Outros multímeros (%)	0	0	0
Produtos de degradação (%)	0	0	0
Número de partículas de 10 pm ou mais (partículas/ml)	0	0	0
Número de partículas de 25 pm oü mais (partículas/ml)	0	0	0
Aceleração térmica (50% - 2W)	hPM-1 restante (%)	99,6	100,2	99,8
Dímeros (%)	1,26	1,35	1,45
Outros multímeros (%)	0	0	0
Produtos de degradação (%)	0,95	0,93	0,99
Número de partículas de 10 pm ou mais (partículas/ml)	0	3	0
Número de partículas de 25 pm ou mais (partículas/ml)	0	0	0

Nenhuma variação em estabilidade com a concentração de hPM-1 foi encontrada.

Exemplo 6: Influência das concentração de tampão de fosfato.

A influência da concentração de tampão de fosfato sobre a estabilidade ao aquecimento foi testada. Amostras contendo tampão de fosfato em várias concentrações mostradas na Tabela 6 foram preparadas e testa10 das como segue.

A estabilidade em aceleração térmica (50°C - 2W) foi avaliada da percentagem de hPM-1 restante e a formação de multímeros e produtos • ·· ···· ·· ········ ··

de degradação como determinado por cromatografia de permeação de gel (GPC). O número de partículas insolúveis por ml foi avaliado por uma contadora de partícula de obscuração de luz automática.

Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 6.

Tabela 6 <Amostras de teste e resultados>

	Amostra 23	Amostra 24	Amostra 25
hPM-1 (mg/mL)	20	20	20
Sacarose (mg/ml)	50	50	50
Polissorbato 80 (mg/ml)	0,5	0,5	0,5
Fosfato de Sódio (mm)	10	15	20
PH	6,5	6,5	6,5
Inicial	conteúdo hPM-1 (mg/ml)	19,3	19,4	19,4
Dímeros (%)	0,17	0,18	0,18
Outros multímeros (%)	0	0	0
Produtos de degradação (%)	0	0	0
Número de partículas de 10 pm ou mais (partículas/ml)	0	0	0
Número de partículas de 25 qm ou mais (partículas/ml)	0	0	0
Aceleração térmica (50% - 2W)	hPM-1 restante (%)	100,1	99,0	99,2
Dímeros (%)	1,37	1,43	1,45
Outros multímeros (%)	0	0	0
Produtos de degradação (%)	0,94	0,95	0,94
Número de partículas de 10 qm ou mais (partículas/ml)	0	0	0
Número de partículas de 25 qm ou mais (partículas/ml)	0	0	0

Nenhuma variação em estabilidade com a concentração de tampão de fosfato foi encontrada.

Exemplo 7: Efeitos da adição de açúcares.

Os testes de estabilidade ao aquecimento foram realizados para avaliar os efeitos da adição de um açúcar (sacarose ou manitol) em concen25

• · · · ······ trações de anticorpo anti-HM1.24 na faixa de 2,5-10 mg mg/ml. As amostras contendo o açúcar em várias concentrações em preparações de anticorpo anti-HM1.24 baixa e elevada (frasconetes de 1 ml/ 5 ml) e determinadas quanto a percentagem restante (%), multímeros (%) e produtos de de5 gradação (%) sob várias condições de estocagem (60°C -1W, 50°C -3M, 5°C -6M, Inicial).

As formulações de teste de preparações de baixa concentração e os resultados são mostrados nas Tabelas 7 e 8, enquanto que as formulações de teste de preparações de concentração elevada e os resultados são mostrados nas Tabelas 9 e 10.

Tabela 7

	Amostra 26	Amostra 27	Amostra 28	Amostra 29	Amostra 30	Amostra 31	Amostra 32
Anticorpo AntiH.M1.24 (mg/ml)	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5	2,5
Sacarose (mg/ml)	10	50	100	-	-	-	-
Manitol (mg/ml)	-	-	-	10	50	100	-
NaCl (mm)	100	100	100	100	100	100	100
PH	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0

Tabela 8

60°C-1W	Percentagem restante (%)	Multímeros (%)	Produtos de degradação (%)
Amostra 26	90,9%	5,06%	1,99%
Amostra 27	91,1%	4,60%	1,98%
Amostra 28	90,0%	4,14%	2,05%
Amostra 29	85,5%	5,04%	2,20%
Amostra 30	90,3%	4,99%	1,99%
Amostra 31	86,6%	5,57%	2,63%
Amostra 32	88,9%	5,39%	2,09%

50°C-3W	Percentagem restante (%)	Multímeros (%)	Produtos de degradação (%)
Amostra 26	77,0%	14,0%	6,98%
Amostra 27	81,5%	13,7%	6,46%
Amostra 28	84,9%	12,9%	4,83%
Amostra 29	78,9%	14,3%	7,31%
Amostra 30	75,2%	13,2%	6,72%
Amostra 31	76,1%	12,7%	6,24%
Amostra 32	76,8%	15,5%	7,62%

5°C-6W	Percentagem restante (%)	Multímeros (%)	Produtos de degradação (%)
Amostra 26	103,8%	3,82%	0,00%
Amostra 27	104,0%	3,44%	0,00%
Amostra 28	104,2%	3,43%	0,00%
Amostra 29	103,8%	3,49%	0,00%
Amostra 30	104,3%	3,46%	0,00%
Amostra 31	104,3%	3,45%	0,00%
Amostra 32	103,5%	3,49%	0,00%

Inicial	Percentagem restante (%)	Multímeros (%)	Produtos de degradação (%)
Amostra 26	100,0%	3,73	0,00%
Amostra 27	100,0%	3,34	0,00%
Amostra 28	100,0%	3,34	0,00%
Amostra 29	100,0%	3,38	0,00%
Amostra 30	100,0%	3,36	0,00%
Amostra 31	100,0%	3,36	0,00%
Amostra 32	100,0%	3,38	0,00%

Após aceleração térmica a 50°C - 3M, as amostras mostraram um aumento na percentagem de monômero de anticorpo restante e um decréscimo na formação de multímeros e produtos de degradação de uma maneira dependente da concentração de sacarose adicionada. Após a aceleração a 60°C-1W, as amostras também mostraram um decréscimo da quantidade de multímeros formada. Sob a aceleração a 50°C-3M, o efeito de adição de açúcar sobre a percentagem de anticorpo restante foi mais

··»····· ·· • · · · • · · · • · · · • · · · • · ··

notável com sacarose do que com manitol. O efeito de adição de açúcar sobre a inibição de associação foi também encontrado com manitol.

Tabela 9

	Amostra 33	Amostra 34	Amostra 35	Amostra 36	Amostra 37	Amostra 38
Anticorpo anti-H.M1.24 (mg/ml)	2,5	5,0	5,0	10	10	10
Polissorbato 80 (%)	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025
Acetato (mm)	20	20	20	20	20	20
NaCI (mm)	100	100	100	100	100	100
PH	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0	6,0
Sacarose (mg/ml)	10	10	20	10	40	0

Tabela 10

60°C-1W	Percentagem restante (%)	Multímeros (%)	Produtos de degradação (%)
Amostra 33	96,6%	4,78%	2,16%
Amostra 34	96,1%	6,47%	1,84%
Amostra 35	96,1%	6,33%	1,84%
Amostra 36	96,1%	6,66%	1,76%
Amostra 37	97,0%	5,96%	1,75%
Amostra 38	95,3%	7,11%	1,82%

50°C-3W	Percentagem restante (%)	Multímeros (%)	Produtos de degradação (%)
Amostra 33	94,6%	5,01%	2,12%
Amostra 34	95,9%	5,62%	2,06%
Amostra 35	95,9%	5,27%	2,09%
Amostra 36	96,7%	5,37%	1,97%
Amostra 37	97,1%	4,95%	1,96%
Amostra 38	95,5%	5,69%	2,02%

5°C-6W	Percentagem restante (%)	Multímeros (%)	Produtos de degradação (%)
Amostra 33	107,8%	3,50%	0,00%
Amostra 34	106,1%	3,52%	0,00%
Amostra 35	106,1%	3,51%	0,00%
Amostra 36	104,0%	3,59%	0,00%
Amostra 37	104,1%	3,57%	0,00%
Amostra 38	103,7%	3,61%	0,00%

··»· ·· »······· ·· »· · · · · · · I »····· · · a » ♦ · · · · · a » · β ·· «· · · a • · · · · · · · »· ···

Inicial	Percentagem restante (%)	Multímeros (%)	Produtos de degradação (%)
Amostra 33	100,0%	3,40%	0,00%
Amostra 34	100,0%	3,36%	0,00%
Amostra 35	100,0%	3,36%	0,00%
Amostra 36	100,0%	3,38%	0,00%
Amostra 37	100,0%	3,37%	0,00%
Amostra 38	100,0%	3,39%	0,00%

Comparação das quantidades de multímeros formados após a aceleração térmica mostrou que a associação é inibida melhor quando a concentração de sacarose adicionada aumenta na mesma concentração de anticorpo anti-HM1.24. Foi descoberto que a sacarose também contribui para a inibição de associação em formulações de anticorpo anti-HM1.24 de concentração elevada.

Exemplo 8: Efeitos de adição de açúcar.

Os efeitos de adição de sacarose foram também testados em várias quantidades. As amostras mostradas na Tabela 11 foram preparadas e estocadas a 50°C - 1M, após o que a percentagem de anticorpo de monômero restante e a quantidade de multímeros foram determinadas por GPC. Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 12.

Tabela 11

	Amostra 39	Amostra 40	Amostra 41	Amostra 42
Anticorpo anti-H.M1.24 (mg/ml)	10	10	10	10
Polissorbato 80 (%)	0,05	0,05	0,05	0,05
Acetato (mmol/l)	10	10	10	10
NaCI (mmol/l)	100	100	100	100
PH	6,0	6,0	6,0	6,0
Sacarose (mg/ml)	0	25	50	75

···*···· ·· • · · • · · · • · · · • · · · • · ·· ·· ···· • · · · • ♦ · · • · · · • · · · · ·· ··

Tabela 12

	Percentagem restante (%)	Multímeros (%)
	Inicial	50°C-1M	Inicial	50°C-1M
Amostra 39	100,0%	83,3%	3,6%	12,2%
Amostra 40	100,0%	86,4%	3,6%	9,7%
Amostra 41	100,0%	87,8%	3,5%	8,4%
Amostra 42	100,0%	87,2%	3,5%	8,9%

Foi descoberto que a sacarose é eficaz para inibição da formação de multímeros de anticorpo anti-HM1.24..

Exemplo 9: Efeitos da adição de açúcares (teste de congelamen5 to/descongelamento).

A influência da adição de açúcares (dissacarídeos de nãoredução e trissacarídeos de não-redução) em estabilidade de congelamento/descongelamento foi testada. As amostras contendo açúcares apresentadas na Tabela 13 foram preparadas e submetidas a um teste de congela10 mento/descongelamento sob as seguintes condições.

A estabilidade em ciclo de congelamento/descongelamento foi avaliada a partir da formação de dímeros (multímeros) como determinado por cromatografia de permeação de gel (GPC).

<Condições do teste>

Descongelamento:-20°C-» 5°C (1 hora)

Mantida: 5°C (6 horas)

Congelamento: 5°C -> 20°C (1 hora): -20°C (16 horas)

O ciclo de temperatura acima foi repetido 3, 7 e 21 vezes.

Tabela 13 < Amostras de teste e resultados >

	Amostra 43	Amostra 44	Amostra 45	Amostra 46
hPM-1 (mg/mL)	20	20	20	20
Polissorbato 80 (mg/mL)	0,5	0,5	0,5	0,5
Fosfato de sódio (mM)	15	15	15	15
PH	6,5	6,5	6,5	6,5
Aditivo (mM)	-	Sacarose 145	Trealose 145	Rafinose 145

Continuação

	Amostra 43	Amostra 44	Amostra 45	Amostra 46
Inicial	Dímeros (%)	0,4	0,4	0,4	0,4
Outros multímeros (%)	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
Quantidade total de multímeros (%)	0,4	0,4	0,4	0,4
3 Ciclos de congelamen to/descong elamento	Dímeros (%)	0,7	0,4	0,5	0,8
Outros multímeros (%)	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
Quantidade total de multímeros (%)	0,7	0,4	0,5	0,8
7 Ciclos de congelamen to/descong elamento	Dímeros (%)	0,8	0,5	0,4	1,0
Outros multímeros (%)	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
Quantidade total de multímeros (%)	0,8	0,5	0,4	1,0
21 Ciclos de congelamento/descong elamento	Dímeros (%)	1,0	0,4	0,5	1,3
Outros multímeros (%)	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
Quantidade total de multímeros (%)	1,0	0,4	0,5	1,3

Esses resultados mostraram que a formação de dímeros de anticorpo hPM-1 durante ciclos de congelamento/descongelamento pode ser notavelmente inibida por adição de dissacarídeos de não-redução (sacaro5 se, trealose).

Exemplo 10: Efeitos da adição de açúcares (Teste de tensão do calor).

A influência da adição de açúcares (dissacarídeos de nãoredução e trissacarídeos de não-redução) em estabilidade durante carregamento térmico foi testada. As amostras contendo açúcares apresentadas nas Tabelas 14 e 15 foram preparadas e submetidas a um teste de tensão do calor sob as seguintes condições.

A estabilidade durante carregamento térmico foi avaliada a partir da formação de dímeros e multímeros como determinado por cromatografia de permeação de gel (GPC).

Tabela 14 < Amostras do teste e resultados >

	Amostra 47	Amostra 48	Amostra 49	Amostra 50
hPM-1 (mg/mL)	20	20	20	20
Polissorbato 80 (mg/mL)	0,5	0,5	0,5	0,5
Fosfato de sódio (mM)	15	15	15	15
PH	6,5	6,5	6,5	6,5
Aditivo (mM)	-	Sacarose 145	Trealose 145	Rafino- se 145
Inicial	Dímeros (%)	0,4	0,4	0,4	0,4
Outros multímeros (%)	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
Quantidade total de multímeros (%)	0,4	0,4	0,4	0,4
Teste de tensão ao aquecimento 60°C -14 dias	Dímeros (%)	5,2	6,0	5,6	6,9
Outros multímeros (%)	6,1	4,5	4,5	4,7
Quantidade total de multímeros (%)	11,2	10,5	10,0	11,7

Esses resultados mostraram que a quantidade total de multímeros e a formação de outros multímeros nas formulações de anticorpo hPM-1 podem ser notavelmente inibida pela adição de dissacarídeos de nãoredução (sacarose, trealose). Tabela 15

	Amostra 51	Amostra 52	Amostra 53	Amostra 54
Anticorpo anti-HM1.24 (mg/ml)	10	10	10	10
Polissorbato 80 (mg/mL)	0,25	0,25	0,25	0,25
Acetato (mm)	30	30	30	30
PH	6,0	6,0	6,0	6,0
Aditivo (mM)	-	Sacarose 145	Trealose 145	Rafinose 145
Inicial	Dímeros (%)	2,8	2,8	2,8	2,8
Outros multímeros (%)	0,5	0,5	0,5	0,5
Quantidade total de multímeros (%)	3,3	3,3	3,3	3,3

Continuação

	Amostra 51	Amostra 52	Amostra 53	Amostra 54
Teste de tensão do calor 60°C 14 dias	Dímeros (%)	9,2	10,4	9,5	9,9
Outros multímeros (%)	5,6	2,9	4,1	4,3
Quantidade total de multímeros (%)	14,8	13,3	13,6	14,2

Foi mostrado que a quantidade total de multímeros e a formação de outros multímeros são notavelmente inibidas pela adição de dissacarídeos de não-redução (sacarose, trealose) em formulações de anticorpo anti5 HM1.24 similarmente às formulações de anticorpo hPM-1.

Exemplo 11: Efeitos da adição de açúcares (teste de aceleração de luz)

A influência da adição de açúcares (dissacarídeos de nãoredução e trissacarídeos de não-redução) em estabilidade durante aceleração de luz foi testada. As amostras contendo açúcares apresentadas nas ♦ 10 Tabelas 16 e 17 foram preparadas e submetidas a um teste de aceleração de luz sob as seguintes condições.

A estabilidade durante aceleração de luz foi avaliada a partir da formação de dímeros e multímeros quando determinada por cromatografia de permeação de gel (GPC).

Tabela 16 < Amostras do teste e resultados >

	Amostra 55	Amostra 56	Amostra 57	Amostra 58
hPM-1 (mg/mL)	20	20	20	20
Polissorbato 80 (mg/mL)	0,5	0,5	0,5	0,5
Fosfato de sódio (mM)	15	15	15	15
pH	6,5	6,5	6,5	6,5
Aditivo (mM)	-	Sacarose 145	Trealose 145	Rafinose 145
Inicial	Dímeros (%)	0,4	0,4	0,4	0,4
Outros multímeros (%)	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
Quantidade total de multímeros (%)	0,4	0,4	0,4	0,4

• · • ·

Continuação

	Amostra 55	Amostra 56	Amostra 57	Amostra 58
Teste de aceleração de luz 1.200.000 Lux.hr	Dímeros (%)	3,5	2,5	3,2	3,5
Outros multímeros (%)	N.D.	N.D.	N.D.	N.D.
Quantidade total de multímeros (%)	3,5	2,5	3,2	3,5

Foi mostrado que a dimerização induzida por luz de anticorpo hPM-1 pode ser notavelmente inibida pela adição de sacarose.

Tabela 17

	Amostra 59	Amostra 60	Amostra 61	Amostra 62
Anticorpo anti-HM1.24 (mg/ml)	10	10	10	10
Polissorbato 80 (mg/mL)	0,25	0,25	0,25	0,25
Acetato (mm)	30	30	30	30
pH	6,0	6,0	6,0	6,0
Aditivo (mM)	-	Sacarose 145	Trealose 145	Rafinose 145
Inicial	Dímeros (%)	2,8	2,8	2,8	2,8
Outros multímeros (%)	0,5	0,5	0,5	0,5
Quantidade total de multímeros (%)	3,3	3,3	3,3	3,3
Teste de aceleração de luz 1.200.000 Lux.hr	Dímeros (%)	3,8	4,1	3,4	3,1
Outros multímeros (%)	2,8	0,8	2,8	2,9
Quantidade total de multímeros (%)	6,6	4,9	6,2	6,0

Foi mostrado que a associação induzida por luz de anticorpo anti-HM1.24 pode ser notavelmente inibida pela adição de sacarose.

Exemplo 12: Efeitos da adição de espécies de tensoativo.

A influência de espécies de tensoativo sobre a estabilidade de congelamento/descongelamento foi testada. As amostras contendo tensoa10 tivos mostradas na Tabela 18 foram preparadas e testadas como segue.

A estabilidade ao ciclo de congelamento/descongelamento (3 ciclos de congelamento a -25°C/descongelamento a 4°C) foi avaliada a partir do número de partículas por ml quando avaliada por uma contadora de partícula de obscuração de luz automática (HIAC).

< Amostras do teste e resultados >

Amos- tra 74	Tf	250	20	o	O	o	CM	in	CM
Amostra 73	Tf	250 I_	20	o	O	o	-	Tf	O
ZL B4 -soiuv	Tf	250	20	7,0	O	o	0,5	CD	CM
Amostra 71	Tf	250	20	o	o	o	0,1	b-	CM
Amostra 70	Tf	250	20	7,0	o	0,1	o	00	CO
Amostra 69	Tf	250	20	7,0	o	0,05	o	ID	CO
Amostra 68	Tf	250	20	7,0	o	0,01	o	Tf	CM
Amostra 67	Tf	250	20	7,0	o	o	o	σ>	O
Amostra 66	Tf	250	20 I	7,0	0,05	o	o	o	-
Amostra 65	Tf	250	20	7,0	0,01	o	o	22	-
Amostra 64	Tf	250	20	o b-~	0,005	o	o	49	o
Amostra 63	Tf	250	20	7,0	o	o	o	290	CO
	hPM-1 (mg/ml)	NaCI (mm)	Fosfato de sódio (mm)	X Q.	Polissorbato 80 (mg/ml)	Polissorbato 20 (mg/ml)	Poloxâmero 188 (mg/ml)	Número de partículas de 10 pm ou mais (partículas/ml)	Número de partículas de 25 pm ou mais (partículas/ml)
Congelamen to/descong elamento (25°C-> 4°C, 3 ciclos)

···· ·· ········ ··

Foi descoberto que a formação de partículas insolúveis durante ciclos de congelamento/descongelamento é notavelmente inibida pela adição de espécies de tensoativo (Polissorbato 80, Polissorbato 20, Poloxâmero 188).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Formulação de solução contendo anticorpo, caracterizada pelo fato de que incluí sacarose como um estabilizador e Polisorbato 80 como um estabilizador, em que o dito anticorpo é o anticorpo humanizado anti5 receptor de interleucina 6 (anticorpo hPM-1), em que a quantidade de sacarose na formulação é de 25 a 100 mg/ml, a quantidade de Polisorbato 80 na formulação é 0,005 a 2 mg/ml, a quantidade de anticorpo na formulação é 2 a 22,5 mg/ml, a formulação apresenta um pH de 6 a 6,5 e em que a formulação é obtida pela dissolução dos constituintes em um tampão de fosfato de

10 sódio apresentando uma concentração de 10 a 20 mM.

Petição 870170075937, de 06/10/2017, pág. 5/8