BRPI0414539B1 - composto, composição farmacêutica, e, uso de um composto - Google Patents

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Abstract

COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE UM COMPOSTO. Novos derivados de polipeptídeo tendo perfil de ação prolongada.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção diz respeito a novos derivados de peptídeo 1 semelhante a glucagon (GLP-1) e seus fragmentos e análogos de tais fragmentos que têm um perfil prolongado de ação e métodos de fabricar e de usá-los. Além disso, a invenção diz respeito a novos derivados de exendina e o uso de tais derivados.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] Os peptídeos são amplamente usados na prática médica e visto que podem ser produzidos pela tecnologia de DNA recombinante pode ser esperado que sua importância também aumentará nos anos futuros. Quando os peptídeos naturais ou seus análogos são usados na terapia, no geral, é observado que estes têm uma alta liberação. Uma alta liberação de um agente terapêutico é inconveniente nos casos onde é desejado manter um alto nível sangüíneo deste por um período prolongado de tempo visto que administrações repetidas, então, serão necessárias. Os exemplos de peptídeos que têm uma alta liberação são: ACTH, fator de liberação de corticotropina, angiotensina, calcitonina, insulina, glucagon, peptídeo 1 semelhante ao glucagon, peptídeo 2 semelhante ao glucagon, fator de crescimento 1 semelhante à insulina, fator de crescimento 2 semelhante à insulina, peptídeo inibidor gástrico, fator de liberação de hormônio de crescimento, peptídeo de ativação da adenilato ciclase da pituitária, secretina, enterogastrina, somatostatina, somatotropina, somatomedina, hormônio paratiróide, trombopoietina, eritropoietina, fatores de liberação hipotalâmicos, prolactina, hormônios estimuladores da tiróide, endorfinas, encefalinas, vasopressina, oxitocina, opióides e análogos destes, superóxido dismutase, interferon, asparaginase, arginase, arginina desaminase, adenosina desaminase e ribonuclease. Em alguns casos é possível influenciar o perfil de liberação de peptídeos pela aplicação de composições farmacêuticas adequadas, mas este método tem várias falhas e, no geral, não aplicáveis.
[0003] O número de peptídeos e proteínas endógenos conhecidos com atividades biológicas interessantes está aumentando rapidamente, também como uma exploração contínua do genoma humano. Devido a suas atividades biológicas, muitos destes peptídeos podem, em princípio, serem usados como agentes terapêuticos. Os peptídeos endógenos, entretanto, nem sempre são adequados como medicamentos candidatos porque estes peptídeos freqüentemente tem vidas médias de alguns minutos devido à degradação rápida pelas peptidases e/ou devido à filtração renal e excreção na urina. A vida média dos polipeptídeos no plasma humano varia grandemente (de alguns minutos a mais de um ano). Similarmente, a vida média de medicamentos de molécula pequena também é altamente variável. A razão desta variabilidade forte de vidas médias de plasma de peptídeos, proteínas ou outros compostos não é, entretanto, bem entendida. Desta maneira, existe uma necessidade de modificar os compostos terapêuticos para fornecer duração mais longa de ação in vivo enquanto mantém a toxicidade baixa e vantagens terapêuticas.
[0004] A albumina de soro tem uma vida média de mais de uma semana e um método para aumentar a vida média do plasma de peptídeos foi derivatizar os peptídeos com uma entidade química que se liga à albumina de soro.
[0005] Knudsen et al. (J. Med. Chem. 2000,43, 1664 a 1669) mostraram que os peptídeos de GLP-1 acilados apresentam potência receptora alta e um aumento de dez vezes da vida média do plasma em porcos.
[0006] Zobel et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 1513 a 1515) mostraram que a vida média do plasma de um peptídeo anticoagulante em coelhos aumentou de 10 a 50 vezes na derivatização do terminal amino com o fosfato éster com base em moléculas pequenas que se ligam à albumina do soro.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0007] A presente invenção diz respeito a um composto que compreende um polipeptídeo terapêutico ligado a um resíduo que se liga à albumina por intermédio de um espaçador hidrofílico.
[0008] A presente invenção também diz respeito a um composto que compreende um polipeptídeo terapêutico ligado a um resíduo que se liga à albumina por intermédio de um espaçador hidrofílico que separa o polipeptídeo e a resíduo que se liga à albumina com uma porção química que compreende pelo menos 5 átomos que não hidrogênio onde de 30 a 50 % destes átomos são N ou O.
[0009] Em uma forma de realização desta invenção o espaçador é definido como -(CH2)ID[(CH2)nE]m(CH2)pQq-, em que l, m e n são independentemente de 1 a 20 e p é de 0 a 10,
[0010] Q é -Z-(CH2)ID[(CH2)nG]m(CH2)p-,
[0011] q é um número inteiro na faixa de 0 a 5, cada D, E e G são independentemente selecionados de -O-, -NR3-, -N(COR4)-, -PR5(O)- e -P(OR6)(O)-, em que R3, R4, R5 e R6 representam independentemente hidrogênio ou alquila C1-6,
[0012] Z é selecionado de -C(O)NH-, -C(O)NHCH2-, -OC(O)NH-, - C(O)NHCH2CH2-, -C(O)CH2-, -C(O)CH=CH-, -(CH2)s-, -C(O)-, -C(O)O-ou -NHC(O)-, em que s é 0 ou 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável ou pró-droga deste.
[0013] A presente invenção também diz respeito a um composto que tem a fórmula (I):
[0014] A—W—B—Y— polipeptídeo terapêutico (I)
[0015] em que
[0016] A é um resíduo que se liga à albumina,
[0017] B é um espaçador hidrofílico sendo -(CH2)ID[(CH2)nE]m(CH2)pQq-, em que
[0018] l, m e n são independentemente de 1 a 20 e p é de 0 a 10,
[0019] Q é -Z-(CH2)ID[(CH2)nG]m(CH2)p-,
[0020] q é um número inteiro na faixa de 0 a 5, cada D, E e G são independentemente selecionados de -O-, -NR3-, -N(COR4)-, -PR5(O)- e -P(OR6)(O)-, em que R3, R4, R5 e R6 representam independentemente hidrogênio ou alquila C1-6,
[0021] Z é selecionado de -C(O)NH-, -C(O)NHCH2-, -OC(O)NH-, - C(O)NHCH2CH2-, -C(O)CH2-, -C(O)CH=CH-, -(CH2)s-, -C(O)-, -C(O)O-ou -NHC(O)-, em que s é 0 ou 1,
[0022] Y é um grupo químico que liga B e o agente terapêutico e
[0023] W é um grupo químico que liga A e B.
[0024] A presente invenção também diz respeito a um composto que tem a fórmula (II)
[0025] A—W—B—Y— polipeptídeo terapêutico —Y’—B’—W’—A’ (II)
[0026] em que
[0027] A e A’ resíduos que se ligam à albumina, B e B’ são espaçadores hidrofílicos independentemente selecionados de -(CH2)lD[(CH2)nE]m(CH2)p-Qq-, em que I, m e n são independentemente de 1 a 20 e p é de 0 a 10,
[0028] Q é -Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-, q é um número inteiro na faixa de 0 a 5, cada D, E e G são independentemente selecionados de -O-, -NR3-, -N(COR4)-, - PR5(O)-e -P(OR6(O)-, em que R3, R4, R5 e R6 representam independentemente hidrogênio ou alquila C1-6,
[0029] Z é selecionado de -C(O)NH-, -C(O)NHCH2-, -OC(O)NH-, - C(O)NHCH2CH2-, -C(O)CH2-, -C(O)CH=CH-, -(CH2)S-, -C(O)-, -C(O)O- ou -NHC(O)-, em que s é 0 ou 1,
[0030] Y é um grupo químico que liga B e o agente terapêutico e
[0031] Y’ é um grupo químico que liga B’ e o agente terapêutico e
[0032] W é um grupo químico que liga A e B e
[0033] W’’ é um grupo químico que liga A’ e B’.
[0034] Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a um composto que tem a fórmula (III)
[0035] A—W’’—B—Y—polipeptídeo terapêutico (III)
[0036] |
[0037] A’
[0038] em que
[0039] A e A’ resíduos que se ligam à albumina, B é um espaçador hidrofílico selecionado de -(CH2)ID[(CH2)nE]m(CH2)p-Qq- em que I, m e n são independentemente de 1 a 20 e p é de 0 a 10,
[0040] Q é -Z- (CH2)ID[(CH2)nG]m(CH2)p-, q é um número inteiro na faixa de 0 a 5, cada D, E e G são independentemente selecionados de -O-, -NR3-, -N(COR4)-, - PR5(O)- e -P(OR6)(O)-, em que R3, R4, R5 e R6 representam independentemente hidrogênio ou alquila C1-6,
[0041] Z é selecionado de -C(O)NH-, -C(O)NHCH2-, -OC(O)NH-, - C(O)NHCH2CH2-, -C(O)CH2-, -C(O)CH=CH-, -(CH2)s-, -C(O)-, -C(O)O-ou -NHC(O)-, em que s é 0 ou 1,
[0042] Y é um grupo químico que liga B e o agente terapêutico e
[0043] W’’ é um grupo químico que liga B com A e A’.
[0044] Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a um composto que compreende um espaçador hidrofílico entre um peptídeo terapêutico e um ou mais resíduos de ligação de albumina, o dito composto tendo um perfil prolongado de ação relativa ao polipeptídeo terapêutico, onde a fração que liga a albumina bem como a fração livre do dito composto são ambos capazes de ligar-se ao receptor mediando o efeito do polipeptídeo terapêutico.
[0045] Em uma forma de realização, o espaçador hidrofílico é uma porção de oligo etileno glicol não ramificada com grupos funcionais apropriados em ambos os terminais que formam uma ponte entre um grupo amino do polipeptídeo terapêutico e um grupo funcional do resíduo que se liga à albumina.
[0046] Em um outro aspecto da presente invenção o polipeptídeo terapêutico é um peptídeo GLP-1.
DEFINIÇÕES
[0047] No presente relatório descritivo, os seguintes termos têm o significado indicado:
[0048] O termo “resíduo que se liga à albumina” como usado neste significa um resíduo que se liga não-covalentemente à albumina de soro humano. O resíduo que se liga à albumina ligado ao polipeptídeo terapêutico tipicamente tem uma afinidade abaixo de 10 μM à albumina de soro humano e preferivelmente abaixo de 1 μM. Uma faixa de resíduos que se liga à albumina são conhecidos entre as porções lipofílicas lineares e ramificadas contendo de 4 a 40 átomos de carbono, compostos com uma estrutura de ciclopentanofenantreno, os peptídeos tendo de 10 a 30 resíduos de aminoácido etc.
[0049] O termo “espaçador hidrofílico” como usado neste significa um espaçador que separa um peptídeo e um resíduo que se liga à albumina com uma porção química que compreende pelo menos 5 átomos que não hidrogênio onde de 30 a 50 % destes são N ou O.
[0050] O termo “polipeptídeo terapêutico” como usado neste significa um polipeptídeo que está sendo desenvolvido para o uso terapêutico ou que foi desenvolvido para o uso terapêutico.
[0051] O termo “polipeptídeo” e “peptídeo” como usado neste significa um composto de pelo menos cindo aminoácidos constituintes conectados pelas ligações de peptídeo. Os aminoácidos constituintes podem ser do grupo dos aminoácidos codificados pelo código genético e estes podem ser aminoácidos naturais que não são codificados pelo código genético, bem como aminoácidos sintéticos. Os aminoácidos naturais que não são codificados pelo código genético são, por exemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, D-alanina e D-glutamina. Os aminoácidos sintéticos compreendem aminoácidos fabricados pela síntese química, isto é, D-isômeros dos aminoácidos codificados pelo código genético tal como D- alanina e D-leucina, Aib (ácido α-aminoisobutirico), Abu (ácido α-aminobutirico), Tie (terc-butilglicina), β-alanina, ácido 3-aminometil benzóico, ácido antranílico.
[0052] O termo “análogo” como usado neste refere-se a um polipeptídeo que significa um peptídeo modificado em que um ou mais resíduos de aminoácido do peptídeo foram substituídos por outros resíduos de aminoácido e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácido foram deletados do peptídeo e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácido foram deletados do peptídeo e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácido foram adicionados ao peptídeo. Tal adição ou anulação de resíduos de aminoácido pode acontecer no terminal N do peptídeo e/ou no terminal C do peptídeo. Um sistema simples é usado para descrever os análogos: Por exemplo, [Arg34]GLP-1(7-37)Lys designa um análogo de GLP-1 em que a lisina de ocorrência natural na posição 34 foi substituída por arginina e um resíduo de lisina foi adicionado ao terminal C (posição 38). As fórmulas dos análogos e derivados de peptídeo destes são desenhados usando-se a abreviação de letras simples padrão para os aminoácidos usados de acordo com a nomenclatura IUPAC-IUB.
[0053] O termo “derivado” como usado neste em relação a um peptídeo significa um peptídeo quimicamente modificado ou um análogo deste, em que pelo menos um substituinte não está presente no peptídeo não modificado ou um análogo deste, isto é, um peptídeo que foi covalentemente modificado. As modificações típicas são amidas, carboidratos, grupos alquila, grupos acila, ésteres e outros. Um exemplo de um derivado de GLP-1 (7-37) é Nε26-(Y-Glu(N2-hexadecanoil)))-[Arg34, Lys25])GLP-1(7- 37).
[0054] O termo “peptídeo GLP-1” como usado neste significa GLP-1 (7-37) (SEQ ID N° 1), um análogo de GLP-1, um derivado de GLP-1 ou um derivado de um análogo de GLP-1. Em uma forma de realização, o peptídeo GLP-1 é um agente insulinotrópico.
[0055] O termo “agente insulinotrópico” como usado neste significa um composto que é um agonista do receptor GLP-1 humano, isto é, um composto que estimula a formação de cAMP em um meio adequado contendo o receptor GLP-1 humano. A potência de um agente insulinotrópico é determinada pelo cálculo do valor EC50 da curva de dose-responsta como descrito abaixo.
[0056] As membranas plasmáticas purificadas de uma linha celular transfectada estável, BHK467-12A (tk-ts13), que expressam o receptor GLP-1 humano foram estimuladas com GLP-1 e os análogos de peptídeo e a potência da produção de cAMP foi medida usando-se o Conjunto de Ensaio de cAMP AlphaScreen™ da Perkin Elmer Life Sciences.
[0057] Uma linha transfectada estável foi preparada em NN e um clone de expressão alta foi selecionado para avaliação. As células foram desenvolvidas em CO2 a 5 % em DMEM, FCS a 5 %, Pen/Strep a 1 % e 0,5 mg/ml de G418.
[0058] As células em confluência de 80 % aproximada foram lavadas 2X com PBS e coletadas com Versene, submetidas à centrifugação por 5 minutos a 1000 rpm e o sobrenadante removido. Todas as etapas adicionais foram realizadas em gelo. O grânulo celular foi homogeneizado pelo Ultrathurax por 20 a 30 segundos em 10 ml de Tampão 1 (20 mM de Na-HEPES, 10 mM de EDTA, pH = 7,4), centrifugado 15 minutos a 20.000 rpm e o grânulo recolocado em suspensão em 10 ml de Tampão 2 (20 mM de Na-HEPES, 0,1 mM de EDTA, pH = 7,4). A suspensão foi homogeneizada por 20 a 30 segundos e centrifugada 15 minutos a 20.000 rpm. A suspensão em Tampão 2, a homogeneização e a centrifugação foram repetidas uma vez e as membranas foram recolocadas em suspensão em Tampão 2 e prontas para análise adicional ou armazenadas a -80° C.
[0059] O ensaio de receptor funcional foi realizado medindo-se a produção decAMP induzida por peptídeo pela The AlphaScreen Technology. O princípio básico da The AlphaScreen Technology é uma competição entre cAMP endógeno e biotin- cAMP exogeneamente adicionada. A captura de cAMP é atingida usando-se um anticorpo específico conjugado às gotas de receptor. O cAMP formado foi contado e medido em um analizador de microplaca AlphaFusion. Os valores de EC50 foram calculados usando-se o software Graph-Pad Prisme.
[0060] O termo “peptídeo GLP-2” como usado neste significa GLP-2 (1-33), um análogo de GLP-2, um derivado de GLP-2 ou um derivado de um análogo de GLP-2.
[0061] O termo “peptídeo exendin-4” como usado neste significa exendin-4 (1-39), um análogo de exendin-4, um derivado de exendin-4 ou um derivado de um análogo de exendin-4. Em uma forma de realização o peptídeo exendin-4 é um agente insulinotrópico.
[0062] Os termos “peptídeo exendin-4 estável” e “peptídeos GLP-1 estáveis” como usado neste significa peptídeos quimicamente modificados derivados de exendin-4 (1- 39) ou GLP-1 (7-37), isto é, um análogo ou um derivado que apresenta uma vida média de eliminação de plasma in vivo de pelo menos 10 horas no homem, como determinado pelo seguinte método. O método para a determinação de vida média de eliminação de plasma de um peptídeo exendin-4 ou de um peptídeo GLP-1 no homem é: O peptídeo é dissolvido em um tampão isotônico, pH 7,4, PBS ou qualquer outro tampão adequado. A dose é injetada perifericamente, preferivelmente abdominal ou coxa superior. As amostras de sangue para a determinação de peptídeo ativo são retiradas em intervalos frequentes e para uma duração suficiente, cobrir a parte de eliminação terminal (por exemplo, Pré-dose, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 24 (dia 2), 36 (dia 2), 48 (dia 3), 60 (dia 3), 72 (dia 4) e 84 (dia 4) horas pós dose). A determinação da concentração de peptídeo ativo é realizada como descrito em Wilken et al., Diabetologia 43 (51): A143, 2000. Os parâmetros farmacocinéticios derivados são calculados a partir dos dados de tempo concentração para cada paciente individual pelo uso de métodos não divididos, usando-se o software comercialmente disponível WinNonlin Versão 2.1 (Pharsight, Cary, NC, USA). A razão de eliminação terminal constante é estimada pela regrassão de log-linear na parte de log-linear terminal da curva de concentração-tempo e usado para calcular a vida média de eliminação.
[0063] O termo “DPP-IV protegido” como usado neste refere-se a um polipeptídeo que significa um polipeptídeo que foi quimicamente modificado a fim de tornar o dito composto resistente à peptidase dipeptidil aminopeptidase-4 de plasma (DPP-IV). A enzima DPP-IV no plasma é conhecida estar envolvida na degradação de diversos tipos de hormônios peptídicos, por exemplo, GLP-1, GLP-2, Exendin-4 etc. desta maneira, um esforço considerável está sendo realizado para desenvolver análogos e derivados dos polipeptídeos suscetíveis à hidrólise mediada por DPP-IV a fim de reduzir a razão de degradação por DPP-IV.
[0064] A resistência de um peptídeo à degradação pela dipeptidil aminopeptidase IV é determinada pelo seguinte ensaio de degradação:
[0065] As alíquotas dos peptídeos são incubadas a 37° C com uma alíquota de dipeptidil aminopeptidase IV purificada por 4 a 22 horas em um tampão apropriado em pH 7 a 8 (o tampão não sendo albumina). As reações enzimáticas são terminadas pela adição de ácido trifluoroacético e os produtos de degradação de peptídeo são separados e quantificados usando-se análise de HPLC ou LC-MS. Um método para realziar esta análise é: As misturas são aplicadas em uma coluna de 150 x 2,1 mm Zorbax 300SB-C18 (poros de 30 nm, partículas de 5 μm) e eluída em uma razão de fluxo de 0,5 ml/minuto com um gradiente linear de acetonitrila em ácido trifluoroacético a 0,1 % (acetonitrila de 0 % a 100 % por 30 minutos). Os peptídeos e seus produtos de degradação podem ser monitorados por sua absorbância em 214 nm (ligações de paptídeo) ou 280 nm (aminoácidos aromáticos) e são quantificados pela integração de suas áreas de pico. O padrão de degradação pode ser determinado usando-se LC- MS onde MS os espectros do pico separado podem ser determinados. A porcentagem de composto intacto/degradado em um dado período é usada para estimar a estabilidade de DPPIV de peptídeos.
[0066] Um peptídeo é definido como DPPIV estabilizado quando este é 10 vezes mais estável do que o peptídeo natural com base na porcentagem intacta em um dado tempo. Desta maneira, um composto de GLP-1 estabilizado por DPPIV é pelo menos 10 vezes mais estável do que GLP-1 (7-37).
[0067] O termo “alquila C1-6” como usado neste significa um grupo de hidrocarboneto saturado, ramificado, reto ou cíclico de 1 a 6 átomos de carbono. Os exemplos representativos incluem, mas não são limitados a, metila, etila, n-propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, n- pentila, isopentila, neopentila, terc- pentila, n-hexila, isoexila, cicloexano e outros.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0068] A presente invenção diz respeito a um composto que compreende um polipeptídeo terapêutico ligado a um resíduo que se liga à albumina por intermédio de um espaçador hidrofílico.
[0069] A presente invenção também diz respeito a um composto que compreende um polipeptídeo terapêutico ligado a um resíduo que se liga à albumina por intermédio de um espaçador hidrofílico que separa o polipeptídeo e a resíduo que se liga à albumina com uma porção química que compreende pelo menos 5 átomos que não hidrogênio onde de 30 a 50 % destes átomos são N ou O.
[0070] Em uma forma de realização desta invenção o espaçador é definido como -(CH2)ID[(CH2)nG]m(CH2)pQq-, em que
[0071] I, m e n são independentemente de 1 a 20 e p é de 0 a 10,
[0072] Q é -Z-(CH2)ID[(CH2)nG]m(CH2)p-,
[0073] q é um número inteiro na faixa de 0 a 5,
[0074] cada D, E e G são independentemente selecionados de -O-, -NR3-, - N(COR4)-, -PR5(O)- e -P(OR6)(O)-, em que R3, R4, R5 e R6 representam independentemente hidrogênio ou alquila C1-6,
[0075] Z é selecionado de -C(O)NH-, -C(O)NHCH2-, -OC(O)NH-, - C(O)NHCH2CH2-, -C(O)CH2-, -C(O)CH=CH-, -(CH2)s-, -C(O)-, -C(O)O-ou -NHC(O)-, em que s é 0 ou 1 ou um sal farmaceuticamente aceitável ou pró-droga deste.
[0076] A presente invenção também diz respeito a um composto que tem a fórmula (I):
[0077] A—W—B—Y—polipeptídeo terapêutico (I)
[0078] em que
[0079] A é um resíduo que se liga à albumina,
[0080] B é um espaçador hidrofílico sendo -(CH2)lD[(CH2)nE]m(CH2)pQq-, em que
[0081] l, m e n são independentemente de 1 a 20 e p é de 0 a 10,
[0082] Q é -Z-(CH2)ID[(CH2)nG]m(CH2)p-,
[0083] q é um número inteiro na faixa de 0 a 5,
[0084] cada D, E e G são independentemente selecionados de -O-, -NR3-, - N(COR4)-, -PR5(O)- e -P(OR6)(O)-, em que R3, R4, R5 e R6 representam independentemente hidrogênio ou alquila C1-6,
[0085] Z é selecionado de -C(O)NH-, -C(O)NHCH2-, -OC(O)NH-, - C(O)NHCH2CH2-, -C(O)CH2-, -C(O)CH=CH-, -(CH2)s-, -C(O)-, -C(O)O-ou -NHC(O)-, em que s é 0 ou 1,
[0086] Y é um grupo químico que liga B e o agente terapêutico e
[0087] W é um grupo químico que liga A e B.
[0088] A presente invenção também diz respeito a um composto que tem a fórmula (II)
[0089] A—W—B—Y—polipeptídeo terapêutico—Y'—B'—W'—A' (II)
[0090] em que
[0091] A e A’ são resíduos que ligam-se à albumina,
[0092] B e B’ são espaçadores hidrofílicos independentemente selecionados de - (CH2)ID[(CH2)nE]m(CH2)p-Qq-, em que
[0093] I, m e n são independentemente de 1 a 20 e p é de 0 a 10,
[0094] Q é -Z-(CH2)ID[(CH2)nG]m(CH2)p-,
[0095] q é um número inteiro na faixa de 0 a 5,
[0096] cada D, E e G são independentemente selecionados de -O-, -NR3-, - N(COR4)-, -PR5(O)-e -P(OR6(O)-, em que R3, R4, R5 e R6 representam independentemente hidrogênio ou alquila C1-6,
[0097] Z é selecionado de -C(O)NH-, -C(O)NHCH2-, -OC(O)NH-, - C(O)NHCH2CH2-, -C(O)CH2-, -C(O)CH=CH-, -(CH2)S-, -C(O)-, -C(O)O- ou -NHC(O)-, em que s é 0 ou 1,
[0098] Y é um grupo químico que liga B e o agente terapêutico e
[0099] Y’ é um grupo químico que liga B’ e o agente terapêutico e
[0100] W é um grupo químico que liga A e B e
[0101] W’’ é um grupo químico que liga A’ e B’.
[0102] Em uma forma de realização da invenção Y’ é selecionado do grupo que consiste de -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -OC(O)NH-, - NHC(O)O-, -C(O)NHCH2-, CH2NHC(O)-, -C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, - CH=CHC(O)-,- (CH2)s-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)- e -C(O)NH-, em que s é 0 ou 1.
[0103] Em uma outra forma de realização da invenção W’ é selecionado do grupo que consiste de -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -OC(O)NH-, - NHC(O)O-, -C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s-, -C(O)-, - C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)- e -C(O)NH-, em que s é 0 ou 1.
[0104] Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a um composto que tem a fórmula (III):
[0105] A—W’’—B—Y—polipeptídeo terapêutico (III)
[0106] |
[0107] A’
[0108] em que
[0109] A e A’ são resíduos que ligam-se à albumina,
[0110] B é um espaçador hidrofílico selecionado de -(CH2)ID[(CH2)mE]m(CH2)p-Qq- em que
[0111] I, m e n são independentemente de 1 a 20 e p é de 0 a 10,
[0112] Q é -Z-(CH2)ID[(CH2)nG]m(CH2)p-,
[0113] q é um número inteiro na faixa de 0 a 5,
[0114] cada D, E e G são independentemente selecionados de -O-, -NR3-, - N(COR4)-, -PR5(O)- e -P(OR6)(O)-, em que R3, R4, R5 e R6 representam independentemente hidrogênio ou alquila C1-6,
[0115] Z é selecionado de -C(O)NH-, -C(O)NHCH2-, -OC(O)NH-, - C(O)NHCH2CH2-, -C(O)CH2-, -C(O)CH=CH-, -(CH2)s-, -C(O)-, -C(O)O-ou -NHC(O)-, em que s é 0 ou 1,
[0116] Y é um grupo químico que liga B e o agente terapêutico e
[0117] W” é um grupo químico que liga B com A e A’.
[0118] Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a um composto que compreende um espaçador hidrofílico entre um peptídeo terapêutico e um ou mais resíduos que se ligam à albumina, o dito composto tendo um perfil prolongado de ação relativa ao polipeptídeo terapêutico, onde a fração que liga a albumina bem como a fração livre do dito composto são ambos capazes de ligar-se ao receptor mediando o efeito do polipeptídeo terapêutico.
[0119] Em uma forma de realização, o espaçador hidrofílico é uma porção de oligo etileno glicol não ramificada com grupos funcionais apropriados em ambos os terminais que formam uma ponte entre um grupo amino do polipeptídeo terapêutico e um grupo funcional do resíduo que se liga à albumina.
[0120] Em uma forma de realização Y é selecionado do grupo que consiste de - C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, - C(O)NHCH2-, CH2NHC(O)-, -C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,- (CH2)s-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)- e -C(O)NH-, em que s é 0 ou 1.
[0121] Em uma outra forma de realização W é selecionado do grupo que consiste de de -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, - C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s-, -C(O)-, -C(O)O-, - OC(O)-, -NHC(O)- e -C(O)NH-, em que s é 0 ou 1.
[0122] Em uma outra forma de realização W” é selecionado do grupo que consiste de —C(O)NHCH— , -C(O)CH- , -(CH2)SÇH- , e -NHC(O)ÇNHC(O)CH2O(CH2)2O(CH2)2NH-
[0123] , em que s é 0,1 ou 2.
[0124] Em uma outra forma de realização I é 1 ou 2, n e m são independentemente de 1 a 10 e p é de 0 a 10.
[0125] Em uma outra forma de realização D é -O-.
[0126] Em uma outra forma de realização da invenção E é -O-.
[0127] Ainda, em uma outra forma de realização da invenção, o espaçador hidrofílico é -CH2O[(CH2)2O]m(CH2)pQq-, onde m é de 1 a 10, p é de 1 a 3 e Q é -Z- CH2O[(CH2)2O]m(CH2)p-.
[0128] Em uma outra forma de realização q é 1.
[0129] Em uma outra forma de realização G é -O-.
[0130] Ainda, em uma outra forma de realização da invenção Z é selecionado do grupo que consiste de- C(O)NH-, -C(O)NHCH2- e -OC(O)NH-.
[0131] Ainda, em uma outra forma de realização q é 0.
[0132] Em uma outra forma de realização I é 2.
[0133] Em uma outra forma de realização n é 2.
[0134] Ainda, em uma outra forma de realização, o espaçador hidrofílico B é - [CH2CH2O]m+1(CH2)pQq-.
[0135] Ainda, em uma outra forma de realização o espaçador hidrofílico B é - (CH2)I-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p-[C(O)NH-(CH2)I-O]m- [(CH2)n-O]m-(CH2)p]q-, onde 1, m, n e p são independentemente de 1 a 5, e q é de 0 a 5.
[0136] Ainda, em uma outra forma de realização -W-B-Y- é selecionado do grupo que consiste de
Figure img0001
Figure img0002
[0137] Ainda, em uma outra forma de realização >W”-B-Y- é
Figure img0003
[0138] Ainda, em uma outra forma de realização o resíduo que se liga à albumina A é selecionado do grupo que consiste de
Figure img0004
Figure img0005
[0139] onde o átomo de carbono quiral é R ou S,
Figure img0006
[0140] onde o átomo de carbono quiral é R ou S,
Figure img0007
[0141] onde o átomo de carbono quiral é R ou S,
Figure img0008
[0142] onde os dois átomos de carbono quirais são independentemente R ou S,
Figure img0009
[0143] onde os dois átomos de carbono quirais são independentemente R ou S,
Figure img0010
[0144] onde os dois átomos de carbono quirais são independentemente L ou D,
Figure img0011
[0145] onde o átomo de carbono quiral é R ou S,
Figure img0012
[0146] onde o átomo de carbono quiral é R ou S,
Figure img0013
[0147] onde os dois átomos de carbono quirais são independentemente R ou S,
Figure img0014
[0148] onde os dois átomos de carbono quirais são independentemente R ou S,
Figure img0015
Figure img0016
Figure img0017
[0149] Ainda, em uma outra forma de realização o peso molar do espaçador hidrofílico está na faixa de 80D a 1000D ou na faixa de 80D a 300D.
[0150] Em uma outra forma de realização da invenção, o resíduo que se liga à albumina é um resíduo lipofílico.
[0151] Em uma outra forma de realização o resíduo que se liga à albumina é negativamente carregado em pH fisiológico. Em uma outra forma de realização o resíduo que se liga à albumina compreende um grupo que pode ser negativamente carregado. Um grupo preferido que pode ser carregado é um grupo de ácido carboxílico.
[0152] Em uma outra forma de realização da invenção, o resíduo que se liga à albumina se liga não-covalentemente à albumina. Em uma outra forma de realização o resíduo que se liga à albumina tem uma afinidade de ligação com relação à albumina de soro humano que está abaixo de cerca de 10 μM ou abaixo de cerca de 1 μM.
[0153] Ainda, em uma outra forma de realização da invenção o resíduo que se liga à albumina é selecionado de um grupo alquila de cadeia reta, um grupo alquila ramificado, um grupo que tem um grupo de ácido w-carboxílico, uma estrutura de ciclopentanofenantreno parcial ou completamente hidrogenada.
[0154] Em uma outra forma de realização o resíduo que se liga à albumina é um resíduo de cibacronila.
[0155] Em uma outra forma de realização o resíduo que se liga à albumina tem de 6 a 40 átomos de carbono, de 8 a 26 átomos de carbono ou de 8 a 20 átomos de carbono.
[0156] Em uma outra forma de realização o resíduo que se liga à albumina é um grupo acila selecionado do grupo que compreende CH3(CH2)rCO-, em que r é um número inteiro de 4 a 38, preferivelmente um número inteiro de 4 a 24, mais preferidos selecionados do grupo que compreende CH3(CH2)6CO-, CH3(CH2)8CO-, CH3(CH2)10CO-, CH3(CH2)12CO-, CH3(CH2)14CO-, CH3(CH2)16CO-, CH3(CH2)18CO-, CH3(CH2)20CO- e CH3(CH2)22CO-.
[0157] Em uma outra forma de realização o resíduo que se liga à albumina é um grupo acila de um ácido alcano a,w-dicarboxílico de cadeia reta ou ramificada.
[0158] Em uma outra forma de realização o resíduo que se liga à albumina é um grupo acila selecionados do grupo que compreende HOOC(CH2)sCO-, em que s é um número inteiro de 4 a 38, preferivelmente um número inteiro de 4 a 24, mais preferidos selecionados do grupo que compreende HOOC(CH2)14CO-, HOOC(CH2)16CO-, HOOC(CH2)18CO-, HOOC(CH2)20CO- e HOOC(CH2)22CO-.
[0159] Em uma outra forma de realização o resíduo que se liga à albumina é um grupo da fórmula CH3(CH2)vCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-, em que v é um número inteiro de 10 a 24.
[0160] Em uma outra forma de realização o resíduo que se liga à albumina é um grupo da fórmula CH3(CH2)wCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-, em que w é um número inteiro de 8 a 24.
[0161] Em uma outra forma de realização o resíduo que se liga à albumina é um grupo da fórmula COOH(CH2)xCO- em que x é um número inteiro de 8 a 24.
[0162] Em uma outra forma de realização o resíduo que se liga à albumina é um grupo da fórmula - NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)yCH3, em que y é um número inteiro de 8 a 18.
[0163] Em uma outra forma de realização da invenção o resíduo que se liga à albumina é um peptídeo, tal como um peptídeo que compreende menos do que 40 resíduos de aminoácido. Diversos peptídeos pequenos cujos resíduos que se ligam à albumina bem como um método para a sua identificação é encontrado em J. Biol Chem. 277, 38 (2002) 35035 a 35043.
[0164] Em uma outra forma de realização da invenção o resíduo que se liga à albumina por intermédio de espaçador e de ligadores é ligado ao dito polipeptídeo terapêutico por intermédio do grupo ε-amino de um resíduo de lisina.
[0165] Em uma outra forma de realização o resíduo que se liga à albumina por intermédio do espaçador e dos ligadores é ligado ao dito polipeptídeo terapêutico por intermédio de um resíduo de aminoácido selecionado de cisteína, glutamato e aspartato.
[0166] Em uma forma de realização da presente invenção, o polipeptídeo terapêutico é um peptídeo GLP-1.
[0167] Em uma outra forma de realização da invenção, o polipeptídeo terapêutico é um peptídeo GLP-1 que compreende a sequência de aminoácido da fórmula (IV):
[0168] Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20- Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35- Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46
[0169] Fórmula (IV) (SEQ ID N°: 2)
[0170] em que
[0171] Xaa7 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, (3- hidróxi-histidina, homoistidina, Nα-acetil-histidina, α-fluorometil-histidina, α-metilhistidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina;
[0172] Xaa8 é Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminocicloexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico ou ácido (1-aminociclooctil) carboxílico;
[0173] Xaa16 é Val ou Leu;
[0174] Xaa18 é Ser, Lys ou Arg;
[0175] Xaa19 é Tyr ou Gln;
[0176] Xaa20 é Leu ou Met;
[0177] Xaa22 é Gly, Glu ou Aib;
[0178] Xaa23 é Gln, Glu, Lys ou Arg;
[0179] Xaa25 é Ala ou Val;
[0180] Xaa26 é Lys, Glu ou Arg;
[0181] Xaa27 é Glu ou Leu;
[0182] Xaa30 é Ala, Glu ou Arg;
[0183] Xaa33 é Val ou Lys;
[0184] Xaa34 é Lys, Glu, Asn ou Arg;
[0185] Xaa35 é Gly ou Aib;
[0186] Xaa36 é Arg, Gly ou Lys;
[0187] Xaa37 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, amida ou está ausente;
[0188] Xaa38 é Lys, Ser, amida ou está ausente.
[0189] Xaa39 é Ser, Lys, amida ou está ausente;
[0190] Xaa40 é Gly, amida ou está ausente;
[0191] Xaa41 é Ala, amida ou está ausente;
[0192] Xaa42 é Pro, amida ou está ausente;
[0193] Xaa43 é Pro, amida ou está ausente;
[0194] Xaa44 é Pro, amida ou está ausente;
[0195] Xaa45 é Ser, amida ou está ausente;
[0196] Xaa46 é amida ou está ausente;
[0197] cotnanto que se Xaa38, Xaa39, Xaa40, Xaa41, Xaa42, Xaa43, Xaa44, Xaa45 ou Xaa46 estiverem ausentes então cada resíduo de aminoácido a jusante também está ausente.
[0198] Em uma outra forma de realização da invenção, o polipeptídeo é um peptídeo GLP-1 que compreende a sequência de aminoácido da fórmula (V):
[0199] Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu- Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37- Xaa38
[0200] Fórmula (V) (SEQ ID N°: 3)
[0201] em que
[0202] Xaa7 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, β- hidróxi-histidina, homoistidina, Nα-acetil-histidina, α-fluorometil-histidina, α-metil- histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina;
[0203] Xaa8 é Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminocicloexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloeptil) carboxílico ou ácido (1-aminociclooctil) carboxílico;
[0204] Xaa18 é Ser, Lys ou Arg;
[0205] Xaa22 é Gly, Glu ou Aib;
[0206] Xaa23 é Gln, Glu, Lys ou Arg;
[0207] Xaa26 é Lys, Glu ou Arg;
[0208] Xaa30 é Ala, Glu ou Arg;
[0209] Xaa34 é Lys, Glu ou Arg;
[0210] Xaa35 é Gly ou Aib;
[0211] Xaa36 é Arg ou Lys;
[0212] Xaa37 é Gly, Ala, Glu ou Lys;
[0213] Xaa38 é Lys, amida ou está ausente.
[0214] Ainda, em uma outra forma de realização da invenção o peptídeo GLP-1 é selecionado de GLP- 1 (7-35), GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-36)-amida, GLP-1 (7-37), GLP- 1 (7-38), GLP-1 (7-39), GLP-1 (7-40), GLP-1 (7-41) ou um análogo deste.
[0215] Em uma outra forma de realização o peptídeo GLP-1 é um fragmento de um peptídeo selecionado do grupo que compreende GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-36) amida, GLP-1 (7-37), GLP-1 (7-38), GLP-1 (7-39), GLP-1 (7-40) e GLP- 1 (7-41) ou um análogo deste.
[0216] Em uma outra forma de realização da invenção, o peptídeo GLP-1 é GLP- 1 (A-B) em que A é um número inteiro de 1 a 7 e B é um número inteiro de 38 a 45 ou um análogo deste que compreende um resíduo que se liga à albumina ligada por intermédio de um espaçador hidrofílico ao resíduo de aminoácido de terminal C e, opcionalmente, um segundo resíduo que se liga à albumina ligada a um dos outros resíduos de aminoácido.
[0217] Em uma outra forma de realização o peptídeo GLP-1 compreende não mais do que quinze resíduos de aminoácido que foram trocados, adicionados ou deletados em comparação com GLP-1 (7-37) (SEQ ID N° 1) ou não mais do que dez resíduos de aminoácido que foram trocados, adicionados ou deletados em comparação com GLP-1 (7-37) (SEQ ID N° 1).
[0218] Em uma outra forma de realização, o peptídeo GLP-1 compreende não mais do que seis resíduos de aminoácidos que foram trocados, adicionado ou deletado em comparação com GLP-1 (7-37) (SEQ ID N° 1).
[0219] Em uma outra forma de realização, o peptídeo GLP-1 compreende não mais do que 4 resíduos de aminoácido que não são codificados pelo código genético.
[0220] Em uma outra forma de realização, o peptídeo GLP-1 é um peptídeo protegido por DPPIV GLP-1.
[0221] Em uma outra forma de realização, o composto de acordo com esta invenção é estabilizado por DPPIV.
[0222] Em uma outra forma de realização, o peptídeo GLP-1 compreende um resíduo Aib na posição 8.
[0223] Em uma outra forma de realização, o resíduo de aminoácido na posição 7 do dito peptídeo GLP-1 é selecionado do grupo que consiste de D-histidina, desamino- histidina, 2-amino-histidina, β-hidr0xi-histidina, homoistidina, Nα-acetil-histidina, α- fluorometil-histidina, α-metil- histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina e 4- piridilalanina.
[0224] Em uma outra forma de realização, o peptídeo GLP-1 é selecionado do grupo que consiste de Arg34GLP-1(7-37), Lys38Arg26,34GLP-1(7-38), Lys38Arg26,34GLP- 1(7-38)-OH, Lys36Arg26,34GLP-1(7-36), Aib8,22,35GLP-1(7-37), Aib8,35GLP-1(7-37), Aib8,22,35GLP-1(7-37), Aib8,22,35Arg26,34Lys38GLP-1(7-38), Aib8,35Arg26,34Lys38GLP-1(7- 38), Aib8,22Arg26,34Lys38GLP-1(7-38), Aib8,22,35Arg26,34Lys38GLP-1(7-38), Aib8,35Arg26,34Lys38GLP-1(7-38), Aib8,22,35Arg26Lys38GLP-1(7-38), Aib8,35Arg26Lys38GLP-1(7-38), Aib8,22Arg26Lys38GLP-1(7-38), Aib8,22,35Arg34Lys38GLP- 1(7-38), Aib8,35Arg34Lys38GLP-1(7-38), Aib8,22Arg34Lys38GLP-1(7-38), Aib8,22,35Ala37Lys38GLP-1(7-38), Aib8,35Ala37Lys38GLP-1(7-38), Aib8,22Ala37Lys38GLP- 1(7-38), Aib8,22,35Lys37GLP-1(7-37), Aib8,35Lys37GLP-1(7-37) e Aib8,22Lys37GLP-1(7- 38).
[0225] Em uma outra forma de realização, o peptídeo GLP-1 é ligado ao dito espaçador hidrofílico por intermédio do resíduo de aminoácido na posição 23, 26, 34, 36 ou 38 relativa à sequência de aminoácido SEQ ID N°: 1.
[0226] Em uma outra forma de realização, o peptídeo GLP-1 é exendin-4 (SEQ ID N° 4).
[0227] Em uma outra forma de realização, o peptídeo GLP-1 é ZP-10, isto é, HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPS-KKKKKK-amida (SEQ ID N° 5).
[0228] Em uma outra forma de realização, o peptídeo GLP-1 é HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGX, em que X = P ou You um fragmento ou um análogo destes.
[0229] Em uma outra forma de realização da invenção, o peptídeo GLP-1 é Arg18, Leu20, Gln34,Lys33 (Nε-(Y-gamaα-aminobutiroil(Nα-hexadecanoil))) Exendin-4-(7-45)- amida ou Arg33, Leu20, Gln34, Lys18 (Nε-(Y-aminobutiroil(Nα-hexadecanoil))) Exendin-4- (7-45)-amida.
[0230] Em uma outra forma de realização da invenção um resíduo que se liga à albumina é ligado ao resíduo de aminoácido de terminal C do peptídeo GLP-1 por intermédio do espaçador hidrofílico.
[0231] Em uma outra forma de realização da invenção um segundo resíduo que se liga à albumina é ligado a um resíduo de aminoácido eu não é o resíduo de aminoácido de terminal C do peptídeo GLP-1.
[0232] Em uma outra forma de realização, o substituinte lipofílico é ligado ao peptídeo GLP-1 por meio de um espaçador hidrofílico de uma tal maneira que um grupo carboxila do espaçador forma uma ligação amida com um grupo amino do peptídeo GLP-1.
[0233] Em uma outra forma de realização da invenção, o composto é selecionado do grupo que consiste de
[0234] N^7-(2-(2-(2-(dodecilamino)etóxi)etóxi)acetil)-[Aib8’22’35,Lys37]GLP-1(7- 37)amida
Figure img0018
[0235] Nε37(2-(2-(2-(17-sulfohexadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil)-[Aib8'22'35 Lys37] GLP-1 (7- 37)amida
Figure img0019
[0236] Nε37-{2-[2-(2-(15-carboxipentadecanoilamino)etóxi)etóxi]acetil}-[Aib8,22,35, Lys37] GLP-1(7-37)amida
Figure img0020
[0237] Nε37-(2-(2-(2-(17-carboxieptadecanoilamino)etóxi)etóxi)acetil)[Aib8,22,35, Lys37]GLP-1(7-37)amida
Figure img0021
[0238] Nε37-(2-(2-(2-(19-carboxinonadecanoilamino)etóxi)etóxi)acetil)[Aib8,22,35, Lys37]GLP-1(7-37)amida
Figure img0022
[0239] [Aib8,22,35,Arg26,34]GLP-1-(7-37)Lys(4-(Hexadecanoilamino)-4(S)- carboxibutiril)-OH
Figure img0023
[0240] [Aib8,22,35,Arg26,34]GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(hexadecanoilamino)etóxi)- etóxi)acetil)-OH
Figure img0024
[0241] Nε37-(2-[2-(2,6-(S)-Bis-{2-[2-(2-(dodecanoilamino)et0xi)et0xi]acetilamino} hexanoilamino)etoxi]etoxi})acetil-[Aib8,22,35]GlP-1(7-37)amida
Figure img0025
[0242] Nε37-(2-[2-(2,6-(S)-Bis-{2-[2-(2-(tetradecanoilamino)et0xi)et0xi]acetil- amino}hexanoilamino)etóxi]etóxi})acetil-[Aib8,22,35]GLP-1(7-37)amida
Figure img0026
[0243] [Aib8,22,35,Arg26,34]GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(Hexadecanoilamino)-4(S)- carboxibutirilamino)etóxi)etóxi)acetil)-OH
Figure img0027
[0244] [Aib8,22,35]GLP-1(7-37)Lys((2-{2-[4-[4-(4-Amino-9,10-dioxo-3-sulfo-9,10- diidro-antracen-1-ilamino)-2-sulfo-fenilamino]-6-(2-sulfo-fenilamino)-[1,3,5]triazin-2- ilamino]-etóxi}-etóxi)-acetil))amida
Figure img0028
[0245] [Aib8,22,35]GLP-1(7-37)Lys(({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(15-carboxipenta- decanoilamino)-etóxi]etóxi}acetilamino)etóxi]etóxi}acetil acetil))amida
Figure img0029
[0246] Nε37-([2-(2-{3-[2,5-dioxo-3-(15-carboxipentadecilsulfanil)-pirrolidin-1-il]- propionilamino}etoxi)etóxi)acetil]-[D-Ala9,Lys37]-GLP-1-[7-37]amida
Figure img0030
[0247] [Aib8,22,35Ala37]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(2-(11-(oxalilamino)undecanoil- amino)etóxi)etóxi)acetil-)))amida
Figure img0031
[0248] [Aib8,22,35,Ala37]-GLP-1(7-37)Lys({2-[2-(2-{2-[2-(2-(15-carbóxi-penta- decanoilamino)-etóxi]etóxi}acetilamino)etóxi]etóxi}acetil)amida
Figure img0032
[0249] [Aib8,22,35,Ala37]-GLP-1(7-37)Lys((2-{2-[11-(5-Dimetilaminonaftaleno-1- sulfonilamino)undecanoilamino]etóxi}etóxi)acetil)amida
Figure img0033
[0250] [Aib8,22,35,Ala37]-GLP-1(7-37)Lys(([2-(2-{2-[1-(4-Clorobenzoil)-5-metóxi-2- metil-1H-indol-3-il]acetilamino}etóxi)etóxi]acetil))amida
Figure img0034
[0251] [Aib8,Arg26,34,Glu22,23,30]GLP-1H(7-37)Lys(2-(2-(2-(octadecanoilamino)- etóxi)etóxi)acetil)amida
Figure img0035
[0252] [Aib8,Arg26,34,Glu22,23,30]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(eicosanoilamino)etóxi)- etóxi)acetil)amida
Figure img0036
[0253] [Gly8,Arg26’34]GLP-1 H-(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(octadecanoilamino)- etóxi]acetil)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0037
[0254] [Aib8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(octadecanoilamino)etóxi)- etóxi]acetil)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0038
[0255] [Aib8]-GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(Hexadecanoilamino)-4(S)-carbóxi- butirilamino)etóxi)etóxi)acetil)-OH
Figure img0039
[0256] [Aib8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(octadecanoilamino)-4- carboxibutirilamino)etóxi)etóxi]acetil)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0040
[0257] [Aib8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-carboxieptanoilamino)etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0041
[0258] [Gly8,Arg26,34]GLP1-(7-37) Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-carboxieptadecanoilamino)etóxi)etóxi]acetil)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0042
[0259] [Aib8]GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(Hexadecanoilamino)-4(S)- carboxibutirilamino)etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)-OH
Figure img0043
[0260] Nε37-(2-(2-(2-(dodecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil)-[Aib8'22'35Lys37]GLP-1 H (7-37)-amida
Figure img0044
[0261] Nε37-(2-(2-(2-(tetradecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil)-[Aib8'22'35Lys37]GLP-1 H(7-37)-amida
Figure img0045
[0262] Nε37-(2-(2-(2-(hexadecanoilamino)etóxi)etóxi)acetil)-[Aib8,22,35Lys37]GLP- 1(7-37)-amida
Figure img0046
[0263] Nε37-(2-(2-(2-(octadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil)-[Aib8'22'35Lys37]GLP-1 (7-37)-amida
Figure img0047
[0264] Nε37-(2-(2-(2-(eicosanoilamino)et0xi)et0xi)acetil)-[Aib8'22'35Lys37]GLP-1(7- 37)-amida
Figure img0048
[0265] Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(octadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetilamino)et0xi)- etóxi)acetil)-[Aib8,Arg26,34,Lys36]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0049
[0266] Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(octadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetilamino)et0xi)- etóxi)acetil))[Arg26,34,Lys36]GLP-1(7-37)-OH
Figure img0050
[0267] Nε36-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(octadecanoilamino)et0xi)et0xi]acetilamino)et0xi)- etóxi)acetil)}-[Gly8,Arg26,34,Lys36]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0051
[0268] Nε37-(2-(2-(2-(4-4(4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-tridecafluorononanoilsulfamoilbutirilamino)etóxi)etóxi)acetil))[Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0052
[0269] Nε37-(2-(2-(2-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,12,12,12-Heneicosafluoro-dodeciloxiacetilamino)etóxi)etóxi)acetil)[Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0053
[0270] Nε37-(2-(2-(2-(4-(hexadecanoilsulfamoil)butirilamino)etóxi)etóxi)acetil)- [Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0054
[0271] [Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys({2-(2-(2-(2-[2-(2-(octadecanoilamino)etóxi)- etóxi]acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)})-OH
Figure img0055
[0272] [Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(octadecanoilamino)-4- carboxibutirilamino)etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0056
[0273] Nε20-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(hexadecanoilamino)-4-carboxibutirilamino)etóxi
[0274] etóxi]acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)}-exendin(1-39)
Figure img0057
[0275] [Ala8, Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys((2-[2-((2-oxalilamino-3-carbóxi-2-4,5,6,7- tetraidro-benzo[b]tiofen-6-il-acetilamino))etóxi]etoxiacetil)amida
Figure img0058
[0276] tetraidro-benzo[b]tiofen-6-il-acetilamino))etóxi]etoxiacetil)amida
Figure img0059
[0277] Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(octadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino)- etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)-[Aib8,Arg26,34,Lys36]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0060
[0278] Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(octadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino)- etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)-[Gly8,Arg26’34,Lys36]GLP-1-(7-37)-QH
Figure img0061
[0279] Nε37-2-(2-(2-(4-(4-(Heptadecanoilamino)-4-(S)-carboxibutirilamino)-4-(S)- carboxibutirilamino)etóxi)etóxi)acetil-[Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37)-NH2
Figure img0062
[0280] Nε37-2-(2-[2-(2-[2-(4-[4-(Heptadecanoilamino)-4-(S)-carboxibutirilamino]-4- (S)-carboxibutirilamino)etóxi]etóxi)acetilamino)etóxi]etóxi)acetil-[Aib8,22,35,Lys37]GLP- 1-(7-37)-NH2
Figure img0063
[0281] Nε26-(2-(2-(2-(4-(Hexadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino)et0xi)- etóxi)acetil)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0064
[0282] Nε26-2-(2-2-(2-(2-(2-(4-(Octadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino)- etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0065
[0283] [Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(19-(carbóxi)nonadecanoilamino)- etóxi)etóxi)acetil)-OH
Figure img0066
[0284] [Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(17-(carbóxi)heptadecanoilamino)- etóxi)etóxi)acetil))-OH
Figure img0067
[0285] [Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(19-(carbóxi)nonadecanoil- amino)-4-carboxibutirilamino)etóxi)etóxi)acetil)-OH
Figure img0068
[0286] [Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(hexadecanoil- amino)etóxi)etóxi)acetil)etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)-acetil)-OH
Figure img0069
[0287] [Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(octadecanoilamino)etóxi)- etóxi)-acetilamino)etóxi)etóxi)acetil) NH2
Figure img0070
[0288] Nε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(17-(carb0xi)heptadecanoil- amino)-4-carboxibutirilamino)etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil- amino)etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)[Lys20]exendin-4(1-39)-NH2
Figure img0071
[0289] Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-Carboxieptadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil- amino)etóxi)etóxi)acetil) [Aib8,Arg26,34,Lys36]GLP-1(7-37)
Figure img0072
[0290] Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-Carboxieptadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil- amino)etóxi)etóxi)acetil) [Arg26,34,Lys36]GLP-1(7-37)
Figure img0073
[0291] Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-Carboxieptadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil- amino)etóxi)etóxi)acetil) [Gly8,Arg26,34,Lys36]GLP-1(7-37)
Figure img0074
[0292] Nε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(Octadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil- amino)etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)[Lys20] Exendin-4 (1-39)amida
Figure img0075
[0293] Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(octadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino)-
Figure img0076
[0294] Nε26-(2-[2-(2-[2-(2-[2-(17-Carboxieptadecanoilamino)et0xi]et0xi)acetil- amino]etóxi)etóxi]acetil)[Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0077
[0295] Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxieptadecanoilamino)-4(S)-carb0xi- butirilamino]etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi]etóxi)acetil][Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0078
[0296] Nε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-Carboxieptadecanoilamino)etóxi)etóxi)- acetilamino)etóxi)etóxi)acetil-amino)etóxi)etóxi)acetil)[Lys20] Exendin-4 (1-39)amida
Figure img0079
[0297] [Gly8,Glu22,23,30,Arg18,26,34]GLP1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-carboxiepta
[0298] -decanoilamino)etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi))etóxi)acetil)-NH2
Figure img0080
[0299] [Ácido imidazolilpropiônico7, Asp16, Aib22,35]GLP1(7-37)Lys NH((2-{[4-(17- carboxieptadecanoilamino)butilcarbamoil]metóxi}etóxi)etóxi))
Figure img0081
[0300] [Ácido imidazolilpropiônico7, Aib22,35]GLP1(7-37)Lys NH((2-{[4-(17- carboxieptadecanoilamino)butilcarbamoil]metóxi}etóxi)etóxi))
Figure img0082
[0301] [3-(5-lmidazoil)propionil7, Aib8] GLP1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(17-carboxi
[0302] -heptanoilamino)etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0083
[0303] Em uma outra forma de realização, o polipeptídeo terapêutico é um polipeptídeo GLP-2.
[0304] Em uma outra forma de realização, o polipeptídeo GLP-2 é um polipeptídeo GLP-2 protegido por DPPIV.
[0305] Em uma outra forma de realização, o polipeptídeo GLP-2 é Gly2-GLP-2 (1- 33).
[0306] Ainda, em uma outra forma de realização, o polipeptídeo GLP-2 é Lys17Arg30-GLP-2 (1-33).
[0307] Em uma outra forma de realização da invenção, o polipeptídeo terapêutico é insulina humana ou um análogo deste.
[0308] Em uma outra forma de realização da invenção, o polipeptídeo terapêutico é selecionado do grupo que consiste de insulina AspB28-humana, LysB28, insulina ProB29-humana, LysB3, insulina GluB29-humana, insulina GlyA21, ArgB31, ArgB32-humana e insulina des(B30) humana.
[0309] Em uma outra forma de realização da invenção, o polipeptídeo terapêutico é hormônio de crescimento humano ou um análogo deste.
[0310] Em uma outra forma de realização da invenção, o polipeptídeo terapêutico é hormônio da paratiróide ou um análogo deste.
[0311] Em uma outra forma de realização da invenção, o polipeptídeo terapêutico é um hormônio estimulador do folículo humano ou um análogo deste.
[0312] Em uma outra forma de realização da invenção, o polipeptídeo terapêutico tem um peso molar menor do que 100 kDa, menor do que 50 kDa ou menor do que 10 kDa.
[0313] Em uma outra forma de realização da invenção o polipeptídeo terapêutico é selecionado do grupo que consiste de um fator de crescimento tal como fator de desenvolvimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento transformador α (TGF-α), fator de crescimento transformador β (TGF-β), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), uma somatomedina tal como o fator de crescimento de insulina I (IGF-I), fator de crescimento de insulina II (IFG-II), eritropoietina (EPO), trombopoietina (TPO) ou angiopoietina, interferon, pro-urocinase, urocinase, ativador de plasminógeno de tecido (t-PA), inibidor do ativador de plasminógeno 1, inibidor do ativador de plasminógeno 2, fator de von Willebrandt, uma citocina, por exemplo, uma interleucina, tal como interleucina (IL) 1, IL-1Ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL- 12, IL- 13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-20 ou IL-21, um fator estimulante de colônia (CFS) tal como GM- CSF, fator e célula tronco, um fator de necrose de tumor, tal como TNF-α, linfotoxina-α, linfotoxina β, CD40L ou CD30L, um inibidor de protease por exemplo, aprotinina, uma enzima, tal como superóxido dismutase, asparaginase, arginase, arginine desaminase, adenosina desaminase, ribonuclease, catalase, uricase, bilirrubina oxidase, tripsina, papaína, fosfatase alcalina, β-glucoronidase, purina nucleosídeo fosforilase ou batroxobina, um opióide, por exemplo, endorfinas, encealinas ou opióides não naturais, um hormônio ou neuropeptídeo, por exemplo, calcitonina, glucagon, gastrinas, hormônio adrenocorticotrópico (ACTH), colecistocininas, hormônio luteinizante, hormônio liberador de gonadotropina, gonadotropinan coriônica, fator de liberação de corticotrofina, vasopressina, oxitocina, hormônios antidiuréticos, hormônio estimulador da tiróide, hormônio de liberação de tirotropina, relaxina, prolactina, peptídeo YY, neuropeptídeo Y, polipeptídeo pancreático, leptina, CART (transcrição regulada por cocaína e anfetamina), um peptídeo relacionado com CART, perilipina, melanocortinas (hormônios estimuladores de melanócito) tais como hormônios concentradores de MC-4, hormônios concentradores de melanina, peptídeos netriuréticos, adrenomedulina, endotelina, secretina, amilina, peptídeo intestinal vasoativo (VIP), polipeptídeo ativador da adenilato ciclase da pituitária (PACAP), bombesina, peptídeos semelhantes à bombesina, timosina, proteína de ligação de heparina, CD4 solúvel, fator de liberação do hipotálamo, melanotoninas e análogos destes.
[0314] Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito a uma composição farmacêutica que compreende um composto de acordo com a invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0315] Em uma forma de realização, a composição farmacêutica é adpatada para a administração parenteral.
[0316] Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito ao uso de um composto de acordo com a invenção para apreparação de um medicamento.
[0317] Em uma forma de realização da invenção um composto de acordo com a invenção em que o polipeptídeo terapêutico é um peptídeo GLP-1 é usado para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de hiperglicemia, diabete do tipo 2, tolerância à glicose deteriorada, diabete do tipo 1, obesidade, hipertensão, síndrome X, dislipidemia, distúrbios cognitivos, aterosclerose, infarto do miocárdio, doença cardíaca coronária e outros distúrbios cardiovasculares, acidente vascular cerebral, síndrome inflamatória do intestino, dispepsia e úlceras gástricas.
[0318] Em uma outra forma de realização da invenção um composto de acordo com a invenção em que o polipeptídeo terapêutico é um peptídeo GLP-1 é usado para a preparação de um medicamento para atrasar ou evitar a progressão da doença em diabete do tipo 2.
[0319] Em uma outra forma de realização da invenção um composto de acordo com a invenção em que o polipeptídeo terapêutico é um peptídeo GLP-1 é usado para a preparação de um medicamento para diminuir a admissão de alimento, diminuição da apoptose de célula β, aumento da fuinção de célula β e massa de célula β e/ou para restaurar a sensibilidade de glicose às células β.
[0320] Em uma outra forma de realização da invenção um composto de acordo com a invenção em que o polipeptídeo terapêutico é um polipeptídeo GLP-2 é usado para a preparação de um medicamento para o tratamento de síndrome do intestino delgado, síndrome inflamatória do intestino ou doença de Crohn.
[0321] Em uma outra forma de realização da invenção um composto de acordo com a invenção em que o polipeptídeo terapêutico é um peptídeo de insulina é usado para a preparaçãode um medicamento para o tratamento ou prevenção de hiperglicemia, diabete do tipo 1, diabete do tipo 2 ou deficiência de célula β.
[0322] O polipeptídeo terapêutico pode ser produzido por um método que compreende cultivar uma célula hospedeira contendo uma sequência de DNA que codifica o polipeptídeo e capaz de expressar o polipeptídeo em um meio nutriente adequado sob condições que permitem a expressão do peptídeo, após o que o peptídeo resultante é recuperado da cultura.
[0323] O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para o desenvolvimento de células hospedeiras, tal como o meio mínimo ou complexo contendo suplementos adequados. Os meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as receitas publicadas (por exemplo, nos catálogos da American Type Culture Collection). O peptídeo produzido pelas células pode ser então recuperado do meio de cultura pelos procedimentos convencionais que incluem a separação da célula hospedeira do meio por centrifugação ou filtração, precipitação dos componentes proteínáceos do sobrenadante ou filtrado por meio de um sal, por exemplo, sulfato de amônio, purificação por uma variedade de procedimentos cromatográficos, por exemplo, cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtração por gel, cromatografia por afinidade ou coisa parecida, dependente do tipo de peptídeo em questão.
[0324] A sequência de DNA que codifica o polipeptídeo terapêutico pode ser, adequadamente, de origem genômica ou de cDNA, por exemplo, obtido pela preparação de uma biblioteca genômica ou de cDNA e avaliação quanto às sequências de DNA que codificam todo ou parte do polipeptídeo por hibridização usando-se sondas de oligonucleotídeo sintéticas de acordo com as técnicas padrão (ver, por exemplo, Sambrook, J, Fritsch, EF and Maniatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989). A sequência de DNA que codifica o polipeptídeo também pode ser preparada sinteticamente pelos métodos padrão estabelecidos, por exemplo, o método de fosfoamidita descrito por Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 a 1869, ou o método descrito por Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801 a 805. A sequência de DNA também pode ser preparada pela reação da cadeia de polimerase usando-se iniciadores específicos, por exemplo, como descrito na US 4.683.202 ou Saiki et al., Science 239 (1988), 487 a 491.
[0325] A sequência de DNA pode ser inserida em qualquer vetor que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinantes e a escolha do vetor, freqüentemente, dependerá da célula hospedeira em que este deve ser introduzido. Desta maneira, o vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existem como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, está integrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossomo(s) em que este foi integrado.
[0326] O vetor é, preferivelmente, um vetor de expressão em que a sequência de DNA que codifica o peptídeo está operacionalmente ligada aos segmentos adicionais requeridos para a transcrição do DNA, tal como um promotor. O promotor pode ser qualquer sequência de DNA que mostra a atividade transcricional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivado dos genes que codificam as proteínas homólogas ou heterólogas à célula hospedeira. Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição do DNA que codifica o peptídeo da invenção em uma variedade de células hospedeiras são bem conhecidos na técnica, cf., por exemplo, Sambrook et al., supra.
[0327] A sequência de DNA que codifica o peptídeo também pode ser, se necessário, operacionalmente conectada a um terminador adequado, sinais de poliadenilação, sequências intensificadoras transcripcionais e sequências intensificadoras translacionais. O vetor recombinante da invenção ainda pode compreender uma sequência de DNA que permite ao vetor replicar na célula hospedeira em questão.
[0328] O vetor também pode compreender um marcador selecionável, por exemplo, um produto de que complementa um defeito na célula hospedeira ou um que confere resistência a um medicamento, por exemplo, ampicilina, canamicina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina, higromicina ou metotrexato.
[0329] Para direcionar um peptídeo precursor da presente invenção no caminho de secreção das células hospedeiras, uma sequência de sinal de secreção (também conhecida como uma sequência lider, sequência prepro ou pré sequência) pode ser fornecida no vetor recombinante. A sequência de sinal de secreção é unida à sequência de DNA que codifica o peptídeo na estrutura de leitura correta. As sequências de sinal de secreção são convencionalmente posicionadas 5’ com relação à sequência de DNA que codifica o peptídeo. A sequência de sinal de secreção pode ser aquela normalmente selecionada com o peptídeo ou pode ser de um gene que codifica uma outra proteína secretada.
[0330] Os procedimentos usados para ligar as sequências de DNA que codificam o presente peptídeo, o promotor e opcionalmente, o terminador e/ou a sequência sinalizadora de secreção, respectivamente e para a inserção em vetores adequados contendo a informação necessária para a replicação, são bem conhecidos pelas pessoas habilitadas na técnica (cf., por exemplo, Sambrook et al., supra).
[0331] A célula hospedeira em que a sequência de DNA ou o vetor recombinante são introduzidos pode ser qualquer célula que seja de produzir o presente peptídeo e inclui bactérias, levedura, fungos e células eucarióticas superiores. Os exemplos de células hospedeiras adequadas que são bem conhecidos e usados e usados na técnica são, sem limitação, E coli, Saccharomyces cerevisiae ou linhas celulares BHK ou CHO de mamíferos.
[0332] Os exemplos de compostos que podem ser úteis como porções de GLP-1 de acordo com a presente invenção são descritos no Pedido de Patente Internacional N° WO 87/06941 (The General Hospital Corporation) que diz respeito a um fragmento de peptídeo que compreende GLP-1 (7-37) e seus derivados funcionais e a seu uso como um agente insulinotrópico.
[0333] Além disso, os análogos de GLP-1 são descritos no Pedido de Patente Internacional N° 90/11296 (The General Hospital Corporation) que diz respeito a fragmentos de peptídeo que compreendem GLP-1 (7-36) e seus derivados funcionais e têm uma atividade insulinotrópica que excede a atividade insulinotrópica de GLP-1 (1-36) ou GLP-1 (1-37) e a seu uso como agentes insulinotrópicos.
[0334] O Pedido de Patente Internacional N° 91/11457 (Buckley et al.) divulga análogos dos peptídeos GLP-1 ativos 7-34, 7-35, 7-36 e 7-37 quen também podem ser úteis como porções de GLP-1 de acordo com a presente invenção.
[0335] Composições farmacêuticas
[0336] As composições farmacêuticas contendo um composto de acordo com a presente invenção podem ser preparadas por técnicas convencionais, por exemplo, como descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985 ou em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19° edição, 1995.
[0337] Um objetivo da presente invenção é fornecer uma formulação farmacêutica que compreende um composto de acordo com a presente invenção que está presente em uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 25 mg/ml e, em que a dita formulação tem um pH de 2,0 a 10,0. A formulação farmacêutica pode compreender um composto de acordo com a presente invenção que está presente em uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 50 mg/ml e, em que a dita formulação tem um pH de 2,0 a 10,0. A formulação pode ainda compreender um sistema de tampão, conservante(s), agente(s) de isotonicidade, agente(s) de quelação, estabilizadores e tensoativos.
[0338] Em uma forma de realização da invenção a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa, isto é, formulação que compreende água. Tal formulação é tipicamente uma solução ou uma suspensão. Em uma outra forma de realização da invenção a formulação farmacêutica é uma solução aquosa. O termo “formulação aquosa” é definido como a formulação que compreende pelo menos água a 50 % p/p. Igualmente, o termo “solução aquosa” é definido como uma solução que compreende pelo menos água a 50 % p/p e, o termo “suspensão aquosa” é definido como uma suspensão que compreende pelo menos água a 50 % p/p.
[0339] Em uma outra forma de realização, a formulação farmacêutica é uma formulação secada por congelamento, a qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso.
[0340] Em uma outra forma de realização, a formulação farmacêutica é uma formulação seca (por exemplo, secada por congelamento ou secada por pulverização) pronta para o uso sem qualquer dissolução anterior.
[0341] Em um outro aspecto a invenção diz respeito a uma formulação farmacêutica que compreende uma solução aquosa de um composto de acordo com a presente invenção e, um tampão, em que o dito composto está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml ou acima e, em que a dita formulação tem um pH de cerca de 2,0 a cerca de 10,0.
[0342] Em um outro aspecto a invenção diz respeito a uma formulação farmacêutica que compreende uma solução aquosa de um composto de acordo com a presente invenção e, um tampão, em que o dito composto está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml ou acima e, em que a dita formulação tem um pH de cerca de 7,0 a cerca de 8,5.
[0343] Em uma outra forma de realização da invenção o pH da formulação é selecionado da lista que consiste de 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 e, 10,0. Preferivelmente, o pH da formulação é pelo menos 1 unidade de pH do ponto isoelétrico do composto de acordo com a presente invenção, ainda mais preferível o pH da formulação é pelo menos 2 unidades de pH do ponto isoelétrico do composto de acordo com a presente invenção.
[0344] Em uma outra forma de realização da invenção o tampão é selecionado do grupo que consiste de acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, diidrogeno fosfato de sódio, hidrogeno fosfato de dissódio, fosfato de sódio e, tris(hidroximetil)-aminometano, hepes, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maléico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas destes. Cada um destes tampões específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção.
[0345] Em uma outra forma de realização da invenção a formulação ainda compreende um conservante farmaceuticamente aceitável. Em uma outra forma de realização da invenção o conservante é selecionado do grupo que consiste de fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metila, p-hidroxibenzoato de propila, 2-fenoxietanol, p- hidroxibenzoato de butila, 2-feniletanol, álcool benzílico, etanol, clorobutanol e, tiomerosal, bronopol, ácido benzóico, imiduréia, cloroexidina, desidroacetato de sódio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etila, cloreto de benzetônio, clorfenesine (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) ou misturas destes. Em uma outra forma de realização da invenção o conservante está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 30 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção o conservante está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção o conservante está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção o conservante está presente em uma concentração de 5 mg/ml a 10 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção o conservante está presente em uma concentração de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada um destes conservantes específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção. O uso de um conservante em composições farmacêuticas é bem conhecido pela pessoa habilitada. Para referência de conveniência é fabricado um Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 1a edição, 1995.
[0346] Em uma outra forma de realização da invenção a formulação ainda compreende um agente isotônico. Em uma outra forma de realização da invenção o agente isotônico é selecionado do grupo que consiste de um sal (por exemplo, cloreto de sódio), um açúcar ou álcool de açúcar, um aminoácido (por exemplo, L-glicina, L- histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina), um alditol (por exemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenoglicol), 1,3-propanodiol, 1,3- butanediol) polietilenoglicol (por exemplo, PEG400) ou misturas destes. Qualquer açúcar, tal como, mono-, di- ou, polissacarídeos ou, glicanos solúveis em água, incluindo por exemplo, frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, trealose, dextrano, pululan, dextrina, ciclodextrina, amido solúvel, amido de hidroxietila e carboximetilcelulose-Na pode ser usado. Em uma forma de realização, o aditivo de açúcar é sacarose. O álcool de açúcar é definido como um hidrocarboneto C4-C8 que tem pelo menos um grupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galacititol, dulcitol, xilitol e, arabitol. Em uma forma de realização, o álcool de aditivo de açúcar é manitol. Os açúcares ou álcoois de açúcar mencionados acima podem ser usados individualmente ou em combinação. Não há nenhum limite fixado para a quantidade usada, visto que o açúcar ou o álcool de açúcar são solúveis na preparação líquida e não afeta adversamente os efeitos de estabilização atingidos usando-se os métodos da invenção. Em uma forma de realização, a concentração de açúcar ou álcool de açúcar está entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 150 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 50 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 7 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 8 mg/ml a 24 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada um destes agentes isotônicos específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção.
[0347] O uso de um agente isotônico em composições farmacêuticas é bem conhecido pela pessoa habilitada. Para referência de conveniência é fabricado um Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[0348] Em uma outra forma de realização da invenção a formulação ainda compreende um agente de quelação. Em uma outra forma de realização da invenção o agente de quelação é selecionado de sais de ácido etilenodiaminotetraacático (EDTA),ácido cítrico e, ácido aspártico e, misturas destes.
[0349] Em uma outra forma de realização da invenção o agente de quelação está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 5mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção o agente de quelação está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 2 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção o agente de quelação está presente em uma concentração de 2 mg/ml a 5 mg/ml. Cada um destes agentes de quelação específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção. O uso de um agente de quelação em composições farmacêuticas é bem conhecido pela pessoa habilitada.
[0350] Para referência de conveniência é fabricado um Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 1a edição, 1995.
[0351] Em uma outra forma de realização da invenção a formulação ainda compreende um estabilizador. O uso de um estabilizador em composições farmacêuticas é bem conhecido pela pessoa habilitada. Para referência de conveniência é fabricado um Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.
[0352] Mais particularmente, as composições da invenção são composições farmacêuticas líquidas estabilizadas cujos componentes terapeuticamente ativos incluem um polipeptídeo que possivelmente apresenta formação de agregado durante o armazenamento em formulações farmacêuticas líquidas. Por “formação de agregado” é pretendida uma interação física entre as moléculas de polipeptídeo que resultam na formação de oligômeros, que podem permanecer solúveis ou, agragados visíveis grandes que precipitam da solução. Por “durante armazenamento” é pretendido uma composição ou formulação farmacêutica líquida uma vez preparada não é imediatamente administrada a um paciente. De preferência, a seguinte preparação, é embalada para armazenamento, em uma forma líquida, em um estado congelado ou, em uma forma seca para reconstituição posterior em uma forma líquida ou outra forma adequada para a administração a um paciente. Por “forma seca” é pretendida que a composição ou formulação farmacêutica líquida seja secada pela secagem por congelamento (isto é, liofilização; ver, por exemplo, Williams e Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59), secagem por pulverização (ver Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U. K. ), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18: 1169-1206; and Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11: 12-20), ou secagem ao ar (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; and Roser (1991) Biopharm. 4: 47-53). A formação de agregado por um polipeptídeo durante o armazenamento de uma composição farmacêutica líquida pode afetar adversamente a atividade biológica daquele polipeptídeo, resultando na perda de eficácia terapêutica da composição farmacêutica. Além disso, a formação de agregado pode causar outros problemas tais como, bloqueio de tubulação, membranas ou bombas quando a composição farmacêutica que contém polipeptídeo é administrada usando-se um sistema de infusão.
[0353] As composições farmacêuticas da invenção podem ainda compreender uma quantidade de uma base de aminoácido suficiente para diminuir a formação de agregado pelo polipeptídeo durante o armazenamento da composição. Por “base de aminoácido” é pretendido um aminoácido ou uma combinação de aminoácidos, onde qualquer aminoácido dado está presente na sua forma de base livre ou na sua forma de sal. Onde uma combinação de aminoácidos é usada, todos os aminoácidos podem estar presentes nas suas formas de base livre, todos podem estar presentes nas suas formas de sal ou, alguns podem estar presentes nas suas formas de base livre enquanto outros estão presentes nas suas formas de sal. Em uma forma de realização, os aminoácidos usados para preparar as composições da invenção são aqueles que carregam uma cadeia secundária carregada, tal como, arginina, lisina, ácido aspártico e, ácid glutâmico. Em uma forma de realização, o aminoácido usado para preparar as composições da invenção é a glicina. Qualquer estereoisômero (isto é, L ou D) de um aminoácido particular (por exemplo, metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina e misturas destes) ou combinações destes estereoisômeros, podem estar presentes nas composições farmacêuticas da invenção contanto que o aminoácido particular esteja presente na sua forma de base livre ou sua forma de sal. Em uma forma de realização, o L- estereoisômero é usado. As composições da invenção também podem ser formuladas com análogos destes aminoácidos. Por “análogo de aminoácido” é pretendido um derivado do aminoácido que ocorre naturalmente, que realiza o efeito desejado de diminuição da formação de agregado pelo polipeptídeo durante o armazenamento das composições farmacêuticas líquidas da invenção. Os análogos de arginina adequados incluem, por exemplo, aminoguanidina, ornitina e N-monoetil L-arginina, análogos de metionina adequados incluem etionina e butionina e análogos de cisteína adequados incluem S-metil-L cisteína.
[0354] Assim como os outros aminoácidos, os análogos de aminoácido são incorporados nas composições em sua forma de base livre ou sua forma de sal. Em uma outra forma de realização da invenção os aminoácidos ou análogos de aminoácido são usados em uma concentração, que é suficiente para prevenir ou retardar a agregação da proteína.
[0355] Em uma outra forma de realização da invenção a metionina (ou outros aminoácidos sulfúricos ou análogos de aminoácido) pode ser adicionada para inibir a oxidação de resíduos de metionina para sulfóxido de metionina quando o polipeptídeo age como o agente terapêutico é um polipeptídeo que compreende pelo menos um resíduo de metionina suscetível a uma tal oxidação. Por “inibir” é pretendido o acúmulo mínimo de espécies oxidades de metionina por tempo. A inibição da oxidação de metionina resulta na retenção maior do polipeptídeo na sua própria forma molecular. Qualquer estereoisômero de metionina (L, D ou uma mistura destes) pode ser usado. A quantidade a ser adicionada deve ser uma quantidade suficiente para inibir a oxidação dos resíduos de metionina tal que a quantidade de sulfóxido de metionina seja aceitável para agências reguladoras. Tipicamente, isto significa que a composição contém não mais do que cerca de 10 % a cerca de 30 % de sulfóxido de metionina. Geralmente, isto pode ser conseguido pela adição de metionina tal que a razão de metionina adicionada aos resíduos de metionina varia de cerca de 1:1 a cerca de 1000:1, tal como, 10:1 a cerca de 100:1.
[0356] Em uma outra forma de realização da invenção a formulação ainda compreende um estabilizador selecionado do grupo de polímeros de peso molecular alto ou compostos moleculares inferiores. Em uma outra forma de realização da invenção o estabilizador é selecionado de polietileno glicol (por exemplo, PEG 3350), ácool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carbóxi-/hidroxicelulose ou derivados destes (por exemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, substâncias que contém enxofre como monotioglicerol, ácido tioglicólico e 2-metiltioetanol e, sais diferentes (por exemplo, cloreto de sódio). Cada um destes estabilizadores específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção.
[0357] As composições farmacêuticas também podem compreender agentes estabilizantes adicionais, que ainda intensificam a estabilidade de um polipeptídeo ativo terapêutico deste. Os agentes estabilizantes de interesse particular para a presente invenção incluem, mas não são limtiados a, metionina e EDTA, que protegem o polipeptídeo contra a oxidação da metionina e um tensoativo não iônico, que protege o polipeptídeo contra a agregação associada com congelamento-descongelamento ou corte mecânico.
[0358] Em uma outra forma de realização da invenção a formulação ainda compreende um tensoativo. Em uma outra forma de realização da invenção o tensoativo é selecionado de um detergente, óleo de rícino etoxilado, glicerídeos poliglicolizados, monoglicerídeos acetilados, ésteres de ácido graxo de sorbitano, polímeros de bloco polioxipropileno-polioxietileno (por exemplo, poloxâmeros, tais como Pluronie F68, poloxamer 188 e 407, Triton X-100), ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano, PEO da forma de estrela, derivados de polioxietileno e polietileno, tais como derivados alquilados e alcoxilados (tweens, por exemplo, Tween-20, Tween-40, Tween-80 and Brij-35), hidroxiestearato de polioxietileno, monoglicerídeos ou seus derivados etoxilados, diglicerídeos ou derivados de polioxietileno destes, álcoois, glicerol, lecitinas e fosfolipídeos (por exemplo, fosfatidil serina, fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil inositol, difosfatidil glicerol e esfingomielina), derivados de fosfolipídeos s (por exemplo, ácido dipalmitoil fosfatídico) e lisofosfolipídeos (por exemplo, palmitoil lisofosfatidil-L-serina e 1-acil-sn- glicero-3-fosfate ésteres de etanolamina, colina, serina ou treonina) e alquila, alcoxila (éster alquílico), alcóxi (éter alquílico), derivados de lisofosfatidila e fosfatidilcolinas, por exemplo, derivados de lauroíla e miristoíla de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina e modificações do grupo superior polar, que é colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol, e os positivamente carregados DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, lisofosfatidilserina e lisofosfatidiltreonina e glicerofosfolipídeos (por exemplo, cefalinas), gliceroglicolipídeos (por exemplo, galactopiranosida), esfingoglicolipídeos (por exemplo, ceramidas, gangliosidas), dodecilfosfocolina, lisolecitina de ovo de galinha, derivados de ácido fusídico (por exemplo, taurodiidrofusidato de sódio etc.), ácidos graxos de cadeia longa e seus sais C6-C12 (por exemplo, ácido oléico e ácido caprílico), acilcarnitinas e derivados, derivados Nα-acilados de lisina, arginina ou histidina ou derivados acetilados de cadeia secundária de lisina ou arginina, derivados Nα-acilados de dipeptídeos que compreendem qualquer combinação de lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou ácido, derivado Nα-acilado de um tripeptídeo que compreende qualquer combinação de um aminoácido neutro e dois aminoácidos carregados, DSS (docusato sódico, registro CAS n° [577-11- 7]), docusato cálcico, registro CAS n° [128-49-4]), docusato potássico, registro CAS n° [7491-09-0]), SDS (dodecil sulfato sódico ou lauril sulfato de sódio), caprilato de sódio, ácido cólico ou derivados destes, ácidos bílicos e seus sais e conjugados de glicina ou taurina, ácido ursodesoxicólico, colato de sódio, desoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, glicocolato de sódio, N-Hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1- propanossulfonato, tensoativos monovalentes de (alquil-aril-sulfonatos) aniônicos, tensoativos zwitteriônicos (por exemplo, N-alquil-N,N-dimetilamônio-1- propanossulfonatos, 3-colamido-1-propildimetilamônio-1- propanossulfonato, tensoativos catiônicos (bases de amônia quaternária) (por exemplo, brometo de cetil- trimetilamônio, cloreto de cetilpiridínio), tensoativos não iônicos (por exemplo, Dodecil β-D-glucopiranosida), poloxaminas (por exemplo, Tetronic's), que são copolímeros de bloco tetrafuncionais derivados da adição sequêncial de óxido de propileno e óxido de etileno para etilenodiamina ou o tensoativo pode ser selecioando do grupo de derivados de imidazolina ou misturas destes. Cada um destes tensoativos específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção.
[0359] O uso de um tensoativo nas composições farmacêuticas é bem conhecido pela pessoa habilitada na técnica. Por conveniência, referência é feita a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19° edição, 1995.
[0360] Uma composição para a administração parenteral de compostos de GLP-1 pode ser, por exemplo, preparada como descrito no WO 03/002136.
[0361] É possível que outros ingredientes estejam presentes na formulação farmacêutica de peptídeo da presente invenção. tais ingreidentes adicionais incluem agentes umectantes, emulsificadores, antioxidantes, agentes de carga, modificadores de tonicidade, agentes quelantes, íons metálicos, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina de soro humano, gelatina ou proteínas) e um zwitterion (por exemplo, um aminoácido, tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Tais ingredientes adicionais, é claro, não devem afetar adversamente a estabilidade total da formulação farmacêutica da presente invenção.
[0362] As composições farmacêuticas contendo um composto de acordo com a presente invenção podem ser administradas a um paciente em necessidade de tal tratamento em diversos locais, por exemplo, em locais tópicos, por exemplo, pele e locais de mucosa, em locais que desviam a absorção, por exemplo, administração em uma artéria, em uma veia, no coração e em locais que envolvem a absorção, por exemplo, administração na pele, sob a pele, em um músculo ou no abdômem.
[0363] A administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ocorrer através de diversas vias de administração, por exemplo, lingual, sublingual, bucal, na boca, oral, o estômago e intestino, nasal, pulmonar, por exemplo, através dos bronquíolos e alvéolos ou uma combinação destes, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, retal, ocular, por exemplo, através da conjuntiva, uretal eparenteral a pacientes em necessidade de tal tratamento.
[0364] As composições da invenção corrente podem ser adminsitrados em diversas formas de dosagem, por exemplo, como soluções, suspensões, emulsões, microemulsões, emulsões múltiplas, espumas, pomadas, pastas, emplastros, unguentos, tabletes, tabletes revestidos, enxágues, cápsulas, por exemplo, cápsulas duras de gelatina e cápsulas moles de gelatina, supositórios, cápsulas retais, gotas, géis, pulverizações, pós, aerossóis, inalantes, gotas oculares, unguentos oftalmológicos, enxágues oftalmológicos, pessários vaginais, anéis vaginais, ubguentos vaginais, solução para injeção, soluções de transformação in situ, por exemplo, formação de gel in situ, ajuste in situ, precipitação in situ, critalização in situ, solução de infusão e implantes.
[0365] As composições da invenção ainda podem ser compostas em, ligadas, por exemplo, através de interações covalentes, hidrofóbicas e eletrostáticas, um veículo de medicamento, sistema d eliberação de medicamento e sistema de liberação de mediamento avançado a fim de intensificar, ainda, a estabilidade do composto, aumentar a biodisponibilidade, aumentar a solubilidade, diminuir os efeitos adversos, atingir a cronoterapia bem conhecida por aqueles habilitados na técnica e aumentar a condescendência do paciente ou qualquer combinação destes. Os exemplos de veículoes, siostemas de liberação de medicamento e sistemas de liberação avançados incluem, mas não são limtiados a, polímeros, por exemplo, celulose e derivados, polissacarídeos, por exemplo, dextrano e derivados, amido e derivados, poli(álcool vinílico), polímeros de acrilato e metacrilato, ácido poliláctico e poliglicólico e seus copolímeros de bloco, polietileno glicóis, proteínas veículoas, por exemplo, albumina, géis, por exemplo, sistemas de termoformação de gel, por exemplo, sistemas co-poliméricos de bloco bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, micelas, lipossomas, microesferas, nanoparticulados, cristais líquidos e dispersões destes, fase L2 e dispersões destes, bem conhecido por aqueles habilitados na técnica de comportamento de fase em sistemas de lipídeo-água, micelas poliméricas, emulsões múltiplas, auto- emulsificantes, auto-microemulsificantes, ciclodextrinas e seus derivados e dendrímeros.
[0366] As composições da invenção corrente são úteis na formulação de sólidos, semi-sólidos, pó e soluções para a administração pulmonar do composto, usando-se, por exemplo, um inalador de dose medida, inalador de pó seco e um nebulizador, todos sendo dispositivos bem conhecidos na técnica.
[0367] As composições da invenção corrente são especificamente úteis na formulação de sistemas de liberação de medicamento de liberação controlada, sustentada, prolongada, atrasada e lenta. Mais especificamente, mas não limitado, as composições são úteis na formulação de sistemas de liberação controlada e de liberação sustentada parenteral (ambos os sistemas levando a uma redução de muitas vezes no número de administrações), bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Ainda mais preferivelmente, são sistemas de liberação controlada e de liberação sustentada administrados subcutaneamente. Sem limitar o escopo da invenção, os exemplos de sistema de liberação controlada e as composições úteis são hirogéis, géis oleaginosos, cristais líquidos, micelas poliméricas, microesferas, nanopartículas. Os métodos para a produção de sistemas de liberação controlada úteis para composições da invenção corrente incluem, mas não são limitados a, cristalização, condensação, co-cristalização, precipitação, co-precipitação, emulsificação, disperção, homogeneização de alta pressão, encapsulação secagem por pulverização, microencapsulação, coacervação, separação de fase, evaporação de solvente para a produção de microesferas, extrusão e processos de fluido supercrítico. Referência geral é feita a Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D. L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) e Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E. J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000).
[0368] A administração parenteral pode ser realizada pela injeção subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa por meio de uma seringa, opcionalmente substituído uma seringa semelhante à caneta.
[0369] Alternativamente, a administração parenteral pode ser realziada por meio de uma bomba de infusão. Uma outra opção é uma composição que possa ser uma solução ou suspensão para a administração do composto de acordo com a presente invenção na forma de uma pulverização nasal ou pulmonar. Ainda, como uma outra opção, as composições farmacêuticas que conêm o composto da invenção também podem ser adaptadas para a administração transdérmica, por exemplo, pela injeção isenta de agulha ou a partir de um emplastro, opcionalmente, um emplastro iontoforético ou transmucosa, por exemplo, administração bucal.
[0370] O termo “formulação estabilizada” refere-se a uma formulação com estabilidade física aumentada, estabilidade química aumentada ou estabilidade física e química aumentada.
[0371] O termo “estabilidade física” da formulação da proteína como usado neste refere-se à tendência da proteína formar agregados biologicamente inativos e/ou insolúveis da proteína como um resultado da exposição da proteína à tensões termo- mecâncias e/ou interação com interfaces e superfícies que são destabilizantes, tais como, superfícies e interfaces hidrofóbicas. A estabilidade física das formulações de proteína aquosas é avaliada por meio da inspeção visual e/ou medições de turbidez após a exposição da formulação enchida em um recipiente adequado (por exemplo, cartuchos ou frascos) à tensão mecânica/física (por exemplo, agitação) em temperaturas difernetes por vários períodos de tempo. A inspeção visual das formulações é realziada em uma luz focalizada fortemente com um fundo escuro. A turbidez da formulação é caracterizada por um registro visual que classifica o grau de turbidez, por exemplo, em uma escala de 0 a 3 (uma formulação que não mostra nenhuma turbidez corresponde a um registro visual 0 e uma formulação que mostra turbidez visual luz do dia corresponde ao registro visual 3). Uma formulação é classificada visualmente instável com respeito à agregação de proteína, quando esta mostra turbidez visual na luz do dia. Alternativamente, a turbidez da formulação pode ser avaliada pelas medições de turbidez simples bem conhecidas pela pessoa habilitada na técnica. A estabilidade física de formulações de proteína aquosas também podem ser avaliadas usando-se um agente ou sonda espectroscópicos do estado conformacional da proteína. A sonda é, preferivelmente, uma molécula pequena que se liga, preferivelmente, a um conformador não natural da proteína. Um exempl ode uma sonda espectroscópica molecular pequena de estrutura de proteína é a Tioflavina T. A Tioflavina T é um pigmento fluorescente que foi amplamente usado para a detecção de fibrilas amilóides. Também na presença de fibrilas e talvez outras configurações de proteína, a Tioflavina T dá origem a uma nova excitação máxima de cerca de 450 nm e emissão intensificada de cerca de 482 nm quando ligado a uma forma de proteína de fibrila. A Tioflavina T não ligada é essencialmente não fluorescente nos comprimentos de onda.
[0372] Outras moléculas pequenas podem ser usadas como sondas das mudanças na estrutura de proteína de estado natural para não natural. Por exemplo, as sondas de “emplastros hidrofóbicos” que se ligam preferivelmente a emplastros hidrofóbicos expostos de uma proteína. Os emplastros hidrofóbicos são, no geral, retirados dentro a estrutura terciária de uma proteína em seu estado natural, mas torna-se exposto assim como a proteína começa a desenvolver e desnaturar. Os exemplos destas sondas espectroscópicas moleculares pequenas são pigmentos aromáticos hidrofóbicos, tais como antraceno, acridina, fenantrolina ou coisa parecida. Outras sondas espectroscópicas são complexos de metal-aminoácido, tais como complexos metálicos de cobalto de aminoácidos hidrofóbicos, tais como fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina e valina ou coisa parecida.
[0373] O termo “estabilidade química” da formulação de proteína como usado neste refere-se às mudanças covalntes químicas na estrutura d eproteína que leva à formação de produtos de degradação química com potencia biológica menos potencial e/ou propriedades imunogênicas aumentadas potenciais em comparação com a estrutura natural. Vários produtos de degradação química podem ser formados depenendo do tipo e natureza da proteína natural e do ambiente ao qual a proteína está exposta. A eliminação da degradação química pode, na maioria das vezes, provavelmente, não ser completamente evitada e o aumento das quantidades de produtos de degradação é freqüentemente visto durante a armazenagem e o uso da formulação de proteína como é bem conhecido pela pessoa habilitada na técnica. A maioria das proteínas está predisposta à desamidação, um processo em que o grupo de amida da cadeia secundária em resíduos de glutaminila ou asparaginila hidrolisa- se para formar ácido carboxílico livre. Outros caminhos de degradação envolve a formação de produtos de transformação de peso molecular alto onde duas ou mais moléculas de proteína são covalentemente ligadas uma à outra através da transamidaão e/ou interações de bissulfeto que levam à formação de produtos de degradação de dímero, oligômero e de polímero que ligam-se covalentemente (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahem. T. J. & Manning M. C., Plenum Press, New York 1992). A oxidação (por exemplo, de resíduos de metionina) pode ser mencionada como uma outra variante de degradação química. A estabilidade química da formulação de proteína pode ser avaliada pela medição da quantidade dos produtos de degradação química em vários pontos de tempo após a exposição a condições ambientais diferentes (a formação de produtos de degradação pode ser, freqüentemente acelerada, por exemplo por um aumento na temperatura). A a quantidade de cada produto de degradação individual é freqüentemente determinada pela separação dos propdutos de degradação dependendo do tamanho da molécula e/u carga que usa várias técnicas de cromatografia (por exemplo, SEC-HPLC e/ou RP-HPLC).
[0374] Em conseqüência, como resumido acima, uma “formulação estabilizada” refere-se a uma formulação com estabilidade física aumentada, estabilidade química aumentada ou estabilidades física e química aumentadas. No geral, uma formulação deve ser estável durante o uso e armazenamento (de acordo com as condições de uso e armazenamento recomendadas) até a data de expiração ser alcançada.
[0375] Em uma forma de realização da invenção a formulação farmacêutica que compreende o composto de acordo com a presente invenção é estável por mais de 6 semanas de uso e por mais de 3 anos de armazenamento.
[0376] Em uma outra forma de realização da invenção a formulação farmacêutica que compreende o composto de acordo com a presente invenção é estável por mais de 4 semanas de uso e por mais de 3 anos de armazenamento.
[0377] Em uma outra forma de realização da invenção a formulação farmacêutica que compreende o composto de acordo com a presente invenção é estável por mais de 4 semanas de uso e por mais de dois anos de armazenamento.
[0378] Ainda em uma forma de realização adicional da invenção a formulação farmacêutica que compreende o composto é estável por mais de 2 semanas de uso e por mais de dois anos de armazenamento.
[0379] As composições farmacêuticas que contém um derivado de GLP-1 de acordo com a presente invenção podem ser parenteralmente administradas a pacientes em necessidade de um tal tratamento. A administração parenteral pode ser realizada por injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa por meio de uma seringa, opcionalmente uma seringa semelhante à caneta. Alternativamente, a administração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão. Uma opção adicional é uma composição que pode ser um pó ou um líquido para a administração do derivado de GLP-1 na forma de uma pulverização nasal ou pulmonar. Ainda, como uma opção adicional, os derivados de GLP-1 da invenção também podem ser transdermicamente administrados, por exemplo, a partir de um emplastro, opcionalmente um emplastro iontoforético ou, transmucosalmente, por exemplo, bucalmente.
[0380] Desta maneira, as composições injetáveis do derivado de GLP-1 da invenção podem ser preparadas usando-se as técnicas convencionais da indústria farmacêutica que envolve dissolver e misturar os ingredientes, como apropriado, para dar o produto final desejado.
[0381] De acordo com um procedimento, o derivado de GLP-1 é dissolvido em uma quantidade de água que é um pouco menor do que o volume final da composição a ser preparada. Um agente isotônico, um conservante e um tampão é adicionado como requerido e o valor de pH da solução é ajustado - se necessário - usando-se um ácido, por exemplo, ácido clorídrico ou, uma base, por exemplo, hidróxido de sódio aquoso como necessário. Finalmente, o volume da solução é ajustado com água para dar a concentração desejada dos ingredientes.
[0382] Além dos componentes mencionados acima, as soluções que contêm um derivado de GLP-1 de acordo com a presente invenção também podem conter um tensoativo a fim de melhorar a solubilidade e/ou a estabilidade do derivado de GLP-1.
[0383] Uma composição para a administração nasal de certos peptídeos pode ser, por exemplo, preparada como descrito na Patente Européia No. 272097 (concedida à Novo Nordisk A/S) ou no WO 93/18785.
[0384] De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o derivado de GLP-1 é fornecido na forma de uma composição adequada para administração por injeção. Uma tal composição pode ser uma solução injetável pronta para o uso ou pode ser uma quantidade de uma composição sólida, por exemplo, um produto liofilizado, que tem que ser dissolvido em um solvente antes que seja injetado. A solução injetável preferivelmente contém não menos do que cerca de 2 mg/ml, preferivelmente não menos do que cerca de 5 mg/ml, mais preferido não menos do que cerca de 10 mg/ml do derivado de GLP-1 e, preferivelmente, não mais do que cerca de 100 mg/ml do derivado de GLP-1.
[0385] Os derivados de GLP-1 desta invenção podem ser usados no tratamento de várias doenças. O derivado de GLP-1 particular a ser usado e o nível de dose ótimo para qualquer paciente dependerá da doença a ser tratada e de uma variedade de fatores que inclui a eficácia do derivado de peptídeo específico utilizado, a idade, peso corporal, atividade física e dieta do paciente, em uma possível combinação com outros medicamentos e da gravidade do caso. É recomendado que a dosagem do derivado de GLP-1 desta invenção seja determinada para cada paciente individualmente por aqueles habilitados na técnica.
[0386] Em particular, é considerado que o derivado de GLP-1 seja útil para a preparação de um medicamento com um perfil prolongado de ação para o tratamento de diabete melito não dependente de insulina e/ou para o tratamento de obesidade.
[0387] Em um outro aspecto a presente invenção diz respeito ao uso de um composto de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento.
[0388] Em uma forma de realização a presente invenção diz respeito ao uso de um composto de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento de hiperglicemia, diabete tipo 2, tolerância à glicose prejudicada, diabete tipo 1, obesidade, hipertensão, síndrome X, dislipidemia, apoptose de célula β, deficiência de célula β, infarto miocárdico, síndrome do intestino inflamatório, dispepsia, distúrbios cognitivos, por exemplo,intensificação cognitiva, neuroproteção, aterosclerose, cardiopatia coronariana e outros distúrbios cardiovasculares.
[0389] Em uma outra forma de realização a presente invenção diz respeito ao uso de um composto de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento de síndrome do intestino delgado, síndrome do intestino inflamatório ou doença de Crohn.
[0390] Em uma outra forma de realização a presente invenção diz respeito ao uso de um composto de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento de hiperglicemia, diabete tipo 1, diabete tipo 2 ou deficiência de célula β.
[0391] O tratamento com um composto de acordo com a presente invenção também pode ser combinado com uma segunda substância ou substâncias farmacologicamente ativas, por exemplo, selecionadas de agentes antidiabéticos, agentes anti-obesidade, agentes reguladores de apetite, agentes anti-hipertensivos, agentes para o tratamento e/ou a prevenção de complicações que resultam de, ou estão associadas com diabetes e agentes para o tratamento e/ou prevenção de complicações e distúrbios que resultam de, ou estão associados com obesidade. No presente contexto a expressão “agente antidiabético” inclui compostos para o tratamento e/ou profilaxia de resistência a insulina e doenças em que resistência a insulina é o mecanismo patofisiológico.
[0392] Os exemplos destas substâncias farmacologicamente ativas são: Insulina, agonistas de GLP-1, sulfoniluréias (por exemplo, tolbutamida, glibenclamida, glipizida e gliclazida), biguanidas, por exemplo, metformin, meglitinidas, inibidores de glicosidase (por exemplo, acorbose), antagonistas de glucagon, inibidores de DPP-IV (dipeptidil peptidase-IV), inibidores de enzimas hepáticas envolvidas na estimulação de gliconeogênese e/ou glicogenólise, moduladores de absorção de glicose, tiazolidinodionas, tais como, troglitazona e ciglitazona, compostos que modificam o metabolismo de lipídeo, tais como, agentes anti-hiperlipidêmicos como inibidores de HMG CoA (estatinas), compostos que reduzem a entrada de alimento, agonistas de RXR e agentes que atuam no canal de potássio dependente de ATP das células β, por exemplo, glibenclamida, glipizida, gliclazida e repaglinida; Colestiramina, colestipol, clofibrato, gemfibrozil, lovastatina, pravastatina, simvastatina, probucol, dextrotiroxina, neteglinida, repaglinida; bloqueadores β, tais como, alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propranolol e metoprolol, inibidores de ACE (angiotensina que converte enzima), tais como, benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, alatriopril, quinapril e ramipril, bloqueadores do canal de cálcio, tais como, nifedipina, felodipina, nicardipina, isradipina, nimodipina, diltiazem e verapamil e bloqueadores α, tais como, doxazosin, urapidil, prazosin e terazosin; agonistas de CART (transcrição regulada por cocaína anfetamina), antagonistas de NPY (neuropeptídeo Y), MC4 (melanocortina 4) agonistas, antagonistas de orexin, agonistas de TNF (fator de necrose tumoral), agonistas de CRF (fator de liberação de corticotropina), antagonistas de CRF BP (proteína de ligação do fator de liberação de corticotropina), agonistas de urocortina, agonistas de β3, agonistas de MSH (hormônio que estimula melanócito), antagonistas de MCH (hormônio que concentra melanócito), agonistas de CCK (colecistocinina), inibidores da reabsorção de serotonina, serotonina e inibidores da reabsorção de noradrenalina, serotonina mista e compostos noradrenérgicos, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas de bombesin, antagonistas de galanina, hormônio do crescimento, compostos que liberam o hormônio do crescimento, agonistas de TRH (hormônio que libera tireotropina), moduladores de UCP 2 ou 3 (proteína 2 ou 3 separada), agonistas de leptina, agonistas de DA (bromocriptina, doprexin), inibidores de lipase/amilase, moduladores de RXR (retinóide X receptor), agonistas de TR β; antagonistas de histamina H3.
[0393] Deve ser entendido que qualquer combinação adequada dos compostos de acordo com a invenção com um ou mais dos compostos mencionados acima e opcionalmente uma ou mais substâncias farmacologicamente ativas adicionais são consideradas estar dentro do escopo da presente invenção.
[0394] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que, entretanto, não devem ser interpretados como limitantes do escopo de proteção. As características divulgadas na descrição anterior e nos seguintes exemplos podem ser, tanto separadamente quanto em qualquer combinação destes materiais para realizar a invenção nas suas diversas formas.
EXEMPLOS
[0395] Os seguintes acrônimos para os produtos químicos comercialmente disponíveis são usados:
[0396] DMF : N,N-Dimetilformamida.
[0397] DCC : N,N-Dicicloexilcarbodiimida
[0398] NMP : N-Metil-2-pirrolidona.
[0399] TFA : Ácido trifluoroacético.
[0400] THF : Tetraidrofurano
[0401] DIEA : diisopropiletilamina
[0402] H2O : água
[0403] CH3CN : acetonitrila
[0404] HBTU : Hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3 tetrametilurônio
[0405] Fmoc : 9 H-fluoren-9-ilmetoxicarbonil
[0406] Boc : terc-butiloxicarbonila
[0407] OtBu : éster terc butílico
[0408] tBu : terc butila
[0409] Trt : trifenilmetil
[0410] Pmc : 2,2,5,7,8-Pentametil-croman-6-sulfonila
[0411] Dde : 1-(4,4-Dimetil-2,6-dioxocicloexilideno)etila
[0412] DCM : diclorometano
[0413] TIS : triisopropilsilano)
[0414] Et2O : éter dietílico
[0415] H-Glu(OH)-OBut: Éster α-terc-butilico de L-glutâmico
[0416] HOOC-(CH2)12-COONSu: Éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico do ácido ra- carboxitridecanóico.
[0417] HOOC-(CH2)14-COONSu: carboxipentadecanóico. Éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico do ácido ra-
[0418] HOOC-(CH2)16-COONSu: carboxiheptadecanóico. Éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico do ácido ra-
[0419] HOOC-(CH2)18-COONSu: Éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico do ácido ra- carboxinonadecanóico.
[0420] Abreviações:
[0421] r.t Temperatura ambiente
[0422] PDMS: Espectrometria de Massa por Desorção de Plasma
[0423] MALDI-MS: Desorção a Laser Assistida por Matriz/ Espectrometria de Massa por Ionização
[0424] HPLC: Cromatografia Líquida de Alto Desempenho
[0425] amu: unidade de massa atômica
[0426] Analítico:
[0427] A resistência de um peptídeo para a degradação por dipeptidil aminopeptidase IV é determinada pelo seguinte ensaio de degradação:
[0428] As alíquotas dos peptídeos são incubadas a 37° C com uma alíquota de dipeptidil aminopeptidase IV purificado por 4 a 22 horas em um tampão apropriado em pH 7-8 (o tampão não sendo albumina). As reações enzimáticas são terminadas pela adição de ácido trifluoroacético e, os produtos de degradação de peptídeo são separados e quantificados usando-se análise de HPLC ou de LC-MS. Um método para realizar esta análise é: As misturas são aplicadas em uma coluna Zorbax 300SB-C18 (poros de 30 nm, partículas de 5 μm) de 150 x 2,1 mm e eluídas em uma taxa de fluxo de 0,5 ml/minuto com um gradiente linear de acetonitrila em ácido trifluoroacético a 0,1 % (acetonitrila de 0 % a 100 % durante 30 minutos). Os peptídeos e seus produtos de degradação podem ser monitorados por sua absorbância a 214 nm (ligações de peptídeo) ou 280 nm (aminoácidos aromáticos) e, são quantificados pela integração de suas áreas de pico. O padrão de degradação pode ser determinado pelo uso de LC-MS onde os espectros de MS do pico separado podem ser determinados. A porcentagem de composto intacto/degradado em um dado tempo é usado para a estimativa da estabilidade dos peptídeos DPPIV.
[0429] Um peptídeo é definido como DPPIV estabilizado quando este é 10 vezes mais estável do que o peptídeo natural com base na porcentagem de composto intacto em um dado tempo. Desta maneira, um composto de GLP-1 estabilizado por DPPIV é pelo menos 10 vezes mais estável do que GLP-1(7-37).
Métodos Sintéticos Gerais
[0430] Os peptídeos podem ser sintetizados em resina de amida Rink protegida por Fmoc (Novabiochem) ou resina de clorotritila ou uma resina similar adequada para a síntese de peptídeo de fase sólida. A química Boc pode ser usada mas, mais conveniente é usar a estratégia Fmoc eventualmente em um sintetizador de peptídeo Applied Biosystems 433A em escala de 0,25 mmol usando-se os protocolos FastMoc UV que utilizam ligações mediadas por HBTU (Hexafluorofosfato de 2-(1H- benzotriazol-1-il)-1,1,3,3 tetrametilurônio) em N-metil pirrolidona (N-metil pirrolidona) (HATU é melhor adaptado para ligações impedidas) e o monitoramento de UV da desproteção do grupo de proteção Fmoc. Outros reagentes de ligação além de HBTU e HATU como descrito em por exemplo, Current Opinion in Chemical Biology, 2004, 8:211-221 também podem ser usados. Os derivados de aminoácido protegidos usados podem ser aminoácidos Fmoc padrão fornecidos em cartuchos pré-pesados (Applied Biosystems) adequados para o sintetizador ABI433A com a exceção de aminoácidos não naturais, tais como, Fmoc-Aib-OH (ácido Fmoc-aminoisobutírico) que são adquiridos de um fornecedor tal como, Bachem e transferidos a cartuchos vazios. O último aminoácido ligado pode ser Boc protegido.
[0431] A ligação de cadeias secundárias e ligadores aos resíduos de lisina específicos no peptídeo protegido ligado por resina bruta pode ser eventualmente introduzida em uma posição específica pela incorporação de Fmoc-Lys(Dde)-OH durante síntese automatizada seguida pela desproteção seletiva com hidrazina. Outros grupos de proteção ortogonais podem ser usados em Lisina.
[0432] Procedimento para a remoção de proteção de Dde. A resina (0,25 mmol) pode ser colocada em um mecanismo de agitador/filtração manual e tratada com hidrazina a 2 % em N-metil pirrolidona (20 ml, 2 x 12 minutos) para remover o grupo DDE e subsequentemente lavado com N-metil pirrolidona (4 x 20 ml).
[0433] Procedimento para a ligação de cadeias secundárias aos resíduos de Lisina.
[0434] O aminoácido (4 equivalentes molares relativos a resina) pode ser dissolvido em N-metil pirrolidona/cloreto de metileno (1:1, 10 ml). Hidroxibenzotriazol (HOBt) (4 equivalentes molares relativos a resina) e diisopropilcarbodiimida (4 equivalentes molares relativos a resina) é adicionado e a solução foi agitada por 15 minutos. A solução é adicionada à resina e diisopropiletilamina (4 equivalentes molares relativos a resina) é adicionada. A resina é agitada 24 horas em temperatura ambiente. A resina é lavada com N-metil pirrolidona (2 x 20 ml), N-metil pirrolidona/Cloreto de metileno (1:1) (2 x 20ml) e cloreto de metileno (2 x 20 ml).
[0435] Procedimento para a remoção de proteção de Fmoc: A resina (0,25 mmol) é colocada em um frasco de filtro em um mecanismo de agitação manual e tratada com N-metil pirrolidona/cloreto de metileno (1:1) (2 x 20 ml) e com N-metil pirrolidona (1 x 20 ml), uma solução de piperidina a 20 % em N-metil pirrolidona (3 x 20 ml, 10 minutos cada). A resina é lavada com N-metil pirrolidona (2 x 20 ml), N-metil pirrolidona/cloreto de metileno (1:1) (2 x 20 ml) e cloreto de metileno (2 x 20 ml).
[0436] Procedimento para a clivagem do peptídeo fora da resina:
[0437] O peptídeo é clivado da resina pela agitação por 180 minutos em temperatura ambiente com uma mistura de ácido trifluoroacético, água e triisopropilsilano (95:2,5:2,5). A mistura de clivagem é filtrada e o filtrado é concentrado a um óleo por uma corrente de nitrogênio. O peptídeo bruto é precipitado a partir deste óleo com 45 ml de éter dietílico e lavado 3 vezes com 45 ml de éter dietílico.
[0438] Purificação: O peptídeo bruto pode ser purificado pela HPLC semipreparativa em uma coluna de 20 mm x 250 mm empacotada com 7 μ de sílica C-18. Dependendo do peptídeo um ou dois sistemas de purificação podem ser usados:
[0439] Sulfato de amônio: A coluna é equilibrada com CH3CN a 40 % em (NH4)2SO4 a 0,05M, que é ajustada ao pH 2,5 com H2SO4 concentrado. Depois da secagem, o peptídeo bruto é dissolvido em 5 ml de ácido acético a 50 % de H2O e diluído a 20 ml com H2O e injetado na coluna que é então eluída com um gradiente de CH3CN de 40 % a 60 % em (NH4)2SO4 a 0,05 M, pH 2,5 a 10 ml/minuto durante 50 minutos a 40° C. O peptídeo que contém frações é coletado e diluído com 3 volumes de H2O e passado através de um cartucho Sep-Pak® C18 (Waters part. #: 51910) que foi equilibrado com TFA a 0,1 %. Este é então eluído com CH3CN a 70 % contendo TFA a 0,1 % e o peptídeo purificado é isolado por liofilização depois da diluição do eluato com água.
[0440] TFA: Depois da secagem, o peptídeo bruto é dissolvido em 5 ml de ácido acético a 50 % de H2O e diluído a 20 ml com H2O e injetado na coluna que é então eluída com um gradiente de CH3CN de 40 a 60 % em TFA a 0,1 % 10 ml/minuto durante 50 minutos a 40° C. O peptídeo que contém frações é coletado. O peptídeo purificado é liofilizado depois da diluição do eluato com água. O produto final obtido pode ser caracterizado pela RP-HPLC analítica (tempo de retenção) e por LCMS.
[0441] A análise de RP-HPLC realizada neste, na seção experimental foi realizada usando-se a detecção de UV a 214 nm e uma coluna Vydac 218TP54 de 4,6 mm x 250 mm de 5 μ de sílica C-18 (The Separations Group, Hesperia, USA) que foi eluída a 1 ml/minuto a 42° C. As condições de elução diferentes foram:
[0442] A1: Equilíbrio da coluna com um tampão que consiste de (NH4)2SO4 a 0,1 M, que foi ajustado ao pH 2,5 com H2SO4 concentrado e elução por um gradiente de CH3CN de 0 % a 60 % no mesmo tampão durante 50 minutos.
[0443] B1: Equilíbrio da coluna com TFA a 0,1 %/H2O e elução por um gradiente de CH3CN a 0 %/TFA a 0,1 %/H2O para CH3CN a 60 %/TFA a 0,1 %/H2O durante 50 minutos.
[0444] B6: Equilíbrio da coluna com TFA a 0,1 %/H2O e elução por um gradiente de CH3CN a 0 %/TFA a 0,1 %/H2O para CH3CN a 90 %/TFA a 0,1 %/H2O durante 50 minutos.
[0445] Um sistema alternativo foi:
[0446] B4: As análises de RP foram realizadas usando-se um sistema Alliance Waters 2695 adaptado com um detector de faixa dupla Waters 2487. As detecções de UV a 214 nm e 254 nm foram coletadas usando-se uma coluna Symmetry300 C18, de 5 μm, 3,9 mm x 150 mm, 42° C. Eluída com um gradiente linear de acetonitrila de 5 a 95 %, água de 90 a 0 % e, ácido trifluoroacético a 5 % (1,0 %) em água durante 15 minutos em uma taxa de fluxo de 1,0 min/minuto.
[0447] LCMS foi realizado em um ajuste que consiste de Bomba de caixa Hewlett Packard série 1100 G1312A, compartimento de coluna Hewlett Packard série 1100, detector de série de diodo Hewlett Packard série 1100 G1315A DAD, detector de dispersão de luz evaporativo Hewlett Packard série 1100 MSD e Sedere 75 controlado pelo software HP Chemstation. A bomba de HPLC é conectada a dois reservatórios de eluente que contém:
[0448] A: TFA a 0,05 %/água
[0449] B: TFA a 0,05 %/acetonitrila
[0450] Ou alternativamente os dois sistemas podem ser:
[0451] A: NH4OH a 10 mM em água
[0452] B: NH4OH a 10 mM em acetonitrila a 90 %
[0453] A análise foi realizada a 23° C injetando-se um volume apropriado da amostra (preferivelmente 20 μl) na coluna que é eluída com um gradiente de A e B.
[0454] As condições da HPLC, os ajustes de detector e os ajustes de espectrômetro de massa usados são dados na seguinte tabela.
[0455] Coluna Waters Xterra MS C-18 (50 X 3 mm id 5 μm)
[0456] Gradiente acetonitrila de 5 % a 100 % linear durante 6,5 minutos 210 nm
[0457] Detecção 210 nm (produção análoga à DAD)
[0458] ELS (produção análogo à ELS)
[0459] MS modo de ionização API-ES. Varredura 550-1500 amu etapa 0,1 amu
[0460] Alternativamente, a análise de LC-MS pode ser realizada em um espectrômetro de massa PE-Sciex API 100 equipado com duas Microbombas Perkin Elmer Series 200, um auto-amostrador Perkin Elmer Series 200, um detector Applied Biosystems 785A UV e um detector de dispersão Sedex 75 Evaporative Light. Uma coluna Waters Xterra 3,0 mm x 50 mm de 5 μl de sílica C-18 foi eluída a 1,5 ml/minuto em temperatura ambiente. Esta foi equilibrada com CH3CN a 5 %/TFA a 0,05 %/H2O e eluída por 1,0 minuto com CH3CN a 5 %/TFA a 0,05 %/H2O e depois com um gradiente linear de CH3CN a 90 % /TFA a 0,05 %/H2O durante 7 minutos. A detecção ocorreu pela detecção de UV a 214 nm e Dispersão de luz Evaporativa. Uma fração do eluato de coluna foi introduzida na interface da ionpulverização de um espectrômetro de massa PE-Sciex API 100. A massa que varia de 300 a 2000 amu foi submetida a varredura a cada 2 segundos durante o funcionamento.
[0461] A análise de MALDI-TOF MS foi realizada usando-se um instrumento Voyager RP (PerSeptive Biosystems Inc., Framingham, MA) equipado com extração demorada e operado em modo linear. O ácido alfa-ciano-4-hidróxi-cinâmico foi usado como matriz e, as designações de massa foram baseadas na calibragem externa. Exemplo 1
[0462] N^7-(2-(2-(2-(dodecilamino)etóxi)etóxi)acetilHAib8’22’35,Lys37]GLP-1(7- 37)amida
Figure img0084
[0463] Uma resina (Rink amida, 0,68 mmol/g Novabiochem 0,25 mmol) foi usada para produzir a seqüência primária em uma máquina ABl433A de acordo com as normas dos fabricantes. Todos os grupos de proteção foram de ácido lábil com a exceção do resíduo usado na posição 37 (FmocLys(ivDde)-OH, Novabiochem) permitindo a desproteção específica desta lisina em vez de qualquer outra lisina.
Procedimento
[0464] A resina preparada acima (0,25 mmole) que contém a seqüência de aminoácido análoga ao GLP-1 foi colocada em um mecanismo agitador/de filtração manual e tratada com hidrazina a 2 % em N-metil pirrolidona em (2 x 12 minutos 2 x 20 ml) para remover o grupo Dde. A resina foi lavada com N-metil pirrolidona (4 x 20 ml). O ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanóico (Neosystem FA03202) (4 equivalentes molares relativos a resina) foi dissolvido em N-metil pirrolidona/cloreto de metileno (1:1, 20 ml). Hidroxibenzotriazol (HOBt) (4 equivalentes molares relativos a resina) e diisopropilcarbodiimida (4 equivalentes molares relativos a resina) foram adicionados e a solução foi agitada por 15 minutos. A solução foi adicionada à resina e diisopropiletilamina (4 equivalentes molares relativos a resina) foi adicionada. A resina foi agitada 24 horas em temperatura ambiente. A resina foi lavada com N-metil pirrolidona (4 x 20 ml). Uma solução de piperidina a 20 % em N-metil pirrolidona (3 x 20 ml, 10 minutos cada) foi adicionada à resina durante a agitação. A resina foi lavada com N-metil pirrolidona (4 x 20 ml). O ácido dodecanóico (4 equivalentes molares relativos a resina) foi dissolvido em N-metil pirrolidona/cloreto de metileno (1:1, 20 ml). Hidrato de hidroxibenzotriazol (HOBt; H2O) (4 equivalentes molares relativos a resina) e diisopropil-carbodiimida (4 equivalentes molares relativos a resina) foram adicionados e a solução foi agitada por 15 minutos. A solução foi adicionada à resina e diisopropiletilamina (4 equivalentes molares relativos a resina) foi adicionada. A resina foi agitada 24 horas em temperatura ambiente. A resina foi lavada com N-metil pirrolidona (2 x 20 ml), N-metil pirrolidona/ cloreto de metileno (1: 1) (2 x 20 ml) e cloreto de metileno (2 x 20 ml). O peptídeo foi clivado da resina por agitação por 180 minutos em temperatura ambiente com uma mistura de ácido trifluoroacético, água e triisopropil-silano (95:2,5:2,5 15 ml). A mistura de clivagem foi filtrada e o filtrado foi concentrado a um óleo a vácuo. O peptídeo bruto foi precipitado a partir deste óleo com 45 ml de éter dietílico e lavado 3 vezes com 45 ml de éter dietílico. O peptídeo bruto foi purificado pela HPLC preparativa em uma coluna de 20 mm x 250 mm empacotada com 7 μ de sílica C-18. O peptídeo bruto foi dissolvido em 5 ml de ácido acético a 50 % em água e diluído a 20 ml com H2O e injetado na coluna que foi então eluída com um gradiente de 40 a 60 % (CH3CN em água com TFA a 0,1 %) 10 ml/minuto durante 50 minutos a 40° C. O peptídeo que contém frações foi coletado. O peptídeo purificado foi liofilizado depois da diluição do eluato com água.
[0465] HPLC: (método B6): RT = 32,8 minutos
[0466] HPLC: (método A1): RT = 43,6 minutos
[0467] LCMS: m/z = 765,0 (M+5H)5+, 957,0 (M+4H)4+, 1275,0 (M+3H)3+. Calculado (M+H)+ = 3825,0
Exemplo 2
[0468] N;'37(2-(2-(2-(17-sulfohexadecanoHamino)etóxi)etàxi)acetH)-[Aib8'2Z35 Lys37] GLP-1 (7- 37)amida
Figure img0085
[0469] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0470] HPLC: (método A1): RT = 45,5 minutos
[0471] LCMS: m/z = 792,9 (M+5H)5+, 990,9 (M+4H)4+, 1320,9 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 3959,9
Exemplo 3
[0472] Nε37-{2-[2-(2-(15-carboxipentadecanoilamino)et0xi)et0xi]acetil}-[Aib8'22'35 Lys37] GLP-1(7-37)amida
Figure img0086
[0473] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0474] HPLC: (método B1): RT = 43,8 minutos
[0475] HPLC: (método A1): RT = 42,0 minutos
[0476] LCMS: m/z = 978,3 (M+4H)4+, 1303,8 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 3909,6
Exemplo 4
[0477] Nε37-(2-(2-(2-(17-carboxieptadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil)[Aib8’22’35 Lys37]GLP-1(7-37)amida
Figure img0087
[0478] Preparada de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0479] HPLC: (método B1): RT = 46,4 minutos
[0480] HPLC: (método A1): RT = 44,4 minutos
[0481] LCMS: m/z = 985,5 (M+4H)4+, 1313,4 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 3937,6
Exemplo 5
[0482] Nε37-(2-(2-(2-(19-carboxinonadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil)[Aib8’22’35 Lys37]GLP-1(7-37)amida
Figure img0088
[0483] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0484] HPLC: (método B1): RT = 49,5 minutos
[0485] HPLC: (método A1): RT = 47,1 minutos
[0486] LCMS: m/z = 992,5 (M+4H)4+, 1322,6 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 3965,7
Exemplo 6
[0487] [Aib8,22,35,Arg26,34]GLP-1-(7-37)Lys(4-(Hexadecanoilamino)-4(S)- carboxibutiril)-OH
Figure img0089
[0488] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0489] HPLC: (método B6): RT = 36,28 minutos
[0490] LCMS: m/z = 995 (M+4H)4+, 1326 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 3977,6
Exemplo 7
[0491] [Aib8,22,35,Arg26,34]GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(hexadecanoilamino)etóxi)- etóxi)acetil)-OH
Figure img0090
[0492] O composto foi preparado de acordo com os métodos no exemplo 1 e em “Métodos sintéticos gerais”.
[0493] HPLC: (método B6): RT = 37,1 minutos
[0494] LCMS: m/z = 999 (M+4H)4+, 1332 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 3993,7
exemplo 8
[0495] Nε37-(2-[2-(2,6-(S)-Bis-{2-[2-(2-(dodecanoilamino)et0xi)et0xi]acetilamino} hexanoilamino)etoxi]etoxi})acetil-[Aib8,22,35]glP-1(7-37)amida
Figure img0091
[0496] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0497] HPLC: (método B6): rT = 38,2 minutos
[0498] LCMS: m/z = 1106,7 (M+4H)4+, 1475,3 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4433,0
Exemplo 9
[0499] Nε37-(2-[2-(2,6-(S)-Bis-{2-[2-(2-(tetradecanoilamino)et0xi)et0xi]acetil- amino}hexanoilamino)etóxi]etóxi})acetil-[Aib8,22,35]GLP-1(7-37)amida
Figure img0092
[0500] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0501] HPLC: (método B6): RT = 42,9 minutos
[0502] LCMS: m/z = 1120,9 (M+4H)4+, 1494,2 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4480,4
Exemplo 10
[0503] [Aib8,22,35,Arg26,34]GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(Hexadecanoilamino)-4(S)- carboxibutirilamino)etóxi)etóxi)acetil)-OH
Figure img0093
[0504] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0505] HPLC: (método B6): RT = 36,0 minutos
[0506] LCMS: m/z = 1032,0 (M+4H)4+, 1374,0 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4122,8
Exemplo 11
[0507] [Aib8,22,35]GLP-1(7-37)Lys((2-{2-[4-[4-(4-Amino-9,10-dioxo-3-sulfo-9,10- diidro-antracen-1-ilamino)-2-sulfo-fenilamino]-6-(2-sulfo-fenilamino)-[1,3,5]triazin-2- ilamino]-etóxi}-etóxi)-acetil))amida
Figure img0094
[0508] Preparada pela carga de DdeLys(Fmoc) -OH na resina Rink. A resina foi então tratada com piperidina como em “Métodos Sintéticos” para remover Fmoc seletivamente. O ácido 2-(2-(2-(Fmoc-amino)etóxi)etóxi)-acético foi ligado no grupo epsilon amino de lisina e Fmoc foi removido. DMSO e Cibacron Blue 3GA (17 equivalentes) (Sigma C-9534) foram adicionados e a mistura foi aquecida a 60° C por 15 horas, lavada com água (3 vezes), metanol (2 vezes), THF (2 vezes) e éter dietílico (2 vezes). O grupo de proteção Dde foi removido e os aminooácidos remanescentes foram adicionados como em “Métodos sintéticos”
[0509] HPLC: (método A1): RT = 38,1 minutos
[0510] LCMS: m/z = 1110,4 (M+4H)4+, 1436,4 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4435,9
Exemplo 12
[0511] [Aib8,22,35]GLP-1(7-37)Lys(({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(15-carboxipenta- decanoilamino)-etóxi]etóxi}acetilamino)etóxi]etóxi}acetil amino)etóxi]-etóxi}- acetil))amida
Figure img0095
[0512] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0513] HPLC: (método A1): RT = 41,2 minutos
[0514] HPLC: (método B6): RT = 30,7 minutos
[0515] LCMS: m/z = 1069,1 (M+4H)4+, 1424,6 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4271
Exemplo 13
[0516] Nε37-([2-(2-{3-[2,5-dioxo-3-(15-carboxipentadecilsulfanil)-pirrolidin-1-il]- propionilamino}etoxi)etóxi)acetil]-[D-Ala9,Lys37]-GLP-1-[7-37]amida
Figure img0096
[0517] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0518] HPLC: (método A1): RT = 45,2 minutos
[0519] LCMS: m/z = 1004,0 (M+4H)4+, 1338,2 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4010,7
Exemplo 14
[0520] [Aib8,22,35Ala37]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(2-(11-(oxalilamino)undecanoil- amino)etóxi)etóxi)acetil-)))amida
Figure img0097
[0521] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0522] HPLC (método A1): RT = 37,9 minutos
[0523] HPLC (método B1): RT = 39,5 minutos
[0524] LCMS: m/z = 993,3 (M+4H)4+, 1323,9 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 3967,6
Exemplo 15
[0525] [Aib8,22,35,Ala37]-GLP-1(7-37)Lys({2-[2-(2-{2-[2-(2-(15-carbóxi-penta- decanoilamino)-etóxi]etóxi}acetilamino)etóxi]etóxi}acetil)amida
Figure img0098
[0526] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0527] HPLC (método B6): RT = 31,1 minutos
[0528] HPLC (método A1): RT = 41,9 minutos
[0529] LCMS: m/z = 1376,3 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4125,8
Exemplo 16
[0530] [Aib8,22,35,Ala37]-GLP-1(7-37)Lys((2-{2-[11-(5-Dimetilaminonaftaleno-1- sulfonilamino)undecanoilamino]etóxi}etóxi)acetil)amida
Figure img0099
[0531] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0532] HPLC (método A1): RT = 42,6 minutos
[0533] HPLC (método B6): RT = 30,4 minutos
[0534] LCMS: m/z = 1377,3 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4128,8
Exemplo 17
[0535] [Aib8,22,35,Ala37]-GLP-1(7-37)Lys(([2-(2-{2-[1-(4-Clorobenzoil)-5-metóxi-2- metil-1H-indol-3-il]acetilamino}etóxi)etóxi]acetil))amida
Figure img0100
[0536] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0537] HPLC (método A1): RT = 41,1 minutos
[0538] HPLC (método B6): RT = 31,1 minutos
[0539] LCMS: m/z = 1351,8 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4052,0
Exemplo 18
[0540] [Aib8,Arg26,34,Glu22,23,30]GLP-1H(7-37)Lys(2-(2-(2-(octadecanoilamino)- etóxi)etóxi)acetil)amida
Figure img0101
[0541] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0542] HPLC (método B6): RT = 39,3 minutos
[0543] LCMS: m/z = 1366,6 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4095,6
Exemplo 19
[0544] [Aib8,Arg26,34,Glu22,23,30]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(eicosanoilamino)etóxi)- etóxi)acetil)amida
Figure img0102
[0545] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0546] HPLC (método B6): RT = 42,6 minutos
[0547] LCMS: m/z = 1375,7 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4123,7
Exemplo 20
[0548] [Gly8,Arg26,34]GLP-1 H-(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(octadecanoilamino)- 4(S)-carboxibutirilamino)etóxi)etóxi)acetil)etóxi)etóxi)acetil)-OH
Figure img0103
[0549] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo11 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0550] HPLC (método B6): RT = 38,0 minutos (99,9%)
[0551] HPLC (método A1): RT = 49,0 minutos
[0552] LCMS: m/z = 1054,6 (M+4H)4+ 1405,3 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4211,8
Exemplo 21
[0553] [Aib8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(octadecanoilamino)etóxi)- etóxi]acetil)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0104
[0554] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0555] HPLC (método B6): RT = 38,7 minutos
[0556] LCMS: m/z = 1029,2 (M+4H)4+ 1371,4 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4110,8
Exemplo 22
[0557] [Aib8]-GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(Hexadecanoilamino)-4(S)-carbóxi- butirilamino)etóxi)etóxi)acetil)-OH
Figure img0105
[0558] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0559] HPLC (método B6): RT = 34,7 minutos
[0560] LCMS: m/z = 1000,3 (M+4H)4+ 1337,4 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4110,8
Exemplo 23
[0561] [Aib8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(octadecanoilamino)-4- carboxibutirilamino)etóxi)etóxi]acetil)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0106
[0562] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0563] HPLC (método B6): RT = 37,5 minutos
[0564] LCMS: m/z = 1414,9 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4239,8
Exemplo 24
[0565] [Aib8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-carboxieptanoil- amino)etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0107
[0566] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0567] HPLC (método B6): RT = 32,4 minutos
[0568] HPLC (método A1): RT = 43,8 minutos
[0569] LCMS: m/z = 1381,3 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4140,0
Exemplo 25
[0570] [Gly8,Arg26,34]GLP1-(7-37) Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-carboxieptadecanoil- amino)etóxi)etóxi]acetil)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0108
[0571] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0572] HPLC (método A1): RT = 42,3 minutos
[0573] LCMS: m/z = 1372,3 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4112,7
Exemplo 26
[0574] [Aib8]GLP-1-(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(Hexadecanoilamino)-4(S)- carboxibutirilamino)etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)-OH
Figure img0109
[0575] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0576] HPLC (método B6): RT = 33,5 minutos
[0577] LCMS: m/z = 1040,3 (M+4H)4+ 1386,6 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4155,8
Exemplo 27
[0578] Nε37-(2-(2-(2-(dodecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil)-[Aib8'22'35Lys37]GLP-1 H
Figure img0110
[0579] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0580] HPLC: (método B6): RT = 32,8 minutos
[0581] LC-MS: m/z = 765,7 (M+H)5+, 957,0 (M+H)4+, 1275,7 (M+H)3+ = Calculado (M+H)+ = 3822,9
Exemplo 28
[0582] Nε37-(2-(2-(2-(tetradecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil)-[Aib8’22’35Lys37]GLP-1 H(7-37)-amida
Figure img0111
[0583] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0584] HPLC: (método B6): RT = 34,6 minutos
[0585] LC-MS: m/z = 771,4 (M+5H)5+, 964,1 (M+4H)4+, 1284,9 (M+H)3+ Calculado (M+H)+ = 3851,5
Exemplo 29
[0586] Nε37-(2-(2-(2-(hexadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil)-[Aib8'22'35Lys37]GLP- 1(7-37)-amida
Figure img0112
[0587] Preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0588] HPLC: (método B6): RT = 36,8 minutos
[0589] LC-MS: m/z = 970,7 (M+4H)4+, 1294,3 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+= 3879,6
Exemplo 30
[0590] Nε37-(2-(2-(2-(octadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil)-[Aib8’22’35Lys37]GLP-1 (7-37)-amida
Figure img0113
[0591] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0592] HPLC: (método B6): RT = 39,4 minutos
[0593] LC-MS: m/z = 977,9 (M+4H)4+, 1303,7 (M+H)3+ Calculado (M+H)+ = 3907,6
Exemplo 31
[0594] Nε37-(2-(2-(2-(eicosanoilamino)et0xi)et0xi)acetil)-[Aib8’22’35Lys37]GLP-1(7- 37)-amida
Figure img0114
[0595] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em Métodos Sintéticos Gerais”.
[0596] HPLC: (método B6): RT = 42,7 minutos
[0597] LC-MS: m/z = 984,8 (M+4H)4+, 1312,8 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 3935,7
Exemplo 32
[0598] N^6-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(octadecanoilamino)etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)- etóxi)acetil)-[Aib8,Arg26,34,Lys36]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0115
[0599] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0600] HPLC: (método B6) RT = 40,7 minutos
[0601] LC-MS: m/z = 792,3 (M+5H)5+, 989,8 (M+4H)4+, 1319,2 (M+3H)3+Calculado (M+H)+= 3955,5
Exemplo 33
[0602] Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(octadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetilamino)et0xi)- etóxi)acetil))[Arg26,34,Lys36]GLP-1(7-37)-OH
Figure img0116
[0603] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0604] HPLC: (método B6) RT = 40,5 minutos
[0605] LC-MS: m/z = 789,5 (M+5H)5+, 986,3 (M+4H)4+, 1314,8 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 3941,5
Exemplo 34
[0606] Nε36-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(octadecanoilamino)et0xi)et0xi]acetilamino)et0xi)- etóxi)acetil)}-[Gly8,Arg26,34,Lys36]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0117
[0607] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0608] HPLC: (método B6) RT = 38,3 minutos
[0609] LC-MS: m/z = 786,8 (M+5H)5+, 982,8 (M+4H)4+, 1310,1 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+= 3927,5
Exemplo 35
[0610] Nε37-(2-(2-(2-(4-4(4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-tridecafluorononanoilsulfamoil- butirilamino)etóxi)etóxi)acetil))[Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0118
[0611] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0612] HPLC: (método B6) RT = 32,4 minutos
[0613] LC-MS: m/z = 1042,7 (M+4H)4+, 1389,9 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4166,4
Exemplo 36
[0614] Nε37-(2-(2-(2-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,12,12,12-Heneicosa- fluoro-dodeciloxiacetilamino)etóxi)etóxi)acetil)[Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0119
[0615] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0616] HPLC: (método B6) RT = 36,7 minutos
[0617] LC-MS: m/z = 1062,8 (M+4H)4+, 1416,9 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4247,3
Exemplo 37
[0618] Nε37-(2-(2-(2-(4-(hexadecanoilsulfamoil)butirilamino)et0xi)et0xi)acetil)- [Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0120
[0619] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0620] HPLC: (método B6): RT = 37,4 minutos
[0621] LC-MS: m/z = 1008,8 (M+4H)4+ 1344,3 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4030,7
Exemplo 38
[0622] [Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys({2-(2-(2-(2-[2-(2-(octadecanoilamino)etóxi)- etóxi]acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)})-OH
Figure img0121
[0623] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0624] HPLC (método B6): RT = 38,5 minutos
[0625] LCMS: m/z = (M+4H)4+ 1025,1 (M+3H)3+ 1366,7 Calculado (M+H)+ = 4096,0
Exemplo 39
[0626] [Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(octadecanoilamino)-4- carboxibutirilamino)etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0122
[0627] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0628] HPLC (método B6): RT = 37,7 minutos
[0629] LCMS: m/z = (M+4H)4+ 1057,8 (M+3H)3+ 1410,2 Calculado (M+H)+ = 4235,9
Exemplo 40
[0630] Nε20-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(hexadecanoilamino)-4-carboxibutirilamino)et0xi)
[0631] etóxi]acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)}-exendin(1-39)
Figure img0123
[0632] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0633] HPLC (método B6): RT = 33,6 minutos
[0634] LCMS: m/z = (M+4H)4+ 1205,3 (M+3H)3+ 1606,9 Calculado (M+H)+ = 4816,5
Exemplo 41
[0635] [Ala8, Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys((2-[2-((2-oxalilamino-3-carbóxi-2-4,5,6,7- tetraidro-benzo[b]tiofen-6-il-acetilamino))etóxi]etoxiacetil)amida
Figure img0124
[0636] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0637] HPLC (método B6): RT = 32,1 minutos
[0638] HPLC (método A1): RT = 42,2 minutos
[0639] LCMS: m/z = 1033,3 (M+4H)4+ 1376,6 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4126,7
Exemplo 42
[0640] [Aib8,22,35]GLP-1(7-37)Lys((2-[2-((2-oxalilamino-3-carbóxi-2-4,5,6,7- tetraidro-benzo[b]tiofen-6-il-acetilamino))etóxi]etoxiacetil)amida
Figure img0125
[0641] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0642] HPLC (método B1): RT = 37,4 minutos
[0643] HPLC (método A1): RT = 35,5 minutos
[0644] LCMS: m/z = 1002,5 (M+4H)4+ 1336,7 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4007,5
Exemplo 43
[0645] Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(octadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino)- etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)-[Aib8,Arg26,34,Lys36]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0126
[0646] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0647] HPLC: (método B6): RT = 39,0 minutos
[0648] LC-MS: m/z = 1022,3 (M+4H)4+, 1362,3 (M+3H)3+, Calculado (M+H)+ = 4084,6
Exemplo 44
[0649] Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(octadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino)- etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)-[Gly8,Arg26,34,Lys36]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0127
[0650] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0651] HPLC: (método B6): RT = 38,6 minutos
[0652] LC-MS: m/z = 1015,2 (M+4H)4+, 1353,4 (M+3H)3+, Calculado (M+H)+ = 4056,6
Exemplo 45
[0653] Nε37-2-(2-(2-(4-(4-(Heptadecanoilamino)-4-(S)-carboxibutirilamino)-4-(S)- carboxibutirilamino)etóxi)etóxi)acetil-[Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37)-NH2
Figure img0128
[0654] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0655] HPLC: (método B4): RT = 10,72 minutos
[0656] LCMS: m/z = 1039,0 (M+4H)4+, 1385,0 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4152,0
Exemplo 46
[0657] Nε37-2-(2-[2-(2-[2-(4-[4-(Heptadecanoilamino)-4-(S)-carboxibutirilamino]-4- (S)-carboxibutirilamino)etóxi]etóxi)acetilamino)etóxi]etóxi)acetil-[Aib8,22,35,Lys37]GLP- 1-(7-37)-NH2
Figure img0129
[0658] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0659] HPLC: (método B4): RT = 10,74 minutos
[0660] LCMS: m/z = 1074 (M+4H)4+, 1433 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4297
Exemplo 47
[0661] Nε26-(2-(2-(2-(4-(Hexadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino)et0xi)- etóxi)acetil)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0130
[0662] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0663] HPLC: (método B4): RT = 10,71 minutos
[0664] LCMS: m/z = 979,0 (M+4H)4+, 1304,0 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 3910,0
Exemplo 48
[0665] Nε26-2-(2-2-(2-(2-(2-(4-(Octadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino)- etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0131
[0666] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0667] HPLC: (método B4): RT = 11,32 minutos
[0668] LCMS: m/z = 1021(M+4H)4+, 1362 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4084
[0669] O peptídeo foi sintetizado em uma resina de clorotritila (Novabiochem) usando-se a estratégia de Fmoc em um sintetizador de peptídeo Advanced Chemtech 348 (0,5 mmol/g, 100 mg de resina/furo e 10 furos foram usados). As ligações foram mediadas em Diisopropilcarbo-diimida (DlC) (Fluka) e 1-hidroxibenzotriazol (HOBt)/1- hidróxi-7-aza-benzotriazol (HOAt) (2:1) (Senn Chemicals) em 1-metil-pirrolidin-2-ona (NMP) e 10 equivalentes molares de aminoácidos e reagentes de ligação foram aplicados. Os derivados de aminoácido protegidos usados foram os aminoácidos Fmoc padrão (Advanced Chemtech) com a exceção dos aminoácidos Fmoc- Lys(ivDde) (Novabiochem) e Fmoc-Glu-OtBu (Bachem). A resina foi posteriormente dividida em 5 porções (0,1 mmol) e o terminal N foi então tratado com (Boc) 20 e DlEA (5 equivalentes molares) em NMP.
[0670] A ligação de cadeias secundárias e ligadores aos resíduos de lisina específicos no peptídeo protegido ligado por resina bruta foi realizada em uma posição específica pela incorporação de Fmoc-Lys(ivDde)-OH durante a síntese automatizada seguida pela desproteção seletiva com hidrazina.
[0671] Procedimento para a remoção da proteção de Dde. A resina (0,1 mmol) foi colocada em uma seringa e tratada com hidrazina a 3 % e piperidina a 3 % em NMP (50 minutos at r. t. ) para remover o grupo Dde e wash com NMP (4 x 5 ml).
[0672] Procedimento para a ligação de cadeias secundárias aos resíduos de Lisina.
[0673] O OEG ou aminoácido (7 equivalentes molares relativos a resina) foi dissolvido em NMP. HOAt (7 equivalentes molares relativos a resina) e diisopropilcarbodiimida (7 equivalentes molares relativos a resina) foram adicionados e a solução foi agitada por 15 minutos. Depois, a solução foi adicionada à resina. A resina foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. A resina foi lavada com NMP (3 x 5 ml).
[0674] Procedimento para a remoção da proteção de Fmoc: A resina (0,1 mmol) foi colocada em uma seringa tratada com uma solução de piperidina a 30 % em NMP (5 ml em 20 minutos). A resina foi lavada com NMP (2 x 5 ml) e cloreto de metileno (2 x 5 ml).
[0675] Procedimento para a clivagem do peptídeo fora da resina:
[0676] O peptídeo foi clivado da resina pela agitação por 120 minutos em temperatura ambiente com uma mistura de ácido trifluoroacético, água e triisopropilsilano (94:3:3). A mistura de clivagem foi filtrada e o filtrado foi concentrado a um óleo por uma corrente de nitrogênio. O peptídeo bruto foi precipitado a partir deste óleo com 10 ml de éter dietílico e lavado 2 vezes com 10 ml de éter dietílico. Exemplo 49
[0677] [Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(19-(carbóxi)nonadecanoilamino)- etóxi)etóxi)acetil)-OH O
Figure img0132
[0678] Uma resina de clorotritila (0,5 mmol/g de Novabiochem, 0,1 mmol) foi usada para produzir a seqüência primária em uma máquina Advanced Chemtech 348. Todos os grupos de proteção foram de ácido lábil com a exceção do resíduo usado na posição 37 (FmocLys(ivDde)-OH, Novabiochem) permitindo a desproteção específica desta lisina em vez de qualquer outra lisina.
Procedimento
[0679] A resina preparada acima (0,1 mmol) que contém a seqüência de aminácido análoga ao GLP-1 foi colocada em uma seringa e tratada com hidrazina a 3 % e piperidina a 3 % em N-metil pirrolidona (50 minutos) para remover o grupo Dde. A resina foi lavada com NMP (4 x 5 ml). O ácido Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanóico (Neosystem FA03202) (7 equivalentes molares relativos a resina) foi dissolvido em NMP. HOAt (7 equivalentes molares relativos a resina) e diisopropilcarbodiimida (7 equivalentes molares relativos a resina) foram adicionados e a solução foi agitada por 15 minutos. A solução foi então adicionada à resina. A resina foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. A resina foi lavada com NMP (4 x 5 ml). Uma solução de piperidina a 30 % em NMP (5 ml, 20 minutos) foi adicionada à resina. A resina foi lavada com NMP (4 x 5 ml). O éster de N-hidroxissuccinimida de C20 (6 equivalentes molares relativos a resina, KJ. Ross-Petersen A/S) e DIEA foram dissolvidos em NMP e adicionados à resina. A resina foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. A resina foi lavada com NMP (3 x 5 ml) e cloreto de metileno (3 x 5 ml). O peptídeo foi clivado da resina por agitação por 120 minutos em temperatura ambiente com uma mistura de ácido trifluoroacético, água e triisopropilsilano (94:3:3,3 ml). A mistura de clivagem foi filtrada e o filtrado foi concentrado a um óleo a vácuo. O peptídeo bruto foi precipitado a partir deste óleo com 10 ml éter dietílico e lavada 2 vezes com 10 ml de éter dietílico. Purificação
[0680] O peptídeo bruto dissolvido em DMSO em uma concentração de 5 a 10 mg/200 μl e aplicado a uma coluna de 7,8 x 300 mm X-Terra Prep MS C18 de 10 μm que funciona a 40°C. Depois de 5 minutos a 30 % de CH3CN, 0,08 % de TFA, 4 ml/minutos, a coluna foi eluída com um gradiente linear de 30 a 65% CH3CN durante 35 minutos. Os picos de UV principais foram manualmente coletados e o pico desejado identificado por MALDI-MS.
[0681] A concentração do peptídeo no eluato foi determinada pela medição da absorção de UV a 280 nm que assume os coeficientes de extinção molar de 1280 e 3690 para tirosina e triptofano respectivamente.
[0682] Depois da determinação da concentração o eluato foi fracionado em frascos que contém a quantidade desejada e secada por centrífuga a vácuo.
[0683] HPLC: elução em 27,9 minutos = 52,9 % de CH3CN
[0684] MALDI-MS: 3996 (MH+)
Exemplo 50
[0685] [Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(17-(carbóxi)heptadecanoilamino)- etóxi)etóxi)acetil))-OH
Figure img0133
[0686] O composto foi preparado como no exemplo anterior e de acordo com os “Métodos sintéticos” exceto que o ácido octadecanodióico C18 foi ligado como um éster terc-butílico monoprotegido (3 equivalentes molares relativos a resina) e a ligação foi mediada com HOAt e DlC (também 3 equivalentes molares relativos a resina) em NMP. O peptídeo bruto foi dissolvido em 22,5 % de CH3CN, 0,1 N de NaOH para a purificação.
[0687] HPLC: elução em 25,4 minutos = 50,4% CH3CN
[0688] MALDl-MS: 3969 (MH+)
Exemplo 51
[0689] [Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(19-(carbóxi)nonadecanoil- amino)-4-carboxibutirilamino)etóxi)etóxi)acetil)-OH
Figure img0134
[0690] O composto foi preparado como nos dois exemplos anteriores e de acordo com os “Métodos sintéticos”. O aminoácido Fmoc-Glu (OtBu) (6 equivalentes molares relativos a resina) foi ligado à resina com HOAt e DlC (6 equivalentes molares relativos a resina). O peptídeo bruto foi dissolvido em 22,5 % de CH3CN, 0,1 N de NaOH para a purificação.
[0691] HPLC: elução em 27,2 minutos = 52,2% CH3CN
[0692] MALDl-MS: 4124 (MH+)
Exemplo 52
[0693] [Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(hexadecanoil- amino)etóxi)etóxi)acetil)etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)-acetil)-OH
Figure img0135
[0694] O composto foi preparado como nos três exemplos anteriores e de acordo com os “métodos sintéticos” exceto que dois OEG adicionais foram ligados à cadeia secundária de Lys.
[0695] HPLC: elução em 25,0 minutos = 50,0 % de CH3CN
[0696] MALDI-MS: 4259 (MH+)
[0697] Exemplo 53
[0698] [Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(octadecanoilamino)etóxi)- etóxi)-acetilamino)etóxi)etóxi)acetil) NH2
Figure img0136
[0699] O composto foi preparado como no Exemplo 1 e de acordo com os “Métodos sintéticos”
[0700] HPLC (método B6): RT = 38,8 minutos
[0701] LCMS: m/z = 1022,3 (M+4H)3+ Calculado (M+H)+ = 4081,7
Exemplo 54
[0702] Nε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(17-(carb0xi)heptadecanoil- amino)-4-carboxibutirilamino)etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil- amino)etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil) [Lys20]exendin-4(1-39)-NH2
Figure img0137
[0703] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0704] HPLC (método A1): RT = 41,9 minutos
[0705] HPLC (método B6): RT = 31,3 minutos
[0706] LCMS: m/z = 1722,7 (M+3H)3+Calculado (M+H)+ = 5164,9
Exemplo 55
[0707] N;'36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-CarboxieptadecanoHamino)etóxi)etàxi)acetil- amino)etóxi)etóxi)acetil) [Aib8,Arg26,34,Lys36]GLP-1(7-37)
Figure img0138
[0708] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0709] HPLC: (método B6): RT = 34,2 minutos
[0710] LC-MS: m/z = 997,2 (M+4H)4+, 1329,4 (M+3H)3+, 1993,2 (M+2H)2+, Calculado (M+H)+ = 3985,5
Exemplo 56
[0711] N^6-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-Carboxieptadecanoilamino)etóxi)etóxi)acetil- amino)etóxi)etóxi)acetil) [Arg26,34,Lys36]GLP-1(7-37)
Figure img0139
[0712] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0713] HPLC: (método B6): RT = 34,2 minutos
[0714] LC-MS: m/z = 993,8 (M+4H)4+, 1324,6 (M+3H)3+, 1987,2 (M+2H)2+, Calculado (M+H)+ = 3971,5
Exemplo 57
[0715] Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-Carboxieptadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil- amino)etóxi)etóxi)acetil) [Gly8,Arg26,34,Lys36]GLP-1(7-37)
Figure img0140
[0716] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0717] HPLC: (método B6): RT = 34,2 minutos
[0718] LC-MS: m/z = 990,3 (M+4H)4+, 1320,3 (M+3H)3+, Calculado (M+H)+= 3957,4
Exemplo 58
[0719] Nε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(Octadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil- amino)etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)[Lys20] Exendin-4 (1-39)amida
Figure img0141
[0720] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0721] HPLC: (método B6): RT = 37,7 minutos
[0722] LC-MS: m/z = 1216,6 (M+4H)4+, 1621,4 (M+3H)3+, Calculado (M+H)+ = 4861,5
Exemplo 59
[0723] Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(4-(octadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino)- etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)-[Arg26,34,Lys36]GLP-1-(7-37)
Figure img0142
[0724] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0725] HPLC: (método B6): RT = 39,1 minutos
[0726] LC-MS: m/z = 1018,8 (M+4H)4+, 1357,6 (M+3H)3+, Calculado (M+H)+ = 4070,6
Exemplo 60
[0727] Nε26-(2-[2-(2-[2-(2-[2-(17-Carboxieptadecanoilamino)et0xi]et0xi)acetil- amino]etóxi)etóxi]acetil)[Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0143
[0728] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0729] HPLC: (método B4): RT = 12,1 minutos
[0730] LCMS: m/z = 993,0 (M+4H)4+, 1325,0 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 3970,0
Exemplo 61
[0731] Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxieptadecanoilamino)-4(S)-carb0xi- butirilamino]etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi]etóxi)acetil][Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0144
[0732] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0733] HPLC: (método B4): RT = 11,8 minutos
[0734] LCMS: m/z = 1026 (M+4H)4+, 1368 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4100
Exemplo 62
[0735] Nε20-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-Carboxieptadecanoilamino)et0xi)et0xi)- acetilamino)etóxi)etóxi)acetil-amino)etóxi)etóxi)acetil)[Lys20] Exendin-4 (1-39)amida
Figure img0145
[0736] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0737] HPLC: (método B6): RT = 32,3 minutos
[0738] LC-MS: m/z = 1223,9 (M+4H)4+, 1630,8 (M+3H)3+, Calculado (M+H)+ = 4891,5
Exemplo 63
[0739] [Gly8,Glu22,23,30,Arg18,26,34]GLP1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-carboxiepta
[0740] -decanoilamino)etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi))etóxi)acetil)-NH2
Figure img0146
[0741] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0742] HPLC: (método B6): RT = 32,0 minutos
[0743] HPLC: (método A1): RT = 43,4 minutos
[0744] LCMS: m/z = 1438,7 (M+3H)3+ Calculado (M+H)+ = 4311,8
Exemplo 64
[0745] [Ácido imidazolilpropiônico7, Asp16, Aib22,35]GLP1(7-37)Lys NH((2-{[4-(17- carboxieptadecanoilamino)butilcarbamoil]metóxi}etóxi)etóxi))
Figure img0147
[0746] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0747] HPLC: (método B1): RT = 32,5 minutos
[0748] HPLC: (método A1): RT = 43,5 minutos
[0749] LCMS: m/z = 1028,8 (M+4H)4+ Calculado (M+H)+ = 4108,7
Exemplo 65
[0750] [Ácido imidazolilpropiônico7, Aib22,35]GLP1(7-37)Lys NH((2-{[4-(17- carboxieptadecanoilamino)butilcarbamoil]metóxi}etóxi)etóxi))
Figure img0148
[0751] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0752] HPLC: (método B6): RT = 33,7 minutos
[0753] HPLC: (método A1): RT = 44,8 minutos
[0754] LCMS: m/z = 1028,8 (M+4H)4+ Calculado (M+H)+ = 4108,7
Exemplo 66
[0755] [3-(5-Imidazoil)propionil7, Aib8] GLP1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(17-carboxi
[0756] -heptanoilamino)etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0149
[0757] O composto foi preparado de acordo com os métodos no Exemplo 1 e em “Métodos Sintéticos Gerais”.
[0758] MALDI-MS: 4127 (MH+)
[0759] HPLC: elução: 25,5 minutos = 50,6 % de CH3CN
DESCOBERTAS BIOLÓGICAS
[0760] Protraimento de derivados de GLP-1 depois da administração i. v. ou s. c.
[0761] O protraimento de um número de derivados de GLP-1 da invenção foi determinado pelo monitoramento da concentração deste em plasma depois da administração sc a porcos sadios, usando-se os métodos descritos abaixo. Para comparação também, a concentração em plasma de GLP-1(7-37) depois da administração sc. foi seguida. O protraimento de outros derivados de GLP-1 da invenção pode ser determinado do mesmo modo.
[0762] Teste farmacocinético de análogos de GLP-1 em miniporcos.
[0763] As substâncias de teste foram dissolvidas em um veículo adequado para administração subcutânea ou intravenosa. A concentração foi ajustada de modo que o volume de dosagem foi de aproximadamente 1 ml.
[0764] O estudo foi realizado em 12 miniporcos Gottingen machos de Ellegaard Gottingen Miniporcos ApS. Um período de aclimatização de aproximadamente 10 dias foi concedido antes que os animais entrassem em estudo. No começo do período de aclimatização os miniporcos tinham cerca de 5 meses de idade e na faixa de peso de 8 a 10 kg.
[0765] O estudo foi conduzido em um ambiente de animal adequado com uma temperatura ambiente determinada em 21-23° C e a umidade relativa a: 50 %. O ambiente foi iluminado para dar um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. A luz foi de 06,00 a 18,00 h.
[0766] Os animais foram alojados em cercados para animais com palha como forragem, seis em cada cercado.
[0767] Os animais tinham acesso livre a qualidade doméstica de beber água durante o estudo, mas foram submetidos ao jejum de aproximadamente das 4 pm do dia anterior à dosagem até aproximadamente 12 horas depois da dosagem.
[0768] Os animais foram pesados na chegada e nos dias de dosagem.
[0769] Os animais receberam uma injeção intravenosa ou subcutânea simples. A injeção subcutânea foi dada no lado direito do pescoço, aproximadamente de 5 a 7 cm da orelha e de 7 a 9 cm do meio do pescoço. As injeções foram dadas comuma tampa na agulha, deixando 0,5 cm da agulha ser introduzida.
[0770] Cada substância de teste foi dada a três animais. Cada animal recebeu uma dose de 2 nmol/kg por peso corporal.
[0771] Seis animais foram dosados por semana enquanto os seis remanescentes foram colocados em repouso.
[0772] Um perfil de concentração-tempo de plasma total foi obtido de cada animal. As amostras de sangue foram coletadas de acordo com a seguinte tabela:
[0773] Depois da administração intravenosa:
[0774] Pré-dose (0), 0,17 (10 minutos), 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas depois da injeção.
[0775] Depois da administração subcutânea:
[0776] Pré-dose (0), 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas depois da injeção.
[0777] Em cada tempo de amostragem, 2 ml de sangue foi retirado de cada animal. As amostras de sangue foram tiradas de uma veia jugular.
[0778] As amostras de sangue foram coletadas em tubos de teste que contêm um tampão para a estabilização a fim de impedir a degradação enzimática dos análogos de GLP-1.
[0779] O plasma foi imediatamente transferido a Micronic-tubes. Aproximadamente 200 μl de plasma foi transferido a cada Micronic-tube. O plasma foi aramzenado a -20° C até ser submetido a ensaio. As amostras de plasma foram submetidas a ensaio quanto ao conteúdo de análogos de GLP-1 usando-se um imunoensaio.
[0780] Os perfis de concentração-tempo de plasma foram analisados por uma análise farnacocinética não compartimental. Os seguintes parâmetros farmacocinéticos foram calculados em cada ocasião: AUC, AUC/Dose, AUC% EXtrap, Cmax, tmax, Xz, t1/2, CL, CL/f, Vz, Vz/f e MRT.
[0781] Os compostos selecionados da invenção foram testados em porcos Dinamarqueses Landrace.
[0782] Teste farmacocinético de análogos de GLP-1 em porcos
[0783] Os porcos (50 % Duroc, 2 5% Yorkshire, 25 % Dinamarquês Landrace, ap 40 kg) foram submetidos a jejum a partir do começo do experimento. Para cada porco 0,5 nmol de composto de teste por kg de peso corporal foi administrado em uma solução isotônica a 50 μM (5 mM de fosfato, pH 7,4, 0,02% Tween® -20 (Merck), 45 mg/ml de manitol (isento de pirogênio, Novo Nordisk). As amostras de sangue foram retiradas de um cateter em veias jugulares. 5 ml das amostras de sangue foram vertidos em vidros resfriados contendo 175 μl da seguinte solução: 0,18 M de EDTA, 15000 KIE/ml de aprotinina (Novo Nordisk) e 0,30 mM de Valina-Pirrolidida (Novo Nordisk), pH 7,4. Dentro de 30 minutos, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 5-6000*g. A temperatura foi mantida a 4° C. O sobrenadante foi pipetado em vidros diferentes e mantido a menos 20° C até o uso.
[0784] As concentrações de plasma dos peptídeos foram determinadas em um sanduíche ELISA ou por RIA usando-se anticorpos mono ou policlonais diferentes. A escolha de anticorpos depende dos derivados de GLP-1. O tempo no qual a concentração de pico em plasma é alcançado varia dentro de limites amplos, dependendo do derivado de GLP-1 particular selecionado.
[0785] Protocolo de ensaio geral para o sanduíche ELISA em placa microtituladora de 96 reservatórios Tampão de revestimento (PBS) :Solução salina tamponada por fosfato, pH 7,2 Tampão de lavagem (PBS-lavagem) :Solução salina tamponada por fosfato, 0,05 % v/v de Tween 20, pH 7,2 Tampão de ensaio (BSA-tampão) :Solução salina tamponada por fosfato, 10 g/l de Albumina de Soro Bovino (Fluka 05477), 0,05 % de v/v Tween 20, pH 7,2 Tampão de estreptavidina :Solução salina tamponada por fosfato, 0,5 M de NaCl, 0,05 % v/v de Tween 20, pH 7,2 Padrão :Compostos individuais em uma matriz de plasma A-TNP :Anticorpo não sentido AMDEX :Estreptavina-rábano silvestre- peroxodase (Amersham RPN4401V) substrato de TMB :3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (<0,02 %), peróxido de hidrogênio
[0786] O ensaio foi realizado como segue (volume/reservatório):
[0787] 1) revestir com 100 μl de anticorpo contagioso 5 μg/ml em tampão de PBS
[0788] incubar o/n, 4° C
[0789] 5x PBS-lavagem bloquear com a última lavagem no mínimo em 30 minutos
[0790] depois esvaziar a placa
[0791] 2.) 20 μl de amostra + 100 μl de anticorpo de detecção biotinilado, 1 μg/ml em tampão de BSA com 10 μg/ml de A-TNP
[0792] incubar 2 h, temperatura ambiente, em um agitador 5x PBS-lavagem, depois esvaziar a placa
[0793] 3.) 100 μl de AMDEX 1:8000 em tampão de estreptavidina
[0794] incubar por 45 a 60 minutos, temperatura ambiente, em um agitador
[0795] 5x PBS-lavagem, depois esvaziar a placa
[0796] 4.) 100 μl de substrato de TMB
[0797] incubar x minutos em temperatura ambiente em um agitador
[0798] interromper a reação com 100 μl de H3PO4 4 M
[0799] Ler a absorbância a 450 nm com 620 nm como referência
[0800] A concentração nas amostras foi calculada a partir das curvas padrão.
[0801] Protocolo de ensaio geral para RIA
[0802] Tampão de DB : 80 mM de tampão de fosfato, 0,1 % de Albumina
[0803] de soro humano, 10 mM de EDTA, 0,6 mM de
[0804] tiomersal, pH 7,5
[0805] Tampão de FAM : 40 mM de tampão de fosfato, 0,1 % de Albumina
[0806] de soro humano, 0,6 mM de tiomersal, pH 7,5
[0807] Carvão vegetal : 40 mM de tampão de fosfato, 0,6 mM de
[0808] tiomersal, 16,7 % de plasma bovino, 15 g/l de
[0809] carbono ativado, pH 7,5 (misturar a suspensão no
[0810] mínimo 1 h antes do uso a 4° C)
[0811] Padrão : Compostos individuais em uma matriz de plasma
[0812] O ensaio foi realizado em tubos minisorp 12 x 75 mm (volume/tubo) como segue:
Figure img0150
Figure img0151
[0813] Misturar - incubar 30 minutos a 4° C - centrifugar a 3000 rpm, 30 minutos - imediatamente depois da transferência dos sobrenadantes para tubos novos, fechar com tampa e contar em contador gama por 1 minuto. A concentração nas amostras foi calculada a partir de curvas padrão individuais.
[0814] Ensaio de radio receptor de GLP-1 (RRA):
[0815] O método é um ensaio de ligação de ligando radiométrico que usa partículas formadoras de imagem LEADseeker. O ensaio é composto de fragmentos de membrana que contêm o receptor GLP-1, análogos de GLP-1 não rotulados, GLP- 1 humano rotulado com 125I e partículas de PS LEADseeker revestidas com aglutinina de germe de trigo (WGA). O GLP-1 frio e rotulado por 125Icompetirá para a ligação ao receptor. Quando as partículas de LEADseeker forem adicionadas, estas serão ligadas aos resíduos de carboidratos nos fragmentos de membrana por intermédio de resíduos de WGA. A proximidade entre as moléculas de 125I e as partículas de LEADseeker causa emissão de luz a partir das partículas. O LEADseeker formará imagem com a luz emitida e será reversivelmente correlacionada com a quantidade de análogo de GLP-1 presente na amostra.
[0816] Reagentes & Materiais:
[0817] Pré tratamento de plasma animal: O plasma animal foi tratado por calor por 4 horas a 56° C e centrifugado a 10.000 rpm por 10 minutos. Posteriormente, Val-Pyr (10 pM) e aprotenina (500 KIE/ml) foram adicionados e armazenados a <-18° C até o uso.
[0818] Calibradores de análogos de GLP-1: Os análogos de GLP-1 foram presos no plasma tratado por calor para produzir linhas de diluição que variam de aproximadamente 1 μM a 1 pM.
[0819] Tampão de ensaio de GLP-1 RRA: 25 mM de Na-HEPES (pH = 7,5), 2,5 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 50 mM de NaCl, 0,1 % de ovalbumina, 0,003 % de tween 20, 0,005 % bacitracina, 0,05 % de NaN3.
[0820] Suspensão do receptor GLP-1: Os fragmentos de membrana do receptor GLP-1 foram purificados a partir das células do rim de hamster filhote (BHK) que expressam o receptor GLP-1 pancreático humano. Armazenado a <- 80° C até o uso.
[0821] Contas formadoras de imagem LEADseeker de poliestireno ligadas por WGA (RPNQ0260, Amersham): as contas foram reconstituídas com tampão de ensaio GLP-1 RRA a uma concentração de 13,3 mg/mL. A suspensão de membrana do receptor GLP-1 foi então adicionada e incubada fria (de 2 8° C) em extremidade sobre extremidade por pelo menos 1 hora antes do uso.
[0822] [125I]-GLP-1(7-36)amida (Novo Nordisk AIS). Armazenada a <-18° C até o uso.
[0823] 99,9 % em volume de etanol (De Dansk Spritfabrikker A/S): Armazenado a <-18° C até o uso.
[0824] Placas de PTFE hidrofóbicas de 0,45 μm MultiScreen® Solvinert (MSRPN0450, Millipore Corp.)
[0825] Placas de poli propileno (cat. no. 650201, Greiner Bio-One)
[0826] Placas de 384 reservatórios de poliestireno branco (cat. no 781075, Greiner Bio-One)
[0827] Mecanismo:
[0828] Misturador de placa horizontal
[0829] Centrifugar com uma montagem de rotor de placa microtituladora de cesto oscilante padrão
[0830] UltraVap - Drydown Sample Concentrator (Porvair)
[0831] LEADseekerTM Multimodality Imaging System (Amersham)
[0832] Procedimento de Ensaio:
[0833] Preparação de Amostra:
[0834] Montar a placa de filtro MultiScreen® Solvinert em uma placa receptora quimicamente comparável (isto é, placas de poli propileno) para coletar o filtrado.
[0835] Adicionar 150 μL etanol gelado a 99,9 % nos reservatórios vazios da placa de filtro MultiScreen® Solvinert seguido por 50 μL de calibrador ou amostra de plasma. Colocar a tampa de armazenagem na placa de filtro.
[0836] Incubar por 15 minutos de 18 a 22° C em um misturador de placa horizontal.
[0837] Colocar o filtro montado e placa receptora, com a tampa, em uma montagem de rotor de placa microtituladora de cesto oscilante padrão. O filtrado é então coletado nos reservatórios vazios da placa receptora a 1500 rpm por 2 minutos.
[0838] Esfriar o filtrado usando-se the UltraVap com N2 aquecido (40° C) pela duração de 15 minutos.
[0839] Reconstituir o material seco pela adição de 100 μL de tampão de ensaio GLP-1 RRA em cada reservatório.
[0840] Incubar por 5 minutos em um misturador horizontal.
[0841] Ensaio de receptor de rádio GLP-1:
[0842] Usar o seguinte esquema de pipetação e placas de 384 reservatórios de poliestireno branco: • 35 μL de tampão de ensaio GLP-1 RRA • 5 μL de filtrado reconstituído. • 10 μL de [125I]-GLP-1(7-36)amida. A solução de estoque foi diluída em tampão de ensaio GLP-1 RRA a 20.000 cpm/reservatório antes do uso. • 15 μL de fragmentos de membrana de receptor GLP-1 (0,5 μg/reservatório) pré-revestidos às contas formadoras de imagem LEADseeker de poliestireno WGA (0,2 mg/reservatório)
[0843] Selar as placas e incubar durante a noite de 18 a 22° C
[0844] A emissão de luz de cada reservatório é detectada pelo uso de LEADseekerTM Multimodality Imaging System para a duração de 10 minutos.
[0845] Estímulo de formação de cAMP em uma linha celular que expressa o receptor GLP-1 humano clonado.
[0846] As membranas plasmáticas purificadas de uma linha celular transfectada estável, BHK467-12A (tk-ts13), que expressa o receptor GLP-1 humano foram estimulada com GLP-1 e análogos de peptídeo e, a potência da produção de cAMP foi medida usando-se o AlphaScreenTM cAMP Assay Kit da Perkin Elmer Life Sciences.
[0847] Uma linha celular transfectada estável foi preparada em NN e um clone de expressão alta foi selecionado para avaliação. As células foram cultivadas a 5 % de CO2 em DMEM, 5 % de FCS, 1 % de Pen/Estrep e 0,5 mg/ml de G418.
[0848] As células em aproximadamente 80 % de confluência foram lavadas 2X com PBS e coletadas com Versene, centrifugadas 5 minutos a 1000 rpm e o sobrenadante removido. As etapas adicionais foram todas feitas em gelo. O grânulo celular foi homogeneizado por Ultrathurax por 20 a 30 segundos em 10 ml de Tampão 1 (20 mM de Na-HEPES, 10 mM de EDTA, pH = 7,4), centrifugado 15 minutos a 20.000 rpm e o grânulo recolocado em suspensão em 10 ml de Tampão 2 (20 mM de Na-HEPES, 0,1 mM de EDTA, pH = 7,4). A suspensão foi homogeneizada por 20 a 30 segundos e centrifugada 15 minutos a 20.000 rpm. A suspensão no Tampão 2, a homogeneização e centrifugação foram repetidas uma vez e as membranas foram recolocadas em suspensão no Tampão 2 e preparadas para análise adicional ou aramzenadas a -80° C. O ensaio de receptor funcional foi realizado medindo-se a produção de cAMP induzida por peptídeo pela The AlphaScreen Technology. O princípio básico de The AlphaScreen Technology é uma competição entre cAMP endógeno e biotina-cAMP exogenamente adicionado. A captura de cAMP é alcançada pelo uso de um anticorpo específico conjugado às contas receptoras. O cAMP formado foi contado e medido em um AlphaFusion Microplate Analyzer. Os valores EC50 foram calculados usando-se o software Graph-Pad Prisme.

Claims (14)

1. Composto, caracterizado pelo fato de apresentar a fórmula (I): A—W—B—Y—polipeptídeo terapêutico (I) em que o dito polipeptídeo é um peptídeo GLP-1 que compreende uma sequência de aminoácido da fórmula (V): Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu- Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37- Xaa38 Fórmula (V) (SEQ ID N°: 3) em que Xaa7 é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, β- hidróxi-histidina, homoistidina, Nα-acetil-histidina, α-fluorometil-histidina, α-metil- histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina; Xaa8 é Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminocicloexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloeptil) carboxílico ou ácido (1-aminociclooctil) carboxílico; Xaa18 é Ser, Lys ou Arg; Xaa22 é Gly, Glu ou Aib; Xaa23 é Gln, Glu, Lys ou Arg; Xaa26 é Lys, Glu ou Arg; Xaa30 é Ala, Glu ou Arg; Xaa34 é Lys, Glu ou Arg; Xaa35 é Gly ou Aib; Xaa36 é Arg ou Lys; Xaa37 é Gly, Ala, Glu ou Lys; Xaa38 é Lys, amida ou está ausente. em que A é um resíduo que se liga à albumina selecionado do grupo que consiste em
Figure img0152
onde o átomo de carbono quiral é R ou S,
Figure img0153
onde o átomo de carbono quiral é R ou S,
Figure img0154
onde o átomo de carbono quiral é R ou S
Figure img0155
onde os dois átomos de carbono quirais são independentemente R ou S,
Figure img0156
Figure img0157
em que B é -(CH2)I-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p-[C(O)NH-(CH2)I-O-[(CH2)n-O]m- (CH2)p]q-, onde l, m, n e p são independentemente de 1 a 5 e q é de 0 a 5. em que Y é um grupo químico que liga B e o agente terapêutico, selecionado do grupo que consiste em -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, - CH2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)CH2-, - CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, - NHC(O)- e -C(O) NH-, em que s é 0 ou 1; e em que W é um grupo químico que liga B com A selecionado do grupo que consiste em -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -OC(O)NH-, - NHC(O)O-, -C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s-, -C(O)-, - C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)- e -C(O)NH-, em que s é 0 ou 1; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que i) q é 0 ou 1; ii) q é 1 ou iii) q é 0.
3. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que I é 2 e/ou em que n é 2.
4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que -W-B-Y- é selecionado do grupo que consiste em
Figure img0158
5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o resíduo que se liga à albumina i) por intermédio do espaçador e dos ligadores é ligado ao dito polipeptídeo terapêutico por intermédio do grupo ε-amino de um resíduo de lisina; e/ou ii) por intermédio de um ligador a um resíduo de aminoácido selecionado de cisteína, glutamato e aspartato.
6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dito peptídeo GLP-1 compreende i) não mais do que dez resíduos de aminoácido que foram trocados, adicionados ou deletados em comparação com GLP-1 (7-37) (SEQ ID N° 1); ii) preferivelmente não mais do que seis resíduos de aminoácidos que foram trocados, adicionados ou deletados em comparação com GLP-1 (7-37) (SEQ ID N° 1); e/ou iii) não mais do que 4 resíduos de aminoácidos que não são codificados pelo código genético.
7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que i) o dito peptídeo GLP-1 compreende um resíduo Aib na posição 8; e/ou ii) o resíduo de aminoácido na posição 7 do dito peptídeo GLP-1 é selecionado do grupo que consiste em D-histidina, desamino-histidina, 2-amino- histidina, β-hidroxi-histidina, homoistidina, Nα-acetil-histidina, α-fluorometil-histidina, α-metil- histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina e 4-piridilalanina.
8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito peptídeo GLP-1 é selecionado do grupo que consiste em Arg34GLP-1(7-37), Lys38Arg26,34GLP-1(7-38), Lys38Arg26,34GLP-1(7-38)- OH, Lys36Arg26,34GLP-1(7-36), Aib8,22,35GLP-1(7-37), Aib8,35GLP-1(7-37), Aib8,22GLP- 1(7-37), Aib8,22,35 Arg26,34Lys38GLP-1(7-38), Aib8,35 Arg26,34Lys38GLP-1(7-38), Aib8,22 Arg26,34Lys38GLP-1(7-38), Aib8,22,35Arg26,34Lys38GLP-1(7-38), Aib8,35Arg26,34Lys38GLP- 1(7-38), Aib8,22,35 Arg26Lys38GLP-1(7-38), Aib8,35 Arg26Lys38GLP-1(7-38), Aib8,22 Arg26Lys38GLP-1(7-38), Aib8,22,35 Arg34Lys38GLP-1(7-38), Aib8,35Arg34Lys38GLP-1(7- 38), Aib8,22Arg34Lys38GLP-1(7-38), Aib8,22,35Ala37Lys38GLP-1(7-38), Aib8,35Ala37Lys38GLP-1(7-38), Aib8,22Ala37Lys38GLP-1(7-38), Aib8,22,35 Lys37GLP-1(7- 37), Aib8,35Lys37GLP-1(7-37) e Aib8,22Lys37GLP-1(7-38).
9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito peptídeo GLP-1 é ligado ao dito espaçador hidrofílico por intermédio do resíduo de aminoácido na posição 23, 26, 34, 36 ou 38 relativa à sequência de aminoácido SEQ ID N°: 1.
10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que um resíduo que se liga à albumina por intermédio do dito espaçador hidrofílico é ligado ao resíduo de aminoácido de terminal C do dito peptídeo GLP-1.
11. Composto de acordo com a reivinidicação 10, caracterizado pelo fato de que um segundo resíduo que se liga à albumina é ligado a um resíduo de aminoácido que não é o resíduo de aminoácido de terminal C.
12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o dito composto é selecionado do grupo que consiste em N^7-{2-[2-(2-(15-carboxipentadecanoilamino)etóxi)etóxi]acetil}-[Aib8’22’35, Lys37] GLP-1(7-37)amida
Figure img0159
N^7-(2-(2-(2-(17-carboxieptadecanoilamino)etóxi)etóxi)acetil)[Aib8’22’35 Lys37]GLP-1(7-37)amida
Figure img0160
N^7-(2-(2-(2-(19-carboxinonadecanoilamino)etóxi)etóxi)acetil)[Aib8’22’35 Lys37]GLP-1(7-37)amida
Figure img0161
[Aib8,22,35]GLP-1(7-37)Lys(({2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(15-carboxipenta- decanoilamino)-etóxi]etóxi}acetilamino)etóxi]etóxi}acetil amino)etóxi]-etóxi}- acetil))amida
Figure img0162
Nε37-([2-(2-{3-[2,5-dioxo-3-(15-carboxipentadecilsulfanil)-pirrolidin-1-il]- propionilamino}etoxi)etóxi)acetil]-[D-Ala9,Lys37]-GLP-1-[7-37]amida
Figure img0163
[Aib8,22,35Ala37]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(2-(11-(oxalilamino)undecanoil- amino)etóxi)etóxi)acetil-)))amida
Figure img0164
[Aib8,22,35,Ala37]-GLP-1(7-37)Lys({2-[2-(2-{2-[2-(2-(15-carbóxi-penta- decanoilamino)-etóxi]etóxi}acetilamino)etóxi]etóxi}acetil)amida
Figure img0165
[Aib8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-carboxieptanoil- amino)etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0166
[Gly8,Arg26,34]GLP1-(7-37) Lys{2-(2-(2-(2-[2-(2-(17-carboxieptadecanoil- amino)etóxi)etóxi]acetil)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0167
Figure img0168
[Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(19-(carbóxi)nonadecanoilamino)- etóxi)etóxi)acetil)-OH
Figure img0169
[Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys((2-(2-(17-(carbóxi)heptadecanoilamino)- etóxi)etóxi)acetil))-OH
Figure img0170
[Gly8,Arg26,34]GLP-1(7-37)Lys(2-(2-(2-(4-(19-(carbóxi)nonadecanoil- amino)-4-carboxibutirilamino)etóxi)etóxi)acetil)-OH
Figure img0171
Figure img0172
Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-Carboxieptadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil- amino)etóxi)etóxi)acetil) [Aib8,Arg26,34,Lys36]GLP-1(7-37)
Figure img0173
Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-Carboxieptadecanoilamino)et0xi)et0xi)acetil- amino)etóxi)etóxi)acetil) [Gly8,Arg26,34,Lys36]GLP-1(7-37)
Figure img0174
Nε36-(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-Carboxieptadecanoilamino)etóxi)etóxi)acetil amino]etóxi)etóxi]acetil)[Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0175
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxieptadecanoilamino)-4(S)-carb0xi- butirilamino]etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi]etóxi)acetil][Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0176
Nε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxieptadecanoilamino)-4(S)-carbóxibutirilamino]etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi]etóxi)acetil][Arg34]GLP-1-(7-37)-OH
Figure img0177
[Gly8,Glu22,23,30,Arg18,26,34]GLP1(7-37)Lys(2-(2-(2-(2-(2-(2-(17-carboxiepta -decanoilamino)etóxi)etóxi)acetilamino)etóxi))etóxi)acetil)-NH2
Figure img0178
[Ácido imidazolilpropiônico7, Asp16, Aib22,35]GLP1(7-37)Lys NH((2-{[4-(17- carboxieptadecanoilamino)butilcarbamoil]metóxi}etóxi)etóxi))
Figure img0179
Ácido imidazolilpropiônico7, Aib22,35]GLP1(7-37)Lys NH((2-{[4-(17- carboxieptadecanoilamino)butilcarbamoil]metóxi}etóxi)etóxi)) NH
Figure img0180
[3-(5-Imidazoil)propionil7, Aib8, Arg26,34] GLP1(7-37)Lys{2-(2-(2-(2-[2-(17- carboxi -heptanoilamino)etóxi)etóxi]acetilamino)etóxi)etóxi)acetil)}-OH
Figure img0181
13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
14. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de hiperglicemia, diabete do tipo 2, tolerância à glicose deteriorada, diabete do tipo 1, obesidade, hipertensão, síndrome X, dislipidemia, distúrbios cognitivos, aterosclerose, infarto do miocárdio, doença cardíaca coronária e outros distúrbios cardiovasculares, acidente vascular cerebral, síndrome inflamatória do intestino, dispepsia e úlceras gástricas; preferencialmente diabete do tipo 2.
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