BRPI0610360A2 - métodos para tratar de cáncer resistente a fármaco - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um método para tratar câncer resistente a fármaco, que inclui administrar a um paciente em necessidade deste, um composto de fórmula I, um tautómero do composto, um sal do composto, um sal do tautómero, uma mistura destes, ou uma composição farmacêutica compreendendo o composto, o tautómero, o sal do composto, o sal do tautómero, ou a mistura, em que o paciente é um paciente de câncer com câncer resistente a fármaco, em que o composto de fórmula I é como definido no pedido de patente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA TRATAR DE CÂNCER RESISTENTE A FÁRMACO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se, geralmente, aos métodos de tra-tamento de câncer. Mais especificamente, a invenção refere-se aos métodose compostos de benzimidazolila de quinolinona 4-amino substituída tais co-mo compostos de 4-amino-5-flúor-3-[5-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-benzimida-zol-2-il]quinolin-2(1H)-ona e formulações farmacêuticas compreendendo taiscompostos para tratamento de câncer resistente a fármaco e pacientes comcâncer resistente a fármaco.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Uma variedade de compostos e composições químicas foi rela-tada como possuindo atividade contra uma ou mais tirosina cinase receptorade fator de crescimento endotelial vascular (VEGF-RTK). Exemplos incluemderivados de quinolina tais como descritos em WO 98/13350, derivados deaminonicotinamida (veja, por exemplo WO 01/55114), compostos anti-sentido (veja, por exemplo WO 01/52904), peptidomiméticos (veja, por e-xemplo WO 01/52875), derivados de quinazolina (veja, por exemplo Patentedos Estados Unidos N9 6.258.951), anticorpos monoclonais (veja, por exem-pio EP 1 086 705 A1), várias 5,10,15,20-tetraaril-porfirinas e 5,10,15-triaril-corróis (veja, por exemplo WO 00/27379), derivados alconossulfônicos hete-rocíclicos e ácido carboxílico de alcano (veja, por exemplo DE19841985),derivados de oxindolilquinazolina (veja, por exemplo WO 99/10349), deriva-dos de 1,4-diazaantracina (veja, por exemplo Patente dos Estados UnidosNe 5.763.441), e derivados cinolina (veja, por exemplo WO 97/34876), e vá-rios compostos de indazol (veja, por exemplo WO 01/02369 e WO01/53268).

A síntese de derivados de quinolona de 4-hidróxi e quinolina de4-hidróxi é descrita em várias referências. Por exemplo, Ukrainets e outrosdescreveu a síntese de 3-(benzimidazol-2-il)-4-hidróxi-2-oxo-1,2-dihidroquinolina. Ukrainets, I. e outros, Tetrahedron Lett. 42, 7747 a 7748(1995); Ukrainets, I. e outros, Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii, 2, 239 a241(1992). Ukrainets também descreveu a síntese, atividade anticonvulsivae anti-tiróide de outras quinolonas de 4-hidróxi e análogos de tio tais como1H-2-oxo-3-(2-benzimidazolil)-4-hidroxiquinolina. Ukrainets, I. e outros, Khi-miya Geterotsiklicheskikh Soedinii, 1, 105 a 108 (1993); Ukrainets, I. e ou-tros, Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii, 8, 1105 a 1108 (1993); Ukrainets,I. e outros, Chem. Heterocyclic Comp. 33, 600 a 604, (1997).

A síntese de vários derivados de quinolina é descrita em WO97/48694. Estes compostos são descritos como capazes de ligação a recep-tores de hormônio nuclear e sendo úteis para estimulação de proliferação deosteoblasto e crescimento ósseo. Os compostos são também descritos co-mo sendo úteis no tratamento ou prevenção de doenças associadas comfamílias de receptor de hormônio nuclear.

Vários derivados de quinolina nos quais o anel de benzeno daquinolina é substituído com um grupo súlfur são descritos em WO 92/18483.

Estes compostos são descritos como sendo úteis em formulações farmacêu-ticas e como medicamentos.

Derivados de quinolona e cumarina foram descritos como possu-indo uso em uma variedade de aplicações não relacionadas à medicina eformulações farmacêuticas. Referências que descrevem a preparação dederivados de quinolona para uso em composições fotopolimerizáveis ou parapropriedades luminescentes incluem: Patente dos Estados Unidos Ne5.801.212 emitida a Okamoto e outros; JP 8-29973; JP 7-43896; JP 6-9952;JP 63-258903; EP 797376; e DE 23 63 459.

Uma pletora de compostos de quinolinona substituída incluindocompostos de benzimidazolila de quinolinona e compostos de benzimidazoli-la de quinolinona 4-amino substituída tais como 4-amino-5-flúor-3-[5-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona foi recentementedescrita em referências tais como WO 02/22598 e WO 2004/043389. Taiscompostos são descritos como VEGF-RTKs inibidoras. Tais compostos sãotambém descritos em pedidos de patente dos Estados Unidos publicadosU.S. 2002/0107392 e U.S. 2003/0028018 e Patente dos Estados Unidos N-6.605.617, 6.774.237, e 6.762.194. Compostos heterocíclicos relacionados aquinolinonas de benzimidazolila foram recentemente descritos em WO02/18383, U.S. 2002/0103230, e Patente dos Estados Unidos Ne 6.756.383.Outros tais compostos são descritos junto com novos usos de tais compos-tos na inibição de serina/treonina cinases e tirosina cinases são descritas emWO 2004/018419, e U.S. 2004/0092535, depositados em 19 de agosto de2003, e prioridade de reivindicação para cada um dos seguintes pedidos dePatente provisionais: Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos N9— 60/405.729 depositado em 23 de agosto de 2002; Pedido de Patente Provi-sório dos Estados Unidos N- 60/426.107 depositado em 13 de novembro de2002; Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos N9 60/426.226 de-positado em 13 de novembro de 2002; Pedido de Patente Provisório dosEstados Unidos N9 60/426.282 depositado em 13 de novembro de 2002; Pe-dido de Patente Provisório dos Estados Unidos N9 60/428.210 depositadoem 21 de novembro de 2002; Pedido de Patente Provisório dos Estados U-nidos N9 60/460.327 depositado em 3 de abril de 2003; Pedido de PatenteProvisório dos Estados Unidos N9 depositado em 3 de abril de 2003; Pedidode Patente Provisório dos Estados Unidos N9 60/460.493 depositado em 3de abril de 2003; Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos N960/478.916 depositado em 16 de junho de 2003; e Pedido de Patente Provi-sório dos Estados Unidos N9 60/484.048 depositado em 1 de julho de 2003.

Ainda outros compostos, método para sua síntese, sais de ácido lático des-tes, e usos destes são descritos nos seguintes pedidos de patente deposita-dos em 5 de novembro de 2004: Pedido de Patente dos Estados Unidos N910/983.174; Pedido de Patente dos Estados Unidos N9 10/982.757; e Pedidode Patente dos Estados Unidos N9 10/982.5423. Cada um dos documentosneste parágrafo é por meio deste incorporado por referência em sua totali-dade e para todos os propósitos como se inteiramente apresentados aqui.

Vários novos compostos foram recentemente constatados úteisno tratamento de câncer. Por exemplo, Gleevec® (mesilato de imatinib) é umcomposto que recentemente mostrou significante atividade em vários cânce-res diferentes. Gleevec tornou-se primeiramente disponível a pacientes comLeucemia Mielóide Crônica (CML) em maio de 2001. De acordo com o No-vartis site da Internet, Gleevec é indicado para o tratamento de pacientesadultos recentemente diagnosticados com CML de Cromossoma Filadélfiapositivo (Ph+) em fase crônica. O acompanhamento é limitado. Gleevec étambém indicado para o tratamento de pacientes com CML de pH+ em criseblasto, fase acelerada, ou em fase crônica depois de falha da terapia de in-terferon-alfa. Gleevec é também indicado para o tratamento de pacientespediátricos com CML de crônica fase de pH+ cuja doença recorreu depoisde transplante dexélula-tronco ou que são resistentes a terapia de interfe-ron-alfa. Gleevec foi aprovado para uso em pacientes com outros câncerestais como Tumores Estromais Gastrointestinais (GIST). Por exemplo, em 1de fevereiro de 2002, a FDA concedeu aprovação de Novartis de Gleevecpara o tratamento de pacientes com GIST maligno não resectável positivo deKIT (CD117) e/ou metastático.

Outros novos fármacos experimentais que estão correntementesendo testados para eficácia no tratamento de câncer incluem BAY43-9006(sorafenib) e Brostalicina. BAY 43-9006 concedeu estado de fármaco órfãopara o tratamento de carcinoma de célula renal pela Administração de Ali-mento e Droga dos Estados Unidos (FDA). BAY 43-9006 está sendo avalia-do para o tratamento de carcinoma de célula renal metastática, uma formaavançada de câncer de rim. Uma designação similar foi concedida na UniãoEuropéia pelo Comitê para Produtos Medicinais Órfãos (COMP) da Agênciade Medicinas Européias (EMEA). BAY 43-9006 é uma nova RAF cinase einibidor de VEGFR que pretende prevenir crescimento de tumor através decombinação de duas atividades anticâncer: inibição de proliferação de célulade tumor e angiogênese de tumor. Brostalicina (PNU-166196) é um agluti-nante de menor sulco de DNA de segunda geração a-bromoacrílico sintéticoestruturalmente relacionado a distamicina A, presentemente em testes deFase II na Europe e nos Estados Unidos. O composto mostra ampla ativida-de antitumor em modelos pré-clínicos e mielotoxicidade in vitro dramatica-mente reduzida em células progenitoras hematopoiéticas humanas compa-rado com aquele de outros aglutinantes menor sulco. Brostalicina mostrouuma atividade 3 vezes mais alta em células de leucemia de murino L1210resistente a melfalana do que na linhagem parental (IC50 = 0,46 e 1,45ng/mL, respectivamente) sob condições nas quais a citotoxicidade de agen-tes antitumor convencionais era ou não afetada ou reduzida.

Ainda que progressos significantes tenham sido feitos no desen-volvimento de composições farmacêuticas para tratamento de câncer, novosmétodos de tratamento de câncer são requeridos. Especialmente necessá-rios são composições farmacêuticas e compostos para uso na preparaçãode composições farmacêuticas que são úteis no tratamento de câncer resis-tente a fármaco e pacientes com cânceres resistentes a fármaco. Tambémnecessários são composições farmacêuticas e compostos que possam seradministrados a pacientes com cânceres resistentes a fármaco em conjun-ção com agentes anticâncer conhecidos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos de tratamento de câncer,métodos de tratamento de câncer resistente a fármaco, e kits e composiçõesterapêuticas para uso em tratamento de câncer em sujeitos tais como aque-les com câncer resistente a fármaco.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método paratratamento de câncer resistente a fármaco. O método inclui administração aum sujeito em necessidade deste, um composto de formula I, um tautômerodo composto, um sal do composto, um sal do tautômero, uma mistura des-tes, ou uma composição farmacêutica compreendendo o composto, o tautô-mero, o sal do composto, o sal do tautômero, ou a mistura. Em algumas mo-dalidades, o sujeito é um paciente de câncer com câncer resistente a fárma-co. O composto de fórmula I tem a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 6</formula>em que:

R1, R2, R3, e R4 podem ser iguais ou diferentes e são indepen-dentemente selecionados de H, Cl, Br, F, I, grupos -OR10, grupos -NR11R12,grupos alquila primária, secundária, ou terciária substituída ou não substituí-da, grupos arila substituída ou não substituída, grupos alquenila substituídaou não substituída, grupos alquinila substituída ou não substituída, gruposheterociclila substituída ou não substituída, ou grupos heterociclilalquilasubstituída ou não substituída;

R5, R6, R7, e R8 podem ser iguais ou diferentes e são indepen-dentemente selecionados de H, Cl, Br, F, I, grupos -OR13, grupos -NR14R15,grupos -SR16, grupos alquila primária, secundária, ou terciária substituída ounão substituída, grupos arila substituída ou não substituída, grupos alquenilasubstituída ou nãô substituída, grupos alquinila substituída ou não substituí-da, grupos heterociclila substituída ou não substituída, grupos heterociclilal-quila substituída ou não substituída, grupos alcoxialquila substituída ou nãosubstituída, grupos ariloxialquila substituída ou não substituída, ou gruposheterocicliloxialquila substituída ou não substituída;

R10 e R13 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituída ou não substituída, gruposarila substituída ou não substituída, grupos heterociclila substituída ou nãosubstituída, grupos heterociclilalquila substituída ou não substituída, gruposalcoxialquila substituída ou não substituída, grupos ariloxialquila substituídaou não substituída, ou grupos heterocicliloxialquila substituída ou não substi-tuída;

R11 e R14 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituída ou não substituída, gruposarila substituída ou não substituída, ou grupos heterociclila substituída ounão substituída;

R12 e R15 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituída ou não substituída, gruposarila substituída ou não substituída, ou grupos heterociclila substituída ounão substituída; eR16 é selecionado de grupos alquila substituída ou não substituí-da, grupos arila substituída ou não substituída, ou grupos heterociclila substi-tuída ou não substituída.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método paratratamento de câncer. O método inclui administração a um sujeito em neces-sidade deste, um fármaco anticâncer selecionado de mesilato de imatinib(Gleevec), BAY43-9006, Brostalicina, lenalidomida (Revlimid), talidomida(Thalomid), docetaxel (Taxotere), erlotinib (Tarceva), vatalinib (PTK-787),captura de VEGF, fenretidina, bortezomib, bevacizumab (Avastin), pertuzu-mab, e/ou rituximab, e um composto de fórmula I, um tautomero do compos-to, um sal do composto, um sal do tautomero, uma mistura destes, ou umacomposição farmacêutica compreendendo o composto, o tautomero, o sal docomposto, o sal do tautomero, ou a mistura. O composto de fórmula I tem aestrutura e variáveis descritas acima.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece kits ecomposições terapêuticas. Os kits e composições terapêuticas incluem umfármaco anticâncer e um composto de fórmula I, um tautomero do composto,um sal do composto, um sal do tautomero, ou uma mistura destes. As com-posições terapêuticas incluem o fármaco anticâncer e o composto de fórmu-Ia I, o tautomero do composto, o sal do composto, o sal do tautomero, ou amistura destes como uma preparação combinada para uso simultâneo, se-parado, ou seqüencial no tratamento de um sujeito que tem câncer resisten-te a fármaco. O composto de fórmula I tem a estrutura e variáveis descritasacima.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método parainibição de uma cinase em um sujeito. O método inclui administração a umsujeito em necessidade deste de um composto de fórmula I, um tautomerodo composto, um sal do composto, um sal do tautomero, uma mistura des-tes, ou uma composição farmacêutica compreendendo o composto, o tautô-mero, o sal do composto, o sal do tautomero, ou a mistura. O composto defórmula I tem a estrutura e variáveis descritas acima, o sujeito é um pacientede câncer, e a cinase compreende um resíduo porteiro mutante.Objetivos, aspectos e vantagens adicionais da invenção serãoaparentes da seguinte descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 é uma imagem escaneada mostrando imagens biolu-minescentes (BLI) de corpo inteiro obtidas usando um Sistema de Imagea-mento de IVIS (Xenogen) de camundongos beges SCID depois de injeçãointravenosa com células KMS-11-luc.

A figura 2 é um gráfico mostrando que camundongos begesSCID injetados com células KMS-11-luc e tratados com 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona (20 mg/kg/d)exibiram uma contagem de fóton média significantemente menor do que a-queles tratados com veículo.

A figura 3 é uma imagem escaneada de BLIs de corpo inteiroobtidas usando um Sistema de Imageamento de IVIS (Xenogen) de camun-dongos beges SCID depois de injeção intravenosa com células KMS-11-luc.

As BLIs na esquerda são de camundongos tratados com veículo e as BLIsna direita são de camundongos tratados com 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona (Composto, 20mg/kg/d).

A figura 4 é um gráfico comparando a porcentagem sobreviventede camundongos beges SCID intravenosamente injetados com células KMS-11-luc e em seguida tratados ou com veículo (diamantes) ou com 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona (tri-ângulos, 20 mg/kg/d).

As figuras 5 a 7 são gráficos mostrando que 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona (Composto1) modula expressão alvo de FLT3 e demonstra efeitos antiproliferativoscontra células MV4;11 e RS4;11. Na figura 5, MV4;11 (A) ou RS4;11 (napresença de ligando de FLT3) (■) foram incubadas com diluições em sériedo Composto 1. A viabilidade da célula foi determinada pelo ensaio de MTSdepois de um período de incubação de 72 horas. Valores de EC50 foram cal-culados usando regressão não linear. Na figura 6, células MV4;11 (ITD) ouna figura 7, RS4;11 (WT) privadas de soro foram incubadas com um aumen-to da concentração do Composto 1 durante 3 horas antes da lise celular. Ascélulas RS4;11 foram estimuladas com ligando de FLT3 (100 ng/ml) durante15 minutos, tal como indicado. Usados de célula inteira foram imunoprecipi-tados com anticorpo de FLT3 anti-humano, redissolvido por SDS-PAGE. I-munomanchamentos foram sondados com anticorpo de antifosfotirosina (fai-xa superior). Membranas foram extraídas e ressondadas com anti-FLT3 parademonstrar-carregamento igual de FLT3 (faixa inferior). Mudanças em p-FLT3 são relatadas como porcentagem de linha de base (no tratamento) u-sando densitometria.

As figuras 8 e 9 são exibições de gráficos de inibição dependen-te de dose de ERK mediada por FLT3 e fosforilação de STAT5 em célulasMV4; 11 por 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona (Composto 1). Células MV4;11 (privadas de soro) foramincubadas com várias concentrações do Composto 1 durante 3 horas epERK intracelular (figura 8) foi detectada por mancha do Oeste e pSTAT5(figura 9) foi determinada usando citometria de fluxo. Mudanças em pERK oupSTAT5 são relatadas como porcentagem de linha de base (no tratamento)usando densitometria.

A figura 10 é um gráfico mostrando que 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona (Composto 1)inibe produção de VEGF autócrino por células MV4;11 in vitro. Células deAML de MV4;11 cultivadas em meios contendo FBS a 10% foram incubadascom ou sem 0,001, 0,01, 0,1, 0,5 e 1 uM de Composto 1 durante 48 horas.

Os sobrenadantes foram analisados quanto a níveis de VEGF humano(normalizados quanto a conteúdo de proteína celular).

A figura 11 é um gráfico mostrando que 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona (Composto 1)inibe fosforilação de FLT3 e STAT5 em xenoenxertos de tumores em ca-mundongos SCID-NOD. Camundongos SCID-NOD portando tumores deMV4;11 s.c. (300 mm3; n= 3 camundongos/grupo) foram tratados com ouveículo ou 10 mg/kg de Composto 1 durante 5 dias. Os tumores foram res-sectados no dia 5 em 4, 8, 24, e 48 h pós-dose, pulverizados e imediatamen-te congelados instantaneamente (-70°C). Para modulação de pFLT3 ou pS-TAT5: lisados de tumor foram imunoprecipitados com anticorpo ou de FLT3anti-humano ou anti-STAT5, redissolvidos por SDS-PAGE. Imunomancha-mentos foram sondados com anticorpo antifosfotirosina apropriado (faixasuperior). Membranas foram extraídas e ressondadas com ou anti-FLT3 ouanti-STAT5 para determinação de proteína de FLT3 ou STAT5 total comocontroles de carregamento (faixa inferior). Cada faixa representa um tumorseparado.

As figuras 12 a 16 são gráficos mostrando a atividade antitumorde 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona (Composto 1) em um modelo de xenoenxerto subcutâneo de tu-mores leucêmicos de MV4;11 ou RS4;11 humana em camundongos SCID-NOD. As células (figura 12) MV4;11 ou (figura 13) RS4;11 foram implantadass.c. dentro do flanco direito de camundongos SCID-NOD (n= 10 camundon-gos/grupo). Em estudos de MV4;11, Veículo (0) ou Composto 1 em doses de1 (•), 5 (▲), ou 30 mg/kg/d durante 15 dias foi administrado oralmentequando tumores eram ~ 300 mm3. Em estudos de RS4;11, Veículo (() ouComposto 1 em doses de 10 (A), 30 , 100 ou 150 (•) mg/kg/d durante8 dias foi administrado oralmente quando tumores eram - 300 mm3. (figura14) Efeito de regimes de dosagem diária, intermitente e cíclica do Composto1 na eficácia de tumores de MV4;11. O Composto 1 foi administrado oral-mente em uma dose de 30 mg/kg ou diariamente , dia sim, dia não/q.o.d.(•) ou cíclica 7 dias sim/7 dias não (X). (figura 15) Composto 1 induz regres-são de grandes tumores de MV4;11. Tumores de MV4;11 s.c. (n=10 camun-dongos/grupo) foram dirigidos a 300 (A), 500 ou 1000 (•) mm3. Tumorestratados por veículo (♦) foram medidos a um volume de tumor máximo de2000 mm3 (na figura 16 mostrados apenas a 1000 mm3). O Composto 1 foiadministrado oralmente em 30 mg/kg/d (primeiro ciclo). A dosagem foi des-continuada depois de 50 dias, e a durabilidade das respostas foram monito-radas depois disso, (figura 16) Tumores recorrentes de MV4;11 depois depré-tratamento com 30 mg/kg/d x 50 dias foram re-tratados com 30 mg/kg/d(segundo ciclo). Painel AD, os dados são expressos como volume médio detumor ± SE (n = 10 camundongos/grupo), Painel E ilustra os volumes de tu-mor de camundongos individuais (n = 10).

A figuras 17 a 19 são exibição de gráficos de apoptose/necrosede tumor e inibição de proliferação celular de tumores de MV4;11 ou RS4;11em camundongos SCID-NOD tratados com 30 mg/kg de 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona (Composto(figura 17) Respostas de tumor de MV4;11 precoce com tratamento de 30mg/kg de Composto 1. Camundongos SCID-NOD portando tumores deMV4;11 s.c. (n= 3-5 /grupo) foram tratados com 30 mg/kg/d de ou Veículo (aaté e) ou Composto 1 durante 5 dias (f-j). Tumores foram ressectados emdias 2 a 5. Tumores incrustados em parafina foram ou manchados com He-matoxilina e Eosina (a, f- dia 1) ou imunomanchados com Ki67 (b, g- dia 5),pERK (c, h dia 5), caspase-3 clivada (d, i- dia 5) ou PARP (e, j- dia 5) (comtinta contadora de hematoxilina). figura 17 ilustra seções representativas detumores tratados individuais de n= 3. (figura 18) Imunoistoquímica de tumo-res de RS4;11 seguinte ao tratamento com tratamento de 30 mg/kg de Com-posto 1. Tumores de RS4;11 (n= 3 a 5 /grupo) foram tratados com ou Veícu-lo (a até c) ou 30 mg/kg/d (d a f) de Composto 1. Tumores foram ressecta-dos nos dias 9. Tumores incrustados em parafina foram ou manchados comHematoxilina e Eosina (a, d) ou imunomanchados com Ki67 (b, e), ou pERK(c, f). A figura 18 ilustra seções representativas de tumores tratados indivi-duais de n= 3. (figura 19) camundongos de SCID-NOD portando tumores deMV4;11 s.c. (n= 3 a 5 /grupo) foram tratados com 30 mg/kg/d de ou Veículoou Composto 1. Tumores tratados por veículo foram ressectados no dia 15 etumores tratados por Composto 1 foram ressectados no dia 89 (50 dosesdiárias de Composto 1 + 39 dias sem tratamento). Tumores incrustados emparafina foram ou manchados com Hematoxilina e Eosina ou imunomancha-dos com Ki67 (com tinta contadora de hematoxilina). (a) Veículo (H&E, dia15); (b) Veículo (Ki67, dia 15); (c) Composto 1, resposta parcial (H&E, dia89); (d) Composto 1, resposta parcial (Ki67, dia 89) e (e) Composto 1, res-posta completa (H&E, dia 89). Setas no ponto c, d para áreas de células viá-veis dispersas em tecido necrótico/ de cicatriz. A figura 19 ilustra seções re-presentativas de tumores tratados de n= 3 a 5. Magnificação das imagenscomo empregada é indicada nas figuras.

As figuras 20 e 21 são gráficos mostrando que 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona (Compos-to 1) prolonga sobrevivência de camundongos SCID-NOD portando célulasMV4;11 intravenosas. Camundongos SCID-NOD irradiados foram implanta-dos com MV4-;11 (1 x 107 células, i.v.), i.w-Os tratamentos foram iniciadosno dia 23, consistindo em 20 mg/kg de ou Veículo oral (♦) ou Composto 1dados diariamente (A) ou programados 7 dias sim/7dias não (■) dos dias 23a 98. Camundongos obtendo sinais precoces de condição de saúde fraca ouparalisia de membro traseiro foram eutanizados. A figura 20 ilustra plotagensde sobrevivente em porcentagem vs. tempo de Kaplan-Meier (n= 10 a 12camundongos/grupo). (figura 21) Avaliação do fluxo citométrico ou histopato-lógico de BM depois de inoculação i.v. de células MV4;11. Tratamentos con-sistidos em 20 mg/kg/d de ou Veículo (a até c) ou Composto 1 (d a f; dias 23a 98). Fêmures foram coletados no dia 51 (a até d) ou dia 167 (e, f), BM foiisolada e analisada quanto a % de células MV4;11 humanas usando citome-tria de fluxo (a,d). Células de BM foram manchadas com anticorpo ou HLA-A,B,C-FITC anti-humano (epitopo de corantes em MHC-I humano, linha sóli-da) ou de controle de isótipo (linha pontilhada). Células enxertadas em por-centagem foram identificadas depois de passagem apropriada, e mancha-mento positivo por HLA-A,B,C anti-humano (marcador). Espécimes de BMde camundongos tratados por veículo (dia 51) ou tratados por Composto 1(dia 167) foram histoquimicamente manchados com H&E (b, e) ou imuno-manchados com um anticorpo mitocondrial anti-humano (c, f) os quais man-cham células MV4;11 humanas em BM de camundongo. Magnificação 400x;setas apontam para células MV4;11 identificadas (b, c).

A figura 22 é um esquema mostrando como os compostos dainvenção seletivamente inibem tirosina cinases receptoras de Classe III, IV,e V (Veja também Tabela de Atividade de 4-Amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona Contra VáriasRTKs).

As figuras 23a e 23b são gráficos plotando volume de tumor co-mo uma função de dias de tratamento com veículo e com 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona. Estes grá-ficos mostram que tratamento com Composto 1 causou regressão e/ou esta-bilização de doença em 90 a 100% dos animais com xenoenxertos de cólonestabilizados grandes (xenoenxertos de tumor de cólon humano KM12L4Aem camundongos nus foram dosados diariamente com Composto 1 quandotumores alcançaram 500 mm3 (23a) ou 1000 mm3 (23b)).

A figura 24 são imagens de PET-CT escaneadas de uma pacien-te fêmea humana com GIST refratário de imatinib tratada com Composto 1(CHIR258).

As figuras 25a e 25b são gráficos de Cmax (ng/mL) médio versusdose e AUC (0, tlast (ng*h/ml_) médio mostrando que exposição de plasmaaumenta proporcionalmente quando o Composto 1 é administrado.

A figura 26 é uma imagem escaneada de uma mancha do Oestemostrando que 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona inibe fosforilação de ERK basal em leucócitos de san-gue periférico (PBL). Amostras de controle positivo foram células do sanguede um doador normal processadas identicamente às amostras clínicas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos de tratamento de câncer,métodos de tratamento de câncer resistente a fármaco, e kits e composiçõesterapêuticas para uso em tratamento de câncer em sujeitos tais como aque-les com câncer resistente a fármaco. Os compostos agem como antagonis-tas de tirosina cinases receptoras, e, mais particularmente, como inibidoresde função de PDGFRa e PDGFRB, bFGF e/ou VEGF-RTK. Tais compostostambém possuem potente atividade com relação a outras tirosina cinases etambém com relação a várias serina/treonina cinases. Os compostos forne-cidos aqui podem ser formulados dentro de formulações farmacêuticas quesão úteis, por exemplo, no tratamento de pacientes com uma necessidadepor um inibidor de VEGF-RTK, especialmente, para uso em composições emétodos para redução de proliferação capilar e no tratamento de câncer,particularmente cânceres resistentes a fármaco.

As seguintes abreviações e definições são usadas ao longo des-te pedido de patente:

"AML" é uma abreviação que significa leucemia mielogenosaaguda.

"ALS" é uma abreviação que significa esclerose amiotrófica late-ral.

"AD" é uma abreviação que significa Doença de Alzheimer.

"APP" é uma abreviação que significa proteína precursora ami-lóide.

"ASCT" é uma abreviação que significa transplante de célula-tronco autóloga.

"BM" é uma abreviação que significa medula óssea.

"bFGF" é uma abreviação que significa fator de crescimento defibroblasto básico.

"FGFR1", também referido como bFGFR, é uma abreviação quesignifica uma tirosina cinase que interage com o fator de crescimento de fi-broblasto FGF.

"Cdc 2" é uma abreviação que significa ciclo 2 de divisão celular.

"Cdk 2" é uma abreviação que significa cinase 2 dependente deciclina.

"Cdk 4" é uma abreviação que significa cinase 4 dependente deciclina.

"Chk 1" é uma abreviação que significa cinase 1 de ponto decontrole.

"CK1e" é uma serina/treonina cinase que significa Caseína cina-se 1 (épsilon).

"c-ABL" é uma abreviação para uma tirosina cinase que significaum produto de oncogene originalmente isolado do vírus de leucemia Abel-son.

"C-Kif é também conhecido como receptor de fator de célula-tronco ou receptor de fator de crescimento de mastócito.

"FGF" é uma abreviação para o fator de crescimento de fibro-blasto que interage com FGFR1.

"FGFR3" é uma abreviação que significa o receptor 3 de fator decrescimento de fibroblasto de tirosina cinase que é freqüentemente expressoem cânceres do tipo mieloma múltiplo.

"Flk-1" é uma abreviação que significa tirosina cinase 1 de fíga-doJetal, também conhecida como tirosina cinase de domínio de inserção decinase ou KDR (humano), também conhecidos como receptor-2 de fator decrescimento endotelial vascular ou VEGFR2 (KDR (humano), Flk-1 (camun-dongo)).

"FLT-1" é uma abreviação que significa tirosina cinase-1 do tipofms, também conhecida como receptor-1 de fator de crescimento endotelialvascular ou VEGFR1.

"FLT-3" é uma abreviação que significa tirosina cinase-3 do tipofms, também conhecida como tirosina cinase I de célula-tronco (STK I).

"FLT-4" é uma abreviação que significa tirosina cinase-4 do tipofms, também conhecida como VEGFR3.

"Fyn" é uma abreviação que significa cinase de oncogene deFYN relacionada a SRC, FGR, YES.

"GSK-3" é uma abreviação que significa glicogênio sintase cina-se 3.

"PAR-1" é uma abreviação que significa uma cinase tambémconhecida como cinase associada desgrenhada, também conhecida como HDAK.

"Lck" é uma abreviação que significa proteína tirosina cinaseespecífica de linfócito.

"MEK1" é uma abreviação que significa uma serina treonina ci-nase na trilha de transdução de sinal de MAPK (proteína cinase ativada pormitógeno) em um módulo que é formado da Raf-MEK1-ERK. MEK1 fosforilaERK (cinase regulada extracelular).

"MM" é uma abreviação que significa mieloma múltiplo."NEK-2" é uma abreviação que significa cinase relacionada aNIM-A.

"NIM-A" é uma abreviação que significa nunca em mitose."PDGF" é uma abreviação que significa fator de crescimentoderivado das plaquetas. PDGF interage com tirosina cinases PDGFRot ePDGFRp.

"Rsk2" é uma abreviação que significa cinase 2 ribossômica S6."Raf" é uma serina/treonina cinase na trilha de transdução desinal de MAPK.

"RTK" é uma abreviação que significa tirosina cinase receptora.

"Tie-2" é uma abreviação que significa tirosina cinase com do-mínios de homologia de Ig e EGF.

"VEGF" é uma abreviação que significa fator de crescimento en-dotelial vascular.

"VEGF-RTK" é uma abreviação que significa tirosina cinase re-ceptora de fator de crescimento endotelial vascular.

Geralmente, referência a um certo elemento tal como hidrogênioou H pretende incluir todos os isótopos deste elemento. Por exemplo, se umgrupo R é definido para incluir hidrogênio ou H, ele também inclui deutério etrício.

A frase "alquila não substituída" refere-se a grupos alquila quenão contêm heteroátomos. Desta forma a frase inclui grupos alquila de ca-deia linear tais como metila, etila, propila, butila, pentila, hexila, heptila, octi-la, nonila, decila, undecila, dodecila e similares. A frase também inclui isôme-ros de cadeia ramificada de grupos alquila de cadeia linear, incluindo masnão limitado a, os seguintes os quais são fornecidos a título de exemplo: -CH(CH3)2, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH(CH2CH3)2, -C(CH3)3, -C(CH2CH3)3, -CH2CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH(CH2CH3)2, -CH2C(CH3)3, -CH2C(CH2CH3)3, -CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH2CH(CH3)2, -CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3), -CH2CH2CH(CH2CH3)2, -CH2CH2C(CH3)3l -CH2CH2C(CH2CH3)3, -CH(CH3)CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH(CH3)CH(CH3)2,-CH(CH2CH3)CH(CH3)CH(CH3)(CH2CH3), e outros. A frase também incluigrupos alquila cíclicos tais como grupos cicloalquila tais como ciclopropila,ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, cicloheptila, e ciclooctila e tais anéissubstituídos com grupos alquila de cadeia linear e ramificados tal como defi-nido acima. A frase também inclui grupos alquila policíclicos tais como, masnão limitado a, adamantila, norbornila, e biciclo[2.2.2]octila e tais anéis subs-tituídos com grupos alquila de cadeia linear e ramificados tal como definidoacima. Desta forma, a frase grupos alquila não substituídos inclui gruposalquila primários, grupos alquila secundários, e grupos alquila terciários.

Grupos alquila não substituídos podem ser ligados a um ou mais átomo(s)de carbono, átomo(s) de oxigênio, átomo(s) de nitrogênio, e/ou átomo(s) desúlfur no composto origem. Grupos alquila não substituídos preferidos inclu-em grupos alquila de cadeia linear e ramificados e grupos alquila cíclicospossuindo 1 a 20 átomos de carbono. Tais grupos alquila não substituídosmais preferidos possuem de 1 a 10 átomos de carbono enquanto tais gruposainda mais preferidos possuem de 1 a 5 átomos de carbono. Grupos alquilanão substituídos mais preferidos incluem grupos alquila de cadeia linear eramificados possuindo de 1 a 4 ou de 1 a 3 átomos de carbono e incluemmetila, etila, propila, e -CH(CH3)2.

A frase "alquila substituída" refere-se a um grupo alquila nãosubstituída tal como definido acima no qual uma ou mais ligações a um car-bono(s) ou hidrogênio(s) são substituídas por uma ligação a átomos de nãohidrogênio e não carbono tais como, mas não limitado a, um átomo de halo-gênio em haletos tais como F, Cl, Br, e I; um átomo de oxigênio em grupostais como grupos hidroxila, grupos alcóxi, grupos arilóxi, e grupos éster; umátomo de súlfur em grupos tais como grupos tiol, grupos sulfeto de alquila earila, grupos sulfona, grupos sulfonila, e grupos sulfóxido; um átomo de ni-trogênio em grupos tais como aminas, amidas, alquilaminas, dialquilaminas,arilaminas, alquilarilaminas, diarilaminas, N-óxidos, imidas, e enaminas; umátomo de silício em grupos tais como em grupos trialquilsilila, grupos dialqui-larilsilila, grupos alquildiarilsilila, e grupos triarilsilila; e outros heteroátomosem vários outros grupos. Grupos alquila substituídos também incluem gru-pos nos quais uma ou mais ligações a um átomo de carbono(s) ou hidrogê-nio(s) é substituída por uma ligação a um heteroátomo tal como oxigênio emgrupos carbonila, carboxila, e éster; nitrogênio em grupos tais como iminas,oximas, hidrazonas, e nitrilas. Grupos alquila substituídos preferidos incluem,entre outros, grupos alquila nos quais uma ou mais ligações a um átomo decarbono ou hidrogênio é/são substituídas por uma ou mais ligações a áto-mos de flúor. Um exemplo de um grupo alquila substituído é o grupo trifluo-rometila e outros grupos alquila que contêm o grupo trifluorometila. Outrosgrupos alquila incluem aqueles nos quaisuma ou mais ligações a um átomode carbono ou hidrogênio é substituída por uma ligação a um átomo de oxi-gênio de modo que o grupo alquila substituído contenha um grupo hidroxila,alcóxi, grupo arilóxi, ou heterociclilóxi. Ainda outros grupos alquila incluemgrupos alquila que possuem um grupo amina, alquilamina, dialquilamina,arilamina, (alquil)(arila)amina, diarilamina, heterociclilamina, (al-quil)(heterociclil)amina, (arila)(heterociclil)amina, ou diheterociclilamina.

A frase "arila não substituída" refere-se a grupos arila que nãocontêm heteroátomos. Desta forma, a título de exemplo, a frase inclui, masnão é limitado a, grupos tais como fenila, bifenila, antracenila, e naftila. Aindaque a frase "arila não substituída" inclua grupos contendo anéis condensa-dos tais como naftaleno, ela não inclui grupos arila que possuem outros gru-pos tais como grupos alquila ou halo ligados a um dos membros de anel,quando grupos arila tais como tolila são considerados aqui serem gruposarila substituídos tal como descrito abaixo. Um grupo arila não substituídopreferido é fenila. Em algumas modalidades, grupos arila não substituídapossuem de 6 a 14 átomos de carbono. Grupos arila não substituídos podemser ligados a um ou mais átomo(s) de carbono, átomo de oxigênio(s), áto-mo(s) de nitrogênio, e/ou átomo(s) de súlfur no composto origem.

A frase "grupo arila substituído" tem o mesmo significado comrelação a grupos arila não substituídos que grupos alquila substituídos ti-nham com relação a grupos alquila não substituídos. No entanto, um grupoarila substituído também inclui grupos arila nos quais um dos carbonos aro-máticos é ligado a um dos átomos de não carbono ou não hidrogênio descri-tos acima e também inclui grupos arila nos quais um ou mais carbonos aro-máticos do grupo arila é ligado a um grupo alquila, alquenila, ou alquinilasubstituído ou não substituído tal como definido aqui. Isto inclui arranjos deligação nos quais dois átomos de carbono de um grupo arila são ligados adois átomos de um grupo alquila, alquenila, ou alquinila para definir um sis-tema de anel fundido (por exemplo diidronaftila ou tetraidronaftila). Destaforma, a frase "arila substituída" inclui, mas não é limitado a grupos tais co-mo tolila, e hidroxifenila entre outros.

A frase "alquenila não substituída" refere-se a grupos cadeialinear e ramificada e cíclicos tais como aqueles descritos com relação a gru-pos alquila não substituída tal como definido acima, exceto que pelo menosuma ligação dupla exista entre dois átomos de carbono. Exemplos incluem,mas não são limitados a vinila, -CH=C(H)(CH3), -CH=C(CH3)2, -C(CH3)=C(H)2, -C(CH3)=C(H)(CH3), -C(CH2CH3)=CH2, ciclohexenila, ciclo-pentenila, ciclohexadienila, butadienila, pentadienila, e hexadienila entre ou-tros. Em algumas modalidades, grupos alquenila não substituídos possuemde 2 a 8 átomos de carbono.

A frase "alquenila substituída" tem o mesmo significado com re-lação a grupos alquenila não substituídos que grupos alquila substituídostinham com relação a grupos alquila não substituídos. Um grupo alquenilasubstituído inclui grupos alquenila nos quais um átomo de não carbono ounão hidrogênio é ligado a um carbono duplo ligado a outro carbono e aque-les nos quais um dos átomos de não carbono ou não hidrogênio é ligado aum carbono não envolvido em uma dupla ligação a outro carbono.

A frase "alquinila não substituída" refere-se a grupos cadeia li-near e ramificada tais como aqueles descritos com relação a grupos alquilanão substituídos tal como definido acima, exceto que pelo menos uma liga-ção tripla exista entre dois átomos de carbono. Exemplos incluem, mas nãosão limitados a -CsC(H), -CsC(CH3), -C=C(CH2CH3), -C(H2)C=C(H), -C(H)2C=C(CH3), e -C(H)2C=C(CH2CH3) entre outros. Em algumas modalida-des, grupos alquinila não substituídos possuem de 2 a 8 átomos de carbono.

A frase "alquinila substituída" tem o mesmo significado com rela-ção a grupos alquinila não substituídos que grupos alquila substituídos ti-nham com relação a grupos alquila não substituídos. Um grupo alquinilasubstituído inclui grupos alquinila nos quais um átomo de não carbono ounão hidrogênio é ligado a um carbono triplo ligado a outro carbono e aquelesnos quais um átomo de não carbono ou não hidrogênio é ligado a um carbo-no não envolvido em uma tripla ligação a outro carbono.

A frase "heterociclila não substituída" refere-se a compostos deanel tanto aromático quanto não aromático incluindo compostos de anel mo-nocíclico, bicíclico, e policíclico tais como, mas não limitado a, quinuclidila,contendo 3 ou mais membros de anel dos quais um ou mais é um heteroá-tomo tal como, mas não limitado a, N, O, e S. Ainda que a frase "heterociclilanão substituída" inclua anéis heterocíclicos condensados tais como benzimi-dazolila, ela não inclui grupos heterociclila que possuem outros grupos taiscomo grupos alquila ou halo ligados a um dos membros de anel quandocompostos tais como 2-metilbenzimidazolila são grupos heterociclila substi-tuídos. Exemplos de grupos heterociclila incluem, mas não são limitados a:anéis de 3 a 8 membros insaturados contendo 1 a 4 átomos de nitrogêniotais como, mas não limitado a pirrolila, pirrolinila, imidazolila, pirazolila, piridi-nila, diidropiridinila, pirimidila, pirazinila, piridazinila, triazolila (por exemplo4H-1,2,4-triazolila, 1H-1,2,3-triazolila, 2H-1,2,3-triazolila etc), tetrazolila, (porexemplo 1 H-tetrazolila, 2H tetrazolila, etc); anéis de 3 a 8 membros satura-dos contendo 1 a 4 átomos de nitrogênio tais como, mas não limitado a, pir-rolidinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila; grupos heterocíclicos insa-turados condensados contendo 1 a 4 átomos de nitrogênio tais como, masnão limitado a, indolila, isoindolila, indolinila, indolizinila, benzimidazolila,quinolila, isoquinolila, indazolila, benzotriazolila; anéis de 3 a 8 membros in-saturados contendo 1 a 2 átomos de oxigênio e 1 a 3 átomos de nitrogêniotais como, mas não limitado a, oxazolila, isoxazolila, oxadiazolila (por exem-plo 1,2,4-oxadiazolila, 1,3,4-oxadiazolila, 1,2,5-oxadiazolila, etc); anéis de 3a 8 membros saturados contendo 1 a 2 átomos de oxigênio e 1 a 3 átomosde nitrogênio tais como, mas não limitado a, morfolinila; grupos heterocícli-cos condensados insaturados contendo 1 a 2 átomos de oxigênio e 1 a 3átomos de nitrogênio, por exemplo, benzoxazolila, benzoxadiazolila, benzo-xazinila (por exemplo 2H-1,4-benzoxazinila etc); anéis de 3 a 8 membrosinsaturados contendo 1 a 3 átomos de sulfur e 1 a 3 átomos de nitrogêniotais como, mas não limitado a, tiazolila, isotiazolila, tiadiazolila (por exemplo1,2,3-tiadiazolila, 1,2,4-tiadiazolila, 1,3,4-tiadiazolila, 1,2,5-tiadiazolila, etc);anéis de 3 a 8 membros saturados contendo 1 a 2 átomos de sulfur e 1 a 3átomos de nitrogênio tais como, mas não limitado a, tiazolodinila; anéis de 3a 8 membros saturados e insaturados contendo 1 a 2 átomos de sulfur taiscomo, mas.nãoJimitado_a,Jienila, diidroditiinila, diidroditionila, tetraidrotiofe-no, tetraidrotiopirano; anéis heterocíclicos condensados insaturados conten-do 1 a 2 átomos de sulfur e 1 a 3 átomos de nitrogênio tais como, mas nãolimitado a, benzotiazolila, benzotiadiazolila, benzotiazinila (por exemplo 2H-1,4-benzotiazinila, etc), diidrobenzotiazinila (por exemplo 2H-3.4-diidrobenzotiazinila, etc), anéis de 3 a 8 membros insaturados contendo á-tomos de oxigênio tais como, mas não limitado a furila; anéis heterocíclicoscondensados insaturados contendo 1 a 2 átomos de oxigênio tais como ben-zodioxolila (por exemplo 1,3-benzodioxoila, etc); anéis de 3 a 8 membrosinsaturados contendo um átomo de oxigênio e 1 a 2 átomos de sulfur taiscomo, mas não limitado a, diidrooxatiinila; anéis de 3 a 8 membros saturadoscontendo 1 a 2 átomos de oxigênio e 1 a 2 átomos de sulfur tais como 1,4-oxatiano; anéis condensados insaturados contendo 1 a 2 átomos de sulfurtais como benzotienila, benzoditiinila; e anéis heterocíclicos condensadosinsaturados contendo um átomo de oxigênio e 1 a 2 átomos de oxigênio taiscomo benzoxathiinila. Grupo heterociclila também inclui aqueles descritosacima no qual um ou mais átomos de S no anel é duplamente ligado a umou dois átomos de oxigênio (sulfóxidos e sulfonas). Por exemplo, grupos he-terociclila incluem oxido de tetraidrotiofeno, e,1-dióxido de tetraidrotiofeno 1.Grupos heterociclila preferidos contêm 5 ou 6 membros de anel. Grupos he-terociclila mais preferidos incluem morfolina, piperazina, piperidina, pirrolidi-na, imidazol, pirazol, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, tetrazol, tiofeno, tiomorfolina,tiomorfolina nos quais o átomo de S da tiomorfolina é ligado a um ou maisátomos de O, pirrol, homopiperazina, oxazolidin-2-ona, pirrolidin-2-ona, oxa-zol, quinuclidina, tiazol, isoxazol, furano, e tetraidrofurano.A frase "heterociclila substituída" refere-se a um grupo heteroci-clila não substituída tal como definido acima no qual um ou mais dos mem-bros de anel é ligado a um átomo de não hidrogênio tal como descrito acimacom relação a grupos alquila substituída e grupo arila substituída. Exemplos,incluem, mas não são limitados a, grupos 2-metilbenzimidazolila, 5-metilbenzimidazolila, 5-clorobenztiazolila, piperazinila de N-alquila tal comopiperazinila de 1-metila, piperazina-N-óxido, N-óxidos de piperazina de N-alquila,-2-fenóxi-tiofeno,-e.-2-cloropiridinila entre outros. Além disso, gruposheterociclila substituída também incluem grupos heterociclila nos quais aligação ao átomo de não hidrogênio é uma ligação a um átomo de carbonoque é parte de uma arila substituída e não substituída, aralquila substituída enão substituída, ou grupo heterociclila não substituída. Exemplos incluemmas não são limitados a 1-benzilpiperidinila, 3-fenitiomorfolinila, 3-(pirrolidin-1-il)-pirrolidinila, e 4-(piperidin-1-il)-piperidinila. Grupos tais como grupos pi-perazina de N-alquila substituída tais como piperazina de N-metila, gruposmorfolina substituída, e grupos N-óxido de piperazina tais como N-óxido depiperazina e N-óxidos de piperazina de N-alquila são exemplos de algunsgrupos heterociclila substituída. Grupos tais como grupos piperazina substi-tuída tais como grupos piperazina de N-alquila substituída tais como pipera-zina de N-metila e outros mais, grupos morfolina substituída, grupos N-óxidode piperazina, e grupos N-óxido de piperazina de N-alquila são exemplos dealguns grupos heterociclila substituída que são especialmente adequadoscomo grupos R6 ou R7.

A frase "heterociclilalquila não substituída" refere-se a gruposalquila não substituída tal como definido acima nos quais uma ligação dehidrogênio ou carbono do grupo alquila não substituída é substituída comuma ligação a um grupo heterociclila tal como definido acima. Por exemplo,metila (-CH3) é um grupo alquila não substituído. Se um átomo de hidrogêniodo grupo metila é substituído por uma ligação a um grupo heterociclila, talcomo se o carbono da metila fosse ligado a carbono 2 de piridina (um doscarbonos ligados ao N da piridina) ou carbonos 3 ou 4 da piridina, em segui-da o composto é um grupo heterociclilalquila não substituída.A frase "heterociclilalquila substituída" tem o mesmo significadocom relação a grupos heterociclilalquila não substituídos que grupos aralqui-la substituídos tinham com relação a grupos aralquila não substituídos. Noentanto, um grupo heterociclilalquila substituído também inclui grupos nosquais um átomo de não hidrogênio é ligado a um heteroátomo no grupo he-terociclila do grupo heterociclilalquila tais como, mas não limitado a, um áto-mo de nitrogênio no anel de piperidina de um grupo piperidinilalquila. Alémdisso, -um grupo heterociclilalquila -substituído-também inclui grupos nosquais uma ligação de carbono ou uma ligação de hidrogênio da parte alquilado grupo é substituída por uma ligação a um grupo arila substituído e nãosubstituído ou aralquila substituída e não substituída. Exemplos incluem masnão são limitados a fenil-(piperidin-1-il)-metila e fenil-(morfolin-4-il)-metila.

A frase "alcóxi não substituído" refere-se a um grupo hidroxila(-OH) no qual a ligação ao átomo de hidrogênio é substituída por uma liga-ção a um átomo de carbono de um grupo alquila não substituída de outramaneira tal como definido acima.

A frase "alcóxi substituído" refere-se a um grupo hidroxila (-OH)no qual a ligação ao átomo de hidrogênio é substituída por uma ligação a umátomo de carbono de um grupo alquila substituído de outra maneira tal comodefinido acima.

A frase "heterociclilóxi não substituído" refere-se a uma hidroxilagrupo (-OH) nos quais a ligação ao átomo de hidrogênio é substituída poruma ligação a um átomo de anel de um grupo heterociclila não substituídode outra maneira tal como definido acima.

A frase "heterociclilóxi substituído" refere-se a um grupo hidroxila(-OH) no qual a ligação ao átomo de hidrogênio é substituída por uma liga-ção a um átomo de anel de um grupo heterociclila substituído de outra ma-neira tal como definido acima.

A frase "ariloxialquila não substituída" refere-se a um grupo al-quila não substituído tal como definido acima no qual uma ligação de carbo-no ou ligação de hidrogênio é substituída por uma ligação a um átomo deoxigênio o qual é ligado a um grupo arila não substituído tal como definidoacima.

A frase "ariloxialquila substituída" refere-se a um grupo ariloxial-quila não substituído tal como definido acima no qual uma ligação a um gru-po carbono ou hidrogênio do grupo alquila do grupo ariloxialquila é ligado aum átomo de não carbono e não hidrogênio tal como descrito acima comrelação a grupos alquila substituídos ou no qual o grupo arila do grupo arilo-xialquila é um grupo arila substituído tal como definido acima.

A frase "heterocicliloxialquila não substituída" refere-se a umgrupo alquila não substituído tal como definido acima no qual uma ligação decarbono ou ligação de hidrogênio é substituída por uma ligação a um átomode oxigênio o qual é ligado a um grupo heterociclila não substituído tal comodefinido acima.

A frase "heterocicliloxialquila substituída" refere-se a um grupoheterocicliloxialquila não substituído tal como definido acima no qual umaligação a um grupo carbono ou hidrogênio do grupo alquila do grupo hetero-cicliloxialquila é ligado a um átomo de não carbono e não hidrogênio tal co-mo descrito acima com relação a grupos alquila substituídos ou no qual ogrupo heterociclila do grupo heterocicliloxialquilo é um grupo heterociclilasubstituída tal como definido acima.

A frase "heterociclilalcóxi não substituído" refere-se a um grupoalquila não substituído tal como definido acima no qual uma ligação de car-bono ou ligação de hidrogênio é substituída por uma ligação a um átomo deoxigênio o qual é ligado ao composto origem, e no qual outra ligação de car-bono ou hidrogênio do grupo alquila não substituído é ligada a um grupo he-terociclila não substituído tal como definido acima.

A frase "heterociclilalcóxi substituído" refere-se a um grupo hete-rociclilalcóxi não substituído tal como definido acima no qual uma ligação aum grupo carbono ou hidrogênio do grupo alquila do grupo heterociclilalcóxié ligado a um átomo de não carbono e não hidrogênio tal como descrito aci-ma com relação a grupos alquila substituídos ou nos quais o grupo heteroci-clila do grupo heterociclilalcóxi é um grupo heterociclila substituído tal comodefinido acima. Além disso, um grupo heterociclilalcóxi substituído tambéminclui grupos nos quais uma ligação de carbono ou uma ligação de hidrogê-nio à porção alquila do grupo pode ser substituída com um ou mais heteroci-clos substituídos e não substituídos adicionais. Exemplos incluem mas nãosão limitados a pirid-2-ilmorfolin-4-ilmetila e 2-pirid-3-il-2-morfolin-4-iletila.

A frase "alcoxialquila não substituída" refere-se a um grupo al-quila não substituído tal como definido acima no qual uma ligação de carbo-no ou ligação de hidrogênio é substituída por uma ligação a um átomo deoxigênio o qual é ligado a um grupo alquila não substituído tal como definidoacima.

A frase "alcoxialquila substituída" refere-se a um grupo alcoxial-quila não substituído tal como definido acima no qual uma ligação a um gru-po carbono ou hidrogênio do grupo alquila e/ou do grupo alcóxi do grupoalcoxialquila é ligado a um átomo de não carbono e não hidrogênio tal comodescrito acima com relação a grupos alquila substituídos.

O termo "protegido" com relação a grupos hidroxila, grupos ami-na, e grupos sulfidrila refere-se a formas destas funcionalidades as quaisestão protegidas de reação indesejável com um grupo proteção conhecidosàqueles versados na técnica tais como aqueles apresentados em ProtectiveGroups in Organic Synthesis, Greene, T.W.; Wuts, P. G. M., John Wiley &Sons, New York, NY, (3rd Edition, 1999) os quais podem ser adicionados ouremovidos usando os procedimentos apresentados neste. Exemplos de gru-pos hidroxila protegidos incluem, mas não são limitados a, éteres de sililatais como aqueles obtidos através de reação de um grupo hidroxila com umreagente tal como, mas não limitado a, f-butildimetil-clorossilano, trimetilclo-rossilano, triisopropilclorossilano, trietilclorossilano; éteres de metila e etilasubstituída tais como, mas não limitado a éter de metoximetila, éter de meti-tiometila, éter de benziloximetila, éter de í-butoximetila, éter de 2-metoxietoximetila, éteres de tetraidropiranila, éter de 1 -etoxietila, éter de ali-la, éter de benzila; ésteres tais como, mas não limitado a, benzoilformiato,formiato, acetato, tricloroacetato, e trifluoracetato. Exemplos de grupos ami-na protegida incluem, mas não são limitados a, amidas tais como, formami-da, acetamida, trifluoroacetamida, e benzamida; imidas, tais como ftalimida,e ditiossuccinimida; e outros. Exemplos de grupos sulfidrila protegida inclu-em, mas não são limitados a, tioéteres tais como tioéter de S-benzila, e tioé-ter de S-4-picolila; derivados de S-metila substituída tais como acetais dehemitio, ditio e aminotio; e outros.

Um "sal farmaceuticamente aceitável" inclui um sal com umabase inorgânica, base orgânica, ácido inorgânico, ácido orgânico, ou ácidode amino básico ou acídico. Como sais de bases inorgânicas, a invençãoinclui, por exemplo, metais de álcali-tais como-sódio ou potássio; metais al-calinos terrosos tais como cálcio e magnésio ou alumínio; e amônia. Comosais de bases orgânicas, a invenção inclui, por exemplo, trimetilamina, trieti-lamina, piridina, picolina, etanolamina, dietanolamina, e trietanolamina. Co-mo sais de ácidos inorgânicos, a presente invenção inclui, por exemplo, áci-do clorídrico, ácido borídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, e ácido fosfórico.Como sais de ácidos orgânicos, a presente invenção inclui, por exemplo,ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido fumárico, ácidooxálico, ácido tartárico, ácido maléico, ácido lático, ácido cítrico, ácido succí-nico, ácido málico, ácido metanossulfônico, ácido benzenossulfônico, e ácidop-toluenossulfônico. Como sais de ácidos de amino básico, a presente in-venção inclui, por exemplo, arginina, lisina e ornitina. Ácidos de amino acídi-co incluem, por exemplo, aspártico ácido e ácido glutâmico.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método paratratamento de câncer resistente a fármaco. O método inclui administração aum sujeito em necessidade destes, um composto de fórmula I, um tautômerodo composto, um sal do composto, um sal do tautômero, uma mistura des-tes, ou uma composição farmacêutica compreendendo o composto, o tautô-mero, o sal do composto, o sal do tautômero, ou a mistura. Em tais métodos,o sujeito é um paciente de câncer com câncer resistente a fármaco, e o com-posto de fórmula I tem a seguinte fórmula:<formula>formula see original document page 28</formula>

em que:

R1, R2, R3, e R4 podem ser iguais ou diferentes e são indepen-dentemente selecionados de H, Cl, Br, F, I, grupos -OR10, grupos -NR11R12,grupos alquila primários, secundários, ou terciários substituídos ou não subs-tituídos, grupos arila substituídos ou não substituídos, grupos alquenila subs-tituídos ou não substituídos, grupos alquinila substituídos ou não substituí-dos, grupos heterociclila substituídos ou não substituídos, ou grupos hetero-ciclilalquila substituídos ou não substituídos;

R5, R6, R7, e R8 podem ser iguais ou diferentes e são indepen-dentemente selecionados de H, Cl, Br, F, I, grupos -OR13, grupos -NR14R15,grupos -SR16, grupos alquila primários, secundários, ou terciários substituí-dos ou não substituídos, grupos arila substituídos ou não substituídos, gru-pos alquenila substituídos ou não substituídos, grupos alquinila substituídosou não substituídos, grupos heterociclila substituídos ou não substituídos,grupos heterociclilalquila substituídos ou não substituídos, grupos alcoxial-quila substituídos ou não substituídos, grupos ariloxialquila substituídos ounão substituídos, ou grupos heterocicliloxialquila substituídos ou não substi-tuídos;

R10 e R13 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, grupos heterociclila substituídosou não substituídos, grupos heterociclilalquila substituídos ou não substituí-dos, grupos alcoxialquila substituídos ou não substituídos, grupos ariloxial-quila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterocicliloxialquila substi-tu idos ou não substituídos;R11 e R14 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclila substituí-dos ou não substituídos;

R12 e R15 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclila substituí-dos ou não substituídos; e

R16 é selecionado de grupos alquila substituídos ou não substitu-idos, grupos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclilasubstituídos ou não substituídos.

Em algumas modalidades do método para tratamento de câncerresistente a fármaco, o sujeito é administrado um composto de fórmula II, umtautômero do composto, um sal do composto, um sal do tautômero, umamistura destes, ou uma composição farmacêutica compreendendo o com-posto, o tautômero, o sal do composto, o sal do tautômero, ou a mistura, emque o composto de fórmula II tem a seguinte fórmula e R7 é um grupo hete-rociclila substituída ou não substituída:

<formula>formula see original document page 29</formula>

Em algumas tais modalidades, R7 é um grupo heterociclila subs-tituídos ou não substituído selecionado de um grupo piperidinila substituídoou não substituído, grupo piperazinila, ou grupo morfolinila. Em algumasdestas modalidades, R7 é um grupo piperazinila de N-alquila substituído ounão substituído. Em algumas tais modalidades, R7 é um grupo piperazinilade N-alquila substituído ou não substituído e o grupo alquila da piperazinilade N-alquila compreende de 1 a 4 átomos de carbono.Em algumas modalidades do método para tratamento de câncerresistente a fármaco, ao sujeito é administrado um composto de fórmula III,um tautomero do composto, um sal do composto, um sal do tautomero, umamistura destes, ou uma composição farmacêutica compreendendo o com-posto, o tautomero, o sal do composto, o sal do tautomero, ou a mistura, emque o composto de fórmula III é como a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 30</formula>

A invenção também fornece um método para tratamento de cân-cer. O método inclui administração a um sujeito em necessidade deste, umfármaco anticancer selecionado de Gleevec, BAY43-9006, Brostalicina, lena-lidomida (Revlimid), talidomida (Thalomid), docetaxel (Taxotere), erlotinib(Tarceva), vatalinib (PTK-787), captura de VEGF, fenretidina, bortezomib,bevacizumab (Avastin), pertuzumab, e/ou rituximab, e um composto de fór-mula I, um tautomero do composto, um sal do composto, um sal do tautome-ro, uma mistura destes, ou uma composição farmacêutica compreendendo ocomposto, o tautomero, o sal do composto, o sal do tautomero, ou a mistura,em que o composto de fórmula I tem a estrutura e propriedades mostradasacima com relação ao método de tratamento de câncer resistente a fármaco.Os compostos de fórmula I, II, e III são úteis em tratamento de pacientes decâncer refratários a um ou mais destes fármacos anticancer. Os compostosde fórmula I, II, e III são úteis em tratamento de pacientes de câncer comcânceres que são refratário ou resistente a um ou mais destes fármacos an-ticancer.

Em uma modalidade do método para tratamento de câncer, aosujeito é administrado um composto de fórmula II, um tautomero do compos-to, um sal do composto, um sal do tautomero, uma mistura destes, ou umacomposição farmacêutica compreendendo o composto, o tautomero, o sal docomposto, o sal do tautômero, ou a mistura, em que o composto de fórmulaII tem a fórmula mostrada acima, e R7 é um grupo heterociclila substituído ounão substituído. Em algumas tais modalidades, R7 é um grupo heterociclilasubstituído ou não substituído selecionado de um grupo piperidinila substitu-ido ou não substituído, grupo piperazinila, ou grupo morfolinila. Em algumasdestas modalidades, R7 é um grupo piperazinila de N-alquila substituído ounão substituído. Em algumas tais modalidades, R7 é um grupo piperazinila- _de Nralquila-substituído ou não substituído e o grupo alquila da piperazinilade N-alquila compreende de 1 a 4 átomos de carbono.

Em uma modalidade do método para tratamento de câncer, aosujeito é administrado um composto de fórmula III, um tautômero do com-posto, um sal do composto, um sal do tautômero, uma mistura destes, ouuma composição farmacêutica compreendendo o composto, o tautômero, osal do composto, o sal do tautômero, ou a mistura, em que o composto defórmula III tem a fórmula mostrada acima.

Em algumas modalidades do método para tratamento de câncer,o composto, o tautômero, o sal do composto, o sal do tautômero, a mistura,ou a composição farmacêutica é administrado ao sujeito depois que o fár-maco anticâncer foi administrado ao sujeito. Em outras modalidades, o com-posto, o tautômero, o sal do composto, o sal do tautômero, a mistura, ou acomposição farmacêutica é administrado ao sujeito antes que o fármaco an-ticâncer fosse administrado ao sujeito. Em ainda outras modalidades, ocomposto, o tautômero, o sal do composto, o sal do tautômero, a mistura, oua composição farmacêutica é administrada ao sujeito ao mesmo tempo quepelo menos alguns dos fármacos anticâncer são administrados ao sujeito.

Em algumas modalidades, um estado de doença estável é al-cançado e/ou uma redução no tamanho do tumor ocorre no sujeito depois deadministração do composto, o tautômero, o sal do composto, o sal do tautô-mero, a mistura, ou a composição farmacêutica.

Em outro aspecto, a invenção fornece composições terapêuticase kits. Tais composições e kits incluem um fármaco anticâncer e um com-posto de fórmula I, um tautômero do composto, um sal do composto, um saldo tautômero, ou uma mistura destes. Tais composições terapêuticas e kitspodem incluir os componentes como uma preparação combinada para usosimultâneo, separado, ou seqüencial no tratamento de um sujeito que temcâncer resistente a fármaco. A fórmula I tem a mesma estrutura e proprieda-des tal como descrito acima com relação ao método para tratamento de cân-cer resistente a fármaco. Em algumas modalidades, o fármaco anticâncerincluído nos kits e composições terapêuticas é um fármaco anticâncer dife-rente do fármaco o qual o câncer é resistente. Em outras modalidades, ofármaco anticâncer incluído nos kits e composições terapêuticas é o fármacoanticâncer que o câncer é resistente. Por exemplo, se um paciente é refratá-rio a Gleevec, em seguida uma kit ou composição podem incluir um ou maiscomposto de fórmula I, II, e/ou III em adição a um fármaco anticâncer talcomo Iressa. Alternativamente, se um paciente é refratário a Gleevec, o kitou composição pode incluir um ou mais composto de fórmula I, II, e/ou III eGleevec. O propósito para a inclusão de Gleevec é que resistência a fárma-co em um paciente pode não ser conhecida até que o fármaco seja adminis-trado ao paciente. Adicionalmente, resistência a um certo fármaco pode de-senvolver-se durante o tratamento. Kits podem incluir um, dois, três, ou maisdiferentes fármacos anticâncer além dos compostos da invenção.

Em algumas modalidades dos kits e composições terapêuticas,o composto de fórmula I, o tautômero do composto, o sal do composto, o saldo tautômero, ou a mistura destes é um composto de fórmula II, um tautô-mero do composto de fórmula II, um sal do composto de fórmula II, um saldo tautômero do composto de fórmula II, ou uma mistura destes, em que ocomposto de fórmula II tem a fórmula mostrada acima e R7 é um grupo hete-rociclila substituído ou não substituído. Em algumas tais modalidades, R7 éum grupo heterociclila substituído ou não substituído selecionado de umgrupo piperidinila substituído ou não substituído, grupo piperazinila, ou grupomorfolinila. Em algumas destas modalidades, R7 é um grupo piperazinila deN-alquila substituído ou não substituído. Em algumas tais modalidades, R7 éum grupo piperazinila de N-alquila substituído ou não substituído e o grupoalquila da piperazinila de N-alquila compreende de 1 a 4 átomos de carbono.Em algumas modalidades dos kits e composições terapêuticas,o composto de fórmula I, o tautomero do composto, o sal do composto, o saldo tautomero, ou a mistura destes é um composto de fórmula III, um tauto-mero do composto de fórmula III, um sal do composto de fórmula III, um saldo tautomero do composto de fórmula III, ou uma mistura destes, em que ocomposto de fórmula III tem a fórmula mostrada acima.

Em algumas modalidades das composições terapêuticas e kits,o fármaco-anticâncer e o composto, o tautomero,-o-sal do composto, o sal dotautomero, a mistura, ou a composição farmacêutica são fornecidos comouma única composição. Em outras modalidades, o fármaco anticâncer e ocomposto, o tautomero, o sal do composto, o sal do tautomero, a mistura, oua composição farmacêutica são fornecidos separadamente como partes deum kit.

A invenção também fornece um método para inibição de umacinase em um sujeito. O método inclui administração a um sujeito em neces-sidade desta, de um composto de fórmula I, um tautomero do composto, umsal do composto, um sal do tautomero, uma mistura destes, ou uma compo-sição farmacêutica compreendendo o composto, o tautomero, o sal do com-posto, o sal do tautomero, ou a mistura, em que o sujeito é um paciente decâncer e a cinase compreende um resíduo porteiro mutante, em que o com-posto de fórmula I tem a estrutura e propriedades mostradas acima com re-lação ao método de tratamento de câncer resistente a fármaco.

Em uma modalidade do método para inibição de uma cinase, aosujeito é administrado um composto de fórmula II, um tautomero do compos-to, um sal do composto, um sal do tautomero, uma mistura destes, ou umacomposição farmacêutica compreendendo o composto, o tautomero, o sal docomposto, o sal do tautomero, ou a mistura, em que o composto de fórmulaII tem a fórmula mostrada acima, e R7 é um grupo heterociclila substituído ounão substituído. Em algumas tais modalidades, R7 é um grupo heterociclilasubstituído ou não substituído selecionado de um grupo piperidinila substitu-ído ou não substituído, grupo piperazinila, ou grupo morfolinila. Em algumasdestas modalidades, R7 é um grupo piperazinila de N-alquila substituído ounão substituído. Em algumas tais modalidades, R7 é um grupo piperazinilade N-alquila substituído ou não substituído e o grupo alquila da piperazinilade N-alquila compreende de 1 a 4 átomos de carbono.

Em uma modalidade do método para inibição de uma cinase, aosujeito é administrado um composto de fórmula III, um tautômero do com-posto, um sal do composto, um sal do tautômero, uma mistura destes, ouuma composição farmacêutica compreendendo o composto, o tautômero, osal do-composto, o sal do tautômero, ou a mistura, em que o composto defórmula III tem a fórmula mostrada acima.

Em uma modalidade do método para inibição de uma cinase, acinase é uma tirosina cinase citoplasmática ou é uma tirosina cinase recep-tora . Em algumas modalidades, a cinase é selecionada de ABL, KIT, PDG-FRa, EGFR, ou FLT3. Em algumas tais modalidades, a cinase é ABL(T315I). Em outras tais modalidades, a cinase é FLT3 (D835Y). Em outrastais modalidades, a cinase é EGFR.

Em algumas modalidades do método para inibição de uma cina-se, o câncer é resistente a mesilato de imatinib (Gleevec), BAY43-9006,Brostalicina, lenalidomida (Revlimid), talidomida (Thalomid), docetaxel (Ta-xotere), erlotinib (Tarceva), gefitinib (Iressa), vatalinib (PTK-787), captura deVEGF, fenretidina, bortezomib, ou um anticorpo monoclonal geral. Em algu-mas modalidades, o câncer do paciente de câncer é selecionado de tumorestromal gastrointestinal, leucemia mielogenosa aguda, leucemia mieloge-nosa crônica, mieloma múltiplo, carcinoma de célula renal, câncer do pulmãode célula não pequena, ou síndrome hipereosinofílica (HES).

A invenção também fornece um método para tratamento de umsujeito sofrendo de um câncer associado com super-expressão de pERK. Ométodo inclui medição de níveis de pERK endógena no paciente e adminis-tração a ele, de um composto de fórmula I, um tautômero do composto, umsal do composto, um sal do tautômero, uma mistura destes, ou uma compo-sição farmacêutica compreendendo o composto, o tautômero, o sal do com-posto, o sal do tautômero, ou a mistura. Em algumas tais modalidades, amedição do nível de pERK endógena é conduzida antes da administração.Em tais modalidades, a medição pode ser desempenhada para determinarum paciente em necessidade do composto, o tautômero, o sal do composto,o sal do tautômero, a mistura, ou a composição farmacêutica. Em outrasmodalidades, a medição do nível de pERK endógena é conduzida depois daadministração. Em tais modalidades, a medição pode ser desempenhadapara determinar a eficácia da administração do composto, o tautômero, o saldo composto, o sal do tautômero, a mistura, ou a composição farmacêuticano paciente.- Em algumas- modalidades, o composto de fórmula I é um com-posto de fórmula II ou um composto de fórmula III, um sal destes, um sal dotautômero destes, uma mistura destes, ou uma composição farmacêuticacompreendendo um destes.

Em algumas modalidades do método para tratamento de umsujeito sofrendo de um câncer associado com super-expressão de pERK, amedição de níveis de pERK endógena nos pacientes compreende extraçãode sangue contendo leucócitos de sangue periférico e medição de níveis depERK endógena através de ensaios de Mancha do Oeste e/ou citometria defluxo. Em algumas modalidades, os níveis de pERK no sujeito são elevados.

Em outras tais modalidades, os níveis de pERK são estabilizados ou reduzi-dos no sujeito.

Em algumas modalidades, R1 é selecionado de H, Cl, Br, F, ou I.

Em algumas tais modalidades, R1 é F. Em algumas modalidades, R2, R3 eR4 são todos os H. Em algumas tais modalidades, R1 é Fe cada um de R2,R3 e R4 é H.

Em outras modalidades, pelo menos um de R6 ou R7 é um grupoheterociclila substituído ou não substituído. Em algumas tais modalidades,um de R6 ou R7 é um grupo heterociclila e os outros de R6 ou R7 é um H. Emalgumas modalidades, um de R6 ou R7 é um grupo heterociclila selecionadode um grupo piperidinila substituído ou não substituído, grupo piperazinila,ou grupo morfolinila. Em algumas tais modalidades um de R6 ou R7 é umgrupo piperazinila de N-alquila tal como um grupo piperazinila N-metila ououtros mais e, em algumas tais modalidades, os outros de R6 ou R7 é um H.

Em várias modalidades, o sal lático do composto é administradoao sujeito ou é incluído nos kits ou composições terapêuticas da invenção.

Em várias modalidades, o câncer é resistente a Gleevec. Emoutras modalidades, o composto, o tautômero, o sal do composto, o sal dotautômero, a mistura, ou a composição farmacêutica é administrado ao sujei-to depois que Gleevec foi administrado ao sujeito e o câncer no sujeito foiconstatado ser resistente a Gleevec.

Em várias modalidades, o câncer é resistente a BAY43-9006.Em outras-modalidades, o composto, o tautômero, o sal do composto, o saldo tautômero, a mistura, ou a composição farmacêutica é administrado aosujeito depois que BAY43-9006 foi administrado ao sujeito e o câncer nosujeito foi constatado ser resistente a BAY43-9006.

Em várias modalidades, o câncer é resistente a Brostalicina. Emoutras modalidades, o composto, o tautômero, o sal do composto, o sal dotautômero, a mistura, ou a composição farmacêutica é administrado ao sujei-to depois que Brostalicina foi administrada ao sujeito e o câncer no sujeito foiconstatado ser resistente a Brostalicina.

Em várias modalidades, o câncer é resistente a, ou os compos-tos, sais, tautômeros, misturas, ou composições farmacêuticas da invençãosão usados em combinação com, um dos seguintes fármacos anticâncer osquais são cada um individualmente preferidos: lenalidomida (Revlimid), tali-domida (Thalomid), docetaxel (Taxotere), erlotinib (Tarceva), gefitinib (Ires-sa), vatalinib (PTK-787), captura de VEGF, fenretidina, bortezomib, ou umanticorpo monoclonal geral (mAb) tal como, mas não limitado a, bevacizu-mab (Avastin), pertuzumab, ou rituximab. Trastuzumab (Herceptin) podetambém ser usado em combinação com os compostos da presente invenção.

Vários cânceres podem ser tratados com os métodos, composi-ções, e kits da presente invenção. Em algumas modalidades, o câncer é umcâncer sólido tal como um tumor sólido o qual, em algumas modalidades éresistente a fármaco. Em outras modalidades, o câncer é câncer "líquido" ouum câncer hematológico. Em ainda outras modalidades, o câncer é tumorestromal gastrointestinal (GIST). Em outras modalidades, o câncer é leuce-mia mielogenosa aguda. Em ainda outras modalidades, o câncer é leucemiamielogenosa crônica, mieloma múltiplo, ou carcinoma de célula renal. Emainda outras modalidades, o câncer é selecionado de câncer de próstata,câncer renal, tumor estromal gastrointestinal, sarcoma, câncer colorretal,câncer de mama, câncer da parótida, câncer gástrico, melanoma, cânceresofágico, câncer de NET (sinonasal), câncer de cólon, câncer ovariano, oucâncer de fígado o qual, em algumas modalidades, é resistente a fármaco.Uma lista de outros cânceresque-podem ser tratados de acordo com a pre-sente invenção inclui, mas não é limitado a, tumor estromal gastrointestinal,leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielogenosa crônica, mieloma múl-tiplo, carcinoma de célula renal, câncer de pulmão de célula não pequena,ou síndrome hipereosinofílica (HES).

Em vários grupos que incluem grupos heterociclila, o grupo hete-rociclila pode ser ligado de vários modos. Por exemplo, em um grupo-OCH2(CH2)q(heterociclila), onde q é selecionado de 0, 1, 2, 3, ou 4, o grupoheterociclila pode ser ligado a um carbono de metileno do grupo-OCH2(CH2)q do -OCH2(CH2)q(heterociclila) por meio de vários membros deanel. A título de exemplo não limitante, onde q é 1 e o grupo heterociclila étetraidrofurano, o grupo pode ser representado pela fórmula-OCH2CH2(tetraidrofuranila) a qual corresponde às seguintes duas estruturas:

<formula>formula see original document page 37</formula>

onde estrutura IV representa o grupo que pode ser referido como o grupo-OCH2CH2(2-tetraidrofuranila) e estrutura V representa o grupo que pode serreferido como o grupo -OCH2CH2(3-tetraidrofuranila). Quando o grupo hete-rociclila é um heterociclo contendo N, tal como, mas não limitado a piperidi-na, piperazina, morfolina, ou pirrolidina, o heterociclo pode ser ligado ao car-bono de metileno por meio de um átomo de anel de carbono ou por meio deum átomo de nitrogênio no anel do heterociclo contendo N. Ambos destessão preferidos. Onde o grupo heterociclila é uma piperidina e q é 2 para umgrupo -OCH2(CH2)q(heterociclila), as seguintes estruturas são possíveis epreferidas:

<formula>formula see original document page 38</formula>

A estrutura VI é um exemplo de um grupo -0(CH2)3(N-piperidinila) ou -0(CH2)3(1-piperidinila). A estrutura VII é um exemplo de umgrupo-0(CH2)3-(2-piperidinila). A estrutura VIII é um exemplo de um grupo -0(CH2)3(3-piperidinila). A estrutura IX é um exemplo de um grupo -0(CH2)3(4-piperidinila). Onde o grupo heterociclila é uma piperazina e q é 1para um grupo -OCH2(CH2)q(heterociclila), as seguintes estruturas são pos-síveis e preferidas:

A estrutura X é um exemplo de um grupo -0(CH2)2(2-piperazinila), e a estrutura XI é um exemplo de um grupo -0(CH2)2(1-piperazinila) ou -0(CH2)2(N-piperazinila). Onde o grupo heterociclila é umamorfolina e q é 1 para um grupo -OCH2(CH2)q(heterociclila), as seguintesestruturas são possíveis e preferidas:<formula>formula see original document page 39</formula>

A estrutura XII é um exemplo de um grupo -0(CH2)2(3-morfolinila), a estrutura XIII é um exemplo de um grupo -0(CH2)2(4-morfolinila) ou -0(CH2)2(N-morfolinila), e a estrutura XIV é um exemplo deum grupo -0(CH2)2(2-morfolinila). Será observado que onde o grupo é umapirrolidina, eqé 1, as estruturas disponíveis incluem -0(CH2)2(1 -pirrolidinila) ou-0(CH2)2(N-pirrolidinila), -0(CH2)2(2-pirrolidinila), e -0(CH2)2(3-pirrolidinila).

O esquema 1 representa uma rotina sintética exemplar para asíntese de um composto de quinolinona de benzimidazolila e não deve serinterpretado limitar a invenção de qualquer maneira.Esquema 1

<formula>formula see original document page 40</formula>

O esquema 2 representa outro método para sintetização de umcomposto da invenção e não limita a invenção de qualquer maneira. Aquelesversados na técnica entenderão que a seleção de um diaminobenzeno subs-tituído ou não substituído e uma antranilonitrila substituída ou não substituí-da permite a síntese de uma ampla variedade de compostos. Aqueles ver-sados na técnica também reconhecerão que certos grupos podem necessitarde proteção usando grupos proteção padrão para a reação de ciclização fi-nal. A rotina sintética extremamente versátil permite uma pletora de compôs-tos possuindo a fórmula III ser facilmente preparada através de uma rotinasintética altamente convergente e eficiente.

Esquema 2

<formula>formula see original document page 41</formula>

Os compostos de Estrutura I são facilmente sintetizados usandoos procedimentos descritos na seguinte seção de Exemplos e descritos nosseguintes documentos os quais são cada um por meio deste incorporadosatravés de referência em suas totalidades e para todos os propósitos comose inteiramente apresentados aqui: Patente dos Estados Unidos N96.605.617, Pedido de Patente dos Estados Unidos publicado N92004/0092535, Pedido de Patente dos Estados Unidos N- 10/983.174, Pedi-do de Patente dos Estados Unidos publicado N9 2004/0220196, Pedido dePatente dos Estados Unidos N9 10/982.757, e Pedido de Patente dos Esta-dos Unidos N9 10/982.543.

Os compostos de Estrutura I, tautômeros dos compostos, saisfarmaceuticamente aceitáveis dos compostos, sais farmaceuticamente acei-táveis dos tautômeros, e misturas destes podem ser usados para prepararmedicamentos, que podem ser usados para os propósitos descritos aqui, epodem ser usados para tratar várias condições biológicas tal como descritoaqui. Os compostos, sais, tautômeros, sais dos tautômeros, e misturas des-tes da invenção são particularmente úteis em tratamento de pacientes quepossuam câncer o qual é resistente a um ou mais outros fármacos anticân-cer tais como Gleevec, BAY43-9006, e Brostalicina.

Formulações farmacêuticas podem incluir quaisquer dos com-postos, tautômeros, ou sais de quaisquer das modalidades descritas acimaem combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável tais como a-quelas descritas aqui. Tais formulações podem também incluir um fármacoanticâncer diferente tal como, mas não limitado a, Gleevec, BAY43-9006, ouBrostalicina.

A presente invenção também fornece composições as quais po-dem ser preparadas através de mistura de um ou mais compostos da pre-sente invenção, ou tautômeros de sais farmaceuticamente aceitáveis destes,ou misturas destes com veículos, excipientes, aglutinantes, diluentes farma-ceuticamente aceitáveis ou outros mais para tratar ou melhorar distúrbiosrelacionados a tumores metastizados. As composições das invenções po-dem ser usadas para criar formulações usadas para tratar tumores metasti-zados tal como descrito aqui. Tais composições podem ser na forma de, porexemplo, grânulos, pós, comprimidos, cápsulas, xarope, supositórios, inje-ções, emulsões, elixires, suspensões ou soluções. As presentes composi-ções podem ser formuladas para várias rotinas de administração, por exem-pio, através de administração oral, através de administração nasal, atravésde administração retal, injeção subcutânea, injeção intravenosa, injeçõesintramusculares, ou injeção intraperitoneal. As seguintes formas de dosagemsão dadas a título de exemplo e não devem ser interpretadas como limitandoa presente invenção.

Para administração oral, bucal, e sub-lingual, pós, suspensões,grânulos, comprimidos, pílulas, cápsulas, cápsulas de gel, e capselas sãoaceitáveis como formas de dosagem sólidas. Estas podem ser preparadas,por exemplo, através de mistura de um ou mais compostos da presente in-venção, sais farmaceuticamente aceitáveis, tautômeros, ou misturas destes,com pelo menos um aditivo tal como um amido ou outro aditivo. Aditivos a-dequados são sacarose, lactose, açúcar de celulose, manitol, maltitol, dex-trano, amido, ágar, alginatos, quitinas, quitosanas, pectinas, goma de traga-canto, goma arábica, gelatinas, colágenos, caseína, albumina, polímerossintéticos ou semi-sintéticos ou glicerídeos. Opcionalmente, formas de dosa-gem orais podem conter outros ingredientes para ajudar na administração,tais como um diluente inativo, ou lubrificantes tais como estearato de mag-nésio, ou conservantes tais como parabeno ou ácido sórbico, ou antioxidan-tes tais como ácido ascórbico, tocoferol ou cisteína, um agente desintegran-te, aglutinantes, de espessamente, tampões, adoçantes, agentes aromati-zantes ou agentes perfumantes. Comprimidos e pílulas podem ser além dis-so tratados com materiais de revestimento adequados conhecidos na técnica.

Formas de dosagem líquidas para administração oral podem serna forma de emulsões, xaropes, elixires, suspensões, e soluções farmaceu-ticamente aceitáveis, as quais podem conter um diluente inativo, tais comoágua. Formulações e medicamentos farmacêuticos podem ser preparadoscomo suspensões ou soluções líquidas usando um líquido estéril, tal como,mas não limitado a, um óleo, água, um álcool, e combinações destes. Ten-soativos, agentes de suspensão, agentes de emulsificação farmaceutica-mente adequados, podem ser adicionados para administração oral ou paren-teral.

Tal como notado acima, suspensões podem incluir óleos. Taisóleos incluem, mas não são limitados a, óleo de amendoim, óleo de gerge-lim, óleo de caroço de algodão, óleo de milho e óleo de oliva. Preparação desuspensão pode também conter ésteres de ácidos graxos tais como oleatode etila, miristato de isopropila, glicerídeos de ácido graxo e glicerídeos deácido graxo acetilado. Formulações de suspensão podem incluir álcoois, taiscomo, mas não limitado a, etanol, álcool isopropílico, álcool hexadecílico,glicerol e propileno glicol. Éteres, tais como mas não limitado a, po-li(etilenoglicol), petróleo hidrocarbonetos tais como óleo mineral e petrolato;e água podem também ser usados em formulações de suspensão.

Para administração nasal, as formulações e medicamentos far-macêuticos podem ser um spray ou aerossol contendo um solvente(s) apro-priado e opcionalmente outros compostos tais como, mas não limitado a,estabilizantes, agentes antimicrobianos, antioxidantes, modificadores de pH,tensoativos, modificadores de biodisponibilidade e combinações destes. Umpropelente para uma formulação de aerossol pode incluir ar comprimido, ni-trogênio, carbono dióxido, ou um solvente de ebulição baixa com base emhidrocarboneto.

Formas de dosagem injetáveis geralmente incluem suspensõesaquosas ou suspensões em óleo as quais podem ser preparadas usando umagente dispersante ou umectante e um agente de suspensão adequado.

Formas injetáveis podem ser em fase de solução ou na forma de uma sus-pensão, o qual é preparada com um solvente ou diluente. Solventes ou veí-culos aceitáveis incluem água esterilizada, solução de Ringer, ou uma solu-ção salina aquosa isotônica. Alternativamente, óleos estéreis podem serempregados como solventes ou agentes de suspensão. De preferência, oóleo ou ácido graxo é não volátil, incluindo óleos natural ou sintético, ácidosgraxos, mono-, di- ou triglicerídeos.

Para injeção, a formulação e/ou medicamento farmacêutico podeser um pó adequado para reconstituição com uma solução apropriada talcomo descrito acima. Exemplos destes incluem, mas não são limitados a,pós secados por congelamento, secados por rotação ou secados por spray,pós amorfos, grânulos, precipitados, ou particulados. Para injeção, as formu-lações podem opcionalmente conter estabilizantes, modificadores de pH,tensoativos, modificadores de biodisponibilidade e combinações destes.

Para administração retal, as formulações e medicamentos far-macêuticos podem ser na forma de um supositório, um ungüento, um ene-ma, um comprimido ou um creme para liberação de composto nos intestinos,flexura sigmóide e/ou reto. Supositórios retais são preparados através demistura de um ou mais compostos da presente invenção, ou sais ou tautô-meros farmaceuticamente aceitáveis do composto, com veículos aceitáveis,por exemplo, manteiga de cacau ou polietileno glicol, o qual está presenteem uma fase sólida em temperaturas de armazenamento normais, e presen-te em uma fase líquida naquelas temperaturas adequadas para liberar umfármaco dentro do corpo, tais como no reto. Óleos podem também ser em-pregados na preparação de formulações do tipo gelatina macia e supositó-rios. Água, solução salina, dextrose aquosa e soluções de açúcar relaciona-das, e gliceróis podem ser empregados na preparação de formulações desuspensão as quais podem também conter agentes de suspensão tais comopectinas, carbômeros, metil celulose, hidroxipropil celulose ou carboximetilcelulose, assim como tampões e conservantes.

Além daquelas formas de dosagem representativas descritasacima, excipientes e veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmenteconhecidos àqueles versados na técnica e são desta forma incluído no pre-sente invenção. Tais excipientes e veículos são descritos, por exemplo, em"Remingtons Pharmaceutical Sciences" Mack Pub. Co., New Jersey (1991),o qual é incorporado aqui através de referência em sua totalidade para todosos propósitos como se inteiramente apresentado aqui.

As formulações da invenção podem ser designadas serem deação curta, liberação rápida, ação longa, e liberação prolongada tal comodescrito abaixo. Desta forma, as formulações farmacêuticas podem tambémser formuladas para liberação controlada ou para liberação lenta.

As presentes composições podem também compreender, porexemplo, micelas ou lipossomas, ou alguma outra forma encapsulada, oupodem ser administradas em uma forma de liberação estendida para forne-cer uma armazenagem e/ou efeito de liberação prolongado. Por esse motivo,as formulações e medicamentos farmacêuticos podem ser comprimidos den-tro de péletes ou cilindros e implantados intramuscularmente ou subcutane-amente como injeções de depósito ou como implantes tais como sondas.Tais implantes podem empregar materiais inertes conhecidos tais como sili-cones e polímeros biodegradáveis.

Dosagens específicas podem ser apensadas dependendo decondições de doença, a idade, peso do corpo, condições de saúde geral,sexo, e dieta do sujeito, intervalos da dose, rotinas de administração, taxa deexcreção, e combinações de fármacos. Quaisquer das formas de dosagemacima contendo quantidades eficazes estão bem dentro dos limites de expe-rimentação de rotina e por esse motivo, bem dentro do escopo da presenteinvenção.

Uma dose terapeuticamente eficaz pode variar dependendo darotina de administração e forma de dosagem. O composto preferido ou com-postos da presente invenção é uma formulação que exiba uma índice tera-pêutico alto. O índice terapêutico é a relação de dose entre efeitos tóxicos eterapêuticos os quais podem ser expressos como ao relação entre LD50 eED50. A LD5o é a dose letal a 50% da população e a ED50 é a dose terapeuti-camente-eficaz em 50% da população. As LD50 e ED50 são determinadasatravés de procedimentos farmacêuticos padrões em culturas de célula ani-mal ou animais experimentais.

"Tratamento" dentro do contexto da presente invenção, quer di-zer um alívio de sintomas associados com um distúrbio ou doença, ou para-da de progressão ou piora adicional daqueles sintomas, ou prevenção ouprofilaxia da doença ou distúrbio. Por exemplo, dentro do contexto de trata-mento de pacientes com um tumor hematológico metastizado, tratamentobem-sucedido pode incluir uma redução na proliferação de nutrição capilardo tumor(s) ou tecido doente, um alívio de sintomas relacionados a um cres-cimento canceroso ou tumor, proliferação capilar, ou de tecido doente, umapausa em capilar proliferação, ou uma pausa na progressão de uma doençatal como câncer ou no crescimento de células cancerosas. Tratamento podetambém incluir administração das formulações farmacêuticas da presenteinvenção em combinação com outras terapias. Por exemplo, os compostos eformulações farmacêuticas da presente invenção podem ser administradosantes de, durante, ou depois de procedimento cirúrgico e/ou terapia de radi-ação. Os compostos da invenção podem também ser administrados em con-junção com outros fármacos anticâncer tais como, mas não limitado a, Glee-vec, BAY43-9006, e Brostalicina e fármacos usados em terapia de anti-sentido e gene. Combinações apropriadas podem ser determinadas por a-queles de versatilidade na técnicas de oncologia e medicina.

Um "estado de doença estável" tal como usado com relação atratamento de câncer quer dizer uma cessação no crescimento do câncer.Isto pode freqüentemente ser visualizado usando um método de varreduratal como tomografia por emissão de pósitrons (PET) tal como mostrado nasfiguras.

Formulações e medicamentos farmacêuticos de acordo com ainvenção incluem o composto de Estrutura I ou os tautômeros, sais, ou mis-turas destes em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.Desta forma, os compostos da invenção podem ser usados para prepararmedicamentos e formulações farmacêuticas. Tais medicamentos e formula-ções farmacêuticas podem ser usados no método de tratamento descritoaqui.

Os compostos e formulações da presente invenção são particu-larmente adequados para uso em terapia de combinação quando eles mos-traram exibir efeito sinérgico quando usado em combinação com fármacosanticâncer tais como, mas não limitado a, camptotecina, doxorrubicina, cis-platina, irinotecano (CPT-11), agentes de alquilação, inibidores de topoiso-merase I e II, e tratamento por radiação. Além disso, os compostos da in-venção podem ser usados em combinação com fármacos anticâncer taiscomo Gleevec, BAY43-9006, e Brostalicina, e encontram uso particular empacientes de câncer com câncer que é resistente a estes fármacos anticân-cer. Por esse motivo, a invenção fornece formulações farmacêuticas queincluem o composto de Estrutura I e tautômeros, sais, e/ou misturas destesem combinação com um fármaco anticâncer. A invenção também fornece ouso dos compostos, tautômeros, sais, e/ou misturas na criação de tais for-mulações e medicamentos e o uso dos compostos em tratamento de pacien-tes de câncer.

Em algumas modalidades, a invenção fornece composições te-rapêuticas compreendendo, um fármaco anticâncer e um composto, um tau-tômero, um sal do composto, um sal do tautômero, ou uma mistura destesde qualquer modalidade da invenção como uma preparação combinada parao uso simultâneo, separado, ou seqüencial no tratamento de um paciente, talcomo um paciente de câncer. Em algumas tais modalidades, o paciente éum paciente de câncer que é resistente a pelo menos um fármaco anticân-cer, tais como Gleevec, BAY43-9006, ou Brostalicina. Em algumas tais mo-dalidades, o fármaco anticâncer e o composto, o tautômero, o sal do com-posto, o sal do tautômero, ou a mistura destes são fornecidos como umaúnica composição. Em outras tais modalidades, o fármaco anticâncer e ocomposto, o tautômero, o sal do composto, o sal do tautômero, ou a misturadestes são fornecidos separadamente como partes de um kit. Tais kits po-dem além disso incluir instruções para uso.

Os compostos da invenção podem ser usados para tratar umavariedade de sujeitos. Sujeitos adequados incluem animais tais como mamí-feros e seres humanos. Mamíferos adequados incluem, mas não são limita-dos a, primatas tais como, mas não limitado a lemurs, macacos(apes), emacacos (monkeys); roedores tais como ratos, camundongos, e cobaias;coelhos e lebres; vacas; cavalos; porcos; cabras; carneira; marsupiais; ecarnívoros tais como felinos, caninos, e ursinos. Em algumas modalidades, osujeito ou paciente é um ser humano. Em outras modalidades, o sujeito oupaciente é uma roedor tais como uma camundongo ou um rato. Em algumasmodalidades, o sujeito ou paciente é uma animal diferente de um ser huma-no e em algumas tais modalidades, o sujeito ou paciente é uma mamíferodiferente de um ser humano.

EXEMPLOS

As seguintes abreviações são usadas nos Exemplos:

EtOH: Etanol

H20: Água

HCI: Ácido clorídrico

HPLC: Cromatografia Líquida de Alto Desempenho

KHMDS: Bis(trimetilsilil)amida de potássio

LiHMDS: Bis(trimetilsilil)amida de lítio

NaHMDS: Bis(trimetilsilil)amida de sódio

NaOH: Hidróxido de sódio

N2: Nitrogênio

TBME: Éter de metila de t-butila

THF: Tetraidrofurano

Nomenclatura para os compostos de Exemplo foi fornecida u-sando software de versão 5,07 ACD Name (14 de novembro de 2001) dis-ponível por avançod Chemistry Development, Inc., software da marca Che-mlnnovation NamExpert + Nomenclator® disponível por ChemlnnovationSoftware, Inc., e versão 2,2 de AutoNom disponível na versão 7,0 de pacotede software ChemOffice® Ultra disponível por CambridgeSoft Corporation(Cambridge, MA). Alguns dos compostos e materiais de partida foram no-meados usando nomenclatura da IUPAC padrão.

Vários materiais de partida podem ser obtidos-de fontes comer-ciais e preparados através de métodos conhecidos àquele versado na técnica.

Exemplo 1

Síntese de 5-(4-Metil-piperazin-1-il)-2-nitroanilina

Procedimento A

<formula>formula see original document page 49</formula>

5-cloro-2-nitroanilina (500 g, 2,898 rnols) e piperazina de 1-metila (871 g, 8,693 rnols) foram colocadas em um frasco de 2000 ml_ equi-pado com um condensador e purgadas com N2. O frasco foi colocado em umbanho de óleo em 100°C e aquecido até que a 5-cloro-2-nitroanilina fossecompletamente reagida (tipicamente durante a noite) tal como determinadoatravés de HPLC. Depois que a HPLC confirmou o desaparecimento do 5-cloro-2-nitroanilina, a mistura de reação foi despejada diretamente (aindaquente) dentro de 2500 ml_ de água a temperatura ambiente com agitaçãomecânica. A mistura resultante foi agitada até que ela alcançasse a tempera-tura ambiente e em seguida ela foi filtrada. O sólido amarelo desta formaobtido foi adicionado a 1000 ml_ de água e agitado durante 30 minutos. Amistura resultante foi filtrada, e o sólido resultante foi lavado com TBME (500ml_, 2X) e em seguida foi secado sob vácuo durante uma hora usando umabarragem de borracha. O sólido resultante foi transferido a uma bandeja desecagem e secado em um forno a vácuo em 50°C a um peso constante paraproduzir 670 g (97,8%) do composto título como um pó amarelo.

Procedimento B

5-Cloro-2-nitroanilina (308,2 g, 1,79 mol) foi adicionada a umfrasco de fundo redondo de 5000 ml_ de 4 gargalos equipado com um agita-dor suspenso, condensador, entrada de gás, funil de adição, e sonda determômetro. O frasco foi em seguida purgado com N2. 1-Metilpiperazina(758,1 g, 840 ml_, 7,57 rnols) e etanol de graduação 200 (508 ml_) foram adi-cionados ao-frasco de reação com agitação, O frasco foi novamente purgadocom N2, e a reação foi mantida sob N2. O frasco foi aquecido em um mantode aquecimento a uma temperatura interna de 97°C (+/- 5°C) e mantido nes-ta temperatura até que a reação fosse concluída (tipicamente cerca de 40horas) tal como determinado através de HPLC. Depois que a reação foi con-cluída, o aquecimento foi descontinuado e a reação foi resfriada a uma tem-peratura interna de cerca de 20°C a 25°C com agitação, e a reação foi agi-tada durante 2 a 3 horas. Cristais semente (0,20 g, 0,85 mmol) de 5-(4-metil-piperazin-1-il)-2-nitroanilina foram adicionados à mistura de reação a não serque a precipitação já tivesse ocorrido. Água (2,450 ml_) foi adicionada à mis-tura de reação agitada durante um período de cerca de uma hora enquantoa temperatura interna foi mantida em uma temperatura variando de cerca de20°C a 30°C. Depois que a adição de água foi concluída, a mistura resultan-te foi agitada durante cerca de uma hora em uma temperatura de 20°C a30°C. A mistura resultante foi em seguida filtrada, e o frasco e massa filtradaforam lavados com água (3 x 2,56 L). O produto sólido amarelo dourado foisecado a um peso constante de 416 g (rendimento de 98,6%) sob vácuo emcerca de 50°C em um forno a vácuo.

Procedimento C

5-Cloro-2-nitroanilina (401 g, 2,32 rnols) foi adicionada a umfrasco de fundo redondo de 12 L de 4 gargalos equipado com um agitadorsuspenso, condensador, entrada de gás, funil de adição, e sonda de termô-metro. O frasco foi em seguida purgado com N2. 1-Metilpiperazina (977 g,1,08 L, 9,75 rnols) e etanol a 100% (650 ml_) foram adicionados ao frasco dereação com agitação. O frasco foi novamente purgado com N2, e a reaçãofoi mantida sob N2. O frasco foi aquecido em um manto de aquecimento auma temperatura interna de 97°C (+/- 5°C) e mantido nesta temperatura atéque a reação fosse concluída (tipicamente cerca de 40 horas) tal como de-terminado através de HPLC. Depois que a reação foi concluída, aquecimen-to foi descontinuado e a reação foi resfriada a uma temperatura interna decerca de 80°C com agitação, e água (3,15 L) foi adicionada à mistura pormeio de um funil de adição durante o período de 1 hora enquanto a tempera-tura interna foi mantida em 82°C (+/- 3°C). Depois que a adição de água foiconcluída, aquecimento foi descontinuado e a mistura de reação foi deixadaresfriar durante um período de não menos do que 4 horas a uma temperatu-ra interna de 20 a 25°C. A mistura de reação foi em seguida agitada duranteuma hora adicional em uma temperatura interna de 20 a 30°C. A misturaresultante foi em seguida filtrada, e o frasco e massa filtrada foram lavadoscom água (1 x 1 L), etanol a 50% (1 x 1L), e etanol a 95% (1 x 1L). O produ-to sólido amarelo dourado foi colocado em uma panela de secagem e seca-do a um peso constante de 546 g (rendimento de 99%) sob vácuo em cercade 50°C em um forno a vácuo.

Exemplo 2

Síntese de éster de etila de ácido [6-(4-Metil-piperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]-acético

Procedimento A

<formula>formula see original document page 51</formula>

Um frasco de 4 gargalos de 5000 ml_ foi equipado com um agi-tador, termômetro, condensador, e entrada/saída de gás. O frasco equipadofoi carregado com 265,7 g (1,12 mol. 1,0 eq) de 5-(4-metil-piperazin-1-il)-2-nitroanilina e 2125 ml_ de EtOH de graduação 200. A solução resultante foipurgada com N2 durante 15 minutos. Depois, 20,0 g de Pd/C a 5% (50% deH20 peso/peso) foram adicionados. A reação foi vigorosamente agitada em40 a 50°C (temperatura interna) enquanto H2 foi borbulhada por meio damistura. A reação foi monitorada de hora em hora quanto ao desaparecimen-to de 5-(4-metil-piperazin-1-il)-2-nitroanilina através de HPLC. O tempo dereação típico era 6 horas.

Depois que toda a 5-(4-metil-piperazin-1-il)-2-nitroanilina desa-pareceu da reação, a solução foi purgada com N2 durante 15 minutos. De-pois, 440,0 g (2,25 rnols) de cloridrato de 3-etóxi-3-iminopropanoato de etilaforam adicionados como um sólido. A reação foi agitada em 40 a 50°C (tem-peratura interna) até que a reação fosse concluída. A reação foi monitoradaem seguida ao desaparecimento do composto de diamino através de HPLC.O tempo de reação típico era 1 a 2 horas. Depois que a reação foi concluída,ela foi resfriada a temperatura ambiente e filtrada por meio de uma almofadade Celita filtrando material. A Celita filtrando material foi lavada com EtOHabsoluto (2 x 250 mL), e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida for-necendo um óleo castanho/laranja espesso. O óleo resultante foi absorvidoem 850 mL de uma solução de HCI a 0,37%. NaOH sólido (25 g) foi em se-guida adicionado em uma porção, e um precipitado formou-se. A misturaresultante foi agitada durante 1 hora e em seguida filtrada. O sólido foi lava-do com H20 (2 x 400 mL) e secado em 50°C em um forno a vácuo fornecen-do 251,7 g (74,1%) de éster de etila de ácido [6-(4-metil-piperazin-1-il)-1H-benzoimidazol-2-il]-acético como um pó amarelo pálido.

Procedimento B

Um frasco encamisado de 4 gargalos de 5000 mL foi equipadocom um agitador mecânico, condensador, sonda de temperatura, entrada degás, e borbulhador de óleo. O frasco equipado foi carregado com 300 g (1,27mol) de 5-(4-metil-piperazni-1-il)-2-nitroanilina e 2400 mL de EtOH de gradu-ação 200 (a reação pode ser e foi conduzida com etanol a 95% e não é ne-cessário usar etanol de graduação 200 para esta reação). A solução resul-tante foi agitada e purgada com N2 durante 15 minutos. Depois, 22,7 g dePd/C a 5% (50% de H20 peso/peso) foram adicionados ao frasco de reação.O vaso de reação foi purgado com N2 durante 15 minutos. Depois de purgacom N2, o vaso de reação foi purgado com H2 por manutenção de um fluxolento mas constante de H2 por meio do frasco. A reação foi agitada em 45 a55°C (temperatura interna) enquanto H2 foi borbulhado por meio da misturaaté que a 5-(4-metil-piperazin-1-il)-2-nitroanilina fosse completamente con-sumida tal como determinado através de HPLC. O tempo de reação típico era 6 horas.

Depois que toda a 5-(4-metil-piperazin-1-il)-2-nitroanilina desa-parecia da reação, a solução foi purgada com N2 durante 15 minutos. O in-termediário de diamina é sensível ao ar e assim cuidado foi tomado paraevitar exposição ao ar. 500 g (2,56 rnols) de cloridrato de 3-etóxi-3-iminopropanoato de etila foram adicionados à mistura de reação durante umperíodo de cerca de 30 minutos. A reação foi agitada em 45 a 55°C (tempe-ratura interna) sob N2 até que a diamina fosse completamente consumida talcomo determinado através de HPLC. O tempo de reação típico era cerca de2 horas. Depois que a reação foi concluída, a reação foi filtrada enquantoquente por meio de uma almofada de Celita. O frasco de reação e Celita fo-ram em seguida lavados com EtOH de graduação 200 (3 x 285 ml_). Os fil-trados foram combinados em um frasco de 5000 ml_, e cerca de 3300 mL deetanol foram removidos sob vácuo produzindo um óleo laranja. Água (530mL) e em seguida HCL a 1M (350 mL) foram adicionados ao óleo resultante,e a mistura resultante foi agitada. A solução resultante foi vigorosamenteagitada enquanto NaOH a 30% (200 mL) foi adicionado durante um períodode cerca de 20 minutos mantendo a temperatura interna em cerca de 25 a30°C enquanto o pH foi conduzido a entre 9 e 10. A suspensão resultante foiagitada durante cerca de 4 horas enquanto mantendo a temperatura internaem cerca de 20 a 25°C. A mistura resultante foi filtrada, e a massa filtrada foilavada com H20 (3 x 300 mL). O sólido coletado foi secado a um peso cons-tante em 50°C sob vácuo em um forno a vácuo fornecendo 345,9 g (90,1%)de éster de etila de ácido [6-(4-metil-piperazin-1-il)-1H-benzoimidazol-2-il]-acético como um pó amarelo pálido. Em um procedimento de preparaçãoalternativo, os filtrados foram combinados e o etanol foi removido sob vácuoaté que pelo menos cerca de 90% fosse removido. Água em um pH neutrofoi em seguida adicionada ao óleo resultante, e a solução foi resfriada a cer-ca de 0°C. Uma solução de NaOH a 20% aquosa foi em seguida adicionadalentamente com rápida agitação para conduzir o pH até 9,2 (leitura com pHmetro). A mistura resultante foi em seguida filtrada e secada tal como descri-to acima. O procedimento de preparação alternativo forneceu o produto cas-tanho claro a amarelo claro em rendimentos tão altos quanto 97%.

Exemplo 3

Método para Redução de Conteúdo de Água de Éster de etila de ácido [6-(4-metil-piperazin-1 -il)-1 H-benzoimidazol-2-il]-acético

Éster de etila de ácido[6-(4-metil-piperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]-acético (120,7 grams) que tinha sido previamente preparado e secado aum conteúdo de água de cerca de 8 a 9% de H20 foi colocado em um frascode fundo redondo de 2000 mL e dissolvido em etanol absoluto (500 mL). Asolução âmbar foi concentrada a um óleo espesso usando um evaporadorgiratório com aquecimento até que todo o solvente fosse removido. O proce-dimento foi repetido mais duas vezes. O óleo espesso desta forma obtido foideixado no frasco e colocado em um forno a vácuo aquecido em 50°C du-rante a noite. Os resultados de análise de Karl Fisher indicaram um conteú-do de água de 5,25%. O conteúdo de água diminuído obtido através destemétodo forneceu rendimentos aumentados no procedimento do Exemplo 4.Outros solventes tais como tolueno e THF podem ser usados em vez do e-tanol para este processo de secagem.

Exemplo 4

Síntese de 4-Amino-5-flúor-3-[6-(4-metil-piperazin-1-il)-1 H-benzimidazol-2-il]-1H-quinolin-2-onaProcedimento A

<formula>formula see original document page 55</formula>

Ester de etila de ácido [6-(4-metil-piperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-ilJ-acético (250 g, 820 mmols) (secado com etanol tal comodescrito acima) foi dissolvido em THF (3800 ml_) em um frasco de 5000 mLequipado com um condensador, agitador mecânico, sonda de temperatura, epurgado com argônio. 2-Amino-6-flúor-benzonitrila (95,3 g, 700 mmols) foiadicionado à solução, e a temperatura interna foi elevada até 40°C. Quandotodos os sólidos tinham dissolvido e a temperatura da solução tinha alcan-çado 40°C, KHMDS sólida (376,2 g, 1890 mmols) foi adicionada durante umperíodo de 5 minutos. Quando adição da base de potássio foi concluída,uma solução amarela heterogênea foi obtida, e a temperatura interna tinhaaumentado até 62°C. Depois de um período de 60 minutos, a temperaturainterna diminuiu de volta para 40°C, e a reação foi determinada ser concluí-da através de HPLC (nenhum material de partida ou intermediário não cicli-zado estava presente). A mistura de reação espessa foi em seguida extin-guida por derramamento dela dentro de H20 (6000 mL) e agitação da mistu-ra resultante até que ela alcançasse a temperatura ambiente. A mistura foiem seguida filtrada, e a almofada de filtro foi lavada com água (1000 mL 2X).

0 sólido amarelo brilhante foi colocado em uma bandeja de secagem e se-cado em um forno a vácuo em 50°C durante a noite fornecendo 155,3 g(47,9%) da 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metil-piperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]-1H-quinolin-2-ona desejada.

Procedimento B

Um frasco encamisado de 4 gargalos de 5000 mL foi equipadocom um aparato de destilação, uma sonda de temperatura, uma entrada degás de N2, um funil de adição, e um agitador mecânico. Ester de etila de áci-do [6-(4-metil-piperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]-acético (173,0 g, 570mmols) foi carregado dentro do reator, e o reator foi purgado com N2 durante15 minutos. THF seco (2600 ml_) foi em seguida carregado dentro do frascocom agitação. Depois que todo o sólido tinha dissolvido, o solvente foi remo-vido através de destilação (vácuo ou atmosférica) (a temperatura elevadaajuda a remover a água) usando aquecimento quando necessário. Depoisque 1000 ml_ de solvente tinha sido removido, destilação foi parada e a rea-ção foi purgada com N2. 1000 ml_ de THF seco foi em seguida adicionado aovaso de reação, e quando todo o sólido foi dissolvido, destilação (vácuo ouatmosférica) foi novamente conduzida até que outros 1000 mL de solventefossem removidos. Este processo de adição de THF seco e remoção de sol-vente foi repetido pelo menos 4 vezes (na 4- destilação, 60% do solventesão removidos em vez de apenas 40% como nas primeiras 3 destilações)depois do que uma amostra de 1 mL foi removido para análise de Karl Fis-cher para determinar conteúdo de água. Se a análise mostrou que a amostracontinha menos do que 0,20% de água, então a reação foi continuada talcomo descrito no próximo parágrafo. No entanto, se a análise mostrou maisdo que 0,20% de água, então o processo de secagem descrito acima foicontinuado até que um conteúdo de água de menos do que 0,20% fossealcançado.

Depois que um conteúdo de água de menos do que ou cerca de0,20% foi alcançado usando o procedimento descrito no parágrafo anterior, oaparato de destilação foi substituído com um condensador de refluxo, e areação foi carregada com 2-amino-6-flúor-benzonitrilo (66,2 g, 470mmols)(em alguns procedimentos 0,95 equivalentes é usado). A reação foiem seguida aquecida a uma temperatura interna de 38 a 42°C. Quando atemperatura interna alcançou 38 a 42°C, solução de KHMDS (1313 g, 1,32mol, KHMDS a 20% em THF) foi adicionada à reação por meio do funil deadição durante um período de 5 minutos mantendo a temperatura interna emcerca de 38 a 50°C durante a adição. Quando adição da base de potássio foiconcluída, a reação foi agitada durante 3,5 a 4,5 horas (em alguns exemplosela foi agitada durante 30 a 60 minutos e a reação pode ser concluída dentrodeste tempo) enquanto mantendo a temperatura interna em a partir de 38 a42°C. Uma amostra da reação foi em seguida removida e analisada atravésde HPLC. Se a reação não foi concluída, solução de KHMDS adicional foiadicionada ao frasco durante um período de 5 minutos e a reação foi agitadaem 38 a 42°C durante 45 a 60 minutos (a quantidade de solução de KHMDSadicionada foi determinada pelo seguinte: Se a relação de IPC é < 3,50, en-tão 125 ml_ foram adicionados; se 10,0 > relação de IPC > 3,50, então 56 mLforam adicionados; se 20,0 > relação de IPC > 10, então 30 ml_ foram adi-cionados. A relação de IPC é igual à área correspondente a 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metil-piperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]-1 H-quinolin-2-ona) divididapela área correspondente ao intermediário não ciclizado). Uma vez que areação foi concluída (relação de IPC > 20), o reator foi resfriado a uma tem-peratura interna de 25 a 30°C, e água (350 ml_) foi carregada dentro do rea-tor durante um período de 15 minutos enquanto mantendo a temperaturainterna em 25 a 35°C (em uma alternativa, a reação é conduzida em 40°C eágua é adicionada dentro de 5 minutos. A extinção mais rápida reduz aquantidade de impureza que se forma durante o tempo). O condensador derefluxo foi em seguida substituído com um aparato de destilação e solventefoi removido através de destilação (vácuo ou atmosférica) usando aqueci-mento tal como requerido. Depois que 1500 mL de solvente tinham sido re-movidos, a destilação foi descontinuada e a reação foi purgada com N2. Á-gua (1660 mL) foi em seguida adicionada ao frasco de reação enquantomantendo a temperatura interna em 20 a 30°C. A mistura de reação foi emseguida agitada em 20 a 30°C durante 30 minutos antes de resfriamentodela a uma temperatura interna de 5 a 10°C e em seguida agitação durante1 hora. A suspensão resultante foi filtrada, e o frasco e massa filtrada foramlavados com água (3 x 650 mL). O sólido desta forma obtido foi secado a umpeso constante sob vácuo em 50°C em um forno a vácuo para fornecer103,9 g (42,6% de rendimento) de 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metil-piperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]-1H-quinolin-2-ona como um pó amarelo.Procedimento C

<formula>formula see original document page 58</formula>

Ester de etila de ácido [6-(4-metil-piperazin-1-il)-1H-benzimi-

dazol-2-il]-acético (608 g, 2,01 rnols) (secado) e 2-amino-6-flúor-benzonitrilo(274 g, 2,01 rnols) foram carregados dentro de um frasco de 12 L de 4 gar-galos assentado em um manto de aquecimento e equipado com um conden-sador, agitador mecânico, entrada de gás, e sonda de temperatura. O vasode reação foi purgado com N2, e tolueno (7,7 L) foi carregado dentro da mis-tura de reação enquanto ela foi agitada. O vaso de reação foi novamentepurgado com N2 e mantido sob N2. A temperatura interna da mistura foi ele-vada até que uma temperatura de 63°C (± 3°C) fosse alcançada. A tempera-tura interna da mistura foi mantida em 63°C (± 3°C) enquanto aproximada-mente 2,6 L de tolueno foram destilados do frasco sob pressão reduzida(380 ± 10 torr, temperatura de destilação t = 40°C (± 10°C) ~ (análise de KarlFischer foi usada para checar o conteúdo de água na mistura. Se o conteúdode água foi maior do que 0,03%, em seguida outros 2,6 L de tolueno foramadicionados e destilação foi repetida. Este processo foi repetido até que umconteúdo de água de menos do que 0,03% fosse alcançado). Depois que umconteúdo de água de menos do que 0,03% foi alcançado, aquecimento foidescontinuado, e a reação foi resfriada sob N2 a uma temperatura interna de17 a 19°C. t-Butóxido de potássio em THF (20% em THF; 3,39 kg, 6,04 rnolsde t-butóxido de potássio) foi em seguida adicionado à reação sob N2 emuma taxa de modo que a temperatura interna da reação fosse mantida abai-xo de 20°C. Depois que adição do t-butóxido de potássio foi concluída, areação foi agitada em uma temperatura interna de menos do que 20°C du-rante 30 minutos. A temperatura foi em seguida elevada a 25°C, e a reaçãofoi agitada durante pelo menos 1 hora. A temperatura foi em seguida eleva-da a 30°C, e a reação foi agitada durante pelo menos 30 minutos. A reaçãofoi em seguida monitorada quanto a conclusão usando HPLC para checarpor consumo dos materiais de partida (tipicamente em 2 a 3 horas, ambosos materiais de partida foram consumidos (menos do que 0,5% em área de% de HPLC)). Se a reação não foi concluída depois de 2 horas, outro 0,05equivalente de t-butóxido de potássio foi adicionado em um tempo, e o pro-cesso foi completado até que HPLC mostrasse que a reação foi concluída.Depois que a reação foi concluída, 650 ml_ de água foram adicionados àmistura de reação agitada. A reação foi em seguida aquecida a uma tempe-ratura interna de 50°C e o THF foi destilado (cerca de 3 L por volume) sobpressão reduzida da mistura de reação. Água (2,6 L) foi em seguida adicio-nada em gotas à mistura de reação usando um funil de adição. A mistura foiem seguida resfriada a temperatura ambiente e agitada durante pelo menos1 hora. A mistura foi em seguida filtrada, e a massa filtrada foi lavada comágua (1,2 L), com etanol a 70% (1,2 L), e com etanol a 95% (1,2 L). O sólidoamarelo brilhante foi colocado em uma bandeja de secagem e secado emum forno a vácuo em 50°C até que um peso constante fosse obtido forne-cendo 674 g (85,4%) da 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metil-piperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]-1 H-quinolin-2-ona desejada.

Exemplo 5

Purificação de 4-Amino-5-flúor-3-[6-(4-metil-piperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]-1 H-quinolin-2-ona

Um frasco de 4 gargalos de 3000 ml_ equipado com um conden-sador, sonda de temperatura, entrada de gás de N2, e agitador mecânico foicolocado em um manto de aquecimento. O frasco foi em seguida carregadocom 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metil-piperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]-1 H-quinolin-2-ona (101,0 g, 0,26 mol), e o sólido amarelo foi suspenso em eta-nol a 95% (1000 ml_) e agitado. Em alguns casos uma relação de solventede 8:1 é usada. A suspensão foi em seguida aquecida até um refluxo suave(temperatura de cerca de 76°C) com agitação durante um período de cercade 1 hora. A reação foi em seguida agitada durante 45 a 75 minutos enquan-to refluxada. Neste ponto, o calor foi removido do frasco e a suspensão foideixada resfriar a uma temperatura de 25 a 30°C. A suspensão foi em se-guida filtrada, e a almofada de filtro foi lavada com água (2 x 500 ml_). O só-lido amarelo foi em seguida colocado em uma bandeja de secagem e seca-do em um forno a vácuo em 50°C até que um peso constante foi obtido (tipi-camente 16 horas) para obter 97,2 g (96,2%) do produto purificado como umpó amarelo.

Exemplo 6

Preparação de sal de Ácido Lático de 4-Amino-5-flúor-3-[6-(4-metil-piperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]-1 H-quinolin-2-ona

<formula>formula see original document page 60</formula>

Ácido D,L-Lático

EtOH, H20

Um frasco encamisado de 4 gargalos de 3000 ml_ foi equipadocom um condensador, uma sonda de temperatura, uma entrada de gás deN2, e um agitador mecânico. O vaso de reação foi purgado com N2 durantepelo menos 15 minutos e em seguida carregado com 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metil-piperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]-1H-quinolin-2-ona (484 g, 1,23mol). Uma solução de Ácido D,L-lático (243,3 g, 1,72 mol de monômero -veja o seguinte parágrafo), água (339 ml_), e etanol (1211 ml_) foi preparadae em seguida carregada ao frasco de reação. Agitação foi iniciada em umataxa média, e a reação foi aquecida a uma temperatura interna de 68 a72°C. A temperatura interna da reação foi mantida em 68 a 72°C durante 15a 45 minutos e em seguida aquecimento foi descontinuado. A mistura resul-tante foi filtrada por meio de uma frita de 10 a 20 mícrons coletando o filtradoem um frasco de 12 L. O frasco de 12 L foi equipado com uma sonda detemperatura interna, um condensador de refluxo, um funil de adição, umaentrada e saída de gás, e um agitador suspenso. O filtrado foi em seguidaagitado em uma taxa média e aquecido ao refluxo (temperatura interna decerca de 78°C). Enquanto mantendo um refluxo suave, etanol (3,596 ml_) foicarregado ao frasco durante um período de cerca de 20 minutos. O frascode reação foi em seguida resfriado a uma temperatura interna variando decerca de 64 a 70°C dentro de 15 a 25 minutos e esta temperatura foi manti-da durante um período de cerca de 30 minutos. O reator foi inspecionadoquanto a cristais. Se nenhum cristal estava presente, em seguida cristais dosal de ácido lático de 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metil-piperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]-1H-quinolin-2-ona (484 mg, 0,1 mole %) foram adiciona-dos ao frasco, e a reação foi agitada em 64 a 70°C durante 30 minutos antesda inspeção novamente do frasco quanto a cristais. Uma vez que cristaisestavam presentes, agitação foi reduzida a uma baixa taxa e a reação foiagitada em 64 a 70°C durante um adicional de 90 minutos. A reação foi emseguida resfriada a cerca de 0°C durante um período de cerca de 2 horas, ea mistura resultante foi filtrada por meio de um filtro calcinado de 25 a 50mícrons. O reator foi lavado com etanol (484 ml_) e agitado até que a tempe-ratura interna fosse cerca de 0°C. O etanol gelado foi usado para lavar amassa filtrada, e este procedimento foi repetido mais 2 vezes. O sólido cole-tado foi secado a um peso constante em 50°C sob vácuo em um forno a vá-cuo produzindo 510,7 g (85,7%) do sal de ácido lático amarelo cristalino de4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metil-piperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]-1 H-quinolin-2-ona. Uma barragem de borracha ou condições inertes foram tipi-camente usadas durante o processo de filtragem. Enquanto o sólido seconão parece ser muito higroscópico, a massa filtrada úmida tende a capturarágua e tornar-se pegajosa. Precauções foram tomadas para evitar exposiçãoprolongada da massa filtrada úmida à atmosfera.

Ácido lático comercial geralmente contém cerca de 8 a 12% depeso/peso de água, e contém dímeros e trímeros além do ácido lático mo-nomérico. A relação em mol de dímero de ácido lático para monômero é ge-ralmente cerca de 1,0:4,7. Ácido lático de nível comercial pode ser usado noprocesso descrito no parágrafo precedente como o sal de monolactato prefe-rencialmente precipitado da mistura de reação.Identificação de Metabólitos

Dois metabólitos de 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metil-piperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]-1H-quinolin-2-ona (Composto 1) foram identificados ecaracterizados em plasma de rato misturado de um estudo de toxicologia de2 semanas tal como descrito nas referências incorporadas aqui. Os dois me-tabólitos identificados foram o composto de N-óxido de piperazina (Compos-to 2) e o composto N-desmetilado (Composto 3) mostrados abaixo.

<formula>formula see original document page 62</formula>

Composto 2

IC5oS de Compostos 1 a 3

A atividade de cinase de várias proteína tirosina cinases foi me-dida usando os procedimentos apresentados abaixo para Compostos 1 a 3para fornecer os valores de IC50 mostrados na seguinte Tabela.

Tabela. IC50S de Compostos 1 a 3

<table>table see original document page 62</column></row><table>1H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona (Composto 2) e 4-Amino-5-flúor-3-(6-piperazin-1 -il-1 H-benzimidazol-2-il)quinolin-2(1 H)-ona (Composto 3)

Para confirmar as estruturas dos metabólitos identificados deComposto 1, os metabólitos foram independentemente sintetizados.

O Composto 2, o metabólito de N-óxido de Composto 1, foi sin-tetizado tal como mostrado no esquema abaixo. Composto 1 foi aquecidoem uma mistura de etanol, dimetilacetamida e peróxido de hidrogênio. Naconclusão da reação, o Composto 2 foi isolado através de filtragem e lavadocom etanol. Se necessário, o produto pode ser além disso purificado atravésde cromatografia de coluna.

<formula>formula see original document page 63</formula>

O Composto 3, o metabólito de N-desmetila do Composto 1, foisintetizado tal como mostrado no esquema abaixo. 5-cloro-2-nitroanilina foitratada com piperazina para produzir 4 o qual foi subseqüentemente protegi-do com um grupo butiloxicarbonila (Boc) para produzir 5. A redução do gruponitro seguida por condensação com éster de etila de ácido 3-etóxi-3-iminopropiônico produziu 6. A condensação de 6 com 6-fluoroantranilonitrilausando hexametildissilazida de potássio como a base produziu 7. O 7 cru foitratado com HCI aquoso para produzir o metabólito desejado como um sóli-do amarelo/castanho depois de purificação.<formula>formula see original document page 64</formula>

Procedimentos de Ensaio

Serina/Treonina Cinases

A atividade de cinase de várias proteína serina/treonina cinasesfoi medida por fornecimento de ATP e um peptídeo ou proteína adequadocontendo um resíduo de aminoácido de serina ou treonina para fosforilação,e ensaio para a. transferência de porção de fosfato ao resíduo de serina outreonina. A atividade de ensaio e síntese de um grande número de compos-tos de fórmula I, II, e III é descrita nas seguintes referências as quais sãototalmente por meio deste incorporadas através de referência em sua totali-dade e para todos os propósitos como se especificamente apresentado aqui:Patente dos Estados Unidos NQ 6.605.617; Pedido de Patente dos EstadosUnidos publicada N9 2004/0092535; Pedido de Patente dos Estados UnidosN9 10/983.174, depositado em 5 de novembro de 2004; e Pedido de Patentedos Estados Unidos publicado N9 2004/0220196. Proteínas recombinantescontendo os domínios de cinase de enzimas GSK-3, RSK-2, PAR-1, NEK-2,e CHK1 foram expressas em células de inseto Sf9 usando um sistema deexpressão de Baculovírus (InVitrogen) e purificadas por meio de interaçãode anticorpo de Glu (para constructos rotulados por Glu-epitopo) ou porCromatografia de íon de Metal (para constructos rotulados por His6 (SEQ IDNO: 1)). Cdc2 (constructo de fusão de GST) e ciclina B foram co-expressosem células de inseto Sf9 usando um sistema de expressão de Baculovírus.Cdk2/ciclina A ativa recombinante é disponível comercialmente e foi com-prada de Upstate Biotechnology. A enzima do Cdc2 purificada usado no en-saio era comercialmente disponível, e ela pode ser comprada de New En-gland Bio Labs. Para cada ensaio, compostos de teste foram consecutiva-mente diluídos em DMSO e em seguida misturados com o tampão de reaçãode cinase apropriado mais 5 a 10 nM de ATP gama-rotulada por 33P. A prote-ína cinase e o substrato de peptídeo biotinilado apropriado foram adiciona-dos para produzir um volume final de 150 uL. Reações foram incubadas du-rante 3 a 4 horas em temperatura ambiente e em seguida paradas por trans-ferência a uma placa de microtítulo branca revestida estreptavidina (ThermoLabsystems) contendo 100 ul. de tampão de reação de interrupção. O tam-pão de reação de interrupção consiste em ATP não rotulada a 50 mM e ED-TA a 30 mM. Depois de 1 hora de incubação, placas de estreptavidina foramlavadas com PBS, e 200 u,L de fluido de cintilação de Microscint 20 foramadicionados por cavidade. As placas foram seladas e contadas usando Top-Count. A concentração de cada composto para inibição a 50% (IC50) foi cal-culada empregando regressão não linear usando software de análise de da-dos XL Fit.

O tampão de reação continha 30 mM de Tris-HCI2 pH 7,5, 10mM de MgCI2, 2 mM de DTT, 4 mM de EDTA, 25 mM de beta-glicerofosfato,5 mM de MnCI2, BSA/PBS a 0,01%, 0,5 |iM de substrato de peptídeo, e 1uJvl de ATP não rotulada. Enzima GSK-3 foi usada em 27 nM, CHK1 em 5nM, Cdc2 em 1 nM, Cdk2 em 5 nM, e Rsk2 em 0,044 unidades/mL. Para oensaio de GSK-3, peptídeo de biotina-CREB (Biotina-SGSGKRREILSRRP(pS)YR-NH2 (SEQ ID NO: 4)) foi usado. Para o ensaiode CHK1, um peptídeo de biotina-Cdc25c (Bioti-na-[AHX]SGSGSGLYRSPSMPENLNRPR[CONH2] (SEQ ID NO: 5)) foi usa-do. Para ensaios do Cdc2 e do Cdk2, um peptídeo de biotina-Histona H1([lcBiotina]GGGGPKTPKKAKKI_[CONH2] (SEQ ID NO: 6)) foi usado. No en-saio de Rsk2, um peptídeo de biotina-p70, 15 mM de MgCI2, 1 mM de DTT,5 mM de EDTA, 2,7 uJvl de peptídeo inibidor de PKC, e 2,7 uM de peptídeoinibidor de PKA foram usados.

Tirosina Cinases

A atividade de cinase de várias proteína tirosina cinases foi me-dida por fornecimento de ATP e um peptídeo ou proteína apropriado conten-do um resíduo de aminoácido de tirosina para fosforilação, e ensaio para atransferência de porção de fosfato ao resíduo de tirosina. Proteínas recom-binantes correspondentes aos domínios citoplasmáticos dos receptores FLT-1 (VEGFR1), VEGFR2, VEGFR3, Tie-2, PDGFRji, PDGFRji, e FGFR1 foramexpressas em células de inseto Sf9 usando um sistema de expressão deBaculovírus (InVitrogen) e podem ser purificadas por meio de interação deanticorpo de Glu (para constructos rotulados por Glu-epitopo) ou por Croma-tografia de íon de Metal (para constructos rotulados de His6 (SEQ ID NO: 1)).Para cada ensaio, compostos de teste foram consecutivamente diluídos emDMSO e em seguida misturados com um tampão de reação de cinase apro-priado mais ATP. Proteína cinase e um substrato de peptídeo biotinilado a-propriado foram adicionados para produzir um volume final de 50 a 100 |iL,as reações foram incubadas durante 1 a 3 horas em temperatura ambiente eem seguida paradas por adição de 25 a 50 yd. de 45 mM de EDTA, 50 mMde Hepes pH 7,5. A mistura de reação parada (75 \xL) foi transferida a umaplaca de microtítulo revestida por estreptavidina (Boehringer Mannheim) eincubada durante 1 hora. Produto de peptídeo fosforilado foi medido com osistema de fluorescência resolvida com o tempo DELFIA (Wallac ou PE Bi-osciences), usando um anticorpo PT66 antifosfotirosina rotulado por Európiocom a modificação de que o tampão de ensaio DELFIA foi suplementadocom 1 mM de MgCl2 para a diluição de anticorpo. Fluorescência resolvidacom o tempo foi lida em um fluorômetro Wallac 1232 DELFIA ou uma leitorade sinal múltiplo PE Victor II. A concentração de cada composto para inibi-ção a 50% (IC50) foi calculada empregando regressão não linear usandosoftware de análise de dados XL Fit.

Cinases FLT-1, VEGFR2, VEGFR3, FGFR3, Tie-2, e FGFR1foram ensaiadas em 50 mM de Hepes pH 7,0, 2 mM de MgCI2, 10 mM deMnCI2, 1 mM de NaF, 1 mM de DTT, 1 mg/mL de BSA, 2 (iM de ATP, e 0,20a 0,50 H.M de substrato de peptídeo biotinilado correspondente. CinasesFLT-1, VEGFR2, VEGFR3, Tie-2, e FGFR1 foram adicionadas em 0,1jig/mL, 0,05 (ig/mL, ou 0,1 ^ig/mL respectivamente. Para o ensaio de cinasePDGFR, 120 (ig/mL de enzima com as mesmas condições de tampão talcomo acima foram usadas exceto para mudança de concentrações de ATP esubstrato de peptídeo para 1,4 [M de ATP, e 0,25 (j.M de substrato de peptí-deo biotina-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2 (SEQ ID NO: 2).

Tirosina cinases recombinantes e ativas Fyn, e Lck são disponí-veis comercialmente e foram compradas de Upstate Biotechnology. Paracada ensaio, compostos de teste foram consecutivamente diluídos em DM-SO e em seguida misturados com um tampão de reação de cinase apropria-do mais 10 nM de ATP gama-rotulada por 33P. A proteína cinase e o substra-to de peptídeo biotinilado apropriado foram adicionados para produzir umvolume final de 150 ui_. As reações foram incubadas durante 3 a 4 horas emtemperatura ambiente e em seguida paradas por transferência a uma placade microtítulo branca revestida por estreptavidina (Thermo Labsystems) con-tendo 100 uJ_ de tampão de reação de interrupção de 100 mM de EDTA e 50)liM de ATP não rotulada. Depois de incubação de 1 hora, as placas de es-treptavidina foram lavadas com PBS e 200 uJ_ de fluido de cintilação Micros-cint 20 foram adicionados por cavidade. As placas foram seladas e contadasusando TopCount. A concentração de cada composto para inibição a 50%(IC50) foi calculada empregando regressão não linear usando software deanálise de dados XL Fit.

O tampão de reação de cinase para Fyn, Lck, e c-ABL continha50 mM de Tris-HCI pH 7,5, 15 mM de MgCI2, 30 mM de MnCI2, 2 mM deDTT, 2 mM de EDTA, 25 mM de fosfato de beta-glicerol, BSA/PBS a 0,01%,0,5 jiM do substrato de peptídeo apropriado (substrato de peptídeo Src bioti-nilado: biotina-GGGGKVEKIGEGTYGVVYK-NH2 (SEQ ID NO: 3) para Fyn eLck), 1 u.M de ATP não rotulada, e 1 nM de cinase.

A atividade de cinase de c-Kit e FLT-3 foram medidas por forne-cimento de ATP e um peptídeo ou proteína contendo um resíduo de aminoá-cido de tirosina para fosforilação, e ensaio para a transferência de porção defosfato ao resíduo de tirosina. Proteínas recombinantes correspondentes aosdomínios citoplasmáticos dos receptores de c-Kite FLT-3 foram compradas(Proquinase). Para teste, um composto exemplar, por exemplo 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona, foidiluído em DMSO e em seguida misturado com o tampão de reação de cina-se descrito abaixo mais ATP. A proteína cinase (c-K/rou FLT-3) e o substra-to de peptídeo biotinilado (biotina-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2 (SEQ ID NO:2)) foram adicionados para produzir um volume final de 100 uL Estas rea-ções foram incubadas durante 2 horas em temperatura ambiente e em se-guida paradas por adição de 50 uL de 45 mM de EDTA, 50 mM de HEPES,pH 7,5. A mistura de reação parada (75 uL) foi transferida a uma placa demicrotítulo revestida por estreptavidina (Boehringer Mannheim) e incubadadurante 1 hora. Produto de peptídeo fosforilado foi medido com o sistema defluorescência resolvida com o tempo DELPHIA (Wallac ou PE Biosciences),usando um anticorpo antifosfotirosina rotulado por Európio, PT66, com amodificação de que o tampão de ensaio DELFIA foi suplementado com 1mM de MgCb para a diluição de anticorpo. Valores de fluorescência resolvi-da com o tempo foram determinados em um fluorômetro Wallac 1232 DEL-FIA ou uma leitora de sinal múltiplo PE Victor II. A concentração de cadacomposto para inibição a 50% (IC50) foi calculada empregando regressãonão linear usando software de análise de dados XL Fit.

Cinases FLT-3 e c-Kit foram ensaiadas em 50 mM de Hepes pH7,5, 1 mM de NaF, 2 mM de MgCI2, 10 mM de MnCI2 e 1mg/mL de BSA, 8uM de ATP e 1 pM de substrato de peptídeo biotinilado correspondente (bio-tina-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2 (SEQ ID NO: 2)). A concentração de cina-ses FLT-3 e c-Kit foram ensaiadas em 2 nM.

Avaliação de Imaqeamento em Tempo Real e Compreensiva de 4-Amino-5-flúor-3-f6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-inquinolin-2(1 H)-onaEficácia em um Modelo de Mieloma Múltiplo Pré-clínico

Mieloma múltiplo (MM), um neoplasma de célula B caracterizadopor expansão clonal de células de plasma na medula óssea hematopoiética,permanece uma malignidade hematológica fatal devido ao desenvolvimentode resistência de fármaco intrínseca e adquirida a despeito de introdução dequimioterapia de alta dosagem convencional. Foi demonstrado que micro-ambiente de medula óssea, onde células de MM preferencialmente resideme desenvolvem-se, desempenha um papel crucial no desenvolvimento deresistência a terapias convencionais e novas para MM. Por esse motivo, a-gentes molecularmente alvejados alvejando não apenas as células de MMmas também interação de microambiente célula de MM-medula óssea ofere-cem uma oportunidade potencial para tratar MM. Avanços recentes no en-tendimento da patologia molecular de MM forneceram novos alvos terapêuti-cos para tratamento desta doença. O FGFR-3 ectopicamente expresso edesregulado, o qual é encontrado em aproximadamente 15% de pacientesde MM resultante de translocação cromossômica de t(4;14) e confere umprognóstico particularmente fraco em clínica, tem se tornado um alvo tera-pêutico atrativo para MM.

4-Amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona (Composto 1) é um inibidor de molécula pequena alve-jando para múltiplas tirosina cinases receptoras incluindo VEGFR-2 e PDG-FR (IC5oS -20 nM em ensaios de cinase) e FGFR-3 (IC50 -5 nM em ensaiosde cinase). Foi demonstrado que 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona inibe autofosforilação de FGFR-3 eproliferação celular em células de MM mutante de FGFR-3 in vitro (S. Trudele outros; Blood; in press). Para avaliar a eficácia antimieloma de 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona, ummodelo de MM pré-clínico in vivo foi desenvolvido no qual lesões de MMmúltiplas de órgãos desenvolvidas depois de injeção i.v. de veia da cauda decélulas KMS-11-luc humanas expressando FGFR-3 (Y373C) mutante esta-velmente transfectado com um constructo de luciferase. Imageamento bio-luminescente (BLI) foi empregado para monitorar não invasivamente o cres-cimento in vivo e metástase de tumores de MM de KMS-11-luc. Detecçãoprecoce e monitoramento compreensivo em série do crescimento de lesõesmetastáticas foram capturadas bem sucedidamente por BLI com este mode-lo. Quase todos os animais injetados de célula de tumor de KMS-11-luc fo-ram constatados desenvolver lesões de MM tão precoce como no dia 26, asquais foram principalmente localizadas na espinha, crânio e pélvis resultan-do em freqüente desenvolvimento de paralisia neste modelo. A eficácia anti-mieloma de 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona neste modelo de MM de KMS-11-luc in vivo injetado i.v.foi investigada e foi constatado que administração oral diária de 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona em20 mg/kg, uma dose que demonstrou inibir fosforilação de ERK em tumoresde KMS-11-luc in vivo, resultou em uma inibição significante de crescimentode tumor de KMS-11, tal como detectado através de imageamento de BLIem série. Além disso, a atividade de crescimento antitumor de 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona tras-ladou a um melhoramento significante na taxa de sobrevivência animal com-parada ao tratamento por veículo. Estes estudos fornecem além disso basepré-clínica para testes clínicos de 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona em pacientes de MM e permitemtambém avaliação de 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona em terapia de combinação com agentesconvencionais ou outros molecularmente alvejados neste modelo in vivo deKMS-11-luc.

Método

Um coorte de 18 camundongos beges SCID imunodeficientesfêmeas (cerca de 8 semanas de idade) foi obtido de The Jackson laboratory(Bar Harbor, ME) e foi alojado em uma facilidade de barreira em gaiolas detampo de filtro estéril com ciclos de claro/escuro de 12 horas. Todos os ex-perimentos foram conduzidos em uma facilidade acreditada pela Associationfor Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International ede acordo com todas as normas do Institutional Animal Care and Use Com-mittee e o Guide for The Care and Use of Laboratory Animais (National Re-search Council). Células de MM de KMS-11-luc alojando FGFR-3 mutante(Y373C) foram cultivadas em Meios de Iscove + FBS a 10% + L-glutamina epassaram duas vezes/semana em uma faixa de 1:2 a 1:4. As células foramimplantadas através de injeção intravenosa dentro da veia da cauda em 10x106 de células por 100 uL de HBSS por camundongo. Os camundongosforam irradiados em 3 GY (3,2 minutos) no dia de implantação de célula. A-nimais receberam tratamento oral diário de 20 mg/kg de 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona ou veículo(n = 9 cada grupo) iniciando em 48 horas depois que as células de KOM11-luc foram injetadas. Imagens bioluminescentes (BLI) foram obtidas usandoum Sistema de Imageamento de IVIS (Xenogen) que incluía uma câmeraCCD resfriada altamente sensível montada em uma caixa de câmera de luzacesa. Imagens e medições de sinais bioluminescentes, tal como quantifica-do por fótons/segundo, foram adquiridas no dia 8 e uma vez por semanadepois disso. Os pesos corporais do animal foram monitorados duas vezespor semana e observações clínicas foram registradas diariamente. De acor-do com normas e regulação de cuidado animal, camundongos foram sacrifi-cados através de inalação de C02 no evento de paralisia ou maior compro-misso na sua qualidade de vida.

Resultados

No dia 8 depois que as células KMS-11-luc foram intravenosa-mente injetadas dentro de camundongos beges SCID, imageamento de cor-po inteiro demonstrou desenvolvimento de crescimento celular e possivel-mente lesões de MM principalmente localizadas em regiões extraesqueléti-cas incluindo pulmão, fígado e baço. Lesões esqueléticas múltiplas difusastípicas incluindo crânio, pélvis e espinha foram claramente observadas namaioria dos camundongos entre dia 41 e dia 48 tal como visto nas imagensde BLI da figura 1, as quais foram associadas com paralisia de membro tra-seiro, resultando em sacrifício de camundongos de acordo com o protocolo.

A eficácia antimieloma de 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona foi testada em KMS-11-luc nes-te modelo in vivo. Camundongos começaram a receber tratamento oral diá-rio de 58 a 20 mg/kg em 48 horas depois que as células KMS-11-luc foraminjetadas. Monitoramento compreensivo e em série de contagens de fótonem cada animal foi desempenhado em um horário de base semanal. Umacontagem de fóton média inferior significante em grupo tratado por 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-onademonstrou comparado ao tratamento por veículo tal como mostrado na fi-gura 2. Isto foi facilmente observado por comparação das imagens de BLI decorpo inteiro tomadas de camundongos injetados com KMS-11-luc tratadacom veículo e aqueles tratados com 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona tal como mostrado na figura 3.

Redução de contagem de fóton em camundongos tratados com4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona tratada estava bem-refletida por um significante aumento no tem-po de sobrevivência comparado aos camundongos tratados com veículo. Nodia 91, 5 dentre 9 animais naqueles camundongos tratados com 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-onapermaneceram vivos com condições saudáveis totais. Em contraste, a maiorparte dos animais no grupo tratado por veículo foi sacrificada ao redor do dia50. Além disso, camundongos tratados com 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona, toleraram estetratamento bem durante o longo período deste estudo. Por causa do óbviomelhoramento no tempo de sobrevivência de camundongos tratados com 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona, o estudo foi terminado no dia 91 por considerações práticas.

Vários estudos com relação a tnibição de cinase em geral, inibi-ção de FGFR3, e tratamento de cânceres incluindo mieloma múltiplo com 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1 H)-ona são apresentados em Pedido de Patente dos Estados Unidos publicadoNg 2004/0092535, e Pedido de Patente dos Estados Unidos N9 10/983.174,Pedido de Patente dos Estados Unidos Ng 2004/0220196, e Patente dos Es-tados Unidos NQ 6.605.617. por esse motivo, cada uma destas referências épor meio deste incorporado através de referência em sua totalidade e paratodos os propósitos como se inteiramente apresentados aqui.

Atividade de 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1 -il)-1 H-benzimidazol-2-inquinolin-2(1H)-ona (Composto 1) em Modelos de Xenoenxerto de TumorExperimental de AML Humana

4-Amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona (Composto 1) é uma nova molécula pequena multialve-jada oralmente ativa que exibe atividade potente contra cinase FLT3 e RTKsde Classe III, IV, e V envolvidas em proliferação endotelial e de célula detumor. Dada a relevância de mutações de FLT3 em leucemia mielogenosaaguda (AML), o Composto 1 foi testado em duas linhagens de célula leucê-mica humana com estado mutacional de FLT3 diferente (MV4;11 FLT3 ITDvs. RS4;11 FLT3 WT). Atividade antiproliferativa do Composto 1 contraMV4;11 foi -24 vezes maior comparada a RS4;11, indicando inibição maispotente de FLT3 constitutivamente ativada. Modulação dependente de dosede fosforilação de receptor e sinalização a jusante (STAT5 e ERK/MAPK) emcélulas MV4;11 com Composto 1 confirmou mecanismo molecular de ação.Modulação alvo de pFLT3, pERK em tumores de MV4;11 foi alcançada emdoses biologicamente ativas do Composto 1. Regressões de tumor e erradi-cação de células de AML da medula óssea (BM) foram demonstradas emmodelos de xenoenxerto subcutâneo e leucêmico de enxertamento de BM.Respostas de tumor foram caracterizadas por proliferação celular diminuídae manchamento imunohistoquímico positivo para caspase-3 ativa e PARPclivada, sugerindo que morte de célula foi mediada por meio de apoptose.Estes dados suportam a avaliação clínica do Composto 1 em AML.

Linhagens de Célula

Células leucêmicas MV4;11 (FLT3 ITD) e RS4;11 (FLT3 WT)humanas foram obtidas de American Tissue Culture Collection (Rockville,MD) 24-26. As células MV4;11 foram desenvolvidas em meio Dulbecco mo-dificado por Iscoves (IMBM) suplementado com soro bovino fetal a 10 %(FBS, Gibco Life Technologies, Gaithersburg, MD) contendo 4 mM de L-glutamina, 5 ng/ml de fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF, R&D Systems, Minneapolis, MN) e Penicilina a 1% eEstreptomicina. RS4;11 foram desenvolvidas em meios RPMI-1640 conten-do FBS a 10 %, 1mM de piruvato de sódio e 10mM de HEPES (pH 7,4). Cé-lulas foram desenvolvidas como culturas de suspensão e mantidas em umaatmosfera umedecida em 37°C e CO2 a 5%.

Ensaios de Cinase

Ensaios de cinase FLT3 in vitro foram conduzidos com 2 nM deenzima de FLT3 (Upstate Biotechnology, Charlottesville, VA) na presença de8 uM de ATP e diluições em série do Composto 1. Substrato de peptídeofosforilado em uma concentração final de 1 uM foi incubado com um anticor-po (PT66) antifosfotirosina rotulado por Európio (Perkin Elmer Life Sciences,Boston, MA). O Európio foi detectado usando fluorescência resolvida com otempo. O IC50 foi calculado usando regressão não linear.

Ensaios de Proliferação

As células foram semeadas em placas de microtítulo de 96 cavi-dades (10.000 células/cavidade) e diluições em série do Composto 1 foramadicionadas. Células RS4;11 foram estimuladas com ligando de FLT3 (100ng/ml, R&D Sistemas, Minneapolis, MN). No término do período de incuba-ção (72 h em 37°C), a viabilidade da célula foi determinada pelo ensaio deMTS (Promega, Madison, Wl). Valores de EC50 foram calculados usandoregressão não linear, e definidos como a concentração necessária para umaredução a 50% na absorvência de células tratadas vs. de controle não trata-das.

Imunoprecipitação e Análise de Mancha do Oeste

Para experimentos in vitro, células MV4;11 e RS4;11 foram tra-tadas com Composto 1 durante 3 horas. Células RS4;11 foram estimuladascom ligando de FLT3 (100 ng/mL) durante 15 minutos depois de incubaçãocom Composto 1. Depois de incubação com fármaco, as células foram colhi-das, lavadas com PBS gelado e lisadas com tampão de RIPA (Nonidet P-40a 1%, desoxicolato de sódio a 0,5%, dodecilsulfato de sódio a 0,1% em solu-ção salina tamponada de fosfato a 1X, pH 7,2) contendo inibidores de prote-ase (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, EM) e inibidores de fosfa-tase (Sigma, St. Louis, MO). Para análises de modulação alvo in vivo, tumo-res ressectados foram congelados instantaneamente, pulverizados e arma-zenados em -70°C antes de lise com 150 mM de NaCI, 1,5 mM de MgCI2,50 mM de Hepes, pH 7,5, glicerol a 10%, Triton X-100 a 1,0%, 1 mM de EG-TA, 50 mM de NaF, 1 mM de Na3V04, 2 mM de Pefabloc (Roche), e coque-tel inibidor de protease completo (Roche). Conteúdo de proteína dos lisadosfoi determinado usando o ensaio de BCA (Bio-Rad, Hercules, CA). Análisede mancha do Oeste para pERK foi desempenhada com um anticorpo decamundongo para pERK (1:1000, Cell Signaling, Beverly, MA) e incubadaem 4°C durante a noite. Nível de ERK total foi avaliado por re-sondagemcom anticorpo contra ERK total (Cell Signaling). As membranas foram emseguida incubadas durante 1 hora em RT com IgG anticoelho conjugada porrábano silvestre peroxidase de 1:5000 (Jackson Immunoresearch, WestGrove, PA). Para imunoprecipitação para detectar FLT3, quantidades iguaisde proteínas (500 ug para STAT5; 1000 ug para FLT3) foram incubadas comanticorpos contra ou FLT3 ou STAT5 humana (Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, CA) durante a noite em 4°C e com proteína A- agarose durante2 horas em 4°C. Fosforilação de FLT3 ou STAT5 foi medida através de son-dagem com um anticorpo antifosfotirosina (anticorpo anti-pFLT3 de Cell Sig-naling, e anticorpo anti-pSTAT5 de Upstate). Proteínas foram detectadasusando quimioluminescência realçada (ECL; Amersham Biosciences, Buc-kinghamshire, England) e visualizadas depois de exposição a filme Kodak.Densitometria de varredura foi desempenhada para quantificar intensidadesde faixa. Para verificar carregamento igual, manchas foram extraídas e res-sondadas com anticorpos a ou anti-FLT3 (Santa Cruz Biotechnology) ou an-ti-STAT5 (BD Biosciences) para medir proteína de FLT3 ou STAT5 total,respectivamente. A quantidade de pFLT3, pERK ou pSTAT5 foi normalizadaa níveis de proteína de FLT3, ERK ou STAT5 total, e comparada a veículoou controles não tratados.

Ensaios Citométricos de Fluxo

Células MV4;11 foram tratadas com Composto 1 durante 3 horassob condições privadas de soro (durante a noite em meios OptiMEM). Paradetecção de pSTAT5, células foram fixadas com formaldeído a 1%, e per-meabilizadas com metanol gelado a 90%. Células permeabilizadas (0,5 -1x106) foram incubadas com anticorpo anti-pSTAT5 (Cell Signaling) durante30 minutos. IgG de coelho purificado (Oncogene, San Diego, CA) na mesmaconcentração foi usada como controle de isótipo. Anticorpo secundário erauma IgG anticoelho de cabra F(ab')2 conjugada por PE (Jackson Immunore-search). Amostras foram armazenadas em 4°C no escuro antes de análisesusando um citômetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA).Intensidade fluorescente média (MFI) foi determinada para manchamento depSTATõ usando software CelIQuest (Becton Dickinson) e a MFI específicaera a diferença da MFI de anticorpo de controle de isótipo.

Para processamento de células de medula óssea (BM) do mode-lo de enxertamento de MV4;11 de camundongo, fêmures foram purgadoscom solução salina gelada e células vermelhas do sangue lisadas com tam-pão de lise de FACS (Becton Dickinson). Enxertamento em porcentagem decélulas leucêmicas humanas em de camundongo foi determinado por man-chamento com HLA-A,B,C-FITC anti-humano (vs. controle de FITC de anti-corpo pareado por isótipo) (BD Pharmingen).

ELISA de VEGF

Células MV4;11 foram cultivadas em FBS a 10% contendo mei-os com várias concentrações (0 a 1 uM) do Composto 1 durante 48 horas.Os sobrenadantes foram coletados depois de centrifugação, e níveis deVEGF foram medidos por ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN). Concen-trações de proteína foram determinadas usando o ensaio de proteína BIO-RAD (Hercules, CA) e resultados foram normalizados a concentração deproteína.

Estudos de Eficácia in vivo

Camundongos SCID-NOD fêmeas (4 a 6 semanas de idade, 18a 22 g) foram obtidos de Charles River (Wilmington, MA) e aclimados duran-te 1 semana em recinto livre de patógeno antes do início do estudo. Animaisreceberam comida de roedor estéril e água ad libitum e foram alojados emgaiolas de tampo de filtro estéril com ciclos de claro/escuro de 12 horas. To-dos os experimentos estavam sob as normas da Association for Assessmentand Accreditation of Laboratory Animal Care International.

Modelo Subcutáneo

Células MV4;11 e RS4;11 foram inoculadas de tumores subcu-tâneos (s.c.) em camundongos SCID-NOD. Células (5 x 106 célu-las/camundongo) foram reconstituídas com Matrigel a 50% (Becton Dickin-son) e implantadas s.c. dentro do flanco direito de camundongos SCID-NOD.Tratamentos foram iniciados quando tumores eram de 200 a 1000 mm3, talcomo delineado em projetos de estudo específicos. Camundongos foramaleatoriamente designados dentro de coortes (tipicamente 10 camundon-gos/grupo para estudos de eficácia e 3 a 5 camundongos/grupo para estu-dos farmacodinâmicos (PD)). O Composto 1 foi administrado como uma so-lução por meio de gavagem oral. Volumes de tumor e pesos corporais foramavaliados 2 a 3 vezes semanalmente. Medições de calibrador de tumoresforam convertidas em volume médio de tumor usando a fórmula: 1/2 (com-primento x [largura ]2). Inibição de crescimento de tumor (TGI) em porcenta-gem foi comparada com camundongos tratados por veículo. Taxas de res-posta foram definidas como respostas completas CR (nenhum tumor palpá-vel) ou respostas parciais PR (50 a 99% de retrocesso) comparado ao volu-me de tumor em iniciação de tratamento.

Modelo de Enxertamento de Medula óssea 0 Intravenoso

Camundongos SCID-NOD foram irradiados (3 Gy) antes de inje-ção de veia da cauda de 1x107 de células MV4;11 em 0,2 ml de salina. Ostratamentos por Composto 1 ou veículo foram iniciados 3 semanas pós-inoculação celular. Camundongos foram monitorados diariamente e forameutanizados aquele momento sinais moribundos ou precoces de perda demotilidade de membro traseiro. Abrangência de vida aumentada (ILS) decamundongos tratados foi calculada como um aumento em porcentagem emtempo de sobrevivência médio (MST) vs. Camundongos de controle tratadospor veículo.

Modulação Alvo in vivo

Tumores s.c. de MV4;11 em camundongos SCID-NOD (n= 3camundongos/grupo) foram dirigidos a 300mm3 e tratamentos consistidosem ou veículo ou Composto 1 foram administrados oralmente em 10 mg/kgdurante 5 dias. Para caracterizar as propriedades de PD do Composto 1,amostras de tumor foram coletadas em várias vezes (N=3 camundongos/ponto do tempo) seguindo dosagem do Composto 1.

Imunoistoquímica

Tumores ressectados foram colocados em formalina tamponadaneutra a 10% durante a noite em RT, transferidos a etanol a 70% e proces-sados para incrustação de parafina usando um processador de tecido Ther-mo Electron Excelsior (Pittsburgh, PA). Amostras de osso (fêmur) foramdescalcificadas (ProtocolTM, Fisher Diagnostics, Middletown, VA). Blocos deparafina foram seccionados a 4 um de espessura e colocados em lâminasde vidro carregadas positivamente. Tecidos foram manchados usando umamáquina de lâmina automatizada Discovery (Ventana Medicai Systems,Tucson, AZ). As lâminas foram tratadas com tampão de citrato (pH 6,0) emum vaporizador pressurizado para resgatar antígeno para manchamento deKi-67, pERK e PARP, e caspase-3 foi resgatada por reagente CC1 Ventana.Os anticorpos primários usados foram Ki-67 (diluição de 1:750, NovoCastraLaboratories, UK), pERK (diluição de 1:100, Biosource, Camarillo, CA), mito-côndria anti-humana (1:200, Chemicon, Temecula, CA), caspase-3 clivada(1:200, Cell Signaling) e PARP clivada (1:100, Biosource). Anticorpo secun-dário era um anticorpo biotinilado de anticoelho de cabra F (ab1) 2, diluiçãode 1:100 (Jackson ImmunoResearch). Lâminas foram contramanchadas comhematoxilina e montada com uma cobertura de vidro. Morfologia do tecidogeral foi também avaliada usando manchamento de hematoxilina e eosina.

Análises Estatísticas

Regressão linear foi desempenhada usando Excel da Microsoft(Redmond, WA). t-Teste do estudante foi usado para medir significancia es-tatística entre dois grupos tratamento. Múltiplas comparações foram feitasusando análise unidirecional da variância (ANOVA), e pós-testes comparan-do mecanismos de tratamento diferentes foram feitos usando teste de Stu-dent-Newman Keul (SigmaStat, San Rafael, CA). Para estudos de sobrevi-vência, teste de grau log foi usado para determinar significancia entre curvasde sobrevivência de vários tratamentos vs. grupos veículo (Prism, San Die-go, CA). Camundongos sacrificados com estado de saúde normal no términodo estudo foram considerados sobreviventes de longa duração e censuradosnesta análise. Diferenças foram consideradas estatisticamente significantesem p < 0,05.

RESULTADOS

Composto 1 Demonstra Inibição Potente de Atividade de Cinase de FLT3

A especificidade do Composto 1 foi testada contra um paineldiverso de RTKs usando ensaios de ligação competitiva por ATP com enzi-mas purificadas tal como descrito acima. O Composto 1 foi constatado seraltamente potente contra FLT3 (1 nM) com atividade nanomolar contra c-KIT(2 nM), VEGFR1/2/3 (10 nM); FGFR1/3 (8 nM); PDGFR8 (27 nM) e CSF-1R(36 nM) (Veja a seguinte Tabela). Para confirmar seletividade contra RTKsde Classe III, IV e V, o Composto 1 foi testado contra outras cinàses nas tri-lhas de PI3K/Akt e MAPK(K) e foi constatado possuir atividade insignificante(IC50 > 10 uM) (Veja a seguinte Tabela).

Tabela. Atividade de 4-Amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona Contra Várias RTKs

<table>table see original document page 79</column></row><table>Os ensaios de RTK in vitro usados para preparar a tabela acimaforam conduzidos com várias diluições de Composto 1 na presença de en-zimas purificadas e ATP tal como descrito acima. Substratos de peptídeofosforilado (1 |iM) foram incubados com anticorpos antifosfoespecíficos rotu-lados por Európio e Európio foi detectado usando fluorescência resolvidacom o tempo.

Efeitos Antiproliferativos Potentes de Composto 1 em Células MV4;11 (FLT3 ITD)

Para determinar se inibição de FLT3 traslada na inibição decrescimento in vitro, a atividade de Composto 1 foi testada contra célulasMV4;11 e RS4;11 usando o ensaio de MTS (figura 5). Composto 1 potente-mente inibiu a proliferação de células MV4;11 de uma maneira dependentede dose com EC50 = 13 nM. Ainda que efeitos dependentes de concentraçãosimilares na proliferação fossem observados com células RS4;11, eles eramaproximadamente 24 vezes menos sensíveis ao Composto 1 (EC50 = 315nM). Efeito antiproliferativo do Composto 1 foi também testado nas célulasmutantes de FLT3 ITD, MOLM13 e MOLM14 com concentrações de EC5osimilares àquelas vistas com MV4;11 (EC50 ~ 6 nM) (dados não mostrados).Estes dados sugerem que o Composto 1 é ativo em ambas as células leu-cêmicas FLT3 ITD e WT, com o receptor constitutivamente ativo sendo maissensível a inibição (figura 5).

Efeitos In Vitro 6o Composto 1 na Sinalização Mediada por FLT3 em CélulasLeucêmicas

A atividade celular in vitro de Composto 1 foi investigada em du-as linhagens de célula leucêmica humana MV4;11 e RS4;11 com compara-ção de estado mutacional de FLT3 (confirmada usando RT-PCR, dados nãomostrados). Células MV4;11 possuem uma mutação de duplicação tandeminterna (ITD) no receptor de FLT3, resultando em FLT3 constitutivamenteativado. Levis M. e outros, Blood, 99:3885-3891 (2002); 0'Farrell A.M. e ou-tros, Blood, 101:3597-3605 (2003). Esta ativação resulta em autofosforilaçãode FLT3 na ausência de estimulação de ligando exógeno (figura 6, faixa 1).Células MV4;11 privadas de soro foram tratadas com Composto 1 durante 3horas, e efeitos diretos em ativação de receptor de FLT3 foi determinada poranálise de seu estado de fosforilação. Exposição de células MV4;11 a con-centrações de aumento de Composto 1 potentemente inibiram pFLT3 deuma maneira dependente de dose com EC50 entre 1 a 10 nM (figura 6).

Enquanto FLT3 ITDs são predominantes em aproximadamente20% de explosões de paciente de AML, a maior parte das leucemias agudasexpressa WT FLT3. Os efeitos de Composto 1 em células RS4;11 leucêmi-cas foram também investigados (FLT3 WT) (figura 7) seguindo ligando deFLT3 exógena (100 ng/ml, 15 minutos) para ativar fosforilação de receptorde FLT3 (figura 7, faixa 1 vs. 2). Composto 1 diminuiu níveis de pFLT3 emcélulas RS4;11 (figura 7). No entanto, comparativamente, concentraçõeselevadas foram requeridas para modulação de WT FLT3 vs. ITD. Inibiçãocompleta foi obtida com concentrações > 0,5 uM (figuras 6 e 7).

Composto 1 Modula ERK e STAT5, Alvos A jusante de Inibição de FLT3

Para também caracterizar os efeitos de Composto 1 em inibiçãode FLT3, modulação de alvos a jusante de FLT3, isto é, STAT5 e ERK, osquais são proteínas chave na sobrevivência e proliferação celular foi investi-gada. Células MV4;11 foram tratadas com concentrações de aumento deComposto 1 durante 3 horas e processadas por citometria de fluxo e Manchado Oeste para detecção de pERK e p-STAT5 (figuras 8 e 9). Em célulasMV4;11, devido a sinalização ativa de FLT3, as células possuem níveis ba-sais altos de pERK e pSTAT5 (figuras 8 e 9). Composto 1 inibiu fosforilaçãode ERK (figura 8) e STAT5 (figura 9) de uma maneira dependente de dose.Inibição substancial de pERK e pSTAT5 (>50%) foi observada em concen-trações > 0,1 uM (fluxo citométrico e Mancha do Oeste). Os efeitos inibitóriosde Composto 1 em pERK e pSTAT5 foi mais potente em células MV4;11comparado a RS4;11 estimuladas por ligando de FLT3 (dados não mostrados).

Composto 1 Inibe Produção de VEGF Autócrino em Células MC4;11 In VitroPara motivar o efeito de Composto 1 em produção de VEGF invitro, um ELISA foi desempenhado em sobrenadantes de cultura de MV4;11(figura 10). Nestes experimentos, células MV4;11 foram cultivadas em FBS a10% contendo meios com concentrações de aumento (0 a 1 uM) de Com-posto 1 durante 48 horas. Na ausência de tratamento de fármaco, célulasMV4;11 secretam VEGF substancial (180 pg/ml), enquanto que, Composto 1inibia produção de VEGF de uma maneira dependente de dose, com umaEC50 entre 0,001 e 0,01 uM e inibição completa em concentrações > 0,5 uM(figura 10).

Composto 1 Modula Sinalização de FLT3 In Vivo

Para examina modulação alvo in vivo, aos camundongos por-tando tumor de MV4;11 (dirigidos a 300 até 500 mm3) foram administradosComposto 1 (10 mg/kg/d) ou veículo durante 5 dias. Tumores foram colhidosdepois de selecionados os pontos do tempo, homogenizados e analisadosquanto a níveis de pFLT3 e pSTAT5 através de IP/Mancha do Oeste. Redu-ções significantes em níveis de pFLT3 e pSTAT5 foram observadas tão pre-coce como 4 horas pós dose com ou uma única dose (dados não mostrados)ou múltiplas doses de Composto 1 (figura 11), sem efeitos na proteína deFLT3 ou STAT5 total (figura 11). Fosforilação de ambos os FLT3 e STAT5declinou relativa a linha de base alcançando uma inibição máxima de -90%em 8 horas pós dose e permaneceu suprimida durante 24 horas (-85% deinibição). Fosfo-FLT3 retornou mais perto aos níveis de linha de base, en-quanto que, p-STAT5 foi ainda inibido (-60% de inibição) 48 horas pós dose(figura 4). Diminuições em níveis de pERK foram também observadas, indi-cando bloqueio de sinalização de FLT3 a jusante (dados não mostrados).

Estudos de Eficácia In Vivo

Efeitos de Resposta a Dose do Composto 1 em Tumores de MC4;11 eRS4;11 In Vivo

Para verificar se os efeitos in vitro de Composto 1 correlacio-nam-se com inibição de crescimento de tumor in vivo, eficácia de Composto1 foi examinada contra xenoenxertos de tumor de MV4;11 ou RS4;11 emcamundongos SCID-NOD. Camundongos foram implantadas s.c, com célu-las de tumor e tratamentos de Composto 1 foram iniciados quando tumoreseram 200 a 300 mm3. Em estudos de eficácia de resposta a dose, o Com-posto 1 foi administrado oralmente em uma faixa de dose de 1 a 30 mg/kg/dpara tumores de MV4;11, e 10 a 150 mg/kg/d para tumores de RS4;11.

Composto 1 foi altamente potente contra tumores de MV4;11,revelando um bom efeito de resposta a dose com significante inibição decrescimento de tumor em doses > 5 mg/kg/d (figura 12). Doses de 30mg/kg/d induziram regressão de tumor (9/10 respostas de tumor), as quaisconsistiram de tanto respondedores parciais quanto completos (1CR, 8PR).Modesta inibição de crescimento de tumor foi observada em 1 mg/kg/d(23%) depois de 2 semanas de dosagem, e foi identificada como a dose es-tatisticamente eficaz mínima neste modelo (p< 0,01 vs. Veículo). Em ca-mundongos portando tumores de RS4;11, tratamento com Composto 1 re-sultou em inibição de crescimento de tumor, no entanto nenhuma regressãofoi observada (figura 13). Os efeitos inibitórios de Composto 1 foram maispotentes contra tumores de MV4;11 comparado a tumores de RS4;11, defi-nido pelas respectivas doses eficazes mínimas em cada um modelo (dia 8:100 mg/kg/d; 48 % de TGI, p<0,01 contra tumores de RS4;11 vs. 1 mg/kg/d;23% de TGI, p<0,01 contra tumores de MV4;11).

Horários de Dose Alternada de Composto 1 são Igualmente Potentes

Os efeitos de doses intermitentes e cíclicas de Composto 1 con-tra tumores de xenoenxerto de MV4;11 foram também examinados (figura14). O Composto 1 foi administrado oralmente em 30 mg/kg diariamente, diasim, dia não (q.o.d.), ou ciclicamente, 7 dias sim seguidos por 7 dias nãodurante 2 ciclos (figura 14). Similar a dosagem diária, regimes de dosagemintermitentes produziram significantes regressões de tumor dentro dos diasde tratamento de fármaco (>94% TGI). Todos os três regimes resultaram ematividade antitumor equivalente (dia 29, p>0,05) e números de respostas vis-tos com q.o.d. (6PR) e 7 dias sim/7 dias não (9PR) foram similares àquelesvistos com tratamento diário (1CR, 9PR).

Composto 1 é Eficaz Contra Grandes Tumores de MV4;11

Os efeitos de Composto 1 em grandes tumores de MV4;11 detamanhos variados; 300, 500 ou 1000 mm3 foram também investigados. Tra-tamento com Composto 1 (30 mg/kg/d) induziu significante regressão emtodos os tumores de MV4;11 a qual foi independente de tamanhos de tumoriniciais no início de tratamento (figura 15). Regressões de tumor foram evi-dentes dentro de 3 a 5 dias de tratamento de fármaco. Todos os tumorestratados responderam (n=27), com 15% de respostas completas e 70% derespostas parciais. Os 15% restantes eram respostas menores ou permane-ceram estáveis. A dosagem foi descontinuada depois de 50 dias. Nenhumtumor regrediu durante o tratamento de 50 dias, indicando resistência contra

0 Composto 1 que não desenvolvia. A durabilidade de respostas depois dedescontinuação de tratamento foi também examinada. Uma CR e aproxima-damente 50% das PRs eram duráveis durante 40 dias depois de cessaçãode dosagem de Composto 1. Dez tumores que regrediram (para 600 a 2000mm3) foram re-tratados com 30 mg/kg/d de Composto 1 iniciando em dia 90do estudo (40 dias depois de cessação de dosagem) e continuados durante60 dias. Todos os tumores foram responsivos ao segundo ciclo de Composto1 (2 CR, 8 PR), indicando claramente uma falta de resistência de tumor aComposto 1 (figura 16).

Avaliação Histológica de Atividade Biológica In Vivo

Além de metas de modulação de volume de tumor e alvo, leitu-ras imunohistoquímicas foram usadas como indicadores de atividade defármaco (figuras 17 a 19). Efeitos temporais de administração de Composto1 (30 mg/kg/d) foram investigados em tumores de MV4;11 depois de 1 ou 5doses (figura 17). Avaliação morfológica usando manchamento de H&E, re-velou que tumores tratados por veículo consistiam de células de tumor deMV4;11 com hipercelularidade marcada indicativo de hiperplasia mielóide(figura 17-uma). Células de tumor manchadas fortemente com Ki67 indican-do uma composição de tumor de células altamente proliferantes (figura 17-b). Durante 24 horas depois de dosagem, tumores tratados com Composto 1mostraram uma redução em células densamente acondicionadas e consisti-ram de áreas esparsas de células apoptóticas/necróticas (dia 1, figura 17-avs. f). Áreas de apoptose/ necrose eram mais pronunciadas depois de 5 do-ses com significantes áreas de coincidente tumor não viável com mancha-mento Ki67 de reduzido (figura 17-g). Modulação alvo foi confirmada in vivode manchamento imunohistoquímico de pERK. Fosfo-ERK foi significante-mente diminuída em tumores tratados por Composto 1 durante o período dedosagem de 5 dias corroborando análises do Oeste de pERK em tumores(figura 17-c vs. h). Apoptose induzida por Composto 1, evidenciada de man-chamento de caspase-3 ativada (figura 17-d vs. i) e PARP clivada (figura 17-e vs. j) aumentado em tumores no dia 5 comparado a controles tratados porveículo. Efeitos similares de celularidade e proliferação diminuída assim co-mo pERK reduzida foram evidentes em tumores de RS4;11 tratados comComposto 1 (30 mg/kg/d) (figura 18).

A histologia de tumores que foram ou definidos como respostasparciais (figura 19-c,d) ou completas (figura 19-e) foi também examinada.Respondedores completos foram totalmente destituídos de células de tumorde MV4;11, exibindo apenas restos de necrose e/ou tecido de cicatriz (figura19-e). Em respostas parciais, bolsas de células de tumor proliferantes positi-vas para Ki67 foram observados na periferia de tumores (figura 19-a,c vs. b,d).

Composto 1 Prolonga Tempo de Sobrevivência de Camundongos PortandoCélulas de Leucemia Humanas Disseminadas

A eficácia do Composto 1 foi testada no modelo de leucemia deMV4;11 no qual células foram inoculadas na veia da cauda dos camundon-gos SCID-NOD irradiados (figura 20). Neste modelo, células MV4;11 disse-minam-se para a medula óssea (), imitando patologicamente um padrão dedoença similar a leucemia humana. Camundongos foram injetados com célu-las MV4;11 no dia 1 e tratamentos de Composto 1 (20 mg/kg, diariamente ou7 dias sim/7 dias não, n= 10 a 12/grupo) foram iniciados no dia 23, depois deenxerto de células MV4;11 em . Camundongos de controle (tratados por veí-culo) tipicamente obtêm paralisia de membro traseiro como uma conseqüên-cia de células de tumor infiltrando a BM, com um tempo de sobrevivênciamédio (MST) de 51 dias (figura 20). Em estudos de sobrevivência, tratamen-to diário com Composto 1 (dia 23 a 100) significantemente atrasou o tempopara progressão de doença (MST = 134 dias) comparado a controles trata-dos por veículo (MST = 51 dias) (p < 0,0001), demonstrando uma abrangên-cia de vida aumentada (ILS) de 163% (figura 20). Admiravelmente, com tra-tamento de Composto 1 diário, 4 camundongos foram sobreviventes de lon-ga duração (MST > 160 dias). Análises histológicas e citometria de fluxo fo-ram usadas para quantificar a % de enxertamento de células MV4;11 em BM(figura 21). Em análises citométricas de fluxo, células MV4;11 humanas fo-ram identificadas em BM de camundongo com um anti-humano HLA-A,B,Canticorpo o qual liga-se a um epitopo em MHCI humano. Em camundongostratados por veículo, aproximadamente 2 a 19% de células de BM isoladastotais consistidas em células MV4;11 enxertadas (dia 51, figura 21-a). Isto foitambém corroborado por imunoistoquímica com um anticorpo a mitocôndriahumana o qual mancha células MV4;11 identificando as células humanas namatriz de BM do camundongo (figura 21-b,c). Composto 1 dosado diaria-mente (20 mg/kg) durante 25 dias significantemente reduziu carga leucêmica(< 1% de células MV4;11 em BM) vs. tratamento por veículo (figura 21-a vs.d). Interessantemente, sobrevivência de camundongos depois de tratamentode Composto 1 imunohistoquimicamente não mostrou nenhuma evidênciade células de tumor (visto como uma ausência de células positivas mitocon-driais anti-humanas no dia 167) na BM e foi definida como "curas" (figura 21-e,f). Dosagem cíclica de Composto 1 (7 dias sim/7 dias não, 5 ciclos) tam-bém resultou em tempos de sobrevivência significantemente aumentados(MST = 118 dias, ILS de 131 % vs. veículo, p = 0,0001), mas não foi tão efi-caz quanto o regime diário (p= 0,007, figuras 20 e 21).

DISCUSSÃO

Alvejamento de trilhas de sinalização de cinase intracelular a-normais implicado na proliferação de célula de tumor pode interromper pro-cessos celulares e causar inibição de crescimento de tumor. Isto foi exempli-ficado pela aprovação de dois agentes alvejados de molécula pequena ima-tinib (Gleevec) em CML (Bcr-Abl) e tumores estromais gastrointestinais (c-KIT) e gefitinib (Irressa) em câncer de pulmão de célula não pequena (EG-FR) avançado ou metastático refratário. Druker B.J. Oncogene, 21:8541-8546 (2002); Giaccone G. Clin Câncer Res. 10:4233S-4237S (2004). Ambosos compostos alvejam defeitos moleculares específicos em células de tumore este sucesso tem dirigido pesquisa em terapias alvejadas moleculares pa-ra outras cinases oncogênicas, incluindo FLT3 15,20-23. Mutações no genede FLT3 são a mais comum alteração genética em AML, onde quase 35%de pacientes alojam mutações ativadoras. Mutações de FLT3 mostraramconferir um prognóstico clínico fraco desta forma implicando FLT3 como umalvo terapêutico em AML. Thiede C. e outros, Blood, 99:4326-4335 (2002);Schnittger S, e outros, Blood, 2002;100:59-66 (2002).

O Composto 1 é um inibidor de cinase multialvejada com potên-cia nanomolar contra RTKs de classe III, IV e V envolvidas em proliferaçãode tumor e angiogênese. Ensaios de cinase bioquímicos demonstram que oComposto 1 tem atividade potente contra FLT3 (IC5o de 1 nM). A atividadede Composto 1 em duas linhagens de células leucêmicas foi caracterizadacom comparação de estado de FLT3, MV4;11 (FLT3 ITD) e RS4;11 (FLT3WT). Composto 1 mostrou reduzir fosforilação de FLT3 de uma maneira de-pendente de dose, confirmando atividade molecular em células. Composto 1in vitro bloqueou subseqüente sinalização a jusante de moléculas em trilhasde MAPK e STAT5 mitogênica, ambos os reguladores chave em trilhas proli-ferativas de célula. Interessantemente, atividade em modulação alvo deFLT3 foi mais pronunciada em células MV4;11 do que RS4;11 tal como fo-ram os efeitos do Composto 1 em ensaios de citotoxicidade/proliferação ce-lular. Efeitos diferenciais similares contra FLT3-ITD e FLT3 do tipo silvestreforam relatados para outros inibidores de FLT3. Pode ser justificado que cé-lulas MV4; 11 de FLT3 ITD possuem sinais constitutivamente ativos (Ras,STAT5) os quais dirigem proliferação celular, e diferem de células (RS4;11)de FLT3 WT as quais podem sustentar crescimento independente de ativa-ção de FLT3 e/ou podem contar com outras trilhas oncogênicas. Minami Y. eoutros, Blood, 102:2969-2975 (2003); Kiyoi H. e outros, Oncogene, 21:2555-2563 (2002); Spiekermann K. e outros, Clin Câncer Res. 9:2140-2150(2003).

Os resultados de estudos in vivo demonstraram que Composto 1tem atividade potente contra ambos os modelos de tumor sólido e BM dis-seminada de leucemia. A atividade molecular de Composto 1 em modelospré-clínicos foi motivada usando metas de PD para estudar a extensão eduração de modulação alvo. Composto 1 mostrou sub-regular substancial-mente ambos pFLT3 e pERK em tumores de MV4;11. Modulação alvo (p-FLT3) foi observada por 4 horas e foi prolongada em tumores até 24 horasseguinte a uma única dose ou múltiplas doses de Composto 1. Efeitos bioló-gicos eram também evidentes da histopatologia de tumor, onde respostas deapoptose, proliferação e pERK diminuída em tumores foram observadasdentro de 1 a 2 dias de tratamento de fármaco. Em xenoenxertos de tumorsólido de MV4;11, regressões de tumor foram também pronunciadas dentrodos dias de tratamento de fármaco. É possível que efeitos inibitórios poten-tes de Composto 1 no modelo de MV4;11 possam surgir de inibição direta deFLT3 em combinação com inibição de outras RTKs. Os dados (RT-PCR, nãomostrados) indicam que células MV4;11 também expressam VEGFR1, cKIT,PDGFRp, FGFR1, CSF-1R 32, a totalidade das RTKs potentemente inibidaspelo Composto 1. O Composto 1 tem <10 nM de atividade contra cinases deVEGF1/2/3, e os dados claramente demonstram que Composto 1 pode inibirníveis de VEGF autócrino em culturas in vitro de MV4;11. Inibição autócrinaou parácrina in vivo de VEGF ou FGF secretado por células de tumor ou cé-lulas estromais de tumor (incluindo células endoteliais) pode inibir prolifera-ção e sobrevivência destas células. Ferrara N. e outros, Nat Med.,9:669-676(2003); Compagni A. e outros, Câncer Res. 60:7163-7169 (2000); CarmelietP. Nat Med., 9:653-660 (2003). Atividade adicional do Composto 1 em tumo-res sólidos pode surgir de seus efeitos potentes contra PDGFR(3 através deimpacção de recrutamento e maturação de pericito de vasos sangüíneosdurante angiogênese. Carmeliet P. Nat Med. 9:653-660 (2003); Ostman A.Cytokine Growth FactorRev., 15:275-286 (2004). No modelo de BM de AML,nós demonstrou-se que Composto 1 melhorou sobrevivência de camundon-gos e em alguns camundongos erradicou a doença. Isto representa o poten-cial do Composto 1 para erradicar tanto blasts circulantes quanto doença deBM por efeitos antiproliferativos diretos ou regulação de angiogênese demedula óssea, o qual pode desempenhar um papel na sobrevivência deblast. Carow CE. e outros, Blood, 87:1089-1096 (1996); Drexler H.G. Leu-kemia, 10:588-599 (1996).Com base na farmacologia e inibição alvo do Composto 1, horá-rios de dose intermitentes e cíclicos de Composto 1 foram estudados. Horá-rios de dosagem alternados do Composto 1 demonstraram atividade similarcomparada a doses diárias do Composto 1, sugerindo o potencial para regi-mes de dosagem flexível na clínica. Doses múltiplas de Composto 1 foramcapazes de suprimir continuamente crescimento de tumores e qualquer re-corrência de tumores depois que a cessação do tratamento foi constatadaser igualmente sensível a retratamento com fármaco. Estes resultados sãorelevantes se trasladados na rotina clínica, tal como alguns pacientes deAML mostraram reincidir no tratamento com inibidores de cinase a despeitode tratamento continuado. Fiedler W. e outros, Blood, (2004); Cools J. e ou-tros, Câncer Res. 64:6385-6389 (2004). Múltiplos mecanismos incluindo me-tabolismo ou efluxo celular (por meio de expressão de transportadores defármaco tais como P-glicoproteína), ou mutações nos domínios de ligação deATP dos sítios ativos de enzima que interferem com ligação de fármacomostraram correlacionar-se com resistência a inibidores de cinase. Bagrint-seva K. e outros, Blood, 103:2266-2275 (2004); Grundler R. e outros, Blood,102:646-651 (2003). O Composto 1 não é um substrato de P-GP, e as res-postas duráveis ao longo do curso do tratamento de fármaco podem implicarque o desenvolvimento de resistência possa ser evitado com Composto 1.

O desenvolvimento clínico de inibidores de FLT3 (SU11248PKC412, CEP-701, MLN518) para AML está ainda em fases precoces.0'Farrell A.M. e outros, Clin. Câncer Res. 9:5465-5476 (2003); Fiedler W. eoutros, Blood, (2004); Stone R.M. e outros, Ann Hematol. 83 Suppl 1 :S89-90(2004); Smith B.D. e outros, Blood, 103:3669-3676 (2004); DeAngelo D.J. eoutros, Blood, 102:65a (2003). Seleção de terapias de agente único aindanão produziu respostas significantes, e o desenvolvimento clínico futuro deinibidores de FLT3 em AML pode depender da combinação destes agentescom ou fármacos citotóxicos ou outros agentes alvejados moleculares. Osdados relataram aqui quanto ao Composto 1, um inibidor de FLT3 potentecom atividade adicional em RTKs conhecidas desempenhar papéis na pato-gênese de AML permite sua avaliação clínica.ATIVIDADE CONTRA CÂNCERES RESISTENTES A FÁRMACO EM PACIENTES

Compostos de fórmula I, II, e III, tais como 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metil-piperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]-1H-quinolin-2-ona (Composto1), possuem atividade direta contra células de tumor e a formação e manu-tenção de vasos sangüíneos suportando tumores. Estes compostos possu-em também atividade oral mostrada em uma variedade de modelos animaisde tumor de angiogênese e metastases. Tal como mostrado na figura 22, aseletividade do Composto 1 inibe RTKs de Classe III, IV e V (Veja tambémTabela com valores de IC50). Administração do Composto 1 a camundongosnus possuindo xenoenxertos de tumor de cólon humano de KM12L4A estabi-lizados grandes forneceu regressão e/ou estabilização de doença em 90 a100% de animais tratados (Veja figura 23).

Estudos de rótulo aberto de multicentro de escala de dose deFase I foram conduzidos para avaliar a segurança, farmacocinética, e farma-codinâmicos do Composto 1 em sujeitos com malignidades sólidas avança-das. Além disso objetivos primários dos estudos incluíam: 1) determinaçãoda Dose Tolerada Máxima (MTD); 2) identificação da Dose limitantes Toxici-dade (DLT); e 3) avaliação da segurança "provil" em sujeito com tumoressólidos avançados. Objetivos secundários do estudo incluáam: 1) avaliaçãofarmacocinética; 2) avaliação do farmacodinâmicos no plasma, linfócitos dosangue periféricos, urina, e células de tumor; 3) recomendação de dose ehorário para investigações futuras; e 4) determinação de evidência de ativi-dade antitumor (RECIST).

Detalhes quanto à este estudo são apresentados abaixoRegimes de Dosagem incluídos:

Dosagem diária única 7 dias sim / 7 dias não, repetida (doses de 25 a100 mg)

Um ciclo de doses > 100 mg de 7 dias sim / 7 dias não, seguido pordosagem diária contínua depois disso

Escala de Dose:

3 a 4 pacientes por coorte, duplicação de dose até que > toxicidade deGrau 2; em seguida esquema de Fibonacci modificadoCritérios de Inclusão:

• Tumores sólidos histologicamente ou citologicamente documentados,refratários a terapia padrão ou para os quais nenhuma terapia padrãocurativa existe

• Idade > 18 anos

• Estado de desempenho de ECOG 0 a 1

• Hemoglobina > 8,0 gm/dL; Neutrófilos > 1.500/mm3; Plaquetas >75.000/mm3

• Creatinina < 1,5 x limite superior de (ULN) normal; Bilirrubina < 1,5 xULN; Fosfatase alcalina < 5 x ULN; Asparato aminotransferase (AST) <2,5 x ULN (exceto envolvimento de fígado < 5 x ULN); Amilase < ULN

• Consentimento informado assinalado

• Dose máxima de terapia antineoplásica (exceto para terapia hormonal)> 21 dias

Critérios de Exclusão:

• Edema intracranial, metástase ou doença epidural

• Doença cardíaca clinicamente significante (NYHA Classe III ou IV); ar-ritmia pré-existente; insuficiência cardíaca congestiva; cardiomiopatia;interval de Qtc > 450 msec (machos) e > 470 msec (fêmeas) ou > G2LVEF (por MUGA ou ecocardiograma)

• Diabetes melito (requerendo medicação crônica) com sinais de doençavascular periférica clinicamente significante

• Pericardite prévia; infusão pleural clinicamente significante nos 12 me-ses anteriores ou ascite recorrente requerendo > 2 intervenções / mês.

• Síndrome de mal-absorção ou toxicidades de Gl não controladas (náu-sea, diarréia, vômito > G2). Pancreatite aguda ou crônica anterior dequalquer etiologia.

• Obstrução biliar intra- ou extra-hepática anterior dentro dos 12 mesesprévios ou história de obstrução maligna requerendo uma sonda biliar,a menos que estavelmente tratada sem nenhuma obstrução ou blo-queio prévio da sonda.Definição de DLT/MTD:

• G4 neutropenia < 5 dias ou neutropenia febril; G4 trombocitopenia

• G4 fadiga, ou um declínio de dois pontos no estado de desempenho deECOG

• G3 ou náusea maior e/ou vômito a despeito do uso de intervenção mé-dica adequada/máxima e/ou profilaxia

• G3 ou toxicidade não-hematológica máxima (exceto fadiga)

• G2 ou toxicidade cardíaca maior de significância clínica (por exemploum declínio no EF restante para 40% < 50% ou diminuição de fraçãopara 15% < 24%; troponina cardíaca T/l > 0,05 ng/MI

MTD: nível de dose abaixo do que > 2/6 pacientes experimentam DLT

Características do Paciente

<table>table see original document page 92</column></row><table>Características do Paciente (continuação)

<table>table see original document page 93</column></row><table>

Matrícula contínua Eventos adversos clínicos relacionados a Fármaco maior do que ou igual a G2:

<table>table see original document page 93</column></row><table>

**DI_t Evidência de atividade antitumor de Composto 1 foi observadacomo 7/22 (32%) de pacientes tinham doença estável (SD) em sua primeiraavaliação. Além disso, SD para mais do que 4 meses foi relatada em 4 paci-entes, incluindo um paciente com um tumor de glândula parótida (mais doque 7 meses) e um paciente de GIST refratário a Gleevec (mais do que 6meses). A figura 24 é uma imagem PET-CT de escaneada do paciente comGIST refratário a Gleevec a qual mostra uma diminuição significante na cap-tação durante tratamento com Composto 1, comparado ao tempo de terapiasugerindo um efeito de tratamento de Composto 1. Informação adicionalquanto à este paciente e o protocolo de tratamento é apresentado abaixo:

Paciente fêmea, com uma diagnose de Tumor Estromal Gastro-intestinal (GIST). Paciente tinha sido previamente tratado como segue:

Fármaco Dose Comentários

Gleevec Dose diária total entre 200 a 800 mg

BAY43-9006 400 mg duas vezes diariamente doença progressiva

Brostalicina 18 mg uma vez diariamente

Gleevec 100 mg dias alternados resistente a fármaco

Brostalicina 12,8 mg uma vez diariamente

O paciente foi matriculado no estudo de acordo com os critériosde inclusão e exclusão do protocolo em 2 de junho de 2004, tal como apre-sentado acima.

Registro de tratamento de Composto 1:

Dose Freqüência Horário

75 mg uma vez diariamente 7 dias em tratamento)/7 dias não10Omg uma vez diariamente 7 dias em tratamento)/7 dias não

O paciente recebeu uma dose total de 9,625 mg (veja tabela fe-chada). O paciente alcançou estável doença (SD) enquanto em tratamentocom Composto 1 (oito ciclos concluídos).

Tal como mostrado na figura 25, exposição de plasma aumentaproporcionalmente com dose de Composto 1 em pacientes. Exposição deplasma no grupo dose de 100 mg aproxima-se da faixa onde eficácia pré-clínica foi notada.

Estudos foram realizados para identificar um marcador farmaco-dinâmico (PD) para atividade biológica de Composto 1 usando leucocitos desangue periférico (PDL) como um tecido substituto em pacientes de tumorsólido onde há acesso limitado ao tecido alvo.

Desenvolvimento Racional e de Ensaio:

• fosforilação de ERK é um efeito a jusante bem caracterizado de ativa-ção de RTK e Composto 1 modula fosforilação de ERK em células detumor e endoteliais.

• para determinar se Composto 1 afeta ativação de ERK em PBL, san-gue de doadores normais foi tratado ex vivo com Composto 1. Nenhu-ma estimulação exógena com PMA ou PHA foi adicionada.

• Inibição dependente de dose em pERK endógena foi observada atra-vés de ensaios de Mancha do Oeste e citometria de fluxo depois de in-cubação de PBL com Composto 1 (Veja figura 26), sugerindo que esteensaio pode ser útil em testes clínicos para mostrar que Composto 1está modulando seus alvos.

O Composto 1 foi testado contra um painel de cinases, incluindouma forma mutante de ABL (T315I) que foi constatada ser resistente a Glee-vec e outros inibidores de cinase. Veja Shah, N.P. Science, 305, p. 399(2004); e LaRosse, Câncer Res. 67, p. 7149-7153 (2002). O resíduo de T315em ABL é conhecido como o "resíduo porteiro" e está localizado em um poc-ket hidrofóbico na estrutura de ABL. Este resíduo, assim como posições aná-logas deste resíduo em outras cinases tais como, mas não limitado a, Flt-3,KIT, PDGFRa, EGFR, e outros mais, é freqüentemente encontrado em paci-entes que reincidiram em certos inibidores de cinase, tais como pacientesque tornaram-se resistentes a certos agentes quimioterapêuticos tais comoGleevec, Iressa, Tarceva, e outros. Desta forma, há uma necessidade médi-ca por estratégias de tratamento alternativo para estes pacientes que torna-ram-se resistentes a estes fármacos. Composto 1 foi constatado inibir o mu-tante T315I de ABL com um valor de IC5o de 0,0184 micromolar quandocomparado a > 10 micromolar para Gleevec e 0,371 micromolar paraSU11248. ABL é uma tirosina cinase citoplasmática. Por esse motivo, oscompostos da invenção possuem a capacidade de inibir cinases mutantesincluindo tirosina cinases receptoras e tirosina cinases citoplasmáticas.

Compostos de Fórmula I, II, e III podem ser usados em pacientes com estamutação em ABL, ou como um tratamento alternativo, ou como um trata-mento concorrente com outros fármacos anticâncer. Composto 1 tambémtem sido testado contra uma forma mutante de FLT3 (D835Y). Este resíduoé freqüentemente mutado em pacientes com malignidades hematológicas.Veja Yamamoto, Y. Blood, 97, 2434 (2001). Desta forma, os compostos deFórmula I, II, e III tais como Composto 1 podem também ser usados paratratar pacientes com esta mutação. Mutação do resíduo porteiro em EGFRrecentemente tem sido relatado em pacientes de câncer de pulmão tratadoscom gefitinib (Iressa). Veja Pao W., PLos Med. 2(3):e73 (2005). Composto 1é testado contra outras cinases com mutações no "resíduo porteiro". Com-posto 1 é útil em tratamento de pacientes de câncer com estas mutações. Aseguinte tabela mostra valores de IC5o de Composto 1 comparado com Gle-evec e SU11248.

<table>table see original document page 96</column></row><table><table>table see original document page 97</column></row><table>

O ensaio para determinação da IC5o de ABL (T315I) foi realizadousando o seguinte procedimento. Em um volume de reação final de 25 [lL,Abi (T315I) (h) (5-10 mU) é incubado com 8 mM de MOPS pH 7,0, 0,2 mMde EDTA, 50 fiM de EAIYAAPFAKKK (SEQ ID NO. 7), 10 mM de Mgacetatoe ATP gama-rotulado por 33P (atividade específica aproximadamente 500cpm/pmol, concentração tal como requerido). A reação é iniciada pela adiçãoda mistura de MgATP. Depois de incubação durante 40 minutos em tempe-ratura ambiente, a reação é parada pela adição de 5 jiL de uma solução deácido fosfórico a 3%. 10 jj.L da reação são em seguida manchados sobre umfiltro P30 mat e lavados três vezes durante 5 minutos em 75 mM de ácidofosfórico e uma vez em metanol antes de secagem e contagem de cintilação.

Outros compostos de fórmula I tais como compostos de fórmulaII e fórmula III foram preparados tal como descrito acima e nas referênciascitadas aqui. Estudos usando estes compostos são realizados usando a me-todologia descrita acima para 4-amino-5-flúor-3-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H-benzimidazol-2-il]quinolin-2(1H)-ona. Estes estudos mostrarão que estescompostos são também úteis em tratamento de câncer, incluindo câncer re-sistente a fármaco, em pacientes camundongos, humanos, e outros mamífe-ros e podem ser usados em combinação com os fármacos anticâncer descri-tos aqui.

Deve ser entendido que os compostos orgânicos de acordo coma invenção podem exibir o fenômeno do tautomerismo. Como as estruturasquímicas dentro deste relatório descritivo podem apenas representar umadas possíveis formas tautoméricas em um tempo, deve ser entendido que ainvenção abrange qualquer forma tautomérica da estrutura desenhada. Porexemplo, o composto possuindo a fórmula IIIB é mostrado abaixo com umtautômero, Tautômero IlIBa:

<formula>formula see original document page 98</formula>

Outros tautômeros do composto possuindo a fórmula IIIB, Tau-tômero IIIIBb e Tautômero IIIIBc, são mostrados abaixo:<formula>formula see original document page 99</formula>

Os conteúdos de cada uma das patentes, pedidos de patente eartigos de jornal citados acima são por meio deste incorporado através dereferência aqui e para todos os propósitos como se inteiramente apresenta-dos em suas totalidades.

É entendido que a invenção não é limitada às modalidades a-presentadas aqui para ilustração, mas abrange todas as tais formas destescomo aproxima-se dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims (72)

1. Método para tratar câncer resistente a fármaco, compreen-dendo: administrar a um indivíduo em necessidade deste, um composto defórmula I, um tautomero do composto, um sal do composto, um sal do tau-tômero, uma mistura destes, ou uma composição farmacêutica compreen-dendo o composto, o tautomero, o sal do composto, o sal do tautomero, ou amistura, em que o indivíduo é um paciente de câncer com câncer resistentea fármaco, e o composto de fórmula I tem a seguinte fórmula:em que:R1, R2, R3, e R4 podem ser iguais ou diferentes e são indepen-dentemente selecionados de grupos H, Cl, Br, F, I, -OR10, grupos -NR11R12,grupos alquila primários, secundários ou terciários substituídos ou não subs-tituídos, grupos arila substituídos ou não substituídos, grupos alquenila subs-tituídos ou não substituídos, grupos alquinila substituídos ou não substituí-dos, grupos heterociclila substituídos ou não substituídos, ou grupos hetero-ciclilalquila substituídos ou não substituídos;R5, R6, R7, e R8 podem ser iguais ou diferentes e são indepen-dentemente selecionados de grupos H, Cl, Br, F, I, -OR13, grupos -NR14R15,grupos -SR16, grupos alquila primários, secundários ou terciários substituí-dos ou não substituídos, grupos arila substituídos ou não substituídos, gru-pos alquenila substituídos ou não substituídos, grupos alquinila substituídosou não substituídos, grupos heterociclila substituídos ou não substituídos,grupos heterociclilalquila substituídos ou não substituídos, grupos alcoxial-quila substituídos ou não substituídos, grupos ariloxialquila substituídos ounão substituídos, ou grupos heterocicliloxialquila substituídos ou não substi-tu idos;R10 e R13 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, grupos heterociclila substituídosou não substituídos, grupos heterociclilalquila substituídos ou não substituí-dos, grupos alcoxialquila substituídos ou não substituídos, grupos ariloxial-quila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterocicliloxialquila substi-tuídos ou não substituídos;R11 e R14 podem ser iguais ou diferentes e são independenté-mente selecionados de grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclila substituí-dos ou não substituídos;R12 e R15 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclila substituí-dos ou não substituídos; eR16 é selecionado de grupos alquila substituídos ou não substitu-ídos, grupos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclilasubstituídos ou não substituídos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o indivíduoé administrado com um composto de fórmula II, um tautomero do composto,um sal do composto, um sal do tautomero, uma mistura destes, ou umacomposição farmacêutica compreendendo o composto, o tautomero, o sal docomposto, o sal do tautomero, ou a mistura, em que o composto de fórmulaII tem a seguinte fórmula e R7 é um grupo heterociclila substituído ou nãosubstituído:<formula>formula see original document page 102</formula>

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que R7 é umgrupo heterociclila substituído ou não substituído selecionado de um grupopiperidinila substituído ou não substituído, grupo piperazinila, ou grupo mor-folinila.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que R7 é umgrupo piperazinila de N-alquila substituído ou não substituído.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, em que R7 é umgrupo piperazinila de N-alquila substituído ou não substituído e o grupo al-quila da piperazinila de N-alquila compreende de 1 a 4 átomos de carbono.

6. Método de acordo com a reivindicação 1 , em que o indivíduoé administrado com um composto de fórmula III, um tautômero do composto,um sal do composto, um sal do tautômero, uma mistura destes, ou umacomposição farmacêutica compreendendo o composto, o tautômero, o sal docomposto, o sal do tautômero, ou a mistura, em que o composto de fórmulaIII tem a seguinte fórmula:<formula>formula see original document page 102</formula>

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-6, em que o sal de ácido lático do composto é administrado ao indivíduo.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, em que o câncer é resistente ao mesilato de imatinib (Gleevec).

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, em que o composto, o tautômero, o sal do composto, o sal do tautômero,a mistura, ou a composição farmacêutica é administrado ao indivíduo apósmesilato de imatinib (Gleevec) ter sido administrado ao indivíduo e o câncerno indivíduo ter sido descoberto ser resistente a mesilato de imatinib (Glee-vec).

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, em que o câncer é resistente a BAY43-9006.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, em que o composto, o tautômero, o sal do composto, o sal do tautômero,a mistura, ou a composição farmacêutica é administrado ao indivíduo apósBAY43-9006 ter sido administrado ao indivíduo e o câncer no indivíduo tersido descoberto ser resistente a BAY43-9006.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, em que o câncer é resistente à Brostalicina.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, em que o composto, o tautômero, o sal do composto, o sal do tautômero,a mistura, ou a composição farmacêutica é administrado ao indivíduo apósBrostalicina ter sido administrado ao indivíduo e o câncer no indivíduo tersido descoberto ser resistente à Brostalicina.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-13, em que o câncer é tumor estromal gastrointestinal (GIST).

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-13, em que o câncer é leucemia mielogenosa aguda.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-13, em que o câncer é selecionado de leucemia mielogenosa crônica, mie-loma múltiplo, ou carcinoma de célula renal.

17. Método para tratar câncer, compreendendo: administrar aum indivíduo em necessidade deste, um fármaco anticâncer selecionado demesilato de imatinib (Gleevec), BAY43-9006, Brostalicina, lenalidomida (Re-vlimid), talidomida (Thalomid), docetaxel (Taxotere), erlotinib (Tarceva), vata-linib (PTK-787), armadilha de VEGF, fenretidina, bortezomib, bevacizumab(Avastin), pertuzumab, e/ou rituximab, e um composto de fórmula I, um tau-tômero do composto, um sal do composto, um sal do tautômero, uma mistu-ra destes, ou uma composição farmacêutica compreendendo o composto, otautômero, o sal do composto, o sal do tautômero, ou a mistura, em que ocomposto de fórmula I tem a seguinte fórmula:<formula>formula see original document page 104</formula>em que:Pi1, R2, R3, e R4 podem ser iguais ou diferentes e são indepen-dentemente selecionados de grupos H, Cl, Br, F, I, -OR10, grupos -NR11R12,grupos alquila primários, secundários ou terciários substituídos ou não subs-tituídos, grupos arila substituídos ou não substituídos, grupos alquenila subs-tituídos ou não substituídos, grupos alquinila substituídos ou não substituí-dos, grupos heterociclila substituídos ou não substituídos, ou grupos hetero-ciclilalquila substituídos ou não substituídos;R5, R6, R7, e R8 podem ser iguais ou diferentes e são indepen-dentemente selecionados de grupos H, Cl, Br, F, I, -OR13, grupos -NR14R15,grupos -SR16, grupos alquila primários, secundários ou terciários substituí-dos ou não substituídos, grupos arila substituídos ou não substituídos, gru-pos alquenila substituídos ou não substituídos, grupos alquinila substituídosou não substituídos, grupos heterociclila substituídos ou não substituídos,grupos heterociclilalquila substituídos ou não substituídos, , grupos alcoxial-quila substituídos ou não substituídos, grupos ariloxialquila substituídos ounão substituídos, ou grupos heterocicliloxialquila substituídos ou não substi-tuídos;R10 e R13 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, grupos heterociclila substituídos-ou- não substituídos, grupos heteroGiclilalquila-substituídos ou não substituí-dos, grupos alcoxialquila substituídos ou não substituídos, grupos ariloxial-quila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterocicliloxialquila substi-tuídos ou não substituídos;R11 e R14 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclila substituí-dos ou não substituídos;R12 e R15 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclila substituí-dos ou não substituídos; eR16 é selecionado de grupos alquila substituídos ou não substitu-ídos, grupos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclilasubstituídos ou não substituídos.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o indiví-duo é administrado com um composto de fórmula II, um tautômero do com-posto, um sal do composto, um sal do tautômero, uma mistura destes, ouuma composição farmacêutica compreendendo o composto, o tautômero, osal do composto, o sal do tautômero, ou a mistura, em que o composto defórmula II tem a seguinte fórmula e R7 é um grupo heterociclila substituído ounão substituído:

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que R7 é umgrupo heterociclila substituído ou não substituído selecionado de um grupopiperidinila substituído ou não substituído, grupo piperazinila, ou grupo mor-folinila.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que R7 é umgrupo piperazinila de N-alquila substituído ou não substituído.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, em que R7 é umgrupo piperazinila de N-alquila substituído ou não substituído e o grupo al-quila da piperazinila de N-alquila compreende de 1 a 4 átomos de carbono.

22. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o indiví--duo é administrado com-u-m~composto.de fórmula-lll,-um tautomero do com-posto, um sal do composto, um sal do tautomero, uma mistura destes, ouuma composição farmacêutica compreendendo o composto, o tautomero, osal do composto, o sal do tautomero, ou a mistura, em que o composto defórmula III tem a seguinte fórmula:<formula>formula see original document page 106</formula>

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17a 22, em que o sal de ácido lático do composto é administrado ao indivíduo.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17a 23, em que o composto, o tautomero, o sal do composto, o sal do tautome-ro, a mistura, ou a composição farmacêutica é administrado ao indivíduo a-pós o fármaco anticâncer ter sido administrado ao indivíduo.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17a 23, em que o composto, o tautomero, o sal do composto, o sal do tautome-ro, a mistura, ou a composição farmacêutica é administrado ao indivíduo an-tes do fármaco anticâncer ter sido administrado ao indivíduo.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17a 23, em que o composto, o tautomero, o sal do composto, o sal do tautôme-ro, a mistura, ou a composição farmacêutica é administrado ao indivíduo aomesmo tempo que pelo menos um pouco do fármaco anticâncer é adminis-trado ao indivíduo.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17a 26, em que o fármaco anticâncer é mesilato de imatinib (Gleevec).

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17a 26, em que o fármaco anticâncer é BAY43-9006.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17a 26, em que o fármaco anticâncer é Brostalicina.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17a 29, em que o câncer é tumor estromal gastrointestinal (GIST).

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17a 29, em que o câncer é leucemia mielogenosa aguda.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17a 29, em que o câncer é selecionado de leucemia mielogenosa crônica, mie-loma múltiplo, ou carcinoma de célula renal.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, em que um estado de doença estável ou redução em tamanho de tumoré alcançado no indivíduo após administração do composto, o tautômero, osal do composto, o sal do tautômero, a mistura, ou a composição farmacêutica.

34. Composição terapêutica, compreendendo: um fármaco anti-câncer e um composto de fórmula I, um tautômero do composto, um sal docomposto, um sal do tautômero, ou uma mistura destes como uma prepara-ção combinada para uso simultâneo, separado, ou seqüencial no tratamentode um indivíduo que tem câncer resistente a fármaco, em que o compostode fórmula I tem a seguinte fórmula:<formula>formula see original document page 108</formula> em que:R1, R2, R3, e R4 podem ser iguais ou diferentes e são indepen-dentemente selecionados de grupos H, Cl, Br, F, I, -OR10, grupos -NR11R12,grupos alquila primários, secundários ou terciários substituídos ou não subs-tituídos, grupos arila substituídos ou não substituídos, grupos alquenila subs-tituídos ou não substituídos, grupos alquinila substituídos ou não substituí-dos, grupos heterociclila substituídos ou não substituídos, ou grupos hetero-ciclilalquila substituídos ou não substituídos;R5, R6, R7, e R8 podem ser iguais ou diferentes e são indepen-dentemente selecionados de grupos H, Cl, Br, F, I, -OR13, grupos -NR14R15,grupos -SR16, grupos alquila primários, secundários ou terciários substituí-dos ou não substituídos, grupos arila substituídos ou não substituídos, gru-pos alquenila substituídos ou não substituídos, grupos alquinila substituídosou não substituídos, grupos heterociclila substituídos ou não substituídos,grupos heterociclilalquila substituídos ou não substituídos, grupos alcoxial-quila substituídos ou não substituídos, grupos ariloxialquila substituídos ounão substituídos, ou grupos heterocicliloxialquila substituídos ou não substi-tuídos;R10 e R13 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, grupos heterociclila substituídosou não substituídos, grupos heterociclilalquila substituídos ou não substituí-dos, grupos alcoxialquila substituídos ou não substituídos, grupos ariloxial-quila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterocicliloxialquila substi-tuídos ou não substituídos;R11 e R14 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclila substituí-dos ou não substituídos;R12 e R15 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de. grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclila substituí-dos ou não substituídos; eR16 é selecionado de grupos alquila substituídos ou não substitu-ídos, grupos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclilasubstituídos ou não substituídos.

35. Composição terapêutica de acordo com a reivindicação 34,em que o composto de fórmula I, o tautômero do composto, o sal do com-posto, o sal do tautômero, ou a mistura destes é um composto de fórmula II,um tautômero do composto de fórmula II, um sal do composto de fórmula II,um sal do tautômero do composto de fórmula II, ou uma mistura destes, emque o composto de fórmula II tem a seguinte fórmula e R7 é um grupo hete-rociclila substituído ou não substituído:<formula>formula see original document page 109</formula>

36. Composição terapêutica de acordo com a reivindicação 35,em que R7 é um grupo heterociclila substituído ou não substituído seleciona-do de um grupo piperidinila substituído ou não substituído, grupo piperazini-la, ou grupo morfolinila.

37. Composição terapêutica de acordo com a reivindicação 36,em que R7 é um grupo piperazinila de N-alquila substituído ou não substituí-do.

38. Composição terapêutica de acordo com a reivindicação 36,em que R7 é um grupo piperazinila de N-alquila substituído ou não substituí-do e o grupo alquila da piperazinila de N-alquila compreende de 1 a 4 áto-mos de carbono.

39. Composição terapêutica de acordo com a reivindicação 34,em que o composto de fórmula I, o tautômero do composto, o sal do com-posto, o sal do tautômero, ou a mistura destes é um composto de fórmula III,um tautômero do composto de fórmula III, um sal do composto de fórmula III,um sal do tautômero do composto de fórmula III, ou uma mistura destes, emque o composto de fórmula III tem a seguinte fórmula: <formula>formula see original document page 110</formula>

40. Composição terapêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 34 a 39, em que a composição terapêutica compreende o salde ácido lático do composto.

41. Composição terapêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 34 a 40, em que o fármaco anticâncer e o composto, o tautô-mero, o sal do composto, o sal do tautômero, a mistura, ou a composiçãofarmacêutica são fornecidos como uma composição simples.

42. Composição terapêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 34 a 40, em que o fármaco anticâncer e o composto, o tautô-mero, o sal do composto, o sal do tautômero, a mistura, ou a composiçãofarmacêutica são fornecidos separadamente como partes de um kit.

43. Composição terapêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 34 a 42, em que o fármaco anticâncer é mesilato de imatinib(Gleevec).

44. Composição terapêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 34 a 42, em que o fármaco anticâncer é BAY43-9006.

45. Composição terapêutica de acordo com qualquer uma dasreivindiGações-34-a-42rem que o fármaco anticâncer é Brostalicina.

46. Composição terapêutica de acordo com as reivindicações 34a 45, em que o câncer resistente a fármaco é tumor estromal gastrointestinal(GIST).

47. Composição terapêutica de acordo com as reivindicações 34a 45, em que o câncer resistente a fármaco é leucemia mielogenosa aguda.

48. Composição terapêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 34 a 45, em que o câncer resistente a fármaco é selecionadode leucemia mielogenosa crônica, mieloma múltiplo, ou carcinoma de célularenal.

49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou 17 a 29, ou composição terapêutica como definido em qualquer umadas reivindicações 34 a 45, em que o câncer resistente a fármaco é um cân-cer sólido.

50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou 17 a 29, ou composição terapêutica como definida em qualquer umadas reivindicações 34 a 45, em que o câncer resistente a fármaco é selecio-nado de câncer de próstata, câncer renal, tumor estromal gastrointestinal,sarcoma, câncer colorretal, câncer de mama, câncer da parótida, câncergástrico, melanoma, câncer esofágico, câncer NET (sinonasal), câncer decólon, câncer de ovário, ou câncer de fígado.

51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, ou composição terapêutica como definida em qualquer uma das reivindi-cações 34 a 49, em que o indivíduo é um paciente de câncer humano.

52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, em que o câncer é resistente à lenalidomida (Revlimid), talidomida (Tha-lomid), docetaxel (Taxotere), erlotinib (Tarceva), gefitinib (Iressa), vatalinib(PTK-787), armadilha de VEGF, fenretidina, bortezomib, ou um anticorpomonoclonal geral.

53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, em que o câncer é resistente a bevacizumab (Avastin), pertuzumab, ourituximab.

54. Método de-acordo-com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, em que o composto, o tautômero, o sal do composto, o sal do tautômero,a mistura, ou a composição farmacêutica é administrado ao indivíduo apóslenalidomida (Revlimid), talidomida (Thalomid), docetaxel (Taxotere), erloti-nib (Tarceva), gefitinib (Iressa), vatalinib (PTK-787), armadilha de VEGF,fenretidina, bortezomib, ou um anticorpo monoclonal geral ter sido adminis-trado ao indivíduo e o câncer no indivíduo ter sido descoberto ser resistenteà lenalidomida (Revlimid), talidomida (Thalomid), docetaxel (Taxotere), erlo-tinib (Tarceva), gefitinib (Iressa), vatalinib (PTK-787), armadilha de VEGF,fenretidina, bortezomib, ou um anticorpo monoclonal geral.

55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 --7, em que o composto, o tautômero, o sal do composto, o sal do tautômero,a mistura, ou a composição farmacêutica é administrado ao indivíduo apósbevacizumab (Avastin), pertuzumab, ou rituximab ter sido administrado aoindivíduo e o câncer no indivíduo ter sido descoberto ser resistente a bevaci-zumab (Avastin), pertuzumab, ou rituximab.

56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17a 26, em que o fármaco anticâncer é selecionado de lenalidomida (Revlimid),talidomida (Thalomid), docetaxel (Taxotere), erlotinib (Tarceva), gefitinib (I-ressa), vatalinib (PTK- 787), armadilha de VEGF, fenretidina, bortezomib,bevacizumab (Avastin), pertuzumab, ou rituximab.

57. Composição terapêutica de qualquer uma das reivindicações-34 a 42, em que o fármaco anticâncer é selecionado de lenalidomida (Revli-mid), talidomida (Thalomid), docetaxel (Taxotere), erlotinib (Tarceva), vatali-nib (PTK-787), armadilha de VEGF, fenretidina, bortezomib, ou um anticorpomonoclonal geral.

58. Composição terapêutica de qualquer uma das reivindicações 34 a 42, em que o fármaco anticâncer é selecionado de bevacizumab (Avas-tin), pertuzumab, ou rituximab.

59. Método para inibir uma cinase em um indivíduo, compreen-dendo: administrar a um indivíduo em necessidade deste, um composto defórmula I, um tautômero do composto, um sal do composto, um sal do tau-~tome.ro,-uma mistura destes,-ou-uma composição.farmacêutica compreen-dendo o composto, o tautômero, o sal do composto, o sal do tautômero, ou amistura, em que o indivíduo é um paciente de câncer e a cinase compreendeum resíduo porteiro mutante, e o composto de fórmula I tem a seguinte fórmula:<formula>formula see original document page 113</formula>em que:R1, R2, R3, e R4 podem ser iguais ou diferentes e são indepen-dentemente selecionados de grupos H, Cl, Br, F, I, -OR10, grupos -NR11R12,grupos alquila primários, secundários ou terciários substituídos ou não subs-tituídos, grupos arila substituídos ou não substituídos, grupos alquenila subs-tituídos ou não substituídos, grupos alquinila substituídos ou não substituí-dos, grupos heterociclila substituídos ou não substituídos, ou grupos hetero-ciclilalquila substituídos ou não substituídos;R5, R6, R7, e R8 podem ser iguais ou diferentes e são indepen-dentemente selecionados de grupos H, Cl, Br, F, I, -OR13, grupos -NR14R15,grupos -SR16, grupos alquila primários, secundários ou terciários substituí-dos ou não substituídos, grupos arila substituídos ou não substituídos, gru-pos alquenila substituídos ou não substituídos, grupos alquinila substituídosou não substituídos, grupos heterociclila substituídos ou não substituídos,grupos heterociclilalquila substituídos ou não substituídos, , grupos alcoxial-quila substituídos ou não substituídos, grupos ariloxialquila substituídos ounão substituídos, ou grupos heterocicliloxialquila substituídos ou não substi-tuídos;R10 e R13 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, grupos heterociclila substituídosou não substituídos, grupos heterociclilalquila substituídos ou não substituí-dos, grupos alcoxialquila substituídos ou não substituídos, grupos ariloxial-quila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterocicliloxialquila substi-tuídos ou não substituídos;R11 e R14 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclila substituí-dos ou não substituídos;R12 e R15 podem ser iguais ou diferentes e são independente-mente selecionados de grupos alquila substituídos ou não substituídos, gru-pos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclila substituí-dos ou não substituídos; eR16 é selecionado de grupos alquila substituídos ou não substitu-idos, grupos arila substituídos ou não substituídos, ou grupos heterociclilasubstituídos ou não substituídos.

60. Método de acordo com a reivindicação 58, em que o indiví-duo é administrado com um composto de fórmula II, um tautômero do com-posto, um sal do composto, um sal do tautômero, uma mistura destes, ouuma composição farmacêutica compreendendo o composto, o tautômero, osal do composto, o sal do tautômero, ou a mistura, em que o composto defórmula II tem a seguinte fórmula e R7 é um grupo heterociclila substituído ounão substituído:<formula>formula see original document page 115</formula>

61. Método de acordo com a reivindicação 59, em que R7 é umgrupo heterociclila substituído ou não substituído selecionado de um grupopiperidinila substituído ou não substituído, grupo piperazinila, ou grupo mor-folinila.

62. Método de acordo com a reivindicação 60, em que R7 é umgrupo piperazinila de N-alquila substituído ou não substituído.

63. Método de acordo com a reivindicação 60, em que R7 é umgrupo piperazinila de N-alquila substituído ou não substituído e o grupo al-quila da piperazinila de N-alquila compreende de 1 a 4 átomos de carbono.

64. Método de acordo com a reivindicação 58, em que o indiví-duo é administrado com um composto de fórmula III, um tautômero do com-posto, um sal do composto, um sal do tautômero, uma mistura destes, ouuma composição farmacêutica compreendendo o composto, o tautômero, osal do composto, o sal do tautômero, ou a mistura, em que o composto defórmula III tem a seguinte fórmula:<formula>formula see original document page 115</formula>

65. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 58a 63, em que o sal de ácido lático do composto é administrado ao indivíduo.

66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 58a 64, em que a cinase é uma tirosina cinase citoplásmica ou é uma tirosinacinase receptora.

67. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 58a 65, em que a cinase é ABL, KIT, PDGFRa, EGFR, ou FLT3.

68. Método de acordo com a reivindicação 66, em que a cinaseéABL(T315l).

69. Método de acordo com a reivindicação 66, em que a cinaseé FLT3 (D835Y).

70. Método de acordo com a reivindicação 66, em que a cinaseé EGFR.

71. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 58a 69, em que o câncer é resistente ao mesilato de imatinib (Gleevec),BAY43-9006, Brostalicina, lenalidomida (Revlimid), talidomida (Thalomid),docetaxel (Taxotere), erlotinib (Tarceva), gefitinib (Iressa), vatalinib (PTK--787), armadilha de VEGF, fenretidina, bortezomib, ou um anticorpo mono-clonal geral.

72. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 58a 70, em que o câncer é selecionado de tumor estromal gastrointestinal, leu-cemia mielogenosa aguda, leucemia mielogenosa crônica, mieloma múltiplo,carcinoma de célula renal, câncer de pulmão de célula não pequena, ou sín-drome hipereosinofílica (HES).