BRPI0613168A2

BRPI0613168A2 - molécula de polipeptìdeo isolada; molécula de ácido nucléico isolada; vetor ou plasmìdeo; célula hospedeira; anticorpo; proteìna de fusão; método para estimular uma resposta imunogênica especìfica à tb em um indivìduo ou para prevenir ou reduzir a gravidade de doença causada pela tb; método para monitorar o tratamento da doença causada pela tb em um indivìduo; método de diagnóstico de doença causada pela tb em um indivìduo; método de distinção entre a doença causada pela tb e a imunidade à doença causada pela tb em um indivìduo; método para detecção da infecção por m. tuberculosis em uma amostra biológica; composição; kit para diagnóstico da presença ou da ausência de infecção por m. tuberculosis em uma pessoa; e composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0613168A2
Application number: BRPI0613168-9A
Authority: BR
Inventors: Antonio Campos-Neto; Suely S Kashino
Original assignee: Forsyth Dental In Ry For Children Fa
Priority date: 2005-07-01
Filing date: 2006-06-29
Publication date: 2010-12-21
Also published as: EP2305701A1; ATE530569T1; US20110268758A1; WO2007005627A8; US7968694B2; US20070036816A1; CN101365714A; EP1910410B1; WO2007005627A2; EP1910410A2; WO2007005627A3

Abstract

MOLéCULA DE POLIPEPTìDEO ISOLADA; MOLéCULA DE ACIDO NUCLéICO ISOLADA; VETOR OU PLASMIDEO; CELULA HOSPEDEIRA; ANTICORPO; PROTEìNA DE FUSãO; MéTODO PARA ESTIMULAR UMA RESPOSTA IMUNOGENICA ESPECIFICA A TB EM UM INDIVìDUO OU PARA PREVENIR OU REDUZIR A GRAVIDADE DE DOENçA CAUSADA PELA TB; MéTODO PARA MONITORAR O TRATAMENTO DA DOENçA CAUSADA PELA TB EM UM INDIVIDUO; MéTODO DE DIAGNóSTICO DE DOENçA CAUSADA PELA TB EM. UM INDIVIDUO; MéTODO DE DISTINçãO ENTRE A DOENçA CAUSADA PELA TB E A IMUNIDADE A DOENçA CAUSADA PELA TEM UM INDIVìDUO; MéTODO PARA DETECçAO DA INFECçãO POR M. TUBERCULOSIS EM UMA AMOSTRA BIOLóGICA; COMPOSIçãO; KIT PARA DIAGNóSTICO DA PRESENçA OU DA AUSêNCIA DE INFECçãO POR M. TUBERCULOSIS EM UMA PESSOA; E COMPOSIçãO FARMACêUTICA. A presente invenção refere-se a antígenos isolados da Tuberculose (TB), que são úteis em composições terapêuticas e vacinais para estimular uma resposta imunológica específica à TB. Os antígenos também são úteis em ensaios para diagnóstico para determinar a presença da TB ativa em um indivíduo. Conseqúentemente, a presente invenção inclui moléculas de polipeptídeos, moléculas de ácidos nucléicos, composições para vacina, ensaios para diagnóstico e métodos de diagnóstico e monitoramento do tratamento relacionado a estes antígenos de TB.

Description

MOLÉCULA DE POLIPEPTÍDEO ISOLADA; MOLÉCULA DEÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA; VETOR OU PLASMÍDEO; CÉLULAHOSPEDEIRA; ANTICORPO; PROTEÍNA DE FUSÃO; MÉTODO PARAESTIMULAR UMA RESPOSTA IMUNOGÊNICA ESPECÍFICA À TB EM UMINDIVÍDUO OU PARA PREVENIR OU REDUZIR A GRAVIDADE DE DOENÇACAUSADA PELA TB; MÉTODO PARA MONITORAR O TRATAMENTO DADOENÇA CAUSADA PELA TB EM UM INDIVÍDUO; MÉTODO DEDIAGNÓSTICO DE DOENÇA CAUSADA PELA TB EM UM INDIVÍDUO;MÉTODO DE DISTINÇÃO ENTRE A DOENÇA CAUSADA PELA TB E AIMUNIDADE À DOENÇA CAUSADA PELA TB EM UM INDIVÍDUO; MÉTODOPARA DETECÇÃO DA INFECÇÃO POR M. TUBERCULOSIS EM UMAAMOSTRA BIOLÓGICA; COMPOSIÇÃO; KIT PARA DIAGNÓSTICO DAPRESENÇA OU DA AUSÊNCIA DE INFECÇÃO POR M. TUBERCULOSIS EMUMA PESSOA; E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Mais de um terço da população mundial está infec-tada com Mycobacterium tuberculosis, a bactéria que causa adoença Tuberculose (TB). Em cada ano, 8 milhões de pessoassão infectadas com TB e 2 milhões de pessoas morrem dadoença. A TB afeta significativamente os países em desen-volvimento e também está se tornando um problema crescentenas áreas desenvolvidas do mundo.

As pessoas infectadas com a TB podem ser assim-tomáticas durante um período de tempo considerável e podemestar em um estágio latente da doença. No seu estado ativo,a doença é freqüentemente manifestada com uma inflamaçãoaguda dos pulmões, resultando em febre e uma tosse improdu-tiva. Se não tratada, ocorrem complicações graves e tipica-mente morte. Os ensaios de diagnóstico atuais sãofreqüentemente inacurados e são incapazes de distinguirentre pessoas no estado latente da doença e aquelas noestágio ativo. Atualmente, a vacinação com bactérias vivasé um método para a imunização de pessoas contra a doença.

Entretanto, a vacinação da TB com certas bactérias vivastem sido freqüentemente a fonte de controvérsia em algunspaíses, incluindo os Estados Unidos e conseqüentementenão tem sido mais colocada em uso amplamente espalhado nosEUA. Adicionalmente, os testes de diagnóstico atuais sãomuitas vezes incapazes de distinguir entre pessoas queforam imunizadas e pessoas infectadas com TB.

A vacinação eficiente e o diagnóstico precoceacurado da doença são importantes para controlar a doença.Conseqüentemente, existe uma necessidade de ensaios dediagnóstico eficientes que detectem a infecção ativa pelasbactérias da TB. Existe ainda uma necessidade de uma vacinaque não utilize uma bactéria viva e forneça uma respostaimunogênica protetora para a doença.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a moléculas depolipeptideos isoladas que possuem uma parte imunogênica deum antígeno de Mycobacterium tuberculosis ou uma variaçãodo antigeno que difere apenas em substituições e/ou modifi-cações conservativas. 0 antígeno possui uma seqüência deaminoácidos das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48ou uma combinação das mesmas; ou uma seqüência de amino-ácidos codificada por uma molécula de ácido nucléico quepossui uma seqüência das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13,15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43,45, 4 7 ou uma combinação das mesmas; a região codificadoradas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23,25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 ou umacombinação das mesmas; um complemento das SEQ ID NOs: 1, 3,5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33,35, 37, 39, 41, 43, 45, 47ou uma combinação das mesmas; ouuma seqüência que se hibridiza (por exemplo, sob condiçõesde alta estringência) com as SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11,13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 4 7 ou uma combinação das mesmas. Em uma modalidade,a molécula de polipeptideo isolada estimula uma respostaimunogênica especifica para a Tuberculose (TB) em um hospe-deiro ou um animal (por exemplo, ser humano, camundongo,porco, cabra, macaco). Em uma outra modalidade, a presenteinvenção inclui uma molécula de polipeptideo isolada de umaparte imunogênica de um antigeno de M. tuberculosis, em queo antigeno compreende uma seqüência de aminoácidos codifi-cada por uma molécula de ácido nucléico que possui mais queou igual a aproximadamente 70% de identidade (por exemplo,aproximadamente 80% de identidade, 90% de identidade, apro-ximadamente 95% de identidade) com qualquer uma dasseqüências citadas anteriormente. A presente invenção, emuma modalidade, inclui uma molécula de polipeptideo isolada,em que a seqüência de aminoácidos possui mais que ou iguala aproximadamente 70% de similaridade (por exemplo, aproxi-madamente 80% de similaridade, aproximadamente 90% desimilaridade, aproximadamente 95% de similaridade) àsseqüências citadas aqui.A presente invenção incorpora ainda moléculas deácidos nucléicos que codificam moléculas de polipeptideosque possuem uma parte imunogênica de um antigeno de M.tuberculosis ou uma variação do antigeno que difere apenasem substituições e/ou modificações conservativas. 0antigeno é codificado por uma molécula de ácido nucléicoque possui uma seqüência das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11,13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47 ou uma combinação das mesmas; a regiãocodificadora das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47ou uma combinação das mesmas; um complemento das SEQ IDNOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 ou uma combinação dasmesmas; que se hibridiza (por exemplo, sob condições dealta estringência) com as SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11,13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47 ou uma combinação das mesmas; ou que codifica asSEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26,28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 ou umacombinação das mesmas. A molécula de ácido nucléico isoladacodifica uma molécula de polipeptídeo que estimula umaresposta imunogênica especifica à TB. A presente invençãoinclui ainda moléculas de ácidos nucléicos isoladas quecodificam uma molécula de polipeptídeo que possui uma parteimunogênica de um antigeno de M. tuberculosis, em que oantigeno é codificado por uma molécula de ácido nucléicoque possui mais que ou igual a aproximadamente 70 % deidentidade (por exemplo, aproximadamente 80% de identidade,90% de identidade, aproximadamente 95% de identidade) dasseqüências citadas. A presente invenção, em uma modalidade,inclui moléculas de ácidos nucléicos isoladas que codificammoléculas de polipeptideos cuja seqüência possui mais queou igual a aproximadamente 70% de similaridade (porexemplo, aproximadamente 80% de similaridade, aproximada-mente 90% de similaridade, aproximadamente 95% de simila-ridade) com as seqüências citadas aqui.

Ainda uma outra modalidade da invenção incluivetores, plasmideos e células hospedeiras que contêm asmoléculas de ácidos nucléicos ou codificam as moléculas depolipeptideos descritas aqui. A célula hospedeira pode serqualquer célula incluindo, por exemplo, células de E. coli,levedura e de mamífero. A presente invenção inclui adicio-nalmente sondas que se hibridizam sob condições deestringência (por exemplo, alta ou moderada) com as molé-culas de ácidos nucléicos descritas aqui.

A presente invenção inclui anticorpos que se ligama uma ou mais das moléculas de polipeptideos descritasaqui. 0 anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou umanticorpo policlonal. A invenção se refere ainda a proteí-nas de fusão que compreendem uma ou mais moléculas depolipeptideos descritas aqui (por exemplo, duas moléculasde polipeptideos). Em adição ao fato de incluir as moléculasde polipeptideos da presente invenção, a proteína de fusãotambém pode incluir antígenos de M. tuberculosis, incluindoaqueles apresentados em uma molécula de MHC de Classe 2(por exemplo, um antígeno de TB na via de células T CD4+).A presente invenção inclui métodos para a esti-mulação de uma resposta imunogênica especifica à TB em umindividuo, prevenindo ou reduzindo a gravidade da doençaTB, através da administração de uma quantidade de uma oumais das moléculas de polipeptideos ou das moléculas deácidos nucléicos descritas aqui (por exemplo, em um carrea-dor). Em um outro aspecto, a presente invenção incluicomposições (por exemplo, composições vacinais ou composi-ções farmacêuticas) que possuem as moléculas de polipepti-deos ou as moléculas de ácidos nucléicos descritas aqui, emum carreador fisiologicamente aceitável. A composiçãotambém pode incluir ou pode ser co-adminstrada com umintensificador da resposta imunológica (por exemplo, umadjuvante-, um outro antigeno de TB, uma citocina ou umaquimiocina imunoestimuladora). Os exemplos de adjuvantesincluem 3D-MPL e QS21. A composição pode ser formulada emuma emulsão de óleo em água.

A presente invenção incorpora ainda métodos parao monitoramento do tratamento da doença TB em um individuo.

Os métodos incluem a detecção do nivel de um ou maispolipeptideos antigênicos de M. tuberculosis descritos aquiem uma amostra proveniente do individuo; e a comparação donivel com um padrão. Um nivel de peptideos antigênicos deTB que é maior que o padrão indica tratamento ineficiente eum nivel que é menor que ou igual ao padrão indica trata-mento eficiente. 0 método de monitoramento do tratamentotambém pode incluir a detecção de níveis de um ou mais dospeptideos antigênicos de TB descritos aqui em uma amostraem um ou mais pontos de tempo (por exemplo, um primeiro ouum ponto de tempo de linha de base e um segundo ponto detempo após o inicio do tratamento) e comparação dos níveisnos pontos de tempo. Os aumentos nos níveis dos peptídeosindicam tratamento ineficiente e a diminuição ou nenhumaalteração nos níveis indica tratamento eficiente.

A invenção inclui um método de diagnóstico dadoença TB em um indivíduo através da detecção da presença,da ausência ou dos níveis de uma ou mais das moléculas depolipeptídeos descritas aqui. Os ensaios de diagnóstico dapresente invenção também permitem que se distinga entre umindivíduo que possui a doença TB ativa e imunidade à TB.

Tal método inclui a detecção da presença, ausência ou donível de uma ou mais das moléculas de polipeptídeosdescritas aqui e a medida do estímulo de uma respostaimunológica específica à TB no indivíduo. A ausência dasmoléculas de polipeptídeos em uma amostra do indivíduo e apresença de uma resposta imunológica específica à TB noindivíduo indica que o indivíduo adquiriu alguma imunidadeà doença TB e não a doença propriamente dita. A medida doestímulo de uma resposta imunológica específica à TB incluia medida da proliferação de células, da produção deinterleucina-12, dos níveis de interferon-γ ou uma combi-nação dos mesmos, em uma amostra do indivíduo.

A presente invenção inclui, em uma modalidadeadicional, métodos para a detecção da infecção por M.tuberculosis em uma amostra biológica, através da avaliaçãoda presença de uma ou mais das moléculas de polipeptídeosdescritas aqui na amostra. A presença de uma ou mais dasmoléculas indica a presença de infecção por M. tuberculosis;e a ausência de uma ou mais das moléculas indica a ausênciade infecção por M. tuberculosis. Em particular, os métodosincluem o contato da amostra com um anticorpo (por exemplo,um anticorpo marcado de forma detectável) que se liga com amolécula de polipeptideo, de forma suficiente para permitira formação de um complexo entre a amostra e o anticorpo,para formar assim um complexo antígeno-anticorpo; e adetecção do complexo antigeno-anticorpo. A presença docomplexo indica a presença de infecção por M. tuberculosise a ausência de um complexo indica a ausência de infecçãopor M. tuberculosis. Em um aspecto, o método inclui ainda ocontato da amostra com um segundo anticorpo especifico aoantigeno ou ao complexo de antigeno-anticorpo. 0 polipep-tideo ou o anticorpo pode estar ligado a um suporte sólidoe a amostra biológica pode ser uma amostra de urina,sangue, saliva, fluido cerebroespinhal ou tecido.

Os métodos para a detecção de infecção por M.tuberculosis em uma amostra biológica também incluem ocontato da amostra com pelo menos dois iniciadores deoligonucleotideo em uma reação em cadeia da polimerase, emque pelo menos um dos iniciadores de oligonucleotideo (porexemplo, pelo menos aproximadamente 10 bases contíguas) éespecífico para uma ou mais das moléculas de ácidosnucléicos isoladas descritas aqui, suficientemente parapermitir a amplificação dos iniciadores; e a detecção naamostra da seqüência de ácido nucléico amplificada. Apresença de qualquer uma das seqüências de ácidos nucléicosamplificadas indica infecção por M. tuberculosis e aausência de qualquer uma das seqüências de ácidos nucléicosamplificadas indica uma ausência de infecção por M.tuberculosis. Um outro método para a detecção da infecçãopor M. tuberculosis em uma amostra biológica inclui ocontato da amostra com uma ou mais sondas de oligonu-cleotideo (por exemplo, pelo menos aproximadamente 15 basescontíguas) específicas para a molécula de ácido nucléicodescrita aqui sob condições de alta estringência, suficien-temente para permitir a hibridização entre a amostra e asonda; e a detecção da molécula de ácido nucléico que sehibridiza com a sonda de oligonucleotídeo na amostra. Apresença de hibridização da sonda indica infecção por M.tuberculosis e a ausência de hibridização indica umaausência de infecção por M. tuberculosis.

Além disso, a presente invenção inclui kits paradiagnosticar a presença ou a ausência de infecção por M.tuberculosis em uma pessoa. O kit compreende um ou maisreagentes para a detecção de uma ou mais das moléculas depolipeptídeos ou das moléculas de ácidos nucléicosdescritas aqui. Os reagentes podem incluir aqueles que sãoutilizados para a realização de um ensaio imunoabsorventeligado à enzima, um ensaio imunocromatográfico rápido, umaanálise de citometria de fluxo ou um ensaio radio-imunológico. Tais kits podem compreender uma ou maismoléculas de ácidos nucléicos que possuem uma seqüência dasSEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25,27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 ou umacombinação das mesmas; os complementos das ditas seqüênciase seqüências de ácidos nucléicos que se hibridizam com umaseqüência citada nas SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45,47 ou uma combinação; e um reagente de detecção. Os kitspodem incluir ainda outros itens tais como suportes sólidose agentes de detecção (por exemplo, um grupo repórter comoradioisótopos, grupos fluorescentes, grupos luminescentes,enzimas, biotina e partículas de corante; conjugado a umagente de ligação tal como antiimunoglobulinas, Proteína G,

Proteína A e lectinas).

As vantagens da presente invenção incluem novosmétodos para a prevenção ou a redução da gravidade dadoença TB através do fornecimento de uma composição vacinaieficiente. Os ensaios da presente invenção permitemadministrar de forma simples e fácil testes de urina paradistinguir rapidamente e eficientemente entre pacientes quepossuem TB ativa e aqueles que não possuem. Novas compo-sições vacinais e ensaios de diagnóstico mais eficientesauxiliarão na redução do presente problema de TB em todo omundo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras 1A-1G são representações esquemáticasque exibem as seqüências de ácidos nucléicos (em negrito)(SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25,27, 29 e 31) e correspondendo às seqüências polipeptídicasde M. tuberculosis (em negrito) (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10,12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32) eluídas dasmoléculas de MHC de classe 1 dos macrófagos de camundongosinfectados com a bactéria M. tuberculosis. Estão tambémrepresentadas as supostas seqüências de ácidos nucléicos ede polipeptídeos de M. tuberculosis que possuem 100% dehomologia com as seqüências isoladas.

A Figura IH é uma tabela que mostra as seqüênciaspeptidicas de M. tuberculosis, SEQ ID Nos: 2, 6, 10, 14,18, 22 e 26, eluidas de moléculas de MHC de classe 1 dosmacrófagos de camundongos infectados com a bactéria M.tuberculosis. A figura mostra ainda a anotação do TheInstitute for Genomic Research (TIGR), a denominação doSwiss-Prot e o nome da proteína.

A Figura 2 é uma representação esquemática quemostra um peptídeo, SEQ ID NO: 30, em negrito, encontradona urina de pacientes com tuberculose pulmonar e suaseqüência de ácido nucléico correspondente, SEQ ID NO: 29.A figura mostra ainda uma seqüência de DNA (SEQ ID NO: 31)e sua seqüência de proteína correspondente (SEQ ID NO: 32)que é uma suposta proteína de biossíntese da molibdopterinaque é encontrada em M. tuberculosis e possui 100% dehomologia com a SEQ ID NO: 30.

A Figura 3 é uma representação esquemática quemostra o protocolo utilizado para purificar e seqüenciaros peptídeos associados ao MHC de Classe I isolados demacrófagos infectados por M. tuberculosis.

A Figura 4 é uma figura que mostra um exemplo deum ensaio imunocromatográfico para a detecção de antígenosde TB da presente invenção em uma amostra.

A Figura 5 é uma tabela que mostra as seqüênciaspeptidicas de M. tuberculosis, SEQ ID Nos: 34, 38, 42 e 46,encontradas na urina de pacientes com tuberculose pulmonare a proteína doadora de M. tuberculosis.As Figuras 6A-B são representações esquemáticasque mostram a seqüência de ácido nucléico (em negrito esublinhada) (SEQ ID NO: 33) e que corresponde à seqüênciapolipeptidica de M. tuberculosis (em negrito e sublinhada)(SEQ ID NO: 34) encontrada na urina de pacientes comtuberculose pulmonar. São também apresentadas as seqüênciasde ácidos nucléicos e de polipeptideos da Homosserina O-acetiltransferase de M. tuberculosis que possuem 100% dehomologia com as seqüências isoladas (SEQ ID NOs: 35 e 36,respectivamente), junto com uma tabela que fornece o nomedo Lócus do Genomic Research (TIGR), o nome do lócusprimário, a denominação do Swiss-Prot, a suposta identifi-cação, o Símbolo Gênico, as funções celulares do TIGR, ascoordenadas, o nome da molécula de DNA, o comprimento dogene, o comprimento da proteína, o peso molecular, o pi, aporcentagem de GC, o número de Licença da enzima, o Reino ea Família.

As Figuras 7A-C são representações esquemáticasque mostram a seqüência de ácido nucléico (em negrito esublinhada) (SEQ ID NO: 37) e que corresponde à seqüênciapolipeptidica de M. tuberculosis (em negrito e sublinhada)(SEQ ID NO: 38) encontrada na urina de pacientes comtuberculose pulmonar. São também apresentadas as seqüênciasde ácidos nucléicos e de polipeptideos da proteína smc departição do cromossomo de M. tuberculosis que possuem 100%de homologia com as seqüências isoladas (SEQ ID NOs: 39 e40, respectivamente), junto com uma tabela que fornece onome do Lócus do TIGR, o nome do lócus primário, a denomi-nação do Swiss-Prot, a suposta identificação, o SímboloGênico, as funções celulares do TIGR, as coordenadas, onome da molécula de DNA, o comprimento do gene, ocomprimento da proteína, o peso molecular, o pi, aporcentagem de GC, o número de Licença da enzima, o Reino ea Família.

As Figuras 8A-B são representações esquemáticasque mostram a seqüência de ácido nucléico (em negrito esublinhada) (SEQ ID NO: 41) e que corresponde à seqüênciapolipeptídica de M. tuberculosis (em negrito e sublinhada)(SEQ ID NO: 42) encontrada na urina de pacientes comtuberculose pulmonar. São também apresentadas as seqüênciasde ácidos nucléicos e polipeptídicas da Ornitinacarbamoiltransferase de M. tuberculosis que possuem 100% dehomologia com as seqüências isoladas (SEQ ID NOs: 43 e 44,respectivamente), junto com uma tabela que fornece o nomedo Lócus do TIGR, o nome do lócus primário, a denominaçãodo Swiss-Prot, a suposta identificação, o Símbolo Gênico,as funções celulares do TIGR, as coordenadas, o nome damolécula de DNA, o comprimento do gene, o comprimento daproteína, o peso molecular, o pi, a porcentagem de GC, onúmero de Licença da enzima, o Reino e a Família.

As Figuras 9A-B são representações esquemáticasque mostram a seqüência de ácido nucléico (em negrito esublinhada) (SEQ ID NO: 45) e correspondente à seqüênciapolipeptídica de M. tuberculosis (em negrito e sublinhada)(SEQ ID NO: 46) encontrada na urina de pacientes comtuberculose pulmonar. São também apresentadas as seqüênciasde ácidos nucléicos e polipeptídicas da fosfoadenosinafosfossulfato reductase de M. tuberculosis que possuem 100%de homologia com as seqüências isoladas (SEQ ID NOs: 47 e48, respectivamente), junto com uma tabela que fornece onome do Lócus do TIGR, o nome do lócus primário, a denomi-nação do Swiss-Prot, a suposta identificação, o SímboloGênico, as funções celulares do TIGR, as coordenadas, onome da molécula de DNA, o comprimento do gene, o com-primento da proteína, o peso molecular, o pi, a porcen-tagem de GC, o número de Licença da enzima, o Reino e aFamília.

A Figura 10 é uma representação do Western Blotque mostra a superexpressão e a purificação dos recom-binantes MT1694, MT2462 e MT2990 dos lisados de E. coli deculturas não induzidas (faixas 1); dos lisados de E. colidas culturas induzidas com isopropil-beta-D-tiogalacto-piranosídeo (IPTG) (faixas 2); e as proteínas recombi-nantes purificadas (faixas 3) e os marcadores de pesomolecular (MWM).

A Figura 11 é uma representação do Western Blotque mostra a identificação de MTB1694 e MT2462 nativas nolisado total bruto de células de M. tuberculosis (Faixa 1);as proteínas do filtrado da cultura (CF) (Faixa 2); oantígeno recombinante purificado (Faixa 3); e os marca-dores de peso molecular (MWM) , em que os antígenos foramsubmetidos à eletroforese e transferidos para uma membranade nitrocelulose seguido pela aplicação de sonda com anti-MTB1694 de coelho ou com o anti-soro anti-MT2462.

A Figura 12A é um gráfico de barras que mostra oreconhecimento de MT1694 e MT2452 através de respostasproliferativas expresso por contagens por minuto (COM) deindivíduos com PPD saudável (uma resposta de teste de peleintradérmico às proteínas da tuberculose utilizando umDerivado de Proteína Purificada) negativo (doador 1) e PPDpositivo (doadores 2-5) após o estímulo com antígenosrecombinantes (5 μg/mL) .

A Figura 12B é um gráfico de barras que mostra oreconhecimento de MT1694 e MT2452 através da produção deIFN-γ de células mononucleares do sangue periférico (PBMC)de indivíduos PPD negativo saudável (doador 1) e PPDpositivo (doadores 2-5) após o estímulo com antígenosrecombinantes (5 pg/mL) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A seguir há uma descrição das modalidades prefe-ridas da invenção. A presente invenção se refere acomposições vacinais e ensaios de diagnóstico para a doençaTuberculose (TB) . A presente invenção se baseia, em parte,na descoberta de certos peptídeo antigênicos de TBapresentados no macrófago com MHC de classe 1, quando umhospedeiro é infectado com a bactéria que causa a TB, asaber, a bactéria M. tuberculosis. Os macrófagos com MHC declasse 1 são células que desempenham uma função na via dascélulas T CD8+ da resposta imunológica. Uma segunda desco-berta que forma a base da presente invenção é a identifi-cação de um peptídeo de TB presente na urina de pessoasinfectadas com TB ativa. A identidade dos peptídeosantigênicos específicos de TB apresentados na célula comMHC de classe e a identidade do peptídeo de TB peptídeoencontrado na urina de pacientes infectados, fornecem asseqüências polipeptídicas necessárias para criar vacinase/ou testes de diagnóstico eficiente.

As composições vacinais para TB da presenteinvenção podem incluir seqüências polipeptídicas ou seqüên-cias de ácidos nucléicos e, opcionalmente, moléculasintensificadoras do sistema imunológico adicionais. Assim,a presente invenção se refere, em parte, às seqüênciaspolipeptídicas de TB antigênicas específicas descobertas,que são mostradas nas Figuras 1, 2 e 5-9, a saber, SEQ IDNOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30,32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 e combinações dasmesmas. As SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22 e 26 foramisolados através da infecção de camundongos com quantidadessignificativas da bactéria M. tuberculosis. Aproximadamenteduas semanas após os camundongos serem infectados, o baçofoi removido e as moléculas de MHC de classe 1, moléculasque apresentam antígenos para as células T CD8+, foramseparadas, de acordo com os métodos detalhados no Exemplo

I. Um número de peptídeos que foram encontrados nasmoléculas de MHC de classe 1 foi identificado como tendoorigem na M. tuberculosis. As SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9,

II, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 e 27, as seqüências deácidos nucléicos que codificam estes polipeptídeosidentificados, também são mostradas na Figura IA-H.

A SEQ ID NO: 30, MVIIELMRR, é um peptídeo encon-trado na urina de pessoas com TB pulmonar e esta seqüênciapossui 100% de homologia com uma proteína de biossíntese deM. tuberculosis, SEQ ID NO: 32, mostrada na Figura 2. Aseqüência de ácido nucléico, SEQ ID NO: 31, que codificaesta proteína também é mostrada. Adicionalmente, as Figuras5-9 mostram as SEQ ID NOs: 34, 38, 42 e 4 6 que também sãoencontradas na urina de pessoas com TB pulmonar e possuem100% de . homologia com as SEQ ID NOs: 36, 40, 44 e 48,respectivamente. Os métodos utilizados para a identificaçãodesta proteína TB na urina de pacientes infectados com TBativa são descritos no Exemplo 2.

Conseqüentemente, a presente invenção se referea estas seqüências, SEQ ID NO: 1-48, que foram identi-ficadas como sendo úteis na ativação de uma respostaimunológica protetora contra TB e para ensaios de diagnós-tico para a identificação de pessoas com TB ativa.

Polipeptideos e Sua Função

A presente invenção se refere a moléculas depolipeptídeos isoladas que foram isoladas incluindo aspartes antigênicas das seqüências de TB apresentadas pelamolécula de MHC de classe 1 em um hospedeiro infectado edas seqüências de TB isoladas da urina de pacientes infec-tados. A presente invenção inclui moléculas de polipep-tídeos que contêm a seqüência de qualquer uma dasseqüências de aminoácidos de TB antigênicas (SEQ ID NOs: 2,4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32,34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 ou combinações das mesmas).

Ver as Figuras 1, 2 e 5-9. A presente invenção se refereainda a moléculas de polipeptídeos que são codificadaspelas seqüências de ácidos nucléicos, SEQ ID NOs: 1, 3, 5,7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35,37, 39, 41, 43, 45, 47 ou combinações das mesmas.Como utilizado aqui, o termo "polipeptídeo"abrange cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento,incluindo proteínas de comprimento completo (isto é,antígenos), em que os resíduos de aminoácidos estão ligadosatravés de ligações peptídicas covalentes. Assim, umpolipeptídeo que compreende uma parte imunogênica de umantígeno de M. tuberculosis pode consistir inteiramente daparte imunogênica ou pode conter seqüências adicionais. Asseqüências adicionais podem ser derivadas do antígenonativo de M. tuberculosis ou podem ser heterólogas e taisseqüências podem (mas não necessariamente) ser imunogê-nicas. Em geral, os polipeptídeos divulgados aqui sãopreparados na forma substancialmente pura. Preferencial-mente, os polipeptídeos são pelo menos aproximadamente 80%puros, mais preferencialmente pelo menos aproximadamente90% puros e mais preferencialmente pelo menos aproxima-damente 99% puros.

Os polipeptídeos antigênicos de TB da presenteinvenção referidos aqui como "isolados" são polipeptídeosque foram separados de outras proteínas e do materialcelular de sua fonte de origem. Os polipeptídeos antigê-nicos de TB isolados, peptídeos derivados através dainfecção com a bactéria M. tuberculosis, incluem umaproteína essencialmente pura, proteínas produzidas atravésde síntese química, através de combinações de síntesesbiológicas e químicas e através de métodos recombinantes.

As proteínas da presente invenção foram isoladas e caracte-rizadas em relação as suas características físicasutilizando os procedimentos descritos na Exemplificação epodem ser produzidas utilizando técnicas de laboratóriopara purificação de proteínas. Tais técnicas incluem, porexemplo, extração por salinificação, imunoprecipitação,cromatografia em coluna, cromatografia líquida em altapressão ou eletroforese.

As composições e os métodos da presente invençãotambém abrangem variações dos polipeptídeos e das moléculasde DNA anteriores. Uma "variação" de polipeptídeo, comoutilizado aqui, é um polipeptídeo que difere do polipep-tídeo citado apenas em relação a substituições e/oumodificações conservativas, de forma que as propriedadesterapêuticas, antigênicas e/ou imunogênicas do polipeptídeosão mantidas. Uma variação de um antígeno específico a M.tuberculosis estimulará, portanto, a proliferação celulare/ou IFN-γ em células Thl produzidas contra tal antígenoespecífico. As variações de polipeptídeos exibem preferen-cialmente pelo menos aproximadamente 70%, mais preferen-cialmente pelo menos aproximadamente 90% e mais preferenci-almente pelo menos aproximadamente 95% de homologia com ospolipeptídeos identificados. Para os polipeptídeos compropriedades imunorreativas, as variações podem, alterna-tivamente, ser identificadas através da modificação daseqüência de aminoácidos de um dos polipeptídeos anteriorese da avaliação da imunorreatividade do polipeptídeomodificado. Tais seqüências modificadas podem serpreparadas e testadas utilizando, por exemplo, osprocedimentos repre-sentativos descritos aqui.

Como utilizado aqui, uma "substituição conser-vativa" é uma em que um aminoácido é substituído por umoutro aminoácido que possui propriedades similares, deforma que um perito na arte da química de peptídeosesperaria que a estrutura secundária e a natureza hidro-pática do polipeptídeo não fossem substancialmentealteradas. Em geral, os grupos de aminoácidos a seguirrepresentam alterações conservativas: (1) ala, pro, gly,glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3)vai, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; e (5) phe,tyr, trp, his.

As variações podem ainda ou alternativamente,conter outras modificações, incluindo a deleção ou a adiçãode aminoácidos que possuem influência mínima sobre aspropriedades antigênicas, a estrutura secundária e anatureza hidropática do polipeptídeo. Por exemplo, umpolipeptídeo pode ser conjugado a uma seqüência sinal (oulíder) na extremidade N-terminal da proteína que direcionade forma co-tradução ou pós-tradução a transferência daproteína. 0 polipeptídeo também pode ser conjugado com umligante ou outra seqüência para facilitar a síntese, apurificação ou a identificação do polipeptídeo (porexemplo, poli-His) ou para aumentar a ligação dopolipeptídeo com um suporte sólido. Por exemplo, um poli-peptídeo pode ser conjugado com a região Fc de umaimunoglobulina.

A presente invenção abrange ainda proteínas epolipeptídeos de TB, variações dos mesmos ou aqueles quepossuem seqüências de aminoácidos análogas às seqüências deaminoácidos dos polipeptídeos antigênicos de TB descritasaqui. Tais polipeptídeos são definidos aqui como análogosantigênicos de TB (por exemplo, homólogos) ou mutantes ouderivados. Seqüências de aminoácidos "análogas" ou"homólogas" se referem a seqüências de aminoácidos comidentidade suficiente de qualquer uma das seqüências deaminoácidos de TB de forma a possuírem a atividadebiológica (por exemplo, a capacidade de ativar uma respostaimunológica protetora contra bactérias da TB) de qualquerum dos polipeptídeos nativos de TB. Por exemplo, umpolipeptídeo análogo pode ser produzido com alterações"silenciosas" na seqüência de aminoácidos em que um oumais, resíduos de aminoácidos diferem dos resíduos deaminoácidos de qualquer uma da proteína de TB, aindapossuindo a função ou a atividade biológica da TB. Osexemplos de tais diferenças incluem adições, deleções ousubstituições de resíduos da seqüência de aminoácidos deTB. São também abrangidos pela presente invenção ospolipeptídeos análogos que exibem atividade biológicamaior ou menor de qualquer uma das proteínas de TB dapresente invenção. Tais polipeptídeos podem ser produzidosatravés de mutação (por exemplo, substituição, deleção ouadição) de um ou mais resíduos de aminoácidos ou ácidosnucléicos em qualquer uma das moléculas de TB isoladasdescritas aqui. Tais mutações podem ser realizadasutilizando os métodos descritos aqui e aqueles conhecidosna arte. Em particular, a presente invenção se refere amoléculas de polipeptídeos homólogas que possuem pelo menosaproximadamente 70% (por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90% ou95%) de identidade ou similaridade com as SEQ ID NOs: 2, 4,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34,36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 ou uma combinação das mesmas.Percentual de "identidade" se refere à quantidade denucleotideos ou de aminoácidos idênticos entre duasseqüências de nucleotideos ou de aminoácidos, respec-tivamente. Como utilizado aqui, "porcentagem desimilaridade" se refere à quantidade de aminoácidossimilares ou conservativos entre duas seqüências de amino-ácidos.

Os polipeptideos da presente invenção, queincluem uma seqüência de comprimento completo, seqüênciasparciais, fragmentos funcionais e homólogos, que permitemou auxiliam na estimulação de uma resposta imunogênicaespecifica ou imunológica protetora à TB. "Imunogênica",como utilizado aqui, se refere à capacidade de ativar umaresposta imunológica (por exemplo, celular) em um paciente,tal como um ser humano e/ou em uma amostra biológica. Emparticular, os antigenos que são imunogênicos (e partesimunogênicas dos mesmos) estimulam a proliferação celular,a produção de interleucina-12 e/ou a produção deinterferon-γ em amostras biológicas que compreendem uma oumais células (por exemplo, células T, células NK, células Be macrófago). Tais células são derivadas de um indivíduoimune à M. tuberculosis. As partes imunogênicas dosantigenos descritos aqui podem ser preparadas e identi-ficadas utilizando as técnicas descritas aqui. Podem serutilizadas outras técnicas, tais como as resumidas em Paul,Fundamental Immunology, 3- ed., Raven Press, 1993, pp. 243-247 e referências citadas no mesmo. Tais técnicas incluem aseleção de partes de polipeptideos do antígeno nativo emrelação às propriedades imunogênicas. Uma parte imunogênicade um polipeptideo é uma parte que, dentro de tais ensaios,gera uma resposta imunológica (por exemplo, proliferação,produção de interferon-γ e/ou produção de interleucina-12)que é substancialmente similar à gerada pelo antigeno decomprimento completo. Em outras palavras, uma parteimunogênica de um antigeno pode gerar pelo menos aproxi-madamente 20% e preferencialmente aproximadamente 100%, daproliferação induzida pelo antigeno de comprimento completono ensaio de proliferação modelo descrito aqui. Uma parteimunogênica pode ainda ou alternativamente, estimular aprodução de pelo menos aproximadamente 20% e preferencial-mente aproximadamente 100%, do interferon-γ e/ou dainterleucina-12 induzida pelo antigeno de comprimentocompleto no ensaio modelo descrito aqui. Como utilizadoaqui, "TB" ou "doença TB" se refere à doença causada pelainfecção de M. tuberculosis. Os polipeptideos homólogospodem ser determinados utilizando métodos conhecidos pelosperitos na arte. As buscas iniciais pela homologia podemser realizadas no NCBI contra os bancos de dados doGenBank, EMBL e SwissProt utilizando, por exemplo, oserviço de rede BLAST. Altschuler, S. F., e outros, J. Mol.Biol., 215: 403 (1990), Altschuler, S. F., Nucleic AcidsRes., 25: 3389-3402 (1998). A análise de computador dasseqüências de nucleotideos pode ser realizada utilizando oMOTIFS e as subrotinas de FindPatterns do software doGenetics Computing Group (GCG, versão 8.0). As comparaçõesde proteínas e/ou nucleotideos foram realizadas de acordocom Higgins e Sharp (Higgins, D. G. e Sharp, P. M., Gene,73: 237-244 (1988), por exemplo, utilizando parâmetros pré-estabelecidos).

Adicionalmente, os polipeptídeos isolados indivi-duais da presente invenção são biologicamente ativos oufuncionais e também desempenham várias funções nasbactérias. Por exemplo, o polipeptideo isolado, tal como aSEQ ID NO: 6 é um transportador ABC de proteína transmem-brana de transporte de glutamina. Similarmente, a SEQ IDNO: 22 é uma proteína do membro integral de transporte deaminoácido catiônico e a SEQ ID NO: 26 é uma ATPase do tipoP de transporte catiônico. A SEQ ID NO: 32, é uma proteínade biossíntese da molibdopterina. A presente invençãoinclui fragmentos destas seqüências de aminoácidos isoladase possui ainda a função ou a atividade biológica daseqüência. Por exemplo, os fragmentos de polipeptídeos quecompreendem mutantes de deleção das proteínas antigênicasde TB podem ser planejados e expressos através de métodosde laboratório bem conhecidos. Os fragmentos, os polipep-tídeos homólogos ou análogos podem ser avaliados em relaçãoà atividade biológica, como descrito aqui.

A presente invenção abrange ainda derivadosbiologicamente ativos dos polipeptídeos antigênicos de TBdescritos anteriormente, referidos aqui como imitadores depeptídeos. Os imitadores podem ser planejados e produzidosatravés de técnicas conhecidas pelos peritos na arte. (ver,por exemplo, a Patentes U.S. N^ 4.612.132; 5.643.873 e5.654.276). Estes imitadores podem ser baseados, porexemplo, em uma seqüência de aminoácidos de TB específica emanter a posição relativa no espaço da seqüência deaminoácidos correspondente. Estes imitadores de peptideospossuem atividade biológica similar à atividade biológicado composto peptidico correspondente, mas possuem uma"vantagem biológica" em relação à seqüência de aminoácidosantigênica de TB em relação a uma ou mais, das propriedadesa seguir: solubilidade, estabilidade e susceptibilidade àhidrólise e à proteólise.

Os métodos para a preparação de imitadores depeptideos incluem a modificação do grupo amino N-terminal,do grupo carboxila C-terminal e/ou a alteração de uma oumais das ligações amino no peptideo para uma ligação semser amino. Duas ou mais tais modificações podem seracopladas em uma molécula imitadora de peptideo. Asmodificações de peptideos para produzir imitadores depeptideo são descritas nas Patentes U.S. N— 5.643.873 e5.654.276. Outras formas dos polipeptídeos antigênicos deTB, abrangidas pela presente invenção, incluem aquelas quesão "funcionalmente equivalentes". Este termo, comoutilizado aqui, refere-se a qualquer seqüência de ácidonucléico e seu aminoácido codificado, que imita a atividadebiológica dos polipeptídeos de TB e/ou domínios funcionaisdos mesmos.

Seqüências de Ácidos Nucléicos de TB, Plasmídeos, Vetores eCélulas Hospedeiras

A presente invenção, em uma modalidade, incluiuma molécula de ácido nucléico isolada que possui umaseqüência das SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47ou combinações das mesmas. Ver as Figuras 1, 2 e 5-9. Apresente invenção inclui as seqüências que são citadas nasFiguras 1, 2 e 5-9, assim como as regiões codificadoras dasmesmas.

Como utilizado aqui, os termos "molécula de DNA"ou "molécula de ácido nucléico" incluem filamentos tantosenso quanto anti-senso, cDNA, DNA genômico, DNA recombi-nante, RNA e moléculas de ácidos nucléicos completamente outotalmente sintetizadas. Uma "variação" de nucleotideo éuma seqüência que difere da seqüência de nucleotideoscitada por possuir uma ou mais deleções, substituições ouadições de nucleotideos. Tais modificações podem serfacilmente introduzidas utilizando técnicas de mutagênesepadronizadas, tal como a mutagênese especifica ao sitiodirecionada ao oligonucleotideo como é ensinada, porexemplo, por Adelman e outros (DNA 2: 183, 1983). Asvariações de nucleotideos podem ser variações alélicas queocorrem naturalmente ou variações que não ocorremnaturalmente. As variações de seqüências de nucleotideosmais preferencialmente pelo menos aproximadamente 80% emais preferencialmente pelo menos aproximadamente 90% dehomologia com a seqüência citada. Tais variações deseqüências de nucleotideos se hibridizarão geralmente com aseqüência de nucleotideos citada sob condições estrin-gentes. Em uma modalidade, "condições estringentes" serefere à pré-lavagem em uma solução de β χ SSC, 0,2% deSDS; hibridização a 65°Celsius, 6xSSC, 0,2% de SDS durantea noite; seguida por duas lavagens de 30 minutos cada emlxSSC, 0,1% de SDS a 65°C e duas lavagens de 30 minutoscada em 0,2XSSC, 0,1% de SDS a 65°C. Δ presente invençãoabrange ainda seqüências de ácidos nucléicos isoladas quecodificam polipeptideos de TB e em particular, aquelas quecodificam uma molécula de polipeptídeo que possui umaseqüência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10,12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40,42, 44, 46, 48 ou combinações das mesmas. Estas seqüênciasde ácidos nucléicos de TB codificam polipeptideos queestimulam uma resposta imunogênica protetora para abactéria M. tuberculosis e/ou estão envolvidas com asfunções descritas adicionalmente aqui.

Como utilizado aqui, um gene ou uma seqüência denucleotideos "isolada" que não é flanqueada pelas seqüên-cias de nucleotideos que normalmente (por exemplo, nanatureza) flanqueiam o gene ou a seqüência de nucleotideos(por exemplo, como nas seqüências genômicas) e/ou foramcompletamente ou parcialmente purificadas de outrasseqüências transcritas (por exemplo, como em uma bibliotecade cDNA ou de RNA) . Assim, uma seqüência gênica ou denucleotideos isolada pode incluir uma seqüência gênica oude nucleotideos que é sintetizada quimicamente ou atravésde meios recombinant es. As construções de ácidosnucléicos contidas em um vetor são incluídas na definiçãode "isolado" como utilizado aqui. Ainda, as seqüências denucleotideos isoladas incluem moléculas de ácidos nucléicosrecombinantes e células hospedeiras heterólogas, assimcomo moléculas de ácidos nucléicos parcialmente ousubstancialmente ou purificadas em solução. Os produtos datranscrição de RNA in vivo e in vitro da presente invençãotambém são abrangidos pelas seqüências de nucleotideos"isoladas". Tais seqüências de nucleotideos isoladas sãoúteis para a produção do polipeptideo antigênico de TBcodificado, como sondas para o isolamento de seqüênciashomólogas (por exemplo, de outras espécies de mamíferos ououtros organismos), para o mapeamento gênico (por exemplo,através da hibridização in situ) ou para a detecção dapresença (por exemplo, através da análise de Southern blot)ou da expressão (por exemplo, através da análise deNorthern blot) de genes relacionados nas células ou notecido. As seqüências de ácidos nucléicos antigênicas de TBda presente invenção incluem seqüências de ácidos nucléicoshomólogas. As seqüências de ácidos nucléicos "análogas" ou"homólogas" se referem às seqüências de ácidos nucléicoscom identidade suficiente com qualquer uma das seqüênciasde ácidos nucléicos de TB, de forma que uma vez codificadasem polipeptídeos, possuem a atividade biológica dequalquer um dos polipeptídeos antigênicos de TB descritosaqui. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico análogapode ser produzida com alterações "silenciosas" naseqüência em que um ou mais nucleotideos diferem dosnucleotideos de qualquer um dos polipeptídeos de TBdescritos aqui, ainda, uma vez codificada em um polipep-tideo, ainda possui sua função ou atividade biológica. Osexemplos de tais diferenças incluem adições, deleções ousubstituições. São também abrangidas pela presente invençãoas seqüências de ácidos nucléicos que codificam polipep-tídeos análogos que exibem atividade biológica maior oumenor que as proteínas de TB da presente invenção. Emparticular, a presente invenção está direcionada a molé-culas de ácidos nucléicos que possuem pelo menosaproximadamente 70% (por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90% ou95%) de identidade com as SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11,13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47 ou combinações das mesmas.

As moléculas de ácidos nucléicos da presenteinvenção, que incluem as seqüências de comprimentocompleto, as seqüências parciais, os fragmentos funcionaise homólogos, uma vez codificadas em polipeptideos, ativamuma resposta imunogênica especifica à TB ou possuem afunção do polipeptideo, como descrito adicionalmente aqui.As seqüências de ácidos nucléicos homólogas podem serdeterminadas utilizando métodos conhecidos pelos peritos naarte e através de métodos descritos aqui que incluemaqueles descritos para seqüências polipeptidicas homólogas.Os antigenos imunogênicos podem ser então seqüenciadosutilizando técnicas tal como a química de Edman. Ver Edmane Berg, Eur. J. Biochem. 80: 116-132, 1967.

São também abrangidas pela presente invenção asseqüências de ácidos nucléicos, DNA ou RNA, que sãosubstancialmente complementares às seqüências de DNA quecodificam os polipeptideos antigênicos de TB da presenteinvenção e que se hibridizam especificamente com suasseqüências de DNA sob condições de estringência conhecidaspelos peritos na arte. Como definido aqui, substancialmentecomplementar significa que o ácido nucléico não precisarefletir a seqüência exata das seqüências de TB, mas temque ser suficientemente similar em relação à seqüência parapermitir a hibridização com a seqüência de ácido nucléicode TB sob condições de alta estringência. Por exemplo,bases não complementares podem estar intercaladas em umaseqüência de nucleotideos ou as seqüências podem ser maislongas ou mais curtas que a seqüência de ácido nucléico deTB, contanto que a seqüência tenha um número suficiente debases complementares à seqüência de TB para permitir ahibridização com a mesma. As condições para estringênciasão descritas, por exemplo, em Ausubel, F. M. e outros,Current Protocols in Molecular Biology, (Current Protocol,1994) e Brown e outros, Nature, 366: 575 (1993); eadicionalmente definidas em associação com certos ensaios.

São ainda abrangidas pela presente invenção asseqüências de ácidos nucléicos, DNA genômico, cDNA, RNA ouuma combinação dos mesmos, que é substancialmente comple-mentar às seqüências de DNA da presente invenção e que sehibridiza especificamente com as seqüências de ácidosnucléicos antigênicas de TB sob condições de estringênciasuficiente (por exemplo, alta estringência) para aidentificação de seqüências de DNA com identidade de ácidonucléico substancial.

A presente invenção inclui ainda partes ou outrasvariações de antigenos de M. tuberculosis que são geradasatravés de meios sintéticos ou recombinant es. Ospolipeptideos sintéticos que possuem menos que aproxima-damente 100 aminoácidos e geralmente menos que aproxima-damente 50 aminoácidos, podem ser gerados utilizandotécnicas bem conhecidas pelos peritos comuns na arte. Porexemplo, tais polipeptideos podem ser sintetizadosutilizando qualquer uma das técnicas em fase sólidadisponíveis comercialmente, tal como o método de síntese emfase sólida de Merrifield, em que os aminoácidos sãoseqüencialmente adicionados a uma cadeia de aminoácidoscrescente. Ver Merrifield, J. Am. Chem. Soe. 85: 2149-2146,1963. 0 equipamento para a síntese automatizada depolipeptídeos está disponível comercialmente de fornece-dores tal como a Applied BioSystems, Inc., Foster City,Calif. e pode ser operado de acordo com as instruções dofabricante. As variações de um antígeno nativo podem sergeralmente preparadas utilizando técnicas padronizadas demutagênese, tal como a mutagênese específica ao sítiodirecionada ao oligonucleotídeo. Seções da seqüência de DNAtambém podem ser removidas utilizando técnicas padronizadaspara permitir a preparação de polipeptídeos truncados. Emuma outra modalidade, a presente invenção inclui moléculasde ácidos nucléicos (por exemplo, sondas ou iniciadores)que se hibridizam com as seqüências de TB, SEQ ID NOs: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33,35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 ou combinações das mesmas sobcondições de estringência alta ou moderada. Em um aspecto,a presente invenção inclui moléculas que são ou sehibridizam com pelo menos aproximadamente 20 nucleotídeoscontíguos ou mais longos em comprimento (por exemplo, 50,100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100,1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100,2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100,3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900 ou 4000).

Tais moléculas se hibridizam com uma das seqüências deácidos nucléicos de TB sob condições de alta estringência.

A presente invenção inclui tais moléculas e aquelas quecodificam um polipeptideo que possui as funções ou aatividade biológica descrita aqui. Tipicamente a sonda deácido nucléico compreende a seqüência de ácido nucléico(por exemplo, as SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47ou combinações das mesmas) e tem comprimento e complemen-taridade suficientes para se hibridizar especificamente comuma seqüência de ácido nucléico que codifica umpolipeptideo antigênico de TB. Por exemplo, uma sonda deácido nucléico pode ter pelo menos aproximadamente 5%, 10%,20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% do comprimento daseqüência de ácido nucléico de TB. Os requerimentos decomprimento e complementaridade suficientes podem serfacilmente determinados por um perito na arte. As condiçõesde hibridização adequadas (por exemplo, condições de altaestringência) são também descritas aqui. Adicionalmente, apresente invenção abrange fragmentos dos polipeptideos dapresente invenção ou seqüências de ácidos nucléicos quecodificam um polipeptideo em que o polipeptideo possui aatividade biológica dos polipeptideos de TB citados aqui.

Tais fragmentos são úteis como sondas para os ensaiosdescritos aqui e como ferramentas experimentais ou no casode fragmentos de ácidos nucléicos, como iniciadores. Umamodalidade preferida inclui iniciadores e sondas que sehibridizam seletivamente com as construções de ácidosnucléicos que codificam qualquer um dos polipeptideos de TBcitados. Por exemplo, os fragmentos de ácidos nucléicos quecodificam qualquer um dos domínios descritos aqui tambémsão implicados pela presente invenção. As condições deestringência para hibridização se referem às condições detemperatura e composição dos tampões que permitem ahibridização de uma primeira seqüência de ácido nucléicocom uma segunda seqüência de ácido nucléico, em que ascondições determinam o grau de identidade entre estasseqüências que se hibridizam uma com a outra. Portanto, as"condições de alta estringência" são aquelas condições emque apenas as seqüências de ácidos nucléicos que são muitosimilares uma à outra se hibridizarão. As seqüências podemser menos similares uma à outra se estas se hibridizaremsob condições de estringência moderada. Ainda, menossimilaridade é necessária para duas seqüências sehibridizarem sob condições de baixa estringência. Variandoas condições de hibridização partindo de um nível deestringência em que não ocorre qualquer hibridização, atéum nível em que a hibridização é observada primeiro, podemser determinadas as condições em que uma certa seqüência sehibridizará com aquelas seqüências que são mais similares àmesma. As condições precisas que determinam a estringênciade uma hibridização particular incluem não apenas a forçaiônica, a temperatura e a concentração dos agentes dedesestabilização tal como a formamida, mas também fatorestais como o comprimento das seqüências de ácidos nucléicos,sua composição de bases, a porcentagem de pares de basesmal pareados entre as duas seqüências e a freqüência deocorrência de subconjuntos das seqüências (por exemplo,pequenos filamentos de repetições) dentro de outrasseqüências que não são idênticas. A lavagem é a etapa emque as condições são ajustadas de forma a determinar umnivel mínimo de similaridade entre as seqüências que sehibridizam com cada outra. De forma geral, partindo, datemperatura mais baixa em que apenas a hibridizaçãohomóloga ocorre, um pareamento errado de 1% entre duasseqüências resulta em um decréscimo de I0C na temperaturade fusão (Tm) para qualquer concentração de SSC escolhida.

Geralmente, o dobro da concentração de SSC resulta em umaumento na Tm de aproximadamente 17°C. Utilizando estaslinhas de guia, a temperatura da lavagem pode serdeterminada empiricamente, dependendo do nível depareamento errado buscado. As condições de hibridização ede lavagem são explicadas em Current Protocols in MolecularBiology (Ausubel, F. M. e outros, eds. , John Wiley & Sons,Inc., 1995, com atualizações suplementares) nas páginas2.10.1 até 2.10.16 e 6.3.1 até 6.3.6.

As condições de alta estringência podem empregara hibridização em (1) IXSSC (10XSSC = 3 M de NaCl, 0,3 M deNa3-Citrato.2H20 (88 g/litro), pH a 7,0 com 1 M de HCl), 1%de SDS (dodecil sulfato de sódio), 0,1-2 mg/mL de DNA detimo de bezerro desnaturado a 65°C, (2) 1XSSC, 50% deformamida, 1% de SDS, 0,1-2 mg/mL de DNA de timo de bezerrodesnaturado a 42°C, (3) 1% de albumina de soro bovino(fração V) , 1 mM de Na2-EDTA, 0,5 M de NaHPO4 (pH 7,2) (1 Mde NaHPO4 = 134 g de Na2HP04-7H20, 4 mL de 85% de H3PO4 porlitro), 7% de SDS, 0,1-2 mg/mL de DNA de timo de bezerrodesnaturado a 65°C, (4) 50% de formamida, 5XSSC, 0,02 M deTris-HCl (pH 7,6), IX solução de Denhardt (100X = 10 g deFicoll 400, 10 g de polivinilpirrolidona, 10 g de albuminade soro bovino (fração V), água até 500 mL), 10% de sulfatode dextran, 1% de SDS, 0,1-2 mg/mL de DNA de timo debezerro desnaturado a 42°C, (5) 5XSSC, 5X solução deDenhardt, 1% de SDS, 100 pg/mL de DNA de timo de bezerrodesnaturado a 65°C ou (6) 5XSSC, 5X solução de Denhardt,50% de formamida, 1% de SDS, 100 ug/mL de DNA de timo debezerro desnaturado a 42°C, com lavagens com altaestringência de (1) 0,3-0,lXSSC, 0,1% de SDS a 65°C ou (2)1 mM de Na2EDTA, 40 mM de NaHPO4 (pH 7,2), 1% de SDS a650C. É pretendido que as condições acima sejam utilizadaspara híbridos de DNA-DNA de 50 pares de bases ou maislongos. Quando se acredita que o híbrido tenha menos que 18pares de bases de comprimento, as temperaturas dehibridização e de lavagem devem ser 5-100C abaixo da Tmcalculada do híbrido, em que a Tm em 0C = (2X o número debases AeT) + (4X o número de bases G e C) . Para oshíbridos acreditados como possuindo de aproximadamente 18até aproximadamente 4 9 pares de bases de comprimento, a Tmem 0C = (81,5°C + 16, 6 (Iogi0M) + 0,41(% de G+C) - 0,61 (%de formamida) - 500/L) , em que "M" é a molaridade decátions monovalentes (por exemplo, Na+) e "L" é o compri-mento do híbrido em pares de bases.

As condições moderadas de estringência podemempregar a hibridização a (1) 4XSSC, (10XSSC = 3 M de NaCl,0,3 M de Na3-Citrato.2H20 (88 g/litro), pH a 7,0 com 1 M deHCl) , 1% de SDS (dodecil sulfato de sódio), 0,1-2 mg/mL deDNA de timo de bezerro desnaturado a 65°C, (2) 4XSSC, 50%de formamida, 1% de SDS, 0,1-2 mg/mL de DNA de timo debezerro desnaturado a 42°C, (3) 1% de albumina de sorobovino (fração V) , 1 mM de Na2-EDTA, 0,5 M de NaHPO4 (pH7,2) (1 M de NaHPO4 = 134 g de Na2HP04-7H20, 4 mL de 85% deH3PO4 por litro), 7% de SDS, 0,1-2 mg/mL de DNA de timo debezerro desnaturado a 65°C, (4) 50% de formamida, 5XSSC,0,02 M de Tris-HCl (pH 7,6), IX solução de Denhardt (100X =10 g de Ficoll 400, 10 g de polivinilpirrolidona, 10 g dealbumina de soro bovino (fração V), água até 500 mL) , 10%de sulfato de dextran, 1% de SDS, 0,1-2 mg/mL de DNA detimo de bezerro desnaturado a 42°C, (5) 5XSSC, 5X soluçãode Denhardt, 1% de SDS, 100 ug/mL de DNA de timo de bezerrodesnaturado a 650C ou (6) 5XSSC, 5X solução de Denhardt,50% de formamida, 1% de SDS, 100 μg/mL de DNA de timo debezerro desnaturado a 420C, com lavagem com estringênciamoderada de 1XSSC, 0,1% de SDS a 65°C. É pretendido que ascondições acima sejam utilizadas para híbridos de DNA-DNAcom 50 pares de bases ou mais longos. Quando se acreditaque o híbrido possui menos que 18 pares de bases decomprimento, as temperaturas de hibridização e de lavagemdevem ser 5-100C abaixo da Tm calculada do híbrido, em queTm em 0C = (2X o número de bases AeT) + (4X o número debases G e C) . Para os híbridos acreditados que tenhamaproximadamente 18 até aproximadamente 4 9 pares de bases decomprimento, a Tm em 0C = (81,5°C + 16,6 (Iogi0M) + 0,41(% deG+C) - 0,61 (% de formamida) - 500/L) , em que "M" é amolaridade de cátions monovalentes (por exemplo, Na+) e "L"é o comprimento do híbrido em pares de bases.

As condições de baixa estringência podem empregara hibridização a (1) 4XSSC, (10XSSC = 3 M de NaCl, 0,3 M deNa3-Citrato.2Η20 (88 g/litro), ρΗ a 7,0 com 1 M de HCl) , 1%de SDS (dodecil sulfato de sódio), 0,1-2 mg/mL de DNA detimo de bezerro desnaturado a 50°C, (2) 6XSSC, 50% deformamida, 1% de SDS, 0,1-2 mg/mL de DNA de timo de bezerrodesnaturado a 40°C, (3) 1% de albumina de soro bovino(fração V), 1 mM de Na2-EDTA, 0,5 M de NaHPO4 (pH 7,2) (1 Mde NaHPO4 = 134 g de Na2HPO4. 7H20, 4 mL de 85% de H3PO4 porlitro), 7% de SDS, 0,1-2 mg/mL de DNA de timo de bezerrodesnaturado a 50°C, (4) 50% de formamida, 5XSSC, 0,02 M deTris-HCl (pH 7,6), IX solução de Denhardt (100X = 10 g deFicoll 400, 10 g de polivinilpirrolidona, 10 g de albuminade soro bovino (fração V), água até 500 mL) , 10% de sulfatode dextran, 1% de SDS, 0,1-2 mg/mL de DNA de timo debezerro desnaturado a 40°C, (5) 5XSSC, 5X solução deDenhardt, 1% de SDS, 100 ug/mL de DNA de timo de bezerrodesnaturado a 500C ou (6) 5XSSC, 5X solução de Denhardt,50% de formamida, 1% de SDS, 100 pg/mL de DNA de timo debezerro desnaturado a 40°C, com lavagens de baixaestringência de 2XSSC, 0,1% de SDS a 50°C ou (2) 0,5% dealbumina de soro bovino (fração V), 1 mM de Na2EDTA, 40 mMde NaHPO4 (pH 7,2), 5% de SDS. É pretendido que ascondições acima sejam utilizadas para híbridos de DNA-DNAcom 50 pares de bases ou mais longos. Quando se acreditaque o híbrido tenha menos que 18 pares de bases decomprimento, as temperaturas de hibridização e lavagemdevem ser 5-100C abaixo da Tm calculada do híbrido, em quea Tm em 0C = (2X o número de bases AeT) + (4X o número debases G e C). Para os híbridos acreditados que possuamaproximadamente 18 até aproximadamente 4 9 pares de bases decomprimento, a Tm em 0C = (81,5°C + 16.6 (IogxoM) + 0,41(% deG + C - 0,61 (% de formamida) - 500/L) ) , em que "M" é amolaridade de cátions monovalentes (por exemplo, Na+) e "L"é o comprimento do híbrido em pares de bases.

As seqüências de ácidos nucléicos de TB dapresente invenção ou um fragmento das mesmas, também podemser utilizadas para isolar homólogos adicionais. Porexemplo, uma biblioteca de cDNA ou de DNA genômico prove-niente do organismo apropriado pode ser verificada com aseqüência de ácido nucléico de TB marcada para a identi-ficação de genes homólogos como descrito, por exemplo, emAusubel e outros, Eds., Current Protocols In MolecularBiology, John Wiley & Sons, Nova York (1997).

Os antígenos imunogênicos podem ser produzidos deforma recombinante utilizando uma seqüência de DNA quecodifica o antígeno, que foi inserida em um vetor deexpressão e expressa em uma célula hospedeira apropriada.As seqüências de DNA que codificam os antígenos de M.tuberculosis podem, por exemplo, ser identificadas atravésda verificação de uma biblioteca de expressão genômica oude cDNA apropriada de M. tuberculosis com o soro obtido depacientes infectados com M. tuberculosis. Tais verificaçõespodem ser geralmente realizadas utilizando técnicas bemconhecidas pelos peritos comuns na arte, tais como asdescritas em Sambrook e outros, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, ColdSpring Harbor, N. Y., 1989. As seqüências de oligo-nucleotídeos degeneradas para uso em tal verificação podemser planejadas e sintetizadas e a verificação pode serrealizada. Também pode ser empregada a reação em cadeia dapolimerase (PCR), utilizando os oligonucleotideos anterio-res em métodos bem conhecidos na arte, para isolar umasonda de ácido nucléico de uma biblioteca de cDNA ougenômica. A verificação da biblioteca pode ser entãorealizada utilizando a sonda isolada. 0 presente métodopode incluir opcionalmente uma sonda antigênica de TBmarcada.

Alternativamente, as bibliotecas genômicas ou dec DNA derivadas de M. tuberculosis podem ser verificadasdiretamente utilizando células mononucleares do sangueperiférico (PBMCs) ou linhagens de células T ou clonesderivados de um ou mais indivíduos imunes à M. tuberculosis.

Em geral, as PBMCs e/ou as células T para uso em taisverificações podem ser preparadas como descrito abaixo. Asverificações diretas das bibliotecas podem ser geralmenterealizadas através da análise de conjuntos de proteínasrecombinantes expressas em relação à capacidade deinduzir a proliferação e/ou a produção de interferon-γ emcélulas T derivadas de um indivíduo imune à M.tuberculosis.

A invenção fornece ainda vetores, plasmídeos ouvírus contendo uma ou mais das moléculas de ácidosnucléicos de TB (por exemplo, possuindo a seqüência das SEQID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 ou combinações dasmesmas). Os vetores adequados para uso em célulaseucarióticas e procarióticas são conhecidos na arte e estãodisponíveis comercialmente ou são facilmente preparados porum perito na arte. Vetores adicionais também podem serencontrados, por exemplo, in Ausubel, F. M. e outros,Current Protocols in Molecular Biology, (Current Protocol,1994) e Sambrook e outros, "Molecular Cloning: A LaboratoryManual", ED. (1989).

Os polipeptideos recombinantes que contêmpartes e/ou variações de um antigeno nativo podem serfacilmente preparados partindo de uma seqüência de DNA quecodifica o polipeptideo utilizando uma variedade detécnicas bem conhecidas pelos peritos comuns na arte. Porexemplo, os sobrenadantes provenientes de sistemas dehospedeiro/vetor adequados que secretam a proteína recom-binante dentro do meio de cultura podem ser primeiramenteconcentrados utilizando um filtro disponível comer-cialmente. Após a concentração, o concentrado pode seraplicado em uma matriz de purificação adequada tal como umamatriz de afinidade ou uma resina de troca iônica.Finalmente, uma ou mais etapas de HPLC em fase inversapodem ser empregadas para purificar adicionalmente umaproteína recombinante.

Qualquer um de uma variedade de vetores deexpressão conhecidos pelos peritos comuns na arte pode serempregado para expressar os polipeptideos recombinantesdesta invenção. A expressão pode ser conseguida em qualquercélula hospedeira adequada que tenha sido transformada outransfectada com um vetor de expressão contendo umamolécula de DNA que codifica um polipeptideo recombinante.As células hospedeiras adequadas incluem célulasprocarióticas, leveduras e eucarióticas superiores. Prefe-rencialmente, as células hospedeiras empregadas são E.Colir levedura ou uma linhagem de células de mamífero talcomo COS ou CHO. As seqüências de DNA expressas dessamaneira podem codificar antigenos que ocorrem naturalmente,partes de antigenos que ocorrem naturalmente ou outrasvariações dos mesmos.

Os usos de plasmídeos, vetores ou vírus contendoos receptores ou os fragmentos de receptores de TB clonadosincluem um ou mais dos seguintes; (1) produção de sondaspara hibridização para a detecção e a medida do nível de TBno tecido ou isolamento de homólogos de TB; (2) produção demRNA ou de proteína de TB in vitro ou in vivo; e (3)produção de animais não humanos transgênicos ou de célulashospedeiras recombinantes.

Em uma modalidade, a presente invenção abrangecélulas hospedeiras transformadas com os plasmídeos, osvetores ou os vírus descritos anteriormente. As moléculasde ácidos nucléicos podem ser inseridas em uma construçãoque pode, opcionalmente, se replicar e/ou se integrar emuma célula hospedeira recombinant e, através de métodosconhecidos. A célula hospedeira pode ser uma eucariótica ouuma procariótica e inclui, por exemplo, levedura (tal comoPichia pastorius ou Saccharomyces cerevisiae) , bactérias(tal como E. coli, M. tuberculosis ou Bacillus subtilis) ,células ou tecidos animais, células Sf9 de insetos (taiscomo células Sf9 infectadas por baculovírus) ou células demamíferos (células somáticas ou embrionárias, células deRim Embrionário Humano (HEK), células de ovário de hamsterchinês, células HeLa, células 293 humanas e célula COS-7 demacaco). As células hospedeiras adequadas na presenteinvenção incluem ainda uma célula de mamífero, uma célulabacteriana, uma célula de levedura, uma célula de inseto euma célula vegetal.

A molécula de ácido nucléico pode ser incorporadaou inserida na célula hospedeira através 'de métodosconhecidos. Os exemplos de métodos adequados de transfecçãoou de transformação das células incluem a precipitação comfosfato de cálcio, a eletroporação, a microinjeção, ainfecção, a lipofecção e a captação direta. "Transformação"ou "transfecção" como utilizado aqui se refere à aquisiçãode características genéticas novas ou alteradas através daincorporação de ácidos nucléicos adicionais, por exemplo,DNA. A "expressão" da informação genética de uma célulahospedeira é um termo da arte que se refere à transcriçãodirecionada do DNA para gerar RNA que é traduzido em umpolipeptídeo. Os métodos para a preparação de tais célulashospedeiras recombinantes e para a incorporação dos ácidosnucléicos estão descritos em maiores detalhes em Sambrook eoutros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", SegundaEdição (1989) e Ausubel e outros "Current Protocols inMolecular Biology", (1992), por exemplo.

A célula hospedeira é então mantida sob condiçõesadequadas para a expressão e para a recuperação do polipep-tídeo antigênico de TB da presente invenção. Geralmente, ascélulas são mantidas em um tampão e/ou meio de crescimentoadequado ou fonte de nutrientes para o crescimento dascélulas e a expressão do(s) produto(s) gênico(s). Os meiosde crescimento não são críticos para a invenção, sãogeralmente conhecidos na arte e incluem fontes de carbono,nitrogênio e enxofre. Os exemplos incluem Luria broth,Superbroth, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM),RPMI-1640, M199 e meios para inseto de Grace. Os meios decultura podem ter um tampão, cuja seleção não é criticapara a invenção. 0 pH dos meios tamponados pode serselecionado e é geralmente um tolerado pelo ou ótimo para ocrescimento da célula hospedeira.

A célula hospedeira é mantida sob uma temperaturae uma atmosfera adequadas. Alternativamente, a célulahospedeira é aeróbica e a célula hospedeira é mantida sobcondições atmosféricas ou outras condições adequadas para ocrescimento. A temperatura também deve ser selecionada deforma que a célula hospedeira tolere o processo e podeestar, por exemplo, entre aproximadamente 13-40 grausCelsius.

Anticorpos e Métodos de Avaliação

0 método para a avaliação da presença ou daausência dos polipeptideos antigênicos de TB descritosaqui, em uma amostra, é abrangido pela presente invenção.

Os ensaios adequados incluem métodos imunológicos, tal comoradioimunoensaio, ensaios imunoabsorventes ligados à enzima(ELISA), ensaios quimioluminescentes e ensaios imunocro-matográficos rápidos. Qualquer método conhecido agora oudesenvolvido posteriormente pode ser utilizado para mediros polipeptideos antigênicos de TB.

Podem ser utilizados os anticorpos reativos comqualquer um dos polipeptideos antigênicos de TB, a saber,SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26,28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 ou umacombinação das mesmas ou porções das mesmas. Em umamodalidade preferida, os anticorpos se ligam especifi-camente aos polipeptideos antigênicos de TB ou a uma partedos mesmos. Os anticorpos podem ser policlonais oumonoclonais e é pretendido que o termo anticorpo abranjaanticorpos policlonais e monoclonais e fragmentos funcio-nais dos mesmos. Os termos policlonal e monoclonal sereferem ao grau de homogeneidade de uma preparação deanticorpos e não é pretendido que sejam limitados a métodosparticulares de produção.

Em várias das modalidades preferidas, técnicasimunológicas detectam a presença, a ausência de niveis depolipeptideos antigênicos de TB descritos aqui através deum anticorpo anti-TB (isto é, um ou mais anticorpos) . 0termo "anticorpo anti-TB" inclui anticorpos monoclonaise/ou policlonais e misturas ou coquetéis dos mesmos e serefere a anticorpos específicos aos polipeptideos quepossuem uma seqüência apresentada nas SEQ ID Nos: 2, 4, 6,8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36,38, 40, 42, 44, 46, 48 ou uma combinação das mesmas oupartes das mesmas. Os anticorpos anti-TB podem serproduzidos contra agentes imunogênicos apropriados, taiscomo os polipeptideos antigênicos de TB isolados e/ourecombinantes descritos aqui, análogos ou parte dos mesmos(incluindo moléculas sintéticas, tais como peptídeossintéticos). Em uma modalidade, os anticorpos são produ-zidos contra polipeptideos antigênicos de TB isolados e/ourecombinantes descritos aqui ou uma parte dos mesmos (porexemplo, um peptideo) ou contra uma célula hospedeira queexpressa os polipeptideos recombinantes antigênicos de TB.

Em adição, as células que expressam os polipeptideosrecombinantes antigênicos de TB descritos aqui, tais comocélulas transfectadas, podem ser utilizadas como agentesimunogênicos ou em uma seleção em relação a um anticorpoque se liga ao receptor.

Qualquer técnica adequada pode preparar oantigeno imunizante e produzir anticorpos policlonais oumonoclonais. A arte contém uma variedade destes métodos(ver, por exemplo, Kohler e outros, Nature, 256: 495-497(1975) e Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976); Milstein eoutros, Nature 266: 550-552 (1977); Koprowski e outros,Patente U.S. N^ 4.172.124; Harlow, E. e D. Lane, 1988,Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring HarborLaboratory: Cold Spring Harbor, N. Y.); Current ProtocolsIn Molecular Biology, Vol. 2 (Suplemento 27, Verão de 94),Ausubel, F. M. e outros, Eds., (John Wiley & Sons: NovaYork, N. Y.), Capitulo 11, (1991)). Geralmente, a fusão deuma linhagem imortal ou mieloma adequado, tal como SP2/0,com células produtoras de anticorpo pode produzir umhibridoma. Os animais imunizados com o antigeno de interessefornecem a célula produtora de anticorpo, preferencialmentecélulas do baço ou dos nodos linfáticos. Condiçõesseletivas de cultura isolam as células de hibridomaprodutoras de anticorpo enquanto as técnicas de diluiçãolimitante produzem as mesmas. Os pesquisadores podemutilizar ensaios adequados tal como ELISA para selecionaras células produtoras de anticorpo com a especificidadedesejada.

Outros métodos adequados podem produzir ou isolaranticorpos da especificidade necessária. Os exemplos deoutros métodos incluem a seleção do anticorpo recom-binante de uma biblioteca ou se baseiam na imunização deanimais transgênicos tais como camundongos.

A presente invenção inclui ensaios para determinarse uma pessoa está infectada com TB ativa, quando comparadacom uma pessoa que não possui TB ativa (por exemplo, possuiTB latente, não há infecção com TB ou foi imunizada contraa infecção por TB). A TB latente ocorre quando uma pessoafoi infectada com M. tuberculosis, mas a bactéria estádormente ou inativa. A infecção com TB inativa se refere auma pessoa infectada com M. tuberculosis e a bactéria estáafetando acuradamente partes do corpo, incluindo os pulmõese outros tecidos. A presente invenção, baseada na desco-berta de que certos antigenos de TB são encontrados naurina de pacientes com TB ativa, inclui ensaios para adeterminação da ausência ou da presença de infecção com TBativa.

De acordo com o método, um ensaio pode determinara presença, a ausência ou o nivel de polipeptideosantigênicos de TB em uma amostra biológica. Tal ensaioinclui a combinação da amostra que será testada com umanticorpo que possui especificidade pelos polipeptideosantigênicos de TB descritos aqui, sob condições adequadaspara a formação de um complexo entre o anticorpo e ospolipeptideos antigênicos de TB e a detecção ou a medida(diretamente ou indiretamente) da formação de um complexo.A amostra pode ser obtida diretamente ou indiretamente (porexemplo, fornecida por um profissional da saúde) e pode serpreparada através de um método adequado para a amostraparticular (por exemplo, urina, saliva, fluido espinhalcerebral, sangue total, plasma rico em plaquetas, plasmapobre em plaquetas, soro) e de um formato de ensaioselecionado. Os métodos de combinação da amostra e doanticorpo e os métodos de detecção da formação de complexosão também selecionados para serem compatíveis com oformato de ensaio.

Marcações adequadas podem ser detectadas direta-mente, como marcações radioativas, fluorescentes ouquimioluminescentes. Estas também podem ser indiretamentedetectadas utilizando marcações tais como marcaçõesenzimáticas e outros padrões antigênicos ou de ligaçãoespecífica como a biotina. Os exemplos de tais marcaçõesincluem marcações fluorescentes tais como fluoresceína,rodamina, marcações quimioluminescentes tal comoluciferase, marcações com radioisótopos tais como 32Ρ, 125I,131I, marcações enzimáticas tais como peroxidase de raizforte e fosfatase alcalina, galactosidase, biotina,avidina, marcadores "spin" e similares. A detecção deanticorpos em um complexo também pode ser feita imunolo-gicamente com um segundo anticorpo, que é então detectado(por exemplo, através de uma marcação). Os métodosconvencionais ou outros métodos adequados podem marcardiretamente ou indiretamente um anticorpo. Os anticorposprimários e secundários marcados podem ser obtidos comerci-almente ou preparados utilizando métodos conhecidos por umperito na arte (ver Harlow, E. e D. Lane, 1988, Antibodies:A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: ColdSpring Harbor, Ν. Y.)).

Em uma modalidade preferida, a presença, aausência ou o nivel de polipeptideos antigênicos de TB emuma amostra é determinado utilizando um ensaio de ELISA, umensaio de ELISA em sanduíche ou um ensaio imunocro-matográfico. Para a detecção de polipeptideos antigênicosde TB em uma amostra adequada, é coletada uma amostra (porexemplo, urina). As amostras podem ser processadas como éconhecido na arte. O ensaio inclui ainda a combinação deuma amostra adequada com uma composição que possui umanticorpo para o polipeptideo anti-TB como detector (porexemplo, MAb de polipeptideos anti-TB biotinilados e MAb depolipeptideos anti-TB conjugados com HRP-estreptavidina oucom HRP) e um suporte sólido, tal como uma placa paramicrotitulação ou um "dipstick", que possui um anticorpo decaptura do polipeptideo anti-TB ligado (diretamente ouindiretamente) ao mesmo. 0 anticorpo detector se liga a umpolipeptideo antigênico diferente do epítopo de TB daquelereconhecido pelo anticorpo de captura, sob condiçõesadequadas para a formação do complexo. 0 ensaio envolveentão a determinação da formação do complexo nas amostras.

A presença de um ou mais dos polipeptideos antigênicos deTB em uma amostra de um indivíduo indica a presença deinfecção por TB ativa, enquanto que a ausência de umpolipeptideo de TB indica que o paciente não possuiinfecção por TB ativa.O suporte sólido, tal como uma placa para micro-titulação, "dipstick", esfera, bloco, tira ou outro suporteadequado, pode ser revestido diretamente ou indiretamentecom um anticorpo de polipeptideo anti-TB ou um antigenoespecifico à TB. Por exemplo, um anticorpo de polipeptideoanti-TB pode revestir um poço de microtitulação ou um MAbde polipeptideo anti-TB biotinilado pode ser adicionado aum suporte revestido com estreptavidina. Em relação a umensaio imunocromatográfico, um bloco ou uma tira pode serrevestida com um anticorpo especifico para o antigeno equando uma amostra que possui um ou mais dos antigenosdescritos aqui entra em contato com o anticorpo, o complexopode apresentar uma coloração com o auxilio de um detector,como descrito adicionalmente aqui. Ver a Figura 4. Umavariedade de métodos de imobilização ou de revestimento bemcomo um número de suportes sólidos pode ser utilizada epode ser selecionada de acordo com o formato desejado.

Em um ensaio imunocromatográfico, uma amostra quepossui os antigenos de TB da presente invenção pode seradicionada ao bloco como é mostrado na Figura 4. A amostrase difunde através de um anticorpo marcado com ouro (mAb#l)que é especifico a uma parte do antigeno e é formado umcomplexo entre o antigeno na amostra e o anticorpo. Àmedida que o complexo se difunde adicionalmente através dobloco que possui um segundo anticorpo (mAb #2), o anticorpose liga a uma parte diferente do antigeno. Quando atinge alinha marcada "linha 1", o complexo marcado apresenta umacoloração e a linha de controle ("linha 2") também mudaráde cor. Se a amostra não contiver os antigenos de TB dapresente invenção, então a linha 1 não apresentarácoloração porque o anticorpo marcado com ouro não se ligarácom a amostra e, portanto, não entrará em contado com alinha 1.

Em uma outra modalidade, a amostra (ou um padrãode polipeptideo antigênico de TB) é combinada com o suportesólido simultaneamente com o anticorpo detector e opcional-mente com um ou mais reagentes através dos quais a detecçãoé monitorada. Por exemplo, a amostra pode ser combinada como suporte sólido simultaneamente com (a) Mab de polipep-tideo anti-TB conjugado com HRP ou (b) um Mab depolipeptideo anti-TB biotinilado e HRP-estreptavidina.

Uma quantidade conhecida de um padrão depolipeptideo antigênico de TB pode ser preparada eprocessada como descrito anteriormente para uma amostraadequada. Este padrão de polipeptideo antigênico de TBauxilia na quantificação da quantidade de polipeptideosantigênicos de TB detectados através da comparação do nivelde polipeptideos antigênicos de TB na amostra em relação aodo padrão.

Um médico, um técnico, um aparato ou uma pessoaqualificada pode comparar a quantidade de complexo detec-tado com um controle adequado para determinar se os niveisestão elevados. Por exemplo, o nivel de polipeptideosantigênicos de TB após o tratamento pode ser comparado comum nivel de linha de base antes do tratamento ou com osniveis em indivíduos normais ou controles adequados. Umdecréscimo ou a manutenção dos níveis de um ou maispolipeptideos de TB na urina, quando comparados aos níveisde linha de base, indica que o tratamento está funcionando,enquanto que aumentos nos níveis indicam que este não éeficiente.

Os ensaios típicos para os polipeptídeos antigê-nicos de TB são ensaios seqüenciais em que uma placa érevestida com o primeiro anticorpo, a amostra é adicionada,a placa é lavada, o segundo anticorpo marcado é adicionadoe a placa é lavada e o segundo anticorpo ligado équantificado. Em uma outra modalidade, um formato no qualos anticorpos e a amostra são adicionados simultaneamente,em um formato de ELISA competitivo, pode atingir maiorsensibilidade.

Uma variedade de métodos pode determinar a quan-tidade de polipeptídeos antigênicos de TB nos complexos.Por exemplo, quando a HRP é utilizada como uma marcação, umsubstrato adequado tal como OPD pode ser adicionado paraproduzir uma intensidade de cor diretamente proporcional aoMab de polipeptídeos anti-TB ligado (avaliada, por exemplo,através da densidade óptica) e, portanto aos polipeptídeosantigênicos de TB na amostra.

Um técnico, um médico, uma pessoa qualificada ouum aparato pode comparar os resultados com um controleadequado tal como um padrão ou níveis de linha de base depolipeptídeos antigênicos de TB em uma amostra do mesmodoador. Por exemplo, o ensaio pode ser realizado utilizandouma quantidade conhecida de padrão de polipeptídeos anti-gênicos de TB no lugar de uma amostra e uma curva padrãopode ser estabelecida. Pode-se comparar de forma relativaas quantidades conhecidas do padrão de polipeptídeosantigênicos de TB com a quantidade de complexo formado oudetectado.

0 ácido nucléico que codifica os polipeptideosantigênicos de TB também pode ser analisado através dehibridização, por exemplo, através da hibridização de umadas seqüências de TB fornecidas aqui (por exemplo, SEQ IDNOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 ou combinações dasmesmas) ou um oligonucleotideo derivado de uma dasseqüências, com uma amostra de tecido contendo DNA ou RNAde uma pessoa. Tal seqüência de hibridização pode ter ummarcador detectável, por exemplo, radioativo, fluorescenteetc., ligado para permitir a detecção do produto dehibridização. Tais métodos incluem o contato da amostra comuma ou mais sondas de oligonucleotideo (por exemplo, pelomenos aproximadamente 15 bases contíguas) específicas paraa molécula de ácido nucléico descrita aqui sob condições dealta estringência, suficientemente para permitir a hibri-dização entre a amostra e a sonda; e a detecção da moléculade ácido nucléico que se hibridiza com a sonda deoligonucleotideo na amostra. A presença de hibridização dasonda indica infecção por M. tuberculosis e a ausência dehibridização indica uma ausência de infecção por M.tuberculosis. Os métodos para hibridização são bemconhecidos e tais métodos são fornecidos na Patente U.S.N- 5.837.490, por Jacobs e outros, cujos ensinamentosinteiros são incorporados aqui como referência em suatotalidade. 0 planejamento da sonda de oligonucleotideodeve preferencialmente seguir estes parâmetros: (a) deveser planejada para uma área da seqüência que possui a menorquantidade de bases ambíguas (wN's"), se alguma e (b) deveser planejada para ter uma Tm de aproximadamente 80°Celsius (assumindo 2° Celsius para cada A ou T e 4°C paracada G ou C).

A presente invenção abrange a detecção dospolipeptideos de TB da presente invenção em uma amostrautilizando métodos de PCR que utilizam iniciadoresdivulgados ou derivados das seqüências descritas aqui. Porexemplo, as seqüências descritas aqui podem ser detectadasatravés da PCR utilizando as SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11,13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47 ou combinações das mesmas. A PCR é aamplificação seletiva de uma seqüência alvo através derodadas repetidas de replicação do ácido nucléico utili-zando iniciadores específicos à seqüência e uma polimerasetermostável. A PCR permite a recuperação de seqüênciasinteiras entre duas extremidades de seqüência conhecida.

Especificamente, o contato da amostra com pelo menos doisiniciadores de oligonucleotídeo em uma PCR, em que pelomenos um dos iniciadores de oligonucleotídeo (por exemplo,pelo menos aproximadamente 10 bases contíguas) é específicopara uma ou mais das moléculas de ácidos nucléicos isoladasdescritas aqui. Os dois ficam em contato suficientementepara permitir a amplificação dos iniciadores. A seqüênciade ácido nucléico amplificada na amostra é detectada. Apresença de qualquer uma das seqüências de ácidos nucléicosamplificadas indica infecção por M. tuberculosis e aausência de qualquer uma das seqüências de ácidos nucléicosamplificadas indica uma ausência de infecção por M.tuberculosis. Os métodos de PCR são descritos aqui e sãoconhecidos na arte.

Assim, a presente invenção inclui kits para adetecção das SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48ou combinações das mesmas ou para a quantificação destasseqüências, possuindo anticorpos específicos para as mesmasou uma parte dos mesmos ou uma seqüência de ácido nucléicoque pode se hibridizar ao ácido nucléico que codifica estasseqüências.

As análises imunológicas ou de ácidos nucléicosadicionais podem ser realizadas utilizando métodosconhecidos na arte. Os ensaios, conhecidos na arte ouaqueles desenvolvidos posteriormente, podem ser utilizadospara avaliar os polipeptídeos antigênicos de TB em umaamostra. Em adição à medida da presença de polipeptídeosantigênicos de TB em uma amostra, há ensaios para adeterminação da eficiência de uma vacina para TB (porexemplo, a extensão até onde a resposta imunológica éestimulada). Estes tipos de ensaios podem ser utilizadosjuntos para avaliar completamente a condição de TB de umapessoa. Por exemplo, um indivíduo que possui uma respostaimunogênica específica para TB, mas que tem teste negativoem relação à presença de um ou mais dos polipeptídeosantigênicos de TB em uma amostra, é um que possui um nívelde imunidade para a doença. Entretanto, uma pessoa quepossui uma resposta imunogênica específica para TB e temteste positivo em relação à presença dos polipeptídeosantigênicos de TB da presente invenção é alguém que prova-velmente possui TB.

A eficiência de uma vacina para TB pode sermedida através da determinação da resposta imunogênica dapessoa que recebeu a vacina. Os antigenos de TB da presenteinvenção (e partes imunogênicas dos mesmos) descritos aquipossuem a capacidade de induzir uma resposta imunogênica.Mais especificamente, os antigenos possuem a capacidade deinduzir a proliferação e/ou a produção de citocinas (istoé, produção de interferon-γ e/ou de interleucina-12) emcélulas T, células NK, células B e/ou macrófagos derivadosde um indivíduo imune à M. tuberculosis. Ver o Exemplo 3.

A seleção do tipo celular para uso na avaliaçãode uma resposta imunogênica a um antígeno dependerá,evidentemente, da resposta desejada. Por exemplo, a produçãoda interleucina-12 é mais facilmente avaliada utilizandopreparações contendo células B e/ou macrófagos. Um indi-víduo imune à M. tuberculosis é um que é considerado comosendo resistente ao desenvolvimento da tuberculose emvirtude de ter montado uma resposta de células T eficientepara M. tuberculosis (isto é, substancialmente isento desintomas da doença). Tais indivíduos podem ser identi-ficados com base em um teste de pele intradérmico fortementepositivo (isto é, endurecimento maior em cerca de 10 mm dediâmetro) para as proteínas da tuberculose utilizando umDerivado de Proteína Purificado (PPD) e a ausência dequaisquer sinais ou sintomas da doença tuberculose. Ascélulas T, as células NK, as células B e os macrófagosderivados de indivíduos imunes à M. tuberculosis podem serpreparadas utilizando métodos conhecidos pelos peritoscomuns na arte. Por exemplo, uma preparação de PBMCs (istoé, células mononucleares do sangue periférico) pode serempregada sem a separação adicional de células docomponente. As PBMCs podem ser geralmente preparadas, porexemplo, utilizando uma centrifugação por densidade atravésde Ficoll (Winthrop Laboratories, NY). As células T parauso nos ensaios descritos aqui podem ser purificadasdiretamente partindo das PBMCs. Alternativamente, umalinhagem de células T enriquecidas reativa contraproteínas micobacterianas ou clones de células T reativos aproteínas micobacterianas individuais, podem serempregados. Tais clones de células T podem ser gerados, porexemplo, através do cultivo de PBMCs de indivíduos imunes àM. tuberculosis com proteínas micobacterianas durante umperíodo de 2-4 semanas. Isto permite a expansão apenas dascélulas T específicas às proteínas micobacterianas,resultando em uma linhagem composta exclusivamente de taiscélulas. Estas células podem então ser clonadas e testadascom proteínas indivi-duais, utilizando métodos conhecidospelos peritos comuns na arte, para definir de forma maisacurada a especi-ficidade das células T individuais. Emgeral, os antígenos que têm teste positivo nos ensaios emrelação à proliferação e/ou à produção de citocinas (istoé, produção de interferon-γ e/ou de interleucina-12)realizados utilizando células T, células NK, células B e/oumacrófagos derivadas de um indivíduo imune à M. tuberculosissão considerados imunogênicos. Tais ensaios podem serrealizados, por exemplo, utilizando os procedimentos repre-sentativos descritos abaixo. As partes imunogênicas de taisantigenos podem ser identificadas utilizando ensaiossimilares e podem estar presentes dentro dos polipeptideosdescritos aqui.

A capacidade de um polipeptideo (por exemplo, umantigeno imunogênico ou uma parte ou outra variação domesmo) induzir a proliferação celular pode ser avaliadaatravés do contato das células (por exemplo, células T e/oucélulas NK) com o polipeptideo e da medida da proliferaçãodas células. Em geral, a quantidade de polipeptideo que ésuficiente para a avaliação de aproximadamente IO5 célulasvaria de aproximadamente 10 ng/mL até aproximadamente 100μg/mL e preferencialmente é de aproximadamente 10 yg/mL. Aincubação do polipeptideo com as células é tipicamenterealizada a 370C durante aproximadamente seis dias. Após aincubação com o polipeptideo, as células são avaliadas emrelação a uma resposta proliferativa, que pode ser avaliadaatravés de métodos conhecidos pelos peritos comuns na arte,tal como a exposição das células a um pulso de timidinamarcada radioativamente e a medida da incorporação damarcação dentro do DNA celular. Em geral, um polipeptideoque resulta em um aumento de pelo menos três vezes naproliferação acima do fundo (isto é, a proliferaçãoobservada para as células cultivadas sem o polipeptideo) éconsiderado como sendo capaz de induzir a proliferação.

A capacidade de um polipeptideo estimular aprodução de interferon-γ e/ou interleucina-12 nas célulaspode ser avaliada através do contato das células com opolipeptideo e da medida do nível de interferon-γ ou deinterleucina-12 produzido pelas células, como demonstradono Exemplo 3. Em geral, a quantidade de polipeptídeo que ésuficiente para a avaliação de aproximadamente IO5 célulasvaria de aproximadamente 10 ng/mL até aproximadamente 100ug/mL e preferencialmente é de aproximadamente 10 pg/mL. Opolipeptídeo pode, mas não necessariamente, ser imobilizadoem um suporte sólido, tal como uma esfera ou uma micro-esfera biodegradável, tal como as descritas nas PatentesU.S. N— 4.897.268 e 5.075.109. A incubação do polipeptídeocom as células é tipicamente realizada a 37 0C duranteaproximadamente seis dias. Após a incubação com opolipeptídeo, as células são avaliadas em relação aointerferon-γ e/ou à interleucina-12 (ou uma ou maissubunidades dos mesmos), que pode ser avaliada através demétodos conhecidos pelos peritos comuns na arte, tal comoum ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) ou, nocaso da subunidade P70 da IL-12, um ensaio biológico talcomo um ensaio que mede a proliferação de células T. Emgeral, um polipeptídeo que resulta na produção de pelomenos 50 pg de interferon-γ por mL de sobrenadantecultivado (contendo IO4 -IO5 células T por mL) é consi-derado capaz de estimular a produção de interferon-γ. Umpolipeptídeo que estimula a produção de pelo menos 10 pg/mLda subunidade P70 da IL-12 e/ou pelo menos 100 pg/mL dasubunidade P40 da IL-12, por IO5 macrófagos ou células B(ou por 3X105 PBMC) é considerado capaz de estimular aprodução de IL-12.

Em geral, os antígenos imunogênicos são aquelesque estimulam a proliferação e/ou a produção de citocinas(isto é, produção de interferon-γ e/ou de interleucina-12)em células T, células NK, células B e/ou macrófagosderivados de pelo menos aproximadamente 25% dos indivíduosimunes à M. tuberculosis. Entre estes antígenos imunogê-nicos, os polipeptídeos que possuem propriedades terapêu-ticas superiores podem ser distinguidos com base namagnitude das respostas nos ensaios anteriores e com basena porcentagem de indivíduos para os quais é observada umaresposta. Em adição, os antígenos que possuem propriedadesterapêuticas superiores não estimularão a proliferação e/oua produção de citocinas in vitro nas células derivadas demais que aproximadamente 25% dos indivíduos que não sãoimunes à M. tuberculosis, eliminando assim as respostas quenão são especificamente causadas por células que respondemà M. tuberculosis. Tais antígenos que induzem uma respostaem uma alta porcentagem de preparações de células T,células NK, células B e/ou macrófagos de indivíduos imunesà M. tuberculosis (com uma baixa incidência de respostasnas preparações celulares de outros indivíduos) possuempropriedades terapêuticas superiores.

Proteínas de Fusão, Composições Vacinais, Modo e Maneira deAdministração

Os polipeptídeos de TB da presente invenção podemestar na forma de um conjugado ou de uma proteína de fusão,que pode ser produzida através de métodos conhecidos. Emparticular, 2 ou mais das seqüências, SEQ ID NOs: 2, 4, 6,8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36,38, 40, 42, 44, 46 ou 48 podem ser fundidas uma com umaoutra ou com outras proteínas, para fornecer uma composiçãovacinai mais eficiente e estimular uma resposta imunogênicamelhorada. Outras proteínas que podem ser utilizadas paraproduzir tal proteína de fusão incluem antígenos de TB queestimulam a via de células T CD4+ da resposta imunológica.

Os exemplos de tais antígenos incluem o Antigeno 85b, ESAT-6, MtB41, Mtb39. Os polipeptídeos de TB da presenteinvenção foram isolados de moléculas de MHC de classe 1,moléculas conhecidas por apresentarem antígenos para ascélulas T CD8+. Embora seja possível que estes polipep-tídeos também sejam apresentados na via de CD4+, a fusão deum antígeno da via de células T CD4 + com dos polipeptídeosda presente invenção pode servir para aumentar a eficiênciada vacina para TB. As proteínas de fusão podem serproduzidas de acordo com métodos conhecidos da tecnologiado DNA. Por exemplo, as proteínas de fusão podem serexpressas partindo de uma molécula de ácido nucléico quecompreende seqüências que codificam uma parte biologi-camente ativa dos polipeptídeos de TB ou os polipeptídeosde TB inteiros apresentados nas SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10,12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40,42, 44, 46, 48 ou combinações das mesmas e seu parceiro defusão, por exemplo, uma outra seqüência da presenteinvenção, uma parte de uma molécula de imunoglobulina ou umoutro antígeno de TB da via das células T CD4 + . Porexemplo, algumas modalidades podem ser produzidas atravésda interseção de um ácido nucléico que compreendeseqüências de imunoglobulina em um vetor de expressãoadequado, vetor de fato ou outros vetores disponíveiscomercialmente. A construção resultante pode serintroduzida em uma célula hospedeira adequada paraexpressão. Após a expressão, as proteínas de fusão podemser isoladas ou purificadas de uma célula através de umamatriz de afinidade. Medindo as alternações nas funções dascélulas transfectadas que ocorrem como um resultado daexpressão de proteínas de TB recombinantes, as célulaspor si mesmas ou as proteínas de TB produzidas partindo dascélulas podem ser utilizadas em uma variedade de ensaios deseleção.

Como citado anteriormente, em certos aspectos ascomposições da invenção compreende proteínas de fusão oumoléculas de fusão com DNA. Cada proteína de fusãocompreende um primeiro e um segundo polipeptídeos dainvenção ou, alternativamente, um polipeptídeo da presenteinvenção e um antígeno conhecido de M. tuberculosis, juntocom variações de tais proteínas de fusão. As proteínas defusão da presente invenção também podem incluir um peptídeoligante entre o primeiro e o segundo polipeptídeos. Asmoléculas de fusão com DNA da presente invenção compreendemuma primeira e uma segunda moléculas de DNA isoladas, cadamolécula de DNA isolada codificando um antígeno de M.tuberculosis da invenção ou um antígeno conhecido de M.tuberculosis.

Uma seqüência de DNA que codifica uma proteína defusão da presente invenção é construída utilizando técnicasconhecidas do DNA recombinante para montar seqüências deDNA separadas que codificam o primeiro e o segundopolipeptídeos em um vetor de expressão apropriado, comodescrito em detalhes abaixo. A extremidade a 3' de umaseqüência de DNA que codifica o primeiro polipeptideo éligada, com ou sem um ligante peptidico, à extremidade a 5'de uma seqüência de DNA que codifica o segundo polipeptideode forma que os quadros abertos das seqüências estão emfase para permitir a tradução do mRNA das duas seqüênciasde DNA em uma única proteína de fusão que mantêm aatividade biológica tanto do primeiro quanto do segundopolipeptídeos.

Uma seqüência ligante peptídica pode serempregada para separar o primeiro e o segundo polipeptídeosem uma distância suficiente para garantir que cadapolipeptideo se dobre em suas estruturas secundárias eterciárias. Tal seqüência ligante peptídica é incorporadana proteína de fusão utilizando técnicas padronizadas bemconhecidas na arte. As seqüências ligantes peptídicasadequadas podem ser escolhidas com base nos fatores aseguir: (1) sua capacidade de adotar uma conformaçãoestendida flexível; (2) sua capacidade de adotar umaestrutura secundária que poderia interagir com epítoposfuncionais no primeiro e no segundo polipeptídeos; e (3) afalta de resíduos hidrofóbicos ou carregados que poderiamreagir com os epítopos funcionais dos polipeptídeos. Asseqüências ligantes peptídicas preferidas contêm resíduosde Gly, Asn e Ser. Outros aminoácidos quase neutros, taiscomo Thr e Ala também podem ser utilizados na seqüêncialigante. As seqüências de aminoácidos que podem serempregadas de forma útil como ligantes incluem asdivulgadas em Maratea e outros, Gene 40: 39-46, 1985;Murphy e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 8258-8262,1986; Patente U.S. Ν£ 4.935.233 e Patente U.S. N4.751.180. A seqüência ligante pode ter de 1 até aproxi-madamente 50 aminoácidos de comprimento. As seqüênciaspeptidicas não são necessárias quando o primeiro e osegundo polipeptideos possuem regiões de aminoácidos N-terminais não essenciais que podem ser utilizadas paraseparar os domínios funcionais e prevenir a interferênciaestérica.

As seqüências de DNA ligadas são ligadas de formaoperacional a elementos reguladores da transcrição ou datradução adequados. Os elementos reguladores responsáveispela expressão do DNA ficam localizados apenas a 5' daseqüência de DNA que codifica os primeiros polipeptideos.

Similarmente, os códons de término precisam terminar atradução e os sinais de término da transcrição estãopresentes apenas a 3' da seqüência de DNA que codifica osegundo polipeptideo.

A eficiência de uma vacina que inclui asseqüências isoladas da presente invenção pode ser deter-minada com base na capacidade do antígeno de fornecer pelomenos aproximadamente uma redução de 50% (por exemplo,aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente80%, aproximadamente 90% ou aproximadamente 100%) nosnúmeros de bactérias e/ou pelo menos aproximadamente umdecréscimo de 40% (por exemplo, aproximadamente 50%,aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente80%, aproximadamente 90% ou aproximadamente 100%) namortalidade após a infecção experimental em um experimentode desafio. Os animais experimentais adequados incluemcamundongos, porquinhos-da-índia e primatas.

As composições da presente invenção são prefe-rencialmente formuladas na forma de composições farmacêu-ticas ou na forma de vacinas para a indução da imunidadeprotetora contra a tuberculose em um paciente. Um pacientepode estar sofrendo de uma doença ou pode estar isento dedoença e/ou infecção detectável. Em outras palavras, aimunidade protetora pode ser induzida para prevenir,reduzir a gravidade ou tratar a tuberculose.

Em uma modalidade, as composições farmacêuticasda presente invenção compreendem um ou mais dos polipep-tideos anteriores, presentes na forma de uma mistura ou naforma de uma proteína de fusão e um carreador fisiolo-gicamente aceitável. Similarmente, as vacinas compreendemum ou mais dos polipeptídeos anteriores e um intensificadorda resposta imunológica não específica, tal como umadjuvante ou um lipossomo (dentro do qual o polipeptídeo éincorporado).

Em uma outra modalidade, uma composição farmacêu-tica e/ou uma vacina da presente invenção pode conter umaou mais das moléculas de DNA da presente invenção,presentes na forma de uma mistura ou na forma de umamolécula de fusão com DNA, cada molécula de DNA codificandoum polipeptídeo como descrito anteriormente, de forma que opolipeptídeo seja produzido in situ. Em tais vacinas, o DNApode estar presente dentro de qualquer uma de uma variedadede sistemas de fornecimento conhecidos pelos peritos comunsna arte, incluindo os sistemas de expressão de ácidosnucléicos, sistemas de expressão bacteriana e viral. Ossistemas de expressão de ácidos nucléicos apropriadoscontêm as seqüências de DNA necessárias para a expressão nopaciente (tal como um promotor adequado e um sinal detérmino). Os sistemas de fornecimento bacterianos envolvema administração de uma bactéria (tal como Bacillus-Calmette-Guerrin) que expressa uma parte imunogênica dopolipeptideo em sua superfície celular. Em uma modalidadepreferida, o DNA pode ser introduzido utilizando um sistemade expressão viral (por exemplo, vaccinia ou outro poxvírus, retrovírus ou adenovírus), que pode envolver o usode um vírus competente em relação à replicação nãopatogênico (defeituoso). As técnicas para a incorporação doDNA dentro de tais sistemas de expressão são bem conhecidaspelos peritos comuns na arte. 0 DNA também pode estar "nu",como descrito, por exemplo, em Ulmer e outros, Science 259:1745-1749, 1993 e revisado por Cohen, Science 259: 1691-1692, 1993. A captação do DNA nu pode ser aumentada atravésdo revestimento do DNA sobre esferas biodegradáveis, quesão eficientemente transportadas para dentro das células.

As moléculas antigênicas de TB da presenteinvenção podem ser administradas com ou sem um carreador.

Os termos "carreador farmaceuticamente aceitável" ou um"carreador" se referem a qualquer excipiente geralmenteaceitável ou composição de fornecimento de fármacos que érelativamente inerte e não tóxica. Os exemplos decarreadores incluem água esterilizada, soluções salinas(tal como a solução de Ringer), álcoois, gelatina, talco,parafina viscosa, ésteres de ácidos graxos, hidróxi-metilcelulose, polivinil pirrolidona, carbonato de cálcio,carboidratos (tais como lactose, sacarose, dextrose,manose, albumina, amido, celulose, silica gel, polietilenoglicol (PEG), leite desnatado em pó, farinha de arroz,estearato de magnésio e similares. As formulações adequadase os carreadores adicionais são descritos em Remington'sPharmaceutical Sciences, (17- Ed., Mack Pub. Co., Easton,PA). Tais preparações podem ser esterilizadas e, sedesejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo,lubrificantes, preservantes, estabilizantes, agentesumectantes, emulsificantes, sais para influenciar a pressãoosmótica, tampões, corantes, preservantes e/ou substânciasaromáticas e similares que não reagem de forma deletériacom os compostos ativos. Os preservantes típicos podemincluir, sorbato de potássio, metabissulfito de sódio,metil parabeno, propil parabeno, timerosal etc. Ascomposições também podem ser combinadas, quando desejado,com outras substâncias ativas, por exemplo, inibidores deenzimas, para reduzir a degradação metabólica. Um carreador(por exemplo, um carreador farmaceuticamente aceitável) épreferido, mas não necessário, para a administração docomposto. A composição pode ser uma solução líquida, umasuspénsão, uma emulsão, um tablete, uma pílula, umacápsula, uma formulação de liberação controlada ou um pó. 0método de administração pode determinar como a composiçãoserá formulada. Por exemplo, a composição pode serformulada na forma de um supositório, com agentesaglutinantes tradicionais e carreadores tais comotriglicerídeos. A formulação oral pode incluir carreadorespadronizados tais como graus farmacêuticos de manitol,lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica,celulose, carbonato de magnésio etc.

As moléculas antigênicas de TB utilizadas nainvenção podem ser administradas de forma intravenosa,parenteral, intramuscular, subcutânea, oral, nasal, tópica,por inalação, por implante, por injeção ou por supositório.A composição pode ser administrada em uma dose única ou emmais de uma dose ao longo de um período de tempo paraconferir o efeito desejado. As quantidades eficientes reaisdo composto ou do fármaco podem variar de acordo com acomposição específica que será utilizada, o modo deadministração e a idade, o peso e a condição do paciente.Por exemplo, como utilizado aqui, uma quantidade eficientedo fármaco é uma quantidade que reduz o número debactérias. As dosagens para um paciente individualparticular podem ser determinadas por um perito comum naarte utilizando considerações convencionais (por exemplo,através de um protocolo farmacológico convencionalapropriado).

Para a aplicação entérica ou em mucosa (incluindoa via oral e a mucosa nasal), são particularmente adequadosos tabletes, os líquidos, as gotas, os supositórios ou ascápsulas. Pode ser utilizado um xarope, um elixir ousimilar em que é empregado um veículo adoçado. Oslipossomos, as microesferas e as microcápsulas estãodisponíveis e podem ser utilizados. A administraçãopulmonar pode ser realizada, por exemplo, utilizandoqualquer um dos vários dispositivos de fornecimentoconhecidos na arte tal como um inalador. Ver, por exemplo,S.P. Newman (1984) em Aerosols and the Lung, Clarke e Davis(eds.), Butterworths, Londres, Inglaterra, pp. 197-224;Publicação PCT N2 WO 92/16192; Publicação PCT N2 WO91/08760.

Para a aplicação parenteral, são particularmenteadequadas as soluções esterilizadas injetáveis,preferencialmente soluções oleosas ou aquosas, assim comosuspensões, emulsões ou implantes, incluindo supositórios.

Em particular, os carreadores para a administração paren-teral incluem soluções aquosas de dextrose, solução salina,água pura, etanol, glicerol, propileno glicol, óleo deamendoim, óleo de gergelim, polímeros em blocos depolioxietileno-polioxipropileno e similares. As ampolas sãounidades de dosagem convenientes. As microesferas biode-gradáveis (por exemplo, galactideo poliláctico) tambémpodem ser empregadas como carreadores para as composiçõesfarmacêuticas desta invenção. As microesferas biodegra-dáveis adequadas são divulgadas, por exemplo, nas PatentesU.S. N— 4.897.268 e 5.075.109.

Qualquer um de uma variedade de adjuvantes podeser empregado nas vacinas desta invenção para aumentar aresposta imunológica. A maior parte dos adjuvantes contémuma substância planejada para proteger o antigeno docatabolismo rápido, tal como hidróxido de alumínio ou óleomineral e um estimulador não específico de respostasimunológicas, tal como o lipídeo A, Bortadella pertussis ouMycobacterium tuberculosis. Os adjuvantes adequados estãodisponíveis comercialmente e incluem, por exemplo, 0Adjuvante Incompleto de Freund e o Adjuvante Completo deFreund (Difco Laboratories) e o Adjuvante 65 da Merck(Merck e Company, Inc., Rahway, NJ.). Outros adjuvantesadequados incluem alúmen, microesferas biodegradáveis,monofosforil lipideo A e quil A.

Nas vacinas da invenção, é preferido que oadjuvante induza uma resposta imunológica compreendendoaspectos de Thl. Os sistemas de adjuvantes adequadosincluem, por exemplo, uma combinação de monofosforillipideo A, preferencialmente monofosforil lipideo A 3-de-0-acilado (3D-MLP) junto com um sal de alumínio. Um sistemamelhorado envolve a combinação de um monofosforil lipideo Ae um derivado da saponina, particularmente a combinação de3D-MLP e a saponina QS21 como divulgado na WO 94/00153 ouuma composição menos capaz de reagir em que a QS21 éenvolta em colesterol como divulgado na WO 96/33739.Experimentos anteriores demonstraram um efeito sinérgicoevidente de combinações de 3D-MLP e QS21 na indução tantode resposta humoral quanto imunológica celular do tipo Thl.Uma formação de adjuvantes particularmente mais potenteenvolvendo QS21, 3D-MLP e tocoferol em uma emulsão de óleo-em-água é descrita na WO 95/17210 e é uma formulaçãopreferida.

A administração das moléculas de polipeptídeosantigênicas de TB da presente invenção e outros compostospode ocorrer simultaneamente ou seqüencialmente no momento.Uma vacina de DNA e/ou uma composição farmacêutica comodescrito anteriormente pode ser administrada simulta-neamente com ou seqüencialmente a um polipeptídeo adicionalda presente invenção, um antigeno conhecido de M.tuberculosis, um intensificador imunológico ou outrocomposto conhecido na arte que seria administrado com talvacina. O composto pode ser administrado antes, depois ouao mesmo tempo em que as moléculas antigênicas de TB.

Assim, o termo "co-administração" é utilizado aqui parasignificar que as moléculas antigênicas de TB e o compostoadicional (por exemplo, composto estimulador imunológico)serão administrados em momentos para atingir uma respostaimunológica especifica para TB, como descrito aqui. Osmétodos da presente invenção não são limitados à seqüênciaem que os compostos são administrados, contanto que ocomposto seja administrado próximo o suficiente em tempopara produzir o efeito desejado.

As rotas e a freqüência de administração dascomposições farmacêuticas e das vacinas da invenção, assimcomo a dosagem, variarão de indivíduo para indivíduo epodem ser paralelas às que estão sendo atualmenteutilizadas na imunização utilizando BCG. Em geral, ascomposições farmacêuticas e as vacinas podem seradministradas através de injeção (por exemplo,intracutânea, intramuscular, intravenosa ou subcutânea), deforma intranasal (por exemplo, por aspiração),intrapulmonar ou oral. Entre 1 e 3 doses podem seradministradas durante um período de 1-36 semanas.

Preferencialmente, são administradas 3 doses, em intervalosde 3-4 meses e vacinações de reforço podem ser fornecidasperiodicamente depois disso. Os protocolos alternativospodem ser apropriados para pacientes individuais. Uma doseadequada é uma quantidade de polipeptideo ou de DNA que,quando administrada como descrito anteriormente, é capaz deproduzir uma resposta imunológica em um paciente imunizadosuficiente para proteger o paciente da infecção por M.tuberculosis pelo menos 1-2 anos. Em geral, a quantidade depolipeptideo presente em uma dose (ou produzida in situpelo DNA em uma dose) varia de aproximadamente 1 pg atéaproximadamente 100 mg por kg de hospedeiro, tipicamente deaproximadamente 10 pg até aproximadamente 1 mg epreferencialmente de aproximadamente 100 pg atéaproximadamente 1 μς. Os tamanhos de doses adequadosvariarão com o tamanho do paciente, mas variarãotipicamente de aproximadamente 0,1 mL até aproximadamente 5 mL.

EXEMPLIFICAÇÃO

Exemplo 1: Peptideos de M. tuberculosis Associados comMoléculas de MHC de Classe I

Uma estratégia para detectar os peptideos de M.tuberculosis associados com as moléculas de MHC de Classe Ide macrófagos de camundongos infectados in vivo foiaplicada para a identificação dos antigenos microbianos.

0 fundamento lógico para pesquisar antigenos oupeptideos de M. tuberculosis associados com as moléculas deMHC de classe I de células infectadas se baseia no fato deque estas moléculas da célula hospedeira são cruciais paraapresentar os antigenos para as células T CD8+, umsubconjunto de células T envolvido na resistência e contraa tuberculose. Portanto, esta abordagem de descoberta dosantigenos possui implicação direta nas estratégias dedesenvolvimento de vacinas contra esta doença.

Os peptideos de M. tuberculosis associados com oMHC de classe I foram isolados partindo de células de baçoaderentes de camundongos C57BL/6 infectados com 107 UFC deM. tuberculosis. Os camundongos C57BL/6 são consideradoscomo sendo relativamente resistentes à infecção por M.tuberculosis, portanto, ideais para este estudo. A infecçãocom um inóculo alto é importante para atingir um alto graude infecção intracelular nas células do baço dos animais.Entre os dias 10 e 14 de infecção os baços dos camundongoscontêm aproximadamente cinco vezes mais células que oscontroles não infectados. Uma grande porcentagem dascélulas do baço é constituída por macrófagos infectados comM. tuberculosis. Os camundongos foram sacrificados e suascélulas de baço aderentes foram obtidas, lisadas com odetergente CHAPS (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis,IN) e as moléculas de MHC de classe I foram isoladas porpurificação por afinidade em uma coluna de proteína Gsepharose ligada ao anticorpo monoclonal anti-H-2 K/Db(ATCC HB-Il). 0 procedimento é resumido na Figura 3.

Os peptideos eluídos compreendendo uma mistura demoléculas abaixo de 5 kDa foram ultra filtrados em umlimite de 5 kDa no Millipore Ultrafree-CL e foram entãofracionados por HPLC em fase inversa "microbore" (Delta-PakCl coluna 8, tamanho de poro 300 Â, partícula de 5μ) . Osperfis da HPLC produziram vários picos, que foramindividualmente analisados por cromatografia líquida emmicrocapilar acoplada com espectrometria de massa comionização por eletrospray (LC-MS) para determinar o pesomolecular e a abundância de todas as espécies de peptideos.

A massa dos peptideos candidatos foi obtida através doespectro de massa em tandem (MS/MS) com dissociação ativadapor colisão (CAD).

As seqüências peptidicas foram pesquisadas emrelação à identidade com proteínas conhecidas em bancos dedados tanto do genoma de M. tuberculosis quanto decamundongo (The Institute for Genomic Research). Váriospeptideos tinham homologia forte com a proteína decamundongo. Entretanto, sete seqüências peptidicas e deácidos nucléicos foram identificadas como tendo origem naM. tuberculosis (Figura 1) . Os genes correspondentes quecodificam o doador da proteína destes peptideos estão sendoclonados e serão expressos utilizando procedimentospadronizados. Em adição, será também preparado o DNAplasmideal bacteriano contendo estes genes de M.tuberculosis. Ambos, proteína recombinante e DNAplasmideal, serão utilizados nos protocolos de imunizaçãovisando investigar o potencial de proteção destas moléculaspara proteger os camundongos contra o desafio com M.tuberculosis virulento. A formulação de proteína seráutilizada para testar a resposta de CD4+ e a imunização comDNA terá como alvo a resposta de células T CD8+.

Exemplo 2: Um Antiqeno de M. tuberculosis Encontrado naUrina de Camundongos Infectados

Uma estratégia para detectar os antígenos de M.tuberculosis na urina de camundongos infectados foiaplicada para a identificação de antigenos microbianos naurina de pacientes com tuberculose ativa.

Os ensaios de detecção de antigenos, em contrastecom a sorologia convencional, detectam a condição da doença5 e não a resposta de anticorpos do hospedeiro ao agenteetiológico da doença. Podem, portanto, ser utilizados tantopara o diagnóstico quanto para o acompanhamento dotratamento. No presente projeto foi utilizada uma abordagempara a descoberta de um antigeno para identificar osantigenos de M. tuberculosis na urina de pacientes humanos.Adicionalmente, proteínas recombinantes serão produzidase validadas como marcadores da doença ativa.

As urinas dos indivíduos (15 mL) foram carregadasem um Vivaspin 5K MWCO com capacidade de 15 mL filtradas ecentrifugadas a 3000G a 4 0C até que o volume do materialretido fosse < 2mL. 0 concentrado foi removido da membranaatravés da lavagem com uréia a 6 M e bicarbonato de amônioa 100 mM. Os concentrados finais foram levados até 4 mL comuréia a 6 M e bicarbonato de amônio a 100 mM pH 8,5. A cadaamostra de concentrado de proteína foram adicionados 20 mLde DTT a 2 M. As amostras foram misturadas com vortex eincubadas a 370C durante 1 hora. As cisteínas reduzidasforam alquiladas através da adição de 200 mL de 0,5 M deiodoacetamida em cada amostra. As amostras foram misturadascom vortex e permitidas que reagissem durante 1 hora àtemperatura ambiente na escuridão. A iodoacetamidaresidual foi extinguida com 15 mL de 2 M de DTT. Partindoda amostra estoque de 4 mL, 300 pL foram removidos paraanálise em gel.Foram obtidas imagens dos géis com uma CâmeraDigital Kodak DC280 ajustada com lentes Macro +10. Asimagens foram processadas utilizando Adobe Photoshop eimpressas. Os géis foram cortados com uma lâmina de barbearlimpa em 33 pedaços de gel cada enquanto as posições doscortes eram marcadas para cada pedaço. Os pedaços foramentão colocados em tubos de centrifuga de 2 mL. Todo oprocessamento adicional das amostras foi realizado em umaBioSafety Cabinet de isolamento dual. Os tubos com ospedaços de gel foram preenchidos até 2 mL com metanol a50%, ácido acético 5% e lavados três vezes com alíquotasadicionais de metanol a 50%, ácido acético a 5%. A soluçãode descoloração foi removida e os tubos foram preenchidoscom 2 mL de acetonitrila. Após 30 minutos com agitação, aacetonitrila foi removida e substituída por bicarbonato deamônio a 100 mM. Após 30 minutos a solução de bicarbonatode amônio foi removida e os tubos foram preenchidos comacetonitrila. Esta etapa de lavagem com acetonitrila,bicarbonato de amônio foi repetida uma vez. A lavagem finalcom acetonitrila foi removida logo antes da digestão e ospedaços de gel foram secos durante 30 minutos em umspeedvac. Os tubos contendo os pedaços de gel secos foramcolocados em gelo e foi permitido que resfriassem. Atripsina com grau de seqüenciamento da Promega foidissolvida em bicarbonato de amônio a 50 mM gelado até umaconcentração de 13,3 mg/mL. Utilizando um pipetador derepetição, 125 mL da solução de tripsina foram adicionadosno fundo de cada tubo. Foi permitido que os pedaços de gelintumescessem durante 15 minutos em gelo, após os quais 125mL adicionais de bicarbonato de amônio a 50 mM foramadicionados em cada tubo. Os tubos foram então tampados eincubados durante 16 horas a 37°C. Após a digestão 650 mLde bicarbonato de amônio a 50 mM foram adicionados em cadatubo. As amostras foram então incubadas durante hora a37 °C. 0 primeiro conjunto de extratos foi removido ecolocado em tubos Axygen de 1,5 mL rotulados, uma segundaextração de 650 mL de bicarbonato de amônio foi realizada eagrupada com a primeira. Estes extratos foram entãoliofilizados enquanto duas extrações ácidas de 650 mL deacetonitrila a 50% ácido fórmico a 0,1% foram realizadas.Todos os extratos foram congelados a -80°C e liofilizadosaté a secura em um ThermoSavant SC280 speedvac < 10 mTorr.O produto da liofilização foi redissolvido em 200 mL deacetonitrila a 5% ácido fórmico a 0,1%. Volumes apropriadosde cada extrato (1-6, 10 mL) (7-12, 20 mL) (13-18, 35 mL)(19-33, 50 mL) foram adicionados em uma placa de 96 poçosaté a carga de molaridade da proteína aproximada e aproteína de cada região de MW do gel, a placa foi congeladaa -800C e liofilizada novamente. Todas as amostras foramredissolvidas em 12 mL de acetonitrila a 5% ácido fórmico a0,1%. As amostras foram então avaliadas por Espectrometriade Massa em uma estação de trabalho LCQ DECA XP plusProteome X da Thermofinnigan. Para cada corrida 10 mL decada amostra reconstituída foram injetados com um FamosAutosampler enquanto a separação foi feita em uma coluna de75 mm i.d. χ 18 cm empacotada com meio C18 correndo a umavazão de 235 nL por minuto fornecida partindo de uma bombaSurveyor MS com um separador de fluxo com um gradiente de5-60% de água e ácido fórmico a 0,1%, acetonitrila ácidofórmico a 0,1% ao longo do curso de 90 min (corrida de 2,5horas), 180 minutos (corrida de 4 horas) ou 400 minutos(corrida de 8 horas). Entre cada conjunto de amostras foramcorridos dois padrões de um 5 Angio mix peptides (MichromBioResources) para determinar o desempenho da coluna eobservar qualquer transporte potencial que poderia terocorrido. O LCQ foi corrido em uma configuração com cincoprincipais com uma verificação por MS e cinco verificaçõescom MS/MS. A exclusão dinâmica foi ajustada em 1 com umlimite de 30 segundos. As IDs dos peptideos foram feitasutilizando Sequest através do Bioworks Browser 3.1. Asbuscas nos bancos de dados de seqüências foram feitasutilizando o NCBI RefSeqHuman Database utilizando cisteinasdiferenciais modificadas com carbamidometila e metioninasoxidadas, seguidas por buscas adicionais utilizandomodificações diferenciais. Foram realizadas buscas secun-dárias utilizando Sequest utilizando o banco de dados deproteínas previstas RefSeqHuman Gnomon. Desta maneiraacertos de proteínas conhecidas e teóricas podem serencontrados sem comprometer a relevância estatística detodos os dados. Os valores de limite de escores dospeptideos foram escolhidos em Xcorr de 1,8 para íons monocarregados, 2,5 para íons duplamente carregados e 3,0 paraíons triplamente carregados, junto com valores de deltaCNde 0,1 e valores de RSP de 1. Os valores de correlaçãocruzada escolhidos para cada peptídeo garante umacombinação de alta confiança para os estados de cargadiferentes, enquanto que o limite de deltaCN garante aimparidade do acerto do peptídeo. 0 valor de RSP de 1garantia que o peptídeo se combinava com o acerto principalno escore preliminar e que o arquivo do fragmento peptídicose combinava apenas a um acerto de proteína. Utilizandoesta abordagem do estado da arte vários peptídeos humanosforam identificados, mas de forma mais importante foipossível assim em alto grau identificar pelo menos cincopeptídeos de M. tuberculosis na urina de três das seisamostras de urina estudadas. Uma das seqüências do peptídeoidentificado (MVIIELMRR - SEQ ID NO: 30) possui homologiaidêntica à da seqüência deduzida de uma proteína de M.tuberculosis (Figura 2) [The Institute for Genomic Research(TIGR) e SWISS-PROT/TrEMBL AC # 033183]. Quatro outrasseqüências foram identificadas, SEQ ID NOs: 34, 38, 42, 46,mostradas nas Figuras 5-9, respectivamente. Esta seqüênciapeptídica foi observada em três de seis amostras de urinade pacientes com tuberculose. Os iniciadores da PCR foramplanejados e sintetizados e utilizados para amplificar ogene de comprimento completo que codifica esta proteínapartindo do DNA genômico de M. tuberculosis. Um fragmentode DNA (~1 kb) contendo na extremidade a 5' um sítio de NdeI e na extremidade a 3' um sítio de Bam HI, foi obtido eestá sendo atualmente utilizado para clonar e expressar ogene.

Exemplo 3: Produção, Purificação e Caracterização deproteínas recombinantes de M. tuberculosis

Foram feitos esforços concentrados para produzir,purificar e caracterizar as proteínas recombinantes quesão réplicas de cinco proteínas de M. tuberculosisencontradas na urina de pacientes com tuberculose pulmonar,como descrito aqui. Três destas (MTP1694 (SEQ ID NO: 42),MTP2462 (SEQ ID NO: 46)) e (MT2990 (SEQ ID NO: 38)) foramobtidas e suas propriedades bioquímicas e biológicas foramcaracterizadas. As três proteínas foram purificadaspartindo de corpos de inclusão com rendimentos variando de10 até 15 mg de proteína purificada por litro de culturainduzida. A Figura 10 ilustra a superexpressão dasmoléculas recombinantes, MT1694, MT2462 e MT2990, em E.coli e mostra que migraram para posições no gel quecorrespondem ao Peso Molecular esperado (MW). As proteínasrecombinant es foram expressas em células hospedeiras deE. coli BL-21(DE3)/pLysS com seis resíduos amino terminaiscom marcação de His. As proteínas foram purificadas atravésde cromatografia por afinidade utilizando matriz de agaroseNi-NTA. A pureza foi avaliada por SDS-PAGE (4-20% degradiente de gel de poliacrilamida) seguida pela coloraçãocom azul de Coomassie. Devido ao fato de que o gene MT2990codifica uma proteína de 130,6 kDa de MW, que é um tamanhode molécula que é difícil de expressar como proteínarecombinante, formas sobrepostas/truncadas desta moléculaforam clonadas e expressas. A proteína clonada e expressailustrada na Figura 10 representa um fragmento do gene decomprimento completo que abrange 100 aminoácidos, tanto amontante quanto a jusante da seqüência de aminoácidos daproteína de M. tuberculosis (MT2990) que possui homologiaidêntica com o peptídeo encontrado na urina de pacientescom tuberculose. Este fragmento da molécula foi escolhidoporque essa parte da proteína é estável e resistente àmaquinaria enzimática proteolitica do hospedeiro, portanto,um alvo para vacina.

Foram produzidos anti-soros de coelho para asproteínas recombinantes MTP1694 e MTP2462 e um anti-soropara MT2990 está sendo e pode ser gerado. Os anti-sorospara MTP1694 e MTP2462 foram utilizados para a validaçãodas proteínas identificadas como moléculas genuínas de M.tuberculosis, que foi realizada através de análises deWestern blot utilizando preparações antigênicas brutas doantígeno de M. tuberculosis (extrato celular bacterianototal) assim como o filtrado de cultura (CF) ou osantígenos de CF (fornecidos pelo Dept. Microbiol. Immunol.Pathol., Colorado State üniversity, Fort Collins CO). Osantígenos foram submetidos à eletroforese sob condiçõesredutoras em um gel em gradiente a 4-20% e transferidospara uma membrana de nitrocelulose seguido pela verificaçãocom sondas com anti-soros de coelho anti-MTB1694 ou anti-MT24 62. A reatividade foi detectada com imunoglobulinaanti-coelho de cabra marcada com peroxidase e desenvolvidautilizando um reagente quimioluminescente (ECL). Δ Figura11 indica que o anti-soro anti-MTP1694 reconhece uma bandade -37 KDa nas preparações tanto de lisado microbacterianoquanto de filtrado de cultura (faixas 1 e 2) assim como,como esperado, a proteína recombinante (faixa 3) . Emcontraste, o anti-soro anti-MTP2462 reconhece uma banda de-27 kDa somente no lisado bacteriano e não no filtrado decultura. As bandas de MW de ambos os antígenos se combinamcom seu MW previsto. Em adição, o MW das moléculasrecombinantes é ligeiramente maior que o das moléculasnativas, o que é esperado porque as moléculas recom-binantes possuem, em adição às seqüências das moléculasnativas, um filamento de 16 aminoácidos derivado do vetorde clonagem (uma marcação de seis histidinas para facilitara purificação e um sitio de trombina composto de 10aminoácidos para permitir a clivagem da marcação com his).

Estes resultados confirmam, portanto, que tanto MTP1694quanto MTP2462 são proteínas genuínas de M. tuberculosisque são ativamente produzidas durante o crescimentobacteriano. Em adição, devido ao fato de que o antígenoMTP1694 está presente na preparação de filtrado de cultura("M. tuberculosis secreta a proteína") estes resultadosdemonstram que esta molécula é útil como uma vacina.

Para avaliar o uso dos antígenos identificadoscom alvos para vacina para seres humanos, foi analisada aresposta de células mononucleares do sangue periférico(PBMC) obtida de doadores positivos para PPD saudáveis (umaresposta do teste de pele intradérmico às proteínas datuberculose utilizando um Derivado de Proteína Purificado)para estes antígenos. Assim, quatro doadores positivos paraPPD saudáveis e um negativo para PPD foram testados com osantígenos MTP1694 e MTP2462. A proteína recombinante(MT299) mencionada anteriormente, não estava disponível nomomento em que estes ensaios foram realizados. Para testarem relação ao reconhecimento do antígeno, tanto a respostaproliferativa induzida pelo antígeno quanto a produção deIFN-γ foram utilizadas, seguidas pelo estímulo comantígenos recombinantes (5 pg/mL) . A proliferação foimedida através da incorporação de [3H]TdR e os resultadossão expressos na forma de contagens por minuto (CPM). 0IFN-γ foi medido através de ELISA em sanduíche nossobrenadantes de cultura. Os resultados são expressos nasFiguras 12A e B e indicam que ambos os antígenos sãofacilmente reconhecidos pelas PBMCs de três dos quatrodoadores positivos para PPD. Não foi observada qualquerresposta com as PBMCs obtidas do doador negativo para PPD.

Estes resultados sugerem que estes antígenos serãoreconhecidos por uma alta porcentagem de indivíduospositivos para PPD saudáveis (presumidamente resistentes).

Em adição, devido ao fato de que a resposta proliferativafoi acompanhada pela produção de IFN-γ, MT1649 e MT24 62estão associadas com a proteção contra a tuberculose,portanto, estas moléculas são alvos para vacina.

Os ensinamentos relevantes de todas asreferências, patentes e/ou pedidos de patentes citados aquisão incorporados aqui como referência em sua totalidade.

Os ensinamentos das patentes a seguir sãoincorporados aqui como referência em sua totalidade:Patente U.S. N-: 6.627.198, intitulada, "Fusion proteinsof Mycobacterium tuberculosis antigens and their uses;"Patente U.S. N-: 6.613.881, intitulada, "Compounds forimmunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods oftheir use"; Patente U.S. N-: 6.592.877, intitulada,"Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis oftuberculosis"; Patente U.S. N-: 6.555.653, intitulada,"Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods oftheir uses"; Patente U.S. N£: 6.544.522, intitulada,"Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis antigens andtheir uses"; Patente U.S. N-: 6.458.366, intitulada,"Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis";Patente U.S. N-: 6.338.852 intitulada, "Compounds andmethods for diagnosis of tuberculosis"; e Patente U.S. N£:6.290.969, intitulada, "Compounds and methods forimmunotherapy and diagnosis of tuberculosis".

Embora esta invenção tenha sido particularmentemostrada e descrita com referências às modalidadespreferidas da mesma, será entendido pelos peritos na arteque várias alterações na forma e nos detalhes podem serfeitas na mesma sem sair do âmbito da invenção abrangidopelas reivindicações em anexo.

Claims

1. Molécula de polipeptideo isolada,caracterizada pelo fato de que compreende uma parteimunogênica de um antígeno de Mycobacterium tuberculosis ouuma variação do dito antigeno que difere apenas emsubstituições e/ou modificações conservativas, em que odito antígeno compreende uma seqüência de aminoácidosselecionada do grupo que consiste de:a) uma seqüência de aminoácidos codificada poruma molécula de ácido nucléico que possui uma seqüência daID de SEQ N2: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23,-25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 ou umacombinação das mesmas;b) uma seqüência de aminoácidos codificada poruma molécula de ácido nucléico que possui a regiãocodificadora da ID de SEQ N°: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,-17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45,-47 ou uma combinação das mesmas;c) uma seqüência de aminoácidos codificada por umcomplemento da ID de SEQ N2: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,-19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47ou uma combinação das mesmas;d) uma seqüência de aminoácidos codificada poruma molécula de ácido nucléico que se hibridiza com a ID deSEQ N5: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,-29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 ou uma combinaçãodas mesmas; ee) uma seqüência de aminoácidos apresentada na IDde SEQ N2: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26,-28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 ou umacombinação das mesmas.

2. Molécula de polipeptideo isolada, de acordocom a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que amolécula de polipeptideo isolada estimula uma respostaimunogênica especifica à Bactéria da Tuberculose (TB) em umhospedeiro.

3. Molécula de polipeptideo isolada,caracterizada pelo fato de que compreende uma parteimunogênica de um antigeno de M. tuberculosis, em que odito antigeno compreende uma seqüência de aminoácidosselecionada do grupo que consiste de:a) uma seqüência de aminoácidos codificada por umácido nucléico que possui mais que ou igual aaproximadamente 70% de identidade com a ID de SEQ Ns: 1, 3,-5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33,-35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 ou uma combinação das mesmas;b) uma seqüência de aminoácidos codificada poruma molécula de ácido nucléico que possui mais que ou iguala aproximadamente 70% de identidade com a regiãocodificadora da ID de SEQ N2: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,-17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45,-47 ou uma combinação das mesmas;c) a uma seqüência de aminoácidos codificada porum complemento que possui mais que ou igual aaproximadamente 70% de identidade com a ID de SEQ N-: 1, 3,-5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33,-35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 ou uma combinação das mesmas;d) uma seqüência de aminoácidos codificada poruma molécula de ácido nucléico que possui mais que ou iguala aproximadamente 70% de identidade com uma molécula que sehibridiza com a ID de SEQ N-: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,-17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45,-47 ou uma combinação das mesmas; ee) uma seqüência de aminoácidos que possui maisque ou igual a aproximadamente 70% de similaridade com umaseqüência apresentada na ID de SEQ N2: 2, 4, 6, 8, 10, 12,-14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42,-44, 46, 48 ou uma combinação das mesmas.

4. Molécula de polipeptideo isolada, de acordocom a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que amolécula de polipeptideo isolada estimula uma respostaimunogênica especifica à TB em um hospedeiro.

5. Molécula de polipeptideo isolada, de acordocom a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que amolécula de ácido nucléico possui mais que ou igual aaproximadamente 80% de identidade ou similaridade,respectivamente, com as ditas seqüências.

6. Molécula de polipeptideo isolada, de acordocom a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que amolécula de ácido nucléico possui mais que ou igual aaproximadamente 90% de identidade ou similaridade,respectivamente, com as ditas seqüências.

7. Molécula de ácido nucléico isolada,caracterizada pelo fato de que codifica uma molécula depolipeptideo que compreende uma parte imunogênica de umantigeno M da tuberculose ou uma variação do dito antigenoque difere apenas em substituições e/ou modificaçõesconservativas, em que o dito antígeno é codificado por umamolécula de ácido nucléico que possui uma seqüênciaselecionada do grupo que consiste de:a) ID de SEQ N2: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,-19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47ou uma combinação das mesmas;b) a região codificadora da ID de SEQ N2: 1, 3,-5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33,-35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 ou uma combinação das mesmas;c) um complemento da ID de SEQ N2: 1, 3, 5, 7, 9,-11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39,-41, 43, 45, 47 ou uma combinação das mesmas;d) que se hibridiza à ID de SEQ N2: 1, 3, 5, 7,-9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37,-39, 41, 43, 45, 47 ou uma combinação das mesmas; ee) que codifica a ID de SEQ N2: 2, 4, 6, 8, 10,-12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40,-42, 44, 4 6, 48 ou uma combinação das mesmas.

8. Molécula de ácido nucléico isolada, de acordocom a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que amolécula de ácido nucléico isolada codifica uma molécula depolipeptideo que estimula uma resposta imunogênicaespecífica à TB em um hospedeiro.

9. Molécula de ácido nucléico isolada, de acordocom a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que amolécula de ácido nucléico é uma molécula de RNA.

10. Molécula de ácido nucléico isolada quecodifica uma molécula de polipeptideo, caracterizada pelofato de que compreende uma parte imunogênica de um antígenode M. tuberculosis, em que o dito antígeno é codificado poruma molécula de ácido nucléico que possui mais que ou iguala aproximadamente 70 % de identidade com uma seqüênciaselecionada do grupo que consiste de:a) ID de SEQ N2: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,- 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47ou uma combinação das mesmas;b) a região codificadora da ID de SEQ Ns: 1, 3,- 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33,- 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 ou uma combinação das mesmas;c) um complemento da ID de SEQ N2: 1, 3, 5, 7, 9,- 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39,- 41, 43, 45, 47 ou uma combinação das mesmas;d) que se hibridiza à ID de SEQ N-: 1, 3, 5, 7,- 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37,- 39, 41, 43, 45, 47 ou uma combinação das mesmas; ee) que codifica a ID de SEQ N2: 2, 4, 6, 8, 10,-12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40,-42, 44, 46, 48 ou uma combinação das mesmas.

11. Molécula de ácido nucléico isolada, de acordocom a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que amolécula de ácido nucléico possui mais que ou igual aaproximadamente 80% de identidade com as ditas seqüências.

12. Molécula de ácido nucléico isolada, de acordocom a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que amolécula de ácido nucléico possui mais que ou igual aaproximadamente 90% de identidade com as ditas seqüências.

13. Vetor ou plasmídeo, caracterizado pelo fatode que compreende uma molécula de ácido nucléico, conformedescrito na reivindicação 7.

14. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato deser transformada com a seqüência de ácido nucléico conformedescrita na reivindicação 7.

15. Anticorpo, caracterizado pelo fato de ligar-se a um polipeptideo conforme descrito na reivindicação 1.

16. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato deque compreende um polipeptideo selecionado do grupo queconsiste de:a) pelo menos um dos polipeptídeos, de acordo coma reivindicação 1;b) pelo menos dois dos polipeptídeos, de acordocom a reivindicação 1;c) pelo menos um polipeptideo, de acordo com areivindicação 1 e um antígeno conhecido de M. tuberculosis;ed) pelo menos um polipeptideo, de acordo com areivindicação 1 e um antígeno de M. tuberculosisapresentado em uma molécula de MHC de Classe 2.

17. Método para estimular uma respostaimunogênica específica à TB em um indivíduo ou paraprevenir ou reduzir a gravidade de doença causada pela TB,sendo que o método é caracterizado pelo fato de compreendera administração de uma quantidade de uma ou mais dasmoléculas de polipeptídeos, de acordo com a reivindicação

18. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a molécula de polipeptideoou uma molécula de ácido nucléico é administrada em umcarreador.

19. Método para estimular uma respostaimunogênica especifica à TB em um indivíduo ou paraprevenir ou reduzir a gravidade da doença causada pela TB,sendo que o método é caracterizado pelo fato de compreendera administração de uma quantidade de uma ou mais dasmoléculas de ácidos nucléicos, de acordo com areivindicação 7.

20. Método para monitorar o tratamento da doençacausada pela TB em um indivíduo, sendo que o método écaracterizado pelo fato de compreender:a) a detecção do nível de uma ou mais dasmoléculas de polipeptídeos, de acordo com a reivindicação 1de uma amostra do indivíduo; eb) a comparação do nível de uma ou mais dasmoléculas com um padrão; em que um nível de moléculas queseja maior que o padrão indica que o tratamento éineficiente e um nível que é menor que ou igual ao nívelindica tratamento eficiente.

21. Método para monitorar o tratamento da doençacausada pela TB em um indivíduo, o método sendocaracterizado pelo fato de compreender:a) a detecção do nível de uma ou mais moléculasde polipeptídeos, de acordo com a reivindicação 1 em umaamostra do indivíduo em mais de um ponto de tempo; eb) a comparação do nível da uma ou mais moléculasde polipeptídeos no um ou mais pontos de tempo; em que umaumento no nível das moléculas indica que o tratamento éineficiente e uma diminuição ou nenhuma alteração no nívelindica tratamento eficiente.

22. Método de diagnóstico de doença causada pelaTB em um indivíduo, sendo que o método é caracterizado pelofato de compreender a detecção da presença ou da ausênciade uma ou mais das moléculas de polipeptídeos, conformedescrito na reivindicação 1.

23. Método de distinção entre a doença causadapela TB e a imunidade à doença causada pela TB em umindivíduo, sendo que o método é caracterizado pelo fato decompreender:a) a detecção da presença ou da ausência de umaou mais das moléculas de polipeptídeos, de acordo com areivindicação; eb) a medida do estímulo de uma respostaimunológica específica à TB no indivíduo.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a medida do estímulo de umaresposta imunológica específica à TB inclui a medida daproliferação celular, da produção de interleucina-12, dosníveis de interferon-γ ou de uma combinação dos mesmos, emuma amostra do indivíduo.

25. Método para detecção da infecção por M.tuberculosis em uma amostra biológica, sendo que o métodoé caracterizado pelo fato de compreender avaliar a presençade uma ou mais das moléculas de polipeptídeos, de acordocom a reivindicação 1 na amostra, em que a presença damolécula indica a presença de infecção por M. tuberculosís;e a ausência da molécula indica a ausência de infecção porM. tuberculosís.

26. Método para detecção de infecção por M.tuberculosís em uma amostra biológica, sendo que o métodoé caracterizado pelo fato de compreende:a) o contato da amostra com um anticorpo que seliga com uma molécula de polipeptideo, de acordo com areivindicação 1, suficientemente para permitir a formaçãode um complexo entre a amostra a o anticorpo, para formarassim um complexo antígeno-anticorpo; eb) a detecção do complexo antígeno-anticorpo; emque a presença do complexo indica a presença de infecçãopor M. tuberculosís; e a ausência de um complexo indica aausência de infecção por M. tuberculosís.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é marcadode forma detectável.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda ocontato da amostra com um segundo anticorpo específico aodito antígeno ou ao dito complexo antígeno-anticorpo.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que o polipeptideo ou oanticorpo está ligado a um suporte sólido.

30. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que a amostra biológica éurina.

31. Método para detecção de infecção por M.tuberculosis em uma amostra biológica, sendo que o métodoé caracterizado pelo fato de compreender:a) o contato da amostra com pelo menos doisiniciadores de oligonucleotideo em uma reação em cadeia dapolimerase, em que pelo menos um dos iniciadores deoligonucleotideo é especifico para uma ou mais da moléculade ácido nucléico isolada, de acordo com a reivindicação 7,suficientemente para permitir a amplificação dosiniciadores; eb) detecção na amostra da seqüência de ácidonucléico amplificada; em que a presença da seqüência deácido nucléico amplificada indica infecção por M.tuberculosis e a ausência da seqüência de ácido nucléicoamplificada indica uma ausência de infecção por M.tuberculosis.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que pelo menos um dosiniciadores de oligonucleotideo compreende pelo menosaproximadamente 10 bases contíguas.

33. Método para detecção de infecção por M.tuberculosis em uma amostra biológica, sendo que o métodoé caracterizado pelo fato de compreender:a) o contato da amostra com uma ou mais sondas deoligonucleotideo específicas para a molécula de ácidonucléico, de acordo com a reivindicação 7 sob condições dealto rigor, suficientemente para permitir a hibridizaçãoentre a amostra e a sonda; eb) a detecção da molécula de ácido nucléico quese hibridiza com a sonda de oligonucleotídeo na amostra; emque a presença de hibridização da sonda indica infecção porM. tuberculosis e a ausência de hibridização indica umaausência de infecção por M. tuberculosis.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33,caracterizado pelo fato de que a sonda compreende pelomenos aproximadamente 15 bases contíguas.

35. Composição, caracterizada pelo fato de quecompreende a seqüência de polipeptídeo da reivindicação 1 eum carreador fisiologicamente aceitável.

36. Composição, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que inclui ainda umintensificador de resposta imunológica.

37. Composição, de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que o intensificador de respostaimunológica é um adjuvante ou um outro antigeno da TB.

38. Composição, de acordo com a reivindicação 37,caracterizado pelo fato de que a composição é umacomposição para vacina.

39. Composição, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que o adjuvante inclui pelomenos um componente selecionado do grupo que consiste de 3D-MPL e QS21.

40. Composição, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que a composição é formulada emuma emulsão de óleo-em-água.

41. Composição, de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que o intensificador de respostaimunológica é uma citocina ou uma quimiocinaimunoestimuladora.

42. Kit para diagnóstico da presença ou daausência de infecção por M. tuberculosis em uma pessoa,sendo que o kit é caracterizado pelo fato de compreender umou mais reagentes para a detecção da molécula depolipeptideo, conforme descrito na reivindicação 1.

43. Kit caracterizado pelo fato de quecompreende:a) a uma ou mais moléculas de ácidos nucléicos quepossuem uma seqüência da ID de SEQ N-: 1, 3, 5, 7, 9, 11,- 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,- 43, 45, 4 7 ou uma combinação das mesmas; os complementosdas ditas seqüências e seqüências de ácidos nucléicos quese hibridizam com uma seqüência citada na ID de SEQ N-: 1,- 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33,- 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 ou uma combinação; eb) um reagente de detecção.

44. Composição farmacêutica, caracterizada pelofato de que compreende o polipeptídeo da reivindicação 1 eum carreador.