BRPI0616054A2 - clivagem de precursores de insulunas por uma variante de tripsina - Google Patents

Abstract

CLIVAGEM DE PRECURSORES DE INSULUNAS POR UMA VARIANTE DE TRIPSINA. A presente invenção refere-se à produção de uma variante de tripsina recombinante com especificidade de substrato aumentada para arginina versus usina, em organismos hospedeiros não-animais. Além disso, a presente invenção refere-se a uma variante de tripsina recombinante e sua produção. Também proporcionados estão o uso de variantes de tripsina pancreática porcina recombinante para clivagem de precursores de insulinas, e kits contendo a variante de tripsina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CLIVAGEMDE PRECURSORES DE INSULUNAS POR UMA VARIANTE DE TRIPSINA".

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se à produção de uma variante detripsina recombinante com especificidade de substrato aumentada para argi-nina versus Iisina em organismos hospedeiros não-animâis. Além disso, apresente invenção refere-se a uma variante de tripsina recombinante e suaprodução. São também proporcionados uso de variantes de tripsina pan-creática porcina recombinante para clivagem de precursores de insulinas ekit contendo a variante de tripsina.

Tripsina é uma serina protease que catalisa a clivagem hidrolíti-ca de peptídeos no grupo carboxila dos aminoácidos básicos arginina e Iisi-na (Keil B., (1971), The Enzyme Vol. II, 3ã Edição, Editor Boyer, Acad. PressNY, pp. 249-275). Tripsina pancreática porcina recombinante tem um pesomolecular de cerca de 23.000 dáltons e uma atividade enzimática ótima nopH 8,0.

Tripsina é usada no processo industrial de produzir insulina eanálogos de insulina. A produção dessas biomoléculas está descrita na Iite-ratura e várias abordagens foram escolhidas. Do ponto de vista econômico,a síntese química de insulina humana e de análogos de insulina não é exe-qüível. Portanto, principalmente dois processos para a produção de insulinae de análogos de insulina existem correntemente, ou seja, abordagem semi-sintética usando insulina porcina como material de partida, e o uso de micro-organismos geneticamente modificados para a expressão de insulina re-combinante.

Insulina é um polipeptídeo de 51 aminoácidos, que são divididosem duas cadeias de aminoácidos: a cadeia A tendo 21 aminoácidos e a ca-deia B tendo 30 aminoácidos. As cadeias são conectadas uma à outra pormeio de 2 pontes de dissulfeto. As preparações de insulina têm sido empre-gadas para terapia de diabetes por muitos anos. Não somente são usadasaqui proteínas de ocorrência natural, mas, recentemente, também derivadose análogos de insulina.

Análogos de insulina são análogos de insulina de ocorrência na-tural, ou seja, insulina humana ou insulina animal, que diferem pela substitu-ição de pelo menos um resíduo da aminoácido de ocorrência natural comoutros resíduos de aminoácidos e/ou adição/remoção de pelo menos umresíduo de aminoácido da insulina correspondente, de outro modo, de insuli-na de ocorrência natural. Os resíduos de aminoácidos adicionados e/ousubstituídos podem ser também aqueles que não ocorrem naturalmente.

Derivados de insulina são derivados de insulina de ocorrêncianatural ou um análogo de insulina, que são obtidos por modificação química.A modificação química pode consistir, por exemplo, na adição de um oumais grupos químicos específicos a um ou mais aminoácidos.

exemplos de derivados de insulina são insulina humana B29N-N-miristoil-des(B30), insulina humana B29-N-palmitoil-des(B30), insulinahumana B29-N-miristoíla, insulina humana B29-N-palmitoíla, insulina huma-na B28-N-miristoil LysB28ProB29, insulina humana B28-N-palmitoil-LysB28ProB29, insulina humana B30-N-miristoil-ThrB29LysB3°, insulina humanaB30-N-palmitoil-ThrB29LysB3°, insulina humana B29-N-(N-palmitoil-Y-glutamil)-des(B30), insulina humana B29-N-(N-litocolil-Y-glutamil)-des(B30),insulina humana B29-N-(co-carboxieptadecanoil)-des(B30) e insulina humanaB29-N-(co-carboxieptadecanoíla).

Análogos de insulina são descritos em EP 0 214 826, EP 0 375437 e EP 0 678 522. EP 0 214 826 refere-se, entre outras, às substituiçõesB27 e B28. EP 0 678 522 descreve análogos de insulina que têm vários a-minoácidos, preferivelmente, prolina, na posição B29, mas não ácido glutâ-mico.

Outros análogos de insulina são insulina humana Lys628Prob29,insulina humana B28 Asp, insulina humana, na qual a prolina na posiçãoB28 foi substituída por Asp, Lys, Leu, Val ou Ala e, onde, na posição B29Lys pode ser substituída por Pro; insulina humana AlaB26; insulina humanades(B28-B30); insulina humana des(B27) ou insulina humana des(B30).

EP 0 375 437 inclui análogos de insulina com Iisina ou argininaem B28, que podem ser opcional e adicionalmente modificados em B3 e/ou A21.

Em EP 0 419 504, são descritos análogos de insulina que sãoprotegidos de modificações químicas, onde em B3 e pelo menos um outroaminoácido nas posições A5, A15, A18 ou A21 são modificados. Em WO92/00321, análogos de insulina são descritos, nos quais pelo menos um a-minoácido das posições B1-B6 é substituído por Iisina ou arginina.

Importantes análogos de insulina discutidos aqui são ainda "in-sulina glargina" (insulina humana Gly A(21), Arg B (31), Arg B (32)) e "insuli-na glulisina" (insulina humana Lys B(3), Glu B(29)).

Processos de DNA recombinante permitem que precursores deinsulina e análogos de insulina, em particular pró-insulina humana ou pró-insulina que tem uma seqüência de aminoácidos e/ou um comprimento decadeia de aminoácido diferindo da insulina humana a ser preparada em mi-croorganismos. As pró-insulinas preparadas de células de Escherichia colinão têm quaisquer pontes de cistina corretamente ligadas. Um processo pa-ra obter insulina humana usando E. coli (EP 0 055 945) está baseado nasseguintes etapas processuais:

Fermentação do microorganismo, separação da célula, rupturada célula, isolamento da insulina ou do precursor de análogo de insulina, re-dobrar para a estrutura tridimensional (nativa) desejada por formação dasrespectivas ligações de dissulfeto para produzir as pré-pró-insulina(s)("PPI"), clivagem tríptica da pré-pró-insulina (possivelmente em presença deCarboxipeptidase B), purificação básica, primeira etapa cromatográfica, cli-vagem enzimática eventual para produzir a respectiva insulina humana ou oanálogo de insulina, segunda etapa cromatográfica e purificação final porHPLC, cristalização e secagem.

Clivagem tríptica da pré-pró-insulinas é uma reação enzimática ecomplexa: a pré-seqüência e o peptídeo C são clivados nesta etapa de mo-do a render os respectivos produtos. Por exemplo, no caso da produção deinsulina humana, os valiosos desejados são Arg(B31), Arg(B32)-insulina eArg(B31 Hnsulina (DE 19821866).Contudo, clivagem tríptica leva à formação de vários subprodu-tos, como resultado da ocorrência de reações colaterais não desejadas. Atripsina é uma endoprotease (tipo serina) que cliva ligações peptídicas emresíduos de arginina (Arg) ou Iisina (Lys) C-terminal. Clivagem tríptica dapré-pró-insulina pode ocorrer em sítios de clivagem diferentes, simultanea-mente. Devido aos vários lados da clivagem dentro de uma molécula de pré-pró-insulina específica, vários produtos secundários indesejados podem serformados durante a reação de clivagem tríptica. Como pode ser visto na Fi-gura 1, vários dos subprodutos gerados durante as reações de clivagem sãouma conseqüência da clivagem da ligação peptídica no lado C-terminal deresíduos Lys em vez de Arg.

Para todas as pré-pró-insulinas, o sítio de clivagem entre a pré-seqüência e a cadeia de insulina B é monobásica. Nessa junção, somenteuma reação de clivagem pode ocorrer.

Nas duas outras junções - cadeia B/peptídeo C e peptídeoC/cadeia A - existem diferentes sítios de clivagem. No caso de sítios de cli-vagem de insulina humana e de insulina glargina entre cadeia B/peptídeo Ce petídeo C/cadeia A são ambos dibásicos (Arg-Arg e Lys-Arg, respectiva-mente). Além disso, clivagem depois de B29-Lys leva à formação de B30-des-Thr ("des-Thr").

Para insulina humana, somente a clivagem tríptica depois dosresíduos B31-Arg e B32-Arg rende produtos valiosos para junção cadeia/Bpeptídeo C, isto é, B31-Arg insulina ("mono-Arg") e B31-Arg, B32-Arg insuli-na ("di-Arg"). Esses produtos podem ser sumarizados como "Arg-insulinas".A clivagem depois de B32-Arg é crucial no processo de produzir insulinaglargina, pois somente Di-Arg-Insulina pode ser usada. Para insulina huma-na ou insulina glargina, clivagem depois de B29-Lys resulta na formação dedes-Thr. Para insulina glulisina, esse sítio de clivagem é monobásico e pos-síveis produtos são espécies contendo Arg.

Com respeito ao peptídeo C/cadeia A, a clivagem tríptica depoisdo Arg e não do resíduo Lys é crucial para produzir produtos valiosos. Cliva-gem falsa depois de Lys resulta na formação de subprodutos AO.De modo a superar as desvantagens do estado da técnica, édesejado usar no processo de clivagem de pré-pró-insulina, um enzima trip-sina com especificidade para Arg intensificada para os diferentes sítios declivagem, como exemplarmente mostrado na Figura 1. Ao se aumentar aespecificidade para Arg de uma enzima tripsina - e, conseqüentemente di-minuir a especificidade para Lys - a formação de subprodutos, especialmen-te os componentes des-Thr e AO podem ser esperados.

Sichler et ai., FEBS Lett. (2002) 530:220-224, examinaram natripsina humana o impacto de uma troca de aminoácido na posição 190 (nu-meração do quimiotripsinogênio, de acordo com Huber, R. & Bode, W., Acc.Chem. Res. (1978) 11:114-122). Foi verificado que nessa posição, uma trocade Serina tipo selvagem para Alanina mutante provocou um aumento da se-letividade do sítio de clivagem para Arginina e um decréscimo para Lisinaquando substratos artificiais são usados. Ao mesmo tempo, verificou-se quea atividade enzimática do mutante diminuiu de um fator de cerca de 2 quan-do em comparação com o tipo selvagem. O teste de tripsina tipo selvagemhumana recombinante e mutante de tripsina humana (troca de aminoácidona posição 190 de Serina para Alanina) para processamento de pre-pró-insulina resultou na formação de grandes quantidades de subprodutos paraambas as enzimas, revelando que um aumento da seletividade para Arg nãopodia ser atribuído à clivagem de pré-pró-insulina (vide abaixo, exemplo 1).

Em vista do estado da técnica, o problema a ser resolvido é pro-porcionar uma variante de tripsina que exibe uma seletividade de sítio declivagem aumentada para Arginina sem uma perda maior da atividade prote-olítica. Um outro problema particular a ser resolvido é proporcionar uma va-riante de tripsina que tem uma seletividade para resíduos de Arginina dentrodos sítios de clivagem para processamento de pré-pró-insulina como exem-plarmente mostrado na Figura 1.

Por conseguinte, o problema é resolvido proporcionando-se umavariante de tripsina porcina com uma troca de aminoácido na posição 172 deSerina para Alanina. Em uma modalidade preferida, a variante Ser172Ala detripsina porcina é proporciona por meio recombinante. Surpreendentemente,foi verificado que a atividade enzimática da variante Ser172Ala de tripsinaporcina é quase igual para as reações de clivagem de pré-pró-insulina quan-do em comparação com a enzima tipo selvagem.

A posição 190 do aminoácido Serina examinada na tripsina hu-mana por Sichler et al. (FEBS Lett. (2002) 530:220-224) corresponde à Seri-na na posição 172 da tripsina porcina conforme dado na SEQ ID NO:1. Am-bas as posições são parte do assim chamado sítio S1 das serina proteasessimilares à tripsina.

Uma modalidade da invenção é, portanto, o uso da tripsina por-cina Ser172Ala em um processo para preparar insulina, um análogo de insu-lina ou um derivado de insulina.

Uma outra modalidade da invenção é um processo para a prepa-ração de insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina, emque:

(a) uma pré-pró-insulina, um análogo de pré-pró-insulina ou um

derivado de pré-pró-insulina é clivada com tripsina porcina Ser 172Ala,(b) os produtos de clivagem resultantes são separados e(aa) se um dos produtos de clivagem resultantes é um análogode insulina ou derivado de insulina, este análogo de insulina ou derivado deinsulina é obtido, ou

(bb) aqueles produtos de clivagem que são precursores de in-sulina, um análogo de insulina ou derivado de insulina são subseqüentemen-te processados e a insulina, análogo de insulina ou derivado de insulina re-sultante de tal processamento subseqüente é separado e obtido;em que a insulina é preferivelmente insulina humana; e o análo-go de insulina é selecionado de um grupo que compreende insulina humanaLysB28ProB29, insulina humana B28 Asp, insulina humana, onde a prolina naposição 28 foi substituída por Asp, Lys, Leu, Val ou Ala e onde, na posiçãoB29 Lys pode ser substituída por Pro; insulina humana AlaB26; insulina hu-mana des(B28-B30); insulina humana des(B27) e insulina humana des(B30),e o derivado de insulina é selecionado do grupo que compreende insulinahumana B29-N-miristoil-des(B30), insulina humana B29-N-palmitoil-des(B30), insulina humana B29-N-miristoíla, insulina humana B29N-palmitoíla, insulina humana B28-N-miristoil-LysB28ProB29, insulina humanaB28-N-palmitoil-LysB28ProB29, insulina humana B30-N-miristoil-ThrB29LysB3°,insulina humana B30-N-palmitoil-ThrB29LysB30, insulina humana B29-N-(N-palmitoil-Y-glutamil)-des(B30), insulina humana B29-N-(N-litocolil-Y-glutamil)-des(B30), insulina humana B29-N-(co-carboxieptadecanoil)-des(B30) e insulina humana B29-N-(co-carboxieptadecanoíla).

Em uma modalidade preferida da invenção, o análogo de insuli-na é insulina glulisina ou insulina glargina.

Em uma outra modalidade da invenção, o subseqüente proces-samento mencionado desses produtos de clivagem que são precursores deinsulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina compreendeclivagem dos ditos produtos com Carboxipeptidase B1 exceto para a insulinaglargina.

Em uma outra modalidade da invenção, a clivagem com a tripsi-na porcina Ser172Ala é realizada em um valor de pH na faixa de 7,5 a 9,5,preferivelmente 8,3; uma temperatura entre 1°C e 30°C, mais preferivelmen-te entre 8 e 15°C, mais preferivelmente a 8°C; e a reação enzimática é ter-minada por acidificação da amostra, preferivelmente por adição de solução1N ou 2N de HCI.

Uma outra modalidade da invenção é a tripsina porcinaSer172Ala caracterizada pela seqüência SEQ ID NO:3; um DNA que codificaa tripsina porcina Ser172Ala, preferivelmente caracterizada pela SEQ ID NO:4.

Uma outra modalidade da invenção é um DNA que codifica opré-tripsinogênio Ser172Ala, caracterizado pela SEQ ID NO:6. O peptídeosinalizador desse pré-tripsinogênio deriva do fator alfa da Saccharomycescerevisiae.

Uma outra modalidade da invenção é um vetor que compreendeum DNA conforme descrito acima.

Uma outra modalidade da invenção é um método para produzir atripsina porcina Ser172Ala, que compreende as etapas de(a) proporcionar um vetor conforme definido na reivindicação 16,

(b) transformar uma cepa hospedeira microbiana com o vetor;

(c) cultivar a cepa hospedeira microbiana transformada em ummeio de crescimento que contém nutrientes, pelo que a cepa hospedeiramicrobiana expressa a tripsina porcina SER172Ala ou o tripsinogênio porci-no Ser172Ala,

(d) no caso do produto de expressão de (c) ser tripsinogênioporcino Ser172Ala, conversão em tripsina porcina Ser172Ala madura, e

e) purificar a tripsina porcina Ser172Ala da cepa hospedeira mi-crobiana e/ou do meio de crescimento,

em particular em que a cepa hospedeira microbiana é um cepade levedura metilotrófica selecionada de um grupo que compreende as es-pécies Hansenula, Pichia, Candida e Torulopsis-, preferivelmente em que acepa hospedeira microbiana é selecionada de um grupo que compreendePichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida boidinii e Toruslopsis gla-brata.

No presente relatório descritivo, os termos "tripsina porcina vari-ante" e "variante de tripsina porcina" designam uma proteína que é uma va-riante, isto é uma forma alélica da isoforma I da proteína tripsina pancreáticaporcina madura, gerada por meio da substituição do aminoácido na posição172 de acordo com a SEQ ID NO:1.

Com a finalidade de designação abreviada da variante de tripsi-na porcina descrita aqui, é mencionado que o número refere-se ao resí-duo/posição do aminoácido ao longo da seqüência de aminoácidos da tripsi-na pancreática porcina madura como dada na SEQ ID NO:1. A identificaçãodos aminoácidos usa a abreviações de as três primeiras letras, bem como oalfabeto de letra simples dos aminoácidos, isto é Asp D Ácido aspártico, ILEIsoleucina, Thr T Treonina, Leu L Lecina, Ser S Serina, Tyr Y tirosina, Glu EÁcido glutâmico, Phe F Fenilalanina, Pro P Prolina, His H Histidina, Gly GGlicina, Lys K Lisina, Ala A Alanina, Arg R Arginina, Cys C Cisteína, Trp WTriptofano, Val V Valina, Gln Q Glutamina, Met M Metionina, Asn N Aspara-gina. Um aminoácido em uma posição particular em uma seqüência de ami-noácidos é dado pela sua abreviação de três letras e um número. Por con-seguinte, Ser172 denota o resíduo de Serina na posição de aminoácido 172na SEQ ID NO: 1. Uma substituição por um aminoácido diferente é dadacomo a abreviação de três letras adicionada depois do número que indica aposição. Por exemplo, "Ser172Ala" denota a substituição de Ser na posição172 na SEQ ID NO:3 por Ala.

O termo "seletividade de sítio de clivagem aumentada" de umavariante de tripsina significa um deslocamento da especificidade para a cli-vagem hidrolítica, pelo que para a variante o deslocamento leva a uma cliva-gem preferida no grupo carboxila de arginina em vez da lisina.

Quando a atividade tríptica é quantificada, o presente ralatóriodescritivo refere-se às "unidades" (U). A atividade proteolítica de tripsina evariantes desta é quantificada usando-se um ensaio fotométrico empregandoos substratos Chromozym TRY, Chromozym TH e Chromozym PL (RocheDiagnostics GmBH). A "atividade proteolítica específica" ou "atividade espe-cífica" de uma dada preparação é definida como o número de unidades pormg de proteína na preparação, determinada pelo método descrito no exem-plo 9.

Uma "levedura metilotrófica" é definida como uma levedura queé capaz de utilizar metanol como sua fonte de carbonos. O termo tambémcompreende suas cepas de laboratório. No caso de uma cepa de levedurametilotrófica ser auxotrófica e por causa desta necessidade de ser suple-mentada com uma substância contendo carbono auxiliar, tal como, por e-xemplo, histidina no caso de uma cepa de levedura metilotrófica incapaz desintetizar este aminoácido em quantidades suficientes, esta substância auxi-liar é considerada como um nutriente, mas não como uma fonte de carbono.

Um "vetor" é definido como um DNA que pode compreender istoé transportar, e manter o fragmento de DNA da invenção, incluindo, por e-xemplo, fagos e plasmídios. Esses termos são entendidos por aqueles ver-sados na técnica de engenharia genética. O termo "cassete de expressão"significa uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma pré-proteína, ope-ravelmente ligada a um promotor e um terminador. Quanto aos vetores con-tendo um cassete de expressão, os termos "vetor" e "vetor de expressão"são usados como sinônimos.

O termo "oligonucleotídeo" é usado para uma molécula de ácidonucléico, DNA (ou RNA), com menos que 100 nucleotídeos de comprimento.

"Transformação" significa introduzir DNA em um organismo, istoé um organismo hospedeiro, de modo que o DNA seja replicável, tanto comoum elemento extracromossômico como por integração cromossômica.

O termo "expressão" e o verbo "expressar" significam transcriçãode seqüências de DNA e/ou a tradução do mRNA transcrito em um organis-mo hospedeiro resultando em uma proteína, isto é não incluindo processospós-traducionais.

Uma seqüência de nucleotídeos "codifica" um peptídeo ou prote-ína quando pelo menos uma porção do ácido nucléico, ou seu complementepode ser diretamente traduzida para proporcionar a seqüência de aminoáci-dos do peptídeo ou proteína, ou quando o ácido nucléico isolado pode serusado, sozinho ou como parte de um vetor de expressão, para expressar opeptídeo ou proteína in vitro, em uma célula hospedeira procariótica, ou emuma célula hospedeira eucariótica.

Um "promotor" é uma seqüência de nucleotídeos reguladora queestimula a transcrição. Esses termos são entendidos por aqueles versadosna técnica de engenharia genética. Como um promotor, um "elemento pro-motor" estimula a transcrição, mas constitui um subfragmento de uma se-qüência de promotores maior.

O termo "operavelmente ligado" refere-se à associação de doisou mais fragmentos de ácidos nucléicos em um vetor simples de modo que afunção de um é afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é operavel-mente ligado com uma seqüência de codificação, isto é uma seqüência denucleotídeos que codifica uma proteína ou uma pré-proteína, quando ela écapaz de afetar a expressão dessa seqüência de codificação, isto é, que aseqüência de codificação está sob controle transcricional do promotor.

O termo "polipeptídeo" ou "proteína" significa um polímero com-posto de mais que 90 monômeros de aminoácidos unidos por ligações pep-tídicas. O termo "peptídeo" denota um oligômero composto de 90 ou menosmonômeros de aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Uma "ligaçãopeptídica" é uma ligação covalente entre dois aminoácidos na qual o grupoα-aminoácido está ligado ao grupo α-carboxila do outro aminoácido.

O termo "pró-proteína", "forma de pró-proteína", "Zimogênio","tripsinogênio", "pré-proteína" ou "pré-pró-proteína" denota uma produto detradução primária que é um precursor de uma proteína madura, isto é nestecaso, uma proteína resulta do processamento pós-trasducional de uma pré-proteína.

O termo "processamento pós-traducional" denota as etapas demodificação que uma pré-proteína ou uma pré-pró-proteína é submetida, denodo a resultar em uma proteína madura em um compartimento celular ouextracelular.

Um "peptídeo sinalizador" é uma seqüência de sinal clivável deaminoácidos presente na pré-proteína ou em uma forma de pré-pró-proteínade uma proteína secretável. Proteínas transportadas através da membranacelular, isto é "secretadas", têm tipicamente uma seqüência N-terminal ricaem aminoácidos hidrofóbicos, tipicamente cerca de 15 a 30 aminoácidos decomprimento. Em algum momento durante o processo de passar através damembrana, a seqüência de sinal é clivada por uma peptidase sinalizadora(Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (eds),Molecular Biology of the Cell, 4- Edição, 2002, Garland Science Publishing).Muitas fontes de peptídeos sinalizadores são bem conhecidas daqueles ver-sados na técnica e podem incluir, por exemplo, a seqüência de aminoácidosdo peptídeo sinalizador fator-α da Saccharomyces cerevisiae e similares.

Um outro exemplo é o peptídeo sinalizador porcino da pré-proteína tripsino-gênio pancreático porcino nativo de acordo com a SEQ ID NO:5, posição 1-16. Em geral, a terminação N da pré-proteína de qualquer proteína essenci-almente secretada é uma fonte potencial de um peptídeo sinalizador ade-quado para uso na presente invenção. Um peptídeo sinalizador pode sertambém bipartite compreendendo dois peptídeos sinalizadores direcionandoa pré-proteína para um primeiro e um segundo compartimento celular. Pep-tídeos de sinal bipartite são clivados, em etapas, no curso da via secretora.Um exemplo específico para eles é a pré-pró-peptídeo do fator-α da Saccha-romyces cerevisiae (Waters et al., J. Bio. Chem. 263 (1988) 6209-14).

Pré-proteínas, com um peptídeo sinalizador N-terminal, são dire-cionadas para entrar na "via secretora". A via secretora compreende os pro-cessos do processamento pós-traducional e finalmente resulta na secreçãode uma proteína. Glicosilação e a formação de ligações de dissulfeto sãoprocessos que fazem parte da via secretora antes da secreção. No presenterelatório descritivo, é entendido que proteínas secretadas por cepas de Ieve-dura metilotrófica passaram através da via secretora.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Todas as serina proteases similares à tripsina compartilham umapreferência por substrato para um resíduo básico, Lisina ou Arginina. En-quanto a mutação de troca de aminoácido em uma serina correspondente àposição 190 de tripsina pancreática humana levada ao deslocamento dese-jado de especificidade com respeito aos substratos artificiais, um decréscimoda atividade proteolítica é a conseqüência.

Além disso, a avaliação do mutante de tripsina humana revelouque o deslocamento observado na especificidade aos resíduos de Argininausando substratos artificiais não poderia ser designada ao processamentode pré-pró-insulina. O exemplo 1 ilustra a conversão de uma pré-pró-insulinacom mutante da tripsina humana Serinal 90Alanina. Altas quantidades desubprodutos, principalmente os componentes B30-des-Thr e AO, são forma-das durante a reação.

Não foi mostrado até onde esse efeito se aplica igualmente atodas as serinas proteases similares à tripsina. Um modo de elucidar essaquestão é introduzir a mutação de troca de Ser-Ala nas seqüências de ami-noácidos de outras espécies de tripsina mamífera em um sítio dentro de ca-da seqüência de polipeptídeos respectiva correspondente à posição 190 doisótipo I da tripsina pancreática humana. Ao fazerem isso, os inventoresconstataram, de forma surpreendente, que tal mutação de troca em tripsinapancreática porcina aumenta a seletividade do sítio de clivagem para Argini-na no processamento da pré-pró-insulina e ao mesmo tempo mantém o nívelmaior de atividade proteolítica.

Aquele versado na técnica está bem a par dos métodos parasubstituir um ou mais resíduos de aminoácidos em uma proteína. O exemplo2 ilustra como um mutante de troca de aminoácido pode ser engenheiradono nível da seqüência de DNA de codificação. Contudo, outros métodos sãopossíveis. Na presente invenção, a seqüência de nucleotídeos sintéticos quecodifica o mutante Ser172Ala da tripsina pancreática porcina conforme dadana SEQ ID NO:4 foi expressa em organismos hospedeiros microbianos.

A variante de tripsina é preferivelmente produzida como proteí-nas heterólogas em organismos hospedeiros microbianos tais como bacté-rias e fungos. Aquele versado na técnica está bem familiarizado com siste-mas de expressão de bactérias que existem para uma variedade de hospe-deiros procarióticos, tais como espécies de E. coli, Bacilos e Estafilococos,entre outras. Microorganismos hospedeiros ainda mais preferidos são fun-gos. Um exemplo de um gênero de fungo preferido é Aspergillus. Aindamesmo mais preferidas são espécies de levedura tais como espécies dosgêneros Saccharomyces ou Schizosaccharomyces. Ainda mesmo mais pre-feridas são cepas de espécies de levedura metilotrófica.

Leveduras metilotróficas têm vias bioquímicas necessárias parautilização de metanol e são classificadas em quatro gêneros, como base namorfologia da célula e características de crescimento: Hansenula, Pichia,Candida, e Torulopsis. Os sistemas de hospedeiros metilotróficos mais alta-mente desenvolvidos utilizam Pichia pastoris (Komagataella pastoris) e Han-senula polymorpha (Pichia angusta).

A expressão de proteínas heterólogas em levedura está descritanas Patentes US 5.618.676, US 5.854.018, US 5.856.123, e US 5.919.651.

Organismos de levedura produzem várias proteínas que são sin-tetizadas intracelularmente, mas têm uma função fora da célula. Essas pro-teínas extracelulares são referidas como proteínas secretadas. Inicialmente,as proteínas secretadas são expressas dentro da célula na forma de umprecursor, uma pré-proteína ou uma pré-pró-proteína contendo um peptídeosinalizador N-terminal assegurando a direção eficaz do produto expresso navia secretora da célula, através da membrana do retículo endoplasmático. Opeptídeo sinalizador é geralmente clivado do produto desejado durantetranslocação. A clivagem é efetuada proteoliticamente por uma peptidasesinalizadora. Uma particular subseqüência de aminoácidos do peptídeo sina-lizador é reconhecida e clivada pela peptidase sinalizadora. Essa subse-qüência é referida como um sítio de clivagem de peptidase sinalizadora.

Uma vez tendo entrado na via secretora, a proteína é transportada ao apare-lho de Golgi. Do aparelho de Golgi, as proteínas são distribuídas para amembrana plasmática, Iisossomos e vesículas secretoras.

As proteínas secretadas são confrontadas com diferentes condi-ções ambientais conforme opostas às proteínas intracelulares. Parte dosprocessos da via secretora é estabilizar as proteínas extracelulares em a-madurecimento. Portanto, as pré-proteínas que são passadas através da viasecretora de levedura sofrem o processo pós-trasducional. Por exemplo, oprocessamento pode compreender a geração de ligações de dissulfeto paraformar reticulações intramoleculares. Além disso, certos aminoácidos da pro-teína podem ser glicolisados.

Várias abordagens foram sugeridas para a expressão e secre-ção em levedura de proteínas heterólogas para levedura. EP O 116 201 des-creve um processo, por meio do qual proteínas heterólogas para levedurasão transformadas por um vetor de expressão contendo DNA que codifica aproteína desejada, um peptídeo sinalizador e um peptídeo agindo como umsítio de clivagem de peptidase sinalizadora. Uma cultura do organismo trans-formado é preparada e crescida, e a proteína é recuperada do meio de cultu-ra. Foi verificado que para uso em células de levedura, um peptídeo sinali-zador adequado é um peptídeo sinalizador fator-α da Saccharomyces cere-visiae (Patente US 4.870.008).

Durante a secreção, a enzima de levedura KEX-2 é a peptidasesinalizadora que reconhece uma seqüência de Lisina-Arginina como seu sí-tio de clivagem na pré-proteína. KEX-2 cliva na junção para a seqüência daproteína desejada. Como resultado, o produto gênico desejado é liberado eisento das porções líder, isto é o peptídeo sinalizador da pré-proteína. A en-doprotease KEX-2 foi originalmente caracterizada na levedura Saeeharomy-ees, onde ela processa especificamente o precursor do fator-alfa tipo corres-pondente e um fator assassino (Julius, D. et al., Cell 37 (1984) 1075-1089).

Espécies de levedura metilotrófica, tal como Pichia pastoris, compartilham aprotease tipo KEX-2 (papel e função similares) com Saccharomyces cerevi-siae (Werten, M.W., et al., Yeast 15 (1999) 1087-1096).

Uma espécie de levedura metilotrófica bem estabelecida exem-plarmente descrita como hospedeiro para expressão de proteína recombi-nante de alto nível é a Pichia pastoris (Patentes 4.683.293, US 4.808.537,US 4.812.405, US 4.818.700, US 4.837.148, US 4.855.231, US 4.857.467,US 4.879.231, US 4.882.279, US 4.885.242, US 4.895.800, US 4.929.555,US 5.002.876, US 5.004.688, US 5.032.516, US 5.122.465, US 5.135.868,US 5.166.329, WO 00/56903). Em ausência de glicose, Pichia pastoris usametanol como fonte de carbono, que ao mesmo tempo é uma indicação deum organismo metilotrófico. O promotor de álcool oxidase (AOX1) dado naSEQ ID NO:7 controla a expressão da álcool oxidase, que catalisa a primeiraetapa no metabolismo do metanol. Tipicamente, 30% da proteína total solú-vel em células induzidas por metanol compreendem álcool oxidase. Váriosvetores de expressão de Piehia transportam o promotor AOX1 e usam meta-nol para induzir expressão de alto nível das proteínas heterólogas deseja-das. As construções de expressão também estão integradas ao genoma daPiehia pastoris, criando um hospedeiro geneticamente transformado e estável.

Usando um vetor de expressão que codifica uma pré-proteínaheteróloga compreendendo um peptídeo sinalizador ou um peptídeo sinali-zador com um sítio de clivagem de peptidase sinalizadora, e uma proteínadesejada, cepas de levedura metilotrófica, tais como cepas de Piehia pasto-ris, podem ser manipuladas de modo a secretar o produto desejado no meiode crescimento, do qual a proteína secretada pode ser purificada.

Pode ser vantajoso produzir seqüências de nucleotídeos quecodificam a pré-proteína possuindo um uso de códon substancialmente dife-rente. Os códons podem ser selecionados para aumentar a taxa na qual aexpressão da pré-proteína ocorre em um hospedeiro de expressão de leve-dura particular de acordo com a freqüência com a qual os códons particula-res são utilizados pelo uso de hospedeiro. Outras razões para alterar subs-tancialmente a seqüência de nucleotídeos que codifica a pré-proteína, semalterar as seqüências de aminoácidos codificadas, incluem a produção detranscritos de RNA tendo mais proteínas desejáveis, tal como meia-vidamais longa, que os transcritos produzidos da seqüência que ocorre natural-mente.

O exemplo 3 ilustra as etapas de clonagem para proporcionarum vetor de expressão que codifica a variante de tripsina. O uso de um vetorque compreende a seqüências de nucleotídeos que codifica a pré-proteínaque é competente para expressão, por exemplo, operavelmente ligada a umpromotor ou elemento de promotor e a um terminador ou elemento de termi-nador, bem como as seqüências requeridas para tradução eficaz, o orga-nismo hospedeiro é transformado com o vetor, e os transformantes são se-lecionados.

Por outro lado, o rendimento de expressão é dependente de al-vejar apropriadamente o produto desejado, por exemplo, à via secretora pormeio de um peptídeo sinalizador tal como o peptídeo sinalizador fator-α daSaccharomyces cerevisiae ou o peptídeo sinalizador porcino do tripsinogêniopancreático porcino nativo. O exemplo 4 proporciona um hospedeiro micro-biano transformado e o exemplo 5 mostra como a expressão da variante detripsina pode ser obtida. Por conseguinte, o produto traducional primáriocompreende um peptídeo sinalizador que direciona o peptídeo para a viasecretora. O exemplo 6 ilustra a medição da atividade típica no sobrenadan-te da levedura metilotrófica transformada.

Por outro lado, o rendimento de expressão pode ser elevadoaumentando-se a dosagem do gene que codifica o produto desejado. Assim,o número de cópias da construção de expressão, que é o vetor de expres-são ou o cassete de expressão, no organismo hospedeiro é ampliado. Ummodo de se conseguir isso é por transformação múltipla de um vetor de ex-pressão que codifica o produto desejado. Um outro modo é introduzir o geneque codifica o produto desejado para o organismo hospedeiro usando umprimeiro e um segundo vetor de expressão, pelo que o segundo vetor deexpressão é baseado em um marcador selecionável que difere do marcadorselecionável usado no primeiro vetor de expressão. O segundo vetor de ex-pressão que codifica o mesmo produto desejado pode ser ainda introduzidoquando o organismo hospedeiro já transporta múltiplas cópias de um primei-ro vetor de expressão (Patente US 5.324.639; Thill1 G.P., et al., Positive andNegative Effects of Muiti-Copy Integrated Expression in Pichia Pastoris, In-ternational Symposium on the Genetics of Microorganims 2 (1990), pp. 477-490; Vedvick, T., et al., J. Ind. Microbiol. 7 (1991) 197-201; Werten, M.W., etal., Yeast 15 (1999) 1087-1096. O exemplo 7 descreve como o rendimentode expressão da variante de tripsina pode ser aumentada de modo a propor-cionar um clone de levedura para a produção em escala industrial.

Os transformantes são repetidamente analisados com respeitoao rendimento da proteína secretada no meio de crescimento. Os transfor-mantes que secretam as quantidades mais altas da proteína recombinanteenzimaticamente ativa são selecionados.

A secreção da variante da tripsina porcina no meio de cresci-mento direciona a proteína recombinante para o espaço extracitoplasmáticode onde ela se difunde no meio de crescimento. A levedura metilotróficatransformada em cultura líquida secreta a variante de tripsina pancreáticaporcina recombinante no meio de crescimento líquido, isto é o meio de cultu-ra líquido. Isso permite uma separação bastante eficaz da biomassa de Ie-vedura da proteína recombinante usando, por exemplo, técnicas de filtração.Como resultado, a variante de tripsina porcina recombinante purificada destafonte é separada muito eficazmente de outras atividades de enzimas, talcomo da ribonuclease ou outras atividades de proteases (não trípticas).

Portanto, uma primeira modalidade da invenção é uma variante,por meio de substituição de aminoácido, do isótipo I de tripsina pancreáticaporcina, em que o aminoácido Serina na posição 172 substitui o resíduo deaminoácido Alanina, numerado a partir da terminação N do isótipo I de tripsi-na pancreática porcina de acordo com a SEQ ID NO:1, para formar uma va-riante de tripsina pancreática com atividade de tripsina.

Preferivelmente, a variante de tripsina pancreática porcina temuma seletividade de sítio de clivagem aumentada para clivagem hidrolíticano grupo carboxila do aminoácido arginina, ao invés de clivagem hidrolíticano grupo carboxila do aminoácido lisina.

Mais preferida, a variante isolada exibe a seletividade aumenta-da quando um polipeptídeo precursor de insulina ou um análogo deste é u-sado como substrato.

Em ainda uma outra modalidade preferida da invenção, a ativi-dade proteolítica específica da variante de tripsina porcina é 100% em com-paração com a tripsina pancreática porcina tipo selvagem. Assim, quandoproduzida e purificada sob condições equivalentes, a atividade de tripsinaespecífica da variante da tripsina pancreática porcina recombinante é 100%quando em comparação com a tripsina pancreática porcina inalterada, ouseja, a forma tipo selvagem.

Uma outra modalidade preferida da invenção é um método paraproduzir uma variante de tripsina pancreática porcina compreende as etapasde (a) proporcionar um vetor que compreende uma seqüência de nucleotí-deos que codifica a variante de tripsina pancreática, (b) transformar uma ce-pa hospedeira microbiana com o vetor, (c) cultivar a cepa hospedeira micro-biana em um meio de crescimento que contém nutrientes, pelo que a cepahospedeira microbiana expressa a variante de tripsina pancreática porcinarecombinante, e (d) purificar a variante da tripsina pancreática porcina re-combinante da cepa hospedeira microbiana e/ou o meio de crescimento.

Eficácia de tradução de uma proteína heteróloga pode ser aper-feiçoada por adaptação dos códons da seqüência de nucleotídeos que codi-fica a proteína heteróloga de acordo com os códons preferidos no organismohospedeiro. Assim, em uma modalidade preferida da invenção, a seqüênciade nucleotídeos que codifica a variante de tripsina pancreática porcina re-combinante é SEQ ID NO:4.

Em uma ainda mais preferida modalidade da invenção, (a) o ve-tor compreende uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma pré-proteína do tripsinogênio pancreático porcino recombinante e um peptídeosinalizador conforme dado na SEQ ID N0:6, (b) a cepa hospedeira microbi-ana é uma cepa de levedura metilotrófica, (c) o meio de crescimento contémmetanol como fonte de carbono, (d) a cepa de levedura metilotrófica expres-sa e secreta a variante de tripsina pancreática porcina recombinante, e (e) avariante de tripsina pancreática porcina é purificada do meio de crescimento.

Peptídeos sinalizadores eucarióticos derivados de levedura, bemcomo derivados de não-levedura em vez daqueles particularmente mencio-nados podem ser usados para o mesmo propósito. Embora os peptídeossinalizadores não possam ser cliváveis pela peptidase sinalizadora, um pep-tídeo de clivagem de peptidase sinalizadora pode ser inserido na seqüênciade aminoácidos de pré-proteína, que está entre a seqüência de aminoácidosdo peptídeo sinalizador e a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo detripsina pancreática porcina, recombinante, variante. Portanto, em ainda umaoutra modalidade muita preferida da invenção, o peptídeo sinalizador contémuma sítio de clivagem de peptidase sinalizadora, que está localizado adja-cente ao primeiro aminoácido (N-terminal) do tripsinogênio pancreático por-cino recombinante.

Em uma outra modalidade preferida da invenção, a seqüênciade nucleotídeos que codifica a pré-proteína é operavelmente ligada a umpromotor ou elemento de promotor. É preferido que o vetor seja um plasmí-dio capaz de ser replicado como um epissoma na cepa de levedura metilo-trófica. Portanto, é preferido que um cromossomo artificial capaz de ser re-plicado na cepa de levedura metilotrófica contenha o vetor. Ainda, é maispreferido que um cromossomo da cepa de levedura metilotrófica contenha ovetor como um integrado.

Assim, no método preferido usando as cepas de levedura metilo-trófica e particularmente cepas de Pichia pastoris, o vetor que codifica umaseqüência de aminoácidos para uma variante de pré-proteína tripsinogêniopancreático porcino que entra na via secretora.

Em uma modalidade preferida da invenção, a cepa de levedurametilotrófica é uma espécie de Hansenula, Pichia, Candida ou Torulopsis. Éaltamente preferido que a cepa de levedura metilotrófica seja selecionada dogrupo que consiste em Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida boi-dinii e Torulopsis glabrata. É ainda mais preferido que a cepa de levedurametilotrófica seja a cepa de Pichia pastoris com o Número de Acesso 76273no American Type Culture Collection, ou um derivado desta.

Uma outra modalidade preferida da invenção é uma cepa de Pi-chia pastoris com um cromossomo que contém um vetor que compreendeuma seqüência de nucleotídeos que codifica uma pré-proteína que consistena variante de tripsina pancreática porcina recombinante e um peptídeo si-nalizador operavelmente ligados com o promotor AOX1 de Pichia pastoris deacordo a SEQ ID NO:7 ou um elemento de promotor deste.

Aquele versado na técnica tem conhecimento do fato de que orendimento de proteína heteróloga secretada, tal como uma variante de trip-sina pancreática porcina, obtenível do meio de crescimento, tal como ummeio de crescimento líquido, pode ser aumentado quando o número de có-pias da seqüência de nucleotídeos que codifica a pré-proteína da qual a pro-teína heteróloga é expressa e secretada, é aumentado. Assim, o rendimentode proteína heteróloga secretada obtenível do meio de crescimento pode seraumentado quando o número de cópias do vetor no genoma da cepa de le-vedura metilotrófica é aumentado. Por exemplo, o número de cópias do vetorque pode ser aumentado por submissão da cepa de levedura metilotrófica arepetidas transformações do vetor e os ciclos de seleção repetidos usandoconcentrações crescentes do agente seletivo contra o qual o marcador sele-tivo compreendido no vetor confere resistência (Patente US 5.324.639; Thill,G.P., et al., Positive and Negative Effects of Multi-Copy Integrated Expres-sion in Pichia pastoris, International Symposium on the Genentics of Micro-organisms 2 (1990), pp. 477-490; Vedvick, T., et al., J. Ind. Microbiol. 7(1991) 197-201).

Um exemplo para um marcador seletivo é o gene Sh ble, que é ogene de resistência a Zeocin™ (Drocourt, D., et al., Nucleic Acids Res. 18(1990) 4009; Carmels, T., et al., Curr. Genet. 20 (1991) 309-314). A proteínacodificada pelo gene Sh ble se liga à Zeocin™ estequiometricamente e comforte afinidade. A ligação de Zeocin™ inibe sua atividade tóxica, selecionan-do assim transformantes contendo o gene Sh ble. É sabido por aquele ver-sado na técnica que o aumento da concentração de Zeocin™ como o agenteseletivo no meio seleciona um aumento do número de cópias do vetor queexpressa o gene Sh ble. Portanto, é vantajoso usar um vetor com o gene Shble como um marcador selecionável para gerar por transformação repetidatransformantes múltiplos da cepa de levedura metilotrófica contendo múlti-plas cópias do vetor. Portanto, é vantajoso que transformações sejam repe-tidas e a seleção para ainda mais transformantes resistentes seja repetidaaté que para a cepa de levedura metilotrófica transformada, mais nenhumoutro aumento do nível de resistência a Zeocin™ seja obtido ou mais ne-nhum outro aumento da concentração de Zeocin™ no meio de seleção sejaainda possível.

Aquele versado na técnica está familiarizado com a purificaçãoda tripsina pancreática porcina recombinantemente expressa e secretadapor meio de cromatografia (Funakoshi, A., et al., J. Biochem. (Tóquio) 88(1980) 1113-1138; Paudel, H.K., e Liao, T.H., J. Biol Chem. 261 (1986)16006-16011; Nefsky, B., e Bretscher1 A., Eur. J. Biochem. 179 (1989) 215-219). É preferido que uma variante de tripsinogênio pancreático porcino nomeio de crescimento seja purificado usando cromatografia de troca iônica.

Etapas de processamento a jusante levando ao produto purificado são des-critas no exemplo 8. A produção da isoforma I de tripsina pancreática porci-na do tipo selvagem foi feita similarmente exceto que a seqüência de codifi-cação do tipo selvagem foi usada para construir o vetor de expressão.

Ainda, uma outra modalidade preferida da invenção é uma vari-ante do isótipo I da tripsina pancreática porcina, por um dos métodos descri-tos acima. Uma outra modalidade da invenção é o uso da variante de tripsi-na pancreática porcina para o processamento da pré-pró-insulina. Os bene-fícios do uso da variante Ser172Ala de tripsina porcina para clivagem enzi-mática de diferentes pré-pró-insulinas são descritos nos exemplos 10-12. Osseguintes exemplos, referências, listagem de seqüências e figuras são pro-porcionados para auxiliar o entendimento da presente invenção, o verdadei-ro escopo da qual está estabelecido nas reivindicações apensas. É entendi-do que modificações podem ser feitas nos procedimentos estabelecidos semse desviar do espírito da invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Esquema dos principais sítios de clivagem tríptica paraas pré-pró-insulinas de insulina humana, Insulina glargina e Insulina glulisi-na. Os triângulos cheios representam sítios de clivagem rendendo produ-to(s), triângulos abertos denotam sítios de clivagem rendendo subprodutos.As ligações de dissulfeto das pré-pré-insulinas não são mostradas.

Figura 2: Clivagem de pré-pró-insulina glargina com tripsina hu-mana do tipo selvagem, recombinante (exemplo 1).

Figura 3: Clivagem de pré-pró-insulina glargina com a variantede tripsina humana Serinal 90Alanina, recombinante (exemplo 1).

Figura 4: Mapa do plasmídio pTyr-Ser172Ala que é um derivadodo plasmídio pPICZaA comercialmente disponível (Invitrogen) que confereresistência à Zeocin™. A inserção designada TrySerI 72Ala é a seqüênciade DNA sintético que codifica a variante de tripsinogênio secretado porcinorecombinante que transporta a substituição de aminoácido Ser172Ala, e que é fundida à seqüência de nucleotídeos que codifica o peptídeo sinalizador defator-α de Saccharomyces cerevisiae. "AOX1-Prom" representa o promotorA0X1 da Piehia pastoris, "Term" denota o terminador A0X1 de Piehia pasto-ris.

Figura 5: É mostrada a clivagem de pré-pró-insulina (insulinahumana) com tripsina porcina recombinante, nativa (exemplo 10, Tabela 1).

Figura 6: É mostrada a clivagem de pré-pró-insulina (insulinahumana) com tripsina porcina variante S172A (exemplo 10, Tabela 1).

Geralmente, nos seguintes exemplos, os métodos sugeridos edescritos nos manuais da Invitrogen "Kit de Expressão de Piehia pastoris"Versão M 011102 25-0043, "pPICZ A, B, e C" Versão D 110801 25-0148,"pPICZa A, B, e C" Versão E 010302 25-0150, e "pPIC9K" Versão E 03040225-0106, foram aplicados. É também feita referência a outros vetores, cepasde levedura e meios aí mencionados. Métodos básicos de biologia molecularforam aplicados conforme descritos por Sambrook, Fritsch & Maniatis, Mole-cular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Edição, CSHL Press, 2001MÉTODO HPCL:

Fase estacionária: Nucleosil 1205 C18, Macherey & Nagel, 250 χ4 mm; Fase móvel A: tampão de fosfato de sódio 45 mM (pH 2,5), NaCI315mM, acetonitrila a 25% (v/v); Fase Móvel B: tampão de fosfato de sódio45mM (pH 2,5), NaCI 55mM, acetonitrila a 65% (v/v); Gradiente: linear, de6% da fase B para 10% da fase B, dentro de 30 minutos.

Os seguintes exemplos têm por objetivo ilustrar a invenção semlimitá-la.

exemplo 1: Clivagem de pré-pró-insulina glargina usando tripsinado tipo selvagem humana, recombinante e variante de tripsina humana Seri-na190Alanina.

Esses experimentos foram conduzidos a 8°C e em um valor depH de 8,3 (solução tamponada) e foram realizados até a escala de 50 mL.

A solução de PPI foi preenchida em um vaso de reação comtermostato, apropriado, e a reação foi iniciada por adição da preparação deenzima. Amostras foram tiradas depois de intervalos de tempo definidos; areação enzimática foi imediatamente interrompida por acidificação da solu-ção de amostra com uma solução de 1N ou 2N de HCI. A concentração dosrespectivos produtos foi determinada por HPLC.

exemplo 2: Mutagênese da seqüência de nucleotídeos sintéticaque codifica tripsinogênio pancreático porcino.

Geralmente, métodos padrão de biologia molecular foram apli-cados conforme descritos por Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Clo-ning, A Laboratory Manual, 3a Edição, CSHL Press, 2001. O método expli-cado abaixo é uma aplicação específica de um método bastante genéricoque é também conhecido como "mutagênese sítio-direcionada".

Mutações foram geradas em um modo sítio-direcionado usandoa reação em cadeia de polimerase (PCR). De modo a mutar uma códon de-sejado, isto é uma tripleto base, um par de oligonucleotídeos de DNA de fitasimples complementares representando uma porção variante da seqüênciade nucleotídeos sintética que codifica um tripsinogênio pancreático porcinofoi desenhado e sintetizado. Os oligonucleotídeos de DNA de fita simpleseram idênticos ou complementares à seqüência dada na SEQ ID N0:2, ex-ceto quanto à seqüência de tripletos a ser mutada. Tipicamente, os oligonu-cleotídeos de DNA tinham um comprimento de cerca de 20 a 45 nucleotí-deos; a seqüência de tripletos a ser mutada ou seu complemento estava lo-calizada na porção central do oligonucleotídeo de DNA compreendendo omesmo, e era flanqueada em ambos os lados por cerca de 10 a 12 nucleotí-deos. Os oligonucleotídeos de DNA foram desenhados de modo que a hibri-dização dos oligonucleotídeos de DNA para o DNA de tripsinogênio pancreá-tico, recombinante, do 'tipo selvagem' (de acordo com a SEQ ID NO:2) resul-tou em híbridos com um desemparelhamento central, mas com pareamentode bases intacto nos flancos do desemparelhamento, incluindo as extremi-dades 5'e 3'de cada oligonucleotídeo de DNA.

Adicionalmente, dois iniciadores de oligonucleotídeo de DNA defita simples foram fornecidos, dos quais o primeiro, designado "5' tripsina"(SEQ ID NO:8) compreendia os 9 nucleotídeos de 5'-terminal da SEQ IDNO:2 e o segundo, designado "3' tripsina" (SEQ ID NO:9) compreendia aseqüência complementar para os 12 nucleotídeos 3'-terminal da SEQ IDNO:2. Os dois iniciadores foram desenhados para compreender sítios declivagem de endonuclease de restrição. Portanto, o primeiro e o segundoiniciadores foram estendidos e seqüências adjacentes incluídas que estavamflanqueando a seqüência de nucleotídeos sintética da SEQ ID N02. "5' trip-sina" continham um sítio EcoRI e um 3' Xba I.

Uma seqüência de nucleotídeos que codificou uma variante, pormeio de substituição de um aminoácido, da proteína tripsina pancreáticaporcina, madura, do tipo selvagem, foi sintetizada por meio de várias etapascom base em PCR.

Uma primeira e uma segunda PCR foram efetuadas usando co-mo DNA de dupla fita de modelo compreendendo a seqüência de nucleotí-deos de acordo com a SEQ ID NO:2 que estava presente como uma inser-ção no vetor. As seqüências de vetor flanqueando a inserção eram tais quedurante a PCR os iniciadores "5' tripsina" e "3' tripsina" se corresponderamperfeitamente quando anelados. A primeira PCR foi feita usando um par deiniciadores do iniciador de "5'tripsina" e um primeiro oligonucleotídeo deDNA de fita simples compreendendo a seqüência mutada, isto é variante detripletos, pelo que os dois iniciadores anelados às fitas de DNA de modeloem oposição. A segunda PCR foi realizada de acordo, usando o iniciador "3'tripsina" e um segundo oligonucleotídeo de DNA de fita simples, que eracomplementar ao primeiro. Como resultado a primeira e a segunda PCR ge-raram dois produtos intermediários: Uma porção 5' e uma porção 3' de umaseqüência de nucleotídeos codificando uma variante de tripsina pancreáticaporcina recombinante, por meio de que a porção 5' transportou a seqüênciamutada em sua extremidade 3' vice versa, a porção 3' transportou a sequê-cia mutada em sua extremidade 5'.

Os dois produtos de ampliação, intermediários, resultantes, fo-ram analisados por eletroforese em gel de agarose, os fragmentos deseja-dos foram excisados e DNA foi isolado dos blocos de agarose usando o "Kitde Extração de Gel QIAquick" (Qiagen, catálogo N0 28704).

Uma terceira PCT foi efetuada subseqüentemente de modo afundir a duas porções. Com essa finalidade, as duas porções foram unidasem uma PCR simples e cinco ciclos de PCR foram efetuados sem quaisqueradicionais iniciadores a montante e a jusante. Durante esses ciclos poucoprodutos inteiros se formaram, pelo que a temperatura de anelamento quefoi usada foi calculada para a seqüência de sobreposição da porção 5' eporção 3'. Subseqüentemente, os iniciadores "5' tripsina" e "3' tripsina" foramadicionados e mais 25 ciclos de PCT foram efetuados, por meio de que atemperatura de anelamento usada aqui correspondeu ao iniciador adiciona-do com a temperatura de fusão mais baixa.

Um fragmento de DNA inteiro mutado foi, subseqüentemente,inserido em um vetor de clonagem usando o "Kit de Clonagem por PCR -extremidade cega" (Roche Diagnostics GmbF, Mannheim; Catálogo N0 1 939645). O fragmento de DNA foi verificado por meio de análise com enzima derestrição e seqüenciamento. O fragmento de DNA verificado foi então exci-sado por meio de clivagem com Xho I e Not I e inserido em vetores de ex-pressão de Pichia pastoris que foram clivados com as mesmas enzimas derestrição (vide exemplo 3 e exemplo 5).

Ser172Ala: O tripleto base "TCT" encontrado na EQ ID N0:2 naposição 528-531 foi substituído por "GCT". Com esta finalidade, em umaprimeira PCR o oligonucleotídeo de DNA "5'-Try-Ser172Ala" (SEQ ID N0:10)foi usado como um iniciador em combinação com "3'-tripsina" e em uma se-gunda PCR "3'-Try-Ser172Ala" (SEQ ID N0:11) foi usado como um iniciadorem combinação com "5'-tripsina". Os fragmentos intermediários isolados fo-ram subseqüentemente usados para a terceira PCT, de modo a gerar o pro-duto inteiro.

exemplo 3: Clonagem do DNA artificial que codifica um tripsino-gênio pancreático porcino, recombinante, variante, em vetores de expressãoderivados de pPICZotA.

O fragmento de DNA que codifica o tripsinogênio pancreáticoporcino, recombinante, variante, que foi gerado a partir de fragmentos dePCR (vide exemplo 2) foi excisado com EcoRI e Xball (Roche DiagnosticsGmbH). O fragmento foi isolado usando o "Kit de Extração de Gel QIAquick",de acordo com as instruções do fabricante.

O fragmento foi ligado ao vetor de pPICSaA, fundindo assim aseqüência de nucleotídeos que codifica o tripsinogênio pancreático porcino,recombinante, variante, à seqüência de nucleotídeos que codifica o peptídeosinalizador fator-α da Saccharomyces eerevisiae. Antes da reação de Iiga-ção, o vetor foi similarmente clivado com EcoRI e Xbal, e isolado.

O procedimento de clonagem seguido inseriu a seqüência denucleotídeos que codifica o tripsinogênio pancreático porcino, recombinante,variante, diretamente e em alinhamento, depois de a seqüência de nucleotí-deos codificar o peptídeo sinalizador fator-α da Saccharomyces eerevisiae.

A seqüência de nucleotídeos que codifica a pré-proteína recom-binante como dada na SEQ ID N0:6 estava sob o controle do promotorAOX-1 de P. pastoris (SEQ ID N0:7), que, por exemplo na Piehia pastoris, éinduzível por metanol.

A construção foi obtida por unir em um volume total de 10 μΙ_ 20ng de fragmento de vetor Iinearizado (em um volume de 1 μΙ_), 100 ng defragmento de PCR ligado (em 3 μΙ_), e incubação durante a noite a 16°C, empresença de T4DNA Iigase (Roche Diagnostics GmbH), de acordo com asinstruções do fabricante. 5 μΙ_ da preparação de ligação foram usados, sub-seqüentemente, para transformar células XL1 Blue de E. coli competentes(Stratagene), em um volume total de 205 μΙ_. Seguinte à incubação em gelopor 30 minutos, as células foram submetidas a choque térmico a 42°C, por90 segundos. Subseqüentemente, as células foram transferidas em 10 mLde meio LB e incubadas, por 1 hora, a 37°C, para permitir a expressão dosmarcadores de seleção. Alíquotas foram plaqueadas, depois disso, em pla-cas LB contendo 10 μg/mL de Zeocin e incubadas por 15 horas, a 37°C.Clones resistentes foram retirados, os plasmídios isolados (Sambrook, Frits-ch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Edição, CSHLPress, 2001) e testados por meio de análise de restrição, bem como poranálise de seqüência. Verificou-se que os clones de construção estavamisentos de erros e os produtos da clonagem foram selecionados. O vetor deexpressão contendo uma tripsina pancreática porcina, recombinante, varian-te com o peptídeo sinalizador fator-α da Saccharomyces cerevisiae foi de-signado pTry-Ser172Ala.

exemplo 4: Transformação de Pichia pastoris com vetores deexpressão pTry-Ser172Ala derivado de pPICZaA.

As cepas hospedeiras usadas eram Pichia pastoris X-33,GS115, KM71H e SMD1168 (Invitrogen). Cepas preferidas foram X-33 eKM71H. A transformação almejou integrar estavelmente construções de ex-pressão no genoma do organismo hospedeiro. Inicialmente, 5 mL de meioYPD (YPD = levedura peptona dextrose; Invitrogen) foram inoculados comcolônia de P. pastoris e pré-cultivados em um agitador durante a noite, a30°C. Para preparar as células competentes para transformação, 100 μί. dapré-cultura foram adicionados como inóculo a 200 mL de meio YPD fresco ecrescidas até que uma OD6Qonm de entre 1,3 e 1,5 fosse alcançado. As célu-las foram centrifugadas em 1.500 χ g, por 5 minutos e re-suspensas em 200mL de água estéril gelada (0C). As células foram centrifugadas novamente a1.500 χ g for 5 minutos e re-suspensas em 100 mL de água estéril gelada.As células foram centrifugadas mais uma vez a 1.500 χ g por 5 minutos e re-suspensas em 10 mL de sorbitol 1M (ICN) gelado. As células preparadasdesse modo foram mantidas em gelo e usadas para transformação imedia-tamente.

Os vetores de expressão pTry-Ser172Ala derivado de pPICZaAa serem usados para transformação foram Iinearizados usando a endonu-clease de restrição Sac I (Roche Diagnostics GmbH), precipitados e re-suspensos em água. A transformação foi obtida por eletroporação usandoum "Gene Pulser IIt (BioRad). Para preparação da transformação, 80 μί decélulas de P. pastoris em solução 1M de sorbitol foram misturados com 1 ^gde DNA de vetor de expressão Iinearizado e transferidos para uma cubetade gelo, que foi então mantida em gelo por 5 minutos. Subseqüentemente, acubeta foi transferida para o Gene Pulser. Os parâmetros de eletroporaçãoforam 1 kV, 1 kQ e 25 μΡ. Seguinte à eletroporação, 1 mL de solução 1Mde sorbitol foi adicionado à suspensão de células, que foi subseqüentementeplaqueada em placas YPDA (YPDS = levedura peptona dextrose sorbitol;Invitrogen) contendo 100 μg/mL de Zeocin™ (Invitrogen), com 100-150 μίde suspensão de células sendo espalhados em uma placa simples. As pla-cas YPDS foram incubadas a 30°C, por 2-4 dias. Clones de levedura foramtransferidos para placas quadriculadas com dextrose mínima. As colôniasdessas placas foram retiradas e re-suspensas separadamente em água es-téril. As células foram digeridas com 17,5 unidades de Iiticase (Roche Diag-nostics GmbH) por 1 hora, a 30°C e depois disso congeladas por 10 minutosa -80°C. Por meio de PCR, a presença dos cassetes de expressão de pTry-Ser172Ala derivado de pICZaA, respectivo, foi verificada. O termo "cassetede expressão" denota uma seqüência de nucleotídeos que codifica a pré-proteína de tripsina pancreática porcina, recombinante, variante, operavel-mente ligada ao promotor AOX1 e ao terminador AOX1, por meio de que ocassete de expressão é derivado do respectivo vetor de pPICZaA usado pa-ra transformação. Quanto aos vetores contendo um cassete de expressão,os termos "vetor" e "vetor de expressão" são sinônimos.

Clones positivos, isto é clones que foram testados positivamentepara a presença de cassetes de expressão completos estavelmente integra-dos ao genoma foram usados para posterior caracterização da expressão detripsina pancreática porcina, recombinante, variante.

Adicionalmente, as transformações de controle foram feitas comcepa Pichia pastoris KM71H usando o vetor pPICZocA original. Clones positi-vos foram obtidos e verificados em um modo similar.

Exemplo 5: Expressão e secreção de tripsinogênio pancreáticoporcino, recombinante, variante.

Um conjunto de clones positivos (20-30) transformados com umvetor de expressão pPICZaA-pTrySer172Ala, cada um em 3 mL de meioBMGY (BMGY = meio complexo de glicerol tamponado; Invitrogen). Depoisdisso, os valores de OD6oonm das culturas foram determinados antes de se-rem passadas para frascos com agitação, cada contendo 10 mL de meioBMMY (Invitrogen), em pH 3. Pré-culturas foram usadas como inóculo pararesultar, cada uma, em OD6Oonm de 1. As culturas foram mantidas em umagitador, a 30°C. Em paralelo, clones de controle positivos foram cultivadossob as mesmas condições.

O meio BMMY (BMMY = meio complexo de metanol tamponado)compreende metanol (Mallinckrodt Baker B.V.), que é um indutor do promo-tor AOX-1 que controla a transcrição da seqüência de nucleotídeos que codi-fica o tripsinogênio pancreático porcino, recombinante, variante.

Amostras de 500 μL foram retiradas do frasco com agitação emintervalos de 24 horas, por um tempo total de 72 horas. Quando uma alíquo-ta de amostra foi removida, a cultura foi também alimentada com metanol a0,5%. As amostras do meio de crescimento de sobrenadante foram testadasquanto à atividade enzimática da tripsina.

Exemplo 6: Análise de expressão de tripsina pancreática porcinavariante

Das alíquotas de amostras obtidas conforme descrição no e-xemplo 5, inicialmente o OD6oo nm foi determinado. Subseqüentemente, ascélulas foram peletizadas por centrifugação e o sobrenadante foi guardado.A atividade da tripsina foi medida no sobrenadante não diluído, bem comoem uma diluição de 1:10.

Enquanto os clones de controle transformados com o vetorpPICZaA não levaram a nenhuma atividade de tripsina mensurável no meio,as cepas de Pichia transformadas com vetores de expressão pPICZaA-pTrySer172Ala mostraram atividade de tripsina devido à variante respectivade tripsina pancreática porcina, recombinante, secretada no meio de cresci-mento, isto é no meio de cultura. Portanto, poderia ser concluído que a ex-pressão de uma pré-proteína recombinante, que, nesse caso, compreende opeptídeo sinalizador fator-α de Saccharomyces cerevisiae permite a secre-ção de uma enzima ativa com atividade proteolítica.

exemplo 7: Aumento do rendimento de expressão por transfor-mação múltipla e concentração de Zeocin™ aumentada.

Os clones de levedura transformados com os vetores de expres-são pDNM derivados de pPICZaA e de pPICZA que mostraram que produ-zem as mais altas atividades de tripsina em meios de sobrenadante foramsubmetidos à eletroporação repetida usando o mesmo vetor de expressãocomo previamente. As condições para eletroporação foram como descritasno exemplo 4 com exceção de que as placas YPDS continham Zeocin™, emconcentrações aumentadas, ou seja, entre 1.000 e 2.000 μg/mL A concen-tração do antibiótico foi aumentada de modo a selecionar transformantestendo incorporados em seu genoma cópias múltiplas do respectivo vetor deexpressão. Clones de levedura com resistência aumentada ao antibióticoforam transferidos para placas com dextrose mínima, quadriculadas. Comojá descritas no exemplo 5, as pré-culturas foram feitas de clones de leveduraindividuais e a expressão foi medida por determinação da atividade enzimá-tica de tripsina secretada no meio de crescimento conforme descrição noexemplo 6. Clones individuais foram encontrados, os quais produziram umaquantidade aumentada da atividade da tripsina. Na média, a atividade detripsina medida no sobrenadante de cepas de Pichia transformadas repeti-damente com o respectivo vetor de expressão pPICZocA-pTry-Ser172Alaestava entre duas vezes e três vezes tão alta como em comparação com asrespectivas cepas de precursor que haviam passado por uma única trans-formação.

exemplo 8: Purificação da variante de tripsinogênio pancreáticoporcino de sobrenadante de cultura líquida e ativação para formar a variantede tripsina.

O caldo de fermentação, inteiro, foi diluído em uma razão decerca de 1:2 a 1:4 com tampão de acetato de amônio (5-20mM) contendocloreto de cálcio 5-30mM, pH 3,5. A variante de tripsinogênio foi purificadapor meio de cromatografia em leito expandido (McCornick (1993); EP 0 699687) usando um trocador de cátion (por exemplo, Streamline®SP, XL). Acromatografia foi efetuada sem separação prévia das células de levedura.Posterior purificação foi efetuada usando uma coluna de leito empacotada(por exemplo, SP-Sepharose® XL). Ativação autocatalítica foi iniciada por re-tamponamento do pH para 7-8 em presença de CaCI2 20mM. A ativação foiterminada trocando o pH de volta para a faixa de 2 a 4. A tripsina purificadafoi armazenada em pH 1,5-3, de modo a evitar autoproteólise.

exemplo 9: Ensaio para determinar a atividade da tripsina espe-cífica da tripsina pancreática porcina, recombinante, variante.

A atividade da tripsina foi determinada usando Chromozym TRY(Roche Diagnostics GmbH) em Tris IOOmM pH 8,0, CaCI2 20mM, a 25°C.Medição fotométrica foi efetuada em 405 nm. Para discriminar entre a espe-cificidade de substrato arginina versus lisina, Chromozym TH (contém argi-nina/Roche Diagnostics GmbH) e Chromozym PL (contém lisina/Roche Di-agnostics GmbH) foram usadas.

exemplo 10: Clivagem da pré-pró-insulina humanaTodos os experimentos foram conduzidos a 8°C e um valor depH de 8,3 (solução tamponada ou controlada por dosagem de NaOH) e fo-ram realizados nos 20 ml para a escala de 3,5 L. Em alguns experimentos, apré-pró-insulina foi também clivada usando tripsina porcina, recombinante,nativa, de modo a comparar, diretamente, ambas as enzimas.A solução de PPI foi preenchida em um vaso de reação comtermostato apropriado e a reação foi iniciada pela adição da preparação deenzima. Amostras foram retiradas depois de intervalos de tempo definidos; areação enzimática foi imediatamente interrompida por acidificação da solu-ção de amostra com uma solução 1N ou 2N de HCI. A concentração dosrespectivos produtos foi determinada por HPLC.

A TABELA 1 MOSTRA RESULTADOS EXEMPLARES DE UM EXPERI-MENTO

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Tabela 1: Resultado da reação de clivagem de pré-pré-insulina(insulina humana) usando tripsina porcina recombinante ativa e a variante detripsina S172A (iguais U/g de PPI usados).

Como pode ser visto da Tabela 1, o uso da variante de TripsinaS172A diminui a formação dos subprodutos indesejados, compostos des-Thre AO, e, conseqüentemente, aumenta a quantidade de Arg-insulinas (Arg-Ins) valiosas e o respectivo rendimento de clivagem.

A figura 5 mostra a conversão da pré-pró-insulina com tripsinaporcina recombinante nativa, a Figura 6 mostra a conversão de PPI com atripsina variante S172A.

exemplo 11: Clivagem da pré-pró-insulina glargina

As condições experimentais do exemplo 10 foram usadas. A pré-pró-insulina foi também clivada usando tripsina porcina, recombinante, nati-va, de modo a comparar diretamente ambas as enzimas.

MÉTODO HPLC: COMO DESCRITO

A Tabela 2 mostras resultados exemplares dos experimentosrealizados. Os valores apresentados marcam o ponto de formação máximado produto.<table>table see original document page 34</column></row><table>

Tabela 2: Resultados da reação de clivagem de pré-pré-insulina(Insulina glargina) usando a tripsina recombinante, nativa, e a varianteS172A (200 U/g de PPI usados).

Como pode ser visto da Tabela 2, o uso da variante de TripsinaS172A diminui a formação dos subprodutos indesejados, compostos des-Thre AO, e, conseqüentemente, aumenta a quantidade de insulina glargina.exemplo 2: Clivagem de pré-pró-insulina glulisinaAs condições experimentais do exemplo 10 foram usadas. A pré-pró-insulina foi também clivada usando tripsina porcina, recombinante, nativade modo a comparar diretamente ambas as enzimas. A tabela 3 mostra re-sultados exemplares dos experimentos. Os valores apresentados marcam oponto de formação máxima de produl tos.

<table>table see original document page 34</column></row><table>

Tabela 3: Resultados da reação de clivagem da pré-pré-insulina(insulina glulisina) usando tripsina recombinante nativa e a variante de Trip-sina S172A.

Como pode ser visto da Tabela 3, o uso da variante TripsinaS172A diminui a formação do composto AO indesejado e, conseqüentemen-te, aumenta a quantidade de insulina glulisina.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Sanofi-Aventis Deutschland GmbHHoffmann-La Roche AGRoche Diagnostics GmbH

<120> ciivagem de precursores de insulinas por uma variante de tripsina

<130> DE 2005/039G

<140> 0577086.6<141> 2005-09-14

<160> 11

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210 > 1<211> 223<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência madura:

Seqüência da Tripsina pancreática porcina selvagem sem opeptideo sinal e propeptídeo

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:<400> 1

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val1 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val35 40 45

Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe50 55 60

Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr65 70 75 80

Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr LeuTVsn Ser Arg Val Ala Thr Vail Ser Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala100 105 no

Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly115 120 125

Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met145 150 155 160

Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser180 185 190

Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn210 215 220

<210> 2<211> 687<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<22 3 > Descrição da Seqüência Artificial:

Seqüência que codifica a tripsina pancreática porcinasem o peptídeo sinal e a parte do propeptídeo que codificao local de clivagem da entetoguinase

<400> 2

gatgatgatg ataaaattgt tggtggttat acttgtgctg ctaattctat tccatatcaa 60

gtttctttaa attctggttc tcatttttgt ggtggttctt tgattaattc tcaatgggtt 120

gtttctgctg ctcattgtta caaatcaaga atccaagtta gattgggtga acataatatt 180

gatgttttgg aaggtaatga acaatttatt aatgctgcta aaattattac tcatccaaat 240

tttaatggta atactttgga taatgatatt atgttgatta aattgtcttc tccagctact 300

ttaaattcaa gagttgctac tgtttctttg ccaagatctt gtgctgctgc tggtactgaa 360

tgtttgattt ctggttgggg taatactaaa tcttctggtt cttcttatcc atctttgttg 420

caatgtttga aagctccagt tttgtctgat tcttcttgta aatcttctta cccaggtcaa 480attactggta atatgatttg tgttggtttt ttggaaggtg gtaaagattc ttgtcaaggt 540gattctggtg gtccagttgt ttgtaatggt caattgcaag gtattgtttc ttggggttat 600ggttgtgctc aaaaaaataa accaggtgtt tacactaaag tttgtaatta tgttaattgg 660attcaacaaa ctattgctgc taattag 687

<210> 3<211> 223<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial.

Seqüência de aminoácidos da tripsina pancreática porcina variante

<220>

<22i> Peptidéo<222> (1) .. (223)

<400> 3

Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val1 5 10 15

Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser20 25 30

Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val35 40 45

Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe50 55 60

Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr65 70 75 80

Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu85 90 95

Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala100 105 110

Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly115 120 125

Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser130 135 140

Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met145 150 155 160

Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ala Cys Gln Gly Asp165 170 175

Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser180 185 190

Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys195 200 205

Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn210 215 220

<210> 4<211> 687<212> DNA

<213=· Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:

Seqüência que codifica o tripsinogênio pancreático porcina variantesem o peptídeo sinal e a parte do proptídeo que codifica o localde clivagem de enteroquinase.

<400> 4

gatgatgatg ataaaattgtgtttctttaa attctggttcgtttctgctg ctcattgttagatgttttgg aaggtaatgatttaatggta atactttggattaaattcaa gagttgctactgtttgattt ctggttggggcaatgtttga aagctccagtattactggta atatgatttggattctggtg gtccagttgtggttgtgctc aaaaaaataaattcaacaaa ctattgctgc

tggtggttat acttgtgctgtcatttttgt ggtggttcttcaaatcaaga atccaagttaacaatttatt aatgctgctataatgatatt atgttgattatgtttctttg ccaagatctttaatactaaa tcttctggtttttgtctgat tcttcttgtatgttggtttt ttggaaggtgttgtaatggt caattgcaagaccaggtgtt tacactaaagtaattag

ctaattctat tccatatcaa 60tgattaattc tcaatgggtt 120gattgggtga acataatatt 180aaattattac tcatccaaat 240aattgtcttc tccagctact 300gtgctgctgc tggtactgaa 360cttcttatcc atctttgttg 420aatcttctta cccaggtcaa 480gtaaagatgc ttgtcaaggt 540gtattgtttc ttggggttat 600tttgtaatta tgttaattgg 660

687

<210? 5<211> 247<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência do aminoácido do pré-tripsinogênio porcina maduro.

<220>

<22i> Peptideo<222> (1)..(16)

<223> Seqüência de aminoácido do peptídeo sinal.<220>

<221> Peptídeo<222> (17)..(247)

<223> Seqüência de aminoácido tripsina porcina<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:

<300>

<400> 5

Ile Pro Asn Thr Phe Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ala Ala Val Ala1 5 10 15

Phe Pro Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala20 25 30

Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe35 40 45

Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His50 55 60

Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp65 70 75 80

Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr85 90 95

His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile100 105 110

Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val ser115 120 125

Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly130 135 140

Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln145 150 155 160

Cys Leu Lys AIa Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr165 170 175

Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Mec Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly180 185 190

Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn195 200 205

Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala C-In Lys210 215 220

Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile225 230 235 240

Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn245

<210> 6<211> 960<212> DNA

<213» Pichia pastoris<220>

<223> Seqüência de nucleotídeos do pré-tripsinogênio pancreático porcina variante<220>

<221> unsure<222> (1)..(267)

<223> Seqüência de nucleotídeo que codifica o peptídeo sinal<220>

<22l> unsure<222> (268) .. (960)

<223> Codificação do tripsinogênio pancreático porcina variante<400> 6

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaacá ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgaa ttcgatgatg atgataaaat tgttggtggt 300tatacttgtg ctgctaattctgtggtggtt ctttgattaaagaatccaag ttagattgggattaatgctg ctaaaattatattatgttga ttaaattgtcttgccaagat cttgtgctgcaaatcttctg gttcttcttagattcttctt gtaaatcttctttttggaag gtggtaaagaggtcaattgc aaggtattgtgtttacacta aagtttgtaa

tattccatat caagtttcttttctcaatgg gttgtttctgtgaacataat attgatgttttactcatcca aattttaatgCtctccagct actttaaatttgctggtact gaatgtttgatecatetttg ttgcaatgttttacccaggt caaattactgtgcttgtcaa ggtgattctgttcttggggt tatggttgtgttatgttaat tggattcaac

taaattctgg ttctcatttt 360ctgctcattg ttacaaatca 420tggaaggtaa tgaacaattt 4 80gtaatacttt ggataatgat 54 0caagagttgc tactgtttet 600tttctggttg gggtaatact 660tgaaagctcc agttttgtct 720gtaatatgat ttgtgttggt 780gtggtceagt tgtttgtaat 84 0ctcaaaaaaa taaaccaggt 900aaactattgc tgctaattaa 960

<210> 7

<211> 938

<212> DNA

<213> Pichia pastoris<220>

<223> Seqüência nucleotidica do promotor AOX1 de pichia pastoris

<400? 7 agatctaaea tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60gtccattetc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120tgcaaacgea ggaccteeae tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattceaa ttcettctat taggctacta 240aeaeeatgac tttattagcc tgtetatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300tttcegaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600ctctateget tctgaacccc ggtgcacctg tgecgaaaeg caaatgggga aacacccgct 660ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttee aagattctgg tgggaatact 720gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaaega 900caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaa 938

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificiallniciador 5' tripsina<400> 8

gctgaagctg aattcgatga tgatg

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:Iniciador 3'-tripsina

<4Õ0> 9

gtttttgttc tagactaatt agcagc

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:iniciador 5'-try-ser172Ala

<400> 10

ggtggtaaag atgcttgtca aggtg

<210> 11<211> 25

<212> DMÁ

<213 > Seqüência Artificial<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial:iniciador 3'-try-ser172Ala

<400> 11

caccttgaca ggcatcttta ccacc

Claims (19)

1. Uso da variante de tripsina porcina Ser172Ala em um proces-so de preparar insulina, um análogo ou um derivado de insulina.

2. Processo para a preparação de insulina, um análogo ou umderivado de insulina, em que(a) uma pré-pró-insulina, um análogo de pré-pró-insulina ou umderivado de pré-pró-insulina é clivado com tripsina porcina Ser172Ala,(b) os produtos de clivagem resultantes são separados e(aa) se um dos produtos de clivagem resultantes é um análogode insulina ou um derivado de insulina, esse análogo de insulina ou derivadode insulina é obtido, ou(cc) aqueles produtos de clivagem sendo precursores de insuli-na, um análogo de insulina ou um derivado de insulina são ainda processa-dos e a insulina, análogo de insulina ou derivado de insulina resultante de talposterior processamento é separado e obtido.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, em que a insulinaé insulina humana.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 2, em que o análogode insulina é selecionado de um grupo que compreende insulina humanaLysB28ProB29, insulina humana B28 Asp, insulina humana, na qual a prolinana posição B28 foi substituída por Asp, Lys, Leu, Val ou Ala e onde na posi-ção B29 Lys pode ser substituída por Pro; insulina humana AlaB26; insulinahumana des(B28-B30); insulina humana des(B27) e insulina humanades(B30).

5. Processo, de acordo com a reivindicação 2, em que o análogode insulina é insulina glulisina.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 2, em que o análogode insulina é insulina glargina.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 2, em que o deriva-do de insulina é selecionado de um grupo que compreende insulina humanaB29-N-miristoil-des(B30), insulina humana B29-N-palmitoil-des(B30), insulinahumana B29-N-miristoíla, insulina humana B29-N-palmitoíla, insulina humana B28-N-miristoil LysB28ProB29, insulina humana B28-N-palmitoil-LysB28ProB29, insulina humana B30-N-miristoil-ThrB29LysB3°, insulina humanaB30-N-palmitoil-ThrB29LysB3°, insulina humana B29-N-(N-palmitoil-Y-glutamil)-des(B30), insulina humana B29-N-(N-litocolil-Y-glutamil)-des(B30),insulina humana B29-N-(ü)-carboxieptadecanoil)-des(B30) e insulina humanaB29-N-(oo-carboxieptadecanoíla).

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2a 5 e 7, em que o posterior processamento daqueles produtos de clivagemsendo precursores de insulina, um análogo de insulina ou um derivado deinsulina compreende uma clivagem dos ditos produtos com Carboxipeptida-se B.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2a 8, em que a clivagem com tripsina porcina Ser172Ala é realizada em umvalor de pH na faixa de 7,5 a 9,5; uma temperatura entre 1°C e 30°C; e areação enzimática é interrompida por acidificação da amostra.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, em que a cliva-gem é realizada em um valor de pH de 8,3; uma temperatura entre 8 e 12°Ce a acidificação é ajustada por adição de solução 1N ou 2N de HCI.

11. Tripsina porcina Ser172Ala, caracterizada pela seqüênciaSEQ ID NO:3.

12. DNA que codifica a tripsina porcina Serl 72Ala.

13. DNA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelaseqüência SEQ ID NO:4.

14. DNA que codifica tripsinogênio porcino Ser172Ala.

15. DNA, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelaseqüência SEQ ID NO:6.

16. Vetor que compreende um DNA conforme definido em qual-quer uma das reivindicações 12, 13, 14 ou 15.

17. Método para produzir tripsina porcina Ser172A)a, compreen-dendo as etapas de:(a) proporcionar um vetor conforme definido na reivindicação 16,(b) transformar uma cepa hospedeira microbiana com o vetor;(c) cultivar a cepa hospedeira microbiana transformada em ummeio de crescimento que contém nutrientes, pelo que a cepa hospedeiramicrobiana expressa a tripsina porcina SER172Ala ou o Ser172Ala tripsino-gênio porcino,(d) no caso do produto de expressão de (c) ser Ser172Ala tripsi-nogênio porcino, conversão em tripsina porcina Ser172Ala madura, ee) purificar a tripsina porcina Ser172Ala da cepa hospedeira mi-crobiana e/ou do meio de crescimento.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que a cepahospedeira microbiana é uma cepa de levedura metilotrófica selecionada dogrupo que compreende as espécies de Hansenula, Pichia, Candida e Toru-lopsis.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que a cepahospedeira microbiana é selecionada de um grupo que compreende Pichiapastoris, Hansenula poiymorpha, Candida boidinii e Torulopsis glabrata.