BRPI0619325B1

BRPI0619325B1 - Uso de um fator de reprogramação, agente para a preparação de uma célula-tronco pluripotente induzida a partir de uma célula somática e métodos para preparar uma célula-tronco pluripotente induzida método e para preparar uma célula somática e uso de células-tronco pluripotentes induzidas

Info

Publication number: BRPI0619325B1
Application number: BRPI0619325-0A
Authority: BR
Inventors: Gail K. Donaldson; Andrew C. Eliot; Dennis Flint; Lori Ann Maggio-Hall; Vasantha Nagarajan
Original assignee: Butamax Advanced Biofuels Llc
Priority date: 2005-10-26
Filing date: 2006-10-25
Publication date: 2020-09-15
Also published as: EP1948814A2; CA2622026A1; US8283144B2; ZA200803755B; UA96928C2; BRPI0619325B8; US8951774B2; US20110112334A1; US20130183731A1; US20140030794A1; NZ566406A; US20160186186A1; US8945859B2; US7851188B2; US20110111472A1; US9506071B2; NZ593809A; US9297029B2; EP3301182B1; CA2622026C

Abstract

células hospedeiras microbianas recombinantes, métodos para produção de isobutanol e meio de fermentação que contém isobutanol. a presente invenção se refere a métodos para produção fermentativa de alcoóis de quatro carbonos. especificamente, butanol, preferencialmente isobutanol é produzido pelo crescimento fermentativo de uma bactéria recombinante que expressa uma via biossintética do isobutanol.

Description

[001] Este pedido reivindica prioridade sobre 35 U.S.C § 119 do Pedido Provisório Série N° 60/730290, depositado em 26 de outubro de 2005.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A invenção relaciona-se ao campo da microbiologia industrial e à produção de álcoois. Mais especificamente, o isobutanol é produzido via fermentação industrial de um microorganismo recombinante.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] O butanol é um químico industrial importante, útil como aditivo de combustível, como matéria prima na indústria de plástico, e na extração de tinta alimentícia na indústria de alimentos e aromatizantes. A cada ano, 10 a 12 bilhões de libras de butanol são produzidos por meios petroquímicos e a necessidade para este produto de consumo químico provavelmente irá aumentar.

[004] Métodos para a síntese química do isobutanol são conhecidos, tal como a síntese oxo, hidrogenação catalítica de monóxido de carbono (Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6a edição, 2003, Wiley-VCHVerlag GmbH and Co., Weinheim, Alemanha, Vol. 5 páginas 716- 719) e condensação Guerbet de metanol com n-propanol (Carlini et al., J. Mol. Catai. A:Chem. 220:215-220 (2004)). Estes processos utilizam como material inicial, derivados de petroquímicos, que geralmente são caros e não respeitam o meio ambiente. A produção de isobutanol a partir de matérias primas derivadas de plantas iria minimizar a emissão de gases de efeito estufa e representariam um avanço na técnica.

[005] O isobutanol é produzido biologicamente como um subproduto de fermentação da levedura. É um componente do “óleo fúsel”, que se forma como resultado do metabolismo incompleto de aminoácidos por este grupo de fungos. O isobutanol é especificamente produzido a partir do catabolismo da L-valina. Após a grupo amino da L-valina ser colhido como uma fonte de nitrogênio, o a-ceto-ácido resultante é descarboxilado e reduzido a isobutanol por enzimas da, assim chamada, via Ehrlich (Dickinson et al., J. Biol. Chem. 273(40):25752-25756 (1998)). A produção de óleo fúsel e/ou seus componentes, alcançada durante a fermentação de bebidas é tipicamente baixa. Por exemplo, a concentração de isobutanol produzido na fermentação da cerveja é relatada ser menor que 16 partes por milhão (Garcia et al., Process Biochemistry 29:303-309 (1994)). A adição de L-valina exógena na fermentação aumenta a produção de isobutanol, como descrito por Dickinson et al., acima, no qual é relatado que uma produção de isobutanol de 3 g/l é obtida pelo fornecimento de L-valina a uma concentração de 20 g/l na fermentação. No entanto, o uso de valina como uma matéria prima seria de custo proibitivo para produção de isobutanol em escala industrial. A biossíntese do isobutanol diretamente a partir de açúcares seria economicamente viável e iria representar um avanço na técnica. Não houve nenhum relato de um microorganismo recombinante projetado para produzir isobutanol.

[006] Existe então a necessidade de um processo de custo efetivo, ambientalmente responsável, para a produção do isobutanol como um produto único. A presente invenção dirige-se a esta necessidade pelo fornecimento de uma produção microbiana recombinante que expresse uma via biossintética do isobutanol.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[007] A invenção fornece um microorganismo recombinante que possui uma via biossintética do isobutanol engenheirada. O microorganismo engenheirado pode ser usado para produção comercial do isobutanol. Consequentemente, em uma realização a invenção fornece um hospedeiro microbiano recombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto, selecionado do grupo que consiste de: i) piruvato para acetolactato (etapa a da via) ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato (etapa b da via) iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para a-ceto-isovalerato (etapa c da via) iv) a-ceto-isovalerato para isobutiraldeído, (etapa d da via), e v) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via) em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana e que dita célula hospedeira microbiana produz isobutanol.

[008] Em outra realização, a invenção fornece uma célula hospedeira microbiana que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídio que catalisa um substrato para conversão em produto, selecionado do grupo que consiste de: i) piruvato para acetolactato, (etapa a da via) ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via) iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para a-ceto-isovalerato, (etapa c da via) iv) a-ceto-isovalerato para isobutiril-CoA, (etapa f da via) v) isobutiril-CoA para isobutiraldeído, (etapa g da via), e vi) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via) em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana e que dita célula hospedeira microbiana produz isobutanol.

[009] Em outra realização, a invenção fornece uma célula hospedeira microbiana que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo que catalisa um substrato para conversão em produto, selecionado do grupo que consiste de: i) piruvato para acetolactato, (etapa a da via) ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via) iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para a-ceto-isovalerato, (etapa c da via) iv) a-ceto-isovalerato para valina, (etapa h da via) v) valina para isobutilamina, (etapa i da via) vi) isobutilamina para isobutiraldeído, (etapa j da via), e vii) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via) em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana e que dita célula hospedeira microbiana produz isobutanol.

[010] Em outra realização, a invenção fornece um método para a produção de isobutanol que compreende: 1) fornecer uma célula hospedeira microbiana recombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídio que catalisa um substrato para conversão em produto, selecionado do grupo que consiste de: i) piruvato para acetolactato, (etapa a da via) ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via) iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para a-ceto-isovalerato (etapa c da via) iv) a-ceto-isovalerato para isobutiraldeído, (etapa d da via), e v) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via) em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana; e 2) contatar a célula hospedeira de (i) com um substrato de carbono fermentável em um meio de fermentação sob condições através das quais o isobutanol é produzido.

[011] Em outra realização, a invenção fornece um método para a produção de isobutanol que compreende: 1) fornecer uma célula hospedeira microbiana recombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídio que catalisa um substrato para conversão em produto, selecionado do grupo que consiste de: i) piruvato para acetolactato, (etapa a da via) ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via) iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para a-ceto-isovalerato (etapa c da via) iv) a-ceto-isovalerato para isobutiril-CoA, (etapa f da via) v) isobutiril-CoA para isobutiraldeído, (etapa g da via), e vi) isobutiraldeído para isobutanol; (etapa e da via) em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana; e 2) contatar a célula hospedeira de (i) com um substrato de carbono fermentável em um meio de fermentação sob condições através das quais o isobutanol é produzido.

[012] Em outra realização, a invenção fornece um método para a produção de isobutanol que compreende: 1) fornecer uma célula hospedeira microbiana recombinante que compreende pelo menos uma molécula de DNA que codifica um polipeptídio que catalisa um substrato para conversão em produto, selecionado do grupo que consiste de: i) piruvato para acetolactato, (etapa a da via) ii) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, (etapa b da via) iii) 2,3-dihidroxi-isovalerato para a-ceto-isovalerato (etapa c da via) iv) a-ceto-isovalerato para valina, (etapa h da via) v) valina para isobutilamiπa, (etapa i da via), e vi) isobutilamiπa para isobutiraldeido, (etapa j da via) e, vii) isobutiraldeido para isobutanol; (etapa e da via) em que pelo menos uma molécula de DNA é heteróloga para dita célula hospedeira microbiana; e 2) contatar a célula hospedeira de (i) com um substrato de carbono fermentável em um meio de fermentação sob condições através das quais o isobutanol é produzido.

[013] Em uma realização substituta, a invenção fornece um isobutanol limitando o meio de fermentação produzido pelos métodos da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[014] A invenção pode ser mais bem entendida a partir de descrições detalhadas, figuras, e descrição de sequências associadas, as quais formam uma parte deste pedido.

[015] A Figura 1 mostra quatro vias biossintéticas do isobutanol diferentes. As etapas marcadas “a”, “b”, “c”, “d”, “e”, “f”, “g”, “h”, “j” e “k” representam o substrato para conversão em produtos descritos abaixo.

[016] As sequência seguintes obedecem ao 37 C.F.R § 1.821- 1.825 (“Requirements for Patent Application Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules”) e estão em consonância com a World Intellectual Property Organization (WIPO) Standard St.25 (1998) e a sequência que lista exigências do EPO e PCT (normas 5.2 e 49.5 (a-bis), e a Seção 208 e Anexo C das Instruções Administrativas). Os símbolos e formatos usados para os dados de sequência de aminoácido e nucleotídeo cumprem as normas estabelecidas no 37 C.F.R. § 1.822. TABELA 1 RESUMO DOS GENES E NÚMEROS DE SEQ ID DAS PROTEÍNAS

[017] SEQ ID Nos: 11-38, 40-69, 72-75, 85-138, 144, 145, 147- 157, 159-176 são sequências de nucleotídeos de oligonucleotídeos de clonagem, seleção ou primers de sequenciamento usadas nos Exemplos descritos no presente.

[018] SEQ ID No:39 é a sequência de nucleotídeos do grupamento de gene cscBKA descrito no Exemplo 16.

[019] SEQ ID No:70 é a sequência de nucleotídeos do promotor glicose isomerase 1.6GI descrito no Exemplo 13.

[020] SEQ ID No:71 é a sequência de nucleotídeos do promotor 1.5GI descrito no Exemplo 13.

[021] SEQ ID No:76 é a sequência de nucleotídeos do promotor GPD descrito no Exemplo 17.

[022] SEQ ID No:77 é a sequência de nucleotídeos do terminador GYC1 descrito no Exemplo 17.

[023] SEQ ID No:79 é a sequência de nucleotídeos do promotor FBA descrito no Exemplo 17

[024] SEQ ID No:81 é a sequência de nucleotídeos do promotor ADH1 descrito no Exemplo 17.

[025] SEQ ID No:82 é a sequência de nucleotídeos do terminador ADH1 descrito no Exemplo 17.

[026] SEQ ID No:84 é a sequência de nucleotídeos do promotor GPM descrito no Exemplo 17.

[027] SEQ ID No: 139 é a sequência de aminoácidos de sacarose hidrolase (CscA).

[028] SEQ ID No: 140 é a sequência de aminoácidos de D- frutoquinase (CscK).

[029] SEQ ID No: 141 é a sequência de sacarose permease (CscB).

[030] SEQ ID No: 142 é a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pFP988DssPspac descrita no Exemplo 20.

[031] SEQ ID No: 143 é a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pFP988DssPgroE descrito no Exemplo 20.

[032] SEQ ID No: 146 é a sequência de nucleotídeos do fragmento do vetor pFP988Dss descrito no Exemplo 20.

[033] SEQ ID No: 177 é a sequência de nucleotídeos do vetor de integração descrito no exemplo 21.

[034] SEQ ID No:267 é a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pC194 descrito no Exemplo 21.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[035] A presente invenção relaciona-se aos métodos para a produção do isobutanol usando-se microorganismos recombinantes. A presente invenção vai de encontro com grandes necessidades comerciais e industriais. O butanol é um importante produto de consumo na indústria química com diversas aplicações, cujo potencial como combustível e aditivo de combustível é particularmente significante. Embora sendo somente um álcool com quatro carbonos, o butanol possui um conteúdo energético similar àquele da gasolina e pode ser misturado com qualquer combustível fóssil. O butanol é favorecido como combustível ou aditivo de combustível, já que produz somente CO2 e um pouco ou nada de SOx ou NOx, quando queimado no motor de combustão interna padrão. Além disso, 0 butanol é menos corrosivo que o etanol, e é o aditivo de combustível mais preferido até esta data.

[036] Além da sua utilidade como um biocombustível ou aditivo de combustível, o butanol tem o potencial de ir de encontro aos problemas de distribuição de hidrogênio na emergente indústria de células de combustível. As células de combustível hoje são importunadas pela preocupação com a segurança associada com o transporte e distribuição de hidrogênio. O butanol pode ser facilmente transformado para seu conteúdo de hidrogênio, e pode ser distribuído através das estações de gás existentes na pureza exigida, tanto para células de combustíveis como veículos.

[037] Finalmente, a presente invenção produz isobutanol a partir de fontes de carbono derivadas de plantas, evitando o impacto ambiental negativo associado com processos petroquímicos padrão para a produção do butanol.

[038] As seguintes definições e abreviações devem ser usadas para a interpretação das reivindicações e da especificação.

[039] O termo “invenção” ou “presente invenção”, como usado no presente, é um termo não limitante e não tem a intenção de se referir a qualquer realização individual da invenção particular, mas englobar todas as possíveis realizações como descritas na especificação e nas reivindicações.

[040] O termo “via biossintética do isobutanol” refere-se a vias enzimáticas para produzir isobutanol.

[041] Os termos “acetolactato sintase” e “acetolactato sintetase” são usados alternadamente no presente para se referir a uma enzima que catalisa a conversão de piruvato para acetolactato e CO2. Acetolactato sintases preferidas são conhecidas pelo número EC 2.2.1.6.9 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego). Estas enzimas estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não limitado a, sequência de aminoácidos de Bacillus subtilis (GenBank Nos: CAB15618 (SEQ ID No: 178), Z99122 (SEQ ID No: 78), NCBI (National Center for Biotechnology Information), sequência de nucleotídeo NCBI, respectivamente), Klebsiella pneumoniae (GenBank Nos: AAA25079 (SEQ ID NO:2), M73842 (SEQ ID NO:1), e Lactococcus lactis (GenBank Nos: AAA25161 (SEQ ID NQ:180), L16975 (SEQ ID NO:179)).

[042] Os termos “ácido acetohidroxi isomeroredutase” e “ácido acetohidroxi redutoisomerase” são usados de forma alternada no presente para se referir a uma enzima que catalisa a conversão de acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato usando-se NADPH (nicotinamida adenina polinucleotídeo fosfato reduzida). Ácido acetohidroxi isomeroredutases são conhecidas pelo número EC 1.1.1.8.6 e as sequências estão disponíveis a partir de um amplo arranjo de microorganismos, incluindo, mas não limitado a, Escherichia coli (GenBank Nos: NP_418222 (SEQ ID NO:4), NC_000913 (SEQ ID NO:3)), Saccharomyces cerevisiae (GenBank Nos: NPJ313459 (SEQ ID NO: 181), NC_001144 (SEQ ID NO: 80)), Methanococcus maripaludis (GenBank Nos: CAF30210 (SEQ ID NO: 183), BX957220 (SEQ ID NO: 182)), e Bacillus subtilis (GenBank Nos: CAB14789 (SEQ ID NO: 185), Z99118 (SEQ ID NO:184)).

[043] O termo “ácido acetohidroxi desidratase” refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de 2,3-dihidroxi-isovalerato para a-ceto- isovalerato. Ácido acetohidroxi desidratases preferidas são conhecidas pelo número EC 4.2.1.9. Estas enzimas estão disponíveis a partir de um amplo arranjo de microorganismos, incluindo, mas não limitado a, E. coli (GenBank Nos: YP-026248 (SEQ ID NO:6), NC_000913 (SEQ ID NO:5)), S. cerevisiae (GenBank Nos: NP_012550 (SEQ ID NO:186), NC_001142 (SEQ ID NO: 83)), M. maripaludis (GenBank Nos: CAF29874 (SEQ ID NO: 188), BX957219 (SEQ ID NO: 187)), e B. subtilis (GenBank Nos: CAB14105 (SEQ ID NO: 190), Z99115 (SEQ ID NO:189)).

[044] O termo “a-ceto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada" refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de a-ceto-isovalerato para isobutiraldeído e CO2. a-ceto-ácido descarboxilases de cadeia ramificada preferidas são conhecidas pelo número EC 4.1.1.72 e estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não limitado a, Lactococcus lactis (GenBank Nos: AAS49166 (SEQ ID NO: 193), AY548760 (SEQ ID NO: 192); CAG34226 (SEQ ID NO: 8), AJ746364 (SEQ ID NO: 192), Salmonella typhimurium (GenBank Nos: NP_461346 (SEQ ID NO:195), NC_003197 (SEQ ID NO:194)), e Clostridium acetobutylicum (GenBank Nos:NP_149189 (SEQ ID NO: 197), NC-001988 (SEQ ID NO: 196)).

[045] O termo “álcool desidrogenase de cadeia ramificada" refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de isobutiraldeído para isobutanol. Álcool desidrogenases de cadeia ramificada preferidas são conhecidas pelo número EC 1.1.1.265, mas podem ser classificadas como outras álcool desidrogenases (especificamente, EC 1.1.1.1 ou 1.1.1.2). Estas enzimas utilizam NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida) e/ou NADPH como doador de elétron e estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não limitado a, S. cerevisiae (GenBank Nos: NP_010656 (SEQ ID NO: 199), NC_001145 (SEQ ID NO: 200)), E.coli (GenBank Nos: NP_417484 (SEQ ID NO: 10), NC_000913 (SEQ ID NO:9)), e C. Acetobutylicum (Genbank Nos: NP-349892 (SEQ ID NQ:203), NC_003030 (SEQ ID NQ:202); NP-349891 (SEQ ID NO: 204), NC_003030 (SEQ ID NO:158)).

[046] O termo “ceto-ácido desidrogenase de cadeia ramificada" refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de a-ceto-isovalerato para isobutiril-CoA (isobutiral-coenzima A), usando-se NAD+ (nicotinamida adenina dinucleotídeo) como receptor de elétrons. Ácido ceto desidrogenases de cadeia ramificada preferidas são conhecidas pelo número EC 1.2.4.4. Estas ceto-ácido desidrogenases de cadeia ramificada são formadas por quatro subunidades e as sequências de todas as subunidades estão disponíveis a partir de um amplo arranjo de microorganismos, incluindo, mas não limitado a, B. subtilis (GenBank Nos: CAB14336 (SEQ ID NQ:206), Z99116 (SEQ ID NQ:205), CAB14335 (SEQ ID NQ:208), Z99116 (SEQ ID NQ:207), CAB14334 (SEQ ID NQ:210), Z99116 (SEQ ID NQ:209); e CAB14337 (SEQID NO:212), Z99116 (SEQ ID NO:211) e Pseudomonas putida (GenBank Nos: AAA65614 (SEQ ID NO:214), M57613 (SEQ ID NO:213); AAA65615 (SEQ ID NO:216), M57613 (SEQ ID NO:215); AAA65617 (SEQ ID NO:218), M57613 (SEQ ID NO:217); e AAA65618 (SEQ ID NQ:220), M57613 (SEQ ID NO:219)).

[047] O termo “aldeído desidrogenase acilaπte" refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de isobutiril-CoA para isobutiraldeido, que utiliza NADH e NADPH como doadores de elétrons. Aldeído desidrogenases acilantes preferidas são conhecidas pelos números EC 1.2.1.10 e 1.2.1.57. Estas enzimas estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não limitado a, Clostridium beijerinckii (GenBank Nos: AAD31841 (SEQ ID NO:222), AF157306 (SEQ ID NO:221)), C. acetobutylicum (GenBank Nos:NP_149325 (SEQ ID NO:224), NC_001988 (SEQ ID NO:223); NP_149199 (SEQ ID NO:226), NC_001988 (SEQ ID NO:225)), P. putida (GenBank Nos: AAA89106 (SEQ ID NO:228), U13232 (SEQ ID NO:227)), e Thermus thermophilus (GenBank Nos: YP_145486 (SEQ ID NQ:230), NC_006461 (SEQ ID NO:229)).

[048] O termo “transaminase" refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de a-ceto-isovalerato para L-valina, usando-se tanto alanina como glutamato como doadores de amina. Transaminases preferidas são conhecidas pelos números EC 2.6.1.42 e 2.6.1.66. Estas enzimas estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não limitado a, E.coli (GenBank Nos: YP_026231 (SEQ ID NO:232), NC_000913 (SEQ ID NO:231)), e Bacillus licheniformis (GenBank Nos:YP_093743 (SEQ ID NO:234), NC_006322 (SEQ ID NO:223)). Exemplos de fontes de enzimas dependentes de glutamato incluem, mas não estão limitadas a, E.coli (GenBank Nos: YP-026247 (SEQ ID NO:236), NC_000913 (SEQ ID NO:235)), S. cerevisiae (GenBank Nos:NP_012682 (SEQ ID NO:238), NC_001142 (SEQ ID NO:237)) e Methanobacterium thermoautotrophlcum (GenBank Nos: NP_276546 (SEQ ID NQ:240), NC-000916 (SEQ ID NO:239)).

[049] O termo “valina desidrogenase” refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de a-ceto-isovalerato para L-valina, usando-se NAD(P)H como doador de elétron e amónia como doador de amina. As valinas desidrogenases preferidas são conhecidas pelos números EC 1.4.1.8 e 1.4.1.9 e estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não limitado a, Streptomyces coelicolor (GenBank Nos: NP_628270 (SEQ ID No:242), NC-003888 (SEQ ID NO:241)), e B. subtilis (GenBank Nos:CAB14339 (SEQ ID NO:244), Z99116 (SEQ ID NO:243)).

[050] O termo “valina descarboxilase” refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de L-valina para isobutilamina e CO2. Valina descarboxilases preferidas são conhecidas pelos números EC 4.1.1.14. Estas enzimas são encontradas em Estreptomicetos, tais como, por exemplo, Streptomyces viridifaciens (GenBank Nos: AAN10242 (SEQ ID NO:246), AY116644 (SEQ ID NO:245)).

[051] O termo “ômega transaminase” refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de isobutilamina para isobutiraldeído usando-se um aminoácido adequado como doador de amina. Omega transaminases são conhecidas pelo número EC 2.6.1.18 e estão disponíveis a partir de diversas fontes, incluindo, mas não limitado a, Alcaligenes denitrificans (AAP92672 (SEQ ID NO: 248), AY330220 (SEQ ID NO:247), Ralstonia eutropha (GenBank Nos: YP-294474 (SEQ ID NO:250), NC_007347 (SEQ ID NO:249)), e Shewanella oneidensis (GenBank Nos: NP_719046 (SEQ ID NO: 252), NC-004347 (SEQ ID NO:251)), e P. putida (GenBank Nos: AAN66223 (SEQ ID NO: 254), AE016776 (SEQ ID NO:253)).

[052] O termo “isobutiril-CoA mutase” refere-se a uma enzima que catalisa a conversão de butiril-CoA para isobutiril-CoA. Esta enzima usa coenzima B12 como cofator. Isobutiril-CoA mutases são conhecidas pelo número EC 5.4.99.13. Estas enzimas são encontradas em diversos estreptomicetos, incluindo, mas não limitado a, Streptomyces cinnamonensis (GenBank Nos: AAC08713 (SEQ ID NO: 256), U67612 (SEQ ID NO:255), CAB59633 (SEQ ID NO:258), AJ246005 (SEQ ID NO:257)), S. coelicolor (GenBank Nos: CAB70645 (SEQ ID NQ:260), AL939123 (SEQ ID NO:259); CAB92663 (SEQ ID NO: 262), AL939121 (SEQ ID NO:261)), e Streptomyces avermitilis (GenBank Nos: NP_824008 (SEQ ID NO:264), NC_003155 (SEQ ID NO:263); NP_824637 (SEQ ID NO:266), NC_003155 (SEQ ID NO:265)).

[053] O termo “anaeróbico facultativo” refere-se a um microorganismo que pode crescer tanto em meios aeróbicos como anaeróbicos.

[054] O termo “substrato de carbono” ou “substrato de carbono fermentável” refere-se a uma fonte de carbono capaz de ser metabolizada pelos organismos hospedeiros da presente invenção e, particularmente, fontes selecionadas do grupo que consiste de monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos e substratos de carbono único ou misturas destes.

[055] O termo gene “refere-se” a um fragmento de ácido nucléico que é capaz de ser expresso como uma proteína específica, opcionalmente que incluem sequências reguladoras anteriores (sequências não codificadoras 5’) e posteriores (sequências não codificadoras 3’) da sequência codificadora. “Gene nativo” refere-se a um gene como é encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras. “Gene quimérico” refere-se a qualquer gene que não é nativo, que compreende sequências reguladoras e codificadoras que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências codificadoras que são derivadas de diferentes fontes, ou sequências reguladoras e sequências codificadoras derivadas da mesma fonte, mas organizadas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. “Gene endógeno” refere-se a um gene nativo em seu local natural no genoma de um organismo. Um gene “estranho” ou “heterólogo” refere-se a um gene não encontrado normalmente no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência de gene. Genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo, ou genes quiméricos. Um “transgene” é um gene que foi introduzido no genoma por um processo de transformação.

[056] Como usado no presente “sequência codificadora” refere- se a uma sequência de DNA que codifica uma sequência de aminoácido. “Sequências reguladoras adequadas” referem-se às sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências não codificadoras 5’), dentro, ou a jusante (sequências não codificadoras 3’) de uma sequência codificadora, e que influencia a transcrição, processo ou estabilidade do RNA, ou tradução da sequência codificadora associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências líder de tradução, introns, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítio de processo do RNA, sítio de ligação efetora e estrutura de loop derivada do loop.

[057] O termo “promotor” refere-se a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência codificadora ou funcional de RNA. Em geral, uma sequência codificadora está localizada 3’ de uma sequência promotora. Promotores podem ser totalmente derivados de um gene nativo, ou podem ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou até compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por esses técnicos no assunto que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos celulares, ou em diferentes estágios do desenvolvimento, ou em resposta a diferentes ambientes ou condições fisiológicas. Promotores que induzem um gene a se expressar na maioria dos tipos celulares são comumente denominados “promotores constitutivos”. É ainda reconhecido que, já que em muitos casos os limites exatos das sequências reguladoras não foram completamente definidos, os fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade idêntica à do promotor.

[058] O termo “operacionalmente ligado” refere-se à associação de sequências de ácido nucléico com um fragmento único de ácido nucléico. De forma que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora quando é capaz de influenciar a expressão desta sequência codificadora (isto é, que a sequência codificadora está sob o controle de transcrição do promotor). Sequências codificadoras podem estar operacionalmente ligadas às sequências reguladoras na orientação sense e antisense.

[059] O termo “expressão”, como usado no presente, refere-se à transcrição e acumulação estável do RNA sense (mRNA) ou antisense derivado de um fragmento de ácido nucléico da invenção. Expressão pode também se referir à tradução do mRNA em um polipeptídeo.

[060] Como usado no presente, o termo “transformação”, refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucléico para um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucléico transformados são denominados “transgênicos”, “recombinantes” ou organismos “transformados”.

[061] Os termos “plasmídeo”, “vetor” e “cassette" referem-se a um elemento extra-cromossômico que frequentemente carrega genes que não são parte do metabolismo central da célula, e usualmente na forma de moléculas de DNA circular dupla fita. Tais elementos podem ser sequências de replicação autônomas, sequências de integração de genoma, sequências de nucleotídeos ou de fago, linear ou circular, de DNA dupla fita ou simples ou RNA, derivadas de qualquer fonte, em que várias sequências de nucleotídeos foram recombinadas ou unidas em uma única construção capaz de introduzir um fragmento promotor e uma sequência de DNA em um produto do gene selecionado junto com a sequência não traduzida 3’ em uma célula. “Cassette de transformação” refere-se a um vetor específico que contém um gene estranho e que possui elementos além do gene estranho, que facilitam a transformação de uma célula hospedeira específica. “Expressão cassette" refere-se a um vetor específico que contém um gene estranho e possui elementos, além do gene estranho, que permitem aumentar a expressão desse gene em um hospedeiro estranho.

[062] Como usado no presente, o termo “degeneração de códon” refere-se à natureza do código genético que permite variação da sequência de nucleotídeo sem afetar a sequência de aminoácido de um polipeptídeo codificado. O técnico no assunto é bem consciente das “tendências dos códons” exibidas por uma célula hospedeira específica no uso dos nucleotídeos dos códons para especificar um dado aminoácido. Dessa forma, quando sintetizando um gene para melhorar a expressão em uma célula hospedeira, é desejável que se projete o gene de modo que sua frequência de uso do códon aproxime-se da frequência de uso do códon preferido da célula hospedeira.

[063] O termo “códon otimizado” refere-se a genes ou regiões codificadoras de moléculas de ácido nucléico para transformação de vários hospedeiros, refere-se à alteração dos códons no gene ou regiões codificadoras das moléculas de ácido nucléico para refletir o uso típico do códon do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo codificado pelo DNA.

[064] Técnicas padrão de DNA recombinante e técnicas de clonagem molecular usadas no presente são bem conhecidas na técnica e estão descritas por Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989) (a seguir “Maniatis”); e por Silhavy, T.J., Bennan, M.L. e Enquist, L.W., Experiments with Gene Fusions, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); e por Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc, e Wiley-lnterscience (1987).

VIAS BIOSSINTÉTICAS DO ISOBUTANOL

[001] Microorganismos que utilizam carboidratos empregam a via de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), e o ciclo pentose fosfato como central, rotas metabólicas para fornecer energia, e precursores celulares para o crescimento e manutenção. Estas vias têm em comum o intermediário gliceraldeído-3-fosfato e, basicamente, o piruvato é formado diretamente ou em combinação com a via EMP. Subsequentemente, o piruvato é transformado em acetil-coenzima A (acetil-CoA) por diversos meios. A acetil-CoA serve como uma chave intermediária, por exemplo, na geração de ácidos graxos, aminoácidos e metabólitos secundários. As reações combinadas de conversão de açúcar para piruvato que produz energia (por exemplo, adenosina-5’- trifosfato, ATP) e que reduzem equivalentes (por exemplo, nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida, NADH, e nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida, NADPH). NADH e NADPH devem ser reciclados para as suas formas oxidativas (NAD+ e NADP+, respectivamente). Na presença de aceptores de elétrons inorgânicos (por exemplo, O2, NOa- e SO<), a redução de equivalentes pode ser usada para aumentar o pool de energia; alternativamente, pode ser formado um subproduto de carbono reduzido.

[002] A invenção possibilita a produção de isobutanol a partir de fontes de carboidratos com microorganismos recombinantes pelo fornecimento de quatro vias de reação completas, como mostrado na Figura 1. Três das vias compreendem conversão de piruvato para isobutanol via uma série de etapas enzimáticas. A via do isobutanol preferida (Figura 1, etapas a até e), compreende as seguintes conversões de substrato para produto. a) piruvato para acetolactato, como catalisado, por exemplo, por acetolactato sintase, b) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, como catalisado, por exemplo, por ácido acetohidroxi isomeroredutase, c) 2,3-dihidroxi-isovalerato para a-ceto-isovalerato, como catalisado, por exemplo, por ácido acetohidroxi desidratase, d) α-ceto-isovalerato para isobutiraldeido, como catalisado, por exemplo, por ceto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada, e e) isobutiraldeido para isobutanol, como catalisado, por exemplo, por álcool desidrogenase de cadeia ramificada.

[003] Esta via combina enzimas conhecidas por estar envolvidas em vias bem caracterizadas para biossíntese da valina (piruvato para a- cetoisovalerato) e catabolismo da valina (a-cetoisovalerato para isobutanol). Visto que muitas enzimas biossintéticas da valina também catalisam reações análogas na via biossintética da isoleucina, a especificidade do substrato é a principal consideração na seleção de fontes de genes. Por esta razão, os genes de interesse primário para a enzima acetolactato sintase são aqueles de Bacillus (alsS) e Klebsiella (budB). Estas acetolactato sintases específicas são conhecidas por participar na fermentação do butanediol nestes organismos e mostram aumento de afinidade para piruvato superior ao cetobutirato (Gollop et al., J. Bacteriol. 172(6):3444-3449 (1990); Holtzclaw et al., J. Bacteriol. 121 (3):917-922 (1975)). As etapas da segunda e terceira via são catalisadas por ácido acetohidroxi redutoisomerase e desidratase, respectivamente. Estas enzimas foram caracterizadas a partir de uma variedade de fontes, tais como, por exemplo, E. coli (Chunduru et al., Biochemistry 28(2):486-493 (1989); Flint et al., J. Biol. Chem. 268(29): 14732-14742 (1993)). As duas etapas finais da via preferida do isobutanol são conhecidas por ocorrer em leveduras, que podem usar valina como uma fonte de nitrogênio e, no processo, secretar isobutanol. 0 α-ceto-isovalerato pode ser convertido para isobutiraldeído por uma variedade de enzimas ceto-ácido descarboxilase, tal como, por exemplo, piruvato descarboxilase. Para prevenir direção errada do piruvato para longe da produção do isobutanol, uma descarboxilase com afinidade diminuída para piruvato é desejável. Até agora existem duas tais enzimas conhecidas na técnica (Smit et al., Appl. Environ. Microbiol. 71 (1 ):303-311 (2005); de la Plaza et al., FEMS Microbiol. Lett. 238(2):367-374 (2004)). Ambas as enzimas são de linhagens de Lactococcus lactis e têm preferência 50 a 200 vezes superior para ceto-isovalerato do que para piruvato. Finalmente, uma variedade de aldeído redutases foi identificada em leveduras, muitas com sobreposição de especificidade de substrato. Aquelas conhecidas por preferir substratos de cadeia ramificada sobre acetaldeído incluem, mas não estão limitadas a álcool desidrogenase VI (ADH6) e Yprlp (Larroy et al., Biochem. J. 361 (PT 1 ):163- 172 (2002); Ford et al., Yeast 19(12): 1087-1096 (2002)), ambas utilizam NADPH como doador de elétron. Uma redutase dependente de NADPH, YqhD, ativa com substratos de cadeia ramificada foi também recentemente identificada em E. coli (Sulzenbacher et al., J. Mol. Biol. 342(2):489-502 (2004)).

[004] Outra via para conversão de piruvato para isobutanol compreende os seguintes substratos para conversões em produtos (Figura 1, etapas a, b, c, f, g, e): a) piruvato para acetolactato, como catalisado, por exemplo, por acetolactato sintase, b) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, como catalisado, por exemplo, por ácido acetohidroxi isomeroredutase, c) 2,3-dihidroxi-isovalerato para a-ceto-isovalerato, como catalisado, por exemplo, por ácido acetohidroxi desidratase, f) a-ceto-isovalerato para isobutiril-CoA, como catalisado, por exemplo, por ácido ceto desidrogenase de cadeia ramificada. g) isobutiril-CoA para isobutiraldeído, como catalisado, por exemplo, por acetaldeído desidrogenase, e e) isobutiraldeído para isobutanol, como catalisado, por exemplo, por um álcool desidrogenase de cadeia ramificada.

[005] As primeiras três etapas nesta via (a, b, c) são as mesmas daquelas descritas acima. A a-ceto-isovalerato é convertida para isobutiril-CoA pela ação de uma ceto-ácido desidrogenase de cadeia ramificada. Enquanto leveduras podem usar somente valina como fonte de nitrogênio, muitos outros organismos (tanto eucariontes como procariontes) podem também usar valina como fonte de carbono. Estes organismos possuem ceto-ácido desidrogenase de cadeia ramificada (Sokatch et al., J. Bacterial. 148(2):647-652 (1981)), que geram isobutiril-CoA. Isobutiril-CoA pode ser convertido em isobutiraldeído por aldeído desidrogenase acilante. Desidrogenases que atuam em substrato de cadeia ramificada foram descritas, mas não clonadas, em Leuconostoc e Propionibacterium (Kazahaya et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 18:43-55 (1972); Hosoi et al., J. Ferment. Technol. 57:418-427 (1979)). No entanto, também é possível que aldeído desidrogenases acilantes que funcionam em cadeia linear de acil-CoAs (isto é, butiril-CoA), possam também trabalhar com isobutiril-CoA. O isobutiraldeído é então convertido para isobutanol por uma álcool desidrogenase de cadeia ramificada, como descrito acima para a primeira via.

[006] Outra via para conversão de piruvato para isobutanol compreende os seguintes substratos para conversões em produtos (Figura 1, etapas a, b, c, h, i, j, e): a) piruvato para acetolactato, como catalisado, por exemplo, por acetolactato sintase, b) acetolactato para 2,3-dihidroxi-isovalerato, como catalisado, por exemplo, por ácido acetohidroxi isomeroredutase, c) 2,3-dihidroxi-isovalerato para α-ceto-isovalerato, como catalisado, por exemplo, por ácido acetohidroxi desidratase, h) a-ceto-isovalerato para valina, como catalisado, por exemplo, por valina desidrogenase ou transaminase, i) valina para isobutilamiπa, como catalisado, por exemplo, por valina descarboxilase, j) isobutilamiπa para isobutiraldeido, como catalisado, por exemplo, por ômega transaminase, e e) isobutiraldeido para isobutanol, como catalisado, por exemplo, por álcool desidrogenase de cadeia ramificada.

[007] As primeiras três etapas desta via (a, b, c) são as mesmas daquelas descritas acima. Esta via requer a adição de uma valina desidrogenase ou uma transaminase adequada. Valina (e/ou leucina) desidrogenase catalisa a aminação de redução e utiliza amónia; valores Kn para amónia estão em variação milimolar (Priestly et al., Biochem J. 261 (3):853-861 (1989); Vancura et al., J. Gen. Microbiol. 134(12):3213-3219 (1988) Zink et al., Arch. Biochem. Biophys. 99:72-77 (1962); Sekimoto et al., J. Biochem (Japan) 116(1): 176-182 (1994)). Transaminases tipicamente utilizam tanto glutamato como alanina, como doadores de amina e foram caracterizados a partir de diversos organismos (Lee-Peng et al., J. Bacteriol. 139(2):339-345 (1979); Berg et al., J. Bacteriol. 155(30; 1009-1014(1983)). Uma enzima específica para alanina pode ser desejável, desde que a geração de piruvato a partir desta etapa possa ser posteriormente acoplada ao consumo de piruvato na via quando o grupo amina for removido (veja abaixo). A próxima etapa é a descarboxilação da valina, uma reação que ocorre na biossíntese de valinimicina em Streptomyces (Garg et al., Mol. Microbiol. 46(2):505-517 (2002)). A isobultilamina resultante pode ser convertida para isobutiraldeido em uma reação dependente de piridoxal 5’-fosfato, por exemplo, por uma enzima da família aminotransferase. Tal enzima do Vibrio fluvialis demonstrou atividade com isobutilamina (Shin et al., Biotechnol. Bioeng. 65(2):206-211 (1999)). Outra aminotransferase de Alcaligenes denitrificans foi clonada e possui alguma atividade com butilamina (Yun et al., Appl. Environ. Microbiol. 70(4):2529-2534 (2004)). Nesta direção, estas enzimas usam piruvato como grupo aceptor de amina, produzindo alanina. Como mencionado acima, efeitos adversos no pool de piruvato podem ser compensados usando-se uma transaminase que produz piruvato no início da via. O isobutiraldeído é então convertido para isobutanol por álcool desidrogenase de cadeia ramificada, como descrito acima para a primeira via.

[008] A quarta via biossintética do isobutanol compreende o substrato para conversão em produto mostrado nas etapas k, g, e na Figura 1. Uma variedade de organismos é conhecida por produzir butirato e/ou butanol via um

[009] Intermediário butiril-CoA (Dürre et al., FEMS Microbiol. Ver. 17(3);251-262 (1995); Abbad-Andaloussi et al., Microbiology 142(5): 1149-1158 (1996)). A produção de isobutanol pode ser engenheirada nestes organismos pela adição de uma mutase capaz de converter butiril-CoA para isobutiril-CoA (Figura 1, etapa k). Os genes para ambas as subunidades de isobutiril-CoA mutase, uma enzima dependente de coenzima B12, foi clonada a partir de Estreptomiceto (Ratnatilleke et al., J.Biol. Chem. 274(44):31679-31685 (1999). O isobutiril-CoA é convertido para isobutiraldeído (etapa g na Figura 1), que é convertido para isobutanol (etapa e na Figura 1).

[010] Dessa forma, com o fornecimento de múltiplas vias recombinantes a partir de piruvato para isobutanol, existem várias escolhas para completar as etapas de conversão individuais, e 0 técnico no assunto será capaz de utilizar sequências publicamente disponíveis para construir as vias relevantes. Uma listagem de um número representativo de genes conhecidos na técnica e úteis na construção de vias sintéticas de isobutanol está listada abaixo na Tabela 2. TABELA 2 FONTES DE GENES DA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL Gene Citação GenBank

HOSPEDEIROS MICROBIANOS PARA PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL

[011] Hospedeiros microbianos para produção de isobutanol podem ser selecionados de bactérias, cianobactérias, fungos filamentosos e leveduras. O hospedeiro microbiano usado para produção de isobutanol é preferivelmente tolerante ao isobutanol, de forma que a produção não seja limitada pela toxicidade do isobutanol. Micróbios que são metabolicamente ativos a níveis de alta titulação de isobutanol não são bem conhecidos na técnica. Embora os mutantes tolerantes ao isobutanol tenham sido isolados a partir de Clostridia solventogênico, poucas informações relacionadas à tolerância ao butanol de outras linhagens de bactérias potencialmente úteis, estão disponíveis. A maioria dos estudos de comparação de tolerância ao álcool em bactérias sugere que o butanol é mais tóxico do que o etanol (de Carvalho et al., Microsc. Res. Tech. 64:215-22 (2004) e Kabelitz et al., FEMS Microbiol. Lett. 220:223-227 (2003)). Tomas et al. (J. Bacteriol. 186:2006-2018 (2004)) relatam que a produção de 1-butanol durante a fermentação em Clostridium acetobutylicum pode ser limitada pela toxicidade de 1-butanol. O efeito primário de 1-butanol em Clostridium acetobutylicum é a ruptura das funções da membrana (Hermann et al., Appl. Environ. Microbiol. 50:1238-1243 (1985)).

[012] Os hospedeiros microbianos selecionados para a produção de isobutanol são preferivelmente tolerantes ao isobutanol e devem ter a capacidade de converter carboidratos em isobutanol. O critério para seleção de hospedeiros microbianos adequados inclui o seguinte: tolerância intrínseca ao isobutanol, alta taxa de utilização de glicose, disponibilidade de ferramentas genéticas para manipulação gênica, e a habilidade para gerar alterações cromossômicas estáveis.

[013] Linhagens hospedeiras adequadas com tolerância para o isobutanol podem ser identificadas pela seleção baseada na tolerância intrínseca da linhagem. A tolerância intrínseca de micróbios para o isobutanol pode ser medida pela determinação da concentração de isobutanol que é responsável por 50% de inibição da taxa de crescimento (IC50) quando em crescimento em um meio mínimo. Os valores IC50 podem ser determinados usando-se métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os micróbios de interesse podem ser cultivados na presença de várias quantidades de isobutanol e a taxa de crescimento monitorada por medições de densidade ótica a 600 nanometres. A duplicação de tempo pode ser calculada a partir da parte logarítmica da curva de crescimento e usada como uma medida da taxa de crescimento. A concentração de isobutanol que produz 50% de inibição de crescimento pode ser determinada a partir de um gráfico da porcentagem de inibição do crescimento versus a concentração de isobutanol. Preferivelmente, a linhagem hospedeira deve ter um IC50 para isobutanol maior que aproximadamente 0,5%.

[014] O hospedeiro microbiano para produção de isobutanol deve também utilizar glicose a uma taxa alta. A maioria dos micróbios é capaz de utilizar carboidratos. No entanto, certos micróbios do meio ambiente não podem utilizar carboidratos com alta eficiência, e dessa forma, não seriam adequados como hospedeiros.

[015] A habilidade para modificação genética do hospedeiro é essencial para a produção de qualquer microorganismo recombinante. A forma de tecnologia de transferência de genes pode ser eletroporação, conjugação, transdução ou transformação natural. Uma ampla variedade de plasmídeos hospedeiros de conjugação e marcadores de resistência à droga está disponível. Os vetores de clonagem são confeccionados para os organismos hospedeiros baseados na natureza dos marcadores de resistência ao antibiótico que podem funcionar naquele hospedeiro.

[016] O hospedeiro microbiano deve também ser manipulado com o objetivo de inativar as vias competitivas para o fluxo de carbono pela deleção de vários genes. Isto requer a disponibilidade tanto de transposons para dirigir a inativação, como vetores de integração cromossômica. Além disso, a produção do hospedeiro deve ser facilmente influenciável para mutagênese química, de modo que as mutações que melhoram a tolerância intrínseca ao isobutanol possam ser obtidas.

[017] Baseados nos critérios descritos acima, hospedeiros microbianos adequados para a produção de isobutanol incluem, mas não estão limitados a, membros do gênero Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacilus, Anthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula e Saccharomyces. Hospedeiros preferidos incluem: Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Bacillus lincheniformis, Paenibacilus macerans, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterecoccos gallinarium, Enterecoccus faecalis, Bacillus subtilis e Saccharomyces cerevisiae.

CONSTRUÇÃO DE HOSPEDEIROS DE PRODUÇÃO

[018] Organismos recombinantes contendo os genes necessários que irão codificar as vias enzimáticas para a conversão de um substrato de carbono fermentável para isobutanol, podem ser construídos usando-se técnicas bem conhecidas. Na presente invenção, genes que codificam as enzimas de uma das vias biossintéticas do isobutanol da invenção, por exemplo, acetolactato sintase, ácido acetohidroxi isomeroredutase, ácido acetohidroxi desidratase, a-ceto-ácido descarboxilase, e álcool desidrogenase de cadeia ramificada, podem ser isolados de várias fontes, como descrito acima.

[019] Métodos de obtenção dos genes desejados a partir de um genoma de bactéria são bem conhecidos na técnica da Biologia Molecular. Por exemplo, se a sequência do gene é conhecida, bibliotecas genômicas podem ser criadas pela digestão da endonuclease de restrição e pode ser classificada com sondas complementares à sequência de gene desejada. Uma vez que a sequência é isolada, o DNA pode ser amplificado usando-se métodos padrão de amplificação dirigida ao primer, tal como reação em cadeia da polimerase (Patente US 4.683.202) para se obter quantidades adequadas de DNA para transformação usando-se vetores apropriados. Ferramentas para otimização do códon para expressão em um hospedeiro heterólogo estão facilmente disponíveis. Algumas ferramentas para otimização do códon estão disponíveis baseadas no conteúdo GC do organismo hospedeiro. O conteúdo GC de alguns hospedeiros microbianos exemplares é dado na Tabela 3. TABELA 3 CONTEÚDO GC DE HOSPEDEIROS MICROBIANOS

[020] Uma vez que os genes da via relevante são identificados e isolados, eles podem ser transformados em hospedeiros de expressão adequados por meios bem conhecidos na técnica. Vetores ou cassettes úteis para a transformação de uma variedade de células hospedeiras são comuns e comercialmente disponíveis por meio de empresas tais como EPICENTRE® (Madison, Wl), Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA), Stratagene (La Jolla, CA) e New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Tipicamente, o vetor ou cassette contém sequências que dirigem transcrição e tradução do gene relevante, um marcador selecionável, e sequências seguindo replicação autônoma ou integração cromossômica. Vetores adequados compreendem uma região 5’ do gene que ancora controles de iniciação da tradução. Ambas as regiões de controle podem ser derivadas de genes homólogos para a célula hospedeira transformada, embora se deva entender que tais regiões de controle podem ser também derivadas de genes que não são nativos para as espécies específicas escolhidas como hospedeiro de produção.

[021] Regiões de iniciação controle ou promotores, que são úteis para dirigir expressão de regiões codificadoras da via relevante na célula hospedeira desejada são numerosas e familiares para aqueles técnicos no assunto. Na prática, qualquer promotor capaz de dirigir estes elementos genéticos é adequado para a presente invenção, que inclui, mas não está limitado a, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, CUP1, FBA, GPD E GPM (úteis para expressão em Saccharomyces)', AOX1 (úteis para expressão em Pichia)', e lac, ara, tet, trp, IPL, IPR, T7, tac e trc (úteis para expressão em Escherichia coli, Alcaligenes e Pseudomonas)', os promotores amy, apr, npre vários promotores de fago úteis para expressão em Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis e Paenibacillus macerans; nisA (úteis para expressão em bactéria Gram-positiva, Eichenbaum et al., Appl. Environ. Microbiol. 64(8):2763-2769 (1998)); e o promotor sintético P11 (útil para expressão em Lactobacillus plantarum, Rud et al., Microbiology 152:1011 -1019 (2006)).

[022] Regiões de terminação controle podem também ser derivadas de vários genes nativos para os hospedeiros preferidos. Opcionalmente, um sítio de terminação pode não ser necessário, no entanto, é preferido que seja incluído.

[023] Certos vetores são capazes de replicação em uma ampla variedade de bactérias hospedeiras e podem ser transferidos por conjugação. A sequência completa e apontada de pRK404 e três vetores pRK437, pRK442 e PRK442(H) estão disponíveis. Estes derivados provaram ser ferrramentas valiosas para manipulação genética em bactérias Gram-negativas (Scott et al., Plasmid 50(1)74-79(2003)). Diversos plasmídeos derivados de lncP4 de variedade ampla de hospedeiros do plasmídeo RSF1010 estão também disponíveis com promotores que podem funcionar em uma ampla variedade de bactérias Gram-negativas. Os plasmídeos pAYC36 e pAYC37, têm promotores ativos junto com sítios múltiplos de clonagem para permitir a expressão de gene heterólogo em bactéria Gram-negativa.

[024] Ferramentas de reposição de gene cromossômico estão também amplamente disponíveis. Por exemplo, um variante termosensível do réplicon de variedade ampla de hospedeiro pWV101 foi modificado para construir um plasmídeo pVE6002 que pode ser usado para efetuar reposição de gene em uma variedade de bactéria Gram-positiva (Maguin et al., J. Bacteriol. 147(17):5633-5638 (1992)). Adicionalmente, transpossomos in vitro estão disponíveis para criar mutações randomicas em uma variedade de genomas por meio de fontes comerciais tal como EPICENTRE®.

[025] A expressão de uma via biossintética do isobutanol em vários hospedeiros microbianos preferidos está descrita em maiores detalhes abaixo.

EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM E. COLI

[026] Vetores e cassettes úteis para a transformação de E.coli são comuns e estão comercialmente disponíveis por meio de empresas listadas acima. Por exemplo, os genes de uma via biossintética do isobutanol podem ser isolados a partir de várias fontes, clonados em um vetor pUC19 modificado e transformado no interior de E. coli NM522, como descrito nos Exemplos 6 e 7.

EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS

[027] Uma série de vetores do tipo ponte de E.coli-Rhodococcus estão disponíveis para expressão em R. erythropolis, incluindo mas não limitados a, pRHBR17 e pDA71 (Kostichka et al., Appl. Microbio. Biotechnol. 62:61-68 (2003)). Adicionalmente, uma série de promotores está disponível para expressão de gene heterólogo em R. erythropolis (ver, por exemplo, Nakashima et al., Appl. Environ. Microbiol. 70:5557-5568 92004), e Tao et al., Appl. Microbiol. Biotechnol 2005, DOI 10.1007/s00253-005-0064). O rompimento do gene atingido dos genes cromossômicos em R. erythropolis pode ser criado usando-se o método descrito por Tao et al., acima, e Brans et al., (Appl. Environ. Microbiol. 66;2029-2036 (2000)).

[028] Os genes heterólogos requeridos para a produção do isobutanol, como descrito acima, podem ser clonados inicialmente em pDA71 ou pRhBR71 e transformados no interior de E.coli. Os vetores podem então ser transformados em R. erythropolis por eletroporação, como descrito por Kostichka et al., acima. Os recombinantes podem ser cultivados em meio sintético contendo glicose e a produção do isobutanol pode ser seguida usando-se métodos conhecidos na técnica.

EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM B. SUBTILIS

[029] Métodos para expressão gênica e criação de mutações em B. subtilis são também bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os genes de uma via biossintética do isobutanol podem ser isolados de várias fontes, clonados no interior de um vetor pUC19 modificado e transformados no interior de Bacillus subtilis BE1010, como descrito no Exemplo 8. Adicionalmente, os cinco genes de uma via biossintética do isobutanol podem ser divididos no interior de dois operons para expressão, como descrito no Exemplo 20. Os três genes da via (bubB, ilvD e kivD) foram integrados no interior de cromossomos de Bacillus subtilis BE1010 (Payne e Jackson, J.Bacterid. 173:2278-2282 (1991)). Os dois genes remanescentes (ilvC e bdhB) foram clonados em um vetor de expressão e transformados dentro de linhagem da Bacillus que transmite genes do isobutanol integrados.

EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM B. LICHENIFORMIS

[030] A maioria dos plasmídeos e vetores tipo ponte que replicam em B. subtilis podem ser usados para transformar B. licheniformis, tanto por transformação protoplástica como por eletroporação. Os genes necessários para a produção do isobutanol podem ser clonados em plasmídeos derivados pBE20 ou pBE60 (Nagarajan et al., Gene 114;121-126 (1992)). Métodos para transformar B. licheniformis são bem conhecidos na técnica (por exemplo, ver Fleming et al, Appl. Environ. Microbiol., 61 (11 ):3775- 3780 91995)). Os plasmídeos construídos para expressão em B. subtilis podem ser transformados no interior de B. licheniformis para produzir um hospedeiro microbiano que produz isobutanol.

EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM PAENIBACILLUS MACERANS

[031] Plasmídeos podem ser construídos como descrito acima para expressão em B. subtilis e usados para transformar Paenibacillus macerans por transformação protoplástica para produzir um hospedeiro microbiano recombinante que produz isobutanol.

EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM ALCALIGENES (RALSTONIA) EUTROPHUS

[032] Métodos para expressão gênica e criação de mutações em Alcaligenes eutrophus são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Taghavi et al., Appl. Environ. Microbiol., 60(10):3585-3591 (1994)). Os genes para a via biossintética do isobutanol podem ser clonados em qualquer um de uma ampla variedade de vetores, e eletroporados para gerar recombinantes que produzem isobutanol. A via do poli(hidroxibutirato) em Alcaligenes foi descrita em detalhes, uma variedade de técnicas genéticas para modificar o genoma de Alcaligenes eutrophus é conhecida, e essas ferramentas podem ser aplicadas para engenheirar uma via biossintética do isobutanol.

EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM PSEUDOMONAS PUTIDA

[033] Métodos para expressão gênica em Pseudomonas putida são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ben-Basset et al., Patente US 6.586.229, que é incorporada ao presente como referência). Os genes para a via biossintética do isobutanol podem ser inseridos no interior de pPCU18 e este DNA ligado pode ser eletroporado em células eletrocompetentes de Pseudomonas putida DOT-T1 C5aAR1 para gerar recombinantes que produzem isobutanol.

EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM SACCHAROMYCES CEREVISIAE

[034] Métodos para expressão gênica em Saccharomyces cerevisiae são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Methods in Enzymology, Volume 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (part A, 2004, Christine Guthrie and Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA). A expressão gênica em levedura tipicamente requer um promotor, seguido pelo gene de interesse, e um terminador transcricional. Uma variedade de promotores de levedura pode ser usada na construção de cassettes de expressão para genes que codificam uma via biossintética do isobutanol, incluindo, mas não limitado a promotores constitutivos FBA, GPD, ADH1 e GPM, e promotores induzíveis GAL1, GAL10 e CUP1. Por exemplo, promotores adequados, terminadores transcricionais e os genes de uma via biossintética do isobutanol podem ser clonados no interior de vetores tipo ponte de E. co//-leveduras, como descrito no Exemplo 17.

EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM LACTOBACILLUS PLANTARUM

[035] O gênero Lactobacillus pertence à família Lactobacillales e muitos plasmídeos e vetores usados na transformação de Bacillus subtilis e Streptococcus podem ser usados para Lactobacillus. Exemplos não limitantes de vetores adequados incluem pAMβl e derivados deste (Renault et al., Gene 183;175-182 (1996); e O’Sullivan et al., Gene 137:227-231 (1993)); pMBB1 e pHW800, um derivado de pMBB1 (Wyckoff et al., Appl. Environ. Microbiol. 62:1481-1486 (1996)); pMG1, um plasmídeo conjugado (Tanimoto et al., J. Bacteriol. 184:5800-5804 (2002)); pNZ9520 (Kleerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:4581-4584 (1997)); pAM401 (Fujimoto et al., Appl. Environ. Microbiol. 67:1262-1267 (2001)); e pAT392 (Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38:1899-1903 (1994)). Diversos plasmídeos de Lactobacillus plantarum forma também reportados (por exemplo, van Kranenburg R, Golic N, Bongers R, Leer RJ, de Vos WM, Siezen RJ, Kleerebezem M. Appl. Environ. Microbiol. 2005 Mar; 71(3): 1223-1230). Por exemplo, a expressão de uma via biossintética do isobutanol em Lactobacillus plantarum está descrita no Exemplo 21.

EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM ENTEROCOCCUS FAECIUM, ENTEROCOCCUS GALLINARIUM E ENTEROCOCCUS FAECALIS

[036] O gênero Enterococcus pertence à família Lactobacillales e muitos plasmídeos e vetores usados na transformação de Lactobacillus, Bacillus subtilis e Streptococcus podem ser usados para Enterococcus. Exemplos não limitantes de vetores adequados incluem pAMβl e derivados deste (Renault et al., Gene 183; 175-182 (1996); e O’Sullivan et al., Gene 137:227-231 (1993)); pMBB1 e pHW800, um derivado de pMBB1, um plasmídeo conjugado (Tanimoto et al., J. Bacteriol. 184:5800-5804 (2002)); pNZ9520 (Kleerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:4581-4584 (1997)); pAM401 (Fujimoto et al., Appl. Environ. Microbiol. 67:1262-1267 (2001)); e pAT392 (Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38:1899-1903 (1994)). A expressão de vetores para E. faecalis que usam o gene nisA de Lactococcus pode também ser usado (Eichenbaum et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:2763- 2769 (1998). Adicionalmente, vetores para reposição de gene no cromossomo E. faecium podem ser usados (Nallaapareddy et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:334-345 (2006)). Por exemplo, a expressão de uma via biossintética do isobutanol em Enterococcus faecalis está descrita no Exemplo 22.

MEIO DE FERMENTAÇÃO

[037] O meio de fermentação na presente invenção contém substratos de carbono adequados. Substratos de carbono adequados podem incluir, mas não estão limitados a, monossacarídeos, tais como glicose e frutose; oligossacarídeos, tais como lactose e sacarose; polissacarídeos, tais como amido ou celulose, ou misturas destes e misturas não purificadas de matérias primas renováveis, tal como soro de queijo saturado, água de maceração de milho, melaço de cana-de-açúcar e malte de cevada. Adicionalmente, o substrato de carbono pode também ser substrato de um carbono, tal como dióxido de carbono ou metanol, para os quais a conversão metabólica em intermediários bioquímicos chave foi demonstrada. Além disso, para substratos de um e dois carbonos, organismos metilotróficos são conhecidos por utilizar uma variedade de outros carbonos contendo compostos tais como metilamina, glicosamina e uma variedade de aminoácidos para atividade metabólica. Por exemplo, leveduras metilotróficas são conhecidas por utilizar o carbono a partir de metilamina para formar trealose ou glicerol (Bellion et al., Microb. Growth C1 Compd., [Int. Symp.], 7a (1993), 415-32. Editores: Murrell, J. Colli; Kelly, Don P.Publisher: Intercept, Andover, UK). De maneira similar, diversas espécies de Candida irão metabolizar alanina ou ácido oléico (Suiter et al., Arch. Microbiol. 153:485-489 (1990)). Então é contemplado que a fonte de carbono utilizada na presente invenção pode englobar uma ampla variedade de substratos contendo carbono e somente será limitada pela escolha do organismo.

[038] Embora esteja contemplado que todos os substratos de carbono mencionados acima e misturas destes sejam adequados na presente invenção, substratos de carbono preferidos são glicose, frutose e sacarose.

[039] Além disso, para uma fonte de carbono apropriada, o meio de fermentação deve conter minerais adequados, sais, cofatores, tampões e outros componentes, conhecidos por aqueles técnicos no assunto, adequados para o crescimento de culturas e promoção da via enzimática necessária para a produção do isobutanol.

CONDIÇÕES DE CULTURA

[040] Tipicamente células são cultivadas em temperaturas na faixa de 25°C a aproximadamente 40°C em meio apropriado. Meios de cultura adequados na presente invenção são meios comuns comercialmente, preparados como caldo Luria Bertani (LB), caldo Sabouraud Dextrose (SD) ou caldo de meio de levedura (YM). Outros meios de cultura definidos ou sintéticos podem também ser usados, e o meio apropriado para cultura de um microorganismo específico será bem conhecido para aquele técnico no assunto da ciência de microbiologia e fermentação. O uso de agentes conhecidos para modular repressão catabólica diretamente ou indiretamente, por exemplo, adenosina cíclica 2':3'-monofosfato, pode também ser incorporado no meio de reação.

[041] Variações de pH adequadas para a fermentação estão entre pH 5,0 a pH 9,0, onde pH 6,0 a pH 8,0 é preferido como uma condição inicial.

[042] Fermentações podem ser realizadas sob condições aeróbicas ou anaeróbicas, onde condição anaeróbica ou microaeróbica são preferidas

[043] A quantidade de isobutanol produzida no meio de fermentação pode ser determinada usando-se uma variedade de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou cromatografia gasosa (GC).

FERMENTAÇÃO INDUSTRIAL EM BATELADA E CONTÍNUA

[044] O presente processo emprega um método de fermentação em batelada. A fermentação em batelada clássica é um sistema fechado onde a composição do meio é estabelecida no início da fermentação e não está sujeita a alterações artificiais durante a fermentação. Dessa forma, no início da fermentação, o meio é inoculado com o microorganismo ou microorganismos desejados e permite-se que a fermentação ocorra sem que se adicione nada ao sistema. Tipicamente, no entanto, a fermentação em “batelada” é de batelada relativa à adição de fonte de carbono, e tenta ser produzida frequentemente com fatores de controle, tais como pH e concentração de oxigênio. Nos sistemas em batelada, o metabólito e composições da biomassa do sistema mudam constantemente até que o período de fermentação seja interrompido. Dentro das culturas em batelada, as células variam de uma fase estática lag e uma fase de crescimento log e finalmente para uma fase estacionária onde a taxa de crescimento é diminuída ou parada. Se não tratadas, as células na fase estacionária irão eventualmente morrer. As células na fase log geralmente são responsáveis pelo volume de produção do produto final ou intermediário.

[045] Uma variação no sistema de batelada padrão é o sistema em batelada alimentada. Os processos de fermentação em batelada alimentada são também adequados na presente invenção e compreendem um sistema em batelada típico, com exceção de que o substrato é adicionado em incrementos à medida que a fermentação progride. Os sistemas em batelada alimentada são úteis quando a repressão catabólica é capaz de inibir o metabolismo das células e onde é desejável ter quantidades limitadas de substrato no meio. Medições da concentração de substrato atual nos sistemas em batelada alimentada são difíceis, então é estimado com base nas mudanças de fatores mensuráveis como pH, oxigênio dissolvido e a pressão parcial de perda de gases, tal como CO2. Fermentações em batelada e em batelada alimentada são comuns e bem conhecidas na técnica e os exemplos podem ser encontrados em D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edição (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, ou Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227, (1992), incorporado ao presente como referência.

[046] Embora a presente invenção seja realizada em batelada, é contemplado que o método seria adaptável para métodos de fermentação contínua. A fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um bioreator e uma quantidade igual de meio condicionado é removido simultaneamente para processamento. A fermentação contínua geralmente mantém as culturas em uma densidade alta constante onde as células estão principalmente na fase log de crescimento.

[047] A fermentação contínua permite a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam o crescimento celular ou a concentração do produto final. Por exemplo, um método irá manter um nutriente limitante tal como o nível da fonte de carbono ou nitrogênio em uma taxa fixa e permite todos os outros parâmetros regularem. Em outros sistemas, uma série de fatores que afetam o crescimento pode ser continuamente alterada enquanto a concentração celular, medida pela turbidez do meio, é mantida constante. Os sistemas contínuos tentam manter condições de crescimento em estado uniforme, e então a perda celular devido ao meio ser esgotado deve ser equilibrada em relação à taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos que modulam nutrientes e fatores de crescimento para os processos de fermentação contínua, assim como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto são bem conhecidas na técnica de microbiologia industrial, e uma variedade de métodos é detalhada por Brock, acima.

[048] É contemplado que a presente invenção pode ser praticada usando-se processos de batelada, batelada alimentada ou contínua e que qualquer forma de fermentação seria adequada. Adicionalmente, é contemplado que as células podem ser imobilizadas em um substrato como catalisador celular completo e sujeitas a condições de fermentação para produção do isobutanol.

MÉTODOS PARA ISOLAMENTO DO ISOBUTANOL DO MEIO DE FERMENTAÇÃO

[049] O isobutanol bioproduzido pode ser isolado do meio de fermentação usando-se métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os sólidos podem ser removidos do meio de fermentação por centrifugação, filtração, decantação ou similares. Então, o isobutanol pode ser isolado do meio de fermentação que foi tratado para remover sólidos como descritos acima, usando-se métodos tais como destilação, extração líquido-líquido, ou separação baseada em membrana. Devido ao isobutanol ter um ponto de ebulição baixo, mistura azeotrópica com água, a destilação pode somente ser usada para separar a mistura acima de sua composição azeotrópica. A destilação pode ser usada em combinação com outros métodos de separação para obter separação do azeótropo. Métodos que podem ser usados em combinação com a destilação para isolar e purificar o isobutanol, incluem mas não estão limitados a, decantação, extração líquido-líquido, adsorção e técnicas baseadas em membrana. Adicionalmente, o isobutanol pode ser isolado usando-se destilação azeotrópica com utilização de um transmissor (ver, por exemplo, Doherty e Malone, Conceptual Design of Distillation Systems, McGrawHill, Nova York, 2001).

[050] A mistura de isobutanol-água forma um azeótropo de forma que a destilação pode ser usada em combinação com a decantação para isolar e purificar o isobutanol. Neste método, o isobutanol que contém caldo de fermentação é destilado para próximo da composição azeotrópica. Então, a mistura azeotrópica é condensada, e o isobutanol é separado do meio de fermentação por decantação. A fase de decantação aquosa pode ser devolvida para a primeira coluna de destilação como refluxo. A fase orgânica decantada rica em isobutanol pode ser também purificada por destilação em uma segunda coluna de destilação.

[051] O isobutanol pode também ser isolado do meio de fermentação usando-se extração líquido-líquido em combinação com a destilação. Neste método, o isobutanol é extraído do caldo de fermentação usando-se extração líquido-líquido com um solvente adequado. A fase orgânica contendo isobutanol é então destilada para separar o isobutanol do solvente.

[052] A destilação em combinação com a adsorção pode ser também usada para isolar o isobutanol do meio de fermentação. Neste método, o caldo de fermentação contendo o isobutanol é destilado para próximo da composição azeotrópica e então a água remanescente é removida pelo uso de um adsorvente, tal como coador molecular (Aden et al., Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover, Relatório NREL/TP-510-32438, National Renewable Energy Laboratory, June 2002).

[053] Adicionalmente, a destilação em combinação com a pervaporação pode ser usada para isolar e purificar o isobutanol do meio de fermentação. Neste método, o caldo de fermentação contendo o isobutanol é destilado para próximo da composição azeotrópica e então a água remanescente é removida por pervaporação através de uma membrana hidrofílica (Guo et al., J. Membr. Sei. 245, 199-210 (2004)).

EXEMPLOS

[054] A presente invenção é também definida nos seguintes Exemplos. Deve ser entendido que estes Exemplos, enquanto indicando realizações preferidas da invenção, são fornecidos somente a título ilustrativo. A partir das discussões acima e destes Exemplos, um técnico no assunto pode averiguar as características essenciais desta invenção, e sem se afastar do espírito e escopo desta, pode fazer várias mudanças e modificações da invenção para adaptá-la para vários usos e condições.

MÉTODOS GERAIS

[055] Técnicas de DNA recombinante e de clonagem molecular usadas nos Exemplos são bem conhecidas na técnica e estão descritas por Sambrook, J. Fristsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY (1989) (Maniatis) e por T.J. Silhavy, M. L. Bennan, e L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY (1984) e por Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. por Greene Publishing Assoc, e Wiley-lnterscience (1987).

[056] Materiais e métodos adequados para a manutenção e crescimento de culturas de bactérias são bem conhecidos na técnica. Técnicas adequadas para uso nos seguintes exemplos podem ser encontradas no Manual of Methods for General Bacteriology (Phillip Gerhardt, R.G.E. Muray, Ralph N. Costlow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg e G. Briggs Phillips, eds), American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994) ou Thomas D. Brock em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edição (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. Todos os reagentes e materiais usados para o crescimento e manutenção de células baterianas foram obtidos de Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wl), BD Diagnostic Systems (Sparks, MD), Life Technologies (Rockville, MD) ou Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a menos que especificado de outra forma.

[057] Linhagens microbianas forma obtidas da Coleção Americana de Tipos de Culturas (ATCC), Manassas, VA, a menos que apontado de outra forma.

[058] Os primers de oligonucleotídeos para uso nos Exemplos seguintes são fornecidos na tabela 4. Todos os primers de oligonucleotídeos são sintetizados por Sigma-Genosys (Woodlands, TX). TABELA 4 CLONAGEM DE OLIGONUCLEOTÍDEOS, SELEÇÃO E PRIMERS DE SEQUENCIAMENTO

MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE ISOBUTANOL NO MEIO DE CULTURA

[059] A concentração de isobutanol no meio de cultura pode ser determinada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o método específico de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) utilizou uma coluna uma coluna Shodex SH-1011 com uma coluna de controle Shodex SH-G, ambas adquiridas da Waters Corporation (Milford, MA), com detecção de índice de refração (RI). A separação cromatográfica foi alcançada usando-se 0,01 M de H2SO4 como fase móvel em uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e uma temperatura de coluna de 50°C. O isobutanol teve um tempo de retenção de 46,6 min sob condições usadas. Alternativamente, os métodos de cromatografia gasosa (GC) estão disponíveis. Por exemplo, um método GC específico utilizou uma coluna HP-INNOWax (30 m x 0,53 mm id, filme de 1 pm de densidade, Agilent Technologies, Wilmington, DE), com um detector por ionização em chama (FID). O gás veículo foi o hélio a uma taxa de fluxo de 4,5 mL/min, medido a 150°C com pressão de descarga constante, a fenda do injetor era 1:25 a 200°C, temperatura do forno era de 45°C por 1 min, 45 a 220°C a 10°C/min, e 220°C por 15 min; e a detecção FID foi empregada a 240°C com 26 mL/min de conjunto de gás hélio. O tempo de retenção do isobutanol foi de 4,5 min.

[060] O significado das abreviações é como segue: “see” significa segundo(s), “min” significa minuto(s), “h” significa hora(s), “psi” significa libras por polegada quadrada, “nm” significa nanômetro, “d” significa dia(s), “pL” significa microlitro(s), “mL” significa mililitro(s), “L” significa litro(s), “mm” significa milímetros, “nm” significa nanômetros, “nM” significa milimolar, “pM” significa micromolar, “M” significa molar, “mmol” significa milimol(es), “pmol” significa micromol(es), “g” significa grama(s), “pg” significa micrograma(s) e “ng” nanograma(s), “PCR” significa reação em cadeia da polimerase, “OD” significa densidade ótica, “ODeoo” significa densidade ótica medida a um comprimento de onda de 600 nm, “kDa” significa kilodaltons, “g” significa constante de gravitação, “bp” significa pares de bases, “kbp” significa pares de kilobase, “% w/v” significa percentual de peso/volume, “% v/v” significa percentual de volume/volume, “IPTG” significa isopropil-β-D- tiogalactopiranoisídeo, “RBS” significa sítio de ligação de ribossomo, “HPLC” significa cromatografia líquida de alta eficiência, “GC” significa cromatografia gasosa. O termo “seletividade molar” é o número de moles do produto produzido por mol de substrato açúcar consumido e é reportado como um percentual.

EXEMPLO 1 CLONAGEM E EXPRESSÃO DE ACETOLACTATO SINTASE

[061] O propósito deste Exemplo foi clonar o gene budB de Klebsiella pneumoniae e expressá-lo em E. coli BL21-AI. O gene budB foi amplificado a partir do DNA genômico linhagem ATCC 25955 de Klebsiella pneumoniae usando-se PCR, resultando em um produto de 1,8 kbp.

[062] O DNA genômico foi preparado usando-se o kit Gentra Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catálogo D- 5000A). O gene budB foi amplificado a partir do DNA genômico de Klebsiella pneumoniae por PCR usando-se os primers N80 e N81 (ver Tabela 2), fornecido como SEQ ID Nos: 11 e 12, respectivamente. Outros reagentes para amplificação de PCR foram fornecidos em kits de fabricantes, por exemplo, Finnzymes Phusio™ Master Mix PCR de Alta Fidelidade (New England Biolabs Inc., Beverly, MA; catalog no. F-531) e usados de acordo com o protocolo do fabricante. A amplificação foi realizada em um DNA Thermocycler GeneAmp 9700 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).

[063] Para estudos da expressão a tecnologia de clonagem Gateway (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) foi usada. O vetor de entrada pENTRSDD-TOPO permitiu clonagem direcional e forneceu uma sequência Shine-Dalgarno para o gene de interesse. O vetor de destino pDEST14 usou um promotor T7 para expressão do gene sem tag. O primer forward incorporou quatro bases (CACC) imediatamente adjacentes ao códon de início de tradução para permitir clonagem direcional no interior de pENTRSDD-TOPO (Invitrogen) para gerar o plasmídeo pENTRSDD-TOPObudB. A construção pENTR foi transformada no interior de células E. coli Top10 (Invitrogen) e plaqueadas de acordo com as recomendações do fabricante. Os transform antes foram cultivados durante a noite e o plasmídeo de DNA foi preparado usando-se o kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Valencia, CA; catalog n° 27106) de acordo com as recomendações do fabricante. Os clones foram sequenciados para confirmar se os genes foram inseridos na orientação correta e para confirmar a sequência. A sequência de nucleotídeos do quadro aberto de leitura (OFR) para este gene e a sequência de aminoácido prevista da enzima são fornecidas como SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:1, respectivamente.

[064] Para criar um clone de expressão, o gene budB foi transferido para o vetor pDEST4 por recombinação para gerar pDEST14budB. O vetor pDEST14budB foi transformado no interior de células E. coli BL21-AI (Invitrogen). Os transform antes foram inoculados em meio Luria Bertani (LB) suplementado com 50 pg/ml de ampicilina. A cultura foi incubada a 37°C com agitação até que a ODΘOO atingisse 0,6-0,8. A cultura foi separada em duas culturas de 25 ml e foi adicionado arabinose a um dos frascos até uma concentração final de 0,2% w/v. O frasco controle negativo não foi induzido com arabinose. Os frascos foram incubados por 4 h a 37°C.com agitação. As células foram colhidas por centrifugação e os pellets de células foram ressuspensos em 50 nM MOPS, tampão pH 7,0. As células foram rompidas tanto por sonicação como por passagem através de uma Célula de Pressão Francesa. O lisado total de células foi centrifugado produzindo o sobrenadante, ou extrato livre de células e o pellet, ou a fração insolúvel. Uma alíquota de cada fração (lisado total de células, extrato livre de células ou a fração insolúvel) foi ressuspensa em SDS (MES) tampão de carga (Invitrogen), aquecido a 85°C por 10 min e sujeitos a análise SDS-PAGE (NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel, catálogo n° NP0322Box, Invitrogen). Uma proteína de peso molecular esperado de aproximadamente 60 kDa, como deduzido a partir da sequência de ácido nucléico, estava presente na cultura induzida, mas não no controle não induzido.

[065] A atividade de acetolactato sintase nos extratos livres de células é medida usando-se o método descrito por Bauerle et al. (Biochim. Biophys. Acta 92(1): 142-149 (1964)).

EXEMPLO 2 (PROFÉTICO) CLONAGEM E EXPRESSÃO DE ÁCIDO ACETOHIDROXI REDUTOISOMERASE

[066] O propósito deste Exemplo é descrever como clonar o gene ilvC de E. coli K12 e expressá-lo em E. coli BL21-AI. O gene ilvC é amplificado a partir do DNA genômico de E.coli usando-se PCR.

[067] O gene ilvC é clonado e expressado da mesma maneira que o gene budB descrito no Exemplo 1. O DNA genômico de E. coli é preparado usando-se o kit Gentra Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catálogo D-5000A). O gene ilvC é amplificado por PCR usando-se os primers N100 e N101 (ver Tabela 2), fornecido como SEQ ID Nos: 13 e 14, respectivamente, criando um produto de 1,5 kbp. O primer forward incorporou quatro bases (CACC) imediatamente adjacentes ao códon de início de tradução para permitir clonagem direcional no interior do pENTRSDD-TOPO (Invitrogen) para gerar o plasmídeo pENTRSDD-TOPOilvC. Os clones são sequenciados para confirmar se os genes são inseridos na orientação correta e para confirmar a sequência. A sequência de nucleotídeos do quadro aberto de leitura (OFR) para este gene e a sequência de aminoácido prevista da enzima são fornecidas como SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, respectivamente.

[068] Para criar um clone de expressão, o gene ilvC é transferido para o vetor pDEST 14 (Invitrogen) por recombinação para gerar pDEST14ilvC. O vetor pDEST14ilvC é transformado no interior de células E. coli BL21-AI e a expressão a partir do promotor T7 é induzida pela adição de arabinose. Uma proteína de peso molecular esperado de aproximadamente 54 kDa, como deduzido a partir da sequência de ácido nucléico, está presente na cultura induzida, mas não no controle não induzido.

[069] A atividade de ácido acetohidroxi redutoisomerase nos extratos livres de células é medida usando-se o método descrito por Arfin e Umbarger. (J. Biol. Chem. 244(5): 1118-1127 (1969)).

EXEMPLO 3 CLONAGEM E EXPRESSÃO DE ÁCIDO ACETOHIDROXI DESIDRATASE

[070] O propósito deste Exemplo é descrever como clonar o gene ilvD de E. coli K12 e expressá-lo em E. coli BL21-AI. O gene ilvD é amplificado a partir do DNA genômico de E.coli usando-se PCR.

[071] O gene ilvD é clonado e expressado da mesma maneira que o gene budB descrito no Exemplo 1. O DNA genômico de E. coli é preparado usando-se o kit Gentra Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catálogo D-5000A). O gene ilvD é amplificado por PCR usando-se os primers N102 e N103 (ver Tabela 2), fornecido como SEQ ID Nos: 15 e 16, respectivamente, criando um produto de 1,9 kbp. O primer forward incorporou quatro bases (CACC) imediatamente adjacentes ao códon de início de tradução para permitir clonagem direcional no interior do pENTRSDD-TOPO (Invitrogen) para gerar o plasmídeo pENTRSDD-TOPOilvD. Os clones são submetidos ao sequenciamento para confirmar se os genes são inseridos na orientação correta e para confirmar a sequência. A sequência de nucleotídeos do quadro aberto de leitura (OFR) para este gene e a sequência de aminoácido prevista da enzima são fornecidas como SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6, respectivamente.

[072] Para criar um clone de expressão, o gene ilvD é transferido para o vetor pDEST 14 (Invitrogen) por recombinação para gerar pDEST14ilvD. O vetor pDEST14ilvD é transformado no interior de células E. coli BL21-AI e a expressão a partir do promotor T7 é induzida pela adição de arabinose. Uma proteína de peso molecular esperado de aproximadamente 66 kDa, como deduzido a partir da sequência de ácido nucléico, está presente na cultura induzida, mas não no controle não induzido.

[073] A atividade de ácido acetohidroxi desidratase nos extratos livres de células é medida usando-se o método descrito por Flint et al. (J. Biol. Chem. 268(20): 14732-14742 (1993)).

EXEMPLO 4 (PROFÉTICO) CLONAGEM E EXPRESSÃO DE CETO-ÁCIDO DESCARBOXILASE DE CADEIA RAMIFICADA

[074] O propósito deste Exemplo é descrever como clonar o gene kivD de Lactococcus lactis e expressá-lo em E. coli BL21-AI.

[075] A sequência de DNA que codifica ceto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada (kivD) de L lactis é obtido pela GenScript (Piscataway, NJ). A sequência obtida é de códon otimizado para expressão tanto em E. coli como B. subtilis e é clonada no interior de pUC57, para formar pUC57-kivD. A sequência de nucleotídeo de códon otimizado do quadro aberto de leitura (ORF) para este gene e a sequência de aminoácidos prevista da enzima são fornecidas como SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8, respectivamente.

[076] Para criar um clone de expressão, sítios de restrição Ndel e BamHI são usados para clonar o fragmento 1,7 kbp kivD de pUC57-kivD no interior do vetor pET-3a (Novagen, Madison, Wl). Isto cria o clone de expressão pET-3a-kivD. O vetor pET-3a-kivD é transformado no interior de células E. coli BL21-AI e a expressão a partir do promotor T7 é induzida pela adição de arabinose. Uma proteína de peso molecular esperado de aproximadamente 61 kDa, como deduzido a partir da sequência de ácido nucléico, está presente na cultura induzida, mas não no controle não induzido.

[077] A atividade de ceto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada nos extratos livres de células é medida usando-se o método descrito por Smit et al. (Appl.Microbiol. Biotechnol 64:396-402 (2003)).

EXEMPLO 5 (PROFÉTICO) CLONAGEM E EXPRESSÃO DE ÁCOOL DESIDROGENASE DE CADEIA RAMIFICADA

[078] O propósito deste Exemplo profético é descrever como clonar o gene yqhD de E. coli K12 e expressá-lo em E. coli BL21-AI. O gene yqhD é amplificado a partir do DNA genômico de E.coli usando-se PCR.

[079] O gene yqhD é clonado e expressado da mesma maneira que o gene budB descrito no Exemplo 1. O DNA genômico de E. coli é preparado usando-se o kit Gentra Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN; número de catálogo D-5000A). O gene yqhD é amplificado por PCR usando-se os primers N104 e N105 (ver Tabela 2), fornecidos como SEQ ID Nos: 17 e 18, respectivamente, criando um produto de 1,2 kbp. O primer forward incorpora quatro bases (CACC) imediatamente adjacentes ao códon de início de tradução para permitir clonagem direcional no interior do pENTRSDD-TOPO (Invitrogen) para gerar o plasmídeo pENTRSDD- TOPOyqhD. Os clones são submetidos ao sequenciamento para confirmar se os genes são inseridos na orientação correta e para confirmar a sequência. A sequência de nucleotídeos do quadro aberto de leitura (OFR) para este gene e a sequência de aminoácido prevista da enzima são fornecidas como SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente.

[080] Para criar um clone de expressão, o gene yqhD é transferido para o vetor pDEST 14 (Invitrogen) por recombinação para gerar pDEST14yq/?D. O vetor pDEST14yq/?D é transformado no interior de células E. coli BL21-AI e a expressão a partir do promotor T7 é induzida pela adição de arabinose. Uma proteína de peso molecular esperado de aproximadamente 42 kDa, como deduzido a partir da sequência de ácido nucléico, está presente na cultura induzida, mas não no controle não induzido.

[081] A atividade de álcool desidrogenase de cadeia ramificada nos extratos livres de células é medida usando-se o método descrito por Sulzenbacher et al. (J. Mol. Biol. 342(2):489-502 (2004)).

EXEMPLO 6 (PROFÉTICO) CONSTRUÇÃO DE UM VETOR DE TRANSFORMAÇÃO PARA OS GENES EM UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL

[082] O propósito deste Exemplo profético é descrever como construir um vetor de transformação que compreende os genes que codificam as cinco etapas de uma via biossintética do isobutanol. Todos os genes são colocados em um único operon sob o controle de um único promotor. Os genes individuais são amplificados por PCR com primers que incorporam sítios de restrição para posterior clonagem e os primers forward contém um sítio de ligação de ribossomo de E. coli otimizado (AAAGGAGG). Os produtos de PCR são clonados TOPO no interior do vetor pCR4Blunt-TOPO e transformados no interior de células E. coli Top10 (Invitrogen). O plasmídeo de DNA é preparado a partir de clones TOPO e a sequência dos genes é verificada. Enzimas de restrição e T4 DNAligase (New England Biolabs, Beverly, MA) são usadas de acordo com as recomendações do fabricante. Para experimentos de clonagem, fragmentos de restrição são purificados em gel usando-se kit de Extração em Gel QIAquick (Qiagen). Após confirmação da sequência, os genes são subclonados no interior de um vetor pUC19 modificado como uma plataforma de clonagem. O vetor pUC19 é modificado por digestão HindiIl/Sapl, criando pUC19dHS. A digestão remove o promotor lac adjacente ao MCD (sítio de clonagem múltiplo), prevenindo transcrição dos operons no vetor.

[083] O gene budB é amplificado a partir do DNA genômico de K. pneumoniae ATCC 25955 por PCR usando-se os primers N110 e N111 (ver Tabela 2), fornecidos como SEQ ID Nos: 19 e 20, respectivamente, criando um produto de 1,8 kbp. O primer forward incorpora sítios de restrição Sphl e Aflll e um sítio de ligação de ribossomo (RBS). O primer reverso incorpora sítios de restrição Pad e Nsil. O produto de PCR é clonado no interior de pCR4 Blunt- TOPO criando pCR4 Blunt-TOPO-budB. O plasmídeo de DNA é preparado a partir dos clones TOPO e a sequência do gene é verificada.

[084] O gene ilvC é amplificado a partir do DNA genômico de E. coli K12 por PCR usando-se o par de primer N112 e N113 (ver Tabela 2) fornecidos como SEQ ID NOs: 21 e 22, respectivamente, criando um produto de 1,5 kbp. O primer forward incorpora sítios de restrição Sail e Nhel e um RBS. O primer reverso incorpora um sítio de restrição Xbal. O produto de PCR é clonado no interior de pCR4 Blunt-TOPO criando pCR4 Blunt-TOPO-ilvC. O plasmídeo de DNA é preparado a partir dos clones TOPO e a sequência do gene é verificada.

[085] O gene ilvD é amplificado a partir do DNA genômico de E. coli K12 por PCR usando-se o par de primer N114 e N115 (ver Tabela 2) fornecidos como SEQ ID NOs: 23 e 24, respectivamente, criando um produto de 1,9 kbp. O primer forward incorpora um sítio de restrição Xbal e um RBS. O primer reverso incorpora um sítio de restrição BamHI. O produto de PCR é clonado no interior de pCR4 Blunt-TOPO criando pCR4 Blunt-TOPO-ilvD. O plasmídeo de DNA é preparado a partir dos clones TOPO e a sequência do gene é verificada.

[086] O gene kivD é amplificado a partir do DNA genômico de E. coli K12 por PCR usando-se o par de primer N116 e N117 (ver Tabela 2) fornecidos como SEQ ID NOs: 25 e 26, respectivamente, criando um produto de 1,7 kbp. O primer forward incorpora um sítio de restrição BamHI e um RBS. O primer reverso incorpora um sítio de restrição Saci. O produto de PCR é clonado no interior de pCR4 Blunt-TOPO criando pCR4 Blunt-TOPO-k/vD. O plasmídeo de DNA é preparado a partir dos clones TOPO e a sequência do gene é verificada.

[087] O gene yqhD é amplificado a partir do DNA genômico de E. coli K12 por PCR usando-se o par de primer N118 e N119 (ver Tabela 2) fornecidos como SEQ ID NOs: 27 e 28, respectivamente, criando um produto de 1,2 kbp. O primer forward incorpora um sítio de restrição Saci. O primer reverso incorpora sítios de restrição Spel e EcoRI. O produto de PCR é clonado no interior de pCR4 Blunt-TOPO criando pCR4 Blunt-TOPO-yçbD. O plasmídeo de DNA é preparado a partir dos clones TOPO e a sequência do gene é verificada.

[088] Para construir o operon da via do isobutanol, o gene yqhD é removido do pCR4 Blunt-TOPO-yqbD com Saci e EcoRI, liberando um fragmento de 1,2 kbp. Este é ligado ao pUC19dHS, que foi previamente digerido com Saci e EcoRI. O clone resultante, pUC19dHS-yqhD é confirmado por digestão de restrição. Em seguida, o gene IlvC é removido do pCR4 Blunt- TOPO-/7vC com Sail e Xbal, liberando um fragmento de 1,5 kbp. Este é ligado ao pUC19dHS-yqhD, que foi previamente digerido com Sail e Xbal. O clone resultante, pUC19dHS-ilvC-yqhD é confirmado por digestão de restrição. O gene budB é então removido do pCR4 Blunt-TOPO-buc/B com Sphl e Nsil, liberando um fragmento de 1,8 kbp. pUC19dHS-ilvC-yqhD é digerido com o fragmento Sphl/Nsil budB (Nsil e Pstl geram terminações compatíveis), formando pUC19dHS-budB-ilvC-yqhD. Um fragmento de 1,9 kbp contendo o gene ilvD é removido é removido do pCR4 Blunt-TOPO-/7vD com Xbal e BamHI e ligado ao pUC19dHS-budB-ilvC-yqhD, que é digerido com estas mesmas enzimas, formando pUC19dHS-budB-ilvC-ilvD-yqhD. Finalmente, kivD é removido é removido do pCR4 Blunt-TOPO-k/vD com BamHI e Saci, liberando um fragmento de 1,7 kbp. Este fragmento é ligado ao pUC19dHS-budB-ilvC- ilvD-yqhD, que foi previamente digerido com BamHI e Saci, formando pUC19dHS-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD.

[089] O vetor pUC19dHS-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD é digerido com Aflll e Spel para liberar um fragmento de operon de 8,2 kbp que é clonado no interior de pBenAS, um vetor tipo ponte de E. colí-B. subtilis. O plasm ideo pBenAS é criado por modificação do vetor pBE93, que é descrito por Nagarajan, (documento WO 93/24631, Exemplo 4). Para fazer pBenAS o promotor de protease neutro (NPR) de Bacillus amyloliquefaciens, sequência sinal e o gene pho/\ são removidos com um Ncol/Hindl11 de digestão de pBE93. O promotor NPR é amplificado por PCR a partir de pBE93 pelos primers BenNF e BenASR, fornecidos como SEQ ID NOs: 29 e 30, respectivamente. O primer incorpora os sítios Aflll, Spel e Hindi 11 a jusante do promotor. O produto PCR é digerido com Ncol e Hindlll e o fragmento é clonado nos sítios correspondentes no vetor, criando pBenAS. O fragmento do operon é subclonado no interior dos sítios Aflll e Spel em pBenAS, criando pBen-budB- ilvC-ilvD-kivD-yqhD.

EXEMPLO 7 (PROFÉTICO) EXPRESSÃO DA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM E. COLI

[090] O propósito deste Exemplo profético é descrever como expressar uma via biossintética do isobutanol em E. coli.

[091] O plasmídeo pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD, construído como descrito no Exemplo 6, é transformado no interior de E.coli NM522 (ATCC No 47000) para fornecer a linhagem E.coli NM522/pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD e a expressão dos genes no operon é monitorada por análise SDS-PAGE, teste de enzima e análise Western blot. Para Western blots, os anticorpos são construídos para peptídeos sintéticos por Sigma-Genosys (The Woodlands, TX).

[092] A linhagem E. coli NM522/pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD é inoculada em um frasco de agitação de 250 ml contendo 50 ml de meio e agitado a 250 rpm e 35°C. O meio é composto de: glicose (5 g/l), MOPS (0,05 M), sulfato de amónio (0,01 M), fosfato de potássio, monobásico (0,005 M), mistura de metal S10 (1% (v/v)), extrato de levedura (0,1% (w/v)), ácido casamino (0,1% (w/v), tiamina (0,1 mg/L), prolina (0,05 mg/L) e biotina (0,002 mg/L), e é titulado a pH 7,0 com KOH. A mistura de metal S10 contém: MgCte (200 mM), CaCI2 (70 mM), MnCl2 (5 mM), FeCIs (0,1 mM), ZnCI2 (0,1 mM), hidrocloreto de tiamina (0,2 mM), CuSCk (172 pM), C0CI2 (253 pM) e Na2MoO4 (242 pM). Após 18h, o isobutanol é detectado por HPLC ou análise GC, usando-se métodos que são bem conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito na seção de Métodos Gerais acima.

EXEMPLO 8 (PROFÉTICO) EXPRESSÃO DA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM BACILLUS SUBTILIS

[093] O propósito deste Exemplo profético é descrever como expressar uma via biossintética do isobutanol em Bacillus subtilis. A mesma abordagem, como descrito no Exemplo 7, é usada.

[094] O plasmídeo pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD, construído como descrito no Exemplo 6, é usado. Este plasmídeo é transformado no interior de Bacillus subtilis BE1010 (J. Bacteriol. 173:2278-2282 (1991)) para fornecer a linhagem B. subtilis BE1010/pBen-budB-ilvC-ilvD-kivD-yqhD e a expressão dos genes no operon é monitorada como descrito no Exemplo 7.

[095] A linhagem B. subtilis BE1010/pBen-budB-ilvC-ilvD- kivD-yqhD é inoculada em um frasco de agitação de 250 mL contendo 50 mL de meio e agitado a 250 rpm e 35°C por 18h. O meio é composto de: dextrose (5 g/L), MOPS (0,05 M), ácido glutâmico (0,02 M), sulfato de amónia (0,01 M), fosfato de potássio, tampão monobásico (0,005 M), mistura de metal S10 (como descrito no exemplo 11, 1% (v/v)), extrato de levedura (0,1% (w/v)), ácido casamino (0,1% (w/v), triptofano (50 mg/L), metionina (50 mg/L) e lisina (50 mg/L), e é titulado a pH 7,0 com KOH. Após 18h, o isobutanol é detectado por HPLC ou análise GC, usando-se métodos que são bem conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito na seção de Métodos Gerais acima.

EXEMPLO 9 CLONAGEM E EXPRESSÃO DE ACETOLACTATO SINTASE

[096] Para criar outro clone de expressão de acetolactato sintase, o gene budB foi clonado no interior do vetor pTrc99A. O gene budB foi inicialmente amplificado a partir de pENTRSDD-TOPObudB (descrito no Exemplo 1) usando-se primers (N110.2 e N111.2, fornecidos como SEQ ID Nos:31 e 32, respectivamente, que introduzem sítios Saci, Spel e Mfel na terminação 5’ e sítios BbvCI, A/7// e BamHI na terminação 3’. O produto de PCR resultante de 1,75 kbp foi clonado no interior de pCR4-Blunt TOPO (Invitrogen) e a sequência de DNA foi confirmada (usando-se primers de sequenciamento N130Seq F1-F4 e R1-R4, fornecidos como SEQ ID Nos: 40-47, respectivamente). O gene budB foi então removido deste vetor usando-se Saci e BamHI e clonado no interior de pTrc99A (Amann et al. Gene 69(2):301-315 (1988)), gerando pTrc99A::budB. O vetor pTrc99A::budB foi transformado no interior de células E. coli TOP10 e os transformantes foram inoculados em meio LB suplementado com 50 pg/mL de ampicilina e cultivados durante a noite a 37°C. Uma alíquota desta cultura foi usada para inocular 50 mL do meio LB suplementado com 50 pg/mL de ampicilina. A cultura foi incubada a 37°C com agitação até que a ODΘOO atingisse 0,6-0,8. A expressão de budB do promotor Trc foi então induzida pela adição de 0,4 mM de IPTG. Os frascos controle negativo foram também preparados de forma não induzida com IPTG. Os frascos foram incubados por 4 h a 37°C com agitação. Os extratos livres de células foram preparados como descrito no Exemplo 1.

[097] A atividade de acetolactato sintase nos extratos livres de células foi medida como descrito no Exemplo 1. Três horas após a indução com IPTG, a atividade de acetolactato sintase de 8 unidades/mg foi detectada. A linhagem controle carregando somente o plasmídeo pTrc99A exibiu 0,33 unidades/mg de atividade de acetolactato sintase.

EXEMPLO 10 CLONAGEM E EXPRESSÃO DE ÁCIDO ACETOHIDROXI REDUTOISOMERASE

[098] O propósito deste Exemplo foi clonar o gene ilvC de E. coli K12 e expressá-lo em E. coli TOP10. O gene ilvC foi amplificado a partir do DNA genômico da linhagem FM5 (ATCC 53911) de E. coli K12 usando-se PCR.

[099] O gene ilvC foi clonado e expressado de uma maneira similar como descrito para a clonagem e expressão de ilvC no Exemplo 2 acima. PCR foi usado para amplificar IlvC do genoma de E. coli FM5 usando-se os primers N112.2 e N113.2 (SEQ ID Nos:33 e 34, respectivamente). Os primers criaram sítios Saci e AflIW e um RBS otimizado na terminação 5’ e sítios BamHI na terminação 3’ de ilvC. O produto de PCR de 1,5 kbp foi clonado no interior de pCR4-Blunt TOPO de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen) gerando pCR4BluntTOPO::ilvC. A sequência do produto de PCR foi confirmada usando-se primers de sequenciamento (N131SeqF1-F3, e N131SeqR1-R3, fornecidos como SEQ ID NOs:48-53, respectivamente). Para criar um clone de expressão, o gene //vCfoi removido do pCR4BluntTOPO::ilvC usando-se Saci e BamHI e clonado no interior de pTrc99A. O vetor pTrc99A::ilvC foi transformado no interior de células E. coli TOP 10 e a expressão do promotor Ter foi induzida pela adição de IPTG, como descrito no Exemplo 9. Os extratos livres de células foram preparados como descrito no Exemplo 1.

[0100] A atividade de ácido acetohidroxi redutoisomerase nos extratos livres de células foi medida como descrito no Exemplo 2. Três horas após a indução com IPTG, a atividade de ácido acetohidroxi redutoisomerase de 0,026 unidades/mg foi detectada. A linhagem controle carregando somente o plasmídeo pTrc99A exibiu 0,001 unidades/mg de atividade de ácido acetohidroxi redutoisomerase.

EXEMPLO 11 CLONAGEM E EXPRESSÃO DE ÁCIDO ACETOHIDROXI DESIDRATASE

[0101] O propósito deste Exemplo foi clonar o gene ilvD de E. coli K12 e expressá-lo em E. coli TOP10. O gene ilvD foi amplificado a partir do DNA genômico da linhagem FM5 (ATCC 53911) de E. coli K12 usando-se PCR.

[0102] O gene ilvD foi clonado e expressado de uma maneira similar como descrito para a clonagem e expressão de ilvC no Exemplo 10. PCR foi usado para amplificar ilvD do genoma de E. coli FM5 usando-se os primers N114.2 e N115.2 (SEQ ID Nos:35 e 36, respectivamente). Os primers criaram sítios Saci e Nhel e um RBS otimizado na terminação 5’ e sítios Bsu361, Pad e BamHI na terminação 3’ de IlvD. O produto de PCR de 1,9 kbp foi clonado no interior de pCR4- Blunt TOPO de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen) gerando pCR4BluntTOPO::ilvD. A sequência do produto de PCR foi confirmada usando-se primers de sequenciamento (N132SeqF1-F4, e N132SeqR1- R4, fornecidos como SEQ ID NOs:54-61, respectivamente). Para criar um clone de expressão, o gene ilvD foi removido do pCR4BluntTOPO::ilvD usando-se Saci e BamHI e clonado no interior de pTrc99A. O vetor pTrc99A::ilvD foi transformado no interior de células E. coli TOP10 e a expressão do promotor Ter foi induzida pela adição de IPTG, como descrito no Exemplo 9. Os extratos livres de células foram preparados como descrito no Exemplo 1.

[0103] A atividade de ácido acetohidroxi desidratase nos extratos livres de células foi medida como descrito no Exemplo 3. Três horas após a indução com IPTG, a atividade de ácido acetohidroxi desidratase de 46 unidades/mg foi medida. A linhagem controle carregando somente o plasmídeo pTrc99A exibiu atividade não detectável de ácido acetohidroxi desidratase.

EXEMPLO 12 CLONAGEM E EXPRESSÃO DE CETO-ÁCIDO DESCARBOXILASE DE CADEIA RAMIFICADA

[0104] O propósito deste Exemplo foi clonar o gene kivD de Lactococcus lactis e expressá-lo em E. coli TOP 10.

[0105] O gene kivD foi clonado e expressado de uma maneira similar como descrito para a clonagem e expressão de ilvC no Exemplo 10 acima. PCR foi usado para amplificar kivD do plasmídeo pUC57-kicD (ver Exemplo 4, acima) usando-se os primers N116.2 e N117.2 (SEQ ID Nos:37 e 38, respectivamente). Os primers criaram sítios Saci e Pad e um RBS otimizado na terminação 5’ e sítios Pcil, Avrll, BglW e BamHI na terminação 3’ de kivD. O produto de PCR de 1,7 kbp foi clonado no interior de pCR4-Blunt TOPO de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen) gerando pCR4BluntTOPO::k/vD. A sequência do produto de PCR foi confirmada usando-se primers N132SeqF1-F4, e N132SeqR1-R4 (fornecidos como SEQ ID NOs:62-69, respectivamente). Para criar um clone de expressão, o gene kivD foi removido do plasmídeo pCR4BluntTOPO::/c/vD usando-se Saci e BamHI, e clonado no interior de pTrc99A. O vetor pTrc99A::k/vD foi transformado no interior de células E. coli TQP10 e a expressão do promotor Ter foi induzida pela adição de IPTG, como descrito no Exemplo 9. Os extratos livres de células foram preparados como descrito no Exemplo 1.

[0106] A atividade de ceto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada nos extratos livres de células foi medida como descrito no Exemplo 4, exceto que o reagente Purplap® (Aldrich, número de catálogo 162892) foi usado para detectar e quantificar os produtos da reação de aldeído. Três horas após a indução com IPTG, a atividade de ceto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada de mais de 3,7 unidades/mg foi detectada. A linhagem controle carregando somente o plasm ideo pTrc99A exibiu atividade não detectável de ceto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada.

EXEMPLO 13 EXPRESSÃO DE ÁLCOOL DESIDRATASE DE CADEIA RAMIFICADA

[0107] E. coli contém um gene nativo (yqhD) que foi identificado como uma propanodiol desidrogenase (Patente US 6.514.733). A proteína Yqhd tem 40% de identidade com AdhB (codificada pelo adhB) de Clostridium, uma suposta butanol desidrogenase dependente de NADH. O gene yqhD foi colocado sob expressão constitutiva de um variante do promotor glicose isomerase 1.6GI (SEQ ID NO:70) em linhagem de E. coli MG1655 1.6yqhD::Cm (documento WO 2004/-33646) usando-se tecnologia À Vermelho (Datsenko e Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97:6640 (2000)). MG1655 1.6yqhD::Cm contém um cassette FRT-CmR-FRT, de forma que o antibiótico marcador pode ser removido. De maneira similar, o promotor nativo foi substituído pelo promotor 1.5GI (documento WO 2033/089621) (SEQ ID NO.71), criando a linhagem MG1655 1.5GI-yqhD::Cm, então, substituindo o promotor de MG1655 1,6yqhD::Cm pelo promotor 1.5GI.

[0108] A linhagem MG1655 1.5GI-yqhD::Cm foi cultivada em meio LB até o meio da fase log e os extratos livres de células foram preparados como descrito no Exemplo 1. Revelou-se que esta linhagem possui atividade de isobutiraldeido redutase dependente de NADPH quando os extratos de células foram analisados seguindo a diminuição na absorbância a 340 nm em pH 7,5 e 35°C.

[0109] Para gerar uma segunda linhagem de expressão contendo 1,5GI-yqhD::Cm, uma fase P1 foi preparada a partir de MG1655 1.5GI yqhD::Cm e o cassette foi transferido para BL21 (DE3) (Invitrogen) por transdução, criando BL21 (DE3) 1.5GI yqhD::Cm.

EXEMPLO 14 CONSTRUÇÃO DE UM VETOR DE TRANSFORMAÇÃO PARA OS PRIMEIROS QUATRO GENES EM UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL

[0110] O propósito deste Exemplo foi construir um vetor de transformação que compreende os primeiros quatro genes (isto é, budB, ilvC, ilvD e kivD) em uma via biossintética do isobutanol.

[0111] Para construir o vetor de transformação, primeiro, o gene ilvC foi obtido a partir de Trc99::ilvC (descrito no Exemplo 10) por digestão com AflW e BamH\ e clonado no interior de pTrc99A::budB (descrito no exemplo 9), que foi digerido com AfZII e BamH\ para produzir o plasmídeo pTrc99A::budB-ilvC. Depois, os genes ilvD e kivD foram obtidos a partir de pTrc99A::budB-ilvD (descrito no Exemplo 11) e pTrc99A::kivD (descrito no Exemplo 12), respectivamente, por digestão com Nhel e Pad {ilvD) e Pad e BamHI {kivD). Estes genes foram introduzidos no interior de pTrc99A::budB-ilvC, que primeiro foi digerido com Nhel e BamHI, por três formas de ligação. A presença de todos os quatro genes no plasmídeo final, pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD, foi confirmada por seleção PCR e digestão de restrição.

EXEMPLO 15 EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL NO CULTIVO DE E. COLI EM GLICOSE

[0112] Para criar as linhagens de E. coli de produção de isobutanol, pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD (descrito no Exemplo 14) foi transformado no interior de E. coli MG1655 1.5GI yqhD::Cm e E. coli (DE3) 1.5GI yqhD::Cm (descrito no Exemplo13). Os transformantes foram inicialmente cultivados em meio LB contendo 50 pg/mL de kanamicina e 100 pg/mL de carbenicilina. As células destas culturas foram usadas para inocular frascos com agitação (aproximadamente 175 mL de volume total), contendo 50 a 170 mL de meio TM3a/glicose (com antibióticos apropriados) para representar condições de oxigênio alta e baixa, respectivamente. O meio TM3a/glicose continha (por litro): glicose (10 g), KH2PO4 (13,6 g), ácido cítrico monohidrato (2,0 g), (NH4)2SO4 (3,0 g), MgSCU 7H2O (2.0 g), CaCI2 2H2O (0,2 g), citrato de amónia férrico (0,33 g), diamina HCI (1,0 mg), extrato de levedura (0,50 g) e 10 mL de solução de elementos traço. O pH foi ajustado para 6,8 com NH4OH. A solução de elementos traço continha: ácido cítrico H2O (4,0 g/l), MnSCU H2O (3,0 g/L), NaCl (1,0 g/L), FeSCU 7H2O (0,10 g/L), CoCI2 6 H2O (0,10 g/L), ZnSO4 7H2O (0,10 g/L), CuSCU 5H2O (0,010 g/L), H3BO3 (0,010 g/L) e Na2MoO4 2H2O (0,010 g/L).

[0113] Os frascos foram inoculados até um início de ODΘOO < 0,01 unidades e incubados a 34° C com agitação a 300 rpm. Os frascos contendo 50 mL do meio foram fechados com tampas de filtro 0,2 pm; os frascos contendo 150 mL de meio foram fechados com tampas lacradas. IPTG foi adicionado até uma concentração final de 0,04 mM quando as células atingiram uma ODεoo > 0,4 unidades. Aproximadamente após 18 h de indução, uma alíquota do caldo foi analisada por HOLC (coluna Shodex Sugar SH1011 (Showa Denko America, Inc. NY) com detecção do índice de refração (RI)) e GC (Varian CP-WAX 58(FFAP) CB, 0,25 mm x 0,2 pm x 25 m (Varian, Inc., Paio Alto, CA) com detecção por ionização em chama (FID)) para o conteúdo de isobutanol, como descrito na seção de Métodos Gerais. Não foi detectado isobutanol nas linhagens controle que carregam somente o vetor pTrc99A (resultados não mostrados). Seletividades molares e titulações de isobutanol produzidas por linhagens que carregam pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD estão mostradas na Tabela 5. Titulações significantemente altas de isobutanol foram obtidas nas culturas de crescimento sob baixas condições de oxigênio. TABELA 5 PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL POR LINHAGENS DE E.COLI CULTIVADAS EM GLICOSE

Determinado por HPLC.

EXEMPLO 16 EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL NO CULTIVO DE E. COLI EM SACAROSE

[0114] Já que as linhagens descritas no Exemplo 15 não foram capazes de crescer em sacarose, um plasm ideo adicional foi construído para permitir a utilização da sacarose para a produção do isobutanol. O grupamento de gene de utilização da sacarose cscBKA, fornecido como SEQ ID NO:39, foi isolado do DNA genômico de uma linhagem de E.coli que utililiza sacarose derivada da linhagem ATCC 13281. Os genes de utilização da sacarose (cscA, cscK e cscB) codificam uma hidrolase sacarose (CscA), fornecidos como SEQ ID NO:39, D-frutoquinase (CscK), fornecido como SEQ ID NO: 140, e sacarosepermease (CscB), fornecido como SEQ ID NO:141. 0 gene repressor específico para sacarose cscR não foi incluído, de forma que os três genes cscBKA foram expressados constitutivamente a partir de seus promotores nativos em E.coli.

[0115] O DNA genômico da linhagem de E. coli que utiliza sacarose foi digerido por completo com BamHI e EcoR\. Fragmentos com uma média de tamanho de aproximadamente 4 kbp foram idolados a partir de um gel agarose e foram ligados ao plasmídeo pl_itmus28 (New England Biolabs), digeridos com BamHL e EcoR\ e transformados no interior de células E.coli TOPIOF’ultra competentes (Invitrogen). Os transform antes foram corridos em placas de ágar MacConkey contendo 1% de sacarose e ampicilina (100 pg/mL) e selecionados para o aparecimento de colônias roxas. O plasmídeo de DNA foi isolado dos transform antes roxos, e sequenciados com primers M13 forward e reverso (Invitrogen), e Scr1-4 (fornecido como SEQ ID NOs:72-75, respectivamente). O plasmídeo contendo os genes cscB, cscK e cscA (cscBKA) foi designado pScrl.

[0116] Para criar um plasmídeo de utilização de sacarose que era compatível com o plasmídeo da via do isobutanol (Exemplo 14), o operon de pScrl foi subclonado no interior de pBHR1 (MoBiTec, Goettingrn, Alemanha). Os genes cscBKA foram isolados por digestão de pScrl com Xhol (seguido por incubação com enzima Klenow para gerar terminações abruptas) e então por digestão com Agel. O fragmento resultante de 4,2 kbp foi ligado no interior de pBHR1 que foi digerido com NaeleAgel, resultando no plasmídeo pBHR1::cscBKA.

[0117] O plasmídeo pBHR1::cscBKA sacarose foi transformado no interior de E. coli BL21 (DE3) 1,5yqhD/pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD e E. coli MG1655 1.5yqhD/pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD (descrito no exemplo 15) por eletroporação. Os transformantes foram inicialmente selecionados em meio LB contendo 100 pg/mL de ampicilina e 50 pg/mL de kanamicina e então selecionados em placas de sacarose MacConkey (1%) para confirmar a expressão funcional do operon sacarose. Para produção de isobutanol, as linhagens foram cultivadas em meio mínimo definido TM3a (descrito no Exemplo 15) contendo 1% de sacarose ao invés de glicose, e o meio de cultura foi analisado para a quantidade de isobutanol produzida, como descrito no Exemplo 15, exceto que as foram tiradas 14 horas após a indução. Novamente, não foi detectado isobutanol nas linhagens controle que carregam somente o vetor pTrc99A (resultados não mostrados). Seletividades molares e titulações de isobutanol produzidas por MG1655 1.5yqhD que carregam pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD estão mostradas na Tabela 6. Resultados similares foram obtidos com as linhagens análogas BL21 (DE3). TABELA 6 PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL POR LINHAGEM DE E. COLI MG1655

*Determinado por HPLC

EXEMPLO 17 EXPRESSÃO DE GENES DA VIA DO ISOBUTANOL EM SACCHAROMYCES CEREVISIAE

[0118] Para expressar os genes da via do isobutanol em Saccharomyces cerevisiae, uma variedade de vetores tipo ponte de E. coli- levedura foram construídos. Uma abordagem de PCR (Yu, et al., Fungal Genet. Biol. 41:973-981 (2004) foi usada para unir genes com promotores de levedura e terminadores. Especificamente, o promotor GPD (SEQ ID NO:76) e terminador CYC1 (SEQ ID NO:77) foram unidos ao gene a/sS de Bacillus subtilis (SEQ ID NO:78), o promotor FBA (SEQ ID NO:79) e o terminador CYC1 foram unidos ao gene ILV5 de S. cerevisiae (SEQ ID NQ:80), o promotor ADH1 (SEQ ID NO:81) e o terminador ADH1 (SEQ ID NO:82) foram unidos ao gene ILV3 de S. cerevisiae (SEQ ID NO:83), e o promotor GPM (SEQ ID NO:84) e o terminador ADH1 foram unidos ao gene kivD de Lactococcus lactis (SEQ ID NO:7). Os primers, fornecidos na tabela 7, foram designados para incluir sítios de restrição para clonagem dos produtos promotor/gene/terminador no interior de vetores tipo ponte de E. co//-levedura da série pRS400 (Christianson et al., Gene 110:119-122 (1992)) e para trocar promotores entre construções. Os primers para as terminações 5’ de ILV5 e ILV3 (N138 e N155, respectivamente, fornecidos como SEQ ID NO:95 e 107, respectivamente) geraram novos códons de início para eliminar alvos mitocondriais destas enzimas.

[0119] Todos os produtos PCR unidos foram primeiro clonados no interior de pCR4-Blunt por reação de clonagem TOPO (Invitrogen) e as sequências foram confirmadas (usando-se primers M13 forward e reverso (Invitrogen) e os primers de sequenciamento são fornecidos na Tabela 7. Dois promotores adicionais (CUP1 e GAL1) foram clonados pela reação TOPO no interior de pCR4-Blunt e confirmados pelo sequenciamento; as sequências de primer estão indicadas na Tabela 7. Os plasmídeos foram transformados tanto no interior de Saccharomyces cerevisiae BY4743 (ATCC 201390) como YJR148w (ATCC 4036939) para avaliar as atividades enzimáticas específicas usando-se os testes enzimáticos descritos nos Exemplo 1-4 e Exemplos 9-12. Para a determinação das atividades enzimáticas, as culturas foram crescidas em uma ODΘOO de 1,0 em meio sintético completo {Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 201-202) não faltando nenhum metabólito necessário para a seleção da expressão do(s) plasmídeo(s), foram colhidos por centrifugação (2600 x g por 8 min a 4°C), lavados com tampão, centrifugados novamente e congelados a -80°C. As células foram descongeladas, ressuspensas em 20 mM Tris-HCI, pH 8,0 até um volume final de 2 mL, e então rompidas usando-se um bead beater com 1,2 g de contas de vidro (0,5 mm de tamanho). Cada amostra foi processada em alta velocidade por um total de 3 minutos (com incubação em gelo após cada minuto de agitação). Os fragmentos celulares foram removidos dos extratos por centrifugação (20.000 x g por 10 min a 4°C). TABELA 7 SEQUÊNCIAS DE PRIMER PARA CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO DE VETORES DE EXPRESSÃO DE S. CEREVISIAE

TABELA 8 VETORES TIPO PONTE DE E.COL/-LEVEDURA QUE CARREGAM GENES DA VIA DO ISOBUTANOL

EXEMPLO 18 PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL POR SACCHAROMYCES CEREVISIAE RECOMBINANTE

[0120] Os plasmídeos pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3 e pHR81 ::FBA-ILV5+GPM-kivD (descritos no Exemplo 17) foram transformados no interior de Saccharomyces cerevisiae YJR148w para produzir linhagens YJR148w/pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD. Uma linhagem controle foi preparada por vetores de transformação pRS423 e pHR81 (descrita no Exemplo 17) no interior de Saccharomyces cerevisiae YJR148w (linhagem YJR148w/pRS423/pHR81). As linhagens foram mantidas em meio completo sintético padrão para S. cerevisiae (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 201-202) contendo 2% de glicose ou sacarose, mas faltando uracila e histidina, para assegurar a manutenção dos plasmídeos.

[0121] Para a produção do isobutanol, as células foram transferidas para meio completo sintético, faltando uracila, histidina e leucina. A remoção da leucina do meio teve a intenção de acionar um aumento no número de cópias do plasmídeo baseado em pHR81 devido à pouca transcrição do alelo Ieu2-d (Erhart e Hollenberg, J. Bacteriol. 156:625-635 (1993)). Culturas aeróbicas foram cultivadas em frascos com 175 mL de capacidade contendo 50 mL de meio em um incubador Innova4000 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) a 30°C e 200 rpm. Culturas com oxigênio baixo foram preparadas pela adição de 45 ml de meio a frascos de soro de 60 ml que foram fechados com tampas onduladas após inoculação, e mantidos a 30°C. Seringas estéreis foram usadas para amostragem e adição de indutores, quando necessário. Aproximadamente 24 h após inoculação, o indutor CuSCM foi adicionado a uma concentração final de 0,03 mM. Culturas controle para cada linhagem sem adição de CuSO4 foram também preparadas. Os sobrenadantes da cultura foram analisados 18 ou 19 h e 35 h após adição de CuSO4 por GC ou HPLC para o conteúdo de isobutanol, como descrito acima no Exemplo 15. Os resultados para Saccharomyces cerevisiae YJR148w/pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD cultivados em glicose estão apresentados naTabela 9. Para os resultados fornecidos na Tabela 9, as amostras das culturas aeróbicas foram tiradas em 35h e as amostras das culturas com baixo oxigênio foram tiradas em 19h e medidas por HPLC.

[0122] Os resultados para Saccharomyces cerevisiae YJR148w/pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD cultivados em sacarose estão apresentados naTabela 10. Os resultados nesta tabela foram obtidos com amostras tiradas em 18h e medidos por HPLC. TABELA 9 PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL POR SACCHAROMYCES CEREVISIAE YJR148W/PRS423::CUP1-ALSS+FBA-ILV3/PHR81::FBA-ILV5+GPM-KIVD

TABELA 10 PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL POR SACCHAROMYCES CEREVISIAE YJR148W/PRS423::CUP1-ALSS+FBA-ILV3/PHR81::FBA-ILV5+GPM-KIVD CULTIVADO EM SACAROSE

Linhagens com sufixos “a”, “b” e “c” indicam isolados separados.

[0123] Os resultados indicam que, quando cultivados em glicose ou sacarose, sob condições aeróbicas ou baixo oxigênio, a linhagem YJR148w/pRS423::CUP1-alsS+FBA-ILV3/pHR81::FBA-ILV5+GPM-kivD produziu níveis consistentemente mais altos de isobutanol, do que a linhagem controle.

EXEMPLO 19 PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL POR SACCHAROMYCES CEREVISIAE RECOMBINANTE

[0124] Os plasmídeos pRS425::CUP1-alsS+FBA-ILV3 e pRS426::GAL1-ILV5+GPM-kivD (descritos no Exemplo 17) foram transformados no interior de Saccharomyces cerevisiae YJR148w para produzir linhagens YJR148w/pRS425::CUP1-alsS+FBA-ILV3/pRS426::GAL1- ILV5+GPM-kivD. Uma linhagem controle foi preparada por vetores de transformação pRS425 e pRS426 (descrita no Exemplo 17) no interior de Saccharomyces cerevisiae YJR148w (linhagem YJR148w/pRS425/pRS426). As linhagens foram mantidas em meio completo sintético, como descrito no Exemplo 18.

[0125] Para a produção do isobutanol, as células foram transferidas para meio completo sintético, contendo 2% de galactose e 1% de rafinose, e faltando e leucina. Culturas aeróbicas e com baixo oxigênio foram preparadas como descrito no exemplo 18. Aproximadamente 12 h após inoculação, o indutor CuSO4 foi adicionado a uma concentração final de 0,5 mM. Culturas controle para cada linhagem sem adição de CuSCM foram também preparadas. Os sobrenadantes da cultura foram analisados 23 h após adição de CuSO4 para determinação de isobutanol por HPLC, como descrito acima no Exemplo 18. Os resultados estão apresentados na Tabela 11. Devido à ampla diferença final na densidade ótica observada e associada com a quantificação da fonte de carbono residual, a concentração de isobutanol por unidade ODeoo (ao invés de seletividades molares) está fornecida na tabela para permitir uma comparação das linhagens contendo os genes da via biossintética do isobutanol com os controles. TABELA 11 PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL POR S. CEREV/S/AEYJR148W/PRS425::CUP1- ALSS+FBA-ILV3/PRS426::GAL1-ILV5+GPM-KIVD CULTIVADO EM GALACTOSE E RAFINOSE

Linhagens com sufixos “a”, “b”, “c”, “d” e “e” indicam isolados separados.

[0126] Os resultados indicam que, em geral, níveis altos de isobutanol para unidade de densidade ótica foram produzidos pela linhagem YJR148w/pRS425::CUP1-alsS+FBA-ILV3/pRS426::GAL1-ILV5+GPM-kivD comparado à linhagem controle, tanto sob condições aeróbicas como de baixo oxigênio.

EXEMPLO 20 EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM BACILLUS SUBTILIS

[0127] O propósito deste Exemplo foi expressar uma via biossintética do isobutanol em Bacillus subtilis. Os cinco genes da via do isobutanol (etapas da via (a) até (e) na Figura 1) foram unidos em dois operons para expressão. Os três genes BudB, ilvD e kivD, que codificam acetolactato sintase, ácido acetohidroxi desidratase e ceto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada, respectivamente, foram integrados no cromossomo de B. subtilis BE1010 (Payne e Jackson, J. Bacteriol. 173:2278-2282 (1991)). Os dois genes ilvC e bdhB, que codificam ácido acetohidroxi isomeroredutase e butanol desidrogenase, respectivamente, foram clonados em um vetor de expressão e transformados no interior da linhagem Bacillus que carrega os genes isobutanol integrados.

INTEGRAÇÃO DOS TRÊS GENES, BUDB, ILVD E KIVD NO CROMOSSOMO DE B. SU5T/L/S BE1010

[0128] Os vetores de integração Bacillus pFP988DssPspac e pFP988DssPgroE foram usados para a integração cromossômica dos três genes, budB (SEQ ID NO:1), ilvD (SEQ ID NO:5) e kivD (SEQ ID NO:7). Ambos os plasmídeos contêm um réplicon de E.coli de pBR322, um marcador antibiótico ampicilina para seleção de E.coli e duas seções de homologia para o gene sacB no cromossomo de Bacillus que dirigem integração do vetor e a sequência que interfere por recombinação homóloga. Entre as regiões de homologia sacB está um promotor spac (PgroE) no pFP988DssPsapc ou em um promotor groEL (PgroE) no pFP988DssPgroE, e um marcador selecionável para Bacillus, eritromicina. A região do promotor também contém a sequência lacO para regulação da expressão por uma proteína repressora lacl. As sequências de pFP988DssPspac (6,341 bp) e pFP988DssPgroE (6,221 bp) são dadas como SEQ ID NO: 142 e SEQ ID NO: 143, respectivamente.

[0129] O cassette com três genes budB-ilvD-kivD foi construído por delação do gene ilvC a partir do plasmídeo pTrc99a budB-ilvC-ilvD-kivD. A construção do plasmídeo pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD está descrita no Exemplo 14. O plasmídeo pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD foi digerido com Aflll e Nhel, tratado com o fragmento Klenow de DNA polimerase para produzir terminações abruptas, e que resulta no fragmento de 9,4 kbp que contém o vetor pTrc99a, budB, ilvD e kivD foi purificado em gel. O fragmento do vetor de 9,4 kbp foi auto-ligado para criar pTrc99A::budB-ilvD-kivD e transformado em células competentes DH5a (Invitrogen). Um clone de pTrc99A::budB-ilvD-kivD foi confirmado para a deleção do gene ilvC por mapeamento por restrição. O plasmídeo resultante pTrc99A::budB-ilvD-kivD foi digerido com Saci e tratado com o fragmento Klenow de DNA polimerase para produzir terminações abruptas. O plasmídeo foi então digerido com BamHI o fragmento resultante de 5,297 bp budB-ilvD-kivD foi purificado em gel. O fragmento de 5,297 bp budB- HvD-kivD foi ligado nos sítios Smal e BamHI do vetor de integração pFP988DssPspac. A mistura de ligação foi transformada em células competentes DH5α. Os transform antes foram selecionados por amplificação PCR do fragmento 5,3 kbp budB-ilvD-kivD com os primers T-budB (bamHI) (SEQ ID NO: 144) e B-kivD (BamHI) (SEQ ID NO: 145). 0 clone correto foi denominado pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD.

[0130] 0 plasm ideo pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD foi preparado a partir de transform antes E. coli, e transformados no interior de células competentes B. subtilis BE1010, que foram preparadas como descrito por Doyle et al. (J. Bacteriol. 144:957 (1980)). Células competentes foram colhidas por centrifugação e os pellets de células foram ressuspensos em um volume pequeno do sobrenadante. Para um volume de células competentes, dois volumes do meio SPII-EGTA (Methods for General and Molecular Bacteriology, P. Gerhardt et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, DC (1994)) foram adicionados. Alíquotas (0,3 ml) de células foram distribuídas em tubos de ensaio e então 2 a 3 pg do plasmídeo pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD foi adicionado aos tubos. Os tubos foram incubados por 30 min a 37°C com agitação, depois disso, 0,1 mL de 10% de extrato de levedura foi adicionado a cada tubo e eles foram mais adiante incubados por 60 min. Os transformantes foram cultivados para seleção em placas LB contendo eritromicina (1,0 pg/mL) usando-se o método de duplo revestimento com ágar (Methods for General and Molecular Bacteriology, acima). Os transformantes foram selecionados por amplificação PCR com os primers N130SeqF1 (SEQ ID NO:40) e N130SeqR1 (SEQ ID NO:44) para budB e N133SeqF1 (SEQ ID NO:62) e N130SeqR1 (SEQ ID NO:66) para kivD. Integrantes positivos mostraram os produtos PCR esperados 1,7 kbp budB e 1,7 kbp kivD. Dois integrantes positivos foram identificados e denominados B. subtilis BE1010 ΔsacB::Psapc-budB-ilvD-kivD#2-3-2 e B. subtilis BE1010 ΔsacB::Psapc-budB-ilvD-kivD#6-12-7.

[0131] O teste das atividades enzimáticas nos integrantes B. subtilis BE1010 ΔsacB::Psapc-budB-ilvD-kivD#2-3-2 e B. subtilis BE1010 ΔsacB::Psapc-budB-ilvD-kivD#6-12-7 indicaram que as atividades de BudB, ilvD e kivD foram baixas sob o controle do promotor spac (Pspac). Para melhorar a expressão de enzimas funcionais, o promotor Pspac foi substituído por um promotor PgroE a partir do plasmídeo pHT01 (MoBitec, Goettingen, Alemanha).

[0132] Um fragmento do vetor de 6,039bp FP988Dss, fornecido como SEQ ID NO:146, foi removido de um plasmídeo não relacionado por digestão por restrição com Xhol e BamHI, e foi purificado em gel. O promotor PgroE foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo pHT01 com primers T- groE(Xhol) (SEQ ID NO:147) e B-groEL (Spel, BamHI) (SEQ ID NO:148). O produto PCR foi digerido com Xhol e BamHI, ligado ao fragmento do vetor 6,039 bp pFP988Dss, e transformado no interior de células DH5a competentes. Os transform antes foram selecionados por amplificação PCR com os primers T-groE (Xhol) e B-groEL (Spel, BamHI). Os clones positivos mostraram os produtos esperados 174 bp PgroEPCR e foram denominados pFP988DssPgroE. O plasmídeo pFP988DssPgroE foi também confirmado pela sequência de DNA.

[0133] O plasmídeo pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD foi digerido com Spel e Pmel e o fragmento resultante 5,313 budB-ilvD-kivD foi purificado em gel. O fragmento budB-ilvD-kivD foi ligado nos sítios Spel e Pmel de pFP988DssPgroE e transformados no interior de células DH5a competentes. Os clones positivos foram selecionados para um produto PCR 1,690 por amplificação por PCR com os primers T-groEL (SEQ ID NO: 149) e N111 (SEQ ID NQ:20). Os clones positivos foram denominados pFP988DssPgroE-budB-ilvD-kivD.

[0134] O plasmídeo pFP988DssPgroE-budB-ilvD-kivD foi preparado a partir do transformante E. coli, e transformado no interior de células competentes Bacillus subtilis BE1010 como descrito acima. Transformantes foram selecionados por amplificação por PCR com os primers N130seqF1 (SEQ ID NO:40) e N130SeqR1 (SEQ ID NO:44) para budB, e N133SeqF1 (SEQ ID NO:62) e N133SeqR1 (SEQ ID NO:66) para kivD. Integrantes positivos mostraram os produtos esperados 1,7 kbp budB e 1,7 kbp kivD budB. Dois integrantes positivos foram isolados e denominados B. subtilis BE1010 ΔsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7 e B. subtilis BE1010 ΔsacB::PgroE- budB-ilvD-kivD#8-16.

PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DOS GENES ILVC E BDHB

[0135] Dois genes remanescentes de isobutanol, ilvC e bdhB, foram expressos a partir de um palsmídeo. Plasmídeo pHT01 (MoBitec), um vetor tipo ponte de Bacillus-E.coli, foi usado para unir um gene ilvC de B. subtilis a um promotor PgroE, de forma que o gene ilvC foi expressado a partir do promotor PgroE que contém uma sequência laco. O gene ilvC, fornecido como SEQ ID NO: 186, foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico de B. subtilis BR151 (ATCC 33677) com primers T-ilvCB.s. (BamHI) (SEQ ID NQ:150) e B-ilvCB.s (Spel BamHI) (SEQ ID NO:151). O produto PCR 1,067 bp ilvc foi digerido com BamHI e ligado ao sítio BamHI de pHT01. A mistura de ligação foi transformada em células competentes DH5a. Os clones positivos foram selecionados para um produto PCR 1,188 bp por amplificação por PCR com os primers T-groEL e B-ilvB.s. (Spel BamHI). O clone positivos foi denominado pHTOI-ilvC(B.s). O plasmídeo pHTOI-ilvC(B.s) foi usado como um modelo para amplificação por PCR do fragmento unido PgroE-/7vC.

[0136] O plasmídeo pBD64 (Minton et al., Nucleic Acids Res. 18:1651 (1990)) é um vetor pouco estável para expressão de genes estranhos em B. subtilis e contém um gene repB e genes de resistência para cloranfenicol e kanamicina para seleção em B. subtilis. Este plasmídeo foi usado para expressão de ilvC e bdhB sob o controle de um promotor PgroE. Para clonar PgroE-/7vC, bdhB e um gene repressor lacl no plasmídeo pBD64, um método de montagem de uma etapa foi usado (Tsuge et al., Nucleic Acids Res. 31: e133 (2003)). Um fragmento de 3,588 bp pBD64 contendo um gene repB, que incluiu a função de replicação, e o marcador antibiótico kanamicina foi amplificado por PCR a partir de pBD64 com primers T-BD64 (Drall) (SEQ ID NO: 152), que introduziu uma sequência Dralll (CACCGAGTG), e B-BD64 (Dralll) (SEQ ID NO: 153), que introduziu uma sequência Dralll (CACCTGGTG). Um gene repressor 1,327 bp lacl foi amplificado por PCR a partir de pMUTIN4 (Vagner et al., Microbiol. 144.3097- 3104 (1998)) com T-laclq (Dralll) (SEQ ID NO: 154), que introduziu uma sequência Dralll (CACCAGGTG) e B-laclq (Dralll) (SEQ ID NO:155), que introduziu uma sequência Dralll (CACGGGGTG). Um cassette unido de 1,224 bp PgroE-/7vC foi amplificado por PCR a partir de pHTOI-ilvC(B.s) com T-groE (Dralll) (SEQ ID NO:156), que introduziu uma sequência Dralll (CACCCCGTG) e B.s.ilvC (Dralll) (SEQ ID NO:157), que introduziu uma sequência Dralll (CACCGTGTG). Um gene de 1,2 kbp bdhB (SEQ ID NO: 158) foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico de Clostridium acetobutylicum (ATCC 824) com primers T-bdhB(Dralll) (SEQ ID NO:159), que introduziu uma sequência Dralll (CACACGGTG) e B-bdhB (rmBT1 Dralll) (SEQ ID NO: 160), que introduziu uma sequência Dralll (CACTCGGTG). As três letras sublinhadas na região variável das sequências de reconhecimento Dralll foram designadas para pareamento de base específico para montar quatro fragmentos com uma ordem de pBD64-lacl-PgroEilvC-bdhB. Cada produto PCR com sítios Dralll em ambas as terminações foi digerido separadamente com Dralll, e os fragmentos Dralll resultantes, 3,588 bp pBD64, lacl, PgroE/7vC e bdhB foram purificados em gel usando-se um kit de extração em gel QIAGEN (QIAGEN). Uma mistura contendo uma concentração equimolar de cada fragmento com uma concentração total de DNA de 30 a 50 pg/100 pL foi preparada para ligação. A solução de ligação foi então incubada a 16°C durante a noite. A ligação gerou arranjos repetidos de DNA de alto peso molecular. A mistura de DNA linear longo ligado, foi diretamente transformada em B. subtilis competentes BE1010, preparada como descrito acima. B. subtilis preferencialmente assume formas repetidas de DNA linear longo, ao invés de DNA circular, para construir um plasmídeo. Após a transformação, a cultura foi espalhada em uma placa LB contendo 10 pg/mL de kanamicina para seleção. Plasmídeos recombinantes positivos foram selecionados por digestão Dralll, fornecendo quatro fragmentos com um tamanho esperado de 3,588 bp (pBD640, 1,327 bp (/ac/), 1,224 bp (PgorE-/7vC), e 1,194 bp (bdhB). O plasmídeo positivo foi denominado pBDPgroE-ilvC(B.s)-bdhB.

DEMONSTRAÇÃO DE PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL A PARTIR DE GLICOSE OU SACAROSE PORB. SU5T/L/SBE1010ASACB::PGROE-BUDB-ILVD- KIVD/PBDPGROE-ILVC(B.S)-BDHB

[0137] Para construir o B. subtilis recombinante que expressa os cinco genes da via biossintética do isobutanol, células competentes de dois integrantes B. subtilis BE1010 ΔsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7 e B.subtilis BE1010 ΔsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#8-16 foram preparadas como descrito acima e transformadas com o plasmídeo pBVPgroE-ilvC (B.s)-bdhB produzindo B. subtilis BE1010 ΔsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7/pBDPgroE-ilvC(B.s)-bdhB e B. subtilis BE1010 ΔsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#8-16/pBDPgroE-ilvC(B.s.)- bdhB.

[0138] As duas linhagens recombinantes foram inoculadas tanto em 25 ml como 100 ml de glicose contendo kanamicina (10 pg/mL) em frascos de 125 ml para simular condições de oxigênio alta e baixa, respectivamente, e cultivadas a 37°C com agitação a 200 rpm. O meio consistia de 10 mM (NH4)2SO4, 5 mM de tampão fosfato de potássio (pH 7,0), 100 mM de tampão MOPS/KOH (pH 7,0), 20 mM de ácido glutâmico/KOH (pH 7,0), 2% de mistura de metal S10, 1% de glicose, 0,01% de extrato de levedura, 0,01% de ácido casamino e 50 pg/mL cada um de, L-triptofano, L-metionina e L-lisina. A mistura de metal S10 consistia 200 mM de MgCte, 70 mM de CaCl2, 5 mM de MnCl2, 0,1 mM de FeCIs, 0,1 mM de ZnCl2, 0,2 mM de hidrocloreto de tiamina, 0,172 mM de CuSCU (), 0,253 mM de C0CI2 () e 0,242 mM de Na2Moθ4. As células foram induzidas com 1,0 mM de isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) na fase log inicial (ODΘOO de aproximadamente 0,2). Após 24h de inoculação, uma alíquota do caldo foi analisada por HPLC (coluna Shodex Sugar SH1011) com detecção de índice de refração (RI) para o conteúdo de isobutanol, como descrito na seção de Métodos Gerais acima. Os resultados de HPLC estão mostrados na Tabela 12. TABELA 12 PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL A PARTIR DE GLICOSE POR LINHAGENS DE B. SUBTILIS BE 101 OΔSACB: :PGROE-BUDB-ILVD-KIVD/PBDPGROE-ILVC(B.S.)-BDHB

B. subtilis a é B. subtilis BE1010 ΔsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7/pBDPgroE- ilvC(B.s)-bdhB B. subtilis b é B. subtilis BE1010 ΔsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#8- 16/pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB.

[0139] O isolado de B. subtilis BE1010 ΔsacB::PgroE-budB-ilvD- kivD#1-7/pBDPgroE-ilvC(B.s)-bdhB foi também examinado para produção de isobutanol a partir de sacarose, essencialmente como descrito acima. A linhagem recombinante foi inoculada em 25 mL ou 75 mL de meio de sacarose contendo kanamicina (10 pg/mL) em frascos de 125 mL para simular níveis de oxigênio alto e médio, respectivamente, e cultivadas a 37°C com agitação a 200 rpm. O meio de sacarose era idêntico ao meio de glicose, exceto que a glicose (10 g/L) foi substituída por 10 g/L de sacarose. As células foram induzidas ou não induzidas com 1,0 mM de isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) na fase log inicial (ODΘOO de aproximadamente 0,2). Após 24h de inoculação, uma alíquota do caldo foi analisada por HPLC (coluna Shodex Sugar SH1011) com detecção de índice de refração (RI) para o conteúdo de isobutanol, como descrito na seção de Métodos Gerais acima. Os resultados de HPLC estão fornecidos na Tabela 13. TABELA 13 PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL A PARTIR DE SACAROSE POR LINHAGEM DE B. SUBTILIS BE 101 OASACB: :PGROE-BUDB-ILVD-KIVD/PBDPGROE-ILVC(B.S.)-BDHB

B. subtilis a é B. subtilis BE1010 ΔsacB::PgroE-budB-ilvD-kivD#1-7/pBDPgroE- ilvC(B.s)-bdhB.

EXEMPLO 21 (PROFÉTICO) EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM LACTOBACILLUS PLANTARUM

[0140] O propósito deste Exemplo é descrever como expressar uma via biossintética do isobutanol em Lactobacillus plantarum. Os cinco genes da via do isobutanol, que codificam cinco atividades enzimáticas estão divididos no interior de cinco operons para expressão. Os três genes BudB, ilvD e kivD, que codificam as enzimas acetolactato sintase, ácido acetohidroxi desidratase e ceto-ácido descarboxilase de cadeia ramificada, respectivamente, estão integrados no cromossomo de Lactobacillus plantarum por recombinação homóloga usando-se o método descrito por Hols et al. (Appl. Environ. Microbiol. 60:1401-1413 (1994)). Os dois genes remanescentes (ilvC e bdhB, que codificam as enzimas ácido acetohidroxi redutoisomerase e butanol desidrogenase, respectivamente) são clonados no interior de um plasmídeo de expressão e transformados no interior da linhagem Lactobacillus que carrega os genes integrados do isobutanol. Lactobacillus plantarum é cultivado em meio MRS (Difco Laboratories, Detroit, Ml) a 37°C e o DNA cromossômico é isolado como descrito por Moreira et al. (BMC Microbiol 5:15 (2005)).

INTEGRAÇÃO

[0141] O cassette budB-ilvD-kivD sob o controle do promotor sintético P11 (rud et al., Microbiology 152:1011-1019 (2006)) é integrado no cromossomo Lactobacillus plantarum ATCC BAA-793 (NCIMD 8826) no locus idhl1 por recombinação homóloga. Para construir o vetor de direcionamento de integração IdhL, um fragmento de DNA de Lactobacillus plantarum (Genbank NC_004567) com homologia para IdhL é amplificado por PCR com os primers LDH EcoRV F (SEQ ID NO:161) e LDH AatlIR (SEQ ID NO:162). O fragmento de PCR de 1986 bp é clonado no interior de pCR4Blunt-TOPO e sequenciado. O clone pCR4Blunt-TOPO-idhl1 é digerido com EcoRV e aatll liberando um fragemento de 1982 bp IdhH que é purificado em gel. O vetor de integração pFP988, fornecido como SEQ ID NO: 177 é digerido com Hindlll e tratado com Klenow de DNA polimerase para produzir terminações abruptas. O plasmídeo linearizado é então digerido com Aatll e o fragmento do vetor de 2931 bp é purificado em gel. O fragmento EcoRV/Aatll Idhl é ligado ao fragmento do vetor pFP988 e transformado no interior de células E. coli Top10. Os transformantes são selecionados em placas ágar LB contendo ampicilina (100 pg/mL) e são selecionados por amplificação por PCR de colônia para confirmar a construção de pF988-ldhL.

[0142] Para adicionar um marcador selecionável ao DNA de integração, o gene Cm com seu promotor é amplificado por PCR a partir de pC194 (genBank NC_002013, SEQ ID NO:267) com os primers Cm F (SEQ ID NO:163) e Cm R (SEQ ID NO:164), que amplifica um produto de PCR de 836 bp. Este produto de PCR é clonado no interior de pCR4Blunt-TOPO e transformado no interior de células E. coli Top10, criando pCR4Blunt- TOPO-Cm. Após o sequenciamento para confirmar se não há erros, são introduzidos por PCR, o cassette Cm é digerido a partir de pCR4Blunt- TOPO-Cm como um fragmento de 828 bp Mlul/Swal e é purificado em gel. O vetor de integração pFP988-ldhL contendo homologia com IdhL é digerido com Mlul e Swal e o fragmento do vetor é purificado em gel. O fragmento do cassette Cm é ligado ao vetor pFP988-ldhL criando pFP988- DldhL::Cm.

[0143] Finalmente o cassette budB-ilvD-kivD de pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD, descrito no Exemplo 20, é modificado para repor o promotor amilase com o promotor sintético P11. Então, o operon completo é transferido para pFP988-DldhL::Cm. O promotor P11 é construído por anelamento de oligonucleotídeo com o primer P11 F-Stul (SEQ ID NO:165) e P11 F-Stul (SEQ ID NO:166). O oligonucleotídeo anelado é purificado em um gel 6% Ultra PAGE (Embi Tec., San Diego, CA). O plasmídeo pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD, contendo o promotor amilase, é digerido com Stul e Spel e o fragmento do vetor resultante de 10,9 kbp é purificado em gel. O fragmento P11 isolado é ligado ao pFP988DssPspac-budB-ilvD-kivD digerido para criar pFP988-P11-budB- ilvD-kivD. O plasmídeo pFP988-P11 -budB-ilvD-kivD é então digerido com Stul e BamHI e o fragmento resultante de 5,4 kbp P11 -budB-ilvD-kivD é purificado em gel. pFP988-Dldhl_::Cm é digerido com Hpal e BamHI e o fragmento do vetor de 5,5 kbp isolado. O operon budB-ilvD-kivD é ligado com o vetor de integração pFP988-Dldhl_::Cm para criar pFP988-Dldhl_- P11 -budB-ilvD-kivD:: Cm.

INTEGRAÇÃO DE PFP988-DLDHL-P11-BUDB-ILVD-KIVD::CM EM L. PLANTARUM BAA-793 PARA FORMAR L. PLA/VTARUM ALDHLI ::BUDB-ILVD-KIVD::CM QUE COMPREENDE OS GENES EXÓGENOS BUDB, ILVDEKIVD.

[0144] Células eletrocompetentes de L plantarum são preparadas como descrito por Aukrust, T.W., et al. (Em: Electroporation Protocols for Microorganisms, Nickoloff, J.A., Ed.; Methods in Molecular Biology, Vol. 47; Humana Press, Inc., Totowa, NJ, 1995, PP 201-208). Após eletroporação as células foram superadas em crescimento meio MRSSM (meio MRS suplementado com 0,5 M de sacarose e 0,1 M de MgCte) como descrito por Aukrust et al., acima por 2 horas a 37°C sem agitação. As células eletroporadas são plaqueadas para seleção em placas MRS contendo cloranfenicol (10 pg/ml) e incubadas a 37°C. Os transform antes são inicialmente selecionados por amplificação por PCR de colônia para confirmar integração, e os clones positivos iniciais são então selecionados de forma mais rigorosa por amplificação por PCR com uma bateria de primers.

PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DOS GENES ILVC E BDHB

[0145] Dois genes remanescentes de isobutanol são expressos a partir do plasmídeo pTRKH3 (O’Sullivan DJ e Klaenhammer TR, Gene 137:227-231 (1993)) sob o controle do promotor Idhl de L plantarum (Ferain et al., J. Bacteriol. 176:596-601 (1994)). O promotor IdhL é amplificado por PCR a partir do genoma de L. plantarum ATCC BAA-793 usando-se os primers PldhL F-Hindlll (SEQ ID NO:167). e PldhL R-BamHI (SEQ ID NO:168). O produto PCR de 411 bp é clonado em pCR4Blunt-TOPO e sequenciado. O plasmídeo resultante, pCR4Blunt-TOPO-PldhL é digerido com Hindlll e BamHI liberando o fragmento PldhL.

[0146] O plasmídeo pTRKH3 é digerido com Hindlll e Sphl e o fragmento do vetor purificado em gel é ligado ao fragmento Pldhl e o fragmento de 2,4 kbp BamHI/Sphl purificado em gel contendo ilvC(B.s.)-bdhB do plasmídeo de expressão de Bacillus pBDPgroE-ilvC(B.s.)-bdhB (Exemplo 20) em uma ligação de três tipos. A mistura de ligação é transformada no interior de células E. coli Top 10 e os transform antes são cultivados em placas de Infusão de Cérebro e Coração (BHI, Difco Laboratories, Detroit, Ml) contendo eritromicina (150 mg/L).

[0147] Os transformantes são selecionados por amplificação por PCR para confirmar construção. O plasmídeo de expressão resultante, pTRKH3-ilvC(B.s.)-bdhB é transformado no interior de ΔldhL1::budB-ilvD- kivD::Cm por eletroporação, como descrito acima.

[0148] L plantarum ΔldhLI::budB-ilvD-kivD::Cm contendo pTRKH3-ilvC(B.s.)-bdhB é inoculado em um frasco de agitação de 250 mL contendo 50 ml de meio MRS mais eritromicina (10 pg/mL) e cultivados a 37°C por 18 a 24 h sem agiração, após isto o isobutanol é detectado por análise HPLC ou GC, como descrito na seção de Métodos Gerais.

EXEMPLO 22 EXPRESSÃO DE UMA VIA BIOSSINTÉTICA DO ISOBUTANOL EM ENTEROCOCCUS FAECALIS

[0149] O propósito deste Exemplo é descrever como expressar uma via biossintética do isobutanol em Enterococcus faecalis. A sequência completa do genoma de Enterococcus faecalis linhagem V583, que é usada como linhagem hospedeira para expressão de uma via biossintética do isobutanol neste Exemplo, foi publicada (Paulsen et al., Science 299:2071-2074 (2003)). Um vetor tipo ponte de E.co//7Gram-positivo, plasmídeo pTRKH3 (O’Sullivan DJ e Klaenhammer TR, Gene 137:227-231 (1993)), é usado para expressão dos cinco genes (budB, ilvC, ilvD, kivD, bdhB) da via do isobutanol em um operon. pTRKH3 contém um plasmideo de origem de replicação p15A de E. coli, o replicon pAMβl, e dois marcadores de seleção para resistência a antibióticos para tetraciclina e eritromicina. A resistência à tetraciclina é expressada somente em E.coli, e a resistência à eritromicina é expressada tanto em E.coli como em bactéria Gram-positiva. Os derivados do plasmideo pAMβl podem se replicar em E. faecalis (Poyart et al., FEMS Microbiol. Lett. 156:193-198 (1997)). O promotor induzível nisA (PnisA), que foi usado para controle eficiente da expressão gênica por nisina em uma variedade de bactérias Gram-positivas incluindo Enterococcus faecalis (Eichenbaum et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:2763-2769 (1998)), é usado para controlar expressão dos cinco genes desejados que codificam as enzimas da via biossintética do isobutanol.

[0150] O plasmideo pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD (descrito no Exemplo 14), que contém o operon da via biossintética do isobutanol, é modificado para substituir o gene ilvC de E.coli (SEQ ID NO:3) com o gene ilvC de B. subtilis (SEQ ID NO:??). Adicionalmente, o gene bdhB (SEQ ID NO: 158) de Clostridium acetobutylicum é adicionado na terminação do operon. Primeiro, o gene bdhB de pBDPgroE-ilvC (B.s)-bhB (descrito no exemplo 20) é amplificado usando-se os primers F-bdhB-Avrll (SEQ ID NO:169) e R-bdhB-BamHI (SEQ ID NQ:170), e então clonado TOPO e sequenciado. O fragmento de 1194 bp bdhB é isolado por digestão com Avrll e BamHI, seguido por purificação em gel. Este fragmento é ligado ao pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD que foi previamente digerido com Avrll e BamHI e o fragmento resultante é purificado em gel. A mistura de ligação é transformada no interior de células E. coli Top 10 por eletroporação e os transformantes são selecionados seguindo cultivo durante a noite a 37°C em placas ágar LB contendo ampicilina (100 pg/mL). Os transformantes são então selecionados por PCR de colônia para confirmar o clone correto contendo pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD-bdhB

[0151] Depois, ilvC(B.s.) é amplificado a partir de pBDPgroE- ilvC(B.s.)-bdhB (descrito no Exemplo 20) usando-se primers F-ilvC(B.s.)-Aflll (SEQ ID NO:171) e R-ilvC(B.s.)-Notl (SEQ ID NO:172). O produto de PCR é clonado TOPO e sequenciado. O fragmento de 1051 bp /7vC(B.s.) é isolado por digestão com Aflll e Notl seguido por purificação em gel. Este fragmento é ligado ao pTrc99A::budB-ilvC-ilvD-kivD-bdhB que foi cortado com Aflll e Notl para liberar ilvC de E.coli (a banda do vetor de 10,7 kbpp é purificada em gel antes da ligação com ilvC(B.s.)). A mistura de ligação é transformada no interior de células E. coli Top 10 por eletroporação e os transformantes são selecionados seguindo cultivo durante a noite a 37°C em placas ágar LB contendo ampicilina (100 pg/mL). Os transformantes são então selecionados por PCR de colônia para confirmar o clone correto contendo pTrc99A::budB-ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB

[0152] Para fornecer um vetor tipo ponte pTRKH3 para E. coli Gram- positiva, o promotor nisA (Chandrapati et al., Mol. Microbiol. 46(2):467-477 (2002)) é amplificado por PCR a partir do DNA genômico de Lactococcus lactis com primers F-PnisA(Hindlll) (SEQ ID NO:173) e R-PnisA(Spel BamHI) (SEQ ID NO:174) e então clonado TOPO. Após sequenciamento, o fragmento do promotor nisA de 312 bp é isolado por digestão com Hindlll e BamHI seguido por purificação em gel. O plasmídeo pTRKH3 é digerido com Hindlll e BamHI e o fragmento do vetor é purificado em gel. pTRKH3 linearizado é ligado ao fragmento PnisA e transformado no interior de células E. coli Top10 por eletroporação. Os transformantes são selecionados seguindo cultivo durante a noite a 37°C em placas ágar LB contendo eritromicina (25 pg/mL). Os transformantes são então selecionados por PCR de colônia para confirmar o clone correto de pTRKH3-PnisA.

[0153] O plamídeo pTRKH3-PnisA é digerido com Spel e BamHI, e o vetor é purificado em gel. O plasmídeo pTrc99A::budB-ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB, descrito acima, é digerido com Spel e BamHI, e o fragmento de 7,5 kbp purificado em gel. O fragmento de 7,5 kbp budB-ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB é ligado no vetor pTRKH3-PnisA nos sítios Spel e BamHI. A mistura de ligação é transformada no interior de células E. coli Top 10 por eletroporação e os transform antes são selecionados seguindo cultivo durante a noite a 37°C em placas ágar LB contendo eritromicina (25 pg/mL). O plasmídeo resultante é denominado pTRKH3-PnisA- budB-ilvC(B.s.)-ilvD-kivD-bdhB. O plasmídeo é preparado a partir de transformantes E. coli e transformados no interior de células E. faecalis V583 por eletroporação usando-se métodos conhecidos na técnica (Aukrust, T.W., et al., Em: Eletroporation Protocols for Microorganisms', Nickoloff, J.A., Ed.; Methods in Molecular Biology, Vol. 47; Humana Press, Inc., Totowa, NJ., 1995, páginas 217-226), resultando em E. faecalis V583/pTRKH3-PnisA-budB-ilvC(B.s)-ilvD-kivD-bdhB.

[0154] O segundo plasmídeo contendo genes reguladores nisA, nisR e nisK, o gene add9 de resistência à espectromicina, e a origem de replicação pSH71 é transformado no interior de E. faecalis V583/pTRKH3-PnisA-budB- ilvC(B.s)-ilvD-kivD-bdhB por eletroporação. O plasmídeo contendo a origem de replicação pSH71 é compatível ∞m derivados pAMβl em E. faecalis (Eichenbaum et al, acima). Transformantes resistentes às duas drogas são selecionados em placas em placas ágar LB contendo eritromicina (25 pg/mL) e espectromicina (100 pg/mL), cultivados a 37°C.

[0155] As linhagens resultantes V583B de E. faecalis contendo os dois plasmídeos, isto é, um plasmídeo de expressão (pTRKH3-PnisA-budB- ilvC(B.s)-ilvD-kivD-bdhB) e um plasmídeo regulaor (pSH71-nisRK), é inoculado em um frasco de agitação contendo 50 ml de caldo Todd-Hewitt suplementado com extrato de levedura (0,2%) (Fischetti et al., J. Exp. Med. 161; 1384-1401 (1985)), nisina (20 g/mL) (Eichenbaum et al., acima), eritromicina (25 pg/mL), e espectromicina (100 pg/mL). O frasco é incubado sem agitação a 37°C por 18-24 h, após esse tempo, a produção de isobutanol é medida por análise HPLC ou GC, como descrito na seção de Métodos Gerais.

Claims

1. CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA RECOMBINANTE, caracterizada por compreender quatro ou cinco moléculas de DNA, simultaneamente expressas, que codificam polipeptídeos que catalisam a conversão do substrato para produto, em que os genes são selecionados do grupo que consiste em: I) budB e a/sS envolvidos na via de reação de piruvato para acetolactato, II) ilvC e ílvõ envolvidos na via de reação de acetolactato para 2,3- dihidroxi-isovalerato, III) ilvD e ilv3 envolvidos na via de reação de 2,3-dihidroxi- isovalerato para a-ceto-isovalerato, IV) kivD envolvido na via de reação de a-ceto-isovalerato para isobutiraldeido, e V) bdhB e yqhD envolvidos na via de reação de isobutiraldeido para isobutanol em que dita célula hospedeira microbiana recombinante é selecionada a partir de Escherichia coli, Bacillus subtilis e Saccharomyces cerevisiae, em que ditas moléculas de DNA são heterólogas para dita célula hospedeira microbiana e, em que dita célula hospedeira microbiana produz isobutanol.

2. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela enzima expressa na via de reação de piruvato para acetolactato ser selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 178 e SEQ ID NQ:180.

3. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela enzima expressa na via de reação de acetolactato para 2,3-dihidroxi- isovaleratoser selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:183 e SEQ ID NO:185.

4. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela enzima expressa na via de reação de 2,3-dihidroxi-isovalerato para a-ceto- isovaleratoser selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188 e SEQ ID NQ:190.

5. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela enzima expressa na via de reação de isobutiraldeído para isobutanol ser selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NQ:10, SEQ ID NO:199, SEQ ID NQ:201, SEQ ID NQ:203 e SEQ ID NQ:204.

6. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela enzima expressa na via de reação de a-ceto-isovalerato para isobutiraldeído ser selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:195 e SEQ ID NO:197.

7. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE ISOBUTANOL, caracterizado por compreender: 1) fornecer uma célula hospedeira microbiana recombinante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; 2) contatar a célula hospedeira de (i) com um substrato de carbono fermentável em um meio de fermentação sob condições através das quais o isobutanol é produzido.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo o substrato de carbono fermentável ser selecionado do grupo que consiste de monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo substrato de carbono ser selecionado do grupo que consiste de glicose, sacarose e frutose.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelas condições através das quais o isobutanol é produzido serem anaeróbicas.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelas condições através das quais o isobutanol é produzido serem microaeróbicas.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela célula hospedeira ser contatada com o substrato de carbono em um meio mínimo.