BRPI0710514A2 - compostos orgánicos, seus usos e processos de preparação, e composições farmacêuticas compreendendo os mesmos - Google Patents

Abstract

<B>COMPOSTOS ORGáNICOS, SEUS USOS E PROCESSOS DE PREPARAçãO, E COMPOSIçõES FARMACêUTICAS COMPREENDENDO OS MESMOS<D>. A presente invenção refere-se a um composto de fórmula (1) e sua preparação e uso como produtos farmacêuticos em que R^ 1^, R^2 ^ e R^ 3^ são como aqui definidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOS-TOS ORGÂNICOS, SEUS USOS E PROCESSOS DE PREPARAÇÃO, ECOMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO OS MESMOS".

A presente invenção refere-se a compostos orgânicos, sua pre-paração e uso como produtos farmacêuticos.

Em um aspecto, a presente invenção fornece compostos de fór-mula (I)

<formula>formula see original document page 2</formula>

em forma livre ou de sal, em que

R1 indica um grupo heterocíclico de 3 a 12 membros ligado a Ncontendo de 1 a 4 átomos de nitrogênio no anel e opcionalmente contendode 1 a 4 outros heteroátomos selecionados no grupo que consiste em oxigê-nio e enxofre, esse grupo sendo opcionalmente substituído por oxo, CrC8-alcóxi, C6-C10-arila, R1a ou por C1-C8-alquila opcionalmente substituída porOH, ou

R1 é -NH-C1-C8-alquil carbonila opcionalmente substituída porOH, -NH-C3-C8-Cicloalquil carbonila, -NH-S02-C1-C8-alquila, -NH-C7-C14-aralquil carbonila, -NH-C(=0)-grupo heterocíclico de 3 a 12 membros, -NH-C(=O)-C6-C10-arila ou -NH-C(=O)-C(=O)-NH-C1-C8-alquila opcionalmentesubstituída por R1a, onde R1a é um grupo heterocíclico de 3 a 12 membroscontendo pelo menos um heteroátomo no anel selecionado no grupo queconsiste em nitrogênio, oxigênio e enxofre, o referido anel heterocíclico de 3a 12 membros sendo opcionalmente substituído por halo, ciano, oxo, OH,carbóxi, amino, nitro, CrC8-alquila, CrC8-alquil sulfonila, aminocarbonila,C1-C8-alquil carbonila ou Ci-C8-alcóxi opcionalmente substituído por amino-carbonila;

R2 é selecionado no grupo que consiste em C1-C8-alquila, R-eS- 1-feniletila, um grupo benzila não substituído, e um grupo feniletila oubenzila substituído em uma ou mais posições com um substituinte seleC10-nado no grupo que consiste em C1-C8-alquila, amino, halo, C1-C8-haloalquila,nitro, OH1 acetamido, C1-C8-alcóxi e sulfo, ou

<formula>formula see original document page 3</formula>

onde

R2a é halo, trifluorometila, ciano, C1-C8-alquila, C1-C8-alquilóxi,etenila ou etinila;

D é óxi, tio, NH, C1-C8-alquilóxi, C1-C8-alquiltio ou -CO-alquilamino; e

G é um anel de 5 a 8 membros parcialmente saturado, totalmen-te saturado ou totalmente insaturado tendo opC10nalmente 1 a 3 heteroáto-mos seleC10nados independentemente entre oxigênio, enxofre e nitrogênio,ou, um anel bicíclico consistindo em dois anéis de 3 a 6 membros fundidosparcialmente saturados, totalmente saturados ou totalmente insaturados,tomados independentemente, tendo opC10nalmente 1 a 4 heteroátomos se-leC10nados independentemente entre nitrogênio, enxofre e oxigênio; em queo referido G é opC10nalmente mono-, di- ou tri-substituído independentemen-te com halo, C1-C8-alquila, trifluorometila, trifluorometóxi, nitro, ciano, C3-C10-cicloalquila, hidróxi ou C1-C8-alcóxi, ou

G é ciano, C1-C8-alcoxicarbonila, C3-C10-cicloalcoxicarbonila,

C(O)NR4R5, C(S)NR4R51 C(NH)NR4NR5, C(N(C1-C3)alquil)NR4R5 ou C(N(C3-C10)cicloalquil)NR4R5;

R3 é seleC10nado entre H, halo, C1-C8-alquila opC10nalmentesubstituída com halo ou OH, C1-C8-alcóxi, amino, C1-C8-alquilamino, C2-C10-alquenos, C2-C10-alquinos opC10nalmente substituídos por Ci-C8-alquila, arilaopC10nalmente substituída por C1-C8-alquila ou OH, tio e C1-C8-alquiltio;

R4 é uma ligação, H, C1-C10-alquila, hidróxi, C1-C10-alcóxi, C3-C10-cicloalcóxi ou um anel de 5 a 8 membros parcialmente saturado, total-mente saturado ou totalmente insaturado opC10nalmente ligado através deC1-C8-alquila, opcionalmente tendo 1 a 3 heteroátomos selecionados inde-pendentemente entre oxigênio, enxofre e nitrogênio, ou, um anel bicíclico ouum anel bicíclico com ponte C1-C8- opcional opcionalmente ligada através deC1-C8-alquila, o referido anel bicíclico ou anel bicíclico com ponte opcional-mente tendo 1 a 4 heteroátomos selecionados independentemente entrenitrogênio, enxofre e oxigênio em que os referidos C1-C10-alquila, C1-C10-alcóxi, C3-C10-cicloalcóxi ou anel(is) de R4 é/são opcionalmente mono-, di-ou tri-substituído(s) independentemente com halo, C1-C8-alquila, trifluorome-tila, nitro, ciano, C3-C10-cicoalquila, OH ou C1-C8-alcóxi;

R5 é uma ligação, H, C1-C8-alquila ou CrCi0-cicloalquila, ou

R4 e R5, tomados juntos com o nitrogênio ao qual eles estão li-gados, formam um anel de 4 a 9 membros totalmente ou parcialmente insa-turados, o referido anel opcionalmente ligado em ponte, opcionalmente ten-do 1 a 3 heteroátomos selecionados independentemente entre oxigênio, en-xofre e nitrogênio, o referido anel sendo opcionalmente mono- ou di-substituído independentemente com oxo, hidróxi, C1-C8-alcóxi, C1-C8-alquila,amino, mono-N- ou di-N,N-C1-C8-alquil aminocarbonila, mono-N- ou di-N,N-C3-C10-cicloalquil aminocarbonila,N-C1-C8-alquil -N-C3-C10-cicloalquil amino-carbonila, mono-N- ou di-N,N-C1 -C8-alquil amino, mono-N-ou di-N,N-C3-C10-cicloalquilamino, N-C1-C8-alquil -N-C3-C10-cicloalquilamino, formilamino, C1-C8-alquil carbonilamino, C3-C10-cicloalquil carbonilamino, C1-C8-alcoxicarbonilamino, N-C1-C8-alcoxicarbonil-W-C1-C8-alquilamino, C1-C8-sulfamoíla, C1-C8-alquil sulfonilamino, C3-C10-cicloalquil sulfonilamino ou umanel de 5 a 8 membros parcialmente saturado, totalmente saturado ou total-mente insaturado, opcionalmente ligado através de C1-C8-alquila, opcional-mente tendo 1 a 3 heteroátomos selecionados independentemente entre oxi-gênio, enxofre e nitrogênio, ou, um anel bicíclico consistindo em dois anéisde 3 a 6 membros fundidos parcialmente saturados, totalmente saturados outotalmente insaturados, tomados independentemente, opcionalmente ligadosatravés de C1-C8-alquila, opcionalmente tendo 1 a 4 heteroátomos selecio-nados independentemente entre nitrogênio, enxofre e oxigênio, e opcional-mente mono- ou di-substituído com halo, trifluorometila, trifluorometóxi, C1-C8-alquila ou C1-C8-alcóxi.

Em outro aspecto, a presente invenção provê compostos defórmula (I)

<formula>formula see original document page 5</formula>

Em forma livre ou de sal, em que

R1 indica um grupo heterocíclico de 3 a 12 membros ligado a Ncontendo de 1 a 4 átomos de nitrogênio no anel e opcionalmente contendode 1 a 4 outros heteroátomos selecionados no grupo que consiste em oxigê-nio e enxofre, ou

R1 é -NH-C1-C8-alquil carbonila;

R2 é C1-C8-alquila ou benzila opcionalmente substituída por ha-logênio, ou

<formula>formula see original document page 5</formula>

R2 é

onde

R2a é halo, trifluorometila, ciano, C1-C8-alquila, C1-C8-alcóxi, ete-nila ou etinila;

Dé óxi, tio, NH, C1-C8-alcóxi, C1-C8-alquiltio ou -CO-alquilamino;e

G é um anel de 5 a 8 membros parcialmente saturado, totalmen-te saturado ou totalmente insaturado tendo opcionalmente 1 a 3 heteroáto-mos selecionados independentemente entre oxigênio, enxofre e nitrogênio,ou, um anel bicíclico consistindo em dois anéis de 3 a 6 membros fundidosparcialmente saturados, totalmente saturados ou totalmente insaturados,tomados independentemente tendo opcionalmente 1 a 4 heteroátomos sele-cionados independentemente entre nitrogênio, enxofre e oxigênio; em que oreferido G é opcionalmente mono-, di- ou tri-substituído independentementecom halo, C1-C8-alquila ; e

R3 é selecionado entre H, halo, C1-C8-alquila opcionalmentesubstituída por halo ou OH, C1-C8-alcóxi, amino, C1-C8-alquilamino, C2-C10-alquenos, C2-C10-alquinos opcionalmente substituídos por C1-C8-alquila, C6-C10-arila opcionalmente substituída por C1-C8-alquila ou OH, tio e C1-C8.alquiltio.

De acordo com a fórmula (I), R1 é adequadamente um grupoheterocíclico de 5 a 12 membros contendo pelo menos um heteroátomo noanel selecionado no grupo que consiste em nitrogênio, oxigênio e enxofre.Preferivelmente R1 é um grupo heterocíclico de 5 a 6 membros, como triazol.

De acordo com a fórmula (I), R1 é também adequadamente -NH-C1-C8-alquilcarbonila. A -NH-C1-C8-alquilcarbonila é preferivelmente -NHC(O)CH3.

onde

R2a é adequadamente um halogênio, como cloro;

D é adequadamente C1-C8-alcóxi; e

G é adequadamente um grupo heterocíclico de 5 membros, co-mo isoxazol mono-substituído por um grupo metila.

De acordo com a fórmula (I), R2 é também adequadamente umgrupo benzila mono-substituído por halogênio. Preferivelmente o halogênio éiodo.

De acordo com a fórmula (I), R2 é também adequadamente C1-C8-alquila. Preferivelmente metila.

De acordo com a fórmula (I), R3 é adequadamente H, halo ouC2-C10-alquinos opcionalmente substituídos por C1-C8-alquila.DefiniçõesTermos usados no relatório possuem os seguintes significados:

"OpC1onalmente substituído" significa que o grupo referido podeser substituído em uma ou mais posições por qualquer radical ou combina-ção de radicais listados abaixo.

"Halo" ou "halogênio", neste contexto, pode ser flúor, cloro, bro-mo ou iodo.

"Hidróxi", neste contexto, é OH.

"C1-C8-alquila ", neste contexto, indica alquila de cadeia reta ouramificada tendo 1 a 8 átomos de carbono. Preferivelmente C1-C8-alquila éC1-C4-alquila .

"C1-C8-alcóxi", neste contexto, indica alcóxi de cadeia reta ouramificada tendo 1 a 8 átomos de carbono, por exemplo, 0-C1C8-alquila .Preferivelmente1 C1C8-alcóxi é C1-C8alcoxi.

"C1-C8-alquilamino" e "di-C1-C8-alquilamino", neste contexto, in-dicam amino substituído respectivamente por um ou dois grupos C1C8-alquila como definido aC1ma, que podem ser iguais ou diferentes.

"C1-C8-alquilcarbonila" e "C1-C8-alcoxicarbonila", neste contexto,indicam C1C8-alquila ou C1Ce-alcóxi, respectivamente, como definido aC1maligados por um átomo de carbono a um grupo carbonila.

"C6-C10-arila", neste contexto, indica um grupo aromático carbo-cíclico monovalente que contém 6 a 10 átomos de carbono e que pode ser,por exemplo, um grupo monocíclico, como fenila; ou um grupo bicíclico, co-mo naftila.

"C7-C14-aralquila ", neste contexto, indica alquila, por exemplo,C1C1aIquiIa, como definido aC1ma, substituído por C6-C10-arila, como aC1madefinido. Preferivelmente, C7-C14-aralquila é C7-C10-aralquila, como fenil-C1C4-alquila .

"C1-C8-alquilaminocarbonila" e "C3-C8-C1cloalquilaminocarbonila"neste contexto indicam C1C8-alquilamino e C3-C8-C1cloalquilamino respecti-vãmente como aC1ma definido ligados por um átomo de carbono a um grupocarbonila. Preferivelmente C1C8-alquilaminocarbonila e C3-C8-C1cloalquil -aminocarbonila são C1C1alquilaminocarbonila e C3-C8-cicloalquilaminocarbonila, respectivamente.

"grupo C3-C15-carbocíclico", neste contexto, indica um grupocarbocíclico tendo 3 a 15 átomos de carbono no anel, por exemplo, um gru-po monocíclico, seja aromático ou não-aromático, como ciclopropila, ciclo-pentila, cicloexila, cicloeptila, ciclooctila ou fenila; ou um grupo bicíclico, co-mo biciclooctila, biciclononila, biciclodecila, indanila ou indenila, novamentequalquer um deles podendo ser substituído por um ou mais, usualmente umou dois, grupos C1-C4-alquila.

"anel heterocíclico de 3 a 12 membros contendo pelo menos umheteroátomo no anel selecionado no grupo que consiste em nitrogênio, oxi-gênio e enxofre", neste contexto, pode ser, por exemplo, furano, pirrol, pirro-lidina, pirazol, imidazol, triazol, isotriazol, tetrazol, tiadiazol, isotiazol, oxadia-zol, piridina, piperidina, pirazina, oxazol, isoxazol, pirazina, piridazina, pirimi-dina, piperazina, pirrolidina, morfolino, triazina, oxazina ou tiazol. Anéis hete-rocíclicos preferidos incluem piperazina, pirrolidina, morfolino, imidazol, iso-triazol, pirazol, tetrazol, tiazol, triazol, tiadiazol, piridina, piperidina, pirazina,furano, oxazol, isoxazol, oxadiazol e azetidina. O anel heterocíclico de 3 a 12membros pode ser não substituído ou substituído.

Neste relatório e nas reivindicações que se seguem, a não serque o contexto indique o contrário, a palavra "compreendem", ou variações,como "compreende" ou "compreendendo", será entendida como implicandoa inclusão de todo o indicado ou etapa ou grupo do indicado ou etapas masnão a exclusão de qualquer outro indicado ou etapa ou grupo do indicado ouetapas. Como entendido por um especialista na arte somente combinaçõesde substituintes que são quimicamente possíveis são modalidades da inven-ção.

Compostos específicos especialmente preferidos de fórmula (I)são aqueles descritos abaixo nos Exemplos.

Estereoisômeros são aqueles compostos onde há um átomo decarbono assimétrico. Os compostos existem em formas isoméricas individu-ais opticamente ativas ou como misturas das mesmas, por exemplo, comomisturas diastereoméricas. A presente invenção abrange os dois isômerosindividuais opticamente ativos R e S, bem como misturas dos mesmos. Isô-meros individuais podem ser separados por métodos bem conhecidos dosversados na arte, por exemplo, cromatografia líquida de alto desempenhoquiral (HPLC).

Tautômeros são um de dois ou mais isômeros estruturais queexistem em equilíbrio e são prontamente convertidos de uma forma isoméri-ca em outra.

Os compostos da invenção podem existir nas duas formas, nãosolvatada e solvatada. O termo "solvato" é usado aqui para descrever umcomplexo molecular compreendendo o composto da invenção e uma oumais moléculas de solvente farmaceuticamente aceitável por exemplo eta-nol. O termo "hidrato" é empregado quando o referido solvente é água.

Síntese

A invenção também provê, em outro aspecto, um método parapreparar um composto de fórmula (I), em forma livre ou de sal que compreende:

(i) (A) para a preparação de compostos de fórmula (I), reagir umcomposto de formula (Ia)

<formula>formula see original document page 9</formula>

onde R2 e R3 são como acima descrito, com cloreto de acetila na presençade uma base;

(B) para a preparação de compostos de fórmula (I), onde R3 éC2-C8-alquinila, reagir um composto de fórmula (Ib)<formula>formula see original document page 10</formula>

onde X é um grupo de saída, com um composto de fórmulaH --- R , onde R pode ser C1-C6-alquila ;

(C) para a preparação de compostos de fórmula (I), reagir umcomposto de fórmula (Ic)

<formula>formula see original document page 10</formula>

onde

R1 e R3 são como definidos acima; e

X é um grupo de saída, com um composto de fórmula H2N-R2,onde R2 é como definido acima na presença de uma base; e

(ii) recuperar o composto resultante de fórmula (I), em forma livreou de sal farmaceuticamente aceitável.

Os compostos de fórmula (I) podem ser preparados, por exem-plo, usando as reações e técnicas descritas abaixo e nos Exemplos. As rea-ções podem ser realizadas em um solvente apropriado para os reagentes emateriais empregados e adequado para as transformações que estão sendoefetuadas. Será entendido pelos especialistas da arte da síntese orgânicaque a funcionalidade presente na molécula deve ser consistente com astransformações propostas. Isto algumas vezes exigirá um julgamento paramodificar a ordem das etapas de síntese ou para selecionar um esquema deprocesso particular em relação a outro para obter um composto da invençãodesejado.

Os vários substituintes dos intermediários e produtos finais desíntese mostrados nos seguintes esquemas de reação podem estar presen-tes em suas formas totalmente elaboradas, com grupos protetores adequa-dos onde requerido, como entendido por um versado na arte, ou em formasprecursoras que podem mais tarde ser elaboradas em suas formas finais pormétodos familiares a um especialista na arte. Os substituintes podem tam-bém ser adicionados em vários estágios através da seqüência de síntese ouapós a finalização da seqüência de síntese. Em muitos casos, manipulaçõesde grupos funcionais comumente usadas podem ser usadas para transfor-mar um intermediário em outro intermediário, ou um composto de fórmula (I)em outro composto de fórmula (I). Exemplos dessas manipulações são con-versão de um éster ou cetona em um álcool; conversão de um éster em umacetona; interconversões de ésteres, ácidos e amidas; alquilação, acilação esulfonilação de alcoóis e aminas; e muitos outros. Substituintes podem tam-bém ser adicionados usando reações comuns, como alquilação, acilação,halogenação ou oxidação. Tais manipulações são bem conhecidas na arte, emuitos trabalhos de referência resumem procedimentos e métodos para es-sas manipulações. Alguns trabalhos de referência que fornecem exemplos ereferências à literatura primária de sínteses orgânicas para muitas manipula-ções de grupos funcionais, bem como outras transformações comumenteusadas na arte da síntese orgânica são March's Organic Chemistry, 5a Edi-ção, Wiley e Chichester, Eds. (2001); Comprehensive Organic Transforma-tions, Larock, Ed., VCH (1989); Comprehensive Organie Funetional GroupTransformations, Katritzky et al. (editores da série), Pergamon (1995); eComprehensive Organie Synthesis, Trost e Fleming (editores da série), Per-gamon (1991). Será também reconhecido que outra consideração importanteno planejamento de qualquer rota sintética neste campo é uma escolha judi-ciosa do grupo protetor usado para proteção dos grupos funcionais reativosnos compostos descritos nesta invenção. Grupos protetores múltiplos dentroda mesma molécula podem ser escolhidos de modo que cada um destesgrupos protetores possam ser removidos sem remoção de outros gruposprotetores na mesma molécula, ou vários grupos protetores possam ser re-movidos usando a mesma etapa de reação, dependendo do resultado dese-jado. Uma exposição respeitada que descreve muitas alternativas para opraticante treinado é Protective Groups In Organic Synthesis (Grupos Prote-tores em Síntese orgânica), Greene e Wuts, Eds., Wiley e Sons (1999). Éentendido pelos especialistas na arte que somente combinações de substitu-intes que são quimicamente possíveis são modalidades da presente invenção.

Atividade e Uso Farmacolóqico

Compostos de fórmula (I) e seus sais farmaceuticamente aceitá-veis são úteis como produtos farmacêuticos. Em particular, eles ativam oreceptor A3 de adenosina, i.e., eles agem como agonistas do receptor A2A.Suas propriedades como agonistas de A3 são descritas em WO 05/063246,WO 02/055085, WO 95/02604 e WO 06/011130.

Compostos dos Exemplos abaixo possuem valores Ki e valoresEC50 abaixo de 5,0 μΜ nos seguintes ensaios. Por exemplo, o composto doExemplo 1 tem um valor Ki de 0,91 nM no ensaio de ligação de Ki e um valorde EC5O de 11,0 nM no ensaio funcional de A3 [35S]-GTPGamaS.

Protocolo de ensaio de ligação para A3

Lista de abreviações

A3 Receptor de Adenosina A3

BSA albumina de soro bovino

CHO ovário de hamster chinês

DMSO sulfóxido de dimetila

EDTA ácido etilenodiaminotetraacético

FCS soro fetal de bezerro

HEPES ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico

I-AB-MECA N6-(4-Amino-3-iodobenzil)-5'-/V-metilcarbamoil-adenosina

Kd constante de dissociação

MgCb cloreto de magnésio

NaCI cloreto de sódio

Tris-HCI cloridrato de Tris(hidroximetil)-aminometano

Introdução

Adenosina, um modulador endógeno de uma ampla faixa defunções biológicas, interage com pelo menos quatro subtipos de receptoressuperficiais celulares classificados como A-i, A2a, A2b e A3, todos acoplados aproteínas G. Ver Linden, Annu Rev Pharmacol Toxicol, Vol. 41, pp. :775-787(2001).

Até recentemente, a maior parte das ações antiinflamatórias daadenosina foram consideradas como sendo produzidas através dos recepto-res A2A- No entanto, o subtipo A3, pode desempenhar um papel básico emdiferentes patologias como inflamação e neurodegeneração [ver Kohno etal., Biochem Biophys Res Commun, Vol. 219, pp. 904-910 (1996)] e asma[ver Jacobson et al., Neuropharmacology, Vol. 36, pp. 1157-1165 (1997)].

O derivado de adenosina, 4-aminobenzil-5'-/\/-metil-carboxamidoadenosina (AB-MECA), é um potente agonista seletivo de re-ceptor A3 que é usado como composto de referência . Ver Varani et al., LifeSei, Vol. 63, No. 5, pp. 81-87 (1998).

Compostos da presente invenção foram testados em um ensaiode ligação para A3 usando o Iigante iodado [125I]-AB-MECA com membranaspreparadas a partir de células de CHO expressando estavelmente recepto-res A3 humanos.

Métodos

Materiais

• Membranas de CHO - adenosina A3

• [125IJ-AB-MECA: Amersham Pharmacia Biotech (Cat# TRK)

• CGS21680: Tocris (1063)

• Placas com 96 poços Unifilter GF/B: Perkin Elmer (Cat#

25 6005174)

• Placas de polipropileno com 96 poços com fundo em U: Grei-ner (Cat# 650201)

• TopSeaI: Canberra Packard (Cat# 6005185)

• BSA: Sigma Cat# A-6003

· Adenosina desaminase (1000 U/mL ): Roche Diagnostics Limited (Cat# 102121)

• Microscint-20 (1 L): Perkin Elmer (Cat# 6013611)• Todos os outros produtos químicos foram da SigmaPreparação de membrana A3

Tampões

• Tampão A HEPES a 10 mM, 0,9 % de NaCl, 0,2% de EDTA,pH 7,4

• Tampão B HEPES a 10 mM, EDTA a 10 mM, pH 7,4

• Tampão C HEPES a 10 mM, 0,1 mM de EDTA, pH 7,4

• Meios de cultura de A3: 500 mL de DMEM modificado por Isco-ves com Glutamax (Cat# 31980-022, Invitogen), 50 mL de FCS (termicamen-te inativado) (cat#10108-157, Invitrogen), 5 mL HEPES (1 M) (Cat# 15630-056, Invitrogen).

Protocolo de preparação

• Células A3 de CHO foram cultivadas em recipientes giratóriosaté 95 % de confluência a 37°C e 5% CO2.

• 40 mL de tampão A gelado (tampão de elevação) foi então adi-cionado e o recipiente giratório retornado para a incubadora por 10 minutos.

• Células foram então raspadas da superfície do recipiente u-sando raspador estéril e transferidas para um tubo Falcon de 50 ml em gelo.

• A superfície do raspador foi então lavada com 10 mL de tam-pão A, sendo este transferido para o tubo Falcon, que foi, então centrifugadoa 500 g por 5 minutos a 4°C.

• O sobrenadante foi removido e 25 mL de tampão B gelado(tampão de lise) foram adicionados ao pélete.

• O pélete foi homogeneizado em gelo usando um politron (4agitações de 5 segundos, com um intervalo de 20 segundos separando cadaagitação).

• Após homogeinização, os tubos foram centrifugados a 39 000χ g por 25 minutos a 4°C usando uma ultracentrífuga Beckman Avanti J-251.

• O sobrenadante foi removido e 20 mL de tampão C gelado(tampão de congelamento) foi adicionado ao tubo.

• O pélete foi novamente homogeneizado em gelo usando umpolitron e então centrifugado a 39 000 g por 25 minutos a 4°C na ultracentrí-fuga Beckman Avanti J-251.

• O sobrenadante foi removido e o pélete foi ressuspenso em 1mL de tampão gelado.

• Quantificação de proteína foi estimada pelo Bradford ProteinMicro-Assay (BioRad®) usando albumina de soro bovino como padrão.

• A concentração de membrana foi ajustada, sendo retiradasalíquotas conforme requerido usando tampão C1 submetidas a congelamentorápido antes da estocagem a -80°C.

Ensaio de ligação

Tampões

• Tampão de ensaio. Tris-HCl a 50 mM, pH 7,4, MgCl2 a 10 mM,EDTA a 1 mM e 0,1% em w/v de BSA. Armazenado a 4°C e mantido poruma semana, uma vez que o BSA é acrescentado.

• Tampão de lavagem. Tris-HCl a 50 mM, pH 7,4 e 0,9% de Na-Cl. Armazenado a 4°C.

Preparação de Composto

Soluções de dez (10) mM de referência e compostos de testeforam preparados em DMSO. As soluções de estoque foram diluídas emtampão de teste contendo 4% (v/v) DMSO para fornecer uma concentraçãofinal de 40 μΜ.

Determinação de Kd

Ligação de radioligante às membranas de CHO A3 foi realizadausando agonista radio-rotulado [125I]-AB-MECA em uma faixa de concentra-ção de 0,002-5 nM para obter ligação de saturação. Experimentos de ligaçãoforam realizados em duplicata usando membrana de 2,5pg em um volumetotal de 200 μL de tampão de ensaio. A ligação não específica foi determi-nada na presença de 10 μΜ do agonista l-AB-MECA.Ensaio de ligação

O ensaio foi realizado em um volume final de 200 pL/poço, emuma placa de polipropileno com 96 poços com fundo em U. Os componentesdo ensaio foram adicionados como se segue:

• 50 μL de composto de teste em tampão de ensaio 4% (v/v)DMSO. Ligação total foi determinada usando 50 μL de veículo. Ligação nãoespecífica foi determinada usando 50 μί de 40 μΜ l-AB-MECA, para forne-cer uma concentração de ensaio final de 10 μΜ.

• 50 μl [125I]-AB-MECA em uma concentração de 1 nM (4x), pa-ra fornecer uma concentração de ensaio final de 0,25 nM.

• 100 pL de membranas de CHO A3 em uma concentração de 25μg/mL em tampão de ensaio contendo 4 U/mL de adenosina desaminase(ADA) (concentração de ensaio final de 2 U/mL), para fornecer uma concen-tração de ensaio final de 2,5 μg/poço.

Diluições de Composto foram preparadas em um Biomek 2000para fornecer uma série de 10 concentrações de 40-0,002 μΜ (4x). Cinqüen-ta (50) uL de cada concentração foi transferida para uma placa Dynex com96 poços usando um Tomtec Quadra. Ligação total foi determinada na au-sência de l-AB-MECA e ligação não específica na presença de 10 μΜ I-AB-MECA. As membranas CHO A3 foram descongeladas imediatamente parauso e diluídas a uma concentração de 25 pg/mL em tampão de ensaio con-tendo adenosina desaminase a 4 U/mL (2x). A suspensão foi mantida emgelo até o uso. O radioligante [125I]-AB-MECA foi diluído e 50 pL adicionadosa todos os poços da placa de 96 poços, para fornecer uma concentraçãofinal de radioligante de 0,25 nM. Cem (100) pL de preparação diluída demembrana foram adicionados a cada poço para fornecer uma concentraçãototal de proteína de 2,5 pg/poço e 50 pL de tampão de ensaio foram adicio-nados por poço. A placa de 96 poços foi rapidamente misturada e incubadapor 120 minutos em temperatura ambiente.

As amostras da placa de ensaio foram coletadas para uma placaGF/B da Unifilter (à qual tinham sido acrescentados 50 pL de polietilenoimi-na 0,5 % (p/v) a todos os poços) usando uma colheitadeira automática Tom-tec 9600. A placa GF/B da Unifilterfoi incubada por 3 horas a 50°C ou de umdia para o outro à temperatura ambiente para secar os filtros. Filme de forrofoi aplicado à placa GF/B da Unifilter, Microscint-20 foi adicionado a cadapoço e a placa selada usando o TopSeaI-S de acordo com as instruções dosfabricantes. A placa Unifilter GF/B foi submetida a contagem usando umPackard TopCount (125I-Scintillation, 1 min./poço). As contagens por minuto(cpm) foram usadas para determinar IC50 e destas um Ki foi determinadousando a equação abaixo. Ver Cheng e Prusoff, Biochem Pharmacol, Vol.22, pp. 3099-3018(1973).

<formula>formula see original document page 17</formula>

onde

C = concentração de radioligante; e

Kd = constante de dissociação para o ligante.

Ensaio Funcional de Ligação A3 [35Sl-GTPGamaSLista de abreviações

[35S]-GTPyS 5'-[y-35S]tiotrifosfato de guanosina, sal trietilamônio

BSA albumina de soro bovinoCHO ovário de hamster chinêsDMSO sulfóxido de dimetilaGDP Guanosina 5'-difosfatoGTP-y-S 5'-O-(3-tiotrifosfato) de guanosinaHEPES ácido 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfônico

I-AB-MECA N6-(4-Amino-3-iodobenzil)-5'-N-metilcarbamoil-adenosina

MgCl2 cloreto de magnésioNaCl cloreto de sódioSPA ensaio de proximidade de cintilaçãoTris-HCl cloridrato de Tris(hidroximetil) aminometanoWGA aglutinina de germe de trigo

Para estabelecer a resposta funcional a compostos desta inven-ção foi realizado um ensaio medindo estimulação agonista a A3 de ligação[35S]-GTPyS em membranas preparadas de células de CHO expressandoestavelmente receptores A3 de adenosina. A estimulação induzida por ago-nista de ligação de [35SJ-GTPyS a proteínas G ativadas foi usada como en-saio funcional para vários receptores, incluindo receptores de adenosina. VerLorenzen et al., Mol Pharmacol, Vol. 49, pp. 915-926 (1996); e Jacobson etal., Drug Dev Res, Vol. 37, ρ. 131 (1996).

Várias considerações devem ser levadas em conta quando serealiza o ensaio de ligação de [35SJ-GTPyS. Em primeiro lugar, GDP é incluí-do no ensaio para promover a inativação da proteína G. Excesso de GDPpode causar uma redução da velocidade catalítica de ativação da proteína Ga qual agonistas de alta eficácia podem ser menos susceptíveis. Agonistasde baixa eficácia podem lutar para elicitar uma resposta onde há altas con-centrações de GDP. Uma teoria possível de porque agonistas de alta eficá-cia são capazes de superar o bloqueio de GDP é que eles induzem ou esta-bilizam alterações na conformação do receptor. Em segundo lugar, altasconcentrações de íons sódio são necessárias para abaixar a atividade basalno ensaio e como resultado ligação de alta afinidade pode ser impedida. Emterceiro lugar, dissociação da subunidade Dda Dy requer íons Mg2+, que po-de afetar a capacidade de certos agonistas de se ligarem. A presença deMg2+ pode também causar ligação irreversível de GTPyS, e assim um estadode não equilíbrio pode ocorrer. Finalmente, em ensaios de ligação de[35S]-GTPyS, GTPyS se liga a todas as proteínas G, i.e., não distingue entrediferentes proteínas G e como em outros ensaios de proteína em membrana,é também susceptível à degradação de proteína por proteases.

O ensaio de ligação GTPyS convencional descrito por Lorenzenet al (1996), supra, é um método baseado em filtração e requer assim umaetapa de filtração; modificamos este método para operar com um formatoSPA de modo que ele possa ser usado em um formato semiautomatizado ehomogêneo. No ensaio SPA membranas são capturadas por contas SPA deaglutinina de germe de trigo (WGA), através de uma interação específicaentre WGA e resíduos carboidrato de glicoproteínas superficiais pelas mem-branas. Com estimulação do receptor, [35SJ-GTPyS se liga especificamente àsubunidade alfa da proteína G, trazendo assim a [35S]-GTPyS a grande pro-ximidade com as contas de SPA. Partículas β emitidas da [35SJ-GTPyS exci-tam o cintilante das contas e produzem luz. [35SJ-GTPyS livre na solução nãoestá em grande proximidade com as contas SPA e por isso não ativam ocintilante e não produzem luz.MetodosMateriais

• Células de CHO adenosina A3

• Ácido A/-2-Hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico (HEPES)(Invitogen, Cat# 15630-056)

• BSA (essencialmente ácido graxo livre) (Sigma, Cat# A-6003)

• Tris (BDH Biochemicals1 Cat# 443864E)

• Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) (Sigma, Cat# E-5391)

• MgCI2 (anidro) (Sigma, Cat# M-8266)

• GDP (sal de sódio) (Sigma, Cat# G-7127)

• GTPyS (sal de tetralítio) (Sigma, Cat# G-8634)

• [35S-GTPyS (Amersham SJ1320, 1 μCi/μL)

• Contas de WGA SPA (Amersham International, Cat#SPQ0031)

• Placas de polipropileno com 96 poços (Greiner, Cat# 650201)

• Optiplates de 96 poços com superfície branca não Iigante :Packard Cat# 6005190

• TopSeal - (contador Canberra Packard Cat# 6005185)Preparação de Membrana A3

Tampões

• Tampão A HEPES a 10 mM, 0,9 % de NaCI, 0,2% de EDTA,PH 7,4

• Tampão B HEPES de 10 mM, EDTA de 10 mM, pH 7,4

• Tampão C HEPES de 10 mM, EDTA de 0,1 mM, pH 7,4

• Como meio de cultura: 500 ml_ de DMEM modificado por Isco-ves com Glutamax (Cat# 31980-022, Invitogen), 50 mL FCS (termicamenteinativado) (cat#10108-157, Invitrogen), 5 mL de HEPES (1 M) (Cat# 15630-056, Invitrogen).

Protocolo de preparação• Células A3 de CHO foram cultivadas em recipientes giratóriosaté 95 % de confluência a 37°C e 5% DE CO2.

• 40 mL de tampão A gelado (tampão de elevação) foi então adi-cionado e o recipiente giratório retornado para a incubadora por 10 minutos.

• Células foram então raspadas da superfície do recipiente u-sando raspador estéril e transferidas para um tubo Falcon de 50 ml em gelo.

• A superfície do raspador foi então lavada com 10 mL de tam-pão A1 sendo este transferido para o tubo Falcon1 que foi, então centrifugadoa 500 g por 5 minutos a 4°C.

• O sobrenadante foi removido e 25 mL de tampão B gelado(tampão de lise) foram adicionados ao pélete.

• O pélete foi homogeneizado em gelo usando um politron (4agitação de 5 segundos, com um intervalo de 20 segundos separando cadaagitação).

• Após homogeinização, os tubos foram centrifugados a 39 000χ g por 25 minutos a 4°C usando uma ultracentrífuga Beckman Avanti J-251.

• O sobrenadante foi removido e 20 mL de tampão C gelado(tampão de congelamento) foi adicionado ao tubo.

• O pélete foi novamente homogeneizado em gelo usando umpolitron e então centrifugado a 39 000 g por 25 minutos a 4°C na ultracentrí-fuga Beckman Avanti J-251.

• O sobrenadante foi removido e o pélete foi ressuspenso em 1mL de tampão gelado.

• Quantificação de proteína foi estimada pelo Bradford ProteinMicro-Assay (BioRad®) usando albumina de soro bovino como padrão.

• A concentração de membrana foi ajustada, sendo retiradasalíquotas conforme requerido usando tampão C, submetidas a congelamentorápido antes da estocagem a -80°C.

Tampão de estocaqem de contas "Bead storage buffer"

• Tris-HCl a 50 mM (7,88 mg/mL), pH 7,4.

• Solução foi estocada a 4°C.

Tampão de ensaio

• HEPES a 20 mM (4,766 g/L)

• MgCl2 a 10mM (2,033 g/L)

• NaCl a 100 mM (5,844 g/L)• EDTA a 1 mM (0,452 g/L)

• pH 7,4

• % de BSA (1 g/L)

Contas de WGA PVT SPA foram usadas em concentração de250 mg/mL em tampão de ensaio e armazenadas a 4°C por um máximo deuma semana.

Concentração [35S]-GTPyS do [35S]-GTPyS de estoque foi de-terminada no dia da seguinte maneira:

A molaridade (μΜ) de

[35]J-GTPyS = concentração radioativa (mCi/mL) χ 1000atividade específica do estoque (Ci/mmol)

Exemplo: No quinto dia, a atividade é de 0,961 uCi/uL (obtida databela para desintegração radioativa de [35S] na contracapa do catálogo daAmersham, referência = 1 uCi/uL); assim para uma batelada de [35SJ-GTPyScom atividade específica 1082 Ci/mmol:

mCi/mmol, a molaridade e 0,961 X 1000 / 1082 = 0,888 um

Protocolo de ensaio

O ensaio foi realizado em um volume final de 250 uL/poço emuma Optiplate de 96 poços com superfície branca não ligante. Componentes

de ensaio foram adicionados como se segue:

• 25 uL de tampão de ensaio foram adicionados a todos os po-ços da Optiplate de 96 poços.

• 25 uL de GDP e 10 μΜ foram também adicionados a cada po-ço.

• Aos poços A1 a D1, e E12 a H12 adicionar 25 uL de 10% DM-SO/tampão de ensaio - controlar para determinar a resposta basal.

• Aos poços E1 a H1 e A12 a D12 adicionar 25 pL de I-AB-MECA a 100 nM em 10% de DMSO/tampão de ensaio - controlar para de-terminar estimulação máxima.

• Compostos foram diluídos em Biomek com mudança de ponta(1 em 3 diluições, em 10% de DMSO/tampão de ensaio), e 25 uL transferi-dos em duplicata para Optiplates.• [35S]-GTPyS foi diluído a 1,25 nM (ver acima) e 25 μL adicio-nados a cada poço para fornecer uma concentração de ensaio final de 0,125ηM [35S]-GTPyS/poço.

• Membranas foram diluídas em tampão de ensaio a 25 pg/mL

· A solução de estoque de contas SPA foi diluída em tampão deensaio para fornecer uma concentração de 5 mg/mL.

• Um pouco antes da adição à placa (não mais de 20 minutosantes do uso) as contas foram misturadas com as membranas razão 1: 2 (50pL contas: 100 μL de membrana).

· Cento e cinqüenta (150) pL da mistura de contas com mem-brana foram adicionados a cada poço.

• A placa foi selada com TopSeaI e incubada em temperaturaambiente por entre 40 e 170 minutos.

• A placa foi centrifugada a 850 χ g por 10 minutos, em tempera-tura ambiente (Jouan B4i) e imediatamente lida no Packard Topcount, pro-grama [35S dpm] por 1 min./poço.

Assim, agentes da invenção podem ser úteis para o tratamentode uma condição mediada por ativação do receptor A3 de adenosina.

Por exemplo, a presente invenção pode ser usada para tratarartrite reumatóide como descrito em WO 04/045627.

Além disso, a presente invenção é baseada na descoberta sur-preendente de que a administração de agonista de receptor A3 de adenosina(A3RAg) alivia sintomas de esclerose múltipla como descrito em WO05/063246.

A presente invenção refere-se, por uma modalidade, a um méto-do para o tratamento de esclerose múltipla (MS) em um paciente humano,compreendendo administrar a um indivíduo com necessidade de tal trata-mento um montante efetivo de um A3RAg.

O termo "esclerose múltipla (MS) refere-se no contexto da pre-sente invenção à doença inflamatória do CNS em que a bainha de mileinaisolante do nervo é parcialmente perdida, resultando em vários sintomas pa-tológicos. MS inclui vários tipos de doença como recorrente/remitente (R-RMS), progressiva secundária (SPMS), progressiva recidivante (PRMS) eprogressiva primária (PPMS).

Os termos "tratamento" ou "proteção neurálgica" no contexto dapresente invenção se referem a qualquer melhoramento nos sintomas clíni-cos da doença, e/ou uma redução na taxa de deterioração ou na taxa derecidiva do paciente de MS, bem como qualquer melhoramento no bem estardos pacientes. Por exemplo, uma melhoria pode ser manifestada por um oumais dos itens a seguir: redução na fraqueza dos músculos, redução nosespasmos dos músculos, redução da espasticidade, melhoria do equilíbrio emelhoria da memória.

A presente invenção baseia-se também na descoberta de queagonistas de receptores de adenosina inibem a replicação viral no interiordas células como descrito em WO 02/055085. Assim, de acordo com a in-venção, é fornecido um método para inibir a replicação viral em células,compreendendo apresentar às células um montante eficaz de pelo menosum A3RAg.

O agonista de acordo com a invenção é um agonista total ouparcial do receptor A3 de adenosina. Neste contexto, um composto é um "a-gonista total" de um receptor A3 de adenosina se ele for capaz de inibir to-talmente a adenilato ciclase (A3), um composto é um "agonista parcial" deum receptor A3 de adenosina se ele for capaz de inibir parcialmente a adeni-lato ciclase (A3).

São também fornecidas pela invenção composições farmacêuti-cas para inibir replicação viral dentro das células, compreendendo um mon-tante efetivo da referida pelo menos uma A3Rag bem como o uso do referidoingrediente ativo (i.e., o A3RA"g) para a fabricação de tal composição farma-cêutica.

A invenção é particularmente útil, embora não limitada a isso,para inibir a replicação de vírus HIV em células humanas.

O método da presente invenção pode ter utilidade particular emaplicações in vivo descritas em WO 95/02604. Por exemplo, como descritoem WO 95/02604, agonistas de receptores A3 de adenosina podem ser usa-das no tratamento de qualquer estado ou condição de doença envolvendo aliberação de inositol-1, 4,5-trifosfato (IP3), diacilglicerol (DAG) e radicais li-vres e subseqüentes cascatas de ácido araquidônico. Assim, alta pressãosangüínea, hiperatividade locomotora, hipertensão, hipoxia aguda, depres-são, e infertilidade podem ser tratados de acordo com o presente método dainvenção, em que um dos compostos acima descritos é acuradamente ad-ministrado por exemplo, em cerca de alguns minutos a cerca de uma horado início dos sintomas. O método também tem utilidade no tratamento deestados e condições crônicas de doenças, em particular, aquelas condiçõese estados de doença em que administração crônica profilática ou terapêuticade um dos compostos acima descritos evitará o início dos sintomas ou redu-zirá o tempo de recuperação. Exemplos de condições e estados de doençaque podem ser cronicamente tratados de acordo com o presente método dainvenção incluem distúrbios inflamatórios, como inflamação vascular e artri-te, alergias, asma, cicatrização de feridas, derrame, insuficiência cardíaca,lesão aguda na medula espinhal, lesão aguda ou trauma na cabeça, ataque,hipoxia neonatal (paralisia cerebral; tratamento profilático envolve exposiçãocrônica através da circulação placentária), hipoxia crônica devida a malfor-mações arteriovenosas e doença oclusiva da artéria cerebral, distúrbios neu-rológicos graves relacionados à excitotoxicidade, doença de Parkinson, co-réia de Huntington1 e outras doenças do sistema nervoso central (CNS), do-ença cardíaca, doença renal e contracepção.

Além disso, foi verificado que os compostos acima aumentam apressão sangüínea basal ou sistêmica, e portanto a administração crônicadestes compostos pode ser usada para tratar hipotensão maligna. Por e-xemplo, a administração de IB-MECA resulta em um aumento significativo(por exemplo, cerca de 10-30 t) em pressão sangüínea basal ou sistêmica(por exemplo, de cerca de 70 mm Hg a cerca de 90 mm Hg).

Foi também verificado que tais compostos são protetores cere-brais significativos, assim, os compostos acima podem ser usados para tra-tar e/ou proteger contra vários distúrbios, incluindo, por exemplo, ataques,choque isquêmico transiente, derrames, isquemia focai originada de tromboou hemorragia cerebral, isquemia global originada de parada cardíaca, trau-ma, paralisia neonatal, choque hipovolêmico, bronquiectase, como agentespara promover o sono, como agentes para tratamento de doenças desmieli-nizantes, por exemplo esclerose múltipla e como agentes neuroprotetores,por exemplo, lesão hemorrágica cerebral, lesão de isquemia - reperfusão damedula espinhal, hiperglicemia e neuropatias associadas. Foi verificado,também que os compostos acima, particularmente, por exemplo, IB-MECA,possuem efeitos procognitivos e, assim, podem ser usados no tratamento dedistúrbios em que a elicitação desse efeito se mostraria útil, como no trata-mento da doença de Alzheimer e outros distúrbios cognitivos e de demência.

De acordo com a WO 06/011130, administração de um A3RAg aum paciente humano aliviou sintomas da síndrome de Sjogren (SS).

Assim, a presente invenção se refere, por uma modalidade, aum método para tratamento de SS em um paciente humano, compreenden-do administrar a um indivíduo com necessidade de tal tratamento um mon-tante efetivo de um A3RAg. Em uma modalidade preferida, o A3Rag é admi-nistrado topicamente, por exemplo, ao olho ou pele. Em outra modalidadepreferida, o A3Rag é administrado oralmente.

O termo "SS" se refere no contexto da presente invenção ao dis-túrbio autoimune que causa KCS, em que células imunes atacam e destro-em as glândulas que produzem lágrimas e saliva. Em uma modalidade dainvenção, o termo refere-se ao distúrbio classificado como SS secundária.Em uma modalidade preferida, a SS secundária resulta de uma condiçãoreumática. Sintomas do distúrbio podem incluir secura do olho, boca, pele,nariz e vaginal, e podem afetar outros órgãos do corpo incluindo rins, vasossangüíneos, pulmões, fígado, pâncreas e cérebro.

O método da invenção é contemplado como de tratamento ouprevenção de sintoma clínico e manifestação de olho seco incluído em SS.O sintoma clínico oftalmológico em SS inclui, mas não se limita em sensaçãode corpo estranho, queimação e coceira; e a manifestação clínica oftalmoló-gica em SS inclui, mas não se limita a, erosões da córnea e da conjuntivacoradas por fluoresceína e rosa Bengala, e tempo de quebra do filme lacri-mal.

Agentes da invenção podem ser usados em combinação comoutros agentes ativos descritos em WO 01/23399, WO 95/02604, WO05/063246, WO 02/055085 e WO 06/011130.

Os agentes da invenção podem ser administrados por qualquerrota apropriada, por exemplo, oralmente, por exemplo, na forma de um com-primido ou cápsula; parenteralmente, por exemplo, intravenosamente; porinalação, ou como descrito em WO 01/23399, WO 95/02604, WO05/063246, WO 02/055085 e WO 06/011130.

Em um outro aspecto, a invenção provê também uma composi-ção farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I), em formalivre ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável, opcionalmente jun-to com um diluente ou portador farmaceuticamente aceitável para o mesmo.A composição pode conter um agente coterapêutico, como um fármaco anti-inflamatório, broncodilatador, anti-histamínico ou antitussígeno, como descri-to aqui anteriormente. Tais composições podem ser preparadas usando di-luentes ou excipientes convencionais e técnicas conhecidas na arte galêni-ca. Assim, formas de dosagem oral podem incluir comprimidos e cápsulas.Formulações para administração tópica podem tomar a forma de cremes,pomadas, géis ou sistemas de administração transdérmica, por exemplo,adesivos. Composições para inalação podem compreender formulações emaerossol ou outras formulações atomizáveis ou formulações em pó seco.Outras formulações podem ser como as descritas em WO 01/23399, WO95/02604, WO 05/063246, WO 02/055085 e WO 06/011130.

Dosagens de compostos de fórmula (I) empregados na práticada presente invenção naturalmente variarão dependendo, por exemplo, dacondição particular a ser tratada, do efeito desejado e do modo de adminis-tração descritos em WO 01/23399, WO 95/02604, WO 05/063246, WO02/055085 e WO 06/011130.

A invenção é ilustrada pelos seguintes Exemplos.

Exemplos 1-5

Compostos de fórmula I<formula>formula see original document page 27</formula>

<table>table see original document page 27</column></row><table>

Exemplo 1

(1S,4R)-4-(2,6-Dicloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enol

2,6-Dicloropurina (10 g, 52,90 rnmols), (1S,4R)-cis 4-acetóxi-2-ciclopenten-1-ol (10 g, 70,40 mmols), tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio (0)(3,20 g, 3,50 mmols) e trifenilfosfina suportada em polímero (3 mmol/g, 11,60g, 35,00 mmols) são adicionados a um frasco seco em estufa sob atmosferade argônio. THF seco desoxigenado (80 L) é acrescentado e a mistura dereação é agitada gentilmente por 5 minutos. Trietilamina (20 mL) é adiciona-da e a mistura de reação é agitada a 50°C. A finalização da reação é mos-trada por LCMS após 1 hora. A mistura de reação é deixada esfriar, filtrada eo solvente é removido em vácuo. O composto do título é obtido após purifi-cação por cromatografia rápida de coluna (sílica, diclorometano:metanol 25:1).

1H RMN (CDCI3, 400 MHz); 8,30(s, 1H), 6,40(m, 1H), 5,90(m,1H), 5,50(m, 1H), 4,95(m, 1H), 3,05(m, 1H), 2,10(m, 1H), MS (ES+) m/e 271(MH+).

(1S.4R)-4-(2,6-dicloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enila de éster de etila de ácidocarbônico

(1S,4R)-4-(2,6-Dicloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enol (9,5 g, 35,05mmols é colocado em um frasco seco em estufa sob atmosfera de argônio.THF seco (200 mL) é adicionado seguido por piridina seca (5,54 g, 70,1mmols). Cloroformato de etila (15,21 g, 140,2 mmols) é acrescentado vaga-rosamente de modo que a temperatura não aumente acima de 40°C e a mis-tura de reação é agitada em temperatura ambiente. Verifica-se a finalizaçãoda reação por LCMS após 1 hora. O solvente é removido em vácuo e o resí-duo é particionado entre diclorometano (200 mL) e água (200 mL). A cama-da orgânica é lavada com água (150 mL) e salmoura (150 mL), seca sobreMgSO4, filtrada e o solvente removido em vácuo. O composto do título é ob-tido após cristalização do metanol.

1H RMN (CDCI3, 400 MHz); 8,20(s, 1H), 6,45(m, 1H), 6,25(m,1H), 5,75(m, 1H), 5,70(m, 1H), 4,25(q, 2H), 3,20(m, 1H), 2,05(m, 1H), 1,35(t,3H), MS (ES+) m/e 343 (MH+).

Di-Boc-[(1S,4R)-4-(2,6-dicloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enil]-amina

(1S,4R)-4-(2,6-dicloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enila de éster deetila de ácido carbônico (2,5 g, 7,29 mmols), iminodicarboxilato de di-t-butila(1,74 g, 8,02 mmols), tris (dibenzilidenoacetona) dipaládio(O) (0,33 g, 0,36mmol) e trifenilfosfina (0,29 g, 1,09 mmol) são colocados em um frasco secoem estufa sob uma atmosfera de argônio. THF seco desoxigenado (30 mL) éacrescentado e a mistura de reação é agitada em temperatura ambiente.Verifica-se a finalização da reação por LCMS após 3 horas. O solvente éremovido em vácuo e o composto do título é obtido após purificação porcromatografia rápida de coluna (sílica, acetato de etila:isoexano 4:1).

1H RMN (CDCI3l 400 MHz); 8,70(s, 1H), 6,20(m, 1H), 5,85(m,1H), 5,80(m, 1H), 5,40(m, 1H), 3,20(m, 1H), 2,15(m, 1H), 1,55(s, 18H), MS(ES+) m/e 470 (MH+).

(1S,2R,3S.5R)-3-(Di-t-butoxicarbonilamino)-5-(2.6-dicloro-purin-9-il)-ciclopentano-1,2-diol

Uma solução aquosa laranja/vermelho-escura de tetróxido derutênio foi preparada dissolvendo tricloreto de rutênio tri-hidratado (60 mg,0,29 mmol) em água (5 ml_) com periodato de sódio (682 mg, 3,19 mmols), eadicionada de uma vez a uma solução resfriada (banho de gelo/água a 0°C)de (1 S,4R)-1 -(di-t-butoxicarbonilamino)-4-(2,6-dicloropurin-9-il)-ciclopent-2-eno (1,00 g, 2,12 mmols)) em acetato de etila:acetonitrila 1:1 (30 ml_). A mis-tura turva marrom resultante foi agitada em gelo/água por 10 minutos, e en-tão extinta pela adição de metabissulfito de sódio aquoso saturado (25 mL) eagitada por 1 hora. A mistura foi diluída pela adição de acetato de etila (75mL), e lavada consecutivamente com água (2 χ 25 mL) e salmoura (20 mL),antes da secagem com sulfato de magnésio. Filtração e remoção de compo-nentes voláteis em pressão reduzida forneceram o produto desejado comoum sólido amarelo pálido, que foi usado sem purificação adicional.

(1S,2R,3S,5R)-3-(Di-t-butoxicarbonilamino)-5-r2-cloro-6-(3-iodobenzilamino)-purin-9-in-ciclopentano-1,2-diol

3-lodobenzilamina (500 mg, 2,15 mmols) e trietilamina (400 pL,291 mg, 2,9 mmols) foram dissolvidos em diclorometano (5 mL) e adiciona-dos a uma solução de (1S,2R,3S,5R)-3-(di-t-butoxicarbonilamino)-5-(2,6-dicloro-purin-9-il)-ciclopentano-1,2-diol (1,07 g, 2,12 mmols) em diclorometa-no (20 mL). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 4dias, antes de remover os componentes voláteis em pressão reduzida. Oproduto desejado foi purificado do resíduo bruto por cromatografia rápida decoluna usando o sistema Argonaut Flashmaster Personal. O resíduo foi car-regado em montante mínimo de diclorometano em um cartucho Si de 70 gVarian Megabond Elut Flash, pré-saturado com isoexano. O produto foi puri-ficado por eluição com isoexano (250 mL), seguido por 1:1 acetato de etila :isoexano (1 L); as frações puras foram combinadas e o solvente removidoem pressão reduzida para fornecer o produto como uma espuma bege (610mg; 41% de rendimento). LC-MS: MH+ 701,49.

(1S.2R.3S.5R)-3-Amino-5-í2-cloro-6-(3-iodo-benzilamino)-purin-9-in-ciclopentano-1,2-diol

(1S,2R,3S,5R)-3-(Di-t-butoxicarbonilamino)-5-[2-cloro-6-(3-iodobenzilamino)-purin-9-il]-ciclopentano-1,2-diol (590 mg, 0,84mmol) foi dis-solvido em metanol (10 mL); Cloreto de hidrogênio 4,0 em 1,4-dioxano (10mL) foi adicionado, e a solução de cor amarelo pálida foi agitada em tempe-ratura ambiente por 1 hora, após o que a reação foi dada como completa porTLC. Os componentes voláteis foram removidos em pressão reduzida, parafornecer um sólido bege (450 mg, rendimento quantitativo). LC-MS: MH+501,15.

N-((1S.2R,3S,4R)-4-[2-Cloro-6-(3-iodobenzilamino)-purin-9-in-2.3-diidroxiciclopentiD-acetamida

(1S,2R,3S,5R)-3-Amino-5-[2-cloro-6-(3-iodo-benzilamino)-purin-9-il]-ciclopentano-1,2-diol (450 mg, 0,4 mmol) foi suspenso em diclorometano(10 mL) com trietilamina (380 pL, 275 mg, 2,73 mmols). Cloreto de acetila(65 μL, 72 mg, 0,91 mmol) foi acrescentado, e a solução amarelo pálida re-sultante foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. Metanol (5 mL) foiadicionado para extinguir qualquer cloreto de acetila residual, e todos oscomponentes voláteis foram removidos em pressão reduzida para forneceruma espuma marrom. O produto foi inicialmente purificado por cromatografiarápida de coluna, usando o sistema Argonaut Flashmaster Personal. A es-puma marrom foi dissolvida em diclorometano (10 mL) e adsorvida em sílica(3 g). Esta foi carregada em um cartucho de Si de 20 g Isolute Flash, pré-saturado com acetato de etila. O produto foi eluído com metanol a 5% emacetato de etila, e remoção do solvente das frações contendo produto purifi-30 cado em pressão reduzida forneceu um sólido incolor. Cristalização a partirde metanol forneceu um sólido cristalino incolor (210 mg, 46% de rendimen-to). LC-MS: MH+ 543,17Exemplo 2

2,6-Dicloro-9-((1R.4S)-4-f1.2.31triazol-2-il-ciclopent-2-enil)-9H-purina

Éster de (1S,4R)-4-(2,6-dicloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enila deéster de etila de ácido carbônico (1,0 g, 2,91 mmols) foi dissolvido em THF seco desoxigenado (20 mL) sob argônio. Trifenil fosfina (115 mg, 0,44 mmol,0,15 equivalente), [1,2,3]triazol (200 pL, 238 mg, 3,45 mmols) e Pd2(dba)3(133 mg, 0,146 mmol, 5 mol%) foram adicionados seqüencialmente. A mistu-ra de reação foi agitada a 50°C por 2 horas, e deixada esfriar até a tempera-tura ambiente, antes dos componentes voláteis serem removidos sob pres- são reduzida. O produto foi purificado por cromatografia rápida de colunausando o Argonaut Flashmaster Personal. O resíduo foi ressuspenso emdiclorometano (5 mL) antes de ser carregado e um cartucho de Si de 25 gIsolute Flash, pré-saturado com isoexano. O produto foi eluído após isoexa-no (500 mL), isoexano : acetato de etila 4 : 1 (250 mL) e isoexano : acetato de etila 1:1 (750 mL). O solvente foi removido das frações contendo produtopuro em pressão reduzida, e o produto foi recristalizado do acetato de etila,para fornecer um sólido bege (280 mg, 30% rendimento). LC-MS MH+321,80

(1R,2S,3R,5S)-3-(2.6-Dicloro-purin-9-il)-5-f1.2.31triazol-2-il-ciclopentano-1,2-diol

2,6-Dicloro-9-((1R,4S)-4-[1,2,3]triazol-2-il-ciclopent-2-enil)-9H-purina (1 equivalente) foi dissolvido em THF (0,1 M) com N-metilmorfolina-N-óxido (2 equivalentes). Tetróxido de ósmio foi adicionado como uma soluçãoa 4% em água (10 mol %), e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 24 horas, antes de uma outra adição de 4% de 0s04(aq) (10mol %) e agitação por mais 24 horas. A mistura de reação foi diluída comacetato de etila, e lavada com HCI(aq) a 0,2 M, e em seguida salmoura, antesda secagem com sulfato de magnésio. Filtração e remoção do solvente empressão reduzida forneceram o produto bruto, a ser purificado por cromato- grafia rápida de coluna /cristalização.

(1R.2S.3R.5S)-3-í2-Cloro-6-(3-iodo-benzilamino)-purin-9-il]-5-[1,2.3]triazol-2-il-ciclopentano-1,2-diol3-lodobenzilamina (1 equivalente) e trietilamina (1,1 equivalente)foram dissolvidos em diclorometano (-0,4 M com relação a 3-iodobenzilamina) e adicionados a uma solução de (1R,2S,3R,5S)-3-(2,6-dicloropurin-9-il)-5-[1,2,3]triazol-2-il-ciclopentano-1,2-diol em diclorometano(1 equivalente; 0,1 Μ). A mistura de reação foi agitada em temperatura am-biente de um dia para o outro, antes da remoção dos componentes voláteisem pressão reduzida. O produto desejado foi purificado por cromatografiarápida de coluna / cristalização.

Exemplo 3

(1 S,4R)-4-(6-Cloro-2-iodo-purin-9-in-ciclopent-2-enol6-Cloro-2-iodo-purina (ver Taddei et al., Org Biomol Chem, Vol.2, pp. 665-670 (2004); 1 equivalente), (1S,4R)-cis-4-acetóxi-ciclopent-2-enol(1,33 equivalente) e trifenil fosfina ligada ao polímero (0,66 equivalente) fo-ram combinados e postos em vácuo a temperatura ambiente por 24 horas.

THF recém-destilado, desoxigenado foi adicionado (a 1,0 M com relação a(1S,4R)-cis-4-acetóxi-ciclopent-2-enol), seguido por Pd2(dba)3 (5 mol%). Amistura foi agitada por 15 minutos à temperatura ambiente, antes que trieti-lamina (seca com hidróxido de potássio) fosse adicionada (3 equivalentes).

A mistura de reação foi agitada por 1 hora a 50°C, deixada esfriar até a tem-peratura ambiente e filtrada. Os componentes voláteis foram removidos empressão reduzida, e o produto purificado por cromatografia rápida de colu-na/cristalização.

Éster (1S,4R)-4-(6-cloro-2-iodo-purin-9-il)-ciclopent-2-enila de éster de etilade ácido carbônico

Piridina (3 equivalentes) foi adicionada a uma solução (1S,4R)-4-(6-cloro-2-iodo-purin-9-il)-ciclopent-2-enol a 0,2 M (1 equivalente) em THFseco. Cloroformato de etila (4 equivalentes) foi vagarosamente adicionado,assegurando que a temperatura de reação não subisse acima de 40°C. Umavez completada a adição, a mistura de reação foi agitada à temperatura am-biente até se completar. Qualquer precipitado foi removido por filtração, e oscomponentes voláteis foram removidos em pressão reduzida. O resíduo foiabsorvido em diclorometano, e lavado consecutivamente com ácido clorídri-co a 0,1 Μ, água (x2) e salmoura, antes da secagem com sulfato de magné-sio. Filtração e remoção de solvente em pressão reduzida, seguidas por puri-ficação por cromatografia rápida de coluna/cristalização, forneceram o pro-duto desejado.

Éster de t-butila de ácido acetil-r(1S,4R)-4-(6-cloro-2-iodo-purin-9-iD-ciclopent-2-enin-carbâmico

Éster de (1S,4R)-4-(6-cloro-2-iodo-purin-9-il)-ciclopent-2-enila deéster de etila de ácido carbônico (1 equivalente), éster de t-butila de ácidoacetil-carbâmico (ver Tanaka et al., Chem Pharm Buli, Vol. 36, No. 8, pp.3215-3129 (1988); 1,15 equivalente) e trifenil fosfina (0,15 equivalente) fo-ram combinados em um frasco seco em estufa em atmosfera de argônio.THF seco desoxigenado (a 0,3 M com relação a éster etila e (1S,4R)-4-(6-cloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enila de éster de etila) de ácido carbônico foi adi-cionado, seguido por Pd2(dba)3 (5 mol %). A mistura de reação foi agitada a50°C por 1 hora, e deixada esfriar até a temperatura ambiente, antes de oscomponentes voláteis serem removidos em pressão reduzida e o produtopurificado por cromatografia rápida de coluna/cristalização.

Éster de t-butila de ácido acetil-r(1S.2R.3S.4R)-4-(6-cloro-2-iodo-purin-9-il)-2.3-diidróxi-ciclopentill-carbâmico

Éster de t-butila de ácido acetil-[(1S,4R)-4-(6-cloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enil]-carbâmico (1 equivalente), metanossulfonamida (1 equiva-lente) e AD-mix-a (1,5 g/mmol substrato) foram combinados em t-butanol :água 1:1 (a 0,1 M com relação a éster t-butila de ácido acetil-[(1S,4R)-4-(6-cloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enil]-carbâmico). Tetróxido de ósmio (5 mol%,como uma solução a 4% em água) foi adicionada, e a mistura de reação foiagitada vigorosamente de um dia para o outro. Uma vez completa, a reaçãofoi particionada entre acetato de etila e água; a fase orgânica foi lavada con-secutivamente com água fresca (x2) e salmoura, antes de secagem comsulfato de magnésio. Filtração e remoção dos componentes voláteis empressão reduzida forneceram o produto desejado.

Éster t-butila de ácido acetil-í(1S,2R,3S,4R)-2.3-diidróxi-4-(2-iodo-6-metilamino-purin-9-il)-ciclopentil1-carbâmicoÉster de t-butila de ácido acetil-[(1S,2R,3S,4R)-4-(6-cloro-2-iodo-purin-9-il)-2,3-diidróxi-ciclopentil]-carbâmico foi adicionado a um grande ex-cesso de metilamina líquida a -20°C, e agitado por 30 minutos, antes de dei-xar aquecer até temperatura ambiente. O produto desejado foi purificado porcromatografia rápida de coluna / cristalização.

N-[(1S,2R,3S,4R)-2,3-Diidróxi-4-(2-iodo-6-metilamino-purin-9-il)-ciclopentin-acetamida

Éster de t-butila de ácido acetil-[(1S,2R,3S,4R)-2,3-diidróxi-4-(2-iodo-6-metilamino-purin-9-il)-ciclopentil]-carbâmico foi dissolvido em dicloro-metano (-0,1 M) e resfriado em gelo/água a 0°C. Ácido trifluoroacético sufi-ciente foi adicionado para fornecer uma solução a 20%, e a mistura de rea-ção foi agitada em gelo até se completar. Os voláteis foram removidos empressão reduzida, e o produto purificado por cromatografia rápida de colu-na/cristalização.

N-K1 S.2R,3S,4R)-4-(2-Hex-1 -inil-6-metilamino-purin-9-il)-2,3-diidróxi-ciclopentill-acetamida

Foi preparada uma solução a 0,05 M de N-[(1S,2R,3S,4R)-2,3-diidróxi-4-(2-iodo-6-metilamino-purin-9-il)-ciclopentil]-acetamida (1 equivalen-te) em uma mistura 7 : 2 de DMF seco e trietilamina. À ela foi adicionadoiodeto de cobre (I) (1 equivalente) e dicloreto de bis(trifenilfosfina)paládio (2mol%), seguido por 1-hexino (6 equivalentes). A mistura resultante foi agita-da à temperatura ambiente até se completar e os componentes voláteis fo-ram removidos em pressão reduzida. O produto foi purificado por cromato-grafia rápida de coluna/cristalização.

Exemplo 4

(1S, 4R)-4-(6-Cloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enol

6-Cloropurina (1 equivalente), (1S,4R)-cis-4-acetóxi-ciclopent-2-enol (1,33 equivalente) e trifenil fosfina ligada ao polímero (0,66 equivalente)foram combinados e colocados sob vácuo à temperatura ambiente por 24horas. THF recém-destilado, desoxigenado foi adicionado (a 1,0 M com rela-ção a (1S,4R)-cis-4-acetóxi-ciclopent-2-enol), seguido por Pd2(dba)3 (5mol%). A mistura foi agitada por 15 minutos a temperatura ambiente, antesque trietilamina (seca com hidróxido de potássio) fosse adicionada(3 equivalentes). A mistura de reação foi agitada por uma hora a 50°C, dei-xada esfriar à temperatura ambiente e filtrada. Os componentes voláteis fo-ram removidos em pressão reduzida, e o produto purificado por cromatogra-fia rápida de coluna/cristalização.

Éster de (1S,4R)-4-(6-cloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enila de éster de etila deácido carbônico

Piridina (3 equivalentes) foi adicionada a uma solução a 0,2 Mde (1S,4R)-4-(6-cloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enol (1 equivalente) em THF se-co. Cloroformato de etila (4 equivalentes) foi vagarosamente adicionado, as-segurando que a temperatura de reação não subisse acima de 40°C. Umavez que a adição se completou, a mistura de reação foi agitada a temperatu-ra ambiente até se completar. Qualquer precipitado foi removido por filtra-ção, e os componentes voláteis foram removidos em pressão reduzida. Oresíduo foi absorvido em diclorometano, e lavado consecutivamente comácido clorídrico a 0,1 M, água (x2) e salmoura, antes da secagem com sulfa-to de magnésio. Filtração e remoção de solvente em pressão reduzida, se-guidas por purificação por cromatografia rápida de coluna/cristalização, for-neceram o produto desejado.

Éster de t-butila de ácido acetil-[(1S,4R)-4-(6-cloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enin-carbâmico

Éster de (1S,4R)-4-(6-cloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enila de ésterde etila de ácido carbâmico (1 equivalente), éster de t-butila de ácido acetil-carbâmico (ver Tanaka et al. (1988), supra; 1,15 equivalente) e trifenil fosfina(0,15 equivalentes) foram combinados em um frasco seco em estufa em at-mosfera de argônio. THF seco desoxigenado (a 0,3 M com relação a ésterde (1S,4R)-4-(6-cloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enila de éster de etila de ácidocarbônico) foram adicionados, seguido por Pd2(dba)3 (5 mol%). A mistura dereação foi agitada a 50°C por 1 hora, e deixada esfriar até a temperaturaambiente, antes dos componentes voláteis serem removidos em pressãoreduzida e o produto purificado por cromatografia rápida de colu-na/cristalização.Éster de t-butila de ácido acetil-[(1S,2R,3S,4R)-4-(6-cloro-purin-9-il)-2,3-diidróxi-ciclopentin-carbâmico

Éster de t-butila de ácido acetil-[(1S,4R)-4-(6-cloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enil]-carbâmico (1 equivalente), metanossulfonamida (1 equiva-lente) e AD-mix-a (1,5 g/mmol substrato) foram combinados em t-butanokágua 1:1 (a 0,1 M com relação a éster de t-butila de ácido acetil-[(1S,4R)-4-(6-cloro-purin-9-il)-ciclopent-2-enil]-carbâmico). Tetróxido de ós-mio (5 mol%, como uma solução a 4% em água) foi adicionada, e a misturade reação foi agitada vigorosamente de um dia para o outro. Uma vez com-pleta, a mistura de reação foi particionada entre acetato de etila e água; afase orgânica foi lavada consecutivamente com água fresca (x2) e salmoura,antes da secagem com sulfato de magnésio. Filtração e remoção dos com-ponentes voláteis em pressão reduzida forneceram o produto desejado.Éster de t-butila de ácido acetil-((1S,2R,3S,4R)-2,3-diidróxi-4-[6-(3-iodo-benzilamino)-purin-9-il1-ciclopentil)-carbâmico

3-lodobenzilamina (1 equivalente) e trietilamina (1,1 equivalente)foram dissolvidas em diclorometano (-0,4 M com relação a 3-iodobenzilamina) e adicionadas a uma solução de éster de t-butila de ácidoacetil-[(1S,2R,3S,4R)-4-(6-cloro-purin-9-il)-2,3-diidroxiciclopentil]-carbâmicoem diclorometano (1 equivalente; 0,1 Μ). A mistura de reação foi agitadacom aquecimento de um dia para o outro, antes da remoção dos componen-tes voláteis em pressão reduzida. O produto desejado foi purificado por cro-matografia rápida de coluna/cristalização.

N-((1S,2R,3S,4R)-2,3-Diidróxi-4-16-(3-iodo-benzilamino)-purin-9-in-ciclopentiD-acetamida

Éster de t-butila de ácido acetil-{(1S,2R,3S,4R)-2,3-diidróxi-4-[6-(3-iodo-benzilamino)-purin-9-il]-ciclopentil}-carbâmico foi dissolvido em diclo-rometano (-0,1 M) e resfriado em gelo/água a 0°C. Ácido trifluoroacético su-ficiente foi adicionado para fornecer uma solução a 20%, e a mistura de rea-ção foi agitada em gelo até se completar. Os voláteis foram removidos empressão reduzida, e o produto purificado por cromatografia rápida de coluna/cristalização.Exemplo 5

Éster de t-butila de ácido acetil-((1S,2R,3S,4R)-4-(6-f5-cloro-2-(3-metil-isoxazol-5-ilmetóxi)-benzilamino1-purin-9-il)-2,3-diidróxi-ciclopentil)-carbâmico

5-Cloro-2-(3-metilisoxazol-5-ilmetóxi)benzilamina (ver DeNinno1et al., J Med Chem, Vol. 46, pp. 353-355 (2003) material suplementar; 1 e-quivalente) e trietilamina (1,1 equivalente) foram dissolvidos em diclorometa-no (~0,4 M com relação a 3-iodobenzilamina) e adicionados a uma soluçãode éster de t-butila de ácido acetil-[(1S,2R,3S,4R)-4-(6-cloro-purin-9-il)-2,3-diidroxiciclopentil]-carbâmico em diclorometano (1 equivalente; 0,1 Μ). Amistura de reação foi agitada com aquecimento de um dia para o outro, an-tes da remoção de componentes voláteis em pressão reduzida. O produtodesejado foi purificado por cromatografia rápida de coluna / cristalização.N-((1S.2R.3S.4R)-4-(6-[5-Cloro-2-(3-metil-isoxazol-5-ilmetóxi)-benzilamino1-purin-9-il)-2,3-diidróxi-ciclopentil)-acetamida

Éster de t-butila de ácido acetil-((1S,2R,3S,4R)-4-{6-[5-cloro-2-(3-metil-isoxazol-5-ilmetóxi)-benzilamino]-purin-9-il}-2,3-diidroxiciclopentil)-carbâmico foi dissolvido em diclorometano (-0,1 M) e resfriado em gelo/águaa 0°C. Ácido trifluroacético suficiente foi adicionado para fornecer uma solu-ção a 20%, e a mistura de reação foi agitada em gelo até se completar. Osvoláteis foram removidos em pressão reduzida, e o produto purificado porcromatografia rápida de coluna / cristalização.

Claims (9)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula<formula>formula see original document page 38</formula>em forma livre ou de sal, em queR1 indica um grupo heterocíclico de 3 a 12 membros ligado a Ncontendo de 1 a 4 átomos de nitrogênio no anel e opcionalmente contendode 1 a 4 outros heteroátomos selecionados no grupo que consiste em oxigê-nio e enxofre, esse grupo sendo opcionalmente substituído por oxo, C1-C8-alcóxi, C6-C10-arila, R1a ou por C1-C8-alquila opcionalmente substituída porOH,ouR1 é -NH-C1-C8-alquil carbonila, -NH-C3-C8-cicloalquil carbonila, -NH-S02-C1-C8-alquila, -NH-C7-Ci4-aralquil carbonila, -NH-C(=0)-grupo hete-rocíclico de 3- a 12 membros, -NH-C(=O)-C6-C10-arila ou -NH-C(=0)-C(=0)-NH-C1-C8-alquila opcionalmente substituída por R1a, onde R1a é um grupoheterocíclico de 3 a 12 membros contendo pelo menos um heteroátomo noanel selecionado no grupo que consiste em nitrogênio, oxigênio e enxofre, oreferido anel heterocíclico de 3 a 12 membros sendo opcionalmente substitu-ído por halo, ciano, oxo, OH1 carbóxi, amino, nitro, C1-C8-alquila, CrC8-alquilsulfonila, aminocarbonila, C1-C8-alquil carbonila ou C1-C8-alcóxi opcional-mente substituído por aminocarbonila;R2 é selecionado no grupo que consiste em metila, R- e S- 1-feniletila, um grupo benzila não substituído, e um grupo feniletila ou benzilasubstituído em uma ou mais posições com um substituinte selecionado nogrupo que consiste em C1-C8-alquila, amino, halo, C1-C8-haloalquila, nitro,OH, acetamido, C1-C8-alcóxi e sulfo, ou<formula>formula see original document page 39</formula>ondeR2a é halo, trifluorometila, ciano, CrC8-alquila, CrC8-alquilóxi,etenila ou etinila;D é óxi, tio, NH, CrC8-alquilóxi, CrC8-alquiltio ou -CO-alquilamino; eG é um anel de 5 a 8 membros parcialmente saturado, totalmen-te saturado ou totalmente insaturado tendo opcionalmente 1 a 3 heteroáto-mos selecionados independentemente entre oxigênio, enxofre e nitrogênio,ou, um anel bicíclico consistindo em dois anéis de 3 a 6 membros fundidosparcialmente saturados, totalmente saturados ou totalmente insaturados,tomados independentemente, tendo opcionalmente 1 a 4 heteroátomos se-lecionados independentemente entre nitrogênio, enxofre e oxigênio; em queo referido G é opcionalmente mono-, di- ou tri-substituído independentemen-te com halo, C1-C8-alquila, trifluorometila, trifluorometóxi, nitro, ciano, C3-C10-cicloalquila, hidróxi ou CrC8-alcóxi, ouG é ciano, CrCe-alcoxicarbonila, C3-C10-cicloalcoxicarbonila,C(O)NR4R51 C(S)NR4R5, C(NH)NR4NR5, C(N(CrC3)alquil)NR4R5 ou C(N(C3-C10)cicloalquil)NR4R5;R3 é selecionado entre H, halo, CrC8-alquila opcionalmentesubstituída com halo ou OH, CrC8-alcóxi, amino, CrC8-alquilamino, C2-C10-alquenos, C2-C10-alquinos opcionalmente substituídos por CrC8-alquila, arilaopcionalmente substituída por CrCs-alquila ou OH, tio e CrC8-alquiltio;R4 é uma ligação, H, CrC10-alquila, hidróxi, CrC10-alcóxi, C3-C10-cicloalcóxi ou um anel de 5 a 8 membros parcialmente saturado, total-mente saturado ou totalmente insaturado opcionalmente ligado através deC1C8-alquila, opcionalmente tendo 1 a 3 heteroátomos selecionados inde-pendentemente entre oxigênio, enxofre e nitrogênio, ou, um anel bicíclico ouum anel bicíclico com ponte CrC8- opcional opcionalmente ligada através deC1-C8-alquila, o referido anel bicíclico ou anel bicíclico com ponte opcional-mente tendo 1 a 4 heteroátomos selecionados independentemente entrenitrogênio, enxofre e oxigênio em que os referidos C1-C10-alquila, C1-C10-alcóxi, C3-C1--cicloalcóxi ou anel(is) de R4 são opcionalmente mono-, di- ortri-substituídos independentemente com halo, C1-C8-alquila, trifluorometila,nitro, ciano, C3-C1--cicloalquila, OH ou C1-C8-alcóxi;R5 é uma ligação, H, C1-C8-alquila ou C1-Ci0-cicloalquila, ouR4 e R5, tomados junto com o nitrogênio ao qual eles estão liga-dos, formam um anel de 4 a 9 membros total ou parcialmente insaturados, oreferido anel opcionalmente ligado em ponte, opcionalmente tendo 1 a 3 he-teroátomos selecionados independentemente entre oxigênio, enxofre e ni-trogênio, o referido anel sendo opcionalmente mono- ou di-substituído inde-pendentemente com oxo, hidróxi, C1-C8-alcóxi, C1-C8-alquila, amino, mono-N- ou di-N,N-C1-C8-alquilaminocarbonila, mono-N- ou di-N,N-C3-C10-cicloalquilaminocarbonila, N-C1-C8-alquil -N-C3-C1--cicloalquilaminocarbonila,mono-N- ou di-N,N-C1-C8-alquil amino, mono-N-ou di-N, N-C3-C10-cicloalquilamino, N-C1-C8-alquil -N-C3-C10-cicloalquilamino, formilamino, C1-C8-alquilcarbonilamino, C3-C1--cicloalquilcarbonilamino, C1-C8-alcoxicarbonilamino, N-C1-C8-alcoxicarbonil-N-C1-C8-alquilamino, C1-C8-sulfamoíla, C1-C8-alquilsulfonilamino, C3-C10-cicloalquilsulfonilamino ou umanel de 5 a 8 membros parcialmente saturado, totalmente saturado ou total-mente insaturado, opcionalmente ligado através de C1-C8-alquila, opcional-mente tendo 1 a 3 heteroátomos selecionados independentemente entreoxigênio, enxofre e nitrogênio, ou, um anel bicíclico consistindo em dois a-néis de 3 a 6 membros fundidos parcialmente saturados, totalmente satura-dos ou totalmente insaturados, tomados independentemente, opcionalmenteligados através de C1-C8-alquila, opcionalmente tendo 1 a 4 heteroátomosselecionados independentemente entre nitrogênio, enxofre e oxigênio, e op-cionalmente mono- ou dissubstituído com halo, trifluorometila, trifluorometó-xi, C1-C8-alquila ou C1-C8-alcóxi.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe-lo fato de queR1 indica um grupo heterocíclico de 3 a 12 membros ligado a Ncontendo de 1 a 4 átomos de nitrogênio no anel e opcionalmente contendode 1 a 4 outros heteroátomos selecionados no grupo que consiste em oxigê-nio e enxofre, ouR1 é -NH-C1-C8-alquilcarbonila;R2 é metila ou benzila opcionalmente substituídas por halogênio,<formula>formula see original document page 41</formula>R2a é halo, trifluorometila, ciano, C1C8-alquila, C1C8-alcóxi, ete-nila ou etinila;D é óxi, tio, NH, C1C8-alcóxi, C1C8-alquiltio ou -CO-alquilamino;eGé um anel de 5 a 8 membros parcialmente saturado, tòtalmen-te saturado ou totalmente insaturado tendo opcionalmente 1 a 3 heteroáto-mos selecionados independentemente entre oxigênio, enxofre e nitrogênio,ou, um anel bicíclico consistindo em dois anéis de 3 a 6 membros fundidosparcialmente saturados, totalmente saturados ou totalmente insaturados,tomados independentemente, tendo opcionalmente 1 a 4 heteroátomos se-lecionados independentemente entre nitrogênio, enxofre e oxigênio; em queo referido G é opcionalmente mono-, di- ou tri-substituído independentemen-te com halo, C1C8-alquila ; eR3 é selecionado entre H, halo, C1Cs-alquila opcionalmentesubstituída por halo ou OH, C1C8-alcóxi, amino, C1-C8-alquilamino, C2-C10"alquenos, C2-C1o-alquinos opcionalmente substituídos por C1C8-alquila, Οβ-C1o-arila opcionalmente substituída por C1C8-alquila ou OH, tio e C1C8-alquiltio.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe-lo fato de queR1 é um grupo heterocíclico de 5 a 12 membros ligado a N con-tendo pelo menos um heteroátomo no anel selecionado no grupo que con-siste em nitrogênio, oxigênio e enxofre, ouR1 é -NH-C1-C8-alquilcarbonila;<formula>formula see original document page 42</formula>ondeR2a é halogênio;D é CrC8-alcóxi; eG é um grupo heterocíclico de 5 membros substituído por umgrupo, ouR2 é uma benzila substituída por halogênio, ouR2 é metila; eR3 é H, halo ou C2-C10-alquinos opcionalmente substituídos porC1-C8-alquila.

4. Composto de fórmula I de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que apresenta a fórmula:<formula>formula see original document page 42</formula>em que R1Re R são<table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table>

5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 4, caracterizado pelo fato de ser para uso como produto farmacêutico.

6. Composições farmacêuticas, caracterizadas pelo fato de quecompreendem o composto como definido em qualquer uma das reivindica-ções 1 a 4.

7. Uso do composto como definido em qualquer uma das reivin-dicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medica-mento para o tratamento de uma condição mediada por ativação do receptorA3 de adenosina.

8. Uso do composto de acordo com a reivindicação 7, caracteri-zado pelo fato de que a referida condição mediada por ativação do receptorA3 de adenosina é artrite reumatoide.

9. Processo para preparação de compostos de fórmula (I)<formula>formula see original document page 44</formula>onde R1, R2 e R3 são como definidos acima,o referido processo sendo caracterizado pelo fato de que com-preende as etapas de:(i)(A) para preparação de compostos de fórmula (I), reagir umcomposto de fórmula (Ia)<formula>formula see original document page 44</formula>onde R2 e R3 são como definidos acima, com cloreto de acetila na presençade base;(B) para preparação de compostos de fórmula (l), onde R3 é C2-Cs-alquinila, reagir um composto de fórmula (lb)<formula>formula see original document page 44</formula>onde X é um grupo de saída, com um composto de fórmula <formula>formula see original document page 44</formula>onde R pode ser CrCe-alquila ;(C) para preparação de compostos de fórmula (I), reagir umcomposto de fórmula (lc)<formula>formula see original document page 45</formula>ondeR1 e R3 são como definidos acima; eX é um grupo de saída, com um composto de fórmula H2N-R21onde R2 é como definido acima na presença de uma base; e(ii) recuperar o composto de fórmula (I) resultante, em forma livreou de sal farmaceuticamente aceitável.