BRPI0712953A2 - anticorpos anti-nkg2a e suas utilizações - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTI-NKG2A E SUAS UTILIZAçõES. São aqui descritas anticorpos anti-NKG2A adequados à terapia humana, incluindo versões humanizadas do anticorpo anti-NKG2A Z270 mu-rídeo, além de métodos e materiais relacionados para a produção e utilização destes anticorpos. Também são descritas seqüências e sítios de regiões determinantes de complementaridade (CDRs) exemplares para retro- substituições de aminoácidos opcionais na região estrutural (FR) e/ou CDRs desses anticorpos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS ANTI-NKG2A E SUAS UTILIZAÇÕES"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção está relacionada aos anticorpos anti- NKG2A, em particular às versões humanizadas do anticorpo murídeo anti- NKG2A Z270, além de métodos de produção e utilização destes anticorpos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

CD94/NKG2A é um receptor inibidor de citotoxicidade encontra- do em subconjuntos de células NK, NKT e T, que restringe sua morte de cé- lulas que expressam o HLA-E CD94/NKG2A-ligante (veja, por exemplo, WO 99/28748). Os anticorpos que inibem CD94/NKG2A podem aumentar a ativi- dade citolítica de linfócitos tumor-específicos contra células tumorais. Portan- to, anticorpos terapêuticos que inibem CD94/NKG2A em pacientes com cân- cer, sem matar as células que expressam CD94/NKG2A, podem ser capa- zes de controlar o crescimento tumoral. Além disso, certos linfomas como, por exemplo, linfomas NK, são caracterizados por expressão de CD94/ NKG2A. Nesses pacientes, os anticorpos terapêuticos que se dirigem e ma- tam células que expressam CD94/NKG2A podem ser capazes de erradicar as células tumorais. Também foi sugerido o uso de anticorpos anti-NKG2A no tratamento de doenças autoimunes ou inflamatórias (veja, por exemplo, U.S. 20030095965A1, WO 2006070286).

Vários anticorpos contra CD94/NKG2A foram descritos na técni- ca. Por exemplo, Sivori e cols. (Eur. J. Immunol. 1996; 26: 2.487-92) refe- rem-se ao anticorpo murídeo anti-NKG2A Z270; Carretero e cols. (Eur. J. Immunol. 1997; 27: 563-7) descrevem o anticorpo anti-NKG2A murídeo Z199 (agora disponível comercialmente por Beckman Coulter, Inc., Ne do Produto IM2750, EUA); Vance e cols. (J. Exp. Med. 1999; 190: 1.801-12) referem -se ao anticorpo anti-NKG2 murídeo 20D5 (agora disponível comercialmente por BD Biosciences Pharmingen, Ns de Catálogo 550518, EUA); e a publicação do pedido de patente U.S. 20030095965 descreve o anticorpo murídeo 3S9, que aparentemente se liga a NKG2A, NKG2C e NKG2E.

Os anticorpos anti-CD94/NKG2A disponíveis atualmente são de origem não humana, o que os torna inadequados para a maioria das aplica- ções terapêuticas em seres humanos em função de sua imunogenicidade. Embora existam abordagens de humanização simples como, por exemplo, enxerto de CDR, tipicamente são necessárias abordagens de humanização individualizadas para se obter uma variante humanizada ótima que minimize a imunogenicidade ao mesmo tempo em que retenha ou melhore suficien- temente as propriedades funcionais. Conseqüentemente, há necessidade de anticorpos anti-CD94/NKG2A que sejam adequados ao tratamento de paci- entes humanos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece anticorpos anti-NKG2A, além de composições que compreendem estes anticorpos, e métodos de produção e utilização destes anticorpos. Em uma modalidade, o anticorpo é uma versão humanizada do anticorpo murídeo anti-NKG2A Z270, aqui denominada "humZ270". Em outra modalidade, o anticorpo é uma versão humanizada de um anticorpo anti-NKG2A que possui domínios da cadeia pesada variável (VH) e/ou da cadeia leve variável (VL) substancialmente idênticos àqueles de Z270.

São fornecidos resíduos exemplares da região determinante de complementaridade (CDR) e/ou sítios para substituições de aminoácidos na região estrutural (framework) (FR) e/ou destes anticorpos para a produção de anticorpos que possuem propriedades aprimoradas como, por exemplo, menor imunogenicidade, propriedade de ligação de antígeno ou outras pro- priedades funcionais aprimoradas e/ou propriedades físico-químicas aprimo- radas como, por exemplo, melhor estabilidade. Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos humanizados nos quais pelo menos uma porção de uma CDR de Kabat é idêntica à porção correspondente na seqüência receptora humana. Em uma modalidade, a seqüência estrutural receptora humana não compreende nenhuma substituição de aminoácidos ou retromutações. Em outra modalidade, a seqüência estrutural humana compreende pelo menos uma substituição de aminoácido. As posições de Kabat para essas substitui- ções de aminoácidos exemplares incluem 5, 66, 67, 69, 71, 73 e 75 na regi- ão estrutural do domínio de VH1 46 e 48 na região estrutural do domínio de VL, e 60, 63, 64 e 65 na CDR-H2.

Em outros aspectos, a invenção fornece composições farmacêu- ticas que compreendem esses anticorpos e um veículo, e imunoconjugados que compreendem estes anticorpos conjugados a um agente citotóxico ou detectável.

Em outros aspectos, a invenção fornece ácidos nucléicos e veto- res que codificam esses anticorpos, e células hospedeiras que contêm esses ácidos nucléicos e/ou vetores. Também são fornecidos métodos recombi- nantes de produção de anticorpos anti-NKG2A por cultivo dessas células hospedeiras de tal forma que sejam produzidos ácidos nucléicos.

Em outros aspectos, a invenção fornece artigos manufaturados que compreendem um recipiente que compreende esses anticorpos anti- NKG2A e instruções que informam um usuário sobre o tratamento de um distúrbio como, por exemplo, câncer ou uma doença viral em um paciente. Opcionalmente, o artigo pode compreender outro recipiente que contém ou- tro agente, em que as instruções informam o usuário sobre o tratamento do distúrbio com o anticorpo em combinação com o agente.

A invenção também fornece métodos de utilização desses anti- corpos anti-NKG2A no tratamento de distúrbios como, por exemplo, câncer, uma doença viral, um distúrbio inflamatório ou um distúrbio autoimune em um paciente, opcionalmente em conjunto com outro agente anticâncer, anti- doença viral ou agente antiinflamatório.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra um alinhamento de Z270VL e Z270VH com segmentos V e J de uma linhagem germinativa selecionada e seqüências de humZ270VL1 (ID. DE SEQ. N9: 4) e humZ270VH1 (ID. DE SEQ. Ns: 5) e- xemplares, com numeração de resíduos de aminoácidos de acordo com o esquema de Kabat (Kabat e cols., 1991, "Sequences of Proteins of Immuno- logical Interest", 5ã Ed. "Public Health Service, National Institutes of Health", Bethesda, MD). Os resíduos de máscara estão sombreados no esquema de Kabat; os resíduos da CDR são mostrados em negrito no esquema de Ka- bat; as diferenças de camundongo/linhagem germinativa estão sombreadas nas seqüências VKI_02/JK4 (ID. DE SEQ. Ns: 9) e VH1_18/JH6 (ID. DE SEQ. Ns: 10); e os resíduos da retromutação potencial estão sombreados nas seqüências de humZ270VH/VL. As retromutações potenciais identifica- das na VL foram L46F e I48V. As retromutações potenciais identificadas na cadeia pesada foram V5Q, M69L, T71V, T73K e T75S. Também são mos- tradas as seqüências de consenso de humZ270VL ("humZ270VL1 cons"; ID. DE SEQ. Ns: 6) e humZ270VH1 ("humZ270VH1 cons"; ID. DE SEQ. Ns: 7) resultantes. Em humZ270VL1 cons, o aminoácido na posição 46 é L ou F, e o aminoácido na posição 48 é I ou V. Em humZ270VH1 cons, o aminoácido na posição 5 é V ou Q; o aminoácido na posição 69 é M ou L; o aminoácido na posição 71 é T ou V; o aminoácido na posição 73 é T ou K; e/ou o amino- ácido na posição 75 é T ou S. Em um humZ270VH1 alternativo, humZ270VH1 cons2 (ID. DE SEQ. Ns: 8), o aminoácido na posição 5 é V ou Q; o aminoácido na posição 60 é S ou A; o aminoácido na posição 63 é L ou F; o aminoácido na posição 64 é Q ou Κ; o aminoácido na posição 65 é G ou D; o aminoácido na posição 66 é R ou Κ; o aminoácido na posição 67 é V ou A; o aminoácido na posição 69 é M ou L; o aminoácido na posição 71 é T ou V; o aminoácido na posição 73 é T ou K; e/ou o aminoácido na posição 75 é T ou S.

A figura 2 mostra as CDRs de um anticorpo humZ270 exemplar, de acordo com as definições de Kabat. As diferenças, em comparação com CDRs de Z270 murídeo, são mostradas em negrito.

As figuras 3A-H mostram plasmídeos citados nos Exemplos. (A) Mapa do vetor pMD19-T para clonagem de TA. (B) Mapa do vetor de clona- gem pJSV002 para expressão transitória. (C) A cadeia leve é inserida em pJSV002 com região constante kappa murídea. (D) Variante pJSV002- mlgG1 que contém a região constante de IgGI murídea. (E) H1 de Z270 pJSV002-mlgG1 que contém a região variável da cadeia pesada de Z270 e região constante da cadeia pesada de IgGI. (F) L11 de Z270 pJSV002- hKappa que contém região variável da cadeia leve e a região constante da cadeia kappa humana. (G) pJSV002-lgG4-S241 P. (H) pJSV002-lgG4-S241 P Ζ270Η1.

A figura 4 mostra diferentes seqüências derivadas ou baseadas em Z270, (A) a (J)1 IDS. DE SEQ. Nos: 14-23, respectivamente. Veja os E- xemplos 2-5 para mais detalhes.

A figura 5 mostra um design exemplar de um vetor para a ex- pressão de cadeias pesadas de Z270 humanizado.

A figura 6 mostra um design exemplar de um vetor para a ex- pressão de cadeias leves de Z270 humanizado.

A figura 7 mostra uma descrição exemplar de um procedimento para a expressão transitória de anticorpos Z270 humanizados em células HEK293.

A figura 8 mostra um ensaio Biacore exemplar para determinar a afinidade de ligação de humZ270 pelo antígeno.

A figura 9 mostra determinações de afinidade de Z270 quimérico (A) e humZ270VL1/VH1 (B).

A figura 10 mostra determinação da afinidade de humZ270VL1/ VH1, que possui diferentes retromutações na cadeia leve ou na cadeia pe- sada. Z270 quimérico foi usado como comparação.

A figura 11 mostra a estratégia para enxerto de CDR padrão de CDRs de Z270 murídeo de Kabat H1-H3 em uma estrutura central receptora de cadeia pesada VH1-18/JH6, sem (humZ270H3) ou com (humZ270VH4) retromutações.

A figura 12 mostra um alinhamento entre construções de humZ270VH em diferentes seqüências receptoras humanas, todas com uma porção de CDR-H2 parcialmente humana.

A figura 13 mostra os resultados da avaliação da afinidade por Biacore de variantes de humZ270 VL1/VH1 e VH3-VH8, todos normalizados para a KD de hZ270VL1/VH1.

A figura 14 mostra os resíduos selecionados para mutagênese por varredura de alanina para identificar resíduos do paratopo críticos nos segmentos VL e VH de Z270.

A figura 15 mostra os resultados da avaliação da afinidade por Biacore de mutantes de alanina Z270VH, normalizados para a ligação de Z270 quimérico.

A figura 16 mostra os resultados da avaliação da afinidade por Biacore de mutantes de alanina Z270VL, normalizados para a ligação de Z270 quimérico.

A figura 17 mostra a ligação de diversas variantes de Z270 re- combinante às células Ba/F3 que superexpressam estavelmente CD94/NKG2A ou CD94/NKG2C, com a utilização de citometria de fluxo.

A figura 18 mostra os resultados de um ensaio para avaliar a habilidade de Z270 recombinante, Z270 quimérico, humZ270VL1/VH1 e Z199 para induzir a morte de células LCL 721.221-Cw3 marcadas com 51Cr por células NKL CD94/NKG2A+, que mostram que humZ270VL1/VH1 foi mais eficiente na indução de morte.

A figura 19 mostra que humZ270VL1/VH1 se liga eficientemente às células Ba/F3-CD94/NKG2A de uma forma concentração-dependente (diamantes). No entanto, quando as células foram pré-incubadas com tetrâ- meros de HLA-E, humZ270VL1/VH1 foi impedida de se ligar às células Ba/F3-CD94/NKG2A (quadrados).

A figura 20 mostra que duas preparações diferentes de humZ270VL1/VH1 e uma variante humZ270 com uma mutação V5Q em VH se ligam às células que expressam CD94/NKG2A-, mas não às que expres- sam CD94/NKG2C, embora a variante V5Q ligeiramente menos eficiente- mente.

DEFINIÇÕES

O termo "anticorpo" é aqui usado em seu significado mais amplo e inclui especificamente anticorpos monoclonais de comprimento total, anti- corpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos bi- específicos) e fragmentos de anticorpo, desde que exibam a atividade bioló- gica desejada. Várias técnicas relevantes para a produção de anticorpos são fornecidas, por exemplo, em Harlow, e cols., "ANTIBODIES: A LABORA- TORY MANUAL", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988). Um "fragmento de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo de comprimento total, de preferência regiões de ligação de antíge- no ou variáveis deste. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem frag- mentos Fab1 Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)3, Fv (tipicamente os domínios de VL e VH de um braço simples de um anticorpo), Fv de cadeia simples (scFv), dsFv, fragmentos Fd (tipicamente o domínio de VH e CH1) e dAb (tipicamen- te um domínio de VH); domínios de VH, VL, VhH, e V-NAR; minibodies, dia- bodies, triabodies, tetrabodies e corpos kappa (veja, por exemplo, Ill e cols., Protein Eng. 1997; 10: 949-57); IgG de camelo; IgNAR; e fragmentos multi- específicos de anticorpo formados a partir de fragmentos de anticorpo, e uma ou mais CDRs isoladas ou um paratopo funcional, em que as CDRs isoladas ou os resíduos ou polipeptídeos de ligação de antígeno podem es- tar associados ou ligados em conjunto de modo a formar um fragmento fun- cional de anticorpo. Foram descritos ou revisados vários tipos de fragmentos de anticorpo, por exemplo, em Holliger e Hudson, Nat. Biotechnol. 2005; 23, 1.126-1.136; WO 2005040219, e Pedidos de Patente U.S. publicados 20050238646 e 20020161201.

O termo "derivado de anticorpo", como aqui usado, compreende um anticorpo de comprimento total ou um fragmento de um anticorpo, que compreende, de preferência, pelo menos regiões de ligação de antígeno ou variáveis deste, em que um ou mais dos aminoácidos são modificados qui- micamente, por exemplo, por alquilação, PEGuilação, acilação, formação de éster ou formação de amida, ou semelhantes, por exemplo, para ligação do anticorpo a uma segunda molécula. Isso inclui, sem limitação, anticorpos PEGuilados, anticorpos cisteína-PEGuilados, e variantes destes.

Um "imunoconjugado" compreende um derivado de anticorpo associado ou ligado a um segundo agente, por exemplo, um agente citotóxi- co, um agente detectável etc.

Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo quimérico huma- no/não humano que contém uma seqüência mínima derivada de imunoglo- bulina não humana. Na maior parte, anticorpos humanizados são imunoglo- bulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região hi- pervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hiperva- riável de uma espécie não humana (anticorpo doador) como, por exemplo, de camundongo, rato, coelho ou primata não humano, que possuem a espe- cificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resí- duos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recep- tor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado com- preenderá substancialmente tudo de pelo menos um e, tipicamente, dois, domínios variáveis, em que todas, ou substancialmente todas, as alças hi- pervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana, e todos, ou substancialmente todos, os resíduos FR são aqueles de uma se- qüência de imunoglobulina humana, o anticorpo humanizado também pode opcionalmente compreender pelo menos uma porção de uma região cons- tante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhe, veja, por exemplo, Jones e cols., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann e cols., Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992), WO 92/02190, Pedido de Patente U.S. 20060073137 e Patentes U.S. 6.750.325, 6.632.927, 6.639.055, 6.548.640, 6.407.213, 6.180.370, 6.054.297, 5.929.212, 5.895.205, 5.886.152, 5.877.293, 5.869.619, 5.821.337, 5.821.123, 5.770.196, 5.777.085, 5.766.886, 5.714.350, 5.693.762, 5.693.761, 5.530.101, 5.585.089 e 5.225.539.

O termo "região hipervariável", quando aqui utilizado, refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat e cols. 1991, supra) e/ou aqueles resíduos de uma "alça hipervariável" (resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Moi Biol. 1987; 196: 901-917).

Tipicamente, a numeração dos resíduos de aminoácidos nessa região é rea- lizada pelo método descrito em Kabat e cols., supra. As frases "posição de Kabat", "com o uso da numeração de Kabat", "numeração o resíduo do do- mínio variável como em Kabat" e "de acordo com Kabat" aqui utilizadas refe- rem-se a esse sistema de numeração para domínios variáveis da cadeia pe- sada ou domínios variáveis da cadeia leve. Com a utilização do sistema de numeração de Kabat, a seqüência de aminoácidos linear real de um peptí- deo pode conter menos aminoácidos ou aminoácidos adicionais que corres- pondem a um encurtamento, ou inserção, em uma FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável da cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de CDR H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 da FR da cadeia pesada. A numeração de resíduos de acordo com Kabat pode ser determi- nada para certo anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da se- qüência do anticorpo com uma seqüência numerada por Kabat "padroniza- da". A menos que indicado de forma diferente ou que o contexto indique o contrário, a posição de todos os resíduos de aminoácidos em uma seqüên- cia de VL ou VH aqui descrita está de acordo com Kabat.

Resíduos da "região estrutural" ou "FR" são aqueles resíduos de VH ou VL diferentes das CDRs aqui definidas.

Uma "variante" de um polipeptídeo refere-se a um polipeptídeo que possui uma seqüência de aminoácidos que é substancialmente idêntica a um polipeptídeo de referência, tipicamente um polipeptídeo nativo ou "pa- rente". A variante de polipeptídeo pode possuir uma ou mais substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácidos em certas posições dentro da seqüência de aminoácidos nativa.

Substituições de aminoácidos "conservadoras" são aquelas nas quais um resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoáci- do que possui uma cadeia lateral com propriedades físico-químicas simila- res. Famílias de resíduos de aminoácidos que possuem cadeias laterais si- milares são conhecidas na técnica, e incluem aminoácidos com cadeias late- rais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acidífe- ras (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treoni- na, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

O termo "substancialmente idênticas", no contexto de duas se- qüências de aminoácidos, significa que as seqüências, quando otimamente alinhadas, por exemplo, pelos programas GAP ou BESTFIT com a utilização das ponderações de lacuna (gap) padronizadas, compartilham pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 70, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 90, pelo menos cerca de 95, pelo menos cerca de 98, ou pelo menos cerca de 99 por cento de identidade de seqüên- cia. Em uma modalidade, as posições de resíduos que não são idênticas diferem em substituições de aminoácidos conservadoras. A identidade de seqüência é medida tipicamente com a utilização de um software de análise de seqüências. O software de análise de proteínas combina seqüências si- milares usando medidas de similaridade atribuídas a várias substituições, eliminações e outras modificações, incluindo substituições de aminoácidos conservadoras. Por exemplo, o software GCG disponível publicamente con- tém programas como, por exemplo, "Gap" e "BestFit", que podem ser usa- dos com parâmetros padronizados para determinar a homologia de seqüên- cia ou a identidade de seqüência entre polipeptídeos intimamente relaciona- dos como, por exemplo, polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma muteína desta. Veja, por exemplo, GCG Versão 6.1. As seqüências de polipeptídeos tam- bém podem ser comparadas com a utilização de FASTA ou ClustalW, apli- cando-se os parâmetros padronizados ou recomendados. Um programa em GCG Versão 6.1., FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3), fornece ali- nhamentos e percentual de identidade de seqüência das regiões da melhor superposição entre as seqüências examinadas e pesquisadas (Pearson, Me- thods Enzymol. 1990; 183: 63-98; Pearson, Methods MoL Biol. 2000; 132: 185-219). Outro algoritmo preferido na comparação de uma seqüência com uma base de dados contendo um número elevado de seqüências de vários organismos, ou na sua dedução, é o programa de computador BLAST, es- pecialmente blastp, com o uso dos parâmetros padronizados. Veja, por e- xemplo, Altschul e cols., J. MoL Biol. 1990; 215: 403-410; Altschul e cols., Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3.389-402 (1997); cada um deles aqui incorpo- rado por referência. Posições de aminoácidos "correspondentes" em duas seqüências de aminoácidos substancialmente idênticas são aquelas alinha- das por qualquer um dos softwares de análise de proteínas aqui menciona- dos, tipicamente com o uso dos parâmetros padronizados.

Um anticorpo que possui uma "característica biológica" de um anticorpo de referência, (por exemplo, Z270), é aquele que possui uma ou mais das características biológicas daquele anticorpo que o distinguem de outros anticorpos que se ligam ao mesmo antígeno (por exemplo, NKG2A). Por exemplo, um anticorpo com uma característica biológica de Z270 pode bloquear a ativação de NKG2A e/ou competir de forma cruzada com Z270 na ligação do domínio extracelular de NKG2A.

NKG2A (OMIM 161555, cuja descrição completa é aqui incorpo- rada por referência) é um membro do grupo de transcritos de NKG2 (Hou- chins, e cols. (1991) J. Exp. Med. 173: 1.017-1.020). NKG2A é codificada por 7 éxons que se estendem por 25 kb, que mostram algum splicing diferencial. NKG2A é um receptor inibidor encontrado na superfície de subconjuntos de células NK, células T α/β, células T γ/δ e células NKT. Como receptores ini- bidores KIR, ela possui um ITIM em seu domínio citoplasmático. Como aqui usado, o termo "NKG2A" refere-se a qualquer variante, derivado ou isoforma do gene NKG2A ou proteína codificada. Também são englobadas quaisquer seqüências de ácidos nucléicos ou de proteínas que compartilham uma ou mais propriedades biológicas ou funções com NKG2A do tipo selvagem, de comprimento total, e que compartilham pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de nucleotídeos ou de aminoá- cidos. A NKG2A humana compreende 233 aminoácidos em 3 domínios, com um domínio citoplasmático que compreende os resíduos 1-70, uma região transmembrana que compreende os resíduos 71-93 e uma região extracelu- lar que compreende os resíduos 94-233, da seguinte seqüência:

MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAEL NLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASVVTIVVIPSTLI QRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACT SKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKD SDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL (ID. DE SEQ. Ne: 11)

NKG2C (OMIM 602891, cuja descrição completa é aqui incorpo- rada por referência) e NKG2E (OMIM 602892, cuja descrição completa é aqui incorporada por referência) são dois outros membros do grupo de transcritos de NKG2 (Gilenke, e cols. (1998) Immunogenetics 48: 163-173). NKG2C e NKG2E são receptores de ativação encontrados na superfície de células NK.

HLA-E (OMIM 143010, cuja descrição completa é aqui incorpo- rada por referência) é uma molécula MHC não clássica que é expressa na superfície celular e regulada pela ligação de peptídeos derivados da se- qüência sinalizadora de outras moléculas MHC da classe I. HLA-E se liga às células natural killer (NK) e a algumas células T, ligando-se especificamente a CD94/NKG2A, CD94/NKG2B e CD94/NKG2C (veja, por exemplo, Braud e cols. (1998) Nature 391: 795-799, cuja descrição completa é aqui incorpora- da por referência). A expressão de superfície de HLA-E é suficiente para proteger as células-alvo da Iise por clones de células CD94/NKG2A+ NK, T ou NKT. Como aqui usado, o termo "HLA-E" refere-se a qualquer variante, derivado ou isoforma do gene HLA-E ou proteína codificada. Também são englobadas quaisquer seqüências de ácidos nucléicos ou de proteínas que compartilham uma ou mais propriedades biológicas ou funções com HLA-E do tipo selvagem, de comprimento total, e que compartilham pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de nu- cleotídeos ou aminoácidos. Um ácido nucléico está "ligado operacionalmente" quando ele está colocado em um relacionamento funcional com outra seqüência de áci- dos nucléicos. Por exemplo, o DNA para uma pré-seqüência ou líder secre- tor está ligado operacionalmente ao DNA para um polipeptídeo caso ele seja expresso como uma pré-proteína que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador está ligado operacionalmente a uma seqüên- cia codificadora caso ele afete a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossomo está ligado operacionalmente a uma seqüência codifi- cadora caso esteja posicionado de forma a facilitar a tradução. Geralmente, "ligado operacionalmente" significa que as seqüências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguas e em fase de leitura. No entanto, intensificadores não precisam ser contíguos. A ligação é obtida por ligação em sítios de restrição convenientes. Caso tais sítios não existam, são usados adaptadores ou vinculadores de oligonucleo- tídeos sintéticos de acordo com a prática convencional.

Uma molécula "isolada" é uma molécula que é a espécie predo- minante na composição em que é encontrada com relação à classe de mo- léculas à qual pertence (ou seja, ela constitui pelo menos cerca de 50% do tipo de molécula na composição e, tipicamente, constituirá pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou mais da espécie de molécula, por exemplo, peptídeo, na composição). Comumente, uma composição de uma molécula de anticorpo exibirá 98%, 98% ou 99% de homogeneidade para as moléculas de anticorpo no contexto de todas as espécies de peptí- deos presentes na composição, ou pelo menos com relação à espécie de peptídeo substancialmente ativa, no contexto do uso proposto.

No contexto da presente invenção, "tratamento" ou "que trata" refere-se à prevenção, ao alívio, ao gerenciamento, à cura ou à redução de um ou mais sintomas ou manifestações clinicamente relevantes de uma do- ença ou um distúrbio, a menos que definido de forma diferente pelo contex- to. Por exemplo, o "tratamento" de um paciente no qual nenhum sintoma ou manifestação clinicamente relevante de uma doença ou distúrbio foi identifi- cado, consiste em uma terapia preventiva ou profilática, enquanto o "trata- mento" de um paciente no qual sintomas ou manifestações clinicamente re- levantes de uma doença ou distúrbio foram identificados geralmente não constitui terapia preventiva ou profilática.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a anticorpos que se ligam à NKG2A. Em um aspecto, o anticorpo é uma versão humanizada do anticorpo Z270, que é um anticorpo monoclonal murídeo que se liga especificamente à NKG2A, mas não à NKG2C ou NKG2E humana. Z270 pode bloquear a fun- ção de CD94/NKG2A humana, e especificamente induz morte de células por linfócitos restritos por CD94/NKG2A de uma forma concentração- dependente.

A invenção fornece, por exemplo, variantes de humZ270 nas quais pelo menos uma porção de uma CDR de VH como, por exemplo, a CDR-H2, é idêntica à porção correspondente da seqüência receptora de VH humana reduzindo, dessa forma, a imunogenicidade do anticorpo humaniza- do. Surpreendentemente, estas variantes humanizadas podem ser mais efi- cazes na potencialização da citotoxicidade de um linfócito citotóxico que ex- pressa CD94/NKG2A do que o Z270 murídeo ou uma forma quimérica de Z270. Em outros aspectos, a invenção fornece anticorpos que possuem CDRs que compreendem certos resíduos de ligação de antígeno que cor- respondem àqueles no anticorpo Z270 murídeo, e seqüências estruturais humanas. Esses e outros aspectos serão descritos com mais detalhe nas seções seguintes e nos Exemplos.

Anticorpos anti-NKG2A humanizados

Foram descritos na técnica métodos para a humanização de an- ticorpos não humanos. Geralmente, em um processo de humanização, os nucleotídeos que codificam as regiões de interação de um anticorpo murídeo podem ser clonados em um vetor de cDNA que codifica IgG humana, o que pode ser feito de tal forma que seja gerado um anticorpo quimérico que con- siste em um arcabouço de IgG humana que abriga CDRs murídeas. Estes anticorpos quiméricos podem exibir uma menor afinidade, menor estabilida- de ou outras características indesejadas, em comparação com o anticorpo murídeo original, e também podem ser imunogênicos. Portanto, aminoácidos individuais no Ab quimérico podem ter que ser otimizados para a obtenção de um mAb funcional de alta qualidade para aplicações terapêuticas em se- res humanos.

Tipicamente, um anticorpo humanizado possui um ou mais resí- duos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que seja não humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentemente denominados resíduos "importados", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser realizada basicamen- te seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones e cols., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann e cols., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen e cols., Science, 239: 1.534-1.536 (1988)), usando como substituintes se- qüências da região hipervariável para as seqüências correspondentes de um anticorpo humano "receptor". Conseqüentemente, estes anticorpos "humani- zados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. Ns 4.816.567) nos quais substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substitu- ído pela seqüência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais al- guns resíduos da região hipervariável e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

Outro método para a produção de anticorpos humanizados é descrito na publicação do pedido de patente U.S. 2003/0017534, em que são produzidos anticorpos humanizados e preparações de anticorpo a partir de animais não humanos transgênicos. Os animais não humanos são proje- tados geneticamente para conter um ou mais loci de imunoglobulina huma- nizada que são capazes de passar por um rearranjo gênico e por uma con- versão gênica nos animais não humanos transgênicos, para a produção de imunoglobulinas humanizadas diversificadas.

A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, para serem usados na produção dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método "best-fif, a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é testada contra uma biblioteca de seqüências conhecidas do domínio variá- vel humano ou contra uma biblioteca de seqüências da linhagem germinativa humana. A seqüência humana mais próxima daquela do roedor pode então ser aceita como uma região estrutural humana para o anticorpo humanizado (Sims e cols., J. Immunol. 1993; 151: 2.296 et seq.) Chothia e cols., Chothia e Lesk1 J. MoL Biol. 1987; 196: 901-917). Outro método utiliza uma região estrutural específica derivada da seqüência de consenso de todos os anti- corpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura central pode ser usada para vários anticorpos humaniza- dos diferentes (Carter e cols., PNAS USA, 1992; 89: 4.285 et seq.·, Presta e cols., J. Immunol. 1993; 151: 2.623 et seq.). Outros métodos projetados para reduzir a imunogenicidade da molécula de anticorpo em um paciente huma- no incluem anticorpos veneered (veja, por exemplo, a Patente U.S. 6.797.492 e publicações de Pedido de Patente U.S. 20020034765 e 20040253645) e anticorpos que foram modificados por análise e remoção de epitopo de célula T (veja, por exemplo, publicações de Pedido de Patente U.S. 20030153043 e Patente U.S. N2 5.712.120).

É importante ainda que os anticorpos sejam humanizados com retenção da alta afinidade pelo antígeno e de outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir esse objetivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das seqüências parentais e de vários produtos humanizados conceituais com a utilização de modelos tridimensionais das seqüências parentais e humaniza- das. Modelos tridimensionais de imunoglobulina são comumente disponíveis, e são familiares àqueles habilitados na técnica. Há programas de computa- dor disponíveis que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensi- onais prováveis de seqüências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do papel provável dos resí- duos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análise de resíduos que influenciam a habilidade da imunoglobulina candi- data de se ligar ao seu antígeno. Dessa forma, resíduos FR podem ser sele- cionados e combinados a partir das seqüências receptoras e importados de tal forma que as características desejadas do anticorpo, por exemplo, afini- dade aumentada pelo(s) antígeno(s)-alvo, sejam obtidas. Em geral, os resí- duos da região hipervariável estão diretamente e mais substancialmente en- volvidos na influência da ligação de antígeno.

O Exemplo 1 abaixo descreve o design de anticorpos humaniza- dos anti-NKG2A exemplares que se ligam à NKG2A, e a análise é, pelo me- nos em parte, ilustrada na figura 1. Como mostrado na figura 1, em um anti- corpo humZ270 da invenção, a porção do terminal C de CDR-H2 (que cor- responde aos resíduos 61-65 de Kabat) é idêntica à porção correspondente da seqüência receptora humana. Além disso, como descrito na legenda da figura, uma seqüência de humZ270VL (ID. DE SEQ. Ns: 4) pode opcional- mente compreender mutações em um ou em ambos os resíduos FR L46 e 148 indicados, e uma seqüência de humZ270VH (ID. DE SEQ. Ne: 5) pode opcionalmente compreender mutações em um ou mais dos resíduos FR V5, M69, T71, T73 e T75 indicados, com numeração de aminoácidos de acordo com Kabat. A Tabela 1 descreve variantes de humZ270VL e humZ270VH exemplares que compreendem retromutações humanas para murídeas e- xemplares nas seqüências FR de humZ270VH e humZ270VL, além de com- binações exemplares de mutações de FR. Na Tabela 1 e em outras partes dessa especificação, as posições de aminoácidos são designadas de acordo com Kabat, nas quais os aminoácidos V5, M69, T71, T73 e T75 no domínio de humZ270VH correspondem aos aminoácidos V5, M70, T72, T74 e T76 no ID. DE SEQ. Ns: 5, ID. DE SEQ. Ns: 7, ID. DE SEQ. Ns: 8, ou outras seqüên- cias de humZ270VH exemplares aqui descritas. Tabela 1

Variantes de humZ270VL e humZ270VH que compreendem retromutações de FR exemplares em seqüências de humZ270VL (ID. DE SEQ. N°: 4 ou 6) e/ou humZ270VH (ID. DE SEQ. N°: 5, 7 ou 8) nativas ou de consenso.

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Conseqüentemente, a presente invenção fornece versões hu- manizadas de um anticorpo anti-NKG2A produzidas pelo hibridoma de Z270, além de versões humanizadas de anticorpos não humanos que comparti- lham características biológicas e/ou identidade de seqüência substancial com Z270. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal ou um fragmento ou derivado deste é capaz de se ligar a uma NKG2A de um primata não hu- mano.

O anticorpo humanizado aqui usado compreende resíduos da região hipervariável ou da CDR não humana incorporados em domínios de VH e VL humanas.

Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígeno das CDRs do anticorpo Z270 murídeo em uma estrutura central receptora humana, em que pelo menos os 6 resíduos de aminoácidos do terminal C da CDR-H2 são iguais àqueles na seqüência receptora humana. Estes anticorpos humanizados podem ser mais eficazes do que o anticorpo murídeo Z270 original ou uma versão quimérica deste, por exemplo, na potencialização da atividade citotó- xica de um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A como, por exem- plo, uma célula NK, uma célula NKT, uma célula T α/β e/ou uma célula T γ/δ, ou de uma população de linfócitos citotóxicos que expressam CD94/NKG2A.

Anticorpos da invenção típicos compreendem resíduos de liga- ção de antígeno que correspondem às CDR-H2 e CDR-H3 de Z270 (ou a porções destas) que compreendem os resíduos D52, D54, R94, F99, T(100C) e W(100F) do ID. DE SEQ. Ns: 2 ou ID. DE SEQ. Ns: 5, os quais demonstraram nos Exemplos serem críticos para a ligação de antígeno. Op- cionalmente, os anticorpos também compreendem os resíduos de VH N35, Y53, E56, D98, V(100A) e L(100D).

Em outro aspecto, um anticorpo humanizado compreende uma seqüência de CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 do ID. DE SEQ. Ns: 5 e uma seqüência de CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. Ns: 5, em que a seqüência de CDR-H2 compreende os resí- duos 50-59 do ID. DE SEQ. Ns: 5. Nesses anticorpos humanizados, a região VH pode ter, por exemplo, 50% ou mais de identidade de seqüência para o ID. DE SEQ. Ns: 5 como, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 75% de identidade de seqüência. Domínios de VH humani- zados exemplares que possuem estas seqüências serão descritos nos e- xemplos e abaixo. Em uma modalidade, nesses anticorpos humanizados, o amino- ácido na posição 5 da região VH pode ser V ou Q; o aminoácido na posição 69 da região VH pode ser M ou L; o aminoácido na posição 71 da região VH pode ser T ou V; o aminoácido na posição 73 da região VH pode ser T ou K; e/ou o aminoácido na posição 75 da região VH pode ser T ou S. Em modali- dades separadas, a região VH compreende os resíduos V5 ou Q5, M69 ou L69, T71 ou V71, T73, ou K71 e/ou T75 ou S75. Em outra modalidade, o aminoácido na posição 69 é L. Em outra modalidade adicional ou alternativa, o aminoácido na posição 71 é V.

O anticorpo humanizado pode compreender uma estrutura cen- tral receptora humana de VH de uma seqüência receptora humana selecio- nada, por exemplo, de VH1_18, VH5_a, VH5_51, VH1_f, e VH1_46, e o segmento J é JH6 como, por exemplo, uma VH1_18, VH5_a, VH5_51, ou VH1_f, ou outras seqüências estruturais de VH de linhagem germinativa hu- mana conhecidas na técnica. Em uma modalidade, o segmento VH é VH1_18. Em uma modalidade específica, região VH compreende a seqüên- cia do ID. DE SEQ. N0: 8. Em outra modalidade específica, a região VH compreende a seqüência do ID. DE SEQ. Ns: 7. Por exemplo, a região VH pode compreender a seqüência do ID. DE SEQ. Ns: 5.

AZ seqüência receptora humana da região VL pode ser, por e- xemplo, VKL02/JK4. Em uma modalidade específica, a região VL compre- ende o ID. DE SEQ. Ns: 4.

Em um aspecto, um anticorpo humanizado da invenção compre- ende uma CDR-H2 que compreende uma porção murídea que consiste nos resíduos 50-59 do ID. DE SEQ. Ns: 2, ligada a uma CDR-H3 que consiste nos resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. Ne: 2 por meio de seqüências de FR adequadas.

Como aqui descrito, em uma modalidade, o anticorpo humaniza- do não compreende nenhuma substituição de FR no domínio de VH. Em outra modalidade, o anticorpo humanizado compreende uma substituição de FR no domínio de VH em uma ou mais posições selecionadas de 5, 69, 71, 73 e 75, utilizando o sistema de numeração do domínio variável de acordo com Kabat. Em outra modalidade, o anticorpo humanizado compreende substituições de FR do domínio de VH em duas ou mais das posições 5, 69, 71, 73 e 75; e em outras modalidades, em três, quatro ou todas essas posi- ções. Em modalidades separadas e independentes, o anticorpo humanizado compreende uma substituição de FR no domínio de VH em uma posição selecionada de 5, 69, 71, 73 e 75. Em outras modalidades separadas e in- dependentes, o anticorpo humanizado compreende substituições de FR do domínio de VH nas posições 5 e 69, ou 5 e 71, ou 5 e 73, ou 5 e 75, ou 69 e 71, 69 e 73, ou 69 e 75, ou 71 e 73, ou 71 e 75, ou 73 e 75, ou 5, 69 e 71, ou 5, 69 e 73, ou 5, 69 e 75, ou 69, 71 e 73, ou 69, 71 e 75, ou 71, 73 e 75, ou 5, 69, 71, e 73, ou 5, 69, 71 e 75, ou 5, 71, 73 e 75, ou 69, 71, 73 e 75, ou 5, 69, 71, 73 e 75. Menos, e não mais, substituições na estrutura central podem minimizar a imunogenicidade, mas a eficácia de ligação pode ser uma con- sideração importante para algumas aplicações. Dessa forma, substituições preferidas são retromutações, ou seja, mutações que substituem um amino- ácido em certa posição na FR humana com o aminoácido na posição cor- respondente em uma FR doadora não humana. Dessa forma, em modalida- des separadas e independentes, a substituição de aminoácido do domínio de VH na posição 5 é V5Q, a substituição de aminoácido na posição 69 é M69L, a substituição de aminoácido na posição 71 é T71V, a substituição de aminoácido na posição 73 é T73K, e a substituição de aminoácido na posi- ção 75 é T75S. Em uma modalidade específica, o anticorpo humanizado compreende uma V na posição 71 e/ou uma L na posição 69.

O anticorpo humanizado aqui utilizado também compreende re- síduos da região hipervariável não humana incorporados em um domínio de VL humana. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado não compreende nenhuma substituição de FR no domínio de VL. Em outra modalidade, o an- ticorpo humanizado compreende uma substituição de FR do domínio de VL em uma das posições 46 e 48, utilizando o sistema de numeração do domí- nio variável de acordo com Kabat. Em outra modalidade, o anticorpo huma- nizado compreende substituições de FR do domínio de VL de ambas posi- ções, 46 e 48. Substituições preferidas são retromutações, ou seja, muta- ções que substituem um aminoácido em certa posição na FR humana com o aminoácido na posição correspondente em uma FR doadora não humana.

Dessa forma, em modalidades separadas e independentes, a substituição de aminoácido do domínio de VL na posição 46 é L46F, e a substituição de a- minoácido do domínio de VL na posição 48 é I48V.

Um anticorpo humanizado exemplar compreende um domínio de VH que compreende uma seqüência de CDR-H1 que corresponde aos resí- duos 31-35 dos IDS. DE SEQ. Nos: 5 ou 7, uma seqüência de CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50-66 dos IDS. DE SEQ. Nos: 5 ou 7 e uma se- qüência de CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 dos IDS. DE SEQ. Nos: 5 ou 7. O anticorpo humanizado pode ainda compreender um a- minoácido na posição de Kabat 5 que é V ou Q, um aminoácido na posição de Kabat 69 que é M ou L, um aminoácido na posição de Kabat 71 que é T ou V, um aminoácido na posição de Kabat 73 é T ou K e/ou um aminoácido na posição de Kabat 75 que é T ou S, no domínio de VH. Em uma modalida- de, o domínio de VH compreende uma substituição na região estrutural em pelo menos uma posição de Kabat selecionada do grupo que consiste em 5, 69, 71, 73 e 75, por exemplo, correspondendo a qualquer uma das substitui- ções de FR de VH, ou combinações destas, listadas na Tabela 1. Em uma modalidade, o domínio de VH compreende a seqüência do ID. DE SEQ. Ns: 7. Em outra modalidade, o domínio de VH compreende a seqüência do ID. DE SEQ. Ns: 5.

Um anticorpo humanizado exemplar também pode compreender (ou alternativamente compreende) um domínio de VL que compreende uma seqüência de CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 do ID. DE SEQ. Ns: 4, uma seqüência de CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 do ID. DE SEQ. Ns: 4 e uma seqüência de CDR-L3 que corresponde aos resí- duos 89-97 do ID. DE SEQ. Ns: 4. O anticorpo humanizado pode ainda com- preender um aminoácido na posição de Kabat 46 que é L ou F e/ou um ami- noácido na posição de Kabat 48 que é I ou V. Em uma modalidade, o domí- nio de VL compreende uma substituição na região estrutural em pelo menos uma posição de Kabat selecionada de 46 e 48, por exemplo, corresponden- do a qualquer uma das substituições de FR de VL, ou combinações destas, listadas na Tabela 1. Em uma modalidade, o domínio de VL compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. Ns: 4. Em outra modalidade, o domínio de VL compreende a seqüência do ID. DE SEQ. Ns: 6.

Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado que se liga à NKG2A humana, o anticorpo compreendendo um domínio de VH que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. Ns: 5, op- cionalmente com uma ou mais substituições de FR nas posições de Kabat 5, 69, 71, 73 e/ou 75. As substituições de FR opcionais pode ser selecionadas, por exemplo, de V5Q, M69L, T71V, T73K e/ou T75S, além de qualquer combinação destas. Um anticorpo humanizado desse tipo também pode compreender (ou alternativamente compreende) um domínio de VL que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. Ns: 4, opcional- mente com uma ou mais substituições de FR nas posições de Kabat 46 e/ou 48. As substituições de FR opcionais pode ser selecionadas, por exemplo, de L46F e/ou I48V.

Opcionalmente, em um aspecto em particular, o domínio de VH compreende modificações de aminoácidos de um ou mais resíduos da CDR, por exemplo, em que as modificações essencialmente mantêm ou aumen- tam a afinidade do anticorpo. Por exemplo, o anticorpo variante pode ter uma, duas, três ou de uma a cerca de sete substituições de aminoácidos nas seqüências de CDR de VH acima.

Em um aspecto em particular, os aminoácidos nas CDRs de VH do anticorpo humanizado que são diferentes dos aminoácidos nas posições correspondentes nas CDRs de VH doadoras não humanas podem ser subs- tituídos para melhorar as propriedades de ligação e/ou a estabilidade do an- ticorpo humanizado. Por exemplo, um ou mais desses aminoácidos podem ser substituídos pelo aminoácido na posição correspondente(s) na CDR de VH doadora não humana. Em uma modalidade, o anticorpo variante com- preende substituições de CDRH2 em uma ou mais posições selecionadas de 60, 63, 64, e 65, de acordo com Kabat (correspondendo às posições 61, 64, 65 e 66 no ID. DE SEQ. Ns: 5 ou 7). Em modalidades separadas e indepen- dentes, o anticorpo variante compreende uma substituição de aminoácido de CDRH2 em uma posição selecionada de 60, 63, 64 e 65. Em outras modali- dades separadas e independentes, o anticorpo variante compreende uma substituição de aminoácido de CDRH2 nas posições 60 e 63, ou 60 e 64, ou 60 e 65, ou 63 e 64, ou 63 e 65, ou 64 e 65, ou 60, 63 e 64, ou 60, 63 e 65, ou 60, 64 e 65, ou 63, 64 e 65, ou 60, 63, 64 e 65. Substituições preferidas são retromutações, ou seja, mutações que substituem um aminoácido em certa posição na CDR humanizada com o aminoácido na posição corres- pondente em uma CDR doadora não humana. Dessa forma, em modalida- des separadas e independentes, a substituição de aminoácido de CDRH2 na posição 60 é A60S, a substituição de aminoácido na posição 63 é L63F, a substituição de aminoácido na posição 64 é Q64K e a substituição de ami- noácido na posição 65 é G65D. Em aspectos nos quais o anticorpo variante compreende uma ou mais das substituições de aminoácidos de CDRH2 A60S, L63F, Q64K e G65D, o anticorpo variante compreende as substitui- ções de aminoácidos de FR de VH nas posições 66 e 67 de acordo com Ka- bat, opcionalmente em conjunto com uma ou mais das substituições de FR de VH descritas previamente. De preferência, as substituições de aminoáci- dos são R66K e V67A. Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo vari- ante compreende um domínio de VH que compreende uma seqüência de CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 do ID. DE SEQ. Ns: 5, uma seqüência de CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50-66 do ID. DE SEQ. Ns: 5 e uma seqüência de CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. N5: 5, com "retromutações" A60S, L63F, Q64K, G65D, R66K e V67A, opcionalmente em conjunto com modificações de aminoácidos adicio- nais.

Em outro aspecto em particular, a invenção fornece um anticor- po humanizado que se liga à NKG2A humana, o anticorpo compreendendo um domínio de VH que compreende os resíduos da CDR não humana incor- porado em um domínio de VH humana, o domínio de VH compreendendo uma seqüência de CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 do ID. DE SEQ. N5: 8, uma seqüência de CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50- 66 do ID. DE SEQ. Ne: 8 e uma seqüência de CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. N2: 8, em que os aminoácidos nas posições de Kabat 63, 64, 65, 66 e 67 são F, K, D, K, A, respectivamente. Em uma modalidade, o domínio de VH compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. Ne: 8. Em outra modalidade, o resíduo na posição de Kabat 60 é A. Em outra modalidade, o resíduo na posição de Kabat 60 é S, e o anti- corpo humanizado compreende as seqüências de CDR-H1, -H2 e H3 de Z270, com retromutações de FR nos dois aminoácidos adjacentes à extre- midade do terminal C de CDR-H2. Os anticorpos humanizados descritos nessa seção podem ainda compreender retromutações de FR em outros resíduos, por exemplo, nas posições de Kabat 5, 69, 71, 73 e/ou 75, como aqui descrito.

Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado no qual todas as CDRs de Kabat na região VH derivam da Z270VH murídea (ID. DE SEQ. Ns: 2), compreendendo ainda mutações S60A, F63L, K64Q e/ou D65G. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende to- das as mutações S60A, F63L, K64Q e/ou D65G.

O anticorpo humanizado também pode compreender um domí- nio de VL que compreende uma seqüência de CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 do ID. DE SEQ. N9: 6, uma seqüência de CDR-L2 que cor- responde aos resíduos 50-56 do ID. DE SEQ. Ns: 6 e uma seqüência de CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 do ID. DE SEQ. N9: 6, por e- xemplo, além do domínio de CDRs de VH descrito acima. Em uma modali- dade, o domínio de VL do anticorpo humanizado compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 6. Em outra modalidade, o domínio de VL do anticorpo humanizado compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N9: 4. Opcionalmente, um anticorpo humanizado desse tipo compreende modificações de aminoácidos de um ou mais resíduos da CDR de VL, por exemplo, em que as modificações essencialmente mantêm ou aumentam a afinidade do anticorpo. Por exemplo, o anticorpo variante pode ter uma, duas, três ou de uma a cerca de sete substituições de aminoácidos nas seqüências de CDR de VL acima. O presente pedido também contempla anticorpos com afinidade amadurecida que se ligam a anti-NKG2A, que contêm CDR ou mutações de FR adicionais que aumentam a afinidade do anticorpo humanizado pelo an- tígeno. Métodos para a preparação destes anticorpos com afinidade matura- da são conhecidos na técnica. O anticorpo parente pode ser um anticorpo humanizado, por exemplo, um que compreende as seqüências de VLTVH dos IDS. DE SEQ. Nos: 4 e 5 (opcionalmente com uma ou mais das substitu- ições de CDRH2 e/ou FR aqui descritas), ou um que compreende as se- qüências de consenso de VLTVH dos IDS. DE SEQ. Nos: 6 e 7, respectiva- mente. De preferência, o anticorpo com afinidade amadurecida se liga à NKG2A com uma afinidade comparável ou superior àquela do Z270 murí- deo, por exemplo, com aumento da afinidade de pelo menos cerca de uma, cerca de duas ou cerca de quatro vezes até cerca de 100 vezes ou cerca de 1.000 vezes, por exemplo, avaliada por um ensaio de ligação como descrito abaixo.

Em outro aspecto, a invenção fornece anticorpos humanizados que compreendem um domínio de VH que possui pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% de identidade de se- qüência (por exemplo, pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 97% ou mais de identidade) para o domínio de VH de Z270, humZ270, humZ270cons e/ou humZ270cons2 (IDS. DE SEQ. Nos: 2, 5, 7 e 8, respectivamente). Em outro aspecto em particular, a invenção fornece um anticorpo humanizado que se liga à NKG2A, que compreende um domínio de VH que compreende os re- síduos da CDR não humana incorporados em um domínio de VH humana, em que o domínio de VH é pelo menos cerca de 50% idêntico a humZ270VH1 (ID. DE SEQ. Ns: 5). Em uma modalidade, o domínio de VH é pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. Ns: 5. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode compreender uma seqüência de CDR-H1 que correspon- de aos resíduos 31-35 do ID. DE SEQ. Ns: 5, uma seqüência de CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50-66 do ID. DE SEQ. Ns: 5 e uma seqüência de CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. N2: 5. O anticorpo humanizado também pode compreender (ou alternativamente compreende) uma V ou Q na posição de Kabat 5, uma M ou L na posição de Kabat 69, uma T ou V na posição de Kabat 71, uma T ou K na posição de Kabat 73 e uma T ou S na posição de Kabat 75, no domínio de VH.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de anticor- po que também (ou alternativamente) compreende um domínio de VL que possui pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência (por exemplo, pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 97% ou mais de identidade) para o domínio de VL de Z270, humZ270 e/ou humZ270 cons (IDS. DE SEQ. Nos: 1, 4 e 6, respecti- vãmente). Em outro aspecto em particular, a invenção fornece um anticorpo humanizado que se liga à NKG2A, que compreende uma região VL que compreende os resíduos da CDR não humana incorporados em um domínio de VL humana, em que o domínio de VL é pelo menos 50% idêntico ao ID. DE SEQ. Ns: 4. Em uma modalidade, a região VL é pelo menos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. Ne: 4. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode compre- ender uma seqüência de CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 do ID. DE SEQ. Ns: 4, uma seqüência de CDR-L2 que corresponde aos resí- duos 50-56 do ID. DE SEQ. Ne: 4 e uma seqüência de CDR-L3 que corres- ponde aos resíduos 89-97 do ID. DE SEQ. N2: 4. O anticorpo humanizado também pode compreender (ou alternativamente compreende) uma L ou F na posição de Kabat 46 e/ou uma I ou V na posição de Kabat 48, no domínio de VL.

Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo humanizado isolado que se liga especificamente à NKG2A e que compreende: (a) se- qüências de CDR-L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3 de VL de Z270 (ID. DE SEQ. N2: 1), VL de humZ270 (ID. DE SEQ. N2: 4) ou VL cons de humZ270 (ID. DE SEQ. N2: 6) ou (b) seqüências de CDR-H1, CDR-H2 e/ou CDR-H3 de VH de Z270 (ID. DE SEQ. N2: 2), humZ270 (ID. DE SEQ. N2: 5), humZ270 cons (ID. DE SEQ. N2: 7), ou humZ270 cons2 (ID. DE SEQ. N2: 8). Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de anticorpo que compreende pelo menos um conjunto completo de CDRs de VH de Z270, humZ270, ou humZ270 cons, em que os 6 aminoácidos do terminal C são idênticos àqueles da se- qüência receptora humana. Em um aspecto em particular, a invenção forne- ce uma molécula de anticorpo que compreende CDR-H1, CDR-H2 (ou uma porção do terminal N desta) e CDR-H3 de Z270, humZ270 ou humZ270 cons, e pelo menos uma parte de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de Z270, humZ270 ou humZ270 cons. Em um aspecto mais específico, a invenção fornece uma molécula de anticorpo em que a molécula de anticorpo com- preende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de Z270, humZ270 ou humZ270 cons, em que a CDR-L1 está ligada à CDR-L2, a CDR-L2 está ligada à CDR-L3, a CDR-H1 está ligada à CDR-H2 e a CDR- H2 está ligada à CDR-H3, por meio de seqüências de FR adequadas.

Em um aspecto em particular, a invenção fornece moléculas de anticorpo que compreendem essencialmente todos os domínios de VH e/ou de VL de humZ270, humZ270 cons ou humZ270 cons2.

Um anticorpo humanizado anti-NKG2A de acordo com a inven- ção pode compreender qualquer cadeia pesada (HC) de comprimento total ou parcial que compreende uma humZ270VH aqui descrito e/ou qualquer HC de comprimento total ou parcial que compreende uma humZ270VH pode ser combinada com qualquer humZ270VL aqui descrita, e o anticorpo ou fragmento resultante testado quanto à ligação de antígeno, aos efeitos fun- cionais sobre células que expressam CD94/NKG2A e/ou à imunogenicidade.

São contempladas várias formas do anticorpo humanizado. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser um fragmento de anticorpo, por exemplo, um Fab ou outro tipo de fragmento aqui descrito. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode ser um anticorpo de comprimento total ou in- tacto, por exemplo, um anticorpo IgGI ou lgG4 de comprimento total ou in- tacto. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado é um anticorpo lgG4 de comprimento total ou um fragmento deste.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo hu- manizado caracterizado por: a) se ligar especificamente à NKG2A; b) não se ligar especificamente a um receptor Fe; e c) quando ligado à NKG2A em uma célula NK humana, faz com que a referida célula NK Iise uma célula humana-alvo que possui HLA-E na superfície da célula-alvo, quando a refe- rida célula-alvo entrar em contato com a referida célula NK. Em uma modali- dade, o anticorpo humanizado compreende uma região constante de IgGI de camundongo ou humana que foi modificada para evitar a ligação a um receptor Fc1 ou a uma região constante de lgG4 humana. Tais anticorpos, bem como fragmentos de anticorpo que não se ligam a um receptor Fc, são particularmente úteis em aplicações nas quais é desejado ativar células NK (por exemplo, câncer, doenças infecciosas), sem levar à eliminação das pró- prias células NK, o que ocorreria caso fosse mediada por citotoxicidade celu- lar dependente de anticorpo, e podem ser denominados anticorpos "não eli- minadores".

Em outro aspecto, o anticorpo humanizado compreende uma região constante de IgGI de camundongo ou humana que se liga a um re- ceptor Fc, ou uma região constante de lgG1, 2, 3 ou 4 humana que foi modi- ficada para se ligar a um receptor Fc ou aumentar a ligação a um receptor Fc1 ou a uma região constante de lgG4 humana. Em outra modalidade, o anticorpo monoclonal ou um fragmento deste está ligado a uma porção que é tóxica para uma célula à qual o anticorpo está ligado. Tais anticorpos são particularmente úteis em aplicações nas quais é desejado eliminar uma célu- la NK1 úteis em certas aplicações como, por exemplo, NK-LDGL (doença linfoproliferativa do tipo NK de linfócitos granulares; alternativamente deno- minada NK-LGL), e podem ser denominados anticorpos "eliminadores".

Para a produção recombinante de anticorpos humanizados, re- giões VH e VL humanizadas, ou versões variantes destas, podem ser clona- das em vetores de expressão que codificam regiões constantes de compri- mento total ou truncadas de um anticorpo humano, de acordo com métodos recombinantes padronizados (veja, por exemplo, Sambrook e cols., "Molecu- lar Cloning: A Laboratory Manual", 2* Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989). O resultado é uma linhagem de célu- las transfectadas que expressa e secreta a molécula de anticorpo humani- zado de interesse, que compreende as regiões VH e VL e regiões constan- tes selecionadas. São conhecidas seqüências de cDNA que codificam as regiões constantes de anticorpos humanos. Seqüências de cDNA exempla- res disponíveis por meio, por exemplo, de GenBank, cada uma das quais incorporada por referência em sua totalidade, são as seguintes:

Região constante da cadeia pesada de IgGI humana: Ne de a- cesso no GenBank: J00228;

Região constante da cadeia pesada de lgG2 humana: Ne de a- cesso no GenBank: J00230;

Região constante da cadeia pesada de lgG3 humana: Ne de a- cesso no GenBank: X04646;

Região constante da cadeia pesada de lgG4 humana: Ns de a- cesso no GenBank: K01316; e

Região constante da cadeia leve kappa humana: Ns de acesso no GenBank: J00241.

Se desejado, a classe de um anticorpo humanizado também po- de ser "mudada" por métodos conhecidos. Por exemplo, um anticorpo que foi produzido originalmente como uma molécula de IgM pode ter sua classe mudada para um anticorpo IgG. As técnicas de mudança de classe também podem ser usadas para converter uma subclasse IgG em outra, por exem- plo, de IgGI em lgG2. Dessa forma, a função efetora dos anticorpos da in- venção pode ser alterada por mudança de isótipo para, por exemplo, um anticorpo lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgD, IgA, IgE ou IgM para vários usos te- rapêuticos.

A região constante pode ainda ser modificada de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, em uma região constante de lgG4, o re- síduo S241 pode ser mutado para um resíduo de prolina (P) para permitir a formação de uma ponte dissulfeto completa na dobradiça (veja, por exemplo, Angal e cols., Moi Immunol. 1993; 30: 105-8).

Fragmentos de anticorpos

Os anticorpos humanizados da invenção podem ser preparados como fragmentos de anticorpo, ou fragmentos de anticorpo podem ser pre- parados a partir de anticorpos humanizados de comprimento total.

Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de frag- mentos de anticorpo de anticorpos humanizados. Tradicionalmente, esses fragmentos eram derivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos de comprimento total (veja, por exemplo, Morimoto e cols., Journal of Bio- chemical and Biophysical Methods, 24: 107-117 (1992); e Brennan e cols., Science, 229: 81 (1985)). No entanto, esses fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Alternativa- mente, fragmentos Fab1-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter e cols., Bio/ Technology, 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, frag- mentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura de célula hospe- deira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anti- corpo ficarão evidentes para aqueles habilitados na técnica. Em outras mo- dalidades, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Veja WO 1993/16185; Patente U.S. N2 5.571.894; e Patente U.S. Ns 5.587.458. O fragmento de anticorpo também pode ser um "anticorpo linear", por exemplo, como descrito na Patente U.S. Ns 5.641.870. Esses fragmen- tos de anticorpo linear podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

Anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuem especifici- dades de ligação por pelo menos dois epitopos diferentes. Métodos para a produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica, e a produ- ção tradicional de anticorpos de comprimento total biespecíficos é normal- mente baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuem especificidades diferentes (Millstein e cols., Nature, 305: 537-539 (1983)). Nos anticorpos biespecíficos de acordo com a presente invenção, pelo menos um epitopo de ligação está na proteína NKG2A. O "braço" de ligação anti-NKG2A pode ser combinado a um "braço" que se liga a uma molécula desencadeante em um leucócito como, por exemplo, uma molécula receptora de célula T (por exemplo, CD2 ou CD3), ou receptores Fc para IgG (Fc-gama-R), por exem- plo, Fc-gama-RI (CD64), Fc-gama-RII (CD32) e Fc-gama-RIII (CD16), de modo a concentrar os mecanismos de defesa celular na célula que expressa NKG2A. Anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos nas células que expressam NKG2A. Esses anticorpos possuem um braço de ligação de NKG2A e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-alfa, alcalóide da vinca, ca- deia de ricina A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2). Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecíficos. Tutt e cols., J. Immunol., 147:60(1991).

Anticorpos, fragmentos de anticorpo e anticorpos multiespecífi- cos da invenção típicos compreendem porções da CDR-H2 e CDR-H3 que consistem nos resíduos D52, D54, R94, F99, T(100C) e W(IOOF) do ID. DE SEQ. Ns: 2 ou ID. DE SEQ. N-: 5, que demonstraram que são críticos para a ligação de antígeno (veja os Exemplos). Opcionalmente, os fragmentos de anticorpo humanizado e anticorpos muItiespecíficos também compreendem os resíduos da cadeia pesada de Z270 N35, Y53, E56, D98, V(100A) e L(100D). Em um aspecto, um fragmento de anticorpo humanizado ou anti- corpo multiespecífico da invenção compreende os resíduos 50-59 da CDR- H2 e os resíduos 95-102 da CDR-H3 do ID. DE SEQ. Ns: 2 ou ID. DE SEQ. N9: 5. Em uma modalidade, o fragmento de anticorpo humanizado ou o anti- corpo multiespecífico não compreende uma, duas ou todas as CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de Z270. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o fragmento de anticorpo ou o anticorpo multiespecífico não compreende a CDR-H1 de Z270.

Derivados de anticorpo

Derivados de anticorpo dentro do escopo dessa invenção inclu- em anticorpos humanizados conjugados ou ligados covalentemente a um segundo agente.

Por exemplo, em um aspecto, a invenção fornece imunoconju- gados que compreendem um anticorpo humanizado conjugado ou ligado covalentemente a um agente citotóxico. O termo "agente citotóxico", como aqui usado, é uma molécula que é capaz de matar uma célula que abriga um receptor de NKG2A em sua superfície celular. Qualquer tipo de porção com um efeito citotóxico ou citoinibidor pode ser conjugada aos presentes anti- corpos para formar um conjugado citotóxico da presente invenção e para inibir ou matar células que expressam um receptor de NK específico, incluin- do radioisótopos terapêuticos, proteínas tóxicas, pequenas moléculas tóxica, por exemplo, fármacos, toxinas, imunomoduladores, hormônios, antagonis- tas de hormônios, enzimas, oligonucleotídeos, inibidores de enzimas, radio- nuclídeos terapêuticos, inibidores da angiogênese, fármacos quimioterápi- cos, alcalóides da vinca, antraciclinas, epidofilotoxinas, taxanos, antimetabó- litos, agentes alquilantes, antibióticos, inibidores de COX-2, SN-38, antimitó- ticos, agentes antiangiogênicos e apoptóticos, particularmente doxorrubicina, metotrexato, taxol, CPT-11, camptotecans, mostardas nitrogenadas, genci- tabina, alquil sulfonatos, nitrosouréias, triazenos, análogos do ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, complexos de coordenação de platina, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, 5-fluoruridina, ribonuclea- se (RNase), DNase I, enterotoxina-A estafilocócica, proteína antiviral da er- va-dos-cancros (pokeweed), gelonina, toxina difterina, exotoxina de Pseu- domonas e endotoxina de Pseudomonas e outros (veja, por exemplo, "Re- mington's Pharmaceutical Sciences", 19ã Ed. (Mack Publishing Co. 1995); "Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics" (Mc- Graw Hilll 2001); Pastan e cols. (1986) Cell 47: 641; Goldenberg (1994) Câncer Journal for Clinicians 44: 43; Patente U.S. Ns 6.077.499; cujas reve- lações integrais são aqui incorporadas por referência). Será observado que uma toxina pode ser de origem animal, de planta, fúngica ou microbiana, ou pode ser criada de novo por síntese química.

Em outra modalidade, o anticorpo é derivatizado com um isótopo radioativo como, por exemplo, um radionuclídeo terapêutico ou um radionu- clídeo adequado para fins de detecção. Qualquer um dentre diversos isóto- pos radioativos pode ser usado, incluindo, sem limitação, 1-131, índio-111, Lutécio-171, Bismuto-212, Bismuto-213, Astatínio-211, Cobre-62, Cobre-64, Cobre-67, ítrio-90, lodo-125, lodo-131, Fósforo-32, Fósforo -33, Escândio- 47, Prata-111, Gálio-67, Praseodímio-142, Samário-153, Térbio-161, Dispró- sio-166, Hólmio-166, Rênio-186, Rênio-188, Rênio-189, Chumbo-212, Ra- dio-223, Actínio-225, Ferro-59, Selênio-75, Arsênico-77, Estrôncio-89, Molib- dênio-99, Ródio-105, Paládio-109, Praseodímio-143, Promécio-149, Érbio- 169, lrídio-194, Ouro-198, Ouro-199 e Chumbo-211. Em geral, de preferên- cia, o radionuclídeo possui uma queda de energia na faixa de 20 a 6.000 keV, de preferência nas faixas de 60 a 200 keV para um emissor Auger, 100- 2,500 keV para um emissor beta e 4.000-6.000 keV para um emissor alfa. Também são preferidos radionuclídeos que decaem substancialmente com a geração de partículas alfa.

Em outras modalidades, o segundo agente é uma porção detec- tável, a qual pode ser qualquer molécula que possa ser quantitativa ou quali- tativamente observada ou medida. Exemplos de marcadores detectáveis úteis nos anticorpos conjugados dessa invenção são radioisótopos, corantes fluorescentes ou um membro de um par de ligação complementar como, por exemplo, um membro de qualquer um de: sistemas de antígeno/anticorpo (diferente de um anticorpo para NKG2A), lectina/carboidrato; avidina/biotina; receptor/ligante; ou polímero molecularmente impresso/molécula de impres- são.

O segundo agente também pode (ou alternativamente) ser um polímero, destinado a aumentar a meia-vida circulante do anticorpo humani- zado, por exemplo. Polímeros e métodos exemplares para anexar estes po- límeros aos peptídeos são ilustrados, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 4.766.106, 4.179.337, 4.495.285 e 4.609.546. Polímeros ilustrativos adicio- nais incluem porções de polióis polioxietilados e polietileno glicol (PEG) (por exemplo, um anticorpo de comprimento total ou fragmento de anticorpo pode ser conjugado a uma ou mais moléculas de PEG com um peso molecular entre cerca de 1.000 e cerca de 40.000 como, por exemplo, entre cerca de 2.000 e cerca de 20.000, por exemplo, cerca de 3.000-12.000).

Os agentes citotóxicos ou outros compostos podem ser ligados ao anticorpo direta ou indiretamente, com o uso de qualquer um entre diver- sos métodos disponíveis. Por exemplo, um agente pode ser anexado à regi- ão da dobradiça do componente do anticorpo reduzido por meio de formação de ligação dissulfeto, com o uso de vinculadores cruzados como, por exem- pio, N-succinil 3-(2-piridilditio)proprionato (SPDP), ou por meio de uma por- ção carboidrato na região Fc do anticorpo (veja, por exemplo, Yu e cols. (1994) Int. J. Câncer 56: 244; Wong, "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking" (CRC Press 1991); Upeslacis e cols., "Modification of antibo- dies by Chemical Methods", em "Monoclonal antibodies: principies and appli- cations", Birch e cols. (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", em "Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinicai application", Ritter e cols. (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), Cat- tel e cols. (1989) Chemistry toóayl\ 51-58, Delprino e cols. (1993) J. Pharm. Sei. 82: 699-704; Arpicco e cols. (1997) Bioconjugate Chemistry 8: 3; Reis- feld e cols. (1989) Antihody, Immunicon. Radiopham. 2: 217; cujas revela- ções de cada um deles são aqui incorporadas por referência).

Alternativamente, pode ser criada uma proteína de fusão que compreenda o anticorpo anti-NKG2A e um segundo agente polipeptídico (citotóxico ou outro), por exemplo, por técnicas recombinantes ou por síntese peptídica.

Ensaios de ligação

A presente invenção fornece anticorpos que se ligam à NKG2A humana, em particular versões humanizadas de um anticorpo anti-NKG2A produzidas pelo hibridoma de Z270.

Pode ser usado qualquer um entre diversos ensaios para avaliar a ligação de um anticorpo à NKG2A humana. Protocolos baseados em ELI- SAs, radioimunoensaios, Western blotting, BIACORE e outros ensaios de competição, entre outros, são adequados ao uso e são bem conhecidos na técnica.

Por exemplo, podem ser usados ensaios de ligação simples, nos quais um anticorpo de teste é incubado na presença de uma proteína ou epi- topo-alvo (por exemplo, NKG2A ou uma porção desta), anticorpos não liga- dos são removidos por lavagem, e a presença de anticorpos ligados é testa- da com o uso, por exemplo, de marcadores radioativos, métodos físicos co- mo, por exemplo, espectrometria de massa, ou marcadores fluorescentes diretos ou indiretos detectados com a utilização, por exemplo, de análise citofluorimétrica (por exemplo, FACScan). Tais métodos são bem conheci- dos por aqueles habilitados na técnica. Qualquer quantidade de ligação aci- ma da quantidade observada com um controle, um anticorpo inespecífico, indica que o anticorpo se liga especificamente ao alvo.

Nestes ensaios, a habilidade do anticorpo de teste para se ligar à célula-alvo ou NKG2A humana podem ser comparada com a habilidade de uma proteína de controle (negativa), por exemplo, um anticorpo desenvolvi- do contra um antígeno estruturalmente não relacionado, ou um peptídeo ou proteína não Ig, para se ligar ao mesmo. Anticorpos ou fragmentos que se ligam às células-alvo ou à NKG2A com o uso de qualquer ensaio adequado com 25%, 50%, 100%, 200%, 1.000%, ou mais de afinidade aumentada em relação à proteína de controle são ditos que "se ligam especificamente a" ou "que interagem especificamente com" o alvo, e são preferidos para uso nos métodos terapêuticos descritos abaixo. A habilidade de um anticorpo de tes- te para afetar a ligação de um anticorpo de controle (positivo) contra NKG2A, por exemplo, Z270, ou derivados deste, também pode ser avaliada.

Os anticorpos humanizados anti-NKG2A podem ou não se ligar à NKG2C humana, podem ou não se ligar à NKG2E humana, ou podem ou não se ligar a qualquer uma entre NKG2C e NKG2E humanas. Em uma mo- dalidade específica, o anticorpo monoclonal, ou fragmento deste, não se liga a outros receptores de NKG2 humana, especificamente aos receptores de ativação de NKG2C ou NKG2E. As propriedades de ligação à NKG2C e à NKG2E-dos anticorpos da invenção podem ser avaliadas em ensaios simila- res àqueles descritos acima, trocando-se simplesmente NKG2A pela molé- cula de interesse.

Em um aspecto, a invenção fornece versões humanizadas de anticorpos não humanos que compartilham características biológicas e/ou identidade de seqüência substancial com Z270. Uma característica biológica exemplar é a ligação ao epitopo de Z270, ou seja, à região no domínio ex- tracelular de NKG2A à qual o anticorpo Z270 se liga. Para avaliação de anti- corpos que se ligam ao epitopo de Z270, pode ser realizado um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, por exemplo, aquele descrito em "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. Harlow e David La- ne (1988).

Em um ensaio de bloqueio cruzado ou de competição exemplar, o anticorpo Z270 (controle) e um anticorpo de teste são misturados (ou pré- adsorvidos) e aplicados a uma amostra que contém NKG2A. Em certas mo- dalidades, seriam pré-misturados os anticorpos de controle com quantidades variáveis do anticorpo de teste (por exemplo, 1:10 ou 1:100) por um período de tempo, antes da aplicação da amostra que contém NKG2A. Em outras modalidades, o anticorpo de controle e quantidades variáveis do anticorpo de teste podem simplesmente ser misturados durante exposição à amostra de antígeno/alvo. Desde que se possam distinguir anticorpos ligados dos anticorpos livres (por exemplo, com o uso de técnicas de separação ou de lavagem para eliminar os anticorpos não ligados) e o anticorpo de controle do anticorpo de teste (por exemplo, com o uso de anticorpos secundários com especificidade de espécie ou de isótipo, marcando-se especificamente o anticorpo de controle com um marcador detectável, ou com a utilização de métodos físicos como, por exemplo, espectrometria de massa, para distin- guir entre diferentes compostos), pode-se determinar se o anticorpo de teste reduz a ligação do anticorpo de controle para o antígeno, o que indica que o anticorpo de teste reconhece substancialmente o mesmo epitopo que o con- trole. Nesse ensaio, a ligação do anticorpo de controle (marcado) na presen- ça de um anticorpo completamente irrelevante é o valor alto do controle. O valor baixo do controle deve ser obtido por incubação do anticorpo de con- trole marcado (Z270) (positivo) com anticorpo de controle não rotulado, em que ocorreria a competição e reduziria a ligação do anticorpo marcado.

Em um ensaio de teste, uma redução significativa na reatividade do anticorpo marcado na presença de um anticorpo de teste é indicativa de um anticorpo de teste que reconhece o mesmo epitopo, ou seja, um que "re- age de forma cruzada" com o anticorpo marcado de controle. Qualquer anti- corpo ou composto de teste que reduza a ligação do controle marcado com o antígeno/alvo em pelo menos 50% ou mais, de preferência 70%, em qual- quer proporção de anticorpo ou composto de controle:de teste entre cerca de 1:10 e cerca de 1:100 é considerado como sendo um anticorpo ou com- posto que se liga a substancialmente ao mesmo epitopo ou determinante que o controle. De preferência, este anticorpo ou composto de teste reduzirá a ligação do controle ao antígeno/alvo em pelo menos 90%. No entanto, qualquer composto ou anticorpo que reduza a ligação de um anticorpo ou composto de controle em qualquer grau mensurável pode ser usado na pre- sente invenção.

Ensaios de bloqueio cruzado similares também podem ser usa- dos para avaliar se um anticorpo de teste (humanizado) afeta a ligação do Iigante natural para NKG2A humana, HLA-E, à NKG2A, trocando-se Z270 por uma forma adequada de HLA-E. Por exemplo, para determinar se uma preparação de anticorpo humanizado anti-NKG2A reduz ou bloqueia intera- ções CD94/NKG2A com HLA-E, o seguinte teste pode ser realizado: uma linhagem de células que expressam CD94/NKG2A, por exemplo, Ba/F3- CD94/NKG2A, NKL ou NK92, é incubada por 30 minutos no gelo, com con- centrações crescentes de um anticorpo de teste anti-NKG2A. As células são então incubadas com tetrâmeros de HLA-E marcados com PE por 30 minu- tos no gelo, lavadas novamente, e a ligação do tetrâmero de HLA-E é anali- sada em um citômetro de fluxo (FACScalibur, Beckton Dickinson) por méto- dos padronizados. Na ausência de anticorpos de teste, o tetrâmero de HLA- E se liga às células. Na presença de uma preparação de anticorpo que blo- queie a ligação de CD94/NKG2A a HLA-E, há uma ligação reduzida de te- trâmeros de HLA-E às células, e estes mAbs são designados "anticorpos de bloqueio".

Em alguns aspectos da invenção, por exemplo, quando não se deseja matar as células que expressam NKG2A, os anticorpos humanizados dessa invenção preferivelmente não demonstram ligação específica subs- tancial aos receptores Fc. Estes anticorpos podem compreender regiões constantes de várias cadeias pesadas que sabidamente não se ligam aos receptores Fe. Um exemplo desse tipo é uma região constante de lgG4. Al- ternativamente, fragmentos de anticorpo que não compreendem regiões constantes como, por exemplo, fragmentos Fab ou F(ab')2, podem ser usa- dos para evitar a ligação do receptor Fe. A ligação do receptor Fc pode ser avaliada de acordo com métodos conhecidos na técnica, incluindo, por e- xemplo, o teste da ligação de um anticorpo à proteína do receptor Fc em um ensaio BIACORE. Além disso, pode ser usado qualquer outro tipo de anti- corpo no qual a porção Fc é modificada para minimizar ou eliminar a ligação aos receptores Fc (veja, por exemplo, WO 03101485, cuja revelação é aqui incorporada por referência). Ensaios como, por exemplo, ensaios baseados em células, para avaliar a ligação do receptor Fc são bem conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, em WO 03101485.

Ensaios de citotoxicidade

Caso um anticorpo anti-NKG2A reduza ou bloqueie as intera- ções CD94/NKG2A com HLA-E, ele poderá aumentar a citotoxicidade de linfócitos restritos por CD94/NKG2A. Isso pode ser avaliado por um ensaio de citotoxicidade típico, cujos exemplos serão descritos abaixo.

A habilidade de um anticorpo para reduzir a sinalização mediada por CD94/NKG2A pode ser testada em um ensaio de citotoxicidade in vitro de 4 horas padronizado usando, por exemplo, células NKL que expressam CD94/NKG2A e células-alvo que expressam HLA-E. Essas células NKL não matam eficientemente alvos que expressam HLA-E porque CD94/NKG2A reconhece HLA-E, levando à iniciação e propagação de sinalização inibidora que evita a citólise mediada por linfócitos. Um ensaio de citotoxicidade in vitro desse tipo pode ser efetuado por métodos padronizados que são bem conhecidos na técnica, como descrito, por exemplo, em Coligan e cols., eds., "Current Protocols in Immunology", Greene Publishing Assoc. e Wiley Inters- cience, N.Y. (1992, 1993). As células-alvo são marcadas com 51Cr, antes da adição de células NKL, e depois a morte é estimada como proporcional à liberação de 51Cr pelas células ao meio, em conseqüência de sua morte. A adição de um anticorpo que evita que CD94/NKG2A se ligue a HLA-E evita a iniciação e propagação da sinalização inibidora por meio de CD94/NKG2A.

Portanto, a adição destes agentes resulta em aumentos na morte mediada por linfócitos das células-alvo. Dessa forma, essa etapa identifica agentes que evitam a sinalização negativa induzida por CD94/NKG2A, por exemplo, por bloqueio da ligação de ligante. Em um ensaio de citotoxicidade por libe- ração de 51Cr específico, células NKL efetoras que expressam CD94/NKG2A podem matar células LCL 721.221-alvo HLA-E-negativas, mas como menor eficiência do que células LCL 721.221-Cw3 de controle que expressam HLA- E. Em contraste, células YTS efetoras desprovidas de CD94/NKG2A matam ambas as linhagens celulares eficientemente. Dessa forma, células NKL efe- toras matam menos eficientemente células LCL 721.221-Cw3 HLA-E+ em função da sinalização inibidora induzida por HLA-E por meio de CD94/ NKG2A. Quando as células NKL são pré-incubadas com anticorpos de blo- queio anti-CD94/NKG2A de acordo com a presente invenção, por exemplo, em um ensaio de citotoxicidade por liberação de 51Cr, células LCL 721.221- Cw3 que expressam HLA-E são mortas mais eficientemente, de uma forma proporcional à concentração de anticorpo.

A atividade inibidora ou potencializadora de um anticorpo dessa invenção também pode ser avaliada por qualquer uma de diversas outras formas, por exemplo, por seu efeito sobre o cálcio intracelular livre como descrito, por exemplo, em Sivori e cols., J. Exp. Med. 1997; 186: 1.129- 1.136, cuja revelação é aqui incorporada por referência. A atividade de célu- las NK, T ou NKT também pode ser avaliada com o uso de ensaios de cito- toxicidade baseados em células, por exemplo, por medida da liberação de cromo ou outro parâmetro para avaliar a habilidade do anticorpo para esti- mular células NK na morte de células-alvo como, por exemplo, células P815, K562 ou células tumorais apropriadas, como revelado em Sivori e cols., J. Exp. Med. 1997; 186: 1.129-1.136; Vitale e cols., J. Exp. Med. 1998; 187: 2.065-2.072; Pessino e cols. J. Exp. Med. 1998; 188: 953-960; Neri e cols., Clln. Diag. Lab. Immun. 2001; 8: 1.131-1.135; Pende e cols. J. Exp. Med. 1999; 190: 1.505-1.516, cujas revelações de cada um deles são aqui incor- poradas por referência.

Em uma modalidade, uma preparação de anticorpo causa um aumento de pelo menos 10% na citotoxicidade de um linfócito restrito por CD94/NKG2A, de preferência, um aumento de pelo menos 40% ou 50% da citotoxicidade de NK ou, mais preferivelmente, um aumento de pelo menos 70% da citotoxicidade de NK.

A atividade de um linfócito citotóxico também pode ser abordada com o uso de um ensaio de liberação de citocina, em que as células NK são incubadas com o anticorpo para estimular a produção de citocina pelas célu- las NK (por exemplo, produção de IFN-γ e TNF-α). Em um protocolo exem- plar, a produção de IFN-γ por PBMC é avaliada por coloração da superfície celular e intracitoplasmática e análise por citometria de fluxo após 4 dias em cultura. Resumidamente, é adicionada Brefeldina A (Sigma Aldrich) em uma concentração final de 5 pg/ml nas últimas 4 horas de cultura. As células são então incubadas com mAb anti-CD3 e anti-CD56, antes da permeabilização (IntraPrep™; Beckman Coulter) e coloração com PE-anti-IFN-γ ou PE-IgGI (Pharmingen). GM-CSF e a produção de IFN-γ por células NK ativadas por anticorpo policlonal são medidas em sobrenadantes com o uso de ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis1 MN, IFN-: conjunto OptEIA, Pharmingen).

Em um aspecto em particular, a invenção fornece anticorpos que são mais capazes, ou mais eficazes, no aumento da citotoxicidade de linfóci- tos restritos por CD94/NKG2A, potencializando a atividade citotóxica de um linfócito restrito por CD94/NKG2A, ou reduzindo ou inibindo a sinalização mediada por CD94/NKG2A, do que o anticorpo original, não humanizado, e/ou uma versão quimérica deste. Estes anticorpos podem ser, por exemplo, pelo menos 2%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20% mais capazes ou eficazes do que o anticorpo original, não hu- manizado, ou versão quimérica deste. Métodos recombinantes

A invenção também fornece ácidos nucléicos isolados que codi- ficam os anticorpos anti-NKG2A aqui descritos, bem como vetores e células hospedeiras que compreendem estes ácidos nucléicos. Também são forne- cidos métodos de produção destes anticorpos anti-NKG2A com a utilização de técnicas recombinantes como, por exemplo, o cultivo de células hospe- deiras adequadas que compreendem estes ácidos nucléicos ou vetores, de tal forma que o ácido nucléico seja expresso e o anticorpo humanizado pro- duzido. Antes do cultivo, a célula hospedeira pode, por exemplo, ser co- transfectada com um vetor que compreende ácidos nucléicos que codificam um domínio variável da cadeia pesada e com um vetor que compreende áci- do nucléico que codifica um domínio variável da cadeia leve. Adicionalmen- te, o anticorpo pode ser recuperado e/ou purificado da célula hospedeira cul- tura com o uso de técnicas conhecidas. Vetores, células hospedeiras e téc- nicas úteis são ainda descritos abaixo e nos Exemplos. Adicionalmente, es- tratégias para a expressão de anticorpos humanizados anti-NKG2A são ilus- tradas nas figuras 4-6.

Geralmente, para a produção recombinante do anticorpo, um á- cido nucléico que o codifica é isolado e inserido em um vetor replicável para clonagem posterior (amplificação do DNA) ou para expressão, tipicamente ligado operacionalmente a um ou mais elementos de controle da expressão. O DNA que codifica o anticorpo monoclonal é facilmente isolado e seqüenci- ado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, pela utiliza- ção de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especifica- mente aos genes que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo). Muitos vetores são conhecidos e disponíveis. Os componentes do vetor ge- ralmente incluem, sem limitação, um ou mais dos seguintes: uma seqüência sinalizadora, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor e uma seqüência de terminação da transcrição.

Componente de seqüência sinalizadora

O anticorpo anti-NKG2A dessa invenção pode ser produzido de forma recombinante não apenas diretamente, mas também como um poli- peptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que é preferivelmente uma seqüência sinalizadora ou outro polipeptídeo que possua um sítio de clivagem específico no terminal N da proteína ou polipeptídeo maduro. De preferência, a seqüência sinalizadora heteróloga selecionada é uma que se- ja reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase sinalizado- ra) pela célula hospedeira. Veja, por exemplo, o Exemplo 2 para seqüências sinalizadoras exemplares para a expressão de cadeias pesadas e/ou leves humanizadas de anticorpos anti-NKG2A, por exemplo, anticorpos Z270 hu- manizados.

Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam a seqüência sinalizadora nativa do anticorpo anti-NKG2A, a se- qüência sinalizadora é substituída por uma seqüência sinalizadora proca- riótica selecionada, por exemplo, do grupo que consiste em fosfatase alcali- na, penicilinase, Ipp ou líderes termoestáveis de enterotoxina II. Para a se- creção por leveduras, a seqüência sinalizadora nativa pode ser substituída, por exemplo, pelo líder de invertase de levedura, pelo líder do fator alfa (in- cluindo líderes do fator alfa de Saccharomyces e Kluyveromyces), pelo líder de fosfatase ácida, pelo líder de glicoamilase de C. albicans ou pelo sinal descrito em WO 1990/13646. Na expressão de célula mamífera, são dispo- níveis seqüências sinalizadoras de mamíferos, além de líderes secretores virais, por exemplo, o sinal do gD do herpes simples.

O DNA para essa região precursora é ligado em estrutura de leitura ao DNA que codifica o anticorpo anti-NKG2A. Origem do componente de replicacão

Os vetores de expressão e os vetores de clonagem contêm uma seqüência de ácidos nucléicos que permite que o vetor se replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clo- nagem, essa seqüência é aquela que permite que o vetor se replique inde- pendentemente do DNA cromossômico do hospedeiro, e inclui origens de replicação ou seqüências autonomamente replicantes. Estas seqüências são conhecidas para diversas bactérias, leveduras e vírus. A origem de replica- ção do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram- negativas, a origem de plasmídeo de 2 μ é adequada para leveduras, e vá- rias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV, EBV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos. Geralmente, o compo- nente de origem de replicação não é necessário para vetores de expressão mamíferos (a origem SV40 pode tipicamente ser usada somente por conter o promotor inicial). Componente de gene de seleção

Vetores de expressão e de clonagem podem conter um gene de seleção, também denominado marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que: (a) conferem resistência a antibióticos ou a outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetracicli- na, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis por meios complexos, por exemplo, o gene que codi- fica D-alanina racemase para bacilos.

Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. Aquelas células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência a fármaco e, dessa forma, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos desta seleção dominante usam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Outros exemplos de marcadores selecionáveis adequados para células de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células competentes para recolher o ácido nucléico que codifica o anticorpo anti- NKG2A, por exemplo, DHFR, timidina quinase, metalotioneína-l e -II, de pre- ferência genes de metalotioneína de primata, adenosina desaminase, omiti- ria descarboxilase etc.

Por exemplo, células transformadas com o gene de seleção de DHFR são inicialmente identificadas por cultivo de todos os transformantes em um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista com- petitivo de DHFR. Quando se emprega DHFR do tipo selvagem, uma célula hospedeira apropriada é a linhagem de células do ovário de hamster chinês (CHO) com deficiência na atividade de DHFR.

Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospe- deiros do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co- transformadas com seqüências de DNA que codificam o anticorpo anti- NKG2A, a proteína DHFR do tipo selvagem e outro marcador selecionável como, por exemplo, aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (ΑΡΗ), podem ser selecionadas por crescimento da célula em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável como, por exemplo, um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina ou G418. Veja a Pa- tente U.S. Ns 4.965.199.

Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb e cols., Nature, 282: 39 (1979)). O gene trpl fornece um marcador de seleção para uma ce- pa de mutante de levedura sem a habilidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC Ns 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). A presença da lesão de trpl no genoma da célula hospedeira de levedura for- nece, então, um ambiente eficaz para a detecção da transformação por crescimento na ausência de triptofano. Do mesmo modo, cepas de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20.622 ou 38.626) são complementadas por plasmídeos conhecidos que possuem o gene Leu2.

Além disso, vetores derivados do plasmídeo circular de 1,6 pm pKD1 podem ser usados para a transformação de leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, um sistema de expressão para a produção em larga esca- la de quimosina recombinante de bezerro foi relatado para K. Iactis (Van den Berg, Bio/Technology, 8: 135 (1990)). Também foram revelados vetores de expressão estáveis multicópias para a secreção de albumina sérica humana recombinante madura por cepas industriais de Kluyveromyces (Fleer e cols., Bio/Technolog, 9: 968-975 (1991)). Componente de promotor

Vetores de expressão e de clonagem normalmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro, e está ligado ope- racionalmente ao ácido nucléico que codifica o anticorpo anti-NKG2A. Pro- motores adequados ao uso com hospedeiros procarióticos incluem o promo- tor de phoA, sistemas promotores de β-lactamase e lactose, fosfatase alcali- na, um sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos como, por exemplo, o promotor tac. No entanto, outros promotores bacterianos conhe- cidos são adequados. Promotores para uso em sistemas bacterianos tam- bém conterão uma seqüência de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada operacional- mente ao DNA que codifica o anticorpo anti-NKG2A. Várias seqüências promotoras são conhecidas para eucariotas. Praticamente todos os genes eucarióticos possuem uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases acima do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra seqüência encontrada 70 a 80 bases acima do início de transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT, em que N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos genes está uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal para adição do tail poli-A à extremidade 3' da seqüência codificadora. Todas essas são se- qüências inseridas adequadamente em vetores de expressão eucarióticos. Exemplos de seqüências promotoras adequadas para uso com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas como, por exemplo, enolase, gliceraldeído-3-fosfato de- sidrogenase, hexoquinase, piruvato desçarboxiIase, fosfofrutoquinase, glico- se-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefos- fato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicoquinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores indutíveis que possuem a vantagem adicional de transcrição controlada pelas condi- ções de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas de degradação associadas ao metabolismo do nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato desidro- genase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Ve- tores e promotores adequados para uso na expressão de levedura são ainda descritos em EP73657. Intensificadores de levedura também são vantajo- samente usados com promotores de levedura.

A transcrição do anticorpo anti-NKG2A por vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obti- dos a partir dos genomas de vírus como, por exemplo, o vírus do polioma, vírus da bouba aviária, adenovírus (por exemplo, Adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus (CMV), um retro- vírus, vírus da hepatite B e, principalmente, o Vírus Símio 40 (SV40), promo- tores mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um pro- motor der imunoglobulina, e promotores de choque térmico, desde que es- ses promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira.

Os promotores iniciais e tardios do vírus SV40 são obtidos con- venientemente como um fragmento de restrição de SV40, que também con- tém a origem de replicação viral do SV40. O promotor inicial imediato do ci- tomegalovírus humano é obtido convenientemente como um fragmento de restrição Hindlll E. Um sistema para a expressão de DNA em hospedeiros mamíferos com o uso do vírus do papiloma bovino como vetor é revelado na Patente U.S. Ns 4.419.446. Uma modificação desse sistema é descrita na Patente U.S. Ns 4.601.978. Veja também Reyes e cols., Nature, 297: 598- 601 (1982) sobre a expressão de cDNA de interferon beta humano em célu- las de camundongo sob o controle de um promotor de timidina quinase do vírus do herpes simples. Alternativamente, uma repetição terminal do termi- nal longo do vírus do sarcoma de Rous pode ser usada como o promotor. Componente do elemento intensificador

A transcrição de um DNA que codifica o anticorpo anti-NKG2A dessa invenção por eucariotas superiores é freqüentemente aumentada por inserção de uma seqüência intensificadora no vetor. Atualmente são conhe- cidas muitas seqüências intensificadoras para genes mamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, po- de-se usar um intensificador de um vírus de uma célula eucariótica. Exem- plos incluem o intensificador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (bp 100-270), o intensificador do promotor inicial de citomegalovírus, o inten- sificador de polioma no lado tardio da origem de replicação, e intensificado- res de adenovírus. Veja também Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982) sobre e- Iementos intensificadores para ativação de promotores eucarióticos. O inten- sificador pode ser unido no vetor em uma posição 5' ou 3' à seqüência codi- ficadora do anticorpo anti-NKG2A, mas está localizada preferivelmente em um sítio 5' do promotor.

Componente de terminação da transcrição

Os vetores de expressão em células hospedeiras eucarióticas (por exemplo, de leveduras, de fungos, de insetos, de plantas, de animal, humanas ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão seqüências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do mRNA. Estas seqüências são comumente disponíveis a partir da extremidade 5', ocasionalmente da extremidade 3', de regiões não traduzidas de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Essas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica o anticorpo anti-NKG2A. Um componente de terminação da transcrição útil é a região de poliadenilação do crescimento hormônio bovino. Veja WO 1994/11026 e o vetor de expres- são nela revelado.

Seleção e transformação de células hospedeiras

Células hospedeiras adequadas à clonagem ou expressão do DNA nos vetores aqui apresentados são as células procarióticas, de levedu- ras ou de eucariotas superiores descritas acima. Procariotas adequados pa- ra essa finalidade incluem eubactérias como, por exemplo, organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae, por exemplo, Escherichia, por exemplo, E coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimuríum, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, além de bacilos como, por exem- plo, B. subtilis e B. Hcheniformis (por exemplo, B. Iicheniformis 41 P revelado em DD 266.710, publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas, por e- xemplo, P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é E coli 294 (ATCC 31.446), embora outras cepas como, por exemplo, E. coli B, E co//'X1776 (ATCC 31.537) e E. co//'W3110 (ATCC 27.325) sejam adequadas. Esses exemplos são ilustrativos, e não limitantes.

Além dos procariotas, micróbios eucarióticos como, por exemplo, fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expres- são adequados para os vetores que codificam o anticorpo anti-NKG2A. Sac- charomyces cerevisiae, ou a levedura de padaria comum, é a levedura mais comumente usada entre os microorganismos hospedeiros eucarióticos infe- riores. No entanto, vários outros gêneros, espécies e cepas são comumente disponíveis e úteis nessa especificação, por exemplo, Schizosaccharomyces pombe-, hospedeiros de Kluyveromyces como, por exemplo, K. laetis, K. fra- gilis (ATCC 12.424), Κ. bulgaricus (ATCC 16.045), Κ. wickeramii (ATCC 24.178), Κ. waltii (ATCC 56.500), Κ. drosophilarum (ATCC 36.906), Κ. ther- motolerans e K. marxianus; Yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida-, Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa·, Schwanniomyces como, por exemplo, Schwanniomyees oceidentalis-, e fun- gos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penieillium, Tolypocladi- um, e hospedeiros de Aspergillus como, por exemplo, A. nidulans e A. niger.

Células hospedeiras adequadas à expressão de anticorpo anti- NKG2A glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e insetos. Foram i- dentificadas várias cepas de baculovírus e variantes e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes para hospedeiros como, por exem- plo, Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albo- pietus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca das frutas) e Bombyx mori. Diversas cepas virais para transfecção são disponíveis publicamente, por exemplo, a variante L-1 de Autographa ealiforniea NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV1 e esses vírus podem ser usados como o vírus das especificação de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

Culturas de células de plantas de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiros.

No entanto, o maior interesse tem sido em células de vertebra- dos, e a propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecido) se tornou um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são a linhagem de rim de macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linhagem embrionária de rim humano (HEK) (células 293 ou 293 subclonadas para o crescimento em cultura em suspensão, Graham e eols., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); cé- lulas de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células do ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e eols., Proe. Natl. Aead. Sei. USA, 77: 4.216 (1980), incluindo linhagens de células DG44 (Urlaub e eols., Som. Cell and Moi Gen., 12: 555-566 (1986)) e DP12); células de Sertoli de camun- dongo (ΤΜ4, Mather1 Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim macaco africano verde (VERO- 76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather e cols., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem descritos acima para a produção do anticorpo anti-NKG2A e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados da forma adequada à indução de promotores, à seleção de transformantes ou à amplificação dos genes que codificam as seqüências desejadas. Cultivo das células hospedeiras

As células hospedeiras usadas para a produção do anticorpo anti-NKG2A dessa invenção podem ser cultivadas em diversos meios. Meios disponíveis comercialmente como, por exemplo, o F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma)), RPMI-1640 (Sigma), FreeStyle™ (Cibco) e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são a- dequados ao cultivo das células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos, por exemplo, em Ham e cols., Meth. Enz. 58: 44 (1979); Barnes e cols., Anal. Biochem., 102: 255 (1980); Patentes U.S. Nos 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 ou 5.122.469; WO 1990/03430; WO 1987/00195; ou Patente U.S. Re. 30.985, pode ser usado como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um desses meios pode ser suplementado da forma necessária com hormônios e/ou outros fatores do crescimento (por exemplo, insulina, transferrina ou fator de crescimento epi- dérmico), sais (por exemplo, cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (por exemplo, HEPES), nucleotídeos (por exemplo, adenosina e timidina), antibióticos (por exemplo, o fármaco Gentamicina ™), microele- mentos (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidos por aqueles habilitados na técnica. As condições de cultura como, por exemplo, tempera- tura, pH, e semelhantes, são aquelas usadas previamente com a célula hos- pedeira selecionada para a expressão, e ficarão evidentes para aqueles ha- bilitados na técnica.

Purificação do anticorpo anti-NKG2A

Quando são utilizadas técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente ou no espaço periplasmático, ou diretamente secretado no meio. Caso o anticorpo seja produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os restos particulados, células hospedeiras ou fragmen- tos lisados, serão removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltra- ção. Carter e cols., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992) descrevem um pro- cedimento para o isolamento de anticorpos que são secretados no espaço periplasmático de E. coli. Resumidamente, a pasta de células é descongela- da na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fluoreto de fenilmetil- sulfonila (PMSF) ao longo de cerca de 30 minutos. Os restos celulares po- dem então ser removidos por centrifugação. Quando o anticorpo for secreta- do no meio, os sobrenadantes destes sistemas de expressão serão geral- mente primeiro concentrados com o uso de um filtro de concentração de pro- teína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração AMICON™ ou MILLIPORE PELLICON™. Um inibidor de protease como, por exemplo, fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), pode ser incluído em qual- quer uma das etapas anteriores para inibir a proteólise, e podem ser acres- centados antibióticos para evitar o crescimento de contaminantes imprevis- tos.

A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatita, eletro- forese em gel, diálise e cromatografia por afinidade, com a cromatografia por afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequabilidade da pro- teína A como Iigante de afinidade depende da espécie e do isótipo de qual- quer domínio Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo. A prote- ína A pode ser usada para a purificação de anticorpos que são baseados em cadeias pesadas humanas gama 1, gama ou gama 4 (Lindmark e cols., J. Immunol. Meth., 62: 1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isótipos de camundongo e para γ humana 3 (Guss e cols., EMBO J., 5: 1.567-1.575 (1986)). A matriz à qual o Iigante de afinidade está anexado é mais freqüentemente agarose, mas outras matrizes são disponíveis. Matri- zes mecanicamente estáveis como, por exemplo, vidro com controle de po- ros ou poli(estirenodivinil)benzeno, permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que os que podem ser obtidos com agarose. Quando o anticorpo compreender um domínio de CH3, a resi- na BAKERBOND ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) será útil para a puri- ficação. Outras técnicas para a purificação de proteína como, por exemplo, fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SE- PHAROSE™, cromatografia em uma resina de troca aniônica ou catiônica (por exemplo, uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocalização, SDS- PAGE e precipitação de sulfato de amônio também são disponíveis, depen- dendo do anticorpo a ser recuperado.

Um método de purificação baseado na proteína A exemplar para Z270, ou versões humanizadas deste, é descrito no Exemplo 6. Formulações farmacêuticas

Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma compo- sição farmacêutica que compreende anticorpos, como aqui descritos, juntos com um ou mais veículos.

Conseqüentemente, um objetivo da invenção é o fornecimento de uma formulação farmacêutica que compreende um anticorpo desse tipo, que está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 500 mg/ml, e em que a referida formulação possui um pH de 2,0 a 10,0. A formulação pode ainda compreender um sistema tampão, conservante(s), agente(s) de tonicidade, agente(s) quelante(s), estabilizantes e tensoativos. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa, ou seja, uma formula- ção que compreende água. Uma formulação desse tipo é tipicamente uma solução ou uma suspensão. Em uma modalidade adicional, a formulação farmacêutica é uma solução aquosa. O termo "formulação aquosa" é defini- do como uma formulação que compreende pelo menos 50 %p/p de água. Da mesma forma, o termo "solução aquosa" é definido como uma solução que compreende pelo menos 50 %p/p de água, e o termo "suspensão aquosa" é definido como uma suspensão que compreende pelo menos 50 %p/p de á- gua.

Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é uma formu- lação Iiofilizada à qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou dilu- entes, antes de sua utilização.

Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é uma formu- lação seca (por exemplo, Iiofilizada ou seca por pulverização) pronta para uso, sem qualquer dissolução prévia.

Em um aspecto adicional, a formulação farmacêutica compreen- de uma solução aquosa de um anticorpo desse tipo, e um tampão, em que o anticorpo está presente em uma concentração de 1 mg/ml ou acima, e em que a referida formulação possui um pH de cerca de 2,0 a cerca de 10,0.

Em outra modalidade, o pH da formulação está na faixa selecio- nada da lista que consiste em cerca de 2,0 a cerca de 10,0, cerca de 3,0 a cerca de 9,0, cerca de 4,0 a cerca de 8,5, cerca de 5,0 a cerca de 8,0, e cer- ca de 5,5 a cerca de 7,5.

Em uma modalidade adicional, o tampão é selecionado do grupo que consiste em acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, diidrogênio fosfato de sódio, fosfato dissódi- co de hidrogênio, fosfato de sódio, e tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maléico, ácido fumárico, ácido tartári- co, ácido aspártico ou misturas destes. Cada um desses tampões específi- cos constitui uma modalidade alternativa da invenção.

Em uma modalidade adicional, a formulação ainda compreende um conservante farmaceuticamente aceitável. O conservante pode ser sele- cionado, por exemplo, do grupo que consiste em fenol, o-cresol, m-cresol, p- cresol, metil p-hidroxibenzoato, propil p-hidroxibenzoato, 2-fenoxietanol, butil p-hidroxibenzoato, 2-feniletanol, álcool benzílico, clorobutanol, e timerosal, bronopol, ácido benzóico, imiduréia, clorexedina, desidroacetato de sódio, clorocresol, etil p-hidroxibenzoato, cloreto de benzetônio, clorfenesina (3p- clorfenoxipropano-1,2-diol), ou misturas destes. O conservante pode estar presente, por exemplo, em uma concentração de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml, de 5 mg/ml a 10 mg/ml, ou de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada um desses conservantes específicos constitui uma modalidade alter- nativa da invenção. O uso de um conservante em composições farmacêuti- cas é bem conhecido por aqueles habilitados na técnica. Por conveniência, faz-se referência a "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 19e edição, 1995.

Em uma modalidade adicional, a formulação ainda compreende um agente isotônico. O agente isotônico pode ser selecionado, por exemplo, do grupo que consiste em um sal (por exemplo, cloreto de sódio), um açúcar ou álcool de açúcar, um aminoácido (por exemplo, L-glicina, L-histidina, ar- ginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina), um alditol (por exemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanediol (propileno glicol), 1,3-propa- nediol, 1,3-butanodiol) polietilenoglicol (por exemplo, PEG400), ou misturas destes. Qualquer açúcar, por exemplo, mono-, di-, ou polissacarídeos, ou glucanos hidrossolúveis, incluindo, por exemplo, frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, trehalose, dextrana, pululana, dextrina, ciclodextrina, amido solúvel, amido de hidroxietil e carboximetilcelu- lose-Na, pode ser usado. Em uma modalidade, o aditivo de açúcar é sacaro- se. Álcool de açúcar é definido como um hidrocarboneto C4-C8 que possui pelo menos um grupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol e arabitol. Em uma modalidade, o aditivo de álcool de açúcar é manitol. Os açúcares ou os alcoóis de açúcar mencionados a- cima podem ser usados individualmente ou em combinação. Não há limite fixo para a quantidade usada, desde que o açúcar ou o álcool de açúcar seja solúvel na preparação líquida e não afete de forma adversa os efeitos estabi- Iizantes obtidos com a utilização dos métodos da invenção. A concentração do açúcar ou do álcool de açúcar pode ser, por exemplo, entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 150 mg/ml. O agente isotônico pode estar presente em uma concentração, por exemplo, de 1 mg/ml a 50 mg/ml, de 1 mg/ml a 7 mg/ml, de 8 mg/ml a 24 mg/ml ou de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada um desses agentes isotônicos específicos constitui uma modalidade alternativa da in- venção. O uso de um agente isotônico em composições farmacêuticas é bem conhecido por aqueles habilitados na técnica. Por conveniência, faz-se referência a "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 19* edição, 1995.

Em uma modalidade adicional, a formulação também compreende um agente quelante. O agente quelante pode ser selecionado, por exem- plo, de sais de ácido etilenodiamina-tetra-acético (EDTA), ácido cítrico e áci- do aspártico, e misturas destes. O agente quelante pode estar presente, por exemplo, em uma concentração de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml, de 0,1 mg/ml a 2 mg/ml ou de 2 mg/ml a 5 mg/ml. Cada um desses agentes quelantes especí- ficos constitui uma modalidade alternativa da invenção. O uso de um agente quelante em composições farmacêuticas é bem conhecido por aqueles habi- litados na técnica. Por conveniência, faz-se referência a "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 19'edição, 1995.

Em uma modalidade adicional da invenção, a formulação ainda compreende um estabilizante. O uso de um estabilizante em composições farmacêuticas é bem conhecido por aqueles habilitados na técnica. Por con- veniência, faz-se referência a "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 19" edição, 1995. Mais particularmente, as composições da in- venção podem ser composições farmacêuticas líquidas estabilizadas cujos componentes terapeuticamente ativos incluem um polipeptídeo que possi- velmente exibe formação de agregados durante o armazenamento em for- mulações farmacêuticas líquidas. O termo "formação de agregados" significa uma interação física entre as moléculas do polipeptídeo que resulta na for- mação de oligômeros, que podem permanecer solúveis, ou grandes agrega- dos visíveis que se precipitam da solução. O termo "durante o armazena- mento" significa uma composição farmacêutica líquida ou uma formulação que, uma vez preparada, não é administrada imediatamente a um indivíduo. Em vez disso, após a preparação, ela é embalada para armazenamento, em uma forma líquida, em um estado congelado ou em uma forma seca para reconstituição posterior em uma forma líquida ou em outra forma adequada à administração a um indivíduo. O termo "forma seca" significa que a com- posição farmacêutica líquida ou a formulação é seca por secagem por con- gelamento (ou seja, liofilização; veja, por exemplo, Williams e Polli (1984) J. Parenteral Sei. Technol. 38: 48-59), secagem por vaporização (veja Masters (1991) em "Spray-Drying Handbook" (5ã edição; Longman Scientific e Tech- nical, Essez, G.B.), pp. 491-676; Broadhead e cols. (1992) Drug Devei. Ind. Pharm. 18: 1.169-1.206; e Mumenthaler e cols. (1994) Pharm. Res. 11: 12- 20) ou secagem ao ar (Carpenter e Crowe (1988) Cryobiology 25: 459-470; e Roser (1991) Biopharm. 4:47-53). A formação de agregados por um polipep- tídeo durante o armazenamento de uma composição farmacêutica líquida pode afetar de forma adversa a atividade biológica daquele polipeptídeo, resultando em perda de eficácia terapêutica da composição farmacêutica. Além disso, a formação de agregados pode causar outros problemas como, por exemplo, bloqueio de sondas, membranas ou bombas quando a compo- sição farmacêutica que contém polipeptídeo é administrada com o uso de um sistema de infusão.

As composições farmacêuticas da invenção podem ainda com- preender uma quantidade de uma base de aminoácido suficiente para dimi- nuir a formação de agregados pelo polipeptídeo durante o armazenamento da composição. O termo "base de aminoácido" significa um aminoácido ou uma combinação de aminoácidos, em que certo aminoácido está presente em sua forma de base livre ou em sua forma de sal. Quando for usada uma combinação de aminoácidos, todos os aminoácidos poderão estar presentes em suas formas de base livre, todos poderão estar presentes em suas for- mas de sal, ou alguns poderão estar presentes em suas formas de base li- vre, enquanto outros estarão presentes em suas formas de sal. Em uma modalidade, os aminoácidos a serem usados na preparação das composi- ções da invenção são aqueles que carregam uma cadeia lateral com carga como, por exemplo, arginina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Qual- quer estereoisômero (ou seja, L, D ou uma mistura destes) de um aminoáci- do específico (por exemplo, metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina e misturas destes) ou combi- nações desses estereoisômeros, pode estar presente nas composições far- macêuticas da invenção, desde que o aminoácido específico esteja presente em sua forma de base livre ou em sua forma de sal. Em uma modalidade, é usado o L-estereoisômero. As composições da invenção também podem ser formuladas com análogos desses aminoácidos. O termo "análogo de amino- ácido" significa um derivado do aminoácido de ocorrência natural que produz o efeito desejado de diminuição da formação de agregados pelo polipeptídeo durante o armazenamento das composições farmacêuticas líquidas da in- venção. Análogos de arginina adequados incluem, por exemplo, aminogua- nidina, ornitina e N-monoetil L-arginina; análogos de metionina adequados incluem etionina e butionina; e análogos de cisteína adequados incluem S- metil-L cisteína. Como ocorre com outros aminoácidos, os análogos de ami- noácidos são incorporados nas composições em sua forma de base livre ou em sua forma de sal. Em uma modalidade adicional da invenção, os amino- ácidos ou análogos de aminoácidos são usados em uma concentração que seja suficiente para evitar ou retardar a agregação da proteína.

Em uma modalidade adicional da invenção, pode ser adicionada metionina (ou outros aminoácidos sulfúricos ou análogos de aminoácidos) para inibir a oxidação de resíduos de metionina em sulfóxido de metionina, quando o polipeptídeo que atua como o agente terapêutico for um polipeptí- deo que compreende pelo menos um resíduo de metionina suscetível a esta oxidação. O termo "inibir" significa o acúmulo mínimo de espécies oxidadas de metionina ao longo do tempo. A inibição da oxidação de metionina resulta em uma maior retenção do polipeptídeo em sua forma molecular adequada. Qualquer estereoisômero de metionina (L ou D), ou combinações destes, pode ser usado. A quantidade a ser adicionada deve ser uma quantidade suficiente para inibir a oxidação dos resíduos de metionina, de tal forma que a quantidade de sulfóxido de metionina seja aceitável pelas agências regu- ladoras. Tipicamente, isso significa que a composição não contém mais do que cerca de 10% a cerca de 30% de sulfóxido de metionina. Geralmente, isso pode ser obtido por adição de metionina, de tal forma que a proporção de metionina adicionada aos resíduos de metionina varie de cerca de 1:1 a cerca de 1.000:1, por exemplo, 10:1 a cerca de 100:1.

Em uma modalidade adicional, a formulação ainda compreende um estabilizante selecionado do grupo de polímeros de alto peso molecular ou compostos de baixo molecular. Em uma modalidade adicional da inven- ção, o estabilizante é selecionado de polietileno glicol (por exemplo, PEG 3350), álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, carbóxi-/hidroxicelulose ou derivados desta (por exemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodex- trinas, substâncias que contêm enxofre como, por exemplo, monotioglicerol, ácido tioglicólico e 2-metiltioetanol, e diferentes sais (por exemplo, cloreto de sódio). Cada um desses estabilizantes específicos constitui uma modalidade alternativa da invenção.

As composições farmacêuticas também podem compreender agentes estabilizantes adicionais que aumentam ainda mais a estabilidade de um polipeptídeo terapeuticamente ativo nelas contido. Agentes estabili- zantes de interesse particular para a presente invenção incluem, sem limita- ção, metionina e EDTA, que protegem o polipeptídeo contra a oxidação de metionina, e um tensoativo não iônico que protege o polipeptídeo contra a agregação associada ao congelamento-descongelamento ou cisalhamento mecânico.

Em uma modalidade adicional, a formulação ainda compreende um tensoativo. O tensoativo pode ser selecionado, por exemplo, de um de- tergente, óleo de rícino etoxilado, glicerídeos poliglicolizados, monoglicerí- deos acetilados, ésteres de ácido graxo de sorbitano, polímeros em bloco de polioxipropileno-polioxietileno (por exemplo, poloxâmeros, tais como Pluro- nic® F68, poloxâmero 188 e 407, Triton X-100), ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano, polioxietileno e derivados de polietileno, tais como derivados alquilados e alcoxilados (Tweens, por exemplo, Tween-20, Tween- 40, Tween-80 e Brij-35), monoglicerídeos ou derivados etoxilados destes, diglicerídeos ou derivados de polioxietileno destes, alcoóis, glicerol, Iectinas e fosfolipídeos (por exemplo, fosfatidil serina, fosfatidil colina, fosfatidil etano- lamina, fosfatidil inositol, difosfatidil glicerol e esfingomielina), derivados de fosfolipídeos (por exemplo, ácido dipalmitoil fosfatídico) e lisofosfolipídeos (por exemplo, palmitoil lisofosfatidil-L-serina e 1-acil-sn-glicero-3-fosfato és- teres de etanolamina, colina, serina ou treonina) e derivados alquil, alcoxil (éster de alquila), alcóxi (éter de alquila) de lisofosfatidil e fosfatidilcolinas, por exemplo, derivados de lauroil e miristoil de lisofosfatidilcolina, dipalmitoil- fosfatidilcolina, e modificações do grupo polar principal, ou seja, colinas, eta- nolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol, e os DO- DAC, DOTMA, DCP1 BISHOP, lisofosfatidilserina e lisofosfatidiltreonina, e glicerofosfolipídeos carregados positivamente (por exemplo, cefalinas), glice- roglicolipídeos (por exemplo, galactopiranosídeo), esfingoglicolipídeos (por exemplo, ceramidas, gangliosídeos), dodecilfosfocolina, lisòlecitina de ovo de galinha, derivados do ácido fusídico (por exemplo, tauro-diidrofusidato de sódio etc.), ácidos graxos de cadeia longa e sais destes, C6-C12 (por exem- plo, ácido oléico e ácido caprílico), acilcarnitinas e derivados, derivados Na- acilados de lisina, arginina ou histidina, ou derivados acilados de cadeia late- ral de lisina ou arginina, derivados Na-acilados de dipeptídeos que compre- endem qualquer combinação de lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou ácido, derivado Na-acilados de um tripeptídeo que compreendem qualquer combinação de um aminoácido neutro e dois aminoácidos com carga, DSS (docusato sódico, registro no CAS Ne [577-11-7], docusato cálci- co, registro no CAS Ns [128-49-4], docusato potássico, registro no CAS Ns [7491-09-0]), SDS (dodecil sulfato de sódio ou lauril sulfato de sódio), capri- Iato de sódio, ácido cólico ou derivados deste, ácidos biliares e sais destes, e conjugados de glicina ou taurina, ácido ursodesoxicólico, colato de sódio, desoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, glicocolato de sódio, N- Hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1 -propanossulfonato, tensoativos aniônicos (alquil-aril-sulfonatos) monovalentes, tensoativos zwitteriônicos (por exem- plo, N-alquil-N,N-dimetilamônio-1 -propanossulfonatos, 3-colamido-1 -propildi- metilamônio-1 -propanossulfonato, tensoativos catiônicos (bases de amônio quaternário) (por exemplo, brometo de cetil-trimetilamônio, cloreto de cetilpi- ridínio), tensoativos não iônicos (por exemplo, Dodecil β-D-glicopiranosídeo), poloxaminas (por exemplo, Tetronic's), que são copolímeros em bloco tetra- funcionais derivados da adição seqüencial de oxido de propileno e óxido de etileno à etilenodiamina, ou o tensoativo pode ser selecionado do grupo de derivados de imidazolina, ou misturas destes. Cada um desses tensoativos específicos constitui uma modalidade alternativa da invenção.

O uso de um tensoativo em composições farmacêuticas é bem conhecido por aqueles habilitados na técnica. Por conveniência, faz-se refe- rência a "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 19* edição, 1995.

Em uma modalidade adicional, a formulação ainda compreende inibidores de protease como, por exemplo, EDTA (etilenodiamina tetra- acético ácido) e HCI de benzamidina, mas outros inibidores de protease dis- poníveis comercialmente também podem ser usados. O uso de um inibidor de protease é particularmente útil em composições farmacêuticas que com- preendem zimógenos de proteases a fim de inibir a autocatálise.

É possível que outros ingredientes possam estar presentes na formulação farmacêutica de peptídeo da presente invenção. Esses ingredi- entes adicionais podem incluir agentes umidificantes, emulsificantes, antioxi- dantes, agentes de volume, modificadores da tonicidade, agentes quelantes, íons metálicos, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina séri- ca humana, gelatina ou proteínas) e um zwitteríon (por exemplo, um amino- ácido como betaína, taurina, arginina, glicina, Iisina e histidina). Esses ingre- dientes adicionais, evidentemente, não devem afetar de forma adversa a estabilidade global da formulação farmacêutica da presente invenção.

As composições farmacêuticas que contêm um anticorpo de a- cordo com a presente invenção podem ser administradas a um paciente que necessita deste tratamento em varias localizações, por exemplo, em locali- zações tópicas, por exemplo, localizações cutâneas e mucosas, em localiza- ções que evitam a absorção, por exemplo, a administração em uma artéria, em uma veia, no coração, e em localizações que envolvem absorção, por exemplo, a administração na pele, sob a pele, em um músculo ou no abdo- me.

A administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ocorrer por meio de diversas vias de administração, por e- xemplo, por via subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, Iin- gual, sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago e intestino, nasal, pulmo- nar, por exemplo, através dos bronquíolos e alvéolos, ou uma combinação destas, por via epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, retal, ocular, por exemplo, através da conjuntiva, uretral e parenteral aos pacientes que ne- cessitam deste tratamento.

As composições da presente invenção podem ser administradas em várias formas de dosagem, por exemplo, como soluções, suspensões, emulsões, microemulsões, emulsão múltipla, espumas, ungüentos, pastas, emplastros, pomadas, comprimidos, comprimidos revestidos, enxágües, cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina dura e cápsulas de gelatina macia, supositórios, cápsulas retais, gotas, géis, sprays, pó, aerossóis, ina- lantes, colírios, pomadas oftálmicas, enxágües oftálmicos, pessários vagi- nais, anéis vaginais, pomadas vaginais, solução para injeção, soluções que se transformam in situ, por exemplo, que se gelificam in situ, que se deposi- tam in situ, que se precipitam in situ, que se cristalizam in situ, solução para infusão e implantes.

As composições da invenção podem ainda ser compostas, ou ane- xadas, por exemplo, por meio de interações covalentes, hidrofóbicas e ele- trostáticas, por um veículo de fármaco, sistema de liberação de fármacos e sistema de liberação de fármacos avançado, a fim de aumentar ainda mais a estabilidade do anticorpo, aumentar a biodisponibilidade, aumentar a solubi- lidade, diminuir os efeitos adversos, obter cronoterapia, bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e aumentam a adesão do paciente, ou qual- quer combinação destes. Exemplos de veículos, sistemas de liberação de fármacos e sistemas de liberação de fármacos avançados incluem, sem limi- tação, polímeros, por exemplo, celulose e derivados, polissacarídeos, por exemplo, dextrana e derivados, amido e derivados, poli(vinil álcool), políme- ros de acrilato e metacrilato, polilático e poliglicólico ácido e copolímeros em bloco destes, polietileno glicóís, proteínas transportadoras, por exemplo, al- bumina, géis, por exemplo, sistemas de termogelificação, por exemplo, sis- temas copoliméricos em bloco bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, micelas, lipossomos, microesferas, nanoparticulados, cristais líqui- dos e dispersões destes, fase L2 e dispersões destas, bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica do comportamento de fase em sistemas de lipídeo-água, micelas poliméricas, emulsões múltiplas, auto-emulsificantes, auto-microemulsificantes, ciclodextrinas e derivados destas, e dendrímeros.

As composições da presente invenção são úteis na formulação de sólidos, semi-sólidos, pós e soluções para administração pulmonar de um anticorpo, com a utilização, por exemplo, de um inalador de dose metrifica- da, inalador de pó seco e um nebulizador, todos sendo dispositivos bem co- nhecidos por aqueles habilitados na técnica.

As composições da presente invenção também são úteis na formulação de sistemas de liberação controlada, sustentada, prolongada, retardada e lenta de fármacos. Mais especificamente, sem limitação, as composições são úteis na formulação de sistemas de liberação parenteral controlada e sistemas de liberação sustentada (ambos os sistemas levando a uma redução de muitas vezes do número de administrações), bem conhe- cidos por aqueles habilitados na técnica. Ainda mais preferivelmente, são usados sistemas de liberação controlada e sustentada administrados por via subcutânea. Sem limitar o escopo da invenção, exemplos de sistemas e composições de liberação controlada úteis são hidrogéis, géis oleaginosos, cristais líquidos, micelas poliméricas, microesferas e nanopartículas.

Os métodos para a produção de sistemas de liberação controla- da úteis para as composições da presente invenção incluem, sem limitação, cristalização, condensação, co-cristalização, precipitação, co-precipitação, emulsificação, dispersão, homogeneização em alta pressão, encapsulação, secagem por vaporização, microencapsulação, coacervação, separação de fases, evaporação de solventes para a produção de microesferas, extrusão e processos de líquidos supercríticos. Faz-se referência geral ao "Handbook of Pharmaceutical Controlled Release" (Wise, D.L., ed. Mareei Dekker1 Nova York, 2000) e "Drug and the Pharmaceutical Sciences", vol. 99: "Protein Formulation and Delivery" (MacNally, E.J., ed. Mareei Dekker, Nova York, 2000).

A administração parenteral pode ser realizada por injeção subeu- tânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa, por meio de uma serin- ga, opcionalmente uma seringa do tipo caneta. Alternativamente, a adminis- tração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão.

Uma opção adicional é uma composição que pode ser uma solução ou sus- pensão para a administração do composto de anticorpo na forma de um s- pray nasal ou pulmonar. Ainda como opção adicional, as composições far- macêuticas que contêm um anticorpo da invenção também podem ser adap- tadas à administração transdérmica, por exemplo, por uma injeção sem agu- lha ou por um emplastro, opcionalmente um emplastro iontoforético, ou ad- ministração transmueosa, por exemplo, bucal.

O anticorpo pode ser administrado por meio da via pulmonar em um veículo, por exemplo, uma solução, suspensão ou pó seco, com o uso de tipos de dispositivos conhecidos adequados à liberação pulmonar de fárma- cos. Exemplos destes compreendem, sem limitação, os três tipos gerais de geração de aerossol para a liberação pulmonar de fármacos, e podem incluir nebulizadores de jato ou ultra-sônico, inaladores de dose metrificada ou ina- ladores de pó seco (veja Yu J., Chien YW. "Pulmonary drug delivery: Physio- logic and mechanistic aspects". Crit. Rev. Ther. Drug Carr. Sys. 14(4) (1997) 395-453).

Com base na metodologia de teste padronizada, o diâmetro ae- rodinâmico (da) de uma partícula é definido como o diâmetro geométrico e- quivalente de uma partícula esférica padronizada de referência de densidade unitária (1 g/cm3). No caso mais simples, para partículas esféricas, o da está relacionado a um diâmetro de referência (d) como uma função da raiz qua- drada da proporção da densidade, como descrito por: Modificações para esse relacionamento ocorrem para partículas não esféricas (veja Edwards D.A., Ben-Jebria A., Langer R. "Recent advan- ces in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles". J. Appl. Physiol. 84(2) (1998) 379-385). Os termos "MMAD" e "MMEAD" são bem descritos e conhecidos na técnica (veja Edwards D.A., Ben-Jebria A., Langer R.), e representam uma medida do valor médio de uma distribuição aerodi- nâmica do tamanho de partícula ("Recent advances in pulmonary drug deli- very using large, porous inhaled particles". J. AppL Physiol. 84(2) (1998) 379-385). O diâmetro aerodinâmico médio da massa (MMAD) e o diâmetro aerodinâmico médio eficaz da massa (MMEAD) são usados de forma inter- cambiável, e são parâmetros estatísticos que descrevem empiricamente o tamanho das partículas de aerossol em relação ao seu potencial para se depositar nos pulmões, independente do formato, tamanho ou densidade reais (veja Edwards D.A., Ben-Jebria A., Langer R. "Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles". J. Appl. Phy- siol. 84(2) (1998) 379-385). O MMAD é normalmente calculado a partir da medida feita com impactadores, um instrumento que mede o comportamento inercial das partículas no ar.

Em uma modalidade adicional, a formulação pode ser aerossoli- zada por qualquer tecnologia de aerossolização conhecida como, por exem- plo, nebulização, para obter um MMAD de partículas de aerossol de menos de 10 μm, mais preferivelmente entre 1-5 pm e principalmente, entre 1-3 pm. O tamanho de partícula preferido se baseia no tamanho mais eficaz para a liberação do fármaco às regiões profundas do pulmão, onda a proteína é otimamente absorvida (veja Edwards D.A., Ben-Jebria A., Langer A., "Re- cent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled parti- cles". J. Appl. Physiol. 84(2) (1998) 379-385).

A deposição nas regiões profundas do pulmão das formulações pulmonares que compreendem o anticorpo pode opcionalmente ser ainda mais otimizada pela utilização de modificações das técnicas de inalação, por exemplo, sem limitação: fluxo de inalação lento (por exemplo, 30 l/min), prender a respiração no momento do acionamento. O termo "formulação estabilizada" refere-se a uma formulação com estabilidade física aumentada, estabilidade química aumentada ou es- tabilidades física e química aumentadas.

O termo "estabilidade física" da formulação de proteína, como aqui usado, refere-se à tendência da proteína para formar agregados biolo- gicamente inativos e/ou insolúveis da proteína em conseqüência da exposi- ção da proteína a estresses termomecânicos e/ou à interação com interfaces e superfícies que sejam destabilizantes, por exemplo, superfícies e interfa- ces hidrofóbicas. A estabilidade física das formulações aquosas de proteína é avaliada por meio de inspeção visual e/ou medidas de turvação após ex- posição da formulação preenchida em recipientes adequados (por exemplo, cartuchos ou frascos) ao estresse mecânico/físico (por exemplo, agitação) em diferentes temperaturas por vários períodos de tempo. A inspeção visual das formulações é realizada em uma luz forte concentrada com um fundo escuro. A turvação da formulação é caracterizada por um ranking de classifi- cação visual do grau de turvação, por exemplo, em uma escala de 0 a 3 (a formulação que não apresenta turvação corresponde a uma classificação visual de 0, e uma formulação que apresenta turvação visual na luz do dia corresponde à classificação visual 3). Uma formulação é classificada como fisicamente instável com relação à agregação de proteína quando ela mostra turvação visual na luz do dia. Alternativamente, a turvação da formulação pode ser avaliada por medidas simples da turvação bem conhecidas por a- queles habilitados na técnica. A estabilidade física das formulações aquosas de proteína também pode ser avaliada com a utilização de um agente ou sonda espectroscópica do estado conformacional da proteína. A sonda é, de preferência, uma pequena molécula que se liga preferencialmente a uma conformação não nativa da proteína. Um exemplo de uma pequena sonda molecular espectroscópica da estrutura da proteína é Tioflavina Τ. A Tiofla- vina T é um corante fluorescente que foi usado amplamente para a detecção de fibrilas amilóides. Na presença de fibrilas, e talvez também de outras con- figurações de proteína, a Tioflavina T dá origem a um novo máximo de exci- tação em torno de 450 nm e uma emissão aumentada am torno de 482 nm, quando ligada a uma forma de fibrila da proteína. A Tioflavina T não ligada é essencialmente não fluorescente nos comprimentos de onda.

Outras pequenas moléculas podem ser usadas como sondas das mudanças na estrutura da proteína do estado nativo para estados não nativos. Por exemplo, as sondas de "porção hidrofóbica" que se ligam prefe- rencialmente às porções hidrofóbicas expostas de uma proteína. As porções hidrofóbicas estão geralmente ocultas dentro da estrutura terciária de uma proteína em seu estado nativo, mas ficam expostas à medida que uma pro- teína começa a se desdobrar ou desnaturar. Exemplos dessas pequenas sondas moleculares espectroscópicas são corantes aromáticos, hidrofóbi- cos, por exemplo, antraceno, acridina, fenantrolina, ou semelhantes. Outras sondas espectroscópicas são formadas por complexos de metal-aminoácido, por exemplo, complexos metálicos de cobalto de aminoácidos hidrofóbicos como, por exemplo, fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina e valina, ou semelhantes.

O termo "estabilidade química" da formulação de proteína, como aqui usado, refere-se às mudanças químicas covalentes na estrutura da pro- teína que levam à formação de produtos da degradação química com menos potência biológica potencial e/ou propriedades imunogênicas aumentadas potenciais, comparada com a estrutura da proteína nativa. Podem ser for- mados vários produtos da degradação química, dependendo do tipo e da natureza da proteína nativa e do ambiente ao qual a proteína é exposta. A eliminação da degradação química pode, muito provavelmente, não ser evi- tada completamente, e quantidades crescentes de produtos da degradação química são freqüentemente observadas durante o armazenamento e uso da formulação de proteína, como é bem conhecido por aqueles habilitados na técnica. A maioria das proteínas possui uma tendência à desamidação, um processo no qual o grupo amida da cadeia lateral em resíduos glutaminil ou asparaginil é hidrolisado para formar um ácido carboxílico livre. Outras vias de degradações envolvem a formação de produtos de transformação de alto peso molecular, nos quais duas ou mais moléculas de proteína são ligadas covalentemente entre si por meio de interações de transamidação e/ou dis- sulfeto, levando à formação de produtos de degradação diméricos, oligomé- ricos e poliméricos ligados covalentemente ("Stability of Protein Pharmaceu- ticals", Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, Nova York 1992). A oxi- dação (de, por exemplo, resíduos de metionina) pode ser mencionada como outra variante da degradação química. A estabilidade química da formulação de proteína pode ser avaliada medindo-se a quantidade dos produtos da degradação química em vários momentos após a exposição a diferentes condições ambientais (a formação de produtos de degradação pode freqüen- temente ser acelerada, por exemplo, por aumento da temperatura). A quan- tidade de cada produto de degradação individual é freqüentemente determi- nada por separação dos produtos de degradação, dependendo do tamanho e/ou da carga da molécula, com o uso de várias técnicas de cromatografia (por exemplo, SEC-HPLC e/ou RP-HPLC).

Desse modo, como exposto acima, uma "formulação estabiliza- da" refere-se a uma formulação com estabilidade física aumentada, estabili- dade química aumentada ou estabilidade física e química aumentadas. Em geral, uma formulação devem ser estável durante o uso e armazenamento (em conformidade com as condições de uso e armazenamento recomenda- das), até que seja atingido o prazo de validade.

Em uma modalidade da invenção, a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável por mais de 6 semanas de uso e por mais de 3 anos de armazenamento.

Em outra modalidade da invenção, a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável por mais de 4 semanas de uso e por mais de 3 anos de armazenamento.

Em uma modalidade adicional da invenção, a formulação farma- cêutica que compreende o anticorpo é estável por mais de 4 semanas de uso e por mais de dois anos de armazenamento.

Ainda em uma modalidade adicional da invenção, a formulação farmacêutica que compreende o anticorpo é estável por mais de 2 semanas de uso e por mais de dois anos de armazenamento.

Formulações de anticorpo adequadas também podem ser de- terminadas examinando-se experiências com outros anticorpos monoclonais terapêuticos já desenvolvidos. Vários anticorpos monoclonais demonstraram que são eficientes em situações clínicas como, por exemplo, Rituxan (Ritu- ximab), Herceptina (Trastuzumab) Xolair (Omalizumab), Bexxar (Tositumo- mab), Campath (Alemtuzumab), Zevalin, Oncolym e formulações similares podem ser usadas com os anticorpos dessa invenção. Por exemplo, pode ser fornecido um anticorpo monoclonal em uma concentração de 10 mg/ml em frascos de uso único de 100 mg (10 ml) ou 500 mg (50 ml), formulado para administração IV em cloreto de sódio 9,0 mg/ml, diidrato de citrato de sódio 7,35 mg/ml, polissorbato 80 0,7 mg/ml e água estéril para injeção. O pH é ajustado em 6,5. Em outra modalidade, o anticorpo é fornecido em uma formulação que compreende cerca de 20 mM de Na-Citrato, cerca de 150 mM de NaCI, em pH de aproximadamente 6,0. Aplicações terapêuticas

Também são fornecidos métodos para o tratamento de um paci- ente com a utilização de um anticorpo anti-NKG2A como aqui descrito. Em uma modalidade, a invenção fornece o uso de um anticorpo, como aqui des- crito, na preparação de uma composição farmacêutica para administração a um paciente humano. Tipicamente, o paciente sofre de, ou apresenta risco para, câncer, uma doença viral, um distúrbio inflamatório ou um distúrbio autoimune. Alternativamente, o anticorpo da invenção é usado para melhorar o resultado de transplante de medula óssea em um paciente.

Por exemplo, em um aspecto, a invenção fornece um método de potencialização da atividade de linfócitos restritos por CD94/NKG2A em um paciente que necessita deste, que compreende a etapa de administração de um anticorpo anti-NKG2A humano ou humanizado ao referido paciente, cujo anticorpo reduz ou evita a ativação mediada por HLA-E do receptor de CD94/NKG2A. Em uma modalidade, o método dirigido ao aumento da ativi- dade destes linfócitos em pacientes que possuem uma doença na qual a atividade aumentada de células NK, T e/ou NKT é benéfica, que envolve, afeta ou é causada por células suscetíveis à Iise por células NK, T ou NKT, ou que é causada ou caracterizada por atividade insuficiente de células NK, T ou NKT como, por exemplo, câncer, uma doença infecciosa ou um distúr- bio imune.

Mais especificamente, os métodos e as composições da presen- te invenção são utilizados para o tratamento de diversos cânceres e outras doenças proliferativas que incluem, sem limitação: carcinoma, incluindo o da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, próstata, pâncreas, estô- mago, cérvice, tireóide e pele, incluindo carcinoma de célula escamosa; tu- mores hematopoiéticos de linhagem linfóide, incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia Iinfocftica crônica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, Iinfoma de Hodgkins, linfoma não Hodgkins, linfoma de célula pilosa e Iinfoma de Burkitt e mieloma múltiplo; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide, incluindo Ieucemias mieló- genas agudas e crônicas, leucemia promielocítica, e síndrome mielodisplási- ca; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rabdomios- sarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwanomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e osteos- sarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, ceratoacantoma, seminoma, câncer folicular da tireóide e teratocarcinoma.

Distúrbios específicos que podem ser tratados de acordo com a invenção incluem tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide, por exem- plo, tumores de célula T e de células B, incluindo, sem limitação, distúrbios de células T como, por exemplo, leucemia T-prolinfocítica (T-PLL), incluindo do tipo pequena célula e célula cerebriforme; leucemia de linfócito granular grande (LGL), de preferência do tipo célula T; síndrome de Sezary (SS); Iin- foma leucemia de célula T do adulto (ATLL); linfoma hepatoesplênico T-NHL; linfoma de células T periféricas/pós-tímicas (subtipos pleomórfico e imuno- blástico); linfoma de células T angio-imunoblástico; linfoma de células T an- giocêntrico (nasal); linfoma de célula grande anaplásico (Ki 1+); linfoma in- testinal de células T; T-linfoblástico; linfoma/leucemia (T-Lbly/T-ALL), mielo- ma múltiplo. Outros distúrbios proliferativos também podem ser tratados de acordo com a invenção, incluindo, por exemplo, hiperplasias, fibrose (espe- cialmente pulmonar, mas também outros tipos de fibrose, por exemplo, fibro- se renal), angiogênese, psoríase, aterosclerose e proliferação de músculo liso nos vasos sangüíneos, por exemplo, estenose ou re-estenose após an- gioplastia.

Em um aspecto em particular, os anticorpos da invenção são usados para o tratamento de doença Iinfoproliferativa do tipo NK de linfócitos granulares (alternativamente denominada NK-LGL), em referência a uma classe de distúrbios proliferativos que é causada pela expansão clonal de células NK ou células NK-//7ce, ou seja, linfócitos granulares grandes que a- presentam uma combinação característica de expressão de antígeno de su- perfície (por exemplo, CD3-, CD56+, CD16+ etc.; veja, por exemplo, Loug- hran (1993) Blood 82: 1). A proliferação celular subjacente a esses distúrbios pode ter efeitos variáveis, variando de sintomas leves observados em alguns pacientes até a forma agressiva, freqüentemente fatal, da doença, denomi- nada leucemia NK-LDGL. Os sintomas dessa classe de distúrbios podem incluir febre, neutropenia leve, trombocitopenia, anemia, linfocitose, esple- nomegalia, hepatomegalia, linfadenopatia, infiltração da medula, e outros (veja, por exemplo, Zambello e cols. (2003) Blood 102: 1.797; Loughran (1993) Blood82: 1; Epling-Burnette e cols. (2004) Blood2003-02-400).

O tratamento baseado no anticorpo CD94/NKG2A também pode ser usado para o tratamento ou prevenção de doenças infecciosas, incluin- do, de preferência, quaisquer infecções causadas por uma infecção por ví- rus, bactérias, protozoários, bolores ou fungos. Esses organismos infeccio- sos virais incluem, sem limitação, hepatite do tipo A, hepatite do tipo B, he- patite do tipo C, influenza, varicela, adenovírus, herpes simples do tipo I (HSV-1), herpes simples do tipo 2 (HSV-2), peste bovina, rinovírus, ecovírus, rotavírus, vírus sincicial respiratório, papiloma vírus, papiloma vírus, citome- galovírus, eqüinovírus, arbovírus, huntavírus, vírus coxsackie, vírus da ca- xumba, vírus do sarampo, vírus da rubéola, vírus da pólio e o vírus da imu- nodeficiência humana do tipo I ou do tipo 2 (HIV-1, HIV-2). Bactérias consti- tuem outra classe preferida de organismos infecciosos, incluindo, sem limita- ção, as seguintes: Estafilococos; Estreptococos, incluindo S. pyogenes; En- terococos; Bacilos, incluindo Bacillus anthracis e Lactobacillus; Listeria; Corynebacterium diphtheriae; Gardnerella, incluindo G. vaginalis; Nocardia; Streptomyees·, Thermoactinomyces vulgaris, Treponema; Camphylobacter, Pseudomonas, incluindo P. aeruginosa; Legionella; Neisseria, incluindo N. gonorrhoeae e N. meningitidis; Flavobactéria, incluindo F. meningosepticum e F. odoratum, Brucela; Bordetela, incluindo B. pertussis e B. bronehiseptica\ Escherichia, incluindo E. eoli, Klebsiella; Enterobacter, Serratia, incluindo S. mareeseens e S. Iiquefaeiens; Edwardsiella; Proteus, incluindo P. mirabilis e P. vulgaris; Estreptobacilos; Rickettsiaceae, incluindo R. fickettsfi, Clamídia, incluindo C. psittaei e C. traehomatis; Micobactérias, incluindo M. tuberculo- sis, M. intracelulare, M. folluitum, M. laeprae, M. avium, M. bovis, M. africa- num, M. kansasii, M. intracelulare e M. Iepraernurium; e Nocardia. Protozoá- rios podem incluir, sem limitação, leishmania, kokzidioa, e tripanossomo. Parasitas incluem, sem limitação, clamídia e rickétsia. Uma lista complete de doenças infecciosas pode ser encontrada na página da Internet do "National Center for Infectious Disease" (NCID) no "Center for Disease Control" (CDC) (endereço na Internet (www) cdc.gov/ncidod/diseases/), cuja lista é aqui in- corporada por referência. Todas essas doenças são candidatas ao tratamen- to com o uso dos anticorpos inibidores anti-CD94/NKG2A da invenção.

Em um aspecto alternativo, os anticorpos anti-NKG2A são usa- dos para se dirigir e matar células que expressam NKG2A, por exemplo, em um paciente que sofre de um câncer caracterizado pela expressão de CD94/NKG2A em células cancerosas, por exemplo, um Iinfoma de NK. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado é administrado na forma de um imunoconjugado que compreende o anticorpo humanizado e um agente cito- tóxico.

Em um aspecto alternativo, os anticorpos anti-NKG2A são usa- dos para tratar ou evitar um distúrbio autoimune ou inflamatório. Distúrbios autoimunes exemplares tratáveis com o uso dos presentes métodos incluem, entre outros, anemia hemolítica, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, lú- pus eritematoso sistêmico, granulomatose de Wegener, hepatite autoimune, doença de Behcet, doença de Crohn, cirrose biliar primária, escleroderma, colite ulcerativa, síndrome de Sjógren, diabetes melito do Tipo 1, uveíte, do- ença de Graves, doença de Alzheimer, tireoidite, miocardite, febre reumáti- ca, escleroderma, espondilite anquilosante, artrite reumatóide, glomerulone- frite, sarcoidose, dermatomiosite, miastenia gravis, polimiosite, síndrome de Guillain-Barré, esclerose múltipla, alopecia areata, pênfigo/penfigóide, penfi- góide bolhoso, tireoidite de Hashimoto, psoríase e vítiligo.

Exemplos de distúrbios inflamatórios que podem ser tratados por esses métodos incluem, sem limitação, adrenalite, alveolite, angiocolecistite, apendicite, balanite, blefarite, bronquite, bursite, cardite, celulite, cervicite, colecistite, cordite, coclite, colite, conjuntivite, cistite, dermatite, diverticulite, encefalite, endocardite, esofagite, inflamação da trompa de Estáquio, fibrosi- te, foliculite, gastrite, gastrenterite, gengivite, glossite, hepatoesplenite, cera- tite, labirintite, laringite, linfangite, mastite, otite média, meningite, metrite, mucite, miocardite, miosite, miringite (inflamação da membrana timpânica), nefrite, neurite, orquite, osteocondrite, otite, pericardite, peritendinite, perito- nite, faringite, flebite, poliomielite, prostatite, pulpite, retinite, rinite, salpingite, esclerite, esclerocoroidite, escrotite, sinusite, espondilite, esteatite, estomati- te, sinovite, inflamação da trompa da Eustáquio, tendinite, tonsilite, uretrite e vaginite.

Também foi demonstrado que a morte por célula NK alorreativa de células dendríticas melhorou o resultado do enxerto de células hemato- poiéticas em um transplante de medula óssea (L. Ruggeri e cols., Science, 2002, 295: 2.097-2.100). Dessa forma, em outra modalidade, a invenção fornece um método para melhorar o resultado de enxerto de células hema- topoiéticas em um paciente, que compreende a etapa de administração, ao referido paciente, de uma composição dessa invenção compreendendo um anticorpo de ativação. O melhor resultado do enxerto se manifesta por um dos seguintes aspectos: redução da incidência ou da gravidade da doença enxerto versus hospedeiro; sobrevida prolongada do enxerto ou uma redu- ção ou eliminação dos sintomas da doença tratada pelo enxerto (por exem- plo, um câncer hematopoiético). De preferência, esse método é usado no tratamento de leucemia.

Combinações

Estão disponíveis diversos agentes terapêuticos para o trata- mento de cânceres. As composições de anticorpo e os métodos da presente invenção também podem, dessa forma, ser combinados com quaisquer ou- tros métodos geralmente empregados no tratamento da doença específica, particularmente um tumor, uma doença cancerosa ou outra doença ou dis- túrbio apresentado pelo paciente. Desde que uma abordagem terapêutica em particular não seja (inerentemente) sabidamente prejudicial à condição do paciente e não se contraponha significativamente ao tratamento baseado no anticorpo anti-CD94/NKG2A, sua combinação com a presente invenção é contemplada.

Em relação ao tratamento de um tumor sólido, a presente inven- ção pode ser usada em combinação com abordagens clássicas como, por exemplo, cirurgia, radioterapia, quimioterapia, e semelhantes. Portanto, a invenção fornece terapias combinadas nas quais os anticorpos anti- CD94/NKG2A de acordo com a invenção são usados simultaneamente, an- tes ou depois de cirurgia ou radioterapia; ou são administrados aos pacien- tes simultaneamente, antes ou depois da administração de outro agente an- ticâncer. Deve-se assegurar que a cirurgia, a radioterapia ou o agente anti- câncer em combinação com o agente ativo na composição dessa invenção exerce um efeito combinado vantajoso sobre o câncer.

Agentes anticâncer exemplares incluem agentes quimioterápi- cos, agentes hormonais, agentes antiangiogênicos, agentes antimetastáti- cos, anticorpos anticâncer (por exemplo, Rituximab), anticorpos contra molé- culas inibidoras de KIR, inibidores do fator de crescimento, compostos pro- motores de apoptose, citocinas e outros agentes iunomoduladores, agentes direcionados ao tumor conjugados a toxinas ou radionuclídeos, compostos que interferem com a replicação de DNA, mitose e segregação cromossômi- ca, e agentes que rompem a síntese e a fidelidade de precursores de polinu- cleotídeo. Para distúrbios autoimunes ou inflamatórios, qualquer outro composto conhecido por ser eficaz para um ou mais tipos de distúrbios auto- imunes ou inflamatórios, ou qualquer sintoma ou característica de distúrbios autoimunes ou inflamatórios, incluindo, entre outros, imunossupressores, por exemplo, azatioprina (por exemplo, Imuran), clorambucil (por exemplo, Leu- keran), ciclofosfamida (por exemplo, Cytoxan), ciclosporina (por exemplo, Sandimune, Neoral), metotrexato (por exemplo, Rheumatrex), corticosterói- des, prednisona (por exemplo, Deltasone, Meticorten), Etanercept (por e- xemplo, Enbrel), infliximab (por exemplo, Remicade), inibidores de TNF, FK- 506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, globulina antilinfócitos, desoxispergualina ou ΟΚΤ.

Exemplos preferidos de compostos imunomoduladores incluem citocinas. Outros exemplos incluem compostos que possuem um efeito, de preferência um efeito de ativação ou potencialização da atividade de célula NK, ou de indução ou apoio à proliferação de células NK. Outros compostos para administração antes, simultaneamente ou depois das composições que compreendem os agentes da invenção são compostos adjuvantes (por e- xemplo, agentes antieméticos e analgésicos) e agentes antivirais.

Como será compreendido por aqueles habilitados na técnica, as doses apropriadas de agentes anticâncer se aproximarão daquelas já em- pregadas em terapias clínicas nas quais os agentes anticâncer são adminis- trados isoladamente ou em combinação com outros agentes. Provavelmente ocorrerão variações na dosagem, dependendo da condição tratada. O médi- co responsável pela administração do tratamento será capaz de determinar a dose apropriada para o paciente individual. Artigos manufaturados

Em outra modalidade da invenção, é fornecido um artigo manu- faturado contendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima. Por exemplo, o artigo manufaturado pode compreender um recipiente que contém um anticorpo, como aqui descrito, junto com instruções que in- formam um usuário sobre o tratamento de um distúrbio como, por exemplo, um câncer ou uma doença viral em um mamífero com o anticorpo em uma quantidade eficaz. Em uma modalidade preferida, o mamífero é um ser hu- mano. O artigo manufaturado tipicamente compreende um recipiente e um rótulo ou uma bula no recipiente ou a ele associado. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas etc. Os recipientes podem ser formados por vários materiais como, por exemplo, vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para o tratamento da condi- ção, e pode ter uma entrada de acesso estéril (por exemplo, o recipiente po- de ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que possui uma tam- pa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um a- gente ativo na composição é o anticorpo humanizado anti-NKG2A aqui des- crito, ou um derivado de anticorpo (por exemplo, um imunoconjugado) que compreende um anticorpo humanizado desse tipo. O rótulo ou bula indica que a composição é usada para o tratamento da condição de escolha, por exemplo, câncer ou uma doença viral.

Além disso, o artigo manufaturado pode compreender: (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende o anticorpo aqui descrito, e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um agente te- rapêutico diferente do primeiro anticorpo. O artigo manufaturado nessa mo- dalidade da invenção pode ainda compreender uma bula que indica que a primeira e segunda composições podem ser usadas em combinação para tratar um câncer ou doença viral. Este agente terapêutico pode ser qualquer uma das terapias adjuvantes descritas na seção precedente (por exemplo, um agente quimioterápico, um agente antiangiogênico, um composto anti- hormonal, um cardioprotetor e/ou a regulados da função imune em um ma- mífero, incluindo uma citocina). Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo manufaturado pode ainda compreender um segundo (ou terceiro) recipiente, que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, por exemplo, á- gua bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fos- fato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo ou- tros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas. Administração

Como descrito acima, vários anticorpos monoclonais demonstra- ram que são eficientes em situações clínicas (como, por exemplo, Rituxan (Rituximab) e outros), e podem ser usados regimes de administração simila- res (ou seja, doses e/ou protocolos de administração) com os anticorpos dessa invenção. As posologias e dosagens para administração podem ser determinadas de acordo com métodos conhecidos para esses produtos, por exemplo, utilizando-se as instruções do fabricante. Por exemplo, uma prepa- ração de anticorpo pode ser fornecida em uma concentração de 10 mg/ml em frascos de uso único de 100 mg (10 ml) ou 500 mg (50 ml). Uma faixa de dosagem adequada exemplar para um anticorpo da invenção pode ser entre cerca de 10 mg/m2 e 500 mg/m2. As quantidades e a posologia da injeção de anticorpos anti-NKG2A que, por exemplo, saturam as células por 24 horas, 48 horas, 72 horas ou uma semana ou um mês, podem ser determinadas levando-se em consideração a afinidade do anticorpo e seus parâmetros farmacocinéticos. No entanto, será observado que essas posologias são e- xemplares, e que a posologia e o esquema ideais e a tolerabilidade dos anti- corpos devem ser determinados em experimentos clínicos. Aplicações não terapêuticas

Os anticorpos (por exemplo, os anticorpos humanizados anti- NKG2A) da invenção também possuem aplicações não terapêuticas.

Por exemplo, os anticorpos podem ser usados como agentes de purificação da afinidade. Nesse processo, os anticorpos são imobilizados em uma fase sólida como, por exemplo, uma resina SEPHADEX™ ou um papel de filtro, com a utilização de métodos bem conhecidos na técnica. O anticor- po imobilizado é colocado em contato com uma amostra que contém a prote- ína NKG2A (ou fragmento desta) a ser purificada e, posteriormente, o supor- te é lavado com um solvente adequado que irá remover substancialmente todo o material na amostra, exceto a proteína NKG2A, que está ligada ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado como, por exemplo, tampão de glicina, pH 5,0, que irá liberar a proteína NKG2A do anticorpo. Os anticorpos anti-NKG2A também podem ser úteis em ensaios diagnósticos para a proteína NKG2A, por exemplo, na detecção de sua ex- pressão em células específicas, tecidos ou soro.

Para aplicações diagnosticas, o anticorpo tipicamente será mar- cado com uma porção detectável. Estão disponíveis vários marcadores que geralmente podem ser agrupados nas seguintes categorias:

(a) Radioisótopos, por exemplo, 35S, 14C, 125I, 3H e 131I. O anti- corpo pode ser marcado com o radioisótopo com a utilização de técnicas descritas em "Current Protocols in Immunology", Volumes 1 e 2, Coligen e cols., Ed. Wiley-lnterscience, Nova York, N.Y., Pubs. (1991), por exemplo, e a radioatividade pode ser medida com o uso de contagem de cintilação.

(b) Marcadores fluorescentes como, por exemplo, quelatos ter- rosos raros (quelatos de európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodami- na e seus derivados, dansil, Lissamina, ficoeritrina e vermelho Texas são disponíveis. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados ao anticor- po com o uso das técnicas reveladas em "Current Protocols in Immunology", supra, por exemplo. A fluorescência pode ser quantificada com a utilização de um fluorímetro.

(c) Vários marcadores enzima-substrato estão disponíveis, e a Patente U.S. Ns 4.275.149 fornece uma revisão de alguns destes. A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogênico que pode ser medida com o uso de várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma mudança de em um substrato, que pode ser medida por es- pectrofotometria. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. As técnicas para a quantificação de uma mudança de fluorescência são descritas acima. O substrato quimiolumines- cente se torna eletronicamente excitado por uma reação química, e pode então emitir luz que pode ser medida (com o uso de um quimioluminômetro, por exemplo) ou doa energia para um receptor fluorescente. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem Iuciferases (por exemplo, Iuciferase de va- ga-lume e Iuciferase bacteriana; Patente U.S. Ns 4.737.456), luciferina, 2,3- diidroftalazinadionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase como, por exemplo, peroxidase de raiz forte (HRPO), fosfatase alcalina, beta-galac- tosidase, glicoamilase, lisozima, oxidases de sacarídeo (por exemplo, glico- se oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (por exemplo, uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, e semelhantes. Técnicas para a conjugação de enzimas aos anticorpos são descritas em O1SuIIivan e cols., "Methods for the Prepa- ration of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", em "Methods in Enzym." (Ed., J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, Nova York, 73: 147-166 (1981).

Exemplos de combinações de enzima-substrato incluem, por exemplo:

(i) Peroxidase de raiz forte (HRPO) com hidrogênio peroxidase como substrato, em que a hidrogênio peroxidase oxida um corante precursor (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB));

(ii) Fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para-nitrofenil como substrato cromogênico; e

(iii) beta-D-galactosidase (beta-D-Gal) com um substrato cro- mogênico (por exemplo, p-nitrofenil-beta-D-galactosidase) ou substrato fluorogênico 4-metilumbeliferil-p-beta-galacto- sidase.

Várias outras combinações de enzima-substrato são conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Para uma revisão geral destas, veja as Patentes U.S. Nos 4.275.149 e 4.318.980.

Algumas vezes, o marcador é conjugado indiretamente ao anti- corpo. Aqueles habilitados na técnica terão conhecimento de várias técnicas para essa finalidade. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado à biotina, e qualquer uma das três categorias amplas de marcadores mencionadas acima pode ser conjugada à avidina, ou vice-versa. A biotina se liga seleti- vamente à avidina e, dessa forma, o marcador pode ser conjugado ao anti- corpo dessa forma indireta. Alternativamente, para se obter a conjugação indireta do marcador com o anticorpo, o anticorpo é conjugado com um pe- queno hapteno (por exemplo, digoxina), e um dos diferentes tipos de marca- dores mencionados acima é conjugado a um anticorpo anti-hapteno (por e- xemplo, anticorpo anti-digoxina). Dessa forma, pode ser obtida a conjugação indireta do marcador com o anticorpo.

Em outra modalidade da invenção, o anticorpo anti-NKG2A não precisa ser marcado, e a sua presença pode ser detectada com a utilização de um anticorpo secundário marcado que se liga ao anticorpo de NKG2A.

Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido como, por exemplo, ensaios de liga- ção competitiva, ensaios em sanduíche diretos e indiretos e ensaios de imu- noprecipitação. Zola, "Monoclonal antibodies: A Manual of Techniques", pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Para imunoistoquímica, a amostra do tumor pode ser fresca ou congelada, ou pode estar embebida em parafina e fixada com um conser- vante como, por exemplo, formalina.

Os anticorpos também podem ser usados para ensaios diagnós- ticos in vivo. Geralmente, o anticorpo é marcado com um radionuclídeo ou um indicador não radioativo detectável, por exemplo, por ressonância nucle- ar magnética ou por outros meios conhecidos na técnica. De preferência, o marcador é um marcador radioativo como, por exemplo, 125I , 131I, 67Cu, 99mTc ou 111In. O anticorpo marcado é administrado a um hospedeiro, de pre- ferência através da corrente sangüínea, e a presença e localização do anti- corpo marcado no hospedeiro são avaliadas. Essa técnica por imagens é usada adequadamente na detecção, estadiamento e tratamento de neopla- sias. O radioisótopo é conjugado à proteína por qualquer meio, incluindo compostos quelantes de metal ou lactoperoxidase, ou técnicas de iodo para iodação.

Por questões de conveniência, os anticorpos da presente inven- ção podem ser fornecidos em um kit, ou seja, uma combinação de reagentes embalada em quantidades predeterminadas com instruções para a realiza- ção do ensaio diagnóstico. Quando o anticorpo for marcado com uma enzi- ma, o kit incluirá substratos e co-fatores necessários para a enzima (por e- xemplo, um precursor de substrato que fornece o cromóforo ou fluoróforo detectável). Além disso, podem ser incluídos outros aditivos como, por e- xemplo, estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise), e semelhantes. As quantidades relativas dos vários reagen- tes podem ser variadas amplamente para o fornecimento de concentrações em solução dos reagentes que otimizem substancialmente a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser fornecidos como pós secos, normalmente liofilizados, incluindo excipientes que, após dissolução, fornecerão uma solução de reagente com a concentração apropriada. Depósitos

O hibridoma de Z270 foi depositado em 22 de dezembro de 2005 na "Collection Nationale de Culture de Microorganismes", Institute Pas- teur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75725 Paris, França, sob o número de a- cesso 1-3549.

EXEMPLOS

Detalhes adicionais da invenção são ilustrados pelos Exemplos não Iimitantes que serão apresentados a seguir.

Exemplo 1 - Seleção de seqüências parentes de humZ270VL e humZ270VH

Esse Exemplo descreve a seleção de seqüências parentes de humZ270VL e humZ270VH, além de retromutações opcionais para seqüên- cias variantes de h270VL e humZ270VH.

Como descrito no Exemplo 2, o hibridoma de Z270 foi clonado, e as seqüências da cadeia VH e VL de Z270 do anticorpo correspondente fo- ram determinadas como sendo:

Z270VL:

DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQFLVYNA KTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPRTFGGG TKLEIK (ID. DE SEQ. N°: 1), com um resíduo de arginina (R) opcional na posição de Kabat 108.

Z270VH:

QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPEQGLQWIG RIDPYDSETHYSQKFKDKAILTVDKSSSTAYMRLSSLTSEDSAVYYCARGG YDFDVGTLYWFFDVWGAGTTVTVS (ID. DE SEQ. Ns: 2), com um resíduo de serina (S) no terminal C opcional.

Uma segunda cadeia leve, Z270VL-NB, também foi identificada. No entanto, essa era uma cadeia leve comum de mieloma. Z270VL-NB:

NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYG ASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGG GTKLEIKRA (ID. DE SEQ. N8: 3), com um resíduo de arginina (R) opcional na posição de Kabat 108, e um resíduo de alanina (A) opcional na posição de Kabat 109.

A partir de uma análise das seqüências de Z270 murídeo, as CDRs de acordo com as definições de Kabat foram determinadas como sendo:

CDR-L1: RASENIYSYLA (resíduos 24-34 do ID. DE SEQ. N2: 1) CDR-L2: NAKTLAE (resíduos 50-56 do ID. DE SEQ. Ns: 1) CDR-L3: QHHYGTPRT (resíduos 89-97 do ID. DE SEQ. Ns: 1) CDR-H1: SYWMN (resíduos 31-35 do ID. DE SEQ. Ns: 2) CDR-H2: RIDPYDSETHYSQKFKD (resíduos 50-66 do ID. DE SEQ. Ns: 2)

CDR-H3: GGYDFDVGTLYWFFDV (resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. Ne: 2).

Foi construído um modelo 3D da estrutura da proteína usando MOE ("Molecular Operating Environment"; disponível em www.chemcomp. com) com modelos estruturais do "Protein Database Bank" (PDB): 10PG e 1XF4. O PDB é descrito em Berman e cols. (Nucl. Acids Res. 2000; 28: 235- 242), e está disponível em www.rcsb.org/pdb. Com base em uma análise estatística de 201 complexos anticorpo-antígeno na base de dados PDB, os resíduos mais prováveis no paratopo foram determinados como sendo: Z270VL: resíduos 24-34, 49-56, 89-97 do ID. DE SEQ. Ns: 1 Z270VH: resíduos 23-35, 49-58, 93-102 do ID. DE SEQ. N2: 2. Utilizando-se MOE, resíduos que interagem (hidrofóbicos, liga- ção de hidrogênio ou carga) com o paratopo foram identificados, e o conjun- to combinado de resíduos (paratopo + resíduos de interação) foi usado como a máscara de Z270.

A pesquisa nas bases de dados de linhagem germinativa V (V- base; disponível em vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) com a Z270VL e Z270VH gerou os seguintes modelos potenciais da estrutura central (valor E forneci- do entre parênteses):

Cadeia pesada: VH1_46 (2e-036), VH1_f (2e-035), VH1_02 (3e- 035), VH1_18 (4e-035), VH1_03 (6e-035); e

Cadeia leve: VKI_02 (1e-039), VKI_012 (1e-039), VKI_L12 (9e- 038), VKI_L8 (9e-038), VKI_A20 (9e-038).

A pesquisa das bases de dados de linhagem germinativa com a máscara gerou os seguintes modelos potenciais da estrutura central (valor E fornecido entre parênteses):

Cadeia pesada: VH5_a (4e-013), VH5_51 (3e-011) VH1_f (1e- 010), VH1_18 (2e-010), VH1_46 (4e-010): e

Cadeia leve: VKI_L9 (2e-012), VKI_02 (3e-012), VKI_012 (3e- 012), VKI_L24 (2e-011), VKI_A20 (2e-011)

Após inspeções manuais dos alinhamentos e dos hits, VH1_18 e VKI_02 foram selecionadas como as plataformas humanas. JH6 e JK4 fo- ram escolhidas como segmentos J da linhagem germinativa.

A humanização foi agora projetada com as seguintes regras:

- Resíduos fora da máscara são considerados humanos.

- Resíduos dentro da máscara e dentro da CDR de Kabat são considerados murídeos.

- Resíduos dentro da máscara e fora da CDR de Kabat com consenso de camundongo/linhagem germinativa são considerados a se- qüência de consenso.

- Resíduos dentro da máscara e fora da CDR de Kabat com dife- rença de camundongo/linhagem germinativa são sujeitos a retromutações potenciais.

A análise é ilustrada na figura 1 para Z270VL e Z270VH, onde os resíduos da máscara são aqueles sombreados no esquema de Kabat; resíduos da CDR são mostrados em negrito no esquema de Kabat; e dife- renças de camundongo/linhagem germinativa estão sombreadas nas se- qüências VKL02/JK4 e VH1_18/JH6 . Z270VL e humZ270VL1, e humZ270VL1 cons podem opcionalmente compreender um resíduo de arginina (R) na po- sição de Kabat 108.

As seqüências resultantes, humZ270VL1 e humZ270VH1, são apresentadas com os resíduos da retromutação potencial como humanos.

As CDRs de um anticorpo Z270 humanizado de acordo com as definições de Kabat são mostradas na figura 2. Das CDRs de humZ270, so- mente a seqüência de CDR-H2 era diferente daquela da CDR murídea cor- respondente, diferindo em 4 posições. No entanto, na verdade, isso significa que aos resíduos 60-65 da CDR-H2 de Kabat eram idênticos à seqüência receptora humana, fornecendo uma molécula mais humana e um risco me- nor de imunogenicidade. Na figura 2, as diferenças são indicadas em texto em negrito.

Exemplo 2 - Clonagem de regiões VH e VL de IgGI Z270

Esse Exemplo descreve a clonagem e seqüenciamento de regi- ões VH e VL de Z270 murídeo.

Cultura de célula de hibridoma de Z270 para extração de RNA total.

O hibridoma de Z270 foi cultivado em RPMI 1640 (Ne de Catálo- go Hyclone SH30011.04) mais FCS 10% (Ns de Catálogo Biochrom S0115). 5 χ 106 a 1 χ 107 células foram coletadas para extração de RNA total.

Cultura de célula de hibridoma de Z270 da produção de anticor- po. A estratégia de cultura em batelada de uma semana foi adotada para a produção do mAb Z270. O meio de cultura foi RPMI 1640 com FCS 10%. O sobrenadante foi coletado a cada 7 dias. A densidade celular de partida na câmara de cultura do frasco CL-1000 (INTEGRA Biosciences, Item Ns 90005, Lote N2 08541150) foi de 2 χ 106 células/ml. Durante a cultura, a den- sidade e a viabilidade celular foram verificadas regularmente. Após cultura de 3 dias em um frasco CL-1000, a densidade estava acima de 1 χ 107 e a viabilidade era de cerca de 85%. Nos 4 dias seguintes, a densidade celular variou entre 1,5 - 2,5 χ 107 células/ml, e a viabilidade diminuiu gradualmente até 60-70%. No 7sdia, o sobrenadante foi coletado, e SDS-PAGE redutor foi usado para estimar a concentração de anticorpo com um controle de quanti- ficação (A-TNP 20050118 2 mg/ml).

Extração de RNA total de Z270. Isso foi feito com o uso do rea- gente TRIZOL Invitrogen, Ne de Catálogo 15596-026, de acordo com as ins- truções do fabricante.

5'-RACE (amplificação rápida de extremidades de cDNA). Foi adaptado um protocolo a partir das instruções do fabricante para uso do pro- duto denominado Kit de Amplificação de cDNA SMART™ RACE por Clonte- ch, Ns de Catálogo 634914, com o seguinte design de Iniciadores Gene- Específicos (GSPs):

GSP1 para amplificação de região variável da cadeia pesada de lgG1

RacePrimerheavy: 5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3' (ID. DE SEQ. N9: 12)

GSP2: para amplificação da região variável da cadeia kappa de lgG1

RacePrimerkappa: 5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (ID. DE SEQ. N2: 13).

Após a síntese da cDNA da primeira fita, RACE e análise das amostras resultantes em um gel de agarose 1,5%, a banda de DNA de RA- CE foi recortada e purificada com kit de purificação em Gel (QIAGEN QIA- quick N9 de Catálogo 28706), e depois clonada em pMD-19 com o uso do Kit de Ligação de DNA (N9 de Catálogo D6022 de TAKARA) Ver. 2.0 por clona- gem de TA (Figura 3A). Os clones positivos foram enviados para seqüenci- amento de DNA.

Vários clones de cadeia leve e cadeia pesada foram seqüencia- dos com seqüência idêntica, com mostrado na figura 4A-D (com o texto em negrito indicando seqüências peptídicas sinalizadoras):

cDNA de VL de Z270: (ID. DE SEQ. N9: 14) proteína de VL de Z270 (ID. DE SEQ. Ns: 15) cDNA de VH de Z270 (ID. DE SEQ. N0: 16) proteína de VH de Z270 (ID. DE SEQ. Ns: 17).

Exemplo 3 - Clonagem de cadeia leve e cadeia pesada de IgGI murídea em pJSV002

A fim de testar a afinidade do anticorpo e usá-lo para controle positivo, a cadeia leve e cadeia pesada do anticorpo Z270 são inseridas em pJSV002 como anticorpo IgGI murídeo. pJSV002 é um vetor de expressão transitória que pode ser usado em combinação com células HEK293 6E para expressão transitória de Z270 (Figura 3B).

A VL de Z270 e a região constante de IgGI são clonadas em sítios EcoRI e Nhe I de pJSV002. O plasmídeo resultante é como exibido na figura 3C. A seqüência inserida com EcoRI e Nhe I (letras maiúsculas) em ambas as extremidades é mostrada na figura 4E (ID. DE SEQ. N3: 18).

A região variável de H1 e a região constante de IgGI são clona- das em sítios EcoRI e Nhe I de pJSV002-mIgGI-variante (Figura 3D). A pJSV002-mIgGI-variante contém região constante da cadeia pesada de IgGI murídea (Figura 3E). A seqüência inserida está entre os sítios EcoRI e Nhe I (gctagc), com os sítios de restrição e a região constante de IgGI murí- dea indicados em letras minúsculas, e é mostrada na figura 4F (ID. DE SEQ. N9: 19).

Exemplo 4 -Construções de plasmídeo para anticorpo Z270 quimérico

A fim de testar a afinidade do anticorpo e usá-lo como controle positivo, a cadeia leve e a cadeia pesada do anticorpo murídeo Z270 são inseridas em pJSV002 como anticorpo humano quimérico lgG4 S241P. O anticorpo contém região variável murídea e região constante de lgG4 huma- na com uma mutação S241P na cadeia pesada.

Para expressão do anticorpo Z270 quimérico (chimZ270), a se- qüência de Z270VL e a região constante da cadeia leve (kappa) humana são inseridas em sítios EcoR I e BamH I de pJSV002 (Figura 3F). É usada a se- qüência mostrada na figura 4G, em que letras maiúsculas indicam sítios de restrição (ID. DE SEQ. N2: 20). A VH de Z270 e a região constante da cadeia pesada humana são inseridas em sítios EcoR I e Nhe I de pJSV002-lgG4-S241 P (Figuras 3G e 3H). É usada a seqüência mostrada na figura 4H, com a seqüência inseri- da real estando entre os sítios Eco Rl e Nhe I (gctagc), em que as letras maiúsculas indicam sítios de restrição (ID. DE SEQ. Ne: 21).

Exemplo 5 - Expressão de Z270 humanizado

De acordo com a estratégia de humanização de Z270 descrita no Exemplo 1, as CDRs da cadeia leve de Z270 são enxertadas no modelo VKL02/JK4 para preparar humZ270VL1. A seqüência mostrada na figura 41 resultada síntese da seqüência entre os sítios EcoRI e Kasl e de sua inser- ção em pJSV002-hKappaC (com região constante Kappa humana em pJSV002), com seqüências codificadoras de CDR em letras maiúsculas e sítios de restrição em com texto em negrito (ID. DE SEQ. Ns: 22).

Para humanização da cadeia pesada, CDRs da cadeia pesada de Z270 (opcionalmente com CDR-H2 otimizada) são enxertadas no modelo VH1_18/JK6 para preparar humZ270VH1. A seqüência entre os sítios EcoRI e Nhel é sintetizada e clonada em pJSV002-hlgG4 S241P (região constante de lgG4 humana S241P em pJSV002, figura 3G), com seqüências codifica- doras de CDR em letras maiúsculas e sítios de restrição em texto em negrito (Figura 4J, ID. DE SEQ. N9: 23).

As construções mutadas são clonadas da mesma forma em pJSV002, com a região constante de lgG4 S241P e região constante da ca- deia Kappa humana correspondentes, com as seguintes combinações de retromutações estruturais em cada um de humZ270VL e humZ270VH:

humZ270VL: Wt (ou seja, no retromutação), L46F, I48V, L46FJ48V

humZ270VH: Wt (ou seja, sem retromutação), V5Q, M69L, T71V, T73K, T75S, V5Q_M69L, V5Q_T71V, V5Q_T73K, V5Q_T75S, M69L_T71 V, M69L_T73K, M69L_T75S, T71V_T73K, T71V_T75S, T73K_T75S, V5Q_M69L_T71 V_T73K_T75S, M69L_T71 V_T73K_T75S, V5Q_ T71 V_T73K_T75S, V5Q_M69L_T73K_T75S, V5Q_M69L_T71 V_ T75S, V5Q_M69L_T71 V_T73K, T71 V_T73K_T75S, M69L_T73K_T75S, M69L_T71 V_T75S, M69L_T71V_T73K, V5Q_T73K_T75S, V5Q_T71 V_T75S, V5Q_T71 V_T73K, V5Q_M69L_T75S, V5Q_M69L_T73K, V5Q_M69L_T71 V. Um design de vetor exemplar para a cadeia pesada (HC) é ilustrado na figu- ra 5, e um design de vetor exemplar para a cadeia leve (LC) é fornecido na figura 6.

Os plasmídeos são transfectados em HEK293 6E para expres- são transitória, usando 293fectina. Materiais: Células: células HEK 293 6E (293-6E) crescem em fase de crescimento exponencial (0,8 a 1,2 χ 106 célu- las/ml). Meio de cultura: FreeStyle™ (Ns de Catálogo 12338-018 de Gibco); 25 pg/ml de Geneticina 418 (Ns de Catálogo 10131-019 de Gibco); plurônico F-68 0,1% (Ne de Catálogo 24040-032 de Gibco). Meio de transfecção: Opti- MEM (Ns de Catálogo 51985-026 de Gibco); 293fectina (N2 de Catálogo 12347019 de Invitrogen). DNA de plasmídeo: DNA de plasmídeo purificado de interesse (veja acima).

Contagem de células e transfecção. Dois dias antes da transfec- ção, o volume necessário para se obter 7,5 χ 10^6 células é transferido em um frasco de 125 ml, e meio Freestyle fresco é adicionado até completar 30 ml (a densidade celular final deve ser de 0,25 χ 10^6 células/ml). Dois dias mais tarde (no dia da transfecção), a densidade celular deve estar entre 1 e 1,2 χ 10^6 células/ml. Alternativamente, um dia antes da transfecção, o volu- me necessário para se obter 1,5 χ 107 células é transferido em um frasco de 125 ml, e meio Freestyle fresco é adicionado até completar 30 ml (a densi- dade celular final deve ser de 0,50 χ 106 células/ml). Vinte e quatro horas mais tarde (no dia da transfecção), a densidade celular deve estar entre 0,9 e 1,2 χ 10^6 células/ml.

Preparação de complexos de 293fectina-DNA. Para preparar a solução de DNA, 30 pg de DNA são diluídos em um volume total de 1 ml de Opti-MEM. Para preparar a solução de 293fectina, 40 μl são diluídos em 960 μl de Opti-MEM. Após incubação por 5 minutos em temperatura ambiente, a solução de 293fectina e a solução de DNA são misturadas, e depois incuba- das por 25 minutos em temperatura ambiente. As células são então transfec- tadas com 2 ml da mistura de 293fectina-DNA, e incubadas a 37°C em uma incubadora umidificada (agitadora orbital) contendo CO2 5% por 4 a 6 dias. A figura 7 ilustra um procedimento geral para a expressão transitória em célu- las HEK293 como, por exemplo, células HEK693 6E.

Exemplo 6 - Purificação de IgGI por cultura de hibridoma de Z270

O anticorpo IgGI Z270 é purificado do líquido da cultura de célu- la de hibridoma de Z270 por adição da amostra em uma coluna HiTrap de Proteína A da HP (1 ml) equilibrada em 3 M NaCI, 50 mM Tris, pH 8,5, em uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min, e eluindo o anticorpo com o uso de 25 mM ácido cítrico, 4,5 mM ácido cítrico sódico, pH 3,0.

Exemplo 7 - Quantificação e determinação da afinidade do anticorpo

Plasm ídeos contendo construções de expressão de cadeia leve e cadeia pesada equivalente são misturadas em pares, e os plasmídeos são usados para transfectar células HEK6E. O sobrenadante do meio de cultura é então coletado.

Para quantificar o anticorpo IgGI (ou lgG4) de camundongo, uma placa de ELISA é revestida com anticorpo de captura anticamundongo de cabra específico para Fc de IgGI poli (ou lgG4). O sobrenadante da ex- pressão do anticorpo é aplicado, seguido por HRP-anticorpo secundário kappa ou Fab poli anticamundongo de caba. O substrato de HRP é aplicado, e a conversão detectada a OD450.

Para analisar a ligação de antígeno dos anticorpos Z270 huma- nizados, é usado o seguinte ensaio Biacore, ilustrado na figura 8. O antíge- no-anticorpo de captura é imobilizado em um chip Biacore. O antígeno e o sobrenadante da cultura são aplicados. As taxas on e off são analisadas pa- ra calcular a afinidade.

Exemplo 8 -Análise Biacore de variantes quiméricas, humanizadas e de retromutação de Z270

Materiais e métodos

Z270 quimérico e humZ270 em estruturas centrais receptoras de cadeia leve VKI_O2/JK4 e de cadeia pesada VH1_18/JH6 foram produzidos de acordo com os métodos descritos nos Exemplos 4 e 5. A propriedades de ligação de antígeno de variantes Z270 quimérico, humZ270 e de retromuta- ção foram alisadas em um Biacore T100 (Biacore AB1 Uppsala, Suécia). 0 antígeno, que estava na forma de uma construção de cadeia simples NKG2A-CD94-mFc, foi imobilizado covalentemente no chip sensor CM5 (Bi- acore AB, Uppsala, Suécia) por meio de grupos amina, usando cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS). O nível de imobilização foi direcionado para 300 RU. As variantes do anticorpo Z270 foram diluídas até uma série de concentrações (0,157, 0,313, 0,625, 1,25, 2,5 nM) no tampão de execução HBS-EP (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, Tween 20 0,005% (v/v)). Todas as amos- tras foram então injetadas sobre o antígeno imobilizado por 2 minutos, na taxa de fluxo de 40 μΙ/min. Subseqüentemente, o tampão de execução foi injetado por 3 minutos a 40 μΙ/min para análise de dissociação do anticorpo. Após cada execução, o tampão de regeneração (10 mM NaOH, 500 mM NaCI) era injetado (30 segundos, 10 μΙ/min) para remover completamente os anticorpos restantes do antígeno. Os dados foram avaliados com o software de avaliação Biacore T100.

Resultados

A afinidade de humZ270 foi determinada como 67 pM. Esse va- lor de KD era maior do que aquele do Z270 quimérico (50 pM) (Figura 9 e Tabela 2). A introdução de retromutações ao humZ270 nas estruturas cen- trais receptoras de cadeia leve VKI_02/JK4 e de cadeia pesada VH1_18/JH6 não aumentaram substancialmente sua afinidade (Figura 10).

Tabela 2

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Exemplo 9 - Geração de humZ270 com CDR-H2 de comprimento total

Em uma estratégia alternativa, mostrada na figura 11, foi investi- gado se as CDRs de Kabat de comprimento total (incluindo a CDR-H2 de comprimento total) resultariam em um aumento da afinidade de humZ270 em estruturas centrais receptoras de cadeia leve VKI_02/JK4 e de cadeia pesada VH1_18/JH6. humZ270VH3 (ID. DE SEQ. Ns: 24) e acompanham diretamente as diferença nas definições de CDR, resultando basicamente em um anticorpo Z270 humanizado enxertado com CDR de Kabat. humZ270VH4 (ID. DE SEQ. NQ: 25) acompanha a observação de que K38, Q46, W47, 148, G49, Y59, Q61, K62, K66, e A67 estão próximos às cadeias laterais de S60, F63, K64, D65, resultando em um anticorpo Z270 humani- zado enxertado com CDR com retromutações R38K, E46Q, M48I, R66K e V67A.

Exemplo 10 - Geração de humZ270 em outras estruturas centrais re- ceptoras humanas

Foram feitas diversas construções humanizadas diferentes com diferentes seqüências estruturais receptoras de cadeia pesada humana para explorar a escolha da estrutura central.

A figura 12 mostra um alinhamento entre as diferentes constru- ções humanizadas Z270VH preparadas. humZ270VH5 (ID. DE SEQ. Ns: 26) é baseada em VH5_a, humZ270VH6 (ID. DE SEQ. Ns: 27) é baseada em VH5_51, humZ270VH7 (ID. DE SEQ. Ns: 28) é baseada em VH1_f, e humZ270VH8 (ID. DE SEQ. N9: 29) é baseada em VH1_46, todas com um segmento J JH6. Os 6 resíduos de aminoácidos do terminal C da CDR-H2 de Kabat de todas as construções humanizadas eram idênticos à estrutura central receptora humana.

Utilizando-se o programa de alinhamento VectorNTI, foram obti- das as seguintes identidades de seqüência entre humZ270VH1 e humZ270VH5, -6, -7 e -8: 78,2% (VH1 vs. VH5), 79,0% (VH1 vs. VH6), 88,7% (VH1 vs. VH7), e 96,0% (VH1 vs. VH8).

Exemplo 11 - Análise Biacore de diferentes variantes de humZ270

Foram analisadas as afinidades de variantes de huZ270, todas compreendendo uma seqüência de humZ270VL1, mas com diferentes estra- tégias empregadas para humanização da seqüência de VH.

Materiais e métodos

Foi usado um Biacore T100 (Biacore AB1 Uppsala, Suécia). O antígeno de CD94/NKG2A foi usado na forma de uma construção cadeia simples NKG2A-CD94-mFc, imobilizado covalentemente no chip sensor CM5 (Biacore AB, Uppsala1 Suécia) por meio de grupos amina, usando clo- ridrato de 1-etil-3-(3-dimetilamínopropil) carbodiimida (EDC) e N-hidroxis- succinimida (NHS). O nível de imobilização foi direcionado para 300 RU. As variantes do anticorpo humZ270 foram diluídas até uma série de concentra- ções (0,157, 0,313, 0,625, 1,25, 2,5 nM) no tampão de execução HBS-EP. Todas as amostras foram então injetadas sobre o antígeno imobilizado por 2 minutos, na taxa de fluxo de 40 μΙ/min. Subseqüentemente, o tampão de e- xecução foi injetado por 3 minutos a 40 μΙ/min para análise de dissociação do anticorpo. Após cada execução, o tampão de regeneração (10 mM, Na- OH, 500 mM NaCI) era injetado (40 segundos, 10 μΙ/min) para remover com- pletamente os anticorpos restantes do antígeno. Os dados foram avaliados com o software de avaliação Biacore T100. O valor de KD de cada variante foi dividido por aquele de huZ270 com uma cadeia pesada humZ270VH1 para obter a mudança relativa de KD. Resultados e conclusões

Os resultados são mostrados na figura 13, em que o valor de KD de cada variante foi normalizado para aquele de huZ270, com uma cadeia pesada de humZ270VH1 para obter a mudança relativa da KD. Como mos- trado na figura 13, não houve diferenças significativas entre as variantes en- xertadas com CDR (VH3, VH4) e a variante de humZ270 que compreende menos resíduos murídeos no segmento de CDR-H2 (humZ270VL1/ VH1). Também não houve diferenças substanciais entre as variantes "com CDR- H2 humanizada" em diferentes estruturas centrais receptoras humanas. Como um anticorpo humZ270 mais humano possui o benefício de um risco menor para uma resposta imunogênica em pacientes humanos, as variantes com CDR-H2 humanizada como, por exemplo, VH1, VH5, VH6 e VH7, po- dem ser escolhidas para aplicações terapêuticas, sem o comprometimento de uma afinidade significativamente menor, quando comparadas com um anticorpo humZ270 com enxerto de CDR padronizado, e com uma probabili- dade menor de uma resposta imunológico do hospedeiro. Exemplo 12 - Identificação de resíduos críticos em Z270VL e VH

A fim de identificar o paratopo de Z270, foi realizada a mutagê- nese por varredura de alanina nas CDRs do anticorpo murídeo. Foram sele- cionados os seguintes aminoácidos para mutagênese de alanina (Figura 14): Z270VL: R24A, S26A, E27A, N28A, Y30A, S31A, N50A, K52A, T53A, E56A, Y92A, T94A

Z270VH: K23A, S25A, T28A, T30A, S31A, N35A, D52A, Y53A, D54A, S55A, E56A, R94A, D98A, F99A, D100A, V(100A)A1 T(100C)A1 L(100D)A, W(100F)A1 D101A.

Materiais e métodos

As propriedades de ligação de antígeno dos mutantes de alanina foram analisadas em um Biacore T100 (Biacore AB1 Uppsala, Suécia). O antígeno, na forma de sc-NKG2A-CD94-mFc, foi imobilizado covalentemente no chip sensor CM5 (Biacore AB1 Uppsala, Suécia) por meio de grupos ami- na, usando cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS). O nível de imobilização foi direcionado para 300 RU. Mutantes de alanina de Z270 purificados foram diluídos até 0,75 nM ou 1,5 nM no tampão de execução HBS-EP. Todas as amostras foram então injetadas sobre o antígeno imobilizado por 3 minutos, na taxa de fluxo de 10 μl/min. Subseqüentemente, o tampão de execução foi injetado por 1 minuto a 10 μl/min para análise da estabilidade da ligação do anticorpo. Após cada execução, o tampão de regeneração (10 mM NaOH, 500 mM NaCl) era inje- tado (35 segundos, 10 μl/min) para remover completamente os anticorpos restantes do antígeno. Os dados foram avaliados com o software de avalia- ção Biacore T100. A ligação relativa de cada mutante foi calculada dividindo- se seu nível de ligação (RU) obtido por Biacore por aquele do chimZ270. Resultados e conclusões

Como mostrado na figura 15, os mutantes de alanina Z270VH D52A, D54A, F99A, T(100C)A e W(100F)A perderam completamente suas propriedades de ligação de antígeno. O mutante de cadeia pesada R94 manteve em torno de 20% da habilidade de ligação de antígeno. Os níveis relativos de ligação de mutantes de cadeia pesada N35A, Y53A, E56A, D98A, V(100A)A e L(100D)A estavam entre 40-70% (Figura 1). Conseqüen- temente, os aminoácidos D52, D54, R94, F99, T(100C) e W(100F) nas CDR- Η2 e CDR-H3 da cadeia pesada de Z270 são os resíduos críticos para o re- conhecimento do antígeno. Enquanto isso, os aminoácidos N35, Y53, E56, D98, V(IOOA) e L(IOOD) na cadeia pesada afetam moderadamente a ligação de antígeno. Curiosamente, todos os mutantes de alanina da cadeia leve de Z270 retêm propriedades de ligação de antígeno comparáveis àquelas do Z270 quimérico (Figura 16). Portanto, nenhum aminoácido na cadeia leve de Z270 contribui significativamente para o reconhecimento de antígeno. Exemplo 13 - HumZ270 se liga especificamente às células que expres- sam CD94/NKG2A

A potência e a especificidade da ligação de humZ270 a CD94/ NKG2A foram testadas em citometria de fluxo, por análise da ligação de Z270 do tipo selvagem (recZ270), Z270 quimérico com lgG4 humana (chimZ270) ou Z270 humanizado (humZ270VL1/VH1) produzidos por células HEK293 às células Ba/F3 que superexpressam estavelmente CD94/NKG2A ou CD94/NKG2C. Para essa finalidade, células Ba/F3-CD94/NKG2A e C foram incubadas com várias concentrações de variantes de Z270 em meio de cultura de tecido contendo FCS 2%, por pelo menos 30 minutos no gelo. Subseqüentemente, as células foram lavadas, e as células incubadas em meio similar com anticorpos secundários conjugados a APC, novamente por pelo menos 30 minutos no gelo. Após lavagem duas vezes com PBS gelado, a ligação dos mAbs às células foi visualizada com a utilização de um FAC- Sarray de BD Biosciences.

Como mostrado na figura 17, todas as variantes de Z270 se li- gam de uma forma dose-dependente às células Ba/F3-CD94/NKG2A, mas não às células Ba/F3-CD94/NKG2C. Dessa forma, todas as variantes se li- gam especificamente a NKG2A, com humZ270 ligando-se com eficácia simi- lar à NKG2A que chimZ270, enquanto recZ270 se liga ligeiramente mais efi- cientemente.

Exemplo 14 - humZ270 induz morte de células-alvo HLA-E+ por células que expressam NKL CD94/NKG2A

Foi investigada a habilidade de recZ270, chimZ270, humZ270VL1/ VH1 e Z199 para induzir morte de células LCL 721.221-Cw3 marcadas com 51Cr por células NKL CD94/NKG2A+. Nesse ensaio, células-alvo LCL 721.221 -Cw3 (HLA-E+) marcadas com 51Cr foram incubadas com células NKL em uma incubadora umidificada contendo CO2 5% por 4 horas a 372C (proporção E:T = 6:1), na presença ou ausência de várias concentrações de mAbs anti-NKG2A. A morte das células-alvo foi analisada medindo-se a quantidade de 51Cr no meio de cultura de tecido liberada pelas células-alvo em conseqüência de sua morte.

Na figura 18, é mostrado que concentrações crescentes de anti- corpo anti-NKG2A induziram a morte de células LCL 721.221-Cw3 por célu- las NKL. Z199, chimZ270 e recZ270 foram igualmente eficientes, enquanto humZ270 induziu mais mortes de células LCL 721.221-Cw3 por células NKL. Dessa forma, humZ270 pode bloquear eficientemente a função inibidora de CD94/NKG2A em linfócitos citotóxicos que expressam CD94/NKG2A como, por exemplo, subconjuntos de células NK, células NKT, células T α/β e célu- las T γ/δ, e foi mais eficiente do que outras variantes recombinantes testa- das.

Exemplo 15 - humZ270 é um antagonista competitivo de CD94/NKG2A

Para testar se humZ270VL1/VH1 evita que o Iigante (ou seja HLA-E) se ligue à CD94/NKG2A, analisamos se humZ270 poderia evitar a ligação de tetrâmeros de HLA-E às células Ba/F3 que superexpressam CD94/NKG2A (Ba/F3-CD94/NKG2A). Para isso, Ba/F3-CD94/NKG2A foram incubadas com: 1) várias concentrações de humZ270 ou 2) incubadas inici- almente com uma concentração de saturação de tetrâmeros de HLA-E (4,7 pg/ml), e a seguir incubadas com várias concentrações de humZ270. Todas as incubações foram realizadas em meio de cultura de tecido contendo FCS 2%, no gelo. Subseqüentemente, as células foram incubadas com anticorpos secundários conjugados a APC específicos para Abs de camundongo, e analisadas por citometria de fluxo usando um FACSarray de BD Bioscien- ces.

Como mostrado na figura 19, humZ270 se liga eficientemente às células Ba/F3-CD94/NKG2A de uma forma concentração-dependente (dia- mantes). No entanto, quando as células foram pré-incubadas com tetrâme- ros de HLA-E, humZ270 foi impedido de se ligar às células Ba/F3- CD94/NKG2A. Dessa forma, HumZ270 e HLA-E se ligam a epitopos sobre- postos em CD94/NKG2A. Portanto, o efeito inibidor de CD94/NKG2A de humZ270 em ensaios de citotoxicidade de NK é provavelmente conseqüên- cia da prevenção da habilidade de HLA-E na indução de sinais negativos aos linfócitos citotóxicos por meio de CD94/NKG2A. Dessa forma, humZ270 pode ser considerado um antagonista competitivo de CD94/NKG2A.

Exemplo 16 - humZ270 se liga especificamente à CD94/NKG2A

A especificidade e a eficácia de humZ270VL1/VH1, e de diver- sas variantes de humZ270VL1/VH1 com retromutações nas regiões variá- veis leves (VL) ou nas regiões variáveis pesadas (VH) foram testadas quanto à ligação a CD94/NKG2A por citometria de fluxo. Para isso, células Ba/F3- CD94/ NKG2A foram incubadas com humZ270-L46F (VL), humZ270-l48V (VL), humZ270-L46F/l48V (VL), humZ270-V5Q (VH), humZ270-M69L (VH), humZ270-T71V (VH), humZ270-T73K (VH), humZ270-T75S (VH), humZ270- V5Q/M69L/T71V/T73K/T75S (VH), humZ270-M69LT71 V/T73K/T75S (VH) ou dois lotes diferentes de humZ270VL1/VH1, sem retromutações ("DK" e "CHN"). Para essa finalidade, células Ba/F3-CD94/NKG2A ou C foram incu- badas com diversas concentrações das variantes de humZ270 em meio de cultura de tecido contendo FCS 2%, por pelo menos 30 minutos no gelo. As células foram então lavadas, e incubadas em meio similar com anticorpos secundários conjugados a APC específicos para anticorpos humanos, no- vamente por pelo menos 30 minutos no gelo. Após lavagem duas vezes com PBS gelado, a ligação de anticorpos secundários às células foi visualizada com a utilização de um FACSarray de BD Biosciences.

Todas as variantes se ligaram especificamente à CD94/NKG2A, e não à CD94/NKG2C. Todas as variantes se ligaram com eficácia similar à CD94/NKG2A, com exceção das variantes que contêm a mutação V5Q (VL), que se ligou ligeiramente menos eficientemente (veja a figura 20).

MODALIDADES EXEMPLARES

Os parágrafos seguintes descrevem modalidades exemplares da invenção. 1. Anticorpo que se liga especificamente à NKG2A, que compre- ende os resíduos de ligação de antígeno das regiões determinantes de com- plementaridade (CDRs) do anticorpo Z270 murídeo e seqüências estruturais receptoras humanas, em que pelo menos os 6 resíduos de aminoácidos do terminal C da CDR-H2 são iguais àqueles na seqüência receptora humana pesada variável (VH).

2. Anticorpo da modalidade 1, que é mais eficaz do que um anti- corpo que compreende seqüências variáveis leves (VL) e VH do anticorpo Z270 murídeo na potencialização da atividade citotóxica de um linfócito cito- tóxico que expressa CD94/NKG2A.

3. Anticorpo da modalidade 1, que é mais eficaz do que um anti- corpo que compreende seqüências variáveis leves (VL) e VH do anticorpo Z270 murídeo na neutralização da atividade inibidora de um receptor de CD94/NKG2A expresso na superfície de um linfócito citotóxico.

4. Anticorpo da modalidade 1, que é mais eficaz do que um anti- corpo que compreende seqüências variáveis leves (VL) e VH do anticorpo Z270 murídeo na redução da inibição mediada por CD94/NKG2A da ativida- de citotóxica de um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A.

5. Anticorpo da modalidade 1, que é mais eficaz do que um anti- corpo que compreende seqüências variáveis leves (VL) e VH do anticorpo Z270 murídeo na indução da morte de uma célula-alvo que expressa Cw3 por um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A.

6. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 2-5, em que o linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A é uma célula NK, uma célula NKT, Uma célula T α/β ou uma célula T γ/δ.

7. Anticorpo da modalidade 6, em que o linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A é uma célula NK.

8. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-7, em que o anticorpo domínio de VH compreende os resíduos D52, D54, F99, T(IOOC) e W(IOOF) das CDRs da VH do anticorpo Z270 murídeo.

9. Anticorpo da modalidade 8, em que o anticorpo domínio de VH ainda compreende os resíduos N35, Y53, E56, D98, V(100A) e L(100D) das CDRs da VH do anticorpo murídeo Z270.

10. anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-9, que com- preende uma CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 do ID. DE SEQ. N2: 5 e uma CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. NB: 5, em que a CDR-H2 compreende os resíduos 50-59 do ID. DE SEQ. N°: 5.

11. anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-10, em que o domínio de estrutura central receptora humana de VH possui 70% ou mais de identidade de seqüência para o ID. DE SEQ. Ns: 5.

12. anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-11, em que o segmento da VH da estrutura central receptora humana de VH é VH1_18, VH5_a, VH5_51, VH1_f ou VH1_46, e o segmento J é JH6.

13. anticorpo da modalidade 12, em que o segmento da VH é VH1_18, VH5_a, VH5_51 ou VH1_f.

14. Anticorpo da modalidade 13, em que o segmento da VH é VH1_18.

15. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-14, em que o seqüência receptora humana do domínio de VH não possui nenhuma retro- mutação.

16. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-14, em que:

(a) o aminoácido na posição 5 do domínio de VH é V ou Q;

(b) o aminoácido na posição 69 do domínio de VH é M ou L;

(c) o aminoácido na posição 71 do domínio de VH é T ou V;

(d) o aminoácido na posição 73 do domínio de VH é T ou K; or

(e) o aminoácido na posição 75 do domínio de VH é T ou S.

17. Anticorpo da modalidade 16, em que o aminoácido na posi- ção 69 é L.

18. Anticorpo da modalidade 16, em que o aminoácido na posi- ção 71 é V.

19. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-15, em que o domínio de VH compreende a seqüência do ID. DE SEQ. N2: 5.

20. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-19, que com- preende uma CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 do ID. DE SEQ. N°: 4, uma CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 do ID. DE SEQ. N°: 4 e uma CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 do ID. DE SEQ. N°: 4.

21. Anticorpo da modalidade 20, em que a seqüência receptora humana do domínio de VL não possui nenhuma retromutação.

22. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 20-21, em que a estrutura central receptora humana do domínio de VL é de VKL02/JK4.

23. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 20-22, em que a estrutura central receptora humana do domínio de VL compreende o ID. DE SEQ. N°: 4.

24. Anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente à NKG2A, que compreende:

(a) uma CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 do ID. DE SEQ. N°: 4;

(b) uma CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 do ID. DE SEQ. N°: 4;

(c) uma CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 do ID. DE SEQ. N°: 4;

(d) uma CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 do ID. DE SEQ. N°: 5;

(e) uma CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. N°: 5; e

(f) uma CDR-H2 que compreende os resíduos 50-59 do ID. DE SEQ. N°: 5; e

(g) seqüências estruturais receptoras humanas;

em que os resíduos 60-65 na CDR-H2 são da seqüência recep- tora humana de VH, e

em que o anticorpo humanizado é mais eficaz do que um anti- corpo que compreende uma seqüência leve variável (VL) que corresponde ao ID. DE SEQ. N°: 1 e uma seqüência de VH que corresponde ao ID. DE SEQ. N°: 2 na potencialização da atividade citotóxica de uma célula NK que expressa CD94/NKG2A. 25. Anticorpo humanizado que se liga à NKG2A humana, o anti- corpo compreendendo um domínio de VH que compreende os resíduos da CDR não humana e uma estrutura central receptora de VH humana, o domí- nio de VH compreendendo uma CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31- 35 do ID. DE SEQ. N2: 5, uma CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50-65 do ID. DE SEQ. Ne: 5 e uma CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. Ns: 5.

26. Anticorpo humanizado da modalidade 25, em que a estrutura central receptora de VH humana não compreende nenhuma retromutação.

27. Anticorpo humanizado da modalidade 25, em que o aminoá- cido na posição de Kabat 5 do domínio de VH é V ou Q.

28. Anticorpo humanizado da modalidade 25, em que o aminoá- cido na posição de Kabat do domínio de VH 69 é M ou L.

29. Anticorpo humanizado da modalidade 25, em que o aminoá- cido na posição de Kabat 71 do domínio de VH é T ou V.

30. Anticorpo humanizado da modalidade 25, em que o aminoá- cido na posição de Kabat 73 do domínio de VH é T ou K.

31. Anticorpo humanizado da modalidade 25, em que o aminoá- cido na posição de Kabat 75 do domínio de VH é T ou S.

32. Anticorpo humanizado da modalidade 25, em que o domínio de VH compreende uma substituição na região estrutural em pelo menos uma posição de Kabat selecionada do grupo que consiste em 5, 69, 71, 73 e 75.

33. Anticorpo humanizado da modalidade 32, em que o domínio de VH compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. Ns: 5, com substituições na estrutura central de acordo com qualquer uma das seguin- tes opções:

(a) nenhuma

(b) V5Q

(c) M69L

(d) T71V

(e) T73K (f) T75S

(Q) V5Q e M69L

(h) V5Q e T71V

(0 V5Q e T73K

(j) V5Q e T75S

(k) M69L e T71V

(O M69Le T73K

(m) M69L e T75S

(n) T71V e T73K

(o) T71V e T75S

(P) T73Ke T75S

(q) V5Q, T73K e T75S

(r) V5Q, T71V e T75S

(s) V5Q, T71V e T73K

(t) V5Q, M69L e T75S

(u) V5Q, M69L e T73K

(v) V5Q, M69L e T71V

(W) T71V, T73K e T75S

(x) M69L, T73K e T75S

(y) M69L, T71V e T75S,

(z) M69L, T71V e T73K,

(aa) V5Q, M69L, T71V e T73K,

(bb) V5Q, M69L, T71V e T75S,

(cc) V5Q, M69L, T73K e T75S,

(dd) V5Q, T71V, T73K e T75S,

(ee) M69L, T71V, T73K e T75S, e

<ff) V5Q, M69L, T71V, T73K e T75S.

34. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 25-32, que compreende um domínio de VL que compreende os resíduos da CDR não humana incorporados em uma estrutura central receptora de VL humana, o domínio de VL compreendendo uma CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 do ID. DE SEQ. N°: 4, uma CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 do ID. DE SEQ. N9: 4 e uma CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 do ID. DE SEQ. N2: 4.

35. Anticorpo humanizado da modalidade 34, em que a estrutura central receptora de VL humana não compreende nenhuma retromutação.

36. Anticorpo humanizado da modalidade 34, em que o aminoá- cido na posição de Kabat 46 do domínio de VL é L ou F.

37. Anticorpo humanizado da modalidade 34, em que o aminoá- cido na posição de Kabat 48 do domínio de VL é I ou V.

38. Anticorpo humanizado da modalidade 34, em que o domínio de VL compreende uma substituição na região estrutural em pelo menos uma posição de Kabat selecionada de 46 e 48.

39. Anticorpo humanizado da modalidade 38, em que o domínio de VL compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. Ns: 4, com substituições na estrutura central de acordo com qualquer uma das seguin- tes opções:

(a) Nenhuma

(b) L46F

(c) I48V

(d) L46 e I48V.

40. Anticorpo humanizado que se liga à NKG2A humana, o anti- corpo compreendendo um domínio de VH que compreende os resíduos da CDR não humana incorporados em um domínio de VH humana, o domínio de VH compreendendo uma substituição na região estrutural em pelo menos uma posição de Kabat no ID. DE SEQ. Ns: 7 selecionada do grupo que con- siste em 5, 69, 71, 73 e 75.

41. Anticorpo humanizado da modalidade 40, compreendendo uma substituição V5Q.

42. Anticorpo humanizado da modalidade 40, compreendendo uma substituição M69L.

43. Anticorpo humanizado da modalidade 40, compreendendo uma substituição T71V.

44. Anticorpo humanizado da modalidade 40, compreendendo uma substituição T73K.

45. Anticorpo humanizado da modalidade 40, compreendendo uma substituição T75S.

46. Anticorpo humanizado da modalidade 40, compreendendo um domínio de VL que compreende os resíduos da CDR não humana incor- porados em um domínio de VL humana, o domínio de VL compreendendo uma substituição na região estrutural em pelo menos uma posição de Kabat no ID. DE SEQ. Ns: 6 selecionada de 46 e 48.

47. Anticorpo humanizado da modalidade 40, compreendendo uma substituição L46F.

48. Anticorpo humanizado da modalidade 40, compreendendo uma substituição I48V.

49. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 40-48, compreendendo uma CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 do ID. DE SEQ. Ns: 5, uma CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50-66 do ID. DE SEQ. NQ: 5 e uma CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. N9: 5.

50. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 40-49, que compreende um domínio de VH que compreende a seqüência do ID. DE SEQ. Ns: 7.

51. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 40-50, compreendendo uma CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 do ID. DE SEQ. NQ: 6, uma CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 do ID. DE SEQ. N2: 6 e uma CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 do ID. DE SEQ. Ns: 6.

52. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 40-52, compreendendo um domínio de VL que compreende a seqüência do ID. DE SEQ. Ns: 6.

53. Anticorpo humanizado que se liga à NKG2A humana, o anti- corpo compreendendo um domínio de VH que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. Ns: 5, opcionalmente com uma ou mais substi- tuições de FR nas posições de Kabat 5, 69, 71, 73 e/ou 75. 54. Anticorpo humanizado da modalidade 53, em que as substi- tuições de FR opcionais são V5Q, M69L, T71V, T73K e/ou T75S.

55. Anticorpo humanizado da modalidade 52, compreendendo ainda um domínio de VL que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. Ns: 4, opcionalmente com uma ou mais substituições de FR nas posições de Kabat 46 e/ou 48.

56. Anticorpo humanizado da modalidade 55, em que as substi- tuições de FR opcionais são L46F e/ou I48V.

57. Anticorpo humanizado que se liga a NKG2A, compreenden- do um domínio de VH que compreende os resíduos da CDR não humana incorporados em um domínio de VH humana, em que o domínio de VH é pelo menos 50% idêntico ao ID. DE SEQ. Ns: 5.

58. Anticorpo humanizado da modalidade 46, em que o domínio de VH é pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. Ns: 5.

59. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 57 e 58, compreendendo uma CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 do ID. DE SEQ. Ns: 5, uma CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50-66 do ID. DE SEQ. Ns: 5 e uma CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. Ns: 5.

60. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 57-59, compreendendo uma V ou Q na posição de Kabat 5, uma M ou L na posição de Kabat 69, uma T ou V na posição de Kabat 71, uma T ou K na posição de Kabat 73 e uma T ou S na posição de Kabat 75, no domínio de VH.

61. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 57-60, compreendendo um domínio de VL que compreende os resíduos da CDR não humana incorporados em um domínio de VL humana, em que o domínio de VL é pelo menos 50% idêntico ao ID. DE SEQ. Ns: 4.

62. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 57-61, compreendendo um domínio de VL pelo menos 90% idêntico ao ID. DE SEQ. Ns: 4.

63. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 57-62, que compreendendo uma seqüência de CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 do ID. DE SEQ. N2: 4, uma seqüência de CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 do ID. DE SEQ. Ns: 4 e uma seqüência de CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 do ID. DE SEQ. N2: 4.

64. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 57-63, compreendendo uma L ou F na posição de Kabat 46 e/ou uma I ou V na posição de Kabat 48.

65. Anticorpo humanizado que se liga à NKG2A humana, o anti- corpo compreendendo um domínio de VH que compreende os resíduos da CDR não humana incorporados em um domínio de VH humana, o domínio de VH compreendendo uma CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 do ID. DE SEQ. N2: 8, uma CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50-66 do ID. DE SEQ. N2: 8, e uma CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. N2: 8, em que os aminoácidos nas posições de Kabat 63, 64, 65, 66 e 67 são F, K, D, K, A, respectivamente.

66. Anticorpo humanizado da modalidade 65, em que o aminoá- cido na posição de Kabat 60 é A.

67. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 65 e 66, em que o domínio de VH compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. Ns: 8.

68. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 65-67, compreendendo ainda um domínio de VL que compreende uma CDR- L1 que corresponde aos resíduos 24-34 do ID. DE SEQ. N2: 6, uma CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 do ID. DE SEQ. N2: 6 e uma CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 do ID. DE SEQ. N2: 6.

69. Anticorpo humanizado de qualquer uma das modalidades 65-68, em que o domínio de VL compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N2: 6.

70. Versão humanizada de um anticorpo anti-NKG2A produzida pelo hibridoma de Z270.

71. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-70, que é um anticorpo multiespecífico ou um fragmento de anticorpo. 72. Anticorpo da modalidade 71, que é um fragmento de anticor- po selecionado de um Fab1 a Fab', um F(ab)2, um F(ab')2, um F(ab)3, um Fv, um Fv de cadeia simples, um dsFv, um fragmento Fd, um fragmento dAb, um minibody, um diabody, um triabody, um tetrabody, um corpo kappa; uma IgG de camelo; uma IgNAR; e um fragmento multiespecífico de anticorpo.

73. Anticorpo da modalidade 72, que é um anticorpo biespecífi- co.

74. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-70, que é um anticorpo lgG4 de comprimento total ou fragmento deste.

75. Anticorpo da modalidade 74, em que o domínio constante da cadeia pesada compreende uma mutação S241P.

76. Acido nucléico isolado que codifica o anticorpo de qualquer uma das modalidades precedentes.

77. Vetor que compreende o ácido nucléico da modalidade 76.

78. Célula hospedeira compreendendo o vetor da modalidade 76.

79. Método de produção um anticorpo que compreende o cultivo da célula hospedeira da modalidade 78, de tal forma que o ácido nucléico seja expresso e o anticorpo produzido.

80. Método da modalidade 79, compreendendo ainda a recupe- ração do anticorpo da célula hospedeira cultura.

81. Método da modalidade 79 em que, antes do cultivo, a célula hospedeira é co-transfectada com um vetor que compreende um ácido nu- cléico que codifica um domínio variável da cadeia pesada e com um vetor que compreende ácido nucléico que codifica um domínio variável da cadeia leve.

82. Imunoconjugado que compreende um anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades 1-75 e um segundo agente.

83. Imunoconjugado da modalidade 82, em que o segundo a- gente é um agente citotóxico.

84. O Imunoconjugado da modalidade 82, em que o segundo agente é uma molécula de PEG. 85. Composição farmacêutica que compreende o anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-75 ou o imunoconjugado de qualquer uma das modalidades 82-84, e um veículo.

86. Composição farmacêutica da modalidade 74, compreenden- do um tampão selecionado de citrato, fosfato, e uma combinação destes, que possui um pH de cerca de 6,0 a cerca de 7,5.

87. Artigo manufaturado compreendendo um recipiente que con- tém o anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-75, e instruções que informam um usuário sobre o tratamento de um distúrbio selecionado de um câncer, uma doença viral, um distúrbio inflamatório e um distúrbio autoimu- ne, em um mamífero, com o anticorpo em uma quantidade eficaz.

88. Artigo da modalidade 87, em que o mamífero é um ser hu- mano.

89. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1 -75 para uso na neutralização da atividade inibidora de um receptor de CD94/NKG2A ex- presso na superfície de um linfócito citotóxico em um paciente humano.

90. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-75 para uso na redução da inibição mediada por CD94/NKG2A da atividade de citotoxici- dade de um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A em um paciente humano.

91. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-75 para uso na potencialização da atividade citotóxica de um linfócito citotóxico que ex- pressa CD94/NKG2A em um paciente humano.

92. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-75 para uso na indução da morte de uma célula-alvo que expressa Cw3 por um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A em um paciente humano.

93. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 89-92, em que o linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A é uma célula NK, uma célu- la NKT, uma célula T α/β ou uma célula T γ/δ.

94. Método de tratamento de um paciente humano que sofre de um distúrbio selecionado de um câncer, uma doença viral, um distúrbio in- flamatório e um distúrbio autoimune, que compreende a administração da composição farmacêutica de qualquer uma das modalidades 85-86.

95. Uso do anticorpo de qualquer uma das modalidades 1 -75 na preparação de um medicamento para administração a um paciente humano que sofre de um distúrbio selecionado de um câncer, uma doença viral, um distúrbio inflamatório e um distúrbio autoimune.

96. Anticorpo de qualquer uma das modalidades 1-75 para uso no tratamento de um paciente humano que sofre de um distúrbio seleciona- do de um câncer, uma doença viral, um distúrbio inflamatório, e um distúrbio autoimune.

97. Método, o uso ou o anticorpo de qualquer uma das modali- dades 89-96, em que o paciente sofre de carcinoma de célula escamosa, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, Iinfoma de células B, Iinfoma de células T, Iinfoma de Hodgkins, Iinfoma não Hodg- kins, Iinfoma de célula pilosa, Iinfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, Ieucemias mielógenas agudas ou crônicas, leucemia promielocítica, fibrossarcoma, rabdomiossarcoma; melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma, glioma, astrocitoma, neuroblastoma, glioma, schwanomas; fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, osteossarcoma, melanoma, xeroderma pigmentoso, ce- ratoacantoma, seminoma, câncer folicular da tireóide, teratocarcinoma, ou- tros carcinomas da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, prósta- ta, pâncreas, estômago, cérvice, tireóide ou pele, outros tumores hemato- poiéticos de linhagem linfóide, outros tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide, outros tumores de origem mesenquimal, outros tumores do sistema nervoso central ou periférico ou outros tumores de origem mesenquimal.

98. Uso de acordo com a modalidade 97, em que o paciente so- fre de mieloma múltiplo, Iinfoma não Hodgkins ou Iinfoma mielógenas aguda.

Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de paten- tes e patentes, aqui citadas são aqui incorporadas por referência, no mesmo grau como se cada referência fosse individual e especificamente indicada para ser incorporada por referência, e fosse aqui apresentada em sua totali- dade.

Todos os títulos e subtítulos são aqui usados apenas por conve- niência, e não devem ser considerados de forma alguma como Iimitantes da invenção.

Qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as variações possíveis destes é englobada pela invenção, a menos que aqui indicado de forma diferente ou de outro modo nitidamente contra-indicado pelo contexto.

A menos que expressamente indicado de forma diferente ou niti- damente contra-indicado pelo contexto, o termo "ou" é aqui usado no sentido inclusivo "e/ou" e, conseqüentemente, como fornecendo implicitamente su- porte a uma modalidade ou aspecto no qual o termo deva ser interpretado no sentido exclusivo de "esse ou aquele".

Os termos "um/uma" e "o/a" e referentes similares usados no contexto de descrever a invenção devem ser considerados como engloban- do tanto o singular quanto o plural, a menos que aqui indicado de forma dife- rente ou nitidamente contra-indicado pelo contexto.

A citação nesse pedido de faixas de valores visa servir como um método abreviado para se referir individualmente a cada valor separado que caia dentro da faixa, a menos que aqui indicado de forma diferente, e cada valor separado é incorporado na especificação como se fosse aqui citado individualmente. A menos que definido de forma diferente, todos os valores exatos aqui fornecidos são representativos de valores aproximados corres- pondentes (por exemplo, todos os valores exemplares exatos fornecidos com relação a um fator ou medida em particular podem ser considerados como fornecendo também uma medida aproximada correspondente, modifi- cada por "cerca de", quando apropriado).

Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qual- quer ordem adequada, a menos que aqui indicado de forma diferente ou niti- damente contra-indicado pelo contexto.

O uso de qualquer e todos os exemplos, ou de linguagem exem- plar (por exemplo, "tal como") aqui fornecido, visa simplesmente melhor ilu- minar a invenção, e não impõem uma limitação ao escopo da invenção, a menos que indicado de forma diferente. Nenhuma linguagem na especifica- ção deve ser considerada como indicando que qualquer elemento seja es- sencial à prática da invenção, a menos que seja explicitamente estabelecido.

A citação e incorporação nessa especificação de documentos de patente é feita apenas por conveniência, e não reflete qualquer visão de va- lidade, possibilidade de patentear e/ou aplicabilidade desses documentos de patente.

A descrição aqui feita de qualquer aspecto ou modalidade da invenção com a utilização de termos como "que compreende", "que possui", "que inclui" ou "que contém", com referência a um elemento ou a elementos, visa apoiar um aspecto ou modalidade similar da invenção que "consiste em", "consiste essencialmente em" ou "que compreende substancialmente" aquele elemento ou elementos em particular, a menos que definido de forma diferentes ou nitidamente contra-indicado pelo contexto (por exemplo, uma composição aqui descrita como compreendendo um elemento em particular deve ser entendida como também descrevendo uma composição que con- siste naquele elemento, a menos que definido de forma diferentes ou nitida- mente contra-indicado pelo contexto).

Essa invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto em questão citados nos aspectos ou reivindicações aqui apresenta- dos no grau máximo permitido pelas leis aplicáveis. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Novo Nordisk A/S

<120> ANTICORPOS ANTI-NKG2A E SUAS UTILIZAÇÕES

<130> 7448.204-W0

<160> 29

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Phe Leu Val 35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

2

124 PRT

Mus musculus

<210> <211> <212> <213>

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60

Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Arg Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120

<210> 3

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 1 5

Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys 20

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 35 40

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 50 55

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr 65 70

Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 10 15

Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr 25 30

Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 45

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 60

Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência humanizada

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 5

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência humanizada

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência humanizada <220>

<221> INCERTO

<222> (46)..(46)

<223> Xaa é L ou F

<220>

<221> INCERTO

<222> (48)..(48)

<223> Xaa é I ou V

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 1 5

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 20

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 35 40

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu 50 55

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15

Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 25 30

Gly Lys Ala Pro Lys Xaa Leu Xaa 45

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 60

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 7

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência humanizada <220>

<221> INCERTO

<222> (5)..(5)

<223> Xaa é V ou Q

<220>

<221> INCERTO

<222> (70)..(70)

<223> Posição de Kobat 69; Xaa é M ou L

<220>

<221> INCERTO

<222> (72) . . (72)

<223> Posição de Kobat 71; Xaa é T ou V <220>

<221> INCERTO

<222> (74).. (74)

<223> Posição de Kobat 73; Xaa é T ou K

<220>

<221> INCERTO

<222> (76).. (76)

<223> Posição de Kobat 75; Xaa é T ou S

<400> 7

Gln Val Gln Leu Xaa Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Xaa Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120

<210> 8

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência humanizada <220>

<221> INCERTO

<222> (5)..(5)

<223> Xaa é V ou Q

<220>

<221> INCERTO

<222> (61)..(61)

<223> Posição de Kobat 60; Xaa é S ou A <220>

<221> INCERTO

<222> (64)..(64)

<223> Posição de Kobat 63; Xaa é L ou F <220>

<221> INCERTO

<222> (65)..(65)

<223> Posição de Kobat 64; Xaa é Q ou K <220>

<221> INCERTO

<222> (66).. (66)

<223> Posição de Kobat 65; Xaa é G ou D <220>

<221> INCERTO

<222> (67)..(67)

<223> Posição de Kobat 66; Xaa é R ou K <220>

<221> INCERTO

<222> (68).. (68)

<223> Posição de Kobat 67; Xaa é V ou A <220>

<221> INCERTO

<222> (70)..(70)

<223> Posição de Kobat 69; Xaa é M ou L <220>

<221> INCERTO

<222> (72)..(72)

<223> Posição de Kobat 71; Xaa é T ou V <220>

<221> INCERTO

<222> (74)..(74)

<223> Posição de Kobat 73; Xaa é T ou K <220>

<221> INCERTO

<222> (76).. (76)

<223> Posição de Kobat 75; Xaa é T ou S

<400> 8

Gln Val Gln Leu Xaa Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Xaa Gln Lys Xaa 50 55 60

Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Thr Xaa Asp Xaa Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 10

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

85 90 95

Met Glu Leu Arg Ala Arg Tyr Tyr 100 Thr Val Thr Val 115 <210> 11 <211> 233 <212> PRT <213> Homo <400> 11

105 110

Met Asp Asn Gln Gly Val Ile Tyr Ser Asp Leu Asn Leu Pro Pro Asn 1 5 10 15

Pro Lys Arg Gln Gln Arg Lys Pro Lys Gly Asn Lys Ser Ser Ile Leu 20 25 30

Ala Thr Glu Gln Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Leu Gln Lys Ala 35 40 45

Ser Gln Asp Phe Gln Gly Asn Asp Lys Thr Tyr His Cys Lys Asp Leu 50 55 60

Pro Ser Ala Pro Glu Lys Leu Ile Val Gly Ile Leu Gly Ile Ile Cys 65 70 75 80

Leu Ile Leu Met Ala Ser Val Val Thr Ile Val Val Ile Pro Ser Thr 85 90 95

Leu Ile Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys 100 105 110

Ala Arg His Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn 115 120 125

Ser Cys Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu 130 135 140

Leu Ala Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu 145 150 155 160

Glu Glu Met Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly 165 170 175

Val Phe Arg Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu 180 185 190

Ala Phe Lys His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys 195 200 205

Ala Val Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser 210 215 220

Ile Ile Tyr His Cys Lys His Lys Leu 225 230

<210> <211>

12 20 <212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador

<400> 12

gccagtggat agacagatgg 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador

<400> 13

gatggataca gttggtgcag c 21

<210> 14

<211> 381

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 14

atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacagg tgccagatgt 60

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 120

atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 180

ggaaaatctc ctcagttctt ggtctataat gcaaaaacct tagcagaagg tgtgccatca 240

aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct 300

gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat cactatggta ctcctcggac gttcggtgga 360

ggcaccaagc tggaaatcaa a 381

<210> 15

<211> 127

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 15 10 15

Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30

Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 35 40 45

Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60

Gln Phe Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr 100 105 110

Gly Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125

<210> 16

<211> 432

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 16

atgggatgga gctatatcat cctcttcttg ttagcaacag ctacatgtgt ccactcccag 60

gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac gttcaccagc tactggatga actgggttaa gcagaggcct 180

gagcaaggcc ttcagtggat tggaaggatt gatccttacg atagtgaaac tcactacagt 240

caaaagttca aggacaaggc catattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300

cgactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag agggggctat 360

gatttcgacg taggaactct ctactggttc ttcgatgtct ggggcgcagg gaccacggtc 420

accgtctcct ca 432

<210> 17

<211> 144

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 17

Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Leu Ala Thr Ala Thr Cys 1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 50 55 60

Gln Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser 65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Arg Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr 115 120 125

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 140

<210> 18

<211> 723

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Chimeric sequence

<400> 18

gaattcgcca ccatgagtgt gcccactcag gtcctggggt tgctgctgct gtggcttaca 60

ggtgccagat gtgacatcca gatgactcag tctccagcct ccctatctgc atctgtggga 120

gaaactgtca ccatcacatg tcgagcaagt gagaatattt acagttattt agcatggtat 180

cagcagaaac agggaaaatc tcctcagttc ttggtctata atgcaaaaac cttagcagaa 240

ggtgtgccat caaggttcag tggcagtgga tcaggcacac agttttctct gaagatcaac 300

agcctgcagc ctgaagattt tgggagttat tactgtcaac atcactatgg tactcctcgg 360

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420

atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480

aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540

aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600

agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660

actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttaggct 720

age 723

<210> 19

<211> 1419

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Chimeric sequence

<400> 19

gaattcgcca ccatgggatg gagetatate atcctcttct tgttagcaac agctacatgt 60

gtccactccc aggtccaact gcagcagcct ggggctgagc tggtgaggcc tggggcttca 120

gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac acgttcacca gctactggat gaactgggtt 180

aagcagaggc ctgagcaagg ccttcagtgg attggaagga ttgatcctta cgatagtgaa 240

actcactaca gtcaaaagtt caaggacaag gccatattga ctgtagacaa atcctccagc 300

acagcctaca tgcgactcag cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttactgtgca 360

agagggggct atgatttcga cgtaggaact ctctactggt tcttcgatgt ctggggcgca 420

gggaccacgg tcaccgtctc ctcagccaaa acgacacccc catctgtcta tccgctagcc 480

cctggatctg ctgcccaaac taactccatg gtgaccctgg gatgcctggt caagggctat 540

ttccctgagc cagtgacagt gacctggaac tctggatccc tgtccagcgg tgtgcacacc 600

ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac actctgagca gctcagtgac tgtcccctcc 660

agcacctggc ccagcgagac cgtcacctgc aacgttgccc acccggccag cagcaccaag 720

gtggacaaga aaattgtgcc cagggattgt ggttgtaagc cttgcatatg tacagtccca 780

gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca aagcccaagg atgtgctcac cattactctg 840 actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac atcagcaagg atgatcccga ggtccagttc 900

agctggtttg tagatgatgt ggaggtgcac acagctcaga cgcaaccccg ggaggagcag 960

ttcaacagca ctttccgctc agtcagtgaa cttcccatca tgcaccagga ctggctcaat 1020

ggcaaggagt tcaaatgcag ggtcaacagt gcagctttcc ctgcccccat cgagaaaacc 1080

atctccaaaa ccaaaggcag accgaaggct ccacaggtgt acaccattcc acctcccaag 1140

gagcagatgg ccaaggataa agtcagtctg acctgcatga taacagactt cttccctgaa 1200

gacattactg tggagtggca gtggaatggg cagccagcgg agaactacaa gaacactcag 1260

cccatcatgg acacagatgg ctcttacttc gtctacagca agctcaatgt gcagaagagc 1320

aactgggagg caggaaatac tttcacctgc tctgtgttac atgagggcct gcacaaccac 1380

catactgaga agagcctctc ccactctcct ggtaaatga 1419

<210> 20

<211> 723

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Chimeric sequence

<400> 20

gaattcgcca ccatgagtgt gcccactcag gtcctggggt tgctgctgct gtggcttaca 60

ggtgccagat gtgacatcca gatgactcag tctccagcct ccctatctgc atctgtggga 120

gaaactgtca ccatcacatg tcgagcaagt gagaatattt acagttattt agcatggtat 180

cagcagaaac agggaaaatc tcctcagttc ttggtctata atgcaaaaac cttagcagaa 240

ggtgtgccat caaggttcag tggcagtgga tcaggcacac agttttctct gaagatcaac 300

agcctgcagc ctgaagattt tgggagttat tactgtcaac atcactatgg tactcctcgg 360

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacggactg tggcggcgcc atctgtcttc 420

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggtaccg ctagcgttgt gtgcctgctg 480

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaggga 720

tcc 723

<210> 21

<211> 1434

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Chimeric seguence

<400> 21

gaattcgcca ccatgggatg gagctatatc atcctcttct tgttagcaac agctacatgt 60 gtccactccc aggtccaact gcagcagcct ggggctgagc tggtgaggcc tggggcttca 120

gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac acgttcacca gctactggat gaactgggtt 180

aagcagaggc ctgagcaagg ccttcagtgg attggaagga ttgatcctta cgatagtgaa 240

actcactaca gtcaaaagtt caaggacaag gccatattga ctgtagacaa atcctccagc 300

acagcctaca tgcgactcag cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttactgtgca 360

agagggggct atgatttcga cgtaggaact ctctactggt tcttcgatgt ctggggcgca 420

gggaccacgg tcaccgtctc ctcagctagc accaagggcc catccgtctt ccccctggcg 480

ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt caaggactac 540

ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 600

ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 660

tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc 720

aaggtggaca agagagttga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct 780

gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg ttccccccaa aacccaagga cactctcatg 840

atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccagga agaccccgag 900

gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960

gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020

tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc 1080

gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc 1140

ccatcccagg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200

taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260

accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg 1320

gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380

cacaaccact acacacagaa gagcctctcc ctgtctctgg gtaaatgagg atcc 1434

<210> 22

<211> 723

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência humanizada

<400> 22

gaattcgcca ccatggacat gagggtcccc gctcagctcc tggggctcct gctactctgg 60

ctccgaggtg ccagatgtga catccagatg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 120

gtaggagaca gagtcaccat cacttgccga gcaagtgaga atatttacag ttatttagca 180

tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tctataatgc aaaaacctta 240

gcagaagggg tcccatcaag gttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagtc tgcaacctga agattttgca acttactact gtcaacatca ctatggtact 360

cctcggacgt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaac ggactgtggc ggcgccatct 420

gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gtaccgctag cgttgtgtgc 480

ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540

caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600

ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660

gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720

tag 723

<210> 23

<211> 1428

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência humanizada

<400> 23

gaattcgcca ccatggactg gacctggagc atccttttct tggtggcagc agcaacaggt 60

gcccactccc aggttcagct ggtgcagtct ggagctgagg tgaagaagcc tggggcctca 120

gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggttac acctttacca gctactggat gaactgggtg 180

cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggaagga ttgatcctta cgatagtgaa 240

actcactatg cacagaagct ccagggcaga gtcaccatga ccacagacac atccacgagc 300

acagcctaca tggagctgag gagcctgaga tctgacgaca cggccgtgta ttactgtgcg 360

agagggggct atgatttcga cgtaggaact ctctactggt tcttcgatgt ctggggccaa 420

gggacaacgg tcaccgtctc ttcagctagc accaagggcc catccgtctt ccccctggcg 480

ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt caaggactac 540

ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 600

ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 660

tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc 720

aaggtggaca agagagttga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct 780

gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg ttccccccaa aacccaagga cactctcatg 840

atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccagga agaccccgag 900

gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960

gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020

tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc 1080

gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc 1140

ccatcccagg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200

taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg 1320

1428

gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc ttctcatgct ccgtgatgca cacaaccact acacacagaa gagcctctcc ctgtctctgg gtaaatga <210> <211> <212> <213> 24 124 PRT Artificial <220> <223> Seqüência humanizada <400> 24

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120

<210> 25

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência humanizada

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile 35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120

<210> 26 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Seqüência ] <400> 26

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120

<210> 27

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência humanizada

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120

<210> 28

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência 1

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Thr Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120

<210> 29

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência humanizada

<400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser'Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120

Claims (15)

1. Anticorpo que se liga especificamente à NKG2A, que compre- ende resíduos de ligação de antígeno das regiões determinantes de com- plementaridade (CDRS) do anticorpo murídeo Z270 e seqüências estruturais receptoras humanas, em que pelo menos os 6 resíduos de aminoácidos do terminal C da CDR-h2 são iguais àqueles no seqüência receptora humana do domínio variável pesado (VH).

2. Anticorpo da reivindicação 1, que é mais eficaz do que um anticorpo que compreende seqüências da região variável leve (VL) (ID. DE SEQ. N°: 1) e VH (ID. DE SEQ. Ne: 2) do anticorpo murídeo Z270 na poten- cialização da atividade citotóxica de um linfócito citotóxico que expressa CD94/NKG2A.

3. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-2, que com- preende uma CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 do ID. DE SEQ. N°: 5 e uma CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. N°: 5, em que a CDR-H2 compreende os resíduos 50-59 do ID. DE SEQ. N°: -5.

4. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que: (a) o aminoácido na posição 5 do domínio de VH é V ou Q; (b) o aminoácido na posição 69 do domínio de VH é M ou L; (c) o aminoácido na posição 71 do domínio de VH é T ou V; (d) o aminoácido na posição 73 do domínio de VH é T ou K; ou (e) o aminoácido na posição 75 do domínio de VH é T ou S.

5. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 -4, em que as seqüências estruturais receptoras humanas do domínio de VH não possuem nenhuma retromutação.

6. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que o domínio de VH compreende a seqüência do ID. DE SEQ. N°: 5.

7. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-6, que com- preende uma CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 do ID. DE SEQ. N°: 4, uma CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 do ID. DE SEQ. N°: -4 e uma CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 do ID. DE SEQ. N9: 4.

8. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-7, em que a estrutura central receptora humana do domínio de VL compreende o ID. DE SEQ. Ns: 4.

9. Anticorpo que se liga especificamente à NKG2A, que compre- ende: (a) uma CDR-L1 que corresponde aos resíduos 24-34 do ID. DE SEQ. Ne: 4; (b) uma CDR-L2 que corresponde aos resíduos 50-56 do ID. DE SEQ. Ne: 4; (c) uma CDR-L3 que corresponde aos resíduos 89-97 do ID. DE SEQ. Ne: 4; (d) uma CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 do ID. DE SEQ. Ns: 5; (e) uma CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. Ns: 5; e (f) uma CDR-H2 que compreende os resíduos 50-59 do ID. DE SEQ. Ns: 5; e (g) seqüências estruturais receptoras humanas; em que os resíduos 60-65 na CDR-H2 são de uma seqüência receptora humana de VH, e em que o anticorpo humanizado é mais eficaz do que um anti- corpo que compreende uma seqüência leve variável (VL) que corresponde ao ID. DE SEQ. Ns: 1 e uma seqüência de VH que corresponde ao ID. DE SEQ. Ns: 2 na potencialização da atividade citotóxica de uma célula NK que expressa CD94/NKG2A.

10. Anticorpo que se liga especificamente à NKG2A, o anticorpo compreendendo um domínio de VH que compreende os resíduos da CDR não humana e seqüências estruturais receptoras humanas de VH, o domínio de VH compreendendo uma CDR-H1 que corresponde aos resíduos 31-35 do ID. DE SEQ. N9: 5, uma CDR-H2 que corresponde aos resíduos 50-65 do ID. DE SEQ. N9: 5 e uma CDR-H3 que corresponde aos resíduos 95-102 do ID. DE SEQ. N3: 5.

11. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-10, que é um anticorpo lgG4.

12. Anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-11, que é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo multiespecífico.

13. Método para a produção de um anticorpo anti-NKG2A, que compreende o cultivo de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucléico que codifica o anticorpo anti-NKG2A de qualquer uma das reivindi- cações 1-12, de tal forma que o ácido nucléico seja expresso e o anticorpo produzido.

14. Composição farmacêutica que compreende o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-12 e um veículo farmaceuticamente acei- tável.

15. Método de tratamento de um paciente humano que sofre de um distúrbio selecionado de um câncer, uma doença viral, um distúrbio in- flamatório e um distúrbio autoimune, que compreende a administração da composição farmacêutica da reivindicação 14.