ES2531933T3 - Anticuerpos anti-NKG2A y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Anticuerpo que se une específicamente a NKG2A, que comprende residuos de unión a antígeno de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo murino Z270 y secuencias de región de entramado aceptoras humanas, en el que el dominio VH comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5 y el dominio 5 VL comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4.

Description

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ejemplo, GCG versión 6.1. Las secuencias de polipéptido también pueden compararse usando FASTA o ClustalW, aplicando parámetros por defecto o recomendados. Un programa en GCG versión 6.1., FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones e identidad de secuencia en porcentaje de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98;

5 Pearson, Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diversos organismos, o cuando se deduce, es el programa informático BLAST, especialmente blastp, que usa parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990;215:403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997). Posiciones de aminoácido “correspondientes” en dos secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas son aquéllas alineadas mediante cualquiera de los software de análisis de proteínas mencionados en el presente documento, normalmente usando parámetros por defecto.

Un anticuerpo que tiene una “característica biológica” de un anticuerpo de referencia, (por ejemplo, Z270), es uno que posee una o más de las características biológicas de ese anticuerpo que lo distingue de otros anticuerpos que

15 se unen al mismo antígeno (por ejemplo NKG2A). Por ejemplo, un anticuerpo con una característica biológica de Z270 puede bloquear la activación de NKG2A, y/o competir de manera cruzada con Z270 en la unión al dominio extracelular de NKG2A.

NKG2A (OMIM 161555, cuya divulgación completa se incorpora al presente documento como referencia) es un miembro del grupo NKG2 de transcritos (Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173:1017-1020). NKG2A se codifica por 7 exones que abarcan 25 kb, mostrando algo de corte y empalme diferencial. NKG2A es un receptor inhibidor encontrado sobre la superficie de subconjuntos de células NK, células T α/β, células T γ/δ, y células NKT. Al igual que los receptores KIR inhibidores, tiene un ITIM en su dominio citoplasmático. Tal como se usa en el presente documento, “NKG2A” se refiere a cualquier variante, derivado o isoforma del gen de NKG2A o proteína codificada.

25 También se engloba cualquier secuencia de ácido nucleico o proteína que comparta una o más propiedades o funciones biológicas con NKG2A de longitud completa, de tipo natural, y que comparta una identidad de aminoácidos o nucleótido de al menos el 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o superior. NKG2A humano comprende 233 aminoácidos en 3 dominios, con un dominio citoplasmático que comprende los residuos 1-70, una región transmembrana que comprende los residuos 71-93 y una región extracelular que comprende los residuos 94233, de la secuencia siguiente:

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NKG2C (OMIM 602891, cuya divulgación completa se incorpora al presente documento como referencia) y NKG2E

35 (OMIM 602892, cuya divulgación completa se incorpora al presente documento como referencia) son otros dos miembros del grupo NKG2 de transcritos (Gilenke, et al. (1998) Immunogenetics 48:163-173). NKG2C y NKG2E son receptores de activación encontrados sobre la superficie de células NK.

HLA-E (OMIM 143010, cuya divulgación completa se incorpora al presente documento como referencia) es una molécula de MHC no clásico que se expresa en la superficie celular y está regulada por la unión de péptidos derivados de la secuencia señal de otras moléculas de MHC de clase I. HLA-E se une a linfocitos citolíticos naturales (natural killer, NK) y a algunas células T, uniéndose específicamente a CD94/NKG2A, CD94/NKG2B y CD94/NKG2C (véase, por ejemplo, Braud et al. (1998) Nature 391:795-799). La expresión en superficie de HLA-E es suficiente para proteger a las células diana de la lisis por clones de células NK, T o NKT CD94/NKG2A+. Tal como

45 se usa en el presente documento, “HLA-E” se refiere a cualquier variante, derivado o isoforma del gen de HLA-E o proteína codificada. También se engloba cualquier secuencia de ácido nucleico o proteína que comparta una o más propiedades o funciones biológicas con HLA-E de longitud completa, de tipo natural, y que comparta una identidad de aminoácidos o nucleótidos de al menos el 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o superior.

Un ácido nucleico está “operativamente unido” cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está operativamente unido al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si está colocado para facilitar la

55 traducción. Generalmente, “operativamente unido” significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas, y en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan los adaptadores o ligadores de oligonucleótido sintéticos según la práctica convencional.

Una molécula “aislada” es una molécula que es la especie predominante en la composición en la que se encuentra

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secuencia humana que está más próxima a la del roedor puede aceptarse entonces como la región de entramado

humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 1993;151:2296 y siguientes.; Chothia et al, Chothia

y Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917). Otro método usa una región de entramado particular derivada de la

secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas.

5 Puede usarse la misma región de entramado para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., PNAS

USA, 1992;89:4285 y siguientes.; Presta et al., J Immunol 1993; 151:2623 y siguientes.). Otros métodos diseñados

para reducir la inmunogenicidad de la molécula de anticuerpo en un paciente humano incluyen anticuerpos

remodelados en su superficie (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense 6.797.492 y las publicaciones de

solicitud de patente estadounidense 20020034765 y 20040253645) y anticuerpos que se han modificado por el 10 análisis y retirada del epítopo de células T modificado (véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente

estadounidense 20030153043 y U.S. Patente No. 5,712,120).

Además es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad por el antígeno y otras

propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, según un método preferido, los anticuerpos 15 humanizados se preparan mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos

humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Se

dispone comúnmente de modelos de inmunoglobulina tridimensionales y los expertos en la técnica están

familiarizados con ellos. Se dispone de programas informáticos que ilustran y muestran estructuras

conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La 20 inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la

secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la

inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta forma, pueden seleccionarse residuos de FR y

combinarse con secuencias del receptor y de importación de modo que se logren las características deseadas del

anticuerpo, tales como afinidad aumentada por el(los) antígeno(s) diana. En general, los residuos de la región 25 hipervariable están implicados directa y lo más sustancialmente en influir en la unión a antígeno.

El ejemplo 1 a continuación describe el diseño de anticuerpos humanizados anti-NKG2A a modo de ejemplo que se

unen a NKG2A, y el análisis se ilustra, al menos en parte, en la figura 1. Tal como se muestra en la figura 1, en un

anticuerpo humZ270, la parte C-terminal de CDR-H2 (correspondiente a los residuos de Kabat 61-65) es idéntica a 30 la parte correspondiente de la secuencia aceptora humana. Además, tal como se describe en la leyenda de la figura,

una secuencia de humZ270VL (SEQ ID NO: 4) puede comprender opcionalmente mutaciones en uno o ambos

residuos de FR indicados, L46 e I48, y una secuencia de humZ270VH (SEQ ID NO: 5) puede comprender

opcionalmente mutaciones en uno o más de los residuos de FR indicados, V5, M69, T71, T73 y T75, numerándose

los aminoácidos según Kabat. La tabla 1 describe variantes de humZ270VL y humZ270VH a modo de ejemplo que 35 comprenden retromutaciones de humano a murino a modo de ejemplo en las secuencias de FR de humZ270VH y

humZ270VL, así como combinaciones a modo de ejemplo de mutaciones de FR. En la tabla 1 y en otro lugar en el

presente documento, las posiciones de aminoácido se designan según Kabat, en las que los aminoácidos V5, M69,

T71, T73 y T75 en el dominio de humZ270VH corresponden a los aminoácidos V5, M70, T72, T74 y T76 en SEQ ID

NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, u otras secuencias de humZ270VH a modo de ejemplo descritas en el 40 presente documento.

Tabla 1

Variantes de humZ270VL y humZ270VH que comprenden retromutaciones de FR a modo de ejemplo en secuencias humZ270VL (SEQ ID NO: 4 ó 6) y/o humZ270VH (SEQ ID NO: 5, 7 u 8) nativas o consenso

Variantes de humZ270VL

Variantes de humZ270VH

Ninguna

Ninguna

L46F

V5Q

I48V

M69L

L46F y I48V

T71V T73K T75S V5Q y M69L V5Q y T71V V5Q y T73K V5Q y T75S M69L y T71V M69L y T73K M69L y T75S T71V y T73K T71V y T75S T73K y T75S V5Q, T73K y T75S V5Q, T71V y T75S V5Q, T71V y T73K V5Q, M69L y T75S

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de dominios variables según Kabat. En otra realización, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones de FR en el dominio VH en dos o más de posiciones 5, 69, 71, 73 y 75; y en otras realizaciones, en tres, cuatro, o en todas estas posiciones. En realizaciones separadas e independientes, el anticuerpo humanizado comprende una sustitución de FR en el dominio VH en una posición seleccionada de 5, 69, 71, 73 y 75. En otras realizaciones 5 separadas e independientes, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones de FR en el dominio VH en las posiciones 5 y 69, o 5 y 71, o 5 y 73, o 5 y 75, o 69 y 71, 69 y 73, o 69 y 75, o 71 y 73, o 71 y 75, o 73 y 75, o 5, 69 y 71, o 5, 69 y 73, o 5, 69 y 75, o 69, 71 y 73, o 69, 71 y 75, o 71, 73, y 75, o 5, 69, 71, y 73, o 5, 69, 71, y 75, o 5, 71, 73, y 75, o 69, 71, 73, y 75, o 5, 69, 71, 73, y 75. Menos en lugar de más sustituciones de región de entramado pueden minimizar la inmunogenicidad, pero la eficacia de unión puede ser una consideración importante para algunas aplicaciones. Por tanto, las sustituciones preferidas son retromutaciones, es decir, mutaciones que sustituyen un aminoácido en una posición determinada en la FR humana por el aminoácido en la posición correspondiente en una FR donadora no humana. Por tanto, en realizaciones separadas e independientes, la sustitución de aminoácido en el dominio VH en la posición 5 es V5Q, la sustitución de aminoácido en la posición 69 es M69L, la sustitución de aminoácido en la posición 71 es T71V, la sustitución de aminoácido en la posición 73 es

15 T73K y la sustitución de aminoácido en la posición 75 es T75S. En una realización particular, el anticuerpo humanizado comprende una V en la posición 71 y/o una L en la posición 69.

El anticuerpo humanizado en el presente documento también comprende residuos de región hipervariable no humanos incorporados en un dominio VL humano. En una realización, el anticuerpo humanizado no comprende sustitución de FR en el dominio VL. En otra realización, el anticuerpo humanizado comprende una sustitución de Fr en el dominio VL en una de las posiciones 46 y 48, utilizando el sistema de numeración de dominios variables según Kabat. En otra realización, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones de FR en el dominio VL de las posiciones tanto 46 como 48. Las sustituciones preferidas son retromutaciones, es decir, mutaciones que sustituyen un aminoácido en una posición determinada en la FR humana por el aminoácido en la posición correspondiente en

25 una FR donadora no humana. Por tanto, en realizaciones separadas e independientes, la sustitución de aminoácido en el dominio VL en la posición 46 es L46F y la sustitución de aminoácido en el dominio VL en la posición 48 es I48V.

Un anticuerpo humanizado a modo de ejemplo comprende un dominio VH que comprende una secuencia de CDR-H1 correspondiente a los residuos 31-35 de las SEQ ID NOS: 5 o 7, una secuencia de CDR-H2 correspondiente a los residuos 50-66 de las SEQ ID NOS: 5 o 7, y una secuencia de CDR-H3 correspondiente a los residuos 95-102 de las SEQ ID NOS: 5 o 7. El anticuerpo humanizado puede comprender además un aminoácido en la posición 5 de Kabat 5 que es V o Q, un aminoácido en la posición de Kabat 69 que es M o L, un aminoácido en la posición de Kabat 71 que es T o V, un aminoácido en la posición de Kabat 73 que es T o K, y/o un aminoácido en la posición de

35 Kabat 75 que es T o S, en el dominio VH. En una realización, el dominio VH comprende una sustitución de región de entramado en al menos una posición de Kabat seleccionada del grupo que consiste en 5, 69, 71, 73 y 75, por ejemplo, correspondiente a cualquiera de las sustituciones de FR de VH, o combinaciones de las mismas, enumeradas en la tabla 1. En una realización, el dominio VH comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7. En otra realización, el dominio VH comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5.

Un anticuerpo humanizado a modo de ejemplo puede comprender también o alternativamente un dominio VL que comprende una secuencia de CDR-L1 correspondiente a los residuos 24-34 de SEQ ID NO: 4, una secuencia de CDR-L2 correspondiente a los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 4, y una secuencia de CDR-L3 correspondiente a los residuos 89-97 de SEQ ID NO: 4. El anticuerpo humanizado puede comprender además un aminoácido en la

45 posición de Kabat 46 que es L o F y/o un aminoácido en la posición de Kabat 48 que es I o V. En una realización, el dominio VL comprende una sustitución de región de entramado en al menos una posición de Kabat seleccionada de 46 y 48, por ejemplo, correspondiente a cualquiera de las sustituciones de FR de VL, o combinaciones de las mismas, enumeradas en la tabla 1. En una realización, el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. En otra realización, el dominio VL comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo humanizado que se une a NKG2A humano, comprendiendo el anticuerpo un dominio VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, opcionalmente con una o más sustituciones de FR en las posiciones de Kabat 5, 69, 71, 73 y/o 75. Las sustituciones de FR opcionales pueden seleccionarse de, por ejemplo, V5Q, M69L, T71V, T73K y/o T75S, así como cualquier

55 combinación de las mismas. Un anticuerpo humanizado de este tipo puede comprender también o alternativamente un dominio VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, opcionalmente con una o más sustituciones de FR en las posiciones de Kabat 46 y/o 48. Las sustituciones de FR opcionales pueden seleccionarse de, por ejemplo, L46F y/o I48V.

Opcionalmente, en un aspecto particular, el dominio VH comprende modificaciones de aminoácido de uno o más residuos de CDR, por ejemplo donde las modificaciones mantienen o mejoran esencialmente la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante de anticuerpo puede tener una, dos, tres, o desde una hasta aproximadamente siete sustituciones de aminoácido en las secuencias de CDR de VH anteriores.

65 En un aspecto particular, los aminoácidos en las CDR de VH del anticuerpo humanizado que son diferentes de los aminoácidos en las posiciones correspondientes en las CDR de VH donadoras no humanas pueden sustituirse para

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mejorar las propiedades de unión y/o la estabilidad del anticuerpo humanizado. Por ejemplo, uno o más de esos aminoácidos puede sustituirse por el aminoácido en la(s) posición/posiciones correspondiente(s) en las CDR de VH donadoras no humanas. En una realización, el anticuerpo variante comprende sustituciones de CDRH2 en una o más posiciones seleccionadas de 60, 63, 64 y 65, según Kabat (correspondientes a las posiciones 61, 64, 65 y 66 en 5 SEQ ID NO: 5 o 7). En realizaciones separadas e independientes, la variante de anticuerpo comprende una sustitución de aminoácido de CDRH2 en una posición seleccionada de 60, 63, 64 y 65. En otras realizaciones separadas e independientes, la variante de anticuerpo comprende sustitución de aminoácido de CDRH2 en las posiciones 60 y 63, o 60 y 64, o 60 y 65, o 63 y 64, o 63 y 65, o 64 y 65, o 60, 63, y 64, o 60, 63, y 65, o 60, 64, y 65,

o 63, 64, y 65, o 60, 63, 64, y 65. Las sustituciones preferidas son retromutaciones, es decir, mutaciones que sustituyen un aminoácido en una posición determinada en la CDR humanizada por el aminoácido en la posición correspondiente en una CDR donadora no humana. Por tanto, en realizaciones separadas e independientes, la sustitución de aminoácido de CDRH2 en la posición 60 es A60S, la sustitución de aminoácido en la posición 63 es L63F, la sustitución de aminoácido en la posición 64 es Q64K y la sustitución de aminoácido en la posición 65 es G65D. En aspectos en los que la variante de anticuerpo comprende una o más de las sustituciones de aminoácido

15 de CDRH2 A60S, L63F, Q64K y G65D, la variante de anticuerpo comprende las sustituciones de aminoácido de FR de VH en las posiciones 66 y 67 según Kabat, de manera opcional conjuntamente con una o más de las sustituciones de FR de VH descritas anteriormente. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácido son R66K y V67A. Por ejemplo, en una realización, la variante de anticuerpo comprende un dominio VH que comprende una secuencia de CDR-H1 correspondiente a los residuos 31-35 de SEQ ID NO: 5, una secuencia de CDR-H2 correspondiente a los residuos 50-66 de SEQ ID NO: 5, y una secuencia de CDR-H3 correspondiente a los residuos 95-102 de SEQ ID NO: 5, con “retromutaciones” A60S, L63F, Q64K, G65D, R66K y V67A de manera opcional conjuntamente con modificaciones de aminoácido adicionales.

En otro aspecto particular, la divulgación proporciona un anticuerpo humanizado que se une a NKG2A humano,

25 comprendiendo el anticuerpo un dominio VH que comprende residuos de CDR no humanos incorporados en un dominio VH humano, comprendiendo el dominio VH una secuencia de CDR-H1 correspondiente a los residuos 31-35 de SEQ ID NO: 8, una secuencia de CDR-H2 correspondiente a los residuos 50-66 de SEQ ID NO: 8, y una secuencia de CDR-H3 correspondiente a los residuos 95-102 de SEQ ID NO: 8, en el que los aminoácidos en las posiciones de Kabat 63, 64, 65, 66, y 67 son F, K, D, K, A, respectivamente. En una realización, el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. En otra realización, el residuo en la posición de Kabat 60 es A. En otra realización, el residuo en la posición de Kabat 60 es S, y el anticuerpo humanizado comprende las secuencias de CDR-H1, -H2, y H3 de Z270, con retromutaciones de FR en los dos aminoácidos adyacentes al extremo C-terminal de CDR-H2. Los anticuerpos humanizados descritos en esta sección pueden comprender además retromutaciones de FR en otros residuos, por ejemplo, en las posiciones de Kabat 5, 69, 71, 73 y/o 75, tal

35 como se describe en el presente documento.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo humanizado en el que las CDR de Kabat en la región VH se derivan todas ellas de Z270VH murino (SEQ ID NO: 2), comprendiendo además mutaciones S60A, F63L, K64Q y/o D65G. En una realización, el anticuerpo humanizado comprende todas las mutaciones S60A, F63L, K64Q y/o D65G.

El anticuerpo humanizado también puede comprender un dominio VL que comprende una secuencia de CDR-L1 correspondiente a los residuos 24-34 de SEQ ID NO: 6, una secuencia de CDR-L2 correspondiente a los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 6, y una secuencia de CDR-L3 correspondiente a los residuos 89-97 de SEQ ID NO: 6, por

45 ejemplo, además de las CDR de dominio VH descritas anteriormente. En una realización, el dominio VL del anticuerpo humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En otra realización, el dominio VL del anticuerpo humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Opcionalmente, un anticuerpo humanizado de este tipo comprende modificaciones de aminoácido de uno o más residuos de CDR de VL, por ejemplo, donde las modificaciones mantienen o mejoran esencialmente la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante de anticuerpo puede tener una, dos, tres, o desde una hasta aproximadamente siete sustituciones de aminoácido en las secuencias de CDR de VL anteriores.

La presente solicitud también contempla anticuerpos madurados por afinidad que se unen a anticuerpos anti-NKG2A, que contienen mutaciones de CDR o FR adicionales que mejoran la afinidad del anticuerpo humanizado por 55 el antígeno. Se conocen en la técnica métodos para preparar tales anticuerpos madurados por afinidad. El anticuerpo original puede ser un anticuerpo humanizado, por ejemplo, uno que comprende las secuencias de VL/VH de las SEQ ID NOS: 4 y 5 (opcionalmente con una o más de las sustituciones de CDRH2 y/o FR descritas en el presente documento), o uno que comprende las secuencias de VL/VH consenso de las SEQ ID NOS: 6 y 7, respectivamente. El anticuerpo madurado por afinidad se une preferiblemente a NKG2A con una afinidad comparable o superior a la de Z270 murino, por ejemplo una afinidad mejorada de desde al menos aproximadamente una, aproximadamente dos o aproximadamente cuatro veces hasta aproximadamente 100 veces

o aproximadamente 1000 veces, por ejemplo tal como se evalúa usando un ensayo de unión tal como se describe a continuación.

65 En otro aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos humanizados que comprenden un dominio VH que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 70%, al menos

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(por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa o fragmento de anticuerpo puede conjugarse con una o más moléculas de PEG con un peso molecular de entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 40.000, tal como entre aproximadamente 2000 y aproximadamente 20.000, por ejemplo, aproximadamente 3.000-12.000).

5 Los agentes citotóxicos u otros compuestos pueden unirse al anticuerpo directa o indirectamente, usando cualquiera de un gran número de métodos disponibles. Por ejemplo, un agente puede unirse en la región bisagra del componente de anticuerpo reducido a través de la formación de un enlace disulfuro, usando agentes de reticulación tales como 3-(2-piridilditio)proprionato de N-succinilo (SPDP), o a través de un resto de hidrato de carbono en la región Fc del anticuerpo (véase, por ejemplo, Yu et al. (1994) Int. J. Cancer 56: 244; Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., “Modification of Antibodies by Chemical Methods,” en Monocloal antibodies: principles and applications, Birch et al. (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies,” en Monoclonal antibodies: Producción, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), Cattel et al. (1989) Chemistry today 7:51-58, Delprino et al. (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704; Arpicco et al.

15 (1997) Bioconjugate Chemistry 8:3; Reisfeld et al. (1989) Antihody, Immunicon. Radiopharrn. 2:217.

Alternativamente, puede obtenerse una proteína de fusión que comprende el anticuerpo anti-NKG2A y un segundo agente polipeptídico (citotóxico u otro), por ejemplo mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos.

Ensayos de unión

La presente invención proporciona anticuerpos que se unen a NKG2A humano, en particular versiones humanizadas de un anticuerpo anti-NKG2A producido por el hibridoma de Z270 tal como se define en las reivindicaciones.

25 Puede usarse cualquiera de una amplia variedad de ensayos para evaluar la unión de un anticuerpo a NKG2A humano. Los protocolos basados en ELISA, radioinmunoanálisis, inmunotransferencia de tipo Western, BIACORE y otros ensayos de competencia, entre otros, son adecuados para su uso y se conocen bien en la técnica.

Por ejemplo, pueden usarse ensayos de unión sencillos, en los que se incuba un anticuerpo de prueba en presencia de una proteína o epítopo diana (por ejemplo, NKG2A o una parte del mismo), se eliminan por lavado los anticuerpos no unidos y se evalúa la presencia de anticuerpos unidos usando, por ejemplo, radiomarcadores, métodos físicos tales como espectrometría de masas, o marcadores fluorescentes directos o indirectos detectados usando, por ejemplo, análisis citofluorométrico (por ejemplo FACScan). Tales métodos se conocen bien por los expertos en la técnica. Cualquier cantidad de unión por encima de la cantidad observada con un anticuerpo no

35 específico control indica que el anticuerpo se une específicamente a la diana.

En tales ensayos, la capacidad del anticuerpo de prueba para unirse a la célula diana o a NKG2A humano puede compararse con la capacidad de una proteína control (negativo), por ejemplo un anticuerpo surgido contra un antígeno estructuralmente no relacionado, o una proteína o péptido distinto de Ig, para unirse a la misma diana. Se dice que los anticuerpos o fragmentos que se unen a las células diana o a NKG2A usando cualquier ensayo adecuado con una afinidad aumentada del 25%, 50%, 100%, 200%, 1000% o superior con respecto a la proteína control, se “unen específicamente a” o “interaccionan específicamente con” la diana, y se prefieren para su uso en los métodos terapéuticos descritos a continuación. También puede evaluarse la capacidad de un anticuerpo de prueba para afectar a la unión de un anticuerpo control (positivo) contra NKG2A, por ejemplo Z270, o derivados del

45 mismo.

Los anticuerpos humanizados anti-NKG2A pueden unirse o no a NKG2C humano, pueden unirse o no a NKG2E humano, o pueden unirse o no a cualquiera de NKG2C y E humanos. En una realización particular, el anticuerpo monoclonal o fragmento no se une a otros receptores NKG2 humanos, específicamente a los receptores de activación NKG2C o NKG2E. Las propiedades de unión a NKG2C y NKG2E de los anticuerpos de la invención pueden evaluarse en ensayos similares a los descritos anteriormente, intercambiando simplemente NKG2A por la molécula de interés.

En un aspecto, la divulgación proporciona versiones humanizadas de anticuerpos no humanos que comparten

55 características biológicas y/o identidad de secuencia sustancial con Z270. Una característica biológica a modo de ejemplo es la unión al epítopo para Z270, es decir, la región en el dominio extracelular de NKG2A a la que se une el anticuerpo Z270. Para examinar anticuerpos que se unen al epítopo para Z270, puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado de rutina, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988).

En un ensayo de competencia o bloqueo cruzado a modo de ejemplo, se mezclan (o se adsorben previamente) el anticuerpo Z270 (control) y un anticuerpo de prueba y se aplican a una muestra que contiene NKG2A. En determinadas realizaciones, podrían premezclarse los anticuerpos control con cantidades variables del anticuerpo de prueba (por ejemplo, 1:10 o 1:100) durante un periodo de tiempo antes de aplicar a la muestra que contiene NKG2A. 65 En otras realizaciones, las cantidades de control y variables del anticuerpo de prueba pueden mezclarse simplemente durante la exposición al antígeno/muestra diana. Siempre que puedan distinguirse los anticuerpos

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las células control LCL 721.221-Cw3 que expresan HLA-E. En cambio, las células efectoras YTS que carecen de CD94/NKG2A destruyen ambas líneas celulares eficazmente. Por tanto, las células efectoras NKL destruyen menos eficazmente las células LCL 721.221-Cw3 HLA-E+ debido a la señalización inhibidora inducida por HLA-E a través de CD94/NKG2A. Cuando se preincuban células NKL con anticuerpos bloqueantes anti-CD94/NKG2A según la

5 presente invención en un ensayo de citotoxicidad de liberación de 51Cr de este tipo, se destruyen más eficazmente las células LCL 721.221-Cw3 que expresan HLA-E, de manera dependiente de la concentración de anticuerpo.

La actividad inhibidora o potenciadora de un anticuerpo de esta invención también puede evaluarse de cualquiera de varias otras formas, por ejemplo, mediante su efecto sobre el calcio libre intracelular tal como se describe, por ejemplo, en Sivori et al., J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136, cuya divulgación se incorpora al presente documento como referencia. También puede evaluarse la actividad de células NK, T o NKT usando ensayos de citotoxicidad basados en células, por ejemplo, midiendo la liberación de cromio u otro parámetro para evaluar la capacidad del anticuerpo para estimular las células NK para destruir células diana tales como células P815, K562, o células tumorales apropiadas tal como se da a conocer en Sivori et al., J. Exp. Med. 1997;186:1129-1136; Vitale et al., J.

15 Exp. Med. 1998; 187:2065-2072; Pessino et al. J. Exp. Med. 1998;188:953-960; Neri et al. Clin. Diag. Lab. Immun. 2001;8:1131-1135; Pende et al. J. Exp. Med. 1999;190:1505-1516, incorporándose las divulgaciones completas de cada uno en el presente documento como referencia.

En una realización, una preparación de anticuerpos produce un aumento de al menos el 10% en la citotoxicidad de un linfocito restringido por CD94/NKG2A, preferiblemente un aumento de al menos el 40% o el 50% en la citotoxicidad de NK, o más preferiblemente un amento de al menos el 70% en la citotoxicidad de NK.

La actividad de un linfocito citotóxico también puede abordarse usando un ensayo de liberación de citocina, en el que se incuban células NK con el anticuerpo para estimular la producción de citocinas de las células NK (por

25 ejemplo producción de IFN-y y TNF-α). En un protocolo a modo de ejemplo, se evalúa la producción de IFN-y a partir de PBMC mediante tinción intracitoplasmática y de la superficie celular y análisis mediante citometría de flujo tras 4 días en cultivo. Brevemente, se añade Brefeldin A (Sigma Aldrich) a una concentración final de 5 µg/ml durante las últimas 4 horas de cultivo. Entonces se incuban las células con AcM anti-CD3 y anti-CD56 antes de la permeabilización (IntraPrep™; Beckman Coulter) y la tinción con PE-IgG1 o PE-anti-IFN-y (Pharmingen). Se mide la producción de GM-CSF e IFN-y a partir de células NK activadas policlonales en sobrenadantes usando ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN, IFN-: OptEIA set, Pharmingen).

En un aspecto particular, la divulgación proporciona anticuerpos que son más capaces de, o más eficaces en, aumentar la citotoxicidad de linfocitos restringidos por CD94/NKG2A, potenciar la actividad citotóxica de un linfocito

35 restringido por CD94/NKG2A, o reducir o inhibir la señalización mediada por CD94/NKG2A, que el anticuerpo no humanizado original y/o una versión quimérica del mismo. Tales anticuerpos pueden ser por ejemplo, al menos el 2%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15% o al menos el 20% más capaces o eficaces que un anticuerpo no humanizado original o una versión quimérica del mismo.

Métodos recombinantes

La divulgación también proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican para los anticuerpos anti-NKG2A descritos en el presente documento, así como vectores y células huésped que comprenden tales ácidos nucleicos. También se proporcionan métodos de producción de tales anticuerpos anti-NKG2A usando técnicas recombinantes

45 tales como, por ejemplo, cultivar células huésped adecuadas que comprenden tales ácidos nucleicos o vectores de modo que se expresa el ácido nucleico y el anticuerpo humanizado producido. Antes del cultivo, la célula huésped puede cotransfectarse, por ejemplo, con un vector que comprende ácidos nucleicos que codifican para un dominio pesado variable y con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para un dominio ligero variable. Adicionalmente, el anticuerpo puede recuperarse y/o purificarse del cultivo de células huésped usando técnicas conocidas. A continuación y en los ejemplos se describen adicionalmente vectores, células huésped y técnicas útiles. Adicionalmente, en las figuras 4-6 se explican resumidamente estrategias para expresar anticuerpos humanizados anti-NKG2A.

Generalmente, para la producción recombinante del anticuerpo, se aísla un ácido nucleico que codifica para él y se

55 inserta en un vector que puede replicarse para su clonación adicional (amplificación del ADN) o para su expresión, de manera habitual operativamente unido a uno o más elementos de control de la expresión. El ADN que codifica para el anticuerpo monoclonal se aísla y se secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que pueden unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Se conocen y están disponibles muchos vectores. Los componentes de vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

Componente de secuencia señal

65 El anticuerpo anti-NKG2A puede producirse de manera recombinante no sólo directamente, sino también como un

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Componente de terminación de la transcripción

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (por ejemplo, células de levaduras, hongos,

5 insectos, plantas, animales, seres humanos o nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Tales secuencias están disponibles comúnmente del extremo 5’, ocasionalmente del extremo 3’, de regiones no traducidas de ADN o ADNC eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos trascritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica para el anticuerpo anti-NKG2A. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO 1994/11026 y el vector de expresión dado a conocer en el mismo.

Selección y transformación de células huésped

15 Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en el presente documento son las células de procariotas, levaduras o eucariotas superiores descritas anteriormente. Los procariotas adecuados para este fin incluyen eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans,y Shigella, así como bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo B. licheniformis 41 P dado a conocer en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa,y Streptomyces. Un huésped de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitativos.

25 Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican para anticuerpos anti-NKG2A. Saccharomyces cerevisiae, una levadura de panadería común, es el más comúnmente usado entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, varios de otros géneros, especies y cepas están disponibles comúnmente y son útiles en el presente documento, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178),

K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; Yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (documento EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (documento EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como,

35 por ejemplo, huéspedes de Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo anti-NKG2A glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y células huésped de insecto permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Una variedad de cepas virales para transfección están públicamente disponibles, por ejemplo la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus pueden usarse como el virus en el presente documento según la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

45 También pueden utilizarse como huéspedes cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.

Sin embargo, el mayor interés ha sido en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea (HEK) de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de hámster recién nacido (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980), incluyendo las líneas

55 celulares DG44 (Urlaub et al., Som. Cell y Mol. Gen., 12: 555-566 (1986)) y DP12); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de anticuerpos anti-NKG2A y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea

65 apropiado para incluir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas.

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formulación farmacéutica es una disolución acuosa. El término “formulación acuosa” se define como una formulación que comprende al menos el 50% p/p de agua. Asimismo, el término “disolución acuosa” se define como una disolución que comprende al menos el 50% p/p de agua, y el término “suspensión acuosa” se define como una suspensión que comprende al menos el 50% p/p de agua.

5 En otra realización, la formulación farmacéutica es una formulación secada por congelación, a la que el médico o el paciente añade disolventes y/o diluyentes antes de su uso.

En otra realización, la formulación farmacéutica es una formulación seca (por ejemplo secada por congelación o secada por pulverización) lista para su uso sin disolución previa.

En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica comprende una disolución acuosa de un anticuerpo de este tipo, y un tampón, en el que el anticuerpo está presente en una concentración de desde 1 mg/ml o superior, y en el que dicha formulación tiene un pH de desde aproximadamente 2,0 hasta aproximadamente 10,0.

15 En otra realización, el pH de la formulación está en el intervalo seleccionado de la lista que consiste en desde aproximadamente 2,0 hasta aproximadamente 10,0, de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 9,0, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,5, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0 y de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5.

En una realización adicional, el tampón se selecciona del grupo que consiste en acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, hidrogenofosfato de sodio, hidrogenofosfato de disodio, fosfato de sodio y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico o mezclas de los mismos. Cada uno de estos tampones específicos

25 constituye una realización alternativa de la invención.

En una realización adicional, la formulación comprende además un conservante farmacéuticamente aceptable. El conservante puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol bencílico, clorobutanol y tiomerosal, bronopol, ácido benzoico, imidurea, clorohexidina, deshidroacetato de sodio, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloruro de bencetonio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) o mezclas de los mismos. El conservante puede estar presente, por ejemplo, en una concentración de desde 0,1 mg/ml hasta 20 mg/ml, desde 0,1 mg/ml hasta 5 mg/ml, desde 5 mg/ml hasta 10 mg/ml, o desde 10 mg/ml hasta 20 mg/ml. Cada uno de estos conservantes específicos constituye una realización alternativa de la invención. El experto

35 conoce bien el uso de un conservante en composiciones farmacéuticas. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995.

En una realización adicional, la formulación comprende además un agente isotónico. El agente isotónico puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en una sal (por ejemplo cloruro de sodio), un azúcar o alcohol de azúcar, un aminoácido (por ejemplo L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina), un alditol (por ejemplo glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol), polietilenglicol (por ejemplo PEG400), o mezclas de los mismos. Puede usarse cualquier azúcar tal como mono-, di-,

o polisacáridos, o glucanos solubles en agua, incluyendo por ejemplo fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, almidón soluble, hidroxietil-almidón

45 y carboximetilcelulosa-Na. En una realización, el aditivo de azúcar es sacarosa. El alcohol de azúcar se define como un hidrato de carbono C4-C8 que tiene al menos un grupo -OH e incluye, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una realización, el aditivo de alcohol de azúcar es manitol. Los azúcares o alcoholes de azúcar mencionados anteriormente pueden usarse individualmente o en combinación. No hay límite fijo a la cantidad usada, siempre que el azúcar o alcohol de azúcar sea soluble en la preparación líquida y no afecte adversamente a los efectos estabilizantes logrados usando los métodos de la invención. La concentración de azúcar

o alcohol de azúcar puede ser, por ejemplo, de entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 150 mg/ml. El agente isotónico puede estar presente en una concentración de desde, por ejemplo, 1 mg/ml hasta 50 mg/ml, desde 1 mg/ml hasta 7 mg/ml, desde 8 mg/ml hasta 24 mg/ml, o desde 25 mg/ml hasta 50 mg/ml. Cada uno de estos agente isotónicos específicos constituye una realización alternativa de la invención. El experto conoce bien el uso de

55 un agente isotónico en composiciones farmacéuticas. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995.

En una realización adicional, la formulación también comprende un agente quelante. El agente quelante puede seleccionarse, por ejemplo, de sales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico y ácido aspártico, y mezclas de los mismos. El agente quelante puede estar presente, por ejemplo, en una concentración de desde 0,1 mg/ml hasta 5 mg/ml, desde 0,1 mg/ml hasta 2 mg/ml, o desde 2 mg/ml hasta 5 mg/ml. Cada uno de estos agentes quelantes específicos constituye una realización alternativa de la invención. El experto conoce bien el uso de un agente quelante en composiciones farmacéuticas. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, 1995.

65 En una realización adicional, la formulación comprende además un estabilizador. El experto conoce bien el uso de

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suspensiones, emulsiones, microemulsiones, emulsión múltiple, espumas, ungüentos, pastas, tiritas, pomadas, comprimidos, comprimidos recubiertos, enjuagues, cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina dura y cápsulas de gelatina blanda, supositorios, cápsulas rectales, gotas, geles, pulverizadores, polvo, aerosoles, inhalantes, colirios, pomadas oftálmicas, enjuagues oftálmicos, óvulos vaginales, anillos vaginales, pomadas vaginales, disolución para

5 inyección, disoluciones de transformación in situ, por ejemplo gelificación in situ, sedimentación in situ, precipitación in situ, cristalización in situ, disolución para infusión e implantes.

Las composiciones pueden elaborarse adicionalmente en, o unirse a, por ejemplo a través de interacciones hidrófobas, electroestáticas y covalentes, un portador de fármacos, un sistema de administración de fármacos y un 10 sistema de administración de fármacos avanzado con el fin de potenciar adicionalmente la estabilidad del anticuerpo, aumentar la biodisponibilidad, aumentar la solubilidad, disminuir los efectos adversos, lograr cronoterapia bien conocida por los expertos en la técnica, y aumentar el cumplimiento del paciente o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos de portadores, sistemas de administración de fármacos y sistemas de administración de fármacos avanzados incluyen, pero no se limitan a, polímeros, por ejemplo celulosa y derivados, polisacáridos, por 15 ejemplo dextrano y derivados, almidón y derivados, poli(alcohol vinílico), polímeros de acrilato y metacrilato, ácido poliláctico y poliglicólico y copolímeros de bloque de los mismos, polietilenglicoles, proteínas portadoras, por ejemplo, albúmina, geles, por ejemplo, sistemas de termogelificación, por ejemplo, sistemas copoliméricos de bloque bien conocidos por los expertos en la técnica, micelas, liposomas, microesferas, nanopartículas, cristales líquidos y dispersiones de los mismos, fase L2 y dispersiones de la misma, bien conocidos por los expertos en la técnica de

20 comportamiento de fases en sistemas de lípido-agua, micelas poliméricas, emulsiones múltiples, autoemulsiones, automicroemulsiones, ciclodextrinas y derivados de las mismas, y dendrímeros.

Las composiciones son útiles en la formulación de sólidos, semisólidos, polvo y disoluciones para la administración pulmonar de un anticuerpo, usando, por ejemplo un inhalador de dosis dosificada, inhalador de polvo seco y un

25 nebulizador, siendo todos ellos dispositivos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Las composiciones también son útiles en la formulación de sistemas de administración de fármacos de liberación controlada, sostenida, prolongada, retardada y lenta. Más específicamente, pero sin limitarse a ello, las composiciones son útiles en la formulación de sistemas de liberación controlada y sistemas de liberación sostenida

30 parenterales (conduciendo ambos sistemas a una reducción de muchas veces en el número de administraciones), bien conocidos por los expertos en la técnica. Incluso más preferiblemente, son sistemas de liberación controlada y sistemas de liberación sostenida administrados por vía subcutánea. Sin limitar el alcance de la invención, los ejemplos de composiciones y sistemas de liberación controlada útiles son hidrogeles, geles oleaginosos, cristales líquidos, micelas poliméricas, microesferas, nanopartículas.

35 Los métodos para producir sistemas de liberación controlada útiles para las composiciones incluyen, pero no se limitan a, cristalización, condensación, cocristalización, precipitación, coprecipitación, emulsificación, dispersión, homogenización a alta presión, encapsulación, secado por pulverización, microencapsulación, coacervación, separación de fases, evaporación de disolvente para producir microesferas, extrusión y procesos de fluido

40 supercrítico. Se hace referencia general a Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, Nueva York, 2000) y Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, Nueva York, 2000).

La administración parenteral puede realizarse mediante inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o

45 intravenosa por medio de una jeringuilla, opcionalmente una jeringuilla de tipo pluma. Alternativamente, la administración parenteral puede realizarse por medio de una bomba de infusión. Otra opción es una composición que puede ser una disolución o suspensión para la administración del compuesto de anticuerpo en forma de una pulverización nasal o pulmonar. Todavía como otra opción, las composiciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo de la invención también pueden adaptarse a la administración transdérmica, por ejemplo, mediante

50 inyección sin agujas o a partir de un parche, opcionalmente un parche iontoforético, o administración transmucosa, por ejemplo bucal.

El anticuerpo puede administrarse a través de la vía pulmonar en un vehículo, como una disolución, suspensión o polvo seco usando cualquiera de los tipos conocidos de dispositivos adecuados para la administración de fármacos

55 pulmonar. Ejemplos de éstos comprenden, pero no se limitan a, los tres tipos generales de generadores de aerosol para administración de fármacos pulmonar, y pueden incluir nebulizadores de chorro o ultrasónicos, inhaladores de dosis dosificada o inhaladores de polvo seco (Cf. Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453).

60 Basándose en metodología de pruebas normalizada, el diámetro aerodinámico (da) de una partícula se define como el diámetro equivalente geométrico de una partícula esférica patrón de referencia de densidad unitaria (1 g/cm3). En el caso más sencillo, para partículas esféricas, da se refiere a un diámetro de referencia (d) como función de la raíz cuadrada de la razón de densidad tal como se describe por:

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Se producen modificaciones a esta relación para partículas no esféricas (cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 3795 385). Los términos “MMAD” y “MMEAD” están descritos y se conocen bien en la técnica y representan una medida del valor medio de una distribución de tamaño de partícula aerodinámico (véase Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). La mediana del diámetro aerodinámico de masa (MMAD) y la mediana del diámetro aerodinámico eficaz de masa (MMEAD) que se usan de manera intercambiable, son parámetros estadísticos y describen empíricamente

10 el tamaño de las partículas de aerosol en relación con su potencial para depositar en los pulmones, independientemente de la forma, el tamaño o la densidad reales (véase Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379385). MMAD se calcula normalmente a partir de la medición realizada con impactores, un instrumento que mide el comportamiento inercial de la partícula en el aire.

15 En una realización adicional, la formulación podría transformarse en aerosol mediante cualquier tecnología de transformación en aerosol conocida, tal como nebulización, para lograr una MMAD de partículas de aerosol inferior a 10 µm, más preferiblemente de entre 1-5 µm, y lo más preferiblemente de entre 1-3 µm. El tamaño de partícula preferido se basa en el tamaño más eficaz para administrar el fármaco a la parte profunda del pulmón, donde la

20 proteína se absorbe de manera óptima (cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385).

La deposición en la parte profunda del pulmón de las formulaciones pulmonares que comprenden el anticuerpo puede optimizarse adicionalmente de manera opcional usando modificaciones de las técnicas de inhalación, por

25 ejemplo, pero sin limitarse a: flujo de inhalación lenta (por ejemplo, 30 l/min), apnea inspiratoria y tiempos de actuación.

El término “formulación estabilizada” se refiere a una formulación con estabilidad física aumentada, estabilidad química aumentada o estabilidad física y química aumentada.

30 El término “estabilidad física” de la formulación de proteína tal como se usa en el presente documento se refiere a la tendencia de la proteína para formar agregados biológicamente inactivos y/o insolubles de la proteína como resultado de la exposición de la proteína a tensiones termo-mecánicas y/o interacción con superficies de contacto y superficies que son desestabilizantes, tales como superficies y superficies de contacto hidrófobas. La estabilidad

35 física de las formulaciones de proteína acuosas se evalúa por medio de inspección visual y/o mediciones de turbidez tras exponer la formulación llena en recipientes adecuados (por ejemplo, cartuchos o viales) a tensión mecánica/física (por ejemplo, agitación) a diferentes temperaturas durante diversos periodos de tiempo. La inspección visual de las formulaciones se realiza en una luz de enfoque nítido con un fondo oscuro. La turbidez de la formulación se caracteriza mediante una puntuación visual que clasifica el grado de turbidez por ejemplo en una

40 escala de desde 0 hasta 3 (una formulación que no muestra turbidez corresponde a una puntuación visual de 0, y una formulación que muestra turbidez visual a la luz del día corresponde a una puntuación visual de 3). Una formulación se clasifica en inestable física con respecto a una agregación de proteínas, cuando muestra turbidez visual a la luz del día. Alternativamente, la turbidez de la formulación puede evaluarse mediante mediciones de turbidez sencillas bien conocidas por el experto. La estabilidad física de las formulaciones de proteína acuosas

45 también puede evaluarse usando una sonda o agente espectroscópico del estado conformacional de la proteína. La sonda es preferiblemente una molécula pequeña que se une preferentemente a un confórmero no nativo de la proteína. Un ejemplo de una sonda espectroscópica molecular pequeña de la estructura de la proteína es tioflavina

T. La tioflavina T es un colorante fluorescente que se ha usado ampliamente para la detección de fibrillas amiloides. En presencia de fibrillas, y quizá también de otras configuraciones de proteína, la tioflavina T da lugar a un nuevo

50 máximo de excitación a aproximadamente 450 nm y emisión potenciada a aproximadamente 482 nm cuando se une a una forma de proteína de fibrilla. La tioflavina T no unida es esencialmente no fluorescente a las longitudes de onda.

Pueden usarse otras moléculas pequeñas como sondas de los cambios en la estructura de la proteína desde

55 estados nativos hasta no nativos. Por ejemplo las sondas de “parche hidrófobo” que se unen preferentemente a parches hidrófobos expuestos de una proteína. Los parches hidrófobos generalmente se ocultan dentro de la estructura terciaria de una proteína en su estado nativo, pero se exponen cuando una proteína comienza a desplegarse o desnaturalizarse. Los ejemplos de estas sondas espectroscópicas moleculares pequeñas son colorantes hidrófobos aromáticos tales como antraceno, acridina, fenantrolina o similares. Otras sondas

60 espectroscópicas son complejos de metal-aminoácido, tales como complejos metálicos de cobalto de aminoácidos hidrófobos, tales como fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina y valina, o similares.

El término “estabilidad química” de la formulación de proteína tal como se usa en el presente documento se refiere a

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cambios covalentes químicos en la estructura de la proteína que conducen a la formación de productos de degradación química con una posible menor potencia biológica y/o posibles propiedades inmunogénicas aumentadas en comparación con la estructura de la proteína nativa. Pueden formarse diversos productos de degradación química dependiendo del tipo y la naturaleza de la proteína nativa y del entorno al que está expuesta la 5 proteína. Lo más probable es que no pueda evitarse completamente la eliminación de la degradación química y a menudo pueden observarse cantidades crecientes de productos de degradación química durante el almacenamiento y el uso de la formulación de proteína, tal como conoce bien el experto en la técnica. La mayor parte de las proteínas son propensas a desamidación, un proceso en el que el grupo amida de cadena lateral en residuos de glutaminilo o asparaginilo se hidroliza para formar un ácido carboxílico libre. Otras rutas de degradación implican la formación de productos de transformación de alto peso molecular donde dos o más moléculas de proteína se unen covalentemente entre sí a través de interacciones de transamidación y/o disulfuro que conducen a la formación de productos de degradación de dímero, oligómero y polímero unidos covalentemente (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, Nueva York, 1992). Puede mencionarse la oxidación (por ejemplo de residuos de metionina) como otra variante de degradación química. La estabilidad química de la

15 formulación de proteína puede evaluarse midiendo la cantidad de los productos de degradación química en diversos puntos de tiempo tras la exposición a diferentes condiciones del entorno (la formación de productos de degradación a menudo puede acelerarse por ejemplo, aumentando la temperatura). La cantidad de cada producto de degradación individual a menudo se determina mediante la separación de los productos de degradación dependiendo del tamaño de la molécula y/o la carga usando diversas técnicas de cromatografía (por ejemplo, SEC-HPLC y/o RP-HPLC).

Por tanto, tal como se explicó resumidamente antes, una “formulación estabilizada” se refiere a una formulación con estabilidad física aumentada, estabilidad química aumentada o estabilidad física y química aumentada. En general, una formulación debe ser estable durante el uso y el almacenamiento (de conformidad con las condiciones de uso y

25 almacenamiento recomendadas) hasta que se alcanza la fecha de caducidad.

En una realización, la formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo es estable durante más de 6 semanas de uso y durante más de 3 años de almacenamiento.

En otra realización, la formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo es estable durante más de 4 semanas de uso y durante más de 3 años de almacenamiento.

En una realización adicional, la formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo es estable durante más de 4 semanas de uso y durante más de dos años de almacenamiento.

35 En una realización incluso adicional, la formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo es estable durante más de 2 semanas de uso y durante más de dos años de almacenamiento.

Las formulaciones de anticuerpo adecuadas también pueden determinarse examinando experiencias con otros anticuerpos monoclonales terapéuticos ya desarrollados. Se ha mostrado que varios anticuerpos monoclonales, tales como Rituxan (rituximab), Herceptin (trastuzumab) Xolair (omalizumab), Bexxar (tositumomab), Campath (alemtuzumab), Zevalin, Oncolym, son eficaces en situaciones clínicas y formulaciones similares pueden usarse con los anticuerpos de esta invención. Por ejemplo, puede suministrarse un anticuerpo monoclonal a una concentración de 10 mg/ml en viales de uso único de o bien 100 mg (10 ml) o bien 500 mg (50 ml), formulado para administración

45 i.v. en cloruro de sodio 9,0 mg/ml, citrato de sodio dihidratado 7,35 mg/ml, polisorbato 80 0,7 mg/ml y agua estéril para inyección. El pH se ajusta a 6,5. En otra realización, el anticuerpo se suministra en una formulación que comprende citrato de Na aproximadamente 20 mM, NaCl aproximadamente 150 mM, a un pH de aproximadamente 6,0.

Aplicaciones terapéuticas

También se proporcionan métodos de tratamiento de un paciente usando un anticuerpo anti-NKG2A tal como se describe en el presente documento. En una realización, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo tal como se describe en el presente documento en la preparación de una composición farmacéutica para su administración a

55 un paciente humano. Normalmente, el paciente padece, o está en riesgo de padecer, cáncer, una enfermedad viral, un trastorno inflamatorio, o un trastorno autoinmunitario. Alternativamente, el anticuerpo de la invención se usa para mejorar el trasplante de médula ósea en un paciente.

Por ejemplo, en un aspecto, la divulgación proporciona un método de potenciación de la actividad de linfocitos restringidos por CD94/NKG2A en un paciente que lo necesita, que comprende la etapa de administrar un anticuerpo humano o humanizado anti-NKG2A a dicho paciente, anticuerpo que reduce o impide la activación mediada por HLA-E del receptor CD94/NKG2A. En una realización, el método se refiere a aumentar la actividad de tales linfocitos en pacientes que tienen una enfermedad en la que la actividad aumentada de células NK, T y/o NKT es beneficiosa, que implica, afecta o está producida por células propensas a lisis por células NK, T o NKT, o que está producida o

65 caracterizada por actividad insuficiente de células NK, T o NKT, tal como un cáncer, una enfermedad infecciosa o un trastorno inmunitario.

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aproximarán a las ya empleadas en terapias clínicas en las que los agentes anticancerígenos se administran solos o en combinación con otros agentes. La variación en la dosificación se producirá probablemente dependiendo del estado que está tratándose. El médico que administra el tratamiento podrá determinar la dosis apropiada para el sujeto individual.

5 Artículos de fabricación

En otra realización, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. Por ejemplo, el artículo de fabricación puede comprender un recipiente que contiene un anticuerpo tal como se describe en el presente documento junto con instrucciones que indican a un usuario cómo tratar un trastorno tal como un cáncer o una enfermedad viral en un mamífero con el anticuerpo en una cantidad eficaz. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano. El artículo de fabricación normalmente comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas, etc. Los recipientes pueden formarse de una variedad

15 de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar el estado y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o un vial para disolución intravenosa que tiene un tapón que puede perforarse mediante una aguja para inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es el anticuerpo humanizado anti-NKG2A en el presente documento, o un derivado de anticuerpo (por ejemplo, un inmunoconjugado) que comprende un anticuerpo humanizado de este tipo. La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar el estado de elección, tal como cáncer o una enfermedad viral.

Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende el anticuerpo descrito en el presente documento, y (b) un segundo 25 recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente terapéutico distinto del primer anticuerpo. El artículo de fabricación en esta realización de la invención puede comprender además un prospecto que indica que las composiciones primera y segunda pueden usarse en combinación para tratar un cáncer o enfermedad viral. Un agente terapéutico de este tipo puede ser cualquiera de las terapias coadyuvantes descritas en la sección anterior (por ejemplo, un agente quimioterápico, un agente antiangiogénico, un compuesto antihormonal, un cardioprotector y/o un regulador de la función inmunitaria en un mamífero, incluyendo una citocina). Alternativa o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y disolución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones,

35 diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Administración

Tal como se describió anteriormente, se ha mostrado que varios anticuerpos monoclonales son eficaces en situaciones clínicas (tales como, por ejemplo, Rituxan (rituximab) y otros), y pueden usarse regímenes de administración similares (es decir, protocolos de administración y/o dosis) con los anticuerpos de esta invención. Los programas y las dosificaciones para administración pueden determinarse según métodos conocidos para estos productos, por ejemplo usando las instrucciones de los fabricantes. Por ejemplo, una preparación de anticuerpos puede suministrarse a una concentración de 10 mg/ml en viales de uso único de o bien 100 mg (10 ml) o bien 500

45 mg (50 ml). Un intervalo de dosificación adecuado a modo de ejemplo para un anticuerpo de la invención puede ser de entre aproximadamente 10 mg/m2 y 500 mg/m2. Las cantidades y el programa de inyección de anticuerpos anti-NKG2A que, por ejemplo, saturan células durante 24 horas, 48 horas, 72 horas o una semana o un mes pueden determinarse considerando la afinidad del anticuerpo y sus parámetros farmacocinéticos. Sin embargo, se apreciará que estos programas son a modo de ejemplo y que el programa y régimen óptimos y la tolerancia de los anticuerpos deben determinarse en ensayos clínicos.

Aplicaciones no terapéuticas

Los anticuerpos (por ejemplo, los anticuerpos humanizados anti-NKG2A) de la divulgación también tienen 55 aplicaciones no terapéuticas.

Por ejemplo, los anticuerpos pueden usarse como agentes de purificación por afinidad. En este procedimiento, los anticuerpos se inmovilizan a una fase sólida tal como una resina de SEPHADEX™ o papel de filtro, usando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteína NKG2A (o fragmento de la misma) que va a purificarse, y a continuación se lava el soporte con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra excepto la proteína NKG2A, que está unida al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, se lava el soporte con otro disolvente adecuado, tal como tampón glicina, pH 5,0, que liberará la proteína NKG2A del anticuerpo.

65 Los anticuerpos anti-NKG2A también pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico para determinar la proteína NKG2A, por ejemplo, detectando su expresión en células, tejidos o sueros específicos.

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ejemplo, 125I, 131I, 67Cu, 99mTc, o 111In. El anticuerpo marcado se administra a un huésped, preferiblemente a través del torrente circulatorio, y se somete a ensayo la presencia y ubicación del anticuerpo marcado en el huésped. Esta técnica de obtención de imágenes se usa de manera adecuada en la detección, estadificación y tratamiento de neoplasias. El radioisótopo se conjuga con la proteína mediante cualquier medio, incluyendo compuestos quelantes

5 metálicos o lactoperoxidasa, o técnicas con Iodogen para yodación.

Por razones de conveniencia, los anticuerpos de la presente invención pueden proporcionarse en un kit, es decir, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Cuando el anticuerpo se marca con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la 10 enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar las concentraciones en disolución de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En particular, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo

15 excipientes que en disolución proporcionarán una disolución de reactivo que tiene la concentración apropiada.

Depósitos

El hibridoma de Z270 se depositó el 22 de diciembre de 2005 en la Collection Nationale de Culture de 20 Microorganismes, Institute Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75725 París, Francia, con el número de registro I3549.

Ejemplos

25 Se ilustran detalles adicionales de la invención mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1 -Selección de secuencias de humZ270VL y humZ270VH originales

Este ejemplo describe la selección de secuencias de humZ270VL y humZ270VH originales así como 30 retromutaciones opcionales para secuencias de h270VL y humZ270VH variantes.

Tal como se describe en el ejemplo 2, se clonó el hibridoma de Z270, y se determinó que las secuencias de cadena VH y VL de Z270 del anticuerpo correspondiente eran:

35 Z270VL:

DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSILAWYQQKQGKSPQFLVYNAKTLAEGVPSRF SGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 1), con un residuo de arginina (R) opcional en la posición de Kabat 108.

40 Z270VH:

QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPEQGLQWIGRIDPYDSETH YSQKFKDKAILTVDKSSSTAYMRLSSLTSEDSAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGAGTT VTVS (SEQ ID NO: 2), 45 con un residuo de serina (S) C-terminal opcional.

También se identificó una segunda cadena ligera, Z270VL-NB. Sin embargo, ésta era una cadena ligera de mieloma común.

50 Z270VL-NB:

NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRY TGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKRA (SEQ ID NO: 3), con un residuo de arginina (R) opcional en la posición de Kabat 108, y un residuo de alanina (A) opcional en la posición de Kabat 109.

55 A partir de un análisis de las secuencias de Z270 murino, se determinaron las CDR según las definiciones de Kabat como:

CDR-L1: RASENIYSILA (residuos 24-34 de SEQ ID NO: 1) 60 CDR-L2: NAKTLAE (residuos 50-56 de SEQ ID NO: 1)

CDR-L3: QHHYGTPRT (residuos 89-97 de SEQ ID NO: 1)

65 CDR-H1: SYWMN (residuos 31-35 de SEQ ID NO: 2)

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anticuerpo contiene región variable murina y región constante de IgG4 humana con una mutación S241 P en la cadena pesada.

Para la expresión del anticuerpo Z270 quimérico (chimZ270), se inserta la secuencia de Z270VL y la región 5 constante de cadena ligera humana (kappa) en los sitios EcoR I y BamH I de pJSV002 (figura 3F). Se usa la secuencia mostrada en la figura 4G, en la que las letras mayúsculas indican sitios de restricción (SEQ ID NO: 20).

Se inserta la región constante de cadena pesada humana y VH de Z270 en los sitios EcoR I y Nhe I de pJSV002IgG4-S241P (figuras 3G y 3H). Se usa la secuencia mostrada en la figura 4H, estando la secuencia insertada real entre los sitios Eco RI y Nhe I (gctagc), en la que las letras mayúsculas indican sitios de restricción (SEQ ID NO: 21).

Ejemplo 5 -Expresión de Z270 humanizado

Según la estrategia de humanización de Z270 descrita en el ejemplo 1, se injertan las CDR de cadena ligera de

15 Z270 en el molde VKI_02/JK4 para preparar humZ270VL1. La secuencia mostrada en la figura 4I resulta de la síntesis de la secuencia entre los sitios EcoRI y Kasl y su inserción en pJSV002-hKappaC (con región constante Kappa humana en pJSV002), con las secuencias codificantes de CDR en letras mayúsculas y los sitios de restricción en negrita (SEQ ID NO: 22).

Para la humanización de la cadena pesada, se injertan las CDR de cadena pesada de Z270 (opcionalmente se injerta CDR-H2 optimizada en el molde VH1_18/JK6 para preparar humZ270VH1. Se sintetiza la secuencia entre los sitios EcoRI y Nhel y se clona en pJSV002-hIgG4 S241 P (región constante de IgG4 S241 P humana en pJSV002, figura 3G), con las secuencias codificantes de CDR en letras mayúsculas y los sitios de restricción en negrita (figura 4J, SEQ ID NO: 23).

25 Se clonan asimismo constructos mutados en pJSV002 con la región constante de IgG4 S241 P y la región constante de cadena Kappa humana correspondientes, con las siguientes combinaciones de retromutaciones de región de entramado en cada uno de humZ270VL y humZ270VH:

humZ270VL: tn (es decir, sin retromutación), L46F, 148V, L46F_I48V

humZ270VH: tn (es decir, sin retromutación), V5Q, M69L, T71V, T73K, T75S, V5Q_M69L, V5Q_T71V, V5Q_T73K, V5Q_T75S, M69L_T71V, M69L_T73K, M69L_T75S, T71V_T73K, T71V_T75S, T73K_T75S, V5Q_M69L_T71V_T73K_T75S, M69L_T71V_T73K_T75S, V5Q_T71V_T73K_T75S, V5Q_M69L_T73K_T75S,

35 V5Q_M69L_T71V_T75S, V5Q_M69L_T71V_T73K, T71V_T73K_T75S, M69L_T73K_T75S, M69L_T71V_T75S, M69L_T71V_T73K, V5Q_T73K_T75S, V5Q_T71V_T75S, V5Q_T71V_T73K, V5Q_M69L_T75S, V5Q_M69L_T73K, V5Q_M69L_T71V. Se ilustra un diseño de vector a modo de ejemplo para la cadena pesada (HC) en la figura 5, y se proporciona un diseño de vector a modo de ejemplo para la cadena ligera (LC) en la figura 6.

Se transfectan los plásmidos en HEK293 6E para expresión transitoria, usando 293fectin. Materiales: Células: Se hacen crecer células HEK 293 6E (293-6E) en fase de crecimiento exponencial (de 0,8 a 1,2x106 células/ml). Medio de cultivo: FreeStyleTM (n.º de cat. 12338-018 de Gibco); geneticina 418 25 µg/ml (n.º de cat. 10131-019 de Gibco); pluronic F-68 al 0,1% (n.º de cat. 24040-032 de Gibco). Medio de transfección: Opti-MEM (n.º de cat. 51985-026 de Gibco); 293fectin (n.º de cat. 12347019 de Invitrogen). ADN de plásmido: ADN de plásmido purificado de interés

45 (véase anteriormente).

Recuento celular e inoculación. Dos días antes de la transfección, se transfiere el volumen necesario para conseguir 7,5x106 células a un frasco de 125 ml, y se añade medio FreeStyle nuevo para completar hasta 30 ml (la densidad celular final debe ser de 0,25x106 células/ml). Dos días después (el día de la transfección), la densidad celular debe ser de entre 1 y 1,2x106 células/ml. Alternativamente, un día antes de la transfección, se transfiere el volumen necesario para conseguir 1,5x107 células a un frasco de 125 ml, y se añade medio FreeStyle nuevo para completar hasta 30 ml (la densidad celular final debe ser de 0,50x106 células/ml). 24 h más tarde (el día de la transfección), la densidad celular debe ser de entre 0,9 y 1,2x106 células/ml.

55 Preparación de complejos de 293fectin-ADN. Para preparar una disolución de ADN, se diluyen 30 µg de ADN en un volumen total de 1 ml de Opti-MEM. Para preparar la disolución de 293fectin, se diluyen 40 µl en 960 µl de Opti-MEM. Tras 5 min de incubación a temperatura ambiente, se mezclan la disolución de 293fectin y la disolución de ADN, y entonces se incuban durante 25 minutos a temperatura ambiente. Entonces se transfectan las células con 2 ml de mezcla de 293fectin-ADN, y se incuban a 37ºC en un incubador humidificado (agitador orbital) que contiene un 5% de CO2 durante de 4 a 6 días. La figura 7 explica resumidamente un procedimiento general para la expresión transitoria en células HEK293, tales como, por ejemplo, células HEK693 6E.

Ejemplo 6 -Purificación de IgG1 a partir de cultivo de hibridoma de Z270

65 Se purifica anticuerpo Z270 IgG1 a partir de fluido de cultivo celular de hibridoma de Z270 añadiendo la muestra sobre una columna HiTrap Protein A HP (1 ml) equilibrada en NaCl 3 M Tris 50 mM pH 8,5, a una velocidad de flujo:

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humZ270VH7 (SEQ ID NO: 28) se basa en VH1_f y humZ270VH8 (SEQ ID NO: 29) se basa en VH1_46, todos con un segmento J JH6. Los 6 residuos de aminoácido C-terminales de la CDR-H2 de Kabat de todos los constructos humanizados eran idénticos a la región de entramado aceptora humana.

5 Usando el programa de alineación VectorNTI, se obtuvieron las siguientes identidades de secuencia entre humZ270VH1 y humZ270VH5, -6, -7 y -8: 78,2% (VH1 frente a VH5), 79,0% (VH1 frente a VH6), 88,7% (VH1 frente a VH7) y 96,0% (VH1 frente a VH8).

Ejemplo 11 -Análisis de Biacore de diferentes variantes de humZ270

Se analizaron las afinidades de variantes de huZ270, comprendiendo todas una secuencia de humZ270VL1 pero con diferentes estrategias empleadas para la humanización de la secuencia de VH.

Materiales y métodos

15 Se usó un dispositivo Biacore T100 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). Se usó antígeno CD94/NKG2A en forma de un constructo de NKG2A-CD94-mFc de cadena sencilla, inmovilizado covalentemente sobre el chip CM5 de sensor (Biacore AB, Uppsala, Suecia) por medio de grupos amina usando clohidrato de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS). Se puso como objetivo un nivel de inmovilización de 300 RU. Se diluyeron variantes de anticuerpo humZ270 hasta una serie de concentraciones (0,157, 0,313, 0,625, 1,25, 2,5 nM) en el tampón de ejecución HBS-EP. Entonces se inyectaron todas las muestras sobre el antígeno inmovilizado durante 2 min a la velocidad de flujo de 40 ul/min. Posteriormente, se inyectó el tampón de ejecución durante 3 min a 40 ul/min para el análisis de disociación del anticuerpo. Tras cada ejecución, se inyectó el tampón de regeneración (NaOH 10 mM, NaCl 500 mM) (40 segundos, 10 ul/min) para separar

25 completamente los anticuerpos restantes del antígeno. Se evaluaron los datos con el software de evaluación de Biacore T100. Se dividió el valor de KD de cada variante entre el de huZ270 con una cadena pesada de humZ270VH1 para obtener el cambio en veces de KD relativo.

Resultados y conclusiones

Se muestran los resultados en la figura 13, en la que se normalizó el valor de KD de cada variante al de huZ270 con una cadena pesada de humZ270VH1 para obtener el cambio relativo en KD. Tal como se muestra en la figura 13, no hubo ninguna diferencia significativa entre las variantes con injerto de CDR (VH3, VH4) y la variante de humZ270 que comprende menos residuos murinos en el segmento de CDR-H2, (humZ270VL1/VH1). Tampoco hubo

35 diferencias sustanciales entre las variantes de “CDR-H2 humanizada” en diferentes regiones de entramado aceptoras humanas. Puesto que un anticuerpo humZ270 más humano tiene el beneficio de un menor riesgo de una respuesta inmunogénica en pacientes humanos, pueden elegirse las variantes de CDR-H2-humanizadas tales como VH1, VH5, VH6 y VH7 para aplicaciones terapéuticas sin el compromiso de una afinidad significativamente inferior en comparación con un anticuerpo humZ270 con injerto de CDR convencional, y con una menor probabilidad de una respuesta inmunitaria del huésped.

Ejemplo 12 -Identificación de residuos críticos en Z270VL y VH

Con el fin de identificar el parátopo de Z270, se realizó mutagénesis de exploración de alanina en las CDR del 45 anticuerpo murino. Se seleccionaron los siguientes aminoácidos para la mutagénesis de alanina (figura 14):

Z270VL: R24A, S26A, E27A, N28A, Y30A, S31A, N50A, K52A, T53A, E56A, Y92A, T94A

Z270VH: K23A, S25A, T28A, T30A, S31A, N35A, D52A, Y53A, D54A, S55A, E56A, R94A, D98A, F99A, D100A, V(100A)A, T(100C)A, L(100D)A, W(100F)A, D101A.

Materiales y métodos

Se analizaron las propiedades de unión a antígeno de los mutantes en alanina en un dispositivo Biacore T100

55 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). Se inmovilizó covalentemente antígeno en forma de sc-NKG2A-CD94-mFc sobre el chip CM5 de sensor (Biacore AB, Uppsala, Suecia) por medio de grupos amina usando clohidrato de 1-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS). Se puso como objetivo un nivel de inmovilización de 300 RU. Se diluyeron mutantes en alanina de Z270 hasta 0,75 nM o 1,5 nM en el tampón de ejecución HBS-EP. Entonces se inyectaron todas las muestras sobre el antígeno inmovilizado durante 3 min a la velocidad de flujo de 10 ul/min. Posteriormente, se inyectó el tampón de ejecución durante 1 min a 10 ul/min para el análisis de la estabilidad de unión del anticuerpo. Tras cada ejecución, se inyectó el tampón de regeneración (NaOH 10 mM, NaCl 500 mM) (35 segundos, 10 ul/min) para separar completamente los anticuerpos restantes del antígeno. Se evaluaron los datos con el software de evaluación de Biacore T100. Se calculó la unión relativa de cada mutante dividiendo su nivel de unión (RU) obtenido de Biacore entre el de chimZ270.

65 Resultados y conclusiones

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Claims (1)

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