BRPI1010620B1 - Métodos de conjugação - Google Patents

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BR
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antibody
conjugate
linker
succinimidyl
reaction
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BRPI1010620-0A
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Brenda A. Kellogg
Rajeeva Singh
Ravi V. J. Chari
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Immunogen, Inc
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Publication date
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Publication of BRPI1010620B1 publication Critical patent/BRPI1010620B1/pt
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Abstract

métodos de conjugação. a presente invenção refere-se um método de conjugar um agente de ligação à célula, tal como um anticorpo, com um grupo efetor (por exemplo, um agente citotóxico) ou um grupo relator (por exemplo, um radionuclídeo), por meio de que o grupo relator ou efetor é primeiro reagido com uma ligante bifuncional e a mistura é, em seguida, usada sem purificação para a reação de conjugação com o agente de ligação à célula. o método descrito nesta invenção é vantajoso para a preparação de conjugados ligados de forma estável de agentes de ligação à célula, tal como anticorpos, com grupos efetores ou relatores. este método de conjugação fornece conjugados em altos rendimentos de alta pureza e homogeneidade que estão sem reticulação intercadeias e resíduos de ligantes inativados.

Description

Este pedido reivindica a prioridade do pedido provisório US61/183.774, depositado em 3 de junho de 2009, a revelação completa do qual está expressamente incorporada neste documento como referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um novo método de conjugação de um grupo efetor (por exemplo, um agente citotóxico) ou um grupo relator (por exemplo, um radiomarcador) a um agente de ligação à célula, como um anticorpo ou um fragmento do mesmo, através de um ligante bifuncional. Mais especificamente, esta invenção refere-se a novos métodos de conjugação de um grupo efetor (por exemplo, maitansinoides) ou um grupo relator (por exemplo, um radiomarcador) a um agente de ligação à célula (por e- xemplo, um anticorpo ou um fragmento do mesmo) através de um ligante bifuncional de modo que o processo elimine as etapas que resultam na formação de espécies hidrolisadas indesejáveis ou espécies de reticulação indesejáveis formadas devido à reações intra-moleculares ou intermolecula- res.
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO
Conjugados de agentes de ligação às células, como anticorpos, com grupos efetores, como agentes citotóxicos pequenos ou proteínas cito- tóxicas, são de imenso interesse para o desenvolvimento de terapias anti- câncer (Richart, A. D., and Tolcher, A. W., 2007, Nature Clinical Practice, 4, 245-25). Estes conjugados são específicos para tumores devido à alta especificidade dos anticorpos selecionados para antígenos expressos na superfície de células tumorais. Na ligação específica à célula tumoral, o conjugado de anticorpo-agente citotóxico é internalizado e degradado dentro da célula cancerígena alvo liberando assim o agente citotóxico ativo que inibe as funções celulares essenciais como a dinâmica de microtúbulos ou a replicação do DNA na morte de célula cancerígena. Vários ligantes foram empregados na ligação de anticorpos com agentes citotóxicos com o objetivo de melhorar a liberação do agente dentro da célula na internalização e processamento de conjugado, enquanto mantendo a estabilidade desejada do conjugado no plasma. Estes ligantes incluem ligantes dissulfeto com diferentes graus de impedimento estérico que influenciam sua cinética de redução com tiol intracelular, ligantes peptídeos cliváveis como ligante valina- citrulina, e ligantes não cliváveis como ligante tioéter (Widdison, W., et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 4392-4408; Erickson, H., et al, Cancer Res., 2006, 66, 4426-4433).
Conjugados de agentes de ligação às células como anticorpos com marcadores ou grupos relatores são uteis para aplicações em imagens de tumores em pacientes com câncer, aplicações em imunoensaios para diagnóstico de várias doenças, terapia de câncer usando conjugados ligantes a nuclídeo radioativo, e aplicações de cromatografia de afinidade para a purificação de agentes bioativos como proteínas, peptídeos, e oligonucleotídeos. Os marcadores ou grupos relatores que estão conjugados com agentes de ligação às células incluem fluoróforos, e marcadores de afinidade como biotina.
O método convencional de conjugação de agente de ligação à célula como um anticorpo (Ab) com um grupo efetor (por exemplo, um agente citotóxico) ou um grupo relator (por exemplo, um radiomarcador) ligado através de um ligante não reduzível (como ligante tioéter) emprega duas e- tapas distintas de reação com o anticorpo e necessita do uso de etapas de purificação. Na primeira etapa de purificação, o anticorpo é reagido com um ligante heterobifuncional que carrega dois grupos reativos diferentes (por exemplo, X e Y). Por exemplo, em uma abordagem, a reação de um resíduo reativo de anticorpo (como resíduos de amino lisina) com o grupo reativo X (como éster A/-hidróxisuccinimida) do reagente heterobifuncional resulta na incorporação do ligante com o grupo reativo Y em um ou mais resíduos reativos no anticorpo (como resíduos de amino lisina). O produto anticorpo inicialmente modificado deve ser purificado a partir do ligante em excesso ou do reagente ligante hidrolisado antes da etapa seguinte ocorrer. Na segunda etapa de reação, o anticorpo ligante modificado contendo o grupo reativo Y (como maleimida ou haloacetamida) é reagido com o efetor como um grupo efetor (C) (por exemplo, um agente citotóxico) contendo um grupo reativo como tiol para gerar o conjugado anticorpo-efetor, que é novamente purificado em uma etapa adicional de purificação (vide, por exemplo, Patentes US 5.208.020, 5.416.064, ou 5.024.834). Assim, no processo acima, pelo menos duas etapas de purificação são necessárias.
Outra abordagem que envolve duas etapas de reação e purificação para conjugar o anticorpo com um grupo efetor ou relator usa a reação de resíduos de tiol no anticorpo (gerado através de modificação de anticorpo com reagentes que geram tiol como 2-iminotiolano, ou através de mutagê- nese para incorporar resíduos de cisteína não nativos, ou através da redução de pontes dissulfeto nativas) com um homoligante bifuncional Y-L-Y contendo grupos reativos Y (como maleimida ou haloacetamida).
Os principais inconvenientes da incorporação de um grupo reativo Y como maleimida (ou haloacetamida) em um anticorpo ou peptídeo são a propensão de grupos reativos de maleimida (ou haloacetamida) de sofrerem reações intra ou intermoleculares com os resíduos nativos de histidina, lisina, tirosina, ou cisteína no anticorpo ou peptídeo (Papini, A. et al., Int. J. Pept. Proteína Res., 1992, 39, 348-355; Ueda, T. et al., Biochemistry, 1985, 24, 6316-6322), e inativação aquosa do grupo Y maleimida. A reação inde- sejada intramolecular ou intermolecular de grupos Y maleimida (ou haloacetamida) incorporados no anticorpo com os resíduos nativos de histidina, lisina, ou cisteína em anticorpo, e inativação aquosa do grupo Y maleimida antes da segunda reação com o grupo efetor ou relator C origina proteínas reticuladas ou conjugados heterogêneos e diminui a eficiência da segunda reação com o grupo efetor ou relator C. O produto de conjugado heterogêneo - proteína reticulada ou peptídeo gerado da reação indesejada do grupo Y inicialmente incorporado (como grupo maleimida) com grupos nativos no anticorpo ou peptídeos (como histidina, lisina, tirosina, ou cisteína), ou com resíduos inativos de maleimida gerados por inativação aquosa pode ter atividade e estabilidade inferiores ao produto conjugado homogêneo desejado.
Os processos de conjugação de anticorpos a agente citotóxicos contendo tiol através de ligantes dissulfeto foram descritos anteriormente (vide, por exemplo, Patentes US 5.208.020, 5.416.064, 6.441.163, Publica ção de Patente US 2007/0048314 Al). Estes processos envolvem a reação inicial do anticorpo com um reagente heterobifuncional, seguido por uma segunda reação com um agente citotóxico contendo tiol. Um processo alternativo foi descrito na Patente US 6.441.163 BI na qual o ligante dissulfeto éster reativo do agente citotóxico é primeiro purificado e em seguida reagido com o anticorpo, mas que envolve uma etapa adicional de reação e purificação partindo do agente citotóxico contendo o grupo tiol antes da etapa de reação com o anticorpo
Outro inconveniente do processo atual para produzir conjugados de agente de ligação à células é a necessidade de duas etapas de purificação, que reduzem o rendimento geral e ainda tornam o processo problemático e não econômico para aumento em escala.
Em vista do exposto, há uma necessidade na arte de desenvolver métodos melhorados de preparar composições conjugadas de agentes de ligação à célula-droga que sejam substancialmente de alta pureza e possam ser preparados evitando etapas árduas e reduzindo o tempo e custo para o usuário. A invenção fornece dito método. Estas e outras vantagens da invenção, bem como características inventivas adicionais, ficarão aparentes a partir da invenção fornecida aqui.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção descreve um método de conjugação para preparar conjugados não reduzíveis, ligados a tio éter de fórmula C-L-CBA, onde C represente uma molécula efetora ou relatora (por exemplo, um agente citotóxico ou um radiomarcador), L é um ligante e CBA é um agente de ligação à célula (por exemplo, um anticorpo ou um fragmento do mesmo), utilizando uma reação direta do agente citotóxico contendo tiol (por exemplo, maitansinoides) com um reagente hetero ou a homo-bifuncional, (por exemplo, ligante clivável ou não clivável) seguida pela mistura de mistura de reação não purificada com um agente de ligação à célula (por exemplo, um anticorpo ou um fragmento do mesmo), gerando, assim, o conjugado não reduzível, ligado a tio éter por um processo que é mais eficiente, tem um alto rendimento, e é possível para aumento de escala. Outra vantagem importan te é que o método de conjugação gera conjugados não reduzíveis ligados a tio éter sem resíduos de proteína intercadeia, reticuladas ou inativadas (por exemplo, resíduos maleimida ou haloacetamida). Os novos métodos revelados neste pedido podem ser aplicados à preparação de qualquer conjugado representado pela fórmula acima.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1 mostra a conjugação de anticorpo com uma mistura de reação do maitansinoide DM1 (ou DM4) e ligante Maleimida-PEGn-NHS.
A figura 2 mostra a SDS-PAGE redutor de conjugados Ab- (PEG4-Mal)-DM4 preparados usando o método descrito nesta invenção versus conjugados preparados usando o método tradicional de 2 etapas. Cada linha de amostra continha 10 μg de proteína; o gel foi corado com Azul de Coomassie. As linhas 1 e 2 continham marcadores de peso molecular. A linha 3 continha conjugado preparado pelo método tradicional de duas etapas com 6,1 DM4 por Ab. A linha 4 continha conjugado preparado pelo método descrito nesta invenção e continha 6,2 DM4 por Ab.
A figura 3 mostra eletroforese ProteinLabChip de conjugados Ab-(PEG4-Mal)-DM4 preparados usando o método descrito nesta invenção versus conjugados preparados usando o método tradicional de 2 etapas. A. Eletroforese ProteinLabChip sob condição redutora (Agilent 2100 Bioanalyzer/ Agilent Proteína 230 kit) de conjugados Ab-(PEG4-Mal)-DM4. Linha 1: marcadores de peso molecular; linha 2: Ab-PEG4-Mal-DM4, 6.2 D/ Ab, sintetizado usando o método descrito nesta invenção; linha 3: Ab-PEG4-Mal-DM4, 6.1 D/ Ab, sintetizado usando o método de conjugação de 2 etapas; linha 4: Ab não conjugado (0,24 micrograma de proteína total em cada linha). As bandas do marcador superior, pico do sistema e marcador inferior representam os marcadores externos do kit. B. Quantificação de bandas de proteína da eletroforese ProteinLabChip.
A figura 4 mostra MS de conjugados Ab-(PEG4-Mal)-DM4 preparados usando o método descrito nesta invenção versus conjugados preparados usando o método tradicional de 2 etapas. A. MS de conjugado preparado pelo método tradicional de duas etapas com 6,1 DM4 por Ab. Devido à heterogeneidade significativa do conjugado os picos de MS não ficaram bem resolvidos. B. MS de conjugado preparado pelo método descrito nesta invenção e continham 6,2 DM4 por Ab. Devido à homogeneidade do conjugado, os picos de MS ficaram bem resolvidos.
A figura 5 mostra ligação de um conjugado anticorpo anti- CanAg-PEG4-Mal-DM1 com 6,7 DM1 por anticorpo (preparado usando o método descrito nesta invenção) versus ligação de anticorpo não modificado para células COLO205 expressando o antígeno CanAg. A ligação foi medida em unidades de fluorescência.
A figura 6 mostra a citotoxidade in vitro de um conjugado anticorpo anti-CanAg-PEG4-Mal-DM1 conjugado com 6,7 DM1 por anticorpo (preparado usando o método descrito nesta invenção) para células CO- LO205 expressando o antígeno CanAg. O conjugado foi adicionado às células COLO205, e após 5 dias de incubação contínua com o conjugado, a viabilidade das células foi medida usando o ensaio WST-8. Um experimento controle para demonstrar a especificidade do conjugado foi conduzido usando um excesso de anticorpo não conjugado anti-CanAg para bloquear a ligação e a citotoxicidade do conjugado para as células de câncer alvo.
A figura 7 mostra a conjugação de anticorpo com uma mistura de reação de DM1 (ou DM4) e ligante Maleimida-Sulfo-NHS.
A figura 8 mostra SDS-PAGE redutor de conjugados Ab-(Sulfo- Mal)-DM1 preparados usando o método descrito nesta invenção versus conjugados preparados usando o método tradicional de 2 etapas. Cada linha de amostra continha 10 μg de proteína; o gel foi corado com Azul de Coomas- sie. Linha 1 continha marcadores de peso molecular. Linhas 3 e 5 continham conjugados preparados pelo método descrito nesta invenção e continham 3,6 e 5,6 DM1 por Ab, respectivamente. Linhas 2 e 4 continham conjugados preparados pelo método tradicional de duas etapas e continham 4,0 e 5,7 DM1 por Ab, respectivamente.
A figura 9 mostra eletroforese ProteinLabChip de conjugado Ab- (Sulfo-Mal)-DMI preparado usando o método descrito nesta invenção versus conjugado preparado usando o método tradicional de 2 etapas. A. Eletrofo- rese ProteinLabChip sob condição redutora (Agilent 2100 Bioanaly- zer/Agilent Proteina 230 kit) de conjugados Ab-(Sulfo-Mal)-DM1. Linha 1: marcadores de peso molecular; linha 2: Ab não conjugado; linha 3: Ab-Sulfo- Mal-DM1, 5,7 D/Ab, sintetizado usando o método de conjugação de 2 etapas; linha 4: Ab-Sulfo-Mal-DM1, 5,6 D/Ab, sintetizado usando o método descrito nesta invenção; 0,22 micrograma de proteína total carregada por poço. As bandas de marcador superior, pico do sistema e marcador inferior representam os marcadores externos adicionados do kit (0,24 micrograma de proteína total por poço). B. Quantificação de bandas de proteína de eletroforese ProteinLabChip.
A figura 10 mostra comparações LC-MS de conjugado Anticor- po-(Sulfo-Mal)-DM1 preparado pelos métodos descritos nesta invenção versus o método de conjugação tradicional de duas etapas. A. MS do conjugado com 3,6 DM1 /Ab preparado usando o método descrito nesta invenção mostra um conjugado homogêneo com picos conjugados discretos conten- do1-6 DM1. B. MS de conjugado com 4,0 DM1/Ab preparados pela conjugação tradicional de duas etapas. O MS para o conjugado preparado pelo método tradicional de duas etapas mostra picos correspondentes a conjugados, e conjugados com ligantes hidrolisados ou reticuladas (como conjugado com 2 DM1, mais um L, 2L, e 3 L), indicando um produto heterogêneo.
A figura 11 mostra a ligação de um conjugado anticorpo anti- CanAg-Sulfo-Mal-DM1 com 5,6 DM4 por anticorpo (preparado usando o método descrito nesta invenção) versus ligação de anticorpo não modificado para células COLO205 que expressam antígeno CanAg. A ligação foi medida em unidades de fluorescência.
A figura 12 mostra a citotoxicidade in vitro de um conjugado anticorpo anti-CanAg-Sulfo-Mal-DM1 com 5,6 DM4 por anticorpo (preparado usando o método descrito nesta invenção) para Células COLO205 que expressam CanAg. O conjugado foi adicionado às células COLO205 e após 5 dias de incubação contínua de incubação contínua com o conjugado, a viabilidade das células foi medida usando o ensaio WST-8. Um experimento controle para demonstrar a especificidade do conjugado foi conduzido usando um excesso de anticorpo anti-CanAg não conjugado para bloquear a ligação e citotoxicidade do conjugado para células cancerígenas.
A figura 13 mostra a conjugação de anticorpo com uma mistura de reação de DM1 (ou DM4) e ligante Sulfo-NHS SMCC.
A figura 14 mostra SDS-PAGE redutor de conjugado Ab- (SMCC)-DMI preparado usando o método descrito nesta invenção versus conjugado preparado usando o método tradicional de 2 etapas. Cada linha de amostra continha 10 microgramas de proteína total; o gel foi corado com Azul de Coomassie Blue. Linha 1 continha marcadores de peso molecular, Linha 2 continha Ab não conjugado, Linha 3 continha conjugado preparado pelo método tradicional de duas etapas com 3,1 DM1 por Ab e Linha 4 continha conjugado preparado pelo método descrito nesta invenção com 3,1 DM1 por Ab.
A figura 15 mostra Eletroforese ProteinLabChip de conjugado Ab-(SMCC)-DM1 preparado usando o método descrito nesta invenção versus conjugado preparado usando o método tradicional de 2 etapas. A. Eletroforese ProteinLabChip sob condição redutora (Agilent 2100 Bioanaly- zer/Agilent Proteína 230 kit) de conjugados Ab-SMCC-DM1. Linha 1 : marcadores de peso molecular; linha 2: Ab-SMCC-DM1, 3.1 D/ Ab, sintetizado usando o método descrito nesta patente; linha 3: Ab não conjugado; linha 4: Ab-SMCC-DM1, 3.1 DZ Ab, sintetizado usando o método de conjugação de 2 etapas; (0,24 micrograma de proteína total em cada linha). As bandas de marcador superior, pico do sistema e marcador inferior representam marcadores externos adicionados do kit. B. Quantificação de bandas de proteína de Eletroforese ProteinLabChip .
A figura 16 mostra a comparação LC-MS de conjugado Anticor- po-(SMCC)-DM1 preparado pelo método descrito nesta invenção versus conjugado preparado pelo método tradicional de conjugação em duas etapas. A. MS do conjugado preparado pelo método sequencial de duas etapas com 3,1 DM1 por Ab. Cada pico principal de conjugado tem picos laterais associados devido à presença de fragmentos de ligantes hidrolisados e reticuladas. B. MS de conjugado preparado pelo método descrito nesta inven ção cm 3,1 DM1 por Ab. Devido à homogeneidade do conjugado, os picos MS foram bem resolvidos.
A figura 17 mostra mecanismos propostos para ligação cruzada intercadeia e inativação de maleimida durante a conjugação pelo método tradicional de 2 etapas.
A figura 18 mostra SDS PAGE não redutor de conjugado Ab- (Sulfo-Mal)-DM4 preparado usando o método descrito nesta invenção e extinção do tiol DM4 livre (após o reagente inicial heterobifuncional DM4 + NHS-Sulfo-Mal na reação de acoplamento) usando ácido 4- maleimidobutírico antes da reação de conjugação do anticorpo. Cada amostra continha 10 μg de proteína; o gel foi corado com Azul de Coomassie. Linhas 1 e 5 continham marcadores de peso molecular. Lane 2 continha Ab isolado. Linha 3 continha conjugado preparado pelo método descrito nesta invenção sem adição de ácido 4-maleimidobutírico. Linha 4 continha conjugado preparado pelo método descrito nesta invenção com adição de ácido 4- maleimidobutíricoapós o reagente inicial heterobifuncional DM4 + NHS- Sul- fo-Mal (antes da etapa de conjugação do anticorpo).
A figura 19 mostra preparação de conjugado ligado a dissulfeto de anticorpo usando uma mistura de reação de DM1 (ou DM4) e ligante SPDB.
A figura 20 mostra a preparação de conjugado de anticorpo- maitansinoide com ambos ligantes dissulfeto e não clivável PEG4-Mal através da conjugação de anticorpo com uma mistura de reação não purificada de DM1 (ou DM4) e ambos ligantes SPDB e NHS-PEG4-Mal.
A figura 21 mostra MS de conjugado anticorpo-maitansinoide com ambos ligantes dissulfeto e não clivável de PEG4-Mal (preparado por conjugação de anticorpo com uma mistura de reação não purificada de DM1, ou DM4, e ambos ligantes SPDB e NHS-PEG4-Mal).
A figura 22 mostra a conjugação de anticorpo com uma mistura de reação de DM1 (ou DM4) e ligante SMCC.
A figura 23 mostra o MS de conjugado atnticorpo-SMCC-DM1 preparado usando SMCC pelo método descrito nesta invenção, contendo média de 3,1 DM1 por anticorpo.
A figura 24 mostra a preparação de conjugado ligado a dissulfeto de anticorpo usando uma mistura de reação de DM1 (ou DM4) e ligante SSNPB.
A figura 25 mostra a conjugação de anticorpo com uma mistura de reação de DM1 (ou DM4) e ligante heterobifuncional com cadeia de carbono alifática linear.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A referência será agora feita em detalhes a certas modalidades da invenção, exemplos das quais são ilustrados nas estruturas e fórmulas que acompanham. Enquanto a invenção será mais bem descrita em conjunto com as modalidades enumeradas, será entendido que não têm a intenção de limitar a invenção a estas modalidades. Pelo contrário, a invenção tem a intenção de cobrir todas as alternativas, modificações e equivalentes que podem ser incluídas no escopo da presente invenção conforme definido pelas reivindicações. Um especialista na técnica reconhecerá muitos métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos aqui, que poderiam ser usados na prática da presente invenção.
Esta invenção descreve um novo método de conjugação de um efetor contendo tiol (por exemplo, um agente citotóxico) ou um grupo relator (por exemplo, um radiomarcador) com um agente de ligação à célula (por exemplo, um anticorpo), no qual o efetor ou relator contendo o grupo tiol é primeiro reagido com um reagente ligante bifuncional em solvente orgânico, aquoso, ou mistura de orgânico/aquoso, seguido por mistura de reação não purificada com o agente de ligação à célula em solventes orgânicos, aquosos ou misturas de orgânicos/aquosos.
Abreviações de legendas
As abreviações que foram usadas nas descrições dos Esquemas e dos Exemplos são as seguintes: C = Grupo efetor ou relator (por exemplo, um agente citotóxico ou um radiomarcador) L = Ligante (por exemplo, ligante clivável ou não clivável) X = grupo reativo amina (por exemplo, éster N- hidróxissuccinimida (éster NHS), éster sulfo- NHS, éster p-nitrofenol, éster tetraflúor sulfonato fenil, éster ácido 1 -hidróxi-2-nitro-benzeno-4-sulfônico) Y = Maleimida, ou haloacetamida (iodoacetamida, bromoaceta- mida) Yb é um grupo dissulfeto reativo misturado (por exemplo, 2- piridilditio, 4-piridilditio, 2-nitro-piridilditio, 5-nitro-piridilditio, 2-carboxi-5-nitro- piridilditio) X' = ligante amida Y' = ligante tioéter (R-S-R1) ou selenoéter (R-Se-R') Yb' = ligante dissulfeto (R-S-S-R')
Em uma modalidade desta invenção, um processo para preparação de um conjugado de ligado a tio éter de um agente de ligação à célula com uma molécula efetora ou relatora é descrito, o processo compreendendo as seguintes etapas: a) contatar um ligante heterobifuncional de fórmula X-L-Y com um efetor contendo molécula de tiol ou relatora C (por exemplo, um maitansinoide ou um radionuclídeo) em misturas de reação de solvente aquoso, solvente orgânico, ou misturas de orgânico/aquoso que rende um produto intermediário de fórmula X-L-Y-C; b) misturar a mistura de reação sem purificação com um agente de ligação à célula como um anticorpo (Ab) para produzir um conjugado de fórmula Ab-(X'-L-Y'-C)m, onde, L é um grupo alquil, alquenil ou alquinil substituído ou não substituído linear, ramificado ou cíclico contendo de 1 a 10 átomos de carbono, uma unidade aril simples ou substituída (substituintes selecionados de alquil, alcoxi, halogênio, nitro, fluoro, carboxi, sulfonato, fosfato, amino, carbonil, piperidina) ou uma unidade contendo polietilenoglicol (preferencialmente espaçador 1-500 PEG, ou mais preferencialmente espaçador 1-24 PEG, ou ainda mais preferencialmente espaçador 2-8 PEG); X e Y são grupos reativos amina ou tiol como éster /V- hidróxisuccinimida e maleimida ou haloacetamida; Ab é um anticorpo; m é um inteiro de 1-20; X' é sítio modificado X (por exemplo, um ligante amida) na reação com anticorpo; Y' é sítio modificado Y (por exemplo, ligante tioéter) na reação com, por exemplo, um agente citotóxico ou um radiomarcador do grupo efetor ou relator; e c) purificar o conjugado por filtração de fluxo tangencial, diálise, ou cromatografia (por exemplo, gel filtração, cromatogra- fia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica) ou uma combinação dos mesmos. Preferencialmente, Y é um grupo reativo tiol selecionado de maleimida ou haloacetamida. Preferencialmente, L é um grupo alquil linear ou ramificado com 1 a 6 carbonos ou espaçador 2-8 PEG. Preferencialmente, C é um agente citotóxico selecionado de um maitansinoide, um análogo CC-1065, um taxano, um agente de ligação a DNA, e mais preferencialmente é um maitansinoide.
Esta sequência de reação representada nas fórmulas 1 e 2:
Figure img0001
não envolve qualquer purificação do produto intermediário X-L-Y' -C, e, portanto, fornece a vantagem de misturá-lo diretamente com o anticorpo (o produto intermediário não purificado é adicionado ao anticorpo ou, o anticorpo é adicionado ao produto intermediário não purificado), tornando, assim, o método vantajoso para conjugação porque este elimina a necessidade de uma etapa árdua de purificação. De maneira importante, este método gera conjugado homogêneo sem resíduos de proteína intercadeia ou maleimida inati- vada, em contraste aos resíduos reticuladas de proteína intercadeia e maleimida inativada observados nos conjugados preparados pela reação tradicional de duas etapas e sequência de purificação.
A reação 1 pode ser conduzida em altas concentrações do ligante heterobifuncional, X-L-Y, e o grupo efetor ou relator C em solvente aquoso, solvente orgânico, ou misturas de reação orgânica/aquosa, resultando em velocidades de reação mais rápidas do que em concentrações mais baixas em soluções aquosas para conjugados preparados pela reação tradicional de duas etapas e sequência de purificação.
O produto intermediário X-L- Y'-C gerado na reação 1 pode ser armazenado de forma não purificada em um estado congelado, em baixas temperaturas em solvente aquoso em pH baixo apropriado pH (por exemplo, pH ~4 a 6), em solvente orgânicos, ou em misturas orgânica/aquosa, ou no estado liofilizado, por períodos prolongados e pode ser misturado posteriormente com a solução de anticorpo para a reação final de conjugação em um valor de pH maior de cerca de 4-9, adicionando, assim, para a conveniência da sequência de reação. O produto intermediário pode ser diluído conforme requerido com solvente orgânico ou com tampão aquoso, ou uma mistura de solvente orgânico e tampão aquoso antes da mistura com o agente de ligação à célula. O termo "cerca de" como usado aqui em reação à valor numérico deve ser entendido como referindo a todos os ditos números, incluindo todos os números e pequenas variações dos mesmos. A reação do produto intermediário X-L- Y'-C com anticorpo pode ser conduzida em valores de pH de cerca de 4 a cerca de pH 9, preferencialmente na faixa de pH de cerca de 5 a 8,7, mais preferencialmente, na faixa de pH de cerca de 6,5 a cerca de 8,5, como, pH 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, e 8,5, uma faixa de pH nestas ou pequenas varia-ções das mesmas. Os tampões usados para a reação do anticorpo com o produto intermediário X-L- Y-C na faixa de pH preferencial de cerca de 6,5 a 8,5 são tampões com valores de pKa próximos à esta faixa de pH, como fosfato e tampão HEPES. Estes tampões preferenciais não devem ter grupos amino primários ou secundários, ou outros grupos reativos, que podem reagir com o ligante X (como éster A/-hidróxisuccinimida).
Uma estequiometria ou ligeiro excesso de C em relação ao ligante heterobifuncional X-L-Y é usado na primeira reação para garantir que todo Grupo Y (como maleimida) é reagido antes da mistura não purificada ser adicionada ao anticorpo. Um tratamento adicional opcional com um reagente de extinção (como ácido 4-maleimidobutírico, ácido 3- maleimidopropiônico, ou /V-etilmaleimida, ou iodoacetamida, ou ácido iodoa- cetamidopropiônico) pode ser feito para garantir que qualquer C não reagido C seja temperado antes da mistura com o anticorpo para minimizar qualquer reação de troca de tiol-dissulfeto não desejada com os grupos nativos anticorpo dissulfeto. No temperamento com reagentes de temperamento tiol polar, carregados (como ácido 4-maleimidobutírico ou ácido 3- maleimidopropiônico), o excesso não reagido de C é convertido em um adu- to polar carregado que pode facilmente ser separado do conjugado ligado de forma covalente. Opcionalmente, a mistura final de reação 2, antes da purificação, é tratada com nucleófilos, como grupo amino contendo nucleófilos (por exemplo, lisina, taurina, hidróxilamina) para temperar qualquer ligante não reagido (X-L-Y1 -C).
Um método alternativo para a reação de anticorpo com a mistura de reação inicial não purificada de maitansinoidemaitansinoides (DMx) e ligante heterobifuncional envolve a mistura da mistura inicial de reação de DMx e ligante heterobifuncional (ao concluir a reação de ligação DMx) com anticorpo em pH baixo (pH ~5) seguido pela adição de tampão ou base para aumentar o pH a cerca de 6,5 a 8,5 para a reação de conjugação.
Este novo método é aplicado à preparação de um conjugado de anticorpo com a droga maitansinoide citotóxica. Os conjugados anticorpo- maitansinoide preparados usando este método delineado na sequência de reação 1-2 de forma inesperada foram muito superior em homogeneidade comparado aos conjugados preparados por reação tradicional de duas etapas e sequência de purificação, baseado na caracterização dos conjugados por SDS-PAGE redutor, eletroforese ProteinLabChip, e espectrometria de massa. O método de conjugação descrito nesta invenção que envolve a sequência de reação 1-2 ainda não requer qualquer etapa intermediária de purificação e é, portanto, mais conveniente do que o método tradicional de duas etapas.
Em uma segunda modalidade da invenção, um processo para a preparação de conjugado ligado a tio éter de um agente de ligação à célula com uma molécula efetora ou relatora é descrito compreendendo as seguintes etapas: a) contatar um homoligante bifuncional de fórmula Y-L-Y com um grupo efetor ou relator C contendo tiol ou amina (como um agente citotóxico) em solvente aquoso, solvente orgânico, ou mistura a mistura de reação a- quosa/orgânica para gerar Y-L- Y'-C, b) misturar a mistura de reação sem purificação com um anticorpo em solução aquosa ou mistura aquo- sa/orgânica para produzir um conjugado de fórmula Ab-(Y'-L-Y'-C)m, onde, L é conforme definido acima; Y é um grupo reativo tiol ou amina como uma maleimida ou haloacetamida, ou /V-hidróxisuccinimida ou sulfo /V- hidróxisuccinimida; Ab é um anticorpo; m é um inteiro de 1 a 20; Y' é o sítio modificado Y (como um ligante tioéter ou amida) na reação com anticorpo ou um sítio modificado Y (como um ligante tioéter ou amida) na reação com o agente citotóxico ou grupo efetor ou relator, e c) purificar o conjugado por filtração de fluxo tangencial, diálise, ou cromatografia (gel filtração, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica) ou uma combinação dos mesmos. A sequência de reação representada nas fórmulas 3 e 4:
Figure img0002
não envolvem qualquer purificação do produto intermediário Y-L- Y'-C, e, portanto, é um método vantajoso para conjugação.
Em uma terceira modalidade, um processo para a preparação de um conjugado ligado a dissulfeto de um agente de ligação à célula com uma molécula efetora ou relatora é descrito e compreende as seguintes etapas: a) contatar um ligante heterobifuncional de fórmula X- L-Yb com o grupo efetor ou relator C (como um agente citotóxico) em solvente aquoso, solvente orgânico ou mistura de reação mistura orgânica/aquosa para gerar o produto intermediário X-L-Yb'-C; b) misturar a mistura de reação sem purificação com o anticorpo em uma solução aquosa ou mistura aquosa/orgânica para produzir um conjugado de fórmula Ab-(X'- L-Yb'-Qm, onde, L é conforme descrito acima; Yb é um dissulfeto reativo como um piridil dissulfeto ou um nitro-piridil dissulfeto; X é um grupo reativo amina como éster /V-hidróxisuccinimida ou sulfo éster /V-hidróxisuccinimida; Ab é um anticorpo; m é um inteiro de 1 a 20; X' é sítio modificado X (como ligante amida) na reação com anticorpo; Yb é sítio modificado Yb (dissulfeto) na reação com o agente citotóxico ou grupo efetor ou relator; e c) purificar o conjugado por filtração de fluxo tangencial, diálise, ou cromatografia (gel filtração, cromatografia de troca, cromatografia de interação hidrofóbica) ou uma combinação dos mesmos. A sequência de reação é representada nas fórmulas 5 e 6:
Figure img0003
Figure img0004
Em uma quarta modalidade, um processo para a preparação de conjugados de anticorpo com grupos efetores ou relatores com dois tipos de ligantes— não clivável (ligante tioéter) e clivável (ligante dissulfeto) — com-preendendo as seguintes etapas é descrito: a) contatar ligantes X-L-Y e X-L- Yb com o agente citotóxico C para gerar compostos intermediários de fórmulas X-L- Y'-C e X-L-Yb'-C, b) misturar as misturas de reação sem purificação com o anticorpo seja em sequência ou simultaneamente conforme indicado nas fórmulas de reação 7 a 9:
Figure img0005
para fornecer um conjugado Ab-(X'-L-Y'-C)m(X'-L-Yb'-C)n', onde, as definições de X, L, Y', C, Yb', e m são conforme mostrado acima, e m' é um inteiro de 1 a 20; e c) purificar o conjugado por filtração de fluxo tangencial, diálise, ou cromatografia (gel filtração, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica) ou uma combinação dos mesmo. Estes dois ligantes efetores intermediários (X-L-Y'-C e X-L-Yb'-C) são misturados sem purificação com o anticorpo em sequências diferentes (primeiro X-L-Y'-C em seguida X-L-Yb'-C, ou primeiro X-L-Yb'-C em seguida X-L-Y'-C ou simultaneamente) em várias proporções.
As reações 1, 3, 5, e 7-8, podem ser conduzidas em altas con-centrações de ligante bifuncional (X-L-Y, X-L-Yb, ou Y-L-Y) e o grupo efetor ou relator C em solvente aquoso, solvente orgânico, ou misturas de reação orgânica/aquosa, resultando em velocidades de reação mais rápidas do que em concentrações menores em soluções aquosas para conjugados preparados pela reação tradicional de duas etapas e sequência de purificação onde a solubilidade de reagentes é limitante.
Os produtos intermediários X-L- Y'-C, ou Y-L- Y'-C, ou X-L-Yb'-C gerados nas reações 1, 3, 5, e 7-8 podem ser armazenados não purificados em um estado congelado, em baixas temperaturas em solvente aquoso em pH apropriado, em solvente orgânicos, ou em misturas orgânicas/aquosas, ou no estado liofilizado, por períodos prolongados e podem ser adicionados mais tarde à solução de anticorpo para a reação final de conjugação, adicionando, portanto, a conveniência desta sequência de reação.
Uma estequimoetria ou um ligeiro excesso de C em relação ao ligante heterobifuncional X-L-Y, ou Y-L-Y, ou X-L-Yb é usado na primeira reação para garantir que todo o grupo Y (como maleimida) é reagido antes de a mistura não purificada ser adicionado ao anticorpo. Um tratamento adicional opcional com um reagente de extinção (como ácido 4-maleimidobutírico, ou ácido 3-maleimidopropiônico, ou /V-etilmaleimida, ou iodoacetamida, ou ácido iodoacético) pode ser realizada para garantir que qualquer grupo não reagido (como tiol) em C seja temperado antes da adição ao anticorpo para minimizar qualquer reação de troca tiol-dissulfeto indesejada com os grupos nativos anticorpo dissulfeto. O temperamento do excesso de C usando um reagente de extinção carregado, polar tiol, após a reação inicial de C com o ligante bifuncional, converte o excesso de C em um aduto solúvel em água altamente polar que é facilmente separado do conjugado ligado de forma covalente por gel filtração, diálise, ou TFF. O produto conjugado final não contém, qualquer C associado não covalentemente. Opcionalmente, as misturas finais de reação 2, 4, 6, e 9, antes da purificação, são tratadas com nucleófilos, como, grupo amino contendo nucleófilos (por exemplo, lisina, taurina, hidróxilamina) para temperar qualquer ligante não reagido (X-L- Y'- C, Y-L- Y'-C, ou X-L-Yb'-C).
Um método alternativo da reação do anticorpo com a mistura de reação inicial não purificada de DMx e ligante bifuncional envolve misturar a mistura de reação inicial de DMx e ligante bifuncional (na conclusão da reação DMx-ligante) com anticorpo em pH baixo (pH ~5) seguido pela adição de tampão ou base para aumentar o pH a cerca de 6,5- 8,5 para a reação de conjugação.
Múltiplas cópias de mais do que um tipo de efetor podem ser conjugadas ao anticorpo pela adição de dois ou mais intermediários ligante- efetor derivados de dois ou mais efetores diferentes, sem purificação, ao anticorpo seja em uma sequência ou simultaneamente.
GRUPO(S) EFETQR(ES)
Os termos Grupo Efetor ou Molécula Efetora são usados de forma intercambiável e o termo "Grupo(s) efetor(es)" ou "Molécula(s) Efeto- ra(s)", como usado aqui, têm a intenção de incluir agentes citotóxicos. Em certos aspectos, pode ser desejável que os grupos ou moléculas efetores sejam ligados por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o potencial impedimento estérico. Múltiplas cópias de mais do que um tipo de efetor podem ser conjugadas ao anticorpo pela adição de dois ou mais intermediários ligante-efetor derivados de dois ou mais efetores diferentes, sem purificação, ao anticorpo seja em uma sequência ou simultaneamente.
Agentes citotóxicos que podem ser usados na presente invenção incluem agentes quimioterápicos ou análogos estruturais de agentes quimio- terápicos. "Agente quimioterápico" é um composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilan- tes, como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquil sulfonatos como bisulfano, improsulfano e piposulfano; aziridinas, como benzodopa, carbo- quona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenofosforamida, trietilenetiofosfaorami- da e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulata- cinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); brios- tatina; calistatina; CC- 1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e cripto- ficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW- 2189 e CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictiina; espongis- tatina; mostardas nitrogenadas como clorambucila, clornafazina, colofosfa- mida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato óxido de meclore- tamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda uracila; nitrosureias como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, como os antibióticos enediina (por exemplo caliqueamicina, especialmente caliqueamicina.gammal e cali- queamicina teta I, vide, por exemplo, Angew Chem Inti. Ed. Engl. 33:183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; bem como neocarzinostatina cromófora e antibióticos cromóforos enediina cromoproteí- na relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, ble- omicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina; cromomici- nas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino- doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e deoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, nitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelami- cina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos, como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, como denopterina, metotrexato, pteropteri- na, trimetrexato; análogos de purina, como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina como, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; androgênios, como calusterona, propionato de dromosta- nolona, epitiostanol, mepitiostana, testolactona; anti-adrenais, como amino- glutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico, como ácido folíni- co; aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptinio; uma epotilona; etoglucideo; nitratio de gálio; hidróxiureia; lentinana; lonidamina; maitansinoides, como maitansina e an- samitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostati- na; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxana; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazonico; triaziquona; 2, 2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente T-2 toxina, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosí- deo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo paclitaxel (TA- XOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.) e doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucila; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina como cispla- tina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposideo (VP-16); ifosfamida; mi- tomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; te- niposideo; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-I I; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); ácido retinoico; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima farma- ceuticamente aceitáveis. Ainda incluídos nesta definição estão agentes anti- hormonais que atuam regulando ou inibido a ação do hormônio em tumores, como anti-estrogênios incluindo por exemplo tamoxifeno, raloxifeno, inibidor de aromatase 4(5)-imidazois, 4-hidróxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LYI 17018, onapristona, e toremifeno (Fareston); e anti-androgênios, como flu- tamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, e goserelina; siRNA e sais, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima farmacêutica mente aceitáveis. Outros agentes quimioterápicos que podem ser usados com a presente invenção são revelados na Publicação US 20080171040 ou Publicação US 20080305044 e estão incorporados aqui em suas totalidades como referência.
Em uma modalidade preferencial, agente quimioterápico e citotóxicos são essencialmente agentes citotóxicos de moléculas pequenas. Uma "droga pequena molécula" é amplamente usado aqui para referir a um composto orgânico, inorgânico, ou organometálico que pode ter um peso molecular de, por exemplo, 100 a 1500, mais apropriadamente de 120 a 1200, favoravelmente de 200 a 1000, e tipicamente contendo um peso molecular de menos do que cerca de 1000. Agentes citotóxicos pequenas moléculas da invenção englobam oligopepetídeos e outras biomoléculas contendo um peso molecular de menos do que cerca de 1000. Agentes citotóxicos pequenas moléculas são bem caracterizados na técnica, como em WO05058367A2, Pedidos de Patentes Europeias Nos. 85901495 e 8590319, e n Patente US 4.956.303, entre outros e estão incorporados aqui em suas totalidades como referência.
Preferencialmente agentes citotóxicos pequenas moléculas são aqueles que permitem a ligação ao agente de ligação à célula. A invenção inclui conhecidos agentes citotóxicos bem como aqueles que podem ser tor- nar conhecidos. Especialmente preferenciais, agentes citotóxicos de pequenas moléculas incluem agentes citotóxicos.
O agente citotóxico pode ser qualquer composto que resulte em morte de uma célula, ou induz a morte celular, ou de alguma maneira diminui a viabilidade celular, onde cada agente citotóxico compreende uma fração tiol.
Agentes citotóxicos preferenciais são compostos maitansinoides, compostos taxanos, compostos CC-1065, compostos daunorrubicina e compostos doxorrubicina, dímeros pirrolobenzodiazepinicos, caliqueamicinas, auristatinaas e análogos e derivados dos mesmos, alguns dos quais estão descritos abaixo.
Outros agentes citotóxicos, que não são necessariamente moléculas pequenas, como siRNA, estão ainda englobados no escopo da presente invenção. Por exemplo, siRNAs podem estar relacionados às reticulação da presente invenção por métodos comumente usados para a modificação de oligonucleotídeos (vide, por exemplo, Publicações de Patentes US 20050107325 e 20070213292). Assim, o siRNA em sua forma 3' ou 5'- fosforomidita é reagido com uma extremidade da ligação cruzada que contém uma funcionalidade hidróxila para gerar uma ligação éster entre o siRNA e a ligação cruzada. De forma semelhante, a reação de siRNA fosforamidita com uma ligação cruzada contendo um grupo amino terminal resulta na ligação da ligação cruzada ao siRNA através de uma amina. siRNA são descritos em detalhes em Publicações de Patente US: 20070275465, 20070213292, 20070185050, 20070161595, 20070054279, 20060287260, 20060035254, 20060008822, 20050288244, 20050176667, que estão aqui incorporadas em suas totalidades como referência.
Maitansinoides
Maitansinoides que podem ser usados na presente invenção são bem conhecidos na técnica e podem ser isolados de fontes naturais de a- cordo com métodos conhecidos ou preparados sinteticamente de acordo com métodos conhecidos.
Exemplos de maitansinoides apropriados incluem maitansinol e análogos de maitansinol. Exemplos de análogos apropriados de maitansinol incluem aqueles contendo um anel aromático modificado e aqueles contendo modificações em outras posições.
Exemplos específicos de análogos apropriados de maitansinol contendo anel aromático modificado incluem: (1) C-19-decloro (Patente US 4,256,746) (preparado por Redução LAH LAH de ansamitocina P2); (2) C-20-hidróxi (ou C-20-demetil) +/-C-19-decloro (Patente US 4.361.650 e 4,307,016) (preparado por demetilação usando Streptomyces ou Actinomyces ou desclorinação usando LAH); e (3) C-20-demetóxi, C-20-acilóxi (-OCOR), +/-decloro (Patente US 4,294,757) (preparado por acilação usando cloretos de acila).
Exemplos específicos de análogos de maitansinol apropriados contendo modificações de outras posições incluem: (1) C-9-SH (Patente US 4.424.219) (preparado por reação de maitansinol com H2S ou P2S5); (2) C-14-alcoximetil (demetóxi/CH20R) (Patente US 4.331 .598); (3) C-14-hidróximetil ou aciloximetil (CH2OH ou CH2OAc) (Patente US 4.450.254) (preparado a partir de Nocardia); (4) C- 15-hidróxi/aciloxi (Patente US 4.364.866) (preparado por conversão de maitansinol por Streptomyces); (5) C-15-metoxi (Patente US 4.313.946 e 4.315.929) (isolado de Trewia nudiflora); (6) C-18-N-demetil (Patente US 4.362.663 e 4.322.348) (preparado por demetilação de maitansinol por Streptomyces); e (7) 4,5-deoxi (Patente US 4.371.533) (preparado por tricloreto de titânio /Redução l_AH de maitansinol).
A síntese de maitansinoides contendo tiol úteis na presente invenção é completamente revelada nas Patentes US 5.208.020. 5.416.064, e Pedido de Patente US 20040235840.
Maitansinoides com uma fração tiol na posição C-3, a posição C-14, a posição C-15 ou a posição C-20 são bem esperados que seja úteis. A posição C-3 é preferencial e a posição C-3 de maitansinol é especialmente preferencial. Ainda preferencial são a fração maitansinoide C-3 tiol contendo N-metil-alanina, e uma fração maitansinoide C-3 tiol contendo N-metil- cisteína, e análogos de cada.
Exemplos específicos de derivados de fração maitansinoide C-3 tiol contendo N-metil-alanina úteis na presente invenção são representados pelas fórmulas M1, M2, M3, M6 e M7.
Figure img0006
em que: / é um inteiro de 1 a 10; e May é um maitansinoide.
Figure img0007
em que: Ri e R2 são H, CH3 ou CH2CH3, e podem ser o mesmo ou diferentes; m é 0, 1, 2 ou 3; e May é um maitansinoide.
Figure img0008
em que: n é um inteiro de 3 a 8; e May é um maitansinoide.
Figure img0009
em que: Yo é Cl ou H; e X3 é H ou CH3.
Figure img0010
em que: Ri, R2, R3, R4 são H, CH3 OU CH2CH3, e podem ser os mesmos ou diferentes; m é 0, 1,2 ou 3; e May é um maitansinoide.
Exemplos específicos de derivados de Fração maitansinoide C-3 tiol contendo N-metil-cisteína úteis na presente invenção são representados pelas fórmulas M4 e M5.
Figure img0011
em que: o é 1, 2 ou 3; p é um inteiro de 0 a 10; e May é um maitansinoide.
Figure img0012
em que: o é 1, 2 ou 3; q é um inteiro de 0 a 10; Yo é Cl ou H; e X3 é H ou CH3.
Maitansinoides preferenciais são aqueles descritos nas Patentes US 5.208.020; 5.416.064; 6.333.410; 6.441.163; 6.716.821; RE39.151 e 7.276.497.
Taxanos
O agente citotóxico de acordo com a presente invenção pode a- inda ser um taxano.
Taxanos que podem ser usados na presente invenção foram modificados para conter uma fração tiol. Alguns taxanos úteis na presente invenção têm a fórmula T1 mostrada abaixo:
Figure img0013
Taxoides preferenciais são aqueles descritos nas Patentes US 6.340.701; 6.372.738; 6.436.931; 6.596.757; 6.706.708; 7.008.942; 7.217.819 e 7.276.499.
Análogos CC-1065
O agente citotóxico de acordo com a presente invenção pode a- inda ser um análogo de CC- 1065.
De acordo com a presente invenção, os análogos de CC- 1065 contêm uma subunidade A e uma subunidade B ou uma subunidade B-C. Análogos de CC- 1065 preferenciais são aqueles descritos nas Patentes US 5.475.092; 5.595.499; 5.846.545; 6.534.660; 6.586.618; 6.756.397 e 7.049.316.
Análogos de Daunorrubicina/Doxorrubicina
O agente citotóxico de acordo com a presente invenção pode a- inda ser um análogo de daunorrubicina ou um análogo de doxorrubicina.
Os análogos de daunorrubicina e doxorrubicina da presente in-venção podem ser modificados para compreender uma fração tiol. Os análo-gos modificados de doxorrubicina/daunorubicina da presente invenção, que têm uma fração tiol, estão descritos em WO 01/38318. Os análogos modifi-cados de doxorrubicina/daunorrubicina podem ser sintetizados de acordo com métodos conhecidos (vide, por exemplo, Patente US 5.146.064).
Auristatina inclui auristatina E, auristatina EB (AEB), auristatina EFP (AEFP), monometil auristatina E (MMAE) e são descritas nas Patentes U.S. No. 5.635.483, Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999); Molecular Cancer The-rapeutics, vol. 3, No. 8, pp. 921-932 (2004); Pedido U.S. No. 11/134826. Pu-blicação de Patente US 20060074008, 2006022925.
Os agentes citotóxicos de acordo com a presente invenção in-cluem dimeros de pirrolobenzodiazepinicos que são conhecidos na técnica (Patentes US 7.049.311; 7.067.511; 6.951.853; 7.189.710; 6.884.799; 6.660.856).
Análogos e derivados
Um especialista na técnica de agente citotóxicos prontamente entenderá que cada um dos agentes citotóxicos descritos aqui pode ser mo-dificado de modo que o composto resultante ainda retenha a especificidade e/ou atividade do composto de partida. O técnico especialista entenderá ain-da que muitos destes compostos podem ser usados no lugar dos agentes citotóxicos descritos aqui. Assim, os agentes citotóxicos da presente inven ção incluem análogos e derivados dos compostos descritos aqui.
GRUPO(S) RELATOR(ES)
Os termos Grupo Relator ou Molécula Relatora são usados de forma intercambiável e o termo "Grupo(s) relator(es)" ou "Molécula(s) relatora (s)", como usados aqui, referem-se a uma substância que é liberada para a substância específica ou células pela porção de afinidade específica do reagente, para uma finalidade diagnóstica ou terapêutica; exemplos são ra- dioisótopos, agentes de contraste paramagnéticos, e agentes anti-câncer. Vários marcadores ou grupos relatores são uteis para aplicações em técnicas de imagem de tumores em pacientes com câncer, aplicações em imuno- ensaios para diagnóstico de várias doenças, terapia de câncer usando con-jugados ligante nuclídeo radioativo, e aplicações em cromatografia de afini-dade for purificação de agentes bioativos como proteínas, peptídeos, e oli-gonucleotídeos. Os marcadores ou grupos relatores que são conjugados com agentes de ligação às células include fluoróforos, e marcadores de afinidade como biotina. Referências a dito grupo relator podem ser encontradas na publicação US no. 2007/0092940. Grupos relatores incluindo, por exemplo, biotina ou fluoresceína pode ainda estar ligados a uma fração PEG conjugada. Um número de grupos relatores apropriados são conhecidos na técnica, por exemplo, Patente US 4.152.411 e Hirschfeld Patente US 4.166.105.Patente US 5.223.242, Patente US 5.501.952, publicação US 20090136940 e estão incorporadas aqui em suas totalidades como referên-cia.
LIGANTES
Os conjugados podem ser preparados por métodos in vitro. Para ligar uma droga ao agente de ligação à célula, um grupo ligante é usado. Grupos ligantes apropriados são bem conhecidos na técnica e incluem ligantes não cliváveis ou cliváveis. Um ligante não clivável é qualquer fração química que é capaz de ligar um agente citotóxico a um agente de ligação à célula de maneira estável e covalente. Ligantes não cliváveis são substanci-almente resistentes a clivagem induzida por ácido, clivagem induzida por luz, clivagem induzida por peptidase, divagem induzida por esterase, e divagem de ligação de dissulfeto. Exemplos de ligantes não cliváveis incluem ligantes contendo um éster N-succinimidil, fração éster N-sulfosuccinimidil, fração baseada em maleimido ou haloacetil para a reação com a droga, o grupo relator ou o agente de ligação à célula. Reagentes reticuladas compreen-dendo uma fração baseada em maleimido incluem N-succinimidil 4- (maleimidometil)ciclohexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N- maleimidometil)-ciclohexano-l-carboxi-(6-amidocaproato), que é um análogo de "cadeia longa" de SMCC (LC-SMCC), ácido K-maleimidoundecanoico N- succinimidil éster (KMUA), ácido Y-maleimidobutírico N-succinimidil éster (GMBS), ácido ε-maleimidocaproico N-hidroxisuccinimida éster (EMCS), és-ter m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster N-(a- maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6-(β-maleimidopropionamido)hexanoate (SMPH), N-succinimidil 4-(p- maleimidofenil)-butirato (SMPB), e N-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI). Reagentes reticuladas compreendendo uma fração baseada e haloacetil in-cluem N-succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil iodoacetato (SIA), N-succinimidil bromoacetato (SBA), e N-succinimidil 3- (bromoacetamido)propionato (SBAP).
Outros reagentes reticuladas desprovidos de átomo de enxofre que formam ligantes não cliváveis podem ainda ser usados no método in-ventivo. Ditos ligantes podem ser derivados de frações a base de ácidos di- carboxilicos. Frações a base de ácidos dicarboxilicos incluem, entre outras, ácidos a,w-dicarboxilicos de fórmula geral mostradas abaixo: HOOC-X,-Yn-Zm-COOH em que X é um grupo alquil, alquenil, ou alquinil linear ou ramificado contendo 2 a 20 átomos de carbono, Y é um grupo cicloalquil ou cicloalquenil contendo 3 a 10 átomos de carbono, Z é um grupo aromático substituído ou não substituído contendo 6 a 10 átomos de carbono, ou um grupo heterocíclico substituído ou não substituído onde o heteroátomo é selecionado de N, O ou S, e onde I, m, e n são cada um 0 ou 1, desde que I, m, e n não sejam todos zero ao mesmo tempo.
Muitos dos ligantes não cliváveis revelados aqui são descritos em detalhes na publicação de patente US 20050169933.
Ligantes Cliváveis são ligantes que podem ser clivados sob con-dições amenas, ou seja condições sob as quais a atividade do agente citotó-xico não é afetada. Muitos ligantes conhecidos caem nesta categoria e são descritos abaixo.
Ligantes lábeis a ácido são ligantes cliváveis em pH ácido. Por exemplo, certos compartimentos intracelulares, como endossomas e lisos- somas, têm um pH ácido (pH A-5), e fornecem condições apropriadas para clivar ligantes lábeis a ácidos.
Ligantes que são fotolábeis são úteis na superfície do corpo e em muitas cavidades do corpo que são acessíveis à luz. Além disso, luz in-fravermelha pode penetrar no tecido.
Alguns ligantes podem ser clivados por peptidases. Somente certos peptídeos são prontamente clivados dentro ou fora das células, vide, por exemplo, Trouet et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 626-629 (1982), Umemoto et al. 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989), e ligantes valina-citrulina clivável por hidrolase lisossomal (Patente US 6.214.345 BI). Além disso, pep-tídeos são compostos de alfa aminoácidos e ligações peptídicas, que quimi-camente são ligações amida entre o carboxilato de um aminoácido e o grupo alfa-amino de um segundo aminoácido. Outras ligações amida, como a liga-ção entre um carboxilato e o grupo epsilon-amino de lisina, não são entendi-das como sendo ligações peptídicas e são consideradas não cliváveis.
Alguns ligantes podem ser clivados por esterases. Novamente certos ésteres podem ser clivados por esterases presentes dentro e fora das células. Ésteres são formados pela condensação de um ácido carboxílico e um álcool. Ésteres simples são ésteres produzidos com álcoois simples, co-mo álcoois alifáticos, e alguns pequenos álcoois cíclicos e aromáticos. Por exemplo, os presentes inventores não encontraram esterase que clivasse o éster em C-3 de maitansina, uma vez que o componente álcool do éster, maitansinol, é muito grande e complexo.
Moléculas ligantes cliváveis preferenciais incluem, por exemplo, N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) (vide, por exemplo, Caris- son et al, Biochem. J, 173: 723-737 (1978)), N-succinimidil 4-(2- piridilditio)butanoato (SPDB) (vide, por exemplo, Patente U.S. 4.563.304), N- succinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoato (SPP) (vide, por exemplo, Número de Registro CAS 341498-08-6), e outros ligantes de reação cruzada, como a- queles descritos na Patente U.S. 6.913.748, que é incorporado aqui em sua totalidade como referência.
Outros ligantes que podem ser usados na presente invenção in-cluem ligantes carregados ou ligantes hidrofílicos e são descritos nos Pedi-dos de Patente US, 12/433.604 e 12/433.668, respectivamente, que são in-corporados aqui em sua totalidade como referência.
AGENTES DE LIGAÇÃO À CÉLULAS
Os agentes de ligação às células usados nesta invenção são proteínas (por exemplo, imunoglobulina e proteínas não imunoglobulina) que se ligam especificamente a antígenos alvos em células cancerígenas. Estes agentes de ligação às células incluem: -anticorpos incluindo: -anticorpos de regeneração (Patente US 5.639.641); -anticorpos humanizados ou totalmente humanos (Anticorpos humanizados ou totalmente humanos são selecionados a partir de, entre outros, huMy9-6, huB4, huC242, huN901, DS6, CD38, IGF-IR, CNTO 95, B- B4, trastuzumabe, bivatuzumabe, sibrotuzumabe, e rituximabe (vide, por e- xemplo, Patente US 5.639.641, 5.665.357, e 7.342.110, Publicação de Pa-tente Internacional WO 02/16,401, Publicação U.S. No. 20060045877, Publi-cação U.S. No. 20060127407, Publicação U.S. No. 20050118183, Pedersen et al, (1994) J. Mol. Biol. 235, 959-973, Roguska et al., (1994) Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 91, 969-973, Colomer et al., Cancer Invest, 19: 49-56 (2001), Heider et al, Eur. J. Cancer, 3 IA: 2385-2391 (1995), Welt et al., ./. Clin. Oncol, 12: 1193-1203 (1994), e Maloney et al., Blood, 90: 2188-2195 (1997)); e -fragmentos de anticorpos como sFv, Fab, Fab', e F(ab')2 que preferencialmente se ligam a uma célula alvo (Parham, J. Immunol. 131 :2895-2902 (1983); Spring et al, J. Immunol. 113:470-478 (1974); Nisonoff et al, Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244 (I960));
Agentes adicionais de ligação às células incluem outras proteí-nas de ligação às células e polipeptídeos exemplificados por, entre outros: - Proteínas de repetição de anquirina (DARPins; Zahnd et al., J. Biol. Chem., 281, 46, 35167-35175, (2006); Binz, H.K., Amstutz, P. & Pluck- thun, A. (2005) Nature Biotechnology, 23, 1257-1268) ou proteínas tipo repe-tição de anquirina ou peptídeos sintéticos descritos, por exemplo, em Publi-cação U.S. No. 20070238667; Patente US 7.101.675; WO/2007/147213; WO/2007/062466); - interferons (por exemplo α, β, y); - limfocinas como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6; -hormônios como insulina, TRH (hormônios de liberação de tiro- tropina), MSH (hormônio estimulante de melanócitos), hormônios esteroides, como androgênios e estrogênios; e fatores de crescimento e fatores estimu-ladores de colônia como EGF, TGF-a, IGF-I, G-CSF, M-CSF e GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984)).
Onde o agente de ligação à célula é um anticorpo este se liga a um antígeno que é um polipeptídeo e pode ser uma molécula transmembra- na (por exemplo receptor) ou um ligante como um fator de crescimento. An- tígenos exemplares incluem moléculas como renina; um hormônio de cres-cimento, incluindo hormônio de crescimento humano e hormônio de cresci-mento bovino; fator de liberação de hormônio de crescimento; hormônio pa- ratireoide; hormônio estimulador da tireoide; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina; pró-insulina; hormônio estimula-dor de folículo; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; fatores de coa-gulação como fator vmc, fator IX, fator tecidual (TF), e fator de von Wille-brand; fatores anti-coagulantes como Proteína C; fator natriurético atrial; sur- factante pulmonar; um ativador de plasminogênio, como uroquinase ou urina humana ou ativador de plasminogênio tipo tecidual (t-PA); bombesina; trom- bina; fator de crescimento hematopoiético; fator de necrose tumoral α eβ; encefalinase; RANTES (regulado na ativação normalmente expressa e se- cretada em célula T); proteína inflamatória de macrófago humano (MIP-I - alfa); uma albumina sérica como albumina sérica humana; Substância inibi- dora de Muellerian; cadeia A de relaxina; cadeia B de relaxina; pró-relaxina; peptídeo de camundongo associado a gonadotropina; uma proteína microbi-ana, como beta-lactamase; DNase; IgE; um antígeno associado a linfócito T citotóxico (CTLA), como CTLA-4; inibina; activina; fator de crescimento endo- telial vascular (VEGF); receptores de hormônios ou fatores de crescimento; proteína A ou D; fatores reumatoides; um fator neurotrófico como fator neu- rotrófico derivado de osso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento de nervo como NGF-β; fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF); fator de crescimento de fibroblas- to como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento de transformação (TGF) como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-beta1, TGF-β2, TGF- β3, TGF-β4, ou TGF- β5; fator de crescimento tipo insulina -I e -II (IGF-I e IGF-II); des(l-3)-IGF-l (IGF-I cerebral), proteínas de ligação a fator de crescimento tipo insulina; proteínas CD como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 e CD40; eritropoietina; fatores osteoindutores; imu- notoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); um interferon como interferon-alfa, -beta, e -gama; fatores estimuladores de colônia (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; interleucinas (ILs), por exemplo, IL-I a IL-10; superóxido dismutase; receptores de célula T; proteínas de superfície de membrana; fatores de aceleração de decaimento; antígeno virai como, por exemplo, uma porção do envelope de HIV; proteínas de transporte; re-ceptores de retorno; adressinas; proteínas regulatórias; integrinas como CD11a, CD11b, CD11c, CD 18, uma ICAM, VLA-4 e VCAM, subunidade al- fa-V de um receptor de integrina humana heterodimérica; uma antígeno as-sociado a tumor como receptores HER2, HER3 ou HER4; e fragmentos de qualquer um dos polipeptídeos listados acima.
Antígenos preferenciais para anticorpos englobados pela pre-sente invenção incluem proteínas CD como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, e CD46; membros da família de receptores ErbB como o receptor EGF, receptores HER2, HER3 ou HER4; moléculas de adesão celular como LFA-I, Mad, p150.95, VLA-4, ICAM-I, VCAM, alfa4/beta7 integrina, e alfa v/beta3 integrina incluindo ambas subunidades alfa ou beta dos mesmos (por exemplo anticorpos anti-CD11a, anti-CD 18 ou anti-CD11b); fatores de crescimento como VEGF; fator tecidual (TF); TGF-β.; alfa interferon (alfa- IFN); uma interleucina, como IL-8; IgE; antígenos de grupo sanguíneo Apo2, receptor de apoptose; receptor flk2/flt3; receptor de obesidade (OB); receptor de mpl; CTLA-4; proteína C etc. Os alvos mais preferenciais aqui são IGF- IR, CanAg, EGF-R, EphA2, MUCI, MUC 16, VEGF, TF, CD 19, CD20, CD22, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD138, CA6, Her2/neu, CRIPTO (uma proteína produzida em níveis elevados em uma maioria de cânceres humanos de mama), alfa v/beta3 integrina, alfa v/beta5 integrina, TGF- β, CD11a, CD 18, Apo2 e C24.
Técnicas de anticorpo monoclonal permitem a produção de es-pecíficos agentes de ligação às células na forma de anticorpos monoclonais. Particularmente bem conhecidos na técnica estão as técnicas de criar anti-corpos monoclonais produzidos por camundongos, ratos, hamsters ou outros mamíferos imunizantes com o antígeno de interesse como a célula alvo in-tacta, os antígenos são isolados a partir da célula alvo, cujos vírus, vírus in-teiros atenuados, e proteínas virais como proteínas de revestimento virai. Células humanizadas sensibilizadas podem ainda ser usadas. Outro método de criar anticorpos monoclonais é o uso de bibliotecas de fagos de sFv (re-gião variável de cadeia simples), especificamente sFv humanos (vide, por exemplo, Griffiths et al, Patente US 5.885.793; McCafferty et al, WO 92/01047; Liming et al, \NO 99/06587.)
A seleção do agente apropriado de ligação à célula é uma ques-tão de escolha que depende da população particular da célula que será alvo, mas em geral anticorpos monoclonais e fragmentos dos mesmos que prefe-rencialmente se ligam a uma célula alvo são preferenciais, se um apropriado está disponível.
Por exemplo, o monoclonal anticorpo My9 é um anticorpo murino lgG2a que é específico para o antígeno CD33 encontrado nas células de Leucemia Mieloide Aguda (AML) (Roy et al. Blood 77:2404-2412 (1991)) e podem ser usados para tratar pacientes com AML. De forma semelhante, o monoclonal anticorpo anti-B4 é um IgGí murino, que se liga ao antígeno CD 19 nas células B (Nadler et al, J. Immunol. 131 :244-250 (1983)) e pode ser usado se as células alvo são células B ou células adoecidas que expressam o antígeno como em linfoma não Hodgkin ou leucemia linfoblástica crônica. De forma semelhante, o anticorpo N901 é um anticorpo monoclonal IgGi murino que se liga a CD56 encontrado em células de carcinoma pulmonar de células pequenas e em células de outros tumores de origem neuroendó- crina (Roy et al. J Nat. Cancer Inst. 88:1136-1145 (1996)), o anticorpo huC242 que se liga ao antígeno CanAg, Trastuzumabe que se liga a HER2/neu, e anticorpo anti-receptor EGF que se liga ao receptor EGF.
MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO
O conjugado, ou seja, o produto finalizado, da presente invenção é purificado para remover qualquer molécula efetora ou relator não reagida ou não conjugada, ou ligante não reagido ou ligante hidrolisado não conju-gado. O método de purificação pode ser uma filtração de fluxo tangencial (TFF, também conhecida como filtração de fluxo cruzado, ultrafiltração, ou diafiltração), gel filtração, cromatografia adsortiva, precipitação seletiva, ou combinações dos mesmos. Os métodos de cromatografia adsortiva incluem cromatografia de troca iônica, cromatografia de hidróxiapatita, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia hidrofóbica de indução de car-ga (HCIC), cromatografia de troca iônica de modo misto, cromatografia por afinidade de metal imobilizado (IMAC), cromatografia de ligante corado, cromatografia de afinidade, e cromatografia de fase reversa. Por exemplo, o conjugado Ab-(X'-L-Y'-C)m descrito na fórmula 2 é purificado a partir de C não reagido C ou ligante X-L-Y ou X-L- Y'-C não reagido/hidrolisado. De forma semelhante, os conjugados descritos aqui nas fórmulas 4, 6, e 9 são purificados. Ditos métodos de purificação são conhecidos pelos especialistas na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, na Publicação US No. 2007/0048314.
LIGANTE HIDROLISADO NÃO DESEJADO OU RETICULAÇÃO DE PRO-TEÍNA EM CONJUGADOS
Métodos tradicionais de conjugação que empregam a reação ini- ciai de uma proteína com um ligante heterobifuncional com resíduos reativos de maleimida ou haloacetamida sofrem de dois grandes inconvenientes: (i) o produto conjugado pode consistir em ligante hidrolisado, devido à inativação aquosa do ligante incorporado no anticorpo antes da reação com a molécula efetora ou relatora; e (ii) reticulação inter ou intra-cadeias de conjugado, devido à reação de grupo maleimida (ou haloacetamida) com os resíduos nativos de histidina, lisina, tirosina, ou cisteína na proteína ou peptídeo (A. Papi- ni et al., Int. J. Pept. Proteína Res., 1992, 39, 348-355; T. Ueda et al., Biochemistry, 1985, 24, 6316-6322). Ditas reticulação intercadeia no anticorpo poderiam resultar em vários ligantes covalentes não redutíveis entre as ca-deias pesadas e leves, ou entre duas cadeias pesadas, que poderia estar aparente na análise por SDS-PAGE redutor conforme as bandas de maior peso molecular do que as bandas esperadas de cadeia pesada e leve. Ditas reticulação intercadeia ou intra-cadeia no anticorpo também seria aparentes por MS conforme picos anômalos de massas diferentes das massas esperadas de anticorpo mais grupos relator ou efetores ligados. Diferente de métodos tradicionais de conjugação, o método descrito neste pedido resulta em conjugados com alta homogeneidade sem ligação cruzada intercadeia substancial ou ligante hidrolisado.
Todas as referências citadas aqui e nos exemplos a seguir estão expressivamente incorporados como referência em suas totalidades.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos, que são somente ilustrativos, não têm a intenção de limitar a presente invenção.
Exemplo 1. Conjugação de anticorpo com agente citotóxico DM1/DM4 usando ligante heterobifuncional Maleimida-PEGn-NHS por este método (figura 1) versus método tradicional de duas etapas.
Soluções estoque de DM1 [A/2-deacetil-A/2-(3-mercapto-1- oxopropil)-maitansina], ou DM4 [A/2-deacetil-/\/2-(4-mercapto-4-metil-l- oxopentil)maitansine] (DMx) tiol e o ligante bifuncional Maleimida-PEGn-NHS foram feitos em /V,/V-dimetilacetamida (DMA) em concentrações de 30 a 60 mM. O ligante e DMx tiol foram misturados juntos em DMA contendo até 50% v/v de 200 mM tampão succinato, 2 mM EDTA, pH 5,0 para gerar uma proporção molar de DMx para ligante de 1,6:1 e uma concentração final de DMx igual a 15 mM. Após a mistura, a mistura de reação foi deixada por 1 -4 h e em seguida uma alíquota da mistura de reação foi diluída 10 vezes e sua absorbância medida em 302-320 nm para determinar a presença de qualquer maleimida remanescente não reagida usando o coeficiente de extinção (ε) de maleimida a 302 nm = 620 M'1 cm’1, e ε320 nm ~ 450 M'1 cm’1. (Análise adicional de HPLC de fase reversa de uma alíquota congelada da mistura de reação foi conduzida depois com monitoramento de absorbância a 302 nm e 252 nm para verificar o completo desaparecimento de um ligante maleimida e formação do reagente desejado ligante-DMx no momento da adição da mistura de reação ao anticorpo). Quando nenhuma maleimida esta presente por UV, uma alíquota da mistura de reação foi adicionada sem purificação a uma solução de anticorpo em tampão fosfato (pH 7,5) sob condições finais de conjugação de 4 mg/ml Ab5 90% tampão fosfato/10% DMA, pH 7,5. A reação de conjugação foi deixada ocorrer em temperatura ambiente por 2 h. O conjugado Ab-DMx foi purificado a partir de um excesso de DMx de molécula pequena e reagentes ligantes usando uma coluna G25 de gel filtração equilibrada em tampão pH 7,5 fosfato, ou usando filtração de fluxo tangencial (TFF). A mistura de conjugação foi ainda mantida a 4°C por 2 dias em tampão pH 7,5 para permitir a dissociação de qualquer espécie de DMx ligada ao anticorpo de forma não covalente ou através de ligante lábil. O conjugado foi então dialisado durante a noite em pH 5,5 tampão histidi- na/glicina e em seguida filtrado por um filtro de 0,22 μm para armazenamento final. O número de moléculas DMx por molécula de Ab (média) no conjugado final foi medido pela determinação da absorbância do conjugado a 252 e 280 nm e usando coeficientes de extinção conhecidos para DMx e anticorpo nestes dois comprimentos de onda.
Várias condições diferentes de reações foram usadas para a re-ação inicial de DMx tiol com o reagente heterobifuncional maleimida-PEG4- NHS: 50% DMA/50% aquoso 200 mM tampão succinato pH 5,0, 2 mM EDTA (v/v); ou 60% DMA/40% 200 mM tampão succinato pH 5,0, 2 mM EDTA (v/v); ou 100% DMA com 1,5 molar equivalente de uma base orgânica (por exemplo N,N'-diisopropil etilamina, DIPEA, ou A-metilmorfolina) por mol de DM4 tiol.
Em uma série de experimentos, o equivalente molar de DMx para ligante maleimida-PEG4-NHS (adquirido de Pierce Endogen) variou de 1,2 - 2,4, e o tempo de reação foi de 30 min. O número de DMx/ Ab medido em conjugados purificados foi medido como uma função de equivalentes adicio-nados de DMx por ligante. As condições de 1,2 - 2,0 equivalentes de DM1/Ligante geraram conjugados com cargas semelhantes de DMx/ Ab, indicando que a reação indesejada de DMx tiol na latera éster NHS do ligan-te não é um problema significativo. A quantidade reticuladas presente nos conjugados finais foi ainda analisada por SDS PAGE redutor mostrando que a presença de contaminantes reticuladas diminui de forma significativamente com proporção aumentada de DM1 /ligante.
Uma etapa opcional de temperamento usando reagentes malei-mida ou haloacetamida (como ácido maleimidobutírico, ou ácido maleimido- propiônico, ou /V-etilmaleimida, ou iodoacetamida, ou ácido iodoacético) foi introduzida após a conclusão da reação inicial de DMx e ligante heterobifun-cional (antes da adição da mistura de reação ao anticorpo) para temperar o excesso de grupo DMx tiol para prevenir qualquer reação indesejada de DMx tiol com o anticorpo.
Um método alternativo de reação do anticorpo com a mistura de reação inicial não purificada de DMx e ligante heterobifuncional envolveu misturar a mistura de reação inicial de DMx e ligante heterobifuncional (na conclusão da reação de DMx-ligante) com anticorpo em pH baixo (pH ~5) seguido pela adição de tampão ou base para aumentar o pH para 6,5 a 8,5 para a reação de conjugação.
Um anticorpo-PEG4-Mal-DM1 ou conjugado DM4 foi feito pelo método tradicional de conjugação de duas etapas para comparação com o método de conjugação descrito nesta invenção. O anticorpo humanizado em uma concentração de 8 mg/ml em tampão pH 7,5 fosfato (50 mM fosfato de potássio, 50 mM cloreto de sódio, 2 mM EDTA, pH 7,5) e 5% DMA foi modi- ficado com excesso de reagente heterobifuncional maleimida-PEG4-ligante NHS (adquirido de Pierce Endogen). Depois de 2 h a 25 C, o anticorpo modi-ficado foi gel purificado por cromatografia G25 para remover excesso de li-gante não reagido, não incorporado. A recuperação de Ab purificado foi de-terminada por absorbância no UV a 280 nm. O número de grupos maleimida ligados no Ab modificado foi determinado usando uma pequena alíquota de f anticorpo modificado pela adição de uma quantidade conhecida de tiol (co-mo 2-mercaptoetanol), adicionado em excesso sobre a maleimida, para reagir com os resíduos de no anticorpo modificado e em seguida analisando o tiol remanescente por ensaio de Ellman usando reagente DTNB (coeficiente de extinção de TNB tiolato a 412 nm= 14150 M"1 cm"1; Riddles, P. W. et al, Metods Enzymol., 1983, 91, 49-60; Singh, R., Bioconjugate Chem., 1994, 5, 348-351). The conjugação de Ab modificado com DM1 ou DM4 tiol foi con-duzida em uma concentração de Ab de 2,5 mg/ml em uma mistura de reação que consiste em 95% tampão fosfato pH 7,5 (50 mM fosfato de potássio, 50 mM cloreto de sódio, 2 mM EDTA, pH 7,5) e 5% DMA. Um excesso de 1,7 equivalente molar de DM1 ou DM4 tiol foi adicionado por mol de maleimida ligada no Ab. Após reagir durante a noite a 25 C, o conjugado foi esterilizado por filtro usando um filtro de 0,22 e gel purificado a partir de um excesso não reagido de DM1 ou DM4 por uma coluna G25 equilibrada em tampão fosfato pH 7,5 (fosfato de potássioõO mM, cloreto de sódioõO mM, EDTA 2 mM, pH 7,5). O conjugado purificado foi mantido a 4°C por 2 dias em tampão fosfato pH 7,5 (fosfato de potássioõO mM, cloreto de sódio50 mM, EDTA 2 mM, pH 7,5) para permitir a dissociação de qualquer espécies de DM1 ou DM4 ligada ao anticorpo de forma não covalente ou através de um ligante lábil. O conju-gado foi subsequentemente dialisado por 2 dias em tampão histidina/glicina pH 5,5 (glicina 130 mM/ histidina 10 mM, pH 5,5) e esterilizado por filtração usando um filtro de 0,22 μm. O número de moléculas de DM1 ou DM4 por molécula de Ab no conjugado final foi medido pela determinação de absor-bância do conjugado a 252 e 280 nm usando coeficientes de extinção co-nhecidos para DM1 /DM4 e Ab nestes dois comprimentos de onda.
SDS PAGE redutor foi conduzido em amostras de conjugado e anticorpo usando o sistema de eletroforese NuPage com um Bis Tris Gel 4 - 12% (Invitrogen). Amostras aquecidas, desnaturadas e reduzidas foram carregadas a 10 μg/linha. O SDS-PAGE redutor dos conjugados preparado u- sando o método descrito nesta invenção mostrou somente as bandas esperadas de cadeia pesada e leve (50 kDa e 25 kDa respectivamente) como as bandas principais (figura 2). Em contraste, os conjugados preparados pelo método tradicional de conjugação em duas etapas mostrou bandas de reticu- lação indesejadas com pesos moleculares de 75, 100, 125, e 150 kDa, presumivelmente correspondentes à espécies de reticulação intercadeia HL, H2, H2L, e H2L2respectivamente (figura 2).
A análise de eletroforese ProteinLabChip (sob condição reduto-ra) do conjugado anticorpo-PEG4-Mal-DM4 preparado pelo método descrito nesta invenção mostrou as bandas esperadas de cadeia pesada e leve com percentuais de 58 e 30% (de proteína total), que são semelhantes àquelas par anticorpo não conjugado de 65 e 30% respectivamente (figura 3). Em contraste, o conjugado preparado usando o método tradicional de conjuga-ção em duas etapas mostrou bandas pesadas e leves de somente 16 e 8% respectivamente, e bandas principais de pesos moleculares maiores que variam de 94-169 kDa presumivelmente devido à ligação cruzada intercadei- a. Baseado na análise quantitativa ProteinLabChip, o conjugado preparado pelo método descrito neste pedido é altamente superior àquele preparado usando o processo convencional de duas etapas (figura 3).
A análise de MS dos conjugados preparados pelo método des-crito nesta invenção mostrou picos discretos de conjugado DMx-anticorpo para anticorpos contendo números aumentados de moléculas de maitansi- noide por molécula de anticorpo (figura 4). Em contraste, o MS do conjugado obtido usando o método tradicional de 2 etapas foi quase sem resolução o que sugere não homogeneidade da preparação do conjugado presumivel-mente devido às reticulação o ligante maleimida inativado. Com base no MS, portanto, o conjugado preparado usando o método descrito nesta invenção é superior àquele sintetizado pelo método tradicional de duas etapas.
A ligação de um conjugado anti-CanAg Ab-PEG4-Mal-DM 1 pre- parado pelo método descrito nesta invenção foi medida por citometria de fluxo usando células COLO 205 expressando o antígeno, e demonstrou-se semelhante àquela do anticorpo não conjugado sugerindo que a conjugação não teve efeito detrimental na ligação do anticorpo (figura 5). A atividade de citotoxicidade do conjugado anti-CanAg Ab-PEG4-Mal-DM1 preparado pelo método descrito nesta invenção foi medida in vitro usando células de colo cancerígenas COLO205 expressando o antígeno (figura 6). As células can-cerígenas que expressam o antígeno foram plaqueadas em cerca de 1000 células/poço em uma placa de 96 poços em meio de cultura contendo soro fetal bovino e exposta a concentrações variadas de conjugado Ab-DMx. A- pós uma exposição de 5 dias ao conjugado, as células viáveis remanescen-tes em cada poço foram medidas usando o ensaio WST-8 (Dojindo Molecular Technologies). Como mostrado na figura 6, o conjugado anti-CanAg Ab- PEG4-Mal-DM1 preparado usando este método foi altamente potente em concentrações baixas para células de colo cancerígenas COLO205 expres-sando o antígeno CanAg. A citotoxicidade do conjugado anti-CanAg Ab- PEG4-Mal-DM1 preparado pelo método descrito nesta invenção foi específica para células COLO205 uma vez que pode ser bloqueada pela adição de excesso de anticorpo não conjugado.
Exemplo 2. Conjugação de anticorpo com DM1/DM4 usando li-gante maleimida-Sulfo-NHS por este método (figura 7) versus método tradi-cional de sequência em duas etapas.
Soluções estoque de DMx tiol e o ligante heterobifuncional ma- leimida-Sulfo-NHS foram feitas em N,N-dimetilacetamida (DMA) em concen-trações de 30-60 mM. O ligante e DMx tiol foram misturados em DMA con-tendo até 40 % v/v de 200 mM tampão succinato, 2 raM EDTA, pH 5,0 para gerar uma proporção de DMx para o ligante de1,6 e a concentração final de DMx igual a 15 mM. Após a mistura, a reação foi deixada por 1-4 h e em se-guida uma alíquota da mistura de reação foi diluída 10 vezes para medir a absorbância em 302-320 nm para avaliar a conclusão da reação e a ausên-cia de maleimida. (Análise adicional de HPLC de fase reversa da alíquota congelada da mistura de reação foi conduzida posteriormente com monito- ramento de absorbância a 302 nm e 252 nm para verificar desaparecimento completo do ligante maleimida e formação do reagente desejado ligante- DMx no momento da adição da mistura de reação ao anticorpo). Quando nenhuma maleimida estava presente por UV, uma alíquota da mistura de reação foi adicionada à mistura de anticorpo em tampão fosfato (pH 7,5) sob condições finais de conjugação de 4 mg/ml Ab, 90% tampão fosfato/10% DMA, pH 7,5. A reação de conjugação foi deixada ocorrer em temperatura ambiente por 2 h. O Conjugado Ab-DMx foi purificado a partir de um excesso de produtos DMx não reagidos e ligantes não conjugados usando uma colu-na de gel filtração G25 equilibrada em tampão pH 7,5 fosfato ou por filtração de fluxo tangencial. O conjugado foi mantido a 4 C por 2 dias em tampão pH 7,5 para permitir a dissociação de qualquer espécie de DMx ligada ao anti-corpo de forma não covalente ou através de ligante lábil. O conjugado foi em seguida dialisado durante a noite em pH 5,5 tampão histidina/glicina e em seguida filtrado por um filtro de 0,22 μm para armazenamento final. O núme-ro de Moléculas de DMx por Ab molécula de anticorpo (média) no conjugado final foi medido por determinação de absorbância do conjugado em 252 e 280 nm e usando coeficientes de extinção conhecidos para DMx e anticorpo nestes dois comprimentos de onda.
Para comparação, os conjugados Ab-Sulfo-Mal-DMx foram pre-parados usando o método tradicional de conjugação de 2 etapas. O anticorpo (Ab) em uma concentração de 8 mg/ml em tampão pH 7,5 fosfato/5% tampão de DMA foi modificado com um excesso de ligante bifuncional ma- leimida-Sulfo-NHS. A reação foi deixada ocorrer a 20 C por 2 h e em seguida o Ab modificado foi purificado a partir de um excesso de ligante não reagido usando cromatografia G25. A recuperação do Ab purificado foi determinada por Absorbância em UV a 280 nm. O número de grupos maleimida ligados no Ab modificado foi determinado usando pequena alíquota de anticorpo modificado pela adição de uma quantidade conhecida de tiol (como 2- mercaptoetanol), adicionada em excesso sobre a maleimida, para reagir com os resíduos de maleimida no anticorpo modificado e em seguida analisando o tiol remanescente por ensaio de Ellman usando reagente DTNB (coeficien- te de extinção de TNB tiolato a 412 nm= 14150 M'1 cm’1; Riddles, P. W. et al, Metods Enzymol., 1983, 91, 49-60; Singh, R., Bioconjugate Chem., 1994, 5, 348-351). A conjugação de Ab modificado com DMx foi conduzida em uma concentração de anticorpo de 2,5 mg/ml em 95% tampão pH 7,5 fosfato/5% DMA (v/v), com 1,7 equivalente molar de DMx tiol adicionado por mol de ma-leimida ligada em Ab. A reação foi deixada por 8-24 h a 18 C e o conjugado foi separado do DMx em excesso não reagido através de cromatografia por exclusão de tamanho G25. Após a purificação o conjugado foi mantido a 4 C por 2 dias em tampão pH 7,5 para permitir a dissociação de qualquer espécie de DMx ligada ao anticorpo de forma não covalente ou através de ligante lábil. O conjugado foi em seguida dialisado durante a noite em pH 5,5 tam-pão histidina/glicina e em seguida filtrado por um filtro de 0,22μm para arma-zenamento final. O número de moléculas de DMx por Molécula de Ab no conjugado final foi medido pela determinação de absorbância do conjugado em 252 e 280 nm e usando coeficientes de extinção conhecidos para DMx e anticorpo nestes dois comprimentos de onda.
SDS PAGE redutor foi conduzido usando amostras de conjuga-do e anticorpo (10 μg/linha) usando o sistema de eletroforese NuPage (Invi- trogen) com um NuPage 4 -12% Bis Tris Mini Gel e NuPAGE MOPS SDS de tampão de corrida (figura 8). As bandas no gel com pesos moleculares de 75, 125, e 150 kDa foram indicativas de espécies de reticulação intercadeia (HL, H2L e H2L2 respectivamente). Uma comparação de conjugados Ab- Sulfo-Mal-DM1 com ~4 DM1 /Ab (linha 3, por este método, e linha 2, pelo método de conjugação tradicional de 2 etapas, respectivamente) e ~6 DM1 /Ab (linha 5, por este método, e linha 4, pelo método de conjugação tradicional de 2 etapas, respectivamente) claramente mostrou que os conjugados feitos pelo método descrito nesta invenção (linhas 3 e 5) tem uma proporção muito menor de espécies reticuladas de alto peso molecular do que os conjugados feitos pelo método tradicional de 2 etapas (linhas 2 e 4).
Análise de Eletroforese ProteinLabChip (sob condição redutora) do conjugado anticorpo-Sulfo-Mal-DM1 preparado pelo método descrito nes-ta invenção mostrou bandas de cadeia pesada e leve principais com percen- tuais de 70 e 28% (de proteína total), que são semelhantes àquelas para anticorpo não conjugado de 70 e 30% respectivamente (figura 9). Em con-traste, o conjugado preparado usando o método tradicional de duas etapas mostrou bandas de cadeia pesada e leve de somente 53 e 23% respectiva-mente, e bandas principais de pesos moleculares maiores variando de 99- 152 kDa presumivelmente devido à ligação cruzada intercadeia. Baseado na análise quantitativa por ProteinLabChip, o conjugado preparado pelo método descrito neste pedido é muito superior em termos de falta reticuladas inter-cadeia comparado ao preparado usando o processo convencional de duas etapas (figura 9).
Os conjugados Ab-Sulfo-mal-DM1 com cargas de droga seme-lhantes feitos pelo método descrito nesta invenção e pelo método tradicional de duas etapas foram comparados por análise LC/MS de exclusão de tama-nho (figura 10). Os conjugados feitos pelo método descrito nesta invenção mostra o espectro MS desejado contendo somente a distribuição esperada de picos com massa igual a Ab-(ligante-DMx)n. No caso dos conjugados feitos usando o método tradicional de duas etapas, os principais picos nos es-pectros continham todos um ou mais fragmentos reticuladas ou hidrolisados além das frações desejadas Ab-(ligante-DMx)n. O mecanismo putativo da ligação cruzada intercadeia ou inativação aquosa de maleimida na sequên-cia de reação tradicional de 2 etapas é mostrado na figura 17, por meio do qual o resíduo de maleimida incorporado (ou haloacetamida) a partir da rea-ção inicial do anticorpo com o ligante heterobifuncional pode reagir com re-síduos intramoleculares (ou intermoleculares) de histidina, lisina, tirosina, ou cisteína resultando na ligação cruzada intercadeia, ou o resíduo inicialmente incorporado de maleimida (ou haloacetamida) pode se tornar inativado (como ou clivagem hidrolítica do anel maleimida ou por adição aquosa a maleimida) e, portanto, se tornar indisponível para a reação rápida com o grupo efetor ou relator contendo tiol. Assim, a análise de LC-MS claramente mostra que o método descrito nesta invenção tem a vantagem de produzir conjugados homogêneos com pouco ou nenhum fragmento hidrolisado ou reticuladas ligado ao anticorpo.
A ligação de um conjugado anti-CanAg Ab-Sulfo-Mal-DM1 com 5, 6 de carga de maitansinoide por molécula de anticorpo (média) preparado pelo método descrito nesta invenção foi medido por citometria de fluxo u- sando as células COLO205 que expressam o antígeno, e demonstrou ser semelhante ao anticorpo não conjugado sugerindo que a conjugação não afetou a ligação do anticorpo ao antígeno alvo (figura 11). A atividade citotó- xica do conjugado anti-CanAg Ab-Sulfo-Mal-DM1 preparado pelo método descrito nesta invenção foi medido in vitro usando células de colo cancerí-genas COLO205 que expressam o antígeno CanAg (figura 12). As células cancerígenas que expressam o antígeno foram plaqueadas em cerca de 1000 células/poço em uma placa de 96 poços no meio de cultura contendo soro fetal bovino e exposta a concentrações variadas de Conjugado Ab- DMx. Após uma exposição de 5 dias ao conjugado, as células viáveis rema-nescentes foram medidas usando Ensaio WST-8 (Dojindo Molecular Tech-nologies). Como mostrado na figura 12, o conjugado anti-CanAg Ab-Sulfo- Mal-DM1 preparado usando este método foi altamente potente em baixas concentrações para as células cancerígenas de colo COLO205 expressando o antígeno CanAg. A citotoxicidade deste conjugado foi específica uma vez que pode bloqueada por competição pelo excesso de anticorpo não conju-gado.
Um método alternativo de conjugação usando o método descrito nesta invenção envolveu uma etapa de temperamento usando reagentes maleimida ou haloacetamida (como ácido 4-maleimidobutírico, ou ácido 3- maleimidopropiônico, ou N-etilmaleimida, ou iodoacetamida, ou ácido iodoa- cético) após a conclusão da reação inicial de DMx e ligante heterobifuncional (antes da adição da mistura de reação ao anticorpo) para temperar o excesso do grupo DMx tiol para prevenir qualquer reação indesejada de DMx tiol com o anticorpo. Em um exemplo específico, após conclusão da reação inicial de DMx e ligante heterobifuncional (antes da adição da mistura de reação ao anticorpo), o ácido 4-maleimidobutírico foi adicionado para temperar o excesso do grupo DMx tiol para prevenir qualquer reação indesejada de DMx tiol com o anticorpo durante a reação de conjugação. À mistura de rea ção de DM4 e o reagente Sulfo-Mal-NHS heterobifuncional que continha um excesso de DM4 (3 mM), na conclusão do acoplamento desejado de DM4 tiol ao grupo maleimida do reagente heterobifuncional, um excesso molar de duas vezes de ácido 4-maleimidobutírico (6 mM) foi adicionado à mistura de reação em temperatura ambiente por 20 minutos para temperar o DM4 re-manescente da reação inicial de acoplamento. Sem purificação da mistura de reação, uma alíquota foi misturada com uma solução de anticorpo em tampão fosfato (pH 7,5) sob condições finais de conjugação de 4 mg/ml Ab, 90% tampão fosfato aquoso/10%D MA, pH 7,5. A reação de conjugação foi deixada ocorrer em temperatura ambiente por 2 h. O conjugado anticorpo- DM4 foi purificado a partir do excesso da pequena molécula DM4 e reagen-tes ligantes usando uma coluna de gel filtração G25 equilibrada em tampão pH 7,5 fosfato. A mistura de conjugação foi mantida a 4 C por 2 dias em tampão pH 7,5 para permitir a dissociação de qualquer espécie de DMx liga-da ao anticorpo de forma não covalente ou através de ligante lábil. O conju-gado foi em seguida dialisado durante a noite em pH 5,5 tampão histidi- na/glicina e filtrado por um filtro de 0,22μm para armazenamento final. O número médio de moléculas DM4 por Molécula de Ab no conjugado final foi medido por determinação de absorbância do conjugado a 252 e 280 nm e usando coeficientes de extinção conhecidos para DM4 e anticorpo nestes dois comprimentos de onda. As amostras de conjugado foram analisadas por SDS PAGE não redutor usando o Sistema de eletroforese NuPage com 4-12% Bis Tris Gel (Invitrogen). As amostras aquecidas e desnaturadas foram carregadas a 10 μg/linha. O SDS-PAGE não redutor do conjugado preparado usando o método descrito nesta invenção (sem temperamento) mostrou evidência de uma banda de cadeia leve (~25 kDa) e banda de meio- anticorpo (cadeia pesada-leve; ~75 kDa) (figura 18). Por outro lado, o conju-gado preparado usando o método descrito nesta invenção que foi tratado com ácido 4-maleimidobutírico (para cobrir o excesso de DMx tiol) tinha quantidades significativamente menores destas bandas indesejadas (em níveis comparáveis à amostra de anticorpo não modificada). Outra vantagem do temperamento da mistura de reação inicial de DMx e heterobifuncional (antes da conjugação com o anticorpo) por reagentes temperantes de tiol como ácido 4-maleimidobutírico é que durante a reação de conjugação do anticorpo não há espécies de DMx "livres" (DM1 ou DM4) e, assim, o conju-gado final após purificação não contém espécies "livres" ou não conjugadas de DMx. O DMx-aduto com ácido 4-maleimidobutírico (ou outros reagentes de temperamento polares tipo tiol) é mais solúvel em água do que DMx e, portando, podem ser mais facilmente separados a partir do conjugado ligado covalentemente anticorpo-DMx.
Exemplo 3. Conjugação de anticorpo com maitansinoide (DM1/DM4) usando ligante sulfo-NHS-SMCC (figura 13).
Soluções estoque de DM1 ou DM4 tiol (DMx) e ligante heterobi-funcional sulfo-SMCC com grupo sulfo-NHS (adquirido de Pierce Endogen; figura 13) foram preparados em DMA em concentrações de 30-60 mM. O ligante e DM1 ou DM4 tiol foram misturados em DMA contendo até 40% v/v de tampão aquoso succinato 200 mM, 2 mM EDTA, pH 5,0 para gerar uma proporção de DM1 ou DM4 (DMx) para o ligante de 1,6:1 e uma concentração final de DMx de 6 mM. Após a mistura, a reação foi deixada por 1-4 h em temperatura ambiente e em seguida uma alíquota da mistura de reação foi diluída 10 vezes para medir a absorbância a 302-320 nm para avaliar se toda a maleimida tinha reagido. (Análise adicional de HPLC de fase reversa da alíquota congelada da mistura de reação foi conduzida posteriormente com monitoramento a 302 nm e 252 nm para verificar desaparecimento completo do ligante maleimida e formação do reagente desejado sulfo-NHS- ligante-Mal-DMx no momento da adição da mistura de reação ao anticorpo). Quando nenhuma maleimida esta presente por UV uma alíquota da reação foi adicionada a uma solução aquosa de um anticorpo em tampão fosfato (pH 7,5) sob condições finais de conjugação de 4 mg/ml Ab, 90% tampão fosfato (aquoso)/10% DMA (v/v), pH 7,5. A reação de conjugação foi deixada para ocorrer em temperatura ambiente por 2 h. O Conjugado Ab-DMx foi purificado a partir de excesso de reagente que não reagiu e excesso de DMx usando uma coluna de gel filtração G25 equilibrada em tampão pH 7,5 fosfa-to (aquosa). O conjugado foi mantido a 4 C por 2 dias em tampão pH 7,5 para permitir a dissociação de qualquer espécie de DMx ligada ao Ab de forma não covalente ou através de ligante lábil. O conjugado foi em seguida dialisado durante a noite em pH 5,5 tampão histidina/glicina e em seguida filtrado por um filtro de 0,22μm para armazenamento final. O número de mo-léculas de DMx por Molécula de Ab no conjugado final foi medido por deter-minação de absorbância do conjugado a 252 e 280 nm e usando coeficien-tes de extinção conhecidos para DMx e anticorpo nestes dois comprimentos de onda.
Para comparação, os conjugados Ab-SMCC-DMx foram prepa-rados usando o método de conjugação tradicional de 2 etapas. O anticorpo (Ab) em uma concentração de 8 mg/ml em 95% pH 6,5 tampão fosfato/5% DMA foi modificado com excesso de ligante bifuncional sulfo-SMCC com o grupo sulfo-NHS (adquirido de Pierce Endogen). A reação foi deixada para ocorrer a 25 C por 2 h e em seguida o Ab modificado foi purificado a partir do excesso de ligante não reagido usando G25 cromatografia. A recuperação de Ab purificado foi determinada por Absorbância em UV a 280 nm. O número de grupos maleimida ligados no Ab modificado foi determinado usando uma pequena alíquota de anticorpo modificado pela adição de uma quantidade conhecida de tiol (como 2-mercaptoetanol), adicionada em excesso sobre a maleimida, para reagir com os resíduos de maleimida no anticorpo modificado e em seguida analisado o tiol remanescente pelo Ensaio de Ell- man usando reagente DTNB (coeficiente de extinção de TNB tiolato a 412 nm= 14150 M'1 cm"1; Riddles, P. W. et al., Metods Enzymol, 1983, 91,49-60; Singh, R., Bioconjugate Chem., 1994, 5, 348-351). A conjugação de Ab mo-dificado com DM1 ou DM4 foi conduzido em uma concentração de anticorpo de 2,5 mg/ml em 95% pH 6,5 tampão fosfato/5% DMA (v/v), com 1,7 equiva-lente mola de DM1 ou DM4 tiol adicionado por mol de maleimida ligada no Ab. A reação foi deixada por 8-24 ha 18 C e o conjugado foi separado do DM1 em excesso não reagido (ou DM4) através de cromatografia G25. Após a purificação o conjugado foi mantido a 4 C por 2 dias em pH 6,5 tampão para permitir a hidrólise de qualquer espécie DM1/DM4 fracamente ligada. O conjugado foi em seguida dialisado durante a noite em pH 5,5 tampão histi- dina/glicina e em seguida filtrado por um filtro de 0,22μm para armazena-mento final. O número de moléculas de DM1/DM4 por Molécula de Ab no conjugado final foi medido por determinação de absorbância do conjugado a 252 e 280 nm e usando coeficientes de extinção conhecidos para DM1 /DM4 e anticorpo nestes dois comprimentos de onda.
SDS PAGE redutor foi conduzido em amostras do conjugado e anticorpo (10 μg/linha ) usando o Sistema de eletroforese NuPage (Invitro- gen) com um NuPage 4 a 12% Bis Tris Mini Gel e NuPAGE MOPS SDS tampão de corrida (figura 14). As bandas no gel com pesos moleculares de 75, 125, e 150 kDa foram indicativas de espécies reticuladas e intercadeia (HL, H2L e H2L2 respectivamente). Uma comparação de conjugados Ab- SMCC-DM1 com 3,1 D/Ab (linha 4, por este método, e linha 3, pelo método tradicional de 2 etapas, respectivamente) claramente mostrou que o conju-gado através do método descrito nesta invenção (linha 4) teve menos espé-cies reticuladas de alto peso molecular do que os conjugados feitos pelo mé-todo tradicional de 2 etapas (linha 3).
A análise de eletroforese ProteinLabChip (sob condição reduto-ra) do conjugado anticorpo-SMCC-DM1 preparado pelo método descrito nes-ta invenção mostrou bandas de cadeia pesada e leve principais com percen-tuais de 67 e 30% (de proteína total), que são semelhantes àquelas para anticorpo não conjugado de 68 e 30% respectivamente (figura 15). Em con-traste, o conjugado preparado usando o método tradicional de duas etapas mostrou bandas pesadas e leves de somente 54 e 24% respectivamente, e bandas principais de pesos moleculares maiores variando de 96-148 kDa presumivelmente devido à ligação cruzada intercadeia. Baseado na análise quantitativa de ProteinLabChip, o conjugado preparado pelo método descrito neste pedido é muiro superior em termos de ausência reticuladas intercadeia comparado ao preparado usando o processo convencional de duas etapas (figura 15).
Os conjugados Ab-SMCC-DM1 com cargas semelhantes de drogas feitos pelo the método descrito nesta invenção e pelo método tradi-cional de duas etapas foram comparados por análise LC/MS por exclusão de tamanho (figura 16). O conjugado preparado pelo método descrito nesta in-venção mostra o espectro MS desejado contendo somente a distribuição de picos desejada com massa igual a Ab-(ligante-DMx)n. No caso do conjugado feito usando o método tradicional de duas etapas o espectro mostra uma mistura heterogênea de espécies que inclui as espécies desejadas Ab- (ligante-DMx)n mais as espécies adicionais contendo maleimida inativada e fragmentos de ligante reticuladas. Os mecanismos putativos da ligação cru-zada intercadeia e inativação de maleimida na tradicional sequência de rea-ção de 2 etapas são mostrados na figura 17 por meio do qual a maleimida incorporada (ou resíduo de haloacetamida) da reação inicial de anticorpo com o ligante heterobifuncional pode reagir com resíduos intramoleculares (ou intermoleculares) de histidina, lisina, tirosina, ou cisteína resultando na ligação cruzada intercadeia, ou o resíduo de maleimida inicialmente incorpo-rado (ou haloacetamida) pode obter inativação por hidrólise ou hidratação do resíduo de maleimida antes da etapa de reação com o agente DM1 ou DM4 contendo o tiol (DMx). Assim a análise de LC-MS claramente mostra que o método descrito nesta invenção tem a vantagem de produzir conjugados homogêneos com pouca ou nenhuma maleimida inativada ou fragmentos de ligante com ligação cruzada anexados ao anticorpo.
Exemplo 4. Conjugação de anticorpo com DM1/DM4 (DMx) com ligantes cliváveis, dissulfeto por este método (figura 19).
As soluções estoque contendo DM1 ou DM4 tiol (DMx) e ligante heterobifuncional ácido 4-(2-piridilditio)butanoico-A/-hidróxisuccinimida éster (SPDB) foram preparados em DMA em concentrações de 30-60 mM. O li-gante e DMx tiol foram misturados em DMA contendo até 40% v/v de um tampão aquoso succinato 200 mM, 2 mM EDTA, pH 5,0 para gerar uma pro-porção de DM1 ou DM4 (DMx) para o ligante de 1,6:1 e uma concentração final de DMx de 8 mM. Após a mistura, a reação foi deixada por 1 h em tem-peratura ambiente e em seguida uma alíquota da reação foi adicionada a uma solução aquosa de anticorpo em tampão fosfato (pH 7,5) sob condições finais de conjugação de 4 mg/ml Ab, 90% tampão fosfato (aquosa)/ 10% DMA (v/v), pH 7,5. A reação de conjugação foi deixada ocorrer em tempera- tura ambiente por 2 h. O Conjugado Ab-DMx foi purificado a partir de um excesso do reagente DMx não reagido DMx usando uma coluna de gel filtra-ção G25 equilibrada em tampão pH 7,5 fosfato (aquoso). O conjugado man-tido a 4°C por 2 dias em tampão pH 7,5 para permitir a dissociação de qual-quer espécie de DMx ligado ao Ab de forma não covalente ou através de ligante lábil. O conjugado foi em seguida dialisado durante a noite em pH 5,5 tampão histidina/glicina e em seguida filtrado por um filtro de 0,22μm para armazenamento final. O número de moléculas de DMx por molécula de Ab no conjugado final foi medido pela determinação de absorbância do conju-gado a 252 e 280 nm usando coeficientes de extinção conhecidos para DMx e anticorpo nestes dois comprimentos de onda.
Exemplo 5. Preparação de conjugado anticorpo-DM1/DM4 (Ab- DMx) com ambos ligantes dissulfeto e não cliváveis usando este método (figura 20).
Soluções estoque de DM1 ou DM4 tiol (DMx) e o ligante hetero-bifuncional NHS-PEGn-Maleimida foram preparadas em N,N- dimetilacetamida (DMA) em concentrações de 30-80 mM. Este ligante NHS- PEG4-Maleimida e DMx tiol foram misturados em DMA contendo até 40% v/v de 200 mM tampão succinato, 2 mM EDTA, pH 5,0 para gerar uma proporção molar de DMx para o ligante de 1,6:1 e uma concentração final de DMx igual a 8,0 mM. A mistura de reação foi deixada para reagir por 2 h em temperatura ambiente. Em uma reação separada em paralelo, o ligante SPDB e DMx tiol foram misturados e reagidos de maneira semelhante às condições usadas para a reação de NHS-PEG4-maleimida exceto para o tempo de reação de 1 h. Após a conclusão de ambas as reações e sem purificação, volumes iguais de mistura de PEG4-Mal-DM4 e mistura de SPDB-DM4 foram combinadas. Uma alíquota das misturas de reações combinadas foi adicionada sem purificação a uma solução de anticorpo em tampão fosfato (pH 7,5) sob condições finais de conjugação de 4 mg/ml Ab, 90% tampão fosfato (aquoso)/10% DMA (v/v), pH 7,5. A reação de conjugação foi deixada para ocorrer em temperatura ambiente por 2 h. O conjugado Ab-DMx foi purificado a partir de reagentes não reagidos em excesso e excesso de DMx usan- do uma coluna de gel filtração G25 equilibrada em tampão pH 7,5 fosfato (aquoso). O conjugado foi mantido a 4°C por 2 dias em tampão pH 7,5 para permitir a dissociação de espécies de DMx ligadas ao Ab de forma não cova- lente ou através de ligante lábil. O conjugado foi em seguida dialisado durante a noite em pH 5,5 tampão histidina/glicina e em seguida filtrado por um filtro de 0,22μm para armazenamento final. O número of moléculas de DMx por molécula de Ab no conjugado final foi medido pela determinação de ab- sorbância do conjugado a 252 e 280 nm usando coeficientes de extinção conhecidos para DMx e anticorpo nestes dois comprimentos de onda.
O conjugado Ab-(ligantes misturados SPDB e PEG4-Mal)-DMx preparados através do método descrito nesta invenção foi testado para de-terminar o percentual de incorporação de ligante clivável versus ligante não clivável no Ab por comparação de proporção de DMx por anticorpo (D/A) antes e após tratamento de DTT (ditiotreitol) do conjugado para reduzir o ligante dissulfeto. Para manter o pH da reação em 7,5 durante a redução com DTT, o conjugado foi primeiro dialisado em HEPES 250 mM tampão pH 7,5. O conjugado foi em seguida reduzido com 25 mM DTT por 20 min a 37°C. Após a reação com DTT, os DMx e DTT liberados foram separados da mistura de reação usando uma coluna de gel filtração G25 equilibrada em 250 mM HEPES tampão pH 7,5. O número médio de moléculas de DMx por molécula de Ab no produto purificado foi medido pela determinação da ab- sorbância do conjugado a 252 e 280 nm e usando coeficientes de extinção conhecidos para DMx e anticorpo nestes dois comprimentos de onda. A proporção entre D/A de conjugado tratado com DTT e D/A de conjugado não tratado com DTT foi usada para calcular o percentual de DMx ligado ao Ab através de ligante não clivável. Duas amostras adicionais, conjugados Ab- SPDB-DM4 e Ab-PEG4-Mal-DM4, foram tratadas com DTT como controles positivo e negativo, respectivamente. Comparando a proporção D/A antes e após o tratamento com DTT, o conjugado controle não clivável Ab-PEG4- Mal-DM4 mostrou que aproximadamente todos os ligantes ligados demonstraram ser não cliváveis (93%) como esperado. O conjugado Ab-(ligante misturado SPDB e PEG4Mal)-DMx contendo ambos ligantes não clivável e dis- sulfeto preparados pelo método descrito nesta invenção teve 41% menos DMx clivado pelo tratamento com DTT em relação à quantidade de perda de DMx do conjugado Ab-SPDB-DMx que consiste totalmente em ligante clivá- vel. Isto demonstrou que o conjugado Ab-( SPDB e PEG4-Mal misturados)- DMx preparados pelo método descrito nesta invenção foi composto de apro-ximadamente de 40% de ligantes não cliváveis e 60% cliváveis. Alterando a proporção inicial de reagentes ligantes não cliváveis e cliváveis, conjugados de anticorpo com maitansinoide ou outro efetor podem ser preparados com proporções diferentes de ligantes não cliváveis e cliváveis. A figura 21 mos-tra o espectro de massa do conjugado deglicosilado descrito acima, que compreende o anticorpo com uma média de 3,5 moléculas de maitansinoide por molécula de anticorpo ligados através de ambos ligantes dissulfeto (SPDB) e ligantes não cliváveis (PEG). O MS mostra discretas espécies de conjugado contendo ambos ligantes cliváveis e ligantes não cliváveis (figura 21). Por exemplo, o pico do conjugado designado D2-PEG-SPDB contém uma molécula de maintasinoide ligada a dissulfeto e uma ligada a tioéter não clivável; o pico do conjugado designado D3-PEG-2SPDB contém duas moléculas maitansinoide ligadas a dissulfeto e uma ligada a tioéter não clivável; e o pico do conjugado designado D3-2PEG-SPDB contém uma molécula de maitansinoide ligada a dissulfeto e duas ligadas a tioéter não clivável.
Exemplo 6. Conjugação de anticorpo com maitansinoide usando ligante SMCC (figure 22).
Soluções estoque de DM1 tiol e ligante heterobifuncional SMCC (Pierce) foram preparadas em DMA em concentrações de 30-60 mM. O li-gante e DM1 tiol foram misturados em DMA contendo até 50% v/v de tampão aquoso 200 mM succinato, 2 mM EDTA, pH 5,0 para gerar uma proporção de DM1 para o ligante de 1,4:1 equivalente em mol e uma concentração final de DM1 de 1 a 6 mM. Após a mistura, a reação foi deixada por até 4 h em temperatura ambiente e em seguida uma alíquota da mistura de reação foi diluída 10 vezes para medir a absorbância em 302-320 nm para avaliar se toda a maleimida tinha reagido com tiol. Quando nenhuma maleimida esta presente pelo UV, uma alíquota da reação foi adicionada a uma solução aquosa de um anticorpo em tampão fosfato (pH 7,5-8,5) sob condições finais de conjugação de 2,5 mg/ml Ab, 70-80% tampão fosfato (aquoso)/30-20% DMA (v/v). A reação de conjugação foi deixada para ocorrer em temperatura ambiente por 3 h. O conjugado Ab-DM1 foi purificado a partir de excesso de reagente não reagido ou hidrolisado e excesso de DM1 usando uma coluna de gel filtração G25 equilibrada em pH 7,4 tampão fosfato (aquoso). O con-jugado foi em seguida dialisado durante a noite em pH 7,4 tampão fosfato (aquoso) e em seguida filtrado por um filtro de 0,22μm para armazenamento final. O número de molécula de DM1 por molécula de Ab no conjugado final foi medido pela determinação de absorbância do conjugado em 252 e 280 nm e usando coeficientes de extinção conhecidos para DM1 e anticorpo nestes dois comprimentos de onda. De forma semelhante, conjugados de anticorpo com DM4 tiol e SMCC podem ser preparados. Estes conjugados de anticorpo com DM1 ou DM4 usando ligante SMCC contêm ligante tioéter não clivável.
O conjugado Ab-SMCC-DM1 preparado pelo método descrito nesta invenção foi caracterizado pela análise de MS de conjugado desglico- silado (figura 23). O conjugado preparado pelo método descrito nesta inven-ção mostra o espectro MS desejado contendo a distribuição esperada dos picos com massa igual a Ab-(ligante-DM1)n.
Exemplo 7. Conjugação de anticorpo com maitansinoide usando ligantes heterobifuncional contendo dissulfeto (SSNPB, SPP).
Ligantes heterobifuncionais contendo dissulfeto SSNPB (N- sulfosuccinimidil-4-(5-nitro-2-piridilditio) butirato) e SPP (/V-succinimidil-3-(2- piridilditio)propionato) podem ser usados para preparar conjugados prepare anticorpo- maitansinoide ligados a dissulfeto pelo método semelhante ao descrito para o ligante SPDB no Exemplo 4. A estrutura do conjugado ligado ao dissulfeto preparado usando SPDB (figura 19) é idêntico ao do conjugado preparado com SSNPB (figura 24). O MS do conjugado ligado a dissulfeto preparado usando SPDB mostrou picos discretos com valores de massa cor-respondentes aos diferentes números de moléculas de maitansinoide ligadas ao anticorpo.
Exemplo 8. Conjugação de anticorpo com maitansinoide conten-do ligantes não cliváveis com cadeia de carbono alquil linear.
Conjugados contendo ligante não clivável com cadeia de carbo-no alquil linear foram preparados usando mistura de reação de maitansinoi-de e heteroligantes bifuncionais com cadeia de carbono alquil linear, seme-lhante ao método descrito para o ligante SMCC no exemplo 6. Por exemplo, conjugados de um anticorpo humanizado com DM1 foram preparados usan-do ligante BMPS (N-β-maleimidopropiloxi]succinimida éster) ou GMBS ((N- [Y-maleimidobutiriloxi]succinimida éster) como mostrado na figura 26. A mis-tura de reação inicial contendo BMPS ou GMBS (8 niM) e DM1 tiol (10,4 mM) em 60% DMA/40% (v/v) 200 mM tampão succinato, pH 5, mostrou reação completa da fração maleimida (baseado no decaimento da absorbância de maleimida em 302-320 nm) quando verificado em 15 min. Esta mistura de reação foi adicionada, em duas porções 30 min de espaço, a uma solução de anticorpo humanizado a 2,5 mg/ml em tampão aquoso EPPS 80%, pH 8,1, contendo 20% DMA (v/v) com o ligante total adicionado a 8 equivalentes molar para o anticorpo. A mistura do conjugado foi gel purificada após 4 h e submetida a 2 rodadas de diálise. Os conjugados com proporção DM1 /anticorpo de 3,8 e 5,1 foram preparados com 71-75% de recuperação, e alto % de monômero (96,2-97,6%). Estes conjugados preparados com GMBS ou BMPS não mostraram nenhuma droga livre pela análise de HISEP HPLC. De maneira semelhante, os conjugados contendo ligantes não cliváveis com cadeias alquil lineares podem ser preparados usando AMAS (N-[β- maleimidoacetoxi]succinimida éster) ou EMOS (N-[β- maleimidocaproiloxi]succinimida éster) ou os ésteres sulfo-N- hidróxisuccinimida (sulfo-GMBS, sulfo-EMCS) como mostrado na figura 25. A Tabela 1 mostra o % de monômeros para selecionar conjugados prepara-dos pelo método descrito nesta invenção, em que todos mostraram alto % de monômero pela análise de cromatografia por exclusão de tamanho. Para comparação, o % de monômero também é mostrado para conjugados prepa-rados pelo método tradicional de conjugação em duas etapas (pela reação inicial de anticorpo com o ligante heterobifuncional seguido pela reação com maiansinoide tiol). Tabela 1. % de monômero para selecionar conjugados preparados pelo mé-todo descrito neste pedido versus método tradicional de conjugação em duas etapas.
Figure img0014

Claims (15)

1. Processo para preparar um conjugado purificado em uma solução, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende um maitansinoide compreendendo um grupo tiol ligado a um anticorpo, o processo compreendendo as etapas de: (a) contatar o maitansinoide com um reagente ligante bifuncional para unir de forma covalente o ligante ao maitansinoide e, assim, preparar uma primeira mistura não purificada compreendendo o maitansinoide contendo ligantes ligadas a estas, (b) conjugar o anticorpo ao maitansinoide contendo ligantes unidos a estas ao reagir a primeira mistura não purificada com o anticorpo para preparar uma segunda mistura e (c) submeter a segunda mistura à uma filtração de fluxo tangencial, diálise, gel filtração, cromatografia adsortiva, precipitação seletiva ou uma combinação das mesmas para assim preparar o conjugado purificado.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é conduzida em uma solução em um pH de 4 a 9.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o maitansinoide é DM1.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o maitansinoide é DM4.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal humano ou humanizado.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é MY9, anti-B4, EpCAM, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD11, CD19, CD20, CD22, CD26, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD79, CD105, CD138, receptores EphA, receptores EphB, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, mesotelina, cripto, alfavbeta3, alfavbeta5 e alfavbeta6, integrina.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humano ou humanizado é huMy9-6, huB4, huC242, huN901, DS6, CNTO 95, B-B4, trastuzumabe, pertuzumabe, bivatuzumabe, sibrotuzumabe, ou rituximabe ou um anticorpo humano ou humanizado que se liga a um antígeno selecionado do grupo que consiste em receptor EphA2, CD38 e IGF-IR.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ligante é um ligante clivável.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ligante é um ligante não clivável.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH da solução na etapa (b) é de 5 a 8,7.
12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o pH da solução na etapa (b) é de 6,5 a 8,5.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o processo ainda compreende a etapa de extinguir o maitansinoide na primeira mistura não purificada com um reagente de extinção entre as etapas (a) e (b).
14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o reagente de extinção é selecionado do grupo que consiste em ácido 4-maleimidobutírico, ácido 3-maleimidopropiônico, N-etilmaleimida, iodoacetamida, e ácido iodoacetamidopropiônico.
15. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o reagente ligante bifuncional é selecionado do grupo que consiste em N-succinimidil 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato (SMCC), N- succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-l-carboxi-(6-amidocaproato) (LC- SMCC), ácido K-maleimidoundecanoico N-succinimidil éster (KMUA), ácido Y- maleimidobutírico N-succinimidil éster (GMBS), ácido ε-maleimidocaproico N- hidroxisuccinimida éster (EMCS), éster m-maleimidobenzoil-N- hidroxisuccinimida (MBS), éster N-(α-maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6-(β-maleimidopropionamido)hexanoate (SMPH), N-succinimidil 4- (p-maleimidofenil)-butirato (SMPB), e N-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI), N- succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil iodoacetato (SIA), N-succinimidil bromoacetato (SBA), N-succinimidil 3- (bromoacetamido)propionato (SBAP), N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato(SPDP), N-succinimidil 4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB), e N-succinimidil 4-(2- piridilditio)pentanoato (SPP).
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