TR201907573T4 - Konjugasyon yöntemleri̇ - Google Patents

Konjugasyon yöntemleri̇ Download PDF

Info

Publication number
TR201907573T4
TR201907573T4 TR2019/07573T TR201907573T TR201907573T4 TR 201907573 T4 TR201907573 T4 TR 201907573T4 TR 2019/07573 T TR2019/07573 T TR 2019/07573T TR 201907573 T TR201907573 T TR 201907573T TR 201907573 T4 TR201907573 T4 TR 201907573T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
antibody
conjugate
dmx
reaction
prepared
Prior art date
Application number
TR2019/07573T
Other languages
English (en)
Inventor
A Kellogg Brenda
Singh Rajeeva
V J Chari Ravi
Original Assignee
Immunogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43298108&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TR201907573(T4) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immunogen Inc filed Critical Immunogen Inc
Publication of TR201907573T4 publication Critical patent/TR201907573T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/38—Antigens from snakes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D213/70—Sulfur atoms
    • C07D213/71—Sulfur atoms to which a second hetero atom is attached
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/14—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Abstract

Bu buluş, bir efektör grubuna (örn., bir sitotoksik ajan) veya bir raportör gruba (örn., bir radyonüklid) sahip bir antikor gibi bir hücre bağlayıcı ajan konjuge etme yöntemini tarif eder, burada raportör veya efektör grubu önce iki işlevli bir bağlayıcı ile reaksiyona sokulur ve karışım daha sonra hücre bağlama maddesi ile konjugasyon reaksiyonu için saflaştırılmadan kullanılır. Bu buluşta tarif edilen yöntem, efektör veya raportör gruplara sahip antikorlar gibi hücre bağlanma ajanlarının kararlı şekilde bağlanmış konjugatlarının hazırlanması için avantajlıdır. Bu konjugasyon yöntemi, yüksek verimlerde, zincirler arası çapraz bağlama ve inaktive edilmiş bağlayıcı rezidülere sahip olmayan yüksek saflıkta ve homojenlikte konjugatlar sağlar.

Description

TARIFNAME KONJUGASYON YÖNTEMLERI tarihinde dosyalanmistir. BULUSUN ALANI Bu bulus, bir efektör grubunun (diger bir deyisle, maytansinoidler) bir hücre baglama ajanina (diger bir deyisle, bir antikor veya bunun bir fragmanina) bir bifonksiyonel baglayici vasitasiyla konjuge edilmesinin yeni bir yöntemiyle ilgilidir; söyle ki proses molekül içi veya moleküller arasi reaksiyonlar nedeniyle olusan arzu edilmeyen hidrolize edilmis türler veya arzu edilmeyen çapraz baglanmis türlerin olusumuna neden olan adimlari ortadan kaldirir. BULUSUN ALT YAPISI Küçük sitotoksik ajanlar veya sitotoksik proteinler gibi efektör gruplarina sahip antikorlar gibi hücre baglama ajanlarinin konjugatlari, anti-kanser terapötiklerinin gelistirilmesi nedeniyle büyük ilgi görmektedir (Richart, AD and Tolcher, AW, 2007, Nature Clinical Practice, 4, 245-25). Bu konjugatlar, seçilen antikorlarin, tümör hücrelerinin hücre yüzeyinde eksprese edilen antijenlere karsi yüksek özgüllügü nedeniyle tümör- spesifiktir. Tümör hücresine spesifik baglanma üzerine, antikor-sitotoksik ajan konjugati hedef kanser hücresinin içine içsellestirilir ve ayristirilir, böylece kanser hücresinin öldürülmesiyle sonuçlanan mikrotübül dinamikleri veya DNA replikasyonu gibi temel hücresel fonksiyonlari engelleyen aktif sitotoksik ajan serbest birakilir. Konjugatin plazma içinde arzu edilen stabilitesini korurken, konjugatin içsellestirilmesi ve islenmesi üzerine hücrenin içine iletilmesini arttirmak amaciyla antikorlari sitotoksik ajanlarla baglamak için çesitli baglayicilar kullanilmistir. Bu baglayicilar, hücre içi tiyol ile indirgeme kinetiklerini etkilemek için farkli derecelerde sterik engel ile tasarlanan disülfit baglayicilari, valin-sitrülin bagi gibi parçalanabilir peptit baglayicilari ve tiyoeter bagi gibi parçalanamayan baglayicilari içerir (Widdison, W., et al., J. Med. Chem., 2006, 49, Etiketli veya haberci gruba sahip antikorlar gibi hücre baglama ajanlarin konjugatlari, kanser hastalarinda tümör görüntüleme uygulamalari, çesitli hastaliklarin teshisi için immünolojik test uygulamalari, radyoaktif nüklid-ligand konjugatlarini kullanarak kanser tedavisi ve saflastirma için afinite kromatografisi uygulamalari için faydalidir. Proteinler, peptidler ve oligonükleidler gibi biyoaktif maddelerin miktari hücre baglama maddeleriyle konjuge edilmis etiketler veya haberci gruplar, floroforlar ve biotin gibi afinite etiketlerini Bir antikor (Ab) gibi hücre baglama ajaninin bir efektör grubuyla (örn., sitotoksik bir ajan) veya indirgenemez bir baglanti (örn., tiyoeter bagi gibi) ile baglanmis bir haberci grupla (örn., bir radyo etiket) konjuge edilmesinin geleneksel yöntemi, antikor ile iki farkli reaksiyon adimi kullanir ve saflastirma adiminin kullanilmasini gerektirir. Birinci reaksiyon adiminda, antikor iki farkli reaktif grup (örnegin, X ve Y) tasiyan heterobifonksiyonel bir baglayici ile reaksiyona sokulur. Örnegin, bir yaklasimda, bir antikorun reaktif rezidülerinin (Iisin amino rezidüleri gibi) heterobifonksiyonel reaktifin X reaktif grubu (N-hidroksisüksinimit ester gibi) ile reaksiyonu, baglayicinin antikordaki bir veya daha fazla reaktif rezidüdeki (Iisin amino rezidüleri gibi) Y reaktif grubu ile birlesmesi ile sonuçlanir. Ilk olarak modifiye edilmis antikor ürünü, bir sonraki adim gerçeklesmeden önce fazlalik baglayicidan veya hidrolize edilmis baglayici reaktifinden saflastirilmalidir. Ikinci reaksiyon adiminda, Y reaktif grubunu (örn., maleimid veya haloasetamid gibi) içeren baglayici modifiye edilmis antikor, ilave bir saflastirma adiminda tekrar saflastirilan antikor-efektör konjugatini üretmek için, tiyol gibi reaktif bir grup içeren bir efektör grubu (C) (örnegin, bir sitotoksik ajan) gibi efektör ile reaksiyona nedenle, yukaridaki proseste en az iki saflastirma adimina ihtiyaç duyulur. Antikoru bir efektör veya haberci grubuyla konjuge etmek için için iki reaksiyon ve saflastirma adimi içeren baska bir yaklasim, antikor içindeki (antikorun 2-iminotiy0l gibi tiyol üreten reaktiflerle modifikasyonu yoluyla veya dogal olmayan sistein rezidülerinin mutajenezi yoluyla veya dogal disülfit baglarinin azaltilmasi yoluyla üretilen) tiyol rezidülerinin Y reaktif gruplar (maleimid veya haloasetamid gibi) içeren bir homobifonksiyonel baglayici Y-L-Y ile reaksiyonunu kullanir. Bir antikor veya peptide, maleimid (veya haloasetamid) gibi bir reaktif grup Y'nin dahil edilmesinin ana dezavantajlari, reaktif maleimid (veya haloasetamid) gruplarinin, dogal histidin, lizin, tirozin veya antikor veya peptiddeki sistein rezidüleri ile molekül içi veya moleküler arasi reaksiyona girme egilimi (Papini, A. et al., Int. J. Pept. Protein Res., grubunun sulu inaktivasyonudur. Antikora dahil edilmis olan maleimid (veya haloasetamid) gruplari Y'nin antikorda dogal histidin, lisin veya sistein rezidüleri ile arzu edilmeyen molekül içi veya moleküller arasi reaksiyonu ve Y maleimid grubunun efektör veya haberci grubu C ile ikinci reaksiyondan önce sulu inaktivasyonu çapraz baglanmis proteinlere veya heterojen konjugatlara yol açar ve ikinci reaksiyonun efektör veya haberci grup C ile verimini düsürür. Baslangiçta dahil edilen grup Y*nin arzu edilmeyen reaksiyonundan üretilen heterojen konjugat ürün çapraz baglanmis protein veya peptit antikorda veya peptidlerde (histidin, lisin, tirosin veya sistein gibi) dogal gruplarla veya sulu inaktivasyon ile üretilen inaktif maleimid rezidüleri ile (örnegin maleimid grubu), arzu edilen homojen konjuge üründen daha düsük aktiviteye ve stabiliteye sahip olabilir. Antikorlarin, tiyol içeren sitotoksik ajanlere disülfit baglari vasitasiyla konjuge edilmesi için prosesler daha önce tarif edilmistir (bakiniz, örn., U.S. Patentleri 5,208,020, antikorun heterobifonksiyonel bir reaktif ile baslangiç reaksiyonunu takiben tiyol içeren bir sitotoksik ajan ile ikinci bir reaksiyonu içerir. Sitotoksik ajanin disülfit-baglanmis reaktif esterinin ilk önce saflastirildigi ve daha sonra antikor ile reaksiyona girdigi, ancak antikor ile reaksiyon adimindan önce ajan sitotoksik tiyol grubundan baslayarak ilave bir reaksiyon ve saflastirma adimi içeren U.S. patenti 6,441,163 B1'de alternatif bir proses tarif edilmistir. Hücre baglama ajanilarin konjugatlarini yapmak için mevcut prosesin bir baska dezavantaji, toplam verimi düsüren ve ayni zamanda prosesi ölçeklendirmek için kullanissiz ve ekonomik olmayan iki saflastirma adimina duyulan ihtiyaçtir. U.S. yönelik yöntemleri açiklar. Yukarida belirtilenler isiginda, teknikte, esas olarak yüksek saflikta olan ve zahmetli adimlardan kaçinarak ve kullanici için zaman ve maliyeti düsürerek hazirlanabilir hücre baglama maddesi-ilaç konjugat bilesimlerinin hazirlanmasi için iyilestirilmis yöntemler gelistirmeye ihtiyaç duyulmaktadir. Bulus böyle bir yöntem saglamaktadir. Bulusun bu ve diger avantajlari ve ayrica ilave bulus özellikleri, burada saglanan bulusun tarifnamesinden anlasilacaktir. BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus, CL-CBA formülünün indirgenemez, tiyoeter-baglanmis konjugatlarinin hazirlanmasina yönelik bir konjugasyon yöntemini tarif etmektedir, burada C, bir sitotoksik ajani temsil eder; L, bir baglayicidir ve CBA, tiyol içeren sitotoksik ajanin (diger bir deyisle, maytansinoidlerin) bir hetero veya bir homo-bifonksiyonel reaktif (örn., parçalanabilir veya parçalanamayan bir baglayici) ile dogrudan reaksiyonu kullanilarak, daha sonra saflastirilmamis reaksiyon karisiminin bir hücre baglama maddesi (diger bir deyisle, bir antikor veya bunun bir fragmani) ile karistirilmasi ile bir hücre baglama ajanidir, böylece indirgenemez, tiyoeter-baglanmis bir konjugatin daha etkin, daha verimli bir prosesle üretilmesini saglar ve ölçeklendirme için uygundur. Bir baska önemli avantaj, bu türlü bir konjugasyon yönteminin, zincirler arasi protein çapraz baglama veya inaktive edilmis rezidüler (örn., maleimid veya haloasetamid rezidüleri) olmaksizin tiyoeter-baglanmis indirgenemez konjugatlar vermesidir. Bu basvuruda açiklanan yeni yöntemler, yukaridaki formül ile temsil edilen herhangi bir konjugatin hazirlanmasinda uygulanabilir. Burada yer alan açiklamaya dayanarak, mevcut bulus bir çözeltide saflastirilmis bir konjugat hazirlamak için bir proses saglar, burada konjugat bir antikora baglanmis bir tiyol grubu içeren bir maytansinoid içerir, bu proses asagidaki adimlari içerir: (a) baglayiciyi maytansinoide kovalent olarak baglamak ve böylece buna baglanmis baglayicilara sahip maytansinoidi içeren saflastirilmamis bir birinci karisim hazirlamak için maytansinoidin bir bifonksiyonel baglayici reaktif ile temas ettirilmesi, (b) bir antikorun, saflastirilmamis birinci karisimin, ikinci bir karisim hazirlamak için antikor ile reaksiyona sokulmasiyla baglanan baglayicilara sahip maytansinoide konjuge edilmesi ve (0) ikinci karisimin tegetsel bir akis filtrasyonu, diyaliz, jel filtrasyonu, adsorptif kromatografi, seçici çökeltme veya bunlarin bir kombinasyonuna tabi tutulmasi, böylece saflastirilmis konjugatin hazirlanmasi. Mevcut bulus ve uygulamalari, ekteki istemlerde açiklanmaktadir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, antikorun maytansinoid DM1 (veya DM4) ve Maleimide-PEGn-NHS baglayicisinin reaksiyon karisimi ile konjugasyonunu göstermektedir Sekil 2, geleneksel 2 adimli yöntem kullanarak hazirlanan konjugelere karsi, bu bulusta tarif edilen yöntemi kullanarak hazirlanan Ab- (PEG4-Mal)-DM4 konjugatlarinin SDS-PAGE'sinin indirgenmesini göstermektedir. Her numune seridi, 10 pg protein içermekteydi; Jel Coomassie Blue ile lekelendi. Serit 1 ve 2, moleküler agirlik markörleri içerir. Serit 3, geleneksel iki adimli yöntemle hazirlanan konjugati Ab basina 6,1 DM4 içermistir. Serit 4, bu bulusta açiklanan yöntemle hazirlanan konjugati ve Ab basina 6.2 DM4 içermistir. Sekil 3, geleneksel 2 adimli yöntem kullanilarak hazirlanan konjugatlara karsi, bu bulusta açiklanan yöntem kullanilarak hazirlanan Ab-(PEG4-Mal)-DM4 konjugatlarinin Protein LabChip elektroforezini göstermektedir. A. Ab-(PEG4- MaI)-DM4 konjugatlarinin indirgenme kosulu (Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230 kiti) altinda Protein LabChip elektroforezi. Serit 1: moleküler agirlik markörleri; serit 2: bu bulusta tarif edilen yöntem kullanilarak sentezlenen Ab- PEG4-Mal-DM4, 6.2 D/Ab; serit 3: 2 adimli konjugasyon yöntemi kullanilarak sentezlenen Ab-PEG4-Mal-DM4, 6.1 D/Ab; serit 4: konjuge edilmemis Ab (her seritte 0.24 mikrogram toplam protein). Üst markör, sistem tepe noktasi ve alt markör bantlari kitten eklenen harici markörleri temsil eder. B. Protein LabChip elektroforezinden protein bantlarinin nicellestirilmesi. Sekil 4, geleneksel 2 adimli yöntem kullanarak hazirlanan konjugatlara karsi, bu bulusta tarif edilen yöntemi kullanarak hazirlanan Ab-(PEG4-MaI)-DM4 konjugatlarinin MS'ini göstermektedir. A. Ab basina 6,1 DM4 olan geleneksel iki adimli yöntemle hazirlanan konjugatin MS'si. Konjugatin belirgin heterojenligi nedeniyle, MS tepe noktalari iyi çözülememistir. B. Bu bulusta açiklanan yöntemle hazirlanan ve Ab basina 6,2 DM4 içeren konjugatin MS'si. Konjugatin homojenligi nedeniyle, MS tepe noktalari iyi çözülmüstür. Sekil 5, bir anti-CanAg antikoru-PEG4-MaI-DM1 konjugatinin antikor basina , modifiye edilmemis antikorun CanAg antijenini eksprese eden COLO205 hücrelerine baglanmasini göstermektedir. Baglanma, floresan birimlerinde ölçülmüstür. Sekil 6, bir anti-CanAg Antikoru-PEG4-MaI-DM1 konjugatinin antikor basina CanAg antijenini eksprese eden COLO205 hücrelerine karsi in vitro sitotoksisitesini göstermektedir. Konjugat, COL0205 hücrelerine eklenmistir ve konjugat ile 5 günlük sürekli inkübasyonun ardindan, hücrelerin canliligi WST-8 tahlili kullanilarak ölçülmüstür. Konjugatin özgüllügünü göstermek için, konjugatin hedef kanser hücrelerine dogru baglanmasini ve sitotoksisitesini bloke etmek için bir konjuge olmayan fazlalik anti-CanAg antikor kullanilarak bir kontrol deneyi yapilmistir. Sekil 7, bir DM1 (veya DM4) ve Maleimide-Sulfo-NHS baglayici reaksiyon karisimiyla antikorun konjugasyonunu göstermektedir. Sekil 8, geleneksel 2 adimli yöntem kullanilarak hazirlanan kongugatlara karsi, bu bulusta tarif edilen yöntem kullanilarak hazirlanan Ab-(Sulfo-Mal)-DM| konjugatlarinin SDS-PAGE'sinin indirgenmesini göstermektedir. Her numune seridi, 10 pg protein içermekteydi; Jel Coomassie Blue ile lekelendi. Serit 1, moleküler agirlik markörleri içermistir. Serit 3 ve 5, bu bulusta açiklanan yöntemle hazirlanan ve Ab basina sirasiyla 3.6 ve 5.6 DM1 ihtiva eden konjugatlar içeriyordu. Serit 2 ve 4, geleneksel iki adimli yöntemle hazirlanan konjugatlari içermekte ve sirasiyla Ab basina 4.0 ve 5.7 DM1 içermektedir. Sekil 9, geleneksel 2 adimli yöntem kullanilarak hazirlanan konjugata karsi, bu bulusta tarif edilen yöntem kullanilarak hazirlanan Ab-(Sulfo-MaI)-DM1 konjugatinin Protein LabChip elektroforezini göstermektedir. A. Ab-(Sulfo-Mal)- DM1 konjugatlarinin indirgenme kosulu (Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230 kiti) altinda Protein LabChip elektroforezi. Serit 1: moleküler agirlik markörleri; serit 2: konjuge olmayan Ab; serit 3: 2 adimli konjugat yöntemi kullanilarak sentezlenen Ab-Sülfo-MaI-DM'l, 5.7 D/Ab; serit 4: Ab-Sülfo-MaI-DM1, .6 D/Ab, bu bulusta tarif edilen yöntem kullanilarak sentezlenmistir; kuyucuk basina 0.22 mikrogram toplam protein yüklenmistir. Üst markör, sistem tepe noktasi ve alt markör bantlari, kitten eklenen harici markörkeri (kuyucuk basina 0.24 mikrogram toplam protein) temsil eder. 8. Protein LabChip elektroforezinden protein bantlarinin nicellestirilmesi. Sekil 10, bu bulusta tarif edilen yöntemle hazirlanan geleneksel iki adimli konjugasyon yöntemi ile hazirlanan Antikor-(Sülfo-MaI)-DMI konjugatinin LC-MS karsilastirmasini göstermektedir. A. Bu bulusta tarif edilen yöntem kullanilarak hazirlanan 3.6 DM1/Ab ile konjugatin MS'si, 1-6 DM1 tasiyan ayrik konjugat tepe noktalarina sahip homojen bir konjugati göstermektedir. B. Geleneksel iki adimli konjugasyon yöntemi ile hazirlanan 4.0 DM1/Ab ile konjugatin MS'si. Geleneksel iki adimli yöntemle hazirlanan konjugat için MS, konjugatlara karsilik gelen tepe noktalari ve bir heterojen ürünü gösteren hidrolize veya çapraz baglanmis baglayicilara (örnegin, 2 DM1 ile konjugat, arti bir L, 2L ve 3 L ile konjugat gibi) sahip konjugatlari göstermektedir. Sekil 11, bir anti-CanAg antikoru-Sulfo-MaI-DMI konjugatinin antikor basina , modifiye edilmemis antikorun CanAg antijenini eksprese eden COL0205 hücrelerine baglanmasini göstermektedir. Baglanma, floresan birimlerinde ölçülmüstür. Sekil 12, bir anti-CanAg Antikoru-Sulfo-MaI-DMI konjugatinin, antikor basina CanAg antijenini eksprese eden COL0205 hücrelerine karsi in vitro sitotoksisitesini göstermektedir. Konjugat, COL0205 hücrelerine eklenmistir ve konjugat ile 5 günlük sürekli inkübasyonun ardindan, hücrelerin canliligi WST-8 tahlili kullanilarak ölçülmüstür. Konjugatin özgüllügünü göstermek için, konjugatin hedef kanser hücrelerine dogru baglanmasini ve sitotoksisitesini bloke etmek için bir konjuge olmayan fazlalik anti-CanAg antikoru kullanilarak bir kontrol deneyi yapilmistir. Sekil 13, bir DM1 (veya DM4) ve Sulfo-NHS SMCC baglayici reaksiyon karisimi ile antikorun konjugasyonunu göstermektedir. Sekil 14, geleneksel 2 adimli yöntemi kullanarak hazirlanan konjugata karsi, bu bulusta tarif edilen yöntemi kullanarak hazirlanan Ab-(SMCC)-DM1 konjugatinin SDS-PAGE'sinin azaltilmasini göstermektedir. Her örnek seritte 10 mikrogram toplam protein; Jel Coomassie Blue ile Iekelendi. Serit 1 moleküler agirlik markörleri içerir, Serit 2 konjuge olmayan Ab içerir, Serit 3 geleneksel iki adimli yöntemle Ab basina 3.1 DM1 ile hazirlanan konjugati içerir ve Serit 4 bu bulusta tarif edilen yöntemle hazirlanan Ab basina 3.1 DM1 ile konjugati içerir. Sekil 15, geleneksel 2 adimli yöntem kullanilarak hazirlanan konjugata karsi bu bulusta tarif edilen yöntem kullanilarak hazirlanan Ab-(SMCC)-DM1 konjugatinin Protein LabChip elektroforezini göstermektedir. A. Ab-SMCC-DM1 konjugatlarinin indirgenme kosulu (Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230 kit) altinda Protein LabChip elektroforezi. Serit 1: moleküler agirlik markörleri; serit 2: Ab-SMCC-DM1, 3.1 D/Ab, bu patentte tarif edilen yöntem kullanilarak sentezlenir; serit 3: konjuge olmayan Ab; serit 4: Ab-SMCC-DM1, 3.1 D/Ab, 2 adimli konjugasyon yöntemi kullanilarak sentezlenmistir; (her seritte 0.24 mikrogram toplam protein). Üst markör, sistem tepe noktasi ve alt markör bantlari kitten eklenen harici markörleri temsil eder. B. Protein LabChip elektroforezinden protein bantlarinin nicellestirilmesi. Sekil 16, geleneksel iki adimli konjugasyon yöntemi ile hazirlanan konjugat ile bu bulusta tarif edilen yöntemle hazirlanan Antikor-(SMCC)-DMI konjugatinin LC-MS karsilastirmasini göstermektedir. A. Ardisik iki adimli yöntemle hazirlanan konjugatin MS'si, Ab basina 3.1 DMl'dir. Her bir ana konjugat tepe noktasi, hidrolize ve çapraz baglanmis baglayici fragmanlarin mevcudiyeti nedeniyle iliskili yan tepe noktalarina sahiptir. B. Bu bulusta açiklanan yöntemle hazirlanan konjugatin MS'si, Ab basina 3.1 DM1'dir. Konjugatin homojenligi nedeniyle, MS zirveleri iyi çözülmüstür. Sekil 17, geleneksel 2 adimli yöntemle konjugasyon sirasinda zincirler arasi çapraz baglama ve maleimid inaktivasyonu için önerilen mekanizmalari göstermektedir. Sekil 18, bu bulusta açiklanan yöntem kullanilarak hazirlanan Ab-(Sulfo-Mal)- DM4 konjugatinin indirgeyici olmayan SDS PAGE'sini ve serbest DM4 tiyolünün, (ilk DM4 + NHS-Sulfo-Mal heterobifonksiyonel reaktif birlestirme reaksiyonundan sonra) antikor konjugasyon reaksiyonundan önce 4-maleimidobuytrik asit.kullanilarak söndürülmesini göstermektedir. Her örnek 10 pg protein içeriyordu; Jel Coomassie Blue ile Iekelendi. Serit 1 ve 5, moleküler agirlik markörleri içerir. Serit 2, yalniz Ab içermistir. Serit 3, 4-maleimidobuytrik asit eklenmeden, bu bulusta tarif edilen yöntemle hazirlanan konjugati içeriyordu. Serit 4, ilk DM4 + NHS-Sülfo-Mal heterobifonksiyonel reaktifin (antikor konjugasyon adimindan önce) sonra 4-maleimidobutirik asit ilavesi ile bu bulusta tarif edilen yöntemle hazirlanan konjugati içeriyordu. Sekil 19, bir DMl (veya DM4) ve SPDB baglayici reaksiyon karisimi kullanarak disülfit-baglanmis antikor konjugatinin hazirlanmasini göstermektedir. Sekil 20, hem disülfit, hem de parçalanamayan PEG4-Mal baglayicilarinin hem disülfit hem de parçalanamayan PEG4-Mal baglayicilariyla, DM1 (veya DM4) ve hem SPDB hem de NHS-PEG4-Mal baglayicilarinin saflastirilmamis bir reaksiyon karisimi ile antikor konjugasyonu yoluyla hazirlanmasini göstermektedir. Sekil 21, hem disülfit hem de parçalanamayan PEG4-Mal baglayicilari ile birlikte antikor-maytansinoid konjugatinin MS'sini gösterir (antikorun DM1 veya DM4'ün saflastirilmamis bir reaksiyon karisimi ile ve hem SPDB hem de NHS-PEG4-Mal baglayicilarinin konjugasyonu ile hazirlanir). Sekil 22, antikorun DM1 (veya DM4) ve SMCC baglayicisinin bir reaksiyon karisimi ile konjugasyonunu göstermektedir. Sekil 23, SMCC kullanilarak hazirlanan ve antikor basina ortalama 3.1 DM1 içeren, bu bulusta tarif edilen yöntemle hazirlanan antikor-SMCC-DMI konjugatinin MS'ini göstermektedir. Sekil 24, DM1 (veya DM4) ve SSNPB baglayicisinin bir reaksiyon karisimi kullanilarak disülfit-baglanmis antikor konjugatinin hazirlanmasini göstermektedir. Sekil 25, bir DM1 (veya DM4) reaksiyon karisimi ile antikorun konjugasyonunu ve alifatik lineer karbon zinciri ile heterobifonksiyonel baglayiciyi göstermektedir. BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Simdi, örnekleri ekteki yapilarda ve formüllerde gösterilen, bulusun bazi uygulamalari detayli olarak açiklanacaktir. Bulus, numaralandirilan uygulamalarla baglantili olarak tarif edilmekle birlikte, bulusun bu açiklamalarla sinirlandirma amaci bulunmadigi anlasilmalidir. Aksine, bulus, istemlerde tanimlandigi gibi mevcut bulus kapsaminda yer alabilecek tüm alternatifleri, modifikasyonlari ve esdegerlerini kapsamayi amaçlamaktadir. Teknikte uzman bir kisi, mevcut bulusun uygulamasinda kullanilabilecek, burada tarif edilenlere benzer veya esdeger birçok yöntem ve materyali fark edecektir. Bu açiklama, tiyol içeren bir efektörün (örn., bir sitotoksik ajan) veya bir haberci grubun (örn., bir radyo-etiket) bir hücre baglama maddesi (örn., bir antikor) ile konjuge edilmesinin yeni bir yöntemini tarif eder; efektör veya haberci içeren grup ilk önce organik, sulu veya karisik organik/sulu çözücüde iki fonksiyonlu bir baglayici reaktif madde ile reaksiyona sokulur, ardindan saflastirilmamis reaksiyon karisiminin hücre baglayici madde ile organik, sulu veya karisik organik/sulu çözücüler içindeki reaksiyonu gerçeklestirilir. Açiklama kisaltmalari Semalarin açiklamalarinda kullanilan kisaltmalar ve takip eden örnekler sunlardir: C = Efektör veya bir haberci grubu (örn., bir sitotoksik ajan veya bir radyo-etiket) L = Baglayici (örn., parçalanabilir veya parçalanamayan bir baglayici) X = amin-reaktif grubu (örn., N-hidroksisüksinimid ester (NHS ester), sulfo-NHS ester, p-nitrofenol ester, tetraflorosülfonat fenil ester, 1-hidroksi-2-nitrobenzen-4- sülfonik asit ester) Y = Maleimid veya haloasetamid (iyodoasetamid, bromoasetamid) Yb, reaktif bir karisik disülfit grubudur (örn., 2-piridildiy0, 4-piridildiyo, 2-nitr0- piridildiyo, 5-nitro-piridildiyo, 2-karboksi-5-nitro-piridildiyo) X' = amid baglantisi Y' = tiyoeter (R-S-R') veya selenoeter (R-Se-R ') baglantisi Yb' = disülfit (R-S-S-R') baglantisi Bu bulusun bir uygulamasinda, bir hücre baglama ajaniin tiyoeter-baglanmis bir konjugatinin bir efektör veya bir haberci molekülü ile hazirlanmasina yönelik bir proses tarif edilmektedir, proses asagidaki adimlari içerir: a) X-L-Y formülüne sahip bir heterobifonksiyonel baglayicinin sulu çözücü, organik çözücü ya da X-L-Y'-C formülüne sahip bir ara ürün veren karma organik/sulu tepkime karisimlari içindeki bir tiyol içeren efektör ya da haberci molekül C (diger bir deyisle bir maytansinoid) ile temas ettirilmesi; b) Formül Ab-(X'-L-Y'-C)m'nin bir konjugatinin üretilmesi, burada L, 1-10 karbon atomu, basit veya sübstitüe edilmis bir aril birimi (alkil, alkoksi, halojen, nitro, floro, karboksi arasindan seçilmis sübstitüentler, sülfonat, fosfat, amino, karbonil, piperidino) veya bir polietilen glikol içeren birim (tercihen 1-500 PEG ayirici veya daha tercihen 1-24 PEG ayirici veya daha da tercihen tasiyan sübstitüe edilmis veya sübstitüe edilmemis lineer, dallanmis veya siklik bir alkil, alkenil veya alkinil grubudur, X ve Y, N- hidroksisüksinimit ester ve maleimid veya haloasetamid gibi amin veya tiyol reaktif gruptur; Ab bir antikordur; m, 1-20 arasinda bir tam sayidir; X', antikorla reaksiyona girdikten sonra modifiye edilmis X bölgesidir (örnegin, bir amid bagi). Y', örnegin, bir sitotoksik ajan veya efektör veya raportör grubun bir radyo etiketi ile reaksiyona girdikten sonraki modifiye edilmis Y bölgesidir (örn., tiyoeter bagi); ve c) konjugatin tegetsel akis filtrasyonu, diyaliz veya kromatografi (örn., jel filtrasyonu, iyon degistirme kromatografisi, hidrofobik etkilesim kromatografisi) veya bunlarin bir kombinasyonu ile saflastirilmasi. Tercihen, Y, maleimid veya haloasetamid arasindan seçilen bir tiyol10 reaktif grubudur. Tercihen L, 1-6 karbonlu veya 2-8 PEG ayirici içeren dogrusal veya dallanmis bir alkil grubudur. O bir maytansinoiddir. Bu reaksiyon dizisi, formül 1 ve 2'de gösterilmistir: Ab + X-L-Y'-C (reaksiyon 1`den saflastirilmamis) e Ab-(X'-L-Y'-C)m (2) ara ürün X-L-Y"-C'nin saflastirilmasini içermez ve bu nedenle bunu dogrudan antikor ile karistirmanin avantajini saglar (saflastirilmamis ara ürün antikora eklenir veya antikor, saflastirilmamis ara ürüne eklenir), bu böylece yöntemi konjugasyon için avantajli hale getirir, çünkü kullanissiz bir saflastirma adimina olan ihtiyaci ortadan kaldirir. Önemli biçimde, bu yöntem, geleneksel iki adimli reaksiyon ve saflastirma dizisi tarafindan hazirlanan konjugatlarda gözlenen zincirler arasi protein çapraz baglama ve inaktive edilmis maleimid rezidülerinin aksine, zincirler arasi protein çapraz baglama veya inaktive edilmis maleimid rezidüleri olmayan homojen konjugat verir. Reaksiyon 1, yüksek konsantrasyonlarda, heterobifonksiyonel baglayici, X-L-Y ve efektör veya haberci grup C'nin, sulu çözücü, organik çözücü veya organik/sulu reaksiyon karisimlarinda yüksek konsantrasyonlarda gerçeklestirilebilir ve bu, geleneksel iki adimli reaksiyon ve saflastirma dizisi tarafindan hazirlanan konjugatlar için sulu çözeltilerdeki düsük konsantrasyonlarda oldugundan daha hizli reaksiyon oranlarina neden olur. Reaksiyon 1'de üretilen ara ürün X-L-Y'-C, donmus halde, düsük sicakliklarda sulu çözücü içinde uygun düsük pH'da (örn., pH ~ 4-6), organik çözücülerde veya karisik organik/sulu karisimlarda veya liyofilize halde uzun süre saflastirilmamis halde saklanabilir ve daha sonra yaklasik 4-9'Iuk daha yüksek bir pH degerinde nihai konjugasyon reaksiyonu için antikor çözeltisi ile karistirilabilir, dolayisiyla bu reaksiyon dizisinin uygunluguna katkida bulunur. Ara ürün, hücre baglama maddesi ile karistirilmadan önce organik çözücü ile veya sulu tampon ile veya organik çözücü ve sulu tampon karisimi ile gerektigi gibi seyreltilebilir. Burada "sayisal" ile baglantili olarak kullanildigi sekliyle "yaklasik" terimi, tüm sayilar ve bunlarin küçük varyasyonlari dahil olmak üzere tüm bu sayilari ifade etmelidir. Ara ürün X-L-Y*-C'nin antikor ile reaksiyonu, yaklasik pH 4 ila yaklasik pH 9 degerlerinde, tercihen yaklasik pH 5 ila 8,7 araliginda,10 arasinda bir pH araligi veya bunlarin küçük varyasyonlari olarak gerçeklestirilebilir. Antikorun ara ürün X-L-Y'-C ile tercih edilen yaklasik 6.5 ila 8.5 pH araliginda reaksiyona sokulmasi için kullanilan tamponlar, fosfat ve HEPES tamponu gibi bu pH araliginda pKa degerlerine sahip tamponlardir. Bu tercih edilen tamponlar, baglayici X ile (N-hidroksisüksinimit ester gibi) reaksiyona girebilecek primer veya sekonder amino gruplarina veya diger reaktif gruplara sahip olmamalidir. Birinci reaksiyonda, tüm Y grubunun (maleimid gibi), saflastirilmamis karisimin antikora eklenmesinden önce reaksiyona girmesini saglamak için, heterobfonksiyonel baglayici X-L-Y üzerinde bir stokiyometrik veya hafif bir C fazlaligi kullanilir. Söndürme reaktifi ile istege bagli bir ilave proses (4-maleimid0bütirik asit, 3-maleimid0pr0piyonik asit veya N- etilmaleimid veya iyodoasetamid veya iyodoasetamidopropiyonik asit gibi), dogal antikor disülfit gruplari ile arzu edilmeyen herhangi bir tiyoI-disülfit degisim reaksiyonunu en aza indirmek amaciyla, reaksiyona girmemis herhangi bir C'nin antikorla karistirilmasindan önce söndürülmesini saglamak için yapilabilir. Polar, yüklü tiyol söndürme reaktifleri (4- maleimidobütirik asit veya 3-maleimidopropiy0nik asit gibi) ile söndürmeden sonra, fazlalik, reaksiyona girmemis C, kovalent olarak baglanmis konjugattan kolayca ayrilabilen polar, yüklü bir eklenme ürününe dönüstürülür. Istege bagli olarak, nihai reaksiyon karisimi 2'ye, saflastirilmadan önce, reaksiyona girmemis herhangi bir baglayiciyi (X-L-Y'-C) söndürmek için nükleofiller (örn., Iizin, taurin, hidroksilamin) içeren amino grubu gibi nükleofiller ile muamele edilir. Antikorun, maytansinoidlerin (DMx) ve heterobifonksiyonel baglayicinin saflastirilmamis baslangiç reaksiyon karisimi ile reaksiyona sokulmasi için alternatif bir yöntem, DMx ve heterobifonksiyonel baglayicinin baslangiç reaksiyon karisiminin (DMx-baglayici reaksiyonun tamamlanmasinin ardindan) düsük pH (pH ~5) degerine sahip antikorla karistirilmasini, ardindan konjugasyon reaksiyonu için pH degerini yaklasik 6.5-8.5'e yükseltmek için tampon veya baz ilave edilmesini içerir. Bu yeni yöntem, sitotoksik maytansinoid ilaç ile bir konjugatin hazirlanmasina uygulanir. Beklenmedik sekilde reaksiyon dizisi 1-2'de ana hatlariyla belirtilen bu yöntem kullanilarak hazirlanan antikor-maytansinoid konjugatlari, SDS-PAGE, protein LabChip elektroforezi ve kütle spektrometresins indirgeyerek konjugatlarin karakterizasyonuna10 dayanan, geleneksel iki adimli reaksiyon ve saflastirma dizisi tarafindan hazirlanan konjugatlara kiyasla homojenlikte çok daha üstün olmustur. Bu bulusta tarif edilen ve reaksiyon dizisi 1-2'yi içeren konjugasyon yöntemi ayrica herhangi bir ara saflastirma adimi gerektirmez ve bu nedenle geleneksel iki adimli yöntemden büyük ölçüde daha uygundut Açiklamanin bir örneginde, bir hücre baglama ajaninin tiyoeter-baglanmis bir konjugatinin bir efektör veya haberci molekülü ile hazirlanmasina yönelik bir proses asagidaki adimlari içeren sekilde tarif edilir: a) Y-L-Y formülünün bir homobifonksiyonel baglayicisinin, Y-L-Y'-C'yi vermek üzere sulu çözücü, organik çözücü veya karisik sulu/organik reaksiyon karisimlarinda bir tiyol- veya amin-içeren efektör veya haberci grup C (sitotoksik bir ajan gibi) ile temas ettirilmesi, b) formül Ab- (Y'-L-Y'-C) m'ye ait bir konjugat üretilmesi için reaksiyon karisiminin saflastirilmadan sulu bir çözeltide veya sulu/organik karisimda bir antikor ile karistirilmasi; burada L, yukarida tanimlandigi gibidir; Y, bir maleimid veya haloasetamid veya N-hidroksisüksinimit veya sulfo N- hidroksisüksinimit gibi bir tiyol veya amin-reaktif grubudur; Ab bir antikordur; m, 1 ila 20 arasinda bir tam sayidir; Y', antikorla reaksiyona sokulmus modifiye edilmis Y bölgesidir (bir tiyoeter veya amid bagi gibi), veya sitotoksik ajan veya efektör veya haberci grubu ile reaksiyona sokuldugunda modifiye edilmis bir Y bölgesidir (tiyoeter veya amid bagi gibi), ve c) konjugatin tegetsel akis filtrasyonu, diyaliz veya kromatografi (jel filtrasyonu, iyon degistirme kromatografisi, hidrofobik etkilesim kromatografisi) veya bunlarin bir kombinasyonu ile saflastirilmasi. Formül 3 ve 4'te gösterilen reaksiyon dizisi: Ab + Y-L-Y'-C (reaksiyon 3'ten saflastirilmamis) -› Ab-(Y'-L-Y'-C)m (4) ara ürün Y-L-Y'-C'nin saflastirilmasini içermez ve bu nedenle konjugasyon için avantajli bir yöntemdir. Baska bir durumda, bir hücre baglama ajaninin bir disülfit-baglanmis konjugatinin bir efektör veya haberci molekülü ile bir konjugatinin hazirlanmasi için bir proses asagidaki adimlari içerecek sekilde tarif edilmektedir: a) X-L-Yb formülüne sahip bir heterobifonksiyonel baglayicinin ara ürün X-L-Yb'-C vermek üzere sulu çözücü, organik çözücü ya da karisik organik/sulu reaksiyon karisimlarinda efektör ya da haberci grubu C (sitotoksik bir madde gibi) ile temas ettirilmesi; b) Ab-(X'-L-Yb'-C)m formülünün bir10 konjugatini üretmek üzere sulu bir çözelti veya sulu/organik karisim içerisinde antikorla saflastirilmadan karistirilmasi, burada L yukarida tanimlandigi gibidir; Yb, bir piridil disülfit veya bir nitro-piridil disülfit gibi reaktif bir disülfittir; X, N-hidroksisüksinimit ester veya sülfo N-hidroksisüksinimit ester gibi bir amin-reaktif gruptur; Ab bir antikordur; m, 1 ila 20 arasinda bir tam sayidir; X', antikor ile reaksiyona sokulduktan sonra modifiye edilmis X bölgesidir (amid bagi gibi): Yb', sitotoksik ajan veya efektör veya haberci grubu ile reaksiyona sokulduktan sonra modifiye edilmis Yb bölgesidir (disülfit): ve c) konjugatin tegetsel akis filtrasyonu, diyaliz veya kromatografi (jel filtrasyonu, degisim kromatografisi, hidrofobik etkilesim kromatografisi) veya bunlarin bir kombinasyonu ile saflastirilmasi. Reaksiyon dizisi formüller 5 ve Gida gösterilmektedir: Ab + X-L-Yb'-C (reaksiyon 5'ten saflastirilmamis) -› Ab-(X'-L-Yb'-C)m (6) Bir baska durumda, antikorun konjugatlarinin efektör veya haberci gruplarla hazirlanmasi için, iki ayri tip baglayici - parçalanamayan (tiyoeter baglantisi) ve parçalanabilir (disülfit baglanti) - içeren bir proses tarif edilmistir, asagidaki adimlari içermektedir: a) X-L-Y'-C ve X-L-Yb'-C formüllerine sahip ara bilesiklerin üretilmesi için, X-L-Y ve X-L-Yb baglayicilarinin sitotoksik ajan C ile temas ettirilmesi, b) bir eklenme ürünü Ab-(X'-L-Y'-C)m(X'-L-Yb'-C)m' saglamak üzere, reaksiyon karisimlarinin bir dizi seklinde veya reaksiyon formülleri 7-9'da belirtildigi gibi ayni anda antikorlarla saflastirilmadan karistirilmasi: Ab + X-L-Y'-C + X-L-Yb'-C (reaksiyonlar 7-8'den saflastirilmamis) burada X, L, Y', C, Yb' ve m yukarida verildigi gibidir ve m', 1 ila 20 arasinda bir tam sayidir; ve c) konjugatin tegetsel akis filtrasyonu, diyaliz veya kromatografi10 (jel filtrasyonu, iyon degistirme kromatografisi, hidrofobik etkilesim kromatografisi) veya bunlarin bir kombinasyonu ile saflastirilmasi. Bu iki baglayici efektör ara maddesi (X-L-Y'-C ve X-L-Yb'-C), antikor ile farkli diziler seklinde (ilk olarak X-L- Y'-C, sonra X-L-Yb'-C veya ilk olarak XL-Yb'-C sonra X-L-Y'-C veya ayni anda) saflastirilmadan çesitli oranlarda karistirilir. Reaksiyonlar 1,3,5 ve 7-8, bifonksiyonel baglayicinin (X-L-Y, veya X-L-Yb, veya Y-L-Y) ve sulu çözücü, organik çözücü veya, organik/sulu reaksiyon karisimlari içindeki efektör veya haberci grubu C'nin yüksek konsantrasyonlarinda gerçeklestirilebilir; geleneksel iki adimli reaksiyon ve reaktiflerin çözünürlügünün sinirlayici oldugu saflastirma dizisi tarafindan hazirlanan konjugatlar için sulu çözeltilerde daha düsük konsantrasyonlardakinden daha hizli reaksiyon oranlari ile sonuçlanir. Reaksiyonlar 1,3,5 ve 7-8'de üretilen ara ürünler X-L-Y'-C, veya Y-L-Y'-C, veya X-L-Yb'- C, donmus halde, düsük sicakliklarda sulu çözücü içinde uygun düsük pH degerinde, organik çözücülerde veya karisik organik/sulu karisimlarda veya Iiyofilize halde uzun süre saflastirilmamis halde saklanabilir ve daha sonra nihai konjugasyon reaksiyonu için antikor çözeltisi ile karistirilabilir, dolayisiyla bu reaksiyon dizisinin uygunluguna katkida bulunur. Birinci reaksiyonda, tüm Y grubunun (maleimid gibi), saflastirilmamis karisim antikora ilave edilmeden önce reaksiyona sokuldugundan emin olmak için, heterobifonksiyonel baglayici X-L-Y veya Y-L-Y veya X-L-Yb'ye göre stokiyometrik veya hafif fazlalik bir C miktarda kullanilir. Dogal antikor disülfit gruplari ile arzu edilmeyen herhangi bir tiyol- disülfür degisim reaksiyonunu minimize etmek için antikora eklenmeden önce C'deki reaksiyona girmemis herhangi bir grubun (tiyol gibi) söndürülmesi içini söndürme reaktifi (4-maleimidobütirik asit veya 3-maleimid0pr0piyonik asit veya N-etilmaleimid veya iyodoasetamid veya iyodoasetik asit gibi) istege bagli bir ilave muamelesi yapilabilir. C'nin bifonksiyonel baglayici ile birinci reaksiyonundan sonra, yüklü bir polar tiyol söndürme reaktifi kullanilarak fazlalik C'nin söndürülmesi, fazlalik C'yi, jel filtrasyonu, diyaliz veya TFF ile kovalent olarak baglanmis konjugattan kolayca ayrilabilen, son derece polar, suda çözünür bir eklenme ürününe dönüstürür. Nihai konjugat ürün kovalent olmayan bir sekilde birlestirilmis herhangi bir C içermez. Istege bagli olarak, nihai reaksiyon karisimlari 2, 4, 6 ve 9'na, saflastirilmadan önce, reaksiyona girmemis baglayicilari (X-L-YîC, Y-L-Y'-C veya X-L-Yb'-C) söndürmek için nükleofiller, örnegin amino grubu içeren nükleofiller (örn., Iisin, taurin, hidroksilamin) ile muamele edilir. Antikorun DMx ve bifonksiyonel baglayicinin saflastirilmamis baslangiç reaksiyon karisimi ile reaksiyona sokulmasi için alternatif bir yöntem, DMx ve bifonksiyonel baglayicinin baslangiç reaksiyon karisiminin (DMx-baglayici reaksiyonun tamamlanmasinin ardindan) düsük pH (pH ~5) degerine sahip antikorla karistirilmasini, ardindan konjugasyon reaksiyonu için pH degerini yaklasik 6.5-8.5'e yükseltmek için tampon veya baz ilave edilmesini içerir. Birden fazla efektör tipinin birden fazla kopyasi, iki veya daha fazla farkli efektörden türetilmis iki veya daha fazla baglayici efektör ara maddesinin, saflastirilmadan, bir dizi seklinde veya es zamanli olarak antikora eklenmesiyle konjuge edilebilir. EFEKTÖR GRUP(LARI) Efektör grubu veya Efektör molekülü terimleri birbirlerinin yerine kullanilir ve burada kullanildigi sekliyle "Efektör grup(lari)" veya "Efektör molekül(leri)" terimi, sitotoksik ajanlari içerdigi anlamina gelir. Bazi açilardan, efektör gruplarinin veya moleküllerinin, potansiyel sterik engeli azaltmak için çesitli uzunluklarda ara kollar ile tutturulmasi istenebilir. Birden fazla efektör tipinin çoklu kopyalari, iki veya daha fazla farkli efektörden türetilmis iki veya daha fazla baglayici-efektör ara ürününün antikora saflastirilmadan, bir dizi seklinde veya es zamanli olarak antikora eklenmesiyle konjuge edilebilir. Bu açiklamada kullanilabilecek sitotoksik ajanlar, kemoterapötik ajanlari veya kemoterapötik ajanlarin yapisal analoglarini içerir. "Kemoterapötik ajan", kanser tedavisinde faydali kimyasal bir bilesiktir. Kemoterapötik ajanlarin örnekleri arasinda, tiotepa ve siklofosfamid (CYTOXANTM); busülfan, improsülfan ve piposülfan gibi alkil sülfonatlar; benzodopa, karbokon, meturedopa ve uredopa gibi aziridinler; altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiyofosfosharamid ve trimetilolomelamin dahil etilenimin ve metilamin; asetogeninler (özellikle bültatasin ve bültatasinon); bir kamptotesin (sentetik analog topotekan dahil); briyostatin; kallistatin; CC-1065 (adozelesin, karzelesin ve bizelesin sentetik analoglari dahil); kriptofisinler (özellikle kriptofisin 1 ve kriptofisin 8); dolastatin; duokarmisin (sentetik analoglar, KW-2189 ve10 CBI-TMI dahil); eleuterobin; pankratistatin; bir sarkoditin; spongistatin; klorambucil, klornafazin, klofosfamid, östramustin, ifosfamid, m-klorethamin, m-klorethamin oksit hidroklorür, melfalan, novembichin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, urasil musidin gibi azot hardallari; karmustin, klorozotosin, fotemustin, Iomustin, nimustin, ranimustin gibi nitrosurealar; enediyne antibiyotikler gibi antibiyotikler (örn., calicheamicin, özellikle calicheamicin 1 ve calicheamicin teta l, bakiniz örn., Angew Chem Int. Ed. Engl. 33: kromoprotein enediyne antiobiyotik kromomoforlar), aklasinomisinler, aktinomisin, authramisin, azaserin, bleomisinler, kaktinomisin, carabicin, karminomisin, karsinophilin; kromomisin, daktinomisin, daunorubisin, detorubisin, 6-diazo-5-okso-L-norleusin, doksorubisin (morfolino-doksorubisin, siyanomorfolinc-doksorubisin, 2-pirr0lino- doksorubisin ve deoksdoksorubisin), epirubisin, esorubisin, idarubisin, marselomisin, nitomisin, mikofenolik asit, nogalamisin, olivomisin, peplomisin, potfiromisin, puromisin, quelamisin, rodorubisin, streptonigrin, streptozosin, tubersidin, ubenimeks, zinostatin, zorubisin; metotreksat ve 5-flüoroürasil (5-FU) gibi anti-metabolitler; denopterin, metotreksat, pteropterin, trimeteksat gibi folik asit analoglari; fludarabin, 6- merkaptopurin, tiamiprin, tiyoguanin gibi purin analoglari; ansitabin, azasitidin, 6- azauridin, karmofur, sitarabin, dideoksiüridin, doksifluridin, enositabin, fluxuridin, 5-FU gibi pirimidin analoglari; kalusteron, dromostanolon propiyonat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton gibi androjenler; aminoglutetimid, mitotan, trilostan gibi anti- adrenallar; frolinik asit gibi folik asit yenileyici; aseglaton; aldofosfamid glikozit; aminolevulinik asit; amsakrin; bestrabusil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolsin; diazikuon; elfomitin; elliptinyum asetat; bir epotilon; etoglusid; galyum nitrat; hidroksiüre; lentinan; lonidamin; maytansin ve ansamitosinler gibi maytansinoidler; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitrakrin; pentostatin; fenamet; pirarubisin; podofilinik acid; 2- etilhidrazid; prokarbazin; PSK@; razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanyum; tenuazonik asit; triazikuon; 2,2',2"-triklorotrietilamin; trikotesenler (özellikle T-2 toksin, verracurin A, roridin A ve anguidin): üretan; vindesin; dakarbazin; mannomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gasitosin; arabinozid ("Ara-C"); siklofosfamid; tiyotepa; taksoitler, örn. paklitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) ve doksetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Pouleno Rorer, Antony, France); klorambucil; gemsitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; sisplatin ve karboplatin gibi platin analoglari; vinblastin; platin; etoposid (VP-16); ifosfamid; mitomisin C; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; navelbin; novantron; teniposid; daunomisin; aminopterin; kseloda; ibandronat; CPT-11; topoizomeraz inhibitörü RFS10 birinin farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlari, asitleri veya türevleri bulunur. Ayni zamanda, bu tanimlamaya örnegin tamoksifen, raloksifen, aromataz inhibe edici 4(5)- imidazoller, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston ve toremifen (Fareston), ve flutamid, nilutamid, bikalutamid, Iöprolid ve goserinelin gibi antiandrojenleri; siRNA ve yukaridakilerden herhangi birinin farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlari, asitleri veya türevleri gibi tümörler üzerimde düzenleyici olarak hareket eden ve horman etkisini inhibe eden anti-hormonal ajanlar dahildir. Bu açiklama ile Tercih edilen bir durumda, kemoterapötik sitotoksik ajanlar, esasen küçük moleküllü sitotoksik ajanlardir. Burada "küçük moleküllü bir ilaç", örnegin 100 ila 1500, daha olarak 1000'in altindaki bir moleküler agirliga sahip olabilen organik, inorganik veya organometalik bir bilesigi belirtmek için yaygin olarak kullanilir. Açiklamanin küçük moleküllü sitotoksik maddeleri, oligopeptidleri ve molekül agirligi yaklasik 1000'den düsük olan diger biyomolekülleri kapsar. Küçük moleküllü sitotoksik maddeler, teknikte No. 4,956,303'te açiklanmaktadir. Tercih edilen küçük moleküllü sitotoksik ajanlar, hücre baglama ajanlari ile baglanmaya izin verenlerdir. Açiklama, bilinen sitotoksik ajanlarin yani sira bilinebilecekleri içerir. Özellikle tercih edilen küçük moleküllü sitotoksik ajanlar, sitotoksik ajanlari içerir. Sitotoksik ajan, bir hücrenin ölümüyle sonuçlanan veya hücre ölümüne neden olan veya bir sekilde hücre canliligini azaltan herhangi bir bilesik olabilir, burada her sitotoksik ajan bir tiyol molekül bölümü içerir. Tercih edilen sitotoksik ajanlar, bazilari asagida tarif edilen maytansinoid bilesikleri, taksan bilesikleri, CC-1065 bilesikleri, daunorubisin bilesikleri ve doksorubisin bilesikleri, pirolobenzodiazepin dimerleri, kalikeamisin, auristatinler ve analoglari ve türevleridir. siRNA gibi zorunlu olarak küçük moleküller olmayan diger sitotoksik ajanlar da bu açiklamanin kapsami dahilindedir. Örnegin, siRNA'lar, oligonükleotitlerin modifikasyonu10 için yaygin olarak kullanilan yöntemler ile mevcut tarifnamenin çapraz baglayicilarina nedenle, 3' veya 5'-fosforomidit formundaki siRNA, siRNA ile çapraz baglayici arasinda bir ester bagi olusturmak için bir hidroksil islevselligi tasiyan çapraz baglayicinin bir ucu ile reaksiyona sokulur. Benzer sekilde, siRNA fosforamiditinin bir terminal amino grubu tasiyan bir çapraz baglayici ile reaksiyonu, çapraz baglayicidan siRNA'ya bir amin vasitasiyla baglanmaya neden olur. siRNA, U.S. Patent Yayini Numaralari: olarak tarif edilmistir. Maytansinoidler Mevcut bulusta kullanilabilecek maytansinoidler, teknikte iyi bilinir ve bilinen yöntemlere göre dogal kaynaklardan izole edilebilir veya bilinen yöntemlere göre sentetik olarak hazirlanabilir. Uygun maytansinoid örnekleri, maytansinol ve maytansinol analoglarini içerir. Uygun maytansinol analoglarinin örnekleri, modifiye bir aromatik halkaya sahip olanlari ve diger pozisyonlarda modifikasyonlara sahip olanlari içerir. Modifiye edilmis bir aromatik halkaya sahip olan uygun maytansinol analoglarinin spesifik örnekleri asagidakileri içerir: hazirlanmistir): ve 4,307,016) (Streptomyces veya Actinomyces kullanilarak demetilasyon veya LAH kullanilarak deklorinasyonla hazirlanmistir); ve (3) C-20-demethoksi, C-20-asiloksi (-OCOR), +/-dikloro (U.S. Patenti No. 4,294,757) (asil kloridler kullanilarak asilasyonla hazirlanmistir). Baska pozisyonlarda modifikasyonlara sahip olan uygun maytansinol analoglarinin spesifik örnekleri asagidakileri içerir: reaksiyonu ile hazirlanmistir); (3) C-14-hidroksimetil veya asiloksimetil (CH20H veya CH20Ac) (U.S. Patent No. 4,450,254) (Nokardiya'dan hazirlanmistir); tarafindan dönüstürülmesiyle hazirlandi); izole edilmistir); Streptomyces ile demetilasyonu ile hazirlanmistir); ve indirgemesi ile hazirlanmistir). Mevcut bulusta faydali tiyol içeren maytansinoidlerin sentezi, U.S. Patent No. C-3 pozisyonunda, C-14 pozisyonunda, (3-15 pozisyonunda veya 0-20 pozisyonunda bir tiyol molekül bölümüne sahip maytansinoidlerin tümünün faydali olmasi beklenir. C-3 pozisyonu tercih edilir ve maytansinolün C-3 pozisyonu özellikle tercih edilir. Ayni zamanda, bir N-metiI-alanin içeren C-3 tiyoI yarim maytansinoid ve bir N-metiI-sistein içeren C-3 tiyol yarim maytansinoid ve her birinin analoglari tercih edilir. Mevcut bulusta faydali N-metiI-alanin içeren C-3 tiyol molekül bölümlerinin maytansinoid türevlerinin spesifik örnekleri M1, M2, M3, M6 ve M7 formülleriyle gösterilmektedir. May maytansinoiddir. R1 ve R2; H, CH3 veya CH20H3'tür ve ayni veya farkli olabilir; m, 0, 1, 2 veya 3'tür; ve May maytansinoiddir. n, 3 ila 8 arasinda bir tam sayidir; ve May maytansinoiddir. I 1,2 veya 3'tür; Yo, CI veya H'dir; ve X3, H veya CHs'tür. CH3 0 R R H ilxi CH-CH-(CR3 R1, R2, R3, R4 ; H, CHs veya CH2CH3'tür ve ayni veya farkli olabilir; m, 0, 1, 2 veya 3'tür; ve May maytansinoiddir. Mevcut bulusta faydali N-metiI-sistein içeren C-3 tiyol molekül bölümü maytansinoid türevlerinin spesifik örnekleri, M4 ve M5 formülleriyle gösterilmektedir. 0 1, 2 veya 3,tür; p, 0 ila 10 arasinda bir tam sayidir; ve May maytansinoiddir. 0 1, 2 veya 3,tür; q, 0 ila 10 arasinda bir tam sayidir; Yo, CI veya H'dir; ve X3, H veya CH3'tür. Taksanlar Mevcut bulusa göre sitotoksik ajan ayrica bir taksan da olabilir. Bu açiklamada kullanilabilecek taksanlar, bir tiyol molekül bölümü içerecek sekilde modifiye edilmistir. Bu açiklamada yararli bazi taksanlar asagida gösterilen T1 formülüne sahiptir: CC-1065 analoglari Mevcut bulusa göre sitotoksik ajan ayrica bir CC-1065 analogu olabilir. Mevcut bulusa göre, CC-1065 analoglari bir A alt birimi ve bir B veya B-C alt birimi Daunorubisin/Doksurubisin Analoglari Mevcut bulusa göre sitotoksik ajan ayrica bir daunorubisin analogu veya bir Mevcut tarifnamenin daunorubisin ve doksorubisin analoglari, bir tiyol molekül bölümü içerecek sekilde modifiye edilebilir. Mevcut tarifnamenin, bir tiyol parçasina sahip olan modifiye edilmis doksorubisin/daunorubisin analoglari, WO 01/38318'de tarif edilmistir. Modifiye edilmis doksorubisin/daunorubisin analoglari, bilinen yöntemlere göre sentezlenebilir (bakiniz örn., U.S. Patent No. 5,146,064). Auristatin, auristatin E, auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), monometil auristatin edilmektedir. Mevcut bulusa göre sitotoksik ajanlar, teknikte bilinen pirolobenzodiazepin dimerlerini 6,660,856). Analog/ar ve türev/er Sitotoksik ajanlar alaninda uzman bir kisi, burada tarif edilen sitotoksik ajanlarin her birinin, ortaya çikan bilesigin, baslangiç bilesiginin spesifikligini ve/veya aktivitesini koruyacak sekilde modifiye edilebilecegini kolayca anlayacaktir. Teknikte uzman kisi, bu bilesiklerin çogunun, burada tarif edilen sitotoksik ajanlarin yerine kullanilabilecegini de anlayacaktir. Dolayisiyla, mevcut tarifnamenin sitotoksik ajanlari, burada tarif edilen bilesiklerin analoglarini ve türevlerini içerir. HABERCI GRUP(LAR) Haberci grubu veya Haberci molekülü terimleri birbirinin yerine kullanilir ve burada kullanildigi sekliyle "Haberci grup(lar)" veya "Haberci molekül(ler)" terimi, tanisal veya terapötik bir amaç için spesifik maddeye veya hücrelere reaktifin spesifik afinite bölümü tarafindan verilen bir maddeye karsilik gelir; örnekleri radyoizotoplar, paramanyetik kontrast ajanlari ve anti-kanser ajanlaridir. Çesitli etiketler veya haberci gruplar, kanser hastalarinda tümör görüntüleme uygulamalari, çesitli hastaliklarin tanisi için immüno- tahlil uygulamalari, radyoaktif nüklid ligand konjugatlarini kullanarak kanser tedavisi ve proteinler, peptidler ve oligonükleidler gibi biyoaktif maddelerin saflastirilmasi için afinite kromatografi uygulamalari için faydalidir. Hücre baglama maddeleiyle konjuge edilmis etiketler veya haberci gruplar, floroforlari ve biotin gibi afinite etiketlerini içerir. Bu veya flüoreserin içeren haberci gruplar ayrica bir PEG konjugat molekül bölümüne de eklenebilir. Teknikte bir dizi uygun haberci grup bilinmektedir, örn., U.S. Patent No. BAG LAYICILAR Konjugatlar, in vitro yöntemlerle hazirlanabilir. Bir ilaci hücre baglama maddesine baglamak için bir baglama grubu kullanilir. Uygun baglama gruplari, teknikte iyi bilinir ve parçalanamayan veya parçalanabilir baglayicilari içerir. Parçalanamayan bir baglayici, sitotoksik bir maddeyi bir hücre baglama maddesine stabil, kovalent bir sekilde baglayabilen herhangi bir kimyasal molekül bölümüdür. Parçalanamayan baglayicilar, asit kaynakli parçalanmaya, isik kaynakli parçalanmaya, peptidaz kaynakli parçalanmaya, esteraz kaynakli parçalanmaya ve disülfit bag parçalanmasina karsi büyük ölçüde dirençlidir. Parçalanamayan baglayicilarin örnekleri arasinda, ilaçla, haberci grubuyla veya hücre baglama ajaniyla reaksiyon için bir N-süksinimidil ester, N- sülfosüksinimil ester molekül bölümü, maleimido veya haloasetil bazli molekül bölümü içeren baglayicilar bulunur. Maleimido bazli bir molekül bölümü içeren çapraz baglama reaktifler arasinda N-süksinimidil 4-(maleimidometil)sikl0heksankarboksilat (SMCC), SMCC'nin "uzun Zincirli" bir analogu (LC-SMCC) olan ,N-süksinimidiI-4-(N- maleimidometil)-sikloheksan-1-karboksi-(ö-amidokaproat), K-maleimidoundekanoik asit N-süksinimidil ester (KMUA). y-maleimidobütirik asit N-süksinimidil ester (GMBS), &- maleimidokaproik asit N-hidroksisüksinimid ester (EMCS), m-maleimidobenzoiI-N- hidroksisüksinimid ester (MBS), N-(oi-maleimidoasetoksi)-süksinimid ester (AMAS), süksinimidiI-ö-(ß-maleimidopropionamid0)heksan0at (SMPH), N-süksinidil 4-(p- maleimidofenil)-butirat (SMPB) ve N-(p-maleimidofenil) izosiyanat (PMPl) bulunur. Bir haloasetil-bazli molekül bölümü içeren çapraz baglama reaktifleri arasinda N- süksinimidiI-4-(iyodoasetil)-aminobenzoat (SIAB), N-süksinimidil iyodoasetat (SlA), N- süksinimil bromoasetat (SBA) ve N-süksinimidil 3-(bromoasetamido)propiyonat (SBAP) Bulusa uygun yöntemde, parçalanamayan baglayicilari olusturan bir sülfür atomu içermeyen diger çapraz baglama reaktifleri de kullanilabilir. Bu tür baglayicilar dikarboksilik asit bazli molekül bölümlerinden türetilebilir. Uygun dikarboksilik asit bazli molekül bölümleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, asagida gösterilen genel formülün ci, (Jo-dikarboksilik asitlerini içerir: HOOC-Xi- Yn-Zm-COOH burada X, 2 ila 20 karbon atomuna sahip olan bir dogrusal veya dallanmis alkil, alkenil veya alkinil grubudur, Y, 3 ila 10 karbon atomu içeren bir sikloalkil veya sikloalkenil grubudur, Z, 6 ila 10 karbon atomu içeren sübstite edilmis veya sübstite edilmemis bir10 aromatik gruptur, veya sübstite edilmis veya sübstite edilmemis bir heterosiklik gruptur, burada hetero atom, N, 0 veya S arasindan seçilir ve burada 1, m ve n'nin her biri 0 veya 1'dir, ancak 1, m ve n'nin tümü ayni anda sifir degildir. yayininda ayrintili olarak tarif edilmistir. Parçalanabilir baglayicilar, hafif kosullar altinda, diger bir deyisle sitotoksik ajanin aktivitesinin etkilenmedigi kosullar altinda parçalanabilir baglayicilardir. Bilinen birçok baglayici bu kategoriye girer ve asagida açiklanmistir. Asit-kararsiz baglayicilar, asit pH'da parçalanabilir baglayicilardir. Örnegin, endozomlar ve Iizozomlar gibi bazi hücre içi bölmeler, asidik bir pH'a (pH 4-5) sahiptir ve asit- kararsiz baglayicilari parçalamak için uygun kosullar saglar. Foto-kararsiz baglayicilar, vücut yüzeyinde ve isiga erisilebilen birçok vücut boslugunda yararlidir. Ayrica, kizilötesi isik dokuya nüfuz edebilir. Bazi baglayicilar peptidazlar ile parçalanabilir. Sadece bazi peptitler kolayca hücrelerin içinde veya disinda kolayca ayrilir, bakiniz örn. Trouet et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci. hidrolaz parçalanabilir valin-sitrülin bagi (U.S. Patent 6,214,345 B1). Ayrica, peptitler, bir amino asidin karboksilati ve bir ikinci amino asidin .alfa-amino grubu arasindaki kimyasal olarak amid baglari olan .alfa-amino asitleri ve peptidik baglardan olusur. Bir lisinin karboksilat ve .epsil0n.-amino grubu arasindaki bag gibi diger amid baglarinin, peptidik baglar olmadigi anlasilir ve parçalanamaz oldugu kabul edilir. Bazi baglayicilar esterazlar tarafindan bölünebilir. Yine, sadece bazi esterler, hücrelerin içinde veya disinda bulunan esterazlarla parçalanabilir. Esterler, bir karboksilik asit ve bir alkolün yogunlasmasi ile olusur. Basit esterler, alifatik alkoller gibi basit alkollerle ve küçük sikIik ve küçük aromatik alkollerle üretilen esterlerdir. Örnegin, mevcut bulus sahipleri, esteri maytansinin C-3'ünde parçalayan bir esteraz bulamamislardir, çünkü esterin alkol bileseni maytansinol, çok büyük ve komplekstir. Tercih edilen parçalanabilir baglayici moleküller, örnegin, N-süksinimidil 3-(2- piridildiyo)propiyonat (SPDP) (bakiniz örn., Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723-737 ( (bakiniz, örn. U.S. Patent (bakiniz, örn., CAS Tescil çapraz baglayicilari içerir. Mevcut bulusta kullanilabilecek diger baglayicilar, yüklü baglayicilari veya hidrofilik tarif edilir. HÜCRE BAGLAMA AJANLARI Bu açiklamada kullanilan hücre baglama maddeleri, özellikle kanser hücreleri üzerindeki antijenleri hedef almak için baglanan proteinlerdir (öm., immünoglobulin ve immünoglobulin olmayan proteinler). Bu hücre baglama ajanlari sunlari içerir: . antikorlar asagidakileri içerir: 0 yeniden kaplanan antikorlar (5,639,641 sayili U.S. Patent); o insanlastirilmis veya tamamen insan antikorlari (Insanlastirilmis veya tamamen insan antikorlari, bunlarla sinirli olmamak üzere, huMy9-6, huB4, bivatuzumab, sibrotuzumab ve rituksimab arasindan seçilir (bakiniz örn., U.S. o st, Fab, Fab' ve F(ab')2 gibi tercihli olarak bir hedef hücreye baglanan Ek hücre baglama ajanlari arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, diger hücre baglayici proteinler ve polipeptitler bulunur: o interferonlar (örn., oi, [3, v); 0 IL-2, lL-3, IL-4, IL-6 gibi Ienfokinler; o insülin, TRH (tirotropin salgilayan hormonlar), MSH (melanosit uyarici hormon), androjenler ve östrojenler gibi steroid hormonlari gibi hormonlar; ve o büyüme faktörleri ve EGF, TGF-d, IGF-1, G-CSF, M-CSF ve GM-CSF gibi koloni Hücre baglama ajaninin bir antikor oldugu durumlarda, bir polipeptid olan bir antijene baglanir ve bir transmembran molekülü (örn., reseptör) veya bir büyüme faktörü gibi bir ligand olabilir. Örnek antijenler, renin; insan büyüme hormonu ve bovin büyüme hormonu dahil bir büyüme hormonu; büyüme hormonu salma faktörü; paratiroid hormonu; tiroid uyarici hormon; lipoproteinler; alfa-1-antitripsin; insülin A-zinciri; insülin B zinciri; proinsülin; folikül uyarici hormon; kalsitonin; lüteinlestirici hormon; glukagon; faktör vmc, faktör IX, doku faktörü (TF) ve von Willebrands faktörü gibi pihtilasma faktörleri; Protein C gibi pihtilasma önleyici faktörler; atriyal natriüretik faktör; akciger surfaktani; ürokinaz veya insan idrari gibi bir plazminojen aktivatörü veya doku tipi plazminojen aktivatörü (t-PA); bombesin; trombin; hemopoietik büyüme faktörü; tümör nekroz faktörü-0( ve -B; enkefalinaz; RANTES (aktivasyon üzerinde regüle edilir, normal olarak T hücresi eksprese edilir ve salgilanir); insan makrofaj enflamatuar proteini (MIP- 1-alfa); insan serum albümini gibi bir serum albümini; Muellerian inhibe edici madde; relaksin A-zinciri; relaksin B-zinciri; prorelaksin; fare gonadotropin ile iliskili peptid; beta- laktamaz gibi bir mikrobiyal protein; DNaz; IgE; CTLA-4 gibi bir sitotoksik T-Ienfosit ile iliskili antijen (CTLA); inhibin; aktivin; vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF); hormonlar veya büyüme faktörleri için reseptörler; protein A veya D; romatoid faktörler; kemikten türetilmis nörotrofik faktör (BDN F), nörotrofin-3, -4, -5 veya -6 (NT-3, NT4, NT- veya NT-6) gibi bir nörotrofik faktör veya NGF-ß gibi bir sinir büyüme faktörü; trombosit kaynakli büyüme faktörü (PDGF); aFGF ve bFGF gibi fibroblast büyüme faktörü; epidermal büyüme faktörü (EGF); TGF-alfa ve TGF-beta gibi dönüstürücü10 büyüme faktörü (TGF), TGF-betal, TGF-ß2, TGF-ßs, TGF- ([34 veya TGF-ß5 dahil; insülin benzeri büyüme faktörü-l ve -Il (IGF-l ve IGF-II), des(, insülin benzeri büyüme faktörü baglayici proteinler, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 ve CD4O gibi CD proteinleri; eritropoietin, osteoindüktif faktörler, immünotoksinler, bir kemik morfogenetik proteini (BMP), interferon-alfa, -beta ve -gama gibi bir interferon, koloni uyarici faktörler (CSF'ler), örnegin M-CSF, GM-CSF ve G- CSF; interlökinler (IL'Ier), örn., IL-1 ila IL-10; süperoksit dismutaz, T-hücre reseptörleri, yüzey membran proteinleri, bozunma hizlandirici faktör, örnegin HIV zarfinin bir kismi gibi viral antijen; transport proteinleri homing reseptörler, adresinler, düzenleyici proteinler, CDlla, CD11b, CDllc, CD18, bir ICAM, VLA-4 ve VCAM gibi integrinler, bir heterodimerik insan integrin reseptörünün bir heterodimerik insan integrin reseptörünün alfa-V alt birimi; HER2, HER3, HER4 reseptörü gibi tümör iliskili bir antijen; ve yukarida listelenen polipeptitlerin herhangi birinin fragmanlarini içerir. Bu bulus tarafindan kapsanan antikorlar için tercih edilen antijenler, CD3, CD4, CD8, HER4 reseptörü gibi ErbB reseptörü familyasi üyeleri; LFA-1, Macl, p150.95, VLA-4, integrin gibi hücre adezyon molekülleri (örn., anti-CD 1 1a , anti-CD 18 veya anti-CDl 1b antikorlari); VEGF gibi büyüme faktörleri; doku faktörü (TF); TGF-ß.; alfa interferon (alfa-IFN); IL-8 gibi bir interlökin; IgE; kan grubu antijenleri Ap02, ölüm reseptörü; fIk2/flt3 reseptörü; obezite (OB) reseptörü; mpI reseptörü; CTLA-4; protein C vb. içerir. Burada en çok tercih edilen hedefler arasinda, IGF-IR, CanAg, EGF-R, EphA2, MUCl, CD138, CA6, Her2/neu, CRlPTO (insan meme kanseri hücrelerinin çogunda yüksek seviyelerde üretilen bir protein), alfa v/beta3 integrin, alfa v/beta5 integrin, TGF-ß, CDl la, CD18, Ap02 ve 024 bulunur. Monoklonal antikor teknikleri, monoklonal antikorlar seklinde spesifik hücre baglama ajanilarin üretimine olanak saglar. Teknikte özellikle iyi bilinen, fareleri, siçanlari, hamsterleri veya herhangi bir diger memeliyi, intakt hedef hücre, hedef hücreden izole edilmis antijenler, tam virüs, atenüe tam virüs, ve viral kaplama proteinleri gibi gibi, ilgili antijen ile immünize etmek suretiyle üretilen monoklonal antikorlari olusturma teknikleridir. Hassaslastirilmis insan hücreleri de kullanilabilir. Monoklonal antikorlar olusturmanin bir baska yöntemi, st'nin faj kütüphanelerinin (tek Zincirli degisken10 bölge), özellikle insan st'lerinin kullanilmasidir (bakiniz örn., Griffiths et.al, U.S. Patent Uygun hücre baglama ajaninin seçilmesi, hedeflenecek belirli hücre popülasyonuna bagli olan bir seçim konusudur, ancak genel olarak, eger uygun olan mevcutsa, tercihli olarak bir hedef hücreye baglanan monoklonal antikorlar ve bunlarin fragmanlari tercih Örnegin, monoklonal antikor My9, Akut Miyeloid Lösemi (AML) hücrelerinde bulunan (1991)) ve AML hastalarini tedavi etmek için kullanilabilir. Benzer sekilde, monoklonal antikor anti-B4, B hücreleri üzerindeki CD 19 antijenine baglanan bir murin IgGi'dir lenfoma veya kronik Ienfoblastik lösemi gibi bu antijeni eksprese eden B hücreleri veya hastalikli hücreler ise, kullanilabilir. Benzer sekilde, N901 antikoru, küçük hücreli akciger kanseri hücrelerinde ve diger nöroendokrin kökenli tümörlerin hücrelerinde bulunan CD56'ya baglanan bir murin monoklonal lgGi antikorudur (Roy et al., J. Nat. Cancer HER2/neu'ya baglanir ve anti-EGF reseptörü antikoru EGF reseptörüne baglanir. SAFLASTIRMA YÖNTEMLERI Mevcut bulusun konjugati, diger bir deyisle nihai ürün, reaksiyona girmemis veya konjuge olmamis herhangi bir efektör veya haberci molekül veya reaksiyona girmemis baglayici veya konjuge olmayan, hidrolize edilmis baglayiciyi çikarmak için saflastirilir. Saflastirma yöntemi tegetsel bir akis filtrasyonu (çapraz akis filtrasyonu, ultrafiltrasyon veya diafiltrasyon olarak da bilinen TFF), jel filtrasyonu, adsorptif kromatografi, seçici çökeltme veya bunlarin kombinasyonlari olabilir. Adsorptif kromatografi yöntemleri arasinda iyon degisimi kromatografisi, hidroksiapatit kromatografisi, hidrofobik etkilesim kromatografisi (HlC), hidrofobik yük indüksiyon kromatografisi (HCIC), karisik mod iyon degisim kromatografisi, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC), boya ligand kromatografisi, afinite kromatografisi ve afinite kromatografisi; ters faz kromatografisi bulunur. Örnegin, formül 2'de açiklanan konjugat Ab-(X'-L-Y'-C)m, reaksiyona girmemis C veya reaksiyona girmemis/hidrolize edilmis baglayici X-L-Y veya X-L-Y'-C'den saflastirilir. Benzer sekilde, formül 4, 6 ve 9'da açiklanan konjugatlar saflastirilir. Bu tür10 saflastirma yöntemleri, teknikte uzman kisilerce bilinmektedir ve örnegin U.S. Yayini No. KONJUGATLARDA ARZU EDILMEYEN HIDROLIZE EDILMIS BAGLAYIZI VEYA PROTEIN ÇAPRAZ BAGLANMA Bir proteinin, reaktif maleimid veya haloasetamid rezidüsüne sahip bir heterobomidal baglayici ile baslangiç reaksiyonunu kullanan geleneksel konjugasyon yöntemleri, iki ana dezavantaja sahiptir: (i) konjugat ürünü, efektör veya haberci molekülle reaksiyondan önce antikor içerisindeki baglayicinin sulu aktiflestirilmesinden dolayi hidrolize baglayicidan olusabilir; ve (ii) maleimid (veya haloasetamid) grubunun, protein veya peptiddeki dogal histidin, lisin, tirosin veya sistein rezidüleri ile reaksiyonuna bagli olarak konjugatin zincir içi veya zincirler arasi çapraz baglanmasi (A. Papini et al., Int. J. 6322). Antikor içindeki bu zincirler arasi çapraz baglanma, agir ve hafif zincirler arasinda veya iki agir zincir arasinda indirgenemez kovalent baglantilara yol açacaktir; bu beklenen agir ve hafif zincir bantlarindan daha yüksek molekül agirlikli bantlar olarak SDS-PAGE analizinin indirgenmesinde açikça görülecektir. Antikor içindeki bu zincir içi veya zincirler arasi çapraz baglanma, ayrica, beklenen antikor kitlelerinin arti baglantili haberci veya efektör gruplarininkinden farkli, anormal kütlelerin tepe noktalari olarak da görünecektir. Geleneksel konjugasyon yöntemlerinden farkli olarak, bu basvuruda tarif edilen yöntem, önemli bir zincirler arasi çapraz baglama veya hidrolize baglayici içermeyen yüksek homojenlige sahip konjugatlar ile sonuçlanir. ÖRNEKLER Sadece açiklama amaçli olan asagidaki örneklerin mevcut bulusu sinirlamasi amaçlanmamistir. Örnek 1. Antikorun, geleneksel iki adimli yönteme karsi bu yöntemle (Sekil 1) heterobifonksiyonel baglayici Maleimide-PEGn-NHS kullanilarak sitotoksik ajan DM1/DM4 ile konjugasyonu. DM1 [AP-deasetil- N2'-(3-merkapto-1-oksopropiI)-maytansin] veya DM4 [AF'-deasetil- AF'-(4-merkapto-4-metiI-1-oksopentil)maytansin] (DMx) tiyol in stok çözeltileri ve10 Maleimide-PEGn-NHS bifonksiyonel baglayicisii 30-60 mM'Iik konsantrasyonlarda N,N- dimetilasetamid (DMA) içerisinde hazirlandi. Baglayici ve DMX tiyol, %50 v/v 200 mM süksinat tamponu, 2 mM EDTA, pH 5.0 ihtiva eden DMA'da birlikte karistirildi ve DMx'in baglayiciya molar oranini 1.6:1 olarak verdi ve nihai DMX konsantrasyonu 15 mM olarak saglandi. Karistirdiktan sonra, reaksiyon karisimi 1-4 saat boyunca birakildi ve daha sonra reaksiyon karisiminin bir alikuotu 10 kez seyreltildi ve maleimidin 302 nm = 620 girmemis kalan herhangi bir maleimidin varligini belirlemek için 302-320 nm'de emilimi ölçüldü. (Reaksiyon karisiminin donmus bir alikuotunun ilave ters faz HPLC analizi, baglayici maleimidin tamamen kayboldugunu ve arzu edilen baglayici-DMX reaktifinin, antikora reaksiyon karisimi eklendigi sirada olusumunu dogrulamak için daha sonra 302 nm ve 252 nm'de absorbans izlemesi ile yapildi). UV ile baska bir maleimid bulunmadiginda, 4 mg/ml Ab, %90 fosfat tamponu/%10 DMA, pH 7.5 nihai konjugasyon kosullari altinda fosfat tamponu (pH 7.5) içindeki bir antikor çözeltisine saflastirilmadan reaksiyon karisiminin bir alikuotu ilave edildi. Konjugasyon reaksiyonunun ortam sicakliginda 2 saat devam etmesine izin verildi. Ab-DMX konjugati, pH 7.5 fosfat tamponunda dengelenmis bir G25 jel filtrasyon kolonu kullanilarak veya tegetsel akis filtrasyonu (TFF) kullanilarak fazlalik küçük moleküllü DMX ve baglayici reaktantlardan saflastirildi. Konjugasyon karisimi ayrica kovalent olmayan veya degisken baglanma yoluyla antikora baglanmis herhangi bir DMX türünün ayrismasini saglamak için pH 7.5 tampon içinde 2 gün boyunca 4 °C'de tutuldu. Konjugat daha sonra gece boyunca pH .5 histidin/glisin tamponu içine diyaliz edildi ve daha sonra nihai depolama için 0.22 um'lik bir filtreden süzüldür. Nihai konjugattaki Ab molekülü basina DMX molekülü sayisi (ortalama) konjugatin 252 ve 280 nm'de absorbansinin belirlenmesi yoluyla ve bu iki dalga boyunda DMX ve antikor için bilinen sönme katsayilari kullanilarak ölçülmüstür. DMX tiyolün heterobifonksiyonel maleimid-PEG4-NHS reaktifi ile baslangiç reaksiyonu için birkaç farkli reaksiyon kosulu kullanildi: %50 DMA/%50 sulu 200 mM süksinat tamponu pH ; veya %60 DMA/%40 200 mM süksinat tamponu pH (örnegin N N'-diizopr0pil etilamin, DIPEA veya 4-metilm0rfolin) ile %100 DMA. Bir dizi deneyde, DMx'in maleimid-PEG4-NHS baglayiciya (Pierce Endogen'den satin alinan) molar esdegeri, 1.2 - 2.4 arasinda degismistir ve reaksiyon süresi, 30 dakika olmustur. Saflastirilmis konjugatlarda ölçülen DMX/Ab sayisi, baglayici basina ilave10 DMX esdegerlerinin bir fonksiyonu olarak ölçüldü. 1.2 - 2.0 esdeger DM1/Baglayici kosullari, benzer DMx/Ab yüklerine sahip konjugatlar verdi, bu, baglayicinin NHS ester tarafinda DMx tiyolünün arzu edilmeyen reaksiyonunun önemli bir sorun olmadigini göstermektedir. Nihai konjugatlarda bulunan çapraz baglama miktari ayrica, çapraz baglanmis kontaminant maddelerin varliginin artan DM1/baglayici orani ile birlikte önemli ölçüde azaldigini gösteren SDS PAGE indirgemesi yoluyla analiz edildi. Maleimid veya haloasetamid reaktifleri (maleimidobütirik asit veya maleimidopropiyonik asit veya N-etilmaleimid veya iyodoasetamid veya iyodoasetik asit gibi) kullanilarak istege bagli bir söndürme adimi, DMX tiyolün antikor ile arzu edilmeyen reaksiyonlarini önlemek için fazlalik DMX tiyol grubunu söndürmek amaciyla, baslangiç DMX ve heterobifonksiyonel baglayici reaksiyonun tamamlanmasindan sonra (antikora reaksiyon karisiminin ilave edilmesinden önce) dahil edildi. Antikorun DMx ve heterobifonksiyonel baglayicinin saflastirilmamis baslangiç reaksiyon karisimi ile reaksiyonunun alternatif bir yöntemi, konjugasyon reaksiyonu için pH degerini 6.5-8.5'e yükseltmek için tampon veya baz ilavesini takiben, DMX ve heterobifonksiyonel baglayicinin baslangiç reaksiyon karisiminin (DMX-baglayici reaksiyonun tamamlanmasinin ardindan) düsük pH'da (pH~5) antikor ile karistirilmasini içermektedir. Bir antikor-PEG4-MaI-DM1 veya DM4 konjugati, bu bulusta tarif edilen konjugasyon yöntemi ile karsilastirmak üzere geleneksel iki adimli konjugasyon yöntemi ile yapilmistir. pH 7.5 fosfat tamponu (50 mM potasyum fosfat, 50 mM sodyum klorid, 2 mM EDTA, pH 7.5) ve %5 DMA içinde 8 mg/ml konsantrasyonda insanlastirilmis antikor, fazlalik heterobifonksiyonel maleimid-PEG4-NHS baglayici reaktif maddesi ile degistirildi (Pierce Endogen'den satin alinmistir). 25 °C'de 2 saat sonrasinda, modifiye edilmis antikor, reaksiyona girmemis, dahil edilmemis fazlalik baglayiciyi çikarmak için G25 kromatografisi ile jel ile saflastirildi. Saflastirilmis Ab'nin geri kazanimi 280 nm'de UV emilimi ile belirlenmistir. Modifiye edilmis Ab'deki baglanmis maleimid gruplarinin sayisi, modifiye edilmis antikordaki maleimid rezidüleri ile reaksiyona girmesi için maleimid üzerinde fazladan bilinen bir miktarda tiyol (2-merkaptoetanol gibi) ilavesi ile modifiye edilmis bir küçük alikuot kullanimi ile belirlendi, ve daha sonra kalan tiolün DM1 veya DM4 tiyolü ile konjugasyonu, %95 fosfat tamponu pH 7.5 (50 mM potasyum fosfat, 50 mM sodyum klorid, 2 mM EDTA, pH 7.5) ve %5 DMA içeren bir reaksiyon karisiminda 2.5 mg/ml'lik bir Ab konsantrasyonunda gerçeklestirildi. Ab'deki baglanmis maleimid mol degeri basina 1.7 molar esdegerde fazlalik DM1 veya DM4 tiyol ilave edildi. 25 °C'de gece boyunca reaksiyona sokulduktan sonra, konjugat, 0.22 um'lik bir filtre kullanilarak steril olarak süzüldü ve jel, reaksiyona girmemis fazlalik DM1 veya DM4'ten fosfat tamponu pH 7.5'de (50 mM potasyum fosfat, 50 mM sodyum klorid, 2 mM EDTA, pH 7.5) dengelenmis bir 625 kolonu ile saflastirildi. Saflastirilmis konjugat, kovalent olmayan bir antikora veya degisken bir bag ile baglanmis herhangi bir DM1 veya DM4 türünün ayrismasina izin vermek üzere 4 °C'de 2 gün süreyle fosfat tamponu pH tutuldu. Konjugat daha sonra 2 gün boyunca histidin/glisin tamponu pH 5.5'te (130 mM glisin/10 mM histidin, pH 5.5) diyaliz edildi ve 0.22 pm'lik bir filtre kullanilarak steril olarak süzüldü. Nihai konjugattaki Ab molekülü basina DM1 veya DM4 molekülleri sayisi, bu iki dalga boyunda DM1/DM4 ve Ab için bilinen sönme katsayilari kullanilarak konjugatin 252 ve 280 nm'de absorpsiyonunu belirleyerek ölçülmüstür. SDS PAGE indirgemesi, %4-12 Bis Tris Gel (lnvitrogen) içeren NuPage elektroforez sistemi kullanilarak konjugat ve antikor numuneleri üzerinde gerçeklestirildi. Isi denatüre edildi ve indirgenmis numuneler 10 ug/seritte yüklendi. Bu bulusta açiklanan yöntem kullanilarak hazirlanan konjugatlarin indirgeme SDS-PAGE'si, ana bantlar olarak sadece beklenen agir ve hafif zincir bantlarini (sirasiyla 50 kDa ve 25 kDa) göstermistir (Sekil 2). Buna karsilik, geleneksel iki adimli konjugasyon yöntemiyle hazirlanan konjugatlar, sirasiyla muhtemelen zincirler arasi çapraz baglanmis türler HL, H2, H2L ve çapraz baglanmis bantlar göstermistir. (Sekil 2). Bu bulusta açiklanan yöntemle hazirlanan antikor-PEG4-Mal-DM4 konjugatinin Protein LabChip elektroforez analizi (indirgeme kosulu altinda), sirasiyla benzer %65 ve %30 konjuge olmayan antikora benzer sekilde, (toplam proteinin) %58 ve %30 yüzdeleri ile beklenen agir ve hafif zincir bantlarini gösterdi (Sekil 3). Buna karsilik, geleneksel iki adimli konjugasyon yöntemi kullanilarak hazirlanan konjugat, sirasiyla sadece %16 ve 169 kDa arasinda degisen yüksek molekül agirlikli ana bantlar gösterdi. Kantitatif10 Protein LabChip analizine dayanarak, bu basvuruda tarif edilen yöntemle hazirlanan konjugat, geleneksel iki adimli proses kullanilarak hazirlananlardan çok daha üstündür Bu bulusta açiklanan yöntemle hazirlanan konjugatlarin MS analizi, antikor molekülü basina artan sayida maytansinoid molekülü tasiyan antikor için ayrik DMx-antikor konjugat tepe noktalarini göstermistir (Sekil 4). Buna karsilik, geleneksel 2 adimli yöntem kullanilarak elde edilen konjugatin MS'si neredeyse çözülmemistir, ve çapraz- baglanma veya inaktive edilmis maleimid baglayicilardan dolayi konjugat preparasyonunun homojensizligini ortaya koymaktadir. Bu nedenle, MS'e dayanarak, bu bulusta tarif edilen yöntem kullanilarak hazirlanan konjugat, geleneksel iki adimli yöntem ile sentezlenenden daha üstündür. Bu bulusta açiklanan yöntemle hazirlanan bir anti-CanAg Ab-PEG4-MaI-DM1 konjugatinin baglanmasi, antijen eksprese eden COL0205 hücrelerini kullanarak akis sitometrisi ile ölçüldü ve konjuge edilmemis antikorunkine benzer oldugu bulundu ve konjugasyonun antikorun baglanmasi üzerinde zararli bir etkisi olmadigini göstermistir (Sekil 5). Bu bulusta tarif edilen yöntemle hazirlanan anti-CanAg Ab-PEG4-MaI-DM1 konjugatinin sitotoksik etkinligi, CanAg antijenini eksprese eden COL0205 kolon kanseri hücreleri kullanilarak in vitro olarak ölçüldü (Sekil 6). Antijen eksprese eden kanser hücreleri, fetal bovin serumu içeren hücre kültürü ortamindaki 96 kuyucuklu bir plaka içerisinde yaklasik 1000 hücre/kuyucukta kaplandi ve degisik konsantrasyonlarda Ab-DMX konjugatina maruz birakildi. Konjugata 5 gün maruz kaldiktan sonra, her kuyucukta kalan canli hücreler WST-8 tahlili (Dojindo Molecular Technologies) kullanilarak ölçülmüstür. Sekil 6'da gösterildigi gibi, bu yöntem kullanilarak hazirlanan anti-CanAg Ab-PEG4-MaI-DM1 konjugati, CanAg antijenini eksprese eden COL0205 kolon kanseri hücrelerine karsi düsük konsantrasyonlarda oldukça etkiliydi. Bu bulusta tarif edilen yöntemle hazirlanan anti-CanAg Ab-PEG4-Mal-DM1 konjugatinin sitotoksisitesi, konjuge olmayan fazlalik antikor ilavesiyle bloke edilebilecegi için COL0205 hücrelerine özgüdür. Örnek 2. Antikorun sirali iki adimli yönteme karsi, bu yöntemle maleimid-Sulfo- NHS baglayici kullanilarak DM1IDM4 ile konjugasyonu (Sekil 7) DMx tiyol ve maleimid-Sulfo-NHS heterobifonksiyonel baglayicilarinin stok çözeltileri, içerisinde hazirlandi. Baglayici ve DMx tiyol, %40 v/v 200 mM süksinat tamponu, 2 mM EDTA, pH 5.0 ihtiva eden DMA'da karistirildi, DMx baglayici oranini 1.6 olarak verdi ve 15 mM'ye esit bir nihai DMx konsantrasyonu elde edildi. Karistirildiktan sonra reaksiyon, 1-4 saat boyunca birakildi ve daha sonra reaksiyonun tamamlanmasini ve maleimid yoklugunu degerlendirmek üzere 302-320 nm'de absorbansi ölçmek için reaksiyon karisiminin bir alikuotu 10 kez seyreltildi. (Reaksiyon karisiminin donmus bir alikuotunun ilave ters faz HPLC analizi, baglayici maleimidin tamamen kayboldugunu ve antikora reaksiyon karisimi eklendigi sirada arzu edilen baglayici-DMx reaktifinin olusumunu dogrulamak için daha sonra 302 nm ve 252 nm'de absorbans izlemesi ile yapildi). UV ile baska bir maleimid bulunmadiginda, 4 mg/ml Ab, %90 fosfat tampon/%10 DMA, pH 7.5 nihai konjugasyon kosullari altinda fosfat tamponu (pH 7.5) içindeki bir antikor karisimina reaksiyon karisiminin bir alikuotu eklenmistir. Konjugasyon reaksiyonunun ortam sicakliginda 2 saat devam etmesine izin verildi. Ab-DMx konjugati, pH 7.5 fosfat tamponunda veya tegetsel akis filtrasyonunda dengelenmis bir G25 jel filtrasyon kolonu kullanilarak reaksiyona girmemis fazlalik DMx ve konjuge olmayan baglayici ürünlerden saflastirildi. Konjugat, kovalent olmayan veya degisken bir bag ile antikora baglanan herhangi bir DMx türünün ayrismasini saglamak için pH 7.5 tamponunda 2 gün boyunca 4 °C'de tutuldu. Konjugat daha sonra gece boyunca pH 5.5 histidin/glisin tamponu içine diyaliz edildi ve daha sonra nihai depolama için 0.22 um'lik bir filtreden süzüldü. Nihai konjugattaki Ab antikor molekülü basina DMx moleküllerinin sayisi (ortalama) konjugatin 252 ve 280 nm'de absorbansinin belirlenmesi yoluyla ve bu iki dalga boyunda DMx ve antikor için bilinen sönme katsayilari kullanilarak ölçülmüstür. Karsilastirma amaciyla, Ab-Sulfo-MaI-DMX konjugatlari, geleneksel 2 adimli konjugasyon yöntemi kullanilarak hazirlandi. 8 mg/ml konsantrasyonunda pH 7.5 fosfat tamponu/%5 DMA tamponu içindeki antikor (Ab), fazlalik bifonksiyonel maleimid-Sulfo- NHS baglayici ile modifiye edildi. Reaksiyonun 20 °C'de 2 saat devam etmesine izin verildi ve daha sonra modifiye edilmis Ab, G25 kromatografisi kullanilarak reaksiyona girmemis fazlalik baglayicidan saflastirildi. Saflastirilmis Ab'nin geri kazanimi 280 nm'de UV emilimi ile belirlenmistir. Modifiye edilmis Ab'deki baglanmis maleimid gruplarinin sayisi, modifiye edilmis antikordaki maleimid rezidüleri ile reaksiyona girmesi için maleimid üzerinde fazladan bilinen bir miktarda tiyol (2-merkaptoetanol gibi) ilavesi edilmesi ile modifiye edilmis küçük bir alikuot kullanilarak belirlendi, ve daha sonra kalan10 tiyolün DTNB reaktifi kullanilarak Ellman testi ile tahlil edilmesi (412 nm = 14150 M'1 cm' 1'de TNB tiyolatinin söndürme katsayisi; Riddles, PW vd., Methods Enzymol; 1983, 91, ile konjugasyonu %95 pH içinde 2.5 mg/ml'lik bir antikor konsantrasyonunda gerçeklestirildi, Ab içindeki baglanmis maleimidin mol degeri basina 1.7 molar esdegerinde DMX tiyol eklendi. Reaksiyon, 8-24 saat 18 ° C'de birakildi ve konjugat, G25 boyut dislama kromatografisi yoluyla reaksiyona girmemis fazlalik DMx'den ayrildi. Saflastirma prosesinden sonra konjugat, kovalent olmayan veya degisken baglanma yoluyla antikora baglanan herhangi bir DMX türünün ayrismasini saglamak Için pH 7.5 tampon içinde 2 gün boyunca 4 °C'de tutuldu. Konjugat daha sonra gece boyunca pH 5.5 histidin/glisin tamponu içine diyaliz edildi ve daha sonra nihai depolama için 0.22 pm'lik bir filtreden süzüldü. Nihai konjugattaki Ab molekülü basina DMX molekülü sayisi, konjugatin 252 ve 280 nm'de absorbansinin belirlenmesi yoluyla ve bu iki dalga boyunda DMX ve antikor için bilinen sönme katsayilari kullanilarak ölçülmüstür. SDS PAGE indirgemesi, bir NuPage %4-12 Bis Tris Mini Jeli ve NuPAGE MOPS SDS çalisan tamponu ile NuPage elektroforez sistemi (Invitrogen) kullanilarak konjugat ve moleküler agirliga sahip olan jel üzerindeki bantlar, zincirler arasi çapraz baglanmis türlerin (sirasiyla HL, H2L ve H2L2) göstergesidir. Ab-Sulfo-Mal-DM1 ~4 DM1/Ab (sirasiyla bu yöntemle serit 3 ve geleneksel 2 adimli konjugasyon yöntemi ile serit 2) ve ~ 6 DM1/Ab (sirasiyla bu yöntemle serit 5, ve geleneksel 2 adimli konjugasyon yöntemi serit 4) konjugatlarinin bir karsilastirmasi, açikça bu bulusta açiklanan yöntemle yapilan konjugatlarin (seritler 3 ve 5) geleneksel 2 adimli yöntemle yapilan konjugatlardan (serit 2 ve 4) daha az oranda yüksek molekül agirlikli çapraz baglanmis tür oranina sahip oldugunu gösterir. Bu bulusta açiklanan yöntemle hazirlanan antikor-Sulfo-Mal-DM1 konjugatinin Protein LabChip elektroforez analizi (Indirgeme kosulu altinda) analizi, antikorun sirasiyla %70 ve %30 konjuge olmayan durumuna benzser, %70 ila 28'lik (toplam proteinin yüzdeleri) agir ve hafif zincir ana bantlarini göstermistir (Sekil 9). Buna karsilik, geleneksel iki adimli yöntem kullanilarak hazirlanan konjugat, sirasiyla sadece %53 ve 23 agir ve hafif bantlar ve muhtemelen zincirler arasi çapraz baglanma nedeniyle 99-152 kDa arasinda degisen yüksek molekül agirlikli ana bantlar gösterdi. Kantitatif Protein LabChip10 analizine dayanarak, bu basvuruda tarif edilen yöntemle hazirlanan konjugat, geleneksel iki adimli prosesi kullanilarak hazirlanana kiyasla zincirler arasi çapraz baglanma eksikligi açisindan daha üstündür (Sekil 9). Bu bulusta açiklanan yöntemle benzer ilaç yükleri ile ve geleneksel iki adimli yöntemle yapilan Ab-Sulfo-mal-DM1 konjugatlari , boyut dislama LC/MS analizi ile karsilastirildi (Sekil 10). Bu bulusta açiklanan yöntemle yapilan konjugatlar, yalnizca Ab-(baglayici- DMxn`ye esit kütle ile tepe noktalarinin beklenen dagilimini içeren arzu edilen MS spektrumunu göstermektedir. Geleneksel iki adimli yöntem kullanilarak yapilan konjugatlarda, spektrumdaki majör tepe noktalarinin tümü, arzu edilen Ab-(baglayici- DMx)n molekül bölümlerine ek olarak bir veya daha fazla hidrolize veya çapraz baglanmis baglayici fragmani içerir. Geleneksel 2 adimli reaksiyon dizisindeki zincirler arasi çapraz baglanma veya maleimidin sulu inaktivasyonunun varsayilan mekanizmasi, Sekil 17'de gösterilmis olup, burada antikorun heterobifonksiyonel baglayici ile baslangiç reaksiyonundan elde edilen dahil edilmis maleimid (veya haloasetamid) rezidüsü, zincirler arasi (veya moleküller arasi) çapraz baglanma ile sonuçlanan intramoleküler histidin, lisin, tirozin veya sistein rezidüleri ile reaksiyona girebilir, veya baslangiçta dahil edilmis maleimid (veya haloasetamid) rezidüsü (örnegin hidrolitik maleimid halka parçalanmasi veya maleimide su ilave edilerek) inaktive edilebilir ve bu nedenle, tiyol içeren efektör veya haberci grubu ile hizli reaksiyon için kullanilamaz hale gelir. Bu nedenle, LC-MS analizi, bu bulusta tarif edilen yöntemin, antikora baglanan az hidrolize edilmis veya hiç hidrolize edilmemis veya çapraz baglanmis baglayici fragmanlarla homojen konjugat üretme avantajina sahip oldugunu açikça göstermektedir. Bir anti-CanAg Ab-Sulfo-MaI-DM1 konjugatinin, bu bulusta tarif edilen yöntemle hazirlanan antikor molekülü basina (ortalama) 5.6 maytansinoid yüke baglanmasi, antijen eksprese eden COL0205 hücreleri kullanilarak akis sitometrisi ile ölçüldü ve konjugasyonun antikorun hedef antijene baglanmasini etkilemedigini ortaya koyan konjuge olmayan antikorunkine benzer oldugu bulundu (Sekil 11). Bu bulusta tarif edilen yöntemle hazirlanan anti-CanAg Ab-Sulfo-MaI-DM1 konjugatinin sitotoksik etkinligi, CanAg antijenini eksprese eden COL0205 kolon kanseri hücreleri kullanilarak in vitro olarak ölçüldü (Sekil 12). Antijeni eksprese eden kanser hücreleri, fetal bovin serumu içeren hücre kültürü ortamindaki 96 kuyucuklu bir plaka içerisinde yaklasik 1000 hücre/kuyucukta kaplandi ve degisik konsantrasyonlarda Ab-DMx konjugatina maruz10 birakildi. Konjugata 5 gün maruz kaldiktan sonra, kalan canli hücreler WST-8 testi (Dojindo Molecular Technologies) kullanilarak ölçülmüstür. Sekil 12'de gösterildigi gibi, bu yöntem kullanilarak hazirlanan anti-CanAg Ab-Sulfo-MaI-DM1 konjugati, CanAg antijenini eksprese eden COLO205 kolon kanseri hücrelerine karsi düsük konsantrasyonlarda oldukça etkiliydi. Bu konjugatin sitotoksisitesi, konjuge olmayan fazlalik antikor ile rekabeti tarafindan bloke edilebilecegi için spesifikti. Bu bulusta tarif edilen yöntemi kullanan alternatif bir konjugasyon yöntemi, DMX tiyolün antikor ile arzu edilmeyen reaksiyonlarini önlemek için fazlalik DMX tiyol grubunu söndürmek amaciyla baslangiç DMX ve heterobifonksiyonel baglayici reaksiyonunun tamamlanmasindan sonra (reaksiyon karisiminin antikora eklenmesinden önce), maleimid veya haloasetamid reaktifleri (4-maleimid obütirik asit veya 3-maleimid opropiyonik asit veya N-etilmaleimid veya iyodoasetamid veya iyodoasetik asit gibi) kullanarak bir söndürme adimini içermektedir. Spesifik bir örnekte, baslangiçtaki DMX ve heterobifonksiyonel baglayici reaksiyonunun tamamlanmasindan sonra (reaksiyon karisiminin antikora eklenmesinden önce), konjugasyon reaksiyonu sirasinda antikor DMX tiyol ile antikorun arzu edilmeyen herhangi bir reaksiyonunu önlemek için fazlalik DMX tiyol grubunu söndürmek için 4-maleimidobütirik asit ilave edildi. Fazlalik DM4 (3 mM) içeren bir DM4 ve Sulfo-MaI-NHS heterobfonksiyonel reaktif Içeren reaksiyon karisimina, arzu edilen DM4 tiyolün heterobfonksiyonel reaktifin maleimid grubuna baglanmasi üzerine, geri kalan DM4'ü baslangiç birlestirme reaksiyonundan söndürmek için, reaksiyon karisimina 20 dakika boyunca ortam sicakliginda iki kat molar fazlalik 4- maleimidobütirik asit (6 mM) ilave edildi. Reaksiyon karisiminin saflastirilmasi olmaksizin, 4 mg/ml Ab, %90 sulu fosfat tampon/%10 DMA, pH 7.5 nihai konjugasyon kosullari altinda fosfat tamponunda (pH 7.5) bir antikor çözeltisiyle bir alikuot karistirildi. Konjugasyon reaksiyonunun ortam sicakliginda 2 saat devam etmesine izin verildi. Antikor-DM4 konjugati, küçük moleküllü fazlalik DM4 ve baglayici reaktantlardan, pH 7.5 fosfat tamponunda dengelenmis bir G25 jel filtrasyon kolonu kullanilarak saflastirildi. Konjugasyon karisimi ayrica kovalent olmayan veya degisken baglanma yoluyla antikora baglanmis herhangi bir DMX türünün ayrismasini saglamak için pH 7.5 tampon içinde 2 gün boyunca 4 °C'de tutuldu. Konjugat daha sonra gece boyunca pH 5.5 histidin/glisin tamponu içine diyaliz edildi ve nihai depolama için 0.22 um'lik bir filtreden süzüldü. Nihai konjugattaki Ab molekülü basina ortalama DM4 molekülü sayisi, konjugatin 252 ve 280 nm'de absorbansinin belirlenmesi yoluyla ve bu iki dalga boyunda DM4 ve antikor için bilinen sönme katsayilari kullanilarak ölçülmüstür.10 Konjugat örnekleri, %4-12'Iik bir Bis Tris Jel (lnvitrogen) içeren NuPage elektroforez sistemi kullanilarak indirgeyici olmayan SDS PAGE ile analiz edildi. Isiyla denatüre edilmis numuneler 10 ug/seritte yüklendi. Bu bulusta açiklanan yöntem kullanilarak hazirlanan konjugatin indirgeyici olmayan SDS-PAGE'si (su verme olmadan) bir hafif zincir bandinin (~25 kDa) ve yari antikor bandinin (agir-hafif zincir; ~75 kDa) bir kanitini olusturmustir (Sekil 18). Öte yandan, 4-maleimidobutirik asit (fazlalik DMX tiyolü kaplamak için) ile muamele edilen bu bulusta tarif edilen yöntem kullanilarak hazirlanan konjugat bu arzu edilmeyen bantlardan (degistirilmemis antikor numunesi ile ayni seviyelerde) önemli ölçüde daha düsük miktarlara sahipti. 4-maleimid obütirik asit gibi tiyol söndürme reaktifleri ile baslangiç DMX ve heterobifonksiyonel reaksiyon karisiminin (antikor ile konjugasyondan önce) söndürülmesinin bir baska avantaji, antikor konjugasyon reaksiyonu sirasinda "serbest" DMX (DM1 veya DM4) veya konjuge olmamis Dmx türlerinin olmamasidir ve bu nedenle saflastirmadan sonraki nihai konjugat "serbest" veya konjuge olmayan DMX türlerini içermez. 4-maleimid obütirik asit (veya diger polar tiyoI-söndürücü reaktifler) içeren DMX-eklenme ürünü, DMX'den daha fazla suda çözünürdür ve bu nedenle kovalent olarak baglanmis antikor- DMX konjugatindan daha kolay ayrilabilir. Örnek 3. Antikorun, sulfo-NHS-SMCC baglayici kullanilarak maytansinoid (DM1/DM4) ile konjugasyonu (Sekil 13). DM1 veya DM4 tiyol (DMX) ve sulfo-SMCC heterobifonksiyonel baglayicisinin sulfo- NHS grubuyla (Pierce Endogen'den satin alindi; Sekil 13) stok çözeltileri DMA'da 30-60 mM konsantrasyonlarinda hazirlandi. Baglayici ve DM1 veya DM4 tiyol, DMA'da %40 v/V'ye kadar sulu 200 mM süksinat tamponu, 2 mM EDTA, pH 5.0 içeren bir DMA içinde karistirildi ve DM1 veya DM4 (DMX) baglayici oranini 1.6:1 olarak ve 6 mM'Iik bir nihai DMX konsantrasyonunu verdi. Karistirdiktan sonra reaksiyon, ortam sicakliginda 1-4 saat bekletildi ve daha sonra, bütün maleimidin reaksiyona girip girmedigini degerlendirmek için 302-320 nm'de absorbansi ölçmek amaciyla reaksiyon karisiminin bir alikuotu 10 kez seyreltildi. (Reaksiyon karisiminin donmus bir alikuotunun ilave ters faz HPLC analizi, daha sonra baglayici maleimidin tamamen kayboldugunu ve reaksiyon karisiminin antikora eklenmesi sirasinda arzu edilen sülfo-NHS-baglayici- Mal-DMX reaktifinin olusturuldugunu dogrulamak için 302 nm ve 252 nm'de izleyerek gerçeklestirildi). UV ile baska bir maleimid bulunmadiginda, 4 mg/ml Ab, %90 fosfat tampon (sulu)/%1O DMA (v/v), pH 7.5 nihai konjugasyon kosullari altinda fosfat10 tamponu (pH 7.5) içindeki bir antikorun sulu bir çözeltisine reaksiyonun bir alikuotu eklenmistir. Konjugasyon reaksiyonunun ortam sicakliginda 2 saat devam etmesine izin verildi. Ab-DMx konjugati, pH 7.5 fosfat tamponunda (sulu) dengelenmis bir G25 jel filtrasyon kolonu kullanilarak reaksiyona girmemis fazlalik reaktif ve fazlalik DMx'den saflastirildi. Konjugat, Ab'ye kovalent olmayan bir sekilde veya kararsiz baglanti yoluyla ayrilan herhangi bir DMX türünün ayrismasini saglamak için pH 7.5 tamponunda 2 gün boyunca 4 °C'de tutuldu. Konjugat daha sonra gece boyunca pH 5.5 histidin/glisin tamponu içine diyaliz edildi ve daha sonra nihai depolama için 0.22 um'lik bir filtreden süzüldü. Nihai konjugattaki Ab molekülü basina DMX molekülü sayisi, konjugatin 252 ve 280 nm'de absorbansinin belirlenmesi yoluyla ve bu iki dalga boyunda DMx ve antikor için bilinen sönme katsayilari kullanilarak ölçülmüstür. Karsilastirma amaciyla, Ab-SMCC-DMX konjugatlari, geleneksel 2 adimli konjugasyon yöntemi kullanilarak hazirlandi. %95 pH 6.5 fosfat tamponu/%5 DMA tamponu içinde 8 mg/ml konsantrasyonundaki antikor (Ab), sulfo-NHS grubuyla (Pierce Endogen'den satin alindi) fazla bifonksiyonel sulfo-SMCC baglayici ile modifiye edildi. Reaksiyonun °C'de 2 saat devam etmesine izin verildi ve sonra modifiye edilmis Ab, G25 kromatografisi kullanilarak reaksiyona girmemis fazlalik baglayicidan saflastirildi. Saflastirilmis Ab'nin geri kazanimi 280 nm'de UV emilimi ile belirlenmistir. Modifiye edilmis Ab'deki baglanmis maleimid gruplarinin sayisi, modifiye edilmis antikordaki maleimid rezidüleri ile reaksiyona girmesi için maleimid üzerinde fazladan ilave edilen bilinen bir miktarda tiyol (2-merkaptoetanol gibi) ilavesi ile modifiye edilmis antikorun küçük bir alikuotu kullanilarak belirlendi, ve daha sonra kalan tiyolün DTNB reaktifi konjugasyonu %95 pH içinde 2.5 mg/ml'lik bir antikor konsantrasyonunda gerçeklestirildi, Ab içindeki baglanmis maleimidin mol degeri basina 1.7 molar esdegerinde DMX tiyol eklendi. Reaksiyon, 8-24 saat 18 ° C'de birakildi ve konjugat, G25 kromatografisi ile fazla, reaksiyona girmemis fazlalik DM1"den (veya DM4) ayrildi. Saflastirmadan sonra konjugat, zayif bir sekilde baglanmis herhangi bir DM1/DM4 türünün hidrolizine izin vermek için pH 6.5 tamponunda 2 gün boyunca 4 °C'de tutuldu. Konjugat daha sonra gece boyunca pH 5.5 histidin/glisin tamponu içine diyaliz edildi ve daha sonra nihai depolama için 0.22 pm'lik bir filtreden süzüldü. Nihai nm'de absorbansinin belirlenmesi yoluyla ve bu iki dalga boyunda DM1/DM4 ve antikor için bilinen sönme katsayilari kullanilarak ölçülmüstür. SDS PAGE indirgemesi, bir NuPage %4-12 Bis Tris Mini Gel ve NuPAGE MOPS SDS çalisan tamponu (Sekil 14) ile NuPage elektroforez sistemi (lnvitrogen) kullanilarak kDa moleküler agirliga sahip olan jel üzerindeki bantlar, zincirler arasi çapraz baglanmis türlerin (sirasiyla HL, H2L ve H2L2) göstergesidir. Ab-SMCC-DM1 ile konjugatlarin 3.1 D/Ab (sirasiyla bu yöntemle serit 4, ve geleneksel 2 adimli yöntemle serit 3) ile karsilastirilmasi, açikça bu bulusta açiklanan yöntemle yapilan konjugatlarin (serit 4) geleneksel 2 adimli yöntemle yapilan konjugatlardan (serit 3) daha az oranda yüksek molekül agirlikli çapraz baglanmis tür oranina sahip oldugunu gösterir. Bu bulusta açiklanan yöntemle hazirlanan antikor-SMCC-DMI konjugatinin Protein LabChip elektroforez analizi (indirgeme kosulu altinda), sirasiyla %68 ve %30 konjuge olmayan antikoruna benzer (Sekil 15) %67 ve 30'Iuk (toplam proteinin) yüzdeleri olan agir ve hafif zincir ana bantlarini gösterdi. Buna karsilik, geleneksel iki adimli yöntem kullanilarak hazirlanan konjugat, sirasiyla sadece %54 ve 24 agir ve hafif bantlar ve muhtemelen zincirler arasi çapraz baglanma nedeniyle 96-148 kDa arasinda degisen yüksek molekül agirlikli ana bantlar gösterdi. Kantitatif Protein LabChip analizine dayanarak, bu basvuruda tarif edilen yöntemle hazirlanan konjugat, geleneksel iki adimli proses kullanilarak hazirlanana kiyasla zincirler arasi çapraz baglanma eksikligi açisindan daha üstündür (Sekil 15). Bu bulusta tarif edilen yöntem ile yapilan benzer ilaç yüklerine sahip ve ve geleneksel iki adimli yöntemle yapilan Ab-SMCC-DM1 konjugatlar, boyut dislama LC/MS analizi ile karsilastirildi (Sekil 16). Bu bulusta açiklanan yöntemle yapilan konjugat, yalnizca Ab- (baglayici-DMx)n`ye esit kütle ile tepe noktalarinin beklenen dagilimini içeren arzu edilen MS spektrumunu göstermektedir. Geleneksel iki adimli yöntemi kullanarak yapilan konjugat durumunda, spektrum arzu edilen Ab-(baglayiCi-DMX)n türlerini ve inaktive edilmis maleimid ve çapraz baglanmis baglayici fragmanlarini içeren ilave türleri içeren türlerin heterojen bir karisimini göstermektedir. Geleneksel 2 adimli reaksiyon dizisindeki zincirler arasi çapraz baglanma ve maleimid inaktivasyonunun varsayilan mekanizmalari, Sekil 17'de gösterilmis olup, burada antikorun heterobfonksiyonel baglayici ile ilk reaksiyonundan dahil edilen maleimid (veya10 haloasetamid rezidüsü) zincir içi çapraz baglanma ile sonuçlanan molekül içi (veya moleküller arasi) histidin, Iisin, tirozin veya sistein rezidüleriyle reaksiyona girebilir veya baslangiçta dahil edilmis maleimid (veya haloasetamid) rezidüsü, tiyol içeren DM1 veya DM4 (DMX) ajani ile reaksiyon adimindan önce maleimid rezidüsünün hidrolizi veya hidrasyonu ile inaktive edilebilir. Bu nedenle, LC-MS analizi, bu bulusta tarif edilen yöntemin, antikora baglanmis az miktarda etkisizlestirilmis maleimid veya çapraz baglanmis baglayici fragmanlarla homojen konjugat üretme avantajina sahip oldugunu açikça göstermektedir. Örnek 4. Antikorun bu yöntemle parçalanabilir disülfit baglayicilara sahip DM1/DM4 (DMX) ile konjugasyonu (Sekil 19). DM1 veya DM4 tiyol (DMX) ve heterobifonksiyonel baglayici 4-(2-piridildiy0) bütanoik asit-N-hidroksisüksinimid ester (SPDB) içeren stok çözeltiler, DMA'da 30-60 mM konsantrasyonlarinda hazirlandi. Baglayici ve DMX tiyol, % 40 DM/hac sulu 200 mM süksinat tamponu, 2 mM EDTA, pH baglayici orani 1.6:1 olacak sekilde ve bir 8 mM'lik DMX nihai konsantrasyon orani vermek üzere karistirildi. Karistirdiktan sonra reaksiyon, ortam sicakliginda 1 saat bekletildi ve daha sonra 4 mg/ml Ab, %90 fosfat tamponunun (sulu)/%10 DMA (v/v), pH 7.5 nihai konjugasyon kosullari altinda fosfat tamponu (pH 7.5) içindeki bir sulu antikor çözeltisine reaksiyondan bir alikuot ilave edildi. Konjugasyon reaksiyonunun ortam sicakliginda 2 saat devam etmesine izin verildi. Ab-DMx konjugati, pH 7.5 fosfat tamponunda (sulu) dengelenmis bir G25 jel filtrasyon kolonu kullanilarak reaksiyona girmemis fazlalik reaktif ve fazlalik DMx'den saflastirildi. Konjugat, Ab'ye kovalent olmayan bir sekilde veya degisken baglanma yoluyla bagli herhangi bir DMX türünün ayrismasini saglamak için pH 7.5 tamponunda 2 gün boyunca 4 °C'de tutuldu. Konjugat daha sonra gece boyunca pH 5.5 histidin/glisin tamponu içine diyaliz edildi ve daha sonra nihai depolama için 0.22 um'lik bir filtreden süzüldü. Nihai konjuge üzerindeki Ab molekülü basina DMX moleküllerinin sayisi, bu iki dalga boyunda DMX ve antikor için bilinen sönme katsayilari kullanilarak konjugatin 252 ve 280 nm'de absorpsiyonunu belirleyerek ölçülmüstür. Örnek 5. Antikor-DM1/DM4 (Ab-DMX) konjugatinin bu yöntem kullanarak hem disülfit hem de parçalanamayan baglayicilarla preparasyonu (Sekil 20). DM1 veya DM4 tiyol (DMX) ve NHS-PEGn-Maleimid heterobifonksiyonel baglayicinin stok çözeltileri, içerisinde hazirlandi. NHS-PEG4-Maleimid baglayici ve DMx tiyol, %40 v/v 200 mM süksinat tamponu, 2 mM EDTA, pH 5.0 ihtiva eden DMA içerisinde bir arada karistirildi ve DMx baglayici molar oranini 1.6:1 olarak verdi ve nihai DMx konsantrasyonunu 8.0 mM'ye esit olarak verdi. Reaksiyon karisimi, ortam sicakliginda 2 saat reaksiyona girmeye birakildi. Ayri bir paralel reaksiyonda, SPDB baglayici ve DMx tiol birlikte karistirilmis ve 1 saatlik bir reaksiyon süresi haricinde NHS-PEG4-maleimid reaksiyonu için kullanilan sartlara benzer bir sekilde reaksiyona sokulmustur. Her iki reaksiyonun tamamlanmasindan sonra ve saflastirilmadan sonra, esit hacimlerde PEG4-MaI-DM4 karisimi ve SPDB-DM4 karisimi birlestirildi. Birlestirilen reaksiyon karisimlarinin bir alikuotu, 4 mg/ml Ab, %90 fosfat tamponu (sulu)/%10 DMA (v/v), pH 7.5 nihai konjugasyon kosullari altinda fosfat tamponu (pH 7.5) içindeki bir antikor çözeltisine saflastirilmadan ilave edildi. Konjugasyon reaksiyonunun ortam sicakliginda 2 saat devam etmesine izin verildi. Ab-DMx konjugati, reaksiyona girmemis fazlalik reaktiflerden ve fazlalik DMx'den, pH 7.5 fosfat tamponunda (sulu) dengelenmis bir G25 jel filtrasyon kolonu kullanilarak saflastirildi. Konjugat, Ab'ye kovalent olmayan bir sekilde veya degisken baglanma yoluyla baglanmis DMx türlerinin ayrismasini saglamak için pH 7.5 tamponunda 2 gün boyunca 4 c'C'de tutuldu. Konjugat daha sonra gece boyunca pH 5.5 histidin/glisin tamponu içine diyaliz edildi ve daha sonra nihai depolama için 0.22 um'lik bir filtreden süzüldü. Nihai konjugat üzerindeki Ab molekülü basina DMx moleküllerinin sayisi, bu iki dalga boyunda DMx ve antikor için bilinen sönme katsayilari kullanilarak konjugatin 252 ve 280 nm'de absorpsiyonunu belirleyerek ölçülmüstür. Bu bulusta tarif edilen yöntemle yapilan Ab-(karisik SPDB ve PEG4-Mal baglayici)-DMX konjugati, antikor basina DMx karsilastirilarak konjugatin DTT (dithiothreitol) prosesinden önce ve sonra disülfit bagini indirgemek için Ab üzerinde parçalanamayan karsi baglayicinin dahil edilme (D/A) oranini belirlemek üzere test edildi. DTT indirgeme sirasinda reaksiyon pH degerinin 7.5'te tutulmasi için konjugat ilk önce 250 mM HEPES tamponu pH 7.5'e diyaliz edildi. Konjugat daha sonra 37 °C'de 20 dakika boyunca 25 mM DTT ile reaksiyona sokularak indirgendi. DTT reaksiyonundan sonra, salinan DMx ve DTT, 250 mM HEPES tamponu pH 7.5'te dengelenmis bir G25 jel filtrasyon kolonu kullanilarak reaksiyon karisimindan ayrildi. Saflastirilmis üründeki Ab molekülü basina ortalama DMx molekülü sayisi, konjugatin 252 ve 280 nm'de absorpsiyonunu10 belirleyerek ve bu iki dalga boyunda DMX ve antikor için bilinen sönme katsayilari kullanilarak ölçüldü. DTT ile muamele edilmis konjugatin D/A orani ve DTT ile muamele edilmemis konjugatin D/A orani, parçalanamayan bag yoluyla Ab'ye baglanmis DMX yüzdesini hesaplamak için kullanilmistir. Iki ek örnek, Ab-SPDB-DM4 ve Ab-PEG4-Mal- DM4 konjugatlarina, sirasiyla pozitif ve negatif kontroller olarak DTT ile muamele edildi. DTT prosesinden önce ve sonra D/A oranini karsilastirarak, kontrol edilemeyen parçalanamaz Ab-PEG4-Mal-DM4 konjugati, yaklasik olarak baglanan bütün baglayicilarin beklendigi gibi parçalanamaz ( %93) oldugu gösterildi. Bu bulusta tarif edilen yöntemle yapilan hem parçalanamaz hem de disülfit baglayicilari içeren Ab- (karisik SPDB ve PEG4MaI baglayici)-DMX konjugati, tamamen parçalanabilir baglayicidan olusan Ab-SPDB-DMx'den DMX kaybi miktarina göre DTT prosesiyle parçalandiginda %41 daha az DMx'e sahiptir. Tamamen parçalanabilir baglayicidan olusan Ab-DMX konjugati bu bulusta tarif edilen yöntemle yapilan Ab-(karisik SPDB ve PEG4-Mal)-DMX konjugatinin yaklasik %40'inin parçalanamaz ve %60'inin parçalanabilir baglayicilardan olustugunu göstermistir. Parçalanamayan ve parçalanabilir baglayici reaktiflerin baslangiç oraninin degistirilmesiyle, antikorun maytansinoid veya baska bir efektör ile konjugatlari. farkli parçalanamayan ve parçalanabilir baglayici orani ile hazirlanabilir. Sekil 21, yukarida tarif edilen, hem disülfit baglayicilar (SPDB) hem de parçalanamayan baglayicilar (PEG) ile baglanan antikor molekülü basina ortalama 3.5 maytansinoid molekülüne sahip antikor içeren, yukarida açiklanan deglikosile edilmis konjugatin kütle spektrumunu göstermektedir. MS, hem parçalanamayan hem de prçalanabilir baglayicilari içeren ayri birlesik türler gösterir (Sekil 21). Örnegin, D2-PEG-SPDB olarak gösterilen konjugat tepe noktasi, bir disülfit-baglanmis ve bir parçalanamayan, tiyoeter-baglanmis maytansinoid molekülüne sahiptir; D3-PEG-2SPDB olarak gösterilen konjugat tepe noktasi, iki disülfit-baglanmis ve bir parçalanamayan, tiyoeter-baglanmis maytansinoid molekülü tasimaktadir; ve D3- 2PEG-SPDB olarak gösterilen konjugat tepe noktasi, bir disülfit-baglanmis ve iki parçalanamayan tiyoeter-baglanmis maytansinoid molekülü tasimaktadir. Örnek 6. Antikorun SMCC baglayici kullanarak maytansinoid ile konjugasyonu DM1 tiyol ve SMCC heterobifonksiyonel baglayicinin (Pierce) stok çözeltileri DMA'da mM süksinat tamponu, 2 mM EDTA, pH 5.0 ihtiva eden DMA içinde karistirildi; DM1'in10 baglayiciya orani 1.4:1 mol esdegerini verdi ve nihai DM1 konsantrasyonu 1 ila 6 mM arasinda bulundu. Karistirdiktan sonra reaksiyon, ortam sicakliginda 4 saate kadar birakildi ve daha sonra, tüm maleimidin tiyol ile reaksiyona girip girmedigini degerlendirmek için 302-320 nm'de absorbansi ölçmek için reaksiyon karisiminin bir alikuotu ile 10 kez seyreltildi. UV ile baska bir maleimid bulunmadiginda, 2.5 mg/ml Ab, fosfat tamponu içindeki bir antikorun sulu bir çözeltisine (pH 7.5-8.5) reaksiyonun bir alikuotu ilave edildi. Konjugasyon reaksiyonunun ortam sicakliginda 3 saat devam etmesine izin verildi. Ab-DM1 konjugati, reaksiyona girmemis veya hidrolize edilmis reaktif fazlaligindan ve DM1 fazlaligindan, pH 7.4 fosfat tamponu (sulu) içerisinde dengelenmis bir G25 jel filtrasyon kolonu kullanilarak saflastirildi. Konjugat daha sonra gece boyunca pH 7.4 fosfat tamponuna (sulu) diyaliz edildi ve daha sonra nihai depolama için 0.22 um'lik bir filtreden süzüldü. Nihai konjugattaki Ab molekülü basina DM1 molekülü sayisi, konjugatin 252 ve 280 nm'de absorbansinin belirlenmesi yoluyla ve bu iki dalga boyunda DM1 ve antikor için bilinen sönme katsayilari kullanilarak ölçülmüstür. Benzer sekilde, antikorun DM4 tiyol ve SMCC ile konjugatlari hazirlanabilir. SMCC baglayici kullanarak DM1 veya DM4 ile antikorun bu konjugatlari, tiyoeter parçalanamayan baglayici içerir. Bu bulusta açiklanan yöntemle yapilan Ab-SMCC-DM1 konjugati, glikosile edilmis konjugatin MS analizi ile karakterize edildi (Sekil 23). Bu bulusta açiklanan yöntemle yapilan konjugat, Ab-(baglayici-DM1)n'ye esit kütle ile tepe noktalarinin beklenen dagilimini içeren arzu edilen MS spektrumunu göstermektedir. Örnek 7. Antikorun, heterobifonksiyonel disülfit içeren baglayicilar (SSNPB, SPP) kullanilarak maytansinoid ile konjugasyonu. Disülfit içeren heterobifonksiyonel baglayicilar SSNPB (N-sülfosüksinimidiI-4-(5-nitro-2- piridildiyo)bütirat) ve SPP (N-süksinimidil-3-(2-piridildiyo)propiyonat) hazirlamak için kullanilabilir antikor-maytansinoid konjugatlari, Örnek 4'te SPDB baglayici hazirlamak için tarif edilene benzer bir yöntemle kullanilabilir. SPDB (Sekil 19) kullanilarak hazirlanan disülfit-baglanmis konjugatin yapisi, SSNPB ile hazirlanan konjugat ile aynidir (Sekil 24). SPDB kullanilarak hazirlanan bir disülfit-baglanmis konjugatin MS'si, antikora-baglanmis farkli sayida maytansinoid molekülüne karsilik gelen kütle degerlerine sahip ayri tepe noktalari göstermistir.10 Örnek 8. Antikorun, parçalanamayan baglayicilari içeren maytansinoid ile lineer alkil karbon zinciri ile konjugasyonu. Dogrusal alkil karbon zincirine sahip parçalanamayan baglayici içeren konjugatlar, örnegin 6'de SMCC baglayici için tarif edilen yönteme benzer sekilde lineer alkil karbon zinciri ile maytansinoid ve heterobifonksiyonel baglayicilarin reaksiyon karisimi kullanilarak hazirlandi. Örnegin, insanlastirilmis bir antikorun konjugatlari DM1 ile Sekil 26'da gösterildigi gibi BMPS (N-[ß-maleimid 0pr0pil0ksi]süksinimit ester) veya GMBS ((N-[v-maleimid obütiriloksi]süksinimit ester) baglayici kullanilarak Sekil 26'da gösterilmistir. % 60 DMA /% 40 (h / h) 200 mM süksinat tamponu, pH 5 içindeki BMPS veya GMBS (8 mM) ve DM1 tiyol ( içeren baslangiç reaksiyon karisimi, 15 °C'de kontrol edildiginde, maleimid molekül bölümünün (maleimid absorbansinin 302- 320 nm'de bozunmasina dayanarak) tam reaksiyonunu gösterdi. Bu reaksiyon karisimi, dakika arayla iki bölüm halinde, %20 DMA (v/v) içeren %80 sulu EPPS tamponu, pH 8.1, içinde 2.5 mg/ml'de insanlastirilmis bir antikor çözeltisine eklendi, toplam baglayici ise antikorun 8 molar esdegeri olarak eklendi. Konjugat karisimi 4 saat jel olarak saflastirildir ve sonrasinda 2 tur diyalize maruz birakildi. DM1/antikor orani 3.8 ve 5.1 GMBS veya BMPS ile hazirlanan bu konjugatlar, HISEP HPLC analizi sonucunda konjuge edilmemis hiç bir serbest ilaç göstermedi. Dogrusal alkil zincirleriyle parçalanamayan baglayici içeren benzer konjugatlar, AMAS (N-[ß-maleimid oasetoksi] süksinimid ester) veya EMCS (N-[ß-maleimid okaproiloksi] süksinimit ester) veya sülfo- N-hidroksisüksinimit esterleri (sulfo-GMBS, sulfo-EMCS) kullanarak Sekil 25'te gösterildigi gibi hazirlanabilir. Tablo 1, bu bulusta açiklanan yöntemle hazirlanan seçme konjugatlar için monomer %'sini göstermektedir, bunlarin tümü boyut dislama kromatografisi analizi ile yüksek monomer %'si göstermistir. Karsilastirma amaciyla, monomer %'si ayrica geleneksel iki adimli konjugasyon yöntemi ile (antikorun heterobifonksiyonel baglayici ile baslangiç reaksiyonu, ardindan mayansinoid tiyol ile reaksiyonu) hazirlanan konjugatlar için de gösterilmistir. TR TR TR TR TR TR TR TR TR

Claims (1)

1.
TR2019/07573T 2009-06-03 2010-06-02 Konjugasyon yöntemleri̇ TR201907573T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18377409P 2009-06-03 2009-06-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201907573T4 true TR201907573T4 (tr) 2019-06-21

Family

ID=43298108

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2019/07573T TR201907573T4 (tr) 2009-06-03 2010-06-02 Konjugasyon yöntemleri̇

Country Status (27)

Country Link
US (8) US8624003B2 (tr)
EP (2) EP2437790B1 (tr)
JP (7) JP5784592B2 (tr)
KR (4) KR102560218B1 (tr)
CN (2) CN104984360A (tr)
AU (1) AU2010256659B2 (tr)
BR (1) BRPI1010620B8 (tr)
CA (1) CA2761959C (tr)
CY (1) CY1121992T1 (tr)
DK (1) DK2437790T3 (tr)
ES (1) ES2726945T3 (tr)
HK (1) HK1216508A1 (tr)
HR (1) HRP20190898T1 (tr)
HU (1) HUE043645T2 (tr)
IL (7) IL300840A (tr)
LT (1) LT2437790T (tr)
ME (1) ME03479B (tr)
MX (3) MX349210B (tr)
PL (1) PL2437790T3 (tr)
PT (1) PT2437790T (tr)
RS (1) RS58810B1 (tr)
RU (2) RU2595424C2 (tr)
SG (2) SG176068A1 (tr)
SI (1) SI2437790T1 (tr)
SM (1) SMT201900284T1 (tr)
TR (1) TR201907573T4 (tr)
WO (1) WO2010141566A1 (tr)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7276497B2 (en) * 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
EP3539572A1 (en) 2005-08-24 2019-09-18 ImmunoGen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
AR076284A1 (es) 2009-04-29 2011-06-01 Bayer Schering Pharma Ag Inmunoconjugados de antimesotelina y usos de los mismos
BRPI1010620B8 (pt) * 2009-06-03 2021-05-25 Immunogen Inc métodos de conjugação
US20130295052A1 (en) * 2010-11-19 2013-11-07 Manu Chaudhary Novel conjugates for targeted drug delivery
RS58367B1 (sr) 2011-03-29 2019-03-29 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
CN103648532A (zh) 2011-06-21 2014-03-19 伊缪诺金公司 具有肽连接子的新型美登木素生物碱衍生物及其偶联物
WO2013081471A2 (en) * 2011-08-31 2013-06-06 Nikolai Vladimirovich Bovin Facile laboratory method for localising biomolecules to the surface of cells and viruses
US20140350228A1 (en) * 2011-12-13 2014-11-27 Immunogen, Inc. Use of n-hydroxysuccinimide to improve conjugate stability
LT2900676T (lt) 2012-09-26 2019-03-25 Immunogen, Inc. Maitanzinolio acilinimo patobulintas būdas
WO2014055877A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
MX2015004258A (es) * 2012-10-04 2015-09-25 Immunogen Inc Uso de una membrana de intercambio iónico para retirar impurezas de conjugados de agentes de unión celular y agentes.
WO2014055842A1 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Process for preparing stable antibody maytansinoid conjugates
WO2014082080A2 (en) * 2012-11-26 2014-05-30 Callidus Biopharma, Inc. Methods for coupling targeting peptides onto recombinant lysosomal enzymes for improved treatments of lysosomal storage diseases
WO2014089177A2 (en) 2012-12-04 2014-06-12 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines
JP6494533B2 (ja) 2013-02-28 2019-04-03 イミュノジェン・インコーポレーテッド 細胞結合剤及び細胞毒性剤としてのマイタンシノイドを含む複合体
WO2014134486A2 (en) 2013-02-28 2014-09-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
US9498532B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
NZ710929A (en) 2013-03-15 2018-02-23 Novartis Ag Antibody drug conjugates
WO2014182970A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Zymeworks Inc. Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs
WO2014194030A2 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
CN104232576B (zh) * 2013-06-14 2018-07-17 加思葆（北京）医药科技有限公司 蛋白-细胞偶联物、其制备方法和用途
US10208125B2 (en) 2013-07-15 2019-02-19 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof
AU2014348552A1 (en) 2013-11-13 2016-06-02 Zymeworks Inc. Monovalent antigen binding constructs targeting EGFR and/or HER2 and uses thereof
HRP20250551T1 (hr) 2013-11-27 2025-06-20 Zymeworks Bc Inc. Bispecifični antigen-vezujući konstrukti koji ciljaju her2
TWI541022B (zh) 2013-12-18 2016-07-11 應克隆公司 針對纖維母細胞生長因子受體－３（ｆｇｆｒ３）之化合物及治療方法
JP2017510548A (ja) * 2014-01-29 2017-04-13 シャンハイ ヘンルイ ファーマスーティカル カンパニー リミテッドＳｈａｎｇｈａｉ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． リガンド‐細胞傷害性薬物抱合体、その製造方法、およびその用途
EP3160513B1 (en) 2014-06-30 2020-02-12 Glykos Finland Oy Saccharide derivative of a toxic payload and antibody conjugates thereof
KR20170040249A (ko) 2014-08-12 2017-04-12 노파르티스 아게 항-cdh6 항체 약물 접합체
GB201416960D0 (en) * 2014-09-25 2014-11-12 Antikor Biopharma Ltd Biological materials and uses thereof
CA2961950A1 (en) 2014-09-28 2016-03-31 The Regents Of The University Of California Modulation of stimulatory and non-stimulatory myeloid cells
GB201419184D0 (en) * 2014-10-28 2014-12-10 Adc Biotechnology Ltd Method of synthesising biomolecule-effector/reporter-conjugates using affinity resins
EP3220959A1 (en) * 2014-11-19 2017-09-27 ImmunoGen, Inc. Process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
EP3223848B1 (en) 2014-11-27 2024-11-27 Zymeworks BC Inc. Methods of using bispecific antigen-binding constructs targeting her2
WO2016090157A1 (en) 2014-12-04 2016-06-09 Celgene Corporation Biomolecule conjugates
TW201711702A (zh) 2015-06-04 2017-04-01 應克隆公司 使用針對纖維母細胞生長因子受體３（ｆｇｆｒ３）之化合物的療法
CN106243127B (zh) * 2015-06-09 2021-01-26 凯惠科技发展(上海)有限公司 抗体药物偶联物、中间体、制备方法、药物组合物及应用
EP3310813A1 (en) 2015-06-17 2018-04-25 Novartis AG Antibody drug conjugates
AU2016334063B2 (en) 2015-10-08 2023-05-25 Zymeworks Bc Inc. Antigen-binding polypeptide constructs comprising kappa and lambda light chains and uses thereof
CN106606784B (zh) * 2015-10-19 2020-01-21 泰州迈博太科药业有限公司 一种靶向表达egfr肿瘤细胞的前抗体偶联药物及其应用
US10918627B2 (en) 2016-05-11 2021-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs
KR20240000650A (ko) 2016-10-19 2024-01-02 인벤라 인코포레이티드 항체 구조물
RU2644280C1 (ru) * 2016-12-12 2018-02-08 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) Способ получения противоопухолевого коньюгата на основе человеческого сывороточного альбумина, содержащего терапевтические и контрастирующий агенты
EP3554544A4 (en) 2016-12-16 2020-07-29 Bluefin Biomedicine, Inc. ANTI-PROTEIN 1 ANTIBODY CONTAINING AN ANTI-CUB DOMAIN (CDCP1), ANTIBODY-DRUG CONJUGATES AND THEIR METHODS OF USE
EP3559039A1 (en) 2016-12-22 2019-10-30 Università Degli Studi Magna Graecia Catanzaro A monoclonal antibody targeting a unique sialoglycosilated cancer-associated epitope of cd43
SI3558391T1 (sl) 2016-12-23 2022-06-30 Immunogen, Inc. Imunokonjugati, ciljno usmerjeni na ADAM9, in načini njihove uporabe
JOP20190187A1 (ar) 2017-02-03 2019-08-01 Novartis Ag مترافقات عقار جسم مضاد لـ ccr7
WO2018185618A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Novartis Ag Anti-cdh6 antibody drug conjugates and anti-gitr antibody combinations and methods of treatment
WO2018209239A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
WO2019000105A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Zymeworks Inc. STABILIZED CHIMERIC FABES
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
MA51629A (fr) 2018-01-12 2020-11-18 Immunogen Inc Procédés de production, purification et formulation de conjugués anticorps-médicaments
CA3094827A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Drug conjugates of cmet monoclonal binding agents, and uses thereof
EP3552631A1 (en) 2018-04-10 2019-10-16 Inatherys Antibody-drug conjugates and their uses for the treatment of cancer
WO2019234136A1 (en) 2018-06-05 2019-12-12 King's College London Btnl3/8 targeting constructs for delivery of payloads to the gastrointestinal system
CA3107417C (en) 2018-07-25 2023-10-17 Daiichi Sankyo Company, Limited Effective method for manufacturing antibody-drug conjugate
JP2022525785A (ja) * 2019-03-18 2022-05-19 ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク 高精度治療のための加水分解できない、切断可能でない、安定なリンカーおよびその用途
US12528821B2 (en) * 2019-03-29 2026-01-20 Purdue Research Foundation pH-dependent composition matters useful for study and diagnosis of alzheimer's disease
US11535634B2 (en) 2019-06-05 2022-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
TW202116356A (zh) 2019-07-10 2021-05-01 美商斯布雷克薩三號公司 作為治療劑之微管靶向藥劑之肽結合物
CN114341162B (zh) 2019-07-10 2025-10-17 赛博克萨2公司 作为治疗剂的细胞毒素的肽缀合物
WO2021031930A1 (zh) * 2019-08-19 2021-02-25 沈阳药科大学 抗体的突变体及其应用
CN113121670B (zh) * 2020-01-15 2022-11-22 天津键凯科技有限公司 二取代peg化白细胞介素2及其制备方法、应用
US20230181756A1 (en) 2020-04-30 2023-06-15 Novartis Ag Ccr7 antibody drug conjugates for treating cancer
US11878986B2 (en) 2020-06-22 2024-01-23 National Health Research Institutes Poly heterocyclic conjugates and their pharmaceutical uses
WO2022182415A1 (en) 2021-02-24 2022-09-01 Massachusetts Institute Of Technology Himastatin derivatives, and processes of preparation thereof, and uses thereof
JP7717832B2 (ja) 2021-04-10 2025-08-04 ジェンマブ エー／エス Ｆｏｌｒ１結合剤、そのコンジュゲートおよびこれを使用する方法
WO2022226317A1 (en) 2021-04-23 2022-10-27 Profoundbio Us Co. Anti-cd70 antibodies, conjugates thereof and methods of using the same
WO2023092099A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Ardeagen Corporation Gpc3 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
AU2022441090A1 (en) 2022-02-17 2024-08-22 Novelty Nobility Inc. Antibody-drug conjugate.
EP4725969A1 (en) 2023-06-09 2026-04-15 Latticon (Suzhou) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Anti-her2 complementary bispecific antibody-drug conjugate, preparation method therefor and use thereof
WO2025005240A1 (ja) 2023-06-30 2025-01-02 第一三共株式会社 活性炭材料を使用する精製工程を含む抗体－薬物コンジュゲートの製造方法
AU2024292473A1 (en) 2023-07-19 2026-01-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with trop-2 targeting adc
EP4509142A1 (en) 2023-08-16 2025-02-19 Ona Therapeutics S.L. Fgfr4 as target in cancer treatment
AU2024353316A1 (en) 2023-09-26 2026-03-26 Genmab A/S Ptk7 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
WO2025181219A1 (en) 2024-02-29 2025-09-04 Genmab A/S Egfr and c-met bispecific binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
WO2025223455A1 (en) 2024-04-24 2025-10-30 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Anti-ptk7/b7h3 antibodies and uses thereof
CN118439981A (zh) * 2024-05-07 2024-08-06 浙江大学 一种氟磺酸类化合物及其应用
WO2026039642A1 (en) 2024-08-16 2026-02-19 Ardeagen Corporation Anti-mesothelin antibody conjugates and methods of use thereof

Family Cites Families (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4166105A (en) 1973-07-30 1979-08-28 Block Engineering, Inc. Dye tagged reagent
SE430062B (sv) 1977-03-04 1983-10-17 Pharmacia Fine Chemicals Ab Kopplings- eller tioleringsreagens
US4152411A (en) 1977-07-27 1979-05-01 Akzona Incorporated High specific activity labeled substances
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4664911A (en) 1983-06-21 1987-05-12 Board Of Regents, University Of Texas System Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties
EP0192009B1 (fr) 1985-01-22 1991-09-04 Saint-Gobain Vitrage International Procédé de prèparation d'un poudre à base de formiate d'indium pour la formation d'une couche mince sur un substrat, notamment en verre.
US5223242A (en) 1985-11-05 1993-06-29 The General Hospital Corporation Negatively charged specific affinity reagents
GB8600582D0 (en) 1986-01-10 1986-02-19 Ca Minister Nat Defence Purifying biological materials
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
EP0247730A3 (en) 1986-04-28 1989-04-12 Antibody Technology Limited Antibodies, their preparation and use and products containing them
US4859449A (en) * 1987-09-14 1989-08-22 Center For Molecular Medicine And Immunology Modified antibodies for enhanced hepatocyte clearance
US5241078A (en) 1988-06-14 1993-08-31 Cetus Oncology Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
JP2818827B2 (ja) 1988-06-24 1998-10-30 サンヨーファイン株式会社 鉄補給飲料
US5024834A (en) 1988-07-12 1991-06-18 Cetus Corporation Thioether linked immunotoxin conjugates
CA2006408A1 (en) 1988-12-27 1990-06-27 Susumu Iwasa Bispecific monoclonal antibody, its production and use
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5714149A (en) * 1989-02-10 1998-02-03 Celltech Therapeutics Limited Crosslinked antibodies and processes for their preparation
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6316003B1 (en) 1989-12-21 2001-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Tat-derived transport polypeptides
FR2656555B1 (fr) 1989-12-29 1994-10-28 Serimer Systeme mecanique de guidage automatique d'une ou plusieurs torches d'une unite de soudage a l'arc.
US5137877B1 (en) 1990-05-14 1996-01-30 Bristol Myers Squibb Co Bifunctional linking compounds conjugates and methods for their production
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2048078A1 (en) 1990-11-15 1992-05-16 Wolfgang A. Wrasidlo Chemical modification of antibodies for creation of immunoconjugates
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
SE9102074D0 (sv) 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
SE470006B (sv) 1991-09-26 1993-10-25 Corline Systems Ab Nytt konjugat, dess framställning och användning samt substrat preparerat med konjugatet
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
US5501952A (en) 1992-07-17 1996-03-26 Aprogenex, Inc. Analogues of reporter groups as background reducers in hybridization assays
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5556623A (en) 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
GB9320575D0 (en) 1993-10-06 1993-11-24 Amp Gmbh Coaxial connector having improved locking mechanism
IL111748A0 (en) 1993-12-03 1995-01-24 Zeneca Ltd Proteins
US5747446A (en) 1994-03-22 1998-05-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with increased biological activity
US5919758A (en) 1994-03-22 1999-07-06 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified polypeptides with altered biological activity
US5580853A (en) 1994-03-22 1996-12-03 New England Deaconess Hospital Modified polypeptides with increased biological activity
US5612474A (en) 1994-06-30 1997-03-18 Eli Lilly And Company Acid labile immunoconjugate intermediates
US6355780B1 (en) 1995-02-22 2002-03-12 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to the death domain motifs of regulatory proteins
WO1996039183A1 (en) 1995-05-31 1996-12-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for targeted delivery of effector molecules
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
WO1998026747A2 (en) * 1996-12-17 1998-06-25 Terman David S Superantigen based methods and compositions for treatment of diseases
US6462070B1 (en) 1997-03-06 2002-10-08 The General Hospital Corporation Photosensitizer conjugates for pathogen targeting
US6371975B2 (en) 1998-11-06 2002-04-16 Neomend, Inc. Compositions, systems, and methods for creating in situ, chemically cross-linked, mechanical barriers
AU736707B2 (en) 1997-06-11 2001-08-02 Anaphore, Inc. Trimerising module
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US5958677A (en) 1997-07-28 1999-09-28 The New York Blood Center, Inc. Method for purifying viral nucleic acids
CA2297070A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
US5965714A (en) 1997-10-02 1999-10-12 Connaught Laboratories, Inc. Method for the covalent attachment of polysaccharides to protein molecules
ES2245805T3 (es) 1997-10-03 2006-01-16 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Polisacaridos que forman iminas, preparacion de los mismos y el uso de los mismos como adyuvantes de inmunoestimulantes.
US6121236A (en) 1998-03-24 2000-09-19 The Children's Medical Center Corporation Multivalent ligands which modulate angiogenesis
CA2329897A1 (en) 1998-04-28 1999-11-04 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Polysaccharide-antigen conjugates
US5981564A (en) 1998-07-01 1999-11-09 Universite Laval Water-soluble derivatives of paclitaxel, method for producing same and uses thereof
US7067109B1 (en) 1998-07-13 2006-06-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment kits comprising therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
DE69930328T2 (de) 1998-08-27 2006-12-14 Spirogen Ltd., Ryde Dimere Pyrrolobenzodiazepine
AUPQ014799A0 (en) 1999-05-04 1999-05-27 Access Pharmaceuticals Australia Pty Limited Amplification of folate-mediated targeting to tumor cells using polymers
AU775373B2 (en) 1999-10-01 2004-07-29 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
ES2276708T3 (es) 1999-11-24 2007-07-01 Immunogen, Inc. Agentes citotoxicos que comprenden taxanos y su uso terapeutico.
ATE344801T1 (de) 1999-12-29 2006-11-15 Immunogen Inc Doxorubicin- und daunorubicin-enthaltende, zytotoxische mittel und deren therapeutische anwendung
WO2001058479A1 (en) 2000-02-08 2001-08-16 The Penn State Research Foundation Immunotherapy using interleukin 13 receptor subunit alpha 2
US6632979B2 (en) * 2000-03-16 2003-10-14 Genentech, Inc. Rodent HER2 tumor model
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
US6596503B1 (en) 2000-08-18 2003-07-22 East Carolina University Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US20060062786A1 (en) * 2000-11-08 2006-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
BR0206985A (pt) 2001-01-29 2005-04-19 Idec Pharma Corp Anticorpos modificados e métodos de uso
WO2002098885A1 (en) 2001-02-07 2002-12-12 Beth Israel Deaconess Medical Center Modified psma ligands and uses related thereto
US20030003048A1 (en) * 2001-04-26 2003-01-02 Chun Li Diagnostic imaging compositions, their methods of synthesis and use
EP1392361A4 (en) 2001-05-11 2009-08-05 Univ Texas ANTI-CD26 MONOCLONAL ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF DISEASES ASSOCIATED WITH CD26 EXPRESSIVE CELLS
EP1258255A1 (en) 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
US6441163B1 (en) * 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
EP2277542B1 (en) 2001-06-01 2014-04-16 Cornell Research Foundation Inc. Modified antibodies to prostrate-specific membrane antigen and uses thereof
US6576802B2 (en) 2001-06-04 2003-06-10 Shell Oil Company One-step production of 1, 3-propanediol from ethylene oxide and syngas with a catalyst with a phospholanoalkane ligand
JP2005532415A (ja) 2001-12-11 2005-10-27 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド スタフィロコッカス・アウレウスエキソポリサッカライド及び方法
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
AU2003201824A1 (en) 2002-01-03 2003-07-24 Smithkline Beecham Corporation Methods for preparing immunoconjugates
DE10202419A1 (de) 2002-01-22 2003-08-07 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens
US7591994B2 (en) 2002-12-13 2009-09-22 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US6660856B2 (en) 2002-03-08 2003-12-09 Kaohsiung Medical University Synthesis of pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine analogues
US6534660B1 (en) 2002-04-05 2003-03-18 Immunogen, Inc. CC-1065 analog synthesis
US6756397B2 (en) 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
CA2478925C (en) 2002-04-26 2016-06-07 Robert Lee Fahrner Non-affinity purification of proteins
SI2371392T1 (sl) * 2002-05-02 2015-10-30 Wyeth Holdings Llc Konjugati derivat-nosilec kaliheamicina
US20090068178A1 (en) 2002-05-08 2009-03-12 Genentech, Inc. Compositions and Methods for the Treatment of Tumor of Hematopoietic Origin
US6596757B1 (en) 2002-05-14 2003-07-22 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising polyethylene glycol-containing taxanes and their therapeutic use
WO2004001007A2 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Idec Pharmaceuticals Corporation Buffered formulations for concentrating antibodies and methods of use thereof
SI1545613T1 (sl) 2002-07-31 2011-11-30 Seattle Genetics Inc Avristatinski konjugati in njihova uporaba za zdravljenje raka avtoimunske bolezni ali infekcijskebolezni
US7390898B2 (en) 2002-08-02 2008-06-24 Immunogen Inc. Cytotoxic agents containing novel potent taxanes and their therapeutic use
JP2006500364A (ja) 2002-08-16 2006-01-05 イムノージェン インコーポレーテッド 高い反応性と溶解度を有する架橋剤および小分子薬物の標的化送達用コンジュゲートの調製におけるそれらの使用
ATE409048T1 (de) 2002-10-08 2008-10-15 Fresenius Kabi De Gmbh Pharmazeutisch aktive oligosaccharid-conjugate
PT2348125T (pt) 2002-10-30 2017-08-29 Nuevolution As Método para a síntese de um complexo bifuncional
BR0316101A (pt) 2002-11-07 2005-09-27 Immunogen Inc Anticorpos anticd33 e processo para tratamento de leucemia melóide aguda usando os mesmos
DE60326060D1 (de) 2003-03-31 2009-03-19 Council Scient Ind Res Nichtvernetzende pyrroloä2,1-cüä1,4übenzodiazepine als potentielle antitumor-agentien und ihre herstellung
DK1620544T3 (en) 2003-04-17 2019-01-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc MODIFIED iRNA AGENTS
US8088387B2 (en) * 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
KR101424624B1 (ko) 2003-05-14 2014-07-31 이뮤노젠 아이엔씨 약물 콘쥬게이트 조성물
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
PL3524611T3 (pl) 2003-05-20 2021-06-14 Immunogen, Inc. Udoskonalone czynniki cytotoksyczne zawierające nowe maitansynoidy
US7595306B2 (en) 2003-06-09 2009-09-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Method of treating neurodegenerative disease
AU2004263830B2 (en) 2003-06-13 2008-12-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded ribonucleic acid with increased effectiveness in an organism
CN102558352A (zh) 2003-06-27 2012-07-11 艾默根佛蒙特有限公司 针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
US20050074425A1 (en) 2003-07-02 2005-04-07 Polycord, Inc. Method for delivering polymerized therapeutic agent compositions and compositions thereof
WO2005044998A2 (en) 2003-11-05 2005-05-19 Palingen, Inc. Enhanced b cell cytotoxicity of cdim binding antibody
EP2905033B1 (en) 2003-12-16 2020-09-02 Nektar Therapeutics Monodisperse PEGylated naloxol compositions
US20050175619A1 (en) 2004-02-05 2005-08-11 Robert Duffy Methods of producing antibody conjugates
US20110064754A1 (en) 2005-03-03 2011-03-17 Center For Molecular Medicine And Immunology Immunoconjugates Comprising Poxvirus-Derived Peptides and Antibodies Against Antigen-Presenting Cells for Subunit-Based Poxvirus Vaccines
EP1610818A4 (en) 2004-03-03 2007-09-19 Millennium Pharm Inc MODIFIED ANTIBODIES AGAINST A PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANE-ANTIGEN AND USE THEREOF
US7189710B2 (en) 2004-03-30 2007-03-13 Council Of Scientific And Industrial Research C2-fluoro pyrrolo [2,1−c][1,4]benzodiazepine dimers
US6951853B1 (en) 2004-03-30 2005-10-04 Council Of Scientific And Industrial Research Process for preparing pyrrolo[2, 1-c] [1,4] benzodiazepine hybrids
WO2005115477A2 (en) 2004-04-13 2005-12-08 Quintessence Biosciences, Inc. Non-natural ribonuclease conjugates as cytotoxic agents
AU2005325262B2 (en) 2004-04-27 2011-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded and double-stranded oligonucleotides comprising a 2-arylpropyl moiety
US7674778B2 (en) 2004-04-30 2010-03-09 Alnylam Pharmaceuticals Oligonucleotides comprising a conjugate group linked through a C5-modified pyrimidine
US20060073528A1 (en) 2004-05-14 2006-04-06 Jean-Michel Lecerf Measurement methods
JP4806680B2 (ja) 2004-05-19 2011-11-02 メダレックス インコーポレイテッド 自己犠牲リンカー及び薬剤複合体
RU2402548C2 (ru) * 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
KR20120064120A (ko) 2004-06-01 2012-06-18 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
CA2572151A1 (en) 2004-06-30 2006-08-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
AU2005328382C1 (en) 2004-07-21 2013-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
JP4193771B2 (ja) 2004-07-27 2008-12-10 セイコーエプソン株式会社 階調電圧発生回路及び駆動回路
CA2574603C (en) 2004-08-04 2014-11-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
CA2486285C (en) 2004-08-30 2017-03-07 Viktor S. Goldmakher Immunoconjugates targeting syndecan-1 expressing cells and use thereof
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
GT200500283A (es) * 2004-10-08 2006-05-08 Inmunoterapia de desordenes autoinmunes
EP1817341A2 (en) 2004-11-29 2007-08-15 Seattle Genetics, Inc. Engineered antibodies and immunoconjugates
PL1819359T3 (pl) 2004-12-09 2015-08-31 Janssen Biotech Inc Immunokoniugaty skierowane przeciw integrynie, metody ich wytwarzania oraz ich zastosowanie
US7408030B2 (en) 2005-01-13 2008-08-05 North Carolina State University Purification of immunoglobulins using affinity chromatography and peptide ligands
US20110166319A1 (en) 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
CA2597407C (en) 2005-02-11 2013-09-10 Immunogen, Inc. Process for preparing stable drug conjugates
EA200702239A1 (ru) 2005-04-15 2008-10-30 Иммьюноджен, Инк. Уничтожение гетерогенной или смешанной клеточной популяции в опухолях
GB2427360A (en) 2005-06-22 2006-12-27 Complex Biosystems Gmbh Aliphatic prodrug linker
JP5436856B2 (ja) 2005-07-15 2014-03-05 アンジオケム インコーポレーティッド 薬学的複合体における担体としてのアプロチニンポリペプチドの使用
WO2007019232A2 (en) 2005-08-03 2007-02-15 Immunogen, Inc. Immunoconjugate formulations
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
EP3539572A1 (en) * 2005-08-24 2019-09-18 ImmunoGen, Inc. Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
CN101443044A (zh) 2005-09-22 2009-05-27 哈达斯特医学研究服务与开发有限公司 治疗活性化合物的葡聚糖和阿拉伯半乳聚糖结合物
BRPI0617546A2 (pt) * 2005-09-26 2011-07-26 Medarex Inc conjugado de fÁrmaco-anticorpo, formulaÇço farmacÊutica, mÉtodo para matar uma cÉlula de tumor, mÉtodo para retardar ou interromper o crescimento de um tumor em um sujeito mamÍfero e composto
EP2298308B1 (en) 2005-11-14 2013-01-16 University Of Southern California Integrin-binding small molecules
WO2007062466A1 (en) 2005-11-29 2007-06-07 The University Of Sydney Demibodies: dimerisation-activated therapeutic agents
US7897568B2 (en) 2006-03-03 2011-03-01 Vinay K. Singh Compositions for treatment of cancer
US7964415B2 (en) 2006-04-26 2011-06-21 Cardiogenics Inc. Stable water-soluble polyethylenimine conjugates and methods of use thereof
ES2567402T3 (es) * 2006-05-30 2016-04-22 Genentech, Inc. Anticuerpos anti CD22, sus inmunoconjugados y usos de los mismos
CA2655379A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Structure of the insulin receptor ectodomain
ES2673822T3 (es) 2006-07-18 2018-06-25 Sanofi Anticuerpo antagonista contra EphA2 para el tratamiento de cáncer
US20080213349A1 (en) 2006-09-11 2008-09-04 Deepak Ramesh Thakker Liposome Complexes Containing Pharmaceutical Agents and Methods
US8969532B2 (en) 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
PL2019104T3 (pl) 2007-07-19 2014-03-31 Sanofi Sa Środki cytotoksyczne obejmujące nowe pochodne tomaymycyny i ich zastosowanie terapeutyczne
WO2009029868A1 (en) 2007-08-31 2009-03-05 University Of Massachusetts Phosphoramidite nucleoside analogs
EP2276506A4 (en) 2008-04-30 2014-05-07 Immunogen Inc EFFICIENT CONJUGATES AND HYDROPHILIC BINDER
KR20200058590A (ko) 2008-04-30 2020-05-27 이뮤노젠 아이엔씨 가교제 및 그 용도
GB0811743D0 (en) 2008-06-26 2008-07-30 Hemosol Biopharma Inc Composition
CA2742846A1 (en) 2008-11-17 2010-05-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable fusogenic lipids for nucleic acids delivery systems
CN102365021B (zh) 2009-02-05 2015-07-15 伊缪诺金公司 新型苯并二氮杂*衍生物
BRPI1010620B8 (pt) 2009-06-03 2021-05-25 Immunogen Inc métodos de conjugação
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
TW201116297A (en) 2009-10-02 2011-05-16 Sanofi Aventis Antibodies that specifically bind to the EphA2 receptor
CN103037900B (zh) 2010-02-24 2016-04-06 伊缪诺金公司 叶酸受体1抗体与免疫缀合物以及其用途
KR20110103182A (ko) 2010-03-12 2011-09-20 삼성전자주식회사 입체 영상 표시 장치
US20120149732A1 (en) 2010-12-14 2012-06-14 Alexander Chucholowski Multifunctional linkers and methods for the use thereof
JP6049642B2 (ja) 2011-02-15 2016-12-21 イミュノジェン・インコーポレーテッド 複合体の調製方法
MX2013011201A (es) 2011-03-29 2013-12-16 Immunogen Inc Proceso para la elaboracion de conjugados de mejor homogeneidad.
WO2012135517A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
RS58367B1 (sr) 2011-03-29 2019-03-29 Immunogen Inc Priprema konjugata antitela i majtanzinoida jednostepenim postupkom
IL281714B2 (en) 2011-04-01 2023-11-01 Immunogen Inc Methods for increasing the effectiveness of FOLR1 cancer therapy
US20130071482A1 (en) 2011-09-20 2013-03-21 The University Of Kentucky Research Foundation Block copolymer cross-linked nanoassemblies as modular delivery vehicles
US20140350228A1 (en) 2011-12-13 2014-11-27 Immunogen, Inc. Use of n-hydroxysuccinimide to improve conjugate stability
WO2014055877A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
WO2014055842A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Process for preparing stable antibody maytansinoid conjugates
MX2015004258A (es) 2012-10-04 2015-09-25 Immunogen Inc Uso de una membrana de intercambio iónico para retirar impurezas de conjugados de agentes de unión celular y agentes.
TR201905612T4 (tr) 2012-12-05 2019-05-21 Univ Heidelberg Ruprecht Karls Proteinlerin ve çok değerlikli, hücreye nüfuz eden peptitlerin konjugatları ve bunların kullanımları.

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024099722A (ja) 2024-07-25
MX383013B (es) 2025-03-13
JP2017128590A (ja) 2017-07-27
IL274599A (en) 2020-06-30
IL216583A0 (en) 2012-02-29
HRP20190898T1 (hr) 2019-08-09
EP3480202A1 (en) 2019-05-08
IL269580A (en) 2019-11-28
KR102444399B1 (ko) 2022-09-16
RU2016130501A (ru) 2018-12-07
US10233257B2 (en) 2019-03-19
IL274599B (en) 2021-09-30
KR20120088549A (ko) 2012-08-08
JP5784592B2 (ja) 2015-09-24
RS58810B1 (sr) 2019-07-31
JP7262507B2 (ja) 2023-04-21
JP2019163276A (ja) 2019-09-26
US20110003969A1 (en) 2011-01-06
RU2016130501A3 (tr) 2020-01-29
US9376500B2 (en) 2016-06-28
JP2012528874A (ja) 2012-11-15
US10815309B2 (en) 2020-10-27
KR102560218B1 (ko) 2023-07-26
PT2437790T (pt) 2019-06-04
IL259869B (en) 2019-10-31
SI2437790T1 (sl) 2019-07-31
SG10201810743WA (en) 2018-12-28
JP7481521B2 (ja) 2024-05-10
KR20190015590A (ko) 2019-02-13
MX2011012794A (es) 2012-05-08
CA2761959A1 (en) 2010-12-09
JP2023075187A (ja) 2023-05-30
WO2010141566A1 (en) 2010-12-09
CN102448500A (zh) 2012-05-09
SG176068A1 (en) 2011-12-29
JP2021113210A (ja) 2021-08-05
AU2010256659A1 (en) 2011-12-01
RU2011153288A (ru) 2013-07-20
US20140179906A1 (en) 2014-06-26
JP6114783B2 (ja) 2017-04-12
JP2016006071A (ja) 2016-01-14
ME03479B (me) 2020-01-20
US8624003B2 (en) 2014-01-07
HK1216508A1 (zh) 2016-11-18
BRPI1010620B8 (pt) 2021-05-25
US20250249109A1 (en) 2025-08-07
KR101947176B1 (ko) 2019-02-12
BRPI1010620A2 (pt) 2016-03-15
SMT201900284T1 (it) 2019-07-11
IL286056A (en) 2021-10-31
EP2437790A1 (en) 2012-04-11
HUE043645T2 (hu) 2019-08-28
EP2437790B1 (en) 2019-02-20
US11498979B2 (en) 2022-11-15
IL259869A (en) 2018-07-31
KR20220144827A (ko) 2022-10-27
DK2437790T3 (da) 2019-05-20
KR102139019B1 (ko) 2020-07-28
IL242589B (en) 2018-11-29
US20170002096A1 (en) 2017-01-05
ES2726945T3 (es) 2019-10-10
US20210163625A1 (en) 2021-06-03
KR20200090974A (ko) 2020-07-29
PL2437790T3 (pl) 2019-09-30
MX349210B (es) 2017-07-18
US9771432B2 (en) 2017-09-26
CN104984360A (zh) 2015-10-21
US20180079828A1 (en) 2018-03-22
CA2761959C (en) 2018-09-11
CY1121992T1 (el) 2020-10-14
IL269580B (en) 2020-06-30
BRPI1010620B1 (pt) 2021-05-04
RU2595424C2 (ru) 2016-08-27
US20230105468A1 (en) 2023-04-06
EP2437790A4 (en) 2015-06-24
IL286056B1 (en) 2023-04-01
AU2010256659B2 (en) 2015-01-29
RU2765240C2 (ru) 2022-01-27
IL286056B2 (en) 2023-08-01
IL300840A (en) 2023-04-01
JP6873184B2 (ja) 2021-05-19
US20190263935A1 (en) 2019-08-29
LT2437790T (lt) 2019-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201907573T4 (tr) Konjugasyon yöntemleri̇
AU2019275619B2 (en) Conjugation methods
HK40007127A (en) Conjugation methods
HK1165306A (en) Conjugation methods
HK1165306B (en) Conjugation methods