CH285942A

CH285942A - Procédé pour la production du sel de sodium de la -thiényl-pénicilline.

Info

Publication number: CH285942A
Authority: CH
Inventors: Company Eli Lilly And
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1946-03-08
Filing date: 1947-03-07
Publication date: 1952-09-30

Description


  Procédé pour la production du sel de sodium de la     a-thiényl-pénicilline.       La présente invention est relative à la  production de pénicillines nouvelles.  



  On connaît. des pénicillines formant un  groupe de composés chimiquement apparen  tés qui, sous des conditions de croissance con  venables, s'obtiennent comme produit du  métabolisme d'une moisissure appropriée. On  n'a pas pu établir nettement la formule mo  léculaire complète de ces corps, mais cepen  dant, on a pu     parvenir    à une connaissance  suffisante clé leur structure pour permettre  de leur attribuer la formule empirique sui  vante:       RO-C,0111        sN2O48       dans laquelle Ro représente un     radieal    orga  nique qui     caractérise    chaque espèce indivi  duelle de pénicilline.  



  Ces pénicillines connues comprennent un  groupe de six pénicillines, dans chacune     des-          ,quelles    le radical Ro ci-dessus représente un  radical     butène-1-yle,        butène-2-yle,        n-butyle,          n-hexyle,    phényle ou     p-hydroxy        phényle.    On  sait, en outre, que dans le mode de production  normal par fermentation, ces six pénicillines  sont obtenues en mélange.  



  Or, la titulaire a découvert qu'il est pos  sible de faire produire à une moisissure pro  ductrice de pénicilline, une pénicilline non  velle, en incorporant au milieu nutritif où la  moisissure se développe, un composé organi  que choisi appelé ici  composé précurseur . Ce  composé précurseur choisi, bien     qu'étranger       aux besoins normaux du métabolisme de la  moisissure peut, être métabolisé et     incorporé     pour une part substantielle à la molécule de la  nouvelle pénicilline. Ce résultat est particu  lièrement remarquable en raison du caractère  spécifique reconnu des systèmes d'enzymes  par lesquels les     organismes    inférieures main  tiennent leur croissance et leur développe  ment.

   Il est surprenant., en outre, que l'utilisa  tion d'un composé précurseur choisi puisse  conduire à. la production d'une pénicilline  nouvelle, pratiquement à l'exclusion des péni  cillines connues et produites normalement.  



  Le présent. brevet a pour objet un procédé  de production du sel de sodium dîme de ces  nouvelles pénicillines, à savoir de la     a-thiényl-          pénicilline.    Ce sel est un produit solide ayant  un angle de rotation optique de [a] D = 265 C  en solution aqueuse à 0,3  /o et répondant à. la  formule suivante:  
EMI0001.0020     
    Ledit procédé est caractérisé en ce qu'on  fait, croître une moisissure productrice clé pé  nicilline sur ou dans un milieu de culture  contenant les éléments nécessaires à la crois  sante de ladite moisissure et un composé pré  .  



  curseur renfermant le radical     thiénylique    et  en ce qu'on forme le sel de sodium de la pé  nicilline ainsi produite.      Le composé     précurseur    renfermant le ra  dical     thiénylique    peut être soit. l'acide     a-thié-          ny        lacétique,    soit un composé     transformable     par la moisissure en cet acide, par exemple  le     N-(2-hydroxyéthyl)-a-tlliényl-acétainide.     



  Le milieu nutritif utilisé pour le dévelop  pement de la     moisissure    peut comprendre des  ingrédients tels que de l'eau, des     sueres,    des  sels minéraux et, de préférence, un ou plu  sieurs     clés    produits mal     déterminés    obtenus  par macération des grains de céréales, ainsi  que du son. On connaît dans la technique un  grand     nombre    de milieux nutritifs appropriés  comprenant des matières de ce type.  



  Pendant la croissance de la moisissure, on  maintient le milieu de culture à une tempé  rature, par exemple, de l'ordre de 20 à 30  C  et de préférence comprise entre     24-    et 26  C.  Avant d'isoler la pénicilline formée, on peut  ne laisser croître la moisissure que pendant  la période où son développement est le plus  rapide, c'est-à-dire en général pendant deux  à trois jours, ou la laisser croître assez long  temps pour obtenir le rendement     maximum,     par exemple 5 jours.  



  La moisissure peut être cultivée dans di  verses conditions. Par exemple, on     petit    la  laisser croître sans aucune agitation du mi  lieu de culture, auquel cas elle se développe  en surface ou, au contraire, on petit     agiter    le  milieu de culture, auquel cas elle se développe  dans toute la masse dudit milieu.  



  Les moisissures utilisables pour réaliser  l'invention sont notamment celles     dit    groupe       Penicillinum        notatum-chrysogenum,    ainsi que  certaines moisissures du groupe Aspergillus.  Bien entendu, toutes les variétés de moisis  sures lie sont pas également efficaces. Les       plus        avantageuses    sont. celles des variétés       X-1612    et Q-176 du groupe     Penicillinum        nota-          tum-chrysogenum    et la variété     C-147    du  groupe Aspergillus     flavus.     



  La concentration en composé précurseur  dans le milieu de culture     petit    être assez va  riable. Cette concentration peut être de     L'or-          dre        de    1     %,        mais        il        est        en        général        désirable     d'utiliser des concentrations plus faibles. Il.  semble que la concentration optimum se    trouve comprise entre 0,01 et 0,05 ";", calculée  en poids-volume, avec la variété     X-1612,    et.

    que cette concentration     optimum    peut être  dépassée avec la variété     Q-176.     



  On peut. associer le composé précurseur à  la     moisissure    et au milieu de     culture    à tout  moment convenable. Ainsi, le     milieu    nutritif  peut être ensemencé avec la moisissure et le  composé précurseur     petit    y être incorporé,  soit. avant, soit après cet ensemencement..

           Exe-vi.p(c:       On prépare un milieu de culture de la 60  composition suivante  
EMI0002.0047     
  
    Lactose <SEP> 125 <SEP> g
<tb>  :Matière <SEP> solide <SEP> obtenue <SEP> par <SEP> ma  cération <SEP> du <SEP> blé <SEP> 100
<tb>  Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 1.0 <SEP> g
<tb>  N-(2-hydroxyéthyl <SEP> )-a-tlliéllyl  acétamide <SEP> <B>0,72</B> <SEP> g
<tb>  Bau <SEP> <B>5</B>000 <SEP> cl113       On répartit le Milieu de culture par     frae-          t.ions    de 200     cm3    dans des flacons     d'Brleii-          iney        er    de 1 litre, on le stérilise,

   on l'ense  mence d'une suspension de spores de moisis  sures     Penicillinuni,    variété N.     R..    R. L. 1976, et  on obture ces flacons avec des tampons de  coton. On maintient les flacons à une tempé  rature de     23-26     C environ en les agitant  constamment pendant cinq jours.

   On filtre  ensuite le contenu des flacons pour séparer le       mycélium    de la moisissure, on laisse refroidir  le filtrat jusqu'à 0  C environ, on     l'aeidifie     jusqu'à un pH de 2,2 environ ait moyen  d'acide     orthophosphorique    et on l'agite avec  un volume égal d'acétate     d'amyle.    On sépare  la couche d'acétate d'amyle et. on la traite  avec trois fractions successives de 1.00     em3     d'eau froide à laquelle on ajoute une solution       décinormale    froide de bicarbonate de sodium  au cours de chaque extraction, jusqu'à, ce que  la phase aqueuse ait Lin pH d'environ 7,0 à. 7,3.

    On réunit les extraits aqueux, on les refroidit  à 0  C environ, on les     acidifie    jusqu'à un pH  d'environ 2,2 par de l'acide     orthophosphori-          que    et on les traite successivement au moyen      de trois fractions d'éther de 100 ci n-3 chacune.

    On réunit les extraits à l'éther et on les fait       passer    dans une colonne d'adsorption     chro-          matographique    du type à la silice, d'environ  30 mm de diamètre et 250 mm de long et  contenant une solution tampon au phosphate,  dont le     pH    est égal à 6,2. 0n développe la  colonne à silice par     lixiviation    au moyen de  six fractions de 100     em3    d'éther contenant  clés quantités     successivement    croissantes de  méthanol dans l'ordre, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 et 30/0.  



  On divise la colonne de silice développée  en environ 12 sections égales et on effectue       l'élution    de chaque section avec trois frac  tions de 30     em3    d'une solution de phosphate       yT/15,    de pH = 7,0.

   Les produits de     l'élution     sont soumis à un titrage bactériologique pour  en déterminer la teneur en pénicilline. 79%  de l'activité bactéricide totale présentée par  la totalité des produits     d'élution    proviennent  d'une bande unique de la colonne de silice et  résultent. de la présence de la     a-thiényl-péni-          cilline.        Cette    bande occupe une position simi  laire à celle où se trouve la pénicilline C dans  les colonnes comparables.

   Les produits     d'élu-          tion    correspondant aux sections de la colonne  de silice qui constituent cette bande uniforme  principale sont rassemblés, refroidis à 0  C  environ, acidifiés jusqu'à un PH de 2,2 envi  ron et traités au moyen de trois fractions de       chloroforme    de 50     em3.    Les extraits au chlo  roforme combinés sont. passés dans une co  lonne d'absorption de silice contenant une  solution tampon de phosphate ayant un pH  de 6,2. On développe la colonne à silice par       lixiviation    avec trois fractions de 150     cm3    de  chloroforme contenant des proportions succes  sivement croissantes de méthanol dans l'or  dre 1, 2 et 3 0/0.

   On divise alors la colonne à  silice développée en 12 sections égales et on  soumet, chaque section à     l'élution    par     trois     fractions de 30     em3    d'une solution tampon de  phosphate     M/15    de pH = 7,0. Le titrage     bac-          tériologique        montre        que        92        %        de        l'activité     bactéricide totale provient d'une seule bande  de la colonne de silice.

   Les produits     d'élution     obtenus par extraction des sections de la co  lonne à silice qui constituent cette bande sont.         rassemblés,        refroidis    à 0  C environ, acidifiés  jusqu'à un     pH    = 2,2 environ et soumis à l'ex  traction au moyen de trois fractions d'éther  de 100     cm3.    On réunit les extraits à l'éther  et on les traite à leur tour par environ 75     cm3     d'une -solution aqueuse froide et diluée de  soude caustique à laquelle on ajoute de la  soude caustique     décinormale    au cours de l'ex  traction, de manière à réaliser un pH final  d'environ 7,0 dans la phase aqueuse.

   De la  solution aqueuse, on peut séparer le sel de  sodium de la     a-thiényl-pénicilline    par tous  moyens appropriés, par exemple par congé  lation et évaporation dans le vide à partir  de l'état congelé.  



  On lave le sel de sodium sec de la     a-          thiényl-pénicilline    ainsi obtenu, plusieurs fois,  à l'aide d'acétone     anhydrique.    On fait alors  cristalliser le sel de sodium en le dissolvant       dans    2     cm3        d'acétone    à     90        %        et        en        le        repré-          cipitant    par 2     cm3    d'acétone anhydre. On  obtient, ainsi 213 mg du sel de sodium de       l'a-thiényl-pénicilline.     



  Le sel de     sodüun    de la     a-thiényl-pénicilline     préparé comme décrit     ci-dessus    titrait. environ  1685 unités Oxford par mg essayé contre l'or  ganisme     Staph.        aureus,    variété 209 P. Un  titrage différentiel réalisé sur     Staph.        aureus     209 P et B.     subtilis,    variété N.     R..    R.. L. B-556,  donna une valeur d'environ 1,13.

   On trouve  un angle de rotation optique         [a]   <B>Il'</B> -     -I-        2650     D         pour        une        solution        de        0,3        %        dans        l'eau.        L'ana-          lyse        montre        la        présence        de        46,

  46        %        de        car-          bone,    3,810/0 d'hydrogène, 7,40 0/0 d'azote et  17,18 0/0 de soufre, contre les chiffres     théori-          ques        de        46,40        %        de        carbone,        4,17        %        d'hydro-          gène,        7,73        %        d'azote        et        17,

  69        0/a        de        soufre.     



  Le     N-(2-hydroxyéthyl)-a-thiénylacétamide     employé dans cet     exemple    peut. être obtenu de  la manière suivante:  On chauffe un mélange de 7,34 g d'acétate  de     méthyl-a-thiényle    et de 3,1 g     d'éthanol-          amine    à 135  C environ pendant 11 heures  environ. L'excès     d'éthanolamine    est ensuite  éliminé du mélange réactionnel en chauffant  ce dernier à 90  C environ sous pression ré-      duite. Le     N-(2-hydroxyéthyl)-a-thiénylacét-          amide    est récupéré sous forme cristalline  après un repos prolongé à la température  ambiante.

   Il possède un point de fusion de       s    66 à 67  C environ.

Claims

REVENDICATION Procédé pour la production du sel de so- ditun de la a-thiény 1-pénicilline, sel répondant à la formule: EMI0004.0008 caractérisé en ce qu'on fait croître une moi sissure productrice de pénicilline sur ou dans un milieu de culture contenant les éléments nécessaires à la croissance de ladite moisis sure et -Lui composé précurseur renfermant le radical thiénylique et en ce qu'on forme le sel de sodium de la pénicilline ainsi produite. Le sel de sodium ainsi obtenu est un pro duit solide cristallin ayant un angle de rotation optique de [a) D =226511 C en solution aqueuse à 0, 3 /o.

SOUS-REVENDICATIONS: 1. Procédé selon la. revendication, caracté risé en qu'on emploie comme composé pré curseur l'acide a-thiényl-acétique. 2. Procédé selon la revendication, carac térisé en ce qu'on emploie comme composé précurseur -an composé pouvant être trans formé par la moisissure en acide a-thiényl-acé- t.ique. 3. Procédé selon la revendication, carac térisé en ce qu'on emploie comme composé précurseur le N-(2-hydroxy-éthyl)-a-thiényl- acéta.mide.