BE550604A - - Google Patents

Description

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  La présente invention est relative à de nouveaux composés 
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 d'acider arninds et à des procédés pour leur production. Plus parti- culière # :nt  l'invention est relative à de nouveaux composés d'acides saiinég, not:1';':.lCl1.t des 6-diaso-5"-oxonorleuclnes et les dérivés inter- ïréd 3.a.ïr.s de mr1¯ez?cirvc utilisés pour leur production. L'invention csb f;E::c. i relative à des procédés pour la production de 6-diazo- 5-o.Jcor.I(J;'1,,'uci;'.<'>f et de certains composés intermédiaires utilisés 
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 pour leur production. 
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 s 6-dl,3o-5-m,onor'leucines, en particulier la 12-6-diazo-5- o:Jcürorl:lJ.cjn:.1' la lLC.difo.'.o5-o::;:onorlel.lcine et la DL-6-dia.zo-5- 
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 croisai-], v-rv >#>.. , ...r:3:.1'; aes propriétés 'uniques ainsi que cela. 



  :"8<"3Cl't 9i > 1?. (1A;.:).' )t,ion qui suit. Comme ces composes ne diffèrent :I v .; clo 1"{1J:1":,: cr.n±. un ; =ns: chimique, ou'en ce que les premiers sont 

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 des formes isomères à activité optique et le dernier constitue la forme optiquement racémique de   6-diazo-5-oxonorleucine   les propriétés chimiques de ces composés sont identiques, comme le sont beaucoup de leurs propriétés physiques. Ces composés ne renferment que les éléments carbone, hydrogène, oxygène et azote et ont la formule empirique C6H9N3O3.

   Ils ont un poids moléculaire de 171 et peuvent être représentés par la formule de structure : 
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La rotation optique spécifique   [[alpha]]D   de L-6-diazo-5- oxonorleucine est de   +21    (5,4% dans l'eau) et celle de D-6-diazo- 5-oxonorleucine,   -16,1    (1,98% dans l'eau à 25 C). 



   La D-6-diazo-5-oxonorleucine, la   L-6-diazo-5-oxonorleucine   et la DL-6-diazo-5-oxonorleucine, sont relativement instables à la chaleur et se décomposent avant de fondre  La décomposition ne se produit à aucune température déterminée et, par conséquent, les points de décomposition et de. fusion varient sur une large gamme qui dépend du procédé applique pour leur détermination. La décompo- sition débute d'ordinaire à 145 C environ et peut se poursuivre      jusqu'à ce qu'on atteigne 155 C. La décomposition s'accompagne d'un dégagement de gaz. Les composés se décomposent dans un acide aqueux avec libération d'azote. Des courbes de fixation d'hydrogène accusent des valeurs de   pK   dans l'eau de 2,1 et 8,95. 



   Les produits sont très solubles dans l'eau mais sont inso- lubles dans des solvants organiques communs non-polaires.' Ils ne sont que très légèrement solubles dans le méthanol absolu,   léthanol   absolu ou l'acétone à froid, mais sont solubles dans une solution aqueuse chaude de ces solvants. Ils donnent des essais colorés spécifiques bleu-pourpre à la ninhydrine. L'oxydation de L-6-diazo- 5-oxonorleucine par l'acide périodique, donne l'acide L-glutamique. 



  Une réaction similaire de la D-6-diazo-5-oxonorleucine ou de la DL-6-diazo-5-oxonorleucine, donne respectivement l'acide D-glutamique 

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 ou l'acide DL-glutamique. 



   Les produits forment des sels métalliques par réaction avec des hydroxydes, carbonates, bicarbonates, oxydes,   alcoxydes,ami     des,etc,   de métal alcalin ou alcalino-terreux. 



   Les spectres d'absorption ultraviolette de D-6-diazo-5- oxonorleucine, L-6-diazo-5-oxonorleucine et DL-5-diazo-5-oxonorleu- cine sont identiques. Dans un tampon aqueux de phosphate au pH 7, on obtient des maxima d'absorption ultraviolette caractéristiques de E11% cm égaux à 683 à une longueur d'onde de   274   millimicrons, et à 376 à une longueur d'onde de 244 millimicrons. 



   Les spectres d'absorption infrarouge de D-6-diazo-5-oxonor- leucine et de   L-6-diazo-5-oxonorleucine   sont identiques. Quand on le détermine par le procédé du disque de bromure de potassium, le spectre accuse des pointes d'absorption aux longueurs d'onde sui- vantes : 3,19,3,32, 3,78,   4,66,   6,14, 6,30,   6,59,   6,90,7,18, 7,39, 7,54, 8,33, 8,66,   8,98,   9,36, 9,71, 10,08, 10,22, 10,59,   11,65,   12,08, 12,34 et 13,16 microns. 



   Le spectre d'absorption infra-rouge de   DL-6-diazo-5-   oxonorleucine, déterminé par les procédés au disque de bromure de potassium, accuse des pointes d'absorption aux longueurs d'onde suivantes :   3,34,   4,66,   6,13,   6,31, 6,59, 7,06, 7,19, 7,43,   8,72,   9,26, 9,90,   10,67   et 11,32 microns. 



   Les composés de l'invention possèdent des propriétés phytotoxiques prononcées, et sont particulièrement utiles comme herbicides, agents désherbants et analogues. On utilise dans ce but une solution aqueuse diluée, et on applique la solution à la plante ou à la récolte de plantes par les procédés connus. Les composés sont efficaces à grande dilution, et possèdent en outre une action sélective contre certains genres de mauvaises herbes nuisibles.

   Par exemple, dans le cas de   L-diazo-5-oxonorleucine,.une   solution aqueuse d'une concentration de 1.000 parties par million, appliquée par arrosage jusqu'au moment où elle s'égoutte à des parcelles d'essais séparées de croissance vigoureuse de chénopodes et de cycloloma 

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 donne 100% de destruction, tandis que la croissance d'une   parcelle   comparable de mais n'est inhibée que dans une mesure de 20% dans des conditions identiques. 



   Les composés de l'invention possèdent un haut degré d'activité contre des levures. Par suite de cette caractéristique, ils sont utiles à la séparation de bactéries à partir de popula-   ' tions   microbiennes mixtes dont   un.   ou plusieurs composants, sont une levure. 



   Les composés de l'invention possèdent également des propriétés uniques en ce qu'ils inhibent la biosynthèse, par des cellules vivantes, d'acides nucléiques essentiels ou de précurseurs d'acide nucléique, et exercent également un effet d'inhibition ' sur la croissance de néoplasmes. L'action inhibitrice du   L-6-diazo-   
5-oxonorleucine, est supérieure à celle des composés   PL-   et D.- correspondants. Le composé   DL   possède, à son tour, une action inhibitrice supérieure à celle du composé D. La croissance de tu- meurs implantées sur des souris ou des rats, est pratiquement inhi- bée par des injections journalières de L-6-diazo-5-oxonorleucine. 



  Les variétés de tumeurs affectées de cette façon, comprennent le Sarcoma 180 (formes liquide et solide), le Sarcoma T 241, le Sarcoma MA 387, l'adénocarcinoma Mammary E 0771, l'adénocarcinoma   Miyono,   le lymphosarcoma Mecca, la sarcoma ostéogénique Rigway, le sarcoma ostéogénique Wagner,   l'adénocarcinoma   Mammary RC, le sarcinoma   Ehrlich   (formes liquide et solide),. le Carcinoma 1025, le carcinoma du cancer 2 (forme fluide) et le lymphosarcoma du rat Murphy. Ces propriétés extraordinaires indiquent que les produits peuvent éventuellement posséder une valeur, soit seuls soit en com- binaison avec d'autres agents inhibiteurs de néoplasme,tels que la 6-mercaptopurine, dans le traitement d'affections néoplastiques (carcinomas, sarcomas, leukémias, etc. ).

   Les produits peuvent être administrés soit par voie orale, soit par voie parentérale.. 



   Le nom commun ou générique   "diazo-oxonorleucine"   a été adopté pour la L-6-diazo-5-oxonorleucine. 

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  L'invention prévoit des moyens chimiques synthétiques 
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 pour la production de la D-6-diazo-5-oxonorleucine,, la L-6-diazo-5- oxonorleucine et la DL-b-diazo-5 -oxonorleucine, ainsi qu'un procédé microbiologique pour la production de L-6-diazo-5-oxonorleucine. 



  On peut préparer la D,-6-diazo-5-oxonorleucine par des procédés synthétiques chimiques en partant de différents dérivés comprenant des dérivés d'acide glutamique ou de norleucine. Le schéma ci-après représente les transformations rencontrées dans la synthèse chimique des produits de l'invention. Il est à remarquer que les formules décrites, aussi bien que d'autres formules données au cours de la description ou des revendications, représentent, à défaut d'indications particulières du contraire, l'isomère optique D, l'isomère optique 1 ou la   forme     optiquement   inactive DL des com- posés chimiques. A défaut d'indications contraires, la même conven- tion s'applique aux dénominations chimiques apparaissant au cours de la description ou des revendications.

   Ainsi, quand une dénomina- tion chimique ne spécifie pas la forme optique envisagée, le nom doit être interprété dans son sens générique, c'est-à-dire comme représentant soit.l'isomère optique D, soit l'isomère optique   L,     .-soit   la forme optiquement racémique DL. 

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   Dans le schéma ci-dessus, R représente un radical de métal alcalin ou   alcaline-terreux,   ou un radical alkyle inférieur, R' représente un radical alkyle inférieur, R" représente un radical alkyle inférieur ou un radical benzyle, et X est un radical de chlore ou de brome. 



   Dans la. production des composés de l'invention, le procédé désigné par A sur le schéma comprend la réaction   d'hydrazine   avec un ester d'alkyle inférieur ou un sel de métal alcalin ou alcalino- terreux de 6-diazo-5-oxo-N-phtaloylnorleucine pour obtenir   l'ester   ou le sel métallique correspondant de 6-diazo-5-oxonorleucine. On transforme le produit d'ester intermédiaire en sel de métal alcalin ou de métal alcalinoterreux de   6-diazo-5-oxonorleucine   par hydrolyse. 



  Quelque soit son mode d'obtention, on transforme le sel métallique en acide aminé libre, la 6-diazo-5-oxonorleucine, par neutralisation. 



  Pour   l'hydrazinolyse,   on utilise deux équivalents d'hydrazine pour obtenir les meilleurs résultats* On peut utiliser un léger excès d'hydrazine,   c'est-à-dire   moins de trois équivalents, mais des quan- tités plus grandes tendent à provoquer la formation de   l'hydrazide   correspondant, et abaissent ainsi le rendement en produit intermé- diaire 6-diazo-5-oxonorleucine désiré. On peut fournir l'hydrazine au mélange de réaction sous différentes formes. Par exemple, on peut utiliser dans le procédé, des solutions aqueuses d'hydrazine ou d'hydrate d'hydrazine.

   Dans le cas où le produit intermédiaire est un sel métallique, la réaction est effectuée dans des conditions aqueuses, et si le produit est un ester, dans un solvant organique tel qu'un alcool aliphatique inférieur, un hydrocarbure chloré, un éther cyclique ou analogue. Des exemples particuliers de solvants pouvant être utilisés, sont le méthanol, l'éthanol, le chloroforme, le chlorure de méthylène, le dioxane, etc. On peut effectuer la réaction le mieux à des températures inférieures à 50 C environ, et de préférence à la température ordinaire ou à une température plus basse.

   On peut préparer les esters de   6-diazo-5-oxo-N-phtaloylnorleu-   cine par le procédé décrit dans le J.Am.chem.Soc.72.   2469,   (1950) 

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 pour la préparation de l'ester'méthylique de 6-diazo-5-oxo-N- phtaloylnorleucine. 



   On effectue l'hydrolyse de l'ester de 6-diazo-5- oxonorleucine dans un milieu aqueux dans des conditions alcalines, en dessous de la température ordinaire, de préférence en présence d'un solvant organique miscible à l'eau. Comme agents alcalins, on peut utiliser des hydroxydes, carbonates, bicarbonates, oxydes, alcoxydes, amides ou analogues de métal alcalin ou de métal alcali- no terreux. On utilise de préférence une solution diluée contenant de 1,0 à 1,1 équivalent d'un hydroxyde de métal alcalin tel que l'hydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium, à une température comprise dans la gamme de -10 à 5 C. D'ordinaire, l'hydrolyse est complète en une heure à 0 C et en une à deux heures à 4 C.

   On effec- tue la neutralisation du sel de métal alcalin ou de métal alcalino- terreux de 6-diazo-5-oxonorleucine par un acide, en dessous de la température ordinaire, de préférence entre -10 et 5 C. Dans ce but, on préfère utiliser un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique ou analogue. La neutralisation s'effectue en abaissant soigneusement le pH dans la gamme de 5,5 à   7\,la   gamme de 6 à 6,5 étant préférée. 



  On peut séparer le produit le mieux par évaporation dans le vide, lyophilisation, chromatographie, etc. 



   Le procédé désigné par B sur le schéma reproduit plus haut, comprend la réaction de 6-amino-5-oxonorleucine, de préférence sous forme d'un sel d'addition d'acide, en milieu aqueux, avec un agent de diazotation, en dessous de la température ordinaire. On peut utiliser différents agents de diazotation, tels que l'acide nitreux, des nitrites d'aigles et des composés de nitrosyle. 



  Quand on utilise l'acide nitreux comme agent de diazotation, on peut utiliser une solution d'acide nitreux, préparée par la réaction de trioxyde d'azote avec de l'eau, ou bien on peut produire l'acide nitreux in situ par addition d'un acide minéral et d'un nitrite inorganique tel que des nitrites de métal alcalin ou de métal alca- 

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 linoterreux ou des nitrites de métaux: lourds. Quelques exemples particuliers de ces nitrites inorganiques sont le nitrite de sodium, le nitrite de potassiura, le nitrite de   baryum.,   le nitrite d'argent, etc. Comme l'acide aminé libre,, la 6-amino-5-oxonorleucine, est relativement instable, il est désirable d'utiliser de la   6-amino-5-     oxonorleucine   sous   forme   de sel d'addition diacide.

   On effectue la réaction   à     un   pH de 4 à 7, de préférence de 5 à 6. Quand on utilise le sel d'addition d'acide, il est préférable de ne pas ajouter d'aci- de minéral au mélange de réaction mais seulement de faire réagir le sel avec le nitrite pour produire de l'acide nitreux in situ. 



  On peut   également   produire l'acide nitreux in situ en faisant bar- boter du trioxyde d'azote dans un mélange de réaction aqueux. En outre, on peut préparer l'acide nitreux en utilisant un nitrate, puis en ajoutant une substance réductrice telle que l'acide arsé- nieux au mélange de réaction. Quelques exemples des nitrites d'alkyles qu'on peut utiliser comme agent de diazotation, sont le nitrite d'éthyle, le nitrite de butyle et le nitrite   d'amyle.   



  Quelques exemples des composés de nitrosyle qu'on peut utiliser dans le procédé, sont le chlorure de nitrosyle, le bromure de nitro- syle et l'acide nitrosyle sulfurique. La quantité d'agent de diazota- tion utilisée dans le procédé n'est pas particulièrement critique, mais, pour des raisons   d'économie,   il y a lieu d'utiliser au moins un équivalent pour chaque équivalent de matière première consistant en 6-amino-5-oxonorleucine.

   On obtient les meilleurs résultats quand on utilise un excès d'agent de diazotation, et   mme,   bien qu'il soit désirable de ne diazoter qu'un des deux groupes amino existant dans la matière de départ consistant en 6-amino-5-oxonorleucine, on peut utiliser jusque trois à quatre équivalents de l'agent de diaztota- tion sans agir de façon nuisible sur le rendement en produit désiré* 
La 6-amino-5-oxonorleucine (aussi appelée 5-oxolysines) et leurs sels d'addition d'acides, sont de nouveaux composés. L'in- vention envisage également les composés de 6-amino-5-oxonorleucine et leur production par hydrolyse acide d'un ester d'alkyle inférieur 

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 d'acide 2e6-diphtalimido-5-OxOcaProïque.

   On conduit le procédé de production en traitant la matière de départ par au moins deux équivalents, et de préférence plus de deux équivalents d'acide minéral. Pour obtenir les meilleurs résultats, on utilise un acide minéral aqueux 3 à 10 fois normal. On effectue la réaction à une température supérieure à 70 C, et de préférence à la température de reflux. On peut utiliser des acides minéraux, tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, etc. On peut, si on le désire, purifier le sel d'ad- dition d'acide de 6-amino-5-oxonorleucine obtenu, par sa transfor- mation en base libre correspondante et sa séparation sous forme de sel relativement insoluble tel que le picrate. 



   Le procédé désigné par C dans le schéma représenté plus haut, comprend le traitement d'un ester d'alpha-benzyle d'acide glutamique par halogénation, la réaction de l'halogénohydrate 
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 d'halogénure de 4-carbobenzo:>::Y-4-fu'ilinobutyryle obtenu avec du diazométhane pour obtenir l'ester benzylique de 6-diazo-5-oxonor- leucine, l'hydrolyse de ce dernier ester et la neutralisation du produit d'hydrolyse pour obtenir l'acide aminé libre, la 6-diazo- 5-oxonorleucine. Au premier stade, on traite l'ester benzylique d' acide glutamique par au moins un équivalent, et de préférence un excès, d'un agent d'halogénation tel que le chlorure de thionyle, le pentachlorure de phosphore, le   pentabromure   de phosphore, le tri- chlorure de phosphore ou le tribromure de phosphore.

   Quand on utilise un halogénure de phosphore comme agent d'halogénation, on utilise le mieux conçue solvant l'halogénure d'acyle correspondant, en parti- culier le chlorure ou le bromure d'acétyle, et on exécute la réaction en dessous de 50 C, de préférence à la température ordinaire. On peut également utiliser des solvants organiques inertes tels que des hydrocarbures, des hydrocarbures chlorés, des éthers cycliques et analogues. Des exemples particuliers de ces solvants sont le benzène, le toluène, le dioxane, le   dichlorure   d'éthylène, etc. Pour la réaction utilisant le chlorure de thionyle, on préfère une température 

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 inférieure à   70 C. La   température   optimum   est comprise dans la gamme de 20 à 50 C.

   Bien qu'un solvant ne soit d'ordinaire pas nécessaire pour la réaction, on peut utiliser différents solvants tels que des hydrocarbures, hydrocarbures chlorés, éthers cycliques, etc. 



   Des exemples particuliers de solvants pouvant être utilisés sont le benzène, le toluène  } le   dioxane, le   dichlorure   d'éthylène, etc. On peut préparer la matière de départ, le glutamate d'alpha- benzyle, par le procédé décrit dans le J.Am.chem.Soc. 75. 4610 (1953) pour la préparation de   1* tester   alpha-benzylique de l'acide L- . glutamique. 



   On effectue la réaction entre   l'hydrohalogénure     d'halogé-   nure de 4-carbobenzoxy-4-aminobutyryle et le diazoraéthaneà froid, c'est-à-dire en dessous de 20 C, et de préférence dans la gamme de -5 à 10 C, dans un solvant organique anhydre inerte. On utilise au moins trois équivalents de diazométhane et on prend des précautions convenables parce que cette substance est toxique et possède des propriétés explosives en présence d'oxygène, particulièrement à température élevée. On peut utiliser comme solvants des hydrocarbures tels que le benzène, le toluène, etc., un éther aliphatique infé- rieur, des éthers cycliques tels que le dioxane, le tétra- hydrofurane, etc. 



   On effectue l'hydrolyse de l'ester benzylique résultant de 6-diazo-5-oxonorleucine dans un milieu aqueux dans des condi- tions alcalines, en dessous de 30 C, de préférence en présence d'un solvant organique miscible à l'eau. Comme agents alcalins, on peut utiliser des hydroxydes, carbonates, bicarbonates, oxydes, alcoxydes, amides, etc. de métal alcalin ou de métal alcalino- terreux. On utilise de préférence une solution diluée, contenant de 
1,0 à 1,1 équivalent, d'un hydroxyde de métal alcalin tel que l'hydroxyde de sodium ou l'hydroxyde de potassium, à une température comprise dans la gamme de 22 à 25 C, pendant une heure, puis on abaisse la température à 0 C pendant environ 10 à 20 heures.

   A la suite de l'hydrolyse, on neutralise le mélange de réaction par un 

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 acide en dessous de la température ordinaire, de préférence entre -10à 5 C. Dans ce but, on peut utiliser un acide tel que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide acétique, etc. On effectue la neutralisation en abaissant avec précaution le pH dans la gamme de 5,5 à 7, la gamme de 6 à 6,5 étant préférée. 



   Le   procède   désigné par D sur le schéma reproduit plus haut, comprend le traitement d'anhydride de gamma-benzyl-N-   carboxy glutamate   par hydrogénation p our obtenir   l'anhydride   de N- carboxyglutamate, le traitement de l'anhydride par un agent d'halo- génation pour obtenir de la 4-halocarbonyléthyloxazolidine-2,5- dione, la réaction du produit résultant avec du diazométhane pour obtenir la 4-(4-diazo-3-(oxobutyl)-oxazolidine-2,5-dione, l'hydrolyse de ce dernier produit, et la neutralisation du produit d'hydrolyse pour obtenir la 6-diazo-5-oxonorleucine . La phase d'hydrogénation s'accomplit à la température ordinaire ou à une température plus élevée avec un catalyseur de métal noble tel que le palladium.

   On effectue la réaction de préférence à une température comprise dans la gamme de 25 à 80 C. On maintient la pression d'hydrogène pendant la réaction dans la gamme de 0,7 à   4,2   kg/cm2 (10 à 60 livres/pouce carré). Des pressions d'hydrogène plus élevées ne sont d'ordinaire pas nécessaires. On utilise en général pour la réaction, un solvant organique inerte, par exemple un ester   d'allcyle   d'un acide gras inférieur tel que l'acétate d'éthyle ou un éther cyclique tel que le dioxane ou le tétrahydrofurane. 



   Pour transformer l'anhydride de   gamma-benzyl-N-carboxy- '   glutamate en   4-halocarbonyléthyloxazolidine-2,5-dione,   on utilise au moins un équivalent d'un agent d'halogénation tel que le chlorure de thionyle, le trichlorure ou le pentachlorure de phosphore, le tri- bromure ou le pentabromure de phosphore, etc. On effectue la réaction, le mieux en mélangeant ensemble l'agent de halogénation et l'anhy- dride de   N-carboxyglutamate,   de préférence à température modérément élevée. Bien que d'ordinaire ce ne soit pas nécessaire, on peut utiliser, si on le désire, un solvant organique tel que le benzène. 

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  On peut préparer la natière de départe l'8nhyëJrié:(;:: de garma-ben'zyl- N-carbocylutazoate par If procédé décrit dans J .ArP..shm..f.Q.9.,t. 19.'. 



  4492   (1954).   
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  On effectue la i-éaction entre la 4-halocarbonyléthyloxa- zol.id.ine--i y5-d¯Lone et le diazométhane à froid, c'est-à-dire en dessous de 20 C, et de préférence dans la gamme de -5 a 1O C, dans an solvant organique inerte. On utilise au moins deux équivalents de dia?,orac:thane. On peut utiliser comme solvants des hydrocarbures tels que le bènZ8n(.1 le toluène et analogues Ces éthers aliphati- ques inférieurs, des éthers cycliques tels que le dioxane, le tétra-   hydrofurane   et analogues. 
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  On effectue l'hydrolyse de la 4-(4-diazo-3-oxobutyl)oxazolidirie¯2,5-dione en 6¯diazo-5-oxonorleucine dans l'eau seule, ou dans un   nilieu   aqueux dans desconditions alcalines, en dessous de 30 C. On peut utiliser comme agents alcalins, des hydroxydes, carbonates, bicarbonates, oxydes, alcoxydes, amides,. etc. de métal 
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 alcalin ou de métal alcalinoterreux. On utilise de préférence une solution diluée contenant approximativement un équivalent d'un hydroxyde de métal alcalin tel que   l'hydroxyde   de sodium ou l'hydroxy- de de potassium, à une température comprise dans la. gamme de   -5   à 
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 10 C. La réaction se produit d'ordinaire presqu'immédiatement à 5 C. Quand l'hydrolyse est complète, on neutralise le mélange de réaction par un acide à la température ordinaire ou plus bas. 



  Dans ce but, on peut utiliser un acide minéral tel que l'acide chlor- hydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique ou l'acide phos- phorique.   On   effectue la neutralisation en abaissant avec précau- tions le pH dans la gamme de 5,5à. 7, de préférence dans la gamme de 6 à 6,5. 



   Le procédé désigné par E sur le schéma représenté plus 
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 haut, comprend le, réaction d'acide If-trif1uoroacéty1g1utamique avec l'anhydride acétique, pour obtenir l'anhydride N-trifluproacétyl- lwtaacue9 lu réaction de ce dernier anhydride avec un agent alcoolique pour obtenir un mélange des esters alpha et gamma de le acide trifluoroacétylg1utlTdque, la. réaction du produit d'ester 

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 résultant avec un agent   d'halogenation   pour obtenir lehalogénure de 4-carbobenzoxy- ou 4-carbalcoxy-4-trifluoroacétamidobutyryle, le traitement de l'halogénure par du diazométhane pour obtenir l'ester de 6-diazo-5-oxo-N-trifluoroacéthylnorleucine, l'hydrolyse de ce dernier ester, et la neutralisation du produit d'hydrolyse pour obtenir la 6-diazo-5-oxonorleucine. 



   On effectue la réaction entre l'acide N-trifluoroacétyl- glutamique et l'anhydride acétique, de préférence en l'absence de solvant, à température ordinaire ou plus élevée.,   @ans   des conditions anhydres. Afin de réduire au minimum les possibilités de racémisa- tion, il est désirable d'effectuer la réaction à des températures qui ne dépassent pas   100 C.   On utilise.au moins un équivalent, et de préférence un excès d'anhydride acétique. Pour obtenir les meil- leurs résultats, on maintient la température de réaction entre 25 et 100 C. 



   On effectue l'alcoolyse de l'anhydride N-trifluoroacétyl- glutamique au moyen d'un agent alcoolique tel qu'un alcoxyde ou benzylate de métal alcalin ou un alcool. Des exemples particuliers d'agents alcooliques pouvant être utilisés, sont le méthoxyde de sodium, l'éthoxyde de sodium, le benzylate de sodium, le méthanol, l'éthanol, l'alcool benzylique ou analogues. quand on utilise les alcoxydes ou benzylates, on utilise d'ordinaire un solvant alcooli- que dans lequel la partie hydrocarbure correspond à la partie hydro- carbure de l'agent alcoolique. On utilise, par exemple, d'ordinaire du méthanol en combinaison avec du méthoxyde de sodium; l'alcool benzylique avec le benzylate de sodium, etc. On effectue la réaction à la température ordinaire à une température plus basse, de préfé- rence dans la gamme de-20 à 0 C.

   La réaction utilisant un alcool est relativement lente, comparativement à celle utilisant un alcoxyde ou benzylate;et on préfère des températures plus élevées, c'est-à- dire des températures comprises dans l'intervalle de 20 à 150 C. 



  Le produit d'estérification est un mélange des esters alpha et gamma d'acide N-trifluoroacétylglutamique. Bien que l'ester alpha soit la matière de départ désirée pour la phase suivante d'halo- 

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 génation du procédé, il n'est pas nécessaire de séparer l'ester gamma, car on peut utiliser de façon satisfaisante le mélange lui- même comme matière de départ. 



   A l'étage d'halogénation, on fait réagir le produit de l'estérification précédente avec au moins un équivalent, et de préférence un excès d'agent d'halogénation, tel que le chlorure de thionyle; le trichlorure ou le tribromure de phosphore, le penta- chlorure ou. le pentabromure de phosphore.   Cuand   on utilise un halogénure d.e phosphore comme   agent   d'halogénation, on utilise de façon satisfaisante l'halogénure d'acyle correspondant, tel que le chlorure ou bromure d'acétyle comme solvant, et on effectue la réaction en dessous' de 50 C, de préférence à la température ordinai- re. On peut également utiliser des solvants organiques inertes tels que des hydrocarbures, des hydrocarbures chlorés, des éthers cycli- ques, etc.

   Des exemples particuliers de ces solvants sont le benzène., le toluène, le dioxane, le   dichlorure   d'éthylène. Dans la réaction utilisant lechlorure de thionyle, on préfère une température infé- rieure à 80 C. La température optimale est comprise dans la gamme de 50 à 80 C. On peut utiliser différents solvants tels que des   hydro-   carbures, des hydrocarbures chlorés, des éthers cycliques ou analo- gues, bien que la réaction avec le chlorure de thionyle s'effectue d.e préférence en l'absence de solvant. Le produit de halogénation est le halogénure de 4-carbobenzoxy- ou de 4-carbalcoxy-4-tri- fluoroacétamidobutyryle. 



   On effectue la réaction entre le 4-carbobenzoxy- ou le 4-carbalcoxy-4-trifluoroacétamidobutyryle et le diazométhane à froide de préférence dans la gamme de -5 à 10 C, dans un solvant organique inerte. On utilise au moins deux équivalents de   diazométha-     ne.   On peut utiliser comme solvants, des hydrocarbures tels que le benzène, le toluène et analogues, des éthers aliphatiques inférieurs, des éthers cycliques tels que le dioxane, le t étrahydrofurane et analogues. La réaction est d'ordinaire complète en une demi-heure à   0-5 C.   Le produit obtenu est l'ester de   6-diazo-5-oxo-N-trifluoro-   

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 acétylnorleucir.e. 



  On effectue 1 'hydrolyse de l'ester de diazo-oxotrifluoro- acétylnorleucine en 6..diazo-5-oxonorleucine dans un milieu alcalin aqueux à une température inférieureà environ 30 C. La réaction est favorisée par l'emploi de solvants   organiser,     irascibles   à l'eau 
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 tels que des alcools aliphatiques inférieure ou dialogues. Comme agents alcalins, cn '.J(;1.'. utiliser des hydroJ<']c1es, carbonates, bicarbonates, oxydes, alcorrydes, acides ou analogues de métal alcalin ou alcalinoterreux. On utilise de préférence une solution diluée contenant deux équivalents d'un hydroxyde de métal alcalin tel que 
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 1'hydroxyde de sodil.Li: 11ou l'hydroxyde de potassium, à une température comprise dans la   garnie   de -10 à 0 C. L'hydrolyse est d'ordinaire complète en huit à douze heures.

   On convertit le produit d'hydrolyse existant sous la forme d'un sel métallique, en acide libre, la 
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 6-dîazo-5-oxonorleueine, par neutralisation du mélange de réaction par un acide en dessous de la température   ordinaire.   Dans ce but, on peut utiliser un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique, 
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 l'acide bronhydrîque, l'acide sulfurique ou l'acide phosphorique. 



  La neutralisation s'effectue en abaissant avec précaution le   pH   dans la gamme de 5,5 à 7 et de préférence 6 à 6,5. On sépare le mieux le produit d'hydrolyse et de neutralisation par des opérations d'ad- 
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 sorption sélective et d' êlutr3.atian, et on purifie l'éluat par séchage en partant de l'état congelé et cristallisation du résidu Bolide à partir d'un solvant approprié. Ou bien, on effectue l' hydrolyse de l'ester de diazooxotrifluoroacétylnorleucine en 6-diazo- 5-oxo-norleucine par des agents enzymatiques, en utilisant par exemple une combinaison d'estérase et d'acylase tel qu'on peut l'obte- air à partir de rognons de porcs. 



   Les exemples qui suivent illustrent en détails la manière dont on peut effectuer la production par synthèse chimique de D-6- 
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 iu.o-5-oxonorleucine, L-6--diazo-5-oxonorleucine DL-6-diazo-5-oxo- norleucine et des différents produits intermédiaires. 

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   Production de 6-diazo-5-oxonorleucine à partir d'esters d'acide N-phtaloylglutamique. 



  EXEMPLE 1. - a) On dissout   @   3 grammes d'ester méthylique de L-6-diazo-   5-oxo-N-phtaloylnorleucine   dans 70 ml. de dichlorure de méthylène; on ajoute 1,35 g d'hydrate d'hydrazine, on remue le mélange pendant environ deux heures et on le   laisse   repos'er à 20-25 C pendant seize heures. On laisse ensuite le mélange de réaction au repos à 0 C pendant quatre heures et on filtre. Le gâteau rie filtre contient le sel   d'hydrazine   d'hydrazide de phtaloyle. On évapore lefiltrat dans le vide. Le produit résiduel consiste en ester méthylique de L-6-diazo-5-oxonorleucine, qui a comme formule : 
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 b)   On   dissout 2,2 grammes d'ester méthylique de L-6-diazo- 5-oxonorleucine dans 60 ml de méthanol, et on refroidit à 0 C. 



  On ajoute 15 ml d'hydroxyde de sodium une fois normaleet on laisse la solution au repos à 0 C pendant 16 heures. On règle la solution froide au   pH   6,5 par addition d'acide chlorhydrique deux fois normal en remuant rapidement. On évapore la solution jaune dans le vide pour séparer le méthanol. On dissout le produit résiduel dans environ 50 ml d'eau, on congèle la solution et on sublime la glace de la masse congelée sous vide élevé.   On   dissout 250 milligrammes du résidu solide dans 10 ml d'eau contenant 1% d'acétone et on verse la solution dans une colonne d'adsorption contenant 15 g de charbon activé et 15 g de terre de diatomées.

   On lave immédiatement la co-   lonne,   on développe au moyen d'environ   2,5   volumes "hold   up"- d'acétone   aqueux à   1% et   on recueille l'éluat en fractions de   10'ml.   On congèle   @@   fractions possédant l'absorption ultraviolette la plus in- 

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 tense à une longueur d'onde de 275 millimicrons, et on sublime la glace de la masse congelée sous vide élevé pour obtenir la L-6- diazo-5-oxonorleucine désirée ayant comme formule : 
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 On peut purifier le produit pare cristallisation à partir d'une solution dans plusieurs gouttes d'eau, par addition de cinq volumes d'éthanol absolu.

   Les propriétés chimiques;, biolo- 
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 giques et physiques de la Z-6-diazo-5-oxonorleucine sont les mêmes que celles données dans la description qui précède. 



   On peut préparer l'isomère optique opposé, la D-6-diazo- 5-oxonorleucine par le même procédé que celui décrit dans   1.' exemple   
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 1 a) et b) en partant de l'ester de D-6-âiazo-5-oxo-N-phtaloylnor- leucine. 



    EXEMPLE   2.- a) On traite une solution de   24   g de l'ester méthylique 
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 de DL-6-diazo-5-oxo-N-phtaloylnorleucine dans 170 ml de chlorure de méthylène, par 7,7 g d'hydrate d'hydrazine, on remue la solution trouble à 22-25 C pendant quinze heures, puis on la filtre. On éva- pore le filtrat dans le vide. Le produit résiduel, l'ester méthy- 
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 lique de DT-6-diazo-5-oxonorleucine a comme formule : 
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 b) On dissout 12,5 grammes d'ester méthylique de DL-6- diazo-5-oxonorleucine dans 300 ml de méthanol, et on refroidit à 0 C. On ajoute 70 millilitres d'hydroxyde de sodium 1 fois normal, et on laisse la solution rouge pâle au repos à 0 C pendant seize heures. On règle le pH de la solution à 6,5 par de l'acide chlorhy- drique 2 fois normal, et on évapore le mélange dans le vide pour séparer le méthanol.

   On congèle le résidu et on sublime la glace de 

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 la masse congelée sous vide élevé. On dissout le résidu solide dans de l'acétone aqueux à 1% et on l'adsorbe sur une colonne contenant 45 g de carbone activé et 45 g de terre de diatomées.   On'   lave la colonne et on développe avec environ   2,5   volumes "hold up" d'acétone aqueux à 1%, et on recueille l'éluat en fractions de 10 ml. On congèle les   fractions   possédant   l'absorption   ultra- violette la plus intense à. 275 millimicrons et on sublime la glace de la masse congelée pour obtenir la DL-6-diazo-5-oxonorleucine désirée.

   Ce produit a corme formule : 
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 On le recristallise à partir d'alcool aqueux pour obtenir une substance ayant une absorption ultraviolette, E11% cm de 683 à une longueur   d'onde   de 274 millimicrons. Les propriétés chimiques, biologiques et autres propriétés physiques de la DL-6-diazo-5-   oxonorleucine   sont les mêmes que celles données dans la description qui précède. 



  EXEMPLE 3. - 
On ajoute 0,90 grammes d'hydrate d'hydrazine à une suspen- sion de 3,1 g de sel de potassium de L-6-diazo-5-oxo-N-phtaloyl- norleucine dans 60 ml de méthanol, on remue le mélange pendant envi- ron deux heures et on le laisse reposer à 20-25 C pendant seize heures. On concentre le mélange de réaction par évaporation dans le vide. On dissout le résidu dans 50 ml d'eau et on règle le pH à 6,5 au moyen d'acide chlorhydrique une fois normal. On filtre la solution et on verse le filtrat dans une colonne d'adsorption contenant 20 g de carbone activé et 20 g de terre de diatomées . On lave la colonne immédiatement, on développe avec environ 2,5 volumes   "hold-up"   d'acétone aqueux à   1%,   et on recueille l'éluat en fractions de 10 ml.

   On congèle les quatre fractions possédant l'absorption ultraviolette la plus intense à 275 millimicrons, et on sublime la glace de la masse congelée sous vide élevé pour obtenir la L-6- 

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 diazo-5-oxonorleucine. Los propriétés chimiques, biologiques et physiques du produit sont les it'>rIlteJ que celles indiquées dans la description qui précède. On peut préparer l'isomère optique opposé, le D-6-diazo-5-c:onoxleuciri, par le même procédé en partant du sel de potassium de D-6-diazo"5-oxo-N-phtaloylnorleucine qui, à son tour, peut être   prépare   en partant de l'ester d'alkyle correspondant par le procède' qui va être décrit de suite après. 
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  On peut préparer la rrmi.;i0re de départ de la manière suivante : on di:::[',01l 4,5 "ranges de l'ester méthylique de L-6- âiazo-5-oxo-II phtaloylnorleucin.e dans 50 ml de méthanol à 70fi. 



  On ajoute 2,5 g de   carbonate   de potassium et on laisse reposer la solution à 10  pendant vingt-quatre heures. On évapore la solution dans le vide. Le produit résiduel est le sel de potassium de 
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 Ii-6-diazo-5¯o3ro-îï-phtalcylnorleucine, qu'on peut - hiliser directe- ment comae matière de départ pour le procédé décrit plus haut, sans autre t?e.ït.cr.4. On peut préparer d'autres sels métalliques de la même minier!-. 



  Pr'j''')iction de 6-d > uî-5-oxonorleucine a partir de ca¯ ,t>a re'c:irE'. ,,¯.,'r..htl7¯:lïco-5-aÏ:ocanraioue,, 4. - a) On r0l.l1.1", et chauffe à des températures de reflux, pondant s2i:.: heures, un :1lélent;e de 5,2 g d'ester méthylique d'acide 'ï,-.?,b-éï lt.¯i.l'.'iia0--j-Gl.OC.ayO:t'al.c!'1e (Sheehan et Bolhofer, J..t..-n..che?.. 



  Soc. 72.   2469   (1950) et de 130   .il   d'acide chlorhydrique concentré de densité 1,18. Oa ajoute par intervalles pendant cette période, trois portions de 20   ml   d'acide chlorhydrique concentré de densité 1,18. On refroidit le mélange pendant seize heures à 0 C et on filtre. On concentre le filtrat dans le vide à un volume de 40   ml   et on extrait le concentré plusieurs fois par l'éther.

   On règle le pH de la solution aqueuse  à 7   à 8 par de l'hydroxyde de sodium.   4   fois normal, on chauffe la solution à 60 C, et on l'ajoute rapide- 
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 ment dans un :101.:'.."", '.ent tourbillonnant, à une solution chaude de 9 g diacide   picriqua     Cens   100 ml   d'eau.   On recueille par filtration le produitqui se sépare, on le lave convenablement à l'eau et à 

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 puis on le sèche dans le vide. Le   .point   ce fusion est 
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 c1"" 166-162' C.

   Le produit qui CODS:i.st. 'C:!.1 oro&uit :!'.ition diacide pici-lque de UL#j-oxolirsiue, a corcio formule : 
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 On ti-f usfoisie le sel de picrate en ichlor:u,r¯'i¯ t on chauffant la ¯.n.i,¯4re pondant fcr-3-n.to minutes ci.: uS 40 ta1 d'acide chlo:c;1'Tdr.l(¯llU concentre, de densité 1,7¯'. On. refroidi bien le ,.ltlE.1l8 oit filtre pour séparer l'acide picrique. On extrait le filtrat de façon r'2pét[e par Ces volumes égaux (P0t.iier, on le traite par \:Ll ch3.rboL1 do 'bois., on filtre, on congèle le filtrat et on siibli'ae la glace de la masse congelée sous vide élevé. On dissout le résidu solide dans 8 ml   d'eau   chaude, on ajoute 35 ml d'éthanol absolu, et   on   sépare le produit cristallisé par filtration. Il fond 
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 i 109"112C.

   Le 'produite qui consiste en dichlorhydrate de DL-5-   oxolysine   raté, a comme formule : 
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 b)   On   refroiditune solution de 250 mg. de   dichlorhydrate   
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 de PL-5-oxolysine et 10 ml d'eau à 0-5 C dans 'un bain de glace. On ajoute une   solution   de 140 mg de nitrite de sodium dans 2 ml d'eau en une fois et on   refroidit   la solutionjaune pendant dix minutes au bain dû glace. On   congelé   alors le mélange de réaction et on sublime la glace à partir de la masse congelée, sous vide élevé. 
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  Le promut résiduel est la DL¯6-ûiazo-5-oxoiiorleucine, ayant cookie farlsm7¯e : 
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 On peut le purifier en le   dissolvant     dans   10   ml     d'eau   contenant 
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 10 r7. d'acétone aqueux à 1:'=, versant la solution dans une colonne d'adsorption qui contient 15 g de carbone activé et 15 g de terre de diatomées, puis on lave la colonne par environ 2,5 volumes 
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 tthald-upri d'acétone aqueux ?;. 1:', et on recueille l'éluat en frac- tions de 10 ni.

   On   congelé   lestrois fractions possédant l'absorption ultraviolette la plus   intense   à une longueur   d'onde   de   275   milli-   microns,   et on   sublime   la   ;;la.^.;:   à partir de la nasse congelée sous vide élevé. On faitrecristalliser le produit résiduel, la DL-6- 
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 diazo-5-oxonorleacinc: par dissolution dans plusieurs gouttes d'eau et addition de cinq volumes d' éthanol absolu. Les propriétés chiini- 'lues, biologiques et physiques de la   DL-6-diazo-5-oxonorleucine   sont les   mènes   que celles données dans la description qui précède. 
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  Les iso-"iures ontiques individuels, c' est-à-dire les L- et D-6-diazo-5-oxonorleucines, peuvent être préparés par le même procédé que celui décrit ci-dessus en a) et b) en partant respec- tivement des esters uéthyliques d'acide Tu- et D-2,6-diphtalimido-5- oxocaproiclue, qu'on peut préparer à partir des anhydrides correspon- dants L- et Q-N-phtaloylg1utadques, (Sheehan et Bolhofer, réfé- rence citée plus   haut).   



   Production de 6-diazo-5-oxonorleucine à partir d' 
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 esters aliha-benzy1ioues d'acide glutilia EX±<;;1PLE - a) On ajoute, en remuant, 2,3 gram-aes d'ester alpha- benzylique d'acide 1.-g1utam.ique (Sachs & Brnad ,.LAm. chel:l. S9Jl. 12. 



    4610     (1953),  à 22-25 C, à un mélange 2,1 g de pentachlorure de phos- phore et 20 ml de chlorure   d'acétyle.     On   obtient une solution claire en environ une heure. Après repos pendant trois heures, à 22-25 C, on évapore la solution dans le vide. Le produit résiduel, le chlor- 
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 hydrate du chlorure de 1-4-carbobenzoxy-4-aminobutyryle, a comme formule 

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 b) On ajoute lentement 2,7 grammes de chlorhydrate de chlorure de L-4-carbobenzoxy-4-aminobutyryle à une solution de trois équivalents de diazométhane dans 100 ml d'éther, à 0-5 C. On laisse le mélange s'échauffer à   22-25 C,   et on sépare alors le solvant dans le vide.

   Le produit résiduel, l'ester benzylique de L-6-diazo- 5-oxonorleucine, a   comme   formule : 
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 c) On dissout   l'ester   benzylique de   L-6-diazo-5-oxonorleu-   cine obtenu ci-dessus en b) dans 50-100 ml de méthanol, et on ajoute lentement à la solution 20 ml d'hydroxyde de sodium 0,5 Normal. On laisse reposer le mélange une heure à 22-25 C puis pendant seize heures à 0 C. On règle le pH du mélange de réaction à 6 au moyen d' acide acétique glacial à 0-5 C, et on fait passer la solution à travers une colonne d'adsorption contenant 60 g de carbone activé et 60 g de terre de diatomée. On élutrie la colonne au moyen de 21/2 volumes   "hold-up"   d'acétone aqueuse à   1%,   et on recueille l'élutriat en fractions de 10 ml.

   On congèle les trois fractions présentant l'absorption ultraviolette la plus intense à une lon- gueur d'onde de 275 millimicrons et on sublime la glace de la masse congelée sous vide élevé. On fait recristalliser le produit résiduel, la L-6-diazo-5-oxonorleucine par dissolution dans une quantité minimum d'eau, et on ajoute cinq volumes d'éthanol chaud. Les propriétés chimiques, biologiques et physiques de la L-6-diazo-5- oxonorleucine sont les mêmes que celles données dans la description précédente. 



   On peut préparer la   D-6-diazo-5-oxonorleucine   et la DL-6- diazo-5-oxonorleucine par le même procédé, en partant respectivement des formes G- et DL- de l'ester alpha-benzylique de l'acide gluta- 

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 mique, et opérant conformément aux paragraphes a), b) et c) ci- dessus. Les produits ainsi obtenus possèdent les mêmes propriétés chimiques, biologiques et physiques que celles données dans la description précédente. 
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  Production de 6-diazo-5-oxonorleueine à partir à' anhydride de N-car'hoxy.l-utanata fa::1.ma¯-benzyliaue. 



  EXEMPLE 6.- a) On dissout 2,6 g d'anhydride de N-carboxy-IL-glutamate de gamma-benzyle dans 60 ml d'acétate   d'éthyle   anhydre, on ajoute à la solution   0,6   g de palladium à 10% sur du charbon de bois, et on remue le mélange à la température ordinaire pendant une heure avec 
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 de l'hydrogène sous. une pression de 2,8 à t, kg/cm2 {.l,.0-bd livres/ pouce carré). Quand la réaction est complète, on sépare le cataly- seur par filtration et on évapore le solvant du filtrat sous pres- 
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 sion réduite. Le produit résiduel, l'anhydride de N-carboxy--L- glutamate, a la fon.lule : 
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 b) On met le produit de a) en suspension dans 15 ml de chlorure de thionyle et on chauffe doucement pendant quinze minutes pour obtenir une solution claire jaune.

   On sépare l'excès de chlorure de thionyle par distillation sous vide. Le produit rési- 
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 duel, la |i-4-(2¯(c32lorocarbonyl)éthyl)-oxazolidine-2,5-dione, 
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 a comme formule : 0 ci - C - CH2CH2-CH - C = 0 1 1 NH 0 nul, / c li 0 c) On dissout le produit de b) dans 20 ml de tétrahydro- furane, et on ajoute la solution goutte-à-goutte, en remuant, à une 

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 solution de diazométhane, préparée à partir de 7 g de nitroso- méthylurée, dans 100 ml de   tétrahydrofurane   à 0-5 C.

   On laisse      chauffer le mélange de réaction à 23-25 C, on filtre, puis on con- centre le filtrat sous pression réduite pour obtenir la L-4- (4-diazo-3-oxobutyl)oxazolidine-2,5-dione, qui a comme formule : 
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 d) On dissout le produit de c) dans 30 ml d'eau contenant 8 ml d'une solution normale d'hydroxyde de sodium à la température ordinaire. Dès que la solution se produit, on règle le pH à 6,5 par de l'acide chlorhydrique dilué, on congèle la solution et on sublime la glace de la masse congelée sous vide élevé. On dissout un gramme du solide résiduel dans environ 40 ml d'eau contenant 1% d'acétone,et on fait passer la solution à travers une colonne d'adsorption contenant 90 g de charbon de bois activé et 90 g de terre de diatomée.

   On lave la colonne, on développe à l'aide d'environ 2,5 volumes   "hold-up"   d'acétone aqueuse à 1% et on recueille l'éluat , en fractions de 10 ml. On congèle les trois fractions possédant l'absorption ultraviolette la plus intense à 275 millimicrons, et on sublime la glace de la masse congelée sous vide élevé. On recristal- lise le solide résiduel, la L-6-diazo-5-oxonorleucine à partir   d'éthanol   absolu contenant quelques gouttes d'eau. 



   On peut préparer la D-6-diazo-5-oxonorleucine et la DL-6- diazo-5-oxonorleucine par le Blême procédé, en partant respectivement des formes D et DL de l'anhydride gamma-benzyle-N-carboxyglutamate, et en opérant conformément aux paragraphes a) à d) ci-dessus. Les produits ainsi obtenus possèdent les mêmes propriétés chimiques, biologiques et physiques que celles données dans la description qui précède. 

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   Production de 6-diazo-5-oxonorleucine à partir de   ¯¯¯¯¯¯l'acide   N-trifluoroacétvlglutamique   EXEMPLE 7.-   a) On chauffe un mélange de 36 g d'acide N-trifluoro- acétyl-L-glutamique et 50 ml d'anhydride acétique à 100 C sur un bain d'eau pendant six minutes. On ajoute rapidement 150 ml de xy- lène et on laisse le mélange de réaction au repos pendant seize heures à -5 C. On enlève le produit qui se sépare, par filtration, on le lave par du xylène et on sèche dans un dessicateur à vide. 



  Le produit fond à   66-68 C     ([alpha])D27   =   -19,7    (solution à 4% dans le dioxane) . Le produit est de l'anhydride   N-trifluoroacétyl-L-   glutamique ayant comme formule : 
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 b) On dissout rapidement 21 grammes d'anhydride N- trifluoroacétyl-L-glutamique dans 100 ml de méthanol froid (0 à 10 C), contenant 5 g de   méthoxyde   de sodium. On laisse reposer la solution obtenue à   0-15 C   pendant quatre heures. On concentre la solution dans le vide et on reprend le produit résiduel dans environ 300 ml d'eau. On acidifie la solution au pH 1,5 par un mélange d'acide chlorhydrique concentré et de glace.

   On extrait la solution aqueuse cinq fois par des portions de 75 ml d'éther, on combine les extraits.;. on les sèche sur du sulfate de magnésium anhydre, on filtre et on concentre le filtrat dans le vide. Le produit résiduel contient une proportion élevée de 1-lester alpha-méthylique de l'acide N- trifluoroacétyl-L-glutamique, ayant comme formule : 
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 Le produit contient également l'ester gamma-méthylique de l'acide N-trifluoroacétyl-L-glutamique.

   On peut préparer le produit corres- 

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 pondant d'ester benzylique à partir d'anhydride N-trifluoroacétyl- L.-glutamique par le procédé ci-dessus en utilisant, au lieu de métha- nol,du méthoxyde de sodium ou une solution de benzylate de sodium préparée en faisant réagir 10   d'alcool     benzylique   avec 2,1 g de 
 EMI27.1 
 sodium dans 100 ml de dioxane jhycxre. Le produit d'ester benzylique résultant peut âtre ensuite traic--' coni'or;:né:W!lt aux paragraphes c), d) et c) qui suivent pour obtenir la L-6-diazo-5-oxonorleucine. 



  On peut préparer l'e3t,:)r alpha-benzylique de l'acide N- vrßfluorotcétg..avluï,.r.¯¯cr¯a.r s,ows une fOl':Jl8 ¯<:=¯pt de l'ester gamma correspondant;, de la manière suivante : On. met 3 d'ester alpha benzylique d'acids T.-;l:z:aioue (Sachs et collaborateurs, JAmch.So.J75¯. 4610 (1953) en suspension dans environ 200 ml d'eau et on règle le pu à 8-9 par une solution 2 211 d'hydroxyde de sodzcu3. On ajoute 5 gr-2-:iaes de thioltrifluoroacétate d'éthyle et on remue le mélange de réaction pendant six à huit heures à 23-24 C. On   règle   le mélange au pH 2 Par un mélange d'acide chlorhydrique concen- tré et   de glace;,   et on extrait par plusieurs portions d'eau. On sèche les extraits d'éther combinés et on les concentre dans le vide. 



  Le produit résiduel,   l'ester   benzylique de l'acide N-trifluoro- 
 EMI27.2 
 acétyl-L-glutam3.aue, a comme formule 
 EMI27.3 
 De même, on peut préparer comme suit l'ester alpha- 
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 méthylique de l'acide N-trifluoroacétyl-1.-g111ta.'1lique sous une fojrïie exempte de l'ester gamma correspondant. On remue un mélange de 50 g d'ester gaiama-benzylique d'acide 1.-g1uta.'1lique, 59 g de thioltri- fluoroacébate d'éthyle et 200 ml d' eau et on le maintient au pH 7-CI par une solution aqueuse normale d'hydroxyde de sodium,   jusqu'à   ce 
 EMI27.5 
 qu'il n'y ait plus Ge.l1dance à se produire de variation du pH. On filtre le '1lance de réaction, et on extrait le filtrat, d'abord f3 31: ..ß :z  .-¯. ort'ia'3 d.J'éther et ensuite nar l'acétate d'éthyle. 



  On met le   gâteau de   filtre en suspension, on l'extrait par l'éther. 

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  On combine les extraits à l'éther et à l'acétate d'éthyle, on les sèche et on les concentre dans le vide en une huile. On reprend   l'huile,   qui cristallise au repos, dans une petite quantité d'éther et on la recristallise en deux fois par addition de cyclohexane- benzène dans le rapport de   4   à 1, et laissant la solution au repos. 



  Le produit cristallisé,   consistant   en aster de   gamma-benzyle   d'acide N-trifluoroacétyl-L-glutamique, fond à 84 C après recristallisation à partir de cyclonexane-benzène 1:1 et de benzène-éther de pétrole. 



  On ajoute lentement une solution de 22 g du produit dans 75 ml d'éther à 300 ml do diazométhane   éthéré,   obtenu à partir de 30 g de   nitrosométhyl-urée   humide, à 5 à 10 C. On concentre la solution, et on la laisse solidifier dans le vide. On purifie le produit, consistant en ester alpha-méthylique-gamma-benzylique de l'acide N-trifluoroacétyl-L-glutamique, par lavage d'une solution du produit dans l'éther par des solutions diluées de bicarbonate de sodium et d'acide chlorhydrique et par de l'eau, par séchage et concentra- tion dans le vide. On traite par hydrogénation une solution de 20 g du produit dans 200 ml de méthanol absolu, dans un appareil de Parr sur du palladium déposé sur du charbon de bois, à 1,75 kg/cm2 (25 livres par pouce carré), pendant une heure.

   On obtient le produit, consistant en ester alpha-méthylique d'acide N-trifluoro- acétyl-L-glutamique, par filtration du mélange de réaction et con- centration du filtrat dans le   vide :    ([alpha])D28,   -45  en solution à 1% dans   l'éthanol..   c) On chauffe le produit d'ester méthylique de b) au   bai.n-   marie avec 100 g de chlorure de thionyle pendant quarante cinq minu- tes à la température de reflux. On concentre la solution résultante dans le vide pour obtenir une huile incolore, on ajoute 25 ml de benzène, et on élimine la totalité des matières volatiles dans le vide.

   Le produit résiduel consiste en un mélange de chlorures de L-4-carbométhoxy-4-trifluoroacétamidobutyryle, ayant corne formule : 

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 et de chlorure de L-2-trifluoroacétamido-4-carbométhoxybutyryle. d) On reprend le produit de c) dans 200 ml d'éther et on   l'ajoute   lentement   à     une   solution éthérée contenant quatre équi- valents   (15   g) de diazométhane à 0-5 C.

   On laisse le mélange de réaction au   repos   à   cette     température   pendant environ trente minu- tes, puis on le   ch@effe à   25 C pendant deux heures et   dénie .   On filtre le   Mélange   de   réaction   et on sépare le solvant par distilla- tion dans le   vide.  Le produit contient   Pester   méthylique de L-6- diazo-5-oxo-N-   @rifluoroacétylnorleucine,   ayant   comme   formule 
 EMI29.2 
 e) On reprend le produit de d) dans 250 ml de méthanol à 0 C. On ajoute deux litres d'hydroxyde de sodium 0,1 N refroidi à 3 C, et on   maintient   la. solution pendant 11 heures à. -5 C.

   On neutra- lise la solution au moyen d'un mélange d'acide chlorhydrique 2 N et de glace, au pH 6,puis on la concentre dans un évaporateur à cir- culation à des   températures   de   20-30 C   jusqu'à un volume de 500 ml. 



  Le produit,   contenant   la L-6-diazo-5-oxonorleucine ayant   corne   for-   mule :    
 EMI29.3 
 peut être   purifié   par adsorption sélective et élutriation à partir d'un adsorbant, de la manière suivante. On verse une solution ne contenant pas plus que 3 g de L-6-diazo-5-oxonorleucine déterminé par un essai biologique,dans une colonne contenant un mélange de 200 g de carbone activé et 200 g de terre de diatomée.

   On élutrie le -produit à l'aide d'environ 2,5 volumes   "hold-up"   d'acétone aqueuse 

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 à 1%, et on recueille l' élutz.ia ; en fractions d'un dixième du volume   "hold-up".   On congèle les fractions possédait   l'absorption   ultra- violette la plus intense à 275 millimicrons, et on sublime la glace 
 EMI30.2 
 de la masse.congelée pour produire la Z-6-diazo--5-ovonorleucine sous forme de poudre jaune pâle.

   Après recristallisation à partir d'éthanol, la poudre a une rotation optique   ([alpha])D26   de   +   21  (c = 5,4% dans   l'eau).   Les caractéristiques chimiques, biologiques 
 EMI30.3 
 et autres caractéristiques T51;..;v.rl:-s du produit sont les lr.'.L,lPf' que celles données dans le description précédente. On peut préparer la JD-6-âiazo-5-osonorleucine et la I1.-6-dic:zo-5-o.,0i10l'10ucine par le même procédé, en partant de lucide H-trifluoroacétyl-D-glutamique ou respectivement de l'acide r;r-trifluOl'oacétyl-DL-glutamiq1.le, et opérant conformér-ent aux chapitres de a) à e) ci-dessus.

   Les propriétés chimiques, biologiques et autres propriétés physiques de la jD-6-diazo-5-o>:onorleucine et c".e la DL-6-diazo-5¯oxonorleucine ainsi produites, sont les mêmes que celles données dans la description qui précède. 



   Comme mentionné plus haut, on peut, conformément à l'in- vention, produire la   L-6-diazo-5-oxonorleucine   par des procédés de synthèse   microbiologique   aussi bien que par des procédés   synthé-     tiques   chimiques. Le procédé synthétique   microbiologique   pour la production de cette substance comprend la culture d'un   microorganis-   
 EMI30.4 
 rr- désigné ici sous le nom de Ptre tor C-3A3. dans des condi- tions artificielles dans tua milieu 1'11.ltrl tIr convenable. On décrit .i..-nessous les détails de ce procédé. 



  Le û'rre torry çes C-2 ,. est un miexoorg2nisme inconnu jusqu'à présenta existant dans des sols. On l'a isolé pour la pre- mère fois   d'un   échantillon de sol recueilli à Chincha, dans le Pérou. 



  Des cultures de l'organisme vivant ont été ajoutées aux collections 
 EMI30.5 
 ;:(rmé'nentt.1s du Bureau de Culture de Pzrke, Davis & Company, Détroit 12, llichigan, sous le n  04997 et aux collections de culture de la Division Fernr'ntélti.on, Branche de Recherches d'utilisation du Nord, U.S. Per'tment of Agriculture. Récria, Illinois, sous la dénomination .>r.l\L ne. 

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   On peut obtenir des cultures de ce microorganisme en préparant une suspension dans de l'eau stérile, d'un échantillon de sol en contenant, par dépôt des particules plus lourdes, dépôt de la 'suspension de sol   surnageante   qui en résulte à des dilutions en série sur des plaques nutrititives, incubation des plaques à   24   à 28 C, pour fournir des cultures du microorganisme, et   transplan   tation de cultures individuelles sélectionnées ressemblant au Streptomyces C-2943 à des plaques d'agar nutritive fraîches. Par sélectionnements et transplantations répétés de cultures non- contaminées;, caractéristiques sur des plaques d'agar nutritive fraîches, on obtient des cultures pures constituant des "thalli" du microorganisme désiré. 



   Le Streptomyces C-2943 est un élément sporulant dans l'air et aérobique, de l'ordre des  Actinomycétales,   et appartient au genre Streptomyces tel que décrit dans la Sixième Edition du Manual of Determinative Bacteriology de Bergey. L'organisme possède les caractéristiques suivantes :quand on le cultive dans des milieux de glucose-tryptone ou   d'agar   nutritif, le mycélium substratal primaire est gris à noir. Dans des milieux   d'asparagine-glycérine   ou de   glucose-agar   synthétique, le mycélium est blanc ou gris clair à pourpre clair ou rouge pâle à gris, et dans des milieux d'agar de Czapek ou de malate calcium, blanc à jaune clair à gris. Dans ces milieux, le mycélium aérien est d'abord blanc, puis tourne au gris.

   Quand on cultive   l'organisme   dans des milieux de glucose- tryptone ou d'agar nutritif, une coloration brun foncé ou noire apparaît dans le substratum, mais quand on le cultive dans des milieux de glycérine-asparagine, d'agar de CZAPEK ou de calcium- malate, la couleur du milieu reste essentiellement la même. 



  Au microscope, les tentacules aériennes sont longs, et compris dans une gamme de longueur de 100 à 500 microns. Une ramification primaire et parfois secondaire se produit. Il se produit des boucles . et spirales terminales. Les spirales sont de longueur variable, et comprennent 2 à 15 tours. Les spires sont souvent détachées et irré- 

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   gulières.   Les parties.les plus éloignées de ces tentacules aérien- nes se subdivisent en chaînes de spores. 



   L'organisme liquéfie lentement la gélatine, en produisant une couleur brun foncé dans le milieu, et d'ordinaire ne peptonise pas le latex de tournesol. En milieu synthétique (Pridham et collaborateurs, J.   Bacteriology   56, 108   (1948)),   l'organisme utilise de nombreuses sources de carbone, comprenant la L-arabinose, cellobiose, dextrine, glucose, D-galactose, glycérine, i-inositol, inuline, lactose, lévulose, maltose, D-mannitol, D-mannose, mélibiose, raffinose, rhamnose, amidon, sucrose,   ,;4halose   et D-xylose; moins rapidement   l'adonitol,   l'aesculine et la salicine; et il n'utilise pas le dulcitol, la mélézitose, et le D-sorbitol. 



  L'organisme utilise des sources d'azote inorganiques et organiques. 



   On effectue la production de L-6-diazo-5-oxonorleucine en utilisant le Streptomyces C-2943 par l'inoculation d'un milieu nutritif aqueux stérile convenable par le   Streptomyces   C-2943, incubation du milieu résultant dans des conditions aérobiques stériles à une température comprise entre 20 et 35 C, séparation de la matière solide existant dans le mélange de culture et séparation de la L-6-diazo-5-oxonorleucine désirée du liquide de culture aqueux. 



   Pour l'inoculation, on peut utiliser des spores ou conidia de Streptomyces C-2943 aussi bien que leurs suspensions aqueuses conteront une petite quantité de savon ou autre agent de mouillage. 



  Pour de grandes fermentations, il est préférable d'utiliser des cultures jeunes, vigoureuses, de   Streptomyces     C-2943   plutôt que les spores ou conidia ou leurs suspensions aqueuses. 



   Des milieux nutritifs aqueux convenables sont ceux qui possèdent un pH compris entre   5,0 et   8,5 et qui contiennent des sour- ces de carbone et d'azote aussi bien que des sels inorganiques. Des sources convenables de carbone et d'azote comprennent entre autres de la farine d'huile de soya, de la farine de gluten de froment, de la levure de brasserie, de l'estomac de porc (extrait par des sels), 

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 de   l'hydrolysat   de protéines de viande, des corps solubles de distillation et des corps solides provenant du rouissage de grain. 



  On a également constaté qu'on obtient des résultats particulièrement bons quand on utilise plusieurs combinaisons de ces sources de car- bone et d'azote avec d'autres matières azotées, telles qu'un mélange de farine d'huile de fèves de soya, caséine hydrolysée en milieu acide et levure dont on a enlevé l'amertume, un mélange d'estomac de porc extrait par des sels et de peptone de fèves de soya et un mélange de farine d'huile de fèves de soya et de caséine hydrolysée en milieu acide. La concentration optimum de ces ingrédients est comprise dans la gamme de 1,5 à   2%   du poids total du milieu. Les sources de carbone peuvent comprendre uniquement les matières mentionnées plus haut, mais on obtient les meilleurs résultats quand on'ajoute du glucose ou de la galactose au milieu. La concentration de glucose ou de galactose peut varier de 0 à 2%.

   Des concentrations supérieures à 2%   semblent   exercer une action nuisible sur le rende- ment en produit désiré. Comme sels inorganiques, on peut utiliser du chlorure de sodium, du chlorure d'ammonium, du nitrate d'ammonium, du chlorure de potassium, du carbonate de calcium, etc. Des sels d'ammonium tels que le chlorure d'ammonium, et le nitrate d'ammonium, sont des constituants particulièrement désirables et aboutissent à de hauts rendements en produit désiré. La concentration optimum de ces sels d'ammonium est comprise entre 0,1 et 0,5% du milieu nutritif. 



   On peut effectuer la culture de   Streptomyces   C-2943 en milieu aqueux suivant un certain nombre de procédés différents. 



  Par exemple, on peut cultiver des microorganismes dans des conditions aérobiques à la surface de ce milieu, ou bien on peut les cultiver en dessous du niveau du milieu, c'est-à-dire dans des conditions submergées, en introduisant simultanément de l'oxygène. 



   Le procédé préféré de production de L-6-diazo-5-oxonorleu- cine par fermentation à grande échelle, comprend l'utilisation de cultures submergées ou épaisses de   Streptomyces   C-2943. Conformément 

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 à cette réalisation de la fermentation, on inocule un milieu nutritif aqueux stérile par du Streptomyces C-2943 et on effectue l'incuba- tion par agitation et aération à une température comprise entre environ 20 et 35 C, de préférence au voisinage de 23-29 C, jusqu'à avoir produit une concentration maximum de L-6-diazo-5-oxonorleucine dans le liquide de culture. La durée nécessaire à la production- maximum de L-6-diazo-5-oxonorleucine varie avec les dimensions et le type d'appareil utilisés.

   Par exemple, dans des fermentations industrielles à grande échelle, telles que celles réalisées dans des appareils de fermentation du type à cuve, la production maximum de L-6-diazo-5-oxonorleucine est atteinte en environ trente deux heu res ou moins. Quand on utilise pour la culture des flacons à agiter, la durée de la production maximum peut être plus longue que celle nécessaire à des cuves de fermentation à grande échelle, et atteindre de trois à huit jours. Dans des conditions de culture submergée, le microorganisme se développe sous forme de particules plus ou moins discrètes dispersées dans la masse du milieu nutritif, par opposition à la pellicule plus ou moins continue présente à la surface du milieu dans le procédé de culture en surface.

   Grâce à cette répartition de l'organisme dans la masse des milieux, on peut cultiver en une fois de grands volumes de milieu nutritif inoculé dans les grands tanks et cuves utilisés d'habitude dans l'industrie de la fermentation. On constate que des fermentateurs à cuve fixe, munis de dispositifs d'agitation et/ou d'aération convenables, aussi bien que des fermentateurs à tambour horizontal, sont parti- culièrement utiles à ce point de vue. Toutefois, pour la préparation de plus petites quantités de l'antibiotique ou de   cultures... du   microorganisme, on peut appliquer le procédé par culture immergée dans de petits flacons ou bocaux qu'on peut secouer ou remuer par de: movens mécaniques appropriés. 



   On peut effectuer l'agitation et l'aération de la culture de différentes façons. On peut produire l'agitation par des turbines, palettes, propulseurs ou autres dispositifs d'agitation   @@canique,   

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 en faisant tourner ou imprimant des secousses au   fermentateur   lui-même, à l'aide de différents dispositifsde pompage ou 'par le passage d'air ou d'autresgaz contenant de l'oxygène à travers le milieu.

   On peut effectuer l'aération par injection d'air ou d'autres gaz contenant de l'oxygène dans le mélange de fermentation à travers des tubes ouverts, des tubes perforés, des milieux de diffusion poreux, tels que des barres de carbone, carborundum, verre aggloméré ou analogues, ou bien. par pulvérisation, éclaboussement ou en ré- pandant le   moût   ou le faisant passer à travers une atmosphère conte- nant de   l'oxygène*   
Le procédé de culture en surface pour la production de L- 6-diazo-5-oxonorleucine comprend   l'inoculation   d'une couche creuse ayant d'ordinaire moins de 2 cm d'un milieu   nutri fiant     auquex   stérile, par du Steptomyces C-2943 et l'incubation du mélange dans des conditions aérobiques à une température comprise entre environ 20 et 35 C,

   de préférence voisine de 23-29 C. Une période   d'incuba-   tion plus longue que celle utilisée dans le procédé de culture en profondeur, est d'ordinaire nécessaire p our obtenir la production maximum de L-6-diazo-5-oxonorleucine. En général, la période d'incubation est comprise aux environs de trois à huit jours. 



   Quand la phase de fermentation du procédé est complète, on sépare la matière solide du liquide de culture, par exemple par filtration, centrifugation, etc. On sépare la L-6-diazo-5-oxonorleu- cine contenue dans le liquide résultant, sous forme concentrée ou cristalline. Un procédé convenable pour isoler le produit comprend la concentration du liquide de culture clarifié en un'petit volume, par exemple un cinquième à un vingtième du volume original, l'ad- dition (l'environ trois à dix volumes d'un solvant organique misci- ble à l'eau tel que le méthanol ou   l'éthanol,   la séparation des im- puretés précipitées de la solution, le traitement de la solution purifiée par adsorption et élutriation à l'aide d'un adsorbant de la L-6-diazo-5-oxonorleucine et l'obtention du produit à partir de l' éluat.

   Un autre procédé convenable comprend la concentration du 

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 liquide de culture clarifié à siccité, l'extraction du produit rési- duel par un. solvant organique miscible à l'eau contenant moins de 50% d'eau, le traitement de l'extrait par adsorption et élutriation à l'aide d'un adsorbant de la L-6-diazo-5-oxonorleucine et l'obten- tion du produit à partir de l'éluat. On effectue l'adsorption en faisant passer la solution purifiée ou l'extrait mentionné à travers une colonne d'adsorption qui contient un adsorbant neutre ayant un pH ou un   pH   réglé compris entre environ 5 à 8 et de préfé- rence 6 à 8. Des exemples d'adsorbants convenables sont l'alumine ou l'alumine de Brockmann. On élutrie le produit de l'adsorbant au moyen d'eau ou d'une solution aqueuse d'un solvant organique miscible à l'eau.

   On recueille l'élutriat en fractions et on sèche les fractions possédant l'absorption ultraviolette la plus intense à une longueur d'onde d'environ 275 millimicrons. Par suite de la nature instable du produit à température élevée, on préfère séparer   l'élutriat oar   congélation de l'élutriat et traitement de la masse congelée sous un vide élevé. On peut ensuite purifier le produit par adsorption et élutriation en utilisant du carbone activé.

   Dans ce but, on dissout le produit sec préparé comme on le décrit plus haut, dans une petite quantité d'eau renfermant une proportion mineure d'un solvant organique miscible à l'eau, on règle le pH de la solu- tion à 6 à 7 si c'est nécessaire, on fait passer la solution à travers une colonne d'adsorption contenant du carbone activé et on élutrie la colonne au moyen d'eau contenant une proportion mineure d'un solvant organique miscible à. l'eau, de préférence l'acétone. 



  Lors de la préparation de la solution pour la phase d'adsorption, de l'eau contenant une proportion mineure d'un solvant organique tel que l'acétone, le méthanol, le phénol et analogues, donnent des résultats satisfaisants. On utilise de préférence de l'eau contenant environ 1% d'acétone, et une quantité suffisante de solvant pour obtenir une solution qui contient environ 2 à 10 mg de   L-6-diazo-5-   oxonorleucine   p ar   millilitre. La quantité de carbone activé néces- saire à l'adsorption de la totalité du produit désiré de la solution, 

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 varie avec la concentration de   .L-6-diazo-5-oxonorleucine   dans le produit sec. Par exemple, une matière contenant 5% de L-6-diazo-5- oxonorleucine nécessite d'ordinaire environ quinze gradues de car- bone activé par gramme.

   On obtient les meilleurs résultats quand le carbone activé est tout d' abord mis en suspension avec de la terre de diatomée, en raison du fait que cette dernière facilite le maintien d'une vitesse d'écoulement   satisfaisants.,   A la suite de la phase d'adsorption, on élutrie la colonne par lavage au   .moyen   d'un   élutrie.nt   convenable tel que l'eau contenant moins de 25%   d'un   solvant organique miscible à l'eau. Pour obtenir les meilleurs ré-   sultats,   on utilise une solution   à.   1% d'acétonc dans l'eau.

   On   :Le-   cueille l'élutriat par fractions et on sèche les fractions possé- dant l'adsorption ultra-violette la plus intense à une longueur d'onde d'environ   275   millimicrons, à partir de l'état congelé. 



  Si on le désire, on. peut encore traiter le produit sec ainsi obtenu par recristallisation à partir   d'un.   solvant convenable bel que du méthanol aqueux, de   l'éthanol   aqueux ou analogues.Le produit est identique à tous points de vue à la substance produite par des pro- cédés de synthèse chimique. 



   Les exemples qui suivent illustrent en   détails la   produc- tion de L-6-diazo-5-oxonorleucine par des procédés synthétiques microbiologiques. 



  EXEMPLE 8. -   On   introduit 300 millimitres d'un milieu nutritif ayant la composition suivante :   Polir cents    
 EMI37.1 
 
<tb> Maltose <SEP> 1,0
<tb> 
<tb> Résidu <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> butanol-acétone <SEP> 0,5
<tb> 
<tb> Caséine <SEP> hydrolysée <SEP> en <SEP> milieu <SEP> acide <SEP> 0,5
<tb> 
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,1
<tb> 
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,5
<tb> 
<tb> Eau <SEP> en <SEP> quantité <SEP> suffisante <SEP> pour
<tb> parfaire <SEP> à <SEP> 100,0.
<tb> 
 dans   chacun     '.le   deux flacons Erlenmeyer   d'un   litre, et on règle le 

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 pH à 7,5 par une solution. d'hydroxyde de sodium 6 fois normale. 



    On   stérilise alors' le milieu nutritif par chauffage des flacons à 120 C pendant vingt-cinq minutes. On refroidit le milieu et on inocule chacun des flacons au moyen de 2 ml d'une suspension dans   40   ml de solution stérile à 0,01% de savon médicinale ou de spores de quatre cultures solidifiées   obliquement     d'aar   (glucose-tryptone- 
 EMI38.1 
 sels raine raux) ce t,-trr::':.oTreesr- '¯l"":."..3. On 'maintient les flacons à la température ordinaire ;2I- b ;} pendant nonante heures en pro- duisant une agitation par des appareils mécaniques faisant toUTrur les flacons à 160 tours par Minute suivant V,'j. cercle de 60 l1.':l (2 3/8 pouces) #'; ....Io-'iiètî1:;.

   Le liquide de culture contient environ un ra de Z-F -:''i ;3--'i.--cvl0r ucina, déterminée par des essais de diffusion dans de x'agar sous fOI';:le de plateaux-disaues, comprenant la mesure de l'exbeasion de l' inhibi tion de la croissance de la le- vue Torul'lnsis albida NRRL ïJ11,.00. On filtre le liquide de culture et on isole du filtrat le produit désiré, la L-6-diazo-5-oxonorleucinE par des opérations d'adsorption et d'élutriation décrites en détails dans la suite. 
 EMI38.2 
 



  5X!<; "PL- 
On introduit douze litres d'un milieu ayant la composition suivante : 
Pour cents 
 EMI38.3 
 
<tb> Monohydrate <SEP> de <SEP> glucose <SEP> 2,0
<tb> 
<tb> Farine <SEP> d'huile <SEP> de <SEP> fèvrs <SEP> de <SEP> soya <SEP> 1,0
<tb> 
<tb> Extrait <SEP> salin <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> 0,5
<tb> 
 
 EMI38.4 
 Chlorure d* ammonium 0,167 
 EMI38.5 
 
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,5
<tb> 
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,5
<tb> 
<tb> Eau <SEP> en <SEP> quantité <SEP> suffisante <SEP> pour
<tb> parfaire <SEP> 100,0
<tb> 
   Hydroxyde   de sodium 10 N en quan- tité suffisante pour porter le   pH à 7,5    dans un appareil de fermentation de 30 1 en verre, muni de disposi- tifs en acier antirouille comprenant un arrosoir, un propulseur, des 

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 palettes et une.

   conduite d'échantillonnage et le milieu qui a été stérilisé par chauffage à 121 C pendant deux heures. Le   pH .du   milieu après la stérilisation, est de 7,8. On refroidit le milieu et on l'inocule au moyen d'une'suspension dans 10 ni de solution stérile à 0,1% d'heptadécyle sulfate de sodium, de spores de culture solidifiée obliquement de (glucose-tryptone-sels minéraux)agar de Streptomyces C-2943.On soumet le milieu inoculé à l'incubation à   25-26 C   pendant   septante-deux   heures, pendant lesquelles on remue le milieu à 225 tours par minute et on fait passer de l'air stérile dans le milieu, à raison de 12 litres par minute.

   Au cours de l'incubation, on ajout ' 8 ml   d'un   milieu   stérilisé   de saindoux brut et d'huiles minérales contenant des mono- et diglycérides, suivait les besoins pour empêcher le moussage. On utilise la culture ainsi obtenue après incubation, à l'inoculation des   cultures'prin-   cipales, comme on le décrit dans la suite. 



     On   stérilise à 121 C pendant deux heures quatre fermenta-   teurs   de 30 litres en verre, contenant chacun 16 litres du milieu décrit plus haut, le   pH   après stérilisation étant de 7,6. On laisse refroidir les fermentateurs contenant le milieu stérile, à la tem- pérature ordinaire, on introduit dans chaque fermentateur des par- ties aliquotes de 800 ml de la culture décrite ci-dessus, qui a été soumise à l'incubation, et on soumet les milieux inoculés à l'incu- bation à 25-26 C pendant quarante heures. Pendant toute la période d'incubation, on introduit de l'air par un arrosoir à raison de 16 litres par minute et on effectue une agitation à l'aide d'un propul- seur tournant à. 200 tours par minute.

   Au cours de l'incubation, on ajoute à chaque   fermentateur   30 ml d'un mélange stérilisé de saindoux et d'huiles Minérales décrit plus haut, suivant les besoins, pour em- pêcher le moussage. La concentration en L-6-diazo-5-oxonorleucine dans les milieux de fermentation, après l'incubation, est d'environ 37 microgrammespar millilitre. 



   On sépare la matière solide présente dans les milieux de fermentation après incubation, par sa mise en suspension avec 1% de terre de diatomées et filtration. La matière filtrée possède 

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 l'activité biologique désirée. Par exemple, une injection intrapé- ritonale journalière de 0,1 ml de ce filtrat pendant cinq jours, inhibe sensiblement la croissance de tumeurs de Sarcoma 180 implantées chez les souris. 



   On lave le gâteau de filtre au moyen   d'eau,   on combine les filtrats et les eaux de lavage   (41,5   litres) et on concentre dans le vide à un volume de 1920 ml. On ajoute de l'éthanol au concentrat pour porter le volume à 19,2 litres, on. sépare par filtration le précipité formé et on lave le gâteau de filtre au moyen d'éthanol. 



  On fait passer le filtrat alcoolique, ayant un pH de 6,5, à travers une colonne d'adsorption préparée comme on le   décrit   plus bas. 



   On remue 2,3 kilogrammes   d'alumine   avec de l'acide chlor- hydrique, de manière que le pH demeure constant à 6,4. On enlève l'alumine, on la lave à l'eau et on l'active par chauffage à 200 C pendant quatre heures. On remue l'alumine avec 90% d'éthanol aqueux et on la charge dans une colonne ayant un diamètre de 10 cm (volume hold-up 2300 ml; débit d'écoulement par gravité, 5 litres par heure). 



   On fait passer le filtrat alcoolique préparé plus haut dans la colonne d'adsorption et on lave la colonne successivement par 1,9 litre   d'éthanol   aqueux à 90% et   12,1   litres d'éthanol aqueux à   75%.   On rejette le produit de percolation. On élutrie alors la colonne au moyen de 18 litres   d'éthanol   aqueux à 25% et on recueille   l'éluat   en fractions   d'un   litre. On concentre les cinq premières fractions d'éluat dans le vide et on sèche le concentrât séché à partir de l'état congelé sous vide élevé.

   Le produit séché possède l'activité biolotique désirée; par exemple, une injection intrapéri- tonale deux fois par jour pendant cinq jours, de 0,5   ml   d'une solu- tion aqueuse du produit, à 300 gamma par millilitre, inhibe prati-   quement   la croissance de tumeurs de Sarcoma 180 implantées chez la souris. 



   On dissout 8,5 graines de la matière sèche contenant en- viron 4% de   dans     150   ml d'acétone à 1% dans   l'@au   (pH : 6,2). On   prépara   une colonne d'adsorption par addi- tion d'une suspension de 125 g de carbone activé et 125 g de terre 

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 EMI41.1 
 de dia tomée dans une solution à lolo d'acétone dans l'eau, à une colonne ayant un diamètre de 6,5 en (Volw.'!Ie hold-up de 800. ml; vitesse d'écoulement par gravité 750 ml/heure). On fait passer la solution aqueuse contenant la Ji-ô-diazo-5-oxonorleucine à travers la colonne, et on lave la colonne au moyen de 1,0 litres de solution d'acétone à 1;. On recueille l'élutriat en fractions de 100 ml. 



  On concentre- les fraction:, ennuis la quinzième jusqu'à la vingt- trois10ne jnclagy eb on 8("...1,,, le concentre en partant de l'état con- gelé, sous viuc élevé  On dissout la substance sèche dans du méthanol aqueux à 90/S.  chenc1, et on conserve la solution à 5 C pendant plusieurs heures. Un recueille la h-G-diQzo-5-oxonorleucine qui se sépare sous'forme cristalline, et on la sèche sous vide. 



  Elle possède nn E?"'3 cria = 6l,3 à 274,5 millimicrons. Les propriétés chimiques, biologiques et autres propriétés physiques du produit, sont les mènes que celles données dans la description qui précède. 
 EMI41.2 
 



  E:X]:1: .LE lq.- a) On introduit dans un flacon d'Erlenmeyer d'un litre, 150   ìl.   d'un   milieu   nutritif ayant la composition suivante : 
Pour cents 
 EMI41.3 
 Monohydrate de glucose 2,0 
 EMI41.4 
 
<tb> 'Farine <SEP> d'huile <SEP> de <SEP> fèves <SEP> de <SEP> soya <SEP> 1,0
<tb> 
<tb> Extrait <SEP> salin. <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> 0,5
<tb> 
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> 0,167 <SEP> ' <SEP> 
<tb> 
 
 EMI41.5 
 ChIo 1;1),1'8 de sodium 0,5 Carbonate de calcium 0,5 
 EMI41.6 
 
<tb> Eau <SEP> en <SEP> quantité <SEP> suffisante <SEP> 100,0
<tb> 
<tb> pour <SEP> parfaire <SEP> à <SEP> 100,0
<tb> 
 
 EMI41.7 
 T-ïyo/'O'ic.Tde de sodium 10 N en ci nanti*".' r;n1'ftsan.t'1 UOlll   porter   le pH à 7,5. 



  On   stérilise ensuite   le milieu nutritif par chauffage du flacon à   121 C     ppndant   une demi-heure, on le refroidit, et on inocule le 
 EMI41.8 
 flacon an !'1():rr!'l à 5 ml d'une suspension dans 10 ml de solution stérile 0,1-" d'heltac1cylesulfate de sodium à 0,1% de spores de   culture     solidifiée obliquement   de   (glucose-tryptone-sels   minéraux) 

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 agar de Streptomyces C-2943. On soumet le flacon à l'incubation à 26 C pendant septante deux heures en produisant une agitation par un appareil mécanique à agitateur faisant tourner le flacon à 160 tours par minute suivant un cercle de 60 mm (2 3/8 pouces) de diamètre.

   On utilise la culture ainsi obtenue, qui a été soumise à l'incubation, à l'Inoculation du milieu de 68 litres (15 gallons) décrit ci-dessous en b). b) On introduit dans un   fermentateur   en acier inoxydable de 136 litres (30 gallons), 68 litres (15 gallons) de milieu nutritif ayant la composition décrite ci-dessus en a), et on stéri- lise le milieu par chauffage à 121 C pendant une heure. Le pH du milieu après stérilisation, est de 6,9. On refroidit le milieu, et on l'inocule au moyen de 90 ml de la culture décrite ci-dessus, ayant subi l'incubation. On soumet le milieu inoculé à l'incubation à 26 C pendant vingt-quatre heures.

   Au cours de la période d'incu- bation, on introduit de l'air stérilisé dans le milieu à travers un arrosoir, à raison de 96 litres (3,4 pieds cubes) par minute, et on remue le mélange au moyen d'une roue à aubes tournant à 200 tours par minute. On utilise la culture de Streptomyces C-2943 qui a été soumise à l'incubation, ainsi obtenue, à l'inoculation du milieu de 68 litres (15 gallons)¯décrit ci-dessous en c). c) On introduit 680 litres (150 gallons) de milieu nutri- tif ayant la composition décrite ci-dessus en a) dans un fermenta- teur en acier inoxydable de 908 titres (200 gallons) et on le stéri- lise par chauffage à 121 C pendant une heure. Le pH du milieu après stérilisation, est de 6,7. On refroidit le milieu et on l'inocule au moyen de 68 litres (15 gallons) de la culture qui a été soumise à l'incubation, décrite ci-dessus en b).

   On soumet le mélange de cul- ture à l'incubation à 27 C pendant septante deux heures, et pendant ce temps, on introduit de l'air stérilisé dans le mélange à travers un arrosoir à raison de 775 litres (25 pieds cubes) par minute, et on agite le mélange au moyen d'une roue à ailettes tournant à raison de 200 tours par minute. Pour empêcher le moussage, on ajoute de temps 

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 en temps, suivant les besoins, 2,4 litres   d'un   mélange stérile de saindoux crû et d'huiles minérales contenant des mono- et diglycé- rides. 



   On sépare la matière solide présente dans le mélange qui a été soumis à l'incubation, par filtration à travers un filtre- presse à cadres et plateaux, recouvert auparavant de terre de dia- tomée, et on concentre le filtrat sous pression réduite à un volume d'environ 36 litres(8 gallon?).  On   mélange le concentré avec 324 litres (72 gallons) d'éthanol on sépare par filtration le précipité qui se forme, et on le   re jette.   d)   On   fait passer une portion de 213 libres (47,5 gallons) du filtrat   d'éthanol   (volume total:345 litres (76,5 gallons) : pH 5,9) à travers une colonne d'adsorption préparée de la manière suivante : on remue 22,5 kg (50 livres) d'alumine avec de l'acide chlorhydrique dilué de manière que le pH reste constant à 6,0. 



  On filtre l'alumine, on la lave au moyen d'eau désionisée, et on l'active par chauffage à 200 C pendant quatre heures. On remue l'alu- mine avec de l'éthanol aqueux à   90%   et on la charge dans une colonne de 1,80 m (6 pieds) ayant un diamètre de 15 cm (6 pouces) (volume hold-up :21,5 litres (4,7   gallons) ;   débit 41 litres (9 gallons) par heure sous une pression de jauge de 0,84   kg/cm2   (12 livres/pouce carré). 



   On soumet le filtrat alcoolique préparé ci-dessus à la percolation à travers la colonne d'adsorption sous une pression positive de 0,84 kg/cm2 (12 livres/pouce carré) et on lave la colon- ne successivement au moyen de 21,5 litres (4,7 gallons) d'éthanol aqueux à 90% et   144   litres (31,7 gallons)   d'éthanol   aqueux à 75%. 



    On   élutrie alors la colonne à l'aide de 129 litres (28,5 gallons)   d'éthanol   aqueux à 25% et on recueille l'éluat en fractions de   11   litres (2,4 gallons). On combine les quatrième, cinquième et sixième fractions, on les concentre dans le vide à 35 C et on sèche le concentrât à partir de l'état congelé sous vide élevé. e)   On chromatographie   la portion de 132 litres (29 gallons) restante du filtrat éthanolique de c) sur 12,2 kg (27 livres) d'alu- 

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 mine conformément au procédé décrit ci-dessus en d), on concentre l'éluat et on le sèche en partant de l'état congelé. 



   On combine les poudres sèches de d) et e). Le produit ainsi obtenu renferme 2,16 grammes de   L-6-diazo-5-oxonorleucine.   



  On le purifie par adsorption et élutriation de la manière suivante : on ajoute une suspension de 780 grammes de charbon de bois activé et de 780 grammes de terre de diatomée dans une solution à 1% d'acétone dans l'eau, à une colonne de 1,50 m (5 pieds) ayant un diamètre de 10 cm (4 pouces). Le lit d'adsorbant déposé a une hau- teur de 55 cm (22 pouces), un volume hold-up   de 4   litres, et un débit d'écoulement par gravité de 1,75 litres par heure sous une jauge de 95 cm (38 pouces). On dissout le produit dans 858 ml d' acétone à   1%   dans l'eau et on traite la solution par percolation à travers la colonne. On élutrie la colonne au moyen de 20 litres d'une solution à 1% d'acétone dans l'eau. On recueille des fractions de 500 ml chacune.

   On combine les dix-septimème à vingtième frac- tions inclus, et on concentre dans le vide. On congèle le concentré, et on en élimine la glace par sublimation sous vide élevé. On fait recristalliser le produit, la L-6-diazo-5-oxonorleucine à partir de méthanol aqueux à 90%. Il possède un E11% cm = 676 à 274 millimicrons. 



  Le produit cristallisé possède l'activité biologique désirée; par exemple, une injection   intrapéritonale   journalière d'une solution aqueuse du produit (0,25 mg/kg) pendant cinq jours, inhibe pratique- ment la croissance de tumeurs de Sarcoma 180 implantées chez la souris. Les propriétés chimiques et autres propriétés biologiques et physiques du produit sont les mêmes que celles données dans la description précédente. 



   Bien que, dans la description qui précède, on ait décrit en détails certaines réalisations de la présente invention, il est bien entendu que des modifications considérables peuvent être appor- tées à ces détails sans sortir du cadre de l'invention.

Claims (1)

1. R E V E N D I C A T I O N S.

   1.- procédé pour la production de 6-diazo-5-oxonorleucine, caractérisé en ce qu'on introduit et/ou on produit dans une substan- ce contenant un radical d'acide glutarique ayant comme formule : EMI45.1 au moins un des groupes chimiques suivants : un groupe diazométhyle sur l'atome de carbone numéro 5, un groupe aminé primaire sur l' atome de carbone n 2 et un groupe OH sur l'atome de carbone n 1.

   2.- Procédé pour la production de 6-diazo-5-oxonorleucine, caractérisé en ce qu'il comprend la réaction d'un composé ayant comme formule : EMI45.2 avec de l'hydrazine pur obtenir un composé ayant comme formule EMI45.3 dans le cas où R représente un radical alkyle inférieur, l'hydrolyse du groupe ester présent en milieu alcalin aqueux en dessous de la tempéra tare ordinaire, et la neutralisation du sel métallique de 6- diazo-5-oxonorleucine par un acide, R représentant un métal alcalin, un métal alcalinoterreux ou un radical alkyle inférieur.

   3.- Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'on effectue la neutralisation en réglant le pH à 5,5 à 7.

   4.- Procédé pour la production de 6-diazo-5-oxonorleucine, caractérisé en ce qu'il comprend la réaction d'un sel d'addition d'acide de 6-amino-5-oxonorleucine avec un agent de diazotation. <Desc/Clms Page number 46>

   5.- Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction en dessous de la température' ordinaire, en milieu aqueux.

   6. - Procédé pour la production de sels d'addition d'acide de 6-amino-5-oxonorleucine caractérisé en ce qu'on traite un ester d'alkyle inférieur d'acide 2,6-diphtalimido-5-oxocaproïque par hy- drolyse acide en milieu aqueux à une température supérieure à 70 C.

   7.- Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise au moins deux équivalents d'acide minéral.

   8.- Procédé pour la production de 6-diazo-oxonorleucine caractérisé en ce qu'on traite l'ester alpha-benzylique d'acide glutamique par halogénation, on fait réagir l'halogènehydrate d'halogénure de 4-carbobenzoxy-4-aminobutyryle obtenu avec du diazo- méthane, on hydrolyse l'ester benzylique résultant de 6-diazo-5- oxonorleucine et on neutralise le produit d'hydrolyse.

   9.- Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'on utilise aumoins un équivalent d'un agent d'halogénation à une température inférieure à 50 C.

   10. - Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'on utilise au moins trois équivalents de diazométhane à une température inférieure à 20 C dans un solvant anhydre.

   11.- Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce qu'on effectue l'hydrolyse dans des conditions alcalines en milieu aqueux à une température inférieure à 30 C.

   12.- Procédé suivit la revendication 8, caractérisé en ce qu'on effectue la neutralisation en réglant le pH à 5,5 à 7.

   13. - Procédé pour la production de 6-diazo-5-oxonorleucine caractérisé en ce qu'on soumet de l'anhydride de N-carboxyglutamate de gamma-benzyle à l'hydrogénation, on fait réagir l'anhydride de N-carboxyglutamate résultant avec un agent d'halogénation, on fait réagir le 4-halocarbonyléthyl-oxazolidine-2,5-obtenu avec du diazo- méthane, on hydrolyse la 4-(4-diazo-3-oxobutyl)-oxazolidine-2,5- dione obtenue, et on neutralise le produit d'hydrolyse. <Desc/Clms Page number 47>

   14.- Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce qu'on effectue l'hydrogénation à l'aide d'un catalyseur 'de métal noble à une pression d'hydrogène de 0,7 à 4,2 kg/cm (10 à 60 livres/ pouce carré).

   15. - Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce qu'on utilise au moins un équivalent d'un agent d'halogénation.

   16. - Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce qu'on utilise au moins deux équivalents de diazométhane à une température inférieure à 20 C dans un solvant organique inerte.

   17.- Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce qu'on effectue l'hydrolyse en milieu aqueux à une température inférieure à 30 C.

   18.- Procédé suivant les revendications 13 et 17, carac- térisé en ce qu'on effectue l'hydrolyse en milieu alcalin et en ce qu'on règle le produit d'hydrolyse au pH 5,5 à 7.

   19.- Procédé pour la production de 6-diazo-5-oxonorleu- cine caractérisé en ce qu'on fait réagir l'acide N-trifluoroacétyl- glutamique avec un équivalent au moins d'anhydride acétique, .on fait réagir l'anhydride N-trifluoroacétylglutamique résultant avec un agent alcoolique pour obtenir un mélange des esters alpha-' et gamma de l'acide N-trifluoroacétylglutamique, on fait réagir l'ester alpha avec un agent de halogénation pour obtenir un composé de halogénure ayant la formule : EMI47.1 on fait réagir le composé de halogénure avec au. moins deux équiva- lents de diazométhane, on hydrolyse l'ester de 6-diazo-5-oxo-N- trifluoroacétylnorleucine obtenu, et on neutralise le produit d'hydrolyse.

   20.- Procédé suivant la revendication 19,caractérisé en ce qu'on effectue la réaction avec l'acide N-trifluoroacétylgluta- mique dans une gamine de températures comprise entre la température <Desc/Clms Page number 48> ordinaire et 100 C.

   21. - Procédé suivent la revendication 19, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction avec l'anhydride N-trifluoroacétyl- glutamique à l'aide de méthoxyde de sodium en dessous de la tempé- rature ordinaire.

   22. - Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction avec l'ester alpha,de l'acide N- trifluoroacétylglutamique avec au moins un équivalent de chlorure de thionyle à une température comprise dans la gamme de 50 à 80 C.

   23.- Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction avec le diazométhane à une température comprise dans la. gamme de-5 à 10 C.

   24.- Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce qu'on effectue l'hydrolyse en milieu aqueux alcalin à une tempé- rature inférieure à 30 C environ.

   25. - Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce qu'on neutralise le produit d'hydrolyse par un acide à un pH de 5,5 à 7 en dessous de la température ordinaire.

   26. - Procédé pour la production de 6-diazo-5-oxonorleucine caractérisé en.,ce qu'on traite un ester de 6-diazo-5-oxo-N-tri- fluoroacétylnorleucine par hydrolyse alcaline en milieu aqueux à une température inférieure à environ 30 C et on neutralise le produit d'hydrolyse par un acide au pH de 5,5 à 7 en dessous de la tempéra- ture ordinaire.

   27.- Procédé de production de L-6-diazo-5-oxonorleucine caractérisé en ce qu'on inocule par dû Streptomyces C-2943 un milieu nutritif aqueux stérile ayant un pH compris entre 5,0 et 8,5 et contenant des sources convenables de carbone, azote et sels minéraux, on soumet le mélange résultant à l'incubation dans des conditions aérobiques à une température comprise entre environ 20 et 35 C pendant une durée suffisante à la production de L-6-diazo-5- oxonorleucine et on sépare la matière solide présente dans le milieu de culture. <Desc/Clms Page number 49>

   28.- Procédé pour la production de L-6-diazo-5-oxonor- leucine caractérisé en ce qu'on inocule au moyen de Streptomyces.

   C-2943 un milieu nutritif aqueux stérile ayant un pH compris entre 5,0 et 8,5 et contenant des sources convenables de carbone, azote et sels minéraux, on soumet- le mélange résultant à l'incubation dans des conditions aérobiques une température comprise entre environ 20 et 35 C pendant un temps suffisant à la production de L-6-diazo-5-oxonorleucine, on sépare la matière solide conte- nue dans le milieu de culture et on isole la L-6-diazo-5-oxonorleu- cine du liquide de culture aqueux.

   29.- Procède suivant la revendication 28,caractérisé en ce qu'on soumet le milieu inoculé à l'incubation dans des condi- tions aérobiques submergées, à une température comprise entre 23 et 29 C.

   30.- Procédé suivant les revendications 28 et 29, carac- térisé en ce que le milieu nutritif contient au moins l'une des substances nutritives suivantes en quantité totale comprise entre 1,5 et 2%: farine d'huile de soya, farine de gluten de froment, levure de brasserie, estomac de porc extrait par des sels, hydrolysat de protéine de viande, produits de distillation solubles, liqueurs de trempage de grain, peptone de fèves de soya et caséine hydrolysée.

   31.- Procédé suivant les revendications 28, 29 et 30, caractérise en ce que le milieu nutritif contient moins de 2% d'un élément du groupe qui consiste en glucose et galactose, entre 0,1 et 0,5% d'un sel inorganique d'ammonium.

   32.- Dans un procédé pour la. production de L-6-diazo-5- oxonorleucine, le -orocédé d'isolement de L-6-diazo-5-oxonorleucine d'un liouide de culture encontenent, caractérisé en ce ou-,on concentra le liquide de culture, on ajoute au liquide concentré un solvant organique miscible à l'eau, on sépare les impuretés précipitées, et on soumet la solution résiduelle à l'adsorption et à l'élutriation à l'aide d'un adsorbant de la L-6-diazo-5-oxonorleucine. <Desc/Clms Page number 50>

   33. - Dans un procède pour la production de L-6-diazo- EMI50.1 5-oxonorleucine, le procédé d'isolement de la L-6-diazo-5-oxonorleu- cine d'un liquide de culture en contenant, caractérisé en ce qu'on concentre le liquide de culture à un cinquièmeà un vingtième de son volume original, on ajoute environ trois à dix volutes d'un solvant organique miscible à l'eau, on sépare des impuretés précipitées, on porte la solution résiduelle au contact d'alumine ayant un pH EMI50.2 compris entre 5 à 3 de manière à produire :l.'ac2sarptian de L-6-diazo- 5-oxonorleueine, on :i1¯itrie:

   la L¯-6-diaso-5-oxnorleucine ttar an éluant du groupe qui consiste en eau. et solutions aqueuses de EMI50.3 solvants organiauec miscibles à l' au et on sépare l' éluant de la portion fractionnelle contenant la 1-6-diazo-5-oxonorleucine.

   34.- Procédé suivant la revendication 33, caractérisé en ce que Incluant est de l'éthanol aaueux. EMI50.4

   35 - Dans un procède de production de L-6-diazo-- oxonorleucine, le procédé d'isolement de L.-6-dia.zo-5-oxonorleucine d'un liquide de culture en contenant, caractérisé en ce qu'on con- centre le liquide de culture à un cinquième à un vingtième de son volurie original, on ajoute environ trois à dix volumes d'un solvant organique miscible à l'eau, on sépare des impuretés précipitées, on porte la solution résiduelle au contact d'alumine ayant un pH compris EMI50.5 ntre 5 et 8 pour produire l'adsorption de la L-6-diazo->-oxonor- J eucine, on élutrie la 1-6-diazo-5-oxonorleucine adsorbée au noyen d'un éluant du groupe qui consiste en eau et solutions aqueuses de solvants organiques miscibles à l'eau, on sépare l'éluant de EMI50.6 .¯lêlu.at contenant la 1-6-diazo-5-oxonol'leucine,

   on forme une solution diluée de la L-6-die.zo-5-oxonorleticiiie ainsi obtenue .dans de l'eau contenant une proportion mineure de solvant organique miscible à l'eau, on règle le pH de la solution au pH 6 à 7, on porte la solu- ;-.;on au contact de carbone activé pour produira ainsi l'adsorption EMI50.7 !'- 1-6- di13.zo-5 -oxoD.ol'leucine on élutrie la L-6-diaiïo-5-oxonorleu- #n're adsorbée nar de l'eau contenant moins de 25% d'un solvant orga- .#A."i.ie ici -cible 1'eau, et on sépare 1 -41-uant de l'éluat contenant <Desc/Clms Page number 51> EMI51.1 la Z-E--ïazo-5-af.onorleucir:

   .e. EMI51.2 36.- procède suivant la revendication 35, caractérise en EMI51.3 ce qu'on effectue l'éll1.tl'ipt.ioú a partir de 1 ' alumine au noyen d'éthanol aqueux et l'élutria cion à partir de carbone au moyen EMI51.4 d'acétone aqueux. EMI51.5

   37.- ---dia.zo-5-olcaoYlcucine.

   3<"> # - Ic*-û-àiû?;o"5 ->'/o.iO'jJ uacine.

   39 * Ï-,¯i-.a,p- 5-¯r,ßrejTW 1'lE?ttCi).e: 1;,0. ' l,.<.-di3.zo"-f)-o?:oiiorleuciiie l7..- Un c¯ -oo;¯' ynt Da a formule 0 1\ TI?CI3 - C - Cif c"ï - 9-CII 1 -COOR 1 i II-L R2 dans l?;u:l. t -¯ ry, ¯ ;su 'un xiéta7¯ alcalin, un métal alcalinoterreux, un radical alkyl" ::L1'!rÜ:nr ou un radical benzyle, et R2 est de l'hydro- gène ou mi ypuieal b'ifl1.l01'O[..,\t.:rle.

   1;'?'.- !';stt2l' jJl.t1:tyliQue de D-6-dis.zo-5-oxonorleucine.

   43. Esber ué tr:,; 7¯inue de e E,-6-dia.zo->-oxonorleucïne.

   J4,. - "rh-r r,,/'t1:f;rlique de LT 6--diao-5-oxororleucïne.

   5.' lester ben:.yl:ic:ucz de j-L.-dia.zo-5-oxonorleucine.

   /.6." Ester bcnxyliaue de T-6-.â.ia:=o-5-ox¯onorleucine.

   /,7. - e.¯!ß--(.-c;ïa;o5-c:onorleucine.

   /,.?#;,- lester l,16th;rlique de Q-6-diazo-5 -oxo-N -trifluoroacé tyl- norl cuc..r-:-n 119.- ::Ler ace:irlic!u de L,-6-diazo-5-oxo-N-trifluoro- Qcétylno cl tel 50 # - ]>±ter ynéthylique de .N-6-cliazo-5-oxo-N -trifluoroacétyl- n()l'l<uci[1 '; 51.- :':F? bensylicjut de D.-6-diazo-5-oxo-IvT-trifluoro- nc p ty In oI.Je1) c in -s , 5?.- ,,;;ter 'E?tt 17¯(t,lle de I-b-d3¯ao-5-oxo-I;-trif7¯uoro.- 'Gr' .t',IT) 11 ') cÎ, i ' '.''!.! '.', 5?,-- "rt'ir- bpnsylique de DL-6-diazo-5-oxo-K-trifluoro- <Desc/Clms Page number 52> acétylnorleueine.

   54.- Composé de la classe consistait en 6-amino-5-oxo- norleucine et ses sels d'addition d'acide, l'oxonorleucine ayant la formule : EMI52.1 EMI52.2 55.- ±-6-araino-5-oxonorleucine.

   56. - L-6-amino-5-oxonorleueine ; 57.- DL-6-amino+5-oxonorleucine.

   58. - 4-- (4-.âiazo-3-oxobutyl) oxazolidine-2, 5-âiones.

   59.- D.-4-- (A-d.iazo-3-oxy'butyl) oxazoliâine-2, 5-âione. 60.- L-4-(4-diazo-.l-oxybutyl)oxazolldine-2,5-dione.: 61. - L-l,.- (.-d.azo-3-oxobutyl) oxazolidine-2, 5-dione.