CH290797A

CH290797A - Procédé de préparation du sel de sodium de n-butylmercapto-pénicilline.

Info

Publication number: CH290797A
Authority: CH
Inventors: Company Eli Lilly And
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1946-03-08
Filing date: 1947-03-07
Publication date: 1953-05-15

Description

Procédé de préparation du sel de sodium de n-butylmercapto-pénicilline. Le présent brevet est relatif à un procédé de préparation du sel de sodium de n-butyl- mercapto-pénicilline, composé nouveau répon dant à la formule suivante: CH3CH2CH2CH2S-C1oH12N204S Na. On connaît des pénicillines formant un groupe de composés chimiquement apparentés qui, sous des conditions de croissance conve nables, s'obtiennent comme produits du méta bolisme d'une moisissure appropriée. On n'a pu établir entièrement la structure molécu laire de ces composés.

On a, toutefois, pu acquérir des connaissances suffisantes sur leur structure pour pouvoir leur attribuer la formule empirique .suivante Ro-C1oHlaN204S dans laquelle Ro représente un radical orga nique qui caractérise chaque pénicilline indi viduelle.

Ces pénicillines connues forment nui groupe de six pénicillines, dans chacune des quelles le radical Ro représente un radical butène-1-yle, butène-2-yle, n-butyle, n-hexyle, phényle ou p-hydroxyphényle. On sait, en outre, que dans le mode de production normal par fermentation, ces six pénicillines sont ob tenues en mélange.

La titulaire a découvert qu'il est possible (le faire produire à une moisissure productrice de pénicilline une pénicilline nouvelle en incorporant au milieu nutritif, .dans lequel la moisissure se développe, un composé organi- que, désigné dans la suite par composé précurseur . Ce composé précurseur, bien qu'étranger aux besoins normaux clu ' métabo lisme de la moisissure, peut être métabolisé et incorporé pour Lune part substantielle à la molécule de la nouvelle pénicilline. Ce résul tat est particulièrement remarquable en rai son du caractère spécifique reconnu des systè mes d'enzymes par lesquels les organismes in férieurs maintiennent leur croissance et leur développement.

Il est surprenant, en outre, que l'utilisation d'un composé ,précurseur puisse conduire à la production d'une péni cilline nouvelle, et cela. pratiquement à l'ex clusion des pénicillines connues se formant normalement.

Ainsi, la présente invention fournit un procédé de production-d'une pénicilline nou velle, sans qu'il y ait production concommit- tante de pénicillines connues, par incorpora tion de quantités importantes d'un composé précurseur choisi.

Le procédé qui fait l'objet du présent brevet est caractérisé en ce qu'on fait croître une moisissure productrice de pénicilline sur ou dans un milieu de culture contenant les éléments nécessaires à la. croissance de la moi sissure et un composé précurseur renfermant le radical n-butylmercapto et qu'on forme le sel de sodium. de la pénicilline ainsi produite. Le sel de sodium de la n-butylmercapto-péni- cilline est un solide blanc cristallisé.

On peut isoler la nouvelle pénicilline par des méthodes connues, par exemple par ad- sorption et extraction, pour obtenir un pro duit suffisamment pur pour les besoins prati ques. Pour obtenir un produit plus pur, on peut soumettre la nouvelle pénicilline à des traitements de purification supplémentaires comme le montre l'exemple ci-après.

Le milieu nutritif utilisé pour le développe ment de la moisissure peut comprendre des ingrédients tels que de l'eau, des sucres, des sels minéraux et, de préférence, un ou plu sieurs des produits mal déterminés obtenus par macération des grains de céréales et du son. On connaît un grand nombre de milieux nutritifs appropriés comprenant des matières de ce type.

Pendant la croissance de la moisissure, on maintient le milieu .de culture à une tempé rature appropriée, par exemple de l'ordre de 20 à 30 C. Les températures qui se sont révé lées particulièrement convenables sont com prises entre 24 et 26 C.

Le temps pendant lequel on laisse la moisissure se développer dépend du but poursuivi. Ainsi, on peut ne laisser croître la moisissure que pendant la période où son développement est le plus rapide, c'est-à-dire deux à trois jours; ou bien on peut laisser croître la moisissure plus long temps pour obtenir le rendement quantitatif maximum, soit en général pendant 5 jours.

La moisissure peut être cultivée sous di verses conditions. On peut, par exemple, la laisser croître sans aucune agitation du milieu de culture, auquel cas elle se développe en sur face, ou, au contraire, on peut agiter le milieu de culture, en secouant ou en remuant, auquel cas elle se .développe dans toute la masse dudit milieu.

Les moisissures utilisables pour réaliser l'invention sont les organismes du type capable de produire des pénicillines, par exemple les moisissures du groupe Penicillium notatum- chrysogenum, ainsi que certaines moisissures du groupe Aspergillus. Bien entendu, toutes les variétés de moisissures ne sont pas égale ment efficaces;

les plus favorables sont celles des variétés g-1612 et Q-176 du groupe Peni- cillium notatum-chrysogeniuu et la variété G-147 du groupe Aspergillus flavlls. La concentration en composé précurseur, qui peut être l'acide n-butylmercapto-acétique ; ou un composé capable de se transformer en cet acide soirs l'action de la moisissure, dans le milieu de culture, peut fortement varier. Cette concentration peut être de l'ordre de 1010, mais il est en général désirable d'utiliser des ; concentrations plus faibles.

La concentration optimum en composé précurseur se trouve comprise entre 0,01 et 0,05 %, calculée en poids-volume, lorsqu'on utilise la variété Y-1612, tandis que cette concentration est , supérieure lorsqu'on utilise la variété Q-176.

On peut ajouter le composé précurseur à tout moment convenable. Ainsi, on peut en semencer le milieu nutritif avec la moisissure, le composé précurseur étant ajouté soit avant, , soit après cet ensemencement. <I>Exemples:</I> On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante
EMI0002.0047

Lactose <SEP> 125 <SEP> g
<tb> Matières <SEP> solides <SEP> d'une <SEP> macération <SEP> de
<tb> grains <SEP> de <SEP> céréales <SEP> 150 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Acide <SEP> n-butylmercaptoacétique <SEP> 0,9 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> 5000 <SEP> cm <SEP> 3 On répartit le milieu de culture par frac tions de 200 cm3 dans des flacons Erlenmeyer de 1 litre, on les stérilise,

on ensemence avec une suspension de spores de moisissure Peni- eillium, variété 1=I. R. R. L. 1976, et on -ôbture les flacons avec un tampon de coton. On main tient les flacons à une- température de 23 à 26 C environ en les agitant constamment pendant cinq jours.

On filtre ensuite le con tenu des flacons pour séparer le mycélium de la moisissure, on laisse refroidir le filtrat jusqu'à 0 C environ, on l'acidifie jusqu'à un pH de 2,2 environ au moyen d'acide ortho- phosphorique et on l'agite avec un volume égal d'acétate d'amyle.

On sépare la couche d'acétate d'amyle et on l'extrait avec trois fractions de 100 cm3 d'eau froide à laquelle on ajoute une solution décinormale froide de bicarbonate de sodium au cours de chaque extraction, jusqu'à ce que la phase aqueuse ait atteint un pg d'environ 7,1 à 7,3.

On réunit les extraits aqueux, on les refroidit à 0 C environ, on les acidifie jusqu'à un pfi d'environ 2,2 par de l'acide orthophosphorique et on les extrait au moyen de trois fractions d'éther de 100 ems chacune. On réunit les extraits à l'éther et on les fait passer dans une colonne d'adsorption chromatographique du type à la silice, d'environ 30 mm de dia mètre et 300 mm de long et contenant une solution tampon au phosphate, dont le p$ est égal à 6,2.

On développe la colonne à silice par lixii-iation au moyen de six fractions de 100 cmB d'éther contenant des quantités suc cessivement croissantes de méthanol dans l'ordre de 1/2, 1, 11/2, 2, 21/ et 3 0/0.

On divise la colonne .de silice développée en environ 12 sections égales et on effectue l'élution de chaque section avec trois fractions de 30 cms d'une solution de phosphate M/15, de<B>pH</B> = 7,0. Les produits de l'élution sont soumis à un titrage bactériologique pour en déterminer la teneur en pénicilline.

L'activité antibiotique provient en grande partie de plu sieurs bandes de la colonne de silice et résulte de la présence de la n-butylmercapto-pénicil- line. Les éluats correspondant à ces bandes sont rassemblés, refroidis à 0 C environ, aci difiés jusqu'à un pH de 2,2 environ et extraits au moyen de trois fractions de chloroforme de 50 cm3. On fait passer les extraits au chloro forme combinés à travers une colonne d'ab sorption de silice contenant une solution tam pon de phosphate ayant un pH -de 6,2.

On développe la colonne à silice par lixiviation avec trois fractions de 100 cm3 de chloroforme contenant des proportions successivement croissantes de méthanol dans l'ordre: 1, 2 et %. On divise alors la colonne à silice d6ve- loppée en 7.2 sections égales et on soumet chaque section à l'élution par trois fractions de 30 cm-9 d'une solution tampon

de phosphate 1#1/15 de p$ = 7,0. L'activité antibiotique provient en grande partie d'une bande" large occupant les 2/3 inférieurs de la colonne de silice. Les éluats obtenus par extraction des sections de la colonne de silice, qui constituent cette bande, sont rassemblés, refroidis à 0 C environ, acidifiés jusqu'à un p$ = 2,

2 environ et soumis à l'extraction au moyen de trois fractions d'éther de 100 cm3. On réunit les extraits à l'éther et on les extrait à leur tour par environ 75 cm3 d'une solution aqueuse froide et diluée de soude caustique à laquelle on ajoute de la soude caustique décinormale au cours de l'extraction, de manière à réaliser un p$ final d'environ 7,0 dans la phase aqueuse.

De la solution aqueuse, on peut séparer le sel de sodium de la n-butylmer- capto-pénicilline, par exemple par congélation et évaporation dans le vide à l'état congelé. On cristallise le sel de sodium de n-butylmer- capto-pénicilline sec en traitant le sel de sodium amorphe par de l'acétone absolu en quantité presque suffisante pour le dissoudre. Lorsqu'on laisse reposer le mélange pendant peu de temps, le sel de sodium cristallisé se sépare.

On recristallise deux fois le sel cristal lisé en le dissolvant dans de l'acétone aqueux < @ .90 % et en ajoutant de l'acétone absolu pour reprécipiter le sel.

Le sel de n-butylmer.. capto-pénicilline cristallisé obtenu présente une teneur .de 3400 unités par cms. L'essai différentiel donne une valeur de 0,53. L'ana- lyse révèle la présence de 7,52 % d'azote et de 17,

26 % de soufre. Les valeurs calculées cor- respondantes; sont de 7,60 % d'azote et de 17,40 % de soiûre.

Claims

REVENDICATION: Procédé pour la production du sel de sodium de n-butylmercapto-pénicilline, sel ré pondant à la formule CH3CH#>CH2CFI,S-C1oHy.2N20,,S Na, caractérisé en ce qu'on fait. croître une moisis sure productrice de pénicilline suy ou dans un milieu de - culture contenant les éléments nécessaires à la croissance de la moisissure et un composé précurseur renfermant le radical n-butylmercapto et qu'on forme le sel de sodium de la pénicilline ainsi produite.

Le sel de sodium de la n-butylmercapto- pénicilline est un solide blanc cristallisé.