CH290798A

CH290798A - Procédé de préparation du sel de sodium d'allylmercapto-pénicilline.

Info

Publication number: CH290798A
Authority: CH
Inventors: Company Eli Lilly And
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1946-03-08
Filing date: 1947-03-07
Publication date: 1953-05-15

Description

Procédé de préparation du sel de sodium d'allylmercapto.pénicilline. Le présent brevet est relatif à un procédé de préparation du sel de sodium de l'allylmer- capto-pénicilline, composé nouveau, répondant à la formule suivante: CH2=CH-CH2S-CioH12N204SNa. On connaît des pénicillines formant un groupe de composés chimiquement apparentés, qui sous des conditions de croissance convena bles, s'obtiennent comme produits du méta bolisme d'une moisissure appropriée.

On n'a pu établir entièrement la structure molécïi- laire de ces composés. On a, toutefois, pu acquérir des connaissances suffisantes sur leur structure pour pouvoir leur attribuer la for mule empirique suivante: -R0-010H13N2()4S dans laquelle Ro représente un radical organi que qui caractérise chaque pénicilline indivi duelle.

Ces pénicillines connues forment un groupe de six pénicillines, dans chacune des quelles le radical Ro représente un radical butène-1-yle, butène-2-yle, n-butyle, n-hexyle, phényle ou p-hydroxyphényle. On sait, en outre, que dans le mode de production normal par fermentation, ces six pénicillines sont ob tenues en mélange.

La titulaire a découvert qu'il est possible de faire produire à une moisissure productrice de pénicilline, une pénicilline nouvelle, en incorporant au milieu nutritif, dans lequel la moisissure se développe, un composé organi que, désigné dans la suite par composé pré curseur . Ce composé précurseur, bien qu'étranger aux besoins normaux du méta bolisme de la moisissure, peut être métabolisé et incorporé pour une part substantielle à la molécule de la nouvelle pénicilline.

Ce résul tat est particulièrement remarquable en raison du caractère spécifique reconnu des systèmes d'enzymes par lesquels les organismes 'infé rieurs maintiennent leur croissance et leur développement. Il est surprenant, en outre, que l'utilisation d'un composé précurseur puisse conduire à la production d'une -péni cilline nouvelle, et cela pratiquement à l'exclu sion des pénicillines connues, se formant nor malement.

Le procédé qui fait l'objet du présent bre vet est caractérisé en ce qu'on fait croître une moisissure productrice de pénicilline sur ou dans un milieu de culture contenant les é@é- ments nécessaires à la croissance de la moisis sure et un composé précurseur renfermant le radical allylmercapto et qu'on forme le sel de sodium de la pénicilline ainsi produite. Le sel de sodium de l'allylmercapto-pénicilline est un solide blanc cristallisé.

On peut isoler la nouvelle pénicilline par des méthodes connues, par exemple par ad sorption et extraction, pour obtenir un pro duit suffisamment pur pour les besoins prati ques. Pour obtenir un produit plus pur, on peut soumettre la nouvelle pénicilline à des traitements de purification supplémentaireq, comme le montre l'exemple ci-après.

Le milieu nutritif utilisé pour le dévelop pement de la moisissure peut comprendre des ingrédients tels que de l'eau, des sucres, des sels minéraux et, de préférence, un ou plu sieurs des produits mal déterminés obtenus par macération des grains de céréales et du son. On connaît un grand nombre de milieux nutritifs appropriés comprenant des matières de ce type.

Pendant la croissance de la moisissure, on maintient le milieu de culture à une tempéra ture appropriée, par exemple de l'ordre de 20 à 30 C. Les températures qui se sont révélées particulièrement convenables sont comprises entre 24 et 26 C.

Le temps pendant lequel on laisse 1a moisissure se développer dépend du but poursuivi. Ainsi, on peut ne laisser croître la moisissure que pendant la période où son développement est le plus rapide, c'est- à-dire, en général, pendant deux à trois jours; ou bien, on peut laisser croître la moisissure plus longtemps pour obtenir le rendement quantitatif maximum, soit pendant 5 jours.

La moisissure peut être cultivée sous diver ses conditions. On peut, par exemple, la lais ser croître sans aucune agitation du milieu de culture, auquel cas elle se développe en surface ou, au contraire, . on peut agiter le milieu de culture, en secouant ou en remuant, auquel Pas elle se développe dans toute la. masse dudit milieu.

Les moisissures utilisables pour réaliser l'invention sont les organismes du type capa ble de produire des pénicillines, par exemple les moisissures du groupe Penieillium notatum- chrysogenum ainsi que certaines moisissures du groupe Aspergillus.

Bien entendu, toutes les variétés de moisissures ne -sont pas égale ment efficaces, les -plus favorables sont celles des variétés g-1612 et Q-176 du groupe Peni- cillium notatum-chrysogenum. et la variété C-147 du groupe Aspergillus flavus.

La concentration en composé précurseur, qui peut être l'acide allylmercaptoacétique ou un composé capable de se transformer en cet acide sous l'action de la moisissure (par exem- ple le N-(2-hydroxy-éthyl)-allylmereaptoacét- amide), dans le milieu de culture peut forte ment varier. Cette concentration peut être de l'ordre de 1 1/a, mais il est en général dési rable d'utiliser des concentrations plus faibles.

La concentration optimum en composé pré curseur se trouve comprise entre 0,01 et 0,05 %, calculée en poids-volume, lorsqu'on utilise la variété X-1612, tandis que cette con centration est supérieure lorsqu'on utilise la variété Q-176.

On peut ajouter le composé précurseur à tout moment convenable. Ainsi, on peut en semencer le milieu nutritif avec la moisissure, le composé précurseur étant ajouté soit avant, soit après cet ensemencement.

EXE,mple: On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante:
EMI0002.0053

Lactose <SEP> 125 <SEP> g
<tb> Matièrés <SEP> solides <SEP> d'une <SEP> macération <SEP> de
<tb> grains <SEP> de <SEP> céréales <SEP> 150 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 25 <SEP> g
<tb> N- <SEP> (2-hydroxyéthyl) <SEP> -allylmercapto acétamide <SEP> 0,7 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> 5000 <SEP> cuis On répartit le milieu de culture par frac tions de 200 cm3 dans des flacons Erlenmeyer de 1 litre, on les stérilise,

on ensemence avec une suspension de spores de moisissure Peni- cillium, variété FI. R. R. L. 1976, et on obture les flacons avec un tampon de coton. On main tient les flacons à une température de 23 à 26 C environ en les agitant constamment pen dant cinq jours.

On filtre ensuite le contenu des flacons pour séparer le mycélium - de la moisissure, on laisse refroidir le filtrat jusqu'à 0 C environ, on l'acidifie jusqu'à un pg de 2,2 environ au moyen d'acide orthophos- phorique et on l'agite avec un volume égal d'acétate d'amyle.

On sépare la couche d'acé tate d'amyle et on l'extrait avec trois fractions de 100 em3 d'eau froide à laquelle on ajoute une solution décinormale froide de bicarbo nate de sodium an cours de chaque extraction, jusqu'à ce que la phase aqueuse ait atteint un pH d'environ 7,1 à 7,3. On réunit les extraits aqueux, on les refroidit à 0 C environ, on les acidifie jusqu'à un pH d'environ 2,2 par de l'acide orthophosphorique et on les extrait au moyen de trois fractions d'éther de 100 cm3 chacune.

On réunit les extraits à l'éther, et on les fait passer dans une colonne d'ad sorption chromatographique de silice, d'envi ron 30 mm de diamètre et 300 mm de long et contenant une solution tampon au phos phate, dont le pH est égal à 6,2. On développe la colonne de silice par lixiviation su moyen de six fractions de 100 cms d'éther contenant des quantités successivement .croissantes de méthanol dans l'ordre de 1/9_, 1, 11/2, 2, 21/4 et 3 0/0.

On divise la colonne -de silice développée en environ 12 sections égales et on effectue l'élution de chaque section avec trois fractions de 30 cm3 d'une solution de phosphate M/15, de pg = 7,0. Les éluats sont soumis à un titrage bactériologique pour en déterminer la teneur en pénicilline.

L'activité antibiotique provient en grande partie d'une seule bande de la colonne de silice et résulte,de la présence de la n-butylmercapto-pénicilline. Les éluats correspondant à cette bande sont ressemblés, refroidis à 0 C environ, acidifiés jusqu'à un pH de 2,

2 environ et extraits au moyen de trois fractions de chloroforme de 50 cm3. On fait passer les extraits au chloroforme com binés à travers une colonne d'adsorption de silice contenant une solution tampon de phos= phate ayant un pH de 6,2. On développe la colonne à silice par lixiviation avec trois frac tions de 100 cm3 de chloroforme contenant des proportions successivement croissantes de mé thanol dans l'ordre: 1, 2 et S 0/0.

On divise alors la colonne de silice développée en 12 sec tions égales et on soumet chaque section à l'élution par trois fractions de 30 cm3 d'une solution tampon de phosphate M/15 de pH = 7,0. L'activité antibiotique provient en grande partie d'une seule bande de la colonne de silice.

Les éluats obtenus par extraction des sections de la colonne de silice, qui constituent cette bande, sont rassemblés, refroidis à 0 C environ, acidifiés jusqu'à un pg = 2,

2 environ et soumis à l'extraction au moyen de trois fractions d'éther de 100 cm3. On réunit les extraits à l'éther et on les extrait à leur tour par environ 75 cm3 d'une solution aqueuse froide et diluée de soude caustique à laquelle on ajoute de la soude caustique décinor- male au cours de l'extraction, de manière à réaliser un pH final d'environ 7,0 dans la phase aqueuse.

De la solution aqueuse, on peut séparer le sel de sodium de l'allylmercapto-pénicilline, par exemple par congélation et évaporation dans le vide à l'état congelé. On cristallise le sel de sodium d'allyl- mercapto-pénicilline sec en traitant le sel de sodium amorphe par de l'acétone absolu en quantité presque suffisante pour le dissoudre. Lorsqu'on laisse reposer le mélange pendant peu de temps, le sel de sodium cristallisé se sépare.

On recristallise deux fois le sel cristal lisé en le dissolvant dans de l'acétone aqueux à 90 % et en ajoutant de l'acétone absolu pour reprécipiter le sel. Le sel d'allylmercapto- pénicilline cristallisé obtenu présente une teneur de 1630 unités par cm3. L'essai diffé rentiel donne une valeur de 0,76.

L'analyse révèle la présence de 8,04 % d'azote et de 18,24 % de soufre. Les valeurs calculées cor respondantes sont de 7,95 % d'azote et -de 18,20 % de soufre.

Claims

. REVENDICATION: Procédé pour la production du sel de sodium.d'allylmercapto-pénieilline, sel répon dant à la formule: CH2=CH-CH2S-CioHi2N204SNa caractérisé en ce qu'on fait croître une moisis sure productrice de pénicilline sur ou dans un milieu de culture contenant les éléments nécessaires à la croissance de la moisissure et un composé précurseur renfermant le radical allylmercapto, et qu'on forme le sel de sodium de la pénicilline ainsi produite.

Le sel de sodium d'allylmercapto-pénicil- line est un solide blanc cristallisé.