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La présente invention est relative à de nouveaux agents antibiotiques et à des procédés pour leur préparation.
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l'ius par-ticuliérement, elle concerne une nouvelle substance antibiotique connue sous l'appellation d(.i "novobiocine" et à des procédés pour sa production.
La découverte des propriétés antibiotiques remar-
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quables de la pénicilline a stimulé dans ce lomaine un gra,nfi intérêt, qui a conduit à la découverte de ne 1JrC:1Jscs autres substances antibiotiques de valeur, telles que la streptomycine, la strepto.thricino, la. graiiiicidiiie, la sub./tiline, la .bacitracine, la chlortétracycline, l'oxytétrnoycline, 18
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terramycine et analogues, Zn géll<6l"al, ces antibiotiques sont particulièrement actifs vis-à-vis de certaines bactéries à gram négatif, tandis que d'autres sont actifs vis-à-vis de
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bactéries à gra1:
1 positif, certains étant actifs tant vis-à- vis de bactéries à gram négatif que de bactéries à gram positif. Toutefois, l'activité de ces antibiotiques connus est
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usuellement limitée à Quelques Microorganismes pathogènes et on a poursuivi les essais dans ce domaine, en vue de décou- vrir d'autres antibiotiques qui agiraient efficacement sur
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d'autres microorganismes patliogéiiesa
Alors que certains de ces antibiotiques se sont révélés sans valeur dans le traitement de diverses maladies, on a constaté que certaines souches de certains agents patho-' gènes devenaient résistantes à un antibiotique particulier,
à tel point que ce dernier n'était plus actif sur ces souches
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résistantes" Les déficiences des antibiotiques connus ont, par
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conséquent, stimula les rechercher Cll vûf cic trouver d'autres antibiotiques actifs, vis-.-vis d'une Gmiwie plus .tendue de germes pathogènes, ainsi qu. vi3-'s.-vis <1<; souches r6sistailt;s de microorganismes particulières.
La présente invention a pour objet un nouvel aiiti-
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biotique présentant un grande efi'icacit. pour inhiber la crois sazlce de bactéries DathorrèncG en particulier les wicroorga- nismes à gram positif'. L'invention a encore pour objet un procédé de préparation de cette nouvelle substance antibio- tique par fermentation dE milieux nutritifs au moyen de sou-
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ches appropriées d'un rr;icraorgallisrne inconnu jusqu'ici. D'au- tres objets de l'invention ressortiront de la description détaillée suivante.
La nouvelle substance antibiotique suivant la pré- .sente invention se forme par la croissance, dans des coud.-
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tions contrôlées, d'une es;:Le inconnue jusqu'ici de iiiicroorganisme, qui a été désignée sous l'appellation de bzz sphero. Ce microorganisme a été isolé d'un échantillon de terre provenant d'un vieux pâturage gazonné de l'état de Vermont U. S. A. ). Ce nouveau niicroorganisme a été désigzlé comme des 1-LA-319 dans la collection de cultures de la Société 1.±ltCK . GU., I1.C. à Rahi'fay, ,,ew ttersey, U.S.A. ùne culture de ce rnicroor,.:;anisme a été déposé à la Section fermentation de la "Tvorthern utilizatiou Research Branch" du départent arruricain de l'agriculture à Peoria -llino3.s et ajoutée à sa collection de cultures perdent: sous l'indice d'identification NRHL 244.
.tre.t Les caractéristiques inorphologiquex- et culturelles du Jtrentomyces sphéroïdes sont ilidinu,-'-es dolls le tableau sui¯ vant :
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r(.! pt o.!!1.Y.:c±P ¯)lll:îJ:'oid C' ::;.¯'::.
Horph .19e;ie (exà,'<1;ià sur YJ.::U, sucrose de Gzap0l et agar C 1.Ilcose-asparétc;inc) 'd.rü:.:: Spores ovalt-(ë-U, 7 à 1,1 n de large sur 1,5 à 2,0 de long. Certaines spirales sont. ou- vertes, mais la majorité d'entre elles est fermée et compacte. Dans certaines zones,les spirales apparaissent comme des billes.
Sucrose de Czapek Croissance claire et rapide, mycélium aé- rien blanc abondant teinte de crème à gris- olive. Pas de croissance dans le mil eu. Pas de pigment soluble. Envers blans devenant de couleur paille. Croissance en surface bril- laute.
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Gélatine Liq;.éi':ctiol1 commençant après 2 à 3 jours. Complète liquéfaction en 10-11 jours. Pas de pigment soluble. Sédiment floconneux de couleur crème.
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Agar glucose- 1 ycel.im.t aérien abondant blanc devenant gris. aspara7,iiie Pas de pigment soluble.
Agar glucose- Croissance jaune modérée. mycélium aérien peptone peptone blanc-grisâtre. Envers de couleur paille. Pas de pigment soluble.
Bouillon, de Pellicule tombant, par agitation, au fond du glucose tube. Pas de pigment soluble. Pellicule de surface dans culture vieille.
5 A 28 C après 7 jours, pas de changement; a- près 14 jours, anneau, pH=7,0; après 15-23 jours, commencement de coagulation et pepto-
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l1isatioll; après 23 jours, PHo'p5. Coagulation complète en 45 jours. A 37 C, pas de croissan- ce.
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Blocs de pommes Croissance blanche, lente et inclinée en deterre 7 jours, croissance grisâtre forte en 14 jours. mycélium aérien gris. Pomme d terre devenant brun foncé.
Agar d'amidon Amidon soluble : anrès 4 jours, a@idon hydrolysé . Forte croissance; Mycélium aérien blanc. Envers de teinte crème 4 paille.
Amidon de pomme de terre : après 4 jours, amidon hydrolysé. Forte croissance; croissance incolore et transparente devenant gris à blanc-grisâtre, mycélium aérien blanc.
Agar au nitrate après 2 jours ; faible réduction en nitrite; après 4 jours, faible réduction @ nitrite.
Agar de glucose/nutritif Croissance modérée incolore. Mycelium nutritif aérien blanc abondant. Envers de teinte jaune paille pâle. Pas de croissance dans le milieu.
Agar de lait hydrolyse de la caséine sous les colonies seulement.
Carotte Croissance blanche très forte Citrates Croissance très inclinée Température optimum 20-26 C: bonne croissance 28 C: croissance excellente 37 C: pas de croissance 50 C: pas de croissance Indol Négatif
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Agar tyrosinique Mycelium aérien blanc abondant. Pas de pigment. Après 18 jours, pigment de tein- te paille. Après 60 jours, pigment solu- ble brun foncé.
Agar nutritif au Mycélium aérien blanc abondant. Pigment glycérol soluble de teinte paille à ambre. Pas de croissance dans le milieu. Envers de tein- te crème.
Sucrose de Czapek Croissance blanche abondante sous forme de pellicule. Sédiment blanc au fond du tu- be et adhérant à la paroi du tube, tant au-dessus qu'en dessous du niveau du flui-. de. Envers de teinte paille.
Cellulose de croissance.
Malate de Ca. Mycélium aérien blanc modéré. Croissance modérée dans le milieu. Pas de pigment soluble. Envers non coloré.
Hydrates de carbone Réaction alcaline;pas de dégagement de gaz à partir d'adonitol, arabinose, cello- biose, dextrine, dextrose, galactose, lac- tose, lévulose, maltose, mannitrol, manno- se, raffinose, rhamnose, salicine, sucrose et xylose.
La description donnée ci-dessus du microorganisme producteur de notobiocine est donnée à titre d'illustration de souches appropriées de Streptomyces sphéroïdes, qui peuvent être utilisées pour la production de novobiocine, mais il va de soi que la présente invention ne doit pas être limitée à des microorganismes répondant à cette description particulière. a présente invention englobe également l'utilisation d'au. tres espéces de Streptomyces sphéroïdes, qui constituent des
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mutantes des organismes dcrit,:3 t;JJ-1<;1; [,,)1- G(-1.1..:::':
obtenues par sélection naturelle ou celles produltM à l' ai.r]0 d'aoûts de mutation, notamment par irradiation aux rayons x, irra-
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diation aux rayons ultra-violets, Moutarde azote,es et analogue s.
Sur la base du fait crue le 01:reyco32!?!i.S:E2!des est un saprophyte et est psychrophile à ucsozoh:i.7.ey tout en ne produisant pas de pigt3etzt soluble dans un quelconque milieu organique autre qu'un milieu spécial présentant une forte concentration en pyrosine, et sur la base du fait que le mycélium aérien est abondant,blanc ou incolore, l'espè-
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ce la plus apparentée décrite dans le 'tBergeyi Anual of Determinative Bacteriologyfl ( 6ième. édition) est le Streptomyces albus .
Des descriptions plus récentes de cultures pro-
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che, qui ont apparu depuis la publication du rnaiiuel de Bergey comportent celles des Streptomyces globisporus, Streptomyces farinosus, Streptomyces longisporus, et Streptomyces atiiiulatus, qui sont décrites dans l'ouvrage IfActinomycetes and Their Antibiotiestl par ûdaksman et Lechevalier.
Le Streptomyces shr oides peut être distingué du Streptomyces et du Str es farinosus par le fait qu'il produit des conidies en spirale serrées, tandis que les deux espèces mentionnées en dernier lieu ne produisent pas de spirales. La formation de spirales ou 1'absence d'une telle formation constitue une caractéristique distinc-
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tive critique parmi les espèces de St2e tom ces , Le Stre toni ces s herodes peut être distingué du Steptonyces lougisporus par le fait qu'il ne donne pas les spores cylindriques à extrémités vives qui caractéri-
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sent le Streptomyces lonsisporus.
Le Streptomyces sphéroïdes peut être distingué du
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Streptomyces aunulatus par le fait qu'il ne produit pas les anneaux de croissance concentriques du Streptomyces annulatus.
Le Strepomyces sphéroïdes diffère du Streptomyce albus par deux caractéristiques physiologiques. Le Strepto- myces albus donne une réduction du nitrate en nitrite, tan- .dis que des nitrites sont à peina détectables après croissan- ce du Streptomyces spheroïdes. Les caractéristioque de crois- sance des deux cultures diffèrent également appréciablement, lors de la croissance sur coins de pommes de terre.
Mais un
Phénomène plus important est la production par le Strepton- ces sphéroïdes de conidies en spirales serrées, qui sont fréquemment enroulées de manière tellement serrée qu'elles paraissent former des sphères fermées de spores amoncelés,,
Cette caractéristique peut . ce point être reproduite dans., des cultures successives de Streptomyces spheroïdes et est à ce point remarquable qu'elle distingue nettement la.culture de n'importe laquelle des nombreuses cultures de Steptomyces albus examinées .
La novobiocine réagit comme un composé organique acide et est aisément soluble dans des solutions alcalines, telles que des solutions aqueuses d'hydroxydes.carbonates et bicarbonates de métaux alcalins, de même que dans le méthanol, l'éthanol, le butanol normal, le butanol secondaire, l'acéta- te d'éthyle, l'acide acétique, le dioxane, l'acétone et la méthyléthylcétone. Elle est insoluble ou faiblement soluble dans l'éther, le benzène, le chloroforme, le tétrachlorure de carone, le dichlorue d'éthylène, l'eau et l'acide chlorhydrique. La novobiocine peut être précipitée de solutions alcalines par acidification.
La novobiocine a été obtenue sous deux formes cristallines par les procédés décrits ci-après. Une forme cristal-
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Une de novobiociuc, qui apparatt sous la forme de rosettes, a un point de fusion d'environ 152-154 C; une autre forme cristalline, qui apparatt sous forme d'aiguilles plates,
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fond à environ 17U-Z?2 0. Ces formes sont quelquefois produites ensemble et peuvent être séparées mécaniquement.
La novobioeine est cpt, znr,tnt ac,;ive ; elle a un 25 pouvoir rotatoire Ld.J D = -27" (C = 1 dans N 10Il lIt) et 25
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-7o = -4.. (C = 1 dans pyridine).
Une solution de novobiocine dans de l'hydroxyde de sodium 0,1N présente une absorption ci'ultra-violet caracté-
1%
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ristique avec une pointe à environ 3U7 mu (El cm 600 );0 Une solution de novobiocine dans une solution méthanolique d'aci- de chlorhydrique 1N présente également une absorption d'ultra- violet caractéristique avec une pointe à environ 324 mu (E1% 390). Une solution de novobiocine dans un phosphate tampon
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lem Une < novobiocine dans un phosphate tampon à pH 7 présente un maximum principal dans le spectre d'absorp- 1% tion dtultra-violet à 304 mu,(E1% 350).
Le spectre d'absorption d'infra-rouge d'un échan- tillon sensiblement pur d'une forme amorphe ou submicrocris- talline de novobiocine en suspension dans une huile minérale (Nujol) a été pris sur un spectrophotomètre d'infra-rouge modèle 12B de Baird Associâtes, en utilisant un prisme de chlorure de sodium. Ce spectre révèle un certain nombre de pointes caractéristiques, dont les plus signifiacatves se pré- sentent aux longueurs d'ondes suivantes exprimées en microns: Il 1.8-6,0 (large), 6,10, 6,21 6,49, 6,63,7,4-7,6 (large épaule-
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ment), 7,70, 7,96, 8,27 (faible), 8,60(épaulement}, 8,7 (épau- lement), 9,13, 9,40, 10,0-10,1 (large), 10,28, 10,60 (large), 12,0-12,30 (large), 12,60-12,75 (large),13,07 et 13,39 .
Le spectre infra-rouge est illustré à la figure 1 des dessins ciannexés, où l'on a porté en absicsse les longeurs d'ondes en microns et en ordonnée le pourcentage de transmittance. L'é-
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chantillon de novobiocine ainorphe ou submicrocristallinc uti- lisé pour déterminer ce spectre a été préparé à partir d'un échantillon de novobiocine cristalline par le procède de nor- malisation suivant.
A une solution'de 1 g de novobiocine cristalline
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-dams 100 cc d-lacétoile, on a ajouté rapidement un litre dotéther de pétrole. De la .novobiocine amorphe s'est alors sépa- rée de la solution* Le produit précipité a été recueilli par filtration, lavé à l'éther de pétrole .et finalement séché à 100 C sous pression réduite.
Des échantillons de novobiocine sensiblement pure, normalisés selon le mode opératoire décrit ci-avant, présentent le spectre d'absorption d'infra-rouge représenté à la figure 1. Les figures 2 et 3 des dessins ci-annexés (dont les abscisses et les ordonnées sont les mêmes qu'à la figure 1) montrent le spectre infra-rouge des formes cristallisées en aiguilles (figure 2) et en rosettes (figure) de la novobiocineo Bien que les diverses formes cristallines de novobiocine produisent des spectres d'absorption différents, c comme montré aux figures 2 et 3, lorsque ces formes sont "normalisées" de la manière décrite plus haut,
les produits ainor- phes et submicrocristallins auront le spectre d'absorption montré à la figure 1.
La novobiocine contient les éléments suivants:carbone, hydrogène, azote et oxygène. La teneur en chacun de ces éléments d'un échantillon de novobiocine cristalline est la suivante:
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Carbone r: ..1F. 6 J, 26 )1 Hydrogène ,; , 5 à , 6 1.3 ; .117 ofi i; 4, é;6 J OXYf.;811C 29,3 ;,
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Selon les données microanalytiques, la- formule - empirique de la novobiocine est dans les limites indiquées par la formule suivante: C30-32H34-42N2O10-12
La novobiocine est ,une substance acide, qui forme des sels par réaction avec des bases. Ainsi, en faisant réagir de la novobiocine avec un équivalent d'hydroxyde de sodium on obtient le sel monosodique de novobiocine. Par réaction avec deux équivalents d'hydroxyde de sodium, on obtient le sel disodique de novobiocine.
De même, en faisant réagir de la novobiocine avec d'autres bases inorganiques, les sels mé- tall,iques correspondants peuvent être obtenus. Lorsqu'on fait réagir la novobiocine avec une base organique, telle qu'une amine, les sels aminés correspondants sont obtenus. Ainsi, en faisant réagir de la novobiocine avec de la méthylamine on obtient le sel méthylaminique de novobiocine:
La nature acide de la novobiocine est également une caractéristique distinctive de ce nouvel antibiotique.
Lorsqu'un échantillon de novobiocine est titré à l'aide d'hy- droxyde de sodium, deux groupes de liaison basiques sont ob- servés . La première liaison pour la formation du sel monoso-. dique se présente à un pH d'environ 7, 0 et a un pK d'environ 3,8. La seconde liaison se présente à un pH d'environ Il,0 et a un pK d'environ 9,4 La titration potentiométrique dans un mélange d'eau et d'acétone (3:4) a révélé deux groupes fonctionnels acides, pH1 1/2 d'environ 4,7 poids équivalent 653 et pH2 1/2 d'environ 10 ,poids équivalent :660- 680. La détermination des groupes acides par le procédé d'ab- sorption ultra-violet a donné es valeurs de pH 1/2 de 3,8 et pH2 1/2 de 9,4 .
Une détermination ébullioscopique du poids moléculaire de la novobiocine dans un azéotrope isopropanoleau a donné une valeur de 5921 25 .
Lanovobiocine possède une activité microbiologique d'environ 5000 unités par mg, cette activité étant
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mesurée par lesprocédés courants de diffusion en cuvette et
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plaque, en utilisant du l3aci.:l.u: mCf athr:ium 1ì'cc ')±3<.;5 et une l'orme sensiblement pure de cathomycino comme étalon .
La novobiocine inhibe principalement les microor- ganismes à gram positif, bien qu'elle présente également une
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certaine activité vis-à-vis de microorganismos à gram n4iàtii; Parmi les organismes, dont la croissance est inhibée par des
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concentrations très faibles de l101nbiocine ou de ses sels, on peut mentionner les suivants: M. EY.
J3e var. albus, pyogenes var. aureus, Stre tococcus rfeRes i'roteus vulgaris, Pasteurella multocide, Xeino hilus rer1?us, Pasteurella avicida, Diplococcus,pl1eumoniae, Corynebacteriuf.1 di phtheriae type intermedius, Corynebacteriam diphtheriae type mitis, CorYl1ebacterium xerose, Coryuebacterium renale, Neisseria menin 1.tidis, Sarcina lutea ("VIJ) , . poezzes var. aureus résistant à l'auréomycine, Lie 12y2.Peties var. aureus résistant à la streptomycine-streptothricine et M. I2yogenes var. aureus résistant à la pénicilline .
Ainsi, on a constaté que le sel sodique de novobio- cine, soumis à l'essai de dilution 'par étalement sur agar ou gélose, inhibe la croissance de diverses souches de M. pyogè-
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nes varo aureus, lvi, pZ2,Ueiies var. albus, Neisseria meningitidis (n 274), et Sarcine lutea (VD)à des concentrations infé- rieures à 0,5 mcg/cc. D'autres microorganismes sont également affectés par la novobiocine ou ses sels à des degrés divers.
La novobiocine est bien tolérée par les souris les rats et les chiens après administration unique ou répétée par la voie buccale. Chez la souris, la dose léthale LD50 est
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d'environ 2,U 9/ka- Aucun signe de toxicité le s'est manifes- tée chez des rats ou des chiens auxquels on a administré 0,2
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g de novobiocine par kg journellement pendant 90 à 140 jours.
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La tlovohico:.l.rrt< <::.1, i>1 <liiii,<; Ii' la i'x'v'tfr'1'ï tion de milieux aqueux :1)rt'U;)t ¯L::>>y d ii:; 1"::; crJ!lfJi1lQw décrites ci-après, nar dû:) souches de :)tl:Pt?..:sz...2."::!.. :!..':.:!'ô)'i>Jr;.:2.1)G3 milieux aqueux, tel:; nue ceux utilisas pour la production d'autres antibiotique}; convienaent pour la production de novobiocine. Ces milieux contiennent des source do carbone et d'azote assimilables par les mic.coorgi.tuic1W;;:J, aiuGÍ que des sels inorganiques. En outre, les milieux de :f8rI10ntia.tion contiennent des traces de métaux nécessaires r)our la crois-
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sance des microorganismes, qui sont ordinairehient orients dans les sources complexes de carbone et d'azote du milieu.
En général, des hydrates de carbone, tels que des sucres, cornme la dextrose, la sucrose, le maltose, le lactose, la dextrine et analogues, ainsi que les amidons constituent des sources appropriées de carbone assimilable dans les mi- lieux nutritifs. La quantité exacte de source de carbone, qui est utilisée dans le milieu, dépendra, en partie, des autres ingrédients du milieu, mais on constate ordinairement qu'une quantité d'hydrate de carbone comprise entre 1 et 6% environ en poids du milieu est satisfaisante. Ces sources de carbone peuvent être utilisées individuellement ou bien plusieurs sources de carbone de ce genre peuvent être combinées dans le milieu.
Diverses sources d'azote, telles que des hydroly-
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sats caséiniques, des produits de digestion papaiques,4.e fari- 'ne de graines de soja, de la farine de cacahéte, de la farine d'arachides, des solubles de distillateurs, des liqueurs de macération de mais, du nitrate de sodium, du. chlorure d'am-
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monium, du sulfate darruIOtl3ur.r et analogues, sont aisément as< Niables par le B spheroïdes et peuvent être utili- sés dans les milieux de fermentation pour la production du nouvel antibiotique.
En général, on constate que les sources
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organiques d'azote, en particulier la farine de graines de soja et les solubles de distillateur,sont très satisfaisan-
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tes pour la production de iiovoblociiio- Les diverses sources organiques et inorganiques d'azote peuvent être utilisées seules ou en combinaison en quantité allant de 0,2 à 6% du poids du milieu aqueux.
On a également constats que l'addition de chlorure de sodium à un milieu contenant des sources appropriées
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de carbone et diazote en une quaiil,lt;;3 comprise entre 0, l et 1% est souhaitable pour la production du nouvel antibiotique. En général, on constate qu'une quantité de chlorure de sodium correspondant à environ 0,25% en poids du milieu nutritif est
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des plus satisfaissante .
Les exemples suivants illustrent quelques milieux convenant pour la croissance de Streptomyces s plie roi de et
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pourrv la production de novobiocine..
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<tb>
<tb> farine <SEP> de <SEP> graines <SEP> de <SEP> soja <SEP> 2 <SEP> %
<tb> Milieu <SEP> n 1 <SEP> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium
<tb>
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dextrose 1-3 %
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<tb>
<tb> ( <SEP> solubles <SEP> de <SEP> distillateur <SEP> 0,75%
<tb>
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Milieu ii 2 ( ? liCJue ur de macération de mais 2-6 ctc:
x,.w,me. 2-y%i Milieu 11 ] solubles de distillateur 3-6 j3 dextrose 1-6 %o
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<tb>
<tb> Milieu <SEP> n <SEP> 4 <SEP> solubles <SEP> de <SEP> distillateur <SEP> 3-6 <SEP> %
<tb>
La fermentation à l'aide du microorganisme producteur de novobiocine peut être exécutée à des températures comprises entre environ 20 et 37 C.
Pour obtenir des résultats optima, on a constaté qu'il est avantageux d'exécuter
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ces fermentations à des températures de 21+-â8 Ù Le pis des milieux nutritifs convenant pour la croissance du Streptomy- ces s heroides et pour la production de 1'antibiotique peut
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varier de 5,5 à 9,0 environ-,
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Bien que la 110vobiocinc puisse ÚLr(,3 J,'()duLt'1 ;)1)1' culture en surface, de iticiïïo qu'eu culture ii;;.<;r=rjj4e , j)rr"fère actuellement exécuter la fermentation z. l'étab i:u..c.#r.
Des fermentations à petite échelle sont aVauij3.rGUS8rrHlt ex4- cutées en plaçant des quantités appropriées de milieu nutri- tif dans des flacons, en stérilisant les flacons et leur con- tenu par chauffage à 120 C, en inoculant le flacon soit à l'aide de spores soit à l'aide d'une culture cellulaire végé-
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tative d'une souche productrice de novobiocine de Streptomy- ces sphéroïdes, en bouchant les flacons à l'aide d'un tampon de coton et en permettant à la fermentation de s'opérer dans Un local dont la température est maintenue à environ 25 C, cette fermentation étant effectuée sur un agitateur pendant deux à sept jours. Lorsou'il s'agit d'opérer à plus grand..
échelle, il est préférable de conduire la fermentation dans des réservoirs appropriés munis d'un agitateur et d'un dispositif pour aérer le milieu de fermentation. Dans ce procédé, le milieu nutritif est formé dans le réservoir et stérilisé par chauffage à 120 pendant une durée appropriée . Après re- froidissement, le milieu stérilisé est inoculé à l'aide d'une source appropriée de culture cellulaire végétative d'une sou-
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che productrice de novobiocine de Streptomyces spheroIdes et la fermentation est admise à s'obérer pendant deux à sept jours, tout en agitant et/ou aérant le milieu nutritif et en maintenant la température à 24-27 C.
Ce procédé de production
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de novobiocine convient particuli'3reil[ellt pour la prédation de grandes quantités de ce nouvel antibiotique.
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Pour la production de novobiocine à l'état immergé, utze petite quantité d'un agent alltl-iÎious5e approprié, tel que l'huile de graines de soja, l'huile de ricin, l'huile de lard, l'octadécatzol en solution là. 1/,, dans de l'huile morale, ou une oxazoline substituée vendue sous la dénomination " Alka-
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terse C " par la Commercial Solvants Corporation, ainsl que d'agents anti-mousse analogues, peut être ajoutéeau bouillon de fermentatin, pour empêcher un moussage excessif pendit la fermentation '
Les exemples suivants illustrent des procèdes de fermentation utilisables pour la production de novobiocine.
EXEMPLE 1.-
Un milieu contenant 2% de farine de grains de soja, 1% de dextrose, 0,25% de chlorure de sodium et 0,75% de solubles de distillateur a été préparé dans de l'eau de robinet. Environ 25 cc du milieu ainsi préparé ont été placés dans un flacon d'une capacité de 75 cc et stérilisés par chauffage à 120 C pendant 20 minutes. Le milieu stérilisé a ensuite été inoculé à l'aide d'une culture végétative de Streptomyces sphéroïdes MA-319 (NRRL 2449) et le flacon a été bouché à l'aide d'un tampon de coton. Le flacon a ensuite été maintenu sur une machine à agiter animée d'un mouvement d'une amplitude de1-1/2 pouces à 28 C pendant 6 jours.
Au bout de cette période de fermentation , le bouillon fermenté a été analysé par le procédé cylindre-plaque, en utilisant du Bacillus megatherium ATCC 9885 comme microorganisme d'essai et on a constaté que ce bouillon avait une activité de 600 u- nités par ce, ce qui correspond à 30 mcg/cc de novobiocine.
En exécutant une autre fermentation, de la manière décrite ci-dessus, mais avec un milieu contenant 2% de farine de graines de soja , 3% de dextrose, 0,25% de chlorure de sodium et 0,75% de solubles de distillateur, le bouillon fer- menté obtenu contenait 256 mcg par cc de novobiocine.
'Il suivant le mode opératoire de l'exemple 1, mais en portant la durée de fermentation à 7 jours, trois milieux contenant (1) 4% de solubles de distillateur et 5% de dextro- se, (2) 2% de liqueur de macération de mais, 5% do solubles
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de distillateur et 5;., de dextrose, et (. ,/ de seigle t;¯o?zlus 5; de solubles de distillateur et. .J;.) de dextrose oni Pl'0clUit respectivement 511 1CLC;rf CCs '/zu me !ce et 740 "ce de novobiocine.
Lsim'slillti . 2.La production de plus grandes quantitcs de novobiociiie par fermentation iLlJ1lcrgée dans den réservoirs aoorcpriés est avantageusement, exécutée cOJ,J!I1G suit : bn flacon de 7¯ake contenant 2 cc d'un ,.tilieu a- queux stérile à base d'agar contenant :
1% extrait de levure
1% dextrose
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>12%Q lJ a2HPO 4Q U?57> uPO 4 , U5> ,JO 4. 7=., 2% agar
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dissous dans - l'eau e cc ilxoculë à l'aide d'une cuiller de terre provenant d'une culture en terre de ;:3tretomye. s¯¯rro- !des MA 31';;1 (NRR1 2449) et incube à 20 C pendant if- à- .;....rs jusuq'à obtention d'une bonne sporulation.
20 cc d'eau stérile ont ensuite été introduits dans le flacon de blake et les spores ont été mises en supension par trituration, aviron .5 cc de la suspension de spores
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résultante ont été introduits dans un f2ncomt lrletzrtteyer d'une capacité de 2 litres contenant 750 cc d'un milieu aqueux stérile de composition suivante :
0,3% extrait de boeuf
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l,0hydrolysat.casélnique (HZ atuine),
10% dextrose, 0,5% chlorure de sodium
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-.1-Yallf, un pH d'environ 7,po Le flacon a ensuite été bouché avec un tampon de conton et incubé à 26 C sur un $agitateur ro-
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tatif pendant 48 heures.
La culture végétafive ainsi préparée a été intro- duite dans un appareil de fermentation en.acier inoxydable d t une capacité de 50 galons,contenant environ 25 à 30 gallons d'un milieu stérile à base d'extrait de boeuf présentant la composition décrite ci-avant. Après addition d'une, petite quantité d'une solution à 1% d'octadécanol dans de l'huile minérale, à titre d'agent antimousse, le milieu a été incubé à 26 C pendant 48 heures. Pendant cette période d'incubation, a le milieu a été agité et on yfait passer de l'air stérile à raison d'environ 3 pieds cubiques par minute.
Un appareil de fermentation en acier inoxydable d'une capacité de 200 galons a ensuite été chargé d'environ 100 calons d'un milieu aqueux contenant les ingrédients sui- vants :
3% de farine de graines de soja (Staley 48-50)
2% de dextrose
0,75% de solubles de distillateur
0,25% de chlorure de sodium Ce milieu @ un pH d'environ 7,1. Après stérilisation du milieu à l'aide de vapeur à environ 120 C pendant 30 minutes, et refroidissement, on a inocule l'appareil de fermentation avec environ 8,4% de l'inoculum végétatif préparé dans l'appa- reil de fermentation de 50 galons spécifié plus haut.
La char- ge a ensuite été incubée à 20 C, tout en l'agitant et en fai- sant passer de l'air à un débit de 12 pieds cubiques par mi- nute. Après 96 heures, le bouillon fermenté contenant de la novobiocine avait une activité d'environ 82 mcg par cc.
La concentration du nouvel antibiotique dans les milisux de fermentation décrits plus haut est ordinairement comprise entre environ 30 et 400 meg par ce et les matières solides contenues dans les bouillons de fermentation ont or-
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dinairement une activitc de l'oraru du 1 à 2 rnG, j>[1t r,1,,F '1 à 2>'±tiGre solide. Les ::;ub:;I,.mc..:3 activée P'.;;lllfO;1,I, Ei,i.3 ui'1(l.s:S <jeu récupérées so>as urne foD.t pllt:.> 1)111") par un Ctt"i,.tl::l L1J.I1J1': de modes opératoires. Un de ces modes opératoires consiste à extraire les substances antibiotiques du milieu de fermentation alcalin, à l'aide de butanol ilorrial ou de butanol ;;,ac.Jnù"ilr,;.
D'autres procèdes de purlri,;t.l#l, qui ':>'),1ij d';crÍt..3 en ù",?;,*11 / dans la demande de bravot 1>ilg<1 n .3ü. i' ddpowêe le 16 avril 1956, peuvent être utilisés pour obtenir de la novobiocine sous forme cristallisée, Ainsi, l'antibiotique à l'état brut peut
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être purifié dans une fort,: ftipsurF3 par r.pr :cipit;ation , partir de solutions alcalines à l'aide d'acides et chromatographie sur alumine, ainsi que par adsorption sur des résines échaneuses
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d'ions appropriées, ces procédés pour. 8tre utilisés en combi: naison.
Un procédé pour la préparation de novobiocine sous forme cristalline peut être exécuté suit
Après filtration de tout le bouillon à pH 9,0,on a ajoue té 5 livres d'un adjuvant de filtration, constitué par une terre à diatomées (Hyfla Supercel), par 100 gallons de bouillon filtré. Le bouillon a été acidifié lentement à pH 2,0 à l'aide d'acide chlorhydrique.
Après agitation pendant 10 minutes, on a filtré et on a lavé le gâteau de filtration à l'aide d'eau. Aucune activité détectable n'était présente dans le filtrat acide. La pureté des matières solides précipitées, à l'exclusion de l'adjuvant de filtration, était d'environ 0,2-0,3%.
Le gâteau de filtration provenant de la précipitation en milieu acide a été extrait à deux reprises avec du méthanol aqueux à 85% à un pH de 9,0, en utilisant un volume de méthanol
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correspondant à un dixième du volume du bouillon originèl pour chaque extraction. La récupération globale obt.mll'3 p::# C\3tt.8 eàtrCi,iOn été 'l"VLF tl #, par rappUI'I.;. au total de produit bioloe;iqu:Hllont actif présent dans le bouillon, La pureté des matières solides en solution était de 1...1 , 5 # La solution méthanolique aqU(J11S(} a 6t4 concr
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jusqu'à obtenir une solution aqueuse d'un volume correspon- dant sensiblement à un dixième du volume de la solution mé- thanolique de départ.
LE! pH a été ajuste à 9,0 à l'aide de soude caustique et la solution a été extraite à deux repriser à l'aide de volumes équivalents de n-butanol. Le coefficient de répartition apparent à pH 9,0 est d'environ 40:1 ..La pu- reté des matières solides dans l'extrait butanolique était de 4 à 6%.
L'extrait butanolique a été concentré jusqu'à un dixième de son.volume de départ et l'extrait concentré-a été ajouté à 15 volumes d'eau à pH 9,0. On a ajouté ensuite un adjuvant. de filtration (Hyflo Supercel) (à raison d'environ 0,5 gr@par gallon sur la base du volume de bouillon originel) et on a:lentament ajusté le pH à 2,0 par addition d'acide chlorhydrique. La-totalité du produit biologiquement actif s'est précipitée sur l'a@juvant de filtration et a été séparée par filtration. La pureté des matières solides, à l'exclusion de l'adjuvant de filtration, était d'environ 10-12%.
Le gâteau filtré a été séché sous vide à 40 C, malaxé et trituré avec de l' éther de pétrole (environ 180- 400 cc pour les matières solides dérivées de chaque gallon de bouillon de fermentation) jusqutà ce que le filtrat soit incolore. Grâce à cette opération, 20 à 25% des matières solides présentes ont été éliminées, tandis qu'ont également été séparés les produits de fermentation huileux inactifs subsistant après le traitement précédent. Licite trituration n'a donné lieu à aucune perte de produit actif et la pureté des matières solides restantes s'est avérée être de 12 à
Le gâteau a alors été extrait au moyen d'éthanol anhydre, jusqu'à ce que les extraits éthanoliques soient colorés en jaune très pâle.
Ces extraits ont alors été combinés et concentrés jusqu'à obtention d'une solution titrant 15 à
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20/ de, têtières solides oou""enallt. environ 4-j. OUO iticg T)r# ec. Cette .têtière solide ave4U une pureté de ZIJ à 30'01 et titrait 20U à 3SU mag par ing de produit biol.o2;1<ju(;1!wnt actif.
La solution ..méthanoJ.i.que coucc:utr(;e a été chromatoùraph,e sur de l'aluiiiiiie lav4-,e à l'acide . Un rapport de 50:1 ente l'alumine et la quanti.té totale de matières soli- des présentes dans la solution de départ doit être utilisé afin d'obtenir une purifications satisfaisante. La matière active a traversé la colonne, tandis qu'une grande quantité de la matière solide étrangère en présence est restée sur la colonne. La colonne d'alumine a ensuite été éluée à l'aide
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d'éthanol pour récupérer la. novobiocine.
Dans les 2,5-3 vo- lumes de vide de la colonne, on a retrouvé environ 95 de
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substance biologiquement active. l'Bl,tU I. -
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<tb>
<tb> Volume <SEP> Essai <SEP> biologi- <SEP> mg/cc <SEP> mcg/mg <SEP> Unités <SEP> totales
<tb>
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(cc) que {mcg/cc} Colon.départ 1000 44.000 265 166 220 x 1(îb Fraction I (x) 1000 2 2e5 37 ,46 x 106 il II 1000 8./.-OO 19,6 428 . x 106
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<tb>
<tb> " <SEP> III <SEP> 1000 <SEP> 15. <SEP> 200 <SEP> 31,3 <SEP> 484 <SEP> 76 <SEP> x <SEP> 106
<tb>
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If IV 1000 12.400 22,3 556 62 x 106 :
q V 1000 7.4uO 13,4 552 37 x 106 If VI 1000 2.600 1, 5 604 13 x 106 If VII 1000 )00 1 3 690 lt-,5 x 106 ioyeniie des 7000 0.700 l3y2 504
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<tb>
<tb> fractions
<tb>
Volume d'alumine = 8.000 cc Volume de vide de colonne = 2.600 cc (Ó) (1ère couleur)
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L'éluat méthanolique proveiiaiit de la colonne d'alun mine a été concentré jusqu'à 5% environ de matières solides
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On a ensuite ajoute de l'eau jusqu'a apparition d'un trouble, ce qui a nécessite un peu plus d'un volume égal d'eau, et on a laissé l'antibiotique se cristalliser. la cristallisation s'est opérée très lentement.
Apres cinq jours, il restait en- core dans les liqueurs surnageantes jusqu'à 15% de la quantité originelle de. substance active. Une agitation et/ou une va- riation de température n'ont eu que peu d'effet sur la vites- se de cristallisation. La novobiocine cristallisée titrait environ 500 à 600 mcg par mg.
Cette matière cristalline a été dissoute dans de ' l'acétone anhydre jusqu'à obtention d'une solution à 30%.
Cette solution a été traitée avec une quantité de Darco G-60 égale à deux fois le poids de la matière cristalline dissoute.
Le Darco a été séparé par filtration, après quoi on a lave à plusieurs reprises à l'acétone, jusqu'à obtenir une solutior diluée titrant environ 5% de matière soluble. Ou a alors ajou- té de l'éther de pétrole jusqu'à apparition d'un trouble et on a laissé la novobiocine se cristalliser. On a ainsi récupé- ré 90 à 95% de l'activité biologique et la. novobiocine cris- tallisée ainsi obtenue titrait 900-1000 meg/mg.
Des sels de novobiocine sont aisément obtenus par réaction de novobiocine avec des bases. Les exemples suivants illustrent la préparation de quelques sels.
EXEMPLE 3. -
Sel monosodique de novobiocine.-
Environ 40 grammes de novobiocine ont été dissous dans 800 cc d'acétate d'éthyle à environ 80 C. Après refroi- dissement de la solution jusqu'à environ 25 C, une solution de 3,43 gr de méthoxyde de sodium dans 34 cc de méthanol a été ajoutée en l'espace de 20 à 30 minutes. Le sel monosodi- que de novobiocine précipité a été. récupéra par filtration et
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lavé avec environ 2UU cc d'acétate citfairf.L. s oro..uit filtré a ensuite été sèche à /()Ou pondant Li lIE: ures -ous pression réduite, puis finalement à 55 C pendant 24 heures sous pres- sion réduite.
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Le sel monosodique de novobiocine ainsi obtenu a été préparé sous forme cristallisée par ú1s::;0lutlon ue 1 er dans 3 cc de méthanol, par dilution de la solution claire ob-
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tellue,at, moyen de 50 cc d'acétone jusqu'à obtenir une solu- tion trouble, par ensemencement de la solution trouble à liai¯ de de quelques cristaux de novobiocine sodique, et par agita- tion de la solution à température ambiante pendant 4 heures environ ou jusqu'à cristallisation complète du sel sodicue.
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Les cristaux précipités de novobiocine i.razzoàodique ont été lavés à l'acétone et séchés sous presion réduite.
EXEMPLE 4. -
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Sel spiramycijlc -ovobiocine. ¯ A une solution de15gr du sel monosodioue de novobi- ocine dans 50 cc d'eau, on a ajouté, en agitant, une solution de 4,5 gr de sulfate de spiramycine dans 40 cc d'eau
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ajustée à un pli de 7. Le sel spiral!lycine-novobiocine, qui s'est formé, a précipité et a été séparé par filtration et séché sous pression réduite. Le produit solide ainsi obtenu est soluble dans le méthanol, l'acétate d'amyle et l'acétone et est partiellement soluble dans le dichlorure d'éthylène.
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EXEii"Ln 5. Sel Ilé0I;IyCZTIe-IIOVObI.OC1.T12.- A une solution de 5 gr de sulfate de néomycine
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dans 50 cc d'eau) on ajoute, en agitant, 2ju cc d'une solutior 10. de novobiocine dans de Itau à pH 7..l...Je sel néomycinenovobiocine- précipité a été récupéré par filtration et séché sous pression recuite.
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1XLIï.'Li: v . - L;01 diliydrostreptonYcille-novobiocillee- A une solution de 5 gr de sulfate de dihydrostrep- tomycine dans 50 cc d'eau à pH 7, on a ajouté, en agitant, 145 cc d'une solution aqueuse à 10% du sel monosodique de novobiocine. Le sel dihydrostreptomycine-novobiocine précipité sous forme d'une matière solide a été recueilli par filtration et séché sous pression réduite.
EXEMPLE 7. -
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Sel streptomycine-novobiocine.Une solution de 100 gr du sel monosodique de novo- filtrée
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oiocine dans 1 litre d'eau a été filtrée. il la solution ob- ,- tenue, on a ajouté, en agitant, une solution de 40 gr de sul- fate de streptomycine dans 40 ce d'eau additionnée d'hydroxy- de de sodium jusqu'à un pH de 7. Le précipité obtenu a été filtré, lavé à l'eau et séché sous pression réduite. On a obtenu ainsi le sel streptomycine-novobiocine sous forme soli- de.
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' EJ#iPIE 8.-
Sel calcique de novobiocine.-
A une solution de 10 gr du sel monosodique de novobiocine dans 200 cc d'eau, on a ajouté, en agitant, 20 cc d'une solution à 10% de chlorure de calcium ajustée à un pH de 10. La pâte obtenue a été agitée pendant 30 minutes supplémentaires, après quoi le 'précipité a été séparé par filtra.. tion, lavé à l'eau et séché.
4 gr du sel solude de novobiocine ainsi obtenu ont été dissous dans 40 cc de méthanol et la solution obtenue, après addition de 25'ce d'eau, a été agitée jusqu'au lendemain à température ambiante. Le sel calcique cristallisé de novobiocine, qui a précipité, a été recueilli par filtration et séché. Le produit ainsi obtenu contenait 2,6% de cal-
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cium, avait un pold:, G, ; 1.v:,1<>iit de '))./ p:Jr i..itr:Jtlol1 (p}i 1/,;.= 10, [; dans acétollc-{':Jlt [, ;,.v:..!.t ul, iii<iice 7.cam 5z;> 307 mu dans UI1P SOLttLiCZIl t,.¯ (Phydrn;:ydc d( )()rjju,.
Le Se]¯ de Oiulil de li IlOVOt)16C7.I1 Sa {t{: pr':paré de la même IIIGnièrc (lt!' le Gel calciqurJ dww 1'<:;:c,.191e pr(;cédeiit, par r6actioii de chlorure de 1.1<l-zz.:;;iull avec de la no-
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vobiocine sodique.
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En suivant les ruodes op,'-rAtoirc:7 , décrits dans les exemples 4 à 7 et en utilisant utze quantitG D.1;!}ropri(.e urun sel acide de benzyl-trill1éthyll;amI1!oniwH, de qUinine, de procaïne, de guaiiiditie, de noformacine, de li-benzyl"J-Ph611YléthYIamine et de N,N-dibenzyléthylènediamiue, on a obtenu les sels correspondants de llovobiocine.
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Les sels de novobiocine se préparent par
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d'autres procédés. Ainsi, les sels d'auines sont obtenus par réaction de novobiocine avec utie quantité sensiblera6nt équivaletite de l'amine en solution d'acétate drttl;TZe. Le sel a'1lÎué de novobiocine précipité est filtré, lavé à l'acétate d'éthyle et séché. En suivant ce mode opératoire, les sels des amines suivantes de novobiocine ont 4aé préparés ; cyclohexylarnine, quinine, I1¯étlyZpzériditle, triéthylamine, dicyclohexylainitie, éthylène diamine et isobutyl 7niiiie .
Un autre procédé pour la prcnaratio.l de sels de Hovobiocine consiste à faire réagir do la novobiocine avec utle ouantité équimoléculaire d' !'Ule a; line eu solution n6thanolique aqueuse, nuis à évaporer le solvant sous pressiou réduite. AiSiie les sels d'arginine, d'histidine et de lysine ont
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été préparés par ce procédé.
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La novobiocille et ses sols cons'i.Guent des agents al1timicrobiens de valeur. Ils peuvent, par éxceuple, dtre utilisés pour (;liI1Jlner les 1!licrOorgallimncs pathog01l0S des installations ph,3rifiaccutiques et; ünalo;u0s ou pour séparer certains'
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microorganismes de solutions collt,i:lz;ulb <les; i;i±1.i<L>,#ge& ctf. plusieurs lll:LCx'OOl'y111.L:.'TriC:i. De lrl%ltl(.' la novobiocine rt rjes sr;]1,iJ sont utilisablespour le traitement d'nimaux l,l:f;ect.: par rl(;;j 1!licrao.l':>'':\llisllles sensibles à l'action ri U nouvel antibiotique. On a constaté, par exemple, que la novobiocine convient très bien pour le traitement de la mammite des vaches.
Des on-
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guents contenant 20 à 10 irigr de novobiocine sodique par 7,5 gr d'onguent conviennent à cette fin.
La novobiocine et ses sels sont actifs vis-à-vis des staphylocoques résistants à la pénicilline, ainsi que vis-à-vis des streptocoques et pneumocoques, Etant do@ dé que
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ces microoxaanisnies sont la cause de la plupart des infec- tions bactériennes des voies respiratoires, la novobiocine peut être utilisée pour le traitement de ces infections chez
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les êtres humains.
A cettf' fin, le sel sodique de novobioe i ne neut être adriiiii,*Lsirç-', par la voie buccale sous forme de cap- sules contenant, par exemple, environ 100 à 500 mgr de l'antibiotique à une dose journalière de 1 à 2 gr , Ainsi, une
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dose appropriée esb nr/né!rt'ie en incorporant 25U mgr du sel monosodique de novobiocine dans une capsule de gélatine mol- le n 1.
La novobiocine et ses sels peuvent aussi être ad- ministrés sous forme de tablettes. Ces tablettes peuvent être préparées en mélangeant de la novobiocine sodique en poudre à une petite quantité d'une solution à 5% de phtalate hydrogéné d'acétate de cellulose dans un mélange à parties égales de méthanol et d'acétone, en granulant la matière par passage sur un tamis n 8, en séchant les granulés résultants, en faisant passer les granulés sèches sur un tamis n 12 et en comprimant les granulés obtenus avec addition d'une petite quantité de karaté de magnésium de manière à former des
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tablettes contenant 2>U mgr de iiovobiociiie sodirjue.
La novobiocine est (G<.11e: iCut effic.-.ce pour lc troi- tement et la lutte contre.des maladies de plantes. Ainsi, elle peut être utilisée pour lutter contre la nielle des ha-
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ricots ou analogues provoquée par le :.Intho1Jlr)!w.G phaseoli. A cette fin, les plantes sont pulvérises à l'aide d'une solution aqueuse contenant environ l.uu parties par millions du sel sodique de novobiocine. Ces solutions peuvent contenir divers agents de mouillage ou d'étalement et/ou d'autres a- geiits actifs et peuvent être préparées selon les éthodes bien connues dans la technique.
La novobiocine décrite dans le présent mémeoire
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est également connue sous l'appellation de "Catliorrtyci,,ie", une marque de la société demanderesse.
Les unités de novobiocine concernent l'activité
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microbiologique de la iiovobiociiie cristalline seasiblel:Jent cette activité pure;,'"a sté arb'trare1Jlent .fixée à 5. Ùûu unités par mgr. Cet- te activité a été déterminée par les procédés classiques de diffusin en cuvette et en plaques, en utilisant le Bacillus
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megatherium i!.T'l'G 9885 ou, de préférence, le Bacillus subtilis AT1-C 12432, comme microorsanisme d'essai. Avec cette souche de .t3acillus subtilis corrrue rnicroorgazüsnte d'essai on peut adopter le mode opératoire suivant Une culture de Bacillus subttlis AT2C 12.L3e est développée sur des milieu, inclinés dtagar à infusion de coeur et cerveau (Difeo 1.artual, :-e édition, pages 1,10 et <'1) pendant 24 heures à 37 C, puis est erntaaga;iuc:e à 5 C pendant des périodes n'excédant.pas ua mois.
Pour l'obtention de -ores, on prépare un inoculum en ajoutât . 5 ce d'eau distil-
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lc:e stfJrile Q UnE' culture Gur IÜliC'1l i1lC1Lh f.t'tllche de Du.cillus subtiliso J'es ce Iules sont a8cptiguc;Gat cnlevées du
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milieu incline, bien mélappsset transférées dans 50 cc d'eau distillée stérile contoue dans un flacon d'Erlenmeyer.
2 cc de la solution bactérienne sont ajoutes, en qualité d'inculum, à une bouteille de Houx contenant un ,,il- lieu contenant 3% de farine de graines de soja, 0,2% de
NaCl, 0,4% de solubles de distillateur, 0,8% de dextrose et
2,0% d'agar. Après incubation pendant 7 jours à 37 C, la culture bactérienne obtenue est mise en suspension dans 50 cc d'eau distillée stérile et est pasteurisée à 65 C pendant 30 minutes.4 cc d'un milieu dilué à 50 volumes de cette sus- pension de spores sont utiliséspar litre de milieu d'essai con. tenant 0,5% de peptone , 0,3% d'extrait de boeuf, 0,3% d'extrait de : levure et 1,5% d'agar à un pH de 5,9-6,1. Des fractions de 15 cc de milieu ensemencé sont réparties dans des bottes de Petri profondes à fond plat.
Six cylindres en acier inoxydable sont placés sur l'agar ensemencé. Trois cylindres alternés sont remplis d'u- ne solution standard de 4 mcgr de novobiocine par cc (ce qu équivaut à 20 unités de novobiocine par cc) et trois autres cylindres sont remplisà l'aide de la solution inconnue dilué approximativement jusqu'à la même puissance à l'aide de phosphate tampon M/20 à pH de 6,0. Une courbe standard journalière est établie avec de la novobiocine pure diluée à diverses concentrations allant de 2 à 16 g./m1.
Après 18 heures d'incubation à 28 C, les diamètre des zones d'inhibition de la solution inconnue et de la solution standard ont été mesurés sur chaque plaque. L'activi- té ou puissance de la solution inconnue est déterminée à partir d'un nomographe basé sur le degré de réponse aux divel ses concentrations établies d'après la courbe journalière standard.