CH654113A5 - Procedes et reactifs pour la detection simultanee de differents marqueurs de l'hepatite. - Google Patents
Procedes et reactifs pour la detection simultanee de differents marqueurs de l'hepatite. Download PDFInfo
- Publication number
- CH654113A5 CH654113A5 CH4579/80A CH457980A CH654113A5 CH 654113 A5 CH654113 A5 CH 654113A5 CH 4579/80 A CH4579/80 A CH 4579/80A CH 457980 A CH457980 A CH 457980A CH 654113 A5 CH654113 A5 CH 654113A5
- Authority
- CH
- Switzerland
- Prior art keywords
- hepatitis
- solid phase
- directed against
- sample
- coated
- Prior art date
Links
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title claims description 32
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title claims description 32
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 9
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 24
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 20
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 17
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 3
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 3
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 3
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical class OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 208000037319 Hepatitis infectious Diseases 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005976 liver dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5761—Hepatitis B
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Description
La présente invention concerne un procédé pour la détection simultanée dans un échantillon d'au moins deux marqueurs différents prouvant l'exposition au virus de l'hépatite, ainsi que deux réactifs pour la mise en œuvre dudit procédé.
Il existe au moins deux types distincts d'hépatites virales. On considère que l'hépatite A est provoquée par l'antigène de l'hépatite A (HAVAg) et elle est généralement caractérisée par une période d'incubation de 2 à 6 semaines, des prodromes modérés et une atteinte clinique relativement peu importante. La maladie est généralement transmise par des aliments ou des boissons contaminés mais on a également montré qu'elle était transmise par inoculation générale. On appelle souvent l'hépatite A hépatite infectieuse, et aux Etats-Unis d'Amérique le nombre des cas signalés est supérieur à 50 000 par an.
On considère que le virus de l'hépatite B est l'agent étiologique le plus probable de l'hépatite sérique. L'hépatite B est généralement transmise par le sang et ses dérivés ou des instruments contaminés tels que des aiguilles, mais elle peut également être transmise d'une autre façon. On a indiqué autrefois que la période d'incubation de l'hépatite B était comprise entre 6 semaines et 6 mois. Cependant on a confirmé des périodes d'incubation aussi brèves que 2 semaines. La maladie peut être modérée ou asymptomatique mais lorsque des symptômes sont présents ils peuvent être particulièrement graves. Parmi les prodromes figurent les douleurs articulaires, l'arthrite, une éruption transitoire, la fièvre, l'anorexie, la fatigue et le prurit associés ou non à un ictère.
On peut associer au virus de l'hépatite B au moins trois systèmes antigènes-anticorps distincts: le système de surface (HBsAg: anti-HBS), le système de noyau (HBcAg: anti-HBc) et le système e (HBeAg: anti-HB,.). L'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg) est présent dans le sang sous forme de sphères de 22 nm et de tubules allongés de 22 nm de diamètre et de longueur variable et il semble représenter le revêtement protéique du virus de l'hépatite B.
On considère que le virus infectieux (particules de Dane) consiste en une particule de 42 nm contenant de l'ADN et une ADN-polymé-rase. La surface de la particule de Dane est semblable ou identique à l'HBsAg. Dans les détergents, la particule de Dane se dégrade en un noyau à forte densité électronique de 27 nm constituant l'HBcAg. Cet antigène est présent dans les noyaux des hépatocytes des patients atteints d'hépatite sérique pendant le stade d'infection aiguë.
Donc on peut prévoir que les patients atteints d'hépatite virale de type B produisent des anticorps dirigés contre l'antigène de surface (anti-HBs) et également contre le noyau protéique (anti-HBC). L'HBsAg du sérum s'est révélé un marqueur fidèle de la présence du virus de l'hépatite B et l'anti-HBc apparaît généralement lors de la virémie précoce, qui accompagne souvent l'antigénémie (HBsAg), à l'apogée du disfonctionnement hépatique et bien avant l'apparition de l'anti-HBs. L'anti-HBC est généralement associé à la circulation prolongée de l'HBsAg, ce qui suggère que l'anti-HBc est produit en réponse à la réplication active du virus.
En 1972, l'antigène e de l'hépatite (HBeAg) a été détecté et caractérisé. Le marqueur e a été trouvé dans le sérum HBsAg-positif et semble être plus couramment présent dans le sérum de porteurs
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3
654 113
chroniques de l'HBsAg ayant une atteinte hépatique active que chez les porteurs sains. Chez les patients, pendant la période d'incubation de l'hépatite B, l'antigène e apparaît juste après l'apparition de l'HBsAg et avant les manifestations cliniques de l'atteinte hépatique. Logiquement, sa présence dans de tels sérums indiquerait un mauvais pronostic et une altération hépatique en cours d'évolution. Inversement, la présence d'anticorps e (anti-HBe) indiquerait un bon pronostic. Ces corrélations ne sont pas absolues mais peuvent constituer des guides cliniques utiles.
Comme les marqueurs sérologiques de l'hépatite apparaissent dans un ordre déterminé régulier au cours de l'infection, de la période aiguë et de la guérison, l'analyse de deux marqueurs ou plus peut être utile pour évaluer l'évolution de la maladie.
Une détermination de plusieurs marqueurs peut également de façon importante permettre un double contrôle de l'HBsAg chez les donneurs de sang ou les patients et permettre ainsi de réduire la fréquence de l'hépatite B. Cette nécessité a été établie par Goldfield et coll., «Am. J. Med. Sci.», 270, 335-342 (1975) qui, au cours de postobservations minutieuses de receveurs de sang HBsAg négatifs, ont démontré l'exposition à l'antigène de l'hépatite chez 7 patients sur 465. Il est évident qu'un procédé pour détecter plus d'un marqueur du virus de l'hépatite B aurait réduit ou évité ces réactions faussement négatives. De même dans de nombreux cas, une réponse positive dans deux tests réduit au minimum les risques d'une réaction faussement positive dans un test.
Bien que le réactif et le procédé décrits et revendiqués soient semblables aux produits et aux procédés connus du commerce pour la détection de divers marqueurs de l'hépatite virale, on ne connaissait pas avant l'invention de description ou de suggestion concernant des techniques pour détecter simultanément ces marqueurs.
L'invention concerne un procédé et des réactifs pour détecter simultanément dans un échantillon au moins deux marqueurs différents prouvant l'exposition au virus de l'hépatite.
Le procédé consiste à mettre l'échantillon en contact avec une phase solide que l'on a revêtue d'au moins deux composés immunoréagissants non complémentaires, différents, qui sont complémentaires des marqueurs inconnus de l'hépatite, à incuber l'échantillon avec la phase solide revêtue pendant une période de 1 à 24 h, à séparer la phase solide revêtue de l'échantillon, à laver la phase solide revêtue, à mettre la phase solide lavée en contact avec un réactif liquide constitué d'au moins deux composés immunoréagissants différents ou d'au moins deux marqueurs de l'hépatite différents, choisis chacun de façon à réagir ou à entrer en compétition avec un des marqueurs inconnus de l'hépatite et marqués chacun avec des marques pouvant être détectées de façon distincte, à séparer la phase solide du réactif liquide et à déterminer la présence des marqueurs de l'hépatite marqués ou des composés immunoréagissants marqués sur la phase solide par détection de chaque marque distincte.
Les exemples non limitatifs suivants illustrent la préparation et l'emploi du réactif selon l'invention. Le premier exemple décrit le procédé de préparation d'un support solide revêtu de deux composés immunoréagissants non complémentaires différents, qui sont complémentaires de marqueurs prouvant l'exposition au virus de l'hépatite.
Plus particulièrement, on revêt un support solide (perles) de deux composés immunoréagissants différents non complémentaires de telle sorte que ces deux composés conservent leur réactivité et soient capables de se combiner à des marqueurs de l'hépatite complémentaires dans un échantillon inconnu.
Dans le premier exemple, on revêt des perles de polystyrène d'un anticorps dirigé contre l'HBsAg et de l'antigène de noyau HBcAg. L'anticorps conserve son affinité et réagit avec tout HBsAg de l'échantillon inconnu et l'antigène de noyau fixé conserve son antigé-nicité et réagit avec tout anticorps dirigé contre le noyau (anti-HBc) de l'échantillon inconnu. La base de l'invention est que les deux réactions immunologiques s'effectuent simultanément avec un seul réactif en phase solide.
Exemple 1 :
Préparation d'un support revêtu
Pour préparer une composition de HBcAg, on met des particules de Dane en contact avec une solution à 2% de mercapto-2 éthanol (2-ME) et 5% de Tween 80 dans du tampon salé au Tris-EDTA (TSE) à 37° C pendant 2 h. On dilue cette solution au Vio dans du 2-ME à 5% dans le TSE et on laisse reposer pendant une nuit avant de diluer à la concentration finale de Vbooo dans du TSE. Séparé-0 ment, on revêt des perles de polystyrène (6,35 mm) avec une dilution au Vzoao de sérum de cobaye anti-HBs dans du tampon salé phosphaté (PBS) par trempage pendant 2 h. On retire les perles, on les lave et on les sèche. On verse ensuite la préparation de noyau sur les perles revêtues et on laisse l'antigène de noyau adhérer aux perles ls pendant 2 d à la température ordinaire. On retire les perles de la solution tampon, on lave, on revêt d'une solution à 10% de saccharose pour stabiliser les composés adhérents et on sèche à l'air.
Bien que l'on préfère des perles de polystyrène car elles sont faciles à revêtir et à manipuler, on peut utiliser dans la pratique de 20 l'invention tout support solide de dimensions macroscopiques ou microscopiques fait en diverses matières plastiques, en métal ou en verre pouvant être facilement revêtu et utilisé.
Bien que l'on puisse revêtir d'abord les perles de l'antigène de noyau puis les revêtir ensuite de l'anti-HBs, on a constaté que lors-2S qu'on revêt d'abord les perles du sérum de cobaye anti-HBs, l'adhérence de l'antigène de noyau est fortement accrue.
Il est également important de noter que l'on peut également utiliser d'autres combinaisons de composés immunoréagissants non complémentaires relatifs au virus de l'hépatite. Bien entendu les 30 composés immunoréagissants doivent être non complémentaires car une attraction complémentaire réduirait l'antigénicité et l'affinité du réactif.
L'exemple suivant illustre la préparation d'un réactif en phase liquide contenant comme composé immunoréagissant de ranti-HBs, 3J marqué avec un marqueur radioactif (12SI) et un marqueur de l'hépatite, l'anti-HBc, marqué par une enzyme réactive (peroxydase de raifort).
Bien que les termes marqueur de l'hépatite et composé immunoréagissant puissent être utilisés l'un pour l'autre, on préfère utiliser le 40 terme marqueur de l'hépatite pour désigner l'antigène ou l'anticorps et leurs équivalents que l'on désire détecter dans l'échantillon inconnu. On utilise le terme composé immunoréagissant pour désigner l'antigène ou l'anticorps complémentaires des marqueurs de l'hépatite à détecter.
45 Par conséquent, dans les exemples suivants, l'antigène et l'anticorps utilisés sur le support solide sont toujours complémentaires d'un des marqueurs inconnus de l'hépatite et par conséquent on les appelle composés immunoréagissants.
Dans le réactif en phase liquide, l'anticorps de surface marqué 50 est complémentaire du marqueur inconnu de l'hépatite (HBsAg) et on l'appelle donc composé immunoréagissant marqué. Cependant, l'anticorps de noyau marqué est identique au marqueur de l'hépatite à détecter et par conséquent on l'appelle marqueur de l'hépatite marqué.
55
Exemple 2:
Anticorps marqué réactif
Pour ioder par le 12SI l'anticorps dirigé contre l'HBsAg (anti-60 HBS), on introduit dans un flacon de 4 ml environ 0,1 ml de tampon phosphate 0,5M à pH 7,5, un petit volume correspondant à 5-6 mCi de Na12SI, et 100,mg d'anti-Hbs purifié, on ajuste le pH à 7,5-8,0 et on mélange tous les ingrédients. On ajoute à ce mélange 50 p.1 d'une solution fraîchement préparée de chloramine T (35 mg dans 10 ml de 65 tampon phosphate 0,05M à pH 7,5). On mélange à nouveau puis on laisse la réaction s'effectuer à la température ordinaire pendant 60 s. On ajoute à la réaction 50 ni d'une solution fraîchement préparée de métasulfite de sodium (35 mg dans 10 ml de tampon phosphate
654113
0,05M à pH 7,5) pour réduire la chloramine T et arrêter ainsi la réaction.
Pour évaluer le rendement de la réaction, on applique 5 ni du mélange réactionnel à une bande de papier Whatman N° 1 et on Chromatographie le mélange dans du méthanol à 70%. La protéine iodée demeure à l'origine tandis que le 12SI libre migre avec le solvant. On considère que le pourcentage de 125I dans la protéine constitue le pourcentage de rendement de la réaction.
On purifie l'anticorps iodé brut avec une colonne de gel de Se-phadex G-50 et du tampon Tris 0,1M contenant 0,9% de chlorure de sodium à pH 7,8. On traite au préalable la colonne avec un petit volume d'une solution aqueuse à 30% de sérum albumine bovine puis avec un volume additionnel égal de tampon Tris 0,1 M contenant 0,9% de chlorure de sodium à pH 7,8. On place l'anticorps iodé au sommet de la colonne et on lave avec le tampon Tris salé. L'anticorps marqué consitue le premier éluat que l'on recueille en bas de la colonne.
Pour conjuguer l'anticorps dirigé contre le noyau de l'hépatite B à la peroxydase de raifort, on active la peroxydase avec du métaper-iodate de sodium. On sépare l'excès de periodate et les sous-produits de la peroxydase active par filtration sur une colonne de gel de Se-phadex G-25. On fait ensuite réagir la peroxydase activée avec l'anticorps (anti-HBc). La réaction est spontanée. On ajoute ensuite du borohydrure de sodium pour stabiliser la liaison formée entre la peroxydase et l'anticorps et on ajoute de l'acétone pour détruire le borohydrure de sodium résiduel.
Lorsqu'on les utilise selon l'invention, on dilue les deux anticorps marqués dans un diluant ayant la composition suivante:
sérum fœtal de veau 50%
sérum humain normal 15%
EDTA 0,005M Tween-20 0,1%
Thiomersal dans le PBS 0,01 %
Il est évident que l'on peut utiliser diverses marques détectables. La seule condition est naturellement que ces marques puissent être détectées de façon distincte. On peut utiliser divers isotopes tout aussi aisément que le 12SI. Il n'est pas nécessaire qu'un des marqueurs de l'hépatite ou composé immunoréagissant ait un marquage radioactif et que l'autre ait un marquage enzymatique ou fluorescent car des isotopes différents peuvent être détectés de façon distincte. De même, tous les composants marqués du réactif peuvent aussi bien être marqués par des enzymes différents nécessitant des subs-5 trats différents pour former des produits réactionnels pouvant être détectés de façon distincte.
Il convient de noter que l'on pourrait marquer l'un quelconque des anticorps et antigènes de l'hépatite A et B dans la pratique de l'invention. Les seules conditions immunochimiques sont que les 10 composants marqués ne soient pas complémentaires entre eux ou avec les marqueurs de l'hépatite à déterminer.
Exemple 3:
15 Détection simultanée de l'HBsAg et de l'anti-HBc
On introduit des échantillons de sérum contenant les marqueurs inconnus de l'hépatite dans des godets différents d'une plaque de mi-crotitration, on ajoute à chaque échantillon de sérum une perle de polystyrène revêtue comme dans l'exemple 1 et on laisse incuber pendant 2 h à 45° C. On retire les perles des godets, on lave à l'eau pour éliminer tout excès de réactif et on les introduit dans 0,2 ml du réactif en phase liquide préparé comme dans l'exemple 2. On incube la phase solide et la phase liquide pendant 1 h à 45° C. On sépare ensuite la phase solide de l'anticorps réactif et on lave 4 fois avec de 25 l'eau pour éliminer l'excès de réactif. On place les perles lavées dans des tubes à essai contenant 30 mg d'o-phénylènediamine dans 10 ml de tampon citrate 0,1 M à pH 5,5 et on laisse incuber pendant 30 min. Après cette période, on arrête la réaction enzymatique par addition de 1 ml d'acide chlorhydrique 1M et on examine les tubes à 3° l'œil nu pour rechercher la présence ou l'absence d'une coloration due à la réaction de l'enzyme de marquage et du substrat. L'absence de coloration, ou une coloration faible, indique que l'anti-HBc était présent dans l'échantillon inconnu et est entré en compétition avec le marqueur marqué de l'hépatite vis-à-vis des sites réactionnels du 35 support revêtu. Ensuite on compte la radioactivité des perles dans un compteur y et on note la valeur en cpm. La radioactivité des perles indique la présence d'HBsAg dans l'échantillon inconnu qui a adhéré à l'anticorps fixé et formé un site de fixation pour l'anticorps à marquage radioactif.
20
R
Claims (12)
- 654 1132REVENDICATIONS1. Procédé pour la détection simultanée dans un échantillon d'au moins deux marqueurs différents prouvant l'exposition au virus de l'hépatite, caractérisé en ce qu'il consiste à:a) mettre l'échantillon en contact avec une phase solide revêtue d'au moins deux composés immunoréagissants non complémentaires, différents, complémentaires des marqueurs inconnus,b) incuber l'échantillon avec la phase solide revêtue pendant une période de 1 à 24 h,c) séparer la phase solide revêtue de l'échantillon,d) laver la phase solide revêtue pour éliminer l'échantillon non fixé,e) mettre la phase solide lavée en contact avec un réactif liquide constitué d'au moins deux marqueurs différents de l'hépatite ou de deux composés immunoréagissants différents, choisis chacun pour réagir ou entrer en compétition avec un des marqueurs inconnus de l'hépatite et marqués chacun par des marques pouvant être détectées de façon distincte,f) séparer la phase solide du réactif liquide, et g) déterminer la présence des marqueurs de l'hépatite marqués ou des composés immunoréagissants marqués sur la phase solide par détection des marques distinctes.
- 2. Procédé selon la revendication 1 pour la détection simultanée dans un échantillon de l'antigène de surface de l'hépatite B et d'un anticorps dirigé contre l'antigène de noyau de l'hépatite B, caractérisé en ce qu'il consiste à:a) mettre l'échantillon en contact avec une phase solide revêtue d'antigène de noyau de l'hépatite B et d'un anticorps dirigé contre l'antigène de surface de l'hépatite B,b) incuber l'échantillon avec la phase solide revêtue pendant une période de 1 à 24 h,c) séparer la phase solide revêtue de l'échantillon,d) laver la phase solide revêtue pour éliminer l'échantillon non fixé,e) mettre le support solide lavé en contact avec un réactif liquide contenant un anticorps dirigé contre l'antigène de surface de l'hépatite B et un anticorps dirigé contre l'antigène de noyau de l'hépatite B marqués chacun avec des marques pouvant être détectées de façon distincte,f) séparer la phase solide des anticorps réactifs marqués, et g) déterminer la présence des anticorps marqués sur le support solide par détection des marques distinctes.
- 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'anticorps dirigé contre l'antigène de surface a un marquage radioactif et l'anticorps dirigé contre l'antigène de noyau a un marquage enzyma-tique.
- 4. Procédé selon îa revendication 3, caractérisé en ce que la marque radioactive est du 12SI et l'enzyme est la peroxydase de raifort.
- 5. Réactif pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une phase solide revêtue d'au moins deux composés immunoréagissants non complémentaires différents, complémentaires des marqueurs inconnus de l'hépatite.
- 6. Réactif selon la revendication 5, caractérisé en ce que la phase solide est revêtue d'antigène de noyau de l'hépatite B et d'un anticorps dirigé contre l'antigène de surface de l'hépatite B.
- 7. Réactif liquide pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué d'au moins deux marqueurs différents de l'hépatite ou de deux composés immunoréagissants différents choisis chacun de façon à réagir ou à entrer en compétition avec un marqueur inconnu de l'hépatite et marqués chacun avec des marques pouvant être détectées de façon distincte.
- 8. Réactif selon la revendication 7, caractérisé en ce que le réactif contient un anticorps dirigé contre l'antigène de surface de l'hépatite B et un anticorps dirigé contre l'antigène de noyau de l'hépatite B.
- 9. Réactif selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'anticorps dirigé contre l'antigène de surface de l'hépatite B a un marquage radioactif.
- 10. Réactif selon la revendication 9, caractérisé en ce que la marque radioactive est du 125I.
- 11. Réactif selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'anticorps dirigé contre l'antigène de noyau de l'hépatite B est marqué par un enzyme.
- 12. Réactif selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'enzyme de marquage est le peroxydase de raifort.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4831979A | 1979-06-14 | 1979-06-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CH654113A5 true CH654113A5 (fr) | 1986-01-31 |
Family
ID=21953924
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CH4579/80A CH654113A5 (fr) | 1979-06-14 | 1980-06-13 | Procedes et reactifs pour la detection simultanee de differents marqueurs de l'hepatite. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPS562558A (fr) |
| AT (1) | AT368813B (fr) |
| AU (1) | AU530580B2 (fr) |
| BE (1) | BE883824A (fr) |
| CA (1) | CA1148859A (fr) |
| CH (1) | CH654113A5 (fr) |
| DE (1) | DE3021891C2 (fr) |
| FR (1) | FR2459482A1 (fr) |
| GB (1) | GB2051357B (fr) |
| IT (1) | IT1140846B (fr) |
| NL (1) | NL8001661A (fr) |
| ZA (1) | ZA801318B (fr) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0058428B1 (fr) * | 1981-02-18 | 1985-10-09 | Eisai Co., Ltd. | Immuno-essai enzymatique pour la mesure simultanée d'une pluralité d'échantillons et dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé |
| GB2165046B (en) * | 1982-02-10 | 1986-10-15 | Baker Terence S | Ligand molecule |
| IE54109B1 (en) * | 1982-02-10 | 1989-06-21 | Boots Celltech Diagnostics | Assay |
| JPS58187861A (ja) * | 1982-04-26 | 1983-11-02 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 成人型ｔ細胞性白血病関連抗体の測定法 |
| GB2125547B (en) * | 1982-07-31 | 1986-04-23 | Mochida Pharm Co Ltd | Simultaneous immunoassay of two or more substances |
| JPS5984162A (ja) * | 1982-11-05 | 1984-05-15 | Toshiba Corp | 免疫分析法 |
| EP0131974A1 (fr) * | 1983-06-08 | 1985-01-23 | Akzo N.V. | Détermination d'antigènes delta dans les fluides corporels |
| ATE42002T1 (de) * | 1983-09-14 | 1989-04-15 | Akzo Nv | Verfahren zur immunochemischen bestimmung von hepatitis-b-core-antigenen. |
| US4701421A (en) * | 1984-08-27 | 1987-10-20 | Akzo, N.V. | Determination of protecting anti-HBV immunoglobulins |
| GB8607101D0 (en) * | 1986-03-21 | 1986-04-30 | Serono Diagnostics Ltd | Immunoassay |
| NO881239L (no) * | 1987-03-23 | 1988-09-26 | Ortho Pharma Corp | Analyse for detektering av hepatitt-antigener og aids-antistoffer. |
| CA1335880C (fr) * | 1988-07-14 | 1995-06-13 | Thomas P. O'connor | Detection d'anticorps et d'antigenes dans le cadre d'un dosage immunologique |
| EP0438457A1 (fr) * | 1988-10-14 | 1991-07-31 | Syntello Ab | Procede de detection simultanee de differents types d'anticorps et/ou d'antigenes produits par des cellules individuelles |
| DE3919810A1 (de) * | 1989-06-16 | 1990-12-20 | Biochrom Beteiligungs Gmbh & C | Festphasenimmunoassay und testbesteck zur bestimmung von antigenen und antikoerpern |
| AT394114B (de) * | 1989-07-13 | 1992-02-10 | Immuno Ag | Verfahren zur bestimmung von antigenen und/oder antikoerpern in menschlichen koerperfluessigkeiten sowie set zur durchfuehrung des verfahrens |
| EP0473065A3 (en) * | 1990-08-29 | 1992-08-26 | Abbott Laboratories | Simultaneous assay for detecting two or more analytes |
| DE4236189A1 (de) * | 1992-10-27 | 1994-04-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur simultanen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern |
| CA2305192C (fr) * | 1998-07-30 | 2009-10-13 | Advanced Life Science Institute, Inc. | Procede pour la determination de l'hepatite a virus de type c |
| EP1672366A3 (fr) * | 1999-06-11 | 2007-11-28 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Procédés et compositions pour essais d'opsonophagocytose |
| JP4353793B2 (ja) * | 2001-06-26 | 2009-10-28 | アボット・ラボラトリーズ | Ｈｃｖ抗原とｈｃｖ抗体との同時検出のための方法 |
| US7101683B2 (en) | 2001-06-26 | 2006-09-05 | Abbott Laboratories | Methods for the simultaneous detection of HCV antigens and HCV antibodies |
| US7332269B2 (en) | 2001-11-11 | 2008-02-19 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | HCV core protein sequences |
| WO2014176535A1 (fr) | 2013-04-26 | 2014-10-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Essai multiplex de l'hépatite b |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3867517A (en) * | 1971-12-21 | 1975-02-18 | Abbott Lab | Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies |
| GB1506017A (en) * | 1974-03-04 | 1978-04-05 | Int Diagnostic Tech | Fluorometric system and method for the detection of biologically derived substances |
| SE7610683L (sv) * | 1975-09-29 | 1977-06-10 | Cordis Corp | Metod for bestemning av nervaron av ett antigen associerat med hepatit |
| AT343822B (de) * | 1976-08-20 | 1978-06-26 | Immuno Ag | Radioimmunologisches verfahren und einrichtung zur bestimmung von antigenen |
| DE2803154C2 (de) * | 1977-01-27 | 1986-07-24 | Becton, Dickinson and Co., Paramus, N.J. | Gleichzeitige Radiountersuchung von Folat und Vitamin B 12 |
| CA1100037A (fr) * | 1977-03-11 | 1981-04-28 | Chung-Mei Ling | Antigene (anti hb.sub.c) depose sur une substance en phase solide |
| US4102996A (en) * | 1977-04-20 | 1978-07-25 | Merck & Co., Inc. | Method of preparing hepatitis B core antigen |
| US4189464A (en) * | 1978-05-05 | 1980-02-19 | Institute For Cancer Research | Hepatitis B testing reagent and method |
| IL55816A (en) * | 1978-10-30 | 1982-04-30 | Ames Yissum Ltd | Method for simultaneous immunoassay of several different antibodies and a kit therefor |
-
1980
- 1980-02-29 CA CA000346729A patent/CA1148859A/fr not_active Expired
- 1980-03-06 ZA ZA00801318A patent/ZA801318B/xx unknown
- 1980-03-06 AU AU56226/80A patent/AU530580B2/en not_active Ceased
- 1980-03-11 GB GB8008095A patent/GB2051357B/en not_active Expired
- 1980-03-20 NL NL8001661A patent/NL8001661A/nl not_active Application Discontinuation
- 1980-05-07 IT IT21874/80A patent/IT1140846B/it active
- 1980-06-06 JP JP7568180A patent/JPS562558A/ja active Granted
- 1980-06-11 DE DE3021891A patent/DE3021891C2/de not_active Expired
- 1980-06-12 AT AT0309980A patent/AT368813B/de not_active IP Right Cessation
- 1980-06-13 FR FR8013217A patent/FR2459482A1/fr active Granted
- 1980-06-13 BE BE0/201040A patent/BE883824A/fr not_active IP Right Cessation
- 1980-06-13 CH CH4579/80A patent/CH654113A5/fr not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-01-16 JP JP2004676A patent/JPH02276969A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2051357A (en) | 1981-01-14 |
| IT1140846B (it) | 1986-10-10 |
| JPH02276969A (ja) | 1990-11-13 |
| ZA801318B (en) | 1981-02-25 |
| DE3021891C2 (de) | 1983-08-04 |
| FR2459482A1 (fr) | 1981-01-09 |
| AT368813B (de) | 1982-11-10 |
| NL8001661A (nl) | 1980-12-16 |
| BE883824A (fr) | 1980-12-15 |
| ATA309980A (de) | 1982-03-15 |
| JPS562558A (en) | 1981-01-12 |
| JPH0220945B2 (fr) | 1990-05-11 |
| GB2051357B (en) | 1983-05-18 |
| CA1148859A (fr) | 1983-06-28 |
| IT8021874A0 (it) | 1980-05-07 |
| DE3021891A1 (de) | 1980-12-18 |
| FR2459482B1 (fr) | 1984-10-26 |
| AU530580B2 (en) | 1983-07-21 |
| AU5622680A (en) | 1980-12-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CH654113A5 (fr) | Procedes et reactifs pour la detection simultanee de differents marqueurs de l'hepatite. | |
| US4855240A (en) | Solid phase assay employing capillary flow | |
| US5648213A (en) | Compositions and methods for use in detection of analytes | |
| US5888827A (en) | Method for determination of cholesterol in low-density lipoprotein or very low-density lipoprotein | |
| CA2058515C (fr) | Methode de preparation de reactifs biologiquement actifs a partir de polymeres renfermant du succinimide; methodes d'utilisation et applications analytiques | |
| JPWO1996029599A1 (ja) | 低密度リポ蛋白中または超低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 | |
| JPH0346561A (ja) | 分析物検出のための方法、試薬及び試験ストリップ | |
| EP0022005B1 (fr) | Procédé de séparation d'une substance protéinique à partir d'une solution la contenant par filtration d'affinité et application dudit procédé aux dosages enzymatiques | |
| JPH0614045B2 (ja) | 末端デオキシヌクレオチジル転移酵素の測定法 | |
| CA2375894C (fr) | Activite des enzymes metabolisant le cholesterol amelioree par un accelerateur de reaction dans les methodes de quantification du cholesterol | |
| US4780410A (en) | Sandwich enzyme immunoassay for PIVKA-II with monoclonal anti-PIVKA-II antibody | |
| JPS63128260A (ja) | 抗ｈｉｖの測定法、そのための手段およびその使用 | |
| CH644455A5 (fr) | Procede d'analyse quantitative des nucleotides cycliques et ensemble de reactifs pour la mise en oeuvre de ce procede. | |
| FR2582103A1 (fr) | Procede de determination d'une substance biologique dans un echantillon | |
| EP0775315B1 (fr) | Procede de separation et/ou de detection et/ou de quantification de compose(s) infectieux et support pour la mise en oeuvre du procede | |
| FI68653B (fi) | Metod foer bestaemning av tyroxin-bindningsindex i serum och testfoerpackning foer utfoerande av bestaemningen | |
| US20030224445A1 (en) | Means for examining nephropathy | |
| FR2597981A1 (fr) | Procede de dosage des antigenes | |
| JPH07155196A (ja) | 生体成分の測定法 | |
| Xu et al. | Characterization of thread proteins expressed in neuroectodermal tumors | |
| JPH0854392A (ja) | 分離工程のない特異的結合アッセイ、試験キットおよび乾式分析要素 | |
| JP3864194B2 (ja) | 複数の亜型が存在する抗原の共通抗原決定基に特異的な抗体の測定法ならびに測定試薬 | |
| JP2005257308A (ja) | 高比重リポ蛋白中コレステロール分析用乾式分析素子 | |
| FR2723204A1 (fr) | Procede de detection et/ou de dosage de compose(s) infectueux dans un materiau biologique et support utilise pour ledit procede | |
| JPH03197865A (ja) | フォスファチジルコリンの測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PL | Patent ceased |